(57)【要約】本発明は、糖尿病に起因する疾患の初期症状の診断と介入後のコントロール状態を的確に評価できる尿検査方法を提供することを課題とする。特に、糖尿病性腎症の初期症状の診断が的確にできる尿検査評価方法を提供することを課題とする。  本発明者は、上記の課題を解決するために、免疫複合体転移酵素免疫測定方法（ＩＣＴ−ＥＩＡ法）を使用して、尿中に排出される以下の糖尿病関連抗原（バイオマーカー）の評価を行ない、複数のバイオマーカーの組合わせにより、糖尿病の進行状況と共に、腎臓の機能障害の進行状況も早期に把握できることを見出し、本発明を完成するに至った。【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿中の糖尿病関連の一つ以上のバイオマーカーを免疫複合体転移測定方法（ＩＣＴ−ＥＩＡ法）で測定することを特徴とする、糖尿病性疾患の進行度評価方法。
【請求項２】
上記バイオマーカーがインスリン、レジスチン、アディポネクチン、レプチンおよびＣＲＰの中から複数選択されることを特徴とする、請求項１に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
【請求項３】
上記バイオマーカーとして、アディポネクチンと共に、レプチンまたはレジスチンが選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
【請求項４】
糖尿病性疾患が糖尿病性腎症であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
【請求項５】
上記尿中のアディポネクチン濃度が１〜１０ｎｇ／ｍｇＣｒｅの場合に、糖尿病性腎症の初期症状であるとして評価することを特徴とする、請求項４の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
【請求項６】
上記バイオマーカーとして、アディポネクチンと共に、インスリン及び／又はレジスチンが選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
【請求項７】
上記バイオマーカーを組み合わせた指標として、アディポネクチンとレジスチンの積、アディポネクチンとインスリンの積、アディポネクチンとレジスチン、インスリンの３つの積のいずれか一つを用いて評価することを特徴とする、請求項６に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
【請求項８】
肥満非糖尿病者（ＯＮＤ）と糖尿病患者（ＤＭ）を識別するために評価することを特徴とする、請求項７に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかの進行度評価方法を用いて、糖尿病患者及び／又は糖尿病予備群に対して、介入療法を行うことを特徴とする、糖尿病性疾患の予防または治療方法。
【請求項１０】
糖尿病性疾患が糖尿病性腎症であることを特徴とする、請求項９に記載の糖尿病性疾患の予防または治療方法。
【請求項１１】
尿中のアディポネクチン濃度が１ｎｇ／ｍｇＣｒｅ以上の場合に、介入療法を開始することを特徴とする、請求項９または１０に記載の糖尿病性疾患の予防または治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病に起因する疾患の初期症状の診断と介入後のコントロール状態を的確に評価するための尿検査方法に関するものである。特に、糖尿病性の腎臓障害の初期症状の診断とコントロール状態を評価するための尿検査方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
国内における糖尿病患者は、２００７年の国民健康・栄養調査に基き、糖尿病予備群も含め約２，２１０万人と推定されている（非特許文献１）。実際、４０歳以上の男・女の３人に１人が糖尿病あるいは予備群と考えられ、この１０年間で８００万人以上増加している。その背景には、わが国の生活習慣の欧米化による肥満・内臓脂肪蓄積を基盤としたメタボリックシンドロームの増加が考えられている。従って、糖尿病あるいは予備群の数は今後も増加の一途をたどると予想されている。
今後の糖尿病対策としては、これら糖尿病予備群の発症を防ぎ、更には糖尿病予備群を増加させないことが急務である。そのためには、糖尿病予備群を抽出し、現状を認識させ生活を変容させることが必須となっている。しかし、これら糖尿病予備群の抽出や認識・変容は、糖尿病予備群が検診に参加することにより初めて可能となる。一般に糖尿病患者は身体的症状が出るまで診療を受けない傾向にある。そこで、本発明者は、非観血的検査法による糖尿病予備群の積極的な参加を促す糖尿病予防の新戦略を提唱している。即ち、家庭で自ら採取し提供できる尿や乾燥ろ紙血を試料として、糖尿病リスクのプロファイリングを行い、現状を認識させ、さらに、その後の生活指導による糖尿病リスク軽減の評価を行うという手法である。本発明者らは、このために独自の超高感度測定法も開発しており、既に糖尿病リスクマーカーであるアディポネクチンに関して、尿や乾燥ろ紙血での検出方法を発表している（非特許文献２）。
しかし、糖尿病予備群の糖尿病への推移状況を的確に診断し、更には積極的な介入により、健康に引き戻すためのコントロール状態を適切に把握するためには、上記非観血的検査法を尿検査に限定して、検査に対する利便性を高め、採血という心理的な抵抗感を排除することが必要である。
一般的に、糖尿病性疾患の診断に用いられる尿検査項目としては、尿糖検査が挙げられる。しかし、尿中に尿糖が排出されてくるのは、通常、血糖値が約１７０ｍｇ／ｄｌ以上の場合の人であり、この値を示す人は、糖尿病予備群ではなく完全な糖尿病患者に該当する。高齢者の場合には、腎機能の低下で血糖値が１７０ｍｇ／ｄｌより更に高くなっても尿糖が出ない場合もあることが指摘されている。
