(57)【要約】  カルシウムシグナルの空間的な制御および操作が容易な、カルシウムシグナルを光制御するポリペプチドを提供すること。  配列番号１または配列番号１と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＬＯＶ２領域と、配列番号２、配列番号３、またはＬＯＶ２−Ｊαの光スイッチとしての機能を維持し、かつ配列番号２もしくは３のアミノ酸配列において、所定の変異を有するアミノ酸配列からなるＪα領域と、配列番号４、またはカルシウムチャネルＯｒａｉ１を活性化でき、かつ、配列番号４のアミノ酸配列において、所定の変異を有するＣＡＤ領域と、を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ＬＯＶ２領域、Ｊα領域およびＣＡＤ領域は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＬＯＶ２領域、Ｊα領域およびＣＡＤ領域の順で配置され、Ｊα領域のＣ末端とＣＡＤ領域のＮ末端との間にアミノ酸配列が介在していないポリペプチドを使用する。
2012111772.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または配列番号１と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＬＯＶ２領域と、
配列番号２、配列番号３、またはＬＯＶ２−Ｊαの光スイッチとしての機能を維持し、かつ配列番号２もしくは３のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるＪα領域と、
配列番号４、またはカルシウムチャネルＯｒａｉ１を活性化でき、かつ配列番号４のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなるＣＡＤ領域と、を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、
前記ＬＯＶ２領域、前記Ｊα領域および前記ＣＡＤ領域は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記ＬＯＶ２領域、前記Ｊα領域および前記ＣＡＤ領域の順で配置され、
前記Ｊα領域のＣ末端と前記ＣＡＤ領域のＮ末端との間にアミノ酸配列が介在していないポリペプチド。
【請求項２】
配列番号５またはカルシウムチャネルとして機能でき、かつ、配列番号５のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなるＯｒａｉ１領域と、
請求項１記載のポリペプチドからなる第１のＢＡＣＣＳ領域と、
請求項１記載のポリペプチドからなる第２のＢＡＣＣＳ領域と、を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、
前記Ｏｒａｉ１領域、前記第１のＢＡＣＣＳ領域および前記第２のＢＡＣＣＳ領域は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記Ｏｒａｉ１領域、前記第１のＢＡＣＣＳ領域および前記第２のＢＡＣＣＳ領域の順で配置されるポリペプチド。
【請求項３】
前記Ｏｒａｉ１領域のＣ末端と前記第１のＢＡＣＣＳ領域のＮ末端の間に第１のリンカーが介在する請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記第１のＢＡＣＣＳ領域のＣ末端と前記第２のＢＡＣＣＳ領域のＮ末端の間に第２のリンカーが介在する請求項２または３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１記載のポリペプチドからなる第１のＢＡＣＣＳ領域と、
請求項１記載のポリペプチドからなる第２のＢＡＣＣＳ領域と、を含み、かつ、
配列番号５またはカルシウムチャネルとして機能でき、かつ、配列番号５のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなるＯｒａｉ１領域を含まないアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項６】
前記第１のＢＡＣＣＳ領域のＣ末端と前記第２のＢＡＣＣＳ領域のＮ末端の間にリンカーが介在する請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸を含む組み換えベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の組み換えベクターを含む遺伝子導入キット。
【請求項１０】
請求項８に記載の組み換えベクターを含み、単離された細胞または非ヒト動物である形質転換体。
【請求項１１】
請求項１０記載の形質転換体に照射する光の強度を操作することによって、前記形質転換体の細胞内カルシウムシグナルを調節する細胞内カルシウムシグナルの調節方法。
【請求項１２】
前記ポリペプチドは、請求項１、５または６のいずれか１項に記載のポリペプチドであり、かつ、前記細胞はＯｒａｉ１を発現している請求項１１に記載の細胞内カルシウムシグナルの調節方法。
【請求項１３】
前記ポリペプチドは、請求項２〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドである請求項９に記載の細胞内カルシウムシグナルの調節方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルシウムシグナルを光制御するポリペプチド、単離された核酸、組み換えベクター、遺伝子導入キット、形質転換体、および細胞内カルシウムシグナルの調節方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、基礎医学研究において、細胞内シグナルの機能等の解明のために、光刺激によって細胞内シグナルを制御するシステムが使用されてきている（非特許文献１；非特許文献２）。例えば、神経機能研究の分野においては、このようなシステムとして、光刺激によって神経細胞の膜電位を変化させることができるチャネルロドプシン２（バクテリア由来の光受容イオンチャネル）が使用されている。【０００３】
また、光刺激によって細胞内シグナルを制御するシステムとして、目的の細胞シグナルタンパク質の機能ドメインと、植物等に由来するタンパク質に含まれる光感受性領域とを融合することによって作製されたポリペプチドも使用される。このようなポリペプチドの具体的な例として、オートムギの光受容体タンパク質であるフォトトロピン１由来の光感受性領域ＬＯＶ２−Ｊαと、動物の細胞骨格制御タンパク質Ｒａｃ１との融合タンパク質が挙げられる。当該融合タンパク質は、光の照射によって局所的に細胞の形態を変化させることができる（非特許文献３）。【０００４】
細胞内シグナルの中でも、カルシウムシグナルは、カルシウムチャネルを介して、受精、細胞増殖、発生、学習と記憶、筋収縮および分泌等の様々な細胞機能において重要な作用を有することが知られており、生体内のほぼ全ての細胞において重要な機能を有する（非特許文献４）。そのため、カルシウムシグナルを光刺激によって制御できるシステムの確立が熱望されており（非特許文献５）、このようなシステムの確立のために様々な試みがなされてきた。【０００５】
光刺激によってカルシウムシグナルを制御する従来のシステムとしては、ケージドカルシウムを使用したシステムが挙げられる（非特許文献１；非特許文献２）。ケージドカルシウム等のケージド化合物は、光刺激によって分解される有機合成分子である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｒａｍｅｒ，Ｒ．Ｈ．，Ｆｏｒｔｉｎ，Ｄ．Ｌ．＆Ｔｒａｕｎｅｒ，Ｄ．  Ｎｅｗ  ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１９，５４４−５５２（２００９）
【非特許文献２】Ｒａｎａ，Ａ．＆Ｄｏｌｍｅｔｓｃｈ，Ｒ．Ｅ．Ｕｓｉｎｇ  ｌｉｇｈｔ  ｔｏ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃａｓｃａｄｅｓ  ｉｎ  ｌｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２０，６１７−６２２（２０１０）
【非特許文献３】Ｗｕ，Ｙ．Ｉ．ら  Ａ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｒａｃ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６１，１０４−１０８（２００９）
【非特許文献４】Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｌｉｐｐ，Ｐ．＆Ｂｏｏｔｍａｎ，Ｍ．Ｄ．Ｔｈｅ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１，１１−２１（２０００）
【非特許文献５】Ｌｉｕ，Ｘ．＆Ｔｏｎｅｇａｗａ，Ｓ．  Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３．０．  Ｃｅｌｌ  １４１，２２−２４（２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ケージドカルシウムを使用したシステムによれば、カルシウムシグナルを迅速に活性化させることができるものの、ケージドカルシウムは低分子であるために拡散しやすく、カルシウムシグナルの空間的な制御が容易ではない。また、ケージドカルシウムを使用したシステムにおける、ケージドカルシウムを細胞外から導入する工程は操作が難しく、特に動物等への応用において限界があった。【０００８】
本発明は、上記現状に鑑み、カルシウムシグナルを容易に光制御できるポリペプチド、単離された核酸、組み換えベクター、遺伝子導入キット、形質転換体、および細胞内カルシウムシグナルの調節方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、オートムギ由来の光感受性タンパク質であるフォトトロピンのＬＯＶ２−Ｊα領域のアミノ酸配列の所定部分と、カルシウムチャネルＯｒａｉ１の制御タンパク質であるＳＴＩＭ１のＣＡＤ領域のアミノ酸配列の所定部分とを組み合わせたポリペプチドにより、上記課題を解決できることを見出した。【００１０】
すなわち、本発明は、
配列番号１または配列番号１と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＬＯＶ２領域と、
配列番号２、配列番号３、またはＬＯＶ２−Ｊαの光スイッチとしての機能を維持し、かつ配列番号２もしくは３のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるＪα領域と、
配列番号４からなるＣＡＤ領域と、またはカルシウムチャネルＯｒａｉ１を活性化でき、かつ配列番号４のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなるＣＡＤ領域と、を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、
上記ＬＯＶ２領域、上記Ｊα領域および上記ＣＡＤ領域は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、上記ＬＯＶ２領域、上記Ｊα領域および上記ＣＡＤ領域の順で配置され、
上記Ｊα領域のＣ末端と上記ＣＡＤ領域のＮ末端との間にアミノ酸配列が介在していないポリペプチド（ＢＡＣＣＳ）を提供する。【００１１】
また、本発明者らは、カルシウムチャネルＯｒａｉ１のアミノ酸配列と、ＢＡＣＣＳとを組み合わせたポリペプチドによっても上記課題を解決できることを見出した。【００１２】
すなわち、本発明は、
配列番号５、またはカルシウムチャネルとして機能でき、かつ、配列番号５のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなるＯｒａｉ１領域と、
第１のＢＡＣＣＳ領域と、
