(57)【要約】  チロシン フェノール-リアーゼ（tyrosine phenol-lyase）活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、フェノール生産能を有する形質転換体。この形質転換体を、還元条件下、チロシン、その塩、又はそのエステルを含有する反応液中で反応させる工程と、反応培地中のフェノールを回収する工程とを含むフェノールの製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシン フェノール-リアーゼ（tyrosine phenol-lyase）活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、フェノール生産能を有する形質転換体。
【請求項２】
チロシン フェノール-リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、パントエア アグロメランス（Pantoea agglomerans）由来の遺伝子、シトロバクター ブラッキー（Citrobacter braakii）由来の遺伝子、デスルフィトバクテリューム ハフニエンス（Desulfitobacterium hafniense） 由来の遺伝子、クロロフレクサス オウランティアカス（Chloroflexus aurantiacus） 由来の遺伝子、ノストック パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)由来の遺伝子、又はトレポネマ デンティコラ（Treponema denticola）由来の遺伝子である請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
チロシン フェノール-リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が下記の(a)又は(b)のDNAである請求項１に記載の形質転換体。
(a)  配列番号16の塩基配列からなるDNA、配列番号23の塩基配列からなるDNA、配列番号24の塩基配列からなるDNA、配列番号25の塩基配列からなるDNA、配列番号26の塩基配列からなるDNA、又は配列番号27の塩基配列からなるDNA
(b)  (a)の何れかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつチロシン フェノール-リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
【請求項４】
宿主のコリネ型細菌が、その染色体上に存在するフェノール2-モノオキシゲナーゼ（phenol 2-monooxygenase）活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、請求項１〜３の何れかに記載の形質転換体。
【請求項５】
宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである請求項１〜４の何れかに記載の形質転換体。
【請求項６】
宿主のコリネ型細菌が、コリネバクテリウム グルミカムR（FERM  P−18976）、ATCC13032、又はATCC13869である請求項１〜３の何れかに記載の形質転換体。
【請求項７】
宿主のコリネ型細菌が、コリネバクテリウム グルミカムR（FERM  P−18976）、ATCC13032、又はATCC13869の染色体上に存在するフェノール2-モノオキシゲナーゼ（phenol 2-monooxygenase）活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、請求項１〜３の何れかに記載の形質転換体。
【請求項８】
コリネバクテリウム グルタミカム PHE31（受託番号：NITE BP−999）形質転換体。
【請求項９】
請求項１〜８の何れかに記載の形質転換体を、還元条件下、チロシン、その塩、又はそのエステルを含有する反応液中で反応させる工程と、反応培地中のフェノールを回収する工程とを含むフェノールの製造方法。
【請求項１０】
反応工程において、形質転換体が実質的に増殖しない請求項９に記載のフェノールの製造方法。
【請求項１１】
還元条件下の反応液の酸化還元電位が−２００〜−５００ミリボルトである請求項９又は１０に記載のフェノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フェノール生産技術に関する。さらに詳しくは、フェノール生産機能を付与するために特定の遺伝子操作が施されたコリネ型細菌の形質転換体、及びこの形質転換体を用いた効率的なフェノールの製造技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球温暖化、及び化石資源枯渇問題を背景に、再生可能資源を原料とした化学品の製造は、バイオ燃料製造と並び、新産業バイオリファイナリーとして低炭素社会実現の重要な方策であることが認識され、大きな注目が集まっている。
しかし、再生可能資源を原料としたバイオフェノール生産は、乳酸やエタノールの生産と比較して、原料となる糖類から代謝反応段数が大変多いために生産性が低く、また生産物であるフェノールにより菌の増殖が阻害されたり、フェノールによる細胞毒性がある等の理由により、これまで工業的生産が不可能とされていた。【０００３】
フェノールの重要な用途として、フェノール樹脂が挙げられる。フェノール樹脂は、フェノールとアルデヒド類との付加縮合反応により生成し、プラスチックの中でも最も古い歴史のある樹脂であり、その優れた耐熱性、耐久性等の特長から、現在でも自動車用金属代替材料、半導体封止材料、回路基板など様々な用途に用いられている。また、これまでフェノール樹脂は、原料のフェノールとアルデヒド類の反応性が極めて高く、得られる高分子が複雑な三次元網目構造になるため、ポリマーの精密構造設計やナノマテリアルへの展開が困難であり、高付加価値の用途への利用が難しいとされてきた。しかしながら、近年、高分子の物性理論やシミュレーションの急速な発展により、ネットワーク構造を精密化すればフェノール樹脂から高機能性材料の創製が可能となってきた。このような背景から日本におけるフェノール樹脂生産量も年々増加している。【０００４】
フェノールの現在の工業的生産法（クメン法）は、石油由来のベンゼンとプロピレンを原料とし、多量の溶剤類及び多量の熱エネルギーを必要とする、典型的な化学工業の高エネルギー消費型プロセスである。従って、地球環境保全や温室効果ガス削減の観点から、二酸化炭素排出が少ない省エネルギー型で、再生可能資源から製造でき、低廃棄物排出の環境調和型プロセスの開発、即ちバイオフェノール製造技術確立が急務となっている。
これまで自然界においてフェノール生産菌は報告されていない。また、遺伝子組換え菌によるフェノール生産技術であって、実用上十分なフェノール生産性が得られる技術も知られていない。【０００５】
ここで、チロシン フェノール-リアーゼは、フェノール、ピルビン酸、及びアンモニアからチロシンを合成する反応、及びその逆反応を触媒する酵素である（例えば、特許文献１）。例えば、特許文献２は、エンテロバクテリアセ（Enterobacteriaceae）属細菌由来のチロシン フェノール-リアーゼを用いて、フェノール、ピルビン酸、及びアンモニアからチロシンを合成したことを教えている。
また、チロシン フェノール-リアーゼを効率よく生産させるために、種々の生物由来のチロシン フェノール-リアーゼ遺伝子で大腸菌を形質転換することが知られている（特許文献３〜５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−３２０２３８
【特許文献２】特開平８−１５４６７５
【特許文献３】特開２００５−２７８４５３
【特許文献４】ＷＯ９０／０４０３１
【特許文献５】特開平４−２１８３８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、チロシンを原料として効率よくフェノールを製造できる微生物、及びチロシンを原料として効率よくフェノールを製造できる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、以下の知見を得た。
(i)  コリネ型細菌にチロシン フェノール-リアーゼ(tyrosine phenol-lyase)遺伝子を導入した形質転換体は、効率よくチロシンからフェノールを生産する。
(ii)  この形質転換体において、宿主のコリネ型細菌の染色体上に存在するフェノール 2-モノオキシゲナーゼ(2-monooxygenase)遺伝子（poxF）が破壊され、又は欠損しているときは、一層効率よくフェノールを生産できる。
(iii)  この形質転換体は、還元条件下の反応液中で実質的に増殖しない状態で反応させる場合、特に、フェノール生産効率が高い。【０００９】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の形質転換体及びフェノールの製造方法を提供する。
