(57)【要約】  熱安定性及びpH耐性にすぐれた新規なクチナーゼ様エステラーゼ及びその用途を提供することを課題とする。枝葉コンポスト由来メタゲノムを用いて構築した遺伝子ライブラリーから新規エステラーゼ遺伝子を単離することに成功した。当該遺伝子はThermobifida fusca由来のクチナーゼ遺伝子に高い相同性を示した。新規エステラーゼ遺伝子がコードするタンパク質はポリエステル分解活性を有し、優れた熱安定性及びpH耐性を示した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と等価なアミノ酸配列を含むエステラーゼ。
【請求項２】
等価なアミノ酸配列が、配列番号１に示すアミノ酸配列と95％以上同一のアミノ酸配列である、請求項１に記載のエステラーゼ。
【請求項３】
下記の酵素化学的性質を備えるエステラーゼ：
（１）作用：ポリエステル分解活性を有する；
（２）基質特異性：中鎖脂肪酸エステルに対して良好に作用する；
（３）成熟体領域の分子量： 27.8kDa（アミノ酸配列より算出）
【請求項４】
以下の特性を更に備える、請求項３に記載のエステラーゼ：
（４）作用温度：30℃〜70℃で高い活性を示す；
（５）pH領域：pH 6.5〜9.5で高い活性を示す；
（６）熱安定性：70℃の熱処理後も活性を維持する。
【請求項５】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるエステラーゼ遺伝子：
（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするDNA；
（Ｂ）配列番号３に示す塩基配列又は配列番号４に示す塩基配列からなるDNA；
（Ｃ）配列番号３に示す塩基配列又は配列番号４に示す塩基配列と等価な塩基配列を有し、且つエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項６】
請求項５に記載のエステラーゼ遺伝子を含む組換えDNA。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えDNAを保有する微生物。
【請求項８】
以下のステップ（１）及び（２）を含むことを特徴とする、エステラーゼの製造法：
（１）請求項７に記載の微生物を、前記遺伝子がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ；
（２）産生された前記タンパク質を回収するステップ。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のエステラーゼを有効成分とする酵素剤。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のエステラーゼ又は請求項９に記載の酵素剤でポリエステルを処理することを特徴とする、ポリエステル分解方法。
【請求項１１】
前記ポリエステルが生分解性プラスチックである、請求項１０に記載の分解方法。
【請求項１２】
前記ポリエステルが乳化処理後のポリ-ε-カプロラクトン、又はポリエチレンテレフタレートである、請求項１０に記載の分解方法。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のエステラーゼ又は請求項９に記載の酵素剤でポリエステル材料を処理することを特徴とする、ポリエステル材料改質方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のエステラーゼ又は請求項９に記載の酵素剤でポリエチレンテレフタレートを処理することを特徴とする、テレフタル酸の製造方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の製造方法で製造したテレフタル酸を原料として用いることを特徴とする、ポリエチレンテレフタレートの製造方法。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のエステラーゼ又は請求項９に記載の酵素剤でトリアシルグリセロールを処理することを特徴とする、トリアシルグリセロールの分解方法。
【請求項１７】
前記トリアシルグリセロールを構成する脂肪酸の炭素数が２〜１６である、請求項１６に記載の分解方法。
【請求項１８】
油脂とアルコールを混合し、請求項１〜４のいずれか一項に記載のエステラーゼ又は請求項９に記載の酵素剤を用いてエステル交換反応を行うことを特徴とする、バイオディーゼルの製造方法。
【請求項１９】
前記アルコールがメタノールである、請求項１８に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は枝葉コンポスト由来新規エステラーゼ及びその用途（ポリエステルの分解や改質など）に関する。本出願は、２０１１年１月１９日に出願された日本国特許出願第２０１１−００８８５２号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
クチナーゼ（EC 3.1.1.74）は植物のクチクラを形成する物質であるクチンを分解できる酵素であり、リパーゼとエステラーゼの中間に位置するものとして分類される。これまでに、いくつかのクチナーゼ又はクチナーゼ様エステラーゼが見出されている（例えば特許文献１、非特許文献１等）。その中の一つであるThermobifida fusca由来のクチナーゼ(ハイドロラーゼ)（TfH；非特許文献１)は脂肪酸（アリファティック）ポリエステルのみならず芳香族（アロマティック）ポリエステルも分解できることで知られている(非特許文献２)。一方、熱耐性を高めたクチナーゼの変異体も作製されている（特許文献２〜４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−７５９０５号公報
【特許文献２】特開２００７−１１６９９４号公報
【特許文献３】特表２００３−５２００１６号公報
【特許文献４】特表２００３−５３４７９７号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Chen, S., Tong, X., Woodard, R. W., Du, G., Wu, J., Chen, J., 2008. Identification and Characterization of Bacterial Cutinase. J. Biol. Chem. 283, 25854-25862.
【非特許文献２】Kleeberg, I., Welzel, K., VandenHeuvel, J.  Muller, R. J., Deckwer, W. D. 2005. Characterization of a New Extracellular Hydrolase from Thermobifida fusca Degrading Aliphatic-Aromatic Copolyesters. Biomacromolecules. 6, 262-270.
【非特許文献３】Gouda, M. K., Kleeberg, I., van den Heuvel, J., Muller, R. J., Deckwer, W. D., 2002. Production of a Polyester Degrading Extracellular Hydrolase from Thermomonospora fusca. Biotechnol. Prog. 18, 927-934.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
T. fusca由来のクチナーゼは作用可能な基質の幅が広いという利点を有する。その一方で、酵素精製品として用いた場合、70℃以上の高温において或いはpH 7.5以上の塩基性領域において不安定である(非特許文献３)。また、その他の既存のクチナーゼ或いはクチナーゼ様酵素においても、その特性には一長一短があり、依然として新規なクチナーゼ或いはクチナーゼ様酵素に対するニーズは高い。特に、熱やpH変化に強い酵素の提供が切望されるところである。そこで本発明は、熱安定性及び広いpH領域で高い酵素活性を持つ、すぐれた新規なクチナーゼ様エステラーゼ及びその用途を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決すべく検討を進める中で、本発明者らはメタゲノムを利用した探索手法に注目した。メタゲノムは特定の環境に棲息する難培養性微生物のDNAを、培養を介さず直接抽出単離したものである。これまでに多種類のリパーゼ、エステラーゼなどの油脂分解酵素遺伝子が油性土壌、海底土壌、砂中生態系などの源由来のメタゲノムから単離されている。しかし、長鎖脂肪酸分解活性の高いリパーゼと短鎖脂肪酸分解活性の高いエステラーゼの両者と比較して、中鎖脂肪酸分解活性を持ち、尚且つ、植物細胞壁の構成成分であるクチンを分解するクチナーゼのメタゲノムからの単離の報告はない。【０００７】
本発明者らは、メタゲノムを抽出する環境源として枝葉コンポストを選定した。使用した枝葉コンポストは4カ月間約67℃の高温で保存されたものであり、ここには植物の枝葉を分解・資化する多種類の微生物が生息すると考えられる。これらの微生物からはクチンなどを構成成分に持つ植物細胞壁の分解活性を持つ酵素遺伝子が発現される可能性が高いとの期待の下、研究を進めた。その結果、十分なサイズのメタゲノムライブラリーの構築に成功するとともに、酵素活性を用いたスクリーニングによって、当該ライブラリーより新規クチナーゼ様エステラーゼ遺伝子を単離することに成功した。DNA配列解析とホモロジー検索を行ったところ、T. fusca由来のクチナーゼ遺伝子と約60%の同一性を持つクチナーゼ様エステラーゼ遺伝子が得られたことがわかった。また、発現実験の結果より、当該遺伝子がコードする酵素は中鎖脂肪酸エステルに対して高い活性（エステラーゼ活性）を示すこと、ポリエステル分解活性を有すること、及び熱安定性に優れ且つ広範なpH域で高い活性を示すことが判明した。更には、当該酵素がテレフタル酸の製造（ポリエチレンテレフタレートの分解による）、トリアシルグリセロールの分解、バイオディーゼルの合成等の用途に有用であることが確認された。以下に示す発明は以上の成果に基づく。
［１］配列番号１に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と等価なアミノ酸配列を含むエステラーゼ。
［２］等価なアミノ酸配列が、配列番号１に示すアミノ酸配列と95％以上同一のアミノ酸配列である、［１］に記載のエステラーゼ。
