(57)【要約】  試料中に含まれるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのアミノ酸配列中に存在するアスパラギン酸のペプチド結合を切断し、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドをペプチド断片にする切断工程；  前記切断工程で切断されたペプチド断片を液体クロマトグラフィーにより分離精製し、測定対象物質であるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのN末端側のペプチド断片を選定する分離精製工程；  前記分離精製工程で分離精製されたペプチド断片を質量分析し、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのＮ末端側のペプチド断片を検出する分析工程；を含む、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの分析方法を提供する。【選択図】  図１０
2012121302.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのアミノ酸配列中に存在するアスパラギン酸のペプチド結合を切断し、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドをペプチド断片にする切断工程；
前記切断工程で切断されたペプチド断片を液体クロマトグラフィーにより分離精製し、測定対象物質であるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのN末端側のペプチド断片を選定する分離精製工程；
前記分離精製工程で分離精製されたペプチド断片を質量分析し、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのＮ末端側のペプチド断片を製造する分析工程；
を含む、試料中に含まれるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの分析方法。
【請求項２】
前記切断工程において、配列特異的切断プロテアーゼ又は酸から選択される切断物質を用いてアスパラギン酸のペプチド結合を切断する、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記切断物質が、エンドペプチダーゼASP-N、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の分析方法。
【請求項４】
前記分離精製工程において、液体クロマトグラフィーが、流速50nL/min〜50μL/minの液体クロマトグラフィーである、請求項１〜３のいずれかに記載の分析方法。
【請求項５】
前記グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドが、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド、グルカゴン様ペプチド-1、グルカゴン様ペプチド-2、グルカゴン、及びそれらの類縁体からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の分析方法。
【請求項６】
前記分離精製工程において、プレカーサーイオンの質量選択により測定対象物質を選定する、請求項１〜５のいずれかに記載の分析方法。
【請求項７】
さらに、前記分離精製工程において、前記ペプチド断片を固相抽出する工程を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の分析方法。
【請求項８】
前記分離精製工程及び分析工程が、高速液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー／マススペクトロメトリー／マススペクトロメトリーにより行われる、請求項１〜７のいずれかに記載の分析方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の分析方法を用いて検量線を作成し、前記検量線を用いて、試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを定量する、試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの定量方法。
【請求項１０】
２種以上のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのペプチド断片を、同時にそれぞれ測定することにより、試料中の２種以上のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを区別して同時に定量する、請求項９に記載の定量方法。
【請求項１１】
活性型グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのペプチド断片と、非活性型グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのペプチド断片とを、同時にそれぞれ測定することにより、試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの活性型と非活性型とを区別して同時に定量する、請求項９又は１０に記載の定量方法。
【請求項１２】
前記検量線を、安定同位体で標識された内標準物質を試料に加えて作成する、請求項９〜１１のいずれかに記載の定量方法。
【請求項１３】
測定対象のペプチド断片及び内標準物質のペプチド断片の各ピーク面積比を用いて定量する、請求項１２に記載の定量方法。
【請求項１４】
前記内標準物質が、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのアミノ酸配列において１位〜15位から選択される1又はそれ以上のアミノ酸を、安定同位体で標識されたアミノ酸で置換したペプチドである、請求項１２又は１３に記載の定量方法。
【請求項１５】
(a)コントロール用マトリクス、
(b)内標準物質又はその溶液、
(c)グルカゴン・セクレチンファミリーペプチド又はそれらの標準物質、若しくはそれらの溶液、
(d)切断物質、
(e)固相抽出プレート
を含む、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの定量用キット。
【請求項１６】
前記切断物質が、エンドペプチダーゼASP-N、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５に記載の定量用キット。
【請求項１７】
前記グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドが、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド、グルカゴン様ペプチド-1、グルカゴン様ペプチド-2、グルカゴン、及びそれらの類縁体からなる群から選択される、請求項１５又は１６に記載の定量用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの分析方法、及び当該分析方法を用いた試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドとは、グルカゴン等とアミノ酸配列の相同性が高いペプチドの総称である。生体内等におけるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの濃度を正確に把握することは、機能研究の上で、患者の疾患状態を把握する上で、又はそれら疾患を改善するための医薬品の開発をする上で重要である。【０００３】
グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの定量方法としては、酵素免疫測定法（ELISA）及びラジオイムノアッセイ（RIA）等で代表されるように、抗体を使用する定量方法が一般的である。しかし、抗体を調製するためには、長時間を要し、かつ高い費用が必要となる。抗体が得られたとしても、抗体は相同性の高い他の生理活性物質とも反応するといった交差性の問題が生じる場合がある。【０００４】
近年、質量分析（mass spectrometry：MS）を用いたグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの定量方法が報告されている(非特許文献1〜3、特許文献1)。しかし、非特許文献１及び２は前処理として抗体を用いており、特許文献１及び非特許文献３は定量感度等の点で未だ満足できるものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第2008/154619号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J Chromatogr A，2001，926，21
【非特許文献２】J Chromatogr B，2004，803，91
【非特許文献３】J Proteome Res，2009，8，3487
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
質量分析を用いた定量方法は、定量感度の点で未だ満足できるものはなく、微量試料での定量方法の確立が求められているのが現状である。さらに、質量分析用に試料を調製した後、測定前に数日間保存すると、測定値の変化を生じる場合がある。本発明はこれらに鑑みてなされたものであり、測定用試料が保存中に化学変化等を受け難く、実用的な条件において、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを安定に分析することが可能な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、測定対象であるペプチド断片によって、質量分析の測定値が安定する場合と安定しない場合がある点に気が付いた。そして、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを分析する場合は、分析するペプチド断片の選択が重要であることを見出した。すなわち、本分析方法は、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチド中のアスパラギン酸のペプチド結合を切断し、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのN末端側のペプチド断片を測定対象として選択することを主たる特徴とする。【０００９】
本発明の主な構成は次のとおりである。
(1)試料中に含まれるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのアミノ酸配列中に存在するアスパラギン酸のペプチド結合を切断し、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドをペプチド断片にする切断工程；前記切断工程で切断されたペプチド断片を液体クロマトグラフィーにより分離精製し、測定対象物質であるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのN末端側のペプチド断片を選定する分離精製工程；前記分離精製されたペプチド断片を質量分析し、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのＮ末端側のペプチド断片を検出する分析工程；を含む、試料中に含まれるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの分析方法。
(2)前記切断工程において、配列特異的切断プロテアーゼ又は酸から選択される切断物質を用いてアスパラギン酸のペプチド結合を切断する、(1)に記載の分析方法。
(3)前記切断物質が、エンドペプチダーゼASP-N、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、(2)に記載の分析方法。
(4)前記分離精製工程において、液体クロマトグラフィーが、流速50nL/min〜50μL/minの液体クロマトグラフィーである、(1)〜(3)のいずれかに記載の分析方法。
(5)前記グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドが、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド、グルカゴン様ペプチド-1、グルカゴン様ペプチド-2、グルカゴン、及びそれらの類縁体からなる群から選択される、(1)〜(4)のいずれかに記載の分析方法。
(6)前記分離精製工程において、プレカーサーイオンの質量選択により測定対象物質を選定する、(1)〜(5)のいずれかに記載の分析方法。
(7)さらに、前記分離精製工程において、前記ペプチド断片を固相抽出する工程を含む、(1)〜(6)のいずれかに記載の分析方法。