項１．  チロシン フェノール-リアーゼ（tyrosine phenol-lyase）活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、フェノール生産能を有する形質転換体。
項２．  チロシン フェノール-リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、パントエア アグロメランス（Pantoea agglomerans）由来の遺伝子、シトロバクター ブラッキー（Citrobacter braakii）由来の遺伝子、デスルフィトバクテリューム ハフニエンス（Desulfitobacterium hafniense） 由来の遺伝子、クロロフレクサス オウランティアカス（Chloroflexus aurantiacus） 由来の遺伝子、ノストック パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)由来の遺伝子、又はトレポネマ デンティコラ（Treponema denticola）由来の遺伝子である項１に記載の形質転換体。
項３．  チロシン フェノール-リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が下記の(a)又は(b)のDNAである項１に記載の形質転換体。
(a)  配列番号16の塩基配列からなるDNA、配列番号23の塩基配列からなるDNA、配列番号24の塩基配列からなるDNA、配列番号25の塩基配列からなるDNA、配列番号26の塩基配列からなるDNA、又は配列番号27の塩基配列からなるDNA
(b)  (a)の何れかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつチロシン フェノール-リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
項４．  宿主のコリネ型細菌が、その染色体上に存在するフェノール2-モノオキシゲナーゼ（phenol 2-monooxygenase）活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、項１〜３の何れかに記載の形質転換体。
項５．  宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである項１〜４の何れかに記載の形質転換体。
項６．  宿主のコリネ型細菌が、コリネバクテリウム グルミカムR（FERM  P−18976）、ATCC13032、又はATCC13869である項１〜３の何れかに記載の形質転換体。
項７．  宿主のコリネ型細菌が、コリネバクテリウム グルミカムR（FERM  P−18976）、ATCC13032、又はATCC13869の染色体上に存在するフェノール2-モノオキシゲナーゼ（phenol 2-monooxygenase）活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、項１〜３の何れかに記載の形質転換体。
項８．  コリネバクテリウム グルタミカム PHE31（受託番号：NITE BP−999）形質転換体。
項９．  項１〜８の何れかに記載の形質転換体を、還元条件下、チロシン、その塩、又はそのエステルを含有する反応液中で反応させる工程と、反応培地中のフェノールを回収する工程とを含むフェノールの製造方法。
項１０．  反応工程において、形質転換体が実質的に増殖しない項９に記載のフェノールの製造方法。
項１１．  還元条件下の反応液の酸化還元電位が−２００〜−５００ミリボルトである項９又は１０に記載のフェノールの製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の形質転換体を用いることにより、チロシンからフェノールを高効率で製造することができる。
一般に微生物はフェノールのような溶剤の細胞毒性により生育が阻害されるため、微生物を用いてフェノールを製造することは困難であったが、本発明方法によれば、微生物を用いて、実用上十分に効率良くフェノールを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例で用いたプラスミドの構成を示す図である。
【図２】各種の微生物の好気条件下における増殖に及ぼすフェノールの影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）フェノール生産能を有する形質転換体
本発明のフェノール生産能を有する形質転換体は、チロシン フェノール-リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された形質転換体である。
【００１３】
宿主
コリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bargeys Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）〕に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、マイクロコッカス属菌等が挙げられる。コリネ型細菌の中ではコリネバクテリウム属菌が好ましい。
【００１４】
コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム  グルタミカム、コリネバクテリウム  エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム  アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム  ハロトレランス（Corynebacterium halotolerance）、コリネバクテリウム  アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）等が挙げられる。
中でも、安全でかつフェノール生産性が高い点で、コリネバクテリウム  グルタミカムが好ましい。好適な菌株として、コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R株（FERM P-18976）、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233（FERM BP-1497）、MJ-233AB-41（FERM BP-1498）等が挙げられる。中でも、R株（FERM P-18976）、ATCC13032株、ATCC13869株が好ましい。
【００１５】
なお、分子生物学的分類により、ブレビバクテリウム フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）、コリネバクテリウム リリウム（Corynebacterium lilium）等のコリネ型細菌もコリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に菌名が統一されている〔Liebl, W. et al., Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum" DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns. Int J Syst Bacteriol. 41:255-260. (1991)、駒形和男ら, コリネフォルム細菌の分類, 発酵と工業, 45:944-963 (1987)〕。
旧分類のブレビバクテリウム  ラクトファーメンタムATCC13869株、ブレビバクテリウム フラバムのMJ-233株（FERM BP-1497）、MJ-233AB-41株（FERM BP-1498）なども好適なコリネバクテリウム グルタミカムである。
ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）（例えばATCC6872株）等が挙げられる。
【００１６】
アースロバクター属菌としては、アースロバクター  グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）（例えばATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株）等が挙げられる。
マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム ボビス（Mycobacterium bovis）（例えばATCC19210株、ATCC27289株）等が挙げられる。
マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス  フロイデンライヒ（Micrococcus freudenreichii）（例えばNo. 239株（FERM P-13221））、マイクロコッカス  ルテウス（Micrococcus leuteus）(例えばNo. 240株（FERM P-13222）)、マイクロコッカス ウレアエ（Micrococcus ureae）（例えばIAM1010株）、マイクロコッカス  ロゼウス（Micrococcus roseus）（例えばIFO3764株）等が挙げられる。
【００１７】
