(57)【要約】  生体の深達度の高い近赤外光（ＮＩＲ）、赤外光、遠赤外光などの赤外域光を利用しうる光線力学治療（ＰＤＴ）や光線力学的診断（ＰＤＤ）に用いることが治療及び／又は診断剤を提供するものである。波長０．７μｍ〜２．５μｍの近赤外光等の赤外域光にてランタニド粒子等のアップコンバージョン発光する粒子と、ポルフィリン等の光増感剤や５−アミノレブリン酸類を含む、がんや感染症の光線力学的治療又は診断剤や治療又は診断キットとする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤外域光にてアップコンバージョン発光する粒子と、光増感剤又は５−アミノレブリン酸類とを含むことを特徴とする光線力学的治療又は診断剤。
【請求項２】
赤外域光にてアップコンバージョン発光する粒子がランタニド粒子であることを特徴とする請求項１記載の光線力学的治療又は診断剤。
【請求項３】
ランタニド粒子がマンノースとの複合体であることを特徴とする請求項２記載の光線力学的治療又は診断剤。
【請求項４】
光増感剤がテトラピロール化合物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の光線力学的治療又は診断剤。
【請求項５】
５−アミノレブリン酸類が、５−アミノレブリン酸若しくはその誘導体、又はこれらの塩であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の光線力学的治療又は診断剤。
【請求項６】
赤外域光が、波長０．７μｍ〜２．５μｍの近赤外光であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の光線力学的治療又は診断剤。
【請求項７】
がんの治療又は診断であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の光線力学的治療又は診断剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤外域光による光線力学的治療又は診断剤、詳しくはランタニド粒子等の赤外域光にてアップコンバージョンを起こす粒子と、光増感剤又は５−アミノレブリン酸類とを含む光線力学的治療剤や光線力学的診断剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内をイメージングする技術は現在、医療の現場において必要不可欠なものとなっている。例としては、がん患者に５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を投与し、代謝物であるプロトポルフィリンＩＸ（ＰＰＩＸ）の青色光励起による赤色光発光を検出することで、境界が不鮮明な腫瘍の輪郭の確認を行う方法があり、外科手術の補助に用いられている。【０００３】
このような腫瘍内に蓄積した光感受性の物質の蛍光発生を利用し、腫瘍の局所診断を行う方法は光線力学的診断（ＰＤＤ）と呼ばれる。さらにＰＰＩＸは励起されると一重項酸素という活性酸素を発生するため、がん組織を破壊することができるが、青色光励起では組織浸透性が低いため表面のがん組織しか破壊できない。そこで、より組織浸透性の高い励起光を用いることで治療効果が期待できる。近赤外光（ＮＩＲ）を用いれば組織浸透性の低さだけでなく、紫外線〜可視光領域で励起する際の背景蛍光、光毒性といった問題点も克服できる。この様々な利点を持つＮＩＲ励起を可能にするツールとして、ランタニドナノ粒子（ＬＮＰ）が知られている（例えば特許文献１参照）。通常の蛍光基は励起光より低エネルギーの光を発するのに対し、ＬＮＰはＮＩＲ励起によってよりエネルギーの高い可視光を発光する、というアップコンバージョン発光が注目を集めている。【０００４】
このようなアップコンバージョン発光を利用した光線力学治療（ＰＤＴ）として、例えば、ＬＮＰ（ＮａＹＦ４；Ｙｂ３＋，Ｅｒ３＋）にコーティングしたシリカ層に光増感色素メロシアニン５４０をドーピングした表面にがん抗原に特異的抗体を結合した抗体−ＬＮＰ複合体（例えば非特許文献１参照）や、希土類元素を含有し、アップコンバージョン発光する蛍光体微粒子の表面に、末端にカルボキシル基を有するポルフィリン系色素がアミド結合により結合されてなる、生体深達性が高く光線力学的治療法等に適した蛍光体微粒子−有機色素複合体（例えば特許文献２参照）が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−１８６５８０号公報
【特許文献２】特開２００９−２４１１５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J. AM. CHEM. SOC. 2007, 129, 4526-4527
