(57)【要約】  本発明は貧血を自然発症することを特徴とするモデル動物に関する。より詳細には、出生後のエリスロポエチン（Ｅｐｏ）の産生低下に伴う貧血を自然発症することを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物、及び前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物から調製されたＥｐｏ産生細胞、ならびに前記Ｅｐｏ産生細胞を用いたスクリーニング方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
出生後に貧血を自然発症することを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
出生後の血中エリスロポエチン（Ｅｐｏ）濃度が低下している、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
遺伝子改変によって出生後の腎臓におけるＥｐｏ産生が抑制されている、請求項２に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
遺伝子改変が、内在性のＥｐｏ遺伝子をノックアウトし、かつ腎臓での発現が抑制されたＥｐｏ遺伝子を外部からトランスジーンとして導入する操作を含む、請求項３に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
外部から導入されるトランスジーンがＥｐｏ遺伝子の転写開始点の上流３．３ｋｂから下流４．５ｋｂまでである、請求項４に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項６】
内在性のＥｐｏ遺伝子がノックアウトされると同時に、レポーター遺伝子がノックインされている、請求項４又は５に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
レポーター遺伝子がＧＦＰ遺伝子である、請求項６に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項１から７のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項９】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３４７として寄託されている受精卵から作製される、請求項１〜８に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に由来する組織又は細胞。
【請求項１１】
請求項１０の組織又は細胞から樹立された細胞株。
【請求項１２】
請求項１から９のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物から調製された受精卵。
【請求項１３】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３４７で特定される、請求項１２に記載の受精卵。
【請求項１４】
請求項１から９のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物から単離されたＥｐｏ産生細胞。
【請求項１５】
Ｅｐｏ産生細胞が腎臓由来のＥｐｏ産生（ＲＥＰ）細胞である、請求項１４に記載のＥｐｏ産生細胞。
【請求項１６】
以下の工程を含む、Ｅｐｏ産生細胞を製造する方法；
（ａ）請求項６から９のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する工程、
（ｂ）  前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物から組織又は細胞を単離する工程、
（ｃ）  前記組織又は細胞の中から、レポーター遺伝子が発現している細胞を検出する工程、及び
（ｄ）  前記レポーター遺伝子が発現している細胞を単離する工程。
【請求項１７】
以下の工程を含む、Ｅｐｏ産生促進活性物質のスクリーニング方法；
（ａ）被検物質を、請求項１６に記載の方法で製造されたＥｐｏ産生細胞に接触させる工程、
（ｂ）前記Ｅｐｏ産生細胞におけるレポーター遺伝子の発現を検出する工程、及び
（ｃ）対照と比較して、レポーター遺伝子の発現を促進する活性を有する被検物質を選択する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は貧血を自然発症することを特徴とするモデル動物に関する。より詳細には、出生後のエリスロポエチン（Ｅｐｏ）の産生低下に伴う貧血を自然発症することを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｅｐｏは赤血球産生を促すサイトカインであり、長年の治療実績を持つ腎性貧血治療薬としても知られている。Ｅｐｏは哺乳動物の肝臓（胎児期）および腎臓（生後）で主に産生される。慢性腎機能不全では腎臓からのＥｐｏ産生が低下して貧血（腎性貧血）となるが（非特許文献１）、この貧血は遺伝子組み換え技術により得られたＥｐｏの投与により改善し、腎性貧血患者の予後と生活の質は飛躍的に改善した。【０００３】
中枢神経系、網膜、腎臓、心臓などで、組織中のＥｐｏがストレスに対する細胞保護作用を示すことが明らかにされ、一部ではこのＥｐｏの造血外効果を目的とした臨床的利用も開始されている。一方で、Ｅｐｏ投与が癌の増殖も刺激するため治療成績を低下するという報告や、血栓形成を助長して生存期間を短縮させる、などの報告があり、新しい米国のガイドラインでは、Ｅｐｏや類似薬剤の投与に、より厳しい基準が適用されるようになっている。しかし、これらのＥｐｏの作用に関しては、臨床の統計的データの他には根拠となる動物実験などのデータが乏しく、有用な実験系の確立が望まれていた。【０００４】
一方、肝細胞由来細胞株を使ったＥｐｏ遺伝子の発現制御の研究から低酸素誘導性転写因子ＨＩＦ：  ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒが同定され、この因子は現在ではエネルギー代謝から炎症、発生、発癌など広範囲の生命活動に重要な因子となっている。腎臓でＥｐｏを産生しているのは少数の特殊な細胞であり、そこには組織特異性と低酸素反応性を規定する未知の因子が働いていることが予想されており、その解明が種々の疾患の病態解明や治療法の開発につながる可能性も高い。しかし、通常の飼育環境ではＥｐｏの産生は非常に低く抑えられているため、脱血やフェニルヒドラジン投与による貧血誘導や、低酸素室での飼育などのＥｐｏ産生刺激を与えなければ、Ｅｐｏ産生細胞の同定や解析ができない状況が長期間続いていた。【０００５】
さらに、Ｅｐｏによる細胞の増殖や生存の制御に関する報告は多いが、Ｅｐｏによる分化誘導機構の研究は少ない。Ｅｐｏが発見された時代には、その受容体が赤血球系細胞に特異的に存在すると考えられ、それらの生存を支持することがＥｐｏの主作用であるとされてきた。その後の研究では、Ｅｐｏが赤血球分化のプログラムにも積極的な影響を与えているのではないかと考えられているが、その詳細なメカニズムはまだ解明されていない。また、高地環境や貧血など、血中Ｅｐｏ濃度の上昇に伴う赤血球造血はストレス造血と呼ばれ、マウスでは脾臓がその造血の場である。通常、定常造血ではＥｐｏ濃度は非常に低く保たれており、ストレス造血と定常造血では異なった分子機構が働くことが予想されるが、その詳細は不明である。さらに、炎症や癌に伴う慢性貧血ではＥｐｏ産生やＥｐｏ感受性が低下するが、その機構も不明である。【０００６】
これらの問題の解決には成体においてＥｐｏ産生を欠損するマウスの開発が望まれる。従来、腎性貧血の研究、及び、Ｅｐｏ産生の少ない実験動物を得るためには、腎臓の機能を低下させてＥｐｏ産生を低下させる方法が用いられてきた（非特許文献２〜４）。この方法では、ラットの腎臓の大部分を切除し、腎機能低下に伴うＥｐｏ産生低下と貧血を誘導するが、手術手技などに熟練が必要であり、また、時間がかかる手技であるため、十分な個体数を得るためには多くの労力を要した。【０００７】
Ｅｐｏ遺伝子ノックアウトマウスでは胎生期に重度貧血を呈して死亡するため、このような目的の解析には使用することができなかった（非特許文献５）。Ｅｐｏ遺伝子に緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ：Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子をノックインしたＥｐｏＧＦＰ／＋マウスを作製し、Ｅｐｏ産生細胞を標識するとともに、ヘテロ体同士を交配させ、ＥｐｏＧＦＰ／ＧＦＰマウスの表現系を検討したところ、最初に報告されたＥｐｏ遺伝子ノックアウトマウスとほぼ同様の表現系を示し、胎生１３日までに死亡した（非特許文献６）。【０００８】
