(57)【要約】  式(I) で表される化合物又はその塩(R1はベンゼン環上の置換基を示し；R2は一価の置換基を示し；R3及びR4は水素原子又はアルキル基を示し；R5及びR6はアルキル基又はアリール基を示し；R7及びR8は水素原子又はアルキル基を示し；R9及びR10は水素原子又は一価の置換基を示し；Xは珪素原子、ゲルマニウム原子、又はスズ原子を示す）。2012111818.tif 000042
2012111818.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式(I)：
【化１】
2012111818.tif 000037
（式中、R1はベンゼン環上に存在する1ないし4個の同一又は異なる一価の置換基を示し；R2は一価の置換基を示し；R3及びR4はそれぞれ独立に水素原子、又は炭素数1〜6個のアルキル基を示し；R5及びR6はそれぞれ独立に炭素数1〜6個のアルキル基又はアリール基を示し；R7及びR8はそれぞれ独立に水素原子、炭素数1〜6個のアルキル基を示し；
R9及びR10はそれぞれ独立に水素原子、又は一価の基を示し；Xは珪素原子、ゲルマニウム原子、又はスズ原子を示す）
で表される化合物又はその塩
【請求項２】
Xが珪素原子又はゲルマニウム原子である請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
R1又はR2がプロトン、金属イオン、活性酸素種、低酸素環境、酵素活性、又はグルタチオンを捕捉可能な捕捉基であり、R9及びR1が水素原子である請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
R9及び/又はR10がプロトン、金属イオン、活性酸素種、低酸素環境、酵素活性、又はグルタチオンを捕捉可能な捕捉基であり、R1及びR2が水素原子である請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
【請求項５】
R9及び/又はR10がペプチダーゼ、プロテーアーゼ、ラクタマーゼ、糖加水分解酵素、転移酵素、酸化還元酵素からなる群から選ばれる酵素活性を捕捉するための捕捉基である請求項４に記載の化合物又はその塩。
【請求項６】
R9及び/又はR10がぺプチダーゼ、プロテアーゼ、及びラクタマーゼからなる群から選ばれる酵素により切断される捕捉基である請求項４及び５に記載の化合物又はその塩。
【請求項７】
R9及び/又はR10がぺプチダーゼ又はプロテアーゼがカスパーゼ、前立腺特異抗原、ロイシンアミノペプチダーゼ、γ-グルタミルタランスペプチターゼからなる群から選ばれる酵素により切断される捕捉基である請求項４ないし６に記載の化合物又はその塩。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載の一般式(I)で表される化合物を含む蛍光プローブ。
【請求項９】
R1又はR2がプロトン、金属イオン、活性酸素種、低酸素環境、酵素活性、又はグルタチオンを捕捉可能な捕捉基であり（ただし、R1とR2が同時に捕捉基であることはなく）、R9及び/又はR10がプロトン、金属イオン、活性酸素種、低酸素環境、酵素活性、又はグルタチオンを捕捉可能な捕捉基である請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
【請求項１０】
測定対象物質の測定方法であって、下記の工程：(a)請求項１に記載の一般式(I)で表される化合物又はその塩と測定対象物質とを接触させる工程、及び(b)上記工程(a)で生成した測定対象物質の捕捉後の化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の一般式(I)で表される化合物 (ただし、R3及びR4が水素原子を示し、R5及びR6がそれぞれ独立に炭素数1〜6個のアルキル基又はアリール基を示し；R7及びR8が水素原子を示し；R9及びR10が水素原子を示し；Xが珪素原子、ゲルマニウム原子、又はスズ原子を示す)又はその塩の製造方法であって、下記の工程：
(a)3-ハロゲン化アニリンとアリルハライドから製造される3-ハロゲン化-N,N-ジアリルアニリンとホルムアルデヒドから下記の一般式(II)：
【化２】
2012111818.tif 000038
(式中、R11はハロゲン原子を示す)で表される化合物を製造する工程、
(b)上記の一般式(II)で表される化合物とジクロロジアルキルシランとを反応させ後、酸化反応によって下記のN,N,N',N'-テトラアリル-ジアミノ-Si-キサントンを製造する工程、
【化３】
2012111818.tif 000039
(c) N,N,N',N'-テトラアリル-ジアミノ-X-キサントンとハロゲン化ベンゼン誘導体から下記の一般式(III)：
【化４】
2012111818.tif 000040
(式中、R1及びR2は上記と同義であるが、R1及びR2の置換基の種類によっては、上記の一般式(III)を製造するために該置換基に保護基が必要な場合があり、この場合には該置換基に適宜保護基を導入してもよい)で表される化合物を製造する工程
(d) 上記の一般式(III）で表される化合物の脱アリル化を行い、上記の一般式(I)（式中、R3及びR4が水素原子を示し、R5及びR6がそれぞれ独立に炭素数1〜6個のアルキル基又はアリール基を示し；R7及びR8が水素原子を示し；R9及びR10が水素原子を示し；Xは珪素原子、ゲルマニウム原子、又はスズ原子を示す）の化合物を製造する工程（R1及びR2に上記の一般式(III)を製造するために保護基を導入した場合には、該保護基の脱保護を工程(d)の前後又は同時に行ってもよい）
を含む方法。
【請求項１２】
下記の一般式(III)：
【化５】
2012111818.tif 000041
(式中、R1、R2、R5、R6、及びXは請求項１１における定義と同義である)
で表される化合物又はその塩。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な蛍光プローブに関する。より具体的には、プロトン、金属イオン、活性酸素種、低酸素環境、酵素活性、又はグルタチオンなどの測定対象物質を捕捉基を介して捕捉することにより蛍光を発する蛍光プローブに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ローダミンはフルオレセインと同様に古くから知られる蛍光色素である。両者はともに、水中で高い蛍光量子収率を持つことから、蛍光性のタグとして広く生物学領域に応用されてきた。また近年、蛍光プローブを用いた生細胞イメージング技法が盛んに用いられているが、この手法で大きな役割を果たす蛍光プローブの母核としてもローダミンは汎用されている。【０００３】
ローダミン骨格を持つ蛍光プローブとしては、一酸化窒素検出用(国際公開WO1999001447）、次亜塩素酸検出用(国際公開WO2007100061)などがこれまでに報告されている。また、ローダミンの基本骨格であるパイロニンY(PY)の酸素原子を珪素原子に置換した化合物(TMDHS：2,7-N,N,N',N'-テトラメチル-9-ジメチル-10-ヒドロ-9-シラアントラセン)及びこの化合物の蛍光プローブへの応用については既に報告がある(Best, Qら、Pacifichem, 2010, 演題番号2335、2010年12月19日；小出裕一郎ら、第4回日本分子イメージング学会, 演題番号P8-9, 2009年5月14日)。【０００４】
このTMDHSを基本骨格として有する蛍光プローブは基本的に分子内光誘起電子移動(photoinduced electron transfer: PeT)およびスピロ環の開環や閉環を利用するプローブである。しかしながら、TMDHSなど従来報告されたPYの酸素原子を珪素原子に置換した化合物はいずれも2位及び7位のアミノ基がメチル基等の水素原子以外の置換基で置換されている。なお、ローダミンにおいて3位及び6位のアミノ基が無置換である化合物（以下、本明細書において「N,N-無置換Oローダミン」と呼ぶ場合がある）の酸素原子を珪素原子に置換したローダミン類縁体についての報告は未だなく、そのようなローダミン類縁体を用いた蛍光プローブについても未だ報告がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開WO1999001447
【特許文献２】国際公開WO2007100061
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Best, Qら、Pacifichem 2010, 演題番号2335、2010年12月19日
【非特許文献２】小出裕一郎ら、第4回日本分子イメージング学会, 演題番号P8-9, 2009年5月14日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、新規な蛍光プローブを提供することにある。より具体的には、3位及び6位のアミノ基が無置換であるローダミンのキサンテン環部位の10位の酸素原子を珪素原子に置換した化合物、及び該化合物の製造方法、並びに該化合物を利用した蛍光プローブ、及び該蛍光プローブを用いる測定対象物質の測定方法を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、3-ブロモ-N,N-ジアリルアニリンを原料としてN,N,N',N'-テトラアリルジアミノ-Si-キサントンを製造し、N,N,N',N'-テトラアリルジアミノ-Si-キサントンとハロゲン化ベンゼン誘導体とを反応させた後にアリル基を脱離させると、3位及び6位のアミノ基が無置換であるローダミンのキサンテン環部位の10位の酸素原子を珪素原子に置換した化合物（以下、本明細書において「N,N-無置換Siローダミン」と呼ぶ場合がある。)を製造できることを見出した。【０００９】
また、N,N-無置換Siローダミンの9位のベンゼン環に測定対象物質を捕捉可能な基(以下、本明細書において「捕捉基」と呼ぶ場合がある）を導入することによって分子内光誘起電子移動を利用した高感度な蛍光off/on型プローブやon/off型プローブ、該ベンゼン環の2位の置換基が形成するラクトン環又はラクタム環などスピロ環の開環や閉環などを利用したプロトン、金属イオン、活性酸素種、低酸素環境、酵素活性、又はグルタチオンなどに対する高感度な蛍光off/on型プローブを設計できることを見出した。さらに、N,N-無置換SiローダミンはN,N-無置換Oローダミンであるローダミン110に対して吸収波長と蛍光波長が約90nm長波長シフトすること、及びN,N-無置換Siローダミンのキサンテン環の3位又は6位の無置換のアミノ基に一つ捕捉基を導入すると該捕捉基が導入されたN,N-無置換Siローダミンの吸収波長が90nm程度短波長にシフトすることから、この捕捉基の導入による吸収波長の変化を利用したプロトン、金属イオン、活性酸素種、低酸素環境、酵素活性、又はグルタチオンなどに対する高感度な蛍光プローブを設計できることを見出した。【００１０】
