(57)【要約】  本発明により、抗VDAC抗体を含有する関節リウマチ等、破骨細胞の活性化が亢進している疾患の治療剤又は予防剤及び抗VDAC抗体を含有するヒト破骨細胞形成抑制剤を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗VDAC抗体、そのFabフラグメント又はF(ab')2フラグメントを含有する、破骨細胞形成抑制剤。
【請求項２】
破骨細胞が、ヒト破骨細胞である請求項１記載の破骨細胞形成抑制剤。
【請求項３】
前記抗VDAC抗体のエピトープが、20個以下のアミノ酸残基から構成される請求項１又は２記載の破骨細胞形成抑制剤。
【請求項４】
前記抗VDAC抗体のエピトープが、配列番号１のアミノ酸配列を含む請求項１〜３のいずれか１項記載の破骨細胞形成抑制剤。
【請求項５】
破骨細胞形成抑制剤を製造するための抗VDAC抗体の使用。
【請求項６】
前記抗VDAC抗体のエピトープが、20個以下のアミノ酸残基から構成される請求項４記載の使用。
【請求項７】
前記抗VDAC抗体のエピトープが、配列番号１のアミノ酸配列を含む請求項４又は５記載の使用。
【請求項８】
抗VDAC抗体、そのFabフラグメント又はF(ab')2フラグメントを含有する、破骨細胞の活性化が亢進している疾患の治療剤又は予防剤。
【請求項９】
破骨細胞の活性化が亢進している疾患が、骨粗鬆症、関節リウマチ、Paget病及び癌の骨転移からなる群から選ばれる請求項７記載の治療剤又は予防剤。
【請求項１０】
破骨細胞が、ヒト破骨細胞である請求項７又は８記載の治療剤又は予防剤。
【請求項１１】
前記抗VDAC抗体のエピトープが、20個以下のアミノ酸残基から構成される請求項７〜９のいずれか１項記載の治療剤又は予防剤。
【請求項１２】
前記抗VDAC抗体のエピトープが、配列番号１のアミノ酸配列を含む請求項７〜１０のいずれか１項記載の治療剤又は予防剤。
【請求項１３】
破骨細胞の活性化が亢進している疾患の治療剤又は予防剤を製造するための抗VDAC抗体の使用。
【請求項１４】
前記抗VDAC抗体のエピトープが、20個以下のアミノ酸残基から構成される請求項１２記載の使用。
【請求項１５】
前記抗VDAC抗体のエピトープが、配列番号１のアミノ酸配列を含む請求項１３記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗VDAC抗体を含有する破骨細胞の活性化が亢進している疾患の治療剤及び破骨細胞形成抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
電位依存性アニオンチャンネル（voltage-dependent anion channel(VDAC)）は、ポリン(porin)とも呼ばれる、分子量30〜35kDaの穴タンパク質である。VDACは、ミトコンドリア外膜に存在し、10kDa以下の分子は自由拡散で通過する。ミトコンドリアと細胞質との間で物質輸送を行っていることが知られている（例えば、非特許文献１）。VDACは、ANT（adenine nucleotide translocase）、シクロフィリンDと一緒になって、PTP（permeability transition pore：ミトコンドリア膜透過性遷移孔）と呼ばれる複合体を形成している。VDACは、細胞のアポトーシスに関与していることにより、最近その機能が非常に注目されている（非特許文献２）。VDACはまれに神経細胞の細胞膜における発現も報告されているが（非特許文献３）、その詳細は不明である。しかし、これまでにヒト破骨細胞の細胞膜における発現は報告されていない。
破骨細胞は、骨の破壊吸収に関与する大きな多核細胞である。破骨細胞による骨吸収が骨芽細胞による骨形成を上回ると、骨粗鬆症や関節リウマチ、高カルシウム血症、変形性関節炎などの骨代謝の異常を引き起こす。破骨細胞と骨芽細胞とのバランスが崩れると、骨破壊が生じる疾患である骨ぺージェット病（Paget's disease)となる。
本発明者らはこれまでに、胃粘膜保護剤テプレノン（セルベックス（登録商標））がヒト破骨細胞形成抑制作用を有することを見出し、前記胃粘膜保護剤が不動性骨粗鬆症の治療剤又は予防剤として使用可能であることを報告した（特許文献１）。本発明者らはまた、ヒト関節リウマチ由来の29merペプチドがヒト破骨細胞形成抑制作用を有することを見出し、前記29merペプチドが骨粗鬆症又は関節リウマチの治療剤として使用可能であることを報告した（非特許文献４、特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開2005-060303号公報
【特許文献２】特開2008-148566号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】清水重臣ら, 細胞工学, Vol.18, No.12, 1765-1772, 1999年
【非特許文献２】S. Shimizu et al., The Journal of Cell, Vol.152, 237-250, 2001.