成体におけるＥｐｏの作用を検討する目的で、条件付きノックアウトマウスを作成した（非特許文献６）。このマウスはｌｏｘＰ配列を挿入したＥｐｏ遺伝子を含む大腸菌人工染色体（ＢＡＣ；Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）によりＥｐｏＧＦＰ／ＧＦＰマウスの致死性をレスキューしたものであり、広汎にＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウスとの交配では胎生致死性が完全に再現された。また、このレスキューされたマウスに薬物誘導性のＣＲＥを発現させると、成体においてＥｐｏ発現の低下が認められた。他の研究室からもＥｐｏ遺伝子にｌｏｘＰ配列を直接挿入して薬物誘導性のＣｒｅリコンビナーゼを作用させた条件付きノックアウトマウスが報告された（非特許文献７）。しかし、これら両者の実験において、体内のＥｐｏ産生細胞すべてにおいてＥｐｏ遺伝子を組み換えることは困難であり、通常環境下で飼育したマウスの貧血は軽度であり、貧血誘導によるＥｐｏ産生誘導が認められ、反応性のヘマトクリット上昇も野生型とほぼ同様に認められた。さらに、離乳後に薬剤投与を始め、薬剤投与終了後、薬剤の影響が完全になくなった時点で解析が可能となるため、多数の個体を必要とする実験では労力と時間を要した。Ｅｐｏ産生の低酸素誘導性制御に必須とされるＨＩＦ２遺伝子についても条件付きノックアウトマウスが報告されており（非特許文献８）、Ｅｐｏ遺伝子の条件付きノックアウトマウスとほぼ同様の表現型であった。【０００９】
１９９３年にＭａｘｗｅｌｌらはＳＶ４０ウィルスのＴ抗原遺伝子を１６ｋｂのＥｐｏ遺伝子断片に挿入してトランスジェニックマウスを作成し、偶然、エリスロポエチン遺伝子座の５’非翻訳領域にトランスジーンの相同組み替えが起きた、とするマウスを報告した（ＥＰＯ-ＴＡｇｈ）（非特許文献９）。このマウスではＥｐｏ  ｍＲＮＡの５’ＵＴＲの配列の一部に続いてＳＶ４０のＴ抗原ｍＲＮＡが転写されており、その３‘側の遺伝子構築の詳細は不明であるが、ＥＬＩＳＡで検出できるＥｐｏ産生が存在することから、少量ながらＥｐｏ遺伝子の翻訳される部分についてはｍＲＮＡと蛋白質が作られていることが推察された。このマウスの血漿Ｅｐｏ濃度は通常環境では５５  ±  １８  ｐｇ／ｍｌ（野生型１２２  ±１６  ｐｇ／ｍｌ）と報告され、野生型よりも低下していたが、低酸素室での飼育では１６２  ±  ２５  ｐｇ／ｍｌ（野生型４６０  ±  ３９）であり、野生型の上昇に比較すると低値ではあるものの、有意に上昇しており、Ｅｐｏ遺伝子発現の低酸素誘導性も残存していると判断された（非特許文献１０）。最初の報告において、ホモ体ではヘマトクリット１３．２  ±  ３．３％と重度の貧血であった（非特許文献９）。その後のＥｐｏＴＡｇの報告では、ホモ体のヘマトクリットは１９．２  ±  ０．２％（非特許文献１１）と報告され、他の報告でも同程度であった（非特許文献１０、１２、１３）。ＥＰＯ-ＴＡｇｈヘテロ体のヘマトクリットは３４．４  ±  ３．５％と報告されており、ＥｐｏＴＡｇヘテロ体ではＥＰＯ-ＴＡｇｈ遺伝子座から産生される物質が、野生型のＥｐｏに対してドミナントネガティブに働いて貧血を引き起こしている可能性も示唆された。ＥＰＯ-ＴＡｇｈホモマウスは遺伝子治療などの研究に用いられているが、マウスＥｐｏに対する免疫応答も報告され、免疫原性の強いＳＶ４０  ＴＡｇを発現するために免疫系が活性化されていることが予想された（非特許文献１１）。これらの結果から、Ｅｐｏ-ＴＡｇマウスについては不明の点が多く、Ｅｐｏ産生不全マウスとしては標準的なものではないことが危惧された。【００１０】
Ｅｐｏ遺伝子を含むＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）を導入したトランスジェニックマウスＥｐｏ-ＢＡＣ-ＧＦＰ-Ｔｇを作成し、Ｅｐｏ  （ＧＦＰ／＋）マウスとの両者を用いて、成人のＥｐｏ産生の主要な臓器である腎臓のＥｐｏ産生細胞（ＲＥＰｓ，  Ｒｅｎａｌ  Ｅｐｏ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ）を同定し、それらが近位尿細管を取り囲むように存在する線維芽細胞様の細胞であり、神経マーカーを発現することを報告した（非特許文献１４及び１５）。【００１１】
過去のＥｐｏ産生制御機構に関する論文は肝がん由来細胞株を用いた研究によるものが多いが、ＲＥＰｓの性状や周囲の環境は肝臓細胞とはまったく異なっており、腎臓においては、肝臓とは異なったＥｐｏ産生制御機構が働いている可能性がある。Ｅｐｏ-ＢＡＣ-ＧＦＰ-Ｔｇマウスは、腎臓におけるＥｐｏ産生制御を解析する優れた実験動物であるが、実際に研究を進める際には、連日の脱血処置により貧血を誘導するか、低酸素室で飼育するなどの処置が必要であり、また、それらの処置により誘導される貧血には個体差が大きいことが難点であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｔａｋｅｄａ  Ａ，  Ｔａｄａ  Ｔ，  Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  Ｓ，  Ｍｏｇｉ  Ｙ，  Ｍａｔｓｕｉ  Ｎ．  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｎｇ  ｔｏ  ｈｉｇｈｅｒ  ｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｈｅｍｏｄｉａｌｙｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｎｏｔ  ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ：  ｔｈｅ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ．  ２００２；４０：１０４-１０９．
【非特許文献２】Ｇａｇｎｏｎ  ＲＦ，  Ｄｕｇｕｉｄ  ＷＰ．  Ａ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．  Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  １９８３；１１：１１-１４．
【非特許文献３】Ｇａｇｎｏｎ  ＲＦ，  Ｇａｌｌｉｍｏｒｅ  Ｂ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｕｒｅｍｉａ．  Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  １９８８；１６：１１９-１２６．
【非特許文献４】Ｇａｒｃｉａ  ＤＬ，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｓ，  Ｒｅｎｎｋｅ  ＨＧ，  Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＢＭ．  Ａｎｅｍｉａ  ｌｅｓｓｅｎｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｗｏｒｓｅｎｓ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｒｅｎａｌ  ｍａｓｓ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．  １９８８；８５：６１４２-６１４６．
【非特許文献５】Ｗｕ  Ｈ，  Ｌｉｕ  Ｘ，  Ｊａｅｎｉｓｃｈ  Ｒ，  Ｌｏｄｉｓｈ  ＨＦ．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ＢＦＵ-Ｅ  ａｎｄ  ＣＦＵ-Ｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｒｅｑｕｉｒｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｏｒ  ｔｈｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｃｅｌｌ．  １９９５；８３：５９-６７．