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＰＤＴは増感剤を投与した後に患部に光を照射し、発生する活性酸素や各種ラジカルなどの殺効果で感染菌やがん細胞などを除去する技術で、手術などの一般法に比べ侵襲性が低く傷跡も残さないため次世代の治療法として注目されている。しかしながら、増感剤を励起する光が到達できる深さまでしか適用できないため、応用範囲が皮膚疾患などに限定されてきた。光の到達度がなるべく深い、波長の長い光で励起できる増感剤が開発されているが、最も長波長で励起できるレザフィリンでもその励起光は６６４ｎｍであり、十分な光到達にはほど遠い。【０００８】
ＰＤＤは増感剤を投与した後に励起光を照射し、増感剤が発する蛍光を観察することで診断を行う手法であるが、多くの増感剤に適した励起光は４００ｎｍ付近であり、脂肪などで遮蔽されるため、偽陰性を引き起こしやすい。【０００９】
本発明の課題は、生体の深達度の高い近赤外光（ＮＩＲ）、赤外光、遠赤外光などの赤外域光を利用しうるＰＤＴやＰＤＤに用いることが治療及び／又は診断剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、５−アミノレブリン酸類とＬＮＰを組み合わせて使用することで、生体への深達度の高い赤外域光を利用するＰＤＴやＰＤＤが可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、（１）赤外域光にてアップコンバージョン発光する粒子と、光増感剤又は５−アミノレブリン酸類とを含むことを特徴とする光線力学的治療又は診断剤や、（２）赤外域光にてアップコンバージョン発光する粒子がランタニド粒子であることを特徴とする前記（１）記載の光線力学的治療又は診断剤や、（３）ランタニド粒子がマンノースとの複合体であることを特徴とする前記（２）記載の光線力学的治療又は診断剤や、（４）光増感剤がテトラピロール化合物であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか記載の光線力学的治療又は診断剤や、（５）５−アミノレブリン酸類が、５−アミノレブリン酸若しくはその誘導体、又はこれらの塩であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか記載の光線力学的治療又は診断剤や、（６）赤外域光が、波長０．７μｍ〜２．５μｍの近赤外光であることを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれか記載の光線力学的治療又は診断剤や、（７）がんの治療又は診断であることを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか記載の光線力学的治療又は診断剤に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、生体への深達度の高い赤外域光を用いたＰＤＴやＰＤＤが可能となり、従来表層の患部に限定されてきたＰＤＴやＰＤＤの対象を全身に拡大することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】市販ランタニド粒子発光によるプロトポルフィリンIXからの一重項酸素の発生実験の結果を示す図である。
【図２】他の態様の市販ランタニド粒子発光によるプロトポルフィリンIXからの一重項酸素の発生実験の結果を示す図である。
【図３】市販ランタニド粒子の細胞毒性試験の結果を示す図である。
【図４】市販ランタニド粒子発光とプロトポルフィリンIXによるがん細胞障害実験の結果を示す図である。
【図５】他の態様の市販ランタニド粒子発光とプロトポルフィリンIXによるがん細胞障害実験の結果を示す図である。
【図６】合成ランタニド粒子発光によるプロトポルフィリンIXからの一重項酸素の発生実験の結果を示す図である。
【図７】合成ランタニド粒子の細胞毒性試験の結果を示す図である。
【図８】合成ランタニド粒子発光とプロトポルフィリンIXによるがん細胞障害実験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の光線力学的治療剤又は本発明の光線力学的診断剤としては、赤外域光にてアップコンバージョン発光する粒子と、光増感剤又は５−アミノレブリン酸類とを含むものであれば特に制限されず、本発明の光線力学的治療又は診断剤と、赤外域光の照射デバイスを組み合わせると、がん、異形成、細菌・真菌感染部位、ウイルス感染細胞の他に、アレルギーによる炎症部位などの病変部のＰＤＴやＰＤＤが可能となる。また、本発明の光線力学的治療又は診断剤は、光線力学的治療又は診断キットとすることもできる。
【００１５】