また、尿タンパクやＣペプチド（ＣＰＲ）についても尿検査が行なわれているが、数値に変動が現れるのは、糖尿病がかなり進行してからの場合が多く、糖尿病予備群に関して、糖尿病への推移状況を初期の段階で的確に評価することは困難な状況であった。
そこで、尿中に排出される特定のタンパク質に着目し、糖尿病性疾患の進行度を検査することが行なわれている。例えば、早期に糖尿病性腎症を検出し進展度を判定するために尿中のプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１を測定する方法（特許文献１）、あるいはサボシンＢとトランスサイレチンを測定する方法（特許文献２）が知られている。
しかしながら、これらのマーカーが糖尿病性疾患（糖尿病性腎症）の進行度の評価になり得るかについては、充分な検証はまだなされていない状況である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００６−６１３４５号公報
【特許文献２】特表２００８−１７５８１４号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】厚生労働省健康局総務課生活習慣病対策室：平成１９年国民健康・栄養調査の概要
【非特許文献２】橋田誠一ら、「高感度アディポネクチン測定法の開発とその運動・栄養指導への応用」徳島文理大学研究紀要第７８号７〜２０頁（２００９年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、糖尿病に起因する疾患の初期症状の診断と介入後のコントロール状態を的確に評価できる尿検査方法を提供することにある。特に、糖尿病性腎症の初期症状の診断が的確にできる尿検査方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、非特許文献２の免疫複合体転移測定方法（ＩＣＴ−ＥＩＡ法）を使用して、尿中に排出される以下の糖尿病関連抗原（バイオマーカー）の検出、評価を試みた。
【表１】
2012121266.tif 000002
2012121266.tif 000003
上記表１に示されるように、尿中に存在するタンパク質は、血液中のタンパク質が腎臓で濾過されて、尿中に排出されるものである。健常人の尿中に排出されるタンパク質は、腎臓の糸球体の網目のサイズに依って大きな影響を受け、血中に存在するタンパク質の分子量が１万以下のものは、尿中に排出され易くなっている。また、分子量が約６万までのタンパク質は尿中にある程度排出される。しかし、６万以上のタンパク質は、あまり排出されないと考えられ、血中と尿の存在比は、タンパク質の分子量が大きくなるほど、血中から尿中に排出され難くなっていると考えられている。例えば、血中から尿へ排出される、糖尿病関連の主なバイオマーカーを表２（糖尿病関連生理活性物質の検出限界と血中及び尿中濃度の一覧表）に示す。表２に示されるように、タンパク質の分子量が大きくなるほど、尿中には排出され難くなっている。
【表２】
2012121266.tif 000004
そこで、上記表１に記載の糖尿病性疾患のバイオマーカーを用いて、非肥満非糖尿病者（ＮＯＮＤＭ）、肥満非糖尿病者（ＯＮＤＭ）、糖尿病者（ＤＭ）の３群から尿を採取し、ＩＣＴ−ＥＩＡ法で尿中のバイオマーカーを測定・評価した。その結果、図１と図３に示すように、糖尿病患者と非糖尿病患者（糖尿病予備群）を明確に区別できるバイオマーカーとして、レジスチン、アディポネクチンを見出すことができた。更に、腎臓悪化の指標として汎用される尿中のアルブミン濃度と尿中のアディポネクチン濃度の相関関係を見たところ、図２に示すように、良好な直線関係を与えることが見出された。即ち、糖尿病が進行し、糖尿病性腎症になってくれば、心臓の糸球体の網目が壊れ、アディポネクチンのような分子量の大きいタンパク質が尿中に漏れて来ることになる。従って、尿中のアディポネクチン濃度を測定することにより、腎機能の悪化の程度（糖尿病性腎症の進行状況）を評価できることを見出した。
更に、本発明者らは、上記ＩＣＴ−ＥＩＡ法で測定した尿中のアディポネクチン濃度と血清中のアディポネクチン濃度を対比し、その比（尿中濃度／血中濃度）を取ることにより、腎機能の悪化の程度をより明確に評価できるパラメーターになることを見出した。即ち、図７に示されるように、腎機能の悪化の指標の尿中アルブミン濃度では捕捉が充分出来ない、初期の腎機能障害者も明瞭に識別できることを見出した。また、尿中に排出されるバイオマーカー（アディポネクチン、レジスチン、インスリン）を組み合すことにより、図１０に示されるように非侵襲的に糖尿病患者と糖尿病予備軍の患者（肥満非糖尿病対象者）を識別できる指標（パラメーター）として使用できることを見出した。本発明者は、以上の知見に基き、本発明を完成した。
即ち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）尿中の糖尿病関連の一つ以上のバイオマーカーを免疫複合体転移測定方法（ＩＣＴ−ＥＩＡ法）で測定することを特徴とする、糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（２）上記バイオマーカーがインスリン、レジスチン、アディポネクチン、レプチンおよびＣＲＰの中から複数選択されることを特徴とする、上記（１）に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（３）上記バイオマーカーとして、アディポネクチンと共に、レプチンまたはレジスチンが選択されることを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（４）糖尿病性疾患が糖尿病性腎症であることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（５）尿中のアディポネクチン濃度が１〜１０ｎｇ／ｍｇＣｒｅの場合に、糖尿病性腎症の初期症状であるとして評価することを特徴とする、上記（４）の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（６）上記バイオマーカーとして、アディポネクチンと共に、インスリン及び／又はレジスチンが選択されることを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（７）上記バイオマーカーを組み合わせた指標として、アディポネクチンとレジスチンの積、アディポネクチンとインスリンの積、アディポネクチンとレジスチン、インスリンの３つの積のいずれか一つを用いて評価することを特徴とする、上記（６）に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（８）肥満非糖尿病者（ＯＮＤ）と糖尿病患者（ＤＭ）を識別するために評価することを特徴とする、上記（７）に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（９）上記バイオマーカーとして、レプチンと共に、インスリンまたはレジスチンの中から１つを選択して用いる、上記（１）又は（２）に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（１０）糖尿病性疾患がインスリン抵抗性または高血糖であることを特徴とする、上記（９）に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（１１）尿中のアディポネクチン濃度を測定することによる、糖尿病性腎症の進行度（腎機能の悪化の程度）を評価することを特徴とする、上記（１）に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（１２）上記尿中のアディポネクチンの濃度と血清中のアディポネクチン濃度の比（尿中濃度／血中濃度）を指標とする、上記（１１）に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（１３）上記アディポネクチン濃度比（尿中濃度／血中濃度）が、１０×１０−５以上の場合に、糖尿病性腎症の初期症状であるとして評価することを特徴とする、上記（１２）の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（１４）上記（１）〜（１３）のいずれかの進行度評価方法を用いて、糖尿病患者及び／又は糖尿病予備群に対して、介入療法を行うことを特徴とする、糖尿病性疾患の予防または治療方法。
（１５）糖尿病性疾患が糖尿病性腎症であることを特徴とする、上記（１４）に記載の糖尿病性疾患の予防または治療方法。
（１６）尿中のアディポネクチン濃度が１ｎｇ／ｍｇＣｒｅ以上の場合に、介入療法を開始することを特徴とする、上記（１４）または（１５）に記載の糖尿病性疾患の予防または治療方法。
（１７）糖尿病性疾患がインスリン抵抗性または高血糖であることを特徴とする、上記（１４）に記載の糖尿病性疾患の予防または治療方法。
（１８）環境要因と日内変動を受け易く、変動し易い糖尿病性関連バイオマーカーの積分値として、一定時間蓄尿された尿中の当該バイオマーカーを評価することを特徴とする、糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（１９）糖尿病性関連バイオマーカーがインスリンである、上記（１８）に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（２０）上記（１８）または（１９）のいずれかの進行度評価方法を用いて、糖尿病患者及び／又は糖尿病予備群に対して、介入療法を行うことを特徴とする、糖尿病性疾患の予防または治療方法。
（２１）糖尿病性疾患に関する介入療法を受けた被験者に関して、介入療法前後の尿中の糖尿病関連の一つ以上のバイオマーカーを免疫複合体転移測定方法（ＩＣＴ−ＥＩＡ法）で測定することにより、介入療法の適否と継続をスクリーニングする方法。
（２２）介入療法が、食事療法、運動療法または薬物療法である、上記（２１）のスクリーニング方法。
（２３）糖尿病性疾患が糖尿病性腎症である、上記（２１）または（２２）に記載のスクリーニング方法。
（２４）バイオマーカーがインスリンまたはアディポネクチンである、上記（２１）〜（２３）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（２５）バイオマーカーがインスリンであり、介入療法が薬物療法である、上記（２１）〜（２４）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の尿中の糖尿病関連バイオマーカーの評価方法により、採取された単一の尿から、同時に多種のバイオマーカーの検査が可能となり、これらのバイオマーカーの検査結果から、糖尿病の進行状況と共に、腎臓の機能障害の進行状況も早期に把握することが可能となった。これらの尿検体は採血と異なり苦痛を伴わず簡便に採取可能であるため、対象者の積極的な検診への参加が期待できる。そのため、本発明の尿中のバイオマーカーの評価方法を用いた診断方法は、糖尿病性疾患の診断として、特に問題の多い糖尿病性腎症の早期発見や、糖尿病予備群の糖尿病リスクの判定や生活指導後の糖尿病リスクの軽減を評価する上で有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
図１は健常者と肥満非糖尿病者、糖尿病患者のそれぞれの尿中のアディポネクチンの濃度（ｎｇ／ｍｇＣｒｅ．）を測定し、対比した図である。糖尿病患者の尿中のアディポネクチン濃度が、健常者と肥満非糖尿病者のそれより有意に高い数値を示した。
図２は尿中のアディポネクチンの濃度（ｎｇ／ｍｇＣｒｅ．）が、腎臓の機能障害の指標であるアルブミン尿の濃度（μｇ／ｍｇＣｒｅ．）と正の相関関係を有することを明らかにした図である。このことから、アディポネクチンの尿中濃度を検査することにより、腎臓の機能障害の様子と病態の進行状況を評価することができるようになった。
