(57)【要約】  本発明は、従来のセルロースゲル培地の欠点を改良した、微生物コロニーの視認性のよいセルロースゲル培地、これを作製するためのセルロースゲル培養基材及びその製造方法、ならびにより迅速で効率のよいセルラーゼ産生微生物又はセルラーゼ活性のスクリーニング法を提供する。  本発明の一つの態様は、培地固化成分としてのセルロースと水とを含有するセルロースゲルからなる培養基材であって、前記セルロースが、当該セルロースを８％(W/V)塩化リチウムを含有するジメチルアセトアミド中に２.５mg/mLの濃度で溶解した溶液の２６℃における粘度が１２〜３５mPa・Sであるものであることを特徴とする、培養基材である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地固化成分としてのセルロースと水とを含有するセルロースゲルからなる培養基材であって、前記セルロースが、当該セルロースを８％(W/V)塩化リチウムを含有するジメチルアセトアミド中に２.５mg/mLの濃度で溶解した溶液の２６℃における粘度が１２〜３５mPa・Sであるものであることを特徴とする、培養基材。
【請求項２】
前記セルロースゲルの厚さ２mmの波長５００nmでの光線透過率が、２５％以上である、請求項１記載の培養基材。
【請求項３】
前記セルロースのゲルろ過によるピークトップ分子量が、１１５，０００〜１,１００，０００である、請求項１又は２記載の培養基材。
【請求項４】
容器に収容されている、請求項１〜３のいずれか１項記載の培養基材。
【請求項５】
前記セルロースゲルが栄養成分を含む請求項１〜４のいずれか１項記載の培養基材からなることを特徴とする固体培地。
【請求項６】
８％(W/V)塩化リチウムを含有するジメチルアセトアミド中に２.５mg/mLの濃度で溶解した溶液の２６℃における粘度が１２〜３５mPa・Sであるセルロースを水に分散させ、固形チオシアン酸塩を添加した後、セルロースを加熱溶解させ、温度を下げて固化させる工程を含むことを特徴とする、セルロースゲル培養基材の製造方法。
【請求項７】
請求項５記載の固体培地に被検微生物又は被検試料を接触させ、セルロースゲルの溶解の有無又は程度を判定する工程を含むことを特徴とする、被検微生物によるセルラーゼ産生能力又は被検試料のセルラーゼ活性の検定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物等の培養に用いる固体培地作製のための培養基材、この培養基材を用いた固体培地、及び前記培養基材の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物等の固体培養法には、従来から寒天（アガー）又はアガロースを固化剤として使用した固体培地が使用されている。この理由は、作製が容易で、培養された微生物を目視で容易に判別しやすく、微生物の単離を容易に行える等の利点を有しているからである。しかし、これらの固体培地は、高温や極端なｐＨ等の極限環境下ではゲルが溶解してしまうため、培養できる微生物が制限される。【０００３】
このような極限環境下での微生物の培養を可能にするために、セルロースのみを固化剤としたセルロースゲル培地が開発された。例えば、特許文献１（国際公開公報ＷＯ２００５／０８３０５６）には、培地固化成分として、セルロースを骨格部分とし、セルロース濃度が０．０１％以上、空隙率が５０％以上である多孔質のセルロースゲル構造体であるセルロースゲルを含む固体培地及びその製造方法が記載されている。この発明の固体培地は、セルロースを溶媒（特にチオシアン酸塩水溶液）に分散させて、攪拌及び／又は加熱により溶解し、次いで冷却及び／又は溶媒除去によりゲル化させて得たセルロースゲルに、栄養素を浸透させることによって製造される。このセルロースゲルは、未修飾のセルロースを原料としているため、熱、極端なｐＨ、高塩濃度、水や有機溶媒に対する溶解性等に対しても強い耐性を持つ。そのため、作製されたセルロースゲル培地は、微生物培養領域で「極限環境」と呼ばれる環境においてもゲルが溶解することはない。したがって、この培地は、寒天培地等の従来の固体培地を使用することができなかった、より広い範囲の培養条件下で使用することができることが記載されている。【０００４】
このように、セルロースゲルを使用した固体培地は、アガロースゲル、ジェランガム又はシリカゲルを用いた固体培地では培養が困難な条件下、例えば１００℃の高温下や強酸性、強アルカリ性条件下でも軟化、離水することなく培養ができるという優れた利点を持つ。しかし、非特許文献１（Deguchi et al., Soft Matter, (2007), 3, 1170‐1175）には、微生物培養に適したセルロースゲル培地を作製するためには、セルロース濃度は２〜３重量％が最適であり、１重量％未満ではゲルの物理強度は失われ、非常に脆くなるため、微生物の塗布又は分散が不可能となることが記載されている。また、セルロース濃度が３重量％を超えると、固化後の培地表面が平らでなくなり、微生物の播種ができなくなることが記載されている。したがって、現状の微生物培養用セルロースゲル培地は、非常に限定された範囲のものしか作製できない。【０００５】
さらに、上記のような、物理的強度や平滑性の点で固体培地として適したセルロース濃度のセルロースゲルは、寒天やアガロースゲル培地のような透明性がなく、白色である。微生物の大部分のコロニーは白色系であるため、セルロースゲル培地上ではコロニーの視認性は悪く、コロニーの観察には適していないが、これを向上させるような選択の余地がなかった。【０００６】
