(57)【要約】  安定的に短時間で膜ろ過を遂行する汎用性の高い膜ろ過性を向上した水溶液の調製方法、該調製方法により調製された水溶液、該調製方法により調製された水溶液を用いる細胞の培養方法、該培養方法を用いた生理活性物質の製造方法、該水溶液の製造方法を用いて製造される生理活性物質、該水溶液の調製方法により調製された水溶液を膜ろ過する方法、水溶液の膜ろ過性を向上する方法および、水溶液を調製し、膜ろ過し、および該水溶液を用いて細胞を培養し、生理活性物質を製造する方法を提供する。本発明は、キレート剤を添加することを特徴とする水溶液の調製方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地およびキレート剤を含む水溶液の調製方法であって、該水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を水溶液に添加することを特徴とする、培地およびキレート剤を含む水溶液の調製方法。
【請求項２】
キレート剤がクエン酸、リンゴ酸、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸  鉄（ＩＩＩ）ナトリウム塩およびシアル酸、並びにそれらの塩または水和物から選ばれる少なくとも１である、請求項１に記載の水溶液の調製方法。
【請求項３】
培地が粉末培地、液体培地またはスラリー状の培地である、請求項１または請求項２に記載の調製方法。
【請求項４】
粉末培地がさらに金属塩、糖類およびビタミンから選ばれる少なくとも１を含む培地である、請求項３に記載の調製方法。
【請求項５】
培地が細胞培養用の培地である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項６】
培地が動物細胞培養用の培地である、請求項５に記載の調製方法。
【請求項７】
培地がチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞培養用の培地である、請求項６に記載の調製方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により調製された、水溶液。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法で調製した水溶液を用いる、細胞の培養方法。
【請求項１０】
細胞が動物細胞である、請求項９に記載の細胞の培養方法。
【請求項１１】
細胞がチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞である、請求項１０に記載の細胞の培養方法。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１項に記載の細胞の培養方法を用いる、生理活性物質の製造方法。
【請求項１３】
生理活性物質がペプチドまたは蛋白質である、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
蛋白質が糖蛋白質または抗体である、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の製造方法を用いて製造される、生理活性物質。
【請求項１６】
培地およびキレート剤を含む水溶液を膜ろ過する方法であって、該水溶液が、水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を添加して調製した水溶液である、膜ろ過する方法。
【請求項１７】
キレート剤がクエン酸、リンゴ酸、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸  鉄（ＩＩＩ）ナトリウム塩およびシアル酸、並びにそれらの塩または水和物から選ばれる少なくとも１である、請求項１６に記載の膜ろ過する方法。
【請求項１８】
培地が粉末培地、液体培地又はスラリー状の培地である、請求項１６または請求項１７に記載の膜ろ過する方法。
【請求項１９】
粉末培地がさらに金属塩、糖類およびビタミンから選ばれる少なくとも１を含む粉末である、請求項１８に記載の膜ろ過する方法。
【請求項２０】
培地が細胞培養用の培地である、請求項１８または１９に記載の膜ろ過する方法。
【請求項２１】
培地が動物細胞培養用の培地である、請求項２０に記載の膜ろ過する方法。
【請求項２２】
培地がチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞培養用の培地である、請求項２１に記載の膜ろ過する方法。
【請求項２３】
膜ろ過に用いるろ過膜の孔径が１ｎｍから１００μｍである、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の膜ろ過する方法。  
【請求項２４】
キレート剤を水溶液に添加してキレート剤を含む水溶液を調製し、該水溶液を膜ろ過する、水溶液の膜ろ過性を向上する方法。
【請求項２５】
さらに培地を水溶液に添加して培地およびキレート剤を含む水溶液を調製し、該水溶液を膜ろ過する、請求項２４に記載の水溶液の膜ろ過性を向上する方法。
【請求項２６】
キレート剤を水溶液の最終ｐＨ調整よりも先に水溶液に添加してキレート剤を含む水溶液を調製することを特徴とする、請求項２４または２５に記載の水溶液の膜ろ過性を向上する方法。
【請求項２７】
キレート剤を、培地よりも先または同時に水溶液に添加することを特徴とする、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の水溶液の膜ろ過性を向上する方法。
【請求項２８】
最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を水溶液に添加して培地および該キレート剤を含む水溶液を調製し、該水溶液を膜ろ過した後、得られた水溶液を用いて細胞を培養することによって、生理活性物質を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は培地およびキレート剤を含む水溶液の調製方法、該調製方法により調製された水溶液、該調製方法により調製された水溶液を用いる細胞の培養方法、該培養方法を用いた生理活性物質の製造方法、該製造方法を用いて製造される生理活性物質、該水溶液の調製方法により調製された水溶液を膜ろ過する方法、水溶液の膜ろ過性の向上方法、又は、水溶液を調製し、該水溶液を膜ろ過した後該水溶液を用いて細胞を培養することによって、生理活性物質を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生理活性物質、中でも糖蛋白質あるいは抗体は、近年、種々のバイオ医薬品として認可され、さらに多くの候補物質が開発中である（非特許文献１）。この為、細胞を用いた糖蛋白質、抗体等の生理活性物質の生産がますます盛んになることが期待される。【０００３】
細胞を用いてこれらの生理活性物質を製造する上で欠かせない細胞培養用水溶液の調製においては、製品、工程の安全のために培地の無菌性を担保する必要がある。これまで細胞培養用水溶液の調製においては、微生物除去を目的とした０．２μｍ膜ろ過工程が広く用いられてきたが、ここ数年マイコプラズマ除去を目的とした０．１μｍ膜ろ過工程の利用が推奨されるようになってきている（非特許文献２）。従って、細胞培養用水溶液の良好な膜透過性は工業化において益々有用になっており、一つの課題である。【０００４】
また、バイオ医薬品は低分子医薬と比較して製造コストが高いことが医薬産業における課題である（非特許文献３）。これまでに細胞培養用水溶液の一部成分の補強、新規成分の追加又は高濃度化により生産性向上を達成することでコスト削減を図る取り組みがなされてきているが、その一方で、その水溶液の良好な膜ろ過は難しさを増している。また、市場ニーズを満たすための製造設備の大型化と設備上の制約から、ますます安定的に短時間で膜ろ過を遂行する汎用性の高い細胞培養用水溶液が求められている。【０００５】
これまで、ろ過設備の改造、ろ過膜の増設やろ過膜素材の変更、あるいは、細胞培養用水溶液調製時の温度など溶解条件の改善による該水溶液の膜ろ過量又は膜ろ過性向上の取り組みが行われてきた（特許文献１、非特許文献４および非特許文献５）。しかし、膜面積の増加による細胞培養用水溶液の膜ろ過性向上は、コスト、設備上の制約から工業的には適さない。また、溶解条件の改善では細胞培養用水溶液ろ過性の飛躍的向上には到っていない。【０００６】
クエン酸、リンゴ酸またはエチレンジアミン四酢酸等のキレート剤は、細胞培養用水溶液中に含まれる成分の１つとして広く知られている（特許文献２および特許文献３）。またシアル酸もキレート作用を有する物質として知られている（非特許文献６）。しかし、キレート剤による細胞培養用水溶液の膜ろ過性を向上する方法は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】日本国特表平０７−５０６４９２号公報
【特許文献２】日本国特開２００３−２５０５３３号公報
【特許文献３】日本国特開２０００−２１７４５５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙ，２００４年５月、Ｖｏｌ．３，ｐ．３８３
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ，１９８９年６月、Ｖｏｌ．３３９，ｐ．４８７−４８８
【非特許文献３】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２００６年１１月、Ｖｏｌ．３３，ｐ．２１２４−２１３１
【非特許文献４】Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、“Ｆｉｌｔｅｒ  Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｍｐｌｅｓ（１−１００ｍＬ）ｉｎ  Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｆｉｌｔｅｒｓ．５．３”、［ｏｎｌｉｎｅ］、［平成２２年１１月１５日検索］、  インターネット＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｌｌ．ｃｏｍ／ｖａｒｉａｎｔｓ／ｐｄｆ／ｐｄｆ／ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＿４９５３３．ｐｄｆ＞
【非特許文献５】Ｔｈｅ  ２３ｒｄ  Ａｎｎｕａｌ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇｏｆ  ｔｈｅ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  要旨集，２０１０年９月、ｐ．１２７
【非特許文献６】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、  １９６７年５月、Ｖｏｌ．４６、Ｎｏ．３、ｐ．５１４−５２１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、上記の課題に鑑み、本発明はろ過性の飛躍的向上を実現した水溶液の調製方法、該調製方法により調製された水溶液、該調製方法により調製された水溶液を用いる細胞の培養方法、該培養方法を用いた生理活性物質の製造方法、該製造方法を用いて製造される生理活性物質、該水溶液の調製方法により調製された水溶液を膜ろ過する方法、水溶液の膜ろ過性の向上方法、又は、水溶液を調製し、該水溶液を膜ろ過した後該水溶液を用いて細胞を培養することによって、生理活性物質を製造する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
即ち、本発明は、以下のとおりである。
１．培地およびキレート剤を含む水溶液の調製方法であって、該水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を水溶液に添加することを特徴とする、培地およびキレート剤を含む水溶液の調製方法。
２．キレート剤がクエン酸、リンゴ酸、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸  鉄（ＩＩＩ）ナトリウム塩およびシアル酸、並びにそれらの塩または水和物から選ばれる少なくとも１である、前項１に記載の水溶液の調製方法。
３．培地が粉末培地、液体培地またはスラリー状の培地である、前項１または前項２に記載の調製方法。
４．粉末培地がさらに金属塩、糖類およびビタミンから選ばれる少なくとも１を含む培地である、前項３に記載の調製方法。
５．培地が細胞培養用の培地である、前項１〜４のいずれか１に記載の調製方法。
６．培地が動物細胞培養用の培地である、前項５に記載の調製方法。
７．培地がチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞培養用の培地である、前項６に記載の調製方法。
８．前項１〜７のいずれか１に記載の方法により調製された、水溶液。
９．前項１〜７のいずれか１に記載の方法で調製した水溶液を用いる、細胞の培養方法。
１０．細胞が動物細胞である、前項９に記載の細胞の培養方法。
１１．細胞がチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞である、前項１０に記載の細胞の培養方法。
１２．前項９〜１１のいずれか１に記載の細胞の培養方法を用いる、生理活性物質の製造方法。
１３．生理活性物質がペプチドまたは蛋白質である、前項１２に記載の製造方法。
１４．蛋白質が糖蛋白質または抗体である、前項１３に記載の製造方法。
１５．前項１２〜１４のいずれか１に記載の製造方法を用いて製造される、生理活性物質。
１６．培地およびキレート剤を含む水溶液を膜ろ過する方法であって、該水溶液が、水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を添加して調製した水溶液である、膜ろ過する方法。
１７．キレート剤がクエン酸、リンゴ酸、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸  鉄（ＩＩＩ）ナトリウム塩およびシアル酸、並びにそれらの塩または水和物から選ばれる少なくとも１である、前項１６に記載の膜ろ過する方法。
１８．培地が粉末培地、液体培地又はスラリー状の培地である、前項１６または前項１７に記載の膜ろ過する方法。
１９．粉末培地がさらに金属塩、糖類およびビタミンから選ばれる少なくとも１を含む粉末である、前項１８に記載の膜ろ過する方法。
２０．培地が細胞培養用の培地である、前項１８または１９に記載の膜ろ過する方法。
２１．培地が動物細胞培養用の培地である、前項２０に記載の膜ろ過する方法。
２２．培地がチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞培養用の培地である、前項２１に記載の膜ろ過する方法。
２３．膜ろ過に用いるろ過膜の孔径が１ｎｍから１００μｍである、前項１６〜２２のいずれか１に記載の膜ろ過する方法。  
２４．キレート剤を水溶液に添加してキレート剤を含む水溶液を調製し、該水溶液を膜ろ過する、水溶液の膜ろ過性を向上する方法。
２５．さらに培地を水溶液に添加して培地およびキレート剤を含む水溶液を調製し、該水溶液を膜ろ過する、前項２４に記載の水溶液の膜ろ過性を向上する方法。
２６．キレート剤を水溶液の最終ｐＨ調整よりも先に水溶液に添加してキレート剤を含む水溶液を調製することを特徴とする、前項２４または２５に記載の水溶液の膜ろ過性を向上する方法。
２７．キレート剤を、培地よりも先または同時に水溶液に添加することを特徴とする、前項２４〜２６のいずれか１に記載の水溶液の膜ろ過性を向上する方法。
２８．最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を水溶液に添加して培地および該キレート剤を含む水溶液を調製し、該水溶液を膜ろ過した後、得られた水溶液を用いて細胞を培養することによって、生理活性物質を製造する方法。
【発明の効果】
【００１１】
驚くべきことに本発明者らは、水溶液調製方法において、キレート剤を添加することにより該水溶液の膜ろ過性が大幅に向上することを初めて見出した。また、本発明者らは、水溶液調製方法において、キレート剤の添加濃度に依存して膜ろ過性が向上することを見出した。【００１２】
さらに、本発明者らは、水溶液調製方法において、水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を添加することにより、該水溶液の膜ろ過性が大幅に向上することを見出した。また、本発明者らは、水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を添加することにより調製した水溶液を用いて細胞を培養し、生理活性物質を製造することができることを見出した。【００１３】
