(57)【要約】  本発明は、細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第１のリガンドを含む第１の成分と、該第１のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第２のリガンドで標的化された、担体、標識剤または標的細胞に関連する疾患を処置するための薬剤を含む第２の成分とを含む、組合わせ医薬組成物または医薬製剤、これらを利用した、標的細胞を標識する方法、標的細胞に関連する疾患を処置する方法などに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第１のリガンドを含む第１の成分と、該第１のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第２のリガンドで標的化された、標的細胞に関連する疾患を処置するための薬剤を含む第２の成分とを含む、標的細胞に関連する疾患を処置するための組合わせ医薬製剤。
【請求項２】
第１の成分と第２の成分とが、同時投与または逐次投与される、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３】
第１のリガンドがマンノースまたは末端にマンノースを有する化合物であり、第２のリガンドがフコースまたはこれを末端に含む分子であり、標的細胞がフコシル化分子産生細胞である、請求項１または２に記載の医薬製剤。
【請求項４】
疾患が、腫瘍性疾患および炎症性疾患からなる群から選択される、請求項３に記載の医薬製剤。
【請求項５】
腫瘍性疾患が、固形腫瘍および白血病からなる群から選択される、請求項４に記載の医薬製剤。
【請求項６】
細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第１のリガンドを含む第１の成分と、該第１のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第２のリガンドで標的化された担体を含む第２の成分とを含む、標的細胞特異的に物質を送達するための組合わせ医薬組成物。
【請求項７】
物質が、標識または標的細胞に関連する疾患を処置するための薬物である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
標識が、気体もしくは生理条件下で気体を発生する物質、放射性同位体、磁性体、核磁気共鳴する元素、核磁気共鳴する元素の緩和時間に影響を与える物質、標識化物質に結合する物質、蛍光物質、フルオロフォア、化学発光物質、酵素、ビオチンもしくはその誘導体、アビジンもしくはその誘導体、または、これらの１または２以上を含む物質からなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第１のリガンドを含む第１の成分と、該第１のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第２のリガンドで標的化された標識剤を含む第２の成分とを含む、標的細胞またはこれを含む組織を標識するための組合わせ医薬組成物。
【請求項１０】
細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第１のリガンドと、該第１のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第２のリガンドで標的化された、標的細胞に関連する疾患を処置するための薬剤とを、単独でまたは組み合わせて含む１または２以上の容器を含む、標的細胞に関連する疾患を処置するためのキット。
【請求項１１】
細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第１のリガンドを含む、該第１のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第２のリガンドで標的化された担体、薬剤または標識剤の標的特異性強化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的化細胞への標的化能が強化された組合わせ医薬製剤、これを利用した標的細胞に関連する疾患の処置方法、標的化された薬剤や担体の標的特異性を強化する剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物において、フコシル化された糖鎖が、血管新生、繁殖、細胞接着、炎症および腫瘍転移などの種々の生理的および病理学的過程に関与していることが知られている（非特許文献１参照）。また、ＣＡ１９−９やＳＬＸをはじめとする多くの糖タンパク質腫瘍マーカーが糖鎖のフコシル化により生じることも知られている（非特許文献２参照）。このように、フコシル化糖鎖は生体において重要な意味を有しているため、フコシル化糖鎖を産生する細胞に特異的に薬剤などの物質を送達することができれば、上記のような種々の現象を制御することが可能となる。しかしながら、かかる試みが成功したという報告は未だない。
また、フコシル化はフコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ）という糖転移酵素によって触媒されていることから、フコシル化糖鎖産生細胞のフコシルトランスフェラーゼを標的分子として標的化することも考えられるが、同酵素は小胞体からゴルジ装置にかけて局在する膜結合型タンパク質であり、細胞表面に存在しないため、これを直接的な標的分子とすることもできない。したがって、フコシル化糖鎖産生細胞特異的に薬剤などの物質を送達する技術はこれまで存在しなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開2009-46441号公報
【特許文献２】特表2004-522722号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ma et al., Glycobiology. 2006;16（12）:158R-184R
【非特許文献２】Mas et al., Glycobiology. 1998;8（6）:605-13
【非特許文献３】Kawakami et al., Biochim Biophys Acta. 2000;1524（2-3）:258-65
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、標的特異性が強化された標的化担体および標的化薬剤、これを利用した標的細胞に関連する疾患の処置方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を続けたところ、フコシル化分子産生細胞にフコースを特異的に結合する機構が存在すること、および、フコースを標的化分子として含む担体が、フコシル化分子産生細胞への物質送達を特異的に促進することを見出した。そして、この知見に基づいてさらに研究を進めたところ、マンノース受容体および／またはフコース受容体のリガンドであるマンノースを併用することで、前記担体の肝臓等における捕捉を回避し、標的特異性を強化できることを見出し、本発明を完成させた。
フコシル化分子産生細胞にフコースを特異的に結合する機構が存在することはこれまで全く知られていなかった。また、特許文献１、２および非特許文献３には、フコースを含む担体が記載されているが、フコシル化分子産生細胞への物質送達を特異的に促進することについては教示されていない。【０００７】
すなわち、本発明は、以下に関する。
（１）細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第１のリガンドを含む第１の成分と、該第１のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第２のリガンドで標的化された、標的細胞に関連する疾患を処置するための薬剤を含む第２の成分とを含む、標的細胞に関連する疾患を処置するための組合わせ医薬製剤。
（２）第１の成分と第２の成分とが、同時投与または逐次投与される、（１）に記載の医薬製剤。
（３）第１のリガンドがマンノースまたは末端にマンノースを有する化合物であり、第２のリガンドがフコースまたはこれを末端に含む分子であり、標的細胞がフコシル化分子産生細胞である、（１）または（２）に記載の医薬製剤。
（４）疾患が、腫瘍性疾患および炎症性疾患からなる群から選択される、（３）に記載の医薬製剤。
（５）腫瘍性疾患が、固形腫瘍および白血病からなる群から選択される、（４）に記載の医薬製剤。
（６）細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第１のリガンドを含む第１の成分と、該第１のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第２のリガンドで標的化された担体を含む第２の成分とを含む、標的細胞特異的に物質を送達するための組合わせ医薬組成物。【０００８】
（７）物質が、検出可能な標識または標的細胞に関連する疾患を処置するための薬物である、（６）に記載の医薬組成物。
（８）標識が、気体もしくは生理条件下で気体を発生する物質、放射性同位体、磁性体、核磁気共鳴する元素、核磁気共鳴する元素の緩和時間に影響を与える物質、標識化物質に結合する物質、蛍光物質、フルオロフォア、化学発光物質、酵素、ビオチンもしくはその誘導体、アビジンもしくはその誘導体、または、これらの１または２以上を含む物質からなる群から選択される、（７）に記載の医薬組成物。
（９）細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第１のリガンドを含む第１の成分と、該第１のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第２のリガンドで標的化された標識剤を含む第２の成分とを含む、標的細胞またはこれを含む組織を標識するための組合わせ医薬組成物。
（１０）細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第１のリガンドと、該第１のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第２のリガンドで標的化された、標的細胞に関連する疾患を処置するための薬剤とを、単独でまたは組み合わせて含む１または２以上の容器を含む、標的細胞に関連する疾患を処置するためのキット。
（１１）細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第１のリガンドを含む、該第１のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第２のリガンドで標的化された担体、薬剤または標識剤の標的特異性強化剤。【０００９】
本発明はまた、以下にも関する。
（ｉ）フコシル化分子産生細胞に対する標的化のための有効量のフコースを含む、前記細胞に標的化された担体。
（ｉｉ）フコースがＬ−フコースである、上記（ｉ）に記載の担体。
（ｉｉｉ）フコシル化分子がＩ型糖鎖を含む、上記（ｉ）または（ｉｉ）に記載の担体。
（ｉｖ）フコシル化分子がＯ結合型フコースを含む、上記（ｉ）または（ｉｉ）に記載の担体。
（ｖ）フコシル化分子産生細胞が、フコシルトランスフェラーゼを発現する、上記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかに記載の担体。
（ｖｉ）フコシルトランスフェラーゼが、ＦＵＴ１、ＦＵＴ２、ＦＵＴ３、ＦＵＴ４、ＦＵＴ５、ＦＵＴ６、ＦＵＴ７、ＦＵＴ８、ＦＵＴ９、ＦＵＴ１０、ＦＵＴ１１、ＰＯＦＵＴ１、ＰＯＦＵＴ２からなる群から選択される、上記（ｖ）に記載の担体。
（ｖｉｉ）高分子ミセル、リポソーム、エマルジョン、微小球およびナノ小球から選択される形態を有する、上記（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかに記載の担体。
（ｖｉｉｉ）リポソームの形態を有し、フコースと、リポソームに含まれる脂質とのモル比が８：１〜１：８である、上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）のいずれかに記載の担体。【００１０】
（ｉｘ）上記（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）のいずれかに記載の担体と、フコシル化分子産生細胞の活性または増殖を制御する薬物とを含む組成物。
（ｘ）フコシル化分子産生細胞の活性または増殖を制御する薬物が抗炎症剤および抗腫瘍剤からなる群から選択される、上記（ｉｘ）に記載の組成物。
（ｘｉ）薬物と、担体とを、医療の現場またはその近傍で混合してなる、上記（ｉｘ）または（ｘ）に記載の組成物。
（ｘｉｉ）上記（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）のいずれかに記載の担体と、標識とを含む組成物。
（ｘｉｉｉ）標識が、気体もしくは生理条件下で気体を発生する物質、放射性同位体、磁性体、核磁気共鳴する原子、核磁気共鳴する原子の緩和時間に影響を与える物質、標識化物質に結合する物質、蛍光物質、フルオロフォア、化学発光物質、酵素、ビオチンもしくはその誘導体、アビジンもしくはその誘導体、または、これらの１または２以上を含む物質からなる群から選択される、上記（ｘｉｉ）に記載の組成物。
（ｘｉｖ）フコシル化分子産生細胞の活性または増殖を制御する薬物と、フコース供与体、ならびに、必要に応じてフコース以外の担体構成物質を、単独でまたは組み合わせて含む１つまたはそれ以上の容器を含む、上記（ｉｘ）〜（ｘｉ）のいずれかに記載の組成物の調製キット。【００１１】
（ｘｖ）フコシル化分子産生細胞に関連する疾患を処置する方法であって、前記疾患を処置するための有効量の上記（ｉｘ）〜（ｘｉ）のいずれかに記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
（ｘｖｉ）疾患が、腫瘍性疾患および炎症性疾患からなる群から選択される、上記（ｘｖ）に記載の方法。
（ｘｖｉｉ）腫瘍性疾患が、固形腫瘍および白血病からなる群から選択される、上記（ｘｖｉ）に記載の方法。
（ｘｖｉｉｉ）検出に有効な量の上記（ｘｉｉ）または（ｘｉｉｉ）に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、フコシル化分子産生細胞を前記対象において検出する方法。
（ｘｉｘ）細胞がイメージングにより検出される、上記（ｘｖｉｉｉ）に記載の方法。
（ｘｘ）細胞が腫瘍細胞および炎症細胞からなる群から選択される、上記（ｘｖｉｉｉ）または（ｘｉｘ）に記載の方法。
（ｘｘｉ）検出に有効な量の上記（ｘｉｉ）または（ｘｉｉｉ）に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患を診断する方法。
（ｘｘｉｉ）上記（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）のいずれに記載の担体を利用した、フコシル化分子産生細胞へ物質を送達する方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の医薬製剤および医薬組成物は、細網内皮系細胞における多特異性レクチンを介した細網内皮系による捕捉を回避することができるため、より効率よく特異的に所望の標的部位に送達される。さらに、本発明の標的特異性強化剤は、細網内皮系細胞における多特異性レクチンをブロックすることにより、これら受容体のリガンドの、これらレクチン以外の標的に対する標的化能を顕著に強化することができ、したがって、かかるリガンドで標的化された薬剤の標的特異性を大幅に高めることができる。
このため、本発明の医薬製剤および医薬組成物において、標的化リガンドとして、例えばフコースを用いた場合には、所望の物質や物体、例えば標識や、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患を処置するための薬物等をフコシル化分子産生細胞に効率的に運搬することにより、最大の効果および最小の副作用において、所望の効果、例えばフコシル化分子産生細胞の活性や増殖の抑制、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患の治癒、進行の抑制または発症や再発の予防などを可能にする。また、本発明の医薬組成物において、標的化リガンドとして、フコースを用いた場合には、フコシル化分子産生細胞特異的に物質を送達することができるため、フコシル化分子産生細胞特異的な標識や、遺伝子導入などに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、各種膵癌細胞株における腫瘍マーカーの分泌およびＦＵＴの発現を示した図である。（ａ）は、各種膵癌細胞株培養上清中のＣＡ１９−９、ＳＰＡＮ−１およびＤＵ−ＰＡＮ−２の濃度を示したグラフである。（ｂ）は、種々の膵癌細胞株における各種フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ）の発現状態を示した図である。
【図２】図２は、フコシル化糖鎖高産生株ＡｓＰＣ−１（上）と、フコシル化糖鎖低産生株ＰＡＮＣ−１（下）におけるフコースの結合量と遊離フコース濃度との関係を示したグラフである。
【図３】図３は、図２の結果を基に、フコシル化糖鎖高産生株ＡｓＰＣ−１（上）と、フコシル化糖鎖低産生株ＰＡＮＣ−１（下）のフコースに対する結合定数ＫｄおよびＢｍａｘの計算結果を示した図である。
【図４】図４は、フコシル化糖鎖高産生株ＡｓＰＣ−１における１４Ｃフコースの結合と、過剰量の非標識フコースの競合によるその阻害を示したグラフである。
【００１４】
【図５】図５は、種々のモル比（フコース／リポソーム）のフコシル化リポソームによるｓｉＲＮＡの導入を示した写真図である。
【図６】図６は、種々のモル比（フコース／リポソーム）のフコシル化リポソームによるｓｉＲＮＡの導入を示した写真図である。
【図７】図７は、フコシル化リポソームによるｓｉＲＮＡの導入に対するフコース添加の影響を示した写真図である。図中、左から順に、無処理群、非フコシル化リポソーム処理群、フコシル化リポソーム処理群、過剰量のフコースの添加を伴うフコシル化リポソーム処理群における結果をそれぞれ示す。
【図８】図８は、各種膵癌細胞株におけるｓｉＲＮＡ導入効率の比較を示した写真図である。図中、上段は無処理群、中段は非フコシル化リポソーム処理群、下段はフコシル化リポソーム処理群における結果をそれぞれ示す。
【図９】図９は、各種膵癌細胞株におけるｓｉＲＮＡ導入効率の比較を示した写真図である。図中、上段は無処理群、中段は非フコシル化リポソーム処理群、下段はフコシル化リポソーム処理群における結果をそれぞれ示す。
【００１５】
【図１０】図１０は、膵癌細胞株（ＡｓＰＣ−１）のフコシルトランスフェラーゼ依存的なＣＡ１９−９の産生を示したグラフである。（ａ）は、ｓｉＲＮＡによるＦＵＴ遺伝子の発現阻害を示す。（ｂ）は、ＦＵＴ−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞における、ＣＡ１９−９の分泌を示す。
【図１１】図１１は、ＣＤＤＰ３を用いたＣＤＤＰ被包化（内包）のスキームである。（ａ）および（ｂ）は、それぞれＣＤＤＰおよびＣＤＤＰ３の化学構造を示す。（ｃ）は、ＮａＣｌを含まないＴＡＰＳバッファー（ｐＨ８．４）中のＣＤＤＰ３である。（ｄ）は、水中での高い溶解度によって、Ｈ２Ｏ分子が配位して可逆平衡状態にあるＣＤＤＰ３を示す。（ｅ）の段階では、ＣＤＤＰ３がリポソームに取り込まれ、リポソーム中で様々な分子形を示す。（ｆ）では、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むＴＡＰＳバッファー（ｐＨ８．４）に変えることにより、リポソーム中に塩素イオンが流入し、塩素イオンと優先的に配位結合を形成することにより、ＣＤＤＰが産生される。
【図１２】図１２は、フコシル化リポソームの調製を示した図である。（ａ）は、フコシル化リポソームの調製スキームである。（ｂ）は、フコシル化リポソームの電子顕微鏡写真図である（バーは１００ｎｍを示す）。
【００１６】
【図１３】図１３は、Ｃｙ５．５内包フコシル化リポソームの生理化学的特徴を示すグラフである。水中で調製したリポソームの平均粒子サイズ（ａ）およびゼータ電位（ｂ）は、動的光散乱光度計により測定した。
【図１４】図１４は、フコシル化リポソームに被包したＣｙ５．５の導入を示した図である（倍率２００倍）。
【図１５】図１５は、Ｃｙ５．５内包フコシル化リポソーム処理細胞のフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。ＡｓＰＣ−１細胞（ＣＡ１９−９産生細胞）（ａ）およびＰＡＮＣ−１細胞（ＣＡ１９−９非産生細胞）（ｂ）は、過剰のフコース存在下（図中、＋Ｆｕｃ×１００）または非存在下において、Ｃｙ５．５内包フコシル化リポソームで２時間処理し、フローサイトメトリーで分析した。
【図１６】図１６は、ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームの各種膵癌細胞株への効果を示したグラフである。細胞は、ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームで２時間処理した後に洗浄し、７２時間インキュベートした。生細胞は、ＷＳＴアッセイによって測定した。（ａ）および（ｂ）の縦軸は％ of controlを示し、（ｂ）の横軸はμＭを示す。
【図１７】図１７は、マンノース処理によるＣｙ５．５の肝臓への蓄積抑制を示す。左の写真図は、マンノース処理（＋）および未処理（−）におけるＣｙ５．５の分布を示す。右のグラフは、製造者の説明書に従って、Living imageを用いて計算した肝臓における全流束を示す。
【００１７】
【図１８】図１８は、マンノース処理（＋）による肝臓へのＣｙ５．５蓄積の抑制効果を示す。（ａ）では、フコースの１０００倍のマンノースを、フコシル化リポソームの注射の前、後、および／または同時に注射した。グラフの縦軸は、全流束（photon/sec）を示す。（ｂ）は、肝臓または腫瘍組織におけるＣｙ５．５の蓄積を示す写真図である（倍率１００倍）。
【図１９】図１９は、フコシル化リポソームによって被包化したＣｙ５．５の導入を示す。（ａ）は、フコシル化リポソームによるＣｙ５．５の導入を示す写真図である（倍率１００倍）。ＡｓＰＣ−１細胞を、マンノースの存在（＋Ｍａｎ）または非存在下で、Ｃｙ５．５を被包するフコシル化リポソームで２時間インキュベーションした後、リン酸緩衝食塩水で２回洗浄し、蛍光顕微鏡で可視化した。（ｂ）は、Ｃｙ５．５を被包するフコシル化リポソームで処理した細胞の、フローサイトメトリーの結果である。
【図２０】図２０は、異種移植モデルにおけるＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームの腫瘍増殖阻害を示すグラフである。結果は、平均値±標準偏差（ｎ＝６）で表されている。＊は、ＮＴ、ＣＤＤＰおよびＦ０と比較して、Ｐ＜０．０１の有意差を示す。ＮＴは、未処理（No Treatment）を示す。
【図２１】図２１は、腫瘍細胞におけるアポトーシス性細胞および白金濃度を示す。（ａ）は、ＨＥ染色（左側）およびＴＵＮＥＬ染色（右側）を示す（倍率２００倍）。腫瘍組織は、処置後２２日目摘出された。（ｂ）は、ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームで処理をした腫瘍細胞における白金濃度を示す。
【００１８】
【図２２】図２２は、各種大腸癌細胞株培養上清中のＣＡ１９−９の濃度を示したグラフである。
【図２３】図２３は、フコシル化リポソームに被包したＣｙ５．５の導入を示した図である（倍率２００倍）。
【図２４】図２０は、Ｃｙ５．５内包フコシル化リポソーム処理細胞のフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
【図２５】図２５は、ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームの各種大腸癌細胞株への効果を示したグラフである。細胞は、ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームで２時間処理した後に洗浄し、７２時間インキュベートした。生細胞は、ＷＳＴ−１アッセイによって測定した。グラフの縦軸は「％ of control」を示す。
【図２６】図２６は、ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームの各種大腸癌細胞株への効果を示したグラフである。細胞は、ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームで２時間処理した後に洗浄し、７２時間インキュベートした。生細胞は、ＷＳＴ−１アッセイによって測定した。グラフの縦軸は「％ of control」を示す。
【００１９】
【図２７】図２７は、ＬＳ１８０担癌マウスにおける、マンノース処理によるＣｙ５．５内包フコシル化リポソームの肝臓への集積抑制効果を示す。左の写真図は、マンノース処理（Ｆ１００＋Ｍ）または未処理（Ｆ１００）マウスにおける、Ｃｙ５．５内包フコシル化リポソーム投与後２および５日目のＣｙ５．５の分布を示す。右のグラフは、Ｃｙ５．５内包フコシル化リポソーム投与後５日目の肝臓における全流束を示す。
【図２８】図２８は、ＬＳ１８０担癌マウスにおける、マンノース処理による肝臓へのＣｙ５．５集積抑制効果および腫瘍へのＣｙ５．５集積促進効果を示す。左の写真図は、処理後１４日目のマンノース処理群（Ｆ１００＋Ｍ）または未処理群（Ｆ１００）マウス（各群３匹）における、肝臓または腫瘍組織へのＣｙ５．５の集積を示す。右のグラフは、処理後１４日目のマンノース処理（Ｆ１００＋Ｍ）または未処理（Ｆ１００）マウスの腫瘍部位における全流束（photon/sec）を示す。
【図２９】図２９は、ＬＳ１８０担癌マウスにおけるＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームの腫瘍増殖阻害を示すグラフである。＊は、Ｆ１００−ＣＤＤＰ群の腫瘍体積が、ＮＴ、ＣＤＤＰおよびＦ０群の腫瘍体積に対して、Ｐ＜０．０５の有意差を有することを示す。Ｆ１００−ＣＤＤＰとＦ５０−ＣＤＤＰとの間に有意差は認められなかった（ＮＳ：Not significant）。ＮＴは、未処理（No Treatment）を示す。