本発明において、赤外域光とは、生体の透過性の高い概ね０．７μｍ〜１ｍｍの波長域に属する光をいい、かかる赤外域光は波長０．７μｍ〜２．５μｍの近赤外光、波長２．５μｍ〜４μｍの中赤外光、波長４μｍ〜１ｍｍの遠赤外光に分類される。かかる赤外域光の中でも、比較的エネルギーが高く生体透過度も高い近赤外光、より好ましくは波長０．７μｍ〜１．５μｍの近赤外光を有利に用いることができる。これら赤外域光は通常のランプやレーザー光線により供給されるが、これらの波長範囲の光を含みさえすれば光源は特に限定されない。
【００１６】
本発明において、アップコンバージョンとは逆ストークスシフトの一種であり、励起状態にある原子や分子にさらに光量子が与えられたときに最初に照射した光より高エネルギーである短波長の光を放出する量子現象をいい、アップコンバージョン発光とは、アップコンバージョンを起こす物質に光を照射したときに発生する、励起エネルギーよりも高いエネルギーの光（励起光よりも波長が短い光）をいう。
【００１７】
赤外域光にてアップコンバージョン発光をする粒子（以下「アップコンバージョン粒子」という場合がある）としては、複数のランタノイドイオンを含む粒子、好ましくは平均粒子径が１０〜５００ｎｍ、より好ましくは５０〜２００ｎｍの微粒子を好適に例示することができ、ランタノイド元素としては原子番号５７〜７１までのＬａ，Ｃｅ，Ｐｒ，Ｎｄ，Ｐｍ，Ｓｍ，Ｅｕ，Ｇｄ，Ｔｂ，Ｄｙ，Ｈｏ，Ｅｒ，Ｔｍ，Ｙｂ，Ｌｕの１５の元素を挙げることができる。上記ランタノイドイオンの中でも、アップコンバージョンの効率の高いものとしてはＹｂ３＋（イットリビウムイオン）とＥｒ３＋（エルビウムイオン）、Ｈｏ３＋（ホロミウムイオン）又はＴｍ３＋（ツリウムイオン）との複合体等を挙げることができる。Ｙｂ３＋と  Ｅｒ３＋を含む粒子の場合、Ｙｂ３＋がｆ軌道遷移で吸収した赤外域光のエネルギーをＥｒ３＋に非放射エネルギー遷移で受け渡し、Ｅｒ３＋にて多光子吸収にも似た遷移を引き起こし、照射光よりも単位あたり高エネルギーである可視光を放射する。このようなランタノイド粒子は良く知られており、例えばＮａＹＦ４；Ｙｂ／Ｅｒでは９８０ｎｍの近赤外光を吸収して６５０ｎｍと５５０ｎｍ付近の可視光を放射するし、ＮａＹＦ４；Ｙｂ／Ｔｍでは９８０ｎｍの近赤外光を吸収して８００ｎｍの近赤外光と４６０ｎｍの可視光を放出する。
【００１８】
これらランタノイド粒子はスクリーン用などに市販されている市販品を購入して用いることもできるし、公知の方法に基づき作製した合成品を用いてもよい。ランタノイド粒子は、例えばＮａＹＦ４；Ｙｂ／Ｅｒの場合、ＹｂＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，ＹｂＣｌ３・６Ｈ２Ｏ，ＥｒＣｌ３・６Ｈ２Ｏ，ＮＨ４Ｆ，ＮａＣｌ，ポリエチレンイミン，エチレングリコールを混合し、オートクレーブで２００℃程度に加熱することで合成できる。細かな組成比や加熱温度、時間の調整で様々な粒径やアップコンバージョン特性の違うランタノイド粒子が合成可能である。
【００１９】
合成されたランタノイド粒子はそのまま用いることもできるし、粉砕化してナノ化してランタノイドナノ粒子（ＬＮＰ）として用いることもできる。また、定法に従い粒子表面を修飾することもできる。表面修飾は、例えば糖やアミノ酸で修飾することで、生体適合性を向上させたり、細胞への取り込みをコントロールすることができる。
【００２０】
例えば、がん組織を貪食するマクロファージはマンノースレセプター、β−グルカンレセプター、Ｆｃレセプター等を有しており、例えばＬＮＰに１−アミノエチルマンノース（ＮＥｔＭａｎ）を付加したマンノース−ＬＮＰ複合体をプローブとして用いることで特異的なイメージングが可能となる。さらにがん組織や腫瘍組織は、正常組織に比べ血管透過性が著しく亢進しているため、微粒子が血管より流出しやすく、またリンパ系が発達していないため、がん組織や腫瘍組織に到達した微粒子が蓄積する特性を有しており、このようなＥＰＲ効果（Enhanced Permeation and Retention effect）を利用することによって、がん細胞に対して受動的ターゲティングが可能となる。そしてＬＮＰの粒径を５０ｎｍ〜２００ｎｍにコントロールすれば、血管に投与した場合に血管の透過性が高い組織に選択的にがん組織や腫瘍組織に辿り着き蓄積させることができる。
【００２１】
本発明でのランタノイド粒子の投与は、ＰＤＴやＰＤＤを行いたい部分に投与することができればその投与方法は特に制限されないが、注射などで直接注入する手法の他、静脈注射、点滴、動脈注射、発布、添鼻、膀注、浣腸、舌下等の投与方法を挙げることができる。表１に各種ランタノイド粒子における発光を示す。なお、被覆剤のＰＥＩはポリエチレンイミンを意味する。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
