(57)【要約】要約  煩雑な操作を必要とすることなく、被検試料中のＨＤＬ２コレステロールを定量する方法が開示されている。コレステロールの定量方法は、ＨＤＬにホスフォリパーゼを作用させ、コレステロールを定量することを含む。被検試料中の高密度リポ蛋白質以外のコレステロールを反応系外に移行させる第一工程と、反応系内に残存する高密度リポ蛋白質のうち高密度リポ蛋白質２コレステロールを定量する第二工程を含み、第二工程をこの方法により行うことにより被検試料中の高密度リポ蛋白質２コレステロールを定量することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高密度リポ蛋白質にホスフォリパーゼを作用させ、コレステロールを定量することを含む、高密度リポ蛋白質２中のコレステロールの定量方法。
【請求項２】
前記ホスフォリパーゼが少なくともホスファチジルコリンに反応性を有する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ホスフォリパーゼがホスフォリパーゼC及び/又はホスフォリパーゼDである請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ホスフォリパーゼの濃度が0.1〜200U/ｍLである請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
ホスフォリパーゼを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により高密度リポ蛋白質２中のコレステロールを定量するためのキット。
【請求項６】
被検試料中の高密度リポ蛋白質以外のコレステロールを反応系外に移行させる第一工程と、反応系内に残存する高密度リポ蛋白質のうち高密度リポ蛋白質２コレステロールを定量する第二工程を含み、該第二工程を前記請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により行う、被検試料中の高密度リポ蛋白質２コレステロールの定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高密度リポタンパク質２（以下、「ＨＤＬ２」と呼ぶことがある）中のコレステロール（ＨＤＬ２中のコレステロールを以下、「ＨＤＬ２コレステロール」と呼ぶことがある）の定量方法およびそのための試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）は動脈硬化壁を含めた各組織からコレステロールを受け取るため細胞内に蓄積したコレステロールの除去作用に関係し、そのためコレステロール逆転送系ともいわれている。冠動脈硬化などの動脈硬化疾患と負の相関があることが知られており、ＨＤＬが低値であることは脂質異常症の一つとして低値限界が設けられており、動脈硬化の指標として有用であることが知られている。【０００３】
ＨＤＬはアポタンパク質とリン脂質、コレステロール、中性脂肪から構成されている。ＨＤＬは密度がｄ＝１．０６３〜１．２１０ｇ／ｍＬであり、さらにｄ＝１．０６３〜１．１２５ｇ／ｍＬであるＨＤＬ２とｄ＝１．１２５〜１．２１０ｇ／ｍＬであるＨＤＬ３の２つの分画に分類される。リポ蛋白の分布曲線によりｄ＝１．１２５ｇ／ｍＬ部分にノッチが認められ、ここから密度の重い部分をＨＤＬ３とされる。また、ＨＤＬ中のアポタンパク質のうちアポリポ蛋白Ｅ含有量差から、アポＥの含有量の多いＨＤＬをアポＥ−ｒｉｃｈ  ＨＤＬとする亜分画の分け方も存在する。【０００４】
従来までにＨＤＬ全体だけではなく、ＨＤＬ２およびＨＤＬ３それぞれの亜分画において異なった働きを示すことが知られている。ＨＤＬ２には抗動脈硬化作用があると言われている。臨床において、ＣＥＴＰ欠損によりＨＤＬがＬＤＬやＩＤＬに代謝されず、ＨＤＬコレステロール量が増加することが知られている。ＣＥＴＰ欠損により増加したＨＤＬはＨＤＬ２であるともいわれている。また、ＣＥＴＰ欠損によりアポＥ−ｒｉｃｈ  ＨＤＬが上昇するとも言われており、アポＥ―ｒｉｃｈ  ＨＤＬはコレステロール引き抜き能が強く抗血小板作用があり、ＨＤＬの中でもより善玉であるとも言われている。また、肝性リパーゼ活性の低下によりＨＤＬ３がＨＤＬ２に変化せず、ＨＤＬ３が増加する。つまり、ＨＤＬの亜分画はそれぞれ病態によりの比率が異なり、ＨＤＬのみを測定するだけでは、これらの変動が見えにくい。これらの傾向からＨＤＬ亜分画それぞれを測定することは、動脈硬化疾患や脂質異常症などの疾患の有無や原因を判断する助けとなることが予想される。また、現在、これらＨＤＬ亜分画の働きを踏まえ、ＣＥＴＰの働きを阻害し、ＬＤＬコレステロール量を減少させ、ＨＤＬコレステロール量を増加させる治療薬の開発が各メーカーで進められている。【０００５】
ＨＤＬ亜分画の簡便な測定方法を確立することは詳細な働きの解明や、これらの治療の効果へと繋がる可能性がある。【０００６】
現在までにＨＤＬ亜分画の測定法として知られているものとしては、超遠心法、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）法、ＨＤＬ３沈殿法（特許文献１）、ＮＭＲ法などが存在する。【０００７】
超遠心は遠心によりリポ蛋白の密度の差を利用して画分する方法であり、作業に熟練が必要なこと、日数がかかること、また費用も高額となる欠点がある。岡崎らによるＨＰＬＣを用いたＨＤＬ２とＨＤＬ３とを分ける方法では、作業に時間を要し、特別な機器が必要である。ＨＤＬ３沈殿法は２価金属イオンおよびデキストラン硫酸を含む試薬によりＨＤＬ３以外を凝集させ、遠心により上清部分のＨＤＬ３を回収し自動分析装置で測定する方法である。やはり、作業に熟練が必要であること、また用手法であり検体の前処理操作が必要であることもあり、測定までにある程度の時間がかかるといった欠点があり、汎用的ではなかった。また、ＮＭＲ法は核磁気共鳴によりリポ蛋白の粒子数を計測する方法であるが、特殊な機械が必要であり、一般的ではない。【０００８】
なお、ＨＤＬ亜画分の分析方法(特許文献２)が存在する。汎用自動分析装置により測定が可能であるが、界面活性剤を使用することによりＨＤＬ３以外のリポ蛋白を酵素の作用から阻害する方法を用いており、ＨＤＬ３を測定し総ＨＤＬからＨＤＬ３の値の差を求めることにより、ＨＤＬ２を測定することが可能であるが、直接ＨＤＬ２を測定できる方法ではない。【０００９】
