(57)【要約】  本発明は、ＧＡＬＡ又はＣｈｏｌ−ＧＡＬＡを含有するリポソームを用いることにより、従来にない優れた肺移行性を有するリポソームを提供する。さらに、当該リポソームを用いることにより、既存のキャリアに比して、ｓｉＲＮＡのノックダウン効果がより強い肺送達キャリアを提供する。
2012124688.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるＧＡＬＡペプチドの、目的物質を肺に送達させるためのベクターの肺移行性素子としての使用。
【請求項２】
前記ＧＡＬＡペプチドがベクターの構成成分に結合されている、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ベクターが脂質及び／又はコレステロールを含み、前記ＧＡＬＡペプチドがカチオン性脂質及び／又はコレステロールに結合されている、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記ベクターがカチオン性脂質および／又はコレステロールを含み、前記ＧＡＬＡペプチドがカチオン性脂質及び／又はコレステロールに結合されている、請求項１または２に記載の使用。
【請求項５】
目的物質をベクターに内包し、かつ、前記ベクターが配列番号１で表されるＧＡＬＡペプチドを含む肺を標的とする物質導入剤。
【請求項６】
ＧＡＬＡペプチドがベクターの構成成分に結合されている、請求項５に記載の物質導入剤。
【請求項７】
前記ベクターが脂質及び／又はコレステロールを含み、前記ＧＡＬＡペプチドがカチオン性脂質及び／又はコレステロールに結合されている、請求項５または６に記載の物質導入剤。
【請求項８】
前記目的物質が薬物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖及びこれらの複合体からなる群から選ばれる、請求項５〜７のいずれか１項に記載の物質導入剤。
【請求項９】
配列番号１で表されるＧＡＬＡペプチドを肺に選択的に物質を送達させるための素子として含有する、目的物質を肺に送達させるためのベクター。
【請求項１０】
前記ベクターが脂質及び／又はコレステロールを含み、前記ＧＡＬＡペプチドがカチオン性脂質及び／又はコレステロールに結合されている、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
前記ベクターがカチオン性脂質を含み、カチオン性脂質がＤＯＴＭＡ、ＤＳＴＡＰ及びＤＯＤＡＰからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、請求項９又は１０に記載のベクター。
【請求項１２】
前記ベクターがポリアルキレングリコール、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンからなる群から選ばれる親水性ポリマーにより修飾されている、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１３】
さらに、補助脂質（Ｈｅｌｐｅｒ  Ｌｉｐｉｄ）を含み，補助脂質（Ｈｅｌｐｅｒ  Ｌｉｐｉｄ）がＥＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＥ又はＳＯＰＥであることを特徴とする請求項９〜１２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１４】
前記ベクターがＤＯＴＭＡ、Ｃｈｏｌ及びＥＰＣを脂質膜の構成要素として含むリポソームであり、前記リポソームの脂質組成(モル比)は、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣが１０〜５０／２０〜５０／２０〜７０であり、前記リポソームは、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣの総脂質量に対しＳＴＲ−ＰＥＧ２０００を１〜１５モル％、Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡを０．１〜５モル％をさらに含む、項９記載のベクター。
【請求項１５】
目的物質を内包し、かつ、配列番号１で表されるＧＡＬＡペプチドを結合したベクターを哺乳動物に投与し、前記目的物質を肺に導入する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺送達のためのベクター、導入剤及び使用に関する。
関連出願の相互参照
本願は、2011年3月14日に出願した特願2011−55765号明細書（その全体が参照により本明細書中に援用される）の優先権の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、低分子医薬、核酸医薬、抗体医薬、ペプチド、タンパク質、糖等の目的物質を標的部位に送達させるためのベクターとして、リポソーム膜の外表面に機能性分子を導入したリポソームの開発が盛んに行われている。バイオ医薬品の中では、抗体医薬、タンパク質医薬に次ぐ次世代バイオ医薬として、核酸医薬の研究が活発に進められている。核酸医薬としては、例えば、アンチセンスやリボザイム、アプタマー、デコイオリゴ、そしてｓｉＲＮＡが挙げられる。核酸医薬の臨床応用は、未だ初期段階にあるが、中でもｓｉＲＮＡが注目され、これまでに欧米のいくつかの製薬企業やベンチャーにより臨床試験が行われている。しかしながら、その臨床試験のほとんどが局所投与に限定されている。デリバリーシステムを用いた全身投与による臨床試験も実施されてはいるものの、肝臓などの受動的な集積が期待できる一部の臓器に限られている。従って、ｓｉＲＮＡに代表される核酸医薬の適用範囲を拡大するためには、能動的な標的化を可能とするデリバリーシステムの構築が求められている。【０００３】
このようなデリバリーシステムの例として、例えば、リポソーム膜の外表面に親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール）が導入されたリポソームが開発されている（特許文献１及び特許文献２参照）。このリポソームによれば、リポソームの血中滞留性を向上させることにより、腫瘍細胞に対するリポソームの指向性を向上させることができる。また、多機能性エンベロープ型ナノ構造体（ＭＥＮＤ：Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ−ｔｙｐｅ  ｎａｎｏ  ｄｅｖｉｃｅ；以下、本明細書において「ＭＥＮＤ」と略す場合がある。）が提案されており、この構造体は、遺伝子、ペプチドなどを特定の細胞内に選択的に送達するためのドラッグデリバリーシステムとして用いることができる。【０００４】
また、ＧＡＬＡに結合したコレステロールを用いて、リポソーム膜の外表面にＧＡＬＡを導入したリポソームが開発されている（非特許文献１参照）。リポソームはエンドサイトーシスするとエンドソーム内に包含された状態となり、エンドソーム内のリポソームは、エンドソームがリソソームと融合することにより分解されるが、このリポソームによれば、リポソーム封入物質をエンドソームから脱出させ、細胞質中へ放出させることができる。【０００５】
ＧＡＬＡは、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、アラニン（ＥＡＬＡ）の繰り返し配列を基本とした３０個のアミノ酸残基から構成されるオリゴペプチドであり、Ｓｚｏｋａ等のグループによって合成され（非特許文献２参照）、現在まで種々の研究が行われている。ＧＡＬＡは、中性ｐＨ条件下では、グルタミン酸の電気反発によりランダムコイル構造をとっているが、酸性条件下ではその電気的反発が解消されることにより脂質膜との親和性が高いα−へリックス構造をとることが知られている（非特許文献２参照）。【０００６】
また、ＧＡＬＡは、これまで、コレステロール（Ｃｈｏｌ）に結合したＧＡＬＡ（Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ）をＭＥＮＤ表面に修飾することにより、エンドソーム内の酸性条件下において、エンドソーム膜とＭＥＮＤ脂質膜との膜融合を引き起こし、内封物質を細胞質中へと放出させることにより、ＭＥＮＤの活性を向上させるｐＨ応答性のエンドソーム脱出促進素子として用いられてきた（特許文献３参照）。【０００７】
上記のように、ＧＡＬＡは、細胞内動態の改善を目的とした機能性素子として用いられてきたが、肺移行性素子としては、これまで知られていない。【０００８】
また、ある種のエンドソーム溶解性ペプチドで修飾されたリポソームの標的器官の一つとして肺が挙げられているが（特許文献４参照）、ここで記載されているペプチドの構成は、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、アラニン（ＥＡＬＡ）の繰り返し配列を基本とした、本願に係るＧＡＬＡペプチドの構成とは大きく異なっており、さらに、当該ペプチドで修飾されたリポソームが肺に特異的に移行することについての記載はなく、また、これを示唆する記載もない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平１−２４９７１７号公報
【特許文献２】特開２００４−１０４８１号公報
【特許文献３】特開２００６−２８０３０号公報
【特許文献４】特表平１０−５０６００１号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｔ．Ｋａｋｕｄｏ等, Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, ２００４；４３：５６１８−５６２３
【非特許文献２】Ｎ．Ｋ．Ｓｕｂｂａｒａｏ等, Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, １９８７；２６：２９６４−２９７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、目的物質を肺に特異的に送達する技術を提供することを目的とする。
本発明は、また、一定期間保存後も凝集しないか、もしくはほとんど凝集しないか、及び／又は保存安定性にも優れたベクターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、医薬などの目的物質を高効率に肺に移行する機能を有するキャリアについて研究を重ねた結果、ＧＡＬＡペプチドが高い肺移行性を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。【００１３】
さらに、ＧＡＬＡペプチドを含むベクター（例えばＧＡＬＡペプチド−脂質で修飾されたリポソーム）をＰＥＧで修飾しても、肺特異的な移行性が消失しないことを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１４】
さらに、ＧＡＬＡペプチド又はＧＡＬＡペプチド−脂質で修飾されたリポソームに、Ｈｅｌｐｅｒ  ｌｉｐｉｄを添加することにより、一定期間保存後も凝集しないか、もしくはほとんど凝集しないか、及び／又は保存安定性に優れた物性を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の使用、物質導入剤及びベクターを提供するものである。
項１．  配列番号１で表されるＧＡＬＡペプチドの、目的物質を肺に送達させるためのベクターの肺移行性素子としての使用。
項２．  前記ＧＡＬＡペプチドがベクターの構成成分に結合されている、項１に記載の使用。
項３．  前記ベクターが脂質及び／又はコレステロールを含み、前記ＧＡＬＡペプチドがカチオン性脂質及び／又はコレステロールに結合されている、項１または２に記載の使用。
項４．  前記ベクターがカチオン性脂質および／又はコレステロールを含み、前記ＧＡＬＡペプチドがカチオン性脂質及び／又はコレステロールに結合されている、項１または２に記載の使用。
項５．  目的物質をベクターに内包し、かつ、前記ベクターが配列番号１で表されるＧＡＬＡペプチドを含む肺を標的とする物質導入剤。
項６．  ＧＡＬＡペプチドがベクターの構成成分に結合されている、項５に記載の物質導入剤。
項７．  前記ベクターが脂質及び／又はコレステロールを含み、前記ＧＡＬＡペプチドがカチオン性脂質及び／又はコレステロールに結合されている、項５または６に記載の物質導入剤。
項８．  前記ベクターがカチオン性脂質及び／又はコレステロールを含み、前記ＧＡＬＡペプチドがカチオン性脂質及び／又はコレステロールに結合されている、項５または６に記載の物質導入剤。
項９．  前記ベクターがポリアルキレングリコール、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンからなる群から選ばれる親水性ポリマーにより修飾されている、項５〜８のいずれか１項に記載の物質導入剤。
項１０．  前記目的物質が肺で作用する生理活性物質である、項５〜９のいずれか１項に記載の物質導入剤。
項１１．  前記目的物質が薬物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖及びこれらの複合体からなる群から選ばれる、項５〜１０のいずれか１項に記載の物質導入剤。
項１２．  前記目的物質が部分二重鎖ＲＮＡ（ｍｄＲＮＡ）、ニックの入ったｄｓＲＮＡ（ｎｄｓＲＮＡ）、ギャップのあるｄｓＲＮＡ（ｇｄｓＲＮＡ）、短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短干渉オリゴヌクレオチド、置換された短干渉オリゴヌクレオチド、修飾された短干渉オリゴヌクレオチド、化学修飾されたｄｓＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）からなる群から選ばれるいずれかの二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である、項５〜１１のいずれか１項に記載の物質導入剤。
項１３．  前記目的物質が核酸であり、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を核酸とともに含む、項１１又は１２に記載の物質導入剤。
項１４．  配列番号１で表されるＧＡＬＡペプチドを肺に選択的に物質を送達させるための素子として含有する、目的物質を肺に送達させるためのベクター。
項１５．  前記ベクターが脂質及び／又はコレステロールを含み、前記ＧＡＬＡペプチドがカチオン性脂質及び／又はコレステロールに結合されている、項１４に記載のベクター。
項１６．  前記ベクターがカチオン性脂質及び／又はコレステロールを含み、前記ＧＡＬＡペプチドがカチオン性脂質及び／又はコレステロールに結合されている、項１４に記載のベクター。
項１７．  前記ベクターがカチオン性脂質を含み、カチオン性脂質がＤＯＴＭＡ、ＤＳＴＡＰ及びＤＯＤＡＰからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、項１５又は１６に記載のベクター。
項１８．  前記ベクターがポリアルキレングリコール、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンからなる群から選ばれる親水性ポリマーにより修飾されている、項１４〜１７のいずれか１項に記載のベクター。
項１９．  ポリアルキレングリコールがＰＥＧ（好ましくは、分子量が２０００のＰＥＧ）である項１８記載のベクター。
項２０．  さらに、補助脂質（Ｈｅｌｐｅｒ  Ｌｉｐｉｄ）を含むことを特徴とする、項１４〜１９のいずれか１項に記載のベクター。
項２１．  補助脂質（Ｈｅｌｐｅｒ  Ｌｉｐｉｄ）がＥＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＥ又はＳＯＰＥであることを特徴とする項２０記載のベクター。
