(57)【要約】  本発明は、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドおよびかかるペプチドを含む融合タンパク質に関するものである。本発明はまた、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドまたはかかるペプチドとの融合タンパク質を含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物などに関するものである。本発明により提供される医薬組成物は、特に関節炎やリウマチの治療に有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
イミュノグロブリン結合能を有するペプチドであって、
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｘ４−Ｘ５−Ｐｈｅ
（ここで、Ｘ４およびＸ５は同時にＴｙｒでないアミノ酸である）
で表されるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項２】
Ｘ４およびＸ５の両方が親水性アミノ酸である、請求項１のペプチド。
【請求項３】
Ｘ４およびＸ５が独立してＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＳｅｒおよびＴｈｒからなる群より選択されるアミノ酸である、請求項１のペプチド。
【請求項４】
配列番号９〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有する請求項１のペプチド。
【請求項５】
式（Ｉ）のアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸（Ｇｌｙを除く）が対応するＤ−アミノ酸で置換されている、請求項１〜４のいずれかのペプチド。
【請求項６】
式（Ｉ）のアミノ酸配列中の全てのアミノ酸（Ｇｌｙを除く）が対応するＤ−アミノ酸で置換されている、請求項１〜４のいずれかのペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかのペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加されている融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかのペプチドをコードする核酸。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかのペプチドがＮ末端および／またはＣ末端に付加されている融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかのペプチド、請求項７の融合タンパク質、請求項８または９の核酸、あるいは請求項８または９の核酸を含むベクターを有効成分として含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物。
【請求項１１】
疾患が関節リウマチである、請求項１０の医薬組成物。
【請求項１２】
疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糸球体腎炎、血管炎、関節炎からなる群より選択されるものである、請求項１０の医薬組成物。
【請求項１３】
有効成分が請求項４〜６のいずれかのペプチドである、請求項１０〜１２のいずれかの医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドおよびかかるペプチドを含む融合タンパク質に関するものである。また、本発明は、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドまたはかかるペプチドとの融合タンパク質を含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物などに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ１ｑは補体タンパク質の１つであり、補体活性化経路において作用することが知られている。例えば、古典経路の活性化は、Ｃ１ｑがイミュノグロブリン分子のＦｃ部分に結合することにより引き起こされるとされている。【０００３】
Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患には多くの種類があり、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糸球体腎炎、血管炎、関節炎などの免疫複合体病やリウマチが典型例として挙げられる。関節リウマチ（ＲＡ）患者の血中にはＣ１ｑが多く存在し、将来関節破壊に陥ることが報告されている（非特許文献１）。このような病態には上述のＣ１ｑによる活性化が関与していると考えられており、Ｃ１ｑとイミュノグロブリン分子との結合の阻害剤の開発が望まれている。【０００４】
現在、関節リウマチの治療薬としてメトトレキセートおよびレフルミドが多く用いられているが、これらの薬剤は副作用があり、大量に投与することができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ochi T et al., Arthritis Rheum. 1988 Jan; 31(1): 37-43
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の解決課題は、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドおよびかかるペプチドを含む融合タンパク質、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドまたはかかるペプチドとの融合タンパク質を含む、およびＣ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患を治療または予防するための、有効で安全な医薬組成物などを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、Ｃ１ｑ由来のアミノ酸配列を有するペプチドが、関節リウマチなどのＣ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患において治療および予防効果を示すことを見出したが（国際公開第２００９／０２５３００号パンフレットおよび国際公開第２０１０／０８４８５１号パンフレットを参照のこと）、さらにペプチドの水溶性を高めるために鋭意研究を重ねた結果、上記ペプチド中の特定位置のアミノ酸を置換することによって、ペプチドの水溶性が改善され、しかもイミュノグロブリン結合能といった生物学的活性が有意に低下しないことを見出し、本発明を完成させた。【０００８】
すなわち、本発明は、以下のものを提供するものである：
（１）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドであって、
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｘ４−Ｘ５−Ｐｈｅ        （Ｉ）
（ここで、Ｘ４およびＸ５は同時にＴｙｒでないアミノ酸である）
で表されるアミノ酸配列を有するペプチド；
（２）Ｘ４およびＸ５の一方または両方が親水性アミノ酸である、（１）のペプチド；
（３）Ｘ４およびＸ５の両方が親水性アミノ酸である、（１）のペプチド；
（４）Ｘ４およびＸ５が独立してＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＳｅｒおよびＴｈｒからなる群より選択されるアミノ酸である、（３）のペプチド；
（５）配列番号９〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有する（１）のペプチド；
（６）配列番号１２のアミノ酸配列を有する（１）のペプチド；
（７）式（Ｉ）のアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸（Ｇｌｙを除く）が対応するＤ−アミノ酸で置換されている、（１）〜（６）のいずれかのペプチド；
（８）式（Ｉ）のアミノ酸配列中の全てのアミノ酸（Ｇｌｙを除く）が対応するＤ−アミノ酸で置換されている、（１）〜（６）のいずれかのペプチド；
（９）Ｄ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅであるアミノ酸配列を有する（８）のペプチド；
（１０）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドをコードする核酸であって、（１）〜（６）のいずれかのペプチドをコードする核酸；
（１１）（５）のペプチドをコードする、（１０）の核酸；
（１２）（６）のペプチドをコードする、（１０）の核酸；
（１３）（１０）〜（１２）のいずれかの核酸を含むベクター；
（１４）（１）〜（６）のいずれかのペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加されている融合タンパク質；
（１５）（７）〜（９）のいずれかのペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加されている融合タンパク質；
（１６）（１４）の融合タンパク質をコードする核酸；
（１７）（１６）の核酸を含むベクター；
（１８）（１０）〜（１２）のいずれかの核酸、（１６）の核酸、あるいは（１３）または（１７）のベクターを含む、細胞；
（１９）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドの製造方法であって、
（ａ）（１３）のベクターを用いて細胞を形質転換する工程、および
（ｂ）該細胞を培養して、ペプチドを産生させる工程
を含む、方法；
（２０）（１９）の方法により得ることのできる、イミュノグロブリン結合能を有するペプチド；
（２１）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加した融合タンパク質の製造方法であって、
（ａ）（１７）のベクターを用いて細胞を形質転換する工程、および
（ｂ）該細胞を培養して、融合タンパク質を産生させる工程
を含む、方法；
（２２）融合タンパク質から目的タンパク質を取り出す工程をさらに含む、（２１）の方法；
（２３）（２１）または（２２）の方法により得ることのできる、融合タンパク質；
（２４）（１）〜（９）のいずれかのペプチド、または（１４）もしくは（１５）の融合タンパク質を含む、イミュノグロブリンを結合させるための組成物；
（２５）イミュノグロブリンの存在もしくは量を決定するためかまたはイミュノグロブリンを単離するためのものである、（２４）の組成物；
（２６）（１）〜（９）のいずれかのペプチド、または（１４）もしくは（１５）の融合タンパク質を固定化した、イミュノグロブリンを結合させるための手段；
（２７）イミュノグロブリンの存在もしくは量を決定するためであるかまたはイミュノグロブリンを単離するためのものである、（２６）の手段；
（２８）イミュノグロブリンを結合させる方法であって、
（ａ）（１）〜（９）のいずれかのペプチド、または（１４）もしくは（１５）の融合タンパク質を試料に添加する工程、および
（ｂ）ペプチドまたは融合タンパク質とイミュノグロブリンとの結合体を調べる工程
を含む、方法；
（２９）（２８）の方法に用いるための、（１）〜（９）のいずれかのペプチドまたは（１４）もしくは（１５）の融合タンパク質を含む融合タンパク質を含むキット；
（３０）標識されている（１）〜（９）のいずれかのペプチドまたは（１４）もしくは（１５）の融合タンパク質；
（３１）（３０）の標識されているペプチドまたは融合タンパク質を試料中の抗体と反応させ、次いで抗体と結合した該ペプチドまたは融合タンパク質を検出することを特徴とする、試料中の抗体の検出方法；
（３２）（１）〜（９）のいずれかのペプチド、（１４）もしくは（１５）の融合タンパク質、（１０）〜（１２）のいずれかの核酸、（１６）の核酸、あるいは（１３）または（１７）のベクターを有効成分として含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物；
（３３）疾患が関節リウマチである、（３２）の医薬組成物；
（３４）疾患が全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糸球体腎炎、血管炎、関節炎などの免疫複合体病である、（３２）の医薬組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドおよびかかるペプチドを含む融合タンパク質、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防においてより有用な医薬組成物などの提供が可能になる。また、水溶性が改善された本発明のペプチドを上記医薬組成物に用いることで、従来と比べて実質的な投与量が高められた医薬組成物を提供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ペプチドＲ１および４〜６がＣ１ｑとイミュノグロブリンの結合を阻害することを示す。図中、ＮＣはペプチドを含まないＤＭＳＯを、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヒトイミュノグロブリン（ＩｇＧ）を含まない反応液に添加したサンプルの結果であって、ＰＣはペプチドを含まないＤＭＳＯを、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヒトイミュノグロブリン（ＩｇＧ）を含む反応液に添加したサンプルの結果である。
【図２】図２は、ペプチドＳＰ１〜７がＣ１ｑとイミュノグロブリンの結合を阻害することを示す。図中、ＮＣはペプチドを含まないＤＭＳＯを、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヒトイミュノグロブリン（ＩｇＧ）を含まない反応液に添加したサンプルの結果であって、ＰＣはペプチドを含まないＤＭＳＯを、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヒトイミュノグロブリン（ＩｇＧ）を含む反応液に添加したサンプルの結果である。
