(57)【要約】  優れたガス透過性とハンドリング性を兼ね備え、細胞培養容器を形成するのに適した多層フィルムと、これを用いて形成された細胞培養容器を提供する。  細胞培養容器を形成するために用いられる多層フィルムであって、密度０．８７ｇ／ｃｍ３〜０．９０ｇ／ｃｍ３のポリエチレン系樹脂からなる基材と、密度０．８９６ｇ／ｃｍ３〜０．９３ｇ／ｃｍ３のポリエチレン系樹脂からなる細胞培養面を形成する内層とを有する構成とする。また、密度０．８８６ｇ／ｃｍ３〜０．９３ｇ／ｃｍ３のポリエチレン系樹脂からなる外層を有する構成とする。この多層フィルムを用いて細胞培養容器を形成する。
2012032761.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養容器を形成するために用いられる多層フィルムであって、密度０．８７ｇ／ｃｍ３〜０．９０ｇ／ｃｍ３のポリエチレン系樹脂からなる基材と、密度０．８９６ｇ／ｃｍ３〜０．９３ｇ／ｃｍ３のポリエチレン系樹脂からなる細胞培養面を形成する内層とを有することを特徴とする多層フィルム。
【請求項２】
少なくとも３層を有する多層フィルムであり、密度０．８８６ｇ／ｃｍ３〜０．９３ｇ／ｃｍ３のポリエチレン系樹脂からなる外層を有することを特徴とする請求項１に記載の多層フィルム。
【請求項３】
基材のポリエチレン系樹脂の密度が、０．８７ｇ／ｃｍ３〜０．８８５ｇ／ｃｍ３であることを特徴とする請求項１または請求項２のいずれかに記載の多層フィルム。
【請求項４】
多層フィルムの厚さに対する基材の厚さが６０％以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の多層フィルム。
【請求項５】
酸素透過係数が７５０ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の多層フィルム。
【請求項６】
二酸化炭素透過係数が２１００ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）以上であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の多層フィルム。
【請求項７】
細胞培養面を形成する内層が、アンチブロッキング剤及び／又はスリップ剤及び／又は滑剤を含有しないことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の多層フィルム。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のいずれかに記載の多層フィルムにより形成されたことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項９】
容器を形成する多層フィルムの厚さが１５０μｍ以下であることを特徴とする請求項８に記載の細胞培養容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養技術に関し、特にガス透過性を向上させた多層フィルム、及び細胞培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫細胞療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。一般的に細胞培養に用いられるディッシュやフラスコといった細胞培養容器は、大量の細胞を培養するには不向きである。そこで、大量培養のための培養容器として培養バッグが用いられている。培養バッグは大量培養が可能なだけでなく、閉鎖系であるために培養期間中における菌やウイルスのコンタミネーションリスクを低減できるというメリットもあり好ましい。
培養バッグを構成する樹脂フィルムに必要な条件としては、ガス透過性、透明性、低細胞毒性、低溶出性、放射線滅菌適性が挙げられる。
これらの要件を満足する材料としてポリエチレン系樹脂が好ましい。ポリエチレン系樹脂とはポリエチレン、エチレンとα−オレフィンの共重合体、エチレンと酢酸ビニルの共重合体、エチレンとアクリル酸やメタクリル酸共重合体と金属イオンを用いたアイオノマー等が挙げられる。【０００３】
このため、従来の培養バッグには、上記の要件を備え、かつ成形加工性に優れた材料であることを理由にＬＬＤＰＥ（直鎖状低密度ポリエチレン）やＬＤＰＥ（低密度ポリエチレン）、ＥＶＡ（エチレン−酢酸ビニル共重合樹脂）、アイオノマー樹脂などからなるフィルムにより形成されたものが使用されている。
しかしながら従来の培養バッグのガス透過性は十分とは言えず、開放系のディッシュ等の培養容器と比較すると、高い細胞密度を得ることができていない。【０００４】
ここで、ポリエチレン系樹脂を用いた細胞培養バッグとして、例えば特許文献１を挙げることができる。この特許文献１に記載の細胞培養用バッグは、エチレンと炭素数６〜８のαオレフインの共重合体からなる線状低密度ポリエチレン７０〜９５重量％、及び低密度ポリエチレン３０〜５重量％の組成のフィルムからなるものである。【０００５】
また、特許文献２には、細胞培養容器を形成するのに適した可撓性の、ガス透過性多層フィルムであって、0.0001インチ乃至約0.0010インチの範囲の厚さを有するポリスチレンより構成された第１の層と、0.004インチ乃至約0.025インチの範囲の厚さを有するポリマー材料より構成された、該第１の層に接着された第２の層を含むフィルムや、これを用いた多層のガス透過性容器が開示されている。【０００６】
【特許文献１】特許第２６４３００３号
