(57)【要約】  ブドウ球菌属内の菌種を判別する方法を提供することを目的とし、多種のレクチンとブドウ球菌属に属する細菌との結合性を調べ、ブドウ球菌属内の菌種間において異なる結合性を示すレクチン、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＬＥＬ、ＫＡＡ１、ＢＣＬ１１、ＣＢＡ、ＨＡＡ、ＨＰＡ、ＳＴＬ、ｐｒｏＢＣＡ１、ｐｒｏＢＣＡ２、ＵＬＬ、ＤＳＡ、ＰＷＭ、ＵＤＡ、ＷＦＬ、ｈｙｐｎｉｎＡ３、ＢＣＬ１１ｄ、ＣＦＡ１、ＣＦＡ２、ＣＬＡ、ＭＰＡ１、ＭＰＡ２、ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ、ａｌｇＣＳＡ、ＢＭＬ１１ｂ及びＢＭＬ１１ｃ等を選抜した。そして、これらのレクチンを用いることによって、ブドウ球菌属内の菌種を判別できることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａｌｇＭＰＬ、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＬＥＬ、ＫＡＡ１、ＢＣＬ１１、ＣＢＡ、ＨＡＡ、ＨＰＡ、ＳＴＬ、ｐｒｏＢＣＡ１、ｐｒｏＢＣＡ２、ＵＬＬ、ＤＳＡ、ＰＷＭ、ＵＤＡ、ＷＦＬ、ｈｙｐｎｉｎＡ３、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３、ＯＡＡ、ＰＮＡ、ＴＬ、ＡＣＧ、ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ、ＭＯＡ、ＡＰＩ  １４４、ＣＶ−Ｎ、ＰＭＡ、ＧＳＬ−ＩＩ、Ｇａｒｌｉｃ  ｌｅｃｔｉｎ、ＰＡＡ、ＵＥＡ−ＩＩ、ＲＳＬ、ＣＰＡ、ＣＨＡ−１、ＬＡＡ、ＳＨＡ、ＬＰＡ、ＤＢＡ、ＴＰＬ−１、ＢＭＬ１１ｂ、ＢＭＬ１１ｃ、ＰＶＬ、ＬＢＡ、ＵＰＬ−１、ＢＰＬ、ＣＦＡ１、ＣＦＡ２、ＢａｎＬｅｃ、ＢＣＬ１１ｄ、ＦＶＥ、ＣＬＡ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  Ｉ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ、ＭＰＡ１、ＭＰＡ２及びａｌｇＣＳＡからなる群から選択される少なくとも１のレクチンとの結合性を指標として、ブドウ球菌属内の菌種を判別する方法。
【請求項２】
ａｌｇＭＰＬ、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＬＥＬ、ＫＡＡ１、ＢＣＬ１１、ＣＢＡ、ＨＡＡ、ＨＰＡ、ＳＴＬ、ｐｒｏＢＣＡ１、ｐｒｏＢＣＡ２、ＵＬＬ、ＤＳＡ、ＰＷＭ、ＵＤＡ、ＷＦＬ、ｈｙｐｎｉｎＡ３、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３、ＯＡＡ、ＰＮＡ、ＴＬ、ＡＣＧ、ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ、ＭＯＡ、ＡＰＩ  １４４、ＣＶ−Ｎ、ＰＭＡ、ＧＳＬ−ＩＩ、Ｇａｒｌｉｃ  ｌｅｃｔｉｎ、ＰＡＡ、ＵＥＡ−ＩＩ、ＲＳＬ、ＣＰＡ、ＣＨＡ−１、ＬＡＡ、ＳＨＡ、ＬＰＡ、ＤＢＡ、ＴＰＬ−１、ＢＭＬ１１ｂ、ＢＭＬ１１ｃ、ＰＶＬ、ＬＢＡ、ＵＰＬ−１、ＢＰＬ、ＣＦＡ１、ＣＦＡ２、ＢａｎＬｅｃ、ＢＣＬ１１ｄ、ＦＶＥ、ＣＬＡ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  Ｉ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ、ＭＰＡ１、ＭＰＡ２及びａｌｇＣＳＡからなる群から選択される少なくとも１のレクチンを含有する、ブドウ球菌属内の菌種を判別するための剤。
【請求項３】
ａｌｇＭＰＬ、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＬＥＬ、ＫＡＡ１、ＢＣＬ１１、ＣＢＡ、ＨＡＡ、ＨＰＡ、ＳＴＬ、ｐｒｏＢＣＡ１、ｐｒｏＢＣＡ２、ＵＬＬ、ＤＳＡ、ＰＷＭ、ＵＤＡ、ＷＦＬ、ｈｙｐｎｉｎＡ３、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３、ＯＡＡ、ＰＮＡ、ＴＬ、ＡＣＧ、ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ、ＭＯＡ、ＡＰＩ  １４４、ＣＶ−Ｎ、ＰＭＡ、ＧＳＬ−ＩＩ、Ｇａｒｌｉｃ  ｌｅｃｔｉｎ、ＰＡＡ、ＵＥＡ−ＩＩ、ＲＳＬ、ＣＰＡ、ＣＨＡ−１、ＬＡＡ、ＳＨＡ、ＬＰＡ、ＤＢＡ、ＴＰＬ−１、ＢＭＬ１１ｂ、ＢＭＬ１１ｃ、ＰＶＬ、ＬＢＡ、ＵＰＬ−１、ＢＰＬ、ＣＦＡ１、ＣＦＡ２、ＢａｎＬｅｃ、ＢＣＬ１１ｄ、ＦＶＥ、ＣＬＡ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  Ｉ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ、ＭＰＡ１、ＭＰＡ２及びａｌｇＣＳＡからなる群から選択される少なくとも１のレクチンを固相化した基材と、
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも１の試薬とからなる、ブドウ球菌属内の菌種を判別するためのキット
（ａ）検体を検出するための試薬
（ｂ）ブロッキングするための試薬
（ｃ）検体を固定するための試薬
（ｄ）検体を希釈するための試薬。
【請求項４】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチン
（ａ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：３４に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【請求項５】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチン
（ａ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：３５に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【請求項６】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチン
（ａ）配列番号：１３に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：１３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：３６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【請求項７】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチン
（ａ）配列番号：１４に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：１４に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：３７に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【請求項８】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチン
（ａ）配列番号：３８に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：３８に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：３９に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【請求項９】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチン
（ａ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：４１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【請求項１０】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチン
（ａ）配列番号：４２に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：４２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：４３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【請求項１１】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチン
（ａ）配列番号：４４に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：４４に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：４５に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【請求項１２】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチン
（ａ）配列番号：４６に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：４６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：４７に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【請求項１３】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチン
（ａ）配列番号：４８に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：４８に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：４９に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【請求項１４】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチン
（ａ）配列番号：５０に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：５０に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：５１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【請求項１５】
緑藻（アブラインビレア  カピチュリフォルミス）由来のレクチンであって、
該緑藻を緩衝液にて抽出し、得られた可溶性画分を塩析し、得られた沈殿物を透析し、ゲル濾過により精製することによって得られる画分に存在し、
還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて示される分子量は１５０００〜２００００Ｄａであり、
トリプシン処理ウサギ赤血球に対して凝集活性を示すレクチン。
【請求項１６】
緑藻（コディウム  スブトゥブロスム）由来のレクチンであって、
該緑藻を緩衝液にて抽出し、得られた可溶性画分を塩析し、得られた沈殿物を透析し、顎下腺ムチン固定化カラムに吸着させた後、Ｎ−アセチルガラクトサミンにて溶出される画分に存在し、
分子量は１００００〜１５０００Ｄａであり、
トリプシン処理ウサギ赤血球に対して凝集活性を示すレクチン。
【請求項１７】
請求項４〜１６のうちのいずれか一項に記載のレクチンにさらに機能性タンパク質が融合されているレクチン。
【請求項１８】
請求項４〜１７のうちのいずれか一項に記載のレクチンをコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブドウ球菌属内の菌種を判別する方法に関し、より詳しくは、特定のレクチンとの結合性を指標として、ブドウ球菌属内の菌種を判別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブドウ球菌（ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属）に属する細菌）は、ヒト等の皮膚や消化管に常在する菌である。その大部分は非病原性であり、皮膚等において常在細菌叢を形成して外部からの病原体の侵入を防ぐバリヤーの役割の一端を担っている。一方、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）はブドウ球菌の一種であるものの、食中毒や膿瘍等の様々な表皮感染症、又は肺炎、髄膜炎、敗血症等の致死的となるような感染症の起因菌である。ゆえに、食中毒等の原因菌である黄色ブドウ球菌と、病原体の侵入を防ぐバリヤーを形成するその他のブドウ球菌とを判別することは、食品衛生上及び医学上極めて重要であるため、簡便かつ迅速に判別する方法の確立が求められている。【０００３】
これまで行われてきた検査判定法は、選択分離培地を用いる培養法が中心であった。マンニット食塩培地等で４８時間の前培養を行い、２４時間の純培養を行って菌を鑑別し、コアグラーゼ試験、ブドウ糖発酵試験、グラム染色等の確認試験を行うため、菌の検出までに３〜４日の日数が必要とされる。このため原因菌の検出は食中毒等の発生後の事後検査に限定されており、黄色ブドウ球菌に汚染された食品が口に入る前に菌を検出できないという問題がある。【０００４】
また、培養法以外の検査判定法としては、検体中の黄色ブドウ球菌外毒素又は黄色ブドウ球菌外毒素に対する抗体を酵素免疫学的方法により検出する方法（特許文献１）、ヒトフィブリノーゲン及び免疫グロブリンＧで感作したポリスチレンラテックス粒子が、黄色ブドウ球菌の産生するプロテインＡと特異的に反応して凝集反応を起こすことを利用する方法（特許文献２）、黄色ブドウ球菌と特異的に反応する抗体やプロテインＡと特異的に反応する抗体を利用したサンドイッチＥＬＩＳＡ法による黄色ブドウ球菌の検出方法（特許文献３）等が知られている。しかしながら、これらの方法は、増菌培養・分離培養が必要であり、食品加工の場等においてリアルタイムで菌の増殖をモニタリングすることができないという欠点をもつ。さらに、抗体を用いた判別方法では、ブドウ球菌属内の菌種を判別することは困難である。【０００５】
また、近年は遺伝子学検査が普及している。遺伝子学検査は細菌固有のＤＮＡやＲＮＡの相違を用いて分離同定する検査であり、黄色ブドウ球菌のｒＲＮＡ遺伝子に対するプライマーを利用したリアルタイムＰＣＲ法（特許文献４）や黄色ブドウ球菌のｇａｐＲ遺伝子に対するプライマーを利用したＬＡＭＰ法（特許文献５）等が知られている。ＰＣＲ法およびＬＡＭＰ法では増菌・分離培養を必要としないため、他の方法に比べて迅速性に利があるが、複数菌種の検査にはその菌種数分の反応液が必要となり、対象菌種数に比例してその煩雑性が増大する。このため、より簡便な検出法の開発が望まれていた。【０００６】
ところで、細菌の表面は糖鎖で覆われており、宿主と細菌の相互作用や病原性、細胞間の相互作用、免疫に関わる重要な因子として表面糖鎖は機能している。また、細菌の表面糖鎖は菌によって異なることが知られている。例えばグラム陰性菌表面にはＯ抗原と呼ばれるリポ多糖が存在し、細菌種によってＯ抗原が異なるため分類に用いられている。さらに、黄色ブドウ球菌と皮膚の常在菌であるブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）では表面糖鎖が異なることが報告されている（非特許文献１）。従って、このような細菌の表面糖鎖を迅速に分析する事が出来れば従来の手法と比べてより簡便に細菌を検出、同定する事が可能であると考えられる。【０００７】
実際、蛍光染色した大腸菌をレクチンマイクロアレイに反応させることで大腸菌の細胞表面糖鎖が解析できることが報告されている（非特許文献２）。また、ＬｕらはＣｏｎＡレクチンと磁気弾性センサーを組み合わせることで、６ｘ１０１から６．１ｘ１０９ｃｅｌｌｓ／ｍｌという幅広いレンジで大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株の検出に成功している（非特許文献３）。さらに、レクチンを用いて黄色ブドウ球菌とブドウ球菌属以外の細菌を判別できる事についての報告もあり、例えば、Ｐａｙｎｅらによって、４種類の生物種由来レクチン（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｈｅｌｉｘ  ｐｏｍａｔｉａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｖｕｌｇａｒｉｓ及びＣａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ由来のレクチン）を用いて黄色ブドウ球菌、大腸菌、リステリア、サルモネラ菌の判別が行われており（非特許文献４）、Ｓｈａｎｇらによって、マンナン結合レクチン（Ｍａｎｎａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌｅｃｔｉｎ）によるブドウ球菌属と大腸菌、クレブシエラ属菌の判別が行われている（非特許文献５）。【０００８】
また、ブドウ球菌属内での判別に関しては、Ｍｕｎｏｚらが黄色ブドウ球菌のタイピングを３２種類の市販レクチンを用いて行っており（非特許文献６）、Ｊａｒｌｏｖらは表皮ブドウ球菌のタイピングを４種類のレクチンで行っている（非特許文献７）。さらに、Ｓａｎｄｒａらによって、Ｎ−アセチルグルコサミンを認識する２種類のレクチンを用いてコアグラーゼ陽性、陰性のブドウ球菌の判別が行われている（非特許文献８）。【０００９】
このように、過去の知見においては、ブドウ球菌属とその他の細菌、又はブドウ菌属に属する菌種内の株のタイピング等についての報告はあるものの、ブドウ球菌属内の菌種を判別する方法、特に黄色ブドウ球菌とその他のブドウ球菌とを判別する方法は、実用化されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平６−８８８２４号公報
【特許文献２】特表平２−５０２９４２号公報
【特許文献３】特開平９−２１１０００号公報
【特許文献４】特表２００６−５０８６６９号公報
【特許文献５】特開２００７−１８９９８０号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓｉｇｒｉｄ  Ｆｌａｈａｕｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、２００８年３月、１９０巻、５号、１６４９〜１６５７ページ
【非特許文献２】Ｋｕ−Ｌｕｎｇ  Ｈｓｕら、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２００６年３月、２巻、３号、１５３〜１５７ページ
【非特許文献３】Ｑｉｎｇｚｈｕ  Ｌｕら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００９年７月、８１巻、１４号、５８４６〜５８５０ページ
【非特許文献４】Ｋｕ−Ｌｕｎｇ  Ｈｓｕら、Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９９２年７月、７３巻、１号、４１〜５２ページ
【非特許文献５】ＳＨＡＮＧ  Ｓｈｉ−ｑｉａｎｇら、Ｊ  Ｚｈｅｊｉａｎｇ  Ｕｎｉｖ  Ｓｃｉ  Ｂ．、２００５年１月、６巻、１号、５３〜５６ページ
【非特許文献６】Ａ  ＭＵＮＯＺら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９９年５月、４８巻、５号、４９５〜４９９ページ
【非特許文献７】Ｊ．Ｏ．ＪＡＲＬＯＶら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９２年９月、３７巻、３号、１９５〜２００ページ
【非特許文献８】ＳＡＮＤＲＡ  Ｋ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９８２年４月、１５巻、４号、５４７〜５５３ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ブドウ球菌属内の菌種を判別することを可能とする方法、特にブドウ球菌属内の菌種を迅速かつ簡便に判別することを可能とする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、多種のレクチンとブドウ球菌属に属する細菌との結合性を調べ、ブドウ球菌属内の菌種間において異なる結合性を示すレクチン（Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＬＥＬ、ＫＡＡ１、ＢＣＬ１１、ＣＢＡ、ＨＡＡ、ＨＰＡ、ＳＴＬ、ｐｒｏＢＣＡ１、ｐｒｏＢＣＡ２、ＵＬＬ、ＤＳＡ、ＰＷＭ、ＵＤＡ、ＷＦＬ、ｈｙｐｎｉｎＡ３、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３、ＯＡＡ、ＰＮＡ、ＴＬ、ＡＣＧ、ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ、ＭＯＡ、ＡＰＩ  １４４、ＣＶ−Ｎ、ＰＭＡ、ＧＳＬ−ＩＩ、Ｇａｒｌｉｃ  ｌｅｃｔｉｎ、ＰＡＡ、ＵＥＡ−ＩＩ、ＲＳＬ、ＣＰＡ、ＣＨＡ−１、ＬＡＡ、ＳＨＡ、ＬＰＡ、ＤＢＡ、ＴＰＬ−１、ＢＭＬ１１ｂ、ＢＭＬ１１ｃ、ＰＶＬ、ＬＢＡ、ＵＰＬ−１、ＢＰＬ、ＣＦＡ１、ＣＦＡ２、ＢａｎＬｅｃ、ＢＣＬ１１ｄ、ＦＶＥ、ＣＬＡ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  Ｉ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ、ＭＰＡ１、ＭＰＡ２、ａｌｇＭＰＬ及びａｌｇＣＳＡ）を選抜した。そして、これらのレクチンを用いることによって、ブドウ球菌属内の菌種を判別できることを見出した。また、これらのレクチンを用いることによって、静止期であっても、対数増殖期であっても、さらには食品中であっても、ブドウ球菌属内の菌種を判別できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１４】
本発明は、より詳しくは、下記を提供するものである。
＜１＞  Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＬＥＬ、ＫＡＡ１、ＢＣＬ１１、ＣＢＡ、ＨＡＡ、ＨＰＡ、ＳＴＬ、ｐｒｏＢＣＡ１、ｐｒｏＢＣＡ２、ＵＬＬ、ＤＳＡ、ＰＷＭ、ＵＤＡ、ＷＦＬ、ｈｙｐｎｉｎＡ３、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３、ＯＡＡ、ＰＮＡ、ＴＬ、ＡＣＧ、ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ、ＭＯＡ、ＡＰＩ  １４４、ＣＶ−Ｎ、ＰＭＡ、ＧＳＬ−ＩＩ、Ｇａｒｌｉｃ  ｌｅｃｔｉｎ、ＰＡＡ、ＵＥＡ−ＩＩ、ＲＳＬ、ＣＰＡ、ＣＨＡ−１、ＬＡＡ、ＳＨＡ、ＬＰＡ、ＤＢＡ、ＴＰＬ−１、ＢＭＬ１１ｂ、ＢＭＬ１１ｃ、ＰＶＬ、ＬＢＡ、ＵＰＬ−１、ＢＰＬ、ＣＦＡ１、ＣＦＡ２、ＢａｎＬｅｃ、ＢＣＬ１１ｄ、ＦＶＥ、ＣＬＡ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  Ｉ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ、ＭＰＡ１、ＭＰＡ２、ａｌｇＭＰＬ及びａｌｇＣＳＡからなる群から選択される少なくとも１のレクチンとの結合性を指標として、ブドウ球菌属内の菌種を判別する方法。
＜２＞  Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＬＥＬ、ＫＡＡ１、ＢＣＬ１１、ＣＢＡ、ＨＡＡ、ＨＰＡ、ＳＴＬ、ｐｒｏＢＣＡ１、ｐｒｏＢＣＡ２、ＵＬＬ、ＤＳＡ、ＰＷＭ、ＵＤＡ、ＷＦＬ、ｈｙｐｎｉｎＡ３、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３、ＯＡＡ、ＰＮＡ、ＴＬ、ＡＣＧ、ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ、ＭＯＡ、ＡＰＩ  １４４、ＣＶ−Ｎ、ＰＭＡ、ＧＳＬ−ＩＩ、Ｇａｒｌｉｃ  ｌｅｃｔｉｎ、ＰＡＡ、ＵＥＡ−ＩＩ、ＲＳＬ、ＣＰＡ、ＣＨＡ−１、ＬＡＡ、ＳＨＡ、ＬＰＡ、ＤＢＡ、ＴＰＬ−１、ＢＭＬ１１ｂ、ＢＭＬ１１ｃ、ＰＶＬ、ＬＢＡ、ＵＰＬ−１、ＢＰＬ、ＣＦＡ１、ＣＦＡ２、ＢａｎＬｅｃ、ＢＣＬ１１ｄ、ＦＶＥ、ＣＬＡ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  Ｉ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ、ＭＰＡ１、ＭＰＡ２、ａｌｇＭＰＬ及びａｌｇＣＳＡからなる群から選択される少なくとも１のレクチンを含有する、ブドウ球菌属内の菌種を判別するための剤。
＜３＞  Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＬＥＬ、ＫＡＡ１、ＢＣＬ１１、ＣＢＡ、ＨＡＡ、ＨＰＡ、ＳＴＬ、ｐｒｏＢＣＡ１、ｐｒｏＢＣＡ２、ＵＬＬ、ＤＳＡ、ＰＷＭ、ＵＤＡ、ＷＦＬ、ｈｙｐｎｉｎＡ３、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３、ＯＡＡ、ＰＮＡ、ＴＬ、ＡＣＧ、ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ、ＭＯＡ、ＡＰＩ  １４４、ＣＶ−Ｎ、ＰＭＡ、ＧＳＬ−ＩＩ、Ｇａｒｌｉｃ  ｌｅｃｔｉｎ、ＰＡＡ、ＵＥＡ−ＩＩ、ＲＳＬ、ＣＰＡ、ＣＨＡ−１、ＬＡＡ、ＳＨＡ、ＬＰＡ、ＤＢＡ、ＴＰＬ−１、ＢＭＬ１１ｂ、ＢＭＬ１１ｃ、ＰＶＬ、ＬＢＡ、ＵＰＬ−１、ＢＰＬ、ＣＦＡ１、ＣＦＡ２、ＢａｎＬｅｃ、ＢＣＬ１１ｄ、ＦＶＥ、ＣＬＡ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  Ｉ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ、ＭＰＡ１、ＭＰＡ２、ａｌｇＭＰＬ及びａｌｇＣＳＡからなる群から選択される少なくとも１のレクチンを固相化した基材と、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも１の試薬とからなる、ブドウ球菌属内の菌種を判別するためのキット
（ａ）検体を検出するための試薬
（ｂ）ブロッキングするための試薬
（ｃ）検体を固定するための試薬
（ｄ）検体を希釈するための試薬。
＜４＞  下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチン
（ａ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：３４に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
＜５＞  下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチン
（ａ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：３５に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
＜６＞  下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチン
（ａ）配列番号：１３に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：１３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：３６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
＜７＞  下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチン
（ａ）配列番号：１４に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：１４に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：３７に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
＜８＞  下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチン
（ａ）配列番号：３８に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：３８に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：３９に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
＜９＞  下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチン
（ａ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：４１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
＜１０＞  下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチン
（ａ）配列番号：４２に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：４２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：４３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
＜１１＞  下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチン
（ａ）配列番号：４４に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：４４に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：４５に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
＜１２＞  下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチン
（ａ）配列番号：４６に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：４６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：４７に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
＜１３＞  下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチン
（ａ）配列番号：４８に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：４８に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：４９に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
＜１４＞  下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチン
（ａ）配列番号：５０に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：５０に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：５１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
＜１５＞  緑藻（アブラインビレア  カピチュリフォルミス）由来のレクチンであって、該緑藻を緩衝液にて抽出し、得られた可溶性画分を塩析し、得られた沈殿物を透析し、ゲル濾過により精製することによって得られる画分に存在し、還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて示される分子量は１５０００〜２００００Ｄａであり、トリプシン処理ウサギ赤血球に対して凝集活性を示すレクチン。