［３］下記の酵素化学的性質を備えるエステラーゼ：
（１）作用：ポリエステル分解活性を有する；
（２）基質特異性：中鎖脂肪酸エステルに対して良好に作用する；
（３）成熟体領域の分子量： 27.8kDa（アミノ酸配列より算出）
［４］以下の特性を更に備える、［３］に記載のエステラーゼ：
（４）作用温度：30℃〜70℃で高い活性を示す；
（５）pH領域：pH 6.5〜9.5で高い活性を示す；
（６）熱安定性：70℃の熱処理後も活性を維持する。
［５］以下の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるエステラーゼ遺伝子：
（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするDNA；
（Ｂ）配列番号３に示す塩基配列又は配列番号４に示す塩基配列からなるDNA；
（Ｃ）配列番号３に示す塩基配列又は配列番号４に示す塩基配列と等価な塩基配列を有し、且つエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
［６］［５］に記載のエステラーゼ遺伝子を含む組換えDNA。
［７］［６］に記載の組換えDNAを保有する微生物。
［８］以下のステップ（１）及び（２）を含むことを特徴とする、エステラーゼの製造法：
（１）［７］に記載の微生物を、前記遺伝子がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ；
（２）産生された前記タンパク質を回収するステップ。
［９］［１］〜［４］のいずれか一項に記載のエステラーゼを有効成分とする酵素剤。
［１０］［１］〜［４］のいずれか一項に記載のエステラーゼ又は［９］に記載の酵素剤でポリエステルを処理することを特徴とする、ポリエステル分解方法。
［１１］前記ポリエステルが生分解性プラスチックである、［１０］に記載の分解方法。
［１２］前記ポリエステルが乳化処理後のポリ-ε-カプロラクトン、又はポリエチレンテレフタレートである、［１０］に記載の分解方法。
［１３］［１］〜［４］のいずれか一項に記載のエステラーゼ又は［９］に記載の酵素剤でポリエステル材料を処理することを特徴とする、ポリエステル材料改質方法。
［１４］［１］〜［４］のいずれか一項に記載のエステラーゼ又は［９］に記載の酵素剤でポリエチレンテレフタレートを処理することを特徴とする、テレフタル酸の製造方法。
［１５］［１４］に記載の製造方法で製造したテレフタル酸を原料として用いることを特徴とする、ポリエチレンテレフタレートの製造方法。
［１６］［１］〜［４］のいずれか一項に記載のエステラーゼ又は［９］に記載の酵素剤でトリアシルグリセロールを処理することを特徴とする、トリアシルグリセロールの分解方法。
［１７］前記トリアシルグリセロールを構成する脂肪酸の炭素数が２〜１６である、［１６］に記載の分解方法。
［１８］油脂とアルコールを混合し、［１］〜［４］のいずれか一項に記載のエステラーゼ又は［９］に記載の酵素剤を用いてエステル交換反応を行うことを特徴とする、バイオディーゼルの製造方法。
［１９］前記アルコールがメタノールである、［１８］に記載の製造方法。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】新規エステラーゼ（LCC）と既知酵素のアミノ酸配列の比較。1JFRAはStreptomyces exfoliatus由来リパーゼの触媒部位の配列（配列番号１０）、YP_288944.1はThermobifida fuscaのクチナーゼ（triacylglycerol lipase）のアミノ酸配列（配列番号１１）、LCCは新規エステラーゼLCCのアミノ酸配列（シグナルペプチドを含む。配列番号２）である。
【図２】SDS-PAGEによるLCCの精製度の比較。精製の各段階で得られたサンプルをSDS-PAGE（12%ポリアクリルアミドゲルを使用）に供した。第１レーンは硫安沈澱後のサンプル（沈澱）、第２レーンはSPセファロース後のサンプル、第３レーンはゲルろ過後のサンプル。
【図３】LCCの基質特異性を示すグラフ。様々な長さのp-ニトロフェニルエステルを使用し、エステラーゼ活性を測定した。
【図４】LCCの活性に対するpHの影響を示すグラフ。p-ニトロフェニルブチレート（C4）を基質として使用し、酵素活性を測定した。2%アセトニトリルをそれぞれ含む10mM酢酸バッファー(pH5.5）（▲）、10mMリン酸バッファー（pH6.0〜7.0）（■）、10mM Tris-HClバッファー（pH7.0〜10.0）（◆）を使用し、30℃で反応させた。
【図５】LCCの活性に対する温度の影響を示すグラフ。p-ニトロフェニルブチレート（C4）を基質として使用した。2%アセトニトリルを含む10mMリン酸バッファー（pH7.0）を用い、各温度での酵素活性を測定した。基質の添加前に3分間、各温度でインキュベートした。
【図６】LCCの耐熱性を示すグラフ。インキュベート時間と残存活性の関係を片対数グラフで表した。10mMリン酸バッファー（pH7.0）中で50℃（●）、60℃（○）、70℃（▲）、80℃（△）の温度条件下、LCCをインキュベートした。所定時間後の各サンプルの酵素活性をp-ニトロフェニルブチレートを基質とし、30℃で酵素活性を測定した。温度条件毎に回帰直線を求めた。
【図７】ポリ-ε-カプロラクトン（PCL）含有プレートを用いた実験の結果。ハロー形成を認める。
【図８】LCCによるPCL分解実験の結果（非分解性PCL率）を示すグラフ。
【図９】LCCによるポリエチレンテレフタレート（PET）分解実験の結果（PETシートの重量の減少）を示すグラフ。
【図１０】LCCによる分解実験の結果。PETシートの1〜2週間における変化を示す。
【図１１】LCCによる分解実験の結果。LCCを作用させなかった場合のPETシートの表面（左）とLCCを作用させた場合のPETシートの表面（右）を示す。
【図１２】LCC及び他の酵素によるPET分解実験の結果（PETシートの重量の減少）を示すグラフ。30℃で各酵素を反応させた。LCCとは対照的に他の酵素では全く分解が見られなかった。
【図１３】LCC及び他の酵素によるPET分解実験の結果（PETシートの重量の減少）を示すグラフ。50℃で各酵素を反応させた。LCCとは対照的に他の酵素では全く分解が見られなかった。
【図１４】LCCのPET分解活性のpH依存性を示すグラフ。pH6.0〜9.0の反応条件で1週間（左）又は2週間（右）、LCCを反応させ、PETシートの重量の減少を測定した。
【図１５】逆相HPLCによるPET分解産物の分離。TPA：テレフタル酸、MHET：モノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタレート
【図１６】LCCによるトリグリセリドの分解実験の結果を示す図。基質（トリグリセリド）溶液に酵素を添加してインキュベートし、反応停止後に上清をキャピラリーガスクロマトグラフィーに供した。基質を省略したサンプルのクロマトグラムを示す。
【図１７】LCCによるトリグリセリドの分解実験の結果を示す図。基質としてトリアセチン（C2）を使用したサンプルのクロマトグラムを示す。
【図１８】LCCによるトリグリセリドの分解実験の結果を示す図。基質としてトリブチリン（C4）を使用したサンプルのクロマトグラムを示す。
【図１９】LCCによるトリグリセリドの分解実験の結果を示す図。基質としてトリカプロイン（C6）を使用したサンプルのクロマトグラムを示す。
【図２０】LCCによるトリグリセリドの分解実験の結果を示す図。基質としてトリカプリリン（C8）を使用したサンプルのクロマトグラムを示す。
【図２１】LCCによるトリグリセリドの分解実験の結果を示す図。基質としてトリカプリン（C10）を使用したサンプルのクロマトグラムを示す。
【図２２】LCCによるトリグリセリドの分解実験の結果を示す図。基質としてトリラウリン（C12）を使用したサンプルのクロマトグラムを示す。
【図２３】LCCによるトリグリセリドの分解実験の結果を示す図。基質としてトリミリスチン（C14）を使用したサンプルのクロマトグラムを示す。
【図２４】LCCによるトリグリセリドの分解実験の結果を示す図。基質としてトリパルミチン（C16）を使用したサンプルのクロマトグラムを示す。
【図２５】LCCによるトリグリセリドの分解実験の結果を示す図。基質としてトリオレイン（C18）を使用したサンプルのクロマトグラムを示す。
【図２６】LCCによるバイオディーゼル（BDF）の合成実験の結果を示す図。油脂とエタノールの混合物に酵素溶液を添加して反応させ、反応停止後に上清をキャピラリーガスクロマトグラフィーに供した。酵素を省略したサンプルのクロマトグラムを示す。
【図２７】LCCによるバイオディーゼル（BDF）の合成実験の結果を示す図。酵素としてLCCを使用したサンプルのクロマトグラムを示す。LCC-MeOH：メタノールを添加しないサンプル、LCC+MeOH：メタノールを添加したサンプル。
【図２８】LCCによるバイオディーゼル（BDF）の合成実験の結果を示す図。酵素としてリパーゼPSを使用したサンプルのクロマトグラムを示す。リパーゼPS-MeOH：メタノールを添加しないサンプル、リパーゼPS+MeOH：メタノールを添加したサンプル。
【図２９】LCCによるバイオディーゼル（BDF）の合成実験の結果を示す図。酵素としてリパーゼAYを使用したサンプルのクロマトグラムを示す。リパーゼAY-MeOH：メタノールを添加しないサンプル、リパーゼAY+MeOH：メタノールを添加したサンプル。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（用語）
本明細書において用語「単離された」は「精製された」と交換可能に使用される。宿主細胞を利用して調製される本発明の酵素（エステラーゼ）に使用する場合の「単離された」とは、宿主細胞に由来する他の成分や培養液等を実質的に含まない状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離された酵素では夾雑成分の含有量は重量換算で全体の約20％未満、好ましくは約10％未満、更に好ましくは約5％未満、より一層好ましくは約1％未満である。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「エステラーゼ」と記載した場合は「単離された状態のエステラーゼ」を意味する。エステラーゼの代わりに使用される用語「本酵素」についても同様である。
【００１０】