【特許文献２】特表平１０−５０７３６３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１に記載の細胞培養用バッグは、線状低密度ポリエチレンと、低密度ポリエチレンをブレンドした単層フィルムからなるものであり、その密度は明らかではなく、フィルムの厚さは例えば５０〜３００μｍとされている。ポリエチレン系樹脂は一般的に結晶化度を下げる、すなわち密度を下げることによりガス透過性が向上する。しかしながら一定以上密度が下がると、樹脂の粘着性が増大してハンドリング性の低下・耐ブロッキング性の低下が生ずる。またフィルムを薄くすることでも培養容器としてのガス透過性は高まるが、一方で容器としての強度が低下する。特許文献１の単層フィルムでは高いガス透過性とハンドリング性を兼ね備えた培養バッグを実現することはできない。【０００８】
さらに、特許文献２に記載のフィルムは、細胞培養容器を形成するための多層のフィルムであるが、細胞培養面を形成する内層にはポリスチレンが使用され、基材にはスチレン―エチレン―ブタジエン―スチレンブロックコポリマー、エチレンビニルアセテート、ポリプロピレンから構成されるポリマー材料等が使用されるものである。しかしながら、これらの構成では満足のいくガス透過性を実現することができない。【０００９】
そこで、本発明者らは鋭意研究した結果、ブロッキングし易く溶出量も多いが、優れたガス透過性を有する非常に低い密度のポリエチレンを基材として使用するとともに、細胞培養面にはブロッキングを引き起こしにくくかつ基材からの溶出物を低減することができるポリエチレン系樹脂を使用することで、優れたガス透過性、耐ブロッキング性、低溶出性及び放射線滅菌適性を兼ね備えた細胞培養容器用の多層フィルムを開発することに成功し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、優れたガス透過性とハンドリング性、耐ブロッキング性、低溶出性及び放射線滅菌適性を兼ね備えた細胞培養容器用多層フィルム、及びこれを用いた細胞培養容器の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するため、本発明の多層フィルムは、細胞培養容器を形成するために用いられる多層フィルムであって、密度０．８７ｇ／ｃｍ３〜０．９０ｇ／ｃｍ３のポリエチレン系樹脂からなる基材と、密度０．８９６ｇ／ｃｍ３〜０．９３ｇ／ｃｍ３のポリエチレン系樹脂からなる細胞培養面を形成する内層とを有する構成としてある。
また、本発明の多層フィルムを、少なくとも３層を有する多層フィルムとし、密度０．８８６ｇ／ｃｍ３〜０．９３ｇ／ｃｍ３のポリエチレン系樹脂からなる外層を有する構成とすることも好ましい。
さらに、本発明の細胞培養容器は、このような多層フィルムにより形成されたものとしてある。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、細胞培養容器のガス透過性を、細胞培養容器のハンドリング性を低下させることなく向上させることができる。このため、従来よりも高密度での培養を行うことができ、細胞増殖効率を向上させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の第一実施形態の多層フィルムの構成を示す図である。
【図２】本発明の第一実施形態の多層フィルムにより形成された細胞培養容器の構成を示す図である。
【図３】本発明の第二実施形態の多層フィルムの構成を示す図である。
【図４】本発明の第二実施形態の多層フィルムにより形成された細胞培養容器の構成を示す図である。
【図５】実施例及び比較例のフィルムの酸素透過測定結果を示す図である。
【図６】実施例及び比較例のフィルムの二酸化炭素透過測定結果を示す図である。
【図７】実施例及び比較例のフィルムの細胞培養試験結果１を示す図である。
【図８】実施例及び比較例のフィルムの細胞培養試験結果２を示す図である。
【図９】実施例及び比較例のフィルムの細胞培養試験結果３を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態について具体的に説明する。
［第一実施形態］
まず、本発明の第一実施形態の多層フィルム、及び細胞培養容器について、図１及び図２を参照して説明する。図１は、本実施形態の多層フィルムの構成を示す図であり、図２は、本実施形態の多層フィルムにより形成された細胞培養容器の構成を示す図である。
本実施形態の多層フィルムは、図１に示すように、細胞培養容器を形成するために用いられるものであり、細胞培養容器の本体部分を形成する基材１と、細胞培養面を形成する内層２（最内層）とを有している。
【００１４】
基材１及び内層２は、高ガス透過性、ヒートシール性、及び透明性を備えた材料を用いて構成される。また、内層２は上記特性に加え、低細胞毒性を備える材料で構成される。このような材料としては、例えば直鎖状低密度ポリエチレン（LLDPE，Linear  Low  Density  Polyethylene）や、超低密度ポリエチレン（VLDPE，Very  Low  Density  Polyethylene／ULDPE，Ultra  Low  Density  Polyethylene）、低密度ポリエチレン（LDPE,  Low  Density  Polyethylene）、あるいはこれらのブレンドなどのポリエチレン系樹脂を用いることができる。
【００１５】
