(57)【要約】 本発明は、連続して細胞をマイクロ流路の特定の領域に連続配置する機能と、画像ベースで複数の単色光の光源からの光によって細胞画像を順次撮影して、この比較解析によって１細胞単位でその細胞の形状と細胞あるいは細胞内の吸収スペクトル分布の情報に基づいて認識を行って細胞を選択的に分離精製する機能を有する細胞濃縮精製装置を提供する。
2012060163.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体由来の細胞試料液（a sample solution of cells derived from a subject）中の細胞を測定して、該細胞を選択的に分離・精製する細胞分析装置であって、
対象細胞を含む細胞を含有する細胞試料液を流す第１の流路と、該第１の流路内に細胞の吸収光スペクトル・イメージング像を検出するための細胞検出部と、前記対象細胞とそれ以外の細胞とを分離して選択的回収が行われる、第１の流路から分岐する少なくとも２本の分岐流路を含む細胞分離部とを含むセルソーターチップと、
前記第１の流路中を流れる前記細胞に、可視光領域スペクトルとなるように配置された複数の単色光光源からの光を照射する光照射手段と、少なくとも２００フレーム／秒の画像取り込みレートで前記細胞の像を各単色光の像として取得する高速カメラであって、前記各単色光像を比較することで前記細胞の吸光特性を空間分解能をもって判別することができる高速カメラとを含む光学系と、
前記少なくとも２本の分岐流路のうちいずれかの流路に前記対象細胞を誘導するための外力を細胞に選択的に印加する機構と、
を備える、細胞分析装置。
【請求項２】
前記外力が、超音波放射圧、重力、静電力、または誘電電気泳動力である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記細胞の前記各単波長について得られた画像を組み合わせて視覚的に観察される色を推定し、該細胞内での空間分布の結果に基づいて、各前記細胞を一細胞レベルで検出し、対象となる細胞を識別する、請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
前記細胞の全体の光学的イメージング像を２値化し、該２値化画像の輝度重心、面積、周囲長、長径、および短径からなる群から選択される少なくとも１つの指標によって、各前記細胞を一細胞レベルで検出し、対象となる細胞を識別する、請求項１〜３のいずれかに記載の装置。
【請求項５】
前記細胞試料液中の前記細胞が蛍光標識されており、前記光学系が、蛍光検出器をさらに含み、前記細胞の蛍光画像の情報が追加的な指標として利用される、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
被験体由来の細胞試料液中の細胞を測定して、該細胞を検出する細胞分析装置であって、
対象細胞を含む細胞を含有する細胞試料液を流す流路と、該流路中に細胞の吸収光スペクトル・イメージング像を検出するための細胞検出部とを含む流路チップと、
前記流路中を流れる前記細胞に、可視光領域スペクトルとなるように配置された複数の単色光光源からの光を照射する光照射手段と、少なくとも２００フレーム／秒の画像取り込みレートで該細胞の像を各単色光の像として取得する高速カメラであって、前記各単色光像を比較することで前記細胞の吸光特性を空間分解能をもって判別することができる高速カメラとを含む光学系と、
を備える、細胞分析装置。
【請求項７】
前記流路中を流れる前記細胞に可視光領域スペクトルとなるように配置された複数の単色光光源からの光を照射する光照射手段と、撮影カメラの受光面のサイズを取得したいスペクトル数分に分割するために得られた像を絞り込むためのスリットと、均等に画像スペクトルを分割することができる2個以上のダイクロイックミラーと光学フィルターの組と、少なくとも２００フレーム／秒の画像取り込みレートで該細胞の像を各単色光の像として取得する高速カメラであって、前記各単色光像を比較することで前記細胞の吸光特性を空間分解能をもって判別することができる高速カメラとを含む光学系と、
を備える、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞分析装置。
【請求項８】
被験体由来の細胞試料液中の細胞を測定して、該細胞を選択的に分離・精製する細胞分析方法であって、
対象細胞を含む細胞を含有する細胞試料液を流す第１の流路と、該第１の流路内に細胞の吸収光スペクトル・イメージング像を検出するための細胞検出部と、前記対象細胞とそれ以外の細胞とを分離して選択的回収が行われる、第１の流路から分岐する少なくとも２本の分岐流路を含む細胞分離部とを含むセルソーターチップの前記第１の流路に前記細胞試料液を導入する工程、
前記第１の流路中を流れる前記細胞に、複数の単色光光源からの光を照射する工程、
少なくとも２００フレーム／秒の画像取り込みレートで前記細胞の像を各単色光の像として取得し得、前記各単色光像を比較することで前記細胞の吸光特性を空間分解能をもって判別することができる高速カメラを用いて、前記細胞の画像を撮像する工程、
前記撮像した画像を分析した結果に基づいて、前記少なくとも２本の分岐流路のうちいずれかの流路に前記対象細胞を誘導するための外力を細胞に選択的に印加する工程、および
前記いずれかの流路に選別された前記対象細胞を回収する工程、
を含む、方法。
【請求項９】
前記細胞試料液中の前記細胞が予め抗体または色素により標識されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞試料液として、予め細胞の形状および／または染色により選別された細胞を含む細胞試料液を用いる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
被験体由来の細胞試料液中の細胞を同定するための細胞分析装置であって、
波長２８０ｎｍから７８０ｎｍの光波長帯域をカバーする波長域内の連続する特定の波長帯の複数の単色光光源のアレイを含むパルス光光源であって、各単色光光源を制御プログラムによってパルス光として照射することが可能なパルス光光源と、
対象細胞を含む細胞を含有する細胞試料液を保持し、前記光源アレイの波長領域について光学的に透明な材料で構成された細胞保持部と、
前記単色光光源アレイの光波長帯域での前記細胞の画像取得ができる波長特性を有する画像取得カメラと、
前記取得した画像を記録するための記録部と、
前記パルス光光源の単色光の波長と取得画像のフレームの相関を関連づけて該画像を前記記録部に記録し、これを用いて前記各単色光像の画像を比較することで前記細胞の細胞内部の吸光特性を空間分解能をもって判別して記録する画像処理部と、
を備える、細胞分析装置。
【請求項１２】
請求項１１記載の細胞分析装置において、前記光源が、前記画像取得カメラの１フレームの画像取得時間より短い時間でのパスル光を発光することができる単色光パスル光源のアレイを含む、請求項１１記載の細胞分析装置。
【請求項１３】
前記画像取得カメラの１フレームの画像取得時間として毎秒１万画像を取得できる高速カメラと、発光時間が０．１ms未満の単色光ＬＥＤ光源のアレイを備える、請求項１２記載の細胞分析装置。
【請求項１４】
請求項１１記載の細胞分析装置において、前記単色光光源アレイの２つ以上の単色光光源を同時にパルス発光させることで画像取得カメラでの取得画像が単色光光源の発光に応じた任意の２波長以上の波長での吸光像として取得することができるようにプログラムされている、請求項１１記載の細胞分析装置。
【請求項１５】
請求項１１記載の細胞分析装置において、前記観察用光源波長帯域について光学的に透明な材料で構成された細胞保持部が、試料溶液を連続して流す機能を有するフローセルである、請求項１１記載の細胞分析装置。
【請求項１６】
前記試料溶液を連続して流す機能を有するフローセルが、観察領域の下流に対象細胞を分離精製するための細胞分離・精製部を備える、請求項１５記載の細胞分析装置。
【請求項１７】
前記制御プログラムにより、前記単色光源アレイ中の各単色光の照射順序を任意に設定できる、請求項１１記載の細胞分析装置。
【請求項１８】
前記取得画像から得られた細胞像の中の核消失を指標にして対象細胞を判別する、請求項１１記載の細胞分析装置。
【請求項１９】
前記取得画像から得られた細胞像の中の細胞サイズと核サイズの比を指標にして対象細胞を判別する、請求項１１記載の細胞分析装置。
【請求項２０】
前記取得画像から得られた細胞像から細胞の集団化の程度を指標にして対象細胞を判別する、請求項１１記載の細胞分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
多細胞生物における生体組織は種々細胞が役割を分担して全体として調和の取れた機能を維持している。あるいは、細胞の一部ががん化（ここでは腫瘍も含め、一括してがんと呼ぶことにする）すると、周辺領域と異なる新生物となるが、がん領域とそこから遠く離れた正常組織部分とはある境界を持って必ずしも区切れるものではなく、がん周辺領域も何らかの影響を受けている。したがって、臓器組織における機能を解析するには狭い領域に存在する少数の細胞を短時間のうちになるべく簡単に、かつ損失を最小にして分離して分析する必要がある。【０００３】