このような方法に代わり、簡便でかつＨＤＬ２中コレステロール量をより選択的に定量できる試薬の発明が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００９−２０７４６３号公報
【特許文献２】特開２００１−３４６５９８号公報
【発明の概要】
【００１１】
本発明の目的は、煩雑な操作を必要とすることなく、被検試料中のＨＤＬ２コレステロールを定量する方法を提供することである。
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、煩雑な操作を必要とすることなく、被検試料中のＨＤＬ２コレステロールを定量する方法を提供することである。また、本発明の方法を用いてＨＤＬ２を定量するための試薬キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ホスフォリパーゼがＨＤＬ中においてＨＤＬ２に作用するが、ＨＤＬ3にはほとんど作用しない条件を見出し、ホスフォリパーゼを利用することによりＨＤＬ２を優先的に測定できる方法に至たり、これが実現可能であることを実験的に確認し、本発明を完成させた。【００１４】
すなわち、本発明は、ＨＤＬにホスフォリパーゼを作用させ、コレステロールを定量することを含む、ＨＤＬ２のコレステロールの定量方法を提供する。また、本発明は、ホスフォリパーゼを含む、上記本発明の方法により高密度リポ蛋白質２中のコレステロールを定量するためのキットを提供する。さらに本発明は、被検試料中の高密度リポ蛋白質以外のコレステロールを反応系外に移行させる第一工程と、反応系内に残存する高密度リポ蛋白質のうち高密度リポ蛋白質２コレステロールを定量する第二工程を含み、該第二工程を前記上記本発明の方法により行う、被検試料中の高密度リポ蛋白質２コレステロールの定量方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、被検試料中のＨＤＬ２コレステロールを、超遠心や前処理といった煩雑な作業を必要とせずに自動分析装置で特異的に定量することが可能となった。また、従来技術である被検体中ＨＤＬ総コレステロール定量法により得られた総ＨＤＬコレステロール量よりＨＤＬ２コレステロール量の差を算出することによりＨＤＬ３コレステロール量を定量することも可能となった。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
上記の通り、本発明のＨＤＬ２コレステロールの定量方法は、ＨＤＬにホスフォリパーゼを作用させ、コレステロールを定量することを含む。この定量方法を、生体から分離した被検試料から予めＨＤＬ以外のリポ蛋白質中のコレステロールを除外した試料に適用することにより、被検試料中のＨＤＬ２コレステロールを定量することができる。すなわち、被検試料中のＨＤＬ以外のコレステロールを反応系外に移行させる第一工程と、反応系内に残存するＨＤＬのうちＨＤＬ２コレステロールを定量する第二工程を含む、被検試料中のＨＤＬ２コレステロールの定量方法における第二工程として、上記本発明の方法を適用することにより、被検試料中のＨＤＬ２コレステロールを定量することができる。以下、この二工程法について説明する。なお、以下の説明では、二工程法を説明するが、この二工程法の第二工程が本発明の方法である（もっとも、この二工程法自体も本発明の方法である）。また、本発明の方法を行うために、以下の第一工程は必須的ではなく、生体から分離した被検試料から他の公知の方法、例えば、超遠心法等により、ＨＤＬのみを取り出し、本発明の方法（下記第二工程）を適用することによっても被検試料中のＨＤＬ２コレステロールを定量することが可能である。もっとも、この場合には、コレステロールの定量に必要な、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼを新たに供給する必要がある（以下の二工程法では第一工程で用いられるコレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼを第二工程で引き続き利用できる）。
【００１７】
本発明の方法に供される被検試料としては、その試料中のＨＤＬ２コレステロールを定量しようとするものであれば特に限定されないが、好ましくは、血清若しくは血漿又はこれらの希釈物であり、特に血清又はその希釈物が好ましい。
【００１８】
本発明で測定しようとするＨＤＬ２は、密度がｄ＝１．０６３〜１．１２５ｇ／ｍＬもしくは、粒子径が１２．１〜１６ｎｍに相当する部分など、ＨＤＬの中でもより大粒子なＨＤＬである。しかし、これらの定義はＨＤＬの連続した範囲の中での区切りであり、必ずしも上記の数値で明確に臨床的意義が限定されるものではない。一般的な報告でも密度の区切りが異なるものも存在するため、おおよそ上記の範囲の大粒子側のＨＤＬをＨＤＬ２とする。なお、大粒子側であれば、アポＥ−ｒｉｃｈ  ＨＤＬなども本発明の測定範囲に含まれる。
【００１９】
本発明の第一工程では、被検試料にコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼ等のコレステロール反応酵素に加え、ホスフォリパーゼやリポプロテインリパーゼを添加し反応させる。ホスフォリパーゼ、リポプロテインリパーゼは１種でも２種以上組み合わせて添加してもよい。加えて、第一工程では界面活性剤を使用することも可能であり、前述した酵素と界面活性剤を組み合わせて使用することも可能である。
【００２０】
本発明の方法の第一工程では、ＨＤＬ以外のリポ蛋白質コレステロールをコレステロールエステラーゼ等の作用により反応系外に移行させる。ここで、「反応系外に移行させる」とは、コレステロール及びそのエステルを消去又は保護することにより、その後の工程において、コレステロール及びそのエステルが関与しないようにすることを意味する。
【００２１】