このような知見に基づいて培地及びキレート剤を含む水溶液の調製方法を提供できることが示された。また、該方法により調製された水溶液、該方法で調製した水溶液を用いた細胞の培養方法、該細胞の培養方法を用いた生理活性物質の製造方法、及び該生理活性物質の製造方法を用いて製造される生理活性物質を提供できることが示された。【００１４】
さらに、該水溶液の調製方法によって調製された水溶液を膜ろ過する方法、およびキレート剤を用いて水溶液を調製することを特徴とする膜ろ過性を向上する方法も提供できることが示された。該調製方法によって調製された水溶液を膜ろ過した後、得られた水溶液を用いて細胞を培養することによって、生理活性物質を製造する方法を提供できることも示された。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１はキレート剤を添加することにより水溶液のろ過性が向上することを示す。縦軸は単位膜面積あたりの最大処理量［Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ２）］を示す。横軸は使用したキレート剤を示す。
【図２】図２は水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を添加することにより水溶液のろ過性が顕著に向上することを示す。縦軸は単位膜面積あたりの最大処理量［Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ２）］を示す。横軸はキレート剤を添加した時点を示す。
【図３】図３はキレート剤の濃度依存的にろ過性が向上することを示す。縦軸は単位膜面積あたりの最大処理量［Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ２）］を示す。横軸はキレート剤の濃度（ｇ／Ｌ）を示す。
【図４】図４はキレート剤によるろ過性向上効果が膜材質及び膜構造に依存しないことを示す。縦軸は単位膜面積あたりの最大処理量［Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ２）］を示す。横軸はろ過膜の材質を示す。
【図５】図５はキレート剤としてシアル酸を添加することにより水溶液のろ過性が顕著に向上することを示す。縦軸は単位膜面積あたりの最大処理量［Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ２）］を示す。横軸は溶液の種類を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明は、培地およびキレート剤を含む水溶液の調製方法であって、該水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を水溶液に添加する水溶液の調製方法に関する。
【００１８】
前記水溶液とは、特に限定されるものではないが、好ましくは細胞等を培養することができる水溶液（細胞培養用水溶液ともいう）が挙げられる。
【００１９】
培地としては、例えば、粉末培地、液体培地またはスラリー状の培地が挙げられる。これらの培地は市場で入手可能な培地から適宜選択でき、また、２種類以上の培地を混合してもかまわない。さらに文献に記載された公知の培地等も選択できる。
【００２０】
また、培地としては、例えば、細菌細胞培養用の培地、酵母細胞培養用の培地、植物細胞培養用の培地、または動物細胞培養用の培地等が挙げられる。これらの中でも、動物細胞培養用の培地が好ましい。また、培地としては、特に制限はないが、例えば、拡大培養培地、基本（初発）培地、またはフィード培地等が挙げられる。
【００２１】
また、培地は、合成培地、半合成培地、または天然培地のいずれでもよい。例えば、基礎培地、血清含有培地、無血清培地、動物由来成分を含まない培地または無蛋白質培地等が挙げられる。これらの中でも、無血清培地、無蛋白質培地または完全合成培地が好ましい。
【００２２】
細胞培養用の培地としては、動物細胞培養用の培地が好ましく、チャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞培養用の培地がより好ましい。
【００２３】
基礎培地としては、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］、Ｆ１２培地（ＬＴＩ社製）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）］、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）［Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４７，９２３（１９７８）］、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３０２培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３２５培地、（ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）、若しくはＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（インビトロジェン社製）など各社の市販培地、またはこれらの改変培地あるいは混合培地等が挙げらる。これらの中でも、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ及びＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３０２培地、またはハイブリドーマＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）が好ましい。
【００２４】
血清含有培地としては、例えば、基礎培地に、ウシ若しくはウマ等の哺乳類動物血清、ニワトリ等の鳥類動物血清、ブリ等の魚類動物血清、または上記血清の分画物の内、１種以上の血清若しくは血清分画物を添加したものが挙げられる。
【００２５】
無血清培地としては、例えば、基礎培地に、血清の代替物である栄養因子または生理活性物質等を添加させたものが挙げられる。
【００２６】
動物由来成分を含まない培地においては、動物由来成分の代わりに添加される物質を添加してもよい。該物質としては、例えば、遺伝子組換え法で製造された生理活性物質、または加水分解物若しくは動物由来原料を含まない脂質等が挙げられる。
【００２７】
無蛋白培地とは、例えば、ＡＤＰＦ培地（Ａｎｉｍａｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ、ハイクローン社製）、ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地（インビトロジェン社製）、ＣＤ−ＣＨＯ培地（インビトロジェン社製）、ＩＳ−ＣＤ−ＣＨＯ培地（アーバイン・サイエンティフィック社製）、またはＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤ−ＣＨＯ培地（ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）等が挙げられる。
【００２８】
粉末培地の製造方法は特に限定はないが、好ましくは、乾燥成分のディスクミル、ボールミル若しくはピンミル等のような混合プロセスによる製造方法、または事前に作られた水溶液の凍結乾燥による製造方法等が挙げられる。
【００２９】
粉末培地には、顆粒形態で存在する培地が含まれる。
【００３０】
顆粒形態で存在する粉末培地の製造方法は特に限定されないが、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）等が挙げられる。また、細粒化した成分に、更に天然糊料、合成糊料、糖類、及び油脂類からなる群から選択される少なくとも１種類の素材を溶解した溶液を噴霧し乾燥させる工程が含まれてもよい。
【００３１】
前記培地に所望の栄養因子を適宜選択して添加することもできる。さらに、所望の栄養因子を適宜選択した成分で培地を構成してもよい。栄養因子としては、例えば、糖類などの炭素源、またはアミノ酸などの窒素源が挙げられる。具体的には、例えば、アミノ酸、金属、ビタミン、糖類、塩、脂質、核酸、生理活性物質、脂肪酸、有機酸、蛋白質、加水分解物等が挙げられる。また、これらの化合物は、塩酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等の塩、及び／または、例えば水和物等の溶媒和物を形成していてもよい。
【００３２】
アミノ酸としては特に限定されないが、例えば、Ｌ−アラニン（Ａｌａ）、Ｌ−アルギニン（Ａｒｇ）、Ｌ−アスパラギン（Ａｓｎ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ａｓｐ）、Ｌ−システイン（Ｃｙｓ）、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸（Ｇｌｕ）、Ｌ−グルタミン（Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇｌｙ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｈｉｓ）、Ｌ−イソロイシン（Ｉｌｅ）、Ｌ−ロイシン（Ｌｅｕ）、Ｌ−リジン（Ｌｙｓ）、Ｌ−メチオニン（Ｍｅｔ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、Ｌ−プロリン（Ｐｒｏ）、Ｌ−セリン（Ｓｅｒ）、Ｌ−スレオニン（Ｔｈｒ）、Ｌ−トリプトファン（Ｔｒｐ）またはＬ−バリン（Ｖａｌ）等が挙げられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。また、これらの塩酸塩、ナトリウム塩等の塩及び／または水和物等の溶媒和物を用いてもよい。ペプチドとして添加してもよく、例えば、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンまたはＬ−アラニル−Ｌ−システインなどが挙げられる。
【００３３】
生理活性物質としては、例えば、インシュリン、トランスフェリン、血清アルブミンまたは増殖因子を含む血清分画物等が挙げられる。
【００３４】
脂質としては、例えば、コレステロール、リノール酸またはリノレイン酸等が挙げられる。また、これらの塩酸塩、ナトリウム塩等の塩及び／または水和物等の溶媒和物を用いてもよい。
【００３５】
金属としては特に限定されないが、例えば、鉄、マンガン、亜鉛、モリブデン、バナジウム、銅、カドミウム、ルビジウム、コバルト、ジルコニウム、ゲルマニウム、ニッケル、スズ、クロムまたはケイ素等が挙げられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。これらの金属は、例えば、塩酸塩、硫酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等の塩、及び／または、例えば水和物等の溶媒和物を形成していてもよい。
【００３６】
糖類としては、単糖、オリゴ糖または多糖のいずれでもよく、特に限定されない。さらにデオキシ糖、ウロン酸、アミノ糖または糖アルコール等の糖誘導体も含まれる。例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、リボース、アラビノース、リブロース、エリトロース、エリトルロース、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、セドヘプツロース、マルトース、ラクトースまたはスクロース等が挙げられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。また、これらの塩酸塩、ナトリウム塩等の塩及び／または水和物等の溶媒和物を用いてもよい。
【００３７】
ビタミンとしては特に限定されないが、例えば、ｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミンまたはＤＬ−α−トコフェロール等が挙げられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。また、これらの塩酸塩、ナトリウム塩等の塩及び／または水和物等の溶媒和物を用いてもよい。
【００３８】
加水分解物としては、例えば、大豆、小麦、米、えんどう豆、綿実、魚若しくは酵母抽出物等の加水分解物、または抽出物等が挙げられる。具体的には、例えば、ＳＯＹ  ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ  ＵＦ（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、カタログ番号：９１０５２−１Ｋ３９８６、または９１０５２−５Ｋ３９８６）が挙げられる。  
【００３９】
キレート剤としては、キレート剤を添加し調製される水溶液の使用目的に適っていれば、特に限定されない。また、本発明のキレート剤としては、１種類若しくは複数の種類のキレート剤を用いてもよい。
【００４０】
キレート剤としては、特に水溶性のキレート剤が好ましく、例えば、アミノカルボン酸系、オキシカルボン酸系、低級二塩基性カルボン酸系、多価アルコール、または無機化合物系等が挙げられる。また、本発明のキレート剤は、キレート効果を維持していれば塩等を形成していてもよく、例えば、塩酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等の塩、及び／または、水和物等の溶媒和物を形成していてもよい。
【００４１】
アミノカルボン酸系のキレート剤としては、具体的には、例えば、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＮＩＭＤＡ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸  鉄（ＩＩＩ）ナトリウム塩（ＥＤＴＡ  ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）、Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン四酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、トリメチレンジアミン四酢酸（ＴＭＴＡ）、エチレングリコールジエチルエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四プロピオン酸（ＥＤＴＰ）、グルタミン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸や、アスパラギン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸、グリシン、アラニン、これらの塩及び／または水和物の溶媒和物等が挙げられる。
【００４２】
オキシカルボン酸系のキレート剤としては、具体的には、例えば、乳酸、グリコール酸、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸、マンデル酸、これらの塩及び／または水和物の溶媒和物等が挙げられる。低級二塩基性カルボン酸系のキレート剤としては、例えば、シュウ酸、マロン酸、これらの塩及び／または水和物の溶媒和物等が挙げられる。
【００４３】
多価アルコールとしては、例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール若しくはトリエチレングリコール等のグリコール類、または糖アルコール類が挙げられる。具体的には、例えば、グリセリン、エリトリット、アラビット、キシリット、ソルビット、マンニットまたはガラクチット等の他イノシトール等が挙げられる。
【００４４】
無機化合物系のキレート剤としては、例えば、ピロリン酸、トリリン酸、縮合リン酸、これらの塩及び／または水和物の溶媒和物等が挙げられる。キレート剤として特に好ましいのは、クエン酸３ナトリウム２水和物、Ｌ−リンゴ酸又はエチレンジアミン四酢酸  鉄（ＩＩＩ）ナトリウム塩である。
【００４５】
さらにキレート剤としては、シアル酸を用いることができる。シアル酸とは、９つの炭素骨格からなるカルボキシル基を持つ２−ケト−３デオキシノン酸を意味し、ノイラミン酸ともいう。
【００４６】
