(57)【要約】【課題】食経験豊富で安全な食品成分または栄養素からなり、皮膚コラーゲン産生促進作用を有する医薬、化粧品およびサプリメントを提供する。【解決手段】本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤は、メナキノン−７を有効成分として含む。本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤は、経皮投与又は経口投与され、医薬、化粧品およびサプリメントとして提供される。【選択図】図１
2012111187.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メナキノン−７を有効成分として含有する皮膚コラーゲン産生促進剤。
【請求項２】
請求項１に記載の皮膚コラーゲン産生促進剤を含む経皮投与剤。
【請求項３】
請求項１に記載の皮膚コラーゲン産生促進剤を含む経口投与剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の疾病、アレルギー、老化に対する改善および／または予防に有効な皮膚コラーゲン産生促進剤に関し、より詳細には、食品由来で安全性の高い皮膚コラーゲン産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、主として表皮、真皮及び皮下組織に分けられる。真皮は、表皮の下にあって皮膚構造を支えるために、コラーゲン、ヒアルロン酸等で構成される細胞外マトリックスと呼ばれる生体構造物で満たされている。この細胞外マトリックス成分は、線維芽細胞等によって産生される。健康で若々しい皮膚では、コラーゲンなどの細胞外マトリックス成分の産生が良好であり、細菌やウィルスによる感染防止、皮膚病防止、アレルギー物質等の異物の進入防止、皮膚の弾力性維持ならびに水分保持がなされている。一方、しみ、しわ、たるみ、肌荒れといった症状に代表される皮膚の老化は、コラーゲン等の細胞外マトリックス成分の減少とともに進行するといわれている。【０００３】
皮膚のコラーゲンを増加させる素材が多数報告されている（特許文献１〜１４）。しかし、ほとんどのものは、その効果は十分でなく、製造コストが非常に高く、そして食経験が十分でないために安全性等に課題が多い。【０００４】
ビタミンＫは、一般に、ビタミンＫ依存性タンパク質が特異的に有するグルタミン酸残基をγカルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）に転換するのに必要なビタミンであると捉えられている。ビタミンＫ依存性タンパク質としては、肝臓で作られるいくつかの血液凝固に関係する因子、骨組織から作られるオステオカルシン、血管などの軟部組織で作られるマトリックスＧｌａタンパク質などが知られている。【０００５】
ビタミンＫ類の皮膚への効果としては、抗ＥＧＦＲ療法に起因する炎症に関連する皮膚状態やＲａｓｈの予防や治療（特許文献１４および１５）が知られている。また、メラニンなど色素沈着に関する皮膚疾患を治療すること（特許文献１６）や、目のアザやクマに対する効果（非特許文献１および２）、顔のしみ、目の下のくま、赤らみ、ほてり等の症状を改善するビタミンＫとビタミンＥの複合製剤（特許文献１７）、およびリポ酸等との組み合わせによる皮膚用外用剤（特許文献１８）が知られている。【０００６】
ビタミンＫ２の一種であるメナキノン−４は、ＳＸＲリセプターを介した骨芽細胞のコラーゲン増加効果が知られている（非特許文献３）。また、メナキノン−４がプロテインキナーゼＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ）依存的な経路で働く因子群について作用することも知られている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１１−３５４５５号公報
【特許文献２】特開２００７−１８６４７１号公報
【特許文献３】特開２００８−９４７５０号公報
【特許文献４】特開２００８−１８９６０７号公報
【特許文献５】特開２００８−２８０２９６号公報
【特許文献６】特開２００９−２４９３６６号公報
【特許文献７】特開２０１０−９５４９９号公報
【特許文献８】特開２００７−９１６３７号公報
【特許文献９】特開２００８−１３３２７０号公報
【特許文献１０】特開２００８−２６０７４７号公報
【特許文献１１】特開２００９−１８４９９７号公報
【特許文献１２】特開２００９−２９８７２４号公報
【特許文献１３】特開２０１０−２１５６４８号公報
【特許文献１４】ＵＳ２００９／０２３４０２２  Ａ１
【特許文献１５】ＵＳ２００９／０２３９９５２  Ａ１
【特許文献１６】ＷＯ／２００９／０６３４８５
【特許文献１７】特開２００４−１９６７５９号公報
【特許文献１８】特開平１０−７５４１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｅｌｓｏｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｓｍｅｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １９９５，８：２５−２７
【非特許文献２】Ｅｌｓｏｎ．，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｓｍｅｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ（１９９９）１２，３２−３４
