(57)【要約】  Ｄ−グルコースに対する基質特異性が高く、耐熱性に優れたフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼおよび、その効率的な製造方法およびそれに用いる酵母形質転換体を提供する。  ケカビ由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子をコードするフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子をチゴサッカロマイセス属の酵母に導入して形質転換体を得る。次いで、この酵母形質転換体を培養し、この培養物よりフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを取得する。  溶存酸素の影響を受けにくく、試料中にグルコース以外の糖化合物が存在する場合でも、グルコース量を正確に測定できるともに耐熱性に優れたフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを効率的に製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｉ）から（ｉｖ）の性質：
（ｉ）作用：電子受容体存在下でグルコース脱水素酵素活性を示す、
（ｉｉ）分子量：タンパク質のポリペプチド鎖部分の分子量が約８０ｋＤａである、
（ｉｉｉ）基質特異性：Ｄ−グルコースに対する反応性に対して、マルトース、及びＤ−ガラクトース、及びＤ−キシロースに対する反応性が低い、
（ｉｖ）５０℃、１５分間の熱処理において５０％以上の残存活性を有する、
を備えるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項２】
配列番号１または配列番号３で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と８５％以上同一なアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる請求項１記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項３】
フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼがケカビ亜門、好ましくは、ケカビ綱、より好ましくは、ケカビ目、さらに好ましくはケカビ科に分類される微生物に由来し、酵母を宿主として発現されることを特徴とする請求項１〜２記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項４】
配列番号１または配列番号３で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と８５％以上同一なアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードするフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を酵母に導入して得られる酵母形質転換体。
【請求項５】
酵母がチゴサッカロマイセス属、サッカロマイセス属、ピキア属、カンジダ属に属する、請求項４記載の酵母形質転換体。
【請求項６】
請求項４〜５記載の酵母形質転換体を培養し、該培養物よりフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
【請求項７】
以下の（Ａ）〜（Ｅ）からなる群より選択されるいずれかのＤＮＡからなるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子：
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号２又は配列番号４で示される塩基配列と８５％以上相同な塩基配列、
を有し、かつフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ酵素活性をもつタンパク質をコードするＤＮＡが導入されている酵母形質転換体を培養し、該培養物よりフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造法およびそれに用いる酵母形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
血中グルコース濃度（血糖値）は、糖尿病の重要なマーカーである。糖尿病患者が自己の血糖値を管理するための装置としては、電気化学的バイオセンサを用いた自己血糖測定（Ｓｅｌｆ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ：ＳＭＢＧ）機器が広く利用されている。ＳＭＢＧ機器に用いられるバイオセンサには、従来、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）等のグルコースを基質とする酵素が利用されている。しかしながら、ＧＯＤは酸素を電子受容体とするという特性を備えているため、ＧＯＤを用いたＳＭＢＧ機器では、測定サンプル中の溶存酸素が測定値に影響を与え、正確な測定値が得られない場合が起こりうる。【０００３】
一方、グルコースを基質とするが、酸素を電子受容体としない別の酵素として、各種のグルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨ）が知られている。具体的には、ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ）やニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素とするタイプのＧＤＨ（ＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨ）や、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするＧＤＨ（ＰＱＱ−ＧＤＨ）が見出されており、ＳＭＢＧ機器のバイオセンサに使用されている。しかしながら、ＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨは、酵素の安定性が乏しく、かつ、補酵素の添加が必要という問題を有し、また、ＰＱＱ−ＧＤＨは基質特異性が低く、測定対象であるグルコース以外にも、マルトース、Ｄ−ガラクトースおよびＤ−キシロースなどの糖化合物に対して作用してしまうため、測定サンプル中のグルコース以外の糖化合物が測定値に影響し、正確な測定値が得られないという問題点が存在する。【０００４】
近年、ＰＱＱ−ＧＤＨをバイオセンサとして用いたＳＭＢＧ機器を用いて、輸液投与を受けていた糖尿病患者の血糖値を測定する際に、ＰＱＱ−ＧＤＨが輸液中に含まれるマルトースにも作用して、実際の血糖値よりも高い測定値が得られ、この値に基づく処置が原因となって患者が低血糖等を発症した例が報告されている。また、同様の事象はガラクトース負荷試験およびキシロース吸収試験を実施中の患者にも起こり得ることも判明している（例えば、非特許文献１参照）。これを受け、厚生労働省医薬食品局は、グルコース溶液に各糖類を添加した場合における血糖測定値への影響を調査する目的で交差反応性試験を行ったところ、６００ｍｇ／ｄＬのマルトース、３００ｍｇ／ｄＬのＤ−ガラクトース、あるいは、２００ｍｇ／ｄＬのＤ−キシロース添加を行った場合には、ＰＱＱ−ＧＤＨ法を用いた血糖測定キットの測定値は、実際のグルコース濃度より２．５〜３倍ほど高い値を示した。すなわち、測定試料中に存在し得るマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースにより測定値が不正確になることが判明し、このような測定誤差の原因となる糖化合物の影響を受けず、グルコースを特異的に測定可能な基質特異性の高いＧＤＨの開発が切に望まれている。【０００５】
上記のような背景の下、上記以外の補酵素を利用するタイプのＧＤＨが着目されるようになってきている。例えば、基質特異性に関する詳細な記載はないが、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来のＧＤＨについての報告（例えば、非特許文献２〜５参照）が知られている。また、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属由来のフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）が開示されており（例えば、特許文献１〜３参照）、Ｄ−キシロースに対する作用性を低減させたアスペルギルス属由来のＦＡＤ−ＧＤＨも開示されている（例えば、特許文献４参照）。【０００６】
上記のとおり、Ｄ−グルコースではない１種または数種の糖化合物に対して反応性が低いＦＡＤ−ＧＤＨがいくつか知られてはいるが、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースのいずれに対しても反応性が十分に低いという特性を有するフラビン結合型ＧＤＨは知られていない。また、Ｄ−グルコース、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースが存在する条件下において、それらの糖化合物による影響を受けることなくグルコース濃度を正確に測定することが可能なフラビン結合型ＧＤＨも知られていない。また、そのような性質を有するとともに耐熱性にも優れたフラビン結合型ＧＤＨも知られていない。さらに、そのような優れた基質特異性を有するフラビン結合型ＧＤＨを効率的に製造する方法および手段については、これまでに全く報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−２８９１４８号公報
【特許文献２】国際公開第０４／０５８９５８号
【特許文献３】国際公開第０７／１３９０１３号
【特許文献４】特開２００８−２３７２１０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】医薬品・医療用具等安全性情報２０６号（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２０６）、２００４年１０月、厚生労働省医薬食品局
【非特許文献２】Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ．  Ｉ．  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ｐ−ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ，  Ｔ．  Ｃ．  Ｂａｋ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｓａｔｏ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １３９，  ２６５−２７６  （１９６７）．
【非特許文献３】Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ.  ＩＩ．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｔ．Ｃ．  Ｂａｋ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １３９，  ２７７−２９３  （１９６７）．
【非特許文献４】Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ.  ＩＩＩ．  Ｇｅｎｅｒａｌ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｔ．Ｃ．  Ｂａｋ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １４６，  ３１７−３２７  （１９６７）．
