(57)【要約】  本発明は、化学合成も容易な低分子化合物でありながらも未分化細胞を神経系細胞へ高い選択率で効率的に分化誘導することができる細胞分化誘導剤と、未分化細胞を神経系細胞へ高い選択率で効率的に分化誘導するための特定のカテコール誘導体の使用、および、特定のカテコール誘導体を用いて未分化細胞を神経系細胞へ高い選択率で効率的に分化誘導するための方法を提供することを目的とする。本発明に係る細胞分化誘導剤は、特定の化学構造を有するカテコール誘導体を含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表されるカテコール誘導体を含むことを特徴とする細胞分化誘導剤。
【化１】
2012157612.tif 000015
［式中、
Ｒ1は、カルボキシ基、（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基、Ｃ1-7アルカノイル基、Ｃ2-8アルキニル基、カルバモイル基、シアノ基、ニトロ基もしくはハロゲン原子、または、置換基αを有していてもよいオキサゾリル基、置換基αを有していてもよいチアゾリル基、置換基αを有していてもよいオキサゾリニル基、もしくは置換基αを有していてもよいチアゾリニル基を示し；
Ｒ2は、水素原子、Ｃ1-6アルキル基またはベンジル基を示し；
ｎは２以上、５以下の整数を示し；
置換基αは、カルボキシ基、（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基、Ｃ1-7アルカノイル基、カルバモイル基、シアノ基、ニトロ基およびハロゲン原子から選択される１以上を示す。
但し、２以上のＲ2Ｏ基は、互いに同一であっても異なっていてもよい。］
【請求項２】
Ｒ2が水素原子である請求項１に記載の細胞分化誘導剤。
【請求項３】
少なくとも２つの−ＯＲ2基が互いに隣り合っている請求項１または２に記載の細胞分化誘導剤。
【請求項４】
Ｒ1がシアノ基またはカルバモイル基である請求項１〜３のいずれかに記載の細胞分化誘導剤。
【請求項５】
さらにレチノイン酸を含む請求項１〜４のいずれかに記載の細胞分化誘導剤。
【請求項６】
未分化細胞を神経系細胞へ分化誘導するためのものである請求項１〜５のいずれかに記載の細胞分化誘導剤。
【請求項７】
未分化細胞を神経堤細胞へ分化誘導するためのものである請求項１〜５のいずれかに記載の細胞分化誘導剤。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載の細胞分化誘導剤を含有することを特徴とする培養液。
【請求項９】
未分化細胞の分化を誘導するために用いられる、下記式（Ｉ）で表されるカテコール誘導体。
【化２】
2012157612.tif 000016
［式中、
Ｒ1は、カルボキシ基、（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基、Ｃ1-7アルカノイル基、Ｃ2-8アルキニル基、カルバモイル基、シアノ基、ニトロ基もしくはハロゲン原子、または、置換基αを有していてもよいオキサゾリル基、置換基αを有していてもよいチアゾリル基、置換基αを有していてもよいオキサゾリニル基、もしくは置換基αを有していてもよいチアゾリニル基を示し；
Ｒ2は、水素原子、Ｃ1-6アルキル基またはベンジル基を示し；
ｎは２以上、５以下の整数を示し；
置換基αは、カルボキシ基、（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基、Ｃ1-7アルカノイル基、カルバモイル基、シアノ基、ニトロ基およびハロゲン原子から選択される１以上を示す。
但し、２以上のＲ2Ｏ基は、互いに同一であっても異なっていてもよい。］
【請求項１０】
未分化細胞を神経系細胞へ分化誘導するための方法であって、
下記式（Ｉ）で表されるカテコール誘導体を含む培地で未分化細胞を培養する工程を含むことを特徴とする方法。
【化３】
2012157612.tif 000017
［式中、
Ｒ1は、カルボキシ基、（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基、Ｃ1-7アルカノイル基、Ｃ2-8アルキニル基、カルバモイル基、シアノ基、ニトロ基もしくはハロゲン原子、または、置換基αを有していてもよいオキサゾリル基、置換基αを有していてもよいチアゾリル基、置換基αを有していてもよいオキサゾリニル基、もしくは置換基αを有していてもよいチアゾリニル基を示し；
Ｒ2は、水素原子、Ｃ1-6アルキル基またはベンジル基を示し；
ｎは２以上、５以下の整数を示し；
置換基αは、カルボキシ基、（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基、Ｃ1-7アルカノイル基、カルバモイル基、シアノ基、ニトロ基およびハロゲン原子から選択される１以上を示す。
但し、２以上のＲ2Ｏ基は、互いに同一であっても異なっていてもよい。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低分子化合物であるカテコール誘導体を含む細胞分化誘導剤、未分化細胞の分化を誘導するための当該カテコール誘導体の使用、および、当該カテコール誘導体を用いて未分化細胞を神経堤細胞などの神経系細胞へ分化誘導するための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
多細胞生物を構成している細胞としては、大きく分類して分化細胞、ＴＡ細胞（Transient Amplifying Cell）および幹細胞がある。分化細胞は最終分化細胞や終末分化細胞とも呼ばれるものであり、神経細胞や臓器細胞など、それ以上は異なる種類の細胞へ分化することはなく、また、ほとんど増殖することはない。ＴＡ細胞は分化細胞と幹細胞の中間的なものであり、分化後、活発に増殖して分化細胞となる。幹細胞は自己複製能と分化能の両方を有する細胞と定義付けられ、自己増殖できると共に、分化してＴＡ細胞となる。【０００３】
即ち幹細胞は、あらゆる細胞へ分化でき、固体を形成できる全能性細胞、単一の細胞にしか分化できない単能性細胞、特殊な操作をしない限り固体にはなれないながらも様々な細胞へ分化できる多能性細胞へ分化可能である。全能性細胞としては受精卵を挙げることができる。単能性細胞としては、精子などの生殖幹細胞を挙げることができる。多能性細胞としては、多能性幹細胞を挙げることができる。【０００４】
幹細胞を利用すれば、例えば患者自身から皮膚組織や臓器組織を調製して拒否反応を示さない再生医療が可能となったり、遺伝病などの特定疾患の患者から問題となっている細胞を増殖させ、新薬の創製に役立てることができるようになる可能性がある。【０００５】
特に近年、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞など多能性を示す未分化細胞を人工的に調製する技術が開発され、再生医療や新薬の創製研究への応用の実用化が近付いている。よって今後は、未分化細胞を目的の機能性細胞へ分化誘導するための技術が求められると考えられる。【０００６】
ＥＳ細胞などを分化させるに当たっては、無秩序に分化させると細胞種の選別が必要となるなど所望の目的での使用が困難となるおそれがあるので、特定種の細胞へ特異的に分化させることが好ましい。例えば、特許文献１には、神経細胞への分化誘導剤としてセサミン類が開示されている。また、特許文献２と非特許文献１には、未分化細胞から外胚葉系細胞への分化誘導剤としてレチノイン酸が記載されている。【０００７】
ところで、多細胞生物の初期胚は、外胚葉、中胚葉および内胚葉に分類される。外胚葉は神経や皮膚組織などとなり、中胚葉は筋肉、骨、血管や血液などとなり、内胚葉は消化管や肺などの特定臓器となる。その他、神経堤細胞と呼ばれるものがある。神経堤細胞は外胚葉に分類されるものではあるが、神経胚形成期において神経堤から遊走し、メラノサイト、末梢神経ニューロン、平滑筋、頭部を中心とする軟骨や硬骨を形成するなど、特異で且つ重要な役割を有することから、第四の胚葉ともいわれている。【０００８】
従来、ＥＳ細胞などの未分化細胞を神経堤細胞に分化誘導する方法としては、フィーダー細胞を含む無血清培地にＥＳ細胞を蒔き、骨形成タンパク質であるＢＭＰ４（Bone Morphogenetic Protein 4）を添加するＳＤＩＡ法が知られている（非特許文献２）。また、特許文献３には、特定成分を含む培地を用い、フィーダー細胞を用いることなく未分化細胞を神経堤細胞に分化誘導する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１０−２０２５５９号公報
