(57)【要約】  本発明は高封入量で薬物を導入することができ、臨床上十分な有効濃度を維持した持続徐放性を有する、皮下投与等に適したリポソーム組成物を提供することを目的とし、本発明のリポソーム組成物は複数層の脂質二重膜で形成された外膜を有する第１のリポソームと、該外膜によって規定される第１のリポソーム内部領域に収容された複数層の脂質二重膜で形成された外膜を有する複数の第２のリポソームとを有し、該第２のリポソームの外膜によって規定される第２のリポソーム内部領域を有するとともに、少なくとも該第２のリポソーム内部領域と前記第１のリポソームの外部との間にイオン勾配が形成されたリポソーム組成物である。
2012091054.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数層の脂質二重膜で形成された外膜を有する第１のリポソームと、該外膜によって規定される第１のリポソーム内部領域に収容された、複数層の脂質二重膜で形成された外膜を有する複数の第２のリポソームとを有し、該第２のリポソームの外膜によって規定される第２のリポソーム内部領域を有するとともに、少なくとも該第２のリポソーム内部領域と前記第１のリポソームの外部との間にイオン勾配が形成されたリポソーム組成物。
【請求項２】
前記イオン勾配はプロトン濃度勾配であり、前記第２のリポソーム内部領域のｐＨ、もしくは前記第２のリポソーム内部領域および前記第１リポソームの内部領域のｐＨが、前記第１のリポソームの外部のｐＨよりも低くなっている請求項１に記載のリポソーム組成物。
【請求項３】
前記第１のリポソームが１〜２０μmの範囲内の平均粒子径を有する請求項１または２に記載のリポソーム組成物。
【請求項４】
前記第２のリポソーム内部領域、もしくは前記第２のリポソームおよび前記第１のリポソームの内部領域に薬物を含有する請求項１ないし３のいずれかに記載のリポソーム組成物。
【請求項５】
前記薬物を、総脂質に対するモル比（ｍｏｌ／ｍｏｌ）で０．０５以上含有している請求項４に記載のリポソーム組成物。
【請求項６】
外膜の内部と外部との間にイオン勾配が形成されたリポソーム組成物の製造方法であって、
脂質を含む水混和性溶媒に対して、該イオン勾配を形成するための化合物を含む第１内水相溶液を体積比０．７〜２．５で混合して第１エマルジョンを調製する工程と、
該第１エマルジョンに対し第２内水相溶液を体積比０．７以上で混合して第２エマルジョンを調製する工程と、
該第２エマルジョンの外水相を、該第１内水相溶液より該イオン勾配を形成するための化合物濃度が低い水溶液で置換する工程とを有するリポソーム組成物の製造方法。
【請求項７】
前記イオン勾配はプロトン濃度勾配である請求項６に記載のリポソーム組成物の製造方法。
【請求項８】
さらに前記イオン勾配による駆動力によって前記リポソーム組成物内部に薬物を導入する工程を有する請求項６又は７に記載のリポソーム組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬物などの有効成分を含有する持続徐放性リポソーム組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
頻回投与を必要とする薬剤は、頻回の通院や穿刺などの苦痛が患者にとって大きな負担となっている。また、嚥下困難を伴う患者は口から薬を飲むことが困難であるため、経口投与以外の投与方法が求められる。認知症患者や脳疾患、パーキンソン病などの介護者を必要とする患者においても、自分で薬を飲む管理が困難であるため、経口投与以外の投与方法や、頻回投与を必要としない治療法の選択肢が求められる。さらに、自律神経失調症など、薬の効果が切れると直ちに日常生活に支障をきたす患者においても、薬の効果が短時間で切れずに長期的に効き続けられる治療法が求められる。あるいは、手術後の痛みに関しても、薬の効果が切れると直ちに我慢できないほどの痛みに襲われるため、リハビリに影響を及ぼし、退院を延ばす要因になりかねない。従って、術後５〜７日間、薬の効果がずっと現れ、痛みを抑制することができれば、術後のリハビリも促進でき、退院を早めるきっかけになると考えられる。
これらのことから、薬の効果を長期的に持続させることができる徐放製剤は、あらゆる疾患領域において、患者のＱＯＬを向上させるものとして非常に期待されている。【０００３】
これまでに検討されている徐放製剤の多くは、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を用いたマイクロスフェアである。例えば、アルツハイマー型認知症治療剤として知られているアリセプト（登録商標  エーザイ株式会社）の有効成分である塩酸ドネペジルを用いたＰＬＧＡマイクロスフェアが検討されており、持続的な放出性が得られている（非特許文献１）。しかしながら、ＰＬＧＡを用いる場合、特に水溶性薬物を高濃度でかつ高効率で封入することは難しく、高い薬物封入量を得るためには未だ課題が残されている。また、ＰＬＧＡを用いると、調製工程において有機溶媒を使用するため有機溶媒の除去が必須となる点（例えば特許文献１、２）や、分解とともに局所的に酸が強まるため炎症を引き起こす点も大きな課題とされている。【０００４】
その他、ブピバカインなどの局所麻酔薬を用いた徐放製剤のアプローチもいくつか検討されているが、術後、５〜７日間続く痛みを十分な期間、緩和できるだけの持続性についてはまだ課題がある（非特許文献２）。また、多胞状リポソーム（ＭＶＬ）は、局所または全身的薬物送達のための脂質ベースの徐放性薬物担体として開発されているが（特許文献１、２）、これに関しても未だ薬物封入量や徐放時間において十分とは言えない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００１−５０５２２４号公報
【特許文献２】特表２００１−５２２８７０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２８（２００７）１８８２−１８８８
【非特許文献２】Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ  １０１（２００４）１３３−１３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、薬物がイオン勾配にそって外部から内部へ移動することで、高効率で、かつ高封入量で薬物を導入することができ、さらに臨床上十分な有効濃度を維持した持続徐放性を有するリポソーム組成物、及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題は以下の本発明によって解決される。
（１）複数層の脂質二重膜で形成された外膜を有する第１のリポソームと、該外膜によって規定される第１のリポソーム内部領域に収容された、複数層の脂質二重膜で形成された外膜を有する複数の第２のリポソームとを有し、該第２のリポソームの外膜によって規定される第２のリポソーム内部領域を有するとともに、少なくとも該第２のリポソーム内部領域と前記第１のリポソームの外部との間にイオン勾配が形成されたリポソーム組成物。