【図３】図３は、ヒトＲＡ患者から採取した滑膜細胞をＴＮＦ−αで刺激することにより誘導されるＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−３の産生が、本発明のペプチドの添加によってそれぞれ抑制されたことを示す。図中、コントロールはペプチド未添加のサンプルの結果を示し、ＳＰ３−１００、ＳＰ３−１０およびＳＰ３−１はＳＰ３のペプチドをそれぞれ１００μｇ、１０μｇおよび１μｇ添加したサンプルの結果を示し、ＳＰ４−１００、ＳＰ４−１０およびＳＰ４−１はＳＰ４のペプチドをそれぞれ１００μｇ、１０μｇおよび１μｇ添加したサンプルの結果を示す。
【図４】図４は、モノクローナル抗体カクテル誘発関節炎マウスを用いた被験物質ａの関節炎抑制作用を、臨床スコアで示したグラフである。○はコントロール群、●は被験物質ａ  １０ｍｇ／ｋｇ投与群、■はメトトレキセート  ０．１５ｍｇ／ｋｇ投与群を示す。
【図５】図５は、モノクローナル抗体カクテル誘発関節炎マウスを用いた被験物質αの関節炎抑制作用を、臨床スコアで示したグラフである。○はコントロール群、●は被験物質α  １０ｍｇ／ｋｇ投与群、■はメトトレキセート  ０．１５ｍｇ／ｋｇ投与群を示す。
【図６】図６は、モノクローナル抗体カクテル誘発関節炎マウスを用いた被験物質VII-1の関節炎抑制作用を、臨床スコアで示したグラフである。○はコントロール群、●は被験物質VII-1  １０ｍｇ／ｋｇ投与群、△は被験物質VII-1  １００ｍｇ／ｋｇ投与群、■はメトトレキセート  ０．１５ｍｇ／ｋｇ投与群を示す。
【図７】図７は、モノクローナル抗体カクテル誘発関節炎マウスを用いた被験物質VII-2の関節炎抑制作用を、臨床スコアで示したグラフである。○はコントロール群、●は被験物質VII-2  １０ｍｇ／ｋｇ投与群、△は被験物質VII-2  １００ｍｇ／ｋｇ投与群、■はメトトレキセート  ０．１５ｍｇ／ｋｇ投与群を示す。
【図８】図８は、モノクローナル抗体カクテル誘発関節炎マウスを用いた被験物質ａの関節炎抑制作用を、後肢容積で示したグラフである。○はコントロール群、●は被験物質ａ  １０ｍｇ／ｋｇ投与群、■はメトトレキセート  ０．１５ｍｇ／ｋｇ投与群を示す。
【図９】図９は、モノクローナル抗体カクテル誘発関節炎マウスを用いた被験物質αの関節炎抑制作用を、後肢容積で示したグラフである。○はコントロール群、●は被験物質α  １０ｍｇ／ｋｇ投与群、■はメトトレキセート  ０．１５ｍｇ／ｋｇ投与群を示す。
【図１０】図１０は、モノクローナル抗体カクテル誘発関節炎マウスを用いた被験物質VII-1の関節炎抑制作用を、後肢容積で示したグラフである。○はコントロール群、●は被験物質VII-1  １０ｍｇ／ｋｇ投与群、△は被験物質VII-1  １００ｍｇ／ｋｇ投与群、■はメトトレキセート  ０．１５ｍｇ／ｋｇ投与群を示す。
【図１１】図１１は、モノクローナル抗体カクテル誘発関節炎マウスを用いた被験物質VII-2の関節炎抑制作用を、後肢容積で示したグラフである。○はコントロール群、●は被験物質VII-2  １０ｍｇ／ｋｇ投与群、△は被験物質VII-2  １００ｍｇ／ｋｇ投与群、■はメトトレキセート  ０．１５ｍｇ／ｋｇ投与群を示す。
【図１２】図１２は、モノクローナル抗体カクテル誘発関節炎マウスを用いた被験物質ａの関節炎抑制作用を、後肢容積増加率で示したグラフである。○はコントロール群、●は被験物質ａ  １０ｍｇ／ｋｇ投与群、■はメトトレキセート  ０．１５ｍｇ／ｋｇ投与群を示す。
【図１３】図１３は、モノクローナル抗体カクテル誘発関節炎マウスを用いた被験物質αの関節炎抑制作用を、後肢容積増加率で示したグラフである。○はコントロール群、●は被験物質α  １０ｍｇ／ｋｇ投与群、■はメトトレキセート  ０．１５ｍｇ／ｋｇ投与群を示す。
【図１４】図１４は、モノクローナル抗体カクテル誘発関節炎マウスを用いた被験物質VII-1の関節炎抑制作用を、後肢容積増加率で示したグラフである。○はコントロール群、●は被験物質VII-1  １０ｍｇ／ｋｇ投与群、△は被験物質VII-1  １００ｍｇ／ｋｇ投与群、■はメトトレキセート  ０．１５ｍｇ／ｋｇ投与群を示す。
【図１５】図１５は、モノクローナル抗体カクテル誘発関節炎マウスを用いた被験物質VII-2の関節炎抑制作用を、後肢容積増加率で示したグラフである。○はコントロール群、●は被験物質VII-2  １０ｍｇ／ｋｇ投与群、△は被験物質VII-2  １００ｍｇ／ｋｇ投与群、■はメトトレキセート  ０．１５ｍｇ／ｋｇ投与群を示す。
【図１６】図１６ａは、アルサス反応における被験物質VII-2の腹腔内投与の効果を示すグラフである。図１６ｂは、アルサス反応における被験物質VII-2の尾静脈内投与の効果を示すグラフである。
【図１７】図１７は、滑膜細胞とＢ細胞が共存するリウマチ関節モデル系における被験物質VII-2のＩｇＧ産生抑制効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、１つの態様において、
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ        （ａ）
で表されるアミノ酸配列（配列番号１）を有するペプチドとほぼ同等かそれ以上のイミュノグロブリン結合能などの生物学的活性を有し、かつ水溶性が改善されたペプチドに関するものである。本発明のペプチドの生物学的活性は、当該技術分野において公知の方法により調べることができる。例えば、ペプチドをイミュノグロブリン存在下でインキュベートし、結合量を調べてもよい。本発明のペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列（ａ）において、１つまたは複数（例えば、２、３、４または５個）のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有するペプチドに関する。本発明のペプチドにおいて、置換されるアミノ酸はいずれのアミノ酸でもよいが、好ましくは上記アミノ酸配列（ａ）のＮ末端から４番目および／または５番目のアミノ酸であり、さらに好ましくは上記配列（ａ）のＮ末端から４番目および５番目の両方のアミノ酸である。
【００１２】
なお、本明細書において、アミノ酸を名称ではなく、３文字表記または１文字表記で表すことがあるが、３文字表記または１文字表記は当業者によく知られている。
【００１３】
本発明のペプチドは、イミュノグロブリン結合能を有し、かつ良好な水溶性を示す限り、上記アミノ酸配列（ａ）のいずれのアミノ酸が他のアミノ酸で置換されてもよく、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジンまたはプロリンなどの天然タンパク質を構成しているアミノ酸、あるいはβ−アラニン、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、５−アミノレブリン酸、５−アミノ吉草酸、ホモシステイン、オルニチン、５−ヒドロキシトリプトファン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ドーパ）、トリヨードチロニン、チロキシン、ホモリジン、ノルロイシン、クレアチン、デスモシン、ノルバリンまたはヨードチロシンなどの天然タンパク質を構成していないアミノ酸に置換されてもよい。
【００１４】
上記アミノ酸配列（ａ）において１つまたは複数のアミノ酸を、親水性アミノ酸に、あるいはペプチドの水溶性を高めるようなアミノ酸誘導体または修飾体などに置換することによって、該アミノ酸配列を有するペプチドの水溶性を改善することができる。したがって、本発明の好ましい態様において、式（ａ）のアミノ酸配列中のアミノ酸は親水性アミノ酸あるいはペプチドの水溶性を高めるようなアミノ酸誘導体または修飾体などで置換されている。親水性アミノ酸の例としてはセリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）またはヒスチジン（Ｈｉｓ）が挙げられるが、これらのアミノ酸に限定されない。
【００１５】
一般に、ペプチド医薬においては、消化管での易分解性を考慮して、静脈注射や皮下注射による投与方法を用いるケースが多い。そのため、水溶性が低いペプチドは臨床適用が難しくなる。しかし経口投与を選択しても、ペプチドが分解されやすいという問題がある。本発明の水溶性を改善されたペプチドは、上記欠点が解消され、静脈注射や皮下注射の場合に優れた効果を発揮する。さらに、本発明の水溶性を改善されたペプチドは、素材として取り扱いやすいという利点を有している。
【００１６】
好ましい態様において、本発明は、
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｘ４−Ｘ５−Ｐｈｅ        （Ｉ）
（ここで、Ｘ４およびＸ５は同時にＴｙｒでないアミノ酸である）
で表されるアミノ酸配列を有するペプチドに関するものである。すなわち、本発明のペプチドは、上記アミノ酸配列（Ｉ）中のアミノ酸残基Ｘ４、Ｘ５のうち一方または両方がＴｙｒ以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列を有するものである。好ましくは、本発明のペプチドは、上記アミノ酸配列（Ｉ）中のアミノ酸残基Ｘ４、Ｘ５の両方がＴｙｒ以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列を有するものである。Ｔｙｒ以外のアミノ酸Ｘ４、Ｘ５としては、上で列挙したアミノ酸が挙げられるが、好ましくは、親水性アミノ酸であり、さらに好ましくは、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）またはヒスチジン（Ｈｉｓ）などの親水性アミノ酸である。Ｔｙｒ以外のアミノ酸Ｘ４、Ｘ５として好ましいものとして、ペプチドの水溶性を高めるようなアミノ酸誘導体または修飾体であってもよい。Ｘ４、Ｘ５は同じ種類のアミノ酸であってもよく、互いに異なる種類のアミノ酸であってもよい。いずれのアミノ酸配列を有する場合であっても、本発明のペプチドはイミュノグロブリン結合能を有するものであって、かつ配列番号１のアミノ酸配列（ａ）を有するペプチドより高い水溶性を有するものである。
【００１７】
好ましい本発明のペプチドとして、配列番号９〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。これらのペプチドもイミュノグロブリン結合能を有する。
【００１８】
さらに、本発明のペプチドは、アミノ酸配列（Ｉ）中の１つまたは複数（例えば、２、３、４、５または６個）のアミノ酸が対応するＤ−アミノ酸でさらに置換されているアミノ酸配列を有するものであってもよい。本発明の好ましい態様において、式（Ｉ）のアミノ酸配列中の全てのアミノ酸は、対応するＤ−アミノ酸で置換されてもよい。なお、いずれのアミノ酸配列を有する場合であっても、本発明のペプチドはイミュノグロブリン結合能を有するものである。
式（Ｉ）のアミノ酸配列中のアミノ酸を対応するＤ−アミノ酸に置換することによって、本発明のペプチドはタンパク質分解を受けにくくなり、投与した対象の体内において高い安定性および長い半減期を有するようになる。
【００１９】
本発明のペプチドは、上記アミノ酸配列（Ｉ）からなるものであってもよく、あるいは、上記アミノ酸配列（Ｉ）をコア配列として含み、かつ、かかるアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に、あるいはかかるアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸残基に、ペプチドまたはアミノ酸、それらのアナログ、ポリエチレングリコール、糖、多糖、ヌクレオチドなどの種々の物質（これらに限定されない）が結合したものであってもよい。Ｎ／Ｃ末端あるいはいずれかのアミノ酸残基に、アミノ酸またはペプチドを介して、あるいは利用可能な官能基を用いてアミノ酸配列の内部に、蛍光標識、ビオチン、ストレプトアビジン、ジコキシゲニン（ＤＩＧ）、磁気ビーズ、ラテックスビーズ、金コロイドなどの物質（これらに限定されない）が結合していてもよい。例えば、本発明のペプチドに別のペプチドが結合する場合、かかるペプチドは、１個〜５０個、例えば、１〜２０個、１〜１５個または１〜９個のアミノ酸からなるものであってもよい（上記アミノ酸の個数は例示であり、限定するものではない）。また、かかるペプチドが、ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、Ｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグまたはＥタグとしての機能を有するもの（これらに限定されない）であってもよい。
【００２０】
本発明のペプチドはまた、上記したペプチドに加えて、上記ペプチドのアミノ酸配列において、１個または数個、例えば、２、３、４または５個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチド、および上記ペプチドのアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上（例えば、９５、９７、９８または９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列を有するペプチドも包含する。アミノ酸配列の相同性は、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング（株）製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（（株）ジェネティクス製）を用いて測定することができる。あるいは、短鎖ペプチドの場合は単純に配列を比較し、計算することもできる。さらに、これらのアミノ酸のいずれかが適宜修飾されたものであってもよい。いずれのアミノ酸配列を有する場合であっても、本発明のペプチドはイミュノグロブリン結合能を有するものであって、配列番号１のアミノ酸配列（ａ）を有するペプチドより高い水溶性を有するものである。
【００２１】
本発明のペプチドは、当業者に既知の種々の方法により製造および取得することができる。例えば、本発明のペプチドをペプチド固相合成法などに従って化学的に合成してもよく、本発明のペプチドコードするヌクレオチド配列に基づき遺伝子工学的に製造してもよく、あるいはこれらの方法を組み合わせて得てもよい。
【００２２】
