(57)【要約】  本発明では、細胞障害や発熱の問題を起こさず、生体透過性のよい（好ましくは波長７００〜１０００ｎｍ程度の）近赤外光を利用してＲＮＡを細胞内に導入する手段を提供することを目的とする。本発明に係るキャリア分子は、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）およびＲＮＡ結合性蛋白質（ＲＢＰ）を含むキャリア蛋白質と、該キャリア蛋白質のＮ末端側またはＣ末端側に連結した、近赤外線領域の波長を有する光で機能する光増感剤（ＰＳＴ）とからなる構造を有することを特徴とする。該キャリア分子と該キャリア分子中のＲＢＰに結合したＲＮＡとからなるキャリア分子／ＲＮＡ複合体を形成させ、該複合体を細胞と接触させて該細胞内のエンドソームに局在化させた後、該キャリア分子／ＲＮＡ複合体中のＰＳＴが機能する近赤外光を照射することにより、該キャリア分子／ＲＮＡ複合体を細胞質中に拡散させて、導入したＲＮＡの機能を発現させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）およびＲＮＡ結合性蛋白質（ＲＢＰ）を含むキャリア蛋白質と、該キャリア蛋白質のＮ末端側またはＣ末端側に連結した、近赤外線領域の波長を有する光で機能する光増感剤（ＰＳＴ）とからなる構造を有することを特徴とするキャリア分子。
【請求項２】
前記光増感剤（ＰＳＴ）が７００ｎｍ〜１０００ｎｍの波長を有する光で機能するものである、請求項１に記載のキャリア分子。
【請求項３】
前記光増感剤（ＰＳＴ）が、下記構造式で表される化合物（ＤＹ７５０）、図３に示す蛍光スペクトルを有する化合物（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７５０）または図４に示す吸収スペクトルを有する化合物（ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ）である、請求項１または２に記載のキャリア分子。
【化１】
2012127739.tif 000006
【請求項４】
前記キャリア蛋白質が、さらにプロテアソーム分解シグナル配列タグ（ＰＤＳ）および／またはＨｉｓ−ｒｉｃｈタグ（ＨＲ）を含む、請求項１〜３のいずれかに記載のキャリア分子。
【請求項５】
前記キャリア蛋白質において、Ｎ末端側から、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）、ＲＮＡ結合性蛋白質（ＲＢＰ）、プロテアソーム分解シグナル配列タグ（ＰＤＳ）および／またはＨｉｓ−ｒｉｃｈタグ（ＨＲ）がこの順序で連結されており、かつ当該キャリア蛋白質のＣ末端側に前記光増感剤（ＰＳＴ）が連結されている、請求項１〜４のいずれかに記載のキャリア分子。
【請求項６】
前記ＣＰＰが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する、ヒト免疫不全ウイルス由来Ｔａｔ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）蛋白質中の１２アミノ酸からなるペプチドである、請求項１〜５のいずれかに記載のキャリア分子。
ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ                            配列番号１
【請求項７】
前記ＲＢＰが、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する、ヒト由来Ｕ１Ａ（Ｕ１  ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）のＲＮＡ結合ドメインである、請求項１〜６のいずれかに記載のキャリア分子。
ＡＶＰＥＴＲＰＮＨＴＩＹＩＮＮＬＮＥＫＩＫＫＤＥＬＫＫＳＬＹＡＩＦＳＱＦＧＱＩＬＤＩＬＶＳＲＳＬＫＭＲＧＱＡＦＶＩＦＫＥＶＳＳＡＴＮＡＬＲＳＭＱＧＦＰＦＹＤＫＰＭＲＩＱＹＡＫＴＤＳＤＩＩＡＫＭＫ                                            配列番号４
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のキャリア分子と、該ＲＮＡキャリア分子中のＲＢＰに結合したＲＮＡとからなる構造を有するキャリア分子／ＲＮＡ複合体。
【請求項９】
前記ＲＮＡが、ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である、請求項８に記載のＲＮＡ複合体。
【請求項１０】
請求項８または９に記載のキャリア分子／ＲＮＡ複合体を含む遺伝子治療薬。
【請求項１１】
がんまたはウイルス疾患を対象とする、請求項１０に記載の遺伝子治療薬。
【請求項１２】
生体外において、請求項８または９に記載のキャリア分子／ＲＮＡ複合体を細胞と接触させて当該細胞内のエンドソームに局在化させる工程、および該キャリア分子／ＲＮＡ複合体中のＰＳＴが機能する近赤外線領域の波長を有する光を照射して該キャリア分子／ＲＮＡ複合体を細胞質中に拡散させる工程を含むことを特徴とする、細胞質内へのＲＮＡの送達方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所定の機能を発現しうるＲＮＡ（機能性ＲＮＡ）を細胞内に導入し、所定の波長を有する光を照射することによりその機能を発現させるための方法および当該方法に用いられるキャリア分子などに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡｉは、ｓｈＲＮＡやｓｉＲＮＡの塩基配列に依存して特定遺伝子の発現が抑制される現象であり、病気の原因となる遺伝子やウイルス遺伝子の発現抑制に基づく疾患治療などに応用できるため近年非常に注目されている。このような目的のために、ＲＮＡを細胞質内に効率的に導入する手段の研究開発が進められている。【０００３】
特許文献１には、ＲＮＡ結合性タンパク質および膜透過性キャリアペプチドを含む融合タンパク質に、該ＲＮＡ結合性タンパク質に対する認識配列および任意の配列を有するＲＮＡを結合させ、この結合体を任意の細胞と混合することにより、該ＲＮＡを細胞内に導入する方法が記載されている。【０００４】