シアル酸には、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グライコリルノイラミン酸、Ｏ−アセチルノイラミン酸、またはデアミノノイラミン酸、または、これらの塩、水和物及び／または誘導体等が含まれる。
【００４７】
またシアル酸には、骨格として５−Ｎ−アセチル、または５−Ｎ−グリコリルノイラミン酸を持つものであって、水酸基の幾つかがＯ−アセチル化されたものを含む。本発明のシアル酸として、特に好ましくは、Ｎ−アセチルノイラミン酸二水和物である。
【００４８】
キレート剤は公知の化学合成法により製造することが出来る。
【００４９】
キレート剤は水溶液の調製時に添加し、特に最終ｐＨ調整よりも先に水溶液に添加することが好ましい。本発明の水溶液の調製方法において、キレート剤を水溶液に添加する順番（添加時期）は、水溶液の最終ｐＨ調整よりも先であれば、添加する培地の組成、キレート剤の種類等により適宜選択できる。水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を水溶液に添加することにより、調製された水溶液の膜ろ過性を向上することができる。
【００５０】
本発明の水溶液の調製方法において、キレート剤はいずれの培地と同時にまたはその前後に水溶液に添加することができ、培地よりも先または同時に水溶液に添加することが好ましい。さらに、キレート剤は培地中に先に添加しておくこともできる。キレート剤を培地よりも先または同時に水溶液に添加することにより、調製された水溶液の膜ろ過性を更に向上することができる。
【００５１】
本発明における最終ｐＨ調整とは、水溶液のｐＨを所定のｐＨに調整する工程のことをいう。最終ｐＨは水溶液の使用目的に応じて調整される。水溶液が細胞培養用水溶液の場合、該ｐＨの値は細胞を培養できるものであればいずれの値であってもよい。ｐＨ調整が不要な場合は、水溶液に含有される物質の水溶液への最終の添加を最終ｐＨ調整とみなす。
【００５２】
最終ｐＨ調整はいずれの酸またはアルカリを用いて行うことが出来る。具体的には、例えば、炭酸水素ナトリウム、塩酸、水酸化ナトリウム等を用いることができる。
【００５３】
水溶液に含有される物質の水溶液への最終の添加を最終ｐＨ調整とみなす場合の例としては、培地中にｐＨを調整するＮａ２ＣＯ３または４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＭＯＰＳ）などの緩衝剤が既に含有されている場合などがある。
【００５４】
キレート剤の添加量は特に限定はないが、水溶液調製後、添加した該キレートの該水溶液中の濃度が好ましくは０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、さらに好ましくは０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、特に好ましくは０．３４ｍｍｏｌ／Ｌ以上であるような量を添加することが好ましい。
【００５５】
また、水溶液へのキレート剤の添加量としては、０．００１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ等の範囲で当業者であれば適宜選択できるが、好ましくは０．３４〜８９ｍｍｏｌ／Ｌ、更に好ましくは０．３４〜１５ｍｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは０．３４〜６．８ｍｍｏｌ／Ｌであるような量を添加することもできる。調製された水溶液中のキレート剤の濃度は、培地中に鉄等の金属の供給源として加えられている鉄等金属とキレート複合体により、さらに高くてもよい。
【００５６】
本発明における水溶液の調製時に、加水分解物、金属塩、糖類、ビタミン、アミノ酸、ｐＨ調整剤、有機酸、脂肪酸、ペプチド、生理活性物質、脂質または核酸等をそれぞれ別に、あるいは一部培地に混合して添加することもできる。金属塩、糖類またはビタミンを培地に混合して添加することもできる。
【００５７】
細胞としては、真核細胞、原核細胞のいずれでもよく、例えば、哺乳類、鳥類、は虫類、両生類、魚類、昆虫類若しくは植物等由来の細胞、細菌、大腸菌若しくは枯草菌等の微生物、細菌、大腸菌若しくは枯草菌等微生物由来の細胞、または、酵母等若しくは酵母等由来の細胞が挙げられる。
【００５８】
これらの中でも、哺乳類に属する動物細胞が好ましく、ヒト若しくはサル等の霊長類に由来する動物細胞またはマウス、ラット若しくはハムスター等のげっ歯類に由来する動物細胞がより好ましく、チャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞が最も好ましい。
【００５９】
本発明におけるチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞とは、チャイニーズハムスター（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ；Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓｇｒｉｓｅｕｓ）の卵巣組織から樹立された株化細胞であればいかなる細胞も包含される。
【００６０】
具体的には、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０８，９４５（１９５８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０，１２７５（１９６８）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５５，５１３（１９６８）、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，４１，１２９（１９７３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８，１１５（１９９６）、Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４８，２６０（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６０，１２７５（１９６８）、Ｃｅｌｌ，６，１２１（１９７５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｉ，ＩＩ，８８３−９００等の文献に記載されているＣＨＯ細胞を挙げることができる。
【００６１】
また、例えば、ＡＴＣＣ（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に登録されているＣＨＯ−Ｋ１株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−６１）、ＤＵＸＢ１１株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７８１）、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−９０９６）、市販のＣＨＯ−Ｓ株（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社  Ｃａｔ＃１１６１９）若しくはＣＨＯ／ＤＧ４４［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）］またはこれら株を様々な培地に馴化させた亜株なども挙げることができる。
【００６２】
哺乳類に属する細胞としては、例えば、骨髄腫細胞、卵巣細胞、腎臓細胞、血球細胞、子宮細胞結合組織細胞、乳腺細胞若しくは胚性網膜芽細胞またはこれらの細胞に由来する細胞等が挙げられる。これらの中でも、骨髄腫細胞、骨髄腫細胞に由来する細胞、卵巣細胞、または卵巣細胞に由来する細胞から選ばれる細胞が好ましい。
【００６３】
例えば、ヒト細胞株であるＨＬ−６０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２４０）、ＨＴ−１０８０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−１２１）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２）、２９３（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１２０６０２）、Ｎａｍａｌｗａ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４３２）、Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１，１５１（１９８８）］、ＮＭ−Ｆ９（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６０５、国際公開第２００５／０１７１３０号）及びＰＥＲ．Ｃ６（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．９６０２２９４０、米国特許第６８５５５４４号明細書）、サル細胞株であるＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−１６５１）及びＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５１）、マウス細胞株であるＣ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６１６）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１５８１）、ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）、ＮＳ０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１８２７）、ラット細胞株であるＹ３  Ａｇ１．２．３．（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６３１）、ＹＯ（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１１０５０１）及びＹＢ２／０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６６２）、ハムスター細胞株である上記記載のチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞及びＢＨＫ２１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１０）またはイヌ細胞であるＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−３４）等が挙げられる。
【００６４】
鳥類に属する細胞としては、例えば、ニワトリ細胞株ＳＬ−２９（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−２９）等が挙げられる。魚類に属する細胞としては、例えば、ゼブラフィッシュ細胞株ＺＦ４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−２０５０）等が挙げられる。
【００６５】
昆虫類に属する細胞としては、例えば、蛾（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株Ｓｆ９（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１７１１）等が挙げられる。また、ワクチン製造に使用される初代培養細胞としては、例えば、初代サル腎細胞、初代ウサギ腎細胞、初代ニワトリ胎児細胞、または初代ウズラ胎児細胞等が挙げられる。
【００６６】
骨髄腫細胞または骨髄腫細胞に由来する細胞としては、例えば、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４、ＮＳ０、Ｙ３  Ａｇ１．２．３．、ＹＯまたはＹＢ２／０等が挙げられる。卵巣細胞または卵巣細胞に由来する細胞としては、例えば、上記記載のチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞等が挙げられる。また、腎臓細胞としては、例えば、２９３、ＶＥＲＯ、ＣＯＳ−７、ＢＨＫ２１またはＭＤＣＫ等が挙げられる。
【００６７】
血球細胞としては、例えば、ＨＬ−６０、Ｎａｍａｌｗａ、Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１またはＮＭ−Ｆ９等が挙げられる。子宮細胞としては、例えば、ＨｅＬａ等が挙げられる。結合組織細胞としては、例えば、ＨＴ−１０８０またはＮＩＨ３Ｔ３等が挙げられる。乳腺細胞としては、例えば、Ｃ１２７１Ｉ等が挙げられる。胚性網膜芽細胞としては、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６等がそれぞれ挙げられる。
【００６８】
細胞としては、物質を生産する能力の有無は、特に限定されず、例えば、体細胞へ数種類の遺伝子を導入することにより得られたｉＰＳ細胞、ヒトを含む哺乳動物ドナーから採取した精子、卵子細胞、物質を産生する細胞または物質を産生するようになった融合細胞等が挙げられる。
【００６９】
これらの中でも、物質を産生する細胞、または、物質を産生するようになった融合細胞等が好ましく、物質を産生する動物細胞、または、物質を産生するようになった動物由来の融合細胞等がより好ましい。例えば、所望の物質が抗体である場合には、Ｂ細胞等の抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合細胞であるハイブリドーマ等が挙げられる。また、変異処理を施して物質を産生するようになった動物細胞、または物質の発現量を上昇させるような変異処理を施した動物細胞等も動物細胞に包含される。
【００７０】
変異処理を施して物質を産生するようになった動物細胞としては、例えば、所望の物質を生産出来るようにする為に、蛋白質の修飾酵素等に変異が導入された細胞等が挙げられる。例えば、所望の物質が糖蛋白質である場合には、糖鎖の構造を変化させるために、種々の糖鎖修飾酵素に変異が導入された細胞等が挙げられる。
【００７１】
さらに、物質を産生する動物細胞としては、所望の物質が産生出来ればいずれの動物細胞を用いてもよく、例えば、物質の生産に関与する遺伝子を含む組換え体ベクターで形質転換された動物細胞も包含される。該形質転換細胞は、物質の生産に関与するＤＮＡとプロモーターを含む組換え体ベクターとを、上記の哺乳類に属する細胞に導入することによって得ることが出来る。
【００７２】
物質の生産に関与する遺伝子としては、例えば、ペプチド等の物質をコードするＤＮＡ、物質の生合成に関わる酵素または蛋白質をコードするＤＮＡ等のいずれも用いることができる。
【００７３】
プロモーターとしては、本発明で用いる動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のイミディエイトアーリー（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーターまたはＳＲαプロモーター等が挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサー等をプロモーターと共に用いてもよい。  
【００７４】
組換え体ベクターは所望のベクターを用いて調製できる。前記組換えベクターを調製するために用いられるベクターとしては、本発明で用いる動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることが出来、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平３−２２９７９号公報、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＳ３−３（日本国特開平２−２２７０７５号公報）、ｐｃＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０等が挙げられる。
【００７５】
宿主細胞への組換え体ベクターの導入方法としては、当該細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることが出来、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（日本国特開平２−２２７０７５号公報）またはリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）］等が挙げられる。