セルロースゲル培地は、セルラーゼ産生菌のスクリーニングにも有用である。従来、セルラーゼ産生菌のスクリーニングはカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等を使用した方法により行われていたが、セルロースゲル培地の使用により、従来の方法と比較して、スクリーニング効率が飛躍的に向上した。これは、セルロースゲル培地の材料であるセルロースが、セルラーゼの直接の基質であるため、セルロースが分解された場合、その場所にセルラーゼ産生菌が存在することを目視で判断できるので、別途のセルラーゼ活性の確認作業を必要としない、スクリーニング用のレプリカの作製を要しない等の理由によるものである。【０００７】
スクリーニングにおいて、作業の効率、特に検出時間の短縮は、その後の開発状況に大きく影響を及ぼすため、スクリーニングの迅速化は恒常的に望まれている。セルラーゼによるセルロースゲルの分解は、セルロース密度が低いほどその影響を顕著に観察することができる。しかし、現状ではセルロースゲル中のセルロース濃度を低減させることが不可能であったため、これ以上の迅速化は望めなかった。また、セルロース培地が白色を呈しているため、分解により生じた穴の確認が培養初期段階においては困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ２００５／０８３０５６（発明の名称：「セルロース固体培地とその製造方法」）
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Deguchi et al., Preparation and characterization of nanofibrous cellulose plate as a new solid support for microbial culture.  Soft Matter, (2007), 3, p.1170-1175
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記のような従来のセルロースゲル培地の欠点を改良し、微生物コロニーの視認性のよいセルロースゲル培地を作製するためのセルロースゲル培養基材及びその製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、この培養基材を使用した固体培地を提供することを目的とする。さらに、本発明は、より迅速で効率のよいセルラーゼ産生微生物又はセルラーゼ活性のスクリーニング法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によれば、
〔１〕  培地固化成分としてセルロースと水とを含有するセルロースゲルからなる培養基材であって、前記セルロースが、当該セルロースを８％(W/V)塩化リチウムを含有するジメチルアセトアミド中に２.５mg/mLの濃度で溶解した溶液の２６℃における粘度が１２〜３５mPa・Sであるものであることを特徴とする、培養基材；
〔２〕  前記セルロースゲルの厚さ２mmの波長５００nmでの光線透過率が、２５％以上である、前記〔１〕記載の培養基材；
〔３〕  前記セルロースのゲルろ過によるピークトップ分子量が、１１５，０００〜１,１００，０００である、前記〔１〕又は〔２〕記載の培養基材；
〔４〕  容器に収容されている、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の培養基材；
〔５〕  前記セルロースゲルが栄養成分を含む前記〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の培養基材からなることを特徴とする固体培地；
〔６〕  ８％(W/V)塩化リチウムを含有するジメチルアセトアミド中に２.５mg/mLの濃度で溶解した溶液の２６℃における粘度が１２〜３５mPa・Sであるセルロースを水に分散させ、固形チオシアン酸塩を添加した後、セルロースを加熱溶解させ、温度を下げて固化させる工程を含むことを特徴とする、セルロースゲル培養基材の製造方法；
〔７〕  前記〔５〕記載の固体培地に被検微生物又は被検試料を接触させ、セルロースゲルの溶解の有無又は程度を判定する工程を含むことを特徴とする、被検微生物によるセルラーゼ産生又は被検試料のセルラーゼ活性の検定方法、が提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のセルロースゲル培養基材及びそれを用いた固体培地は、寒天培地と同程度の透明性（光線透過率）を有するため、従来のセルロースゲル培地の欠点であった培地上でのコロニーの視認性が飛躍的に向上しており、コロニーの判別が容易に行えるようになる。また、本発明のセルロースゲル培養基材及びそれを用いた固体培地は、セルロース濃度が低く、ゲルが低密度であるにもかかわらず、従来のセルロースゲル培地が有する、物理的に強い、溶解しにくい等の有利な特徴をすべて保持している。そのため、種々の微生物等の極限環境下における固体培養に、従来のセルロースゲル培地と同様に使用できる。【００１３】
また、微生物のスクリーニングにおいては迅速に且つ正確に目的の微生物の単離作業が行えることが望ましいが、本発明のセルロースゲル培養基材及びそれを用いた固体培地を使用することにより、さらに短時間でのスクリーニングが可能になる。すなわち、本発明のセルロースゲル培養基材及びそれを用いた固体培地は、レプリカの作製や別途のセルラーゼ活性のアッセイを必要とせず、単離した微生物のセルラーゼ活性や組換えセルラーゼ活性の有無又は強弱を培地上で直接目視で評価することができる。さらに、本発明のセルロースゲル培養基材及びそれを用いた固体培地は、従来のセルロースゲル培地と比較してゲル密度が１／７〜１／２程度であるため、セルラーゼの分解の様子（セルラーゼ活性）を非常に短い時間で迅速に且つ容易に判断することができる。したがって、本発明によれば、セルロース分解微生物の探索やその酵素活性の強弱を判定する作業の効率化が可能となる。【００１４】