また、コリネ型細菌は、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。例えば、ラクテート（乳酸）デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase：LDH）、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ（phosphoenolpyrvate carboxylase）、マレートデヒドロゲナーゼ（malate dehydrogenase）などの遺伝子の破壊株が挙げられる。このような遺伝子破壊株を宿主として用いることにより、フェノールの生産性を向上させたり、副生成物の生成を抑制したりすることができる。
中でも、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。この遺伝子破壊株は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されていることにより、ピルビン酸から乳酸への代謝経路が遮断されている。中でも、コリネバクテリウム グルタミカムの、特にR（FERM P-18976）株のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。
このような遺伝子破壊株は、遺伝子工学的手法により常法に従い作製できる。例えば、ＷＯ２００５／０１０１８２Ａ１に、乳酸デヒドロゲナーゼ破壊株、及びその作製方法が記載されている。
実施例３に示した通り、本発明者らは、コリネ型細菌が、他細菌に比べて、フェノールに対する耐性が極めて高いことを見出した。この点で、コリネ型細菌は本発明方法によるフェノール製造に好適である。
また、コリネ型細菌は、他の好気性細菌に比べて、実質的に増殖しない還元条件下で効率よく物質生産を行える。この点でも、コリネ型細菌は本発明方法によるフェノール製造に好適である。
【００１８】
チロシン フェノール-リアーゼ酵素遺伝子(tpl)
チロシン フェノール-リアーゼは、チロシンからピルビン酸及びアンモニアを脱離させてフェノールを生成する反応、及びその逆反応を触媒する酵素である。また、チロシン フェノール-リアーゼは、カテコールとピルビン酸からＬ−ＤＯＰＡを生成する反応も触媒する。
チロシン フェノール-リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の由来は特に限定されないが、パントエア アグロメランス（Pantoea agglomerans）由来の遺伝子、シトロバクター ブラッキー（Citrobacter braakii）由来の遺伝子、デスルフィトバクテリューム ハフニエンス（Desulfitobacterium hafniense）由来の遺伝子、クロロフレクサス オウランティアカス（Chloroflexus aurantiacus） 由来の遺伝子、ノストック パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)由来の遺伝子、トレポネマ デンティコラ（Treponema denticola）由来の遺伝子が好ましく、パントエア アグロメランス由来の遺伝子がより好ましい。
【００１９】
パントエア アグロメランス（Pantoea agglomerans）由来の遺伝子としては配列番号16の塩基配列からなるDNAが挙げられ、シトロバクター ブラッキー（Citrobacter braakii）由来の遺伝子配列番号23の塩基配列からなるDNAが挙げられ、デスルフィトバクテリューム ハフニエンス（Desulfitobacterium hafniense） 由来の遺伝子配列番号24の塩基配列からなるDNAが挙げられ、クロロフレクサス オウランティアカス（Chloroflexus aurantiacus） 由来の遺伝子配列番号25の塩基配列からなるDNAが挙げられ、ノストック パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)由来の遺伝子配列番号26の塩基配列からなるDNAが挙げられ、トレポネマ デンティコラ（Treponema denticola）由来の遺伝子としては配列番号27の塩基配列からなるDNAが挙げられる。
【００２０】
また、本発明では、配列番号16、23、24、25、26、又は27の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつチロシン フェノール-リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
本発明において「ストリンジェントな条件」は、一般的な条件、例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, 1989, Vol2, p11.45に記載された条件を指す。具体的には、完全ハイブリッドの融解温度(Ｔｍ)より5〜10℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合を指す。
【００２１】
チロシン フェノール-リアーゼ活性は、「J. Biol. Chem., 245, 1767-1772 (1970)“Materials and Methods”」に記載の方法を改変して測定できる。簡単に説明すると、試験用液に被験酵素を添加し、50 mM リン酸カリウムバッファー, pH 8.0, 2.5 mM L-Tyr, 0.1 mM ピリドキサールリン酸, 20% グリセロールと酵素を含む反応液を調製し、30℃、30 分間反応を行った(0, 5, 10, 20, 30 min)。反応停止は0.6N 塩酸（終濃度）添加により行った。これを遠心分離後、フィルターろ過し、生じたフェノールはHPLCで分析、定量した（Cosmosil C18 ARII, 移動相20% MeOH, 0.07% 過塩素酸）。反応初速度とタンパク濃度から比活性を算出した（1分間当たり、1マイクロモルのフェノールを産生せしめる酵素量を1 unitとした）。
また、本発明では、配列番号16、23、24、25、26、又は27の塩基配列と同一性が90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上の塩基配列からなり、かつチロシン フェノール-リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
本発明において、塩基配列の同一性は、GENETYX ver.8（GENETYX 株式会社ゼネティックス製）により算出した値である。
【００２２】
配列番号16、23、24、25、26、又は27の塩基配列からなるDNAのホモログは、例えば、これらの塩基配列に基づき常法に従い設計したプライマー又はプローブを用いたPCR又はハイブリダイゼーションにより、他生物種のDNAライブラリーから選択することができ、これにより高確率でチロシン フェノール-リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAが得られる。
【００２３】
形質転換のためのベクターの構築
PCRで増幅したチロシン フェノール-リアーゼ酵素をコードするDNAは、それぞれ、宿主で増幅できる適切なベクターにクローニングすればよい。
プラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内で自律複製機能を司る遺伝子を含むものであれば良い。その具体例としては、ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）2256由来のpAM330〔特開昭58-67699〕、〔Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903（1984）〕 及び 〔Yamaguchi, R. et al., Determination of the complete nucleotide sequence of the Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330 and the analysis of its genetic information. Nucleic Acids Symp. Ser. 16:265-267（1985）〕、コリネバクテリウム グルタミカム ATCC13058由来のpHM1519 〔Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903（1984）〕及びpCRY30 〔Kurusu, Y. et al., Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57:759-764 （1991）〕、コリネバクテリウム グルタミカム T250由来のpCG4〔特開昭57-183799〕、〔Katsumata, R. et al., Protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA. J. Bacteriol.、159:306-311 （1984）〕、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50〔特開昭62-166890〕、pEK0、pEC5、pEKEx1 〔Eikmanns, B.J. et al., A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and promoter probing. Gene, 102:93-98 （1991）〕などが挙げられる。