ここで、「消去」とは、被検試料中のリポ蛋白のコレステロールを分解し、その後の工程において、コレステロール測定の反応に作用させないようにすることである。リポ蛋白コレステロールを消去するための方法としては、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ発生した過酸化水素を、カタラーゼを用いて水と酸素に分解する方法が挙げられる。また、ペルオキシダーゼを用いて水素供与体と発生した過酸化水素を反応させ無色キノンに転化してもよいが、これらに限定されるものではない。コレステロールの消去の方法自体はこの分野において周知である。
【００２２】
「保護」とは、被検試料中のリポ蛋白をその後の工程においてコレステロール測定に反応しないように、保護を行なうことである。リポ蛋白を保護するのには、各リポ蛋白をコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼが作用しないように特異的に保護する界面活性剤を用いる方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
第一工程は、反応系外に移行させるための酵素系や界面活性剤を単独または同時に添加しておくことにより、両工程を単一の工程として同時に行うこともできる。
【００２４】
第一工程において、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼを用いる場合、コレステロールエステラーゼの濃度（本明細書において、濃度は特に断りがない限り終濃度を意味する）は０．１〜１０．０Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、０．２〜２．０Ｕ／ｍＬ程度がより好ましい。コレステロールオキシダーゼの濃度は０．０５〜１０．０Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、０．１〜１．０Ｕ／ｍＬ程度がより好ましい。なお、コレステロールエステラーゼは、エステル型コレステロールに作用するものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、旭化成社製のコレステロールエステラーゼ(ＣＥＢＰ、ＣＥＮ)や東洋紡社製のコレステロールエステラーゼ(ＣＯＥ−３１１、ＣＯＥ−３１３)やキッコーマン社製のコレステロールエステラーゼ（ＣＨＥ−ＸＥ）などの市販品を用いることができる。また、コレステロールオキシダーゼは、遊離型コレステロールに作用するものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、旭化成社製のコレステロールオキシダーゼ(ＣＯＮII)や東洋紡社製のコレステロールオキシダーゼ（ＣＯＯ−３１１、ＣＯＯ−３２１、ＣＯＯ−３３１）やキッコーマン社製のコレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯ−ＣＥ、ＣＨＯ−ＰＥＷＬ、ＣＨＯ−ＢＳ）などの市販品を用いることができる。
【００２５】
コレステロールデヒドロゲナーゼを用いる場合は、０．０１〜２００Ｕ/ｍＬが好ましく、さらに好ましくは０．１〜１００Ｕ／ｍＬが好ましい。なお、コレステロールデヒドロゲナーゼとしては、コレステロールを酸化して酸化型補酵素を還元する能力を有する酵素であれば特に制限されるものではなく、例えば、天野エンザイム社製のコレステロールデヒドロゲナーゼ（ＣＨＤＨ−５）などの市販品を用いることが可能である。
【００２６】
さらにホスフォリパーゼやリポプロテインリパーゼを添加することが可能であり、その場合は０．０１〜０．５Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、０．０２〜０．５Ｕ／ｍＬがさらに好ましい。リポプロテインリパーゼ、ホスフォリパーゼは市販品を用いることが可能であり、例えば、東洋紡社製のリポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ−３１１やＬＰＬ−３１４）、天野エンザイム社製のリポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ−３など）、旭化成社製のリポプロテインリパーゼ（ＬＰＢＰやＬＰなど）を用いることができる。ホスフォリパーゼは、例えば旭化成社製のスフィンゴミエリナーゼ（ＳＰＣ）やホスフォリパーゼであるホスフォリパーゼＡ２（ＰＬＡ２Ｌ)、ホスフォリパーゼＤ（ＰＬＤまたはＰＬＤＰまたはＰＬＤＰＶ)、ホスフォリパーゼＣ（ＰＬＣ)を用いることが可能である。ただし、スフィンゴミエリナーゼを用いる場合は、スフィンゴミエリナーゼの終濃度は０．０５〜５０Ｕ/ｍＬ程度が好ましく、０．１〜３０Ｕ/ｍLがより好ましい。スフィンゴミエリナーゼは少なくともスフィンゴミエリンに作用するものであれば特に制限されるものではなく、スフィンゴミエリン以外のリン脂質を構成する成分であるホスファチジルイノシトールなどに対する活性を有してもよい。なお、第一工程におけるホスフォリパーゼの濃度とその他の条件下においてはＨＤＬ２への影響が少なくＨＤＬ以外のリポ蛋白へ作用させることが出来るため、ＨＤＬ以外を反応系外へ導きやすくなる。
【００２７】
界面活性剤を添加する場合は、０．００１〜５.０重量％濃度で添加するのが好ましく、０．００２〜３．０重量％程度がより好ましい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウムのような陰イオン界面活性剤；及び／又はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物、アミドノニオン、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ＨＬＢ値が１４〜１７のポリオキシエチレン多環フェニルエーテルのような非イオン系界面活性剤を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。より具体的には、プルロニックＰ１２３（アデカ）、プルロニックＦ６８（アデカ））、プルロニックＦ８８（アデカ）、レベノールＷＸ（花王)、ノニオンHS２２０(日油) 、ナイミッドＭＴ−２１５（日油）、Ｎｅｗｃｏｌ-７２３（日本乳化剤）、Ｎｅｗｃｏｌ−２６１４（日本乳化剤）、Ｎｅｗｃｏｌ−７１４（日本乳化剤）を挙げることができる。
【００２８】