また、本発明のセルロースゲル培養基材及びそれを用いた固体培地は、セルロース原料の選択範囲が広いため、任意の強度とすることが可能であり、微生物培養用以外にも、例えば植物のカルス培養などに使用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、各種セルロースのゲルろ過による分子量測定の結果を表す図である。パネル（Ａ）は、検量線から算出した各セルロース試料の分子量分布及びピークトップ分子量；パネル（Ｂ）は、各試料をインジェクションして得られたゲルろ過のパターンを表す図である。黒の太線は試料１、黒の細線は試料２、グレーの太線は試料３をそれぞれ表す。矢印は、各試料のピークトップ分子量の位置を表す。
【図２】図２は、各培養基材を上からデジタルカメラにて撮影した写真を示す。パネル（Ａ）は、試料１（セルロース濃度３％）；パネル（Ｂ）は試料２（セルロース濃度１％）をそれぞれ用いて作製した培養基材である。
【図３】図３は、各培養基材の走査型電子顕微鏡写真を示す図である（倍率５０,０００倍）。パネル（Ａ）は、試料１（セルロース濃度３％）；パネル（Ｂ）は試料２（セルロース濃度１％）；パネル（Ｃ）は、試料３（セルロース濃度１％）をそれぞれ用いて作製した培養基材である。
【図４】図４は、各培養基材の光線透過率を表す図である。パネル（Ａ）は、１％寒天、試料１（１％及び３％）、試料２（０．５％及び１％）をそれぞれ用いて作製した培養基材の透過率を表す。パネル（Ｂ）は、試料１〜３（いずれも１％）をそれぞれ用いて作製した培養基材の透過率を表す。「ａ」の線は１％寒天（比較例）、「ｂ」の線は試料２（０．５％）、「ｃ」の線は試料２（１％）、「ｄ」の線は試料１（１％）、「ｅ」の線は試料１（３％）、「ｆ」の線は試料３（１％）をそれぞれ表す（ｎ＝３）。
【図５】図５は、各培養基材（セルロース濃度１％）について測定した応力を示す図である。矢印は、最大応力値を表す。グレーの太線は試料１、黒の太線は試料２、黒の細線は試料３をそれぞれ表す。
【図６】図６は、試料１（３％）及び試料２（１％）をそれぞれ用いて作製した培養基材の引張り強度を示す図である（ｎ＝３）。点線は試料１（３％）、グレーの線は試料２（１％）をそれぞれ表す。
【図７】図７は、セルロースゲル培地上での大腸菌の生育試験の結果を示す図である。パネル（Ａ）は１％寒天、パネル（Ｂ）は試料１（３％）、パネル（Ｃ）は試料２（１％）、パネル（Ｄ）は試料２（０．５％）を固化剤とした培地上に生じたコロニーの写真である。パネル（Ｅ）は各培地上に生じたコロニー数を示す図である（ｎ＝９）。
【図８】図８は、セルロースゲル培地上での枯草菌の生育試験の結果を示す図である。パネル（Ａ）は１％寒天、パネル（Ｂ）は試料１（３％）、パネル（Ｃ）は試料２（１％）、パネル（Ｄ）は試料２（０．５％）を固化剤とした培地上に生じたコロニーの写真である。パネル（Ｅ）は各培地上に生じたコロニー数を示す図である（ｎ＝９）。
【図９】図９は、セルロースゲル培地上での酵母菌の生育試験の結果を示す図である。パネル（Ａ）は１％寒天、パネル（Ｂ）は試料１（３％）、パネル（Ｃ）は試料２（１％）、パネル（Ｄ）は試料２（０．５％）を固化剤とした培地上に生じたコロニーの写真である。パネル（Ｅ）は各培地上に生じたコロニー数を示す図である（ｎ＝９）。
【図１０】図１０は、セルロース分解菌を生育させたセルロースゲル培地の写真を示す図である。パネル（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）は試料１（３％）、パネル（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ）は試料２（１％）を固化剤とした培地上に生じたコロニー（溶解穴）の写真である。培養時間は、パネル（Ａ）及び（Ｂ）は４８時間、パネル（Ｃ）〜（Ｆ）は７２時間である。１目盛＝０．１mm。
【図１１】図１１は、セルロース分解菌を生育させたセルロース培地の写真を示す図である。パネル（Ａ）は試料１（３％）、パネル（Ｂ）試料２（１％）を固化剤とした培地上に培養７日後に生じたコロニーの写真である。矢印はコロニー（溶解穴）の位置を示す。１目盛＝０．１mm。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
従来のセルロースゲル培地では、セルロース濃度は２〜３％が最適であり、セルロース濃度を低減させると物理強度が保てず、培地として使用に適さないとされていた。高分子化合物は、分子量が大きくなるほど粘性が増加することから、物理強度の増強という点からすると、分子量の大きいセルロース、例えばバクテリアセルロースの使用が考えられる。しかし、本発明者らは、予想に反して、このような分子量の大きいセルロースを低濃度で用いたセルロースゲルは予測不能な不規則な収縮を起こすため均一な培地を作製することができず、使用に適さないこと、ある特定の性質を有するセルロースを用いることにより低濃度でも十分な強度を有するセルロースゲルの作製が可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１７】
すなわち、本発明において使用されるセルロースとしては、微生物由来又は植物由来のいずれでもよいが、植物由来のセルロースが好ましい。ゲルろ過による分子量（ピークトップ分子量）は、１１５，０００〜１,１００，０００であることができ、１１５，０００〜５５０，０００が好ましい。本発明において使用されるセルロースは、８％(W/V)塩化リチウムを含有するジメチルアセトアミド中に２.５mg/mLの濃度で溶解した溶液の２６℃における粘度が、１２〜３５mPa・Sであるものが好ましく、１２〜３０mPa・Sがさらに好ましく、１２〜２７mPa・Sが特に好ましい。
【００１８】
本発明のセルロースゲル培養基材及び培地におけるセルロース濃度は、０．１〜１．８％程度の低濃度とすることができ、好ましくは０．２〜１．５％、最も好ましくは０．５〜１％である。
【００１９】