【非特許文献３】Akanda N, et al., Cell Cycle. 2008 Oct;7(20):3225-34.
【非特許文献４】Kotake S et al., Bone. 2009; 45: 627-639.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、新規破骨細胞形成抑制剤を提供することを目的とする。
本発明はまた、破骨細胞の活性化が亢進している疾患の新規治療剤又は予防剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らが鋭意検討した結果、本発明者らは、VDACがヒト破骨細胞の細胞膜に発現していることを発見した。免疫電顕および通常の免疫染色により、VDACがヒト破骨細胞膜に局在していることも確認した。
ヒト破骨細胞におけるVDACの機能を解明すべく、種々検討したところ、Receptor activator NF-kappa B ligand (RANKL)刺激によるヒト単球から破骨細胞への分化の過程に、VDACに対する抗体（抗VDAC抗体）を添加すると、破骨細胞の分化が有意に抑制されるだけでなく、破骨細胞による骨吸収活性も抑制されることが分かった。更に、パッチクランプ法により、抗VDAC抗体が成熟ヒト破骨細胞膜のクロライド電流を抑制する傾向があることが分かった。
以上の結果から、抗VDAC抗体が、破骨細胞の分化又は活性化を抑制することが明らかとなった。本発明は係る知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明により、抗VDAC抗体、そのFabフラグメント又はF(ab')2フラグメントを含有する、破骨細胞形成抑制剤を提供する。
本発明はまた、破骨細胞形成抑制剤を製造するための抗VDAC抗体の使用を提供する。
本発明はまた、抗VDAC抗体、そのFabフラグメント又はF(ab')2フラグメントを含有する、破骨細胞の活性化が亢進している疾患の治療剤又は予防剤を提供する。
本発明はまた、破骨細胞の活性化が亢進している疾患の治療剤又は予防剤を製造するための抗VDAC抗体の使用を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、破骨細胞形成及び骨吸収を抑制することができ、破骨細胞の活性化が亢進している疾患の治療剤及び破骨細胞形成抑制剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動図である。図１中、Ｍは分子量マーカー、Ｕは未精製、2C8は5D1/3F3/2C8株由来のモノクローナル抗体で作成したカラムで精製した蛋白質、2H10は5D1/2B9/2H10株由来のモノクローナル抗体で作成したカラムで精製した蛋白質を意味する。
【図２】図２は、バンド１のマススペクトルである。
【図３】図３は、バンド１のm/z1456.7 のMS/MSスペクトルである。
【図４】図４は、バンド１のm/z1693.8のMS/MSスペクトルである。
【図５】図５は、バンド１のm/zの2474.2のMS/MSスペクトルである。
【図６】図６は、バンド１のMowse scoreに基づく蓋然性を示すグラフである（gi|238427, Mass: 30833, Score: 174, Expect:5.5e-13）。図６中、174のバーは174, 171, 171を含みいずれもVDACとヒットした。斜線で示した領域は、ランダムなヒットの領域であり、有意な結果ではない。
【図７】図７は、ヒト破骨細胞のミトコンドリア及び細胞膜におけるVDACの発現を示す免疫電子顕微鏡写真である。図７中、下の枠がミトコンドリア、図７中、上の枠が細胞膜である。
【図８】図８は、ヒト破骨細胞のミトコンドリアにおけるVDACの発現を示す免疫電子顕微鏡写真である。図７中の下の枠内の拡大図である。図８中、ドットがミトコンドリアにおけるVDACである。
【図９】図９は、ヒト破骨細胞の細胞膜におけるVDACの発現を示す免疫電子顕微鏡写真である。図７中の上の枠内の拡大図である。図９中、ドットが細胞膜におけるVDACである。
【図１０】図１０はDAPIによる核染色および、抗CD51/61抗体、抗VDAC抗体による破骨細胞の免疫染色を示す。
【図１１】図１１は、コントロール、マウスIgG存在下、抗VDAC抗体存在下における破骨細胞の写真である。