項２２．  前記ベクターがリポソームであり、リポソーム組成がカチオン性脂質／Ｃｈｏｌ／補助脂質／ＳＴＲ−ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ又は補助脂質／Ｃｈｏｌ／ＳＴＲ−ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ（より好ましくはＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＡＰ又はＤＳＴＡＰから選ばれるカチオン性脂質／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ、ＤＯＰＥ又はＳＯＰＥから選ばれる補助脂質／ＳＴＲ−ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ又はＥＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＳＴＲ−ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡであり、更に好ましくはＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ−ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ、ＤＯＤＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ−ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ、ＤＳＴＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ−ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ／ＳＴＲ−ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＳＯＰＥ／ＳＴＲ−ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ又はＥＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＳＴＲ−ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ）である項１４記載のベクター。
項２３．  前記ベクターがＤＯＴＭＡ、Ｃｈｏｌ及びＥＰＣを脂質膜の構成要素として含むリポソームであり、前記リポソームの脂質組成（モル比）は、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣが１０〜５０／２０〜５０／２０〜７０であり、前記リポソームは、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣの総脂質量に対しＳＴＲ−ＰＥＧ２０００を１〜１５モル％、Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡを０．１〜５モル％をさらに含む、項１４記載のベクター。
項２４．  目的物質を内包し、かつ、配列番号１で表されるＧＡＬＡペプチドを結合したベクターを哺乳動物に投与し、前記目的物質を肺に導入する方法。
項２５．  抗癌剤を内包し、かつ、配列番号１で表されるＧＡＬＡペプチドを結合したベクターを肺癌を有する哺乳動物に投与する工程を含む、肺癌の治療方法。
項２６．  前記肺癌が肺転移した癌である項２４に記載の治療方法。
項２７．  配列番号１で表されるＧＡＬＡペプチドを結合したベクターに抗癌剤を内包することを特徴とする肺癌治療剤。
項２８．  前記肺癌が肺転移した癌である項２７に記載の肺癌治療剤。
項２９．  前記ＧＡＬＡペプチドが、総脂質量に対し１〜４モル％の範囲で脂質成分に結合されている、項３に記載の使用、項７に記載の物質導入剤、項１５に記載のベクター。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、目的物質を肺に特異的に送達するためのベクターないし物質導入剤、特にリポソームが提供される。また、本発明のベクターないし物質導入剤、特にリポソームは、肺に移行すると同時に、主要集積臓器である肝臓への移行性を抑制することができる。さらに、本発明のベクターないし物質導入剤、特にリポソームは、特に肺において、既存のｓｉＲＮＡデリバリーキャリアを凌駕するノックダウン効果を示し、目的物質の導入効果が非常に優れていることが実証された。
本発明で使用するＧＡＬＡペプチドを含むベクター及び物質導入剤は、凝集の問題がないため、血管を詰まらせることがない。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１−Ａ】ＧＡＬＡ修飾リポソームの肺移行性を経時的に評価した結果を示す。
【図１−Ｂ】図１−Ａの縦軸を拡大した図を示す。
【図２】ＧＡＬＡ修飾リポソームの肝臓移行性を経時的に評価した結果を示す。
【図３】血液とＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを任意の割合で混合し血球成分との相互作用を評価した結果を示す。
【図４】ｓｉＲＮＡを［３２Ｐ］で、脂質膜を［３Ｈ］で標識したＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを尾静脈投与し、１時間の肺に含まれる［３２Ｐ］、［３Ｈ］を測定することにより、ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤの肺への移行性を評価した結果を示す。
【図５】蛍光標識ｓｉＲＮＡを封入したＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを尾静脈投与し、１時間後の肺におけるＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤの局在を共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて評価した結果を示す。
【図６】ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ及びＧＡＬＡ未修飾ＭＥＮＤを尾静脈投与し、２４時間後の肺でのＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ及びＧＡＬＡ未修飾ＭＥＮＤの各ノックダウン効果をｑＲＴ−ＰＣＲ法により評価した結果を示す。
【図７】ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを尾静脈投与し、２４時間後の肺でのＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果をｑＲＴ−ＰＣＲ法により評価した結果を示す。
【図８】ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを尾静脈投与し、２４時間後の肝臓でのＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果をｑＲＴ−ＰＣＲ法により評価した結果を示す。
【図９】ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを尾静脈投与し、２４時間後の脾臓でのＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果をｑＲＴ−ＰＣＲ法により評価した結果を示す。
【図１０】カチオン性脂質として、ＤＯＴＭＡ、ＤＳＴＡＰ及びＤＯＤＡＰを用いた場合のＭＥＮＤのノックダウン効果を示す。
【図１１】Ｈｅｌｐｅｒ  ｌｉｐｉｄとして、ＥＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＯＰＥを用いた場合の各ＭＥＮＤのノックダウン効果を示す。
【図１２】ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ４日連続投与時における体重変化を示す。
【図１３】ＭＥＮＤ４日間連続投与時におけるＡＳＴ及びＡＬＴの測定結果を示す。
【図１４】ＰＥＧ修飾ＭＥＮＤの体内動態評価の結果を示す。
【図１５】ＰＥＧ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果を示す。
【図１６】ＭＥＮＤ保存品のノックダウン効果を示す。
【図１７】ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを室温で１ヶ月保存した後の保存安定性の結果を示す。
【図１８】ＧＡＬＡ修飾量が異なるＭＥＮＤを尾静脈内投与し、２４時間後の肺でのＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果をｑＲＴ−ＰＣＲ法により評価した結果を示す。
【図１９】肺転移モデルにおけるＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ投与による肺転移抑制効果を示す。
【図２０】肺転移モデルにおけるＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ投与によるノックダウン効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１８】
本発明のベクターは、ＧＡＬＡペプチドを含むことで、肺への選択的な移行を実現できる。
【００１９】
「配列番号１で表されるＧＡＬＡペプチド」は、下記の３０アミノ酸のペプチドである。
Ａｌａ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  （配列番号１）
配列番号１記載のペプチドは、その配列中に、グルタミン酸（Ｅ）−アラニン（Ａ）−ロイシン（Ｌ）−アラニン（Ａ）の部分構造を４単位有するが、当該部分構造を好ましくは３単位又は４単位、より好ましくは、４単位を保持したまま、それ以外のアミノ酸配列において、アミノ酸の欠失、置換又は付加が行われることが好ましい。これらの改変型ＧＡＬＡペプチドも本発明の「配列番号１で表されるＧＡＬＡペプチド」に含まれる。
【００２０】
配列番号１記載のアミノ酸配列において欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数及び位置は、アミノ酸の個数は１又は複数個、好ましくは１又は数個であり、その具体的な範囲は、欠失に関しては通常１〜４個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個であり、置換に関しては通常１〜６個、好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜２個であり、付加に関しては通常１〜１２個、好ましくは１〜６個、さらに好ましくは１〜４個である。アミノ酸の置換は、疎水性アミノ酸（Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）、塩基性アミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、中性アミノ酸（Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ）の間の類似アミノ酸の置換が好ましい。なお、本明細書において、ＧＡＬＡペプチドは、単に「ＧＡＬＡ」と称する場合がある。
【００２１】
ＧＡＬＡペプチドは、ベクターを構成する構成成分に結合されるのが好ましい。ベクターを構成する成分としては、脂質、蛋白質若しくはペプチド、糖鎖、水溶性又は水混和性ポリマー（中性、カチオン性又はアニオン性）、界面活性剤などが挙げられる。結合は共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合などの任意の結合が挙げられるが、共有結合又は配位結合が好ましく、共有結合が最も好ましい。
【００２２】
ＧＡＬＡペプチドは、細胞に物質を導入できるキャリア（ベクター）に含まれる。細胞に物質を導入できるキャリア（ベクター）としては、脂質ベースのトランスフェクション試薬、ウイルス由来の粒子、リポソーム、ポリプレックス、ミセルなどが挙げられ、好ましい実施形態ではリポソームに修飾ないし結合される。ベクターがリポソームの場合、ＧＡＬＡペプチドは、リン脂質、コレステロール、脂質（好ましくはカチオン性脂質）、補助脂質（Ｈｅｌｐｅｒ  Ｌｉｐｉｄ）等のリポソームの構成成分のいずれに結合させてもよい。コレステロール（コレステリル−ＯＨ）に結合された配列番号１のＧＡＬＡペプチドは、例えば以下の構造を有する（以下、「Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ」と略す場合がある）：
（コレステリル）-O(C=O)-(WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA)-NH2
上記において、「−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−」はＧＡＬＡペプチドのＮ末端のアミノ基と結合しており、「−ＮＨ２」はＧＡＬＡペプチドのＣ末端のカルボキシル基がアミノ基で保護されていることを意味する。コレステロールとＧＡＬＡペプチドの結合は、上記のようにウレタン結合でもよく、エステル結合、エーテル結合のいずれでもよい。コレステリル基は、ＧＡＬＡペプチドのＮ末端、Ｃ末端のいずれに結合してもよく、或いはＧＡＬＡペプチドの任意のアミノ酸の側鎖に結合してもよい。また、コレステリル基はアルキレン、ペプチド、ポリエーテルなどの任意のリンカーを介してＧＡＬＡペプチドに結合してもよい。さらに上記ではＣ末端がアミドになっているが、Ｃ末端はカルボン酸（ＣＯＯＨ）、エステル、カルボン酸の塩などの他の基であってもよい。
【００２３】
ＧＡＬＡペプチドをコレステロール、リン脂質などの脂質成分に結合させてベクター若しくは物質導入剤に含ませる場合、ＧＡＬＡペプチドは総脂質量に対し、０．１〜５モル％、好ましくは０．３〜４モル％、より好ましくは０．５〜４モル％、更に好ましくは、１〜４モル％、特に好ましくは１．５〜２モル％程度使用される。なお、本明細書中で示される「総脂質量」には、リポソームの修飾成分に結合した脂質成分の量は含まない。即ち、ＧＡＬＡペプチドに結合した脂質成分の量は含まれない。同様に、ベクターがＰＥＧ修飾された場合、ＰＥＧに結合した脂質成分の量は含まれない。
【００２４】
例えば、ＧＡＬＡペプチドに結合していない脂質成分（総脂質量）が１００モル、ＧＡＬＡペプチドが結合した脂質成分が５モルの場合、ＧＡＬＡ修飾量（ＧＡＬＡペプチドが結合した脂質の総脂質量に対する割合）は、５モル％になる。
【００２５】
ベクターが脂質成分以外から構成される場合でも、ＧＡＬＡペプチドはベクターの総重量の０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜５重量％、より好ましくは０．５〜４重量％、特に好ましくは１〜２．５重量％程度使用される。
上記に、ＧＡＬＡペプチドをコレステロールに結合させる実施形態について記載したが、コレステロール以外のベクターの構成要素にＧＡＬＡペプチドを結合させることができ、その態様は当業者には明らかである。
【００２６】
本発明のベクター及び物質導入剤のゼータ電位は、中性付近のｐＨ（例えばｐＨ７もしくは７．４）で−１００〜１００ｍＶ程度、好ましくは−５０〜５０ｍＶ程度、より好ましくは−３０〜３０ｍＶ程度である。ゼータ電位は、ゼータサイザーを用いて測定することができる。
【００２７】
本発明のベクター及び物質導入剤の平均粒径は、特に限定されるものではないが、例えば、粒子径３０〜１０００ｎｍであり、好ましくは、５０〜３００ｎｍ、より好ましくは５０〜２００ｎｍ、特に５０〜１５０ｎｍである。平均粒径は、例えば、動的光散乱法、静的光散乱法、電子顕微鏡観察法、原子間力顕微鏡観察法等により測定することができる。
