(57)【要約】  複数の検出対象物質を同時に同一の測定により検出可能な複数物質応答性物質を提供する。特異的結合物質と、当該特異的結合物質と特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーとが結合してなる複合体の複数種類が、高分子ゲルに固定されているとともに、当該複数種類の複合体は、架橋を形成するように、高分子ゲルに固定されていることを特徴とする複数物質応答性ゲルによれば、複数の検出対象物質を同時に同一の測定により検出することができる。
2012117588.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種類の特異的結合物質と、当該複数種類の特異的結合物質と特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーとが結合してなる複数種類の複合体が、高分子ゲルに固定されているとともに、
当該複数種類の複合体は、架橋を形成するように、高分子ゲルに固定されていることを特徴とする複数物質応答性ゲル。
【請求項２】
前記複合体は、特異的結合物質と、結合パートナーとが、それぞれ、高分子ゲルに結合することによって、架橋を形成するように、高分子ゲルに固定されていることを特徴とする請求項１に記載の複数物質応答性ゲル。
【請求項３】
前記複合体は、特異的結合物質と結合する複数の結合パートナーが、高分子ゲルに結合することによって、架橋を形成するように、高分子ゲルに固定されており、特異的結合物質は高分子ゲルに結合していないことを特徴とする請求項１に記載の複数物質応答性ゲル。
【請求項４】
前記特異的結合物質が除去されていることを特徴とする請求項３に記載の複数物質応答性ゲル。
【請求項５】
前記高分子ゲルは、相互に架橋しない複数の架橋ポリマーからなる相互侵入網目ポリマーであり、
前記複数の架橋ポリマーのそれぞれに、異なる種類の前記複合体が固定されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の複数物質応答性ゲル。
【請求項６】
前記高分子ゲルは、単一の架橋ポリマーであって、
当該単一の架橋ポリマーに、複数種類の前記複合体が固定されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の複数物質応答性ゲル。
【請求項７】
前記特異的結合物質および結合パートナーの少なくともいずれかは、生体分子であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の複数物質応答性ゲル。
【請求項８】
前記特異的結合物質および結合パートナーの少なくともいずれかは、タンパク質、核酸、糖質、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、オリゴペプチド、ポリペプチド、ホルモンまたは金属イオンであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の複数物質応答性ゲル。
【請求項９】
前記複数の結合パートナーは、包接化合物を形成する複数のホスト分子であることを特徴とする請求項３〜６のいずれか１項に記載の複数物質応答性ゲル。
【請求項１０】
上記ホスト分子は、シクロデキストリン、クラウン化合物、シクロファン、アザシクロファン、カリックスアレーンおよびそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種類以上の分子であることを特徴とする請求項９に記載の複数物質応答性ゲル。
【請求項１１】
複数の検出対象物質と接触させたときに、体積が変化することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の複数物質応答性ゲル。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の複数物質応答性ゲルと試料とを接触させる工程と、検出対象物質の有無を前記複数物質応答性ゲルの体積変化により検出する工程とを含むことを特徴とする検出方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の複数物質応答性ゲルを含有する検出キット。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の複数物質応答性ゲルを含有する検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数物質応答性ゲルおよびその製造方法並びにその利用に関するものであり、特に、複数の検出対象物質を同時に認識して体積変化する複数物質応答性ゲルおよびその製造方法並びにその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍マーカーなどの疾病マーカーの場合には数種類の生体分子がマーカー分子として利用されているため、一つの疾病に対して２種類以上の疾病マーカーを同時検出することができれば、より正確な診断が可能となる。【０００３】
従来、検出対象物質である複数の生体分子を同時に検出する方法として、検出対象物質と選択的または特異的に結合するプローブのアレイまたはマイクロアレイが知られている。しかし、かかる方法では、複数の検出対象物質は同時に測定されるが、それら複数の検出対象物質は個別に測定される必要がある。【０００４】
ところで、本発明者らは、標的とする生体分子を感知して膨潤または収縮する生体分子応答性ゲルについて報告している（例えば、特許文献１、非特許文献１、２等参照）。特許文献１に記載の核酸応答性ゲルは、ハイブリダイズする２本の１本鎖核酸を架橋点として導入したゲルである。そして、ハイブリダイズする２本の１本鎖核酸が鎖交換を起こして解離するような標的と接触したときに、架橋点が減少してゲルが膨潤する性質を利用して、標的とする核酸分子を検出するものである。また、非特許文献１には、抗原抗体複合体を架橋点として導入したゲルが標的抗原の存在下で次第に膨潤することを示している。非特許文献２には、標的糖タンパク質に対するリガンドを導入したゲルが標的糖タンパク質の存在下で次第に収縮することを示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】日本国公開特許公報「特開２００７−２４４３７４号公報（２００７年９月２７日公開）」
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nature 399, 766-769(1999)
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 1190-1193 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、前記従来のアレイまたはマイクロアレイでは、複数の検出対象物質は同時に測定されるが、それら複数の検出対象物質は個別に測定される必要がある。複数の検出対象物質が、同時に同一の測定により検出されるような検出方法を提供することができれば、複数の検出対象物質を同時に、かつ簡便に検出することができるが、かかる方法は今までに報告されていない。【０００８】
本発明は、前記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、複数の検出対象物質を同時に同一の測定により検出可能な複数物質応答性物質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る複数物質応答性ゲルは、前記課題を解決するために、複数種類の特異的結合物質と、当該複数種類の特異的結合物質と特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーとが結合してなる複数種類の複合体が、高分子ゲルに固定されているとともに、当該複数種類の複合体は、架橋を形成するように、高分子ゲルに固定されていることを特徴としている。【００１０】
前記の構成によれば、複数の検出対象物質を同時に同一の測定により検出することができるという効果を奏する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る複数物質応答性ゲルは、以上のように、複数種類の特異的結合物質と、当該複数種類の特異的結合物質と特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーとが結合してなる複数種類の複合体が、高分子ゲルに固定されているとともに、当該複数種類の複合体は、架橋を形成するように、高分子ゲルに固定されている構成を備えているので、複数の検出対象物質を同時に同一の測定により検出することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の実施例１において、ビニル基導入ＩｇＧおよびビニル基導入ａｎｔｉ−ＩｇＧを合成する工程を示す図である。
【図２】本発明の実施例１において、ビニル基導入ＡＦＰおよびビニル基導入ａｎｔｉ−ＡＦＰを合成する工程を示す図である。
【図３】本発明の実施例１において、第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーを合成する工程を示す図である。
【図４】本発明の実施例１において、第２の複合体が固定された第２の架橋ポリマーを形成させ、ＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルを製造する工程を示す図である。
【図５】本発明の参考例３において、ＡＦＰ抗原抗体架橋ゲルおよびＩｇＧ抗原抗体架橋ゲルを、それぞれの標的抗原（検出対象物質）であるＡＦＰおよびＩｇＧが溶解したＰＢＳ中に浸漬させた際の膨潤率測定を行った結果を示す図であり、（ａ）はＡＦＰ抗原抗体架橋ゲルの膨潤率測定を行った結果を示す図であり、（ｂ）はＩｇＧ抗原抗体架橋ゲルの膨潤率測定を行った結果を示す図である。
【図６】本発明の実施例１において、ＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルをＰＢＳ中で平衡膨潤させた後、標的抗原（検出対象物質）水溶液に浸漬させた際の膨潤率測定を行った結果を示す図である。
【図７】複数物質応答性ゲルおよび対照の、検出対象物質と接触させたときの様子を模式的に示す図であり、（ａ）は対照であるポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）  ＩＰＮゲルを、複数の検出対象物質と接触させたときのＰＡＡｍ  ＩＰＮゲルの様子を模式的に示す図であり、（ｂ）は複数物質応答性ゲルであるＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルを検出対象物質の１つと接触させたときのＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルの様子を模式的に示す図であり、（ｃ）は複数物質応答性ゲルであるＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルを２つの検出対象物質と接触させたときのＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルの様子を模式的に示す図である。
【図８】複数物質応答性ゲルの一実施形態を模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、記述した範囲内で種々の変形を加えた態様で実施できるものである。
【００１４】
本発明者らがこれまでに特許文献１、非特許文献１等で報告した生体分子応答性ゲルは、高分子ゲルに架橋点を形成する単一種類の複合体を導入し、かかる複合体の結合を解離させることによって、架橋点が減少してゲルが膨潤することを利用するものであった。また、本発明者らが、非特許文献２で報告した、リガンドを導入したゲルは、高分子ゲルに、単一種類の検出対象物質と、当該検出対象物質と特異的かつ可逆的に結合する２種類のリガンドとの複合体を、架橋点を形成するように固定した後、検出対象物質が除去されたインプリントゲルである。かかるゲルは、当該リガンドと特異的かつ可逆的に結合する検出対象物質の存在下で、リガンドと検出対象物質とが結合して架橋点を形成することにより、ゲルが収縮することを利用するものであった。すなわち、架橋点の減少または増加を体積変化により検出するものであった。したがって、複数種類の検出対象物質と結合するような、複数種類の複合体またはリガンドを導入したとしても、架橋点の減少または増加は検出できても、いずれの検出対象物質による体積変化であるのかは区別することができないと考えられた。
【００１５】
ところが、本発明者らが、複数種類の特異的結合物質と、当該複数種類の特異的結合物質と種類ごとにそれぞれ特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーとが結合してなる複数種類の複合体を、高分子ゲルに、当該複合体が架橋を形成するように固定したところ、驚くべきことに、当該複合体と反応して複合体を解離させる一部の種類の検出対象物質が存在するときには、当該ゲルはわずかにしか体積が増加しないのに対して、複数種類の前記複合体を解離させるすべての種類の検出対象物質が存在する場合には、大きく体積が増加することを見出した。そして、かかるゲルによれば、複数種類の検出対象物質を同時に、体積変化の測定のみにより、検出できることに思い至り本発明を完成させるに至った。
【００１６】
また、上述した検出対象物質と特異的かつ可逆的に結合するリガンドが固定されたインプリントゲルにおいて、複数種類の検出対象物質と結合するリガンドを固定した場合にも同様の現象が起こると考えられる。すなわち、すべての種類の検出対象物質が存在する場合に、一部の種類の検出対象物質が存在する場合と比べて、体積が大きく減少するため、複数の検出対象物質を、同時に、体積変化のみにより検出することができる。
【００１７】
（Ｉ）複数物質応答性ゲル
本発明に係る複数物質応答性ゲルは、複数種類の特異的結合物質と、当該複数種類の特異的結合物質と種類ごとにそれぞれ特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーとが結合してなる複数種類の複合体が高分子ゲルに固定されているとともに、当該複数種類の複合体は、架橋を形成するように、高分子ゲルに固定されているものである。
【００１８】