例えば、N,N-無置換Siローダミンのキサンテン環の3位又は6位の無置換のアミノ基を一つアシル化した化合物の極大吸収波長は500nm付近であり590nm付近の光は吸収しないので、590nm付近の励起光で測定を行うと全く蛍光を発しないが、そのアシル基を除去することにより極大吸収波長が590nm付近に移動するので590nm付近の励起光で測定を行うと610nm付近の強い蛍光を観察できる。この性質を利用することによりN,N-無置換Siローダミンのキサンテン環の3位又は6位の無置換のアミノ基を一つアシル化した化合物をぺプチダーゼ、プロテアーゼ、又はβ-ラクタマーゼ活性測定用の蛍光プローブとして利用することができる。本発明は上記の知見を基に完成されたものである。【００１１】
すなわち、本発明により、下記の一般式(I)：
【化１】
2012111818.tif 000003
(式中、R1はベンゼン環上に存在する1ないし4個の同一又は異なる一価の置換基を示し；R2は一価の置換基を示し；R3及びR4はそれぞれ独立に水素原子、又は炭素数1〜6個のアルキル基を示し；R5及びR6はそれぞれ独立に炭素数1〜6個のアルキル基又はアリール基を示し；R7及びR8はそれぞれ独立に水素原子、炭素数1〜6個のアルキル基を示し；R9及びR10はそれぞれ独立に水素原子、又は一価の置換基を示し；Xは珪素原子、ゲルマニウム原子、又はスズ原子を示す)で表される化合物又はその塩が提供される。【００１２】
上記発明の好ましい態様によれば、R1が水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する1又は2個の一価の置換基(該置換基は、測定対象物質を捕捉可能な捕捉基、炭素数1〜6個のアルキル基、炭素数1〜6個のアルケニル基、炭素数1〜6個のアルキニル基、炭素数1〜6個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれる)を示し、R2は一価の置換基(該置換基は、測定対象物質を捕捉可能な捕捉基、炭素数1〜6個のアルキル基、炭素数1〜6個のアルケニル基、炭素数1〜6個のアルキニル基、炭素数1〜6個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれる)を示し、R3及びR4がそれぞれ独立に水素原子又は炭素数1〜6個のアルキル基を示し、R5及びR6がそれぞれ独立に炭素数1〜6個のアルキル基を示し、R7及びR8がそれぞれ独立に水素原子又は炭素数1〜6個のアルキル基を示し、R9及びR10は水素原子、又は測定対象物質を捕捉可能な捕捉基を示し、Xは珪素原子又はゲルマニウム原子を示す化合物又はその塩が提供される。【００１３】
さらに好ましい態様によれば、R1が水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する1又は2個の一価の置換基(該置換基は測定対象物質を捕捉可能な捕捉基、炭素数1〜6個のアルキル基、炭素数1〜6個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれる)を示し、R2は一価の置換基(該置換基は、測定対象物質を捕捉可能な捕捉基、炭素数1〜6個のアルキル基、炭素数1〜6個のアルケニル基、炭素数1〜6個のアルキニル基、炭素数1〜6個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれる)を示し、R3及びR4が水素原子を示し、R5及びR6がそれぞれ独立に炭素数1〜3個のアルキル基を示し、R7及びR8が水素原子を示し、R9及びR10はそれぞれ独立に水素原子であるか、あるいは測定対象物質を捕捉可能な捕捉基を示し；Xは珪素原子を示す上記の化合物又はその塩が提供される。【００１４】
なお、上記態様において、R1又はR2とR9及び/又はR10が同時に捕捉基であってもよいが、R1又はR2が捕捉基である場合には、同時にR9及び/又はR10が捕捉基ではないことが好ましく、R9及び/又はR10が捕捉基である場合には、同時にR1及びR2が捕捉基ではないことが好ましい。R1又はR2とR9及び/又はR10が同時に捕捉基であってR1又はR2にPeT型のoff/on型プローブとして機能する捕捉基が置換し、R9及び/又はR10に吸収波長の変化を利用した捕捉基が置換した場合には、例えば、PeT型の捕捉基により蛍光がoff/onし、吸収波長の変化を利用した捕捉基により励起波長も変化するので、二つの測定対象の時空間的な変化を測定することができる。【００１５】
別の観点からは、蛍光プローブの製造に用いるための上記一般式(I)(式中、R9及びR10は水素原子を示す)で表される化合物又はその塩、及び蛍光プローブの製造のための上記一般式(I)で表される化合物又はその塩の使用が本発明により提供される。【００１６】
さらに別の観点からは、本発明により、上記一般式(I) (式中、R1又はR2が捕捉基を示し、R9及びR10は水素原子を示す)で表される化合物又はその塩を含むプロトン、金属イオン、活性酸素種、低酸素環境、酵素活性、又はグルタチオンなどの測定用蛍光プローブ；上記一般式(I) (式中、R9及び/又はR10が捕捉基を示し、R1及びR2は捕捉基以外の一価の置換基を示す) で表される化合物又はその塩を含むプロトン、金属イオン、活性酸素種、低酸素環境、酵素活性、又はグルタチオンなどの測定用蛍光プローブ；上記一般式(I) (式中、R1又はR2が捕捉基を示し、R9及び/又はR10が捕捉基を示す)で表される化合物又はその塩を含むプロトン、金属イオン、活性酸素種、低酸素環境、酵素活性、又はグルタチオンからなる群から選ばれる二つの測定対象を測定するための測定用蛍光プローブが提供される。また、上記一般式(I)(式中、R1及びR2は捕捉基以外の一価の置換基を示し、R9及び/又はR10は酵素活性及びグルタチオンの捕捉基を示す)で表される化合物又はその塩を含む酵素活性及びグルタチオンの測定用の蛍光プローブ；上記一般式(I)(式中、R1及びR2は捕捉基以外の一価の置換基を示し、R9及び/又はR10はぺプチダーゼ、プロテアーゼ、及びβ-ラクタマーゼからなる群から選ばれる酵素の捕捉基を示す) で表される化合物又はその塩を含むぺプチダーゼ、プロテアーゼ、又はβ-ラクタマーゼなどの測定用蛍光プローブが提供される。【００１７】
また、上記の一般式(I)(式中、R3及びR4が水素原子を示し、R5及びR6がそれぞれ独立に炭素数1〜6個のアルキル基又はアリール基を示し；R7及びR8が水素原子を示し；R9及びR10が水素原子を示し；Xが珪素原子、ゲルマニウム原子、又はスズ原子を示す)で表される化合物又はその塩の製造方法であって；
(a)3-ハロゲン化アニリンとアリルハライドから製造される3-ハロゲン化-N,N-ジアリルアニリンとホルムアルデヒドから下記の一般式(II)：
【化２】
2012111818.tif 000004
(式中、R11はハロゲン原子を示す)で表される化合物を製造する工程、
(b)上記の一般式（II）で表される化合物とX(Halo)2(R5)(R6)(Haloは塩素原子又は臭素原子を示し、X、R4、及びR5は上記と同義である)とを反応させ後、酸化反応によって下記のN,N,N',N'-テトラアリル-ジアミノ-X-キサントンを製造する工程、
【化３】
2012111818.tif 000005
(c) N,N,N',N'-テトラアリル-ジアミノ-X-キサントンとハロゲン化ベンゼン誘導体から下記の一般式(III)：
【化４】
2012111818.tif 000006
(式中、R1及びR2は上記と同義であるが、R1及びR2の置換基の種類によっては、上記の一般式(III)を製造するために該置換基に保護基が必要な場合があり、この場合には該置換基に適宜保護基を導入してもよい)で表される化合物を製造する工程、及び
(d) 上記の一般式(III）で表される化合物の脱アリル化を行い、上記の一般式(I)（式中、R3及びR4が水素原子を示し、R5及びR6がそれぞれ独立に炭素数1〜6個のアルキル基又はアリール基を示し；R7及びR8が水素原子を示し；R9及びR10が水素原子を示し；Xは珪素原子、ゲルマニウム原子、又はスズ原子を示す）の化合物を製造する工程（R1及びR2に上記の一般式(III)を製造するために保護基を導入した場合には、該保護基の脱保護を工程(d)の前後又は同時に行ってもよい）のいずれか1つ以上の工程、好ましくは連続した2以上の工程を含む方法が提供される。脱アリル化に際して上記の一般式(III)で表される化合物を還元して9H-キサンテンとした後に脱アリル化を行うことも反応収率を改善するために好ましい。【００１８】
さらに、上記の一般式(I)で表される化合物又はその塩の製造方法であって、上記工程(d)を含む方法；上記の一般式(I)で表される化合物又はその塩の製造方法であって、上記工程(c)及び(d)を含む方法；上記の一般式(I)で表される化合物又はその塩の製造方法であって、上記工程(b)、(c)、及び(d)を含む方法；上記の一般式(I)で表される化合物又はその塩の製造方法であって、上記工程(a)、(b)、(c)、及び(d)を含む方法が提供される。【００１９】
上記の製造方法の好ましい態様であって；
(a)3-ハロゲン化アニリンとアリルハライドから製造される3-ハロゲン化-N,N-ジアリルアニリンとホルムアルデヒドから下記の一般式(II)：
【化５】
2012111818.tif 000007
(式中、R11はハロゲン原子を示す)で表される化合物を製造する工程、
(b)上記の一般式（II）で表される化合物とジクロロジメチルシランとを反応させ後、酸化反応によって下記のN,N,N',N'-テトラアリル-ジアミノ-Si-キサントンを製造する工程、
【化６】
2012111818.tif 000008
(c) N,N,N',N'-テトラアリル-ジアミノ-Si-キサントンとハロゲン化ベンゼン誘導体から下記の一般式(IIIa)：
【化７】
2012111818.tif 000009
(式中、R1及びR2は上記と同義であるが、R1及びR2の置換基の種類によっては、上記の一般式(IIIa)を製造するために該置換基に保護基が必要な場合があり、この場合には該置換基に適宜保護基を導入してもよい)で表される化合物を製造する工程、及び
(d) 上記の一般式(IIIa）で表される化合物の脱アリル化を行い、上記の一般式(I)（式中、R3及びR4が水素原子を示し、R5及びR6がメチル基を示し；R7及びR8が水素原子を示し；R9及びR10が水素原子を示し；Xは珪素原子を示す）の化合物を製造する工程（R1及びR2に上記の一般式(IIIa)を製造するために保護基を導入した場合には、該保護基の脱保護を工程(d)の前後又は同時に行ってもよい）
のいずれか1つ以上の工程、好ましくは連続した2以上の工程を含む方法も提供される。脱アリル化に際して上記の一般式(IIIa)で表される化合物を還元して9H-キサンテンとした後に脱アリル化を行うことも反応収率を改善するために好ましい。【００２０】