本発明における光増感剤は可視光を吸収して蛍光を発し、また、活性酸素を発生することができる。これら光増感剤としては、ＰＤＴやＰＤＤに使用されている光増感剤であればすべて使用することができるが、中でもテトラピロール系化合物を好適に例示することができ、具体的には、フォトフリン、レザフリン、プロトポルフィリンIX、フォスキャン、クロリン、ウロポルフィリンI、ウロポルフィリンIII、ヘプタカルボキシルポルフィリンI、ヘプタカルボキシルポルフィリンIII、ヘキサカルボキシルポルフィリンI、ヘキサカルボキシルポルフィリンIII、ペンタカルボキシルポルフィリンI、ペンタカルボキシルポルフィリンIII、コプロポルフィリンI、コプロポルフィリンIII、イソコプロポルフィリン、ハルデロポルフィリン、イソハルデロポルフィリン、ヘマトポルフィリン、メソポルフィリン、エチオポルフィリン、ピロポルフィリン、デューテロポルフィリンIX、ペンプトポルフィリン、ＡＴＸｓ−１０等を挙げることができる。また、投与量は可視光でのＰＤＴで推奨されると同量である。
【００２４】
本発明における５−アミノレブリン酸類（ＡＬＡ類）としては、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）若しくはその誘導体、又はこれらの塩を挙げることができる。ＡＬＡは公知の化合物であり、それ自身は可視光の吸収も弱く光照射で蛍光も活性酸素も発生しないが、投与後体内で光増感物質であるプロトポルフィリンに代謝されるため光増感剤として有利に作用する。ＡＬＡ類を投与した場合のプロトポルフィリンIXの蓄積は、がん、異形成、細菌・真菌感染部位、ウイルス感染細胞などの病変部に特異的であり、また、ＡＬＡ類は安全性も高い化合物であるためもっとも有望な光増感剤として作用する。
【００２５】
ＡＬＡの誘導体は、式Ｒ２Ｒ１ＮＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＲ３[式中、Ｒ１及びＲ２は各々独立に、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリール基又はアラルキル基を示し；Ｒ３はヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基又はアミノ基を示す。但し、Ｒ１及びＲ２が水素原子でＲ３がヒドロキシ基のＡＬＡは除く。]で示すことができる。ＡＬＡ誘導体としては、ＡＬＡメチルエステル、ＡＬＡエチルエステル、ＡＬＡプロピルエステル、ＡＬＡブチルエステル、ＡＬＡペンチルエステル、ＡＬＡヘキシルエステル等を挙げることができる。また、ＡＬＡ誘導体として、エステル基とアシル基を有するＡＬＡ誘導体を好適に例示することができる。エステル基とアシル基を有するＡＬＡ誘導体としては、メチルエステル基とホルミル基、メチルエステル基とアセチル基、メチルエステル基とｎ−プロパノイル基、メチルエステル基とｎ−ブタノイル基、エチルエステル基とホルミル基、エチルエステル基とアセチル基、エチルエステル基とｎ−プロパノイル基、エチルエステル基とｎ−ブタノイル基の組み合わせを具体的に例示することができる。
【００２６】
ＡＬＡ又はその誘導体の塩としては特に制限されないが、薬学的に許容される無機酸又は有機酸の酸付加塩が好ましい。無機酸の付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩を挙げることができ、有機酸の付加塩としては、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等を挙げることができる。その他、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩や、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩等も挙げることができる。なお、これらの塩は使用時において溶液として用いられる。
【００２７】
これらのＡＬＡ類のうち、もっとも望ましいものはＡＬＡ、ＡＬＡメチルエステル、ＡＬＡエチルエステル、ＡＬＡプロピルエステル、ＡＬＡブチルエステル、ＡＬＡペンチルエステル、及びこれらの塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩である。
【００２８】
以上のＡＬＡ類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またいずれかを単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。また、ＡＬＡ類は、化学合成、微生物による生産、酵素による生産のいずれの方法によっても製造することができる。
【００２９】
上記ＡＬＡ類を水溶液として調製する場合には、ＡＬＡ類の分解を防ぐため、水溶液がアルカリ性とならないように留意する必要がある。アルカリ性となってしまう場合は、酸素を除去することによって分解を防ぐことができる。
【００３０】
