(57)【要約】  本発明は水や有機溶媒への溶解性が高いピロロキノリンキノン塩及びその製造方法を提供することを目的とする。本発明によれば、ピロロキノリンキノンイオンと水酸基を有するアンモニウム塩とからなる水や有機溶媒への溶解性が高いピロロキノリンキノンアンモニウム塩及びその製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で表される酸化型ピロロキノリンキノンアンモニウム塩。
【化１】
2012070649.tif 000010
（上記式中、Ｒ１は炭素数が１から４のヒドロキシアルキル基を表し、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ炭素数が１から４のヒドロキシアルキル基又はアルキル基を表し、Ｒ４は水素又は炭素数が１から４のヒドロキシアルキル基若しくはアルキル基を表し、ｎは１〜３である。）
【請求項２】
式（２）で表される還元型ピロロキノリンキノンアンモニウム塩。
【化２】
2012070649.tif 000011
（上記式中、Ｒ１は炭素数が１から４のヒドロキシアルキル基を表し、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ炭素数が１から４のヒドロキシアルキル基又はアルキル基を表し、Ｒ４は水素又は炭素数が１から４のヒドロキシアルキル基若しくはアルキル基を表し、ｎは１〜３である。）
【請求項３】
Ｒ１がヒドロキシエチル基を表し、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がメチル基を表す、請求項１に記載の酸化型ピロロキノリンキノンアンモニウム塩。
【請求項４】
Ｒ１がヒドロキシエチル基を表し、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がメチル基を表す、請求項２に記載の還元型ピロロキノリンキノンアンモニウム塩。
【請求項５】
請求項１又は３に記載の酸化型ピロロキノリンキノンアンモニウム塩と還元剤とを含んでなる組成物。
【請求項６】
酸化型ピロロキノリンキノンアンモニウム塩に対する還元剤の重量比が０．０１から１００の範囲である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１又は３に記載の酸化型ピロロキノリンキノンアンモニウム塩と請求項２又は４に記載の還元型ピロロキノリンキノンアンモニウム塩とを含んでなる組成物。
【請求項８】
式（５）で表される酸化型のピロロキノリンキノン若しくは式（６）で表される還元型のピロロキノリンキノン又はそのアルカリ金属塩とアンモニウム塩とを含んでなる組成物。
【化３】
2012070649.tif 000012
【化４】
2012070649.tif 000013
【請求項９】
アンモニウム塩がコリン塩であり、酸化型若しくは還元型ピロロキノリンキノン又はそのアルカリ金属塩に対するコリン塩の重量比が０．０１から２０００の範囲である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の式（１）で表される酸化型ピロロキノリンキノンアンモニウム塩又は請求項２に記載の式（２）で表される還元型ピロロキノリンキノンアンモニウム塩の製造方法であって、式（５）で表される酸化型のピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩又は式（６）で表される還元型のピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩を酸性条件下にした後、アンモニウムハイドロキサイドを混合させる工程を含むことを特徴とする、ピロロキノリンキノンアンモニウム塩の製造方法。
【化５】
2012070649.tif 000014
【化６】
2012070649.tif 000015
【請求項１１】
アンモニウムハイドロキサイドがコリンハイドロキサイドであり、製造された塩が酸化型又は還元型のピロロキノリンキノンのコリン塩である、請求項１０に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本願は、先行する日本国特許出願である特願２０１０−２６３５４８（出願日：２０１０年１１月２６日）の優先権の利益を享受するものであり、その開示内容全体は引用することにより本明細書の一部とされる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は溶解性の高いピロロキノリンキノン塩及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ピロロキノリンキノン（以下、単に「ＰＱＱ」ということがある）は新しいビタミンの可能性があることが提案されて（例えば、非特許文献１参照）、健康補助食品、化粧品などに有用な物質として注目を集めている。ＰＱＱは細菌に限らず、真核生物のカビ、酵母に存在し、補酵素として重要な働きを行っている。また、ＰＱＱについて近年までに細胞の増殖促進作用、抗白内障作用、肝臓疾患予防治療作用、創傷治癒作用、抗アレルギー作用、逆転写酵素阻害作用およびグリオキサラーゼＩ阻害作用−制癌作用など多くの生理活性が明らかにされている。【０００４】