(8)前記分離精製工程及び分析工程が、高速液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー／マススペクトロメトリー／マススペクトロメトリーにより行われる、(1)〜(7)のいずれかに記載の分析方法。
(9)(1)〜(8)のいずれかに記載の分析方法を用いて検量線を作成し、前記検量線を用いて、試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを定量する、試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの定量方法。
(10)２種以上のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのペプチド断片を、同時にそれぞれ測定することにより、試料中の２種以上のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを区別して同時に定量する、(9)に記載の定量方法。
(11)活性型グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのペプチド断片と、非活性型グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのペプチド断片とを、同時にそれぞれ測定することにより、試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの活性型と非活性型とを区別して同時に定量する、(9)又は(10)に記載の定量方法。
(12)前記検量線を、安定同位体で標識された内標準物質を試料に加えて作成する、(9)〜(11)のいずれかに記載の定量方法。
(13)測定対象のペプチド断片及び内標準物質のペプチド断片の各ピーク面積比を用いて定量する、(12)に記載の定量方法。
(14)前記内標準物質が、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのアミノ酸配列において１位〜15位から選択される1又はそれ以上のアミノ酸を、安定同位体で標識されたアミノ酸で置換したペプチドである、(12)又は(13)に記載の定量方法。
(15)(a)コントロール用マトリクス、(b)内標準物質又はその溶液、(c)グルカゴン・セクレチンファミリーペプチド又はそれらの標準物質、若しくはそれらの溶液、(d)切断物質、(e)固相抽出プレートを含む、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの定量用キット。
(16)前記切断物質が、エンドペプチダーゼASP-N、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、(15)に記載の定量方法。
(17)前記グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドが、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド、グルカゴン様ペプチド-1、グルカゴン様ペプチド-2、グルカゴン、及びそれらの類縁体からなる群から選択される、(15)又は(16)に記載の定量方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、調製後時間が経っても精度よくグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを分析できる。あるいは、試料中の微量のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを高感度で定量でき、定量値の再現性が良好である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】2種類のペプチド断片を等量混合し、直後にLC/MS分析した際のクロマトグラムを示す図である。
【図２】2種類のペプチド断片を等量混合し、冷蔵保存後17日目にLC/MS分析した際のクロマトグラムを示す図である。
【図３】GIP類縁体をエンドペプチダーゼAsp-Nで切断した際のクロマトグラムを示す図である。
【図４】GIPを2%ギ酸で切断した際のクロマトグラムを示す図である。
【図５】GIPを2%酢酸で切断した際のクロマトグラムを示す図である。
【図６】GIPを1%トリフルオロ酢酸で切断した際のクロマトグラムを示す図である。
【図７】GLP-1をエンドペプチダーゼAsp-Nで切断した際のクロマトグラムを示す図である。
【図８】GlucagonをエンドペプチダーゼAsp-Nで切断した際のクロマトグラムを示す図である。
【図９】GLP-1類縁体をエンドペプチダーゼAsp-Nで切断した際のクロマトグラムを示す図である。
【図１０】活性型GIP定量時の、活性型GIPのペプチド断片及び対応する内標準物質のクロマトグラムを示す図である。
【図１１】活性型GIP定量における活性型GIPの検量線を示す図である。
【図１２】活性型GIP及び非活性型GIP同時定量時の、活性型GIPのペプチド断片及び対応する内標準物質のクロマトグラムを示す図である。
【図１３】活性型GIP及び非活性型GIPの同時定量時の、非活性型GIPのペプチド断片及び対応する内標準物質のクロマトグラムを示す図である。
【図１４】活性型GIP及び非活性型GIPの同時定量における、活性型GIPの検量線を示す図である。
【図１５】活性型GIP及び非活性型GIPの同時定量における、非活性型GIPの検量線を示す図である。
【図１６】糖尿病患者血漿試料中の活性型GIP及び非活性型GIPの同時定量時の、活性型GIPのクロマトグラムを示す図である。
【図１７】糖尿病患者血漿試料中の、活性型GIP及び非活性型GIPの同時定量時の、非活性型GIPのクロマトグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明の実施形態を更に詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１３】
本発明で分析するグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドは、グルカゴン等とアミノ酸配列の相同性が高いペプチドである。ここで定義するグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドには、その類縁体も含まれる。グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドとしては、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（GIP）、グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）、グルカゴン様ペプチド-2（GLP-2）、グルカゴン（Glucagon）等が挙げられる。中でも、GIP、GLP-1は、インクレチンとして知られている。ここには、生体内に内在するもの、人工的に合成されたもの、及び種変異体が含まれる。
【００１４】
グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの類縁体とは、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加（例えば、挿入）されたものであって、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドと実質的に同様の活性を有するものをいう。グルカゴン・セクレチンファミリーペプチド類縁体のアミノ酸配列は、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのアミノ酸配列と80％以上の相同性を有するものが好ましい。このようなペプチドデザインは、効果の増強、選択性の強化、又はペプチド分解に対する安定性などを目的として成され、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの種類によって異なるが、当業者に周知の方法で行うことができる。また、糖鎖、脂肪酸、脂質、核酸などがペプチド鎖に結合しているグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドであってもよい。すなわち、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの類縁体とは、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの誘導体、並びに修飾型、キメラ型及びハイブリット型形態が含まれる。
【００１５】
グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（以下、GIPという。）は、アミノ酸42個からなる活性型GIPがあり、GIP1-42［配列番号13］と表記するのが通常である。活性型GIPは、DPP-IVによりN末端側アミノ酸が2残基切断され、非活性型のGIP3-42［配列番号14］となる。従って、GIPのN末端側のペプチド断片を測定することにより、活性型GIPと非活性型GIPとを区別して同時に分析又は定量することができる。GIPは、ヒト、マウス、又はラットなどの種差により、1以上のアミノ酸が置換されている。ヒト活性型GIPは、以下の配列からなるペプチドであるが、マウス及びラットでは、18位のHisがArgに置換されている。
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln［配列番号13］
【００１６】
GIPの類縁体としては、具体的には、次のものがよく知られている。尚、非活性型GIPの類縁体としては、これらGIP類縁体のN末端側アミノ酸が2残基切断されたペプチドが挙げられる（なお、アミノ酸配列に変更がなく、アミノ酸の一部修飾体については、配列番号は省略する）。
[N-Acetyl]-GIP［配列番号13のN-Acetyl変異体］、 [N-Pyroglutamyl]-GIP［配列番号13のN-Pyroglutamyl変異体］、 [N-Glucitol]-GIP［配列番号13のN-Glucitol変異体］、 [N-Palmitate]-GIP［配列番号13のN-Palmitate変異体］、 [N-Fmoc]-GIP［配列番号13のN-Fmoc変異体］、 [N-alkyl]-GIP［配列番号13のN-alkyl変異体］、 [N-glycosyl]-GIP［配列番号13のN-glycosyl変異体］、 [N-isopropyl]-GIP［配列番号13のN-isopropyl変異体］、 [Gly2]-GIP［配列番号15］、 [D-Ala2]-GIP［配列番号16］（但し、D-Alaは、D型Alanineを意味する。下記においても同じ）。、 [Aib2]-GIP［配列番号17］（但し、Aibは、Aminoisobutylic acidを意味する。下記においても同じ。）、 [Phosphoserine2]-GIP［配列番号18］、 [Sar2]-GIP［配列番号19］（但し、Sarは、N-Methylglycine(MeGly), sarcosineを意味する。下記においても同じ。）、 [Pro3]-GIP［配列番号20］、 [Hyp3]-GIP［配列番号21］（但し、Hypは、Hydroxyprolineを意味する。下記においても同じ。）、 [Lys3]-GIP［配列番号22］、 [Tyr3]-GIP［配列番号23］、 [Phe3]-GIP［配列番号24］、[Ser2]-GIP［配列番号113］
【００１７】
グルカゴン様ペプチド-1（glucagon-like peptide-1：以下、GLP-1という。）は、通常、活性体として、GLP-1（7-36）［配列番号25］のアミド又はGLP-1（7-37）［配列番号26］のアミドが知られている。国際特許出願第91/11457号には、GLP-1（7-34）［配列番号27］、GLP-1（7-35）［配列番号28］にも活性があることが報告されている。一般的には、GLP-1前駆体のN末端を1位と表記するため、活性型GLP-1はN末端が7位である。活性型GLP-1は、GIPと同様に、DPP-IVによりN末端側アミノ酸が2残基切断され活性を失い、GLP-1（9-36）［配列番号29］、GLP-1（9-37）［配列番号30］等となる。従って、GLP-1のN末端側フラグメントを測定することにより、活性型GLP-1と非活性型GLP-1とを区別して同時に分析又は定量することができる。GLP-1（7-37）は、以下の配列からなるペプチドである。
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly[配列番号26]
【００１８】
GLP-1の類縁体としては、具体的には、次のものがよく知られている。尚、非活性型GLP-1の類縁体としては、これらGLP-1類縁体のN末端側アミノ酸が2残基切断されたペプチドが挙げられる。