本発明における光増感剤やＡＬＡ類には、必要に応じて薬効成分、栄養剤、賦形剤等の他の成分を加えることができる。本発明における増感剤の剤型としては、注射剤、点滴剤、膀胱内注入剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、シロップ剤、発布剤、座薬等を例示することができる。これらは溶剤、分散媒、増量剤、賦形剤等を適宜用い、常法に従って製剤することができる。
【００３１】
本発明における光増感剤やＡＬＡ類は、アップコンバージョン粒子と同時に投与しても良いし、また、別々に投与することもできる。増感剤を配合できる担体としては、摂取するために適した有機または無機の固体または液体の、通常は不活性な製薬学的に許容できる担体材料が用いられる。具体的には、担体には例えば結晶性セルロース、ゼラチン、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物性および動物性脂肪および油、ガム、ポリアルキレングリコールがある。
【００３２】
本発明におけるテトラピロール系の光増感剤の多くは静脈内注射や点滴で投与される。他方、本発明におけるＡＬＡ類は静脈内注射や点滴に限らず、舌下投与も含む経口投与、パップ剤等による経皮投与、座薬、膀胱内注入などの各種の投与形態が適用可能であるが、患者の負担を考えると経口投与が有利である。
【００３３】
上記ＡＬＡ類の投与量は、ＡＬＡ塩酸塩換算で、成人１人当たりＡＬＡ類の合計が、３０ｍｇ〜３０００ｍｇ、好ましくは５００ｍｇ〜２０００ｍｇである。
【００３４】
本発明における光増感剤やＡＬＡ類の投与から赤外域光の照射までの時間は通常の可視光評価と同じでよく、例えばフォトフリン等のテトラピロール化合物の場合は投与より２日〜４日、ＡＬＡ類の場合は投与より３〜６時間程度である。これに対し、アップコンバージョン粒子は、光照射時までに患部に到達すればよいが、一般に直接投与や血管経由の投与の場合は速やかに患部に到達するため、この場合は治療直前に投与することができる。アップコンバージョン粒子は一般にがん等の患部にＥＰＲ効果により貯留されるため、数日前の投与でも問題はないし、粒子を貯留させておいて光増感剤やＡＬＡ類のみを追加しながら複数回の治療を行うことも可能である。
【００３５】
本発明の光線力学的治療剤を用いたＰＤＴの場合、光増感物質とアップコンバージョン粒子とが患部に存在するタイミングで赤外域光を照射すると、透過度の高い赤外域光は体内の深部であってもアップコンバージョン粒子に到達し、可視光が放出される。アップコンバージョン粒子近傍に存在する光増感物質はその可視光で励起され活性酸素を生じ患部を治療できる。この仕組みにより光深達度の問題で外部からの可視光照射では励起できない深部での治療が可能になる。治療したい場所が特定される場合は多方向からの赤外域光で効率よく励起でき、このような目的には近赤外光レーザーを有利に用いることができる。
【００３６】
ＡＬＡ類の投与、あるいはマンノース−ＬＮＰ複合体、がん抗原特異抗体−ＬＮＰ複合体の投与など、いずれか一方あるいはその両方が患部に選択性がある場合は、赤外域光治療器などで幹部周辺を照射することで患部を選択的に治療することができる。
【００３７】
また、ＰＤＴ対象の一つであるがんの腹腔内転移などの場合は現在有効な治療法が知られていないが、ＬＮＰ等のアップコンバージョン粒子と、光増感剤やＡＬＡ類とを投与し、赤外域光で長時間照射することで治療が可能となる。一般の可視光を用いるＰＤＴの場合は光障害が問題になるが、可視光は直接にはアップコンバージョン粒子を励起しないので光障害を避けられる。
【００３８】
通常のＡＬＡ類や光増感剤を用いるＰＤＤの場合、励起効率の高い青い可視光を照射して光増感物質のソーレーバンドで吸収し、発生する赤色蛍光で患部を診断する。一般に浅い部位の診断や手術中の切除部位の決定などに使われる技術であるために、光深達度の低い青い光でも問題がないように思われるが、実際の手術などでは患部の表層に脂肪組織が存在する場合が多く、青色可視光は脂肪で吸収されてしまうため、光増感物質を励起することができない。現実には、例えばセンチネルリンパ節のがん転移などをＰＤＤする場合は切除した後切断し、切断面を観察する必要がある。
【００３９】
本発明の光線力学的診断剤を用いたＰＤＤの場合、発生する蛍光は赤色であるため脂肪組織を透過でき、脂肪の上からでも十分観察できる。赤外域光は容易に脂肪を透過するためＬＮＰ等のアップコンバージョン粒子によって可視光が発光し、さらに光増感物質で透過度の高い長波長の蛍光を発する。このように切除することなく転移の有無を観察できることはＱＯＬ上の福音となる。また、脂肪が少ない病巣の場合は青色可視光での励起でも十分蛍光を出せるが、青色可視光の照射は少なからず病巣が青色を呈するため正常な組織観察のじゃまとなる。しかしながら励起光として赤外域光を使用する限り、人間の目には見えないので全く観察の妨げにならない。
【００４０】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４１】