【非特許文献５】Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ.  ＩＶ．  Ｈｉｓｔｉｄｙｌ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ａｓ  ａｎ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ，  Ｔ．Ｃ．  Ｂａｋ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｓａｔｏ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １４６，  ３２８−３３５  （１９６７）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、Ｄ−グルコースに対する基質特異性が高く、耐熱性に優れたフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼおよび、その効率的な製造方法およびそれに用いる形質転換体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の課題を解決するために、本発明者等は鋭意検討を重ね、グルコース量の正確な測定を可能とする新規なＧＤＨを生産する微生物のスクリーニングを実施した結果、ケカビ亜門に属する菌株から、グルコースに特異性が高く、グルコース以外の糖化合物の共存条件下で測定を行った場合でもグルコースを正確に測定できるＧＤＨ活性を有する新規なＧＤＨを見出した。
本発明者等は、このＧＤＨを精製し諸性質を決定した結果、この酵素が新規なフラビン結合型ＧＤＨであることを確認し、実際にマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース存在下でのＤ−グルコース測定を実施するとともに、その新規なＧＤＨのアミノ酸配列とそれをコードする遺伝子配列情報を取得した。さらに、本来の由来微生物の培養物からでは十分な量の酵素を取得することが困難であるという課題を解決するために、検討を重ねた。
その結果、このフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子を酵母へと導入して形質転換体を得、この酵母形質転換体を培養した場合に、その培養物からより多くのフラビン結合型ＧＤＨを効率的に取得できることを見出した。さらに、驚くべきことに、この酵母形質転換体から得られるフラビン結合型ＧＤＨは、本来の由来微生物中で製造されるものと比較して、その耐熱性が顕著に向上していることを見出し、本発明を完成した。【００１１】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）以下の（ｉ）から（ｉｖ）の性質：
（ｉ）作用：電子受容体存在下でグルコース脱水素酵素活性を示す、
（ｉｉ）分子量：タンパク質のポリペプチド鎖部分の分子量が約８０ｋＤａである、
（ｉｉｉ）基質特異性：Ｄ−グルコースに対する反応性に対して、マルトース、及びＤ−ガラクトース、及びＤ−キシロースに対する反応性が低い、
（ｉｖ）５０℃、１５分間の熱処理において５０％以上の残存活性を有する、
を備えるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
（２）配列番号１または配列番号３で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と８５％以上同一なアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる上記（１）記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
（３）フラビン結合型ＧＤＨがケカビ亜門、好ましくは、ケカビ綱、より好ましくは、ケカビ目、さらに好ましくはケカビ科に分類される微生物に由来し、酵母を宿主として発現されることを特徴とする上記（１）〜（２）記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
（４）配列番号１または配列番号３で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と８５％以上同一なアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードするフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を酵母に導入して得られる酵母形質転換体。
（５）酵母がチゴサッカロマイセス属、サッカロマイセス属、ピキア属、カンジダ属に属する、上記（４）記載の酵母形質転換体。
（６）上記（４）〜（５）記載の酵母形質転換体を培養し、該培養物よりフラビン結合型ＧＤＨを採取することを特徴とする、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
（７）以下の（Ａ）〜（Ｅ）からなる群より選択されるいずれかのＤＮＡからなるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子：
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号２又は配列番号４で示される塩基配列と８５％以上相同な塩基配列、
を有し、かつフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ酵素活性をもつタンパク質をコードするＤＮＡが導入されている酵母形質転換体を培養し、該培養物よりフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の酵母形質転換体および、それを用いたフラビン結合型ＧＤＨの製造法によれば、測定試料に含まれるマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース等の糖化合物の影響を受けることなく、正確にＤ−グルコース量を測定することが可能であり、かつ、優れた耐熱性を有する新規なフラビン結合型ＧＤＨを効率的に取得できる。これにより、マルトースを含む輸液の投与を受けている患者や、ガラクトース負荷試験およびキシロース吸収試験を実施中の患者の試料についても、正確に血糖値を測定することが可能な実用性に優れたＧＤＨを効率的に提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明に使用するフラビン結合型ＧＤＨの一例の吸収スペクトルを示す図である。
【図２】本発明に使用するフラビン結合型ＧＤＨの一例の至適ｐＨを示す図である。
【図３】本発明に使用するフラビン結合型ＧＤＨの一例の至適温度を示す図である。
【図４】本発明に使用するフラビン結合型ＧＤＨの一例の熱安定性を示す図である。
【図５】本発明に使用するフラビン結合型ＧＤＨの一例のｐＨ安定性を示す図である。
【図６】本発明に使用するフラビン結合型ＧＤＨの一例のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動結果である。
【図７】本発明に使用するフラビン結合型ＧＤＨの一例を用いて測定した、Ｄ−グルコース量の測定結果を示す図である。
【図８】本発明の酵母形質転換体により生産される本発明のフラビン結合型ＧＤＨの一例のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動結果である。
【図９】本発明の酵母形質転換体により生産されるフラビン結合型ＧＤＨの一例の熱安定性を示す図である。
【図１０】本発明の酵母形質転換体および比較例の麹菌形質転換体により生産されるフラビン結合型ＧＤＨの一例の熱安定性を示す、熱処理時間と残存活性の関係を表す図である。
【図１１】比較例の麹菌形質転換体により生産されるケカビ由来フラビン結合型ＧＤＨの一例のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（フラビン結合型ＧＤＨの基質特異性）
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨは、基質特異性に優れ、Ｄ−グルコースに対する選択性が極めて高いことを特徴とする。具体的には、本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨは、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースに対する反応性が極めて低い。具体的には、Ｄ−グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、マルトース、Ｄ−ガラクトースおよびＤ−キシロースに対する反応性がいずれも２％以下であることを特徴とする。本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨは、このような高い基質特異性を有するため、マルトースを含む輸液の投与を受けている患者や、ガラクトース負荷試験およびキシロース吸収試験を実施中の患者の試料についても、測定試料に含まれるマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース等の糖化合物の影響を受けることなく、正確にＤ−グルコース量を測定することが可能となる。【００１５】
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨは、上述のようにＤ−グルコースの代わりにマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース等の糖化合物を基質として測定を行った際の測定値が非常に低く、さらに、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース等の糖化合物が夾雑する条件下でも正確にグルコース測定値を測定できることを特徴とする。具体的には、それらの夾雑糖化合物が存在しない条件でのＤ−グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、夾雑糖化合物としてマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースから選択される１以上が存在する場合の測定値が９６％〜１０３％であり、夾雑糖化合物としてマルトース、Ｄ−ガラクトースおよびＤ−キシロースの３種が同時に存在する場合でも、測定値が９６％〜１０４％であることを特徴とする。このような特性を有するフラビン結合型ＧＤＨを用いた場合には、測定試料中にマルトースやＤ−ガラクトース、Ｄ−キシロースが存在している状況でも、グルコース量を正確に測定することが可能であり、好ましい。【００１６】
（本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨの酵素化学的特徴）
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨとして好ましい酵素の例としては、以下の酵素化学的特徴を有するものが挙げられる。
（１）作用：電子受容体存在下でＧＤＨ活性を示す
（２）分子量：タンパク質のポリペプチド鎖部分の分子量が約８０ｋＤａである
（３）基質特異性：Ｄ-グルコースに対する反応性と比較して、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースに対する反応性が低い
（４）至適ｐＨ：ｐＨ６．５〜７．０
（５）至適温度：３７〜４０℃
（６）安定ｐＨ範囲：ｐＨ３．５〜７．０
（７）４０度、１５分間の熱処理において８０％以上の残存活性を有する、
（８）フラビン化合物を補酵素とする
（９）Ｋｍ値：Ｄ−グルコースに対するＫｍ値が２６〜３３ｍＭである
上記のような酵素化学的特徴を有するＧＤＨであれば、測定試料に含まれるマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース等の糖化合物の影響を受けることなく、正確にＤ−グルコース量を測定することが可能となる。また、血糖値の測定等の臨床診断に応用するために好適なｐＨ範囲、温度範囲で良好に作用するので、診断用測定試薬等の用途に好適に使用することができる。