また、基材１には、上記ポリエチレン系樹脂であって、密度が０．８７ｇ／ｃｍ３〜０．９０ｇ／ｃｍ３のものを用いることが好ましい。細胞培養容器の本体部分を形成する基材１の材料として、このような非常に低い密度のものを使用することで、本実施形態の多層フィルムのガス透過性を優れたものとすることが可能となる。
【００１６】
ここで、上記ポリエチレン系樹脂の密度０．８７ｇ／ｃｍ３〜０．９０ｇ／ｃｍ３は、このポリエチレン系樹脂を、細胞培養容器を構成する多層フィルムの基材として使用する場合に、ハンドリングができる最も低密度の範囲を示している。すなわち、密度が０．８７ｇ／ｃｍ３を下回ると、軟化温度や融点の低下によりフィルム自体を構成することが困難となる。したがって、基材の密度は、０．８７ｇ／ｃｍ３以上とすることが好ましい。また、密度が０．９０ｇ／ｃｍ３より大きくなると、強度やハンドリング性は向上するが、密度が増えるに従いガス透過性が低下する。このため、基材の密度は、０．９０ｇ／ｃｍ３以下とすることが好ましい。
【００１７】
また、ガス透過性をさらに向上させるために、基材の密度を０．８８５ｇ／ｃｍ３以下にすることがより好ましい。ポリエチレン系樹脂の基材の密度を０．８８５ｇ／ｃｍ３以下にすると、粘着性が大きく、これを細胞培養面に使用するとブロッキングが生じ内面が貼り合わさって離れず、細胞培養容器として使用することができなくなる。一方、細胞培養容器の外側の面に用いる場合には、フィルム自体に粘着性はあるものの細胞培養容器として使用することは可能である。
このため、本実施形態の多層フィルムを、細胞培養容器の本体部分を形成する基材１と、細胞培養面を形成する内層２により構成するとともに、基材１にこのような非常に低い密度のものを使用することで、細胞培養容器のガス透過性をさらに向上させ、かつハンドリングし得るものとすることが可能である。
【００１８】
内層２は、本実施形態の多層フィルムを用いて細胞培養容器を製造する場合に、その細胞培養容器における細胞培養面を形成する層を構成する。
また、内層２には、上記ポリエチレン系樹脂であって、密度が０．８９６ｇ／ｃｍ３〜０．９３ｇ／ｃｍ３のものを用いることが好ましい。
【００１９】
細胞培養面を形成する内層２の材料として、上記ポリエチレン系樹脂の密度が０．８９６ｇ／ｃｍ３未満のものを使用するとブロッキングが生じ、内面が貼り合わさって離れず、細胞培養容器として使用することができなくなる。一方、内層２の密度を０．８９６ｇ／ｃｍ３以上にすれば、ブロッキングが比較的生じにくくなる。このため、内層２の密度は０．８９６ｇ／ｃｍ３以上とすることが好ましい。
また、内層２の密度を０．９３ｇ／ｃｍ３より大きくすると、基材１の密度を低減させることにより得られる高ガス透過性の効果が、内層２により大きく低減されてしまう。このため、内層２の密度は０．９３ｇ／ｃｍ３以下とすることが好ましい。
【００２０】
また、本実施形態の内層２は、上記ポリエチレン系樹脂に、アンチブロッキング剤、及び／又は、スリップ剤、及び／又は、滑剤を含有させることなく製造されたものとすることが好ましい。これらを含有させると、内層２にブロッキングが生じにくくなる一方、溶出してくるアンチブロッキング剤、及び／又は、スリップ剤、及び／又は、滑剤によって細胞の増殖が阻害されてしまうことがある。一般に、アンチブロッキング剤やスリップ剤、滑剤として脂肪酸アミドや脂肪酸エステル、微粒子等が用いられる。
なお、本実施形態において、基材１と内層２との間にさらに他の層を形成させることもできる。
【００２１】
また、本実施形態の多層フィルムは、基材１の厚さを、内層２の厚さに対して、１．５以上の比率で構成することが好ましい。すなわち、本実施形態の多層フィルムは、基材と内層を備えた多層構造としてあるところ、このように基材１の厚さを多層フィルムの厚さの６割以上とすれば、基材１を非常に低い密度のポリエチレン系樹脂を用いて形成することによるガス透過性の向上効果が、内層２により大きく低減されることを防止することが可能となる。
さらに、本実施形態の多層フィルムの厚さは、１５０μｍ以下とすることが好ましい。
この多層フィルムを用いて形成する培養容器としてのガス透過性を考慮した場合、多層フィルム厚さを１５０μｍ以下にすることが適切であるためである。これは、以下の第二実施形態においても同様である。
【００２２】
また、本実施形態の多層フィルムは、上記のような構成を備えることにより、以下の実施例に示す通り、酸素透過係数が７５０ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）以上、二酸化炭素透過係数が２１００ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）以上のものを得ることができる。
【００２３】
次に、このような基材１及び内層２からなる多層フィルムを用いて製造される細胞培養容器１０の例を図２に示す。同図に示すように、細胞培養容器１０において、非常に低い密度のポリエチレン系樹脂からなる基材１の内側に内層２が接着されており、これが細胞培養面を形成する構成となっている。このため、基材１の材料として、上述したようにブロッキングの観点から細胞培養面には使用できないレベルの低い密度のポリエチレン系樹脂を使用して細胞培養容器のガス透過性を向上させるとともに、内層２により細胞培養面を形成することで、細胞培養容器の内面がブロッキングにより粘着して離れなくなることを防止するとともに、基材からの溶出物を低減することが可能となっている。
【００２４】