上記のようなセルロースを上記の濃度で用いることにより、従来のものと比較して透明性が高く、寒天培地に匹敵する透明性を有するセルロースゲルの製造が可能となる。本発明の培養基材及び培地のセルロースゲルは、厚さ２mm（±０．１mm）で波長５００nmでの全光線透過率が２５％以上であり、好ましくは３０％以上、最大１００％までである。なお、全光線透過率は、以下のとおりに測定する：
分光光度計（「ベックマン・コールター DU800」又は同等の機器）を使用し、透過率測定（Ｔ％）モードにて、波長５００nmで、シャーレに収容されたセルロースゲル（厚さ約２mm（２mm±０．１mm））を測定する。培養基材を収容したシャーレの透過率をブランクとする。
【００２０】
セルロースゲル培養基材は、基本的には水を含んだセルロースゲル（及びその収容容器）からなっている。セルロースゲル培養基材には、上記以外に、必要に応じて、水に溶解する物質又は溶媒を含有させても良い。このような任意の成分としては、水に溶解する有機溶媒（例えばアルコール（メタノール、エタノール、プロパノール等）やアセトンなどの極性有機溶媒）、ｐＨ調整剤や色素などの各種の培地の構成成分などが挙げられる。
【００２１】
本発明のセルロースゲル培養基材は、特許文献１及び非特許文献１等に記載された従来の方法にしたがって製造することができるが、好ましくは以下のようにして製造することができる。所望の濃度となるように計量したセルロースを、予め算出した必要量の水に添加して攪拌することにより、十分に分散させる。これに固形のチオシアン酸塩を５０％(W/W)以上になるように添加し、室温で十分に攪拌混合した後、加熱攪拌することによりセルロースを溶解させる。加熱温度は９０℃〜１００℃程度が適温であり、加熱時間は１０分〜３０分程度である。この溶液を所定の容器に分注し、冷ますことによって固化させ、セルロースゲルを形成させる。その後、十分に脱塩することにより、水とセルロースゲルとからなる培養基材が得られる。例えば、固化後、アルコール処理及び脱塩を行う。具体的には、アルコール処理は、セルロースゲルと等量（終濃度５０％（V/V））以上のアルコール（エタノール、メタノール等）を添加して数時間室温で振とうすること等により行うことができる。脱塩工程は、例えば水洗により行うことができる。
【００２２】
上記のようにして製造したセルロースゲル培養基材は、公知の方法によって滅菌することができる。滅菌方法としては、高圧蒸気滅菌（典型的には１２１℃で１５〜２０分程度）が好ましい。
【００２３】
上記のセルロースゲルを収容する容器としては、各種サイズのシャーレ（平板培地作製用）や試験管（斜面培地等作製用）等、任意の形状及び材質のものを利用することができる。微生物の視認性の点から、材質は、透明又は半透明のものが好ましく、透明のもの（例えばガラス、プラスチック等）が最も好ましい。
【００２４】
この培養基材に栄養成分を含ませることにより、固体培地を作製することができる。栄養成分は、例えば、培養基材に、セルロースゲル体積と同容積の２倍濃度の液体培地（培養液）を添加し、ゲル内の水と置換させて１倍濃度とすることにより、培養基材に含有させることができる。栄養成分としては、使用目的に応じて、公知の処方の各種培地又はそれらに基づいて任意の成分を添加又は除去したもの等から、任意のものを選択することができる。
【００２５】
本発明の培養基材及び培地を使用して培養可能な微生物は、非常に多岐にわたる。これらの微生物としては、標準的な条件下で生育可能な従来公知の細菌、真菌、古細菌等に加え、高温、極端なｐＨ、高塩濃度等の条件の極限環境下又は有機溶媒存在下等の特殊環境下に生息する未知の微生物の単離にも使用することができる。
【００２６】
セルロースゲルを構成するセルロースは、セルラーゼの本来の基質である。そのため、セルロース培地は、従来の寒天培地又はセルロース含有アガロースゲル培地と違い、セルラーゼの分解活性を培地上で、直接目視で確認できる利点がある。セルラーゼによるセルロースゲルの分解速度はセルロースの密度に依存しているため、低濃度のセルロースを用いた低密度のゲルを使用することにより、容易にセルラーゼ活性の有無等を視覚的に判別することができる。本発明のセルロースゲル培養基材及び培地は、単位体積あたりのセルロース量を従来のセルロースゲルプレートの１／７〜１／２程度にすることができるので、セルラーゼによるゲルの分解が迅速かつ広範囲で起こり、セルラーゼ活性の検出及び活性の強弱も迅速かつ容易に観察することができる。したがって、本発明の培地は、上記のとおり各種微生物の培養に加えて、セルラーゼ活性又はその強度についてのスクリーニングに特に適している。
【００２７】
スクリーニング方法の一例は、以下のとおりである。例えば培地としてＮＢ（Nutrient broth）培地等を使用し、通常使用する培地濃度の１／２〜１／１００程度に希釈する。この培地を本発明のセルロースゲル培養基材に浸透させてスクリーニング用培地を作製する。試料としては、例えば木片、茎、葉等を採取し、滅菌水で洗浄した後、ろ紙等の上で乾燥させ、必要に応じて裁断等を行ったものを試料とし、培地に直接静置する。あるいは、細かく裁断した試料を滅菌水等に懸濁した後、培地に塗布する。この培地をインキュベーターに静置して、２０℃〜４０℃の温度範囲内の一定の温度で、適当な時間、培養を行う。培養後、セルロースゲルの溶解により生じる穴の大きさ、数等を目視で観察し、陽性及び陰性コントロールと比較することにより、試料中のセルラーゼ活性又はセルラーゼ産生微生物の有無又は活性の強弱を判定することができる。
【００２８】
以下、本発明のセルロースゲル培養基材及び固体培地の製造例及び試験例に基づいて、本発明をさらに説明する。なお、以下においては、「％」は特に示さない限り「％（W/V）」である。
【００２９】
１．セルロース試料のゲルろ過による分子量測定
セルロース試料として、商品名「Avicel」、Merck社製（「試料１」）、商品名「セリッシュ」、ダイセル化学製（「試料２」）、及びバクテリアセルロース（ＢＣ）（「試料３」）を使用した。試料１及び２は、植物由来セルロースである。なお、試料１は、特許文献１及び非特許文献１において記載された実験において使用されたものと同等である。