ＰＱＱは、有機化学的合成法（非特許文献２）または発酵法（特許文献１）などの方法により得た産物をクロマトグラフィーに供し、流出液中のＰＱＱ区分を濃縮して、有機溶媒を加え、晶析により結晶化し（特許文献２）、アルカリ金属塩として得られている。このＰＱＱのアルカリ金属塩は水溶性物質として知られているが、実際には溶解性は低く、また、フリー体の溶解性はさらに低いものである。また、アルコールへの溶解性は水以上に低い。アルカリ金属塩は水素結合とイオン結合によって分子間の相互作用がある（非特許文献３）ために溶解性が低くなっている。その為、高濃度の水溶液を作ることは難しく、有機溶媒溶液での提供は更に困難である。【０００５】
一方で、水溶液、エタノール溶液は食品、医薬品分野で提供する際に最も使用されるため、高濃度で溶解しやすく、析出しない状態が求められている。また、分離精製を行う上でも溶解性の低さは、溶解させるために大量の溶媒（特に水）が必要になり、大きな装置が必要になる、また、廃液量が多くなる等の弊害を有している。また、水は蒸発させるために大量の熱が必要で燃料費が大量にかかるため、蒸気圧の高い溶媒への溶解性が求められている。これらから、溶解性の向上したＰＱＱが求められている。【０００６】
また、ＰＱＱはキノン構造を有し、そのキノン構造部分は還元されやすく（非特許文献４）、還元型のＰＱＱについてはその機能も注目されている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第２７５１１８３号公報
【特許文献２】特公平７−１１３０２４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】nature, vol422, 24 April, 2003, p832
【非特許文献２】JACS, 103巻, 5599〜5600頁（1981）
【非特許文献３】JACS, 111巻, 6822〜6828頁（1989）
【非特許文献４】Bull. Chem. Soc. Jpn. 59巻, 1911〜1914頁(1986）
【非特許文献５】J. Agric. Food Chem., 57巻, 450〜456頁(2009）
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、水や有機溶媒への溶解性が高いピロロキノリンキノンの塩とその製造方法を提供することを目的とする。
【００１０】
本発明者らは、ピロロキノリンキノンイオンとアンモニウムイオンから塩を形成させることにより、水や有機溶媒への溶解性が高いピロロキノリンキノン塩を調製できることを見出した。本発明者らはまた、得られた酸化型ピロロキノリンキノンのアンモニウム塩に対応する還元型ピロロキノリンキノンのアンモニウム塩を調製できることを確認した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
〔１〕式（１）で表される酸化型ピロロキノリンキノンアンモニウム塩。
【化１】
2012070649.tif 000002
（上記式中、Ｒ１は炭素数が１から４のヒドロキシアルキル基を表し、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ炭素数が１から４のヒドロキシアルキル基又はアルキル基を表し、Ｒ４は水素又は炭素数が１から４のヒドロキシアルキル基若しくはアルキル基を表し、ｎは１〜３である。）
〔２〕式（２）で表される還元型ピロロキノリンキノンアンモニウム塩。
【化２】
2012070649.tif 000003
（上記式中、Ｒ１は炭素数が１から４のヒドロキシアルキル基を表し、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ炭素数が１から４のヒドロキシアルキル基又はアルキル基を表し、Ｒ４は水素又は炭素数が１から４のヒドロキシアルキル基若しくはアルキル基を表し、ｎは１〜３である。）
〔３〕Ｒ１がヒドロキシエチル基を表し、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がメチル基を表す、〔１〕に記載の酸化型ピロロキノリンキノンアンモニウム塩。
〔４〕Ｒ１がヒドロキシエチル基を表し、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がメチル基を表す、〔２〕に記載の還元型ピロロキノリンキノンアンモニウム塩。
〔５〕〔１〕又は〔３〕記載の酸化型ピロロキノリンキノンアンモニウム塩と還元剤とを含んでなる組成物。
〔６〕酸化型ピロロキノリンキノンアンモニウム塩に対する還元剤の重量比が０．０１から１００の範囲である、〔５〕に記載の組成物。