【００２０】
【図３０】図３０は、各種胆道癌細胞株培養上清中のＣＡ１９−９の濃度を示したグラフである。
【図３１】図３１は、Ｃｙ５．５内包フコシル化リポソーム処理細胞のフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
【図３２】図３２は、Ｃｙ５．５内包フコシル化リポソームで処理したＣＡ１９−９高産生胃癌細胞株ＣＯＬＯ２０５細胞のフローサイトメトリーの結果および蛍光顕微鏡像を示した図である。
【図３３】図３３は、Ｃｙ５．５内包フコシル化リポソームで処理したＣＡ１９−９非産生胃癌細胞株ＭＫＮ４５細胞のフローサイトメトリーの結果および蛍光顕微鏡像を示した図である。
【図３４】図３４は、ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームのＣＡ１９−９高産生胃癌細胞株ＣＯＬＯ２０５細胞への効果を示したグラフである。細胞は、ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームで１時間処理した後に洗浄し、７２時間インキュベートした。生細胞は、ＷＳＴ−１アッセイによって測定した。
【図３５】図３５は、ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームのＣＡ１９−９非産生胃癌細胞株ＭＫＮ４５細胞への効果を示したグラフである。細胞は、ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームで１時間処理した後に洗浄し、７２時間インキュベートした。生細胞は、ＷＳＴ−１アッセイによって測定した。
【００２１】
【図３６】図３６は、各種白血病細胞株におけるＣＤ３３およびＮｏｔｃｈ−１の発現を示した図である。
【図３７】図３７は、各種白血病細胞株におけるフコシルトランスフェラーゼの発現を示した図である。
【図３８】図３８は、蛍光標識内包フコシル化リポソームで処理したＮｏｔｃｈ−１発現白血病細胞株（ＨＬ−６０）および非発現白血病細胞株（ＭＯＬＴ−４）の細胞のフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
【図３９】図３９は、ＦＡＭ内包フコシル化リポソームで処理したＮｏｔｃｈ−１発現白血病細胞株（ＨＬ−６０）および非発現白血病細胞株（ＭＯＬＴ−４）の蛍光顕微鏡像である。
【図４０】図４０は、ドキソルビシンを被包するフコシル化リポソームのＮｏｔｃｈ−１発現白血病細胞株（ＨＬ−６０）および非発現白血病細胞株（ＭＯＬＴ−４）への効果を示したグラフである。細胞は、ドキソルビシンを被包するフコシル化リポソームで２時間処理した後に洗浄し、７２時間インキュベートした。生細胞は、ＷＳＴ−１アッセイによって測定した。
【図４１】図４１は、白血病患者検体におけるＣＤ３３およびＮｏｔｃｈ−１の発現状態を示した図である。
【図４２】図４２は、白血病患者検体由来のＮｏｔｃｈ−１発現白血病細胞および非発現白血病細胞に対するドキソルビシンを被包するフコシル化リポソームの効果を示したグラフである。細胞は、ドキソルビシンを被包するフコシル化リポソームで２時間処理した後に洗浄し、７２時間インキュベートした。生細胞は、ＷＳＴ−１アッセイによって測定した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の１つの側面は、細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第１のリガンド（本明細書において、阻害リガンド、ブロッキングリガンドまたは遮断リガンドと称する場合がある）を含む第１の成分と、該第１のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第２のリガンド（本明細書において、標的化リガンドまたはターゲティングリガンドと称する場合がある）で標的化された、標的細胞に関連する疾患を処置するための薬剤を含む第２の成分とを含む、標的細胞に関連する疾患を処置するための組合わせ医薬製剤に関する。
本発明において、細網内皮系細胞における多特異性レクチンには、細網内皮系細胞、例えば、脾洞内皮細胞、脾索細網細胞、リンパ細網細胞、リンパ内皮細胞、クッパー細胞、肝類洞内皮細胞、骨髄毛細血管内皮細胞、単球、組織球、肺胞大食細胞、小膠細胞、マクロファージ等において発現している任意の多特異性レクチン、すなわち、複数の糖に対する結合能を有するレクチンが含まれる。かかるレクチンとしては、限定されずに、例えば、マンノース受容体およびフコース受容体が挙げられる。
【００２３】
マンノース受容体は、ＣＤ２０６としても知られる、Ｉ型膜貫通タンパク質を指す。この受容体は、クッパー細胞、肝類洞内皮細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞、リンパ内皮細胞等に発現し、細菌などの病原体の貪食に関与していると考えられている（Kerrigan AM et al., Immunobiology. 2009;214(7):562-75、Takahashi et al., Cell Tissue Res. 1998;292(2):311-23）。同受容体はＣ型レクチン様ドメインを有しており、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびグルコース（Ｇｌｃ）と結合するが、ガラクトース（Ｇａｌ）とは結合しない（Taylor ME et al., J Biol Chem. 1992;267(3):1719-26）。したがって、マンノース受容体のリガンドとしては、限定されずに、例えば、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコース、これらの糖を末端に有する任意の化合物、例えば、これらの糖を末端に有する糖鎖（例えば、マンナン、デキストラン等）、これらの糖の配糖体（例えば、マンノシド、フコシド、グルコシドなど）、これらの糖の誘導体（例えば、メチル化糖などのアルキル化糖、アミノ糖、糖アルコール、糖リン酸、糖ペプチド、糖タンパク質など）、マンノシル化オリゴリジン（Biessen EA et al., J Biol Chem. 1996;271(45):28024-30）、抗マンノース受容体抗体（PAM-1（Am J Pathol. 1997;150(3):929-38）、MR5D3（Serotec, Oxford, UK）など）、フコシル化ＢＳＡ、マンノシル化ＢＳＡ（Higuchi Y et al., Int J Pharm. 2004;287(1-2):147-54）などが挙げられる。
【００２４】
フコース受容体は、肝臓のクッパー細胞等に発現し、マンノース受容体と同様、細菌などの病原体の貪食に関与していると考えられており、フコースおよびガラクトースと結合するが、マンノースとは結合しない（上記Higuchi et al.）。また、フコース受容体へのフコースの結合は、以下の種々の糖類によって阻害されることが知られている：Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース、メチルガラクトシド、アラビノース、ガラクトース、マンノース、タロース、ガラクトサミン、マンノサミン、メチルグルコシド、メチルアラビノシド、グルコース、グルコサミン、リボース、メチルマンノシド、キシロース、アルトロース、Ｎ−アセチルマンノサミン、アロース、メチルグルコース、リキソース、グルクロン酸、マンノース６リン酸、デオキシグルコース（Lehrman MA et al., J Biol Chem. 1986;261(16):7426-32）。
【００２５】
したがって、フコース受容体のリガンドとしては、限定されずに、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース、メチルガラクトシド、アラビノース、ガラクトース、マンノース、タロース、ガラクトサミン、マンノサミン、メチルグルコシド、メチルアラビノシド、グルコース、グルコサミン、リボース、メチルマンノシド、キシロース、アルトロース、Ｎ−アセチルマンノサミン、アロース、メチルグルコース、リキソース、グルクロン酸、マンノース６リン酸、デオキシグルコース、これらの糖を末端に有する化合物、例えば、これらの糖を末端に有する糖鎖（例えば、マンナン、デキストラン等）、これらの糖の配糖体（例えば、フコシド、ガラクトシド、マンノシド、グルコシドなど）、これらの糖の誘導体（例えば、メチル化糖などのアルキル化糖、アミノ糖、糖アルコール、糖リン酸、糖ペプチド、糖タンパク質など）、種々のグリコシル化ＢＳＡ、抗フコース受容体抗体などが挙げられる。
【００２６】
ある化合物が細網内皮系細胞における多特異性レクチンのリガンドであるか否かは、当該レクチン、例えば、マンノース受容体またはフコース受容体などと、当該化合物との結合性を評価することにより決定することができる。かかる結合性の評価方法としては、例えば、上記各文献（Taylor et al.、Biessen et al.、Higuchi et al.、Lehrman et al.など）に記載の方法などを適宜用いることができる。したがって、上記に例示した以外の化合物であっても、かかる方法により細網内皮系細胞における多特異性レクチンとの結合性が認められれば、本発明におけるリガンドに含まれ得る。
【００２７】
本発明におけるリガンドとして利用可能な糖類（他の化合物に結合した形態のものを含む）は、所望の特性（すなわち、第１のリガンドについては、細網内皮系細胞における多特異性レクチンとの結合能、第２のリガンドについては、細網内皮系細胞における多特異性レクチンとの結合能および標的化能）を有する限り、Ｌ体およびＤ体の両方を包含する。したがって、限定されずに、例えば、Ｌ−およびＤ−マンノース、Ｌ−およびＤ−フコース、Ｌ−およびＤ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｌ−およびＤ−グルコース、ならびにＬ−およびＤ−ガラクトースなどが本発明におけるリガンドに含まれ得る。本発明においては、これらの形態の一方を用いても、両方を用いてもよい。
【００２８】
マンノース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコース、ガラクトース等の糖類は市販されているか、種々の天然の給源から公知の手法で得ることができる。また、化合物をマンノース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコース、ガラクトース等で修飾する方法は当該技術分野で知られており（例えば、Lee YC et al., Biochemistry. 1976;15(18):3956-63等に記載のアミジン化反応、Lee RT et al., Biochemistry. 1980;19(1):156-63等に記載の還元的アミノ化など）、また、種々の糖修飾化合物が市販されている（例えば、Dextra Ltd., Reading, UKから市販されている種々の単糖結合ＢＳＡ）。したがって、当業者は、これら任意の給源から所望のリガンドを入手、精製または合成することができる。
【００２９】
本発明における第１のリガンドは、上記リガンドを１種または２種以上含んでいてもよい。第１のリガンドに含まれるリガンドまたはリガンドの組合わせは、細網内皮系細胞における多特異性レクチンのいずれか１種のみに結合しても、その２種以上、またはその全てに結合してもよい。これらのリガンドのうち、マンノース受容体およびフコース受容体の少なくとも１種、好ましくは、これら受容体の両方に結合するリガンドが好ましい。第１のリガンドに好ましいリガンドとしては、限定されずに、例えば、マンノース、フコース、グルコース、これらを末端に有する化合物、Ｎ−アセチルグルコサミンとガラクトースとの組合わせ、Ｎ−アセチルグルコサミンとガラクトースの両方を末端に有する化合物、Ｎ−アセチルグルコサミンを末端に有する化合物とガラクトースを末端に有する化合物との組合わせ等が挙げられる。
【００３０】
本発明における第２のリガンドは、上記リガンドのうち、第１のリガンドとは異なる、所定の標的細胞を標的化できるものを指す。第２のリガンドとしては、限定することなく、例えば、フコース、マンノース、ガラクトース、これらを含む分子、例えば、糖鎖（例えば、これらを側鎖末端や非還元末端に含む糖鎖）、糖タンパク質、糖脂質などが挙げられる。フコースまたはこれを含む分子は、フコシル化分子産生細胞、フコース結合機構保有細胞およびフコシルトランスフェラーゼ発現細胞からなる群から選択される細胞を標的化することができる。マンノースまたはこれを含む分子は、ＤＣ−ＳＩＧＮ（上記Kerrigan et al.）などのマンノース結合性レクチンを発現する細胞、例えば、樹状突起細胞等を標的化することができる。ガラクトースまたはこれを含む分子は、アシアロ糖タンパク質受容体（上記Zelensky et al.）を発現する細胞、例えば、肝実質細胞等を標的化することができる（特開2007-112768）。
【００３１】
フコースまたはこれを含む分子を第２のリガンドとして用いる場合、第１のリガンドとしては、フコース以外のもの、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、メチルガラクトシド、アラビノース、ガラクトース、マンノース、タロース、ガラクトサミン、マンノサミン、メチルグルコシド、メチルアラビノシド、グルコース、グルコサミン、リボース、メチルマンノシド、キシロース、アルトロース、Ｎ−アセチルマンノサミン、アロース、メチルグルコース、リキソース、グルクロン酸、マンノース６リン酸、デオキシグルコース、これらの糖を末端に有する化合物、例えば、これらの糖を末端に有する糖鎖（例えば、マンナン、デキストラン等）、これらの糖の配糖体（例えば、ガラクトシド、マンノシド、グルコシドなど）、これらの糖の誘導体（例えば、メチル化糖などのアルキル化糖、アミノ糖、糖アルコール、糖リン酸、糖ペプチド、糖タンパク質など）、種々のグリコシル化ＢＳＡ、マンノシル化オリゴリジン、抗フコース受容体抗体および抗マンノース受容体抗体からなる群から選択される１種または２種以上のものを用いることができる。
【００３２】
これらのうち、マンノース受容体およびフコース受容体の両方に結合し得るリガンドまたはリガンドの組合わせが好ましく、限定されずに、例えば、マンノース、グルコース、これらを末端に有する化合物、Ｎ−アセチルグルコサミンとガラクトースとの組合わせ、Ｎ−アセチルグルコサミンとガラクトースの両方を末端に有する化合物、Ｎ−アセチルグルコサミンを末端に有する化合物とガラクトースを末端に有する化合物との組合わせ、抗フコース受容体抗体および抗マンノース受容体抗体の組合わせ等が挙げられる。この態様において特に好ましい第１のリガンドは、マンノースおよび／またはマンノースを末端に有する化合物である。
【００３３】
マンノースまたはこれを含む分子を第２のリガンドとして用いる場合、第１のリガンドとしては、マンノース以外のもの、例えば、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、メチルガラクトシド、アラビノース、ガラクトース、タロース、ガラクトサミン、マンノサミン、メチルグルコシド、メチルアラビノシド、グルコース、グルコサミン、リボース、メチルマンノシド、キシロース、アルトロース、Ｎ−アセチルマンノサミン、アロース、メチルグルコース、リキソース、グルクロン酸、マンノース６リン酸、デオキシグルコース、これらの糖を末端に有する化合物、例えば、これらの糖を末端に有する糖鎖（例えば、デキストラン等）、これらの糖の配糖体（例えば、ガラクトシド、フコシド、グルコシドなど）、これらの糖の誘導体（例えば、メチル化糖などのアルキル化糖、アミノ糖、糖アルコール、糖リン酸、糖ペプチド、糖タンパク質など）、種々のグリコシル化ＢＳＡ、抗フコース受容体抗体および抗マンノース受容体抗体からなる群から選択される１種または２種以上のものを用いることができる。
【００３４】
これらのうち、マンノース受容体およびフコース受容体の両方に結合し得るリガンドまたはリガンドの組合わせが好ましく、限定されずに、例えば、フコース、グルコース、これらを末端に有する化合物、Ｎ−アセチルグルコサミンとガラクトースとの組合わせ、Ｎ−アセチルグルコサミンとガラクトースの両方を末端に有する化合物、Ｎ−アセチルグルコサミンを末端に有する化合物とガラクトースを末端に有する化合物との組合わせ、抗フコース受容体抗体および抗マンノース受容体抗体の組合わせ等が挙げられる。
【００３５】
ガラクトースまたはこれを含む分子を第２のリガンドとして用いる場合、第１のリガンドとしては、ガラクトース以外のもの、例えば、フコース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、メチルガラクトシド、アラビノース、ガラクトース、タロース、ガラクトサミン、マンノサミン、メチルグルコシド、メチルアラビノシド、グルコース、グルコサミン、リボース、メチルマンノシド、キシロース、アルトロース、Ｎ−アセチルマンノサミン、アロース、メチルグルコース、リキソース、グルクロン酸、マンノース６リン酸、デオキシグルコース、これらの糖を末端に有する化合物、例えば、これらの糖を末端に有する糖鎖（例えば、マンナン、デキストラン等）、これらの糖の配糖体（例えば、マンノシド、フコシド、グルコシドなど）、これらの糖の誘導体（例えば、メチル化糖などのアルキル化糖、アミノ糖、糖アルコール、糖リン酸、糖ペプチド、糖タンパク質など）、種々のグリコシル化ＢＳＡ、マンノシル化オリゴリジン、抗フコース受容体抗体および抗マンノース受容体抗体からなる群から選択される１種または２種以上のものを用いることができる。これらのうち、マンノース受容体およびフコース受容体の両方に結合し得るリガンドまたはリガンドの組合わせが好ましく、限定されずに、例えば、マンノース、フコース、グルコース、これらを末端に有する化合物、抗フコース受容体抗体および抗マンノース受容体抗体の組合わせ等が挙げられる。
【００３６】
第２のリガンドによって標的化される細胞要素、例えば細胞表面受容体は、第２のリガンドのみを特異的に認識してもよいし、第２のリガンドに対し、第１のリガンドよりも高い親和性を有していてもよい。後者の場合、第２のリガンドによって標的化される細胞要素は、第２のリガンドに対し、第１のリガンドよりも２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上または１０倍以上高い親和性を有する。第２のリガンドに対する親和性が第１のリガンドに対する親和性より大きければ大きい程、第２のリガンドによって標的化された薬剤の標的特異性はより高くなる。リガンドの細胞要素に対する親和性は、文献的に知られているか（例えば、上記Taylor et al.、Biessen et al.、Higuchi et al.、Lehrman et al.、Kerrigan et al.など）、これらの文献に記載の方法などを適宜用いて実験的に決定することができる。
【００３７】
本明細書中、標的化とは、物質、例えば薬剤、標識、担体などを、特定の標的、例えば特定の細胞や組織（本発明においては第２のリガンドを認識する細胞要素を有する細胞やかかる細胞を含む組織）などに、標的としない細胞や組織よりも、標的化していない前記物質と比較して、迅速、効率的かつ／または大量に送達すること、すなわち標的に特異的に送達することを可能にすることをいい、標的化剤とは、物質と結合または反応した場合に、当該物質をこのように標的化できる物質を意味する。したがって、本発明における第２のリガンドは、標的化剤として機能する。また、標的特異性とは、標的化された物質、例えば、薬剤、標識、担体などが、標的細胞へ、標的としない細胞よりも迅速、効率的かつ／または大量に送達される程度を意味し、これが高ければ、標的化物質はより効率的に標的細胞に送達され、標的としない細胞への送達は抑制される。
【００３８】
本発明において、フコシル化分子産生細胞は、フコシル化分子を産生するものであれば特に限定されず、フコシル化分子を細胞表面または細胞内に含むものであっても、フコシル化分子を細胞外に放出するものであってもよい。したがって、本発明におけるフコシル化分子産生細胞としては、特に限定されずに、腫瘍、例えば、膵臓腫瘍、胆道系腫瘍、肝臓腫瘍、消化管腫瘍、脳腫瘍、肺腫瘍、骨軟部腫瘍、造血器腫瘍、より具体的には、膵癌、胆道系癌、肝癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、さらには、乳癌、肺癌、子宮内膜癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫などにおける細胞や、膵炎、肝硬変、肝炎などの炎症性疾患における炎症部位の細胞、リンパ球などの免疫系の細胞などが挙げられる。炎症部位の細胞としては、限定されずに、例えば、炎症部位に本来存在する細胞であって、炎症の影響を受けているものが挙げられる。すなわち、炎症部位の細胞は、膵炎であれば炎症の影響を受けている膵臓の構成細胞（膵管細胞、外分泌細胞、内分泌細胞等）、肝炎であれば炎症の影響を受けている肝臓の構成細胞（肝実質細胞、胆管細胞、星細胞等）などを指す。炎症の影響としては、例えば、炎症性サイトカインへの暴露や、炎症性細胞との接触等が挙げられる。白血病としては、限定されずに、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）等が挙げられる。
本発明の一態様において、フコシル化分子産生細胞は、好ましくは正常細胞以外の細胞である。かかる細胞としては、例えば、上記の腫瘍細胞や炎症部位の細胞が挙げられる。
【００３９】
本発明において、フコシル化分子は、フコースが付加された任意の分子、例えば、限定されずに、フコシル化糖鎖、フコシル化糖タンパク質、フコシル化糖脂質などを含む。付加されるフコースの数は特に限定されず、１個または２個以上であってもよい。したがって、フコシル化糖タンパク質やフコシル化糖脂質は、糖部分としてフコースのみを含んでも、フコースを構成糖として含む糖鎖、すなわちフコシル化糖鎖を含んでもよい。
【００４０】
本発明において、フコシル化糖鎖は、糖鎖単体として産生されても、他の物質と結合した形で産生されてもよい。したがって、フコシル化糖鎖は、タンパク質に結合した糖タンパク質の形で産生されても、脂質に結合した糖脂質の形で産生されてもよい。また、本発明におけるフコシル化糖鎖は、フコースが含まれていればいずれの構造の糖鎖であってもよいが、フコースが非還元末端に含まれているものが好ましい。含まれるフコースはＬ−フコースまたはＤ−フコースであってもよいが、Ｌ−フコースが好ましい。また、フコシル化糖鎖は、Ｉ型糖鎖抗原（例えば、ＣＡ１９−９、ＳＰＡＮ−１、ＤＵ−ＰＡＮ−２、ＣＡ５０、ＫＭＯ−１等）を含んでも、ＩＩ型糖鎖抗原（例えば、ＳＬＸ、ＣＳＬＥＸ等）を含んでも、母核糖鎖抗原（例えば、ＣＡ７２−４、ＣＡ５４６、ＳＴＮ等）を含んでもよい。本発明の一態様では、Ｉ型糖鎖抗原を含む糖鎖が好ましい。また、フコシル化は、種々の結合様式、例えば、α１，２結合、α１，３結合、α１，４結合またはα１，６結合などでなされてもよい。このうち、本発明においては、α１，４結合が好ましい。本発明において特に好ましい糖鎖は、ＣＡ１９−９、ＳＰＡＮ−１およびＤＵ−ＰＡＮ−２からなる群から選択される糖鎖抗原を含む。
【００４１】
本発明におけるフコシル化糖タンパク質は、フコースを糖部分に含む任意の糖タンパク質を含み、限定されずに、例えば、Ｎｏｔｃｈ受容体（Ｎｏｔｃｈ−１、Ｎｏｔｃｈ−２、Ｎｏｔｃｈ−３、Ｎｏｔｃｈ−４など）、Ｎｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ−１、Ｄｅｌｔａ−３、Ｄｅｌｔａ−４、Ｊａｇｇｅｄ−１、Ｊａｇｇｅｄ−２など）、ハプトグロビン、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）−Ｌ３などを包含する。フコースは、糖タンパク質の糖鎖に付加されても、タンパク質部分に直接付加されてもよい。糖タンパク質の糖鎖はＩ型糖鎖、ＩＩ型糖鎖、母核糖鎖を包含する種々の構造を有してよく、また、O結合型であってもN結合型であってもよい。
本発明におけるフコシル化糖脂質は、フコースを糖部分に含む任意の糖脂質を含み、限定されずに、例えば、フコシルＧＭ１などを包含する。糖脂質の糖鎖はＩ型糖鎖、ＩＩ型糖鎖、母核糖鎖を包含する種々の構造を有してよい。
【００４２】
本発明の一態様において、フコシル化分子産生細胞は、正常細胞よりもフコシル化分子の産生が増大している。ここで、正常細胞とは、例えば、対象となる細胞が腫瘍細胞であれば、腫瘍化していない同種の細胞を指し、対象となる細胞が炎症部位の細胞であれば、炎症が生じる前の、または、炎症が生じていない部分の同種の細胞を指す。フコシル化分子の産生量は、限定されずに、例えば、上記の糖鎖抗原を認識する抗体やレクチンなどを用いて適宜測定することができる。本発明の一態様において、フコシル化分子産生細胞のフコシル化分子産生量は、正常細胞に比べ、２倍以上、好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは２０倍以上、特に好ましくは５０倍以上である。また、別の態様において、フコシル化分子産生細胞のフコシル化分子産生量は、細胞株ＭＩＡＰａＣａ、ＰＡＮＣ−１、ＫＰ４、ＰＫ４５Ｈ、ＨＴ−２９、ＨＣＴ−１５、ＲＢＥ、ＯＣＵＧ−１、ＴＧＢＣ１４ＴＫＢ、ＳＳＰ−２５、ＹＳＣＣＣ、ＴＫＫＫ、ＨｕＨ−２８、ＭＫＮ４５、ＭＫＮ７４、ＮＵＧＣ−４および／またはＭＯＬＴ−４より多く、ＰＫ５９、ＡＳＰＣ１、ＳＷ１１１６、ＬＳ１７４Ｔ、ＣＯＬＯ２０５、ＬＳ１８０、ＨｕＣＣＴ１、ＪＲ−Ｓｔ、ＨＳＣ−３９、ＮＣＩ−Ｎ８７および／またはＨＬ−６０と同等かまたはこれより多い。
【００４３】