【００７６】
形質転換細胞としては、具体的には、例えば、抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体を生産する形質転換細胞７−９−５１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６９１）、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ２７６０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０５４）、抗ＣＣＲ４ヒト化抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ８７５９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２９）及びＫＭ８７６０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３０）、７０９ＬＣＡ−５００Ｄ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３９）、抗ＩＬ−５受容体α鎖キメラ抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ７３９９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４９）、抗ＩＬ−５受容体α鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ８３９９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４８）及びＫＭ９３９９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４７）、抗ＧＭ２ヒト型ＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ８９６６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１０５）、ＫＭ８９６７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１０６）、ＫＭ８９６９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５２７）、ＫＭ８９７０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５２８）、抗ＣＤ２０抗体を生産する形質転換株Ｍｓ７０４−ＣＤ２０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００９２）及びアンチトロンビンＩＩＩを生産する形質転換細胞Ｍｓ７０５−ｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８４７２）等が挙げられる。
【００７７】
本発明は、水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を添加することを特徴とする、培地とキレート剤を含む水溶液の調製方法により調製された水溶液に関する。
【００７８】
また、本発明は、水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を添加することを特徴とする、培地とキレート剤を含む水溶液の調製方法により調製された水溶液を用いた、細胞の培養方法に関する。
【００７９】
細胞を培養する方法としては、例えば、バッチ培養、リピートバッチ培養、フェドバッチ培養またはパーフュージョン培養等が挙げられる。細胞を培養する方法は、用いる細胞に適した方法であればいずれでもよいが、フェドバッチ培養が好ましい。
【００８０】
具体的には、例えば、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃等の条件下で、例えば、フェドバッチ培養では３〜２０日間、パーフュージョン培養では３〜６０日間、培養を行う。また、培養中必要に応じて、ストレプトマイシンまたはペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。なお、溶存酸素濃度制御、ｐＨ制御、温度制御または攪拌等は通常の細胞の培養に用いられる方法を用いることが出来る。
【００８１】
水溶液の保存方法としては、水溶液が無菌状態を保持する方法であれば特に制限されないが、例えば、ステンレスタンクまたはディスポーサブルバッグ等を用いる方法等が挙げられる。
【００８２】
培養方法の培養量としては、細胞培養用プレートを用いた通常０．１ｍＬ〜１０ｍＬのごく微量な培養量でも、三角フラスコ等を用いた通常１０〜１０００ｍＬの少量の培養量でも、ジャー等の培養槽等を用いた通常１〜２００００Ｌの商用生産に用いることが出来る大量の培養量でも、いかなる培養量でもよい。
【００８３】
また、本発明は、水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を添加し調製された、培地およびキレート剤を含む水溶液を用いて細胞を培養することを含む、生理活性物質の製造方法に関する。
【００８４】
本発明の生理活性物質の製造方法で製造される生理活性物質がペプチドまたは蛋白質である場合、宿主細胞内にペプチドまたは蛋白質を生産させる直接発現方法、宿主細胞外にペプチドまたは蛋白質を分泌生産させる方法（モレキュラー・クローニング第２版）等を用いることができる。
【００８５】
ペプチドまたは蛋白質は、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、または日本国特開平５−３３６９６３号公報、国際公報第９４／２３０２１号等に記載の方法を利用することにより、宿主細胞外へ積極的に分泌させることが出来る。即ち、遺伝子組換えの手法を用いて、所望のペプチドまたは蛋白質のＮ末端にシグナルペプチドを結合させた形で発現させることにより、所望のペプチドまたは蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることが出来る。
【００８６】
また、日本国特開平２−２２７０７５号公報に記載されている、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用することにより、所望のペプチドまたは蛋白質の生産量を上昇させることも出来る。
【００８７】
本発明の方法により製造される所望のペプチドまたは蛋白質は、例えば、通常のペプチドまたは蛋白質の単離精製法等を用いて単離精製することが出来る。
【００８８】
所望のペプチドまたは蛋白質が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザーまたはダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
【００８９】
前記無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常のペプチドまたは蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、プロテインＡ若しくはプロテインＧ等を含むレジンを用いたアフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、または等電点電気泳動等の電気泳動法等を、単独あるいは組み合わせて用いることにより、粗精製標品または精製標品を得ることが出来る。
【００９０】
所望のペプチドまたは蛋白質が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ペプチドまたは蛋白質を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、粗精製標品または精製標品を得ることができる。
【００９１】
生理活性物質としては、細胞、好ましくは動物細胞が生産出来る物質であればいかなるものでもよいが、哺乳類に属する動物細胞が生産できる物質が好ましい。該物質としては、例えば、アミノ酸、ペプチド、蛋白質若しくはリボザイム等の生体触媒分子、ケラチン、コラーゲン、エラスチン、レシリン若しくはフィブロイン等の構造の形成／保持分子、痘瘡ワクチン、ポリオワクチン、麻疹ワクチン、風疹ワクチン、おたふく風邪ワクチン、狂犬病ワクチン、水痘ワクチン、ウシ流行熱ワクチン、イバラキ病ワクチン若しくはウシ伝染性気管炎ワクチン等のワクチン、またはアデノウィルス若しくはバキュロウィルス等のウイルス等が挙げられる。
【００９２】
ペプチドとしては、真核細胞由来のペプチドが好ましく、より好ましくは動物細胞由来のペプチド、例えば、哺乳動物細胞由来のペプチドが挙げられる。また、前記ペプチドとしては、所望のペプチドが含まれており、活性を有していればいかなる形状でもよく、例えば、他のペプチドと融合させた融合ペプチド等の人工的に改変されたペプチドであってもよいし、部分断片からなるペプチドであってもよい。
【００９３】
ペプチドとしては、例えば、糖蛋白質の部分断片のうち、該糖蛋白質の活性を維持しているペプチド等が挙げられる。また、糖蛋白質が酵素である場合には、酵素の活性を調節するペプチドまたは酵素の構造を保持するペプチド等も包含される。酵素の活性を調節するペプチドとしては、具体的には、例えば、糖蛋白質のアゴニストまたはアンタゴニストとして機能するペプチド等が挙げられる。
【００９４】
アゴニストとしては、糖蛋白質の活性を亢進する活性を有するペプチドであればいかなるものでもよく、具体的には、例えば、ソマトスタチン誘導体、ソマトロビン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、グルカゴン、インスリン、インスリン様成長因子または性腺刺激ホルモン等が挙げられる。
【００９５】
アンタゴニストとしては、糖蛋白質の活性を抑制する活性を有するペプチドであればいかなるものでもよく、具体的には、例えば、ペグビソマトン等が挙げられる。
【００９６】
蛋白質としては、真核細胞由来の蛋白質が好ましく、動物細胞由来の蛋白質がより好ましく、例えば、哺乳動物細胞由来の蛋白質が挙げられる。また、蛋白質は、所望の蛋白質が含まれており、活性を有していればいかなる構造でもよく、例えば、他の蛋白質と融合させた融合蛋白質等の人工的に改変された蛋白質であってもよいし、部分断片からなる蛋白質であってもよい。
【００９７】
蛋白質としては、具体的には、例えば、糖蛋白質または抗体等が挙げられる。
【００９８】
糖蛋白質とは、具体的には、例えば、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，５５５８（１９７７）］、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）［Ｎａｔｕｒｅ，３６９  ５３３（１９９４）］、組織型プラスミノーゲンアクチベータ、プロウロキナーゼ、トロンボモジュリン、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、血液凝固因子ＸＩ、血液凝固因子ＸＩＩ、プロトロンビン複合体、フィブリノゲン、アルブミン、性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子、アクチビン、骨形成因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニ−刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８，９０１７（１９８３）］マクロファ−ジコロニ−刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３，２６９（１９９２）］、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，１９９８（１９７７）］、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン−２（ＩＬ−２）［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９３，１００７（１９７６）］、インターロイキン６、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）［Ｊ．Ｌｅｕｃ．Ｂｉｏｌ．，５５，２８０（１９９４）］、可溶性インターロイキン４受容体、腫瘍壊死因子α、ＤＮａｓｅＩ、ガラクトシダーゼ、αグルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘモグロビン若しくはトランスフェリン、またはこれらの誘導体、及びこれらの糖蛋白質の部分断片等が挙げられる。
【００９９】
抗体としては、抗原結合性を有する抗体であればいかなるものでもよく、例えば、腫瘍関連抗原を認識する抗体またはその抗体断片、アレルギー若しくは炎症に関連する抗原を認識する抗体またはその抗体断片、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体またはその抗体断片、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体またはその抗体断片、あるいはウイルス若しくは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体またはその抗体断片等が挙げられる。
【０１００】
腫瘍関連抗原としては、例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌｉｇａｎｄ（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５９、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８９、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ１０５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５８、ＣＤ１６０、ＣＤ１６２、ＣＤ１６４、ＣＤ２００、ＣＤ２２７、ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４（ＡＲＰ４）、ａｕｒｏｒａ、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−ＤＣ、ｉｎｔｅｇｌｉｎ、ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ２（ＢＳＴ２）、ＣＡ１２５、ＣＡ１９．