(57)【要約】  大建中湯について簡便な試験管内試験によるバイオアッセイ方法を提供し、更にこれを利用した大建中湯のより正確性の高い品質管理方法を提供することを目的とする。当該方法は、培養セロトニン産生細胞に、大建中湯を含有する被験試料を添加し、次いで培養上清中のセロトニン含量を測定することを特徴とする大建中湯の薬理活性のバイオアッセイ方法並びにこのバイオアッセイ方法により、大建中湯として臨床的に薬理効果が認められた基準製剤と被検製剤を同一条件で薬理活性を評価し、基準製剤と被検製剤の同等性を評価する大建中湯製剤の品質管理方法である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養セロトニン産生細胞に、大建中湯を含有する被験試料を添加し、次いで培養上清中のセロトニン含量を測定することを特徴とする大建中湯の薬理活性のバイオアッセイ方法。
【請求項２】
セロトニン産生細胞が、エンテロクロマフィン様細胞である請求項第１項記載の大建中湯の薬理活性のバイオアッセイ方法。
【請求項３】
セロトニン産生細胞が、ＲＩＮ−１４Ｂ細胞、ＱＧＰ−１細胞およびＫＲＪ−Ｉ細胞から選ばれる細胞株である請求項第１項または第２項記載の大建中湯の薬理活性のバイオアッセイ方法。
【請求項４】
請求項１ないし３の何れかの項記載の大建中湯の薬理活性のバイオアッセイ方法により、大建中湯として臨床的に薬理効果が認められた基準製剤と被検製剤を同一条件で薬理活性を評価し、基準製剤と被検製剤の同一性を評価することを特徴とする大建中湯製剤の品質管理方法。
【請求項５】
大建中湯の濃度として、９０〜９００μｇ／ｍＬの範囲でバイオアッセイ方法を行う請求項４記載の大建中湯製剤の品質管理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大建中湯のバイオアッセイ方法に関し、更に詳細には、培養したセロトニン産生細胞を用い、漢方製剤である大建中湯の薬理活性価（セロトニン放出活性）を定量的に評価しうるバイオアッセイ方法およびこれを用いた大建中湯の品質管理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
漢方薬は、生薬をブレンドした医薬品であり、その活性成分が全て特定されているわけではない。また、単一の活性成分のみで効果を発揮するわけではなく、多成分により複合的に作用するものであるため、その品質を保証するには、その製剤全体として評価をすることができる測定方法が必要であるとされている。実際、米国ＦＤＡの植物薬ガイダンスでは、漢方薬などの製品に関してバイオアッセイなどによる品質管理を求めている。【０００３】
この品質管理方法には、薬効に係わると思われる成分を全て測定し、それらを総合的に評価する方法と、生物材料を用いて生理活性を評価するバイオアッセイがある。前者の場合、測定にかかるコストや測定方法の確立の点で問題がある。一方、バイオアッセイには、生体内（in  vivo）試験と、試験管内（in  vitro）試験があるが、生体内試験の系は、試験施設、試験動物、処理能力等の点で種々の制約があり、漢方薬の品質評価に用いるには困難が伴っていた。【０００４】
一方、試験管内試験の系では、特殊な施設を必要とせず、安定した試験結果が短期間に得られるため、この系でバイオアッセイ法を確立することが求められている。しかし、それ自身が複数の有効成分を含む生薬を組み合わせた漢方薬については、常に適切なバイオアッセイ系が見出されているというものではなく、その確立が待たれている。【０００５】
従来、漢方薬である大建中湯の薬理効果に関する品質管理のためのバイオアッセイ方法として、既に大建中湯投与による腸平滑筋収縮を直接測定する方法（マグヌス法）が構築されている（非特許文献１）。【０００６】
しかし、このマグヌス法はラットから摘出した腸管を使用するため、品質評価のルーチン試験として実施するバイオアッセイ方法としては、使用性が悪く、また、感度、再現性等においても不十分であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「日医大医会誌」、第６巻（３）、第１２７−１２９頁（２０１０）、管  隼人および内田  英二
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って本発明の課題は、大建中湯について簡便な試験管内試験によるバイオアッセイ方法を提供し、更にこれを利用した大建中湯のより正確性の高い品質管理方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、大建中湯の腸管運動亢進作用や腸管血流増加作用や、これらの作用とセロトニンの関与についての報告（非特許文献１）に着目し、大建中湯とセロトニンの関係に関し鋭意研究を行った。そしてその結果、大建中湯がセロトニン産生細胞に対して、セロトニン放出促進作用を有すること、および放出されるセロトニンの量を測定することにより、大建中湯の薬理活性価を測定することが可能であること、並びにこのバイオアッセイ系を利用することで、適切に大建中湯の品質管理を行うことができることを見出し、本発明を完成した。【００１０】