また、再生医療の分野では、組織の中から臓器幹細胞を分離し、これを再培養して分化誘導し目的の組織、ひいては臓器を再生しようとする試みがなされている。【０００４】
細胞を識別したり分離したりしようとすると、何らかの指標に従い区別する必要がある。一般に細胞の区別には、
１）目視による形態学的な細胞分類：例えば尿中に出現する異型細胞検査による膀胱がんや尿道のがんなどの検査や血中の異型細胞分類、組織中における細胞診によるがん検査などをあげることができる。
２）蛍光抗体法による細胞表面抗原（マーカー）染色による細胞分類：一般にＣＤマーカーと呼ばれる細胞表面抗原を、それに特異的な蛍光標識抗体で染色するもので、セルソーターによる細胞分離やフローサイトメーターや組織染色によるがん検査などに用いられている。もちろんこれらは、医療面のみならず、細胞生理研究用や、工業的な細胞利用の上でも多用されている。
３）あるいは、幹細胞の分離に関しては、細胞内に取り込まれる蛍光色素をレポーターとして幹細胞を含む細胞を大まかに分離し、更にその後で実際に培養を行うことで目的の幹細胞を分離する例がある。これは、幹細胞の有効なマーカーがまだ確立されていないので、実際に培養し、分化誘導したもののみを利用することで、実質的に目的細胞を分離しているのである。
４）また、細胞の中の微小器官、細胞内抗生物質の種類に応じて、その光の吸収特性、複屈折特性が異なることを利用して、これを画像化することで細胞内の状態を観察する技術として、位相差光学顕微鏡や微分干渉光学顕微鏡などが存在しているが、ともに同時に複数の波長の光を用いると色収差のために像がぼけるため単色光を用いて観察を行う。
５）あるいは、特定の細胞あるいは細胞内小器官が、特異的に染まる染色法、例えば、グラム染色では、クリスタルバイオレットやゲンチアナバイオレットで染色し、ヨウ素溶液で媒染した後、アルコールで脱色し、その後フクシンまたはサフラニンで対比染色を行うことで、グラム陽性菌は暗い青や青紫に染まり、グラム陰性菌は対比染色によって赤やピンクに染まるため、細胞が染色された色を識別することで、細菌のグラム陽性か陰性を判断することができる。また、ロマノフスキー染色では、還元したエオシンとメチレンブルー（時にその酸化物であるアズールAとアズールBを含む）の組み合わせで染色することによって、全て骨髄生検や骨髄穿刺液・末梢血液塗沫の検体を診るのに使われ、異なった種類の白血球を容易に区別できる。あるいは、パパニコロー染色では、核はヘマトキシリン、細胞質はオレンジG、エオジンＹ、ライトグリーンＳＦ（分子量の小さい順）が、細胞質構造が緻密なものには分子量の小さい色素が入りやすく（例：角化型扁平上皮細胞：オレンジ）、疎なものには両方が入り込むが、分子量の大きい色素は移動性が少なく荷電が大きいので細胞内に吸着されやすく（例：非角化型扁平上皮細胞、腺細胞：ライトグリーン）、類脂質はビスマルクブラウンで染めることができ、悪性腫瘍細胞や感染症などを濃青緑色から暗赤色までの色のちがいで同定する方法である。ギムザ染色は、塩基性色素のメチレン青と、その酸化誘導体であるメチレンアズールとエオジンの酸性色素との混合液であるが、これらの色素は、末端のメチル基の違いや細胞内へ浸透する分子の影響によって染色性が異なり、比較的メチル基の少ないアズール・エオジネートは細胞質のみならず核内にも浸透し、核酸のリン酸基と結合し赤紫色調の核に染色される。他方、比較的分子の大きく極性の強いメチレン青は、細胞質のタンパク質と結合し青色調を呈することから、この染色の程度によって細胞の情報を得ることができる。ここで重要なことは、既存の染色による細胞同定法は、異なる複数の吸光特性を持った色素を組み合わせて、それらの色素の発色（吸収）の程度の相対的な組み合わせから視覚的にどのように異なる強度で各色成分が組み合わされるかで、どのような色に見えるかという視覚系の情報処理に依存した直観的でかつ可視スペクトル全体領域のスペクトルを対象とした計測法となっていることである。このことは、特定の１波長の蛍光を定量的に計測すればよい蛍光計測評価技術と最も異にする部分である。【０００５】
このように培養液中の特定の細胞を分離し回収することは、生物学・医学的な分析においては重要な技術である。細胞の比重の違いで細胞を分離する場合には速度沈降法によって分離することができる。しかし、未感作の細胞と感作した細胞とを見分けるような、細胞の比重の違いがほとんど無い場合には、蛍光抗体で染色した情報あるいは目視の情報を基に細胞を１つ１つ分離する必要がある。【０００６】
この技術については、例えば、セルソーターがある。セルソーターは、蛍光染色処理後の細胞を電荷を持たせた液滴中に１細胞単位で単離して滴下し、この液滴中の細胞の蛍光の有無、光散乱量の大小を基に、液滴が落下する過程で、落下方向に対して法平面方向に高電界を任意の方向に印加することで、液滴の落下方向を制御して、下部に置かれた複数の容器に分画して回収する技術である（非特許文献１：Kamarck,M.E., Methods Enzymol. Vol.151, p150-165 (1987)）。【０００７】
しかし、この技術は高価であること、装置が大型であること、数千ボルトという高電界が必要であること、一定以上の濃度まで濃縮された試料が多量に必要であること、液滴を作成する段階で細胞に損傷を与える可能性があること、直接試料を観察できないことなどの問題がある。これらの問題を解決するため、近年、マイクロ加工技術を用いて微細な流路を作成し、流路内の層流中を流れる細胞を直接顕微鏡観察しながら分離するセルソーターが開発されている（非特許文献２：Micro Total Analysis, 98, pp.77-80 (Kluwer Academic Publishers, 1998)；非特許文献３：Analytical Chemistry, 70, pp.1909-1915 (1998)）。しかし、このマイクロ加工技術を用いて作成するセルソーターでは観察手段に対する試料分離の応答速度が遅く、実用化するためには、試料に損傷を与えず、かつ、より応答の速い分離処理方法が必要であった。また、利用するサンプル溶液中の細胞濃度も一定以上の濃度に事前に高めることをしないと、希薄な細胞濃度であっては、十分に装置の分離効率を高めることができないという問題点、さらに微量なサンプルの濃縮を別装置で行った場合には、その濃縮液をロスなく回収することが困難であるだけでなく、煩雑な前処理段階において、細胞が汚染されるなどの回収した細胞を再利用するという観点では望ましくない問題が発生することが課題となっていた。【０００８】
本発明者らは、このような問題点を解消するため、マイクロ加工技術を活用して、試料の微細構造と試料中の蛍光分布に基づいて試料を分画し、回収する試料に損傷を与えることなく、簡便に細胞試料を分析分離することのできる細胞分析分離装置を開発している（特許文献１：特開２００３−１０７０９９；特許文献２：特開２００４−８５３２３；特許文献３：ＷＯ２００４／１０１７３１）。【０００９】
現在、癌組織の検出はMRI (核磁気共鳴画像法)やCT (コンピュータ断層撮影法)の改良によって飛躍的に改善されているが、良性・悪性腫瘍の同定については、バイオプシーによる評価を超える手法は存在していない。悪性腫瘍の問題点として、癌細胞自身の組織から血管あるいはリンパ管に浸潤する能力により他臓器に転移すること知られている。このように末梢血を循環する悪性腫瘍細胞は末梢血循環癌細胞(Circulating Tumor Cells: CTCs)と呼ばれ、血液細胞（赤血球を含む）10万細胞に数百細胞程度の癌細胞が存在すると考えられている。近年、特定のターゲットに対する制癌剤が次々と開発されており、血液中の悪性腫瘍の種類が同定できれば、その細胞を効果的に破壊する制癌剤を選択できるようになってきた。【００１０】
他方、細胞の像からより詳細な細胞の分類を可能にするイメージング法については、例えば、近年、定量化イメージングサイトメトリー（Quantitative Imaging Cytometry）技術が研究されている（非特許文献４：Harnett, M., “Laser scanning cytometry: understanding the immune system in situ. Nature Review Immunology, Vol. 7, pp. 897-904 (2007)）。このイメージングサイトメトリーは、従来の光学顕微鏡のイメージング法とサイトメトリーの概念を融合したもので、従来の組織のランダムな顕微鏡イメージングから、細胞形状や蛍光標識などの特定のインデックスについて基準値を設けて、組織中のすべての細胞を計測して統計処理するものである。ここでは、蛍光計測などについては、集束レーザー光を走査して計測するスキャニング型の蛍光イメージング法が主流となっている。【００１１】
