(57)【要約】【課題】スイッチング機能（血液成分中において蛍光色素が消光し、イメージングすべき腫瘍や炎症部位で蛍光を発する機能）を有する新規なイメージング用蛍光ナノ粒子プローブを提供する。【解決手段】親水性ブロック鎖と疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックポリマーからなる分子集合体とそれに内包されている蛍光色素を含む蛍光ナノ粒子プローブであって、(a)親水性ブロック鎖が、サルコシン単位及びアルキレンオキシド単位から選ばれる単位を親水性必須構成単位として含むものであり、(b)疎水性ブロック鎖が、アミノ酸単位及びヒドロキシル酸単位からなる群から選ばれる単位を疎水性必須構成単位として含むものであり、(c)蛍光色素が下記式(I)：  【化１】2012118136.tif 000051で示される蛍光基と、乳酸単位を５〜５０有するポリ乳酸基とを含むポリ乳酸結合シアニン化合物であり、前記蛍光色素が前記分子集合体１個当たり複数分子内包される、蛍光ナノ粒子プローブ。【選択図】図１
2012118136.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性ブロック鎖と疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックポリマーからなる分子集合体と、前記分子集合体に内包されている蛍光色素を含む蛍光ナノ粒子プローブであって、
（ａ）前記親水性ブロック鎖が、サルコシン単位及びアルキレンオキシド単位から選ばれる単位を親水性必須構成単位として含み且つ前記親水性必須構成単位を２０個以上有するものであり、
（ｂ）前記疎水性ブロック鎖が、アミノ酸単位及びヒドロキシル酸単位からなる群から選ばれる単位を疎水性必須構成単位として含み、且つ前記疎水性必須構成単位を１５個以上有するものであり、
（ｃ）前記蛍光色素が、下記構造式（I）：
【化１】
2012118136.tif 000040
（式（I）中、Ｒ１は、置換されていてもよい炭化水素基であり、Ｒ２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基であり；Ａ−は陰イオンであり、ｍは０又は１であり；環Ｂ及び環Ｄは、それぞれ同一又は異なっていてもよい含窒素複素環であり；Ｌは、環状構造を含んでいてもよく、置換されていてもよいポリメチン鎖を構成する連結基である。）で示される蛍光基と、乳酸単位を５〜５０個有するポリ乳酸基とを含むポリ乳酸結合シアニン化合物であり、
前記蛍光色素が前記分子集合体１個当たり複数分子内包される、蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項２】
前記蛍光色素が、前記分子集合体に、前記両親媒性ブロックポリマー及び前記蛍光色素の合計に対し１〜５０ｍｏｌ％となる量で内包される、請求項１に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項３】
細胞に接触又は取り込まれた場合の蛍光強度が、血中成分に接触した場合の蛍光強度の１０倍以上である、請求項１又は２に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項４】
Ｌが表す前記連結基が、以下に示す構造：
【化２】
2012118136.tif 000041
（式中、Ｒ３及びＲ３’は、水素であるか、又はそれらが互いに連結して前記環状構造を形成するものであり；Ｘは水素又はハロゲンである。）のいずれかを有するものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項５】
前記環Ｂが以下に示す構造：
【化３】
2012118136.tif 000042
（式中、Ｒ１は、置換されていてもよい炭化水素基であり、Ｒ４及びＲ５は、水素又はアニオン性置換基であるか、若しくはそれらが互いに連結してアリール環を形成するものである。）のいずれかであり、
前記環Ｄが以下に示す構造： 
【化４】
2012118136.tif 000043
（式中、Ｒ２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基であり、Ｒ４及びＲ５は、水素又はアニオン性置換基であるか、若しくはそれらが互いに連結してアリール環を形成するものである。）のいずれかである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項６】
前記蛍光基が、下記構造式（II）：
【化５】
2012118136.tif 000044
（式中、Ｒ１は、置換されていてもよい炭化水素基であり、Ｒ２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基であり；Ｒ３及びＲ３’は、水素であるか、又はそれらが互いに連結して環状構造を形成するものであり；Ｘは水素又はハロゲンであり；Ａ−は陰イオンであり、ｍは０又は１であり；環Ｂ及び環Ｄは、それぞれ同一又は異なっていてもよい含窒素縮合芳香族複素環であり；Ｒ４及びＲ５は、水素又はアニオン性置換基であるか、若しくはそれらが互いに連結してアリール環を形成するものである。）で示されるものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項７】
前記蛍光基が、下記構造式（III）：
【化６】
2012118136.tif 000045
（式中、Ｒ２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基である。）
で示されるものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項８】
前記蛍光基が、下記構造式（IV）：
【化７】
2012118136.tif 000046
（式中、Ｒ２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基である。）
で示されるものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項９】
前記蛍光基が下記式（X）：
【化８】
2012118136.tif 000047
（式中、Ｒ２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基である。）
で示されるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項１０】
前記蛍光色素が下記式（III-i）：
【化９】
2012118136.tif 000048
（式中、ｎは５〜５０の整数である。）
である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項１１】
前記蛍光色素が下記式（IV-i）：
【化１０】
2012118136.tif 000049
（式中、ｎは５〜５０の整数である。）
である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項１２】
前記蛍光色素が下記式（X-i）：
【化１１】
2012118136.tif 000050
（式中、ｎは５〜５０の整数である。）
である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項１３】
前記疎水性ブロック鎖が、
疎水性アミノ酸単位を１０個以上有する疎水性ポリペプチド鎖、
ヒドロキシル酸単位を１５個以上有する疎水性ポリエステル鎖、及び、
アミノ酸単位及びヒドロキシル酸単位の両方を合計２０個以上有する疎水性デプシペプチド鎖、
からなる群から選ばれる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項１４】
前記疎水性ブロック鎖が、２５個以上の乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項１５】
前記親水性ブロック鎖が抗体を有することにより、表面が前記抗体によって修飾された請求項１〜１４のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項１６】
前記抗体が、腫瘍が有する物質に対する抗体である、請求項１５に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブを非ヒト動物に投与する工程と、蛍光を検出する工程とを含む、蛍光分子イメージング法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体適合性を有する両親媒性物質からなる分子集合体に蛍光色素を内包してなる蛍光ナノ粒子及びそれをプローブとして用いた蛍光イメージングに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年ナノテクノロジーへの関心が高まっており、ナノサイズ物質特有の性質を活かした新規機能性材料が開発されている。この新規機能性材料は、エネルギー、エレクトロニクス、及び医薬などの幅広い分野での応用が可能となっている。ナノテクノロジーは、なかでも、生体試料中の物質の検出、in vivo でのイメージングにおいて注目を浴びている。【０００３】
医薬の分野においては、腫瘍部分に近赤外蛍光色素を集め、腫瘍部分をイメージングする近赤外蛍光撮影法が注目されている。この方法においては、励起光照射により近赤外領域に蛍光を放射する性質を持つ化合物を、造影剤として生体内に投与する。次に身体の外側から近赤外の波長である励起光を照射し、腫瘍部分に集まった蛍光造影剤から放射される蛍光を検出して、病変部位を確定するものである。【０００４】
イメージング用プローブとして用いられる物質は、主としてキャリア剤と蛍光色素とからなり、それぞれ様々な態様のものが報告されている。
キャリア剤としては、リポソームナノ粒子（特開２００５−２２００４５号公報（特許文献１））、ペプチド性ナノ粒子（Journal of Controlled Release 51 (1998) 241-248（非特許文献１）、疎水性ブロックとしてポリグルタミン酸メチルエステルを有する両親媒性ブロックポリマーを用いたナノ粒子（特開２００８−０２４８１６号公報（特許文献２））、ポリサルコシン鎖とポリ乳酸鎖とから構成される両親媒性ブロックポリマーを用いたナノ粒子（Chemistry Letters, vol.36, no.10, 2007, p.1220-1221（非特許文献２））、ポリサルコシン鎖とポリ乳酸鎖とから構成される両親媒性ブロックポリマーと、ポリ乳酸とを用いたナノ粒子（国際公開第２００９／１４８１２１号パンフレット（特許文献３））等が挙げられる。【０００５】
蛍光色素はキャリア剤に共有結合により結合又は非共有結合により内包されるものであり、フルオレセイン系色素、シアニン系色素、ローダミン系色素などが用いられる。シアニン系色素としては、インドシアニングリーン（ICG）が用いられることが多いが、様々なインドシアニン誘導体が開発されている（Bioconjugate Chem. 1996, 7, 356-362（非特許文献３）、日本薬学会第１３１年会、２９ｐ−ａｍ３９５Ｑポスター、２０１０年３月２９日（非特許文献４））。また、インドシアニン誘導体と消光剤とを同時内包させることにより消光したナノ粒子に、腫瘍組織に到達した際に蛍光性を獲得させる方法も報告されている（Cancer Research, 60, 4953-4958, September 1, 2000（非特許文献５）、Bioconjugate Chem. 2002, 13, 605-610（非特許文献６）、Cancer Research, 2009; 69: (4). February 15, 2009（非特許文献７））。【０００６】
より具体的には、上記非特許文献４においては、ポリサルコシン鎖とポリ乳酸鎖とからなる両親媒性ポリマー（PSar70-PLLA30）の6mg/mL溶液500μLとインドシアニン誘導体IC7-1の1mg/mL溶液3.16μLとからナノ粒子IC7-1 lactosomeを作成したことが開示されている。すなわち、このナノ粒子IC7-1 lactosomeにおけるインドシアニン誘導体IC7-1の内包量が0.48mol%であることが開示されている。この内包量は、ナノ粒子IC7-1 lactosome１個に対してインドシアニン誘導体IC7-1分子１個に相当する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−２２００４５号公報
【特許文献２】特開２００８−０２４８１６号公報
【特許文献３】国際公開第２００９／１４８１２１号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】「ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Journal of Controlled Release）」、第51巻、1998年、ｐ．241−248
【非特許文献２】「ケミストリ・レターズ（Chemistry Letters）」、第36巻、第10号、2007年、p.1220-1221
【非特許文献３】「バイオコンジュゲート・ケミストリ（Bioconjugate Chemistry）」 1996年, 第7巻, p.356-362
【非特許文献４】日本薬学会第１３１年会、２９ｐ−ａｍ３９５Ｑポスター、２０１０年３月２９日
【非特許文献５】「キャンサー・リサーチ（Cancer Research）」, 第60巻, p.4953-4958, 2000年9月1日
【非特許文献６】「バイオコンジュゲート・ケミストリ（Bioconjugate Chemistry）2002年, 第13巻, p.605-610