さらに、上記の一般式(I)(式中、R3及びR4が水素原子を示し、R5及びR6がメチル基を示し；R7及びR8が水素原子を示し；R9及びR10が水素原子を示し；Xは珪素原子を示す)で表される化合物又はその塩の製造方であって、上記工程(d)を含む方法；上記の一般式(I)(式中、R3及びR4が水素原子を示し、R5及びR6がメチル基を示し；R7及びR8が水素原子を示し；R9及びR10が水素原子を示し；Xは珪素原子を示す)で表される化合物又はその塩の製造方であって、上記工程(c)及び(d)を含む方法；上記の一般式(I)(式中、R3及びR4が水素原子を示し、R5及びR6がメチル基を示し；R7及びR8が水素原子を示し；R9及びR10が水素原子を示し；Xは珪素原子を示す)で表される化合物又はその塩の製造方であって、上記工程(b)、(c)、及び(d)を含む方法；及び上記の一般式(I)(式中、R3及びR4が水素原子を示し、R5及びR6がメチル基を示し；R7及びR8が水素原子を示し；R9及びR10が水素原子を示し；Xは珪素原子を示す)で表される化合物又はその塩の製造方であって、上記工程(a)、(b)、(c)、及び(d)を含む方法が提供される。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により提供される一般式(I)で表される化合物又はその塩は、R1、R2、R9、及びR10の1ないし2個が測定対象物質を捕捉可能な捕捉基である場合（ただし、R1とR2が同時に捕捉基であることはない）、測定対象物質の捕捉前後で蛍光特性が変化する性質を有しており、この性質を利用することにより、一般式(I)で表される化合物又はその塩はプロトン、金属イオン、活性酸素種、低酸素環境、酵素活性、又はグルタチオンなどの測定対象物質を高感度に測定可能な蛍光プローブを製造するための化合物として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】1% DMSOを含む0.1 M リン酸ナトリウムバッファー中で2-Me SiR600(例2(3))のpHプロファイルを吸収スペクトル(上段)及び蛍光スペクトル(下段)で示した図である。蛍光は励起波長593 nmで測定した。
【図２】1% DMSOを含む0.1 M リン酸ナトリウムバッファー中でN-アセチル-2-Me SiR600(例2(4))のpHプロファイルを吸収スペクトル(上段)及び蛍光スペクトル(下段)で示した図である。蛍光は励起波長505 nmで測定した。
【図３】1% DMSOを含む0.1 M リン酸ナトリウムバッファー中で2-COOH SiR600(例2(6))のpHプロファイルを吸収スペクトル(上段)及び蛍光スペクトル(下段)で示した図である。蛍光は励起波長590 nmで測定した。
【図４】1% DMSOを含む0.1 M リン酸ナトリウムバッファー中で2-COOH SiR600(例2(6)) (1μM)及びN-アセチル-2-COOH SiR600(例2(7)) (1μM)のpHプロファイルを吸収スペクトルで示した図である。
【図５】1% DMSOを含む0.1 M リン酸ナトリウムバッファー中でZ-DEVD-SiR600(例4(2))のpHプロファイルを吸収スペクトルで示した図である。下段はZ-DEVD-SiR600のpH依存的吸収減少を説明したスキームである。
【図６】Z-DEVD-SiR600(例4(2))をcaspase-3と反応させた場合の反応スキーム(a)、並びに吸収スペクトル(b)、蛍光スペクトル(c)、及び反応の動力学パラメータ(d)を示した図である。蛍光は励起波長593 nmで測定した。
【図７】Leu-SiR600(例4(3))をLAPと反応させた場合の反応スキーム(a)、並びに吸収スペクトル(b)及び蛍光スペクトル(c)を示した図である。蛍光は励起波長593 nmで測定した。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基(例えばアルコキシ基など)のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数1〜6個、好ましくは炭素数1〜4個、さらに好ましくは炭素数1〜3個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、n-ブチル基、sec-ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、シクロプロピルメチル基、n-ペンチル基、n-ヘキシル基などを挙げることができる。本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
【００２４】
一般式(I)で表される化合物において、R1は水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する1ないし4個の同一又は異なる一価の置換基を示す。R1がベンゼン環上に存在する一価の置換基を示す場合には、ベンゼン環上に同一又は異なる置換基が1ないし2個程度存在していることが好ましい。R1が1個又は2個以上の一価の置換基を示す場合には、該置換基はベンゼン環上の任意の位置に置換することができる。好ましくは、R1は水素原子を示すか、1個の置換基が存在する場合である。
【００２５】
R1が示す一価の置換基は、測定対象物質に対する捕捉基として作用する置換基であってもよい。捕捉基として作用する置換基は、単独で捕捉基として作用する置換基であってもよく、あるいはベンゼン環上の2個以上の置換基の組み合わせにより、好ましくはベンゼン環上において隣接する2個の置換基の組み合わせにより捕捉基として作用する置換基であってもよい。このような2個の置換基が結合して環状構造を形成していてもよく、測定対象物質との反応後に該環状構造が開環構造に変化するものであってもよい。あるいは隣接する2個の置換基が測定対象物質との反応後にこれらの2個の置換基とともに環状構造を形成するものであってもよい。捕捉基として作用するためにベンゼン環が捕捉基の一部を形成していてもよい。さらに、単独で捕捉基として作用する置換基がベンゼン環上に2個以上結合していてもよく、異なる測定対象物質に対してそれぞれ捕捉基として作用する異なる2種以上の置換基がベンゼン環上に存在していてもよい。ベンゼン環上において捕捉基として作用する1個又は2個以上の置換基の置換位置は特に限定されず、任意の位置に置換することができる。
【００２６】
測定対象物質の種類は特に限定されず、例えば、プロトン、金属イオン(例えば、ナトリウムイオンやリチウムイオンなどのアルカリ金属イオン、カルシウムイオンなどのアルカリ土類金属イオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオンなど)、活性酸素種（例えば、ヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、次亜塩素酸、過酸化水素など）、低酸素環境、又は酵素（ペプチダーゼ、プロテーアーゼ、ラクタマーゼ、糖加水分解酵素、転移酵素、酸化還元酵素）、グルタチオンなどのいずれであってもよい。
【００２７】
測定対象物質を特異的に捕捉する捕捉基としては、例えば、
ａ)プロトンに対する捕捉基としては、-CR20-A-N R21R22（式中R20、R21、R22はれぞれ独立に水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜6個のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、R20とR21またはR20とR22が結合した炭素数1〜3個のアルキレン基を示し； Aは置換基を有していてもよい炭素数1〜3個のアルキレン基を示す）で表される捕捉基
【００２８】
ｂ)金属イオンに対する捕捉基としては、ナトリウムイオン、リチウムイオン、カリウムイオン、及びマグネシウムイオンは国際公開WO2005085811の8ページの[化4]に記載の捕捉基（ただし、国際公開WO2005085811の8Pの[化4]に示されたR3が結合するベンゼン環は、本明細書中のR1及びR2が結合するベンゼン環に相当する）、カルシウムイオンは-N(CH2COOR23)2（式中、R23は水素原子を示すか金属イオン、又はエステルを示す）が5ないし8原子の距離で存在する捕捉基（例えば、-CON[CH2-CON(CH2COOR23)2]2、特開2005-201845の10Pの37行目からP12の19行目に記載の捕捉基）、亜鉛イオンは-NH-CH2CH2-NR24R25（式中、R24及びR25は、それぞれ独立に水素原子、2-ピリジルメチル基、2-ピリジルエチル基、2-メチル-6 -ピリジルメチル基、又は2-メチル-6-ピリジルエチル基を示すが同時に水素原子であることはない）で表される捕捉基
【００２９】
ｃ）活性酸素種に対する捕捉基としては、パーイキシナイトライト、ヒドロキシルラジカル、次亜塩素酸はp-アミノフェニルオキシメチル基、p-ヒドロキシフェニルオキシメチル基、一酸化窒素はベンゼン環上に隣接するジアミノ基（該アミノ基の一方は炭素数1〜6個のアルキル基をひとつ有していても良い）、次亜塩素酸は-CH2-SHで表される捕捉基（該捕捉基は、本明細書の一般式(I)のR2に置換することで機能し、Xを含むキサンテン環の10位の炭素(R1及びR2が置換しているベンゼン環が置換している炭素)と結合してチオフェン環を形成する）で表される捕捉基
【００３０】
ｄ）低酸素環境としては-CO-N(R26)-B1-N(R27)- B2-( B3)r-p-C6H4-N=N-Ar-R28（式中、R26及びR27はそれぞれ独立に水素原子又は炭素数1〜6個のアルキル基を示し、R26及びR27は互いに結合して炭素数2〜6個のアルキレン基となってもよく；Y1は炭素数1〜6個のアルキレン基を示し；B2は単結合、-CO-、又は-SO2-を示し；B3は-O-G-N(R29)-（式中、Gは炭素数1〜6個のアルキレン基を示し、R29は水素原子又は炭素数1〜6個のアルキル基を示す）を示し；rは0又は1を示し；p-C6H4-はp-フェニレン基を示し；Arはアリールジイル基を示し；R28はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基を示す。）で表される捕捉基
【００３１】
ｅ）酵素に対する捕捉基（酵素に対する捕捉基としては、酵素と接触することで切断される一価の置換基であるか、酵素との接触によって置換基がさらに別の置換基で修飾される一価の置換基であってもよい）としては、ペプチダーゼ、プロテーアーゼは本明細書中の化[11]〜[化14]及びGGTの蛍光プローブとして記載した捕捉基や国際公開WO2010095450の12頁の[化4]に記載されている(1)から(7)の化合物に置換したアミノ酸残基（アミノ酸残基とは、アミノ酸のアミノ基又はカルボキシ基から水素原子が一つ外れた基を示す）を含むたんぱく質を構成する20種類のL-アミノ酸に由来するアシル残基（以上のアミノ酸残基は、本明細書の一般式(I)のR9又はR10が結合しているアミノ基に結合するか、アミノ基、カルボキシ基などを介してR1又はR2として本明細書の一般式(I)に結合してもよい）、ラクタマーゼは本明細書中の化[15]に記載した捕捉基、糖加水分解酵素はガラクトシル基、グルコシル基、グルクロノシル基、グルクロン酸転移酵素は水酸基、アミノ基、カルボキシ基、チオール基
【００３２】
ｆ）グルタチオンに対する捕捉基としては、本明細書中の化[16]に記載した捕捉基
などの捕捉基を挙げることができる。これらの捕捉基は直接一般式(I)で表される化合物、又はその塩に置換してもよく、スペーサーを介して一般式(I)で表される化合物、又はその塩に置換してもよい場合もある。
【００３３】