また、本実施形態の多層フィルムはポリエチレン系樹脂のみにより構成されており、培養容器に必要とされる放射線滅菌適性にも優れる。一般的な滅菌法としてγ線滅菌や電子線滅菌といった放射線滅菌と高圧蒸気滅菌やエチレンオキサイドガス滅菌等が挙げられる。高圧蒸気滅菌は時間、手間等がかかること、エチレンオキサイドガスはその毒性のため製品への残留が問題となる。従って、γ線や電子線といった放射線滅菌が望ましいが、耐性のない樹脂には使用できない。しかし、本実施形態の多層フィルムは放射線耐性に優れるポリエチレン系樹脂のみにより構成されており、γ線や電子線といった放射線滅菌が可能となっている。
【００２５】
以上説明したように、本実施形態の多層フィルム、及び細胞培養容器によれば、細胞培養容器の基材としてハンドリングができる最も低密度の範囲のポリエチレン系樹脂を使用するとともに、内層にはブロッキングが比較的生じにくく、かつ密度の低いポリエチレン系樹脂を使用して構成することができる。また、培養容器としての放射線滅菌適性も有しており、このため、従来よりもガス透過性に優れ、細胞培養効率を向上させることができる細胞培養容器を提供することが可能となっている。
【００２６】
［第二実施形態］
次に、本発明の第二実施形態の多層フィルム、及び細胞培養容器について、図３及び図４を参照して説明する。図３は、本実施形態の多層フィルムの構成を示す図であり、図４は、本実施形態の多層フィルムにより形成された細胞培養容器の構成を示す図である。
本実施形態は、第一実施形態にさらに密度０．８８６ｇ／ｃｍ３〜０．９３ｇ／ｃｍ３のポリエチレン系樹脂を外層３に設けた構成である。なお、本実施形態の多層フィルムは、基材１と外層３との間にさらに一又は二以上の外層を設けることもできる。また、基材１と内層２との間にさらに一又は二以上の内層を設けることもできる。
外層３の密度が０．８８６ｇ／ｃｍ３より小さい場合には、フィルムの粘着性のため、本実施形態の多層フィルムを用いた細胞培養容器の製造、取り扱いが機械的に困難となるが、０．８８６ｇ／ｃｍ３以上であれば、細胞培養容器の製造、取り扱いが機械的に可能となる。このため、外層３の密度は０．８８６ｇ／ｃｍ３以上とすることが好ましい。
また、外層３の密度が０．９３ｇ／ｃｍ３より大きい場合には、基材１の材料として超低密度のものを用いることより得られる高ガス透過性の効果が、外層３により低減されてしまう。このため、外層３の密度は０．９３ｇ／ｃｍ３以下とすることが好ましい。
【００２７】
また、本実施形態の多層フィルムは、基材１の厚さを、フィルムにおける基材１以外の厚さ、すなわち内層２及び外層３の厚さの合計に対して１．５以上の比率で構成することが好ましい。このように多層フィルムにおける基材１の厚さの割合を６割以上とすれば、第一実施形態において上述した通り、基材１によるガス透過性の向上効果を、その他の層により大きく低減させることなく細胞培養容器を製造することが可能となる。
【００２８】
次に、このような基材１、内層２、及び外層３からなる多層フィルムを用いて製造される細胞培養容器２０の例を図４に示す。同図に示すように、細胞培養容器２０は、非常に低い密度のポリエチレン系樹脂からなる基材１の内側に内層２が接着されて細胞培養面を形成するとともに、基材１の外側に外層３が接着されて細胞培養容器の外面を形成する構成となっている。
このため、本実施形態では、基材１の材料として、細胞培養容器のガス透過性を向上させるために極めて密度が低いポリエチレン系樹脂を使用しても、細胞培養容器の内面同士が引っ付いて離れなくなることはなく、また細胞培養容器を製造する際に機械的な取り扱いが可能である。
このように、本実施形態の細胞培養容器は、製造工程を含めたあらゆる使用範囲においてハンドリング性を低下させることなく、ガス透過性を向上させたものとなっている。
【００２９】
以上説明したように、本実施形態の多層フィルム、及び細胞培養容器によれば、フィルムの基材としてハンドリングができるぎりぎりの超低密度のポリエチレン系樹脂を使用するとともに、フィルムの最内層及び最外層にはブロッキングが比較的生じにくく、かつ低い密度のポリエチレン系樹脂を使用することができる。その結果、従来よりもガス透過性に優れ、取り扱い易い細胞培養容器を得ることが可能となっている。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明の多層フィルムのガス透過性試験に関する実施例と比較例、及び本発明の細胞培養容器の細胞培養試験に関する実施例と比較例について説明する。以下、本発明の多層フィルムを細胞培養フィルム、及びこのフィルムを用いて作製した細胞培養容器を培養バッグと称する場合がある。【００３１】
＜ガス透過性試験＞
（実施例１）
３層からなる細胞培養フィルムを、ラボプラストミル（株式会社東洋精機製作所製）によりＴ−ダイ法にて共押出成形した。このとき、基材には、カーネルＫＳ２４０Ｔ（ＬＬＤＰＥ，日本ポリエチレン株式会社製、密度０．８８０ｇ／ｃｍ３）を使用した。また、内層及び外層には、エクセレンＧＭＨ  ＣＢ２００１（ＬＤＰＥ，住友化学工業株式会社製、密度０．９２０ｇ／ｃｍ３）とカーネルＫＭ２６２（ＬＬＤＰＥ，日本ポリエチレン株式会社製、密度０．８９８ｇ／ｃｍ３）を６：４の重量比でブレンドした樹脂を使用した。製造した細胞培養フィルムにおける基材の厚さは６６μｍ、内層の厚さは１９μｍ、外層の厚さは１２μｍであり、細胞培養フィルム全体の厚さは９７μｍであった。【００３２】
この細胞培養フィルムを使用して、混合ガス透過測定装置ＧＰＭ−２５０（ジーエルサイエンス株式会社製）により単位厚さ当たりの酸素透過係数（ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ））を測定した。その結果を図５に示す。同図において、酸素透過係数が大きいほど、細胞培養フィルムのガス透過性が高いことを示している。