［市販ＬＮＰによる一重項酸素の発生（１）］
１，３−ジフェニルイソベンゾフラン（ＤＰＢＦ）を用いて一重項酸素１Ｏ２の発生を検出した。
アルミホイルで遮光したビーカーに１００ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＰＢＦ２．８ｍｇ（１×１０−４Ｍ）、ＰＰＩＸ２．０ｍｇ（２×１０−５Ｍ）を入れ撹拌した。そこから２５ｍｌを別の遮光したバイアルに移し、市販のＬＮＰ（Shanghai Keyan Phosphor Technology Co. Ltd.製「Up-Conversion Anti-Counterfreit Phosphor (Green)」）２５０ｍｇを入れ、半導体レーザにより９８０ｎｍのＮＩＲ（出力４００ｍＡ）を５０ｍｍ上方から照射した。照射始めを０ｍｉｎとして、撹拌しながら０，３，５，７，１０，１５，２０ｍｉｎのサンプルを５００μｌ取り、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移して１００００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心した。遠心後の上清４０μｌをＤＭＳＯ５６０μｌで１５倍に希釈し、４１５ｎｍの吸光度を測定した（ＬＮＰ（＋），ＮＩＲ（＋））。残った７５ｍｌのサンプルでコントロール実験を行った。ネガティブコントロール実験としてＮＩＲを照射しない場合（ＬＮＰ（＋），ＮＩＲ（−））、ＬＮＰが存在しない場合（ＬＮＰ（−），ＮＩＲ（＋））を行い、ポジティブコントロールとして、ＰＰＩＸを励起できることが知られている４００ｎｍのＵＶを照射するという条件（ＵＶ（＋），ＬＮＰ（−））で同様の実験を行った。結果を図１に示す。【００４２】
図１のＮＩＲ（＋）ＬＮＰ（＋），ＵＶ（＋）ＬＮＰ（−）では吸光度の減少が観察され、ＤＰＢＦが分解されていることが確認できた。つまり一重項酸素が発生していることが示唆された。一方で、ＮＩＲ（＋）ＬＮＰ（−），ＮＩＲ（−）ＬＮＰ（＋）では吸光度の減少は確認されなかった。以上のことからＮＩＲ照射によってＬＮＰを介して間接的にＰＰＩＸを励起し、一重項酸素を発生させることができるということが分かった。
【実施例２】
【００４３】
［市販ＬＮＰによる一重項酸素の発生（２）］
実施例１と同様に、ＤＰＢＦを用いて一重項酸素１Ｏ２の発生を検出した。
アルミホイルで遮光したビーカーに１００ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＰＢＦ２．８ｍｇ（１×１０−４Ｍ）、ＰＰＩＸ３．６ｍｇ（３．６×１０−５Ｍ）を入れ撹拌した。そこから２５ｍｌを別の遮光したバイアルに移し、市販のＬＮＰ６２．５ｍｇを入れ、半導体レーザにより９８０ｎｍのＮＩＲ（出力４００ｍＡ）を５０ｍｍ上方から照射した。照射始めを０ｍｉｎとして、撹拌しながら０，１，２，３，６，８，１０，１５ｍｉｎのサンプルを５００μｌ取り、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移して１００００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心した。遠心後の上清４０μｌをＤＭＳＯ５６０μｌで１５倍に希釈し、４１５ｎｍの吸光度を測定した（ＬＮＰ（＋），ＮＩＲ（＋））。残った７５ｍｌのサンプルでコントロール実験を行った。ネガティブコントロール実験として、ＮＩＲを照射せず、ＬＮＰも存在しない場合（ＬＮＰ（−），ＮＩＲ（−））、ＮＩＲを照射しない場合（ＬＮＰ（＋），ＮＩＲ（−））、ＬＮＰが存在しない場合（ＬＮＰ（−），ＮＩＲ（＋））で同様の実験を行った。結果を図２に示す。【００４４】
図２のＮＩＲ（＋）ＬＮＰ（＋）では吸光度の減少が観察され、ＤＰＢＦが分解されていることが確認できた。つまり一重項酸素が発生していることが示唆された。一方で、ＮＩＲ（−）ＬＮＰ（−），ＮＩＲ（＋）ＬＮＰ（−），ＮＩＲ（−）ＬＮＰ（＋）では吸光度の減少は確認されなかった。以上のことからＮＩＲ照射によってＬＮＰを介して間接的にＰＰＩＸを励起し、一重項酸素を発生させることができるということが分かった。
【実施例３】
【００４５】
［市販ＬＮＰの細胞毒性試験］
ヒト胃がん由来細胞株であるＭＫＮ４５細胞をＬＮＰ存在下で培養し、市販のＬＮＰの細胞毒性試験を行った。