９、ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ  ９（ＣＡ９）、ｃａｄｈｅｒｉｎ、ｃｃ−ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＣＲ）４、ＣＣＲ７、ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）、ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１（ＣＦＲ−１）、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−Ｍｙｃ、ｃｏｌｌａｇｅｎ、ＣＴＡ、ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＣＴＧＦ）、ＣＴＬＡ−４、ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ−１８、ＤＦ３、Ｅ−ｃａｔｈｅｒｉｎ、ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ３）、ＥＧＦＲ４（ＨＥＲ４）、ｅｎｄｏｇｌｉｎ、ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥｐＣＡＭ）、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＰＣＲ）、ｅｐｈｒｉｎ、ｅｐｈｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｅｐｈ）、ＥｐｈＡ２、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｓｅ−２（ＥＴ２）、ＦＡＭ３Ｄ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＡＰ）、Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇ１（ＦｃＲＨ１）、ｆｅｒｒｉｔｉｎ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ８（ＦＧＦ８）、ＦＧＦ８  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｂａｓｉｃ  ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、ｂＦＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＦＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１、ＦＬＴ３、ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  １０（ＦＺＤ１０）、ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４（ＦＺＤ−４）、Ｇ２５０、Ｇ−ＣＳＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ（例えば、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２またはＧＭ３等）、ｇｌｏｂｏ  Ｈ、ｇｐ７５、ｇｐ８８、ＧＰＲ−９−６、ｈｅｐａｒａｎａｓｅ  Ｉ、ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）、ＨＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＨＬＡ  ａｎｔｉｇｅｎ（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ等）、ＨＭ１．２４、ｈｕｍａｎ  ｍｉｌｋ  ｆａｔｇｌｏｂｕｌｅ（ＨＭＦＧ）、ｈＲＳ７、ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９０（ｈｓｐ９０）、ｉｄｉｏｔｙｐｅ  ｅｐｉｔｏｐｅ、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）、ＩＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＧＦＲ）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（例えば、ＩＬ−６またはＩＬ−１５等）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（例えば、ＩＬ−６ＲまたはＩＬ−１５Ｒ等）、ｉｎｔｅｇｒｉｎ、ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ−４（ＩＲＴＡ−４）、ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ  １、ＫＤＲ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＳ１／４、ｌａｍｐ−１、ｌａｍｐ−２、ｌａｍｉｎｉｎ−５、Ｌｅｗｉｓ  ｙ、ｓｉａｌｙｌＬｅｗｉｓ  ｘ、ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ−ｂｅｔａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＬＴＢＲ）、ＬＵＮＸ、ｍｅｌａｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ（ＭＣＳＰ）、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＩＣＡ、Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＭＩＳＩＩＲ）、ｍｕｃｉｎ、ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＮＣＡＭ）、Ｎｅｃｌ−５、Ｎｏｔｃｈ１、ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ、ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、ＰＤＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｆａｃｔｏｒ−４（ＰＦ−４）、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＡ）、ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＣＡ）、ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）、Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＴＨｒＰ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢＬｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ（ＲＨＡＭＭ）、ＲＯＢＯ１、ＳＡＲＴ３、ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ  ４Ｂ（ＳＥＭＡ４Ｂ）、ｓｅｃｒｅｔｏｒｙＬｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＳＬＰＩ）、ＳＭ５−１、ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−７２（ＴＡＧ−７２）、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴｆＲ）、ＴＧＦ−ｂｅｔａ、Ｔｈｙ−１、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ｍｕｃｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  １（ＴＩＭ−１）、ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ（ｈＴＦ）、Ｔｎ  ａｎｔｉｇｅｎ、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＴＦ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇＬｉｇａｎｄ（ＴＲＡＩＬ）、ＴＲＡＩＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（例えば、ＤＲ４またはＤＲ５等）、ｓｙｓｔｅｍ  ＡＳＣ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ２（Ａ��ＣＴ２）、ｔｒｋＣ、ＴＲＯＰ−２、ＴＷＥＡＫ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆｎ１４、ｔｙｐｅ  ＩＶ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２またはＶＥＧＦＲ３等）またはｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＶＬＡ−４等が挙げられる。
【０１０１】
抗体としては、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれでもよい。抗体のクラスとしては、例えば、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、イムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）、イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）、及びイムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）が挙げられるが、好ましくはＩｇＧである。更にＩｇＧのサブクラスとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４が挙げられる。
【０１０２】
また、抗体には、抗体の一部分を含む断片等が包含され、例えば、Ｆａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ、ｓｃＦｖ）及びジスルフィド安定化抗体（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ、ｄｓＦｖ）、または抗体のＦｃ領域を含む融合蛋白質等が挙げられる。
【０１０３】
抗体としては、例えば、動物に抗原を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌する抗体の他、遺伝子組換え技術により作製された抗体、即ち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得された抗体等が挙げられる。具体的には、ハイブリドーマが生産する抗体、ヒト型キメラ化抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体等が挙げられる。
【０１０４】
ヒト型キメラ抗体とは、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以下、重鎖はＨ鎖として、可変領域はＶ領域としてＨＶまたはＶＨとも称す）及び抗体軽鎖可変領域（以下、軽鎖はＬ鎖としてＬＶまたはＶＬとも称す）と、ヒト抗体の重鎖定常領域（以下、定常領域はＣ領域としてＣＨとも称す）及びヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることが出来る。
【０１０５】
ヒト型キメラ抗体は、モノクロ−ナル抗体を生産するハイブリドーマよりＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨ及びヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することが出来る。
【０１０６】
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと称す）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましく、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３またはｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることが出来る。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることが出来る。
【０１０７】
ヒト化抗体としては、例えば、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト型相同性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ、以下、ＣＤＲと称す）のアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬの適切な位置に移植して作製されたＣＤＲ移植抗体等が挙げられる。
【０１０８】
ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨ及びヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することが出来る。
【０１０９】
ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましく、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３またはｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることが出来る。また、ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることが出来る。
【０１１０】
ヒト抗体とは、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養物より該抗体を精製することが出来る。
【０１１１】
ヒト抗体はヒト抗体ファージライブラリーから調製することができる。ヒト抗体ファージライブラリーとは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂまたはｓｃＦｖ等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、固相化した抗原に対する結合活性を指標にして、抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することが出来る。該抗体断片より、２本の完全なＨ鎖及び二本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へ変換することが出来る。
【０１１２】
ヒト抗体は、ヒト抗体産生ハイブリドーマより、ＶＬ及びＶＨをコードするｃＤＮＡを取得し、適宜上述の方法等により野生型（以下、ＷＴと記載する）の１以上のアミノ酸残基をＣｙｓ残基に置換させたヒト抗体のＣＬ及びＣＨをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入し、動物細胞へ導入することにより発現させて製造することも出来る。
【０１１３】
ヒト抗体産生ハイブリドーマは、ヒト抗体産生トランスジェニック動物から、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法により取得出来る。ヒト抗体産生トランスジェニック動物とは、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物をいう。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することが出来る［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，７２２（２０００）］。
【０１１４】
あるいは、ヒト抗体は、ヒト抗体産生ハイブリドーマより、ＶＬ及びＶＨをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＬ及びＣＨをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入し、さらに適宜上述の方法等によりＷＴの１以上のアミノ酸残基をＣｙｓ残基に置換してヒト抗体発現ベクターを構築し、該ヒト抗体発現ベクターを動物細胞へ導入し、発現させて製造することも出来る。
【０１１５】
ヒト抗体に用いるＷＴのＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましく、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることが出来る。また、ヒト抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることが出来る。
【０１１６】
本発明の方法により製造される抗体としては、具体的には以下の抗体が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
【０１１７】
腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、例えば、抗ＧＤ２抗体［Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３，３３１（１９９３）］、抗ＧＤ３抗体［Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，２６０（１９９３）］、抗ＧＭ２抗体［Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４，１５１１（１９９４）］、抗ＨＥＲ２抗体［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５（１９９２）、ＵＳ５７２５８５６］、抗ＣＤ５２抗体［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５（１９９２）］、抗ＭＡＧＥ抗体［Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３，４９３（２０００）］、抗ＨＭ１．２４抗体［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６，３８７（１９９９）］、抗副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）抗体［Ｃａｎｃｅｒ，８８，２９０９（２０００）］、抗ｂＦＧＦ抗体、抗ＦＧＦ−８抗体［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９９１１（１９８９）］、抗ｂＦＧＦＲ抗体、抗ＦＧＦ−８Ｒ抗体［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１６４５５（１９９０）］、抗ＩＧＦ抗体［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７（１９９５）］、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７（１９９５）］、抗ＰＳＭＡ抗体［Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１６０，２３９６（１９９８）］、抗ＶＥＧＦ抗体［Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７，４５９３（１９９７）］、抗ＶＥＧＦＲ抗体［Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９，２１３８（２０００）、国際公開第９６／３００４６号］、抗ＣＤ２０抗体［Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１０，５４８（１９９８）、米国特許第５７３６１３７号明細書］、抗ＣＤ１０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体（国際公開第９６／４０２０１０号）、抗Ａｐｏ−２Ｒ抗体（国際公開第９８／５１７９３号）、抗ＡＳＣＴ２抗体（国際公開第２０１０／００８０７５号）、抗ＣＥＡ抗体［Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（２３  ｓｕｐｐｌ）：５９３５ｓ−５９４５ｓ，（１９９５）］、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体または抗Ａ３３抗体等が挙げられる。
【０１１８】
アレルギーまたは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、例えば、抗インターロイキン６抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５（１９９２）］、抗インターロイキン６受容体抗体［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１，３７１（１９９４）］、抗インターロイキン５抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５（１９９２）］、抗インターロイキン５受容体抗体、抗インターロイキン４抗体［Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，３，５６２（１９９１）］、抗インターロイキン４受容体抗体［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１７，４１（１９９８）］、抗腫瘍壊死因子抗体［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３，１８３（１９９４）］、抗腫瘍壊死因子受容体抗体［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５８，２３７（２０００）］、抗ＣＣＲ４抗体［Ｎａｔｕｒｅ，４００，７７６，（１９９９）］、抗ケモカイン抗体（Ｐｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１７４，２４９，１９９４）または抗ケモカイン受容体抗体［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１３７３（１９９７）］等が挙げられる。
【０１１９】
循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、例えば、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，２９６８（１９９４）］、抗血小板由来増殖因子抗体［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，１１２９（１９９１）］、抗血小板由来増殖因子受容体抗体［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１７４００（１９９７）］、抗血液凝固因子抗体［Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０１，１１５８（２０００）］、抗ＩｇＥ抗体、抗αＶβ３抗体またはα４β７抗体等が挙げられる。
【０１２０】
ウイルスまたは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、例えば、抗ｇｐ１２０抗体［Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，３８５（２０００）］、抗ＣＤ４抗体［Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２５，２０６５（１９９８）］、抗ＣＣＲ５抗体または抗ベロ毒素抗体［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７，３９６（１９９９）］等が挙げられる。
【０１２１】
また、本発明は、水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を添加することを特徴とする培地およびキレート剤を含む水溶液の調製方法により調製された水溶液を用いて細胞の培養をすることにより製造された、生理活性物質に関する。
【０１２２】
また、本発明は、培地およびキレート剤を含む水溶液を膜ろ過する方法であって、該水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を添加して調製した水溶液を用いる該膜ろ過する方法に関する。
【０１２３】
膜ろ過する方法としては、処理水溶液を圧力により多孔質膜を透過させ、溶液中の成分、粒子、夾雑物等を除去する方法であれば、特に限定されないが、精密ろ過法、限外ろ過法、透析法、電気透析法または逆浸透法が好ましく、精密ろ過法、限外ろ過法または透析法がより好ましく、精密ろ過法が特に好ましい。
【０１２４】
膜ろ過に用いるろ過膜としては、特に限定されないが、精密ろ過膜、限外ろ過膜、透析膜、電気透析膜または逆浸透膜が好ましく、精密ろ過膜、限外ろ過膜または透析膜がより好ましく、精密ろ過膜が特に好ましい。
【０１２５】
ろ過膜の材質としては、特に限定されないが、例えば、酢酸セルロース、芳香族ポリアミド、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニル−ポリアクリロニトリル共重合体、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン（ＰＥＳ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、セラミックス、ポリビニルアルコール、ポリビニルデンジフルオライド、セルロースの酢酸−硝酸混合エステル、ポリテトラフルオロエチレン、アルミナ、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体若しくはテフロン（登録商標）等、またはそれらの誘導体等が挙げられる。これらの中でも、ポリエーテルスルフォンまたはポリフッ化ビニリデン等が好ましい。
【０１２６】
ポリエーテルスルフォンまたは、その誘導体を用いたろ過膜としては、具体的には、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＰＬＵＳ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｉｌｔｅｒｓ（孔径：０．２２、または０．４５μｍ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＳＨＣ  カートリッジ  フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＳＨＲ  カートリッジ  フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、スーポア  ＥＢＶ（Ｐａｌｌ社製）、スーポア  ＥＫＶ（Ｐａｌｌ社製、カタログ番号：ＡＢ３ＥＫＶ７ＰＨ４）、スーポアライフ２００（Ｐａｌｌ社製）、ザルトポア（登録商標）２（膜構造：２層膜、孔径：０．２＋０．１、０．４５＋０．２、または０．８＋０．４５μｍ）（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ  ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、ザルトポア（登録商標）２  ＸＬＧ（膜構造：２層膜、孔径：０．８＋０．２μｍ）（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ  ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、ザルトポア（登録商標）２  ＸＬＩ（膜構造：２層膜、孔径：０．３５＋０．２μｍ）（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ  ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、ザルトポア２  ハイフロー（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ  ｂｉｏｔｅｃｈ社製）またはＰＥＳメンブレンカートリッジフィルター  ＴＣＳ（孔径：０．２０、または０．４５μｍ）（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）等が挙げられる。
【０１２７】
または、ポリフッ化ビニリデンまたは、その誘導体を用いたろ過膜としては、具体的には、例えば、Ｄｕｒａｐｒｅ（登録商標）Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｉｌｔｅｒｓ（孔径：０．１０、０．２２、０．４５、０．６５、または５．０μｍ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、Ｄｕｒａｐｏｒｅ  ＩＩ  Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｆｉｌｔｅｒ  ＣａｒｔｒｉｄｇｅｇＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、Ｄｕｒａｐｏｒｅ  ＩＩ  Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  ＶＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、フロロダイン（登録商標）ＩＩ−ＤＦＬＰ（Ｐａｌｌ社製）、フロロダインＩＩ−ＤＢＬＰ（Ｐａｌｌ社製）、フロロダインＩＩ−ＤＪＬＰ（Ｐａｌｌ社製）、ウルチポアＶＦ−ＤＶ２０（Ｐａｌｌ社製）またはウルチポアＶＦ−ＤＶ５０（Ｐａｌｌ社製）等が挙げられる。
【０１２８】
また、ポリエーテルスルフォンまたはその誘導体とポリフッ化ビニリデンまたはその誘導体を組み合わせたろ過膜としては、具体的には、例えば、Ｆｌｕｏｒｏｄｙｎｅ（登録商標）ＥＸｇｒａｄｅ  ＥＤＦ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｐａｌｌ社製、カタログ番号：ＡＢ３ＵＥＤＦ７ＰＨ４）等が挙げられる。
【０１２９】
また、ポリエーテルスルフォンまたは、ポリフッ化ビニリデン以外の膜材質を用いたろ過膜としては、具体的には、例えば、Ｏｍｎｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｉｌｔｅｒｓ（孔径：０．１、０．２、０．４５、１．０、５．０、または１０μｍ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、ＭＦ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｉｌｔｅｒｓ（孔径：０．０２５、０．０５、０．１、０．２２、０．３、０．４５、０．６５、０．８、１．２、３、５、または８μｍ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、Ｎｙｌｏｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｉｌｔｅｒｓ（孔径：０．２０、または５．０μｍ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、ウルチポアＮ６６（孔径：０．２、または０．４５μｍ）（Ｐａｌｌ社製）、ポジダイン（登録商標）（孔径：０．１０、０．２０、０．３、または０．４５μｍ）（Ｐａｌｌ社製）、バラファイン  ＶＦＳＰ（孔径：０．２、または０．４５μｍ）（Ｐａｌｌ社製）、バラファイン  ＶＦＳＥ（孔径：０．０２、０．１、または０．２μｍ）（Ｐａｌｌ社製）、バラファイン  ＶＦＳＧ（孔径：０．０２、０．１、または０．２μｍ）（Ｐａｌｌ社製）、ザルトロン（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ  ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、アセテートメンブレンカートリッジフィルター  ＴＣＲ（孔径：０．２０、０．４５、または８．０μｍ）（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）、ユミクロンカートリッジフィルター（孔径：０．２、０．４、０．６、０．９、または２．５μｍ）（ユアサメンブレンシステム社製）等が挙げられる。
【０１３０】
ろ過膜の孔径としては、特に限定されないが、１ｎｍから１００μｍが好ましく、５ｎｍから１０μｍがより好ましく、より好ましくは１０ｎｍから１μｍが更に好ましく、０．１μｍから０．５μｍが特に好ましい。膜孔径の具体例としては、上記に記載したろ過膜具体例の孔径が挙げられる。
【０１３１】
ろ過膜の構造としては、例えば、マイレクス（Ｍｉｌｌｅｘ）フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号：ＳＬＧＶ０３３ＲＳ）の様に、一枚からなるろ過膜構造を取ってもよく、また、０．５／０．２  μｍ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＳＨＣ  Ｄｉｓｋ  Ｗ／Ｔｙｐａｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号：ＨＧＥＰ０２５５０）の様に１枚以上のプレフィルターが付属されることにより、２層以上の構造となっていてもよい。
【０１３２】
水溶液のろ過性評価方法としては、特に限定されないが、例えば、Ｖｍａｘ試験等が挙げられる。Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ２）とは、ろ過開始から無限時間後に得られる単位膜面積あたりの最大処理量であり、ＢｉｏＰｈａｒｍ，４６，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ（１９９５）記載の方法により測定することが出来る。
【０１３３】