【図１２】図１２は、抗VDAC抗体存在下及びマウスIgG存在下における、ウェルあたりの破骨細胞の総面積を示すグラフ（図12-1）と、図12-1で用いたのとは異なるクローン由来の抗VDAC抗体を用いた場合の破骨細胞の総面積を示すグラフ（図12-2）と、市販の骨吸収抑制剤の存在下及び不存在下における、破骨細胞の総面積を示すグラフ（図12-3）である。  図12-4は、図12-2に示したデータを元にして作成し、統計処理と共に示したグラフである。  図12-5は、図12-1で用いた抗VDAC抗体と、図12-2で用いた抗VDAC抗体とを同時に検討した結果である。
【図１３】図１３は、マウスIgG存在下及び抗VDAC抗体存在下における、ウェルあたりの骨吸収窩の数を示すグラフである。
【図１４】図１４は、マウスIgG存在下及び抗VDAC抗体存在下における、ウェルあたりの骨吸収窩の総面積を示すグラフである。
【図１５】図１５は、ヒト末梢血単球、単核破骨細胞前駆細胞、成熟破骨細胞における、電位依存性クロライド電流に対する抗VDAC抗体及び非特異的抗体の影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明で用いる抗VDAC抗体は、VDACのエピトープに結合し得るモノクローナル抗体である。抗VDAC抗体と同じエピトープを認識する抗体もまた、本発明において使用することができる。
本発明で用いる抗体として、VDACのエピトープに結合し得るモノクローナル抗体、抗VDAC抗体と同じエピトープを認識する抗体であれば、クラス/サブクラスを問わず適用可能であり、それらのFcドメインを結合した抗体関連タンパク質にも同様に適用可能である。また、精製原料の純度に関係なく適用可能である。たとえば、天然のヒト抗体、もしくは遺伝子組み換え法で調製されたヒト化抗体やヒト型抗体、マウス等のモノクローナル抗体等があげられる。
本発明ではまた、抗VDAC抗体のFabフラグメント又はF(ab')2フラグメント等、抗VDAC抗体と同様に、破骨細胞の分化又は形成の抑制活性及び破骨細胞の活性化抑制活性を有するフラグメントもまた使用することができる。
抗VDAC抗体は、破骨細胞膜蛋白から公知の方法により製造することもできるし、市販品を使用することもできる。市販品としては、例えばInvitrogen社、Calbiochem社、Santa Cruz社から販売されている。
【００１０】
本発明で用いる抗体のエピトープは、20個以下のアミノ酸残基から構成されるのが好ましい。10個以下のアミノ酸残基から構成されるのがより好ましい。下記配列番号１のアミノ酸配列を含むのがさらに好ましい。
Ser Leu Ile Gly Leu Gly Tyr Thr Gln Thr    （配列番号１）
1               5                   10
【００１１】
抗VDAC抗体は、そのままあるいは各種の医薬組成物として投与される。
投与対象は、破骨細胞の活性化が亢進している疾患の治療が必要であるか、又は破骨細胞形成の抑制が必要な、ヒトを含む動物である。破骨細胞の活性化が亢進している疾患としては、例えば、骨粗鬆症、関節リウマチ、Paget病、癌（肺癌、乳癌、前立腺癌等）の骨転移などの骨減少性ならびに骨破壊性疾患があげられる。
破骨細胞としてはヒト破骨細胞が好ましい。
医薬組成物の剤形としては、皮下注射または点滴静脈注射が望ましい。これらは常法に従って製造することができる。
【００１２】
抗VDAC抗体は、成人一日当たり、通常、精製蛋白質換算で1000〜10000μg/kg体重、好ましくは3000〜5000μg/kg体重の用量を一回又は複数回で投与する。
本発明の治療剤又は抑制剤の投与量は、投与ルート、治療期間、患者の年齢及び体重などにより決定される。
【実施例１】
【００１３】
１．新規ヒト破骨細胞膜表面蛋白の同定
（１）破骨細胞の細胞膜蛋白質に対するモノクローナル抗体作成
（i）５名の健常人末梢血の単球を、フラスコにおいてM-CSF, RANKLの存在下で約２週間培養し、破骨細胞へ分化させた。このヒト破骨細胞にトリプシン及びEDTAを添加後、37℃で15分培養し、その後細胞スクレイパーにて剥離し、回収した。この操作を繰り返し、ヒト成熟破骨細胞の細胞膜を集めた。このヒト成熟破骨細胞より、RIPA bufferを用い、膜蛋白質を調整した。
（ii）得られた膜蛋白質を抗原とし、マウスに免疫した。免疫したマウスの脾細胞とミエローマ細胞とを融合し、ハイブリドーマ４種類を得た。スクリーニングは、破骨細胞の膜蛋白質を固相化したプレートを用いたELISA法にて行った。陽性となったwellについて、さらにヒト破骨細胞に対する反応性と単球に対する非特異的反応性を調べ、クローニングを行い、最終株として、5D1/2B9/2H10及び5D1/3F3/2C8を得た。