DNAについて使用する場合の「単離された」とは、もともと天然に存在しているDNAの場合、典型的には、天然状態において共存するその他の核酸から分離された状態であることをいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列（例えばプロモーター領域の配列やターミネーター配列など）など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。例えばゲノムDNAの場合の「単離された」状態では、好ましくは、天然状態において共存する他のDNA成分を実質的に含まない。一方、cDNA分子など遺伝子工学的手法によって調製されるDNAの場合の「単離された」状態では、好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない。同様に、化学合成によって調製されるDNAの場合の「単離された」状態では、好ましくは、dNTPなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「DNA」と記載した場合には単離された状態のDNAを意味する。
【００１１】
本発明者らは、枝葉コンポスト由来メタゲノムより、クチナーゼ様エステラーゼ遺伝子を単離・同定することに成功した。当該成果に基づき本発明は新規エステラーゼ（以下、「本酵素」とも呼ぶ）及びそれをコードする遺伝子を提供する。
【００１２】
（新規エステラーゼ）
本酵素の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質からなるという特徴を備える。DNA解析及びホモロジー検索の結果、本酵素はクチナーゼ様酵素であると判断された。クチナーゼ（EC 3.1.1.74）は、植物のクチクラを形成する物質であるクチンを分解できる酵素である。T. fusca由来のクチナーゼは難分解性ポリエステルを分解できる酵素として注目されている。後述の実施例に示す通り、本酵素はT. fusca由来のクチナーゼより熱安定性及びpH許容性に優れており、様々な用途での利用、活用が期待される。特に、高温環境下や高塩基性環境下において、従来の酵素より高い酵素活性を発現できる。
【００１３】
ここで、一般に、あるタンパク質のアミノ酸配列の一部に改変を施した場合において改変後のタンパク質が改変前のタンパク質と同等の機能を有することがある。即ちアミノ酸配列の改変がタンパク質の機能に対して実質的な影響を与えず、タンパク質の機能が改変前後において維持されることがある。そこで本発明は他の態様として、配列番号１に示すアミノ酸配列と等価なアミノ酸配列からなり、エステラーゼ活性を有するタンパク質（以下、「等価タンパク質」ともいう）を提供する。ここでの「等価なアミノ酸配列」とは、配列番号１に示すアミノ酸配列と一部で相違するが、当該相違がタンパク質の機能（ここではエステラーゼ活性）に実質的な影響を与えていないアミノ酸配列のことをいう。「エステラーゼ活性」の有無は例えば、p-ニトロフェニルエステルを用いた後述の測定法によって評価できる。エステラーゼ活性の程度は、エステラーゼとしての機能を発揮できる限り特に限定されない。但し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質と同程度又はそれよりも高いことが好ましい。
【００１４】
「アミノ酸配列の一部の相違」とは、典型的には、アミノ酸配列を構成する１〜数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１〜数個のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変異（変化）が生じていることをいう。ここでのアミノ酸配列の相違はエステラーゼ活性が保持される限り許容される（活性の多少の変動があってもよい）。この条件を満たす限りアミノ酸配列が相違する位置は特に限定されず、また複数の位置で相違が生じていてもよい。ここでの「複数」とは例えば全アミノ酸の約30％未満に相当する数であり、好ましくは約20％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約10％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約5％未満に相当する数であり、最も好ましくは約1％未満に相当する数である。即ち等価タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と例えば約70%以上、好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90％以上、より一層好ましくは約95%以上、最も好ましくは約99%以上の同一性を有する。
【００１５】
好ましくは、エステラーゼ活性に必須でないアミノ酸残基において保存的アミノ酸置換を生じさせることによって等価タンパク質を得る。ここで、配列番号１のアミノ酸配列はエステラーゼ、リパーゼによく保存されているGXSXGモチーフ（配列番号１２）を含む。この事実より、配列番号１のアミノ酸との相違をもたらす上記の変異は、当該モチーフ以外の箇所で生じていることが好ましい。尚、ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
【００１６】
「等価タンパク質」が付加的な性質を有していてもよい。かかる性質として、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質に比べて熱安定性やpH許容性に優れているという性質、低温及び／又は高温においてのみ異なる機能を発揮するという性質、至適pHが異なるという性質等が挙げられる。
【００１７】
ところで、二つのアミノ酸配列又は二つの核酸（以下、これらを含む用語として「二つの配列」を使用する）の同一性（％）は例えば以下の手順で決定することができる。まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる（例えば、第一の配列にギャップを導入して第二の配列とのアライメントを最適化してもよい）。第一の配列の特定位置の分子（アミノ酸残基又はヌクレオチド）が、第二の配列における対応する位置の分子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるといえる。二つの配列の同一性は、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり（すなわち、同一性（％）＝同一位置の数／位置の総数 × 100）、好ましくは、アライメントの最適化に要したギャップの数およびサイズも考慮に入れる。
【００１８】
本酵素が、より大きいタンパク質（例えば融合タンパク質）の一部であってもよい。融合タンパク質において付加される配列としては、例えば、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、組み換え生産の際の安定性を確保する付加配列等が挙げられる。
【００１９】
上記アミノ酸配列を有する本酵素は、遺伝子工学的手法によって容易に調製することができる。例えば、本酵素をコードするDNAで適当な宿主細胞（例えば大腸菌や酵母）を形質転換し、形質転換体内で発現されたタンパク質を回収することにより調製することができる。回収されたタンパク質は目的に応じて適宜精製される。このように組換えタンパク質として本酵素を得ることにすれば種々の修飾が可能である。例えば、本酵素をコードするDNAと他の適当なDNAとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本酵素を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはN末端若しくはC末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。
【００２０】
本発明者らによる検討の結果、単離・同定に成功した本酵素の酵素化学的性質を以下の通り決定することに成功した。
【００２１】
（１）作用
本酵素はポリエステル分解活性を有する。後述の実施例に示すように、本酵素は乳化処理後のポリ-ε-カプロラクトン（PCL）を分解可能であり、ポリエチレンテレフタレート（PET）に対しても分解活性を示す。
【００２２】
（２）基質特異性
本酵素は中鎖脂肪酸エステルに対して良好に作用する。ここでの中鎖とは炭素数が4〜8（C4〜C8）をいう。本酵素の基質特異性は、後述の実施例に示す方法（p-ニトロフェニルエステルを基質として用いた測定法）で測定・評価することができる。本酵素は中鎖脂肪酸エステルに対して良好に作用することから、炭素数が2（C2）の短鎖脂肪酸エステルに対する本酵素の活性と中鎖脂肪酸エステルに対する本酵素の活性を比較すると、後者の方が高くなる。また、中鎖脂肪酸エステルに対する本酵素の活性と長鎖脂肪酸エステル（C12〜18）に対する本酵素の活性を比較すると、前者の方が高くなる。
【００２３】
（３）成熟体領域の分子量
本酵素の成熟体領域（シグナルペプチドや、組換えタンパク質として発現させた場合の発現ベクター由来の配列等を含まない）の分子量は27.8kDaである。当該分子量は配列解析ソフトウエアを用いてアミノ酸配列より算出した値である。尚、前駆体（成熟体領域にシグナルペプチドが付加されたもの）の分子量は31.5kDaである。
【００２４】
（３）作用温度
本酵素は30℃〜70℃において高い活性（至適温度での活性を100%としたときに、当該温度範囲内では相対活性が50%以上となる）を示す。至適温度は50℃である。至適温度は、後述の測定法（10mMリン酸緩衝液（pH 7.0)中）による測定で算出された値である。
【００２５】
（４）pH許容性
本酵素はpH 6.5〜9.5という広いpH域で高い活性を示す。即ち、処理に供する酵素溶液のpHがこの範囲内にあれば、最大活性の50%以上の活性を示す。至適pHはpH 8.5である。pH許容性及び至適pHは、例えば、pH 6〜7のpH域については10mMリン酸緩衝液中で、pH 7〜10については10mMトリス塩酸緩衝液中で測定した結果を基に判断される。
【００２６】
（５）熱安定性
本酵素は極めて優れた耐熱性を示す。10mMリン酸緩衝液（pH 7.0）中、70℃の条件で60分間処理しても本酵素は50%以上の活性を維持する。
【００２７】
（新規エステラーゼをコードするDNA）