第２のＢＡＣＣＳ領域と、を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、
上記Ｏｒａｉ１領域、上記第１のＢＡＣＣＳ領域および上記第２のＢＡＣＣＳ領域は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、上記Ｏｒａｉ１領域、上記第１のＢＡＣＣＳ領域および上記第２のＢＡＣＣＳ領域の順で配置されるポリペプチド（Ｏｒａｉ１−ＢＡＣＣＳ）も提供する。【００１３】
Ｏｒａｉ１−ＢＡＣＣＳにおける上記Ｏｒａｉ１領域のＣ末端と上記第１のＢＡＣＣＳ領域のＮ末端の間には第１のリンカーが介在してもよい。【００１４】
Ｏｒａｉ１−ＢＡＣＣＳにおける上記第１のＢＡＣＣＳ領域のＣ末端と上記第２のＢＡＣＣＳ領域のＮ末端の間には第２のリンカーが介在してもよい。【００１５】
また、本発明者らは、ＢＡＣＣＳをタンデムに２つつなげたポリペプチドによっても上記課題を解決できることを見出した。【００１６】
すなわち、本発明は、
第１のＢＡＣＣＳ領域と、
第２のＢＡＣＣＳ領域と、を含み、かつ、
配列番号５またはカルシウムチャネルとして機能でき、かつ、配列番号５のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなるＯｒａｉ１領域を含まないアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＢＡＣＣＳ×２）も提供する。【００１７】
ＢＡＣＣＳ×２における上記第１のＢＡＣＣＳ領域のＣ末端と上記第２のＢＡＣＣＳ領域のＮ末端の間にはリンカーが介在してもよい。【００１８】
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸も提供する。【００１９】
本発明はまた、上記核酸を含む組み換えベクターも提供する。【００２０】
本発明はまた、上記組み換えベクターを含む遺伝子導入キットも提供する。【００２１】
本発明はまた、上記組み換えベクターを含み、単離された細胞または非ヒト動物である形質転換体も提供する。【００２２】
本発明はまた、上記形質転換体に照射する光の強度を操作することによって、上記形質転換体の細胞内カルシウムシグナルを調節する細胞内カルシウムシグナルの調節方法も提供する。【００２３】
本発明はまた、上記ポリペプチドが、ＢＡＣＣＳであり、かつ、上記細胞がＯｒａｉ１を発現している細胞内カルシウムシグナルの調節方法も提供する。【００２４】
本発明はまた、上記ポリペプチドがＯｒａｉ１−ＢＡＣＣＳである細胞内カルシウムシグナルの調節方法も提供する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、カルシウムシグナルを容易に光制御できるポリペプチドが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】（Ａ）は、「ＢＡＣＣＳ」の模式図を示し、（Ｂ）は、「Ｏｒａｉ１−ＢＡＣＣＳ」の模式図を示す。
【図２Ａ】様々な動物種におけるＯｒａｉ１、Ｏｒａｉ２およびＯｒａｉ３のアミノ酸配列の比較を示す。
【図２Ｂ】様々な動物種におけるＳＴＩＭ１のＣＡＤ領域のアミノ酸配列の比較を示す。
【図３】様々な植物種におけるＬＯＶ２−ＪαにおけるＪα領域のアミノ酸配列の比較を示す。
【図４】（Ａ）は、ＬＯＶ２−Ｊαの明変異体にＣＡＤ領域を融合したタンパク質（ＬＯＶ  ｌｉｔ−ＣＡＤ）の模式図を示す。（Ｂ）は、黄色蛍光タンパク質を組み込まれたＯｒａｉ１（Ｏｒａｉ１−ＹＦＰ）のＨＥＫ２９３細胞中の局在のイメージング（左図）、赤色蛍光タンパク質を組み込まれたＬＯＶ  ｌｉｔ−ＣＡＤ（ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＬＯＶ−ＣＡＤ）のＨＥＫ２９３細胞中の局在のイメージング（中央図）、およびこれらの２つの結果をマージした結果（右図）を示す。（Ｃ）は、ＣＡＤ領域のＮ末端側を様々に欠損させたことによる、ＬＯＶ  ｌｉｔ−ＣＡＤの細胞膜への移行の有無についての結果を示す。
【図５】（Ａ）は、ＬＯＶ２−Ｊαの暗変異体にＣＡＤ領域を融合したタンパク質（ＬＯＶ  ｄａｒｋ−ＣＡＤ）の模式図を示す。（Ｂ）は、黄色蛍光タンパク質を組み込まれたＯｒａｉ１（Ｏｒａｉ１−ＹＦＰ）のＨＥＫ２９３細胞中の局在のイメージング（左図）、赤色蛍光タンパク質を組み込まれたＬＯＶ  ｄａｒｋ−ＣＡＤ（ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＬＯＶ  ｄａｒｋ−ＣＡＤ）のＨＥＫ２９３細胞中の局在のイメージング（中央図）、およびこれらの２つの結果をマージした結果（右図）を示す。（Ｃ）は、ＬＯＶ２−Ｊαの暗変異体によるＣＡＤ領域の機能の阻害を妨げない（すなわち、ＬＯＶ  ｄａｒｋ−ＣＡＤを細胞膜へ局在させない）Ｊα領域のアミノ酸配列についての４つの候補（膜への局在化が「なし」であるもの）の同定結果を示す。
【図６】（Ａ）は、ポリペプチド（ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＬＯＶ（４０４−５３８）−ＣＡＤ（３４７−４４８））、Ｏｒａｉ１およびＮＦＡＴ−ＧＦＰを共発現させたＨＥＫ２９３細胞中における、光を遮断した場合のポリペプチドの局在のイメージング（上図）、および４７０ｎｍの光（青色光）を２０分照射した場合のポリペプチドの局在のイメージング（下図）を示す。（Ｂ）は、ＬＯＶ２領域のアミノ酸配列、様々なＪα領域のアミノ酸配列、およびＣＡＤ領域のアミノ酸配列を結合させたポリペプチド（ＬＯＶ−ＣＡＤ）による、ＮＦＡＴ転写因子の核移行の有無、およびＬＯＶ−ＣＡＤの細胞膜への移行の有無の結果を示す。
【図７】（Ａ）は、赤色蛍光タンパク質、ＢＡＣＣＳ、２ＡペプチドおよびＯｒａｉ１を順にＮ末端からＣ末端へ融合させたポリペプチド（ｍＣｈｅｒｒｙ−ＢＡＣＣＳ−２Ａ−Ｏｒａｉ１）をＨＥＫ２９３細胞中で発現させ、４７０ｎｍの光（青色光）を試験期間中継続して照射した後の、カルシウム蛍光プローブであるＦｌｕｏ−４を使用したカルシウムイメージング結果を示す。左図はｍＣｈｅｒｒｙの蛍光による、ポリペプチド発現細胞の同定結果を示す。中央図および右図は、それぞれ、光刺激前および光刺激後のカルシウムイメージング結果を示す。（Ｂ）は、８つの細胞におけるカルシウム濃度の経時変化を示す。
【図８】（Ａ）は、赤色蛍光タンパク質を組み込まれたＯｒａｉ１−ＢＡＣＣＳ（Ｏｒａｉ１−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＢＡＣＣＳ×２）をＨＥＫ２９３細胞中で発現させ、４７０ｎｍの光（青色光）を試験期間中継続して照射した後の、カルシウム蛍光プローブであるＦｌｕｏ−４を使用したカルシウムイメージング結果を示す。左図はｍＣｈｅｒｒｙの蛍光による、ポリペプチド発現細胞の同定結果を示す。中央図および右図は、それぞれ、光刺激前および光刺激後のカルシウムイメージング結果を示す。（Ｂ）は、ＨＡタグおよび／または蛍光物質を組み込まれたＯｒａｉ１−ＢＡＣＣＳを発現したＨＥＫ２９３細胞におけるカルシウム濃度の経時変化を示す。（Ｃ）は、ＨＡタグおよび蛍光物質を組み込まれたＯｒａｉ１−ＢＡＣＣＳ（Ｏｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ×２−ＩＲＥＳ−ＹＦＰ）をＨＥＫ２９３細胞に発現させ、光の照射および光の遮断を３回行った際の、赤色蛍光カルシウムセンサーであるＲｈｏｄ−３を用いたカルシウムイメージングによって観察された細胞内カルシウム濃度の経時変化を示す。
【図９】（Ａ）は、Ｏｒａｉ１にＢＡＣＣＳを１つだけ融合させ、赤色蛍光タンパク質を組み込んだポリペプチド（Ｏｒａｉ１−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ×１）および転写因子ＮＦＡＴに黄色蛍光タンパク質を組み込んだポリペプチド（ＮＦＡＴ−ＹＦＰ）をＨＥＫ２９３細胞中で共発現させ、４７０ｎｍの光（青色光）を２０分間照射した後の結果を示す。（Ｂ）は、対照実験として、ＢＡＣＣＳを２つタンデムにつなげ、赤色蛍光タンパク質を組み込んだＯｒａｉ１−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ×２、ＮＦＡＴ−ＧＦＰをＨＥＫ２９３細胞中で共発現させ、４７０ｎｍの光（青色光）を２０分間照射した後の結果を示す。
【図１０】（Ａ）は、Ｏｒａｉ１−ＢＡＣＣＳに、Ｏｒａｉ１の変異（Ｏｒａｉ１（Ｌ２７３Ｄ））を組み込んだＯｒａｉ１（Ｌ２７３Ｄ）−ＢＡＣＣＳ×２の模式図を示す。（Ｂ）は、ＨＡタグおよび蛍光物質を組み込まれたＯｒａｉ１（Ｌ２７３Ｄ）−ＢＡＣＣＳ（Ｏｒａｉ１（Ｌ２７３Ｄ）−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ×２−ｉｇＹ）を発現するＨＥＫ２９３細胞に、４７０ｎｍの光（青色光）を照射する前、および１０分間照射した後の、赤色蛍光カルシウムセンサーであるＲｈｏｄ−３を使用したカルシウムイメージングを示す。
【図１１】（Ａ）は、ＳＴＩＭ１のＣＤＩ（Ｃａｌｃｉｕｍ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）領域を含むようにＣＡＤ領域のＣ末端を伸長したポリペプチド（Ｏｒａｉ１−ＢＡＣＣＳ（３４７−６３０）×２）の模式図を示す（斜線部がＣＤＩ領域を示す）。（Ｂ）は、ＨＡタグおよび蛍光物質を組み込まれたＯｒａｉ１−ＢＡＣＣＳ（Ｏｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ×２−ｉｇＹ）およびＯｒａｉ１−ＢＡＣＣＳ（３４７−６３０）（Ｏｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ（３４７−６３０）×２−ｉｇＹ）を発現した細胞について、赤色蛍光カルシウムセンサーであるＲｈｏｄ−３を使用したカルシウムイメージング結果を示す。
【図１２】（Ａ）は、「ＢＡＣＣＳ×２」の模式図を示す。（Ｂ）は、ＢＡＣＣＳ×２−ｉｇＹ（Ｂ×２）およびＯｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ×２−ｉｇＹ（ＯＢ×２）を発現した細胞それぞれについてのカルシウムイメージング結果を示す。
【図１３】ＢＡＣＣＳ×２−ｉｇＹ（Ｂ×２）およびＹＦＰ−ＢＡＣＣＳ×２（ＹＢ×２）を発現した細胞についてのカルシウムイメージング結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
（ＢＡＣＣＳ）
本発明は、オートムギの光受容体タンパク質であるフォトトロピン１の光感受性領域であるＬＯＶ２−Ｊα領域のアミノ酸配列と、カルシウムチャネルＯｒａｉ１の制御タンパク質であるＳＴＩＭ１のＣＡＤ領域のアミノ酸配列と、を含むポリペプチド（Ｂｌｕｅ  ｌｉｇｈｔ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｓｗｉｔｃｈ、以下「ＢＡＣＣＳ」と呼ぶ）を提供する。ＢＡＣＣＳを発現させた細胞においては、細胞中の内在性のＯｒａｉ１、または細胞に遺伝子導入することによってＢＡＣＣＳと共に発現させたＯｒａｉ１を、青色光の照射によって開くことができる。青色光の照射によって活性化されたＯｒａｉ１は、青色光を遮断することで不活性の状態に戻る。また、ＢＡＣＣＳは、本発明の属する技術分野において公知の遺伝子組み換え技術によって容易に細胞特異的に発現させることができるため、Ｏｒａｉ１の活性を局所的に制御できる。従って、ＢＡＣＣＳによれば、カルシウムシグナルの空間的な制御を容易に行うことができる。また、ＢＡＣＣＳは、照射する光の強度の操作のみによってその機能を制御できるため、容易な操作によってカルシウムシグナルを制御することができる。
【００２８】
（ＬＯＶ２−Ｊα）