測定対象物質を特異的に捕捉する捕捉基は上記のように種々提案されており、測定対象物質の種類に応じて適宜選択可能である。例えば、国際公開WO2008099914及び国際公開WO2008059910 （以上、プロトン）、Bioorg. Med. Chem. Lett., 15, pp.1851-1855, 2005 (ナトリウムイオン及びカリウムイオン）、J. Biol.Chem., 260, pp.3440-3450, 1985 (カルシウムイオン）、American Journal of Physiology, 256, C540-548, 1989 (マグネシウムイオン）、特許4402191号公報及びJ. Am. Chem. Soc., 127, pp.10197-10204, 2005、J. Am. Chem. Soc., 124, pp.776-778, 2002、Cell Calcium, 31, pp.245-251, 2002、米国特許第5648270号明細書及び特開2000-239272号公報 (以上、亜鉛イオン）、国際公開WO2001064664 (活性酸素）、国際公開WO2009110487 (過酸化水素）、特許第4373608号公報及び国際公開WO2002018362 (以上、一重項酸素）、特許第3200024号公報、米国特許第6441197号明細書、米国特許第675623号明細書、及び特許第3967943号公報(以上、一酸化窒素)、国際公開WO2010026743及び特開2009-275006号公報 (以上、低酸素環境）、国際公開WO12005024049（以上、等加水分解酵素）、国際公開WO2010095450（以上、プロテアーゼ）のほか、モレキュラープローブス社のカタログ（Molecular Probes Handbook 11th Edition）の第10章（酵素基質と分析）、第17章(シグナル伝達プローブ）、第18章(一酸化窒素を含む活性酸素種プローブ）、第19章(カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、及び他の金属イオンインディケーター）、第20章(pHインディケーター）、及び第21章(ナトリウムイオン、カリウムイオン、塩素イオン、及び他のイオン)に記載された捕捉基を用いることもできる。もっとも、捕捉基は上記刊行物に記載されたものに限定されることはない。また、上記の刊行物には測定対象物質を特異的に捕捉する捕捉基と併せて使用方法についても記載されているので、本明細書の一般式(I)の化合物又はその塩が、測定対象物質の特異的な測定を目的とした蛍光プローブとして利用可能なことが当業者に容易に理解されよう。
【００３４】
例えば、一酸化窒素の捕捉基として下記の構造の捕捉基を例示することができる(下記の捕捉基のベンゼン環は、一般式(I)で表される化合物においてR1及びR2が置換しているベンゼン環を示す）。本明細書において、本化合物をジアミノN,N-無置換Siローダミンと呼ぶ場合がある。
【００３５】
【化８】
2012111818.tif 000010
【００３６】
本明細書において「捕捉」という用語は、捕捉基が実質的に化学変化を起こさずに金属イオンなどをキレート化などにより捕捉する場合のほか、測定対象物質との化学反応により化学構造が変化する場合を含めて最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
【００３７】
本発明により提供される一般式(I)で表される化合物又はその塩、及び該化合物の製造方法、並びに該化合物を利用した蛍光プローブ、及び該蛍光プローブを用いる測定対象物質の測定方法に関し、上記刊行物に開示された方法等の開示のすべてを参照により本明細書の開示に含める。
【００３８】
R2が示す一価の置換基は測定対象物質に対する捕捉基として作用する置換基であってもよい。捕捉基として作用する置換基は、単独で捕捉基として作用する置換基であってもよく、あるいはベンゼン環上のR1との組み合わせにより捕捉基として作用する置換基であってもよい。この場合には、R2に対してオルト位のR1とR2が結合して環状構造を形成していてもよく、測定対象物質との反応後に該環状構造が開環構造に変化するものであってもよい。あるいはR2に対してオルト位のR1とR2が測定対象物質との反応後にこれらの2個の置換基とともに環状構造を形成するものであってもよい。捕捉基として作用するためにベンゼン環が捕捉基の一部を形成していてもよい。R2が示す捕捉基としては、例えば、上記の捕捉基を例示することができる。
【００３９】
また、R2が-(CR12R13)n-Y-H［式中、R12及びR13は水素原子を示すか、R12とR13が一緒になって＝O又は＝Sを示し；Yは酸素原子、硫黄原子または-NR14-(式中、R14は一価の置換基を示す)を示し；nは1または2を示す］基である場合には、R2がXを含むキサンテン環の10位の炭素(R1及びR2が置換しているベンゼン環が置換している炭素)と結合してラクトン環又はラクタム環などのスピロ環を形成することがある。このような基としては、例えば、ヒドロキシメチル基、メルカプトメチル基、ヒドロキシエチル基、メルカプトエチル基、カルボキシ基、カルボキシメチル基、カルバモイル基及び-CONHNH2などを挙げることができる。 R2が示す一価の置換基が、Xを含むキサンテン環の10位の炭素（R1及びR2が置換しているベンゼン環が置換している炭素）と結合してラクトン環又はラクタム環などのスピロ環を形成した場合には、キサンテン環共役系が切断されて一般式(I)で表される化合物の吸収波長が大きく短波長側にシフトすることがある。なお、一般式(I)で表される化合物がこのようなラクトン環又はラクタム環などのスピロ環を形成した構造異性体を取り得ることは当業者に容易に理解されよう。
【００４０】
R14が示す一価の置換基は、水素原子、炭素数1〜6個のアルキル基、アリール基、アミノ基が好ましく、Org. Lett., 12, pp.476-479, 2010に記載された水銀を捕捉するための基、J. Fluoresc., 19, pp.601-606, 2009に記載されたジアセチルを捕捉するための基、Org. Biomol. Chem., 8, pp.5277-5279, 2010に記載された銅イオンを捕捉するための基などであってもよい。
【００４１】
【化９】
2012111818.tif 000011
【００４２】
上記一般式(I)で表される化合物は塩として存在する場合がある。塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。もっとも、本発明の化合物の塩はこれらに限定されることはない。本明細書中の他の化合物も同様である。
【００４３】
一般式(I)で表される本発明の化合物は、置換基の種類に応じて1個または2個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。また、一般式(I)で表される本発明の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。本明細書中の他の化合物も同様である。
【００４４】
本発明により提供される一般式(I) (式中、R1及びR2は捕捉基以外の一価の置換基を示し、R9及び/又はR10は捕捉基を示す)で表される蛍光プローブは、測定対象物質との接触によりR9及び/又はR10の捕捉基が切断されて吸収波長が長波長にシフトした化合物(上記一般式(I)においてR9及び／又はR10が無置換アミノ基になった化合物に相当する)を生成することができ、測定対象物質の測定のための蛍光プローブとして好適に用いることができる。測定対象物質としては、酵素（ペプチダーゼ、プロテーアーゼ、ラクタマーゼ、糖加水分解酵素、転移酵素、酸化還元酵素など）、グルタチオンがあげられる。例えば、酵素としてはぺプチダーゼ、プロテアーゼ、又はラクタマーゼであることが好ましい。
【００４５】
ぺプチダーゼ又はプロテアーゼの種類はR9及び/又はR10がアシル基である上記一般式(I)で表される本発明の化合物において、該アシル基を加水分解できるものであればその種類は特に限定されず、ぺプチダーゼはエンドペプチダーゼ又はエキソペプチダーゼのいずれであってもよく、プロテアーゼはエンドプロテアーゼ又はエキソプロテアーゼのいずれであってもよい。例えば、特定のアミノ酸を基質とするペプチダーゼ又はプロテアーゼを測定するために、R9及び/又はR10に該アミノ酸に由来するアシル残基を用いることができ、このように設計された化合物を用いることによって、特定のペプチダーゼ又はプロテアーゼを特異的に測定することができる（アミノ酸に由来するアシル残基は、アミノ酸のカルボキシ基から水酸基を除去した残りの部分構造を示す）。このような観点から、ペプチダーゼ又はプロテアーゼに対する蛍光プローブとしては、R9及び/又はR10としてペプチダーゼ又はプロテアーゼにより加水分解可能なアミノ酸由来のアシル残基を用いることが好ましく、例えば、たんぱく質を構成する20種類のL-アミノ酸に由来するアシル残基や、セレノシステイン、ピロリシン、シスチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、チロキシン、O-ホシホセリン、デスモシン、β-アラニン、サルコシン、オルニチン、クレアチン、γアミノ酪酸、又はオパインなどに由来するアシル残基を用いることができる。
【００４６】
R10が捕捉基であって測定対象物質との接触により切断されて吸収波長が長波長にシフトする化合物（上記一般式(I)においてR9及び／又はR10が無置換アミノ基の化合物に相当する)における測定対象物質の捕捉前後での構造の変化を下記に示す。なおRは、便宜的にR1及びR2をまとめて示している。
【００４７】
【化１０】
2012111818.tif 000012
【００４８】
プロテアーゼがカスパーゼ-3(Caspase-3)である場合における好適なR10の例である。DEVDはアミノ酸の一文字表記を表す。本明細書において本化合物をN-DEVD置換Siローダミンと呼ぶことがある。
【化１１】
2012111818.tif 000013
【００４９】
プロテアーゼがカスパーゼ-1(Caspase-1、ICEとも呼ばれる)である場合における好適なR10の例である。DHEWはアミノ酸の一文字表記を表す。
【化１２】
2012111818.tif 000014
【００５０】
プロテアーゼがPSA(Prostate-specific antigen：前立腺特異抗原)である場合における好適なR10の例である。QLKSSHはアミノ酸の一文字表記を表す。
【化１３】
2012111818.tif 000015
【００５１】
ペプチダーゼがLAP(leucine aminopeptidase：ロイシンアミノペプチダーゼ)である場合における好適なR10の例である。
【化１４】
2012111818.tif 000016
【００５２】
ペプチダーゼがGGT(γ-glutamyl transpeptidase：γ-グルタミルトランスペプチターゼ)である場合における好適なR10の例である。例えば、下記の化合物をWO2011087000に記載の方法に従ってγGlu-RhoHMの代わりに用いれば、がん細胞やがん組織を特異的に測定することが可能であり、がん診断薬として利用することができる。
【化１５】
2012111818.tif 000017
【００５３】
ラクタマーゼがβ-Lactamase(β-ラクタマーゼ)である場合における好適なR10の例である。
【化１６】
2012111818.tif 000018
【００５４】
接触により切断する測定対象物質がグルタチオン（Glutathione）である場合における好適なR10の例である。
【化１７】
2012111818.tif 000019
【００５５】
