(57)【要約】  細胞における、目的とするＲＮＡを発現しうるＤＮＡ配列の運搬体としてはプラスミドベクターが広く使用されているが、その構築は技術的な熟練及び時間を要するため、より簡便で迅速な方法が望まれている。その解決方法としてＰＣＲ法により増幅したリニアＤＮＡを用いた方法が検討されているが、細胞内でのＲＮＡ発現が非常に低いという欠点がある。そこで発明者らは、主にＰＣＲ法を用いるだけで作製することができ、高いＲＮＡ発現が可能なリニアＤＮＡによるＲＮＡ発現方法を開発することを課題とした。  発明者らはリニアＤＮＡに用いるターミネータの配列について鋭意検討を重ねた結果、リニアＤＮＡにおいてもプラスミドベクターを用いた場合と同等の発現を可能とする最小単位のターミネータ配列を見出した。かかるターミネータ配列を備えたリニアＤＮＡは簡便かつ迅速に作製することが可能であり、さらに高いＲＮＡ発現を実現できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
2012147370.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターミネータ配列を含むＤＮＡ配列の相補配列からなり、リニアＤＮＡによる細胞におけるＲＮＡ発現用のリバースプライマーであって、前記ターミネータ配列が、３０〜２００塩基からなり、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むことを特徴とするリバースプライマー。
【請求項２】
ターミネータ配列を含むＤＮＡ配列の相補配列が、増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列であることを特徴とする請求項１記載のリバースプライマー。
【請求項３】
ターミネータ配列を含むＤＮＡ配列の相補配列が、アニーリング配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列であることを特徴とする請求項１記載のリバースプライマー。
【請求項４】
ターミネータ配列が、β−グロビン（β-globin）又はＳＶ４０（シミアンウイルス４０）のターミネータ配列由来であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のリバースプライマー。
【請求項５】
ターミネータ配列が、配列番号１又は２で示される配列の一部又は全長であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のリバースプライマー。
【請求項６】
プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列とを順次備えた二本鎖ＤＮＡ配列からなる、細胞におけるＲＮＡ発現用のリニアＤＮＡであって、前記ターミネータ配列が、３０〜２００塩基からなり、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むことを特徴とするリニアＤＮＡ。
【請求項７】
目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列とターミネータ配列との間に、アニーリング配列を備えたことを特徴とする請求項６記載のリニアＤＮＡ。
【請求項８】
ターミネータ配列が、β−グロビン（β-globin）又はＳＶ４０（シミアンウイルス４０）のターミネータ配列由来であることを特徴とする請求項６又は７記載のリニアＤＮＡ。
【請求項９】
ターミネータ配列が、配列番号１又は２で示される配列の一部又は全長であることを特徴とする請求項６〜８のいずれか記載のリニアＤＮＡ。
【請求項１０】
目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列がｓｈＲＮＡ発現ＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項６〜９のいずれかに記載のリニアＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項６〜１０記載のリニアＤＮＡを、細胞内に導入することを特徴とするリニアＤＮＡを用いたＲＮＡ発現方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ターミネータ配列を含むＤＮＡ配列の相補配列からなる哺乳動物等の細胞におけるＲＮＡ発現用のリバースプライマーや、プロモーター配列と目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列とターミネータ配列とを順次備えた二本鎖ＤＮＡ配列からなる細胞におけるＲＮＡ発現用のリニアＤＮＡや、該リニアＤＮＡを用いて細胞においてＲＮＡを高発現させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々なタンパク質を細胞に発現させる技術は、細胞や細胞内におけるタンパク質の機能解析、有用タンパク質の生産などに広く用いられており、今日では欠かせない技術である。細胞内で特定のタンパク質を発現させるためには、細胞内へ遺伝子を導入する方法が有用であり、導入する遺伝子の運搬体としてプラスミドベクターを利用した方法が広く利用されている。プラスミドは細菌や酵母の細胞質内に存在し、染色体のＤＮＡとは独立して自律的に複製を行う、環状二本鎖の構造体である。遺伝子工学分野においては、様々な改変が施され、外来遺伝子が挿入されたプラスミドがプラスミドベクターとして細胞に導入され、遺伝子発現に利用されている。【０００３】
多くのプラスミドベクターは主に、大腸菌等の宿主細胞において複製するための複製起点、プロモーター配列、ターミネータ配列（ポリＡ付加配列、ポリＡ配列と呼ばれるものもある）、薬剤耐性や栄養要求性のマーカー遺伝子、外来遺伝子を挿入するための様々な制限酵素サイトを含むマルチクローニングサイトなどを有している。プロモーター配列は遺伝子の転写の開始を制御する配列であり、多くの場合５００〜１０００塩基程度の配列が使用されている。これらの配列はプラスミドベクターによる遺伝子発現に最適化するために、ウィルスなどの遺伝子発現量の多いプロモーターが用いられ、また元来のプロモーター配列から改変されていることも多い。また、ターミネータ配列は遺伝子の転写の終了を制御し、また転写されたＲＮＡを安定化する配列であり、多くの場合２００〜１０００塩基程度の配列が使用されている。【０００４】
プラスミドベクター構築の一般的で最も容易な例は、以下のとおりである（図１）；（１）目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列を、制限酵素サイトを含むプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅し、両端に制限酵素サイトを持つ目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の増幅産物を得る；（２）工程（１）にて得た増幅産物及びプラスミドベクターを制限酵素により処理する；（３）工程（２）の制限酵素処理物を精製する；（４）工程（３）のプラスミドベクター及び増幅産物をライゲーション反応により連結し、環状化する；（５）工程（４）のライゲーション反応物を大腸菌に形質転換し、選択薬剤を含むプレートにまいて３７℃で一晩インキュベーションする；（６）工程（５）のプレートから大腸菌コロニーをひろい、液体培地にて大腸菌を増殖させる；（７）工程（６）の大腸菌よりプラスミドベクターを精製し、得たプラスミドベクターの配列や構成などを確認する；（８）工程（７）で確認された目的のプラスミドベクターをもつ大腸菌を増殖させ、プラスミドベクターを精製し必要量を得る。これらの工程を全て終えるには、５日〜１週間、あるいはそれ以上の日時を要するのが通例であり、プロジェクトの進行において律速となる実験の一つといえる。【０００５】
プラスミドベクターは、導入した培養細胞内でも比較的安定に維持され、高いＲＮＡ発現を得ることができるという利点を有する。しかし、プラスミドベクターの構築は、上述のとおり酵素処理や大腸菌の生育に多くの時間が必要で完成に時間を要する上、技術的な熟練が求められる。また、構築されたプラスミドベクターを大腸菌内で増幅させる工程だけでも、大腸菌にプラスミドベクターを形質転換し、コロニーを形成させるのに一晩、プラスミドベクターを有する大腸菌の培養に１２時間から通常一晩程度の時間がかかり、プラスミドベクターの増幅にも時間がかかる。そのため、技術的に容易で、発現用ＤＮＡの構築及び増幅に要する時間が大幅に短縮された、遺伝子発現の方法が求められていた。【０００６】
近年、正確性の高いポリメレースが開発されたことから、ＰＣＲ法により遺伝子を数時間で合成することが可能になった。そこで、作製に手間と時間がかかる環状のプラスミドベクターに代わって、ＰＣＲ法により増幅した線状のリニアＤＮＡをそのまま細胞内に導入し、遺伝子発現を行う方法が検討されている。この方法で作製した導入用遺伝子が細胞内で十分な遺伝子発現を達成できれば、従来の手間と時間のかかるプラスミド構築を、簡便で迅速なＰＣＲ法によるリニアＤＮＡの作製に替えることが可能となり、大幅な時間の短縮、ハイスループット化が期待できる。しかしながら、ＰＣＲ法で作製したリニアＤＮＡを細胞に遺伝子導入しても、同じ遺伝子配列を持たせたプラスミドと比べ、著しく発現量が低い、あるいは発現しないという問題があった。【０００７】
特許文献１には、細胞での発現に必要な配列である、プロモーター配列、目的遺伝子、発現マーカー遺伝子、ターミネータ配列、ポリアデニレーションシグナル配列を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法を用いて調製する方法が記載されている。しかし、特許文献１記載の方法は細胞内においてリニアＤＮＡが分解されやすく高い発現を得られにくいという問題を解決するために、かかるＤＮＡ断片を環状化する手法が採られており、従来法と同様に細胞内に環状プラスミドベクターを導入するものである。したがってＤＮＡの環状化や環状化したＤＮＡの選択などに要する手間や時間も従来どおりであり、従来法と比べて著しく手間や時間を短縮できるものではない。【０００８】
また特許文献２には、プロモーター、コード領域などを含むリニアＤＮＡが、線状発現エレメントとして記載されている。この特許文献２記載の方法はプロモーターなどの各構成要素を単独に増幅し、それぞれの末端にオーバーハングする一本鎖ＤＮＡ同士のアニーリングにより構成要素同士を非共有結合により連結するものであり、このためにはｄＵＭＰ含有ＰＣＲプライマー及びウラシルＤＮＡグリコシラーゼを用いる方法や、非塩基ホルホルアミデートを用いる方法、ｒＵ／ＲＮａｓｅＡを用いる方法などを利用することができる。しかし、いずれの方法も高価な試薬や煩雑な操作が必要であるという問題があり、ハイスループットに適用できるような、技術的に容易で、時間が大幅に短縮された遺伝子発現の方法とはいえないものである。そして特許文献３には、無細胞系における遺伝子発現のための、プラスミドベクター上のプロモーター、ターミネータを含む、線状ＤＮＡ断片を簡便に作製するための方法が記載されているが、培養細胞におけるリニアＤＮＡによる遺伝子発現の低さを解決することはできていない。【０００９】
また、非特許文献１には、同一ベクター上に、目的遺伝子の一つの下流にＡＡＴＡＡＡ配列を改変したＳＶ４０のポリＡシグナルを備え、もう一つの目的遺伝子の下流にはＡＡＴＡＡＡ配列を改変していないＳＶ４０のポリＡシグナルを備えることにより、一つのベクターを用いて、それぞれ発現量の異なる複数の遺伝子発現を行う方法が記載されている。また、特許文献４には、順次コード領域、翻訳終止コドン、およびポリアデニル化シグナルを含む非翻訳領域からなるＤＮＡの、非翻訳領域のヌクレオチド配列を翻訳終止コドンとＡＡＴＡＡＡポリアデニル化シグナルとの間の距離が３００塩基対以下となるように改変して、ベクターＤＮＡで用いることにより、タンパク質生産を増加させる方法が記載されている。しかしながら、これらはいずれも環状のプラスミドベクターを利用した方法であり、ベクターの作製にかかる手間と時間は従来よりも増加するものである。したがって、培養細胞においてプラスミドベクターに匹敵する高い遺伝子発現を可能とする、技術的に容易で、作製に要する時間が大幅に短縮されたリニアＤＮＡによる遺伝子発現の方法は開発されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００４−１４１０２５号公報
【特許文献２】特表２００２−５４０７７２号公報
【特許文献３】特開２００３−１８９８９０号公報
【特許文献４】特開平７−１６３３８８号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Yuansheng Yang et al., Biotechnology and Bioengineering, 102, 1152-1160 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
細胞における目的とするＲＮＡを発現しうるＤＮＡ配列の操作には、目的とするＲＮＡを発現しうるＤＮＡ配列の運搬体としてプラスミドベクターが広く使用されているが、プラスミドベクターの構築は技術的な熟練が必要となる上、多くの日時を要するため、より簡便で迅速な方法が望まれている。その解決方法として、ＰＣＲ法により増幅したリニアＤＮＡを細胞内に導入する方法が検討されているが、リニアＤＮＡを用いた方法ではプラスミドベクターを用いた場合に比べ、細胞内でのＲＮＡ発現が非常に低いという欠点があり、未だ実用化されていない。本発明の課題は、主にＰＣＲ法を用いるだけで簡便かつ迅速に作製することができるリニアＤＮＡなおかつプラスミドベクターを用いた場合に匹敵する高いＲＮＡ発現が可能なリニアＤＮＡによるＲＮＡを発現するための方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明者らはリニアＤＮＡに用いるターミネータに注目し、その配列について鋭意検討を重ねた結果、リニアＤＮＡにおいてもプラスミドベクターを用いた場合と同等のＲＮＡ発現を可能とする、最小単位のターミネータ配列を見いだした。かかるターミネータ配列を備えたリニアＤＮＡは、主にＰＣＲ法にて簡便かつ迅速に作製することが可能であり、さらに高いＲＮＡ発現を実現できることを確認し、本発明を完成するに至った。【００１４】
すなわち、本発明は［１］ターミネータ配列を含むＤＮＡ配列の相補配列からなり、リニアＤＮＡによる細胞におけるＲＮＡ発現用のリバースプライマーであって、前記ターミネータ配列が、３０〜２００塩基からなり、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むことを特徴とするリバースプライマーや、［２］ターミネータ配列を含むＤＮＡ配列の相補配列が、増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列であることを特徴とする前記［１］記載のリバースプライマーや、［３］ターミネータ配列を含むＤＮＡ配列の相補配列が、アニーリング配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列であることを特徴とする前記［１］記載のリバースプライマーや、［４］ターミネータ配列が、β−グロビン（β-globin）又はＳＶ４０（シミアンウイルス４０）のターミネータ配列由来であることを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれか記載のリバースプライマーや、［５］ターミネータ配列が、配列番号１又は２で示される配列の一部又は全長であることを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれか記載のリバースプライマーに関する。【００１５】
また、本発明は［６］プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列とを順次備えた二本鎖ＤＮＡ配列からなる、細胞におけるＲＮＡ発現用のリニアＤＮＡであって、前記ターミネータ配列が、３０〜２００塩基からなり、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むことを特徴とするリニアＤＮＡや、［７］目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列とターミネータ配列との間に、アニーリング配列を備えたことを特徴とする前記［６］記載のリニアＤＮＡや、［８］ターミネータ配列が、β−グロビン（β-globin）又はＳＶ４０（シミアンウイルス４０）のターミネータ配列由来であることを特徴とする前記［６］又は［７］記載のリニアＤＮＡや、［９］ターミネータ配列が、配列番号１又は２で示される配列の一部又は全長であることを特徴とする前記［６］〜［８］のいずれか記載のリニアＤＮＡや、［１０］目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列がｓｈＲＮＡ発現ＤＮＡ配列であることを特徴とする［６］〜［９］のいずれかに記載のリニアＤＮＡに関する。【００１６】
さらに、本発明は［１１］前記［６］〜［１０］記載のリニアＤＮＡを、細胞内に導入することを特徴とするリニアＤＮＡを用いたＲＮＡ発現方法に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、哺乳動物等の細胞において高いＲＮＡ発現が可能なリニアＤＮＡを作製することや、かかるリニアＤＮＡを用いて哺乳動物等の細胞において高いＲＮＡ発現を行うことが可能となる。また、発現させる配列を適宜選択することにより、タンパク質過剰発現のみならずタンパク質発現抑制なども可能となるなど、汎用性が高いという利点も有している。本発明によると、主にＰＣＲ法を用いるため複雑な操作を必要とせず、簡便かつ迅速にリニアＤＮＡを作製することができる。そのため、一度に多量のサンプルを扱うことができ、機械による自動化も可能であり、ハイスループットによるＲＮＡ発現実験、スクリーニングなどにおいても効果的に本発明を利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】一般的なプラスミドの作製方法（従来法）の概略を表す図である。
【図２】本発明のリニアＤＮＡの作製方法の概略１、２を表す図である。概略１（左パネル）は、目的にあったプロモーターの下流に目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が連結されたテンプレートを使用し、１００塩基対以下の短いターミネータ配列を付加する場合の、１ステップでリニアＤＮＡを作製する方法を表す。概略２（右パネル）は、目的にあったプロモーターの下流に目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が連結されたテンプレートを使用し、１００塩基対以上の長いターミネータ配列を付加する、又は、アニーリング配列を用いてターミネータ配列を付加する、２ステップでリニアＤＮＡを作製する方法を表す。
【図３】本発明のリニアＤＮＡの作製方法の概略３、４を表す図である。目的にあったプロモーターの下流に目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が連結されていないテンプレートを使用し、１００塩基対以下の短いターミネータ配列を付加する、１ステップでリニアＤＮＡを作製する方法を表す。
【図４】本発明のリニアＤＮＡの作製方法の概略５、６を表す図である。目的にあったプロモーターの下流に目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が連結されていないテンプレートを使用し、１００塩基対以上の長いターミネータ配列を付加する、又は、アニーリング配列を用いてターミネータ配列を付加する、２ステップでリニアＤＮＡを作製する方法を表す。
【図５】本発明のリニアＤＮＡの作製方法の概略７、８を表す図である。目的にあったプロモーターの下流に目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が連結されていないテンプレートを使用し、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列をＰＣＲによって付加する、リニアＤＮＡを作製する方法を表す。
【図６】本発明のリニアＤＮＡの作製方法の概略９、１０を表す図である。目的にあったプロモーターの下流に目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が連結されていないテンプレートを使用し目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列をＰＣＲによって付加する、リニアＤＮＡを作製する方法の別の態様を表す。
【図７】プラスミドベクターを用いた場合に比べ、プラスミドベクターを線状化したリニアＤＮＡを用いると遺伝子発現は著しく低いことを示す図である。分泌型ルシフェラーゼ遺伝子を挿入したプラスミドベクター又は、かかるプラスミドベクターのプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子及びターミネータ配列からなるリニアＤＮＡ（ＰＣＲ増幅産物）をＣＯＳ７細胞に導入し、ルシフェラーゼの発現量を測定したグラフである。
【図８】ＳＶ４０ターミネータ配列（ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ）、ＢＧＨターミネータ配列（ＢＧＨ  ｐｏｌｙＡ）、又はβ−グロビンターミネータ配列（β−グロビン  ｐｏｌｙＡ）を用いたリニアＤＮＡ（ＰＣＲ増幅産物）は、プラスミド由来のターミネータ配列（ｐｏｌｙＡ）を使用した場合に比べ、ルシフェラーゼ（ＲＬＵ）遺伝子発現量が高いことを示す図である。