なお、上記の諸性質パラメータは典型的な例であるが、所定の測定条件においてＤ−グルコースの測定を行う際に本発明の効果を達成可能である範囲で、上記パラメータのうちには、許容可能な変動の幅を有するものがある。例えば、安定ｐＨ範囲や至適ｐＨ範囲、至適温度範囲等のパラメータは、所定の測定条件を含む範囲で、上記の典型的な範囲よりやや広くてもよいし、逆に、上記の典型的な範囲よりやや狭い場合でも、測定条件において十分な活性および／または安定性が確保されていればよい。Ｋｍ値は一般的には小さくなるほど基質特異性が良いとされるが、本発明の酵素としては、所定の測定条件において実質的に十分な基質の選択が実現される範囲の値を有していればよい。【００１７】
上記の各種の酵素化学的性質は、酵素の諸性質を特定するための公知の手法、例えば、以下の実施例に記載の方法を用いて調べることができる。酵素の諸性質は、本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨを生産する微生物の培養液や、精製工程の途中段階において、ある程度調べることもでき、より詳細には、精製酵素を用いて調べることができる。
精製酵素とは、当該酵素以外の成分、特に当該酵素以外のタンパク質（夾雑タンパク質）を実質的に含まない状態に分離された酵素をいう。具体的には、例えば、夾雑タンパク質の含有量が重量換算で全体の約２０％未満、好ましくは約１０％未満、更に好ましくは約５％未満、より一層好ましくは約１％未満である。なお、本明細書中に後述する「ＭｐＧＤＨ」、「ＭｊＧＤＨ」および「ＭｃＧＤＨ」は、特に断りの無い限り、精製酵素をいう。【００１８】
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨが利用する電子受容体は、特に限定されず、例えば、血糖値測定に用いるために好適な試薬成分として公知の任意の電子受容体を用いることができる。【００１９】
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨが利用する補酵素は、フラビン化合物であることを特徴とする。フラビン化合物には、例えば、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）等が挙げられる。【００２０】
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨとして好ましい酵素の例としては、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定したときに、タンパク質のポリペプチド鎖部分の分子量が約８０ｋＤａであるフラビン結合型ＧＤＨが挙げられる。なお、本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨには糖鎖が結合していると考えられ、糖鎖を除去する操作を行わない場合、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した際の分子量はこれより大きめに測定される傾向を有する。
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨとして好ましい酵素の例としては、Ｄ−グルコースに対するＫｍ値が２６〜３３ｍＭであるフラビン結合型ＧＤＨが挙げられる。【００２１】
（フラビン結合型ＧＤＨの作用原理および活性測定法）
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。
したがって、この原理を利用して、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）および２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いた以下の測定系により、本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨの活性を測定することができる。
（反応１）  Ｄ−グルコ−ス ＋ ＰＭＳ（酸化型）
→ Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン ＋ ＰＭＳ（還元型）
（反応２）  ＰＭＳ（還元型） ＋ ＤＣＩＰ（酸化型）
→ ＰＭＳ ＋ ＤＣＩＰ（還元型）【００２２】
まず、（反応１）において、グルコースの酸化に伴いＰＭＳ（還元型）が生成する。続いて進行する（反応２）により、ＰＭＳの酸化と共にＤＣＩＰが還元されるため、酸化型ＤＣＩＰの消失を６００ｎｍの波長の吸光度変化量から測定することができる。
具体的には、フラビン結合型ＧＤＨの活性は、以下の手順に従って測定する。１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １．７９ｍＬ、１．２５Ｍ Ｄ−グルコース溶液 ０．０８ｍＬおよび２０ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．０１ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温する。次いで、２０ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．０２ｍＬおよび酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始する。反応開始時、および、経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を求め、次式に従いフラビン結合型ＧＤＨ活性を算出する。この際、フラビン結合型ＧＤＨ活性は、３７℃において濃度５０ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。【００２３】
【数１】
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【００２４】
なお、式中の２．０は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは１０ｍＭ 酢酸緩衝液を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。【００２５】
（フラビン結合型ＧＤＨの由来）
上記の特徴を有し、本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨは、ケカビ亜門、好ましくは、ケカビ綱、より好ましくは、ケカビ目、さらに好ましくは、ケカビ科に分類される微生物から得ることができる。ケカビ亜門、好ましくは、ケカビ綱、より好ましくは、ケカビ目、さらに好ましくは、ケカビ科に分類される微生物としては、例えば、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属等が挙げられる。Ｍｕｃｏｒ属に分類される微生物であって、本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨを生産する具体的な好ましい微生物の例としては、ムコール・プライニ（Mucor prainii）、ムコール・ジャバニカス（Mucor javanicus）もしくはムコール・シルシネロイデス・ｆ・シルシネロイデス（Mucor circinelloides f. circinelloides）が挙げられる。より具体的には、Mucor prainii NISL0103、Mucor javanicus NISL0111もしくはMucor circinelloides f. circinelloides NISL0117が挙げられる。Ａｂｓｉｄｉａ属に分類される微生物であって、本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨを生産する具体的な好ましい微生物の例としては、アブシジア・シリンドロスポラ（Absidia cylindrospora）、アブシジア・ヒアロスポラ（Absidia hyalospora）を挙げることができる。より具体的には、Absidia cylindrospora NISL0211、Absidia hyalospora NISL0218を挙げることができる。Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ属に分類される微生物であって、本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨを生産する具体的な好ましい微生物の例としては、アクチノムコール・エレガンス（Actinomucor elegans）を挙げることができる。より具体的には、Actinomucor elegans NISL9082を挙げることができる。なお、上記の菌株はＮＩＳＬ（財団法人  野田産業科学研究所）の保管菌株であり、所定の手続きを経ることにより、分譲を受けることができる。【００２６】
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨは、上述の通り、「ケカビ亜門、好ましくは、ケカビ綱、より好ましくは、ケカビ目、さらに好ましくは、ケカビ科に分類される微生物に由来し、上述の各種性質を具備するフラビン結合型ＧＤＨ」である。さらにまた、それらのフラビン結合型ＧＤＨ生産微生物から公知の遺伝子工学的手法によって取得したフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子を利用し、必要によりそれを一部改変して、適当な宿主微生物に各種公知の手法により導入して生産された組換えフラビン結合型ＧＤＨもまた、本発明に用いる「ケカビ亜門、好ましくは、ケカビ綱、より好ましくは、ケカビ目、さらに好ましくは、ケカビ科に分類される微生物に由来し、上述の各種性質を具備するフラビン結合型ＧＤＨ」に含まれる。同様に、「Ｍｕｃｏｒ属に分類される微生物」、あるいは、特定の生産微生物菌株名を記載したフラビン結合型ＧＤＨについても、各々に由来する遺伝子情報を元に取得される、上述の各種性質を具備するフラビン結合型ＧＤＨをも本発明に包含する。【００２７】
（フラビン結合型ＧＤＨのアミノ酸配列）
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨは、配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８５％以上相同なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする。配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するフラビン結合型ＧＤＨは、上述の各種の性質を有する。また、配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するフラビン結合型ＧＤＨと同様な諸性質を有するＧＤＨも、本発明のフラビン結合型ＧＤＨに含まれる。【００２８】
（フラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子配列）
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子とは、配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８５％以上相同なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するフラビン結合型ＧＤＨをコードするＤＮＡをいう。または、本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子とは、配列番号２又は配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡをいう。あるいは、本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子とは、配列番号２又は配列番号４で示される塩基配列と８５％以上の相同性、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を有し、且つフラビン結合型ＧＤＨ酵素活性をもつタンパク質をコードするＤＮＡをいう。【００２９】
（フラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子配列を含むベクター、形質転換体）
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子は、適当な公知の各種ベクター中に挿入することができる。さらに、このベクターを適当な公知の各宿主に導入して、フラビン結合型ＧＤＨ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡが導入されている形質転換体を作製することができる。これらの遺伝子の取得方法や、遺伝子配列、アミノ酸配列情報の取得方法、各種ベクターの製造方法や形質転換体の作製方法は、当業者にとって公知であり、一例を後述する。【００３０】
フラビン結合型ＧＤＨを生産する微生物からフラビン結合型ＧＤＨ遺伝子を取得するには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、フラビン結合型ＧＤＨ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ＷＩＬＥＹ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。【００３１】
次いで、フラビン結合型ＧＤＨのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーからスクリーニングする方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の目的遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。【００３２】
このようにして得られたフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子の好ましい一例として、Ｍｕｃｏｒ属由来のフラビン結合型ＧＤＨ遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子は、常法通り各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましく、例えば、単離したＭｕｃｏｒ属由来のフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子を含む組換え体プラスミドを作製し、そこから例えば、ＱＩＡＧＥＮ（キアゲン社製）を用いることにより、抽出、精製して得ることができる。本発明において用いることのできるベクターＤＮＡとしては、例えば、プラスミドベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等を用いることができる。具体的には、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋  （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等が好ましい。【００３３】
上記方法により得られたフラビン結合型ＧＤＨ遺伝子の塩基配列の決定・確認は、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）等を用いることにより行い得る。【００３４】
得られたフラビン結合型ＧＤＨ遺伝子は、常法により、形質転換または形質導入することができる。具体的には、例えば、相同組換えやトランスポゾンを利用することにより宿主の染色体上に直接的に挿入する手法、及びプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、人工染色体等のベクター上に連結することにより宿主内に導入する手法などが挙げられる。【００３５】
また、上記挿入遺伝子には、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１のような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子等が挙げられる。また、挿入遺伝子は、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列（例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター等が挙げられる。【００３６】
（本発明の形質転換体に使用する宿主）
本発明の形質転換体における宿主の例としては、酵母が挙げられる。酵母に分類される微生物としては、例えば、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属する酵母が挙げられる。これらの属に分類される微生物であって、本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨを生産する具体的な好ましい微生物としては、チゴサッカロマイセス・ルキシー（Zygosaccharomyces rouxii）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、カンジダ・アンタークティカ（Candida antarctica）等が挙げられる。より具体的には、Zygosaccharomyces rouxii ＩＦＯ１８７６が挙げられる。【００３７】
（酵母の形質転換）
本発明では宿主として酵母を用いる。酵母への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、酢酸リチウムを用いる方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５，  ２５５−２６９（１９９５））やエレクトロポレーション（Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５５  （２００３）４８１−４８４）等を好適に用いることができるが、これに限定されず、スフェロプラスト法やガラスビーズ法等を含む各種任意の手法を用いて形質転換を行えば良い。【００３８】
（フラビン結合型ＧＤＨの製造）
上記の形質転換により得られる形質転換体を用いて、フラビン結合型ＧＤＨを製造する。具体的には、上記の形質転換により得られる酵母形質転換体を培養し、該培養物よりフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを取得することができる。
ある有用なタンパク質をコードする遺伝子を異種の宿主に導入することによって生産させる技術は、理論的には公知である。しかしながら、実際には、どのような遺伝子を、どのような異種宿主にどのように導入するかによって、その効果の度合いは一律ではなく、異種宿主へ導入しようとしても導入自体うまくいかないか、異種宿主での発現がうまくいかないことは多くある。すなわち、個々の物質生産において、具体的にどのような遺伝子を、どのような宿主にどのように導入した場合に効率的な製造が可能となるかを見出すことは容易とはいいがたく、効率的な製造を実現し得る遺伝子、宿主、導入方法等の組み合わせを見出すことは、産業上非常に有用である。
本発明の酵母形質転換体を培養することにより、本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨの由来微生物（すなわち、ケカビ）を培養して製造を行う場合と比較して、格段に効率の良い酵素の製造を実現できる。具体的には、培養後の菌体内、あるいは菌体外において確認される酵素発現量がより多くなる。さらに、宿主によっては、発現された酵素の分泌パターンが変化し、効率的な製造が行えるようになる。例えば、Ｍｕｃｏｒ属由来のフラビン結合型ＧＤＨ遺伝子を含む遺伝子発現カセットを用いてチゴサッカロマイセス属の酵母を形質転換して得られる酵母形質転換体を酵母形質転換体を培養することにより生産されるフラビン結合型ＧＤＨは、そのほとんどが菌体外に分泌されるようになる。このように、菌体外に目的酵素が分泌生産されるようになることによって酵素の精製工程が非常に効率化されることは、より好ましい本発明の効果である。
例えば、本発明に使用する各種ケカビ由来のフラビン結合型ＧＤＨは、本来の由来微生物を培養した場合にはその生産量は十分とはいいがたく、より大スケールでの菌体培養が必要となるとともに、培養した菌体から酵素を抽出するための付加的な工程を必要とすることになる。【００３９】
（酵母形質転換体の培養）
本発明の酵母形質転換体の培養は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの培養において広く用いられているＹＰＤ（バクトペプトン  ２％，バクトイースト・エクストラクト  １％，グルコース  ２％）液体培地を好適に用いることができると考えられるが、その他にも、添加することにより本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨの製造量を向上させることができる栄養源や成分があれば、単独で、あるいは組み合わせて用いてもよい。
培地に使用する炭素源としては、同化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、デンプン加水分解物、グリセリン、フラクトース、糖蜜などが挙げられる。窒素源としては、利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、大豆粉、マルツエキス、アミノ酸、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどが挙げられる。無機物としては、例えば、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、硫酸第１鉄、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、炭酸ナトリウム、塩化カルシウムなどの種々の塩が挙げられる。その他、必要に応じてビタミン類、消泡剤などを添加してもよい。【００４０】
培養条件は、培養する微生物により異なっても良いが、例えば、培地の初発ｐＨは、ｐＨ５〜１０に調整し、培養温度は、２０〜４０℃、培養時間は、１５〜２５時間、１〜２日間、あるいは１０〜５０時間等、適宜設定することができ、通気撹拌深部培養、振盪培養、静地培養などにより実施する。例えば、チゴサッカロマイセス属の酵母を培養する場合の培地および培養条件の一例として、バクトペプトン  ２％，バクトイースト・エクストラクト  １％，グルコース  ２％の培地を用いた、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間の振盪が挙げられる。なお、本発明に使用するＧＤＨの本来の生産微生物であるケカビ亜門の微生物を原株のまま培養する場合の培地および培養条件の一例としては、イーストエキス２．０％、グルコース４％、ｐＨ６．０の培地を用いた、３０℃、１３０ｒｐｍで２〜５日間、３〜５日間等の振盪が挙げられる。本発明の酵母形質転換体を用い、使用する形質転換体によって培養条件を最適化することにより達成される培養時間の短縮や酵素生産量の増加は、より効率的な酵素製造に貢献することとなる。【００４１】
培養終了後、該培養物あるいは培養菌体内部からフラビン結合型ＧＤＨを採取するには、通常の酵素の採取手段を用いることができる。上記酵素が菌体内に存在する場合には、培養物から、例えば、濾過、遠心分離などの操作により菌体を分離し、この菌体から酵素を採取するのが好ましい。例えば、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイノミルなどの、通常の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームなどの細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ−１００などの界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法などを単独または組み合わせて採用することができる。上記酵素が菌体外に存在する場合には、濾過、遠心分離などの操作により菌体を分離し、上清を回収すればよい。【００４２】