また、本発明は、キレート剤を水溶液に添加してキレート剤を含む水溶液を調製し、該水溶液を膜ろ過する、水溶液の膜ろ過性を向上する方法に関する。さらに本発明はキレート剤および培地を水溶液に添加してキレート剤および培地を含む水溶液を調製し、該水溶液を膜ろ過する、水溶液の膜ろ過性を向上する方法も含む。
【０１３４】
また、本発明は、水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を水溶液に添加することによって培地および該キレート剤を含む水溶液を調製し、該水溶液を膜ろ過した後、得られた水溶液を用いて細胞を培養することによって、生理活性物質を製造する方法に関する。
【実施例】
【０１３５】
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。【０１３６】
［実施例１］キレート剤によるろ過性向上効果
粉末培地を含む水溶液調製時に各種キレート剤を添加したときの該水溶液のろ過性への影響を検討し、Ｖｍａｘ（単位膜面積あたりの最大処理量）の値が向上することを明らかにした。【０１３７】
水溶液の調製は以下の手順により行った。まず９００ｍＬの純水（以下、ＰＷと称す）に、キレート剤としてクエン酸３ナトリウム２水和物（小堺製薬社製）、Ｌ−リンゴ酸（Ｗａｋｏ社製、カタログ番号：１３８−０７５１２）、またはエチレンジアミン四酢酸  鉄（ＩＩＩ）ナトリウム塩（以下、ＥＤＴＡ  ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔと称す）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ番号：ＥＤＦＳ−１００Ｇ）をそれぞれ２．０ｇ添加し攪拌した。キレート剤が完全に溶解した後のｐＨは、クエン酸３ナトリウム２水和物添加液で８．４１、Ｌ−リンゴ酸添加液で２．５７、ＥＤＴＡ  ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ添加液で５．１１であった。【０１３８】
次に、６．７ｇのＳＯＹ  ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ  ＵＦ（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、カタログ番号：９１０５２−１Ｋ３９８６）を添加し、約１５分間攪拌した。さらにアミノ酸、金属塩、ビタミン等を含む改良粉末培地ＥＸ−ＣＥＬＬ  ３０２（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）２２．６ｇとＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：１４１９０−２５０）を用いて溶解した１ｍｍｏｌ／ＬのＭｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ番号：Ｍ８４０７−５００ＭＧ）０．５ｍＬを加えて、約３０分間攪拌した。【０１３９】
さらに、最終ｐＨ調整として１．６ｇの炭酸水素ナトリウム（関東化学社製、カタログ番号：３７１１６−００）を加えて、約５分間攪拌した後、ＰＷを加え１Ｌとし、さらに約１０分間攪拌した。【０１４０】
水溶液調製後の上記記載の添加した各キレート剤の濃度は、クエン酸３ナトリウム２水和物が６．８ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｌ−リンゴ酸が１５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＥＤＴＡ  ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔが５．４ｍｍｏｌ／Ｌとなる。【０１４１】
次に、調製した水溶液のＶｍａｘ試験を以下の手順で行った。加圧タンク（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に試験水溶液を１Ｌ入れた。試験用フィルターには、孔径０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘ（登録商標）ＧＶ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号：ＳＬＧＶ０３３ＲＳ）を用いた。フィルターをタンクへ接続し、圧縮空気により１００ｋＰａの圧力をかけた。【０１４２】
試験開始前にタンクのバルブを若干開け、水溶液を用いてフィルターを湿潤した。フィルターを湿潤した後、バルブを全開して試験を開始した。バルブ全開時の時間を０とし、ろ過処理量５ｇ増加するのにかかる経過時間を測定した。水溶液の密度を１ｇ／ｍＬとして、測定重量よりろ過量（Ｖ）を算出した。計測は３分以上行った。計測値を横軸に時間（ｔ）、縦軸にｔ／Ｖにとってグラフを作成し、得られた直線の傾きの逆数からＶｍａｘを算出した。【０１４３】
結果を図１に示す。Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ２）の値は、キレート剤を添加しなかった水溶液では４５２であったのに対し、キレート剤として、クエン酸３ナトリウム２水和物を添加した水溶液では１９３１、Ｌ−リンゴ酸を添加した水溶液では２４８３、ＥＤＴＡ  ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔを添加した水溶液では１８３４と増大した。【０１４４】
以上から、水溶液の調製時にキレート剤を添加することで水溶液のＶｍａｘの値が向上することを明らかにした。【０１４５】
［実施例２］クエン酸３ナトリウム２水和物の添加時期とろ過性向上効果
粉末培地を含む水溶液調製時における、クエン酸３ナトリウム２水和物の添加時期とろ過性への影響を検討し、クエン酸３ナトリウム２水和物をアミノ酸、金属塩、ビタミン等を含む粉末培地と同時または前に添加することにより、Ｖｍａｘ（単位膜面積あたりの最大処理量）が大幅に増加することを明らかにした。さらに、クエン酸３ナトリウム２水和物を最終ｐＨ調整工程より前に添加することにより、Ｖｍａｘ（単位膜面積あたりの最大処理量）が増加することを明らかにした。【０１４６】
水溶液の調製は、クエン酸３ナトリウム２水和物の添加を除き、以下の手順により行った。まず９００ｍＬの純水（以下、ＰＷと称す）に、６．７ｇのＳＯＹ  ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ  ＵＦ（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、カタログ番号：９１０５２−５Ｋ３９８６）を添加し、約１５分間攪拌した。【０１４７】
さらにアミノ酸、金属塩、ビタミン等を含む改良ＥＸ−ＣＥＬＬ  ３０２（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）２２．６ｇとＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：１４１９０−２５０）を用いて溶解した１ｍｍｏｌ／ＬのＭｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ番号：Ｍ８４０７−５００ＭＧ）０．５ｍＬを加えて、約３０分間攪拌した。【０１４８】
さらに、最終ｐＨ調整として１．６ｇの炭酸水素ナトリウム（関東化学社製、カタログ番号：３７１１６−００）を加えて、約５分間攪拌した後、ＰＷを加え１Ｌとし、さらに約１０分間攪拌した。【０１４９】
上記の水溶液調製手順のうち以下条件Ａ〜Ｈの時点でクエン酸３ナトリウム２水和物（小堺製薬社製）を添加し、水溶液を調製した。上記記載の添加したクエン酸３ナトリウム２水和物の水溶液調製後の濃度は０．１ｇ／Ｌ（０．３４ｍｍｏｌ／Ｌ）となる。【０１５０】
条件Ａ：添加なし
条件Ｂ：ＳＯＹ  ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ  ＵＦ添加の１０分前
条件Ｃ：ＳＯＹ  ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ  ＵＦ添加の１分前
条件Ｄ：ＳＯＹ  ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ  ＵＦ添加と同時
条件Ｅ：改良ＥＸ−ＣＥＬＬ  ３０２添加の１０分前
条件Ｆ：改良ＥＸ−ＣＥＬＬ  ３０２添加と同時
条件Ｇ：炭酸水素ナトリウム添加の１５分前
条件Ｈ：ＰＷで１Ｌに調製した直後【０１５１】
次に、調製した水溶液のＶｍａｘ試験を以下の手順で行った。加圧タンク（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に試験水溶液を１Ｌ入れた。試験用フィルターには、孔径０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘ（登録商標）ＧＶ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号：ＳＬＧＶ０３３ＲＳ）を用いた。フィルターをタンクへ接続し、圧縮空気により１００ｋＰａの圧力をかけた。試験開始前にタンクのバルブを若干開け、水溶液を用いてフィルターを湿潤した。フィルターを湿潤した後、バルブを全開して試験を開始した。【０１５２】
バルブ全開時の時間を０とし、ろ過処理量５ｇ増加するのにかかる経過時間を測定した。水溶液の密度を１ｇ／ｍＬとして、測定重量よりろ過量（Ｖ）を算出した。計測は３分以上行った。計測値を横軸に時間（ｔ）、縦軸にｔ／Ｖにとってグラフを作成し、得られた直線の傾きの逆数からＶｍａｘを算出した。【０１５３】
結果を図２に示す。Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ２）の値は、条件Ａでは１１６３であったのに対し、条件Ｂでは３１９９、条件Ｃでは３６５２、条件Ｄでは３７８３、条件Ｅでは３０６０、条件Ｆでは３５８１となり、改良ＥＸ−ＣＥＬＬ  ３０２添加と同時または前にクエン酸３ナトリウム２水和物を添加することにより水溶液のろ過性が大幅に向上した。【０１５４】
さらに、条件ＧでのＶｍａｘ（Ｌ／ｍ２）の値は２５０２となり、ｐＨ調整工程である炭酸水素ナトリウムの添加前に、クエン酸３ナトリウム２水和物を添加することにより水溶液のろ過性が向上した。一方、ｐＨ調整後にクエン酸３ナトリウム２水和物を添加する条件Ｈでは１４４１となり、水溶液のろ過性の向上はＡと同等あるいは微増に留まった。【０１５５】
以上から、クエン酸３ナトリウム２水和物を最終ｐＨ調整工程より前に添加することにより、水溶液のＶｍａｘ（単位膜面積あたりの最大処理量）が増加することを明らかにした。さらに、特に、クエン酸３ナトリウム２水和物をアミノ酸、金属塩またはビタミン等を含む粉末培地と同時または前に水溶液に添加することにより、水溶液のＶｍａｘが増加することを明らかにした。【０１５６】
［実施例３］クエン酸３ナトリウム２水和物添加濃度と水溶液ろ過性の向上の相関
水溶液調製時に添加するクエン酸３ナトリウム２水和物の濃度とろ過性への相関を検討し、濃度依存的にＶｍａｘ（単位膜面積あたりの最大処理量）が向上することを明らかにした。【０１５７】
水溶液の調製は以下の手順により行った。まず９００ｍＬの純水（以下、ＰＷと称す）に、クエン酸３ナトリウム２水和物（小堺製薬社製）を０ｇ（添加なし）、０．１ｇまたは１．０ｇ添加し攪拌した。クエン酸３ナトリウム２水和物が完全に溶解した後、６．７ｇのＳＯＹ  ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ  ＵＦ（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、カタログ番号：９１０５２−１Ｋ３９８６）を添加し、約１５分間攪拌した。【０１５８】
さらに、アミノ酸、金属塩、ビタミン等を含む改良ＥＸ−ＣＥＬＬ  ３０２（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）２２．６ｇとＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：１４１９０−２５０）を用いて溶解した１ｍｍｏｌ／ＬのＭｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ番号：Ｍ８４０７−５００ＭＧ）０．５ｍＬを加えて、約３０分間攪拌した。【０１５９】
さらに、最終ｐＨ調整として１．６ｇの炭酸水素ナトリウム（関東化学社製、カタログ番号：３７１１６−００）を加えて、約５分間攪拌した後、ＰＷを加え１Ｌとし、さらに約１０分間攪拌した。水溶液調製後の上記記載の添加したクエン酸３ナトリウム２水和物の濃度は、０ｇ／Ｌ（添加せず）、０．１ｇ／Ｌ（０．３４ｍｍｏｌ／Ｌ）、または１．０ｇ／Ｌ（３．４ｍｍｏｌ／Ｌ）となる。【０１６０】
次に、調製した水溶液のＶｍａｘ試験を以下の手順で行った。加圧タンク（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に試験水溶液を１Ｌ入れた。試験用フィルターには、孔径０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘ（登録商標）ＧＶ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号：ＳＬＧＶ０３３ＲＳ）を用いた。フィルターをタンクへ接続し、圧縮空気により１００ｋＰａの圧力をかけた。【０１６１】
試験開始前にタンクのバルブを若干開け、水溶液を用いてフィルターを湿潤した。フィルターを湿潤した後、バルブを全開して試験を開始した。バルブ全開時の時間を０とし、ろ過処理量５ｇ増加するのにかかる経過時間を測定した。水溶液の密度を１ｇ／ｍＬとして、測定重量よりろ過量（Ｖ）を算出した。計測は３分以上行った。計測値を横軸に時間（ｔ）、縦軸に（ｔ／Ｖ）をとってグラフを作成し、得られた直線の傾きの逆数からＶｍａｘを算出した。【０１６２】
結果を図３に示す。Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ２）の値は、キレート剤を添加しなかった水溶液は４５２であったのに対し、０．１ｇ／Ｌのクエン酸３ナトリウム２水和物を添加した水溶液は１７０６、１．０ｇ／Ｌのクエン酸３ナトリウム２水和物を添加した水溶液は２５８８と増大した。【０１６３】
以上から、水溶液の最終ｐＨ調整前にキレート剤としてクエン酸３ナトリウム２水和物を添加することでクエン酸３ナトリウム２水和物の濃度依存的に水溶液のＶｍａｘの値が向上することを明らかにした。【０１６４】
［実施例４］キレート剤によるろ過性向上効果の膜材質・膜構造非依存性
粉末培地を含む水溶液調製時におけるキレート剤による水溶液ろ過性向上効果を、複数のろ過膜を用いて検討した。その結果、孔径０．２２μｍのポリフッ化ビニリデン（以下、ＰＶＤＦと称す）膜、または、プレフィルターとして孔径０．５μｍのポリエーテルスルフォン（以下、ＰＥＳと称す）膜を組み合わせた孔径０．２μｍのＰＥＳ膜（以下、孔径０．５／０．２μｍのＰＥＳ膜と称す）において、Ｖｍａｘ（単位膜面積あたりの最大処理量）の値が向上することを明らかにした。【０１６５】
水溶液の調製は以下の手順により行った。まず９００ｍＬの純水（以下、ＰＷと称す）に、クエン酸３ナトリウム２水和物（小堺製薬社製）を０ｇ（添加なし）または、０．１ｇ添加し攪拌した。クエン酸３ナトリウム２水和物が完全に溶解した後、６．７ｇのＳＯＹ  ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ  ＵＦ（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、カタログ番号：９１０５２−１Ｋ３９８６、または９１０５２−５Ｋ３９８６）を添加し、約１５分間攪拌した。【０１６６】
さらにアミノ酸、金属塩、ビタミン等を含む改良粉末培地ＥＸ−ＣＥＬＬ  ３０２（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）２２．６ｇとＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：１４１９０−２５０）を用いて溶解した１ｍｍｏｌ／ＬのＭｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ番号：Ｍ８４０７−５００ＭＧ）０．５ｍＬを加えて、約３０分間攪拌した。さらに、最終ｐＨ調整として１．６ｇの炭酸水素ナトリウム（関東化学社製、カタログ番号：３７１１６−００）を加えて、約５分間攪拌した後、ＰＷを加え１Ｌとし、さらに約１０分間攪拌した。水溶液調製後の上記記載の添加したクエン酸３ナトリウム２水和物の濃度は、０ｇ／Ｌ（添加なし）または、０．１ｇ／Ｌ（０．３４ｍｍｏｌ／Ｌ）となる。【０１６７】