【非特許文献３】Ｉｃｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００６  ２８１（２５）：１６９２７−３４
【非特許文献４】Ｉｃｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００７，３９：２３９−４７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従来知られている皮膚コラーゲンの産生を促進する物質は、有効性と安全性の面でかならずしも満足されない。そこで、本発明の目的は、食経験豊富で安全な食品成分または栄養素であって、微量でコラーゲン産生促進作用を持つ素材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、納豆に含まれ長期間の摂取経験のあるビタミンＫのうちのメナキノン−７の生理機能について、鋭意研究してきた。その中で、皮膚細胞への効果を調べたところ、意外なことに、メナキノン−４には見られず、メナキノン−７にのみ皮膚細胞のコラーゲン産生促進作用があることを見出し、本発明に至った。すなわち、本発明は、メナキノン−７を有効成分として含有する皮膚コラーゲン産生促進剤を提供する。【００１１】
特許文献１４〜１８でビタミンＫ類の皮膚への作用が知られていても、後述の実施例および比較例が示すように、メナキノン−４には皮膚コラーゲン産生促進作用がなく、メナキノン−７にはコラーゲン産生促進作用があることは従来知られていない。本発明により、メナキノン−７を有効成分とする皮膚コラーゲン産生促進剤が提供できることは全く意外なことである。【００１２】
さらに、本発明者らは、経口で摂取したメナキノン−７が、皮膚での有効量となる濃度に達することを見出した。この知見をもとに、本発明は、皮膚コラーゲン産生促進剤を含む経皮投与剤および経口投与剤もまた提供する。従来知られてきた皮膚コラーゲン促進する化合物は、経口で摂取したときに、皮膚に分配されることが明らかでなかった。メナキノン−４に皮膚コラーゲン産生促進作用がないことが明らかになったことを総合すると、メナキノン−７を有効成分とする皮膚コラーゲン産生促進剤を含む経皮投与剤および経口投与剤が皮膚コラーゲン増加作用を有することは、全く意外なことである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のメナキノン−７を有効成分として含有するコラーゲン産生促進剤は、細菌やウィルスによる感染防止、皮膚病防止、アレルギー物質等の異物の進入防止、皮膚の老化、しわ予防・改善、水分保持などに極めて有効である。【００１４】
ヒトが一日あたり必要とされるビタミンＫの目安量は５５〜８０μｇ（日本人の食事摂取基準２０１０年版）であるが、許容上限摂取量は設定されておらず、ビタミンＫは安全性の高い物質といえる。特に、メナキノン−７は納豆からの長期摂取の経験があることから安全性がさらに高い。したがって、本発明のコラーゲン産生促進剤は、皮膚のしわ改善・予防剤あるいは皮膚の老化改善・予防剤として、従来知られている製品よりも安全性の点で優れる。【００１５】
脂溶性であるメナキノン−７は、従来のコラーゲン産生促進剤よりも体内に蓄積されやすいため、作用が長続きするという効果もある。また、メナキノン−７は、経口で摂取しても分解・代謝されることなく、メナキノン−７として作用できることから、非常に有利なコラーゲン産生促進剤である。【００１６】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、医薬として利用できるが、サプリメントや化粧品用途としても日常的に摂取または使用することが極めて容易である。よって、皮膚の老化および疾病の予防も企図される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】正常ヒト真皮線維芽細胞に対するメナキノン−７（ＭＫ−７）、メナキノン−４（ＭＫ−４）、ビタミンＫ１（ＶＫ１）のコラーゲン産生促進作用を評価した結果である。試料未添加時における単位タンパク量当たりのコラーゲン産生量を１００としたときの相対値とする。メナキノン−７のみが有意にコラーゲン産生量が増加した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に、本発明のコラーゲン産生促進剤の一実施形態を詳細に説明する。まず、本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤に使用可能なメナキノン−７は、ビタミンＫ２の一種である。ビタミンＫ２はイソプロノイド側鎖の長さの違いによって、メナキノン−４からＭＫ−１５まで分類される。本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤は、イソプロノイド側鎖の長さが７であるビタミンＫ２を必須の成分とする。
【００１９】
メナキノン−７は、栄養素として食品中に多く含まれ、特に納豆および納豆菌由来のもの、枯草菌、乳酸菌など微生物由来のものから取得することができる。また、メナキノン−７は、上記以外にも、化学的に合成したものも使用可能である。
【００２０】