〔７〕〔１〕又は〔３〕に記載の酸化型ピロロキノリンキノンアンモニウム塩と〔２〕又は〔４〕に記載の還元型ピロロキノリンキノンアンモニウム塩とを含んでなる組成物。
〔８〕酸化型若しくは還元型ピロロキノリンキノン又はそのアルカリ金属塩とアンモニウム塩とを含んでなる組成物。
〔９〕アンモニウム塩がコリン塩であり、酸化型若しくは還元型ピロロキノリンキノン又はそのアルカリ金属塩に対するコリン塩の重量比が０．０１から２０００の範囲である、〔８〕に記載の組成物。
〔１０〕〔１〕に記載の式（１）で表される酸化型ピロロキノリンキノンアンモニウム塩又は〔２〕に記載の式（２）で表される還元型ピロロキノリンキノンアンモニウム塩の製造方法であって、酸化型又は還元型ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩を酸性条件下にした後、アンモニウムハイドロキサイドを混合させる工程を含むことを特徴とする、ピロロキノリンキノンアンモニウム塩の製造方法。
〔１１〕アンモニウムハイドロキサイドがコリンハイドロキサイドであり、製造された塩が酸化型又は還元型のピロロキノリンキノンのコリン塩である、〔１０〕に記載の製造方法。
【００１１】
本発明により、ピロロキノリンキノンの溶解性の高い塩を提供することが可能になる。これにより高いＰＱＱ濃度の水溶液やアルコール溶液を提供することができ、例えば、医薬品、食品及び飼料での使用に有効な均一で高濃度の溶液を提供可能とする。また、本発明によれば、ピロロキノリンキノンのコリン塩を提供することが可能になる。これにより、栄養成分として重要であり、肝臓、脂質の代謝、神経機能の改善といった機能を有するコリン成分をＰＱＱと同時に摂取することが可能となる。
【発明の具体的説明】
【００１２】
本発明により提供される塩は水酸基を有するアンモニウムとピロロキノリンキノンの塩である。アンモニウムとピロロキノリンキノンの塩を形成させることによりピロロキノリンキノンの溶解性を大幅に改善することができる。ピロロキノリンキノンは一般的にはキノン構造を有する下記式（５）の酸化型ピロロキノリンキノン（フリー体）を意味するが、キノン構造が還元されたヒドロキノリン構造を有する下記式（６）の還元型ピロロキノリンキノン（フリー体）も作製できる。
【化３】
2012070649.tif 000004
【化４】
2012070649.tif 000005
本明細書では、特に明示がない限り、「ピロロキノリンキノン」（ＰＱＱ）は酸化型ピロロキノリンキノン（酸化型ＰＱＱ）を意味するものとするが、本発明によれば、酸化型ピロロキノリンキノンの塩と還元型ピロロキノリンキノンの塩が提供される。
【００１３】
より具体的には、本発明によれば、前記式（１）に示す酸化型ピロロキノリンキノンイオンとアンモニウムイオンのモル比が１：１から１：３の範囲である酸化型ピロロキノリンキノンアンモニウム塩と、前記式（２）に示す還元型ピロロキノリンキノンイオンとアンモニウムイオンのモル比が１：１から１：３の範囲である還元型ピロロキノリンキノンアンモニウム塩が提供される。式（１）及び式（２）において「−ｎＨ」は、酸化型又は還元型のピロロキノリンキノンが、アンモニウムイオンの個数に対応した価数の酸化型又は還元型のピロロキノリンキノンイオンであることを意味する。式（１）に示す酸化型ピロロキノリンキノンイオンとアンモニウムイオンのモル比は、好ましくは１：１．４から１：３（ｎ＝１．４〜３）、より好ましくは１：１．９から１：３（ｎ＝１．９〜３）、特に好ましくは１：２から１：３（ｎ＝２〜３）、最も好ましくは１：２．４から１：３（ｎ＝２．４〜３）の範囲である。式（２）に示す還元型ピロロキノリンキノンイオンとアンモニウムイオンのモル比は、好ましくは１：１．４から１：３（ｎ＝１．４〜３）、より好ましくは１：１．９から１：３（ｎ＝１．９〜３）、特に好ましくは１：２から１：３（ｎ＝２〜３）、最も好ましくは１：２．４から１：３（ｎ＝２．４〜３）の範囲である。
【００１４】
ヒドロキシアルキル基としては、例えば、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基等が挙げられる。
【００１５】
本発明による塩のより好ましい塩としては、前記式（１）に示す酸化型ピロロキノリンキノンイオンとＲ１が２−ヒドロキシエチル基、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がメチル基であるトリメチルヒドロキシエチルアンモニウムイオン（コリンイオン）とのモル比が１：１から１：３の範囲である酸化型ピロロキノリンキノンコリン塩と、前記式（２）に示す還元型ピロロキノリンキノンイオンとコリンイオンとのモル比が１：１から１：３の範囲である還元型ピロロキノリンキノンコリン塩が挙げられる。上記の酸化型ピロロキノリンキノンコリン塩と還元型ピロロキノリンキノンコリン塩はそれぞれ下記式（３）及び式（４）で表すことができる。
【００１６】
【化５】
2012070649.tif 000006
（上記式中、ｎは１〜３である。）
【００１７】
【化６】
2012070649.tif 000007