【特許文献２】特表２００７−５３５９５７号公報
【特許文献３】国際公開第２０１０／１４０６９８号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Bain，Gら，Developmental Biology，第１６８号，第３４２〜３５７頁（１９９５年）
【非特許文献２】Kenji MIZUSEKIら，Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America，第１００号，第５８２８〜５８３３頁（２００３年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述したように、ＥＳ細胞などの未分化細胞を神経堤細胞に分化誘導する方法は既に知られていた。しかし非特許文献２に記載されているＳＤＩＡ法ではフィーダー細胞を用いているため、たとえ患者由来のｉＰＳ細胞から誘導された神経堤細胞であっても患者へ導入する際に拒否反応が生じるおそれがあり、また、フィーダー細胞のロットにより分化誘導率が大きく変動するという問題がある。さらに、分泌性タンパク質であるＢＭＰ４は非常に高価であり、これを分化誘導剤として用いるとコストの問題が生じる。特許文献３に記載の方法ではフィーダー細胞は必要とされないが、骨形成タンパク質（ＢＭＰ４）などを用いなければ分化誘導率が非常に低く、やはりコストや効率の問題がある。【００１２】
一方、特許文献１で用いられているセサミン類は低分子ではあるが、当該技術では神経細胞の前駆体細胞を神経細胞へ分化誘導しているのみであり、ｉＰＳ細胞を分化誘導しているわけではない。また、低分子化合物であるとはいってもセサミン類はゴマ油から抽出しなければならないし、不斉炭素を４個も有することから化学合成も難しい。さらに、特許文献２と非特許文献１に記載のレチノイン酸も低分子化合物だが、例えばＥＳ細胞にレチノイン酸を作用させると外胚葉系以外の細胞も分化誘導されるため、優れた細胞分化誘導剤であるとはいえない。【００１３】
以上のとおり、従来、安価な低分子化合物であって、未分化細胞を選択的かつ効率的に神経系細胞へ分化誘導できるものはなかった。【００１４】
そこで本発明は、化学合成も容易な低分子化合物でありながらも未分化細胞を神経系細胞へ高い選択率で効率的に分化誘導することができる細胞分化誘導剤と、未分化細胞を神経系細胞へ高い選択率で効率的に分化誘導するための特定のカテコール誘導体の使用、および、特定のカテコール誘導体を用いて未分化細胞を神経系細胞へ高い選択率で効率的に分化誘導するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、特定構造のカテコール誘導体が、非常にシンプルな化学構造を有しながらも未分化細胞を神経系細胞へ効率的に分化誘導できることを見出して、本発明を完成した。【００１６】
本発明に係る細胞分化誘導剤は、下記式（Ｉ）で表されるカテコール誘導体を含むことを特徴とする。【００１７】
【化１】
2012157612.tif 000002
【００１８】
［式中、
Ｒ1は、カルボキシ基、（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基、Ｃ1-7アルカノイル基、Ｃ2-8アルキニル基、カルバモイル基、シアノ基、ニトロ基もしくはハロゲン原子、または、置換基αを有していてもよいオキサゾリル基、置換基αを有していてもよいチアゾリル基、置換基αを有していてもよいオキサゾリニル基、もしくは置換基αを有していてもよいチアゾリニル基を示し；
Ｒ2は、水素原子、Ｃ1-6アルキル基またはベンジル基を示し；
ｎは２以上、５以下の整数を示し；
置換基αは、カルボキシ基、（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基、Ｃ1-7アルカノイル基、カルバモイル基、シアノ基、ニトロ基およびハロゲン原子から選択される１以上を示す。【００１９】
但し、２以上のＲ2Ｏ基は、互いに同一であっても異なっていてもよい。］
本発明において「Ｃ1-6アルキル基」は、炭素数１〜６の直鎖状または分枝鎖状の飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基等である。好ましくはＣ1-4アルキル基であり、より好ましくはＣ1-2アルキル基であり、最も好ましくはメチル基である。【００２０】
「（Ｃ1-6アルコキシ）カルボニル基」とは、Ｃ1-6アルキルオキシカルボニル基（Ｃ1-6アルキル−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−基）をいう。例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｎ−ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ｎ−ペントキシカルボニル基、ｎ−ヘキソキシカルボニルシル基等である。好ましくは（Ｃ1-4アルコキシ）カルボニル基であり、より好ましくは（Ｃ1-2アルコキシ）カルボニル基であり、最も好ましくはメトキシカルボニル基である。【００２１】
「Ｃ1-7アルカノイル基」は、ホルミル基および上記Ｃ1-6アルキル基に置換されたカルボニル基を意味する。例えば、ホルミル基、アセチル基、ｎ−プロピオニル基、イソプロピオニル基、ｎ−ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基を挙げることができる。好ましくはＣ1-5アルカノイル基であり、より好ましくはＣ1-3アルカノイル基であり、最も好ましくはホルミル基またはアセチル基である。【００２２】
「Ｃ2-8アルキニル基」は、炭素−炭素三重結合を有し、炭素数が２〜８の直鎖状または分枝鎖状の不飽和脂肪族炭化水素基をいう。当該基としては、１位炭素、即ちカテコール誘導体（Ｉ）のベンゼン環に結合している炭素原子が炭素−炭素三重結合を有するものが好ましい。例えば、エチニル基、１−プロピニル基、１−ブチニル基、１−ペンチニル基、３−メチル−１−ブチニル基、４−メチル−１−ペンチニル基を挙げることができる。好ましくはＣ2-4アルキニル基であり、エチニル基または１−プロピニル基がより好ましい。【００２３】
「ハロゲン原子」としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を挙げることができ、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子が好ましく、塩素原子または臭素原子がより好ましい。【００２４】
本発明に係る上記細胞分化誘導剤としては、Ｒ2が水素原子であるもの、少なくとも２つの−ＯＲ2基が互いに隣り合っているもの、また、Ｒ1がシアノ基またはカルバモイル基であるものが好ましい。本発明者らによる実験的知見によれば、これらが特に比較的低濃度で且つ高い選択性で未分化細胞を神経系細胞へ高効率で分化誘導できる。【００２５】
その他、ｎとしては２以上、４以下の整数がより好ましく、２または３がさらに好ましい。一般的に、ベンゼン化合物は置換基数が多いものほど合成し難くなって高価であることによる。【００２６】
２以上のＲ2Ｏ基は、互いに同一であっても異なっていてもよいが、製造がより容易であることから、同一であることが好ましい。【００２７】
上記化合物（Ｉ）が置換基としてカルボキシ基を有する場合、塩であってもよい。本発明により得られた神経堤細胞を再生医療などに用いる場合には、当該塩は薬学上許容されるものであることが好ましい。かかる塩としては、例えば、ナトリウム塩やカリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩やマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩などの無機アミン塩；トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩などの有機アミン塩を挙げることができる。【００２８】
チアゾリル基における置換基αの数は、置換可能であれば特に制限されないが、１以上、２以下が好ましく、１がより好ましい。【００２９】