本発明は本酵素に関連する核酸も提供する。即ち本酵素をコードする遺伝子、本酵素をコードする核酸を同定するためのプローブとして用いることができる核酸、本酵素をコードする核酸を増幅又は突然変異等させるためのプライマーとして用いることができる核酸が提供される。一態様において本発明の遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列をコードするDNAからなる。当該態様の具体例は、配列番号３に示す塩基配列からなるDNAである。本発明の他の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列にペプチド配列が付加された配列（配列番号２）をコードするDNAからなる。当該態様の具体例は、配列番号４に示す塩基配列からなるDNAである。
【００２８】
本酵素をコードする遺伝子は典型的には本酵素の調製に利用される。本酵素をコードする遺伝子を用いた遺伝子工学的調製法によれば、より均質な状態の本酵素を得ることが可能である。また、当該方法は大量の本酵素を調製する場合にも好適な方法といえる。尚、本酵素をコードする遺伝子の用途は本酵素の調製に限られない。例えば、本酵素の作用機構の解明などを目的とした実験用のツールとして、或いは本酵素の変異体（改変体）をデザイン又は作製するためのツールとして、当該核酸を利用することもできる。
【００２９】
本発明において「アミノ酸配列をコードするDNA」とは、それを発現させた場合に当該アミノ酸配列を含む発現産物（タンパク質）が得られるDNA、即ち、当該アミノ酸配列に対応する塩基配列を有するDNAのことをいう。従ってコドンの縮重も考慮される。
【００３０】
本発明の核酸は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって、単離された状態に調製することができる。
【００３１】
本発明の他の態様では、本酵素をコードする遺伝子の塩基配列と比較した場合にそれがコードするタンパク質の機能は同等であるものの一部において塩基配列が相違する核酸（以下、「等価核酸」ともいう。また、等価核酸を規定する塩基配列を「等価塩基配列」ともいう）が提供される。等価核酸の例として、本発明の本酵素をコードする核酸の塩基配列を基準として１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、本酵素に特徴的な酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。塩基の置換や欠失などは複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは、当該核酸がコードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが例えば2〜40塩基、好ましくは2〜20塩基、より好ましくは2〜10塩基である。
【００３２】
以上のような等価核酸は例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやDNAリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）やランダム突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）による変異の導入などによって得られる。また、紫外線照射など他の方法によっても等価核酸を得ることができる。
【００３３】
本発明の他の態様は、本酵素をコードする遺伝子の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸に関する。本発明の更に他の態様は、本発明の本酵素をコードする遺伝子の塩基配列、或いはそれに相補的な塩基配列に対して少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.9%同一な塩基配列を有する核酸を提供する。
【００３４】
本発明の更に別の態様は、本酵素をコードする遺伝子の塩基配列又はその等価塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する核酸に関する。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)やCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアミド、10×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約42℃〜約50℃でインキュベーションし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて約65℃〜約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液として50％ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を挙げることができる。
【００３５】
本発明の更に他の態様は、本酵素をコードする遺伝子の塩基配列、或いはそれに相補的な塩基配列の一部を有する核酸（核酸断片）を提供する。このような核酸断片は、本酵素をコードする遺伝子の塩基配列を有する核酸などを検出、同定、及び／又は増幅することなどに用いることができる。核酸断片は例えば、本酵素をコードする遺伝子の塩基配列において連続するヌクレオチド部分（例えば約10〜約100塩基長、好ましくは約20〜約100塩基長、更に好ましくは約30〜約100塩基長）にハイブリダイズする部分を少なくとも含むように設計される。プローブとして利用される場合には核酸断片を標識化することができる。標識化には例えば、蛍光物質、酵素、放射性同位元素を用いることができる。
【００３６】
本発明のさらに他の局面は、本発明の遺伝子（本酵素をコードする遺伝子）を含む組換えDNAに関する。本発明の組換えDNAは例えばベクターの形態で提供される。本明細書において用語「ベクター」は、それに挿入された核酸を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子をいう。
【００３７】
使用目的（クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。大腸菌を宿主とするベクターとしてはM13ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、pBR322又はその改変体（pB325、pAT153、pUC18など）等、酵母を宿主とするベクターとしてはpYepSec1、pMFa、pYES2等、昆虫細胞を宿主とするベクターとしてはpAc、pVL等、哺乳類細胞を宿主とするベクターとしてはpCDM8、pMT2PC等を例示することができる。
【００３８】
本発明のベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞（宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や、発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には、選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。
【００３９】
本発明の核酸のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えDNA技術（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。
【００４０】
宿主細胞としては、取り扱いの容易さの点から、大腸菌（エシェリシア・コリ）、出芽酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）などの微生物を用いることが好ましいが、組換えDNAが複製可能で且つ本酵素の遺伝子が発現可能な宿主細胞であれば利用可能である。大腸菌の例としてT7系プロモーターを利用する場合は大腸菌BL21(DE3)pLysS、そうでない場合は大腸菌JM109を挙げることができる。また、出芽酵母の例として出芽酵母SHY2、出芽酵母AH22あるいは出芽酵母INVSc1（インビトロジェン社）を挙げることができる。
【００４１】
本発明の他の局面は、本発明の組換えDNAを保有する微生物（即ち形質転換体）に関する。本発明の微生物は、上記本発明のベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって得ることができる。例えば、塩化カルシウム法（ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー(J. Mol. Biol.)、第53巻、第159頁 (1970)）、ハナハン（Hanahan）法（ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー、第166巻、第557頁 (1983)）、SEM法（ジーン（Gene)、第96巻、第23頁(1990)〕、チャング（Chung）らの方法（プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ USA、第86巻、第2172頁(1989)）、リン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション(Potter,H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))、リポフェクション(Felgner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413-7417(1984))等によって実施することができる。尚、本発明の微生物は本酵素の生産に利用できる。
【００４２】
（新規エステラーゼの製造法）
本発明の更なる局面は本酵素（エステラーゼ）の製造法を提供する。本発明の製造法では上記の形質転換体を用いて本酵素を製造する。この製造法ではまず、それに導入された遺伝子によってコードされるタンパク質が産生される条件下で上記の形質転換体を培養する（ステップ（１））。様々なベクター宿主系に関して形質転換体の培養条件が公知であり、当業者であれば適切な培養条件を容易に設定することができる。培養ステップに続き、産生されたタンパク質（即ち、エステラーゼ）を回収する（ステップ（２））。培養液又は菌体よりエステラーゼが回収される。培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過（例えば珪藻土をろ過助剤としたろ過）、遠心処理等することによって不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて分離、精製を行うことにより目的の酵素を得ることができる。他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理、ビーズ処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより目的の酵素を得ることができる。ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。尚、各精製工程では原則としてエステラーゼ活性を指標として分画を行い、次のステップへと進む。但し、予備試験などによって、適切な条件を既に設定可能な場合にはこの限りでない。回収及びその後の精製については、上記態様の場合と同様に行えばよい。