非特許文献１および２には、ＲＮＡ結合性タンパク質および膜透過性キャリアペプチドに加えて可視領域の波長の光で励起する蛍光色素（たとえばAlexa Fluor 546、励起波長530-550nm）を含む融合タンパク質にｓｉＲＮＡを結合させた複合体が記載されている。そして、この結合体と細胞を接触させ、当該結合体がエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれエンドソームに局在化した後、励起光を照射することにより、蛍光色素が光増感剤として作用し、ｓｉＲＮＡがエンドソームから細胞質に放出され、所定のＲＮＡｉ効果を達成できることが記載されている（図１参照）。なお、非特許文献１および２には、近赤外領域の波長の光で励起する蛍光色素を用いても上記のような作用効果が奏されることは、記載も示唆もされていない。【０００５】
一方、特許文献２には、機能性分子キャリアとして金ナノロッドを用い、金ナノロッド凝集体とＤＮＡとの複合体を培養細胞に添加し、近赤外域（波長１０６４ｎｍ）のパルスレーザーを照射することにより、ＤＮＡを金ナノロッドから脱離させて、当該ＤＮＡからの遺伝子を効率的に発現させる方法が記載されている（実施例参照）。しかしながら、金ナノロッドは光熱変換機能を有し、金ナノロッドを集積させた標的部位周辺組織へのフォトサーマル治療（腫瘍細胞等を発生した熱で死滅させる）ために用いられている材料でもあるため（たとえば特許文献３参照）、そのようなことを目的としない使用における細胞毒性や安全性について懸念される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２８０２６１号公報
【特許文献２】特開２００５−２５５５８２号公報
【特許文献３】特開２０１０−０８３８０３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】T. Endoh, M. Sisido and T.Ohtsuki (2008) Cellular siRNA delivery mediated by a cell permeant RNA-binding protein and photoinduced RNA interference.  Bioconjugate chemistry 19(5), 1017-1024.
【非特許文献２】T. Endoh, M. Sisido and T.Ohtsuki (2009) Spatial regulation of specific gene expression through photoactivation of RNAi.  Journal of Controlled Release 137, 241-245.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
非特許文献１および２に記載された方法によりＲＮＡを細胞内に導入する場合、励起光として可視光が用いられるが、可視光は生体内への透過性に劣る。そのため、生体の表層（たとえば皮膚表面）にある細胞へのＲＮＡの導入には適用できるが、生体内の深部にある細胞へのＲＮＡの導入には不適当である。【０００９】
本発明は、細胞障害や発熱の問題を起こさず、生体透過性のよい（好ましくは波長７００〜１０００ｎｍ程度の）近赤外光を利用してＲＮＡを細胞内に導入する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、近赤外光を励起光とする蛍光色素のうち特定のものが、非特許文献１等に記載の複合体中の蛍光色素として用いた場合に、近赤外光の照射により光増感剤として作用し、エンドソームから細胞質にＲＮＡを放出させる能力を有することを見いだした（図１参照）。さらに、その複合体中の融合タンパク質に特定のペプチドをさらに加えることにより、ＲＮＡの細胞質内への導入効率をさらに高めることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１１】
すなわち、本発明は下記の事項を包含する。
［１］細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）およびＲＮＡ結合性蛋白質（ＲＢＰ）を含むキャリア蛋白質と、該キャリア蛋白質のＮ末端側またはＣ末端側に連結した、近赤外線領域の波長を有する光で機能する光増感剤（ＰＳＴ）とからなる構造を有することを特徴とするキャリア分子。【００１２】
［２］前記光増感剤（ＰＳＴ）が７００ｎｍ〜１０００ｎｍの波長を有する光で機能するものである、［１］に記載のキャリア分子。
［３］前記光増感剤（ＰＳＴ）が、下記構造式で表される化合物（ＤＹ７５０）、図３に示す蛍光スペクトルを有する化合物（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７５０）または図４に示す吸収スペクトルを有する化合物（ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ）である、［１］または［２］に記載のキャリア分子。
【化１】
2012127739.tif 000002
【００１３】
［４］前記キャリア蛋白質が、さらにプロテアソーム分解シグナル配列タグ（ＰＤＳ）および／またはＨｉｓ−ｒｉｃｈタグ（ＨＲ）を含む、［１］〜［３］のいずれかに記載のキャリア分子。【００１４】
［５］前記キャリア蛋白質において、Ｎ末端側から、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）、ＲＮＡ結合性蛋白質（ＲＢＰ）、プロテアソーム分解シグナル配列タグ（ＰＤＳ）および／またはＨｉｓ−ｒｉｃｈタグ（ＨＲ）がこの順序で連結されており、かつ当該キャリア蛋白質のＣ末端側に前記光増感剤（ＰＳＴ）が連結されている、［１］〜［４］のいずれかに記載のキャリア分子。【００１５】
［６］前記ＣＰＰが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する、ヒト免疫不全ウイルス由来Ｔａｔ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）蛋白質中の１２アミノ酸からなるペプチドである、［１］〜［５］のいずれかに記載のキャリア分子。
ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ                                  配列番号１【００１６】
［７］前記ＲＢＰが、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する、ヒト由来Ｕ１Ａ（Ｕ１  ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）のＲＮＡ結合ドメインである、［１］〜［６］のいずれかに記載のキャリア分子。
ＡＶＰＥＴＲＰＮＨＴＩＹＩＮＮＬＮＥＫＩＫＫＤＥＬＫＫＳＬＹＡＩＦＳＱＦＧＱＩＬＤＩＬＶＳＲＳＬＫＭＲＧＱＡＦＶＩＦＫＥＶＳＳＡＴＮＡＬＲＳＭＱＧＦＰＦＹＤＫＰＭＲＩＱＹＡＫＴＤＳＤＩＩＡＫＭＫ                                                                    配列番号２【００１７】
［８］［１］〜［７］のいずれかに記載のキャリア分子と、該ＲＮＡキャリア分子中のＲＢＰに結合したＲＮＡとからなる構造を有するキャリア分子／ＲＮＡ複合体。
［９］前記ＲＮＡが、ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である、［８］に記載のＲＮＡ複合体。【００１８】
［１０］［８］または［９］に記載のキャリア分子／ＲＮＡ複合体を含む遺伝子治療薬または診断薬。
［１１］がんまたはウイルス疾患を対象とする、［１０］に記載の遺伝子治療薬または診断薬。【００１９】
［１２］生体外において、［８］または［９］に記載のキャリア分子／ＲＮＡ複合体を細胞と接触させて当該細胞内のエンドソームに局在化させる工程、および該キャリア分子／ＲＮＡ複合体中のＰＳＴが機能する近赤外線領域の波長を有する光を照射して該キャリア分子／ＲＮＡ複合体を細胞質中に拡散させる工程を含むことを特徴とする、細胞質内へのＲＮＡの送達方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によるＲＮＡキャリアは大部分を生体分子である蛋白質で合成することができるため、生分解性で細胞毒性がなく、安全なＲＮＡキャリアとして使用することができる。また、近赤外光を照射したときのみＲＮＡが細胞質内に拡散するので、位置やタイミングを指定してＲＮＡを細胞質内に送達させ、ＲＮＡｉ等のＲＮＡ機能の発現を引き起こすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、所定の波長を有する光の照射によりRNAを細胞質内に送達する方法の概要 。A) RNAキャリア蛋白質 (CPP-RBP) とRNAの複合体。B) エンドサイトーシスを経由するCPP-RBP/RNA複合体の細胞質への移行。蛍光基を付加したCPP-RBPは、まず1) CPPを介して細胞内に導入され、2) エンドサイトーシスを経由してエンドソームに取り込まれる。次に、3) 用いる蛍光色素の励起波長の光を照射することにより、エンドソーム膜が崩壊し、4) CPP-RBP/RNA複合体が細胞質に拡散して、5)RNAの機能が発現する（導入したRNAがshRNA等の場合はDNAiが誘導される）。
【図２】図２は、ＤＹ７５０の励起スペクトル（左）および蛍光スペクトル（右）を表す。
【図３】図３は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０の蛍光スペクトル（右）を表す（対比のためＣｙ７の蛍光スペクトル（左）も併記されている）。
【図４】図４は、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷの励起スペクトルを表す（蛍光スペクトルも併記されている）。
【図５】図５は、実施例３）で行った、近赤外光照射によるキャリア/shRNA複合体の細胞質への移行の有無を示す画像である。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＤＹ７５０およびＩＲＤｙｅ８００ＣＷでは細胞質中にＲＮＡが見られ、特にＤＹ７５０について明瞭であり、これらの蛍光色素を用いると近赤外光の照射によりキャリア/shRNA 複合体を細胞質中に拡散させることができることが確認された。
【図６】図６は、実施例４）で作製したTatU1A-DY750を用いた近赤外光照射によるRNAi効果を示すグラフである。
【図７】図７は、実施例６）で作製したTatU1A-His6-DY750を用いた近赤外光照射によるRNAi効果を示すグラフである。
【図８】図８は、実施例７）で行った、ヒト腫瘍細胞におけるRNAi効果を示すグラフである。(A)フローサイトメトリーによる測定結果。(B)フローサイトメトリーの結果から算出された平均蛍光強度。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
―キャリア蛋白質―
本発明におけるキャリア蛋白質は、少なくとも細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）とＲＮＡ結合性蛋白質（ＲＢＰ）を必須の構成要素として含み、好ましくはさらにプロテアソーム分解シグナル配列タグ（ＰＤＳ）および／またはＨｉｓ−ｒｉｃｈタグ（ＨＲ）を構成要素として含むペプチド（融合タンパク質）を指す。
【００２３】
ＣＰＰ、ＲＢＰ、ＰＤＳ、Ｈｉｓ6の要素同士は、直接ペプチド結合を介して連結していてもよいし、リンカーとなるペプチド（通常１〜２０個程度のアミノ酸からなるもの）を介して連結していてもよい。また、上記所定の要素およびリンカーを含むキャリア蛋白質全体がペプチド（アミノ酸）のみで構成されることが望ましいが、リンカーとしてペプチド（アミノ酸）以外の化合物、たとえばＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などを用いてキャリア蛋白質を構成することも可能である。
【００２４】