[Ser8]-GLP-1(7-37)［配列番号31］、[Gly8]-GLP-1(7-37) ［配列番号32］、[Val8]-GLP-1(7-37) ［配列番号33］、[Glu22]-GLP-1(7-37) ［配列番号34］、[Lys22]-GLP-1(7-37) ［配列番号35］、[Val8，Glu22]-GLP-1(7-37) ［配列番号36］、[Val8，Lys22]-GLP-1(7-37) ［配列番号37］、[Gly8，Glu22]-GLP-1(7-37) ［配列番号38］、[Gly8，Lys22]-GLP-1(7-37) ［配列番号39］、[Val8，Glu30]-GLP-1(7-37) ［配列番号40］、[Gly8，Glu30]-GLP-1(7-37) ［配列番号41］、[Val8，His37]-GLP-1(7-37) ［配列番号42］、[Gly8，His37]-GLP-1(7-37) ［配列番号43］、[Arg34]-GLP-1(7-37) ［配列番号44］、[Lys18]-GLP-1(7-37) ［配列番号45］、[Gly8，Glu22，Gly36]-GLP-1(7-37) ［配列番号46］、[Aib8，Aib22]-GLP-1(7-37) ［配列番号47］、[Aib8，Aib35]-GLP-1(7-37) ［配列番号48］、[Aib8，Aib22，Aib35]-GLP-1(7-37) ［配列番号49］、[Glu22，Glu23]-GLP-1(7-37) ［配列番号50］、[Gly8，Glu22，Glu23]-GLP-1(7-37) ［配列番号51］、[Val8，Glu22，Glu23]-GLP-1(7-37) ［配列番号52］、[Val8，Glu22，Val25]-GLP-1(7-37) ［配列番号53］、[Val8，Glu22，Ile33]-GLP-1(7-37) ［配列番号54］、[Val8，Glu22，Val25，Ile33]-GLP-1(7-37) ［配列番号55］、及びこれらの37位が欠失したGLP-1(7-36)型、並びにこれらの36位と37位とが欠失したGLP-1(7-35)型
【００１９】
他に、GLP-1受容体作動薬としてエキセンディン（Exendin）が知られており、これもGLP-1類縁体に含まれる。Exendinとしては、Exendin-3［配列番号56］、Exendin-3のアミド［配列番号56に同じ配列のC末端アミド誘導体］、Exendin-4［配列番号57］、Exendin-4のアミド［配列番号57に同じ配列のC末端アミド誘導体］、Exendin-4の酸［配列番号57に同じ配列の酸変異体］、Exendin-4-LysLysLysLysLys［配列番号58］、Exendin-4-LysLysLysLysLysLys［配列番号59］、Exendin-4（1-30）［配列番号60］、Exendin-4（1-30）のアミド［配列番号60に同じ配列のC末端アミド誘導体］、Exendin-4（1-28）［配列番号61］、Exendin-4（1-28）のアミド［配列番号61に同じ配列のＣ末端アミド誘導体］、14Leu25Phe-Exendin-4のアミド［配列番号62に同じ配列のC末端アミド誘導体］、及び14Leu25Phe-Exendin-4（1-28）のアミド［配列番号63のC末端アミド誘導体］等の類縁体が知られている。その他の類縁体は国際公開第2009/035540号などに具体的に開示されている。尚、Exendin-4は、アメリカ毒トカゲの唾液腺の分泌物から発見されたGLP-1様活性を有する生理活性ペプチドである。
【００２０】
グルカゴン様ペプチド-2（glucagon-like peptide-2：以下GLP-2という。）とは、プログルカゴンの翻訳後プロセシングを介して生成される33アミノ酸の腸栄養性ペプチドホルモンであり、GLP-2［配列番号64］と表記するのが通常である。GIPと同様に、DPP-IVによりN末端側アミノ酸が2残基切断され活性を失い、非活性型GLP-2（3-33）［配列番号65］となる。GLP-2もN末端側フラグメントを測定することにより、活性型GLP-2と非活性型GLP-2とを区別して同時に分析又は定量することができる。GLP-2の類縁体としては、具体的には、次のものがよく知られている。尚、非活性型GLP-2の類縁体としては、これらGLP-2ペプチドのN末端側アミノ酸が2残基加水分解されたペプチドが挙げられる。
[Ser2]-GLP-2［配列番号66］、[Gly2]-GLP-2 ［配列番号67］、[Val2]-GLP-2［配列番号68］
【００２１】
グルカゴン（以下Glucagonという。）とは、29アミノ酸から成るペプチドホルモンで、Glucagon［配列番号69］と表記するのが通常である。Glucagonの類縁体としては、具体的には、次のものがよく知られている。
[Arg12]-Glucagon［配列番号70］、[Arg12，Lys20]-Glucagon［配列番号71］、[Arg12，Lys24]-Glucagon［配列番号72］、[Arg12，Lys29]-Glucagon［配列番号73］、[Glu9]-Glucagon［配列番号74］、[Glu9，Glu16，Lys29]-Glucagon［配列番号75］、[Lys13，Glu17]-Glucagon［配列番号76］、[Glu20，Lys24]-Glucagon［配列番号77］
【００２２】
試料としては、血液、血清、血漿、尿、唾液、滲出液、及び組織抽出液などの生体試料、並びに薬剤、及び細胞培養液などの生体外試料が挙げられる。好ましくは5μL〜5mL、かつ0.1pM〜500pMの濃度範囲の試料で、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの定量ができる。より好ましくは10μL〜3mL、かつ0.5pM〜200pMの濃度範囲の試料で、上記定量ができる。5mL以下の試料で定量できれば、採血量が少なくてすむため患者らの負担を軽減でき、抽出操作も煩雑にならない。試料が血漿の場合、好ましくは5μL〜500μL、かつ0.1pM〜500pMの濃度範囲の血漿で、上記定量ができる。より好ましくは10μL〜300μL、かつ0.5pM〜200pMの濃度範囲の血漿で上記定量ができる。
【００２３】
グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのペプチド断片とは、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを何らかの方法により切断した後のペプチドのことであり、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのアミノ酸配列の連続した一部分を指す。本分析方法では、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのアミノ酸配列におけるアスパラギン酸（Asp）のペプチド結合を切断し、このペプチド断片のうち、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのN末端側のペプチド断片を質量分析する。この切断は、アスパラギン酸のN末端側を切断しても良いし、C末端側を切断しても良い。このようなペプチド断片は安定した測定値が得られやすく、感度が向上する。また、抗体を使用しなくても質量分析を用いた分析ができる。さらに、多価イオンが生じにくく、種差の影響を軽減できる。例えば、GIPの1位〜17位のアミノ酸配列は、相同性が高く、ヒト、ラット、及びマウスにおいて一致している。保存安定性には、測定対象のペプチド断片が酸化されやすいアミノ酸を含まないことが重要である。酸化されやすいアミノ酸としては、メチオニン（Met）、トリプトファン（Trp）、システイン（Cys）がある。グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのN末端側のペプチド断片は、上記アミノ酸を含まず、保存安定性が良好である。異なるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドであれば、本方法におけるペプチド断片は異なるものとなる。生体内には、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのアスパラギン酸で切断したＮ末端側ペプチドと同じ配列を持つペプチドが存在しないと思われる。前記2点より、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのN末端側のペプチド断片は、質量分析により区別され、特異性高く分析することが可能である。
【００２４】
アミノ酸配列におけるアスパラギン酸のペプチド結合は、ペプチド結合を切断する物質（切断物質）を用いて切断することができる。ペプチド結合を切断する物質としては、配列特異的切断プロテアーゼ又は酸などを挙げることができる。配列特異的切断プロテアーゼとしては、例えばエンドペプチダーゼAsp-Nがある。エンドペプチダーゼAsp-Nはアスパラギン酸（Asp）のN末端側のペプチド結合を加水分解する。酸には、有機酸及び無機酸等がある。有機酸としては、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、クエン酸、クロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸（TFA）、安息香酸、サリチル酸、シュウ酸、コハク酸、マロン酸、フタル酸、酒石酸、リンゴ酸、グリコール酸等のカルボン酸、並びに、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸等のスルホン酸等が挙げられる。無機酸としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、テトラフルオロホウ酸、過塩素酸、過ヨウ素酸等挙げられる。これら酸は、それぞれ単独で用いても良いし、2種以上を適宜組み合わせて用いても良い。これらの切断物質の中では、エンドペプチダーゼASP-N、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれかが好ましい。切断物質として酸を用いる場合は、通常、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチド5nmol当たり、1〜2%の有機酸を10μL〜3mＬ使用するのが好ましく、100μL〜1mL使用するのがさらに好ましい。また、切断の際の酸性度は、pH1〜5が好ましく、pH2〜4がさらに好ましい。これら酸でアスパラギン酸（Asp）のC末端側又はN末端側のペプチド結合を加水分解でき、その加水分解されたグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのＮ末端側のペプチド断片を用いて分析及び定量ができる。
【００２５】
グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを配列特異的切断プロテアーゼにより切断する場合は、反応温度は、通常25〜45℃であり、好ましくは35〜40℃である。反応時間は、通常4〜24時間であり、好ましくは10〜18時間である。グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを酸により切断する場合は、反応温度は、通常60〜120℃であり、好ましくは95〜110℃である。反応時間は、通常30分〜24時間であり、好ましくは2〜20時間である。いずれの反応でも溶媒を用いることができ、反応を阻害しない溶媒であればどのようなものを用いてもよい。
【００２６】
2種以上のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドについて、アスパラギン酸（Asp）のペプチド結合を切断した場合、N末端側ペプチド断片を測定することにより、2種以上のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを区別して、かつ、同時に分析することができる。この場合、抽出条件が同じグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを2種以上選択することが好ましい。
【００２７】
グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの生理活性には、N末端側のアミノ酸配列が重要である。すなわち、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドには、Dipeptidil peptidase-4（以下、DPP-4という。）などの酵素によってN末端側のアミノ酸2残基が失われ活性を失うものがある。例えば、活性型GIPであるGIP1-42は、DPP-4によりN末端側の2残基（1位Tyr及び2位Ala）が切断され、GIP3-42となり活性を失う。従って、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのN末端側ペプチド断片を測定することにより、N末端側の2残基を保持した活性型グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドと、N末端側の2残基を失った非活性型グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドとを区別して定量することができる。活性型と非活性型とを区別して定量できれば、活性型及び非活性型の両方のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを同時に定量することができる。