同図に示されるように、実施例１で得られた細胞培養フィルムの酸素透過係数はおよそ９７０ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）を示している。【００３３】
また、この細胞培養フィルムを使用して、同様に混合ガス透過測定装置ＧＰＭ−２５０により単位厚さ当たりの二酸化炭素透過係数（ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ））を測定した。その結果を図６に示す。同図において、二酸化炭素透過係数が大きいほど、細胞培養フィルムのガス透過性が高いことを示している。
同図に示されるように、実施例１で得られた細胞培養フィルムの二酸化炭素透過係数はおよそ２１９０ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）を示している。【００３４】
（実施例２）
実施例１と同様にして、３層からなる細胞培養フィルムを製造した。このとき、基材には、カーネルＫＳ３４０Ｔ（ＬＬＤＰＥ，日本ポリエチレン株式会社製  密度０．８８０ｇ／ｃｍ３）を使用した。また、内層及び外層には、カーネルＫＦ２８３（ＬＬＤＰＥ，日本ポリエチレン株式会社製、密度０．９２１ｇ／ｃｍ３）とカーネルＫＭ２６２（ＬＬＤＰＥ，日本ポリエチレン株式会社製、密度０．８９８ｇ／ｃｍ３）を６：４の重量比でブレンドした樹脂を使用した。製造した細胞培養フィルムにおける基材の厚さは６３μｍ、内層の厚さは１７μｍ、外層の厚さは１２μｍであり、細胞培養フィルム全体の厚さは９２μｍであった。【００３５】
この細胞培養フィルムを使用して、実施例１と同様に、単位厚さ当たりの酸素透過係数と二酸化炭素透過係数を測定した。その結果をそれぞれ図５、図６に示す。
これらの図において、実施例２で得られた細胞培養フィルムの酸素透過係数はおよそ８１０ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）を示し、二酸化炭素透過係数はおよそ２４９０ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）を示している。【００３６】
（実施例３）
実施例１と同様にして、３層からなる細胞培養フィルムを製造した。このとき、基材には、カーネルＫＳ２４０Ｔ（ＬＬＤＰＥ，日本ポリエチレン株式会社製、密度０．８８０ｇ／ｃｍ３）を使用した。また、内層及び外層には、エクセレンＧＭＨ
ＣＢ２００１（ＬＤＰＥ，住友化学工業株式会社製、密度０．９２０ｇ／ｃｍ３）を使用した。製造した細胞培養フィルムにおける基材の厚さは６５μｍ、内層の厚さは１５μｍ、外層の厚さは１４μｍであり、細胞培養フィルム全体の厚さは９４μｍであった。【００３７】
この細胞培養フィルムを使用して、実施例１と同様に、単位厚さ当たりの酸素透過係数と二酸化炭素透過係数を測定した。その結果をそれぞれ図５、図６に示す。
これらの図において、実施例３で得られた細胞培養フィルムの酸素透過係数はおよそ８００ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）を示し、二酸化炭素透過係数はおよそ２３８０ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）を示している。【００３８】
（実施例４）
２層からなる細胞培養フィルムを、ラボプラストミル（株式会社東洋精機製作所製）によりＴ−ダイ法にて共押出成形した。このとき、基材には、カーネルＫＳ２４０Ｔ（ＬＬＤＰＥ，日本ポリエチレン株式会社製、密度０．８８０ｇ／ｃｍ３）を使用した。また、内層には、エクセレンＧＭＨ  ＣＢ２００１（ＬＤＰＥ，住友化学工業株式会社製、密度０．９２０ｇ／ｃｍ３）を使用した。製造した細胞培養フィルムにおける基材の厚さは８８μｍ、内層の厚さは１８μｍであり、細胞培養フィルム全体の厚さは１０６μｍであった。【００３９】
この細胞培養フィルムを使用して、実施例１と同様に、単位厚さ当たりの酸素透過係数と二酸化炭素透過係数を測定した。その結果をそれぞれ図５、図６に示す。
これらの図において、実施例４で得られた細胞培養フィルムの酸素透過係数はおよそ９１０ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）を示し、二酸化炭素透過係数はおよそ２５４０ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）を示している。【００４０】
（実施例７）
３層からなる細胞培養フィルムを、ラボプラストミル（株式会社東洋精機製作所製）によりＴ−ダイ法にて共押出成形した。このとき、基材には、カーネルＫＦ２６１Ｔ（ＬＬＤＰＥ，日本ポリエチレン株式会社製、密度０．８９８ｇ／ｃｍ３）を使用した。また、内層には、ユメリット１２５ＦＮ（ＬＬＤＰＥ，宇部丸善ポリエチレン製、密度０．９２４ｇ／ｃｍ３）を、外層には、ユメリット１２５ＦＮ（ＬＬＤＰＥ，宇部丸善ポリエチレン製、密度０．９２４ｇ／ｃｍ３）を使用した。製造した細胞培養フィルムにおける基材の厚さは７５μｍ、内層の厚さは１２μｍ、外層の厚さは１３μｍであり、細胞培養フィルム全体の厚さは１００μｍであった。【００４１】
この細胞培養フィルムを使用して、実施例１と同様に、単位厚さ当たりの酸素透過係数と二酸化炭素透過係数を測定した。その結果をそれぞれ図５、図６に示す。