本発明は、さらなる態様において、イミュノグロブリン結合能を有する本発明のペプチドをコードする核酸に関するものである。本明細書において核酸とは、１本鎖または２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。本発明の核酸は、当業者に公知の種々の方法により製造および取得され得る。本発明はまた、ある態様において、配列番号９〜１５のアミノ酸配列のいずれかをコードするヌクレオチド配列を有する核酸に関する。本発明において、配列番号９〜１５のアミノ酸配列のいずれかをコードするヌクレオチド配列としては、配列番号１６〜２２のヌクレオチド配列が例示される。そのため、本発明はまた、配列番号１６〜２２のヌクレオチド配列のいずれかを有する核酸に関する。また、配列番号９〜１５のアミノ酸配列のいずれかをコードする上記以外のヌクレオチド配列（例えば、縮重配列）を有する核酸もまた本発明に含まれる。
【００２３】
本発明の核酸はまた、上記核酸以外に、（ａ）上記核酸のヌクレオチド配列において、１または数個、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加されたヌクレオチド配列を有する核酸、（ｂ）上記核酸またはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成し得る核酸、あるいは（ｃ）上記核酸のヌクレオチド配列と５０％以上（例えば、６０、７０、８０、９０、９５、９７、９８または９９％以上）の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸などである。さらに、本発明の核酸は、上記核酸中のヌクレオチドのいずれかが適宜修飾されたものであってもよい。いずれのヌクレオチド配列を有する場合であっても、本発明の核酸は、イミュノグロブリン結合能を有し、配列番号１のアミノ酸配列（ａ）を有するペプチドより高い水溶性を有するペプチドをコードするものである。
【００２４】
上記ストリンジェントな条件としては、例えば、J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されるような条件が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液（Denhardt's solution）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中６８℃でプローブとハイブリッド形成させた後、洗浄条件を２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中室温から０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中６８℃まで変化させる条件、６５℃で、２×ＳＳＰＥ（Frederick M. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", 1987, John Wiley & Sons, Hoboken NJ.に記載）および０．１％  ＳＤＳを含む溶液中で１５分を２回、０．５×ＳＳＰＥおよび０．１％  ＳＤＳを含む溶液中でさらに１５分を２回、次に、０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％  ＳＤＳを含む溶液中で１５分を２回の条件、または６５℃で、２×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳおよびホルムアミド（５〜５０％）を含む溶液中で１５分を２回、０．５×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳおよびホルムアミド（５〜５０％）を含む溶液中でさらに１５分を２回、次に、０．１×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳおよびホルムアミド（５〜５０％）を含む溶液中で１５分を２回の条件などである。
【００２５】
上記ヌクレオチド配列の相同性は、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング（株）製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（（株）ジェネティクス製）を用いて測定することができる。
【００２６】
本発明の核酸は、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するものであればいずれのものであってもよい。また、上記ヌクレオチド配列からなる核酸であってもよく、あるいは上記ヌクレオチド配列をコア配列として含み、かつかかる配列の５’末端および／または３’末端に、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはそれらのアナログなどの種々の物質が結合したものであってもよい。例えば、本発明の核酸にポリヌクレオチドが結合する場合、かかるポリヌクレオチドは、１〜１５０個、例えば、１〜６０個、１〜４５個または１〜１８個のヌクレオチドからなるものであってもよい（上記ヌクレオチドの個数は例示であって限定するものではない）。
【００２７】
本発明は、さらなる態様において、上記核酸を含むベクターに関するものである。本発明のベクターは、上記核酸を含んでいればいずれのものであってもよい。ベクターを導入する宿主の種類、必要とされる産物、使用目的などの種々の条件に応じてベクターを適宜選択あるいは設計し、得ることができる。本発明のベクターは、例えば、配列番号１６〜２２のいずれかで示すヌクレオチド配列の５’末端または３’末端にインフレームで目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を挿入することにより、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドが目的のタンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加された融合タンパク質の発現用ベクターとして用いることもできる。融合タンパク質からの目的のタンパク質の単離を容易にするために、本発明のベクターは、上記ヌクレオチド配列と目的のタンパク質のヌクレオチド配列挿入部の間に、例えば、ＨＲＶ  ３Ｃ、トロンビン、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ、エンテロキナーゼなどのプロテーゼにより認識される配列を含んでいてもよい。本発明のベクターを細胞に導入して、本発明のペプチドや融合蛋白を産生させることができる。
【００２８】
本発明は、別の態様において、本発明のイミュノグロブリン結合能を有するペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加された融合タンパク質に関するものである。本発明の融合タンパク質は、当業者に既知の種々の方法により製造および取得することができる。本発明の融合タンパク質はイミュノグロブリン結合能を有するペプチドを含むので、かかるペプチドをタグ配列として用い、目的のタンパク質を単離および／または精製することなどが可能になる。また、本発明のペプチドはProtein AまたはProtein Gほどイミュノグロブリンとの結合能が高くないので、本発明の融合タンパク質は、例えば、精製用カラムに固定された場合、Protein AまたはProtein Gと比較して、マイルドな条件下でのイミュノグロブリンの精製およびかかるカラムの繰り返し使用（劣化が抑えられる）を可能にし、例えば、イミュノグロブリンの検出用プローブとして用いた場合、リプローブが容易であるなどの利点を有する。
【００２９】
本発明の融合タンパク質に含まれる目的のタンパク質は、いずれのタンパク質であってもよい。本発明の融合タンパク質が、例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、パーオキシデース（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼおよびグリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質などの酵素を目的のタンパク質として含む場合、本発明の融合タンパク質に含まれるイミュノグロブリン結合能を有するペプチドとイミュノグロブリンとの結合を検出することなどが容易になる。本発明の融合タンパク質はまた、例えば、ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、Ｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはＥタグなどのタグ配列、核移行シグナル、シリカ結合タンパク質、Protein Aなどを含んでいてもよい。
【００３０】
本発明の融合タンパク質は、本発明のペプチドと目的のタンパク質との間にプロテアーゼにより認識されるペプチドを含んでいてもよい。かかるペプチドを含むことにより、融合タンパク質から目的のタンパク質を容易に単離することができる。
【００３１】
本発明は、さらなる態様において、上記融合タンパク質をコードする核酸に関するものである。
【００３２】
さらに、本発明は、上記融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターに関するものである。かかるベクターを細胞に導入し、タンパク質を産生させることにより、本発明の融合タンパク質を得てもよい。
【００３３】
本発明は、１つの態様において、上記イミュノグロブリン結合能を有するペプチドをコードする核酸、上記融合タンパク質をコードする核酸、またはそれらの核酸を含むベクターを含む細胞に関するものである。本発明の細胞は、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などの宿主細胞を上記核酸またはベクターを用いて形質転換することにより製造することができる。本発明の細胞を培養し、産生されたイミュノグロブリン結合能を有するペプチド、またはイミュノグロブリン結合能を有するペプチドを含む融合タンパク質を回収することにより、本発明のペプチドまたは融合タンパク質を製造することもできる。
【００３４】
本発明は、さらなる態様において、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドの製造方法であって、
（ａ）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドをコードする核酸を含むベクターを用いて細胞を形質転換する工程、および
（ｂ）該細胞を培養して、ペプチドを産生させる工程
を含む方法に関するものである。細胞の形質転換は、当業者に既知の手段および／または方法により行われ得る。
【００３５】
そのため、本発明は、上記ペプチドの製造方法により得ることのできる、イミュノグロブリン結合能を有し、かつ水溶性が改善されたペプチドに関するものである。
【００３６】
本発明は、別の態様において、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加した融合タンパク質の製造方法であって、
（ａ）イミュノグロブリン結合能を有するペプチドが目的のタンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加した融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターを用いて細胞を形質転換する工程、および
（ｂ）該細胞を培養して、融合タンパク質を産生させる工程
を含む方法に関するものである。本発明の融合タンパク質の製造方法は、融合タンパク質から目的タンパク質を取り出す工程をさらに含んでいてもよい。
【００３７】
そのため、本発明は、上記融合タンパク質の製造方法により得ることのできる、イミュノグロブリン結合能を有し、かつ水溶性が改善されたペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加された融合タンパク質に関するものである。
【００３８】
本発明は、さらなる態様において、イミュノグロブリン結合能を有するペプチド、またはかかるペプチドを含む融合タンパク質を含む、イミュノグロブリンを結合させるための組成物に関するものである。上記ペプチドまたは融合タンパク質以外の成分は、本発明の組成物が用いられる目的など種々の条件に応じて適宜選択され得る。上述の通り、本発明の組成物はイミュノグロブリン結合能を有するペプチドを含むものであるので、本発明の組成物は、例えば、イミュノグロブリンの存在または量を決定するための組成物であってもよく、イミュノグロブリンを単離するための組成物であってもよい。本発明の組成物により、試料中のイミュノグロブリンの量を決定すること、試料からイミュノグロブリンを単離することなどが可能になる。
【００３９】
本発明は、もう１つの態様において、イミュノグロブリン結合能を有するペプチド、またはかかるペプチドを含む融合タンパク質を固定化した、イミュノグロブリンを結合させるための手段に関するものである。本発明の手段は、例えば、プレート、樹脂、カラム、ビーズ、アガロース、セファロースなどの糖を含むレジン、シリカ基板、ガラス（スライドガラスなど）、金属（金など）、アパタイトなどの担体に上記ペプチドまたは融合タンパク質が固定されたものである。固定化は、ペプチド、またはタンパク質のアミノ基もしくはカルボキシル基を介した方法、アミノ酸側鎖のＳＨ基を介した方法、イオン的な結合による方法、疎水的な結合による方法などの当業者に既知の手段・方法により行われ得る。
【００４０】
上述の通り、本発明の手段はイミュノグロブリン結合能を有するペプチドが固定化されたものであるので、本発明の手段は、イミュノグロブリンの存在もしくは量を決定するための手段、およびイミュノグロブリンを単離するための手段を含むものである。本発明の手段を、例えば、ＥＬＩＳＡ用プレート、イミュノグロブリン精製用カラム、検出用ガラスアレイ、マイクロ流路系、ＳＰＲ用センサーチップ、検出用シリカ基板、抗体医薬品精製システムなどとして用いることもできる。
【００４１】
本発明は、さらなる態様において、イミュノグロブリンを結合させる方法であって、
（ａ）イミュノグロブリン結合能を有するペプチド、またはかかるペプチドを含む融合タンパク質を試料に添加する工程、および
（ｂ）ペプチドまたは融合タンパク質とイミュノグロブリンとの結合体を調べる工程
