(57)【要約】【課題】  本発明は、安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカン、これを用いた腸管に吸収された後の動態を観察するためのプローブならびに安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンの製造方法を提供する。【解決手段】  安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカン。本発明によれば、β−１，３−１，６グルカンの新たな機能の発見や創出に寄与することができる。
2012147978.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカン。
【請求項２】
独立行政法人産業技術総合研究所  特許微生物センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）に寄託された寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１４のアウレオバシジウム プルランス Ｍ−２（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ Ｍ−２）を、安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃを含む液体培地中で培養することにより得られる、請求項１に記載の安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカン。
【請求項３】
培地のｐＨが３．０〜８．０である、請求項２に記載の安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカン。
【請求項４】
安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されていないβ−１，３−１，６グルカンと物性に差がない、請求項１から請求項３のいずれかに記載の安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカン。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれかに記載の安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンを用いた腸管吸収された後の動態を観察するためのプローブ。
【請求項６】
独立行政法人産業技術総合研究所  特許微生物センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）に寄託された寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１４のアウレオバシジウム プルランス Ｍ−２（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ Ｍ−２）を、安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃを含むｐＨが３．０〜８．０の液体培地中で培養する工程を有する安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカン、これを用いた腸管に吸収された後の動態を観察するためのプローブならびに安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
βグルカンは、Ｄ−グルコースを構成糖として構成される多糖類であり、例えば、β−１，３グルカンとは、β−ピラノース型の環状Ｄ−グルコース同士がグルコース１位の炭素に結合している水酸基部位とグルコース３位の炭素に結合している水酸基部位との間で縮合してβ−１，３グルコシド結合を形成し、環状β−ピラノース型のＤ−グルコースが重合するように構成されている多糖類である。【０００３】
βグルカンのような多糖類は、エネルギー源である糖の貯蔵分子や細胞壁などの構造分子として自然界の生物中に多種多様に存在している。例えば、キノコ類であるアガリクス茸や霊芝（レイシ）、舞茸（マイタケ）、椎茸（シイタケ）などが含有するβグルカンは、健康を維持増進するための様々な生理活性を有していることが知られており、免疫増強作用や抗腫瘍活性、ガン細胞増殖抑制作用、抗アレルギー作用、抗炎症作用、コレステロール低下作用、抗血栓作用、食物繊維作用、血圧降下作用、血糖降下作用、肝機能亢進などを目的とする機能性素材や医薬品などとして利用する試みが数多くなされている。また、難消化性を利用した便秘の予防・改善のための整腸剤、あるいはその保湿性を利用した化粧品などの機能性素材としても幅広い応用が期待されている。【０００４】
有益な活性を有するβグルカンとして、β−１，３グルコシド結合からなる主鎖に加えて、グルコース６位の炭素からのＤ−グルコースの側鎖を有するβ−１，３−１，６グルカンがよく知られており、ラミナランともいわれている物質である。しかしながら、その枝分かれ構造が活性に影響を与えていると考えられているものの、その作用機序は必ずしも明らかではなく、また、βグルカンは天然物から得られる高分子ポリマーであることから、分岐の度合や主鎖の長さ、側鎖の長さなどの構造の他、アミノ化やリン酸化、メチル化、アセチル化などによるＤ−グルコース水酸基における修飾の有無や度合は均一ではないため、その構造や化学修飾が活性に与える影響についても未だ解明されていない。そのため、これまでは経験的にキノコ類由来のβグルカンが好んで用いられ、他の生物種由来のβグルカンが利用されることは少なかった。【０００５】