これらの図において、実施例７で得られた細胞培養フィルムの酸素透過係数はおよそ７８０ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）を示し、二酸化炭素透過係数はおよそ２４００ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）を示している。【００４２】
（比較例１）
単層の細胞培養フィルムを、エボリューＳＰ０５１１（ＬＬＤＰＥ，株式会社プライムポリマー製、密度０．９０３ｇ／ｃｍ３）を材料として、ラボプラストミルにより製造した。この細胞培養フィルムの厚さは９７μｍであった。
この細胞培養フィルムを使用して、実施例１と同様に、単位厚さ当たりの酸素透過係数と二酸化炭素透過係数を測定した。その結果をそれぞれ図５、図６に示す。
これらの図において、比較例１で得られた細胞培養フィルムの酸素透過係数はおよそ５００ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）を示し、二酸化炭素透過係数はおよそ１５５０ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）を示している。【００４３】
（比較例２）
単層からなる細胞培養フィルムを、ハーモレックスＮＦ３２５Ｎ（ＬＬＤＰＥ，日本ポリエチレン株式会社製、密度０．９０８ｇ／ｃｍ３）を材料として製造した。この細胞培養フィルムの厚さは９７μｍであった。
この細胞培養フィルムを使用して、比較例１と同様に、酸素透過係数と二酸化炭素透過係数を測定した。その結果をそれぞれ図５、図６に示す。
これらの図において、比較例２で得られた細胞培養フィルムの酸素透過係数はおよそ４８０ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）を示し、二酸化炭素透過係数はおよそ１４８０ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）を示している。【００４４】
（比較例３）
単層からなる細胞培養フィルムを、カーネルＫＦ２７１（ＬＬＤＰＥ，日本ポリエチレン株式会社製、密度０．９１３ｇ／ｃｍ３）を材料として製造した。この細胞培養フィルムの厚さは９７μｍであった。
この細胞培養フィルムを使用して、比較例１と同様に、酸素透過係数と二酸化炭素透過係数を測定した。その結果をそれぞれ図５、図６に示す。これらの図において、比較例３で得られた細胞培養フィルムの酸素透過係数はおよそ３７０ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）を示し、二酸化炭素透過係数はおよそ１１８０ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）を示している。【００４５】
以上の結果から、実施例１−４，７の酸素透過係数は、比較例のうち最も酸素透過係数が大きい比較例１の酸素透過係数に対して、それぞれ９４％、６２％、６０％、８２％、５６％大きいことがわかる。
また、実施例１−４，７の二酸化炭素透過係数は、比較例のうち最も二酸化炭素透過係数が大きい比較例１の二酸化炭素透過係数に対して、それぞれ４１％、６１％、５４％、６４％、５５％大きいことがわかる。
したがって、本発明の細胞培養フィルム、及びこれを用いて製造した細胞培養容器は、優れたガス透過性を示すことが明らかとなった。【００４６】
＜細胞培養試験１＞
（実施例５）
次に、実施例１において得られた細胞培養フィルムを用いて細胞培養容器を２個製造し、それぞれの細胞培養容器を使用して、異なる培養時間による細胞培養試験を行った。
細胞培養容器のサイズはいずれも８０ｍｍ×８０ｍｍであり、培養液としては、ＡｌｙＳ５０５Ｎ−７（株式会社細胞科学研究所製）５０ｍｌをそれぞれに使用した。また、培養細胞には、ｈＰＢＭＣ（Ｈｕｍａｎ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌｓ、Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ）を使用し、初期細胞密度をそれぞれ約１８万ｃｅｌｌｓ／ｍｌとした。その結果を図７に示す。
同図に示される通り、培養時間を９５時間としたときの回収時細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、約２９８万、培養時間を１２０時間としたときの回収時細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、約３７０万であった。【００４７】
（比較例４）
比較例１の細胞培養フィルムを用いて細胞培養容器を２個製造し、それぞれの細胞培養容器を使用して、異なる培養時間による細胞培養試験を行った。
細胞培養容器のサイズ、培養液、培養細胞、初期細胞密度の各条件は、実施例５と同様であり、細胞培養容器を形成する細胞培養フィルムのみが実施例５と相違している。その結果を図７に示す。
同図に示される通り、培養時間を９５時間としたときの回収時細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、約３０５万、培養時間を１２０時間としたときの回収時細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、約３２４万であった。【００４８】
（比較例５）
比較例２の細胞培養フィルムを用いて細胞培養容器を２個製造し、それぞれの細胞培養容器を使用して、異なる培養時間による細胞培養試験を行った。