本発明の別の態様において、フコシル化分子産生細胞は、フコース結合機構を有している。フコース結合機構は、細胞に備わった、フコースを選択的に結合し、かつ／または取り込む機構を指し、限定されずに、例えば、受容体や運搬体などの細胞要素を含む。フコース結合機構保有の有無は、例えば、放射性標識などにより検出可能に標識したフコースの、被験細胞への結合量や結合定数を調べることにより判定することができる（実施例３参照）。例えば、フコース結合機構を有する細胞は、後述の実施例３に記載の手法で測定した場合、結合定数Ｋｄが２５ｎＭ以上、好ましくは２８ｎＭ以上、より好ましくは３０ｎＭ以上、さらに好ましくは３４ｎＭ以上であり、ｂｍａｘが５ｐｍｏｌ／１０６細胞以上、好ましくは７．５ｐｍｏｌ／１０６細胞以上、より好ましくは１０ｐｍｏｌ／１０６細胞以上、さらに好ましくは１１ｐｍｏｌ／１０６細胞以上である。
【００４４】
本発明の別の態様において、フコシル化分子産生細胞には、フコシルトランスフェラーゼが発現している。フコシルトランスフェラーゼは、フコースをフコース供与体からフコースアクセプター（例えば、糖鎖、ポリペプチド、脂質等）に転移させられるものであれば特に限定されずに、例えば、既知のＦＵＴ１、ＦＵＴ２、ＦＵＴ３、ＦＵＴ４、ＦＵＴ５、ＦＵＴ６およびＦＵＴ７、ＦＵＴ８、ＦＵＴ９、ＦＵＴ１０およびＦＵＴ１１を含む。本発明の一態様において、フコシルトランスフェラーゼは、ＦＵＴ１、ＦＵＴ２、ＦＵＴ３およびＦＵＴ４からなる群から選択される。本発明の別の態様において、フコシルトランスフェラーゼは、ＦＵＴ１、ＦＵＴ２、ＦＵＴ４、ＦＵＴ５、ＦＵＴ６およびＦＵＴ８からなる群から選択される。本発明のさらに別の態様において、フコシルトランスフェラーゼは、ＦＵＴ１、ＦＵＴ２、ＦＵＴ３、ＦＵＴ４、ＦＵＴ５、ＦＵＴ６およびＦＵＴ８からなる群から選択される。また、本発明の一態様において、フコシルトランスフェラーゼは、フコースをα１，４結合で転移できるものが好ましく、かかるフコシルトランスフェラーゼとしては、例えばＦＵＴ３等が挙げられる。また、本発明の一態様において、好ましいフコシルトランスフェラーゼは、ＣＡ１９−９の産生と関連性の高いＦＵＴ３および／またはＦＵＴ６である。本発明の別の態様において、フコシルトランスフェラーゼは、フコースをポリペプチドに結合できるものが好ましく、かかるフコシルトランスフェラーゼとしては、例えばＰＯＦＵＴ１、ＰＯＦＵＴ２などが挙げられる。また、本発明の一態様において、好ましいフコシルトランスフェラーゼは、Ｎｏｔｃｈ−１のフコシル化と関連性の高いＰＯＦＵＴ１である。
【００４５】
フコシルトランスフェラーゼは、遺伝子の転写から、タンパク質の成熟に至る一連のタンパク質発現過程の中で発現していればよく、その発現は、遺伝子および／またはタンパク質レベルで検出することができる。具体的には、遺伝子レベルでは、例えば、ノーザンブロッティング法、サザンブロッティング法、ＤＮＡマイクロアレイ解析、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ等のＰＣＲ法、in situハイブリダイゼーション法、in vitro転写法等の任意の公知の遺伝子発現解析法により、また、タンパク質レベルでは、免疫沈降法、電気泳動、ウェスタンブロッティング法、質量分析法、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫組織化学法、免疫細胞化学法等の任意の公知のタンパク質検出法により検出することができる。本発明の一態様において、フコシル化分子産生細胞のフコシルトランスフェラーゼ発現量は、正常細胞に比べ、２倍以上、好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは２０倍以上、特に好ましくは５０倍以上である。また、本発明の一態様において、フコシル化分子産生細胞のフコシルトランスフェラーゼ発現量は、細胞株ＭＩＡＰａＣａ、ＰＡＮＣ−１、ＫＰ４、ＰＫ４５Ｈ、ＨＴ−２９、ＨＣＴ−１５、ＲＢＥ、ＯＣＵＧ−１、ＴＧＢＣ１４ＴＫＢ、ＳＳＰ−２５、ＹＳＣＣＣ、ＴＫＫＫ、ＨｕＨ−２８、ＭＫＮ４５、ＭＫＮ７４、ＮＵＧＣ−４および／またはＭＯＬＴ−４より多く、ＰＫ５９、ＡＳＰＣ１、ＳＷ１１１６、ＬＳ１７４Ｔ、ＣＯＬＯ２０５、ＬＳ１８０、ＨｕＣＣＴ１、ＪＲ−Ｓｔ、ＨＳＣ−３９、ＮＣＩ−Ｎ８７および／またはＨＬ−６０と同等かまたはこれより多い。
【００４６】
本発明において、フコース結合機構保有細胞は、上記フコース結合機構を保有する細胞を意味する。フコース結合機構に関する詳細は上記のとおりである。また、フコース結合機構は、フコシル化分子の産生量およびフコシルトランスフェラーゼの発現量と関連しているため、これらをフコース結合機構保有の指標として用いることもできる。したがって、本発明の一態様において、フコース結合機構保有細胞は、フコシル化分子を産生する。また、本発明の別の態様において、フコース結合機構保有細胞はフコシルトランスフェラーゼを発現する。フコシル化分子の産生およびフコシルトランスフェラーゼの発現に関する詳細は上記のとおりである。
【００４７】
本発明において、フコシルトランスフェラーゼ発現細胞は、上記フコシルトランスフェラーゼを発現する細胞を意味する。フコシルトランスフェラーゼの発現に関する詳細は上記のとおりである。フコシルトランスフェラーゼの発現はフコシル化分子の産生およびフコース結合機構の存在と関連しているため、これらをフコシルトランスフェラーゼ発現の指標として用いることもできる。したがって、本発明の一態様において、フコシルトランスフェラーゼ発現細胞は、フコシル化分子を産生する。また、本発明の別の態様において、フコシルトランスフェラーゼ発現細胞はフコース結合機構を有する。フコシル化分子の産生およびフコース結合機構の存在に関する詳細は上記のとおりである。
【００４８】
本発明における薬剤は、標的細胞に関連する疾患を処置するための薬物（以下、医薬化合物と称する場合もある）であって、第２のリガンドで標的化されたもの（以下、標的化薬物、標的化医薬化合物と称する場合もある）であっても、第２のリガンドで標的化された担体（標的化担体）に含まれた標的細胞に関連する疾患を処置するための薬物（以下、薬物含有標的化担体と称する場合もある）であっても、標的化担体に含まれた標的化薬物（以下、標的化薬物含有標的化担体と称する場合もある）であってもよい。
【００４９】
標的化薬物は、第２のリガンドが標的化剤として機能し得る形で薬物と複合体を形成していれば特に限定されず、第２のリガンドが、標的とする細胞要素と接触可能な態様で、薬物と直接、または、リンカー、スペーサーなどの介在化学構造を介して結合したものを含む。第２のリガンドは、薬物と共に標的細胞に取り込まれた後、または、薬物が標的細胞に取り込まれる際に、薬物から切り離され、薬物が所望の効果を奏するよう設計することもできる。糖または糖鎖を所望の化合物に結合させる方法は周知である。糖をアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質に結合する手法は特によく知られており、これらの分子をリンカーやスペーサーとして利用することもできる（Negre E et al., Antimicrob Agents Chemother. 1992;36(10):2228-32）。
【００５０】
標的化担体は、第２のリガンドが標的化剤として機能し得る形で担体と複合体を形成していれば特に限定されず、第２のリガンドが、標的とする細胞要素と接触可能な態様で、担体と直接、または、リンカー、スペーサーなどの介在化学要素を介して結合したものを含む。担体の成分としては、特に限定されずに、医薬および薬学の分野で知られる任意のものを用いることができるが、第２のリガンドを包含し得るか、または、これと結合し得るものが好ましい。このような成分としては、例えば、脂質、例えば、グリセロリン脂質などのリン脂質、スフィンゴミエリンなどのスフィンゴ脂質、コレステロールなどのステロール、大豆油、ケシ油などの植物油、鉱油、卵黄レシチンなどのレシチン類、ポリエチレングリコール、ＰＥＧ:ポリマー担体等が挙げられるが、これらに限定されない。このうち、リポソームを構成し得るもの、例えば、レシチンなどの天然リン脂質、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）などの半合成リン脂質、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、コレステロールなどが好ましい。
【００５１】
特に好ましい成分としては、細網内皮系による捕捉を回避し得る成分、例えば、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタメートクロリド（ＴＭＡＧ）、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラパルミチルスペルミン（ＴＭＴＰＳ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ジドデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアンモニオプロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド（ＤＣ−６−１４）などのカチオン性脂質が挙げられる。
【００５２】
担体への第２のリガンドの結合または包含は、化学的および／または物理的な方法によって第２のリガンドを担体に結合させるかまたは包含させることによっても可能となる。第２のリガンドを担体に結合させる方法としては、限定されずに、例えば、リポソームをトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンにより親水性化処理し、リンカータンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの生体由来のタンパク質を結合させ、これに糖鎖を結合させる方法（WO2007/091661、Hirai et al., Biochem Biophys Res Commun. 2007;353(3):553-8、Hirai et al., Int J Pharm. 2010;391(1-2):274-83）、糖付加コレステロール誘導体でリポソームを作製する方法（特許文献１）、ポリ−Ｌ−リジンに糖を付加する方法（上記Negre et al.）、糖脂質でリポソームを作製する方法またはｐ−アミノフェニル−D−グリコシドをグルタルアルデヒドを用いてホスファチジルエタノールアミンリポソームに共有結合する方法（Ghosh P et al., Biochim Biophys Acta. 1980;632(4):562-72）、コレステン−５−イルオキシ−Ｎ−（４−（（１−イミノ−２−β−D−チオグリコシルエチル）アミノ）ブチル）ホルムアミドでリポソームを作製する方法（非特許文献１）等が挙げられる。または、担体への第２のリガンドの結合または包含は、該担体の作製時に、第２のリガンドと、担体構成成分とを混合することによっても可能となる。
【００５３】
担体に結合させるかまたは包含させる第２のリガンドの量は、担体構成成分中の重量比で０．０１％〜１００％、好ましくは０．２％〜２０％、さらに好ましくは１〜５％とすることが可能である。担体への第２のリガンドの結合または包含は、該担体に薬物等を担持させる前に行ってもよいし、担体、第２のリガンドおよび薬物を同時に混合することなどによって行ってもよいし、または、薬物を既に担持した状態の担体と、第２のリガンドとを混合することなどによって行ってもよい。したがって、本発明はまた、既存の任意の薬物結合担体や薬物封入担体、例えば、DaunoXome（R）、Doxil、Caelyx（R）、Myocet（R）などのリポソーム製剤に第２のリガンドを結合させる工程を含む、薬物含有標的化担体の製造方法にも関する。
【００５４】
担体の形態は、所望の物質や物体を、標的とする細胞に運搬できればいずれの形態でもよく、例えば、限定するものではないが、高分子ミセル、リポソーム、エマルジョン、微小球、ナノ小球、ポリマーマトリックス、リポプレックスなどのうちいずれの形態をとることもできる。本発明においては、送達効率の高さ、送達できる物質の選択肢の広さや製剤の容易性等の観点から、これらのうちリポソームまたはリポプレックスの形態が好ましく、中でもカチオン性脂質を含むカチオン性リポソームが特に好ましい。担体がリポソームの形態である場合、第２のリガンドとリポソーム構成脂質とのモル比は、好ましくは８：１〜１：８、より好ましくは４：１〜１：４、さらに好ましくは２：１〜１：２、特に１：１である。別の態様において、第２のリガンドの担体懸濁液における濃度は、５〜５００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜２５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは２０〜２００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは２５〜１００μｇ／ｍｌである。
【００５５】
担体は、これに含まれる第２のリガンドが、標的化分子として機能する態様で存在していれば、薬物を内部に含んでも、薬物の外部に付着して存在しても、また、薬物と混合されていてもよい。ここで、標的化分子として機能するとは、第２のリガンドを含む担体が、これを含まない担体よりも迅速かつ／または大量に、標的細胞に到達し、かつ／または取り込まれることを意味し、これは、例えば、標識を付した、または標識を含む担体を細胞培養物に添加し、所定時間後に標識の存在部位を分析することにより容易に確認することができる。構造的には、例えば、第２のリガンドが、遅くとも標的細胞に到達するまでに、担体を含む製剤の外部に、少なくとも部分的に露出しているか、標的となる細胞要素が認識し得る態様で存在していれば、上記要件を充足し得る。
投与経路や薬物放出様式などに応じて、上記薬剤を、適切な材料、例えば、腸溶性のコーティングや、時限崩壊性の材料で被覆してもよく、また、適切な薬物放出システムに組み込んでもよい。
【００５６】
本発明において、標的細胞に関連する疾患を処置するための薬物は、標的細胞に関連する疾患を処置し得る任意の薬物を包含する。
標的細胞がフコシル化分子産生細胞である場合、標的細胞に関連する疾患を処置するための薬物としては、限定されずに、例えば、フコシル化分子産生細胞の活性または増殖を制御する薬物を含む。ここで、フコシル化分子産生細胞の活性とは、同細胞が示す分泌、取り込み、遊走等の種々の活性を指すが、例えば、腫瘍細胞においては、腫瘍の発症、進行、再発および／または転移、悪液質などの症状の発現や増悪化などに関与する活性を意味する。かかる活性としては、例えば、限定することなく、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）や免疫抑制酸性タンパク（ＩＡＰ）などの産生・分泌が挙げられる。
【００５７】
したがって、フコシル化分子産生細胞の活性または増殖を制御する薬物とは、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患の発症、進行および／または再発に関係するフコシル化分子産生細胞の物理的、化学的および／または生理的な作用等を直接または間接に抑制する何れの薬物であってもよい。例えば、腫瘍細胞においては、かかる薬物は限定されずに、上記生理活性物質の活性もしくは産生を阻害する薬物、例えば、前記生理活性物質を中和する抗体および抗体断片、前記生理活性物質の発現を抑制する、ＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｄＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｒａｓｉＲＮＡなど）、リボザイム、アンチセンス核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、またはこれらの複合物を含む）などの物質、もしくはドミナントネガティブ変異体等のドミナントネガティブ効果を有する物質、またはこれらを発現するベクター、ナトリウムチャンネル阻害剤などの細胞活性化抑制剤、アルキル化剤（例えば、イホスファミド、ニムスチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、ラニムスチン等）、抗腫瘍性抗生物質（例えば、イダルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、ミトキサントロン、マイトマイシンＣ等）および代謝拮抗剤（例えば、ゲムシタビン、エノシタビン、シタラビン、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン等）などの細胞増殖抑制剤、ならびにcompound  861、gliotoxinなどのアポトーシス誘導剤を包含する。また、本発明における「フコシル化分子産生細胞の活性または増殖を制御する薬物」は、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患の発症、進行および／または再発の抑制に直接または間接に関係するフコシル化分子産生細胞の物理的、化学的および／または生理的な作用等を直接または間接に促進する何れの薬物であってもよい。
【００５８】
フコシル化分子産生細胞の活性または増殖を制御する薬物としてはまた、フコシル化分子の産生を抑制する物質、例えば、フコシルトランスフェラーゼの機能を阻害する抗体および抗体断片、フコシルトランスフェラーゼの発現を抑制する、ＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｄＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｒａｓｉＲＮＡなど）、リボザイム、アンチセンス核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、またはこれらの複合物を含む）などの物質、もしくはドミナントネガティブ変異体等のドミナントネガティブ効果を有する物質、またはこれらを発現するベクターなどが挙げられる。フコシルトランスフェラーゼとしては、例えば、ＦＵＴ１、ＦＵＴ２、ＦＵＴ３、ＦＵＴ４、ＦＵＴ５、ＦＵＴ６、ＦＵＴ７およびＦＵＴ８等が挙げられ、これらに対するｓｉＲＮＡの配列として、例えば、下表２に記載のものなどを使用できる。フコシルトランスフェラーゼの他の例としては、ＦＵＴ９、ＦＵＴ１０、ＦＵＴ１１、ＰＯＦＵＴ１およびＰＯＦＵＴ２等が挙げられる。
【００５９】
本発明の一態様において、阻害されるフコシルトランスフェラーゼは、ＦＵＴ１、ＦＵＴ２、ＦＵＴ３およびＦＵＴ４からなる群から選択される。本発明の別の態様において、フコシルトランスフェラーゼは、ＦＵＴ１、ＦＵＴ２、ＦＵＴ４、ＦＵＴ５、ＦＵＴ６およびＦＵＴ８からなる群から選択される。本発明のさらに別の態様において、フコシルトランスフェラーゼは、ＦＵＴ１、ＦＵＴ２、ＦＵＴ３、ＦＵＴ４、ＦＵＴ５、ＦＵＴ６およびＦＵＴ８からなる群から選択される。また、本発明の一態様において、阻害されるフコシルトランスフェラーゼは、フコースをα１，４結合で転移できるものが好ましく、かかるフコシルトランスフェラーゼとしては、例えばＦＵＴ３等が挙げられる。また、本発明の一態様において、阻害されるフコシルトランスフェラーゼは、ＣＡ１９−９の産生と関連性の高いＦＵＴ３および／またはＦＵＴ６である。本発明の別の態様において、阻害されるフコシルトランスフェラーゼは、フコースをポリペプチドに結合できるものが好ましく、かかるフコシルトランスフェラーゼとしては、例えばＰＯＦＵＴ１、ＰＯＦＵＴ２などが挙げられる。また、本発明の一態様において、阻害されるフコシルトランスフェラーゼは、Ｎｏｔｃｈ−１のフコシル化と関連性の高いＰＯＦＵＴ１である。
【００６０】
フコシル化分子産生細胞に関連する疾患は、フコシル化分子産生細胞に起因する疾患のみならず、同細胞がその影響を受ける疾患をも包含し、限定されずに、腫瘍、例えば、膵臓腫瘍、胆道系腫瘍、肝臓腫瘍、消化管腫瘍、脳腫瘍、肺腫瘍、骨軟部腫瘍、造血器腫瘍、より具体的には、例えば、膵癌、胆道系癌、肝癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、さらには、乳癌、肺癌、子宮内膜癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫などの腫瘍性疾患や、膵炎、肝硬変、肝炎などの炎症性疾患を含む。また、創傷治癒に関与する内皮細胞、線維芽細胞およびケラチノサイトにおいてＮｏｔｃｈが活性化していることから（Chigurupati et al., PLoS One. 2007 Nov 14;2(11):e1167）、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患には、創傷も含まれる。
【００６１】
したがって、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患を処置するための薬物としては、限定されずに、例えば、腫瘍性疾患の発症、進行および／または再発を抑制する抗腫瘍剤、例えば、限定することなく、イホスファミド、ニムスチン（例えば、塩酸ニムスチン）、シクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、ラニムスチン等のアルキル化剤、ゲムシタビン（例えば、塩酸ゲムシタビン）、エノシタビン、シタラビン・オクホスファート、シタラビン製剤、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤（例えば、ＴＳ−１）、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン等の代謝拮抗剤、イダルビシン（例えば、塩酸イダルビシン）、エピルビシン（例えば、塩酸エピルビシン）、ダウノルビシン（例えば、塩酸ダウノルビシン、クエン酸ダウノルビシン）、ドキソルビシン（例えば、塩酸ドキソルビシン）、ピラルビシン（例えば、塩酸ピラルビシン）、ブレオマイシン（例えば、塩酸ブレオマイシン）、ペプロマイシン（例えば、硫酸ペプロマイシン）、ミトキサントロン（例えば、塩酸ミトキサントロン）、マイトマイシンＣ等の抗腫瘍性抗生物質、エトポシド、イリノテカン（例えば、塩酸イリノテカン）、ビノレルビン（例えば、酒石酸ビノレルビン）、ドセタキセル（例えば、ドセタキセル水和物）、パクリタキセル、ビンクリスチン（例えば、硫酸ビンクリスチン）、ビンデシン（例えば、硫酸ビンデシン）、ビンブラスチン（例えば、硫酸ビンブラスチン）等のアルカロイド、アナストロゾール、タモキシフェン（例えば、クエン酸タモキシフェン）、トレミフェン（例えば、クエン酸トレミフェン）、ビカルタミド、フルタミド、エストラムスチン（例えば、リン酸エストラムスチン）等のホルモン療法剤、カルボプラチン、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、ネダプラチン等の白金錯体、サリドマイド、ネオバスタット、ベバシズマブ等の血管新生阻害剤、Ｌ−アスパラギナーゼなどを挙げることができる。
【００６２】
フコシル化分子産生細胞に関連する疾患を処置するための薬物としてはさらにまた、限定されずに、炎症性疾患の発症、進行および／または再発を抑制する抗炎症剤、例えば、ステロイド系抗炎症剤（プレドニゾロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、フルチカゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン等）や非ステロイド系抗炎症剤（アセチルサリチル酸、ロキソプロフェン、アセトアミノフェン、ケトプロフェン、チアプロフェン酸、スプロフェン、トルメチン、カルプロフェン、ベノキサプロフェン、ピロキシカム、ベンジダミン、ナプロキセン、ジクロフェナク、イブプロフェン、ジフルニサール、アザプロパゾン等）、炎症性サイトカインの発現を抑制するＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｄＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｒａｓｉＲＮＡなど）、アンチセンス核酸などの物質、および／または炎症性サイトカインの作用を抑制する薬物、例えば、炎症性サイトカインに対する抗体や、炎症性サイトカインの受容体拮抗剤などを挙げることができる。
【００６３】
標的細胞が樹状突起細胞である場合、標的細胞に関連する疾患としては、限定されずに、例えば、種々の免疫疾患、例えば、アレルギー、免疫不全、感染症、腫瘍、癌等が挙げられる。したがって、標的細胞に関連する疾患を処置するための薬物としては、限定されずに、例えば、ステロイド、アザチオプリン、メルカプトプリン、シクロスポリンなどの免疫抑制剤、抗原、ＤＮＡワクチンなどの核酸ワクチン、ＮＦκＢデコイなどが挙げられる。
【００６４】
標的細胞が肝実質細胞である場合、標的細胞に関連する疾患としては、限定されずに、例えば、肝癌、感染症、例えば、ＨＢＶ感染症、ＨＣＶ感染症などのウイルス性肝炎、肝実質細胞の機能障害、例えば、高脂血症、酵素欠損症など、さらには、肝実質細胞に遺伝子を導入・発現することによって治癒し得る疾患、例えば、糖尿病、ＡＤＡ欠損症、血友病等が挙げられる。したがって、標的細胞に関連する疾患を処置するための薬物は疾患によって異なるが、限定されずに、例えば、抗癌剤、ウイルス遺伝子の発現を抑制するＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｄＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｒａｓｉＲＮＡなど）、リボザイム、アンチセンス核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、またはこれらの複合物を含む）などの物質、アポリポプロテインＢ遺伝子、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子、インスリン遺伝子、アデノシン・デアミナーゼ遺伝子、第ＶＩＩＩ因子遺伝子、第ＩＸ因子遺伝子、これらの核酸分子を発現させるベクター等が挙げられる。
【００６５】