すなわち本発明は、培養セロトニン産生細胞に、大建中湯を含有する被験試料を添加し、次いで培養上清中のセロトニン含量を測定することを特徴とする大建中湯の薬理活性のバイオアッセイ方法である。【００１１】
また本発明は、上記の大建中湯の薬理活性のバイオアッセイ方法により、大建中湯として臨床的に薬理効果が認められた基準製剤と被検製剤を同一条件で薬理活性を評価し、基準製剤と被検製剤の同等性を評価することを特徴とする大建中湯製剤の品質管理方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のバイオアッセイ方法によれば、試験施設、試験動物、処理能力等の制約なく、簡単な試験管内試験により、大建中湯の薬理活性価（セロトニン放出活性）を測定することが可能であると共に、品質を評価するために適切な濃度範囲で本試験をおこなうことにより、大建中湯について正確性の高い品質管理を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】大建中湯濃度とセロトニン（５−ＨＴ）放出量の関係を示す図面である。
【図２】ＨＰＬＣによる、培養試料液中のセロトニンの測定結果を示す図面である。図中（ａ）は、大建中湯を添加しなかった場合のセロトニン（５−ＨＴ）放出を、（ｂ）は、大建中湯を９００μｇ／ｍｌ添加した場合のセロトニン（５−ＨＴ）放出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
大建中湯は、一般に表１の組成の混合生薬の抽出エキスを粉末化したもの（無コウイ大建中湯と称されることがある。）に、抽出エキスの８倍量程度の粉末飴（コウイ（膠飴）  英名：ｍａｌｔｏｓｅ）を配合したものである。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
そして、本発明のバイオアッセイ法の対象になる大建中湯としては、大建中湯にさらに医薬品添加物として添加が認められている成分を加えて顆粒等に製剤化した大建中湯製剤も含まれる。このような製剤化した大建中湯製剤としては、例えば、ツムラ大建中湯エキス顆粒（医療用）のような医療用医薬品として市販されているものを挙げることができる。
【００１７】
なお、上記の医薬品添加物として添加が認められている成分とは、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等の賦形剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等が挙げられる。
【００１８】
本発明の大建中湯のバイオアッセイ方法は、培養セロトニン産生細胞に大建中湯を含有する被験試料を添加し、添加後のセロトニン産生細胞におけるセロトニン放出量から大建中湯の薬理活性値を評価するものである。
【００１９】
本発明で用いるセロトニン産生細胞の例として、エンテロクロマフィン細胞を挙げることができる。このエンテロクロマフィン細胞は、内分泌細胞であり、生体内に存在するセロトニンを大量に産生、分泌することができる細胞である。そして、生体内に存在するセロトニンの９０％が腸管のエンテロクロマフィン細胞内に存在しているという事実から腸管のエンテロクロマフィン細胞を好ましく用いることができる。
【００２０】
さらに、上記セロトニン産生細胞としては、一定の安定したセロトニンを産生できるエンテロクロマフィン様の細胞株を用いることもできる。エンテロクロマフィン様の細胞株とは、たとえば、ラット膵臓癌由来のＲＩＮ−１４Ｂ細胞、ヒト膵臓癌由来のＱＧＰ−１細胞、ヒト小腸カルチノイド由来のＫＲＪ−Ｉ細胞等が挙げられる。このうち、特に好ましい細胞株としては、増殖性に優れる点でＲＩＮ−１４Ｂ細胞が挙げられる。
【００２１】
本発明の大建中湯のバイオアッセイ方法は、まずセロトニン産生細胞を、その生育に適した培地、例えば、抗生物質、血清等を含むＲＰＭＩ１６４０等の培地で、例えば、１日間ないし３日間、３７℃において培養した後、リン酸緩衝液等で置換し、これに所定量の被験試料を加えた後、同じ温度で、更に２０分間から３時間培養した後、培地中へのセロトニン放出量を測定することにより行われる。
【００２２】
大建中湯を含有する被験試料は、一般には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような溶媒に溶解ないし懸濁し、前記培地中に加えられる。
【００２３】
また、セロトニン放出量を測定する方法としては、セロトニン放出量が測定できる方法であれば特に制約なく公知方法を利用できるが、好ましい方法としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）や、ＨＰＬＣ法が挙げられる。
【００２４】