【非特許文献７】「キャンサー・リサーチ（Cancer Research）」2009年; 第69巻: (第4号). 2009年2月15日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、スイッチング機能（ナノ粒子調製時及び血液成分中において蛍光色素が消光し、イメージングすべき腫瘍又は炎症部位で蛍光を発する機能）を有する新規なイメージング用蛍光ナノ粒子プローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、シアニン系蛍光化合物が高濃度内包されることにより自己消光したナノ粒子が、血中成分に接触することによって蛍光強度を回復するという驚くべき効果をすでに見出している。本発明者らは、さらに鋭意検討の結果、ポリ乳酸結合シアニン系蛍光化合物が高濃度内包されることにより自己消光したナノ粒子が、血中成分との接触では自己消光状態を保ち、細胞に接触又は取り込まれることによって蛍光強度を回復するというさらなる驚くべき効果を見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下のスイッチング型蛍光ナノ粒子プローブ及びそれを用いたイメージング法を含む。【００１１】
（１）
親水性ブロック鎖と疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックポリマーからなる分子集合体と、前記分子集合体に内包されている蛍光色素を含む蛍光ナノ粒子プローブであって、
（ａ）前記親水性ブロック鎖が、サルコシン単位及びアルキレンオキシド単位から選ばれる単位を親水性必須構成単位として含み且つ前記親水性必須構成単位を２０個以上有するものであり、
（ｂ）前記疎水性ブロック鎖が、アミノ酸単位及びヒドロキシル酸単位からなる群から選ばれる単位を疎水性必須構成単位として含み、且つ前記疎水性必須構成単位を１５個以上有するものであり、
（ｃ）前記蛍光色素が、下記構造式（I）：
【化１】
2012118136.tif 000003
（式（I）中、Ｒ１は、置換されていてもよい炭化水素基であり、Ｒ２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基であり；Ａ−は陰イオンであり、ｍは０又は１であり；環Ｂ及び環Ｄは、それぞれ同一又は異なっていてもよい含窒素複素環であり；Ｌは、環状構造を含んでいてもよく、置換されていてもよいポリメチン鎖を構成する連結基である。）で示される蛍光基と、乳酸単位を５〜５０個有するポリ乳酸基とを含むポリ乳酸結合シアニン化合物であり、
前記蛍光色素が前記分子集合体１個当たり複数分子内包される、蛍光ナノ粒子プローブ。【００１２】
上述のスイッチング型蛍光ナノ粒子プローブにおいては、内包された複数分子の蛍光色素が会合することによって、蛍光が消光している。【００１３】
（２）
前記蛍光色素が、前記分子集合体に、前記両親媒性ブロックポリマー及び前記蛍光色素の合計に対し１〜５０ｍｏｌ％となる量で内包される、（１）に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。【００１４】
上記の蛍光ナノ粒子における蛍光色素内包量は、粒子１個に対して蛍光色素が２〜２００分子に相当する。【００１５】
（３）
細胞に接触又は取り込まれた場合の蛍光強度が、血中成分に接触した場合の蛍光強度の１０倍以上である、（１）又は（２）に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
上記蛍光強度が１０倍となる場合の一例として、蛍光色素内包量が２０ｍｏｌ％（すなわち蛍光ナノ粒子１個に対して蛍光色素が５０分子に相当）である場合が挙げられる。蛍光ナノ粒子プローブの蛍光強度は、細胞に添加することにより上昇し、添加２４時間後において１０倍以上に達しうる。【００１６】
（４）
Ｌが表す前記連結基が、以下に示す構造：
【化２】
2012118136.tif 000004
（式中、Ｒ３及びＲ３’は、水素であるか、又はそれらが互いに連結して前記環状構造を形成するものであり；Ｘは水素又はハロゲンである。）のいずれかを有するものである、（１）〜（３）のいずれかに記載の蛍光ナノ粒子プローブ。【００１７】
（５）
前記環Ｂが以下に示す構造：
【化３】
2012118136.tif 000005
（式中、Ｒ１は、置換されていてもよい炭化水素基であり、Ｒ４及びＲ５は、水素又はアニオン性置換基であるか、若しくはそれらが互いに連結してアリール環を形成するものである。）のいずれかであり、
前記環Ｄが以下に示す構造： 
【化４】
2012118136.tif 000006
（式中、Ｒ２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基であり、Ｒ４及びＲ５は、水素又はアニオン性置換基であるか、若しくはそれらが互いに連結してアリール環を形成するものである。）のいずれかである、（１）〜（４）のいずれかに記載の蛍光ナノ粒子プローブ。【００１８】
（６）
前記蛍光基が、下記構造式（II）：
【化５】
2012118136.tif 000007
（式中、Ｒ１は、置換されていてもよい炭化水素基であり、Ｒ２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基であり；Ｒ３及びＲ３’は、水素であるか、又はそれらが互いに連結して環状構造を形成するものであり；Ｘは水素又はハロゲンであり；Ａ−は陰イオンであり、ｍは０又は１であり；環Ｂ及び環Ｄは、それぞれ同一又は異なっていてもよい含窒素縮合芳香族複素環であり；Ｒ４及びＲ５は、水素又はアニオン性置換基であるか、若しくはそれらが互いに連結してアリール環を形成するものである。）で示されるものである、（１）〜（５）のいずれかに記載の蛍光ナノ粒子プローブ。【００１９】
（７）
前記蛍光基が、下記構造式（III）：
【化６】
2012118136.tif 000008
（式中、Ｒ２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基である。）
で示されるものである、（１）〜（６）のいずれかに記載の蛍光ナノ粒子プローブ。【００２０】
（８）
前記蛍光基が、下記構造式（IV）：
【化７】
2012118136.tif 000009
（式中、Ｒ２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基である。）
で示されるものである、（１）〜（６）のいずれかに記載の蛍光ナノ粒子プローブ。【００２１】
（９）
前記蛍光基が下記式（X）：
【化８】
2012118136.tif 000010
（式中、Ｒ２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基である。）
で示されるものである、（１）〜（３）のいずれかに記載の蛍光ナノ粒子プローブ。【００２２】
（１０）
前記蛍光色素が下記式（III-i）：
【化９】
2012118136.tif 000011
（式中、ｎは５〜５０の整数である。）
である、（１）〜（６）のいずれかに記載の蛍光ナノ粒子プローブ。【００２３】
（１１）
前記蛍光色素が下記式（IV-i）：
【化１０】
2012118136.tif 000012
（式中、ｎは５〜５０の整数である。）
である、（１）〜（６）のいずれかに記載の蛍光ナノ粒子プローブ。【００２４】
（１２）
前記蛍光色素が下記式（X-i）：
【化１１】
2012118136.tif 000013
（式中、ｎは５〜５０の整数である。）
である、（１）〜（４）のいずれかに記載の蛍光ナノ粒子プローブ。【００２５】
（１３）
前記疎水性ブロック鎖が、
疎水性アミノ酸単位を１０個以上有する疎水性ポリペプチド鎖、
ヒドロキシル酸単位を１５個以上有する疎水性ポリエステル鎖、及び、
アミノ酸単位及びヒドロキシル酸単位の両方を合計２０個以上有する疎水性デプシペプチド鎖、
からなる群から選ばれる、（１）〜（１２）のいずれかに記載の蛍光ナノ粒子プローブ。【００２６】
（１４）
前記疎水性ブロック鎖が、２５個以上の乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖である、（１）〜（１３）のいずれかに記載の蛍光ナノ粒子プローブ。【００２７】
（１５）前記親水性ブロック鎖が抗体を有することにより、前記抗体による表面修飾がされた（１）〜（１４）のいずれかに記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
（１６）
前記抗体が、腫瘍が有する物質に対する抗体である、（１５）に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。【００２８】
（１７）
（１）〜（１６）のいずれかに記載の蛍光ナノ粒子プローブを非ヒト動物に投与する工程と、蛍光を検出する工程とを含む、蛍光分子イメージング法。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によると、スイッチング機能（血液中において蛍光色素が消光し、イメージングすべき腫瘍又は炎症部位で蛍光を発する機能）を有する新規なイメージング用蛍光ナノ粒子プローブを提供することができる。
より具体的には、本発明によると、ポリ乳酸結合シアニン化合物を内包させるべき蛍光色素とし、蛍光色素内包量を従来のナノ粒子におけるものより高濃度にすることによって、調製時及び血中成分含有環境内存在時において内包された蛍光色素の蛍光が（蛍光色素の）濃度依存的に減少し、且つ、血中の成分に接触させた際に蛍光が回復するナノ粒子であって、ＥＰＲ効果による所望の組織への良好な集積性を有するナノ粒子を提供することができる。このため、生体内の所望の組織において特異的に高輝度の蛍光を呈する蛍光ナノ粒子プローブ及びそれを用いた蛍光イメージング法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】実施例２で得られた、ICG-PLLA内包ラクトソーム（ICG濃度で0.48μM）の蛍光強度測定結果である。それぞれICG-PLLA30又はICG-PLLA32を0.6、1、1.5、2、3、4又は8 mol%内包した場合の蛍光強度（(A)、(B)）、及び、817nmにおける蛍光強度（C）を示す。
【図２】実施例３で得られた、IC7-1、IC71-PLLA、ICG、ICG-PLLAをそれぞれ20 mol%内包したラクトソームに対して、PBS、SDS、BSA又は血漿を加えた場合の蛍光スペクトル測定結果である。
【図３】実施例４で得られた、IC71-PLLA30を20mol%内包したラクトソームの外部環境変化による蛍光強度の経時変化を示したものである。
【図４】実施例５−１で得られた、IC71-PLLA30を1mol%及び20mol%内包したラクトソームと、IC71-PLLA30を1mol%及び20mol%内包した抗体修飾ラクトソームとの、細胞に接触又は取り込まれた際の蛍光スペクトル測定結果である。
【図５】実施例５−２で得られた、Cy5-PLLA30を1mol%内包し且つ抗体修飾されたラクトソーム（Cy5 anti HER2 lactosome）、及びCy5-PLLA30を1mol%内包し且つ抗体修飾されていないラクトソーム（Cy5 lactosome）それぞれが、細胞に接触又は取り込まれた場合の蛍光顕微鏡による観察結果である。
【図６】実施例５−３で得られた、Cy5-PLLA30を20mol%内包し且つ抗体修飾されたラクトソーム（Cy5 anti HER2 lactosome）、及びCy5-PLLA30を20mol%内包し且つ抗体修飾されていないラクトソーム（Cy5 lactosome）それぞれが細胞へ取り込まれる態様の蛍光顕微鏡による観察結果である。
【図７】実施例５−４で得られた、IC71-PLLA30を20mol%内包し且つ抗体修飾されたラクトソーム（anti HER2 lactosome）、及びIC71-PLLA30を20mol%内包し且つ抗体修飾されていないラクトソーム（Lactosome）それぞれが、細胞（N87、BT-474、SK-BR-3及びMCF-7）に接触又は取り込まれた際の蛍光スペクトル測定結果である。
【図８】実施例６で得られた、1 mol% IC71-PLLA30 抗HER2scFv-lactosome（Ａ）及び20 mol% IC71-PLLA30抗HER2scFv-lactosome（Ｂ）を用いた担がんマウスの蛍光イメージング結果である。
【図９】実施例６で得られた、蛍光イメージング結果に基づいて、腫瘍部位（Ａ）及びバックグラウンド（Ｂ）の蛍光強度の経時変化を示したものである。
【図１０】実施例６で得られた、蛍光イメージング結果に基づいて、腫瘍部位とバックグラウンドの蛍光強度比の経時変化を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
［１．両親媒性ブロックポリマー］
本発明の両親媒性ブロックポリマーは、以下の親水性ブロック及び疎水性ブロックを有する。以下、本発明において、用語「アミノ酸」は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及びそれらの修飾及び／又は化学的変更による誘導体を含む概念で用いる。さらに、本明細書において、アミノ酸は、α−、β−、γ−アミノ酸を含む。好ましくは、αアミノ酸である。
【００３２】
［１−１．親水性ブロック鎖］