他方、細胞像全体の複数の蛍光像、あるいは、複数の蛍光偏光像を同時に１つのカメラの受光画面上で取得する技術として、デュアル・ビュー顕微鏡技術がある（非特許文献５：Kinosita K Jr, Itoh H, Ishiwata S, Hirano K, Nishizaka T, Hayakawa T.“Dual-view microscopy with a single camera: real-time imaging of molecular orientations and calcium.”，J Cell Biol. 1991 Oct;115(1):67-73.）。ここでは位相差顕微鏡観察用の光源光と蛍光観察用の励起光を同一の光路上に導入し、これによって試料を観察したのちにダイクロイックミラーによって、波長分割をして蛍光像と位相差像を1枚のCCDカメラの受光画面の半分ずつに投影することで、1画像フレーム中に蛍光像と位相差像を同時に記録できるものである。また、この組み合わせによって2つの蛍光の観察、1つの蛍光の縦偏光と横偏光の比較などを行うことができる技術である。しかし、この技術について吸光スペクトル計測などの用途での利用は無い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００３−１０７０９９号公報
【特許文献２】特開２００４−８５３２３号公報
【特許文献３】国際公開第２００４／１０１７３１号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Kamarck,M.E., Methods Enzymol. Vol.151, p150-165 (1987)
【非特許文献２】Micro Total Analysis, 98, pp.77-80 (Kluwer Academic Publishers, 1998)
【非特許文献３】Analytical Chemistry, 70, pp.1909-1915 (1998)
【非特許文献４】Harnett, M., “Laser scanning cytometry: understanding the immune system in situ. Nature Review Immunology, Vol. 7, pp. 897-904 (2007)
【非特許文献５】Kinosita K Jr, et al., Dual-view microscopy with a single camera: real-time imaging of molecular orientations and calcium. J Cell Biol. 1991 Oct;115(1):67-73.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
臨床現場において、CTCsは癌転移に関して存在を確認する事が重要視されているにも拘わらず、これを癌転移の指標とした診断基準は、現状確立されていない。理由として、それ自体の多様性・希少性のため、採血後の血液から多様な形状を持つがん細胞を、その形状のみからがん細胞であることを特定するためには膨大な形状データベースを構築する必要があり、それゆえ確実に選択的にがん細胞を回収するアルゴリズムを開発することは非常に困難な課題であった。【００１５】
そのため、特にこれまでは、蛍光標識による血中の癌細胞の標識同定を行っていたが、特定のがんに特異的な蛍光標識を適切に選択できたかどうかについては、これを保証する手法が存在しない。そのため、CTCの計測について、血中がん細胞が存在するにもかかわらず、これを検出することができない「偽陰性」の問題があった。【００１６】
したがって、もし、血液中を流れるCTCsをモニターする技術が実現すれば、血液中を流れる転移癌の原因となる悪性腫瘍細胞の存在を定量的に計測することができ、それによって投与した制癌剤の効果を定量的に継続して評価することができ、不要な制癌剤の投与、過剰な制癌剤の投与を防ぐことができるのみならず、再発の有無についても検知することができる世界初の手法の実現となる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
このような状況に鑑み、本発明者らは、すでに本発明者らが提案してきた細胞形状あるいは細胞集団化のイメージング観察技術に基づいたフローサイトメトリーならびにセルソーティング、そしてこれらの技術に加えて同時に蛍光検出を行うことによる比較解析によって細胞を回収する技術に加えて、既存の細胞検査識別技術である、細胞のイメージングの吸収光スペクトル解析技術を加えて、細胞および細胞内の吸収スペクトル・イメージングのデータに基づいて細胞を識別することができ、かつ、必要に応じて選択的に対象となる細胞を回収することができる細胞分析装置を提供する。これは、従来のフローサイトメトリー技術では、蛍光光や散乱光など、バックグランド光が無いところでの試料からのシグナルを検出する場合には、バルク溶液容器中の微量細胞の光学的信号が取得可能であったことに対して、これらの従来技術では、バルク容器中に存在する微量細胞の吸収による微小な入射光の減少をバルクとして定量的に計測し、かつ、細胞あるいは細胞内の特定の領域の吸収スペクトルを空間分解能をもって計測できないことから、われわれは、新たに超高速カメラとフラッシュ単色光光源を組み合わせて、各単色入射光波長における画像イメージングを取得することによって空間分解能を持った吸収スペクトルを取得して、これによって吸光フローサイトメトリー技術を新たに提案するものである。【００１８】
また、特に血中を流れる赤血球細胞、白血球細胞以外の細胞となるがん細胞、幹細胞などについては、その多様性および／または未分化性から染色または抗体反応のみでは識別し対応できない細胞も存在する可能性もあるため、その場合には対象となる細胞を標識する手法以外にも、既知の白血球、赤血球等の血液細胞を染色して、染色されなかった細胞を目的細胞として回収する手法、または既知の細胞の形状から異なる細胞を回収する方法等が有効である。すなわち、上記、本発明者らが提案してきた細胞形状あるいは細胞集団化のイメージング観察技術に基づいたフローサイトメトリーおよびセルソーティング、ならびにこれらの技術に加えて同時に蛍光検出を行うことによる比較解析によって細胞を回収する技術さらに既存の細胞検査識別技術である、細胞のイメージングの吸収光スペクトル解析技術を加えて、細胞および細胞内の吸収スペクトル・イメージングのデータに基づいて細胞を識別する技術を、既知の血中の赤血球細胞および白血球細胞の標識として用い、標識されなかった細胞をがん細胞または幹細胞の候補細胞として回収する方法を新たに提案するものである。また、形状による識別については、特に、細胞のサイズに対して核のサイズの比率が非常に大きな未成熟細胞を対象とするものである。【００１９】
すなわち、本発明は、以下の装置を提供する。
［１］被験体由来の細胞試料液（a sample solution of cells from a subject）中の細胞を測定して、該細胞を選択的に分離・精製する細胞分析装置であって、
対象細胞を含む細胞を含有する細胞試料液を流す第１の流路と、該第１の流路内に細胞の吸収光スペクトル・イメージング像を検出するための細胞検出部と、上記対象細胞とそれ以外の細胞とを分離して選択的回収が行われる、第１の流路から分岐する少なくとも２本の分岐流路を含む細胞分離部とを含むセルソーターチップと、
上記第１の流路中を流れる上記細胞に、可視光領域スペクトルとなるように配置された複数の単色光光源からの光を照射する光照射手段と、少なくとも２００フレーム／秒の画像取り込みレートで上記細胞の像を各単色光の像として取得する高速カメラであって、上記各単色光像を比較することで上記細胞の吸光特性を空間分解能をもって判別することができる高速カメラとを含む光学系と、
上記少なくとも２本の分岐流路のうちいずれかの流路に上記対象細胞を誘導するための外力を細胞に選択的に印加する機構と、
を備える、細胞分析装置。
［２］上記外力が、超音波放射圧、重力、静電力、または誘電電気泳動力である、上記［１］に記載の装置。
［３］上記細胞の上記各単波長について得られた画像を組み合わせて視覚的に観察される色を推定し、該細胞内での空間分布の結果に基づいて、各上記細胞を一細胞レベルで検出し、対象となる細胞を識別する、上記［１］または［２］に記載の装置。
［４］上記細胞の全体の光学的イメージング像を２値化し、該２値化画像の輝度重心、面積、周囲長、長径、および短径からなる群から選択される少なくとも１つの指標によって、各上記細胞を一細胞レベルで検出し、対象となる細胞を識別する、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の装置。
［５］上記細胞試料液中の上記細胞が蛍光標識されており、上記光学系が、蛍光検出器をさらに含み、上記細胞の蛍光画像の情報が追加的な指標として利用される、上記［４］に記載の装置。
［６］被験体由来の細胞試料液中の細胞を測定して、該細胞を検出する細胞分析装置であって、
対象細胞を含む細胞を含有する細胞試料液を流す流路と、該流路中に細胞の吸収光スペクトル・イメージング像を検出するための細胞検出部とを含む流路チップと、
上記流路中を流れる上記細胞に、可視光領域スペクトルとなるように配置された複数の単色光光源からの光を照射する光照射手段と、少なくとも２００フレーム／秒の画像取り込みレートで該細胞の像を各単色光の像として取得する高速カメラであって、上記各単色光像を比較することで上記細胞の吸光特性を空間分解能をもって判別することができる高速カメラとを含む光学系と、
を備える、細胞分析装置。