オートムギ由来のフォトトロピン１の光感受性は、フォトトロピン１中のアミノ酸４０４−５４３位の領域に依存しており、当該領域はＬＯＶ２−Ｊαと呼ばれる（Ｈａｒｐｅｒら、２００３）。ＬＯＶ２−Ｊαは、青色領域である４４７ｎｍの吸収極大波長を有するため（Ｓａｌｏｍｏｎら、２０００）、青色光の照射によって構造が変化する。具体的には、光が遮断されている状態では、ＬＯＶ２領域およびＪα領域が疎水結合によって結合している。一方、光が照射されている状態では、ＬＯＶ２領域およびＪα領域の疎水結合が外れる。これを「明状態」と呼ぶ。ＬＯＶ２−Ｊαにシグナルタンパク質が融合した状態では、光が遮断されている状態において、ＬＯＶ２−Ｊαがシグナルタンパク質の立体障害として機能する。一方、光が照射されている状態では、ＬＯＶ２−Ｊαの構造が変化し、シグナルタンパク質の立体障害が解消される。その結果、所望の細胞内シグナルを生じさせることができる。
【００２９】
ＬＯＶ２−Ｊαを明状態にするための光は、青色領域の波長（５１０ｎｍ以下）であればよい。例えば、市販の青色ＬＥＤを使用することによってＬＯＶ２−Ｊαの構造を容易に変化させることができる。また、光の照射時間は特に限定されないが、ミリ秒単位の照射によって、ＬＯＶ２−Ｊαを効率よく明状態にすることができる（Ｎａｋａｓｏｎｅら、２００８）。
【００３０】
また、ＬＯＶ２−Ｊαの明状態を解除するためには、照射する光の波長を５１０ｎｍよりも長波長にするか、光を遮断すればよい。
【００３１】
［ＬＯＶ２領域］
本発明のポリペプチドを構成するＬＯＶ２−Ｊαのうち、ＬＯＶ２領域は、オートムギ由来のフォトトロピンのアミノ酸配列の４０４−５２２位に対応する。
【００３２】
ＬＯＶ２領域は、多くの植物間で保存されており、例えば、オートムギのＬＯＶ２領域のアミノ酸配列との相同性は、アジアイネのフォトトロピン１；８１％、シロイヌナズナのフォトトロピン１；８７％、シロイヌナズナのフォトトロピン２；８３％、エンドウマメのフォトトロピン１；８７％、ソラマメのフォトトロピン１；トウモロコシのフォトトロピン１；９５％、トマトのフォトトロピン１；８７％である。
【００３３】
ＬＯＶ２領域が機能的である植物種のＬＯＶ２領域は、オートムギのアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有している。このようなアミノ酸配列を用いることによって、ＢＡＣＣＳが光感受性作用を発揮できると考えられる。アミノ酸配列にＬＯＶ２領域の機能に関わる領域が含まれているかどうかは、例えば、得られるポリペプチドに対して青色光を照射または遮断し、円偏光二色性スペクトルを観察することによって特定できる。従って、オートムギのＬＯＶ２領域を様々な植物種由来の配列または合成配列に置き換えることも可能である。例えば、本発明のポリペプチドを構成するＬＯＶ２領域に相当するアミノ酸配列として、オートムギ由来のフォトトロピンのアミノ酸配列の４０４−５２２位と、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を使用することができる。
【００３４】
［Ｊα領域］
本発明のポリペプチドを構成するＬＯＶ２−Ｊαのうち、Ｊα領域は、オートムギ由来のフォトトロピンのアミノ酸配列の５２３−５３５位または５２３−５３８位に対応する。
【００３５】
Ｊα領域は、ＢＡＣＣＳが、光の照射によってＯｒａｉ１を開き、光の遮断によってＯｒａｉ１を閉じるという所望の反応（以下、このような反応を「光スイッチ」と呼ぶ）をするために重要な領域である。なぜならば、ＢＡＣＣＳにおけるＪα領域のアミノ酸配列は、Ｏｒａｉ１の制御タンパク質であるＣＡＤ領域のアミノ酸配列との間にアミノ酸配列を介在させずに直接結合しているため、この結合部位の構造によっては、光の遮断状態においてシグナルタンパク質であるＣＡＤ領域の立体障害が解消されてしまう。その結果、光の遮断状態においてもＣＡＤ領域がＯｒａｉ１に結合し、Ｏｒａｉ１が活性化されることになり、Ｏｒａｉ１の制御タンパク質としてのＣＡＤ領域の機能が阻害されないからである。例えば、これまで、ＬＯＶ２−Ｊαの４０４−５４６位（Ｗｕら、２００９）および４０４−５４３位（Ｓｔｉｃｋｌａｎｄら、２００８）を使用した光感受性ポリペプチドが作製されてきたものの、光を遮断した際にも光スイッチが完全には切れず、シグナルが遮断されない等の問題があった。これは、ＬＯＶ２領域の存在によって生じる、シグナルタンパク質のシグナル機能部位における立体障害が不十分であることによるものと考えられる。
【００３６】
Ｊα領域としてフォトトロピンのアミノ酸配列５２３−５３５位または５２３−５３８位を有するＢＡＣＣＳは、光に対する所望の反応を示す。これらの配列を有するＢＡＣＣＳは、細胞において、青色光の照射によって、カルシウムシグナルを調節することができるため好ましい。Ｊα領域としてフォトトロピンのアミノ酸配列５２３−５３８位を有するＢＡＣＣＳは、光に応答してカルシウムシグナルを強く調節できるため特に好ましい。Ｊα領域としてフォトトロピンのアミノ酸配列５２３−５３５位を有するＢＡＣＣＳも、光を遮断した状態でカルシウムシグナルを誘導してしまうものの、光の照射によってシグナルの強さを調節することができる。
【００３７】
また、ＬＯＶ２−Ｊαが機能するためにはＪα領域のＩ５３２、Ａ５３６、Ｉ５３９のアミノ酸が疎水性である必要があることが報告されている（Ｈａｒｐｅｒら、２００４）。そのため、ＢＡＣＣＳを作製する際には、Ｊα領域におけるこれらの部位が疎水性アミノ酸になるようにする必要がある。例えば、ＢＡＣＣＳを構成するアミノ酸配列においては、ＬＯＶ２−Ｊα（４０４−５３８）とＣＡＤ領域のつなぎ目に位置する、疎水性アミノ酸である「Ｌ（ロイシン）」が、ＬＯＶ２−Ｊαの光スイッチとしての機能に重要な役割を果たしている。つまり「Ｌ」はＣＡＤ領域に由来するが、同時に、ＬＯＶ２−Ｊαの５３９番目のアミノ酸としても機能している。この「Ｌ」は、Ｊα領域と直接結合しているＣＡＤ領域がＯｒａｉ１を活性化させる場合においても重要である。このため、光を遮断した状態においては、Ｊα領域のこの「Ｌ」は、ＬＯＶ２領域との疎水結合に利用され、その結果、ＣＡＤ領域がＯｒａｉ１と相互作用することが阻害されることになる。
【００３８】
本発明者らが鋭意検討した結果、フォトトロピンのアミノ酸配列の５２３−５３５位または５２３−５３８位に対応するＪα領域を有するＢＡＣＣＳであれば、照射する光の強度の操作に応じてＯｒａｉ１の活性化を制御できることを見出した。ただし、上記Ｊα領域のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であって、ＬＯＶ２−Ｊαの光スイッチとしての機能を維持するアミノ酸配列を有するＢＡＣＣＳについても、照射する光の強度の操作に応じてＣＡＤ領域の機能を発揮させ、または阻害することで、同様に所望の反応を生じさせることができるため、本発明の範囲に含まれる。ここで、「１もしくは複数のアミノ酸配列が置換されたアミノ酸配列」とは、本発明のポリペプチドを構成するＪα領域である、オートムギ由来のフォトトロピンのアミノ酸配列の５２３−５３５位または５２３−５３８位と、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を指す。アミノ酸配列にＬＯＶ２−Ｊαの光スイッチとしての機能を維持するアミノ酸配列が含まれているかどうかは、例えば、得られるポリペプチドについて、円偏光二色性スペクトル等を観察することによって特定できる。
【００３９】
（ＣＡＤ領域）
本発明のポリペプチドを構成するＣＡＤ領域は、ヒトＳＴＩＭ１のＣＡＤ領域のアミノ酸配列の３４７−４４８位に対応する。当該ＣＡＤ領域は、単独でカルシウムチャネルＯｒａｉ１の活性を制御できる。ＢＡＣＣＳ中のＬＯＶ２−Ｊαが光の照射によって明状態になると、ＣＡＤ領域が活性化し、Ｏｒａｉ１と結合し、その結果Ｏｒａｉ１を活性化させる。
【００４０】
ただし、カルシウムチャネルＯｒａｉ１を活性化でき、かつ上記ＣＡＤ領域のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列を有するＢＡＣＣＳについても、カルシウムチャネルＯｒａｉ１の活性を制御できるため、本発明の範囲に含まれる。ここで、「１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列」とは、本発明のポリペプチドを構成するＣＡＤ領域である、ヒトＳＴＩＭ１のＣＡＤ領域のアミノ酸配列の３４７−４４８位と、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列のことをいう。アミノ酸配列にカルシウムチャネルＯｒａｉ１を活性化するアミノ酸配列が含まれているかどうかは、例えば、当該アミノ酸配列をＯｒａｉ１領域と共発現させ、カルシウムイオンの流入があるかどうかを、ＮＦＡＴの局在を観察することによって特定できる。
【００４１】
（Ｏｒａｉ１−ＢＡＣＣＳ）
また、本発明は、ＢＡＣＣＳを、カルシウムチャネルＯｒａｉ１のアミノ酸配列のＣ末端にタンデムに２つつなげたタンパク質（以下、「Ｏｒａｉ１−ＢＡＣＣＳ」と呼ぶ）も提供する。
【００４２】
ＢＡＣＣＳは、内在性のＯｒａｉ１が発現した場合、または細胞内でＯｒａｉ１遺伝子と共発現した場合等に、カルシウムイオンチャネルであるＯｒａｉ１を光依存的に開閉することができる。そのため、Ｏｒａｉ１とＢＡＣＣＳを結合させ、単一のポリペプチドとして発現させることによって、Ｏｒａｉ１とＢＡＣＣＳとの空間的距離を近づけることができ、ＢＡＣＣＳのみからなるポリペプチドと比較して、さらに効率の良い光活性化カルシウムチャネルとして機能する。
【００４３】
Ｏｒａｉ１とＣＡＤ領域が１：２の比で存在する場合に、Ｏｒａｉ１を効率的に活性化させることができ、さらに、Ｏｒａｉ１のＣ末端にＣＡＤ領域をタンデムに２つつなげた場合にＯｒａｉ１が構成的に活性化されることが報告されている（Ｌｉら、２０１０）。そこで、本発明者らは、Ｏｒａｉ１のＣ末端にＢＡＣＣＳをタンデムに２つつなげた構造を有するＯｒａｉ１−ＢＡＣＣＳを作製した。
【００４４】
（Ｏｒａｉ１）
カルシウムチャネルＯｒａｉ１は、細胞膜上に局在し、ストア作動性カルシウム流入に関与するストア作動性カルシウムチャネルである。Ｏｒａｉ１の活性は、小胞体に局在する小胞体タンパク質ＳＴＩＭ１のＣＡＤ領域によって制御される（Ｈｏｇａｎら、２０１０）。Ｏｒａｉ１は特に免疫細胞において重要な作用を有する。
【００４５】
Ｏｒａｉ１を活性化するヒトＳＴＩＭ１内の領域として、ＣＡＤ（アミノ酸３４２−４４８位；Ｐａｒｋら、２００９）、ＳＯＡＲ（アミノ酸３４４−４４２位；Ｙｕａｎら、２００９）、ＯＡＳＦ（アミノ酸２３３−４５０位または４７４位；Ｍｕｉｋら、２００９）、ＣＣＢ９（アミノ酸３３９−４４４位；Ｋａｗａｓａｋｉら、２００９）が同定されている。なお、ヒトＳＴＩＭ１内のアミノ酸３４２−４４０位の領域は、Ｏｒａｉ１を活性化することができない（Ｐａｒｋら、２００９）。
【００４６】
本発明のポリペプチドを構成するＯｒａｉ１は、ヒトＯｒａｉ１のアミノ酸配列の１−３０１位に対応する。
【００４７】
Ｏｒａｉ１は、Ｏｒａｉ２およびＯｒａｉ３との配列類似性が高いだけでなく、線虫、ヒト等の様々な種間で保存されている（Ｈｏｇａｎら、２０１０）。そのため、Ｏｒａｉ１−ＢＡＣＣＳを構成するＯｒａｉ１の配列は、ヒト由来のものだけではなく、様々な種のホモログであっても、カルシウムチャネルとして機能する可能性が極めて高い。従って、本発明のポリペプチドを構成するＯｒａｉ１としてこれらのホモログを代用できる。また、ヒトＯｒａｉ１がカルシウムチャネルとして機能するための領域が保存されているのであれば、ヒトＯｒａｉ１のアミノ酸配列の１−３０１位において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、付加されていても、本発明のポリペプチドを構成するＯｒａｉ１として使用することができる。ここで、「１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、付加」とは、本発明のポリペプチドを構成するＯｒａｉ１である、ヒトＯｒａｉ１のアミノ酸配列の１−３０１位と、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を指す。アミノ酸配列にＯｒａｉ１がカルシウムチャネルとして機能するための領域が含まれているかどうかは、例えば、当該アミノ酸配列をＣＡＤ領域と共発現させ、カルシウムイオンの流入があるかどうかを、ＮＦＡＴの局在を観察することによって特定できる。