を含む方法に関するものである。試料は、イミュノグロブリンが含まれている可能性があればいずれのものであってもよい。イミュノグロブリンとの結合体の存在および／または量を調べることにより、試料中にイミュノグロブリンが存在するかどうか、さらには、試料中に存在するイミュノグロブリンの量を決定することなどが可能になる。本発明の方法に用いるペプチドまたは融合タンパク質は標識されたものであってもよい。標識としては、ビオチン化、蛍光標識、ＲＩ標識、酵素標識など当業者に既知の種々のものが挙げられる。かかる標識を付すことにより、ペプチドまたは融合タンパク質との結合体を調べることが容易になる。さらに、本発明の方法は、結合体からイミュノグロブリンを単離する工程を含んでいてもよい。
【００４２】
従って、本発明は、イミュノグロブリンを結合させる方法に用いるための、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドまたはかかるペプチドを含む融合タンパク質を含むキットに関するものである。本発明のキットには、上記ペプチドまたは融合タンパク質以外に、例えば、標識、結合体を調べる手段などを含み得る。
【００４３】
本発明は、別の態様において、イミュノグロブリン結合能を有する本発明のペプチド、かかるペプチドを含む融合タンパク質、かかるペプチドまたは融合蛋白をコードする核酸、あるいはかかる核酸を含むベクターを有効成分として含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物に関するものである。Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患とは、かかる結合により直接的または間接的に生じる疾患をいい、例えば、関節リウマチ、関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、血管炎症群、腎炎などの免疫複合体病、その他の炎症性疾患、乾癬症、および悪性腫瘍などが挙げられる。本発明の医薬組成物は、含まれるイミュノグロブリン結合能を有するペプチドがＣ１ｑとイミュノグロブリンとの結合を阻害することにより、上記疾患を治療および予防することができる。
【００４４】
なお、本発明のペプチドは、元々ヒトの体内に存在するＣ１ｑに由来するものであるので、本発明のペプチドをヒトに投与することで生じる副作用は生じないか、あったとしても少ない。さらに、本発明のペプチドは、天然のタンパク質由来のアミノ酸配列を改変することによって水溶性が改善されており、医薬組成物として対象に投与した場合、実質的な投与量が高められる等の利点を有する。また、Ｄ−体アミノ酸を構成成分に含むことでタンパク質分解への抵抗性が高まるので、本発明のペプチドは、投与した対象の体内において高い安定性および長い半減期を有する。
【００４５】
本発明の医薬組成物の有効成分として使用可能な本発明のペプチドは、イミュノグロブリン結合能を有するペプチドであって、
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｘ４−Ｘ５−Ｐｈｅ        （Ｉ）
（ここで、Ｘ４およびＸ５は同時にＴｙｒでないアミノ酸である）
で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである。本発明の医薬組成物の有効成分として好ましい本発明のペプチドの例は、上記アミノ酸配列（Ｉ）においてＸ４、Ｘ５がともに親水性アミノ酸であるものである。かかる親水性アミノ酸としてはＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＳｅｒおよびＴｈｒなどが挙げられる。本発明の医薬組成物の有効成分として、より好ましい本発明のペプチドの例は、配列番号９〜１５のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドである。さらに好ましくは、式（Ｉ）のアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸（Ｇｌｙを除く）、あるいはすべてのアミノ酸（Ｇｌｙを除く）が対応するＤ−アミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００４６】
本発明の医薬組成物の投与方法は、疾患の種類、対象の状態、および／または標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。当該方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経鼻投与、経口投与、経肺投与、座剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の医薬組成物に含まれるペプチドの量、医薬組成物の剤形、投与頻度などは、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択できる。例えば、１回あたりのペプチド投与量を０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇとしてもよいが、本発明のペプチドの投与量はこれらに限定されるものではない。
【００４７】
本発明は、さらなる態様において、有効量のイミュノグロブリン結合能を有するペプチド、かかるペプチドを含む融合タンパク質、かかるペプチドまたは融合蛋白をコードする核酸、あるいはかかる核酸を含むベクターを対象に投与することを含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防方法に関するものである。
【００４８】
本発明は、さらに別の態様において、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防に用いられる、イミュノグロブリン結合能を有するペプチド、かかるペプチドを含む融合タンパク質、かかるペプチドまたは融合蛋白をコードする核酸、あるいはかかる核酸を含むベクターに関するものである。
【００４９】
本発明は、さらなる態様において、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防に用いられる医薬の製造のための、イミュノグロブリン結合能を有するペプチド、かかるペプチドを含む融合タンパク質、かかるペプチドまたは融合蛋白をコードする核酸、あるいはかかる核酸を含むベクターの使用を提供する。
【００５０】
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００５１】
ペプチドの水溶性の検討
本発明者は、Ｃ１ｑ由来のアミノ酸配列を有するペプチドについて検討し、配列番号１で示すアミノ酸配列（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ）を有するペプチドまたはその修飾物が、関節リウマチ、および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糸球体腎炎、血管炎、関節炎などの免疫複合体病などの、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患において治療および予防効果を示すことを見出したが（国際公開第２００９／０２５３００号パンフレットおよび国際公開第２０１０／０８４８５１号パンフレットを参照のこと）、上記ペプチドの水溶性をさらに高めるために、以下の検討を行った。【００５２】
（１）変異導入部位の検討
イミュノグロブリン結合能を有するペプチドを有し、種々の治療および予防効果を示す、配列番号１で示すアミノ酸配列を有するペプチドについて、上記結合能に関与せず、変異を導入し得る部位をアラニンスクリーニングにより探索した。【００５３】
表１に示すアミノ酸配列を有するペプチドをＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ社（上海）に委託して作製した。【００５４】
【表１】
2012043397.tif 000002
【００５５】
ヒトＣ１ｑタンパク質（Ｃａｒｂｉｏｃｈｅｍ社製）を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０％  グリセロール（ｐＨ７．２）に溶解し、２００μｇ／ｍｌ  ヒトＣ１ｑタンパク質溶液を調製した。ヒトＣ１ｑタンパク質溶液を５ｍｍ×１５ｍｍの大きさのニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｃ；アマシャム社製）に２μｌ（４００ｎｇ）ずつスポットし、室温にて約１時間風乾した。ニトロセルロース膜をＴＢＳに浸し、５分間インキュベートし、５％ブロッキング剤（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を含むＴＢＳ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて室温にて１時間ブロッキングを行った。ＴＢＳにて軽く洗浄した後、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヒトイミュノグロブリン（ＩｇＧ）（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）をＴＢＳにて１０００倍希釈し、各ペプチドの濃度が５００μｇ／ｍｌとなるように混合した溶液２０μｌに浸し、室温で１時間反応させた。ＴＴＢＳ溶液（ＴＢＳに最終濃度０．０５％で  Ｔｗｅｅｎ  ２０を加えたもの）にて軽く洗浄した後、同液にて１０分間、３回振盪しながら洗浄した。【００５６】
ＡＬＰ標識イミュノグロブリン（ＩｇＧ）を用いて、ヒトＣ１ｑタンパク質とＩｇＧとの結合体を検出した。ニトロセルロース膜をＡＬＰ発色バッファー（１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２入りＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．５）で軽く洗浄後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液（プロメガ社製）を含むＡＬＰ発色バッファー３０μｌに浸し、室温で１０分間発色させた。染色像が得られたところでニトロセルロース膜を十分量の蒸留水に浸し、発色バッファーを洗い流した。洗浄後、ニトロセルロース膜を風乾してＭｕｌｔｉ  Ｇａｕｇｅ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）を用いて染色像の取り込みを行った。【００５７】
結果を図１に示す。配列番号１で示すアミノ酸配列において、３〜５番目のアミノ酸をアラニンに置換したペプチドにおいて、イミュノグロブリン結合能は保持されていた。特に、４番目または５番目のアミノ酸を元のアミノ酸と異なる種類のものに置換しても、イミュノグロブリン結合能にはほとんど影響がないことが示された。【００５８】
（２）ペプチドへの親水性アミノ酸導入の検討
（１）で変異を導入し得ることが確認された４番目および５番目のアミノ酸を種々の親水性アミノ酸に置換したペプチドの水溶性を検討した。表２に示すアミノ酸をＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ社（上海）に委託して作製した。表２に記載のペプチドのうち、ＳＰ１〜７は４番目および５番目のアミノ酸を種々の親水性アミノ酸に置換したペプチドである。【００５９】
【表２】
2012043397.tif 000003
【００６０】
結果を表３に示す。表３において、１０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度でも溶媒（ＰＢＳまたは生理食塩水）に溶けたペプチドには○を付し、１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶媒に溶けなかったペプチドに×を付している。配列番号１で示すアミノ酸配列において、元の配列を有するペプチド（Ｒ１）では１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶媒に溶けなかったが、Ｎ末端から４番目および５番目のアミノ酸を親水性アミノ酸に置換したペプチドでは１０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度でも十分溶媒に溶けた。以降の実験では、４番目および５番目のアミノ酸を親水性アミノ酸に置換したペプチドを用いた。【００６１】
一般に、ペプチド医薬においては、消化管での易分解性を考慮して、静脈注射や皮下注射による投与方法を用いるケースが多い。そのため、水溶性が低いペプチドは臨床適用が難しくなる。経口投与を選択しても、ペプチドが分解されやすいという問題がある。一方、本発明のペプチドは水溶性が高いので、高用量で静脈注射や皮下注射を行うことができる。さらに本発明のペプチドは水溶性が高いので、素材として取り扱いやすいという利点も有している。【００６２】
【表３】
2012043397.tif 000004
【実施例２】
【００６３】
水溶性を付与したペプチドのイミュノグロブリン結合能の確認
実施例１（２）で得られたペプチドについて、イミュノグロブリン結合能の確認を行った。【００６４】
ＳＰ１〜７のペプチドをそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌとなるようにＤＭＳＯに溶解した。また、国際公開第２００９／０２５３００号および国際公開第２０１０／０８４８５１号にてイミュノグロブリン結合能が確認されているＳＴＧＫＦＴＣＫＶＰＧＬＹＹＦのアミノ酸配列を有するペプチド（Ｒ８）、ｄＰＧｄＬｄＹｄＹｄＦおよびｄＳｄＫｄＶｄＰＧｄＬｄＹｄＹｄＦのアミノ酸配列（配列中、「ｄＬ」、「ｄＰ」、「ｄＡ」、「ｄＹ」、「ｄＦ」、「ｄＳ」、「ｄＫ」、「ｄＶ」および「ｄＴ」は、それぞれロイシン、プロリン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン、セリン、リシン、バリンおよびトレオニンのＤ体をそれぞれ意味する）を有するペプチド（それぞれＲ９および１０）についても同様に溶液を調製し、以下の実験に供した。【００６５】