［７］上記流路中を流れる上記細胞に可視光領域スペクトルとなるように配置された複数の単色光光源からの光を照射する光照射手段と、撮影カメラの受光面のサイズを取得したいスペクトル数分に分割するために得られた像を絞り込むためのスリットと、均等に画像スペクトルを分割することができる2個以上のダイクロイックミラーと光学フィルターの組と、少なくとも２００フレーム／秒の画像取り込みレートで該細胞の像を各単色光の像として取得する高速カメラであって、上記各単色光像を比較することで上記細胞の吸光特性を空間分解能をもって判別することができる高速カメラとを含む光学系と、
を備える、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の細胞分析装置。
［８］被験体由来の細胞試料液中の細胞を測定して、該細胞を選択的に分離・精製する細胞分析方法であって、
対象細胞を含む細胞を含有する細胞試料液を流す第１の流路と、該第１の流路内に細胞の吸収光スペクトル・イメージング像を検出するための細胞検出部と、上記対象細胞とそれ以外の細胞とを分離して選択的回収が行われる、第１の流路から分岐する少なくとも２本の分岐流路を含む細胞分離部とを含むセルソーターチップの上記第１の流路に上記細胞試料液を導入する工程、
上記第１の流路中を流れる上記細胞に、複数の単色光光源からの光を照射する工程、
少なくとも２００フレーム／秒の画像取り込みレートで上記細胞の像を各単色光の像として取得し得、上記各単色光像を比較することで上記細胞の吸光特性を空間分解能をもって判別することができる高速カメラを用いて、上記細胞の画像を撮像する工程、
上記撮像した画像を分析した結果に基づいて、上記少なくとも２本の分岐流路のうちいずれかの流路に上記対象細胞を誘導するための外力を細胞に選択的に印加する工程、および
上記いずれかの流路に選別された上記対象細胞を回収する工程、
を含む、方法。
［９］上記細胞試料液中の上記細胞が予め抗体または色素により標識されている、上記［８］に記載の方法。
［１０］上記細胞試料液として、予め細胞の形状および／または染色により選別された細胞を含む細胞試料液を用いる、上記［８］または［９］に記載の方法。
［１１］被験体由来の細胞試料液中の細胞を同定するための細胞分析装置であって、
波長２８０ｎｍから７８０ｎｍの光波長帯域をカバーする波長域内の連続する特定の波長帯の複数の単色光光源のアレイを含むパルス光光源であって、各単色光光源を制御プログラムによってパルス光として照射することが可能なパルス光光源と、
対象細胞を含む細胞を含有する細胞試料液を保持し、上記光源アレイの波長領域について光学的に透明な材料で構成された細胞保持部と、
上記単色光光源アレイの光波長帯域での前記細胞の画像取得ができる波長特性を有する画像取得カメラと、
上記取得した画像を記録するための記録部と、
上記パルス光光源の単色光の波長と取得画像のフレームの相関を関連づけて該画像を前記記録部に記録し、これを用いて上記各単色光像の画像を比較することで上記細胞の細胞内部の吸光特性を空間分解能をもって判別して記録する画像処理部と、
を備える、細胞分析装置。
［１２］上記［１１］記載の細胞分析装置において、上記光源が、上記画像取得カメラの１フレームの画像取得時間より短い時間でのパスル光を発光することができる単色光パスル光源のアレイを含む、上記［１１］記載の細胞分析装置。
［１３］上記画像取得カメラの１フレームの画像取得時間として毎秒１万画像を取得できる高速カメラと、発光時間が０．１ms未満の単色光ＬＥＤ光源のアレイを備える、上記［１２］記載の細胞分析装置。
［１４］上記［１１］記載の細胞分析装置において、上記単色光光源アレイの２つ以上の単色光光源を同時にパルス発光させることで画像取得カメラでの取得画像が単色光光源の発光に応じた任意の２波長以上の波長での吸光像として取得することができるようにプログラムされている、上記［１１］記載の細胞分析装置。
［１５］上記［１１］記載の細胞分析装置において、上記観察用光源波長帯域について光学的に透明な材料で構成された細胞保持部が、試料溶液を連続して流す機能を有するフローセルである、上記［１１］記載の細胞分析装置。
［１６］上記試料溶液を連続して流す機能を有するフローセルが、観察領域の下流に対象細胞を分離精製するための細胞分離・精製部を備える、上記［１５］記載の細胞分析装置。
［１７］上記制御プログラムにより、上記単色光源アレイ中の各単色光の照射順序を任意に設定できる、上記［１１］記載の細胞分析装置。
［１８］上記取得画像から得られた細胞像の中の核消失を指標にして対象細胞を判別する、上記［１１］記載の細胞分析装置。
［１９］上記取得画像から得られた細胞像の中の細胞サイズと核サイズの比を指標にして対象細胞を判別する、上記［１１］記載の細胞分析装置。
［２０］上記取得画像から得られた細胞像から細胞の集団化の程度を指標にして対象細胞を判別する、上記［１１］記載の細胞分析装置。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、微量な被検対象の細胞が、吸収によってどのような視覚的な色をもっているかを推定し、あるいは吸収スペクトルの特性を解析し、その色あるいは吸収特性の細胞内分布によって細胞を識別することができ、対象細胞を選択的に回収し精製して、その対象細胞の正確な遺伝子情報、発現情報の解析が実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の細胞分析装置１の一例を概念的に示す模式図である。
【図２】本発明の細胞分析装置１で使用されるセルソーターチップの一例を概念的に示す模式図である。
【図３】本発明において使用される画像イメージング記録の例を模式的に示す図である。
【図４】本発明において使用される光学系および画像イメージング記録の第2の例を模式的に示す図である。
【図５】本発明において得られた特定の波長の単色光によって吸収された細胞の像の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、図面を参照して本発明の実施形態をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲がこれらの実施形態に限定されるものではない。
【００２３】
図１は、本発明の細胞分析装置１の一実施形態の概念図である。
【００２４】
図１に示すように、本発明の細胞分析装置１は、典型的には、セルソーターチップ１００の基板上に形成したマイクロ流路を流れる細胞から、毎秒1万画像程度の細胞像の画像データを取得して、その画像情報の分析結果に基づいてリアルタイムで細胞集団あるいは細胞塊を最大毎秒1万細胞の時間処理能力で精製回収する画像検出型１細胞分離・精製モジュール２００、およびモジュール２００で取得した各種データを記録／解析し、モジュール２００の各部を制御する記録・制御部３００を備える。また、図示していないが、本発明の細胞分析装置１は、取得した画像データ、分析結果等を表示するディスプレイを備えていてもよい。
【００２５】
図２は、本発明の細胞分析装置１において用いる細胞の分離を行うセルソーターチップ１００の一例を示した模式図である。図２に示すように、セルソーターチップ１００は、チップ基板１０７上に形成された流路１０２、および流路１０２を流れる細胞に外力を適用するための外力発生器１０３および分離された細胞を流すための分岐流路（１０８，１０９）を備える。外力発生器１０３は、チップ基板１０７と必ずしも一体化していなくてもよい。
【００２６】
本発明の細胞分析装置１において使用されるセルソーターチップ１００は、典型的にはチップ基板１０７の流路１０２内に、細胞を分離精製する機能を持つ細胞分離・精製部、そして分離部の前段に分離精製する細胞を識別判断する光学的解析部（または細胞検出部）を含む。ただし、フローサイトメトリー機能による細胞の同定のみが目的の場合は、細胞検出部のみで足り、細胞分離・精製部は必ずしも必要ない。
【００２７】
細胞分離・精製部には、少なくとも２本の分岐流路（１０８，１０９）が含まれ、例えば、細胞が流れている流路の中で、細胞に対して外力を異なる方向に加えて下流の２つに分岐した流路のいずれか一方に、回収したい細胞を、他方の流路にその他の細胞を誘導するために、外力を細胞によって反対に加えて細胞の流れる位置を移動させることで、上記２つに分岐する流路のうちのいずれかに細胞を誘導することができる。
【００２８】
フローサイトメトリーにおいて細胞の吸光を計測するためには、細胞の画像イメージング機能が必要である。本発明の細胞分析装置１によれば、上記画像検出型１細胞分離・精製モジュールの画像に基づいた形状の微細な識別評価によって、細胞の形状を判別して、流路によって連続して搬送される細胞試料から、コンタミネーションや操作による消失を最小限に無くするかたちで微量の細胞を無染色であっても回収することができる。以下、画像検出型１細胞分離・精製モジュール２００の各部について具体的に説明する。
【００２９】
図１を参照して、画像検出型１細胞分離・精製モジュール２００は、典型的には、セルソーターチップ１００、光源２０１、ミラー２０２、集光レンズ２０３、ダイクロイックミラー２０４、必要に応じてフィルター２０５、高感度光検出素子（または蛍光検出器）２０６、および高速カメラ２０７を含む。