ここで、「高分子ゲル」とは、網目構造を有する高分子化合物が液体を吸収して膨潤したものであれば特に限定されるものではない。例えば、網目構造を有する高分子化合物が水で膨潤したヒドロゲルであってもよいし、網目構造を有する高分子化合物が有機溶媒で膨潤したオルガノゲルであってもよい。中でも、前記高分子ゲルは、固定される複合体および検出対象物質の少なくともいずれかが生体物質である場合の安定性の観点からヒドロゲルであることがより好ましい。なお、本発明に係る複数物質応答性ゲルは、膨潤した状態で、検出対象物質に対する応答性を示すが、本発明では、膨潤したゲルから、水、有機溶媒等を除いて乾燥状態としたものも、前記「高分子ゲル」および複数物質応答性ゲルに含めるものとする。なお、本発明において、高分子化合物とは、分子量が１０００以上の化合物をいう。ここで、本明細書において、分子量とはゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）測定による分子量をいう。
【００１９】
本発明において、前記複合体は、特異的結合物質と、当該特異的結合物質と特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーとが結合してなるものであればよい。また、複合体を形成する特異的結合物質および結合パートナーの数は特に限定されるものではなく、１の特異的結合物質と１の結合パートナーとから形成される複合体であってもよいし、１の特異的結合物質と複数の結合パートナーとから形成される複合体またはその逆であってもよい。
【００２０】
前記特異的結合物質および前記結合パートナーは、他の化学物質と特異的かつ可逆的に結合して複合体を形成するものであれば特に限定されるものではないが、前記特異的結合物質および前記結合パートナーの少なくともいずれかは、好ましい実施形態においては、例えば、生体分子である。生体分子には、他の化学物質と特異的かつ可逆的に結合する多種多様な物質があり、本発明で用いられる特異的結合物質および結合パートナーの少なくともいずれかが、かかる生体分子であることが好ましい。かかる生体分子は特に限定されるものではないが、例えば、タンパク質、核酸、糖質、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、オリゴペプチド、ポリペプチド、ホルモン、金属イオン等を挙げることができる。
【００２１】
前記特異的結合物質と前記結合パートナーとが結合してなる複合体としては、例えば、抗原と抗体との複合体、核酸と当該核酸とハイブリダイズする核酸との複合体、酵素と基質との複合体、糖質とレクチンとの複合体を挙げることができる。また、前記複合体は、抗原と抗体との結合、核酸と当該核酸とハイブリダイズする核酸との結合、酵素と基質との結合、および糖質とレクチンとの結合から選択される１種類以上の結合を複数含む複合体であってもよい。なお、ここで、これらの複合体を形成する要素はどちらが特異的結合物質であっても、結合パートナーであってもよい。
【００２２】
前記複合体が、核酸と当該核酸とハイブリダイズする核酸との複合体である場合は、前記特異的結合物質は、例えば一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＰＮＡ等である。そしてこれらに対して特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーは、これらとハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＰＮＡ等である。これらが結合して形成される複合体は、ハイブリダイズしている２本の一本鎖核酸であり、２本の一本鎖核酸は、ＤＮＡ同士、ＲＮＡ同士、またはＰＮＡ同士であってもよいし、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡから選択される２種類の組み合わせであってもよい。ここで、２本の一本鎖核酸がハイブリダイズしている部分において、２本の一本鎖核酸は完全に相補的であってもよいし、１または複数の塩基がミスマッチであってもよい。なお、前記複合体が、核酸と当該核酸とハイブリダイズする核酸である場合の高分子ゲルへの結合形式、鎖交換、核酸の大きさ等については、特許文献１の記載が援用される。
【００２３】
前記複合体が、抗原と抗体との複合体または抗原と抗体との結合を含む複合体である場合は、抗原としては、特に限定されるものではないが、例えば、タンパク質、糖質、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、オリゴペプチド、ポリペプチド、ホルモン、金属イオン等を挙げることができる。より具体的には、かかる抗原としては、例えば、α‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１９−９、塩基性胎児タンパク質（ＢＦＰ）、膵胎児抗原（ＰＯＡ）、アルドラーゼ、アルカリ・フォスファターゼ、γグルタミルトランスペプチダーゼ、ニューロン特異的エノラーゼ、５´ヌクレオチド・フォスフォジエステラーゼ・アイソザイムＶ（５´−ＮＰＤ−Ｖ）、異常プロトロンビン（ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）等の腫瘍マーカー；ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等の免疫グロブリン；Ｂ型肝炎ウイルス関連抗原、Ｃ型肝炎ウイルス関連抗原、インフルエンザウイルス等のウイルス抗原；甲状腺ホルモン、ステロイドホルモン等のホルモン等を挙げることができる。また、抗体としては、前記抗原と特異的かつ可逆的に抗原抗体反応を起こすものであれば特に限定されるものではなく、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよく、また、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ´）、Ｆ（ａｂ´）２等であってもよい。かかる抗体の由来も特に限定されるものではなく、常法により調製することができる。具体的には、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の哺乳動物に抗原を投与し、免疫して得ることができる。また、例えば、抗原で免疫したマウス等の哺乳動物の脾臓からとったＢ細胞と、骨髄腫細胞とのハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体として得ることができる。
【００２４】
本発明に係る複数物質応答性ゲルでは、特異的結合物質と、当該特異的結合物質と特異的かつ可逆的に結合する前記結合パートナーとが結合してなる複合体の複数種類が高分子ゲルに固定されていればよく、固定されている複合体の組み合わせは特に限定されるものではない。例えば、ある疾患に特徴的な複数種類のマーカーと、当該複数種類のマーカーとそれぞれ特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーとが結合してなる複数種類の複合体を組み合わせることにより、疾患の診断をより正確に行うことができる。あるいは、異なる複数の疾患にそれぞれ特徴的なマーカーと、当該複数種類のマーカーとそれぞれ特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーとが結合してなる複数種類の複合体を組み合わせることにより、複数の疾患について同時に診断を行うことができる。
【００２５】
なお、本発明において、高分子ゲルに固定されているとは、高分子ゲルを構成する網目構造を有する高分子化合物に結合していることをいう。
【００２６】
（Ｉ−１）
本発明に係る複数物質応答性ゲルの好ましい一実施形態は、前記複合体が、特異的結合物質と、結合パートナーとが、それぞれ、高分子ゲルに結合することによって、架橋を形成するように、高分子ゲルに固定されている複数物質応答性ゲルである。
【００２７】
すなわち、前記複合体は、例えば、図７の（ｂ）、（ｃ）の上側に示す円内に模式的に示すように、高分子ゲルに架橋を形成するように結合されている。なお、図７の（ｂ）、（ｃ）に示す例では、四角で示される抗原と該抗原と特異的かつ可逆的に結合する抗体とが結合してなる第１の複合体と、楕円で示される抗原と該抗原と特異的かつ可逆的に結合する抗体とが結合してなる第２の複合体とが、高分子ゲルの網目構造内に固定されている。ここで架橋は、複合体を形成する特異的結合物質（または結合パートナー）である抗原と、結合パートナー（または特異的結合物質）である抗体とのそれぞれが、当該高分子ゲルの網目構造に結合することによって形成される。すなわち、特異的結合物質と結合パートナーのそれぞれは、高分子ゲルの網目構造を形成する高分子化合物と架橋の片方でのみ結合しているが、複合体を形成することによって、架橋が形成されることになる。
【００２８】
なお、本発明に係る複数物質応答性ゲルでは、前記複合体を形成する特異的結合物質と結合パートナーとが高分子ゲルに結合する方式は特に限定されるものではないが、例えば、共有結合、イオン結合、配位結合等の化学結合を介して結合されていることが好ましい。これにより、前記複合体が、高分子ゲルに安定して固定される。なお、前記特異的結合物質と前記結合パートナーとは、直接高分子ゲルに結合していてもよいし、二価の基を介して高分子ゲルに結合していてもよい。
【００２９】
ここで、前記複合体では、特異的結合物質と結合パートナーとは可逆的に結合している。すなわち、特異的結合物質と結合パートナーとは、水素結合、配位結合、共有結合、イオン結合、疎水結合等によって互いに結合しているが、温度、ｐＨ等の条件の変化や他の分子の存在により、特異的結合物質と結合パートナーとが解離する方向に反応が進むことが可能であり、かかる反応は可逆的である。
【００３０】
このように、本実施形態に係る複数物質応答性ゲルにおいては、特異的結合物質と結合パートナーとが可逆的に結合しているため、前記複合体を形成している特異的結合物質または結合パートナーとより安定な複合体を形成する化学物質、または競争的に複合体を形成する化学物質が存在すると、かかる化学物質は、複合体を形成している特異的結合物質または結合パートナーと取って代わり、特異的結合物質または結合パートナーとの交換が起こる。
【００３１】
複合体を形成している特異的結合物質と結合パートナーとが、解離した場合、図７の例の（ｂ）、（ｃ）の下側に示す円内に模式的に示すように、架橋が切断されることになり、架橋点が減少すると考えられる。一般に高分子ゲルの膨潤率は架橋密度が減少すると増加することが知られている。したがって、架橋点が減少する結果、複数物質応答性ゲルは膨潤率が増加して、体積が増加する方向に体積変化すると考えられる。すなわち、本実施形態に係る複数物質応答性ゲルは、前記複合体を形成している特異的結合物質または結合パートナーとより安定な複合体を形成する化学物質、または競争的に複合体を形成する化学物質と接触させたときに、架橋密度が減少し、体積が増加する。すなわち、前記複合体を形成している特異的結合物質または結合パートナーとより安定な複合体を形成する化学物質、または競争的に複合体を形成する化学物質が、本発明に係る複数物質応答性ゲルの検出対象物質であるといえる。例えば、本発明に係る複数物質応答性ゲルを、特異的結合物質または結合パートナーと接触させたときには、これらは、高分子ゲルに固定されている特異的結合物質または結合パートナーと競争的に複合体を形成することができる。よって、本発明に係る複数物質応答性ゲルは、固定されているものと同じ特異的結合物質または結合パートナーを検出することができる。また、例えば、本発明に係る複数物質応答性ゲルを、特異的結合物質または結合パートナーとより安定な複合体を形成することができる物質と接触させたときには、当該物質は、高分子ゲルに固定されている特異的結合物質または結合パートナーと複合体を形成するため、これらの物質と特異的結合物質または結合パートナーとの交換が起こる。よって、本発明に係る複数物質応答性ゲルは、特異的結合物質または結合パートナーとより安定な複合体を形成することができる物質を検出することができる。
【００３２】
ここで、本実施形態に係る複数物質応答性ゲルでは、複数種類の前記複合体が、高分子ゲルに固定されている。そして、複数種類の前記複合体をそれぞれ構成する、複数種類の特異的結合物質または結合パートナーと、それぞれ結合可能な複数種類の前記検出対象物質のうち、一部の種類が存在するときには、複数物質応答性ゲルはわずかに体積が増加する。そして、複数種類の前記検出対象物質のうちすべての種類が存在する場合にはじめて、大きく体積が増加する。
【００３３】
このように、本実施形態に係る複数物質応答性ゲルは、複数種類の前記複合体が、高分子ゲルの網目構造内に固定されていることにより、複数種類の前記複合体をそれぞれ構成する、複数種類の特異的結合物質または結合パートナーと、それぞれ結合可能な複数種類の前記検出対象物質のうち、すべて存在する場合にはじめて大きく膨潤率が増加するので、複数の前記検出対象物質を、同時に検出することができる。
【００３４】
本発明において、前記高分子ゲルは、網目構造を有する高分子化合物を少なくとも１種類含んでいればよい。したがって、前記高分子ゲルを構成する高分子化合物は、単一の架橋ポリマーからなるものであってもよいし、相互に架橋しない複数の架橋ポリマーからなる相互侵入網目ポリマー（ＩＰＮ（Interpenetrating Polymer-Networks）ポリマー）であってもよい。
【００３５】
ここで、相互侵入網目ポリマーとは、相互に架橋しない複数の架橋ポリマーが相互侵入網目構造を形成して、その網目構造が相互に入り組んでいる混合物をいう。
【００３６】
ここで、前記高分子ゲルが、相互侵入網目ポリマーである場合は、相互侵入網目ポリマーを構成する複数の架橋ポリマーのそれぞれには、それぞれ、異なる種類の前記複合体が固定されている。相互侵入網目ポリマーを構成する架橋ポリマーの数は２以上、１０以下であれば特に限定されるものではない。例えば、前記高分子ゲルが、第１の架橋ポリマーと、第２の架橋ポリマーとからなる相互侵入網目ポリマーである場合、第１の架橋ポリマーと、第２の架橋ポリマーには、異なる種類の前記複合体が固定される。なお、このとき、それぞれの架橋ポリマーに固定される前記複合体は１種類であっても２種類以上であってもかまわないが、同じ種類の前記複合体が、複数の架橋ポリマーに固定されないことが好ましい。これにより、本実施形態では、前記複数種類の複合体によって形成されている架橋のすべての種類が解離することによってはじめて大きく膨潤率が増加するという効果を得ることができると考えられる。その理由は明らかではないが、１種類の架橋ポリマーの架橋点のみが減少しても、他の架橋ポリマーの存在により、体積の増加が抑えられることが理由として考えられる。
【００３７】
すなわち、前記相互侵入網目ポリマーでは、互いに化学結合せず、相互に侵入したネットワークが物理的に絡み合ったＩＰＮ構造を形成させることにより、それぞれの独立したネットワークの架橋点として前記複合体が結合していると考えられる。かかる相互侵入網目ポリマーは、２種類以上の複合体を有しており、１種類の検出対象物質が存在しても異なる検出対象物質に対する複合体が解離しないため、相互に侵入したネットワークは膨潤できず、その応答性は非常に低くなることが考えられる。しかし、複数の検出対象物質が同時に存在すると、それぞれに対する複合体が交換反応によって解離するため、相互侵入した複数のネットワークが同時に広がり、ゲル全体が膨潤することができると考えられる。