【００２８】
質量分析による測定の精度を上げるため、測定対象ペプチドのアミノ酸数は、5〜14個が好ましく、6〜9個がより好ましい。本方法におけるペプチド断片は、これらの数値範囲となり、質量分析による測定に相応しいものである。
【００２９】
GIP又はその類縁体のN末端側ペプチド断片は、以下式で表すことができる。
式：X1-X2-X3-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-X4［配列番号78］
[式中、
X1は、Tyr、D-Tyr、N-Acetyl-Tyr、N-Pyroglutamyl-Tyr、N-Glucitol-Tyr、N-Palmitate-Tyr、N-Fmoc-Tyr、N-alkyl-Tyr、N-glycosyl-Tyr、N-isopropyl-Tyr又は欠失、
X2は、Ala、D-Ala、Gly、Ser、2-Aminobutylic acid、Aminoisobutylic acid、Phosphoserine、Sarcosine、又は欠失、
X3は、Glu、D-Glu、Pro、Hydroxyproline、Lys、Tyr、又はPhe、
X4は、Asp又は欠失、
を意味する。]
【００３０】
GIP又はその類縁体のN末端側ペプチド断片の具体例としては、以下のものがある。また、下記GIP又はその類縁体のN末端側ペプチド断片のN末端側のアミノ酸2残基が欠除したものが、非活性型のペプチド断片である。
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser［配列番号1］、N-Acetyl-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser［配列番号1のN-Acetyl変異体］、N-Pyroglutamyl-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser［配列番号1のN-Pyroglutamyl変異体］、N-Glucitol-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser［配列番号1のN-Glucitol変異体］、N-Palmitate-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser［配列番号1のN-Palmitate変異体］、N-Fmoc-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser［配列番号1のN-Fmoc変異体］、N-alkyl-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser［配列番号1のN-alkyl変異体］、N-glycosyl-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser［配列番号1のN-glycosyl変異体］、N-isopropyl-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser［配列番号1のN-isopropyl変異体］、Tyr-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser［配列番号79］、Tyr-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser［配列番号5］、Tyr-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser［配列番号80］、Tyr-Abu-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser［配列番号81］（但し、Abuは、2-Aminobutylic acidを意味する。下記においても同じ。）、Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser［配列番号82］、Tyr-Phosphoserine-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser［配列番号83］、Tyr-Sar-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser［配列番号84］、Tyr-Ala-Pro-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser［配列番号85］、Tyr-Ala-Hyp-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser［配列番号86］、Tyr-Ala-Lys-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser［配列番号87］、Tyr-Ala-Tyr-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser［配列番号88］、Tyr-Ala-Phe-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser［配列番号89］、Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp［配列番号2］、N-Acetyl-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp［配列番号2のN-Acetyl変異体］、N-Pyroglutamyl-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp［配列番号2のN-Pyroglutamyl変異体］、N-Glucitol-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp［配列番号2のN-Glucitol変異体］、N-Palmitate-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp［配列番号2のN-Palmitate変異体］、N-Fmoc-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp［配列番号2のN-Fmoc変異体］、N-alkyl-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp［配列番号2のN-alkyl変異体］、N-glycosyl-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp［配列番号2のN-glycosyl変異体］、N-isopropyl-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp［配列番号2のN-isopropyl変異体］、Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号4]、Tyr-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp［配列番号90］、Tyr-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp［配列番号91］、Tyr-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp［配列番号92］、Tyr-Abu-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp［配列番号93］、Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp［配列番号94］、Tyr-Phosphoserine-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp［配列番号95］、Tyr-Sar-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp［配列番号96］、Tyr-Ala-Pro-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp［配列番号97］、Tyr-Ala-Hyp-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp［配列番号98］、Tyr-Ala-Lys-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp［配列番号99］、Tyr-Ala-Tyr-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp［配列番号100］、Tyr-Ala-Phe-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp［配列番号101］、
【００３１】
GLP-1又はその類縁体のN末端側ペプチド断片は、以下式で表すことができる。
式：His-X8-X9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-X15［配列番号102］
[式中、
X8は、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Lys、又はAib、
X9は、Glu、Gly、又はLys、
X15は、Asp又は欠失、
を意味する。]
【００３２】
GLP-1又はその類縁体のN末端側ペプチド断片の具体例としては、以下のものがある。また、下記GLP-1又はその類縁体のN末端側ペプチド断片のN末端側のアミノ酸2残基が欠除したものが、非活性型のペプチド断片である。
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser[配列番号6]、His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser[配列番号10]、His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser［配列番号103］、His-Val-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser［配列番号104］、His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser［配列番号105］、His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp[配列番号7]、His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp［配列番号106］、His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp［配列番号107］、His-Val-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp［配列番号108］、His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp［配列番号109］ 
【００３３】
GLP-2のN末端側ペプチド断片の具体例としては、以下のものがある。また、下記GLP-2のN末端側ペプチド断片のN末端側のアミノ酸2残基が欠除したものが、非活性型のペプチド断片である。
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser［配列番号110］、His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp［配列番号111］
【００３４】
GlucagonのN末端側ペプチド断片の具体例としては、以下のものがある。
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser[配列番号11]、His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp[配列番号12]
【００３５】