ヒトＣ１ｑタンパク質（Ｃａｒｂｉｏｃｈｅｍ社製）を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０％  グリセロール（ｐＨ７．２）に溶解し、２００μｇ／ｍｌ  ヒトＣ１ｑタンパク質溶液を調製した。ヒトＣ１ｑタンパク質溶液を５ｍｍ×１５ｍｍの大きさのニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｃ；アマシャム社製）に２μｌ（４００ｎｇ）ずつスポットし、室温にて約１時間風乾した。ニトロセルロース膜をＴＢＳに浸し、５分間インキュベートし、５％ブロッキング剤（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を含むＴＢＳ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて室温にて１時間ブロッキングを行った。ＴＢＳにて軽く洗浄した後、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヒトイミュノグロブリン（ＩｇＧ）（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）をＴＢＳにて１０００倍希釈し、各ペプチドの濃度が５００μｇ／ｍｌとなるように混合した溶液２０μｌに浸し、室温で１時間反応させた。ＴＴＢＳ溶液（ＴＢＳに最終濃度０．０５％で  Ｔｗｅｅｎ  ２０を加えたもの）にて軽く洗浄した後、同液にて１０分間、３回振盪しながら洗浄した。【００６６】
ＡＬＰ標識イミュノグロブリン（ＩｇＧ）を用いて、ヒトＣ１ｑタンパク質とＩｇＧとの結合体を検出した。ニトロセルロース膜をＡＬＰ発色バッファー（１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２入りＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．５）で軽く洗浄後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液（プロメガ社製）を含むＡＬＰ発色バッファー３０μｌに浸し、室温で１０分間発色させた。染色像が得られたところでニトロセルロース膜を十分量の蒸留水に浸し、発色バッファーを洗い流した。洗浄後、ニトロセルロース膜を風乾してＭｕｌｔｉ  Ｇａｕｇｅ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）を用いて染色像の取り込みを行い、数値化した。【００６７】
結果を図２に示す。図中、ＮＣはペプチドを含まないＤＭＳＯを、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヒトイミュノグロブリン（ＩｇＧ）を含まない反応液に添加したサンプルの結果であって、ＰＣはペプチドを含まないＤＭＳＯを、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヒトイミュノグロブリン（ＩｇＧ）を含む反応液に添加したサンプルの結果を示す。配列番号１で示すアミノ酸配列において、４番目および５番目のアミノ酸を親水性アミノ酸に置換したアミノ酸配列を有する各ペプチドは、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合を阻害した。
【実施例３】
【００６８】
ＴＮＦ−α刺激により誘導される炎症関連蛋白の産生に対する本発明のペプチドの抑制効果
ヒトＲＡ患者から採取した滑膜細胞をＴＮＦ−αにより刺激することで産生されるサイトカインや細胞外プロテアーゼなどの炎症関連蛋白が、本発明のペプチドを添加することにより減少するかどうか、リアルタイムＰＣＲ法を用いて検討した。【００６９】
１０％  ＦＢＳ、１％  Ｌ−Ｇｌｕおよび１％  Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）を用いて、滑膜細胞（Passage 3-5）を１０ｃｍ径の培養ディッシュで８０〜９０％のコンフルエントになるまで培養した。培養した細胞を２４ウェルプレートに５×１０５細胞／ウェルの割合で播種し、２４時間インキュベーションした。１０μｇ／ｍｌのｒｈＴＮＦ−α（R&D Recombinant Human TNF-α/TNFSF1A  #210-TA）を１０倍希釈したものを１０μｌ／ウェルで添加し、滑膜細胞を刺激した。それぞれのペプチド添加量が１、１０または１００μｇとなるように、生理食塩水（大塚製薬社製）で各濃度に調製した本発明のペプチド溶液を１０μｌ／ウェルで添加し、２４時間インキュベーションした。培地を除去し、ＰＢＳ（−）で洗浄した。ＴＲＩｚｏｌ（invitrogen TRIzol Reagent #15596-018）を１ｍｌ／ウェルで添加し、セルスクレーパーで細胞を掻き取り、１．５ｍｌエッペンチューブに回収した。ＲＮＡを抽出した後で、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Applide Biosystems)を用いてｃＤＮＡを調製し、リアルタイムＰＣＲ（ABI PRISM 7900HT）で各遺伝子の発現量を半定量化し評価した。【００７０】
結果を図３に示す。ＳＰ３およびＳＰ４などの本発明のペプチドは、ＴＮＦ−αで刺激することにより誘導されるＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−３などの各種炎症関連蛋白の産生を抑制することが示された。
【実施例４】
【００７１】
モノクローナル抗体カクテル関節炎マウスモデルにおける本発明のペプチドの関節炎抑制作用
１．材料および方法
１−１  マウス（ＢＡＬＢ／ｃ  Ｃｒ  Ｓｌｃ  （ＳＰＦ））を用い、モノクローナル抗体カクテル誘発関節炎に対する発明のペプチドの関節炎抑制作用を検討した。通常飼料を与えて６日間馴化してから試験に使用した。【００７２】
１−２  試験に用いたペプチドのアミノ酸配列
・ペプチドＲ１：  ＰＧＬＹＹＦ  （被験物質ａ）
・ペプチドＲ９：  ｄＰＧｄＬｄＹｄＹｄＦ  （被験物質α）
・ペプチドＳＰ４：  ＰＧＬＥＫＦ  （被験物質ＶＩＩ−１）
・Ｄ−アミノ酸（グリシン以外）で構成されたペプチドＳＰ４：
ｄＰＧｄＬｄＥｄＫｄＦ（被験物質ＶＩＩ−２）【００７３】
１−３  実験概略
関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル２ｍｇ／個体を静脈内投与し、その３日後にリポ多糖（ＬＰＳ）を５０μｇ／個体で腹腔内投与し、関節炎を惹起した。ペプチドＲ１およびＲ９を、ＬＰＳ投与翌日（４日目）より１４日目まで、１日１回、１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与、およびペプチドＳＰ４およびＤ−アミノ酸（グリシン以外）で構成されたペプチドＳＰ４を、ＬＰＳ投与翌日（４日目）より１４日目まで、１日１回、１０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。陽性対照薬のメトトレキセート（ＭＴＸ）を、４日目より１日１回、０．１５ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。コントロール群には生理食塩水を、４日目より１日１回、１０ｍＬ／ｋｇ投与した。０日目より１４日目までの偶数日に四肢の臨床スコアを観察し、後肢容積を測定した。【００７４】
また、以下のようにして関節組織標本作製および軟Ｘ線写真撮影を行った。麻酔下にてヘパリン含有生理食塩液で脱血を行い、氷冷４％パラホルムアルデヒド液を持続注入して全身灌流固定した。灌流固定後、両後肢の膝関節（大腿骨中心部および脛骨中心部を切断し、皮膚および筋肉を除去）および踵関節（脛骨中心部から指先まで）を摘出し、さらに４％パラホルムアルデヒド液で一晩浸漬固定（４℃）した。その後、両膝および両踵関節を５０ｍＭ  ＰＢＳ（４℃）に移した後、踵関節の軟Ｘ線写真撮影を２方向（内側面方向および上面方向）から行った。【００７５】
１−４  ペプチド溶液の調製
ペプチドＲ１およびＲ９を秤量してメノウ乳鉢に入れ、乳棒で粉砕した後に生理食塩液を徐々に加えて懸濁し、１ ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、使用するまで調製物を冷蔵保存した。またペプチドＳＰ４およびＤ−アミノ酸（グリシン以外）で構成されたペプチドＳＰ４は生理食塩液を１．０ｍｌ添加し溶解させ、１０ｍｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、使用するまで調製物を冷蔵保存した。【００７６】
１−５  メトトレキセート溶液の調製
メトトレキセートを、１ｍｇ秤量し、０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液１ｍｌを加え溶解した。作製した１ｍｇ／ｍｌ液を０．１５ｍｌ分取し、これに生理食塩液を９．８５ｍｌ加え、０．０１５ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。使用するまで調製物を冷蔵保存した。【００７７】
１−６  体重測定、一般症状観察および群分け
動物の体重測定は、試験期間中、関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル投与日を０日目とし、０、３、６、９、１２および１４日目に測定した。一般状態観察は、毎日実施した。【００７８】
１−７  関節炎モデルの作製
０日目に７週齢のマウス４０匹に関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル２ｍｇ／個体を静脈内投与し、３日目にＬＰＳを５０μｇ／個体で腹腔内投与した。【００７９】
１−８  ペプチド溶液の投与
ペプチド溶液は、４日目より１日１回１０ｍｇ／ｋｇあるいは１００ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した。対照として、４日目より生理食塩液を１日１回腹腔内投与した。投与量は、１０ｍｌ／ｋｇとした。メトトレキセートは、４日目より１日１回０．１５ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した。投与量は、１０ｍｌ／ｋｇとした。投与には注射針（２６Ｇ；テルモ）および注射筒（１．０ｍｌ容量；テルモ）を用いた。【００８０】
１−９  臨床スコア観察
臨床スコアの観察は、０日目より１４日目までの偶数日に以下に従って観察した。四肢の合計で最大１２スコアとした。足の腫れを肉眼で観察した。
＜臨床スコア＞
０：  正常な関節
１：  わずかな炎症および赤み
２：  手足全体に及び、手足の使用を妨げる重篤な紅斑および腫れ
３：  強直、関節硬直、機能喪失を伴う、手足または関節の変形【００８１】
１−１０  試験群
試験群は以下のとおりであった。
【表４】
2012043397.tif 000005
【００８２】
１−１１  統計学的解析処理方法
試験成績は平均値±標準誤差で表示し、EXSAS（Version7.1.6，株式会社  アームシステックス）を用いて解析を行った。臨床スコアはWilcoxon検定を行った。体重および足容積などの定量的データは、Bartlett検定を行い、分散が均一であればDunnettの多重比較検定を行い、分散が不均一であればSteelの多重比較検定を行った。有意水準は両側５％とした。【００８３】
２．結果
２−１  動物の体重変化および一般的状態
コントロール群の体重は、０日目で２２．５±０．２  ｇであり、ＬＰＳ投与後の６日目で１８．１±０．２ｇと低下した。９日目で１９．６±０．３ｇ、１２日目で２１．１±０．４ｇ、１４日目で２２．２±０．４ｇと徐々に体重が回復した。他の被験物質投与群の体重もコントロール群と同様に推移し、有意差は認められなかった。また、試験期間中すべての動物について副作用と思われる症状は認められなかった。【００８４】
２−２  臨床スコア
結果を図４〜７に示す。
コントロール群の臨床スコアは、０日目で０．０±０．０、２日目で０．６±０．２であり、ＬＰＳ投与後である４日目で３．０±０．３、６日目で６．６±０．７、８日目で６．８±０．６、１０日目で８．４±０．５、１２日目で１１．０±０．３、１４日目で１１．２±０．４と経時的に増加した。１４日目のスコアは、前肢および後肢のスコアが５例とも２ないし３であり、総スコアは１０〜１２であった（図４〜図７）。【００８５】
被験物質ａ  １０ｍｇ／ｋｇ投与群の臨床スコアは、最大値の１４日目で９．６±０．８とコントロール群と比較して低値で推移し、スコア０を認めた例数が２例であり、総スコアは７〜１２であった（図４）。【００８６】
被験物質α  １０ｍｇ／ｋｇ投与群の臨床スコアは、１２日目で７．０±０．７、１４日目で７．４±０．９であり、コントロール群と比較して有意な低値を示した。１４日目では、スコア０を認めた例数が３例であり、総スコアは５〜１０であった（図５）。【００８７】
被験物質VII−１  １０ｍｇ／ｋｇ投与群の臨床スコアは、１２日目で７．２±１．０、１４日目で７．４±１．１であり、コントロール群と比較して有意な低値を示した。１４日目では、スコア０を認めた例数が３例であり、総スコアは５〜１０であった（図６）。【００８８】
被験物質VII−１  １００ｍｇ／ｋｇ投与群の臨床スコアは、１２日目で７．２±０．９、１４日目で８．０±０．９であり、コントロール群と比較して有意な低値を示した。１４日目では、スコア０を認めた例数が２例であり、総スコアは５〜１０であった（図６）。【００８９】
被験物質VII−２  １０ｍｇ／ｋｇ投与群の臨床スコアは、１０日目で５．０±０．８、１２日目で５．８±０．９、１４日目で６．０±１．０であり、コントロール群と比較して有意な低値を示した。１４日目では、スコア０を認めた例数が４例であり、総スコアは４〜１０であった（図７）。【００９０】
被験物質VII−２  １００ｍｇ／ｋｇ投与群の臨床スコアは、１０日目で５．８±０．５、１２日目で６．８±０．７、１４日目で７．２±０．８であり、コントロール群と比較して有意な低値を示した。１４日目では、スコア０を認めた例数が４例であり、総スコアは４〜８であった（図７）。【００９１】
ＭＴＸ  ０．１５ｍｇ／ｋｇ投与群の臨床スコアは、１２日目で８．２±０．９、１４日目で８．６±０．９であり、コントロール群と比較して有意な低値を示した。１４日目では、スコア０を認めた例数が１例であり、総スコアは６〜１１であった（図４〜図７）。【００９２】
２−３  後肢容積
結果を図８〜１１、図１２〜１５に示す。