図３は健常者と肥満非糖尿病者、糖尿病患者のそれぞれの尿中のレジスチンの濃度（ｎｇ／ｍｇＣｒｅ．）を測定し、対比した図である。糖尿病患者の尿中のレジスチン濃度が、健常者と肥満非糖尿病者のそれより有意に高い数値を示した。
図４は健常者と肥満非糖尿病者、糖尿病患者のそれぞれの尿中のレプチンの濃度（ｐｇ／ｍｇＣｒｅ．）を測定し、対比した図である。肥満非糖尿病者の尿中のレプチン濃度が、健常者と糖尿病患者のそれより有意に高い数値を示した。尿中のレプチン濃度を評価することで、肥満への移行状況が早期に検知され、糖尿病（インスリン抵抗性等）の発症を回避するために介入療法を開始することができる。
図５は健常者（ＮＤＭＮＯ）と肥満非糖尿病者（ＮＤＭＯ）、糖尿病患者（ＤＭ）のそれぞれの尿中のインスリンの濃度（μＵ／ｍｇＣｒｅ．）を測定し、対比した図である。糖尿病患者の尿中のインスリン濃度が、健常者のインスリン濃度より、有意に高い数値を示した。また、肥満非糖尿病者の尿中のインスリンの濃度も、糖尿病患者のインスリン濃度より低い数値ではあるが、健常者のインスリン濃度より高い数値を示した。このことは、肥満非糖尿病者において、既にインスリン抵抗性が起こり始めていることを示している。
図６は経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を行なった被験者の試験開始後６０分経過した後の乾燥濾紙血中のインスリン濃度（Ｕ／ｍｌ）と、ＯＧＴＴ後２時間蓄尿の尿中インスリン量が正の相関関係にあることを示した図である。被験者の血中インスリン濃度が上昇（糖尿病が進行）しているほど、尿中に排出されるインスリン量は増大することが示されている。
図７は腎機能の悪化の指標である尿中アルブミン濃度と共に、糸球体濾過値（ｅＧＦＲ）、血清中のアディポネクチン濃度、尿中のアディポネクチン濃度、及びアディポネクチンの濃度比（尿中濃度／血清中濃度）を記載した４人の被験者の検査データを掲載した図である。アディポネクチンの濃度比（尿／血中の濃度比）を指標とすることにより、アルブミン尿が検出される腎機能障害者（被験者Ｂ）と共に、微量アルブミン尿が検出されない腎機能障害者（被験者Ｃ）についても識別が明確にできるようになる。
図８は図７に記載の４名の被験者の血清中アディポネクチン濃度（μｇ／ｍｌ）をカラム分画毎に表示した図である。縦軸は血清中アディポネクチン濃度であり、被験者Ａを基準にして相対比で表示した。横軸は、カラム分画の番号を表わす。
図９は図７に記載の４名の被験者の尿中アディポネクチン濃度（ｎｇ／ｍｌ）をカラム分画毎に表示した図である。腎機能障害者（被験ＣとＤ）においては、尿中に排出されるアディポネクチンは、血清中では少ない濃度の低分子（３量体）が尿中に多く排出されていることが分った。被験者の内、健常者（被験者ＡとＢ）の尿中には単分子が相対的に多く排出されており、腎機能障害者（被験ＣとＤ）では、単分子よりも低分子が多く尿中に排出されていた。
図１０は尿中のアディポネクチン濃度、レジスチン濃度、インスリン濃度を用いて、糖尿病予備軍である肥満非糖尿病者（ＯＮＤ）と糖尿病患者（ＤＭ）あるいは健常者（非肥満非糖尿病者ＮＯＮＤ）を識別できるパラメーターを作成し、パラメーター間の有効性を評価した図である。腎障害指標のアディポネクチンと糖尿病指標のインスリンやレジスチンを組み合わせると、糖尿病性腎症の指標となり得ることを示している。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
−本発明の第一の態様−
本発明の第一の態様は、一つ以上のバイオマーカーを免疫複合体転移測定方法（ＩＣＴ−ＥＩＡ法）で評価することを特徴とする、糖尿病性疾患の評価診断方法に関する発明である。
本発明の「バイオマーカー」とは、尿中に排出され測定評価できる糖尿病のバイオマーカーのことであって、例えばインスリン、レジスチン、アディポネクチンおよびＣＲＰ（炎症性蛋白）を挙げることができる。好ましいバイオマーカーとしては、アディポネクチンまたはレジスチンを挙げることができる。
本発明の「糖尿病性疾患」とは、微小血管障害によって生じる糖尿病性神経障害・糖尿病性網膜症・糖尿病性腎症のことを言う。糖尿病性神経障害の内、自律神経障害としては、例えば胃腸障害（便秘／下痢）、発汗障害、起立性低血圧、インポテンツ等を挙げることが出来る。感覚神経障害としては、例えば末梢のしびれ、神経痛等を挙げることができる。糖尿病性網膜症とは、硝子体出血、牽引性網膜剥離、虹彩血管新生などにより失明に至る病気であり、その他に、白内障、緑内障をはじめとする眼科疾患の原因となっている。糖尿病性腎症とは、蛋白尿が進行し、徐々に体がむくむネフローゼ症候群という病態になり腎不全となって行く病気である。現在、日本において透析導入の原因の第一位となっている。なお、本発明の評価診断方法は、尿中のバイオマーカーを測定、評価する方法であるため、特に糖尿病性腎症の評価、診断に向く方法であると考えられる。
本発明の「免疫複合体転移酵素免疫測定方法（ＩＣＴ−ＥＩＡ法）」とは、非競合法（サンドイッチ）エンザイムイムノアッセイ法（ＥＩＡ）の高感度化した改良方法に関するものである（非特許文献２参照）。ＩＣＴ−ＥＩＡ法では、使用する抗体の非特異吸着（バックグランド）を下げることができたので、多くの高分子生理活性物質のａｍｏｌレベル以下（ｚｍｏｌ）の測定が可能となっている（Ｈａｓｈｉｄａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｖｏｌｕｍｅ  １，（１９９５）  ｐｐ４０３−４５１，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ参照）。