（上記式中、ｎは１〜３である。）
【００１８】
式（３）及び式（４）において「−ｎＨ」は、酸化型又は還元型のピロロキノリンキノンが、コリンイオンの個数に対応した価数の酸化型又は還元型のピロロキノリンキノンイオンであることを意味する。また、式（３）に示す酸化型ピロロキノリンキノンイオンとコリンイオンのモル比は、好ましくは、１：１．４から１：３（ｎ＝１．４〜３）、より好ましくは１：１．９から１：３（ｎ＝１．９〜３）、特に好ましくは１：２から１：３（ｎ＝２〜３）、最も好ましくは１：２．４から１：３（ｎ＝２．４〜３）の範囲である。式（４）に示す還元型ピロロキノリンキノンイオンとコリンイオンのモル比は、好ましくは、１：１．４から１：３（ｎ＝１．４〜３）、より好ましくは１：１．９から１：３（ｎ＝１．９〜３）、特に好ましくは１：２から１：３（ｎ＝２〜３）、最も好ましくは１：２．４から１：３（ｎ＝２．４〜３）の範囲である。
【００１９】
本明細書において「アルキル」とは直鎖状、分岐状または環状のアルキルを意味する。炭素数が１から４のアルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル等が挙げられる。
【００２０】
本発明のＰＱＱアンモニウム塩は、ＰＱＱのフリー体又はアルカリ金属塩とアンモニウムを反応させることで作ることができる。反応の際、モル比、若しくはｐＨを制御することでアンモニウムの付加数を制御できる。
【００２１】
使用するＰＱＱはフリー体、アルカリ金属塩としてはナトリウム、カリウム、リチウム、セシウム、ルビジュウムの塩であればよく、単独、混合どちらでも良い。より好ましくは、ナトリウム、カリウムの塩であり、最も手に入れやすいナトリウム塩が特に好ましい。カルボン酸の塩としてはモノ、ジ、トリの交換どれでも良く、特に好ましくはジナトリウム塩である。これらの原料は有機化学的合成法および発酵法などにより製造することが可能である。原料に用いるＰＱＱの塩は結晶でもよいし、非晶質でもよい。また、不純物を含んでいてもよい。
【００２２】
使用するアンモニウムは、水酸基を有する４級アンモニウム塩、水酸基を有する３級アミンのアンモニウム塩である。水酸基を有するアンモニウム塩の具体的な例は、トリメチルヒドロキシエチルアンモニウム塩（コリン塩）、トリメチルヒドロキシプロピルアンモニウム塩、トリメチルヒドロキシブチルアンモニウム塩、トリエチルヒドロキシエチルアンモニウム塩、トリエチルヒドロキシプロピルアンモニウム塩、ジ（ヒドロキシエチル）ジメチルアンモニウム塩、ジ（ヒドロキシプロピル）ジメチルアンモニウム塩、トリ（ヒドロキシエチル）メチルアンモニウム塩、トリ（ヒドロキシプロピル）メチルアンモニウム塩、トリヒドロキシエチルアンモニウム塩、トリヒドロキシプロピルアンモニウム塩、ジメチル（ヒドロキシエチル）アンモニウム塩、ジメチル（ヒドロキシプロピル）アンモニウム塩、ジヒドロキシエチルメチルアンモニウム塩、ジヒドロキシプロピルメチルアンモニウム塩等である。
【００２３】
使用するアンモニウム塩は、アンモニウムハイドロキサイド、アンモニウムカーボネート、アンモニウムクロライド、アンモニウムブロマイド、アンモニウムアイオダイド等が使用でき、より好ましくはアンモニウムハイドロキサイドである。
【００２４】
ＰＱＱアンモニウム塩を水溶液中で作製する場合、水溶液のｐＨを２から１０にすればよい。ＰＱＱに対し２個のアンモニウム塩の場合ｐＨが２から５、ＰＱＱに対し３個のアンモニウム塩の場合はそれ以上（ｐＨ５以上）のｐＨで得られることが多い。ｐＨの値によっては整数比ではなく、不定比組成の塩が得られる。すなわち、本発明の塩の組成（モル比）は整数比である必要はなく、不定比の物質として得ることができる。このｐＨは目安で、共存する塩等の影響で得られる物質が変わる場合もある。
【００２５】
反応は水中、有機溶媒中どちらでも可能である。反応温度は特に制限がないが、−２０℃から１４０℃、より好ましくは−１０℃から９０℃が行い易い。反応に必要な時間は混合速度、攪拌、温度、濃度等によって変化するが１０分から７日間行うことが好ましい。反応が進むことにより、水やアルコールへの溶解性は向上する。これ以外の方法としてイオン交換樹脂を使用してＰＱＱアルカリ金属塩からＰＱＱアンモニウム塩へ交換することでも得ることができる。
【００２６】
また、原料として入手しやすいＰＱＱアルカリ金属塩をｐＨ１前後の強酸性条件にすることでフリー体として析出させて濾過した後、アンモニウムハイドロキサイドと反応させることによっても作ることができる。ＰＱＱフリー体に対し、アンモニウムハイドロキサイドを１から３倍のモル比で混合することができる。
【００２７】