次いで、濾過または遠心分離などにより不溶物を取りのぞき、酵素抽出液を得る。得られた抽出液から、フラビン結合型ＧＤＨを、必要に応じて単離、精製するには、必要により核酸を除去したのち、これに硫酸アンモニウム、アルコール、アセトンなどを添加して分画し、沈殿物を採取する。さらに精製度の高い酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトラゲルもしくはバイオゲルなどを用いるゲル濾過法、イオン交換体、ヒドロキシアパタイトなどを用いる吸着溶出法、アフィニティクロマト法、分子ふるい膜もしくは中空糸膜などを用いる分画法などを適宜選択し、またこれらを組み合わせて実施する。【００４３】
本発明に使用するフラビン結合型ＧＤＨは、公知の遺伝子組換え手法を用いて遺伝子配列およびアミノ酸配列の一部を欠失、置換、付加および／または挿入により改変したものであってもよい。このように所望の特性を付与させたフラビン結合型ＧＤＨについても、本発明の酵母形質転換体を用いて効率よく製造することが可能である。【００４４】
上記のような方法で製造されたフラビン結合型ＧＤＨは、夾雑糖化合物の存在下においても正確にグルコース量を測定できることから、グルコースセンサなどへの応用・実用化に好適に用いることができる。【００４５】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４６】
（ケカビ由来のフラビン結合型ＧＤＨの取得）
１．ＧＤＨ生産菌のスクリーニング
自然界から分離した菌株および微生物保存機関（（財）野田産業科学研究所）から分与された保存菌約５００株から、ＧＤＨ生産菌のスクリーニングを行った。マルツエキス培地（マルツエキス２．０％、Ｄ−グルコース２．０％、ポリペプトン０．１％、ｐＨ６．０）３ｍｌに供試菌株をそれぞれ接種し、３〜５日、３０℃で振とう培養した。この培養液を８００×ｇ、１０分間遠心分離して菌体を沈殿として得た。その後、この菌体を１０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に懸濁し、ビーズショッカー（安井器械（株）製）により菌体を破砕（２，０００ｒｐｍ、６０秒、１６回）し、４℃、２０,０００×ｇ、１０分間の遠心によって回収された上清を粗酵素液とした。【００４７】
２．ＧＤＨ活性の確認
以下の手順に従って各溶液を混合し、吸光度を測定して、粗酵素液中のＧＤＨ活性を調べた。１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １．７９ｍＬ、１．２５Ｍ Ｄ−グルコース溶液 ０．０８ｍＬおよび２０ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．０１ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温後、２０ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．０２ｍＬおよび酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始した。反応開始時から酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を測定し、次式に従いＧＤＨ活性を算出した。この際、ＧＤＨ活性は、３７℃において濃度５０ｍＭのＤ−グルコ−ス存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義した。【００４８】
【数２】
2012073986.tif 000003
【００４９】
なお、式中の２．０は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは１０ｍＭ 酢酸緩衝液を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。【００５０】
各菌株の粗酵素液について、上記活性測定法に基づいてＧＤＨ活性の有無を調べた結果を表１に示す。【００５１】
【表１】
2012073986.tif 000004
【００５２】
その結果、Mucor prainii NISL0103、Mucor javanicus NISL0107、Mucor javanicus NISL0108、Mucor javanicus NISL0111、Mucor javanicus NISL0112、Mucor javanicus NISL0115、Mucor circinelloides f. circinelloides NISL0116、Mucor circinelloides f. circinelloides NISL0117、Mucor hiemalis f. silvaticus NISL0118、Absidia cylindrospora NISL0211、Absidia hyalospora NISL0218、Actinomucor elegans NISL9082由来の粗酵素液中にＧＤＨ活性が検出された。
【実施例２】
【００５３】
（ケカビ由来フラビン結合型ＧＤＨの精製）
前培養用培地（イーストエキス ２．０ ％、グルコース ４％、ｐＨ６．０）０．１Ｌを０．５Ｌ容坂口フラスコに入れ、予めプレート培地上で培養したMucor prainii NISL0103、Mucor javanicus NISL0111、Mucor circinelloides f. circinelloides NISL0117を、約１ｃｍ２分それぞれ接種し、３０℃、１３０ｒｐｍで２日間回転振とう培養した。これを種培養として、３０Ｌ容ジャーファメンターに入れた上記培地２０Ｌに０．２Ｌずつ接種し（ジャーファメンター２基）、３０℃、２００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍで３日間培養した。培養終了後、培養液４０Ｌをろ布でろ過し、菌体を回収した。次いで、得られた菌体を１０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に懸濁した。【００５４】
上記の菌体懸濁液を、ダイノミルに送液（１５０ｍｌ／分）して破砕し、６,０００×ｇで３０分遠心して上清を回収した。この上清を分画分子量６，０００の中空糸膜ＡＩＰ２０１３（旭化成ケミカルズ社製）を用いて濃縮し、濃縮後の酵素液に硫酸アンモニウムを７０％飽和となるよう徐々に添加し、余分な蛋白質を沈殿させた。一晩、４℃で放置後、遠心分離（２０,０００×ｇ、６０分）により上清を回収した。
この上清を、緩衝液Ａ（１０ｍＭ 酢酸緩衝液、２Ｍ 硫酸アンモニウム、ｐＨ５．０）にて予め平衡化したブチルトヨパール６５０Ｃ（東ソー社製）カラム（２６φ×２８．５ｃｍ）にかけ、緩衝液Ａから緩衝液Ｂ（１０ｍＭ 酢酸緩衝液、ｐＨ５．０）のリニアグラジエントによって溶出させた。溶出された活性画分をセントリコンプラス−７０（ミリポア社製）で濃縮後、緩衝液Ｃ（１０ｍＭ 酢酸緩衝液、ｐＨ４．５）で透析し、予め緩衝液Ｃで平衡化したＳＰセファロースＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）カラム（２６φ×２８．５ｃｍ）にかけ、緩衝液Ｃから緩衝液Ｄ（１０ｍＭ 酢酸緩衝液、２００ｍＭ 塩化カリウム、ｐＨ４．５）のリニアグラジエントで溶出させた。溶出された活性画分を濃縮し、精製酵素を得た。
以降、各精製酵素について、Mucor prainii NISL0103由来のＧＤＨをＭｐＧＤＨ、Mucor javanicus NISL0111由来のＧＤＨをＭｊＧＤＨ、Mucor circinelloides f. circinelloides NISL0117由来のＧＤＨをＭｃＧＤＨと表記する。
【実施例３】
【００５５】
（Ｍｕｃｏｒ属由来フラビン結合型ＧＤＨの酵素化学的性質の検討）
実施例２により得られた各精製ＧＤＨの諸性質を調べた。
（ａ）吸収スペクトルの測定
ＭｐＧＤＨ、ＭｊＧＤＨおよびＭｃＧＤＨを１０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で透析し、２５０−８００ｎｍにおける吸収スペクトルを分光光度計Ｕ−３０１０（日立ハイテクノロジーズ社製）により測定した。測定結果を図１に示す（図１（Ａ）はＭｐＧＤＨの吸収スペクトル、図１（Ｂ）はＭｊＧＤＨの吸収スペクトル、図１（Ｃ）はＭｃＧＤＨの吸収スペクトルを示す）。いずれのＧＤＨについても、波長３４０〜３５０ｎｍ付近および波長４２０〜４３０ｎｍ付近に極大を示す２つのピークが確認され、このような吸収スペクトルの形状がフラビン酵素に特有の形状であることから、本発明のＧＤＨがフラビン結合型タンパク質であることが強く示唆された。【００５６】
（ｂ）ＧＯＤ活性の測定
実施例２により得られたＭｐＧＤＨ、ＭｊＧＤＨおよびＭｃＧＤＨと、Aspergillus niger由来の市販のグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ、ｂｉｏｚｙｍｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて、ＧＤＨ活性およびＧＯＤ活性を測定した。結果を表２に示す。
ＧＤＨ活性は、実施例１の方法に準じ、ＧＯＤ活性は、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、およびＮ−エチルーＮ−（２−ヒドロキシー３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）を使用した以下の方法で測定した。１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） ３０．０ｍＬ、８３３ｍＭ Ｄ−グルコース溶液 ６．０ｍＬ、２５ｍＭ ４−ＡＡ溶液 ０．３ｍＬ、４０ｍＭ ＴＯＯＳ溶液 ０．３ｍＬおよび５００Ｕ／ｍＬ ＰＯＤ溶液 ０．３ｍＬを混合後、３．０ｍＬを試験管に移し、３７℃で５分間保温後、酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加して反応を開始した。酵素反応の進行に伴う５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの増加量（ΔＡ５５５）を測定し、次式に従ってＧＯＤ活性を算出した。この際、ＧＯＤ活性は、３７℃において濃度１３１ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＨ２Ｏ２を生成する酵素量を１Ｕと定義した。【００５７】
【数３】
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【００５８】
なお、式中の３．１は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、３２．８は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．５は１分子のＨ２Ｏ２が還元されるときに生じるキノンイミン染料の分子数、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ５５５ｂｌａｎｋは１０ｍＭ 酢酸緩衝液を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの増加量、ｄｆは希釈倍数を表す。【００５９】
【表２】
2012073986.tif 000006
【００６０】
表２に示す通り、ＭｐＧＤＨ、ＭｊＧＤＨおよびＭｃＧＤＨはいずれも全くＧＯＤ活性を示さず、専らＧＤＨ活性を示した。一方、ＧＯＤは主としてＧＯＤ活性を示すが、ＧＤＨ活性も併せ持つことが判明した。すなわち、本発明のＧＤＨは酸素を電子受容体として利用しないため、Ｄ−グルコースを定量する際に反応系の溶存酸素の影響を極めて受けにくいことが示された。【００６１】
（ｃ）至適ｐＨ
