(57)【要約】  この発明は、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測のための組成物及び方法、具体的には、配列表に記載される配列番号１〜９、配列番号１１〜１９、及び配列番号２１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、を含むポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片、或いは、それらに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いてＨｅｒ２蛋白質の発現量の増減を指標にしてトラスツズマブに対する治療感受性を予測するための組成物、キット、ＤＮＡチップ、並びに方法に関する。
2012147800.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）〜（ｅ）に示すポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又はその断片からなる群から選択される２以上のポリヌクレオチドを含む、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測用組成物：
（ａ）配列番号１〜９、配列番号１１〜１９、及び配列番号２１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片
（ｂ）配列番号１〜９、配列番号１１〜１９、及び配列番号２１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、を含むポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１〜９、配列番号１１〜１９、及び配列番号２１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片
（ｄ）配列番号１〜９、配列番号１１〜１９、及び配列番号２１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片。
【請求項２】
下記の（ｆ）〜（ｊ）に示すポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又はその断片からなる群から選択される１又は２をさらに含む、請求項１のいずれか１項に記載の組成物：
（ｆ）配列番号１０及び配列番号２０で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片
（ｇ）配列番号１０及び配列番号２０で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、を含むポリヌクレオチド
（ｈ）配列番号１０及び配列番号２０で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片
（ｉ）配列番号１０及び配列番号２０で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｊ）前記（ｆ）〜（ｉ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片。
【請求項３】
請求項１に記載の（ａ）〜（ｅ）に示すポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、及び／又はその断片の２以上を含む、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測用キット。
【請求項４】
請求項２に記載の（ｆ）〜（ｊ）に示すポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、及び／又はその断片の１又は２をさらに含む、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１〜２３のいずれかで表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その相補的配列からなるポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらの１６以上の連続した塩基を含む断片である、請求項３〜４に記載のキット。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、別個に又は任意に組み合わせて異なる容器に包装されている、請求項３〜５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７】
請求項１に記載の（ａ）〜（ｅ）に示すポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、及び／又はその断片の２以上を含む、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測用ＤＮＡチップ。
【請求項８】
請求項２に記載の（ｆ）〜（ｊ）に示すポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、及び／又はその断片の１又は２をさらに含む、請求項７に記載のＤＮＡチップ。
【請求項９】
請求項１〜２のいずれかに記載の組成物、請求項３〜６のいずれかに記載のキット、又はそれらの組み合わせを用いて、乳ガン患者由来の試料における標的核酸の発現量の２以上を測定し、乳ガン患者がトラスツズマブに対する治療感受性を発揮することの可能性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで予測、判定若しくは評価することを含む、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測のための方法。
【請求項１０】
ＤＮＡチップを用いる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜２のいずれかに記載の組成物、請求項３〜６のいずれかに記載のキット、請求項７〜８のいずれかに記載のＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、乳ガン患者がトラスツズマブに対する治療感受性を持つことが既知の複数の試料中の標的核酸の発現量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する第１の工程、前記第１の工程で得られた該標的核酸の発現量を測定し、該標的核酸の発現量から算出される遺伝子発現量を教師とした判別式（サポートベクターマシン）を作成する第２の工程、乳ガン患者の手術時又は生検検査時に採取した試料中の該標的核酸の発現量を第１の工程と同様にｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する第３の工程、前記第２の工程で得られた判別式に第３の工程で得られた該標的核酸の発現量から算出した乳ガン病変部における遺伝子発現量を代入し、該判別式から得られた結果に基づいて、乳ガン患者がトラスツズマブに対する治療感受性を持つことを予測、判定若しくは評価する第４の工程を含む、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測のための方法
【請求項１２】
請求項１〜２のいずれかに記載の組成物、請求項３〜６のいずれかに記載のキット、請求項７〜８のいずれかに記載のＤＮＡチップ、又はそれらの組合せの、乳ガン患者がトラスツズマブに対する治療感受性を持つことをｉｎ  ｖｉｔｒｏで予測、判定若しくは評価するための乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測用組成物及び方法への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測（或いは、判定、評価、検出又は診断）に有用な組成物、該組成物を利用した乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測（或いは、判定、評価、検出又は診断）方法、及び該組成物を利用した乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測（或いは、判定、評価、検出又は診断）用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
乳ガンとは、乳房組織内の細胞が悪性化して無秩序に増殖する疾患であり、女性の罹患率は日本で２５人〜３０人に１人、欧米では８〜１０人に１人とされる。なお、罹患率は低いが男性も乳ガンに罹患することが知られている。最近の研究により、乳ガンは異なる生物学的特性を有する多様な集団からなっており、治療に対する反応性や予後がそれぞれの集団の患者で異なることがわかってきた。すなわち、ＤＮＡチップ解析による網羅的な発現遺伝子解析によって乳ガンは大きくわけて５つの分子サブタイプに分類できることが示唆されている。ただし、日常臨床においては、エスロトジェン受容体、プロジェステロン受容体、Ｈｅｒ２タンパク質の発現を検出することによって４つのサブタイプに分類して治療方針が検討されることが多い。乳ガンの治療は原則的には外科療法であるが、進行度や転移、全身状態、乳ガンの分類によって薬物療法や放射線療法が併用される。特に薬物療法の実施においては、上述の乳ガンサブタイプに応じて、対象患者に投与すべき薬物を評価し、適切な治療方針を選択することが重要である（非特許文献１）。【０００３】
これらのサブタイプの中で、乳ガンの約２５％を占めるＨｅｒ２陽性乳ガンは悪性度、転移率が高く予後不良であり、Ｈｅｒ２陽性乳ガンの治療成績の向上は今後も極めて重要な課題となっている。【０００４】
トラスツズマブ（商品名「ハーセプチン」（登録商標、中外製薬））は厚生労働省によって認可された抗体医薬であり、Ｈｅｒ２陽性乳ガンの細胞表面に存在するＨｅｒ２タンパク質に結合することで抗腫瘍効果を引き起こす。トラスツズマブはＨｅｒ２陽性乳ガンに対して用いられる第一選択薬である。しかしその一方で、Ｈｅｒ２陽性乳ガン患者の中には、トラスツズマブの効果がないトラスツズマブ非感受性乳ガン患者や、トラスツズマブの投薬によって心不全・呼吸困難・アレルギーといった重篤な副作用を生じる患者の存在も知られている。現在の臨床診断において乳ガンがＨｅｒ２陽性であるか否かを区別するために用いられている手法は免疫組織化学的手法によるＨｅｒ２タンパク質の過剰発現の検出、及び／又はＨｅｒ２タンパク質に対応するゲノム上の遺伝子増幅の検出であるが、これの手法では上述のＨｅｒ２陽性であるにもかかわらずトラスツズマブ非感受性を示す乳ガン患者、及び副作用を併発する乳ガン患者を判別することはできない。【０００５】
具体的には、免疫組織化学的手法によってＨｅｒ２タンパク質の過剰発現が認められ、トラスツズマブ単剤による治療を受けた患者のうちトラスツズマブに感受性を示した患者の割合は３５％以下であることが知られており（非特許文献２）、免疫組織化学的手法によるＨｅｒ２タンパク質の過剰発現の検出又はＨｅｒ２タンパク質に対応するゲノム上の遺伝子増幅の検出によってＨｅｒ２陽性を区別する検査方法（非特許文献３の検査方法）において、トラスツズマブに他の抗ガン剤を組み合わせた治療を受けた患者のうちトラスツズマブに感受性を示した患者の割合は６５．２％以下であることが知られている（非特許文献３）。すなわち、現在、臨床現場で利用されている非特許文献３の検査方法でのトラスツズマブ感受性予測の精度は６５．２％にとどまる。【０００６】
一方、乳ガン治療のための薬物療法は特に近年目覚しい発展をとげており、ガンの性質に応じてさまざまな治療薬を選択することが可能になりつつある。このような状況において、現在、Ｈｅｒ２陽性を区別するために用いられている方法以上に高い精度で、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性を予測することが可能になれば、Ｈｅｒ２陽性乳ガン患者の治療法の選択をより容易にし、薬物療法の効果の最大化及び副作用の最小化ができると考えられる。【０００７】
これまでのＨｅｒ２陽性乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性に関する報告には、非特許文献４に記載のＰＴＥＮタンパク質の活性化、非特許文献５に記載のＣｙｃｌｉｎ  Ｅの遺伝子増幅及び／又は過剰発現、非特許文献６に記載のｍｉＲ−１２５ａ及び／又はｍｉＲ−１２５ｂによるＨｅｒ２タンパク質発現の制御についてのものが存在する。【０００８】
非特許文献４では、Ｈｅｒ２陽性乳ガン患者のＰＴＥＮの発現量を免疫組織学的手法で評価し、ＰＴＥＮの発現を抑制した細胞はトラスツズマブによる増殖抑制を受けにくいこと、ＰＴＥＮの発現量がＨｅｒ２陽性乳ガン患者のトラスツズマブによる病勢進行の抑制と相関していることを示している。【０００９】
また非特許文献５では、Ｈｅｒ２陽性乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性患者におけるＣｙｃｌｉｎ  Ｅタンパク質の発現量を免疫組織化学的手法で評価し、トラスツズマブと他の抗ガン剤による治療を受けた患者群においてＣｙｃｌｉｎ  Ｅタンパク質の発現量が多い群においては病勢が進行しなかった患者の割合が高かったことを示している。【００１０】
また、非特許文献６はｍｉＲ−１２５ａ及びｍｉＲ−１２５ｂの発現量増加がトラスツズマブの標的タンパク質であるＨｅｒ２タンパク質の発現量を低下させることを示している。【００１１】
また、ｌｅｔ−７ａ（特許文献１）、ｌｅｔ−７ｂ（特許文献１）、及びｍｉＲ−１４５（特許文献２）は乳ガン患者で発現量が低下すること、そしてｍｉＲ−２００ｃ（特許文献３）は乳ガン患者で発現量が上昇することが知られる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＵＳ２００８／００７６６７４  Ａ１
【特許文献２】特表２０１０−５１０９６４
【特許文献３】特表２０１０−５０４３５０
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】日本乳癌学会編  乳癌取扱い規約  第１６版  ２００８年、日本乳癌学会編  乳癌診療ガイドライン１．薬物療法  ２０１０年版  ２０１０年
【非特許文献２】Ｃ．Ｌ．Ｖｏｇｅｌら、２００２年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、第２０巻、ｐ．７１９−７２６
【非特許文献３】Ａ．Ｕ．Ｂｕｚｄａｒら、２００５年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、第２３巻、ｐ３６７６−３６８５
【非特許文献４】Ｙｏｉｃｈｉ，Ｎ．ら、２００４年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、第６巻、ｐ．１１７−１２７
【非特許文献５】Ｍａｕｒｉｚｉｏ，Ｓ．ら、２０１１年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．、Ｅａｒｌｙ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐｎａｓ．１０１４８３５１０８
【非特許文献６】Ｓｃｏｔｔ，ＧＫ．ら、２００７年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、第２８２巻、ｐ．１４７９−１４８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
このように、先行技術においてトラスツズマブに対する治療感受性と結果的に相関する発現量を示す遺伝子、タンパク質は複数知られているが、いずれにおいてもＨｅｒ２陽性乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性を予測するマーカーとしての価値は十分に見出されていない。【００１５】
非特許文献４のＰＴＥＮはＰＴＥＮの発現量によって個々の乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性を投与前に予測することは不可能である。そして、非特許文献５のＣｙｃｌｉｎ  ＥはＣｙｃｌｉｎ  Ｅタンパク質の発現量によって個々の乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性を予測することはできない。また、非特許文献６のｍｉＲ−１２５ａ及びｍｉＲ−１２５ｂはｍｉＲ−１２５ａ及びｍｉＲ−１２５ｂの発現量増加とＨｅｒ２陽性乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性との関係は不明であり、いずれを用いることによっても個々の乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性を予測することはできない。従って、これらの発現量を指標に用いて一般に臨床上の利用は行われておらず、さらに予測精度が高い乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測マーカーが切望されている。【００１６】