【００４３】
酵素の精製度は特に限定されない。また、最終的な形態は液体状であっても固体状（粉体状を含む）であってもよい。
【００４４】
（酵素剤）
本酵素は例えば酵素剤の形態で提供される。酵素剤は、有効成分（本発明の酵素）の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としてはデンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、D-グルコース、ソルビトール、D-マンニトール、白糖、グリセロール等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはエタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
【００４５】
本酵素剤の一態様は、本酵素に加えて、別の酵素を有効成分として含有する。これによって、複合的な酵素反応が可能な酵素組成物となる。当該「別の酵素」として、リパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ等が挙げられる。尚、「別の酵素」として二種類以上の酵素を採用してもよい。
【００４６】
（新規エステラーゼの用途）
本発明の更なる局面は本酵素又は本酵素剤の用途を提供する。本酵素及び本酵素剤は様々な用途で利用可能である。本発明が提供する用途の一つはポリエステルの分解である。即ち、本酵素又は本酵素剤でポリエステルを処理することを特徴とするポリエステル分解方法を提供する。分解対象物となり得るポリエステルは特に限定されない。例えば、生分解性プラスチック（ポリ-ε-カプロラクトン（PCL）、ポリL-乳酸（PLA）、ポリブチレンサクシネート（PBS）、ポリエチレンサクシネート（PES）、ポリエチレンアジペート（PEA）、ポリブチレンサクシネート・アジペート重合体（PBSA））を本酵素又は本酵素剤による処理に供することができる。その他、ポリエチレンテレフタレート（PET）の処理にも本酵素又は本酵素剤は適用可能である。処理方法としては、例えば、反応容器（処理タンクなど）内に用意した分解対象物（予め細断や粉砕などを施しておくと良い）に対して本酵素又は本酵素剤を添加し、反応させる。或いは、戸外又は屋内に堆積させたり、地中に埋設した分解対象に対して本酵素又は本酵素剤を添加し、反応させることにしてもよい。本酵素又は本酵素剤による処理に先立って、分解対象物を液状にしておくことにしてもよい（例えば、界面活性剤等を用いて乳化させたポリエステルを本酵素又は本酵素剤で処理する）。
【００４７】
処理条件は、本酵素の作用が発揮される限り特に限定されない。上記の通り、本酵素は作用温度域及び作用pH域が共に広いことから、処理対象に応じて適切な処理条件を設定し易い。処理時の温度条件の例として30℃〜70℃、pH条件の例としてpH 6.5〜9.5を挙げることができる。
【００４８】
本酵素又は本酵素剤でポリエチレンテレフタレート（PET）を処理すると、テレフタル酸（TPA）を得ることができる。そこで本発明は、本酵素又は本酵素剤でPETを処理することを特徴とする、TPAの製造方法も提供する。当該方法で製造したTPAは、従来の方法で製造したTPAと同様に、例えばPETの原料として使用可能である。そこで本発明は更に、本発明の製造方法で製造したPTAを原料として用いることを特徴とする、PETの製造方法も提供する。製造工程や製造条件等は従来のPETの製造方法に準ずればよい。例えば、本発明の製造方法で製造したPTAとエチレングリコールを重縮合させることによってPETを得る。
【００４９】
本酵素又は本酵素剤をトリアシルグリセロール（トリグリセリド）の分解に利用することもできる。即ち、本発明は、本酵素又は本酵素剤でトリアシルグリセロールを処理することを特徴とする、トリアシルグリセロールの分解方法も提供する。様々な分子種のトリアシルグリセロールに本発明を適用可能であるが、好ましくは、構成脂肪酸の炭素数が２〜１６のトリアシルグリセロールを処理対象とする。構成脂肪酸は飽和脂肪酸であっても不飽和脂肪酸であってもよい。構成脂肪酸の例を挙げれば、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸である。
【００５０】
本酵素及び本酵素剤をポリエステル含有繊維、ポリエステル含有織物、ポリエステル樹脂（例えば自動車用樹脂製品、建材、家庭用樹脂製品、文具等の材料）などのポリエステル材料の改質に利用することもできる。ここでの「改質」は例えば、手触り（肌触り）の改良、柔軟性の改良、空気透過性の改良、水透過性の改良、色沈着性の改良、保湿性の改良、発散性ないし発汗性の改良、保温性の改良である。
【００５１】
本発明の分解方法又は改質方法で処理する材料は必要に応じて前処理に供される。前処理の例は破砕、粉砕、蒸煮、熱処理、各種処理剤（アルカリ、有機溶媒、含水有機溶媒、二酸化硫黄など）による化学的処理、酵素処理である。
【００５２】
本酵素及び本酵素剤はバイオディーゼルの製造にも適用可能である。バイオディーゼルとは、トリアシルグリセロールとアルコールとのエステル変換反応で生ずる脂肪酸アルキルエステルのことであり、近年、グリーンエネルギーとしてバイオエタノールとともに注目されている。
【００５３】
本酵素又は本酵素剤をバイオディーゼルの製造に適用する場合、油脂（トリアシルグリセロール）とアルコールを混合し、本酵素又は本酵素剤を用いてエステル交換反応を行う。様々な油脂を原料として採用することが可能である。油脂の例を挙げれば、菜種油、大豆油、パーム油、オリーブ油、サフラワー油、コメ油、ヤシ油、ナンヨウアブラギリ油、魚油、豚脂、牛脂、廃食用油である。アルコールとしては、好ましくはメタノールを用いる。メタノールを用いた場合、油脂のメチルエステル化が生じ、脂肪酸メチルエステルが生ずる。エステル交換反応後は、常法に従い精製すればよい。精製方法の典型例（脂肪酸メチルエステルを精製する例）を示すと次の通りである。まず、エステル交換反応後の反応液に適当な酸を添加して中和させ、脂肪酸メチルエステルとグリセリンを分離させる。続いて、分離した脂肪酸メチルエステルを水洗した後、蒸留処理に供してメタノールを除去する。
【実施例】
【００５４】
１．新規油脂分解酵素の探索
大阪府吹田市万博記念公園では、園内で発生する植物残材を園内で有効活用する「植物残材ゼロミッション」という取り組みが行われており、その一環としてコンポスト（堆肥）化事業が行われている。本事業では、園内で剪定や伐採により発生した幹や枝葉を粉砕したもの（ウッドチップ）に尿素を添加して、屋外の堆肥化ヤードに積み上げ、水分調整や切り返しなどの処理を行いながら自然に発生する微生物による分解や発酵を促進させて堆肥化させている。この堆肥化過程で、積み上げられたウッドチップ内部の温度は発酵熱で最高８０℃に達する。そのため、本コンポストは多種多様な高熱性微生物の宝庫であると考えられる。また、本コンポストは、油脂分解酵素の基質となる植物性油脂や天然樹脂ポリマーなどが多く含まれるため、それらに基質特異性を示す油脂分解酵素の取得が期待できる。本発明者らは本コンポストを採集し、-70℃で冷凍保存した。そのうち、発酵時の温度67℃、pH 6.0で4ヶ月間発酵させた枝葉コンポストをメタゲノム調製試料として用いた。【００５５】
（１）方法
メタゲノムDNAの抽出にはISOIL Large Beads Kit (株式会社ニッポンジーン、日本)を用いた。実験操作は添付の実験プロトコールに従った。コンポスト2.5 gを溶解用試薬（Lysis solution HE）によく懸濁し、65℃で1時間、時々混ぜながらインキュベートした。上清を別のチューブにとり、12000×gで1分遠心分離した。上清に精製用試薬（Purification solution）を加えた後、更にCHCl3を加え、15秒間よく攪拌した。12000×gで15分間遠心分離した後、水層を別のチューブに移し、沈澱用試薬（precipitation solution）を加え混ぜた。20000×gで15間遠心分離した後、上清を捨てた。洗浄用試薬（Wash solution）を加えて良く攪拌した後、20000×gで10分間遠心分離した。その後、70% エタノールとethachinmateを加えて良く攪拌し、20000×gで5分間遠心分離した。上清を捨てて風乾し、TE（pH 8.0）に再溶解した。【００５６】
Fosimid library production kit(Epicentre, Madison, WI)を用いてメタゲノムDNAライブラリーの構築を行った。コンポストから抽出したメタゲノムDNAを、マイクロピペットチップを用いてシェアリングにより目的サイズまで切断した。得られたメタゲノムDNA断片の末端を平滑化するため、End-repair反応を行った。End-repair反応は、End-repair反応液（10×End-Repair B, 2.5 mM dNTPmix, 10 mM ATP, End-Repair Ez mix）に2.6μgのメタゲノムDNA断片を混ぜ、室温で45分間反応を行い、70℃で10分間加熱してEnd-Repair Ez mix に含まれるT4 DNAポリメラーゼ及びT4 DNAキナーゼを失活させた。その後、低融点アガロースゲル（low melting point agarose gel）電気泳動を50V, 8時間行い、25 kb以下のDNAを含まないように、コントロールDNA (36 kb)と同程度の移動度の切断（sheared）DNAのバンドを切り取り回収した。続いて、キットに含まれているライブラリー構築用ベクターpCC1Fosと混ぜてライゲーションを行った。ライゲーション反応は、反応液（10xF-link ligation B,10 mM ATP, 0.5 μg/μl pCC1Fos、回収切断DNA）にFast-link DNAリガーゼを加えて室温で2時間反応を行い、70℃で10分間の加熱で酵素を失活させた。その後、Lambda Packaging Extractsを用いてEP1300 E.coliに感染させた。パッケージング反応は、上記ライゲーション溶液に解凍したpackaging extractを1/2量加え、泡を作らないようにそうっと混ぜたのち、30℃で90分間静置した。さらに残りのPackaging Extractを加えて、30℃で90分間静置した。これに、ファージ希釈バッファー(10 mM TrisHCl (pH 8.3), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2)とCHCl3を順に加えて、氷中に置いた。得られたパッケージング産物にEP1300 E.coli (OD600 = 0.8 - 1.0, LB + 10 mM MgSO4)に加えて、37℃で20分間置き、クロラムフェニコール(12.5 microg/ml)を含むLBプレートにスプレッドした。【００５７】