第一工程で用いる反応液には通常の生化学反応に用いられる各種の緩衝液を使用することができ、ｐＨが５〜８の間であるのが好ましい。溶液としては、グッド、トリス、リン酸、グリシンの緩衝溶液が好ましく、グッド緩衝液であるビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシエチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、ピペラジン−１、４−ビス（２−エタンスルフォン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン−１、４−ビス（２−エタンスルフォン酸）、１．５ナトリウム塩、一水和物（ＰＩＰＥＳ１．５Ｎａ）、２−ヒドロキシ−3−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）―２―アミノエタンスルフォン酸（ＢＥＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルフォン酸（ＨＥＰＥＳ）およびピペラジン−１、４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルフォン酸）（ＰＯＰＳＯ）が好ましい。
【００２９】
第一工程においては、ＨＤＬ以外のリポ蛋白質を差別しやすくする目的で、一価またはニ価の陽イオンまたはそれらの塩を添加することができる。具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マンガン、塩化カルシウム、塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、硫酸リチウム、硫酸アンモニウム、酢酸マグネシウム等を用いることが可能である。濃度は１〜５０．０ｇ／Ｌが好ましく、さらに５〜３０ｇ／Ｌが好ましい。
【００３０】
第一工程の反応温度は２５〜４０℃程度が好ましく、さらに３５〜３８℃が好ましく、３７℃が最も好ましい。反応時間は特に限定されず、通常、２〜１０分程度である。
【００３１】
第一工程は、界面活性剤の非存在下で行うことが可能であるが、スフィンゴミエリナーゼ等の酵素と界面活性剤を組み合わせて使用しても構わない。
【００３２】
なお、第一工程に界面活性剤を共存させる場合でも、反応条件（反応温度、時間、緩衝液等）は上記の通りである。
【００３３】
続く第二工程では、反応系内に残存するＨＤＬのうちＨＤＬ２のコレステロールを定量する。これは、反応系内に残存するＨＤＬにホスフォリパーゼを作用させて、ＨＤＬ２のコレステロールを優先的に定量させることにより行われる。
【００３４】
第二工程で用いるホスフォリパーゼは少なくともグリセロリン脂質に対して作用すればよく、さらに少なくともホスファチジルコリンに活性を有するものであれば好ましいが、ホスファチジルコリン以外のリゾホスファエタノールアミン等や、または、グリセロリン脂質以外のスフィンゴミエリンやセラミドなどに対して活性を有していても構わない。ホスフォリパーゼは市販品を使用することが可能であり、具体的には、旭化成社製のホスフォリパーゼＡ２（ＰＬＡ２Ｌ)、ホスフォリパーゼＣ（ＰＬＣ)、ホスフォリパーゼＤ（ＰＬＤまたはＰＬＤＰまたはＰＬＤＰＶ）、リゾホスフォリパーゼ（ＬＹＰＬ)を用いることが可能であるが、特にホスフォリパーゼＣとホスフォリパーゼＤが好ましい。
【００３５】
第二工程においてホスフォリパーゼを用いる場合は、１種または２種以上を組み合わせて作用させてもよく、濃度（２種以上組み合わせる場合はその終濃度）は０．５〜２００Ｕ／ｍＬが好ましく、さらに１．０〜１００Ｕ／ｍLがより好ましく、さらに３．０〜５０Ｕ／ｍＬがより好ましい。第一工程でホスフォリパーゼを用いた場合は、第一工程で用いた濃度以上の濃度を第二工程で用いる。
【００３６】
第二工程においては、ホスフォリパーゼ等の作用を利用しコレステロールを定量する。コレステロールの定量方法自体は周知であり、周知のいずれの方法をも採用することができ、下記実施例にも具体的に記載されている。例えば、リポ蛋白中のエステル型コレステロールにコレステロールエステラーゼを用いて加水分解し、遊離型コレステロールと脂肪酸が生じ、生じた遊離型コレステロールと元来リポ蛋白中に存在する遊離コレステロールとをコレステロールオキシダーゼを用いてコレステノンと過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下でキノン色素を形成させ定量する。キノン色素を発生させる化合物として、例えばＨＤＡＯＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン）、ＤＡＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン）又はＴＯＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン）と４−アミノアンチピリンが挙げられるが、キノン色素を発生させることができる組み合わせであればこれらに限定されるものではない。第一工程でコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを用いる場合には、第二工程では、第一工程で用いたコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼをそのまま用いることができ、新たに添加する必要はない。
【００３７】
コレステロールに反応するコレステロール測定用酵素としてコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼを用いる場合、酵素反応により過酸化水素が発生する。発生した過酸化水素からペルオキシダーゼの存在下で水素供与体と水素受容体とのカップリング反応により形成した色素は波長４００〜７００ｎｍでの吸光度を測定することによりＨＤＬ２中のコレステロールを定量することができる。
【００３８】
コレステロールに反応するコレステロール測定用酵素としてコレステロールエステラーゼおよびコレステロールデヒドロゲナーゼを用いる場合、酵素反応によりＮＡＤ（Ｐ）からＮＡＤ（Ｐ）Ｈが発生する。発生したＮＡＤ（Ｐ）Ｈは波長３３０〜４００ｎｍでの吸光度を測定することによりＨＤＬ２中のコレステロールを定量することができる。
