(57)【要約】  ロイコ型色原体含有水溶液に、ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩を添加することを特徴とする、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法；ロイコ型色原体を、ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩を含む水溶液中で共存させることを特徴とする、ロイコ型色原体の安定化方法；ロイコ型色原体と、ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩とを含有する液状試薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイコ型色原体含有水溶液に、ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩を添加することを特徴とする、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法。
【請求項２】
ロイコ型色原体を、ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩を含む水溶液中で共存させることを特徴とする、ロイコ型色原体の安定化方法。
【請求項３】
ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩が、以下の一般式（Ｉ）
【化４】
2012081540.tif 000007
（式中、Ｒ１とＲ２は同一又は異なって、それぞれ、水素原子、又は、置換若しくは非置換のアルキル基を表し、Ｒ３は、酸素原子、又は、Ｒ４−Ｎで表わされる基を表し、Ｒ４は、置換若しくは非置換の２−ピリジルを表し、Ｘは、水酸基又はアミノ基を表す。）で表わされる化合物又はその塩である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである請求項４記載の方法。
【請求項６】
ロイコ型色原体と、ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩とを含有する液状試薬。
【請求項７】
ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩が、以下の一般式（Ｉ）
【化５】
2012081540.tif 000008
（式中、Ｒ１とＲ２は同一又は異なって、それぞれ、水素原子、又は、置換若しくは非置換のアルキル基を表し、Ｒ３は、酸素原子、又は、Ｒ４−Ｎで表わされる基を表し、Ｒ４は、置換若しくは非置換の２−ピリジルを表し、Ｘは、水酸基又はアミノ基を表す。）で表わされる化合物又はその塩である、請求項６記載の試薬。
【請求項８】
ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である請求項６又は７記載の試薬。
【請求項９】
フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである請求項８記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法、ロイコ型色原体の安定化方法及びロイコ型色原体を含有する液状試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ロイコ型色原体は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、過酸化水素と反応し、色素を生成する色原体の１種であり、カップリング型色原体とは異なり、それ単独で色素を生成する色原体であり、フェノチアジン系のロイコ型色原体、トリフェニルメタン系のロイコ型色原体、ジフェニルアミン系のロイコ型色原体等が知られている（例えば、特許文献１〜３参照）。【０００３】
ロイコ型色原体は、カップリング型色原体と同様、血清等の試料中に存在するコレステロールや糖化ヘモグロビン等の定量すべき成分の定量にしばしば使用される。すなわち、試料中の定量すべき成分を過酸化水素に変換し、生成した過酸化水素を、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、ロイコ型色原体と反応させて色素に導き、生成した色素の吸光度から、試料中の定量すべき成分を定量することが、臨床検査において、しばしば行われている。特に、ロイコ型色原体は、高感度色原体として、試料中に微量しか存在しない定量すべき成分の定量に好適に用いられる（例えば、非特許文献１参照）。【０００４】
この様に、ロイコ型色原体は、高感度色原体として、試料中の微量の定量すべき成分の定量に使用されるが、一方で、その保存安定性が悪く、特に、溶液中では時間と共に、自然発色してしまうという欠点を有している。このロイコ型色原体の有する安定性不良という課題に対して、これまで、ロイコ型色原体の溶液中で安定化方法が検討され、報告されている（例えば、特許文献４、５参照）。しかしながら、これらのロイコ型色原体の安定化方法は厳しい条件下で行わなければならない等、必ずしも、満足の行く安定化方法とは言えない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭５７−０２９２９７号公報
【特許文献２】特開平３−２０６８９６号公報
【特許文献３】特開昭６２−０９３２６１号公報
【特許文献４】ＷＯ２００５／０８８３０５パンフレット