【非特許文献６】Ｓｈｕｎ  Ｙａｍａｚａｋｉ，  Ｎｏｒｉｏ  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｎａｏｓｈｉ  Ｏｂａｒａ，  Ｘｉａｏｑｉｎｇ  Ｐａｎ，  Ｉｋｕｏ  Ｈｉｒａｎｏ，  Ｋｏｕ-ｉｃｈｉ  Ｊｉｓｈａｇｅ，  Ｋｕｒｉｓｕ  Ｈｏｎｄａ，  Ｎａｏｋｏ  Ｍｉｎｅｇｉｓｈｉ，  ａｎｄ  Ｍａｓａｙｕｋｉ  Ｙａｍａｍｏｔｏ．  Ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ-Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｍｉｃｅ  Ｆｒｏｍ  Ａｎｅｍｉａ  ｂｙ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＢＡＣ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ．  Ｂｌｏｏｄ  （ＡＳＨ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ），  Ｎｏｖ  ２００９；  １１４：  ３６１４．
【非特許文献７】Ｚｅｉｇｌｅｒ  ＢＭ，  Ｖａｊｄｏｓ  Ｊ，  Ｑｉｎ  Ｗ，  Ｌｏｖｅｒｒｏ  Ｌ，  Ｎｉｓｓ  Ｋ．  Ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ-ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ａｎｅｍｉａ．  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ  ＆  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ
【非特許文献８】Ｋａｐｉｔｓｉｎｏｕ  ＰＰ，  Ｌｉｕ  Ｑ，  Ｕｎｇｅｒ  ＴＬ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｅｐａｔｉｃ  ＨＩＦ-２  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎ  ｒｅｎａｌ  ａｎｅｍｉａ．  Ｂｌｏｏｄ．  ２０１０；１１６：３０３９-３０４８．
【非特許文献９】Ｍａｘｗｅｌｌ  ＰＨ，  Ｏｓｍｏｎｄ  ＭＫ，  Ｐｕｇｈ  ＣＷ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｎａｌ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ-ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．  １９９３；４４：１１４９-１１６２．
【非特許文献１０】Ｅｌ  Ｈａｓｎａｏｕｉ-Ｓａａｄａｎｉ  Ｒ，  Ｐｉｃｈｏｎ  Ａ，  Ｍａｒｃｈａｎｔ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｎｅｍｉａ  ｉｎ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ-ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ  ｈｙｐｏｘｉａ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  -  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ＆  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．  ２００９；２９６：Ｒ８０１-８１１．
【非特許文献１１】Ｒｉｎｓｃｈ  Ｃ，  Ｄｕｐｒａｚ  Ｐ，  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＢＬ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｂｙ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｍｙｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｎｅｍｉａ．  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．  ２００２；６２：１３９５-１４０１．
【非特許文献１２】Ｂｉｎｌｅｙ  Ｋ，  Ａｓｋｈａｍ  Ｚ，  Ｉｑｂａｌｌ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｏｎｇ-ｔｅｒｍ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｎｅｍｉａ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｈｙｐｏｘｉａ-ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｂｌｏｏｄ．  ２００２；１００：２４０６-２４１３．
【非特許文献１３】Ｇｒｕｂｅｒ  Ｍ，  Ｈｕ  Ｃ-Ｊ，  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＲＳ，  Ｂｒｏｗｎ  ＥＪ，  Ｋｅｉｔｈ  Ｂ，  Ｓｉｍｏｎ  ＭＣ．  Ａｃｕｔｅ  ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ａｂｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｆ-２｛ａｌｐｈａ｝  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ａｎｅｍｉａ．  ＰＮＡＳ．  ２００７；１０４：２３０１-２３０６．
【非特許文献１４】Ｓｕｚｕｋｉ  Ｎ，  Ｏｂａｒａ  Ｎ，  Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｍ，  Ｈｅｌｍｕｔ  Ｓ，  Ｂｅｒｎｈａｒｄ  Ｂｎ．  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ［ｈｙｐｈｅｎ  （ｔｒｕｅ  ｇｒａｐｈｉｃ）］Ｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ  Ｍｉｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．  Ｖｏｌ．  Ｖｏｌｕｍｅ  ４３５：  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；  ２００７：１５７-１７７．
【非特許文献１５】Ｏｂａｒａ  Ｎ，  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｎ，  Ｋｉｍ  Ｋ，  Ｎａｇａｓａｗａ  Ｔ，  Ｉｍａｇａｗａ  Ｓ，  Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｍ．  Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ＧＡＴＡ  ｂｏｘ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ-ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｂｌｏｏｄ．  ２００８；１１１：５２２３-５２３２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、Ｅｐｏの産生低下に伴う貧血を自然発症するモデル動物を確立し、Ｅｐｏの作用メカニズムや、Ｅｐｏ産生低下に伴う疾患状態の新たな治療方法の研究に有用な実験動物系を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従来Ｅｐｏ遺伝子をホモで欠損したマウスは胎生致死であるため、成体において内在性のＥｐｏ産生を遺伝的に欠損したマウスは得られていなかった。発明者らは、ＧＦＰ遺伝子の挿入によりホモでＥｐｏ遺伝子を欠損したマウスに、非翻訳領域の一部を欠失させたＥｐｏ遺伝子を導入することで、胎生致死をレスキューすることを検討した。その結果、偶然にもレスキューされたマウスのなかに、出生後にＥｐｏ産生が低下し、重度の貧血を自然発症するマウスが得られた。【００１５】
このレスキューマウスを解析した結果、内因性のＥｐｏ産生をほとんど欠いていること、胎生期には導入遺伝子によってＥｐｏ産生が補われる結果、胎生致死を回避できることが確認された。【００１６】
すなわち、本発明は出生後に貧血を自然発症することを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。【００１７】