【００３０】
光源２０１は、例えば、セルソーターチップ１００を通過する細胞に対して、単色光を発するパルスレーザーや高輝度ＬＥＤがセットとなったスペクトル解析用の光源アレイなどからなる。好ましくは、光源２０１は、複数の単色光を発する単色パルスレーザーや単色高輝度ＬＥＤが組み合わされて広帯域をカバーする光源セットとなったスペクトル解析用の単色光光源アレイなどからなる。光源の照射光については、連続光を照射しても良いが、好ましくは、ブレの無い、より画像の空間分解能を高めるために、高速カメラ２０７のシャッター周期に同期してパルス光を発生させる。それにより、短時間の光照射で、より高時間分解能の像を取得することができる。
【００３１】
本発明によれば、複数単色光源を組み合わせることで、従来のバンドパスフィルターを用いた装置ではできなかった２光源（以上）の重ね合わせ画像の取得が可能となる。特に、各単色光光源の発光を連続ではなくパルス光とすることにより、複数の単色光光源から得られる吸光イメージを複数の波長について組み合わせた吸収スペクトル画像を得ることができる。好適な実施形態では、光源は、画像取得する高速カメラ２０７のシャッター周期（１フレームを取得する撮影時間分解能）より短時間でのパルス光源として発光できる機能を有する。これについては、従来のキセノンフラッシュ光源では毎秒４００回の発光程度が限界となっていることから、例えば、毎秒１万フレームの画像取得が可能な高速カメラであれば、少なくとも０．１ｍｓ未満でのインターバルで発光する光源が必要であるが、任意の単色光をこのような短時間で発光できる光源として現状の技術では、単色光パルスLED光源が利用可能であるが、これに限定されない。そして、各取得画像イメージ（画像フレーム）と単色光光源パルスの組み合わせを、取得したい波長領域についてインターバルにして複数の単色光イメージを取得して比較することで、この波長帯域の吸光スペクトル画像を得ることができる。すなわち、例えば、２８０ｎｍ〜３３０ｎｍの単色パルス光を発光させたところで画像取得カメラの１枚の画像を取得し、次に連続して次の画像取得カメラの１枚の画像を取得するフレーム時間内に次の単色光（例えば、３３０ｎｍ〜３８０ｎｍ）を発光させて次の波長域での吸光イメージを取得する、ということを連続して行う事で取得画像のセットが空間情報を持った吸光スペクトルイメージとなるのである。
【００３２】
高感度光検出素子（または蛍光検出器）２０６は、蛍光を検出するフォトマルチプライヤーなどから構成される。
【００３３】
高速カメラ２０７は、典型的には、カメラの受光面を構成する受光素子の光電子変換効率の波長による依存性を調整するために、受光側の出力が同程度となるように、各波長の光源の強度を受光側特性に合わせて調整する手段を有していてもよい。あるいは、各波長の光源強度は同じにしておき、受光素子の光電子変換効率の波長依存性を予め勘案した電子回路的あるいは画像処理プログラム段階での各波長受信データの増幅補正を行うことができる電子的2次元撮像素子、あるいはコンピュータ、増幅電子回路を有するカメラ、例えばＣＣＤカメラ（ビデオカメラ、デジタルカメラ）等であってもよい。
【００３４】
画像取得を実現するシステムとして、本発明の装置は、一実施形態において、（１）光源に複数の単色フラッシュ光源を用いて、各画像ごとに異なる単色フラッシュ光源の光を用いて、連続した複数枚の異なる波長での細胞像を比較解析することで、細胞の吸収波長特性を反映したイメージング像を取得して、その各波長の吸収（あるいは透過）光強度の組み合わせによって推定される空間分布を持ったスペクトル特性あるいは視覚的な色情報への変換（類推）を行って、細胞の種類を同定するシステムを備えている。このようなパルス光源の光の照射、画像の取り込み、解析等はコンピュータ（例えば、ＰＣ）を用いてプログラムにより実現することができる。好ましくは、上記光源は、複数の各々が異なる波長の単色フラッシュ光源を備えている。
【００３５】
ここで、例えば、単色フラッシュ光源の波長については、２８０nm〜７８０ｎｍの範囲で、例えば、５０ｎｍ幅での単色光のアレイを用いることができる。すなわち、例えば、波長２８０ｎｍ〜３３０ｎｍの波長域のみの単色光を発する光源、３３０ｎｍ〜３８０ｎｍの波長域のみの単色光を発する光源、３８０ｎｍ〜４３０nmの波長域のみの単色光を発する光源、というような具合に、あわせて１０個の異なる波長の単色光源を組み合わせることで、上記全波長域をカバーできる単色光源アレイとすることができる。ここでは一例として５０ｎｍの波長幅を述べたが、波長分解能と解析速度（全体域をカバーするための単色光源数）のバランスを考えて単色光光源の波長については１０ｎｍから１００ｎｍの波長幅の範囲のいずれかの波長幅（例えば、１０ｎｍ毎、２０ｎｍ毎、３０ｎｍ、等）を目的に応じて適宜選ぶことが望ましい。
【００３６】
このように、本発明に従って（according to the present invention）、光源が単色光アレイとなる場合には、画像取得カメラの撮影可能な波長域が上記単色光源アレイの波長域全体をカバーしている限り、各光源が単色光であることから、特に画像取得カメラにはフィルターを加えて透過光の波長域を選択する必要は無く、直接、対物レンズを通過した光のすべてをカメラに誘導することができる。したがって、吸光バンドパスフィルターを一切必要としない最も単純な光学系の構成を実現することができる（すなわち、単色光源アレイからのフラッシュ光はコンデンサーレンズによって流路中の細胞に照射され、得られた単色光での細胞像は対物レンズから直接、画像取得カメラの撮像面に照射されるものである）。そのため、従来の広帯域波長光源を用いた場合には、本発明と同様な効果をもたらす複数の単色光の像を得るためには、その波長幅に応じた複数のバンドパスフィルター群を光学系に組み込むという複雑な装置構成が必要であり、かつ、各フィルターの透過率の違いによる補正や複数のフィルターの組み合わせによる透過光の減衰などの問題への対応が必要であったものが、本発明のひとつのこのような特徴を用いれば、バンドパスフィルターを一切用いる必要が無い単純な装置構成が可能である。このように、本発明によれば、上記従来の問題が解決される事に加え、単色光光源アレイを構成する単色光光源の帯域幅を自在に交換調整するだけで、従来技術では光学フィルターの作成が困難であった波長帯域幅や領域での対応も可能となり、簡単に異なる波長幅のスペクトル画像を得ることができるようになる。また、従来のプリズムやスリット等を用いたスペクトロスコピーと異なり、瞬時に着目したい特定の複数の単色光のみを、連続して、波長域をジャンプして吸光イメージを取得することもできるし、あるいは、例えば、植物のファイトクロムに代表されるように照射される光によってその吸収特性が変わるタンパク質等に対応できるように照射する単色光の順番を自在にプログラムして組み合わせを変えることも可能である。
【００３７】
また、本発明の特徴を用いる事で、従来のバンドパスフィルター構造では不可能であった、任意の２波長以上の複数の単色パルス光の重ね合わせ画像取得が可能となる。すなわち、単色光源アレイ中の任意の２波長以上の複数の単色パルス光の同時照射によって、例えば、特定の２単色光の吸光画像イメージを重ね合わせた像を１枚の画像として光学的に取得する事ができる。すなわち、例えば、２８０ｎｍ〜３３０ｎｍの単色パルス光と４８０ｎｍ〜５３０ｎｍの単色パルス光を同時に画像取得カメラの１フレーム時間内に発光させる事で、２つの波長での吸収特性を組み合わせた従来装置では得ることができない画像を取得することができる。こうすることで、特に早い動きをする対象試料について、必要な波長域の組み合わせの吸収画像を１枚の画像で瞬時に得る事が可能となり、従来は存在しなかった「複数波長重ね合わせスペクトロスコピーイメージング」という新しい指標に基づいたスペクトロイメージング分野が細胞判別の新しい領域として創成される可能性を持っている。
【００３８】
また、上記で述べた装置構成は、特にセルソーターでの細胞判別で用いた場合の例として記載したが、光学顕微鏡に組み込む事で複数の単色光パルスによる吸光画像イメージの重ね合わせ像を画像取得カメラによって取得しても良い。あるいは、上記実施例では、細胞分離機能を有するセルソーターをその一例として述べたが、細胞精製機能（または細胞分離・精製部）を有さない細胞観察機能だけを有する基板、細胞保持容器または流路等であってもよい。例えば、上記単色光パルス光源アレイの発光波長領域について光学的に透明な合成石英等の素材からなる基板またはそのような基板に形成された細胞を含む溶液を流す流路であってもよい。例えば、該流路を流れる試料の吸光イメージングを連続して行う吸光イメージングサイトメトリー技術としてももちろん利用しても良い。
【００３９】
あるいは、別の実施形態において、（２）複数の単色フラッシュ光源あるいは、白色光源を用いて、各観察したい波長領域の像をダイクロイックミラー等のフィルターで分割し、これらを同時に１つのCCDカメラの受光面上に、受光面の半分あるいは複数の波長の場合には、観測したい分割数分だけ分割してイメージを投影し、その投影された各波長成分の像を比較することによって、その各波長の吸収（あるいは透過）光強度の組み合わせによって推定される空間分布を持ったスペクトル特性あるいは視覚的な色情報への変換（類推）を行って、細胞の種類を同定するシステムを備えている。