（iii）これらの最終株からモノクローナル抗体を得た。【００１４】
（２）抗体カラムに結合する蛋白質の精製
上で得られたモノクローナル抗体（invitrogen A31855 anti-porin, human mitochondrial, mouse IgG2b, monoclonal 31HL）をカラムに固定化し、それぞれの抗体カラムを作成した。破骨細胞膜蛋白質から抗体カラムに結合する画分の精製操作をおこなった。【００１５】
（３）精製蛋白質の同定
（i）得られた画分のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(CBB染色)及びウエスタンブロティングを実施し、両者の結果から、抗体カラムで精製されていると予想された３種類の蛋白質を得た（図1）。３種類の蛋白質のうち、36kDaをバンド１、31kDaをバンド２、28kDaをバンド３とよぶ。
（ii）これらの蛋白質を消化酵素（Achromobacter protease I (リジルエンドペプチダーゼ、Lys-C, 和光)）で切断してゲル内消化を行い、次いで、消化物のマススペクトルをとった。さらに、バンド１のm/z1456.7、m/z1693.8、m/zの2474.2のMS/MSスペクトルをとった。次いで、ピークリストを作成し、ソフトウェア（MASCOT、Matrix Science社製）を用いて、登録配列から計算される予測データと実測データとを比較し、確率論に基づくMowse scoreにより同定の蓋然性を評価することにより、peptide mass fingerprinting(PMF)法を行った結果、一つの蛋白質がVDACと最終的に同定された。バンド２，３についても同様に実験を行ったが、これら蛋白質は同定が困難であった。
バンド１のマススペクトルを図2に示す（バンド２，３については図示せず）。バンド１のm/z1456.7、m/z1693.8、m/zの2474.2のMS/MSスペクトルを図3〜5に示す。バンド１のMowse scoreに基づく蓋然性を図6に示す。【００１６】
２．破骨細胞のミトコンドリア及び細胞膜におけるVDACの発現
免疫電子顕微鏡によりヒト破骨細胞でのVDACの発現を検討したところ、ミトコンドリア(図7；下の枠、図8；ドット)及び細胞膜(図7；上の枠、図9；ドット)にVDACの発現が認められた。【００１７】
３．VDACの破骨細胞膜への局在の確認
DAPIによる核染色および, 抗CD51/61抗体、抗VDAC抗体による破骨細胞の免疫染色により、VDACの破骨細胞膜への局在を確認した。
多核の破骨細胞(図10-1；核はDAPIにより青に染色されている、bar=10μm)におけるCD51/61(図10-2；緑)と、VDAC(図10-3；赤)とを重ねると、赤と緑が重なって黄色の部分が示された（図10-4；３個の枠、図10-5、図10-6及び図10-7；枠の拡大像  矢頭）。これにより、CD51/61とVDACを共発現している膜部分があることが示唆された。【００１８】
４．抗VDAC抗体による破骨細胞の分化・形成の抑制
（１）前記1.(1)(i)工程において得られたヒト破骨細胞形成の培養系に、抗VDAC抗体(5μg/ml、invitrogen A31855 anti-porin, human mitochondrial, mouse IgG2b, monoclonal 31HL)を添加した。コントロールには何も添加しなかった。比較対照物質として、同量のマウスIgGを添加した（n=4）。
その結果、コントロール（図11-1）及びマウスIgG（図11-2、図12-1）と比べ、抗VDAC抗体を添加した場合（図11-3、図12-1）、破骨細胞の形成が有意に抑制された。
（２）異なるクローン由来の抗VDAC抗体（VDAC1（20B12），SANTA CRUZ Biotechnology, Inc., sc-58649, mouse monoclonal IgG2b, 100μg/ml）を用い、２名の健常人から得た末梢血を得たこと以外は前記（１）と同様にして破骨細胞の分化・形成の抑制を評価した（n=4）。
その結果、コントロールと比べ、異なるクローン由来の抗VDAC抗体を添加した場合も、破骨細胞の形成が有意に抑制された（図12-2）。【００１９】