本発明において、親水性ブロック鎖が有する「親水性」という物性の具体的な程度としては、特に限定されるものではないが、少なくとも、親水性ブロック鎖が、後述の特定の疎水性ブロック鎖に対して、相対的に親水性が強い領域であり、当該親水性ブロック鎖が当該疎水性ブロック鎖とコポリマーを形成することによって、コポリマー分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の親水性を有していれば良い。或いは、当該両親媒性ブロックポリマーが溶媒中で自己組織化して、自己集合体、好ましくは粒子状の自己集合体を形成することが可能となる程度の親水性を有していれば良い。
【００３３】
親水性ブロック鎖は、サルコシンに由来する単位、及びアルキレンオキシド又はアルキレングリコールに由来する単位からなる群から選ばれる単位を親水性必須構成単位として含み、且つ前記親水性必須構成単位を２０個以上有する親水性分子鎖である。具体的には、親水性分子鎖は、サルコシン単位を２０個、好ましくは３０個以上有する親水性ポリペプチド鎖；アルキレンオキシド単位を２０個以上有する親水性ポリエーテル鎖；及び、サルコシン単位及びアルキレンオキシド単位の両方を合計２０個、好ましくは３０個以上有する親水性複合鎖、が含まれる。
【００３４】
サルコシンとはすなわちＮ−メチルグリシンである。
アルキレンオキシド単位としては、具体的には、エチレンオキシド単位（ポリエチレングリコール単位）、プロピレンオキシド単位（プロピレングリコール）などが挙げられる。また、アルキレンオキシド単位においては、水素が置換されていてもよい。
サルコシン単位及びアルキレンオキシド単位以外の構成単位を有する場合、そのような構成単位としては特に限定されないが、例えばサルコシン以外のアミノ酸（親水性アミノ酸及びその他のアミノ酸を含む）とすることができる。そのようなアミノ酸としては、好ましくは、αアミノ酸である。例えば、セリン、スレオニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００３５】
親水性ブロック鎖において、その鎖を構成する構成単位の種類・比率は、ブロック鎖全体が上述したような親水性となるように、当業者によって適宜決定される。
【００３６】
親水性ブロック鎖は、例えば構成単位数５００程度を上限として設計することができる。本発明においては、しばしば、３０〜３００、より好ましくは５０〜２００程度の構成単位数を有する親水性ブロック鎖が合成されうる。構成単位数が５００程度を超えると、分子集合体を形成した場合に、当該形成された分子集合体の安定性を欠く傾向にある。構成単位数が３０を下回ると、分子集合体の形成自体が困難となる傾向にある。
【００３７】
親水性ブロック鎖においては、同じ構成単位のすべてが連続していてもよいし、非連続であってもかまわない。親水性ブロック鎖において、上記特定の単位以外の他の構成単位を含む場合、他の構成単位の種類・比率は、ブロック鎖全体が上述したような親水性となるように、当業者によって適宜決定される。またその場合、後述の基本特性を損なわないように分子設計されることが好ましい。
【００３８】
サルコシン（すなわちＮ−メチルグリシン）は水溶性が高く、また、サルコシンのポリマーはＮ置換アミドを有することから通常のアミド基に比べてシス−トランス異性化が可能であり、さらに、Ｃα炭素まわりの立体障害が少ないことから、高い柔軟性を有するものである。このようなポリペプチドを構成ブロック鎖として用いることは、当該ブロック鎖に高い親水性と高い柔軟性とを併せ持つという基本特性が備わる点で非常に有用である。
【００３９】
また、ポリアルキレンオキシド鎖は、親水性が高く、免疫原性や毒性などの悪影響を及ぼさないものである。このようなポリエーテル鎖を構成ブロック鎖として用いることは、当該ブロック鎖に高い親水性を与え、キャリア剤に抗原性を減少させ且つ良好な血中安定性及び血中滞留性を与えるという基本特性が備わる点で非常に有用である。
【００４０】
［１−２．疎水性ブロック鎖］
本発明において、疎水性ブロック鎖が有する「疎水性」という物性の具体的な程度としては、特に限定されるものではないが、少なくとも、疎水性ブロック鎖が、上記の特定の親水性ブロック鎖に対して、相対的に疎水性が強い領域であり、当該疎水性ブロック鎖が当該親水性ブロック鎖とコポリマーを形成することによって、コポリマー分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の疎水性を有していれば良い。或いは、当該両親媒性ブロックポリマーが溶媒中で自己組織化して、自己集合体、好ましくは粒子状の自己集合体を形成することが可能となる程度の疎水性を有していれば良い。
【００４１】
疎水性ブロック鎖は、アミノ酸に由来する構成単位及びヒドロキシル酸に由来する構成単位からなる群から選ばれる単位を必須構成単位として含み、且つ当該必須構成単位を２０個以上有する疎水性分子鎖である。具体的には、疎水性分子鎖は、疎水性アミノ酸単位を２０個以上有する疎水性ポリペプチド鎖；ヒドロキシル酸単位を２０個以上有する疎水性ポリエステル鎖；及び、アミノ酸単位及びヒドロキシル酸単位の両方を合計２０個以上有する疎水性デプシペプチド鎖、が含まれる。
本発明における疎水性ブロック鎖は、へリックス構造を有しているものが好ましい。
【００４２】
疎水性アミノ酸は、その多くが、脂肪族側鎖、芳香族側鎖などを有する。天然アミノ酸では、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、チロシン、及びトリプトファンなどが挙げられる。非天然アミノ酸では、特に限定されないが、グルタミン酸メチルエステル、グルタミン酸ベンジルエステル、アスパラギン酸メチルエステル、アスパラギン酸エチルエステル、アスパラギン酸ベンジルエステルなどのアミノ酸誘導体が挙げられる。
【００４３】
ヒドロキシル酸としては、特に限定されないが、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシイソ酪酸などが挙げられる。
【００４４】
疎水性ブロック鎖において、その鎖を構成する構成単位の種類・比率は、鎖全体が疎水性となるように、当業者によって適宜決定される。
【００４５】
疎水性ブロック鎖は、例えば構成単位数１００程度を上限として設計することができる。本発明においては、しばしば、１０〜８０、好ましくは２０〜５０程度の構成単位数を有する疎水性ブロック鎖が合成されうる。構成単位数が１００程度を超えると、分子集合体を形成した場合に、当該形成された分子集合体の安定性を欠く傾向にある。構成単位数が１０を下回ると、分子集合体の形成自体が困難となる傾向にある。
【００４６】
疎水性ブロック鎖においては、同じ構成単位のすべてが連続していてもよいし、非連続であってもかまわない。疎水性ブロック鎖において、上記特定の単位以外の他の構成単位を含む場合、他の構成単位の種類・比率は、ブロック鎖全体が上述したような疎水性となるように、当業者によって適宜決定される。またその場合、後述の基本特性を損なわないように分子設計されることが好ましい。
【００４７】
疎水性ブロック鎖に採用されるアミノ酸単位及びヒドロキシル酸単位は、優れた生体適合性及び安定性を有するものである。このため、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から得られる分子集合体は、生体、特に人体への応用性という点で非常に有用である。
また、特にポリ乳酸は、優れた生分解性を有することから代謝が早く、生体内においてがん組織以外への組織への集積性が低い。このため、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から得られる分子集合体は、がん組織への特異的な集積性という点で非常に有用である。
そして、ポリ乳酸は、低沸点溶媒への溶解性に優れるものであることから、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から分子集合体を得る際に、有害な高沸点溶媒の使用を回避することが可能である。このため、このような分子集合体は、生体への安全性という点で非常に有用である。
さらに、ポリ乳酸の鎖長を調整することは、このようなポリ乳酸を構成単位とする両親媒性物質から得られる分子集合体の形状制御及び大きさ制御の一要因として寄与する点で好ましい。このため、このような構成ブロックを用いることは、得られる分子集合体形状の用途性に優れるという点で非常に有用である。
【００４８】
疎水性ブロック鎖は、光学純度の観点から、さらに以下のバリエーションを有することができる。
例えば、疎水性ブロック鎖における乳酸単位が、Ｌ−乳酸単位のみで構成されてもよいし、Ｄ−乳酸単位のみで構成されてもよいし、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位との両者から構成されてもよい。疎水性ブロック鎖は、上記例示のものから選ばれた１種が単独で使用されてもよいし、複数種が組み合わされて使用されてもよい。
【００４９】
乳酸単位がＬ−乳酸単位とＤ−乳酸単位との両者から構成される場合、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位との重合順番は限定されない。Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位とが１個又は２個ずつ交互に重合されていてもよいし、ランダムに重合されていてもよいし、ブロック重合されていてもよい。
【００５０】
従って、乳酸単位がＬ−乳酸単位とＤ−乳酸単位との両者から構成される場合、それぞれの乳酸単位の含有量は特に限定されない。すなわち、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位とが異なる量で含有されていてもよいし、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位とが同量含有されていてもよい。この場合、当該１０個以上の乳酸単位が全体として光学純度０％のラセミ体であり得る。
【００５１】
［１−３．その他の基］
本発明において、両親媒性ブロックポリマーを構成する構成単位は、さらなる基を有しても良い。そのような基としては、例えば、本発明のナノ粒子が、分子イメージングシステムや薬剤搬送システムに用いられる分子プローブとして用いられる場合に、そのような分子プローブとしてさらに有用となるような形態・機能などを持たせることができる機能性基が挙げられる。機能性基は例えば有機基であり、当業者によって適宜選択されるものである。機能性基は、ナノ粒子の血中安定性を高めるものや、標的細胞に標的細胞に発現している生体分子に結合することによってナノ粒子の指向性を制御し、これによりナノ粒子のターゲティング性を高めることができるものが挙げられる。
【００５２】
水溶性高分子の例としては、ポリエーテル鎖、ポリビニルアルコール鎖などの高分子が挙げられる。糖鎖の例としては、カルボキシルメチルセルロース、アミロースなどの安定剤や、ターゲット部位の細胞に発現しているタンパク質への特異的結合能を有するものが挙げられる。
抗体の例としては、ターゲット部位の細胞に発現している抗原への特異的結合能を有するものが挙げられる。
リガンドの例としては、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）などの接着因子が挙げられる。
【００５３】
これらの基は、両親媒性ブロックポリマーの親水性ブロック側の末端構成単位に結合することができる。このことによって、ミセルであるナノ粒子を形成した場合に、ナノ粒子は、機能性基をその表面に保持する形態、すなわち機能性基による表面修飾の形態を有しうる。
【００５４】
［２．蛍光色素］
本発明においてキャリア剤に内包される蛍光色素は、少なくとも蛍光基とポリ乳酸基とを含むポリ乳酸結合シアニン化合物である。
【００５５】
［２−１．蛍光基］
蛍光色素における蛍光基は、以下の一般式（I）で表される。
【化１２】
2012118136.tif 000014
【００５６】
上記式（Ｉ）中、Ｒ１は、置換されていてもよい炭化水素基であり、Ｒ２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基である。
Ｒ１における炭化水素基は、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数２〜５のアルキル基でありうる。
Ｒ２における炭化水素基は、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数２〜５のアルキレン基でありうる。
Ｒ１及びＲ２における置換基は、アニオン性であってもよい置換基であり、カルボキシル基、カルボキシレート基、金属カルボキシレート基、スルホニル基、スルホネート基、金属スルホネート基、又は水酸基でありうる。前記金属は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属でありうる。
【００５７】
Ｌは、ポリメチン鎖を構成する連結基であり、環状構造を含んでいてもよく、置換されていてもよい。ポリメチン鎖の鎖長は例えば炭素数３〜７でありうる。ポリメチン鎖を構成する連結基Ｌの好ましい態様として、以下の構造を有するものが挙げられる。
【化１３】
2012118136.tif 000015
【００５８】
上記式において、Ｒ３及びＲ３’は、水素であるか、又はそれらが互いに連結して環状構造を形成するものである。環状構造は、エチレン性二重結合などの不飽和結合を少なくとも一つ有し、その不飽和結合がポリメチン鎖の一部として電子共鳴するものであり、例えば、シクロペンテン環、シクロヘキセン環などが挙げられる。Ｒ３及びＲ３’は互いに連結して環状構造をとることにより、蛍光色素の分子構造をリジッド化しうる。
【００５９】
Ｘは水素又はハロゲンである。ハロゲンは、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩでありうる。