試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのペプチド断片は、質量分析計による分析工程の前に、サンプル中に多数存在するたんぱく質、ペプチド、及び生体内低分子物質等の夾雑成分を除くための処理を施すことが好ましい。この処理をすれば分析工程の際の定量感度又は精度を更に上げることができる。当業者であれば、濃縮、転溶、抽出、結晶化、遠心分離、精製手段の1種又は2種以上を組み合わせて、適宜これら夾雑成分を除去する処理を行うことができる。夾雑成分を除去する処理は、切断工程の前後いずれか、又はその両方において行うことができる。
【００３６】
前記夾雑成分を除くための処理として行う抽出方法としては、例えば、固相抽出法などを挙げることができる。固相抽出法は、固相にグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを保持（吸着）させ、次いで溶出溶媒により固相に保持（吸着）されたグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを溶出させる等の公知の方法により実施できる。また、これら固相は1種又は2種以上を組み合わせて使用できる。好ましい固相の組み合わせとしては、例えば、イオン交換タイプの固相抽出ツールと逆相タイプの固相抽出ツールとを組み合わすなど、性質の異なる固相を用いることである。そうすれば、多種類の夾雑成分を効率良く除くことができる。陰イオン交換タイプの固相抽出ツール又は陽イオン交換タイプの固相抽出ツールを使用することができ、当業者であれば、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの種類によって適宜選択できる。固相抽出法は、上記固相が充填された市販のカートリッジ又はミニカラム又は96-wellタイプの固相抽出プレート等を用いることができる。また、濃縮操作は、例えば減圧濃縮等により行うことができる。
【００３７】
前記夾雑成分を除くための処理として行う精製は、液体クロマトグラフィー等により行うことが出来る。液体クロマトグラフィーでは、移動相と固定相の２つの相が関与している。例えば、逆相クロマトグラフィーにおいて、移動相は水−アセトニトリル混液、固定相はオクタデシルシリル基(C18)をシリカゲル担体に結合させたものを用い、両者の極性の差と測定対象ペプチドの極性の相互作用により他成分との分離を行う。ペプチドの水溶性や等電点を利用して、逆相クロマトグラフィー若しくはイオン交換クロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせにより夾雑成分と測定対象ペプチドを分離することが可能である。特にカラムスイッチング法を用いれば、複数種類の固相を用いて効率よく夾雑成分を除くことが可能である。その他の精製方法としては、サイズ除去クロマトグラフィー、及び電気泳動法等を挙げることができる。本方法では、液体クロマトグラフィーによる精製を必須とするが、その他の精製を1種又は2種以上組み合わせて行うこともできる。液体クロマトグラフィーには、HPLC、UPLC、UHPLC、nanoflow-LCなどが知られている。上記切断工程で得られたペプチド断片を含む試料を液体クロマトグラフィーにより分離精製する際は、カラムを加温し（好ましくは40〜60℃）、移動相として0.1%ギ酸を含むメタノールを用いることができる。ただし、上記条件は処理される試料により変動し、特に限定されない。液体クロマトグラフィーの流速は、好ましくは50nL/min〜50μL/minであり、さらに好ましくは100nL/min〜1μL/minである。低流速であれば、エレクトロイオンスプレーイオン化の際に極微細な帯電液滴を作り出せ、高効率な脱溶媒が可能になる。液体クロマトグラフィーで用いるカラムの内径は、好ましくは50μm以上１mm未満であり、さらに好ましくは50μm以上800μm以下である。内径の小さなカラムを使用すれば、カラム内での測定対象とするペプチド断片の拡散を防止でき、測定感度の向上を図ることができる。
【００３８】
液体クロマトグラフィーで分離・溶出したペプチド断片は、質量分析計により測定する。質量分析において、測定対象物質は、まず、何らかの手法でイオン化され、そのイオンの質量/荷電比（m/z）とその質量のイオン量を計測する。従って、質量分析計には、イオン化とイオン計測法との種々の組み合わせが存在する。例えば、エレクトロスプレー・イオン化法（ESI：electrospray ionization)又は大気圧化学イオン化法（APCI：atmospheric pressure chemical ionization）による質量分析計、液体クロマトグラフィーに連結した質量分析計(LC/MS、LC/MS/MS、LC/MS/MS/MSなど)、質量分析計を2台以上結合した質量分析計（MS/MS、MS/MS/MSなど）、タンデムマススペクトロメーター（tandem mass spectrometer:tandem MS）質量分析計、透過型四重極質量分析計を2台直列に置き、その間にコリジョンセルを設けた三連四重極質量分析計（LC/MS/MSなど）、イオントラップ機能を利用した質量分析計（MS/MS/MSなど）、又は四重極飛行時間型質量分析計等、種々の機能を持つ質量分析計が知られている。LC/MS/MSは、定量対象となるペプチド固有のプレカーサーイオンを選択し、ついでアルゴン等を衝突させてイオンを解離させ新しいイオン群を発生させ、この新しいイオン群（プロダクトイオン）から１つあるいは複数のイオンを質量分析計（MS)で分析する。これにより特異性の高い定量が可能となっており、近年開発されたMS/MS/MSも更に特異性の高い定量法の確立が期待されている。MS/MS/MSは、プレカーサーイオンから生じた1次プロダクトイオン、更に1次プロダクトイオンから生じた2次プロダクトイオンを設定して測定できることから、類似のアミノ酸配列が混在する系での測定に有利である。尚、プレカーサーイオンとは、上記エレクトロスプレー・イオン化、大気圧化学イオン化等によって生じたイオンであり、かつ、プロダクトイオンの前駆イオンである。
【００３９】
本発明の一実施形態では、分離工程及び分析工程を、液体クロマトグラフィーと質量分析法との組み合わせからなる方法で実施することができる。かかる方法の具体例としては、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析（LC/MS/MS、LC/MS/MS/MSなど）、液体クロマトグラフィー・質量分析（LC/MS)法などが挙げられる。本発明では特に限定されないが、液体クロマトグラフィーにイオントラップ機能を備えた三連四重極質量分析計を連結した、nanoFlowLC-MS/MS/MSを用いるのが好ましい。
【００４０】
マススペクトルは、ペプチド断片を質量分析した結果得られる、横軸にm/z、縦軸に検出強度をとったスペクトルを示す。m/zはイオンの質量を統一原子質量単位で割り、更にイオンの電化数で割って得られた値である。質量分析計は、測定対象物質固有のm/zを装置に入力することにより特異的にそのm/zのイオンだけを検出器に導くことが出来るため、特異性の高い分析が可能になる。グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのペプチド断片の一例を表1に示す。他のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドについても同様に、当業者に周知の方法で固有のプレカーサーイオンのm/zを設定できる。MS/MS、あるいはMS/MS/MSを用いる場合は、同様にしてフラグメントイオンを1〜5個、好ましくは1〜3個のm/zを設定し特異性の高い定量を行うことが出来る。
【００４１】
【表１】
2012121302.tif 000003
【００４２】
本発明の別の一形態では、検量線を用いて、試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチド又はその類縁体を定量する。検量線は、段階的に希釈した標準溶液を用い、その標準物質由来のペプチド断片を質量分析計により測定し、当業者にとって一般的な方法に従って作成することが可能である。検量線は、真度が定量下限濃度において±20％以内であり、その他の濃度において±15％以内であり、かつ相関係数が0.990以上であるのが好ましい。検量線を用いて定量を行なう場合には、(a)一定量の標準物質を注入して検出されるピーク面積より求める絶対検量線法、(b)測定対象試料とは別の標準物質（内標準物質）を添加して両者の検出ピーク面積の比より求める内部標準法などが用いられる。定量精度を上げるためには内部標準法を用いて検量線を作成することが好ましい。内標準物質を用いた場合には、例えば、試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの面積ピークと、内標準物質の面積ピークとの比を求め、この比をグラフ上にプロットすることにより、信頼性の高い検量線を作成することができる。また、標準物質を溶解して調製した標準溶液を用いることによって、試料に含まれるヒトの内因性グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを測定でき、標準濃度以下の濃度域においても定量することができる。定量下限濃度は、検量線作成のために用いる標準物質を添加した試料のうち、試料中の標準物質の濃度の一番薄い濃度であり、上記真度が±20%以内であることを意味する。検量線の真度は、定量値から添加濃度を減じた値を添加濃度で除することで算出される。上記相関係数は表計算ソフトを用いて計算できる。そして、作成した検量線を用いて試料中に含まれるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを定量することが可能である。
【００４３】
内標準物質としては、例えば、測定対象のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの1又はそれ以上のアミノ酸を、安定同位体標識したアミノ酸に置換したものが好ましい。測定対象アミノ酸の1〜15位の中から選択されるいずれかのアミノ酸が、安定同位体標識したアミノ酸に置換されていることがさらに好ましい。安定同位体でラベル化したペプチドを使用する場合は、例えば、Pheを安定同位体でラベル化するなどして内標準物質を得ることができる。Pheはグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの1〜15位のいずれかに存在していることが多い。例えば、GIP1-42の6位、GLP-1（7-36）の12位、GLP-2の6位、Glucagonの6位にPheが存在する。Pheは安定同位体でのラベル化に適したアミノ酸であり、本来の測定対象ペプチドと10Da以上の差を持たせることができるため、質量分析による定量の際のクロストークを最小にすることができる。その他、Leu、Ile、Val、Ala、Tyr、Glu、Gly、Thr、Ser又はProなども、安定同位体でのラベル化に適したアミノ酸である。安定同位体としては、2H、13C、15N、及び18O等が挙げられ、これらを単独で、又は2種以上を組み合わせて用いることができる。その他にも、H218O中で加水分解酵素切断を行うことにより18Oを導入する方法、また、市販の安定同位体標識試薬等を用いて安定同位体ラベル化を行う方法等がある。安定同位体標識ペプチドは、定量対象ペプチドと標識アミノ酸の質量が異なる点以外では化学的に同一でLC-MS/MS測定において同一の挙動を示すことから、夾雑成分のイオン化に与える影響も排除することが可能であり内部標準ペプチドとして有利に用いることができる。いずれの方法も測定対象物質と内標準物質に質量差を生ずる為、LC/MS等により別のピークとして検出され、両ピークの面積又は高さの比に基づき定量が可能である。
【００４４】
安定同位体標識した内標準物質は、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの全アミノ酸配列であっても良いし、測定対象のペプチド断片であっても良い。定量値の正確性を上げるためには、全アミノ酸配列の一部を標識した内標準物質が好ましい。仮に、測定対象のペプチド断片の一部を標識した内標準物質を用いた場合、切断工程に至るまでの前処理において抽出効率が定量対象であるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドと同じであるとは限らない。また、配列特異的プロテアーゼ又は酸による消化効率も必ずしも定量対象であるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドと同じであるとは限らない。これら抽出効率及び消化効率は、サンプル毎に異なるため、測定対象ペプチド断片の一部を標識した内標準物質では定量対象であるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを完全に補正することは難しい。従って、全アミノ酸配列の一部を標識してサンプルに添加した場合、前処理の全過程においてグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの量を補正することができるため、定量値の正確性を上げることができる。尚、内標準物質としては、安定同位体で標識したペプチドだけでなく、測定対象のペプチド断片の一以上のアミノ酸を改変したペプチド、又は、測定対象のペプチド断片のアミノ酸配列順序を変えたペプチドを使用することもできる。