【００３０】
各セルロース試料１５０ mgを純水１００ mLに分散し、振とう機（回転数：１４０rpm, 高崎科学器械；以下も同じ）上で室温で２４時間以上振とう攪拌した。ろ紙を用いた吸引ろ過を行い、集めたセルロース試料をアセトン（和光純薬工業）１００ mL中に再分散させ、振とう機上で室温で２４時間以上振とう攪拌することにより洗浄した。
【００３１】
次に、ろ紙を用いた吸引ろ過にて脱液した後、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ、和光純薬工業）で洗浄した。すなわち、ＤＭＡｃ  １００mL中にセルロース試料を再分散させ、振とう機上で室温で２４時間以上振とう攪拌した。
【００３２】
ろ紙を用いた吸引ろ過にて脱液した後、ろ紙に試料をはさみ、余分な液体を除去した。室温にて一晩真空乾燥を行い、８％ ＬｉＣｌ（和光純薬工業）を含むＤＭＡｃを、試料濃度が１０ mg/mLになるように加え、溶解するまで４０℃で静置した。１％ ＬｉＣｌを含むＤＭＡｃにてそれぞれの溶液を２０倍希釈し、高速遠心機 (CF16RXII, 日立製作所)を用いて、１５，０００ rpmで１５分間遠心し、上清を回収した。
【００３３】
分子量マーカーとして、各種分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ、関東化学）及びポリエチレンオキシド（ＰＥＯ、関東化学）を、それぞれ終濃度が０．５ mg/mLになるように１％ ＬｉＣｌを含むＤＭＡｃに添加した。分子量マーカーのサイズは、９０万、５８万、２７万、１９万、１０万、４．３万、２．１万、６千、４千、千、６百、４百、２百とした。分子量マーカーを調製後、ＰＥＧ及びＰＥＯが溶解するまで４０℃で静置させ、１５，０００ rpmで１５分間遠心し、上清を回収した。
【００３４】
ＨＰＬＣ分析は以下のとおりに行った。分析機種としては、ＨＰＬＣ本体はWaters社製商品名「Waters e2695」を使用し、検出器としてWaters社製商品名「示差屈折計2414」使用した。カラムは、東ソー社製商品名「TSKgel SuperAWM-H」(粒径９μm、６．０ mm I.D.×１５ cm)×２本、東ソー社製商品名「ガードカラム：TSKguardcolumn SuperAW-H」(４．６ mm I.D.×３．５ cm)を使用した。流速は、０．６ mL/minとし、溶離液には、１％ ＬｉＣｌを含むＤＭＡｃを使用した。サンプル注入量は５０ μL、カラム温度は４０℃に設定した。示差屈折計の設定は、極性（＋）、Res (1s) とした。
【００３５】
結果を図１に示す。パネル（Ａ）は、検量線から算出した各セルロース試料の分子量分布及びピークトップ分子量を表す。試料１のピークトップ分子量は約１０万、試料２のピークトップ分子量は４４万、試料３のピークトップ分子量は２５０万であった。パネル（Ｂ）は、各試料をインジェクションして得られたゲルろ過のパターンを表す図であり、パネル（Ａ）の作成に使用したデータである。縦軸は示差屈折計から得られたシグナル強度、横軸は保持時間を表す。
【００３６】
２．セルロース溶液の粘度測定
セルロース溶液の粘度測定は、エー・アンド・デイ社製音叉振動式粘度計(ＳＶ−１０Ａ)を使用して行った。各セルロース試料を、８％ ＬｉＣｌを含むＤＭＡｃに２.５mg/mLの濃度で溶解させ、２６℃で粘度を測定した。粘度計の較正は、水及び粘度計校正用標準液(日本グリース、ＪＳ−１００)を使用して行った。２６℃での水及び標準液の粘度値は０．９及び５４．０ mPa・Sである。
【００３７】
その結果、８％ ＬｉＣｌ／ＤＭＡｃ（溶媒）、試料１（ピークトップ分子量１０万）、試料２（ピークトップ分子量４４万）、試料３（ピークトップ分子量２５０万）の粘度は、それぞれ、５．３、７．９、２６．９、４１．４ mPa・Sであった。
【００３８】
３．セルロースゲル培養基材の作製
３−１  試料１を用いたセルロースゲル培養基材
セルロース濃度３％のセルロース培養基材を、以下のようにして作製した。
市販のチオシアン酸カルシウム（関東化学）に蒸留水を添加し、終濃度が５７％(W/W)以上になるようにチオシアン酸カルシウム水溶液を調製した。このチオシアン酸カルシウム溶液１００mLに対し、試料１のセルロース３gを添加し、室温で３時間以上攪拌した。得られた懸濁液を内径８．４cmのプラスチック製シャーレに１５mLずつ分注した後、１２０℃、１分間の加熱によりセルロースを溶解した。シャーレを４℃で２時間静置した後、室温に移し、等量以上のメタノール（和光純薬工業）を添加して、振とう機を使用して２時間振とうした。
【００３９】
振とう後、水道水を張った容器にシャーレを入れ、水を流しながら脱塩を行った。２時間以上経過した後、水道水を蒸留水に置換し、脱塩を行っている容器内の導電率を、導電率計（TWIN COMPACT METER、HORIBA）を使用して測定し、導電率が１０μS/cm以下になった時点で脱塩を終了した。
脱塩したセルロースゲルをガラスシャーレ又は耐熱性シャーレ等の容器に移し、１２１℃で２０分間高圧蒸気滅菌した。
また、試料１のセルロース量を１gとした以外は上記と同様にして、セルロース濃度１％のセルロースゲル培養基材を作製した。
【００４０】
３−２  試料２を用いたセルロースゲル培養基材
試料２のセルロース１ gに対し２９．７ mLの水の割合になるように、セルロースと水とを混合し、ビーカー中で十分に攪拌（１０分間以上）した。チオシアン酸カルシウム（４水和物、関東化学）の終濃度が５０％(W/W)になるよう固形のチオシアン酸カルシウムを添加し、全量１００mLとなった液を室温で３時間以上攪拌した。その後、この溶液を９０℃程度で１０分間攪拌し、内径８．４cmのプラスチック製シャーレに１５mLずつ分注後、１２０℃、１分間の加熱によりセルロースを溶解させた。この加熱処理後、４℃で２時間冷却し、室温の等量以上のエタノール（純正化学）を添加し、室温で２時間振とう処理をした。