【特許文献５】ＷＯ２００７／０８３７０３パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】臨床検査，1997年，Vol.41，No.9，p.1014-1019
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ロイコ型色原体が水溶液中で安定に保存されるロイコ型色原体含有水溶液の保存方法、及び、ロイコ型色原体の安定化方法およびロイコ型色原体を安定に保持する試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは本課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ロイコ型色原体含有水溶液に、ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩を添加することにより、ロイコ型色原体が安定に保持される、という知見を見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の［１］〜［９］に関する。【０００９】
［１］  ロイコ型色原体含有水溶液に、ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩を添加することを特徴とする、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法。
［２］  ロイコ型色原体を、ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩を含む水溶液中で共存させることを特徴とする、ロイコ型色原体の安定化方法。【００１０】
［３］  ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩が、以下の一般式（Ｉ）【００１１】
【化１】
2012081540.tif 000002
【００１２】
（式中、Ｒ１とＲ２は同一又は異なって、それぞれ、水素原子、又は、置換若しくは非置換のアルキル基を表し、Ｒ３は、酸素原子、又は、Ｒ４−Ｎで表わされる基を表し、Ｒ４は、置換若しくは非置換の２−ピリジルを表し、Ｘは、水酸基又はアミノ基を表す。）で表わされる化合物又はその塩である、［１］又は［２］記載の方法。【００１３】
［４］  ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］  フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである［４］記載の方法。【００１４】
［６］  ロイコ型色原体と、ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩とを含有する液状試薬。
［７］  ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩が、以下の一般式（Ｉ）【００１５】
【化２】
2012081540.tif 000003
【００１６】
（式中、Ｒ１とＲ２は同一又は異なって、それぞれ、水素原子、又は、置換若しくは非置換のアルキル基を表し、Ｒ３は、酸素原子、又は、Ｒ４−Ｎで表わされる基を表し、Ｒ４は、置換若しくは非置換の２−ピリジルを表し、Ｘは、水酸基又はアミノ基を表す。）で表わされる化合物又はその塩である、［６］記載の試薬。【００１７】
［８］  ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である［６］又は［７］記載の試薬。
［９］  フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである［８］記載の試薬。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、ロイコ型色原体を水溶液中で安定に保存されるロイコ型色原体含有水溶液の保存方法、ロイコ型色原体の安定化方法、ロイコ型色原体を含有する液状試薬が提供される。本発明の方法及び試薬は、糖尿病の診断に用いられる糖化ヘモグロビンの測定等に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（１）ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法とロイコ型色原体の安定化方法
本発明は、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法に関する。本発明のロイコ型色原体含有水溶液の保存方法により、水溶液中でロイコ型色原体が安定に保存される。ロイコ型色原体が水溶液中で安定に保存されるとは、水溶液中でロイコ型色原体が熱に対して安定であることのみならず、光に対しても安定であることを意味する。
【００２０】
本発明のロイコ型色原体含有水溶液の保存方法においては、ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩が、ロイコ型色原体含有水溶液に添加される。
【００２１】
本発明におけるニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩は、ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、金属イオン配位能を有し、かつ、ロイコ型色原体を安定に保持し得る化合物又はその塩であれば特に制限はなく、例えば以下の一般式（Ｉ）
【００２２】
【化３】
2012081540.tif 000004