本発明で用いられるＥＩＡ法とは、特異的な抗原抗体反応をする抗原または抗体に酵素を付着させ、酵素の活性を測定することによって抗原抗体反応の結合量を測定する方法であり、具体的には例えば、ＥＩＡ  セロトニン・キット（EIA  serotonin  kit；ベックマン・コールター社製）等の市販のキットを用いて行うことができる。
【００２５】
更に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法によりセロトニン放出量を測定するにあたっては、試料のチャージ量、分析用カラムの種類、分析用カラムの直径及び長さ、分析用カラムの温度、移動相の組成、移動相流量等の条件は、適宜選択することができ、セロトニンの分離に最も適した条件を選択すればよい。このような条件としては、セロトニンのリテンションタイム(保持時間)が他の検出物と重ならないような条件が好ましい。なお、分析用カラムとしては、通常使用されるカラム、例えば、ＯＤＳ等を充填したカラム等、また検出器としては、一般に汎用される電気化学検出器（ＥＣＤ）等が使用できる。
【００２６】
本発明のバイオアッセイ方法においては、実施例１の結果にみられるように濃度に依存した反応が得られる濃度範囲（０〜９００μｇ／ｍＬ）において、さらに好ましくは統計学的に有意な反応が得られる濃度範囲（９０〜９００μｇ／ｍＬ）において、同時に複数、好ましくは３点以上測定し、これから被験試料中の大建中湯の薬理活性価（セロトニン放出活性）を定量することが好ましいが、条件がほとんど変わらないのであれば、上記濃度範囲の濃度の大建中湯を含む試料で既に作製された検量線を使用して測定しても良い。
【００２７】
本発明のバイオアッセイ方法により製品である大建中湯の品質評価を行う場合は、まず、臨床的に薬理効果が認められた大建中湯の複数ロットについて、その薬理活性価（セロトニン放出活性）を測定し、その値に基づいて規格範囲を設定する。次いで、同じ方法により、評価すべき大建中湯の品質試験用サンプルについて薬理活性価（セロトニン放出活性）を測定する。そして、このサンプルの薬理活性値が、設定した規格の範囲内であるかどうかで同等性を評価し、同等と認められるものを合格品とすることで品質管理を行なえばよい。
【実施例】
【００２８】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。【００２９】
実  施  例  １
大建中湯のバイオアッセイ試験：
（１）被験試料の調製：
表１の配合割合の生薬混合物を、その混合物重量の１０倍量の精製水で１時間、１００℃で加熱抽出し、粉末化することにより無コウイ大建中湯エキス末を得た。この無コウイ大建中湯エキス末を１００ｍｇ／ｍＬ濃度のＤＭＳＯ懸濁液とし、これを、８８．８ｍｇ／ｍＬ濃度の膠飴水溶液に対して１：９の割合で混和し、９０ｍｇ／ｍＬ濃度の大建中湯溶液を調製した。これを０．１％ＢＳＡ−Ｈａｎｋｓ緩衝液＊で希釈して９ｍｇ／ｍＬ濃度としたのち１５分間の超音波処理を行い、大建中湯被験試料を調製した。【００３０】
また、陽性対照試料として、アリルイソチオシアネ−ト（ＡＩＴＣ、和光純薬工業）をＤＭＳＯに加え、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＩＴＣのＤＭＳＯ溶液を調製した。【００３１】
＊０．１％ＢＳＡ−Ｈａｎｋｓ緩衝液
１リットルの蒸留水に１ｇウシ血清アルブミン、１ｇブドウ糖、８ｇ塩化ナトリウム、４００ｍｇ塩化カリウム、４７．９ｍｇリン酸一水素ナトリウム(無水)、６０ｍｇリン酸二水素カリウム(無水)、４６．８ｍｇ塩化マグネシウム(無水)、４８．８ｍｇ硫酸マグネシウム(無水)、１４０ｍｇ塩化カルシウム(無水)を溶解し、ｐＨ７．２〜７．４に調製した。【００３２】
（２）セロトニン産生細胞（ＲＩＮ−１４Ｂ細胞）の培養：
ラット膵臓癌細胞株ＲＩＮ−１４Ｂ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＲＰＭＩ１６４０培地（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、１．５ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン  Ｇおよび１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン）中で継代培養し、セロトニン産生細胞とした。なお、細胞の回収にあたっては、トリプシン−ＥＤＴＡ液を用いた。【００３３】
（３）セロトニン（５−ＨＴ）放出試験：
上記（２）で得られたセロトニン産生細胞を、９６穴平底プレートに３×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌで分注した。７２時間の前培養を行なった後、培養上清を上記（１）で得た各被験試料を含む０．１％ＢＳＡ−Ｈａｎｋｓ緩衝液に置換し、５％炭酸ガスインキュベーターの中で更に１時間培養した。【００３４】