近年、自然界に広く存在する不完全菌である、通称、黒酵母と呼ばれているアウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｓｐ．）に属する菌が産生するβ−１，３−１，６グルカンが、キノコ類由来のβグルカンと同等またはそれ以上の機能を有することが知られるようになり、様々な機能が見出されている。例えば、本願発明者らにより、アウレオバシジウム属に属する菌が産生するβ−１，３−１，６グルカンを含有する培養物などが、便秘改善機能（特許文献１）、皮膚保湿機能（特許文献２）、あるいは免疫賦活機能（特許文献３）を有することが見出され、飲食物などとして提供されている。【０００６】
このように、β−１，３−１，６グルカンについて様々な機能が見出されるに伴い、生体内におけるβ−１，３−１，６グルカンの動態を観察したい、特に、腸管に吸収された後の動態を観察したいというニーズが生じていた。なお、生体内における物質の動態を観察したいというニーズは、β−１，３−１，６グルカンに限らず様々な物質について存在し、例えば、安定同位体標識アミノ酸（特許文献４）や安定同位体標識酵母（特許文献５）、安定同位体標識オリゴヌクレオチド（特許文献６）、安定同位体標識抗体（特許文献７）などが開発されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−２６９４０７号公報
【特許文献２】特開２００４−２６９４０８号公報
【特許文献３】特開２００５−２２００６５号公報
【特許文献４】国際公開ＷＯ２００３／０５３９１０号パンフレット
【特許文献５】特開平６−２６１７４３号公報
【特許文献６】特開２０００−２９０２９１号公報
【特許文献７】特開２００３−９６０９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、安定同位体で標識されたβ−１，３−１，６グルカンはこれまでに報告がされておらず、安定同位体２Ｈや安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンも同様である。一方、プローブとしては、従来、安定性ではない同位体標識や蛍光標識のものの感度が良く、好まれてはいるが、安定性ではない同位体標識のプローブは生体への影響が懸念され、この影響により生体内において正確なトレースができない可能性がある。また、蛍光標識については、標識物質の分だけ分子量が異なるため、生体内での動向が異なり、同位体標識のプローブと同様、生体内において正確なトレースができない可能性がある。これらのことから、生体内における正確なトレースを実現するためには、安定性同位体標識のプローブが有効であるいえる。【０００９】
本発明は、安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカン、これを用いた腸管に吸収された後の動態を観察するためのプローブならびに安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究の結果、安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃを含む液体栄養培地においてアウレオバシジウム属に属する菌を培養することにより、安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンが産生されること、さらには、産生された安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンを用いることにより小腸に吸収された後のβ−１，３−１，６グルカンの動態を観察することができることを見出し、下記の各発明を完成した。【００１１】
（１）安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカン。【００１２】
（２）独立行政法人産業技術総合研究所  特許微生物センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）に寄託された寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１４のアウレオバシジウム プルランス Ｍ−２（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ Ｍ−２）を、安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃを含む液体培地中で培養することにより得られる、（１）に記載の安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカン。【００１３】
（３）培地のｐＨが３．０〜８．０である、（２）に記載の安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカン。【００１４】
（４）安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されていないβ−１，３−１，６グルカンと物性に差がない、（１）から（３）のいずれかに記載の安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカン。【００１５】
（５）（１）から（４）のいずれかに記載の安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンを用いた腸管吸収された後の動態を観察するためのプローブ。【００１６】
（６）独立行政法人産業技術総合研究所  特許微生物センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）に寄託された寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１４のアウレオバシジウム プルランス Ｍ−２（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ Ｍ−２）を、安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃを含むｐＨが３．０〜８．０の液体培地中で培養する工程を有する安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンの製造方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係る安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンによれば、生体内におけるβ−１，３−１，６グルカンの動態、特に、β−１，３−１，６グルカンが腸管に吸収された後の動態を観察することができ、β−１，３−１，６グルカンの新たな機能の発見や創出に寄与することができる。また、本発明に係る安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンの製造方法によれば、安定同位体２Ｈや安定同位体１３Ｃで標識されたにもかかわらず、安定同位体で標識されていないβ−１，３−１，６グルカンと物性に遜色がない標識されたβ−１，３−１，６グルカンを得ることができる。さらに、本発明に係るプローブによれば、生体への影響が懸念されない、生体内において正確なトレースが可能性となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】コントロール、安定同位体２Ｈで標識されたβ−１，３−１，６グルカンおよび安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンの各３試料についてのサイクルごとの安定同位体２Ｈ／１Ｈ比および安定同位体１３Ｃ／１２Ｃ比の平均値および標準偏差値を示す図である。
【図２】マウスから採取した小腸および大腸を分割する様子を示す図である。
【図３】ＨＥ染色したリンパ節を示す図である。
【図４】分割した小腸３における、リンパ節組織を採取する様子とリンパ節における安定同位体２Ｈ／１Ｈ比および安定同位体１３Ｃ／１２Ｃ比を示す図である。
【図５】分割した小腸３の異なる位置おける、リンパ節組織を採取する様子とリンパ節における安定同位体２Ｈ／１Ｈ比および安定同位体１３Ｃ／１２Ｃ比を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明に係る安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカン、これを用いたプローブ、ならびに本発明に係る安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンの製造方法について詳細に説明する。
【００２０】
安定同位体とは、電子や陽子、中性子を放出して原子番号が変遷し得る放射性同位体とは異なり、自然界で一定の割合をもって安定に存在する同位体であり、例えば２Ｈや１３Ｃの他、１５Ｎや１７Ｏ、１８Ｏなどを挙げることができる。
【００２１】
本発明における「で標識された」は、「が取り込まれた」、「を構成元素として有する」と交換可能に用いられる。
【００２２】
本発明に係る安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンは、安定同位体２Ｈないし安定同位体１３Ｃを含有する液体培地中で微生物を培養し、産生させることができる。そのような液体培地は、当業者によって適宜調製可能な液体培地を用いることができ、特に限定されないが、例えば、安定同位体２Ｈ標識Ｄ−グルコースおよび／または安定同位体１３Ｃ標識Ｄ−グルコース、安定同位体２Ｈおよび安定同位体１３Ｃ標識Ｄ−グルコース、安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃ標識Ｌ−グルコースなどの安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃ標識単糖、安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃ標識マルトースや安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃ標識スクロース、安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃ標識ラクトース、安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃ標識セロビオース、安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃ標識トレハロース、安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃ標識シクロデキストリン、安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃ標識グリコーゲン、安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃ標識アミロペクチン、安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃ標識アミロース、安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃ標識デンプン、安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃ標識セルロースなどの安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃ標識多糖、安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃ標識エタノールなどの安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃ標識アルコール、安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃ標識アミノ酸、安定同位体２Ｈ標識Ｈ２Ｏ、安定同位体１３Ｃ標識ＣＯ２などのうちから選択される１または２以上の他、米糠、乳酸菌溶液、アスコルビン酸ナトリウムを含む液体培地を挙げることができる。