【００４１】
振とう後、水道水を張った容器にシャーレを入れ、水を流しながら脱塩を行った。２時間以上経過した後、水道水を蒸留水に置換し、脱塩を行っている容器内の導電率を、導電率計（TWIN COMPACT METER、HORIBA）を使用して測定し、導電率が１０μS/cm以下になった時点で脱塩を終了した。
脱塩したセルロースゲルをガラスシャーレ又は耐熱性シャーレ等の容器に移し、１２１℃で２０分間高圧蒸気滅菌した。
また、試料２のセルロース量を０．５gとした以外は上記と同様にして、セルロース濃度０．５％のセルロースゲル培養基材を作製した。
【００４２】
３−３  試料３を用いたセルロースゲル培養基材
上記３−２と同様の方法にしたがって、試料３を用いたセルロース濃度１％のセルロースゲル培養基材を作製した。
【００４３】
このようにして作製した各培養基材の特徴を表１に示す。
【００４４】
【表１】
2012057064.tif 000002
【００４５】
表１において、「密度」は含有セルロース理論値をセルロースゲルの体積（直径及び厚さをノギス又はレオメーターで測定して算出）で除して算出した。また、「相対体積％」は、各セルロースゲルの体積を、試料１（１％）のセルロースゲルの体積を１００％とし、これに対する相対値（％）として算出した。
【００４６】
４．培養基材の外観及び微細構造等
４−１  外観
図２に、上記のようにして作製した各培養基材を、上からカメラにて撮影した写真を示す。パネル（Ａ）は試料１（セルロース濃度３％）、パネル（Ｂ）は試料２（セルロース濃度１％）を用いたものである。
試料１を用いた培養基材は明らかに不透明で白色であるのに対し、試料２を用いた培養基材は透明性を有していた。
【００４７】
４−２  微細構造
走査型電子顕微鏡（型番ＪＳＭ−６７００Ｆ、日本電子製）を用いて上記で作製した各培養基材の構造を観察した（倍率５０,０００倍）。結果を図３に示す。パネル（Ａ）は試料１（セルロース濃度３％）、パネル（Ｂ）は試料２（セルロース濃度１％）を用いたものである。パネル（Ｃ）は、試料３（セルロース濃度１％）を用いて作製した培養基材である。
電子顕微鏡写真により、いずれの培養基材もナノファイバー化したセルロースを骨格部分とした網目構造を形成しており、大きな空隙を有する多孔質の構造体であることが確認された。
【００４８】
４−３  透明性
培養基材の透明性をさらに評価するために、分光光度計（「ベックマン・コールター DU800」）を使用し、透過率測定 (Ｔ％)モードにて３００nm〜８００nmまでの波長でシャーレ内のセルロースゲルをスキャンした。セルロースゲルの厚さはいずれも約２mm（２mm±０．１mm）であり、培養基材を収容したシャーレの透過率をブランクとした。セルロースゲルの透過率は波長５００nmでの測定値にて評価した。比較のため、１％寒天（清水食品、商品名「Taiyo-Agar, BMM-5」）を用いた培養基材についても同様に測定した。
【００４９】
結果を、図４に示す。パネル（Ａ）は、１％寒天、試料１（１％及び３％）、試料２（０．５％及び１％）の透過率を表す。パネル（Ｂ）は、試料１〜３（いずれも１％）の透過率を表す。波長５００nmでの透過率は、試料２を用いた培養基材では、セルロース濃度１％で４５．８％（ＳＤ±４．２）、セルロース濃度０．５％で７４．０％（ＳＤ±１．３）であった。試料２のセルロース濃度０．５％の透過率は、寒天に匹敵するものであった。
一方、試料１を用いた培養基材では、セルロース濃度３％で１２．５％（ＳＤ±１．０）、セルロース濃度１％で５１．４％（ＳＤ±４．０）、試料３を用いた培養基材では、セルロース濃度１％で２３．０％（ＳＤ±２．０）であった。
【００５０】
４−４  応力
各培養基材の応力測定を行った。応力の測定は、サン科学社製レオメーター  CR-500DX-SIIを使用して、以下のように行った。直径３mmの感圧軸を使用し、１mm/６秒の速度で試料台を移動させ、感圧軸がセルロースゲル（直径６．６〜８．４cm×厚さ２mm±０．１mm）表面に接してから１mm押し込むまでの応力の変化をモニターした（ｎ＝３）。最大応力は、感圧軸を１mm押し込んだ時に測定された。
【００５１】
セルロース濃度１％の測定結果を図５に示す。最大応力値（矢印で示す）は、試料１を用いて作製した培養基材では０．１４±０．０８N、試料２を用いて作製した培養基材では０．４７±０．０７N、試料３を用いた培養基材では０．２３±０．０２Nであった。また、セルロース濃度０．５％の試料２では０．１４±０．００N、セルロース濃度３％の試料１では０．８８±０．０４Nであった。
試料２で作製したセルロースゲルは同濃度の試料１及び３で作製したセルロースゲルと比較して応力値が高いことが示された。
【００５２】
４−５  引張り強度
各培養基材の引張り強度を測定した。引張り強度の測定はサン科学社製レオメーター  CR-500DX-SIIを使用して、以下のようにして行った。各培養基材のゲル試料を幅１cm、長さ３cmのダンベル状に切り抜いた試験片（厚さ２mm±０．１mm）を用意した。試験片を測定機にセットし、試料台を０．４２mm/1秒の速度で移動させ、切断に要した力とゲルが切断した時の引張り距離を測定した。
【００５３】
結果を図６及び表２に示す。
【００５４】
【表２】
2012057064.tif 000003
【００５５】
試料１のセルロース濃度１％の試験片は、強度不足のため測定機に設置することができず、測定ができなかった。試料２のセルロース濃度１％で作製した培養基材は、試料１のセルロース濃度３％で作製した培養基材よりも、切断に要した力は小さかったが、引張り距離は試料１のセルロース濃度３％で作製した培養基材よりも２倍程度大きかった。このことは、試料２を用いて作製した培養基材が伸縮性に優れたゲルであることを示している。
【００５６】
５．培地の作製及び各種微生物の培養試験