【００４０】
ここで、白色光あるいは複数の波長を混在させた入射光を使用する場合には、上記のように、複数のフィルターを用いて波長分割した画像イメージングデータを、単一のカメラの受光面の分割された領域のそれぞれに投影してスペクトル・イメージングデータとして取得してもよい。
【００４１】
他方、複数の単色光光源をひとつずつ発光させて用いる場合には、上記と同様なスペクトル・イメージングデータとする手法と、各単色光光源のパルス発光と画像イメージング像1枚とを組み合わせることでフィルターを用いずに各スペクトルデータを取得することができる。この場合は、移動する物体を順次、異なる単色光でイメージングしてゆくため、位置情報についての補正が必要となるが、波長フィルターが必要無くなるため、特に多くの波長分解をして計測をする場合に生じる多数のフィルターによる累積的光量の損失が抑えられるという利点がある。
【００４２】
ここで、画像による処理と、蛍光による処理とを併用してもよいことは言うまでもない。ただし、蛍光による計測を加えた場合には、蛍光観察用フィルター２０５を加える必要があり、この波長については、吸光スペクトル・イメージングを取得することができないため注意が必要である。また、図示していないが、高速カメラ２０７で得られた画像データは記録するだけでなく、コンピュータ（３００）のモニターに実時間で表示して使用者の観察に供することもできる。また、観察したい蛍光が複数の場合には、フィルター２０５を適切に調整し、複数の励起光を透過させるとともに、下段での蛍光検出のための蛍光波長に重ならない波長を選んで、細胞に光を照射し、観察したい蛍光の種類に合わせてダイクロイックミラー２０４から、フィルター２０５、蛍光検出器２０６までの装置を付加したものを複数組み合わせれば良い。また、この構成を用いることで、細胞像についての蛍光観察結果をデータとして用いることもできる。
【００４３】
本発明の細胞分析装置が具有する蛍光計測機能を用いることによって、標的とする細胞の蛍光標識の有無を1細胞レベルで検出して確認し、上記、吸光情報に加えて、蛍光標識された細胞を判定して総合的な判断によって、選択的に対象とする細胞を回収することができる。このように、本発明の細胞分析装置によれば、セルソーターチップ１００の流路を流れる細胞について同時に複数の情報を検出することができる。したがって、本発明の細胞分析装置によれば、従来の散乱光検出型セルソーター技術では識別できなかった指標に基づいて細胞を精密に分離・精製することができる。
【００４４】
本発明の細胞分析装置１において使用される記録・制御部３００は、例えば、電子的記録媒体（例：ROM、RAM、ハードディスク、USB、メモリカード等）を備えたパソコン（personal computer）、プログラム型演算素子、SPGA等から構成される。なお、記録部と制御部とは必ずしも一体化していなくよもよい。
【００４５】
本発明において使用される細胞認識と分離のアルゴリズムに関しては、次のような特徴がある。
【００４６】
細胞を画像として捕らえて評価する場合はセルソーターチップ１００の流路部分をＣＣＤカメラ等の高速カメラで観測する部位を設け、測定範囲を面に広げ画像認識で細胞の識別を行い、追跡することでより確実な細胞分離を行う。このとき重要なのは、画像の取り込み速度である。一般の３０フレーム／秒のビデオレートのカメラでは、画像での細胞取りこぼしが生じる可能性がある。最低２００フレーム／秒の取り込みレートがあれば、通常、流路中をかなりの速度で流れる細胞を認識できる。
【００４７】
画像検出型１細胞分離・精製モジュール２００において、細胞を画像として捕らえて評価する場合は、流路分岐部分の上流にＣＣＤカメラで観測する部位を設け、必要に応じてその下流に細胞分離領域を設置する。画像データに加えて、流路を通過する細胞にレーザーなどを照射し、細胞を蛍光で修飾している場合はその蛍光を光検出器で検出することもできる。この場合も、検出部の下流に細胞分離領域となる分離流路点を設置することができる。
【００４８】
細胞分離領域である選別部で細胞を分離する場合、外力発生器１０３により、細胞選別部に外部から細胞に外力を加えて細胞を移動させることができる。外力としては、例えば、誘電電気泳動力、静電力、超音波放射圧などを用いることができる。
【００４９】
誘電電気泳動力を用いる場合には１対の櫛形電極を設置し、細胞を分離して排出することのできる流路を設ける。静電力による場合は、電極に電圧をかけて細胞の流路内での位置変更を行う。このとき、一般に細胞はマイナスにチャージしているのでプラスの電極に向かって動く。あるいは外力として超音波放射圧を用いる場合には、細胞を音圧の節に誘導することができる。
【００５０】
以下、本発明の細胞分析装置１を用いて、対象細胞を含む細胞試料液中の対象細胞を分離・精製する細胞分析／分離方法について説明する。
【００５１】
チップ１００上で、まず、試料溶液は、流入口からシリンジポンプ、空気圧、液位差などの脈流が発生しない細胞導入手段によってマイクロ流路１０２に１０１の方向で導入される（図２を参照）。マイクロ流路に導入された細胞を含む試料液は、細胞選別部の前段に配置された細胞検出領域において、細胞を計測されて、その各細胞の種類を判定された後に、外力発生器１０３を用いて上流から下流への流れに垂直な方向への外力を加えることの有無によって、細胞選別部分岐部において分岐する２つの流路（１０８，１０９）を通って第一の流出口１０５と第二の流出口１０６のいずれかに誘導される。
【００５２】
また、本発明では、例えば細胞試料液のチップ内への導入圧力を、液の移動の駆動力として用いることができる。
【００５３】
画像検出型1細胞分離・精製モジュール２００（図１を参照）では、例えば1次検出として、1細胞レベルでの蛍光標識に基づいた蛍光の発光の有無を確認する。これによって細胞が対象となる細胞かどうかを従来の蛍光を用いた標識技術で確認することができる。そのうえで、蛍光を発して対象となる細胞について、高速カメラ２０７によって採取した画像をリアルタイムで分析することで、（１）蛍光を発する細胞が、どのような吸光特性を持っているか、あるいは細胞内がどのような吸光特性分布をもっているかというイメージングによる判別を行い、また、（２）蛍光を発する細胞が健常な状態であるか、細胞の核と細胞形状が変形しているアポトーシス等の状態となっているかなどの、細胞内小器官の形状を判別したり、あるいは細胞に対する核のサイズの比を比較してどのようながん細胞であるかを判別したり、あるいは、核の消失を行うM期の細胞が存在するかどうかなど、目的に応じて、画像から得られ得る情報の解析に基づいて、健常な孤立細胞の回収、血中での細胞集団あるいは細胞塊、あるいはアポトーシスを起こしている細胞、または特定の吸収特性を持った細胞の回収を行うことができる。
【００５４】
また、画像の検出の結果に基づいて判断して分離・精製を行う際は、細胞の吸収特性、細胞内の特定の微小器官の吸収特性に加えて、細胞のサイズの違い、細胞の集団数などの情報が画像情報として取得され、その結果に基づいて細胞が精製される。画像取得については、高速カメラが用いられ、精細な画像を取得するために高速カメラのシャッター周期に合わせて光源の発光が調整され、各シャッターが切られる期間のうちの一定の時間だけ光源の光を発光させる。例えば、シャッタースピードが1万分の1秒である場合は、その10分の1の期間だけ、ＬＥＤ光源あるいはパルスレーザー光源等の高速発光制御が可能な光源で対象となる細胞に光を照射することで、細胞試料の集団化の有無などの精細な形状を獲得することができる。
【００５５】
本発明において検出、分析、および／または分離の対象として想定している細胞は、ここでは血中細胞を中心に記述したが、血中細胞に限定されないことは言うまでもない。例えば、小さいものではバクテリア、大きいものでは動物細胞（例えば、がん細胞）、特にがん細胞においては細胞集団・細胞塊などが含まれるがこれらに限定されない。したがって、細胞試料サイズとしては典型的には約０．５μｍから約１００μｍ程度の範囲となる。そのため細胞分離機能を組み込んだ流路をバイオチップ基板の一面に形成して細胞濃縮および分離を連続して行う場合に、まず問題になるのが流路幅（断面形状）である。また、流路は基板表面の一つに基板の厚み方向で約１０〜約１００μｍのスペースを使用して、実質２次元平面状に作成することとなる。細胞の大きさからしてバクテリア用では厚み方向で約５〜約１０μｍ、動物細胞用および細胞集団・細胞塊用では厚み方向で約１００から約５００μｍが最も典型的なサイズとなる。細胞試料液の調製は、例えば、血液中の細胞検査の場合には、直接、ヘパリン入りの採血管でヒト血液を採取し、これをそのまま細胞試料として用いることができる。あるいは、赤血球について事前に選択的に溶血させて除去したい場合には、例えば、10倍容量のBD Pharm Lyseで室温で15分処理した後に分析に用いればよい。さらに、さまざまな染色法を用いる場合には、その染色法それぞれについて、従来の生検で用いる染色法をそのまま用いればよい。
【００５６】