また、そのような微生物もまた、パン酵母や黒酵母（アウレオバシジウム属に属する菌）などを挙げることができるが、アウレオバシジウム属に属する菌が好ましく、独立行政法人産業技術総合研究所  特許微生物センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ；茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、郵便番号３０５−８５６６、日本）に、２００４年４月２２日に寄託された寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１４のアウレオバシジウム プルランス Ｍ−２（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ Ｍ−２）がより好ましい。
【００２３】
なお、本発明における液体培地のｐＨは３．０〜８．０の範囲が好ましいが、３．５〜７．５の範囲がより好ましく、４．０〜７．０の範囲がさらに好ましく、４．５〜７．０の範囲がよりさらに好ましい。
【００２４】
本発明において、生成された安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカン（培養物の形態を含む）は、精製して用いることができる。そのような精製は、当業者によって適宜選択可能な手法や器具を用いて行うことができ、特に限定されないが、本実施例においては、エタノール沈殿法を好適な精製方法として用いている。
【００２５】
β−１，３−１，６グルカンが安定同位体２Ｈ，１３Ｃで標識されているか否かを確認する方法としては、例えば、安定同位体２Ｈ，１３Ｃで標識されていないβ−１，３−１，６グルカンとの比較により、安定同位体２Ｈ／１Ｈ比ないし安定同位体１３Ｃ／１２Ｃ比を測定する方法により確認することができる。そのような方法には、投影型二次イオン質量分析装置や二次元固体撮像素子を組み合わせた同位体顕微鏡を用いることができる。なお、本実施例においては、投影型二次イオン質量分析装置と発明者らが独自に開発した二次元固体撮像素子を組み合わせた同位体顕微鏡が用いられている。
【００２６】
本発明に係る安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンは、腸管に吸収されることが確認されていることから、生体内におけるβ−１，３−１，６グルカンの動態、特に、β−１，３−１，６グルカンが腸管に吸収された後の動態を観察するためのプローブとして用いることができ、本発明に包含される。
【００２７】
本発明に係るプローブは、哺乳動物において用いることができ、そのような哺乳動物としては、ヒト、サル（ヒトを除く霊長目）、ウシ、ウマ、ブタ、ミニブタ、フェレット、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミなどを挙げることができるが、ヒトにおける代謝試験は可能であるものの安全性の問題が解決しない限り、ヒトを除く哺乳動物において用いるのが好ましい
【００２８】
なお、一般に哺乳動物は、βアミラーゼなどのβ−１，３−１，６グルカンを消化し得る酵素を有していないため、β−１，３−１，６グルカンは哺乳動物の消化器官ではほとんど分解されないが、本発明に係るプローブには、本発明に係る安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンの分解産物が含まれる。
【００２９】
生体内に取り込まれた本発明に係るプローブを検出する方法としては、例えば、安定同位体２Ｈ／１Ｈ比ないし安定同位体１３Ｃ／１２Ｃ比を測定する方法により検出することができる。そのような方法には、投影型二次イオン質量分析装置や二次元固体撮像素子を組み合わせた同位体顕微鏡を用いることができる。なお、本実施例においては、投影型二次イオン質量分析装置と発明者らが独自に開発した二次元固体撮像素子を組み合わせた同位体顕微鏡が用いられている。
【００３０】
また、本発明に係る安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンの製造方法は、
(i)独立行政法人独立行政法人産業技術総合研究所  特許微生物センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）に寄託された寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１４のアウレオバシジウム プルランス Ｍ−２（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ Ｍ−２）を、安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃを含むｐＨが３．０〜８．０の液体培地中で培養する工程
上記(i)の工程を有している。なお、本発明に係る安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンの製造方法において、上述した本発明に係る本発明に係る安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンおよびこれを用いたプローブの構成と同等または相当する構成については再度の説明を省略する。
【００３１】