標的細胞に関連する疾患を処置するための薬物は、標的細胞内に送達されることが好ましいが、状況によっては、標的細胞の周囲に送達されることが好ましい場合もある。例えば、標的細胞がフコシル化分子産生細胞である場合、炎症性サイトカインの発現を抑制するＲＮＡｉ分子、アンチセンス核酸などの物質は、フコシル化分子を産生しない炎症性サイトカイン産生細胞にも送達することができ、これにより膵炎や肝炎などの、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患をより有効に処置することができる。
【００６６】
標的細胞に関連する疾患を処置するための薬物は、標識されていてもいなくてもよい。標識化により、送達の成否や、標的細胞の増減などをモニタリングすることが可能となり、特に試験・研究レベルにおいて有用である。
本明細書において、標識は、それ自体、またはそれが付されたものを直接的または間接的に検出せしめることができる任意の物質を指す。標識は、当業者に公知な任意のもの、例えば、気体もしくは生理条件下で気体を発生する物質、任意の放射性同位体、磁性体、核磁気共鳴する元素（例えば、水素、リン、ナトリウム、フッ素等）、核磁気共鳴する元素の緩和時間に影響を与える物質（例えば、金属原子もしくはこれを含む化合物）、標識化物質に結合する物質（例えば抗体）、蛍光物質、フルオロフォア、化学発光物質、酵素、ビオチンもしくはその誘導体、アビジンもしくはその誘導体などから選択することができる。
【００６７】
本明細書において、標識は検出可能なものであってよく、これには、既存の任意の検出手段により検出し得る任意の標識が含まれる。検出手法としては、限定されることなく、例えば、肉眼、光学検査装置（例えば、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、位相差顕微鏡、in vivoイメージング装置など）、Ｘ線装置（例えば、単純Ｘ線装置、ＣＴ（コンピュータ断層撮影）装置など）、ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）装置、核医学検査装置（シンチグラフ装置、ＰＥＴ（positron emission tomography）装置、ＳＰＥＣＴ（single photon emission computed tomography）装置など）、超音波検査装置およびサーモグラフィー装置によるものなどが挙げられる。各検出手法に適した標識は当業者に知られており、例えば、Lecchi et al., Q J Nucl Med Mol Imaging. 2007;51（2）:111-26などに記載されている。
【００６８】
肉眼および光学検査装置での検出に適した標識としては、例えば、種々の蛍光標識および発光標識が挙げられる。
具体的な蛍光標識としては、限定されることなく、例えば、ＣｙTMシリーズ（例えば、ＣｙTM２、３、５、５．５、７など）、DyLightTMシリーズ（例えば、DyLightTM 405、488、549、594、633、649、680、750、800など）、Alexa Fluor(R)シリーズ（例えば、Alexa Fluor(R) 405、488、549、594、633、647、680、750など）、HiLyte FluorTMシリーズ（例えば、HiLyte FluorTM 488、555、647、680、750など）、ATTOシリーズ（例えば、ATTO488、550、633、647N、655、740など）、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、テキサスレッド、ＧＦＰ、ＲＦＰ、Ｑｄｏｔなどを用いることができる。in vivoイメージングに適した蛍光標識としては、例えば、生体透過性が高く、自家蛍光の影響を受けにくい波長、例えば、近赤外波長の蛍光を発するものや、蛍光強度の強いものが挙げられる。かかる蛍光標識としては、限定することなく、例えば、ＣｙTMシリーズ、DyLightTMシリーズ、Alexa Fluor(R)シリーズ、HiLyte FluorTMシリーズ、ATTOシリーズ、テキサスレッド、ＧＦＰ、ＲＦＰ、Ｑｄｏｔおよびこれらの誘導体などが挙げられる。
具体的な発光標識としては、限定されることなく、例えば、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン、イクオリンなどを用いることができる。
【００６９】
Ｘ線装置での検出に適した標識としては、例えば、種々の造影剤が挙げられる。具体的な造影剤としては、限定されることなく、例えば、ヨウ素原子、ヨウ素イオン、ヨウ素含有化合物などを用いることができる。
【００７０】
ＭＲＩ装置での検出に適した標識としては、例えば、核磁気共鳴する元素や核磁気共鳴する元素の緩和時間に影響を与える物質などが挙げられる。核磁気共鳴する元素には、例えば、水素、リン、ナトリウム、フッ素等が含まれる。核磁気共鳴する元素の緩和時間に影響を与える物質としては、限定されずに、種々の金属原子や１種または２種以上の該金属原子を含む化合物、例えば１種または２種以上の該金属原子の錯体などが挙げられる。具体的には、限定されることなく、例えば、ガドリニウム（ＩＩＩ）（Ｇｄ（ＩＩＩ））、イットリウム−８８（８８Ｙ）、インジウム−１１１（１１１Ｉｎ）、およびこれらと、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、（１，２−エタンジイルジニトリロ）四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン、２，２’−ビピリジン（ｂｉｐｙ）、１，１０−フェナントロリン（ｐｈｅｎ）、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ＤＰＰＥ）、２，４−ペンタンジオン（ａｃａｃ）、シュウ酸塩（ｏｘ）などの配位子との錯体、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、酸化マンガン（ＭｎＯ）などを用いることができる。
【００７１】
核医学検査装置での検出に適した標識としては、例えば、種々の放射性同位体や１種または２種以上の該放射性同位体を含む化合物、例えば１種または２種以上の該放射性同位体の錯体などが挙げられる。放射性同位体としては、限定されることなく、例えば、テクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ）、インジウム−１１１（１１１Ｉｎ）、ヨウ素−１２３（１２３Ｉ）、ヨウ素−１２４（１２４Ｉ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）、ヨウ素−１３１（１３１Ｉ）、タリウム−２０１（２０１Ｔｌ）、炭素−１１（１１Ｃ）、窒素−１３（１３Ｎ）、酸素−１５（１５Ｏ）、フッ素−１８（１８Ｆ）、銅−６４（６４Ｃｕ）、ガリウム−６７（６７Ｇａ）、クリプトン−８１ｍ（８１ｍＫｒ）、キセノン−１３３（１３３Ｘｅ）、ストロンチウム−８９（８９Ｓｒ）、イットリウム−９０（９０Ｙ)などを用いることができる。また、放射性同位体を含む化合物としては、限定されることなく、例えば、１２３Ｉ−ＩＭＰ、９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯ、９９ｍＴｃ−ＥＣＤ、９９ｍＴｃ−ＭＤＰ、９９ｍＴｃ−テトロフォスミン、９９ｍＴｃ−ＭＩＢＩ、９９ｍＴｃＯ４−、９９ｍＴｃ−ＭＡＡ、９９ｍＴｃ−ＭＡＧ３、９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡ、９９ｍＴｃ−ＤＭＳＡ、１８Ｆ−ＦＤＧ１などが挙げられる。
【００７２】
超音波検査装置での検出に適した標識としては、限定されることなく、例えば、生体許容性の気体もしくは生理条件下で気体を発生する物質、脂肪酸、または、これらの物質を含む物質が挙げられる。気体としては、限定されずに、例えば、空気、希ガス、窒素、Ｎ２Ｏ、酸素、二酸化炭素、水素、不活性希ガス（例えば、ヘリウム、アルゴン、キセノンまたはクリプトン）、フッ化硫黄（例えば、六フッ化硫黄、十フッ化二硫黄、トリフルオロメチル硫黄ペンタフルオリド）、六フッ化セレニウム、ハロゲン化シラン（例えば、テトラメチルシラン）、低分子炭化水素（例えば、Ｃ１〜７アルカン（メタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタンなど）、シクロアルカン（シクロブタン、シクロペンタンなど）、アルケン（エチレン、プロペン、ブテンなど））、フッ素含有ガス、アンモニアなど、生理条件下で気体を発生する物質としては、限定されずに、例えば、ドデカフルオロペンタン（ＤＤＦＰ）、生理条件下で気化するパーフルオロカーボン（特開2010-138137）などが、上記物質を含む物質としては、ナノ粒子、リポソームなどが挙げられる。フッ素含有ガスとしては、限定されずに、例えば、ハロゲン化炭化水素ガス（例えばブロモクロロジフルオロメタン、クロロジフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ブロモトリフルオロメタン、クロロトリフルオロメタン、クロロペンタフルオロエタン、ジクロロテトラフルオロエタン、パーフルオロカーボン）、フッ素化ケトン（例えば、パーフルオロアセトンなど）、フッ素化エーテル（例えば、パーフルオロジエチルエーテル）などが挙げられる。
【００７３】
パーフルオロカーボンとしては、限定されずに、例えばパーフルオロアルカン（例えば、パーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロ−ｎ−ブタン、パーフルオロペンタン、パーフルオロヘキサン、パーフルオロヘプタン）、パーフルオロアルケン（例えば、パーフルオロプロペン、パーフルオロブテン（例えば、パーフルオロブト−２−エン）、パーフルオロブタジエン）、パーフルオロアルキン（例えば、パーフルオロブト−２−イン）、パーフルオロシクロアルカン（例えば、パーフルオロシクロブタン、パーフルオロメチルシクロブタン、パーフルオロジメチルシクロブタン、パーフルオロトリメチルシクロブタン、パーフルオロシクロペンタン、パーフルオロメチルシクロペンタン、パーフルオロジメチルシクロペンタン、パーフルオロシクロヘキサン、パーフルオロメチルシクロヘキサン、パーフルオロシクロヘプタン）などが挙げられる。
【００７４】
超音波検査装置での検出に適した標識として、既に市販されているものを利用することもできる。市販されている超音波検査用標識としては、限定されずに、例えば、第１世代のAlbunex（Mallinckrodt）、Echovist（SHU 454、Schering）、Levovist（SHU 508、Schering）、Myomap（Quadrant）、Quantison（Quadrant）、Sonavist（Schering）、Sonazoid（GE Healthcare）など、第２世代のDefinity/luminity（Bristol-Myers Squibb Medical Imaging）、Imagent-imavist（Alliance）、Optison（GE Healthcare）、biSphere/cardiosphere（POINT Biomedical）、SonoVue (BR1, Bracco)、AI700/imagify（Acusphere）など、第３世代のEchogen（Sonus Pharmaceuticals）などが挙げられる（Reddy et al., World J Gastroenterol. 2011 Jan 7;17(1):42-8）。また、超音波検査装置での検出に適した標識は、上記のほか、特開平５−１９４２７８、特開平８−３１０９７１、特開平８−１５１３３５、特開２００２−３０８８０２、ＷＯ２００４／０６９２８４、ＷＯ２００５／１２０５８７などにも記載されている。
【００７５】
本発明において「標的細胞用」とは、担体や薬剤が標的細胞を標的として使用するのに適していることを意味し、これは例えば、担体や薬剤が標的細胞に、標的としない細胞よりも迅速、高効率かつ／または大量に送達されることを含む。例えば、本発明の標的化薬物または標的化担体は、標的細胞に、標的としない細胞に比べ、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．５倍以上、２倍以上、さらには３倍以上の速度および／または効率で送達され得る。
【００７６】
本発明の組合わせ医薬製剤における第１のリガンドを含む第１の成分と、第２のリガンドで標的化された薬剤を含む第２の成分とは、第１の成分が、第２の成分の標的特異性を高める限りは任意の比率で存在してもよく、当業者であれば、例えば、実験動物などの対象に、所定量の標識を付した第２の成分に対して、第１の成分の量を変化させるか、所定量の第１の成分に対して、標識を付した第２の成分の量を変化させて投与し、標的組織または細胞における標識量を測定することなどにより、適切な比率を適宜決定することができる。例えば、第１のリガンドとしてマンノースを、第２のリガンドとしてフコースをそれぞれ用いた場合、マンノースとフコースとの比率は、例えば質量比で、２００００：１〜２００：１、１００００：１〜３００：１、５０００：１〜５００：１、３０００：１〜１０００：１、２５００：１〜１５００：１、モル比で、１６０００：１〜１６０：１、８０００：１〜２４０：１、４０００：１〜４００：１、２４００：１〜５００：１、２０００：１〜１２００：１などとすることができる。また、第１のリガンドとしてマンノースを用いる場合、第１の成分の投与量は、マンノースとして１回あたり、０．０１〜１００００ｍｇ／ｋｇ体重、０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、０．５〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、または、０．０５〜５００００μモル／ｋｇ体重、０．５〜５０００μモル／ｋｇ体重、２．５〜２５００μモル／ｋｇ体重、５〜５００μモル／ｋｇ体重、２５〜２５０μモル／ｋｇ体重などとすることができる。
【００７７】
本発明の組合わせ医薬製剤において、第１の成分と第２の成分とは、同時投与または逐次投与することができる。したがって、第１の成分は、第２の成分と同時に投与しても、第２の成分の前に投与しても、第２の成分の後に投与してもよい。第１の成分と第２の成分とを逐次投与する場合、第１の成分の直後に第２の成分を連続して投与しても、第２の成分の直後に第１の成分を連続して投与しても、第１の成分を投与後、時間間隔を空けて第２の成分を投与しても、第２の成分を投与後、時間間隔を空けて第１の成分を投与してもよいし、これらの投与方法を組合わせてもよい。したがって、例えば、第１の成分を投与後、時間間隔を空けて、第１の成分と第２の成分を同時投与し、その後にさらに時間間隔を空けて第１の成分を投与してもよい。時間間隔は、４８時間以内、３６時間以内、２４時間以内、１２時間以内、６時間以内、５時間以内、４時間以内、３時間以内、２時間以内、１時間以内、３０分以内、１５分以内、または１０分以内などであってもよい。当業者であれば、例えば、実験動物などの対象に第１の成分および第２の成分を種々の順序および時間間隔で投与し、標的組織または細胞における標識量を測定することなどにより、適切な時間間隔を適宜決定することができる。
【００７８】
本発明の組合わせ医薬製剤は、第１の成分と第２の成分とを同時に投与する場合には、単一の投与形態としてもよいし、第１の成分と第２の成分とを別々の投与形態としてもよい。第１の成分と第２の成分とを同時に投与しない場合には、当然のことながら、第１の成分と第２の成分とを別々の投与形態とする。また、第１の成分と第２の成分とを同時に投与するのに加え、第１の成分をさらに別のタイミングで投与する場合には、第１の成分と第２の成分とを別々の投与形態としてもよいし、第１の成分と第２の成分とを含む単一の投与形態と、第１の成分のみを含む別の投与形態との組合わせとしてもよい。第１の成分と第２の成分とを別々の投与形態とする場合、第１の成分と第２の成分とは同一の包装で提供してもよいし、各成分を別包装としてもよい。また、本発明の組合わせ医薬製剤は、第１の成分と第２の成分とを組合わせて使用する方法を示した指示、例えば、使用説明書や、使用方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリーなどをさらに含んでもよい。
【００７９】
本発明の別の側面は、細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第１のリガンドを含む第１の成分と、該第１のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第２のリガンドで標的化された担体を含む第２の成分とを含む、標的細胞特異的に物質を送達するための組合わせ医薬組成物に関する。
本発明のこの側面における細網内皮系細胞、多特異性レクチン、第１のリガンド、第２のリガンド、標的化、担体、第１の成分と第２の成分との比率および投与順序については、本発明の組合わせ医薬製剤について上述したとおりである。ただし、本発明の組合わせ医薬組成物が送達する物質は、標的細胞に関連する疾患を処置するための薬物に限られず、投与部位から標的細胞が存在する病変部位へ、生物の体内を物理的に移動できるような大きさのものであれば任意の物質を含む。したがって、本発明の医薬組成物は、原子、分子、化合物、タンパク質、核酸等はもとより、ベクター、ウイルス粒子、細胞、１以上の要素で構成された薬物放出システム、マイクロマシン等の物質をも運搬することができる。前記物質は、好ましくは標的細胞および／またはその周囲に何らかの影響を与える性質を有し、例えば、標的細胞を標識するものや、標的細胞および／またはその周囲に存在する細胞の活性または増殖を制御する（例えば、これを増強または抑制する）ものを含む。
本発明の医薬組成物の一態様において、送達される物質は、本発明の組合わせ医薬製剤について上述した標識および／または標的細胞に関連する疾患を処置するための薬物である。
【００８０】
本発明の別の側面は、細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第１のリガンドを含む第１の成分と、該第１のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第２のリガンドで標的化された標識剤を含む第２の成分とを含む、標的細胞または標的細胞を含む組織（以下、標的組織と称することがある）を標識するための、標的細胞または標的細胞を含む組織を検出するための、標的細胞または標的細胞を含む組織をイメージングするための、標的細胞に関連する疾患を診断、検出および／またはモニタリングするための、標的細胞に関連する疾患の可能性を検出するための、および／または標的細胞に関連する疾患に対する処置の効果を評価するための、組合わせ医薬組成物（以下、標識含有組成物と称することがある）に関する。
本発明のこの側面における細網内皮系細胞、多特異性レクチン、第１のリガンド、第２のリガンド、標的化、第１の成分と第２の成分との比率および投与順序については、本発明の組合わせ医薬製剤について上述したとおりである。ここで、標識剤は、第２のリガンドで標的化された標識のみで構成されても、第２のリガンドで標的化された担体に担持された標識であっても、第２のリガンドで標的化された担体に担持された第２のリガンドで標的化された標識であってもよい。標識については、本発明の組合わせ製剤に関して上記したとおりである。
【００８１】
標的細胞を含む組織としては、標的細胞がフコシル化分子産生細胞である場合は、限定されずに、例えば、腫瘍組織、例えば、膵臓腫瘍、胆道系腫瘍、肝臓腫瘍、消化管腫瘍、脳腫瘍、肺腫瘍、骨軟部腫瘍、造血器腫瘍、より具体的には、膵癌、胆道系癌、肝癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、さらには、乳癌、肺癌、子宮内膜癌、前立腺癌、リンパ腫などの組織や、白血病に冒された骨髄組織、膵炎、肝硬変、肝炎などの炎症性疾患における炎症部位の組織、リンパ系などの免疫系の組織、創傷を受けた皮膚組織などが、標的細胞が樹状突起細胞である場合は、例えば、皮膚、鼻腔、肺、胃腸管などが、標的細胞が肝実質細胞である場合は、肝臓などが、それぞれ挙げられる。
【００８２】
標的細胞または標的細胞を含む組織の標識および検出（イメージングを含む）は、in vivoで行っても、in vitroで行ってもよい。また、前記組成物は、標識を、標的細胞または標的細胞を含む組織を標識するため、標的細胞または標的細胞を含む組織を検出するため、標的細胞または標的細胞を含む組織をin vivoまたはin vitroでイメージングするため、標的細胞に関連する疾患を診断、検出および／またはモニタリングするため、標的細胞に関連する疾患の可能性を検出するため、または標的細胞に関連する疾患に対する処置の効果を評価するための有効量で含んでもよい。該有効量は、例えば、標識が、in vivoまたはin vitroで検出され得る程度に、標的細胞に取り込まれる量であってもよい。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。前記組成物は、標識剤のほかに、任意の薬物、例えば、上記の標的細胞の活性または増殖を制御する薬物、標的細胞に関連する疾患を処置する薬物等を含んでもよい。
【００８３】
本発明のさらなる側面は、細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第１のリガンドを含む、該第１のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第２のリガンドで標的化された担体、薬剤または標識剤（以下、標的化担体等と略す場合がある）の標的特異性強化剤に関する。
本発明のこの側面における細網内皮系細胞、多特異性レクチン、第１のリガンド、第２のリガンド、標的化、担体、薬剤、標識剤、標的特異性については、本発明の組合わせ医薬製剤および組合わせ医薬組成物について上述したとおりである。
【００８４】
本発明の標的特異性強化剤は、上記の第２のリガンドで標的化された担体等の標的特異性を強化するものである。すなわち、第２のリガンドで標的化された担体等の標的特異性は、本発明の標的特異性強化剤の使用により、これを使用しなかった場合に比べて高まる。標的特異性の程度は、本発明の標的特異性強化剤と、第２のリガンドで標的化された担体等とを対象、例えば実験動物などに投与し、標的細胞における分布と、標的としない細胞における分布との差異、または、治療効果などを、第２のリガンドで標的化された担体等を、本発明の標的特異性強化剤と併用しなかった場合の分布の差異または治療効果などと比較することなどにより評価することができる。例えば、限定されずに、標的特異性強化剤と、第２のリガンドで標的化された担体等とを併用した場合の標的としない細胞における分布に対する標的細胞における分布の割合が、併用しなかった場合の割合より高い場合、または併用した場合の治療効果が併用しなかった場合のものより優れている場合、担体等の標的特異性が強化されているものとする。
【００８５】
本発明の標的特異性強化剤と、第２のリガンドで標的化された担体等との投与比率は、標的特異性強化剤が、担体等の標的特異性を高める限りは任意の比率であってよく、当業者であれば、例えば、実験動物などの対象に、所定量の標識を付した担体等に対して、標的特異性強化剤の量を変化させるか、所定量の標的特異性強化剤に対して、標識を付した担体等の量を変化させて投与し、標的組織または細胞における標識量を測定することなどにより、適切な比率を適宜決定することができる。例えば、第１のリガンドとしてマンノースを、第２のリガンドとしてフコースをそれぞれ用いた場合、マンノースとフコースとの比率は、例えば質量比で、２００００：１〜２００：１、１００００：１〜３００：１、５０００：１〜５００：１、３０００：１〜１０００：１、２５００：１〜１５００：１、モル比で、１６０００：１〜１６０：１、８０００：１〜２４０：１、４０００：１〜４００：１、２４００：１〜５００：１、２０００：１〜１２００：１などとすることができる。また、第１のリガンドとしてマンノースを用いる場合、標的特異性強化剤の投与量は、マンノースとして１回あたり、０．０１〜１００００ｍｇ／ｋｇ体重、０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、０．５〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、または、０．０５〜５００００μモル／ｋｇ体重、０．５〜５０００μモル／ｋｇ体重、２．５〜２５００μモル／ｋｇ体重、５〜５００μモル／ｋｇ体重、２５〜２５０μモル／ｋｇ体重などとすることができる。
【００８６】
本発明の標的特異性強化剤は、第２のリガンドで標的化された担体等と同時投与または逐次投与することができる。したがって、標的特異性強化剤は、担体等と同時に投与しても、担体等の前に投与しても、担体等の後に投与してもよい。標的特異性強化剤と担体等とを逐次投与する場合、標的特異性強化剤の直後に担体等を連続して投与しても、担体等の直後に標的特異性強化剤を連続して投与しても、標的特異性強化剤を投与後、時間間隔を空けて担体等を投与しても、担体等を投与後、時間間隔を空けて標的特異性強化剤を投与してもよいし、これらの投与方法を組合わせてもよい。したがって、例えば、標的特異性強化剤を投与後、時間間隔を空けて、標的特異性強化剤と担体等を同時投与し、その後にさらに時間間隔を空けて標的特異性強化剤を投与してもよい。時間間隔は、４８時間以内、３６時間以内、２４時間以内、１２時間以内、６時間以内、５時間以内、４時間以内、３時間以内、２時間以内、１時間以内、３０分以内、１５分以内、または１０分以内などであってもよい。当業者であれば、例えば、実験動物などの対象に標的特異性強化剤および担体等を種々の順序および時間間隔で投与し、標的組織または細胞における標識量を測定することなどにより、適切な時間間隔を適宜決定することができる。
【００８７】
本発明の医薬製剤、医薬組成物または標的特異性強化剤は、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる（例えば、標準薬剤学、渡辺喜照ら編、南江堂、２００３年などを参照）。
例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であることができる。
【００８８】