また、上記記載の技術を用いて血中を流れる赤血球細胞、白血球細胞以外の細胞となるがん細胞、幹細胞などを回収する手順については、すでに標識抗体および／または染色法が決まっているものについては、それらの標識・染色技術をそのまま用いれば良いが、目的細胞の多様性および／または未分化性から染色または抗体反応のみでは識別し対応できない細胞も存在する。その場合には、既知の血液細胞である白血球、赤血球細胞、および血小板細胞の形状または染色による識別同定を行い、これらの識別によって同定できなかった細胞を目的細胞の候補として回収すればよい。すなわち、上記、本発明者らが提案してきた細胞形状あるいは細胞集団化のイメージング観察技術に基づいたフローサイトメトリーおよびセルソーティング、ならびにこれらの技術に加えて同時に蛍光検出を行うことによる比較解析によって細胞を回収する技術、さらに既存の細胞検査識別技術である、細胞のイメージングの吸収光スペクトル解析技術を加えて、細胞および細胞内の吸収スペクトル・イメージングのデータに基づいて細胞を識別する技術を、既知の血中の赤血球細胞および白血球細胞の標識として用い、標識されなかった細胞をがん細胞または幹細胞の候補細胞として回収すればよい。また、形状による識別については、特に、細胞のサイズに対して核のサイズの比率が非常に大きな未成熟細胞を判別して回収すればよい。
【００５７】
次に、図３を用いて本発明において用いる画像処理法について説明する。図３は、画像処理法の一例を説明するための模式図である。
【００５８】
まず、細胞認識は、例えば、各細胞が最初に画像フレームに現れたときに細胞にナンバリングを施し、以下、画像フレームから消えるまで同一ナンバーで管理を行うこととする。すなわち、連続する複数枚のフレームで細胞像が移動する状況をナンバーで管理する。各フレーム内での細胞は上流側にあったものから順に下流側に移行し、画像中に認識されるナンバリングされた特定細胞の移動速度はある範囲に収まるとの条件でフレーム間の細胞をリンクさせる。このようにすることで、たとえ、細胞の追い抜きがあったとしても各細胞を確実に追跡できるようにする。また、このようにすることで、複数の連続した画像において、異なる単色光を照射して順次、画像を取得することで、同一細胞の吸収（あるいは透過）光スペクトル・イメージングが可能となる。
【００５９】
これで、細胞の認識および吸収スペクトル・イメージングが可能となるが、細胞のナンバリングには、まず細胞像を２値化し、その重心を求める。２値化した細胞の輝度重心、面積、周囲長、長径、短径を求め、これらのパラメーターを用いて各細胞をナンバリングする。各細胞像をこの時点で画像として自動保存することも使用者にとって益があるので行えるようにする。
【００６０】
つぎに、細胞分離に使用する場合であるが、ナンバリングした細胞のうち、特定の細胞のみを分離しなくてはならない。分離の指標は上記した輝度重心、面積、周囲長、長径、短径などの情報でもよいし、画像とは別に蛍光検出を行うことを併用して蛍光を利用した情報を得てもよい。いずれにせよ、検出部で得た細胞をナンバリングに従い分離する。具体的には、所定時間毎に取り込まれる前記画像からナンバリングされた細胞の移動速度（Ｖ）を計算し、細胞移動速度（Ｖ）に対して検出部から選別部までの距離を（Ｌ）、印加時間（Ｔ）によって、印加タイミングを（Ｌ／Ｖ）から（Ｌ／Ｖ＋Ｔ）までとすることでちょうど目的のナンバーの細胞が電極間に来た時に細胞を電気的に振り分けて分離する。
【００６１】
フローセル中を流速ｖで流れてくる細胞３０１を、一定のインターバルで画像取得すると、例えば図３では、ｎ番目の画像で、まず第一の単色光での細胞像を取得することができる。次に、次の画像フレームの取得時間のタイミングで、次の単色パルス光を発光させてその画像を（ｎ＋１）番目の画像として取得することができ、その間に、細胞はｖ・Δτだけ、画像内を流速方向に進行する。同様に、次に、第３の単色パルス光を発光させて、その入射光波長での細胞の画像を（ｎ＋２）番目の画像として取得すると、細胞は同様に、さらにｖ・Δτだけ、画像内を流速方向に進行している。これらの画像を、流速方向と反対方向に、ｖ・Δτだけ移動させれば、細胞のそれぞれの単色光による像は重ね合わせることができるので、細胞あるいは細胞内の空間分解能を持った吸収特性（吸収の波長依存関係）を画像処理によって取得することができる。
【００６２】
他方、複数の波長を同時に１画面で処理する場合には、例えば図４に示すような方法が有効である。これは、同時に発光する複数の単色パルス光源あるいは、白色パルス光源を光源２０１として用い、得られた像について、スペクトロスコピー・イメージングとなるように、まず、高速カメラ２０７の受光面を分割したいスペクトル領域数分に均等に分割して同じ画像が投影できるように像領域を狭めることができるスリット４０１を用いて、画像のサイズを調整し、次に、均等に波長分割することができる２つ以上のダイクロイックミラーと波長フィルターを並列に並べ、ここを領域を狭めた観察像を通過させ、スペクトル分解する。次に、ミラー２０４の角度を微調整して、各ミラーから高速カメラの受光面に投影される位置が、各ミラーからの像で重ならずに、横に並ぶように配置する。このように配置することで、１枚の受光面４０２上に、異なる入射光波長の同様な細胞像４０３，４０４，４０５を並べて記録することができ、これら横にならぶ細胞の光強度を相対比較することで細胞イメージのスペクトル分布を取得することができる。
【００６３】
つぎに、本発明で使用されるセルソーターチップ１００の作製方法について説明する。
【００６４】
細胞の分離精製チップの構成の一例は以下のとおりである。入れられた試料溶液中の細胞の濃縮から配列、精製までを行う平面チップ上に２次元に展開して配置された一連の微細加工された流路と、チップに組み込まれた細胞に力を作用させる手段からなる。
【００６５】
まず、チップ基板の内部にマイクロ流路１０２を、上面にこの流路に連通する開口を設け、試料や必要な緩衝液（培地）の供給口とする。流路の作成はＰＭＭＡなどのプラスチックを金型に流し込むいわゆる射出成型で作成することで作成することもできるし、あるいは、複数のガラス基板を接着することで作成することもできる。チップのサイズは、例えば５０×７０×１ｍｍ（ｔ）であるがこれに限定されない。チップの内面に刻まれた溝や貫通穴を流路やウェルを流れる細胞を、高倍率の光学顕微鏡で観察できるように、ＰＭＭＡプラスチックを用いた場合には、例えば、０．１ｍｍ厚のラミネートフィルムを熱圧着して用いており、また、ガラスの場合は同様に０．１ｍｍのガラスを光学接着することで用いている。例えば、開口数１．４、倍率１００倍の対物レンズを用いて、０．１ｍｍのラミネートフィルムを通して流路内を流れる細胞を観察できる。プラスチックの場合、プラスチックを透光性の高いものとすれば、チップ基板１００の上面側からも観測できる。また、本発明で想定している細胞は、小さいものではバクテリア、大きいものでは動物細胞でがん細胞のようなものであり、さらにこれらの細胞集団あるいは細胞塊となる。したがって、細胞試料サイズとしては典型的には０．５μｍから５００μｍ程度の広い範囲となるが、厳密にこの範囲に限定されるわけではなく、本発明が有効に使用される限り任意のサイズの細胞が使用されうる。細胞濃縮と細胞分離を基板の一面に組み込んだ流路を用いて連続して行おうとすると、まず問題になるのが流路幅（断面形状）である。また、流路１０２はチップ１００表面の一つに基板の厚み方向で典型的には１０〜５００μｍ内外のスペースに実質２次元平面状に作成することとなる。細胞の大きさからしてバクテリア用では厚み方向で５〜１０μｍ、動物細胞用および細胞集団・細胞塊用では厚み方向で１０から５００μｍが適当なサイズとなる。
【００６６】
（実験結果およびスクリーニングインデックス）
図５は、実際に本発明の一実施形態に係る細胞分析装置を用いてさまざまな細胞のさまざまな単色光に対する吸光イメージを取得したものの一例について、特徴的な波長部分のイメージの一部を示したものである。この場合は、ギムザ染色した細胞についてのイメージであるが、この写真からもわかるように、細胞の種類の違いによって各吸収波長での細胞内での吸収特性が異なっており（染色の特性が異なっている）、このような取得画像を用いて、上でも述べたように（１）細胞内の核の有無あるいは細胞内の核の状態（M期）の区別、（２）細胞内の核のサイズの細胞サイズに対する割合、（３）特定の吸収波長での細胞内オルガネラの染色特性とその量（あるいは積算面積の細胞サイズに対する割合）、（４）細胞内での同一位置（同一オルガネラ）の複数の波長での吸収特性（吸収スペクトル）比較に基づいたオルガネラ種類と数の同定、（５）細胞のクラスター化の有無とクラスター中での各細胞の上記（１）（２）（３）の指標の特性等についての情報を得る事ができる。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明は、血中の微量な対象細胞を細胞の吸光特性という指標で分離精製して、その対象細胞の正確な遺伝子情報、発現情報の解析、再培養等を行うために特に有用である。
【符号の説明】
【００６８】
１  細胞分析装置
１００  セルソーターチップ
１０１  細胞サンプルの導入路
１０２  流路
１０３  外力発生器
１０４  外力の向き
１０５  回収細胞の流れ（１）