本発明に係る細胞分化誘導剤は、さらにレチノイン酸を含むことが好ましい。レチノイン酸の併用により、神経系細胞への誘導効果がより一層向上する。【００３０】
本発明に係る細胞分化誘導剤としては、未分化細胞を神経系細胞へ分化誘導するためのものが好ましい。【００３１】
また、本発明に係る未分化細胞を神経系細胞へ分化誘導するための方法は、未分化細胞に、本発明に係る上記細胞分化誘導剤を作用させる工程を含むことを特徴とする。【００３２】
本発明に係るカテコール誘導体（Ｉ）は、上記細胞分化誘導剤の有効成分であり、未分化細胞の分化を誘導するために用いられる。【００３３】
また、本発明に係る未分化細胞を神経系細胞へ分化誘導するための方法は、上記細胞分化誘導剤の有効成分であるカテコール誘導体（Ｉ）を含む培地で未分化細胞を培養する工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００３４】
本発明に係る細胞分化誘導剤の有効成分であるカテコール誘導体（Ｉ）は、非常にシンプルな化学構造を有するものであることから、安価で入手可能であるか或いは容易に合成可能である。よって、高価なタンパク質に比べて低コストである。また、本発明の細胞分化誘導剤の有効成分であるカテコール誘導体（Ｉ）は、比較的低濃度であっても、フィーダー細胞を用いることなく、高い選択性と良好な効率をもって未分化細胞を神経系細胞へ分化誘導することが可能になる。従って本発明は、ｉＰＳ細胞を用いた再生医療や創薬研究などの実現をより一層促進できるものとして、産業上非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、本発明の細胞分化誘導剤を用いてマウスＥＳ細胞を処理した場合の拡大写真と、本発明の細胞分化誘導剤を用いることなく同様に処理したコントロールの拡大写真である。
【図２】図２は、本発明の細胞分化誘導剤を用いてマウスＥＳ細胞を処理した場合の拡大写真である。
【図３】図３は、本発明の細胞分化誘導剤を用いてマウスＥＳ細胞を処理した場合の拡大写真である。
【図４】図４は、本発明の細胞分化誘導剤またはレチノイン酸を使って分化誘導したマウスＥＳ細胞を、外胚葉幹細胞マーカーおよび中胚葉幹細胞マーカーで染色した場合の拡大写真である。
【図５】図５は、マウスＥＳ細胞とその胚様体および本発明の分化誘導剤で処理したマウスＥＳ細胞の遺伝子発現を解析した結果を示す電気泳動写真である。
【図６】図６は、本発明の細胞分化誘導剤を用いてヒトｉＰＳ細胞を処理した場合の拡大写真と、本発明の細胞分化誘導剤を用いることなく同様に処理したコントロールの拡大写真である。
【図７】図７は、本発明の細胞分化誘導剤とレチノイン酸との併用効果を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の細胞分化誘導剤を用いてマウスＥＳ細胞を処理した場合の拡大写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明に係る細胞分化誘導剤は式（Ｉ）で表されるカテコール誘導体を含むものであり、非常にシンプルな化学構造を有するため、市販のものがあればそれを購入すればよいし、或いは、当業者であれば市販の化合物から常法により容易に合成可能である。
【００３７】
例えば、２以上の水酸基を有するベンゼン化合物として様々な化合物が市販されている。当業者であれば、かかるフェノール性水酸基をアルコキシ基やベンジルオキシ基へ誘導することは容易である。
【００３８】
また、当業者であれば、フェノール性水酸基の置換位置に応じてＲ1基を導入したり、官能基変換することができる。例えば、以下のように官能基変換することが可能である。
【００３９】
【化２】
2012157612.tif 000003
【００４０】
［式中、Ｈａｌはハロゲン原子を示し、ＲはＣ1-6アルキル基を示す］
さらに、オキサゾリニル基またはチアゾリニル基を有する化合物（Ｉ）は、以下のとおり、ベンゾニトリル化合物とセリンまたはシステインを反応させ、閉環することにより合成することができる。この際、カルボキシ基が置換しているオキサゾリニル環等の炭素原子における絶対配置は、光学活性なセリン等を用いることで制御可能である。また、オキサゾリニル環等のカルボキシ基は、上記と同様に官能基変換が可能である。なお、以下ではシステインを用いてチアゾリニル基を導入する反応を代表して示す。
【００４１】
【化３】
2012157612.tif 000004
【００４２】
上記反応では、塩基の存在下、ベンゾニトリル化合物とシステインを反応させればよい。溶媒としては、システイン等が水に溶解するのに対してベンゾニトリル化合物の中には水に溶解し難いものもあるので、水と水混和性有機溶媒との混合溶液を用いることが好ましい。かかる水混和性有機溶媒としては、メタノールやエタノールなどのアルコール類；ジメチルホルムアミドやジメチルアセトアミドなどのアミド類；ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類などを挙げることができる。また、反応液のｐＨを維持するために、水としては緩衝液を用いてもよい。塩基としては、炭酸水素ナトリウムなどアルカリ金属の炭酸水素塩；炭酸ナトリウムなどアルカリ金属の炭酸塩；水酸化ナトリウムなどのアルカリ金属の水酸化物などを用いることができる。反応温度は特に制限されず適宜調整すればよいが、通常、３０℃以上、１００℃以下程度とすることができる。
【００４３】
オキサゾリル基またはチアゾリル基を有する化合物（Ｉ）は、以下のとおり、ベンズアミド化合物またはベンゾチオアミド化合物とハロゲン化ピルビン酸エステル化合物を反応させ、閉環することにより合成することができる。オキサゾリル環等のアルコキシカルボニル基（エステル基）は、上記と同様に官能基変換が可能である。なお、以下ではベンゾチオアミド化合物を用いてチアゾリル基を導入する反応を代表して示す。
【００４４】
【化４】
2012157612.tif 000005
【００４５】
上記式中、Ｈａｌはハロゲン原子を示し、ＲはＣ1-6アルキル基、特にＣ1-2アルキル基を示す。
【００４６】
上記反応では、ベンゾチオアミド化合物とハロゲン化ピルビン酸エステル化合物を反応させる。溶媒としては、メタノールやエタノールなどのアルコール類；ジクロロメタンやクロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類；ジメチルホルムアミドやジメチルアセトアミドなどのアミド類などを挙げることができる。反応温度は特に制限されず適宜調整すればよいが、通常、３０℃以上、１００℃以下程度とすることができる。
【００４７】
本発明に係る上記カテコール誘導体は、さらにレチノイン酸を含むものであってもよい。レチノイン酸を併用することにより、神経系細胞への誘導効果がより一層向上する。
【００４８】
レチノイン酸の含有量は適宜調整すればよいが、例えば、本発明に係る上記カテコール誘導体１モルに対して０．５倍モル以上、２．０倍モル以下程度が好ましい。当該割合が０．５倍モル以上であれば、レチノイン酸による相乗効果が期待できる。一方、当該割合が高過ぎると、レチノイン酸により外胚葉系以外の細胞も分化誘導されて選択率が低下するおそれがあり得るため、当該割合としては２．０倍モル以下が好ましい。当該割合としては、０．７倍モル以上がより好ましく、０．８倍モル以上がさらに好ましく、また、１．５倍モル以下がより好ましく、１．２倍モル以下がさらに好ましい。
【００４９】
上記のとおり、本発明に係る細胞分化誘導剤の主要成分である上記カテコール誘導体は非常にシンプルな化学構造を有し、合成が極めて容易なものでありながら、未分化細胞を神経系細胞へ高い選択率で効率的に分化誘導することができる。以下、分化誘導方法につき説明する。
【００５０】
（１）  未分化細胞の調製
本発明方法で用いる未分化細胞としては、神経系細胞へ分化する多能性を有するものであれば特に制限されないが、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞のように、神経系細胞への分化能を有すると共に自己複製能を有するものが、特に再生医療への適用のために有用である。また、これら細胞から得られる胚様体も本発明における未分化細胞に含めるものとする。胚様体は一般的に外胚葉、中胚葉および内胚葉を含み、神経系細胞は外胚葉系の細胞であるので、胚様体を用いることによって、神経系細胞への分化誘導がより容易となる。
【００５１】