【００２４】
好ましいプロモーターとしては、コリネバクテリウム  グルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3-フォスフェートデヒドロゲナーゼA遺伝子(gapA)のプロモーターPgapA、マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（mdh）のプロモーターPmdh、ラクテートデヒドロゲナーゼA遺伝子（ldhA）のプロモーターPldhAなどが挙げられ、中でも、PgapAが好ましい。
好ましいターミネーターとしては、大腸菌rRNAオペロンのrrnB T1T2 ターミネーター、大腸菌のtrpA ターミネーター、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）のtrp ターミネーターなどが挙げられ、中でも、rrnB T1T2 ターミネーターが好ましい。
【００２５】
形質転換
形質転換方法は、公知の方法を制限無く使用できる。このような公知の方法として、例えば塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、電気穿孔法などが挙げられる。中でも、コリネ型細菌には、電気パルス法が好適であり、電気パルス法は、公知の方法 〔Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric. Biol. Chem. 54:443-447 （1990）〕 及び 〔Vertes A.A. et al., Presence of mrr- and mcr-like restriction systems in Coryneform bacteria. Res. Microbiol. 144:181-185 （1993）〕により行うことができる。
【００２６】
形質転換体は、微生物の培養に通常使用される培地を用いて培養すればよい。この培地としては、通常、炭素源、窒素源、無機塩類及びその他の栄養物質等を含有する天然培地又は合成培地等を用いることができる。
炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、アラビノース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、ソルビトール、グリセリン等の糖質又は糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸又はグルコン酸等の有機酸；エタノール、プロパノール等のアルコール等が挙げられる。また、所望によりノルマルパラフィン等の炭化水素等も用いることができる。炭素源は、１種を単独で使用でき、又は２種以上を混合して使用してもよい。培地中のこれら炭素源の濃度は、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等が挙げられる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ベプトン、NZ−アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、１種を単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。培地中の窒素源濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、又は炭酸カルシウム等が挙げられる。これら無機塩は、１種を単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。培地中の無機塩類濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（ｗ／ｖ％）とすればよい。
栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、又は動植物若しくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、例えば、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
培地のｐＨは約5〜8が好ましい。
【００２７】
好ましい微生物培養培地としては、A培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。
培養温度は約15〜45℃とすればよく、培養時間は約1〜7日間とすればよい。
【００２８】
宿主染色体遺伝子の破壊又は欠失
宿主のコリネ型細菌は、その染色体上に存在するフェノール2-モノオキシゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子(poxF)が破壊され、または欠失していることが好ましく、これにより、一層効率良くフェノールを製造することができる。
遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能する酵素タンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型又は破壊型の遺伝子に置換することができる。欠失型又は破壊型の遺伝子によってコードされる酵素タンパク質は、生成したとしても、野生型酵素タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失している。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子欠失又は破壊は既に確立しており、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
具体的には、実施例１の項目に記載の方法により、フェノール2-モノオキシゲナーゼ遺伝子（poxF）が破壊され、又は欠失したコリネ型細菌を得ることができる。
【００２９】
（ＩＩ）フェノールの製造方法
上記説明した本発明の形質転換体を、チロシンを含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のフェノールを回収する工程とを含む方法によりフェノールを製造することができる。
微生物の増殖
反応に先立ち、形質転換体を好気条件下で、温度約25〜38℃で、約12〜48時間培養して増殖させることが好ましい。
【００３０】
培養用培地
反応に先立つ形質転換体の好気的培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地を用いることができる。
炭素源として、糖類（グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖；スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖；澱粉のような多糖；糖蜜等）、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。
炭素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。
【００３１】
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ−アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。窒素源の培地中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、１種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（ｗ／ｖ％）とすればよい。
【００３２】
栄養物質としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、動植物又は微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地中の濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
培地のｐＨは約6〜8が好ましい。
【００３３】
具体的な好ましいコリネ型細菌用培地としては、A培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。
【００３４】
反応液
反応液は、フェノール前駆体（フェノール原料）を含有する水、緩衝液、無機塩培地などを用いることができる。