前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、出生後の血中エリスロポエチン（Ｅｐｏ）濃度が低下していることを特徴とする。【００１８】
ある実施形態において、前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、遺伝子改変によって出生後の腎臓におけるＥｐｏ産生が抑制されている。【００１９】
前記遺伝子改変としては、たとえば、内在性のＥｐｏ遺伝子をノックアウトし、かつ腎臓での発現が抑制されたＥｐｏ遺伝子を外部からトランスジーンとして導入する操作を含む。【００２０】
前記トランスジーンは、好ましくは、Ｅｐｏ遺伝子の転写開始点の上流３．３ｋｂから下流４．５ｋｂまでを含む。【００２１】
ある実施形態において、前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、内在性のＥｐｏ遺伝子がノックアウトされると同時に、レポーター遺伝子がノックインされている。
レポーター遺伝子の好適な例としては、たとえばＧＦＰ遺伝子を挙げることができる。【００２２】
非ヒト哺乳動物は、特に限定されないが、たとえばマウスが好ましく、例えば実施例で示す４５８系統のマウスが好ましい。【００２３】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の一例として、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３４７として寄託されている受精卵から作製されるマウスを挙げることができる。【００２４】
本発明は、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物に由来する組織又は細胞、前記組織又は細胞から樹立された細胞株も提供する。【００２５】
本発明はまた、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物から調製された受精卵も提供する。そのような受精卵の例としては、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３４７で特定される受精卵を挙げることができる。【００２６】
本発明はまた、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物から単離されたＥｐｏ産生細胞も提供する。前記Ｅｐｏ産生細胞としては、腎臓由来のＥｐｏ産生（ＲＥＰ）細胞が挙げられる。
さらに本発明は、以下の工程を含む、Ｅｐｏ産生細胞を製造する方法を提供する；
（ａ）請求項６から１０のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する工程、
（ｂ）  前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物から組織又は細胞を単離する工程、
（ｃ）  前記組織又は細胞の中から、レポーター遺伝子が発現している細胞を検出する工程、及び
（ｄ）  前記レポーター遺伝子が発現している細胞を単離する工程。【００２７】
さらに本発明は、以下の工程を含む、Ｅｐｏ産生促進活性物質のスクリーニング方法を提供する；
（ａ）被検物質を、請求項１７に記載の方法で製造されたＥｐｏ産生細胞に接触させる工程、
（ｂ）前記Ｅｐｏ産生細胞におけるレポーター遺伝子の発現を検出する工程、及び
（ｃ）対照と比較して、レポーター遺伝子の発現を促進する活性を有する被検物質を選択する工程。
【発明の効果】
【００２８】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物（マウス等）は、出生後に自然にＥｐｏ産生が低下してほとんど検出できないレベルに達することから、内在性のＥｐｏの影響を無視できる動物実験系として利用できる。また、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物では、ＧＦＰの蛍光の減衰を指標にＥｐｏ産生を容易に確認することができる。それゆえ、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、赤血球造血因子、定常造血とストレス造血、Ｅｐｏの造血外作用等の研究に加えて、腎性貧血や慢性貧血等のＥｐｏが関連する疾患の治療法の開発に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】３．３Ｋ-Ｅｐｏ３’トランスジーンの構築を示す図である。両矢頭で示す部分は、内在性Ｅｐｏ遺伝子と区別するために欠失させた３’ＵＴＲ内の３１０-ｂｐの領域を示す。
【図２】ターゲッティングコンストラクトを示す図である。Ｅｐｏ遺伝子の第２〜４エクソンがＥＧＦＰ（クロンテック）遺伝子に置換されている。Ｅｐｏ（ｗｔ）：野生型のＥｐｏ遺伝子座、Ｅｐｏ（ＧＦＰｎ）：ターゲッティングベクターによりターゲッティングされた状態のＥｐｏ遺伝子座、Ｅｐｏ（ＧＦＰ）：最終的にＧＦＰがノックインされたＥｐｏ遺伝子座。
【図３】Ｅｐｏ（ＧＦＰ／ＧＦＰ）マウスのトランスジェニックレスキュー実験を示す図である。
【図４】レスキュー実験から得られた産仔のＰＣＲ遺伝子型決定を示す図である。Ｅｐｏ-ＧＦＰ（ノックアウトアリル：図２の両矢頭領域に該当する）、３．３Ｅｐｏ-Ｔｇ（矢頭で示すバンド、トランスジーンにおいて欠失させた領域：図１の両矢頭領域に該当する）、Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ（野生型Ｅｐｏ遺伝子アリルに特有の配列：図２の＊に該当）。
【図５】レスキュー実験から得られた産仔における各遺伝子型の割合を示す図である。
【図６】８〜１０週齢のレスキューマウスのＨｃｔ値（％）を示す図である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５（Ｅｐｏ（＋／＋）マウスとの比較）
【図７】８〜１０週齢のレスキューマウスの血漿中におけるＥｐｏ濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す図である。
【図８】１週齢から１０週齢までの赤血球数（ｘ１０６／μＬ）とＨｃｔ値（％）の経時変化を示す図である。−○−：コントロールのＥｐｏ（ＧＦＰ／＋）マウス、−●−：Ｉ-Ｓａｍマウス；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５
【図９】１週齢から４週齢までの血漿中のＥｐｏ濃度を示す図である。左：コントロールのＥｐｏ（ＧＦＰ／＋）マウス、右：Ｉ-Ｓａｍマウス。
【図１０】１週齢の肝臓におけるＥｐｏ発現レベルを示す図である。グラフ左：コントロールのＥｐｏ（ＧＦＰ／＋）、中央：Ｅｐｏ（ＧＦＰ／＋）：Ｔｇマウス、右：Ｉ-Ｓａｍマウス。
【図１１】胎生１３日における胎仔所見を示す図である。左：コントロールのＥｐｏ（ＧＦＰ／＋）マウス、中央：Ｅｐｏ（ＧＦＰ／ＧＦＰ）マウス、右：Ｉ-Ｓａｍマウス。
【図１２】胎生１３日における胎仔肝臓のＥｐｏ発現レベルを示す図である。左から、Ｅｐｏ（ＧＦＰ／ＧＦＰ）マウス、コントロールのＥｐｏ（ＧＦＰ／＋）マウス、Ｅｐｏ（ＧＦＰ／＋）：Ｔｇマウス、Ｉ-Ｓａｍマウス。３．３Ｅｐｏ-Ｔｇ（トランスジーンにおいて欠失させた領域：図１の両矢頭領域に該当する）、ｅｎｄｏ−Ｅｐｏ（内在性Ｅｐｏ）、ＨＰＲＴ（ハウスキーピング遺伝子）＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５
【図１３】Ｉ-Ｓａｍの生存率を示す図である。
【図１４】Ｉ-Ｓａｍの血液データを示す（Ａ：８〜１０週齢、Ｂ：１年齢）。
【図１５】Ｅｐｏ遺伝子のコピー数を示す図である。１：Ｅｐｏ（＋／−）、２：Ｅｐｏ（＋／＋）、３〜９：トランスジーン（Ｔｇ）を１コピー持つＩ-Ｓａｍ（ヘミ接合体）、１０〜１３：Ｔｇを２コピー持つＩ-Ｓａｍ（ホモ接合体）。
【図１６】ホモ接合体のＩ-ＳａｍのＨｃｔ値（％）を示す図である。Ｉ-Ｓａｍｈｏｍｏ：トランスジーン（Ｔｇ）を２コピー持つＩ-Ｓａｍ、Ｉ-Ｓａｍｈｅｍｉ：Ｔｇを１コピー持つＩ-Ｓａｍ。
【図１７】血漿中Ｅｐｏ濃度を示す図である。
【図１８】Ｉ-Ｓａｍの全身におけるＥｐｏ発現を示す図である。左から、腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ）、肝臓（Ｌｉｖｅｒ）、脳（Ｂｒａｉｎ）、精巣（Ｔｅｓｔｉｓ）、胸腺（Ｔｈｙｍｕｓ）、心臓（Ｈｅａｒｔ）、肺（Ｌｕｎｇ）、胃（Ｓｔｏｍａｃｈ）、腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、筋肉（Ｍｕｓｃｌｅ）、貧血時の腎臓（Ａｎｅ，Ｋｉｄ：１００とした）。