Ａ−は陰イオンであり、ｍは０又は１である。ｍが０の場合、Ｒ１、Ｒ２、後述のＲ４及びＲ５のいずれかがアニオン性基であり、分子全体としてベタイン構造をとる。ｍが１の場合、Ａ−は、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−等のハロゲンイオン、ＣＩＯ４−、ＢＦ４−、ＰＦ６−、ＳｂＦ６−、ＳＣＮ−等でありうる。
【００６０】
環Ｂ及び環Ｄは、同一又は異なっていてもよい含窒素複素環である。好ましくは、含窒素縮合芳香族複素環である。たとえば、含窒素二環式又は三環式芳香族複素環でありうる。好ましくは、環Ｂ及び環Ｄは、同一である。
環Ｂの好ましい態様としては、以下に示す構造が挙げられる。
【００６１】
【化１４】
2012118136.tif 000016
【００６２】
環Ｄの好ましい態様としては、以下に示す構造が挙げられる。
【化１５】
2012118136.tif 000017
【００６３】
上記式において、Ｒ４及びＲ５は、水素又はアニオン性置換基でありうる。アニオン性置換基は、カルボキシレート基、金属カルボキシレート基、スルホネート基、又は金属スルホネート基でありうる。前記金属は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属でありうる。
又は、Ｒ４及びＲ５は、それらが互いに連結してアリール環を形成しうる。前記アリール環は、置換されてよいベンゼン環でありうる。
【００６４】
本発明において好ましい蛍光基の例は、下記構造式（II）で示されるインドシアニン化合物由来の基である。
【化１６】
2012118136.tif 000018
【００６５】
構造式（II）で示される蛍光基の具体例として、環Ｂ及び環Ｄがいずれも含窒素三環式芳香族複素環であるＩＣ７−１基（III）、ＩＣＧ基（IV）及びＩＲ８２０基（V）、環Ｂ及び環Ｄがいずれも含窒素二環式芳香族複素環であるＩＲ７８３基（VI）及びＩＲ８０６基（VII）、及び、環Ｂが含窒素三環式芳香族複素環、環Ｃが含窒素二環式芳香族複素環であるＩＣ７−２基（VIII）が挙げられる。これら基の構造式を以下に示す。
【００６６】
【化１７】
2012118136.tif 000019
【００６７】
【化１８】
2012118136.tif 000020
【００６８】
【化１９】
2012118136.tif 000021
【００６９】
【化２０】
2012118136.tif 000022
【００７０】
【化２１】
2012118136.tif 000023
【００７１】
【化２２】
2012118136.tif 000024
【００７２】
上記（II）〜（VIII）に例示されるシアニン系蛍光基は、近赤外光を発する。近赤外領域（７００〜１３００ｎｍ）では、水素結合を有する各置換基の吸収が存在するものの、その吸収は比較的小さい。このため、近赤外光は生体組織を透過しやすい特性を有する。このような近赤外光の特性を利用すれば、身体に無用の負荷を与えることなく体内の情報を得ることが可能である。
【００７３】
本発明において好ましい蛍光基の他の例は、下記構造式（IX）で示されるインドシアニン化合物由来の基である。
【００７４】
【化２３】
2012118136.tif 000025
【００７５】
構造式（IX）で示される蛍光基の具体例としては、Ｃｙ５由来の基やＣｙ７由来の基が挙げられる。Ｃｙ５由来の基のより具体的な例として、下記構造式（X）で示される基が挙げられる。
【００７６】
【化２４】
2012118136.tif 000026
【００７７】
上記（IX）及び（X）に例示されるシアニン系蛍光基のような、ポリメチン架橋の炭素数が上記の蛍光基（II）〜（VIII）より少ない蛍光基である場合は、上記の蛍光基（II）〜（VIII）より短波長であることから、非侵襲的に体内の情報を得る用途よりも、外科的手術を必要とする場合において、開腹又は開胸後に、切除すべき組織の大きさ及び位置の情報を得る用途において有用である。
【００７８】
［２−２．ポリ乳酸基］
ポリ乳酸基は、乳酸単位を主たる構成成分とする基である。乳酸単位のすべてが連続していてもよいし、非連続であってもかまわない。基本的に、ポリ乳酸基の構造や鎖長は、上述１−２の疎水性ブロック鎖の分子設計における場合と同様の観点で決定することができる。このようにすることによって、分子集合体において、蛍光色素（ポリ乳酸結合シアニン化合物）と、両親媒性ブロックポリマーの疎水性ブロック鎖との親和性に優れるという効果も得られる。
【００７９】
ポリ乳酸基の乳酸単位数は、５〜５０、好ましくは１５〜３５である。この範囲内で、ポリ乳酸結合シアニン化合物全体の長さが上述の両親媒性ブロックポリマーの長さを超えないように分子設計される。好ましくは、両親媒性ブロックポリマーにおける疎水性ブロックの２倍の長さを超えないように分子設計される。構成単位数が上記範囲を上回ると、分子集合体を形成した場合に、当該形成された分子集合体の安定性を欠く傾向にある。構成単位数が上記範囲を下回ると、血中成分においてナノ粒子のオフ状態を維持しにくい傾向にある。
【００８０】
ポリ乳酸基は、光学純度の観点から、さらに以下のバリエーションを有することができる。
例えば、ポリ乳酸基における乳酸単位が、Ｌ−乳酸単位のみで構成されてもよいし、Ｄ−乳酸単位のみで構成されてもよいし、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位との両者から構成されてもよい。疎水性ポリマーＡ２は、上記例示のものから選ばれた１種が単独で使用されてもよいし、複数種が組み合わされて使用されてもよい。
【００８１】
当該乳酸単位がＬ−乳酸単位とＤ−乳酸単位との両者から構成される場合、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位との重合順番は限定されない。Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位とが１個又は２個ずつ交互に重合されていてもよいし、ランダムに重合されていてもよいし、ブロック重合されていてもよい。
【００８２】
従って、乳酸単位がＬ−乳酸単位とＤ−乳酸単位との両者から構成される場合、それぞれの乳酸単位の含有量は特に限定されない。すなわち、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位とが異なる量で含有されていてもよいし、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位とが同量含有されていてもよい。この場合、当該１０個以上の乳酸単位が全体として光学純度０％のラセミ体であり得る。
【００８３】
［２−３．ポリ乳酸結合シアニン化合物の具体例］
ポリ乳酸結合シアニン化合物において、蛍光基は、ポリ乳酸基の末端乳酸単位に結合しうる。また、ポリ乳酸結合シアニン化合物は、分子設計上化学的又は生化学的に許容される蛍光基及び乳酸単位以外の構成要素のいかなるものも有しうる。この場合、他の構成要素は、ポリ乳酸結合シアニン化合物が全体として上記定義された「疎水性」の範疇を越える影響を与えない程度で含まれる。
【００８４】
以下に、ポリ乳酸結合シアニン化合物の具体例（III-i）、（VI-i）及び（X-i）を示す。下記式において、ｎは、５〜５０の整数である。化合物（III-i）は、蛍光基としてＩＣ７−１基を有するものである。また、化合物(VI-i)は、蛍光基としてＩＣＧ基を有するものである。さらに、化合物（X-i）は、蛍光基としてＣｙ５基を有するものである。本明細書において、ポリ乳酸結合シアニン化合物におけるｎが例えば３０である場合、この化合物を例えばIC71-PLLA30、IC71-PDLA30、ICG-PLLA30、ICG-PDLA30、Cy5-PLLA30、Cy5-PDLA30などと記載する。
同様に、他の構造を有する蛍光基についても、当業者がポリ乳酸結合シアニン化合物の構造を決定することができる。
【００８５】
【化２５】
2012118136.tif 000027
【００８６】
【化２６】
2012118136.tif 000028
【００８７】
【化２７】
2012118136.tif 000029
【００８８】
［３．ナノ粒子］
本発明のナノ粒子は、上記両親媒性ブロックポリマーの凝集により、或いは自己集合的な配向会合により成り立つ分子集合体をキャリア剤として、上記蛍光色素が内包された構造体である。
【００８９】
［３−１．ナノ粒子の構造］
本発明における分子集合体はミセルを構成する。両親媒性ブロックポリマーは、自己組織化によって、疎水性ブロック鎖がコア部を形成する。一方、蛍光色素は、当該疎水コア部に位置する。このとき、シアニン系蛍光基を有する蛍光色素は会合している。これにより、蛍光は消光している（すなわち後述のオフ状態にある）。
本発明のナノ粒子のキャリア剤である分子集合体は、後述のオン状態において、外部環境に応答可能な柔軟性と蛍光色素が分子集合体に保持されることが可能な内包安定性とを両立することができる。
【００９０】
［３−２．ナノ粒子における蛍光色素の内包量］
本発明のナノ粒子は、ナノ粒子１個につき蛍光色素を複数分子内包する。例えば、両親媒性ブロックポリマー及び蛍光色素の合計に対し、蛍光色素の量が１〜５０ｍｏｌ％でありうる。好ましくは、５〜２０ｍｏｌ％、又は１０〜２０ｍｏｌ％でありうる。本発明においては一般的に、両親媒性ブロックポリマー及び蛍光色素の合計に対し１ｍｏｌ％となる蛍光色素の量は、ナノ粒子１個に内包される蛍光色素２分子に相当する。上記範囲を下回ると、スイッチング機能を具備することができない傾向にあり、上記範囲を上回ると、ナノ粒子の形成が困難となる傾向にある。
【００９１】
また、蛍光色素の内包によって、ナノ粒子の疎水コア部の体積の増大させる効果があるため、蛍光色素の内包量によってナノ粒子の粒径制御を行う場合もある。
【００９２】
［３−３．ナノ粒子のスイッチング機能］
［３−３−１．オフ機能］
本発明のナノ粒子には、蛍光色素が複数分子内包されている。内包されている複数の分子は会合することによって自己消光する。
消光の度合いは、内包される蛍光色素の量に依存する。すなわち、内包される蛍光色素の量が多くなるほど、特定量の蛍光色素当たりの蛍光強度は指数関数的に減少する。減少する度合いは蛍光色素によって異なりうるが、特定蛍光色素濃度（例えば0.48μＭ）で測定した場合において、蛍光色素内包量を２．８〜３．７ｍｏｌ％増やすごとに蛍光強度は１／２に減少する場合がある。例えば、２．８ｍｏｌ％増やすごとに蛍光強度が１／２に減少しうる場合として、ラクトソーム（ナノ粒子のキャリア部分であってポリサルコシン−ポリ乳酸両親媒性ブロックポリマーからなる分子集合体）にポリ（Ｄ）乳酸結合ＩＣＧを内包したものを上記濃度に調整して測定した場合が挙げられる。また、３．７ｍｏｌ％増やすごとに蛍光強度が１／２に減少しうる場合としては、ラクトソームにポリ（Ｌ）乳酸結合ＩＣＧを内包したもの上記濃度に調整して測定した場合が挙げられる。
従って、本発明のナノ粒子は少ない蛍光分子数で効率よく消光することが可能である。
【００９３】
上述のような消光状態（オフ状態）は、少なくともナノ粒子調製時の環境及び血液成分が存在する環境において保たれる。オフ状態が保たれる環境としては、後述のオン状態を惹起する環境でなければどのような環境でも良い。例えば、界面活性剤が含まれていない、水や水溶液などの水系環境、無水環境及び血中成分が存在する環境が挙げられる。水や水溶液としては、生化学的、薬学的に許容することができるものであればよく、具体的には、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられ、好ましくはリン酸緩衝生理食塩水が挙げられる。また、無水環境にあるナノ粒子とは、すなわち凍結乾燥処理されたナノ粒子である。血中成分としては、血液、血漿、血清、アルブミンなどが挙げられる。血中成分が存在する環境にあるナノ粒子とは、例えば血管内に投与され、且つターゲット部位の細胞にたどり着いていない（細胞に未だ接触していない）状態のナノ粒子である。
【００９４】
［３−３−２．オン機能］
上述のオフ状態にあるナノ粒子は、外部環境が変化すると、外部環境に応答することによって蛍光を回復した状態（すなわちオン状態）となる。
オン状態を惹起する環境としては、ナノ粒子に内包された蛍光色素の会合を解くことができる環境であれば特に限定されない。蛍光色素の会合を解くことができる環境とは、キャリア剤である分子集合体構造を変形させる作用を有する環境であると考えられる。
【００９５】
オン状態を惹起する環境に含まれる成分としては、具体的には、細胞成分が挙げられる。すなわち、細胞に接触又は細胞に取り込まれることによってオン状態が惹起される。細胞としては特に限定されない。本発明のナノ粒子がＥＰＲ効果を利用する観点からより具体的には、血管病変部位（例えば、悪性腫瘍部位、炎症部位、動脈硬化部位、血管新生部位など）に存在する細胞である。細胞成分の具体例としては、細胞を構成する成分であればよく、異なる細胞間で移動可能な成分である細胞分泌物や細胞組織液等は含まない。例えば、本発明のキャリア剤である分子集合体構造を変形又は分解させる作用を有するプロテアーゼ、エステラーゼ、サルコシンデヒドロゲナーゼ等の酵素、或いは、リソソーム分解酵素等の細胞内酵素であり、分子集合体に内包されていた蛍光色素の会合を解くことができるアルブミン等のタンパク質、及び脂質等の細胞内成分が挙げられる。オン状態が惹起されるメカニズムとして考えられるものの１つとしては、例えばリソソーム分解酵素等の細胞内酵素によりキャリア剤である分子集合体構造が分解された後、遊離した色素が近辺のタンパクや脂質膜に吸着し、オン状態になる、というものである。