本発明に係る安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンの製造方法においては、必要とする安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンの純度や態様などに応じて、上述の(i)の工程の他に、精製工程、凍結乾燥工程、粉砕工程、洗浄工程、安定同位体２Ｈや安定同位体１３Ｃで標識されているか否かの確認工程などを１または２回以上行ってもよい。
【００３２】
以下、本発明に係る安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカン、これを用いたプローブならびにその製造方法について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００３３】
＜実施例１＞安定同位体２Ｈまたは安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンの調製
（１）安定同位体２Ｈ含有培地においてアウレオバシジウム プルランス Ｍ−２を培養することによるβ−１，３−１，６グルカンの調製
［１−１］安定同位体２Ｈ含有培地の調製
３００ｍＬ三角フラスコに、下記の組成および終濃度となるように蒸留水に溶解し、これを液体栄養培地（ｐＨ３．０〜８．０）とした。【００３４】
安定同位体２Ｈ標識Ｄ−グルコース｛Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ−１，２，３，４，５，６，６−ｄ７（９８％）；和光純薬社｝１．５％（ｗ／ｖ）
微細化米糠（オリザジャームＤＬＳ；オリザ油化社）０．２％（ｗ／ｖ）
乳酸菌溶液１．０％（ｖ／ｖ）
これにアスコルビン酸ナトリウムが０．１５％（ｗ／ｖ）かつｐＨが３．０〜８．０、好ましくは４．５〜７．０となるように１０％アスコルビン酸ナトリウム溶液を添加した。【００３５】
［１−２］アウレオバシジウム プルランス Ｍ−２の培養
オートクレーブ（ＬＳＸ−７００；トミー精工社）を用いて１２１℃の条件下で１５分間滅菌した後、あらかじめ−８０℃で凍結保存しておいたアウレオバシジウム プルランス Ｍ−２（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ Ｍ−２；独立行政法人産業技術総合研究所  特許微生物センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）に寄託、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１４）０．５ｍＬを植菌し、振盪培養装置（ＢＲ−４０ＬＥ；ＴＡＩＴＥＣ社）を用いて攪拌回転数１５０ｒｐｍ、培養温度２４．５℃の条件下で５日間、回転振盪培養した。下記に培養結果を示す。【００３６】
＜安定同位体２Ｈ含有培地における培養結果＞
全糖濃度  ０．９３ｇ／ｄＬ
Ｄ−グルコース残糖濃度  ０
多糖濃度  ０．９３ｇ／ｄＬ
β−１，３−１，６グルカン  ０．６５ｇ／ｄＬ【００３７】
［１−３］β−１，３−１，６グルカンの精製
培養物３０ｍＬを回収し、蒸留水で１０倍希釈した後、高速遠心分離機（６９３０；久保田商事社）を用いて回転数１４５００ｒｐｍ、６℃の条件下で３０分間、遠心分離を行い、培養物上清約３００ｍＬを回収した。続いて、ロータリーエバポレーター（ＲＥ１１１；柴田化学社）を用いて、回収した培養物上清を１００ｍＬに減圧濃縮した。以下、エタノール沈殿法を用いて濃縮した培養物上清に含まれるβ−１，３−１，６グルカンを精製した。【００３８】
濃縮した培養物上清にエタノール（特級；関東化学社）を６６％（ｖ／ｖ）になるまで添加し、一晩６℃の冷蔵庫内に静置した後、高速遠心分離機（６９３０；久保田商事社）を用いて回転数１４５００ｒｐｍ、６℃の条件下で３０分間、遠心分離を行い、β−１，３−１，６グルカンを含む沈殿物を回収した。得られた沈殿物を蒸留水に溶解し、沈殿物水溶液を４０ｍＬ調製した。前述したエタノール添加工程〜冷蔵庫内静置工程〜遠心分離工程〜沈殿物回収工程〜４０ｍＬ沈殿物水溶液の調製工程〜エタノール添加工程〜冷蔵庫内静置工程〜遠心分離工程〜沈殿物回収工程の各工程を経て、β−１，３−１，６グルカンを含む沈殿物を得た。【００３９】
得られたβ−１，３−１，６グルカンを含む沈殿物を蒸留水に溶解し、沈殿物水溶液を１５０ｍＬ調製し、ロータリーエバポレーター（ＲＥ１１１；柴田化学社）を用いて沈殿物水溶液を３０ｍＬに減圧濃縮するとともに残存するエタノールを除去した。オートクレーブ（ＬＳＸ−７００；トミー精工社）を用いて濃縮した沈殿物水溶液３０ｍＬを９０℃の条件下で３０分間滅菌し、β−１，３−１，６グルカン精製物を得た。【００４０】
（２）安定同位体１３Ｃ含有培地においてアウレオバシジウム プルランス Ｍ−２を培養することによるβ−１，３−１，６グルカンの調製
安定同位体２Ｈ標識Ｄ−グルコース｛Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ−１，２，３，４，５，６，６−ｄ７（９８％）；和光純薬社｝の代わりに安定同位体１３Ｃ標識Ｄ−グルコース｛Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ−Ｕ−１３Ｃ６（９９％）；和光純薬社｝を同量用いた他は、本実施例（１）［１−１］〜［１−３］の手法に基づいてβ−１，３−１，６グルカン精製物を得た。なお、アウレオバシジウム プルランス Ｍ−２の培養結果を下記に示す。【００４１】
＜安定同位体１３Ｃ含有培地における培養結果＞
全糖濃度  １．１３ｇ／ｄＬ
Ｄ−グルコース残糖濃度  ０
多糖濃度  １．１３ｇ／ｄＬ
β−１，３−１，６グルカン  ０．７９ｇ／ｄＬ【００４２】
（３）β−１，３−１，６グルカンが安定同位体２Ｈ，１３Ｃで標識されているか否かの確認