【００２８】
本発明の導入剤は、ベクターとともに細胞内に送達しようとする目的物質を含む。目的物質はベクターと共有結合してもよく、ベクターと複合体を形成してもよく、ベクターが中空粒子の場合には、ベクター内部に封入または内包することができる。本発明の目的物質は、特に肺細胞に導入されて効果を発揮する生理活性物質である。
【００２９】
本発明の物質導入剤は、目的物質の肺細胞内送達のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏのいずれでも使用することができる。
【００３０】
目的物質の種類は特に限定されるものではなく、例えば、薬物、核酸、ペプチド（オキシトシン、ブラジキニン、チロトロビン放出因子、エンケファリン等の生理活性ペプチド、ペプチドホルモンなど）、タンパク質（酵素、インターロイキン等の各種サイトカイン、細胞伝達因子、細胞成長因子等）、糖又はこれらの複合体等が挙げられ、肺疾患の種類、診断、治療等の目的に応じて適宜選択することができる。なお、「核酸」には、ＤＮＡ又はＲＮＡに加え、これらの類似体又は誘導体（例えば、ｓｉＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）が含まれる。また、核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよいし、線状又は環状のいずれであってもよい。
【００３１】
目的物質が薬物の場合、例えば制がん剤、血管拡張薬、肺血管炎治療薬、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、気管支拡張剤、鎮咳剤、肺線維化抑制剤、抗結核薬等が挙げられる。具体的には、制がん剤として、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シスプラチン、オキザリプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、イリノテカン、ＳＮ−３８、アクチノマイシンＤ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキサート、アザチオプリン、フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、ドセタキセル、シクロホスファミド、カペシタビン、エピルビシン、ゲムシタビン、ミトキサントロン、ロイコボリン、ビノレルビン、トラスツズマブ、エトポシド、エストラムスチン、プレドニゾン、インターフェロンα、インターロイキン−２、ブレオマイシン、イホスファミド、メスナ、アルトレタミン、トポテカン、シタラビン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルダラビン、ゲムツズマブ、イダルビシン、ミトキサントロン、トレチノイン、アレムツズマブ、クロランブシル、クラドリビン、イマチニブ、エピルビシン、ダカルバジン、プロカルバジン、メクロレタミン、リツキシマブ、デニロイキンジフチトクス、トリメトプリム／スルファメトキサゾール、アロプリノール、カルムスチン、タモキシフェン、フィルグラスチム、テモゾロマイド、メルファラン、ビノレルビン、アザシチジン、サリドマイド、およびマイトマイシン等が挙げられる。血管拡張薬として、ボセンタン、アンブリセンタン、ベラプロストナトリウム、シルデナフィル、エポプロステノール等が挙げられる。肺血管炎治療薬として、副腎皮質ステロイド、シクロホスファミド、アザチオプリン、メトトレキサート、アスピリン等が挙げられる。抗菌剤として、アムホテリシンＢ等が挙げられる。抗ウイルス剤として、ビダラビン、アシクロビル、トリフルオロチミジン等が挙げられる。抗炎症剤として、フェニルブタゾン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、インドメタシン、スリンダク、ピロキシカム、ジクロフェナック、プレドニゾン、ベクロメタゾン、デキサメタゾン等が挙げられる。
目的物質が核酸の場合、例えば部分二重鎖ＲＮＡ（ｍｄＲＮＡ）、ニックの入ったｄｓＲＮＡ（ｎｄｓＲＮＡ）、ギャップのあるｄｓＲＮＡ（ｇｄｓＲＮＡ）、短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短干渉オリゴヌクレオチド、置換された短干渉オリゴヌクレオチド、修飾された短干渉オリゴヌクレオチド、化学修飾されたｄｓＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）からなる群から選ばれるいずれかの二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が好ましく例示される。目的物質は単独で或いは２種以上を混合して用いることができる。例えば２種以上のｓｉＲＮＡを併用することも可能である。
物質導入剤がｓｉＲＮＡなどの核酸を目的物質として含む場合、ポリエチレンイミン（ＰＥI）のようなカチオンを共存させるのが好ましい。
【００３２】
置換および修飾（化学修飾を含む）の１つの実施形態において、二重鎖ＲＮＡは、デオキシリボヌクレオチドまたは２つのデオキシリボヌクレオチド（例えばチミジン、アデニン）を含むオーバーハング等、二重鎖ＲＮＡの３’末端の一端または両端に１〜４ヌクレオチドのオーバーハングを含み得る。二重鎖ＲＮＡは、一端または両端に平滑末端を有し得る。一部の実施形態において、第１および第２の鎖の５’末端はリン酸化されている。二重鎖ＲＮＡの実施形態のいずれにおいても、３’末端のヌクレオチドオーバーハングは、核酸の糖、塩基、または骨格において化学的に修飾されたリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。二重鎖ＲＮＡの実施形態のいずれにおいても、３’末端のヌクレオチドオーバーハングは、１つ以上の普遍的な塩基リボヌクレオチドを含むことができる。二重鎖ＲＮＡの実施形態のいずれにおいても、３’末端のヌクレオチドオーバーハングは、１つ以上の非環式ヌクレオチドを含むことができる。二重鎖ＲＮＡの実施形態のいずれにおいても、ｄｓＲＮＡは、５’リン酸塩（Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ．． １１０：５６３‐５７４， ２００２； およびＳｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ． １０：５３７‐５６８，２００２を参照）または５’，３’二リン酸塩等の末端リン酸基をさらに含むことができる。
【００３３】
二重鎖ＲＮＡは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−２−メトキシエチル、ハロゲン、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アリル、またはこれらの任意の組み合わせ等の２’糖置換をさらに含み得る。さらなる実施形態において、二重鎖ＲＮＡは、第１の鎖または１つ以上の第２の鎖の一端または両端上に、アルキル、脱塩基、デオキシ脱塩基、グリセリル、ジヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、反転したデオキシヌクレオチド部分、またはこれらの任意の組み合わせ等の末端キャップ置換基をさらに含む。
【００３４】
さらに他の実施形態において、二重鎖ＲＮＡは、独立してホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、メチルホスホン酸塩、アルキルホスホン酸塩、３’−アルキレンホスホン酸塩、５’−アルキレンホスホン酸塩、キラルホスホネート、ホスホノ酢酸塩、チオホスホノ酢酸塩、ホスフィン酸塩、ホスホロアミド酸塩、３’−アミノホスホロアミド酸塩、アミノアルキルホスホロアミド酸塩、チオノホスホロアミド酸塩、チオノアルキルホスホン酸塩、チオノアルキルリン酸トリエステル、セレノリン酸塩、ボラノリン酸結合、またはこれらの任意の組み合わせ等の、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合をさらに含み得る。
二重鎖ＲＮＡは、５‐メチルシトシン；５−ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２−アミノアデニン；６−メチル，２−プロピル、またはアデニンおよびグアニンのその他のアルキル誘導体；８−置換されたアデニンおよびグアニン（８−アザ、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル等）；７−メチル、７−デアザ、および３−デアザアデニンならびにグアニン；２−チオウラシル；２−チオチミン；２−チオシトシン；５−メチル、５−プロピニル、５−ハロ（５−ブロモまたは５−フルオロ等）、５−トリフルオロメチル、または他の５−置換されたウラシルおよびシトシン；ならびに６−アゾウラシルなどの核酸アナログを使用することで、置換ないし修飾(化学修飾を含む)することができる。
【００３５】
二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などのＲＮＡは化学的に修飾され得る。このような化学修飾の非限定的な例には、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、「非環状」ヌクレオチド、５’−Ｃ−メチルヌクレオチド、および末端へのグリセリルおよび／または逆方向デオキシ無塩基残基の導入が挙げられる。これらの化学修飾は、細胞内におけるＲＮＡｉ活性を維持することができる。
リポソームは、脂質二重層構造を有する閉鎖小胞である限り、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）であってもよいし、ＳＵＶ（ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）  、ＬＵＶ（ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）  、ＧＵＶ（ｇｉａｎｔ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）等の一枚膜リポソームであってもよい。
本発明のベクター（キャリア）は、親水性ポリマーにより修飾することができる。
親水性ポリマーとしては、ポリアルキレングリコール（ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、或いはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのブロック共重合体などのポリアルキレングリコールの共重合体）、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンなどが挙げられ、好ましくはポリアルキレングリコール（ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、或いはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのブロック共重合体などのポリアルキレングリコールの共重合体）、特に好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられ、これらの親水性ポリマーによりベクター（キャリア）を修飾するのが好ましい。ＰＥＧの長さは、５００〜１００００程度の分子量の範囲で適宜選択することができ、好ましくは分子量が１０００〜５０００であり、より好ましくは分子量が２０００である。ＰＥＧにより修飾された脂質としては、ＤＳＰＥ（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）−ＰＥＧ２０００、ＤＭＰＥ（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）−ＰＥＧ２０００、ＤＳＧ（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）−ＰＥＧ２０００、ＤＭＧ（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）−ＰＥＧ２０００、コレステリル化ＰＥＧ２０００、ＳＴＲ（Ｓｔｅａｒｙｌ）−ＰＥＧ２０００又はＣ８セラミド−ＰＥＧ２０００、Ｃ１６セラミド−ＰＥＧ２０００などが挙げられ、これらのうち、ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００又はＣ８セラミド−ＰＥＧ２０００が好ましい。他の親水性ポリマーの分子量も同様に当業者は適宜選択できる。
【００３６】
例えばリポソームをＰＥＧ修飾する場合、ステアリル化ＰＥＧ（ＳＴＲ−ＰＥＧ）、Ｃ８セラミド−ＰＥＧ、コレステリル化ＰＥＧ（Ｃｈｏｌ−ＰＥＧ）を使用するのが、肺移行性能及び目的物質（例えばｓｉＲＮＡ等の核酸医薬）の機能発現を損ねることなく保存安定性に優れたベクター（例えばリポソーム製剤）を得るために好ましく、また、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＳＧ−ＰＥＧ、Ｃ１６セラミド−ＰＥＧ等を使用するのが、血中安定性を向上させるために好ましい。
【００３７】
親水性ポリマーは、リポソームを修飾する場合、リポソームを構成する脂質を１００モル％とした場合に１〜１５モル％程度の割合で修飾するのが好ましい。
【００３８】
以下において、目的物質をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで肺に送達するベクター（キャリア）としてリポソームを例に挙げて説明するが、本発明はリポソームに限定されず、ＧＡＬＡペプチドを細胞内に導入可能な任意のベクター（キャリア）が本発明に包含される。
【００３９】
本発明のリポソームにおいて、脂質二重層を構成する脂質の種類は特に限定されるものではなく、その具体例としては、ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン等のリン脂質又はこれらの水素添加物；スフィンゴミエリン、ガングリオシド等の糖脂質が挙げられ、これらのうち１種又は２種以上を使用することができる。リン脂質は、卵黄、大豆その他の動植物に由来する天然脂質（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチン等）、合成脂質又は半合成脂質のいずれであってもよい。これらの脂質は単独で又は２種以上を混合して使用することができる。
【００４０】
脂質二重層には、脂質二重層を物理的又は化学的に安定させたり、膜の流動性を調節したりするために、例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール等の動物由来のステロール；スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等の植物由来のステロール（フィトステロール）；チモステロール、エルゴステロール等の微生物由来のステロール；グリセロール、シュクロース等の糖類；トリオレイン、トリオクタノイン等のグリセリン脂肪酸エステルのうち、１種又は２種以上を含有させることができる。その含有量は特に限定されるものでないが、脂質二重層を構成する総脂質量に対して５〜４０％（モル比）であることが好ましく、１０〜３０％（モル比）であることがさらに好ましい。
【００４１】
脂質二重層には、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン等の抗酸化剤；ステアリルアミン、オレイルアミン等の正荷電を付与する荷電物質；ジセチルホスフェート等の負電荷を付与する荷電物質；膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質等の膜タンパク質を含有させることができ、その含有量は適宜調節することができる。