【００２３】
（式中、Ｒ１とＲ２は同一又は異なって、それぞれ、水素原子、又は、置換若しくは非置換のアルキル基を表し、Ｒ３は、酸素原子、又は、Ｒ４−Ｎで表わされる基を表し、Ｒ４は、置換若しくは非置換の２−ピリジルを表し、Ｘは、水酸基又はアミノ基を表す。）で表わされる化合物又はその塩［以下、化合物（Ｉ）と記す］等が挙げられる。
【００２４】
化合物（Ｉ）において、アルキル基としては、例えば炭素数１〜６のメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。置換アルキル基における置換基としては、スルホ基、カルボキシル基、水酸基、アミド基、ハロゲン原子等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。置換２−ピリジルの置換基としては、電子供与性基、電子吸引性基等が挙げられ、電子吸引性基が好ましい。
【００２５】
電子供与性基としては、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、置換若しくは非置換のアミノ基、チオアルキル基等が挙げられる。アルキル基及びアルコキシ基におけるアルキルとしては、例えば炭素数１〜６のメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。置換アミノ基としては、Ｎ−モノ置換アミノ基、Ｎ，Ｎ−ジ置換アミノ基等が挙げられる。置換アミノ基における置換基としては、例えば前述のアルキル基等が挙げられる。
【００２６】
電子吸引性基としては、例えばニトロ基、シアノ基、ホルミル基、アシル基、ハロゲン原子、スルホ基、カルボキシル基等が挙げられる。置換２−ピリジルの具体例としては、例えば５−ニトロ−２−ピリジル、５−クロロ−２−ピリジル、５−ブロモ−２−ピリジル、５−ヨード−２−ピリジル、５−スルホ−２−ピリジル、５−カルボキシ−２−ピリジル等が挙げられる。塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩等が挙げられる。また、化合物（Ｉ）には、水和物も含まれる。
【００２７】
化合物（Ｉ）の具体例（製品）としては、例えばNitroso-PSAP｛２−ニトロソ−５−［Ｎ−プロピル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アミノ］フェノール｝、Nitro-PAPS｛２−（５−ニトロ−２−ピリジルアゾ）−５−［Ｎ−プロピル−Ｎ−（スルホプロピル）アミノ］フェノール  二ナトリウム塩、二水和物｝、5-Br-PSAA｛２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５−［Ｎ−プロピル−Ｎ−（スルホプロピル）アミノ］アニリン  ナトリウム塩｝、5-Br-PAPS｛２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５−［Ｎ−プロピル−Ｎ−（スルホプロピル）アミノ］フェノール  二ナトリウム塩、二水和物｝（いずれも、同仁化学研究所社製）等が挙げられる。
【００２８】
本発明のロイコ型色原体の保存方法において、ロイコ型色原体の保存安定性は、ロイコ型色原体含有水溶液の着色により評価することができ、着色が大きい程、すなわち、ロイコ型色原体含有水溶液の吸光度が大きい程、安定性が悪いと評価することができる。一方、ロイコ型色原体含有水溶液の着色が小さい程、すなわち、ロイコ型色原体含有水溶液の吸光度が小さい程、安定性が良いと評価することができる。
【００２９】
本発明におけるロイコ型色原体含有水溶液とは、ロイコ型色原体が水性媒体中に溶解された水溶液であり、ロイコ型色原体を水性媒体に添加して溶解させることにより調製することができる。ロイコ型色原体が溶解される水性媒体は、ロイコ型色原体が溶解されれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。また、ロイコ型色原体含有水溶液の調製に際して、ロイコ型色原体の水性媒体への溶解補助剤として、有機溶媒を用いることもできる。有機溶媒に溶解させたロイコ型色原体を水性媒体に添加し、ロイコ型色原体を水性媒体に溶解させ、ロイコ型色原体含有水溶液を調製することもできる。有機溶媒としては、ロイコ型色原体を溶解させるものであれば特に制限はなく、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジオキサン、アセトン、メタノール、エタノール等が挙げられる。
【００３０】
水性媒体のｐＨは、ロイコ型色原体が溶解されるｐＨであれば特に制限はなく、例えばｐＨ４〜１０である。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するｐＨに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
【００３１】
グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。
【００３２】
緩衝液の濃度は、ロイコ型色原体が溶解される濃度であれば特に制限はされないが、通常０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌであり、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌが好ましい。
【００３３】