【００３８】
また、前記高分子ゲルが、相互侵入網目ポリマーである場合は、相互侵入網目ポリマーを構成する複数の架橋ポリマーは、同じ架橋ポリマーであっても、異なる架橋ポリマーであってもよい。しかし、同じ種類の架橋ポリマーを組み合わせた方が、複数のポリマーが互いに相分離せず、良好な相互侵入網目構造を形成することができるため、前記複数の架橋ポリマーは、同じ架橋ポリマーであることがより好ましい。また、複数の架橋ポリマーが同じであることにより体積変化が均一である方が、すべての種類の複合体が解離した時の膨潤率と、一部の種類の複合体が解離したときの膨潤率との差が均一で、安定した検出結果が得られるため、前記複数の架橋ポリマーは、同じ架橋ポリマーであることがより好ましい。
【００３９】
また、前記高分子ゲルが、単一の架橋ポリマーである場合は、当該単一の架橋ポリマーに、複数種類の前記複合体が固定される。これにより、前記高分子ゲルが相互侵入網目ポリマーである場合と同様の理由により、前記複数種類の複合体によって形成されている架橋のすべての種類が解離することによってはじめて大きく膨潤率が増加するという効果を得ることができると考えられる。
【００４０】
前記架橋ポリマーは、網目構造を有し、水や有機溶媒により膨潤する高分子化合物であれば特に限定されるものではない。中でも、前記高分子ゲルは、水によって膨潤する高分子化合物であることがより好ましいので、前記架橋ポリマーは、親水性のモノマーを重合、架橋することにより得られる高分子化合物であることがより好ましい。かかるモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリル酸；アルキル（メタ）アクリレート；マレイン酸；ビニルスルホン酸；ビニルベンゼンスルホン酸；（メタ）アクリルアミド；アクリルアミドアルキルスルホン酸；（メタ）アクリロニトリル；ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド等のアミノ置換（メタ）アクリルアミド；ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸アミノ置換アルキルエステル；２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート等のヒドロキシエチルメタクリレート；スチレン；ビニルピリジン；ビニルカルバゾール；ジメチルアミノスチレン；Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチル（メタ）アクリルアミド等のアルキル置換（メタ）アクリルアミド；酢酸ビニル；アリルアミン等を単独または２種以上組み合わせて使用することができる。中でも、前記モノマーは、（メタ）アクリルアミド；（メタ）アクリル酸；アルキル（メタ）アクリレート；２−ヒドロキシエチルメタクリレート等のヒドロキシエチルメタクリレート；Ｎ，Ｎ’−ジメチル（メタ）アクリルアミド；Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド；酢酸ビニル；アリルアミン等であることがより好ましい。また、得られる複数物質応答性ゲルの性能に悪影響を与えるものでなければ、さらに他のモノマーを組み合わせてもよい。なお、本明細書において、「アクリル」または「メタアクリル」を意味する場合「（メタ）アクリル」と表記する。
【００４１】
また、前記架橋ポリマーは、一分子中に２個以上の反応性官能基を有する架橋剤を共重合または反応させることによって架橋されているものであることがより好ましい。前記反応性官能基としては、例えば、ビニル基、（メタ）アクリロイル基、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、イソシアネート基等を挙げることができる。前記架橋剤としては、従来公知のものを適宜選択して用いればよいが、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス（メタ）アクリルアミド、トリレンジイソシアネート、ジビニルベンゼン、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の重合性官能基を有する架橋性モノマー；グルタールアルデヒド；多価アルコール；多価アミン；多価カルボン酸；金属イオン等を好適に用いることができる。これらの架橋剤は単独で用いてもよく、また２種類以上を組み合わせて用いてもよい。また、前記架橋ポリマーは、前記架橋剤を用いずに、本発明で用いる前記複合体と共重合させることによって、当該複合体のみにより架橋されているものであってもよい。
【００４２】
前記架橋ポリマーとしては、具体的には、例えば、ポリ（メタ）アクリルアミド；ポリ−Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド；ポリ−Ｎ，Ｎ’-ジメチル（メタ）アクリルアミド；ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート；ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ−アルキル（メタ）アクリレート、ポリマレイン酸、ポリビニルスルホン酸、ポリビニルベンゼンスルホン酸、ポリアクリルアミドアルキルスルホン酸、ポリジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、これらと（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸アルキルエステル等との共重合体；ポリジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミドとポリビニルアルコールとの複合体；ポリビニルアルコールとポリ（メタ）アクリル酸との複合体；カルボキシアルキルセルロース金属塩；ポリ（メタ）アクリロニトリル；アルギン酸；キトサン；ポリアリルアミン；セルロースまたはこれらの誘導体や架橋物、金属塩を挙げることができる。これらの中でも、前記架橋ポリマーは、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ−アルキル（メタ）アクリレート、ポリ−Ｎ，Ｎ’-ジメチル（メタ）アクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリアリルアミン、セルロース、キトサン、アルギン酸、これらの誘導体であることがより好ましい。また、前記架橋ポリマーの分子量は、１０００以上５００００００以下であることが好ましい。分子量がかかる範囲となっていることにより、適度な架橋剤によって架橋ポリマーを合成しやすいので好ましい。
【００４３】
本発明に係る複数物質応答性ゲルは、平衡に達するまで膨潤している状態で前記検出対象物質の検出に用いる。本実施形態に係る複数物質応答性ゲルは、前記検出対象物質と接触したときに、液体を吸収して、さらに膨潤し、体積が増加する。本発明において、これらの膨潤の際に吸収される液体は、特に限定されるものではなく、水や水系の緩衝液であってもよいし有機溶媒であってもよい。かかる液体としては、具体的には、例えば、水；リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、酢酸緩衝液等の水系の緩衝液；メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、イソペンチルアルコール等のアルコール；アセトン、２−ブタノン、３−ペンタノン、メチルイソプロピルケトン、メチルｎ−プロピルケトン、３−ヘキサノン、メチルｎ−ブチルケトン等のケトン；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン等のエーテル；酢酸エチルエステル等のエステル；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド；ジメチルスルホキシド；アセトニトリル等のニトリル；プロピレンカーボネート；ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン等の低級飽和炭化水素；キシレン；トルエン；またはこれらの２種以上の混合物等を挙げることができる。中でも、前記液体は生体分子を検出する場合の安定性の観点から水または水系の緩衝液であることがより好ましい。本発明に係る複数物質応答性ゲルを平衡に達するまで膨潤させたときに含まれる前記液体の割合は、高分子ゲルの架橋密度、高分子ゲルや溶媒の種類、温度、ｐＨ、イオン強度等によって変化するが、複数物質応答性ゲルと複数物質応答性ゲルに含まれる前記液体の合計重量に対して、３０重量％以上９９．９重量％以下であることが好ましく、７０重量％以上９９重量％以下であることがより好ましい。本発明に係る複数物質応答性ゲルを平衡に達するまで膨潤させたときに含まれる前記液体の割合が前記範囲であることにより、適度な強度を有する高分子ゲルが得られ、前記検出対象物質が高分子ゲル内に拡散することができる高分子網目構造となるので好ましい。
【００４４】
また、本実施形態に係る複数物質応答性ゲルの架橋密度は、０．１（ｍｏｌ／ｍ３）以上５００（ｍｏｌ／ｍ３）以下であることが好ましく、１（ｍｏｌ／ｍ３）以上１００（ｍｏｌ／ｍ３）以下であることがより好ましい。複数物質応答性ゲルの架橋密度が前記範囲であることにより、複数物質応答性ゲルが大きな体積変化を示すことが期待でき、さらに適度な強度を持つので好ましい。なお、本明細書において、架橋密度とは、後述する実施例に記載の方法により求められた値をいう。
【００４５】
本実施形態の複数物質応答性ゲルにおける、前記複合体の合計の含有量は、複数物質応答性ゲルが検出対象物質に応答して膨潤率が増加することができる範囲であれば、特に限定されるものではないが、乾燥状態の複数物質応答性ゲルに対して、０．０１重量％以上であることが好ましく、０．１重量％以上であることがより好ましく、１重量％以上であることがさらに好ましい。前記複合体の合計の含有量が大きければそれだけ複数物質応答性ゲルが検出対象物質に応答したときの架橋密度の変化が大きくなる。それゆえ、検出対象物質を認識する認識能を向上することができる。複合体をたくさん入れすぎるとある含有量以上において認識能が向上しない可能性はあるが特に前記複合体の含有量の上限はない。
【００４６】
また、本発明に係る複数物質応答性ゲルの形状は特に限定されるものではなく、どのような形状のものであってもよく、用途に応じて好ましい形状を適宜選択すればよい。かかる形状としては、例えば、円柱状、板状、フィルム状、粒子状、球状、直方体状等を挙げることができる。例えばセンサーチップ等に用いる場合には、薄膜状やフィルム状等であることが好ましく、診断試薬等に用いる場合には、粒子状等であることが好ましい。
【００４７】
本発明に係る複数物質応答性ゲルを所望の形状とするためには、例えば、複数物質応答性ゲルの原料となるモノマー組成物等を重合前に所望の型に注入し、重合を行う方法等を用いることができる。
【００４８】
また、複数物質応答性ゲルの大きさも特に限定されるものではなく、用途に応じて好ましい大きさを適宜選択すればよい。例えば、センサー等に用いる場合には、サイズが小さい高分子ゲルを用いることが好ましく、例えば球状である場合には、その直径が０．０１μｍ以上１００μｍ以下であることが好ましい。複数物質応答性ゲルのサイズが小さいほど、応答速度が速くなるため、センサー等に好適に用いることができる。
【００４９】
（Ｉ−２）
本発明に係る複数物質応答性ゲルの他の好ましい一実施形態は、前記複合体が、特異的結合物質と結合する複数の結合パートナーが高分子ゲルに結合することによって、架橋を形成するように、高分子ゲルに固定されており、特異的結合物質は高分子ゲルに結合していない複数物質応答性ゲルから、前記特異的結合物質が除去されているインプリントゲルである。なお、本発明において、１の特異的結合物質と結合する複数の結合パートナーを結合パートナーセットと称することがある。
【００５０】
かかるインプリントゲルは、前記複合体が、特異的結合物質と結合する複数の結合パートナーが高分子ゲルに結合することによって、架橋を形成するように、高分子ゲルに固定された後に、当該特異的結合物質が除去されて得られるものであるため、当該特異的結合物質に対して相補的な結合部位をインプリントゲル内に構築することができる。すなわち、高分子ゲル中に、除去された特異的結合物質と結合する複数の結合パートナーが、当該特異的結合物質の形に従い、当該特異的結合物質の特徴的な官能基を認識するように配置される。この官能基周辺が、当該検出対象物質に対して特異的に結合する部位（特異的結合部位）となる。
【００５１】
このように、本実施形態にかかる複数物質応答性ゲルは、分子インプリンティング法により形成されたものである。ここで、分子インプリンティング法とは、ポリマーを合成する際、ポリマー合成用のモノマーに、検出対象物質を混入させて重合を行い、得られたポリマーから検出対象物質を除去することにより、検出対象物質の鋳型をポリマー内にとる方法をいう。
【００５２】
したがって、本発明にかかる複数物質応答性ゲルには、インプリントゲルを製造する中間体である前記特異的結合物質が除去される前の、前記複合体が、特異的結合物質と結合する複数の結合パートナーが高分子ゲルに結合することによって、架橋を形成するように、高分子ゲルに固定されているゲルも含まれる。すなわち、本発明に係る複数物質応答性ゲルの他の好ましい一実施形態は、前記複合体が、特異的結合物質と結合する複数の結合パートナーが高分子ゲルに結合することによって、架橋を形成するように、高分子ゲルに固定されており、特異的結合物質は高分子ゲルに結合していない複数物質応答性ゲルであってもよい。
【００５３】
インプリントゲルを製造する中間体である前記特異的結合物質が除去される前のゲルでは、前記複合体は、例えば、図８左側に示す円内に模式的に示すように、高分子ゲルに架橋を形成するように結合されている。なお、図８に示す例では、四角で示される抗原と該抗原と特異的かつ可逆的に結合する２つの結合パートナーとが結合してなる第１の複合体と、楕円で示される抗原と該抗原と特異的かつ可逆的に結合する２つの結合パートナーとが結合してなる第２の複合体とが、高分子ゲルの網目構造内に固定されている。ここで架橋は、特異的結合物質と結合する複数の結合パートナーが高分子ゲルに結合することによって形成され、特異的結合物質は高分子ゲルに結合していない。すなわち、結合パートナーのそれぞれは、高分子ゲルの網目構造を形成する高分子化合物と架橋の片方でのみ結合しているが、特異的結合物質と複合体を形成することによって、架橋が形成されることになる。