本発明のリポソームは、３０アミノ酸から構成されるＧＡＬＡペプチドを表面に有する。なお、一枚膜リポソームについては脂質二重層の外表面がリポソームの表面であり、多重膜リポソームについては最外層の脂質二重層の外表面がリポソームの表面である。また、本発明のリポソームは、表面以外の部分（例えば、脂質二重層の内表面）に上記ペプチドを有していてもよい。
【００４２】
本発明のベクターには、好ましくはカチオン性脂質が含まれる。カチオン性脂質としては、例えば、ＤＯＤＡＣ（ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）、ＤＤＡＢ（ｄｉｄｏｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ  ｐｒｏｐａｎｅ）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）−ｃａｒｂａｍｏｌ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、ＤＭＲＩＥ（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ）、ＤＯＳＰＡ（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ−Ｎ−［２（ｓｐｅｒｍｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｕｍ  ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）、ＤＳＴＡＰ（１，２−Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−３−Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｐｒｏｐａｎｅ）、ＤＯＤＡＰ（ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ）等が挙げられる。好ましいカチオン性脂質はＤＯＴＭＡ、ＤＳＴＡＰ又はＤＯＤＡＰであり、特に好ましくはＤＯＴＭＡが挙げられる。カチオン性脂質は単独で又は２種以上を混合して使用することができる。
カチオン性脂質において、ＤＯＴＭＡ及びＤＳＴＡＰは４級アミンを有しており，常に正電荷を帯びているが，ＤＯＤＡＰは３級アミンを有しており，生理的ｐＨにおいて電荷を持たないものである。このようにカチオン性脂質の種類、配合量を変更することで、カチオン性脂質の構造，特徴に幅を持たせることができる。
【００４３】
本発明のベクターは、好ましくは、補助脂質（Ｈｅｌｐｅｒ  ｌｉｐｉｄ）が含まれる。補助脂質としては、例えば、ＥＰＣ（ｅｇｇ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＤＬＰＣ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＤＭＰＣ（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＤＰＰＣ（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＤＳＰＣ（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＰＯＰＣ（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＤＯＰＣ（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＤＯＰＥ（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ），ＳＯＰＥ（ｓｔｅａｒｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）等が挙げられる。これらのうち、ＥＰＣ，ＤＯＰＣ，ＤＯＰＥ，ＳＯＰＥが好ましい。
【００４４】
例えば、補助脂質として、ＤＯＰＣを含むＭＥＮＤは室温で１ヶ月保存後も凝集は全く見られず、ＤＯＰＣは保存安定性にも優れている。
本発明のリポソームの好ましい態様として、上記ＧＡＬＡペプチドが疎水性基又は疎水性化合物で修飾されており、疎水性基又は疎水性化合物が脂質二重層に挿入され、上記ペプチドが脂質二重層から露出しているリポソームを例示することができる。なお、本態様において、「ペプチドが脂質二重層から露出している」には、ペプチドが脂質二重層の外表面又は内表面のいずれか一方から露出している場合、両方から露出している場合が含まれる。
【００４５】
疎水性基又は疎水性化合物は、脂質二重層に挿入され得る限り特に限定されるものでない。疎水性基としては、例えば、ステアリル基、パルミチル基、オレイル基、パルミトオレイル基、リノリル基、リノレイル基等の飽和又は不飽和の脂肪酸基、脂肪族アルコール、脂肪族アミン或いはその他の炭素数１０以上の炭化水素基を含む基（例えばコレステリル基（Ｃｈｏｌ）などのステロール由来の基）又はそれらの誘導体等が挙げられるが、これらのうち特に炭素数１０〜２０の脂肪酸基（例えば、パルミトイル基、オレイル基、ステアリル基、アラキドイル基等）が好ましい。また、疎水性化合物としては、例えば、上記に例示したリン脂質、糖脂質又はステロール、長鎖脂肪族アルコール（例えば、ホスファチジルエタノールアミン、コレステロール等）、ポリオキシプロピレンアルキル、グリセリン脂肪酸エステル等が挙げられる。
【００４６】
本発明のリポソームは、例えば、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、凍結・融解法等の公知の方法を用いて作製することができる。
水和法によるリポソームの製造例を以下に示す。
脂質二重層の構成成分である脂質と、疎水性基又は疎水性化合物で修飾された上記ペプチドとを有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を得る。この際、有機溶剤としては、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン等の炭化水素類；塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；メタノール、エタノール等の低級アルコール類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；アセトン等のケトン類等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。次いで、脂質膜を水和させ、攪拌又は超音波処理することにより、上記ペプチドを表面に有するリポソームを製造することができる。
【００４７】
また、水和法による別の製造例を以下に示す。
【００４８】
脂質二重層の構成成分である脂質を有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を得、この脂質膜を水和させ、攪拌又は超音波処理することによりリポソームを製造する。次いで、このリポソームの外液に、疎水性基又は疎水性化合物で修飾された上記ペプチドを添加することにより、リポソームの表面に上記ペプチドを導入することができる。また、脂質が溶解した有機溶剤に疎水性基又は疎水性化合物で修飾された上記ペプチドを添加することでリポソームの表面に上記ペプチドを導入することができる。
【００４９】
例えば、カチオン性脂質として４級アミンを用いる場合のリポソームの調製は、後述する実施例３−１と同様の方法、これに準じた方法又はこれらと常法とを組み合わせることにより、また、カチオン性脂質として３級アミンを用いる場合のリポソームの調製は、後述する実施例３−２と同様の方法、これに準じた方法又はこれらと常法とを組み合わせることにより製造することができる。
【００５０】
カチオン性リポソームの調製にあたり、カチオン性脂質／Ｃｈｏｌ／補助脂質の割合は、適宜変更することができる。その組成比率（モル比）としては１０〜５０／２０〜５０／２０〜７０であるのが好ましく、２０〜４０／３０〜５０／２０〜４０であるのがより好ましく、３０／４０／３０であるのが特に好ましい。カチオン性脂質／Ｃｈｏｌ／補助脂質の好ましい組合せとしては、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＡＰ又はＤＳＴＡＰから選ばれるカチオン性脂質／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ、ＤＯＰＥ又はＳＯＰＥから選ばれる補助脂質であり、より好ましくはＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ、ＤＯＤＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ、ＤＳＴＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＳＯＰＥである。当該リポソームにＣｈｏｌ−ＧＡＬＡを修飾する場合には、Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡの添加割合は、適宜変更することができ、総脂質量（カチオン性脂質／Ｃｈｏｌ／補助脂質の脂質の総量）に対して、例えば、０．１〜５モル％が挙げられ、好ましくは０．３〜４モル％、より好ましくは０．５〜４モル％、更に好ましくは、１〜４モル％、特に好ましくは１．５〜２モル％である。また、当該リポソームに適宜ＰＥＧを修飾することができる。ＰＥＧ修飾する場合には、ＰＥＧの添加割合は、適宜変更することができ、総脂質量（カチオン性脂質／Ｃｈｏｌ／補助脂質の脂質の総量）に対して、例えば、０．１〜１５モル％が挙げられ、好ましくは１〜５モル％である。なお、添加されるＰＥＧは脂質に結合したＰＥＧであることが好ましく、ＳＴＲ−ＰＥＧ又はＣ８セラミド−ＰＥＧがより好ましく、ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００又はＣ８セラミド−ＰＥＧ２０００が特に好ましい。
【００５１】
また、上述の補助脂質を用いて、リポソーム組成を補助脂質／Ｃｈｏｌとした中性リポソームを調製することができ、その組成比率（モル比）としては適宜変更することができるが、４０〜９０／１０〜６０であるのが好ましく、６０〜８０／２０〜４０であるのがより好ましく、７０／３０であるのが特に好ましい。補助脂質／Ｃｈｏｌの好ましい組合せとしては、ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＬＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ、ＳＯＰＥ／Ｃｈｏｌであり、より好ましくはＥＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ、ＳＯＰＥ／Ｃｈｏｌであり、特に好ましくはＥＰＣ／Ｃｈｏｌである。当該リポソームにＣｈｏｌ−ＧＡＬＡを修飾する場合には、Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡの添加割合は、適宜変更することができ、総脂質量（補助脂質／Ｃｈｏｌの脂質の総量）に対して、例えば、０．１〜５モル％が挙げられ、好ましくは０．３〜４モル％、より好ましくは０．５〜４モル％、更に好ましくは、１〜４モル％、特に好ましくは１．５〜２モル％である。 また、当該リポソームに適宜ＰＥＧを修飾することができ、ＰＥＧを修飾する場合には、ＰＥＧの添加割合は、適宜変更することができ、総脂質量（補助脂質／Ｃｈｏｌの脂質の総量）に対して、例えば、０．１〜１５モル％が挙げられ、好ましくは１〜５モル％である。なお、添加されるＰＥＧは脂質に修飾したＰＥＧであることが好ましく、ＳＴＲ−ＰＥＧ又はＣ８セラミド−ＰＥＧがより好ましく、ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００又はＣ８セラミド−ＰＥＧ２０００が特に好ましい。
【００５２】
本発明の好ましいリポソーム組成としては、カチオン性脂質／Ｃｈｏｌ／補助脂質／ＳＴＲ−ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ又は補助脂質／Ｃｈｏｌ／ＳＴＲ−ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡであり、より好ましくはＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＡＰ又はＤＳＴＡＰから選ばれるカチオン性脂質／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ、ＤＯＰＥ又はＳＯＰＥから選ばれる補助脂質／ＳＴＲ−ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ又はＥＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＳＴＲ−ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡであり、更に好ましくはＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ−ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ、ＤＯＤＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ−ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ、ＤＳＴＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ−ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ／ＳＴＲ−ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＳＯＰＥ／ＳＴＲ−ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ又はＥＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＳＴＲ−ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡである。なお、ＳＴＲ−ＰＥＧはＰＥＧ分子量２０００であるＳＴＲ−ＰＥＧ２０００が特に好ましい。
【００５３】
本発明の最も好ましいリポソームは、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡの組成を有し、そのＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣの組成比率（モル比）は１０〜５０／２０〜５０／２０〜７０であり、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣの総脂質量に対して、ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００は１〜１５モル％、Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡは０．１〜５モル％であるのが好ましく；
そのＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣの組成比率（モル比）は２０〜４０／３０〜５０／２０〜４０であり、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣの総脂質量に対して、ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００は１〜５モル％、Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡは１〜４モル％であるのがより好ましく；
そのＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣの組成比率（モル比）は３０／４０／３０であり、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣの総脂質量に対して、ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００は１〜５モル％、Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡは１．５〜２モル％であるのが最も好ましい。ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００とＣｈｏｌ−ＧＡＬＡはリポソームの修飾成分であるので、それらの添加量はＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣの３成分からなるリポソームの総脂質量を１００モル％とし、それに対する比率として表した。
【００５４】
本発明のリポソームの内部には、肺細胞内に送達しようとする目的物質を封入することができる。
【００５５】
本発明の物質導入剤（特にリポソーム）に封入される目的物質は、肺疾患の種類により上述の薬物(制ガン剤、血管拡張薬、抗菌剤など)、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの類似体又は誘導体（例えばｓｉＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）、ペプチド（オキシトシン、ブラジキニン、チロトロビン放出因子、エンケファリン等の生理活性ペプチド、ペプチドホルモンなど）などが挙げられる。肺疾患の種類に応じて好適な目的物質を封入することにより、肺疾患の治療又は予防が可能である。本明細書における「肺疾患」としては、肺癌、肺の炎症性疾患、肺線維症、肺塞栓症、肺高血圧症、肺血管炎、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、石綿症／粉塵疾患（ｄｕｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）、喘息、気管支拡張症、気管支肺形成異常（ＢＰＤ）、慢性気管支炎、慢性の咳、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、感冒、嚢胞性線維症、気腫、ハンタウイルス、ヒストプラズマ症、インフルエンザ、レジオネラ症、リンパ管平滑筋肉腫症、百日咳、胸膜炎、気胸症、原発性肺胞換気過少症候群、肺胞蛋白症、呼吸窮迫症候群、ＲＳウイルス、サルコイドーシス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、または結核等が挙げられ、これらに限定されない。治療又は予防対象として好ましい肺疾患としては、肺の血管に関わる肺疾患であり、肺癌、肺高血圧症、肺血管炎等が挙げられ、特には肺癌（非小細胞肺癌、小細胞肺癌を含む）が挙げられる。肺癌は原発性肺癌だけでなく、肺以外の臓器から転移してできた転移性肺癌も含む。更に、肺癌を原発巣とする他臓器（例えば、副腎、肝臓、脳、又は骨等）への癌転移を抑制するために、本発明の物質導入剤を使用することも可能である。このような、肺癌の治療、肺からの癌転移抑制のために本発明物質導入剤に封入される目的物質としては、上述の制がん剤（例えば、塩酸アムルビシン、ゲフィチニブ、シスプラチン、ビンブラスチン、マイトマイシンＣ、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、カルボプラチン、イリノテカン、テガフール、エトポシド、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、イホスファミド、ビンデシン等）、血管新生に関与する因子（例えば、ＣＤ３１、ＥＳＡＭ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｄｌｌ、ＳＦＲＰ、ＣＤ１５１、ｂＦＧＦ、ＴＧＦβ１、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ等）をターゲットとするｓｉＲＮＡが好ましく、ＣＤ３１、ＥＳＡＭ、ＣＤ１５１、ＶＥＧＦ又はＥＧＦをターゲットとするｓｉＲＮＡがより好ましく、抗ＣＤ３１  ｓｉ  ＲＮＡが特に好ましい。これらは、目的に応じて単独又は２種以上を混合して用いることができる。
【００５６】
肺高血圧症のために本発明物質導入剤に封入される目的物質としては、上述の血管拡張剤（例えば、ボセンタン、アンブリセンタン、ベラプロストナトリウム、シルデナフィル、エポプロステノール等）、血管拡張に関与する因子（例えば、エンドセリン受容体（ＥＴＡ，ＥＴＢ）、ＰＤＥ５等）の抗ｓｉＲＮＡが好ましい。
【００５７】
肺血管炎のために本発明物質導入剤に封入される目的物質としては、副腎皮質ステロイド、シクロホスファミド、アザチオプリン、メトトレキサート、アスピリン等が好ましい。
【００５８】
本発明の物質導入剤は、単独または肺疾患のための他の治療と一緒のいずれかで用いられ得る。
【００５９】
目的物質が水溶性である場合には、リポソームの製造にあたり脂質膜を水和する際に使用される水性溶媒に目的物質を添加することにより、リポソーム内部の水相に目的物質を封入することができる。また、目的物質が脂溶性である場合には、リポソームの製造にあたり使用される有機溶剤に目的物質を添加することにより、リポソームの脂質二重層に目的物質を封入することができる。本明細書において「封入」とは、リポソームのような中空粒子の内部に目的物質を含む場合と、脂質二重膜のようなベクターを構成する表面部分に保持される場合の両方を含む。
【００６０】
目的物質を送達すべき生物種は、肺を有する脊椎動物であれば特に限定されるものではないが、哺乳動物であることが好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。
【００６１】
本発明のリポソームは、例えば、分散液の状態で使用することができる。分散溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン酸緩衝液，  酢酸緩衝液等の緩衝液を使用することができる。分散液には、例えば、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤等の添加剤を添加して使用してもよい。
【００６２】
本発明のリポソームは、分散液を乾燥（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥等）させた状態で使用することもできる。乾燥させたリポソームは、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン酸緩衝液，酢酸緩衝液等の緩衝液を加えて分散液とすることができる。
【００６３】
各リポソームは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏのいずれにおいても使用することができる。各リポソームをｉｎ  ｖｉｖｏにおいて用いる場合には、投与経路として、例えば、静脈注射、点滴等が挙げられ、投与量及び投与頻度は、本発明に係るリポソームに封入された目的物質の種類や量等に応じて適宜調整することができる。
【００６４】
本発明のリポソームは、また、体重減少、肝障害のいずれも見られず、安全に投与することができる。
【実施例】
【００６５】
以下、本発明を実施例に基づき、より詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。【００６６】
各実施例で用いた試薬、材料、動物等を以下に示す。
ＥＰＣは日本油脂（Ｔｏｋｙｏ，ＪＡＰＡＮ）から購入した。ＤＯＴＡＰ、ＤＳＴＡＰ、ＤＯＤＡＰ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＤＯＰＥ、ＳＯＰＥ、ＤＯＰＣ、Ｃ８  セラミド−ＰＥＧ２０００はＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）から購入した。ＤＯＴＭＡは東京化成工業株式会社（Ｔｏｋｙｏ，ＪＡＰＡＮ）から購入した。ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００は和光純薬株式会社より購入した。
Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ  （コレステリル−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−ＷＥＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＨＬＡＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＡ−ＮＨ２，Ｍｗ．３４４４．０，  ＞７１％  ｐｕｔｉｔｙ）は、前記特許文献３に記載の方法、これに準じた方法又はこれらと常法とを組み合わせることにより合成した。
ＰＥＩ（ｂｒａｎｃｈ  ｔｙｐｅ，Ｍｗ．ａｖｅ．１０，０００）は和光純薬株式会社より購入した。
トランスアミナーゼＣII−テストワコーは和光純薬株式会社より購入した。
ＲＮＡｌａｔｅｒはＡｍｂｉｏｎより購入した。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ、ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより購入した。ｓｉＲＮＡ及びＣｙ５標識ｓｉＲＮＡの合成は北海道システムサイエンスに委託した。Ｐｒｉｍｅｒ及びＰｒｏｂｅの合成は常法に従い合成した。使用したｓｉＲＮＡ、Ｐｒｉｍｅｒ、Ｐｒｏｂｅの配列を以下に示す。
［ｓｉＲＮＡ］  
ＣＤ３１−１  ｓｅｎｓｅ  ：  ＧＣＡＣＡＧＵＧＡＵＧＣＵＧＡＡＣＡＡＴＴ  (配列番号２)
ＣＤ３１−１  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ：  ＵＵＧＵＵＣＡＧＣＡＵＣＡＣＵＧＵＧＣＴＴ  （配列番号３）
ＣＤ３１−２  ｓｅｎｓｅ  ：  ＧＵＧＣＡＵＡＧＵＵＣＡＡＧＵＧＡＣＡＴＴ  （配列番号４）
ＣＤ３１−２  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ：  ＵＧＵＣＡＣＵＵＧＡＡＣＵＡＵＧＣＡＣＴＴ  （配列番号５）
ＣＤ３１−３  ｓｅｎｓｅ  ：  ＧＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＴ  （配列番号６）
ＣＤ３１−３  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ：  ＵＧＵＣＣＵＵＣＣＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＴＴ  （配列番号７）
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｓｅｎｓｅ  ：  ＧＣＧＣＵＧＣＵＧＧＵＧＣＣＡＡＣＣＣＴＴ  （配列番号８）
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ：  ＧＧＧＵＵＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＴＴ  （配列番号９）
ＣＤ３１  ｓｉＲＮＡは上記３種類を等量混合して使用した。  
［Ｐｒｉｍｅｒ、Ｐｒｏｂｅ］  
ＣＤ３１  Ｆｏｒｗａｒｄ  ：  ＣＡＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣ  （配列番号１０）
ＣＤ３１  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ：  ＡＣＡＧＧＡＴＧＧＡＡＡＴＣＡＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣ  （配列番号１１）
ＣＤ３１  Ｐｒｏｂｅ  ：  ［ＦＡＭ］  ＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＴＣＴＣＧＣＴＧＡＡＣＡＣＣＧＣ  ［ＴＡＭＲＡ］（配列番号１２）
ＣＤ３４  Ｆｏｒｗａｒｄ  ：  ＴＣＴＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＡＡＧＴＧＡＡＧＣ  （配列番号１３）
ＣＤ３４  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ：  ＣＣＴＣＡＧＡＣＴＧＧＧＣＴＡＧＡＡＧＣＡ  （配列番号１４）
ＣＤ３４  Ｐｒｏｂｅ  ：  ［ＦＡＭ］  ＡＣＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣ  ［ＴＡＭＲＡ］（配列番号１５）
ＩＣＲマウス雄５週齢、Ｃ５７ＢＬ／６マウス雄６週齢は日本ＳＬＣより購入した。
その他、特に記述がない限り、市販の特級または一級のもの、あるいはそれに準ずるものを用いた。【００６７】
また、各実施例で用いた機器等を以下に示す。【００６８】
脂質薄膜の調製には、ポンプＤＩＶＡＣ  １．２、トラップＥＶＡＬＡ  ＵＮＩ  ＴＲＡＰ  ＵＴ−１０００（いずれも東京理科器械）を用いた。【００６９】
超音波処理には、浴槽型ソニケーターＡＵ−２５Ｃ（アイワ医科工業）を使用した。動的光散乱（ＤＬＳ）  による粒子径、ζ電位の測定には、ＺＥＴＡ  ＳＩＺＥＲ  Ｎａｎｏ−ＺＳ  （Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．）を用いた。
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲには、ＡＢＩ  ７５００  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。【００７０】
β線の測定には、液体シンチレーションカウンターＴＲＩ−ＣＡＢＢ  １６００ＴＲ（ＰＡＣＫＡＲＤ）  を用いた。【００７１】
共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）には、Ａ１（Ｎｉｋｏｎ）、対物レンズＰｌａｎ  Ａｐｏ  ＶＣ  ２０×及び６０×、レーザーＡｒ  ｌａｓｅｒ及びＨｅ／Ｎｅ  ｌａｓｅｒを用いた。【００７２】
逆転写反応には、ＰＣＲサーマルサイクラーＴＰ３０００（タカラバイオ株式会社）を用いた。
ｐＨ測定には、Ｄｏｃｕ−ｐＨＭｅｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いた。【００７３】
使用した脂質は、適量のＥｔＯＨで希釈する事で任意の濃度（１〜１０ｍＭ）に調製した。【００７４】
Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡはＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ４−ＡＲ−３００  （Ｓｉｚｅ  １０×２５０  ｍｍ）を用いて逆相ＨＰＬＣを行い精製した。Ｈ２Ｏ／０．１％  ＴＦＡをＢｕｆｆｅｒ  Ａ、ＣＨ３ＣＮ／０．１％  ＴＦＡをＢｕｆｆｅｒ  Ｂとした。Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ（Ｐｕｒｉｔｙ：  ＞７１％）をＤＭＦに溶解したもの（Ｃｒｕｄｅとして４ｍｇ／ｍＬ）をインジェクションしたのち、流速２．０ｍＬ／ｍｉｎ、２５℃で、５０％  Ｂ→９５％  Ｂ（２０ｍｉｎ）とグラジエントをかけた（詳細は下記）。２１５ｎｍにおける吸光度で検出することでＣｈｏｌ−ＧＡＬＡを回収し、凍結乾燥させた。精製したＣｈｏｌ−ＧＡＬＡは、ＨＰＬＣで純度を確認した後、１ｍＭ  ＥｔＯＨ溶液として分注し、−８０℃で保存した。
＜条件＞  
インジェクション量：２５０μＬ（４ｍｇ／ｍＬ  ｉｎ  ＤＭＦ）
流速：２ｍＬ／ｍｉｎ  
カラム温度：２５℃  
プロトコル：【００７５】
【表１】
2012124688.tif 000003
【００７６】
Ｌｉｐｏｓｏｍｅ、ＭＥＮＤの粒子径とζ（ゼータ）電位はＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＫ）を用いて測定した。【００７７】
実験データは、特に断りのない限り３回以上の実験値の平均値±標準偏差で表記した。有意差検定を用いる場合にはＯｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡにより検定を行い、さらにＤｕｎｎｅｔｔ法にて多重比較を行い、Ｐ＜０．０５の場合を有意差ありとした。【００７８】
（実施例１）Ｌｉｐｏｓｏｍｅの調製
１）  脂質薄膜の調製  
ガラス試験管にＥＰＣ（ＥｔＯＨ溶液）、Ｃｈｏｌ（ＥｔＯＨ溶液）をモル比７０／３０で調製し（リポソームａ）、リポソームａの総脂質量に対して、ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００（ＥｔＯＨ溶液）を５モル％になるように添加し、ＥｔＯＨを適当量添加後、デシケーターで減圧乾燥し、溶媒を留去することで、脂質組成がＥＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００である脂質薄膜を調製した（図１では“Ｌｉｐｏｓｏｍｅ”と略す）。また、ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００にＣｈｏｌ−ＧＡＬＡを修飾する際には、リポソームａの総脂質量の２モル％を脂質溶液中に添加し、脂質組成がＥＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡである脂質薄膜を調製した（図１では“ＧＡＬＡ−Ｌｉｐｏｓｏｍｅ”と略す）。また、図１で“Ｃａｔｉｏｎｉｃ−Ｌｉｐｏｓｏｍｅ”で表される脂質薄膜を調製する際には、ＤＯＴＭＡ（ＥｔＯＨ溶液）、Ｃｈｏｌ、ＥＰＣをモル比３０／４０／３０とし、上記と同様の操作で脂質組成がＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣである脂質薄膜（リポソームｂ）を調製した。
２）  リポソームの調製  
上記１）で調製した脂質薄膜に脂質濃度が２．６４ｍＭ（ｉｎ  ｖｉｖｏ実験）、０．５５  ｍＭ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験）となるように１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ  ５％  Ｇｌｕｃｏｓｅ（ＨＢＧ）（ｉｎ  ｖｉｖｏ実験）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ＨＢ）（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験）を添加後、室温で１５分以上水和した。その後、浴槽型ソニケーターで約１分間超音波処理を行うことで、リポソームを調製した。
（実施例２）リポソームの体内動態評価
１）  リポソームの投与、臓器の回収、［３Ｈ］の測定
上記２）で調製されたリポソームの脂質膜を［３Ｈ］で標識することで投与サンプルとした。  
１０μＬ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ／ｇ  ｍｏｕｓｅの条件で、マウス（ＩＣＲ、５週齢、♂）尾静脈より投与した。投与１、５、１５分および１、６時間後にエーテル麻酔によりマウスを処置した後、開腹し、下大静脈より採血した後、肺、肝臓を摘出した。生理食塩水で臓器をよく洗浄し、重量を測定した後（肝臓に関しては、肝臓を細断後よく混合し、肝臓０．２ｇを使用した。）、プラスチックバイアルに入れ、２ｍＬのＳｏｌｕｅｎｅ−３５０を添加し、５０℃で一晩インキュベーションすることで組織を溶解させた。この溶液に対して、Ｈｉｏｎｉｃ  ｆｌｕｏｒ  １０ｍＬを添加しよく混合させた後、４℃で一晩静置し、液体シンチレーションカウンターにて［３Ｈ］のカウントを測定した。また、［３Ｈ］の投与量を評価するため、投与したＬｉｐｏｓｏｍｅサンプル１０μＬに対してＨｉｏｎｉｃ  ｆｌｕｏｒ  １０ｍＬを添加し、よく混合させた後、４℃で一晩静置し、同様に［３Ｈ］のカウントを測定した。【００７９】
２）  臓器移行量評価
各臓器サンプルの［３Ｈ］カウント（測定値）を測定に供した臓器重量で除することにより、各臓器１ｇに含まれる［３Ｈ］を算出した後、投与したリポソームに含まれる［３Ｈ］で除することで、投与量に対する臓器移行量を割合として算出した。【００８０】
ＧＡＬＡ修飾リポソーム（ＧＡＬＡ−Ｌｉｐｏｓｏｍｅ）の肺及び肝臓移行性を経時的に評価した結果を図１−Ａ、図１−Ｂ及び図２に示す。【００８１】
図１−Ａ、図１−Ｂ及び図２に示すように、ＧＡＬＡで修飾されたリポソームの肺移行性が認められた。また、ＧＡＬＡで修飾されたリポソームの肺移行性向上のため、肝臓への移行性が減少していることが認められた。
（実施例３−１）ＭＥＮＤ１の調製
１）  脂質薄膜の調製  
実施例１と同様の方法により、ガラス試験管にＤＯＴＭＡ（ＥｔＯＨ溶液）、Ｃｈｏｌ（ＥｔＯＨ溶液）、ＥＰＣ（ＥｔＯＨ溶液）をモル比３０／４０／３０になるように添加し、ＥｔＯＨを適当量添加後、デシケーターで減圧乾燥し、溶媒を留去することで、脂質組成がＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣである脂質薄膜（リポソームｂ）を調製した。ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００（ＥｔＯＨ溶液）を修飾する際には、リポソームｂの総脂質量の５モル％を脂質溶液中に添加し、脂質組成がＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００である脂質薄膜（以下、“ＭＥＮＤ１”と略す場合がある）を調製した。Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡを修飾する際には、リポソームｂの総脂質量の２モル％を脂質溶液中に添加し、脂質組成がＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡである脂質薄膜（以下、“ＧＡＬＡ−ＭＥＮＤ１”と略す場合がある）を調製した。
２）  ｓｉＲＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘ（ｓｉＲＮＡコア粒子）の調製  
Ｃｈａｒｇｅ  ｒａｔｉｏ（＋／−）＝１．８となるようにＰＥＩ／ｓｉＲＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘを調製した。ボルテックス中、０．３３３  ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ溶液に対して、０．１２５ｍｇ／ｍＬのＰＥＩ溶液を滴下（ｖｏｌｕｍｅ比  ｓｉＲＮＡ溶液：ＰＥＩ溶液＝６：４）し、室温で１５分間以上インキュベーションすることで調製した。ｓｉＲＮＡ溶液およびＰＥＩ溶液は、ＨＢＧにより希釈したものを用いた。
３）ＭＥＮＤの調製
上記１）で得られた脂質薄膜を調製した試験管に、ｓｉＲＮＡコア粒子溶液を、脂質濃度が２．６４ｍＭになるように添加後、室温で１５分以上水和させた。その後、浴槽型ソニケーターで約１分間超音波処理を行うことでＭＥＮＤを調製し、ｓｉＲＮＡコア粒子を封入したＭＥＮＤ１及びＧＡＬＡ−ＭＥＮＤ１を作製した。
（実施例３−２）ＭＥＮＤ２の調製
１）  脂質薄膜の調製
実施例１記載の調製法に準じて、ガラス試験管にＤＯＤＡＰ（ＥｔＯＨ溶液）、Ｃｈｏｌ（ＥｔＯＨ溶液）、ＥＰＣ（ＥｔＯＨ溶液）をモル比３０／４０／３０になるように添加し、成分がＤＯＤＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣである脂質溶液（リポソームｃ）を調製した。得られた脂質溶液にＳＴＲ−ＰＥＧ２０００（ＥｔＯＨ溶液）を、リポソームｃの総脂質量の５モル％を添加し、脂質組成がＤＯＤＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００である脂質薄膜を調製した（以下、“ＭＥＮＤ２”と略す場合がある）。Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡを修飾する際には、リポソームｃの総脂質量の２モル％をＭＥＮＤ２の脂質溶液中に添加し、ＥｔＯＨを適当量添加後、デシケーターで減圧乾燥し、溶媒を留去することで、脂質組成がＤＯＤＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡである脂質薄膜を調製した（以下、“ＧＡＬＡ−ＭＥＮＤ２”と略す場合がある）。
２）  ｓｉＲＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘ（ｓｉＲＮＡコア粒子）の調製
Ｃｈａｒｇｅ  ｒａｔｉｏ（＋／−）＝１．８となるようにＰＥＩ／ｓｉＲＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘを調製した。ボルテックス中、０．３３３ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ溶液に対して、０．１２５ｍｇ／ｍＬのＰＥＩ溶液を滴下（ｖｏｌｕｍｅ比  ｓｉＲＮＡ溶液：ＰＥＩ溶液＝６：４）し、室温で１５分間以上インキュベーションすることで調製した。ｓｉＲＮＡ溶液およびＰＥＩ溶液は、ＨＢＧ（ｐＨ未調整  （ｐＨ  ５．０））により希釈したものを用いることで酸性溶液コア粒子を調製した。
３）ＭＥＮＤの調製
上記１）で得られた脂質薄膜を調製した試験管に、ｓｉＲＮＡコア粒子溶液を、脂質濃度が２．６４ｍＭになるように添加後、室温で１５分以上水和させた。その後、浴槽型ソニケーターで約１分間超音波処理後、調製溶液が中性となるようにＨＢＧ（ｐＨ８．１）をｓｉＲＮＡコア粒子溶液と等量添加することでＭＥＮＤを調製し、ｓｉＲＮＡコア粒子を封入したＭＥＮＤ２及びＧＡＬＡ−ＭＥＮＤ２を作製した。
（実施例４）血球との相互作用
マウス血液（へパリン含、２０  ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）とＧＡＬＡ−ＭＥＮＤ１溶液を１：１のｖｏｌｕｍｅ比になるように混合し、３７℃条件下でシェイカーを用いて５分間混合した（サンプル１）。この混合液に、血液をさらに添加しｖｏｌｕｍｅ比１０：１とした後、先ほどと同様の条件で混合した（サンプル２）。サンプル１、２をスライドガラス上に１０μＬ添加しカバーガラスを載せた後、顕微鏡を用いて観察した。  【００８２】
血液と得られたＧＡＬＡ−ＭＥＮＤ１を任意の割合で混合し血球成分との相互作用を評価した結果を図３に示す。【００８３】
図３に示すように、ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤと血液との凝集は可逆的であることが認められた。
（実施例５）ＭＥＮＤの体内動態評価
ＭＥＮＤの脂質膜を［３Ｈ］、ｓｉＲＮＡを［３２Ｐ］で標識することで投与サンプルとした。  
マウス（ＩＣＲ、５週齢、♂）の尾静脈よりＭＥＮＤ１あるいはＧＡＬＡ−ＭＥＮＤ１溶液（２ｍｇ  ｓｉＲＮＡ／ｋｇ  ｍｏｕｓｅ）を投与した。投与１時間後にエーテル麻酔によりマウスを処置した後、開腹し、下大静脈より血液を採取した後、肺を摘出した。重量を測定した後、０．１ｍｇ程度をプラスチックバイアルに入れ、２ｍＬのＳｏｌｕｅｎｅ−３５０を添加し、５０℃で一晩インキュベーションすることで組織を溶解させた。
この溶液に対して、Ｈ２Ｏ２  ２００μＬ（１００μＬ×２）を添加することで脱色処理をした後、Ｈｉｏｎｉｃ  ｆｌｕｏｒ  １０ｍＬを添加しよく混合させた。４℃で一晩静置し、液体シンチレーションカウンターにて［３Ｈ］、［３２Ｐ］のカウントを測定した。また、未投与マウスから摘出した肺に既知量のＭＥＮＤ１溶液を添加し同様の操作を行うことで検量線を作製し、［３Ｈ］、［３２Ｐ］の各臓器への移行量を算出した。
ｓｉＲＮＡを［３２Ｐ］で、脂質膜を［３Ｈ］で標識したＭＥＮＤ１あるいはＧＡＬＡ−ＭＥＮＤ１を尾静脈投与し、１時間の肺に含まれる［３２Ｐ］、［３Ｈ］を測定することにより、ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤの肺への移行性を評価した結果を図４に示す。【００８４】
図４に示すように、ＧＡＬＡ修飾により、ＭＥＮＤ１の肺への移行性が有意に向上した。
（実施例６）ＣＬＳＭによるＭＥＮＤの肺での局在観察
Ｃｙ５標識ｓｉＲＮＡを用いて調製したＭＥＮＤ１およびＧＡＬＡ−ＭＥＮＤ１を投与サンプルとした。
マウス（ＩＣＲ、５週齢、♂）の尾静脈より実施例３−１で得られたＭＥＮＤ１あるいはＧＡＬＡ−ＭＥＮＤ１溶液（２ｍｇ  ｓｉＲＮＡ／ｋｇ  ｍｏｕｓｅ）を投与した。尾静脈投与１時間後に、麻酔下でマウスより肺を摘出し、数ｍｍ程度の肺組織片を作製した。作製した肺組織片をＧＳＬ  Ｉ−Ｂ４  Ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ  ＦＩＴＣ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（フナコシ社製）溶液中（生理食塩水を用いて２０μｇ／ｍＬに希釈したもの）に３０分間浸透させた後、ＣＬＳＭを用いて観察した。【００８５】
蛍光標識ｓｉＲＮＡを封入したＭＥＮＤ１あるいはＧＡＬＡ−ＭＥＮＤ１を尾静脈投与し、１時間後の肺におけるＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤの局在を共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて評価した結果を図５に示す。【００８６】
図５に示すように、ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤにおいて、肺への高い集積性が認められ、血管内皮細胞と共局在していることが示された。
（実施例７−１）ＧＡＬＡ修飾の有無によるｉｎ  ｖｉｖｏ  ノックダウン効果
ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ及びＧＡＬＡ未修飾ＭＥＮＤを用いて、ＧＡＬＡ修飾の有無によるノックダウン効果を調べた。
１）ＭＥＮＤ溶液の調製
実施例３−１と同様の方法により、ＧＡＬＡ−ＭＥＮＤ１溶液及びＧＡＬＡ未修飾のＭＥＮＤ１溶液を調製した。即ち、脂質組成がＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ＝３０／４０／３０で調製したリポソームの総脂質量に対しＳＴＲ−ＰＥＧ２０００を５モル％修飾したものがＭＥＮＤ１であり、更にＣｈｏｌ−ＧＡＬＡを総脂質量に対して２モル％修飾したものがＧＡＬＡ−ＭＥＮＤ１である。