【図１９】Ｉ-Ｓａｍの全身におけるＧＦＰ発現を示す図である。左から、腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ）、肝臓（Ｌｉｖｅｒ）、脳（Ｂｒａｉｎ）、精巣（Ｔｅｓｔｉｓ）、胸腺（Ｔｈｙｍｕｓ）、心臓（Ｈｅａｒｔ）、肺（Ｌｕｎｇ）、胃（Ｓｔｏｍａｃｈ）、腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、筋肉（Ｍｕｓｃｌｅ）、貧血時の腎臓（Ａｎｅ，Ｋｉｄ：１００とした）。
【図２０】Ｉ-Ｓａｍの腎臓と肝臓におけるＧＦＰ発現細胞を示す図である。４％パラホルムアルデヒドで固定した組織から凍結切片を作成し、共焦点蛍光顕微鏡により観察した（左：腎臓、右：肝臓）。
【図２１】Ｉ-Ｓａｍの大脳の多重蛍光免疫染色を示す図である。ＧＦＰ：抗ＧＦＰ抗体による染色像、ＤＡＰＩ：ＤＡＰＩによる核染色像、ＮｅｕＮ：抗ＮｅｕＮ抗体による核染色像、ＧＦＡＰ：抗ＧＦＡＰ抗体による染色象、矢印：ＧＦＰとＧＦＡＰの両者を発現する細胞。
【００３０】
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１１−０８３６６４号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
１．定義
本明細書において、「Ｅｐｏ（ＧＦＰ／ＧＦＰ）マウス」とは、Ｅｐｏ遺伝子の第２エクソンにＧＦＰｃＤＮＡ配列とｐｏｌｙＡ配列が挿入された遺伝子Ｅｐｏ（ＧＦＰ）（図２）をホモに持つマウスであり、ノックインノックアウトマウスとも呼ばれる。マウスはＥｐｏ欠損を示し、Ｅｐｏ遺伝子の転写時にＧＦＰを発現する。この遺伝子変異は遺伝子相同組み換え法とＣｒｅ／ｌｏｘＰ法により作成され（図２）、Ｅｐｏ（ＧＦＰ／＋）マウスとはそのヘテロ体である。
【００３２】
本明細書において、「３．３Ｋ-Ｅｐｏ-３’」とは、トランスジェニックマウス作成時に受精卵に導入された遺伝子断片であり、Ｅｐｏ遺伝子の転写開始点の上流３．３ｋｂから下流４．５ｋｂを含み、本来のＥｐｏ遺伝子と区別するために第５エクソンの非翻訳領域を一部欠失している（図１、図４参照）。
【００３３】
本明細書において、「トランスジーン」とは、トランスジェニックマウスの持つ導入遺伝子（外部から導入された遺伝子）であり、本発明では３．３Ｋ-Ｅｐｏ３’と同等である。
【００３４】
本明細書において、「レポーター遺伝子」とは、標的遺伝子プロモーター支配下に連結され、そのプロモーター活性の検出を可能にする遺伝子である。本発明においては、レポーター遺伝子は、Ｅｐｏ遺伝子がノックアウトされるように、標的遺伝子であるＥｐｏ遺伝子プロモーター支配下に連結される。
【００３５】
レポーター遺伝子は、宿主において産生しうる他のいかなるタンパク質とも明確に区別可能な、レポータータンパク質をコードするものであればよい。好ましくは、形質転換前の細胞が当該レポータータンパク質と同一または類似のタンパク質をコードする遺伝子を持たないようなものがよい。より好ましくは、外来の基質と特異的に反応することにより定量的測定が容易な代謝産物を生じるような酵素等をコードする遺伝子である。そのようなレポーター遺伝子としては、例えば、ａ）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ｂ）ホタルルシフェラーゼ、ｃ）β−ガラクトシダーゼ、ｄ）分泌型アルカリホスファターゼ、ｅ）緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）やその改変型等が挙げられる。
【００３６】
とくに、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）は自らが蛍光を発するため直接定量が可能なレポーター遺伝子であり、その改変型も市販されており、そのような改変型も含めて、本明細書では「ＧＦＰ」と記載する。
【００３７】
本明細書において、「３．３Ｋ-Ｅｐｏ３’トランスジェニックマウス」とは、上記３．３Ｋ-Ｅｐｏ３’領域のトランスジーンを持つトランスジェニックマウスであり、３．３Ｋ-Ｅｐｏ３’Ｔｇ、あるいはＴｇと省略される（図１、図３参照）。
【００３８】
本明細書において、「Ｅｐｏ（ＧＦＰ／ＧＦＰ）  ：  ３．３Ｋ-Ｅｐｏ３’マウス」とはＥｐｏ遺伝子ノックインノックアウトホモマウスであって、トランスジェニックマウス由来の３．３Ｋ-Ｅｐｏ３’を持つマウスである。３ラインのうち２ラインは成体における貧血を呈さず、Ｅｐｏ産生は通常飼育下では正常量認められ、むしろ多血症傾向である（図５、図６、図７参照）。
【００３９】
本明細書において、「Ｉ-Ｓａｍ  （Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ-Ｓｕｐｅｒ  ａｎｅｍｉｃ  ｍｏｕｓｅ）」又は「Ｅｐｏ欠損ＧＦＰ貧血マウス」とは、Ｅｐｏ（ＧＦＰ／ＧＦＰ）  ：  ３．３Ｋ-Ｅｐｏ３’マウスの１ラインであり、次の特徴を持つマウスラインである。
【００４０】
「Ｉ-Ｓａｍ」は、Ｅｐｏ（ＧＦＰ／ＧＦＰ）の胎生致死性を回避して出生する（図５）。生後８−１０週以降の血漿Ｅｐｏは検出できないか、非常に低く、重度の貧血を呈する（図７、８）。Ｅｐｏ産生の低下による重度の貧血によりＥｐｏ（ＧＦＰ）遺伝子からの転写が亢進し、本来Ｅｐｏ産生能力を持つ細胞がＧＦＰにより標識されている（図１８−２０参照）。
【００４１】
本明細書において、「非ヒト哺乳動物」とは、ヒト以外の霊長類を含む哺乳動物を意味する。特に、ラットやマウス等のゲッ歯動物が簡便であり、特にマウスが好適である。
【００４２】
本明細書において、「貧血」とは、血液中の赤血球が欠乏すること、及びそれにより起こる諸症状を意味する。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関しては、野生型の正常値と比較して、赤血球数及び／又はヘマトクリット値が少なくとも２割、好ましくは４割、特に好ましくは６割以上低下している状態を意味する。
【００４３】
２．本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物
本発明は、出生後にエリスロポエチン（Ｅｐｏ）産生が低下することで、貧血を自然発症することを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。
【００４４】
２．１  特徴
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物（マウス等）は、出生後に自然にＥｐｏ産生が低下してほとんど検出できないレベルに達し、貧血を自然発症する。そのため、生後２−３ヶ月以上であれば、内在性のＥｐｏの影響を無視できる動物実験系として利用できる。したがって、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、赤血球造血因子の研究、定常造血とストレス造血の研究、Ｅｐｏの造血外作用の研究、慢性的な重度の貧血と組織反応の研究に有用な実験動物である。
【００４５】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、Ｅｐｏ−ＧＦＰノックイン遺伝子をホモで有し、組み込まれたＧＦＰの蛍光により、Ｅｐｏ遺伝子座の転写量を検出することができる。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物では、重度の貧血により、Ｅｐｏ遺伝子座の転写は常に大きく刺激された状態にあり、潜在的な能力を持つ細胞も含めて、腎臓や肝臓、さらにその他の組織のＥｐｏ産生能力を持つ細胞がＧＦＰにより標識されている。
【００４６】
上記のとおり、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物では、Ｅｐｏ遺伝子座の転写は常に大きく刺激された状態にあるが、遺伝子改変によって出生後の腎臓におけるＥｐｏタンパク自体の産生は抑制された状態にある。
【００４７】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物では、出生前においては、外部から導入された遺伝子によって、肝臓等で外来性のＥｐｏ産生が起きるため、Ｅｐｏ不足やそれに伴う貧血による致死を免れる。
【００４８】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いてＥｐｏ産生制御の研究を行い、未知の因子がＥｐｏ産生を制御することが明らかになれば、当該因子を新しい治療の分子標的として活用できる。また、腎機能障害や慢性炎症、担がんなどの実験モデルを組み合わせることにより、ＧＦＰの蛍光の減衰を指標に腎性貧血や慢性貧血の分子機構の解明を目指すことができる。