【図９】プライマー内に設計可能な長さのβ−グロビンのターミネータ配列を探索した結果を示す図である。グラフの左から１〜１２番目のグラフは順に塩基番号１〜１７０、１７５、…、５３４番目のβ−グロビンのターミネータ配列を用いた場合、左から１３〜２４番目のグラフは順に塩基番号２１〜１７０、１７５、…、５３４番目のβ−グロビンのターミネータ配列を用いた場合の分泌型ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を測定した結果を表し、以下左から２５〜１０８番目のグラフも同様である。最も短い配列で最も効率よくルシフェラーゼ遺伝子の発現を達成できる配列として、アスタリスクで示した塩基番号１２１〜１７０番目のβ−グロビンのターミネータ配列の塩基配列を得た。
【図１０】リニアＤＮＡによるタンパク質の高発現には、β−グロビンのターミネータ配列の塩基番号１４０〜１５５番目の配列が重要であることを示す図である。グラフは左から順にターミネータ配列なしのネガティブコントロール、塩基番号１２１〜１４０、１４９、…、１７０番目のβ−グロビンのターミネータ配列を用いた場合の分泌型ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を測定した結果を表す。アスタリスクで示した塩基番号１２１〜１５５番目以上の長さのβ−グロビンのターミネータ配列を用いたリニアＤＮＡは高いルシフェラーゼ遺伝子の発現量を示した。
【図１１】β−グロビンのターミネータ配列のうち、高発現に重要な配列は（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）であることを示す図である。塩基番号１２１〜１７０番目のβ−グロビンのターミネータ配列において、各塩基がＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃの場合に、かかるターミネータ配列を用いたリニアＤＮＡによる分泌型ルシフェラーゼ発現量を測定した結果を表すグラフである。４本の棒グラフの下の番号は、置換したβ−グロビンターミネータ配列の塩基番号を表し、４本の棒グラフは左から順にその塩基がＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃである場合を表す。塩基番号の下のＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃは、塩基番号１２１〜１７０番目の野生型β−グロビンのターミネータ配列を用いたリニアＤＮＡと同程度の遺伝子発現を達成できた塩基を表す。
【図１２】ヒト胎児腎細胞由来２９３細胞において、ＣＭＶプロモーターと、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子と、塩基番号１２１〜２００番目のβ−グロビンのターミネータ配列又は塩基番号１２１〜２２０番目のＳＶ４０のターミネータ塩基配列とを順次備えたリニアＤＮＡによって、高い遺伝子発現が得られたことを示す図である。１２１−１５５（１５１Ｔ）は塩基番号１２１〜１５５番目のβ−グロビンターミネータ配列において、塩基番号１５１番目の塩基がチミン（Ｔ）に置換された変異ターミネータ配列を、１２１−２２０ＡＡＴＡＡＡ mutationは塩基番号１２１〜２２０番目のＳＶ４０ターミネータ配列においてＡＡＴＡＡＡがＡＡｃｇＡＡに置換された変異ターミネータ配列を表し、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基配列をもたないネガティブコントロールである。「−」はターミネータ配列なしのリニアＤＮＡを用いたネガティブコントロールを示す。pCMV-Glucはプラスミドベクターを用いたポジティブコントロール、CMV-Gluc linearは、ＣＭＶプロモーター、ルシフェラーゼ遺伝子、pCMV-Gluc由来のターミネータ配列からなるリニアＤＮＡを用いたネガティブコントロールを示す。３ＧＣ９はＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、アニーリング配列（GGGCCCGGG；配列番号５１）を順次備えたリニアＤＮＡ（CMV-hGluc-3GC9）を表し、３ＧＣ９＋１２１−１９０、３ＧＣ９＋１３０−１９０、３ＧＣ９＋１３０−２２０はいずれも分泌型ルシフェラーゼ遺伝子とターミネータ配列の間にアニーリング配列（GGGCCCGGG；配列番号５１）をもつリニアＤＮＡを表す。
【図１３】マウス線維芽細胞ＮＩＨ−３Ｔ３細胞において、ＣＭＶプロモーターと、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子と、塩基番号１２１〜２２０番目のβ−グロビンのターミネータ配列又は塩基番号１２１〜２２０番目のＳＶ４０のターミネータ塩基配列とを順次備えたリニアＤＮＡによって高い遺伝子発現が得られたことを示す図である。１２１−１５５（１５１Ｔ）は塩基番号１２１〜１５５番目のβ−グロビンターミネータ配列において、塩基番号１５１番目の塩基がチミン（Ｔ）に置換された変異ターミネータ配列を、１２１−２２０ＡＡＴＡＡＡ mutationは塩基番号１２１〜２２０番目のＳＶ４０ターミネータ配列においてＡＡＴＡＡＡがＡＡｃｇＡＡに置換された変異ターミネータ配列を表し、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基配列をもたないネガティブコントロールである。「−」はターミネータ配列なしのリニアＤＮＡを用いたネガティブコントロールを示す。pCMV-Glucはプラスミドベクターを用いたポジティブコントロール、CMV-Gluc linearは、ＣＭＶプロモーター、ルシフェラーゼ遺伝子、pCMV-Gluc由来のターミネータ配列からなるリニアＤＮＡを用いたネガティブコントロールを示す。３ＧＣ９はＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、アニーリング配列（GGGCCCGGG；配列番号５１）を順次備えたリニアＤＮＡ（CMV-hGluc-3GC9）を表し、３ＧＣ９＋１３０−１９０は分泌型ルシフェラーゼ遺伝子とＳＶ４０ターミネータ配列の間にアニーリング配列（GGGCCCGGG；配列番号５１）をもつリニアＤＮＡを表す。
【図１４】アフリカミドリザル腎臓由来細胞ＣＯＳ７細胞において、ＣＭＶプロモーターと、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子と、塩基番号１２１〜２００番目のβ−グロビンのターミネータ配列又は塩基番号１２１〜２２０番目のＳＶ４０のターミネータ塩基配列とを順次備えたリニアＤＮＡによって高い遺伝子発現が得られたことを示す図である。１２１−１５５（１５１Ｔ）は塩基番号１２１〜１５５番目のβ−グロビンターミネータ配列において、塩基番号１５１番目の塩基がチミン（Ｔ）に置換された変異ターミネータ配列を、１２１−２２０ＡＡＴＡＡＡ mutationは塩基番号１２１〜２２０番目のＳＶ４０ターミネータ配列においてＡＡＴＡＡＡがＡＡｃｇＡＡに置換された変異ターミネータ配列を表し、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基配列をもたないネガティブコントロールである。「−」はターミネータ配列なしのリニアＤＮＡを用いたネガティブコントロールを示す。pCMV-Glucはプラスミドベクターを用いたポジティブコントロール、CMV-Gluc linearは、ＣＭＶプロモーター、ルシフェラーゼ遺伝子、pCMV-Gluc由来のターミネータ配列からなるリニアＤＮＡを用いたネガティブコントロールを示す。３ＧＣ９はＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、アニーリング配列（GGGCCCGGG；配列番号５１）を順次備えたリニアＤＮＡ（CMV-hGluc-3GC9）を表し、３ＧＣ９＋１３０−１９０は分泌型ルシフェラーゼ遺伝子とＳＶ４０ターミネータ配列の間にアニーリング配列（GGGCCCGGG；配列番号５１）をもつリニアＤＮＡを表す。
【図１５】ヒト上皮細胞由来ＨｅＬａ細胞において、ＣＭＶプロモーターと、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子と、塩基番号１２１〜２００番目及び１２１〜２２０番目のβ−グロビンのターミネータ配列又は塩基番号１２１〜２２０番目のＳＶ４０のターミネータ塩基配列とを順次備えたリニアＤＮＡによって高い遺伝子発現が得られたことを示す図である。１２１−１５５（１５１Ｔ）は塩基番号１２１〜１５５番目のβ−グロビンターミネータ配列において、塩基番号１５１番目の塩基がチミン（Ｔ）に置換された変異ターミネータ配列を、１２１−２２０ＡＡＴＡＡＡ mutationは塩基番号１２１〜２２０番目のＳＶ４０ターミネータ配列においてＡＡＴＡＡＡがＡＡｃｇＡＡに置換された変異ターミネータ配列を表し、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基配列をもたないネガティブコントロールである。「−」はターミネータ配列なしのリニアＤＮＡを用いたネガティブコントロールを示す。pCMV-Glucはプラスミドベクターを用いたポジティブコントロール、CMV-Gluc linearは、ＣＭＶプロモーター、ルシフェラーゼ遺伝子、pCMV-Gluc由来のターミネータ配列からなるリニアＤＮＡを用いたネガティブコントロールを示す。３ＧＣ９はＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、アニーリング配列（GGGCCCGGG；配列番号５１）を順次備えたリニアＤＮＡ（CMV-hGluc-3GC9）を表し、３ＧＣ９＋１３０−１９０は分泌型ルシフェラーゼ遺伝子とＳＶ４０ターミネータ配列の間にアニーリング配列（GGGCCCGGG；配列番号５１）をもつリニアＤＮＡを表す。
【図１６】マウスのＥＳ細胞であるＥＢ３細胞において、ＣＭＶプロモーターと、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子と、塩基番号１２１〜２２０番目のβ−グロビンのターミネータ配列又は塩基番号１２１〜２２０番目のＳＶ４０のターミネータ塩基配列とを順次備えたリニアＤＮＡによって高い遺伝子発現が得られたことを示す図である。１２１−１５５（１５１Ｔ）は塩基番号１２１〜１５５番目のβ−グロビンターミネータ配列において、塩基番号１５１番目の塩基がチミン（Ｔ）に置換された変異ターミネータ配列を、１２１−２２０ＡＡＴＡＡＡ mutationは塩基番号１２１〜２２０番目のＳＶ４０ターミネータ配列においてＡＡＴＡＡＡがＡＡｃｇＡＡに置換された変異ターミネータ配列を表し、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基配列をもたないネガティブコントロールである。「−」はターミネータ配列なしのリニアＤＮＡを用いたネガティブコントロールを示す。pCMV-Glucはプラスミドベクターを用いたポジティブコントロール、CMV-Gluc linearは、ＣＭＶプロモーター、ルシフェラーゼ遺伝子、pCMV-Gluc由来のターミネータ配列からなるリニアＤＮＡを用いたネガティブコントロールを示す。３ＧＣ９はＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、アニーリング配列（GGGCCCGGG；配列番号５１）を順次備えたリニアＤＮＡ（CMV-hGluc-3GC9）を表し、３ＧＣ９＋１３０−１９０は分泌型ルシフェラーゼ遺伝子とＳＶ４０ターミネータ配列の間にアニーリング配列（GGGCCCGGG；配列番号５１）をもつリニアＤＮＡを表す。
【図１７】ヒト胎児腎細胞由来２９３細胞及びマウス線維芽細胞ＮＩＨ−３Ｔ３細胞における、ＳＶ４０プロモーター配列と塩基番号１２１〜２２０番目のＳＶ４０のターミネータ配列をもつリニアＤＮＡによるルシフェラーゼ遺伝子発現を示す図である。pCL-SVは分泌型ルシフェラーゼ遺伝子発現プラスミドベクターを、SV-cLucはＳＶ４０プロモーター配列及びプラスミドベクター由来のターミネータ配列をもつ分泌型ルシフェラーゼ遺伝子発現リニアＤＮＡを、SV-ｃLuc SV40 polyA121-220はＳＶ４０プロモーター配列をもち塩基番号１２１〜２２０番目のＳＶ４０のターミネータ配列をもつ分泌型ルシフェラーゼ遺伝子発現リニアＤＮＡを用いたことを示す。
【図１８】作製した遺伝子発現用リニアＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を示す図である。Ｍはマーカー（ｋｂｐ）を表す。左パネルに、ターミネータ配列なし、塩基番号１２１〜１５５、１２１〜１６０、１２１〜１７０、１２１〜１８０、１２１〜１９０番目のβ−グロビンターミネータ配列を用いたCMV-hGluc terminator beta-globinリニアＤＮＡを示す。中央パネルにCMV-hGluc terminator 121-220(SV40)リニアＤＮＡを示す。右パネルにＣＭＶプロモーター、CMV(-27-1)-hCluc-terminator(121-140)(SV40)、CMV-hCluc-terminator(121-220)(SV40)リニアＤＮＡを示す。
【図１９】作製したｓｈＲＮＡ発現用リニアＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を示す図である。Ｍはマーカー（ｂｐ）を表す。
【図２０】増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列としてｓｈＲＮＡ発現ＤＮＡ配列を用いた場合の結果を示す図である。pEGFP-C1とhU6pあるいはpEGFP-C1とhU6p-EGFP shRNA polyT terminaterあるいはpEGFP-C1とhU6p-EGFPshRNA 3CG9-SVterminaterをHEK293細胞に導入し、４８時間後の蛍光を観察した図である。視野１、２において、左側が蛍光観察、右側が明視野像である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明のリバースプライマーとしては、ターミネータ配列を含むＤＮＡ配列の相補配列からなり、リニアＤＮＡによる細胞におけるＲＮＡ発現用のリバースプライマーであって、前記ターミネータ配列の長さは特に制限されないが、好ましくは３０〜２００塩基からなり、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むことを特徴とするリバースプライマーであれば特に制限されず、例えば（Ａ／Ｔ／Ｇ）は、Ａ，Ｔ又はＧを意味する。本発明におけるターミネータ配列としては、転写終結点及びその周辺の、転写単位の末端にある転写終了を示すＤＮＡ配列に由来するものであってもよく、原核生物のターミネータ配列由来でも、真核生物のターミネータ配列由来でもよい。原核生物のターミネータ配列としては、転写されたＲＮＡの配列が相補的な二本鎖を形成しヘアピン構造を作る、十数塩基からなるパリンドローム配列（回文配列、逆方向反復塩基配列）、及び転写終結シグナルとなるチミン（Ｔ）の連続配列であるＴクラスターを含む配列を挙げることができる。また、転写の終結は、ρ因子というタンパク質がｍＲＮＡと鋳型ＤＮＡの塩基対を破壊して転写が終結するρ因子依存性終結でも、ρ因子非依存性終結でもよい。真核生物のターミネータ配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩ，II，IIIのいずれのポリメラーゼのターミネータ配列でもよく、ポリアデニル化シグナル（ポリＡ配列、ポリＡ付加配列ともいう）を含む３'−非翻訳ＤＮＡ配列を挙げることができ、ポリアデニル化シグナルは一次転写産物の３'−末端にポリＡ配列の付加を促進させる。ターミネータ配列は細菌、真菌、ウィルス、動物、植物などから単離することも、データベース上の配列に基づいて人工的に合成することもできる。
【００２０】
本発明におけるターミネータ配列は、ＲＮＡ発現を行う細胞の種類、プロモーターの種類、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の種類などによっても適宜選択することができる。ここで、「目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列」は、目的とするＲＮＡを発現しうるＤＮＡ配列を意味する。ターミネータ配列の由来としては、β−グロビン（β-globin）ターミネータ配列、ＳＶ４０ターミネータ配列、ＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）ターミネータ配列、ＨＳＶ・ＴＫターミネータ配列、ＣＹＣ１ターミネータ配列、ＡＤＨターミネータ配列、ＳＰＡターミネータ配列、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子ターミネータ配列、カリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ遺伝子のターミネータ配列、トウモロコシ由来のZein遺伝子ターミネータ配列、ルビスコ小サブユニット（ＳＳＵ）遺伝子ターミネータ配列、サブクローバー・スタント・ウイルス（ＳＣＳＶ）遺伝子ターミネータ配列、又はＬａｃＺアルファターミネータ配列、ｐｏｌｙＴターミネータ配列などを挙げることができ、好ましくはラビットβ−グロビン（β-globin）のターミネータ配列（配列番号７）、ＳＶ４０のターミネータ配列（配列番号８）、ＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）のターミネータ配列（配列番号９）を挙げることができ、より好ましくはβ−グロビン（β-globin）のターミネータ配列（配列番号７）又はＳＶ４０のターミネータ配列（配列番号８）を挙げることができる。
【００２１】
本発明の（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むターミネータ配列（以下、「本発明のターミネータ配列」ともいう）としては、１番目の塩基がＡ（アデニン）、Ｔ（チミン）、又はＧ（グアニン）であり、２番目の塩基がＡ、Ｔ、又はＧであり、３番目の塩基がＴであり、４番目の塩基がＡであり、５番目の塩基がＡであり、６番目の塩基がＡであり、７番目の塩基がＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣ（シトシン）であり、８番目の塩基がＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣであり、９番目の塩基がＡ、Ｇ、又はＣである、連続した９塩基の配列を含むターミネータ配列であればよく、かかる連続した９塩基が１又は２以上含まれていてもよい。かかる（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むターミネータ配列の長さは、ＲＮＡ発現用の二本鎖リニアＤＮＡの構築に必要となる時間及び手間を軽減する観点から短い方が好ましいが、所望する細胞内におけるＲＮＡ発現レベルによって長さを適宜調節することができる。本発明のリバースプライマーやリニアＤＮＡにおけるターミネータ配列の長さは、特に制限されないが、好ましくは３０〜２００塩基、好ましくは３５〜１５０塩基、より好ましくは４０〜１００塩基を挙げることができる。最も好ましくは、配列番号７で示されるβ−グロビン（β-globin）又は配列番号８で示されるＳＶ４０のターミネータ配列の塩基配列における塩基番号１２１〜２２０番目の塩基配列（配列番号１又は２）の一部又は全長、中でも、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基を含む長さ３５〜１００塩基の配列を例示することができる。かかる配列は、例えば配列番号７で示されるβ−グロビンターミネータ配列における、塩基番号１２１〜２２０番目（配列番号１）、塩基番号１２１〜２００番目（配列番号３１）、塩基番号１２１〜１９０番目（配列番号３０）、塩基番号１２１〜１８０番目（配列番号２９）、塩基番号１２１〜１７０番目（配列番号１３）、塩基番号１２１〜１６７番目（配列番号１８）、塩基番号１２１〜１６４番目（配列番号１７）、塩基番号１２１〜１６１番目（配列番号１６）、塩基番号１２１〜１６０番目（配列番号２８）、塩基番号１２１〜１５８番目（配列番号１５）、塩基番号１２１〜１５５番目（配列番号１４）で示される塩基配列や、配列番号８で示されるＳＶ４０ターミネータ配列における、塩基番号１２１〜２２０番目（配列番号２）で示される塩基配列を挙げることができる。本明細書においてターミネータ配列は、ＤＮＡ配列だけでなく、ＤＮＡそのものを指す場合もある。
【００２２】
本発明においてＲＮＡ発現を行う細胞としては、哺乳動物細、植物細胞、昆虫細胞、大腸菌、酵母等を挙げることができ、中でも好ましくは哺乳動物細胞であり、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌなど由来の細胞を挙げることができ、中でもヒト、マウス由来の細胞を好適に例示することができる。本発明においてＲＮＡ発現を行う細胞株としては、２９３細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ７細胞、ＨＯＳ細胞、ＳａＭ−１細胞、ｊｕｒｋａｔ細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＣａＣＯ−２細胞、ＳａＯＳ細胞、Ｋ５６２細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ１細胞、Ｌ９２９細胞、Ｆ９細胞、ＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１細胞、ＰＣ−１２細胞、ＲＯＳ１７／２．８細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＢＨＫ−２１細胞などを例示することができ、ＥＢ３細胞などのＥＳ細胞や、組織から採取した初代培養細胞などでもよい。