【００３９】
キノン色素を発生させる化合物の濃度は、例えば、ＨＤＡＯＳであれば濃度は０．５〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌ程度が好ましく、４−アミノアンチピリンであれば０．１〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、また、ペルオキシダーゼの濃度は０．４〜５．０Ｕ／ｍＬが好ましい。また、第一工程で発生した過酸化水素をカタラーゼで分解する工程ではカタラーゼの阻害剤であるアジ化ナトリウムを使用し、第二工程の反応液中へ添加する。この場合のアジ化ナトリウムの濃度は、通常、０．１ｇ／Ｌ〜１．０ｇ／Ｌ程度である。
【００４０】
第一工程において、ペルオキシダーゼを用いる場合、ペルオキシダーゼの濃度は２．０〜５．０Ｕ/ｍL程度が好ましく、さらに３．０〜４．０Ｕ/ｍL程度が好ましい。また、無色キノンに転化する化合物を用いる場合、その濃度は０．４〜０．８ｍｍoｌ／Ｌ程度が好ましい。
【００４１】
第二工程においては界面活性剤の存在は必須ではなく、添加していてもしていなくてもよい。添加する場合は、第一工程で用いる事のできる界面活性剤を第一工程の同濃度もしくはそれ以下の範囲内で添加する。
【００４２】
第二工程の他の反応条件（反応温度、時間、緩衝液、ｐＨ等）は上記した第一工程の反応条件と同様でよい。
【００４３】
上記までの第一工程と第二工程でＨＤＬ２コレステロールを測定する方法は、上記した各試薬を含む試薬キットとして組み合わせることが可能である。
【００４４】
さらに、被検試料中のＨＤＬコレステロール量から第一工程と第二工程から得られたＨＤＬ２コレステロール量の差を算出し、被検試料中のＨＤＬ３コレステロール量を求めることも可能である。被検試料中のＨＤＬコレステロール量を求める方法は周知であり（例えば、特開２００１−１０３９９８号公報）、そのためのキットも市販されているので、それらを用いて容易に定量することができる。
【００４５】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４６】
超遠心法を用いてＨＤＬ２とＨＤＬ３を回収し、下記調製試薬Ａを第一工程として調製試薬Ｉを第二工程として組み合わせて反応させ、第二工程でホスフォリパーゼＤを用いることによりＨＤＬ３よりもＨＤＬ２へ特異的に反応するか確認を行った。すなわち、この方法は具体的には次のようにして行った。超遠心法は臭化ナトリウム溶液などを用いることにより、血清などの被検試料のリポ蛋白の密度の差を利用しＣＭ、ＬＤＬ、ＨＤＬ２、ＨＤＬ３などの各分画を調製する方法である。本特許の実施例ではＨＤＬ２分画は密度ｄ＝１．０６３〜１．１２５ｇ/ｍL、ＨＤＬ３分画は密度ｄ＝１．１２５〜１．２１０ｇ／ｍＬの密度範囲中のリポ蛋白を含む分画である。測定は超遠心分画２μＬに対し第一工程用調製試薬を１５０μＬ混合し３７℃５分反応の後、第二工程用調製試薬を５０μＬの割合で混合し３７℃５分反応さる。波長は主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍを用いた。【００４７】
測定されたＨＤＬ２の吸光度をＨＤＬ３の吸光度で除する事により、ＨＤＬ２とＨＤＬ３の反応性の倍率を算出しＨＤＬ試薬で測定した場合との比較を行った。結果を表１に示す。ＨＤＬ試薬は本実施例ではＨＤＬ−ＥＸデンカ生研社製を使用した。【００４８】
調製試薬Ａ
ＢＥＳ緩衝液    １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ６．６
ＨＤＡＯＳ    ０．７ｍｍｏｌ／Ｌ
カタラーゼ    ６００Ｕ／mＬ
塩化ナトリウム    １ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ    １．４Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ    ０．８Ｕ／ｍＬ
プルロニックＦ６８    ０．２ｇ／Ｌ【００４９】
調製試薬Ｉ
ＢＥＳ緩衝液    １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ７．０
アジ化ナトリウム  ０．１％
４−アミノアンチピリン  ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ    ２．４Ｕ／ｍＬ
ホスフォリパーゼＤ（ＰＬＤＰ）    １．０Ｕ／ｍＬ【００５０】
【表１】
2012118017.tif 000002
【００５１】
各調製試薬の倍率はＨＤＬ試薬で測定した倍率よりも高い値を示し、ホスフォリパーゼＤを用いることによりＨＤＬ試薬よりもＨＤＬ２を優先的に測定している結果が得られた。
【実施例２】
【００５２】
実施例１と同様にして、超遠心法を用いてＨＤＬ２とＨＤＬ３を回収し、下記調製試薬ＢまたはＣを第一工程として調製試薬Ｉを第二工程として組み合わせて反応させた。ＨＤＬ２について測定された吸光度をＨＤＬ３について測定された吸光度で除する事により、ＨＤＬ２とＨＤＬ３の反応性の倍率を算出しＨＤＬ試薬で測定した場合との比較を行った。結果を表２に示す。ＨＤＬ試薬は本実施例ではＨＤＬ−ＥＸデンカ生研社製を使用した。【００５３】
調製試薬Ｂ
ＢＥＳ緩衝液    １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ６．６
ＨＤＡＯＳ    ０．７ｍｍｏｌ／Ｌ
カタラーゼ    ６００Ｕ／mＬ
塩化ナトリウム    １ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ    １．４Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ    ０．８Ｕ／ｍＬ
プルロニックＦ６８    ０．２５ｇ／Ｌ
スフィンゴミエリナーゼ    ０．５Ｕ／ｍＬ【００５４】
調製試薬Ｃ
ＢＥＳ緩衝液    １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ６．６
ＨＤＡＯＳ    ０．７ｍｍｏｌ／Ｌ
カタラーゼ    ６００Ｕ／ｍＬ