本発明は、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測（或いは、判定、評価、検出又は診断）に有用な組成物、該組成物を利用した乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測（或いは、判定、評価、検出又は診断）方法、及び該組成物を利用した乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測（或いは、判定、評価、検出又は診断）用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
乳ガン患者のトラスツズマブに対する感受性の予測用の遺伝子マーカー探索の方法としては、乳ガン患者に対するトラスツズマブよる治療又はトラスツズマブとその他の抗ガン剤の併用による治療によって検査時、治療前、治療中、もしくは治療後に採取する乳ガン患者由来組織、体液、もしくは分泌物に含まれる遺伝子、タンパク質、もしくは代謝産物などの量をトラスツズマブに対する治療感受性のある患者とトラスツズマブに対する治療感受性のない患者の間で何らかの手段を用いて比較する方法が挙げられる。【００１８】
ＤＮＡチップを用いた遺伝子発現量解析は、近年、このようなマーカー探索の手法として特に汎用されている。ＤＮＡチップには数百から数万種の遺伝子に対応した塩基配列を利用したプローブが固定されている。被検試料をＤＮＡチップに添加することによって試料中の遺伝子がプローブと結合し、この結合量を何らかの手段によって測定することにより、被検試料中の遺伝子量を知ることができる。ＤＮＡチップ上に固定化するプローブに対応した遺伝子の選択は自由であり、また検査時、治療前、治療中、もしくは治療後に採取する乳ガン患者由来組織、ＦＦＰＥ標本、体液、もしくは分泌物などの試料を用いて、該試料中の遺伝子発現量を比較することによって乳ガンの診断に利用可能なマーカーとなりうる遺伝子群を推定することが可能である。【００１９】
上記の課題を解決するために、本発明者らは治療前の乳ガン患者から採取した乳ガン病変部の針生検組織から得た遺伝子発現量をＤＮＡチップによって解析し、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性を予測しうるマーカーとなる遺伝子を見出し、さらにそれらの遺伝子発現量がトラスツズマブに対する治療感受性の高い乳ガン患者において、乳ガン患者から得た乳ガン病変部の遺伝子発現量が減少、低減もしくは増加、増大していることを見出し、本発明を完成させた。【００２０】
１．発明の概要
本発明は、以下の特徴を有する。【００２１】
本発明は、第１の態様において、下記の（ａ）〜（ｊ）に示すポリヌクレオチド、その変異体又はその断片からなる群から選択される２以上のポリヌクレオチドを含む、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測用組成物を提供する。【００２２】
（ａ）配列番号１〜９、配列番号１１〜１９、及び配列番号２１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片
（ｂ）配列番号１〜９、配列番号１１〜１９、及び配列番号２１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、を含むポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１〜９、配列番号１１〜１９、及び配列番号２１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片
（ｄ）配列番号１〜９、配列番号１１〜１９、及び配列番号２１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片。【００２３】
（ｆ）配列番号１０及び配列番号２０で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片
（ｇ）配列番号１０及び配列番号２０で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、を含むポリヌクレオチド
（ｈ）配列番号１０及び配列番号２０で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片
（ｉ）配列番号１０及び配列番号２０で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｊ）前記（ｆ）〜（ｉ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片。【００２４】
本発明は、第２の態様において、上記の（ａ）〜（ｅ）に示すポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、及び／又はその断片の２以上を含む、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測用キットを提供する。【００２５】
その実施形態において、上記キットは、上記の（ｆ）〜（ｊ）に示すポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、及び／又はその断片の１又２をさらに含む。【００２６】
また、上記ポリヌクレオチドが、配列番号１〜２３のいずれかで表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その相補的配列からなるポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらの１６以上の連続した塩基の２以上を含む断片である、上記のキットを提供する。【００２７】
さらに別の実施形態において、上記ポリヌクレオチドが、別個に又は任意に組み合わせて異なる容器に包装されている、上記のキットを提供する。【００２８】
本発明は、第３の態様において、上記の（ａ）〜（ｅ）に示すポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、及び／又はその断片の２以上を含む、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測用ＤＮＡチップを提供する。【００２９】
その実施形態において、上記ＤＮＡチップは、上記の（ｆ）〜（ｊ）に示すポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、及び／又はその断片の１又２をさらに含む。【００３０】
本発明は、第４の態様において、上記の組成物のポリヌクレオチドの乳ガン患者由来の試料における標的核酸の発現量の２以上を測定し、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで予測、判定若しくは評価することを含む、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測のための方法を提供する。【００３１】
その実施形態において、上記の方法は、本発明の第２の態様に記載のキットを使用する。【００３２】
別の実施形態において、上記の方法は、本発明の第３の態様に記載のＤＮＡチップを使用する。【００３３】
本発明はさらに、第５の態様において、上記のいずれかに記載の組成物、上記のいずれかに記載のキット、上記のいずれかに記載のＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、乳ガン患者がトラスツズマブに対して治療感受性を持つことが既知の複数の試料中の標的核酸の発現量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する第１の工程、前記第１の工程で得られた該標的核酸の発現量を測定し、該標的核酸の発現量から算出される遺伝子発現量を教師とした判別式（サポートベクターマシン）を作成する第２の工程、乳ガン患者の手術時又は生検検査時に採取した試料中の該標的核酸の発現量を第１の工程と同様にｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する第３の工程、前記第２の工程で得られた判別式に第３の工程で得られた該標的核酸の発現量から算出した乳ガン病変部における遺伝子発現量を代入し、該判別式から得られた結果に基づいて、乳ガン患者がトラスツズマブに対して治療感受性を発揮することの可能性を予測、判定若しくは評価する第４の工程を含む、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測のための方法を提供する。【００３４】
本発明はさらに、第６の態様において、上記のいずれかの組成物、上記のいずれかのキット、又は上記のいずれかのＤＮＡチップ、又はそれらの組合せの、乳ガン患者がトラスツズマブに対して治療感受性を持つことの可能性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで予測、判定若しくは評価するための乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測用組成物及び方法への使用を提供する。【００３５】
２．定義
本明細書中で使用する用語は、以下の定義を有する。【００３６】
ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの略号による表示は、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）及び当技術分野における慣用に従うものとする。【００３７】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ及びＤＮＡのいずれも包含する核酸に対して用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ及び合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。また、本明細書では、ポリヌクレオチドは核酸と互換的に使用される。【００３８】
本明細書において「遺伝子」とは、ＲＮＡ、及び２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成する正鎖（又はセンス鎖）又は相補鎖（又はアンチセンス鎖）などの各１本鎖ＤＮＡを包含することを意図して用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。【００３９】
従って、本明細書において「遺伝子」は、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片、及びヒトゲノムのいずれも含む。また該「遺伝子」は特定の塩基配列（又は配列番号）で示される「遺伝子」だけではなく、これらによってコードされるＲＮＡと生物学的機能が同等であるＲＮＡ、例えば同族体（すなわち、ホモログもしくはオーソログ）、遺伝子多型などの変異体、及び誘導体をコードする「核酸」が包含される。かかる同族体、変異体又は誘導体をコードする「核酸」としては、具体的には、後に記載したストリンジェントな条件下で、上記の配列番号１〜２３で示されるいずれかの塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「核酸」を挙げることができる。なお、「遺伝子」は、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンを含むことができる。【００４０】
本明細書において「転写産物」とは、遺伝子のＤＮＡ配列を鋳型にして合成されたＲＮＡのことをいう。ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子の上流にあるプロモーターと呼ばれる部位に結合し、ＤＮＡの塩基配列に相補的になるように３'末端にリボヌクレオチドを結合させていく形でＲＮＡが合成される。このＲＮＡには遺伝子そのもののみならず、発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンをはじめとする転写開始点からポリＡ配列の末端にいたるまでの全配列が含まれる。【００４１】
また、本明細書において「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」は、特に言及しない限り、ヘアピン様構造のＲＮＡ前駆体として転写され、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ切断活性を有するｄｓＲＮＡ切断酵素により切断され、ＲＩＳＣと称するタンパク質複合体に取り込まれ、ｍＲＮＡの翻訳抑制に関与する１６〜２５塩基、好ましくは１６〜２５塩基、より好ましくは２０〜２５塩基の非コーディングＲＮＡを意図して用いられる。また本明細書で使用する「ｍｉＲＮＡ」は特定の塩基配列（又は配列番号）で示される「ｍｉＲＮＡ」だけではなく、該「ｍｉＲＮＡ」の前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ又はｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）を含有し、これらによってコードされるｍｉＲＮＡと生物学的機能が同等であるｍｉＲＮＡ、例えば同族体（すなわち、ホモログもしくはオーソログ）、遺伝子多型などの変異体、及び誘導体をコードする「ｍｉＲＮＡ」も包含する。かかる前駆体、同族体、変異体又は誘導体をコードする「ｍｉＲＮＡ」としては、具体的には、ｍｉＲＢａｓｅ  ｒｅｌｅａｓｅ１６（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）により同定することができ、後に記載したストリンジェントな条件下で、上記の配列番号１〜２３で示されるいずれかの特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「ｍｉＲＮＡ」を挙げることができる。【００４２】
本明細書において「プローブ」とは、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡ又はそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するために使用されるポリヌクレオチド及び／又はそれに相補的なポリヌクレオチドを包含する。【００４３】
本明細書において「プライマー」とは、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡ又はそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し、増幅する、連続するポリヌクレオチド及び／又はそれに相補的なポリヌクレオチドを包含する。【００４４】
ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、配列番号によって定義される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチドの全長配列、又はその部分配列、（ここでは便宜上、これを正鎖と呼ぶ）に対してＡ：Ｔ（Ｕ）、Ｇ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味する。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズできる程度の相補関係を有するものであってもよい。【００４５】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、プローブが他の配列に対するよりも、検出可能により大きな程度（例えばバックグラウンド測定値の平均＋バックグラウンド測定値の標準誤差×２以上の測定値）で、その標的配列に対してハイブリダイズする条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、ハイブリダイゼーションが行われる環境によって異なる。ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに対して１００％相補的である標的配列が同定され得る。【００４６】
本明細書において「変異体」とは、核酸の場合、多型性、突然変異などに起因した天然の変異体、あるいは配列番号１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、又はその部分配列において１、２もしくは３又はそれ以上、好ましくは１もしくは２個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体、あるいは配列番号１〜２３のｍｉＲＮＡの前駆体ＲＮＡの塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、又はその部分配列において１又は２以上、好ましくは１又は数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体、あるいは該塩基配列の各々又はその部分配列と約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の％同一性を示す変異体、あるいは該塩基配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと上記定義のストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸を意味する。【００４７】