ｐＨを調整する方法としては、酸、アルカリを加えることができる。無機、有機、どちらでも使用できる。水、または有機溶媒中で形成したアンモニウム塩は乾燥、濃縮、温度低下、貧溶媒添加、塩析、ｐＨ変化によって得ることができる。アンモニウム塩を溶解させるための溶媒は、水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、イソプロパノール、グリセリン、プロピレングリコール、メトキシエタノール、メトキシプロパノール、ジメチルスルホキシド、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、メチルピロリドン等の極性溶媒が使用できる。より好ましくは、混入しても毒性の低い水、エタノール、メタノール、イソプロパノールである。これに溶解度を下げる操作、具体的には冷却、濃縮、貧溶媒添加、塩析を行えばよい。貧溶媒は使用する溶媒によって変える必要があるが、ヘキサン、ジエチルエーテル、シクロヘキサンが使用しやすい。
【００２８】
本発明では、アルカリ金属が残留しても特に問題がない。本発明のアンモニウム塩は、アンモニウム塩とアルカリ金属塩との混合塩であってもよい。ＰＱＱアンモニウム塩はアンモニウムの付加数が多くなる程、溶解性向上の効果が高い。
【００２９】
入手しやすく、毒性の低く安全性の高いＰＱＱコリン塩の好ましい具体的な製造方法について説明する。ＰＱＱアルカリ金属塩をフリー体にした後、それをコリン塩にする製造法は、特別な装置を必要とせず、容易に行うことが出来る。ＰＱＱのアルカリ金属塩を水に溶解させる。ｐＨは３から１３であることが望ましく、より好ましくは５から１２である。ｐＨ調整の為にアルカリ性の溶液を加えて調整してもよい。温度は０から１４０℃であれは良く、この溶液に酸を加え、ｐＨを１．８以下にすると固体のＰＱＱのフリー体が析出する。これをろ過、遠心分離等の方法で分離する。
【００３０】
このフリー体を、水や有機溶媒中でコリンハイドロキサイドと反応させることでＰＱＱコリン塩を作成することができる。反応時間は特に制限がないが、５分から１週間ぐらいで行うことができる。スケールが小さい場合は短時間ですむが、大きな場合は長時間必要である。このとき−２０℃から１４０℃の範囲の温度で使用すれば良く、好ましくは０℃から８０℃の範囲である。反応した液は乾固、若しくは再結晶でコリン塩を固体として得ることができる。本発明では必ずしも固体である必要はない。再結晶させる溶媒は水または溶媒中で行えばよい。得られた固体は常圧、減圧で乾燥すればよい。
【００３１】
コリンイオン源としては、塩化コリン、臭化コリン、ヨウ化コリン、炭酸コリン、重炭酸コリン、水酸化コリン、酢酸コリン、酒石酸コリン、乳酸コリン、リン酸コリン等が使用できる。反応の際には水酸化コリンが好ましく、その他の場合で好ましくは塩化コリンである。
【００３２】
本発明のコリン塩は単離せずに使用してもよい。また、本発明ではＰＱＱのフリー体やアルカリ金属塩とコリン塩を混合させて使用してもよく、この場合、好ましくは重量比でＰＱＱ１に対してコリン塩の割合が０．０１から２０００が好ましく、より好ましくは０．０１から１００である。
【００３３】
すなわち、本発明によれば、酸化型又は還元型のピロロキノリンキノンのフリー体又はそのアルカリ金属塩とアンモニウム塩とを含んでなる組成物が提供される。この組成物では、酸化型又は還元型のピロロキノリンキノンのフリー体又はそのアルカリ金属塩に対するアンモニウム塩の重量比は０．０１から２０００の範囲、好ましくは、０．０１から１００の範囲、とすることができる。上記組成物においてアンモニウム塩がコリン塩である場合には、酸化型又は還元型のピロロキノリンキノンのフリー体又はそのアルカリ金属塩に対するコリン塩の重量比は０．０１から２０００の範囲、好ましくは、０．０１から１００の範囲、とすることができる。
【００３４】
前述の通り本発明によれば酸化型ＰＱＱのアンモニウム塩に加えて還元型ＰＱＱのアンモニウム塩が提供される。本発明の還元型ＰＱＱのアンモニウム塩は、酸化型ＰＱＱのアンモニウム塩を形成させた後に還元反応を行うことで容易に得ることができる。あるいは、溶解していない還元型ＰＱＱのフリー体又はアルカリ金属塩をアンモニウムイオンと反応させることによっても得ることもできる。還元型ＰＱＱは酸化型ＰＱＱより溶解度が低く、析出し易い。還元型ＰＱＱのフリー体又はアルカリ金属塩とアンモニウムイオンとを反応させることによる還元型ＰＱＱのアンモニウム塩の調製は、前述の酸化型ＰＱＱのアンモニウム塩の調製手順に従って行うことができる。
【００３５】
還元反応は触媒還元、試薬還元どちらでもよく、特に制限されない。貴金属触媒、ラネー触媒等条件を選んで反応することができる。試薬還元剤は、アスコルビン酸、システイン、ボロハイドライド、ＮＡＤＰＨ、ハイドロサルファイト、ヒドラジン等の一般的なもので使用可能である。より好ましくは生体毒性の低いアスコルビン酸、システイン、ＮＡＤＰＨが適している。これらの物質は単独で使用することもできるが、混合物で使用することも可能である。この還元体を作るためにコリン塩と還元剤を混合させて提供することも可能である。重量比でＰＱＱコリン塩１に対し、０．０１から１００の還元剤を用いることが好ましく、より好ましくは０．１から１００である。還元体は高いラジカル消去能を有しており、活性酸素が引き起こすとされる障害の対策に有効である。
【００３６】