液体培地（ＲＰＭＩ−１６４０，ＦＢＳ（＋），ＰＳＮ（＋））中で培養されたＭＫＮ４５細胞の入った１０ｃｍ  ｄｉｓｈの培地をアスピレーションし、ＰＢＳ溶液３ｍｌで洗った。そこにトリプシン１ｍｌを加え、５分間インキュベート（３７℃，５％ＣＯ２）した。新しい培地を５ｍｌ加え、トリプシンの酵素反応を終了させた。合計６ｍｌを１１００ｒｐｍで５分間遠心した。この際、サンプル１０μｌを死細胞を染める色素トリパンブルーと混合し、血球計算版で生細胞数をカウントした。遠心後の上清をアスピレーションし、新しい培地２ｍｌを加えた。そこから９６ｗｅｌｌプレートに、２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように１００μｌずつ合計４８ｗｅｌｌにＬＮＰ濃度１０ｍｇ／ｍｌから２倍希釈で１０系統濃度を振り、コントロールとブランクを含めて１２系統、ｎ＝４で細胞を播いた。一晩培養した後、各ｗｅｌｌの培地を捨てＰＢＳ溶液１００μｌで洗い、１００μｌの新しい培地とＰＢＳで１０倍に希釈したＭＴＴメタノール溶液を１０μｌ、各ｗｅｌｌに加えた。４時間インキュベートした後に１０％ＳＤＳを１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、一晩インキュベートし、５７０ｎｍ−６６０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図３に示す。【００４６】
図３のグラフからわかるように、市販ＬＮＰの濃度に依存して細胞毒性が確認された。この結果を受けて、生存率に影響を与えないＬＮＰ濃度２．０〜２．５ｍｇ／ｍｌで以後の実験を行うこととした。
【実施例４】
【００４７】
［市販ＬＮＰでのＡＬＡ−ＰＤＴ（１）］
ＭＫＮ４５細胞をＡＬＡ，ＬＮＰ存在下でＮＩＲ照射し、細胞死が起こるか確認した。
液体培地（ＲＰＭＩ−１６４０，ＦＢＳ（＋），ＰＳＮ（＋））中で培養されたＭＫＮ４５細胞の入った１０ｃｍｄｉｓｈの培地をアスピレーションし、ＰＢＳ溶液３ｍｌで洗った。そこにトリプシン１ｍｌを加え、５分間インキュベート（３７℃，５％ＣＯ２）した。新しい培地を５ｍｌ加え、トリプシンの酵素反応を終了させた。合計６ｍｌを１１００ｒｐｍで５分間遠心した。この際、サンプル１０μｌを死細胞を染める色素トリパンブルーと混合し、血球計算版で細胞数をカウントした。遠心後の上清をアスピレーションし、新しい培地２ｍｌを加えた。そこから９６ｗｅｌｌプレートに、２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように１００μｌずつＡＬＡ濃度１０００，１００，１０，０μＭとブランク用に播いた。それぞれＬＮＰ（＋）とＬＮＰ（−）の系統を用意し、ＮＩＲ（＋）とＮＩＲ（−）用にプレートを２枚に分けた。一晩培養した後、培地を捨て新しい培地（ＬＮＰ（＋）はＬＮＰ  ２．５ｍｇ／ｍｌを含む）１００μｌと０．２ＭのＡＬＡを上述の濃度になるように調整し、添加した。４時間インキュベートした後に９８０ｎｍのＮＩＲ（４００ｍＡ）をプレートの５０ｍｍ上方から３ｍｉｎ／ｗｅｌｌ照射した。一晩培養した後、各ｗｅｌｌの培地を捨てＰＢＳ溶液１００μｌで洗い、１００μｌの新しい培地とＰＢＳで１０倍に希釈したＭＴＴメタノール溶液を１０μｌ、各ｗｅｌｌに加えた。４時間インキュベートした後に１０％ＳＤＳを１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、一晩インキュベートし、５７０ｎｍ−６６０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図４に示す。【００４８】
図４からもわかるように、ＮＩＲを照射しない条件では細胞生存率に変化はなかったが、ＬＮＰ（−）ＮＩＲ（＋）の条件では若干の生存率低下が確認された。この原因としては発熱などが考えられる。ＮＩＲ照射による市販ＬＮＰのアップコンバージョン発光により、ＡＬＡ−ＰＤＴ活性が確認できた。しかし、４０％程度の細胞が生存しているので、さらに低い生存率にするためにＡＬＡ添加後の培養時間を４時間から２４時間に延長し、ＰＰＩＸをより多く蓄積させることが考えられる。
【実施例５】
【００４９】
［市販ＬＮＰでのＡＬＡ−ＰＤＴ（２）］
ＭＫＮ４５細胞を２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとし、ＡＬＡ濃度を２０００，１０００，１００，１０，０μＭとし、ＡＬＡ添加後の培養時間を４時間から２４時間に変更し、ＮＩＲの照射時間を９０ｍｉｎ／ｗｅｌｌ照射する以外は、実施例４と同様に、市販ＬＮＰでのＡＬＡ−ＰＤＴを行った。結果を図５に示す。【００５０】
図５からもわかるように、ＮＩＲを照射しない条件、及びＬＮＰ（−）ＮＩＲ（＋）の条件では細胞生存率に変化はなかったが、ＮＩＲ（＋）ＬＮＰ（＋）の条件では大幅に生存率が低下し、ＮＩＲ照射による市販ＬＮＰのアップコンバージョン発光により、ＡＬＡ−ＰＤＴ活性が確認できた。
【実施例６】
【００５１】
［マンノース−ＬＮＰ複合体の合成］
オレイン酸（ＯＡ）コートＬＮＰ（ＮａＹＦ４；Ｙｂ／Ｅｒ  ｏｒ  Ｔｍ／Ｇｄ＝１８／２／３０ｍｏｌ％）を合成した。