＜１６＞  緑藻（コディウム  スブトゥブロスム）由来のレクチンであって、該緑藻を緩衝液にて抽出し、得られた可溶性画分を塩析し、得られた沈殿物を透析し、顎下腺ムチン固定化カラムに吸着させた後、Ｎ−アセチルガラクトサミンにて溶出される画分に存在し、分子量は１００００〜１５０００Ｄａであり、トリプシン処理ウサギ赤血球に対して凝集活性を示すレクチン。
＜１７＞  ＜４＞〜＜１６＞のうちのいずれか一項に記載のレクチンにさらに機能性タンパク質が融合されているレクチン。
＜１８＞  ＜４＞〜＜１７＞のうちのいずれか一項に記載のレクチンをコードするＤＮＡ。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ブドウ球菌属内の菌種を判別すること、特にブドウ球菌属内の菌種を迅速かつ簡便に判別することを可能とする方法が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの各種レクチンに対する結合性を示すグラフである。
【図２】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ６５３８株）の各種レクチンに対する結合性を示すグラフである。
【図３】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２７２１７株）及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１２２２８株）の各種レクチンに対する結合性を示すグラフである。
【図４】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１４９９０株）及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ（ＡＴＣＣ２７８４０株）の各種レクチンに対する結合性を示すグラフである。
【図５】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ（ＡＴＣＣ３５６６１株）の各種レクチンに対する結合性を示すグラフである。
【図６】ブドウ球菌等の各種レクチンに対する結合性を示すレーダーチャートである。
【図７】ブドウ球菌属の菌種とＴａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２との結合性をチューキー・クレーマー（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ）多重比較法によって解析した結果を示す、プロット図である。
【図８】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１２２２８株）存在下における、レクチン等を固定していないプレートウェル（Ｂｌａｎｋ）のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ６５３８株）の識別性を調べた結果を示すグラフである。なお、レクチン等を固定していないプレート（Ｂｌａｎｋ）は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ共に結合しないため、図９〜１１に示した試験における陰性対照とした。
【図９】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１２２２８株）存在下における、抗Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ血清を固定したプレートウェルのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ６５３８株）の識別性を調べた結果を示すグラフである。
【図１０】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１２２２８株）存在下における、ＰＮＡを固定したプレートウェルのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ６５３８株）の識別性を調べた結果を示すグラフである。
【図１１】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１２２２８株）存在下における、ａｌｇＭＰＬを固定したプレートウェルのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ６５３８株）の識別性を調べた結果を示すグラフである。
【図１２】牛乳中、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１２２２８株）存在下における、レクチン等を固定していないプレートウェル（Ｂｌａｎｋ）のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ６５３８株）の識別性を調べた結果を示すグラフである。なお、図１２に示した試験結果は、図１３〜１５に示した試験における陰性対照である。
【図１３】牛乳中、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１２２２８株）存在下における、抗Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ血清を固定したプレートウェルのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ６５３８株）の識別性を調べた結果を示すグラフである。
【図１４】牛乳中、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１２２２８株）存在下における、ＰＮＡを固定したプレートウェルのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ６５３８株）の識別性を調べた結果を示すグラフである。
【図１５】牛乳中、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１２２２８株）存在下における、ａｌｇＭＰＬを固定したプレートウェルのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ６５３８株）の識別性を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
＜ブドウ球菌属内の菌種を判別する方法＞
本発明のブドウ球菌属内の菌種を判別する方法は、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＬＥＬ、ＫＡＡ１、ＢＣＬ１１、ＣＢＡ、ＨＡＡ、ＨＰＡ、ＳＴＬ、ｐｒｏＢＣＡ１、ｐｒｏＢＣＡ２、ＵＬＬ、ＤＳＡ、ＰＷＭ、ＵＤＡ、ＷＦＬ、ｈｙｐｎｉｎＡ３、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３、ＯＡＡ、ＰＮＡ、ＴＬ、ＡＣＧ、ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ、ＭＯＡ、ＡＰＩ  １４４、ＣＶ−Ｎ、ＰＭＡ、ＧＳＬ−ＩＩ、Ｇａｒｌｉｃ  ｌｅｃｔｉｎ、ＰＡＡ、ＵＥＡ−ＩＩ、ＲＳＬ、ＣＰＡ、ＣＨＡ−１、ＬＡＡ、ＳＨＡ、ＬＰＡ、ＤＢＡ、ＴＰＬ−１、ＢＭＬ１１ｂ、ＢＭＬ１１ｃ、ＰＶＬ、ＬＢＡ、ＵＰＬ−１、ＢＰＬ、ＣＦＡ１、ＣＦＡ２、ＢａｎＬｅｃ、ＢＣＬ１１ｄ、ＦＶＥ、ＣＬＡ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  Ｉ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ、ＭＰＡ１、ＭＰＡ２、ａｌｇＭＰＬ及びａｌｇＣＳＡからなる群から選択される少なくとも１のレクチンとの結合性を指標として、菌種を判別する方法である。
【００１８】
本発明において、「菌種の判別」とは、特定の菌種又は複数の菌種に着目して、本発明にかかるレクチンを１若しくは複数組み合わせて用いることにより、１若しくは複数の菌種の存在の有無を判別することを意味する。
【００１９】
本発明にかかる「ブドウ球菌属内の菌種」とは、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属）に属する菌種のことであり、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・キャピティス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、スタフィロコッカス・カプラエ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｒａｅ）、スタフィロコッカス・ワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉ）、スタフィロコッカス・ホミニス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、スタフィロコッカス・ヘモリチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）が挙げられる。本発明において、これらの中では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓからなる群から選択される少なくとも１の菌種を判別することが好ましい。
【００２０】
また、本発明の方法により、ブドウ球菌属内の菌種を判別し得る検体としては、前記「ブドウ球菌属内の菌種」を含むもの又は含んでいる可能性のあるものであれば特に限定はされず、目的に応じて適宜選択、調製することができる。例えば、食品の衛生検査を目的とする場合は、該食品、該食品からの抽出液、該食品からの培養物、該食品を取り扱う器具等の拭き取り試料、該試料の培養物が挙げられる。また、感染症患者の検査を目的とする場合は、該患者から採取した生体試料（血液試料、唾液試料、尿試料、便試料、粘膜関連リンパ組織試料、脳脊髄液試料、関節液試料、胸膜液試料、化膿創からの分泌液試料）、及びこれら試料の培養物が挙げられる。なお、前記試料の培養物を調製するにあたっては、後述の「検体を培養するための培地」を適宜選択して利用することができる。
【００２１】
さらに、後述の実施例において示す通り、本発明の方法によりブドウ球菌属内の菌種を判別し得る検体において、前記「ブドウ球菌属内の菌種」は静止期の状態であってもよく、対数増殖期の状態であってもよい。
【００２２】
静止期は、生菌数が増加しない時期、分裂新生した菌数と死滅する菌数が等しい時期又は菌の分裂が停止した時期である。また、自然界での細菌の増殖法は何らかの表層に付着してコロニーを形成するのが一般的であるため、可視コロニーは静止期の状態にある。さらに、食中毒が起こる際に食品中に存在する細菌は、多くの場合静止期に近い状態にある。従って、本発明の方法は、可視コロニー、食中毒を引き起こせる程に汚染されている食品等に対しても好適に用いることができる。
【００２３】
一方、対数増殖期は、２分裂が一定速度で繰り返される時期であり、この時期にある細菌集団は比較的均質であるため、細菌の性状の解析に適した状態である。従って、本発明の方法は、性状の解析に適した状態にある細菌、菌数が少ないため、培養を要する検体に対しても好適に用いることができる。
【００２４】
本発明にかかる「レクチン」とは、糖鎖を認識するタンパク質であって、イムノグロブリン以外のタンパク質である。本発明においては、特に、ブドウ球菌属内の菌種間において異なる結合性を示す、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＬＥＬ、ＫＡＡ１、ＢＣＬ１１、ＣＢＡ、ＨＡＡ、ＨＰＡ、ＳＴＬ、ｐｒｏＢＣＡ１、ｐｒｏＢＣＡ２、ＵＬＬ、ＤＳＡ、ＰＷＭ、ＵＤＡ、ＷＦＬ、ｈｙｐｎｉｎＡ３、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３、ＯＡＡ、ＰＮＡ、ＴＬ、ＡＣＧ、ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ、ＭＯＡ、ＡＰＩ  １４４、ＣＶ−Ｎ、ＰＭＡ、ＧＳＬ−ＩＩ、Ｇａｒｌｉｃ  ｌｅｃｔｉｎ、ＰＡＡ、ＵＥＡ−ＩＩ、ＲＳＬ、ＣＰＡ、ＣＨＡ−１、ＬＡＡ、ＳＨＡ、ＬＰＡ、ＤＢＡ、ＴＰＬ−１、ＢＭＬ１１ｂ、ＢＭＬ１１ｃ、ＰＶＬ、ＬＢＡ、ＵＰＬ−１、ＢＰＬ、ＣＦＡ１、ＣＦＡ２、ＢａｎＬｅｃ、ＢＣＬ１１ｄ、ＦＶＥ、ＣＬＡ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  Ｉ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ、ＭＰＡ１、ＭＰＡ２、ａｌｇＭＰＬ及びａｌｇＣＳＡからなる群から選択される少なくとも１のタンパク質が用いられる。
【００２５】
本発明にかかる「Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２」は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：１に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。  
【００２６】
配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４−２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７，１９９３）に基づいている。ＢＬＡＳＴＰによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（以下、同様）。また、かかる配列番号：１等に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン及び配列番号：１等に記載のアミノ酸配列からなるレクチンは、当業者であれば、これらのレクチンをコードするＤＮＡの塩基配列に基づき、後述の＜レクチン及び該レクチンをコードするＤＮＡ＞に記載のレクチンの調製方法等によって各々得ることができる（以下、同様）。
【００２７】
本発明にかかる「ＬＥＬ」は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：２に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。
【００２８】
本発明にかかる「ＬＥＬ」の典型例としては、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  Ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（トマト）レクチン（ＬＥＬ．ＴＬ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：Ｌ−１１７０）が挙げられる。
【００２９】
本発明にかかる「ＫＡＡ１」は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチンである。
（ａ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：３４に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【００３０】
本発明にかかる「ストリンジェントな条件」とは、核酸間で相補的な結合が形成され、非相補的な結合が形成されない条件である。本発明にかかる「ストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーション」の態様としては、例えば、ハイブリダイゼーションを「６×ＳＳＣ、４０％ホルムアミド、２５℃」、洗浄を「１×ＳＳＣ、５５℃」で行う条件が挙げられる。より好ましい条件としては、ハイブリダイゼーションを「６×ＳＳＣ、４０％ホルムアミド、３７℃」、洗浄を「０．２×ＳＳＣ、５５℃」で行う条件、特に好ましい条件としては、ハイブリダイゼーションを「６×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、３７℃」、洗浄を「０．１×ＳＳＣ、６２℃」で行う条件を用いることができる。なお、当業者であれば、塩濃度（ＳＳＣの希釈率等）、ホルムアミドの濃度、温度等の諸条件を適宜選択することで、前記条件と同様のストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件を実現することができる。また、本発明にかかる「ストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーション」の別の態様としては、例えば、相同性が極めて高い核酸同士（例えば、相同性が９５％以上の核酸同士）はハイブリダイズするが、それより相同性が低い核酸同士はハイブリダイズしないような条件が挙げられる（以下、同様）。また、配列番号：３４等に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチンは、当業者であれば後述の＜レクチン及び該レクチンをコードするＤＮＡ＞に記載のレクチンの調製方法等によって得ることができる（以下、同様）。
【００３１】
本発明にかかる「ＢＣＬ１１」は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチンである。
（ａ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：３５に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【００３２】
本発明にかかる「ＣＢＡ」は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチンである。
（ａ）配列番号：３８に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：３８に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：３９に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【００３３】
配列番号：３９に記載の塩基配列からなるＤＮＡがコードするレクチンは前駆体であり、その成熟型レクチンは、配列番号：３８に記載のアミノ酸配列からなるレクチン等である。
【００３４】
また、本発明にかかる「ＣＢＡ」は、ヒゲミルから分離・抽出・精製して得られ、還元状態のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは分子量６．５ｋＤａと１４．３ｋＤａとの間に、非還元状態では１４．３ｋＤａと２０．１ｋＤａとの間に各々単一バンドとして検出されるレクチンでもある。さらに、トリプシン処理した赤血球を凝集する活性を有し、また、ブタアシアロサイログロブリンで血球凝集活性が抑制される、すなわちブタアシアロサイログロブリンに対して特異性を示すレクチンでもある。本発明にかかる「ＣＢＡ」は、例えば、赤血球を凝集することのできる最低濃度が７８１ｎｇ／ｍｌであり、３０μｇ／ｍｌ  ブタアシアロサイログロブリンで血球凝集活性が抑制される。
【００３５】
本発明にかかる「ＣＢＡ」の調製方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。すなわち、先ず、湿重量１ｋｇのヒゲミルを液体窒素で凍結、粉末化し、５００ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液（ＴＢＳ、ｐＨ７．５）を加えて一晩攪拌する。次いで、得られた混合物を１３，５００ｇにて３０分間遠心し、上清を回収し、終濃度７５％飽和となるように硫安を加えて３０分間攪拌した後に一晩静置し、その後１３，５００ｇにて３０分間遠心して沈殿を回収する。そして、回収した沈殿物を少量のＴＢＳに溶解し、ＴＢＳで透析して硫安を除去する。次いで、得られた透析液を１０，０００ｇ，３０分間遠心して沈殿物を除いた後に２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４緩衝液（ｐＨ７．５）に透析して、３．３１ｍｌのＴＳＫｇｅｌ  Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷカラム（７．５ｘ７５ｍｍ）に流し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎにて１〜０Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４の勾配により溶出する。そして、血球凝集活性のある画分を集め、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．８５％  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に透析することにより、ヒゲミルから本発明にかかる「ＣＢＡ」を精製することができる。
【００３６】
本発明にかかる「ＨＡＡ」は、プティ・グリから分離・抽出・精製して得られ、抗アルブミン腺に対する免疫電気泳動において１本のバンドとして検出されるレクチンである。また、Ａ１、Ａ２細胞を凝集する活性を有し、さらに、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンで該凝集活性が抑制される、すなわちＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンに対して特異性を示すレクチンでもある。
【００３７】
本発明にかかる「ＨＡＡ」は、例えば、Ａ１、Ａ２細胞を凝集することのできる最低濃度が０．５μｇ／ｍｌであり、２０ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンでＡ１、Ａ２細胞凝集活性が抑制される。本発明にかかる「ＨＡＡ」の典型例としては、レクチン  エスカルゴ（Ｈｅｌｉｘ  ａｓｐｅｒｓａ）由来（シグマ・アルドリッチ社製、製品番号：Ｌ６６３５）が挙げられる。
【００３８】
本発明にかかる「ＨＡＡ」の調製方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。すなわち、先ず、１／４０００で凝集活性があるプティ・グリのアルブミン腺抽出物２０ｍｌを０．０１Ｍ  トリス緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した６００ｍｌのセファデックスＧ−２００（３．８×５３ｃｍ）に１５ｍｌ／ｈの流速で流し、トリス緩衝液で溶出する。なお、トリス緩衝液での溶出物には血球凝集活性は無く、０．００２Ｍ  Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを同じ流速で流し、再溶出を行い５００ｍｌ流した後に凝集活性のある画分が得られる。このようにして集めた活性のある画分を、蒸留水にて透析した後、ロータリエバポレーターを用いて４０℃で乾燥することにより、固形物として、プティ・グリから本発明にかかる「ＨＡＡ」を精製することができる。
【００３９】
本発明にかかる「ＨＰＡ」は、配列番号：５に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：５に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。本発明にかかる「ＨＰＡ」の典型例としては、Ｐｕｒｅ  Ｈｅｌｉｘ  ｐｏｍａｔｉｏｎ  レクチン（カタツムリ）−ＨＰＡ−（ＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：Ｌ−３６０１）が挙げられる。
【００４０】
本発明にかかる「ＳＴＬ」は、配列番号：６に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：６に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。本発明にかかる「ＳＴＬ」の典型例としては、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ジャガイモ）レクチン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：Ｌ−１１６０）が挙げられる。
【００４１】
本発明にかかる「ｐｒｏＢＣＡ１」は、配列番号：７に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：７に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。
【００４２】
本発明にかかる「ｐｒｏＢＣＡ１」は前駆体であり、その成熟型レクチン（ＢＣＡ１）は、配列番号：７に記載の１〜１２５位のアミノ酸配列からなるレクチン、又は配列番号：７に記載の１〜１２５位のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。
【００４３】
本発明にかかる「ｐｒｏＢＣＡ２」は、配列番号：８に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：８に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。なお、本発明にかかる「ｐｒｏＢＣＡ２」は前駆体であり、その成熟型レクチン（ＢＣＡ２）は、配列番号：９に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：９に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。
【００４４】
本発明にかかる「ＵＬＬ」は、配列番号：１０に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：１０に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。
【００４５】
本発明にかかる「ＤＳＡ」は、シロバナヨウシュチョウセンアサガオから分離・抽出・精製して得られ、還元状態のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分子量４６ｋＤａと４０ｋＤａの二つのバンドを示し、非還元のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて８６ｋＤａの分子量を示すレクチンである。すなわち、本発明にかかる「ＤＳＡ」は、ジスルフィド結合による二量体である。また、本発明にかかる「ＤＳＡ」は、ヒトＯ型赤血球を凝集する活性を有し、さらにβ（１，４）結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに特異的に結合するレクチンである。本発明にかかる「ＤＳＡ」は、例えば、ヒトＯ型赤血球を凝集することのできる最低濃度が３０μｇ／ｍｌである。本発明にかかる「ＤＳＡ」の典型例としては、ＤＳＡ（生化学工業株式会社製、コード番号：３０００３７）が挙げられる。
【００４６】
本発明にかかる「ＤＳＡ」の調製方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。すなわち、先ず、シロバナヨウシュチョウセンアサガオの種子２００ｇを５００ｍｌのメタノールで４回抽出し、残った種子を２５０ｍｌのジクロロメタンで洗浄して乾燥する。乾燥した種子に１５ｇのポリビニルポリピロリドンを加え、混合し、７００ｍｌのＰＢＳで一晩抽出する。抽出物を１１，０００ｇで２０分間遠心し、残された沈殿物を５００ｍｌのＰＢＳで再度抽出を行う。得られた抽出物は混合し、０．０１Ｍの酢酸で透析を行う。透析によって生じた茶色の沈殿物を遠心処理により分離し、遠心上清を再度ＰＢＳにて透析を行う。レクチンを含む抽出液をＮ，Ｎ’−ジアセチルキトビノシド−セファロースカラムに流速２０ｍｌ／ｈで流し、ＰＢＳで洗浄を行い、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンオリゴマーで段階的に溶出を行う。なお、かかる場合、本発明にかかる「ＤＳＡ」は、ＰＢＳでカラムを洗浄して１ｍｇ／ｍｌのオリゴマーで溶出した画分に含まれるので、画分を集めＰＢＳで透析を行う。そして、透析したレクチン溶液１０ｍｌから１２ｍｌをセファデックスＧ−２００スーパーファインカラム（２．５ｃｍ×８６ｃｍ）にてゲル濾過精製することにより、シロバナヨウシュチョウセンアサガオから本発明にかかる「ＤＳＡ」を精製することができる。
【００４７】
本発明にかかる「ＰＷＭ」は、ヨウシュヤマゴボウから分離・抽出・精製して得られ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、分子量２２，０００±３３００、３１，０００±４６００、２５，０００±３７００、２１，０００±３２００及び１９，０００±２９００  Ｄａの５つのバンドとして検出されるレクチンである。また、本発明にかかる「ＰＷＭ」は、血液型（ＡＢＯ型）非特異的血球凝集活性を有し、さらに、１−４結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン又はＮ−アセチルラクトサミンにより血球凝集活性は抑制される、すなわち、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン又はＮ−アセチルラクトサミンに対して特異性を示すレクチンである。また、本発明にかかる「ＰＷＭ」はマイトジェン活性も有するレクチンである。本発明にかかる「ＰＷＭ」としては、例えば、血球凝集活性の最小値及びマイトジェン活性が下記表１に示すものが挙げられる。本発明にかかる「ＰＷＭ」の典型例としては、ＰＷＭ（生化学工業株式会社製、コード番号：３００１４１）が挙げられる。
【００４８】
【表１】
2012133127.tif 000002
【００４９】
本発明にかかる「ＰＷＭ」の調製方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。すなわち、先ず、早秋と冬にかけて収穫したヨウシュヤマゴボウの根をすり潰し、ＰＢＳを加えて抽出を行い、更に水で透析を行い、茶色の沈殿物を残して上清を回収する。得られた上清を５×３０ｃｍのハイドロキシアパタイトカラム（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  ＨＴ、バイオラッド社製）に流し、５ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．８）で溶出し、さらに５０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．８）で溶出する。なお、得られた画分には血球凝集活性とマイトジェン活性が認められる。次いで、この画分を水で透析し、乾燥して固形物とする。そして、得られた固形物を２〜５ｍｌのＰＢＳに溶解し、２．５×９０ｃｍのセファデックスＧ−７５に流してゲル濾過を行うことにより、ヨウシュヤマゴボウから本発明にかかる「ＰＷＭ」を精製することができる。また、かかる精製をして得られた５つの画分（ｐａ−１、ｐａ−２、ｐａ−３、ｐａ−４、ｐａ−５、各番号はセファデックスＧ−７５でのゲル濾過の溶出順を示す。）のヨウシュヤマゴボウの根１ｋｇからの収量の例等を表１に示す。
【００５０】
本発明にかかる「ＵＤＡ」は、配列番号：１１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：１１に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。本発明にかかる「ＵＤＡ」の典型例としては、Ｐｕｒｅ  Ｕｒｔｉｃａ  ｄｉｏｉｃａ  レクチン（イラクサ）−ＵＤＡ−（ＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：Ｌ−８００５）が挙げられる。
【００５１】