すなわち、本発明によれば酸化型ＰＱＱアンモニウム塩と還元剤とを含んでなる組成物が提供される。この組成物では、酸化型ＰＱＱアンモニウム塩に対する還元剤の重量比は０．０１から１００の範囲、好ましくは、０．１から１００の範囲とすることができる。上記組成物において酸化型ＰＱＱアンモニウム塩が酸化型ＰＱＱコリン塩である場合には、該コリン塩に対する還元剤の重量比は０．０１から１００の範囲、好ましくは、０．１から１００の範囲とすることができる。
【００３７】
酸化型ＰＱＱアンモニウム塩に対する還元剤の添加量によっては組成物中に酸化型ＰＱＱの塩と還元型ＰＱＱの塩が混在することがある。また、還元型ＰＱＱと酸化型ＰＱＱを混合することにより、あるいは、還元型ＰＱＱが酸化剤や空気中の酸素などで酸化されることにより、酸化型ＰＱＱの塩と還元型ＰＱＱの塩が組成物中で混在することがある。このような組成物も本発明の一面を構成する。すなわち、本発明によれば本発明の酸化型ＰＱＱのアンモニウム塩と本発明の還元型ＰＱＱのアンモニウム塩を含んでなる組成物が提供される。本発明のより具体的な態様としては、本発明の酸化型ＰＱＱのコリン塩と本発明の還元型ＰＱＱのコリン塩を含んでなる組成物が提供される。
【００３８】
本発明のＰＱＱアンモニウム塩は水や有機溶媒への高い溶解性から様々な産業への利用が考えられるが、例えば、医薬又は機能性食品の有効成分とすることができる。即ち、皮膚外用剤、注射剤、経口剤、坐剤等の形態、或いは、日常食する飲食物、栄養補強食、各種病院食等の形態で提供可能である。尚、調製の際に使用される添加剤としては、液剤としては水、果糖、ブドウ糖等の糖類、落下生油、大豆油、オリーブ油等の油類、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のグリコール類を用いることができる。錠剤、カプセル剤、顆粒剤などの固形剤の賦型剤としては乳糖、ショ糖、マンニット等の糖類、滑沢剤としてはカオリン、タルク、ステアリン酸マグネシウム等、崩壊剤としてデンプン、アルギン酸ナトリウム、結合剤としてはポリビニルアルコール、セルロース、ゼラチン等、界面活性剤としては脂肪酸エステル等、可塑剤としてはグリセリン等を例示することができるが、これらに限定されるものではない。また、必要に応じて溶解促進剤、充填剤等を加えてもよい。
【００３９】
本発明のＰＱＱアンモニウム塩は、単独でも、他の素材と組み合わせても使用できる。組み合わせ可能な素材としては、ビタミンＢ、ビタミンＣ及びビタミンＥ等のビタミン類、アミノ酸類、アスタキサンチン、α-カロテン、β-カロテン等のカロテノイド類、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸等のω３脂肪酸類、アラキドン酸等のω６脂肪酸類などが例示されるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例及び比較例によって本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例にのみ限定されるものではない。【００４１】
使用する試薬は特に明記のないものについては、和光製を使用した。紫外可視吸収の分析はＨＩＴＡＣＨＩ製Ｕ−２０００spectrometerを使用した。【００４２】
（ＨＰＬＣ分析）
島津製作所製高速液体クロマトグラフィーＬＣ−２０Ａにカラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＴＭＳ（５μｍ）１５０×４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．を設置し、溶離液を１００ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＨ／１００ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（３０／７０，ｐＨ５．１）で２６０ｎｍで検出した。【００４３】
（イオンクロマトグラフィー分析）
ＤＩＯＮＥＸ製イオンクロマトグラフィーＤＸ−１２０にＣＳ１２Ａカラムをつけ、関東化学製ダイオネクス用陽イオン分析用溶離液ＣＳ１２Ａを使用した。【００４４】
（ＮＭＲ分析）
ＪＥＯＬ製５００ＭＨｚ ＮＭＲ、ＪＮＭ−ＥＣＡ５００スペクトルメーターを使用した。(ＤＭＳＯ−ｄ６：２．５２９ｐｐｍ基準)、１３Ｃ−ＮＭＲで (ＤＭＳＯ−ｄ６：３９．５ｐｐｍ基準）とした。【００４５】
実施例１：ＰＱＱジナトリウム塩の合成およびＰＱＱモノコリン塩の調製
ＰＱＱジナトリウム塩の合成
特許第２６９２１６７号公報の実施例１に基づき、ハイホミクロビウム  デニトリフィカンス（Hyphomicrobium denitrificans）ＤＳＭ１８６９を培養して得られた培養液を遠心分離して、菌体を除去し、ＰＱＱを含有する培養上澄液を得た。尚、この菌株はＤＳＭ（Deutsche Sammlung von Microorganismen (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)から入手できるものである。【００４６】