本発明におけるロイコ型色原体としては、例えばフェノチアジン系色原体、トリフェニルメタン系色原体、ジフェニルアミン系色原体、ｏ−フェニレンジアミン、ヒドロキシプロピオン酸、ジアミノベンジジン、テトラメチルベンジジン等が挙げられ、フェノチアジン系色原体が好ましい。フェノチアジン系色原体としては、例えば１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、１０−Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ−６７）等が挙げられる。フェノチアジン系色原体の中でも、１０−Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ−６７）が特に好ましい。トリフェニルメタン系色原体としては、例えばＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４’’−トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ−ＰＳ）等が挙げられる。ジフェニルアミン系色原体としては、例えばＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。
【００３４】
さらに、本発明は、ロイコ型色原体の安定化方法に関する。本発明におけるロイコ型色原体の安定化とは、ロイコ型色原体含有水溶液中のロイコ型色原体の熱に対する安定化のみならず、ロイコ型色原体の光に対する安定化をも意味する。ここで、ロイコ型色原体の安定化は、ロイコ型色原体含有水溶液の着色により評価することができ、着色が大きい程、すなわち、ロイコ型色原体含有水溶液の吸光度が大きい程、安定性が悪いと評価する。一方、ロイコ型色原体含有水溶液の着色が小さい程、すなわち、ロイコ型色原体含有水溶液の吸光度が小さい程、安定性が良いと評価する。
【００３５】
本発明のロイコ型色原体の安定化方法においては、ロイコ型色原体を、ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩を含む水溶液中で共存させる。本発明のロイコ型色原体の安定化方法に用いられるニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩としては、前述の、ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩等が挙げられ、化合物（Ｉ）等が例示される。
【００３６】
本発明の安定化方法において用いられるロイコ型色原体及びロイコ型色原体含有水溶液としては、前述のロイコ型色原体の保存方法におけるロイコ型色原体及びロイコ型色原体含有水溶液が挙げられる。本発明においてロイコ型色原体含有水溶液中のロイコ型色原体の濃度は、ロイコ型色原体が水性媒体に溶解される濃度であれば特に制限はされないが、通常０．０００１〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌであり、０．０００５〜１．０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。
【００３７】
本発明において水溶液中にロイコ型色原体と共存させるニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩の濃度としては、通常０．０００１〜２００μｍｏｌ／Ｌであり、０．００５〜１００μｍｏｌ／Ｌが好ましい。
【００３８】
本発明におけるロイコ型色原体の熱に対する安定性を測定する方法は、熱に対するロイコ型色原体の安定性を測定することができれば特に制限はないが、例えば、ロイコ型色原体を含有する水溶液を、５℃または３０℃で保存した後の水溶液の着色を吸光度計により測定する方法等が挙げられる。
【００３９】
また、本発明におけるロイコ型色原体の光による安定性を測定する方法は、光に対するロイコ型色原体の安定性を測定することができれば特に制限はないが、例えば、ロイコ型色原体を含有する水溶液に１５時間光を照射し、照射後の水溶液の着色を吸光度計により測定する方法等が挙げられる。
【００４０】
（２）液状試薬
本発明の液状試薬は、ロイコ型色原体と、ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩とを含有する液状試薬である。
【００４１】
本発明の液状試薬においては、ロイコ型色原体は、水性媒体中で、ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩と共存する。本発明の液状試薬におけるロイコ型色原体としては、前述のロイコ型色原体が挙げられる。本発明の液状試薬における水性媒体としては、前述の水性媒体が挙げられる。本発明の液状試薬におけるニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩としては、前述の、ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩等が挙げられ、化合物（Ｉ）等が例示される。
【００４２】
本発明の液状試薬におけるニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩の濃度としては、通常０．０００１〜１０％であり、０．０００５〜５％が好ましい。本発明の液状試薬におけるロイコ型色原体の濃度としては、ロイコ型色原体が水性媒体に溶解される濃度であれば特に制限はなく、通常０．０００１〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌであり、０．０００５〜１．０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。ロイコ型色原体の水性媒体への溶解に際しては、前述の有機溶媒を溶解補助剤として用いることもできる。