本発明の医薬製剤または医薬組成物は、いずれの形態で供給されてもよいが、保存安定性の観点から、用時調製可能な形態、例えば、医療の現場あるいはその近傍において、医師および／または薬剤師、看護士、もしくはその他のパラメディカルなどによって調製され得る形態で提供されてもよい。この場合、本発明の医薬製剤または医薬組成物は、これらに必須の構成要素の少なくとも１つを含む１個または２個以上の容器として提供され、使用の前、例えば、２４時間前以内、好ましくは３時間前以内、そしてより好ましくは使用の直前に調製される。調製に際しては、調製する場所において通常入手可能な試薬、溶媒、調剤器具などを適宜使用することができる。
【００８９】
本発明のさらなる側面は、細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第１のリガンドと、該第１のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第２のリガンドで標的化された、標的細胞に関連する疾患を処置するための薬剤とを、単独でまたは組み合わせて含む１または２以上の容器を含む、本発明の医薬製剤を調製するための、または標的細胞に関連する疾患を処置するためのキット、ならびに、そのようなキットの形で提供される本発明の医薬製剤の必要構成要素にも関する。また、本発明は、細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第１のリガンドと、該第１のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第２のリガンドで標的化された担体または標識剤とを、単独でまたは組み合わせて含む１または２以上の容器を含む、本発明の医薬組成物を調製するための、標的細胞に物質を送達するための、標的細胞または標的細胞を含む組織を標識するための、標的細胞または標的細胞を含む組織を検出するための、標的細胞または標的細胞を含む組織をイメージングするための、標的細胞に関連する疾患を診断、検出および／またはモニタリングするための、標的細胞に関連する疾患の可能性を検出するための、および／または標的細胞に関連する疾患に対する処置の効果を評価するためのキット、ならびに、そのようなキットの形で提供される本発明の医薬組成物の必要構成要素にも関する。
【００９０】
本発明のキットの各構成要素は、本発明の医薬製剤および医薬組成物について上記したとおりである。本キットは、上記のほか、本発明の医薬製剤または医薬組成物の調製方法や投与方法などに関する指示、例えば、使用説明書や、使用方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリーなどをさらに含んでいてもよい。また、本発明のキットは、本発明の医薬製剤または医薬組成物を完成するための構成要素の全てを含んでいてもよいが、必ずしも全ての構成要素を含んでいなくてもよい。したがって、本発明のキットは、医療現場や、実験施設などで通常入手可能な試薬や溶媒、例えば、無菌水や、生理食塩水、ブドウ糖溶液などを含んでいなくてもよい。
【００９１】
本発明のさらなる側面は、本発明の医薬製剤および／または医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、標的細胞の活性または増殖を制御するための、または標的細胞に関連する疾患を処置するための方法、さらには、本発明の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、標的細胞特異的に物質を送達するための、または標的細胞もしくは標的組織を標識するための、標的細胞または標的細胞を含む組織を検出するための、標的細胞または標的細胞を含む組織をイメージングするための、標的細胞に関連する疾患を診断、検出および／またはモニタリングするための、標的細胞に関連する疾患の可能性を検出するための、および／または標的細胞に関連する疾患に対する処置の効果を評価するための方法に関する。ここで、有効量とは、例えば、標的細胞の活性または増殖を制御するための方法については、標的細胞の活性または増殖を増大または減少させ得る量であり、標的細胞に関連する疾患を処置するための方法については、当該疾患の発症や再発を抑制し、症状を軽減し、または進行を遅延もしくは停止し得る量であり、好ましくは、当該疾患の発症および再発を予防し、または当該疾患を治癒する量であり、標的細胞特異的に物質を送達するための方法については、標的としていない細胞に比べて、標的細胞に、迅速および／または大量に物質を送達し得る量であり、標的細胞もしくは標的組織をin vivoまたはin vitroで標識するための、標的細胞または標的細胞を含む組織をin vivoまたはin vitroで検出するための、標的細胞または標的細胞を含む組織をin vivoまたはin vitroでイメージングするための、標的細胞に関連する疾患を診断、検出および／またはモニタリングするための、標的細胞に関連する疾患の可能性を検出するための、および／または標的細胞に関連する疾患に対する処置の効果を評価するための方法における有効量は、例えば、標的細胞もしくは標的組織を検出可能に標識し得る量である。
【００９２】
また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどの実験動物や、疾患モデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、医薬製剤に含まれる第１のリガンドおよび第２のリガンド、ならびに本発明の方法に用いる薬物や標識の用量は当業者に公知であるか、または、上記の試験等により適宜決定することができる。標的細胞もしくは標的組織を標識するための方法において、担体が送達するものは医薬組成物について上記した標識である。
標的細胞に関連する疾患の可能性は、標的細胞に関連する疾患と関連性の高い指標の存在を含み、かかる指標としては、例えば、正常個体より多い標的細胞の数、正常個体より高い標的細胞の活性、正常個体における標的細胞の検出結果と異なる検出結果等が含まれる。
【００９３】
本発明の方法において投与する医薬製剤または医薬組成物の具体的な用量は、処置を要する対象に関する種々の条件、例えば、標的の種類、方法の目的、治療内容、疾患の種類、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。
投与経路としては、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路が含まれる。
投与頻度は、用いる製剤または組成物の性状や、上記のような対象の条件によって異なるが、例えば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎など）、１週間に数回（例えば、１週間に２、３、４回など）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎など）であってもよい。この場合、各投与において、本医薬製剤または医薬組成物の第１の成分および第２の成分を両方とも投与することが好ましいが、投与頻度が多い場合、例えば、１日多数回投与する場合には、第１の成分の投与頻度を第２の成分の投与頻度に対して減少させることも可能である。ここで、各投与とは、第２の成分の１回の投与あたり第１の成分を複数回投与する場合には、これら一連の投与を含む。
【００９４】
本発明の検出、イメージング、診断、モニタリングおよび／または評価方法は、前記標識含有組成物に含まれる標識を検出することをさらに含んでもよい。標識は、検出の時点で組成物に含まれていても、これと分離して存在していてもよい。標識の検出は、標識を検出し得る任意の手法、例えば、限定することなく、肉眼、光学検査装置（例えば、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、位相差顕微鏡、in vivoイメージング装置など）、Ｘ線装置（例えば、単純Ｘ線装置、ＣＴ（コンピュータ断層撮影）装置など）、ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）装置、核医学検査装置（シンチグラフ装置、ＰＥＴ装置、ＳＰＥＣＴ装置など）、超音波検査装置およびサーモグラフィー装置による手法などにより行うことができる。各検出手法に適した標識は当業者に知られており（例えば、Lecchi et al., Q J Nucl Med Mol Imaging. 2007;51（2）:111-26などを参照）、非限定的な例はすでに上記したとおりである。
【００９５】
本発明の一態様において、標的細胞はin vivoで検出（例えば、イメージング）される。かかる検出には、限定することなく、光学検査装置（例えば、in vivoイメージング装置など）、Ｘ線装置（例えば、単純Ｘ線装置、ＣＴ（コンピュータ断層撮影）装置など）、ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）装置、核医学検査装置（シンチグラフ装置、ＰＥＴ装置、ＳＰＥＣＴ装置など）、超音波検査装置およびサーモグラフィー装置などの、in vivo検出に適した任意の装置を用いることができ、かかる検出に適した標識も当業者に知られている（例えば、Lecchi et al., Q J Nucl Med Mol Imaging. 2007;51（2）:111-26などを参照）。
【００９６】
標的細胞をin vivoで検出（例えば、イメージング）することにより、標的細胞の存在部位（例えば、臓器や器官）や、標的細胞に関連する疾患の病巣を決定することができる。したがって、本発明は、前記標識含有組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、標的細胞の存在部位および／または標的細胞に関連する疾患の病巣の決定方法にも関する。かかる方法は、標的細胞に関連する疾患の診断に資することができる。
また、標識をin vitroまたはin vivoで検出することにより、標的細胞の数、分布など、標的細胞に関連する疾患の診断に資する情報を得ることができる。したがって、本発明は、前記標識含有組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、標的細胞に関連する疾患の診断を補助する方法にも関する。同方法は、標的細胞に関連する疾患の診断に資する情報を、医師に提供することをさらに含んでもよい。
【００９７】
本発明の標的細胞に関連する疾患の検出および診断方法、標的細胞に関連する疾患の可能性の検出方法、および標的細胞に関連する疾患の診断を補助する方法は、対象における標識の検出結果と、基準となる標識の検出結果とを比較することをさらに含んでもよい。基準となる標識の検出結果は、例えば、標的細胞に関連する疾患を有しないことが分かっている対象における標識の検出結果（「陰性検出結果」とも称する）、または、標的細胞に関連する疾患を有していることが分かっている対象における標識の検出結果（「陽性検出結果」とも称する）であってもよい。ここで、例えば、対象における標識の検出結果が陰性検出結果と同等（例えば、それと顕著に異ならない）であれば、陰性と判定し、対象における標識の検出結果が陰性検出結果を顕著に上回る場合、陽性と判定することができる。また、対象における標識の検出結果が陽性検出結果と同等である（例えば、それと顕著に異ならない）場合に、陽性と判定することもできる。
【００９８】
本発明の検出、イメージング、診断、診断補助、モニタリングおよび／または評価方法における標識の検出結果は、検出された標識のシグナル強度および／またはシグナル分布であってもよい。
ここで標識のシグナル強度は、標識から発せられる種々のシグナル、例えば、蛍光シグナル、発光シグナル、磁性シグナル、放射性シグナルなどの強さまたはこれに類する測定値を意味し、典型的には適切な検出手段で測定される。検出手段の具体例は、すでに上述した。シグナル強度は、対象の全体から得られるものであっても、対象の特定の部位または領域から得られるものであってもよい。また、シグナル強度は、測定する部位の面積または体積に対する平均値であってもよいし、積算値であってもよい。シグナル強度が経時的に変化する場合、本方法におけるシグナル強度は、ある特定の時点のものであってもよいし、ある期間について積算されたものであってもよい。疾患の進行に従って標的細胞の数、活性等が増大する場合、シグナル強度の増大は疾患の存在または進行の指標となり得、逆にシグナル強度の低減は、疾患の改善の指標となり得る。
【００９９】
標識のシグナル分布は、標識から発せられるシグナルの対象における位置に関する情報を意味し、これは２次元的なものであっても３次元的なものであってもよい。シグナル分布を、解剖学的な臓器の位置関係、または、ＣＴ像、ＭＲＩ像、超音波像などの組織の構造的な情報と照合することにより、シグナルがどの組織から発せられているのかを特定することができる。シグナル分布が経時的に変化する場合、本方法におけるシグナル分布は、ある特定の時点のものであってもよいし、ある期間について積算されたものであってもよい。疾患の進行に従って標的細胞の存在領域が拡大する場合、シグナル分布の拡大は疾患の存在または進行の指標となり得、逆にシグナル分布の縮小は、疾患の改善の指標となり得る。
本発明の方法においては、シグナル強度とシグナル分布とを組み合わせて評価することも可能である。どの位置にどの程度の強度のシグナルが検出されるかを評価することにより、より精確な判定や、より正確な情報の提供を行うことができる。
【０１００】
本発明のモニタリング方法は、第１の時点の検出結果と、第１の時点より後の第２の時点の検出結果とを比較することをさらに含んでもよい。例えば、検出結果が標的細胞の数に関する指標（例えば、標的細胞に取り込まれた標識からのシグナル強度、シグナル分布など）である場合、第２の時点での指標が第１の時点での指標よりも小さいことは、標的細胞の数の減少を示し、標的細胞に関連する疾患が、標的細胞の増殖により悪化するものであれば、当該標的細胞に関連する疾患が改善したことを意味する。例えば、ここで、第２の時点におけるシグナル強度が第１の時点におけるシグナル強度よりも低ければ、疾患が改善していると判定することができ、また逆に第２の時点におけるシグナル強度が第１の時点におけるシグナル強度よりも高ければ、疾患が悪化していると判定することができる。また、例えば、第２の時点におけるシグナル分布が第１の時点におけるシグナル分布よりも縮小していれば、疾患が改善していると判定することができ、また逆に第２の時点におけるシグナル分布が第１の時点におけるシグナル分布よりも拡大していれば、疾患が悪化していると判定することができる。
【０１０１】
本発明の処置の効果の評価方法は、治療前の第１の時点の検出結果と、第１の時点より後の、治療後の第２の時点の検出結果、または、第１の治療の後の第１の時点の検出結果と、第１の治療の後になされた第２の治療の後の第２の時点の検出結果とを比較することをさらに含んでもよい。例えば、検出結果が標的細胞の数に関する指標（例えば、標的細胞に取り込まれた標識からのシグナル強度、シグナル分布など）である場合、第２の時点での指標が第１の時点での指標よりも小さいことは、標的細胞の数の減少を示し、標的細胞に関連する疾患が、標的細胞の増殖により悪化するものであれば、当該標的細胞に関連する疾患が改善したこと、すなわち、処置の効果がポジティブであることを意味する。例えば、ここで、第２の時点におけるシグナル強度が第１の時点におけるシグナル強度よりも低ければ、疾患が処置により改善しており、したがって、処置が成功していると判定することができ、また逆に第２の時点におけるシグナル強度が第１の時点におけるシグナル強度よりも高ければ、疾患が処置により悪化しており、処置があまり成功していないか、不成功であると判定することができる。また、例えば、第２の時点におけるシグナル分布が第１の時点におけるシグナル分布よりも縮小していれば、疾患が処置により改善しており、したがって、処置が成功していると判定することができ、また逆に第２の時点におけるシグナル分布が第１の時点におけるシグナル分布よりも拡大していれば、疾患が処置により悪化しており、処置があまり成功していないか、不成功であると判定することができる。
【０１０２】
本発明のさらなる側面は、本発明の標的特異性強化剤の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、本発明の第２のリガンドで標的化された担体、薬剤または標識剤（以下、標的化担体等と略す場合がある）の標的特異性を強化するための方法に関する。ここで、有効量とは、例えば、上記担体、薬剤または標識剤の標的特異性を高め、上記薬剤の治療効果を高める量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどの実験動物や、疾患モデル動物における、上記のような標的特異性を評価するための試験などにより適宜決定することができる。また、標的特異性強化剤に含まれる第１のリガンドの用量は上記の試験等により適宜決定することができる。第１のリガンドとしてマンノースを、第２のリガンドとしてフコースをそれぞれ用いた場合のマンノースとフコースとの比率、およびマンノースの用量は、本発明の標的特異性強化剤について上記したとおりである。
【０１０３】
本発明の方法において投与する標的特異性強化剤の具体的な用量は、処置を要する対象に関する種々の条件、例えば、標的の種類、疾患の種類、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。
投与経路としては、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路が含まれる。
投与頻度は、用いる剤の性状や、上記のような対象の条件によって異なるが、例えば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎など）、１週間に数回（例えば、１週間に２、３、４回など）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎など）であってもよい。この場合、各投与において、標的特異性強化剤および第２のリガンドで標的化された担体等を両方とも投与することが好ましいが、投与頻度が多い場合、例えば、１日多数回投与する場合には、標的特異性強化剤の投与頻度を担体等の投与頻度に対して減少させることも可能である。また、担体等の１回の投与に対し、標的特異性強化剤を複数回（２、３、４回または５回以上など）投与してもよく、これらの投与は担体等の投与と同時、および／または投与の前および／もしくは後であってもよい。したがって、例えば、標的特異性強化剤を、担体等の投与前に１回、担体等の投与と同時に１回、さらに担体等の投与後に１回といったタイミングで複数回投与することができる。
【０１０４】
本発明の方法において、用語「対象」は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、標的細胞に関連する疾患の処置、検出、診断、診断補助もしくはモニタリング、または標的細胞に関連する疾患の可能性の検出が企図される場合には、典型的には当該疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を、標的化薬剤、標識剤または担体の標的特異性の強化が企図される場合には、かかる薬剤、標識剤または担体を投与する予定の対象または投与した対象を、標的細胞に関連する疾患に対する処置の効果の評価が企図される場合には、典型的には当該疾患に対する治療を受けているか、受けようとしている対象を、それぞれ意味する。
また、用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、標的細胞に関連する疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、当該疾患発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
【０１０５】
本発明の１つの側面は、フコースを含む、フコシル化分子産生細胞用物質送達担体に関する。本発明の一態様は、フコースによってフコシル化分子産生細胞に標的化された担体に関する。同担体は、フコシル化分子産生細胞に対する標的化のための有効量のフコースを含んでもよい。したがって、本発明の一態様は、フコシル化分子産生細胞に対する標的化のための有効量のフコースを含む、前記細胞に標的化された担体に関する。また、同担体は、フコシル化分子産生細胞へ物質を送達するために用いることができる。したがって、本発明の一態様は、フコースを含む、フコシル化分子産生細胞へ物質を送達するための担体に関する。フコシル化分子産生細胞については、本発明の組合わせ医薬製剤に関して上記したとおりである。
【０１０６】
本発明の別の側面は、フコースを含む、フコース結合機構保有細胞用物質送達担体に関する。この担体は、フコース結合機構をその標的とするものである。したがって、本発明の一態様は、フコースによってフコース結合機構保有細胞に標的化された担体に関する。フコース結合機構に関する詳細は上記のとおりである。同担体は、フコース結合機構保有細胞に対する標的化のための有効量のフコースを含んでもよい。したがって、本発明の一態様は、フコース結合機構保有細胞に対する標的化のための有効量のフコースを含む、前記細胞に標的化された担体に関する。また、同担体は、フコース結合機構保有細胞へ物質を送達するために用いることができる。したがって、本発明の一態様は、フコースを含む、フコース結合機構保有細胞へ物質を送達するための担体に関する。また、フコース結合機構は、フコシル化分子の産生量およびフコシルトランスフェラーゼの発現量と関連しているため、これらをフコース結合機構保有の指標として用いることもできる。したがって、本発明の一態様において、フコース結合機構保有細胞は、フコシル化分子を産生する。また、本発明の別の態様において、フコース結合機構保有細胞はフコシルトランスフェラーゼを発現する。フコシル化分子の産生およびフコシルトランスフェラーゼの発現に関する詳細は、本発明の組合わせ医薬製剤に関して上記したとおりである。
【０１０７】
本発明のさらなる側面は、フコースを含む、フコシルトランスフェラーゼ発現細胞用物質送達担体に関する。同担体は、フコシルトランスフェラーゼ発現細胞に対する標的化のための有効量のフコースを含んでもよい。したがって、本発明の一態様は、フコシルトランスフェラーゼ発現細胞に対する標的化のための有効量のフコースを含む、前記細胞に標的化された担体に関する。また、同担体は、フコシルトランスフェラーゼ発現細胞へ物質を送達するために用いることができる。したがって、本発明の一態様は、フコースを含む、フコシルトランスフェラーゼ発現細胞へ物質を送達するための担体に関する。フコシルトランスフェラーゼの発現に関する詳細は上記のとおりである。フコシルトランスフェラーゼの発現はフコシル化分子の産生およびフコース結合機構の存在と関連しているため、これらをフコシルトランスフェラーゼ発現の指標として用いることもできる。したがって、本発明の一態様において、フコシルトランスフェラーゼ発現細胞は、フコシル化分子を産生する。また、本発明の別の態様において、フコシルトランスフェラーゼ発現細胞はフコース結合機構を有する。フコシル化分子の産生およびフコース結合機構の存在に関する詳細は、本発明の組合わせ医薬製剤に関して上記したとおりである。
【０１０８】
本明細書中、標的化とは、物質、例えば薬剤や担体などを、特定の標的、例えば特定の細胞や組織（本発明においてはフコシル化分子産生細胞および／またはフコース結合機構保有細胞および／またはフコシルトランスフェラーゼ発現細胞（以下、代表的にフコシル化分子産生細胞のみを記載する）やかかる細胞を含む組織）などに、標的としない細胞や組織よりも、標的化していない前記物質と比較して、迅速、効率的かつ／または大量に送達すること、すなわち標的に特異的に送達することを可能にすることをいい、標的化剤とは、物質と結合または反応した場合に、当該物質をこのように標的化できる物質を意味する。したがって、本発明におけるフコースは、標的化剤として機能する。また、標的特異性とは、標的化された物質、例えば、薬剤や担体などが、標的細胞へ、標的としない細胞よりも迅速、効率的かつ／または大量に送達される程度を意味し、これが高ければ、標的化物質はより効率的に標的細胞に送達され、標的としない細胞への送達は抑制される。
【０１０９】
本発明の担体に含まれるフコースは、フコシル化分子産生細胞への物質送達を促進するものであれば特に限定されず、例えばＬ−フコース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコースおよび／またはＤ−フコースを含む糖鎖、例えば、Ｌ−フコースおよび／またはＤ−フコースを側鎖に含む糖鎖やＬ−フコースおよび／またはＤ−フコースを非還元末端に含む糖鎖、Ｌ−フコースおよび／またはＤ−フコースが結合したポリペプチドもしくは脂質などを用いることができる。
【０１１０】
本発明の担体は、これらのフコース自体で構成してもよいし、フコースを、これとは別の担体構成成分に結合または包含させることにより構成してもよい。したがって、本発明の担体は、フコース以外の担体構成成分を含んでいてもよい。この場合、フコース以外の担体構成成分とフコースとの関係は、フコースが標的化剤として機能し得る形でフコース以外の担体構成成分が形成する構造体と複合体を形成していれば特に限定されず、フコースが、標的とする細胞要素と接触可能な態様で、フコース以外の担体構成成分が形成する構造体と直接、または、リンカー、スペーサーなどの介在化学要素を介して結合したものを含む。フコース以外の担体構成成分としては、特に限定されずに、医薬および薬学の分野で知られる任意のものを用いることができるが、フコースを包含し得るか、または、これと結合し得るものが好ましい。
【０１１１】
このような成分としては、脂質、例えば、グリセロリン脂質などのリン脂質、スフィンゴミエリンなどのスフィンゴ脂質、コレステロールなどのステロール、大豆油、ケシ油などの植物油、鉱油、卵黄レシチンなどのレシチン類、ポリエチレングリコール、ＰＥＧ:ポリマー担体等が挙げられるが、これらに限定されない。このうち、リポソームを構成し得るもの、例えば、レシチンなどの天然リン脂質、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）などの半合成リン脂質、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、コレステロールなどが好ましい。