【００４９】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いて治療法を検討することができる疾患としては、限定されるものではないが、貧血や組織酸素分圧の変動が原因となる疾患があげられる。貧血としては、限定されるものではないが、腎不全又は末期腎疾患に関連する貧血、化学療法又は放射線療法に起因する貧血、慢性疾患、例えば、慢性感染症、自己免疫疾患、関節リウマチ、ＡＩＤＳ、悪性腫瘍による貧血、未熟児貧血、甲状腺機能低下症による貧血、鉄欠乏症などの栄養障害による貧血、及び、血液障害に関連する貧血があげられる。また、組織酸素分圧の変動が原因となる疾患としては、未熟児網膜症、及び、虚血性疾患、たとえば、脳梗塞、脳塞栓症、心筋梗塞などがあげられる。
【００５０】
２．２  「Ｉ-Ｓａｍ（Ｅｐｏ欠損ＧＦＰ貧血マウス）」
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の一つの実施形態として、上記した「Ｉ-Ｓａｍ（Ｅｐｏ欠損ＧＦＰ貧血マウス）」を挙げることができる。
【００５１】
「Ｉ-Ｓａｍ（Ｅｐｏ欠損ＧＦＰ貧血マウス）」は、本来Ｅｐｏ産生能を持つ細胞がＥｐｏ遺伝子にノックインされたＧＦＰ遺伝子によって標識されているマウスである。当該マウスでは、重度の貧血によりＥｐｏ遺伝子座の転写が活性化されているため、全身のＥｐｏを産生する能力をもつ細胞の多くがＧＦＰを発現しており、実際に腎臓のＧＦＰ陽性細胞は瀉血による貧血などで見られるよりも非常に増加している。血中Ｅｐｏ濃度は出生後徐々に低下し、生後８-１０週では検出できないか非常に低値となる。
【００５２】
通常内在性のＥｐｏ産生をホモ欠損するマウスは胎生致死となり、成体の実験には使用できない。そこで、本発明ではトランスジーンからのＥｐｏ産生により胎仔期の貧血による致死性を回避させ、出生後Ｅｐｏ産生が消失するマウス（「Ｉ-Ｓａｍ（Ｅｐｏ欠損ＧＦＰ貧血マウス）」）を作成することで、目的を達成する。本発明では、腎臓など生後の主要なＥｐｏ産生組織において、導入トランスジーンが転写活性を持たないことを利用する。この点で、通常の条件付きノックアウトの方法とは異なる手法を用いている。このトランスジーンの活性は、導入した遺伝子領域とその挿入部位の染色体位置効果の両者によるものである。
【００５３】
「Ｉ-Ｓａｍ（Ｅｐｏ欠損ＧＦＰ貧血マウス）」は、Ｅｐｏ（ＧＦＰ／ＧＦＰ）マウスへのＥｐｏ遺伝子トランスジーン導入によるレスキュー実験の中から見いだされたものである。胎児期には導入されたトランスジーンの活性により  Ｅｐｏ産生が起こり胎生致死を免れるが、出生後はＥｐｏ産生能力が失われて重度の貧血を呈する。
【００５４】
「Ｉ-Ｓａｍ（Ｅｐｏ欠損ＧＦＰ貧血マウス）」は、Ｅｐｏ遺伝子断片（上流３．３ｋｂから下流４．５ｋｂまで）の領域が導入されている。同じ領域を用いて数ラインのトランスジェニックマウスを作製した中で、レスキュー実験により同様の表現系を呈するのは１ラインのみであり、トランスジーンの活性はその挿入部位付近の染色体構造の影響を受けると考えられる（染色体位置効果）。
【００５５】
「Ｉ-Ｓａｍ（Ｅｐｏ欠損ＧＦＰ貧血マウス）」は成育には大きな異常を認めず、寿命も野生型マウスと大きな差はない。雌雄とも生殖能力は低下せず、「Ｉ-Ｓａｍ（Ｅｐｏ欠損ＧＦＰ貧血マウス）」の交配により効率よく同じ表現系のマウスを得ることができる。さらに、Ｅｐｏ（ＧＦＰ／＋）ヘテロマウスとの交配により、貧血を呈さない同腹コントロールが得られる。「Ｉ-Ｓａｍ（Ｅｐｏ欠損ＧＦＰ貧血マウス）」の腎臓の形態や組織像には大きな異常を認めず、血清クレアチニン値は正常である。心肥大を認めるが、貧血による二次的なものであると考えられる。
【００５６】
Ｅｐｏ遺伝子にＧＦＰ遺伝子を相同組み換えしたＥｐｏ（ＧＦＰ／ＧＦＰ）ノックインマウスを利用することにより、Ｅｐｏ遺伝子座の転写状況をＧＦＰの蛍光によって把握する。通常の条件ではＥｐｏ産生は強く抑制されているが、「Ｉ-Ｓａｍ（Ｅｐｏ欠損ＧＦＰ貧血マウス）」では、Ｅｐｏ欠損による貧血により、本来Ｅｐｏ産生能を持つはずの細胞の多くでＥｐｏ遺伝子座の転写が刺激されＧＦＰの発光が検出される。
【００５７】
なお、「Ｉ-Ｓａｍ（Ｅｐｏ欠損ＧＦＰ貧血マウス）」と正常マウスを交配して作成された受精卵は、２０１１年３月１日付にて、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３４７として寄託されている。
【００５８】
本発明の貧血マウスは、上記受精卵から得られたマウスを自然交配して得ることができる。詳細に説明すると、この受精卵は確率的にＥｐｏ（ＧＦＰ/＋）４５８Ｔｇ＋とＥｐｏ（ＧＦＰ/＋）４５８Ｔｇ−が５０：５０で含まれるが、ＥｐｏもＴｇ遺伝子もメンデル遺伝し、Ｅｐｏ（ＧＦＰ/ＧＦＰ）４５８Ｔｇ−は胎生致死である。よって、上記受精卵から得られたマウス同士で自然交配させると、Ｅｐｏ（ＧＦＰ/＋）４５８Ｔｇ＋同士の交配の場合は確率的に１/５で、Ｅｐｏ（ＧＦＰ/＋）４５８Ｔｇ＋とＥｐｏ（ＧＦＰ/＋）４５８Ｔｇ−の交配の場合は確率的に１/７で、生まれてくる子供は貧血マウスとなる。
【００５９】
２．３  本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の利用方法
（１）内在性のＥｐｏの影響を無視できる動物実験系
赤血球造血因子の解析には動物を使った投与実験は必須であるが、通常の動物実験では内在性のＥｐｏの影響を排除することが困難であった。また、従来の赤血球造血の研究はＥｐｏ依存性のストレス造血を中心に解析が進められてきたが、定常造血ではごく少量のＥｐｏ存在下に造血が進み、Ｅｐｏ非依存性の赤血球分化が起きている可能性も否定はできない。コロニーアッセイなど細胞培養系における検討においても、通常の動物由来の細胞では、体内でＥｐｏによる刺激を受けており、この影響がどの程度かを検討する方法が存在しなかった。Ｅｐｏ遺伝子ノックアウトマウスの胎仔肝臓細胞の解析は可能であるが、胎児期の造血と成体の造血の分子機構は大きく異なっており、成体造血組織を用いた解析の必要性があった。
【００６０】
近年、Ｅｐｏ投与症例数の拡大にともない、癌や動脈硬化病変へのＥｐｏの好ましからざる作用が報告され、米国血液学会の出した新しいガイドラインなどではその適応基準が非常に厳しくなっている。その根拠は臨床例の統計的解析のみであり、実験動物の系を使ってその妥当性を検討する必要がある。また、組織保護目的でのＥｐｏの利用に関しても、因果関係や作用機序を動物実験によって確認する必要がある。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、上記した実験動物系として好適に利用できる。
【００６１】
（２）組織に内在するＥｐｏ産生能とそれを刺激又は抑制する経路や物質の研究に利用できる実験動物系
内在性のＥｐｏ産生を刺激する薬剤の開発が行われているが、通常の免疫染色では少量のＥｐｏを産生する細胞を検出することは難しく、また、使用する抗体によっては特異性に問題がある可能性もあり、細胞レベルでＥｐｏ産生の誘導を確認する簡便な方法が存在しなかった。
【００６２】
腎性貧血の病態形成については、腎不全に伴う尿毒症物質の蓄積がＥｐｏ産生を障害するという説や、線維化などの組織構築の変化によりＥｐｏ産生細胞が失われるとする説があったが、その実態は不明であった。また、透析患者においてＥｐｏが不要になる患者が存在することが明らかになったが、腎機能とＥｐｏ産生について検討する有用な動物実験系がなかった。さらに、慢性炎症、担癌状態に伴う貧血にはＥｐｏ産生やＥｐｏ感受性の変化が関わるが、その機序を解明し治療法を見いだす有用な実験動物が必要であった。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、上記した実験動物系として好適に利用できる。
【００６３】
（３）慢性的な組織低酸素に対する反応の解析に役立つ実験動物系
慢性的な重度の貧血を呈する実験動物は数少ない。特に、成長期を過ぎるとほぼ一定の重度貧血となり、炎症症状などを認めず、寿命や生殖が保たれた実験動物は少ない。慢性的な貧血による組織の酸素不足が組織にどのような影響を与えるか、さらにそれに対する低酸素応答系などの組織の反応については解析可能な実験動物が存在しなかった。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、上記した実験動物系として好適に利用できる。
【００６４】
（４）脳内Ｅｐｏ産生を刺激する薬剤のスクリーニング