被験試料は、１％ＤＭＳＯを含む０．１％ＢＳＡ−Ｈａｎｋｓ緩衝液で段階希釈して培養系中で最終濃度２７、９０、２７０、９００μｇ／ｍＬとなるように添加し、培養系でのＤＭＳＯの最終濃度は０．１％とした。また、陽性対照群では、被験試料に変え、上記（１）で得た陽性対照試料を、培養系中で最終濃度１００μｍｏｌ／Ｌ、ＤＭＳＯの最終濃度が０．１％となるように加えた。【００３５】
最後に、培養上清を３２０ｇで、５分間、４℃で遠心処理し、その上清を５−ＨＴ濃度測定用試料（以下、「測定用試料」という）とした。【００３６】
（４）ＥＩＡ法によるセロトニン（５−ＨＴ）測定：
ＥＩＡ法による５−ＨＴ放出測定は、ＥＩＡ  セロトニン・キット（ベックマン・コールター社製)を用い、製品の添付プロトコールに準じて行った。【００３７】
すなわち、アシル化試薬の入ったチューブに、上記（３）で得た測定用試料を加え、さらにアシル化バッファー５０μＬを添加して試薬が溶解するまでボルテックスにて攪拌した。室温、遮光条件下で３０分間反応を行い、アシル化反応液を得た。測定試料を加えない系でも上記と同様に処理し、コントロールとした。【００３８】
次に抗５−ＨＴ抗体がコートされた９６穴プレートの適当なウェルに、各アシル化反応液２０μＬを移し、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣＥ）−５−ＨＴ結合体２００μＬを加えて、室温、遮光条件下、プレートミキサーで振盪しながら３時間、競合的にインキュベートした。【００３９】
キットに添付のウォッシュバッファーを用い、３００μＬ／ｗｅｌｌで３回プレートを洗浄し、未結合のものを除いた後、ＡＣＥ基質を２００μＬ／ｗｅｌｌ加えて１５〜２０分放置した。発色を確認した後、反応停止剤５０μＬを加えて反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図１に示す。【００４０】
図１の結果に示すように、２７、９０、２７０、９００μｇ／ｍＬ濃度の大建中湯を加えた測定試料では、無添加のコントロールに比べ、明らかに上清中の５−ＨＴ量が多く、しかも濃度依存的であり、検量線が形成しうるものであった。また、陽対照のＡＩＴＣを加えた測定試料も、コントロールに比べ、明らかに高い５−ＨＴ濃度を示し、大建中湯がセロトニン産生細胞に作用したことによる５−ＨＴであることが示された。【００４１】
（５）ＨＰＬＣによるセロトニン（５−ＨＴ）測定：
次に、（３）で得られた測定用試料のうち、９００μｇ／ｍＬ大健中湯のものと、コントロールのものの培養試料液について、ＨＰＬＣを用い、これに含まれる５−ＨＴを検出した。その結果を図２の（ａ）および（ｂ）に示す（５−ＨＴの保持時間は、（ａ）で１６.２７分、（ｂ）で１６．１１分である）。【００４２】
なお、ＨＰＬＣによる５−ＨＴ分析は、以下の条件でおこなった。また、５−ＨＴ標準液は、終濃度１００ｍｇ／Ｌ濃度となるようにＥＤＴＡを添加した０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸水溶液で調製した。【００４３】
ＨＰＬＣ分析条件
微量生体試料分析システム：ＨＴＥＣ−５００（ＥＩＣＯＭ）
データ処理装置：ＥＰＣ−３００（ＥＩＣＯＭ）
データ解析ソフトウェア：ＰｏｗｅｒＣｈｒｏｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ
２．５．７（ｅＤＡＱ）
分析カラム：ＥＩＣＯＭＰＡＫ  ＣＡ−５ＯＤＳ
２．１ｍｍΦ×１５０ｍｍ
プレカラム：ＥＩＣＯＭ  ＰＲＥＰＡＫＳＥＴ−ＣＡ
３．０ｍｍΦ×４ｍｍ
移動相：８０％  ０．１Ｍ  リン酸緩衝液（Ｎａ＋）ｐＨ６
２０％  メタノール
５００ｍｇ/Ｌ  １−オクタンスルホン酸ソーダ（ＳＤＳ）
５０ｍｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ＋
流速：２３０μＬ／ｍｉｎ
分析温度：２５℃
設定加電圧：＋４５０ｍＶ（＋４００〜＋４５０ｍＶ）  ｖｓ
Ａｇ／ＡｇＣｌ
作用電極：グラファイト電極  ＷＥ−３Ｇ
ガスケット：ＧＳ−２５
分析カラム：８０％【００４４】
図２の結果から、ＨＰＬＣによる測定でもセロトニン放出活性が測定できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明によれば、大建中湯の品質評価をおこなう際に、試験施設、試験動物、処理能力等の制約がほとんどなく、試験が可能であり、更に適切な濃度範囲で試験をおこなうことにより、大建中湯について正確性の高い品質評価を行うことができる。【００４６】
従って本発明は、従来の大建中湯のバイオアッセイ方法に比べ、経済性が高く、簡単に品質評価を行うことができるので、漢方製剤の品質管理において極めて有利なものである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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