【０１１２】
特に好ましい成分としては、細網内皮系による捕捉を回避し得る成分、例えば、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタメートクロリド（ＴＭＡＧ）、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラパルミチルスペルミン（ＴＭＴＰＳ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ジドデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアンモニオプロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド（ＤＣ−６−１４）などのカチオン性脂質が挙げられる。
【０１１３】
本発明の担体へのフコースの結合または包含は、化学的および／または物理的な方法によってフコースを担体の他の構成成分に結合させるかまたは包含させることによっても可能となる。フコースを担体に結合させる方法としては、限定されずに、例えば、リポソームをトリス（ヒドロキシアルキル）アミノアルカンにより親水性化処理し、リンカータンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの生体由来のタンパク質を結合させ、これに糖鎖を結合させる方法（WO2007/091661、Hirai et al., Biochem Biophys Res Commun. 2007;353(3):553-8、Hirai et al., Int J Pharm. 2010;391(1-2):274-83）、糖付加コレステロール誘導体でリポソームを作製する方法（特許文献１）、ポリ−Ｌ−リジンに糖を付加する方法（上記Negre et al.）、糖脂質でリポソームを作製する方法またはｐ−アミノフェニル−D−グリコシドをグルタルアルデヒドを用いてホスファチジルエタノールアミンリポソームに共有結合する方法（Ghosh P et al., Biochim Biophys Acta. 1980;632(4):562-72）、コレステン−５−イルオキシ−Ｎ−（４−（（１−イミノ−２−β−D−チオグリコシルエチル）アミノ）ブチル）ホルムアミドでリポソームを作製する方法（非特許文献１）等が挙げられる。または、本発明の担体へのフコースの結合または包含は、該担体の作製時に、フコースと、それ以外の担体構成成分とを混合することによっても可能となる。
【０１１４】
本発明の担体に結合させるかまたは包含させるフコースの量は、限定されずに、担体構成成分中の重量比で０．０１％〜１００％、好ましくは０．２％〜２０％、さらに好ましくは１〜５％とすることが可能である。担体へのフコースの結合または包含は、該担体に薬物等を担持させる前に行ってもよいし、担体、フコースおよび薬物等を同時に混合することなどによって行ってもよいし、または、薬物等を既に担持した状態の担体と、フコースとを混合することなどによって行ってもよい。したがって、本発明はまた、既存の任意の薬物結合担体や薬物封入担体、例えば、ＤａｕｎｏＸｏｍｅe（Ｒ）、Ｄｏｘｉｌ、Ｃａｅｌｙｘ（Ｒ）、Ｍｙｏｃｅｔ（Ｒ）などのリポソーム製剤にフコースを結合させる工程を含む、フコシル化分子産生細胞特異的製剤の製造方法にも関する。
【０１１５】
本発明の担体の形態は、所望の物質や物体を、標的とする細胞に運搬できればいずれの形態でもよく、例えば、限定するものではないが、高分子ミセル、リポソーム、エマルジョン、微小球、ナノ小球、ポリマーマトリックス、リポプレックスなどのうちいずれの形態をとることもできる。本発明においては、送達効率の高さ、送達できる物質の選択肢の広さや製剤の容易性等の観点から、これらのうちリポソームまたはリポプレックスの形態が好ましく、中でもカチオン性脂質を含むカチオン性リポソームが特に好ましい。担体がリポソームの形態である場合、フコースとリポソーム構成脂質とのモル比は、好ましくは８：１〜１：８、より好ましくは４：１〜１：４、さらに好ましくは２：１〜１：２、特に１：１である。別の態様において、フコースの担体懸濁液における濃度は、５〜５００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜２５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは２０〜２００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは２５〜１００μｇ／ｍｌである。
【０１１６】
本発明の担体は、これに含まれるフコースが、標的化分子として機能する態様で存在していれば、運搬物を内部に含んでも、運搬物の外部に付着して存在しても、また、運搬物と混合されていてもよい。ここで、標的化分子として機能するとは、フコースを含む担体が、これを含まない担体よりも迅速かつ／または大量に、標的細胞に到達し、かつ／または取り込まれることを意味し、これは、例えば、標識を付した、または標識を含む担体を細胞培養物に添加し、所定時間後に標識の存在部位を分析することにより容易に確認することができる。構造的には、例えば、フコースが、遅くとも標的細胞に到達するまでに、担体を含む製剤の外部に、少なくとも部分的に露出しているか、標的となる細胞要素が認識し得る態様で存在していれば、上記要件を充足し得る。
【０１１７】
本担体が送達する物質や物体は特に制限されないが、投与部位から標的細胞が存在する病変部位へ、生物の体内を物理的に移動できるような大きさであることが好ましい。したがって、本発明の担体は、原子、分子、化合物、タンパク質、核酸等の物質はもとより、ベクター、ウイルス粒子、細胞、１以上の要素で構成された薬物放出システム、マイクロマシン等の物体をも運搬することができる。前記物質または物体は、好ましくは標的細胞および／またはその周囲に何らかの影響を与える性質を有し、例えば、標的細胞を標識するものや、標的細胞および／またはその周囲に存在する細胞の活性または増殖を制御する（例えば、これを増強または抑制する）ものを含む。
【０１１８】
したがって、本発明の一態様においては、担体が送達する物は、本発明の組合せ医薬製剤に関して上記した「フコシル化分子産生細胞の活性または増殖を制御する薬物」である。本発明の担体の送達物としてはまた、フコシル化糖分子生細胞に関連する疾患を処置する薬物である。これらの薬物については、本発明の組合わせ医薬製剤に関して上記したとおりである。
【０１１９】
本発明において「フコシル化分子産生細胞用」とは、フコシル化分子産生細胞を標的として使用するのに適していることを意味し、これは例えば、フコシル化分子産生細胞に、フコシル化分子非産生細胞よりも迅速、高効率かつ／または大量に物質を送達できることを含む。例えば、本発明の担体は、フコシル化分子産生細胞に、フコシル化分子非産生細胞に比べ、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．５倍以上、２倍以上、さらには３倍以上の速度および／または効率で物質を送達することができる。
【０１２０】
本発明はまた、前記担体と、前記フコシル化分子産生細胞の活性または増殖を制御する薬物とを含む組成物（以下、薬物含有組成物と称することがある）、および、前記担体の、かかる組成物の製造への使用に関する。本発明の一態様において、前記組成物は、フコシル化分子産生細胞の活性または増殖を制御するための、またはフコシル化分子産生細胞に関連する疾患を処置するためのものであってよい。また、前記組成物は、フコシル化分子産生細胞の活性または増殖を制御する薬物を、フコシル化分子産生細胞の活性または増殖を制御するため、またはフコシル化分子産生細胞に関連する疾患を処置するための有効量で含んでもよい。ここで、有効量とは、例えば、後者については、当該疾患の発症や再発を抑制し、症状を軽減し、または進行を遅延もしくは停止する量であり、好ましくは、当該疾患の発症および再発を予防し、または当該疾患を治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、担体に含まれるフコース、および本発明の方法に用いる薬物の用量は当業者に公知であるか、または、上記の試験等により適宜決定することができる。
【０１２１】
本発明の組成物におけるフコシル化分子産生細胞の活性または増殖を制御する薬物およびフコシル化分子産生細胞に関連する疾患は、本発明の組合わせ医薬製剤に関連してすでに上記したとおりである。したがって、前記組成物は、標識された薬物を含んでもよい。また、前記組成物は、フコシル化分子産生細胞の活性または増殖を制御する薬物のほか、標識や、他の薬物、例えば、上記したフコシル化分子産生細胞に関連する疾患を処置する薬物などをさらに含んでもよい。
【０１２２】
本発明はさらに、前記担体と、標識とを含む組成物（以下、標識含有組成物と称することがある）、および、前記担体の、かかる組成物の製造への使用に関する。本発明の一態様において、前記組成物は、フコシル化分子産生細胞またはこれを含む組織を標識するための、フコシル化分子産生細胞またはこれを含む組織を検出するため、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患を診断、検出および／またはモニタリングするための、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患の可能性を検出するための、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患の診断を補助するための、またはフコシル化分子産生細胞に関連する疾患に対する処置の効果を評価するためのものであってよい。フコシル化分子産生細胞またはこれを含む組織は、in vivoまたはin vitroイメージングによって検出してもよい。したがって、上記組成物はフコシル化分子産生細胞またはこれを含む組織の、in vivoまたはin vitroイメージングに用いることができる。また、前記組成物は、標識を、フコシル化分子産生細胞またはこれを含む組織を標識するため、フコシル化分子産生細胞またはこれを含む組織を検出するため、フコシル化分子産生細胞またはこれを含む組織をin vivoまたはin vitroでイメージングするため、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患を診断、検出および／またはモニタリングするため、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患の可能性を検出するため、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患の診断を補助するため、またはフコシル化分子産生細胞に関連する疾患に対する処置の効果を評価するための有効量で含んでもよい。
【０１２３】
ここで、フコシル化分子産生細胞またはこれを含む組織を標識するため、フコシル化分子産生細胞またはこれを含む組織を検出するため、フコシル化分子産生細胞またはこれを含む組織をin vivoまたはin vitroでイメージングするため、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患を診断、検出および／またはモニタリングするため、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患の可能性を検出するため、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患の診断を補助するため、またはフコシル化分子産生細胞に関連する疾患に対する処置の効果を評価するための有効量は、例えば、標識が、in vivoまたはin vitroで検出され得る程度に、フコシル化分子産生細胞に取り込まれる量であってもよい。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。
【０１２４】
本発明の標識含有組成物における標識およびフコシル化分子産生細胞に関連する疾患、フコシル化分子産生細胞を含む組織は、本発明の組合わせ医薬製剤および組合わせ医薬組成物に関連してすでに上記したとおりである。前記組成物は、標識のほかに、任意の薬物、例えば、上記のフコシル化分子産生細胞の活性または増殖を制御する薬物、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患を処置する薬物等を含んでもよい。
本発明の組成物においては、担体に含まれるフコースが標的化分子として機能する態様で存在する限り、担体は、送達物をその内部に含んでも、送達物の外部に付着して存在しても、また、送達物と混合されていてもよい。したがって、投与経路や薬物放出様式などに応じて、上記組成物を、適切な材料、例えば、腸溶性のコーティングや、時限崩壊性の材料で被覆してもよく、また、適切な薬物放出システムに組み込んでもよい。
【０１２５】
本発明の組成物は、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる（例えば、標準薬剤学、渡辺喜照ら編、南江堂、２００３年などを参照）。
例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であることができる。
したがって、本発明の組成物は、１または２以上の薬学的に許容し得る界面活性剤、担体、希釈剤および／または賦形剤を含む医薬組成物とすることができる。薬学的に許容し得る担体、希釈剤等は医薬分野でよく知られており、例えば、その全体を本明細書に援用するRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)などに記載されている。
【０１２６】
本発明の担体または組成物は、いずれの形態で供給されてもよいが、保存安定性の観点から、好ましくは用時調製可能な形態、例えば、医療の現場あるいはその近傍において、医師および／または薬剤師、看護士、もしくはその他のパラメディカルなどによって調製され得る形態で提供される。この場合、本発明の担体または組成物は、これらに必須の構成要素の少なくとも１つを含む１個または２個以上の容器として提供され、使用の前、例えば、２４時間前以内、好ましくは３時間前以内、そしてより好ましくは使用の直前に調製される。調製に際しては、調製する場所において通常入手可能な試薬、溶媒、調剤器具などを適宜使用することができる。
【０１２７】
したがって、本発明はまた、フコース、および／または送達物、および／またはフコース以外の担体構成物質を、単独でもしくは組み合わせて含む１個または２個以上の容器を含む担体もしくは組成物の調製キット、ならびに、そのようなキットの形で提供される担体または組成物の必要構成要素にも関する。本発明のキットは、上記のほか、本発明の担体および組成物の調製方法や投与方法などに関する指示、例えば、説明書や、使用方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリーなどをさらに含んでいてもよい。また、本発明のキットは、本発明の担体または組成物を完成するための構成要素の全てを含んでいてもよいが、必ずしも全ての構成要素を含んでいなくてもよい。したがって、本発明のキットは、医療現場や、実験施設などで通常入手可能な試薬や溶媒、例えば、無菌水や、生理食塩水、ブドウ糖溶液などを含んでいなくてもよい。
【０１２８】
本発明はさらに、前記薬物含有組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、フコシル化分子産生細胞の活性または増殖を制御するための、またはフコシル化分子産生細胞に関連する疾患を処置するための方法に関する。フコシル化分子産生細胞、フコシル化分子産生細胞の活性、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患、有効量、用量、投与経路、投与頻度、対象、処置などについては、本発明の組合わせ医薬製剤などについてすでに記載したものと同様である。
【０１２９】
本発明はさらに、前記標識含有組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、フコシル化分子産生細胞またはこれを含む組織をin vivoまたはin vitroで標識するための、フコシル化分子産生細胞またはこれを含む組織をin vivoまたはin vitroで検出するための、フコシル化分子産生細胞またはこれを含む組織をin vivoまたはin vitroでイメージングするための、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患を診断、検出および／またはモニタリングするための、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患の可能性を検出するための、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患の診断を補助するための、またはフコシル化分子産生細胞に関連する疾患に対する処置の効果を評価するための方法に関する。前記有効量は、フコシル化分子産生細胞またはこれを含む組織を標識するため、フコシル化分子産生細胞またはこれを含む組織を検出するため、フコシル化分子産生細胞またはこれを含む組織をイメージングするため、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患を診断、検出および／またはモニタリングするため、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患の可能性を検出するため、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患の診断を補助するため、またはフコシル化分子産生細胞に関連する疾患に対する処置の効果を評価するための有効量、または検出のための有効量であってもよい。フコシル化分子産生細胞、フコシル化分子産生細胞に関連する疾患、有効量などについては、本発明の組合わせ医薬製剤および組合わせ医薬組成物などについてすでに記載したものと同様である。
【０１３０】
本発明はまた、上記フコシル化分子産生細胞を標的とする担体を利用した、フコシル化分子産生細胞へ物質を送達する方法に関する。この方法は、限定されずに、例えば、上記担体に送達物を担持させる工程と、送達物を担持した担体をフコシル化分子産生細胞を含む生物や媒体、例えば培養培地などに投与または添加する工程とを含む。これらの工程は、公知の任意の方法や、本明細書中に記載された方法などに従って適宜達成することができる。上記送達方法はまた、別の送達方法、例えば、フコシル化分子産生細胞が存在する臓器を標的とする他の送達方法などと組み合わせることもできる。また、上記方法は、in vitroでなされる態様も、in vivoでなされる態様、例えば、体内のフコシル化分子産生細胞を標的とする態様も含む。
【実施例】
【０１３１】
以下の実施例で本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例は例証を目的とするものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
本発明の実施例に用いた細胞培養方法を以下に示す。膵癌細胞株ＫＰ４、ＰＫ−５９、ＰＫ−４５Ｈ、ＭＩＡＰａＣａ２およびＰＡＮＣ−１、胆道癌細胞株ＨｕＣＣＴ１、ＲＢＥ、ＴＧＢＣ２４ＴＫＢ、ＴＧＢＣ１４ＴＫＢ、ＳＳＰ−２５、ＹＳＣＣＣ、ＴＫＫＫおよびＨｕＨ−２８、胃癌細胞株ＭＫＮ４５、ＭＫＮ７４、ＮＵＧＣ−４およびＫＡＴＯ−ＩＩＩは理研バイオリソースセンターより、膵癌細胞株ＡｓＰＣ−１およびＢｘＰＣ−３、大腸癌細胞株ＳＷ１１１６、ＣＯＬＯ２０５、ＨＴ−２９およびＨＣＴ−１５、胃癌細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７、白血病細胞株ＨＬ−６０、ＲＰＭＩ８２２６、ＫＧ−１およびＭＯＬＴ−４はアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）より、大腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔは東北大学より、大腸癌細胞株ＬＳ１８０はＤＳファーマより、胃癌細胞株ＯＣＵＧ−１はＪＣＲＢより、胃癌細胞株ＪＲ−ＳｔおよびＨＳＣ−３９はＩＢＬよりそれぞれ入手した。【０１３２】
ＢｘＰＣ−３、ＡｓＰＣ−１、ＰＡＮＣ−１、ＰＫ−４５ＨおよびＰＫ−５９細胞は、Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Invitrogen）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（GIBCO）で、ＫＰ４およびＭＩＡＰａＣａ２細胞は、Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Invitrogen）を含む１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ（GIBCO）で、ＣＯＬＯ２０５、ＨＣＴ−１５、ＨｕＣＣＴ１、ＲＢＥ、ＳＳＰ−２５、ＹＳＣＣＣ、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＭＫＮ４５、ＭＫＮ７４、ＮＵＧＣ−４、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ、ＨＬ−６０、ＲＰＭＩ８２２６、ＫＧ−１およびＭＯＬＴ−４細胞は、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地（GIBCO）で、ＳＷ１１１６細胞は１０％ＦＢＳ添加Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５培地で、ＬＳ１７４Ｔ、ＬＳ１８０およびＨｕＨ−２８細胞は、１０％ＦＢＳ添加ＭＥＭで、ＨＴ−２９細胞は１０％ＦＢＳ添加ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培地で、ＯＣＵＧ−１、ＴＧＢＣ２４ＴＫＢ、ＴＧＢＣ１４ＴＫＢおよびＴＫＫＫ細胞は、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ（GIBCO）で、ＪＲ−ＳｔおよびＨＳＣ−３９細胞は、１０％ＦＢＳ添加ＴＩＬ培地で、それぞれ培養した。各細胞の培養条件は当業者に知られており、各細胞の供給者から入手可能である。【０１３３】
実施例１  各種膵癌細胞培養上清中の腫瘍マーカー濃度の検討
各種膵癌細胞株の細胞５×１０６個を２５ｃｍ２フラスコに播種し、無血清培地Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（R）３ｍｌで４８時間培養した。培養上清中のフコシル化糖鎖抗原腫瘍マーカー、ＣＡ１９−９、Ｓｐａｎ−１およびＤｕｐａｎ−２の濃度はＥＬＩＳＡ法で検討した。結果を図１（ａ）に示す。これに基づいて、ＰＫ５９、ＡｓＰＣ−１をフコシル化糖鎖高産生株、ＭＩＡＰａＣａ２、ＰＡＮＣ−１をフコシル化糖鎖低産生株とした。【０１３４】
実施例２  各種膵癌細胞株におけるフコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ）の発現
ＰＫ５９、ＡｓＰＣ−１、ＭＩＡＰａＣａ２およびＰＡＮＣ−１の各細胞株につき、１×１０６個の細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ランダムヘキサマー（１００ｐＭ）およびＭＭＬＶ（GIBCO）を用いて、製造者の説明書に従って全ＲＮＡ（１μｇ）を逆転写した。使用したＰＣＲプライマー配列を、表１に示す。
【表１】
2012066896.tif 000002
ｃＤＮＡは、Pfu Turbo(Stratagene)、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、および１００ｐＭの各プライマーを用いて、２５〜３０サイクルで増幅した。サイクルは、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒および７２℃で６０秒からなる。また、各ＦＵＴのプライマーは（Mas et al., Glycobiology. 1998;8(6):605-13.）に基づいて作製した。【０１３５】
ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲルで泳動後、発現をＵＶ下で観察した結果を図１（ｂ）に示す。各種細胞株において、ＦＵＴ７以外のすべてのＦＵＴ遺伝子の発現が観察された。これに基づいて、ＰＫ５９、ＡｓＰＣ−１をフコシルトランスフェラーゼ高発現株、ＭＩＡＰａＣａ２、ＰＡＮＣ−１を低発現株とした。【０１３６】
実施例３  各種膵癌細胞におけるフコース結合機構の存在
フコシル化糖鎖高産生株ＡｓＰＣ−１と、フコシル化糖鎖低産生株ＰＡＮＣ−１におけるフコース（特に記載がない限りＬ−フコースを指す）の結合を放射性標識フコースを用いて検討した。
１２ウェルのカルチャープレートに１×１０５個の細胞を播種後、１晩培養し、０〜２００ｎＭの濃度にＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した１４Ｃ−フコース（比活性：５５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を細胞に添加し４℃で１時間培養した。冷ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００／ＰＢＳ−０．２５％トリプシンで細胞を可溶化し、細胞膜に結合した１４Ｃ−フコースの放射活性を測定した（図２および３）。【０１３７】
また、別な実験では、１２ウェルのカルチャープレートに２×１０５個の細胞を播種後、１晩培養し、１０ｎｍｏｌの１４Ｃ−フコース（比活性：５５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を、単独で、または、１μｍｏｌのフコースとともに添加し、４℃で、１、３または２４時間培養した。各条件の細胞を冷ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００／ＰＢＳ−０．２５％トリプシンで可溶化し、１４Ｃ−フコースの放射活性を測定した（図４）。【０１３８】