次に、試験用フィルターとして、孔径０．２２μｍのＰＶＤＦ膜であるＭｉｌｌｅｘ（登録商標）ＧＶ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号：ＳＬＧＶ０３３ＲＳ）を用い、調製した水溶液のＶｍａｘ試験を以下の手順で行った。加圧タンク（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に試験水溶液を１Ｌ入れた。フィルターをタンクへ接続し、圧縮空気により１００ｋＰａの圧力をかけた。【０１６８】
試験開始前にタンクのバルブを若干開け、水溶液を用いてフィルターを湿潤した。フィルターを湿潤した後、バルブを全開して試験を開始した。バルブ全開時の時間を０とし、ろ過処理量５ｇ増加するのにかかる経過時間を測定した。水溶液の密度を１ｇ／ｍＬとして、測定重量よりろ過量（Ｖ）を算出した。計測は３分以上行った。計測値を横軸に時間（ｔ）、縦軸にｔ／Ｖにとってグラフを作成し、得られた直線の傾きの逆数からＶｍａｘを算出した。【０１６９】
さらに、試験用フィルターとして、孔径０．５／０．２μｍのＰＥＳ膜である０．５／０．２μｍ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＳＨＣ  Ｄｉｓｋ  Ｗ／Ｔｙｐａｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号：ＨＧＥＰ０２５５０）を用い、調製した水溶液のＶｍａｘ試験を以下の手順で行った。加圧タンク（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に試験水溶液を１Ｌ入れた。【０１７０】
ＰＷにより充分に湿潤させた試験用フィルターをフォルダー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に装着し、フォルダーを加圧タンクに接続した。フォルダー付属のバルブを開け、エアーベントから十分にエアーを押し出した。加圧タンクに圧縮空気により１２０ｋＰａの圧力をかけた後、バルブを全開して試験を開始した。【０１７１】
バルブ全開時の時間を０とし、ろ過処理量５ｇ増加するのにかかる経過時間を測定した。水溶液の密度を１ｇ／ｍＬとして、測定重量よりろ過量（Ｖ）を算出した。計測は３分以上行った。計測値を横軸に時間（ｔ）、縦軸にｔ／Ｖにとってグラフを作成し、得られた直線の傾きの逆数からＶｍａｘを算出した。【０１７２】
結果を図４に示す。孔径０．２２μｍのＰＶＤＦ膜を用いたろ過において、Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ２）の値は、クエン酸３ナトリウム２水和物を添加しなかった水溶液では９５７であったのに対し、クエン酸３ナトリウム２水和物を添加した水溶液では３１９９と増大した。さらに、孔径０．５／０．２μｍのＰＥＳ膜を用いたろ過において、Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ２）の値は、クエン酸３ナトリウム２水和物を添加しなかった水溶液では１５１１であったのに対し、クエン酸３ナトリウム２水和物を添加した水溶液では３９２２と増大した。【０１７３】
以上から、使用するろ過膜の材質がＰＶＤＦまたはＰＥＳの場合であっても、水溶液の最終ｐＨ調整前にキレート剤を水溶液に添加することで、水溶液のろ過性が向上することを明らかにした。さらに、使用するろ過膜の構造が単一の層であっても、プレフィルターと組み合わせた複数の層であっても、水溶液の最終ｐＨ調整前にキレート剤を添加することで、その水溶液のろ過性が向上することを明らかにした。【０１７４】
［実施例５］最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を添加し調製された水溶液を用いた動物細胞の培養と生理活性物質の生産
最終ｐＨ調整よりも先にクエン酸３ナトリウム２水和物を添加し調製された水溶液を用いて、動物細胞の培養を行った。その結果、クエン酸３ナトリウム２水和物を添加した水溶液においても、添加しなかった水溶液と同等以上の細胞増殖、力価が得られることを明らかにした。【０１７５】
生産水溶液１Ｌ当りの調製手順を以下に示す。【０１７６】
最初に約９００ｍＬの純水（以下、ＰＷと称す）に、クエン酸３ナトリウム２水和物（小堺製薬社製）を０ｇ（添加せず）、または０．１ｇ添加し攪拌した。クエン酸３ナトリウム２水和物が完全に溶解した後、６．７ｇのＳＯＹ  ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ  ＵＦ（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、カタログ番号：９１０５２−１Ｋ３９８６、または９１０５２−５Ｋ３９８６）を添加し、約１５分間攪拌した。【０１７７】
次にアミノ酸、金属塩、ビタミン等を含む改良粉末培地ＥＸ−ＣＥＬＬ  ３０２（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）２２．６ｇとＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：１４１９０−２５０）を用いて溶解した１ｍｍｏｌ／ＬのＭｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ番号：Ｍ８４０７−５００ＭＧ）０．５ｍＬを加えて、約３０分間攪拌した。【０１７８】
さらに、最終ｐＨ調整として１．６ｇの炭酸水素ナトリウム（関東化学社製、カタログ番号：３７１１６−００）を加えて、約５分間攪拌した後、ＰＷを加え１Ｌとし、その後、約１０分間攪拌し、生産水溶液とした。水溶液調製後の上記記載の添加したクエン酸３ナトリウム２水和物の濃度は、０ｇ／Ｌ（添加なし）、または０．１ｇ／Ｌ（０．３４ｍｍｏｌ／Ｌ）なる。【０１７９】
上記手順で調製された生産水溶液を用いて、モノクローナル抗体を発現するＣＨＯ細胞を３Ｌリアクターにて、１４日間フェドバッチ培養した。培養初期の播種密度は、約３．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり、培養期間中、培養用水溶液の温度は３５℃、ｐＨは７．１０に制御した。【０１８０】
フィード用水溶液には、アミノ酸［Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン一塩酸、Ｌ−アスパラギン一水和物、Ｌ−シスチン二塩酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン一塩酸二水和物、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン一塩酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物、Ｌ−バリン（以上、シグマ−アルドリッチ社製）、Ｌ−アスパラギン酸、グリシン（以上、和光純薬工業社製）、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（協和発酵バイオ製）、及びＬ−メチオニン（純正化学社製）］、ビタミン［Ｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサール塩酸、リボフラビン、チアミン塩酸、シアノコバラミン（以上、シグマ−アルドリッチ社製）］、リコンビナントヒトインスリン（ジェーアールエイチバイオサイエンス社製）、エタノールアミン（シグマ−アルドリッチ社製）、ＳＯＹ  ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ  ＵＦ（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、コレステロール脂質濃縮溶液（２５０×水溶液、インビトロジェン社製）、エチレンジアミン四酢酸第二鉄ナトリウム塩（シグマ−アルドリッチ社製）及びグルコース（和光純薬工業社製）からなる水溶液を用いた。上記フィード用水溶液を培養３、６、９及び１２日目にそれぞれ初発生産水溶液量の約６．３％添加した。【０１８１】
その結果、クエン酸３ナトリウム２水和物を添加しなかった水溶液を用いた培養においては、最高到達生細胞密度が５．４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、培養終了時のモノクローナル抗体の力価が１．８ｇ／Ｌであったのに対して、０．１ｇ／Ｌのクエン酸３ナトリウム２水和物を添加した水溶液を用いた培養においては、最高到達生細胞密度が５．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、培養終了時のモノクローナル抗体の力価が１．９ｇ／Ｌであった。【０１８２】
以上から、最終ｐＨ調整よりも先にクエン酸３ナトリウム２水和物を添加し調製された水溶液においても、クエン酸３ナトリウム２水和物を添加しなかった水溶液と同等以上の細胞増殖、力価が得られることを明らかにした。【０１８３】
［実施例６］Ｎ−アセチルノイラミン酸二水和物添加によるろ過性向上効果
粉末培地を含む水溶液調製時にキレート剤として、Ｎ−アセチルノイラミン酸二水和物を添加したときの該水溶液のろ過性への影響を検討し、水溶液のＶｍａｘ（単位膜面積あたりの最大処理量）値が向上することを明らかにした。【０１８４】
水溶液の調製は以下の手順により行った。まず、１６０ｍＬの純水（以下ＰＷと略す）に、水酸化ナトリウム（純正化学社製、カタログ番号：３９１５５−０３０１）４．０ｇ、Ｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号：Ｔ１１４５−１００Ｇ）４．５ｇ、Ｌ−（−）−Ｃｙｓｔｉｎｅ  Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄ（和光純薬社製、カタログ番号：０３４−０５３２２）６．１６ｇを添加し、約３０分間攪拌後、ＰＷを加え２００ｍＬとした水溶液（以下、Ｃｙｓ−Ｔｙｒ溶液と略す）を調製した。【０１８５】
つぎに、８００ｍＬのＰＷに、アミノ酸、金属塩、ビタミン等を含む粉末培地  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ａ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：Ａ１２８７０ＳＢ）３２．６ｇ、液体添加物  ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：Ａ１２８７２ＳＡ）０．５ｍＬ、アミノ酸、金属塩、ビタミン等を含む粉末培地Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ｂ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：Ａ１１４９８ＳＡ）２７．１ｇ、Ｌ−（＋）−グルタミン（和光純薬社製、カタログ番号：０７８−００５２５）５．０ｇ、ペプトン  ＳＥ５０ＭＡＦ−ＵＦ（和光純薬社製、カタログ番号：Ｐ４２４７４）３０．０ｇ、Ｄ（＋）−グルコース（和光純薬社製、カタログ番号：０４１−００５９５）７０．０ｇを添加し、キレート剤として、Ｎ−アセチルノイラミン酸二水和物（協和発酵バイオ社製）３０．９ｇを添加し、約３０分間攪拌した。【０１８６】
攪拌後のｐＨは、４．０５であった。その後、Ｃｙｓ−Ｔｙｒ溶液を５０ｍＬ添加し、約２０分間攪拌した。Ｃｙｓ−Ｔｙｒ溶液添加後のｐＨは、４．３７であった。その後、最終ｐＨ調整として５ｍｏｌ／ｌ  水酸化ナトリウム溶液（和光純薬社製、カタログ番号：１９６−０５３７５）１７ｍＬを加え約２０分間攪拌した後、ＰＷを加え１Ｌとし、溶液Ａとした。溶液Ａの最終ｐＨは８．１であった。水溶液調製後の上記記載の添加したＮ−アセチルノイラミン酸二水和物の濃度は、３０．９ｇ／Ｌ（８９ｍｍｏｌ／Ｌ）となる。【０１８７】
一方、８００ｍＬのＰＷに、アミノ酸、金属塩、ビタミン等を含む粉末培地  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ａ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：Ａ１２８７０ＳＢ）３２．６ｇ、液体添加物  ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：Ａ１２８７２ＳＡ）０．５ｍＬ、アミノ酸、金属塩、ビタミン等を含む粉末培地Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ｂ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：Ａ１１４９８ＳＡ）２７．１ｇ、Ｌ−（＋）−グルタミン（和光純薬社製、カタログ番号：０７８−００５２５）５．０ｇ、ペプトン  ＳＥ５０ＭＡＦ−ＵＦ（和光純薬社製、カタログ番号：Ｐ４２４７４）３０．０ｇ、Ｄ（＋）−グルコース（和光純薬社製、カタログ番号：０４１−００５９５）７０．０ｇを添加し、キレート剤ではない酸として  ５ｍｏｌ／ｌ  塩酸（和光純薬社製、カタログ番号：０８１−０５４３５）２８ｍＬを添加し、約３０分間攪拌した。攪拌後のｐＨは、３．０９であった。その後、Ｃｙｓ−Ｔｙｒ溶液を５０ｍＬ添加し、約２０分間攪拌した。Ｃｙｓ−Ｔｙｒ溶液添加後のｐＨは、３．３９であった。【０１８８】
その後、最終ｐＨ調整として５ｍｏｌ／ｌ  水酸化ナトリウム溶液（和光純薬社製、カタログ番号：１９６−０５３７５）２８ｍＬを加え約２０分間攪拌した後、ＰＷを加え１Ｌとし、溶液Ｂとした。溶液Ｂの最終的なｐＨは８．１であった。【０１８９】
次に、調製した水溶液のＶｍａｘ試験を以下の手順で行った。加圧タンク（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に試験水溶液を１Ｌ入れた。試験用フィルターには、孔径０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘ（登録商標）ＧＶ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号：ＳＬＧＶ０３３ＲＳ）を用いた。【０１９０】
フィルターをタンクへ接続し、圧縮空気により１００ｋＰａの圧力をかけた。試験開始前にタンクのバルブを若干開け、水溶液を用いてフィルターを湿潤した。フィルターを湿潤した後、バルブを全開して試験を開始した。【０１９１】
バルブ全開時の時間を０とし、ろ過処理量５ｇ増加するのにかかる経過時間を測定した。水溶液の密度を１ｇ／ｍＬとして、測定重量よりろ過量（Ｖ）を算出した。計測は３分以上行った。計測値を横軸に時間（ｔ）、縦軸にｔ／Ｖにとってグラフを作成し、得られた直線の傾きの逆数からＶｍａｘを算出した。【０１９２】
結果を図５に示す。Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ２）の値は、キレート剤を添加しなかった溶液Ｂでは１９０であったのに対し、キレート剤としてＮ−アセチルノイラミン酸二水和物を添加した溶液Ａでは２０２５と増大した。【０１９３】
以上から、粉末培地を含む水溶液の調製時にキレート剤として、Ｎ−アセチルノイラミン酸二水和物を添加することで、水溶液のＶｍａｘの値が向上することを明らかにした。【０１９４】
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１０年１２月２７日付けで出願された日本出願（特願２０１０−２９０４４４）に基づいており、その全体が引用により援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１９５】
本発明により、ろ過性の飛躍的向上を実現した水溶液調製方法が提供された。該調製方法を用いることで、安定的に短時間で膜ろ過を遂行する汎用性の高い細胞培養用水溶液が提供された。また、ろ過性の飛躍的向上を実現した、該調製方法により調製された水溶液、該調製方法により調製された水溶液を用いる細胞の培養方法、該培養方法を用いた生理活性物質の製造方法、該製造方法を用いて製造される生理活性物質、該調製方法により調製された水溶液を膜ろ過する方法、キレート剤を添加して水溶液を調製することを特徴とする水溶液の膜ろ過性を向上する方法又は、水溶液を調製し、膜ろ過し、および該水溶液を用いて細胞を培養し、生理活性物質を製造する方法が提供された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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