【００４８】
（リンカー）
Ｏｒａｉ１−ＢＡＣＣＳを構成する、Ｏｒａｉ１のＣ末端と第１のＢＡＣＣＳのＮ末端との間、および第１のＢＡＣＣＳのＣ末端と第２のＢＡＣＣＳのＮ末端との間にはそれぞれ、アミノ酸配列の小断片（以下、「リンカー」と呼ぶ）が介在してもよい。当該リンカーは、蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ、ＹＦＰ等）等であってもよい。Ｏｒａｉ１−ＢＡＣＣＳにこのようなリンカーが含まれることにより、細胞内のＯｒａｉ１−ＢＡＣＣＳの発現を容易に検出することができる。
【００４９】
Ｏｒａｉ１のＣ末端と第１のＢＡＣＣＳのＮ末端との間に介在するリンカーは、立体障害を回避する観点から、２０残基以上のアミノ酸配列からなるリンカーであってもよい。
【００５０】
第１のＢＡＣＣＳのＣ末端と第２のＢＡＣＣＳのＮ末端との間に介在するリンカーは、立体障害を回避する観点から、２５残基以上のアミノ酸配列からなるリンカーであってもよい。
【００５１】
（ＢＡＣＣＳ×２）
また、本発明は、ＢＡＣＣＳをタンデムに２つつなげたタンパク質（以下、「ＢＡＣＣＳ×２」と呼ぶ）も提供する。
【００５２】
ＣＡＤは２量体の形態で１つのＯｒａｉ１と相互作用し、Ｏｒａｉ１を効率的に活性化させることができることが報告されている（Ｌｉら、２０１０）。そのため、タンデムに２つつながれたＢＡＣＣＳ（すなわち、ＢＡＣＣＳ×２）によれば、効率よくＣＡＤを２量体様の構造にすることができるため、内因性Ｏｒａｉ１を効率的に活性化できる。
【００５３】
ＢＡＣＣＳ×２を構成する、第１のＢＡＣＣＳ領域のＣ末端と、第２のＢＡＣＣＳ領域のＮ末端との間には、リンカーが介在してもよい。ＢＡＣＣＳ×２において、リンカーは、第１のＢＡＣＣＳ領域のＮ末端や、第２のＢＡＣＣＳ領域のＣ末端に付加されてもよい。例えば、第１のＢＡＣＣＳ領域のＮ末端のリンカーとしては蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ、ＹＦＰ等）等が挙げられる。第２のＢＡＣＣＳ領域のＣ末端のリンカーとしては２Ａペプチド等が挙げられる。ＢＡＣＣＳ×２にこのようなリンカーが含まれることにより、細胞内のＢＡＣＣＳ×２の発現を容易に検出することができる。
【００５４】
ＢＡＣＣＳ×２に含まれるリンカーは、立体障害を回避する観点から、２５残基以上のアミノ酸配列からなるリンカーであってもよい。
【００５５】
（製法）
本発明のポリペプチドは、本発明の属する技術分野において公知の遺伝子組み換え技術によって作製できる。例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸をベクターに組み込み、当該ベクターを大腸菌や細胞（ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞等）等に導入することによって、ポリペプチドとして大量に発現させることができる。
【００５６】
（核酸）
本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸は、本発明の属する技術分野において公知の遺伝子組み換え技術によって作製できる。例えば、アミノ酸配列情報からプライマーを作成し、ＰＣＲ等によってクローニングしたＬＯＶ２−Ｊα領域をコードする核酸や、ＣＡＤ領域をコードする核酸を、ライゲーション反応等によってつなげることにより本発明のポリペプチドをコードする核酸を単離することができる。
【００５７】
本願明細書で使用される用語「核酸」には、ＤＮＡ、ＲＮＡ等が含まれる。
【００５８】
（組み換えベクター）
本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸を含む組み換えベクターは、本発明の属する技術分野において公知の遺伝子組み換え技術によって作製できる。例えば、任意のプラスミドを、任意の制限酵素（ＢｇｌＩＩ、ＳａｌＩ等）で切断し、その切断部位に、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸をリガーゼで結合させることによって作製できる。
【００５９】
本願明細書で使用される用語「組み換えベクター」は、組み換えＤＮＡ実験等において異種ＤＮＡの運搬に使用されるＤＮＡを指す。本発明の組み換えベクターとしては、例えば、本発明のポリペプチドを発現するＤＮＡ断片、任意の制限酵素認識部位、任意の複製開始点等を有するクローニングベクターや、本発明のポリペプチドを発現するＤＮＡ断片、転写開始点等を有する発現ベクター等が挙げられる。
【００６０】
また、本発明の範囲には、このような組み換えベクターを含む遺伝子導入キットも含まれる。当該キットを使用して遺伝子導入を行うことで、本発明のポリペプチドを容易に発現させることができる。当該キットには、例えば、本発明の組み換えベクター、形質転換用試薬、取扱説明書等が含まれるが、これに限定されない。
【００６１】
（形質転換体）
上記の組み換えベクターを含む形質転換体は、本発明の属する技術分野において公知の遺伝子組み換え技術によって作製できる。本願明細書で使用される用語「形質転換体」は、単離された細胞または非ヒト動物である。細胞としては特に限定されず、任意の細胞株（例えば、ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞等）を使用できる。また、非ヒト動物としては特に限定されず、大腸菌、哺乳類（マウス、ラット等）、モデル動物等を使用できる。
【００６２】
本発明の形質転換体は、例えば、単離された細胞に、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウイルス等によって組み換えベクターを導入することによって、単離された細胞の形質転換体が得られる。また、非ヒト動物の受精卵前核中へＤＮＡ顕微注入、ＥＳ細胞への相同組み換え、組み換えウイルスによる感染等を行うことによって非ヒト動物の形質転換体が得られる。本発明のポリペプチドは、上記のような公知の技術によって容易に細胞特異的に発現させることができるだけでなく、追加の薬剤等を使用することなく、照射する光の強度の操作のみによってその機能を発揮させることができるため、特に、非ヒト動物に対して容易かつ安全に応用できる。
【００６３】
（本発明のポリペプチドを使用した応用）
さらに、本発明によれば、上記形質転換体に照射する光の強度を操作することによって、上記形質転換体の細胞内カルシウムシグナルを調節することができる。光の強度の操作とは、上記形質転換体に照射される光の波長、光の照射時間、および光の照射量等の調節を指す。例えば、上記形質転換体に対する青色領域の波長の光の照射によって細胞内カルシウムシグナルを活性化することができる。また、上記形質転換体に対する５１０ｎｍ以下の波長の光の遮断によって細胞内カルシウムシグナルを不活性化することができる。
【００６４】
例えば、ＢＡＣＣＳを使用すれば、Ｏｒａｉ１を発現している細胞における細胞内カルシウムシグナルを調節できる。また、Ｏｒａｉ１−ＢＡＣＣＳを使用すれば、Ｏｒａｉ１を発現している細胞だけではなく、Ｏｒａｉ１を発現していない細胞における細胞内カルシウムシグナルを調節できる。
【００６５】
Ｏｒａｉ１とＣＡＤ領域が１：２の比で存在する場合に、Ｏｒａｉ１を効率的に活性化させることができ、細胞内カルシウムシグナルの応答性が上昇することが知られている（Ｌｉら、２０１０）。これを踏まえると、Ｏｒａｉ１に対するＢＡＣＣＳの発現量比がＯｒａｉ１：ＢＡＣＣＳ＝１：２以下となると、細胞内カルシウムシグナルの応答性が低下すると考えられる。Ｏｒａｉ１を発現している細胞においては、内因性Ｏｒａｉ１に対するＢＡＣＣＳの割合がＯｒａｉ１：ＢＡＣＣＳ＝１：２以下となりにくくするために、内因性Ｏｒａｉ１の量に応じて、ＢＡＣＣＳ×２（ＢＡＣＣＳのみをタンデムに２つ発現させたもの）、ＢＡＣＣＳ×２−２Ａ−Ｏｒａｉ１（Ｏｒａｉ１：ＢＡＣＣＳ＝１：２）やＢＡＣＣＳ×２−ＩＲＥＳ−Ｏｒａｉ１（Ｏｒａｉ１：ＢＡＣＣＳ＝１：４〜１：１０）等を好適に使用できる。なお、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）とは、メッセンジャーＲＮＡの途中から翻訳を開始させることができる配列である。ＩＲＥＳ依存的な翻訳は、多くの場合、５’キャップ依存的な翻訳の２０〜５０％の効率であることが報告されている（Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉら、２０００）。つまり、例えばＢＡＣＣＳ×２−ＩＲＥＳ−Ｏｒａｉ１においては、ＩＲＥＳ依存的なＯｒａｉ１の翻訳は、５’キャップ依存的なＢＡＣＣＳの翻訳に対して２０〜５０％の効率であると予測されるため、ＩＲＥＳを含む組み換え体によれば、Ｏｒａｉ１とＢＡＣＣＳとの発現量比を効率的に調整できる。一方、Ｏｒａｉ１を発現していない細胞においては、内因性Ｏｒａｉ１が存在しないため、Ｏｒａｉ１とＢＡＣＣＳ×２の融合蛋白（Ｏｒａｉ１−ＢＡＣＣＳ×２）を好適に使用できる。
【００６６】
このように、本発明によれば、照射する光の強度を操作することによって形質転換体の細胞内のカルシウムチャネルの活性化を制御することにより、細胞内カルシウムイオンの流入の調節ができるため、細胞内カルシウムイオン濃度やカルシウムイオンによって活性化される細胞内の生理現象（例えば、筋収縮、シナプス伝達、分泌、細胞分化等）を調節できる。
【００６７】
本発明のポリペプチドは、カルシウムシグナルに関連する基礎医学または生命科学分野の研究や医薬品の開発において有利に使用することができる。本発明のポリペプチドを使用する基礎医学または生命科学の分野としては特に限定されず、筋収縮の制御、神経伝達シグナル、免疫応答、発生、および分泌制御等の分野の研究において使用できる。また、研究手法としては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、またはｉｎ  ｖｉｖｏ等の系において使用できる。
【００６８】
本発明のポリペプチドは、医薬品の開発においても使用でき、例えば、糖尿病、高血圧等の疾病における創薬ターゲットの評価、新薬候補化合物のスクリーニング等に使用できる。
【実施例】
【００６９】
以下の実施例に基づき、本発明について詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。なお、本実施例においては、オートムギのフォトトロピン１のＬＯＶ２−Ｊα領域、ヒトのＯｒａｉ１、およびヒトのＳＴＩＭ１のＣＡＤ領域を使用した。【００７０】
（実施例１：ＬＯＶ２−ＪαとＣＡＤの結合部位の最適化に関する検討）
ＬＯＶ２−ＪαとＣＡＤの結合部位の配列に関して最適な組み合わせを特定するため、ＬＯＶ２−Ｊαと、ＣＡＤとを結合させたポリペプチド（以下、「ＬＯＶ−ＣＡＤ」と呼ぶ）を作製し、光刺激によってＯｒａｉ１を活性化できるＬＯＶ−ＣＡＤをスクリーニングした。なお、ＬＯＶ２−Ｊαの構造は、Ｊα領域のＣ末端側に結合する領域を制御すると考えられるため、ポリペプチドの作製時には、ＬＯＶ２−Ｊαの塩基配列のＣ末端側と、ＣＡＤの塩基配列Ｎ末端側とを結合させる必要がある。【００７１】
（１）ＬＯＶ−ＣＡＤを発現する組み換えベクターの作製
以下に、ＬＯＶ２−Ｊα（４０４−５３８）およびＣＡＤ（３４７−４４８）の塩基配列を組み込んだプラスミドの作製例を示す。他のポリペプチドを発現するプラスミドも同様にして作製した。なお、フォトトロピン１  ＬＯＶ２−Ｊα（ＩＤ  ２２０２４，ＰＡ−Ｒａｃ１）、Ｏｒａｉ１−ＹＦＰ（ＩＤ  １９７５６）、ＳＴＩＭ１−ＣＦＰ（ＩＤ  １９７５５）およびＮＦＡＴ−ＧＦＰ（ＩＤ  １１１０７）のプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅ社より購入した。
ＬＯＶ−ＣＡＤを、制限酵素（ＢｇｌＩＩ）認識配列が組み込まれたＬＯＶ２のＰＣＲ断片と、制限酵素（ＳａｌＩ）認識配列が組み込まれたＣＡＤ領域のＰＣＲ断片との、リコンビナントＰＣＲによる融合遺伝子として得て、これをＰＣＲサーマルサイクラーによって増幅した。使用したプライマーと鋳型を以下に示す。【００７２】