微生物培養に関連する操作は、滅菌済みの器具及び溶液等を用いて、全て無菌的に行った。
５−１  大腸菌を使用した培養試験
菌株として、E. coli ＡＴＣＣ  ２５９２２を使用した。検定用培地としては普通ブイヨン培地（極東製薬工業）を用いた。上記のように作製した各種培養基材に、１２１℃、２０分で高圧蒸気滅菌済みの２倍濃度の検定用液体培地を１５mL加え、シェーカー（タイテック）にて２時間振とうすることにより、培養基材に浸透させ、培養基材中の水を１倍濃度の培地組成の液体に置換した。２時間後、シャーレ内に余った培地をアスピレータで吸引除去し、クリーンベンチ内で１０分間乾燥させた後、検定用固定培地として使用した。
【００５７】
菌の前培養を、トリ・ソイ血液寒天培地（ヒツジ）Ｎｏ．２（極東製薬工業）で３７℃、１８〜２４時間、好気培養によって行った。得られたコロニーを採取して、１２１℃、２０分で高圧蒸気滅菌済みの生理食塩水に懸濁し、McFarland #0.5の菌液を調製した。更にこの菌液を滅菌済みの生理食塩水で５０，０００倍希釈した。この菌液５０μLを各検定用固体培地に接種し、コンラージ棒で均一に塗り広げた。培養は、３５℃、１８時間、好気培養により行った。菌株の評価は、発育コロニー数を測定することにより行った（ｎ＝９）。
【００５８】
結果を図７に示す。パネル（Ａ）は寒天培地（１％）、パネル（Ｂ）は試料１（３％）、パネル（Ｃ）は試料２（１％）、パネル（Ｄ）は試料２（０．５％）の培地に生じたコロニーを上から撮影した写真を、それぞれ表す。試料２を用いた培地上のコロニーは、寒天培地上のものと同様、容易に視認できた。また、大腸菌は、いずれの固体培地においても同等の生育を示した（パネル（Ｅ））。
【００５９】
５−２  枯草菌を使用した培養試験
菌株として、B. subtilis ＡＴＣＣ ６６３３を使用した。検定用培地としては普通ブイヨン培地（極東製薬工業）を用いた。上記のように作製した各種培養基材に１２１℃、２０分で高圧蒸気滅菌済みの２倍濃度の検定用液体培地を１５mL加え、シェーカー（タイテック）にて２時間振とうすることにより、培養基材に浸透させ、培養基材中の水を１倍濃度の培地組成の液体に置換した。２時間後、シャーレ内に余った培地をアスピレータで吸引除去し、クリーンベンチ内で１０分間乾燥させた後、検定用固定培地として使用した。
【００６０】
菌の前培養を、トリ・ソイ血液寒天培地（ヒツジ）Ｎｏ．２（極東製薬工業）で３７℃、１８〜２４時間、好気培養によって行った。得られたコロニーを採取して、１２１℃、２０分で高圧蒸気滅菌済みの生理食塩水に懸濁し、McFarland #0.5の菌液を調製した。更にこの菌液を滅菌済みの生理食塩水で１０，０００倍希釈した。この菌液５０μLを各検定用固体培地に接種し、コンラージ棒で均一に塗り広げた。培養は、３５℃、１８時間、好気培養により行った。菌株の評価は、発育コロニー数を測定することにより行った（ｎ＝９）。
【００６１】
結果を図８に示す。パネル（Ａ）は寒天培地（１％）、パネル（Ｂ）は試料１（３％）、パネル（Ｃ）は試料２（１％）、パネル（Ｄ）は試料２（０．５％）の培地に生じたコロニーを上から撮影した写真を、それぞれ表す。試料２を用いた培地上のコロニーは、寒天培地上のものと同様、容易に視認できた。また、大腸菌は、いずれの固体培地においても同等の生育を示した（パネル（Ｅ））。
【００６２】
５−３  酵母を使用した培養試験
菌株として、C. albicans ＡＴＣＣ １０２３１を使用した。検定用培地としてはサブローブドウ糖培地（極東製薬工業）を用いた。上記のように作製した各種培養基材に１２１℃、２０分で高圧蒸気滅菌済みの２倍濃度の検定用液体培地を１５mL加え、シェーカー（タイテック）にて２時間振とうすることにより、培養基材に浸透させ、培養基材中の水を１倍濃度の培地組成の液体に置換した。２時間後、シャーレ内に余った培地をアスピレータで吸引除去し、クリーンベンチ内で１０分間乾燥させた後、検定用固定培地として使用した。
【００６３】
菌の前培養を、サブロー寒天培地（極東製薬工業）で３７℃、２０〜２４時間好気培養によって行った。得られたコロニーを採取して、１２１℃、２０分で高圧蒸気滅菌済みの生理食塩水に懸濁し、McFarland #0.5の菌液を調製した。更にこの菌液を滅菌済みの生理食塩水で２，５００倍希釈した。この菌液５０μLを各検定用固体培地に接種し、コンラージ棒で均一に塗り広げた。培養は、３５℃、２４時間、好気培養により行った。菌株の評価は、発育コロニー数を測定することにより行った（ｎ＝９）。
【００６４】
結果を図９に示す。パネル（Ａ）は寒天培地（１％）、パネル（Ｂ）は試料１（３％）、パネル（Ｃ）は試料２（１％）、パネル（Ｄ）は試料２（０．５％）の培地に生じたコロニーを上から撮影した写真を、それぞれ表す。試料２を用いた培地上のコロニーは、寒天培地上のものと同様、容易に視認できた。また、大腸菌は、いずれの固体培地においても同等の生育を示した（パネル（Ｅ））。
【００６５】
５−４  セルラーゼ産生菌を使用した培養試験
菌株として、S. degradans ＤＳＭ １７０２４を使用した。検定用培地としては２倍濃度のダイゴ人工海水ＳＰ溶液（和光純薬工業）に２ mMとなるように硫酸アンモニウム（和光純薬工業）を添加し、１２１℃、２０分で高圧蒸気滅菌したものを用いた。上記のように作製した各種培養基材に検定用液体培地を１５mL加え、シェーカー（タイテック）にて２時間振とうすることにより、培養基材に浸透させ、培養基材中の水を１倍濃度の培地組成の液体に置換した。２時間後、シャーレ内に余った培地をアスピレータで吸引除去し、クリーンベンチ内で１０分間乾燥させた後、検定用固定培地として使用した。使用した培養基材は、試料１（セルロース濃度３％）及び試料２（セルロース濃度１％）を用いて作製した培養基材であった。
【００６６】