Ｈ２Ｏ  ６ｍｌにＮａＯＨ  １．２ｇ，Ｅｔｈａｎｏｌ  ２０ｍｌ，Ｏｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ２０ｍｌ，０．２Ｍ  ＲＥＣｌ３  ８ｍｌ（Ｈ２Ｏ  ８ｍｌ，ＹＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  ２４４．７ｍｇ，ＹｂＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  １１２．６ｍｇ，ＥｒＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  ｏｒ  ＴｍＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  １２．２ｍｇ，ＧｄＣｌ３・ｘＨ２Ｏ  １１４．５ｍｇ），２Ｍ  ＮＨ４Ｆ  ４ｍｌ（Ｈ２Ｏ  ４ｍｌ，ＮＨ４Ｆ  ２９８ｍｇ）を加え、オートクレーブで２００℃，２時間１４００回転で撹拌しながら反応させた。約２時間室温になるまで冷却し、１００００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を捨て、Ｈ２ＯとＥｔＯＨでそれぞれ３回ずつ洗浄した。【００５２】
オレイン酸コートＬＮＰのオレイン酸部位オレフィンの酸化的解裂を行った。
Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ  ２００ｍｌに上述の方法で合成したＯＡコートＬＮＰ（ＮａＹＦ４；Ｙｂ／Ｅｒ  ｏｒ  Ｔｍ／Ｇｄ＝１８／２／３０ｍｏｌ％）２００ｍｇ，ｔｅｒｔ−Ｂｕｔａｎｏｌ  １４０ｍｌ，Ｈ２Ｏ  ２０ｍｌ，５ｗｒ％  Ｋ２ＣＯ３ａｑ  １０ｍｌを加え室温で撹拌した。２０分後、Ｌｅｍｉｅｕｘ  ｖｏｎ−Ｒｕｄｏｌｆｆ  ｒｅａｇｅｎｔ  ４０ｍｌ（Ｈ２Ｏ  ４０ｍｌ，ＫＭｎＯ４  ３６．８ｍｇ，ＮａＩＯ４  ９００．５ｍｇ）を加え、４０℃で４８時間オイルバス中で反応させた。反応後、１００００ｒｐｍで１０分間遠心し、Ｈ２Ｏ，ａｃｅｔｏｎｅ，ＥｔＯＨで洗った。洗浄後、ＨＣｌ（予めｐＨ４〜５に調整）１００ｍｌを加え室温で３０分撹拌した。その後反応液を１００００ｒｐｍで１０分間遠心し、Ｈ２Ｏで２回洗浄した。【００５３】
酸化後オレイン酸コートＬＮＰにＮＥｔＭａｎを付加した。
上述の方法で合成したオレイン酸部位を酸化したＬＮＰ（ＮａＹＦ４；Ｙｂ／Ｅｒ／Ｇｄ＝１８／２／３０  ｍｏｌ％）７０ｍｇをＨ２Ｏ  １０ｍｌに、ＮＨＳ，ＥＤＣをそれぞれ７００ｍｇずつＨ２Ｏ  １０ｍｌに溶かし、室温で撹拌した。２０分後、ＮＥｔＭａｎ  ５００ｍｇをＨ２Ｏ  １０ｍｌに溶かしたものを加え４時間室温で反応させた。Ａｍｉｎｏ  Ｅｔｈａｎｏｌ  １０ｍｌを加え、さらに４時間反応させた。反応後の溶液を１００００ｒｐｍで１０分間遠心し、ＬＮＰを回収した。回収したＬＮＰをＨ２Ｏで洗浄した。
【実施例７】
【００５４】
［合成ＬＮＰによる一重項酸素の発生］
市販ＬＮＰに代えて実施例６で調製したオレイン酸コートＬＮＰを用いる以外は実施例２と同様に、合成ＬＮＰによる一重項酸素の発生実験を行った。結果を図６に示す。【００５５】
図６のＮＩＲ（＋）ＬＮＰ（＋）では吸光度の減少が観察され、ＤＰＢＦが分解されていることが確認できた。つまり一重項酸素が発生していることが示唆された。一方で、ＮＩＲ（−）ＬＮＰ（＋）では吸光度の減少は確認されなかった。以上のことから、ＮＩＲ照射によって合成ＬＮＰを介して間接的にＰＰＩＸを励起し、一重項酸素を発生させることができるということが分かった。
【実施例８】
【００５６】
［合成ＬＮＰの細胞毒性試験］
実施例６で調製した合成ＬＮＰ及び市販ＬＮＰを用いる以外は実施例３と同様に、細胞毒性試験を行った。結果を図７に示す。【００５７】
図７のグラフからわかるように、合成品及び市販品ともにＬＮＰの濃度に依存して細胞毒性が確認されたが、合成ＬＮＰの方が市販ＬＮＰよりも細胞毒性が強いことがわかった。
【実施例９】
【００５８】
［合成ＬＮＰでのＡＬＡ−ＰＤＴ（１）］
実施例６で調製した合成ＬＮＰの濃度を２ｍｇ／ｍＬとし、ＡＬＡ濃度を２０００，１５００，１０００，１００，０μＭとする以外は、実施例５と同様に、合成ＬＮＰでのＡＬＡ−ＰＤＴを行った。結果を図８に示す。【００５９】
図８からもわかるように、ＮＩＲを照射しない条件ＮＩＲ（−）ＬＮＰ（＋）では細胞生存率に変化はなかったが、ＮＩＲ（＋）ＬＮＰ（＋）の条件では大幅に生存率が低下し、ＮＩＲ照射による合成ＬＮＰのアップコンバージョン発光により、ＡＬＡ−ＰＤＴ活性が確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の光線力学的治療又は診断剤は、生体深達性が高く、ＰＤＴやＰＤＤに最適であり、肺癌、胃癌、子宮癌、皮膚癌等の各種癌や各種感染症の治療等に有利に使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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