未分化細胞の由来は特に制限されず、魚類、両生類、鳥類、哺乳類に由来するものであってもよいが、再生医療への適用を考慮すれば哺乳類由来のものが好ましく、ヒト由来のものがより好ましい。
【００５２】
上記未分化細胞は、常法により調製することができる。例えばＥＳ細胞は、胚盤胞期胚の内部にある内部細胞塊をｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養し、細胞塊の解離と継代を繰り返すことにより未分化幹細胞集団として単離できる。ｉＰＳ細胞は、線維芽細胞などの体細胞に特定の遺伝子を導入することにより調製される。間葉系幹細胞は、臍帯血、骨髄、胎盤などから単離したものを培養して用いることができる。また、胚様体は、これら細胞を胚様体形成用培地中で浮遊培養することにより得られる。
【００５３】
（２）  本発明に係る細胞分化誘導剤の添加
本発明に係る細胞分化誘導剤は、上記未分化細胞の培養液に添加することにより、未分化細胞へ作用させることができる。
【００５４】
特に未分化細胞として胚様体を用いる場合には、胚様体形成用培地から分化誘導に適した培地に変更することが好ましい。かかる培地としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硝酸鉄、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどの無機塩；天然アミノ酸や非天然アミノ酸などのアミノ酸；パントテン酸カルシウム、葉酸、イノシトール、ニコチンアミド、ピリドキシン塩酸塩、チアミン塩酸塩などのビタミン類；グルコースやピルビン酸ナトリウムなどのその他の栄養源などを含むものを挙げることができる。また、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）、血清などを添加してもよい。
【００５５】
本発明に係る細胞分化誘導剤は、未分化細胞の培地へそのまま添加混合してもよいが、溶解性などの問題から十分に混合できないおそれがあり得るため、事前に溶液とすることが好ましい。かかる溶液の溶媒としては、本発明に係る細胞分化誘導剤の水溶性が十分であれば蒸留水などとすることができるが、水溶性が十分でない場合には、細胞分化誘導剤を水混和性有機溶媒に溶解した上で添加してもよい。なお、かかる水混和性有機溶媒としては、メタノールやエタノールなどのアルコール溶媒；ジメチルホルムアミドやジメチルアセトアミドなどのアミド溶媒；ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド溶媒などを挙げることができる。但し、これら有機溶媒は、細胞に有害である場合があるので、溶液濃度をできるだけ高くして有機溶媒の添加量を極力低減することが好ましい。
【００５６】
本発明に係る細胞分化誘導剤の添加量は、化合物の活性などにより適宜調整すればよいが、例えば、培地全体に対して１０μＭ以上、３００μＭ以下程度とすることができる。当該濃度が１０μＭ以上であれば、より確実に神経系細胞への分化誘導を促進することが可能になる。一方、当該濃度が高過ぎるとかえって細胞毒性が表われるおそれがあり得るので、当該濃度としては３００μＭ以下が好ましい。当該濃度としては、１５μＭ以上がより好ましく、２０μＭ以上がさらに好ましく、また、２００μＭ以下がより好ましく、１５０μＭ以下がさらに好ましい。
【００５７】
本発明に係る細胞分化誘導剤を添加した後の培養条件は、用いる未分化細胞の種類などに応じて適宜調整すればよい。例えば、雰囲気を５％二酸化炭素雰囲気とし、２５℃以上、４５℃以下程度で、１日以上、１０日以下程度培養すればよい。
【００５８】
本発明に係る細胞分化誘導剤は、未分化細胞を神経系細胞へ分化誘導することができる。本発明における神経系細胞としては、神経細胞やグリア細胞などの神経細胞の他、神経幹細胞、神経前駆細胞、神経堤細胞など神経細胞の前駆細胞を挙げることができる。
【００５９】
分化誘導された神経系細胞であることは、形態観察や発現タンパク質の特定や遺伝子発現解析などにより決定することができる。例えば、一般的な神経細胞は、突起を有する独特の形態を有する。また、神経堤細胞は外胚葉系の細胞でありながら、外胚葉幹細胞マーカーであるＮｅｓｔｉｎと共に中胚葉幹細胞マーカーであるＦｌｋ１も発現する。さらに、神経堤細胞マーカーとしてはＳｏｘ９、Ｓｏｘ１０、Ｓｌｕｇを挙げることができる。よって、これらタンパク質に特異的な抗体を一次抗体として用いるＥＬＩＳＡや、これらタンパク質をコードする遺伝子の発現解析により、分化誘導された細胞が神経堤細胞であるか否か決定可能である。
【００６０】
上記のとおり形態観察などで神経系細胞を特定し、他の細胞から分離することができる。
【００６１】
単離された神経系細胞は、神経細胞に関係する疾患の治療や再生医療などに適用できる。例えば、本発明により神経堤細胞を分化誘導して単離した上で、神経堤の誘導や形成の欠陥、また、神経堤細胞の遊走の欠陥などに起因する疾患の治療や再生医療などに適用でき得る。さらに、得られた神経堤細胞を常法によりグリア細胞、色素細胞、角膜実質細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞、骨細胞などに分化誘導し、これら細胞群に関する疾患の治療や再生医療に適用でき得る。
【００６２】
本願は、２０１１年５月１９日に出願された日本国特許出願第２０１１−１１２８３１号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１１年５月１９日に出願された日本国特許出願第２０１１−１１２８３１号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。【００６４】
実施例１  ２−｛２，３−ビス（ベンジルオキシ）フェニル｝チアゾール−４−カルボン酸【００６５】
【化５】
2012157612.tif 000006
【００６６】
（１）  ２，３−ジヒドロキシベンズアミド
２，３−ジヒドロキシ安息香酸（５ｇ，３２．４ｍｍｏｌ）をメタノール（５０ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を０℃に冷却した。同温にて濃硫酸（３ｍＬ）を滴下し、１５時間加熱還流した。反応溶液を減圧濃縮し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を発泡が収まるまで加えた後、酢酸エチル（１００ｍＬ）で３回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過し、濾液を減圧濃縮した。残渣に２８％アンモニア水（９２ｍＬ）を加え、５０℃で１６時間撹拌した。次いで反応溶液をおよそ２０ｍＬまで減圧濃縮し、酢酸エチル（５０ｍＬ）で５回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過し、濾液を減圧濃縮することで、淡桃色固体の目的化合物（３．９２ｇ，収率：８０％）を得た。【００６７】
（２）  ２，３−ビス（ベンジルオキシ）ベンズアミド
２，３−ジヒドロキシベンズアミド（２ｇ，１３．０６ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（１３．０６ｍＬ）に溶解し、得られた溶液に室温にて炭酸カリウム（９．０３ｇ，６５ｍｍｏｌ）と臭化ベンジル（３．２６ｍＬ，２７．４１ｍｍｏｌ）を加え、１８時間撹拌した。次いで反応溶液に水（２０ｍＬ）を加えた後、酢酸エチル（１００ｍＬ）で３回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過し、濾液を減圧濃縮して粗生成物を得た。シリカゲル（関東化学社製，Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｎ）を用いたカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム）により精製し、淡桃色固体の目的化合物（３．５９ｇ，収率：８３％）を得た。【００６８】
（３）  ２，３−ビス（ベンジルオキシ）ベンゾチオアミド