（２）前記イオン勾配はプロトン濃度勾配であり、前記第２のリポソーム内部領域のｐＨ、もしくは前記第２リポソーム内部領域および前記第１リポソームの内部領域のｐＨが、前記第１のリポソームの外部のｐＨよりも低くなっている上記（１）に記載のリポソーム組成物。
（３）前記第１のリポソームが１〜２０μmの範囲内の平均粒子径を有する上記（１）または（２）に記載のリポソーム組成物。
（４）前記第２のリポソーム内部領域、もしくは前記第２のリポソームおよび前記第１のリポソームの内部領域に薬物を含有する上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のリポソーム組成物。
（５）前記薬物を総脂質に対するモル比（ｍｏｌ／ｍｏｌ）で０．０５以上含有している上記（４）に記載のリポソーム組成物。
（６）前記第１のリポソームおよび前記第２のリポソームの脂質膜は、リン脂質とコレステロールを含む脂質により構成されている上記（１）ないし（５）のいずれかに記載のリポソーム組成物。
（７）前記リン脂質は飽和リン脂質である上記（６）に記載のリポソーム組成物。【０００９】
（８）外膜の内部と外部との間にイオン勾配が形成されたリポソーム組成物の製造方法であって、脂質を含む水混和性溶媒に対して、該イオン勾配を形成するための化合物を含む第１内水相溶液を体積比０．７〜２．５で混合して第１エマルジョンを調製する工程と、該第１エマルジョンに対し第２内水相溶液を体積比０．７以上で混合して第２エマルジョンを調製する工程と、該第２エマルジョンの外水相を、少なくとも該第１内水相溶液より該イオン勾配を形成するための化合物濃度が低い水溶液で置換する工程とを有するリポソーム組成物の製造方法。
（９）前記該イオン勾配はプロトン濃度勾配である上記（８）に記載のリポソーム組成物の製造方法。
（１０）前記第１内水相溶液は硫酸塩を含む水溶液である上記（８）又は（９）に記載のリポソーム組成物の製造方法。
（１１）前記硫酸塩は硫酸アンモニウムである上記（１０）に記載のリポソーム組成物の製造方法。
（１２）さらに前記イオン勾配による駆動力によって前記リポソーム組成物内部に薬物を導入する工程を有する上記（８）ないし（１１）のいずれかに記載のリポソーム組成物の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、複数層の脂質二重膜で形成された外膜を有する第１のリポソームと、該外膜によって規定される第１のリポソーム内部領域に収容された、複数層の脂質二重膜で形成された外膜を有する複数の第２のリポソームとを有し、該第２のリポソームの外膜によって規定される第２のリポソーム内部領域を有するとともに、少なくとも該第２のリポソーム内部領域と前記第１のリポソームの外部との間にイオン勾配が形成されたリポソーム組成物である。本発明のリポソーム組成物は、薬物を高効率で封入し、かつ長期的な薬物の持続徐放が可能である。
本発明のリポソーム組成物の製造方法によれば、薬物を高効率で封入し、かつ長期的な薬物の持続徐放が可能なリポソーム組成物を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は本願実施例において調製例２で製造された、薬物導入後のリポソーム組成物の断面を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した写真である。（倍率：３２０００倍）
【図２】図２はエクストルージョン法−１によって調製されたドネペジルリポソーム（比較例２）等の経時的な血中動態の結果を表すグラフである。
【図３】図３は本発明による調製例２、３、４で得られたリポソーム組成物等の経時的な血中動態の結果を表すグラフである。
【図４】図４は本発明による調製例５、６で得られたリポソーム組成物等の経時的な血中動態の結果を表すグラフである。
【図５】図５は本発明による調製例１２で調製したリポソーム組成物の薬物動態の結果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜リン脂質＞
本発明のリポソーム組成物の脂質二重膜（以下、単に脂質膜、あるいはリポソーム膜ということもある）を構成する主要な脂質であるリン脂質は、生体膜の主要構成成分であり、一般的に、分子内に長鎖アルキル基より構成される疎水性基と、リン酸基より構成される親水性基とをもつ両親媒性物質である。リン脂質としては、ホスファチジルコリン（＝レシチン）、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールなどのグリセロリン酸；スフィンゴミエリン（ＳＭ）などのスフィンゴリン脂質；カルジオリピンなどの天然または合成のジホスファチジルリン脂質およびこれらの誘導体；これらの水素添加物たとえば水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、水素添加卵黄ホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリンが好ましい。リン脂質は単一種または複数種の組合せで用いることができる。
【００１３】
＜リン脂質以外の添加物＞
本発明のリポソーム組成物は、上記主構成成分とともに他の膜成分を含んでいても良く、たとえば、リン脂質以外の脂質もしくはその誘導体、膜安定化剤、酸化防止剤などを必要に応じて含むことができる。リン脂質以外の脂質とは、分子内に長鎖アルキル基等の疎水性基を有し、リン酸基を分子内に含まない脂質であり、特に限定されないがグリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、コレステロールなどのステロール誘導体およびこれらの水素添加物などの誘導体を挙げることができる。コレステロール誘導体としては、シクロペンタノヒドロフェナントレン環を有するステロール類が挙げられる。これらの中でも、本発明のリポソーム組成物はコレステロールを含むことが好ましい。酸化防止剤としては、たとえばアスコルビン酸、尿酸あるいはトコフェロール同族体すなわちビタミンＥなどが挙げられる。トコフェロールには、α、β、γ、δの４個の異性体が存在するが、本発明ではいずれも使用できる。
【００１４】
なお、本発明のリポソーム組成物の脂質二重膜組成は、リン脂質１００〜５０ｍｏｌ％およびコレステロール０〜５０ｍｏｌ％が好ましく、より好まくは、リン脂質７０〜５０ｍｏｌ％およびコレステロール３０〜５０ｍｏｌ％である。
【００１５】
本発明のリポソーム組成物は、複数層の脂質二重膜で形成された外膜を有する第１のリポソームと、該外膜によって規定される第１のリポソーム内部領域に収容された、複数層の脂質二重膜で形成された外膜を有する複数の第２のリポソームとを有し、該第２のリポソームの外膜によって規定される第２のリポソーム内部領域を有する。
本発明のリポソーム組成物は、その態様として、薬物が内封されていない空リポソームおよび薬物が内封されているリポソームを含む。
【００１６】
第１のリポソームの外径は、徐放性能に優れ、また細い針でも容易に投与可能であるという点から、１〜２０μｍであるのが好ましく、３〜１０μｍであるのがさらに好ましい。また第２のリポソームの外径は特に限定されないが、薬物封入量および徐放性能に優れるという点から、１００〜８００ｎｍであるのが好ましい。