必要に応じて、キャリア蛋白質の内部または末端に上記要素以外のペプチドが含まれていてもよい。たとえば、発現ベクターが産生した本発明のキャリア蛋白質をアフィニティ・クロマトグラフィによって精製・回収するためのＨｉｓタグまたはＧＳＴタグがキャリア蛋白質のＮ末端付近に連結されていてもよい（キャリア蛋白質の回収後に上記Ｈｉｓタグを切断しない場合は、当該Ｈｉｓタグを膜透過性を高めるためのＨＲとして利用することができる。そのようなＨＲはキャリア蛋白質のＮ末端側およびＣ末端側の両方に連結されていてもよい。）。また、後述するような手法によりＰＳＴをキャリア蛋白質に連結させるために、システインを末端付近に位置させておいてもよい。
【００２５】
・細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）
ＣＰＰは、一般的にアルギニンなどの塩基性アミノ酸に富んだアミノ酸配列を有する、細胞膜と結合し自身を細胞内に取り込ませる働きを持つポリペプチドとして知られており、膜透過性ドメイン（Protein Transduction Domain: PTD）と称されることもある。当初、ＣＰＰは、細胞膜を透過して自発的に細胞内に侵入すると考えられたため「細胞膜透過性ペプチド」と命名されているが、現在では一般的に、主に細胞のエンドサイトーシス経路を経て細胞内に取り込まれると考えられている。そして、ＣＰＰに連結させて細胞内に運ぼうとする積み荷の性質により、そのままエンドソームに局在化することも多い。本発明においてＣＰＰは、これと連結した複合体の他の要素と共にエンドソームに局在化する能力を有するペプチドを指す用語として定義される。
【００２６】
本発明では様々なＣＰＰを用いることができ、目的とする細胞（通常は哺乳動物細胞）に対応するものであればよく、その種類は特に限定されるものではない。また、ＣＰＰは、野生型のアミノ酸配列を有するものであってもよいし、細胞内に侵入する（好ましくは野生型よりも優れた）能力を有する範囲で、野生型のアミノ酸配列に対して置換、欠失、付加を施した変異型のアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００２７】
たとえば、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（HIV-1）に由来するTrans-activator of transcription protein（Ｔａｔタンパク質）に含まれる、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明におけるＣＰＰとして好適である。
ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ                                  配列番号１
【００２８】
また、フロックハウスウイルス（ＦＨＶ）に由来する配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するＣＴＰ５１２（Cytoplasmic Transduction Peptide）も、本発明における好ましいＣＰＰとして挙げられる。
ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ                            配列番号３
ＹＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲＲ                                  配列番号４
その他、Ｒｅｖペプチド、ネコヘルペスウイルスＣｏａｔタンパク質由来ペプチド、ポリアルギニンなどもＣＰＰとして挙げられる。
【００２９】
・ＲＮＡ結合性蛋白質（ＲＢＰ）
ＲＢＰは、ＲＮＡの塩基配列または立体構造に依存的または非依存的に結合するタンパク質として公知である。
【００３０】
本発明では様々なＲＢＰを用いることができ、その種類は特に限定されるものではないが、通常、ＲＮＡの特定の塩基配列または立体構造を認識し、特定のＲＮＡと特異的に結合するものを用いるようにする。また、ＲＢＰは、野生型のアミノ酸配列を有するものであってもよいし、ＲＮＡと結合する（好ましくは野生型よりも優れた）能力を有する範囲で、野生型のアミノ酸配列に対して置換、欠失、付加を施した変異型のアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００３１】
たとえば、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する、ヒト由来Ｕ１Ａ（Ｕ１  ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）のＲＮＡ結合ドメインは、本発明におけるＲＢＰとして好適である。
ＡＶＰＥＴＲＰＮＨＴＩＹＩＮＮＬＮＥＫＩＫＫＤＥＬＫＫＳＬＹＡＩＦＳＱＦＧＱＩＬＤＩＬＶＳＲＳＬＫＭＲＧＱＡＦＶＩＦＫＥＶＳＳＡＴＮＡＬＲＳＭＱＧＦＰＦＹＤＫＰＭＲＩＱＹＡＫＴＤＳＤＩＩＡＫＭＫ                                                                    配列番号２
【００３２】
また、ｓｅｘ−ｌｅｔｈａｌタンパク質は、上記ヒト由来Ｕ１ＡよりもＲＮＡ運搬能にやや劣るが、本発明のＲＢＰとして用いてもよい。その他、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、伸長因子Ｔｕ、ＲＲＭモチーフを構造中に有するタンパク質などの、公知のＲＢＰを用いることもできる。
【００３３】
・プロテアソーム分解シグナル配列タグ（ＰＤＳ）
プロテアソーム分解シグナル配列は、タンパク質の末端に付加されるアミノ酸配列であって、そこにユビキチンが結合し、プロテアソームでその配列を有するタンパク質を分解しうるものとして公知であり、タンパク質分解（シグナル）配列、分解促進配列などと称されることもある。
【００３４】
本発明では様々なＰＤＳを用いることができ、その種類は特に限定されるものではない。また、ＰＤＳは、野生型のアミノ酸配列を有するものであってもよいし、プロテアソームにより分解される（好ましくは野生型よりも優れた）能力を有する範囲で、野生型のアミノ酸配列に対して置換、欠失、付加を施した変異型のアミノ酸配列を有するものであってもよい。たとえば、ＣＬ１、ＣＬ２、ＣＬ６，ＣＬ９，ＣＬ１０、ＣＬ１１、ＣＬ１２、ＣＬ１５、ＣＬ１６、ＳＬ１７、ＰＥＳＴなどの公知のＰＤＳを用いることができる。