塩化ナトリウム    １ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ    １．４Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ    ０．８Ｕ／ｍＬ
プルロニックＦ６８    ０．２５ｇ／Ｌ
スフィンゴミエリナーゼ    １．０Ｕ／ｍＬ【００５５】
調製試薬Ｉ
ＢＥＳ緩衝液    １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ７．０
アジ化ナトリウム  ０．１％
４−アミノアンチピリン  ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ    ２．４Ｕ／ｍＬ
ホスフォリパーゼＤ（ＰＬＤＰ）    １．０Ｕ／ｍＬ【００５６】
【表２】
2012118017.tif 000003
【００５７】
各調製試薬の倍率はＨＤＬ試薬で測定した倍率よりも高い値を示し、第一工程でスフィンゴミエリナーゼを用い、第二工程でホスフォリパーゼＤを用いることにより、ＨＤＬ試薬よりもＨＤＬ２を優先的に測定している結果が得られた。
【実施例３】
【００５８】
実施例１と同様にして、超遠心法を用いてＨＤＬ２とＨＤＬ３を回収し、下記調製試薬Ｄ〜Ｆを第一工程として調製試薬Ｉを第二工程として組み合わせて反応させ、第一工程で第二工程よりも低濃度のホスフォリパーゼＤを用い、加えて第二工程においてもホスフォリパーゼＤを用いることによりＨＤＬ３よりもＨＤＬ２へ特異的に反応するか確認を行った。結果はＨＤＬ２の吸光度をＨＤＬ３の吸光度で除する事により、ＨＤＬ２とＨＤＬ３の反応性の倍率を算出しＨＤＬ試薬で測定した場合との比較を行った。結果を表３に示す。ＨＤＬ試薬は本実施例ではＨＤＬ−ＥＸデンカ生研社製を使用した。【００５９】
調製試薬Ｄ
ＢＥＳ緩衝液    １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ６．６
ＨＤＡＯＳ    ０．７ｍｍｏｌ／Ｌ
カタラーゼ    ６００Ｕ／ｍＬ
塩化ナトリウム    １ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ    １．４Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ    ０．８Ｕ／ｍＬ
プルロニックＦ６８    ０．２５ｇ／Ｌ
ホスフォリパーゼＤ（ＰＬＤＰ）    ０．１Ｕ／ｍＬ【００６０】
調製試薬Ｅ
ＢＥＳ緩衝液    １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ６．６
ＨＤＡＯＳ    ０．７ｍｍｏｌ／Ｌ
カタラーゼ    ６００Ｕ／ｍＬ
塩化ナトリウム    １ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ    １．４Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ    ０．８Ｕ／ｍＬ
プルロニックＦ６８    ０．２５ｇ／Ｌ
ホスフォリパーゼＤ（ＰＬＤＰ）    ０．３Ｕ／ｍＬ【００６１】
調製試薬Ｆ
ＢＥＳ緩衝液    １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ６．６
ＨＤＡＯＳ    ０．７ｍｍｏｌ／Ｌ
カタラーゼ    ６００Ｕ／ｍＬ
塩化ナトリウム    １ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ    １．４Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ    ０．８Ｕ／ｍＬ
プルロニックＦ６８    ０．２５ｇ／Ｌ
ホスフォリパーゼＤ（ＰＬＤＰ）    ０．５Ｕ／ｍＬ【００６２】
調製試薬Ｉ
ＢＥＳ緩衝液    １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ７．０
アジ化ナトリウム  ０．１％
４−アミノアンチピリン  ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ    ２．４Ｕ／ｍＬ
ホスフォリパーゼＤ（ＰＬＤＰ）    １．０Ｕ／ｍＬ【００６３】
【表３】
2012118017.tif 000004
【００６４】
各調製試薬の倍率はＨＤＬ試薬で測定した倍率よりも高い値を示し、第一工程で第二工程よりも低濃度のホスフォリパーゼＤを用い、加えて第二工程においてもホスフォリパーゼＤを用いることにより、ＨＤＬ試薬よりもＨＤＬ２を優先的に測定している結果が得られた。
【実施例４】
【００６５】
実施例１と同様にして、超遠心法を用いてＨＤＬ２とＨＤＬ３を回収し、下記調製試薬ＧまたはＨを第一工程として調製試薬Ｉを第二工程として組み合わせて反応させ、第一工程でスフィンゴミエリナーゼと第二工程よりも低濃度のホスフォリパーゼＤを用い、加えて第二工程においてもホスフォリパーゼＤを用いることによりＨＤＬ３よりもＨＤＬ２へ特異的に反応するか確認を行った。結果はＨＤＬ２の吸光度をＨＤＬ３の吸光度で除する事により、ＨＤＬ２とＨＤＬ３の反応性の倍率を算出しＨＤＬ試薬で測定した場合との比較を行った。結果を表４に示す。ＨＤＬ試薬は本実施例ではＨＤＬ−ＥＸデンカ生研社製を使用した。【００６６】
調製試薬Ｇ
ＢＥＳ緩衝液    １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ６．６
ＨＤＡＯＳ    ０．７ｍｍｏｌ／Ｌ
カタラーゼ    ６００Ｕ／ｍＬ
塩化ナトリウム    １ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ    １．４Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ    ０．８Ｕ／ｍＬ
プルロニックＦ６８    ０．２５ｇ／Ｌ
スフィンゴミエリナーゼ    ０．５Ｕ／ｍＬ
ホスフォリパーゼＤ（ＰＬＤＰ）    ０．１Ｕ／ｍＬ【００６７】
調製試薬Ｈ
ＢＥＳ緩衝液    １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ６．６