本発明において、複数の第２のリポソームはそれぞれ独立して第１のリポソームの中に存在し、その数は特に限定されない。
【００１７】
本発明のリポソーム組成物は、少なくとも該第２のリポソーム内部領域と前記第１のリポソームの外部との間にイオン勾配が形成される。以下、単に「イオン」と言う場合には、当該イオン勾配を形成するイオンを意味するものとする。本発明において、第２のリポソーム内部領域と第１のリポソームの外部との間にイオン勾配が形成されるとは、（１）第２のリポソームが有する外膜を挟んで、第２のリポソーム内部領域と、第１のリポソーム内部領域及び第１のリポソームの外部との間にイオン濃度に差があること、（２）第１のリポソームが有する外膜を挟んで、第２のリポソーム内部領域及び第１のリポソーム内部領域と、第１のリポソームの外部との間にイオン濃度に差があること、（３）第２のリポソームが有する外膜を挟んで、第２のリポソーム内部領域と第１のリポソーム内部領域との間にイオン濃度に差があり、かつ第１のリポソームが有する外膜を挟んで第１のリポソーム内部領域と第１のリポソームの外部との間にイオン濃度に差があること（この場合、第１のリポソーム内部領域のイオン濃度は、第２のリポソーム内部領域のイオン濃度と第１のリポソームの外部のイオン濃度との間の値となる。）、のうちのいずれかであることをいう。
本発明において、イオン勾配は、薬剤を多く導入する観点から、第２のリポソーム内部領域のイオン濃度が最も高いのが好ましい。また、第２のリポソーム内部領域のイオン濃度≧第１のリポソーム内部領域のイオン濃度＞第１のリポソームの外部のイオン濃度とすることができる。また、第２のリポソーム内部領域のイオン濃度＞第１のリポソーム内部領域のイオン濃度≧第１のリポソームの外部のイオン濃度とすることができる。また、第２のリポソーム内部領域のイオン濃度＞第１のリポソーム内部領域のイオン濃度＞第１のリポソームの外部のイオン濃度とすることができる。第２のリポソーム内部領域のイオン濃度＝第１のリポソーム内部領域のイオン濃度＝第１のリポソームの外部のイオン濃度である場合は本願発明から除かれる。イオン勾配としてプロトン勾配（ｐＨ勾配）を用いる場合には、イオン濃度（プロトン濃度）が高いことはｐＨが低いことに対応する。すなわち、この場合には第２のリポソーム内部領域のｐＨが最も低いのが好ましい。
【００１８】
空リポソームに対する薬物の導入前後において、第１のリポソームの形状及び外径、第２のリポソームの形状及び外径はほぼ同じである。薬物が導入されたリポソームにおいて、第１のリポソームの外径、第２のリポソームの外径は薬物が内封されていない空リポソームと同様である。
【００１９】
本発明のリポソーム組成物が薬物を内包する場合、このようなリポソーム組成物は、前記第２のリポソーム内部領域、もしくは前記第２のリポソームおよび前記第１のリポソームの内部領域に薬物を含有することができる。
リポソーム組成物に含有される薬物の量は特に限定されず、用途に応じて適宜調整し得るが、リポソーム組成物が有する総脂質（リポソーム組成物を製造する際に使用される総脂質）に対するモル比［薬剤（ｍｏｌ）／総脂質（ｍｏｌ）］で０．０５以上であるのが好ましく、０．０６〜０．１４とすることができる。
【００２０】
＜イオン勾配法＞
イオン勾配法は、リポソーム膜の内側／外側にイオン勾配を形成し、外部に添加された薬物がこのイオン勾配に従いリポソーム膜を透過することで薬物をリポソーム内部に封入する方法であり、イオン勾配としてはプロトン勾配（ｐＨ勾配）が好ましい。イオン勾配法では、薬物が内封されていない空リポソームを製造し、空リポソームの外液に薬物を添加することにより、リポソームに薬物を導入することができる。
【００２１】
本発明は、イオン勾配法により薬物を封入するためのリポソーム組成物、およびイオン勾配法により薬物を封入したリポソーム組成物である。なかでも、イオン勾配としてｐＨ勾配を用いるｐＨ勾配法が最も好ましく適用される。
ｐＨ勾配を形成する方法としては、第１内水相及び／または第２内水相として酸性ｐＨの緩衝液（例えばｐＨ２〜３のクエン酸溶液）を用いてリポソームを形成し、次いで第１リポソームの外部ｐＨを中性付近（例えばｐＨ６．５〜７．５の緩衝液）に調整することで、第２リポソーム及び第１リポソームの内部がより低く、第１リポソームの外部がより高いｐＨ勾配を形成する様態とすることができる。
また、アンモニウムイオン勾配を介してｐＨ勾配を形成することもできる。この場合、例えば、第１内水相及び／または第２内水相として硫酸アンモニウム溶液を用いてリポソームを形成し、次いで第１リポソームの外部水相の硫酸アンモニウムを除去するか、または希釈することによって少なくとも第２リポソーム及び第１リポソームの内側と第１リポソームの外側にアンモニウムイオンの勾配を形成する。すると、生成したアンモニウムイオン勾配によって、第１リポソーム及び第２リポソームの内水相から第１リポソームの外水相へアンモニアの流出が起こり、結果的に内水相にアンモニアが残したプロトンが蓄積することによってｐＨ勾配が形成され、第１リポソーム及び第２リポソームの内水相は第１リポソームの外水相より酸性になる。
【００２２】
＜封入される薬物＞
本発明のリポソーム組成物に封入する薬物は、イオン勾配法でリポソーム内に封入可能な薬物であれば特に限定されずに用いることができる。このような薬物は、イオン化可能な両親媒性薬物であることが好ましく、両親媒性弱塩基性薬物であることがさらに好ましい。また、効果の面からは局所投与において持続徐放性が望まれる薬物が好ましく、特に脳血管障害、パーキンソン病、認知症等の治療薬や、鎮痛薬、局所麻酔薬、抗悪性腫瘍剤であることが好ましい。これらの薬物としては、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、フィソスチグミン、ヘプチルフィソスチグミン、フェンセリン、トリセリン、シムセリン、チアトルセリン、チアシムセリン、ネオスチグミン、フペルジン、タクリン、メトリフォネート、ミノサイクリン、塩酸ファスジル、ニモジン、モルヒネ、ブピバカイン、ロピバカイン、レボブピバカイン、トラマドール、リドカイン、ドキソルビシンなどが挙げられる。その他、ドーパミン、Ｌ−ＤＯＰＡ、セロトニン、エピネフリン、コデイン、メペリジン、メタドン、モルフィン、アトロピン、デシクロミン、メチキセン、プロパンテリン、イミプラミン、アミトリプチリン、ドキセピン、デシプラミン、キニジン、プロプラノロール、クロルプロマジン、プロメタジン、ペルフェナジンなどが挙げられる。
【００２３】
＜リポソーム第１内水相溶液＞
本発明のリポソーム組成物の製造方法において、第１エマルジョンを調製する工程で使用される第１内水相溶液は、イオン勾配を形成するための化合物を含む。