本明細書において「数個」とは、約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３又は２個の整数を意味する。【００４８】
本明細書において、変異体は、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法を利用した突然変異導入法などの周知の技術を用いて作製可能である。【００４９】
本明細書において「％同一性」は、２つの配列を最大一致度となるように整列（アラインメント）したときに、総塩基数（ギャップのある場合には、ギャップ数も含む。）あたりの同一塩基の数の割合（％）を指し、上記のＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質／遺伝子の検索システムを用いて、ギャップを導入して、又はギャップを導入しないで、決定することができる（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．、第９０巻、ｐ．５８７３−５８７７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２１５巻、ｐ．４０３−４１０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、１９８８年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．、第８５巻、ｐ．２４４４−２４４８）。【００５０】
本明細書において「誘導体」とは、修飾核酸、非限定的に例えば、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド（例えばハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど）を含む誘導体、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ；  Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｐ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ；  Ｏｂｉｋａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３９：５４０１）などを含むことを意味する。【００５１】
本明細書において「予測、判定、検出又は診断用組成物」とは、乳ガンの罹患の有無、罹患の程度、乳ガンの改善の有無や改善の程度、乳ガンの治療に対する感受性を診断するために、また乳ガンの予防、改善又は治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接又は間接的に利用されるものをいう。これには乳ガンの罹患に関連して生体内、特に乳房組織において発現が変動する遺伝子を特異的に認識し、また結合することのできるヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドを包含する。これらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、上記性質に基づいて生体内、組織や細胞内などで発現した上記遺伝子を検出するためのプローブとして、また生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。【００５２】
本明細書でおいて「予測」とは、予測、判定、評価、検出又は診断を指す。【００５３】
本明細書において予測、判定、評価、検出又は診断の対象となる「試料」とは、乳ガンの発生、及び乳ガンに対する治療効果の発揮にともない本発明の遺伝子が発現変化する組織及び生体材料を指す。具体的には乳房組織及びその周辺の脈管、リンパ節及び臓器、また転移が疑われる臓器、皮膚、及び血液、尿、唾液、汗、組織浸出液などの体液、その他、便、毛髪などを指す。【００５４】
本明細書で使用される「ＦＦＰＥ標本」とは、生体組織をホルマリンで固定し、パラフィンで包埋したホルマリン固定パラフィン包埋標本を指す。【００５５】
本明細書で使用される「トラスツズマブに対する治療感受性」とは、トラスツズマブによる治療によって、乳ガンの病勢進行が抑制される性質のことを言う。病勢の進行を検出する方法は、病理学的検討によってもよいし、画像診断による腫瘍の大きさの評価や患者の状態などの臨床的検討によってもよい。乳ガン患者に対するトラスツズマブによる治療においては、トラスツズマブと共にトラスツズマブ以外の抗ガン剤の１つ又は複数が併用されてもよい。【００５６】
本明細書で使用される「抗ガン剤」とは、トラスツズマブと併用されて乳ガンの薬物療法で使用される薬剤を指す。抗ガン剤としては、例えば、シクロフォスファミド、チオテパなどのアルキル化剤、フルオロウラシル、テガフール、カルモフール、ドキシフルリジン、カペシタビンなどの５−ＦＵ系代謝拮抗剤、メトトレキサート、ゲムシタビンなどの代謝拮抗薬、アドリアマイシン、エピルビシン、ピラルビシンなどのアンスラサイクリン系薬、ミトザントロンなどのアンスラキノン系薬、マイトマイシンＣなどの抗ガン抗生物質、ピノレルビンなどのビンアルカロイド、パクリタキセル、ドセタキセルなどのタキサン系薬、イリノテカンなどのトポイソメラーゼＩ阻害薬、タモキシフェン、トレミフェンなどの抗エストロゲン薬、ファドロゾール、アナストロゾール、エクセメスタン、レトロゾールなどのアロマターゼ阻害薬、メドロキシプロゲステロンなどの黄体ホルモン剤、ゴセレリン、リュープロレリンなどのＬＨ−ＲＨアゴニスト、シスプラチン、カルボプラチンなどのプラチナ製剤、エリブリンなどの非タキサン系微小管ダイナミクス阻害剤、ラパチニブ、ベバシズマブ、パーツズマブなどの分子標的薬などが挙げられる。【００５７】
本明細書で使用される「順位」とは、Ｒａｉｎｅｒ，Ｂ．ら、２００４年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第５７３巻、ｐ．８３−９２に示す偽陽性率を考慮した統計学的検定において算出される順位統計量を指す。【００５８】
本明細書で使用される「ＡＵＲＯＣ値」とは、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）下の面積を意味し、患者を陽性群と陰性群に分けるための予測、判定、評価、検出又は診断の方法の精度を測る指標となる。これらの曲線では、評価対象となる方法が示す結果に関して、陽性患者において陽性の結果がでる確率（感度）と、陰性患者において陰性の結果がでる確率（特異性）の逆数がプロットされる。【００５９】
本明細書において、「Ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ  ｃｒｏｓｓｖａｌｉｄａｔｉｏｎ法（以下、ＬＯＯＣＶ法）」とは、データセットから１つの検体を除いて対象群と被対象群を検定、判別式を作成し、除いた１つの検体で判別式を評価する、これをデータセットすべての検体に対して繰り返した評価の平均を全体の精度とする方法を意味する。【００６０】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１２３４遺伝子」又は「ｍｉＲ−１２３４」という用語は、配列番号１に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１２３４遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００５５８９）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３４遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ．８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。【００６１】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ遺伝子」又は「ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ」という用語は、配列番号２に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００２８７７）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ．８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。【００６２】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−４９４遺伝子」又は「ｍｉＲ−４９４」という用語は、配列番号３に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−４９４遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００２８１６）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−４９４遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ．８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。【００６３】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−２６ａ遺伝子」又は「ｍｉＲ−２６ａ」という用語は、配列番号４に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００００８２）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ．８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。【００６４】
本明細書で使用される「ｌｅｔ−７ａ遺伝子」又は「ｌｅｔ−７ａ」という用語は、配列番号５に記載のｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００００６２）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ．８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。【００６５】
本明細書で使用される「ｌｅｔ−７ｂ遺伝子」又は「ｌｅｔ−７ｂ」という用語は、配列番号６に記載のｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００００６３）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ．８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。【００６６】
本明細書で使用される「ｌｅｔ−７ｇ遺伝子」又は「ｌｅｔ−７ｇ」という用語は、配列番号７に記載のｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００００４１４）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ．８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。【００６７】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−９４０遺伝子」又は「ｍｉＲ−９４０」という用語は、配列番号８に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−９４０遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００４９８３）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−９４０遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ．８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。【００６８】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１４７０遺伝子」又は「ｍｉＲ−１４７０」という用語は、配列番号９に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１４７０遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００７３４８）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−１４７０遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ．８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。【００６９】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ遺伝子」又は「ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ」という用語は、配列番号１０に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００００４４３）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ．８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。【００７０】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−２００ｃ遺伝子」又は「ｍｉＲ−２００ｃ」という用語は、配列番号１１に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００００６１７）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ．８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。【００７１】
本明細書で使用される「ｌｅｔ−７ｅ遺伝子」又は「ｌｅｔ−７ｅ」という用語は、配列番号１２に記載のｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００００６６）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ．８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。【００７２】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１２２８遺伝子」又は「ｍｉＲ−１２２８」という用語は、配列番号１３に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００５５８３）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ．８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。【００７３】