【表１】
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【００７３】
得られたＰＣＲ産物を、ＢｇｌＩＩとＳａｌＩを使用して制限酵素処理した。次いで、制限酵素処理されたＰＣＲ産物を、赤色蛍光タンパク質レポーターベクターであるｐｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１ベクターのＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩサイトにライゲーションし、ポリペプチドｔｄＴｏｍａｔｏ−ＬＯＶ（４０４−５３８）−ＣＡＤ（３４７−４４８）の組み換えベクター（以下、「ｐｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ」と呼ぶ）を作製した。なお、ｐｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１ベクターは、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）のＧＦＰ配列をｔｄＴｏｍａｔｏで置換したものである。さらに、当該組み換えベクターから転写されるｍＲＮＡの安定性を高め、導入遺伝子の発現を増強することができる、ウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後制御エレメントＷＰＲＥを３’非翻訳領域に挿入した組み換えベクター（以下、「ｐｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ−ＷＰＲＥ」と呼ぶ）を作製した。【００７４】
（２）ＣＡＤ領域のＮ末端配列に関する検討
ＬＯＶ２−Ｊαの塩基配列に結合するＣＡＤ領域の塩基配列のＮ末端配列について、Ｏｒａｉ１の活性化に必要な最小領域を検討した。
検討のために、ＬＯＶ２領域の光照射条件下における構造を模倣した変異体（以下、「明変異体」と呼ぶ）およびＬＯＶ２領域の光遮断条件下における構造を模倣した変異体（以下、「暗変異体」と呼ぶ）を作製した。例えば、Ｊα領域のアミノ酸配列は、Ｉ５３２Ｅ、Ａ５３６Ｅ、Ｉ５３９Ｅ、Ｄ５４０Ｒの変異によって明変異体になることが知られている（Ｈａｒｐｅｒら、２００４）。本実施例では、明変異体として、Ｊα領域に、リコンビナントＰＣＲによりＩ５３９Ｅ変異（Ｉ５３９Ｅ）を導入した。また、暗変異体として、ＬＯＶ２領域に、リコンビナントＰＣＲによってＣ４５０Ａ変異（Ｃ４５０Ａ）を導入した。以下、当該明変異体であるＬＯＶ２−Ｊαを、「ＬＯＶ  ｌｉｔ」、当該暗変異体であるＬＯＶ２−Ｊαを「ＬＯＶ  ｄａｒｋ」と呼ぶ。ＬＯＶ  ｌｉｔおよびＬＯＶ  ｄａｒｋは、それぞれ、光の照射の有無に関わらず、光が照射された状態の構造、および光が遮断された状態の構造を有している。
まず、ＬＯＶ  ｌｉｔ（４０４−５４６）に、Ｎ末端を様々に欠損させたＣＡＤ領域（３４２−４４８から３５０−４４８）を融合したタンパク質（以下、「ＬＯＶ  ｌｉｔ−ＣＡＤ」と呼ぶ）を作製した（図４Ａ）。ＬＯＶ  ｌｉｔ−ＣＡＤを、Ｏｒａｉ１と共にＨＥＫ２９３細胞中で共発現させ、以下の手順でＬＯＶ  ｌｉｔ−ＣＡＤの細胞内局在を観察した。
赤色蛍光タンパク質であるｔｄＴｏｍａｔｏを、ＬＯＶ  ｌｉｔ−ＣＡＤのＮ末端側に融合したポリペプチドとして発現するように、組み換えベクター「ｐｔｄＴｏｍａｔｏ−ＬＯＶ  ｌｉｔ−ＣＡＤ−ＷＰＲＥ」を作製した。また、同様に、黄色蛍光タンパク質をＣ末端側に組み込んだＯｒａｉ１を発現するように、組み換えベクター「Ｏｒａｉ１−ＹＦＰ」も作製した。ｐｔｄＴｏｍａｔｏ−ＬＯＶ  ｌｉｔ−ＣＡＤ−ＷＰＲＥおよびＯｒａｉ１−ＹＦＰを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（インビトロジェン社製）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入し、当該細胞を１０％  仔ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ社製）入りＭＥＭ（ナカライテスク株式会社製）（以下、「ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ」と呼ぶ）培地中で培養した。遺伝子導入の２４〜４８時間後に、暗室において、細胞を４％  パラホルムアルデヒドで固定し、ｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光の局在をコンフォーカル顕微鏡（商品名；Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０、カールツァイス社製）で観察した。
Ｏｒａｉ１は細胞膜上に発現するため、Ｏｒａｉ１と結合したＬＯＶ  ｌｉｔ−ＣＡＤは、細胞膜に局在する（図４Ｂ）。なお、Ｊα領域の５４６番目のアミノ酸とＣＡＤ領域の３４７番目のアミノ酸はともに「Ｌ」であるため、ＬＯＶ  ｌｉｔ（４０４−５４６）−ＣＡＤ（３４８−４４８）はＬＯＶ  ｌｉｔ（４０４−５４５）−ＣＡＤ（３４７−４４８）とも解釈できる点に注意されたい。Ｏｒａｉ１を活性化する領域としては、ＣＡＤ（３４７−４４８）がＮ末端に関して最小領域であることが分かった。（図４Ｃ）。【００７５】
（３）ＬＯＶ２−ＪαのＣ末端配列に関する検討
ＣＡＤ領域（３４７−４４８）を含むように、ＬＯＶ  ｄａｒｋのＣ末端の長さを様々に変えてポリペプチド（以下、「ＬＯＶ  ｄａｒｋ−ＣＡＤ」と呼ぶ）を作製した（図５Ａ）。ＬＯＶ  ｄａｒｋ−ＣＡＤは、Ｏｒａｉ１を活性化させるのに十分なＣＡＤ領域を含むため、ＬＯＶ  ｄａｒｋのタンパク質構造による立体障害がない場合は、Ｏｒａｉ１と結合できる。本項では、ＬＯＶ  ｄａｒｋが立体障害となりＯｒａｉ１と結合できないポリペプチドを探索する。Ｏｒａｉ１と結合できないＬＯＶ  ｄａｒｋ−ＣＡＤは、細胞質に分布するポリペプチドとして認められた（図５Ｂ）。
ＬＯＶ２−ＪαのＣ末端側の、ＣＡＤ領域とのつなぎ目に関しては、上記「（２）ＣＡＤ領域のＮ末端配列に関する検討」で説明した重要な疎水性アミノ酸（Ｉ５３２，Ａ５３６，Ｉ５３９）の配列を変化させないようにアミノ酸配列のつなげ方を工夫した。当該疎水性アミノ酸配列を変化させる場合においても、ＬＯＶ２−Ｊα領域に結合したＣＡＤ領域の配列によってＬＯＶ２−Ｊα領域のアミノ酸の特性が変化しないように（すなわち、Ｊα領域中の５３２番目、５３６番目、５３９番目のアミノ酸が疎水性アミノ酸になるように）アミノ酸配列のつなげ方を工夫した。
図５Ｃに示す１５種類のポリペプチドおよびＯｒａｉ１を、ＨＥＫ２９３細胞中で共発現させたところ、ＬＯＶ  ｄａｒｋ（４０４−５４２）、ＬＯＶ  ｄａｒｋ（４０４−５３９）、ＬＯＶ  ｄａｒｋ（４０４−５３８）、およびＬＯＶ  ｄａｒｋ（４０４−５３５）は、細胞膜への局在化が阻害された。【００７６】
（４）光によるＯｒａｉｌ１の活性化についてのＮＦＡＴを使用した検証
本発明のポリペプチドが、光の照射によってＯｒａｉｌ１を活性化できるかどうかについて、カルシウムシグナルにより核に移行することが知られる転写因子ＮＦＡＴを使用して検証した。
まず、４つの候補の野生型ＬＯＶ（４０４−５４２、４０４−５３９、４０４−５３８、４０４−５３５）にＣＡＤ（３４７−４４８）を融合したタンパク質を、Ｏｒａｉ１、および核移行シグナルを検出するためのレポーター遺伝子ＮＦＡＴ−ＧＦＰと共にＨＥＫ２９３細胞中で共発現させた。
具体的には、３つのプラスミド、ｐｔｄＴｏｍａｔｏ−ＬＯＶ−ＣＡＤ−ＷＰＲＥ、Ｏｒａｉ１（Ｏｒａｉ１−ＹＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ社製）からＹＦＰを除去して作製した）およびＮＦＡＴ−ＧＦＰを、ＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入し、当該細胞をＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地中で培養した。遺伝子導入から２４〜４８時間後、暗室にて、４％  パラホルムアルデヒドで細胞を固定した。これを暗条件における試料とし、図６に「暗」として示した。また、遺伝子導入から２４〜４８時間後、培地をＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地からＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ培地に変え、４７０ｎｍの光を２０分照射した後に４％  パラホルムアルデヒドで細胞を固定した。これを明条件における試料とし、図６に「明」として示した。
それぞれのサンプルについて、光を遮断した場合と、４７０ｎｍの光を照射した場合におけるＮＦＡＴの局在を観察した。ＮＦＡＴの細胞内局在をコンフォーカル顕微鏡（商品名；Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０、カールツァイス社製）で観察した結果を図６Ａに示す。
ＬＯＶ（４０４−５４２）−ＣＡＤ（３４７−４４８）およびＬＯＶ（４０４−５３９）−ＣＡＤ（３４７−４４８）を導入した細胞においては、光を照射してもＮＦＡＴの核への局在化の効率が悪かった。また、ＬＯＶ（４０４−５３５）−ＣＡＤ（３４７−４４８）を導入した細胞においては、光の照射によってＮＦＡＴが効率よく核へ局在化したものの、光を遮断した状態においてもＮＦＡＴの核への局在化が見られた（図６Ｂ）。
一方、ＬＯＶ（４０４−５３８）−ＣＡＤ（３４７−４４８）を導入した細胞においては、光を遮断した状態ではＮＦＡＴが細胞質中で認められ、光を照射した状態では、ＮＦＡＴが核で認められた（図６ＡおよびＢ）。【００７７】
以上の結果を踏まえ、ＬＯＶ（４０４−５３８）−ＣＡＤ（３４７−４４８）を、Ｏｒａｉ１を光制御できるポリペプチドの候補とした。当該ポリペプチドを以下、ＢＡＣＣＳ（Ｂｌｕｅ  ｌｉｇｈｔ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｓｗｉｔｃｈ）と呼ぶ。ＢＡＣＣＳのアミノ酸配列では、ＬＯＶ２−ＪαとＣＡＤ領域のつなぎ目に位置する「Ｌ」が重要な役割を果たしていると思われる。ＬＯＶ２−Ｊαが光スイッチとして機能するためにはこの部位のアミノ酸が疎水性である必要がある（Ｈａｒｐｅｒら、２００４）。つまり、この「Ｌ」が、光を遮断した状態において、ＬＯＶ２領域およびＪα領域の構造を安定化させていると考えられている。一方、この「Ｌ」は、ＣＡＤ領域がＯｒａｉ１を活性化させる場合においても重要であるため、光照射によりＪα領域がＬＯＶ２領域から離れて「Ｌ」が融合タンパク質の表面に露出したときにのみＯｒａｉ１を活性化することができると推測される。【００７８】
（５）カルシウムイメージングによる検証
ＢＡＣＣＳによって活性化された細胞内カルシウムシグナルを直接的に観察するために、カルシウムセンサーを使用して以下の手順でカルシウムイメージングを行った。
蛍光タンパク質を組み込まれたＢＡＣＣＳの組み換えベクター（ｐｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ−ＷＰＲＥまたはｐｍＣｈｅｒｒｙ−ＢＡＣＣＳ−ＷＰＲＥ）、およびＢＡＣＣＳと共にＯｒａｉ１を同時に発現させる組み換えベクター（ｐｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ−２Ａ−Ｏｒａｉ１−ＷＰＲＥ）を作製した。ｐｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ−２Ａ−Ｏｒａｉ１−ＷＰＲＥは、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ  ｖｉｒｕｓ由来の２Ａペプチド（Ｆｅｌｉｐｅら、２００６）の２２アミノ酸およびＯｒａｉ１をｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳのＣ末端に融合させた構成となっている。タンパク質への翻訳の際に、２Ａペプチド配列が存在していると、その２Ａペプチドを挟む前後のポリペプチドがつながらずに、２つのポリペプチドとして発現する。すなわち、ｐｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ−２Ａ−Ｏｒａｉ１−ＷＰＲＥは１回の翻訳によって、２つの分離したポリペプチド（ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳおよびＯｒａｉ１）として発現する。