【００４３】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００４４】
尚、本実施例、比較例及び試験例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。
【００４５】
ＭＥＳ（同仁化学研究所社製）、ペルオキシダーゼ（東洋紡績社製）、ＢＳＡ（プロメライン社製）、Nitroso-PSAP［化合物（Ｉ）;同仁化学研究所社製］、5-Br-PSAA［化合物（Ｉ）;同仁化学研究所社製］。
【実施例１】
【００４６】
以下の組成からなるＤＡ−６７含有水溶液を調製した。
ＭＥＳ（ｐＨ６．３）                １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                          ２０μｍｏｌ／Ｌ
Nitroso-PSAP                        １μｍｏｌ／Ｌ
【実施例２】
【００４７】
以下の組成からなるＤＡ−６７含有水溶液を調製した。
ＭＥＳ（ｐＨ６．３）                １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                          ２０μｍｏｌ／Ｌ
5-Br-PSAA                           ５μｍｏｌ／Ｌ【００４８】
［比較例１］
以下の組成からなるＤＡ−６７含有水溶液を調製した。
ＭＥＳ（ｐＨ６．３）                １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                          ２０μｍｏｌ／Ｌ
【実施例３】
【００４９】
（１）ＤＡ−６７安定性評価用試料の調製
実施例１のＤＡ−６７含有水溶液を５℃で７日間保存したもの、及び、３０℃で７日間保存したものをＤＡ−６７安定性評価用試料として用いた。【００５０】
（２）安定性測定用試薬の調製
以下の組成からなる安定性測定用試薬を調製した。
＜ＤＡ−６７安定性測定用試薬＞
ＭＥＳ（ｐＨ６．３）                １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ                              ０．００５％【００５１】
（３）ＤＡ−６７含有水溶液中のＤＡ−６７の安定性の評価
調製直後の実施例１のＤＡ−６７含有水溶液３０μＬに（２）で調製したＤＡ−６７安定性測定用試薬１２０μＬを添加し、３７℃で５分間加温した後の溶液の吸光度（Ｅ直後）を、主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで日立７１７０Ｓにて測定した。調製直後のＤＡ−６７含有水溶液の代わりに、（２）のＤＡ−６７安定性測定用試薬を用いて同様の測定を行い、吸光度（Ｅブランク）を測定した。Ｅ直後からＥブランクを差し引き、調製直後のＤＡ−６７含有水溶液に対する吸光度（△Ｅ直後）とした。【００５２】
同様に、５℃で７日間保存したＤＡ−６７含有水溶液、及び、３０℃で７日間保存したＤＡ−６７含有水溶液を試料として用いて測定を行い、５℃で７日間保存したＤＡ−６７含有水溶液に対する吸光度（△Ｅ５℃）、及び、３０℃で７日間保存したＤＡ−６７含有水溶液に対する吸光度（△Ｅ３０℃）をそれぞれ測定した。【００５３】
測定した△Ｅ５℃、△Ｅ３０℃それぞれから△Ｅ直後を差し引いた値を、それぞれ△Ｅ１、△Ｅ２とし、ＤＡ−６７の安定性の指標とした。その結果を第１表に示す。△Ｅ１、△Ｅ２のいずれにおいても、値が０に近い程、水溶液中での着色が抑制され、ＤＡ−６７が水溶液中で安定に保存されること、すなわち、水溶液中でＤＡ−６７が安定化されることを示している。
【実施例４】
【００５４】
実施例１のＤＡ−６７含有水溶液の代わりに、実施例２のＤＡ−６７含有水溶液を用いる以外は、実施例３と同様の方法により、△Ｅ１、及び、△Ｅ２を測定した。その結果を第１表に示す。【００５５】
［比較例２］
実施例１のＤＡ−６７含有水溶液の代わりに、比較例１のＤＡ−６７含有水溶液を用いる以外は、実施例３と同様の方法により、△Ｅ１、及び、△Ｅ２を測定した。その結果を第１表に示す。【００５６】
【表１】
2012081540.tif 000005
【００５７】
第１表に示される通り、実施例３〜４と比較例２との比較から、化合物（Ｉ）であるNitroso-PSAP又は5-Br-PSAAを含む水溶液中では、化合物（Ｉ）を含有しない場合と比較して、５℃でも３０℃においても着色が顕著に抑制されていた。化合物（Ｉ）は、ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩であることから、ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩を含む水溶液中のＤＡ−６７が熱に対して安定であり、ＤＡ−６７含有水溶液がニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩により安定に保存され、ＤＡ−６７がニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩により水溶液中で安定化されることが明らかとなった。