２，３−ビス（ベンジルオキシ）ベンズアミド（３９３ｍｇ，１．２ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（４．８ｍＬ）に溶解し、得られた溶液に室温にてＬａｗｅｓｓｏｎ試薬（２９１ｍｇ，０．７１９ｍｍｏｌ）を加え、１０時間加熱還流した。次いで反応溶液を減圧濃縮して粗生成物を得た。シリカゲル（関東化学社製，Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｎ）を用いたカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム）により精製し、黄色固体の目的化合物（３７１ｍｇ，収率：８６％）を得た。【００６９】
（４）  ２−｛２，３−ビス（ベンジルオキシ）フェニル｝チアゾール−４−カルボン酸エチル
２，３−ビス（ベンジルオキシ）ベンゾチオアミド（３７１ｍｇ，１．０６ｍｍｏｌ）をエタノール（５．３ｍＬ）に溶解し、得られた溶液に室温にて臭化ピルビン酸エチル（１６０μＬ，１．２７ｍｍｏｌ）を加え、４時間加熱還流した。反応溶液を室温まで冷却し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）を加えた後、酢酸エチル（５０ｍＬ）で３回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過し、濾液を減圧濃縮して粗生成物を得た。シリカゲル（関東化学社製，Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｎ）を用いたカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム）により精製し、紫色油状の目的化合物（４３２ｍｇ，収率：９２％）を得た。【００７０】
（５）  ２−｛２，３−ビス（ベンジルオキシ）フェニル｝チアゾール−４−カルボン酸
２−｛２，３−ビス（ベンジルオキシ）フェニル｝チアゾール−４−カルボン酸エチル（４３２ｍｇ，０．９７ｍｍｏｌ）をメタノール（９．７ｍＬ）に溶解し、得られた溶液へ４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（２．４３ｍＬ，９．７ｍｍｏｌ）を室温にて加え、３時間撹拌した。次いで反応溶液をおよそ１０ｍＬまで減圧濃縮し、６Ｎ塩酸（１０ｍＬ）を加えてクロロホルム（５０ｍＬ）で３回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過し、濾液を減圧濃縮することで、褐色不定形（アモルファス）の目的化合物（３２４ｍｇ，収率：８０％）を得た。【００７１】
実施例２  （Ｒ）−２−｛２，３−ビス（ベンジルオキシ）フェニル｝−４，５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸【００７２】
【化６】
2012157612.tif 000007
【００７３】
（１）  ２，３−ビス（ベンジルオキシ）ベンゾニトリル
２，３−ビス（ベンジルオキシ）ベンズアミド（８００ｍｇ，２．４ｍｍｏｌ）を水−アセトニトリルの混合溶媒（１：１，４０ｍＬ）に溶解し、得られた溶液へ塩化パラジウム（６４ｍｇ，０．３６ｍｍｏｌ）を室温にて加え、５０℃で６時間撹拌した。次いで反応溶液をおよそ１０ｍＬまで減圧濃縮した後、酢酸エチル（１００ｍＬ）で３回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過し、濾液を減圧濃縮して粗生成物を得た。シリカゲル（関東化学社製，Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｎ）を用いたカラムクロマトグラフィー（溶離液：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝５／１）により精製し、淡黄色固体の目的化合物（６９２．３ｍｇ，収率：９１％）を得た。【００７４】
（２）  （Ｒ）−２−｛２，３−ビス（ベンジルオキシ）フェニル｝−４，５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸
２，３−ビス（ベンジルオキシ）ベンゾニトリル（６２４ｍｇ，１．９８ｍｍｏｌ）を１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）−メタノールの混合溶媒（１：１，２８ｍＬ）に懸濁させ、得られた懸濁液へＬ−システイン塩酸塩・一水和物（４６９ｍｇ，２．９７ｍｍｏｌ）と炭酸水素ナトリウム（２８６ｍｇ，３．４ｍｍｏｌ）を室温にて加え、６５℃で２０時間撹拌した。反応溶液を氷冷した後、濾過した。残渣を水（１０ｍＬ）、エタノール（１０ｍＬ）、ジエチルエーテル（１０ｍＬ）で洗浄することで黄色固体の目的化合物（１８５ｍｇ，収率：２２％）を得た。【００７５】
実施例３  ２，３−ジヒドロキシベンゾニトリル【００７６】
【化７】
2012157612.tif 000008
【００７７】
２，３−ジメトキシベンゾニトリル（２ｇ，１２．２６ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（１２．２６ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を−７８℃に冷却した。アルゴン雰囲気下、同温にて三臭化ホウ素（１Ｍジクロロメタン溶液，３０．６４ｍＬ，３０．６４ｍｍｏｌ）を滴下し、室温にて１９．５時間撹拌した。反応溶液を氷冷し、水（２０ｍＬ）を加えた後、クロロホルム（１００ｍＬ）で３回、および酢酸エチル（１００ｍＬ）で３回抽出した。得られた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過し、濾液を減圧濃縮して粗生成物を得た。シリカゲル（関東化学社製，Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｎ）を用いたカラムクロマトグラフィー（溶離液：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）により精製し、淡茶色固体の目的化合物（１．６２ｇ，収率：９８％）を得た。【００７８】
実施例４  ２−（２，３−ジヒドロキシフェニル）チアゾール−４−カルボン酸【００７９】
【化８】
2012157612.tif 000009
【００８０】
（１）  （Ｒ）−２−（２，３−ジヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸
２，３−ジヒドロキシベンゾニトリル（１．４３ｇ，１０．５８ｍｍｏｌ）を１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）−メタノールの混合溶媒（１：１，１５１ｍＬ）に懸濁し、得られた懸濁液へＬ−システイン塩酸塩・一水和物（２．５ｇ，１５．８７ｍｍｏｌ）と炭酸水素ナトリウム（１．５３ｇ，１８．２０ｍｍｏｌ）を室温にて加え、６５℃で２０時間撹拌した。反応溶液を室温とした後、溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸エチル（５０ｍＬ）にて洗浄し、０．５Ｍ塩酸（２０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（１００ｍＬ）で３回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過し、濾液を減圧濃縮することで黄色固体の目的化合物（２．２３１ｇ，収率：８８％）を得た。【００８１】
（２）  （Ｒ）−２−（２，３−ジメトキシフェニル）−４，５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸メチル
（Ｒ）−２−（２，３−ジヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸（５３０ｍｇ，２．２１５ｍｍｏｌ）をアセトン（４．５ｍＬ）に溶解し、得られた溶液へ硫酸ジメチル（７２３μＬ，７．６４ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（１ｇ，７．６４ｍｍｏｌ）を室温にて加え、７０℃で２４時間撹拌した。反応懸濁液をセライトで濾過した後、濾液を減圧濃縮して粗生成物を得た。シリカゲル（関東化学社製，Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｎ）を用いたカラムクロマトグラフィー（溶離液：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝１０／１）により精製し、淡黄色油状の目的化合物（１９９ｍｇ，収率：３２％）を得た。【００８２】