【００２３】
本発明のリバースプライマーは特に制限されないが、３０塩基以上、好ましくは３０〜２００塩基、より好ましくは３５〜１５０塩基、さらに好ましくは４０〜１００塩基のリバースプライマーを挙げることができ、人工的に化学合成したり、かかるリバースプライマーのＤＮＡ配列をテンプレートにＰＣＲ法にて増幅したり、遺伝子工学的手法にて、かかるリバースプライマーのＤＮＡ配列を組み込んだプラスミドを大腸菌などを用いて増幅し、制限酵素などを用いて切り出すことなどによって作製することができ、市販品を入手してもよい。本発明におけるリバースプライマー及びフォワードプライマーは、ＰＣＲ反応を阻害しない限りは、標識分子やタグ、同位体などで標識や修飾を受けたＤＮＡ分子であってもよい。かかる標識分子としては、蛍光色素、化学物質などを挙げることができ、タグとしてはＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、ＭＹＣタグ、ＧＦＰタグ、ＭＢＰタグ、ＧＳＴタグ、ＨＩＳタグなどを挙げることができる。
【００２４】
本発明のリバースプライマーにおける、ターミネータ配列を含むＤＮＡ配列の相補配列は、増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列とすることができる。本発明における増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列としては、目的とする遺伝子をコードするＤＮＡ配列や、ｓｈＲＮＡ（small hairpin ＲＮＡ）発現配列、ｓｉＲＮＡ(short interfering ＲＮＡ)発現配列、ｍｉＲＮＡ（micro-ＲＮＡ）、核酸アプタマー発現配列、デゴイ発現配列、アンチセンスオリゴヌクレオチド発現配列、リボザイム発現配列などの目的とする機能性核酸を発現するＤＮＡ配列が挙げられる。タンパク質の発現を目的とする場合は、遺伝子をコードするＤＮＡ配列を設定でき、タンパク質を発現させるためのＤＮＡ配列からなるものであればよく、遺伝子をコードする配列の全長でも、その一部でもよく、変異体であってもよい。また、その由来はいかなる生物から単離された遺伝子でも、遺伝子工学的に作製した人工的な遺伝子でもよく、遺伝子におけるＮ末端の開始コドン及びＣ末端に停止コドンは適宜、含んでも、含んでいなくてもよい。また、タンパク質の発現ノックダウンを目的とする場合は、増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列としてｓｈＲＮＡ発現ＤＮＡ配列、ｓｉＲＮＡ発現ＤＮＡ配列、アンチセンスオリゴヌクレオチドを設定することができ、タンパク質の活性化作用を阻害又は抑制する場合は、増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列として核酸アプタマー発現配列、リボザイム発現配列を設定することができ、特定の遺伝子の転写を抑制する場合は、増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列としてデゴイ発現配列を設定することができる。
【００２５】
また、本発明のリバースプライマーにおける、ターミネータ配列を含むＤＮＡ配列の相補配列は、アニーリング配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列とすることができる。アニーリング配列としては、かかる配列によってプライマーとテンプレートがアニーリングし、ＰＣＲ反応を行うことができる配列であればよく、例えば好ましくは５〜２０塩基、より好ましくは７〜１５塩基、さらに好ましくは８〜１２塩基の塩基配列を挙げることができる。アニーリング配列の塩基配列も特に制限されず、短い配列で効率よくプライマーとアニーリングさせる観点から、アニーリング配列におけるグアニン（Ｇ）又はシトシン（Ｃ）の割合（ＧＣ率）が好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上であり、ＧＣ率１００％のGGGCCCGGG（配列番号５１）の９塩基を好適に例示することができる。本明細書においてアニーリング配列は、ＤＮＡ配列だけでなく、ＤＮＡそのものを指す場合もある。
【００２６】
本発明のリニアＤＮＡとしては、プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列とを順次備えた、哺乳動物等の細胞におけるＲＮＡ発現用の二本鎖ＤＮＡであって、上記ターミネータ配列の長さは特に制限されないが、好ましくは、３０〜３００塩基からなり、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むものであれば特に制限されず、かかるターミネータ配列はβ−グロビン、ＳＶ４０又はＢＧＨのターミネータ配列由来が好ましく、中でも配列番号１又は２で示される配列の一部又は全長の配列が特に好ましい。また、本発明のリニアＤＮＡは、上記プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列、ターミネータ配列以外にいかなる構成因子を含んでもよく、さらにプロモーター活性を増強するエンハンサーや、タグなどの配列、アニーリング配列などを備えたリニアＤＮＡでもよい。アニーリング配列を備える場合、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列とターミネータ配列との間にアニーリング配列を備えることも、プロモーター配列と目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列との間にアニーリング配列を備えることも、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列とターミネータ配列との間，及びプロモーター配列と目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列との間に２カ所にアニーリング配列を備えることもできる。また、本発明のリニアＤＮＡは、線状のＤＮＡであれば、人工的に合成されたものでもよく、本発明のリニアＤＮＡは前記本発明のリバースプライマーを用いて作製することもでき、ｍＲＮＡの転写を阻害しない限りは、メチル化や糖化などの修飾を受けていてもよく、二本鎖ＤＮＡであることが好ましい。
【００２７】
本発明のリニアＤＮＡにおける増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列としては、遺伝子をコードするＤＮＡ配列やｓｈＲＮＡ（small hairpin ＲＮＡ）発現配列、ｓｉＲＮＡ(short interfering ＲＮＡ)発現配列、ｍｉＲＮＡ（micro-ＲＮＡ）、核酸アプタマー発現配列、デゴイ発現配列、アンチセンスオリゴヌクレオチド発現配列、リボザイム発現配列などの機能性核酸を発現するＤＮＡ配列が挙げられる。タンパク質の発現を目的とする場合は、遺伝子をコードするＤＮＡ配列を設定でき、タンパク質を発現させるためのＤＮＡ配列からなるものであればよく、遺伝子をコードする配列の全長でも、その一部でもよく、変異体であってもよい。また、その由来はいかなる生物から単離された遺伝子でも、遺伝子工学的に作製した人工的な遺伝子でもよく、遺伝子におけるＮ末端の開始コドン及びＣ末端に停止コドンは適宜、含んでも、含んでいなくてもよい。また、タンパク質の発現ノックダウンを目的とする場合は、増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列としてｓｈＲＮＡ発現ＤＮＡ配列、ｓｉＲＮＡ発現ＤＮＡ配列、アンチセンスオリゴヌクレオチドを設定することができ、タンパク質の活性化作用を阻害又は抑制する場合は、増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列として核酸アプタマー発現配列、リボザイム発現配列を設定することができ、特定の遺伝子の転写を抑制する場合は、増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列としてデゴイ発現配列を設定することができる。
【００２８】
本発明のリニアＤＮＡの使用目的は特に制限されないが、たとえば、疾患の治療効果を有するタンパク質を発現する配列や、疾患の原因又は進行に関わるタンパク質の発現抑制機能を有する配列を増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列とすることにより、ＤＮＡワクチンとして使用することができる。また、本発明のリニアＤＮＡはＮ末端及びＣ末端に生体内における分解を抑制する配列、たとえばテロメア構造を付加することもできる。また、Ｎ末端及びＣ末端を、平滑末端同士又は、Ｎ末端及びＣ末端に付加した制限酵素認識配列や適宜付加した相補結合可能な配列によって、Ｎ末端とＣ末端を連結して環状にすることもできる。
【００２９】
本発明のリニアＤＮＡにおけるプロモーターとしては、リニアＤＮＡを発現させる哺乳動物等の細胞の種類や目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列、ターミネータ配列などにより適宜選択することができ、かかる細胞としては、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、大腸菌、酵母を挙げることができ、中でも哺乳動物細胞においてＲＮＡ発現を誘導することができるものが好ましく、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウィルス後期（Adenovirus Major Late、ＡＭＬ）のＡＭＬプロモーター、ＳＶ４０及びＨＴＬＶ−１  ＬＴＲの融合プロモーターであるＳＲαプロモーター、ヒト伸長因子１−アルファ（ＥＦ１−α）プロモーター、ヒトユビキチンＣプロモーター、α−アクチンプロモーター、β−アクチンプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、テトラサイクリンによってＲＮＡ発現が抑制されるＴｅｔ−Ｏｆｆプロモーターや、テトラサイクリンによってＲＮＡ発現が誘導されるＴｅｔ−Ｏｎプロモーター、亜鉛などの金属や種々の刺激により誘導されるメタロチオネインプロモーター、活性酸素により誘導されるＡＲＥプロモーターなどを挙げることができ、中でもヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（配列番号１０）及びシミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモーター（配列番号１１）を好適に例示することができ、ＲＮＡ発現の誘導に機能しうる限りは、その部分配列であっても、ＤＮＡ配列の置換、欠失、挿入を含んでいてもよい。
【００３０】
本発明のリニアＤＮＡは、化学合成や遺伝子工学的手法を用いて作製してもよく、具体的には、ＤＮＡ合成装置を用いて合成する方法や、リニアＤＮＡ配列をプラスミドベクターに挿入し、かかるベクターを、大腸菌を用いて増幅する方法や、ＰＣＲ法を用いた方法を好適に例示することができる。本発明のリニアＤＮＡのＰＣＲ法を用いた作製方法は、テンプレートや、ターミネータ配列の長さなどによって適宜調整して作製することができる。本発明のリニアＤＮＡのＰＣＲ法を用いた作製方法において使用するテンプレートは、目的にあったプロモーターの下流に、すでに目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が動作可能に連結されているＤＮＡを使用することも、目的にあったプロモーターの下流に動作可能に目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が連結されていないＤＮＡを用いることもできる。
【００３１】
目的にあったプロモーターの下流に、すでに目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が連結されているテンプレートは、プロモーター配列と目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列を順次備えたＤＮＡであり、目的にあったプロモーターの下流に動作可能に目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が連結されたＤＮＡであればよく、二本鎖線状ＤＮＡでも、環状ＤＮＡでもよい。また同一ＤＮＡ上に、他の遺伝子や複製起点など他の構成因子を含んでいてもよく、大腸菌で容易に増幅が可能で安定な、大腸菌プラスミドを好適に例示することができる。また、目的にあったプロモーターの下流に、すでに目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が連結されているＤＮＡがない場合は、ＰＣＲ反応により目的にあったプロモーターの下流に、動作可能に目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列を連結することができる。この場合に使用するテンプレートは、二本鎖線状ＤＮＡでも、環状ＤＮＡでもよく、またプロモーター及び目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列それぞれの配列は、独立した別のＤＮＡ分子上にあってもよいし、同一のＤＮＡ分子上にあってもよい。またテンプレートであるプロモーター及び目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と同一ＤＮＡ上に、他の遺伝子や複製起点など他の構成因子を含んでいてもよい。さらに、目的にあったプロモーターの下流に、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列がない場合に、プライマー上に目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の相補配列を設定することで、ＰＣＲ反応により目的にあったプロモーターの下流に目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列を連結することもできる。
【００３２】
本発明のリニアＤＮＡのＰＣＲ法での作製方法は、使用するターミネータ配列の長さにより２通りに分けることができる。本発明のリニアＤＮＡのＰＣＲ法での作製において、使用するターミネータ配列が短い場合は１回のＰＣＲ反応により線状ＤＮＡにターミネータ配列を付加することができ、使用するターミネータ配列が長い場合は、２回以上のＰＣＲ反応により線状ＤＮＡにターミネータ配列を付加することができる。ここで「ターミネータ配列が短い」とは、ターミネータ配列が１つのプライマー内に設計できる長さであり、１回のＰＣＲ反応により線状ＤＮＡにターミネータ配列を付加することができる長さをいい、１００塩基未満をいう。ここで「ターミネータ配列が長い」とは、ターミネータ配列がプライマー内に設計できる長さではなく、２回以上のＰＣＲ反応によりターミネータ配列を付加した線状ＤＮＡを作製することができる長さをいい、１００塩基超を目安とすることができる。本発明のリニアＤＮＡにおけるターミネータ配列は、従来使用されてきたターミネータ配列よりも短く２００塩基以下の長さで使用できるものであるから、長いターミネータ配列をもつリニアＤＮＡの作製には、２回のＰＣＲ反応を行う方法を好適に例示することができる。また、アニーリング配列を使用して、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と短いターミネータ配列を連結する場合は、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列にアニーリング配列を付加するために１回ＰＣＲ反応を行い、さらに目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列とアニーリング配列を順次備えたＤＮＡに短いターミネータ配列を連結するために１回ＰＣＲ反応を行うことができる。アニーリング配列を使用して、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と長いターミネータ配列を連結する場合は、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列にアニーリング配列を付加するために１回ＰＣＲ反応を行い、さらに目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列とアニーリング配列とを順次備えたＤＮＡに長いターミネータ配列を連結するために２回のＰＣＲ反応を行うことができる。
【００３３】
本発明のリニアＤＮＡの作製に用いる、プロモーターに特異的な配列からなるフォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、プロモーターに特異的な配列からなるプライマーであればよく、好ましくは１５〜５０塩基、より好ましくは１６〜４０塩基、さらに好ましくは１７〜３０塩基のプライマーを挙げることができ、人工的に化学合成することも市販品を入手することもできる。ＣＭＶプロモーター及びＳＶ４０プロモーターＤＮＡを増幅するプライマーとしては、配列番号４及び６、配列番号３及び５を例示することができる。また、増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列特異的な配列からなるフォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列特異的な配列からなるプライマーであればよく、好ましくは１５〜５０塩基、より好ましくは１６〜４０塩基、さらに好ましくは１７〜３０塩基のプライマーを挙げることができ、人工的に化学合成することも市販品を入手することもできる。
【００３４】
本発明のリニアＤＮＡのＰＣＲ法での作製において、ＰＣＲ法は常法により行うことができ、反応液の組成や反応温度、反応時間などはテンプレート、プライマーや必要とする増幅産物の量などに応じて適宜調整することができる。複数の工程のＰＣＲ反応を行い、前工程のＰＣＲ産物をテンプレートとして用いる場合は、アガロースゲル電気泳動やスピンカラムなどにより精製することもできるが、ＰＣＲ反応が阻害されない限りは、反応液の一部を精製することなく別工程のテンプレートとして用いてもよい。
【００３５】
以下に、本発明のリニアＤＮＡのＰＣＲ法を用いた作製方法を例示する。
１．プロモーター配列と目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列を順次備えたＤＮＡをテンプレートとして、ターミネータ配列を１ステップで付加する場合（図２左パネル）
目的にあったプロモーターの下流に、すでに目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が連結されているＤＮＡがある場合に、以下の（ａ）及び（ｂ）のプライマーを用いたＰＣＲ反応により、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー（プロモーターに特異的な配列からなるプロモーター配列増幅用フォワードプライマー）；
（ｂ）増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなり、前記ターミネータ配列が、３０〜２００塩基からなり、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むことを特徴とするリバースプライマー；
また、（ａ）及び（ｂ）のプライマーを哺乳動物等の細胞におけるＲＮＡ発現用の二本鎖リニアＤＮＡ作製用キットとして提供することもでき、かかるキットはこれらプライマーのほかバッファーやｄＮＴＰｓやコントロール用テンプレートなどを含んでもよい。
【００３６】
２．プロモーター配列と目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列を順次備えたＤＮＡをテンプレートとし、ターミネータ配列を２ステップで付加する場合（図２右パネル）
目的にあったプロモーターの下流に、すでに目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が連結されているコンストラクトがある場合に、以下の工程１及び２からなるＰＣＲ反応により、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
＜工程１＞
プロモーター配列と目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列を順次備えたＤＮＡをテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｂ’）のプライマーを用いて、プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列の一部とを順次備えた配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法で作製する。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｂ’）増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなるリバースプライマー；
＜工程２＞
工程１で得られた増幅産物をテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｃ）のプライマーを用いて、プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡをＰＣＲ法で増幅し、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｃ）ターミネータ配列の相補配列からなるリバースプライマー；