【００９６】
細胞成分が少なくとも生体の体内環境における濃度であれば、ナノ粒子のオン状態を惹起することができる。オン状態を惹起することが可能な細胞成分濃度範囲としては、一例に過ぎないが、例えば0.03〜10重量％、又は、内包する蛍光色素の0.4〜47倍（モル基準）である。上記範囲は、細胞成分が例えばアルブミンなどの場合に該当する。上記範囲を下回ると、蛍光強度が十分に回復しない傾向にある。上記範囲を上回る範囲も許容するが、上記範囲を上回ると、最大限蛍光が回復することにより蛍光強度が頭打ちとなる傾向にある。
【００９７】
オン状態となることによって、オフ状態の場合に消光していた蛍光が回復する。回復後の蛍光強度は、キャリア剤や内包された蛍光色素によって異なりうるが、オフ状態（例えばリン酸緩衝生理食塩水中や血液成分中に存在している状態）における蛍光強度と比較して大きければよい。一例に過ぎないが、内包された蛍光色素の量が１〜５０ｍｏｌ％（ナノ粒子１個当たり蛍光色素２〜２００分子に相当）である場合で、最大限１．１〜１２，０００倍程度、或いは１０〜２０ｍｏｌ％（ナノ粒子１個当たり蛍光色素２２〜５０分子に相当）である場合で最大限１１〜１３０倍程度となりうる。本発明においては、回復後の蛍光強度がオフ状態における蛍光強度と比較して１０倍以上であることが好ましい。１００倍以上であればより好ましい。上記範囲の上限は特に限定されるものではないが、例えば２０，０００倍又は１５，０００倍である。
【００９８】
［３−４．ナノ粒子の大きさ］
［３−４−１．ナノ粒子の大きさ］
本発明のナノ粒子の大きさは、例えば粒子径１０〜５００ｎｍである。ここで「粒子径」とは、粒子分布で最も出現頻度の高い粒径、すなわち中心粒径をいう。粒子径が１０ｎｍより小さいものは作成が難しく、５００ｎｍより大きいものは、特に生体内へ注射により投与する場合に、注射剤として好ましくない場合がある。
【００９９】
［３−４−２．ナノ粒子の大きさ測定］
本発明のナノ粒子の大きさを測定するための方法は特に限定されるものではなく、当業者によって適宜選択されるものである。例えば、透過型電子顕微鏡（Transmission Electron Microscope;ＴＥＭ）による観察法や、動的光散乱（Dynamic Light Scattering;ＤＬＳ）法などが挙げられる。ＤＬＳ法においては、溶液中でブラウン運動している粒子の移動拡散係数を測定する。
【０１００】
［３−４−３．ナノ粒子の大きさ制御］
分子集合体の大きさを制御する手段の例として、両親媒性ブロックポリマーの鎖長を制御することが挙げられる。好ましくは、両親媒性ブロックポリマーにおける疎水性ブロックの重合度を調整することが有効である。また、分子集合体の大きさを制御する手段の他の例として、蛍光化合物の配合量を制御することが挙げられる。
【０１０１】
［３−５．ナノ粒子の形成］
ナノ粒子の作成法は特に限定されず、所望するナノ粒子の大きさ、特性、担持させる蛍光色素の種類、性質、含有量などに応じて、当業者が適宜選択することができる。必要に応じ、下記のようにナノ粒子を形成した後に、得られたナノ粒子に対して、公知の方法によって表面修飾を行っても良い。
なお、粒子が形成されたことの確認は、電子顕微鏡観察によって行うと良い。
【０１０２】
［３−５−１．フィルム法］
フィルム法は、リポソームの調製に用いられていた方法である。本発明における両親媒性ブロックポリマーは低沸点溶媒への溶解性を有するため、この方法を用いたナノ粒子の調製が可能である。
フィルム法は、次の工程を含む。すなわち、容器（例えばガラス容器）中に、両親媒性ブロックポリマーと蛍光色素とを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程；前記溶液から前記有機溶媒を除去し、前記容器の内壁に両親媒性ブロックポリマーと蛍光色素とを含むフィルムを得る工程；及び、前記容器中に水又は水溶液を加え、超音波処理又は加温処理を行い、前記フィルム状物質を、蛍光色素を内包する分子集合体に変換してナノ粒子の分散液を得る工程、を含む。さらに、フィルム法は、前記のナノ粒子の分散液を凍結乾燥処理に供する工程を含んでも良い。
【０１０３】
両親媒性ブロックポリマーと蛍光色素とを有機溶媒中に含む溶液は、両親媒性ブロックポリマーをあらかじめフィルムの状態でストックしておき、ナノ粒子調製時に、蛍光色素を含む溶液を加えてフィルムを溶解することによって調製してもよい。
【０１０４】
フィルム法に用いる有機溶媒としては、低沸点溶媒を用いることが好ましい。本発明における低沸点溶媒とは、１気圧における沸点が１００℃以下、好ましくは９０℃以下のものをいう。具体的には、クロロホルム、ジエチルエーテル、アセトニトリル、エタノール、アセトン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ヘキサンなどが挙げられる。
両親媒性ブロックポリマー及び蛍光色素の溶解にこのような低沸点溶媒を使用することによって、溶媒の除去が非常に簡単になる。溶媒の除去の方法としては特に限定されることなく、使用する有機溶媒の沸点などに応じ、当業者が適宜決定すればよい。例えば、減圧下における溶媒除去を行ってもよいし、自然乾燥による溶媒除去を行ってもよい。
【０１０５】
有機溶媒が除去された後は、容器内壁に両親媒性ブロックポリマーと蛍光色素とを含むフィルムが形成される。このフィルムが張り付いた容器中に、水又は水溶液を加える。水又は水溶液としては特に限定されることなく、生化学的、薬学的に許容することができるものを当業者が適宜選択すればよい。例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。
【０１０６】
水又は水溶液が加えられた後、加温処理を行う。加温によりフィルムが容器内壁から剥がれる過程で分子集合体を形成する。加温処理は、例えば７０〜１００℃、５〜６０分の条件下で行うことができる。加温処理終了時には、蛍光色素が内包された分子集合体（ナノ粒子）が前記の水又は水溶液中に分散された分散液が容器中に調製される。
【０１０７】
得られた分散液は、直接生体に投与されることが可能である。すなわち、無溶媒のナノ粒子そのものの状態で保存されなくてもよい。
一方、得られた分散液を凍結乾燥処理しても良い。凍結乾燥処理の方法としては公知の方法を特に限定されることなく用いることができる。たとえば、上記のようにして得られたナノ粒子の分散液を液体窒素などによって凍結させ、減圧下で昇華させることによって行うことができる。これにより、ナノ粒子の凍結乾燥処理物が得られる。すなわち、ナノ粒子を凍結乾燥処理物として保存することが可能になる。必要に応じ、この凍結乾燥物に水又は水溶液を加えて、ナノ粒子の分散液を得ることによって、ナノ粒子を使用に供することができる。水又は水溶液としては特に限定されることなく、生化学的、薬学的に許容することができるものを当業者が適宜選択すればよい。例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。
【０１０８】
ここで、凍結乾燥処理前の分散液中には、両親媒性ブロックポリマーと蛍光色素とから形成された本発明のナノ粒子以外にも、そのようなナノ粒子の形成に寄与しなかった両親媒性ブロックポリマー及び／又は蛍光色素が各々それ自体として残存しうる。このような分散液を凍結乾燥処理に供すると、溶媒が濃縮される過程で、本発明のナノ粒子を形成せず残存していた両親媒性ブロックポリマーと蛍光色素とから、さらにナノ粒子を形成することが可能になる。従って、本発明のナノ粒子の調製を効率的に行うことが可能になる。
【０１０９】
［３−５−２．インジェクション法］
インジェクション法は、本発明のナノ粒子に限らず、他の多くのナノ粒子の調製に用いられる方法である。この方法においては、有機溶媒、例えばトリフルオロエタノール、エタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどに、両親媒性ブロックポリマーと蛍光色素とを溶解し、得られた溶液を、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などの水系溶媒に分散させ、精製処理、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、フィルタリング、超遠心などの処理を行った後、有機溶媒を除去することによってナノ粒子を調製することができる。このようにして得られたナノ粒子を生体内へ投与する場合であって、有機溶媒に生体に有害なものを用いた場合は、この有機溶媒の除去を厳密に行う必要がある。
【０１１０】
［４．蛍光分子イメージング法］
本発明の蛍光分子イメージング法は、上記の蛍光ナノ粒子をプローブとして生体内に投与することを含む。本発明の蛍光分子イメージング法は、上記の蛍光プローブを用いることに特徴付けられており、その他の具体的な手順は、公知の蛍光分子イメージング法に準じ、当業者が適宜決定することができる。
【０１１１】
［４−１．蛍光プローブの投与］
蛍光プローブを投与される生体としては特に限定されないが、非ヒト動物でありうる。非ヒト動物としては特に限定されないが、ヒト以外の哺乳類、より具体的には、霊長類、齧歯類（マウス、ラットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、及びウマなどが挙げられる。
生体内への投与の方法としては特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。従って、投与の方法としては、蛍光プローブが細胞成分と接触することができる態様であれば、全身投与及び局所投与とを問わない。すなわち、分子プローブの投与は、注射（針有型、針無型）、内服、外用のいずれの方法によっても行うことができる。
【０１１２】
本発明の蛍光プローブは、スイッチング機能を備えている。このため、蛍光プローブ調製後から生体内に投与され血中成分と接触した状態においては蛍光が消光しているが、ターゲット部位の細胞に接触又は取り込まれることによって蛍光を発する。
【０１１３】
［４−２．投与ターゲット］
本発明の方法において蛍光プローブとして用いられるナノ粒子は、血管病変部位（例えば、悪性腫瘍部位、炎症部位、動脈硬化部位、血管新生部位など）への特異的集積性に優れたものである。本発明の蛍光プローブは、ＥＰＲ (enhanced permeability and retention) 効果によりこれらの部位の組織へ集積するため、その集積性は血管病変部位の組織の種類によらない。本発明の蛍光プローブの投与ターゲットとしてはがんであることが好ましい。投与ターゲットとなりうるがんは多岐に亘る。例えば、肝臓がん、すい臓がん、肺がん、子宮頸がん、乳がん、大腸がんなどが挙げられる。
【０１１４】
［４−３．蛍光プローブの検出］
本発明の分子イメージングシステムにおいては、投与された蛍光プローブに由来する蛍光を検出する工程を含む。投与された蛍光プローブを検出することによって、体外から投与ターゲットの様子（特にがんなどの組織の位置・大きさ）を観測することができる。
検出方法としては、投与された蛍光プローブを可視化させることができるあらゆる手段を用いることができる。当該手段としては、蛍光プローブが有する蛍光色素の種類に応じて、当業者が適宜決定することができる。
【０１１５】
例えば、蛍光プローブを投与された生体を励起光照射し、体内の蛍光プローブが有する蛍光色素が発する蛍光を検出することができる。
励起波長や、検出すべき蛍光波長といったパラメーターは、投与される蛍光プローブが有する蛍光色素の種類、及び投与ターゲットの種類に応じて、当業者が適宜決定することができる。
【０１１６】
投与から検出開始までの時間は、投与される蛍光プローブが有する蛍光色素の種類、及び投与ターゲットの種類に応じて、当業者が適宜決定することができる。例えば、投与後１〜２４時間、とすることができる。上記範囲を下回ると、シグナルが強すぎ、投与ターゲットと他の部位（バックグラウンド）とを明確に分けることができない傾向にある。また、上記範囲を上回ると、蛍光プローブが投与ターゲットから排泄されてしまう傾向にある。
【０１１７】
蛍光プローブの検出は、正確性の観点から、生体の一方向からではなく、複数の方向からの測定によって行うことが好ましい。具体的には、少なくとも３方向、より好ましくは少なくとも５方向からの測定を行うと良い。５方向からの測定を行う場合は、例えば、左右両腹側から、左右両体側から、及び背中側からの測定を行うことができる。
【実施例】
【０１１８】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。
実施例においては、本発明のナノ粒子として、ポリサルコシン−ポリ乳酸両親媒性ブロックポリマー（PSar-PLLA）又は抗体修飾ポリサルコシン−ポリ乳酸両親媒性ブロックポリマー（抗HER2 scFv-PSar-PLLA）をキャリア剤とし、蛍光化合物で標識したポリ乳酸ICG-PLLA30、ICG-PDLA32、又はIC71-PLLA30（ポリ乳酸結合シアニン化合物）を蛍光色素として内包させたナノ粒子を調製した。しかしながら、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
また、比較用のナノ粒子として、上記のポリサルコシン−ポリ乳酸両親媒性ブロックポリマー（PSar-PLLA）をキャリア剤とし、ICG（Sigma）又はIC7-1を蛍光色素として内包させたナノ粒子を調製した。【０１１９】
［実験例１：N-[5-Anilino-3-chloro-2,4-(propane-1,3-diyl)-2,4-pentadiene-1-ylidene]anilinium Chloride (化合物1)の合成］