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤へのメナキノン−７の含有量は、組成物の形態及び摂取量によって変わってくるが、通常、０．００００２〜１００重量％でよく、好ましくは０．０００３〜７０重量％、より好ましくは０．００３〜５０重量％の範囲である。メナキノン−７が０．００００２重量％以下であると、皮膚コラーゲン増加効果を得るのに必要な量を摂取できない場合がある。
【００２１】
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤には、必須成分のメナキノン−７に加えて、皮膚コラーゲン産生促進効果を有する従来知られている食品成分の一種または二種以上を添加してもよい。また、コラーゲンやコラーゲン分解物、アミノ酸などのコラーゲンの原料となる成分を添加してもよい。
【００２２】
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤を医薬として用いる場合は、必須成分のメナキノン−７及び適宜のコラーゲン酸産生物質及びコラーゲン、コラーゲン分解物、アミノ酸類に加えて、医薬の助剤として汎用されるものを添加してもよい。例えば、剤形及び投与方法に応じて、汎用の賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、ビタミン、キサンチン誘導体、ｐＨ調整剤、清涼化剤、懸濁化剤、粘稠剤、溶解補助剤、抗酸化剤、コーティング剤、可塑剤、界面活性剤、水、アルコール類、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料、香料、着色剤などを発明の効果を損なわない質的および量的範囲で添加することが可能である。
【００２３】
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤は、医薬として使用するために、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、チュアブル錠、ドロップのような固形製剤や、ドリンク剤、水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ、ドライシロップのような液剤などの経口投与剤、あるいは液剤、水剤、乳剤、クリームのような経皮投与剤の形態に加工される。
【００２４】
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤を医薬として使用する場合の摂取方法は、特に限定されない。例えば、経口摂取、経皮摂取、輸液、注射（筋肉内、腹腔内、皮下又は静脈）等である。好ましくは、患者の負担が少ない点で、錠剤、カプセル剤等の経口摂取である。
【００２５】
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤を医薬に用いる場合には、症状に応じて、適宜、摂取量を設定すればよいが、一般に、予防薬として用いる場合は、１日あたりのメナキノン−７の摂取量として、１０μｇ〜１００ｍｇでよく、２０μｇ〜１００ｍｇが好ましいが好ましく、５〜５０ｍｇがさらに好ましい。治療薬として用いる場合は、１〜１５０ｍｇで使用可能である。
【００２６】
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤を化粧品として用いる場合は、必須成分のメナキノン−７及び適宜の皮膚コラーゲン産生物質やコラーゲンの原料となるアミノ酸類、コラーゲン分解物、コラーゲン、ゼラチンに加えて、化粧品の助剤として汎用されるものを添加してもよい。例えば、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，４−ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、ペンチレングリコール、イソプレングリコール、グルコース、マルトース、フルクトース、キシリトール、ソルビトール、マルトトリオース、エリスリトール等の多価アルコール；メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、イソブチルアルコール等の低級アルコール；オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ウンデシレン酸等の高級脂肪酸類；オリーブ油、トウモロコシ油、ツバキ油、マカデミアナッツ油、アボカド油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油等の油脂；カルナバロウ、キャンデリラロウ、ミツロウ、ラノリン等のロウ類；ソルビトール、マンニトール、グルコース、ショ糖、ラクトース、トレハロース等の糖類；カラギーナン、キサンタンガム、ゼラチン、ペクチン、アガロース、アルギン酸塩、デキストリン、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アラビアガム、カラヤガム、トラガントガム、タマリンドガム等の増粘剤；フェノキシエタノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、パラオキシ安息香酸エステル、安息香酸、サリチル酸とその塩類、ソルビン酸とその塩類、デヒドロ酢酸とその塩類、クロルクレゾール、ヘキサクロロフェン等の防腐剤；ラウロイル硫酸ナトリウム、