このように、ＢＡＣＣＳと共にＯｒａｉ１を同時に発現できる組み換えベクターによれば、２つのタンパク質の発現を同時に制御できるため、タンパク質発現細胞において発現するＢＡＣＣＳおよびＯｒａｉ１の比を一定にすることができる。
まず、Ｏｒａｉ１−ＹＦＰプラスミドから、組み換えベクターＯｒａｉ１−ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ−ＳａｌＩ（以下、「ｐＯｒａｉ１−ＳａｌＩ」と呼ぶ）を作製した。
実施例１で作製したｐｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ−ＷＰＲＥ中の、制限酵素認識部位であるＢｓｐＥＩ−ＳａｌＩサイトで挟まれたＢＡＣＣＳを、ｐＯｒａｉ１−ＳａｌＩを制限酵素（ＢｓｐＥＩおよびＳａｌＩ）で処理した断片と置き換えて、ｐｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢｓｐＥＩ−Ｏｒａｉ１−ＷＰＲＥを作製した。
ｐｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢｓｐＥＩ−Ｏｒａｉ１−ＷＰＲＥ中のＢｓｐＥＩサイトに、ＢＡＣＣＳおよび２Ａペプチドを融合させたＢｓｐＥＩ−ＬＯＶ（４０４−５３８）−ＣＡＤ（３４７−４４８）−２Ａ−ＢｓｐＥＩを挿入し、ｐｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ−２Ａ−Ｏｒａｉ１−ＷＰＲＥを作製した。このプラスミド中のｔｄＴｏｍａｔｏを制限酵素（ＡｇｅＩおよびＢｇｌＩＩ）で処理して得られた断片を、赤色蛍光タンパク質レポーターベクターであるｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１ベクターを制限酵素（ＡｇｅＩおよびＢｇｌＩＩ）処理した断片と置き換えることで、組み換えベクターｐＣｈｅｒｒｙ−ＢＡＣＣＳ−２Ａ−Ｏｒａｉ１−ＷＰＲＥを作製した。【００７９】
当該組み換えベクターをＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入し、ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地中でＢＡＣＣＳとＯｒａｉ１を同時発現させた。遺伝子導入から２４〜３６時間後に、青色光（４７０ｎｍ）で発現細胞を刺激し、カルシウムイオン蛍光インジケーターであるＦｌｕｏ−４またはＲｈｏｄ−３（インビトロジェン社製）を添加し、カルシウム濃度の変化を観察した（図７Ａ）。観察は５秒間毎のタイムラプスで、コンフォーカル顕微鏡（商品名；ＢｉｏＲａｄ  ＭＲＣ１０２４、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）で行った。それぞれの細胞について、ΔＦ（蛍光変化量）／Ｆ０（光刺激前の蛍光強度）を算出し、観察終了時点の値が１になるようにΔＦを基準化し、縦軸にプロットし、横軸に時間（秒）を示した結果を図７Ｂに示す。図７Ｂに示される通り、ＢＡＣＣＳ−２Ａ−Ｏｒａｉ１発現細胞において、光の照射によるカルシウム濃度の上昇が認められた。
各組み換えベクターを作製するために使用したプライマーおよび鋳型を以下に示す。【００８０】
【表２】
2012111772.tif 000004
【００８１】
（実施例２：Ｏｒａｉ１とＢＡＣＣＳとのポリペプチドの作製）
ＢＡＣＣＳは、内在性のＯｒａｉ１が発現した場合、またはＯｒａｉ１遺伝子と共発現した場合等に、カルシウムイオンチャネルＯｒａｉ１を光依存的に開閉することができる。そこで、Ｏｒａｉ１とＢＡＣＣＳを結合させ、単一のポリペプチドとして発現させることによって、カルシウム流入を制御できるポリペプチドを作製した。Ｏｒａｉ１とＣＡＤは１：２の比で存在する場合に最も効率よくＯｒａｉ１を活性化させることができ、Ｏｒａｉ１のＣ末端にＣＡＤをタンデムに２つつなげた場合にＯｒａｉ１が構成的に活性化されることが報告されている（Ｌｉら、２０１０）。そこで、Ｏｒａｉ１のＣ末端にＢＡＣＣＳを２つタンデムにつなげた組み換えベクターを以下の手順で作製した。【００８２】
（１）ｐＯｒａｉ１−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥの作製
翻訳効率を上げるためにＯｒａｉ１−ＹＦＰの開始コドンの５’末端側にｋｏｚａｋ様配列（ＣＣＡＣＣ）を挿入した。具体的には、当該プラスミド中のＯｒａｉ１−ＹＦＰ中の制限酵素認識部位であるＢｇｌＩＩ−ＢｓｐＥＩサイトに、制限酵素（ＸｈｏＩ）認識部位およびＫｏｚａｋ配列（以下、「ＫＺＫ」と略す）を有する下記のリンカーを挿入した。【００８３】
【表３】
2012111772.tif 000005
【００８４】
また、並行して、実施例１と同様に、組み換えベクターｐｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ−ＷＰＲＥを作製し、その制限酵素認識部位であるＮｈｅＩ−ＡｇｅＩサイトに、制限酵素（ＸｈｏＩ）認識部位を有する下記のリンカーを挿入し、組み換えベクター（ｐＸｈｏＩ−ＡｇｅＩ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ−ＷＰＲＥ）を作製した。【００８５】
【表４】
2012111772.tif 000006
【００８６】
ｐＫＺＫ−Ｏｒａｉ１−ＹＦＰを制限酵素（ＸｈｏＩおよびＡｇｅＩ）によって処理し、得られたＤＮＡ断片を、ｐＸｈｏＩ−ＡｇｅＩ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ−ＷＰＲＥ中のＸｈｏＩ−ＡｇｅＩサイトに挿入し、組み換えベクター（ｐＫＺＫ−Ｏｒａｉ１−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ−ＷＰＲＥ）を作製した。
当該組み換えベクター中のＯｒａｉ１とｔｄＴｏｍａｔｏとの間には、Ｏｒａｉ１−ＹＦＰに由来する、制限酵素認識部位であるＥｃｏＲＩ−ＡｇｅＩサイトを有するリンカーが含まれるが、当該制限酵素認識部位を除去する目的で、このＥｃｏＲＩ−ＡｇｅＩサイトを下記の配列に置き換えた。得られた組み換えベクター（ｐＫＺＫ−Ｏｒａｉ１−ｌｉｎｋｅｒ２−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ−ＷＰＲＥ）のアミノ酸配列は変化していない。【００８７】
【表５】
2012111772.tif 000007
【００８８】
下記のプライマーおよび鋳型を使用して、ＰＣＲサーマルサイクラーによって増幅した。得られたＰＣＲ産物（ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片）を、ｐＫＺＫ−Ｏｒａｉ１−ｌｉｎｋｅｒ２−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ−ＷＰＲＥ中のｔｄＴｏｍａｔｏとＢＡＣＣＳの間の制限酵素認識部位であるＢｇｌＩＩサイトに挿入し、組み換えベクター（ｐＫＺＫ−Ｏｒａｉ１−ｌｉｎｋｅｒ２−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ−Ｌ１−ＢＡＣＣＳ−ＷＰＲＥ、以下「ｐＯｒａｉ１−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥ」と呼ぶ）を作製した。「Ｌ１」はＬｉら（２０１０）が作製したＯｒａｉ１−Ｌ２−ＣＡＤ（３３６−４８５）−Ｌ１−ＣＡＤ（３３６−４８５）中の「Ｌ１」のアミノ酸配列を参考にした。【００８９】
【表６】
2012111772.tif 000008
【００９０】
（２）ｐＯｒａｉ１−Ｃｈｅｒｒｙ−ＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥ、ｐＯｒａｉ１−ＹＦＰ−ＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥおよびｐＯｒａｉ１−ＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥの作製
ｐＯｒａｉ１−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥを制限酵素（ＡｇｅＩおよびＢｇｌＩＩ）で処理して得られたｔｄＴｏｍａｔｏ部分を、蛍光タンパク質融合発現ベクターｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１を制限酵素（ＡｇｅＩおよびＢｇｌＩＩ）で処理して得られた断片と置き換えて、組み換えベクター（ｐＯｒａｉ１−Ｃｈｅｒｒｙ−ＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥ）を作製した。また、ｐＯｒａｉ１−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥ中のｔｄＴｏｍａｔｏ（ＡｇｅＩ−ＢｇｌＩＩ断片）を、黄色蛍光タンパク質発現ベクターｐＥＹＦＰ−Ｃ１のＡｇｅＩ−ＢｇｌＩＩと置き換えて、組み換えベクター（ｐＯｒａｉ１−ＹＦＰ−ＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥ）を作製した。また、ｐＯｒａｉ１−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥ中のｔｄＴｏｍａｔｏ（ＡｇｅＩ−ＢｇｌＩＩ断片）を、下記リンカーと置き換えて、組み換えベクター（ｐＯｒａｉ１−ＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥ）を作製した。【００９１】
【表７】
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【００９２】
（３）ｐＯｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥの作製
下記のプライマーおよび鋳型を使用して、ＰＣＲサーマルサイクラーによって増幅した。得られたＰＣＲ産物（３ｘＨＡタグ配列）を、ｐＯｒａｉ１−ＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥ中の制限酵素認識部位であるＡｇｅＩサイトに挿入し、組み換えベクター（ｐＯｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥ）を作製した。【００９３】
【表８】
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【００９４】
（４）ｐＯｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ×２−ｉｇＹ−ＷＰＲＥ、およびｐＯｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ×２−ｉｍＴｍ−ＷＰＲＥの作製
ｐＯｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥ発現細胞を蛍光により可視化するために、ＩＲＥＳ−ｇａｐＹＦＰ（Ｉｍａｉら、２００６；以下、「ｉｇＹ」と略す）またはＩＲＥＳ−ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ｍｙｃ（Ｍｕｚｕｍｄａｒら、２００７；以下、「ｉｍＴｍ」と略す）を、ｐＯｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥの３’非翻訳領域の制限酵素認識部位であるＳａｌＩサイトに挿入し、組み換えベクター（それぞれ、ｐＯｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ×２−ｉｇＹ−ＷＰＲＥ、ｐＯｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ×２−ｉｍＴｍ−ＷＰＲＥ）を作製した。なお、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）配列は、メッセンジャーＲＮＡの途中から翻訳を開始させることができる配列である。例えば、Ｏｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ×２−ｉｇＹのメッセンジャーＲＮＡからは、Ｏｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ×２とｇａｐＹＦＰという、２つのポリペプチドが翻訳される。
上記組み換えベクターによる発現産物は、Ｏｒａｉ１とＢＡＣＣＳの間に、２１アミノ酸リンカー（Ｏｒａｉ１−ＢＡＣＣＳ×２）、５７アミノ酸リンカー（Ｏｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ×２）、２５８アミノ酸リンカー（Ｏｒａｉ１−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＢＡＣＣＳ２）、４９８アミノ酸リンカー（Ｏｒａｉ１−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ×２）、２６１アミノ酸リンカー（Ｏｒａｉ１−ＹＦＰ−ＢＡＣＣＳ×２）のいずれかが挿入されたコンストラクトとなる。
いずれにおいても、４７０ｎｍの光（青色光）の照射によって、効率よくカルシウム濃度が上昇した（図８Ｂ、略記はそれぞれ、Ｃｈｅ；Ｏｒａｉ１−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＢＡＣＣＳ×２、Ｔ；Ｏｒａｉ１−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ×２、ＨＡ；Ｏｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ×２−ｉｍＴｍ、を示す）。なお、カルシウム濃度の変化は実施例１と同様に算出した。また、Ｏｒａｉ１−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＢＡＣＣＳ×２をＨＥＫ２９３細胞中で発現させ、４７０ｎｍの光（青色光）を試験期間中継続して照射した後の、カルシウム蛍光プローブであるＦｌｕｏ−４を使用したカルシウムイメージング結果を図８Ａに示す。
Ｏｒａｉ１とＢＡＣＣＳの間のリンカーの長さに関して、本実験により、最短で２１アミノ酸で機能することが確認された。さらに、光の照射および遮断を繰り返すことで、カルシウムチャネルの開閉を制御できることを確認した（図８Ｃ）。【００９５】
（実施例３：Ｏｒａｉ１に結合させるＢＡＣＣＳの数の検討）
Ｏｒａｉ１とＣＡＤは１：２の比で存在する場合にＯｒａｉ１を効率よく活性化させることができるという報告がある（Ｌｉら、２０１０）。そこで、Ｏｒａｉ１とＣＡＤの比がＯｒａｉ１−ＢＡＣＣＳの作用に与える影響を検証すべく、Ｏｒａｉ１にＢＡＣＣＳを１つだけ結合したポリペプチドを作製し、実施例１（４）同様に、ＮＦＡＴを使用した核移行アッセイを行った。
実施例２（１）の中で作製したｐＫＺＫ−Ｏｒａｉ１−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ×１−ＷＰＲＥを、Ｏｒａｉ１にＢＡＣＣＳを１つだけ結合したポリペプチド（Ｏｒａｉ１−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ×１）として使用した。
核移行シグナルを検出するためのレポーター遺伝子ＮＦＡＴ−ＧＦＰから、制限酵素（ＡｇｅＩおよびＳａｃＩ）でＮＦＡＴを切り出し、これを蛍光タンパク質発現ベクターｐＥＹＦＰ−Ｎ１の制限酵素認識部位であるＡｇｅＩ−ＳａｃＩサイトに挿入し、組み換えベクター（ＮＦＡＴ−ＹＦＰ）を作製した。
Ｏｒａｉ１−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ×１およびＮＦＡＴ−ＹＦＰを、ＨＥＫ２９３細胞中で共発現させ、４７０ｎｍの光（青色光）を２０分間照射した。その結果、ＮＦＡＴ−ＹＦＰの蛍光（図９Ａ中「ＮＦＡＴ−ＹＦＰ」）は細胞質中にのみ認められ、核において観察されず、ＮＦＡＴの核移行が認められなかった。つまり、Ｏｒａｉ１にＢＡＣＣＳを１つしか結合していないポリペプチドによるＯｒａｉ１の活性化は困難であることが示された。
対照実験として、Ｏｒａｉ１−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＢＡＣＣＳ×２、ＮＦＡＴ−ＧＦＰをＨＥＫ２９３細胞中で共発現させた。４７０ｎｍの光を２０分間照射することでＮＦＡＴは核に移行した（図９Ｂ中「ＮＦＡＴ−ＧＦＰ」）。【００９６】
（実施例４：Ｏｒａｉ１の変異体を使用したＢＡＣＣＳの光応答の検討）
ＣＡＤ領域によるＯｒａｉ１の活性化が抑制されるＯｒａｉ１の変異（Ｏｒａｉ１（Ｌ２７３Ｄ））を、Ｏｒａｉ１−ＣＡＤ−ＣＡＤ（Ｏｒａｉ１のＣ末端にＣＡＤをタンデムに２つつなげたコンストラクトによって構成的に活性化されている）に導入すると、構成的なカルシウムの流入は観察されない（Ｌｉら、２０１０）。
そこで、Ｏｒａｉ１に不活性型変異Ｌ２７３ＤをリコンビナントＰＣＲによって導入し、さらにＨＡタグおよび蛍光物質を組んだ組み換えベクター（Ｏｒａｉ１（Ｌ２７３Ｄ）−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ×２−ｉｇＹ）を作製した（図１０Ａ）。これをＨＥＫ２９３細胞に導入してカルシウムシグナルを観察した。
Ｏｒａｉ１（Ｌ２７３Ｄ）−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ×２に４７０ｎｍの光（青色光）を照射する前、および１０分間照射した後の、赤色蛍光カルシウムセンサーであるＲｈｏｄ−３によるカルシウムイメージング結果を、図１０Ｂに示す。図１０Ｂに示される通り、光の照射の前後で細胞内カルシウム濃度に変化は認められなかった。
また、ＢＡＣＣＳのＬＯＶ２−Ｊαを暗変異体にしたポリペプチド（Ｏｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ（ｄａｒｋ）×２）を作製した。Ｏｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ（ｄａｒｋ）×２を発現するＨＥＫ２９３細胞に４７０ｎｍの光（青色光）を照射しても、細胞内のカルシウム濃度の上昇は認められなかった（データは示していない）。
以上から、ＢＡＣＣＳが光に応答してＯｒａｉ１に作用し、Ｏｒａｉ１を活性化させることが示された。【００９７】
（実施例５：ＣＤＩ領域を含むＯｒａｉ１−ＢＡＣＣＳについての検討）
ＳＴＩＭ１のＣＤＩ（Ｃａｌｃｉｕｍ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）（アミノ酸４７０−４９１位）領域は、Ｏｒａｉ１を素早く不活性化するのに必要な領域を含む（Ｍｕｌｌｉｎｓら、２００９）。そのため、Ｏｒａｉ１−ＢＡＣＣＳにＣＤＩ領域を組み込むことによって、一旦活性化されたＯｒａｉ１をすぐに不活性化できるカルシウムチャネルが得られる可能性がある。
そこで、ＣＤＩ領域を含むようにＯｒａｉ１−ＢＡＣＣＳにおけるＣＡＤ領域のＣ末端を伸長し（伸長されたＣＡＤ領域を「ＣＡＤ（３４７−６３０）」と示す）、これにＨＡタグおよび蛍光物質が組み込まれた組み換えベクター（Ｏｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ（３４７−６３０）×２−ｉｇＹ；図１１Ａ）を作製した。ＣＡＤ（３４７−６３０）のＤＮＡ断片は、プラスミドＳＴＩＭ１−ＣＦＰからＰＣＲによって増幅し、上記実施例１と同様の手順でＢＡＣＣＳ（３４７−６３０）を作製した。
これらの組み換えベクターをＨＥＫ２９３細胞中で発現させ、当該細胞に４７０ｎｍの光（青色光）を照射し、赤色蛍光カルシウムセンサーであるＲｈｏｄ−３を使用したカルシウムイメージングを行った。測定開始５０秒後から１０分間４７０ｎｍの光（青色光）を照射し、その後１５分間、暗条件で観察した。
その結果、Ｏｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ（３４７−６３０）×２−ｉｇＹにおいては光の照射によって細胞内カルシウムの濃度が上昇した。しかし、その後、予想に反してカルシウムの濃度の減少（すなわち、Ｏｒａｉ１の不活性化）がすぐに認められることはなく、光を遮断しても、細胞内カルシウム濃度が低下しなかった（図１１Ｂ、略記はそれぞれ、ＷＴ；ＣＤＩ領域を含まないＯｒａｉ１−ＢＡＣＣＳ、ＣＤＩ；ＣＤＩ領域を含むＯｒａｉ１−ＢＡＣＣＳ、を示す）。なお、カルシウム濃度の変化は実施例１と同様に算出した。この結果は、Ｏｒａｉ１−ＢＡＣＣＳにＣＤＩ領域を導入することは適切ではなく、また、Ｏｒａｉ１−ＢＡＣＣＳを構成するＣＡＤ領域のＣ末端側の配列の長さがＯｒａｉ１−ＢＡＣＣＳの作用において重要であることを示唆している。【００９８】
ＬＯＶ２−Ｊα内のＧ５２８Ａ変異およびＮ５３８Ｅ変異の２重変異（ＧＶＭＬＩＫＫＴＡＥＮからＡＶＭＬＩＫＫＴＡＥＥ）によって、ＬＯＶ２の光スイッチとしてのダイナミックレンジが大きくなることが報告されている（Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄら、２０１０）。このような２重変異をＮＦＡＴアッセイに使用した４つの野生型ＬＯＶ（４０４−５４２、４０４−５３９、４０４−５３８、４０４−５３５）に導入し、４７０ｎｍの光を照射した。その結果、いずれのコンストラクトにおいてもＮＦＡＴが核へ移行せず、光スイッチがオンにならなかった（データは示していない）。【００９９】
（実施例６：ＢＡＣＣＳ×２の作製）
Ｏｒａｉ１発現ベクターを使用せずに、ＢＡＣＣＳ×２が単独でどの程度Ｏｒａｉ１を活性化できるかを調べるために、ＢＡＣＣＳを２つタンデムにつなげた組み換えベクターを以下の手順で作製した。本例では、ＨＥＫ２９３Ｔで発現している内在性のＯｒａｉ１に対してＢＡＣＣＳ×２が及ぼす影響を検討した。【０１００】
（１）ｐＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥの作製
下記のプライマーおよび鋳型を使用して、ＰＣＲサーマルサイクラーによって増幅した。得られたＰＣＲ産物（ＡｇｅＩ−ＢａｍＨＩ断片とＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片）を、ｐＯｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥ改変ベクター（インサートの開始コドン近傍の配列を、下記リンカーでＮｈｅＩ−ＸｈｏＩ−ＫＺＫ−開始コドン−ＡｇｅＩに改変したもの）のＡｇｅＩ−ＳａｌＩ断片を除いたベクターに挿入し、組み換えベクター（ｐＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥ）を作製した（図１２Ａ）。
上記組み換えベクターによる発現産物は、実施例２におけるｐＯｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥ発現産物中のＢＡＣＣＳ×２の領域と同一のアミノ酸配列を有し、かつ、Ｎ末端に１０アミノ酸（ＭＧＰＶＧＧＳＧＧＳ）、Ｃ末端に９アミノ酸（ＧＧＳＧＧＳＧＬＶ）が付加されている。これらは融合タンパク質を作製する際にリンカーとして利用できるように付加したものである。【０１０１】
【表９】