油脂分解活性のあるクローンの検出にはトリブチリン含有プレートを用いた(Mizuguchi S et. al. (1999). “Identification of the gene encoding esterase, a homolog of Hormone-Sensitive Lipase, from an oil-degrading bacterium,stain HD-1.” J.Biochem.126: 731-737)。次の手順でトリブチリン含有プレートを調製した。まず、0.1 % Tween 80、1%トリブチリン（tributyrin）1×LBブロス、1.5%アガ―を混ぜてオートクレーブした。オートクレーブ後、60℃の温水中、超音波処理を30分行い、均一にした  後、アラビノースとクロラムフェにコールを加えてプレートに注いだ。このようにして調製したトリブチリン含有プレートを用い、リパーゼ/エステラーゼ活性を指標にスクリーニングを行ない、ハロー提示クローン（油脂分解酵素遺伝子をコードしたフォスミドクローン）を単離した。【００５８】
油脂分解酵素遺伝子のORF（オープン・リーディング・フレーム）配列はEZ::TN<KAN-2> (Epicentre, Madison, WI)を用いてin vitroトランスポゾン変異法により決定した。0.2μgの油脂分解酵素遺伝子をコードしたフォスミドクローンを反応液（6×10-3 pmolトランスポゾン、Ez-Tn5 10×B）に加えた後、トランスポザーゼを加え2時間37℃でインキュベートした。トランスポザーゼを失活させるため、停止試薬を加えた後、10分間70℃でインキュベートした。反応液に100%エタノールを加え、15分間、-30℃でインキュベートした後、15分間、15000 rpm、4℃で遠心分離し、上清を捨てた。その後、70%エタノールを加え、5分間、15000rpm、4℃で遠心分離した後、上清を捨てた。得られたトランスポゾン変異フォスミドクローンを用いてEPI300T1E.coli細胞を形質転換した。0.005%カナマイシンと0.01%アラビノースを含むLBT-プレート(LBブロス,1%トリブチリン, 0.1%Tween80, 1.5%寒天)上にスプレッドした。【００５９】
ホモロジーサーチはBLASTX解析によって行い、他のリパーゼとエステラーゼのシークエンスの比較はNCBI Entrez server (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)を利用して検索した。マルチプルアライメント及び進化系統樹の作成はCLUSTALW (http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html)を利用し (TYPE: protein, ARIGN: on, TREE: (DISTANCE: kimura, TOOSGAPS: on, OUTPUTTREE: phylip)  BOOTSTRAP (DISTANCE: kimura, TOSGAPS: on, OUTPUTTREE: phylip, COUNT 100, SEED 111) )に設定した。系統樹描画ツールはTree viewを用いた。ドメイン解析はSMART (http://smart.embl.de/)を利用した。【００６０】
目的の遺伝子（LCC遺伝子）はフォスミドDNAからPCRで増幅した。LCCのN末端側にコードされているシグナル配列を利用して発現するために合成したプライマー配列はLip 6-for 5’-GAGTTTCATATGGACGGAGTTCTC-3’（配列番号５）(下線部はNde I)とLip 6-rev 5’-CAGGATCCACTACTGGCAG TGGCG-3’（配列番号６）(下線部はBam HI)である。PCRはKOD+ポリメラーゼ(東洋紡、日本)を用いて、30サイクルでアニーリング反応を温度50℃、30秒で行い、伸長反応を74℃、60分で行った。PCR産物をpUC19のSma Iサイトに導入し、E.coli JM109を形質転換した。得られたリコンビナントプラスミドをシークエンシングによってLCC配列が挿入されていることを確認した。LCC配列の挿入が確認できたプラスミドからNde I及びBamH IによってLCC配列を切り出し、pET25bのNde I-BamH Iサイトに導入した後、E.coli JM109を形質転換した。LCCの挿入が確認されたプラスミドでE.coli BL21(DE3)を形質転換した。【００６１】
LCCのN末端側にコードされているシグナル配列を削り、pET25bのpelBリーダーの下流にLCC遺伝子を挿入するために合成したプライマー配列は、LCC-for (5’-GCGTCGCCATGGATTCCAACCCGTACCAG -3’ （配列番号７）(下線部はNco I))とLCC-rev (5’-CAGGATCCACTA CTGGCAGTGGCG-3’ （配列番号８）(下線部はBamH I))であり、北海道システムサイエンス社に受注して合成した。PCRはKOD+ポリメラーゼ(東洋紡、日本)を用いて、30サイクルでアニーリング反応を温度64℃、30分で行い、伸長反応を74℃、60分で行った。得られたPCR産物をクローニングベクターpUC19のSma I部位に挿入し他後、E.coli JM109を形質転換し、シークエンシングによってLCC遺伝子配列を確認した。LCC遺伝子配列が確認できたプラスミドをNco IとBamH Iで切断し、発現ベクターpET25bのpelBリーダー下流のNco I-BamH I部位に挿入した後、E.coli JM109を形質転換した。LCC遺伝子が挿入されていることが確認できたプラスミドでE.coli BL21 codon+ (DE3)を形質転換した。【００６２】
pET25b-LCCを保有するE.coli BL21codon+(DE3)は50 mg/lアンピシリンを添加したLB培地で37℃、200 rpmで培養した。培養液がOD600 1.0に達した時点で1 mM イソプロピルβ-D-チオガラクトシド（IPTG）を添加しLCCを誘導した。IPTGで誘導後一晩培養した培養上清を集めるために、遠心分離を行った（8,000×g,30分,4℃)。培養上清に70% (NH4)2SO4を加え、硫安沈殿を行った。沈殿したタンパク質を集めるため、遠心分離を行い(8,000×g,30分, 4℃)、バッファーA(10 mM Tris-HCl (pH7.0) , 1 mM EDTA, 1 mM DTT)に再懸濁した後、バッファーAにより、4℃で一晩透析を行った。透析後のサンプルをSP-セファロースカラムクロマトグラフィーでNaCl濃度を0 Mから1 Mまで0.2 Mごとに段階的にあげてバッファーAにより溶出した。12 % SDS-PAGEでLCCのバンドが確認されたフラクションを集め、ゲルろ過クロマトグラフィー((Superdex 200) (Pharmacia Biotech, Piscatawzy, NJ, USA)) を行った。溶出速度は0.5 ml/分でバッファー(10 mM Tris-HCl (pH7.0), 1 mM EDTA, 1 mM DTT, NaCl 0.2 M) により溶出した。12 % SDS-PAGEでLCCのバンドが確認されたフラクションを集め、限外ろ過（Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Devices 10K (Millipore, USA)）によって濃縮した後、4℃で保存した。【００６３】
エステラーゼ活性測定は基質としてpニトロフェニルブチレート(p-NPB)(SIGMA,USA)を用いて行った。酵素活性の1ユニットは1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを生成する酵素量と定義した。サンプルと1 mM p-NPBをバッファー(2 % アセトニトリル、10 mMリン酸緩衝液(pH 7.0))に加え30℃で酵素活性を測定した。p-ニトロフェノールの生成量を調べるため、U-2810形分光光度計（日立製作所、日本）を使用し、405 nmの吸収を測定した（参考文献：Mizuguchi, S., Amada, K., Haruki, M., Imanaka, T., Morikawa, M., Kanaya, S., 1999. Identification of the Gene Encoding Esterase, a Homolog of Hormone-Sensitive Lipase, from an Oil-Degrading Bacterium, Strain HD-1. Journal of Biochemistry 126, 731-737.）。p-ニトロフェノールの量は吸光度405 nmにおける分子吸光定数18,600M-1・cm-1により算出した。【００６４】