前駆体としては、チロシン（Ｌ-チロシン、Ｄ-チロシン、又はこれらの混合物）、その塩、又はそのエステルを用いることができる。中でも、Ｌ-チロシン、その塩、又はそのエステルが好ましい。塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩などが挙げられる。また、エステルとしては、炭素数１〜４のアルコールとのエステルなどが挙げられる。チロシンは、水に難溶なので、チロシン塩を用いるのが好ましく、ナトリウム塩がより好ましい。前駆体は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。
反応液中のチロシン、その塩、又はそのエステルの濃度は、約0.5〜10（ｗ／ｖ％）が好ましく、約1〜7（ｗ／ｖ％）がより好ましく、約2〜5（ｗ／ｖ％）がさらにより好ましい。上記範囲であれば、効率良く、フェノールを製造できる。
緩衝液としては、リン酸バッファー、トリスバファー、炭酸バッファーなどが挙げられる。緩衝液の濃度は、約10〜150 mMが好ましい。
無機塩培地としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等の無機塩の１種又は２種以上を含む培地が挙げられる。中でも、硫酸マグネシウムを含む培地が好ましい。無機塩培地として、具体的には、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（ｗ／ｖ％）とすればよい。
反応液のｐＨは約6〜8が好ましい。反応中は、アンモニア水溶液、水酸化ナトリウム水溶液などを用いて、ｐＨコントローラー (例えば、エイブル株式会社製、型式：DT-1023）で、反応液のｐＨを中性付近、特に約７にコントロールしながら反応させることが好ましい。
反応条件
反応温度、即ち反応中の形質転換体の生存温度は、約20〜50℃が好ましく、約25〜47℃がより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良くフェノールを製造できる。
また、反応時間は、約1〜7日間が好ましく、約1〜3日間がより好ましい。
培養は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、バッチ式が好ましい。
【００３５】
＜還元条件＞
反応は、好気的条件で行ってもよく、還元条件で行ってもよいが、還元条件で行うことが好ましい。還元条件では、コリネ型細菌は実質的に増殖せず、一層効率的にフェノールを生産させることができる。
還元条件は、反応液の酸化還元電位で規定される。反応液の酸化還元電位は、約−200 mV〜−500 mVが好ましく、約−250 mV〜−500 mVがより好ましい。
反応液の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬（還元状態であれば、青色から無色への脱色）で推定できるが、正確には酸化還元電位差計（例えば、BROADLEY  JAMES社製、ORP Electrodes）を用いて測定できる。
【００３６】
還元条件にある反応液の調整方法は、公知の方法を制限なく使用できる。例えば、反応液調製用の液体媒体として、蒸留水などの代わりに反応液用水溶液を使用してもよく、反応液用水溶液の調整方法は、例えば硫酸還元微生物などの絶対嫌気性微生物用の培養液調整方法（Pfennig, N. et al．（1981）：The dissimilatory sulfate-reducing bacteria，In The Prokaryotes，A Handbook on Habitats，Isolation and Identification of Bacteria，Ed. By Starr，M.P. et al．p926-940，Berlin，Springer Verlag．）や「農芸化学実験書  第三巻、京都大学農学部  農芸化学教室編、1990年第26刷、産業図書株式会社出版」などが参考となり、所望する還元条件下の水溶液を得ることができる。
具体的には、蒸留水などを加熱処理や減圧処理して溶解ガスを除去することにより、還元条件の反応液用水溶液を得ることができる。この場合、約10 mmHg以下、好ましくは約5 mmHg以下、より好ましくは約3 mmHg以下の減圧下で、約1〜60分程度、好ましくは約5〜40分程度、蒸留水などを処理することにより、溶解ガス、特に溶解酸素を除去して還元条件下の反応液用水溶液を作成することができる。
また、適当な還元剤（例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオン、硫化ソーダ等）を添加して還元条件の反応液用水溶液を調整することもできる。
これらの方法を適宜組み合わせることも有効な還元条件の反応液用水溶液の調整方法である。
【００３７】
反応中も反応液を還元条件に維持することが好ましい。反応途中での還元条件を維持するために、反応系外からの酸素の混入を可能な限り防止することが望ましく、具体的には、反応系を窒素ガス等の不活性ガスや炭酸ガス等で封入する方法が挙げられる。酸素混入をより効果的に防止する方法としては、反応途中において本発明の好気性細菌の菌体内の代謝機能を効率よく機能させるために、反応系のｐＨ維持調整液の添加や各種栄養素溶解液を適宜添加する必要が生じる場合もあるが、このような場合には添加溶液から酸素を予め除去しておくことが有効である。
【００３８】
フェノールの回収
上記のようにして培養することにより、反応液中にフェノールが生産される。反応液を回収することによりフェノールを回収できるが、さらに、公知の方法でフェノールを反応液から分離することもできる。そのような公知の方法として、蒸留法、膜透過法、有機溶媒抽出法等が挙げられる。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例1  フェノール生産遺伝子のクローニングと発現
(1) 微生物からの染色体DNAの抽出
コリネバクテリウム グルタミカム （Corynebacterium glutamicum） R (FERM P-18976)からの染色体DNA抽出は、A培地 [(NH2)2CO  2 g、(NH4)2SO4  7 g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 gを蒸留水1 Lに溶解] に、炭素源として、最終濃度4%になるように50% (w/v)グルコース溶液を添加し、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで33℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット（商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製）を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００４０】
パントエア アグロメランス（Pantoea agglomerans）NBRC 12686からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.802培地[polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水1 Lに溶解]に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００４１】
(2) クローニングベクターの構築
クローニングベクターpCRB22の構築
コリネバクテリウム  カゼイ JCM12072由来のプラスミドpCASE1のDNA複製起点（以降、pCASE1-oriと記す）配列、及びクローニングベクターpHSG298（タカラバイオ株式会社製）をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、pCASE1-ori配列、クローニングベクターpHSG298をそれぞれクローン化するべく、配列番号1（pCASE1-ori配列）、配列番号2（クローニングベクター−pHSG298）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【００４２】
pCASE1-ori配列増幅用プライマー
（a-1）；  5’- AT AGATCT AGAACGTCCGTAGGAGC -3’ （配列番号3）
（b-1）；  5’- AT AGATCT GACTTGGTTACGATGGAC -3’（配列番号4）
尚、プライマー（a-1）及び（b-1）には、BglII制限酵素部位が付加されている。
クローニングベクターpHSG298増幅用プライマー
（a-2）；  5’- AT AGATCT AGGTTTCCCGACTGGAAAG -3’ （配列番号5）
（b-2）；  5’- AT AGATCT CGTGCCAGCTGCATTAATGA -3’（配列番号6）
尚、プライマー（a-2）及び（b-2）には、BglII制限酵素部位が付加されている。【００４３】
鋳型DNAは、Japan. Collection of Microorganisms (JCM)より入手したコリネバクテリウム  カゼイ JCM12072から抽出したトータルDNA及びクローニングベクターpHSG298（タカラバイオ株式会社製）を用いた。【００４４】
実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