本発明にかかる「ＷＦＬ」は、ノダフジから分離・抽出・精製して得られるレクチンである。また、ポリアクリルアミド電気泳動によりｐＨ９．４、８．０、４．０で単一バンドとして検出され、さらに還元状態のＳＤＳ  ＰＡＧＥにおいては３２ｋＤａの分子量を示し、非還元でのＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動においては６８ｋＤａの分子量を示すレクチンである。また、本発明にかかる「ＷＦＬ」は、ヒトＡ１赤血球を凝集する活性を有し、さらにＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンで凝集活性が抑制される、すなわちＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンに対して特異性を示すレクチンである。本発明にかかる「ＷＦＬ」は、例えば、ヒトＡ１赤血球を凝集することのできる最低濃度が１５〜３０μｇ／ｍｌであり、６３μｇ／ｍｌ  Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンで凝集活性が抑制される。本発明にかかる「ＷＦＬ」の典型例としては、Ｐｕｒｅ  Ｗｉｓｔｅｒｉａ  ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ  レクチン（フジ）−ＷＦＡ−（ＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：Ｌ−３１０１）が挙げられる。
【００５２】
本発明にかかる「ＷＦＬ」の調製方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。すなわち、先ず、ノダフジ種子を破砕し、０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）に混合する。一晩静置し、遠心した上清を４０％硫安で塩析し、得られた上清を更に７０％硫安で塩析する。なお、かかる場合、得られた沈殿には７０％の血球凝集活性が残っている。そして、得られた画分に８０％飽和硫安を加え、セライト５４５カラムに流し、硫安濃度を下げつつ溶出する。次いで、６０％から５０％の硫安濃度の画分を集め、０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で透析し、限外濾過で濃縮を行う。更にセライト溶出物をＤＥＡＥセファロースＡ−５０へ流し、０Ｍから０．６ＭのＮａＣｌで勾配をかけて溶出を行う。そして、血球凝集活性がある、０．２５Ｍの溶出画分を集め、セファデックスＧ−２００カラムに流してゲル濾過精製することにより、主要ピークに血球凝集活性が認められる、本発明にかかる「ＷＦＬ」をノダフジから精製することができる。
【００５３】
本発明にかかる「ｈｙｐｎｉｎＡ３」は、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：１２に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。
【００５４】
本発明にかかる「Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３」は、配列番号：５２に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：５２に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。
【００５５】
本発明にかかる「ＯＡＡ」は、配列番号：５３に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：５３に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。
【００５６】
本発明にかかる「ＰＮＡ」は、配列番号：５４に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：５４に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。本発明において「ＰＮＡ」の典型例としては、ＰＮＡ  Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（生化学工業株式会社製、コード番号：Ｊ１１４）が挙げられる。
【００５７】
本発明にかかる「ＴＬ」は、チューリップから分離・抽出・精製して得られ、還元状態のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは分子量２８０００を示し、６Ｍ  塩化グアニジニウムを添加したゲルろ過による分子量測定では３００００前後の分子量を示すレクチンである。また、ヒトＯ型赤血球を用いた血球凝集阻害試験において、Ｎ−アセチルガラクトサミンで最も強く抑制（例えば、濃度０．２ｍＭで抑制）が認められるレクチンである。本発明にかかる「ＴＬ」の典型例としては、Ｐｕｒｅ  Ｔｕｌｉｐａ  ｓｐ．Ｌｅｃｔｉｎ（Ｔｕｌｉｐ）−ＴＬ−（ＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：Ｌ−８００１）が挙げられる。
【００５８】
本発明にかかる「ＴＬ」の調製方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。すなわち、先ず、チューリップの球根５０ｇを細かく断片化し、５ｍＭ  チオ尿素を含むＰＢＳ（１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１０ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４，３ｍＭ  ＫＣ１，１４０ｍＭ  ＮａＣ１，ｐＨ７．４）２５０ｍｌでホモゲナイズする。氷上で３０分間静置した後に上清を別容器に移し、沈殿に対して同量のＰＢＳを加えて再抽出する。二つの抽出物を混合し、低温下において２０，０００ｇにて１時間遠心し、上清を回収して−８０℃で一晩凍結し、解凍後にサンプルを１００，０００ｇ，３０分間遠心して上清をＰＢＳで平衡化した１０ｍｌのフェツイン−アガロースカラム（７．５ｘ７５ｍｍ）に流す。カラムはＰＢＳで吸光度２８０が０．０１以下になるまで洗浄し、２０ｍＭ  １，３−ジアミノプロパン（ＤＡＰ）により溶出を行う。溶出された画分のｐＨを０．１Ｍ  ＨＣｌにて８．７に調整し、１０ｍＭ  ２−アミノ−２−（ハイドロキシメチル）−ｌ，３−プロパンジオール（トリス）−ＨＣ１（ｐＨ８．７）で平衡化したＤＥＡＥ−バイオ−ゲルに流し、０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌの濃度勾配により溶出を行なうことにより、本発明にかかる「ＴＬ」をチューリップから精製することができ、例えば、かかる精製方法にて、１ｇのチューリップの球根から２ｍｇのＴＬを得ることができる。
【００５９】
本発明にかかる「ＡＣＧ」は、配列番号：５５に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：５５に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。
【００６０】
本発明にかかる「ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ」は、緑藻（Ａｖｒａｉｎｖｉｌｌｅａ  ｃａｐｔｉｔｕｌｉｆｏｒｍｉｓ（アブラインビレア  カピチュリフォルミス））由来のレクチンであって、該緑藻を緩衝液にて抽出し、得られた可溶性画分を塩析し、得られた沈殿物を透析し、ゲル濾過により精製することによって得られる画分に存在し、還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて示される分子量は１５０００〜２００００Ｄａであり、トリプシン処理ウサギ赤血球に対して凝集活性を示すレクチンである。
【００６１】
本発明にかかる「ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ」の例としては、下記精製法によって得られるレクチンが挙げられる。すなわち、先ず、海藻（アブラインビレア  カピチュリフォルミス）を凍結粉砕し、これに緩衝液（例えば、ｐＨ７〜８のトリス緩衝液、リン酸緩衝液）を加え、撹拌後（例えば、４℃下で一晩攪拌した後）、遠心分離し、上清を得て抽出液とする。次いで、得られた抽出液に、無機塩（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム）を所定の飽和濃度（例えば、７０〜８０％）となるように撹拌しながら加え、撹拌後静置（例えば、一晩静置）することにより、塩析する。そして、これを遠心分離して得られた沈殿を少量の緩衝液（例えば、ｐＨ７〜８のトリス緩衝液、リン酸緩衝液）に溶かし、同緩衝液に対して十分透析する。次いで、内液を回収して塩析画分とし、該塩析画分をゲルろ過に供する。そして、波長２８０ｎｍにおける吸光度及びトリプシン処理ウサギ赤血球に対する凝集活性を指標として選択された、ゲルろ過の溶出画分に存在するレクチンが、本発明にかかる「ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ」の典型例として挙げられる。
【００６２】
本発明にかかる「ＭＯＡ」は、配列番号：５６に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：５６に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。本発明にかかる「ＭＯＡ」の典型例としては、Ｐｕｒｅ  Ｍａｒａｓｍｉｕｍ  ｏｒｅａｄｅｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  Ｌｅｃｔｉｎ（ｍｕｓｈｒｏｏｍ）−ＭＯＡ−（ＥＹ  Ｌａｂｏｐｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：Ｌ−９００１）が挙げられる。
【００６３】
本発明にかかる「ＡＰＩ  １４４」は、配列番号：５７に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：５７に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。
【００６４】
本発明にかかる「ＣＶ−Ｎ」は、配列番号：５８に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：５８に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。
【００６５】
本発明にかかる「ＰＭＡ」は、配列番号：５９に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：５９に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。本発明にかかる「ＰＭＡ」の典型例としては、Ｐｕｒｅ  Ｐｏｌｙｇｏｎａｔｕｍ  ｍｕｌｉｔｉｆｌｏｒｕｍ  Ｌｅｃｔｉｎ（Ｃｏｍｍｏｍ  Ｓｏｌｏｍｏｎ’ｓ  Ｓｅａｌ）−ＰＭＡ−（ＥＹ  Ｌａｂｏｐｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：Ｌ−８００９）が挙げられる。
【００６６】
本発明にかかる「Ｇａｒｌｉｃ  ｌｅｃｔｉｎ」は、配列番号：６０に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：６０に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。
【００６７】
本発明にかかる「ＧＳＬ−ＩＩ」は、配列番号：１５に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：１５に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。本発明にかかる「ＧＳＬ−ＩＩ」の典型例としては、Ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ）  Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ  Ｌｅｃｔｉｎ（ＧＳＬ）ＩＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：Ｌ−１２１０）、Ｐｕｒｅ  Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ  Ｌｅｃｔｉｎ−ＧＳ−ＩＩ−（ＥＹ  Ｌａｂｏｐｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：Ｌ−２４０２）が挙げられる。
【００６８】
本発明にかかる「ＰＡＡ」は、アボガドから分離・抽出・精製して得られ、表２に記載のアミノ酸組成を示すレクチンである。また、表３に示す通り、各種赤血球に対して血球凝集活性を示すレクチンである。本発明にかかる「ＰＡＡ」の典型例としては、Ｃｒｕｄｅ  Ｐｅｒｓｅａｕ  ａｍｅｒｉｃａｎａ  Ｌｅｃｔｉｎ（Ａｖｏｃａｄｏ）−ＰＡＡ−（ＥＹ  Ｌａｂｏｐｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：Ｌ−６１００）が挙げられる。
【００６９】
【表２】
2012133127.tif 000003
【００７０】
【表３】
2012133127.tif 000004
【００７１】
本発明にかかる「ＰＡＡ」の調製方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。すなわち、先ず、アボガドの種子から種皮を取り除き、凍結乾燥して細粉化する。粉末化した種子（１００ｇ）を１．０Ｌの水又は１．０ＬのＰＢＳに懸濁し、４℃にて１６〜２０時間の攪拌を行い、遠心によって固形物を除去する。８００ｍＬの上清を５Ｌの水にて５回透析した後に、凍結乾燥してレクチン活性のある固形物（例えば、８００〜１２００ｍｇ）を得ることにより、本発明にかかる「ＰＡＡ」をアボガドから精製することができる。このようにして精製して得られた抽出物を濃度１．０ｍｇ／ｍｌになるよう、ＰＢＳに溶解し、得られた溶解液５０μｌを用いて、２％に希釈した各種赤血球５０μｌとの血球凝集活性を調べた結果、例えば表３に示すような、各種赤血球に対して血球凝集活性が示される。なお、表３に記載の希釈倍率は、前記抽出物をＰＢＳにて倍々希釈した回数を示す。
【００７２】
本発明にかかる「ＵＥＡ−ＩＩ」は、配列番号：６１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：６１に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。本発明にかかる「ＵＥＡ−ＩＩ」の典型例としては、Ｐｕｒｅ  Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ（Ｇｏｒｓｅ，Ｆｕｒｚｅ）−ＵＥＡ−Ｉ−（ＥＹ  Ｌａｂｏｐｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：Ｌ−２２０１）が挙げられる。
【００７３】
本発明にかかる「ＲＳＬ」は、配列番号：６２に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：６２に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。
【００７４】
本発明にかかる「ＣＰＡ」は、配列番号：６３に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：６３に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。本発明にかかる「ＣＰＡ」の典型例としては、Ｐｕｒｅ  Ｃｉｃｅｒ  ａｒｉｅｔｉｎｕｍ  Ｌｅｃｔｉｎ（Ｃｈｉｃｋ  Ｐｅａ）−ＣＰＡ−（ＥＹ  Ｌａｂｏｐｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：Ｌ−６６０１）が挙げられる。
【００７５】
本発明にかかる「ＣＨＡ−１」は、配列番号：６４に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：６４に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。
【００７６】
本発明にかかる「ＬＡＡ」は、配列番号：６５に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：６５に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。本発明にかかる「ＬＡＡ」の典型例としては、Ｐｕｒｅ  Ｌａｂｕｒｎｕｍ  ａｌｐｉｎｕｍ  Ｌｅｃｔｉｎ（Ｓｃｏｔｃｈ  Ｌａｂｕｒｎｕｍ）−ＬＡＡ−（ＥＹ  Ｌａｂｏｐｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：Ｌ−５３０１）が挙げられる。
【００７７】
本発明にかかる「ＳＨＡ」は、ムラサキサルビアから分離・抽出・精製して得られ、非還元のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは分子量５００００を示し、還元状態では分子量３５０００を示すレクチンである。また、Ａ１赤血球に対して特異的な凝集活性を示すレクチンであり、例えば、ヒト赤血球凝集試験では濃度２７μｇ／ｍｌでＡ１赤血球を凝集するが、Ｏ型及びＢ型赤血球凝集では認められず、また、単糖による抑制試験では０．１ｍＭ  Ｎ−アセチルガラクトサミンによる血球凝集の抑制が認められるレクチンが、本発明にかかる「ＳＨＡ」として挙げられる。さらに、本発明にかかる「ＳＨＡ」の典型例としては、Ｐｕｒｅ  Ｓａｌｖｉａ  ｈｏｒｍｉｎｕｍ−ＳＨＡ−（ＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：Ｌ−３４０１）が挙げられる。
【００７８】
本発明にかかる「ＳＨＡ」の調製方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。すなわち、先ず、３０ｇのムラサキサルビア種子をブレンダーにて挽き、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含んだ４００ｍｌ  ＰＢＳを加えて一晩攪拌を行なう。攪拌液を２０，０００ｇにて３０分間遠心し、沈殿に対して再度５ｍＭ  ＥＤＴＡを含んだ４００ｍｌ  ＰＢＳを加え、一晩攪拌を行なう。そして、二つの遠心上清を混合し、−２０℃で一晩凍結した後に解凍し、３，５００ｇ、３０分間遠心して沈殿物を除去する。得られた上清に等量のエタノールを加えて２０，０００ｇ、３０分間遠心して上清を回収し、更に上清に対して終濃度８０％のエタノールを加えて４℃にて一晩静置し、２０，０００ｇ、３０分間遠心して沈殿を得る。得られた沈殿を水で溶解し、水で３日間透析を行なった後に凍結乾燥する。４０ｍｇ得られた凍結乾燥品を１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣ１  バッファー（ｐＨ７．３）に溶解し、３，５００ｇ、３０分間遠心して上清を回収し、０．２μｍのニトロセルロースフィルターでろ過をする。得られたサンプルを１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣ１  バッファー（ｐＨ７．３）で平衡化したＤＥＡＥ−ＴＳＫ  ５４５カラム（２．１５ｘ１５ｃｍ）に室温で２ｍｌ／分の流速で流し、カラムを通過したサンプルを集め、ＰＭ−１０  Ｄｉａｆｌｏ  メンブレン（アミコン社製）を用いて濃縮する。濃縮品をＴＢＳで平衡化したＧａｌＮＡｃ−Ｓｙｎｓｏｒｂ（０．５ｘ５ｃｍ）カラムに流し、ＴＢＳで洗浄した後に吸着したレクチンを０．１Ｍ  ＧａｌＮＡＣを含むＴＢＳで溶出し、ＴＢＳで透析することにより、本発明にかかる「ＳＨＡ」をムラサキサルビアから、例えば１．５ｍｇ精製することができる。
【００７９】
本発明にかかる「ＬＰＡ」は、アメリカカブトガニから分離・抽出・精製して得られる、分子量３３ｋＤａのレクチンである。また、本発明にかかる「ＬＰＡ」は、ヒツジ赤血球に対して凝集活性を示すレクチンである。本発明にかかる「ＬＰＡ」の典型例としては、Ｐｕｒｅ  Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ  （Ｈｏｒｓｅｓｈｏｅ  Ｃｒａｂ）−ＬＰＡ−（ＥＹ  Ｌａｂｏｐｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：Ｌ−１５０１）が挙げられる。
【００８０】
本発明にかかる「ＬＰＡ」の調製方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。すなわち、先ず、アメリカカブトガニから心臓穿刺により血液を採取し、１４１，０００ｇ、１６時間の超遠心又は３％  ポリエチレングリコール−８０００（ＰＥＧ）を添加した３０，０００ｇ、３０分間の遠心によりヘモシアニンを分離する。分離した上清に１０％  ＰＥＧを添加して３０，０００ｇ、３０分間の遠心を行い、沈殿をバッファーＡ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＣａＣｌ２，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０）に溶解して、バッファーＡで平衡化した０．２倍量のセファロース  ４Ｂに通過させる。そして、素通りした画分を血漿量の０．１倍のホスホリルエタノールアミン−アガロースと混ぜてタンパク質を吸着させ、１Ｍ  ＮａＣｌを含んだバッファーＡで洗浄し、０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ６．７）で溶出させる。得られた画分をバッファーＡで透析し、バッファーＡで平衡化したフェツイン−アガロースカラムに流し、０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ６．７）で溶出させることにより、アメリカカブトガニから本発明にかかる「ＬＰＡ」を調製することができる。また、かかる精製法により、例えば、血漿中に含まれる５１９ｍｇのタンパク質より１．３ｍｇの精製された「ＬＰＡ」を得ることができる。
【００８１】
本発明にかかる「ＤＢＡ」は、配列番号：６６に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：６６に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。本発明において「ＤＢＡ」の典型例としては、ＤＢＡ（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  ｂｉｆｌｏｒｕｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（生化学工業株式会社製、コード番号：Ｊ１０４）が挙げられる。
【００８２】
本発明にかかる「ＴＰＬ−１」は、配列番号：６７に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：６７に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。
【００８３】
本発明にかかる「ＢＭＬ１１ｂ」は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチンである。
（ａ）配列番号：１３に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：１３に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：３６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【００８４】
本発明にかかる「ＢＭＬ１１ｃ」は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチンである。
（ａ）配列番号：１４に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：１４に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：３７に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【００８５】
本発明にかかる「ＰＶＬ」は、配列番号：１６に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：１６に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。本発明にかかる「ＰＶＬ」の典型例としては、ムジナタケレクチン（Ｐｓａｔｈｙｒｅｌｌａ  Ｖｅｌｕｔｉｎａ  Ｌｅｃｔｉｎ、和光純薬工業株式会社製、販売元コード：１６５−１７５９１）が挙げられる。
【００８６】
本発明にかかる「ＬＢＡ」は、配列番号：６８に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：６８に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。本発明にかかる「ＬＢＡ」の典型例としては、Ｐｕｒｅ  Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ（Ｌｉｍａ  Ｂｅａｎ）−ＬＢＡ−（ＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：Ｌ−１７０１）が挙げられる。
【００８７】
本発明にかかる「ＵＰＬ−１」は、配列番号：６９に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：６９に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。
【００８８】
本発明にかかる「ＢＰＬ」は、配列番号：７０に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：７０に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。本発明にかかる「ＢＰＬ」の典型例としては、Ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｂａｕｈｉｎｉａ  Ｐｕｒｐｕｒｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ（ＢＰＬ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：Ｌ−１２８０）が挙げられる。
【００８９】
本発明にかかる「ＣＦＡ１」は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチンである。
（ａ）配列番号：４２に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：４２に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：４３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【００９０】
配列番号：４３に記載の塩基配列からなるＤＮＡがコードするレクチンは前駆体であり、その成熟型レクチンは、配列番号：４２に記載のアミノ酸配列からなるレクチン等である。
【００９１】
本発明にかかる「ＣＦＡ２」は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチンである。
（ａ）配列番号：４４に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：４４に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：４５に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【００９２】
配列番号：４５に記載の塩基配列からなるＤＮＡがコードするレクチンは前駆体であり、その成熟型レクチンは、配列番号：４４に記載のアミノ酸配列からなるレクチン等である。
【００９３】
本発明にかかる「ＢａｎＬｅｃ」は、配列番号：７１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：７１に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。本発明にかかる「ＢａｎＬｅｃ」の典型例としては、Ｐｕｒｅ  Ｍｕｓａ  ａｃｕｍｉｎａｔａ  Ｌｅｃｔｉｎ（ｂａｎａｎａ）−ＢａｎＬｅｃ−（ＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：Ｌ−９００７）が挙げられる。
【００９４】
本発明にかかる「ＢＣＬ１１ｄ」は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチンである。
（ａ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：４１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【００９５】
配列番号：４１に記載の塩基配列からなるＤＮＡがコードするレクチンは前駆体であり、その成熟型レクチンは、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列からなるレクチン等である。
【００９６】
本発明にかかる「ＦＶＥ」は、配列番号：７２に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：７２に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。
【００９７】
本発明にかかる「ＣＬＡ」は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチンである。
（ａ）配列番号：４６に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：４６に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：４７に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【００９８】
本発明にかかる「Ｐｒｏ−ＣＦＡ  Ｉ」及び「Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ」は、紅藻であるコメノリから分離・抽出・精製して得られ、アガロースゲル電気泳動及び濾紙電気泳動にてブロードであるが分子量８０００００のほぼ単一なバンドを示し、アルーシャンブルー染色において陽性を示すペプチジルグリカン性凝集素である。また、本発明にかかる「Ｐｒｏ−ＣＦＡ  Ｉ」及び「Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ」は、プロナーゼ処理依存性凝集活性を示すレクチンである。
【００９９】
本発明にかかる「Ｐｒｏ−ＣＦＡ  Ｉ」及び「Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ」の調製方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。すなわち、先ず、紅藻であるコメノリを凍結乾燥後、ボールミルで粉末藻体とする。粉末藻体（１００ｇ）を１０倍容の０．８５％  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．０）で４℃下で一晩攪拌する。これを遠心分離（６０００ｒｐｍｘ４０分）して上清を得て、一次抽出液とする。抽出残渣を同様の抽出操作に付し、抽出液の赤血球凝集活性が検出されなくなるまで、計１４回抽出を繰り返す。このようにして得られた抽出残渣に１Ｌの０．０５％アクチナーゼＥを加え、３７℃で２４時間攪拌する。これを遠心分離（６０００ｒｐｍｘ４０分）して上清を得、これにｐ−アミジノフェニルメタンスルホニルフルオライド（プロテアーゼ阻害剤）を５ｎＭとなるように加える。プロナーゼ処理抽出液を８０％飽和硫安塩析に付し、得られた沈殿をＰＢＳに対して十分透析し、内液を得て硫安塩析画分とする。硫安塩析画分をＰＢＳで平衡化したアシアロフェツイン固定化カラム（１ｘ１０ｃｍ）に添加し、カラムをＰＢＳで十分洗浄した後、ＰＢＳ中１Ｍ  ＮａＣｌで溶出する。１Ｍ  ＮａＣｌ溶出画分（活性画分）を蒸留水に対し十分透析後、限外ろ過により濃縮する。これをＰＢＳで平衡化したトヨパール  ＨＷ−６５カラム（２．２ｘ９２ｃｍ）に添加し、ＰＢＳにて溶出する。そして、ゲルろ過で得られた活性ピークを回収し、限外ろ過にて濃縮した後、２０ｍＭ  リン酸塩緩衝液で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（７．５ｘ７５ｍｍ）に注入する。カラムを同緩衝液で十分洗浄後、同緩衝液中０〜２ＭＮａＣｌの間で溶出プログラムを作製し、同プログラムを用いて溶出する。そして、溶出液から、凝集活性を示した２つの糖ピークを各々回収することにより、本発明にかかる「Ｐｒｏ−ＣＦＡ  Ｉ」及び「Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ」をコメノリから精製することができる。