上記のフラビン結合型ＧＤＨにおける至適ｐＨを調べた。結果を図２に示す（図２（Ａ）はＭｐＧＤＨ、（Ｂ）はＭｊＧＤＨ、（Ｃ）はＭｃＧＤＨの結果を示す）。具体的には、１００ｍＭ 酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０−５．５、図中△印でプロット）、１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．５−６．５、図中斜め四角印でプロット）、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０−８．０、図中丸印でプロット）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５−９．０、図中×印でプロット）を用い、それぞれのｐＨにおいて、温度３７℃にて酵素反応を行い、相対活性を比較した。
その結果、上記のフラビン結合型ＧＤＨはいずれも、ｐＨ６．５もしくはｐＨ７．０において最も高い活性を示し、ｐＨ７．０付近に至適ｐＨを有していた。個別にみると、ＭｐＧＤＨおよびＭｃＧＤＨの相対活性が最も高かったのはｐＨ７．０においてであり、その周辺域として、ｐＨ６．５−７．５の範囲で最大相対活性値の８０％以上を示したことから、この範囲で好適に使用できると考えられた。また、ＭｊＧＤＨの相対活性が最も高かったのはｐＨ６．５においてであり、その周辺域として、ｐＨ６．０−７．０の範囲で最大相対活性値の８０％以上を示したことから、この範囲で好適に使用できると考えられた。【００６２】
（ｄ）至適温度範囲
実施例１記載の活性測定法に準じ、種々の温度にて本酵素の活性測定を行った。具体的には、１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １．７９ｍＬ、１．２５Ｍ Ｄ−グルコース溶液 ０．０８ｍＬおよび２０ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．０１ｍＬを混合し、３７℃で保温する代わりに各温度で５分間保温後、２０ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．０２ｍＬおよび酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、各温度にて反応を開始した。反応開始時、および、２分後の吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量を求めた。結果を図３に示す（図３（Ａ）はＭｐＧＤＨ、（Ｂ）はＭｊＧＤＨ、（Ｃ）はＭｃＧＤＨの結果を示す）。いずれも３７℃付近で最大の活性を示し、最大活性に対して８０％以上の活性を示す温度範囲は３０〜４０℃であった。以上より、本発明のフラビン結合型ＧＤＨの至適温度範囲は、３０〜４０℃、最も好ましい温度は３７℃であると考えられた。【００６３】
（ｅ）Ｄ−グルコースに対するＫｍ値
前記活性測定法において、基質であるＤ−グルコース濃度を変化させて活性測定を行い、ラインウェーバー・バークプロットから、ミカエリス定数（Ｋｍ）を求めた。この結果、Ｄ−グルコースに対するＫｍ値は、ＭｐＧＤＨで３１．１ｍＭ、ＭｊＧＤＨで２６．４ｍＭ、ＭｃＧＤＨで３３．２ｍＭであった。【００６４】
（ｆ）熱安定性
１００ｍＭ 酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて、本発明のフラビン結合型ＧＤＨを各温度で１５分間処理した時の熱安定性の結果を図４に示す（図４（Ａ）はＭｐＧＤＨ、（Ｂ）はＭｊＧＤＨ、（Ｃ）はＭｃＧＤＨの結果を示す）。本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、４０℃、１５分間の熱処理後に８０％以上の残存活性を有しており、約４０℃まで安定であることがわかった。【００６５】
（ｇ）安定ｐＨの範囲
次いでこれらのフラビン結合型ＧＤＨにおける安定ｐＨを調べた。結果を図５に示す（図５（Ａ）はＭｐＧＤＨ、（Ｂ）はＭｊＧＤＨ、（Ｃ）はＭｃＧＤＨの結果を示す）。具体的には、１００ｍＭ グリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．５−３．５、図中四角印でプロット）、１００ｍＭ 酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ３．５−５．５、図中△印でプロット）、１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．５−６．５、図中斜め四角印でプロット）、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０−８．０、図中丸印でプロット）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５−９．０、図中×印でプロット）を用い、それぞれのｐＨにおいて２５℃で１６時間処理した後、フラビン結合型ＧＤＨの残存活性をそれぞれ測定した。その結果、いずれも、最大の残存活性を示したｐＨ５．０付近での活性に対し８０％以上の活性を示すｐＨ範囲はｐＨ３．５−７．０であった。以上から、これらのフラビン結合型ＧＤＨの安定ｐＨ範囲はｐＨ３．５−７．０であることが判った。【００６６】
（ｈ）分子量
スーパーセップエース １０〜２０％（和光純薬工業社製）を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によりＭｐＧＤＨ、ＭｊＧＤＨおよびＭｃＧＤＨの分子量を求めた。また、脱糖鎖キット（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＰＺＭ製）を用いて、各フラビン結合型ＧＤＨを脱糖鎖処理し、同様に電気泳動に供した。結果を図６に示す。泳動サンプルは以下の通りである。
レーン１：分子量マーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（１０−２５０ｋＤａ），上から２５０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、６０ｋＤａ、５０ｋＤａ、４０ｋＤａ、３０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２０ｋＤａ、１５ｋＤａ）
レーン２：ＭｐＧＤＨ
レーン３：脱糖鎖処理後のＭｐＧＤＨ
レーン４：ＭｊＧＤＨ
レーン５：脱糖鎖処理後のＭｊＧＤＨ
レーン６：ＭｃＧＤＨ
レーン７：脱糖鎖処理後のＭｃＧＤＨ
レーン８：脱糖鎖反応に使用した酵素【００６７】
図６より、これらのフラビン結合型ＧＤＨの分子量は、ＭｐＧＤＨで約９０〜１３０ｋＤａ、ＭｊＧＤＨで約１００〜１５０ｋＤａ、ＭｃＧＤＨで約１３０〜２００ｋＤａであり、脱糖鎖キット（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＰＺＭ製）により糖鎖を除去した後の分子量はＭｐＧＤＨ、ＭｊＧＤＨおよびＭｃＧＤＨいずれも約８０ｋＤａであった。【００６８】
（ｉ）基質特異性
実施例１の酵素活性測定方法に準じ、基質としてはＤ−グルコース、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、マンノース、スクロース、トレハロース、マルトトリオース、マルトテトラオースをそれぞれ用いて、各基質に対するフラビン結合型ＧＤＨの活性を測定した。基質濃度は５０ｍＭとした。結果を表３に示す。【００６９】
【表３】
2012073986.tif 000007
【００７０】
その結果、これらのフラビン結合型ＧＤＨは、Ｄ−グルコースに対する活性を１００％とした場合に、各種の糖化合物に対し、いずれも反応性が非常に低いことが判明した。そして、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースに対する活性は、いずれも、２％以下であった。【００７１】
（ｊ）１，１０−フェナントロリンによる阻害効果
これらのフラビン結合型ＧＤＨの活性に対する１，１０−フェナントロリンの阻害効果を、以下の方法で調べた。実施例１の酵素活性の測定方法に準じ、ただし、終濃度が１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２５ｍＭおよび５０ｍＭとなるように１，１０−フェナントロリンを添加した場合の酵素活性を求め、１，１０−フェナントロリン無添加の阻害率を０％として、その阻害率を計算した。結果を表４に示す。【００７２】
【表４】
2012073986.tif 000008
【００７３】
本発明のフラビン結合型ＧＤＨに対する１，１０−フェナントロリンの阻害効果は低く、１ｍＭの１，１０−フェナントロリン添加では２〜４％程度の阻害効果が認められるに過ぎず、５ｍＭの添加でも阻害率は１０％程度であった。
【実施例４】
【００７４】
（ケカビ由来フラビン結合型ＧＤＨを用いたグルコース濃度の定量性の検証１）
上述のフラビン結合型ＧＤＨを用いて、グルコースの測定を行った。具体的には、１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １．７９ｍＬ、Ｄ−グルコース溶液（２５０、７５０、１，２５０、１，７５０、２，５００、３，２５０、４，０００、５，０００ｍｇ／ｄＬ） ０．０８ｍＬおよび２０ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．０１ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温後、２０ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．０２ｍＬおよび０．８Ｕ／ｍＬ ＧＤＨ溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始した。酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）とグルコースの終濃度の関係を図７に示す（図７（Ａ）はＭｐＧＤＨを用いた測定結果、（Ｂ）はＭｊＧＤＨを用いた測定結果、（Ｃ）はＭｃＧＤＨを用いた測定結果を示す）。【００７５】
図７に示す通り、ケカビ由来のフラビン結合型ＧＤＨを用いることにより、終濃度２００ｍｇ／ｄＬ以下のグルコース濃度であれば、測定試料中のグルコース濃度を精度良く測定できることが確認された。
【実施例５】
【００７６】
（ケカビ由来のフラビン結合型ＧＤＨを用いたグルコース濃度の定量性の検証２）
１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １．７７ｍＬ、Ｄ−グルコース溶液（１０，０００、１６，０００ｍｇ／ｄＬ） ０．０２ｍＬおよび２０ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．０１ｍＬを混合した。続いて、マルトース溶液（３，０００、６，０００、９，０００、１２，０００、１５，０００ｍｇ／ｄＬ）もしくはＤ−ガラクトース溶液（１，５００、３，０００、４，５００、６，０００、７，５００ｍｇ／ｄＬ）もしくはＤ−キシロース溶液（１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００ｍｇ／ｄＬ） ０．０８ｍＬを添加して３７℃で５分間保温した後、２０ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．０２ｍＬおよび２．０Ｕ／ｍＬ ＧＤＨ溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始した。酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）、およびグルコースの終濃度の関係を表５〜７に示す。【００７７】
【表５】
2012073986.tif 000009
【００７８】
【表６】
2012073986.tif 000010
【００７９】
【表７】
2012073986.tif 000011
【００８０】
表５〜７より、ケカビ由来のこれらのＧＤＨは、終濃度６００ｍｇ／ｄＬ以下のマルトース、または、終濃度３００ｍｇ／ｄＬ以下のＤ−ガラクトース、あるいは終濃度２００ｍｇ／ｄＬ以下のＤ−キシロースを含有するサンプルのグルコース濃度を精度良く定量できることが示された。