２）  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、６ｗ、♂）の尾静脈より上記１で得られたＭＥＮＤ溶液（０．５−４ｍｇ  ｓｉＲＮＡ／ｋｇ  ｍｏｕｓｅ）を投与した。尾静脈投与２４時間後に、エーテル麻酔によりマウスを処置した後、開腹し、各臓器（肺、肝臓、脾臓）を摘出した。摘出した臓器は、ＲＮＡｌａｔｅｒに浸し、４℃で一晩置いたのち、−２０℃で保存した。
３）  ｍＲＮＡ抽出  
−２０℃で保存した臓器サンプルを室温に戻し、２０−３０ｍｇを評量したのち、ＲＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔおよびＱＩＡ  ｃｕｂｅ（ＱＵＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付のプロトコルに従いＲＮＡ抽出を行った。
４）  逆転写反応  
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇをＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  Ｋｉｔを用いて添付プロトコルに従い、ｃＤＮＡを調製した。Ｄｅｎａｔｕｒｅおよび逆転写反応は、サーマルサイクラーを用いて、Ｄｅｎａｔｕｒｅ  （６５℃，５ｍｉｎ→４℃，ｈｏｌｄ）、逆転写反応（４２℃，６０ｍｉｎ→９５℃，５ｍｉｎ→４℃，ｈｏｌｄ）の条件で行った。
５）  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ定量  
ＴａｑＭａｎ法に基づいた相対定量法（ΔΔＣｔ法）を用いてｍＲＮＡ（ＣＤ３１）の定量を行った。目的の濃度に希釈したｃＤＮＡ  ５μＬに対して、１００μＭ  Ｕｐｐｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ  ０．２５μＬ、１００μＭ  Ｌｏｗｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ  ０．２５μＬ、１００μＭ  ｐｒｏｂｅ  ０．０６２５μＬ、ｆｉｌｔｒａｔｅｄ  ＤＤＷ  ６．９３７５μＬ、ＴａｑＭａｎ  Ｍ．Ｍ．２×１２．５μＬ添加した後、９５℃、１０ｍｉｎで初期変性を行った後、９５℃、１５ｓｅｃのＰＣＲ変性反応、６０℃、１ｍｉｎのアニーリング／伸長反応を１サイクルとして４０サイクルＰＣＲ反応を行った。ＣＤ３４を内部標準遺伝子として、ΔΔＣｔ法による相対定量を用いてＣＤ３１のｍＲＮＡ量を算出した。【００８７】
ＧＡＬＡ−ＭＥＮＤ１及びＭＥＮＤ１を尾静脈投与し、２４時間後の肺でのＧＡＬＡ−ＭＥＮＤ１及びＭＥＮＤ１の各ノックダウン効果をｑＲＴ−ＰＣＲ法により評価した結果を図６に示す。なお、図６において、ＧＡＬＡ（＋）はＧＡＬＡ−ＭＥＮＤ１、ＧＡＬＡ（−）はＭＥＮＤ１の結果を示している。【００８８】
図６に示すように、ＭＥＮＤにＧＡＬＡを修飾することによって肺におけるノックダウン効果が大幅に向上した。
（実施例７−２）Ｉｎ  ｖｉｖｏノックダウン評価
１）実施例７−１と同様の方法により、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、ｍＲＮＡ抽出、逆転写反応及びＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ定量を用いて、実施例３−１と同様の方法により作製したＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ（脂質組成は、モル比でＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ＝３０／４０／３０であり、ＧＡＬＡ修飾量は総脂質量に対して２モル％である）を尾静脈投与し、２４時間後の肺、肝臓及び脾臓におけるＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果をｑＲＴ−ＰＣＲ法により評価した。【００８９】
ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを尾静脈投与し、２４時間後の肺でのＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果をｑＲＴ−ＰＣＲ法により評価した結果を図７に示す。【００９０】
ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを尾静脈投与し、２４時間後の肝臓でのＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果をｑＲＴ−ＰＣＲ法により評価した結果を図８に示す。【００９１】
ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを尾静脈投与し、２４時間後の脾臓でのＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果をｑＲＴ−ＰＣＲ法により評価した結果を図９に示す。【００９２】
図７に示すように、ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤは、既存のキャリアであるＡｔｕＰＬＥＸに比して、肺において、顕著に強いノックダウン効果を奏することが示された。【００９３】
また、図８に示すように、ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤは、既存のキャリアであるＡｔｕＰＬＥＸに比して、肝臓において、１．０−４．０ｍｇ／ｋｇ投与時にノックダウン効果を奏することが示されたが、図７と比較して、肺における場合のノックダウン効果は肝臓における場合よりもはるかに強いことが示された。【００９４】
また、図９に示すように、ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤは脾臓では有意なノックダウン効果は認められなかった。
（実施例７−３）カチオン性脂質の異なるＭＥＮＤのノックダウン効果
カチオン性脂質の異なるＧＡＬＡ−ＭＥＮＤを調製して、各ＧＡＬＡ−ＭＥＮＤのノックダウン効果を比較した。
１）ＭＥＮＤの調製
カチオン性脂質としてＤＯＴＭＡを用いたＧＡＬＡ−ＭＥＮＤ１（脂質組成はＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ）の調製は実施例３−１と同様の方法により行い、カチオン性脂質としてＤＳＴＡＰを用いたＧＡＬＡ−ＭＥＮＤ３（脂質組成はＤＳＴＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ）の調製はＤＯＴＭＡをＤＳＴＡＰに変更する以外は実施例３−１記載の調製法に準じて行った。また、カチオン性脂質としてＤＯＤＡＰを用いたＧＡＬＡ−ＭＥＮＤ２（脂質組成はＤＯＤＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ）の調製は、実施例３−２と同様の方法により行った。
２）ｉｎ  ｖｉｖｏノックダウン評価
上記１）で得られた異なるカチオン性脂質を含有する各ＧＡＬＡ−ＭＥＮＤにおけるノックダウン効果を評価した。評価方法は、前記実施例７−１と同様の方法により行った。【００９５】
カチオン性脂質として、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＡＰ及びＤＳＴＡＰを用いた場合のＧＡＬＡ−ＭＥＮＤ１〜３のノックダウン効果を図１０に示す。なお、投与量は０．５ｍｇ  ｓｉＲＮＡ／ｋｇとした。【００９６】
図１０に示すように、カチオン性脂質が３級アミンか４級アミンかによらず、本発明に係るＭＥＮＤは高いノックダウン効果を奏することが示された。その中でもカチオン性脂質としてＤＯＴＭＡを含有するＭＥＮＤが最も高いノックダウン効果を奏することが示された。【００９７】
（実施例７−４）Ｈｅｌｐｅｒ  ｌｉｐｉｄが異なるＭＥＮＤのノックダウン効果
Ｈｅｌｐｅｒ  ｌｉｐｉｄの異なるＭＥＮＤを調製して、各ＭＥＮＤのノックダウン効果を比較した。【００９８】
１）ＭＥＮＤの調製
Ｈｅｌｐｅｒ  ｌｉｐｉｄを含むＭＥＮＤの調製は、前記実施例３−１と同様の方法により行った。即ち、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／Ｈｅｌｐｅｒ  ｌｉｐｉｄをモル比３０／４０／３０とするリポソームを調製し、当該リポソームの総脂質量に対して、ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００を５モル％、Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡを２モル％修飾したＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを調製した。【００９９】
２）ｉｎ  ｖｉｖｏノックダウン評価
異なるＨｅｌｐｅｒ  ｌｉｐｉｄを含有する各ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤにおけるノックダウン効果を評価した。評価方法は、前記実施例７−１と同様の方法により行った。【０１００】
Ｈｅｌｐｅｒ  ｌｉｐｉｄとして、ＥＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＯＰＥを用いた場合の各ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果を図１１に示す。なお、図１１において、“ＥＰＣ”は脂質組成がＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ、“ＤＯＰＥ”は脂質組成がＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ／ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ、“ＳＯＰＥ”は脂質組成がＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＳＯＰＥ／ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡであるＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを示す。また、投与量は０．５ｍｇ  ｓｉＲＮＡ／ｋｇとした。【０１０１】
図１１に示すように、Ｈｅｌｐｅｒ  ｌｉｐｉｄの種類によらず、Ｈｅｌｐｅｒ  ｌｉｐｉｄを含む、本発明に係るＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤが高いノックダウン効果を奏することが示された。
（実施例８−１）ＭＥＮＤ４日連続投与時における体重変化
１）ＭＥＮＤ溶液の調製
実施例３−１の方法に準じてＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ溶液を調製した。即ち、脂質組成は、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ＝３０／４０／３０（モル比）であり、ＧＡＬＡ修飾量は、総脂質量に対して２モル％とした。
上記１）で作製したＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ溶液をマウス（Ｃ５７ＢＬ／６、６ｗ、♂）の尾静脈より４日間連続で投与した（２７Ｇの注射針を使用）。投与開始日から最終投与後１日まで各日マウスの体重を測定し、連続投与時における体重変化を算出した。なお、投与量は１あるいは２ｍｇ  ｓｉＲＮＡ／ｋｇ／ｄａｙとした。【０１０２】
ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ４日連続投与時における体重変化を図１２に示す。【０１０３】
図１２に示すように、１〜２ｍｇ／ｋｇにおいて、本発明のＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤは、４日間連続投与時における体重減少が見られなかった。
（実施例８−２）ＭＥＮＤ  ４日間連続投与時におけるＡＳＴ及びＡＬＴ
実施例８−１で使用したＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを４日間連続でマウスに尾静脈投与し、最終投与後２４時間にエーテル麻酔によりマウスを処置した後、開腹し、２３Ｇの注射針及び１ｍＬシリンジを用いて後大静脈より血液を採取した。４℃で４時間静置した後、遠心（４℃、１２０００ｒｐｍ、２ｍｉｎ）し、上清を血清として回収した。血清５μＬに対してＡＳＴ及びＡＬＴ測定キット（トランスアミナーゼＣII−テストワコー）を用いて添付の方法に従い、血清中ＡＳＴ及びＡＬＴを測定した。その結果を図１３に示す。【０１０４】
図１３に示すように、本発明に係るＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤは、ＡＳＴ及びＡＬＴにおいて変化が観察されず、４日間連続投与後翌日には肝障害は起きていないと考えられた。
（実施例９）ＰＥＧ修飾ＭＥＮＤの体内動態評価
ＰＥＧ未修飾のＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤとＰＥＧ修飾ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを用いて、ＰＥＧ修飾の有無によるＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤの体内動態を比較した。【０１０５】
実施例３−１の方法により作製したＭＥＮＤを用いた。ＰＥＧ修飾量は総脂質量に対して１モル％あるいは５モル％とした。
ＭＥＮＤの体内動態評価は、実施例５に準じて行った。なお、ＰＥＧ未修飾ＭＥＮＤ（脂質組成：ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ）、１％ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００修飾ＭＥＮＤ（脂質組成：ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００）、１％Ｃ８セラミド−ＰＥＧ２０００修飾ＭＥＮＤ（脂質組成：ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／Ｃ８セラミド−ＰＥＧ２０００）の体内動態評価はＮ＝２で行った。
ＰＥＧ未修飾のＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ（脂質組成：ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ）とＰＥＧ修飾ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ（脂質組成：ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ、及びＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／Ｃ８セラミド−ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ）の肺移行率の比較を図１４に示す。【０１０６】
図１４に示すように、ＳＴＲ−ＰＥＧ及びＣ８セラミド−ＰＥＧをＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤに修飾しても高い肺移行性が認められた。【０１０７】
（実施例１０）ＰＥＧ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果