2012067174.tif 000002
【００４５】
2012067174.tif 000003
【００４６】
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、pCASE1-ori配列の場合約1.4-kb、クローニングベクターpHSG298の場合、約2.7-kbのDNA断片が検出できた。
上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウム  カゼイ株由来のプラスミドpCASE1-ori配列含む約1.4-kb DNA断片10μl及びクローニングベクターpHSG298を含む約2.7-kb DNA断片10μlを各々制限酵素BglIIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製）1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションA液とした。
得られたライゲーションA液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素BglIIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpHSG298約2.7-kbのDNA断片に加え、pCASE-ori配列の約1.4-kb DNA断片が認められた。
pCASE1-ori配列を含むクローニングベクターをpCRB22と命名した。【００４７】
クローニングベクターpCRB207の構築
コリネバクテリウム グルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）をコードするgapA遺伝子のプロモーター配列（以降、PgapAと記す）を含むDNA断片、及びクローニングベクターpKK223-3（ファルマシア社製）由来rrnBT1T2双方向ターミネーター配列（以降、ターミネーター配列と記す）を含むDNA断片を以下の方法により増幅した。
PCRに際して、PgapA配列及びターミネーター配列をそれぞれクローン化するべく、配列番号7（PgapA配列）、配列番号8（ターミネーター配列）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【００４８】
PgapA配列増幅用プライマー
(a-3)； 5’- CTCT GTCGAC CCGAAGATCTGAAGATTCCTG -3’（配列番号9）
(b-3)； 5’- CTCT GTCGAC GGATCC CCATGG TGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG -3’
（配列番号10）
尚、プライマー（a-3）には、SalI制限酵素部位が、プライマー（b-3）には、SalI、BamHI及びNcoI制限酵素部位が付加されている。
ターミネーター配列増幅用プライマー
（a-4）；  5’- CTCT GCATGC CCATGG CTGTTTTGGCGGATGAGAGA -3’
（配列番号11）
（b-4）；  5’- CTCT GCATGC TCATGA AAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG -3 
（配列番号12）
尚、プライマー（a-4）には、SphI及びNcoI制限酵素部位が、プライマー（b-4）には、SphI及びBspHI制限酵素部位が付加されている。【００４９】
鋳型DNAは、コリネバクテリウム グルタミカム R (FERM P-18976)から抽出した染色体DNA及びpKK223-3プラスミド（ファルマシア社製）を用いた。【００５０】
実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
2012067174.tif 000004
【００５１】
2012067174.tif 000005
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、PgapA配列の場合約0.6-kb、ターミネーター配列の場合、約0.4-kbのDNA断片が検出できた。【００５２】
上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウム グルタミカム R由来PgapA配列を含む約0.6-kb DNA断片10μlとクローニングベクターpCRB22約4.1-kbを各々制限酵素SalIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションB液とした。
得られたライゲーションB液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素SalIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB22約4.1-kbのDNA断片に加え、PgapA配列）の約0.6-kb DNA断片が認められた。
PgapA配列を含むクローニングベクターをpCRB206と命名した。【００５３】
上記PCRにより増幅したpKK223-3プラスミド由来ターミネーター配列を含む約0.4-kb DNA断片10μlを制限酵素NcoI及びBspHIで、上述のクローニングベクターpCRB206  2μlを制限酵素NcoIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションC液とした。
得られたライゲーションC液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB206約4.7-kbのDNA断片に加え、ターミネーター配列の約0.4-kb DNA断片が認められた。
rrnBT1T2ターミネーター配列を含むクローニングベクターをpCRB207と命名した。【００５４】
クローニングベクターpCRB209の構築
コリネバクテリウム グルタミカムR由来のgapA（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase A）遺伝子のプロモーター（以降、PgapAと記す）配列を含むDNA断片を以下の方法により増幅した。
PCRに際して、pCRB207配列をクローン化するべく、配列番号13（pCRB207）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。
pCRB207配列増幅用プライマー
（a-5）； 5’- CTCT CATATG CTGTTTTGGCGGATGAGAG -3’
（配列番号14）
（b-5）； 5’- CTCT CATATG GTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG -3’
（配列番号15）
尚、プライマー（a-5）及び（b-5）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【００５５】
鋳型DNAは、gapAプロモーター及びrrnBT1T2ターミネーター配列を含有するクローニングベクターpCRB207を用いた。【００５６】
実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（宝酒造株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
2012067174.tif 000006
【００５７】
2012067174.tif 000007
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、クローニングベクターpCRB207配列を含む約5.1-kbのDNA断片が検出できた。【００５８】
上記のPCRにより増幅したpCRB207由来遺伝子を含む約5.1-kb DNA断片10μlを制限酵素NdeIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ  （宝酒造株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションD液とした。
得られたライゲーションD液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素NdeIで切断し、制限酵素サイトの挿入を確認した。
PgapA配列及びrrnBT1T2ターミネーター配列を含むクローニングベクタ−をpCRB209と命名した。【００５９】
(3) フェノール生産遺伝子のクローニング
パントエア アグロメランス由来のフェノール生産遺伝子のクローニング
パントエア アグロメランス由来のチロシン フェノール-リアーゼ活性を有する遺伝子をコードするtpl遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、tpl遺伝子をクローン化するべく、配列番号16（パントエア アグロメランスtpl遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【００６０】
tpl遺伝子増幅用プライマー