イオン勾配を形成するイオンとしては、上記の通りプロトンが好ましい。また、イオン勾配（ｐH勾配）を形成するための化合物としては、例えば、電離してプロトン、アンモニウムイオン、プロトン化したアミノ基を発生させる化合物が挙げられる。具体的には例えば、硫酸アンモニウム、硫酸デキストラン、コンドロイチン硫酸のような硫酸塩；水酸化物；燐酸、グルクロン酸、クエン酸、炭酸、炭酸水素、硝酸、シアン酸、酢酸、安息香酸、これらの塩；臭化物、塩化物のようなハロゲン化物；無機または有機アニオン類；アニオン性重合体が挙げられる。
【００２４】
ｐＨ勾配法により弱塩基性薬物（例えば上記のものが挙げられる。）を本発明のリポソーム組成物の内水相（少なくとも第２内水相）に封入した場合、薬物は内水相に存在するプロトンによってプロトン化され、電荷を帯びる。その結果、薬物がリポソーム外へ拡散してゆくことが妨げられ、薬物はリポソーム内水相に保持される。
また、イオン勾配を形成するための化合物が電離した場合、プロトン等のイオン勾配を形成するイオン（カチオン）とともに、硫酸イオン等のアニオンを生じるが、当該アニオンがプロトン化された弱塩基性薬物と塩又はコンプレックスを形成すると、さらに薬物を安定的に内水相に保持することができる。すなわち、イオン勾配を形成するための化合物は、塩基性薬物と塩又はコンプレックスを形成することができる塩基性薬物に対する対イオン（アニオン）を電離により生じるものとすることができる。このような対イオンは、薬学的に許容されるアニオンであれば特に限定されないが、硫酸イオンが最もが好ましい。硫酸イオンを生じる化合物としては硫酸アンモニウムが一般的であるが、その他、硫酸デキストランやコンドロイチン硫酸などからも選択できる。また、その他の対イオンとしては、水酸化物、燐酸塩、グルクロン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、硝酸塩、シアン酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、臭化物、塩化物、および他の無機または有機アニオン類、またはアニオン性重合体などから電離して生じるアニオンが挙げられる。
本発明においては、第１内水相溶液中のイオン勾配を形成するための化合物の濃度は、５０〜５００ｍＭであることが好ましく、１００〜３００ｍＭであることがさらに好ましい。
【００２５】
本発明のリポソーム組成物の製造方法において、第１エマルジョンを調製する工程で、脂質を含む溶液を調製する際に使用される溶媒は水混和性溶媒である。水混和性溶媒とは、本発明のリポソーム組成物の製造に用いられるリン脂質およびその他の膜成分を溶解し、かつ水と混和することができる溶媒をいう。水混和性溶媒としては例えば、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールが挙げられる。
水に混和しない溶媒（水不混和性溶媒ともいう。例えば、クロロホルムのような水不混和性の有機溶媒が挙げられる。）は本願発明において使用されない。第１エマルジョンを調製する工程で水不混和性溶媒を使用した場合、得られるリポソームは大きなリポソームの中に複数の小さなリポソーム及び第１内水相を収容した形態とはならず、単に発泡スチロールのように個々のリポソームが集合した形態［いわゆる多胞状リポソーム（ＭＶＬ）］となるにすぎない。
リポソーム原料としての脂質の量（リン脂質その他の脂質の合計量）は水混和性溶媒の２０〜１００質量％であることが好ましく、２０〜６０質量％であることがさらに好ましい。
第１エマルジョン（脂質を含む水混和性溶媒とイオンを含む第１内水相溶液との混合物）中、脂質二重膜を構成し得る成分以外の成分が、本発明のリポソーム組成物を構成する第２のリポソームの内部領域を満たすことができる。第２のリポソームの内部領域には他に後述する第２内水相溶液の一部が混合してもよい。
第１エマルジョンを調製する方法は特に制限されず、従来公知の方法を用いることができる。
【００２６】
ｐＨ勾配法を用いる場合、内水相（第１及び／又は第２のリポソーム内部領域）のｐＨは、適宜調整し得る。例えば、第１内水相溶液に、イオン勾配を形成するための化合物としてクエン酸を用いた場合、あらかじめ内水相（第２のリポソーム内部領域）と外水相（第１のリポソーム内部領域及び／又は第１のリポソームの外部）のｐＨ勾配を形成しておく必要があり、その場合は内水相と外水相のｐＨの差が３以上であることが好ましい。
また、硫酸アンモニウムを用いた場合は、化学平衡によってｐＨ勾配が形成されるため、予め内水相溶液のｐＨを調整する必要はない。この場合、第２内水相に外水相と同じ溶液を使用した場合は、第２エマルジョン形成時からイオン勾配の形成が始まり、外液置換でさらに勾配が形成される。第２内水相に第１内水相と同じ硫酸アンモニウム溶液を用いた場合は、外液置換のときにイオン勾配が形成されると考えられる。
【００２７】
本発明のリポソーム組成物の調製において、脂質を含む水混和性溶媒とそこに加える第１内水相溶液は、体積比（第１内水相溶液／水混和性溶媒）として０．７〜２．５とすることができ、１．０〜２．０が好ましい。
【００２８】
＜リポソーム第２内水相溶液＞
本発明において、脂質を含む水混和性溶媒に第１内水相溶液を加えて第１エマルジョンを調製後、さらに該第１エマルジョンに第２内水相溶液を加える工程において、第２内水相溶液は特に限定されるものでない。例えば、第１内水相と同じ溶液、ＨＥＰＥＳ溶液やＮａＣｌ溶液、グルコースやショ糖などの糖類水溶液が挙げられ、好ましくは第１内水相と同じ溶液である。また、第１内水相および第２内水相が共に硫酸アンモニウム水溶液であるのが最も好ましい。第１エマルジョンとそこに加える第２内水相溶液は、体積比［第２内水相溶液／（第１エマルジョン＝第１内水相溶液＋水混和性溶媒）］として０．７以上とすることができ、０．７〜２．５が好ましく、１．０〜１．５が特に好ましい。
第２エマルジョン中、脂質二重膜を構成し得る成分以外の成分が本発明のリポソーム組成物を構成する第１のリポソームの内部領域（但し第２のリポソームを除く。）を満たすことができる。第１のリポソームの内部領域（但し第２のリポソームを除く。）は第１エマルジョンの一部を含んでもよい。
第２エマルジョンを調製する方法は特に制限されず、従来公知の方法を用いることができる。
【００２９】
＜リポソーム外水相溶液＞
本発明のリポソーム組成物の製造方法は、第２エマルジョンの外水相を該第１内水相溶液よりイオン勾配を形成するための化合物濃度が低い水溶液で置換する工程を有する。
第２エマルジョンを調製した後の第１のリポソームの外水相を、リポソーム第２内水相溶液、又は、リポソーム第１内水相溶液及びリポソーム第２内水相溶液を含む混合液から、少なくとも該第１内水相溶液よりイオン勾配を形成するための化合物濃度が低い水溶液で置換することによって、少なくとも第２のリポソーム内部領域と第１のリポソームの外部との間にイオン勾配を形成し、且つ、リポソーム組成物系内から水混和性溶媒が除去され、得られるリポソームに本発明のリポソーム組成物が有する形態を与えることができる。