【００３５】
なお、ＰＤＳを用いた場合、複合体が細胞質内に導入された後、キャリア蛋白質がプロテアソーム分解系を介して分解され、キャリアタンパク質とＲＮＡの解離が促進されることにより、ＲＮＡの機能発現の効果が高くなるものと考えられる。
【００３６】
・Ｈｉｓ−ｒｉｃｈタグ（ＨＲ）
ＨＲは、典型的には６個のヒスチジン（Ｈｉｓ）からなる、複合体の細胞内への導入効率をより高めることのできるペプチドである。６個のヒスチジンからなるペプチドはアフィニティ・クロマトグラフィのために利用されているＨｉｓタグとしても知られている。本発明におけるＨＲは、そのようなＨｉｓタグと同じく（６個の）ヒスチジンのみからなるペプチドであってもよいし、ＨＲを用いない場合よりも細胞内侵入性を向上させる能力を有する範囲でＨｉｓ6を改変したペプチド、たとえばヒスチジンの数を７〜１０個程度に増加させたペプチドや、ヒスチジン以外のアミノ酸を織り交ぜたペプチドであってもよい。ＨＲを構成するアミノ酸数は通常は６〜２０個程度であり、また全アミノ酸中のヒスチジンの割合は通常は５０％〜１００％の範囲である。
【００３７】
・作製方法
上記の要素を含むキャリア蛋白質は公知の手段により作製することができる。代表的には、１）ＰＣＲ法を利用して本発明の所定の要素を含むポリペプチドに対応する塩基配列を有するＤＮＡを作製し、２）作製したＤＮＡをプラスミド等のベクターに導入し、３）部位特異的変異導入法（Site-Directed Mutagenesis）を利用して、Ｃ末端にシステインが配置されたポリペプチドに対応する塩基配列を有するベクターを作製し、４）得られたベクターを発現させて目的とするキャリア蛋白質を回収する、という方法が挙げられる。
【００３８】
―キャリア分子―
本発明におけるキャリア分子は、上述したキャリア蛋白質と、近赤外線領域の波長の光（近赤外光）で機能する光増感剤とが連結した分子を指す。
【００３９】
・光増感剤（ＰＳＴ）
「近赤外線領域の波長の光（近赤外光）で機能する」光増感剤とは、近赤外光を照射することにより、細胞内に取り込まれエンドソームに局在化していた複合体を細胞質中に拡散させ所定の機能を発揮させる状態にすることが可能である光増感剤をいう。なお、そのメカニズムとしては、近赤外光の照射により励起された光増感剤が一重項酸素を発生させ、これがエンドソーム膜を不安定化させる（破壊する）ためであると推測される。
【００４０】
本発明において、「近赤外領域」は７００ｎｍ〜２５００ｎｍを指す。本発明では、そのような近赤外線領域の波長、より好ましくは７００〜１０００ｎｍの波長、特に好ましくは７００〜８５０ｎｍの波長の光で機能する、換言すれば極大励起波長がこれらの領域にある光増感剤が用いられる。上記の近赤外線領域の波長が好ましい理由は、生体中のヘモグロビンや水による吸収を回避して、生体組織透過性が高い波長だからである。
【００４１】
本発明におけるＰＳＴの具体例としては、ＤＹ７５０（ＤＹＯＭＩＣＳ  ＧｍｂＨ社製）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０（登録商標、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ（登録商標、ＬＩ−ＣＯＲ社製）が挙げられる。ＤＹ７５０は、下記式に示す構造式および図２に示す励起スペクトル（極大励起波長は７４７ｎｍ）を有する化合物である（ＤＹＯＭＩＣＳ  ＧｍｂＨ社ホームページ、http://www.dyomics.com/dy-750.html参照）。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０は、構造式は明らかにされていないが、図３に示す蛍光スペクトルを有する化合物で極大励起波長は７４９ｎｍである（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社ホームページ、http://www.invitrogen.jp/catalogue/molecular#probes/alexa/alexa#index.htmlおよびhttp://www.invitrogen.jp/catalogue/molecular#probes/alexa/alexafluor750/index.html参照）。ＩＲＤｙｅ８００ＣＷは、構造式は明らかにされていないが、図４に示す励起スペクトル（極大励起波長は７７４ｎｍ）を有する化合物である（ＬＩ−ＣＯＲ社のホームページより入手可能なカタログ、http://biosupport.licor.com/docs/800CW#Micro#08618.pdf参照）。
【００４２】
【化２】
2012127739.tif 000003
・作製方法
キャリア分子は公知の手法によりキャリア蛋白質とＰＳＴとを連結させて作製することができる。代表的には、キャリア蛋白質中唯一のシステインをＮ末端付近またはＣ末端付近に配置しておき、一方ＰＳＴには当該システインのチオール基と選択的に反応する（キャリア蛋白質中の他のアミノ酸残基とは反応しない）マレイミド基を導入しておき、これらの官能基を反応させてキャリア蛋白質にＰＳＴを結合させる手法が挙げられる。このような手法は、市販の「マレイミド基の付いたＰＳＴ」を用いて、末端１箇所にシステインを含むキャリア蛋白質と混ぜ合わせたのちに、ゲル濾過スピンカラムなどで未反応のＰＳＴを除去することで行うことができる。
【００４３】
―キャリア分子／ＲＮＡ複合体―
本発明におけるキャリア分子／ＲＮＡ複合体（単に「複合体」と称するときもある。）は、上述したキャリア分子にＲＢＰを介してＲＮＡが結合した複合体を指す。ただし、ＲＮＡはＲＢＰとの特異的な結合とともに、正電荷を多く有するＣＰＰ（たとえばＴａｔ）との静電気的・非特異的な結合によってキャリア分子と複合体を形成していてもよい。
【００４４】
・ＲＮＡ