上記した各種蛍光プローブを用いる測定対象物質の測定は、捕捉基に関する上記刊行物に記載された方法など当業者に周知の方法に準じて行うことができるので、研究のための試薬としての使用のほか動物や人の診断のための試薬として使用することも出来る。例えば、上記した各種蛍光プローブを用いることにより、試験管中で測定対象物質の濃度や量を測定することが可能になり、あるいは生細胞や生体に取り込ませてバイオイメージングの手技により画像化して測定することができる。代表的な例として、下記の工程：(a)捕捉基を有する一般式(I)で表される化合物又はその塩と測定対象物質とを接触させる工程、及び(b)上記工程(a)で生成した測定対象物質の捕捉後の前記化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法をあげることができる。
【００５６】
上記したように、本発明の化合物ではR9及び／又はR10を周知の方法で容易に適宜な置換基とすることができる。例えば、ラベル化のための置換基、ケージド化合物とするための置換基など、捕捉基以外の機能性置換基を導入できることも当業者には容易に理解されよう。なお、本明細書において用いられる「測定」という用語は、定量、定性、又は診断などの目的で行われる測定、検査、検出などを含めて、最も広義に解釈しなければならない。
【００５７】
本発明の化合物は下記の合成スキームに従って合成することができる。
【化１８】
2012111818.tif 000020
【００５８】
(1)工程(a)
国際公開WO2005/085811には、例１で合成されるN,N,N',N'-テトラアリル-ジアミノ-Si-キサントンの珪素原子が酸素原子である類似化合物（3,6-ビスジメチルアミノキサントン）を用いてN,N,N',N'-テトラメチルローダミン誘導体の合成方法が開示されているので、該合成方法を参考にしてN,N,N',N'-テトラアリル-ジアミノ-Si-キサントンからN,N,N',N'-テトラアリル-ジアミノ-Si-ローダミン誘導体を合成することができる。例えば、溶媒中、- 78℃でハロゲン化ベンゼン誘導体に対して1当量から1.1当量のsec-ブチルリチウムを加えた後、ハロゲン化ベンゼン誘導体に対して1/5当量のN,N,N',N'-テトラアリル-ジアミノ-Si-キサントンを加え、塩酸で処理することによりN,N,N',N'-テトラアリル-ジアミノ-Si-ローダミン誘導体を合成することができる。また、本明細書の実施例にはXとして珪素原子又はゲルマニウム原子を含むN,N,N',N'-テトラアリル-ジアミノ-X-ローダミンの製造方法の具体例が開示されているので、これらを参考にすることによってN,N,N',N'-テトラアリル-ジアミノ-X-ローダミン誘導体を合成することができる。
【００５９】
(2)工程(b)
N,N,N',N'-テトラアリル-ジアミノ-Si-キサントンのアリル保護基は有機合成において汎用されているアミノ基の保護基の一つであり、触媒量のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム及び5〜6当量の1,3-ジメチルバルビツール酸で処理することで容易に脱保護される。脱アリル化に際して上記の一般式(III)で表される化合物を還元して9H-キサンテンとした後に脱アリル化を行うことも反応収率を改善するために好ましい。
上記例1及び例2の合成方法と従来公知の方法とを適宜組み合わせることによってR1やR10が捕捉基で置換されている蛍光プローブを得ることができる。
【００６０】
本発明の蛍光プローブの使用方法は特に限定されないが、例えば、国際公開WO1999/001447において一酸化窒素測定方法として記載された方法に準じて一酸化窒素を測定することができる。例えば、自発的一酸化窒素発生剤であるNOC-12及びNOC-13を用い、反応液中に生成する一酸化窒素とジアミノ-N,N-無置換Xローダミンとを接触させ反応させることができる。反応溶媒としては、例えば0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)を用い、ジアミノ-N,N-無置換Xローダミン溶液に各種濃度のNOC類を添加して37℃で反応させた後、適当な励起波長及び蛍光波長で分光蛍光計にて蛍光強度を測定することにより一酸化窒素の生成量を測定することができる。
【００６１】
また、特表2004-521080号公報において蛍光基質開裂によるカスパーゼ活性測定方法として記載された方法に準じカスパーゼ-3の酵素活性を測定することができる。標準的な反応混合物(最終容量300μL)には、N-DEVD置換Siローダミン及び精製又は粗カスパーゼ-3酵素を50 mMHEPES/KOH(pH7.0)、10% (体積基準) グリセリン、0.1%(w/v)CHAPS、2 mM EDTA、5 mM ジチオトレイトール中に含有させ、この混合物を25℃でインキュベーションし、適当な励起波長及び蛍光波長で蛍光分光光度計にて反応を連続的にモニタリングすることによりカスパーゼ-3の酵素活性を測定することができる。具体的手法は本明細書の実施例に記載されている。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。実施例中、Meはメチル基、Acはアセチル基を意味する。【００６３】
例1
以下のスキームに従って本発明の一般式(I)(式中、R3及びR4が水素原子を示し、R5及びR6がメチル基を示し；R7及びR8が水素原子を示し；R9及びR10が水素原子を示し；Xは珪素原子を示す)で表される化合物の合成中間体であるN,N,N',N'-テトラアリル-ジアミノ-Si-キサントンを合成した。同様にしてXがゲルマニウム原子である化合物、及びR5及びR6がエチル基である化合物も合成した。【００６４】
【化１９】
2012111818.tif 000021
【００６５】
(1)工程(a1)
炭酸カリウム (22.0 g, 159 mmol)をアセトニトリルに懸濁し、3-ブロモアニリン (8.71 mL, 80.0 mmol)、アリルブロミド (23.7 mL, 280 mmol) を加えて80℃で14時間攪拌した。室温まで冷却した後にセライトろ過を行い、酢酸エチルでよく洗った。溶媒を除去した後にカラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 1/40 酢酸エチル/ヘキサン) で精製し、3-ブロモ-N,N-ジアリルアニリン (17.1 g, 67.9 mmol, 収率85%) を得た。
1H-NMR (300.40 MHz, CDCl3): δ 3.87-3.90 (m, 4H), 5.11-5.15 (m, 2H), 5.17-5.18 (m, 2H), 5.75-5.88 (m, 2H), 6.58 (dd, 1H, J = 2.2, 8.1 Hz), 6.77-6.81 (m. 2H), 7.01 (t, 1H, J = 8.1Hz)
13C-NMR (75.45 MHz, CDCl3): δ 52.7, 110.8, 115.0, 116.3, 119.0, 123.3, 130.2, 133.2, 150.0
HRMS (ESI+): Found: 252.0429, calculated 252.0388 for [M+H]+(+4.1 mmu)【００６６】
(2)工程(a2)
3-ブロモ-N,N-ジアリルアニリン(17.1 g, 67.9 mmol) を酢酸 (200 mL) に溶解し、37% ホルムアルデヒド液 (10.2 g, 340 mmol)を加えて80℃で75分間加熱した。室温まで冷却した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と水酸化ナトリウムで中和した。この混合物をジクロルメタンで抽出し、食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥して溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 1/30 酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、ビス(2-ブロモ-4-N,N-ジアリルアミノフェニル)メタン (15.2 g, 29.5 mmol, 収率87%)を得た。
1H-NMR (300.40 MHz, CDCl3): δ 3.85-3.87 (m, 8H), 3.96 (s, 2H), 5.13-5.19 (m, 8H), 5.76-5.88 (m, 4H), 6.54 (dd, 2H, J = 2.9, 8.8 Hz), 6.81 (d, 2H, J =8.1 Hz), 6.90 (d, 2H, J = 2.9 Hz)
13C-NMR (75.45 MHz, CDCl3): δ 39.7, 52.7, 111.7, 116.0, 116.2, 125.5, 126.9, 130.8, 133.5, 148.1
HRMS (ESI+): Found: 517.0654, calculated 517.0677 for [M+H]+(-2.3 mmu)【００６７】
(3)工程(b)
乾燥させアルゴン置換したフラスコにビス(2-ブロモ-4-N,N-ジアリルアミノフェニル)メタン (8.16 g, 15.8 mmol) と脱水テトラヒドロフラン(THF, 50 mL)を加えた。-78℃に冷却後、1M sec-ブチルリチウム (45 mL, 45mmol) を加え、20分間攪拌した。そのままの温度でジクロロジメチルシラン (2.9 mL, 30 mmol) を脱水THF 10 mLに溶解してゆっくりと加え、室温に戻して1時間攪拌した。2N 塩酸で反応を停止して炭酸水素ナトリウムで中和した。この混合物をジクロルメタンで抽出して食塩水で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶媒を除去した。残渣をアセトン (150 mL)に溶解し、0℃に冷却して過マンガン酸カリウム (6.88 g, 43.5 mmol)を少量ずつ2時間かけて加え、さらに同じ温度で1時間攪拌した。ジクロルメタン (200 mL)を加えてろ紙を用いて吸引ろ過した。溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, ジクロルメタン) で精製してN,N,N',N'-テトラアリル-ジアミノ-Si-キサントン (2.23 g, 5.20 mmol, 収率33%) を得た。
1H-NMR (300.40 MHz, CDCl3): δ 0.41 (s, 6H), 4.02 (d, 8H, J = 5.1 Hz), 5.17-5.23 (m, 8H), 5.82-5.94 (m, 4H), 6.80-6.83 (m, 4H), 8.34 (d, 2H, J = 8.1 Hz)
13C-NMR (75.45 MHz, CDCl3): δ -1.1, 52.8, 113.5, 114.8, 116.7, 130.0, 131.7, 133.1, 140.5, 150.2, 185.1
HRMS (ESI+): Found:429.2347, calculated 429.2362 for [M+H]+(-1.5 mmu)【００６８】
(4)N,N,N',N'-3,6-テトラアリルジアミノ-Ge-キサントン