【００４５】
本発明の一態様は、試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチド又はその類縁体を定量するためのキットを構成する。このキットは、(a)コントロール用マトリクス、(b)内標準物質又はその溶液、(c)グルカゴン・セクレチンファミリーペプチド又はそれら溶液、(d)切断物質、(e)固相抽出プレートを含む。前記(d)切断物質は、段落２４に記載したとおりであるが、エンドペプチダーゼASP-N、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれかが好ましい。また、このキットには、必要に応じて切断物質処理用のbufferを加えることもできる。このキットの使用方法を以下に説明する。まず、試料及び(a)コントロール用マトリクスに、(b)内標準物質又はその溶液を添加し、検量線の場合は更に(c)所定量のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチド又はそれら溶液を添加する。その後、(d)切断物質を用いてペプチド断片とし、ついで、(e)固相抽出プレートを用いて抽出操作を行う。検量線および試料から得られた抽出サンプル中のペプチド断片を測定し、試料から得られたグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの面積ピークと、内標準物質の面積ピークとの比を検量線にあてはめることにより、試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを定量することができる。
【実施例】
【００４６】
本発明は、以下の実験例によって、さらに詳しく説明されるが、これらは本発明を限定するものではなく、また本発明の範囲を逸脱しない範囲で変化させてもよい。【００４７】
＜試験１＞グルカゴン・セクレチンファミリーペプチド測定方法の比較
方法
グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドであるGIPの測定対象となるペプチド断片の安定性を比較した。固相合成により合成した下記(a)(b)のペプチド断片に、0.1%TFA-20%アセトニトリルを加えて2.0μM溶液とした。この溶液をLC/MS/MS（Applied Biosystems：QSTAR（登録商標）Elite）にて測定した。測定は、調製直後及び調製後17日目に行った。
(a)GIP1-8：GIP1-42の9位のアスパラギン酸がN末端側で切断されたGIP1-8を用いた。GIP1-8のアミノ酸配列は、Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser［配列番号1］である。
(b)GIP1-16：GIP1-42の16位のリジンがC末端側で切断されたGIP1-16を用いた。尚、GIP1-42をTrypsinで切断すると16位のリジンがC末端側で切断される。GIP1-16のアミノ酸配列は、Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys［配列番号112］である。【００４８】
結果
調製直後の測定値を図1に示し、調製後17日目の測定値を図2に示す。
GIP1-8では、1つのピークが観測された（m/z887.4（[M＋H]＋））。GIP1-16では、2つのピークが観測された（m/z905.9（[M＋2H]2＋）及びm/z913.9（[M＋2H]2＋））。GIP1-16で観測されたピークの1つは、冷蔵保存した際に経時的に大きくなり、調製後17日目では、もう一方のピークとのピーク強度比はほぼ１：１となった。経時的に変化するピークは、GIP1-16のメチオニン（Met）が酸化された酸化体のピークであった。ピークが経時的に大きくなることは、経時的にペプチドの分子量が変化し、試料中の濃度を正確に測定できないことを示している。GIP1-8のペプチド断片は、GIP1-16のペプチド断片より安定性が勝っていた。【００４９】
＜実施例1＞GIP類縁体の測定方法
方法
グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドであるGIP類縁体（2S-GIP-NH2）［配列番号113のC末端アミド誘導体］を測定する一実施形態を示す。このGIP類縁体は、活性型GIPの2位のアラニンをセリンに置換し、C末端をアミド化したGIP類縁体である。切断物質はASP-Nを用いた。当該GIP類縁体を、50mMのTris/HCl及び2.5mMのZnSO4溶液(pH8.0)で溶解した。この溶液に、Asp-Nを1μg加え、37℃で15時間インキュベートして、当該GIP類縁体を切断した。その後、試料をLC/MS（LCQ Deca XP Plus）で分析した。
結果
GIP類縁体をAsp-Nにより切断し、分析した結果を図３に示す。1つのピーク（m/z 903（[M＋H]＋））が観察された。このピークは、活性型GIP類縁体の9位のアスパラギン酸のN末側が切断された2S-GIP1-8であった。
2S-GIP1-8：Tyr-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号5]【００５０】
＜実施例2＞GIPの測定方法
方法
グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドである活性型GIP[配列番号13]を測定する一実施形態を示す。切断物質はギ酸を用いた。活性型GIP1-42を精製水で溶解し100μM溶液とした。この溶液50μLに、2％ギ酸を500μL加え、108℃で18時間までインキュベートして、経時的に活性型GIP1-42の切断を確認した。その後、各試料をLC/MS（LCQ Deca XP Plus）で分析した。
結果
活性型GIP1-42をギ酸により切断し、分析した結果を図４に示す。m/z 887（[M＋H]＋）、及びm/z 1002（[M＋H]＋）のピークが観察された。これら２つのピークは、活性型GIP1-42の9位のアスパラギン酸のN末端側が切断されたGIP1-8、及び活性型GIP1-42の9位のアスパラギン酸のC末端側が切断されたGIP1-9であった。
GIP1-8：Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号1]
GIP1-9：Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号2]【００５１】
＜実施例3＞GIPの測定方法
グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドである活性型GIP[配列番号13]を測定する他の実施形態を示す。切断物質は酢酸を用いた。2％ギ酸500μLに代えて2％酢酸500μLを加えた他は、実施例2と同様の方法で分析した。分析結果を図５に示す。活性型GIP1-42の9位のアスパラギン酸のN末端側が切断されたGIP1-8[配列番号1]、及び活性型GIP1-42の9位のアスパラギン酸のC末端側が切断されたGIP1-9[配列番号2]のピークが観察された。【００５２】
＜実施例4＞GIPの測定方法
グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドである活性型GIP［配列番号13］を測定する他の実施形態を示す。切断物質はトリフルオロ酢酸を用いた。2％ギ酸500μLに代えて1％トリフルオロ酢酸500μLを加えた他は、実施例2と同様の方法で分析した。分析結果を図６に示す。活性型GIP1-42の9位のアスパラギン酸のN末端側が切断されたGIP1-8［配列番号1］、及び活性型GIP1-42の9位のアスパラギン酸のC末端側が切断されたGIP1-9［配列番号2］のピークが観察された。【００５３】
＜実施例5＞GLP-1の測定方法
方法
グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドであるGLP-1(7-36）［配列番号25］を測定する一実施形態を示す。切断物質はASP-Nを用いた。GIP類縁体に代えてGLP-1(7-36）とした他は、実施例1と同様の方法で分析した。
結果
分析結果を図７に示す。GLP-1(7-36）の15位のアスパラギン酸のN末端側が切断されたGLP-1(7-14）のピークが観察された（m/z 425（[M＋2H]2＋））。
GLP-1(7-14）：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser[配列番号6]【００５４】
＜実施例6＞Glucagonの測定方法
方法
グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドであるGlucagon［配列番号69］を測定する一実施形態を示す。切断物質はASP-Nを用いた。GIP類縁体に代えてGlucagonとした他は、実施例1と同様の方法で分析した。
結果
分析結果を図８に示す。Glucagonの9位のアスパラギン酸のN末端側が切断されたGlucagon1-8のピークが観察された（m/z 864（[M＋H]＋））。
Glucagon1-8：His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser[配列番号11]【００５５】
＜実施例7＞GLP-1類縁体の測定方法
方法
グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドであるGLP-1類縁体（8S-GLP-1）［配列番号31］を測定する一実施形態を示す。この類縁体は、GLP-1(7-36）の8位のアラニンをセリンに置換したGLP-1類縁体である。切断物質はASP-Nを用いた。GIP類縁体5nmolに代えてGLP-1類縁体5nmolとし、Asp-Nの量を1μgから2μgに代えた他は、実施例1と同様の方法で分析した。
結果
分析結果を図９に示す。GLP-1類縁体の14位のアスパラギン酸のN末端側が切断された8S-GLP-1(7-14）のピークが観察された（m/z 865（[M＋H]＋））。
8S-GLP-1(7-14）：His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser[配列番号10]【００５６】
実施例1〜7で示す通り、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの1〜14位から選ばれるいずれかのアスパラギン酸のペプチド結合を切断すれば、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの種類を問わず、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのペプチド断片を良好に分析できた。【００５７】
＜実施例8＞活性型GIPの定量方法
試料中の活性型GIP［配列番号13］の濃度を、検量線を用いて定量する一実施形態を示す。
方法
１．検量線用試料の調製
内標準物質として、GIPの6位のPheが安定同位体ラベル化アミノ酸である13C9,15N-Pheに置換された、以下の内標準物質を合成した。以下（１）〜（３）の手順に従い、検量線用の試料を調製した。
[標準物質]
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln［配列番号13］
[内標準物質]
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-13C9,15N-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln（アミノ酸配列は、配列番号13に同じ）
（１）活性型GIP標準溶液の調製：活性型GIP1-42（ペプチド研究所より購入）を精製水で溶解し、100μM溶液を調製した。この溶液を希釈し、20.0pM、200pM、2.00nM、20.0nM、及び1.00μM標準溶液を調製した。
（２）内標準物質標準溶液の調製：合成した上記内標準物質を溶解し、100μM溶液を調製した。この溶液を希釈し、2.00nM、20.0nM、及び1.00μM内標準物質標準溶液を調製した。
（３）検量線用試料の調製：2ｍLチューブに、DPP-4阻害剤（Diprotin A、0.3M）2μLを加え、氷冷下で活性炭処理したヒトのEDTA添加血漿200μL、活性型GIP標準溶液、及び内標準物質標準溶液を加え検量線用試料を調製した。活性型GIP標準溶液、及び内標準物質標準溶液の添加割合を表２に示す。尚、DPP-4阻害剤は、前処理過程におけるGIP1-42のGIP3-42への分解、あるいはGIP1-8のGIP3-8への分解を抑制するために添加した。【００５８】