本明細書で使用される「ｌｅｔ−７ｃ遺伝子」又は「ｌｅｔ−７ｃ」という用語は、配列番号１４に記載のｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００００６４）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ．８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。【００７４】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１２２９遺伝子」又は「ｍｉＲ−１２２９」という用語は、配列番号１５に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１２２９遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００５５８４）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２９遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ．８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。【００７５】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−２０５遺伝子」又は「ｍｉＲ−２０５」という用語は、配列番号１６に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−２０５遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００００２６６）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ．８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。【００７６】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１４５遺伝子」又は「ｍｉＲ−１４５」という用語は、配列番号１７に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１４５遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００００４３７）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ．８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。【００７７】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１８１ａ遺伝子」又は「ｍｉＲ−１８１ａ」という用語は、配列番号１８に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００００２５６）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ．８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。【００７８】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１９１遺伝子」又は「ｍｉＲ−１９１」という用語は、配列番号１９に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１９１遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００００４４０）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ．８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。【００７９】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１２５ｂ遺伝子」又は「ｍｉＲ−１２５ｂ」という用語は、配列番号２０に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００００４２３）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ．８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。【００８０】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−９２ａ遺伝子」又は「ｍｉＲ−９２ａ」という用語は、配列番号２１に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００００９２）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ．８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。【００８１】
本明細書で使用される「ｌｅｔ−７ｄ遺伝子」又は「ｌｅｔ−７ｄ」という用語は、配列番号２２に記載のｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００００６５）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ．８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。【００８２】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−２３ａ遺伝子」又は「ｍｉＲ−２３ａ」という用語は、配列番号２３に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００００７８）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ．８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。【００８３】
本発明は、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測（或いは、判定、評価、検出又は診断）に有用な組成物、該組成物を利用した乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測（或いは、判定、評価、検出又は診断）方法、及び該組成物を利用した乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測（或いは、判定、評価、検出又は診断）用キットを提供するものであり、これによって、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性に対して特異的かつ高予測率の、及び迅速でかつ簡便な、予測（或いは、判定評価、検出又は診断）方法を提供するという格別の作用効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】表１に記載の遺伝子を決定するための解析の流れを示す。
【図２】表１に記載の遺伝子に対応する配列番号１〜２３のポリヌクレオチドを組み合わせて用いた場合の乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測率を示す。縦軸は乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測に対するＡＵＲＯＣ値、横軸は表１に記載の遺伝子に対応する配列番号１〜２３において、３５症例の乳ガン患者に対してＬＯＯＣＶ法によるＳＶＭ法を用いた場合の乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測に必要な遺伝子の合計数をそれぞれ示す。
【図３】図１に記載の手順で選び出されるＳＶＭ法を用いた乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測に用いられる２０種の遺伝子の、ＬＯＯＣＶ法による選択結果を示す。図３に示す表の行方向は、３４症例の学習データセットと１つのテストデータの組み合わせからなる３５種類の教師データセットを示す。列方向は、各教師データセットにおいて選ばれた予測用遺伝子の配列番号を示す。表中の数字は、各教師データセットにおいて予測用遺伝子を選択した際に、当該遺伝子が何番目に選択されたかの優先順位を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
以下に本発明をさらに具体的に説明する
１．乳ガンの標的核酸
本発明の上記定義の、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測用組成物及びキットを使用して乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性を予測するためのマーカーとしての標的核酸には、例えば、配列番号１〜２３で表される塩基配列を含むヒト遺伝子（すなわち、それぞれ、ｍｉＲ−１２３４、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−２６ａ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−９４０、ｍｉＲ−１４７０、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２２８、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２２９、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−９２ａ、ｌｅｔ−７ｄ、及びｍｉＲ−２３ａ）、それらの同族体、あるいはそれらの変異体又は誘導体が含まれる。ここで、遺伝子、同族体、転写産物、変異体及び誘導体は、上記定義のとおりである。好ましい標的核酸は、配列番号１〜２３で表される塩基配列を含むヒト遺伝子、それらの転写産物、より好ましくは該転写産物、すなわちｍｉＲＮＡ、その前駆体ＲＮＡであるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである。
【００８６】
本発明において乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性を予測するための標的となる上記遺伝子はいずれも、トラスツズマブに対する治療感受性がある乳ガン患者と比べてトラスツズマブに対する治療感受性がない乳ガン患者において、乳ガン病変部から得られた遺伝子発現量が減少、低減もしくは増加、増大しているものである（後述の実施例の表１参照）。
【００８７】
第１の標的核酸は、ｍｉＲ−１２３４遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−１２３４遺伝子又はその転写産物の発現が乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【００８８】
第２の標的核酸は、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ遺伝子又はその転写産物の発現が乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【００８９】
第３の標的核酸は、ｍｉＲ−４９４遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−４９４遺伝子又はその転写産物の発現が乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【００９０】
第４の標的核酸は、ｍｉＲ−２６ａ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−２６ａ遺伝子又はその転写産物の発現が乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【００９１】
第５の標的核酸は、ｌｅｔ−７ａ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｌｅｔ−７ａ遺伝子又はその転写産物の発現が乳ガン患者で発現量が低下することが知られているが（上記特許文献１）、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【００９２】
第６の標的核酸は、ｌｅｔ−７ｂ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｌｅｔ−７ｂ遺伝子又はその転写産物の発現が乳ガン患者で発現量が低下することが知られているが（上記特許文献１）、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【００９３】
第７の標的核酸は、ｌｅｔ−７ｇ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｌｅｔ−７ｇ遺伝子又はその転写産物の発現が乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【００９４】
第８の標的核酸は、ｍｉＲ−９４０遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−９４０遺伝子又はその転写産物の発現が乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【００９５】
第９の標的核酸は、ｍｉＲ−１４７０遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−１４７０遺伝子又はその転写産物の発現が乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【００９６】
第１０の標的核酸は、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−１２５ａ遺伝子又はその転写産物の発現量増加がトラスツズマブの標的タンパク質であるＨｅｒ２タンパク質の発現量を低下させることが知られているが（上記非特許文献５）、ｍｉＲ−１２５ａの発現量がＨｅｒ２陽性乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性を予測するという報告は知られていない。
【００９７】
第１１の標的核酸は、ｍｉＲ−２００ｃ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−２００ｃ遺伝子又はその転写産物の発現が乳ガン患者で発現量が低下することが知られているが（上記特許文献２）、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【００９８】
第１２の標的核酸は、ｌｅｔ−７ｅ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｌｅｔ−７ｅ遺伝子又はその転写産物の発現が乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【００９９】
第１３の標的核酸は、ｍｉＲ−１２２８遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−１２２８遺伝子又はその転写産物の発現が乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１００】
第１４の標的核酸は、ｌｅｔ−７ｃ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｌｅｔ−７ｃ遺伝子又はその転写産物の発現が乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１０１】
第１５の標的核酸は、ｍｉＲ−１２２９遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−１２２９遺伝子又はその転写産物の発現が乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１０２】
第１６の標的核酸は、ｍｉＲ−２０５遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−２０５遺伝子又はその転写産物の発現が乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１０３】
第１７の標的核酸は、ｍｉＲ−１４５遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−１４５遺伝子又はその転写産物の発現が乳ガン患者で発現量が低下することが知られているが（上記特許文献３）、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１０４】
第１８の標的核酸は、ｍｉＲ−１８１ａ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−１８１ａ遺伝子又はその転写産物の発現が乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１０５】
第１９の標的核酸は、ｍｉＲ−１９１遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−１９１遺伝子又はその転写産物の発現が乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１０６】
第２０の標的核酸は、ｍｉＲ−１２５ｂ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−１２５ｂ遺伝子又はその転写産物の発現量増加がトラスツズマブの標的タンパク質であるＨｅｒ２タンパク質の発現量を低下させることが知られているが（上記非特許文献５）、ｍｉＲ−１２５ｂの発現量がＨｅｒ２陽性乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性を予測するという報告は知られていない。
【０１０７】
第２１の標的核酸は、ｍｉＲ−９２ａ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−９２ａ遺伝子又はその転写産物の発現が乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１０８】
第２２の標的核酸は、ｌｅｔ−７ｄ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｌｅｔ−７ｄ遺伝子又はその転写産物の発現が乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１０９】