【００５４】
かかる中間体から、前記特異的結合物質が除去されている複数物質応答性ゲルは、図８右側に示す円内に模式的に示すように、架橋が切断されることになり、架橋点が減少すると考えられる。これにより、架橋点が減少する結果、複数物質応答性ゲルは膨潤率が増加する。
【００５５】
なお、本実施形態に係る複数物質応答性ゲルにおいて、前記結合パートナーが高分子ゲルに結合する方式は特に限定されるものではないが、例えば、共有結合、イオン結合、配位結合等の化学結合を介して結合されていることが好ましい。これにより、前記複合体が、高分子ゲルに安定して固定される。なお、前記結合パートナーは、直接高分子ゲルに結合していてもよいし、二価の基を介して高分子ゲルに結合していてもよい。また、前記特異的結合物質と結合パートナーとが可逆的に結合している点は、上記Ｉ−１の実施形態と同様である。
【００５６】
そして、上述した分子インプリンティング法により前記特異的結合物質が除去されている複数物質応答性ゲルは、当該特異的結合物質が存在すると、高分子ゲルに固定されている複数の結合パートナーが、検出対象物質を認識して結合する結果、再び複合体が形成される。
【００５７】
複合体が再び形成される結果、図８左側に示す円内に示すように、架橋が再び形成されることになり、架橋点が増加すると考えられる。これにより、架橋点が増加する結果、複数物質応答性ゲルは膨潤率が減少して、体積が減少する方向に体積変化すると考えられる。すなわち、本実施形態に係る複数物質応答性ゲルは、前記複合体を形成している特異的結合物質と接触させたときに、体積が減少する。また、前記複合体を形成している特異的結合物質が、本発明に係る複数物質応答性ゲルの検出対象物質であるといえる。
【００５８】
ここで、本実施形態に係る複数物質応答性ゲルでは、複数種類の前記特異的結合物質を特異的に認識する複数種類の結合パートナーセットが、高分子ゲルに固定されている。そして、複数種類の前記結合パートナーセットと、それぞれ結合可能な複数種類の前記検出対象物質のうち、一部の種類が存在するときには、複数物質応答性ゲルはわずかに体積が減少する。そして、複数種類の前記検出対象物質のうちすべての種類が存在する場合にはじめて、大きく体積が減少する。
【００５９】
このように、本実施形態に係る複数物質応答性ゲルは、複数種類の前記結合パートナーセットが、高分子ゲルの網目構造内に固定されていることにより、複数種類の結合パートナーセットと、それぞれ結合可能な複数種類の前記検出対象物質のうち、すべて存在する場合にはじめて大きく膨潤率が減少するので、複数の前記検出対象物質を、同時に検出することができる。
【００６０】
本実施形態において用いられる、前記高分子ゲル、前記高分子ゲルが、相互侵入網目ポリマーである場合の複数種類の前期複合体または前記結合パートナーが固定される方法、架橋ポリマーの数は、上記Ｉ−１の実施形態と同様である。
【００６１】
これにより、本実施形態では、前記複数種類の複合体により形成する架橋のすべての種類が形成されることによってはじめて大きく体積が減少するという効果を得ることができると考えられる。その理由は明らかではないが、１種類の架橋ポリマーの架橋点のみが増加しても、上記Ｉ−１の場合と同様に他の架橋ポリマーの存在により、体積の減少が抑えられることが理由として考えられる。
【００６２】
また、前記高分子ゲルが、単一の架橋ポリマーである場合も、上記Ｉ−１の場合と同様に、前記複数種類の複合体を形成する架橋のすべての種類が形成されることによってはじめて大きく体積変化という効果を得ることができると考えられる。
【００６３】
前記架橋ポリマー、複数物質応答性ゲルの膨潤の際に吸収される液体、複数物質応答性ゲルを平衡に達するまで膨潤させたときに含まれる前記液体の割合、複数物質応答性ゲルの架橋密度、前記複合体の合計の含有量、複数物質応答性ゲルの形状、大きさも上記Ｉ−１の実施形態と同様である。
【００６４】
なお、本実施形態においては、前記特異的結合物質および前記結合パートナーは、上述した例の他、それぞれ、包接化合物を形成するゲスト分子および包接化合物を形成する複数のホスト分子であってもよい。
【００６５】
ここで、包接化合物とは、２種類以上の分子が適当な条件下で組み合わさってできる化合物で、ホスト分子が、ゲスト分子を取り囲んだ構造の化合物をいう。また、ホスト分子とは、当該ホスト分子内に検出対象物質を包接することができる化合物であれば特に限定されるものではない。かかるホスト分子は、上述したような包接化合物を形成するものであれば特に限定されるものではないが、例えば、シクロデキストリン、クラウン化合物、シクロファン、アザシクロファン、カリックスアレーンおよびそれらの誘導体等を挙げることができる。これらは、環構造を有し、環構造の内孔の大きさ、体積、形状によって特定の分子を認識し包接することができる。
【００６６】
（Ｉ−３）
本発明の一実施形態に係る複数物質応答性ゲルは、上述したように、固定された複数種類の前記複合体をそれぞれ構成する、複数種類の特異的結合物質または結合パートナーと、それぞれ交換する複数種類の前記検出対象物質のうち、一部の種類に応答してわずかに体積変化を起こし、複数種類の前記検出対象物質のうちすべての種類の組み合わせに応答して大きい体積変化を起こす高分子ゲルである。より具体的には、この複数物質応答性ゲルは、複数種類の前記検出対象物質のうち、一部の種類を認識すると、液体を吸収してわずかに膨潤率が増加し、複数種類の前記検出対象物質のうちすべての種類の組み合わせを認識すると、液体を吸収して大きく膨潤率が増加する高分子ゲルである。
【００６７】
また、本発明の他の実施形態に係る複数物質応答性ゲルは、上述したように、複数種類の前記特異的結合物質を特異的に認識する結合パートナーが、高分子ゲルに固定されている。そして、この複数物質応答性ゲルは、複数種類の前記結合パートナーと、それぞれ結合可能な複数種類の前記検出対象物質のうち、一部の種類が存在するときには、複数物質応答性ゲルはわずかに体積が減少し、複数種類の前記検出対象物質のうちすべての種類が存在する場合にはじめて、大きく体積が減少する高分子ゲルである。
【００６８】
腫瘍マーカーなどの疾病マーカーの場合には複数種類の生体分子がマーカー分子として利用されているため、一つの疾病に対して２種類以上の疾病マーカーを同時検出して体積変化する複数物質応答性ゲルを利用すれば、より正確な診断が可能となる。さらに，複数の疾病に対するマーカー分子に対して、１種類のみが存在する場合と、２種以上が同時に存在する場合とを区別することができるため、複数の疾病を同時診断することができるようになるだけでなく、診断の幅も広がる。それゆえ、本発明に係る複数物質応答性ゲルによれば、従来の技術に比較して飛躍的に診断精度が向上し、さらに正確な薬物放出制御システムなどへの応用も可能である。また、従来の生体応答性ゲルの場合には、標的生体分子の数だけゲルを合成する必要があり、さらに個別に応答するために複数の標的生体分子を同時に検出することは困難であったが、かかる問題を解決することができる。
【００６９】
ここで、本発明の複数物質応答性ゲルの体積変化は、可逆的であることにより複数物質応答性ゲルを繰り返し使用が可能であり，さらに再現性よいセンサー材料として利用することが可能となる。
【００７０】
本発明に係る複数物質応答性ゲルが、複数種類の前記検出対象物質のうち、一部の種類を認識して体積変化を起こすときの、体積変化量は特に限定されるものではないが、体積変化後の体積を体積変化前の体積で除した値である膨潤率の絶対値が、１．０２以上であることが好ましい。また、複数種類の前記検出対象物質のうちすべての種類の組み合わせを認識して体積変化を起こすときの、体積変化量も特に限定されるものではないが、体積変化後の体積を体積変化前の体積で除した値である膨潤率の絶対値が、１．０２以上であることが好ましく、１．０８以上であることが好ましく、１．１以上であることがさらに好ましい。膨潤率の絶対値が大きいほど感度が向上するため好ましい。また、本発明に係る複数物質応答性ゲルにおいて、前記膨潤率の絶対値の上限は、導入されている架橋の量、高分子ゲルや溶媒の種類、高分子鎖にある解離基の状態等により異なるが、通常２程度である。なお、膨潤率は、複数物質応答性ゲルが円柱状の場合は、後述する実施例に記載の方法により得られる値をいう。後述する実施例では円柱状の複数物質応答性ゲルの膨潤率を求める方法が記載されているが、複数物質応答性ゲルが例えば球状である場合は、実施例の「円柱の直径」の代わりに球の直径を用いて計算すればよい。
【００７１】
また、本発明の複数物質応答性ゲルは、さらに、シリカ粒子等の微粒子、色材、蛍光発色団を有する分子、蛍光共鳴エネルギー移動を利用するためのドナーやアクセプター等で標識化した複数物質応答性ゲルであってもよい。かかる複数物質応答性ゲルを用いることにより、複数物質応答性ゲルの体積変化を、分光器、蛍光顕微鏡等を用いて、または目視によって簡便に検出することができる。
【００７２】
（ＩＩ）複数物質応答性ゲルの製造方法
本発明にかかる複数物質応答性ゲルの製造方法は、複数種類の特異的結合物質と、当該複数種類の特異的結合物質と特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーとが結合してなる複数種類の複合体が、高分子ゲルに固定されている複数物質応答性ゲルを製造する方法を含んでいればいかなる方法であってもよい。
【００７３】
（ＩＩ−１）複数物質応答性ゲルが相互侵入網目ポリマーである場合
本発明に係る複数物質応答性ゲルの製造方法の一実施形態として、前記複数物質応答性ゲルが、相互侵入網目ポリマーである場合は、本発明に係る複数物質応答性ゲルの製造方法は、第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーを製造する第１工程と、第１工程で得られた、第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーと、第２の複合体が固定された第２の架橋ポリマーとからなる相互侵入網目ポリマーを製造する第２工程とを含んでいればよい。ここで、第１の複合体とは、第１の特異的結合物質と、当該第１の特異的結合物質と特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーとが結合してなる複合体であり、第２の複合体とは、第２の特異的結合物質と、当該第２の特異的結合物質と特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーとが結合してなる複合体であって、前記第１の特異的結合物質と第２の特異的結合物質とは異なる物質である。
【００７４】
より具体的には、前記第１の複合体は、上述した複数物質応答性ゲルの実施形態に応じて、前記第１の特異的結合物質およびその結合パートナー、あるいは、当該結合パートナーのみに反応性官能基を導入後、第１の特異的結合物質とその結合パートナーとを結合させたものである。また、前記第２の複合体は、上述した複数物質応答性ゲルの実施形態に応じて、前記第２の特異的結合物質およびその結合パートナー、あるいは、当該結合パートナーのみに反応性官能基を導入後、第２の特異的結合物質とその結合パートナーとを結合させたものである。
【００７５】
前記第１工程は、第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーを製造することができる工程であれば特に限定されるものではなく、例えば以下に示す（ａ）または（ｂ）の工程を好適に用いることができる。
（ａ）第１の特異的結合物質と、当該第１の特異的結合物質と特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーとが結合してなる第１の複合体を、第１の架橋ポリマーを形成するモノマーと共重合させて、第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーを製造する１次重合工程。
（ｂ）第１の特異的結合物質と、当該第１の特異的結合物質と特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーとが結合してなる第１の複合体を、ポリマーと結合させる複合体結合工程と、複合体結合工程で得られた、第１の複合体が結合されたポリマーを、架橋剤と反応させて、第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーを製造する１次架橋工程。
【００７６】
（ａ）の１次重合工程では、前記第１の複合体を、第１の架橋ポリマーを形成するモノマーと、架橋剤の存在下または不存在下で、共重合させて第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーを得る。本工程で用いられるモノマーについては、前記（Ｉ）で説明したとおりであるのでここでは説明を省略する。また、ここで用いられる架橋剤についても前記（Ｉ）で説明したとおりであるのでここでは説明を省略する。なお、１次重合工程は架橋剤の存在下で行うことが好ましいが、架橋剤の不存在下で行ってもよい。かかる場合は、前記第１の複合体のみによって架橋された複数物質応答性ゲルを得ることができる。
【００７７】
さらに、１次重合工程では、前記第１の複合体を、前記モノマーおよび必要に応じて前記架橋剤に加えて、さらに他のモノマーと共重合させてもよい。かかる他のモノマーとしては、得られる第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーの性能に悪影響を与えるものでなければ特に限定されるものではない。
【００７８】
ここで、重合方法としては、特に限定されるものではなく、ラジカル重合、イオン重合、重縮合、開環重合等を好適に用いることができる。また、重合に用いられる溶媒としては、例えば、水、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、酢酸緩衝液、メタノール、エタノール等を好適に用いることができる。
【００７９】
重合開始剤としても、特に限定されるものではなく、例えば、過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウム等の過硫酸塩；過酸化水素；ｔ−ブチルハイドロパーオキシド、クメンハイドロパーオキシド等のパーオキシド類、アゾビスイソブチロニトリル、過酸化ベンゾイル、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩等を好適に使用することができる。これらの重合開始剤の中でも、特に、過硫酸塩やパーオキシド類等のような酸化性を示す開始剤は、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン等とのレドックス開始剤としても用いることができる。あるいは、光、放射線等を開始剤として用いてもよい。