【表２】
2012121302.tif 000004
【００５９】
２．前処理
（１）除タンパク
上記検量線用試料に180mM炭酸アンモニウム溶液100μL及びエタノール900μLを加え、20分氷冷した。遠心分離後上清を濃縮乾固した。
（２）試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの切断
前記除タンパク後の検量線用試料をプロテアーゼ（ASP-N）によって切断した。前記除タンパク後の検量線用試料に、50mMのTris/HCl、2.5mMのZnSO4溶液(pH8.0)を100μL加え、更に0.1mg/mLのAsp-N水溶液を8μL加え、37℃で16時間インキュベートした。
（３）固相抽出
固相プレート（Waters製；Oasis MAX 96-well μElution Plate）を使用し、上記（２）で得られた検量線用試料に5%アンモニア水300μLを添加し、これをコンディショニングされた固相プレートに負荷した。固相プレートを洗浄後、0.1%ギ酸-75%アセトニトリル50μLで溶出した。溶出液は、HPLC用バイヤルに移し、遠心エバポレータを用いて濃縮乾固した。さらに、0.1%TFA-10％アセトニトリル20μLで再溶解した。
（４）フィルターろ過
再溶解後の試料を遠心式フィルターユニット（0.2μm）で遠心ろ過し、HPLC用試料とした。【００６０】
３．測定
前記前処理を施したHPLC用試料5μLをnanoFlowLC-MS/MS/MSに注入し、HPLC用試料に含まれる標準物質及び内標準物質由来ペプチドを測定した。測定条件を表３及び表４に示す。
（１）HPLC条件
【表３】
2012121302.tif 000005
（２）MS条件
【表４】
2012121302.tif 000006
【００６１】
結果
検量線用試料を測定し、活性型GIP由来のペプチド断片（Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser［配列番号1］）及び内標準物質由来のペプチド断片（Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-13C9,15N-Phe-Ile-Ser（アミノ酸配列は、配列番号1に同じ））をそれぞれ独立したピークとして検出できた（図１０）。活性型GIP濃度と両者のピーク面積比（活性型GIP由来ペプチドのピーク面積／内標準物質由来ペプチドのピーク面積）を線形最小二乗法により直線回帰して、傾きと切片及び相関係数（ｒ）を求めた。1pM〜500pMの範囲で検量線を作成した結果、相関係数（ｒ）は0.990以上であり、定量限界は1pMであった（図１１）。【００６２】
＜実施例9＞ヒト血漿中活性型GIPの同時再現性試験
方法
実施例8と同様にしてヒト血漿中活性型GIP［配列番号13］を定量し、各検量線に、得られたピーク面積比をあてはめて、各サンプルの濃度を算出した。濃度毎に、得られた測定値(n=3)の真度（Bias%）、精度（%CV）を算出した。判定基準は、真度±15％以内（定量限界は±20％以内）、精度15％以内（定量限界は20%以内）であること、とした。
結果
結果を表５に示す。各濃度における活性型GIPは、同時再現性の判定基準を満たした。このことは、定量値の再現性が良好であることを示している。
【表５】
2012121302.tif 000007
【００６３】
＜実施例10＞活性型GIP及び非活性型GIPの同時定量方法
方法
１．検量線用の試料の調製
実施例8と同様にして、標準物質及び内標準物質を含む測定用試料を調製した。内標準物質として、GIPの6位のPheを13C9,15N-Pheに置換した、以下のペプチドを合成し加えた。尚、非活性型GIPの内標準物質は、活性型GIP内標準物質のN末端2残基が欠除したものである。
[活性型GIPの標準物質]
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln［配列番号13］
[非活性型GIP標準物質]
Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln（GIP3-42：［配列番号14］）
[活性型GIPの内標準物質]
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-13C9,15N-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln（アミノ酸配列は、配列番号13に同じ）
[非活性型GIPの内標準物質]
Glu-Gly-Thr-13C9,15N-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln（アミノ酸配列は、配列番号14に同じ）
（１）活性型GIP標準溶液の調製：活性型GIP（ペプチド研究所より購入）に精製水を加えて溶解し、100μM溶液とした。この溶液を50%エタノールで希釈し、20.0ｐM、200ｐM、2.00nM、20.0nM、及び1.00μM標準溶液を調製した。
（２）活性型GIP用内標準物質標準溶液の調製：合成した内標準ペプチドを溶解し、100μM溶液を調製した。この溶液を希釈し、1.00nM、10.0nM、及び1.00μM標準溶液を調製した。
（３）非活性型GIP標準溶液の調製：購入した非活性型GIPを溶解し、100μM溶液を調製した。この溶液を希釈し、20.0ｐM、200ｐM、2.00nM、20.0nM、及び1.00μM標準溶液を調製した。
（４）非活性型GIP用内標準物質標準溶液の調製：合成した内標準ペプチドを50%エタノールで溶解し、100μM溶液を調製した。この溶液を50%エタノールで希釈し、1.00nM、10.0nM、及び1.00μM標準溶液を調製した。
（５）検量線用試料の調製：2ｍLチューブにDPP-4阻害剤（Diprotin A、0.3M）2μLを加え、氷冷下で活性炭処理したヒトのEDTA添加血漿200μL、活性型GIP標準溶液、及び活性型GIP用内標準物質標準溶液、ならびに非活性型GIP標準溶液、及び非活性型GIP用内標準物質標準溶液を表６のように加え、検量線用試料を調製した。
【表６】
2012121302.tif 000008
２．前処理
実施例8と同様の方法で前処理を行った。
３．測定
実施例8と同様にして測定した。測定条件は表７及び表８に示す。
（１）HPLC条件
【表７】
2012121302.tif 000009
（２）MS条件
【表８】
2012121302.tif 000010
【００６４】
結果
検量線用試料を測定し、活性型GIP由来のペプチド断片（Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号1]）と活性型GIP用内標準物質由来のペプチド断片（Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-13C9,15N-Phe-Ile-Ser（アミノ酸配列は、配列番号1に同じ））をそれぞれ独立したピークとして検出できた（図１２）。また、非活性型GIP由来のペプチド断片（Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号3]）と非活性型GIP用内標準物質由来のペプチド断片（Glu-Gly-Thr-13C9,15N-Phe-Ile-Ser（アミノ酸配列は、配列番号3に同じ））をそれぞれ独立したピークとして検出できた（図１３）。活性型GIP濃度と両者のピーク面積比（活性型GIP由来ペプチドのピーク面積／内標準物質由来ペプチドのピーク面積）を線形最小二乗法により直線回帰して傾きと切片及び相関係数（ｒ）を求めた。1pM〜500pMの範囲で検量線を作成した結果、重み付け1/xを設定して相関係数（ｒ）は0.990以上であった（図１４）。非活性型GIP濃度と両者のピーク面積比（非活性型GIP由来ペプチドのピーク面積／非活性型GIP用内標準物質由来ペプチドのピーク面積）を線形最小二乗法により直線回帰して傾きと切片及び相関係数（ｒ）を求めた。10pM〜500pMの範囲で検量線を作成した結果、重み付け1/xを設定して相関係数（ｒ）は0.990以上であった（図１５）。【００６５】
＜実施例11＞糖尿病患者における活性型GIP非活性型GIPの同時定量
α-グルコシダーゼ阻害剤服用（50mg，1日3回）糖尿病患者6例の食前及び食後1時間における血漿中活性型GIP［配列番号13］と非活性型GIP［配列番号14］の同時定量を行った。
１．試料の調製
（１）検量線用の試料の調製
実施例9と同様にして、表９のように試料を調製した。
【表９】
2012121302.tif 000011
（２）糖尿病患者の血漿試料の調製
α-グルコシダーゼ阻害剤を服用中の患者からたんぱく安定化剤入り採血管（べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー製）を用いて採血し、血漿を得た。この血漿200μLに上記検量線作成時と同量の活性型GIP用内標準物質及び非活性型GIP用内標準物質を添加した。
２．測定
実施例8と同様にして、前処理を施した試料を測定した。測定条件は、表１０〜表１２に示す。
【表１０】
2012121302.tif 000012
【表１１】
2012121302.tif 000013
【表１２】
2012121302.tif 000014
【００６６】
結果
糖尿病患者血漿試料を測定し、活性型GIP由来のペプチド断片［配列番号1］と活性型GIP用内標準物質由来のペプチド断片（アミノ酸配列は、配列番号1に同じ）をそれぞれ独立したピークとして検出できた（図１６）。また、非活性型GIPも同様にそれぞれ独立したピークとして検出できた（図１７）。活性型GIP濃度と両者のピーク面積比（活性型GIP由来ペプチドのピーク面積／内標準物質由来ペプチドのピーク面積）を線形最小二乗法により直線回帰して1pM〜500pMの範囲で重み付け1/xを設定して検量線を作成した。糖尿病患者血漿試料から得られたピーク面積比（活性型GIP由来ペプチドのピーク面積／内標準物質由来ペプチドのピーク面積）をこの検量線に当てはめ、血漿中活性型GIP濃度を算出した。非活性型GIPは、10pM〜500pMの範囲で重み付け1/xを設定して、活性型GIPと同様に検量線を作成し、糖尿病患者の血漿中非活性型GIP濃度を算出した。その結果を表１３に示す。表中の数値は、それぞれの平均血漿中濃度±標準偏差を示す。
【表１３】
2012121302.tif 000015
【００６７】
GIP以外の他のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドも、実施例8〜実施例11と同様にして検量線を作成し、その検量線を用いて、試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを定量することができる。即ち、定量対象とするペプチドをそのアミノ酸の一部を安定同位体ラベルと置換するなどした内標準物質と共に抽出し、抽出過程において実施例1〜7で示す通り、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの1〜14位から選ばれるいずれかのアスパラギン酸のペプチド結合を切断してペプチド断片を得る。このペプチド断片に応じた質量分析条件を設定することによりGIPと同様に特異性の高い定量が可能である。更に、抽出条件が同じであれば、活性型GIPと非活性型GIPの同時定量が可能であったように、異なるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを同時に定量することも可能である。
【図１】
2012121302.tif 000016
【図２】
2012121302.tif 000017
【図３】
2012121302.tif 000018
【図４】
2012121302.tif 000019
【図５】
2012121302.tif 000020
【図６】
2012121302.tif 000021
【図７】
2012121302.tif 000022
【図８】
2012121302.tif 000023
【図９】
2012121302.tif 000024
【図１０】
2012121302.tif 000025
【図１１】
2012121302.tif 000026
【図１２】
2012121302.tif 000027
【図１３】
2012121302.tif 000028
【図１４】
2012121302.tif 000029
【図１５】
2012121302.tif 000030
【図１６】
2012121302.tif 000031
【図１７】
2012121302.tif 000032
【配列表】
2012121302000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年7月25日(2013.7.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのアミノ酸配列中に存在するアスパラギン酸のペプチド結合を切断し、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドをペプチド断片にする切断工程；