【００３７】
（ｂ’）のリバースプライマーは、ターミネータ配列において（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列は含まなくてもよく、工程２のＰＣＲ反応により増幅される、プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列とを順次備えた本発明のリニアＤＮＡにおいて、ターミネータ配列が（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含んでいればよい。例えば、（ｂ’）のリバースプライマーで（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基を含まず、（ｃ）のリバースプライマーが前記連続した９塩基の配列を含むことにより本発明のリニアＤＮＡを作製する例を挙げることができる。
また、（ａ）、（ｂ’）及び（ｃ）のプライマーを哺乳動物等の細胞におけるＲＮＡ発現用の二本鎖リニアＤＮＡ作製用キットとして提供することもでき、かかるキットはこれらプライマーのほかバッファーやｄＮＴＰｓやコントロール用テンプレートなどを含んでもよい。
【００３８】
別の様態としては、アニーリング配列を用いて、以下の工程１及び２のＰＣＲ反応により、本発明のリニアＤＮＡを作製することもできる。
＜工程１＞
プロモーター配列と目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列を順次備えたＤＮＡをテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｆ）のプライマーを用いて、プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、アニーリング配列とを順次備えた配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法で作製する。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｆ）増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列とアニーリング配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなるリバースプライマー；
＜工程２＞
工程１で得られた増幅産物をテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｃ’）のプライマーを用いて、プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、アニーリング配列と、ターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡをＰＣＲ法で増幅し、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｃ’）アニーリング配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなり、前記ターミネータ配列が、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むリバースプライマー；
（ｆ）のリバースプライマーにおけるアニーリング配列と、（ｃ’）のリバースプライマーにおけるアニーリング配列は、工程２のＰＣＲ反応において増幅産物を得られる程度の同一性があればよく、一部同一の配列であれば完全に同一の配列でなくてもよい。ＰＣＲ反応を効率よく行う観点からは、同一のアニーリング配列を用いる例を好適に例示することができる。
また、（ａ）、（ｃ’）、及び（ｆ）のプライマーを哺乳動物等の細胞におけるＲＮＡ発現用の二本鎖リニアＤＮＡ作製用キットとして提供することもでき、かかるキットはこれらプライマーのほかバッファーやｄＮＴＰｓやコントロール用テンプレートなどを含んでもよい。
【００３９】
３．プロモーター配列ＤＮＡと目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列とをそれぞれテンプレートとし、ターミネータ配列を１ステップで付加する場合−１（図３左パネル）
目的にあったプロモーターの下流に、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が連結されているコンストラクトがない場合に、以下の工程１〜３のＰＣＲ反応により、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
＜工程１＞
プロモーター配列ＤＮＡをテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｄ）のプライマーを用いて、プロモーター配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法で作製する。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｄ）プロモーター配列特異的リバースプライマー（プロモーターに特異的な配列の相補配列からなるプロモーター配列増幅用リバースプライマー）；
＜工程２＞
目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列をテンプレートとし、以下の（ｅ）及び（ｂ）のプライマーを用いて、プロモーター配列の一部と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡをＰＣＲ法で作製する。
（ｅ）プロモーター配列のＣ末端側領域と増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列とを順次備えたＤＮＡ配列からなるフォワードプライマー；
（ｂ）増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなり、前記ターミネータ配列が、３０〜２００塩基からなり、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むことを特徴とするリバースプライマー；
＜工程３＞
工程１及び２で得られた増幅産物をテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｂ）のプライマーを用いて、プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡをＰＣＲ法により増幅し、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｂ）増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなり、前記ターミネータ配列が、３０〜２００塩基からなり、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むことを特徴とするリバースプライマー；
また、（ａ）、（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）のプライマーを哺乳動物等の細胞におけるＲＮＡ発現用の二本鎖リニアＤＮＡ作製用キットとして提供することもでき、かかるキットはこれらプライマーのほかバッファーやｄＮＴＰｓやコントロール用テンプレートなどを含んでもよい。
【００４０】
４．プロモーター配列ＤＮＡと目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列ＤＮＡとをそれぞれテンプレートとし、ターミネータ配列を１ステップで付加する場合−２（図３右パネル）
目的にあったプロモーターの下流に、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が連結されているコンストラクトがない場合に、以下の工程１〜３のＰＣＲ反応により、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
＜工程１＞
プロモーター配列ＤＮＡをテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｄ’）のプライマーを用いて、プロモーター配列及び増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の一部とを順次備えた配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法で作製する。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｄ’）プロモーター特異的配列と増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列のＮ末端側領域とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなるリバースプライマー；
＜工程２＞
目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列をテンプレートとし、以下の（ｇ）及び（ｂ）のプライマーを用いて、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列とターミネータ配列とを順次備えた配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法で作製する。
（ｇ）増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列からなるフォワードプライマー；
（ｂ）増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなり、前記ターミネータ配列が、３０〜２００塩基からなり、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むことを特徴とするリバースプライマー；
＜工程３＞
工程１及び２で得られた増幅産物をテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｂ）のプライマーを用いて、プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡをＰＣＲ法で増幅し、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｂ）増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなり、前記ターミネータ配列が、３０〜３００塩基からなり、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むことを特徴とするリバースプライマー；
また、（ａ）、（ｂ）、（ｄ’）及び（ｇ）のプライマーを哺乳動物等の細胞におけるＲＮＡ発現用の二本鎖リニアＤＮＡ作製用キットとして提供することもでき、かかるキットはこれらプライマーのほかバッファーやｄＮＴＰｓやコントロール用テンプレートなどを含んでもよい。
【００４１】
５．プロモーター配列ＤＮＡと目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列とをそれぞれテンプレートとし、ターミネータ配列を２ステップで付加する場合−１（図４左パネル）
目的にあったプロモーターの下流に、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が連結されているコンストラクトがない場合に、以下の工程１〜３のＰＣＲ反応により、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
＜工程１＞
プロモーター配列ＤＮＡをテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｄ）のプライマーを用いて、プロモーター配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法で作製する。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｄ）プロモーター配列特異的リバースプライマー；
＜工程２＞
目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列をテンプレートとし、以下の（ｅ）及び（ｂ’）のプライマーを用いて、プロモーター配列の一部と目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列ＤＮＡとターミネータ配列とを順次備えた配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法で作製する。
（ｅ）プロモーター配列のＣ末端側領域と増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列とを順次備えたＤＮＡ配列からなるフォワードプライマー；
（ｂ’）増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなるリバースプライマー；
＜工程３＞
工程１及び２で得られた増幅産物をテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｃ）のプライマーを用いて、プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡをＰＣＲ法で増幅し、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｃ）ターミネータ配列の相補配列からなるリバースプライマー；
（ｂ’）のリバースプライマーは、ターミネータ配列において（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列は含まなくてもよく、工程３のＰＣＲ反応により増幅される、プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列とを順次備えた本発明のリニアにおいて、ターミネータ配列が（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含んでいればよい。例えば、（ｂ’）のリバースプライマーで（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基を含まず、（ｃ）のリバースプライマーが前記連続した９塩基の配列を含むことにより本発明のリニアを作製する例を挙げることができる。
また、（ａ）、（ｂ’）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のプライマーを哺乳動物等の細胞におけるＲＮＡ発現用の二本鎖リニアＤＮＡ作製用キットとして提供することもでき、かかるキットはこれらプライマーのほかバッファーやｄＮＴＰｓやコントロール用テンプレートなどを含んでもよい。
【００４２】
別の様態としては、アニーリング配列を用いて以下の工程１〜３のＰＣＲ反応により、本発明のリニアＤＮＡを作製することもできる。
＜工程１＞
プロモーター配列ＤＮＡをテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｄ）のプライマーを用いて、プロモーター配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法で作製する。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｄ）プロモーター配列特異的リバースプライマー；
＜工程２＞
目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列をテンプレートとし、以下の（ｅ）及び（ｆ）のプライマーを用いて、プロモーター配列の一部と目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列とアニーリング配列とを順次備えた配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法で作製する。
（ｅ）プロモーター配列のＣ末端側領域と増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列とを順次備えたＤＮＡ配列からなるフォワードプライマー；
（ｆ）増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列とアニーリング配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなるリバースプライマー；
＜工程３＞
工程１及び２で得られた増幅産物をテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｃ’）のプライマーを用いて、プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、アニーリング配列と、ターミネータ配列とを順次備えた配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法で増幅し、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｃ’）アニーリング配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなり、前記ターミネータ配列が、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むリバースプライマー；
【００４３】
（ｆ）のリバースプライマーにおけるアニーリング配列と、（ｃ’）のリバースプライマーにおけるアニーリング配列は、工程３のＰＣＲ反応において増幅産物を得られる程度の同一性があればよく、一部同一の配列であれば完全に同一の配列でなくてもよい。ＰＣＲ反応を効率よく行う観点からは、同一のアニーリング配列を用いる例を好適に例示することができる。
また、（ａ）、（ｃ’）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）のプライマーを哺乳動物等の細胞におけるＲＮＡ発現用の二本鎖リニアＤＮＡ作製用キットとして提供することもでき、かかるキットはこれらプライマーのほかバッファーやｄＮＴＰｓやコントロール用テンプレートなどを含んでもよい。
【００４４】
６．プロモーター配列ＤＮＡと目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列とをそれぞれテンプレートとし、ターミネータ配列を２ステップで付加する場合−２（図４右パネル）
目的にあったプロモーターの下流に、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が連結されているコンストラクトがない場合に、以下の工程１〜３のＰＣＲ反応により、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
＜工程１＞
プロモーター配列ＤＮＡをテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｄ’）のプライマーを用いて、プロモーター配列及び増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の一部とを順次備えた配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法で作製する。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｄ’）プロモーター特異的配列と増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列のＮ末端側領域とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなるリバースプライマー；
＜工程２＞
目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列をテンプレートとし、以下の（ｇ）及び（ｂ’）のプライマーを用いて、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡをＰＣＲ法により増幅する。
（ｇ）増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列からなるフォワードプライマー；
（ｂ’）増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなるリバースプライマー；
＜工程３＞
工程１及び２で得られた増幅産物をテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｃ）のプライマーを用いて、プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列とを順次備えた配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法で増幅し、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｃ）ターミネータ配列の相補配列からなるリバースプライマー；
【００４５】