【実施例６】
【００８１】
（フラビン結合型ＧＤＨを用いたグルコース濃度の定量性の検証３）
１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １．６１ｍＬ、Ｄ−グルコース溶液（１０，０００、１６，０００ｍｇ／ｄＬ） ０．０２ｍＬおよび２０ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．０１ｍＬを混合した。続いて、マルトース溶液（３，０００、６，０００、９，０００、１２，０００、１５，０００ｍｇ／ｄＬ）、Ｄ−ガラクトース溶液（１，５００、３，０００、４，５００、６，０００、７，５００ｍｇ／ｄＬ）およびＤ−キシロース溶液（１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００ｍｇ／ｄＬ） をそれぞれ０．０８ｍＬ添加して３７℃で５分間保温した後、２０ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．０２ｍＬおよび２．０Ｕ／ｍＬ のフラビン結合型ＧＤＨ溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始した。酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）とグルコースの終濃度の関係を表８〜９に示した。【００８２】
【表８】
2012073986.tif 000012
【００８３】
【表９】
2012073986.tif 000013
【００８４】
表８〜９より、ＭｐＧＤＨまたはＭｊＧＤＨは、終濃度６００ｍｇ／ｄＬ以下のマルトース、終濃度３００ｍｇ／ｄＬ以下のＤ−ガラクトースおよび終濃度２００ｍｇ／ｄＬ以下のＤ−キシロースを含有する試料中のグルコース濃度を、極めて精度良く定量できることが示された。
【実施例７】
【００８５】
（Ｍｕｃｏｒ属由来フラビン結合型ＧＤＨ遺伝子のクローニングと酵母形質転換体の作製）
（１）ｍＲＮＡの調製
Mucor prainii NISL0103をマルツエキス培地（マルツエキス  ２．０％、グルコース  ４．０％、ポリペプトン  ０．１％、ｐＨ６．０）３ｍＬに接種し、２日、３０℃で振とう培養した。この培養液を濾紙濾過し、菌糸体を回収した。得られた菌糸を液体窒素中で凍結させ、乳鉢を用いて菌糸を粉砕した。次いで、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いて、本キットのプロトコールに従って、粉砕した菌体からｍＲＮＡを得た。【００８６】
（２）ＧＤＨ部分アミノ酸配列の決定
実施例２より得られたＭｐＧＤＨをスーパーセップエース  １０−２０％（和光純薬工業社製）に供し、電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをＱｕｉｃｋ−ＣＢＢ（和光純薬工業社製）を用いて染色し、当該酵素の分子量に相当するバンド部分を切り出した。切り出したゲル断片を外部機関に委託し、その中に含まれるタンパク質の内部アミノ酸配列情報を取得した。その結果、得られたアミノ酸配列は、ＬＶＥＮＦＴＰＰＴＰＡＱＩＥ（配列番号５）およびＩＲＮＳＴＤＥＷＡＮＹＹ（配列番号６）であった。【００８７】
（３）ＧＤＨ遺伝子配列の決定
上記の部分アミノ酸配列情報に基づき、ミックス塩基を含有するディジェネレートプライマー（プライマーの一例を配列番号７（フォワードプライマー）、配列番号８（リバースプライマー）に示す）を作製した。なお、配列番号７および８に記載の１文字表記において、混合塩基はそれぞれ、ｈ＝ａ＋ｃ＋ｔ、ｒ＝ａ＋ｇ、ｙ＝ｃ＋ｔ、ｄ＝ａ＋ｇ＋ｔを表す。上記（１）にて調製したMucor prainii NISL0103のｍＲＮＡをテンプレートとし、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、本キットのプロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲを行った。逆転写反応には本キット付属のオリゴｄＴプライマーを、ＰＣＲによるｃＤＮＡ増幅には配列番号７、８に示すディジェネレートプライマーを用いた。反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、８００ｂｐ程度の長さに相当するシングルバンドが確認された。このバンドに含まれる増幅ＤＮＡ断片を精製し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ  Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）を用いて、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）に前記増幅ＤＮＡ断片をライゲーションすることにより、組換えプラスミドｐＴＭＧＤ−１を構築した。【００８８】
次いで、得られたｐＴＭＧＤ−１を用い、公知のヒートショック法により大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（ニッポンジーン社製）を形質転換した。得られた形質転換体からＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（シグマ社製）を用いてプラスミドを抽出・精製し、プラスミド中に含まれる前記増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した（７６７ｂｐ）。【００８９】
得られた前記増幅ＤＮＡ断片の配列情報を元に、３’−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔ（タカラバイオ社製）を用いて３’側のＧＤＨ遺伝子未知領域を、また、５’−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔ（タカラバイオ社製）を用いて５’側のＧＤＨ遺伝子未知領域を決定した。いずれも各キットのプロトコールに従い、３’−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔでは本キット付属の３サイトアダプタープライマーおよび配列番号９に示すプライマーを用い、また、５’−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔでは配列番号１０、１１、１２、１３、１４に示すプライマーをそれぞれ用いた。前記の方法に従って得られた複数のプラスミド中に含まれるＤＮＡ断片の塩基配列解析を行った結果、配列番号２および配列番号４に示す全鎖長１９２６ｂｐのMucor prainii NISL0103由来ＧＤＨ遺伝子配列が明らかとなった。当該遺伝子配列により予測した当該酵素遺伝子のアミノ酸配列を配列番号１および配列番号３に示す。【００９０】
（４）酵母形質転換体の作製、酵母形質転換体の培養、およびＧＤＨ活性の確認
Ｄｏｕｂｌｅ−ｊｏｉｎｔ  ＰＣＲ（Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００４年，第４１巻，ｐ９７３−９８１）を行い、５’アーム領域〜ＵＲＡ５遺伝子（ウラシル栄養要求性マーカー）〜ＴＤＨ１プロモーター〜ＧＤＨ遺伝子〜３’アーム領域をタンデムに連結した遺伝子発現カセットを構築した。なお５’アーム領域、及び３’アーム領域とは、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ１８７６におけるＴＤＨ１遺伝子の上流、及び下流のそれぞれ約１ｋｂの領域である。これをエレクトロポレーションによってＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ  ＩＦＯ１８７６のコンピテントセルに対して形質転換を行った。なお、エレクトロポレーションはＪ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５５  （２００３）４８１−４８４の報告と同様に実施した。ここで得られた菌体を最小培地のプレートにスプレッドし、ウラシル非要求性を指標として酵母形質転換体を取得した。【００９１】
前記のＧＤＨ遺伝子発現カセットが挿入された本発明の酵母形質転換体、および、ＧＤＨ遺伝子発現カセットが挿入されていないコントロール株を、それぞれ１白金耳、ＹＰＤ液体培地（バクトペプトン  ２％，バクトイースト・エクストラクト  １％，グルコース  ２％）１ｍＬを含む試験管に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍの条件で２４時間前培養を行った。この前培養液を、ＹＰＤ液体培地５０ｍＬを含む３００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコに１％（ｖ／ｖ）となるようそれぞれ植菌し、３０℃、２００ｒｐｍの条件で２４時間旋回培養を行った。
得られた培養液を５０ｍＬ容ファルコンチューブに移し、４℃、８，０００×ｇ、５分間の条件で遠心分離を行うことで菌体と培養上清を分離し、各々に含まれるＧＤＨ活性を測定した。具体的には、得られた菌体を５０ｍＬの１０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に再懸濁し、この溶液をマルチビーズショッカー（安井器械社製）により２，０００ｒｐｍ、６０秒×８回の菌体破砕を行い、１４，０００ｒｐｍ、３０分間の遠心分離後、得られた上清画分の酵素活性を測定して「菌体内ＧＤＨ」の活性とした。また、培養上清中の培地成分を除去する目的で培養上清をＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、スウェーデン）にかけ、１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にて溶出して得られたＧＤＨ画分の酵素活性を測定して「菌体外ＧＤＨ」の活性とした。【００９２】
（５）本発明の酵母形質転換体によるＧＤＨの生産
前述の酵素活性測定法により測定を行った結果、「菌体内ＧＤＨ」の活性は４．６Ｕ／ｍＬ、「菌体外ＧＤＨ」の活性は２７．６Ｕ／ｍＬであった。すなわち、本発明の形質転換体を培養した場合は、生産されるＧＤＨの大半は培養上清中に分泌されることが確認された。そして、このことは、本発明のＧＤＨにおいて、Ｍｕｃｏｒ由来のシグナル配列が異種の宿主である酵母内においても機能し、しかもむしろ本来の由来微生物により達成されるよりも効率良くＧＤＨを培養上清中に分泌させることができたことを意味する。一般には、シグナル配列の機能は、そのタンパク質を生産する宿主に限定的であることが多く、ある宿主において効果的なシグナル配列が異種の宿主に同様の効果を奏することはほとんどないことから、この結果は全く予期せぬ効果であった。
上述の通り、本発明の酵母形質転換体の培養上清からは、植菌後２４時間の培養後で２７．６Ｕ／ｍＬのフラビン結合型ＧＤＨが確認されている。また、このＧＤＨは培養上清中にほぼシングルバンドの純度で存在するため、非常に効率的に精製工程を行うことができる。一方、実施例１の表１記載の通り、Ｍｕｃｏｒ属やＡｂｓｉｄｉａ属、Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ属等のケカビ由来の本来のＧＤＨ生産微生物を培養して得られる酵素の生産量は、０．００１Ｕ／ｍＬ未満か、０．１〜０．２Ｕ／ｍＬのものが多く、最大でも０．７１４Ｕ／ｍＬというレベルにとどまっていた。すなわち、本発明の酵母形質転換体を用いることによって、培養液あたり４０〜２００倍以上の酵素活性を得ることができ、より小さい設備で効率よく製造を行うことができるようになる。さらには、これら本来のＧＤＨ生産微生物の培養工程には、３〜５日という長期間培養工程と、遠心分離で菌体を取得し菌体破砕（酵素抽出）を行う工程、さらに、再度遠心分離して粗酵素液を調製するという工程が含まれるが、本発明の酵母形質転換体を用いることによって、培養日数および、菌体破砕（酵素抽出）工程を大幅に短縮することができるようになり、効率的な製造が可能となる。【００９３】