p-ニトロフェニルエステルに対する基質特異性を調べるため、2 mM p-ニトロフェニルアセテート(C2) (SIGMA,USA)、p-ニトロフェニルブチレート(C4)、p-ニトロフェニルカプロエート(C6)、p-ニトロフェニルカプリレート(C8)、p-ニトロフェニルラウレート(C12)、p-ニトロフェニルミリステート(C14)、p-ニトロフェニルパルミテート(C16)、p-ニトロフェニルステアレート(C18)を基質として用い、バッファー(10 mMリン酸緩衝液(pH7.8)、10 % TritonX-100)中でインキュベート（37℃）した。酵素活性の1ユニットは1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを生成する酵素量と定義した。p-ニトロフェノールの生成量を調べるため、U-2810形分光光度計（日立製作所、日本）を使用し、405 nmの吸収を測定した（参考文献：Amada, K., Haruki, M., Imanaka, T., Morikawa, M., Kanaya, S., 2000. Overproduction in Escherichia coli, purification and characterization of a family I.3 lipase from Pseudomonas sp. MIS38. Biochimica et Biophysica Acta 1478, 201-210.）。【００６５】
ポリ-ε-カプロラクトンに対する基質特異性は、ポリ-ε-カプロラクトン含有プレートで検出した。ポリ-ε-カプロラクトン含有プレートを作製するため、最終濃度1 % ポリ-ε-カプロラクトン（和光純薬工業、日本）、0.01 % Tween 80をジクロロメタンに加えエマルジョン化し、10 mMリン酸緩衝液(pH 7.0)でメスアップした。その後、1.5 %寒天を加えた。ポリ-ε-カプロラクトン含有プレート上に100 ngのLCCを添加して50℃で一晩インキュベートし、ハロー形成を調べた（参考文献：Nishida, H., Tokiwa, Y., 1993. Distribution of Poly(β-hydroxybutyrate) and Poly(ε-caprolactone) Aerobic Degrading Microorganisms in Different Environments. Journal of Environmental Polymer Degradation 1, 227-233.）。【００６６】
酵素活性の至適温度を調べるため、20℃から80℃までの各温度について、1 mM p-ニトロフェニルブチレートをバッファー( 10 mM Tris-HCl (pH7.0), 2 % アセトニトリル)に加えた基質反応液に20 ngのLCC（サンプル）を加え、3分間インキュベートして酵素活性を測定した。酵素活性の1ユニットは1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを生成する酵素量と定義した。p-ニトロフェノールの生成量を調べるため、U-2810形分光光度計（日立製作所、日本）を使用し、405 nmの吸収を測定した（参考文献：Kleeberg, I., Welzel, K., VandenHeuvel J.,Muller, R. J., Decker, W. D. 2005. Characterization of a New Extracellular Hydrolase from Thermobifida fusca Degrading Aliphatic-Aromatic Copolymers. Biomacromolecules 6, 262-270.）。【００６７】
酵素活性の至適pHを調べるため、pH 5.5からpH 9.5までの範囲について、1 mM p-ニトロフェニルブチレート、10 mM 各バッファー、2 % アセトニトリルからなる基質反応液に20 ngのLCC（サンプル）を加え、30℃で3分間インキュベートして酵素活性を測定した。バッファーについては、pH 5.5は酢酸緩衝液、pH 6.0からpH 7.0まではリン酸緩衝液、pH 7.0からpH 9.5まではTris-HCl緩衝液を使用した。酵素活性の1ユニットは1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを生成する酵素量と定義した。p-ニトロフェノールの生成量はU-2810形分光光度計（日立製作所、日本）を使って、348 nmの吸収を測定した（参考文献：Mizuguchi, S., Amada, K., Haruki, M., Imanaka, T., Morikawa, M., Kanaya, S., 1999. Identification of the Gene Encoding Esterase, a Homolog of Hormone-Sensitive Lipase, from an Oil-Degrading Bacterium, Strain HD-1. Journal of Biochemistry 126, 731-737.）。【００６８】
熱安定性は、50℃、60℃、70℃、80℃において所定時間、20ngのLCCを10 mM リン酸緩衝液（pH 7.0）中でインキュベートし、残存活性を測定した。残存活性は、基質としてp-ニトロフェニルブチレートを用い、30℃で測定した。酵素活性の1ユニットは1分間に1 μmol p-ニトロフェノールを生産する酵素量と定義した。p-ニトロフェノールの生成量を調べるため、U-2810形分光光度計（日立製作所、日本）を使用し、405 nmの吸収を測定した（参考文献：Mizuguchi, S., Amada, K., Haruki, M., Imanaka, T., Morikawa, M., Kanaya, S., 1999. Identification of the Gene Encoding Esterase, a Homolog of Hormone-Sensitive Lipase, from an Oil-Degrading Bacterium, Strain HD-1. Journal of Biochemistry 126, 731-737.）。【００６９】
（２）結果
メタゲノムライブラリーを構築し、酵素活性を用いたスクリーニングを行った結果、新規クチナーゼ様エステラーゼ（leaf-branch compost cutinase homologue:LCC）をメタゲノムから単離することに成功した。DNA配列を決定した結果、LCC遺伝子は882bp（配列番号４）からなることがわかった。また、本遺伝子を翻訳した結果、LCCは293アミノ酸残基（配列番号２）からなることがわかった。LCCの分子量は前駆体31.5kDa、成熟型（シグナルペプチドを除いたもの）27.8kDa（DNA・protein解析ソフトDNASIS（登録商標）にアミノ酸配列を入力して分子量を算出した）であった。N末端の35アミノ酸残基（配列番号９）はシグナルペプチド配列であり、成熟型のLCCは258アミノ酸残基（配列番号１）からなる。アミノ酸配列のアライメント比較より、LCCはT. fusca由来のクチナーゼ（図１のYP_288944.1、配列番号１１）と約60%の同一性を有し、エステラーゼ／リパーゼによく保存されているGXSXGモチーフ（配列番号１２）を保存していることがわかった（図１）。また、エステラーゼ／リパーゼが属するセリン加水分解酵素ファミリータンパク質の触媒トライアドを形成するGXSXGモチーフ中のセリン、アスパラギン酸、ヒスチジンがS.exfoliatusの触媒トリアッドであるセリン、アスパラギン酸、ヒスチジンの位置と一致した。【００７０】
発現ベクターを構築して発現させた後、精製（硫安分画、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー）したLCC蛋白質のSDS-PAGEの結果を図２に示す。また、LCCの基質特異性を調べた結果を図３に、活性のpH依存性を調べた結果を図４に、至適温度を調べた結果を図５に、熱安定性を調べた結果を図６に示す。LCCは中鎖脂肪酸エステル（C4〜C8）に対して高い活性を示した（図３）。また、pH6.5〜9.5という広範なpH域で高い活性を示した（図４）。一方、30℃〜70℃の温度範囲で比較的安定した活性を示し、至適温度は50℃であった。また、極めて熱安定性に優れ、70℃、60分間の熱処理後も50%以上の活性を維持した。ポリ-ε-カプロラクトン含有プレートを用いた実験の結果、ハローの形成を認め（図７）、LCCがポリ-ε-カプロラクトン分解活性を示すことが確認された。【００７１】
精製したLCCのN末端アミノ酸配列分析を行ったところ、シグナルペプチドの切断位置が、ドメイン予測用ソフトやアライメント比較に基づき予測した位置ではなく、発現ベクター由来のpelBリーダー配列内にあることが判明した。実際に発現・精製された酵素タンパク質（配列番号１３）はpelBリーダー配列の後半部分QPAMAとリンカー(MD)を含むことになり、その分子量は28.5 kDaになる（DNASIS（登録商標）で算出）。尚、当該酵素タンパク質の等電点（pI）は9.3であった。【００７２】
以上の通り、枝葉コンポスト由来メタゲノムを利用することにより、新規エステラーゼ及びその遺伝子を単離・同定することに成功した。当該エステラーゼの特性を検討した結果、優れた熱安定性及びpH耐性を示すことが確認された。【００７３】
２．新規クチナーゼ様エステラーゼ（LCC）のポリエステル分解活性
LCCのポリエステル分解能を評価するため、ポリεカプロラクタン（PCL）及びポリエチレンテレフタレート（PET）を用いた分解実験を行った。【００７４】
２−１．PCLの分解
Masakiらの文献（Kazuo Masaki, Numbi Ramudu Kamini, Hiroko Ikeda, and Haruyuki Iefuji Cutinase-Like Enzyme from the Yeast Cryptococcus sp. Strain S-2 Hydrolyzes Polylactic Acid and Other Biodegradable Plastics. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY 2005, 71, 7548-7550）を参考にし、界面活性剤（プライサーフA212CシュッカNO.62K811 LOT NO.6713C6又はプライサーフA215CシュッカNO.62K811 LOT NO.6711D1、第一工業製薬株式会社製）を用いてPCLを乳化させた後、LCCによる分解を行った。20 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 ml中、0.4 mg乳化PCLとLCC(1mg/ml) 50μlを加え、50℃で反応させ、5秒毎に660nmの吸光度（A660）を測定した。図８に示す通り、LCCによる迅速且つ効率的なPCLの分解を認めた。【００７５】
２−２．PETの分解１