【００８０】
また、重合温度は特に限定されるものではないが、前記第１の複合体が解離しない温度であることが好ましい。前記第１の複合体が生体分子を含む場合には、当該生体分子が変性しない温度とする。また、重合時間も、特に限定されるものではないが、通常４時間〜４８時間である。
【００８１】
重合の際の、モノマー、架橋剤等の濃度は、第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーが得られる濃度であれば特に限定されるものではない。また、前記重合開始剤の濃度も特に限定されるものではなく適宜選択すればよい。
【００８２】
得られた第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーは、１次重合工程で得られた反応混合物から、未反応モノマー、架橋剤、溶媒等を除去することにより得られる。なお、未反応モノマー、架橋剤、溶媒等を除去する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、中性付近の緩衝液中で、得られた第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーを洗浄する方法を挙げることができる。
【００８３】
前記（ｂ）の工程は、１次重合工程において、第１の複合体を、第１の架橋ポリマーを形成するモノマーと、架橋剤の存在下または不存在下で、共重合させて第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーを製造するかわりに、第１の複合体を、ポリマーに結合した後に、第１の複合体が結合したポリマーを架橋する方法を用いる。なお、ここで、第１の複合体は、架橋を形成するように非架橋ポリマーに結合される。
【００８４】
前記複合体結合工程では、前記第１の複合体をポリマーと結合させる。ここで、前記第１の複合体を結合させるポリマーは、特に限定されるものではないが、例えば、非架橋ポリマーであり、前記（Ｉ）で述べた高分子化合物を好適に用いることができる。なお、かかる高分子化合物は、非架橋ポリマーであればよいが、前記第１の複合体を結合させることができるかぎりにおいて網目構造を有している架橋ポリマーであってもよい。また、前記第１の複合体を前記ポリマーと結合させる方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００８５】
前記１次架橋工程では、前記第１の複合体が結合された前記ポリマーを、架橋剤と反応させて網目構造を形成する。ここで、架橋剤としては、前記（Ｉ）で説明した架橋剤を好適に用いることができる。また、架橋反応の条件も、高分子化合物や架橋剤の種類等に応じて適宜選択すればよい。
【００８６】
前記第２工程は、第１工程で得られた、第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーと、第２の複合体が固定された第２の架橋ポリマーとからなる相互侵入網目ポリマーを製造することができる工程であれば特に限定されるものではなく、例えば以下に示す（ｃ）または（ｄ）の工程を挙げることができる。
（ｃ）第２の特異的結合物質と、当該第２の特異的結合物質と特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーとが結合してなる第２の複合体を、前記第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーの存在下で、第２の架橋ポリマーを形成するモノマーと共重合させて、第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーと、第２の複合体が固定された第２の架橋ポリマーとからなる相互侵入網目ポリマーを製造する工程。
（ｄ）第２の特異的結合物質と、当該第２の特異的結合物質と特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーとが結合してなる第２の複合体を、ポリマーと結合させる複合体結合工程と、複合体結合工程で得られた、第２の複合体が結合されたポリマーを、前記第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーの存在下で、架橋剤と反応させて、第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーと、第２の複合体が固定された第２の架橋ポリマーとからなる相互侵入網目ポリマーを製造する工程。
【００８７】
前記（ｃ）の工程では、第２の架橋ポリマーが形成されるが、このとき、前記第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマー内および前記第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーと第２の架橋ポリマーとの相互間に架橋が形成されないような重合条件を適宜選択すればよい。かかる重合条件としては、これに限定されるものではないが、例えば、前記第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーに架橋が形成されないように、１次重合工程とは異なる重合方法を用いることが挙げられる。例えば、前記第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーとして光、放射線等によっては架橋が形成されないものを選択し、かかる第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーに、前記第２の複合体、第２の架橋ポリマーを形成するモノマー、および、必要に応じて架橋剤を、これらを含む溶液に浸漬することにより取り込ませた後、溶液から取り出し、光、放射線等を開始剤として用いて重合を行う方法を挙げることができる。
【００８８】
前記重合条件を満たすものであれば、本工程において用いることができるモノマー、架橋剤、架橋剤の使用および不使用、他のモノマーとの共重合、重合方法、重合に用いられる溶媒、重合開始剤、温度条件、反応時間、モノマー等の濃度については、１次重合工程で説明したとおりであるのでここでは説明を省略する。
【００８９】
得られた複数物質応答性ゲルは、反応混合物から、未反応モノマー、架橋剤、溶媒等を除去することにより得られる。なお、未反応モノマー、架橋剤、溶媒等を除去する方法は、１次重合工程で説明したとおりである。また、本発明に係る複数物質応答性ゲルは、ヒドロゲルまたはオルガノゲルであることが好ましいが、乾燥状態としたものであってもよい。乾燥状態とした本発明の複数物質応答性ゲルは、例えば、洗浄後の複数物質応答性ゲルを凍結乾燥することにより得ることができる。
【００９０】
前記（ｄ）の工程は、前記（ｃ）の工程において、第２の複合体を、第２の架橋ポリマーを形成するモノマーと、前記第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーの存在下で、共重合させて第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーと、第２の複合体が固定された第２の架橋ポリマーとからなる相互侵入網目ポリマーを製造するかわりに、第２の複合体を、ポリマーに結合した後に、前記第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーの存在下で、架橋剤と反応させる方法を用いる。なお、ここで、第２の複合体は、架橋を形成するように非架橋ポリマーに結合される。
【００９１】
前記複合体結合工程では、前記第２の複合体をポリマーと結合させる。ここで、前記第２の複合体を結合させるポリマー、前記第１の複合体を前記ポリマーと結合させる方法については、前記（ｂ）の工程と同様である。
【００９２】
また、（ｄ）の工程で用いられる架橋剤としては、前記（Ｉ）で説明した架橋剤を好適に用いることができる。また、架橋反応の条件も、高分子化合物や架橋剤の種類等に応じて適宜選択すればよい。
【００９３】
本実施形態に係る複数物質応答性ゲルの製造方法は、少なくとも前記第１工程と第２工程とを含んでいればよく、各工程において用いられる方法はどのような組み合わせであってもよい。例えば、（ａ）と（ｃ）との組み合わせ、（ａ）と（ｄ）との組み合わせ、（ｂ）と（ｃ）との組み合わせ、または（ｂ）と（ｄ）との組み合わせを好適に用いることができる。
【００９４】
また、本実施形態に係る複数物質応答性ゲルの製造方法は、少なくとも上記工程を含んでいればよいが、前記複数物質応答性ゲルが、３以上の架橋ポリマーからなる相互侵入網目ポリマーである場合は、さらに、第３以降の架橋ポリマーを重合する工程を追加すればよい。例えば、前記複数物質応答性ゲルが、３の架橋ポリマーからなる相互侵入網目ポリマーである場合は、第３の複合体を、前記第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーと、第２の複合体が固定された第２の架橋ポリマーとからなる相互侵入網目ポリマーの存在下で、第３の架橋ポリマーを形成するモノマーと、架橋剤の存在下または不存在下で、共重合させて、前記第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーと、第２の複合体が固定された第２の架橋ポリマーと、第３の複合体が固定された第３の架橋ポリマーとからなる相互侵入網目ポリマーを製造すればよい。あるいは、第３の複合体を、ポリマーに結合した後に、前記第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーと、第２の複合体が固定された第２の架橋ポリマーとの存在下で、架橋剤と反応させる方法を用いてもよい。
【００９５】
（ＩＩ−２）複数物質応答性ゲルが単一の架橋ポリマーである場合
本発明に係る複数物質応答性ゲルの製造方法の他の一実施形態として、本発明に係る複数物質応答性ゲルが、単一の架橋ポリマーである場合は、例えば、少なくとも前記第１の複合体と、前記第２の複合体とを、当該架橋ポリマーを形成するモノマーと、架橋剤の存在下または不存在下で、共重合する重合工程とを含む製造方法により、本発明に係る複数物質応答性ゲルを製造することができる。
【００９６】
また、本実施形態における他の製造方法としては、少なくとも、前記第１の複合体と、前記第２の複合体とを、ポリマーと結合させる複合体結合工程と、前記複合体結合工程により、前記複合体が結合された前記ポリマーを、架橋剤と反応させて網目構造を形成する架橋工程とを含む製造方法を挙げることができる。
【００９７】
ここで、前記第１の複合体と前記第２の複合体とを結合させるポリマーは、特に限定されるものではないが、例えば、非架橋ポリマーであり、前記（Ｉ）で述べた高分子化合物を好適に用いることができる。なお、かかる高分子化合物は、非架橋ポリマーであればよいが、前記第１の複合体と前記第２の複合体とを結合させることができるかぎりにおいて網目構造を有している架橋ポリマーであってもよい。
【００９８】
本実施形態において用いることができるモノマー、架橋剤、架橋剤の使用および不使用、他のモノマーとの共重合、重合方法、重合に用いられる溶媒、重合開始剤、温度条件、反応時間、モノマー等の濃度、複数物質応答性ゲルの洗浄方法等については、複数物質応答性ゲルが、相互侵入網目ポリマーである場合の前記製造方法において説明したとおりであるのでここでは説明を省略する。
【００９９】
本実施形態に係る複数物質応答性ゲルの製造方法は、少なくとも上記工程を含んでいればよい。前記複数物質応答性ゲルが、３種類以上の前記複合体を固定したものである場合は、前記重合工程において３種類以上の複合体を用いればよい。
【０１００】
（ＩＩ−３）複数物質応答性ゲルが（Ｉ−１）の複数物質応答性ゲルである場合
前記（Ｉ−１）の複数物質応答性ゲルは、前記複合体が、特異的結合物質と、結合パートナーとが、それぞれ、高分子ゲルに結合することによって、架橋を形成するように、高分子ゲルに固定されている複数物質応答性ゲルである。かかる複数物質応答性ゲルは、反応性官能基が導入された第１の特異的結合物質と、反応性官能基が導入されたその結合パートナーとを結合させて得られる第１の複合体と、反応性官能基が導入された第２の特異的結合物質と、反応性官能基が導入されたその結合パートナーとを結合させて得られる第２の複合体とを用いて、前記（ＩＩ−１）または（ＩＩ−２）に記載の方法により製造することができる。
【０１０１】
したがって、前記（Ｉ−１）の複数物質応答性ゲルの製造方法は、さらに、反応性官能基が導入された前記第１の特異的結合物質と、反応性官能基が導入された前記結合パートナーとを結合させて第１の複合体を作製する複合体形成工程と、反応性官能基が導入された前記第２の特異的結合物質と、反応性官能基が導入された前記結合パートナーとを結合させて第２の複合体を作製する複合体形成工程とを含んでいてもよい。
【０１０２】
前記複合体形成工程は、例えば、反応性官能基が導入された特異的結合物質の溶液と、反応性官能基が導入された結合パートナーの溶液とを、前記特異的結合物質と結合パートナーとが結合する条件下で混合することにより行うことができる。
【０１０３】
（ＩＩ−４）複数物質応答性ゲルが（Ｉ−２）の複数物質応答性ゲルである場合
前記（Ｉ−２）の複数物質応答性ゲルは、前記複合体が、特異的結合物質と結合する複数の結合パートナーが高分子ゲルに結合することによって、架橋を形成するように、高分子ゲルに固定されており、特異的結合物質は高分子ゲルに結合していない複数物質応答性ゲル、または、かかるゲルから前記特異的結合物質が除去されているインプリントゲルである。
【０１０４】
前記特異的結合物質が除去される前の中間体であるゲルは、反応性官能基が導入されていない第１の特異的結合物質と、反応性官能基が導入されたその結合パートナーとを結合させて得られる第１の複合体と、反応性官能基が導入されていない第２の特異的結合物質と、反応性官能基が導入されたその結合パートナーとを結合させて得られる第２の複合体とを用いて、前記（ＩＩ−１）または（ＩＩ−２）に記載の方法により製造することができる。
【０１０５】
したがって、前記（Ｉ−２）の複数物質応答性ゲルの製造方法は、さらに、前記第１の特異的結合物質と、反応性官能基が導入された前記結合パートナーとを結合させて第１の複合体を作製する複合体形成工程と、前記第２の特異的結合物質と、反応性官能基が導入された前記結合パートナーとを結合させて第２の複合体を作製する複合体形成工程とを含んでいてもよい。
【０１０６】
前記複合体形成工程は、例えば、反応性官能基が導入された特異的結合物質の溶液と、反応性官能基が導入された結合パートナーの溶液とを、前記特異的結合物質と結合パートナーとが結合する条件下で混合することにより行うことができる。
【０１０７】