乾燥させアルゴン置換したフラスコに、ビス(2-ブロモ-4-N,N-ジアリルアミノフェニル)メタン(6.16 g, 11.9 mmol) と脱水THF (40 mL)を加えた。-78℃に冷却後、1M sec-ブチルリチウム(BuLi) (34 mL, 34 mmol) を加え、20分間攪拌した。そのままの温度でジクロロジメチルゲルマン (2.62 mL, 22.7 mmol) を脱水THF 15 mLに溶解したものをゆっくりと加え、室温に戻し1時間攪拌した。2N 塩酸で反応を止め、炭酸水素ナトリウムで中和した。これをジクロルメタンで抽出して食塩水で洗い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶媒を除去した。これをアセトン (120 mL)に溶解し、0℃に冷却した。この混合物に過マンガン酸カリウム (5.20 g, 32.9 mmol)を少量ずつ2時間かけて加え、さらに同じ温度で1時間攪拌した。この混合物にジクロルメタン (200 mL)を加えて、その溶液をろ紙を用いて吸引ろ過した。そして溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィー (シリカゲル、ジクロルメタン) で精製することにより目的物(1.29 g, 2.72 mmol, 収率 23%)を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ0.54 (s, 6H), 4.00-4.02 (m, 8H) 5.17-5.23 (m, 8H), 5.81-5.94 (m, 4H), 6.72 (d, 2H, J = 2.9 Hz), 6.78 (dd, 2H, J = 2.6, 9.2 Hz), 8.36 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ-1.8, 52.3, 112.6, 114.4, 116.2, 129.6, 131.7, 132.7, 142.8, 149.8, 184.5
LRMS (ESI+): m/z Found 475, calculated 475 for [M+H]+【００６９】
(5)3,6-ジアミノ-Ge-キサントン
乾燥させアルゴン置換したフラスコに、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム (330 mg, 0.285 mmol) と  1,3-ジメチルバルビツール酸(1.41 g, 9.04 mmol) を加えた。この混合物に、N,N,N',N'-テトラアリルジアミノ-Ge-キサントン (1.00 g, 2.11 mmol) をジクロルメタン 50 mL に溶解して加え、35℃で16時間攪拌した。溶媒を除去して飽和炭酸ナトリウム水溶液に懸濁し、ジクロルメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 4/3 酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、3,6-ジアミノ-Ge-キサントン混合物 (760 mg, 収率定量的) を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ0.55 (s, 6H), 6.73-6.76 (m, 4H), 8.33 (d, 2H, J = 9.5 Hz)
13C NMR (75 MHz, CD3OD): δ-1.9, 116.1, 118.3, 130.9, 133.2, 145.2, 152.9, 187.3
LRMS (ESI+): m/z Found: 315, calculated 315 for [M+H]+【００７０】
(6)N,N,N',N'-3,6-テトラアリルジアミノ-ジエチルSi-キサントン
乾燥させアルゴン置換したフラスコにビス(2-ブロモ-4-N,N-ジアリルアミノフェニル)メタン(1.65 g, 3.20 mmol) と脱水THF (20 mL)を加えた。-78℃に冷却後、1M sec-BuLi (10 mL, 10 mmol) を加え、20分間攪拌した。そのままの温度でジクロロジエチルシラン(1.04 mL, 7.02 mmol) を脱水THF 5 mLに溶解してゆっくり加え、室温に戻し1時間攪拌した。2N 塩酸で反応を止め、炭酸水素ナトリウムで中和した。これをジクロルメタンで抽出して食塩水で洗い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶媒を除去した。これをアセトン(50 mL)に溶解し、0℃に冷却した。この混合物に過マンガン酸カリウム (1.49 g, 9.43 mmol)を少量ずつ2時間かけて加え、さらに同じ温度で1時間攪拌した。この混合物にジクロルメタン(50 mL)を加えて、その溶液をセライトろ過した。そして溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィー (シリカゲル, 10/1 ヘキサン/酢酸エチル) で精製することによりN,N,N',N'-3,6-テトラアリルジアミノ-ジエチルSi-キサントン (419 g, 0.917 mmol, 収率 29%)を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ0.91 (s, 10H), 4.01-4.02 (m, 8H) 5.17-5.22 (m, 8H), 5.82-5.94 (m, 4H), 6.79-6.84 (m, 4H), 8.35 (d, 2H, J = 8.8 Hz)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ5.56, 7.48, 52.7, 113.3, 115.0, 116.5, 130.9, 131.6, 133.1, 138.3, 149.9, 185.3
HRMS (ESI+): m/z Found 457.2661, calculated 457.2675 for [M+H]+(-1.5 mmu)【００７１】
(7)3,6-ジアミノ-ジエチルSi-キサントン
乾燥させアルゴン置換したフラスコに、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム (204 mg, 0.176 mmol) と1,3-ジメチルバルビツール酸(1.04 g, 6.67 mmol) を加えた。この混合物に、N,N,N',N'-テトラアリルジアミノ-ジエチルSi-キサントン (419 mg, 0.917 mmo) をジクロルメタン 30 mL に溶解して加え、35℃で16時間攪拌した。溶媒を除去して飽和炭酸ナトリウム水溶液に懸濁し、ジクロルメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 4/5 酢酸エチル/ヘキサン)で精製し、3,6-ジアミノ-ジエチルSi-キサントン (236 mg, 0.796 mmol, 収率 87%) を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ0.83-0.95 (m, 10H), 4.10 (s, 4H), 6.76-6.81 (m, 4H), 8.33 (d, 2H, J = 7.8 Hz)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ5.37, 7.38, 116.2, 117.5, 132.0, 132.9, 138.8, 148.9, 185.5
HRMS (ESI+): m/z Found 297.1462, calculated 297.1423 for [M+H]+(3.9 mmu)【００７２】
例2
例1で合成されるN,N,N',N'-テトラアリル-ジアミノ-Si-キサントンを用い、本発明の一般式(I)において、R1が水素原子であり、R2がメチル基又はカルボキシル基であり、R3及びR4が水素原子であり、R5及びR6がメチル基であり、R7及びR8が水素原子であり、R9及びR10が水素原子であり、Xが珪素原子である化合物又はその塩を合成した。また、上記の化合物にR10としてアセチル基を導入した化合物を合成した。【００７３】
(1)N,N,N',N'-テトラアリル-2-メチル SiR600
【化２０】
2012111818.tif 000022
【００７４】
よく乾燥させアルゴン置換したフラスコに、2-ブロモトルエン(253 μl, 2.10 mmol) と脱水THF (25 mL)を加えた。-78℃に冷却後、1M sec-ブチルリチウム(2.3 ml, 2.3 mmol)を加えて20分間攪拌した。そのままの温度でN,N,N',N'-テトラアリル-Si-キサントン(180 mg, 0.42 mmol) を脱水THF 5 mL に溶解したものをゆっくりと加え、室温に戻した。室温で30分間攪拌後、2N 塩酸を6 mL加えて10分間攪拌した。それをジクロロメタンで抽出して食塩水で洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー (シリカゲル, 5% メタノール/ ジクロロメタン)で精製してN,N,N',N'-テトラアリル-2-メチル SiR600 (215 mg, 0.40 mmol, 収率 95%) を得た。
1H-NMR (300 MHz, CD3OD): δ 0.55 (s, 3H), 0.57 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 4.31 (d, J = 5.1 Hz, 8H), 5.19-5.31 (m, 8H), 5.88-6.00 (m, 4H), 6.79 (dd, J = 9.6 Hz, 3.0 Hz, 2H), 7.10-7.13 (m, 3H), 7.33-7.47 (m, 5H)
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ -1.57, -1.32, 19.51, 54.64, 115.87, 118.13, 122.89, 126.79, 129.13, 130.12, 131.35, 132.58, 136.89, 139.85, 142.91, 149.83, 155.52, 172.10
HRMS (ESI+) Calcd for [M]+, 503.2882 Found, 503.2856 (-2.7 mmu)【００７５】
(2)9-o-トルイル-9H-Si-キサンテン-3,6-ジアミン
【化２１】
2012111818.tif 000023
【００７６】