【０１００】
本発明にかかる「ＭＰＡ１」は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチンである。
（ａ）配列番号：４８に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：４８に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：４９に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【０１０１】
配列番号：４９に記載の塩基配列からなるＤＮＡがコードするレクチンは前駆体であり、その成熟型レクチンは、配列番号：４８に記載のアミノ酸配列からなるレクチン等である。
【０１０２】
本発明にかかる「ＭＰＡ２」は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチンである。
（ａ）配列番号：５０に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：５０に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：５１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【０１０３】
配列番号：５１に記載の塩基配列からなるＤＮＡがコードするレクチンは前駆体であり、その成熟型レクチンは、配列番号：５０に記載のアミノ酸配列からなるレクチン等である。
【０１０４】
本発明にかかる「ａｌｇＭＰＬ」は、配列番号：７３に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：７３に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。
【０１０５】
本発明にかかる「ａｌｇＣＳＡ」は、緑藻（Ｃｏｄｉｕｍ  ｓｕｂｔｕｂｕｌｏｓｕｍ（コディウム  スブトゥブロスム））由来のレクチンであって、該緑藻を緩衝液にて抽出し、得られた可溶性画分を塩析し、得られた沈殿物を透析し、顎下腺ムチン固定化カラムに吸着させた後、Ｎ−アセチルガラクトサミンにて溶出される画分に存在し、分子量は１００００〜１５０００Ｄａであり、トリプシン処理ウサギ赤血球に対して凝集活性を示すレクチンである。
【０１０６】
本発明にかかる「ａｌｇＣＳＡ」の例としては、下記精製法によって得られるレクチンが挙げられる。すなわち、先ず、緑藻クロミルを凍結粉砕し、これに緩衝液（例えば、ｐＨ７〜８、トリス緩衝液、リン酸緩衝液）を加え、撹拌後（例えば、４℃下で一晩攪拌した後）、遠心分離し、上清を回収する。得られた抽出液に無機塩（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム）を所定の飽和濃度（例えば、７０〜８０％）となるよう撹拌しながら加え、撹拌後静置する（例えば、４℃下でさらに３０分撹拌した後、一晩静置する）ことにより、塩析する。これを遠心分離して得られた沈殿を緩衝液（例えば、ｐＨ７〜８、トリス緩衝液、リン酸緩衝液）に溶かし、該緩衝液に対して十分透析する。次いで、内液を回収し、塩析画分とする。得られた塩析画分を顎下腺ムチン固定化カラムに添加し、洗浄した後、Ｎ−アセチルガラクトサミンにて溶出する。そして、波長２８０ｎｍにおける吸光度及びトリプシン処理ウサギ赤血球に対する凝集活性を指標として選択された、ゲルろ過の溶出画分に存在するレクチンが、本発明にかかる「ａｌｇＣＳＡ」の典型例として挙げられる。
【０１０７】
これらのレクチンの態様としては、植物、動物、微生物（菌やウィルス等）等の天然物から、分離・抽出・精製して得られる「天然レクチン」があり得る。また、タンパク質のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異しうる。従って、本発明においては、このような天然の変異体も「天然レクチン」に含まれる。
【０１０８】
また、かかるレクチンの態様として、天然レクチンの遺伝子配列を基に、無細胞タンパク質合成系（例えば、網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液）、大腸菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等を用い、遺伝学的手法により合成されたレクチン（人工レクチン）もあり得る。さらに、かかる「人工レクチン」は、人工的にアミノ酸配列に改変が加えられたもの（例えば、糖鎖結合部位を含むレクチンの部分的断片）であってもよい。また、「人工レクチン」は、機能性タンパク質が直接的に又は間接的に融合していてもよい。機能性タンパク質としては特に制限はなく、本発明にかかるレクチンに付与したい機能に応じて適宜選択される。例えば、本発明にかかるレクチンの精製を容易にする目的で用いる機能性タンパク質としては、Ｍｙｃ−タグ（ｔａｇ）タンパク質、Ｈｉｓ−タグタンパク質、ヘマグルチニン（ＨＡ）−タグタンパク質、ＦＬＡＧ−タグタンパク質（登録商標、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質が挙げられる。
【０１０９】
また、かかるレクチンの態様として、二量体、多量体、酵素消化等により断片化されたもの（例えば、シグナルペプチドが除去されたレクチン、前駆体型（プロ（ｐｒｏ））レクチンからプロセシングを受けて生成された成熟型レクチン）であってもよい。
【０１１０】
さらに、これらのレクチンにおいては、静止期におけるブドウ球菌属と静止期におけるブドウ球菌以外の菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）との判別ができるという観点から、本発明にかかる「レクチン」は、ＨＡＡ、ＨＰＡ、ＬＥＬ、ＳＴＬ、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＢＣＬ１１又はＵＬＬであることが好ましい。
【０１１１】
また、これらのレクチンにおいては、静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓとの判別、静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓとの判別、静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓと静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓとの判別並びにブドウ球菌属と静止期のブドウ球菌以外の菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）との判別ができるという観点から、本発明にかかる「レクチン」は、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２又はＬＥＬであることがより好ましい。
【０１１２】
また、これらのレクチンにおいては、対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓとの判別、対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓとの判別並びに対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓと対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓとの判別ができるという観点から、本発明にかかる「レクチン」は、ｐｒｏＢＣＡ１、ｐｒｏＢＣＡ２、ＵＥＡ−ＩＩ、ＲＳＬ、ＣＰＡ又はＣＨＡ−１であることがより好ましい。
【０１１３】
さらに、本発明においては、これらのレクチンについて、２種以上のレクチンを組み合わせて用いてもよく、例えば、静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓとの判別ができるＢＣＬ１１と、静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓとの判別ができるｈｙｐｎｉｎＡ３と、静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓと静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓとの判別ができるＷＦＬとを組み合わせて用いることにより、静止期において、これら３菌種間のいずれにおいても判別することが可能となる。
【０１１４】
また、本発明において、静止期にあるブドウ球菌属内の菌種を対象とする場合には、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＬＥＬ、ＫＡＡ１、ＢＣＬ１１、ＣＢＡ、ＨＡＡ、ＨＰＡ、ＳＴＬ、ｐｒｏＢＣＡ１、ｐｒｏＢＣＡ２、ＵＬＬ、ＤＳＡ、ＰＷＭ、ＵＤＡ、ＷＦＬ、ｈｙｐｎｉｎＡ３、ＢａｎＬｅｃ、ＢＭＬ１１ｂ、ＢＣＬ１１ｄ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  Ｉ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ、ＣＨＡ−１、ＦＶＥ、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３、ＲＳＬ、ＡＰＩ  １４４、ＣＬＡ、ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ、ＵＰＬ−１、ＢＭＬ１１ｃ、ＭＰＡ１及びａｌｇＣＳＡからなる群から選択される少なくとも１のレクチンとの結合性を指標として、静止期にあるブドウ球菌属内の菌種を判別することが好ましく、これらレクチン全てを用いて、静止期にあるブドウ球菌属内の菌種を判別することがより好ましい。
【０１１５】
また、本発明において、対数増殖期にあるブドウ球菌属内の菌種を対象とする場合には、ＣＢＡ、ｐｒｏＢＣＡ１、ｐｒｏＢＣＡ２、ＤＳＡ、ＯＡＡ、ＰＮＡ、ＴＬ、ＡＣＧ、ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ、ＭＯＡ、ＡＰＩ  １４４、ＣＶ−Ｎ、ＰＭＡ、ＧＳＬ−ＩＩ、Ｇａｒｌｉｃ  ｌｅｃｔｉｎ、ＰＡＡ、ＵＥＡ−ＩＩ、ＲＳＬ、ＣＰＡ、ＣＨＡ−１、ＬＡＡ、ＳＨＡ、ＬＰＡ、ＢＰＬ、ＣＦＡ１、ＣＦＡ２、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ、ＭＰＡ２及びａｌｇＭＰＬからなる群から選択される少なくとも１のレクチンとの結合性を指標として、対数増殖期にあるブドウ球菌属内の菌種を判別することが好ましく、これらレクチン全てを用いて、対数増殖期にあるブドウ球菌属内の菌種を判別することがより好ましい。
【０１１６】
また、本発明において、牛乳中の対数増殖期にあるブドウ球菌属内の菌種を対象とする場合には、ａｌｇＭＰＬ、ＰＮＡ、ＧＳＬ−ＩＩ、ＢＣＬ１１、ＤＢＡ、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３、ＴＰＬ−１、ＢＭＬ１１ｂ、ＢＭＬ１１ｃ、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＰＶＬ、ＬＢＡ及びＵＰＬ−１からなる群から選択される少なくとも１のレクチンとの結合性を指標として、牛乳中の対数増殖期にあるブドウ球菌属内の菌種を判別することが好ましく、これらレクチン全てを用いて、牛乳中の対数増殖期にあるブドウ球菌属内の菌種を判別することがより好ましい。
【０１１７】
さらに、本発明において、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＬＥＬ、ＫＡＡ１、ＢＣＬ１１、ＣＢＡ、ＨＡＡ、ＨＰＡ、ＳＴＬ、ｐｒｏＢＣＡ１、ｐｒｏＢＣＡ２、ＵＬＬ、ＤＳＡ、ＰＷＭ、ＵＤＡ、ＷＦＬ、ｈｙｐｎｉｎＡ３、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３、ＯＡＡ、ＰＮＡ、ＴＬ、ＡＣＧ、ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ、ＭＯＡ、ＡＰＩ  １４４、ＣＶ−Ｎ、ＰＭＡ、ＧＳＬ−ＩＩ、Ｇａｒｌｉｃ  ｌｅｃｔｉｎ、ＰＡＡ、ＵＥＡ−ＩＩ、ＲＳＬ、ＣＰＡ、ＣＨＡ−１、ＬＡＡ、ＳＨＡ、ＬＰＡ、ＤＢＡ、ＴＰＬ−１、ＢＭＬ１１ｂ、ＢＭＬ１１ｃ、ＰＶＬ、ＬＢＡ、ＵＰＬ−１、ＢＰＬ、ＣＦＡ１、ＣＦＡ２、ＢａｎＬｅｃ、ＢＣＬ１１ｄ、ＦＶＥ、ＣＬＡ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  Ｉ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ、ＭＰＡ１、ＭＰＡ２、ａｌｇＭＰＬ及びａｌｇＣＳＡ、これらレクチン全てを用いてブドウ球菌属内の菌種を判別することが特に好ましい。
【０１１８】
また、後述の実施例において示す通り、ＧＳＬ−ＩＩ、ＰＶＬ及びＷＧＡからなる群から選択される少なくとも１のレクチンは、静止期のブドウ球菌属と静止期におけるブドウ球菌以外の菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）との判別に用いることができるため、該レクチンを本発明にかかるレクチン（例えば、ＣＢＡ、ｐｒｏＢＣＡ１、ｐｒｏＢＣＡ２、ＫＡＡ１、ＤＳＡ、ＰＷＭ、ＵＤＡ、ＷＦＬ、ｈｙｐｎｉｎＡ３）と組み合わせて用いることも好ましい。
【０１１９】
なお、本発明において、「ＷＧＡ」は、配列番号：１７に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：１７に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンである。本発明において「ＷＧＡ」の典型例としては、Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＷＧＡ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、カタログ番号：Ｌ−１０２０）や、ＷＧＡ（Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ）小麦胚芽レクチン（生化学工業株式会社製、コード番号：３００１９１）が挙げられる。
【０１２０】
また、前記レクチンの代わりに、ブドウ球菌属とブドウ球菌以外の菌とを判別できる抗体と、本発明にかかるレクチンとを組み合わせて用いることも好ましい。このような抗体としては、例えば、抗Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓマウスモノクローナル抗体（ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社製、カタログＮｏ．ＬＳ−Ｃ７６０００）が挙げられる。
【０１２１】
本発明にかかるレクチンを前記検体と接触させ、該検体に含まれ得るブドウ球菌等と結合させる際の条件としては特に制限はないが、本発明にかかるレクチンと該検体に含まれ得るブドウ球菌等との接触頻度を上げ、これらを結合し易くするという観点から、前記検体に含まれ得るブドウ球菌等は培養されていることが好ましく、また、前記検体は、ブドウ球菌等に特異的に認識する抗体やレクチンを固相化した磁性ビーズ等を用いてアフィニティ精製が施され、該ブドウ球菌等が濃縮されていることが好ましい。
【０１２２】
なお、かかる培養や精製には、後述の＜ブドウ球菌属内の菌種を判別するためのキット＞に記載の「検体を培養するための培地」や「抗体やレクチンを固相化した磁性ビーズ」を好適に用いることができる。
【０１２３】
また、本発明にかかるレクチンを前記検体と接触させ、該検体に含まれ得るブドウ球菌等と結合させる際の条件としては、本発明にかかるレクチンは基材上に固相化されていることが好ましい。
【０１２４】
このような基材の材質としては特に制限はなく、例えば、合成樹脂（ナイロン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン等）、ガラス等のシリカ類、金属（白金、銀、銅、金等）、シリコン、雲母、及びこれらの混合物が挙げられる。また、材質の表面はレクチンを固相化させるために表面処理（例えば、マキシソープ処理、ポリソープ処理、メディソープ処理、マルチソープ処理）が施されていてもよい。
【０１２５】
さらに、このような基材の形状としては特に制限はなく、例えば、プレート、チップ、ビーズが挙げられる。また、基材上に本発明にかかるレクチンを含む複数種のレクチンを固相化し、アレイとして本発明の方法に利用してもよい。かかる場合、該レクチンは、明瞭な識別パターンが検出できるように基材上に配列され固相化されていることが好ましい。なお、かかるアレイの製造や利用は、当業者であれば、公知のＤＮＡチップやプロテインチップ等の作製手順や検出方法を適宜変更して成し得る。
【０１２６】
本発明にかかるレクチンの前記基材への固相化方法としては特に制限はなく、例えば、物理吸着、静電的相互作用、疎水的相互作用、架橋剤、本発明にかかるレクチンに特異的な抗体等を利用する方法が挙げられる。
【０１２７】
本発明にかかるレクチンの固相化時の濃度は、基材の材質、形状、固相化の方法、用いるレクチンと菌との結合性、該レクチンに結合した菌を検出する方法等に併せて適宜調整すればよく、例えば、１〜１０,０００μｇ／ｍｌの濃度が挙げられ、好ましくは５〜２０μｇ／ｍｌである。
【０１２８】
本発明にかかるレクチンの固相化後、各種の高分子性ポリマー（例えば、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリカルボキシレート、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ））をブロッキング剤として使用することができる。市販品として、日本油脂社製のＮ１０１、Ｎ１０２、リピジュア（登録商標）等を好適に用いることができる。なお、これらのブロッキング剤は非特異的吸着の防止の他、レクチンを固相化した基板の安定性を上げることにも寄与する。また、グリシン等のアミノ酸やサッカロース等をブロッキング時に共存させてもよい。
【０１２９】
本発明にかかるレクチンを前記検体と接触させる際の条件としては、本発明にかかるレクチンとブドウ球菌が結合できる条件であればよく、例えば、０℃〜４０℃の温度下で接触させることが挙げられ、４〜３７℃の温度下で接触させることが好ましい。また、前記検体の調製において、菌を希釈する液体のｐＨとしては例えばｐＨ６〜８が挙げられ、後述の本発明にかかる「検体を希釈するための試薬」に記載の緩衝液を好適に用いることができる。さらに、レクチンに接触させる菌の濃度としては波長６６０ｎｍにおける濁度０．００１〜４が挙げられ、好ましくは０．１〜１が挙げられる。
【０１３０】
本発明にかかるレクチンに結合したブドウ球菌を検出する方法としては特に制限はなく、公知のブドウ球菌の検出方法を適宜選択して利用することができる。かかる方法としては、例えば、クリスタルバイオレットによる染色をした後、洗浄後、該色素をブドウ球菌等から流出させ、その吸光度（波長：５７０ｎｍ）を測定する方法が挙げられる。さらに、金属薄膜上に固相化したレクチンにブドウ球菌が結合することにより生ずる表面プラズモン共鳴現象をＢｉａｃｏｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にて測定する方法が挙げられる。また、マイクロプレートにアレイ化したレクチンに結合したブドウ球菌をＣＣＤカメラにて計測することにより、またはＣｙ３やＣｙ５等の蛍光試薬で標識して蛍光強度を測定することにより、細菌数を定量する方法が挙げられる。さらに、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ（登録商標、日立ソリューションズ社製）にレクチンを固相化し、Ｌｕｍｉｎｅｘシステム（登録商標、日立ソリューションズ社製）を用いて、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｎａｌｙｔｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ法にて測定する方法や、レクチンを固相化したイムノクロマトによる定性測定方法が挙げられる。
【０１３１】
また、前記の通り、本発明にかかるレクチンに結合したブドウ球菌を検出する又は検出し易くするために、該ブドウ球菌を染色してもよい。かかる染色に用いられる試薬として、例えば、クリスタルバイオレット、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）、並びに、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３及びＣｙ５等の蛍光試薬が挙げられる。さらに、特異性高くブドウ球菌を検出するという観点から、かかる検出に用いられる試薬として、例えば、標識された抗体や標識されたレクチンが挙げられる。このような標識としては、例えば、放射性物質、蛍光色素、化学発光物質、酵素、補酵素を用いることが可能であり、具体的には、ラジオアイソトープ、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、リゾチーム、ビオチン／アビジンが挙げられる。また、かかる抗体やレクチンとしては、検出の対象となるブドウ球菌に特異的に結合できるものであればよく、例えば、本発明にかかるレクチンを好適に用いることができる。
【０１３２】
さらに、かかるブドウ球菌の検出の前後において、架橋試薬によって、本発明にかかるレクチンに結合したブドウ球菌を固定してもよい。かかる架橋試薬としては特に限定されず、例えば、グルタルアルデヒド、ビスマレイミドヘキサン、ビス（スルホサクシニジル）スベレート、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒロドキシスクシニミドエステル、スクシニミル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート等の架橋基が挙げられる。
【０１３３】
本発明にかかるレクチンとブドウ球菌との結合性については、前記方法によって得られた数値（吸光度、細菌数、蛍光強度等）をそのまま本発明の方法における判別の指標として用いてもよく、対数変換やその他の数値変換を施した値を用いることもできる。また、後述の実施例において示すように、レクチン非存在下にいて得られる数値を基準として、本発明にかかるレクチンを用いて得られる数値を補正した値を用いてもよく、各菌間で共通して反応が確認されているレクチン（例えば、静止期の各菌間における、ＧＳＬ−ＩＩ）を用いて得られる数値を基準として、本発明にかかるレクチンを用いて得られる数値を補正した値を用いてもよい。
【０１３４】
前記結合性を指標として菌種を判別する方法としては特に制限はなく、本発明にかかるレクチンはブドウ球菌属内の菌種間で異なる結合性を有するため、ブドウ球菌属内の少なくとも１の菌種に対する結合性を基準として、他の菌種に対する結合性を比較することにより、相対的に判別することもできる。また、かかる「判別」についても特に制限はなく、例えば、各種統計方法（ｔ検定、分散分析、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ多重比較法、ダネットの多重比較検定等）を利用し、前記菌種間で異なる結合性における有意差の有無をもって評価することができる。さらに、本発明の方法において、本発明にかかる複数種のレクチンを用いた場合には、例えば、特開２００９−１４８２３６号公報において示されているように、ブドウ球菌属内の菌種に対する各レクチンの結合性を基準として、分類（クラスター解析）することによって判別することもできる。なお、かかるクラスター解析は、ＴＩＧＲｍｅＶ、ＮＩＡ Ａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｓｔａｌｉｂ−ＭＵＬＴＩ，ＭＵＬＴＩＶ，ＮｅｔＬｉｂ，ＡＬＮ，ＭＩＸＭＯＤ，Ｃｌｕｓｔｅｒ ３．０，ＭｅＶ Ｖ４．０等のソフトウェアを適宜選択して利用して行うことができる。また、本発明の方法において、本発明にかかる複数種のレクチンを用いた場合には、後述の実施例において示すような、各菌種におけるレーダーチャート図を基準として判別することもできる。
【０１３５】
＜ブドウ球菌属内の菌種を判別するための剤＞
本発明のブドウ球菌属内の菌種を判別するための剤は、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＬＥＬ、ＫＡＡ１、ＢＣＬ１１、ＣＢＡ、ＨＡＡ、ＨＰＡ、ＳＴＬ、ｐｒｏＢＣＡ１、ｐｒｏＢＣＡ２、ＵＬＬ、ＤＳＡ、ＰＷＭ、ＵＤＡ、ＷＦＬ、ｈｙｐｎｉｎＡ３、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３、ＯＡＡ、ＰＮＡ、ＴＬ、ＡＣＧ、ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ、ＭＰＡ２、ＭＯＡ、ＡＰＩ  １４４、ＣＶ−Ｎ、ＰＭＡ、ＧＳＬ−ＩＩ、Ｇａｒｌｉｃ  ｌｅｃｔｉｎ、ＰＡＡ、ＵＥＡ−ＩＩ、ＲＳＬ、ＣＰＡ、ＣＨＡ−１、ＬＡＡ、ＳＨＡ、ＬＰＡ、ＤＢＡ、ＴＰＬ−１、ＢＭＬ１１ｂ、ＢＭＬ１１ｃ、ＰＶＬ、ＬＢＡ、ＵＰＬ−１、ＢＰＬ、ＣＦＡ１、ＣＦＡ２、ＢａｎＬｅｃ、ＢＣＬ１１ｄ、ＦＶＥ、ＣＬＡ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  Ｉ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ、ＭＰＡ１、ａｌｇＭＰＬ及びａｌｇＣＳＡからなる群から選択される少なくとも１のレクチンを含有することを特徴とする。
【０１３６】
本発明の剤は、後述の実施例において示す通り、ブドウ球菌属内の菌種を判別することができるため、食品の衛生検査等のために用いられる試薬として、また、感染症患者の検査等のために用いられる診断薬として好適に用いることができる。
【０１３７】
本発明の剤としては、これら本発明にかかるレクチンのうちの少なくとも１のレクチンを含んでいればよいが、２種以上の本発明にかかるレクチンを含んでいてもよい。これら本発明にかかるレクチンの調製方法としては特に制限はなく、例えば、＜ブドウ球菌属内の菌種を判別する方法＞に記載の各調製方法（分離・抽出・精製方法）や、後述の＜レクチン及び該レクチンをコードするＤＮＡ＞に記載のレクチンの調製方法が挙げられる。
【０１３８】
また、本発明の剤としては、本発明にかかるレクチンの他、剤として許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩が挙げられる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ−マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
【０１３９】
＜ブドウ球菌属内の菌種を判別するためのキット＞
本発明のブドウ球菌属内の菌種を判別するためのキットは、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＬＥＬ、ＫＡＡ１、ＢＣＬ１１、ＣＢＡ、ＨＡＡ、ＨＰＡ、ＳＴＬ、ｐｒｏＢＣＡ１、ｐｒｏＢＣＡ２、ＵＬＬ、ＤＳＡ、ＰＷＭ、ＵＤＡ、ＷＦＬ、ｈｙｐｎｉｎＡ３、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３、ＯＡＡ、ＰＮＡ、ＴＬ、ＡＣＧ、ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ、ＭＰＡ２、ＭＯＡ、ＡＰＩ  １４４、ＣＶ−Ｎ、ＰＭＡ、ＧＳＬ−ＩＩ、Ｇａｒｌｉｃ  ｌｅｃｔｉｎ、ＰＡＡ、ＵＥＡ−ＩＩ、ＲＳＬ、ＣＰＡ、ＣＨＡ−１、ＬＡＡ、ＳＨＡ、ＬＰＡ、ＤＢＡ、ＴＰＬ−１、ＢＭＬ１１ｂ、ＢＭＬ１１ｃ、ＰＶＬ、ＬＢＡ、ＵＰＬ−１、ＢＰＬ、ＣＦＡ１、ＣＦＡ２、ＢａｎＬｅｃ、ＢＣＬ１１ｄ、ＦＶＥ、ＣＬＡ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  Ｉ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ、ＭＰＡ１、ａｌｇＭＰＬ及びａｌｇＣＳＡからなる群から選択される少なくとも１のレクチンを固相化した基材と、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも１の試薬とからなることを特徴とする
（ａ）検体を検出するための試薬
（ｂ）ブロッキングするための試薬
（ｃ）検体を固定するための試薬
（ｄ）検体を希釈するための試薬。
【０１４０】
本発明のキットは、後述の実施例において示す通り、ブドウ球菌属内の菌種を判別することができるため、食品の衛生検査等のために用いられるキットとして、また、感染症患者の検査等のために用いられるキットとして好適に用いることができる。
【０１４１】
本発明にかかるレクチンを固相化した基材は、例えば、＜ブドウ球菌属内の菌種を判別する方法＞に記載の、基材の材質、配列、固相化方法、固相化時の濃度等を適宜選択して調製することができる。
【０１４２】
本発明にかかる「検体を検出するための試薬」は、前記検体に含まれ得る「ブドウ球菌属内の菌種」等を検出することができるものであればよく、例えば、クリスタルバイオレット、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）、並びに、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３及びＣｙ５等の蛍光試薬、前記標識された抗体、前記標識されたレクチンが挙げられる。
【０１４３】
本発明にかかる「ブロッキングするための試薬」は、本発明にかかる基材への非特異的吸着を抑制するものであればよく、例えば、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリカルボキシレート、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）等の高分子性ポリマーが挙げられる。また、本発明にかかる「ブロッキングするための試薬」は、グリシン等のアミノ酸やサッカロース等も含有するものであってもよい。
【０１４４】
本発明にかかる「検体を固定するための試薬」は、前記検体に含まれ得る「ブドウ球菌属内の菌種」等と、本発明にかかるレクチンとを架橋とを架橋できるものであればよく、例えば、グルタルアルデヒド、ビスマレイミドヘキサン、ビス（スルホサクシニジル）スベレート、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒロドキシスクシニミドエステル、スクシニミル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート等が挙げられる。
【０１４５】
本発明にかかる「検体を希釈するための試薬」は、前記検体に含まれ得る「ブドウ球菌属内の菌種」等と、本発明にかかるレクチンとの結合を阻害しないものであればよく、例えば、緩衝液（ｐＨ６〜８）、より具体的にはトリス緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液が挙げられる。また、これらの緩衝液においては、塩類、界面活性化剤、タンパク質、糖、双性イオン化合物等を適宜含有していてもよい。
【０１４６】
このような塩類としては特に制限はないが、緩衝液中で陽イオンを生じさせる塩類であることが好ましく、例えば、塩化カルシウム（カルシウムイオン）、塩化マンガン（マンガンイオン）、塩化マグネシウム（マグネシウムイオン）が挙げられる。
【０１４７】
このような界面活性化剤としては特に制限はないが、非イオン性の界面活性剤が好ましく、例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が挙げられる。
【０１４８】
このようなタンパク質としては特に制限はないが、安定化剤やブロッキング剤として作用するものが好ましく、例えば、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、カゼインが挙げられる。
【０１４９】