コントロール群の後肢容積は、０日目０．２１２ｃｍ３であり、ＬＰＳ投与後である４日目よりも６日目で後肢容積は著しい増加を示した。後肢容積は４日目で０．２８７ｃｍ３、６日目で０．４１９ｃｍ３、８日目で０．４６０ｃｍ３と最大値に達し、その後低下し、１４日目では０．３３１ｃｍ３であった（図８〜図１１）。０日目の容積を１００％とした時の増加率は、４日目で１３６．０％、６日目で１９８．３％、８日目で２１７．８％と最大の増加率を示し、１４日目では１５６．８％に低下した（図１２〜図１５）。【００９３】
被験物質ａ  １０ｍｇ／ｋｇ投与群の後肢容積は、０日目で０．２１３ｃｍ３であり、６日目で０．４０３ｃｍ３（増加率１９０．２％）、８日目で０．４５２ｃｍ３（増加率２１３．２％）と最大値に達し、その後徐々に低下し、１４日目では０．３４３ｃｍ３（増加率１６１．８％）であり、コントロール群と比較して有意差は認められなかった（図８、図１２）。【００９４】
被験物質α  １０ｍｇ／ｋｇ投与群の後肢容積は、０日目で０．２１２ｃｍ３であり、６日目で０．３６７ｃｍ３（増加率１７３．７％）、８日目で０．４５５ｃｍ３（増加率２１５．１％）と最大値に達し、その後徐々に低下し、１４日目では０．３２８ｃｍ３（増加率１５５．１％）であった。コントロール群と比較して６日目の容積で有意な低下が認められた（図９、図１３）。【００９５】
被験物質VII−１  １０ｍｇ／ｋｇ投与群の後肢容積は、０日目で０．２２３ｃｍ３であり、６日目で０．３６８ｃｍ３（増加率１６５．２％）、８日目で０．４３８ｃｍ３（増加率１９６．６％）と最大値に達し、その後徐々に低下し、１４日目では０．３３２ｃｍ３（増加率１４９．１％）であった。コントロール群と比較して６日目の容積および増加率で有意な低下が認められた（図１０、図１４）。【００９６】
被験物質VII−１  １００ｍｇ／ｋｇ投与群の後肢容積は、０日目で０．２１９ｃｍ３であり、６日目で０．３６２ｃｍ３（増加率１６５．５％）、８日目で０．４１８ｃｍ３（増加率１９１．４％）と最大値に達し、その後徐々に低下し、１４日目では０．３２９ｃｍ３（増加率１５０．３％）であった。コントロール群と比較して６日目の容積および増加率で有意な低下が認められた（図１０、図１４）。【００９７】
被験物質VII−２  １０ｍｇ／ｋｇ投与群の後肢容積は、０日目で０．２１１ｃｍ３であり、６日目で０．３６３ｃｍ３（増加率１７２．０％）、８日目で０．４２９ｃｍ３（増加率２０４．０％）と最大値に達し、その後徐々に低下し、１４日目では０．３４０ｃｍ３（増加率１６１．８％）であった。コントロール群と比較して６日目の容積の有意な低下と増加率で低下傾向（Ｐ＝０．０７５３）が認められた（図１１、図１５）。【００９８】
被験物質VII−２  １００ｍｇ／ｋｇ投与群の後肢容積は、０日目で０．２２３ｃｍ３であり、６日目で０．３７３ｃｍ３（増加率１６７．４％）、８日目で０．４２０ｃｍ３（増加率１８８．５％）と最大値に達し、その後徐々に低下し、１４日目では０．３５６ｃｍ３（増加率１５９．６％）であった。コントロール群と比較して６日目の容積の低下傾向（Ｐ＝０．０８７６）と有意な増加率の低下が認められた（図１１、図１５）。【００９９】
ＭＴＸ  ０．１５ｍｇ／ｋｇ投与群の後肢容積は、０日目で０．２１６ｃｍ３であり、６日目で０．３８１ｃｍ３（増加率１７６．２％）、８日目で０．４４１ｃｍ３（増加率２０４．２％）と最大値に達し、その後徐々に低下し、１４日目では０．３５６ｃｍ３（増加率１６５．４％）であった。コントロール群と比較して有意差は認められなかった（図８〜図１１、図１２〜図１５）。【０１００】
３．考察
コントロール群の後肢容積は、２日目より増加し始め、８日目（ＬＰＳ投与５日後）に最大値に達し、その後徐々に低下した。コントロール群の後肢容積の著しい増加は４日目から６日目で認められた。コントロール群と比較して、６日目で被験物質α  １０ｍｇ／ｋｇ投与群、被験物質VII−１  １０ｍｇ／ｋｇ投与群および１００ｍｇ／ｋｇ投与群、VII−２  １０ｍｇ／ｋｇ投与群および１００ｍｇ／ｋｇ投与群に後肢容積および増加率で有意な低下作用が認められた。これらの結果は、最も浮腫が増悪する時にこれらの被験物質が抑制的に効果を発揮したことを示す。また、容積が最大値に達した８日目において、コントロール群との容積率の差は、陽性対照群のＭＴＸ投与群で−１３．６％、被験物質VII−１  １０ｍｇ／ｋｇ投与群および１００ｍｇ／ｋｇ投与群でそれぞれ−２１．２％および−２６．４％、被験物質VII−２  １０ｍｇ／ｋｇ投与群および１００ｍｇ／ｋｇ投与群でそれぞれ−１３．８％および−２９．３％であり、コントロール群と比較して有意差は認められなかったものの浮腫に対する抑制効果が認められた。【０１０１】
コントロール群の臨床スコアは、２日目より悪化し始め、４日目から６日目の浮腫を伴うスコアの増加、その後８日目から１４日目までの関節の硬化に伴う２相性のスコアの増加が認められた。４日目から６日目までの１相目ではスコアの有意差は認められなかったが、被験物質α  １０ｍｇ／ｋｇ投与群、被験物質VII−２  １０ｍｇ／ｋｇ投与群および１００ｍｇ／ｋｇ投与群でコントロール群と比較してスコアの低下が認められた。８日目から１４日目までの２相目では、被験物質α  １０ｍｇ／ｋｇ投与群、被験物質VII−１  １０ｍｇ／ｋｇ投与群、１００ｍｇ／ｋｇ投与群および陽性対照群のＭＴＸ投与群で１２日目および１４日目で有意なスコアの改善効果が認められた。被験物質VII−２  １０ｍｇ／ｋｇ投与群および１００ｍｇ／ｋｇ投与群では、１０日目、１２日目および１４日目で有意なスコアの改善効果が認められた。コントロール群の１４日目のスコアは、前肢および後肢のスコアが５例とも２ないし３であり、総スコアは１０〜１２であったのに対し、被験物質VII−２  １０ｍｇ／ｋｇ投与群および１００ｍｇ／ｋｇ投与群ではスコア０を認めた例数がそれぞれ４例であり、総スコアはそれぞれ４〜１０および４〜８であった。【０１０２】
以上の結果より、この動物モデルにおける被験物質の関節炎抑制効果は、VII−２≧VII−１≧α＞ａの順であった。また、これらの被験物質の関節炎抑制効果はメトトレキセートと同程度かそれよりも大きく、特にVII−２およびVII−１の関節炎抑制効果が大きかった。この理由としては、被験物質VII−２およびVII−１の水溶性が高いことが関連していると考えられた。【０１０３】
これらの結果から、本発明のペプチドは、臨床において既に用いられている医薬品（メトトレキセート）より優れた関節炎抑制作用を有しており、関節炎および関連する疾患の処置および予防に有用であることが明らかになった。なお、メトトレキセートは微量の使用であっても重大な副作用をもたらすことが知られている。一方で、本発明のペプチドは天然由来のものであり、上記試験において副作用は一切認められなかった。従って、本発明のペプチドは、安全性の面からも従来用いられている医薬と比べて有利であるといえる。
【実施例５】
【０１０４】
アジュバント関節炎ラットモデルにおける本発明のペプチドの関節炎抑制作用
モノクローナル抗体カクテル関節炎マウスモデルにおいて本発明のペプチドが良好な炎症抑制効果を示したので、アジュバント関節炎ラットモデルにおける本発明のペプチドの炎症抑制効果についても調べた。アジュバント関節炎モデルは、全身性の炎症を評価するモデルであり、ヒト関節リウウマチの病態に最も近いモデルであるといわれている。【０１０５】
１．材料および方法
１−１  ラット
オスのＬｅｗｉｓ／ＣｒｌＣｒｌｊ  （ＳＰＦ）を用い、アジュバント誘発関節炎に対する発明のペプチドの関節炎抑制作用を検討した。ラット４５匹を日本チャールス・リバー株式会社から購入し、通常飼料を与えて７日間馴化してから使用した（使用開始時の体重範囲は１９３．３ｇ〜２１８．３ｇ）。【０１０６】
１−２  被験物質
試験に用いたペプチドのアミノ酸配列は以下のものであった。
・Ｄ−アミノ酸（グリシン以外）で構成されたペプチドＳＰ４：
ｄＰＧｄＬｄＥｄＫｄＦ（被験物質ＶＩＩ−２）【０１０７】
１−３  アジュバント関節炎モデルの作成
メノウ乳鉢上において結核死菌（Mycobacterium butyricum; Lot No. 0260570, Difco）を微粉化後、流動パラフィンを少量ずつ加えて馴染ませながら１．０ｍｇ／ｍＬとなるよう乳化させた。得られた乳化液はNK MICRONIZER（日本精機）を用いて確実に微細に乳化できたことを確認後に使用した。
ラットの右の後肢を露出させ、右後肢足蹠皮内に２５Ｇ注射針付きシリンジを用いて上記乳化液１００μＬを注射（１回）して関節炎を惹起した（惹起０日）。陰性対照群には流動パラフィンを同様に接種した。【０１０８】
１−４  試験群および投与方法
被験物質の調製および試験群は表５に説明するとおりであった。各群５匹とした。
【表５】
2012043397.tif 000006
動物は各群５匹とし、投与液量はすべて５ｍｌ／ｋｇで投与した。【０１０９】
メトトレキセート前投与群を除き、アジュバント投与後１０日目（惹起１０日）から２１日目（惹起２１日）まで毎日、被験物質を投与した（１１回）。メトトレキセート前投与群には惹起前にメトトレキセートを予防的に１回投与し、惹起日から毎日、メトトレキセートを投与した（２１回）。
試験日数の表示方法はアジュバント接種日（惹起０日）を起算日とした。【０１１０】
１−５  観察および測定方法
（ｉ）体重測定
惹起０、３、７、１０、１４、１７、２１日の午前中に全生存例について体重測定した。
（ｉｉ）関節炎スコアの測定
後肢のみを対象に、以下に示す基準に従って評価した。
指関節の腫脹について
０点：腫脹なし
１点：２指以下の腫脹
２点：３指の腫脹
３点：４指の腫脹
４点：全指の腫脹
後肢の甲の腫脹について
０点：腫脹なし
１点：軽度の腫脹
２点：中程度の腫脹
３点：やや重度の腫脹
４点：重度の腫脹
発赤の程度
０点：発赤なし
１点：軽度の発赤
２点：中程度の発赤
３点：やや重度の発赤
４点：重度の発赤
（ｉｉｉ）左右後肢の足容積の測定
プレシスモメーター（UNICOM TK105）を用いて測定した。足容積の増加率（足蹠腫脹率 ,paw swelling %）は以下の計算式により算出した。
足蹠腫脹率（％）＝［（Ｖｔ−Ｖｏ）／Ｖｏ］ｘ１００
Ｖｔ：アジュバント接種後の足容積（ｍＬ）
Ｖｏ：アジュバント接種前の足容積（ｍＬ）（惹起０日に測定）
なお、本試験では、被験物質により治療的効果を評価するために、惹起１０日に対する浮腫の変化率も計算した。
（ｉｖ）血漿中のＴＮＦ−αならびにＩＬ−１βの測定
ＴＮＦ−α  ＥＬＩＳＡキット（レビス（登録商標）ＴＮＦ−α−ラット）ならびにＩＬ−１β  ＥＬＩＳＡキット（Quantikine（登録商標）Rat IL-1β/IL-1F2）を用いてダブルポイント法にて測定した。【０１１１】
１−６  統計学的解析
統計学的解析
データは平均±標準偏差で示し、陰性対照群と陽性対照群との検定では分散に一様性が認められなかったため、Aspin-Welchのｔ−検定による有意差検定を行った。陽性対象群に対する各投与群の有意差検定には分散に一様性が認められなかったため、ノンパラメトリック手法を用いてKruskal-Wallis検定後のDunnett型多重比較検定で評価した。ｐ＜０．０５を有意差ありとした。【０１１２】
２．結果
２−１  動物の体重および状態
陰性対照群に比べて各惹起群で若干の体重の増加抑制が見られたが、どの群も有意な抑制ではなかった。試験期間中に死亡、異常および副作用と見られる症状を呈した動物はなかった。【０１１３】
２−２  足容積増加率（表６ａ、６ｂ、７ａ、７ｂ）
陰性対照群では左右後肢とも成長に伴う自然な足容積の増加が認められ、惹起２１日での足容積増加率は左後肢で９．２０％、右後肢で７．６５％となった。関節炎対照群では、左右後肢ともアジュバントによる惹起による経日的で、顕著な足容積の増加が認められ、ともに惹起３日以降、対照群と比較して有意であり、惹起２１日での足容積増加率は左後肢で２２．０３％、右後肢で５３．０４％となった。【０１１４】
メトトレキセート前投与群では、左後肢で惹起１４日までは陰性対照群と同様の推移を示し、惹起１４日のみ有意な増加抑制効果がみとめられたが、惹起１７および２１日では足容積が急に増加し、後者での足容積増加率は１２．４７％と陰性対照群との差が開いた。また、右後肢の増加率においては経日的な増加が認められたが、その増加率は関節炎対照群のそれの最大でも７割以下であり、惹起１４日においては有意な増加抑制効果が確認された。【０１１５】
惹起１０日から投与を開始したメトトレキセート投与群では、惹起１０日に対する左後肢の足容積増加率が惹起１４日では全く増加しなかったが、惹起１７日では増加に転じ、惹起２１日では関節炎対照群のそれと同等となった。右後肢では惹起１０から２１日の期間において惹起１４日では有意な低下を示したが、その他の日では惹起１０日に対する足容積増加率には大きな変化は認められなかった。【０１１６】
レフルミド群では惹起１０日に対する左右後肢の足容積増加率には大きな変化は認められなかったが、惹起２１日では惹起１０日に対してともに負の値となった。【０１１７】
被験物質VII−２の１０ｍｇ／ｋｇ群においては、両後肢で惹起１４日から顕著かつ有意な足容積増加抑制が認められ、惹起１０日に対する左後肢の足容積増加率は惹起１４日、１７日、２１日ではそれぞれ、マイナス４．０％、マイナス７．２％ならびにマイナス６．８％となり、右後肢の惹起１０日に対する足容積増加率は惹起１４日、１７日、２１日ではそれぞれ、マイナス６．４％、マイナス９．９％ならびにマイナス９．７％となった。【０１１８】
被験物質VII−２の１００ｍｇ／ｋｇ群は、その１０ｍｇ／ｋｇ群と、両後肢でほぼ同様の推移を示したが、惹起１４日から顕著かつ有意な足容積増加抑制が認められ、惹起１０日に対する左後肢の足容積増加率は惹起１４日、１７日、２１日ではそれぞれ、マイナス５．０％、マイナス７．０％ならびにマイナス７．０％となり、右後肢の惹起１０日に対する足容積増加率は惹起１４日、１７日、２１日ではそれぞれ、マイナス６．６％、マイナス６．３％ならびにマイナス４．８％と、惹起１４日でのみ有意となった。
【表６】
2012043397.tif 000007
【表７】
2012043397.tif 000008
【０１１９】
２−３  指関節の腫脹のスコア（表８ａ、８ｂ）
陰性対照群では左右後肢とも異常は認められなかった。関節炎対照群では、左右後肢とも惹起７日からスコア変化が認められ、左後肢では惹起７日と惹起１４から２１日までに陰性対照群と比較して有意で経日的なスコア上昇が認められた。右後肢では惹起１４および１７日に有意なスコア上昇が認められた。【０１２０】