（a-6）；  5’- CTCT CATATG AACTATCCTGCCGAGC -3’（配列番号17）
（b-6）；  5’- CTCT CATATG TTAAATAAAGTCAAAACGCGCAGTAAAG -3’
（配列番号18）
尚、プライマー（a-6）及び（b-6）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。【００６１】
鋳型DNAは、パントエア アグロメランスは、NITE Biological Resource Center（NBRC）より入手したパントエア アグロメランスNBRC 12686から抽出した染色体DNAを用いた。【００６２】
実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
2012067174.tif 000008
【００６３】
2012067174.tif 000009
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、パントエア アグロメランス tpl遺伝子の場合約1.4-kbのDNA断片が検出できた。【００６４】
(4) フェノール生産遺伝子発現プラスミドの構築
フェノール生産遺伝子のpCRB209へのクローニング
上記項(3)に示したPCRにより増幅したパントエア アグロメランス株由来tpl遺伝子を含む約1.4-kb DNA断片10μl及びPgapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB209  2μlを各々制限酵素NdeIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ  （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションE液とした。【００６５】
得られたライゲーションE液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
各々培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB209約5.1-kbのDNA断片に加え、パントエア アグロメランス株由来tpl遺伝子（ライゲーションE液）の場合、長さ約1.4-kbの挿入断片が認められた。
パントエア アグロメランス株由来tpl遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-tpl/PAと命名した（図１）。【００６６】
(5) コリネバクテリウム グルタミカムの染色体遺伝子破壊用プラスミドの構築
コリネバクテリウム グルタミカム株poxF遺伝子破壊用プラスミドの構築
コリネバクテリウム グルタミカム株の染色体上poxF遺伝子のマーカーレス破壊用プラスミドを構築するために必要なDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際してコリネバクテリウム グルタミカム  Rの配列を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【００６７】
poxF-1領域増幅用プライマー
（a-7）； 5’- CTCT TCTAGA TACGTCCTAAACACCCGAC -3’（配列番号19）
（b-7）； 5’- GACCAACCATTGCTGACTTGCGTATCCATAGTCAGGCTTC -3’
（配列番号20）
尚、プライマー（a-7）には、XbaI制限酵素部位が付加されている。
poxF-2領域増幅用プライマー
（a-8）； 5’- CAAGTCAGCAATGGTTGGTC -3’            （配列番号21）
（b-8）； 5’- CTCT TCTAGA TGATCAGTACCAAGGGTGAG -3’（配列番号22）
尚、プライマー（b-8）には、XbaI制限酵素部位が付加されている。【００６８】
鋳型DNAは、コリネバクテリウム グルタミカムRから抽出した染色体DNAを用いた。【００６９】
実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
2012067174.tif 000010
【００７０】
2012067174.tif 000011
【００７１】
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、コリネバクテリウム  グルタミカムpoxF-1領域の場合約0.8-kb、poxF-2領域の場合約0.8-kbのDNA断片が検出できた。
次に、上記のPCRにより増幅したpoxF-1領域断片とpoxF-2領域断片を1μlずつ混合し、PCRにより2種の断片の結合反応を行った。
実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
2012067174.tif 000012
【００７２】
2012067174.tif 000013
【００７３】
さらに、得られたpoxF-1及びpoxF-2の結合断片を鋳型とし、PCRによりpoxF欠失断片の増幅を行った。【００７４】
実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
2012067174.tif 000014
【００７５】
2012067174.tif 000015
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、poxF欠失断片約1.6-kbが検出できた。【００７６】
上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウム グルタミカム R由来poxF欠失配列約1.7-kb DNA断片10μlと約4.4-kbのマーカーレス染色体遺伝子導入用プラスミドpCRA725 [J. Mol. Microbiol. Biotechnol.、Vol. 8、243-254(2004) 、（特開2006-124440）] 2μlを各々制限酵素XbaIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションF液とした。
得られたライゲーションF液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素XbaIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRA725約4.4-kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウム グルタミカム株由来poxF欠失遺伝子（ライゲーションF液）の場合、長さ約1.7-kbの挿入断片が認められた。
コリネバクテリウム グルタミカム株由来poxF欠失遺伝子を含むプラスミドをpCRA725- poxF/CGと命名した。【００７７】
(6) フェノール分解に関わる遺伝子破壊株の構築
マーカーレス染色体遺伝子導入用ベクターpCRA725は、コリネバクテリウム グルタミカムR内で複製不能なプラスミドである。pCRA725- poxF /CGを用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol.、Vol. 144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムRを形質転換し、カナマイシン 50μg/mlを含むA寒天培地〔A液体培地、および1.5% 寒天〕に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10%(W/V)スクロース含有BT寒天培地[(NH2)2CO  2g、(NH4)2SO4  7g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 mlを蒸留水1Lに溶解、および1.5% 寒天]に塗付した。【００７８】
プラスミドpCRA725- poxF /CGが染色体上の相同領域との一重交叉株の場合、pCRA725- poxF /CG上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、バチラス  サブチリス（Bacillus subtilis）のsacR-sacB遺伝子の発現によるスクロース含有培地での致死性を示すのに対し、二重交叉株の場合、pCRA725- poxF /CG上のカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、sacR-sacB遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での生育性を示す。従って、マーカーレス染色体遺伝子破壊株は、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示す。
そこで、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示した株を選択した。このコリネバクテリウム グルタミカムR株poxF遺伝子マーカーレス破壊株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ΔpoxFと命名した。【００７９】