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン等の非イオン界面活性剤、アルキルサルフェート塩、ノルマルドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンドデシルモノメチルアンモニウムクロライド等の陽イオン界面活性剤；ステロイド系及び非ステロイド系抗炎症剤；ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、（メナキノン−７以外の）ビタミンＫ群のビタミン類やジカプリル酸ピリドキシン、ジパルミチン酸ピリドキシン、ジパルミチン酸アスコルビル、モノパルミチン酸アスコルビル、モノステアリン酸アスコルビル等のビタミン誘導体；フラボノイド、カロテノイド等の抗酸化剤；スクワラン、スクワレン、流動パラフィン等の高級脂肪族炭化水素類；セラミド、セレブロシド、スフィンゴミエリン等のスフィンゴ脂質；コレステロール、フィトステロール等のステロール類；メチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、メチルシクロポリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、オクタメチルシクロペンタシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、メチルハイドロジェンポリシロキサン等のシリコーン類；パラアミノ安息香酸、パラアミノ安息香酸モノグリセリンエステル、アントラニル酸メチル、ホモメンチル−Ｎ−アセチルアントラニレート、パラメトキシケイ皮酸オクチル、エチル−４−イソプロピルシンナメート等の紫外線吸収剤；ベントナイト、スメクタイト、バイデライト、ノントロナイト、サポナイト、ヘクトライト、ソーコナイト、スチーブンサイト等の鉱物；ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛等の無機顔料；赤色２０２号、黄色４号、青色４０４号等の着色料；香料；香油等が挙げられる。
【００２７】
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤を化粧品として使用するために、液剤、水剤、乳剤、乳液、クリーム、粉体のような経皮投与剤、あるいは散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、チュアブル錠、ドロップのような固形製剤やドリンク剤、水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ、ドライシロップのような液剤などの経口投与剤の形態に加工される。
【００２８】
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤を化粧品として使用する場合の摂取方法は、経口摂取又は経皮摂取である。化粧品としての即効性の観点から、水剤、乳剤、乳液、クリームでの経皮投与が好ましい。
【００２９】
本発明のコラーゲン産生促進剤を化粧品に用いる場合には、１日あたりのメナキノン−７の摂取量（塗布量）として、０．００１〜１００ｍｇが好ましく、０．０５〜５０ｍｇがさらに好ましい。
【００３０】
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤をサプリメントとして用いる場合は、必須成分のメナキノン−７及び適宜他のコラーゲン増加物質に加えて、サプリメントの添加剤として汎用されるものを添加してもよい。例えば、経口投与剤の形態に応じて、汎用の賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、ビタミン、キサンチン誘導体、アミノ酸、ｐＨ調整剤、清涼化剤、懸濁化剤、粘稠剤、溶解補助剤、抗酸化剤、コーティング剤、可塑剤、界面活性剤、水、アルコール類、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料、香料、着色剤などを発明の効果を損なわない質的および量的範囲で添加することが可能である。
【００３１】
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤をサプリメントとして使用するために、例えば、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、チュアブル錠、ドロップのような通常の食品とは異なる経口投与剤に加工される。
【００３２】
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤をサプリメントなどの健康食品に用いる場合には、安全性を考慮して、１日あたりのメナキノン−７の摂取量として、０．０１〜５０ｍｇが好ましく、０．０１〜１ｍｇがさらに好ましい。
【００３３】
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤の配合例を示す。しかし、本発明は、以下の配合例に限定されるものではない。
【００３４】
［配合例１］錠剤
【表１】
2012111187.tif 000003
【００３５】
［配合例２］カプセル
【表２】
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【００３６】
［配合例３］化粧水
【表３】
2012111187.tif 000005