このような糖としては特に制限はないが、安定化剤やブロッキング剤として作用するものが好ましく、例えば、ショ糖、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ガラクトース、グルコース、マンノース、キシロース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、フコース、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、デアミノノイラミン酸（２−ｋｅｔｏ−３−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｙｃｅｒｏ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏ−ｎｏｎｏｎｉｃ  ａｃｉｄ；ＫＤＮ）、グルクロン酸、イズロン酸、ラクトース、キトビオース、キトトリオースが挙げられる。
【０１５０】
このような双性イオン化合物としては特に制限はないが、安定化剤やブロッキング剤として作用するものが好ましく、例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジン、ヒスチジンが挙げられる。
【０１５１】
また、本発明のブドウ球菌属内の菌種を判別するためのキットは、前記基材等以外に、本発明のブドウ球菌属内の菌種を判別するための方法に用いることのできる他の試薬を含んでいてもよい。かかる他の試薬としては、検体を培養するための培地、抗体やレクチンを固相化した磁性ビーズ、洗浄液、陽性対照、陰性対照が挙げられる。
【０１５２】
このような「検体を培養するための培地」は、前記検体に含まれ得る「ブドウ球菌属内の菌種」等を増殖させることができるものであればよく、例えば、マンニット食塩培地、卵黄加マンニット食塩培地、ブドウ球菌培地Ｎｏ．１１０、ベアードパーカー培地、緩衝ペプトン水、ＬＢ培地、ハートインフュージョン培地、ブレインハートインフュージョン培地、トリプチックソイ培地、標準寒天培地、普通寒天培地、血液寒天培地が挙げられる。
【０１５３】
このような「抗体やレクチンを固相化した磁性ビーズ」としては、前記検体に含まれ得る「ブドウ球菌属内の菌種」等に対して特異的に結合できる抗体やレクチンが固相化している磁性ビーズであればよく、例えば、抗プロテインＡ抗体、本発明にかかるレクチン又はＷＧＡが固相化している磁性ビーズ挙げられる。
【０１５４】
「洗浄液」としては、前記検体に含まれ得る「ブドウ球菌属内の菌種」等と、本発明にかかるレクチンとの結合を阻害せず、基材等に非特異的に吸着した菌や蛍光色素等を洗浄できるものであればよく、例えば、前記「検体を希釈するための試薬」が挙げられる。
【０１５５】
「陽性対照」及び「陰性対照」としては、例えば、検出の対象である特定のブドウ球菌属内の菌種及び該菌種とは異なる菌種が各々挙げられる。
【０１５６】
また、本発明のブドウ球菌属内の菌種を判別するためのキットは、検体を検出するための試薬として、前記標識された抗体又は前記標識されたレクチンを用いる際には、該標識と反応させて化学発光等を生じさせるための「酵素基質液」を含んでいてもよく、また該反応を停止させるための「停止液」を含んでいてもよい。
【０１５７】
また、本発明のキットには、本発明の方法を実施する際の、前記基材等の使用説明書を含めることができる。
【０１５８】
＜レクチン及び該レクチンをコードするＤＮＡ＞
本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチンを提供するものである。
（ａ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：３４に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【０１５９】
本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチンを提供するものである。
（ａ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：３５に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【０１６０】
本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチンを提供するものである。
（ａ）配列番号：１３に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：１３に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：３６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【０１６１】
本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチンを提供するものである。
（ａ）配列番号：１４に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：１４に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：３７に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【０１６２】
本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチンを提供するものである。
（ａ）配列番号：３８に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：３８に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：３９に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【０１６３】
本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチンを提供するものである。
（ａ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：４０に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：４１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【０１６４】
本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチンを提供するものである。
（ａ）配列番号：４２に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：４２に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：４３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【０１６５】
本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチンを提供するものである。
（ａ）配列番号：４４に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：４４に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：４５に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【０１６６】
本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のレクチンを提供するものである。
（ａ）配列番号：４６に記載のアミノ酸配列からなるレクチン
（ｂ）配列番号：４６に記載のアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチン
（ｃ）配列番号：４７に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするレクチン。
【０１６７】
また、本発明は、緑藻（アブラインビレア  カピチュリフォルミス）由来のレクチンであって、該緑藻を緩衝液にて抽出し、得られた可溶性画分を塩析し、得られた沈殿物を透析し、ゲル濾過により精製することによって得られる画分に存在し、還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて示される分子量は１５０００〜２００００Ｄａであり、トリプシン処理ウサギ赤血球に対して凝集活性を示すレクチンを提供するものである。
【０１６８】
さらに、本発明は、緑藻（コディウム  スブトゥブロスム）由来のレクチンであって、該緑藻を緩衝液にて抽出し、得られた可溶性画分を硫酸アンモニウムにより塩析し、得られた沈殿物を透析し、顎下腺ムチン固定化カラムに吸着させた後、Ｎ−アセチルガラクトサミンにて溶出される画分に存在し、分子量は１００００〜１５０００Ｄａであり、トリプシン処理ウサギ赤血球に対して凝集活性を示すレクチンを提供するものである。
【０１６９】
また、これらのレクチンにさらに機能性タンパク質が融合されている態様のレクチンを本発明は提供するものである。かかる態様にて、機能性タンパク質は、例えば、前記レクチンのＮ末側、Ｃ末側のどちらか一方若しくは両側、及び／又はシグナル配列等と成熟レクチン配列との間に、直接的に又は間接的に融合させることができる。機能性タンパク質と前記レクチンとを間接的に融合させる場合には、リンカーペプチドを介して融合させることができる。かかるリンカーペプチドの配列、長さについては特に制限はなく、通常、１〜５０アミノ酸、好ましくは１〜３０アミノ酸、より好ましくは１〜２０アミノ酸からなるポリペプチドが挙げられる。機能性タンパク質としては特に制限はなく、前記レクチンに付与したい機能に応じて適宜選択される。例えば、前記レクチンの精製を容易にする目的で用いられる機能性タンパク質としては、Ｍｙｃ−タグ（ｔａｇ）タンパク質、Ｈｉｓ−タグタンパク質、ヘマグルチニン（ＨＡ）−タグタンパク質、ＦＬＡＧ−タグタンパク質（登録商標、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質が挙げられる。前記レクチンの検出を容易にする目的で用いられる機能性タンパク質としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ)、ルシフェラーゼが挙げられる。
【０１７０】
また、前記レクチン並びに機能性タンパク質が融合されている当該レクチンは、各々のレクチンをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを無細胞タンパク質合成系（例えば、網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液）に導入しインキュベーションすることにより、または該ベクターを適当な細胞に導入して得た形質転換体を培養し、発現させたタンパク質を精製することにより調製することが可能である。したがって、本発明は、これらのレクチンのうちのいずれか一のレクチンをコードするＤＮＡを提供するものでもある。
【０１７１】
なお、本発明において、具体的なアミノ酸配列又は塩基配列を得られていないレクチン（前記緑藻（アブラインビレア  カピチュリフォルミス）由来のレクチン及び緑藻（クロミル）由来のレクチン）においては、必要に応じ、電気泳動による分離、逆相ＨＰＬＣによるペプチド精製等を施した上で、アミノ酸分析機器（例えば、Ｐｒｏｃｉｓｅ４９４（登録商標、アプライドバイオシステムズ社製）、ＰＰＳＱ−３１Ａ／３３Ａ（島津製作所製））を用いて、前記緑藻由来のレクチンのＮ末端領域のアミノ酸配列を決定することができる。また、質量分析器（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて、前記緑藻由来のレクチン中の任意のアミノ酸配列を決定することができる。そして、このようにして決定されたアミノ酸配列に基づき、例えば、後述の実施例に示すように、縮重プライマーを設計し、前記緑藻由来の完全長ｃＤＮＡを鋳型として、ＲＡＣＥ法を行うことにより、前記緑藻由来のレクチンをコードするＤＮＡを調製することができる。
【０１７２】
また、本発明において、天然レクチンのアミノ酸配列（例えば、配列番号３に記載のアミノ酸配列）と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンをコードするＤＮＡは、当業者に公知のハイブリダイゼーション技術（例えば、Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９８３年、１００巻、３３３〜３４２ページに記載の方法、Ｂｅｎｔｏｎ，Ｗ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９７７年、１８０〜１８２ページに記載の方法）を利用して調製することができる。すなわち、当業者であれば、天然レクチンをコードするＤＮＡ（例えば、配列番号３４に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ）、またはその一部を利用してハイブリダイゼーションを行い、種々の生物からこれと相同性の高いＤＮＡを単離し、天然レクチンのアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンをコードするＤＮＡを選択することができる。
【０１７３】
また、天然レクチンをコードするＤＮＡの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ（例えば、配列番号３４に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ）は、当業者であれば、天然レクチンをコードするＤＮＡ、またはその一部を利用して、前記「ストリンジェントな条件」下で、ハイブリダイゼーションを行うことによって、種々の生物から調製することができる。
【０１７４】
さらに、天然レクチンのアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるレクチンをコードするＤＮＡは、当業者に公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）や、部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．＆Ｆｒｉｔｚ，ＨＪ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９８７，１５４，３５０．）等の遺伝子増幅技術や組換え技術を利用して調製することも可能である。
【０１７５】
そして、当業者であれば公知の手法を適宜選択し、本発明のＤＮＡを用いて本発明のレクチンを調製することができる。かかる公知の手法としては、例えば、宿主（前記適当な細胞）が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の場合、プラスミドベクターｐＥＴ−３（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ５６，１２５−３５（１９８７））、ｐＧＥＸ−１（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｇｅｎｅ  ６７，３１−４０（１９８８））等を用いる方法が挙げられる。そして、大腸菌の形質転換方法としては、熱ショック法（例えば、塩化カルシウム法、Ｈａｎａｈａｎ法、Ｉｎｏｕｅ法、塩化ルビジウム法）、電気穿孔法等が挙げられる。
【０１７６】
また、宿主が分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）の場合には、プラスミドベクターｐＥＳＰ−１（Ｌｕ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２００，１３５−１４４（１９９７））等を用いる方法が挙げられる。そして、酵母の形質転換方法としては、例えば、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、電気穿孔法等が挙げられる。
【０１７７】
さらに、宿主が昆虫細胞の場合には、バキュロウイルスベクターｐＢａｃＰＡＫ８／９（ＢＤクロンテック社）等を用いる方法が挙げられる。そして、昆虫細胞の形質転換は、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７−５５（１９８０））等に記載の方法に従って行うことができる。
【０１７８】
また、宿主が哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞）の場合、ｐＭＳＧ（ＢＤクロンテック社）等のベクターを用いる方法が挙げられる。そして、ほ乳動物細胞への組換えＤＮＡの導入は、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒＥｂ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２，４５６−４６７（１９７３））、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｉｌｍａｎ，Ｇ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，１６４１−１６４３（１９８４））、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，７４１３−７４１７（１９８７））、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１，８４１−８４５（１９８２））等で行うことができる。
【０１７９】
また、宿主細胞において発現させた組換えタンパク質は、公知の方法により精製することができ、例えば、本発明のレクチンを特異的に認識する抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィー精製法が挙げられる。なお、本発明のレクチンを特異的に認識する抗体は、当業者であれば適宜公知の手法を選択して調製することができる。かかる公知の手法としては、本発明のレクチンを免疫動物に接種し、該動物の免疫系を活性化させた後、該動物の血清（ポリクローナル抗体）を回収する方法、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法が挙げられる。
【０１８０】
また、宿主細胞において発現させた組換えタンパク質を精製する公知の方法としては、Ｈｉｓ−タグタンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質等の機能性タンパク質を融合させた形態で前記レクチンを合成し、金属キレート樹脂、ＧＳＴ親和性レジンに結合させることにより精製する方法等が挙げられる（Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，７２１１−７２１５（１９８８））。さらに、例えば、トロンビン、血液凝固因子Ｘａ等で機能性タンパク質と前記レクチンとの間を切断することにより、前記レクチンとのみを分離して精製することもできる。
【実施例】
【０１８１】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【０１８２】
（実施例１）
＜静止期の細菌に結合するレクチンのスクリーニング＞
＜使用したレクチン＞
レクチンのスクリーニングは、市販レクチン、天然抽出物精製レクチン及び組換えレクチンを用いて行った。用いたレクチンは以下の通りである。
市販レクチン：
（ＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）
ＡＡＡ、ＡＣＡ、ＡＭＡ、ＡＰＰ、ＡＳＡ、ＢＤＡ、ＣＡ、ＣＡＡ、ｃａｌｓｅｐａ、ＣＣＡ、ＣＰＡ、ＣＳＡ、ＧＨＡ、ＧＳ−ＩＡ４、ＧＳ−ＩＩ、ＨＭＡ、ＨＰＡ、ＩＲＡ、ＬＡＡ、ＬＢＡ、ＬＦＡ、ＬＰＡ、ＭＩＡ、ＭＮＡ−Ｇ、ＭＮＡ−Ｍ、ＭＯＡ、ＭＰＡ、ＰＡＡ、ＰＭＡ、ＰＳＬ、ＰＴＡ−Ｇａｌ、ＰＴＡ−ＧａｌＮＡｃ、ＲＰＡ、ＳＨＡ、ＳＴＡ、ＴＫＡ、ＴＬ、ＵＤＡ、ＵＥＡ−ＩＩ、ＶＦＡ、ＶＲＡ、ＷＦＡ
（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）
ＥＥＬ、ＧＮＬ、ＧＳＬ−Ｉ、ＧＳＬ−ＩＢ４、ＧＳＬ−ＩＩ、ＨＨＬ、Ｊａｃａｌｉｎ、ＬＥＬ、ＭＡＨ、ＭＡＬ、ＭＰＬ、ＮＰＬ、ＰＴＬ−Ｉ、ＰＴＬ−ＩＩ、ＲＣＡ−Ｉ、Ｓｃ−ＷＧＡ、ＳＪＡ、ＳＮＡ、ＳＴＬ、ＷＦＬ
（生化学工業株式会社製）
ＡＡＬ、ＡＢＡ、ａｎｔｉ−Ｈ、ＣｏｎＡ、ＤＢＡ、ＤＳＡ、ＥＣＡ、ＧＮＡ、ＬＣＡ、Ｌｏｔｕｓ、ＰＨＡ−Ｅ４、ＰＨＡ−Ｌ４、ＰＮＡ、ＰＳＡ、ＰＷＭ、ＳＢＡ、ＳＳＡ、ＴＪＡ−Ｉ、ＴＪＡ−ＩＩ、ＵＥＡ−Ｉ、ＷＧＡ
（シグマ・アルドリッチ社製）
ＣＦＬ、ＨＡＡ、ＰＡ−Ｉ
（和光純薬工業株式会社製）
ＰＶＬ
天然抽出物精製レクチン：
ＣＢＡ、ａｌｇＣＰＡ、ＢＣＡ、ＢＣＬ１１、ミルレクチン
組換えレクチン：
ｒＡＣＧ、ｒｐｒｏＢＣＡ１、ｒＢＣＡ１、ｒｐｒｏＢＣＡ２、ｒＢＣＡ２、ｒＢＣＬ１１、ｒＣＶ−Ｎ、ｒＫＡＡ１、ｒＧＲＦＴ、ｒｈｙｐｎｉｎＡ１、ｒｈｙｐｎｉｎＡ３、ｒＭＶＬ、ｒＭＶＮ、ｒＯＡＡ、ｒＰＡ−ＩＩＬ、ｒＴａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ｒＴＤＡ、ｒＴＰＬ−１、ｒＴＰＬ−２、ｒＵＬＬ
なお、「組換えレクチン」の「ｒ」は組換えタンパク質（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であることを示すためにレクチン名の前に付されている。【０１８３】
前記の通り、市販レクチンはＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、生化学工業株式会社、シグマ・アルドリッチ又は和光純薬工業株式会社から購入したものを本実施例において使用した。天然抽出物精製レクチンは広島大学又はグライエンスで調製したものを使用した。組換えレクチンは組換えレクチンはグライエンスで作製したものを使用した。【０１８４】
なお、ＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製のＧＳ−ＩＩと、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製のＧＳＬ−ＩＩとは、製造会社が異なるだけで、同一のレクチンである。【０１８５】
＜使用した菌株＞
本実施例に使用した菌株を表４に示す。食中毒菌として黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）を２株、常在菌として皮膚常在ブドウ球菌  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓをそれぞれ２株、ブドウ球菌以外の菌として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）をそれぞれ１株ずつ使用した。各菌株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より購入した。各菌株の詳細については表４に示す。【０１８６】
【表４】
2012133127.tif 000005
【０１８７】
＜プレート遠心法によるレクチンスクリーニング＞
マイクロプレート（Ｎｕｎｃ社製、表面処理：マキシソープ、カタログ番号：４４５１０１）に５０ｍＭ  炭酸バッファー（ｐＨ９．６）で１０ｕｇ／ｍｌに希釈した前記１１９種類のレクチン１００ｕｌを各々４℃で一晩感作し、該マイクロプレートにレクチンを固相化した。次いで、レクチン溶液を除去し、５倍希釈した免疫学的測定用ブロッキング試薬Ｎ１０１（日本油脂社製）３００ｕｌを加え、室温で３時間ブロッキングした。【０１８８】
そして、表４に示した各菌株をＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ培地中で３７℃、２４時間、静置又は振盪培養し、各菌が静止期の状態に至った培養液をＰＢＳで３回洗浄し、波長６６０ｎｍでの濁度（吸光度）が１になるよう１％  ＢＳＡ／ＴＢＳ−ＣＭ（ＴＢＳ、１％ＢＳＡ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２）で調製した菌懸濁液１００ｕｌをプレートに添加し、遠心機で４℃、５１０ｘｇで１０分間遠心した。遠心後、ＴＢＳ−ＣＭ（ＴＢＳ、１％ＢＳＡ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２）２５０ｕｌをプレートに穏やかに添加し、プレートシール（Ｎｕｎｃ社製、カタログ番号：２３６３６６）でシール後、プレートを逆さにして遠心機で４℃、１６０ｘｇで５分間遠心した。遠心後、プレートから上清２５０ｕｌを除去し、１００ｕｌのＴＢＳ−ＣＭ／０．５％  グルタルアルデヒド溶液を添加し、室温で１時間固定した。グルタルアルデヒド溶液を除去後、ＰＢＳで洗浄して２．３％  クリスタルバイオレット１００ｕｌを加え、室温で１時間染色し、流水で洗浄した。その後、９９．５％  エタノール１００ｕｌを加え、室温で１時間色素を溶出し、５７０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（サーモエレクトロン株式会社製、製品名：Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＪＸ）で定量した。なお、かかる検出に要した時間は３時間半程度であったことから、本発明の方法は、迅速かつ簡便に行える方法であることが示された。【０１８９】
そして、前記の通り、１１２種類のレクチンを固相化したプレート（レクチン固相プレート）を用いて、プレート遠心法により９種類の菌のレクチンへの結合を調べた。なお、レクチン固相プレートに結合した菌は、クリスタルバイオレットで染色され、５７０ｎｍで吸収が見られる。各菌間で共通して反応が見られたレクチン  ＧＳＬ−ＩＩの吸光度を指標に、同一菌のプレート間のバラつきを補正したデータを棒グラフで示した。すなわち、ＧＳＬ−ＩＩレクチンの吸光度を１００とし、補正は下記の数式で行った。
各レクチンの補正値（Ｉｎｄｅｘ）＝（各レクチンの吸光度の平均値−Ｂｌａｎｋの吸光度の平均値）×１００／ＧＳＬ−ＩＩの吸光度の平均値
得られた結果を図１〜５に示す。【０１９０】
なお図１〜５中、「ＢＳＡ」は牛血清アルブミンを、「Ｂｌａｎｋ」はレクチンが無いことを示す。また「ｒＫＡＡ」はｒＫＡＡ１による結果であることを示す。【０１９１】
次に、１１２種類のレクチンからＡＢＡ、ＤＳＡ、ＧＳ−ＩＩ／ＧＳＬ−ＩＩ、ＨＡＡ、ＨＰＡ、ＬＥＬ、ＰＶＬ、ＰＷＭ、ＳＢＡ、ＳＴＬ、ＵＤＡ、ＷＦＬ、ＷＧＡ、ｒｐｒｏＢＣＡ２、ｒＢＣＬ１１、ｒＫＡＡ１、ｒＰＡ−ＩＩＬ、ｒＴａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２及びｒＵＬＬ  ２０種類のレクチンを選抜し、プレート遠心法により得られた９種類の菌のレクチンへの結合をレーダーチャートで示した。得られた結果を図６に示す。なお図６中、「ｒＴａｃｈｙ」はｒＴａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２による結果であることを示し、「ｒｐｒｏＢＣ」はｒｐｒｏＢＣＡ２による結果であることを示し、「ｒＫＡＡ」はｒＫＡＡ１による結果であることを示す。【０１９２】
図１〜６に示した結果から明らかなように、ブドウ球菌属とそれ以外の菌の間で、結合するレクチンの種類に大きな差が認められた。また、ブドウ球菌属内でも、種間で結合するレクチンの種類に差が認められた。【０１９３】
（実施例２）
＜静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓとを判別できるレクチンの選択＞
前記吸光度データを用いて有意差検定を行い、静止期の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）と静止期にあるその他のブドウ球菌（皮膚常在ブドウ球菌：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）とを判別できるレクチンを選択した。得られた結果を有意差検定の条件とともに表５に示す。なお、実施例２〜８において、統計的な差はスチューデントのｔ検定（両側検定）によって確認した。また、Ｆ検定により不等分散と考えられた場合はウェルチのｔ検定（両側検定）を行った。そして、Ｐ＜０．０５を統計的に有意であると判断した。【０１９４】
【表５】
2012133127.tif 000006
【０１９５】
表５に示した結果から明らかなように、ＬＥＬ、ＳＴＬ、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＢＣＬ１１又はＵＬＬによって、静止期の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）と静止期にあるその他のブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）とを判別することができた。【０１９６】
（実施例３）
＜静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓとを判別できるレクチンの選択＞
前記吸光度データを用いて有意差検定を行い、静止期の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）と静止期にあるその他のブドウ球菌（皮膚常在ブドウ球菌：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ）とを判別できるレクチンを選択した。得られた結果を有意差検定の条件とともに表６に示す。【０１９７】
【表６】
2012133127.tif 000007
【０１９８】
表６に示した結果から明らかなように、ＨＡＡ、ＬＥＬ、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＤＳＡ、ＰＷＭ又はｈｙｐｎｉｎＡ３によって、静止期の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）と静止期にあるその他のブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ）とを判別することができた。【０１９９】
（実施例４）
＜静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓとを判別できるレクチンの選択＞
前記吸光度データを用いて有意差検定を行い、静止期の皮膚常在ブドウ球菌の菌種間を判別できるレクチン、すなわち静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓとを判別できるレクチンを選択した。得られた結果を有意差検定の条件とともに表７に示す。【０２００】
【表７】
2012133127.tif 000008
【０２０１】
表７に示した結果から明らかなように、ＣＢＡ、ＬＥＬ、ＳＴＬ、ｐｒｏＢＣＡ１、ｐｒｏＢＣＡ２、ＫＡＡ１、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＤＳＡ、ＰＷＭ、ＵＤＡ又はＷＦＬによって、静止期の皮膚常在ブドウ球菌の菌種間、すなわち静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓとを判別することができた。【０２０２】
（実施例５）
＜静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと静止期にあるその他のブドウ球菌とを判別できるレクチンの選択＞
前記吸光度データを用いて有意差検定を行い、静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと静止期にあるその他のブドウ球菌（皮膚常在ブドウ球菌  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ）とを判別できるレクチンを選択した。得られた結果を有意差検定の条件とともに表８に示す。【０２０３】
【表８】
2012133127.tif 000009
【０２０４】
表８に示した結果から明らかなように、ＨＡＡ、ＨＰＡ又はＢＣＬ１１によって、静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと静止期にあるその他のブドウ球菌とを判別することができた。【０２０５】
（実施例６）