（ｂ’）のリバースプライマーは、ターミネータ配列において（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列は含まなくてもよく、工程３のＰＣＲ反応により増幅される、プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列とを順次備えた本発明のリニアにおいて、ターミネータ配列が（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含んでいればよい。例えば、（ｂ’）のリバースプライマーで（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基を含まず、（ｃ）のリバースプライマーが前記連続した９塩基の配列を含むことにより本発明のリニアを作製する例を挙げることができる。
また、（ａ）、（ｂ’）、（ｃ）、（ｄ’）及び（ｇ）のプライマーを哺乳動物等の細胞におけるＲＮＡ発現用の二本鎖リニアＤＮＡ作製用キットとして提供することもでき、かかるキットはこれらプライマーのほかバッファーやｄＮＴＰｓやコントロール用テンプレートなどを含んでもよい。
【００４６】
別の様態としては、アニーリング配列を用いて、以下の工程１〜３のＰＣＲ反応により、本発明のリニアＤＮＡを作製することもできる。
＜工程１＞
プロモーター配列ＤＮＡをテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｄ’）のプライマーを用いて、プロモーター配列及び増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の一部とを順次備えた配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法で作製する。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｄ’）プロモーター特異的配列と増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列のＮ末端側領域とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなるリバースプライマー；
＜工程２＞
目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列をテンプレートとし、以下の（ｇ）及び（ｆ）のプライマーを用いて、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列とアニーリング配列とを順次備えた配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法で作製する。
（ｇ）増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列からなるフォワードプライマー；
（ｆ）増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列とアニーリング配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなるリバースプライマー；
＜工程３＞
工程１及び２で得られた増幅産物をテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｃ’）のプライマーを用いて、プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、アニーリング配列と、ターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡをＰＣＲ法により増幅し、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｃ’）アニーリング配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなり、前記ターミネータ配列が、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むリバースプライマー；
【００４７】
（ｆ）のリバースプライマーにおけるアニーリング配列と、（ｃ’）のリバースプライマーにおけるアニーリング配列は、工程３のＰＣＲ反応において増幅産物を得られる程度の同一性があればよく、一部同一の配列であれば完全に同一の配列でなくてもよい。ＰＣＲ反応を効率よく行う観点からは、同一のアニーリング配列を用いる例を好適に例示することができる。
また、（ａ）、（ｃ’）、（ｄ’）、（ｆ）及び（ｇ）のプライマーを哺乳動物等の細胞におけるＲＮＡ発現用の二本鎖リニアＤＮＡ作製用キットとして提供することもでき、かかるキットはこれらプライマーのほかバッファーやｄＮＴＰｓやコントロール用テンプレートなどを含んでもよい。
【００４８】
上記のように、アニーリング配列を利用すれば、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列にアニーリング配列を介してターミネータ配列を連結することができるので、ある目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列に様々なターミネータ配列が付加されたＲＮＡ発現用リニアＤＮＡを容易に作製することができる。同様に、プロモーター配列にアニーリング配列を介して目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が連結されたＤＮＡを作製することもできる。以下に、プロモーター配列、アニーリング配列１、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列、アニーリング配列２、ターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡをＰＣＲ反応により増幅する方法を示す。
＜工程１＞
プロモーター配列ＤＮＡをテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｈ）のプライマーを用いて、プロモーター配列及びアニーリング配列１とを順次備えた配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法で作製する。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｈ）プロモーター配列とアニーリング配列１とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなるリバースプライマー；
＜工程２＞
目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列をテンプレートとし、以下の（ｉ）及び（ｆ）のプライマーを用いて、アニーリング配列１と目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列とアニーリング配列２とを順次備えた配列からなる増幅産物をＰＣＲ法により増幅する。
（ｉ）アニーリング配列１と増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列からなるフォワードプライマー；
（ｆ）増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列とアニーリング配列２とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなるリバースプライマー；
＜工程３＞
工程１及び２で得られた増幅産物をテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｃ’）のプライマーを用いて、プロモーター配列と、アニーリング配列１と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、アニーリング配列２と、ターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡをＰＣＲ法により増幅し、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｃ’）アニーリング配列２とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなり、前記ターミネータ配列が、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むリバースプライマー；
【００４９】
（ｈ）のリバースプライマーにおけるアニーリング配列１と（ｉ）のフォワードプライマーにおけるアニーリング配列１は、工程３のＰＣＲ反応において増幅産物を得られる程度の同一性があればよく、一部同一の配列であれば完全に同一の配列でなくてもよい。ＰＣＲ反応を効率よく行う観点からは、同一のアニーリング配列を用いる例を好適に例示することができる。（ｆ）のリバースプライマーにおけるアニーリング配列２と（ｃ’）のリバースプライマーにおけるアニーリング配列２は、工程３のＰＣＲ反応において増幅産物を得られる程度の同一性があればよく、一部同一の配列であれば完全に同一の配列でなくてもよい。ＰＣＲ反応を効率よく行う観点からは、同一のアニーリング配列を用いる例を好適に例示することができる。
【００５０】
アニーリング配列１及びアニーリング配列２の配列は、工程２や３においてＰＣＲ増幅産物が得られればよく、同一配列でもよいが、効率よくＰＣＲ反応を行い目的の増幅産物であるプロモーター配列、アニーリング配列１、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列、アニーリング配列２、ターミネータ配列を順次備えたＤＮＡを得るためには、異なるＤＮＡ配列であることが望ましい。開始コドンであるＡＴＧを含むアニーリング配列１を用い、発現させるＤＮＡ配列をかかるＡＴＧと翻訳フレームを合わせて連結して本発明のリニアＤＮＡを作製することもでき、開始コドンを含まないタンパク質コードＤＮＡ配列を用いる場合に有用である。さらに、アニーリング配列１にはコザック（Kozak）配列を含むこともでき、コザック配列及びコザック配列が機能するよう配置された開始コドンを含むことで、タンパク質発現を増強することもできる。アニーリング配列２には、停止コドンであるＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡを一つ以上、特定の翻訳フレーム又は３つ全ての翻訳フレームで機能するように配置したアニーリング配列２を使用することもできる。
また、（ａ）、（ｃ’）、（ｉ）、（ｆ）及び（ｈ）のプライマーを哺乳動物等の細胞におけるＲＮＡ発現用の二本鎖リニアＤＮＡ作製用キットとして提供することもでき、かかるキットはこれらプライマーのほかバッファーやｄＮＴＰｓやコントロール用テンプレートなどを含んでもよい。
【００５１】
７．プロモーター配列ＤＮＡをテンプレートとし、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列のテンプレートを用いずに、リバースプライマー上に目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の相補配列を設定することで、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列及びターミネータ配列を１ステップで付加する場合−１（図５左パネル）
目的にあったプロモーターの下流に、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が連結されているコンストラクトがない場合に、以下の工程１のＰＣＲ反応により、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
＜工程１＞
プロモーター配列ＤＮＡをテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｊ）のプライマーを用いて、プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡをＰＣＲ法により増幅し、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｊ）プロモーター配列のＣ末端側領域と増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなり、前記ターミネータ配列が、３０〜２００塩基からなり、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むことを特徴とするリバースプライマー；
また、（ａ）及び（ｊ）のプライマーを細胞におけるＲＮＡ発現用の二本鎖リニアＤＮＡ作製用キットとして提供することもでき、かかるキットはこれらプライマーのほかバッファーやｄＮＴＰｓやコントロール用テンプレートなどを含んでもよい。
【００５２】
８．プロモーター配列ＤＮＡをテンプレートとし、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列のテンプレートを用いずに、リバースプライマー上に目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の相補配列を設定することで、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列及びターミネータ配列を１ステップで付加する場合−２（図５パネル右）
目的にあったプロモーターの下流に、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が連結されているコンストラクトがない場合に、以下の工程１及び２のＰＣＲ反応により、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
＜工程１＞
プロモーター配列ＤＮＡをテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｋ）のプライマーを用いて、プロモーター配列及び増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列全長とを順次備えた配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法で作製する。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｋ）プロモーター配列のＣ末端側領域と増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列全長の特異的配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなるリバースプライマー；
＜工程２＞
工程１で得られた増幅産物をテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｂ）のプライマーを用いて、プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡをＰＣＲ法で増幅し、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｂ）工程１で作製した増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなり、前記ターミネータ配列が、３０〜３００塩基からなり、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むことを特徴とするリバースプライマー；
また、（ａ）、（ｂ）及び（ｋ）のプライマーを細胞におけるＲＮＡ発現用の二本鎖リニアＤＮＡ作製用キットとして提供することもでき、かかるキットはこれらプライマーのほかバッファーやｄＮＴＰｓやコントロール用テンプレートなどを含んでもよい。
【００５３】
別の様態としては、アニーリング配列を用いて、以下の工程１〜２のＰＣＲ反応により、本発明のリニアＤＮＡを作製することもできる。
＜工程１＞
プロモーター配列ＤＮＡをテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｌ）のプライマーを用いて、プロモーター配列及び増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列全長とアニーリング配列を順次備えた配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法で作製する。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｌ）プロモーター配列のＣ末端側領域と増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列全長とアニーリング配列の特異的配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなるリバースプライマー；
＜工程２＞
工程１で得られた増幅産物をテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｃ’）のプライマーを用いて、プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、アニーリング配列と、ターミネータ配列とを順次備えた配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法で増幅し、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｃ’）アニーリング配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなり、前記ターミネータ配列が、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むリバースプライマー；
【００５４】
（ｌ）のリバースプライマーにおけるアニーリング配列と、（ｃ’）のリバースプライマーにおけるアニーリング配列は、工程２のＰＣＲ反応において増幅産物を得られる程度の同一性があればよく、一部同一の配列であれば完全に同一の配列でなくてもよい。ＰＣＲ反応を効率よく行う観点からは、同一のアニーリング配列を用いる例を好適に例示することができる。
また、（ａ）、（ｃ’）、及び（ｌ）のプライマーを哺乳動物等の細胞におけるＲＮＡ発現用の二本鎖リニアＤＮＡ作製用キットとして提供することもでき、かかるキットはこれらプライマーのほかバッファーやｄＮＴＰｓやコントロール用テンプレートなどを含んでもよい。
【００５５】
９．プロモーター配列ＤＮＡをテンプレートとし、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列のテンプレートを用いずに、リバースプライマー上に目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の相補配列を設定することで、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列及びターミネータ配列を１ステップで付加する場合−３（図６パネル左）
目的にあったプロモーターの下流に、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が連結されているコンストラクトがない場合に、以下の工程１及び２のＰＣＲ反応により、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
＜工程１＞
プロモーター配列ＤＮＡをテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｍ）のプライマーを用いて、プロモーター配列及び増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列のＮ末端側領域を含む一部とを順次備えた配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法で作製する。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｍ）プロモーター配列のＣ末端側領域と増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列のＮ末端側領域を含む一部に特異的配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなるリバースプライマー；
＜工程２＞
工程１で得られた増幅産物をテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｎ）のプライマーを用いて、プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡをＰＣＲ法で増幅し、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｎ）工程１で作製した増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列のＣ末端側領域の一部に特異的配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなり、前記ターミネータ配列が、３０〜３００塩基からなり、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むことを特徴とするリバースプライマー；
また、（ａ）、（ｍ）及び（ｎ）のプライマーを細胞におけるＲＮＡ発現用の二本鎖リニアＤＮＡ作製用キットとして提供することもでき、かかるキットはこれらプライマーのほかバッファーやｄＮＴＰｓやコントロール用テンプレートなどを含んでもよい。
【００５６】
１０．プロモーター配列ＤＮＡをテンプレートとし、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列のテンプレートを用いずに、リバースプライマー上に目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の相補配列を設定することで、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列及びターミネータ配列を２ステップで付加する場合−４（図６右パネル）