（３）  ２−（２，３−ジメトキシフェニル）チアゾール−４−カルボン酸メチル
（Ｒ）−２−（２，３−ジメトキシフェニル）−４，５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸メチル（１９９ｍｇ，０．７０７ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（３．５ｍＬ）に溶解し、得られた溶液へ二酸化マンガン（１．２ｇ，１４．１５ｍｍｏｌ）を室温にて加え、室温で２５時間撹拌した。反応懸濁液をセライトで濾過した後、濾液を減圧濃縮することで白色固体の目的化合物（１９３．３ｍｇ，収率：９８％）を得た。【００８３】
（４）  ２−（２，３−ジヒドロキシフェニル）チアゾール−４−カルボン酸
２−（２，３−ジメトキシフェニル）チアゾール−４−カルボン酸メチル（１９３ｍｇ，０．６９１ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（０．６９１ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を−７８℃に冷却した。アルゴン雰囲気下、同温にて三臭化ホウ素（１Ｍジクロロメタン溶液，２．１ｍＬ，２．０７３ｍｍｏｌ）を滴下し、室温にて１時間撹拌した。次いで反応溶液を冷却し、水（５ｍＬ）を加えた後、酢酸エチル（５０ｍＬ）で５回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過し、濾液を減圧濃縮することで黄色固体の目的化合物（１５３．２ｍｇ，収率：９３％）を得た。【００８４】
実施例５  ３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸メチル【００８５】
【化９】
2012157612.tif 000010
【００８６】
３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸（４００ｍｇ，２．３５ｍｍｏｌ）をメタノール（４ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を０℃に冷却した。当該溶液へ濃硫酸（０．４ｍＬ）をゆっくり滴下した後、１７時間加熱還流した。反応溶液を減圧濃縮し、水（１０ｍＬ）を加えた後、酢酸エチル（５０ｍＬ）で３回抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過し、濾液を減圧濃縮して白色固体の目的化合物（４０７ｍｇ，収率：９４％）を得た。【００８７】
実施例６  ３，４，５−トリヒドロキシベンズアミド【００８８】
【化１０】
2012157612.tif 000011
【００８９】
（１）  ３，４，５−トリメトキシ安息香酸メチル
３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸（５００ｍｇ，２．９４ｍｍｏｌ）をアセトン（６ｍＬ）に溶解し、得られた溶液に室温にて炭酸カリウム（１．８ｇ，１３．２ｍｍｏｌ）と硫酸ジメチル（１．２５ｍＬ，１３．２ｍｍｏｌ）を加え、１３．５時間加熱還流した。反応懸濁液をセライトで濾過した後、濾液を減圧濃縮して粗生成物を得た。シリカゲル（関東化学社製，Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｎ）を用いたカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝３０／１）により精製し、白色固体の目的化合物（６３０ｍｇ，収率：９５％）を得た。【００９０】
（２）  ３，４，５−トリメトキシベンズアミド
３，４，５−トリメトキシ安息香酸メチル（３００ｍｇ，１．３３ｍｍｏｌ）に２８％アンモニア水溶液（３．８ｍＬ）を室温で加え、５０℃で１０時間撹拌した。次いで、反応溶液を減圧濃縮して粗生成物を得た。シリカゲル（関東化学社製，Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｎ）を用いたカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝１０／１およびｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝１／２→０／１００）により精製し、白色固体の目的化合物（１７５ｍｇ，収率：６３％）を得た。【００９１】
（３）  ３，４，５−トリヒドロキシベンズアミド
３，４，５−トリメトキシベンズアミド（９５ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（０．４５ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を−７８℃に冷却した。アルゴン雰囲気下、同温にて三臭化ホウ素（１Ｍジクロロメタン溶液，１．３５ｍＬ，１．３５ｍｍｏｌ）を滴下し、室温にて１８時間撹拌した。次いで反応溶液を氷冷し、水（５ｍＬ）を加えた後、酢酸エチル（５０ｍＬ）で３回抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過し、濾液を減圧濃縮して粗生成物を得た。シリカゲル（関東化学社製，Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｎ）を用いたカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル／メタノール＝１００／０→１０／１→５／１）により精製し、淡茶色固体の目的化合物（２７．４ｍｇ，３６％）を得た。【００９２】
実施例７  マウスＥＳ細胞の分化誘導実験
（１）  マウスＥＳ細胞の分化誘導
直径６０ｍｍのペトリディッシュへ、表１に示す組成のＥＳ培地とＮＰ培地を１：１の割合で混合した胚様体形成用培地（４ｍＬ）を加え、さらにマウスＥＳ細胞（The Wellcome Trust Sanger InstituteのDr．Alan Bradleyから入手，ＡＢ２−２）を１×１０6個蒔き、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で１日間培養した。次いで、ガラスピペットを用いたピペッティングにより細胞を剥離した後、同じペトリディッシュに蒔き直し、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で３日間培養して胚様体を形成させた。得られた細胞塊を回収し、沈降させた後に表１に示す組成のＮＰ培地（１０ｍＬ）に懸濁した。【００９３】
【表１】
2012157612.tif 000012
【００９４】
次いで、上記培養細胞懸濁液（１００μＬ）をＩ型コラーゲンコートされた９６ウェルプレートに添加し、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で一晩インキュベートした。別途、各被検化合物を分化用培地（ＥＳ培地から２−メルカプトメタノールと白血病抑制因子を除いた培地）に溶解し、最終濃度が２５〜１００μＭとなるように各ウェルへ添加した。化合物としては実施例１〜６の化合物の他、実施例１〜６の方法に準じて合成した化合物も用いた。化合物の構造を表２に示す。さらに、各ウェルへ血清を最終濃度で５％、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）を最終濃度で２ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で４日間接着培養した。【００９５】
培養後、各ウェルへパラホルムアルデヒドを最終濃度で２％となるように添加して細胞を固定した。細胞をヘマトキシリンで染色し、光学顕微鏡を用いて形態変化を観察した。化合物を添加せずジメチルスルホキシドのみを最終濃度で０．５％となるように添加したコントロールの２００倍の光学顕微鏡写真を図１（１）に、各被検化合物を添加して形態変化が認められた場合の最小濃度の５０倍、１００倍または２００倍の光学顕微鏡写真を図１（２）〜図３に示す。また、形態変化が認められた場合の各被検化合物の最小濃度を表２にまとめる。【００９６】
【表２】
2012157612.tif 000013