＜静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓと静止期にあるその他のブドウ球菌とを判別できるレクチンの選択＞
前記吸光度データを用いて有意差検定を行い、静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓと静止期にあるその他のブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）とを判別できるレクチンを選択した。得られた結果を有意差検定の条件とともに表９に示す。【０２０６】
【表９】
2012133127.tif 000010
【０２０７】
表９に示した結果から明らかなように、ＣＢＡ、ＬＥＬ、ＳＴＬ、ｐｒｏＢＣＡ１、ｐｒｏＢＣＡ２、ＫＡＡ１、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＵＬＬ、ＤＳＡ、ＰＷＭ、ＵＤＡ又はＷＦＬによって、静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓと静止期にあるその他のブドウ球菌とを判別することができた。【０２０８】
（実施例７）
＜静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと静止期にあるその他のブドウ球菌とを判別できるレクチンの選択＞
前記吸光度データを用いて有意差検定を行い、静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと静止期にあるその他のブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ）とを判別できるレクチンを選択した。得られた結果を有意差検定の条件とともに表１０に示す。【０２０９】
【表１０】
2012133127.tif 000011
【０２１０】
表１０に示した結果から明らかなように、ＢＣＬ１１によって、静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと静止期にあるその他のブドウ球菌とを判別することができた。【０２１１】
以上の結果から、ＣＢＡ、ＨＡＡ、ＨＰＡ、ＬＥＬ、ＳＴＬ、ｐｒｏＢＣＡ１、ｐｒｏＢＣＡ２、ＫＡＡ１、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＵＬＬ、ＤＳＡ、ＰＷＭ、ＵＤＡ、ＷＦＬ、ｈｙｐｎｉｎＡ３又はＢＣＬ１１によって、静止期にあるブドウ球菌属内の菌種の判別をできることが明らかになった。【０２１２】
（実施例８）
＜静止期のブドウ球菌と静止期にあるブドウ球菌属以外の細菌とを判別できるレクチンの選択＞
前記吸光度データを用いて有意差検定を行い、静止期のブドウ球菌（ブドウ球菌：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ）と静止期にあるブドウ球菌属以外の細菌（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及び緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））とを判別できるレクチンを選択した。得られた結果を有意差検定の条件とともに表１１に示す。【０２１３】
【表１１】
2012133127.tif 000012
【０２１４】
表１１に示した結果から明らかなように、ＧＳ−ＩＩ（ＧＳＬ−ＩＩ）、ＨＡＡ、ＨＰＡ、ＬＥＬ、ＰＶＬ、ＳＴＬ、ＷＧＡ、ＢＣＬ１１、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２又はＵＬＬのレクチンによって、静止期のブドウ球菌と静止期にあるブドウ球菌属以外の細菌とを判別することができた。【０２１５】
このように、ＨＡＡ、ＨＰＡ、ＬＥＬ、ＳＴＬ、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＵＬＬ及びＢＣＬ１１は、静止期にあるブドウ球菌属内の菌種の判別のみならず、静止期のブドウ球菌と静止期にあるブドウ球菌属以外の細菌とを判別することができる。また、静止期にあるブドウ球菌属内の菌種の判別が可能な本発明のレクチンと、ＧＳ−ＩＩ（ＧＳＬ−ＩＩ）、ＰＶＬ又はＷＧＡのレクチンとを組み合わせて用いることによって、静止期にあるブドウ球菌属内の菌種の判別のみならず、静止期のブドウ球菌と静止期にあるブドウ球菌属以外の細菌とを判別することも可能となる。【０２１６】
なお、ブドウ球菌とブドウ球菌属以外の細菌とを判別することができるレクチンの由来は下記の通りである。
ＧＳ−ＩＩ／ＧＳＬ−ＩＩ：グリフォニア・シンプリシフォリア（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）由来
ＰＶＬ：ムジナタケ（Ｐｓａｔｈｙｒｅｌｌａ  ｖｅｌｕｔｉｎａ）由来
ＷＧＡ：コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）由来。【０２１７】
（実施例９）
＜Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２によるブドウ球菌属内における菌種の判別についての検証＞
前述の通り、静止期にある、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓにおけるいずれの２菌種間においても、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２によって判別できることが明らかになった。そこで、一元配置分散分析に基づくチューキー・クレーマー（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ）多重比較法により、本判別方法の有用性を確認してみた。得られた結果を図７に示す。【０２１８】
図７に示した結果から明らかなように、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２によって、静止期にある、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ、いずれの菌種間においても判別することができた。【０２１９】
（実施例１０）
＜静止期にあるブドウ球菌属内の菌種を判別するレクチンのスクリーニング２＞
実施例１に記載のレクチンとは異なるレクチンを対象として、静止期の細菌に結合するレクチンのスクリーニングを、実施例１に記載の方法と同様の方法にて行った。すなわち、市販レクチン５種類、天然抽出物精製レクチン１８種類及び組換えレクチン１４種類の計３７種類の新たなレクチンを、実施例１同様にマイクロプレートに固相化した。また、表１２に記載の各菌株を、Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ培地中で３７℃、２２５ｒｐｍで振盪培養し、６６０ｎｍでの濁度が２．０以上に達した後６時間培養した状態を静止期として培養液をサンプリングし、実施例１同様に６６０ｎｍでの濁度が１になるように菌濁液を調製した。【０２２０】
そして、前記３７種類のレクチンを固相したプレートを用いて、プレート遠心法により、表１２に記載の９種類の菌のレクチンへの結合を調べた。なお、各菌に対して、レクチン毎に独立して３回（Ｎ＝３）測定を行った。また、レクチン毎の吸光度の測定値からプレートのウェルにレクチンが固定されていないＢｌａｎｋの測定値を引いたデータを用い、統計解析を行った。統計的な差はウェルチのｔ検定（両側検定）によって検証し、Ｐ＜０．０５を統計的に有意であると判断した。【０２２１】
【表１２】
2012133127.tif 000013
【０２２２】
（実施例１１）
＜静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓとを判別できるレクチンの選択２＞
前記吸光度データを用いて有意差検定を行い、静止期の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）と静止期にあるその他のブドウ球菌（皮膚常在ブドウ球菌：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ）とを判別できるレクチンを選択した。得られた結果を有意差検定の条件とともに表１３に示す。【０２２３】
【表１３】
2012133127.tif 000014
【０２２４】
表１３に示した結果から明らかなように、ＲＳＬ、ＣＨＡ−１、ＣＬＡ、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３、ＢａｎＬｅｃ、ＡＰＩ  １４４、ＡＣ−Ａｖｒａｎｉｎ又はＢＭＬ１１ｂによって、静止期の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）と静止期にあるその他のブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ）とを判別することができた。  【０２２５】
従って、実施例３の結果と併せて、ＨＡＡ、ＬＥＬ、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＤＳＡ、ＰＷＭ、ｈｙｐｎｉｎＡ３、ＲＳＬ、ＣＨＡ−１、ＣＬＡ、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３、ＢａｎＬｅｃ、ＡＰＩ  １４４、ＡＣ−Ａｖｒａｎｉｎ又はＢＭＬ１１ｂによって、静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓとを判別できることが明らかになった。【０２２６】
（実施例１２）
＜静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓとを判別できるレクチンの選択２＞
前記吸光度データを用いて有意差検定を行い、静止期の皮膚常在ブドウ球菌の菌種間を判別できるレクチン、すなわち静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓとを判別できるレクチンを選択した。得られた結果を有意差検定の条件とともに表１４に示す。【０２２７】
【表１４】
2012133127.tif 000015
【０２２８】
表１４に示した結果から明らかなように、ＦＶＥ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ、ＲＳＬ、ＣＨＡ−１、ＢＭＬ１１ｂ、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３又はＰｒｏ−ＣＦＡ  Ｉによって、静止期の皮膚常在ブドウ球菌の菌種間、すなわち静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓとを判別することができた。【０２２９】
従って、実施例４の結果と併せて、ＣＢＡ、ＬＥＬ、ＳＴＬ、ｐｒｏＢＣＡ１、ｐｒｏＢＣＡ２、ＫＡＡ１、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＤＳＡ、ＰＷＭ、ＵＤＡ、ＷＦＬ、ＦＶＥ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ、ＲＳＬ、ＣＨＡ−１、ＢＭＬ１１ｂ、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３又はＰｒｏ−ＣＦＡ  Ｉによって、静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓとを判別できることが明らかになった。【０２３０】
（実施例１３）
＜静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと静止期にあるその他のブドウ球菌とを判別できるレクチンの選択＞
前記吸光度データを用いて有意差検定を行い、静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと静止期にあるその他のブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ）とを判別できるレクチンを選択した。得られた結果を有意差検定の条件とともに表１５に示す。【０２３１】
【表１５】
2012133127.tif 000016
【０２３２】
表１５に示した結果から明らかなように、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ、ａｌｇＣＳＡ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  Ｉ、ＦＶＥ、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３、ＣＬＡ、ＡＰＩ  １４４、ＭＰＡ１，ＣＨＡ−１、ＲＳＬ、ＵＰＬ−１、ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ、ＢＭＬ１１ｃ又はＢＭＬ１１ｂによって、静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと静止期にあるその他のブドウ球菌とを判別することができた。【０２３３】
従って、実施例７の結果と併せて、ＢＣＬ１１、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ、ａｌｇＣＳＡ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  Ｉ、ＦＶＥ、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３、ＣＬＡ、ＡＰＩ  １４４、ＭＰＡ１，ＣＨＡ−１、ＲＳＬ、ＵＰＬ−１、ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ、ＢＭＬ１１ｃ又はＢＭＬ１１ｂによって、静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと静止期にあるその他のブドウ球菌とを判別できることが明らかになった。【０２３４】
（実施例１４）
＜静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓと静止期にあるその他のブドウ球菌とを判別できるレクチンの選択２＞
前記吸光度データを用いて有意差検定を行い、静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓと静止期にあるその他のブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）とを判別できるレクチンを選択した。得られた結果を有意差検定の条件とともに表１６に示す。【０２３５】
【表１６】
2012133127.tif 000017
【０２３６】
表１６に示した結果から明らかなように、ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ、ＢａｎＬｅｃ、ＲＳＬ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ、ＦＶＥ、ＣＬＡ、ＣＨＡ−１、ＡＰＩ  １４４、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３、ＢＭＬ１１ｂ又はＢＣＬ１１ｄによって、静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓと静止期にあるその他のブドウ球菌とを判別することができた。【０２３７】
従って、実施例６の結果と併せて、ＣＢＡ、ＬＥＬ、ＳＴＬ、ｐｒｏＢＣＡ１、ｐｒｏＢＣＡ２、ＫＡＡ１、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＵＬＬ、ＤＳＡ、ＰＷＭ、ＵＤＡ、ＷＦＬ、ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ、ＢａｎＬｅｃ、ＲＳＬ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ、ＦＶＥ、ＣＬＡ、ＣＨＡ−１、ＡＰＩ  １４４、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３、ＢＭＬ１１ｂ又はＢＣＬ１１ｄによって、静止期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓと静止期にあるその他のブドウ球菌とを判別できることが明らかになった。【０２３８】
（実施例１５）
＜対数増殖期にあるブドウ球菌属内の菌種を判別するレクチンのスクリーニング＞
＜使用したレクチン＞
対数増殖期の細菌に結合するレクチンのスクリーニングは、市販レクチン９２種類、天然抽出物精製レクチン２５種類及び組換えレクチン３６種類の計１５３種類のレクチンを用いて行った。【０２３９】
なお、市販レクチンはＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、生化学工業株式会社、シグマ・アルドリッチ、和光純薬工業株式会社から購入した。天然抽出物精製レクチンは広島大学又はグライエンスにて調製し、組換えレクチンはグライエンスにて作製した。【０２４０】
＜使用した抗血清＞
Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ１４９９０に紫外線を照射し、成育しないことを確認した菌体を抗原としてウサギに免疫し、ブドウ球菌に結合する抗血清を調製し、本実施例に供した。【０２４１】
＜使用した菌株＞
対数増殖後期のスクリーニング実験に使用した菌株を表１７に示す。食中毒菌として黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）を５株、常在ブドウ球菌としてＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ及びＳ．ｃａｐｉｔｉｓをそれぞれ３株、その他のブドウ球菌としてＳ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ及びＳ．ｈｏｍｉｎｉｓをそれぞれ１株、ブドウ球菌以外の菌として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）をそれぞれ１株使用した。各菌株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より購入した。【０２４２】
【表１７】
2012133127.tif 000018
【０２４３】
＜プレート遠心法によるレクチンスクリーニング＞
マイクロプレート（Ｎｕｎｃ社製、表面処理：マキシソープ、カタログ番号：４４５１０１）に５０ｍＭ  炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１０ｕｇ／ｍｌに希釈した前記レクチン又は前記抗血清１００ｕｌを各々４℃で一晩感作し、該マイクロプレートにレクチン又は抗血清を固相化した。次いで、レクチン溶液等を除去した後、５倍希釈した免疫学的測定用ブロッキング試薬Ｎ１０１（日本油脂社製）３００ｕｌを加え室温で３時間ブロッキングした。【０２４４】
そして、表１７に記載の各菌株をＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ培地中で３７℃、２２５ｒｐｍで振盪培養し、経時的に６６０ｎｍにおける濁度を測定して菌株毎に増殖曲線を描いた。増殖曲線から濁度が０．６〜１．０にある状態の菌を対数増殖後期の菌としてサンプリングした。次いで、サンプリングした培養液を遠心して菌体を回収した後、ＰＢＳで３回洗浄して波長６６０ｎｍでの濁度（吸光度）が１になるよう１％  ＢＳＡ／ＣＭ−ＴＢＳ（ＴＢＳ、１％ＢＳＡ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２）で菌懸濁液を調製した。そして、菌懸濁液１００ｕｌをプレートに分注し、遠心機で４℃、５１０ｘｇで１０分間遠心した。遠心後、ＣＭ−ＴＢＳ（ＴＢＳ、１％ＢＳＡ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２）２５０ｕｌをプレートに穏やかに添加し、プレートシール（Ｎｕｎｃ社製、カタログ番号：２３６３６６）でシール後、プレートを逆さにして遠心機で４℃、１６０ｘｇで５分間遠心した。遠心後、プレートから上清２５０ｕｌを除去し、１００ｕｌのＴＢＳ−ＣＭ／０．５％  グルタルアルデヒド溶液を添加し、室温で１時間固定した。グルタルアルデヒド溶液を除去後、ＰＢＳで洗浄して２．３％  クリスタルバイオレット溶液を１００ｕｌ加え、室温で１時間染色した。流水で余分な色素を洗浄した後、９９．５％  エタノール１００ｕｌを加え、室温で１時間色素を溶出し、５７０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで定量した。【０２４５】
そして、前記１５３種類のレクチンを固相したプレートを用いて、プレート遠心法により、表１７に記載の１６種類の菌のレクチンへの結合を調べた。なお、各菌に対して、レクチン毎に独立して３回（Ｎ＝３）測定を行った。また、レクチン毎の吸光度の測定値からプレートのウェルにレクチンが固定されていないＢｌａｎｋの測定値を引いたデータを用い、統計解析を行った。統計的な差はウェルチのｔ検定（両側検定）によって検証し、Ｐ＜０．０５を統計的に有意であると判断した。【０２４６】
（実施例１６）
＜対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと対数増殖期にあるその他のブドウ球菌とを判別できるレクチンの選択＞
前記吸光度データを用いて有意差検定を行い、対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと対数増殖期にあるその他のブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ）とを判別できるレクチンを選択した。得られた結果を有意差検定の条件とともに表１８に示す。【０２４７】
【表１８】
2012133127.tif 000019
【０２４８】
表１８に示した結果から明らかなように、ＣＶ−Ｎ、ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ、ＰＭＡ，ＧＳＬ−ＩＩ、ＯＡＡ、ＡＣＧ、ＡＰＩ  １４４、ＰＮＡ、ａｌｇＭＰＬ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ、ＣＢＡ、Ｇａｒｌｉｃ  ｌｅｃｔｉｎ、ＴＬ、ＭＯＡ、ＭＰＡ２又はＤＳＡによって、対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと対数増殖期にあるその他のブドウ球菌とを判別することができた。【０２４９】
（実施例１７）
＜対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと対数増殖期にあるその他のブドウ球菌とを判別できるレクチンの選択＞
前記吸光度データを用いて有意差検定を行い、対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと対数増殖期にあるその他のブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ）とを判別できるレクチンを選択した。得られた結果を有意差検定の条件とともに表１９に示す。【０２５０】
【表１９】
2012133127.tif 000020
【０２５１】
表１９に示した結果から明らかなように、ＳＨＡ、ＲＳＬ、ｐｒｏＢＣＡ２、ｐｒｏＢＣＡ１、ＣＰＡ、ＵＥＡ−ＩＩ、ＬＡＡ，ＣＨＡ−１、ＯＡＡ、ＬＰＡ又はａｌｇＭＰＬによって、対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと対数増殖期にあるその他のブドウ球菌とを判別することができた。【０２５２】
（実施例１８）
＜対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓと対数増殖期にあるその他のブドウ球菌とを判別できるレクチンの選択＞
前記吸光度データを用いて有意差検定を行い、対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓと対数増殖期にあるその他のブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ）とを判別できるレクチンを選択した。得られた結果を有意差検定の条件とともに表２０に示す。【０２５３】
【表２０】
2012133127.tif 000021
【０２５４】
表２０に示した結果から明らかなように、ｐｒｏＢＣＡ２、ＬＡＡ、ＬＰＡ、ＯＡＡ、ｐｒｏＢＣＡ１、ＵＥＡ−ＩＩ、ＣＰＡ、ＣＨＡ−１、ＰＡＡ、ＲＳＬ、ａｌｇＭＰＬ又はＳＨＡによって、対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓと対数増殖期にあるその他のブドウ球菌とを判別することができた。【０２５５】
従って、実施例１７及び１８の結果から、ＳＨＡ、ＲＳＬ、ｐｒｏＢＣＡ２、ｐｒｏＢＣＡ１、ＣＰＡ、ＵＥＡ−ＩＩ、ＬＡＡ，ＣＨＡ−１、ＯＡＡ、ＬＰＡ又はａｌｇＭＰＬは、対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと対数増殖期にあるその他のブドウ球菌とを判別でき、さらに対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓと対数増殖期にあるその他のブドウ球菌とを判別できることが明らかになった。【０２５６】
（実施例１９）
＜対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓとを判別できるレクチンの選択＞
前記吸光度データを用いて有意差検定を行い、対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓとを判別できるレクチンを選択した。得られた結果を有意差検定の条件とともに表２１に示す。【０２５７】
【表２１】
2012133127.tif 000022
【０２５８】
表２１に示した結果から明らかなように、ＣＶ−Ｎ、ＳＨＡ、ＯＡＡ、ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ、ｐｒｏＢＣＡ２、ＵＥＡ−ＩＩ、ＡＣＧ、ＰＮＡ、ＬＡＡ、ＴＬ、ＭＯＡ、ＲＳＬ、ａｌｇＭＰＬ、ｐｒｏＢＣＡ１、ＣＨＡ−１、ＭＰＡ２、ＣＢＡ又はＣＰＡによって、対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓとを判別することができた。【０２５９】
（実施例２０）
＜対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓとを判別できるレクチンの選択＞
前記吸光度データを用いて有意差検定を行い、対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓとを判別できるレクチンを選択した。得られた結果を有意差検定の条件とともに表２２に示す。【０２６０】
【表２２】
2012133127.tif 000023
【０２６１】
表２２に示した結果から明らかなように、ＧＳＬ−ＩＩ、ＬＰＡ、ｐｒｏＢＣＡ２、ＯＡＡ、ｐｒｏＢＣＡ１、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ、ＡＣＧ、ＵＥＡ−ＩＩ、ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ、ａｌｇＭＰＬ、ＰＡＡ、ＡＰＩ  １４４、ＣＰＡ、ＤＳＡ、ＲＳＬ、ＣＢＡ又はＣＨＡ−１によって、対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓと対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓとを判別することができた。【０２６２】
（実施例２１）
＜対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓとを判別できるレクチンの選択＞
前記吸光度データを用いて有意差検定を行い、対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓとを判別できるレクチンを選択した。得られた結果を有意差検定の条件とともに表２３に示す。【０２６３】
【表２３】
2012133127.tif 000024
【０２６４】
表２３に示した結果から明らかなように、ｐｒｏＢＣＡ２、ＧＳＬ−ＩＩ、ｐｒｏＢＣＡ１、ＬＰＡ、ＬＡＡ、ＣＰＡ、ＣＨＡ−１、ＵＥＡ−ＩＩ、ＲＳＬ、ＳＨＡ又はＰＡＡによって、対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓとを判別することができた。【０２６５】
（実施例２２）
＜対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓと対数増殖期にあるその他のブドウ球菌とを判別できるレクチンの選択＞
前記１５３種類のレクチンを固相したプレートを用いて、プレート遠心法により、表１７に記載の１６種類の菌のレクチンへの結合を調べた。なお、各菌に対して、レクチン毎に独立して３回（Ｎ＝３）測定を行った。また、レクチン毎の吸光度の測定値からプレートのウェルにレクチンが固定されていないＢｌａｎｋの測定値を引いたデータを用い、統計解析を行った。全体の群間の差は一元配置分散分析で検証した。また、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓとその他の菌との差はダネットの多重比較検定にて解析した。得られた結果を有意差検定の条件とともに表２４及び２５に示す。【０２６６】
【表２４】
2012133127.tif 000025
【０２６７】
【表２５】
2012133127.tif 000026
【０２６８】
表２４及び２５に示した結果から明らかなように、ＢＰＬ又はＣＦＡ（ＣＦＡ１及びＣＦＡ２）によって、対数増殖期のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓと対数増殖期にあるその他のブドウ球菌とを判別することができた。【０２６９】
（実施例２３）
＜他菌混在下における黄色ブドウ球菌のレクチンによる識別＞
他菌（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）が混在している場合でも、レクチンにて食中毒菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）を識別できることを確認するため、前記同様に試験した。【０２７０】
すなわち、食中毒菌を識別可能であることが実証されたレクチン２種（ＰＮＡ及びａｌｇＭＰＬ）を各々用いることにより、各レクチン単独で複数菌混在下の食中毒菌を識別できるか確認するため、食中毒菌としてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ６５３８、常在菌として黄色ブドウ球菌との識別が困難といわれる常在ブドウ球菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ１２２２８を選び、それぞれを混ぜた場合のレクチンの反応について検証を行った。各菌は波長６６０ｎｍでの濁度０．５又は１で最終濃度を一定とし、適当な比率で混合した。なお、各菌とも対数増殖後期の細菌を利用し、１％ＢＳＡ／ＣＭ−ＴＢＳ（ＴＢＳ、１％ＢＳＡ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２）に懸濁したものを用いて、前記同様にプレート遠心法により測定を行った。得られた結果を図８〜１１に示す。なお、図８〜１１において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの濃度はグラフの左から右に濃くなるように配置されており（各図のグラフ下の横軸  参照）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの濃度はグラフの右から左に濃くなるように配置されている（各図のグラフ上の横軸  参照）。また、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓとＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓとを最終濃度一定で適当な比率で混合した結果は破線で示す。すなわち、各図のグラフの左端でＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓが１００％、右端でＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓが１００％、中央でそれぞれ５０％ずつとなっている。【０２７１】