【００３７】
［配合例４］クリーム
【表４】
2012111187.tif 000006
【実施例】
【００３８】
以下に、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００３９】
〔実施例１〕
正常ヒト線維芽細胞を用いて、メナキノン−７の皮膚コラーゲン産生促進作用をビタミンＫ１およびメナキノン−４と比較した。メナキノン−７試薬（和光純薬工業株式会社）は、ＨＰＬＣで純度検定したものを使用した。設定濃度は、細胞培養系におけるビタミンＫ類の最大溶解度１．５ｘ１０−５Ｍで比較した。ビタミンＫ１（和光純薬工業株式会社）およびメナキノン−４（Ｓｉｇｍａ社）の純度はＨＰＬＣ法により検定したものを使用した。【００４０】
１．試験方法
正常ヒト真皮線維芽細胞（クラボウ社製）を０．５重量％仔牛血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ社）を用いて１ウェル当たり２．０ｘ１０４個の細胞密度となるように９６穴マイクロプレートに播種した。播種４８時間後、表５に記載の濃度のメナキノン−７を含有する０．５重量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭと交換した。メナキノン−７は、エタノールに溶解した後、０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭにて１００倍希釈した溶液を試験最高濃度液として調製した。また、陽性コントロールとしてアスコルビン酸リン酸マグネシウム塩（ＶＣ−ＰＭｇ）を用い、試験方法に問題がないことを確認した。４８時間試料含有培地で培養した後、培地上清を回収してＩ型コラーゲン量測定のＥＬＩＳＡに供した。細胞は０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液にて溶解後、タンパク量を定量した。【００４１】
２．コラーゲン量の測定
培地および検量線用Ｉ型コラーゲン溶液を高吸着型ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに入れ、３７℃にて２時間コーティングした後、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を用いて３７℃にて１時間ブロッキングした。一次抗体反応は、Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｒａｂｂｉｔ）を０．３％ＢＳＡ溶液で希釈し、３７℃にて１時間反応させた。ニ次抗体反応は、ヒストファインＭＡＸ−ＰＯ（Ｒ）（Ｒａｂｂｉｔ）をリン酸緩衝液で希釈し、３７℃にて１時間反応させた。次に、０．３ｍｇ／ｍｌの２，２’−Ａｚｉｎｏｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）ｄｉａｍｍｏｕｎｉｕｍ  ｓａｌｔ  （ＡＢＴＳ）および０．０３％の過酸化水素を含むリン酸−クエン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ  ４．０）溶液を加えて２０分間反応させ、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定した。【００４２】
培地中のＩ型コラーゲン量は、同じＥＬＩＳＡプレートで測定した検量線から換算し、全細胞のタンパク量で培地中のＩ型コラーゲン量を除することによって単位タンパク量あたりのＩ型コラーゲン量として算出した。【００４３】
図１は、正常ヒト真皮線維芽細胞に対するメナキノン−７、ビタミンＫ１ならびにメナキノン−４（それぞれ、１．５ｘ１０−５Ｍという高用量において）のコラーゲン産生促進作用を、試料未添加時における単位タンパク量当たりのＩ型コラーゲン産生量を１００としたときの相対値として評価した結果である。試料添加は各群ｎ＝６で試験を実施し、結果はそれぞれの平均値＋標準偏差で示している。なお、統計処理については、試料未添加の対照群に対するＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定を実施し、１％未満の危険率の場合＊をつけた。【００４４】
図１に示したように、メナキノン−７（図１内のＭＫ−７）のみが有意にコラーゲン産生量が増加した。メナキノン−４（図１内のＭＫ−４）については、さらにその４倍量の６．０ｘ１０−５Ｍでも評価したが、やはりコラーゲン産生量はまったく増加しなかった。【００４５】
〔実施例２〕
表５に示す濃度範囲のメナキノン−７におけるヒト真皮線維芽細胞に対するコラーゲン産生促進作用を調べた。結果を表５に示す。試料添加は各群ｎ＝６で試験を実施し、結果はそれぞれの平均値で示している。なお、統計処理については、試料未添加の対照群に対するＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定を実施し、１％未満の危険率の場合＊をつけた。【００４６】
【表５】
2012111187.tif 000007
【００４７】
表５に示したように、メナキノン−７は、０．５ｘ１０−６Ｍという低濃度においても有意にヒト真皮線維芽細胞のＩ型コラーゲン産生を促進することが明らかとなった。【００４８】
〔実施例３〕