本実施例（１）または（２）で得られたβ−１，３−１，６グルカンについて、安定同位体２Ｈまたは安定同位体１３Ｃで標識されているか否かを確認した。安定同位体２Ｈ標識Ｄ−グルコース｛Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ−１，２，３，４，５，６，６−ｄ７（９８％）；和光純薬社｝の代わりにＤ−グルコースを同量用いた他は、本実施例（１）［１−１］〜［１−３］の手法に基づいてβ−１，３−１，６グルカン精製物を得、これをコントロールとした。【００４３】
コントロール、本実施例（１）および（２）で得られたβ−１，３−１，６グルカンをそれぞれ室温下で４８時間静置して流動性を失わせ、イオン照射による帯電を押さえるために、流動性を失ったβ−１，３−１，６グルカンに厚さ３０ｎｍの金蒸着を施した後、１インチサイズの試料ホルダにマウントして試料を作成した。試料はそれぞれ３つずつ作成した。続いて、投影型二次イオン質量分析装置（ＩＭＳ １２７０；ＣＡＭＥＣＡ社）と独自に開発した二次元固体撮像素子を組み合わせた同位体顕微鏡を用いて、作成した試料について安定同位体２Ｈおよび安定同位体１３Ｃの二次元分布を各々１９サイクル観察し、安定同位体２Ｈ／１Ｈ比および安定同位体１３Ｃ／１２Ｃ比ならびにそれらの平均値および標準偏差値を試料ごとに算出した。さらにこれら試料ごとの安定同位体２Ｈ／１Ｈ比および安定同位体１３Ｃ／１２Ｃ比の平均値および標準偏差値から、コントロール、本実施例（１）および（２）で得られたβ−１，３−１，６グルカンの各３試料についての安定同位体２Ｈ／１Ｈ比および安定同位体１３Ｃ／１２Ｃ比の平均値ならびに標準偏差値をサイクルごとに算出した。【００４４】
試料ごとの安定同位体２Ｈおよび安定同位体１３Ｃの二次元分布１９サイクルの値、安定同位体２Ｈ／１Ｈ比および安定同位体１３Ｃ／１２Ｃ比ならびにそれらの平均値および標準偏差値を表１〜９に、コントロール、本実施例（１）および（２）で得られたβ−１，３−１，６グルカンの各３試料についてのサイクルごとの安定同位体２Ｈ／１Ｈ比および安定同位体１３Ｃ／１２Ｃ比の平均値および標準偏差値を図１に示す。【００４５】
【表１】
2012147978.tif 000003
【００４６】
【表２】
2012147978.tif 000004
【００４７】
【表３】
2012147978.tif 000005
【００４８】
【表４】
2012147978.tif 000006
【００４９】
【表５】
2012147978.tif 000007
【００５０】
【表６】
2012147978.tif 000008
【００５１】
【表７】
2012147978.tif 000009
【００５２】
【表８】
2012147978.tif 000010
【００５３】
【表９】
2012147978.tif 000011
【００５４】
表１〜９および図１に示すように、安定同位体２Ｈ含有培地においてアウレオバシジウム プルランス Ｍ−２を培養することにより調製したβ−１，３−１，６グルカン（図１中の２Ｈｇｌｕｃａｎ）は、コントロール（図１中のｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して安定同位体２Ｈ／１Ｈ比の値（図１中の２Ｈ／１Ｈ）が顕著に上昇し、安定同位体１３Ｃ含有培地においてアウレオバシジウム プルランス Ｍ−２を培養することにより調製したβ−１，３−１，６グルカンは（図１中の１３Ｃｇｌｕｃａｎ）、コントロールと比較して安定同位体１３Ｃ／１２Ｃ比の値（図１中の１３Ｃ／１２Ｃ）が顕著に上昇していることが明らかとなった。このことから、安定同位体２Ｈ含有培地あるいは安定同位体１３Ｃ含有培地においてアウレオバシジウム プルランス Ｍ−２を培養することにより、安定同位体２Ｈまたは安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンを調製することができることが示された。【００５５】
なお、上述したアウレオバシジウム プルランス Ｍ−２の培養結果に基づき、精製物について、安定同位体２Ｈ標識Ｄ−グルコースからの安定同位体２Ｈの収率および安定同位体１３Ｃ標識Ｄ−グルコースからの安定同位体１３Ｃの収率を算出したところ、安定同位体２Ｈの収率が４２．１３％、安定同位体１３Ｃの収率が３４．６６％であった。【００５６】
＜実施例２＞安定同位体２Ｈまたは安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンの物性の確認
（１）ｐＨの測定
ｐＨ計（７４４型；メトロノームジャパン社）を用いて、実施例１で作成したコントロール、安定同位体２Ｈで標識されたβ−１，３−１，６グルカンおよび安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンのｐＨを測定した。その結果を下記に示す。【００５７】
＜ｐＨ測定結果＞
コントロール  ６．６２
安定同位体２Ｈで標識されたβ−１，３−１，６グルカン  ６．６４
安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカン  ６．６９【００５８】
（２）粘度の測定
振動式粘度計（ＶＭ−１０Ａ；セコニック社）を用いて、実施例１で作成したコントロール、安定同位体２Ｈで標識されたβ−１，３−１，６グルカンおよび安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンの粘度を測定した。その結果を下記に示す。【００５９】
＜粘度測定結果（ｍＰａ・ｓ）＞
コントロール  ４１．３
安定同位体２Ｈで標識されたβ−１，３−１，６グルカン  ４７．８
安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカン  ４１．４【００６０】