本発明のリポソーム組成物の製造方法に使用される、置換するための外水相としては、少なくとも第１内水相溶液よりイオン勾配を形成するための化合物濃度が低い水溶液が用いられ、具体的にはＨＥＰＥＳ溶液やＮａＣｌ溶液、グルコースやショ糖などの糖類水溶液が用いられる。外水相のｐＨについては緩衝剤によって調整されていることが望ましく、脂質の分解および生体内投与時のｐＨ格差を考慮してｐＨ５．５から８．５の範囲で調整されることが好適であり、より好ましくはｐＨ６．５〜７．５の範囲である。リポソームの内水相と外水相の浸透圧については、両者の浸透圧差でリポソームが破壊されることのない範囲の浸透圧で調整されていればよく特に限定はされないが、リポソームの物理的安定性を考慮すると該浸透圧差は少ないほど望ましい。
置換するための外水相は、第１内水相溶液及び第２内水相溶液よりイオン勾配を形成するための化合物濃度が低い水溶液であるのが好ましい態様の１つとして挙げられる。
【００３０】
本発明のリポソーム組成物の製造方法はさらに前記イオン勾配による駆動力によって前記リポソーム組成物内部に薬物を導入する工程を有することができる。イオン勾配による駆動力によって前記リポソーム組成物内部に薬物を導入する工程においては、例えば、前記の薬物を例えば水等に溶解させ、得られた薬物溶液をリポソーム外水相がリポソーム外水相溶液で置換された後のリポソーム混合物に加えてこれらを混合し、リポソーム膜の相転移温度以上に加熱して撹拌することで、薬物を封入したリポソームを製造することができる。
【００３１】
＜投与方法＞
本発明のリポソーム組成物の投与方法は特に制限されないが、非経口的、かつ局所的に投与することが好ましい。たとえば、皮下、筋肉内、腹腔内、髄腔内、硬膜外、脳室内を選択することができ、症状により適宜投与方法を選択することができる。具体的な投与方法としては、リポソーム組成物をシリンジやスプレー式デバイスよって投与することができる。また、カテーテルを体内、たとえば管腔内、たとえば血管内に挿入して、当該カテーテルを通して投与することも可能である。
【実施例】
【００３２】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００３３】
各例で調製された薬物封入リポソームの各濃度および粒子径は、以下のように求めた。【００３４】
リン脂質濃度（ｍｇ／ｍＬ）：高速液体クロマトグラフィーまたはリン脂質定量を用いて定量されるリポソーム懸濁液中でのリン脂質濃度。【００３５】
コレステロール濃度（ｍｇ／ｍＬ）：高速液体クロマトグラフィーを用いて定量されるリポソーム懸濁液中でのコレステロール濃度。【００３６】
総脂質濃度（ｍｏｌ／Ｌ）：上記リン脂質濃度およびコレステロール濃度から算出される膜構成成分である脂質の合計モル濃度（ｍＭ）。【００３７】
薬物濃度（ｍｇ／ｍＬ）：上記で得られた、製剤の総脂質濃度が約２０〜３０ｍｇ／ｍＬとなるようにＲＯ水（逆浸透膜浄水）でリポソーム組成物を希釈した後、これをさらにメタノールで２０倍希釈してリポソームを崩壊した。この溶液において、３１５ｎｍでの吸光度を、紫外吸光光度計を用いて高速液体クロマトグラフィーにて定量した。内封された塩酸ドネペジル濃度を薬剤量（ｍｇ）／製剤全量（ｍＬ）で示す。【００３８】
薬剤担持量（薬物／総脂質のモル比）：リポソームに内封された塩酸ドネペジル濃度を上記総脂質濃度に対する上記薬剤濃度の比から、薬剤／総脂質のモル比で示す。【００３９】
血漿中塩酸ドネペジル濃度（ｍｇ／ｍＬ）：採取した血漿を処理し、最終的に遠心分離にて得られた上清を、励起波長（Ｅｘ）３２２ｎｍ、検出波長（Ｅｍ）３８５ｎｍでの蛍光を、蛍光光度計を用いて高速液体クロマトグラフィーにて定量した。【００４０】
粒子径（μｍ）：光散乱回折式粒度分布計ベックマンコールターＬＳ２３０で測定した第１のリポソームの平均粒子径。【００４１】
以下に使用した各成分の略称および分子量を示す。
ＨＳＰＣ：水素添加大豆フォスファチジルコリン（分子量７９０、リポイド（Ｌｉｐｏｉｄ）社製ＳＰＣ３）
ＳＰＣ：大豆フォスファチジルコリン（分子量７７９、日油株式会社）
ＤＭＰＣ：ジミリストイルフォスファチジルコリン（分子量６７７．９、日油株式会社）
Ｃｈｏｌ：コレステロール（分子量３８８．６６、Ｓｏｌｖａｙ社製）
ＰＥＧ５０００‐ＤＳＰＥ：ポリエチレングリコール（分子量５０００）−フォスファチジルエタノールアミン（分子量６０８１、日油株式会社）
塩酸ドネペジル（分子量４１５．９５、ＵＩＮＡＮ  ＣＨＥＮＧＨＵＩ−ＳＨＵＡＮＦＤＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｉｔｄ）【００４２】
＜異なる内水相による調製＞
（調製例１〜４）
（１）空リポソーム調製
ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ＝５４／４６（モル比。以下同様）となるようにＨＳＰＣおよびコレステロールをそれぞれ１．４１ｇおよび０．５９ｇ秤量し、無水エタノール４ｍＬを添加して加温溶解した。溶解した脂質エタノール溶液に、約７０℃に加温した１００ｍＭ（調製例１）、１５０ｍＭ（調製例２）、２５０ｍＭ（調製例３）の硫酸アンモニウム水溶液もしくは３００ｍＭクエン酸水溶液（ｐＨ３．０）（調製例４）を、エタノールと同量（４ｍＬ）添加し、約１０分間加温撹拌しながらエマルジョンを形成した。さらに、このエマルジョンに約７０℃に加温した２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／０．９％塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）１０ｍＬを加え、引き続き約１０分間加温攪拌した。加温終了後のリポソームは、速やかに氷冷した。【００４３】
（２）ｐＨ勾配形成
上記得られたリポソームに２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／０．９％塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）を加えて分散し、３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離することでリポソームを沈殿させた。その後、上清を除き、引き続き、ｐＨ７．５の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／０．９％塩化ナトリウムを添加し分散させ、同様に遠心分離した。これを３回繰り返した後にｐＨ７．５の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／０．９％塩化ナトリウムに再分散し、ｐＨ勾配を形成した。【００４４】
（３）ｐＨ勾配による薬物導入
イオン勾配形成後のリポソームのＨＳＰＣおよびコレステロールを定量し、総脂質濃度を求めた。算出した総脂質濃度をもとに、塩酸ドネペジル（ＤＮＰ，分子量４１５．９５）／総脂質（ｍｏｌ／ｍｏｌ）比が０.１６となるように塩酸ドネペジル量を計算し、必要量のＤＮＰを秤量後、ＲＯ水により２０ｍｇ／ｍＬのＤＮＰ溶液（薬物溶液）を調製した。６５℃で加温したリポソーム溶液に、あらかじめ６５℃に加温したＤＮＰ溶液を所定量添加後、引き続き、６５℃で６０分間、加温攪拌することで薬物導入を行った。薬物導入後のリポソームは速やかに氷冷した。【００４５】
（４）未封入薬物除去