【００９７】
図１〜３と表１のとおり、本発明に係る分化誘導剤は、比較的低濃度でマウスＥＳ細胞を、突起を有する形態の細胞に分化誘導できることが実証された。特に被検化合物番号１２〜１３の化合物は、ほぼ全て細胞の形態を顕著に変化させることができた。【００９８】
（２）  形態が変化した細胞の特定
上記（１）のとおり被検化合物１により分化誘導された細胞をパラホルムアルデヒドで固定した後、ＰＢＳで洗浄し、５％ヤギ血清／１％ＢＳＡ／ＰＢＳを１００μＬ／ウェルの最終濃度となるように添加し、室温で６０分間インキュベートすることによりブロッキングした。次いで、抗ＮｅｓｔｉｎマウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製，最終濃度：５μｇ／ｍＬ）または抗Ｆｌｋ１ウサギＩｇＧ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製，最終濃度：５μｇ／ｍＬ）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。各ウェルをＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、二次抗体として、ＦＩＴＣ標識抗マウス抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製，最終濃度：１μｇ／ｍＬ）またはウサギＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製，最終濃度：１μｇ／ｍＬ）を添加し、室温で２時間インキュベートした。各ウェルをＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて蛍光写真を撮影した。【００９９】
また、対照として、未分化細胞を神経外胚葉に分化誘導する作用を示すレチノイン酸１μＭを使って同様の処理を行った。得られた写真のうち、レチノイン酸を使った場合の写真を図４の左側２列に、本発明に係る分化誘導剤を使った場合の写真を図４の右側２列に、また、ＦＩＴＣ標識抗マウス抗体を検出した写真を図４の上段に、ウサギＩｇＧ抗体を検出した写真を図４の下段に示す。【０１００】
図４のとおり、レチノイン酸を用いて分化誘導された細胞は、Ｎｅｓｔｉｎを発現している一方でＦｌｋ１を発現していない。Ｎｅｓｔｉｎは外胚葉幹細胞マーカーであり、Ｆｌｋ１は中胚葉幹細胞マーカーであるので、レチノイン酸は未分化細胞を外胚葉幹細胞へ分化誘導することが確認できた。一方、本発明に係る分化誘導剤により分化誘導された細胞は、ＮｅｓｔｉｎとＦｌｋ１が陽性であった。この実験結果により、本発明に係る分化誘導剤は、未分化細胞を、外胚葉系細胞に分類されるものでありながら中胚葉細胞としての性質も有する神経堤細胞へ分化誘導できることが明らかとなった。【０１０１】
（３）  ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現解析
８０μＭの被検化合物４を用いて５日間処理した以外は上記（１）と同様にして、マウスＥＳ細胞を分化誘導した。得られた細胞からトリゾル試薬を用いて全ＲＮＡを抽出し、得られた全ＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型として、Ｏｃｔ３／４・Ｎａｎｏｇ（未分化細胞マーカー）、Ｎｅｓｔｉｎ（神経幹細胞マーカー）、Ｓｏｘ９・Ｓｏｘ１０・Ｓｌｕｇ（神経堤細胞マーカー）、ＧＡＴＡ２（中胚葉マーカー）、Ｓｃａ−１（幹細胞マーカー）、ｃ−ｋｉｔ（造血幹細胞マーカー）の各プライマーを用いてＰＣＲを行い、各マーカーの発現解析を行った。また、比較のために、未分化マウスＥＳ細胞と、マウスＥＳ細胞を３日間培養した胚様体についても同様に発現解析を行った。結果を図５に示す。【０１０２】
図５のとおり、マウスＥＳ細胞とその胚様体では、遺伝子発現にほとんど差が無い。一方、本発明に係る分化誘導剤で処理したマウスＥＳ細胞では、マウスＥＳ細胞とその胚様体では発現していない神経堤細胞マーカーであるＳｏｘ９とＳｏｘ１０が発現しており、同じく神経堤細胞マーカーであるＳｌｕｇの発現が顕著に強くなっている。従って、かかる実験結果からも、本発明に係る分化誘導剤が未分化細胞を神経堤細胞へ分化誘導できることが証明された。【０１０３】
実施例８  ヒトｉＰＳ細胞の分化誘導実験
実施例７（１）において、マウスＥＳ細胞の代わりにヒトｉＰＳ細胞（理化学研究所から入手，ｈＰＳ０００１  ２０１Ｂ７  ｌｏｔ３）を用いた以外は同様にして分化誘導した。【０１０４】
上記のとおり被検化合物により分化誘導された細胞をパラホルムアルデヒドで固定した後、ＰＢＳで洗浄を行い、５％ヤギ血清／１％ＢＳＡ／ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで添加し、室温で６０分間インキュベートすることによりブロッキングした。次いで、抗ＮｅｓｔｉｎマウスＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ社製，最終濃度５μｇ／ｍＬ）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。各ウェルをＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、二次抗体として、ＦＩＴＣ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製，最終濃度１μｇ／ｍＬ）を添加し、室温で２時間インキュベートした。また、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８でも染色を行った。各ウェルをＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて蛍光写真を撮影した。画像解析した結果を図６に示す。なお、図６において、緑色部分は外胚葉幹細胞マーカーであるＮｅｓｔｉｎ陽性の細胞であり、青色部分は核染色剤であるＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８陽性の細胞である。【０１０５】
図６のとおり、コントロール細胞では細胞数自体が少なく、また、細胞全体に対するＮｅｓｔｉｎ陽性細胞の割合も明らかに少なかった。一方、本発明化合物を用いた場合には、細胞全体が十分にＮｅｓｔｉｎに対して陽性であり、外胚葉幹細胞に分化していることが認められた。かかる結果により、本発明化合物の分化誘導効果がヒトｉＰＳ細胞でも実証された。なお、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８陽性細胞とＮｅｓｔｉｎ陽性細胞とにずれが認められるのは、画像解析ソフトによるオートコントラストのため写真上部の細胞の緑色が強くなってしまったことと、Ｎｅｓｔｉｎが細胞の突起部分を強く染色し、細胞体自体の染色が弱くなってしまったことによると考えられる。【０１０６】
実施例９  レチノイン酸との併用効果
直径６０ｍｍのペトリディッシュへ、表１に示す組成のＥＳ培地とＮＰ培地を１：１の割合で混合した胚様体形成用培地（４ｍＬ）を加え、さらにマウスＥＳ細胞（The Wellcome Trust Sanger InstituteのDr.Alan Bradleyから入手，ＡＢ２−２）を１×１０6個蒔き、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で１日間培養した。次いで、ガラスピペットを用いたピペッティングにより細胞を剥離した後、同じペトリディッシュに蒔き直し、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で３日間培養して胚様体を形成させた。得られた細胞塊を回収し、沈降させた後に表１に示す組成のＮＰ培地（１０ｍＬ）に懸濁した。次いで、培養細胞懸濁液（５ｍＬ）をＩ型コラーゲンコートされた９６ウェルプレートに添加し、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、被検化合物５を単独で、或いは被検化合物とレチノイン酸を併用して各最終濃度１０ｎＭで添加し、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で４日間接着培養した。培養後、ＰＢＳで洗浄し、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎを用いて細胞を剥がし、細胞数を計数した。実験は４回行い、その平均を求めた。結果を図７に示す。なお、図７中、「ＲＡ」はレチノイン酸を示す。【０１０７】