（３）抗VDAC抗体(5μg/ml)に代えて、市販の骨吸収抑制剤（帝人ファーマ株式会社、販売名  テイロック（登録商標）注射液  ５ｍｇ、有効成分：一般名  アレンドロン酸ナトリウム水和物）を0.2μg/mL又は2μg/mLの量で添加したこと以外は前記（１）と同様にして破骨細胞の分化・形成の抑制を評価した。コントロールには何も添加しなかった。
その結果、コントロールと比べ、市販の骨吸収抑制剤を添加した場合、破骨細胞の形成が有意に抑制された（図12-3）。
図12-1及び図12-2と図12-3とを比較すると、グラフの線の傾きが同程度であるから、抗VDAC抗体は、既存の骨吸収抑制剤と同程度又はそれ以上の破骨細胞分化・形成抑制効果を示していると言える。
（４）前記（２）で得られたデータを元にして作成したグラフを統計処理と共に示す（図12-4）。＊p<0.0001, ＊＊p=0.0009。
（５）更に、（１）で用いた抗VDAC抗体と、（２）で用いた抗VDAC抗体とを同時に用いたこと以外は前記（１）と同様にして破骨細胞の分化・形成の抑制を検討した（図12-5）。＊p=0.0147, ＊＊p=0.0421。【００２０】
５．破骨細胞による骨吸収活性の抑制
骨培養システム（BD Bioscience製、BD BioCoat（TM）オステオロジック（TM））を用い、破骨細胞の骨吸収能を吸収窩で評価した。前記システムの培養容器には、骨代替物として合成リン酸カルシウム薄膜がコートされており、このコート上で破骨細胞を培養することにより、前記薄膜上に骨吸収窩が形成され、骨吸収能を評価することができる。
前記1.(1)(i)工程において得られたヒト破骨細胞形成の培養系に、抗VDAC抗体(5μg/ml)を添加した。陽性コントロールとして、同量のマウスIgG抗体を添加した。各培養系を、37℃において１４日間培養後、骨吸収窩の数及び総面積を、蛍光顕微鏡BZ9000(キーエンス社)を用いて測定した。
その結果、破骨細胞の分化・形成と同様に、マウスIgGと比べ、抗VDAC抗体を添加した場合、骨吸収窩の数及び総面積において有意な抑制が認められた(図13、図14)。【００２１】
６．成熟破骨細胞の電位依存性クロライド電流に対する抗VDAC抗体の影響
ヒト末梢血単球、単核破骨細胞前駆細胞、成熟破骨細胞における電位依存性クロライド電流に対する抗VDAC抗体(5μg/ml)(図15、▲)の影響を、パッチクランプ法を用いて検討した。陰性コントロールとして細胞外液(図15、○)を、比較対照物質として非特異的抗体であるNon-specific rabbit IgG (R&D 20116, mouse IgG2b isotype control)(図15、□)を同様の方法で適用した。
ヒト末梢血単球(図15-1)及び単核破骨細胞前駆細胞(図15-2)において、抗VDAC抗体は、電位依存性クロライド電流強度補正値に対して影響を与えなかった。一方、成熟破骨細胞(図15-3)において、抗VDAC抗体は非特異的抗体と比較して、電位依存性クロライド電流を減少させる傾向を示した。
以上の結果より、抗VDAC抗体は、実際に成熟破骨細胞の電位依存性クロライド電流を減少させる傾向があることが示された。【００２２】
７．抗VDAC抗体のエピトープの解析
抗VDCAモノクローナル抗体（VDAC1（20B12），SANTA CRUZ Biotechnology, Inc., sc-58649, mouse monoclonal IgG2b, 100μg/ml）に対するエピトープを調べるため、合成ペプチド（表1）を用いてELISAによる解析を行った。合成ペプチドは、VDAC1を網羅するようにペプチド28種類を用意した。【００２３】
７．１．合成ペプチドのプレートへの固定
アビジンビオチン法で合成ペプチドをプレートに以下の通り固定した。
合成ペプチド（325 nmol／ペプチド）を250 μLのDMSOに溶解した後、Wash Buffer（0.05% Tween-20を含むPBS）で6400倍希釈した。
ストレプトアビジンコートプレートをWash Bufferで洗浄（350μL，3回）した後、希釈したペプチド100 μLをプレートに加え、冷蔵で1晩静置した。【００２４】
７．２．ペプチドと反応する抗体のELISAによる検出
7.1でペプチドを固定化したプレートについてELISAを行い、ペプチドと結合した抗体を検出した。検出手順は下記の通りである。1条件2 wellで行い平均値をとった。
（１）well中の液を抜き取り、Wash Bufferで洗浄（350μL，3回）した後、Blocking Buffer（SynBlock）200μL加え37℃で1時間振とうした。