Sephadex Ｇ−１０（ファルマシア製）カラムに、この培養上澄液を通過させてＰＱＱを吸着させ、ＮａＣｌ水溶液で溶出させて得られたｐＨ７．５のＰＱＱ水溶液にさらにＮａＣｌを６０ｇ／Ｌ濃度になるように加えて冷却し、固体を得た。得られた固体を水に溶かし高速液体クロマトグラフィーのＵＶ吸収によるＰＱＱ純度は９９．０％以上であった。この固体をイオン交換水に溶解し、ＰＱＱ１０ｇ／Ｌを含む溶液を８００ｇ用意した。塩酸を加えてｐＨを３．５にした後、ここにエタノールを２００ｍＬ添加した。この時、赤色固体が析出した。室温下で５時間攪拌した後、５℃で２４時間静置し、固体を析出させた。連続遠心分離で固体を回収し、５０℃で減圧乾燥しＰＱＱジナトリウム塩を得た。【００４７】
フリー体生成
上記で得たジナトリウム塩２ｇを水１９８ｇに加え、ＮａＯＨでｐＨ９にあわせた。この液に和光純薬製濃塩酸を５０％希釈した液７．７ｇを攪拌しながら添加してｐＨを０．９にした。３０分攪拌後、析出した固体をろ過し、水、イソプロパノールで洗浄し、さらに５０℃で一晩減圧乾燥した。回収したＰＱＱフリー体は、赤色結晶で重量１．６ｇであった。生成したＰＱＱのフリー体を重ＤＭＳＯで１Ｈ，１３Ｃ−ＮＭＲを室温測定した。その結果、１Ｈ−ＮＭＲでは7.21, 8.60 ppm、１３Ｃ−ＮＭＲでは113.5, 124.5, 126.4, 127.6, 129.2, 134.3, 136.3, 146.8, 148.7, 160.9, 164.9, 168.7, 173.3, 178.0ppmにケミカルシフトを示していた。【００４８】
ＰＱＱモノコリン塩の調製
上記で得られたＰＱＱのフリー体を使用した。フリー体０．６２ｇを水に懸濁した。ここに東京化成製コリンハイドロキサイド（４８〜５０％）水溶液１．３９ｇを加えた。均一な溶液になりｐＨは９．４になった。ここに塩化コリンを１０ｇ加えたが析出は生じなかった。ここに塩酸を加えるとｐＨ４以下で固体が析出し、最終的にｐＨを３．５にした。これを４℃に冷却し、１時間後に遠心分離で固体を得た。これをイソプロパノールで３回洗浄し、減圧乾燥を一晩行った。赤い粉末０．６４ｇ得た。【００４９】
この固体０．１５ｇを重ＤＭＳＯ０．８ｇに溶解させ、ＪＥＯＬ製５００ＭＨｚ ＮＭＲ、ＪＮＭ−ＥＣＡ５００スペクトルメーターを使用し、１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲを室温測定した。その結果、１Ｈ−ＮＭＲで3.15, 3.44(t), 3.87(d), 7.15, 8.64ppm, (ＤＭＳＯ−ｄ６:２．５２９ｐｐｍ基準)、１３Ｃ−ＮＭＲで53.3, 55.3, 67.1, 114.0, 123.0, 126.0, 127.8, 130.8, 137.6, 144.6, 146.6, 147.9, 161.5, 165.7, 167.0, 173.5, 179.9ppm (ＤＭＳＯ−ｄ６：３９．５ｐｐｍ基準)であった。１Ｈ−ＮＭＲの結果はコリンに由来する3.15, 3.44, 3.87ppmとＰＱＱに由来する7.15, 8.64ppmを示していた。この積分比からコリンとＰＱＱのモル比は1：1で存在していることが分かった。【００５０】
１３Ｃ−ＮＭＲもコリンの炭素が、53.3, 55.3, 67.1ppmに、それ以外は実施例１のＰＱＱフリー体とほぼ同じケミカルシフトにピークを示し、このことからも得られた赤い粉末がＰＱＱモノコリン塩であることが確認できた。【００５１】
実施例２：ＰＱＱ１．４コリン塩の調製
実施例１と同様のＰＱＱのフリー体を使用した。フリー体０．４７ｇをイソプロパノール１００ｍｌに懸濁した。ここに東京化成製コリンハイドロキサイド（４８〜５０％）水溶液０．９８ｇを加えた。反応が進むと溶液になった。これを３００ｍｌナスフラスコでエバポレーターを使用して溶媒を除去し、ヘキサンで洗浄し、乾燥して固体０．９７ｇを得た。得られた固体は、エタノールに可溶の固体でＰＱＱとコリンの比が約１．４であった。すなわち、ＰＱＱとコリンのモル比は約１：１．４であり、不定比なＰＱＱコリン塩であった。【００５２】
実施例３：ＰＱＱジコリン塩の調製
実施例１と同様のＰＱＱのフリー体１．２０ｇを水１００ｍｌに懸濁した。ここに東京化成製コリンハイドロキサイド（４８〜５０％）水溶液を約１．８ｇ加え、３０分かけてｐＨを３．２にした。これを３００ｍｌナスフラスコでエバポレーターを使用して溶媒を除去した。得られた固体をエタノールとイソプロパノール混合溶媒に溶かし、ヘキサンを加えると固体が析出した。上澄みをデカンテーションで除去し、固体を得た。この固体を減圧乾燥し、固体２ｇを得た。これを０．０２５ｍＭに希釈して紫外可視スペクトル（２２０〜７００ｎｍ）を測定した結果、酸化型ナトリウム塩と同じスペクトルであった。ＰＱＱの構造は維持されていた。ＬＣ分析とイオンクロマトグラフィー分析からＰＱＱとコリンのモル比は１：１．９で、ＰＱＱジコリン塩であった。【００５３】