PETシートを23〜28 mgの重さになるように角切りし、1mg/ml LCCを含む1 mlの100 mM Tris-HCl(pH 8.0)にひたし、50℃の恒温槽に入れ、50rpmで1〜2週間振盪し、重量の減少を測定した。表１及び図９〜１１に示す通り、1週間で約19%、2週間で約37%の重量の減少を認め、LCCがPETに対して高い分解活性を示すことが示された。
【表１】
2012099018.tif 000002
【００７６】
２−３．PETの分解２
LCCによるPETの分解能を他の酵素と比較した。PETシートを25〜50 mgの重さになるように角切りし、各種酵素を含む1 mlの100 mM Tris-HCl(pH 8.0)にひたし、30℃又は50℃の恒温槽に入れ、50rpmで1〜2週間振盪し、重量の減少を測定した。使用した酵素は次の通りである。
LCC（5μg/ml）
大腸菌由来エステラーゼ（Kanaya, S., Koyanagi, T., and Kanaya, E. (1998) Biochem. J. 332, 75-80.）（50μg/ml）
市販のリパーゼ（リパーゼAY（天野エンザイム株式会社）、リパーゼPS（天野エンザイム株式会社）（50μg/ml）【００７７】
表２（30℃で反応）及び表３（50℃で反応）並びに図１２〜１３に示す通り、LCCを使用した場合、30℃の反応温度で約4〜約12%、50℃の反応温度で約20〜約36％の重量の減少を認めた。対照的に、他の酵素を使用した場合には重量の減少は全く認められなかった。このように、PETに対する分解活性はLCCに特異的であることが判明した。
【表２】
2012099018.tif 000003
【００７８】
【表３】
2012099018.tif 000004
【００７９】
２−４．LCCのPET分解活性のpH依存性
PETシートを25〜50 mgの重さになるように角切りし、5μg/ml LCCを含む1 mlの100 mM Tris-HCl(pH 7.0、8.0、9.0)又はリン酸バッファー（pH6.0）にひたし、50℃の恒温槽に入れ、50rpmで1〜2週間振盪し、重量の減少を測定した。表４及び図１４に示す通り、pH9.0で最大の分解活性（約30〜54%の分解）を示した。
【表４】
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【００８０】
３．新規クチナーゼ様エステラーゼ（LCC）によるPETの分解
LCCのPET分解能を検証した。PETシートを25〜50 mgの重さになるように角切りし、5μg/ml LCCを含む1 mlの100 mM Tris-HCl(pH 8.0)にひたし、50℃の恒温槽に入れ、24時間インキュベートした。反応後の溶液15μlをHPLCクロマトグラフィーに供した。株式会社日立ハイテクノロジーズ社製のHPLC装置（Hitachi Elite Lachrom L-2130ポンプ、L-2420 UV-VIS 検出器、Chromato-Integrator D-2500）を用いた。カラムには逆相カラムCosmosil 5C18-AR-II 150 mm × 4.6 mm（ナカライテスク株式会社）を使用した。アセトニトリル（B）と0.25%トリフルオロ酢酸溶液(A)のリニアグラージェント（A 90%、B 10%からA 60%、B 40%（15分後））で分離した。フローレートは1 ml/分、検出波長は241 nmとした。【００８１】
キャリブレーション用の標準試薬として、100 mM Tris-HCl (pH 8.0)に溶解したテレフタル酸(TPA)とビス(2-ヒロドキシエチル)テレフタレート(BHET) (東京化成工業株式会社）を使用した。TPAについて、20 μg/mlまでの線形キャリブレーションカーブが得られた。一方、BHETの保持時間については、BHETの一部が加水分解してモノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタレート(MHET)が生ずること等の理由から、評価が困難であった。【００８２】
HPLCクロマトグラフィーの結果、テレフタル酸（保持時間(rt) 9.05）及びMHET（保持時間(rt) 12.26）が検出された（図１５）。この結果より、LCCによるPETの分解によってテレフタル酸が生ずること、言い換えれば、PETからのテレフタル酸の製造にLCCが有用であることが確認された。【００８３】
４．新規クチナーゼ様エステラーゼ（LCC）によるトリグリセリドの分解
LCCを50 mM リン酸緩衝液（pH 7.0）で透析した後、1.0 mg/mLとなるように調製した。基質となるトリグリセリドとして、トリアセチン（C2；東京化成工業）、トリブチリン（C4；SIGMA）、トリカプロイン（C6；東京化成工業）、トリカプリリン（C8；SIGMA）、トリカプリン（C10；東京化成工業）、トリラウリン（C12；東京化成工業）、トリミリスチン（C14；東京化成工業）、トリパルミチン（C16；和光純薬工業）、トリオレイン（C18；SIGMA）を用い、濃度が1% (w/v)となるように50 mM リン酸緩衝液（pH 7.0）、1% (v/v) Triton X-100（SIGMA）で溶解した。【００８４】
調製した基質溶液450 μLを37℃で10分間プレインキュベートした後、50 μLの酵素液（1.0 mg/mL）を添加し、さらに40分間インキュベートした。50 μLの1.1 N 塩酸を添加することで反応を停止した後、さらに2 mLのジエチルエーテルを添加し、ボルテックスにて30秒間撹拌した。15,000 rpmで3分間遠心し、上清1 mLをバイアルチューブ（Agilent）に移した。得られた上清を用いて、キャピラリーガスクロマトグラムにより分析を行った。各サンプルから1.0 μLの試料を取り、DB-1701キャピラリーカラム（0.25 mm × 15 m；J&W Scientific、Forson、CA）によるガスクロマトグラム（GC-17A；島津製）にて反応物中の遊離脂肪酸の有無を解析した。インジェクターおよびディテクターの温度はそれぞれ300℃、カラム温度は60℃で3分間保持した後、300℃まで10℃/分の条件で昇温し、それ以降300℃で4分間保持した。【００８５】
各クロマトグラム（図１６〜図２５）において、酵素反応によって生成された遊離脂肪酸の位置を矢印で示した。図１７〜図２４に示す通り、各トリグリセリドのうちC2〜C16のものについては分解能を示すことが分かった。【００８６】
５．新規クチナーゼ様エステラーゼ（LCC）によるバイオディーゼル（BDF）の合成
LCCを50 mM リン酸緩衝液（pH 7.0）で透析した。透析後のLCC、リパーゼ PS（天野エンザイム株式会社）、リパーゼ AY（天野エンザイム株式会社）を用い、p-ニトロフェニルラウリン酸（SIGMA）を基質とした分光光度法によりリパーゼ活性を測定した。標準的な活性測定法のもと、37℃の温度条件下で1分間に1 μmolのp-ニトロフェノールを生成する酵素量を1 Unitとした。【００８７】
上述のLCC、リパーゼ PS、リパーゼ AYを用い、油脂とメタノールを反応させて油脂のメチルエステル化を行った。油脂はトリラウリン（C12；東京化成工業）を用いた。トリラウリンとメタノール（和光純薬工業）0.5 g/25 μL (mol/mol = 1/1)の混合物を初期基質とし、これに500 U/mLの各酵素液を50 μL加えて反応混合物とし、46℃、24時間、スターラーで撹拌しながら反応を行った。メチルエステル化の起こらないネガティブコントロールとして、メタノールを添加していないサンプルを用意し、同様に反応を行った。24時間後、55 μLの1.1 N 塩酸（和光純薬工業）を添加することで反応を停止した後、さらに2 mLのクロロホルム（和光純薬工業）を添加し、ボルテックスにて30秒間撹拌した。15,000 rpmで3分間遠心し、下層の溶液1 mLをバイアルチューブ（Agilent）に移した。得られた上清を用いて、キャピラリーガスクロマトグラムにより分析を行った。【００８８】
トリラウリン分解能の確認については、各サンプルから1.0 μLの試料を取り、DB-1HTキャピラリーカラム（0.25 mm × 15 m；Agilent J&W）によるガスクロマトグラム（GC-17A；島津製）にて反応液中のトリラウリン量の減少を解析した。インジェクターおよびディテクターの温度はそれぞれ380℃、カラム温度は120℃で3分間保持した後、220℃まで15℃/分の条件で昇温し、220℃で1分間保持した。それ以降、370℃まで20℃/分の条件で昇温し、370℃で3分間保持した。【００８９】
ラウリン酸のメチルエステル化能の確認については、各サンプルから1.0 μLの試料を取り、DB-1701キャピラリーカラム（0.25 mm × 5 m；Agilent J&W）によるガスクロマトグラム（GC-17A；島津製）にて反応物中のラウリン酸メチルエステルの有無を解析した。インジェクターおよびディテクターの温度はそれぞれ300℃、カラム温度は60℃で3分間保持した後、300℃まで10℃/分の条件で昇温し、それ以降300℃で4分間保持した。【００９０】
DB-1701キャピラリーカラムで解析した各クロマトグラム（図２６〜図２９）において、酵素反応によって生成されたラウリン酸およびラウリン酸メチルエステルの位置を矢印で示した。図２６〜図２９に示す通り、いずれの酵素もメタノール非存在下ではラウリン酸のみが生成され、メタノール存在下ではラウリン酸メチルエステルが生成されることが分かった。ピーク面積から、ラウリン酸のメチルエステル化能はLCCが最も高く、次点がリパーゼ PS、リパーゼ AYが３種類のうちで最も低かった。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明のエステラーゼは優れた熱安定性を有するとともに、広範なpH域で高活性を示す。従って、高温環境下や高塩基性環境下などにおいても使用可能であり、その利用価値・応用可能性は極めて高い。例えば、ポリエステル製品（育苗資材、被覆資材、支柱、線材、ハウス資材などの農業用資材、車両用樹脂製品、建築用資材等）の分解処理や、テレフタル酸の製造、ポリエステル材料（ポリエステル含有繊維、ポリエステル樹脂等）の改質、バイオディーゼルの生産等、様々な用途に本発明のエステラーゼを適用可能である。【００９２】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【配列表フリーテキスト】
【００９３】
配列番号５〜８：人工配列の説明：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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