Ｗｉｓｔａｒ系ラット（雄、５週齢）を、精製飼料ＡＩＮ９３Ｇ（オリエンタル酵母社製）を１週間自由に摂取させ馴化した後、群間の体重が均一になるように１群３匹に群分けした。ラット標準食（ＡＩＮ９３Ｇ）と、メナキノン−７を添加したメナキノン−７添加飼料（メナキノン−７：１５０μｇ／ｇ）を各群３匹ずつのラットに、９０日間自由摂取させた後、皮膚中のビタミンＫ濃度を測定した。ビタミンＫの分析は、高速液体クロマトグラフィーを用い、白金黒を用いたポストカラム還元蛍光検出法により分析した（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １６２２，１４５−１５０）。結果を表６に示す。【００４９】
【表６】
2012111187.tif 000008
※平均±ＳＤ    【００５０】
１５０μｇ／ｇのメナキノン−７食を摂取することにより、コラーゲン産生促進に必要なメナキノン−７濃度（０．５ｘ１０−６Ｍ：３２５ｎｇ／ｇ）を超えるメナキノン−７が皮膚組織に検出された。このことから、メナキノン−７は経口摂取が有望な投与経路であると考えられる。【００５１】
〔実施例４〕
４週齢のＣｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）（ＳＰＦ）雄ラットを、入荷後１週間の検疫期間を含め投与開始まで馴化した。検疫・馴化期間中、一般状態観察を毎日行い、体重を入荷後１日（入荷翌日）、３日及び７日に測定した。群間の体重が均一になるように１群５匹に４群に群わけをした。【００５２】
ラット標準食ＡＩＮ９３Ｇに、メナキノン−７を添加した３種類の飼料：高ＭＫ７食（メナキノン−７：４５．４μｇ／ｇ食）、中ＭＫ７食（メナキノン−７：１５μｇ／ｇ食）、および低ＭＫ７食（メナキノン−７：４．５４μｇ／ｇ食）、ならびにＭＫ７無添加食を、９０日間自由摂取させた。【００５３】
最終日に絶食後、解剖を行い、腹部をバリカンで丁寧に毛を取り除いた後、真皮を含む皮膚を採取した。皮膚を１００ｍｇ程度に切り取り、正確に秤量した。皮膚コラーゲン量を皮膚コラーゲン定量キット（ｂｉｏｃｏｌｏｒ社製商品名Ｓｉｒｃｏｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）により測定した。ＭＫ７無添加食をコントロールとして、添加食３群のコラーゲン増加量を比較した。Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定により統計処理を行い、危険率Ｐ＜０．０５を有意差ありと判断した。結果を表７に示す。表中、＊印は、有意差ありを示す。【００５４】
【表７】
2012111187.tif 000009
【００５５】
表７に示すように、ＭＫ７を経口摂取すると、用量依存的にコラーゲンが増加する傾向を示した。そして、４５．４μｇ／ｇ食の摂取で、皮膚コラーゲンが統計的に有意に増加することを確認した。
【図１】
2012111187.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成24年1月20日(2012.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メナキノン−７を有効成分として含有する皮膚コラーゲン産生促進剤。
【請求項２】
請求項１に記載の皮膚コラーゲン産生促進剤を含む皮膚コラーゲン産生促進用経皮投与剤。
【請求項３】
請求項１に記載の皮膚コラーゲン産生促進剤を含む皮膚コラーゲン産生促進用経口投与剤。
【手続補正書】
【提出日】平成24年6月13日(2012.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メナキノン−７を有効成分として含有する皮膚コラーゲン産生促進剤（ただし、食品を除く）。
【請求項２】
請求項１に記載の皮膚コラーゲン産生促進剤を含む皮膚コラーゲン産生促進用経皮投与剤。
【請求項３】
請求項１に記載の皮膚コラーゲン産生促進剤を含む皮膚コラーゲン産生促進用経口投与剤（ただし、食品を除く）。
【請求項４】
メナキノン−７を有効成分として含有する皮膚コラーゲン産生促進剤を含む食品。
【請求項５】
請求項１に記載の皮膚コラーゲン産生促進剤を含む皮膚コラーゲン産生促進用経口投与剤を含む食品。
【請求項６】
メナキノン−７を有効成分として含有させることからなる、皮膚コラーゲン産生促進剤の製造方法。
【請求項７】
メナキノン−７を有効成分として含有させることからなる、皮膚コラーゲン産生促進用経皮投与剤の製造方法。
【請求項８】
メナキノン−７を有効成分として含有させることからなる、皮膚コラーゲン産生促進用経口投与剤の製造方法。
【手続補正書】
【提出日】平成24年7月13日(2012.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メナキノン−７を有効成分として含有する皮膚コラーゲン産生促進剤（ただし、食品を除く）。
【請求項２】
請求項１に記載の皮膚コラーゲン産生促進剤を含む皮膚コラーゲン産生促進用経皮投与剤。
【請求項３】
請求項１に記載の皮膚コラーゲン産生促進剤を含む皮膚コラーゲン産生促進用経口投与剤（ただし、食品を除く）。
【請求項４】
メナキノン−７を有効成分として含有させることからなる、皮膚コラーゲン産生促進用経皮投与剤の製造方法。
【国際調査報告】
2012111187.tif 000011
2012111187.tif 000012
2012111187.tif 000013
2012111187.tif 000014