ＰＥＧ未修飾のＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤとＰＥＧ修飾ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを用いて、ＰＥＧ修飾の有無によるＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果を比較した。
使用したＭＥＮＤは、実施例９で使用したＰＥＧ未修飾のＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤとＰＥＧ修飾ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを用いた。即ち、ＰＥＧはＳＴＲ−ＰＥＧ２０００及びＣ８セラミド−ＰＥＧ２０００を使用し、ＰＥＧ修飾量は総脂質量に対して１モル％及び５モル％とした。ＭＥＮＤのノックダウン評価は、実施例７−１と同様の方法を用いた。なお、投与量は１ｍｇ  ｓｉＲＮＡ／ｋｇとした。ＰＥＧ未修飾のＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤとＰＥＧ修飾ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果の比較を図１５に示す。【０１０８】
図１５に示すように、ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００及びＣ８セラミド−ＰＥＧ２０００をＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤに修飾しても高いノックダウン効果が得られ、さらにＰＥＧを修飾することによりＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤの凝集を抑制することができた。【０１０９】
（実施例１１）一定期間保存後ＰＥＧ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果
次に、一定期間保存後のＰＥＧ未修飾のＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤとＰＥＧ修飾ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果を比較した。【０１１０】
用いたＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤは、実施例９で使用したＰＥＧ未修飾のＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤとＰＥＧ修飾ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを用いた。なお、ＰＥＧは、ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００を用い、当該ＰＥＧの修飾量は総脂質量に対して５モル％とした。ＭＥＮＤは、ＨＢＧ溶液中（ｐＨ７．４）、室温で１６日間保存した。ＭＥＮＤのノックダウン評価は、実施例７−１と同様の方法を用いた。なお、投与量は１ｍｇ  ｓｉＲＮＡ／ｋｇとした。１６日間保存ＭＥＮＤのノックダウン評価はＮ＝２で行った。  室温で１６日間保存したＰＥＧ未修飾ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤとＰＥＧ修飾ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果を図１６に示す。【０１１１】
図１６に示すように、ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００修飾ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤは室温で１６日間保存しても、肺において高いノックダウン効果を奏することが示された。
（実施例１２）ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤの保存安定性
次に、Ｈｅｌｐｅｒ  ｌｉｐｉｄの変更によるＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤの物性への影響を、室温で１ヶ月後のＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤの凝集の有無により確認した。【０１１２】
用いたＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤは、実施例３−１の方法、これに準じた方法又はこれらと常法とを組み合わせることにより作製した。ＭＥＮＤは、ＨＢＧ溶液中、室温で１ヶ月間保存した。室温で１ヶ月後のＭＥＮＤの性状を図１７に示す。なお、図１７において、“ＥＰＣ”はＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ、“ＤＬＰＣ”はＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＬＰＣ／ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ、“ＤＭＰＣ”はＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＰＣ／ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ、“ＤＰＰＣ”はＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣ／ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ、“ＤＳＰＣ”はＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＣ／ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ、“ＰＯＰＣ”はＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＰＯＰＣ／ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ、“ＤＯＰＣ”はＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＣ／ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ、“ＤＯＰＥ”はＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ／ＳＴＲ−ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ−ＧＡＬＡ  の脂質組成からなるリポソームを示す。【０１１３】
図１７に示すように、Ｈｅｌｐｅｒ  ｌｉｐｉｄとしてＥＰＣ、ＤＬＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＣを使用した場合、ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤは、室温１ヶ月で凝集は見られず、また、Ｈｅｌｐｅｒ  ｌｉｐｉｄとしてＤＯＰＥを使用した場合、ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤは、室温１ヶ月でわずかにしか凝集が見られなかった。
（実施例１３） ｉｎ  ｖｉｖｏ  ノックダウンに及ぼすＧＡＬＡ修飾量の影響
ＧＡＬＡ修飾量が異なるＭＥＮＤを用いて、ＧＡＬＡ修飾量がノックダウン効果に及ぼす影響を評価した。即ち、実施例７−１と同様の方法により、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、ｍＲＮＡ抽出、逆転写反応及びＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ定量を用いて、実施例３−１と同様の方法により作製したＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ（脂質組成は、モル比でＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／＝３０／４０／３０であり、当該リポソームの総脂質量に対するＳＴＲ−ＰＥＧ２０００修飾量は５モル％であり、ＧＡＬＡ修飾量は１〜４モル％である）を尾静脈投与し、２４時間後の肺におけるＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果をｑＲＴ−ＰＣＲ法により評価した。ＧＡＬＡ修飾量が異なるＭＥＮＤを尾静脈投与し、２４時間後の肺でのＧＡＬＡ修飾量が異なるＭＥＮＤの各ノックダウン効果をｑＲＴ−ＰＣＲ法により評価した結果を図１８に示す。【０１１４】
図１８に示すように、ＧＡＬＡを１〜４モル％修飾することによって、肺におけるノックダウン効果が向上し、特にＧＡＬＡを１．５〜２モル％修飾することによって肺におけるノックダウン効果が最も向上した。
（実施例１４）ＭＥＮＤ投与によるメラノーマ肺転移がんモデルにおける抗腫瘍効果
１）ＭＥＮＤ溶液の調製
実施例３−１と同様の方法により、ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ溶液及びＧＡＬＡ未修飾ＭＥＮＤ溶液を調製した。脂質組成は、脂質組成は、モル比でＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／＝３０／４０／３０であり、当該リポソームの総脂質量に対するＳＴＲ−ＰＥＧ２０００修飾量は５モル％であり、ＧＡＬＡ修飾量は２モル％である。
２）メラノーマ肺転移がんモデルの作製
ルシフェラーゼ（ＧＬ４）安定発現Ｂ１６−Ｆ１０マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６−Ｆ１０−ｌｕｃ２；  Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０メディウム中で４８時間培養した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、６ｗ、♂）の尾静脈より、Ｂ１６−Ｆ１０−ｌｕｃ２細胞（２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ）を投与することによりメラノーマ肺転移がんモデルを作製した（ｄａｙ０）。
３）メラノーマ肺転移がんモデルへのＭＥＮＤ投与
Ｂ１６−Ｆ１０−ｌｕｃ２細胞移植後翌日より３日おきに、コントロールｓｉＲＮＡ（ａｎｔｉ−Ｌｕｃ（ＧＬ３））あるいはａｎｔｉ−ＣＤ３１  ｓｉＲＮＡを封入したＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ（１ｍｇ  ｓｉＲＮＡ／ＫＧ  ｍｏｕｓｅ）をモデルマウスに投与し、腫瘍移植後１７日にマウスを開腹し、肺を摘出した。摘出した肺は腫瘍肺転移評価とＣＤ３１  ｍＲＮＡ発現量評価用として２つに分割した。なお、ＭＥＮＤ投与期間中、マウスの体重をモニタリングした。
４）腫瘍肺転移の定量評価
アシストチューブ中で摘出した肺サンプルに対してｉｎ  ｖｉｖｏ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  １  ｍＬを添加し、ＰＯＬＹＴＲＯＮホモジナイザー（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社製）を用いてホモジナイズした。ホモジェネートをサンプルチューブに回収した後、遠心（４℃、１３，０００ｒｐｍ、１０分間）し、その上清２０μＬをＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ５０μＬと混合させた後、ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ，  ＡＴＴＯ社製）でルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／ｌｕｎｇ）は肺全体におけるｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔｓ（ＲＬＵ）として算出した。結果を図１９に示す。
５）ＣＤ３１  ｍＲＮＡ発現量評価
実施例７−１と同様の方法により、摘出した肺におけるＣＤ３１  ｍＲＮＡ量を算出した。結果を図２０に示す。【０１１５】
図１９に示すように、ａｎｔｉ−ＣＤ３１  ｓｉＲＮＡを封入したＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを投与することにより、未処置群およびコントロールｓｉＲＮＡ投与群に比べて有意に肺転移の進行が抑制された。また、図２０に示すように、ａｎｔｉ−ＣＤ３１  ｓｉＲＮＡを封入したＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを投与することにより、未処置群およびコントロールｓｉＲＮＡ投与群に比べて有意にＣＤ３１  ｍＲＮＡ発現量が抑制された。
これまでにＣＤ３１のノックアウトあるいは抗ＣＤ３１抗体投与は腫瘍組織における血管新生を阻害し、その結果メラノーマ肺転移の進行が抑制されることが報告されている(Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Oct 26;107(43):18616-21)。今回の得られたＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ投与により得られた肺転移の進行抑制効果は、ＣＤ３１  ｍＲＮＡのノックダウンにより肺転移腫瘍組織における血管新生が阻害されたことに起因していると考えられた。
なお、肺転移モデルマウスにおいてＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ投与による体重減少は見られなかったことから、ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤは毒性を示すことなく、肺転移の治療が可能であることが示唆された。【０１１６】
これらの結果から、ＧＡＬＡ修飾リポソームが肺特異的に移行することが認められた。
さらに、ｓｉＲＮＡ封入ＧＡＬＡ修飾リポソームが、肺において効率的なノックダウン効果を有することが認められた。
また、本発明のＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを投与しても、体重減少や肝障害が見られず、安全に投与することができることが確認された。
以上から、本発明のＧＡＬＡペプチドで修飾されたベクターは、目的物質を肺に特異的に送達させるためのキャリア、好ましくは医薬、より好ましくはｓｉＲＮＡ等の核酸医薬を肺に特異的に送達させるためのキャリアとして有用であることが明らかになった。【０１１７】
実施例で得られた物質導入剤としてのリポソーム（ＭＥＮＤ）は、平均サイズが９０〜１７０ｎｍ程度、ゼータ電位は−５０〜５０ｍＶの範囲内であった。
実施例１及び３で調製したリポソームのサイズ及びゼータ電位をそれぞれ表２及び表３に示す。【０１１８】
【表２】
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【０１１９】
【表３】
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【０１２０】
本明細書に記載された文献は、その全体が本明細書に参考として援用される。
【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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