これらの結果より、フコースが、受容体様の機構を介して、ＡｓＰＣ−１およびＰＡＮＣ−１に結合し、その親和性がフコシル化糖鎖高産生株であるＡｓＰＣ−１においてより高いことが判明した。また、１４Ｃ−フコースの結合が、非標識フコースにより阻害されたことから、この機構がフコース特異的なものであることも明らかとなった。これは、フコシル化糖鎖産生細胞、特にフコシル化糖鎖高産生細胞において、フコース特異的な受容体様の結合機構が存在することを示すものである。【０１３９】
実施例４  フコシル化リポソームによるｓｉＲＮＡの導入
リポソーム（Lipotrust、１０ｎｍｏｌ）とＬ−フコース（０〜２０ｎｍｏｌ）（SIGMA, MO, USA）を懸濁し、５分間室温で放置した後、マイクロパーティションシステム（Sartorion VIVASPIN 5000MWCO PES）により遊離フコースを除去した。次にＦＡＭ標識ｓｉＲＮＡ（random）（センス鎖：5'-CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG-3'（配列番号１９）、アンチセンス鎖：5'-GCAAUGAAGCCGGUCUAGCGAAUCGAU-3'（配列番号２０）を加えインキュベーション後、チャンバースライドに播種したＡｓＰＣ−１細胞に添加し、１時間培養した。培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し４％パラホルムアルデヒドで固定後、ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩで対比染色して蛍光顕微鏡下に観察した。その結果、リポソーム：フコースのモル比は１：１が最も高い導入効率であることが判明した（図５および６）。【０１４０】
実施例５  フコシル化リポソームによる導入に対するフコースの影響
ｓｉＲＮＡの導入が、フコシル化分子産生細胞に存在するフコース特異的な受容体様の結合機構によるものであることを確認するため、過剰のフコース存在下におけるｓｉＲＮＡ導入効率を検討した。リポソーム（Lipotrust、１０ｎｍｏｌ）とフコース（１０ｎｍｏｌ）とを懸濁し、５分間室温で放置した後、マイクロパーティションシステム（Sartorion VIVASPIN 5000MWCO PES）により遊離フコースを除去した。次に上記と同じＦＡＭ標識ｓｉＲＮＡ（random）を加えインキュベーション後、チャンバースライドに播種したＡｓＰＣ−１細胞に添加し、１時間培養した（Liposome+F）。また、リポソーム単独群（Liposome）、リポソーム添加前１０分間、１μｍｏｌ（×１００）のフコースを加えプレインキュベーションした群（Liposome+F+CE）も同時に検討した。培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩで対比染色して蛍光顕微鏡下に観察した。その結果、フコースの存在によりｓｉＲＮＡの導入が顕著に抑制された（図７）。すなわち、過剰量のフコースによりｓｉＲＮＡの導入が阻害されたことから、フコシル化リポソームによるｓｉＲＮＡの導入は、フコース特異的な受容体様の結合機構を介していることが示唆された。【０１４１】
実施例６  各種膵癌細胞株におけるｓｉＲＮＡ導入効率の比較
フコシル化糖鎖高産生株と低産生株におけるフコシル化リポソームによるｓｉＲＮＡ導入効率の検討を行った。前述の方法に従い、フコシル化リポソームを作製し、高産生株（ＰＫ５９、ＡｓＰＣ−１）と低産生株（ＭＩＡＰａＣａ２、ＰＡＮＣ−１）におけるＦＡＭ−ｓｉＲＮＡの導入を蛍光顕微鏡下で観察した。この結果、高産生株においては細胞内に多量のＦＡＭの緑色が認められたのに対し、低産生株における細胞内のＦＡＭの緑色は顕著に少なかった（図８および９）。これは、フコシル化リポソームが、フコシル化糖鎖の産生量依存的に細胞に物質を送達することを示すものである。【０１４２】
実施例７  膵癌細胞株のフコシルトランスフェラーゼ依存的なＣＡ１９−９の産生
ＦＵＴが、膵癌細胞株のＣＡ１９−９産生の原因遺伝子であることを検証するため、細胞をｓｉＲＮＡでトランスフェクションし、各種ＦＵＴ遺伝子の発現を阻害した。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、精製され、アニーリングした二本鎖の形で作製した。ヒトＦＵＴ遺伝子を標的とする配列を、表２に示す。
【表２】
2012066896.tif 000003
【０１４３】
ｓｉＲＮＡトランスフェクションの実験は、１００ｎＭのｓｉＲＮＡとTransMessenger Transfection Reagent（QIAGEN）を用いて、製造者の説明書に従って行った。ｓｉＲＮＡトランスフェクションの４０時間後に、ＲＴ−ＰＣＲでＦＵＴｍＲＮＡの発現を解析した。ｓｉＲＮＡによるＦＵＴ遺伝子の発現阻害の結果を図１０（ａ）に示す。【０１４４】
各種ＦＵＴ遺伝子の発現阻害細胞のうち、ＦＵＴ３またはＦＵＴ６をノックダウンした細胞において、１４Ｃ−フコースの吸収が抑制された。また、同様にＦＵＴ３またはＦＵＴ６をノックダウンした細胞において、ＣＡ１９−９の産生が抑制された（図１０（ｂ））。図中、ＮＴは未処理（No Treatment）を示し、２、３および６は、それぞれＦＵＴ２、ＦＵＴ３およびＦＵＴ６のｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞を示す。
以上の結果から、ＦＵＴ３およびＦＵＴ６が、ＣＡ１９−９の産生に必要であることが示唆された。【０１４５】
実施例８  Ｃｙ５．５およびＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームの調製
本発明のＣｙ５．５およびシス−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）（シスプラチン、ＣＤＤＰ）を被包するフコシル化リポソームを以下のようにして調製した。始めに、Dahara, S., Indian J. Chem. 1970;7:193−194の方法に従って、ＣＤＤＰ３の合成を行った。テトラクロロ白金（ＩＩ）酸カリウム（４．１５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を蒸留水に溶解した後、ヨウ化カリウム（６．６４ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下および光遮蔽下において５分間氷上で攪拌した。次いで、アンモニア水溶液（２８％、１．３５ｍＬ）を反応液に加え、３時間氷上で攪拌した。形成した黄色結晶は、蒸留水およびエタノールで洗浄し、減圧下で１０時間、４０℃で乾燥した。この段階で、４．４９ｇのＣＤＤＰ２（cis-diamminediiodoplatinum(II)）が得られた。ＣＤＤＰ２（２．４１ｇ、５ｍｍｏｌ）を蒸留水に懸濁した後、硝酸銀（１．６８ｇ、９．９ｍｍｏｌ）を加え、光遮蔽下で２４時間氷上で攪拌した。ヨウ化銀を取り除くために反応液を濾紙に通した後、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮し、白色結晶が得られた。結晶は、氷冷の蒸留水およびエタノールで洗浄した後、減圧下で１０時間、４０℃で乾燥した。ＣＤＤＰ３の最終産生量は、１．０ｇであった。【０１４６】
次に、ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ガングリオシド、リン酸ジセチル（ＤＣＰ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）を、３５：４０：５：１５：５のモル比（全脂質４５６ｍｇ）で混合し、ミセル形成を容易にするためにコール酸（４６９ｍｇ）を添加した。混合物は、３０ｍＬのメタノール／クロロホルム溶液（１：１、ｖ／ｖ）に溶解した。脂質薄膜を得るために、溶媒は３７℃で、ロータリーエバポレーターを用いて蒸発させ、減圧下で乾燥した。得られた脂質薄膜は、ＮａＣｌを含まない１０ｍＭ  Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）バッファー（ｐＨ８．４）３０ｍＬに溶解し、均一のミセル懸濁液を得るために超音波処理をした。【０１４７】
ＣＤＤＰの被包化のスキームを、図１１に示す。１ｇのＣＤＤＰ３を、ＮａＣｌを含まない１０ｍＭ  ＴＡＰＳバッファー（ｐＨ８．４）７０ｍＬに完全に溶解し、１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを８．４に調整した。ＣＤＤＰ３およびＣｙ５．５の溶液を、上述のミセル懸濁液に加えた。コール酸、遊離ＣＤＤＰ３および遊離Ｃｙ５．５を取り除くため、ミセル溶液は、限外濾過ディスクメンブレン（分子量カットオフ：１０，０００）（Amicon PM10、Millipore）と、それに適合する限外濾過セルホルダー（Amicon model 8200、Millipore）を用いて、１０ｍＭ  ＴＡＰＳバッファー（ｐＨ８．４）で限外濾過した。その結果、ＣＤＤＰ３を被包するリポソーム１００ｍＬが得られた。リポソーム中のＣＤＤＰ３をＣＤＤＰに変換するため、限外濾過ディスクメンブレン（分子量カットオフ：３００，０００）（Amicon XM300、Millipore）に通して、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  ＴＡＰＳバッファー（ｐＨ８．４）でバッファーを交換した。【０１４８】
リポソームのフコシル化のスキームを、図１２（ａ）に示す。図中、ＨＳＡはヒト血清アルブミン、ＢＳ３はビス（スルホスクシンイミジル）スベラート、Ｔｒｉｓはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、およびＤＴＳＳＰは３，３’−ジチオビス（プロピオン酸３−スルホスクシンイミジル）を示す。【０１４９】
親水性化処理およびリポソーム表面へのＬ−フコースの結合は、Yamazaki, N. J Membrane Sci 1989;41:249-267およびYamazaki et al., Methods Enzymol. 1994;242:56-65に記載の方法に従って行った。バッファーを交換するため、溶液を５ｍＭの炭酸水素ナトリウムのバッファー（ＣＢＳ、ｐＨ８．５）で、Amicon XM300のメンブレンに通して限外濾過した。１００ｍＬのリポソーム溶液に、１００ｍｇの架橋剤ＢＳ３を加え、２５℃で２時間攪拌した。ＢＳ３がリポソーム表面に結合した後、懸濁液を４℃で一晩攪拌した。４００ｍｇのＴｒｉｓを加えて２５℃で２時間攪拌し、ＢＳ３にＴｒｉｓが結合するように４℃で一晩さらに攪拌した。残留するＴｒｉｓを除去するため、懸濁液を１０ｍＭ  ＴＡＰＳバッファー（ｐＨ８．４）で、Amicon XM300のメンブレンに通して限外濾過した。【０１５０】
さらに、上記Hirai et al. 2007およびHirai et al. 2010に記載の方法に従って、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をリポソーム表面に結合させた。リポソーム表面を酸化するため、１０８ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウムを１００ｍＬのリポソーム溶液に加え、４℃で一晩攪拌した。残留する過ヨウ素酸ナトリウムを除去するため、懸濁液を１０ｍＭ  リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ８．０）で、Amicon XM300のメンブレンに通して限外濾過した。その後、２００ｍｇのＨＳＡを懸濁液に加え、２５℃で２時間攪拌した。３１．３ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え、２５℃で２時間攪拌し、さらに４℃で一晩攪拌した。残留するシアノ水素化ホウ素ナトリウムを除去するため、溶液をＣＢＳバッファー（ｐＨ８．５）で、Amicon XM300のメンブレンに通して限外濾過した。【０１５１】
架橋剤であるＤＴＳＳＰにより、Ｌ−フコースをリポソーム表面に結合した。１００ｍｇのＤＴＳＳＰを１００ｍＬのリポソーム溶液に加え、２５℃で２時間攪拌し、さらに４℃で一晩攪拌した。残留するＤＴＳＳＰを除去するため、溶液をＣＢＳバッファー（ｐＨ８．５）で、Amicon XM300のメンブレンに通して限外濾過した。グリコシルアミノ化反応によって、フコース還元末端をアミノ化した。８ｍｇのフコースを２ｍＬの蒸留水に溶解し、１ｇの炭酸水素アンモニウムを加え、３７℃で３日間攪拌した。アミノ化フコースを、終濃度１０、２５、５０、１００ｇ／ｍＬとなるように加え、２５℃で２時間攪拌した。その後、リポソーム表面を繰り返し親水化させるため、Ｔｒｉｓを終濃度１３２ｍｇ／ｍＬとなるように加え、４℃で一晩攪拌した。残留するフコースおよびＴｒｉｓを除去するため、溶液を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．２）で、Amicon XM300のメンブレンに通して限外濾過した。【０１５２】
フコシル化していないリポソームは、フコース結合の工程を除いて、上述のＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームと同様に調製した。ＣＤＤＰを被包するリポソームおよびＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームは、さらに２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．２）で、Amicon XM300のメンブレンを用いて限外濾過し、１０倍に濃縮した。【０１５３】
実施例９  Ｃｙ５．５を被包するフコシル化リポソームの生理化学的特徴
図１２（ａ）に示すように、２５（Ｆ２５）、５０（Ｆ５０）、１００（Ｆ１００）μｇ／ｍＬの終濃度となるように、改変したコール酸透析法によって調製したリポソームに、ＤＴＳＳＰを介してアミノ化フコースを架橋した。さらに、リポソーム表面を親水性化するため、ＢＳ３およびＴｒｉｓを結合した。リポソーム表面の親水性化は、肝臓および脾臓の細網内皮系、マクロファージおよび血管内皮細胞への取り込みを防止することができ、さらに血漿中のオプソニンタンパク質の吸着も防いで、リポソームが血流中で長く維持されるようになる。図１２（ｂ）に示す電子顕微鏡観察結果から、ほぼすべてのフコシル化リポソームが球状であり、Ｃｙ５．５を被包するリポソームは約８０ｎｍの大きさであった。【０１５４】
Ｃｙ５．５内包フコシル化リポソームの生理化学的特徴を、図１３および表３に示す。
【表３】
2012066896.tif 000004
【０１５５】
水中で調製したリポソームの平均粒子サイズおよびゼータ電位は、標準ラテックスナノ粒子で較正した動的光散乱光度計によって、２５℃で測定した（Zetasizer Nano-S90、Malvern）。Zetasizer Nano-S90により測定した粒子の大きさは、顕微鏡観察の結果とも一致しており、リポソーム膜表面の電荷を示すゼータ電位は、各リポソームにおいて、−４０ｍＶ以下で負に荷電していた。４℃で６月間保存した後の粒子サイズ分布は、調製直後とほぼ同一であったことから、これらリポソームの安定した性質が示された。【０１５６】
実施例１０  フコシル化リポソームに被包したＣｙ５．５の導入
フコシル化リポソームの特異的送達を調べるため、Ｃｙ５．５を被包するフコシル化リポソームを、ＣＡ１９−９産生または非産生の膵臓腺癌細胞にトランスフェクトした。ＡｓＰＣ−１細胞をＣｙ５．５内包フコシル化リポソームとともに２時間インキュベートした後、リン酸緩衝食塩水で２回洗浄し、蛍光顕微鏡で可視化した（図１４）。ＣＡ１９−９を多く分泌するＡｓＣＰ−１細胞において、フコシル化リポソーム（Ｆ０）ではなく、フコシル化リポソーム（Ｆ５０）が、Ｃｙ５．５を効率よく導入した。【０１５７】
フローサイトメトリーの結果からも、フコシル化リポソーム（Ｆ５０）が、ＣＡ１９−９非産生細胞ではなく（図１５（ｂ））、ＣＡ１９−９産生細胞（図１５（ａ））において、最も効率よくＣｙ５．５をトランスフェクトしていることが示された（図１５）。さらに、過剰のフコースが効率的導入を阻害したことからも（図中、＋Ｆｕｃ×１００）、フコシル化リポソームによるＣｙ５．５の導入は、フコース受容体依存的に媒介されていることを示している。【０１５８】
実施例１１  ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームの生理化学的特徴
ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームの生理化学的特徴を、表４に示す。ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームの粒子サイズは、約２００ｎｍで、ＣＤＤＰの終濃度は約２ｍｇ／ｍＬと推定された。
【表４】
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【０１５９】
脂質濃度分析は、以下の手順で行った。ＣＤＤＰを被包するリポソームおよびＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームを、コレステロールＥ−テストワコーのキットを用いて、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００存在下で全コレステロールとして測定した。脂質濃度は、式（１）により各脂質（４．５）のモル比から計算した。
式（１）：脂質濃度（ｍｇ／ｍＬ）＝コレステロール濃度（ｍｇ／ｍＬ）×４．５【０１６０】
ＣＤＤＰの測定、ＣＤＤＰ濃度および被包効率の計算は、以下の手順で行った。ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームを蒸留水で１０，０００倍希釈し、白金濃度を自動の無炎原子吸光分析装置（ＦＡＡＳ）（Model AA-6700、SHIMADZU）で測定した。シス-ジアミンジクロロ白金を標準物質として使用した。５０〜２５０ｎｇ／ｍＬの白金濃度の検量線は、各試料の分析前に作成した。ＣＤＤＰ量は、式（２）により計算した。【０１６１】
式（２）：ＣＤＤＰ濃度＝Ａ×（３００／１９５）
式（２）において、Ａは白金濃度を示し、３００はＣＤＤＰの分子量、および１９５は白金の分子量を示す。【０１６２】
被包効率およびＣＤＤＰと脂質との重量比は、式（３）および式（４）によってそれぞれ計算した。
式（３）：被包効率（％）＝（リポソーム中のＣＤＤＰ量／ＣＤＤＰ初期量）×１００
式（４）：ＣＤＤＰと脂質との重量比＝ＣＤＤＰ濃度（ｍｇ／ｍＬ）／脂質濃度（ｍｇ／ｍＬ）【０１６３】
実施例１２  ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームの各種膵癌細胞株への効果
ＷＳＴ−１アッセイによって、ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームの細胞毒性効果を調べた結果を図１６に示す。２×１０４の各種細胞株（ＡｓＰＣ−１など）を２４ウェルのプレートにそれぞれ移し、１０％のウシ胎仔血清、５％のＬ−グルタミン、および１％の抗生物質を添加したＲＰＭＩ−１６４０で１日培養した。その後、様々な投与量で、ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームまたはＣＤＤＰを被包するリポソームとともに、細胞をインキュベートした。２時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、最後に血清および抗生物質を含むＲＰＭＩ−１６４０で懸濁した。７２時間培養後、ＷＳＴ−１試薬を添加し、増殖アッセイをSato , Y. Nat Biotechnol. 2008;26(4):431-42の方法で行った。実験は３連で最低２回繰り返した。【０１６４】
その結果、ＣＤＤＰを被包するリポソーム（Ｆ５０）（５０μｇ／ｍＬのリポソームに結合したフコース）が最も高い細胞毒性効果を示した（図１６（ａ））。また、ＣＡ１９−９産生細胞（ＰＫ４５Ｈ、ＡｓＰＣ−１およびＫＰ４）においては、ＣＤＤＰを被包するリポソーム（Ｆ５０）は、ＣＤＤＰを被包するリポソーム（Ｆ０）より効率的であり、フコース依存的な細胞毒性効果を示している（図１６（ｂ））。【０１６５】
実施例１３  膵癌皮下モデルの作製
皮下モデルの作製では、ＡｓＰＣ−１細胞（２×１０６個）をマウス（４週〜６週齢）の背側に播種した。注射後０〜４日目までバイオルミネセンスを測定し、処理を開始する前に、マウスを無作為に複数の集団に分けた。in vivo光学イメージングは、Xenogen-IVIS-cooled CCD optical system（Xenogen-IVIS）を用いて行った。結合（フコシル化リポソーム中のＣＤＤＰなど）または遊離のＣＤＤＰは、各投与につき２ｍｇ／ｋｇの用量であった。注射は、第１週目に２回、そして２および３週目に２回行った。使用したマウスはすべて、最後に注射した日の翌日、バイオルミネセンスの最終測定の前に屠殺した。【０１６６】
実施例１４  マンノース処理によるフコシル化リポソームの腫瘍への蓄積
膵癌モデルマウスにおけるフコシル化リポソームの送達を調べたところ、フコシル化リポソームに被包したＣｙ５．５は、肝臓に蓄積し、Ｃｙ５．５の腫瘍病変部への蓄積が減少していることが観察された。本発明者らは、このフコシル化リポソームの肝臓への捕捉は、非実質細胞に存在するレクチンが原因であると予測した。【０１６７】
そこで、レクチンを介するフコースの取り込みを抑制するため、フコシル化リポソームの注射前および注射後に過剰量のマンノース処理を行った。Ｃｙ５．５を被包するフコシル化リポソームまたはＣｙ５．５を被包するリポソームは、尾静脈から投与した（５０μｌ／マウス）。同一マウスの腫瘍領域（両脇腹病変部の背後）を、投与前および注射の０〜９６時間後にＩＶＩＳイメージングシステムを用いて観察した。Ｄ−マンノース（SIGMA）はＰＢＳに溶解し、マウスの尾静脈に５０μＬ（０．０２ｍｇ／μＬ）注射した。投与したマンノースは、フコースの１０００倍の過剰量であった。【０１６８】
その結果、フコシル化リポソームとマンノースとを併用した場合に、Ｃｙ５．５の腫瘍への蓄積および肝臓におけるＣｙ５．５の減少が観察された（図１７、図１８（ａ））。Ｃｙ５．５の蓄積は、フコシル化リポソームの投与後一週間まで持続した。さらに、腫瘍組織を顕微鏡観察したところ、Ｃｙ５．５の蓄積が確認された（図１８（ｂ））。【０１６９】
過剰量のマンノースが、フコシル化リポソームのトランスフェクション効率へ与える影響についても、フローサイトメトリーを用いて検討したが、明らかな影響は観察されなかった（図１９）。マンノースは、ヘキソキナーゼによって、マンノース−６−リン酸にリン酸化された後、解糖系で使用されるフルクトース−６−リン酸に変換される。しかしながら、９０％の摂取したマンノースは、３０〜６０分で尿中に未変換のまま排出され、残りの９９％が続く８時間内に排出される。投与したマンノース量は、マウスにとって１ｍｇのマンノースに相当し、ヒトでは０．６ｇに相当するが、この量では明白な悪影響は観察されなかった。【０１７０】
表５に、治療期間中の血液学的／生化学的な分析の結果を示す。試料は、マウス眼窩静脈叢より採取した。表中、ＷＢＣは白血球数を、ＲＢＣは赤血球数を、Ｈｂはヘモグロビン濃度を、ＰＬＴは血小板数を、ＡＳＴはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ濃度を、ＡＬＴはアラニンアミノトランスフェラーゼ濃度を、Ｂｉｌはビリルビン濃度を、ＢＳは血糖値を、Ｃｒはクレアチニン濃度を、それぞれ示す。
【表５】
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【０１７１】
健康なヒトの血清には、平均５４．１±１１．９μＭのマンノースが含まれていることから、使用したマンノースはヒト身体の全マンノースに対して少量である。【０１７２】
実施例１５  異種移植モデルにおけるＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームの腫瘍増殖阻害
膵癌モデルマウス（ＡｓＰＣ−１）におけるＣＤＤＰ、ＣＤＤＰを被包するリポソーム（Ｆ０）、およびＣＤＤＰを被包するリポソーム（Ｆ５０）による腫瘍増殖抑制効果を比較した（図１１）。ＣＤＤＰ（２ｍｇ／ｋｇ）、ＣＤＤＰを被包するリポソーム（Ｆ０）（２ｍｇ／ｋｇ  ＣＤＤＰ）またはＣＤＤＰを被包するリポソーム（Ｆ５０）（２ｍｇ／ｋｇ  ＣＤＤＰ）の溶液を、マウスの尾静脈から１週間に２回注射した。マンノース処理はリポソームの投与１時間前、投与と同時および投与１日後に行った。移植から４、８、１１、１５、１８および２２日後、腫瘍の容積をそれぞれ測定した。その結果、ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームは、腫瘍の増殖をほぼ完全に阻害した（図２０）。【０１７３】
ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソーム（Ｆ５０）で処理した腫瘍において、アポトーシス性の細胞が他の腫瘍より多いことが、ＴＵＮＥＬ染色によって観察された（図２１（ａ））。また、腫瘍細胞におけるＣＤＤＰ濃度を測定したところ、腫瘍細胞にＣＤＤＰが送達され、蓄積していることが確認された（図２１（ｂ））。測定は、最後の注射の翌日にマウスを屠殺して腫瘍を収集し、ＩＣＰ分析によって行った。
また、表５に示すように、マンノースまたはＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームの投与は、悪影響を及ぼさないことが示された。【０１７４】
実施例１６  各種大腸癌細胞培養上清中のＣＡ１９−９濃度の検討
各種大腸癌細胞株の細胞５×１０６個を２５ｃｍ２フラスコに播種し、無血清培地Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（R）３ｍｌで４８時間培養した。培養上清中のＣＡ１９−９の濃度はＥＬＩＳＡ法で検討した。結果を図２２および表６に示す。