本発明の「糖尿病性疾患の進行度評価方法」とは、尿中の糖尿病関連の複数のバイオマーカーの濃度または存在量の変動を測定することにより、被験者の糖尿病性疾患の進行状況を的確に評価する方法である。この評価方法により、被験者の糖尿病性疾患の進行を抑制し改善するための治療剤の投与や生活指導等の介入療法が的確に行なえるようになる。
例えば、バイオマーカーとして、アディポネクチンを指標にした場合、尿中のアディポネクチン濃度が１〜１０ｎｇ／ｍｇＣｒｅの場合には、糖尿病性腎症の初期症状であるとして評価することができる。そこで、尿中のアディポネクチン濃度が１ｎｇ／ｍｇＣｒｅ以上となった場合には、介入療法を開始すると糖尿病性腎症への進行を抑制回避できることになる。更には改善することができるようになる。
また、図７に示すように、尿中のアディポネクチン濃度と血清中のアディポネクチン濃度の濃度比（尿中濃度／血中濃度）を指標とすることにより、微量アルブミン尿が検出されない腎機能障害者についても識別が明確にできるようになった。上記濃度比が、１０×１０−５以上の場合に、糖尿病性腎症の初期症状であるとして評価できることになる。より明確には、上記濃度比が２０×１０−５以上の場合に糖尿病性腎症の初期症状として判断できることになる。
更に、上記尿中のバイオマーカーとして、インスリン、レジスチン、アディポネクチン、レプチンおよびＣＲＰの中から複数選択し、それらを組み合せて指標として使用することができる。例えば、図１０に示されるように、アディポネクチンとレジスチンの積、アディポネクチンとインスリンの積、アディポネクチンとレジスチン、インスリンの３つの積のいずれか一つを用いて、被験者の糖尿病性疾患の進行状況を的確に評価することができる。即ち、糖尿病予備軍である、肥満非糖尿病者（ＯＮＤ）と糖尿病患者（ＤＭ）あるいは健常者（非肥満非糖尿病者ＮＯＮＤ）を識別できる指標（パラメーター）とすることができる。即ち、腎障害指標となる尿中のアディポネクチン濃度と糖尿病指標の尿中のインスリンやレジスチンの濃度を組み合わせて指標とすると、糖尿病性疾患（糖尿病性腎症を含む）の進行度を表わす、より適切な指標になり得ることが示めされている。
同様に、尿中のレプチン濃度を中心にして、インスリンまたはレジスチンの尿中濃度を組み合わせることにより、糖尿病性疾患（糖尿病性腎症を含む）の進行度を表わす指標として、より適切なものになることが分かる。
−本発明の第二の態様−
本発明の第二の態様は、上記の糖尿病性疾患の進行度評価方法を用いて、糖尿病患者及び／又は糖尿病予備群に対して、介入療法を行うことを特徴とする、糖尿病性疾患の予防または治療方法に関する発明である。
本発明の「介入療法」とは、プロトコールに基づく生活習慣（食事・身体活動中心）の改善または公知の高脂血症治療剤、糖尿病疾患治療剤の服用を言う。即ち、食事療法や運動療法を生活習慣の中に取り入れ、必要カロリーと消費カロリーのコントロールを行なうものであり、精神的なストレスを軽減するよう指導して、糖尿病の発症にかかわる要因を削除軽減することを行なう。更には、初期症状の糖尿病患者に対しては、バイオマーカーの数値を下げるための薬物療法を行なうことを介入療法として含むものである。上記の糖尿病性疾患の進行度評価方法を用いて、早期の介入療法を開始することにより、重症度への移行を抑制、回避し、症状を改善し、健康な状態に戻すことができる。
−本発明の第三の態様−
本発明の第三の態様は、上記の介入療法の結果を判定し、被験者に対する介入療法の適否、継続の可否を判断する方法に関する発明である。
本発明の「スクリーニングする方法」とは、介入療法前後の尿中の糖尿病関連の一つ以上のバイオマーカーの数値（免疫複合体転移測定方法（ＩＣＴ−ＥＩＡ法）で測定された値）を比較対比し、介入療法が被験者に対して適否であるか否かを評価し、その介入療法の継続の是非をスクリーニングする方法のことを言う。例えば、バイオマーカーとしてアディポネクチンを指標とし、尿中のアディポネクチン濃度が１ｎｇ／ｍｇＣｒｅ以上となった場合に介入療法を行ない、介入療法後に尿中のアディポネクチン濃度を測定し、アディポネクチン濃度が以前より低くなっていない場合には、その介入療法は、該当する被験者には適していなかったことになる。その場合には、介入療法の内容を変化させ、被験者の現状に適合したものにすることができる。
糖尿病性疾患が糖尿病性腎症の場合、２００８年の統計では、人工透析の要因の第一位に挙げられている。従って、糖尿病性腎症の進行を抑制、回避できれば、糖尿病患者にとって大きな朗報になる。そのため、本スクリーニング方法を用いて、被験者にとって一番適切な介入療法を、尿中のバイオマーカーの測定、評価から、早期に簡易に決定して行けることになる。
なお、本発明の第二の態様と第三の態様で使用される用語で、第一の態様と共通する用語は同じ意味を表わすものである。そのため、特に言及することをしていない。
【実施例】
【００１０】
次に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）尿中のアディポネクチンの測定と健常者と糖尿病患者、肥満穂糖尿病者の３群間の比較
（１）試薬と方法
［方法］
測定方法は、非特許文献２に記載の免疫複合体転移酵素免疫測定法（ＩＣＴ−ＥＩＡ法）を準用した。
［抗原］
標準リコンビナント・ヒト・アディポネクチンはＢｉｏＶｅｎｄｏｒ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  Ｉｎｃ社（Ｐａｌａｃｋｅｃｈｏ，Ｃｚｅｃｈ  Ｒｅｐｕｂｌｉｃ）より購入した。
［抗体］
モノクローナル抗ヒト・アディポネクチン抗体（ＢＡＦ１０６５及びＭＡＢ１０６５１）はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（ＭＮ，ＵＳＡ）より購入した。
［尿サンプル］
被験者の早朝第一尿（１０ｍＬ）に１／５０容量の５％ＢＳＡおよび５％ＮａＮ３を加え、透析まで４℃で保存した。２４時間以内に採取した尿を透析した。