このコリン塩の重ＤＭＳＯ溶媒中１Ｈ−ＮＭＲの結果はコリンに由来する3.15, 3.44, 3.88ppmとＰＱＱに由来する6.59, 8.21ppmを示していた。積分比は上記の比と一致していた。【００５４】
実施例４：ＰＱＱ２．４コリン塩の調製
実施例１と同様のＰＱＱのフリー体を使用した。フリー体１．１６ｇを水２５ｍｌに懸濁した。ここに東京化成製コリンハイドロキサイド（４８〜５０％）水溶液を約２．１ｇ加え、その後塩酸を加えて、３０分かけてｐＨを７．５にした。これを３００ｍｌナスフラスコでエバポレーターを使用して溶媒を除去し、エタノールとヘキサンを加えると固体が析出した。上澄みをデカンテーションで除去し、固体を得た。この固体を減圧乾燥し、固体２．３ｇを得た。この固体はアセトニトリル、イソプロパノール、ジメチルスルホキシドに溶解できた。ＬＣ分析とイオンクロマトグラフィー分析からＰＱＱとコリンのモル比は１：２．４で、不定比なＰＱＱコリン塩であった。【００５５】
このコリン塩の重ＤＭＳＯ溶媒中１Ｈ−ＮＭＲの結果はコリンに由来する3.20, 3.51, 3.90ppmとＰＱＱに由来する6.82, 8.38ppmを示していた。積分比は上記の比と一致していた。【００５６】
実施例５：ＰＱＱトリコリン塩の調製
実施例１と同様のＰＱＱのフリー体を使用した。フリー体０．３４ｇを水２５ｍｌに懸濁した。ここに東京化成製コリンハイドロキサイド（４８〜５０％）水溶液を約０．７５ｇ加えｐＨを９にした。一晩攪拌後これを３００ｍｌナスフラスコでエバポレーターを使用して溶媒を除去した。ヘキサンで洗浄し固体を得た。この固体を減圧乾燥し０．６７ｇ得た。ＬＣ分析とイオンクロマトグラフィー分析からＰＱＱとコリンのモル比は１：３で、ＰＱＱトリコリン塩であった。【００５７】
このコリン塩の重ＤＭＳＯ溶媒中１Ｈ−ＮＭＲの結果はコリンに由来する3.15, 3.44, 3.87ppmとＰＱＱに由来する6.60, 8.22ppmを示していた。積分比は上記の比と一致していた。【００５８】
実施例６〜１５並びに比較例１及び２
溶解性試験
ＰＱＱジナトリウムは実施例１に記載の方法の物質を使用した。また、ＰＱＱモノコリン塩は実施例１のコリン塩を使用し、ＰＱＱ１．４コリン塩は実施例２のコリン塩を使用し、ＰＱＱジコリン塩は実施例３のコリン塩を使用し、ＰＱＱ２．４コリン塩は実施例４を使用し、ＰＱＱトリコリン塩は実施例５のコリン塩を使用した。【００５９】
これらの塩を室温２３〜２８℃で飽和するように溶解させ、これをｐＨ７．５のリン酸バッファーで２０倍または４００倍に希釈し、紫外可視吸収の分析はＨＩＴＡＣＨＩ製Ｕ−２０００spectrometerを使用し４５０ｎｍの吸光度（０−２の範囲）でピロロキノリンの溶解性を測定した。
【表１】
2012070649.tif 000008
【００６０】
このように、ＰＱＱに対するコリンの比が増加するに従い、ＰＱＱコリン塩の水およびエタノールへの溶解性は上昇した。また、特に、ＰＱＱとコリンのモル比が１：１．９〜１：３の場合にコリン塩の溶解性が高く、ナトリウム塩と比較して１０倍以上水またはエタノールに溶解することができる。さらに、エタノールにおいてナトリウム塩は殆ど溶けないが、コリン塩にすることで水と同様に溶解することができるようになった。【００６１】
実施例１６〜１８及び比較例３：混合試験
ＰＱＱジナトリウム０．１ｇに対し、塩化コリンを所定量加えた。これにエタノール８ｍｌ加え、上澄みの４５０ｎｍでの吸光度を測定した。塩化コリンを加えていない比較例３を標準とし、ＰＱＱの溶解量を算出した結果を以下の表２に示す。
【表２】
2012070649.tif 000009
【００６２】
塩化コリンを混合することでアルコールへの溶解度が向上しており、有効な組成物であった。【００６３】
実施例１９：還元体の作製
実施例３で生成したＰＱＱジコリンを０．５ｍＭの水溶液とアスコルビン酸１０ｍＭの水溶液を２ｍｌ容器中で等量混合した。これを水で１０倍に希釈して紫外可視スペクトル（２２０−７００ｎｍ）を測定した。新たなピークが３００ｎｍ付近に現れ、Bull. Chem. Soc. Jpn. 59巻、1911〜1914頁（1986）に示される還元反応が進んでいることがわかった。転化率が７０℃１５時間で１００％と室温２０時間で６３％であった。このようにＰＱＱジコリン塩から、対応するコリン塩の還元体を作製することができた。【００６４】
実施例２０：ＰＱＱトリエタノールアミン塩の調製
実施例１で作製したＰＱＱのフリー体０．４７ｇを水２０ｍｌに懸濁した。ｐＨメーターで観察しながらそこに和光製トリエタノールアミンを加え、ｐＨ３．７にした。反応が進むと溶液になり、これを一晩攪拌した。得られた溶液を３００ｍｌナスフラスコでエバポレーターを使用して溶媒を除去し、イソプロパノールで洗浄し、減圧乾燥して固体０．７９ｇ得た。これをＬＣ、イオンクロマトグラフィーで分析した結果、ＰＱＱに対してトリエタノールアミンが１：２のモル比で塩を形成していることが分かった。
【国際調査報告】
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