(7) フェノール生産遺伝子導入株の構築
上述のプラスミドpCRB209-tpl/PAを用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol.、Vol. 144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムΔpoxF株を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入プラスミドを確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB209-tpl/PAの導入が認められた。
得られた株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）PHE31と命名した。【００８０】
コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）PHE31は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818）の独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センターに寄託した（受託日：2010年11月2日、受託番号：NITE BP-999）。【００８１】
実施例２  コリネバクテリウム グルタミカム  フェノール生産遺伝子導入株及び副生経路破壊株のフェノール生成実験
実施例１において作製したコリネバクテリウム グルタミカムPHE31株(フェノール生産遺伝子発現プラスミドpCRB209-tpl/PAを導入したpoxF染色体遺伝子マーカーレス破壊株)を、カナマイシン50μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO  2g、(NH4)2SO4  7g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁] に塗布し、28℃、20時間暗所に静置した。
上記のプレートで生育したコリネバクテリウム グルタミカムPHE31株を、カナマイシン50μg/mlを含有したA液体培地10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、28℃にて15時間、好気的に振盪培養を行った。
上記条件で生育したコリネバクテリウム グルタミカムPHE31株を、カナマイシン50μg/mlを含有したA液体培地500mlの入った容量2Lの三角フラスコに植菌し、28℃にて15時間、好気的に振盪培養を行った。
このようにして培養増殖されたそれぞれの菌体は、遠心分離 (4℃、5,000×g, 15分)により菌体を回収した。得られた菌体を、終菌体濃度10％となるようにBT(-尿素)液体培地〔0.7% 硫酸アンモニウム、0.05% リン酸二水素カリウム、0.05% リン酸水素二カリウム、0.05% 硫酸マグネシウム・7水和物、0.0006% 硫酸鉄・7水和物、0.00042% 硫酸マンガン水和物、0.00002% ビオチン、0.00002% チアミン塩酸塩〕に50ml懸濁した。この菌体懸濁液を容量100mlメディウム瓶に入れ、還元条件下（酸化還元電位；-450 mV）、反応開始からそれぞれ0, 1, 3, 10時間後に、基質として40 mMのL-チロシン二ナトリウム塩を逐次添加し、33℃に保った水浴中で攪拌しながら反応させた。
サンプリングした反応液を遠心分離 (4℃、15,000×g、10分)し、得られた上清液を用いてフェノールの定量を行った。
この結果、コリネバクテリウム グルタミカムPHE31株は、還元条件下における反応において、24時間後に34 mMのフェノールを生成していた。【００８２】
実施例３  フェノール生産用宿主としての適性試験
フェノールによる好気増殖への影響
コリネバクテリウム グルタミカム、エシェリヒア コリおよびシュードモナス プチダについて、好気培養におけるフェノールの生育阻害試験を行った。尚、本試験に用いたシュードモナス プチダS12は、溶媒耐性菌として報告されており、これまでに唯一フェノール生産の宿主として用いられた技術が開示されている。
コリネバクテリウム グルタミカムRをA寒天培地[(NH2)2CO  2g、(NH4)2SO4  7g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁]に塗布し、33℃、15時間暗所に静置した。
上記のプレートで生育したコリネバクテリウム グルタミカムRを、A液体培地[(NH2)2CO  2g、(NH4)2SO4  7g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 g、glucose 40 gを蒸留水1Lに溶解] 10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて13時間、好気的に振盪培養を行った。
上記条件で生育したコリネバクテリウム グルタミカムRを、A液体培地100mlに初期菌体濃度OD610=0.05となるように植菌し、同時にフェノールが終濃度0、0.16、0.2、0.24、0.32mMとなるように添加し、33℃にて好気的に振盪培養を行った。菌体の生育はOD610の吸光度を測定することにより行った。【００８３】
エシェリヒア コリJM109をLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布し、37℃、15時間暗所に静置した。
上記プレートで生育したエシェリヒア コリJM109を、LB液体培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキスおよび0.5% 塩化ナトリウム〕10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、37℃にて13時間、好気的に振盪培養を行った。
上記条件で生育したエシェリヒア コリJM109をLB液体培地100mlに初期菌体濃度OD610=0.05となるように植菌し、同時にフェノール濃度が終濃度0、0.16、0.20mMとなるように添加し、37℃にて好気的に振盪培養を行った。菌体の生育はOD610の吸光度を測定することにより行った。【００８４】
シュードモナス プチダF1およびS12をLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布し、30℃、15時間暗所に静置した。
上記プレートで生育したシュードモナス プチダF1およびS12を、LB（+グルコース）液体培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウムおよび0.4%グルコース〕10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、30℃にて13時間、好気的に振盪培養を行った。
上記条件で生育したシュードモナス プチダF1およびS12株をLB（+グルコース）液体培地100mlに初期菌体濃度OD610=0.05となるように植菌し、同時にフェノール濃度が終濃度0、0.10、0.20mMとなるように添加し、30℃にて好気的に振盪培養を行った。菌体の生育はOD610の吸光度を測定することにより行った。
培地中へのフェノール添加による好気増殖への影響の解析結果を図２に示す。【００８５】
エシェリヒア コリは、0.16%フェノール存在下で著しく増殖阻害を受け、0.20％フェノールでは完全に増殖が阻害された。
シュードモナス プチダF1及び溶剤耐性菌として報告されていたシュードモナス プチダS12は、ほぼ同じ傾向を示し、0.10%フェノール存在下で著しく増殖阻害を受け0.20％フェノールでは完全に増殖が阻害された。
これに対して、コリネバクテリウム グルタミカムは、エシェリヒア コリが顕著な増殖阻害を受けた0.16%のフェノール存在下においても増殖への影響はほとんどなく、エシェリヒア コリやシュードモナス プチダでは完全に増殖を阻害された0.20%のフェノール存在下においても良好な生育を示した。さらに0.24%のフェノール存在下において増殖が可能であった。
このように、コリネバクテリウム グルタミカムはエシェリヒア コリおよびシュードモナス プチダと比較して、フェノールに対し高い耐性を有し、フェノール生産の宿主として高い適性を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明方法によれば、微生物を用いて実用的な効率でチロシンからフェノールを製造することができる。
【図１】
2012067174.tif 000016
【図２】
2012067174.tif 000017
【配列表】
2012067174000001.app
【国際調査報告】
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2012067174.tif 000019
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