100 mL 3つ口フラスコに無水DMF(13 mL, 0.17 mol)を入れ0℃まで冷却した。その中へ、オキシ塩化リン(11 mL, 0.12 mol)を15分かけ滴下した。0℃で１時間攪拌した後、シクロヘサノン(5.5 mL, 0.053 mol)を加えた。室温で１時間攪拌した後、過熱還流させさらに１時間攪拌した。室温まで冷却した後、aniline/EtOH=1/1（体積比）の混合溶液 18 mLを加えた。30分後、H2O/HCl=10/1（体積比）の混合溶液 110 mLを加え、5℃で一晩放置した。沈殿物をろ取し、THF、冷水で洗浄した後、結晶をP2O5と共にデシケーター内で乾燥させ、化合物１を得た（スキーム１）。収率は53.6% (10.2 g)であった。【０１２０】
【化２８】
2012118136.tif 000030
【０１２１】
［実験例２：3-(5-Carboxy-pentyl)-1,1,2-trimethyl-1H-benzo[e]indolium; iodide (化合物2)の合成］
50 mLのナスフラスコに、6-Bromohexanoic Acid(8.4 g, 43.0 mmol)、ヨウ化カリウム(7.2 g, 43 mmol)及びトルエン5 mLを加えた後、1,1,2-Trimethyl-1H-benzo[e]indole(3.0g, 14.3 mmol)を加えた。15時間加熱還流した後、析出した固体を濾取した。固体は、THF、冷水、Chloroformの順で洗浄した後、デシケーターで乾燥させ、化合物２を得た（スキーム２）。収率は77% (5.0 g)であった。【０１２２】
【化２９】
2012118136.tif 000031
【０１２３】
［実験例３：中間体3の合成］
化合物1(3.00 g, 8.35 mmol)、化合物2(3.77 g, 8.35 mmol)、無水酢酸ナトリウム(0.753 g, 9.19 mmol)、を75.0 mLの無水エタノールに溶解し、窒素雰囲気下6時間加熱還流した。反応終了後、0.2 mol/Lのリン酸緩衝液 pH=7.0を加え中和した後、有機物をクロロホルムで抽出した。抽出物を一旦濃縮し、カラムクロマトグラフィーにて精製し、中間体３を得た（スキーム３）。収率は25.5% (1.45 g)であった。【０１２４】
【化３０】
2012118136.tif 000032
【０１２５】
［実験例４：3-(2-Hydroxy-ethyl)-1,1,2-trimethyl-1H-benzo[e]indolium; iodide(化合物4)の合成］
50 mLの３つ口フラスコに1,1,2-Trimethyl-1H-benzo[e]indole(2.0 g, 9.556 mmol)と無水トルエン10 mLを加え、窒素雰囲気下80℃に加熱した。1,1,2-Trimethyl-1H-benzo[e]indoleがトルエンに完全に溶解した後、2-Iodoethanol(1.64 g, 9.556 mmol)を加えた。２時間加熱還流を行った後、室温まで冷却し、析出した淡青色結晶を濾取した。結晶をトルエンで洗浄し、デシケーター内で乾燥させ、化合物４を得た（スキーム４）。収率は33% (1.21 g)であった。【０１２６】
【化３１】
2012118136.tif 000033
【０１２７】
［実験例５：IC7-1の合成］
中間体3(1.16 g, 1.70 mmol)、化合物4(0.714 g, 1.87 mmol)、及び無水酢酸ナトリウム(0.153 g, 1.87 mmol)を29.0mLの無水エタノールに溶解し、窒素雰囲気下5時間加熱還流した。反応終了後、0.2 mol/Lのリン酸緩衝液 pH=7.0を加え中和した後、有機物をクロロホルムで抽出した。抽出物を一旦濃縮し、カラムクロマトグラフィーにて精製し、IC7-1を得た（スキーム５）。収率は85.3 % (1.22 g)であった。【０１２８】
【化３２】
2012118136.tif 000034
【０１２９】
［実験例６：IC7-1 NHSエステルの合成］
IC7-1(600 mg, 0.713 mmol)を12 mLの無水DMFに溶解し、氷浴中で0度に冷却した。その後、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）(440 mg, 2.14mmol)を加え20分攪拌した後、N-ヒドロキシこはく酸イミド（NHS）(246 mg, 2.14 mmol)を加え、1.5時間かけて室温に戻した。その後室温で2日間攪拌した（スキーム６）。反応終了後、酢酸エチルを加えDCウレアを析出させ、濾取した。濾液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーにて精製し、目的のC7-1 NHSエステルを得た。収率は14.9% (100.0 mg)であった。【０１３０】
【化３３】
2012118136.tif 000035
【０１３１】
［実験例７：アミノ化ポリL-乳酸及びアミノ化ポリD-乳酸の合成］
本実験例では、Ｌ−ラクチド（化合物６）とＮ−カルボベンゾキシ−１，２−ジアミノエタン塩酸塩（化合物７）とを用いて、アミノ化ポリL-乳酸（a-PLA）を合成した（スキーム７）。【０１３２】
【化３４】
2012118136.tif 000036
【０１３３】
重合開始剤であるＮ−カルボベンゾキシ−１，２−ジアミノエタン塩酸塩（化合物７）（310 mg, 1.60 mmol）に、オクタン酸スズ（6.91 mg）をトルエン（1.0 ｍL）に拡散させたものを加えた。トルエンを減圧留去した後、Ｌ−ラクチド（化合物６）（3.45 g, 24
mmol）を加え、Ar雰囲気下、120 ℃にて重合反応を行った。12時間後、反応容器を室温に空冷した。得られた黄白色固体を少量のクロロホルム（10 mL程度）に溶解させた。クロロホルムを冷メタノール（100 mL）に滴下することにより白色沈殿を得た。得られた白色沈殿は遠心分離により回収し、減圧乾燥した。【０１３４】
得られた白色沈殿（500 mg）のジクロロメタン(1 ml)溶液に25v/v%臭化水素／酢酸（2.0 mL）を加え、遮光、乾燥空気下にて2時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を冷メタノール（100 mL）に滴下し、析出してきた沈殿を遠心分離にて回収した。得られた白色沈殿はクロロホルムに溶解させた後、飽和NaHCO3水溶液にて洗浄し、無水MgSO4にて脱水操作を行った。セライト(R)濾過によりMgSO4を除去した後、真空乾燥することにより、白色のアモルファス状粉末のa-PLA（440 mg）を得た。【０１３５】
アミノ化ポリD-乳酸は、L-ラクチドの代りにD-ラクチドを用いたことを除いて上述と同様の方法で調製した。【０１３６】
［実験例８：ポリ乳酸結合蛍光化合物（IC71-PLLA30、ICG-PLLA30及びCy5-PLLA30）の合成］
a-PLA 2.0 mg (1.0 eq)を含むDMF溶液に、IC7-1 NHSエステル、ICG-Sulfo-OSu、又はCy5 NHS エステルを1.3 eqとなるように溶かしたDMF溶液を加え、室温で約20時間攪拌した。その後、LH20カラムにて精製を行い、溶媒を減圧留去し、ポリ乳酸結合蛍光化合物を得た。IC71-PLLA30の合成スキームをスキーム８に示した。【０１３７】
【化３５】
2012118136.tif 000037
【０１３８】
ICG-PLLA30及びCy5-PLLA30は、IC7-1 NHS エステルの代わりにICG-Sulfo-OSu及びCy5 NHS エステルをそれぞれ用いたことを除いて上述と同様の方法で調製した。【０１３９】
［実験例９：ポリサルコシン−ポリ乳酸両親媒性ブロックポリマー（PSar70-PLLA30）の合成］
本実験例では、サルコシン−NCA（Sar-NCA）とアミノ化ポリL-乳酸（a-PLA）とから、ポリサルコシン−ポリ乳酸両親媒性ブロックポリマー（PSar70-PLLA30）を合成した（スキーム９）。
【化３６】
2012118136.tif 000038
【０１４０】
a-PLA（383 mg, 0.17 mmol）とサルコシン−NCA (Sar-NCA) (3.21 g, 27.9 mmol) に、Ar雰囲気下、ジメチルホルムアミド（DMF）（140 mL）を加え、室温にて12時間攪拌した。反応溶液を0 ℃に冷却した後、グリコール酸（72 mg, 0.95 mmol）、Ｏ−（ベンゾトリアゾル−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（HATU）（357 mg, 0.94 mmol）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）（245 μL, 1.4 mmol）を加え、室温にて18時間反応させた。【０１４１】
ロータリーエバポレーターによりDMFを減圧溜去した後、LH20カラムにて精製を行った。UV270 nmにてピークが検出されたフラクションを回収・濃縮した。得られた濃縮溶液を0 ℃にてジエチルエーテル中に滴下し、再沈澱することにより、目的物であるPSar70-PLLA30（1.7 g）を得た。【０１４２】
［実験例１０：NH化ポリサルコシン−ポリ乳酸両親媒性ブロックポリマー（NH-PSar56-PLLA30）の合成］
a-PLA（1.48 g, 0.654 mmol）とサルコシン−NCA (Sar-NCA) (7.53 g, 6.54 mmol) に、Ar雰囲気下、ジメチルホルムアミド（DMF）（140 mL）を加え、室温にて12時間攪拌した。ロータリーエバポレーターによりDMFを減圧溜去した後、LH20カラムにて精製を行った。UV270 nmにてピークが検出されたフラクションを回収・濃縮した。得られた濃縮溶液を0 ℃にてジエチルエーテル中に滴下し、再沈澱することにより、目的物であるNH-PSar56-PLLA30（4.7 g）を得た。【０１４３】
［実施例１：蛍光色素内包ナノ粒子の作成］
ナノ粒子のキャリア部分であってポリサルコシン−ポリ乳酸両親媒性ブロックポリマーからなる分子集合体をラクトソーム（Lactosome）と記載する。また、抗体修飾ポリサルコシン−ポリ乳酸両親媒性ブロックポリマーからなる分子集合体を抗体修飾ラクトソームと記載する。【０１４４】
［実施例１−１：蛍光色素内包ラクトソームの作製１］
本実施例では、蛍光色素としてICG-PLLA30又はICG-PDLA32を内包させたラクトソームを以下のように調製した。【０１４５】
キャリア剤であるポリ乳酸−ポリサルコシン両親媒性ブロックポリマー（PSar70-PLLA30・ 26H2O, MW=7767）及び上記の蛍光色素それぞれのクロロホルム溶液（0.2 mM）を調製した。蛍光色素ICG-PLLA30及びICG-PDLA32については、蛍光色素のモル濃度がそれぞれ0.6 mol%、1 mol%、1.5 mol%、2 mol%、3 mol%、4 mol%、及び5 mol%となるように、ガラス容器内で両溶液を混合した。また、蛍光色素ICG-PLLA30については、蛍光色素のモル濃度が8 mol%となるように、ガラス容器内で両溶液を混合した。その後、フィルム法に従ってラクトソームを作製した。フィルム法は、以下の通り行った。混合液から溶媒を減圧留去しガラス容器の壁面にキャリア剤及び蛍光色素を含むフィルムを形成させた。さらに、フィルムを形成したガラス容器内に、水または緩衝液を加え、温度８２℃で２０分間湯せんした後、室温で３０分間放置し、0.2 mmのフィルターでろ過し凍結乾燥した。【０１４６】
［実施例１−２：蛍光色素内包ラクトソームの作製２］
本実施例では、蛍光色素として、IC71-PLLA30、ICG-PLLA30、IC7-1（比較用）、又はICG（比較用）を内包させたラクトソームを以下のように調製した。
キャリア剤であるポリ乳酸−ポリサルコシン両親媒性ブロックポリマー（PSar70-PLLA30・ 26H2O, MW=7767）及び上記の蛍光色素それぞれのクロロホルム溶液（0.2 mM）を調製した。蛍光色素のモル濃度がそれぞれ20 mol%となるように、ガラス容器内で両溶液を混合した。その後、フィルム法に従って実施例１−１と同様の操作を行った。【０１４７】
［実施例１−３：蛍光色素内包抗体修飾ラクトソームの作製１］
本実施例では、蛍光色素としてIC71-PLLA30を内包させた抗体修飾ラクトソーム（抗HER2scFv-lactosome）を以下のように調製した。【０１４８】
NH-PSar56-PLLA30100 mgを乾燥させたジメチルホルムアミド（DMF） 2.5 mLに溶解した後、N-succimidyl 3-Maleimidopropyonate（NSMP）21.3 mg (5 当量)及びDiisopropylethylamine （DIEA）5.45μL (2 当量)を加え、室温で7時間撹拌した（スキーム１０）。DMFを留去した後、得られた白色沈殿を酢酸エチルで3回洗浄し、マレイミド修飾PSar56-PLLA30を得た(収量: 59.1 mg)。マレイミド修飾PSar56-PLLA30をPSar72-PLLA30と1:1（モル比）で混合した後、IC71-PLLA30を加え、フィルム法に従ってマレイミドラクトソームを作製した。【０１４９】
【化３７】
2012118136.tif 000039
【０１５０】
抗HER2 単鎖抗体（抗HER2 scFv）を大腸菌発現系より調製し、IMACキット（バイオラッド社製）を用い、添付のプロトコルに従って精製した。抗 HER2 scFv (3 mg/mL PBS) 100