（２）well中の液を抜き取り、モノクローナル抗体20B12（Blocking Bufferで5 μg/mLに希釈）50μL加え、37℃で1時間振とうした。
（３）well中の液を抜き取り、Wash Bufferで洗浄した後、HRP標識Goat anti Mouse IgG (Fc) （原液をWash Bufferで25000倍希釈）50μL加え、37℃で1時間振とうした。
（４）well中の液を抜き取り、プレートを洗浄した後、発色液60μLを加え、37℃で30分インキュベートした．停止液60μLを加え発色を停止した後、プレートリーダーで450nmの吸光度（Reference 595nm）を測定した。【００２５】
ポジティブコントロールとしてインターフェロンβモノクローナル抗体に反応するインターフェロンβの構成ペプチドを使用した。ネガティブコントーロールとして同じインターフェロンβの構成ペプチドで抗体と反応しないものを使用した。検出手順は下記の通りである。
（１）well中の液を抜き取り、Wash Bufferで洗浄（350μL，3回）した後、Blocking Buffer 200 μLを加え37℃で1時間振とうした。
（２）well中の液を抜き取り、Wash Bufferで洗浄した後、HRP標識抗インターフェロンβモノクローナル抗体（Wash Bufferに溶解，3 mL/バイアル）100μL加え、37℃で1時間振とうした。
（３）well中の液を抜き取り、プレートを洗浄した後、発色液60μL加え、37℃で30分インキュベートした．停止液60μL加え発色を停止した後、プレートリーダーで450nmの吸光度（Reference 595nm）を測定した。【００２６】
【表１】
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【００２７】
表2、3に吸光度データを示す。ペプチド24，25で抗体との反応が見られ，それ以外はほぼブランクレベルであった。特にペプチド24は顕著であり、この配列中にエピトープが含まれると考えられる。ペプチド24と25は重なりが10残基あり、ペプチド25にも弱い反応が見られたことから、重なり10残基のうちの何残基かがエピトープの一部を形成すると考えられる。報告されているVDAC蛋白の立体構造は円筒形をしているが（Hiller, S., et al., Science, 2008, Vol. 321: 1206-1210）、報告されている立体構造と、今回特定された10残基の位置とから、ペプチドNo.24とNo.25との重なり10残基は、円筒形の側面に位置することが分かった。この位置は、外から投与した抗体が認識可能な位置であると思われる。【００２８】
【表２】
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【００２９】
【表３】
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【００３０】
以上述べたとおり、膜蛋白によるマウスの免疫、ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体の作成からという免疫学の正統的な方法を駆使し、通常ミトコンドリアにのみ発現しているVDACがヒト破骨細胞膜に発現していることをはじめて明らかにできた。
さらに、その細胞膜における局在を免疫電顕および通常の免疫染色法により示すことができた。しかも、このVDACに対する抗体は成熟破骨細胞のクロライド電流を減少させる傾向があることが示された。さらに、RANKL刺激によるヒト単球からの破骨細胞形成を、この抗VDAC抗体は抑制した。
以上より、今後この抗体が破骨細胞の活性化が亢進している疾患、例えば骨粗鬆症、関節リウマチ、Paget病など、あるいは肺癌、乳癌、前立腺癌などの骨転移の治療への応用の可能性が示唆された。
【図２】
2012050154.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１】
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【図７】
2012050154.tif 000021
【図８】
2012050154.tif 000022
【図９】
2012050154.tif 000023
【図１０】
2012050154.tif 000024
【配列表】
2012050154000001.app
【国際調査報告】
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