図８〜１１に示した結果から明らかな通り、各菌単独でレクチンプレートに反応させた場合、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（実線）は濃度依存的に右肩上がりの曲線を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（点線）は濃度依存的に右肩下がりの曲線を示した。そして、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓとＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓとを混合した場合、食中毒菌を識別できない抗Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ血清では混合比を変えても吸光度はほぼ一定の値を示したのに対し、ＰＮＡやａｌｇＭＰＬ等、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを識別可能なレクチンは、属内の他菌混在下でも濃度依存的にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを検出できることが明らかになった。特にＰＮＡは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ単独の場合の濃度反応曲線と、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと混合した場合の濃度反応曲線とがほぼ一致した。【０２７２】
従って、本発明にかかるレクチン（例えば、ＰＮＡ、ａｌｇＭＰＬ）によって、食中毒菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）と他菌（例えば、常在ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ等）とが混在している場合でも食中毒菌を検出可能であることが示された。【０２７３】
（実施例２４）
＜食品中における黄色ブドウ球菌のレクチンによる識別＞
食品中の食中毒菌（黄色ブドウ球菌、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）をレクチンによって識別できることを確認するため、また、実用性の観点から、簡便かつ迅速に本発明の方法により食中毒菌を検出できることを示すため、レクチンによる牛乳中の食中毒菌の直接的な検出を試みた。牛乳中にはレクチンと菌との結合を阻害する可能性のあるラクトオリゴ糖、糖タンパク質、糖脂質が多量に含まれていることから、この牛乳における試験は、食品中における黄色ブドウ球菌のレクチンによる識別におけるメルクマールとなり得る。【０２７４】
使用した菌株を表２６に示す。各菌とも対数増殖後期の細菌を利用し、市販の成分無調整牛乳に懸濁したものを用いた。また、レクチンは、対数増殖期のスクリーニングに用いたもののうち、市販レクチン１４種類、天然抽出物精製レクチン５種類及び組換えレクチン１７種類の計３６種類を使用した。そして、前記同様に、プレート遠心法により測定を行った。【０２７５】
【表２６】
2012133127.tif 000027
【０２７６】
なお、各菌に対して、レクチン毎に独立して３回（Ｎ＝３）測定を行った。また、レクチン毎の吸光度の測定値からプレートのウェルにレクチンが固定されていないＢｌａｎｋの測定値を引いたデータを用い、統計解析を行った。全体の群間の差は一元配置分散分析で検証した。また、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓとその他の菌との差はダネットの多重比較検定にて解析した。得られた結果を有意差検定の条件とともに表２７〜３９に示す。【０２７７】
【表２７】
2012133127.tif 000028
【０２７８】
【表２８】
2012133127.tif 000029
【０２７９】
【表２９】
2012133127.tif 000030
【０２８０】
【表３０】
2012133127.tif 000031
【０２８１】
【表３１】
2012133127.tif 000032
【０２８２】
【表３２】
2012133127.tif 000033
【０２８３】
【表３３】
2012133127.tif 000034
【０２８４】
【表３４】
2012133127.tif 000035
【０２８５】
【表３５】
2012133127.tif 000036
【０２８６】
【表３６】
2012133127.tif 000037
【０２８７】
【表３７】
2012133127.tif 000038
【０２８８】
【表３８】
2012133127.tif 000039
【０２８９】
【表３９】
2012133127.tif 000040
【０２９０】
表２７〜３９に示した結果から明らかなように、少なくとも、ａｌｇＭＰＬ、ＰＮＡ、ＤＢＡ、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３、ＴＰＬ−１、ＧＳＬ−ＩＩ、ＢＭＬ１１ｂ、ＢＣＬ１１、ＢＭＬ１１ｃ、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＰＶＬ、ＬＢＡ又はＵＰＬ−１によって、牛乳中に存在する食中毒菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）を識別できることが明らかになった。【０２９１】
（実施例２５）
＜食品中での他菌混在下における黄色ブドウ球菌のレクチンによる識別＞
食品中（例えば、牛乳中）、複数の菌が混在する状況下においても、本発明にかかるレクチンにより食中毒菌を識別できることを確認するため、食中毒菌としてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ６５３８、常在菌として黄色ブドウ球菌との識別が困難といわれる常在ブドウ球菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ１２２２８とを選び、実施例２３に記載の方法と同様の方法にて試験した。なお、各菌とも対数増殖後期の細菌を利用し、市販の成分無調整牛乳に懸濁したものを用いて、プレート遠心法により測定を行った。【０２９２】
得られた結果を図１２〜１５に示す。なお、図１２〜１５において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの濃度はグラフの左から右に濃くなるように配置されており（各図のグラフ下の横軸  参照）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの濃度はグラフの右から左に濃くなるように配置されている（各図のグラフ上の横軸  参照）。また、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓとＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓとを最終濃度一定で適当な比率で混合した結果は破線で示す。すなわち、各図のグラフの左端でＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓが１００％、右端でＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓが１００％、中央でそれぞれ５０％ずつとなっている。【０２９３】
図１２〜１５に示した結果から明らかな通り、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓとＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓとを混合した場合、食中毒菌を識別できない抗Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ血清では混合比を変えても吸光度はほぼ一定の値を示したのに対し、ＰＮＡやａｌｇＭＰＬ等、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを識別可能なレクチンは、牛乳中の属内の他菌混在下でも、濃度依存的にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを検出できることが明らかになった。特にＰＮＡは、牛乳中でも、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ単独の場合の濃度反応曲線と、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと混合した場合の濃度反応曲線とがほぼ一致した。【０２９４】
従って、本発明にかかるレクチン（例えば、ＰＮＡ、ａｌｇＭＰＬ）によって、食品中（例えば、牛乳中）、食中毒菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）と他菌（例えば、常在ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ等）とが混在している場合でも食中毒菌を検出可能であることが示された。【０２９５】
以上の通り、多種のレクチンとブドウ球菌属に属する細菌との結合性を調べた結果、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＬＥＬ、ＫＡＡ１、ＢＣＬ１１、ＣＢＡ、ＨＡＡ、ＨＰＡ、ＳＴＬ、ｐｒｏＢＣＡ１、ｐｒｏＢＣＡ２、ＵＬＬ、ＤＳＡ、ＰＷＭ、ＵＤＡ、ＷＦＬ、ｈｙｐｎｉｎＡ３、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３、ＯＡＡ、ＰＮＡ、ＴＬ、ＡＣＧ、ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ、ＭＯＡ、ＡＰＩ  １４４、ＣＶ−Ｎ、ＰＭＡ、ＧＳＬ−ＩＩ、Ｇａｒｌｉｃ  ｌｅｃｔｉｎ、ＰＡＡ、ＵＥＡ−ＩＩ、ＲＳＬ、ＣＰＡ、ＣＨＡ−１、ＬＡＡ、ＳＨＡ、ＬＰＡ、ＤＢＡ、ＴＰＬ−１、ＢＭＬ１１ｂ、ＢＭＬ１１ｃ、ＰＶＬ、ＬＢＡ、ＵＰＬ−１、ＢＰＬ、ＣＦＡ１、ＣＦＡ２、ＢａｎＬｅｃ、ＢＣＬ１１ｄ、ＦＶＥ、ＣＬＡ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  Ｉ、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ、ＭＰＡ１、ＭＰＡ２、ａｌｇＭＰＬ又はａｌｇＣＳＡによって、ブドウ球菌属内の菌種を判別できることが明らかになった。【０２９６】
なお、これらのレクチンは下記生物種由来のものである。
Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ  ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ  ｌｅｃｔｉｎ  ２）：カブトガニ（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ  ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ）由来
ＬＥＬ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ  ｌｅｃｔｉｎ）：トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）由来
ＫＡＡ１（Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ  ａｌｖａｒｅｚｉｉ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  １）：キリンサイ属コットーニィ種（カッパフィカスアルバレジ、Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ  ａｌｖａｒｅｚｉｉ（旧名Ｅｕｃｈｅｕｍａ  ｃｏｔｔｏｎｉｉ））由来
ＢＣＬ１１（Ｂｒｙｏｐｓｉｓ  ｃｏｒｔｉｃｕｌａｎｓ  １１ｋＤａ  ｌｅｃｔｉｎ）：ネザシハネモ（Ｂｒｙｏｐｓｉｓ  ｃｏｒｔｉｃｕｌａｎｓ）由来
ＣＢＡ（Ｃｏｄｉｕｍ  ｂａｒｂａｔｕｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）：ヒゲミル（Ｃｏｄｉｕｍ  ｂａｒｂａｔｕｍ）由来
ＨＡＡ（Ｈｅｌｉｘ  ａｓｐｅｒｓａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）：プティ・グリ（Ｈｅｌｉｘ  ａｓｐｅｒｓａ）由来
ＨＰＡ（Ｈｅｌｉｘ  ｐｏｍａｔｉａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）：リンゴマイマイ（Ｈｅｌｉｘ  ｐｏｍａｔｉａ）由来
ＳＴＬ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  ｌｅｃｔｉｎ）：ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）由来
ｐｒｏＢＣＡ１（Ｂｏｏｄｌｅａ  ｃｏａｃｔａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  １  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）、ｐｒｏＢＣＡ２（Ｂｏｏｄｌｅａ  ｃｏａｃｔａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ２  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）：アオモグサ（Ｂｏｏｄｌｅａ  ｃｏａｃｔａ）由来
ＵＬＬ（Ｕｌｖａ  ｌｉｍｎｅｔｉｃａ  ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）：ウムトゥチュラノリ（Ｕｌｖａ  ｌｉｍｎｅｔｉｃａ）由来
ＤＳＡ（Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）：シロバナヨウシュチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）由来
ＰＷＭ（Ｐｏｋｅ  ｗｅｅｄ  ｍｉｔｏｇｅｎ）：ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）由来
ＵＤＡ（Ｕｒｔｉｃａ  ｄｉｏｉｃａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）：セイヨウイラクサ（Ｕｒｔｉｃａ  ｄｉｏｉｃａ）由来
ＷＦＬ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ  ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ  ｌｅｃｔｉｎ）：ノダフジ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ  ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）由来
ｈｙｐｎｉｎＡ３（Ｈｙｐｎｅａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  ｌｅｃｔｉｎ  Ａ３）：カギイバラノリ（Ｈｙｐｎｅａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）由来
Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−３（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ  ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ  ｌｅｃｔｉｎ  ３）：カブトガニ由来
ＯＡＡ（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ａｇａｒｄｈｉｉ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）：オシラトリア・アガーディ（藍藻）由来
ＰＮＡ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、
Ｐｅａｎｕｔ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）：ピーナッツ由来
ＴＬ（Ｔｕｌｉｐａ  ｌｅｃｔｉｎ）：チューリップ由来
ＡＣＧ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ  ｇａｌｅｃｔｉｎ）：ヤナギマツタケ由来
ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎ（Ａｖｒａｉｎｖｉｌｌｅａ  ｃａｐｉｔｕｌｉｆｏｒｍｉｓ−ａｖｒａｎｉｎ）：アブラインビレア  カピチュリフォルミス（緑藻）由来
ＭＯＡ（Ｍａｒａｓｍｉｕｍ  ａｒｅａｄｅｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）：シバフタケ由来
ＡＰｌ  １４４（Ａｘｉｎｅｌｌａ  ｐｏｌｙｐｏｉｄｅｓ  ｌｅｃｔｉｎ  １４４）：タコウチュウジクカイメン由来
ＣＶ−Ｎ（ｃｙａｎｏｖｉｒｉｎ−Ｎ）：ストック・エリプソスポルム（藍藻）由来
ＰＭＡ（Ｐｏｌｙｇｏｎａｔｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）：ポリゴナツム・ムルティフロルム由来
ＧＳＬ−ＩＩ（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ  ｌｅｃｔｉｎ−ＩＩ）グリフォニア・シンプリシフォリア由来
Ｇａｒｌｉｃ  ｌｅｃｔｉｎ（Ａｌｌｉｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ  ｌｅｃｔｉｎ）
：ニンニク由来
ＰＡＡ（Ｐｅｒｓｅａｕ  ａｍｅｒｉｃａｎａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）：アボカド由来
ＵＥＡ−ＩＩ（Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−ＩＩ）：ハリエニシダ由来
ＲＳＬ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ｌｅｃｔｉｎ）：ラルストニア・ソラナケアルム由来
ＣＰＡ（Ｃｉｃｅｒ  ａｒｉｅｔｉｎｕｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）：ヒヨコマメ由来
ＣＨＡ−１（Ｃｅｐａｅａ  ｈｏｒｔｅｎｓｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  １）：ニワノオウシュウマイマイ由来
ＬＡＡ（Ｌａｂｕｒｎｕｍ  ａｌｐｉｎｕｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）キバナフジ由来
ＳＨＡ（Ｓａｌｖｉａ  ｈｏｒｍｉｎｕｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）：ムラサキサルビア由来
ＬＰＡ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）：アメリカカブトガニ由来
ＤＢＡ（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  ｂｉｆｌｏｒｕｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）：ヒマラヤフジマメ由来
ＴＰＬ−１（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ  ｐｌａｓｍａ  ｌｅｃｔｉｎ  １）：カブトガニ（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ  ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ）由来
ＢＭＬ１１ｂ（Ｂｒｙｏｐｓｉｓ  ｍａｘｉｍａ  １１ｋＤａ  ｌｅｃｔｉｎ  ｂ）、ＢＭＬ１１ｃ（Ｂｒｙｏｐｓｉｓ  ｍａｘｉｍａ  １１ｋＤａ  ｌｅｃｔｉｎ  ｃ）：オオハネモ由来
ＰＶＬ（Ｐｓａｔｈｙｒｅｌｌａ  ｖｅｌｕｔｉｎａ  ｌｅｃｔｉｎ）：ムジナタケ由来
ＬＢＡ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔｕｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）：リママメ由来
ＵＰＬ−１（Ｕｌｖａ  ｐｅｒｔｕｓａ  ｌｅｃｔｉｎ  １）：アナアオサ由来
ＢＰＬ（Ｂａｕｈｉｎｉａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ  ｌｅｃｔｉｎ）：ムラサキソシンカ由来
ＣＦＡ１（Ｃｏｄｉｕｍ  ｆｒａｇｉｌｅ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  １）、ＣＦＡ２（Ｃｏｄｉｕｍ  ｆｒａｇｉｌｅ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ２）：ミル由来
ＢａｎＬｅｃ（Ｂａｎａｎａ  ｌｅｃｔｉｎ）：タイワンバナナ（Ｍｕｓａ  ａｃｕｍｉｎａｔａ）由来
ＢＣＬ１１ｄ（Ｂｒｙｏｐｓｉｓ  ｃｏｒｔｉｃｕｌａｎｓ  １１ｋＤａ  ｌｅｃｔｉｎ  ｄ）：ネザシハネモ由来
ＦＶＥ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ  ｅｄｉｂｌｅ）：エノキタケ由来
ＣＬＡ（Ｃｏｄｉｕｍ  ｌａｔｕｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）：ヒラミル由来
Ｐｒｏ−ＣＦＡ  Ｉ（Ｐｒｏｎａｓｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃａｒｐｏｐｅｌｔｉｓ  ｆｌａｂｅｌｌａｔｅ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  Ｉ）、Ｐｒｏ−ＣＦＡ  ＩＩ／  Ｐｒｏｎａｓｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃａｒｐｏｐｅｌｔｉｓ  ｆｌａｂｅｌｌａｔｅ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ＩＩ）：コメノリ由来
ＭＰＡ１（Ｍｅｒｉｓｔｏｔｈｅｃａ  ｐａｐｕｌｏｓａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  １）、ＭＰＡ２（Ｍｅｒｉｓｔｏｔｈｅｃａ  ｐａｐｕｌｏｓａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ２）：トサカノリ由来
ａｌｇＭＰＬ（ＭＰＬ、Ｍｅｒｉｓｔｏｔｈｅｃａ  ｐａｐｕｌｏｓａ  ｌｅｃｔｉｎ）：トサカノリ由来
ａｌｇＣＳＡ（ＣＳＡ、Ｃｏｄｉｕｍ  ｓｕｂｔｕｂｕｌｏｓｕｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）：クロミル由来。【０２９７】
また、これらレクチンの内、ＫＡＡ１、ＢＣＬ１１、ＢＣＬ１１、ＢＭＬ１１ｂ、ＢＭＬ１１ｃ、ＣＢＡ、ＢＣＬ１１ｄ、ＣＦＡ１、ＣＦＡ２、ＣＬＡ、ＭＰＡ１、ＭＰＡ２、ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎは、本発明者によって、抽出、単離、精製、又は全長のアミノ酸配列及び塩基配列の決定がされたものである。以下にこれらレクチンの単離方法又はクローニング方法を示す。【０２９８】
（実施例２６）
＜ＫＡＡ１  ｃＤＮＡクローニング＞
ＲＮＡ安定化溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、ＲＮＡｌａｔｅｒ）中で−２０℃保存したキリンサイ属コットーニィ種（Ｋａｐｐａｐｈｙｃｕｓ  ａｌｖａｒｅｚｉｉ（旧名Ｅｕｃｈｅｕｍａ  ｃｏｔｔｏｎｉｉ））の藻体よりＰｌａｎｔ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出後、ＮｕｃｌｅｏＴｒａｐ  ｍＲＮＡ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社製）によりｍＲＮＡを精製し、さらにＧｅｎｅＲａｃｅｒ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により完全長ｃＤＮＡを調製した。【０２９９】
全アミノ酸配列が既知である近縁種  トゲキリンサイ（Ｅｕｃｈｅｕｍａ  ｓｅｒｒａ）由来レクチンＥＳＡ２及びＫＡＡの既知部分のアミノ酸配列を参考にして、縮重プライマー  ＫＡＡ＿５’ＲＡＣＥ＿ｄ＿Ｒ１、ＫＡＡ＿５’ＲＡＣＥ＿ｄ＿Ｒ２およびＫＡＡ＿３’ＲＡＣＥ＿ｄ＿Ｆ１を設計し、上記Ｋ．ａｌｖａｒｅｚｉｉ由来完全長ｃＤＮＡ溶液を鋳型にＲＡＣＥ法（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅法（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ））に供した。まず、５’ＲＡＣＥとして、ＫＡＡ＿５’ＲＡＣＥ＿ｄ＿Ｒ２およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿５’＿Ｐｒｉｍｅｒのプライマーペア及びＢｌｅｎｄＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、ＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲ反応溶液（５０μｌ）の組成は下記の通りである。
１ｘＢｌｅｎｄＴａｑバッファー；ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  １０ｎｍｏｌ、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿５’＿Ｐｒｉｍｅｒ  ３０ｐｍｏｌ、ＫＡＡ＿５’ＲＡＣＥ＿ｄ＿Ｒ２  ２５０ｐｍｏｌ、１０倍希釈完全長ｃＤＮＡ溶液  １μｌ、ＢｌｅｎｄＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ  １．２５Ｕ。また、ＰＣＲの反応条件は、熱変性９４℃３分後、熱変性９４℃３０秒、アニーリング６４℃３０秒および伸長反応７２℃１分のサイクルを３５回行い、最後に７２℃５分で反応終了した。【０３００】
そして、ＰＣＲ反応溶液を１００倍希釈後、これを鋳型にＫＡＡ＿５’ＲＡＣＥ＿ｄ＿Ｒ１及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿５’＿Ｎｅｓｔｅｄ＿Ｐｒｉｍｅｒのプライマーペアに用いるＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲに供した。なお、ＰＣＲ反応溶液（５０μｌ）の組成は下記の通りである。
１ｘＢｌｅｎｄ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ；ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  １０ｎｍｏｌ、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿５’＿Ｎｅｓｔｅｄ＿Ｐｒｉｍｅｒ  １０ｐｍｏｌ、ＫＡＡ＿５’ＲＡＣＥ＿ｄ＿Ｒ１  ２５０  ｐｍｏｌ、１００倍希釈ＰＣＲ反応溶液  １μｌ、Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ  １．２５Ｕ。また、ＰＣＲの反応条件は、アニーリング温度を５８℃とし、上述と同様にして行った。【０３０１】
次いで、得られた増幅産物につき、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にサブクローニング後、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．３．１及びＡＢＩ  ３１３０ｘｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、塩基配列決定に供した。【０３０２】
次に、３’ＲＡＣＥとして、ＫＡＡ＿３’ＲＡＣＥ＿ｄ＿Ｆ１およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿３’＿Ｐｒｉｍｅｒのプライマーペアを用いて、上記と同様にしてＰＣＲを行い、得られた増幅産物につき塩基配列決定に供した。５’及び３’ＲＡＣＥにより明らかとなった５’及び３’末端配列に特異的なプライマー、ＫＡＡ１＿５’Ｅｎｄ＿Ｆ及びＫＡＡ１＿３’Ｅｎｄ＿Ｒを設計し、これらをプライマーペアとし、ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いるＰＣＲに供した。なお、ＰＣＲ反応溶液組成及び反応条件は同ＤＮＡポリメラーゼの添付説明書に従って行った。そして、得られた増幅産物を塩基配列の決定に供し、ＫＡＡ１  ｃＤＮＡ全長配列を明らかにした。得られた塩基配列を配列番号：３４に示し、得られた塩基配列に基づくアミノ酸配列を配列番号：３に示す。また、実施例２６において用いたプライマーの塩基配列を表４０に示す。【０３０３】
【表４０】
2012133127.tif 000041
【０３０４】
（実施例２７）
＜ＢＣＬ１１  ｃＤＮＡクローニング＞
ＲＮＡｌａｔｅｒ中で−２０℃保存したネザシハネモ（Ｂｒｙｏｐｓｉｓ  ｃｏｒｔｉｃｕｌａｎｓ）藻体よりＰｌａｎｔ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて全ＲＮＡを抽出後、ＮｕｃｌｅｏＴｒａｐ  ｍＲＮＡによりｍＲＮＡを精製し、さらにＧｅｎｅＲａｃｅｒ  Ｋｉｔにより完全長ｃＤＮＡを調製した。【０３０５】
ＢＣＬ１１の既知Ｎ末端アミノ酸配列から、ＣＯＤＥＨＯＰ  ｐｒｏｇｒａｍにより縮重プライマーＢＣＬ１１＿５’ＲＡＣＥ＿ｄｃ＿Ｒ１を設計し、上記ネザシハネモ由来完全長ｃＤＮＡ溶液を鋳型にＲＡＣＥ法に供した。まず、５’ＲＡＣＥとして、ＢＣＬ１１＿５’ＲＡＣＥ＿ｄｃ＿Ｒ１およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿５’＿Ｐｒｉｍｅｒのプライマーペア及びＢｌｅｎｄＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲ反応溶液（５０μｌ）の組成は下記の通りである。
１ｘＢｌｅｎｄ  Ｔａｑバッファー；ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  １０ｎｍｏｌ、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿５’＿Ｐｒｉｍｅｒ  ３０ｐｍｏｌ、ＢＣＬ１１＿５’ＲＡＣＥ＿ｄｃ＿Ｒ１  ２５０ｐｍｏｌ、１０倍希釈完全長ｃＤＮＡ溶液  １μｌ、Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ  １．２５Ｕ。また、ＰＣＲの反応条件は、熱変性９４℃３分後、熱変性９４℃３０秒、アニーリング５０℃３０秒及び伸長反応７２℃３０秒のサイクルを３５回行い、最後に７２℃５分で反応終了した。【０３０６】
次いで、得られた増幅産物につき、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒにサブクローニング後、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．３．１およびＡＢＩ  ３１３０ｘｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて塩基配列決定に供した。【０３０７】