Ｉ−Ｓａｍでは、重度の貧血のため、脳も低酸素状態にあり、星状細胞においてＥｐｏ遺伝子にノックインされたＧＦＰ遺伝子の発現が見られる。神経細胞に隣接するグリア細胞から産生されたＥｐｏが、脳血管関門を介さずパラクライン的に働くことが予想されることから、Ｉ−Ｓａｍを用いて、脳梗塞治療などを想定した神経系の虚血／再還流実験等を行うことで、脳内Ｅｐｏ産生を刺激する薬剤をスクリーニングできる。Ｅｐｏの全身投与はヘモグロビンを増加させ、血液の粘稠度を増して脳梗塞の再発を誘発する可能性があるが、脳内Ｅｐｏ産生を特異的に刺激する薬剤であればその可能性は低い。それゆえ、Ｉ−Ｓａｍを用いたスクリーニング系は、安全で効果的な新規脳梗塞治療薬の探索に有用である。
【００６５】
３．本発明のＥｐｏ産生細胞
３．１  Ｅｐｏ産生細胞
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物から単離されたＥｐｏ産生細胞では、Ｅｐｏ発現の活性化をレポーター遺伝子を通じて簡便に検出することができる。それゆえ、本発明のＥｐｏ産生細胞は、Ｅｐｏ産生の制御メカニズムの研究や、後述するＥｐｏ産生促進活性物質のスクリーニング等に利用することができる。
【００６６】
Ｅｐｏ産生細胞は、Ｅｐｏを産生している組織や器官の細胞であれば特に限定されないが、例えば、腎臓や肝臓由来の細胞を挙げることができ、特に腎臓由来のＥｐｏ産生（ＲＥＰ：Ｒｅｎａｌ  Ｅｐｏ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ）細胞が好ましい。
【００６７】
３．２  Ｅｐｏ産生細胞の調製方法
本発明のＥｐｏ産生細胞は、例えば、（ａ）内在性のＥｐｏ遺伝子がノックアウトされると同時に、レポーター遺伝子がノックインされ、かつ腎臓での発現が抑制されたＥｐｏ遺伝子が外部からトランスジーンとして導入されているトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する工程、（ｂ）前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物から組織又は細胞を単離する工程、（ｃ）前記組織又は細胞の中から、レポーター遺伝子が発現している細胞を検出する工程、及び（ｄ）前記レポーター遺伝子が発現している細胞を単離する工程によって、調製することができる。
【００６８】
レポーター遺伝子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、ＧＦＰ、及び改変型ＧＦＰ等が挙げられるが、なかでもＧＦＰや改変型ＧＦＰが好ましい。
【００６９】
本発明においては、上記レポーター遺伝子は、Ｅｐｏ遺伝子プロモーター支配下にＥｐｏ遺伝子がノックアウトされるように連結される。
【００７０】
３．３  Ｅｐｏ産生促進活性物質のスクリーニング方法
本発明のＥｐｏ産生細胞を利用して、Ｅｐｏ産生促進活性物質をスクリーニングすることができる。そのようなスクリーニング方法は、例えば、（ａ）被検物質を、上記方法で製造されたＥｐｏ産生細胞に接触させる工程、（ｂ）前記Ｅｐｏ産生細胞におけるレポーター遺伝子の発現を検出する工程、及び（ｃ）対照と比較して、レポーター遺伝子の発現を促進する被検物質を選択する工程によって、実施することができる。
【００７１】
スクリーニングされたＥｐｏ産生促進活性物質は、上記したＥｐｏ産生の低下に伴う貧血や組織酸素分圧の変動が原因となる疾患の治療薬候補として有用である。
【実施例】
【００７２】
以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００７３】
［実施例１］
腎不全などにともなうＥｐｏ産生の低下は重度の貧血を引き起こす。このことは腎不全患者へのＥｐｏ投与によって貧血が劇的に改善したことによって明らかである。しかし、成体における赤血球造血がすべてＥｐｏ依存性であるかは明らかではないため、これについて検討を行った。【００７４】
１．実験・方法：
１．１  レスキューマウス（Ｉ−Ｓａｍ）の確立
（１）３．３Ｋ-Ｅｐｏ３’トランスジェニックマウス
マウスエリスロポエチン（Ｅｐｏ）遺伝子の転写開始点の上流３．３-ｋｂｐから下流４．５-ｋｂｐまでの領域をクローニングし、内在性Ｅｐｏ遺伝子と区別するために、３’ＵＴＲ内の３１０-ｂｐの領域を欠失させた（図１：両矢頭で示す部分）。このトランスジーンをマウス受精卵に顕微注入し、独立した異なる１０系統の３．３Ｋ-Ｅｐｏ３’トランスジェニックマウスを樹立した。【００７５】
（２）Ｅｐｏ（ＧＦＰ／＋）マウス
Ｅｐｏ遺伝子座にＧＦＰ  ｃＤＮＡが挿入された変異マウスを樹立するため、ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡ、ｌｏｘＰ配列に隣接したＭＣ１−Ｎｅｏカセット（Morita  M.  et  al.,  EMBOJ.  2003;  22(5):1134-1146.）、ＭＣ１−ＤＴ３カセット（Takahashi  S.  et  al.,  M.  J.Biol.  Chem.  1997;  272(19):12611-12615.）、及び１２９ＳＶマウス由来ゲノム配列（Imagawa  S,  et  al.,  Int.  J.  Hematol.  2002;75(4):376-381.）を有するターゲッティングベクターを作製した。本ターゲッティングベクターにおいては、Ｅｐｏ遺伝子の第２〜４エクソンがＥＧＦＰ（クロンテック）遺伝子に置換されている（図２）。【００７６】
ターゲッティングベクターの相同組換えを通して得られた変異ＥＳ細胞（遺伝子型Ｅｐｏ（ＧＦＰｎ／＋））をＣ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞に注入し、４系統の独立した生殖系列キメラマウスを作製した。ＭＣ１−Ｎｅｏカセットを切り出すため、遺伝子型Ｅｐｏ（ＧＦＰｎ／＋）のヘテロ接合体ノックインマウスを、生殖系列にＣｒｅリコンビナーゼを発現するＡｙｕ１−Ｃｒｅトランスジェニックマウスと交配し、遺伝子型Ｅｐｏ（ＧＦＰ／＋）マウスを得た。このＥｐｏ（ＧＦＰ／＋）マウスの交配を繰り返し、Ｅｐｏ遺伝子をホモでノックアウトしたＥｐｏ（ＧＦＰ／ＧＦＰ）を得た。これまでの報告と同様に、Ｅｐｏ（ＧＦＰ／ＧＦＰ）マウスは、重度の貧血を呈して胎生１３日頃までに死亡した。【００７７】
（３）Ｅｐｏ（ＧＦＰ／ＧＦＰ）マウスのトランスジェニックレスキュー
３．３Ｋ-Ｅｐｏ３’トランスジェニックマウスとＥｐｏ（ＧＦＰ／＋）マウスの交配を繰り返し、Ｅｐｏ（ＧＦＰ／ＧＦＰ）  ：  ３．３Ｋ-Ｅｐｏ３’マウス（レスキューマウス）が得られるかどうかを検証した（図３）。【００７８】
産仔からゲノムＤＮＡを抽出し、３種類のＰＣＲを行った。すなわち、Ｅｐｏ-ＧＦＰプライマーセットを用いて、ノックアウトアリルを検出し（図２の両矢頭）、３．３Ｅｐｏ-Ｔｇプライマーセット（同上）を用いて、トランスジーンにおいて欠失させた領域を検出し、野生型プライマーセット（同上）を用いて、野生型Ｅｐｏ遺伝子アリルに特有の配列（図２の＊）を検出した。トランスジーンにおいて欠失させた領域は、野生型Ｅｐｏ遺伝子アリルやノックアウトアリルよりも短いＰＣＲ産物として観察された（図４の矢頭で示すバンド）。【００７９】
用いたプライマーの配列を下記に記載する。
・Ｅｐｏ−ＧＦＰプライマーセット
ＧＦＰ−ｃｓ    ：  actctcggcatggacgagctg（配列番号１）
Ｅｐｏ−ＲＴＲ  ：  gtgagtgttcggagtggagcagg（配列番号２）
・３．３Ｅｐｏ−Ｔｇプライマーセット
Ｅｐｏ−５ＵＴＲｓ  ：  acaggaaggtctcacatagcc（配列番号３）
Ｅｐｏ−ｓ５        ：  tacagctaggagagttgtgtgg（配列番号４）
・野生型プライマーセット
Ｅｐｏ−５ＵＴＲｓ  ：  acaggaaggtctcacatagcc（配列番号３）
Ｅｐｏ−Ｂ６ａｓ    ：  tggggaaacccccatgagatc（配列番号５）【００８０】
レーン７及び８では、野生型Ｅｐｏ遺伝子アリルに特有の配列は観察されず、ノックアウトアリルとトランスジーンにおいて欠失させた領域のみ観察された。この結果から、Ｅｐｏ（ＧＦＰ／ＧＦＰ）  ：  ３．３Ｋ-Ｅｐｏ３’マウス（レスキューマウス）が出生することが確認された（図４：レーン７＆８）。【００８１】
（４）レスキュー実験から得られた産仔における各遺伝子型の割合
異なる４系統のトランスジェニックマウスを用いて、上記と同様のレスキュー実験を行い、得られた産仔における各遺伝子型の割合を調べた。その結果、３系統においてＥｐｏ（ＧＦＰ／ＧＦＰ）  ：  ３．３Ｋ-Ｅｐｏ３’（レスキューマウス）は期待値に従って出生することが確認された（図５）。これらのレスキューマウスは交配可能であり、得られる産仔も期待値に従って出生した。【００８２】
１．２  レスキューマウス（Ｉ-Ｓａｍ）の特徴
（１）Ｈｃｔ値（ヘマトクリット値）（％）