また、前記特異的結合物質が除去される前の中間体であるゲルは、前記（ＩＩ−１）または（ＩＩ−２）のように、複合体を先に形成した後に、架橋ポリマーを形成するモノマーと共重合させるか、またはポリマーに固定して架橋するかわりに、前記結合パートナーの少なくとも１つをポリマーに固定し、その後、特異的結合物質の存在下で、反応性官能基が導入された他の結合パートナーと結合させてもよい。より具体的には、例えば、第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーと、第２の複合体が固定された第２の架橋ポリマーとは、それぞれ、非特許文献２に記載の方法に準じて製造することができる。
【０１０８】
中でも、標的分子に対するリガンドモノマーと標的分子との複合体を形成させた後に、モノマーと重合させてゲルを合成し、さらに鋳型分子を取り除いて結合サイトを形成させる方法を好適に用いることができる。
【０１０９】
前記特異的結合物質が除去された複数物質応答性ゲルは、上記方法により得られた中間体から、第１の特異的結合物質および第２の特異的結合物質を除去することにより製造することができる。
【０１１０】
したがって、前記（Ｉ−２）の複数物質応答性ゲルの製造方法は、さらに、第１の特異的結合物質および第２の特異的結合物質を除去する工程を含んでいてもよい。
【０１１１】
前記中間体から、第１の特異的結合物質および第２の特異的結合物質を除去する方法は特に限定されるものではなく、前記複合体における特異的結合物質とその結合パートナーとの可逆的な結合を分解することにより、特異的結合物質を除去できる方法であればどのような方法であってもよい。除去の方法としては複合体を解離することができる条件を挙げることができ、例えば複合体が解離するｐＨを有する溶媒、複合体が解離するイオン強度の高い溶媒等を用いて前記中間体を洗浄する方法、複合体が解離する温度で適当な溶媒を用いて前記中間体を洗浄する方法、電気泳動によって前記中間体から鋳型分子を取り除く方法などを挙げることができる。
【０１１２】
〔その他の工程〕
さらに、本発明に係る複数物質応答性ゲルの製造方法は、少なくとも前記第１の特異的結合物質およびその結合パートナー、あるいは、当該結合パートナーのみ、ならびに、前記第２の特異的結合物質およびその結合パートナー、あるいは、当該結合パートナーのみにそれぞれ反応性官能基を導入する反応性官能基導入工程を含んでいてもよい。
【０１１３】
前記反応性官能基導入工程では、特異的結合物質と、当該特異的結合物質と特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーとにそれぞれ反応性官能基を導入する。ここで用いる反応性官能基としては、高分子ゲルの網目構造を形成する高分子化合物と化学的に結合可能な基であれば、特に限定されるものではなく、例えば、ビニル基、（メタ）アクリロイル基、水酸基、カルボキシル基、アミノ基等を挙げることができる。
【０１１４】
前記反応性官能基を導入する方法も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いればよい。例えば、ビニル基を導入する場合の一例として、末端がアミノ化された特異的結合物質または末端がアミノ化された結合パートナーをＮ−スクシンイミジルアクリレートと反応させる方法を挙げることができる。
【０１１５】
本発明に係る複数物質応答性ゲルの製造方法としては、上述したような方法を好適に用いることができる。したがって、本発明に係る複数物質応答性ゲルには、前記製造方法により得られる複数物質応答性ゲルも含まれる。
【０１１６】
（ＩＩＩ）複数物質応答性ゲルの利用
（ＩＩＩ−１）複数物質応答性ゲルを用いた検出方法
本発明に係る複数物質応答性ゲルでは、複数種類の前記複合体、または複数種類の前記複合体から検出対象である特異的結合物質を除去することにより検出対象を認識するように配置された結合パートナーが、高分子ゲルに固定されている。そして、複数種類の前記検出対象物質のうち、一部の種類が存在するときには、複数物質応答性ゲルはわずかに体積が変化する。そして、複数種類の前記検出対象物質のうちすべての種類が存在する場合にはじめて、大きく体積が変化する。
【０１１７】
それゆえ、本発明に係る複数物質応答性ゲルは、前記検出対象物質のうち、一部の種類を検出することができる。さらに、複数種類の前記検出対象物質のうちすべての種類を同時に検出するために利用することができる。したがって、本発明に係る複数物質応答性ゲルを用いた検出対象物質の検出方法も本発明に含まれる。なお、本明細書において、検出対象物質とは、本発明の複数物質応答性ゲルが応答して体積変化を起こす物質をいう。
【０１１８】
本発明に係る検出対象物質の検出方法は、本発明に係る複数物質応答性ゲルと試料とを接触させる工程と、検出対象物質の有無を前記複数物質応答性ゲルの体積変化により検出する工程とを含んでいればよい。
【０１１９】
前記試料に含まれる検出対象物質は、前記複合体を形成している特異的結合物質または結合パートナーとより安定な複合体を形成する化学物質、または競争的に複合体を形成する化学物質であり、特異的結合物質が除去された実施形態では除去された特異的結合物質である。より具体的には、前記検出対象物質としては、特異的結合物質、結合パートナーと同じ化学物質または、核酸の場合は完全相補に限らずハイブリダイズ可能な核酸であり、抗原の場合にはそれと結合する抗体である。好ましい実施形態においては、前記検出対象物質は、例えば、上述した生体分子である。
【０１２０】
前記試料としては、例えば、尿、血液、血清、血漿、唾液、関節液、腹水、胸水、髄液、痰、涙液等を挙げることができる。
【０１２１】
また、検出対象物質の有無を複数物質応答性ゲルの体積変化により検出する方法としては、従来公知の刺激応答性ゲルの体積変化を検出する方法を用いればよく、特に限定されるものではない。かかる方法としては、例えば、体積変化を顕微鏡で観察する方法、天秤でゲルの重量変化を測定する方法、複数物質応答性ゲル内にシリカ粒子等の微粒子を配列しこれによって生じた構造色の波長や強度の変化を測定する方法、複数物質応答性ゲル内に色材を分散し光の透過率を測定する方法、複数物質応答性ゲル内に蛍光発色団を有する分子等を導入し蛍光強度を測定する方法等を挙げることができる。
【０１２２】
また、検出対象物質の有無は、体積変化を検出する前記方法の他、複数物質応答性ゲルの重量変化を検知する方法によっても検出することができる。さらに、網目構造内に固定する複合体を形成する特異的結合物質および結合パートナーの少なくともいずれかをあらかじめ蛍光物質等で標識化し分光器等で検知する方法によっても検出することができる。かかる方法としては、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用する方法を挙げることができる。
【０１２３】
（ＩＩＩ−２）検出キット
複数物質応答性ゲルの利用に関する本発明には、上述した検出対象物質の検出方法だけでなく、該検出方法を実施するための検出キットが含まれる。本発明の検出キットは、具体的には、少なくとも本発明の複数物質応答性ゲルを含む構成であればよい。
【０１２４】
また、前記検出キットには、さらに、コントロールとなる比較用の標本（検出対象物質等）類や、各種バッファー等が含まれていてもよい。
【０１２５】
前記検出キットを用いることで、本発明に係る検出対象物質の検出方法を容易かつ簡素に実施することができ、本発明を臨床検査産業や医薬品産業等の産業レベルで利用することが可能となる。
【０１２６】
また、本発明を用いれば、検出対象物質を高感度でかつ簡便に検出または同定することができる。そのため、本発明は、各種疾患の治療、予防又は診断、あるいは科学技術研究における分析等に応用することも可能である。
【０１２７】
（ＩＩＩ−３）検出装置
本発明に係る複数物質応答性ゲルを、高分子ゲルの膨潤に伴う体積変化を検知可能なセンサーに固定化した場合、このセンサーを利用して、簡便かつ確実に検出対象物質を検出することができる検出装置を製造することができる。
【０１２８】
前記検出装置としては、より具体的には、例えば、本発明に係る複数物質応答性ゲルを、微細なセンサーチップ表面に固定化した検出装置であって、前記センサーチップが複数物質応答性ゲルの膨潤率増加による体積の増加を測定して表示する測定装置と連結されているものを挙げることができる。かかる検出装置を用いることにより、試料を検出用チップの表面に接触させるだけで、検出対象物質の有無を特異的に検出することが可能となる。
【０１２９】
前記センサーチップが連結されている測定装置としては特に限定されるものではなく、従来公知の装置を好適に用いることができる。かかる装置としては、例えば、膜厚測定装置を挙げることができる。この場合には、試料中の検出対象物質に応答した複数物質応答性ゲルの体積変化を膜厚変化として検知することにより、検出対象物質を検出することができる。
【０１３０】
また、前記測定装置は重量計であってもよい。この場合、検出対象物質を含有する試料を検出用チップの表面に接触させると、複数物質応答性ゲル内に検出対象物質が取り込まれるために複数物質応答性ゲルの重量が増加する一方で複数物質応答性ゲルは膨潤率が変化する。そして複数物質応答性ゲルの膨潤率の変化による体積変化は、取り込んだ検出対象物質の量および検出対象物質の取り込みに伴う複数物質応答性ゲルの重量に依存する。したがって、検出対象物質の取り込みによる複数物質応答性ゲルの重量変化を測定することにより、検出対象物質を検出することができる。
【０１３１】
また、上述したシリカ粒子等の微粒子、色材、蛍光発色団を有する分子等で標識化した複数物質応答性ゲルを用いる場合は、前記測定装置としては、分光器等を挙げることができる。
【０１３２】
なお、前記センサーチップは、上述した体積変化を測定して表示する測定装置に限定されるものではなく、検出対象物質による交換または検出対象物質の結合を検知できるものであれば、体積変化以外の他の量を測定する装置と連結されていてもよい。かかる装置としては、蛍光共鳴エネルギー移動を測定するための分光器等であってもよい。かかる場合、複数物質応答性ゲルとしては、蛍光共鳴エネルギー移動を利用するためのドナーやアクセプター等で標識化した複数物質応答性ゲルを用いればよい。
【０１３３】
すなわち、本願には以下の発明が含まれる。
【０１３４】
本発明に係る複数物質応答性ゲルは、複数種類の特異的結合物質と、当該複数種類の特異的結合物質と特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーとが結合してなる複数種類の複合体が、高分子ゲルに固定されているとともに、当該複数種類の複合体は、架橋を形成するように、高分子ゲルに固定されていることを特徴としている。
【０１３５】
前記の構成によれば、複数の検出対象物質を同時に同一の測定により検出することができるという効果を奏する。
【０１３６】
本発明に係る複数物質応答性ゲルでは、前記複合体は、特異的結合物質と、結合パートナーとが、それぞれ、高分子ゲルに結合することによって、架橋を形成するように、高分子ゲルに固定されていてもよい。
【０１３７】
前記の構成によれば、複数の検出対象物質を同時に、体積の増加を検出することにより検出することができるという効果を奏する。
【０１３８】
本発明に係る複数物質応答性ゲルでは、前記複合体は、特異的結合物質と結合する複数の結合パートナーが高分子ゲルに結合することによって、架橋を形成するように、高分子ゲルに固定されており、特異的結合物質は高分子ゲルに結合していないものであってもよい。かかる複数物質応答性ゲルでは、前記特異的結合物質が除去されていてもよい。
【０１３９】
前記の構成によれば、複数の検出対象物質を同時に、体積の減少を検出することにより検出することができるという効果を奏する。
【０１４０】
本発明に係る複数物質応答性ゲルでは、前記高分子ゲルは、相互に架橋しない複数の架橋ポリマーからなる相互侵入網目ポリマーであり、前記複数の架橋ポリマーのそれぞれに、異なる種類の前記複合体が固定されていてもよい。
【０１４１】
本発明に係る複数物質応答性ゲルでは、前記高分子ゲルは、単一の架橋ポリマーであって、当該単一の架橋ポリマーに、複数種類の前記複合体が固定されていてもよい。
【０１４２】
本発明に係る複数物質応答性ゲルでは、前記特異的結合物質および結合パートナーの少なくともいずれかは、生体分子であることがより好ましい。
【０１４３】
本発明に係る複数物質応答性ゲルでは、前記特異的結合物質および結合パートナーの少なくともいずれかは、タンパク質、核酸、糖質、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、オリゴペプチド、ポリペプチド、ホルモンまたは金属イオンであることがより好ましい。
【０１４４】
本発明に係る複数物質応答性ゲルでは、前記複数の結合パートナーは、包接化合物を形成する複数のホスト分子であってもよい。
【０１４５】
本発明に係る複数物質応答性ゲルでは、上記ホスト分子は、シクロデキストリン、クラウン化合物、シクロファン、アザシクロファン、カリックスアレーンおよびそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種類以上の分子であってもよい。
【０１４６】
本発明に係る複数物質応答性ゲルは、複数の検出対象物質と接触させたときに、体積が変化する。
【０１４７】
本発明に係る検出方法は、前記複数物質応答性ゲルと試料とを接触させる工程と、検出対象物質の有無を前記複数物質応答性ゲルの体積変化により検出する工程とを含むことを特徴としている。
【０１４８】
本発明に係る検出キットは、前記複数物質応答性ゲルを含有するものである。
【０１４９】
本発明に係る検出装置は、前記複数物質応答性ゲルを含有するものである。
【０１５０】