（６）本発明の酵母形質転換体が生産するＧＤＨの分子量と糖鎖の付加状態
本発明の酵母形質転換体の培養上清をＭｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−５０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、米国）を用いて５０倍濃縮し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（スーパーセップエース１０〜２０％、和光純薬工業社製）に供した。泳動サンプルは以下の通りである。結果を図８に示す。
レーン１：分子量マーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（１０〜２５０ｋＤａ），上から２５０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、６０ｋＤａ、５０ｋＤａ、４０ｋＤａ、３０ｋＤａ）
レーン２：コントロール株の培養上清（５０倍濃縮サンプル）
レーン３：本発明の酵母形質転換体の培養上清（５０倍濃縮サンプル）【００９４】
図８の通り、本発明の酵母形質転換体の培養上清中には、コントロール株の培養上清からは検出されないバンドが検出された。このバンドは本発明のＧＤＨに相当し、分子量にして約２００ｋＤａを中心付近とし、バンドの上端から下端は分子量にして約１５０〜２５０ｋＤａに及ぶ幅広のシングルバンドである。このような幅広のバンドの様子からは、このタンパク質に多量の糖鎖が付加されていることが強く示唆される。
なお、本発明に用いるＧＤＨの本来の由来微生物であるケカビが生産するＧＤＨにおいても、このような糖鎖の付加が認められており、図６に示す通り、ＧＤＨから糖鎖を外す処理を行う前後で、検出されるバンドの分子量の変化が確認されている。糖鎖を外す前のケカビ由来ＧＤＨは、微生物の種類によって若干の幅を有するが、バンドの幅の中心付近に相当する分子量にして約１００〜１５０ｋＤａであり、実施例７に記載の酵母形質転換体に用いられたＭｐＧＤＨの場合は、約１００ｋＤａである。一方、このＭｐＧＤＨの遺伝子情報を利用して作製した本発明の酵母形質転換体の培養上清中に認められるＧＤＨは、糖鎖を外す前の分子量が、バンドの幅の中心付近に相当する分子量として約２００ｋＤａであり、本来の由来微生物中で発現する場合の約２倍に増加していることがわかる。
より具体的な糖鎖の付加状況の詳細については、各種公知の分析方法を用いることにより明らかになるであろうが、上述の分子量変化からも容易に推察されるように、本発明の酵母形質転換体を用いることにより、ケカビ由来ＧＤＨと同じポリペプチド配列を有するＧＤＨでありながら、糖鎖の付加状態が大きく異なる新規なＧＤＨを製造することができることがわかった。そして、本発明のＧＤＨにおけるこのような糖鎖の付加状態の変化がＧＤＨの酵素としての性質に顕著な変化をもたらすことにより、実用性に一層優れたＧＤＨを提供することが可能となることは、全く予期せぬ効果であった。【００９５】
（７）本発明の酵母形質転換体が生産するＧＤＨの諸性質
実施例３に準じて、本発明の酵母形質転換体の培養上清から取得された本発明のフラビン結合型ＧＤＨにおける至適ｐＨ、至適温度範囲、熱安定性、安定ｐＨの範囲、基質特異性等の諸性質を調べた。その結果、本発明の酵母形質転換体が生産する本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、特にその熱安定性において、ケカビ由来ＧＤＨの熱安定性よりも優れていることが確認された。その結果を図９に示す。
図４に示す通り、本来の由来微生物であるケカビによって生産されるＧＤＨは、３５℃まではほとんど失活せず、４０℃、１５分間の処理で８０％以上の残存活性を有することを特徴とする。そして、４５℃、１５分間の処理では残存活性が４０〜６０％となり、５０℃、１５分間の処理により、３種のうち２種では完全に失活し、最も耐熱性の高い１種でも約４０％まで低下した。そして、５５℃以上の熱処理に供した場合は、いずれも完全に失活した。
これに対し、図９に示す通り、本発明の酵母形質転換体の培養上清から取得された本発明のフラビン結合型ＧＤＨでは、４０℃、１５分間の処理ではほぼ１００％の活性が残存剤していた。さらに、４５℃、１５分間の処理でも残存活性が８０％を超えており、５０℃、１５分間の処理でも５０％以上、ほぼ６０％に近い残存活性が確認された。さらに、ケカビにおいて生産させたものでは１５分間の熱処理により完全に失活していた５５℃以の熱処理に供した場合においても、約１０％の残存活性が確認された。
図１０の黒丸のプロットは、本発明の酵母形質転換体により生産されるＧＤＨを５０℃での熱処理に供した際の、熱処理時間と残存活性との関係を示す。この結果、本発明の酵母形質転換体により生産されるＧＤＨは、５０℃での熱処理を３０分間行っても、２０％を超える活性が残存していることがわかる。このような熱安定性は、本来の由来微生物が生産するＧＤＨと比較して、顕著に優れている。本来のケカビで生産されるＧＤＨでは達成できなかったこのように高い耐熱性が、酵母形質転換体を用いることにより獲得されるという本発明の知見は、製造・流通時に非常に有利であるとともに、酵素の使用時においても、より広範な温度範囲での用途が可能となるという点で非常に優れた新規な酵素を提供でき、ＧＤＨの付加価値を高めることに寄与する。
なお、耐熱性以外のその他の性質においては、本発明の酵母形質転換体の培養上清から取得された本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、実施例２により得られた精製ＧＤＨと同様の性質を有していることが確認された。【００９６】
（８）麹菌を宿主とする形質転換体が生産するＧＤＨの耐熱性に関する比較検討
本発明においては、宿主として酵母を用いているが、比較のため、酵母以外の宿主を用いて同様に形質転換体を作製し、得られるＧＤＨの耐熱性を比較を行った。比較用の宿主としては、本来の由来微生物と同じカビの一種である麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）を用いた。
具体的には、Ｄｏｕｂｌｅ−ｊｏｉｎｔ  ＰＣＲ（Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００４年，第４１巻，ｐ９７３−９８１）を行い、５’アーム領域〜ＰｙｒＧ遺伝子（ウラシル栄養要求性マーカー）〜ＴＥＦ１プロモーター遺伝子〜フラビン結合型ＧＤＨ遺伝子〜３’アーム領域から成るカセットを構築し、Aspergillus sojae K.K.1-2株を宿主に、プロトプラスト−ＰＥＧ法により形質転換を行った。得られた菌株の中から目的の麹菌形質転換体を、ＰＣＲで確認して選抜した。【００９７】
次いで、０．８％散水した小麦ふすまを１５０ｍＬ三角フラスコに５ｇ取り、綿栓をして１２１℃、５０分オートクレーブ滅菌したものに対し、上記の麹菌形質転換体の分生子懸濁液を、１×１０５／ｇ麹となるように植菌し、３０℃、６４時間培養した。コントロール株としては、形質転換をしていない麹菌宿主を用いた。
培養後のふすま麹２ｇに対し、５倍量の１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加え、ポリトロンホモジナイザーＰＴ３０００（キネマチカ社製）で３０秒×８回破砕を行った。破砕後、１４，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離を行い、得られた上清画分を粗酵素液とした。前述の酵素活性測定法により、この粗酵素液中のＧＤＨ活性を測定したところ、コントロール株を用いて得られた粗酵素液中のＧＤＨ活性は０．３Ｕ／ｍＬであったのに対し、麹菌形質転換体を用いて得られた粗酵素液中のＧＤＨ活性は１４．０Ｕ／ｍＬであり、麹菌形質転換体において本発明のフラビン結合型ＧＤＨが発現されていることが確認された。【００９８】
実施例２に準じて得られた上記の麹菌形質転換体により生産されたケカビ由来精製フラビン結合型ＧＤＨを、上述の（６）の方法に準じてＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供した。泳動サンプルは以下の通りである。結果を図１１に示す。なお、レーン２および３のサンプルは、別の形質転換体により生産されたＧＤＨである。
レーン１：分子量マーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（１０−２５０ｋＤａ），上から２５０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、６０ｋＤａ、５０ｋＤａ、４０ｋＤａ、３０ｋＤａ）
レーン２、３：得られた麹菌形質転換体により生産されたＧＤＨ【００９９】
図１０の通り、麹菌形質転換体により生産されるケカビ由来ＧＤＨは、分子量にして約９０ｋＤａを中心付近とし、バンドの上端から下端は分子量にして約８０〜１００ｋＤａに及ぶ幅広のシングルバンドである。
図６、図８、および図１１のバンドを比較した場合、麹菌形質転換体により生産されるケカビ由来ＧＤＨの分子量は、本来の由来微生物であるケカビにより生産されるＧＤＨの分子量に非常に近く、一方、本発明の酵母形質転換体により生産されるケカビ由来ＧＤＨの分子量とは大きく異なっていることがわかる。すなわち、このことから推察して、麹菌形質転換体により生産されるケカビ由来ＧＤＨにおける糖鎖の付加状態は、本来の由来微生物であるケカビにより生産されるＧＤＨにおける糖鎖の付加状態に近く、一方、本発明の酵母形質転換体により生産されるケカビ由来ＧＤＨの糖鎖の付加状態とは大きく異なっていることが強く示唆された。
実際に、この麹菌形質転換体により生産されるケカビ由来ＧＤＨの耐熱性データを図１０に示す。図１０の白三角のプロットは、麹菌形質転換体により生産されるＧＤＨを５０℃での熱処理に供した際の、熱処理時間と残存活性との関係を示す。この結果、麹菌形質転換体により生産されるＧＤＨは、５０℃での熱処理を１５分間行うことにより、残存活性が２０％未満に低下した。また、３０分間の処理では、残存活性が１０％未満に低下した。この熱安定性は、本来の由来微生物が生産するＧＤＨと比較して格別向上していないどころか、むしろ低下傾向を示しているとも思われる。
すなわち、ケカビ由来のＧＤＨ遺伝子を各種の宿主に導入した場合において、本来の酵素の性質を保持した状態で活性を容易に発現できるとは限らず、まして、本来の酵素の性質よりも優れた状態の酵素として活性を発現させるということは容易に実現できないことである。本発明の酵母形質転換体を用いることによりこれが実現できるという知見は、製造・流通時に非常に有用で、かつ、広範な温度範囲での用途が可能である新規な酵素を提供できるという点で非常に有意義であり、より付加価値の高いＧＤＨの提供に寄与する。
麹菌形質転換体により生産されるケカビ由来ＧＤＨの熱安定性は、本発明の酵母形質転換対により生産されるＧＤＨの熱安定性よりは、図６に示されている本来の由来微生物であるケカビにより生産されるＧＤＨの熱安定性に比較的近いことが認められる。そして、この結果からは各ＧＤＨにおける糖鎖の付加状況と熱安定性の類似性と相関を有することが示唆される。すなわち、本発明の酵母形質転換体により生産されるＧＤＨには多量の糖鎖が付加しており、このことにより、本来の由来微生物であるケカビにより生産されるＧＤＨが有し得なかった高い耐熱性を獲得するに至ったのではないかという可能性が推察される。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
溶存酸素の影響を受けにくく、試料中にグルコース以外の糖化合物が存在する場合でも、グルコース量を正確に測定できるとともに耐熱性に優れたフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを効率的に製造できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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