図７のとおり、本発明化合物を用いた場合の神経系細胞数は１．７１±０．５１×１０6個であったのに対して、レチノイン酸との併用により３．２３±０．４２×１０6個と顕著に増大し、約１．８９倍となった（Ｐ値：０．００２３）。以上の結果より、本件発明化合物とレチノイン酸との併用により、神経系細胞への分化誘導効果がさらに向上できることが明らかとなった。【０１０８】
実施例１０  マウスＥＳ細胞の分化誘導実験
直径６０ｍｍのペトリディッシュへ、実施例７で用いた胚様体形成用培地（４ｍＬ）を加え、さらにマウスＥＳ細胞（ＡＢ２−２）を１×１０6個蒔き、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で３日間培養した。得られた胚葉体を１５ｍＬ容チューブに回収した。上記ペトリディッシュを洗浄するために１×ＰＢＳ（５ｍＬ）を加え、同ＰＢＳを上記チューブに回収した。回収された細胞の半量を別のチューブに移し、室温で５分間静置した。上清を除去した後、実施例７で用いたＮＰ培地（１０．５ｍＬ）を加えた。よく懸濁した後、Ｉ型コラーゲンコートされた９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ添加し、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で一晩インキュベートした。各ウェルへ、表３の組成を有するＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍを適量添加した。【０１０９】
【表３】
2012157612.tif 000014
【０１１０】
さらに、３，４−ジヒドロキシベンゾニトリル（東京化成社製）をＤＭＳＯに溶解し、最終濃度が１２．５μＭ、２５μＭまたは５０μＭ、総量が２００μＬとなるように各ウェルへ添加した。さらに、各ウェルへ血清を最終濃度で５％、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）を最終濃度で１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で４日間培養した。【０１１１】
培養後、各ウェルから培養液を１００μＬ除去した後、パラホルムアルデヒドを最終濃度で４％となるように添加し、一晩静置して細胞を固定した。次いで、パラホルムアルデヒドを除去した。各ウェルへＰＢＳ（２００μＬ）を加えてから３分間静置し、ＰＢＳを除去するという洗浄操作を１０回繰り返した。各ウェルへヘマトキシリン（６０μＬ）加えることにより細胞を染色した。各ウェルへＰＢＳ（２００μＬ）を加えてから３分間静置し、ＰＢＳを除去するという洗浄操作を１０回繰り返した。各ウェルへＰＢＳ（１００μＬ）を加えた後、光学顕微鏡を用いて形態変化を観察した。【０１１２】
５０μＭの濃度で本発明化合物を添加した場合の５０倍の拡大写真を図８（１）に、１００倍の拡大写真を図８（２）〜（３）に示す。図８のとおり、全体的に突起を有する神経系細胞が観察された。また、他の形態の細胞は見られず、本発明化合物によれば、未分化細胞を高い選択率で神経系細胞へ分化誘導できることが証明された。
【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年3月18日(2013.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表されるカテコール誘導体を有効成分として含み、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を神経系細胞へ分化誘導するためのものであることを特徴とする細胞分化誘導剤。
【化１】
2012157612.tif 000026
［式中、
Ｒ１は、カルボキシ基、（Ｃ１−６アルコキシ）カルボニル基、Ｃ１−７アルカノイル基、Ｃ２−８アルキニル基、カルバモイル基、シアノ基、ニトロ基もしくはハロゲン原子、または、置換基αを有していてもよいオキサゾリル基、置換基αを有していてもよいチアゾリル基、置換基αを有していてもよいオキサゾリニル基、もしくは置換基αを有していてもよいチアゾリニル基を示し；
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基またはベンジル基を示し；
ｎは２以上、５以下の整数を示し；
置換基αは、カルボキシ基、（Ｃ１−６アルコキシ）カルボニル基、Ｃ１−７アルカノイル基、カルバモイル基、シアノ基、ニトロ基およびハロゲン原子から選択される１以上を示す。
但し、２以上のＲ２Ｏ基は、互いに同一であっても異なっていてもよい。］
【請求項２】
Ｒ２が水素原子である請求項１に記載の細胞分化誘導剤。
【請求項３】
少なくとも２つの−ＯＲ２基が互いに隣り合っている請求項１または２に記載の細胞分化誘導剤。
【請求項４】
Ｒ１がシアノ基またはカルバモイル基である請求項１〜３のいずれかに記載の細胞分化誘導剤。
【請求項５】
さらにレチノイン酸を含む請求項１〜４のいずれかに記載の細胞分化誘導剤。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を神経堤細胞へ分化誘導するためのものである請求項１〜５のいずれかに記載の細胞分化誘導剤。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載の細胞分化誘導剤を含有することを特徴とする培養液。
【請求項９】
カテコール誘導体（Ｉ）を１０μＭ以上、３００μＭ以下含有する請求項８に記載の培養液。
【請求項１０】
ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を神経系細胞へ分化誘導するために用いられる、下記式（Ｉ）で表されるカテコール誘導体。
【化２】
2012157612.tif 000027
［式中、
Ｒ１は、カルボキシ基、（Ｃ１−６アルコキシ）カルボニル基、Ｃ１−７アルカノイル基、Ｃ２−８アルキニル基、カルバモイル基、シアノ基、ニトロ基もしくはハロゲン原子、または、置換基αを有していてもよいオキサゾリル基、置換基αを有していてもよいチアゾリル基、置換基αを有していてもよいオキサゾリニル基、もしくは置換基αを有していてもよいチアゾリニル基を示し；
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基またはベンジル基を示し；
ｎは２以上、５以下の整数を示し；
置換基αは、カルボキシ基、（Ｃ１−６アルコキシ）カルボニル基、Ｃ１−７アルカノイル基、カルバモイル基、シアノ基、ニトロ基およびハロゲン原子から選択される１以上を示す。
但し、２以上のＲ２Ｏ基は、互いに同一であっても異なっていてもよい。］
【請求項１１】
未分化細胞を神経系細胞へ分化誘導するための方法であって、
下記式（Ｉ）で表されるカテコール誘導体を有効成分として含む培地で未分化細胞を培養することにより、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を神経系細胞へ分化誘導する工程を含むことを特徴とする方法。
【化３】
2012157612.tif 000028
［式中、
Ｒ１は、カルボキシ基、（Ｃ１−６アルコキシ）カルボニル基、Ｃ１−７アルカノイル基、Ｃ２−８アルキニル基、カルバモイル基、シアノ基、ニトロ基もしくはハロゲン原子、または、置換基αを有していてもよいオキサゾリル基、置換基αを有していてもよいチアゾリル基、置換基αを有していてもよいオキサゾリニル基、もしくは置換基αを有していてもよいチアゾリニル基を示し；
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基またはベンジル基を示し；
ｎは２以上、５以下の整数を示し；
置換基αは、カルボキシ基、（Ｃ１−６アルコキシ）カルボニル基、Ｃ１−７アルカノイル基、カルバモイル基、シアノ基、ニトロ基およびハロゲン原子から選択される１以上を示す。
但し、２以上のＲ２Ｏ基は、互いに同一であっても異なっていてもよい。］
【国際調査報告】
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