μLにTris (2-carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) 63.7 μg (10当量)を加え、氷冷下2時間撹拌した。スピンカラム (Sephadex G-50；GEヘルスケア株式会社製)を用いて精製した後、上記のマレイミドラクトソーム(1 mg/mL PBS) 1 mLを加え、氷冷下4時間反応した。さらにCysteine・HCl (20 mM PBS) 50 μLを加え、30分氷冷下撹拌した。その後、Amicon（ミリポア社製） (100 kDa cut)を用いて精製した。得られた抗 HER2 scFv-lactosomeを、サイズ排除カラム(Superdex 200 10/300 GL ；GEヘルスケア株式会社製)を用いて確認した。また、抗体結合量はBCAプロテインアッセイキット（Thermo Scientific社製）を用いて定量した。得られた蛍光色素内包抗体修飾ラクトソームの粒子径は38.5 nm (Intensity)、抗体結合数は10 /lactosomeであった。【０１５１】
［実施例１−４：蛍光色素内包ラクトソームの作製３］
本実施例では、蛍光色素としてポリ乳酸結合シアニン化合物Cy5-PLLA30を用いたことを除いて実施例１−１及び１−２と同様の手順を行い、蛍光色素Cy5-PLLA30のモル濃度が1 mol%及び20 mol%である蛍光色素内包ラクトソームをそれぞれ作製した。【０１５２】
［実施例１−５：蛍光色素内包抗体修飾ラクトソームの作製２］
本実施例では、蛍光色素としてポリ乳酸結合シアニン化合物Cy5-PLLA30を用いたことを除いて実施例１−３と同様の手順を行い、Cy5-PLLA30を内包させた抗体修飾ラクトソーム（Cy5 anti HER2 lactosome）を作製した。【０１５３】
［実施例２：蛍光色素内包ラクトソームの蛍光スペクトル］
実施例１−１で得られた蛍光色素内包ラクトソーム（ICG-PLLA30/Lactosome、ICG-PDLA32/Lactosome）について、蛍光色素ICG-PLLA30又はICG-PDLA32を0.6 mol%、1 mol%、1.5 mol%、2 mol%、3 mol%、及び4 mol%内包したものの凍結乾燥品、及び、蛍光色素ICG-PLLA30を8 mol%内包したものの凍結乾燥品について、以下のように蛍光スペクトルの測定を行った。蛍光スペクトルは、励起波長730 nmで750-900 nmの範囲を蛍光分光光度計（RF-5300PC 島津製作所社製）で測定した。【０１５４】
それぞれのラクトソームが、両親媒性ポリマー濃度で1 mg/mlとなるように超純水に分散させ、蛍光剤濃度が0.48 μMとなるように希釈した後、蛍光スペクトルを測定した(図１(A)及び(B))。図１(A)及び(B)において、横軸は波長（Wavelength）を表し、縦軸は蛍光強度（Fluorescence intensity）を表す。また、それぞれ817 nmにおける蛍光強度の減少を図１(C)に示した。図１(C)において、縦軸は蛍光強度（Fluorescence intensity）を表す。結果、ICG-PLLA30又はICG-PDLA32を1 mol%以上内包することにより蛍光強度が減少することが分かった。ICG-PLLA30の場合は蛍光色素配合量を3.7 mol%増やすごとに蛍光強度が1/2に減少し、ICG-PDLA32の場合は蛍光色素配合量を2.8 mol%増やすごとに蛍光強度が1/2に減少する傾向を示した。
従って、ポリ乳酸結合シアニン化合物を高密度に内包したラクトソームにおいて蛍光が消光していることが明らかとなった。【０１５５】
［実施例３：外部環境変化による蛍光色素内包ラクトソームの蛍光強度変化１］
IC71（比較用）、IC71-PLLA30、ICG（比較用）、及びICG-PLLA30を20mol%配合したラクトソーム（1mg/ml)に対して、リン酸緩衝生理食塩水(PBS；超純水1Lに対して、Na2HPO4・12H2Oが29g、NaH2PO4・2H2Oが2.96g、NaClが8.7g含まれる組成を有する)、血漿(Plasma; (ddY 雄性より採血)、5重量% アルブミン（BSA）、及び5重量% SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）をそれぞれ1:1（体積比）で混合し、遮光下室温で30分間放置後、両親媒性ポリマー濃度で1/15 mg/mlとなるようにPBSで希釈し、蛍光スペクトルを測定した(図２(A)-(D))。図２において、横軸は波長（Wavelength）を表し、縦軸は蛍光強度（Fluorescence intensity）を表す。結果、ポリ乳酸が結合していないIC7-1及びICGについては、SDS、血漿、及びBSA溶液中で蛍光強度の回復が観測された。それに対して、ポリ乳酸が結合したIC71-PLLA30及びICG-PLLA30の場合は、血漿及びBSA溶液中で蛍光の消光状態が保たれており、SDS溶液中でのみ蛍光強度が回復した。SDSは界面活性剤であることからラクトソーム粒子の構造変化により蛍光強度が回復したと考えられる。【０１５６】
［実施例４：外部環境変化による蛍光色素内包ラクトソームの蛍光強度の経時変化２］
IC71-PLLA30を20mol%配合したラクトソーム（1mg/ml）に対して、PBS、5重量%SDS、5重量% BSA、血漿、RPMI（Roswell Park Memorial Institute）1640培地をそれぞれ1:1（体積比）で混合し、遮光下室温で30分、1時間、3時間、6時間、及び24時間放置後、両親媒性ポリマー濃度で1/30 mg/mlとなるようにPBSで希釈し、蛍光スペクトルを測定した(図３)。図３において、横軸は時間（Time(H)）を表し、縦軸は蛍光強度（Fluorescence intensity）を表す。結果、PBSおよびRPMI1640培地中では24時間後まで蛍光強度に変化はなく、消光状態が保たれていた。BSAおよび血漿中では30分後の蛍光強度と比較して、それぞれ24時間後に1.7倍および2.2倍に蛍光強度が増加した。SDS中では3時間後まで蛍光強度が増加し、その後24時間まで一定であった。【０１５７】
［実施例５−１：蛍光強度の回復１（in vitro）］
12 well plateに、HER2を発現するN87細胞を1x105 cell/well加え、一晩培養した後、PBSで2回洗浄した。1 mol % 又は20 mol% のIC71-PLLA30を内包した 抗HER2scFv-lactosome、及び1 mol % 又は20 mol% のIC71-PLLA30を内包したlactosome (40 μg/mL RPMI1640)
をそれぞれ 1 mL/wellずつ加えた。遮光下37℃、5％CO2下にてインキュベートし、インキュベート開始30分、1時間、3時間、6時間、24時間後に細胞をPBSで2回洗浄した。PBS洗浄後におけるそれぞれの細胞をClairvivo OPT（島津製作所製）を用いて蛍光撮像した（励起：785 nm、蛍光：845 nm、露光時間 20秒 (1 mol%) 5秒 (20 mol%)）。その結果を図４に示す。図４において、横軸は時間（Time(H)）を表し、縦軸は蛍光強度（Normalized intensity/mg protein）を表す。Normalized intensityは、細胞の蛍光強度を、添加した溶液の蛍光強度で除算した値である。【０１５８】
図４が示すように、ポリ乳酸結合シアニン化合物を1mol%内包した場合と20 mol%内包した場合とを比較すると、表面未修飾のラクトソームにおいては、20mol%内包した場合の方が添加24時間後で約93倍高い蛍光強度を示した。一方、抗HER2scFv修飾ラクトソームにおいては、20mol%内包した場合の方が添加24時間後で約120倍高い蛍光強度を示した。抗HER2scFv修飾ラクトソームの方が高い蛍光強度を示した理由は、細胞表面に発現しているHER2に対して抗HER2scFvが結合し、より細胞に取り込まれやすくなるからと考えられる。【０１５９】
［実施例５−２：蛍光強度の回復２（in vitro）］
本実施例では、蛍光色素としてのポリ乳酸結合シアニン化合物Cy5-PLLA30を1mol%内包し且つ抗体修飾されたラクトソーム（Cy5 anti HER2 lactosome）と、Cy5-PLLA30を1mol%内包し且つ抗体修飾されていないラクトソーム（Cy5 lactosome）とについて、細胞へ取り込まれる態様を蛍光顕微鏡を用いて評価した。【０１６０】
3.5cm Glass base dish (IWAKI)にN87細胞を1×105cells加え、一晩培養した後、PBSで２回洗浄し、ラクトソーム溶液として、Cy5 anti HER2 lactosome (40μg/mL RPMI) 1mL/well、又はCy5 lactosome (40μg/mL RPMI) 1mL/wellを加えた。各ラクトソーム溶液添加後１時間、３時間、６時間及び２４時間後にラクトソーム溶液を除去し、PBSで２回洗浄後、蛍光顕微鏡下（BZ9000, KEYENCE）で観察した。図５（Ａ）に抗体修飾されたラクトソーム（HER2 lactosome）、図５（Ｂ）に抗体修飾されていないラクトソーム（lactosome）についての蛍光観察結果を、明視野像（下段の像）とともに示す。図５が示すように、抗体修飾がない場合でもラクトソーム添加後24時間には細胞内に取り込まれていることが分かった。また、抗体修飾がある場合には、添加後1時間から細胞膜に蛍光が観察され、徐々に細胞内に局在していくことが分かった。【０１６１】
［実施例５−３：蛍光強度の回復３（in vitro）］
本実施例では、蛍光色素としてのポリ乳酸シアニン化合物Cy5-PLLA30を20%内包し且つ抗体修飾されたラクトソーム（Cy5 anti HER2 lactosome）と、Cy5-PLLA30を20mol%内包し且つ抗体修飾されていないラクトソーム（Cy5 lactosome）とについて、細胞へ取り込まれる態様を蛍光顕微鏡を用いてより詳細に評価した。【０１６２】
3.5cm Glass base dish (IWAKI)にN87細胞を1×105cells加え、一晩培養した後、PBSで２回洗浄し、ラクトソーム溶液として、抗体修飾されたラクトソーム Cy5 anti HER2 lactosome (40μg/mL RPMI) 1mL/well、又は抗体修飾されていないラクトソーム Cy5 lactosome (40μg/mL RPMI) 1mL/wellを加えた。各ラクトソーム溶液添加後３時間、６時間及び２４時間後にラクトソーム溶液を除去し、PBSで２回洗浄した。さらに、細胞核染色剤としてHoechst33342（同仁化学研究所）及びリソソーム染色剤としてLyso Tracker Yellow HCK-123（インビトロジェン）を用いて細胞を染色し、蛍光顕微鏡下（BZ9000, KEYENCE）で観察した。【０１６３】
染色された細胞と、蛍光が観察された細胞とを比較観察した結果を図６に示す。図６（Ａ）は抗体修飾されたラクトソーム（HER2 lactosome）、図６（Ｂ）は抗体修飾されていないラクトソーム（lactosome）を取り込んだ細胞の写真であり、それぞれ、明視野（Bright Field）、Hoechst33342の蛍光、Lyso Tracker Yellow HCK-123の蛍光、及びCy5の蛍光を観察したものである。【０１６４】
図６が示すように、細胞内でのCy5の蛍光の局在は、Lyso Trackerの局在場所と一致した。従って、細胞内に取り込まれたラクトソームは、リソソームに取り込まれ、リソソーム内の酵素により分解され、蛍光が回復したと考えられる。なお、ラクトソームは細胞核内には取り込まれていないことが示唆された。【０１６５】
［実施例５−４：蛍光強度の回復４（in vitro）］
12 well plateに、HER2を発現するN87、BT-474及びSK-BR-3細胞と、HER2を発現しないMCF-7細胞とをそれぞれ1x105 cell/well加え、一晩培養した後、PBSで2回洗浄した。20 mol% のIC71-PLLA30を内包し且つHER2抗体によって修飾されたラクトソーム（anti HER2 lactosome）(40 μg/mL RPMI1640)、及びIC71-PLLA30を内包した抗体非修飾ラクトソーム（Lactosome）(40 μg/mL RPMI1640)をそれぞれ 1 mL/wellずつ加えた。遮光下37℃、5％CO2下にてインキュベートし、インキュベート開始1時間、3時間、6時間及び24時間後に細胞をPBSで2回洗浄した。PBS洗浄後におけるそれぞれの細胞をClairvivo OPT（島津製作所製）を用いて蛍光撮像した（励起：785 nm、蛍光：845 nm、露光時間：5秒）。HER2を発現するN87、BT-474、及びSK-BR-3細胞については、さらに競合阻害実験として、抗HER2抗体を単独で抗体修飾ラクトソームの100当量加えた蛍光撮像も行った。【０１６６】
得られた蛍光スペクトル測定結果を図７に示す。図７において、横軸は時間（Time(hr)）を表し、縦軸は蛍光強度（Normalized intensity/mg protein）を表す。Normalized intensityは、細胞の蛍光強度を、添加した溶液の蛍光強度で除算した値である。また、「anti HER2 lactosome」はIC71-PLLA30内包抗体修飾ラクトソームを用いた結果、「anti HER2 lactosome (阻害)」は競合阻害実験の結果、及び「lactosome」はIC71-PLLA30内包抗体非修飾ラクトソームを用いた結果を表す。【０１６７】
図７が示すように、HER2を発現するN87、BT-474及びSK-BR-3細胞を用いた場合は、HER2抗体修飾ラクトソームのほうが蛍光強度の回復割合が高く、HER2を発現しないMCF-7細胞を用いた場合は、抗体標識の有無に関わらず蛍光強度の回復割合は同程度であった。抗HER2抗体を加えて競合阻害実験を行った場合は、HER2抗体修飾ラクトソームの蛍光強度の回復割合が低くなることから、HER2抗体修飾ラクトソームが、細胞表面に発現しているHER2との相互作用により細胞内に取り込まれていることが示された。【０１６８】