第２３の標的核酸は、ｍｉＲ−２３ａ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−２３ａ遺伝子又はその転写産物の発現が乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１１０】
２．乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測用組成物
本発明において、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性を予測するために使用可能な核酸組成物は、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性についての標的核酸としての、ヒト由来のｍｉＲ−１２３４、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−２６ａ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−９４０、ｍｉＲ−１４７０、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２２８、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２２９、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−９２ａ、ｌｅｔ−７ｄ、及びｍｉＲ−２３ａ、それらの同族体、あるいはそれらの変異体又は誘導体の存在、遺伝子発現量又は存在量を定性的及び／又は定量的に測定することを可能にする。
【０１１１】
上記の標的核酸は、いずれも、トラスツズマブに対する治療感受性が高い乳ガン患者と比べて、トラスツズマブに対する感受性が低い乳ガン患者において乳ガン組織から得られた遺伝子発現量が減少、低減もしくは増加、増大する。それゆえ、本発明の組成物は、トラスツズマブに対する治療感受性が高い乳ガン患者の乳ガン組織とトラスツズマブに対する治療感受性が低い乳ガン患者の乳ガン組織について、それぞれ標的核酸の発現量を測定し、それらを比較するために有効に使用することができる。
【０１１２】
本発明で使用可能な組成物は、乳ガンに罹患した患者の試料において配列番号１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、を含むポリヌクレオチド群及びその相補的ポリヌクレオチド群、該塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でそれぞれハイブリダイズするポリヌクレオチド群及びその相補的ポリヌクレオチド群、ならびにそれらのポリヌクレオチド群の塩基配列において１６以上、好ましくは２１〜２４の連続した塩基を含むポリヌクレオチド群から選ばれた２以上のポリヌクレオチドの組み合わせを含む。これらのポリヌクレオチドは、標的核酸である上記予測用マーカーを検出するためのプローブ及びプライマーとして使用できる。
【０１１３】
具体的には、本発明の組成物は、以下に示すポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又はその断片からなる群から選択される２以上のポリヌクレオチドを含むことができる。
【０１１４】
（１）配列番号１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片。
【０１１５】
（２）配列番号１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、を含むポリヌクレオチド。
【０１１６】
（３）配列番号１〜９、配列番号１１〜１９、及び配列番号２１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片。
【０１１７】
（４）配列番号１〜９、配列番号１１〜１９、及び配列番号２１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、を含むポリヌクレオチド。
【０１１８】
（５）配列番号１〜９、配列番号１１〜１９、及び配列番号２１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片。
【０１１９】
（６）配列番号１〜９、配列番号１１〜１９、及び配列番号２１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【０１２０】
（７）配列番号１〜９、配列番号１１〜１９、及び配列番号２１〜２３で表される塩基配列においてｕがｔである塩基配列の各々と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドのいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片。
【０１２１】
（８）配列番号１０、及び配列番号２０で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片。
【０１２２】
（９）配列番号１０、及び配列番号２０で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、を含むポリヌクレオチド。
【０１２３】
（１０）配列番号１０、及び配列番号２０で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片。
【０１２４】
（１１）配列番号１０、及び配列番号２０で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【０１２５】
（１２）配列番号１０、及び配列番号２０で表される塩基配列においてｕがｔである塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドのいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片。
【０１２６】
上記（１）〜（１２）のポリヌクレオチドの断片は、各ポリヌクレオチドの塩基配列、或いは各変異体もしくは誘導体の塩基配列、において、例えば、連続する１６〜配列の全塩基数、１６〜２４、１８〜２４、２１〜２４塩基などの範囲の塩基数を含むことができるが、これらに限定されないものとする。
【０１２７】
本発明で使用される上記ポリヌクレオチド類又はその断片類はいずれもＤＮＡでもよいしＲＮＡでもよい。
【０１２８】
本発明の組成物としてのポリヌクレオチドは、ＤＮＡ組換え技術、ＰＣＲ法、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機による方法などの一般的な技術を用いて作製することができる。
【０１２９】
ＤＮＡ組換え技術、部位特異的突然変異導入法、ＰＣＲ法などの技術は、例えばＡｕｓｕｂｅｌら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＵＳ  （１９９３）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＵＳ  （１９８９）などに記載される技術を使用することができる。
【０１３０】
ヒト由来の、ｍｉＲ−１２３４、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−２６ａ、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−９４０、ｍｉＲ−１４７０、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２２８、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２２９、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−９２ａ、ｌｅｔ−７ｄ、及びｍｉＲ−２３ａ遺伝子は公知であり、前述のようにその取得方法も知られている。このため、これらの遺伝子をクローニングすることによって、本発明の組成物としてのポリヌクレオチドを作製することができる。
【０１３１】
本発明の組成物を構成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ自動合成装置を用いて化学的に合成することができる。この合成には一般にホスホアミダイト法が使用され、この方法によって全長のｍｉｃｒｏＲＮＡに相当する一本鎖ＤＮＡを自動合成することができる。ＤＮＡ自動合成装置は、例えばＰｏｌｙｇｅｎ社、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社などから市販されている。
【０１３２】
あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡクローニング法によって作製することもできる。ｃＤＮＡクローニング技術は、例えばｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｗａｋｏ（和光純薬工業）などを利用できる。
【０１３３】
３．乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測用キット
本発明はまた、本発明の組成物に含まれるものと同じポリヌクレオチド、その変異体及び／又はその断片の２以上、を含む、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測用キットを提供する。
【０１３４】
本発明のキットは、上記２に記載したポリヌクレオチド類から選択される、２以上のポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、及び／又はその断片を含む。ここで、変異体及び誘導体は上で定義されたものを含む。
【０１３５】
本発明のキットは、配列番号１〜９、配列番号１１〜１９、及び配列番号２１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、を含むポリヌクレオチド、その相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらのポリヌクレオチドの断片、その変異体、もしくはその誘導体、の２以上を含むことができる。
【０１３６】
本発明のキットは、さらに配列番号１０及び配列番号２０で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、を含むポリヌクレオチド、その相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらのポリヌクレオチドの断片の１又は２をさらに含むことができる。
【０１３７】
本発明のキットに含むことができるポリヌクレオチド断片は、例えば下記の（１）〜（２）からなる群より選択される、２以上のＤＮＡである：
（１）配列番号１〜９、配列番号１１〜１９、及び配列番号２１〜２３で表される塩基配列においてｕがｔである塩基配列又はその相補的配列において、１６以上の連続した塩基を含むＤＮＡ。
【０１３８】
（２）配列番号１〜９、配列番号１１〜１９、及び配列番号２１〜２３で表される塩基配列においてｕがｔである塩基配列又はその相補的配列において、１６以上の連続した塩基を含むＤＮＡに加えて、配列番号１０及び配列番号２０で表される塩基配列においてｕがｔである塩基配列又はその相補的配列において、それぞれ１６以上の連続した塩基をさらに含むＤＮＡ。
【０１３９】
好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドが、配列番号１〜９、配列番号１１〜１９、及び配列番号２１〜２３のいずれかで表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その相補的配列からなるポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらの１６以上、好ましくは２１〜２４、の連続した塩基を含む断片である。
【０１４０】
別の好ましい実施形態では、本発明のキットは、上記のポリヌクレオチドに加えて、配列番号１０及び配列番号２０で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その相補的配列からなるポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらの１６以上、好ましくは２１〜２４、の連続した塩基を含む断片をさらに含むことができる。
【０１４１】
本発明はまた、本発明の組成物に含まれるものと同じポリヌクレオチド、その変異体及び／又はその断片の遺伝子発現量から算出される乳ガン患者の乳ガン組織における遺伝子発現量の２以上、を測定することを含む乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測用キットを提供する。
【０１４２】
本発明において、上記ポリヌクレオチドの断片のサイズは、上記の各ポリヌクレオチドの塩基配列、或いは上記の各変異体若しくは誘導体の塩基配列、において、例えば、連続する１６〜配列の全塩基数、１６〜２４、１８〜２４、２１〜２４塩基などの範囲の塩基数である。
【０１４３】
本発明のキットには、上で説明した本発明におけるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片に加えて、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測を可能とする既知の又は将来見出されるポリヌクレオチドも包含させることができる。
【０１４４】
本発明のキットに含まれるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片は、個別に又は任意に組み合わせて異なる容器に包装される。
【０１４５】
４．ＤＮＡチップ
本発明はさらに、本発明の組成物及び／又はキットに含まれるものと同じポリヌクレオチド（或いは、上記の２節の組成物及び／又は３節のキットに記載されたポリヌクレオチド）、変異体、断片及びそれらの組み合わせを含む乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測用ＤＮＡチップを提供する。
【０１４６】
ＤＮＡチップの基板としては、ＤＮＡを固相化できるものであれば特に制限はなく、スライドガラス、シリコン製チップ、ポリマー製チップ及びナイロンメンブレンなどを例示することができる。またこれらの基板にはポリＬリジンコートやアミノ基、カルボキシル基などの官能基導入などの表面処理がされていてもよい。
【０１４７】
また固相化法については一般に用いられる方法であれば特に制限はなく、スポッター又はアレイヤーと呼ばれる高密度分注機を用いてＤＮＡをスポットする方法や、ノズルより微少な液滴を圧電素子などにより噴射する装置（インクジェット）を用いてＤＮＡを基板に吹き付ける方法、又は基板上で順次ヌクレオチド合成を行う方法を例示することができる。高密度分注機を用いる場合には、例えば多数のウェルを持つプレートのおのおののウェルに異なった遺伝子溶液を入れておき、この溶液をピン（針）で取り上げて基板上に順番にスポットすることによる。インクジェット法では、ノズルより遺伝子を噴射し，基板上に高速度で遺伝子を整列配置することによる。基板上でのＤＮＡ合成は、基板上に結合した塩基を光又は熱によって脱離する官能基で保護し、マスクを用いることにより特定部位の塩基だけに光又は熱を当て、官能基を脱離させる。その後、塩基を反応液に加えて、基板上の塩基とカップリングさせる工程を繰り返すことによって行われる。
【０１４８】
固相化されるポリヌクレオチドは、上記で説明した本発明の全てのポリヌクレオチドである。
【０１４９】
例えば、そのようなポリヌクレオチドは、以下に示すポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又はその断片からなる群から選択される２以上のポリヌクレオチドを含むことができる。
【０１５０】
（１）配列番号１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片。
【０１５１】
（２）配列番号１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、を含むポリヌクレオチド。
【０１５２】
（３）配列番号１〜９、配列番号１１〜１９、及び配列番号２１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片
（４）配列番号１〜９、配列番号１１〜１９、及び配列番号２１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、を含むポリヌクレオチド
（５）配列番号１〜９、配列番号１１〜１９、及び配列番号２１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片
（６）配列番号１〜９、配列番号１１〜１９、及び配列番号２１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（７）前記（３）〜（６）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片。
【０１５３】
（８）配列番号１０及び配列番号２０で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片