メトトレキセート前投与群では、左右後肢ともに関節炎対照群より小さなスコアを示したが、有意となる観察時点は無かった。【０１２１】
惹起１０日から投与を開始したメトトレキセート投与群では、左右後肢ともに関節炎対照群より小さなスコアを示したが、有意となる観察時点は無く、メトトレキセート前投与群より低いスコアが確認できたのは左右後肢の惹起１７日だけであった。【０１２２】
レフルミド群では惹起１０日の投与前に認められた左および右後肢でのスコア１．４ならびに１．６を経日的に低下させ、惹起２１日でのスコアは前者で０．４、後者で０．６となった。【０１２３】
被験物質VII−２の１０ｍｇ／ｋｇ群においても、惹起１０日の左および右後肢でのスコア０．８ならびに１．０を経日的に低下させ、左後肢では惹起１７日以降のスコアは０と有意な指関節の腫脹減退作用を示した。右後肢においては、惹起２１日でのスコアは０．２と指関節の腫脹を減退させた。【０１２４】
被験物質VII−２の１００ｍｇ／ｋｇ群においては惹起１０日の左および右後肢でのスコア０．６ならびに１．０を経日的に低下させ、左後肢では惹起１７日以降スコアは０と有意な指関節の腫脹減退作用を示し、右後肢においては、惹起２１日でのスコアは０．２と指関節の腫脹を減退させた。
【表８】
2012043397.tif 000009
【０１２５】
２−４  甲の腫脹スコア（表９ａ、９ｂ）
陰性対照群では左右後肢とも異常は認められなかった。関節炎対照群では、左右後肢とも惹起７日からスコア変化が認められ、左後肢では惹起１０から２１日まで、陰性対照群と比較して有意で経日的なスコア上昇が認められた。右後肢では惹起７日以降、有意なスコア上昇が認められた。【０１２６】
メトトレキセート前投与群では、左右後肢ともに関節炎対照群より小さなスコアを示し、左後肢では惹起１０および１４日に関節炎対照群と比較して有意なスコア低下が認められた。右後肢では惹起７日から１４日まで有意なスコア低下が認められたが、両後肢とも惹起１７日および２１日のスコアは急に大きくなった。【０１２７】
惹起１０日から投与を開始したメトトレキセート投与群では、惹起１４日の左後肢のみでスコアの改善傾向を示した以外は、関節炎対照群とは差が無かった。【０１２８】
レフルミド群では、左後肢において惹起１０日のスコア０．６より低いスコアが惹起１４日以降認められたが、右後肢では惹起１０日のスコアを惹起１４日以降悪化させることはないという程度であった。【０１２９】
被験物質VII−２の１０ｍｇ／ｋｇ群においては、左後肢の惹起１０日のスコアが０．２と低かったが、惹起１４日以降にはスコアが０となる有意な作用を示し、右後肢では惹起１０日のスコア０．８を惹起１４日以降悪化させることはなかった。【０１３０】
被験物質VII−２の１００ｍｇ／ｋｇ群においては、左後肢の惹起１０日のスコア０であったが、惹起２１日に甲の腫脹を示す１例が認められ、スコアは０．２となった。右後肢では惹起１０日のスコア１．０を惹起１４日以降悪化させることはなく、惹起１７日までは有意であった。
【表９】
2012043397.tif 000010
【０１３１】
２−５  発赤のスコア（表１０ａ、１０ｂ）
陰性対照群では左右後肢とも異常は認められなかった。関節炎対照群では、左後肢では惹起１０日からスコア変化が認められ、惹起１４日に陰性対照群と比較して有意なスコア上昇が認められた。右後肢では惹起７日からスコア変化が認められ、惹起１０および１４日に有意なスコア上昇が認められた。【０１３２】
メトトレキセート前投与群では、左右後肢ともに関節炎対照群より小さなスコアを示したが、左後肢では惹起１４日に関節炎対照群と比較して有意なスコア低下が、右後肢では惹起１０および１４日に有意なスコア低下が認められた。【０１３３】
惹起１０日から投与を開始したメトトレキセート投与群では、左後肢では関節炎対照群より小さなスコアを示したのは惹起１４日だけで、右後肢では惹起１４日以降に関節炎対照群よりスコアは小さくかったが、ともに有意なスコア低下ではなかった。【０１３４】
レフルミド群では惹起１０日の投与前に認められた左および右後肢でのスコア０．８ならびに１．２を、左後肢では若干低下させる傾向を示したが、惹起２１日の右後肢でのスコアは１．４と上昇した。【０１３５】
被験物質VII−２の１０  ｍｇ／ｋｇ  群においては、惹起１０日の左肢でのスコア０．２を惹起１４日以降には０とする有意な発赤減退作用を示したが、右後肢では惹起１７日までスコアは変化せず、惹起２１日において０．６と僅かに低下した。【０１３６】
被験物質VII−２の１００  ｍｇ／ｋｇ群においては、左後肢の惹起１０日のスコア０であったが、惹起１７日および２１日に発赤を示す各１例が認められ、ともにスコアは０．２と上昇した。右後肢では惹起１０日のスコア１．０を惹起１４日以降悪化させることはなかった。
【表１０】
2012043397.tif 000011
【０１３７】
２−６  スコア合計（表１１ａ、１１ｂ）
陰性対照群では左右後肢とも異常は認められなかった。関節炎対照群では、左右後肢ともに惹起７日からスコア変化が認められ、陰性対照群と比較して有意なスコア上昇が認められた。左後肢のスコアは惹起１４日に最大２．８に達し、その後ほぼ変化しなかった。また、右後肢の最大スコアは惹起１７日の５．８であった。【０１３８】
メトトレキセート前投与群では、左右後肢ともに関節炎対照群より小さなスコアを示したが、左後肢では惹起１０日と１４日に関節炎対照群と比較して有意なスコア低下が、右後肢では惹起７日および１０日に有意なスコア低下が認められた。しかし、左後肢では惹起１７日および２１日にはそれぞれ１．４、０．８と高いスコアを示して有意とはならなかった。右後肢においても、同様に惹起１４、１７および２１日にはそれぞれ１．８、３．２および２．８と高いスコアを示して有意とはならなかった。【０１３９】
惹起１０日から投与を開始したメトトレキセート投与群では、左後肢でのスコアは惹起１４、１７および２１日にはそれぞれ１．２、１．８および１．８と高いスコアを示して有意とはならなかった。右後肢でのスコアも惹起１４、１７および２１日にはそれぞれ３．６、３．８および４．２と高いスコアを示して有意とはならなかった。【０１４０】
レフルミド群では惹起１０日の投与前に認められた左および右後肢でのスコア２．８ならびに４．２を、左後肢では惹起１４日以降半分以下に低下させる傾向を示したが、有意とはならなかった。一方、右後肢においては惹起１７日のスコアは２．０と有意に低下した。【０１４１】
被験物質VII−２の１０ｍｇ／ｋｇ群においては、両後肢とも惹起１４日以降には有意なスコア低下を示した。【０１４２】
被験物質VII−２の１００ｍｇ／ｋｇ群においては、左後肢の惹起１４日以降には有意なスコア低下を示し、右後肢では惹起１４以降でスコアの低減作用を示し、惹起１４日および２１日では有意となった。
【表１１】
2012043397.tif 000012
【０１４３】
２−７  血漿中ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α（表１２）
惹起２１日に動物を剖検し、血漿を調製し、血漿中ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α濃度を測定した。測定した全ての群で、ＴＮＦ−α濃度は検出限界（８ｐｇ／ｍＬ）以下であった。【０１４４】
一方、ＩＬ−１β濃度は陰性対照群で２０．６ｐｇ／ｍＬで、関節炎対照群では１５．１ｐｇ／ｍＬと低くなった。メトトレキセート前投与群および惹起１０日から投与を開始したメトトレキセート投与群ではそれぞれ、１８．４ｐｇ／ｍＬ、２２．６ｐｇ／ｍＬであった。【０１４５】
レフルミド群では１３．０ｐｇ／ｍＬと低い値を示した。
被験物質VII−２は１０ｍｇ／ｋｇ群および１００ｍｇ／ｋｇ群の値はそれぞれ、１０．５ｐｇ／ｍＬ、１３．９ｐｇ／ｍＬであった。
【表１２】
2012043397.tif 000013
【０１４６】
３．考察
被験物質VII−２の抗炎症作用を確認するため、ラットを用いたアジュバント関節炎モデルにおける関節炎スコア、後肢浮腫量ならびに、アジュバント接種２１日後の動物から得た血漿中ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１β量を指標に陽性対照薬のそれらと比較検討した。【０１４７】
陰性対照群では左右後肢とも成長に伴う自然な足容積の増加が認められ、惹起２１日での足容積増加率は左後肢で９．２０‰、右後肢で７．６５％であった。【０１４８】
関節炎対照群では、左右後肢ともアジュバントによる惹起により、顕著な足容積の増加が認められ、ともに惹起３日以降、経日的かつ有意に増加した。また、全てのスコア増加は惹起１０日には左後肢にも認められ、後肢容積の増加だけでなく、リウマチ様の免疫反応に伴う炎症が良く再現した結果となった。【０１４９】
メトトレキセートを惹起０日の惹起前から投与したメトトレキセート前投与群では、左後肢で惹起１４日までは陰性対照群と同様の推移を示し、惹起１４日では有意な増加抑制効果がみとめられたが、その後、惹起１７および２１日では足容積ならびに各スコアが急に増加した。本モデルやコラーゲン関節炎モデルで、通常確認されるメトトレキセートが完全に炎症を抑えられないという結果を良く再現した結果となった。【０１５０】
惹起１０日から投与を開始したメトトレキセートの治療的投与群では、後肢容積は惹起１７日以降に増加に転じ、惹起２１日では関節炎対照群のそれと同等となった。スコアにおいても、今回使用した被験物質の中で一番高く、ほぼ関節炎対照群の値に近いことから、メトトレキセートの治療的投与は無効とのデータを再現できたと考えられた。【０１５１】
レフルミド群では惹起１０日に対する左右後肢の足容積増加率には大きな変化は認められなかったが、惹起２１日では惹起１０日に対してともに僅かに負の値となるという増加抑制を示すのみで、強い足浮腫量減少作用は確認出来ず、また、スコアにおいても有意となったのは右後肢においては惹起１７日の合計スコアのみであった。しかし、惹起２１日の時点で悪化したとの評価は右後肢の発赤スコアのみで、それも惹起１０日の投与前に認められた右後肢でのスコア１．２が１．４と上昇した程度であり、その他は全て減少傾向を示していることから、本実験での浮腫抑制効果は弱いが薬効は充分発現されているものと考えられた。【０１５２】
被験物質VII−２の１０ｍｇ／ｋｇ群、及び、被験物質VII−２の１００ｍｇ／ｋｇでは、両後肢で惹起１４日から顕著かつ有意な足容積増加抑制を示し、その効果は同様かつ同程度の抗炎症作用であったことから、１０ｍｇ／ｋｇの投与でも十分な抗炎症作用を有するものと考えられた。特に右後肢の足容積増加抑制の傾向から、アジュバントや薬剤の投与足に代表される急性炎症と免疫性炎症の複合例にも抗炎症作用を有することが考えられた。【０１５３】
関節破壊の指標としての指関節の腫脹では被験物質VII−２の１０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇの抑制効果は強力で、惹起１４日目以降はメトトレキセート前投与群、メトトレキセート投与群およびレフルミド投与群の抑制効果と同等かそれを上回る効果が得られた。甲の腫脹に代表される浮腫の軽減効果でも被験物質VII−２の効果は強く、惹起１４日目以降はメトトレキセート前投与群、メトトレキセート投与群およびレフルミド投与群の抑制効果と同等かそれを上回る効果が得られた。
【０１５４】
陰性対照群を除く、各社を惹起２１日でのＩＬ−１β濃度の低いものから並べると、被験物質VII−２の１０ｍｇ／ｋｇ群、レフルミド群、被験物質VII−２の１００ｍｇ／ｋｇ群、関節炎対照群、メトトレキセート前投与群およびメトトレキセート群となり、これは今回の試験において惹起２１日での抗炎症効果の発現状況をそのまま反映するものであった。一方、惹起２１日での血漿中ＴＮＦ−α濃度は全群で検出限界（８ｐｇ／ｍＬ）以下であった。【０１５５】
これらの結果を総合すると、被験物質VII−２は、１０ｍｇ／ｋｇの投与で、１００ｍｇ／ｋｇと同様の強い抗炎症作用を示すことがわかった。この結果は被験物質VII−２の水溶性の高さが寄与している可能性がある。そして被験物質VII−２は、惹起１４日以降はメトレキセート前投与群と同等またはそれ以上の関節炎抑制効果を示すことがわかった。また、被験物質VII−２は、抗リウマチ薬であるレフルミドよりも強力な関節炎抑制効果を示すことも確認された。【０１５６】
これらの試験結果より、被験物質VII−２は、メトトレキセートやレフルミドと同等あるいはそれらを上回る強い関節炎抑制効果を有し、特にリウマチなどの免疫性の炎症に対して有効であると結論づけられた。
なお、メトトレキセートは微量の使用であっても重大な副作用をもたらすことが知られている。一方で、本発明のペプチドは天然由来のものであり、上記試験においても副作用は一切認められなかった。従って、本発明のペプチドは、安全面からも従来用いられている医薬品と比べて有利であるといえる。また、被験物質VII−２は、１０ｍｇ／ｋｇの投与量でも１００ｍｇ／ｋｇの投与量と遜色ない関節炎抑制効果を有していた。これらの結果は、被験物質VII−２自体が高い有効性有するだけでなく、その水溶性が高いことによるものと考えられた。
【実施例６】
【０１５７】
本発明のペプチドの免疫複合体病抑制作用の検証
III型アレルギー（アルサス）反応誘発ラットモデルにおける本発明のペプチドの免疫複合体病抑制作用
１．材料および方法
１−１  動物および実験操作
７週齢のＳｌｃ：Ｗｉｓｔａｒ系ラットの雄４２匹を用いて、被験物質ＶＩＩ−２について、腹腔内投与と尾静脈内投与の各々にて試験を行った。馴化は、固形通常飼料ＣＲＦ−１を与えて６日以上行った。投与前日に動物の背部を剪毛し、投与当日、卵白Ovalbumin（MP Biomedicals製）（以下、「ＯＶＡ」）＋エバンスブルー色素混合溶液を尾静脈内投与した。腹腔内投与する際はＯＶＡ＋エバンスブルー色素混合溶液の投与３０分後に、尾静脈内投与する際は５０分後に、被験物質溶液をそれぞれ投与した。抗ＯＶＡ（Nordic immunological Laboratories製）溶液の皮内投与については、被験物質を腹腔内投与する場合は被験物質投与３０分後に、被験物質を静脈内投与する場合は１０分後に、動物の背部に０．１ｍｌ／部位の用量で皮内投与し、局所的にアルサス反応を惹起させた。惹起４時間後、動物を安楽死させ十分に脱血した後に、背部皮膚を剥離した。剥離した皮膚のアルサス反応部位を打ち抜き、その皮膚よりエバンスブルー色素を一晩かけて抽出した。漏出色素量は、分光光度計でエバンスブルー色素に関する吸光度を測定し、検量線を用いて定量化した。【０１５８】
１−２  対象物質および被験物質