上述したｐＨおよび粘度の測定結果より、コントロール、安定同位体２Ｈで標識されたβ−１，３−１，６グルカンおよび安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンのいずれも物性に差がないことが明らかとなった。すなわち、安定同位体２Ｈ含有培地あるいは安定同位体１３Ｃ含有培地においてアウレオバシジウム プルランス Ｍ−２を培養することにより調製したβ−１，３−１，６グルカンは、安定同位体２Ｈまたは安定同位体１３Ｃで標識されたにもかかわらず、アウレオバシジウム プルランス Ｍ−２が産生する安定同位体で標識されていないβ−１，３−１，６グルカンと物性に遜色がないことが示され、安定同位体２Ｈまたは安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンは、例えば、腸管で吸収されるか否かを調べるため、および腸管で吸収された場合のその後の動態を観察するためのプローブとして役立つことが示された。【００６１】
＜実施例３＞小腸における安定同位体２Ｈまたは安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンの吸収後の動態観察
小腸におけるβ−１，３−１，６グルカンの吸収後の動態を調べるために、実施例１で作成した安定同位体２Ｈで標識されたβ−１，３−１，６グルカンおよび安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンを用いて観察した。【００６２】
（１）安定同位体２Ｈまたは安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンのマウスへの投与
安定同位体２Ｈで標識されたβ−１，３−１，６グルカンおよび安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンをそれぞれマウスに投与した。１３週齢の雄のＣ５７ＢＬ−６マウス（日本クレア社）を５匹用意し、実施例１（１）および（２）で得られた粘性を有する液状の安定同位体２Ｈで標識されたβ−１，３−１，６グルカンおよび安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンを同量混ぜたものを、ゾンテを用いて１匹当たり２００μＬずつ、１時間おきに計５回経口投与した。【００６３】
（２）観察用切片の作成
最初の投与から６時間後にマウスを解剖し、洗浄を行わないままで大腸および小腸を採取し、採取した小腸は図２に示すように２〜５の４つに分割した。続いて、β−１，３−１，６グルカンは小腸組織であるパイエル板に存在するＭ細胞から取り込まれると発明者らは考え、分割した小腸２〜５から、小腸組織に存在するリンパ節組織をそれぞれ採取した。ヘマトキシリン・エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ；ＨＥ）染色したリンパ節を図３に矢印で示す。図３において、左下方向の部分が小腸管内を示している。また、分割した小腸３における、リンパ節組織を採取する様子を図４および図５の左側図および中央図に示す。左側図からの矢印で示された中央図において四角で囲まれた枠内の組織が、採取されたリンパ節組織を示している。【００６４】
続いて、１００ｍＬの蒸留水にＰａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（ＰＦＡ）８ｇを溶解して得られた８％（ｗ／ｖ）ＰＦＡ水溶液３０ｍＬに、０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液に０．１ｍｏｌ／ＬのＬ−ｌｙｓｉｎｅを加えて得られた溶液（ｐＨ７．４）を９０ｍＬ加え、さらにメタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）を０．２５７ｇ加えて攪拌することにより、ＰＬＰ固定液を調製した。下記にＰＬＰ固定液の最終濃度を示す。【００６５】
＜ＰＬＰ固定液＞
０．０１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＩＯ４
０．０７５ｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ
０．０７５ｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液
２％（ｗ／ｖ）ＰＦＡ【００６６】
調製したＰＬＰ固定液に採取した組織を浸漬し、２４時間静置した後、組織を水道水で軽く洗浄した後、パラフィン置換器（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＵＩＰ ５ Ｊｒ；ＳＡＫＵＲＡ社）を用いてパラフィン置換した。その後、パラフィン包埋器（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＴＥＣ Ｊｒ；ＳＡＫＵＲＡ社）を用いて組織をパラフィンで包埋したブロックを作成し、切片作成器（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ Ｃｒｏｓｓｔｏｍｅ Ｊｒ；ＳＡＫＵＲＡ社）を用いて組織を厚さ４μｍにスライスした。スライスした組織をスライドガラス上に載せ、ウォーマー（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ Ｓｌｉｄｅ Ｗａｒｍｅｒ Ｊｒ；ＳＡＫＵＲＡ社）を用いて４２℃で一晩静置した。続いて、実施例１（３）と同様の手法に基づいて、１インチサイズの試料ホルダにマウントして試料を作成した後、投影型二次イオン質量分析装置（ＩＭＳ １２７０；ＣＡＭＥＣＡ社）と独自に開発した二次元固体撮像素子を組み合わせた同位体顕微鏡を用いて安定同位体２Ｈおよび安定同位体１３Ｃの二次元分布を測定し、安定同位体２Ｈ／１Ｈ比および安定同位体１３Ｃ／１２Ｃ比を測定した。その結果を図４および図５に示す。【００６７】