N,N,N',N'-テトラアリル-2-メチル SiR600 (350 mg, 0.65 mmol) をメタノール (20 mL) に溶解し、そこに水素化ホウ素ナトリウム (29 mg, 0.77 mmol)を加え、0℃で30分間攪拌した後、溶媒を減圧留去し、水を加えた。これをジクロロメタンで抽出し、食塩水で洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を減圧留去した後、1, 3-ジメチルバルビツール酸(543 mg, 3.48 mmol)とテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム (121 mg, 0.104 mmol)を加え、反応容器内を脱気した後にアルゴン置換し、35℃で21時間攪拌した。反応溶液を飽和炭酸ナトリウム水溶液に懸濁し、これをジクロロメタンで抽出し、飽和炭酸ナトリウム水溶液と食塩水で洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させて溶媒を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 50% 酢酸エチル/ n-ヘキサン)で精製し、9-o-トルイル-9H-Si-キサンテン-3,6-ジアミン(135 mg, 0.39 mmol, 収率 60%)を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.39 (s, 3H), 0.54 (s, 3H), 2.22 (s, 3H), 3.56 (s, 4H), 5.53 (s, 1H), 6.55 (dd, J = 2.9 Hz, 8.0 Hz, 2H), 6.80 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.91 (d, J = 2.9 Hz, 2H), 7.05-7.12 (m, 4H)
13C-NMR (75 MHz, CDCl3) δ -1.03, -0.42, 20.51 20.92, 50.07, 117.00, 118.96, 125.88, 126.11, 130.10, 131.11, 131.13, 134.15, 135.47, 139.11, 143.40, 145.89
HRMS (ESI+) Calcd for [M+H]+, 345.1787 Found, 345.1739 (-4.8 mmu)【００７７】
(3)2-Me SiR600
【化２２】
2012111818.tif 000024
【００７８】
9-o-トルイル-9H-Si-キサンテン-3,6-ジアミン(35 mg, 0.102 mmol) をジクロロメタン (10 ml)に溶解し、p-クロラニル(25 mg, 0.102 mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。反応溶液に水を加え、酢酸エチルで抽出して食塩水で洗い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。残渣をHPLCで精製して2-Me SiR600 (26 mg, 0.057 mmol, 収率56%)を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ 0.53 (s, 3H), 0.54 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 6.56 (dd, J= 2.4 Hz, 9.2 Hz, 2H), 7.02 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.11 (s, 1H), 7.18 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 7.33-7.50 (m, 3H)
13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ -1.76, -1.51, 19.44, 116.87, 124.39, 126.74, 128.50, 130.05, 131.30, 136.86, 140.07, 143.85, 150.45, 158.52, 171.96
HRMS (ESI+) Calcd for [M]+, 343.1630 Found, 343.1628 (-0.3 mmu)【００７９】
(4)N-アセチル-2-Me SiR600
【化２３】
2012111818.tif 000025
【００８０】
2-Me SiR600 (2.2 mg, 4.8μmol) をジメチルホルムアミド(DMF, 4 ml)に溶解し、無水酢酸(4.1 μl, 44.8 μmol)とピリジン(120 μl, 1.5 mmol) を加え、室温で40時間攪拌した。反応混合物をHPLCで精製してN-アセチル-2-Me SiR600を得た。
LRMS (ESI+) [M]+ 385【００８１】
(5)N,N,N',N'-テトラアリル-2-COOH SiR600
【化２４】
2012111818.tif 000026
【００８２】
よく乾燥させアルゴン置換したフラスコに、2-ブロモ安息香酸t-ブチル(3.6 g, 14.0 mmol) と脱水THF (40 mL)を加えた。-78℃に冷却後、1M sec-ブチルリチウム(14 ml, 14.0 mmol)を加えて3分間攪拌した。そのままの温度でN,N,N',N'-テトラアリル-Si-キサントン (1.2 g, 2.8 mmol) を脱水THF 10 mL に溶解してゆっくりと加え、室温に戻した。室温で20分間攪拌後、2N 塩酸を10 mL加えて10分間攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで抽出して食塩水で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥して溶媒を減圧留去した後、トリフルオロ酢酸(12 ml)を加え、室温で1時間攪拌した。溶媒を減圧留去した後、水を加え、ジクロロメタンで抽出して食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥して溶媒を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー (シリカゲル, 30% 酢酸エチル/ n-ヘキサン)で精製してN,N,N',N'-テトラアリル-2-COOH SiR600 (935 mg, 1.75 mmol, 収率 63%) を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.60 (s, 6H), 3.97 (d, J = 5.1 Hz, 8H), 5.17-5.23 (m, 8H), 5.75-5.88 (m, 4H), 6.68 (dd, J = 3.0 Hz, 6.8 Hz, 2H), 6.83 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.15 (d,J = 3.0 Hz, 2H), 7.37 (d, J= 7.1Hz, 1H), 7.59 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 7.70 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 7.1 Hz, 1H)
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ -2.03, 0.40, 52.76, 92.12, 112.97, 116.22, 116.82, 124.98, 125.63, 127.58, 128.13, 128.69, 131.90, 133.39, 133.66, 137.32, 147.51, 153.68, 170.44
HRMS (ESI+) Calcd for [M+H]+, 533.2624 Found, 533.2593  (-3.1 mmu)【００８３】
(6)2-COOH SiR600
【化２５】
2012111818.tif 000027
【００８４】
N,N,N',N'-テトラアリル-2-COOH SiR600 (310 mg, 0.58 mmol)をジクロロメタン (30 ml)に溶解し、1,3-ジメチルバルビツール酸(454 mg, 2.91 mmol)とテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(101 mg, 0.087 mmol)を加え、反応容器内を脱気した後にアルゴン置換し、35℃で20時間攪拌した。反応溶液を飽和炭酸ナトリウム水溶液に懸濁してジクロロメタンで抽出し、飽和炭酸ナトリウム水溶液と食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥して溶媒を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 80% 酢酸エチル/ n-ヘキサン)で精製し、2-COOH SiR600 (114 mg, 0.31 mmol, 収率 53%)を得た。
1H-NMR (400 MHz, DMF-d7): δ 0.65 (s, 3H), 0.73 (s, 3H), 6.74-6.75 (m, 4H), 7.23 (s, 2H), 7.56 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.85 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.99 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 8.12 (d, J = 7.2 Hz, 1H)
13C-NMR (400 MHz, DMF-d7) δ -1.62, 0.33, 92.50, 115.72, 119.33, 125.46, 125.78, 127.16, 128.44, 129.81, 132.42, 134.91, 137.14, 149.16, 155.28, 170.72
HRMS (ESI+) Calcd for [M+H]+, 373.1372 Found, 373.1347 (-2.5 mmu)【００８５】
(7)N-アセチル-2-COOH SiR600
【化２６】
2012111818.tif 000028
【００８６】
2-COOH SiR600 (8 mg, 21.4 μmol) をDMF (6 ml)に溶解して無水酢酸(2.0 μl, 21.4 μmol)とピリジン(400 μl, 5.06 mmol) を加え、室温で24時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、水を加えてジクロロメタンで抽出し、食塩水で洗浄した。溶媒を留去し、残渣をHPLCで精製してN-アセチル-2-COOH SiR600 (1.0 mg, 2.4 μmol, 収率11%)を得た。
HRMS (ESI+): Found: 415.1453, calculated 415.1478 for [M+H]+(-2.5 mmu).【００８７】
例3
例2で合成した2-Me SiR600及びアセチル化体(N-Ac-2-Me SiR600)の吸光及び蛍光スペクトル、並びにpHプロファイルを測定した。結果を図1及び2、並びに表1に示す。2-Me SiR600はキサンテン環3位のアミノ基をアセチル化することにより吸収極大波長が2-Me SiR600に比べ大きく短波長側に変化した。また、アセチル化体はpHの低下に依存して吸光度が減少するものの2-Me SiR600はｐHに依存した吸光度の変化はほとんどなかった。従って、3位のアミノ基をアシル化した2-Me SiR600は分子内光誘起電子移動を用いることなく吸収波長変化により大きなS/N比を持つ酵素活性検出蛍光プローブとして機能させることができる。【００８８】