ＨＤＡＯＳ    ０．７ｍｍｏｌ／Ｌ
カタラーゼ    ６００Ｕ／ｍＬ
塩化ナトリウム    １ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ    １．４Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ    ０．８Ｕ／ｍＬ
プルロニックＦ６８    ０．２５ｇ／Ｌ
スフィンゴミエリナーゼ    ０．５Ｕ／ｍＬ
ホスフォリパーゼＤ（ＰＬＤＰ）    ０．３Ｕ／ｍＬ【００６８】
調製試薬Ｉ
ＢＥＳ緩衝液    １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ７．０
アジ化ナトリウム  ０．１％
４−アミノアンチピリン  ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ    ２．４Ｕ／ｍＬ
ホスフォリパーゼＤ（ＰＬＤＰ）    １．０Ｕ／ｍＬ【００６９】
【表４】
2012118017.tif 000005
【００７０】
各調製試薬の倍率はＨＤＬ試薬で測定した倍率よりも高い値を示し、第一工程でスフィンゴミエリナーゼと第二工程よりも低濃度のホスフォリパーゼＤを用い、加えて第二工程においてもホスフォリパーゼＤを用いることにより、ＨＤＬ試薬よりもＨＤＬ２を優先的に測定している結果が得られた。
【実施例５】
【００７１】
実施例１と同様にして、超遠心法を用いてＨＤＬ２とＨＤＬ３分画を回収し、下記調製試薬Ｂを第一工程として、調製試薬ＪまたはＫを第二工程として組み合わせて反応させ、第一工程でスフィンゴミエリナーゼを用い、第二工程でホスフォリパーゼＣを用いることによりＨＤＬ３よりもＨＤＬ２へ特異的に反応するか確認を行った。結果はＨＤＬ２の吸光度をＨＤＬ３の吸光度で除する事により、ＨＤＬ２とＨＤＬ３の反応性の倍率を算出しＨＤＬ試薬で測定した場合との比較を行った。結果を表５に示す。ＨＤＬ試薬は本実施例ではＨＤＬ−ＥＸデンカ生研社製を使用した。【００７２】
調製試薬Ｂ
ＢＥＳ緩衝液    １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ６．６
ＨＤＡＯＳ    ０．７ｍｍｏｌ／Ｌ
カタラーゼ    ６００Ｕ／ｍＬ
塩化ナトリウム    １ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ    １．４Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ    ０．８Ｕ／ｍＬ
プルロニックＦ６８    ０．２５ｇ／Ｌ
スフィンゴミエリナーゼ    ０．５Ｕ／ｍＬ【００７３】
調製試薬Ｊ
ＢＥＳ緩衝液    １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ７．０
アジ化ナトリウム  ０．１％
４−アミノアンチピリン  ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ    ２．４Ｕ／ｍＬ
ホスフォリパーゼＣ    １．０Ｕ／ｍＬ【００７４】
調製試薬Ｋ
ＢＥＳ緩衝液    １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ７．０
アジ化ナトリウム  ０．１％
４−アミノアンチピリン  ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ    ２．４Ｕ／ｍＬ
ホスフォリパーゼＣ    ２．０Ｕ／ｍＬ【００７５】
【表５】
2012118017.tif 000006
【００７６】
各調製試薬の倍率はＨＤＬ試薬で測定した倍率よりも高い値を示し、第一工程でスフィンゴミエリナーゼを用い、第二工程でホスフォリパーゼＣを用いることによりＨＤＬ試薬よりもＨＤＬ２を優先的に測定している結果が得られた。
【実施例６】
【００７７】
実施例１と同様にして、超遠心法を用いてＨＤＬ２とＨＤＬ３分画を回収し、調製試薬Ｂを第一工程として、下記調製試薬ＬまたはＭを第二工程として組み合わせて反応させ、第二工程においてホスフォリパーゼＣまたはＤを用いることによりＨＤＬ３よりもＨＤＬ２へ特異的に反応することを確認した。結果はＨＤＬ２の吸光度をＨＤＬ３の吸光度で除する事により、ＨＤＬ２とＨＤＬ３の反応性の倍率を算出しＨＤＬ試薬で測定した場合との比較を行った。結果を表６に示す。ＨＤＬ試薬は本実施例ではＨＤＬ−ＥＸデンカ生研社製を使用した。【００７８】
調製試薬Ｌ
ＢＥＳ緩衝液    １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ７．０
アジ化ナトリウム  ０．１％
４−アミノアンチピリン  ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ    ２．４Ｕ／ｍＬ
ホスフォリパーゼＤ（ＰＬＤＰ）    ２．０Ｕ／ｍＬ【００７９】
調製試薬Ｍ
ＢＥＳ緩衝液    １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ７．０
アジ化ナトリウム  ０．１％
４−アミノアンチピリン  ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ    ２．４Ｕ／ｍＬ
プルロニックＦ６８    ０．２５ｇ／L
ホスフォリパーゼＣ    １．０Ｕ／ｍＬ【００８０】
【表６】
2012118017.tif 000007
【００８１】
各調製試薬の倍率はＨＤＬ試薬で測定した倍率よりも高い値を示し、第二工程においてホスフォリパーゼＣまたはＤを用いることにより、ＨＤＬ試薬よりもＨＤＬ２を優先的に測定している結果が得られた。
【実施例７】
【００８２】
実施例１と同様にして、超遠心法を用いてＨＤＬ２とＨＤＬ３分画を回収し、下記調製試薬Ｎを第一工程として、調製試薬ＪまたはＫを第二工程として組み合わせて反応させ、第二工程においてホスフォリパーゼＣを用いることによりＨＤＬ３よりもＨＤＬ２へ特異的に反応することを確認した。結果はＨＤＬ２をＨＤＬ３で除する事により、ＨＤＬ２とＨＤＬ３の反応性の倍率を算出しＨＤＬ試薬で測定した場合との比較を行った。結果を表７に示す。ＨＤＬ試薬は本実施例ではＨＤＬ−ＥＸデンカ生研社製を使用した。【００８３】