キャリア蛋白質中のＲＢＰに結合させるＲＮＡは、当該ＲＢＰのＲＮＡ認識部位に認識される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、細胞質内に導入することにより所定の機能を発揮する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下「機能性ＲＮＡ」と称する。）とを含み、これらは直接結合していても、リンカーとなるオリゴヌクレオチドを介して結合していてもよい。
【００４５】
機能性ＲＮＡとしては様々なＲＮＡを用いることができ、その種類は特に限定されるものではない。本発明における代表的な機能性ＲＮＡとしては、特定の遺伝子の発現を抑制するためのｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）、ｍｉＲＮＡ（micro RNA）が挙げられる。また、細胞内で特定のタンパク質を合成するためのｍＲＮＡや、タンパク質の特定の部位に非天然アミノ酸を導入するための改変されたｔＲＮＡも本発明における機能性ＲＮＡとして用いることができる。その他、アンチセンスＲＮＡ、アプタマーＲＮＡ、リボザイムなども本発明における機能性ＲＮＡとなり得る。
【００４６】
・形成方法
キャリア分子／ＲＮＡ複合体は、あらかじめ作製したキャリア分子とＲＮＡとを溶液中で混合することにより、容易に形成させることができる。これらの混合量（モル）の比率は適宜調整することができるが、たとえば、実施例で用いているキャリア（TatU1A, TatU1A-CL1, TatU1A-His6）の場合、ＲＮＡ：キャリア分子＝１：５〜１０とすることが好ましい。
【００４７】
―キャリア分子／ＲＮＡ複合体の細胞質内への送達方法―
本発明によるキャリア分子／ＲＮＡ複合体は、以下のような手順により細胞質内に送達することができる。
【００４８】
まず、キャリア分子／ＲＮＡ複合体を細胞と接触させて当該細胞内のエンドソームに局在化させる。通常、細胞にキャリア分子／ＲＮＡ複合体を含む溶液を添加すれば、一定の時間の経過の後、エンドサイトーシスにより自ずとキャリア分子／ＲＮＡ複合体は取り込まれ、細胞内のエンドソームに局在化する。細胞は、通常は動物細胞（ヒトの細胞を含む）であり、生体内にあるものでも、生体外にあるもの（培養細胞）でもよい。すなわち、本発明による細胞質内へのＲＮＡの送達方法は、生体内、生体外どちらにおいても適用することができる。
【００４９】
次いで、キャリア分子／ＲＮＡ複合体中のＰＳＴが機能する近赤外線領域の波長を有する光を照射して該キャリア分子／ＲＮＡ複合体を細胞質中に拡散させる。そのような所定の近赤外光を照射しなければ、キャリア分子／ＲＮＡ複合体はほとんどエンドソーム中に局在化したままであり、ＲＮＡの所定の機能は実質的に発現しない。
【００５０】
励起光を照射する手段は特に限定されるものではない。所定の波長の近赤外光を発するキセノンアークランプや色素ポンプレーザーを光源とし、必要に応じて適切なフィルターを用いて、ＲＮＡの機能を発現させたい所望の部位の細胞に近赤外光を照射すればよい。
【００５１】
このような手順によりキャリア分子／ＲＮＡ複合体が細胞質内に送達された後は、細胞質中の各種の生体物質の作用によりＲＮＡの所定の機能が発揮される。たとえば、機能性ＲＮＡとしてｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを用いた場合、Ｄｉｃｅｒ酵素の作用によりリンカー配列部分および一本鎖ループ配列部分が切断・分解され、二本鎖部分が細胞固有の特定の構造体に認識されることにより、ｍＲＮＡからの翻訳反応を阻害し、ＲＮＡｉが達成される。
【００５２】
―用途―
本発明のキャリア分子は、当該キャリア分子に結合しうる任意のＲＮＡを細胞質内に導入することができ、その用途は特に限定されるものではない。代表的には、本発明のキャリア分子／ＲＮＡ複合体は、たとえばがんやウイルス疾患を対象とする遺伝子治療薬として使用することができる。この場合、ＲＮＡ（機能性ＲＮＡ）としては、ＲＮＡｉによりがんまたはウイルス疾患の原因となっている特定の遺伝子の発現を抑制することのできる、適切な塩基配列を有するものが選択される。
【実施例】
【００５３】
1) キャリア蛋白質の調製
CPPとしてヒト免疫不全ウィルス由来Tat (trans-activator of transcription) 蛋白質の11アミノ酸からなる膜透過ドメインと、RBPとしてヒト由来U1A (U1 small nuclear ribonucleoprotein A) のRNA結合ドメインとを融合した、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するキャリア蛋白質TatU1Aを調製した (図1A)。下記配列番号５のアミノ酸配列中、二重下線部（13-24位）がTat、下線部（36-132位）がU1Aの配列である。【００５４】
【化３】
2012127739.tif 000004
また、この蛋白質のC末端に、PDSとしてのCL1、あるいはHRとしてのHis6タグを付加した、それぞれ配列番号６および７で示されるアミノ酸配列を有するキャリア蛋白質TatU1A-CL1およびTatU1A-His6も同時に調製した。下記配列番号６のアミノ酸配列中、二重下線部（13-24位）がTat、下線部（36-132位）がU1A、一点鎖線（135-150位）がCL1の配列である。下記配列番号７のアミノ酸配列中、二重下線部（13-24位）がTat、下線部（36-132位）がU1A、二点鎖線（135-141位）がHis6の配列である。【００５５】
【化４】
2012127739.tif 000005
なお、いずれのキャリア蛋白質も、後にチオール反応性の色素（光増感剤）を付加するため、C末端はシステインにしてある。このC末端のシステインは、キャリア蛋白質の中で唯一のシステインである。【００５６】
2) キャリア蛋白質への（光増感剤としての）近赤外蛍光色素の付加
1)で調製したキャリア蛋白質に、近赤外光で励起される蛍光色素を付加した。蛍光色素として、DY750 (DYOMICS GMMBH社製)、HiLyte Fluor750 (Anaspec社製)、IRDye800CW (LI-COR社製)、Alexa Fluor 750 (Invitrogen社製) 、DyLight750 (Takara社製) 、DyLight800 (Takara社製)を用いた。Protein Assay Kitを用いて定量したキャリア分子の蛋白質濃度と、分光光度計を用いて吸光度測定により定量した蛍光色素濃度から、蛍光色素付加率を求めた。付加率が10〜30%程度になるように、未標識のキャリア蛋白質を添加し調製した。【００５７】