前記切断工程で切断されたペプチド断片を液体クロマトグラフィーにより分離精製し、測定対象物質であるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのN末端側のペプチド断片を選定する分離精製工程；
前記分離精製工程で分離精製されたペプチド断片を質量分析し、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのＮ末端側のペプチド断片を検出する分析工程；
を含む、試料中に含まれるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの分析方法。
【請求項２】
前記切断工程において、配列特異的切断プロテアーゼ又は酸から選択される切断物質を用いてアスパラギン酸のペプチド結合を切断する、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記切断物質が、エンドペプチダーゼASP-N、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の分析方法。
【請求項４】
前記分離精製工程において、液体クロマトグラフィーが、流速50nL/min〜50μL/minの液体クロマトグラフィーである、請求項１〜３のいずれかに記載の分析方法。
【請求項５】
前記グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドが、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド、グルカゴン様ペプチド-1、グルカゴン様ペプチド-2、グルカゴン、及びそれらの類縁体からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の分析方法。
【請求項６】
前記分離精製工程において、プレカーサーイオンの質量選択により測定対象物質を選定する、請求項１〜５のいずれかに記載の分析方法。
【請求項７】
さらに、前記分離精製工程において、前記ペプチド断片を固相抽出する工程を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の分析方法。
【請求項８】
前記分離精製工程及び分析工程が、高速液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー／マススペクトロメトリー／マススペクトロメトリーにより行われる、請求項１〜７のいずれかに記載の分析方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の分析方法を用いて検量線を作成し、前記検量線を用いて、試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを定量する、試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの定量方法。
【請求項１０】
２種以上のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのペプチド断片を、同時にそれぞれ測定することにより、試料中の２種以上のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを区別して同時に定量する、請求項９に記載の定量方法。
【請求項１１】
活性型グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのペプチド断片と、非活性型グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのペプチド断片とを、同時にそれぞれ測定することにより、試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの活性型と非活性型とを区別して同時に定量する、請求項９又は１０に記載の定量方法。
【請求項１２】
前記検量線を、安定同位体で標識された内標準物質を試料に加えて作成する、請求項９〜１１のいずれかに記載の定量方法。
【請求項１３】
測定対象のペプチド断片及び内標準物質のペプチド断片の各ピーク面積比を用いて定量する、請求項１２に記載の定量方法。
【請求項１４】
前記内標準物質が、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのアミノ酸配列において１位〜15位から選択される1又はそれ以上のアミノ酸を、安定同位体で標識されたアミノ酸で置換したペプチドである、請求項１２又は１３に記載の定量方法。
【請求項１５】
(a)コントロール用マトリクス、
(b)内標準物質又はその溶液、
(c)グルカゴン・セクレチンファミリーペプチド又はそれらの標準物質、若しくはそれらの溶液、
(d)切断物質、
(e)固相抽出プレート
を含む、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの定量用キット。
【請求項１６】
前記切断物質が、エンドペプチダーゼASP-N、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５に記載の定量用キット。
【請求項１７】
前記グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドが、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド、グルカゴン様ペプチド-1、グルカゴン様ペプチド-2、グルカゴン、及びそれらの類縁体からなる群から選択される、請求項１５又は１６に記載の定量用キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明の主な構成は次のとおりである。
(1)試料中に含まれるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのアミノ酸配列中に存在するアスパラギン酸のペプチド結合を切断し、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドをペプチド断片にする切断工程；前記切断工程で切断されたペプチド断片を液体クロマトグラフィーにより分離精製し、測定対象物質であるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのN末端側のペプチド断片を選定する分離精製工程；前記分離精製されたペプチド断片を質量分析し、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのＮ末端側のペプチド断片を検出する分析工程；を含む、試料中に含まれるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの分析方法。
(2)前記切断工程において、配列特異的切断プロテアーゼ又は酸から選択される切断物質を用いてアスパラギン酸のペプチド結合を切断する、(1)に記載の分析方法。
(3)前記切断物質が、エンドペプチダーゼASP-N、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、 (2)に記載の分析方法。
(4)前記分離精製工程において、液体クロマトグラフィーが、流速50nL/min〜50μL/minの液体クロマトグラフィーである、(1)〜(3)のいずれかに記載の分析方法。
(5)前記グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドが、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド、グルカゴン様ペプチド-1、グルカゴン様ペプチド-2、グルカゴン、及びそれらの類縁体からなる群から選択される、(1)〜(4)のいずれかに記載の分析方法。
(6)前記分離精製工程において、プレカーサーイオンの質量選択により測定対象物質を選定する、(1)〜(5)のいずれかに記載の分析方法。
(7)さらに、前記分離精製工程において、前記ペプチド断片を固相抽出する工程を含む、(1)〜(6)のいずれかに記載の分析方法。
(8)前記分離精製工程及び分析工程が、高速液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー／マススペクトロメトリー／マススペクトロメトリーにより行われる、(1)〜(7)のいずれかに記載の分析方法。
(9)(1)〜(8)のいずれかに記載の分析方法を用いて検量線を作成し、前記検量線を用いて、試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを定量する、試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの定量方法。
(10)２種以上のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのペプチド断片を、同時にそれぞれ測定することにより、試料中の２種以上のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを区別して同時に定量する、(9)に記載の定量方法。
(11)活性型グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのペプチド断片と、非活性型グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのペプチド断片とを、同時にそれぞれ測定することにより、試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの活性型と非活性型とを区別して同時に定量する、(9)又は(10)に記載の定量方法。
(12)前記検量線を、安定同位体で標識された内標準物質を試料に加えて作成する、(9)〜(11)のいずれかに記載の定量方法。
(13)測定対象のペプチド断片及び内標準物質のペプチド断片の各ピーク面積比を用いて定量する、(12)に記載の定量方法。
(14)前記内標準物質が、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのアミノ酸配列において１位〜15位から選択される1又はそれ以上のアミノ酸を、安定同位体で標識されたアミノ酸で置換したペプチドである、(12)又は(13)に記載の定量方法。
(15)(a)コントロール用マトリクス、(b)内標準物質又はその溶液、(c)グルカゴン・セクレチンファミリーペプチド又はそれらの標準物質、若しくはそれらの溶液、(d)切断物質、(e)固相抽出プレートを含む、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの定量用キット。
(16)前記切断物質が、エンドペプチダーゼASP-N、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、(15)に記載の定量用キット。
(17)前記グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドが、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド、グルカゴン様ペプチド-1、グルカゴン様ペプチド-2、グルカゴン、及びそれらの類縁体からなる群から選択される、(15)又は(16)に記載の定量用キット。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
グルカゴン様ペプチド-1（glucagon-like  peptide-1：以下、GLP-1という。）は、通常、活性体として、GLP-1（7-36）［配列番号25］のアミド又はGLP-1（7-37）［配列番号26］のアミドが知られている。国際公開第91/11457号には、GLP-1（7-34）［配列番号27］、GLP-1（7-35）［配列番号28］にも活性があることが報告されている。一般的には、GLP-1前駆体のN末端を1位と表記するため、活性型GLP-1はN末端が7位である。活性型GLP-1は、GIPと同様に、DPP-IVによりN末端側アミノ酸が2残基切断され活性を失い、GLP-1（9-36）［配列番号29］、GLP-1（9-37）［配列番号30］等となる。従って、GLP-1のN末端側フラグメントを測定することにより、活性型GLP-1と非活性型GLP-1とを区別して同時に分析又は定量することができる。GLP-1（7-37）は、以下の配列からなるペプチドである。
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly[配列番号26]
【国際調査報告】
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