（９）配列番号１０及び配列番号２０で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、を含むポリヌクレオチド
（１０）配列番号１０及び配列番号２０で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片
（１１）配列番号１０及び配列番号２０で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（１２）前記（８）〜（１１）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は１６以上の連続した塩基を含むその断片。
【０１５４】
本発明において、上記ポリヌクレオチドの断片のサイズは、上記の各ポリヌクレオチドの塩基配列、或いは上記の各変異体若しくは誘導体の塩基配列、において、例えば、連続する１６〜配列の全塩基数、１６〜２４、１８〜２４、２１〜２４塩基などの範囲の塩基数である。
【０１５５】
好ましい実施形態によれば、本発明のＤＮＡチップは、配列番号１〜２３で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、又はその相補的配列を含むポリヌクレオチドの２以上、から全部を含むことができる。
【０１５６】
本発明において、固相化されるポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡのいずれでもよいし、あるいは１本鎖でもよいし又は２本鎖でもよい。ここで、合成ＤＮＡ及び合成ＲＮＡは、上記「誘導体」の定義で説明したような修飾核酸を含む。
【０１５７】
標的遺伝子、ＲＮＡ又はｃＤＮＡの遺伝子発現量を検出、測定することができるＤＮＡチップの例としては、東レ株式会社の３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏ  ｃｈｉｐ、Ａｇｉｌｅｎｔ社のＨｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｋｉｔ（Ｖ２）、ＥＸＩＱＯＮ社のｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ（登録商標）  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ＡＲＲＡＹなどを挙げることができる。
【０１５８】
ＤＮＡチップの作製について、例えば予め調製したプローブを固相表面に固定化する方法を使用することができる。予め調製したポリヌクレオチドプローブを固相表面に固定化する方法では、官能基を導入したポリヌクレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面にオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを点着し、共有結合させる（例えば、Ｊ．Ｂ．Ｌａｍｔｕｒｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４年、第２２巻、ｐ．２１２１−２１２５、Ｚ．Ｇｕｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４年、第２２巻、ｐ．５４５６−５４６５）。ポリヌクレオチドは、一般的には、表面処理した固相担体にスペーサ−やクロスリンカーを介して共有結合される。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこに合成ポリヌクレオチドを共有結合させる方法も知られている（Ｇ．Ｙｅｒｓｈｏｖら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．、１９９６年、第９４巻、ｐ．４９１３）。また、シリカマイクロアレイ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプトアビジンを含むアガロースの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電させることでビオチン化ポリクレオチドを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイブリダイゼーションを可能にする方法も知られている（Ｒ．Ｇ．Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．、１９９７年、第９４巻、ｐ．１１１９―１１２３）。
【０１５９】
ＤＮＡチップ解析を利用する場合は、本発明の上記診断用組成物をＤＮＡプローブ（一本鎖又は二本鎖）として基板に貼り付けたＤＮＡチップを用いる。遺伝子群を基板に固相化したものには、一般にＤＮＡチップ及びＤＮＡアレイという名称があり、ＤＮＡチップにはＤＮＡマクロアレイとＤＮＡマイクロアレイが包含されるが、本明細書ではＤＮＡチップといった場合、該ＤＮＡアレイを含むものとする。
【０１６０】
５．乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測の検出法
本発明は、本発明の組成物、キット、ＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで予測する方法であって、手術時又は生検検査時に採取した試料である乳ガン患者の乳ガン組織を用いて、試料中の遺伝子発現量を該診断用組成物で構成されるＤＮＡチップによって解析し、トラスツズマブに対する治療感受性を示す乳ガン患者の試料中の遺伝子発現量とトラスツズマブに対する治療感受性を示さない乳ガン患者の試料中の遺伝子発現量を比較して、該試料中の標的核酸の発現量から算出される、乳ガン組織から得られた遺伝子発現量が減少、低減もしくは増加、増大している場合、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性を予測することを含み、ここで、該標的核酸が該組成物、キット又はＤＮＡチップに含まれるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片によって検出可能なものである、方法を提供する。
【０１６１】
本発明はまた、本発明の組成物、組成物の遺伝子発現量を測定することによって構成されるキット又はＤＮＡチップの、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性を示す可能性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで予測するための使用を提供する。
【０１６２】
本発明の上記方法において、組成物、キット又はＤＮＡチップは、上で説明したような、本発明のポリヌクレオチド、その変異体又はその断片を単一であるいはあらゆる可能な組み合わせで含むものが使用される。
【０１６３】
本発明の乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測において、本発明の組成物、キット又はＤＮＡチップに含まれるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片は、プライマーとして又はプローブとして用いることができる。プライマーとして用いる場合には、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓなどを利用できるが、この方法に限定されない。
【０１６４】
本発明の組成物又はキットに含まれるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片は、ノーザンブロット法、サザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法などの、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、常法に従ってプライマー又はプローブとして利用することができる。測定対象試料としては、使用する検出方法の種類に応じて、乳ガン患者の手術時又は生検検査時に採取した試料である乳ガン組織の試料から回収する。乳ガン患者から採取された乳ガン組織の試料の状態は、採取されたままの生の状態でもよく、一旦凍結された状態でもよく、またホルマリンによって固定された状態でもよい。ホルマリン溶液は、市販のホルマリン（ホルムアルデヒド濃度３７％）を水で希釈したものを使用してもよいし、水で希釈した溶液のｐＨを炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム等で中性に調整したものや、リン酸緩衝液で希釈してｐＨを中性に調整したものを使用することも好ましい。また、悪臭、刺激臭を取り除き、濃度を調製したホルマリン溶液を使用してもよい。なお、ホルマリン溶液中のホルムアルデヒド含量は、１〜３０％が好ましく、２〜２０％がより好ましい。さらに、ホルマリン固定された組織がパラフィンに包埋された状態のＦＦＰＥ標本を試料としてもよい。またさらにそれらの試料／標本から常法に従って調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いてもよいし、さらに該ＲＮＡをもとにして調製される、ｃＤＮＡを含む各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。
【０１６５】
検体採取の時期はトラスツズマブ単独又はトラスツズマブと抗ガン剤の併用による治療の開始前であっても開始後であってもよいが、トラスツズマブ又はトラスツズマブと抗ガン剤の併用による治療の開始前であることが望ましい。
【０１６６】
あるいは、採取した試料における本発明の遺伝子、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなどの核酸の発現量は、ＤＮＡチップを用いて検出あるいは定量することができる。この場合、本発明の組成物又はキットはＤＮＡチップのプローブとして使用することができる。かかるＤＮＡチップを試料から採取したＲＮＡをもとに調製される標識ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズさせ、該ハイブリダイズによって形成された上記プローブと標識ＤＮＡ又はＲＮＡとの複合体を、該標識ＤＮＡ又はＲＮＡの標識を指標として検出することにより、試料中での本発明の乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測用組成物の発現の有無又は発現した遺伝子の量（遺伝子発現量）を評価することができる。本発明の方法では、ＤＮＡチップを好ましく使用できるが、これは、ひとつの試料について同時に複数遺伝子の発現の有無又は遺伝子発現量の評価が可能である。
【０１６７】
本発明の組成物、キット又はＤＮＡチップは、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測のために有用である。具体的には、該組成物、キット又はＤＮＡチップを使用した乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測は、手術時又は生検検査時に採取した試料である乳ガン患者の乳ガン組織を用いて、試料中の該診断用組成物の遺伝子発現量を測定し、トラスツズマブに対する治療感受性を示す乳ガン患者の試料中の遺伝子発現量とトラスツズマブに対する治療感受性を示さない乳ガン患者の試料中の遺伝子発現量を比較して、該試料中の標的核酸の発現量から算出される、乳ガン組織から得られた遺伝子発現量が減少、低減もしくは増加、増大していることを比較することによって行うことができる。この場合、遺伝子発現量の違いには、該診断用組成物の遺伝子発現の有無も含む。
【０１６８】
本発明の組成物、キット又はＤＮＡチップを利用した乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測方法は、乳ガン患者の試料の一部又は全部を生検検査時に採取するか、もしくは手術によって摘出した試料である乳ガン患者の乳ガン組織を用いて、試料中の遺伝子発現量を該診断用組成物のポリヌクレオチド群から選ばれた単数又は複数のポリヌクレオチド、その変異体又はその断片を用いて測定し、トラスツズマブに対する治療感受性を示す乳ガン患者の試料中の遺伝子発現量とトラスツズマブに対する治療感受性を示さない乳ガン患者の試料中の遺伝子発現量を比較して、該試料中の標的核酸の発現量から算出される、乳ガン組織から得られた遺伝子発現量が減少、低減もしくは増加、増大していることを比較することにより、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性を予測することを含む。
【０１６９】
本発明の方法は、例えば以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の工程：
（ａ）乳ガン患者由来の試料を、本発明の組成物、キット又はＤＮＡチップのポリヌクレオチドと接触させる工程、
（ｂ）試料中の標的核酸の発現量を、上記ポリヌクレオチドをプローブとして用いて測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の結果をもとに、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性を予測する工程、
を含むことができる。
【０１７０】
本発明方法で用いられる試料としては、乳ガン患者の試料、例えば乳房組織及びその周辺組織、乳ガンが疑われる組織など、から調製される試料を挙げることができる。具体的には該組織から調製されるＲＮＡ含有試料、或いはそれからさらに調製されるポリヌクレオチドを含む試料は、乳ガン患者の試料の一部又は全部を生検検査時に採取するか、もしくは手術によって摘出した試料から回収して調製することができる。
【０１７１】
ここで患者とは、乳ガンを罹患した又は乳ガンの罹患が強く疑われる哺乳動物を指し、哺乳動物とは、例えば非限定的にヒト、サル、イヌ、マウス、ラットなどを指し、好ましくはヒトである。
【０１７２】
本発明の方法は、測定対象として用いる試料の種類に応じて工程を変更することができる。
【０１７３】
測定対象物としてＲＮＡを利用する場合、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測は、例えば下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：
（ａ）乳ガン患者の試料から調製されたＲＮＡ又はそれから転写された相補的ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）を、本発明の組成物、キット又はＤＮＡチップのポリヌクレオチドと結合させる工程、
（ｂ）  該ポリヌクレオチドに結合した試料由来のＲＮＡ又は該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記ポリヌクレオチドをプローブとして用いて測定する工程、
（ｃ）  上記（ｂ）の測定結果に基づいて、乳ガン患者がトラスツズマブに対する治療感受性を示すこと又は示さないことを予測する工程、
を含むことができる。
【０１７４】
本発明によって乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性を予測するために、例えば種々のハイブリダイゼーション法を使用することができる。かようなハイブリダイゼーション法には、例えばノーザンブロット法、サザンブロット法、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法などを使用することができる。
【０１７５】
ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明の診断用組成物をプローブとして用いることによって、ＲＮＡ中の各遺伝子発現の有無やその遺伝子発現量を検出、測定することができる。具体的には、本発明の予後予測のための診断用組成物（相補鎖）を放射性同位元素（３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓなど）や蛍光物質（シアン系、ローダミン系、フルオレサミン系など）などで標識し、それを常法にしたがってナイロンメンブレンなどにトランスファーした被検者の試料由来のＲＮＡとハイブリダイズさせたのち、形成された診断用組成物（ＤＮＡ）とＲＮＡとの二重鎖を診断用組成物の標識物（放射性同位元素又は蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器（ＢＡＳ−１８００ＩＩ、富士写真フィルム株式会社、などを例示できる）又は蛍光検出器（ＳＴＯＲＭ８６０、ＧＥヘルスケア社、などを例示できる）で検出、測定する方法を例示することができる。
【０１７６】