薬物導入後のリポソームに２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／０．９％塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．５）を添加し分散させて、３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離することでリポソームを沈殿させた。その後上清を除き、引き続き、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／０．９％塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）を添加し分散させ、同様に遠心分離した。これを３回繰り返すことで未封入薬物除去を行った。【００４６】
上記、本発明による製造法で得られた調製例１〜４のリポソーム組成物について、第１内水相、膜組成比、薬剤担持量（薬剤／総脂質モル比）および粒子径を表１に示す。電子顕微鏡観察の結果、本発明によるリポソーム組成物は図１に示すように、各リポソーム（第1のリポソーム）の中に多数のベシクル（第２のリポソーム）が存在し、かつ、それぞれのリポソームの外膜は複数層の脂質二重膜で形成されている。しかも、このように厚い複数層の脂質二重膜を有し、かつ内部には同じく複数層の脂質二重膜を有する多数のベシクルを含有しているにも関わらず、リポソーム形成後に内部と外部の間に、薬物導入に十分なｐＨ勾配を形成することが可能であり、該ｐＨ勾配に伴い薬物を高効率で封入できる。【００４７】
図１は本願実施例において調製例２で製造された、薬物導入後のリポソームの断面を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した写真である。倍率は３万２千倍である。図１において示されるリポソームはリポソームのほぼ中央で分割されている。図１に示すリポソームは、複数層の脂質二重膜で形成された外膜を有する第１のリポソームと、該外膜によって規定される第１のリポソーム内部領域に収容された、複数層の脂質二重膜で形成された外膜を有する複数の第２のリポソームとを有する。図１において、第１のリポソームの外径は約４μｍであり、第２のリポソームの外径は１００〜８００ｎｍである。【００４８】
また上記、本発明による製造法で得られた調製例１〜４のリポソーム組成物について、内水相の硫酸アンモニウム濃度の増加に依存して薬物の封入量が向上することが明らかとなった。これは、内水相に残存するプロトン量に伴い、薬物の保持能力が高まったためだと考えられる。従って、より高い薬物封入量を得るためには、１５０ｍＭ以上の硫酸アンモニウム濃度が好ましいと考えられる。また、硫酸アンモニウムの代わりにｐＨ３．０のクエン酸溶液を内水相に用いた場合も同様に高い薬物封入量のリポソームが得られた。【００４９】
【表１】
2012091054.tif 000003
【００５０】
＜異なる内水相容量の検討＞
（調製例５）
ＨＳＰＣ／Ｃｈｏl＝５４／４６となるように、ＨＳＰＣおよびコレステロールをそれぞれ１．４１ｇおよび０．５９ｇ秤量し、４ｍＬのエタノール溶液に溶かした。溶解後、この脂質エタノール溶液に対して２倍量（８ｍＬ）の１５０ｍＭ硫酸アンモニウム水溶液を加え、約１０分間加温攪拌した。その後、１９ｍＬの１５０ｍＭ硫酸アンモニウム水溶液を加え、引き続き、約１０分間加温攪拌した。その後、調製例１〜４と同様にｐＨ勾配を形成し薬物導入および未封入薬物除去を行なった。その結果、表１に示すように、調製例１〜４と同様に高い薬物封入量が得られた。【００５１】
（調製例６）
リン脂質としてアルキル基鎖長の短いＤＭＰＣを用いた。ＤＭＰＣ／Ｃｈｏl＝５４／４６となるようにＤＭＰＣおよびコレステロールをそれぞれ２．７０ｇおよび１．３０ｇ秤量し、４ｍＬのエタノール溶液に溶かした。その後、４ｍＬの１５０ｍＭ硫酸アンモニウム水溶液を加え、約１０分間加温攪拌した。その後、１０ｍＬの１５０ｍＭ硫酸アンモニウム水溶液を加え、引き続き、約１０分間、加温攪拌した。その後、調製例１〜４と同様にｐＨ勾配を形成し薬物導入および未封入薬物除去を行なった。
その結果、表１に示すように、リン脂質のアルキル基鎖長が短い場合でも調製例１〜４と同様に高い薬物封入量が得られることが明らかとなった。【００５２】
＜イオン勾配法以外の方法（パッシブ法）によるＤＮＰリポソームの調製＞
（比較例１）
薬物導入において、イオン勾配法の代わりに従来法であるパッシブ法を用いた。パッシブ法とは、あらかじめ内水相に薬物を溶解してリポソームを調製する方法である。第１内水相溶液の生理食塩水にあらかじめ所定量の塩酸ドネペジルを溶解させ、その後、調製例１〜４と同様にしてリポソームを調製した。尚、外水相にも生理食塩水を用いた。
その結果、表２に示すように、本発明法によるリポソームと比較して、封入効率および薬物封入量が著しく低下することが明らかとなった。さらに、比較例１と本発明によるリポソーム組成物の薬物放出性をｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価系で比較した結果、比較例１は本発明よりも著しく放出が速いことが明らかとなった。【００５３】
以上のことから、臨床上、十分な薬物封入量を確保し、かつ長期持続徐放性を得るためには、薬物をイオン勾配法、特にｐＨ勾配法で導入することが重要であり、かつイオン勾配法、特にｐＨ勾配法で導入されることで薬物が内部でプロトン化され、かつリポソームが図１に示すような層状構造を有することで、より長期的な持続放出性が得られることが明らかとなった。【００５４】
【表２】
2012091054.tif 000004
【００５５】
＜異なる製造法によるドネペジルリポソームの調製＞
（比較例２）エクストルージョン法−１（粒子径３００ｎｍ付近）
ＨＳＰＣ／Ｃｈｏl＝５４／４６となるようにＨＳＰＣおよびコレステロールをそれぞれ０．７１ｇおよび０．２９ｇ秤量し、無水エタノール１ｍＬを添加して加温溶解した。得られた脂質エタノール溶液１ｍＬに、約７０℃に加温した２５０ｍＭ硫酸アンモニウム水溶液（内水相）９ｍＬを添加し、加温しながら超音波装置にて攪拌して粗リポソーム懸濁液を調製した。この粗リポソーム懸濁液を、約７０℃に加温したエクストルーダー（The  Extruder  T.10、Lipexbiomembranes  Inc.）に取り付けたフィルター（孔径０．４μｍ×５回Whatman社）を順次、通し、３００ｎｍ付近の空リポソームを調製した。引き続き、リポソームを加温状態で維持したまま、ＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥの水溶液（３７．７ｍｇ／ｍＬ）を総脂質に対して０．７５ｍｏｌ％となるように直ちに添加し、加温攪拌することで、リポソームの膜表面（外表面）をＰＥＧ修飾した。加温終了後のリポソームは、速やかに氷冷した。上記氷冷したＰＥＧ修飾後のリポソームを、外水相溶液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ／０．９％塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．５））で充分に置換したゲルろ過を用いて外液置換を行った。その後、総脂質に対して薬物／総脂質（ｍｏｌ／ｍｏｌ）＝０．１６となるように薬物導入を行った。引き続き、２０ｍＭＨＥＰＥＳ／０．９％塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．５）で充分に置換したゲルろ過を用いて未封入薬物除去を行った。【００５６】