本発明に係る複数物質応答性ゲルの製造方法は、複数種類の特異的結合物質と、当該複数種類の特異的結合物質と特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーとが結合してなる複数種類の複合体が、高分子ゲルに固定されている複数物質応答性ゲルの製造方法であって、第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーを製造する第１工程と、第１工程で得られた、第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーと、第２の複合体が固定された第２の架橋ポリマーとからなる相互侵入網目ポリマーを製造する第２工程とを含み、前記第１工程は、下記（ａ）または（ｂ）：（ａ）第１の特異的結合物質と、当該第１の特異的結合物質と特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーとが結合してなる第１の複合体を、第１の架橋ポリマーを形成するモノマーと共重合させて、第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーを製造する１次重合工程、（ｂ）第１の特異的結合物質と、当該第１の特異的結合物質と特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーとが結合してなる第１の複合体を、ポリマーと結合させる複合体結合工程と、複合体結合工程で得られた、第１の複合体が結合されたポリマーを、架橋剤と反応させて、第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーを製造する１次架橋工程であり、前記第２工程は、下記（ｃ）または（ｄ）：（ｃ）第２の特異的結合物質と、当該第２の特異的結合物質と特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーとが結合してなる第２の複合体を、前記第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーの存在下で、第２の架橋ポリマーを形成するモノマーと共重合させて、第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーと、第２の複合体が固定された第２の架橋ポリマーとからなる相互侵入網目ポリマーを製造する工程、（ｄ）第２の特異的結合物質と、当該第２の特異的結合物質と特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーとが結合してなる第２の複合体を、ポリマーと結合させる複合体結合工程と、複合体結合工程で得られた、第２の複合体が結合されたポリマーを、前記第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーの存在下で、架橋剤と反応させて、第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーと、第２の複合体が固定された第２の架橋ポリマーとからなる相互侵入網目ポリマーを製造する工程であり、前記第１の特異的結合物質と第２の特異的結合物質とは異なる物質であることを特徴としている。
【０１５１】
前記の構成によれば、複数の検出対象物質を同時に同一の測定により検出することが可能な複数物質応答性ゲルを製造することができる。
【０１５２】
本発明に係る複数物質応答性ゲルの製造方法は、さらに、反応性官能基が導入された前記第１の特異的結合物質と、反応性官能基が導入されたその結合パートナーとを結合させて第１の複合体を作製する複合体形成工程と、反応性官能基が導入された前記第２の特異的結合物質と、反応性官能基が導入されたその結合パートナーとを結合させて第２の複合体を作製する複合体形成工程とを含んでいてもよい。
【０１５３】
本発明に係る複数物質応答性ゲルの製造方法は、前記第１の特異的結合物質と、反応性官能基が導入されたその結合パートナーとを結合させて第１の複合体を作製する複合体形成工程と、前記第２の特異的結合物質と、反応性官能基が導入されたその結合パートナーとを結合させて第２の複合体を作製する複合体形成工程とを含んでいてもよい。かかる複数物質応答性ゲルの製造方法は、さらに、第１の特異的結合物質および第２の特異的結合物質を除去する工程を含んでいてもよい。
【実施例】
【０１５４】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。【０１５５】
〔実施例１：複数物質応答性ゲルの製造〕
２種類の特異的結合物質として、抗原タンパク質である腫瘍マーカーのα‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）および免疫グロブリン（ＩｇＧ）を用い、複数物質応答性ゲルを合成した。【０１５６】
＜１−１：ビニル基導入ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧおよびビニル基導入ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧの合成＞
図１に示すように、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中で、ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧおよびその抗体であるａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧを、それぞれ、Ｎ−アクリロキシスクシンイミド（N-succinimidyl acrylate（ＮＳＡ））と反応させることにより、ビニル基導入ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧおよびビニル基導入ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧを合成した。【０１５７】
具体的には、５ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ：７．４）に１２５ｍｇ（０．５μｍｏｌ）のＲａｂｂｉｔ ＩｇＧを溶かし、Ｎ−アクリロキシスクシンイミド５ｍｇ（２ｍｇ ＮＳＡ／ｍｌ ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド））（３０μｍｏｌ）を加えて、３６℃で１時間穏やかに反応させた。【０１５８】
その後、ゲルろ過により生成物であるビニル基導入抗原を単離した。カラムはセファデックスをガラス管に充填して作製し、ゲルろ過により得られる溶液の吸光度を紫外・可視吸光光度計（ＵＶ−２５００ＰＣ、（株）島津製作所社製）で経時的に測定することにより、高分子物質であるビニル基導入抗原と低分子物質である未反応のＮＳＡの分離を行った。ゲルろ過の条件は、抗原とＮＳＡの特性吸収波長がそれぞれ２８０ｎｍと２６０ｎｍであることから、波長２７０ｎｍで測定を行った。【０１５９】
次に、ビニル基導入抗原がネイティブな抗原と同じ２８０ｎｍに特性吸収波長を持つことから、ネイティブな抗原を用いて作成した検量線によって求めた下記式からビニル基導入抗原の濃度を求めた。
C (mg/L) = 974.89×Abs
同様の方法により、ビニル基導入ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧを合成した。２ｍｌのＰＢＳに３０ｍｇのａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧを溶かし、ＮＳＡ０．１９ｍｇ（１ｍｇ ＮＳＡ／ｍｌ ＤＭＳＯ）を加えて、３６℃で１時間穏やかに反応させた。【０１６０】
その後、ゲルろ過により生成物であるビニル基導入抗体を単離した。作成した検量線によって求めた下記式からビニル基導入抗体の濃度を求めた。
C (mg/L) = 626.3×Abs
＜１−２：ビニル基導入ＡＦＰおよびビニル基導入ａｎｔｉ−ＡＦＰの合成＞
図２に示すように、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中でＡＦＰおよびその抗体であるａｎｔｉ−ＡＦＰを、それぞれ、Ｎ−アクリロキシスクシンイミド（N-succinimidyl acrylate（ＮＳＡ））と反応させることにより、ビニル基導入ＡＦＰおよびビニル基導入ａｎｔｉ−ＡＦＰを合成した。【０１６１】
具体的には、前記１−１と同様にして、１ｍｌのＰＢＳに２ｍｇのＡＦＰを溶かし、ＮＳＡ１９．８９μｇ（１ｍｇ ＮＳＡ／ｍｌ ＤＭＳＯ；２０μｌ）を加えて３６℃で１時間穏やかに反応させた。ＡＦＰ：ＮＳＡはモル比で１：４であった。【０１６２】
その後、ゲルろ過により生成物であるビニル基導入抗体を単離した。作成した検量線によって下記式からビニル基導入ＡＦＰの濃度を求めた。
C (mg/L) =111.83×Abs
また、同様に、１．５ｍｌのａｎｔｉ−ＡＦＰ（フナコシ(株)）にＮＳＡ７．４６μｇ（１ｍｇ ＮＳＡ／ｍｌ ＤＭＳＯ）を加えて３６℃で１時間穏やかに反応させた。ＡＦＰ：ＮＳＡはモル比で１：２であった。なお、ａｎｔｉ−ＡＦＰの初期濃度が不明なため、紫外・可視吸光光度計（ＵＶ−２５５０  （株）島津製作所社製）を用いて吸光度を測定し、ａｎｔｉ−ＡＦＰの分量を求めてから使用した。【０１６３】
その後、ゲルろ過により生成物であるビニル基導入抗体を単離し、以下に示した式からビニル基導入anti-AFPの濃度を求めた。
C (mg/L) =626.6×Abs
ビニル基を導入した抗原および抗体は、ゲル合成に用いるとき、濃度が薄い場合のみ凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡＦＤＵ−１２０東京理科器機（株））により濃縮(溶液状態は維持)して用いた。【０１６４】
＜１−３：ＡＦＰ抗原抗体架橋ＰＡＡｍゲル（第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマー）の調製＞
図３に示すように、前記１−２で合成したビニル基導入ＡＦＰとビニル基導入ａｎｔｉ−ＡＦＰを用いて、第１の複合体であるＡＦＰ抗原抗体複合体を形成させた後、主鎖を形成するモノマー、架橋剤、およびレドックス開始剤を加えて共重合させることによって第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマーとなるＡＦＰ抗原抗体架橋ゲルを合成した。【０１６５】
具体的には、前記１−２で調製したビニル基導入ＡＦＰ０．０１５ｍｇを含むビニル基導入ＡＦＰのＰＢＳ溶液０．２ｍｌとビニル基導入ａｎｔｉ−ＡＦＰ０．００７５ｍｇを含むビニル基導入ａｎｔｉ−ＡＦＰのＰＢＳ溶液０．２ｍｌを混合し、あらかじめＡＦＰ抗原抗体複合体を形成させた。この溶液に、アクリルアミド（ＡＡｍ）９０ｍｇ（１８ｗｔ％対（ＡＡｍ＋ビニル基導入抗原溶液＋ビニル基導入抗体溶液；計５００ｍｇ））、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡＡ）の５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ溶液０．０１８ｍｌ（０．１ｗｔ％対ＡＡｍ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレジアミン（ＴＥＭＥＤ）の０．８ＭＰＢＳ溶液（０．８モルＰＢＳ溶液）０．０１ｍｌ、および過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）の０．１ＭＰＢＳ溶液０．０１ｍｌを加え、内径１．５ｍｍのガラス管内に重合溶液を注入し、５℃で６時間共重合させた。その後、ガラス管から得られたゲルを取り出し、ＰＢＳ中で十分に洗浄して未反応物を取り除き平衡膨潤に達するまで浸漬させた。また、同様にして抗原抗体複合体を用いずに、ポリアクリルアミドゲルも合成した。ゲルの洗浄確認は、顕微鏡を用いて円柱形であるゲルの直径を測定し、２４時間後再度ゲルの直径を測定したときに変化がない場合を洗浄終了時とした。さらに、紫外・可視吸光光度計（ＵＶ−２５５０（株）島津製作所社製）によって洗浄液を測定することにより確認した。【０１６６】
＜１−４：ＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルの調製＞
さらに、得られたＡＦＰ抗原抗体架橋ＰＡＡｍゲルを、図４に示すように、ビニル基を導入したＩｇＧ抗原抗体複合体、ＡＡｍ、ＭＢＡＡおよび光重合開始剤Ｖ−５０（和光純薬製）の混合溶液に浸漬させた後、ＵＶ光を照射することによって、第２の複合体であるＩｇＧ抗原抗体複合体が固定された第２の架橋ポリマーを形成させ、ＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルを製造した。【０１６７】
具体的には、前記１−１で調製したビニル基導入ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ４ｍｇを含むビニル基導入ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧのＰＢＳ溶液０．２ｍｌと、ビニル基導入ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ２ｍｇを含むビニル基導入ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧのＰＢＳ溶液０．２ｍｌを混合し、あらかじめ抗原抗体結合を形成させた。この溶液に、さらに、ＡＡｍ９０ｍｇ（最終的な濃度：１８ｗｔ％対（ＡＡｍ＋ビニル基導入抗原溶液＋ビニル基導入抗体溶液＋ＰＢＳ水溶液）を加え、ＰＢＳ水溶液で全量が５００ｍｇとなるように調整した後、ＭＢＡＡの５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ溶液０．０１８ｍｌ（０．１ｗｔ％対ＡＡｍ）、および図４に示す構造を有する光重合開始剤Ｖ−５０の１５０ｍｇ／ｍｌＰＢＳ溶液を３０μｌ（Ｖ−５０：４．５ｍｇ （５ｗｔ％対ＡＡｍ））を溶解した溶液に、前記１−３で調製したＡＦＰ抗原抗体架橋ＰＡＡｍゲルを２４時間浸漬した。このようにして、ＡＦＰ抗原抗体架橋ＰＡＡｍゲルに十分にモノマーなどを取り込ませた後、このゲルに、ＵＶ光（３６５ｎｍ）を、ハンディーＵＶランプＳＬＵＶ−６（ＡＳ ＯＮＥ（株）製））を用いて１０分間照射することによって、第２の複合体を固定した第２の架橋ポリマーを形成させ、ＩＰＮ構造を有する複数物質応答性ゲルであるＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルを合成した。【０１６８】
〔比較例１：ＰＡＡｍ  ＩＰＮゲルの製造〕
ビニル基導入抗原およびビニル基導入抗体を用いない以外は、前記実施例１の１−３、１−４と同様の条件で、ＰＡＡｍ  ＩＰＮゲルを調製した。【０１６９】
すなわち、ＰＢＳ１ｍｌに、アクリルアミド（ＡＡｍ）９０ｍｇ（１８ｗｔ％対（ＡＡｍ＋ＰＢＳ））、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡＡ）の５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ溶液０．０１８ｍｌ（０．１ｗｔ％対ＡＡｍ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレジアミン（ＴＥＭＥＤ）の０．８ＭＰＢＳ溶液０．０１ｍｌ、および過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）の０．１ＭＰＢＳ溶液０．０１ｍｌを加え、ガラス管内に重合溶液を注入し、共重合させて第１の架橋ポリマーのゲルを合成した。【０１７０】