調製試薬Ｎ
ＢＥＳ緩衝液    １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ６．６  ＨＤＡＯＳ    ０．７ｍｍｏｌ／Ｌ
カタラーゼ    ６００Ｕ／ｍＬ
塩化ナトリウム    １ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ    １．４Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ    ０．８Ｕ／ｍＬ【００８４】
【表７】
2012118017.tif 000008
【００８５】
各調製試薬の倍率はＨＤＬ試薬で測定した倍率よりも高い値を示し、第二工程においてホスフォリパーゼＣを用いることにより、ＨＤＬ試薬よりもＨＤＬ２を優先的に測定している結果が得られた。
【実施例８】
【００８６】
実施例１と同様にして、超遠心法を用いてＨＤＬ２とＨＤＬ３分画を回収し、調製試薬Ｎを第一工程として、調製試薬ＬまたはＭを第二工程として組み合わせて反応させ第二工程においてホスフォリパーゼＣまたはＤを用いることによりＨＤＬ３よりもＨＤＬ２へ特異的に反応することを確認した。結果はＨＤＬ２の吸光度をＨＤＬ３の吸光度で除する事により、ＨＤＬ２とＨＤＬ３の反応性の倍率を算出しＨＤＬ試薬で測定した場合との比較を行った。結果を表８に示す。ＨＤＬ試薬は本実施例ではＨＤＬ−ＥＸデンカ生研社製を使用した。【００８７】
【表８】
2012118017.tif 000009
【００８８】
各調製試薬の倍率はＨＤＬ試薬で測定した倍率よりも高い値を示し、第二工程においてホスフォリパーゼＣまたはＤを用いることにより、ＨＤＬ試薬よりもＨＤＬ２を優先的に測定している結果が得られた。
【実施例９】
【００８９】
超遠心法を用いてＨＤＬ２とＨＤＬ３分画を回収し、下記調製試薬Ｖを第一工程として、調製試薬Ｊ〜Ｋを第二工程として組み合わせて反応させ、第一工程へリポプロテインリパーゼを用い、第二工程でホスフォリパーゼＣを用いることにより、ＨＤＬ３よりもＨＤＬ２へ特異的に反応するか確認を行った。結果はＨＤＬ２の吸光度をＨＤＬ３の吸光度で除する事により、ＨＤＬ２とＨＤＬ３の反応性の倍率を算出しＨＤＬ試薬で測定した場合との比較を行った。結果を表９に示す。ＨＤＬ試薬は本実施例ではＨＤＬ−ＥＸデンカ生研社製を使用した。【００９０】
調製試薬V
ＢＥＳ緩衝液    １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ６．６
ＨＤＡＯＳ    ０．７ｍｍｏｌ／Ｌ
カタラーゼ    ６００Ｕ／ｍＬ
塩化ナトリウム    １ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ    １．４Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ    ０．８Ｕ／ｍＬ
リポプロテインリパーゼ(ＬＰＬ―３１１）  ０．１Ｕ/ｍＬ【００９１】
【表９】
2012118017.tif 000010
【００９２】
各調製試薬の倍率はＨＤＬ試薬で測定した倍率よりも高い値を示し、第一工程へリポプロテインリパーゼを用い、第二工程でホスフォリパーゼＣを用いることにより、ＨＤＬ試薬よりもＨＤＬ２を優先的に測定している結果が得られた
【実施例１０】
【００９３】
実施例１と同様にして、超遠心法を用いてＨＤＬ２とＨＤＬ３分画を回収し、下記調製試薬Ｗを第一工程として、調製試薬Ｉ、Ｌを第二工程として組み合わせて反応させた。第一工程へリポプロテインリパーゼを用い、第二工程でホスフォリパーゼＤを用いることにより、ＨＤＬ３よりもＨＤＬ２へ特異的に反応するか確認を行った。結果はＨＤＬ２の吸光度をＨＤＬ３の吸光度で除する事により、ＨＤＬ２とＨＤＬ３の反応性の倍率を算出しＨＤＬ試薬で測定した場合との比較を行った。結果を表１０に示す。ＨＤＬ試薬は本実施例ではＨＤＬ−ＥＸデンカ生研社製を使用した。【００９４】
調製試薬W
ＢＥＳ緩衝液    １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐH６．６
ＨＤＡＯＳ    ０．７ｍｍｏｌ／Ｌ
カタラーゼ    ６００Ｕ／ｍＬ
塩化ナトリウム    １ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ    １．４Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ    ０．８Ｕ／ｍＬ
スフィンゴミエリナーゼ  ０．５Ｕ／ｍＬ
リポプロテインリパーゼ(ＬＰＬ−３１１）  ０．１Ｕ／ｍＬ【００９５】
【表１０】
2012118017.tif 000011
【００９６】
各調製試薬の倍率はＨＤＬ試薬で測定した倍率よりも高い値を示し、第一工程へリポプロテインリパーゼを用い、第二工程でホスフォリパーゼＣまたはＤを用いることによりＨＤＬ試薬よりもＨＤＬ２を優先的に測定している結果が得られた
【実施例１１】
【００９７】
超遠心法を用いてＣＭ、ＶＬＤＬ分画とＬＤＬ分画を回収し、調製試薬Ｂを第一工程として、調製試薬Ｊ、Ｋ、Ｉ、Ｌを第二工程として組み合わせて反応させ、第一工程にスフィンゴミエリナーゼを用い、第二工程にホスフォリパーゼを用いることにより、第一工程においてＨＤＬ以外のリポ蛋白質を消去し反応に影響しないことを確認した。一般的にＨＤＬ以外のリポ蛋白への影響の少ないＨＤＬ試薬と比較した比較率を算出し、ＨＤＬ以外のリポ蛋白の測定への影響を検討した。結果を表11に示す。ＨＤＬ試薬は本実施例ではＨＤＬ−ＥＸデンカ生研社製を使用した。【００９８】
比較率＝検討試薬吸光度／ＨＤＬ試薬吸光度×１００【００９９】
【表１１】
2012118017.tif 000012
【０１００】
ＣＭ、ＶＬＤＬ分画およびＬＤＬ分画については、一般的なＨＤＬ試薬と同等程度若しくはそれ以下であり、ＨＤＬ以外のリポ蛋白の影響はなかった。
【国際調査報告】
2012118017.tif 000013
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2012118017.tif 000016