目的にあったプロモーターの下流に、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が連結されているコンストラクトがない場合に、以下の工程１及び２のＰＣＲ反応により、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
＜工程１＞
プロモーター配列ＤＮＡをテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｏ）のプライマーを用いて、プロモーター配列及び増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の全長とターミネータ配列とを順次備えた配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法で作製する。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｏ）プロモーター特異的配列と増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の全長とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなるリバースプライマー；
＜工程２＞
工程１で得られた増幅産物をテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｃ）のプライマーを用いて、プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡをＰＣＲ法で増幅し、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｃ）ターミネータ配列の相補配列からなるリバースプライマー；
【００５７】
（ｏ）のリバースプライマーは、ターミネータ配列において（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列は含まなくてもよく、工程２のＰＣＲ反応により増幅される、プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列とを順次備えた本発明のリニアＤＮＡにおいて、ターミネータ配列が（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含んでいればよい。例えば、（ｏ）のリバースプライマーで（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基を含まず、（ｃ）のリバースプライマーが前記連続した９塩基の配列を含むことにより本発明のリニアＤＮＡを作製する例を挙げることができる。
また、（ａ）、（ｃ）及び（ｏ）のプライマーを細胞におけるＲＮＡ発現用の二本鎖リニアＤＮＡ作製用キットとして提供することもでき、かかるキットはこれらプライマーのほかバッファーやｄＮＴＰｓやコントロール用テンプレートなどを含んでもよい。
【００５８】
別の様態としては、アニーリング配列を用いて以下の工程１〜３のＰＣＲ反応により、本発明のリニアＤＮＡを作製することもできる。
＜工程１＞
プロモーター配列ＤＮＡをテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｐ）のプライマーを用いて、プロモーター配列及び増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の全長とアニーリング配列とを順次備えた配列からなるＤＮＡをＰＣＲ法で作製する。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｐ）プロモーター特異的配列と増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の全長とアニーリング配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなるリバースプライマー；
＜工程２＞
工程１で得られた増幅産物をテンプレートとし、以下の（ａ）及び（ｃ’）のプライマーを用いて、プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、アニーリング配列と、ターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡをＰＣＲ法で増幅し、本発明のリニアＤＮＡを作製することができる。
（ａ）プロモーター配列特異的フォワードプライマー；
（ｃ’）アニーリング配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列からなり、前記ターミネータ配列が、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むリバースプライマー；
【００５９】
（ｐ）のリバースプライマーにおけるアニーリング配列と、（ｃ’）のリバースプライマーにおけるアニーリング配列は、工程２のＰＣＲ反応において増幅産物を得られる程度の同一性があればよく、一部同一の配列であれば完全に同一の配列でなくてもよい。ＰＣＲ反応を効率よく行う観点からは、同一のアニーリング配列を用いる例を好適に例示することができる。
また、（ａ）、（ｃ’）、及び（ｐ）のプライマーを哺乳動物等の細胞におけるＲＮＡ発現用の二本鎖リニアＤＮＡ作製用キットとして提供することもでき、かかるキットはこれらプライマーのほかバッファーやｄＮＴＰｓやコントロール用テンプレートなどを含んでもよい。
【００６０】
本発明のリニアＤＮＡを用いたＲＮＡ発現方法としては、本発明のＲＮＡ発現用の二本鎖リニアＤＮＡを、哺乳動物等の細胞内に導入することによる方法であればよく、本発明のリニアＤＮＡを細胞内に導入する方法としては、遺伝子導入方法としてはリポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等を挙げることができ、Lipofectin Reagent（登録商標）、Lipofectamine（登録商標），Lipofectamine（登録商標）2000 Reagent（インビトロジェン社製）や、SuperFect（登録商標）Transfection Reagent（キアゲン社製）及びFuGENE（登録商標） HD Transfection Reagent，FuGENE（登録商標）6 Transfection Reagent（Roche社製）などの市販のトランスフェクション試薬ならびに当技術分野で広く用いられている手法に従って実施することができる。本発明のリニアＤＮＡを用いた細胞におけるＲＮＡ発現の確認方法は特に制限されず、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列にルシフェラーゼ遺伝子を用いてルシフェラーゼアッセイを行うことにより定量することも、抗体を用いて、ウェスタンブロッティングやＥＬＩＳＡ法など常法により検出することもできる。
【００６１】
本発明のリニアＤＮＡを用いたＲＮＡ発現方法は、簡便かつ迅速に作業を行うことができるため、多量のサンプルを平行して扱うハイスループット化や、機械による自動化も可能である。そのため、スクリーニングに好適に利用することができ、例えば、（ア）様々な遺伝子について、本発明のリニアＤＮＡを作製する；（イ）リニアＤＮＡを培養細胞に導入する；（ウ）コントロールの細胞と比較して、リニアＤＮＡを導入することにより指標が変化する遺伝子を選択する；の工程（ア）〜（ウ）を備えた、哺乳動物等の細胞発現リニアＤＮＡを用いたスクリーニングを行うことができる。工程（イ）においては、あらかじめプラスミドによるＲＮＡ発現を行った細胞を用いることも、サイトカインや化学物質等で刺激を与えた細胞を用いることも、複数の種類のリニアＤＮＡを導入することもできる。工程（ウ）においては、目的に応じた方法にて指標を設定することができる。例えば、細胞分裂を抑制する遺伝子をスクリーニングする場合には、工程（ウ）においては細胞分裂が抑制された、コントロールと比較して細胞数が少ないサンプルを選択することができる。また、あるシグナル伝達に関係する遺伝子をスクリーニングする場合には、工程（イ）においてリニアＤＮＡ及びシグナル伝達のルシフェラーゼレポーターＤＮＡが導入された細胞にサイトカインで刺激を行い、工程（ウ）においてルシフェラーゼレポーターの発現を指標に、刺激依存的又は刺激非依存的にシグナル伝達が増強又は抑制されるサンプルを選択することができる。
【００６２】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６３】
［プラスミドを用いた遺伝子発現とリニアＤＮＡによる遺伝子発現の比較］
分泌型ルシフェラーゼ発現プラスミドベクターpCMV-Gluc（New England Biolabs社製）をテンプレートとして、配列番号４及び１２のプライマーを用いてＰＣＲ法により、プロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子及びプラスミド由来のターミネータ配列からなるルシフェラーゼ発現リニアＤＮＡを作製した。ＰＣＲはKOD plus ポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。詳細の条件は以下のとおりである。それぞれの最終濃度はテンプレート５０ｐｇ／μＬ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、icyclerサーマルサイクラー（BIO-RAD社製）を用いて９４℃２０秒、５５℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。ルシフェラーゼ発現プラスミドベクターpCMV-Gluc１００ｎｇ又はルシフェラーゼ発現リニアＤＮＡ１００ｎｇを、FuGENE（登録商標）HD Transfection Reagentキット（Roche社製）を用いて、２０００細胞／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌプレートに捲いて２０時間後のアフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ７細胞に導入した。その後２４〜９６時間の間に６回培養上清を採取し、それぞれの培養上清に含まれる分泌型ルシフェラーゼ量をBioLux Gaussia Luciferase assay kit（New England Biolabs社製）を用いてGLOMAX20/20 Luminometer（Promega社製）で測定した。結果を図７に示す。これまで知られていたとおり、リニアＤＮＡを用いた場合は、プラスミドベクターを用いた場合に比べて遺伝子発現が著しく低いことが確認された。【００６４】
そこで、リニアＤＮＡによる遺伝子発現におけるターミネータ配列の影響を調べるために、ＣＭＶプロモーターの下流に分泌型ルシフェラーゼ遺伝子を備え、その下流にプラスミドのポリＡ、ＳＶ４０ターミネータ配列（配列番号８）、ＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）ターミネータ配列（配列番号９）、又はβ−グロビンのターミネータ配列（配列番号７）をもつルシフェラーゼ発現リニアＤＮＡをＰＣＲ法にて作製した。ルシフェラーゼ発現プラスミドベクターpCMV-Gluc１００ｎｇ又は、前記ルシフェラーゼ発現リニアＤＮＡ１００ｎｇを、ヒト胎児腎細胞由来２９３細胞にFuGENE（登録商標）HD Transfection Reagentキット（Roche社製）により導入した。２４時間後に培養上清を採取し、培養上清に含まれる分泌型ルシフェラーゼをBioLux Gaussia Luciferase assay kit（New England Biolabs社製）とGLOMAX20/20 Luminometer（Promega社製）を用いて測定した結果を図８に示す。プラスミド由来のポリＡを用いたリニアＤＮＡではルシフェラーゼの発現は非常に低いが、ＳＶ４０ターミネータ配列やＢＧＨターミネータ配列、β−グロビンのターミネータ配列を使用すると、リニアＤＮＡによるルシフェラーゼ遺伝子発現が高くなり、ＢＧＨターミネータ配列とβ−グロビンターミネータ配列を用いたリニアＤＮＡは、プラスミドベクターを超える遺伝子発現を示した。中でも、β−グロビンのターミネータ配列を用いたリニアＤＮＡが最も高いルシフェラーゼ遺伝子の発現を示した。
【実施例２】
【００６５】
［リニアＤＮＡによる遺伝子発現において重要なターミネータ配列の探索］
遺伝子発現用のリニアＤＮＡを簡便かつ迅速に作製するためには、ターミネータ配列はできるだけ短い方が好ましい。すなわち、１ステップで目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の下流にターミネータ配列を付加することができる、プライマー内に設計可能である長さのターミネータ配列であることが望ましい。そこで、リニアＤＮＡによる遺伝子発現を可能とする、できるだけ短いターミネータ配列を調べるために、ＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子及び、図９に示す様々な長さのβ−グロビンのターミネータ配列を順次備えた、ルシフェラーゼ遺伝子発現リニアＤＮＡをＰＣＲ法にて作製した。これらのルシフェラーゼ発現リニアＤＮＡ１００ｎｇを２９３細胞にFuGENE（登録商標）HD Transfection Reagentキット（Roche社製)により導入し、２４時間後に採取した培養上清に含まれる分泌型ルシフェラーゼをBioLux Gaussia Luciferase assay kit（New England Biolabs社製）とGLOMAX20/20 Luminometer（Promega社製）を用いて測定した（図９）。その結果から、塩基番号１２１〜１７０番目のβ−グロビンのターミネータ配列（配列番号１３）を、最も短い配列で最も効率よくルシフェラーゼ遺伝子の発現を達成できる配列であると判断した。【００６６】
さらに、塩基番号１２１〜１７０番目のβ−グロビンのターミネータ配列において、遺伝子発現に重要な塩基を探索するために、ＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、塩基番号１２１〜１４０、１４９、１５２、１５５（配列番号１４）、１５８（配列番号１５）、１６１（配列番号１６）、１６４（配列番号１７）、１６７（配列番号１８）又は１７０番目（配列番号１３）の様々な長さのβ−グロビンのターミネータ配列を付加したルシフェラーゼ遺伝子発現リニアＤＮＡを以下の方法で作製した。pCMV-Gluc（New England Biolabs 社製）をテンプレートに、配列番号４及び１９で示されるプライマーを用いてＰＣＲ法で、ＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、塩基番号１２１〜１４０番目のβ−グロビンターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡ、CMV-hGluc-terminator(121-140)(b-globin)を作製した。ＰＣＲ反応は、TOYOBOのKOD plus ポリメラーゼを用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度はテンプレート５０ｐｇ／μＬ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、icyclerサーマルサイクラー（BIO-RAD社製）を用いて９４℃２０秒、５５℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製したCMV-hGluc-terminator(121-140)(b-globin)をテンプレートとして、配列番号４で示されるフォワードプライマー及び２０〜２７で示されるリバースプライマーを使ってＰＣＲ法にて、ＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、様々な長さのβ−グロビンのターミネータ配列を順次備えたルシフェラーゼ発現リニアＤＮＡを作製した。ＰＣＲ反応は、KOD plus ポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度はテンプレート５０ｐｇ／μＬ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、icyclerサーマルサイクラー（BIO-RAD社製）を用いて９４℃２０秒、６０℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。これらのリニアＤＮＡ各１００ｎｇを２９３細胞にFuGENE（登録商標）HD Transfection Reagentキット（Roche社製）により導入し、２４時間後に採取した培養上清に含まれる分泌型ルシフェラーゼをBioLux Gaussia Luciferase assay kit（New England Biolabs社製）とGLOMAX20/20 Luminometer（Promega社製）を用いて測定した（図１０）。その結果、塩基番号１２１〜１４０番目のβ−グロビンのターミネータ配列では、ネガティブコントロールのターミネータなしのリニアＤＮＡと同程度のルシフェラーゼ遺伝子発現が観察された。塩基番号１２１〜１５５番目以上のβ−グロビンのターミネータ配列は、塩基番号１２１〜１７０番目のβ−グロビンのターミネータ配列と同程度のルシフェラーゼ発現を示し、また塩基番号１２１〜１５２番目のβ−グロビンのターミネータ配列を用いた場合はルシフェラーゼ発現量が低いことから、リニアＤＮＡによる遺伝子発現において、塩基番号１５５〜１７０番目のβ−グロビンのターミネータ配列が特に重要であることが示唆された。【００６７】
リニアＤＮＡによる遺伝子発現において重要な塩基を調べるために、ＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、塩基番号１２１〜１７０番目のβ−グロビンのターミネータ配列（配列番号１３）を順次備えたリニアＤＮＡにおいて、ターミネータ配列の１塩基ずつをアデニン（Ａ），チミン（Ｔ），グアニン（Ｇ），又はシトシン（Ｃ）に置換したリニアＤＮＡをＰＣＲ法にて作製した。pCMV-Gluc（New England Biolabs 社製）をテンプレートに、配列番号４及び１９で示されるプライマーを用いてＰＣＲ法で、ＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、塩基番号１２１〜１４０番目のβ−グロビンターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡ、CMV-hGluc-terminater(121-140)(b-globin)を作製した。ＰＣＲ反応は、KOD plus ポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度はテンプレート５０ｐｇ／μＬ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、icyclerサーマルサイクラー（BIO-RAD社製）を用いて９４℃２０秒、５５℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製したCMV-hGluc-terminator(121-140)(b-globin)をテンプレートとして、配列番号４で示されるフォワードプライマー及び、β−グロビンターミネータ配列１４１−１６７の１塩基ずつをアデニン（Ａ），チミン（Ｔ），グアニン（Ｇ），又はシトシン（Ｃ）に置換した配列の相補配列であるリバースプライマーに用いて、ＰＣＲ法で変異ターミネータリニアＤＮＡを作製した。これらの変異ターミネータリニアＤＮＡ各１００ｎｇを２９３細胞にFuGENE（登録商標）HD Transfection Reagentキット(Roche社製)により導入し、２４時間後に採取した培養上清に含まれる分泌型ルシフェラーゼをBioLux Gaussia Luciferase assay kit（New England Biolabs社製）を用いてGLOMAX20/20 Luminometer（Promega社製）を用いて測定した。野生型ターミネータ配列のリニアＤＮＡを用いた場合のルシフェラーゼ発現量を１００とし、それに対する各変異体ターミネータ配列のリニアＤＮＡを用いた場合のルシフェラーゼ発現の割合を図１１に示す。その結果、塩基番号１４３〜１４８及び１５１番目のβ−グロビンのターミネータ配列が重要であり、β−グロビンのターミネータ配列（配列番号７）において塩基番号１４３〜１５１番目の配列が（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列であることがリニアＤＮＡによる遺伝子発現に重要であることが示唆された。
【実施例３】
【００６８】
［ターミネータ配列の由来及び細胞の種類の検討］
リニアＤＮＡによる遺伝子発現における、ターミネータ配列の種類、対象細胞の種類及び目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列とターミネータの間の９塩基付加について検討した。