【実施例５】
【００５８】
以下の組成からなるＤＡ−６７含有水溶液を調製した。
ＭＥＳ（ｐＨ６．３）                １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                          ２０μｍｏｌ／Ｌ
Nitroso-PSAP                        ５μｍｏｌ／Ｌ
【実施例６】
【００５９】
以下の組成からなるＤＡ−６７含有水溶液を調製した。
ＭＥＳ（ｐＨ６．３）                １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                          ２０μｍｏｌ／Ｌ
Nitroso-PSAP                        １０μｍｏｌ／Ｌ
【実施例７】
【００６０】
以下の組成からなるＤＡ−６７含有水溶液を調製した。
ＭＥＳ（ｐＨ６．３）                １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                          ２０μｍｏｌ／Ｌ
5-Br-PSAA                           １０μｍｏｌ／Ｌ
【実施例８】
【００６１】
（１）ＤＡ−６７安定性評価用試料の調製
実施例５のＤＡ−６７含有水溶液に対して、１１００ルクスの光を２４時間照射したものをＤＡ−６７安定性評価用試料として用いた。【００６２】
（２）安定性測定用試薬の調製
以下の組成からなる安定性測定用試薬を調製した。
＜ＤＡ−６７安定性測定用試薬＞
ＭＥＳ（ｐＨ６．３）                １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ                              ０．００５％【００６３】
（３）ＤＡ−６７の光に対する安定性の評価
調製直後の実施例５のＤＡ−６７含有水溶液３０μＬに（２）で調製したＤＡ−６７安定性測定用試薬１２０μＬを添加し、３７℃で５分間加温した後の溶液の吸光度（Ｅ直後）を、主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで日立７１７０Ｓにて測定した。調製直後のＤＡ−６７含有水溶液の代わりに、（２）のＤＡ−６７安定性測定用試薬を用いて同様の測定を行い、吸光度（Ｅブランク）を測定した。Ｅ直後からＥブランクを差し引き、調製直後のＤＡ−６７含有水溶液に対する吸光度（△Ｅ直後）とした。【００６４】
同様に、（１）で調製した光照射後のＤＡ−６７含有水溶液を試料として用いて測定を行い、光照射後のＤＡ−６７含有水溶液に対する吸光度（△Ｅ光）を測定した。【００６５】
測定した△Ｅ光から△Ｅ直後を差し引いた値を△Ｅ３とし、ＤＡ−６７の光に対する安定性の指標とした。その結果を第２表に示す。△Ｅ３の値が０に近い程、光照射によるＤＡ−６７の着色が抑制されることを示している。
【実施例９】
【００６６】
実施例５のＤＡ−６７含有水溶液の代わりに、実施例６のＤＡ−６７含有水溶液を用いる以外は、実施例８と同様の方法により、△Ｅ３を測定した。その結果を第２表に示す。
【実施例１０】
【００６７】
実施例５のＤＡ−６７含有水溶液の代わりに、実施例２のＤＡ−６７含有水溶液を用いる以外は、実施例８と同様の方法により、△Ｅ３を測定した。その結果を第２表に示す。
【実施例１１】
【００６８】
実施例５のＤＡ−６７含有水溶液の代わりに、実施例７のＤＡ−６７含有水溶液を用いる以外は、実施例８と同様の方法により、△Ｅ３を測定した。その結果を第２表に示す。【００６９】
［比較例３］
実施例５のＤＡ−６７含有水溶液の代わりに、比較例１のＤＡ−６７含有水溶液を用いる以外は、実施例８と同様の方法により、△Ｅ３を測定した。その結果を第２表に示す。【００７０】
【表２】
2012081540.tif 000006
【００７１】
第２表に示される通り、実施例８〜１１と比較例３との比較から、化合物（Ｉ）であるNitroso-PSAP、5-Br-PSAAを含む水溶液においては、化合物（Ｉ）を含有しない場合と比較して、光照射による着色が顕著に抑制されていた。化合物（Ｉ）は、ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩であることから、ニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩を含む水溶液中のＤＡ−６７が光に対して安定であり、ＤＡ−６７含有水溶液がニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩により安定に保存され、ＤＡ−６７がニトロソ基及びアゾ基からなる群より選ばれる少なくとも一つの置換基を有し、かつ、金属イオン配位能を有する化合物又はその塩により安定化されることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明により、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法、ロイコ型色原体の安定化方法及びロイコ型色原体を含有する液状試薬が提供される。本発明の方法及び試薬は、糖尿病の診断に用いられる糖化ヘモグロビンの測定等に有用である。
【国際調査報告】
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