定量ＲＴ―ＰＣＲ法を利用する場合には、本発明の上記診断用組成物中のポリヌクレオチドをプライマーとして用いることによって、ＲＮＡ中の遺伝子発現の有無やその遺伝子発現量を検出、測定することができる。具体的には、被検者の試料由来のＲＮＡから常法にしたがってｃＤＮＡを調製して、これを鋳型として標的の各遺伝子の領域が増幅できるように、本発明の組成物をもとに調製した１対のプライマー（上記ｃＤＮＡに結合する正鎖と逆鎖からなる）をｃＤＮＡとハイブリダイズさせて常法によりＰＣＲ法を行い、得られた二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、二本鎖ＤＮＡの検出法としては、上記ＰＣＲをあらかじめ放射性同位元素や蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行う方法、ＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドなどで二本鎖ＤＮＡを染色して検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法にしたがってナイロンメンブレンなどにトランスファーさせて標識した診断用組成物中のポリヌクレオチドをプローブとしてこれとハイブリダイズさせて検出する方法をとることができる。
【０１７７】
ハイブリダイゼーション条件は、限定されないが、例えば３０℃〜６０℃で、ＳＳＣと界面活性剤を含む溶液中で１〜２４時間の条件とする。ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２）であり、界面活性剤はＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ、もしくはＴｗｅｅｎなどを含む。ハイブリダイゼーション条件としては、より好ましくは３〜４×ＳＳＣ、０．１〜０．５％  ＳＤＳを含む。ハイブリダイゼーション後の洗浄条件としては、例えば、３０℃の０．５×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、及び３０℃の０．２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、及び３０℃の０．０５×ＳＳＣ溶液による連続した洗浄などの条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが望ましい。具体的にはこのような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
【０１７８】
本発明の組成物又はキットのポリヌクレオチド断片をプライマーとしてＰＣＲを実施する際のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、例えば１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１〜２ｍＭ  ＭｇＣｌ２などの組成のＰＣＲバッファーを用い、当該プライマーの配列から計算されたＴｍ＋５〜１０℃において１５秒から１分程度処理することなどが挙げられる。かかるＴｍの計算方法としてＴｍ＝２×（アデニン残基数＋チミン残基数）＋４×（グアニン残基数＋シトシン残基数）などが挙げられる。
【０１７９】
これらのハイブリダイゼーションにおける「ストリンジェントな条件」の他の例については、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ＆  Ｒｕｓｓｅｌ，  Ｄ．  著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１年１月１５日発行、の  第１巻７．４２〜７．４５、第２巻８．９〜８．１７などに記載されており、本発明において利用できる。
【０１８０】
また、定量ＲＴ−ＰＣＲ法を用いる場合には、ＴａｑＭａｎ商標  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社：ＬＮＡ商標−ｂａｓｅｄ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ＰＣＲ、Ｅｘｉｑｏｎ社：Ｎｃｏｄｅ商標  ｍｉＲＮＡ  ｑＲＴ−ＰＣＴ  キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社などの、ｍｉＲＮＡを定量的に測定するために特別に工夫された市販の測定用キットを用いてもよい。
【０１８１】
本発明はまた、本発明の組成物、キット、ＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、乳ガン患者由来の試料中の標的核酸又は遺伝子の発現量を測定し、該遺伝子発現量を用いて教師データセットとしたＳＶＭ法を用いて、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性を予測する方法を提供する。
【０１８２】
すなわち、本発明はさらに、本発明の組成物、キット、ＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、乳ガン患者がトラスツズマブに対する治療感受性を示すこと／又は示さないことが既知の複数の試料中の標的核酸の発現量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する第１の工程、前記第１の工程で得られた該標的核酸の発現量の測定値を用いてＳＶＭ法による乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性を予測する判別式を作成する第２の工程、乳ガン患者の乳ガン組織から得られる該標的核酸の発現量を第１の工程と同様にｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する第３の工程、前記第２の工程で得られた判別式に第３の工程で得られた該標的核酸の発現量を判別式に代入し、該判別式から得られた結果に基づいて、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性を予測する第４の工程を含む、ここで、該標的核酸が該組成物、キット又はＤＮＡチップに含まれるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片によって検出可能なものである、前記方法を提供する。
【０１８３】
あるいは、本発明の方法は、例えば下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：
（ａ）乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性が既知の試料中の標的遺伝子の発現量を、本発明による予測（判定、検出又は診断）用組成物、キット又はＤＮＡチップを用いて測定する工程、
（ｂ）（ａ）で測定された遺伝子発現量の測定値を、下記の手順に従って数２〜数５の式に代入し、ＳＶＭ法を用いた判別式を作成する工程、
（ｃ）乳ガン患者由来の試料中の該標的遺伝子の発現量を、本発明による予測（判定、検出又は診断）用組成物、キット又はＤＮＡチップを用いて測定し、（ｂ）で作成した判別式にそれらを代入して、得られた結果に基づいて乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性を予測する工程、
を含むことができる。
【０１８４】
ＳＶＭ法は、１９９５年にＡＴ＆ＴのＶ．Ｖａｐｎｉｋが１９９５年に考案した判別分析法（Ｔｈｅ  Ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｎｉｎｇ  Ｔｈｅｏｒｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、１９９５年）である。分類すべき群分けが既知のデータセットの特定のデータ項目を説明変数、分類すべき群分けを目的変数として、該データセットを既知の群分けに正しく分類するための超平面と呼ばれる境界面を決定し、該境界面を用いてデータを分類する判別式を決定する。そして該判別式は、新たに与えられるデータセットの測定値を説明変数として該判別式に代入することにより、群分けを予測することができる。また、このときの予測結果は分類すべき群でも良く、分類すべき群に分類されうる確率でも良く、超平面からの距離でも良い（例えば、麻生英樹ら著、統計科学のフロンテイア６「パターン認識と学習の統計学  新しい概念と手法」、岩波書店（２００４年））。
【０１８５】
本発明のＳＶＭ法による判別式の説明変数は、上記２節に記載したポリヌクレオチド類から選択されるポリヌクレオチド又はその断片を測定することによって得られる値を含み、具体的には本発明の乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性を予測するための説明変数は、例えば下記の（１）〜（２）からなる群より選択される遺伝子発現量である：
（１）配列番号１〜９、配列番号１１〜１９、及び配列番号２１〜２３で表される塩基配列においてｕがｔである塩基配列又はその相補的配列において、１６以上の連続した塩基を含むＤＮＡのいずれかによって測定される乳ガン患者の乳ガン組織における遺伝子発現量。
【０１８６】
（２）配列番号１〜９、配列番号１１〜１９、及び配列番号２１〜２３で表される塩基配列においてｕがｔである塩基配列又はその相補的配列において、１６以上の連続した塩基を含むＤＮＡに加えて、配列番号１０及び配列番号２０で表される塩基配列においてｕがｔである塩基配列又はその相補的配列において、それぞれ１６以上の連続した塩基をさらに含むＤＮＡのいずれかによって測定される乳ガン患者の乳ガン組織における遺伝子発現量。
【０１８７】
本発明の方法で使用可能な判別式の算出例を以下に示す。
【０１８８】
まず乳ガン患者を、トラスツズマブに対する治療感受性を示す患者群とトラスツズマブに対する治療感受性を示さない患者群の２群に群分けする。乳ガン患者がトラスツズマブに対する治療感受性を示すと判断する基準としては、トラスツズマブによる治療後の乳ガンの病勢進行が抑制された状態を示すものとして、トラスツズマブ治療後に実施する病理検査結果が日本乳癌学会編「乳癌取扱い規約  第１６版」に定める組織学的治療効果基準のＧｒａｄｅ３に分類される病理学的完全奏効、すなわち全てのガン細胞が壊死に陥っているか、又は消失した場合、又は肉芽腫様組織又は繊維化巣で置き換えられている状態であることが病理学的に確認されることを基準として用いることができる。または、前記の組織学的治療効果基準がＧｒａｄｅ３に分類される病理学的完全奏効が確認されることに加えて、臨床的にリンパ節転移巣が確認されないことの両者を満たすことを基準とすることができる。
【０１８９】
次に、分けられた２群の乳ガン患者の乳ガン組織由来の生体試料の網羅的遺伝子発現量からなるデータセット（以下、教師データセット）を用意し、該２群の間で遺伝子発現量に明確な差が見られる遺伝子を説明変数、該群分けを目的変数（たとえば−１と１）としたＳＶＭ法による判別式を決定する（数１）。このとき、該判別式は数２で定義される制約条件、及び数３〜５で定義される重み係数（ｗ）とバイアス定数（ｂ）を持つ。
【０１９０】
このときの数１〜数５は、以下の式からなる。
【数１】
2012147800.tif 000003
【０１９１】
（ここで、ｘは乳ガン患者の乳ガン組織由来の生体試料から得られた網羅的遺伝子発現量からなるデータを示し、ｘｉは該データから選択した特定の遺伝子の発現量を示す。）
【数２】
2012147800.tif 000004
【０１９２】
（ここで、Ｔは内積、ｙはデータの分類、ζはスラック変数を示す。）
【数３】
2012147800.tif 000005
【０１９３】
（数３は数２にＬａｇｕｒａｎｇｅの未定定数法を用いることで帰着するＬａｇｕｒａｎｇｅ定数αを用いた最適化問題を示す。）
【数４】
2012147800.tif 000006
【０１９４】
（ここで、Ｃは実験により決定される制約条件パラメータを示す。）
【数５】
2012147800.tif 000007
【０１９５】
そして、トラスツズマブに対する治療感受性を示すかどうか未知の乳ガン患者については、該乳ガン患者の乳ガン組織由来の生体試料における、該判別式で使用する遺伝子の発現量を測定し、それらを該判別式のｘｉに代入することによって、該２群のいずれに所属するかを予測することができる。
【０１９６】
以上に示すように、トラスツズマブに対する治療感受性を示すかどうか未知の乳ガン患者が、トラスツズマブに対する治療感受性を示す、又は示さない、のいずれの群に属するかを判定する判定式の作成には、教師データセットから作成した判別式が必要であり、該判別式の予測精度を上げるためには、教師データセット中の２群間に明確な差がある遺伝子を判別式に用いることが必要である。
【０１９７】
また、判別式の説明変数に用いる遺伝子の決定は、次のように行うことが好ましい。まず、教師データセットである、トラスツズマブに対する治療感受性を示す乳ガン患者群の乳ガン組織由来の生体試料の網羅的遺伝子発現量とトラスツズマブに対する治療感受性を示さない乳ガン患者群の乳ガン組織由来の生体試料の網羅的遺伝子発現量をデータセットとし、パラメトリック解析であるｔ−検定のｐ値、ノンパラメトリック解析であるＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定のｐ値、又はＲａｎｋＰｒｏｄｕｃｔ法の順位などを利用して、該２群間における各遺伝子の発現量の差の大きさを求める。
【０１９８】
次に、ここで求めた遺伝子発現量の差が大きい任意の数の遺伝子を用いた判別式を作成し、この判別式に対し、別の独立の乳ガン患者の乳ガン組織由来の生体試料由来の遺伝子発現量を説明変数に代入して、この独立の乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性についての判別結果を決定する。最大の予測精度を得る判別式を構築するためには、この判別式の作成と予測精度の決定を、遺伝子を遺伝子発現量の差の大きい順に一つずつ増やしながら繰り返して評価する。
【０１９９】
また、該判別式に用いる遺伝子の決定と予測精度の決定には、ＬＯＯＣＶ法を用いることが好ましい（図１）。すなわち、まず教師データセットから１つのデータをテストデータとして抜き出し、残りを学習データセットとする。そして、学習データセットを用いて判別式を作成し、該判別式を用いてテストデータが所属する群を予測する。そして、教師データセットから重複せずにテストデータを分けることができる複数の組合せに対して、より好ましくは重複せずにテストデータを分けることができる全ての組合せに対して判別式の予測値を決定し、決定した予測値とテストデータが所属する真の群を用いてＡＵＲＯＣ値を得て、これを予測精度とする。
【０２００】
本発明の方法において、例えば、上に記載したような配列番号１〜２３に基づく１又は複数の上記ポリヌクレオチド、並びに／或いは、上に記載したような１〜２３に基づく１又は複数のポリヌクレオチド、からの任意の組み合わせを用いて、かつ上記の２３種の標的遺伝子の発現量がすべてトラスツズマブに対する治療感受性を示す乳ガン患者とトラスツズマブに対する治療感受性を示さない乳ガン患者間で異なり、乳ガン患者由来の乳ガン病変部において発現が増加／減少していることを指標にして、これら２３種の遺伝子について発現量を測定し、これらの遺伝子の任意の２０種類の遺伝子発現量の組み合わせを用いることにより、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性をＡＵＲＯＣ値として０．９５１の予測精度で見分けることができる（図２）。
【０２０１】
(実施例)
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。しかし、本発明の範囲は、この実施例によって制限されないものとする。
【実施例１】
【０２０２】
１．試料の採取
Ｈｅｒ２タンパク質の免疫組織化学的染色法のスコアが３＋となること、又は前記スコアが２＋であり、かつ蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法のＨｅｒ２／ＣＥＰ１７比が２．２より大きいと判定されたことによってＨｅｒ２陽性と判別された、インフォームドコンセントを得た３５症例の手術前初発乳ガン患者から、トラスツズマブと抗ガン剤の併用による治療を行う前に針生検を用いて乳ガン組織を採取し、採取した乳ガン組織からＦＦＰＥ標本を得た。そして、ＦＦＰＥ標本から厚さ１０μｍに薄切した乳ガン組織の病理標本を得た。【０２０３】
具体的には、３５症例のＨｅｒ２陽性乳ガン患者にはトラスツズマブと抗ガン剤の併用による治療を行う前に針生検による乳ガン組織採取を行った。そして、針生検実施後にトラスツズマブと、シクロフォスファミド及びドセタキセルを含む術前化学療法による治療を行った。トラスツズマブとこれら抗ガン剤による治療効果の判定基準は、手術時に採取された病理検査標本について行い、日本乳癌学会編「乳癌取扱い規約  第１６版」に定める組織学的治療効果の基準による、Ｇｒａｄｅ３に分類される病理学的完全奏効が確認されかつ臨床的にリンパ節転移巣がないことが確認された場合をトラスツズマブに対する治療感受性有りとした。【０２０４】
この治療効果の判定基準に従い、非特許文献３の検査方法を用いた場合、この３５症例のＨｅｒ２陽性乳ガン患者のうち、トラスツズマブと抗ガン剤の併用による治療に対して感受性を示した患者数は１９症例と分かっている。すなわち、非特許文献３の検査方法の予測精度は５４．２％となる。【０２０５】
２．ｔｏｔａｌＲＮＡの抽出
試料として上の「１」で得た、３５症例のＨｅｒ２陽性乳ガン患者の病理標本からレーザーマイクロダイセクションシステム（ライカ社）を用いて乳ガン病変部の組織を切り出した。この切出し組織から、Ａｒｃｔｕｒｕｓ（登録商標）  Ｐａｒａｄｉｓｅ（登録商標）  Ｐｌｕｓ  ２  ｒｏｕｎｄ  ａｍｉｎｏａｌｌｙｌキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、同社の定める手順に従ってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを得た。【０２０６】