透析は、透析用セルロースチューブ（透析膜ＵＣ８−３２−２５、三光純薬、東京）を用い、緩衝液（０．１ＭＮａＣｌを含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０）に対して１．５ｍｌの上記尿サンプルの透析を行なった。透析後、透析尿の重量を秤量し、希釈倍率による補正を行なった。透析尿は直ちにマイクロチューブ（Ｓａｆｅ−Ｌｏｃｋ  Ｔｕｂｅｓ１．５ｍｌ）に分注し、−２０℃で凍結保存を行なった。尚、尿中クレアチニン濃度は市販キット（クレアチニン−テストワコー、和光純薬、大阪）により測定した。
（２）尿中のアディポネクチンの測定
上記透析尿サンプル１００μｌを用いて、尿中のアディポネクチン濃度を測定した。健常者の尿中アディポネクチン濃度は、０．４±０．４（ＳＤ）ｎｇ／ｍｇクレアチニン（範囲；０．０１〜３．１４ｎｇ／ｍｇクレアチニン）であった。また、肥満非糖尿病者の尿中アディポネクチン濃度は、０．５±０．４（ＳＤ）ｎｇ／ｍｇクレアチニン（範囲；０．１〜２．４ｎｇ／ｍｇクレアチニン）であり、糖尿病患者の尿中アディポネクチン濃度は、２．９±９．８（ＳＤ）ｎｇ／ｍｇクレアチニン（範囲；０．１〜４８．８ｎｇ／ｍｇクレアチニン）であった。その結果を図１に示す。図１から明らかなように、糖尿病患者の尿中アディポネクチン濃度は、健常者と肥満非糖尿病者のそれより有意に（ｐ＜０．００１、＜０．０５）高値を示した。
（実施例２）尿中のアディポネクチン濃度とアルブミン濃度との対比
糖尿病患者では、試験紙法による尿蛋白が陰性の病期であっても、すでに組織学的変化が始まっている。この初期の病変（早期腎症）を診断する指標の一つとして尿中微量アルブミンが測定され、微量アルブミン尿を呈する症例の多くは後に持続性蛋白尿を呈し、糖尿病性腎症に移行することが明らかにされている。従って、尿中アルブミンを測定し、早期糖尿病性腎症の有無を確認して、対策を講じることが重要である。また、糸球体障害の指標であるので糸球体に組織変化をもたす腎疾患の原発性腎疾患でも有用であるとされている。
そこで、実施例１の透析尿サンプルを用いて、Ｈｕｍａｎ  Ａｌｂｕｍｉｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ａｓｓａｙ  Ｐｒｏ，Ｓｔ  Ｃｈａｒｂｅｓ，ＭＯ）を使用して、尿中アルブミン（クレアチニン基準）の測定を行なった。その測定結果と、実施例２のアディポネクチンの測定結果を合わせて、図２に示す。
図２に示されるように、尿中アディポネクチンと尿中アルブミンは良好な相関関係を有することが分かった。即ち、尿中のアディポネクチン濃度を測定することにより、尿サンプル提供者の糖尿病への進行度が判明すると共に、腎臓の障害レベルが判別できることが明らかになった。即ち、尿中のアディポネクチン濃度が１ｎｇ／ｍｇＣｒｅより少ない場合であると、尿中アルブミン濃度が３０μｇ／ｍｇＣｒｅ以下の正常値を示すことになる。このことは、腎臓に障害が起きておらず、アディポネクチン（分子量４４万）の漏出がほとんど見られない状況であることを表わしている。また、尿中のアディポネクチン濃度が１〜１０ｎｇ／ｍｇＣｒｅの範囲にある場合には、尿中アルブミン濃度が３０〜３００μｇ／ｍｇＣｒｅの範囲の値を示すことになる。この尿中アルブミン濃度の範囲になると、腎臓に初期の機能障害が起きていることを表わしている。その結果、アディポネクチン（分子量４４万）の漏出が次第に起きて来る状況になったことを表わしている。更に尿中のアディポネクチン濃度が１０ｎｇ／ｍｇＣｒｅより大きくなる場合には、尿中アルブミン濃度が３００μｇ／ｍｇＣｒｅより大きくなり、腎臓に機能障害が顕著に起きていることを表わしている。
以上のように、アディポネクチンの尿中濃度を検査することにより、腎臓の機能障害の様子と病態の進行状況を評価することができることが見出された。更に、同じ尿サンプルを用いて、実施例４のレジスチンを同時評価することによって、糖尿病の有無、病態への進行状況等が同時に明らかとなってくる。具体的には尿検査のみによって、簡便に糖尿病性腎症の早期発見、早期対応が可能となっている。
本発明の高い利便性から、尿を用いた健康診断の参加率を向上させることができ、糖尿病予備群の捕捉が容易になっている。また、その後の介入療法の効果の判定も容易であることから、糖尿病予備群の病態改善が観察し易くなっている。
（実施例３）尿中のレジスチンの測定と健常者と糖尿病患者、肥満穂糖尿病者の３群間の比較
（１）試薬と方法
［方法］
測定方法は、実施例１と同じＩＣＴ−ＥＩＡ法を使用し、同じ尿サンプルを使用した。
［抗原］
標準リコンビナント・ヒト・レジスチンはＢｉｏＶｅｎｄｏｒ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  Ｉｎｃ社（Ｐａｌａｃｋｅｃｈｏ，Ｃｚｅｃｈ  Ｒｅｐｕｂｌｉｃ）のＨｕｍａｎ  Ｒｅｓｉｓｔｉｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔに標準として添付されているものを購入、使用した。
［抗体］モノクローナル抗ヒト・レジスチン抗体（１８４３０５５及び１８４３２０）はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（ＭＮ，ＵＳＡ）より購入した。
（２）尿中のレジスチンの測定
実施例１の透析尿サンプルを用いて、尿中のレジスチン濃度を測定した。健常者の尿中レジスチン濃度は、１８．６±２０．９（ＳＤ）ｎｇ／ｍｇクレアチニン（範囲；０．５〜１３９．４ｎｇ／ｍｇクレアチニン）であった。また、肥満非糖尿病者の尿中レジスチン濃度は、１５．４±１７．２（ＳＤ）ｎｇ／ｍｇクレアチニン（範囲；４．１〜７３．０ｎｇ／ｍｇクレアチニン）であり、糖尿病患者の尿中レジスチン濃度は、３０．０±３６．２（ＳＤ）ｎｇ／ｍｇクレアチニン（範囲；２．２〜１５９．３ｎｇ／ｍｇクレアチニン）であった。その結果を図３に示す。図３から明らかなように、糖尿病患者の尿中レジスチン濃度は、健常者と肥満非糖尿病者のそれより有意に（ｐ＜０．０５）高値を示した。