2012111772.tif 000011
【０１０２】
（２）ｐＢＡＣＣＳ×２−ｉｇＹ−ＷＰＲＥの作製
上記で得られたｐＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥ発現細胞を蛍光により可視化するために、実施例２と同様に、ｉｇＹを、ｐＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥの３’非翻訳領域の制限酵素認識部位であるＳａｌＩサイトに挿入し、組み換えベクター（ｐＢＡＣＣＳ×２−ｉｇＹ−ＷＰＲＥ）を作製した。
ＢＡＣＣＳ×２−ｉｇＹを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対してカルシウムイメージングを行った。カルシウム蛍光プローブとしてＲｈｏｄ−３（赤色蛍光カルシウムセンサー）を用いた。観察開始５０秒後から、コンフォーカル顕微鏡の４４２ｎｍの波長のレーザーを５秒毎に照射して細胞を刺激した後、それぞれの細胞について、蛍光強度変化を検討した。各時点での蛍光強度として、ΔＦ（蛍光変化量）／Ｆ０（光刺激前の蛍光強度）を算出した。ΔＦ／Ｆ０の値を縦軸にプロットし、横軸に時間（秒）を示した結果を図１２Ｂに示す。比較試験としてＯｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ×２−ｉｇＹを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞で同様にカルシウムイメージングを行った。なお、図中のＢ×２はＢＡＣＣＳ×２−ｉｇＹ（解析細胞数ｎ＝４５）を、ＯＢ×２はＯｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ×２−ｉｇＹ（解析細胞数ｎ＝３５）を示す。各時点のΔＦ／Ｆ０は、各細胞についての平均値として標準誤差と共に示した。青色光照射開始時に認められる、わずかな蛍光強度の上昇は、測定機器によるノイズである。
図１２Ｂに示される通り、ＢＡＣＣＳ×２はＯｒａｉ１発現ベクターを使用しなくとも内在性のＯｒａｉ１を活性化でき、Ｏｒａｉ１−ＨＡ−ＢＡＣＣＳ×２よりも効率よくカルシウム濃度を上昇させることが認められた。【０１０３】
（３）ｐＹＦＰ−ＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥの作製
ＢＡＣＣＳ×２のＮ末端に蛍光タンパク質を融合できることを確認するために、下記のプライマーおよび鋳型を使用して、ＰＣＲサーマルサイクラーによって増幅した。得られたＰＣＲ産物（ＮｈｅＩ−ＡｇｅＩ断片）をｐＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥのＮｈｅＩ−ＡｇｅＩサイトに挿入し、組み換えベクター（ｐＹＦＰ−ＢＡＣＣＳ×２−ＷＰＲＥ）を作製した。ＹＦＰ−ＢＡＣＣＳ×２を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対してカルシウムイメージングを行った。併せて、ＢＡＣＣＳ×２−ｉｇＹを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対してもカルシウムイメージングを行った。カルシウム蛍光プローブとしてＲｈｏｄ−３（赤色蛍光カルシウムセンサー）を用いた。観察開始５０秒後から、４７０ｎｍ波長のＬＥＤランプを継続的に照射して細胞を刺激した。それぞれの細胞について、上記同様にΔＦ／Ｆ０を算出して縦軸にプロットし、横軸に時間（秒）を示した結果を図１３に示す。なお、図中のＢ×２はＢＡＣＣＳ×２−ｉｇＹ（解析細胞数ｎ＝５）を、ＹＢ×２はＹＦＰ−ＢＡＣＣＳ×２（解析細胞数ｎ＝５）を示す。各時点のΔＦ／Ｆ０は、各細胞についての平均値として標準誤差と共に示した。
図１３に示される通り、Ｎ末端へタンパク質を融合しても、ＢＡＣＣＳ×２は内在性のＯｒａｉ１を活性化でき、効率よくカルシウム濃度を上昇できることが認められた。【０１０４】
【表１０】
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【０１０５】
ＳＴＩＭ１はＳＴＩＭ２との配列類似性が高く、線虫、ヒト等の様々な種間で保存されている（図２Ｂ；Ｙｕａｎら、２００９より改変）。図２Ｂの略記はそれぞれ、Ｈ．ｓａｐ；ヒト、Ｂ．ｔａｕ；ウシ、Ｐ．ｔｒｏ；チンパンジー、Ｅ．ｃａｂ；ウマ、Ｇ．ｇａｌ；ニワトリ、Ｍ．ｍｕｓ；マウス、Ｒ．ｎｏｒ；ラット、Ｓ．ｓｃｒ；ブタ、Ｘ．ｌａｅ；アフリカツメガエル、Ｄ．ｒｅｒ；ゼブラフィッシュ、Ｄ．ｍｅｌ；ショウジョウバエ、Ａ．ｇａｍ；蚊、Ｎ．ｖｉｔ；宝石バチ、Ｃ．ｅｌｅ；線虫、を示す。【０１０６】
同様に、Ｏｒａｉ１はＯｒａｉ２およびＯｒａｉ３との配列類似性が高く、線虫、ヒト等の様々な種間で保存されている（図２Ａ）。図２Ａの略記はそれぞれ、ｈ；ヒト、ｍ；マウス、ｚ；ゼブラフィッシュ、ｘ；アフリカツメガエル、ｄ；ショウジョウバエ、ｃｅ；線虫、を示す。【０１０７】
また、Ｊα領域も、様々な植物種で高度に保存されている（図３）。図３の略記はそれぞれ、Ｏｓ；イネ  フォトトロピン１、Ｚｍ；トウモロコシ  フォトトロピン１、Ａｔ；シロイヌナズナ  フォトトロピン１およびフォトトロピン２、Ｐｓ；エンドウマメ  フォトトロピン１、Ｖｆ；ソラマメ  フォトトロピン１、Ａｃ；ホウライシダ  フィトクロム３、Ａｓ；オートムギ  フォトトロピン１、を示す（Ｈａｒｐｅｒら、２００４より引用）。【０１０８】
さらに、ＬＯＶ２領域も、前述のように多くの植物間で保存されており、例えば、オートムギのＬＯＶ２領域のアミノ酸配列との相同性は、アジアイネのフォトトロピン１；８１％、シロイヌナズナのフォトトロピン１；８７％、シロイヌナズナのフォトトロピン２；８３％、エンドウマメのフォトトロピン１；８７％、ソラマメのフォトトロピン１；トウモロコシのフォトトロピン１；９５％、トマトのフォトトロピン１；８７％である。【０１０９】
これらのことから、各領域は、様々な種のホモログで代用できる可能性がある。【０１１０】
以下に、本実施例で使用したプラスミドのコンストラクトを示す。【０１１１】
【表１１】
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【０１１２】
【表１２】
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【０１１３】
【表１３】
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【０１１４】
【表１４】
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【０１１５】
【表１５】
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【０１１６】
【表１６】
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【０１１７】
【表１７】
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【０１１８】
【表１８】
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【０１１９】
【表１９】
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【０１２０】
【表２０】
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【０１２１】
【表２１】
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【０１２２】
【表２２】
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【０１２３】
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１２．Ｍｕｌｌｉｎｓ，Ｆ．Ｍ．，Ｐａｒｋ，Ｃ．Ｙ．，Ｄｏｌｍｅｔｓｃｈ，Ｒ．Ｅ．＆Ｌｅｗｉｓ，Ｒ．Ｓ．ＳＴＩＭ１  ａｎｄ  ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔ  ｗｉｔｈ  Ｏｒａｉ１  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  Ｃａ２＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＡＣ  ｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０６，１５４９５−１５５００（２００９）．
１３．Ｍｕｚｕｍｄａｒ，Ｍ．Ｄ．，Ｔａｓｉｃ，Ｂ．，Ｍｉｙａｍｉｃｈｉ，Ｋ．，Ｌｉ，Ｌ．＆Ｌｕｏ，Ｌ．Ａ  ｇｌｏｂａｌ  ｄｏｕｂｌｅ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｒｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｍｏｕｓｅ．Ｇｅｎｅｓｉｓ  ４５，５９３−６０５（２００７）．
１４．Ｐａｒｋ，Ｃ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．ＳＴＩＭ１  ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ＣＲＡＣ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｖｉａ  ｄｉｒｅｃｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｔｏ  Ｏｒａｉ１．Ｃｅｌｌ  １３６，８７６−８９０（２００９）．
１５．Ｒａｎａ，Ａ．＆Ｄｏｌｍｅｔｓｃｈ，Ｒ．Ｅ．Ｕｓｉｎｇ  ｌｉｇｈｔ  ｔｏ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃａｓｃａｄｅｓ  ｉｎ  ｌｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２０，６１７−６２２（２０１０）．
１６．Ｓａｌｏｍｏｎ，Ｍ．，Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｋｎｉｅｂ，Ｅ．，Ｌｅｍｐｅｒｔ，Ｕ．＆Ｂｒｉｇｇｓ，Ｗ．Ｒ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＦＭＮ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌａｎｔ  ｂｌｕｅ  ｌｉｇｈｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｐｈｏｔｏｔｒｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９，９４０１−９４１０（２０００）．
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【図１】
2012111772.tif 000025
【図３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2012111772.tif 000031
【図４】
2012111772.tif 000032
【図５】
2012111772.tif 000033
【図６】
2012111772.tif 000034
【図７】
2012111772.tif 000035
【図８】
2012111772.tif 000036
【図９】
2012111772.tif 000037
【図１０】
2012111772.tif 000038
【配列表】
2012111772000001.app
【国際調査報告】
2012111772.tif 000039
2012111772.tif 000040
2012111772.tif 000041
2012111772.tif 000042