３．遺伝子発現量の測定
試料として上の「２」で得た３５症例のＨｅｒ２陽性乳ガン患者のｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用い、オリゴＤＮＡマイクロアレイとして、３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏ  ｃｈｉｐ（東レ株式会社）によって、遺伝子発現量を測定した。オリゴＤＮＡマイクロアレイの測定は、東レ株式会社が定める手順に基づいて操作し、ハイブリダイゼーションを行ったＤＮＡマイクロアレイを３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）スキャナー（東レ株式会社）を用いてスキャンし、画像を取得して３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（東レ株式会社）にて蛍光強度を数値化した。数値化された蛍光強度を、底が２の対数値に変換して遺伝子発現量とし、３５症例のＨｅｒ２陽性乳ガン患者に対する、Ｈｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏ  ｃｈｉｐの各プローブがハイブリダイゼーションによって検出した核酸配列、すなわち網羅的なｍｉＲＮＡの遺伝子発現量を得た。【０２０７】
４．予測スコアリングシステム
上の「１」〜「３」で得た３５症例のＨｅｒ２陽性乳ガン患者の乳ガン組織由来のｔｏｔａｌ  ＲＮＡから検出されたｍｉＲＮＡの遺伝子発現量を、上のセクション「３」で得た各患者のトラスツズマブに対する治療感受性の有無の臨床情報を基に患者間で比較して、トラスツズマブに対する治療感受性予測用遺伝子を決定し、その遺伝子を用いた場合のＨｅｒ２陽性乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測精度をＭａｔｌａｂ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２０１１ａ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ社）を用いて算出した。すなわち、図１に示すＬＯＯＣＶ法に従い、まず上のセクション「３」で得た３５症例のＨｅｒ２陽性乳ガン患者群のうち、７５％以上の症例で遺伝子発現量が５以上となるｍｉＲＮＡを選び出した。次に、３５症例のＨｅｒ２陽性乳ガン患者から任意の１症例を分け、この症例のｍｉＲＮＡの遺伝子発現データをテストデータとした。そして、残りの３４症例のｍｉＲＮＡの遺伝子発現データを学習データセットとした。次に、学習データセットをＨｅｒ２陽性乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性有無の臨床情報を群分けの指標として２群に分け、この学習データセットに対して、ＲａｎｋＰｒｏｄｕｃｔ法による２群の差の検定を行い、学習データセット中の各遺伝子のトラスツズマブに対する治療感受性への関与の高さを示す順位を算出した。次に、ＲａｎｋＰｒｏｄｕｃｔ法から得た順位が最も高い１種類の遺伝子を用いてトラスツズマブに対する治療感受性を予測するための判別式を、ＳＶＭ法（数１〜数５）を用いて作成し、この判別式を用いてテストデータのトラスツズマブに対する治療感受性を予測した。【０２０８】
引き続き、前記の手順を残りの３４通りの全ての組合せに対して行い、結果として３５通りのトラスツズマブに対する治療感受性の予測値を算出した。この３５通りの予測値と上の「１」で得たＨｅｒ２陽性乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性有無の臨床情報を用いて算出した予測精度(ＡＵＲＯＣ値)は０．５４０となり、３５通りの組合せで少なくとも１回以上選択された遺伝子は配列番号１の遺伝子であった。【０２０９】
次にトラスツズマブに対する治療感受性の予測精度を更に高めるために、トラスツズマブに対する治療感受性への関与が高い遺伝子を更に組み合わせた。すなわち上記の手順によって、ＲａｎｋＰｒｏｄｕｃｔ法による順位を算出し、２番目以降に順位が高い２以上の遺伝子を用いてＳＶＭ法による判別式を作成し、判別式を用いてテストセットのトラスツズマブに対する治療感受性を予測する手順を、ＬＯＯＣＶ法によって３５通りの全ての組合せに対して行い、それぞれの遺伝子数のときの予測精度（ＡＵＲＯＣ値）を求めた。【０２１０】
その結果、トラスツズマブに対する治療感受性の予測精度は、２遺伝子のときにＡＵＲＯＣ値が０．５１６、３遺伝子のときにＡＵＲＯＣ値が０．６６４、４遺伝子のときにＡＵＲＯＣ値が０．７１４、５遺伝子のときにＡＵＲＯＣ値が０．６７４、６遺伝子のときにＡＵＲＯＣ値が０．７０１、７遺伝子のときにＡＵＲＯＣ値が０．７０７、８遺伝子のときにＡＵＲＯＣ値が０．７４７、９遺伝子のときにＡＵＲＯＣ値が０．８１３、１０遺伝子のときにＡＵＲＯＣ値が０．８１６、１１遺伝子のときにＡＵＲＯＣ値が０．８３９、１２遺伝子のときにＡＵＲＯＣ値が０．８４２、１３遺伝子のときにＡＵＲＯＣ値が０．７８０、１４遺伝子のときにＡＵＲＯＣ値が０．７７６、１５遺伝子のときにＡＵＲＯＣ値が０．７５７、１６遺伝子のときにＡＵＲＯＣ値が０．７０７、１７遺伝子のときにＡＵＲＯＣ値が０．７３７、１８遺伝子のときにＡＵＲＯＣ値が０．８４９、１９遺伝子のときにＡＵＲＯＣ値が０．９０１、２０遺伝子のときにＡＵＲＯＣ値が０．９５１、２１遺伝子のときにＡＵＲＯＣ値が０．９０８、そして２２遺伝子のときにＡＵＲＯＣ値が０．８８５となり、トラスツズマブに対する治療感受性の予測精度は２０遺伝子を用いたときに予測精度は最大化した（図２）。そして、この２０遺伝子を用いた場合に３５通りの組合せで少なくとも１回以上選択された遺伝子は配列番号１〜２３の遺伝子となり、２３種類の各遺伝子が３５通りの組合せで選択された回数は表１のとおりとなった。すなわち、この２０遺伝子を用いた本発明による予測精度は、非特許文献３の検査方法による予測精度（５４．２％）よりも遥かに高いことが示された。
【表１】
2012147800.tif 000008
【０２１１】
このＡＵＲＯＣ値が最大化したときに、ＳＶＭ法を用いた乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測に用いられる遺伝子２０種の、ＬＯＯＣＶ法による選抜結果を図３に示す。表中の数字は、各教師データセットにおいて、予測用遺伝子を選択した際に、当該遺伝子が何番目に選択されたかの優先順位を示す。例えば、３５通りの各教師データセットにおいて、トラスツズマブに対する治療感受性への関与が高い１個の遺伝子の選ぶ場合（図２のグラフにおいて、遺伝子数が１の場合）に用いる予測用遺伝子の選び方は３５通りあるが、選択された３５通りの遺伝子の全ては配列番号１であり、配列番号１を用いた場合のトラスツズマブに対する治療感受性の予測精度はＡＵＲＯＣ値で０．５４０しかないことを示す。また、例えば、予測精度（ＡＵＲＯＣ値）が最大の０．９５１となる３５症例から３４症例を選び出す３５通りの各教師データセットにおいて、トラスツズマブに対する治療感受性への関与が高い２０個の遺伝子の組み合わせは、配列番号１〜２０、配列番号１〜１９及び２１、配列番号１〜１９及び２２、配列番号１〜１９及び２３、配列番号１〜１８、２０及び２１、配列番号１〜１８、２０及び２２、配列番号１〜１７及び１９〜２１、配列番号１〜１７、１９、２０及び２２、配列番号１〜１７、１９、２１及び２２、配列番号１〜１６及び１８〜２１、配列番号１〜１６、１８、１９、２１及び２２、配列番号１〜１５及び１７〜２１、配列番号１〜１５、１７〜１９、２２及び２３の１３通りの組み合わせとなる。すなわち、各教師データセットにおいて２０個の遺伝子を選択する場合（図２のグラフにおいて、遺伝子数が２０の場合）に用いる予測用遺伝子は、配列番号１〜２３の２３個の遺伝子となる。【０２１２】
各教師データセットにおいて選択する遺伝子数（図２のグラフにおける遺伝子数）が１個〜２０個の場合に、それぞれ用いる予測用遺伝子（配列番号）、またその遺伝子を用いるときの予測精度（ＡＵＲＯＣ値）は、表２に示すとおりとなる。
【表２】
2012147800.tif 000009
【０２１３】
以上から、乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測において、最も高いＡＵＲＯＣ値を示す遺伝子数は図２のグラフにおいて、遺伝子数が２０の場合であり、このときに用いる予測用遺伝子は、表２に示す配列番号１〜２３の２３個の遺伝子となる。
【実施例２】
【０２１４】
配列番号１〜２３を用いて乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測を行う場合に、従来法よりも高い精度でトラスツズマブ感受性を予測できる最も少ない遺伝子の組合せを確認するために、実施例１で対象とした３５症例のＨｅｒ２陽性乳ガン患者群、およびこの患者群とは異なる４８症例の独立の患者群に対する予測精度を確認した。【０２１５】
１．４８症例の患者群からの試料の採取
Ｈｅｒ２タンパク質の免疫組織化学的染色法のスコアが３＋となること、又は前記スコアが２＋であり、かつ蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法のＨｅｒ２／ＣＥＰ１７比が２．２より大きいと判定されたことによって、Ｈｅｒ２陽性と判別された、インフォームドコンセントを得た実施例１で収集した症例とは異なる４８症例の手術前初発乳ガン患者から、トラスツズマブと抗ガン剤の併用による治療を行う前に針生検を用いて乳ガン組織を採取し、採取した乳ガン組織からＦＦＰＥ標本を得た。そして、ＦＦＰＥ標本から厚さ１０μｍに薄切した乳ガン組織の病理標本を得た。【０２１６】
具体的には、４８症例のＨｅｒ２陽性乳ガン患者にはトラスツズマブと抗ガン剤の併用による治療を行う前に針生検による乳ガン組織採取を行った。そして、針生検実施後にトラスツズマブと、フルオロウラシル、エピルビシン、シクロフォスファミド及びドセタキセルを含む術前化学療法による治療を行った。トラスツズマブとこれら抗ガン剤による治療効果の判定基準は、実施例１の判定基準と同じく、手術時に採取された病理検査標本について行い、日本乳癌学会編「乳癌取扱い規約  第１６版」に定める組織学的治療効果の基準による、Ｇｒａｄｅ３に分類される病理学的完全奏効が確認されかつ臨床的にリンパ節転移巣がないことが確認された場合をトラスツズマブに対する治療感受性有りとした。【０２１７】
この治療効果の判定基準に従い、現在、臨床現場で利用されている非特許文献３の検査方法を用いた検査法を用いた場合、この４８症例のＨｅｒ２陽性乳ガン患者のうち、トラスツズマブと抗ガン剤の併用による治療に対して感受性を示した患者数は２０症例と分かっている。すなわち、非特許文献３の検査方法の予測精度は４１．７％となる。【０２１８】
２．４８症例の患者群由来試料からのｔｏｔａｌＲＮＡの抽出
実施例１の「２」と同じく、試料として上の「１」で得た、４８症例のＨｅｒ２陽性乳ガン患者の病理標本からレーザーマイクロダイセクションシステム（ライカ社）を用いて乳ガン病変部の組織を切り出した。この切出し組織から、Ａｒｃｔｕｒｕｓ（登録商標）  Ｐａｒａｄｉｓｅ（登録商標）  Ｐｌｕｓ  ２  ｒｏｕｎｄ  ａｍｉｎｏａｌｌｙｌキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、同社の定める手順に従ってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを得た。【０２１９】
３．４８症例の患者群由来試料遺伝子発現量の測定
実施例１の「２」と同じく、試料として上の「２」で得た４８症例のＨｅｒ２陽性乳ガン患者のｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用い、オリゴＤＮＡマイクロアレイとして、３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏ  ｃｈｉｐ（東レ株式会社）によって、遺伝子発現量を測定した。オリゴＤＮＡマイクロアレイの測定は、東レ株式会社が定める手順に基づいて操作し、ハイブリダイゼーションを行ったＤＮＡマイクロアレイを３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）スキャナー（東レ株式会社）を用いてスキャンし、画像を取得して３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（東レ株式会社）にて蛍光強度を数値化した。数値化された蛍光強度を、底が２の対数値に変換して遺伝子発現量とし、４８症例のＨｅｒ２陽性乳ガン患者に対する、Ｈｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏ  ｃｈｉｐの各プローブがハイブリダイゼーションによって検出した核酸配列、すなわち網羅的なｍｉＲＮＡの遺伝子発現量を得た。【０２２０】
４．予測スコアリングシステム
実施例１の「１」〜「３」で得た３５症例のＨｅｒ２陽性乳ガン患者の乳ガン組織由来のｔｏｔａｌ  ＲＮＡから検出された配列番号１〜２３のｍｉＲＮＡの遺伝子発現量を、実施例１の「３」で得た各患者のトラスツズマブに対する治療感受性の有無の臨床情報をもとに患者間で比較して、配列番号１〜２３のｍｉＲＮＡから選ばれる任意の２遺伝子を用いた場合の、Ｈｅｒ２陽性乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性を予測する予測スコアリングシステムを、Ｍａｔｌａｂ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２０１１ａ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ社）を用いて作成した。【０２２１】
すなわち、３５症例のＨｅｒ２陽性乳ガン患者から任意の１症例を分け、この症例のｍｉＲＮＡの遺伝子発現データをテストデータとした。そして、残りの３４症例のｍｉＲＮＡの遺伝子発現データを学習データセットとした。次に、学習データセットをＨｅｒ２陽性乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性有無の臨床情報を群分けの指標として２群に分け、この学習データセットに対して、配列番号１〜２３のｍｉＲＮＡから選ばれる任意の２遺伝子を用いてトラスツズマブに対する治療感受性を予測するための判別式を、ＳＶＭ法（数１〜数５）を用いて作成し、この判別式を用いてテストデータのトラスツズマブに対する治療感受性を予測した。引き続き、前記の手順を残りの３４通りの全ての組合せに対して行い、結果として３５通りのトラスツズマブに対する治療感受性の予測値を算出し、３５症例の患者群に対する予測精度（ＡＵＲＯＣ値）を求めた。【０２２２】
最終的に、３５症例の患者群に対して、配列番号１〜２３のｍｉＲＮＡから選ばれる全ての２遺伝子の組合せについてＡＵＲＯＣ値を求め、非特許文献３の検査方法の予測精度の６５．２％を上回る２遺伝子の組合せ、及びその予測精度を求めた。【０２２３】
５．配列番号１〜２３から選ばれる２遺伝子を用いたトラスツズマブに対する治療感受性予測
実施例２の「１」〜「３」で得た４８症例のＨｅｒ２陽性乳ガン患者の乳ガン組織由来のｔｏｔａｌ  ＲＮＡから検出されたｍｉＲＮＡの遺伝子発現量に対して、上の「４」で作成した、配列番号１〜２３のｍｉＲＮＡから選ばれる２遺伝子の組合せを用いて作成した予測スコアリングシステムを用いた場合の、Ｈｅｒ２陽性乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性の予測精度をＭａｔｌａｂ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２０１１ａ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ社）を用いて、すべての２遺伝子の組み合わせについて決定した。【０２２４】
その結果、実施例１で対象とした３５症例のＨｅｒ２陽性乳ガン患者、及び実施例２で対象とした４８症例のＨｅｒ２陽性乳ガン患者の両方に対して、トラスツズマブに対する治療感受性の予測精度が、共に高くなる実施例１で得た配列番号１〜２３の遺伝子から選ばれる２遺伝子の組合せ、及びその予測精度は表３に示すとおりとなる。すなわち、表３の２遺伝子の組合せの本発明による予測精度は、実施例１の３５症例のＨｅｒ２陽性乳ガン患者に対する非特許文献３の検査方法の予測精度（５４．２％）、及び実施例２の４８症例のＨｅｒ２陽性乳ガン患者に対する非特許文献３の検査方法の予測精度（４１．７％）よりも遥かに高い値を示す。
【表３】
2012147800.tif 000010
【産業上の利用可能性】
【０２２５】
本発明により、予測精度に優れた乳ガン患者のトラスツズマブに対する治療感受性予測用組成物を提供することができるため、乳ガン患者のトラスツズマブ又はトラスツズマブと抗ガン剤の併用によるトラスツズマブに対する治療感受性を予測するために非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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