ＣＭＶプロモーターと、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子と、塩基番号１２１〜１４０番目、１２１〜１５５番目（配列番号１４）、１２１〜１６０番目（配列番号２８）、１２１〜１７０番目（配列番号１３）、１２１〜１８０番目（配列番号２９）、１２１〜１９０番目（配列番号３０）、１２１〜２００番目（配列番号３１）又は１２１〜２２０番目（配列番号１）のβ−グロビンのターミネータ配列とを順次備えたリニアＤＮＡを以下の方法で作製した。pCMV-Gluc（New England Biolabs 社製）をテンプレートに、配列番号４及び１９で示されるプライマーを用いてＰＣＲ法で、ＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、塩基番号１２１〜１４０番目のβ−グロビンターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡ、CMV-hGluc-terminator(121-140)(b-globin)を作製した。ＰＣＲ反応はKOD plus ポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度はテンプレート５０ｐｇ／μＬ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、icyclerサーマルサイクラー（BIO-RAD社製）を用いて９４℃２０秒、５５℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製したCMV-hGluc-terminator(121-140)(b-globin)をテンプレートとして、配列番号４で示されるフォワードプライマー及び配列番号２２、３２、２７、３３〜３６で示されるプライマーを使ってＰＣＲ法にて、ＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、様々な長さのβ−グロビンのターミネータ配列を順次備えたルシフェラーゼ発現リニアＤＮＡを作製した。ＰＣＲ反応は、KOD plusポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度はテンプレート５０ｐｇ／μＬ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、icyclerサーマルサイクラー（BIO-RAD社製）を用いて９４℃２０秒、６０℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。リニアＤＮＡによる遺伝子発現に重要な（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の９番目の塩基に相当する、塩基番号１５１番目の塩基がチミン（Ｔ）に置換された１２１〜１５５番目のβ−グロビンターミネータ塩基配列１２１〜１５５（１５１Ｔ）はネガティブコントロールであり、変異を含むターミネータ配列のプライマーを使用して、同様に作製した。【００６９】
また、ＣＭＶプロモーターと、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子と、塩基番号１２１〜１４０番目又は１２１〜２２０番目（配列番号２）のＳＶ４０のターミネータ塩基配列とを順次備えたリニアＤＮＡを以下の方法で作製した。pCMV-Gluc（New England Biolabs 社製）をテンプレートに、配列番号４及び３７で示されるプライマーを用いてＰＣＲ法で、ＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、塩基番号１２１〜１４０番目のＳＶ４０ターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡ、CMV-hGluc-terminator(121-140)(SV40)を作製した。ＰＣＲ反応は、KOD plus ポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度はテンプレート５０ｐｇ／μＬ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、icyclerサーマルサイクラー（BIO-RAD社製）を用いて９４℃２０秒、５５℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製したCMV-hGluc-terminator(121-140)(SV40)をテンプレートとして、配列番号４及び３８で示されるプライマーを使ってＰＣＲ法にて、ＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子及び塩基番号１２１〜２２０番目のＳＶ４０のターミネータ配列を順次備えたルシフェラーゼ発現リニアＤＮＡ、CMV-hGluc-SV40pA121-220を作製した。ＰＣＲ反応は、KOD plus ポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度はテンプレート５０ｐｇ／μＬ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、icyclerサーマルサイクラー（BIO-RAD社製）を用いて９４℃２０秒、６０℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。ＣＭＶプロモーターと、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子と、配列番号３９で示される、ＡＡＴＡＡＡに変異を導入した塩基番号１２１〜２２０番目のＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えたリニアＤＮＡ、１２１−２２０ＡＡＴＡＡＡ mutationはネガティブコントロールであり、変異を含むターミネータ配列のプライマーを使用して、同様に作製された。かかるＡＡＴＡＡＡはリニアＤＮＡによる遺伝子発現に重要な（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の最初の６塩基に相当する。コントロールとして、ルシフェラーゼ発現プラスミドベクターpCMV-Glucと、かかるプラスミドをテンプレートに配列番号４及び１２で示されるプライマーを用いてＰＣＲ法にて増幅した、ＣＭＶプロモーター、ルシフェラーゼ遺伝子及びプラスミドのポリＡを備えたリニアＤＮＡ、CMV-Gluclinerを使用した。【００７０】
また、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列とターミネータの間に９塩基程度の余分なアニーリング配列の付加があるリニアＤＮＡを作製し、遺伝子発現の検討を行った。アニーリング配列にはGGGCCCGGG（配列番号５１）を用い、リニアＤＮＡを以下の方法で作製した。まず、pCMV-Gluc（NewEngland Biolabs 社製）をテンプレートに、配列番号４及び４７で示されるプライマーを用いてＰＣＲ法で、ＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、アニーリング配列（配列番号５１）を順次備えたリニアＤＮＡ、CMV-hGluc-3GC9を作製した。ＰＣＲ反応は、KOD plus ポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度はテンプレート５０ｐｇ／μＬ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、icyclerサーマルサイクラー（BIO-RAD社製）を用いて９４℃２０秒、５５℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製したCMV-hGluc-3GC9をテンプレートとして、配列番号４及び４８〜５０で示されるプライマーを使ってＰＣＲ法にて、ＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、アニーリング配列（配列番号５１）、及びターミネータ配列を順次備えたルシフェラーゼ発現リニアＤＮＡ、ＣＭＶプロモーターと、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子と、アニーリング配列（GGGCCCGGG；配列番号５１）の９塩基と、塩基番号１２１〜１９０番目（配列番号３０）のβ−グロビンのターミネータ配列、１３０〜１９０番目のβ−グロビンのターミネータ配列、又は１３０〜２２０番目のＳＶ４０のターミネータ配列とを順次備えたリニアＤＮＡCMV-hGluc-3GC9-terminatorを作製した。ＰＣＲ反応は、KOD plus ポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度はテンプレート５０ｐｇ／μＬ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、icyclerサーマルサイクラー（BIO-RAD社製）を用いて９４℃２０秒、６０℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。【００７１】
作製したリニアＤＮＡをそれぞれ、ヒト胎児腎細胞２９３細胞、マウス線維芽細胞ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、アフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ７細胞、ヒト上皮細胞由来ＨｅＬａ細胞又はマウスのＥＳ細胞であるＥＢ３細胞にFuGENE（登録商標）HD Transfection Reagentキット（Roche社製）により導入した。２４時間後に採取した培養上清１５μＬを用いて、BioLux Gaussia Luciferase assay kit（New England Biolabs社製）を用いてGLOMAX20/20 Luminometer（Promega社製）により分泌型ルシフェラーゼの量を測定した。ルシフェラーゼの量は、測定時間３秒間の測定値を元に、測定培養上清１μＬ、測定時間１秒間あたりの測定値として図１２〜１４に示す。２９３細胞（図１２）、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（図１３）及び、ＥＢ３細胞（図１６）では、プラスミドベクターよりもβ−グロビンターミネータ配列を用いたリニアＤＮＡ方が高いルシフェラーゼ遺伝子の発現がみられた。ＣＯＳ７細胞（図１４）及びＨｅＬａ細胞（図１５）においては、プラスミドベクターの方が、β−グロビンターミネータ配列を用いたリニアＤＮＡよりも高いルシフェラーゼ遺伝子の発現を示したが、塩基番号１２１〜２２０番目β−グロビンターミネータ配列を用いたリニアＤＮＡは、１２１〜１５５（１５１Ｔ）のネガティブコントロールと比較して十分高い発現を示し、有用であることが示された。また、用いたリニアＤＮＡのうち、２９３細胞（図１２）、ＣＯＳ７細胞（図１４）、ＨｅＬａ細胞（図１５）では１２１〜２００番目のβ−グロビンのターミネータ塩基配列において、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（図１３）及びＥＢ３細胞（図１６）では、塩基番号１２１〜２２０番目のβ−グロビンのターミネータ塩基配列において、最も高いルシフェラーゼの発現が見られた。また、いずれの種類の細胞においても、ＳＶ４０ターミネータ配列よりもβ−グロビンターミネータ配列を用いた方が遺伝子発現レベルは高いものの、２９３細胞（図１２）、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（図１３）、ＣＯＳ７細胞（図１４）、ＥＢ３細胞（図１６）ではＳＶ４０ターミネータ配列１２１−２２０ＡＡＴＡＡＡ mutationのネガティブコントロールより十分高い遺伝子発現を示したことから、塩基番号１２１〜２２０番目のＳＶ４０ターミネータ配列も、哺乳動物におけるリニアＤＮＡによる遺伝子発現に利用できることが示された。塩基番号１２１〜２２０番目のＳＶ４０ターミネータ配列において、２箇所のＡＡＴＡＡＡをＡＡｃｇＡＡに置換した変異ターミネータ配列（配列番号３９）用いたＳＶ４０ターミネータ配列１２１〜２２０ＡＡＴＡＡＡ mutationでは遺伝子発現が大幅に減少したことから、リニアＤＮＡによる遺伝子発現においては、ターミネータ配列が長い場合も、塩基番号１４３〜１５１番目のβ−グロビンのターミネータ配列は（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列が重要であることが示された。また、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列とターミネータの間に９塩基（配列番号５１）が付加されたリニアＤＮＡにおいても、かかる９塩基が付加されてないリニアＤＮＡと同程度の遺伝子発現を示したことから、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列とターミネータの間に９塩基程度のアニーリング配列を付��することによる発現低下は起こらないことが示唆された。従って、Ｎ末端に９塩基程度のアニーリング配列を備えた目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列増幅用のリバースプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅した、Ｃ末端にアニーリング配列を備えた目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列をテンプレートとすれば、Ｃ末端にアニーリング配列を備えたターミネータ配列の相補配列を共通のターミネータ配列付加用リバースプライマーとして用いることができ、様々なターミネータ配列を備えた遺伝子発現用リニアＤＮＡを容易に低コストで作製することができる。なお、様々な長さ、種類のターミネータ配列を用いたリニアＤＮＡを用いることによって細胞内におけるＲＮＡ発現量を制御することができ、例えば細胞に対して毒性を示すことが予想される遺伝子などを発現させる場合などに特に有用である。
【実施例４】
【００７２】
［プロモーターの検討］
ＳＶ４０プロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、塩基番号１２１〜２２０番目のＳＶ４０のターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡ、SV-cLuc-SV40polyA121-220を以下の方法で作製した。pCL-SV（アトー社製）をテンプレートとして、配列番号５２及び５３で示されるプライマーを用いてＳＶ４０プロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、塩基番号１２１〜１４０番目のＳＶ４０ターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡ、SV40-hCluc-terminator(121-140)(SV40)を作製した。ＰＣＲ反応は、KOD plusポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度はテンプレート５０ｐｇ／μＬ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、icyclerサーマルサイクラー（BIO-RAD社製）を用いて９４℃２０秒、５５℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製したSV40-hCluc-terminator(121-140)(SV40)をテンプレートとして、配列番号５２及び３８で示されるプライマーを使ってＰＣＲ法にて、ＳＶ４０プロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子及び塩基番号１２１〜２２０番目のＳＶ４０のターミネータ配列を順次備えたルシフェラーゼ発現リニアＤＮＡ、SV40-hCluc-SV40pA121-220を作製した。ＰＣＲ反応は、KOD plus ポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度はテンプレート５０ｐｇ／μＬ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、icyclerサーマルサイクラー（BIO-RAD社製）を用いて９４℃２０秒、６０℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。コントロールとして、pCL-SVをテンプレートにＰＣＲ法にて作製した、ＳＶ４０プロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子及びプラスミドポリＡを順次備えたリニアＤＮＡ、SV-cLucを用いた。これらのリニアＤＮＡを、それぞれ１００ｎｇを、２９３細胞又はＮＩＨ−３Ｔ３細胞にFuGENE（登録商標）HD Transfection Reagentキット（Roche社製）により導入し、２４時間後に採取した培養上清に含まれる分泌型ルシフェラーゼをCLuc Reporter Assay Kit（アトー社製）とGLOMAX20/20 Luminometer（Promega社製）を用いて測定した（図１７）。その結果、ＳＶ４０プロモーター及び塩基番号１２１〜２２０番目のＳＶ４０ターミネータ配列を用いたリニアＤＮＡも、２９３細胞及びＮＩＨ−３Ｔ３細胞においてルシフェラーゼ遺伝子を発現することができ、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞においてはプラスミドベクターを用いた場合よりも高い遺伝子発現が見られた。【００７３】
以上の結果から、ＳＶ４０プロモーターを用いた場合も、２９３細胞及びＮＩＨ−３Ｔ３細胞においてルシフェラーゼ遺伝子をリニアＤＮＡにより発現することができることが確認された。すなわち、本発明のリニアＤＮＡは、様々な由来のプロモーターやターミネータ配列を利用して、様々な種類の哺乳動物細胞において遺伝子発現が可能であることが示された。
【実施例５】
【００７４】
［リニアＤＮＡの作製］
リニアＤＮＡを作製した例を以下に示す。
１．目的にあったプロモーターの下流に、すでに目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が連結されているコンストラクトがあり、ターミネータ配列を１ステップで付加する場合（図２左パネル参照）
CMV-hGluc-terminator（β−グロビン）の例を以下に示す。
pCMV-Gluc（New England Biolabs社製）をテンプレートに、配列番号４及び２２、３２〜３４で示されるプライマーを用いてＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、β−グロビンターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡをＰＣＲ法で作製した。かかるリニアＤＮＡのβ−グロビンターミネータ配列は、塩基番号１２１〜１５５番目、１２１〜１６０番目、１２１〜１８０番目、１２１〜１９０番目のβ−グロビンターミネータ配列を順次備えている。ＰＣＲ反応は、KOD plusポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度はテンプレート５０ｐｇ／μＬ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、icyclerサーマルサイクラー（BIO-RAD社製）を用いて９４℃２０秒、５５℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製したリニアＤＮＡをアガロース電気泳動で確認した結果を、図１８左パネルに示す。【００７５】
２．目的にあったプロモーターの下流に、すでに目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が連結されているコンストラクトがあり、ターミネータ配列を２ステップで付加する場合２−１．CMV-hGluc-terminator (SV40)の例を以下に示す。（図２右パネル参照）
pCMV-Gluc（New England Biolabs社製）をテンプレートに、配列番号４及び３７で示されるプライマーを用いてＰＣＲ法で、ＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、塩基番号１２１〜１４０番目のＳＶ４０ターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡ、CMV-hGluc-terminator(121-140)(SV40)を作製した。ＰＣＲ反応は、KOD plusポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度はテンプレート５０ｐｇ／μＬ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、icyclerサーマルサイクラー（BIO-RAD社製）を用いて９４℃２０秒、５５℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製したCMV-hGluc-terminator(121-140)(SV40)をテンプレートとして、配列番号４及び３８で示されるプライマーを使ってＰＣＲ法にて、ＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子及び塩基番号１２１〜２２０番目のＳＶ４０のターミネータ配列（長さ１００塩基）を順次備えたルシフェラーゼ発現リニアＤＮＡ、CMV-hGluc-SV40pA121-220を作製した。ＰＣＲ反応は前記と反応溶液組成にて９４℃２０秒、６０℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製したリニアＤＮＡをアガロース電気泳動で確認した結果を、図１８中央パネルに示す。【００７６】