さらに、ＡＡｍ９０ｍｇ（１８ｗｔ％対（ＡＡｍ＋ビニル基導入抗原溶液＋ビニル基導入抗体溶液）、ＭＢＡＡの５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ溶液０．０１８ｍｌ（０．１ｗｔ％対ＡＡｍ）、およびＶ−５０の１５０ｍｇ／ｍｌＰＢＳ溶液を３０μｌ（Ｖ−５０：４．５ｍｇ （５ｗｔ％対ＡＡｍ））を溶解した溶液に、前記第１の架橋ポリマーのゲルを浸漬させた後、ＵＶ光を照射することによって２次ネットワークを形成させ、ＩＰＮゲルを製造した。【０１７１】
〔参考例１：ＡＦＰ抗原抗体架橋ゲルの製造〕
ＡＦＰとその抗体との複合体が固定されたＡＦＰ抗原抗体架橋ゲルを合成した。実施例１の１−３により得られたＡＦＰ抗原抗体架橋ＰＡＡｍゲル（第１の複合体が固定された第１の架橋ポリマー）を、そのままＡＦＰ抗原抗体架橋ゲルとして用いた。【０１７２】
〔参考例２：ＩｇＧ抗原抗体架橋ゲルの製造〕
ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧとその抗体との複合体が固定されたｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ抗原抗体架橋ゲルを合成した。ビニル基導入ＡＦＰ０．０１５ｍｇを含むビニル基導入ＡＦＰのＰＢＳ溶液０．２ｍｌとビニル基導入ａｎｔｉ−ＡＦＰ０．００７５ｍｇを含むビニル基導入ａｎｔｉ−ＡＦＰのＰＢＳ溶液０．２ｍｌのかわりに、前記１−１で調製したビニル基導入ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ４ｍｇを含むビニル基導入ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧのＰＢＳ溶液０．５ｍｌと、ビニル基導入ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ２ｍｇを含むビニル基導入ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧのＰＢＳ溶液０．５ｍｌを用いた以外は、実施例１の１−３と同様にして、ＩｇＧ抗原抗体架橋ゲルを製造した。【０１７３】
〔実施例２：複数物質応答性ゲルの膨潤率測定〕
実施例１で製造したＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルをＰＢＳ中で平衡膨潤させた後、標的抗原水溶液に浸漬させた際の膨潤率測定を行い、ゲルの応答挙動について検討した。【０１７４】
実施例１で製造した洗浄後のＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルを、ＰＢＳ中で平衡膨潤させた。平衡膨潤させた後のＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルを３〜４ｍｍ程度の長さに切断し、２５℃で、ＡＦＰをＰＢＳに溶解させたＡＦＰ水溶液（２００μｇ／ｍｌ）、ＩｇＧをＰＢＳに溶解させたＩｇＧ溶液（２ｍｇ／ｍｌ）、ＡＦＰとＩｇＧとをＰＢＳに溶解させたＡＦＰ／ＩｇＧ混合溶液（ＡＦＰ：２００μｇ／ｍｌ、ＩｇＧ：２ｍｇ／ｍｌ）に、それぞれ浸漬した。円柱状であるＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルの直径変化を、光学顕微鏡を用いて測定し、下記式から膨潤率を求めた。測定は倒立型研究用顕微鏡ＩＸ７０（OLYMPUS(株)社製）を用い、付属のデジタルカメラ（ＤＰ７０、OLYMPUS(株)社製）で撮影し、パソコン上でゲルの直径を測定して平均値をとった。
膨潤率（Swelling ratio）＝（ｄ／ｄ０）３    …      （１）
ここで、ｄは、標的抗原溶液中に浸漬後の任意の時間におけるＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルの円柱の直径であり、ｄ０はＰＢＳ中での平衡膨潤時（ｔ＝０）におけるＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルの円柱の直径を表している。【０１７５】
また、対照として、比較例１で製造したポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）ゲルを用いて同様の測定を行った。【０１７６】
図６に結果を示す。図６において、縦軸は膨潤率（単位：ｍ３／ｍ３）、横軸は、時間（単位：時間）を示す。図６中、○はＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルをＡＦＰ／ＩｇＧ混合溶液に浸漬したときの膨潤率変化を、●はＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルをＩｇＧ溶液に浸漬したときの膨潤率変化を、△はＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルをＡＦＰ溶液に浸漬したときの膨潤率変化を、黒の三角は対照であるポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）ゲルをＡＦＰ／ＩｇＧ混合溶液に浸漬したときの膨潤率変化を示す。【０１７７】
図６に示すように、ＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルは、標的抗原が１種類しか存在しないＡＦＰ溶液やＩｇＧ溶液中ではごく僅かしか膨潤率が増加しなかった。しかし、２種類の標的抗原が同時に存在するＡＦＰ／ＩｇＧ混合溶液中ではＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルの膨潤率は大きく増加した。かかる結果より、ＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルは２種類の標的抗原を同時検出した場合にのみ大きく膨潤率が増加する複数生体複数物質応答性ゲルであることが判る。【０１７８】
〔参考例３〕
比較例２、３で製造した、ＡＦＰ抗原抗体架橋ゲルおよびＩｇＧ抗原抗体架橋ゲルを、それぞれの標的抗原であるＡＦＰおよびＩｇＧが溶解したＰＢＳ中に浸漬させた際の膨潤率測定を行った。【０１７９】
また、対照として、比較例１で製造したポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）ゲルを用いて同様の測定を行った。【０１８０】
図５に結果を示す。図５（ａ）、（ｂ）において、縦軸は膨潤率（単位：ｍ３／ｍ３）、横軸は、時間（単位：時間）を示す。図５中（ａ）は、ＡＦＰ抗原抗体架橋ゲルを、その標的抗原であるＡＦＰが溶解したＰＢＳ中に浸漬させた際の膨潤率変化を示す。○はＡＦＰ抗原抗体架橋ゲルを、●は対照であるポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）ゲルの膨潤率を示す。また、図５中（ｂ）は、ＩｇＧ抗原抗体架橋ゲルを、その標的抗原であるＩｇＧが溶解したＰＢＳ中に浸漬させた際の膨潤率変化を示す。○はＩｇＧ抗原抗体架橋ゲルを、●は対照であるポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）ゲルの膨潤率を示す。【０１８１】
図５に示すように、いずれのゲルも、それぞれ、標的抗原であるＡＦＰおよびＩｇＧ存在下で次第に膨潤率が増加し、明確な抗原応答性を示すことがわかった。このような抗原応答性膨潤挙動は、標的生体分子の存在によって架橋点として作用していた抗原抗体複合体が解離し、架橋密度が減少するためと考えられる。【０１８２】
〔実施例３：複数物質応答性ゲルの架橋密度測定〕
次に、ＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルの２種類抗原応答挙動を検討するため、当該ゲルのＰＢＳ中およびＡＦＰ／ＩｇＧ溶液中での圧縮弾性率を測定し、有効架橋密度を算出した。【０１８３】
具体的には、洗浄後、ＰＢＳ中で平衡膨潤させたＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルの直径および高さを、光学顕微鏡（ＮＲＭ−２ＸＺ型、カートン（株）社製）を用いて測定した。また、圧縮弾性率装置（ＳＭＴ１−１０Ｎ、(株)島津製作所社製）を用いてＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルのＰＢＳ中およびＡＦＰ／ＩｇＧ溶液中での圧縮弾性率を測定し、次式によって有効架橋密度νｅを算出した。
Ｇ＝Ｒ・Ｔ・νｅ・ｖ２１／３
ここでＧは圧縮弾性率（単位：Ｐａ）、Ｒは気体定数、Ｔは絶対温度（単位：Ｋ）、νｅは有効架橋密度（ｍｏｌ／ｍ３）、ｖ２は膨潤ゲル全体（高分子化合物＋溶媒）に対する高分子化合物の体積分率である。なお、高分子化合物の体積分率は、膨潤ゲルを５０℃の乾燥機内で十分に乾燥させ、その乾燥前の重量（Ｗ）と乾燥後の重量（Ｗ０）を求め、Ｗ０／Ｗ＝Ｖ０／Ｖと近似した。【０１８４】
なお、圧縮弾性率の測定条件を以下に示す。
モード：荷重速度 １０ｍｍ／ｍｉｎ
治具：圧縮
波形：正弦波
リミット：荷重/応力  下限０．０００  上限０．０２０Ｎ、変位  下限０．００１  上限５０．０００ｍｍ
また、対照として、参考例１で製造したＡＦＰ抗原抗体架橋ゲルのＰＢＳ中での圧縮弾性率を測定し、有効架橋密度を算出した。【０１８５】
表１に結果を示す。標的抗原が存在しないＰＢＳ中では、１次ネットワークのＡＦＰ抗原抗体架橋ゲルに比較してＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルの有効架橋密度の方が大きな値を示した。この結果は、１次ネットワークのＡＦＰ抗原抗体架橋ネットワークに２次ネットワークのＩｇＧ抗原抗体架橋ネットワークを相互侵入させることによって有効架橋密度が増加したことを示している。さらに、ＡＦＰ−ＩｇＧ抗原抗体架橋ＩＰＮゲルをＡＦＰ／ＩｇＧ混合水溶液に浸漬すると、その架橋密度が大きく減少することが明らかとなった。【０１８６】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【０１８７】
本発明に係る複数物質応答性ゲルは、例えば、複数の疾病マーカーを同時に検出でき、より精度よく診断できるだけでなく、複合的な要因によって引き起こされる疾病の発見を可能にする新材料としての応用が期待できる。【０１８８】
それゆえ、本発明は、医薬品製造業、工業薬品製造業等の各種化学工業、さらには医療産業等に利用可能であり、しかも非常に有用であると考えられる。
【図１】
2012117588.tif 000004
【図２】
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【図３】
2012117588.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年7月23日(2012.7.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種類の特異的結合物質と、当該複数種類の特異的結合物質と特異的かつ可逆的に結合する結合パートナーとが結合してなる複数種類の複合体が、高分子ゲルに固定されているとともに、
当該複数種類の複合体は、架橋を形成するように、高分子ゲルに固定されていることを特徴とする複数物質応答性ゲル。
【請求項２】
前記複合体は、特異的結合物質と、結合パートナーとが、それぞれ、高分子ゲルに結合することによって、架橋を形成するように、高分子ゲルに固定されていることを特徴とする請求項１に記載の複数物質応答性ゲル。
【請求項３】
前記複合体は、特異的結合物質と結合する複数の結合パートナーが、高分子ゲルに結合することによって、架橋を形成するように、高分子ゲルに固定されており、特異的結合物質は高分子ゲルに結合していないことを特徴とする請求項１に記載の複数物質応答性ゲル。
【請求項４】
前記特異的結合物質が除去されていることを特徴とする請求項３に記載の複数物質応答性ゲル。
【請求項５】
前記高分子ゲルは、相互に架橋しない複数の架橋ポリマーからなる相互侵入網目ポリマーであり、
前記複数の架橋ポリマーのそれぞれに、異なる種類の前記複合体が固定されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の複数物質応答性ゲル。
【請求項６】
前記高分子ゲルは、単一の架橋ポリマーであって、
当該単一の架橋ポリマーに、複数種類の前記複合体が固定されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の複数物質応答性ゲル。
【請求項７】
前記特異的結合物質および結合パートナーの少なくともいずれかは、生体分子であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の複数物質応答性ゲル。
【請求項８】
前記特異的結合物質および結合パートナーの少なくともいずれかは、タンパク質、核酸、糖質、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、オリゴペプチド、ポリペプチド、ホルモンまたは金属イオンであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の複数物質応答性ゲル。
【請求項９】
前記複数の結合パートナーは、包接化合物を形成する複数のホスト分子であることを特徴とする請求項３〜６のいずれか１項に記載の複数物質応答性ゲル。
【請求項１０】
上記ホスト分子は、シクロデキストリン、クラウン化合物、シクロファン、アザシクロファン、カリックスアレーンおよびそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１種類以上の分子であることを特徴とする請求項９に記載の複数物質応答性ゲル。
【請求項１１】
複数の検出対象物質と接触させたときに、体積が変化することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の複数物質応答性ゲル。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の複数物質応答性ゲルと試料とを接触させる工程と、検出対象物質の有無を前記複数物質応答性ゲルの体積変化により検出する工程とを含むことを特徴とする検出方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の複数物質応答性ゲルを含有する検出キット。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の複数物質応答性ゲルを、センサーチップ表面に固定化した検出装置であって、前記センサーチップが複数物質応答性ゲルの膨潤率増加による体積の増加を測定して表示する測定装置と連結されていることを特徴とする検出装置。
【国際調査報告】
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