3) 近赤外蛍光色素の付いたキャリア蛋白質によるRNAの細胞内エンドソーム内導入と近赤外光による細胞質への拡散
種々の蛍光色素で標識したキャリア蛋白質（ここではTatU1A）について、U1Aが認識する配列を付加したshRNAの細胞質移行を試みた。shRNAとTatU1A-蛍光色素コンジュゲート（以下これをキャリアと呼ぶ）をそれぞれ最終濃度200 nMおよび2 mMとなるように混合し、遮光条件下で37 ℃で10分間インキュベーションすることにより、キャリア/shRNA 複合体を調製した。ここでは、複合体の細胞内局在を可視化するために、FAM標識したshRNAを用いた。約70%コンフルエントになるまで培養した哺乳動物細胞 (CHO細胞) に、上記キャリア/shRNA混合液を添加し、37 ℃で2時間、CO2インキュベーターで培養した。それぞれの蛍光色素の励起波長で光照射し、キャリア/shRNA 複合体の細胞内局在を蛍光顕微鏡観察により評価した。蛍光色素（光増感剤）としてAlexa Fluor 750, DY750, IRDye800CW を用いた場合にのみ、細胞内に点在 (エンドソームに局在) していたshRNAが近赤外光の照射により細胞質に拡散した (図５)。すなわち、近赤外光照射特異的にキャリア/shRNA 複合体を細胞質に導入できることを示した。このときHiLyte Fluor750、Alexa Fluor 750、およびDyLight750を用いた場合は750±20nmの光(epitex社製 Infrared illuminator L750-66-60)、IRDye800CWおよびDyLight800を用いた場合には780±20 nmの光(epitex社製 Infrared illuminator L780-66-60)を励起光として用いた。【００５８】
4) 近赤外光による哺乳動物細胞の細胞質内へのRNA導入とそのRNAの機能発現（RNAi）の確認
750 nm付近に吸収をもつ蛍光色素DY750を付加したTatU1A (TatU1A-DY750) を用いて、近赤外光照射によるRNAi誘導の検討を行った。shRNAとTatU1A-DY750をそれぞれ最終濃度200 nMおよび2 mMとなるように混合し、遮光条件下で37 ℃で10分間インキュベーションすることにより、TatU1A-DY750/shRNA複合体を調製した。ここでは、EGFPのmRNAを標的とするため、anti-EGFP配列のshRNAを用いた。EGFPを安定発現するCHO細胞 (EGFP-CHO細胞) を約70%コンフルエントになるまで培養し、上記TatU1A-DY750/shRNA 混合液を添加し、さらに37 ℃、2時間CO2インキュベーターで培養した。DY750の励起波長で光照射し、37 ℃で20時間CO2インキュベーターで培養した後、細胞を回収し、フローサイトメトリー法によりRNAi効果を検討した。その結果、光照射した細胞集団のEGFP平均蛍光強度は、光照射しなかったものと比較し、顕著に減少した (図６)。すなわち、光照射を行った細胞において、EGFPに対するRNAi効果が認められた。【００５９】
以上の結果から、TatU1A-DY750によりshRNAを細胞内に導入し、光照射特異的に、つまり近赤外光を照射したときのみshRNAを細胞質に移行させることができ、RNAi（shRNAの機能発現）を誘導することができた。【００６０】
5) RNA運搬能の高いキャリア蛋白質の選抜
上記1)で作製したTatU1Aに対して、CPP部分をFHV (フロックハウスウイルス由来のアルギニンペプチド； RRRRNRTRRNRRRVR)またはCTP512 (cytoplasmic transduction peptide；YGRARRRRRRR。変異導入のしやすさを考慮して、配列番号４に記載のアミノ酸配列の４位のＲが欠失したものを用いた。)に変えたものを作製した。しかし、FHV-U1AやCTP-U1Aの細胞質へのRNA運搬能はTatU1Aと大差なかった。次に、CPPとしてTatを用い、RBP部分をSxl蛋白質またはバクテリオファージλ-Nペプチドにしたものを作製した。このTatSxlはのRNA運搬能を持っていたもののTatU1Aより劣っていた。TatλNはRNA運搬能が全く見られなかった。【００６１】
次に、1)で作製したTatU1A-CL1、TatU1A-His6およびTatU1AのRNA運搬能を調べたところ、TatU1A-CL1およびTatU1A-His6はTatU1AよりもRNA運搬能が高かった。すなわち、キャリア蛋白質部分としては、TatU1A-CL1およびTatU1A-His6が、以上で検討された中で最もRNAキャリアとしての能力が高かった。【００６２】
6) 近赤外光による哺乳動物細胞の細胞質内へのRNA導入とそのRNAの機能発現（RNAi）の確認
4)と同様、750 nm付近に吸収をもつ蛍光色素DY750を付加したTatU1A-His6 (TatU1A-His6-DY750) を用いて、近赤外光照射によるRNAi誘導の検討を行った。shRNAとTatU1A-His6-DY750をそれぞれ最終濃度200 nMおよび2 mMとなるように混合し、遮光条件下で37 ℃で10分間インキュベーションすることにより、TatU1A-His6-DY750/shRNA複合体を調製した。ここでは、EGFPのmRNAを標的とするため、anti-EGFP配列のshRNAを用いた。EGFPを安定発現するCHO細胞 (EGFP-CHO細胞) を約70%コンフルエントになるまで培養し、上記TatU1A-His6-DY750/shRNA 混合液を添加し、さらに37 ℃、2時間CO2インキュベーターで培養した。DY750の励起波長で光照射し、37 ℃で20時間CO2インキュベーターで培養した後、細胞を回収し、フローサイトメトリー法によりRNAi効果を検討した。その結果、光照射した細胞集団のEGFP平均蛍光強度は、光照射しなかったものと比較し、顕著に減少した (図７)。すなわち、光照射を行った細胞において、EGFPに対するRNAi効果が認められた。以上の結果から、TatU1A-His6-DY750によりshRNAを細胞内に導入し、光照射特異的にshRNAを細胞質に移行させることができ、RNAi（shRNAの機能発現）を誘導することができた。【００６３】