菌の前培養用培地調製は、以下の手順で行った。Marine broth（ベクトンディッキンソンアンドカンパニー） １．８７gを蒸留水５０ mLに溶解し、マグネティックスターラーでよく攪拌した。また、蒸留水中１％セロビオース(MP bio.)溶液を別途調製した。Marine Broth及びセロビオース溶液を１２１℃、２０分で高圧蒸気滅菌し、室温に冷ました後、クリーンベンチ内でMarine brothを０．４５μmのメンブレンフィルターでろ過した。３mLのMarine brothにセロビオース溶液を３００μL添加し、ボルテックスミキサーでよく攪拌した。
【００６７】
上記のように調製した前培養用培地３mLにグリセロール保存菌液を５０〜１００μL滴下し、混合した後、３０℃、２０〜２4時間好気培養することにより、菌を前培養した。前培養した菌液を１２１℃、２０分で高圧蒸気滅菌済みのMarine broth 溶液にてMcFarland ＃0.5になるよう希釈し、さらにMarine broth溶液にて菌液を１００〜５００倍希釈した。この菌液５０μLを各検定用固体培地に接種し、コンラージ棒で均一に塗り広げた。培養は、３０℃、好気培養により行った。培地上に形成された穴（溶解穴）の直径を、顕微鏡の接眼ミクロメーターを用いて測定した。各培地（ｎ＝３）からランダムに５個の穴を選び、それらの直径の平均値を算出した。
【００６８】
結果を図１０に示す。パネル（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）は試料１（セルロース濃度３％）；パネル（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ）は試料２（セルロース濃度１％）の培地である。パネル（Ａ）及び（Ｂ）は４８時間、（Ｃ）〜（Ｆ）は７２時間培養後の培地表面の写真を示す図である（パネル（Ａ）、（Ｂ）、（Ｅ）及び（Ｆ））。
【００６９】
４８時間の培養後、試料２（セルロース濃度１％）の培地では０．４ mmの穴が観察されたが、試料１を用いた培地では、顕微鏡（ミクロメーター)は測定できない小さな穴しか観察されなかった。さらに、７２時間培養後の穴の大きさを測定したところ、試料２の培地では０．８mmであり、試料１の培地では０．２mmであった。
【００７０】
さらに、培養７日後においても同様に測定した。結果を図１１に示す。パネル（Ａ）は試料１の培地、パネル（Ｂ）は試料２の培地である。７日後の穴の大きさは、試料２の培地では１．３mmであったのに対し、試料１の培地では０．４mmであった。
【００７１】
したがって、S. degradansによるセルロース培地の分解速度は、試料１の培地よりも試料２の培地の方が速く、分解菌の存在を早く容易に確認できることが示された。
【００７２】
６．種々のセルロース試料を用いた培養基材の作製
試料２及び試料３を用い、遠藤貴士著「ボールミル処理による非晶セルロースの調製」（Cellulose Commun., 13 (2): 80-84, 2006）を参考として、種々の分子量のセルロース試料を調製した。
ボールミル容器（体積１L）へ試料２のセルロース原料を１０g入れ、０、５、１８、３０、４３、９１時間、ボールミル処理を行った。同様に、試料３のセルロース試料については、０、５、１８、３０、４３時間、ボールミル処理を行った。
【００７３】
処理後の各試料について、上記１．に記載したとおりにゲルろ過により分子量を測定した。また、上記２．に記載したとおりに、セルロース溶液を調製し、溶液の粘度を測定した。さらに、上記３．に記載した方法にしたがって、それぞれの試料を１％のセルロース濃度で含む培養基材を作製し、上記４．に記載したとおりに透過率、最大応力、密度を測定した。
【００７４】
結果を表３及び４にそれぞれまとめて示す。
【００７５】
【表３】
2012057064.tif 000004
【００７６】
【表４】
2012057064.tif 000005
【００７７】
試料２及び試料３のいずれも、ボールミル処理時間の増大とともに分子量の低下及び粘度の低下が起こっていること、及びセルロース分子量と粘度とには正の相関があることが確認された。
【００７８】
試料２及び３をそれぞれ固化剤として作製した培養基材のいずれについても、波長５００nmでの透過率は分子量及び粘度の減少と共に増加した（表３及び４）。試料３については、未処理のセルロースを用いて培養基材を作製した場合、ゲルが収縮することが既にわかっていたが（表１）、この収縮によりセルロース密度は増加し、必然的に光線透過率が低下する。しかし、ボールミル処理後のセルロースを用いて作製した培養基材は、処理時間の増大と共に相対体積％が１００％に近づいた。すなわち、セルロースゲルのセルロース密度が処理時間の増大と共に低下し、それに伴って培養基材の収縮も抑制されたため、培養基材の透過率が上昇したと考えられる。透過率は、ボールミル処理時間が３０時間の時に最大になった。
【００７９】
一方、４３時間処理した試料３のセルロースを用いた場合は、密度は低下しているものの、透過率も減少し、透明性が低下していた。この現象は９１時間処理した試料２のセルロースにおいても確認された（表４）。
【００８０】
試料２を固化剤として作製した培養基材について、５時間〜４３時間の処理で分子量及び粘度が低下すること、及びこの分子量の低下（あるいは粘度の低下）の範囲では作製した培養基材の物性（透過率、応力、密度）には影響を与えないこと、が明らかになった。しかし、９１時間処理した試料２のセルロースについては、作製された培養基材の物性が非常に脆いものとなっていた。
【００８１】
この出願は、平成２２年１０月２９日出願の日本特許出願、特願２０１０−２４４３２７に基づくものであり、特願２０１０−２４４３２７の明細書及び特許請求の範囲に記載された内容は、すべてこの出願明細書に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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