上述の通り、採取された組織はリンパ節組織であり、図４および図５の右側図に示すように、リンパ節において安定同位体２Ｈ／１Ｈ比および安定同位体１３Ｃ／１２Ｃ比の値が極めて高いことから、安定同位体２Ｈで標識されたβ−１，３−１，６グルカンおよび安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンがリンパ節に取り込まれていることが示された。【００６８】
以上の結果から、安定同位体２Ｈで標識されたβ−１，３−１，６グルカンおよび安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカン、すなわちβ−１，３−１，６グルカンは、パイエル板を通じて腸管に点在するリンパ組織に取り込まれることが明らかとなった。また、パイエル板の近傍には腸間膜リンパ節が存在しており、β−１，３−１，６グルカンによる免疫細胞の刺激がパイエル板や腸間膜リンパ節で起こっている可能性が示唆された。なお、パイエル板以外の小腸上皮では、安定同位体２Ｈで標識されたβ−１，３−１，６グルカンおよび安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンはいずれも検出されなかった（図示しない）。
【図１】
2012147978.tif 000012
【図２】
2012147978.tif 000013
【図３】
2012147978.tif 000014
【図４】
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【図５】
2012147978.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成24年12月11日(2012.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンを用いた腸管吸収された後の動態を観察するためのプローブ。
【請求項２】
リンパ節に取り込まれる、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンが独立行政法人産業技術総合研究所  特許微生物センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）に寄託された寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１４のアウレオバシジウム プルランス Ｍ−２（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ Ｍ−２）を、安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃを含む液体培地中で培養することにより得られる安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンである、請求項１または請求項２に記載のプローブ。
【請求項４】
培地のｐＨが３．０〜８．０である、請求項３に記載のプローブ。
【請求項５】
安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンが安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されていないβ−１，３−１，６グルカンと物性に差がない安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンである、請求項１から請求項４のいずれかに記載のプローブ。
【手続補正書】
【提出日】平成25年7月2日(2013.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−１，３−１，６グルカンが腸管吸収された後の動態を観察するための腸管吸収後動態観察用プローブであって、
独立行政法人産業技術総合研究所  特許微生物センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）に寄託された寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１４のアウレオバシジウム プルランス Ｍ−２（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ Ｍ−２）を安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃを含む液体培地中で培養することにより得られる安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンを用いた前記腸管吸収後動態観察用プローブ。
【請求項２】
腸管のリンパ節に取り込まれる、請求項１に記載の腸管吸収後動態観察用プローブ。
【請求項３】
前記液体培地のｐＨが３．０〜８．０である、請求項１または請求項２に記載の腸管吸収後動態観察用プローブ。
【請求項４】
前記安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンが安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されていないβ−１，３−１，６グルカンと物性に差がない安定同位体２Ｈおよび／または安定同位体１３Ｃで標識されたβ−１，３−１，６グルカンである、請求項１から請求項３のいずれかに記載の腸管吸収後動態観察用プローブ。
【国際調査報告】
2012147978.tif 000017
2012147978.tif 000018
2012147978.tif 000019
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