次に、得られた塩基配列を参考にプライマーＢＣＬ１１＿３’ＲＡＣＥ＿Ｆ１を設計し、３’ＲＡＣＥとして当該プライマー及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿３’＿Ｐｒｉｍｅｒのプライマーペアを用いてＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲ反応溶液（５０μｌ）の組成は下記の通りである。
１ｘＢｌｅｎｄ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ；ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  １０ｎｍｏｌ、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿３’＿Ｐｒｉｍｅｒ  １０ｐｍｏｌ、ＢＣＬ１１＿３’ＲＡＣＥ＿Ｆ１  １０ｐｍｏｌ、１０倍希釈完全長ｃＤＮＡ溶液  １μｌ、Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ  １．２５Ｕ。また、ＰＣＲの反応条件は、アニーリング温度を６０℃、伸長反応を１分とし、上述と同様にして行い、得られた増幅産物につき塩基配列決定に供した。５’及び３’ＲＡＣＥにより明らかとなった５’及び３’末端配列に特異的なプライマー、ＢＣＬ１１＿５’Ｅｎｄ＿ＦおよびＢＣＬ１１＿３’Ｅｎｄ＿Ｒを設計し、これらをプライマーペアとし、ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ  ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲに供した。なお、ＰＣＲ反応溶液組成及び反応条件は同ＤＮＡポリメラーゼの添付説明書に従って行った。そして、得られた増幅産物につき塩基配列の決定に供し、ＢＣＬ１１  ｃＤＮＡ全長配列を明らかにした。得られた塩基配列を配列番号：３５に示し、得られた塩基配列に基づくアミノ酸配列を配列番号：４に示す。また、実施例２７において用いたプライマーの塩基配列を表４０に示す。【０３０８】
（実施例２８）
＜ＢＭＬ１１ｂ及びＢＭＬ１１ｃ  ｃＤＮＡクローニング＞
ＲＮＡｌａｔｅｒ中で−２０℃保存したオオハネモ（Ｂｒｙｏｐｓｉｓ  ｍａｘｉｍａ）藻体よりＰｌａｎｔ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて全ＲＮＡを抽出後、ＮｕｃｌｅｏＴｒａｐ  ｍＲＮＡによりｍＲＮＡを精製し、さらにＧｅｎｅＲａｃｅｒ  Ｋｉｔにより完全長ｃＤＮＡを調製した。【０３０９】
ＢＣＬ１１の演繹アミノ酸配列を参考に縮重プライマーＢＣＬ１１＿ｌｉｋｅ＿ｃｏｍｍｏｎ＿Ｒ１を設計し、上記オオハネモ由来完全長ｃＤＮＡ溶液を鋳型にＲＡＣＥ法に供した。まず、５’ＲＡＣＥとして、ＢＣＬ１１＿ｌｉｋｅ＿ｃｏｍｍｏｎ＿Ｒ１及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿５’＿Ｐｒｉｍｅｒのプライマーペア及びＢｌｅｎｄＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲ反応溶液（５０μｌ）の組成は下記の通りである。
１ｘＢｌｅｎｄ  Ｔａｑバッファー；ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  １０ｎｍｏｌ、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿５’＿Ｐｒｉｍｅｒ  ３０ｐｍｏｌ、ＢＣＬ１１＿ｌｉｋｅ＿ｃｏｍｍｏｎ＿Ｒ１  ２５０ｐｍｏｌ、１０倍希釈完全長ｃＤＮＡ溶液  １μｌ、Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ  １．２５Ｕ。また、ＰＣＲの反応条件は、熱変性９４℃３分後、熱変性９４℃３０秒、アニーリング５８℃３０秒及び伸長反応７２℃３０秒のサイクルを３５回行い、最後に７２℃５分で反応終了した。【０３１０】
次いで、得られた増幅産物につき、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒにサブクローニング後、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．３．１及びＡＢＩ  ３１３０ｘｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて塩基配列決定に供した。その結果、配列が類似するものの異なる２種類の増幅産物が得られたことから、それぞれの５’末端配列に特異的なプライマー、ＢＭＬ１１ｂ＿５’Ｅｎｄ＿ＦおよびＢＭＬ１１ｃ＿５’Ｅｎｄ＿Ｆを設計した。さらに３’ＲＡＣＥとして、ＢＭＬ１１ｂ＿５’Ｅｎｄ＿Ｆ及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿３’＿Ｐｒｉｍｅｒ、又はＢＭＬ１１ｃ＿５’Ｅｎｄ＿Ｆ及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿３’＿Ｐｒｉｍｅｒのプライマーペアに、ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ  ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲに供した。なお、ＰＣＲ反応溶液組成及び反応条件は同ＤＮＡポリメラーゼの添付説明書に従って行った。得られた増幅産物につき塩基配列の決定に供し、ＢＭＬ１１ｂ及びＢＭＬ１１ｃ  ｃＤＮＡ全長配列を明らかにした。得られた塩基配列を、ＢＭＬ１１ｂについては配列番号：３６に示し、ＢＭＬ１１ｃについては配列番号：３７に示す。また、得られた塩基配列に基づくアミノ酸配列を、ＢＭＬ１１ｂについては配列番号：１３に示し、ＢＭＬ１１ｃについては配列番号：１４に示す。さらに、実施例２８において用いたプライマーの塩基配列は表４０に示す。【０３１１】
（実施例２９）
＜ＣＢＡの精製＞
湿重量１ｋｇのヒゲミルを液体窒素で凍結、粉末化し、５００ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液（ＴＢＳ、ｐＨ７．５）を加えて一晩攪拌した。混合物を１３，５００ｇにて３０分間遠心し、上清を回収し、終濃度７５％飽和となるように硫安を加えて３０分間攪拌した後に一晩静置して、その後１３，５００ｇにて３０分間遠心して沈殿を回収した。沈殿物は少量のＴＢＳに溶解し、ＴＢＳで透析して硫安を除去した。透析液を１０，０００ｇ，３０分間遠心して沈殿物を除いた後に２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４緩衝液（ｐＨ７．５）に透析して、３．３１ｍｌのＴＳＫｇｅｌ  Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷカラム（７．５ｘ７５ｍｍ）に流し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎにて１〜０Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４の勾配により溶出を行った。次いで、血球凝集活性のある画分を集め、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．８５％  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に透析することにより、１ｋｇのヒゲミルから８ｍｇの精製ＣＢＡを得た。【０３１２】
なお、還元状態のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは精製ＣＢＡは分子量６．５と１４．３ｋＤａとの間に、非還元状態では１４．３と２０．１ｋＤａとの間に各々単一バンドとして検出された。また、精製ＣＢＡはトリプシン処理したウサギ赤血球を７８１ｎｇ／ｍｌで凝集する活性があり、３１μｇ／ｍｌのブタアシアロサイログロブリンで血球凝集活性は抑制された。【０３１３】
（実施例３０）
＜ＣＢＡのｃＤＮＡクローニング＞
ＲＮＡｌａｔｅｒ中で−２０℃保存したヒゲミル（Ｃｏｄｉｕｍ  ｂａｒｂａｔｕｍ）藻体よりＰｌａｎｔ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて全ＲＮＡを抽出後、ＮｕｃｌｅｏＴｒａｐ  ｍＲＮＡによりｍＲＮＡを精製し、さらにＧｅｎｅＲａｃｅｒ  Ｋｉｔにより完全長ｃＤＮＡを調製した。また、実施例２９において精製したＣＢＡを用いて、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。そして、このＣＢＡのＮ末端アミノ酸配列からプライマーＣＢＡ＿ｄ＿Ｆ１を設計し、上記ヒゲミル由来完全長ｃＤＮＡ溶液を鋳型にＲＡＣＥ法に供した。まず、３’ＲＡＣＥとして、ＣＢＡ＿ｄ＿Ｆ１及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿３’＿Ｐｒｉｍｅｒのプライマーペア、並びにＢｌｅｎｄＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲを行った。【０３１４】
なお、ＰＣＲ反応溶液（１０μｌ）の組成は下記の通りである。
１ｘＢｌｅｎｄ  Ｔａｑバッファー；ｄＮＴＰｍｉｘ２ｎｍｏｌ、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿３’＿Ｐｒｉｍｅｒ  ６ｐｍｏｌ、ＣＢＡ＿ｄ＿Ｆ１  ５０ｐｍｏｌ、１０倍希釈完全長ｃＤＮＡ溶液  １μｌ、Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．２５Ｕ。また、ＰＣＲの反応条件は、熱変性９４℃５分後、熱変性９４℃３０秒、アニーリングは５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、または６４℃３０秒及び伸長反応７２℃９０秒のサイクルを３５回行い、最後に７２℃５分で反応終了した。反応が終了したＰＣＲ反応溶液を回収し、アニーリングに用いた８つの温度すべてのＰＣＲ産物をプールした。【０３１５】
プールしたＰＣＲ産物を滅菌水で１００倍希釈して鋳型とし、プライマー対としてＣＦＡをＬｙｓ−Ｃで部分消化したペプチド配列から設計したＣＢＡ＿ｄ＿Ｆ２ｌプライマー（濃度５０ｐｍｏｌ）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿３’＿Ｎｅｓｔｅｄ＿Ｐｒｉｍｅｒ（濃度２ｐｍｏｌ）を用いてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲ反応はアニーリング温度を５４℃とした以外は上記と同様に行った。【０３１６】
次いで、得られた増幅産物につき塩基配列の決定に供し、５’ＲＡＣＥのためのプライマーＣＢＡ＿Ｒ１を設計した。そして、５’ＲＡＣＥとして、ＣＢＡ＿Ｒ１及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿５’＿Ｐｒｉｍｅｒのプライマーペアを用いて、ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  Ｎｅｏ  ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲに供した。ＰＣＲ反応溶液組成は同ＤＮＡポリメラーゼの添付説明書に従って行った。ＰＣＲの反応条件は、熱変性９４℃２分後、熱変性９８℃１０秒、アニーリングは５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、または６４℃３０秒及び伸長反応６８℃３０秒のサイクルを３５回行い、最後に６８℃５分で反応終了した。反応が終了したＰＣＲ反応溶液を回収し、アニーリングに用いた８つの温度すべてのＰＣＲ産物をプールした。
プールしたＰＣＲ産物を滅菌水で１００倍希釈して鋳型とし、プライマー対としてＣＢＡ＿Ｒ２  プライマー及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿５’＿Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒを用いて  ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲ反応は上記と同様に行った。得られた増幅産物につき塩基配列の決定に供し、３’ＲＡＣＥにより得られた配列を合わせて、ＣＢＡのｃＤＮＡ全長配列を明らかにした。得られた塩基配列を配列番号：３９に示す。また、得られた塩基配列に基づくアミノ酸配列を配列番号：３８に示す。さらに、実施例３０において用いたプライマーの塩基配列は表４０に示す。【０３１７】
（実施例３１）
＜ＢＣＬ１１ｄのｃＤＮＡクローニング＞
実施例２７で調製したネザシハネモ由来の完全長ｃＤＮＡを鋳型に、ＢＭＬ１１ｃ＿５’Ｅｎｄ＿Ｆ及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿３’＿Ｐｒｉｍｅｒのプライマーペアに、ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  Ｎｅｏ  ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲに供した。なお、ＰＣＲ反応溶液組成及び反応条件は同ＤＮＡポリメラーゼの添付説明書に従って行った。得られた増幅産物につき塩基配列の決定に供したところ、ＢＭＬ１１ｃと配列が一致する配列と、ＢＣＬ１１ｃと配列が異なるＢＣＬ１１ｃ様ｃＤＮＡが得られた。そのため、前者をＢＣＬ１１ｃ、後者をＢＣＬ１１ｄと命名した。ＢＣＬ１１ｄの５’末端配列を確認するために、ＢＣＬ１１ｄの３’末端配列を参考に設計したプライマーＢＣＬ１１ｃ＿３’Ｅｎｄ＿Ｒ及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿５’＿Ｐｒｉｍｅｒのプライマーペアに、ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  Ｎｅｏ  ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲに供した。なお、ＰＣＲ反応溶液組成及び反応条件は同ＤＮＡポリメラーゼの添付説明書に従って行った。得られた増幅産物につき塩基配列の決定に供し、ＢＣＬ１１ｄ  ｃＤＮＡ全長配列を明らかにした。得られた塩基配列を配列番号：４１に示す。また、得られた塩基配列に基づくアミノ酸配列を配列番号：４０に示す。さらに、実施例３１において用いたプライマーの塩基配列は表４０に示す。【０３１８】
（実施例３２）
＜ＣＦＡ（ＣＦＡ１及びＣＦＡ２）のｃＤＮＡクローニング＞
ＲＮＡｌａｔｅｒ中で−２０℃保存したミル（Ｃｏｄｉｕｍ  ｆｒａｇｉｌｅ）藻体よりＰｌａｎｔ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて全ＲＮＡを抽出後、ＮｕｃｌｅｏＴｒａｐ  ｍＲＮＡによりｍＲＮＡを精製し、さらにＧｅｎｅＲａｃｅｒ  Ｋｉｔにより完全長ｃＤＮＡを調製した。【０３１９】
ＣＦＡのアミノ酸部分配列から、ＣＦＡ＿５’ＲＡＣＥ＿Ｒ１を設計し、上記ミル由来完全長ｃＤＮＡ溶液を鋳型にＲＡＣＥ法に供した。まず、５’ＲＡＣＥとして、ＣＦＡ＿５’ＲＡＣＥ＿Ｒ１及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿５’＿Ｐｒｉｍｅｒのプライマーペア並びにＢｌｅｎｄＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲ反応溶液（１０μｌ）の組成は下記の通りである。
１ｘＢｌｅｎｄ  Ｔａｑバッファー；ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  ２ｎｍｏｌ、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿５’＿Ｐｒｉｍｅｒ  ６ｐｍｏｌ、ＣＦＡ＿５’ＲＡＣＥ＿Ｒ１  ５０ｐｍｏｌ、１０倍希釈完全長ｃＤＮＡ溶液  １μｌ、Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．２５Ｕ。また、ＰＣＲの反応条件は、熱変性９４℃３分後、熱変性９４℃３０秒、アニーリング５０℃３０秒及び伸長反応７２℃６０秒のサイクルを３０回行い、最後に７２℃５分で反応終了した。【０３２０】
次に、アミノ酸部分配列から設計したＣＦＡ＿５’ＲＡＣＥ＿Ｒ２と、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿５’＿Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒとのプライマーペアを用いて先に増幅されたＰＣＲ産物を鋳型にしてＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲ反応溶液（５０μｌ）の組成は下記の通りである。
１ｘＢｌｅｎｄ  Ｔａｑバッファー；ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  ２ｎｍｏｌ、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿５’＿Ｐｒｉｍｅｒ  ２ｐｍｏｌ、ＣＦＡ＿５’ＲＡＣＥ＿Ｒ１  ５０ｐｍｏｌ、１０倍希釈完全長ｃＤＮＡ溶液  １μｌ、Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．２５Ｕ。また、ＰＣＲの反応条件は、アニーリング温度を６０℃、伸長反応を１分とし、前記同様に行い、得られた増幅産物につき塩基配列決定に供したところ、異なる配列を有する２つの増幅配列が得られたのでＣＦＡ１及びＣＦＡ２と名付けた。次に、３’ＲＡＣＥとして、ＣＦＡ１＿３’ＲＡＣＥ＿Ｆ又はＣＦＡ２＿３’ＲＡＣＥ＿Ｆ、及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿３’＿Ｐｒｉｍｅｒのプライマーペアを用いて、上記と同様にしてＰＣＲを行い、得られた増幅産物につき塩基配列決定に供した。そして、５’ＲＡＣＥにより得られた配列を合わせて、ＣＦＡ１及びＣＦＡ２のｃＤＮＡ全長配列を明らかにした。得られた塩基配列を、ＣＦＡ１については配列番号：４３に示し、ＣＦＡ２については配列番号：４５に示す。また、得られた塩基配列に基づくアミノ酸配列を、ＣＦＡ１については配列番号：４２に示し、ＣＦＡ２については配列番号：４４に示す。さらに、実施例３２において用いたプライマーの塩基配列は表４０に示す。【０３２１】
（実施例３３）
＜ＣＬＡのｃＤＮＡクローニング＞
ＲＮＡｌａｔｅｒ中で−２０℃保存したヒラミル（Ｃｏｄｉｕｍ  ｌａｔｕｍ）藻体よりＰｌａｎｔ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて全ＲＮＡを抽出後、ＮｕｃｌｅｏＴｒａｐ  ｍＲＮＡによりｍＲＮＡを精製し、さらにＧｅｎｅＲａｃｅｒ  Ｋｉｔにより完全長ｃＤＮＡを調製した。【０３２２】
ＣＬＡの既知Ｎ末端アミノ酸配列から、ＣＬＡ＿ｄ＿Ｆ１を設計し、上記ヒラミル由来完全長ｃＤＮＡ溶液を鋳型にＲＡＣＥ法に供した。まず、３’ＲＡＣＥとして、ＣＬＡ＿ｄ＿Ｆ１及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿３’＿Ｐｒｉｍｅｒのプライマーペア並びにＢｌｅｎｄＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲ反応溶液（１０μｌ）の組成は下記の通りである。
１ｘＢｌｅｎｄ  Ｔａｑバッファー；ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  ２ｎｍｏｌ、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿３’＿Ｐｒｉｍｅｒ  ６ｐｍｏｌ、ＣＬＡ＿ｄ＿Ｆ１  ５０ｐｍｏｌ、１０倍希釈完全長ｃＤＮＡ溶液  １μｌ、Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．２５Ｕ。また、ＰＣＲの反応条件は、熱変性９４℃５分後、熱変性９４℃３０秒、アニーリングは５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、または６４℃３０秒及び伸長反応７２℃６０秒のサイクルを３５回行い、最後に７２℃５分で反応終了した。反応が終了したＰＣＲ反応溶液を回収し、アニーリングに用いた８つの温度すべてのＰＣＲ産物をプールした。【０３２３】
次に、アミノ酸部分配列から設計したＣＬＡ＿ｄ＿Ｆ２と、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿３’＿Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒとのプライマーペアを用いて先に増幅シ、プールしたＰＣＲ産物を鋳型にＰＣＲを行った。ＣＬＡ＿ｄ＿Ｆ２の濃度を５０ｐｍｏｌ、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿３’＿Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒの濃度を２ｐｍｏｌ及びアニーリング温度を５８℃とした以外のＰＣＲ条件は上記と同じである。  次いで、得られた増幅産物につき塩基配列決定に供した。そして、５’ＲＡＣＥとして、３’ＲＡＣＥの配列情報から設計したＣＬＡ＿３’Ｅｎｄ＿Ｒ及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿５’＿Ｐｒｉｍｅｒのプライマーペアを用いて、ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  Ｎｅｏ  ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲに供した。ＰＣＲ反応溶液組成は同ＤＮＡポリメラーゼの添付説明書に従って行った。ＰＣＲの反応条件は、熱変性９４℃２分後、熱変性９８℃１０秒、アニーリングは６０℃３０秒及び伸長反応６８℃３０秒のサイクルを３５回行い、最後に６８℃５分で反応終了した。得られた増幅産物につき塩基配列の決定に供し、３’ＲＡＣＥにより得られた配列を合わせて、ＣＬＡのｃＤＮＡ全長配列を明らかにした。得られた塩基配列を配列番号：４７に示す。また、得られた塩基配列に基づくアミノ酸配列を配列番号：４６に示す。さらに、実施例３３において用いたプライマーの塩基配列は表４０に示す。【０３２４】
（実施例３４）
＜ＭＰＡ１及びＭＰＡ２のｃＤＮＡクローニング＞
ＲＮＡｌａｔｅｒ中で−２０℃保存したトサカノリ（Ｍｅｒｉｓｔｏｔｈｅｃａ  ｐａｐｕｌｏｓａ）藻体よりＰｌａｎｔ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて全ＲＮＡを抽出後、ＮｕｃｌｅｏＴｒａｐ  ｍＲＮＡによりｍＲＮＡを精製し、さらにＧｅｎｅＲａｃｅｒ  Ｋｉｔにより完全長ｃＤＮＡを調製した。【０３２５】
実施例２６に記載のＫＡＡ１の塩基配列を参考にプライマーＫＡＡ＿ｃｏｍｍｏｎ＿Ｆ１を設計し、前記トサカノリ由来完全長ｃＤＮＡ溶液を鋳型にＲＡＣＥ法に供した。まず、３’ＲＡＣＥとして、ＫＡＡ＿ｃｏｍｍｏｎ＿Ｆ１及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿３’＿Ｐｒｉｍｅｒのプライマーペア並びにＢｌｅｎｄＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲを行った。【０３２６】
ＰＣＲ反応溶液及び反応条件：１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒを８．０μｌ、ｄＮＴＰｍｉｘ（２．５ｍＭずつ）を８μｌ、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（ＴＭ）  ３’  Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）を４．８μｌ、ＫＡＡ＿ｃｏｍｍｏｎ＿Ｆ１（１００μＭ）を４μｌ、１０倍希釈トサカノリ由来ｃＤＮＡ溶液を１．６μｌ、Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ（登録商標）（２．５Ｕ／μｌ）を０．８μｌ及び滅菌水を加えて反応液を８０μｌとし十分に混合した後、１０μｌずつ分注してＰＣＲに供した。ＰＣＲ反応はＴ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ９６  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社製）を用いて、９４℃で５分間の熱変性の後、熱変性を９４℃で３０秒間、アニーリングは５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、または６４℃３０秒間及び伸長反応を７２℃で１分間のサイクルを３０回行った。最後に７２℃で５分間保持し、反応を終了した。【０３２７】
続いて、アニーリング温度５０〜５８℃で行ったＰＣＲ産物をプールし、滅菌水で１００倍希釈して鋳型とし、プライマー対としてＫＡＡ＿３’ＲＡＣＥ＿ｄ＿Ｆ１（１００μＭ）またはＫＡＡ＿３’ＲＡＣＥ＿ｄ＿Ｆ２（１００μＭ）４μｌ及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿３’  ＿Ｎｅｓｔｅｄ＿Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）を１．６μｌを用いてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲ反応は上記と同様に行った。【０３２８】
次いで、得られた増幅産物につき塩基配列の決定に供したところ、ＫＡＡ＿３’ＲＡＣＥ＿ｄ＿Ｆ１及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿３’＿Ｎｅｓｔｅｄ＿Ｐｒｉｍｅｒ、並びにＫＡＡ＿３’ＲＡＣＥ＿ｄ＿Ｆ１及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿３’＿Ｎｅｓｔｅｄ＿Ｐｒｉｍｅｒをプライマーペアに用いたものともにＫＡＡ１と配列相同性を示すＤＮＡ断片が得られた。一方、これらは配列類似するものの明らかに異なる配列を有していたことから、前者をＭＰＡ１、後者をＭＰＡ２と命名した。ＭＰＡ１及びＭＰＡ２の５’末端配列を確認するために、それぞれの塩基配列を参考にプライマーＭＰＡ１＿Ｒ１及びＭＰＡ２＿Ｒ１を設計し、５’ＲＡＣＥに供した。すなわち、ＭＰＡ１＿Ｒ１及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿５’＿Ｐｒｉｍｅｒのプライマーペア、又はＭＰＡ２＿Ｒ１及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ＿５’＿ＰｒｉｍｅｒのプライマーペアにＢｌｅｎｄ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲに供した。なお、ＰＣＲ反応溶液組成及び反応条件は同ＤＮＡポリメラーゼの添付説明書に従って行った。得られた増幅産物につき塩基配列の決定に供し、ＭＰＡ１及びＭＰＡ２の５’末端塩基配列を決定した。そして、３’ＲＡＣＥにより得られた配列を合わせて、ＭＰＡ１およびＭＰＡ２の全長塩基配列を明らかにした。得られた塩基配列を、ＭＰＡ１については配列番号：４９に示し、ＭＰＡ２については配列番号：５１に示す。また、得られた塩基配列に基づくアミノ酸配列を、ＭＰＡ１については配列番号：４８に示し、ＭＰＡ２については配列番号：５０に示す。さらに、実施例３４において用いたプライマーの塩基配列は表４０に示す。【０３２９】
（実施例３５）
＜ＡＣ−ａｖｒａｎｉｎの精製＞
ベトナムのニャチャンで採集した海藻アブラインビレア  カピチュリフォルミス(Ａｖｒａｉｎｖｉｌｌｅａ  ｃａｐｔｉｔｕｌｉｆｏｒｍｉｓ)（和名不詳）を検体として用いた。試料は採集後−３０℃下で保存し，４℃下で解凍して供試した。解凍試料（３００ｇ）を測り取り、ハサミで細断し，液体窒素下ブレンダーを用いて粉末とした。これに６００ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ＴＢ，ｐＨ７．５）を加え、４℃下で一晩撹拌後、遠心分離（８，５００ｒｐｍ、３０分、４℃）し、上清を得て抽出液とした。次いで、抽出液に硫安粉末を７５％飽和濃度となるように撹拌しながら加え、３０分撹拌後，一晩静置した。これを遠心分離（８，５００ｒｐｍ、３０分、４℃）して得られた沈殿を少量のＴＢに溶かし、同緩衝液に対して十分透析した。そして、内液を回収して７５％飽和硫安塩析画分とした。得られた硫安塩析画分をスーパーデックス７５カラム（１０×３００ｍｍ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いるゲルろ過に供した。すなわち、硫安塩析画分１ｍｌずつを０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．０）で平衡化したスーパーデックス７５カラムに供し、同緩衝液で溶出した。溶出液は１ｍｌずつ分取し、２８０ｎｍにおける吸光度及びトリプシン処理ウサギ赤血球に対する凝集活性を測定した。本ゲルろ過での精製を計１８回行った。そして、各活性画分を回収し、合一した。また、本精製画分は、還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて、分子量１８０００の単一バンドを示した。【０３３０】
（実施例３６）
＜ａｌｇＣＳＡの精製＞
採集後、冷凍保存（−３０℃）していた緑藻クロミル（Ｃｏｄｉｕｍ  ｓｕｂｔｕｂｕｌｏｓｕｍ（コディウム  スブトゥブロスム））を試料とした。凍結試料を抽出前日に４℃下に一晩置くことにより解凍した。解凍試料５００ｇをハサミで細断後，液体窒素下ブレンダーを用いて粉末とした。これに１０００ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ＴＢ，ｐＨ７．５）を加え，４℃下で一晩撹拌後，遠心分離（８，５００ｒｐｍ、３０分、４℃）し，上清を得て抽出液（９４５ｍｌ，７４６ｍｇ  タンパク質）とした。次いで、抽出液に固形硫安を７５％飽和濃度となるよう撹拌しながら加え、４℃下でさらに３０分撹拌した後、一晩静置した。これを遠心分離（８，５００ｒｐｍ、３０分、４°Ｃ）して得られた沈殿を少量のＴＢに溶かし、ＴＢに対して十分透析した。次いで、内液を回収し、７５％飽和硫安塩析画分（１１７ｍｌ、２４２ｍｇ）とし、次の実験に供するまで−２０°Ｃで凍結保存した。そして、硫安塩析画分を２０ｍＭ  ＴＢ（ｐＨ７．５）で平衡化したウシ顎下腺ムチン固定化カラム（１ｘ１０ｃｍ）に添加した。カラムを同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液中１Ｍ  ＮａＣｌ及び０．２Ｍ  Ｎ−アセチルガラクトサミンで順次溶出した。流速は０．２ｍｌ／ｍｉｎとし、溶出液を２ｍｌずつ分取し、各フラクションの２８０ｎｍの吸光度及びトリプシン処理ウサギ赤血球に対する凝集活性を測定した。そして、凝集活性を示した０．２Ｍ  ＧａｌＮＡｃ溶出画分（４．５ｍｌ、１．８５ｍｇ）を最終精製標品とした。また、精製タンパク質の分子量は１３０００Ｄａであった。
【産業上の利用可能性】
【０３３１】
以上説明したように、本発明によれば、静止期であっても、対数増殖期であっても、さらには食品中であっても、ブドウ球菌属内の菌種を判別することが可能となる。さらに、本発明において、ＨＡＡ、ＨＰＡ、ＬＥＬ、ＳＴＬ、Ｔａｃｈｙｌｅｃｔｉｎ−２、ＵＬＬ又はＢＣＬ１１を用いることにより、ブドウ球菌属内の菌種の判別のみならず、ブドウ球菌とブドウ球菌属以外の細菌とを判別することができる。したがって、本発明は、食品の衛生検査や感染症患者の検査等として有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０３３２】
配列番号１８〜３３、７４〜８９
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号２２、２３、２４、２７、３１、７４、７５、７９、８０、８３、８４及び８７
＜２２３＞  ｎはイノシンを示す
配列番号７３
＜２２３＞  Ｘａａはピログルタミン酸を示す
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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