（実施例４）尿中のレプチンの測定と健常者と糖尿病患者、肥満穂糖尿病者の３群間の比較
（１）試薬と方法
［方法］
測定方法は、実施例１と同じＩＣＴ−ＥＩＡ法を使用し、同じ尿サンプルを使用した。
［抗原］
標準リコンビナント・ヒト・レプチンはＰｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＥＣ（Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）を購入した。
［抗体］
モノクローナル抗ヒト・レプチン抗体（３Ｄ１０及び１６Ｃ９）は日本臨床医学研究所（京都）より購入した。
（２）尿中のレプチンの測定
実施例１の透析尿サンプルを用いて、尿中のレプチン濃度を測定した。健常者の尿中レプチン濃度は、５．２±８．２（ＳＤ）ｐｇ／ｍｇクレアチニン（範囲；０．１〜７７．７ｐｇ／ｍｇクレアチニン）であった。また、肥満非糖尿病者の尿中レプチン濃度は、３４．５±１４６．３（ＳＤ）ｐｇ／ｍｇクレアチニン（範囲；１．４〜８７４．０ｐｇ／ｍｇクレアチニン）であり、糖尿病患者の尿中レプチン濃度は、６．０±７．５（ＳＤ）ｐｇ／ｍｇクレアチニン（範囲；０．６〜１１６５ｐｇ／ｍｇクレアチニン）であった。その結果を図４に示す。図４から明らかなように、肥満非糖尿病者の尿中レプチン濃度は、健常者と糖尿病者のそれより有意（ｐ＜０．０１、０．００１）に高値を示す傾向にあった。
レプチンは脂肪組織によって作り出され、エネルギーの取り込みと消費の制御に重要な役割を果たす１６ｋＤａのペプチドホルモンであり、食欲と代謝の調節を行うとされている。従って、肥満非糖尿病者の血中のレプチン濃度は高く、それを反映して、尿中のレプチン濃度も高くなっている。この尿中のレプチン濃度を測定することにより、肥満への移行状況が早期に検知され、インスリン抵抗性等の発症を回避するために介入療法を開始することができる。
（実施例５）尿中のインスリン濃度と血中のインスリン濃度との比較
（１）試薬と方法
［方法］
測定方法は、実施例１と同じＩＣＴ−ＥＩＡ法を使用し、血液サンプルと尿サンプルについては、非特許文献２の方法に従って採取した。
本実施例の目的は、糖尿病の検査であるブドウ糖付加試験（ＯＧＴＴ）における、血中インスリン濃度と尿中インスリン濃度の相関性を検証することである。そのため、ＯＧＴＴ後６０分後に血液を濾紙法（乾燥濾紙血）により採取すると共に、ＯＧＴＴ後２時間の蓄尿を採取し、サンプルとした。
［血液サンプル］
乾燥濾紙血サンプルは、ＯＧＴＴ後６０分後に穿刺具を用いて血液を濾紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒｋ  Ｓｃｈｕｅｌｌ、ドイツ）に塗布し、風乾させた後、４℃で保存した。
乾燥濾紙血をパンチャー（セントラル科学）で打ち出したディスク（直径１／８インチ）１個に、５００μｌの緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＣＬ、０．１％ＢＳＡ、１ｍＭ  ＭｇＣＬ２、０．１％ＮａＮ３を含む０．０１％Ｍ  リン酸Ｎａ緩衝液ｐＨ７．０）を加え、４℃で２４時間抽出した。なお、１ディスク当たり約２．４〜２．７μｌの血液が含まれている。
［抗原］
標準リコンビナント・ヒト・インスリンはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｓｔ  Ｃｈａｒｂｅｓ，ＭＯ）を購入した。
［抗体］
モノクローナル抗ヒト・インスリン抗体（１６Ｅ９及び６Ｆ７）は日本臨床医学研究所（京都）より購入した。
（２）血中インスリンと尿中インスリンの測定
実施例１の尿サンプルを用いて、尿中のインスリン濃度を測定した。健常者の尿中インスリン濃度は、４．３±２．８（ＳＤ）μＵ／ｍｇクレアチニン（範囲；０．６〜１３．３μＵ／ｍｇクレアチニン）であった。また、肥満非糖尿病者の尿中インスリン濃度は、９．０±５．５（ＳＤ）μＵ／ｍｇクレアチニン（範囲；１．８〜２５．８μＵ／ｍｇクレアチニン）であり、糖尿病患者の尿中インスリン濃度は、１３．８±１７．６（ＳＤ）μＵ／ｍｇクレアチニン（範囲；１０．３〜９０．０μＵ／ｍｇクレアチニン）であった。その結果を図５に示す。図５から明らかなように、糖尿病患者の尿中インスリン濃度は、健常者と肥満非糖尿病者のそれより有意に（ｐ＜０．００１）高値を示した。
即ち、糖尿病患者の尿中のインスリン濃度が、健常者のインスリン濃度より、有意に高い数値を示し、また、肥満非糖尿病者の尿中のインスリンの濃度が、糖尿病患者のインリン濃度より低い数値ではあるものの、健常者のインスリン濃度より高い数値を示している。この結果から、肥満非糖尿病者において、既にインスリン抵抗性が起こり始めていることを示している。そして、糖尿病患者になれば更にインスリン抵抗性が高まっていくことが、尿中のインスリン濃度の数値ときれいに相関していることが示された。
また、上記被験者に経口ブドウ糖負荷試験（Ｏｒａｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｅｓｔ：ＯＧＴＴ）を行なったところ、ブドウ糖水溶液を服用後６０分経過後の乾燥濾紙血中のインスリン濃度（Ｕ／ｍｌ）と、ＯＧＴＴ後２時間蓄尿の尿中インスリン量は、図６に示すように良好な相関性を示すことが明らかとなった。
血中インスリン濃度は、食事や行動による影響を受け、数値が変動し易いバイオマーカーである。そのため、採血の時間や採血スケジュールが厳しく制約されることになる。そのため、病院でないと検査できない種類の診断方法である。しかし、尿中インスリン濃度は、２時間蓄尿であるため数値変動も少なく、家庭でも容易に採取でき、それを試験機関に送付して評価することが可能である。従って、蓄尿の尿中インスリン濃度（尿中の総インスリン量）の測定を健康診断のバイオマーカーとすることにより、家庭でも容易にブドウ糖付加試験が実施でき、糖尿病予備群の発見が容易になり、早期介入療法が開始できることになった。