細胞培養容器のサイズ、培養液、培養細胞、初期細胞密度の各条件は、実施例５と同様であり、細胞培養容器を形成する細胞培養フィルムのみが実施例５と相違している。その結果を図７に示す。
同図に示される通り、培養時間を９５時間としたときの回収時細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、約２４１万、培養時間を１２０時間としたときの回収時細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、約２８８万であった。【００４９】
（比較例６）
比較例３の細胞培養フィルムを用いて細胞培養容器を２個製造し、それぞれの細胞培養容器を使用して、異なる培養時間による細胞培養試験を行った。
細胞培養容器のサイズ、培養液、培養細胞、初期細胞密度の各条件は、実施例５と同様であり、細胞培養容器を形成する細胞培養フィルムのみが実施例５と相違している。その結果を図７に示す。
同図に示される通り、培養時間を９５時間としたときの回収時細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、約２２７万、培養時間を１２０時間としたときの回収時細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、約２７９万であった。【００５０】
（参考例１）
細胞培養用ｄｉｓｈ（ベクトン・ディッキンソン  アンド  カンパニー製）を２個使用して、それぞれ異なる培養時間による細胞培養試験（コントロール実験）を行った。
培養液、培養細胞、及び初期細胞密度の各条件は、実施例５と同様であり、細胞培養バッグを使用することなく開放系での細胞培養を行った点のみが実施例５と相違している。その結果を図７に示す。
同図に示される通り、培養時間を９５時間としたときの回収時細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、約３００万、培養時間を１２０時間としたときの回収時細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、約４１８万であった。【００５１】
以上の結果に示される通り、培養時間が９５時間の場合には、実施例５の細胞培養容器を使用したときの細胞密度は、比較例４に示す単層の細胞培養容器を用いた場合や、参考例１に示す開放系の培養の場合とほぼ同様となっている。
しかしながら、培養時間が長くなるにつれて、細胞培養バッグのガス透過性の影響が大きくなり、培養時間が１２０時間の場合には、実施例５の細胞培養バッグを使用したときの細胞密度は、比較例４−６に示す細胞培養容器を用いた場合の細胞密度に対して、それぞれおよそ１４％、２８％、３３％大きくなっている。
また、培養時間が９５時間の場合も、実施例５の細胞培養容器を使用したときの細胞密度は、比較例５，６に示す細胞培養容器を用いた場合の細胞密度に対して、それぞれおよそ２４％、３１％大きくなっている。
したがって、本発明の高ガス透過性を示す細胞培養フィルムを用いて形成された細胞培養容器によれば、細胞培養効率を向上できることが明らかとなった。【００５２】
＜細胞培養試験２＞
（実施例６）
次に、実施例１において得られた細胞培養フィルムを用いて細胞培養容器を２個製造し、それぞれの細胞培養容器を使用して、異なる培養時間による細胞培養試験を行った。
細胞培養容器のサイズはいずれも８０ｍｍ×８０ｍｍであり、培養液としては、ＡｌｙＳ５０５Ｎ−０（株式会社細胞化学研究所製）４０ｍｌをそれぞれ使用した。また、培養細胞には、Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１株（Ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋａｅｍｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔ）を使用し、初期細胞密度をそれぞれ約４.６万ｃｅｌｌｓ／ｍｌとした。その結果を図８に示す。
同図に示される通り、培養時間を７２時間としたときの回収時細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、約５３万、培養時間を９６時間としたときの細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、約９９万であった。【００５３】
（比較例７）
比較例１の細胞培養フィルムを用いて細胞培養容器を２個製造し、それぞれの細胞培養容器を使用して、異なる培養時間による細胞培養試験を行った。
細胞培養容器のサイズ、培養液、培養細胞、初期細胞密度の各条件は、実施例６と同様であり、細胞培養容器を形成する細胞培養フィルムのみが実施例６と相違している。その結果を図８に示す。
同図に示される通り、培養時間を７２時間としたときの回収時細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、約５３万、培養時間を９６時間としたときの回収時細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、約８９万であった。【００５４】
（比較例８）
比較例２の細胞培養フィルムを用いて細胞培養容器を２個製造し、それぞれの細胞培養容器を使用して、異なる培養時間による細胞培養試験を行った。
細胞培養容器のサイズ、培養液、培養細胞、初期細胞密度の各条件は、実施例６と同様であり、細胞培養容器を形成する細胞培養フィルムのみが実施例６と相違している。その結果を図８に示す。