【表１】
2012111818.tif 000029
【００８９】
同様にして2-COOH SiR600及びそのアセチル化体の吸光及び蛍光スペクトル、並びにpHプロファイルを測定した。結果を図3及び4、並びに表2に示す。図4に示すように2-COOH SiR600はアセチル化することで生理的pH領域では可視領域に吸収を持たなくなったこと及び2-COOH SiR600は生理的pH領域以上のｐHでは吸光度の変化がほとんどなかったから、下記のスキームに示すように蛍光プローブとして利用することができる。【００９０】
【表２】
2012111818.tif 000030
【００９１】
【化２７】
2012111818.tif 000031
【００９２】
例4
例2で合成した2-Me SiR600を原料化合物として用い、以下のスキームに示す工程によりR10としてオリゴペプチド残基(Cbz-Asp-Glu-Val-Asp)を導入したcaspase-3活性用蛍光プローブ(Z-DEVD-SiR600：Cbz及びZはベンジルオキシカルボニル基を意味する)、及びロイシン残基(Leu)を導入したロイシンアミノペプチダーゼ(LAP)活性検出用プローブ(Leu-SiR600)を合成した。
【化２８】
2012111818.tif 000032
(RはCbz-Asp-Glu-Val-Asp残基又はLeu残基を示す)【００９３】
(1) Cbz-DEVD-OHペプチド
【化２９】
2012111818.tif 000033
Cbz-DEVD-OHペプチドを2-クロロトリチルクロライドレジン(1.3 mmol/g, 100-200 mesh, 1% DVB) を用いて通常のFmoc固相合成法で合成した。【００９４】
(a)ペプチドカップリングサイクル: Fmocアミノ酸（レジンの5当量）とO-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N',-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（HATU：レジンの5当量）をDMFに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA：レジンの10当量）を加えて攪拌した。この溶液をN末脱保護ペプチドをカップリングさせたレジンに加えて40分攪拌した。
(b)Fmoc 脱保護サイクル: Fmoc保護基の脱保護は、20% (v/v)ピペリジン/DMF溶液をレジンに加え、12分攪拌することで行った。
(c)レジンからの切り出し: トリフルオロ酢酸:ジクロロメタン = 2 : 98 の溶液をレジンに加え、1 分攪拌を10回行なうことで、Cbz-DEVD-OHペプチドをレジンから切り出した。レジンを濾過で除き、ろ液を減圧留去し、残渣に過剰量の冷水を加えて生じた沈殿をろ取し、Cbz-DEVD-OHペプチドを得た。
HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 801.3898 Found, 801.3904 (+0.6 mmu).【００９５】
(2) Z-DEVD-SiR600
【化３０】
2012111818.tif 000034
【００９６】
9-o-トルイル-9H-Si-キサンテン-3,6-ジアミン(48 mg, 0.14 mmol)をDMF (10 ml)に溶解し、Cbz-DEVD-OH (120 mg, 0.154 mmol)、HATU (117 mg, 0.308 mmol)、1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール 1水和物( HOBt・H2O : 47 mg, 0.308 mmol)、及びDIPEA (79 μl, 0.616 mmol)を加え、39時間室温で攪拌した。反応混合物に水を加え、ジクロロメタンで抽出して食塩水で洗い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。残渣をジクロロメタン(20 ml)に溶解してp-クロラニル(34.4 mg, 0.14 mmol)を加え、室温で3時間攪拌した。反応混合物に水を加えてジクロロメタンで抽出し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と食塩水で洗い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。残渣にトリフルオロ酢酸(10 ml)を加え、室温で1時間攪拌した後に溶媒を減圧留去した。残渣をHPLC (溶離液, 40% アセトニトリル/0.1% トリフロロ酢酸/水 (0分) から 52%アセトニトリル/0.1% TFA/水(15分); 流速 = 5.0 mL/min) で精製し、Z-DEVD-SiR600 (6.5 mg, 6.2 μmol, 収率4%)を得た。
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 935.3647 Found, 935.3617 (-3.1 mmu). 
精製後のHPLCクロマトグラム（16% アセトニトリル/0.1 % トリフルオロ酢酸/水から80% アセトニトリル/0.1% トリフルオロ酢酸/水(流速 = 1.0 mL/min)のリニアグラディエント, Abs. 500 nm）では15.8分に単一ピークを認めた。【００９７】
1% DMSOを含むpH3〜10の0.1 M リン酸ナトリウムバッファー中でZ-DEVD-SiR600の吸収スペクトルを測定した。測定結果を図5、光化学特性をSiR600と共に下記の表3に示す。
Z-DEVD-SiR600はpHに依存して吸光度が変化するものの、caspase-3と接触して生成するSiR600の極大吸収(593nm)付近の光は吸収せず、593nm付近の励起光を使用するcaspase-3活性測定がZ-DEVD-SiR600の影響を受けずに行えることが確認された。
【表３】
2012111818.tif 000035
【００９８】
(3)Leu-SiR600
【化３１】
2012111818.tif 000036
【００９９】
2-MeSiR600 (3 mg, 6.5 μmol)をDMF (6 ml)に溶解し、Boc-Leu-OH・H2O (17.1 mg, 68.7 μmol)、HATU (22 mg, 57.9 μmol)、HOBt・H2O (6.8 mg, 44.4 μmol)、及びDIPEA (14.2 μl, 111 μmol)を加えて室温で25時間攪拌した。溶媒を減圧留去した後、水を加えてジクロロメタンで抽出して食塩水で洗い, 有機層を硫酸ナトリウムで乾燥して溶媒を減圧留去した。残渣にトリフルオロ酢酸(6 ml)を加え、室温で一時間攪拌した後に溶媒を減圧留去した。残渣をHPLC (溶離液, 32% アセトニトリル/0.1% トリフルオロ酢酸/水(0分) から48%アセトニトリル/0.1% トリフルオロ酢酸/水(20分);流速 = 5.0 mL/min)で精製し、Leu-SiR600 (1.4 mg, 2.46 μmol, 38%)を得た。
HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 456.2471 Found, 456.2425 (-4.7 mmu). 
精製後のHPLCクロマトグラム（16% アセトニトリル/0.1 % トリフルオロ酢酸/水から80% アセトニトリル/0.1% トリフルオロ酢酸/水(流速 = 1.0 mL/min)のリニアグラディエント, Abs. 500 nm）では13.5分に単一ピークを認めた。【０１００】
例5
Z-DEVD-SiR600に対してcaspase-3を反応させて蛍光プローブとしての機能を評価した。Z-DEVD-SiR600(2 μM)にcaspase-3(0.5μg)を添加して10時間反応させた。反応は100 μM ジチオスレイトール(DTT)、10%グリセリン、0.1% CHAPS、100 mM NaCl、及び0.1% DMSOを含む20 mM HEPES バッファー(pH 7.4) 0.75 mlを用いて37℃で行った。反応前後の吸収スペクトル及び蛍光スペクトル（励起波長をそれぞれ図6(b)及び(c)に示し、反応の動力学パラメータを図6(d)に示した。図6(b)に示すようにZ-DEVD-SiR600の極大吸収波長は500nm付近であるが、Z-DEVD-SiR600がcaspase-3と反応して生成する2-Me SiR600は593nmに極大吸収を持つので、593nmの励起光で反応の前後の測定を行えば、図6(c)に示すように反応前にはほとんど蛍光が観察されずに、反応後に非常に強い蛍光が観察できる。すなわち、Z-DEVD-SiR600がcaspase-3に対する蛍光プローブとして好適に使用できることが示された。【０１０１】
例6
Leu-SiR600に対してロイシンアミノペプチダーゼを反応させて蛍光プローブとしての機能を評価した。Leu-SiR600 (6 μM)にロイシンアミノペプチダーゼ(0.096ユニット)を添加して2.5時間反応させた。反応は0.8% DMSOを含む0.1 M リン酸ナトリウムバッファー(pH 7.4) 0.75 mlを用いて37℃で行った。反応前後の吸収スペクトル及び蛍光スペクトルをそれぞれ図7(b)及び(c)に示す。図7(b)に示すようにLeu-SiR600の極大吸収波長は500nm付近であるが、Leu-SiR600がロイシンアミノペプチダーゼと反応して生成する2-Me SiR600は593nmに極大吸収を持つので、593nmの励起光で反応の前後の測定を行えば、図7(c)に示すように反応前にはほとんど蛍光が観察されずに、反応後に非常に強い蛍光が観察できる。すなわち、Leu-SiR600がcaspase-3に対する蛍光プローブとして好適に使用できることが示された。【０１０２】
例5及び例6のZ-DEVD-SiR600を用いたcaspase-3の測定結果及びLeu-SiR600を用いたロイシンアミノペプチダーゼの測定結果より、本発明により提供される一般式(I)で表される化合物（式中、R9及び/又はR10が測定対象物質との接触により切断される一価の置換基を示す）又はその塩は、ペプチダーゼ又はプロテアーゼ測定のための蛍光プローブとして好適に利用できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明により提供される一般式(I)で表される化合物又はその塩は測定対象物質の捕捉前後で蛍光特性が変化する性質を有しており、金属イオン、活性酸素種、プロトン又は酵素活性などの測定対象物質を高感度に測定可能な蛍光プローブを製造するための化合物として利用することができる。
【図１】
2012111818.tif 000043
【図２】
2012111818.tif 000044
【図３】
2012111818.tif 000045
【図４】
2012111818.tif 000046
【図５】
2012111818.tif 000047
【図６】
2012111818.tif 000048
【図７】
2012111818.tif 000049
【国際調査報告】
2012111818.tif 000050
2012111818.tif 000051
2012111818.tif 000052
2012111818.tif 000053