１０６  回収細胞の流れ（２）
１０７  チップ基板
１０８，１０９  分岐流路
２００  画像検出型１細胞分離・精製モジュール
２０１  レーザー
２０２  ミラー
２０３  集光レンズ
２０４  ダイクロイックミラー
２０５  波長フィルター
２０６  蛍光検出用フォトマルチプライヤー
２０７  高速カメラ
３００  記録・制御部
３０１  細胞
４０１  スリット
４０２  高速カメラの受光面
４０３、４０４、４０５  各単色光による細胞イメージ
【図１】
2012060163.tif 000003
【図２】
2012060163.tif 000004
【図３】
2012060163.tif 000005
【図４】
2012060163.tif 000006
【図５】
2012060163.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成25年2月27日(2013.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体由来の細胞試料液中の細胞を測定して、該細胞を選択的に分離・精製する細胞分析装置であって、
対象細胞を含む細胞を含有する細胞試料液を流す第１の流路と、該第１の流路内に細胞の吸収光スペクトル・イメージング像を検出するための細胞検出部と、前記対象細胞とそれ以外の細胞とを分離して選択的回収が行われる、第１の流路から分岐する少なくとも２本の分岐流路を含む細胞分離部とを含むセルソーターチップと、
前記第１の流路中を流れる前記細胞に、可視光領域スペクトルとなるように配置された複数の単色光光源からの光を照射する光照射手段と、少なくとも２００フレーム／秒の画像取り込みレートで前記細胞の像を各単色光の像として取得する高速カメラであって、前記各単色光像を比較することで前記細胞の吸光特性を空間分解能をもって判別することができる高速カメラとを含む光学系と、
前記少なくとも２本の分岐流路のうちいずれかの流路に前記対象細胞を誘導するための外力を細胞に選択的に印加する機構と、
を備える、細胞分析装置。
【請求項２】
前記外力が、超音波放射圧、重力、静電力、または誘電電気泳動力である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記細胞の前記各単波長について得られた画像を組み合わせて視覚的に観察される色を推定し、該細胞内での空間分布の結果に基づいて、各前記細胞を一細胞レベルで検出し、対象となる細胞を識別する、請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
前記細胞の全体の光学的イメージング像を２値化し、該２値化画像の輝度重心、面積、周囲長、長径、および短径からなる群から選択される少なくとも１つの指標によって、各前記細胞を一細胞レベルで検出し、対象となる細胞を識別する、請求項１〜３のいずれかに記載の装置。
【請求項５】
前記細胞試料液中の前記細胞が蛍光標識されており、前記光学系が、蛍光検出器をさらに含み、前記細胞の蛍光画像の情報が追加的な指標として利用される、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
被験体由来の細胞試料液中の細胞を測定して、該細胞を検出する細胞分析装置であって、
対象細胞を含む細胞を含有する細胞試料液を流す流路と、該流路中に細胞の吸収光スペクトル・イメージング像を検出するための細胞検出部とを含む流路チップと、
前記流路中を流れる前記細胞に、可視光領域スペクトルとなるように配置された複数の単色光光源からの光を照射する光照射手段と、少なくとも２００フレーム／秒の画像取り込みレートで該細胞の像を各単色光の像として取得する高速カメラであって、前記各単色光像を比較することで前記細胞の吸光特性を空間分解能をもって判別することができる高速カメラとを含む光学系と、
を備える、細胞分析装置。
【請求項７】
前記流路中を流れる前記細胞に可視光領域スペクトルとなるように配置された複数の単色光光源からの光を照射する光照射手段と、撮影カメラの受光面のサイズを取得したいスペクトル数分に分割するために得られた像を絞り込むためのスリットと、均等に画像スペクトルを分割することができる2個以上のダイクロイックミラーと光学フィルターの組と、少なくとも２００フレーム／秒の画像取り込みレートで該細胞の像を各単色光の像として取得する高速カメラであって、前記各単色光像を比較することで前記細胞の吸光特性を空間分解能をもって判別することができる高速カメラとを含む光学系と、
を備える、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞分析装置。
【請求項８】
被験体由来の細胞試料液中の細胞を測定して、該細胞を選択的に分離・精製する細胞分析方法であって、
対象細胞を含む細胞を含有する細胞試料液を流す第１の流路と、該第１の流路内に細胞の吸収光スペクトル・イメージング像を検出するための細胞検出部と、前記対象細胞とそれ以外の細胞とを分離して選択的回収が行われる、第１の流路から分岐する少なくとも２本の分岐流路を含む細胞分離部とを含むセルソーターチップの前記第１の流路に前記細胞試料液を導入する工程、
前記第１の流路中を流れる前記細胞に、複数の単色光光源からの光を照射する工程、
少なくとも２００フレーム／秒の画像取り込みレートで前記細胞の像を各単色光の像として取得し得、前記各単色光像を比較することで前記細胞の吸光特性を空間分解能をもって判別することができる高速カメラを用いて、前記細胞の画像を撮像する工程、
前記撮像した画像を分析した結果に基づいて、前記少なくとも２本の分岐流路のうちいずれかの流路に前記対象細胞を誘導するための外力を細胞に選択的に印加する工程、および
前記いずれかの流路に選別された前記対象細胞を回収する工程、
を含む、方法。
【請求項９】
前記細胞試料液中の前記細胞が予め抗体または色素により標識されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞試料液として、予め細胞の形状および／または染色により選別された細胞を含む細胞試料液を用いる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
被験体由来の細胞試料液中の細胞を同定するための細胞分析装置であって、
波長２８０ｎｍから７８０ｎｍの光波長帯域をカバーする波長域内の連続する特定の波長帯の複数の単色光光源のアレイを含むパルス光光源であって、各単色光光源を制御プログラムによってパルス光として照射することが可能なパルス光光源と、
対象細胞を含む細胞を含有する細胞試料液を保持し、前記光源アレイの波長領域について光学的に透明な材料で構成された細胞保持部と、
前記単色光光源アレイの光波長帯域での前記細胞の画像取得ができる波長特性を有する画像取得カメラと、
前記取得した画像を記録するための記録部と、
前記パルス光光源の単色光の波長と取得画像のフレームの相関を関連づけて該画像を前記記録部に記録し、これを用いて前記各単色光像の画像を比較することで前記細胞の細胞内部の吸光特性を空間分解能をもって判別して記録する画像処理部と、
を備える、細胞分析装置。
【請求項１２】
請求項１１記載の細胞分析装置において、前記光源が、前記画像取得カメラの１フレームの画像取得時間より短い時間でのパルス光を発光することができる単色光パルス光源のアレイを含む、請求項１１記載の細胞分析装置。
【請求項１３】
前記画像取得カメラの１フレームの画像取得時間として毎秒１万画像を取得できる高速カメラと、発光時間が０．１ms未満の単色光ＬＥＤ光源のアレイを備える、請求項１２記載の細胞分析装置。
【請求項１４】
請求項１１記載の細胞分析装置において、前記単色光光源アレイの２つ以上の単色光光源を同時にパルス発光させることで画像取得カメラでの取得画像が単色光光源の発光に応じた任意の２波長以上の波長での吸光像として取得することができるようにプログラムされている、請求項１１記載の細胞分析装置。
【請求項１５】
請求項１１記載の細胞分析装置において、前記観察用光源波長帯域について光学的に透明な材料で構成された細胞保持部が、試料溶液を連続して流す機能を有するフローセルである、請求項１１記載の細胞分析装置。
【請求項１６】
前記試料溶液を連続して流す機能を有するフローセルが、観察領域の下流に対象細胞を分離精製するための細胞分離・精製部を備える、請求項１５記載の細胞分析装置。
【請求項１７】
前記制御プログラムにより、前記単色光源アレイ中の各単色光の照射順序を任意に設定できる、請求項１１記載の細胞分析装置。
【請求項１８】
前記取得画像から得られた細胞像の中の核消失を指標にして対象細胞を判別する、請求項１１記載の細胞分析装置。
【請求項１９】
前記取得画像から得られた細胞像の中の細胞サイズと核サイズの比を指標にして対象細胞を判別する、請求項１１記載の細胞分析装置。
【請求項２０】
前記取得画像から得られた細胞像から細胞の集団化の程度を指標にして対象細胞を判別する、請求項１１記載の細胞分析装置。
【国際調査報告】
2012060163.tif 000008
2012060163.tif 000009
2012060163.tif 000010
2012060163.tif 000011