同図に示される通り、培養時間を７２時間としたときの回収時細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、約５１万、培養時間を９６時間としたときの回収時細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、約８８万であった。【００５５】
（参考例２）
細胞培養用ｄｉｓｈ（ベクトン・ディッキンソン  アンド  カンパニー製）を２個使用して、それぞれ異なる培養時間による細胞培養試験（コントロール実験）を行った。
培養液、培養細胞、及び初期細胞密度の各条件は、実施例６と同様であり、細胞培養バッグを使用することなく開放系での細胞培養を行った点のみが実施例６と相違している。その結果を図８に示す。
同図に示される通り、培養時間を７２時間としたときの回収時細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、約６２万、培養時間を９６時間としたときの回収時細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、約１１１万であった。【００５６】
以上の結果に示される通り、培養時間が７２時間の場合には、実施例６の細胞培養容器を使用したときの細胞密度は、比較例７，８の細胞培養容器を用いた場合とほぼ同様の値を示し、参考例２に示す開放系の培養の場合よりもやや小さくなっている。
しかしながら、培養時間が長くなるにつれて、細胞培養容器のガス透過性の影響が大きくなり、培養時間が９６時間の場合には、実施例６の細胞培養容器を使用したときの細胞密度は、比較例７，８に示す細胞培養容器を用いた場合の細胞密度に対して、それぞれおよそ１１％、１３％大きくなっている。
このように、培養する細胞や培養液、初期培養密度の条件を変えた場合でも、本発明の高ガス透過性を示す細胞培養フィルムを用いて形成された細胞培養容器によれば、細胞培養効率を向上できることが明らかとなった。【００５７】
＜細胞培養試験３＞
（実施例８）
次に、実施例７において得られた細胞培養フィルムを用いて細胞培養容器を２個製造し、それぞれの細胞培養容器を使用して、異なる培養時間による細胞培養試験を行った。
細胞培養容器のサイズはいずれも８０ｍｍ×８０ｍｍであり、培養液としては、ＡｌｙＳ５０５Ｎ−７（株式会社細胞化学研究所製）４０ｍｌをそれぞれ使用した。また、培養細胞には、ｈＰＢＭＣ（Ｈｕｍａｎ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌｓ、Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ）を使用し、初期細胞密度をそれぞれ約１８．５万ｃｅｌｌｓ／ｍｌとした。その結果を図９に示す。
同図に示される通り、培養時間を７２時間としたときの回収時細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、約１１４万、培養時間を２１６時間としたときの細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、約３５０万であった。【００５８】
（比較例９）
比較例２の細胞培養フィルムを用いて細胞培養容器を２個製造し、それぞれの細胞培養容器を使用して、異なる培養時間による細胞培養試験を行った。
細胞培養容器のサイズ、培養液、培養細胞、初期細胞密度の各条件は、実施例８と同様であり、細胞培養容器を形成する細胞培養フィルムのみが実施例８と相違している。その結果を図９に示す。
同図に示される通り、培養時間を７２時間としたときの回収時細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、約１００万、培養時間を２１６時間としたときの回収時細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、約３０１万であった。【００５９】
以上の結果に示される通り、培養時間が７２時間の場合には、実施例８の細胞培養容器を使用したときの細胞密度は、比較例９に示す細胞培養容器を用いた場合の細胞密度に対して、およそ１４％大きくなっている。また、培養時間が２１６時間の場合には、実施例８の細胞培養容器を使用したときの細胞密度は、比較例９に示す細胞培養容器を用いた場合の細胞密度に対して、およそ１６％大きくなっている。
このように、本発明の細胞培養フィルムの密度範囲内における比較的高い密度の基材及び外層を用いて形成された細胞培養容器により培養を行った場合、この基材よりも密度が大きく、かつ外層よりも密度が小さい単層フィルムからなる細胞培養容器により培養を行った場合よりも、細胞培養効率を向上できることが明らかとなった。【００６０】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、第二実施形態において、基材１として単独ではハンドリングができない密度のポリエチレン系樹脂を使用し、これを内層２と外層３に挟み込むことで、ガス透過性をさらに向上させるなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明は、細胞培養容器を用いて、細胞を大量培養する場合に好適に利用することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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