陰性対照物質は生理食塩水、陽性対照物質はヒドロコルチゾン溶液とした。
ヒドロコルチゾン溶液は、所定量秤量したヒドロコルチゾンを乳鉢に入れて乳棒で破砕した後、最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように生理食塩液を加えることにより調製し、これを陽性対照物質投与液とした。【０１５９】
被験物質溶液は以下のようにして調製した。
所定量秤量した被験物質VII−２を生理食塩液に溶解し、２０ｍｇ／ｍＬ溶液とし、これを１００ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与群の投与液とした。１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与群の投与液は、上記投与液を生理食塩液で１０倍希釈することで２ｍｇ／ｍＬ溶液として調製した。１００ｍｇ／ｋｇ尾静脈内投与群の投与液は、所定量秤量した被験物質VII−２を生理食塩液にて溶解し、５０ｍｇ／ｍＬ溶液としたものを投与液とした。【０１６０】
１−３  アルサス反応
ＯＶＡ＋エバンスブルー色素混合溶液を２ｍｌ／ｋｇ尾静脈内投与した。腹腔内投与する場合はＯＶＡ＋エバンスブルー色素混合溶液の投与３０分後に、尾静脈内投与する場合は５０分後に、各ペプチド溶液をそれぞれ投与した。抗ＯＶＡ溶液の皮内投与については、腹腔内投与の場合は被験物質投与３０分後に、静脈内投与の場合は１０分後に、動物の背部に０．１ｍＬ／部位の用量で被験物質溶液を皮内投与し、局所的にアルサス反応を惹起させた。皮内投与は動物１匹に対して、ＰＢＳ２ヵ所（ＰＢＳ（１）、ＰＢＳ（２））、抗ＯＶＡ溶液２ヵ所（抗ＯＶＡ（１）、抗ＯＶＡ（２））とした。惹起４時間後に、動物をエーテル麻酔下の断頭により安楽死させ、十分に脱血させた後に背部皮膚を剥離した。剥離した皮膚のアルサス反応部位をポンチで打ち抜き、色素抽出に使用した。【０１６１】
１−４  色素抽出および測定
ポンチで打ち抜いた皮膚片短冊上に数ヶ所の切れ込みをいれ、２ｍｌの色素抽出液中に浸漬して１０分間振とう攪拌した。その後、室温で一晩静置した。一晩静置した後、再度１０分間振とう攪拌し、遠心分離（１５００ｒｐｍ，１５分）を行い、その上清を色素測定用試料とした。測定にはＵＶ−１６００（株式会社島津製作所）を使用し、ＯＤ６２０ｎｍの波長で測定した。漏出色素量は、色素量標準曲線から算出した。【０１６２】
１−５  試験群
試験群は以下のとおりであった。
【表１３】
2012043397.tif 000014
【０１６３】
１−６  データの処理および統計処理
体重測定値および漏出色素量について、群平均値（ｍｅａｎ）±標準偏差（ＳＤ）を算出した。漏出色素量については、抗ＯＶＡ溶液投与２ヵ所の平均値からＰＢＳ投与２ヵ所の平均値を差し引いたものを各動物の値とした。漏出色素量について以下の統計解析を行った。
被験物質の腹腔内投与試験では、各群間でBartlettの等分散検定を行った結果、分散に違いがなかったため、Dunnettの多重比較検定で、陰性対照群とその他の各群の間の平均値の差を検定した。陰性対照群と陽性対照群の間ではＦ検定を行った結果、分散に違いがあったため、Aspin-Welchのｔ検定で２群間の平均値の差を検定した。
被験物質の尾静脈内投与試験では、陰性対照群と被験物質投与群の間でＦ検定を行い、分散に違いがなかったためStudentのｔ検定で、２群間の平均値の差を検定した。有意水準はBartlettの等分散検定では５％、その他の検定では両側５％とした。【０１６４】
２．結果
２−１  動物の体重変化および一般的状態
試験期間中すべての群の動物において順調な体重増加が見られた。群間での体重変化に有意差は認められなかった。また、試験期間中すべての動物について一般状態に異常は認められず、副作用と思われる症状も見られなかった。【０１６５】
２−２  漏出色素量測定結果および統計処理結果
動物の各アルサス反応惹起部（皮内投与部位）における漏出色素濃度（μｇ／ｍＬ）を算出した。算出した各部位の漏出色素濃度を以下の計算式に代入し、動物１匹あたりの漏出色素量（μｇ／動物）を算出した。
＊計算式：[{(抗OVA(1)+抗OVA(2))/2}-{(PBS(1)+PBS(2))/2}]×2【０１６６】
２−２−１  腹腔内投与試験結果（図１６（ａ）参照）
各群における漏出色素量平均値（ｍｅａｎ）±標準偏差（ＳＤ）は、陰性対照物質投与群：１１．０９９±３．０７１μｇ／動物、被験物質VII−２  １０ｍｇ／ｋｇ投与群：８．７０５±１．１１６μｇ／動物、被験物質VII−２  １００ｍｇ／ｋｇ投与群：６．９９１±０．９１８μｇ／動物、陽性対照物質  ５０ｍｇ／ｋｇ投与群：５．６６５±０．６７４μｇ／動物であった。陰性対照物質投与群と陽性対照物質投与群の間に有意差が認められた（Ｐ＝０．０１５７）。
また陰性対照物質投与群と被験物質VII−２  １００ｍｇ／ｋｇ投与群との間に有意差が認められた（Ｐ＝０．００９４）。【０１６７】
２−２−２  尾静脈内投与試験結果（図１６（ｂ）参照）
各群における漏出色素量平均値（ｍｅａｎ）±標準偏差（ＳＤ）は、陰性対照物質投与群：１０．８１６±２．０９３μｇ／動物、被験物質VII−２  １００ｍｇ／ｋｇ投与群：８．３０８±２．０５０μｇ／動物であった。統計処理の結果、陰性対照物質投与群と被験物質VII−２  １００ｍｇ／ｋｇ投与群の間に有意差は認められなかったが、平均値について若干の低値が認められた。【０１６８】
３．考察
腹腔内投与試験では、陽性対照物質（Hydrocortisone）５０ｍｇ／ｋｇ投与群と陰性対照物質投与群の間に有意な抑制効果が認められた（Ｐ＝０．０１５７）ことから、動物モデルを用いた本試験の妥当性に問題はないと考えられた。被験物質VII−２  １０ｍｇ／ｋｇ投与群ではアルサス反応に対する抑制効果に有意差は認められなかったが（Ｐ＝０．１７６５）、平均値に差異が見られた。被験物質VII−２  １００ｍｇ／ｋｇ投与群では有意な抑制効果が認められた（Ｐ＝０．００９４）。尾静脈内投与試験では、被験物質VII−２  １００ｍｇ／ｋｇ投与群ではアルサス反応に対する抑制効果に統計学的な有意差は認められなかったが（Ｐ＝０．０９２０）、漏出色素量は対照群と比較してその平均値よりも低値を示し、アルサス反応に対する抑制傾向が認められた。【０１６９】
以上より、被験物質VII−２は、ＩＩＩ型アレルギー（アルサス）反応に対して抑制効果を示すことが明らかとなった。従って、本発明のペプチドは、明確かつ十分な免疫複合体病抑制作用を有しており、ＳＬＥ、糸球体腎炎、関節炎、血管炎などの免疫複合体病の処置および予防に有用であることが明らかになった。また、この試験において、本発明のペプチドを投与したことによる異常や副作用は、すべての試験動物において見られなかった。
【実施例７】
【０１７０】
関節リウマチ患者の滑膜細胞を用いたＢ細胞との共培養によるＩｇＧ産生に対する本発明のペプチドの抑制効果の検証【０１７１】
リウマチ関節において、滑膜細胞とＢ細胞が共存して刺激し合って炎症性物質であるＩｇＧが産生されることが知られている。そこで、モデル系を用いて本発明のペプチドのＩｇＧ産生抑制効果について調べた。【０１７２】
１．実験方法
関節リウマチ患者の滑膜細胞（Ｐａｓｓａｇｅ  ３−７）を２４ウェルプレートに撒き（３ｘ１０４個／ウェル）、一晩培養した。被験物質VII−２を１０μｇ／ｍｌとなるよう添加し、３０分間前処理を行った。次に、Ｂ細胞を添加して（1x106個/ウェル）、滑膜細胞との共培養を行った。５日間培養し、上清を回収し、ＥＬＩＳＡにてＩｇＧ量を測定した（Human IgG EIA Kit(TaKaRa, #MK136)を使用）。被験物質VII−２を添加せずに同様の操作を行った系をコントロール系として用いた。【０１７３】
２．結果
結果を図１７に示す。被験物質VII−２は１０μｇ／ｍｌという低濃度でもＩｇＧの産生をコントロールの約４分の３にまで抑制することがわかった。なおかつ、本発明のペプチドが滑膜細胞だけではなく、Ｂ細胞系の活性化抑制にも効果を示すことがわかった。この結果は、被験物質VII−２が実際の関節リウマチにおいても炎症を抑制しうることを示すものであり、上記の実施例の結果とも矛盾しない。
【産業上の利用可能性】
【０１７４】
本発明によれば、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防において、より有用な医薬組成物の提供が可能になる。水溶性が改善された本発明のペプチドを上記医薬組成物に用いることで、従来と比べて実質的な投与量が高められた医薬組成物を提供することができる。本発明により提供される医薬組成物は、特に関節炎やリウマチの治療に有効である。したがって、本発明は、製薬分野、研究用試薬分野などにおいて利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【０１７５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
2012043397000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年6月29日(2012.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イミュノグロブリン結合能を有するペプチドであって、
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｘ４−Ｘ５−Ｐｈｅ
（ここで、Ｘ４およびＸ５の両方が親水性アミノ酸である）
で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
Ｘ４およびＸ５が独立してＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＳｅｒおよびＴｈｒからなる群より選択されるアミノ酸である、請求項１のペプチド。
【請求項３】
配列番号９〜１５のいずれかのアミノ酸配列からなる請求項１のペプチド。
【請求項４】
式（Ｉ）のアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸（Ｇｌｙを除く）が対応するＤ−アミノ酸で置換されている、請求項１〜３のいずれかのペプチド。
【請求項５】
式（Ｉ）のアミノ酸配列中の全てのアミノ酸（Ｇｌｙを除く）が対応するＤ−アミノ酸で置換されている、請求項１〜３のいずれかのペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかのペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加されている融合タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかのペプチドをコードする核酸。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかのペプチドがＮ末端および／またはＣ末端に付加されている融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかのペプチド、請求項６の融合タンパク質、請求項７または８の核酸、あるいは請求項７または８の核酸を含むベクターを有効成分として含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物。
【請求項１０】
疾患が関節リウマチである、請求項９の医薬組成物。
【請求項１１】
疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糸球体腎炎、血管炎、関節炎からなる群より選択されるものである、請求項９の医薬組成物。
【請求項１２】
有効成分が請求項３〜５のいずれかのペプチドである、請求項９〜１１のいずれかの医薬組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成24年10月31日(2012.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イミュノグロブリン結合能を有するペプチドであって、配列番号９〜１５のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
配列番号９〜１５のいずれかのアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸（Ｇｌｙを除く）が対応するＤ−アミノ酸で置換されている、請求項１のペプチド。
【請求項３】
配列番号９〜１５のいずれかのアミノ酸配列中の全てのアミノ酸（Ｇｌｙを除く）が対応するＤ−アミノ酸で置換されている、請求項１のペプチド。
【請求項４】
配列番号：１２のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項５】
配列番号：１２のアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸（Ｇｌｙを除く）が対応するＤ−アミノ酸で置換されている、請求項４のペプチド。
【請求項６】
配列番号：１２のアミノ酸配列中の全てのアミノ酸（Ｇｌｙを除く）が対応するＤ−アミノ酸で置換されている請求項４のペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかのペプチドが目的のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付加されている融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１または４のペプチドをコードする核酸。
【請求項９】
請求項１または４のペプチドがＮ末端および／またはＣ末端に付加されている融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかのペプチドを有効成分として含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物。
【請求項１１】
疾患が関節リウマチである、請求項１０の医薬組成物。
【請求項１２】
疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糸球体腎炎、血管炎、関節炎からなる群より選択されるものである、請求項１０の医薬組成物。
【国際調査報告】
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