（実施例６）尿中のアディポネクチン濃度と血清中のアディポネクチン濃度の濃度比（尿中濃度／血中濃度）を指標とする糖尿病性疾患の進行度の評価試験
（１）試薬と方法
測定方法は、実施例１と同じＩＣＴ−ＥＩＡ法を使用し、男女各２名の血液サンプルと尿サンプルについては、非特許文献２の方法に従って採取した。
上記血液サンプルと尿サンプルをカラムクロマトグラフィー処理を行い、フラクション・コレクターで各１ｍｌを採取、分画した。その分画に含まれる、アディポネクチンの量を測定し、得られたアディポネクチンの量を積分した。
カラムは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（２．６ｘ６０ｃｍ）を使用し、流出液は、１０ｍＭ  ＮａＰＢ、ｐＨ７．０、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１％ＢＳＡ、０．１％  ＮａＮ３の組成の緩衝液を用いた。溶出条件は、１ｍＬ／ｍｉｎ、１ｍＬ分画で行った。
（２）測定結果
カラム分画のアディポネクチン濃度の測定結果を図８と図９に示す。図８は、４名の被験者の血清中アディポネクチン濃度（μｇ／ｍｌ）をカラム分画毎に表示した図である。縦軸は血清中アディポネクチン濃度であり、被験者Ａを基準にして相対比で表示した。横軸は、カラム分画の番号を表わす。図９は、４名の被験者の尿中アディポネクチン濃度（ｎｇ／ｍｌ）をカラム分画毎に表示した図である。図８と図９の対比から、腎機能障害者（被験ＣとＤ）の場合には、尿中に排出されるアディポネクチンは、血清中では少ない濃度の低分子（３量体）が多く排出されていることが示された。被験者の内、健常者（被験者ＡとＢ）の尿中には単分子が相対的に多く排出されており、腎機能障害者（被験ＣとＤ）では、単分子よりも低分子が多く尿中に排出されていた。
これらの結果をまとめると、図７に示される表が得られる。図７に示すように、尿中のアディポネクチン濃度と血清中のアディポネクチン濃度の濃度比（尿中濃度／血中濃度）を指標とすることにより、微量アルブミン尿が検出されない初期症状の腎機能障害者についても識別が明確にできるようになった。即ち、上記濃度比が、１０×１０−５以上の場合に、糖尿病性腎症の初期症状であるとして判断できることになる。より明確には、上記濃度比が２０×１０−５以上の場合に糖尿病性腎症の初期症状として判断できることになる。
以上のことから、尿中のバイオマーカーの濃度を選択し、同一の血清中のバイオマーカーの濃度を測定して、その濃度比（尿中濃度／血中濃度）を指標とすることにより、糖尿病性疾患の進行度の評価が充分行なえることが示された。
（実施例７）尿中のバイオマーカーとしてアディポネクチン、インスリン、レジスチンを使用し、複数組み合わせて指標とする糖尿病性疾患の進行度の評価試験
実施例１に準じて得られた尿中アディポネクチン濃度、実施例３に準じて得られた尿中レジスチン濃度、実施例５に準じて得られた尿中インスリン濃度は、糖尿病が進行し、腎機能が障害を受けるに従い、それぞれの排出量が増大する。そこで、これらの濃度を指標として、それぞれの数値の積を取ることにより、腎機能障害の程度を拡大して評価できないかを検討した。
まず、アディポネクチンとレジスチンの積を取って指標としたところ、図１０に示されるように、健常人（非肥満非糖尿病対象者）と糖尿病予備軍である肥満非糖尿病対象者の間では、有意な差は見られなかったが、肥満非糖尿病対象者と糖尿病患者の間では、明確な数値上の相違が見出せた。このように、アディポネクチンとレジスチンの積を指標とすれば、肥満非糖尿病対象者と糖尿病患者を明確に識別できることが明らかとなった。
更に、アディポネクチンとインスリンの積を取って指標としたところ、同様に、肥満非糖尿病対象者と糖尿病患者を明確に識別できることが明らかとなった。そこで、アディポネクチンとレジスチン、インスリンの３種の積を取って指標としたところ、数値的に大きな差を示して、肥満非糖尿病対象者と糖尿病患者を明確に識別できることが明らかとなった。
以上のように、尿中のバイオマーカーの積を使用して、糖尿病性疾患の進行度の評価が充分行なえることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００１１】
本発明の尿中糖尿病関連バイオマーカーの評価方法は、採取された単一の尿から、多種のバイオマーカーの検査が可能であり、得られたバイオマーカーの数値から、糖尿病の進行状況と共に、腎臓の機能障害の進行状況も早期に把握することが可能である。また、尿検体は採血と異なり苦痛を伴わず簡便に採取できるため、対象者の積極的な検診への参加が期待できる。そのため、本発明の評価方法を用いて、健康診断への応用と介入療法と組み合わせての医療システムの構築が可能となる。
【図１】
2012121266.tif 000005
【図２】
2012121266.tif 000006
【図３】
2012121266.tif 000007
【図４】
2012121266.tif 000008
【図５】
2012121266.tif 000009
【図６】
2012121266.tif 000010
【図７】
2012121266.tif 000011
【図８】
2012121266.tif 000012
【図９】
2012121266.tif 000013
【図１０】
2012121266.tif 000014
【国際調査報告】
2012121266.tif 000015
2012121266.tif 000016
2012121266.tif 000017
2012121266.tif 000018
2012121266.tif 000019
2012121266.tif 000020
2012121266.tif 000021
2012121266.tif 000022