7) ヒトの腫瘍細胞における近赤外光RNAi誘導
4)と同様、750 nm付近に吸収をもつ蛍光色素DY750を付加したTatU1A-CL1 (TatU1A-CL1-DY750) を用いて、近赤外光照射によるRNAi誘導の検討を行った。shRNAとTatU1A-CL1-DY750をそれぞれ最終濃度200 nMおよび2 mMとなるように混合し、遮光条件下で37 ℃で10分間インキュベーションすることにより、TatU1A-CL1-DY750/shRNA複合体を調製した。ここではヒト腫瘍細胞である悪性中皮腫細胞211H を用いた。EGFPを安定発現する211H 細胞を約70%コンフルエントになるまで培養し、上記TatU1A-CL1-DY750/shRNA 混合液を添加し、さらに37 ℃、2時間CO2インキュベーターで培養した。DY750の励起波長で光照射し、37 ℃で20時間CO2インキュベーターで培養した後、細胞を回収し、フローサイトメトリー法によりRNAi効果を検討した。その結果、光照射した細胞集団のEGFP平均蛍光強度は、光照射しなかったものと比較し、顕著に減少した (図８)。すなわち、光照射を行った細胞において、EGFPに対するRNAi効果が認められた。
【配列表フリーテキスト】
【００６４】
配列番号４：CTP512
配列番号５：TatU1A
配列番号６：TatU1A-CL1
配列番号７：TatU1A-His6
【図２】
2012127739.tif 000007
【図１】
2012127739.tif 000008
【図３】
2012127739.tif 000009
【図４】
2012127739.tif 000010
【図５】
2012127739.tif 000011
【図６】
2012127739.tif 000012
【図７】
2012127739.tif 000013
【図８】
2012127739.tif 000014
【配列表】
2012127739000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年4月6日(2012.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）およびＲＮＡ結合性蛋白質（ＲＢＰ）を含むキャリア蛋白質と、該キャリア蛋白質のＮ末端側またはＣ末端側に連結した、７００ｎｍ〜１０００ｎｍの波長を有する光で機能する光増感剤（ＰＳＴ）とからなる構造を有するキャリア分子であって、
前記光増感剤（ＰＳＴ）は、下記構造式で表される化合物（ＤＹ７５０）、図３に示す蛍光スペクトルを有する化合物（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７５０）または図４に示す吸収スペクトルを有する化合物（ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ）であることを特徴とするキャリア分子。
【化１】
2012127739.tif 000015
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
前記キャリア蛋白質が、さらにプロテアソーム分解シグナル配列タグ（ＰＤＳ）および／またはＨｉｓ−ｒｉｃｈタグ（ＨＲ）を含む、請求項１に記載のキャリア分子。
【請求項５】
前記キャリア蛋白質において、Ｎ末端側から、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）、ＲＮＡ結合性蛋白質（ＲＢＰ）、プロテアソーム分解シグナル配列タグ（ＰＤＳ）および／またはＨｉｓ−ｒｉｃｈタグ（ＨＲ）がこの順序で連結されており、かつ当該キャリア蛋白質のＣ末端側に前記光増感剤（ＰＳＴ）が連結されている、請求項１または４に記載のキャリア分子。
【請求項６】
前記ＣＰＰが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する、ヒト免疫不全ウイルス由来Ｔａｔ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）蛋白質中の１２アミノ酸からなるペプチドである、請求項１、４または５のいずれかに記載のキャリア分子。
2012127739.tif 000016
【請求項７】
前記ＲＢＰが、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する、ヒト由来Ｕ１Ａ（Ｕ１  ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）のＲＮＡ結合ドメインである、請求項１または４〜６のいずれかに記載のキャリア分子。
2012127739.tif 000017
【請求項８】
請求項１または４〜７のいずれかに記載のキャリア分子と、該ＲＮＡキャリア分子中のＲＢＰに結合したＲＮＡとからなる構造を有するキャリア分子／ＲＮＡ複合体。
【請求項９】
前記ＲＮＡが、ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である、請求項８に記載のＲＮＡ複合体。
【請求項１０】
請求項８または９に記載のキャリア分子／ＲＮＡ複合体を含む遺伝子治療薬。
【請求項１１】
がんまたはウイルス疾患を対象とする、請求項１０に記載の遺伝子治療薬。
【請求項１２】
生体外において、請求項８または９に記載のキャリア分子／ＲＮＡ複合体を細胞と接触させて当該細胞内のエンドソームに局在化させる工程、および該キャリア分子／ＲＮＡ複合体中のＰＳＴが機能する近赤外線領域の波長を有する光を照射して該キャリア分子／ＲＮＡ複合体を細胞質中に拡散させる工程を含むことを特徴とする、細胞質内へのＲＮＡの送達方法。
【国際調査報告】
2012127739.tif 000018
2012127739.tif 000019
2012127739.tif 000020
2012127739.tif 000021
2012127739.tif 000022
2012127739.tif 000023