【表６】
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なお、上記結果に基づいて、以下の検討には高産生株としてＣＯＬＯ２０５を、低産生株としてＨＴ−２９をそれぞれ用いた。【０１７５】
実施例１７  フコシル化リポソームに被包したＣｙ５．５の導入
フコシル化リポソームの特異的送達を調べるため、まず、蛍光顕微鏡法でＣｙ５．５の細胞内導入を確認した。１×１０５個のＣＯＬＯ２０５細胞をチャンバースライドに播種し、実施例８で得たＣｙ５．５内包フコシル化リポソームとともに２時間インキュベートした後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。４％パラホルムアルデヒドで固定後、ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩで対比染色してから蛍光顕微鏡で可視化した（図２３）。フコースを含まないリポソーム（Ｆ０）では、細胞内にＣｙ５．５の赤い蛍光がほとんど見られないが、フコシル化リポソーム（Ｆ２５、Ｆ５０およびＦ１００）により、Ｃｙ５．５が効率よく導入されたことが分かる。【０１７６】
フコシル化リポソームの特異的送達は、フローサイトメトリー法でも検討した。１×１０６個のＣＯＬＯ２０５細胞を６ウェルカルチャーフラスコに播種し、Ｃｙ５．５内包フコシル化リポソームを添加し２時間培養した。培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞懸濁液を作製、FACSCaliburTMフローサイトメーター（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）にてＣｙ５．５陽性細胞を検出した（図２４）。この結果からも、フコシル化リポソームによるＣｙ５．５の効率的な細胞内導入が確認された。【０１７７】
実施例１８  ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームの各種大腸癌細胞株への効果
ＷＳＴ−１アッセイによって、ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームの細胞毒性効果を調べた。２×１０４個の各種細胞を９６ウェルカルチャーフラスコに播種し、ＣＤＤＰを被包する、フコシル化されていない（Ｆ０）、または、種々の程度にフコシル化された（Ｆ５０、Ｆ１００）リポソームとともに、細胞をインキュベートした。２時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、培養液（ＣＯＬＯ２０５は１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地、ＨＴ−２９は１０％ＦＢＳ添加ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培地）に置換後、さらに７２時間培養してから実施例１２と同様にＷＳＴ−１試薬でのアッセイを行い、生細胞数を計測した。図２５に示す結果から、ＣＡ１９−９高産生株では低産生株に比し、ＣＤＤＰ内包フコシル化リポソームによる高い殺細胞効果を認めた。
また、別の実験では、同様の条件の下で、種々の濃度のＣＤＤＰ内包フコシル化リポソーム（Ｆ１００）またはＣＤＤＰ内包非フコシル化リポソーム（Ｆ０）とともに細胞をインキュベートし、同様に生細胞数を計測した（図２６）。この結果、ＣＤＤＰ内包フコシル化リポソームが用量依存的に殺細胞効果を示すことが明らかとなった。【０１７８】
実施例１９  マンノース処理によるフコシル化リポソームの腫瘍への集積
ヌードマウス（５週齢、三共ラボサービス）の背部皮下２箇所にＬＳ１８０細胞１×１０６個をそれぞれ移植した。腫瘍径が５ｍｍに達した後（移植後約２週間）、Ｃｙ５．５内包フコシル化リポソーム（Ｆ１００）５０μｌを尾静脈より注射した（Ｃｙ５．５：０．３μｇ、フコース１μｇ相当）。マンノース処理群（Ｆ１００＋Ｍ）では、ＰＢＳに溶解したＤ−マンノース（SIGMA）５ｍｇ／１００μｌを、リポソーム投与１時間前に腹腔内投与し、さらに、リポソーム投与時に尾静脈より投与した（合計１０ｍｇ／２００μｌ）。各投与におけるマンノースは、フコースの５０００倍の過剰量であった。リポソーム投与後２日目、５日目および１４日目に、Ｃｙ５．５の集積をIn vivo image analyzer（IVIS(R) Lumina、Caliper Life Sciences）で観察した。Ｃｙ５．５の肝臓への集積結果を図２７に、腫瘍への集積結果を図２８にそれぞれ示す。この結果、フコシル化リポソームとマンノースとを併用した場合に、肝臓におけるＣｙ５．５の集積が少なく（図２７）、逆に、腫瘍への集積が極めて多くなること（図２８）が明らかとなった。【０１７９】
実施例２０  ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームの腫瘍増殖阻害
ヌードマウス（５週齢、三共ラボサービス）の背部皮下２箇所にＬＳ１８０細胞１×１０６個をそれぞれ移植した。腫瘍径が５ｍｍに達した後（移植後約２週間）、マウスを、未処理群（ＮＴ）、ＣＤＤＰ単独群（ＣＤＤＰ）、ＣＤＤＰ内包非フコシル化リポソーム群（Ｆ０−ＣＤＤＰ）、ＣＤＤＰ内包非フコシル化リポソーム群（Ｆ５０−ＣＤＤＰおよびＦ１００−ＣＤＤＰ）の５群に分け（各群６匹）、未処理群を除き、ＣＤＤＰ２ｍｇ／ｋｇ相当の量の各処置剤を１００μｌ、週２回尾静脈注射した。また、マンノース処理は、ＰＢＳに溶解したＤ−マンノース（SIGMA）５ｍｇ／１００μｌを、各処置剤の投与１時間前に腹腔内投与し、さらに、各処置剤の投与時に尾静脈より投与した（合計１０ｍｇ／２００μｌ）。処置開始後４、８、１１、１５、１８および２２日目の腫瘍径を計測した。図２９に示す結果から、ＣＤＤＰ内包非フコシル化リポソームを投与したＦ１００−ＣＤＤＰ群の腫瘍体積が、未処理群、ＣＤＤＰ単独群およびＣＤＤＰ内包非フコシル化リポソーム群の腫瘍体積に比べ有意に減少したことが明らかとなった。【０１８０】
実施例２１  各種胆道癌細胞培養上清中のＣＡ１９−９濃度の検討
各種胆道癌細胞株の細胞５×１０６個を２５ｃｍ２フラスコに播種し、無血清培地Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（R）３ｍｌで４８時間培養した。培養上清中のＣＡ１９−９の濃度はＥＬＩＳＡ法で検討した。結果を図３０に示す。これに基づいて、以下の検討には高産生株であるＨｕＣＣＴ１を用いた。【０１８１】
実施例２２  フコシル化リポソームに被包したＣｙ５．５の導入
フコシル化リポソームの特異的送達を調べるため、フローサイトメトリー法でＣｙ５．５の細胞内導入を確認した。１×１０６個のＨｕＣＣＴ１細胞を６ウェルカルチャーフラスコに播種し、実施例８で得たＣｙ５．５内包フコシル化リポソームを添加し２時間培養した。培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞懸濁液を作製、FACSCaliburTMフローサイトメーター（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）にてＣｙ５．５陽性細胞を検出した（図３１）。この結果、フコシル化リポソーム（Ｆ５０）により、非フコシル化リポソーム（Ｆ０）よりも、Ｃｙ５．５が効率よく導入されたことが分かる。また、過剰のフコースが効率的導入を阻害したことは（図中、Ｆ５０＋Ｆｕｃ）、フコシル化リポソームによるＣｙ５．５の導入が、フコース受容体依存的であることを示すものである。【０１８２】
実施例２３  各種胃癌細胞培養上清中のＣＡ１９−９濃度の検討
各種胃癌細胞株の細胞５×１０６個を２５ｃｍ２フラスコに播種し、無血清培地Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（R）３ｍｌで４８時間培養した。培養上清中のＣＡ１９−９の濃度はＥＬＩＳＡ法で検討した。結果を表７に示す。
【表７】
2012066896.tif 000008
なお、上記結果に基づいて、以下の検討には高産生株としてＪＲ−Ｓｔを、低産生株としてＭＫＮ４５をそれぞれ用いた。【０１８３】
実施例２４  フコシル化リポソームに被包したＣｙ５．５の導入
フコシル化リポソームの特異的送達を調べるため、フローサイトメトリー法および蛍光顕微鏡法でＣｙ５．５の細胞内導入を確認した。
フローサイトメトリー法においては、１×１０６個の各種細胞を６ウェルカルチャーフラスコに播種し、実施例８で得たＣｙ５．５内包フコシル化リポソームを添加し１時間インキュベートした。インキュベート後、細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞懸濁液を作製、FACSCaliburTMフローサイトメーター（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）にてＣｙ５．５陽性細胞を検出した。図３２および３３の左側のチャートに示す結果から、高産生株のＪＲ−Ｓｔ細胞では、非フコシル化リポソーム（Ｆ０）に比べ、フコシル化リポソーム（Ｆ５０およびＦ１００）によってＣｙ５．５が効率よく導入されたが、低産生株のＭＫＮ４５細胞では、フコシル化リポソーム（Ｆ５０およびＦ１００）によっても、Ｃｙ５．５の導入は、非フコシル化リポソーム（Ｆ０）と同程度の低いレベルに止まることが分かる。また、過剰のフコースがＪＲ−Ｓｔ細胞におけるフコシル化リポソームによるＣｙ５．５の効率的導入を阻害したことは（図中、Ｆ１００＋Ｆｕｃ）、フコシル化リポソームによるＣｙ５．５の導入が、フコース受容体依存的であることを示すものである。【０１８４】
蛍光顕微鏡法においては、１×１０５個の各種細胞をチャンバースライドに播種し、実施例８で得たＣｙ５．５内包フコシル化リポソームとともに１時間インキュベートした後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。４％パラホルムアルデヒドで固定後、ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩで対比染色してから蛍光顕微鏡で可視化した。図３４および３５の右側の蛍光顕微像から、高産生株のＪＲ−Ｓｔ細胞では、非フコシル化リポソーム処理細胞（Ｆ０）に比べ、フコシル化リポソーム処理細胞（Ｆ５０およびＦ１００）において細胞内にＣｙ５．５の赤い蛍光が多く認められたが、低産生株のＭＫＮ４５細胞では、フコシル化リポソーム（Ｆ１００）によっても、細胞内に導入されたＣｙ５．５の量は、非フコシル化リポソーム（Ｆ０）と同程度の低いレベルに止まることが分かる。また、過剰のフコースにより、ＪＲ−Ｓｔ細胞へのＣｙ５．５の導入がほとんど認められなかったことは（図中、Ｆ１００＋Ｆｕｃ）、フコシル化リポソームによるＣｙ５．５の導入が、フコース受容体依存的であることを示すものであり、フローサイトメトリー法での結果が裏付けられた。【０１８５】
実施例２５  ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームの各種胃癌細胞株への効果
ＷＳＴ−１アッセイによって、ＣＤＤＰを被包するフコシル化リポソームの細胞毒性効果を調べた。２×１０４個の各種細胞を９６ウェルカルチャーフラスコに播種し、ＣＤＤＰを被包する、フコシル化されていない（Ｆ０）、または、種々の程度にフコシル化されたリポソーム（Ｆ２５、Ｆ５０またはＦ１００）とともに、細胞をインキュベートした。１時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、培養液（１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地）に置換後、さらに７２時間培養してから実施例１２と同様にＷＳＴ−１試薬でのアッセイを行い、生細胞数を計測した。図３４および３５の左側のグラフに示す結果が示すとおり、ＣＡ１９−９高産生株（ＪＲ−Ｓｔ）では低産生株（ＭＫＮ４５）に比し、ＣＤＤＰ内包フコシル化リポソームによる高い殺細胞効果を認めた。
また、別の実験では、同様の条件の下で、種々の濃度（０、０．１、１、１０または１００μＭ）のＣＤＤＰ内包フコシル化リポソーム（Ｆ１００）またはＣＤＤＰ内包非フコシル化リポソーム（Ｆ０）とともに細胞をインキュベートし、同様に生細胞数を計測した（図３４および３５の右側のグラフ）。この結果、ＣＡ１９−９高産生株において、ＣＤＤＰ内包フコシル化リポソームが用量依存的に殺細胞効果を示すことが明らかとなった。【０１８６】
実施例２６  各種白血病細胞株の細胞におけるＣＤ３３およびＮｏｔｃｈ−１発現の検討
各種白血病細胞株の細胞１×１０６個を０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄後、１ｍｌのＰＢＳ中の１０μｌの抗体（ＰＥ結合ＣＤ３３抗体（R&D）およびＦＩＴＣ結合Ｎｏｔｃｈ−１抗体（R&D））で１０分間反応させて標識し、ＰＢＳで細胞を洗浄して細胞懸濁液を作製した。これをFACSCaliburTMフローサイトメーター（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）に供して陽性細胞を検出し、CellQuest Pro software（BD Biosciences）で解析した。図３６に示す結果から明らかなとおり、ＨＬ−６０、ＫＧ−１およびＲＰＭＩ８２２６の各細胞においてＣＤ３３およびＮｏｔｃｈ−１がともに発現しており、ＨＬ−６０細胞においてＮｏｔｃｈ−１の発現率が特に高かったが、ＭＯＬＴ−４ではＣＤ３３もＮｏｔｃｈ−１も殆ど発現していなかった。【０１８７】
実施例２７  各種白血病細胞株におけるフコシルトランスフェラーゼの発現
各白血病細胞株につき、１×１０６個の細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ランダムヘキサマー（１００ｐＭ）およびＭＭＬＶ（GIBCO）を用いて、製造者の説明書に従って全ＲＮＡ（１μｇ）を逆転写した。各フコシルトランスフェラーゼのプライマーを下表に示す。
【表８】
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ｃＤＮＡを、Pfu Turbo(Stratagene)、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、および１００ｐＭの各プライマーを用いて、２５〜３０サイクルで増幅した。各サイクルは、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒および７２℃で６０秒からなる。
ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲルで泳動後、発現をＵＶ下で観察した。図３７に示す結果から、Ｎｏｔｃｈ−１のフコシル化に関与するとされるＰＯＦＵＴ１が、Ｎｏｔｃｈ−１陽性のＨＬ−６０、ＫＧ−１およびＲＰＭＩ８２２６の各細胞において発現している一方、Ｎｏｔｃｈ−１陰性のＭＯＬＴ−４ではほとんど発現していないことが分かる。これに基づいて、以下の検討では、Ｎｏｔｃｈ−１発現株としてＨＬ−６０を、Ｎｏｔｃｈ−１非発現株としてＭＯＬＴ−４をそれぞれ用いた。【０１８８】
実施例２８  フコシル化リポソームに被包した蛍光標識の導入
フコシル化リポソームの特異的送達を調べるため、フローサイトメトリー法および蛍光顕微鏡法で蛍光標識の細胞内導入を確認した。
フローサイトメトリー法においては、１×１０６個の各種細胞を６ウェルカルチャーフラスコに播種し、実施例８で得たＣｙ５．５内包フコシル化リポソーム（ＨＬ−６０細胞）または実施例８と同様にして得たＦＡＭ内包フコシル化リポソーム（ＭＯＬＴ−４細胞）を添加し２時間インキュベートした。インキュベート後、細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞懸濁液を作製、FACSCaliburTMフローサイトメーター（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）にて蛍光標識陽性細胞を検出した。図３８に示す結果から、Ｎｏｔｃｈ−１発現株のＨＬ−６０細胞では、非フコシル化リポソーム（Ｆ０）に比べ、フコシル化リポソーム（Ｆ２５およびＦ５０）によって蛍光標識が効率よく導入されたが、Ｎｏｔｃｈ−１非発現株のＭＯＬＴ−４細胞では、フコシル化リポソームによっても、蛍光標識の導入は、非フコシル化リポソームと同程度の低いレベルに止まることが分かる。【０１８９】
蛍光顕微鏡法においては、１×１０５個の各種細胞をチャンバースライドに播種し、実施例８と同様にして得たＦＡＭ内包フコシル化リポソームとともに２時間インキュベートした後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。４％パラホルムアルデヒドで固定後、ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩで対比染色してから蛍光顕微鏡で可視化した。図３９に示す蛍光顕微像では、Ｎｏｔｃｈ−１発現株のＨＬ−６０細胞において、非フコシル化リポソーム処理細胞（Ｆ０）に比べ、フコシル化リポソーム処理細胞（Ｆ２５およびＦ５０）において細胞内にＦＡＭの蛍光が顕著に多く認められたが、Ｎｏｔｃｈ−１非発現株のＭＯＬＴ−４細胞では、フコシル化リポソームによっても、細胞内に導入されたＦＡＭの量は、非フコシル化リポソームと同程度の低いレベルに止まっており、フローサイトメトリー法での結果が裏付けられた。【０１９０】
実施例２９  ドキソルビシンを被包するフコシル化リポソームの各種白血病細胞株への効果
ＷＳＴ−１アッセイによって、ドキソルビシンを被包するフコシル化リポソームの細胞毒性効果を調べた。ドキソルビシン内包フコシル化リポソームは、実施例８と同様の手法で作製した。２×１０４個の各種細胞を９６ウェルカルチャーフラスコに播種し、種々の濃度のドキソルビシン内包フコシル化リポソーム（Ｆ−ＤＯＸ）またはドキソルビシン単独（ＤＯＸ）とともに、細胞をインキュベートした。２時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、培養液（１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地）に置換後、さらに７２時間培養してから実施例１２と同様にＷＳＴ−１試薬でのアッセイを行い、生細胞数を計測した。図４０に示すとおり、Ｎｏｔｃｈ−１発現株（ＨＬ−６０）では、ドキソルビシン内包フコシル化リポソーム（Ｆ−ＤＯＸ）が、ドキソルビシン単独（ＤＯＸ）に比べ顕著な用量依存的な殺細胞効果を示した。これに対し、Ｎｏｔｃｈ−１非発現株（ＭＯＬＴ−４）では、このような用量依存的な殺細胞効果は認められなかった。【０１９１】
実施例３０  白血病患者由来の検体におけるＣＤ３３およびＮｏｔｃｈ−１発現の検討
白血病患者検体は患者本人の同意のもと末梢血を採取し、Ficoll-Hypaqueにて単核球を分離し使用前まで液体窒素内で保存した。検体を採取した患者の内訳は下表９に示すとおりである。
【表９】
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【０１９２】
各検体の細胞１×１０６個を０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄後、１ｍｌのＰＢＳ中の１０μｌの抗体（ＰＥ結合ＣＤ３３抗体（R&D）およびＦＩＴＣ結合Ｎｏｔｃｈ−１抗体（R&D））で１０分間反応させて標識し、ＰＢＳで細胞を洗浄して細胞懸濁液を作製した。これをFACSCaliburTMフローサイトメーター（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）に供して陽性細胞を検出し、CellQuest Pro software（BD Biosciences）で解析した。図４１に示す結果から、１例のＡＬＬ（急性リンパ性白血病）検体を除き、ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）検体においてＮｏｔｃｈ−１／ＣＤ３３陽性細胞が高頻度に認められることが分かる。参考のため、下表１０に、各検体におけるＮｏｔｃｈ−１および／またはＣＤ３３陽性細胞の割合を示す。表中、２０以上の数値を四角で囲ってある。なお、各検体は上表９と同じ順序で記載してある。
【表１０】
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【０１９３】
実施例３１  ドキソルビシンを被包するフコシル化リポソームの各種白血病検体細胞への効果
ＷＳＴ−１アッセイによって、ドキソルビシンを被包するフコシル化リポソームの細胞毒性効果を調べた。２×１０４個の各種細胞を９６ウェルカルチャーフラスコに播種し、０．１μＭまたは１．０μＭのドキソルビシン単独（ＤＯＸ）、ドキソルビシン内包フコシル化（Ｆ２５）または非フコシル化リポソーム（Ｆ０）とともに、細胞をインキュベートした。２時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、培養液（１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地）に置換後、さらに７２時間培養してから実施例１２と同様にＷＳＴ−１試薬でのアッセイを行い、生細胞数を計測した。図４２に示すとおり、Ｎｏｔｃｈ−１発現検体（Ｃａｓｅ１および２）では、ドキソルビシン内包フコシル化リポソームが、ドキソルビシン単独およびドキソルビシン内包非フコシル化リポソームに比べ顕著な殺細胞効果を示した。これに対し、Ｎｏｔｃｈ−１非発現検体（Ｃａｓｅ４）では、このような顕著な殺細胞効果は認められなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年10月19日(2012.10.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第１のリガンドを含む、細網内皮系細胞における多特異性レクチンをブロックするための第１の成分と、該第１のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第２のリガンドで標的化された、標的細胞に関連する疾患を処置するための薬剤を含む第２の成分とを含む、標的細胞に関連する疾患を処置するための組合わせ医薬製剤。
【請求項２】
第１の成分と第２の成分とが、同時投与および／または逐次投与される、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３】
第１のリガンドがマンノースまたは末端にマンノースを有する化合物であり、第２のリガンドがフコースまたはこれを末端に含む分子であり、標的細胞がフコシル化分子産生細胞である、請求項１または２に記載の医薬製剤。
【請求項４】
疾患が、腫瘍性疾患および炎症性疾患からなる群から選択される、請求項３に記載の医薬製剤。
【請求項５】
腫瘍性疾患が、固形腫瘍および白血病からなる群から選択される、請求項４に記載の医薬製剤。
【請求項６】
細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第１のリガンドを含む、細網内皮系細胞における多特異性レクチンをブロックするための第１の成分と、該第１のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第２のリガンドで標的化された担体を含む第２の成分とを含む、標的細胞特異的に物質を送達するための組合わせ医薬組成物。
【請求項７】
物質が、標識または標的細胞に関連する疾患を処置するための薬物である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
標識が、気体もしくは生理条件下で気体を発生する物質、放射性同位体、磁性体、核磁気共鳴する元素、核磁気共鳴する元素の緩和時間に影響を与える物質、標識化物質に結合する物質、蛍光物質、フルオロフォア、化学発光物質、酵素、ビオチンもしくはその誘導体、アビジンもしくはその誘導体、または、これらの１または２以上を含む物質からなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第１のリガンドを含む、細網内皮系細胞における多特異性レクチンをブロックするための第１の成分と、該第１のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第２のリガンドで標的化された標識剤を含む第２の成分とを含む、標的細胞またはこれを含む組織を標識するための組合わせ医薬組成物。
【請求項１０】
第１のリガンドがマンノースまたは末端にマンノースを有する化合物であり、第２のリガンドがフコースまたはこれを末端に含む分子であり、標的細胞がフコシル化分子産生細胞である、請求項６〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第１のリガンドと、該第１のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第２のリガンドで標的化された、標的細胞に関連する疾患を処置するための薬剤とを、単独でまたは組み合わせて含む１または２以上の容器を含む、標的細胞に関連する疾患を処置するためのキット。
【請求項１２】
第１のリガンドがマンノースまたは末端にマンノースを有する化合物であり、第２のリガンドがフコースまたはこれを末端に含む分子であり、標的細胞がフコシル化分子産生細胞である、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第１のリガンドを含む、該第１のリガンドとは異なる細網内皮系細胞における多特異性レクチンの第２のリガンドで標的化された担体、薬剤または標識剤の標的特異性強化剤。
【請求項１４】
第１のリガンドがマンノースまたは末端にマンノースを有する化合物であり、第２のリガンドがフコースまたはこれを末端に含む分子であり、標的特異性がフコシル化分子産生細胞に対する特異性である、請求項１３に記載の標的特異性強化剤。
【国際調査報告】
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