［実施例６：蛍光強度の回復（in vivo）］
右下肢にN87細胞を移植したBalb/cヌードマウス(雌性、4週齢に移植3-4週間後に使用) に、1 mol% 又は20 mol% IC71-PLLA30 抗HER2scFv-lactosome (2 mg/mL PBS)の0.1mlを尾静脈より投与し、投与直後1、 3、 6、 9、 12、及び24時間後に、Clairvivo OPT（島津製作所製）を用いて撮像した（励起：785 nm, 蛍光：845 nm、露光時間 10 sec (1 mol%)
5 sec (20 mol%)）。
図８に上記の担がんマウスの蛍光イメージング結果を示す。蛍光強度は腫瘍部位の投与24時間後の蛍光強度を100％として、40-100%の範囲を表示した。IC71-PLLA30を1mol%内包した場合（図８(A)）も20mol%内包した場合（図８(B)）も、投与後右下肢の腫瘍部位の蛍光強度が徐々に上昇した。この蛍光強度範囲では、IC71-PLLA30を1mol%内包した場合は、投与直後から蛍光が観察されたが、IC71-PLLA30を20mol%内包した場合は、投与3時間後まで蛍光は観察されなかった。この結果は、IC71-PLLA30を20mol%内包した場合の投与初期段階では、内包された蛍光剤がより好ましく消光していたことを示していると考えられる。【０１６９】
図８の蛍光イメージング結果に基づき、図９(A)及び(B)に、それぞれ、腫瘍（Tumor）部位及びバックグラウンド（Background;具体的には背中）の蛍光強度の経時変化を示す。図９において、横軸は時間（Time(H)）を表し、縦軸は蛍光強度（Fluorescence intensity (counts/sec)）を表す。結果、投与直後から蛍光強度の上昇が観測された。1 mol% IC71-PLLA30 抗HER2scFv-lactosomeを投与した場合と20 mol% IC71-PLLA30 抗HER2scFv-lactosomeを投与した場合とを比較すると、投与1時間後まで両者の蛍光強度に違いはないが、後者の場合において、投与3時間後から腫瘍部位の蛍光強度が投与24時間後まで急激に増加した。投与直後の腫瘍部位の蛍光強度は24時間後の強度と比較して、IC71-PLLA30を1mol%内包した場合と20mol%内包した場合で、それぞれ約49%と約5.7%であった。いずれの場合においても、血中で消光状態が保たれたオフ状態のナノ粒子がEPR効果により腫瘍に集積するにつれて、細胞と接触することにより消光された蛍光剤がオン状態に変化したことを示している。【０１７０】
図１０に腫瘍部位とバックグラウンドとの蛍光強度比（T/B比）の経時変化を示す。図１０において、横軸は時間（Time(H)）を表し、縦軸は腫瘍部位とバックグラウンドとの蛍光強度比（Tumor/Background ratio）を表す。結果、T/B比の上昇が確認された。蛍光剤を20mol%内包したほうが1mol%内包したものと比較して、T/B比の値が高いことが示された。1mol%と20mol%のT/B比の差は投与3時間後において最も大きく、20mol%内包したほうが1mol%内包したものと比較して約1.4倍T/B比が高かった。いずれの場合においても、T/B比の向上は、オフ状態のナノ粒子がEPR効果により腫瘍に集積した後、細胞と接触することにより消光された蛍光剤がオン状態に変化したためと考えられる。【０１７１】
なお、常時オン状態のプローブを投与した場合は、血中濃度に依存して経時的にバックグラウンドの蛍光強度が減少するが、図９（Ｂ）に示すように、20 mol% IC71-PLLA30 抗HER2scFv-lactosomeを投与した場合は、バックグラウンドにおいても投与3時間後から蛍光強度の増加が観察された。これは、血中においてもラクトソームが分解しているために起こったと考えられる。しかしながら、その分解に時間がかかることと、消光状態の間にEPR等により腫瘍に運ばれることにより血中に滞留する分が減ることとにより、結果的に、1 mol% IC71-PLLA30 抗HER2scFv-lactosomeを投与した場合と比べてT/B比が高くなったと考えられる。
【図１】
2012118136.tif 000052
【図２】
2012118136.tif 000053
【図３】
2012118136.tif 000054
【図４】
2012118136.tif 000055
【図５】
2012118136.tif 000056
【図６】
2012118136.tif 000057
【図７】
2012118136.tif 000058
【図８】
2012118136.tif 000059
【図９】
2012118136.tif 000060
【図１０】
2012118136.tif 000061
【手続補正書】
【提出日】平成25年8月28日(2013.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性ブロック鎖と疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックポリマーからなる分子集合体と、前記分子集合体に内包されている蛍光色素を含む蛍光ナノ粒子プローブであって、
（ａ）前記親水性ブロック鎖が、サルコシン単位及びアルキレンオキシド単位から選ばれる単位を親水性必須構成単位として含み且つ前記親水性必須構成単位を２０個以上有するものであり、
（ｂ）前記疎水性ブロック鎖が、アミノ酸単位及びヒドロキシル酸単位からなる群から選ばれる単位を疎水性必須構成単位として含み、且つ前記疎水性必須構成単位を１５個以上有するものであり、
（ｃ）前記蛍光色素が、下記構造式（I）：
【化１】
2012118136.tif 000062
（式（I）中、Ｒ１は、置換されていてもよい炭化水素基であり、Ｒ２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基であり；Ａ−は陰イオンであり、ｍは０又は１であり；環Ｂ及び環Ｄは、それぞれ同一又は異なっていてもよい含窒素複素環であり；Ｌは、環状構造を含んでいてもよく、置換されていてもよいポリメチン鎖を構成する連結基である。）で示される蛍光基と、乳酸単位を５〜５０個有するポリ乳酸基とを含むポリ乳酸結合シアニン化合物であり、
前記分子集合体１個当たり、複数分子の前記蛍光色素が会合により自己消光した状態で内包されており、
血中成分との接触においては自己消光状態を維持する、蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項２】
前記蛍光色素が、前記分子集合体に、前記両親媒性ブロックポリマー及び前記蛍光色素の合計に対し１〜５０ｍｏｌ％となる量で内包される、請求項１に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項３】
細胞に接触又は取り込まれた場合の蛍光強度が、血中成分に接触した場合の蛍光強度の１０倍以上である、請求項１又は２に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項４】
Ｌが表す前記連結基が、以下に示す構造：
【化２】
2012118136.tif 000063
（式中、Ｒ３及びＲ３’は、水素であるか、又はそれらが互いに連結して前記環状構造を形成するものであり；Ｘは水素又はハロゲンである。）のいずれかを有するものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項５】
前記環Ｂが以下に示す構造：
【化３】
2012118136.tif 000064
（式中、Ｒ１は、置換されていてもよい炭化水素基であり、Ｒ４及びＲ５は、水素又はアニオン性置換基であるか、若しくはそれらが互いに連結してアリール環を形成するものである。）のいずれかであり、
前記環Ｄが以下に示す構造：
【化４】
2012118136.tif 000065
（式中、Ｒ２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基であり、Ｒ４及びＲ５は、水素又はアニオン性置換基であるか、若しくはそれらが互いに連結してアリール環を形成するものである。）のいずれかである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項６】
前記蛍光基が、下記構造式（II）：
【化５】
2012118136.tif 000066
（式中、Ｒ１は、置換されていてもよい炭化水素基であり、Ｒ２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基であり；Ｒ３及びＲ３’は、水素であるか、又はそれらが互いに連結して環状構造を形成するものであり；Ｘは水素又はハロゲンであり；Ａ−は陰イオンであり、ｍは０又は１であり；環Ｂ及び環Ｄは、それぞれ同一又は異なっていてもよい含窒素縮合芳香族複素環であり；Ｒ４及びＲ５は、水素又はアニオン性置換基であるか、若しくはそれらが互いに連結してアリール環を形成するものである。）で示されるものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項７】
前記蛍光基が、下記構造式（III）：
【化６】
2012118136.tif 000067
（式中、Ｒ２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基である。）
で示されるものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項８】
前記蛍光基が、下記構造式（IV）：
【化７】
2012118136.tif 000068
（式中、Ｒ２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基である。）
で示されるものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項９】
前記蛍光基が下記式（X）：
【化８】
2012118136.tif 000069
（式中、Ｒ２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基である。）
で示されるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項１０】
前記蛍光色素が下記式（III-i）：
【化９】
2012118136.tif 000070
（式中、ｎは５〜５０の整数である。）
である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項１１】
前記蛍光色素が下記式（IV-i）：
【化１０】
2012118136.tif 000071
（式中、ｎは５〜５０の整数である。）
である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項１２】
前記蛍光色素が下記式（X-i）：
【化１１】
2012118136.tif 000072
（式中、ｎは５〜５０の整数である。）
である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項１３】
前記疎水性ブロック鎖が、
疎水性アミノ酸単位を１０個以上有する疎水性ポリペプチド鎖、
ヒドロキシル酸単位を１５個以上有する疎水性ポリエステル鎖、及び、
アミノ酸単位及びヒドロキシル酸単位の両方を合計２０個以上有する疎水性デプシペプチド鎖、
からなる群から選ばれる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項１４】
前記疎水性ブロック鎖が、２５個以上の乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項１５】
前記親水性ブロック鎖が抗体を有することにより、表面が前記抗体によって修飾された請求項１〜１４のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項１６】
前記抗体が、腫瘍が有する物質に対する抗体である、請求項１５に記載の蛍光ナノ粒子プローブ。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の蛍光ナノ粒子プローブを非ヒト動物に投与する工程と、蛍光を検出する工程とを含む、蛍光分子イメージング法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
本発明によると、スイッチング機能（血液中において蛍光色素が消光し、イメージングすべき腫瘍又は炎症部位で蛍光を発する機能）を有する新規なイメージング用蛍光ナノ粒子プローブを提供することができる。
より具体的には、本発明によると、ポリ乳酸結合シアニン化合物を内包させるべき蛍光色素とし、蛍光色素内包量を従来のナノ粒子におけるものより高濃度にすることによって、調製時及び血中成分含有環境内存在時において内包された蛍光色素の蛍光が（蛍光色素の）濃度依存的に減少し、且つ、細胞に接触又は取り込まれた際に蛍光が回復するナノ粒子であって、ＥＰＲ効果による所望の組織への良好な集積性を有するナノ粒子を提供することができる。このため、生体内の所望の組織において特異的に高輝度の蛍光を呈する蛍光ナノ粒子プローブ及びそれを用いた蛍光イメージング法を提供することができる。
【国際調査報告】
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