２−２．CMV-EGFP-terminator(SV40)（図２右パネル参照）
ＣＭＶプロモーター、ＥＧＦＰ及びＳＶ４０ターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡは以下の方法で作製した。pEGFP-C1（Clontech社製）をテンプレートに、配列番号４及び４４で示されるプライマーを用いてＰＣＲ法でＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、塩基番号１２１〜１４０番目のＳＶ４０ターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡ、CMV-EGFP-terminator(121-140)を作製した。ＰＣＲ反応は、KOD plus ポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度はテンプレート５０ｐｇ／μＬ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、icyclerサーマルサイクラー（BIO-RAD社製）を用いて９４℃２０秒、５５℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。これをテンプレートに配列番号４及び３８で示されるプライマーを用いてＰＣＲ法で、ＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、塩基番号１２１〜２２０番目のＳＶ４０ターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡ、CMV-EGFP-SV40pA121-220を作製した。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ反応は前記と反応溶液組成にて９４℃２０秒、６０℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。【００７７】
３．目的にあったプロモーターの下流に、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列が連結されているコンストラクトがなく、ターミネータ配列を２ステップで付加する場合
３−２．CMV-hCluc-terminator(β-globin)（図４左パネル参照）
ＣＭＶプロモーター、ｈＣｌｕｃ及びβ−グロビンターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡは以下の方法で作製した。pEGFP-C1（Clontech社製）をテンプレートに配列番号４及び６で示されるプライマーを用いてＰＣＲ法にてＣＭＶプロモーターを増幅した。また、pCL-SV（アトー社製）をテンプレートに、配列番号４１及び４２で示されるプライマーを用いてＰＣＲ法で、ＣＭＶプロモーターのＣ末端側領域配列、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、塩基番号１２１〜１４０番目のβ−グロビンターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡ、CMV(-27-1)-hCluc-terminator(121-140)(b-globin)を作製した。ＰＣＲ反応は、KOD plus ポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度はテンプレート５０ｐｇ／μＬ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、icyclerサーマルサイクラー（BIO-RAD社製）を用いて９４℃２０秒、５５℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。次に、作製したＣＭＶプロモーターとCMV(-27-1)-hCluc-terminator(121-140)(b-globin)をテンプレートとして、配列番号４及び３５、３６で示されるプライマーを使ってＰＣＲ法にて、ＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子及び塩基番号１２１〜２００番目、１２１〜２２０番目のＳＶ４０のターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡ、CMV-hCluc-bglobinpA121-200を作製した。ＰＣＲ反応は前記と反応溶液組成にて９４℃２０秒、６０℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。【００７８】
３−３．CMV-hCluc-terminator(SV40)（図４左パネル参照）
ＣＭＶプロモーター、ｈＣｌｕｃ及びＳＶ４０ターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡは以下の方法で作製した。pEGFP-C1（Clontech社製）をテンプレートに配列番号４及び６で示されるプライマーを用いてＰＣＲ法にてＣＭＶプロモーターを増幅した。また、pCL-SV（アトー社製）をテンプレートに、配列番号４１及び４３で示されるプライマーを用いてＰＣＲ法で、ＣＭＶプロモーターのＣ末端側領域配列、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、塩基番号１２１〜１４０番目のＳＶ４０ターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡ、CMV(-27-1)-hCluc-terminator(121-140)(SV40)を作製した。ＰＣＲ反応は、KOD plus ポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度はテンプレート５０ｐｇ／μＬ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、icyclerサーマルサイクラー（BIO-RAD社製）を用いて９４℃２０秒、５５℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。次にＣＭＶプロモーター及びCMV(-27-1)-hCluc-terminator(121-140)(SV40)をテンプレートとして、配列番号４及び３８で示されるプライマーを使ってＰＣＲ法にて、ＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子及び塩基番号１２１〜２２０番目のＳＶ４０のターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡ、CMV-hCluc-terminator(121-220)(SV40)を作製した。ＰＣＲ反応は前記と反応溶液組成にて９４℃２０秒、６０℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製したリニアＤＮＡをアガロース電気泳動で確認した結果を、図１８右パネルに示す。【００７９】
３−４．CMV-hGluc-terminator(β-globin)（図４右パネル参照）
ＣＭＶプロモーター、ｈＧｌｕｃ及びβ−グロビンターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡは以下の方法で作製した。pEGFP-C1（Clontech社製）をテンプレートに配列番号４及び６で示されるプライマーを用いてＰＣＲ法にてＣＭＶプロモーターを増幅した。また、pCMV-Gluc（New England Biolabs社製）をテンプレートに、配列番号４０及び１９で示されるプライマーを用いてＰＣＲ法で、ＣＭＶプロモーターのＣ末端側領域配列、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、塩基番号１２１〜１４０番目のβ−グロビンターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡ、CMV(-27-1)-hGluc-terminator(121-140)(b-globin)を作製した。ＰＣＲ反応は、KOD plus ポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度はテンプレート５０ｐｇ／μＬ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、icyclerサーマルサイクー（BIO-RAD社製）を用いて９４℃２０秒、５５℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製したＣＭＶプロモーター及びCMV(-27-1)-hGluc-terminator(121-140)(b-globin)をテンプレートとして、配列番号４で示されるフォワードプライマー及び３６で示されるリバースプライマーを使ってＰＣＲ法にて、ＣＭＶプロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、塩基配列１２１−２２０のβ−グロビンターミネータ配列を順次備えたルシフェラーゼ発現リニアＤＮＡを作製した。ＰＣＲ反応は前記と反応溶液組成にて９４℃２０秒、６０℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。【００８０】
３−５．SV40-hGluc-terminator(SV40)（図４右パネル参照）
ＳＶ４０プロモーター、ｈＧｌｕｃ及びＳＶ４０ターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡは以下の方法で作製した。pEGFP-C1（Clontech社製）をテンプレートに、配列番号３及び４５で示されるプライマーを用いてＰＣＲ法でＳＶ４０プロモーター、塩基番号１〜３０番目の分泌型ルシフェラーゼ遺伝子を順次備えたリニアＤＮＡ、SV40-hGluc(1-30)を作製した。配列番号１９及び４６で示されるプライマーを用いてＰＣＲ法で分泌型ルシフェラーゼ遺伝子、塩基番号１２１〜１４０番目のβ−グロビンターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡ、hGluc-terminator(121-140)を作製した。ＰＣＲ反応は、KOD plus ポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度はテンプレート５０ｐｇ／μＬ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、icyclerサーマルサイクラー（BIO-RAD社製）を用いて９４℃２０秒、５５℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。次に、SV40-hGluc(1-30)及びhGluc-terminator(121-140)をテンプレートに、配列番号３及び３６で示されるプライマーを用いてＰＣＲにて、ＳＶ４０プロモーター、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子及び塩基番号１２１〜２２０番目のβ−グロビンのターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡ、SV40-hGluc-bglobinpA121-200を作製した。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ反応は前記と反応溶液組成にて９４℃２０秒、６０℃３０秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。【００８１】
４．増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列としてｓｈＲＮＡ発現ＤＮＡ配列を設定した場合
ｈＵ６プロモーター配列、ｓｈＲＮＡ発現ＤＮＡ配列としてＥＧＦＰｓｈＲＮＡ発現ＤＮＡ配列、アニーリング配列、塩基番号１３０〜２２０番目のＳＶ４０のターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡを以下の方法で作成した。
４−１．ｈＵ６プロモーター配列の作製
Human genome(promega社製)をテンプレートとして、配列番号５４で示されるフォワードプライマー及び配列番号５５で示されるリバースプライマーを用いてｈｕｍａｎ  ｈＵ６プロモーターを増幅した。ＰＣＲ反応は、ＧＸＬポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度はテンプレート５０ｐｇ／μＬ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、icyclerサーマルサイクー（BIO-RAD社製）を用いて９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃３０秒のサイクルを３０回行った。作製したリニアＤＮＡをアガロース電気泳動で確認した結果を図１９に示す（左レーン）。
４−２．ｈＵ６プロモーター配列、ＥＧＦＰｓｈＲＮＡ発現ＤＮＡ配列、アニーリング配列（３ＧＣ９）を順次備えたリニアＤＮＡの作製
４−１で作製したｈＵ６プロモーターをテンプレートとして、配列番号５４で示されるフォワードプライマー及び配列番号５７で示されるリバースプライマーを使ってＰＣＲ法にて、ｈＵ６プロモーター配列、ＥＧＦＰｓｈＲＮＡ発現ＤＮＡ配列、アニーリング配列（３ＧＣ９）を順次備えたリニアＤＮＡを作製した。ＰＣＲ反応はそれぞれの最終濃度はテンプレート５０ｐｇ／μＬ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、icyclerサーマルサイクー（BIO-RAD社製）を用い９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃４５秒のサイクルを３０回行った。
４−３．ｈＵ６プロモーター配列、ＥＧＦＰｓｈＲＮＡ発現ＤＮＡ配列、アニーリング配列（３ＧＣ９）、ＳＶ４０ターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡの作製
４−２で作製したｈＵ６プロモーター配列、ＥＧＦＰｓｈＲＮＡ発現ＤＮＡ配列、アニーリング配列（３ＧＣ９）をテンプレートとして、配列番号５４で示されるフォワードプライマー及び配列番号５０で示されるリバースプライマーを使ってＰＣＲ法にて、ｈＵ６プロモーター配列、ＥＧＦＰｓｈＲＮＡ発現ＤＮＡ配列、アニーリング配列（３ＧＣ９）、ＳＶ４０ターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡを作製した。ＰＣＲ反応はそれぞれの最終濃度はテンプレート５０ｐｇ／μＬ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、icyclerサーマルサイクー（BIO-RAD社製）を用い９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃４５秒のサイクルを３０回行った。作製したリニアＤＮＡをアガロース電気泳動で確認した結果を図１９に示す（右レーン）。
４−４．ｈＵ６プロモーター配列、ＥＧＦＰｓｈＲＮＡ発現ＤＮＡ配列、ｐｏｌｙＴターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡの作製
ターミネータとしてＳＶ４０ターミネータの代わりにｓｈＲＮＡ発現を行う際に一般的に用いられているｐｏｌｙＴターミネータでリニアＤＮＡを作製した。４−１で作製したｈＵ６プロモーター配列をテンプレートとして、配列番号５４で示されるフォワードプライマー及び配列番号５６で示されるリバースプライマーを使ってＰＣＲ法にて、ｈＵ６プロモーター配列、ＥＧＦＰｓｈＲＮＡ発現ＤＮＡ配列、ｐｏｌｙＴターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡを作製した。ＰＣＲ反応はそれぞれの最終濃度はテンプレート５０ｐｇ／μＬ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、icyclerサーマルサイクー（BIO-RAD社製）を用い９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃４５秒のサイクルを３０回行った。作製したリニアＤＮＡをアガロース電気泳動で確認した結果を図１９に示す（真ん中レーン）。
４−５．ＨＥＫ２９３細胞への導入
ｐEGFP−C1(クロンテック社製) １２．５ｎｇ／wellと作製した３つのリニアＤＮＡそれぞれ５０ｎｇ/wellを、ＨＥＫ２９３細胞にFuGENE（登録商標）HD Transfection Reagentキット（Roche社製）を用いて導入し、４８時間後に蛍光観察した（図２０）。その結果、ｈＵ６プロモーター配列のみを導入した場合には蛍光が観察されたが（図２０の上段）、ｈＵ６プロモーター配列、ＥＧＦＰｓｈＲＮＡ発現ＤＮＡ配列、アニーリング配列（３ＧＣ９）、ＳＶ４０ターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡを導入した場合に蛍光が観察されなくなり（図２０の下段）、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列としてＥＧＦＰｓｈＲＮＡ発現ＤＮＡ配列を用いることでＥＧＦＰｓｈＲＮＡが発現され、その結果ＥＧＦＰｓｉＲＮＡ（short interfering ＲＮＡ）が産生され、ＥＧＦＰ発現を抑制できることが確認された。ｈＵ６プロモーター配列、ＥＧＦＰｓｈＲＮＡ発現ＤＮＡ配列、ｐｏｌｙＴターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡを導入した場合でも蛍光が抑制されているが、ｈＵ６プロモーター配列、ＥＧＦＰｓｈＲＮＡ発現ＤＮＡ配列、アニーリング配列（３ＧＣ９）、ＳＶ４０ターミネータ配列を順次備えたリニアＤＮＡを導入した場合の方がより蛍光が少なく（図２０中段）、本発明のリニアＤＮＡによるタンパク質発現抑制効果が高いことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明は、培養細胞におけるＲＮＡ発現や、リニアＤＮＡによるＲＮＡ発現などの技術分野や、培養細胞におけるＲＮＡ発現を用いたスクリーニングなどの分野に好適に利用することができる。
【図１】
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【図７】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年10月30日(2012.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターミネータ配列を含むＤＮＡ配列の相補配列からなり、リニアＤＮＡによる細胞におけるＲＮＡ発現用のリバースプライマーであって、前記ターミネータ配列が、３０〜２００塩基からなり、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含み、β−グロビン（β−ｇｌｏｂｉｎ）又はＳＶ４０（シミアンウイルス４０）のターミネータ配列由来であることを特徴とするリバースプライマー。
【請求項２】
ターミネータ配列を含むＤＮＡ配列の相補配列が、増幅対象の目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列の特異的配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列であることを特徴とする請求項１記載のリバースプライマー。
【請求項３】
ターミネータ配列を含むＤＮＡ配列の相補配列が、アニーリング配列とターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ配列の相補配列であることを特徴とする請求項１記載のリバースプライマー。
【請求項４】
ターミネータ配列が、配列番号１又は２で示される配列の一部又は全長であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のリバースプライマー。
【請求項５】
プロモーター配列と、目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列とを順次備えた二本鎖ＤＮＡ配列からなる、細胞におけるＲＮＡ発現用のリニアＤＮＡであって、
前記ターミネータ配列が、３０〜２００塩基からなり、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含み、β−グロビン（β−ｇｌｏｂｉｎ）又はＳＶ４０（シミアンウイルス４０）のターミネータ配列由来であることを特徴とするリニアＤＮＡ。
【請求項６】
目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列とターミネータ配列との間に、アニーリング配列を備えたことを特徴とする請求項５記載のリニアＤＮＡ。
【請求項７】
ターミネータ配列が、配列番号１又は２で示される配列の一部又は全長であることを特徴とする請求項５又は６記載のリニアＤＮＡ。
【請求項８】
目的ＲＮＡ発現ＤＮＡ配列がｓｈＲＮＡ発現ＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項５〜７のいずれかに記載のリニアＤＮＡ。
【請求項９】
請求項５〜８記載のリニアＤＮＡを、細胞内に導入することを特徴とするリニアＤＮＡを用いたＲＮＡ発現方法。
【国際調査報告】
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