（比較例３）エクストルージョン法−２（粒子径１〜２μｍ付近）
比較例２と同様にエクストルーダーを用いて調製したが、エクストルーダーには孔径２μｍのフィルターを用いて該フィルターを５回通して空リポソームを得た。薬物導入および未封入薬物除去は比較例２と同様に調製し、１〜２μｍ付近のマルチラメラリポソームを得た。【００５７】
（比較例４）脂質膜導入法
ＨＳＰＣおよびドネペジルを溶解したエタノール溶液に第１内水相溶液としてｐＨ６．５のクエン酸塩酸水溶液を加え、脂質膜内に塩酸ドネペジルを封入した。それ以外は比較例１と同様にして調製しドネペジルリポソームを得た。【００５８】
比較例２〜４で得られたドネペジルリポソームの第１内水相、膜組成比、薬剤担持量（薬剤／総脂質モル比）および粒子径を表３に示す。
その結果、エクストルージョン法で調製した粒子径の小さなリポソーム組成物（比較例２および３）については、高い薬物封入量が得られた。一方、脂質膜に薬物を封入した製剤（比較例４）は、薬物／総脂質比が比較的低く、封入効率は３３％程度であった。【００５９】
【表３】
2012091054.tif 000005
【００６０】
＜ドネペジルリポソームの薬物動態１＞
調製例２、３、４および比較例２、３、４で調製したドネペジルリポソーム組成物およびドネペジル単体の薬物動態試験を行った。塩酸ドネペジル量として表４に示す容量でラット背部皮下にドネペジルリポソーム組成物を投与した。尚、塩酸ドネペジル単体においては、皮下投与ならびに静脈内投与も行った。投与後、１、４、８、２４、４８、７２、９６、１６８、１９２、２１６、２４０、２６４、３３６時間経過後、尾静脈より採血し、遠心分離（６，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）して血漿を分取した。得られた血漿を処理し、励起波長（Ｅｘ）３２２ｎｍ、検出波長（Ｅｍ）３８５ｎｍでの蛍光強度を高速液体クロマトグラフィーにて定量し、各血漿中の塩酸ドネペジル濃度を求めた。その結果を図２ならびに図３に示す。【００６１】
【表４】
2012091054.tif 000006
【００６２】
図２に示すように、塩酸ドネペジル単体を静脈内投与もしくは皮下投与したときの血中塩酸ドネペジル濃度は、投与後急激に減少し、それぞれ投与後８時間および４８時間までしか検出されなかった。比較例２において調製した３００ｎｍ付近のリポソーム組成物は、ドネペジル単体に比べて初期バーストがなく、４８時間まで徐放が認められたが、投与後４８時間で既に１０ｎｇ／ｍｌを下回った。おそらく、粒子径が約３００ｎｍと比較的小さいと、投与部位において拡散しやすく、リポソームごとリンパ節や血中に移行することが予想されるため、リポソームとしての消失が早く、期待される徐放性が得られないと考えられる。また、脂質膜に薬物を封入した比較例４については、初期の放出量が多く、その後、急激に血中濃度が低下し持続的な徐放性は得られなかった。おそらく、塩酸ドネペジルは脂質膜透過性が高いため、膜に封入すると安定に保持されず、その結果、速い放出性を示したと考えられる。【００６３】
一方、本発明による調製例２、３、４で得られたリポソーム組成物は、図３に示すように、初期バーストもなく、顕著な徐放時間の延長が認められ、約２週間にわたる徐放性を得ることができた。本発明によるリポソーム組成物は図１に示すように、各リポソーム内に多数のベシクルを含有し、かつ該リポソームは、何層にもわたる層状構造を有する厚い脂質膜で覆われているため、それらの構造によって薬物の脂質膜透過性が抑制され、さらにｐＨ勾配法により薬物が保持されていることで、より放出性が抑制され、その結果、著しく長い持続徐放性が得られたと考えられる。特に、内水相に硫酸イオンが存在することで（調製例２、３）、より徐放時間が延びるため、内水相溶液には硫酸アンモニウムを用いることが、好ましいと示唆された。これは、内水相においてプロトン化した薬物が硫酸イオンとインターラクションすることで、より放出速度が抑えられ長期的な持続徐放性を達成できたためと考えられる。【００６４】
以上のことから、初期バーストを抑え、より長期的な持続徐放性を達成するためには、リポソームが図１のような形態を有し、かつｐＨ勾配法で薬物が封入され、より好ましくは内水相に硫酸イオンが存在することが重要であることが明らかとなった。【００６５】
また、比較例３のエクストルーダーで調製した約１．７μｍのリポソーム組成物については、４日間まで高い血中濃度を維持し、その後、急激に低下した。【００６６】
＜ドネペジルリポソームの薬物動態２＞
本発明によるリポソーム組成物は、高い薬物封入量を得ることができるため、皮下投与における薬物投与量を上げることが可能である。そこで、調製例５、６で調製されたドネペジルリポソーム組成物について、塩酸ドネペジル量として５０ｍｇ/ｋｇとしてラット背部皮下にドネペジルリポソーム組成物を投与した。さらに、比較としてドネペジル単体を５ｍｇ／ｋｇでラット背部皮下に投与した。ドネペジル単体については、投与後、０．５、１、５、１０、３０、１２０、４８０、１４４０、２８８０分経過後に尾静脈より採血した。一方、リポソーム組成物については、投与後、１、３、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６、２６４、２８８、３１２、３３６時間経過後に尾静脈より採血した。採血後、＜ドネペジルリポソームの薬物動態１＞と同様に処理し、各血漿中の塩酸ドネペジル濃度を求めた。その結果を図４に示す。【００６７】
【表５】
2012091054.tif 000007
【００６８】
図４に示すように、ドネペジル単体は、投与後０．５時間で最大血中濃度を示し、その後、急激に減少した。４８時間後は既に検出限界以下であった。
一方、調製例５、６で調製した本発明によるリポソーム組成物は初期バーストもなく、臨床上、十分な有効濃度を１４日間にわたり持続することが可能であった。特に、調製例５については、血中濃度２０〜３０ｎｇ／ｍＬを１４日間、一定に保つことができた。さらに、１４日以上の持続徐放性も期待されるプロファイルを示したことから、持続徐放製剤として優れた製剤であることが明らかとなった。【００６９】
＜第１内水相／エタノール比率および第２内水相／（第１内水相＋エタノール）比率の検討＞
（調製例７〜１１および比較例５〜７）
ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ＝５４／４６となるようにＨＳＰＣおよびコレステロールをそれぞれ１．４１ｇおよび０．５９ｇ秤量し、無水エタノール４ｍＬを添加して加温溶解した。溶解後、この脂質エタノール溶液に対して約７０℃に加温した１５０ｍＭ硫酸アンモニウム水溶液（第１内水相）を表１に示す比率でそれぞれ添加し、約１０分間加温攪拌した。引き続き、第２内水相（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／０．９％塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５））を、（第１内水相＋エタノール）の容量に対して表１に示す比率でそれぞれ加え、さらに、約１０分間加温攪拌した。その後、調製例１，２と同様にｐＨ勾配を形成し薬物導入および未封入薬物除去を行った。【００７０】
表１に、調製例７〜１１および比較例５〜７で調製したリポソーム組成物の、第１内水相／エタノール比率および第２内水相／（第１内水相＋エタノール）比率、薬剤担持量（薬剤/総脂質モル比）および粒子径を示す。
また表６は、調製例２、５、７〜１１および比較例５〜７の薬剤担持量について比較したものである。
その結果、調製例７〜１１は、調製例２や５と同等の薬剤担持量が得られ、比較的高い薬物封入量が得られることが明らかとなった。また、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏの放出性もほぼ同じ挙動を示した。
一方、比較例５は薬物封入量が著しく低かった。これは、第１内水相／エタノールの比率が低いため、第１エマルジョンがきれいに形成されず、その影響によって脂質玉（脂質の凝集体）のようなものが形成されたためだと考えられる。また、比較例６および７については、第１内水相／エタノール比率が高いため、この時点で安定な１つの大きなリポソームのようなものを形成し、第２内水相はこれらの構造に影響を及ぼしにくいと考えられる。さらに、これら比較例５、６、７のｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出性は、調製例２や５、７〜１１と比較して初期の放出速度が高い傾向がみられた。これらの結果より、比較例５、６、７は、内水相がきれいに形成された構造になっておらず、その結果、十分な量の薬物が内水相に安定に封入されないために、薬物封入量がやや低下し、初期の放出が速いと想定される。一方、比較例３は、多層膜を有するものの、内側に１個の大きな内水相を有する構造をとるため脂質膜の層が非常に薄いと考えられる。その結果、薬物封入量が非常に高く、かつ、放出も非常に高いと考えられる。【００７１】
【表６】
2012091054.tif 000008
【００７２】
＜本発明による塩酸ブピバカインリポソームの調製＞
（調製例１２、１３）
調製例１〜４と同様に、ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ＝５４／４６となるように、ＨＳＰＣおよびコレステロールをそれぞれ４．２３ｇおよび１．７６ｇ秤量し、２４ｍＬのエタノール溶液に溶かした。溶解後、この脂質エタノール溶液に対して等量（２４ｍＬ）の１５０ｍＭあるいは２５０ｍＭ硫酸アンモニウム水溶液を加え、約１０分間加温攪拌した。その後、７６．８ｍＬの１５０ｍＭあるいは２５０ｍＭ硫酸アンモニウム水溶液を加え、約１０分間加温攪拌し、その後、速やかに氷冷した。引き続き、遠心分離にて外水相をｐＨ６．５の１０ｍＭ  クエン酸／０．９％塩化ナトリウムに変換しイオン勾配を形成した。
その後、薬物導入も調製例１〜４と同様に行った。薬物として塩酸ブピバカインを用いた。必要量の塩酸ブピバカイン（ＢＰＶ）を秤量後、ＲＯ水により１０ｍｇ／ｍＬのＢＰＶ溶液（薬物溶液）を調製し、６５℃で６０分間、加温攪拌することで薬物導入を行った。薬物導入後のリポソームは速やかに氷冷した。引き続き、未封入薬物除去も調製例１〜４と同様に行った。
その結果、表１に示すように、塩酸ブピバカインを用いた場合もドネペジルリポソームと同様に、比較的高い薬物封入量が得られることが明らかとなった。これらのことから、図１の構造を有するリポソームに塩酸ブピバカインもｐＨ勾配法で導入できることが明らかとなった。【００７３】
＜塩酸ブピバカインリポソームの薬物動態＞
調製例１２で調製した塩酸ブピバカインリポソームおよび塩酸ブピバカイン単体の薬物動態試験を行った。投与量は、塩酸ブピバカイン量として表７に示す容量でラット背部皮下に投与した。塩酸ブピバカインリポソーム組成物は、投与後、１、２４、７２、１２０、１６８時間経過後に、一方、塩酸ブピバカイン単体は、投与後、０．５、４、２４時間経過後、投与部位の背部皮下組織を採取しホモジネイト処理を行った。引き続きホモジネイト溶液を処理し、得られた試料溶液を高速液体クロマトグラフィーにて定量し（紫外可視吸光光度計、測定波長２１０ｎｍ）、投与部位の背部皮下組織に残存する塩酸ブピバカイン濃度を求めた。その結果を図５に示す。塩酸ブピバカイン単体の投与部位残存率は、投与後４時間で１％を下回った。このことから、塩酸ブピバカイン単体は数時間で投与部位から消失することが明らかとなり、持続的な血中濃度は得られないことが示唆された。一方、塩酸ブピバカインリポソームは、投与部位からの持続的な消失プロファイルが得られ、投与後、７日目において約３５％の塩酸ブピバカインが残存していた。これらのことから、投与したリポソームは、投与部位で持続的に塩酸ブピバカインを放出することが示唆された。以上のことから、本発明で得られた塩酸ブピバカインリポソームは、１週間以上の長期徐放能を有していることが明らかとなった。【００７４】
【表７】
2012091054.tif 000009
【００７５】
＜本発明による塩酸ロピバカインリポソームの調製＞
（調製例１４）
薬物として塩酸ロピバカインを用いる他は調製例２と同様にリポソーム組成物を作製し、塩酸ロピバカインリポソームを得た。
その結果、表１に示すように、塩酸ロピバカインを用いた場合も同様にｐＨ勾配法で導入でき、比較的高い薬物封入量を有するリポソーム組成物が得られることが明らかとなった。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの放出性も、持続的な放出性を示した塩酸ドネペジルリポソームおよび塩酸ブピバカインリポソームと同等な放出プロファイルを示したことから、同様に徐放性能を有することが示唆された。【００７６】
＜本発明による塩酸トラマドールリポソームの調製＞
（調製例１５）
薬物として塩酸トラマドールを用いる他は調製例３と同様にリポソーム組成物を作成し、塩酸トラマドールリポソームを得た。
その結果、表１に示すように、塩酸トラマドールを用いた場合も同様にｐＨ勾配法で導入でき、比較的高い薬物封入量を有するリポソーム組成物が得られることが明らかとなった。
【図１】
2012091054.tif 000010
【図２】
2012091054.tif 000011
【図３】
2012091054.tif 000012
【図４】
2012091054.tif 000013
【図５】
2012091054.tif 000014
【国際調査報告】
2012091054.tif 000015
2012091054.tif 000016
2012091054.tif 000017
2012091054.tif 000018