８〜１０週齢のレスキューマウスのＨｃｔ値（％）を調べた。４５８系統のレスキューマウスは重度の貧血を呈していたが、他の系統では多血症を示していた（図６）。以下、この４５８系統のレスキューマウスをＩ-Ｓａｍ（Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ-Ｓｕｐｅｒ  ａｎｅｍｉｃ  ｍｏｕｓｅ）と呼ぶ。【００８３】
（２）血漿中Ｅｐｏ濃度（ｐｇ／ｍＬ）
８〜１０週齢のレスキューマウスの血漿中のＥｐｏ濃度（ｐｇ／ｍＬ）を、Ｅｐｏ  ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ，  Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ  Ｅｐｏ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ)）を用いて測定した。Ｉ-ＳａｍはＥｐｏ濃度が検出限界以下であったが、他の系統のレスキューマウスでは、コントロールのＥｐｏ（ＧＦＰ／＋）と同程度かやや多い傾向のＥｐｏ濃度を示した（図７）。【００８４】
（３）赤血球数（ｘ１０６／μＬ）とＨｃｔ値（％）の経時変化
１週齢から１０週齢までの赤血球数（ｘ１０６／μＬ）とＨｃｔ値（％）の経時変化を調べた（図８）。コントロールのＥｐｏ（ＧＦＰ／＋）は、出生後の貧血状態から成長するにつれて赤血球量が上昇したが、Ｉ-Ｓａｍは、２週齢まではコントロールと比べて軽度の貧血を示すが、３週齢以降に徐々に赤血球量が減少し、一定の貧血レベルで保たれた。【００８５】
（４）１週齢から４週齢までの血漿中のＥｐｏ濃度
Ｉ-ＳａｍとＥｐｏ（ＧＦＰ／＋）について、１週齢から４週齢までの血漿中のＥｐｏ濃度を比較した（図９）。１週齢では、コントロールのＥｐｏ（ＧＦＰ／＋）と同程度のＥｐｏが検出されたが、２週齢以降になると、Ｉ-Ｓａｍの血漿Ｅｐｏ濃度は検出限界レベルまで低下した。【００８６】
（５）１週齢の肝臓におけるＥｐｏ発現レベル
内在性のＥｐｏ  ｍＲＮＡと３．３Ｋ-Ｅｐｏ３’トランスジーン由来のＥｐｏ  ｍＲＮＡの両方を検出するプライマーを用いて、Ｅｐｏ  ｍＲＮＡレベルを定量した（図１０）。Ｉ-Ｓａｍの肝臓においてＥｐｏ  ｍＲＮＡが検出され、コントロールのＥｐｏ（ＧＦＰ／＋）に比べて発現レベルが高かった。【００８７】
（６）胎仔所見（胎生１３日）
胎生１３日における胎仔の写真を図１１に示す。Ｅｐｏ（ＧＦＰ／ＧＦＰ）は胎仔肝臓における造血障害を起こすため、重度の貧血を呈し、胎生１３日前後に死亡する。一方、Ｉ-Ｓａｍは、胎仔肝臓の造血は回復し、コントロールのＥｐｏ（ＧＦＰ／＋）と同様の所見を認めた。【００８８】
胎生１３日における胎仔肝臓のＥｐｏ発現レベルをみたところ、Ｉ-Ｓａｍの胎仔肝臓ではＥｐｏ  ｍＲＮＡが検出され、その発現レベルはコントロールのＥｐｏ（ＧＦＰ／＋）に比べて２割程度であった（図１２）。このＩ-Ｓａｍの胎仔肝臓に発現するＥｐｏ  ｍＲＮＡは、３．３Ｋ-Ｅｐｏ３’トランスジーンに由来することを、内在性Ｅｐｏ  ｍＲＮＡと区別するプライマーを用いて確認された。【００８９】
（７）Ｉ-Ｓａｍの生存率
Ｉ-Ｓａｍの生存率は、Ｅｐｏ（ＧＦＰ／＋）マウスと有意差は認められなかった（図１３）。【００９０】
（８）Ｉ−Ｓａｍの血液データ
Ｉ−Ｓａｍの血液データは、コントロールのＥｐｏ（ＧＦＰ／＋）と比べて生後８〜１０週において赤血球数（ＲＢＣ）、ヘモグロビン濃度（ＨＧＢ）、ヘマトクリット値（ＨＣＴ）がいずれも低下しており重度の貧血を呈していた。生後１年においてもこれらの数値は変化しておらず、同様の貧血状態が持続されていた（図１４）。【００９１】
（９）Ｅｐｏ遺伝子のコピー数
ゲノムＤＮＡを用いて、リアルタイムＰＣＲ法によりＥｐｏ遺伝子の第４エクソン部分のコピー数を定量した（図１５）。内部標準として、別の染色体に位置するＧａｔａ２遺伝子を用いた。Ｅｐｏ（＋／−）のコピー数を１としたときに、Ｅｐｏ（＋／＋）が２コピーになることを確認した（グラフバー１＆２）。Ｉ-Ｓａｍ同士の交配により、トランスジーン（Ｔｇ）を１コピー持つＩ-Ｓａｍ（ヘミ接合体、グラフバー３〜９）と、Ｔｇを２コピー持つＩ-Ｓａｍ（ホモ接合体、グラフバー１０〜１３）が出生した。【００９２】
ホモ接合体のＩ-ＳａｍのＨｃｔ値（％）を測定したところ、２４週齢において、ホモ接合体（Ｉ-Ｓａｍｈｏｍｏ）は、ヘミ接合体（Ｉ-Ｓａｍｈｅｍｉ）と同様に重度の貧血を示すことが確認された（図１６）。【００９３】
（１０）Ｉ-Ｓａｍの血漿中Ｅｐｏ濃度
Ｉ-Ｓａｍの血漿中Ｅｐｏ濃度を、生後１０週と１年のマウスで測定した（図１７）。【００９４】
２．結果
Ｉ-Ｓａｍは生後１週から貧血を認める。その後、野生型では赤血球数、ヘマトクリットともに約２倍に増加するが、Ｉ-Ｓａｍは生後２週では多少増加するものの、その後減少し、生後８から１０週ではＨｃｔ  １４．２  ±  ３．０％  （生後８−１０週、同時期のコントロール  ４４．２  ±  ２．３  ％）と著しい貧血を呈する。（図８、１４）。血漿Ｅｐｏ濃度も同様に生後１週ではコンロトールとして用いたＥｐｏ（ＧＦＰ／＋）と同程度であったが、生後２週にコントロールではＥｐｏ濃度が上昇するのに対し、低下し、その後も低下したままであった（図９）。生後１０週のデータを示す（図１７）。この表現型は生後１年のＩ-Ｓａｍにおいても改善することも悪化することもなかった。【００９５】
Ｉ-Ｓａｍでは生後１週の血漿Ｅｐｏ濃度がコントロールと同程度かそれ以上であったので、胎仔期の主要なＥｐｏ産生臓器である肝臓におけるＥｐｏ  ｍＲＮＡの発現を定量ＲＴ-ＰＣＲ法により検討したところ、コントロールより増加傾向にあることがわかった（図１０）。【００９６】
Ｅｐｏ（ＧＦＰ／ＧＦＰ）マウスは胎生１３日には貧血を呈し、肝臓は白い。この時期の前後にＥｐｏ（ＧＦＰ／ＧＦＰ）マウスは胎生致死となる。一方、Ｉ-Ｓａｍはヘテロ体Ｅｐｏ（ＧＦＰ／＋）と同様に肝臓にヘモグロビンの赤を認め、血管内にも赤血球を認めた（図１１）。Ｉ-Ｓａｍはメンデル則に従って出生し、胎生致死性が回避されていた（図５）。【００９７】
胎生１３日の肝臓のＥｐｏ  ｍＲＮＡ発現を検討したところ、定量ＲＴ-ＰＣＲ法においてヘテロ体Ｅｐｏ（ＧＦＰ／＋）の約２割であり、トランスジーン由来であった（図１２）。【００９８】
Ｉ−Ｓａｍと正常マウスを交配して作成された受精卵は、２０１１年３月１日付にて、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３４７として国際寄託した。【００９９】
［実施例２］
成体におけるＥｐｏ産生臓器は腎臓と肝臓であるが、その他の臓器についてもＥｐｏ産生の報告が散見される。そこで、Ｉ-Ｓａｍマウスでは、重度の貧血があり、各組織において最大限に近い低酸素応答性のＥｐｏ遺伝子の転写活性誘導が起きていると予想し、Ｉ-ＳａｍとＥｐｏ（ＧＦＰ／＋）  各３匹の生後１２週マウスについてＥｐｏ発現とＧＦＰ発現を検討した。【０１００】
１．実験・方法
（１）Ｅｐｏ発現
１２週齢のＩ-ＳａｍとＥｐｏ（ＧＦＰ／＋）マウス各３匹の各臓器からＲＮＡを抽出し、逆転写を行った後に、定量的ＰＣＲ法によりＥｐｏ  ｍＲＮＡレベルを定量した。Ｅｐｏ（ＧＦＰ／＋）は、腎臓で低いレベルのＥｐｏ発現を認めるが、貧血時には腎臓の発現が強く誘導される（Ａｎｅ，Ｋｉｄ、１００とした）。【０１０１】
（２）ＧＦＰ発現
３匹の各臓器からＲＮＡを抽出し、逆転写を行った後に、リアルタイムＰＣＲ法によりＧＦＰ  ｍＲＮＡレベルを定量した。また、腎臓と肝臓について、４％パラホルムアルデヒドで固定した組織から凍結切片を作成し、共焦点蛍光顕微鏡により観察した。【０１０２】
２．結果
Ｅｐｏ  ｍＲＮＡの定量ＲＴ-ＰＣＲ法による解析では、重度の貧血にも関わらず、Ｉ-Ｓａｍでは腎臓、及び、肝臓でのＥｐｏ  ｍＲＮＡ発現を認めなかった。脳と精巣においてＥｐｏ  ｍＲＮＡ発現を認めた（図１８）。一方、ＧＦＰ  ｍＲＮＡの発現はＩ-Ｓａｍの腎臓と肝臓において強く、脳にも認められた（図１９）。Ｉ-Ｓａｍは慢性的な貧血を呈するため、Ｅｐｏ遺伝子座に導入されたＧＦＰ遺伝子の発現が強く誘導されていることが確認された。【０１０３】
Ｉ-Ｓａｍの腎臓と肝臓のＧＦＰ蛍光の観察を行ったところ、ＧＦＰの強い発現が認められた（図２０）。腎臓では、通常、Ｅｐｏ産生細胞は皮質髄質境界部の尿細管周囲間質細胞に限定して認められるが（Ｏｂａｒａ、２００８）、Ｉ-Ｓａｍでは尿細管間質細胞に限定して発現しているものの、皮質表面から髄質深部まで認められ、長期の重度貧血により、Ｅｐｏ産生能力を持つ細胞は増加し、その分布も変動することが示された。また、肝臓では中心静脈の周囲にＧＦＰ発現細胞が増加していることが確認された。【０１０４】
［実施例３］
Ｉ-Ｓａｍは慢性的な貧血により、脱血等の刺激無しで、Ｅｐｏ産生細胞でＧＦＰ遺伝子を発現している。腎臓、肝臓等のＥｐｏ遺伝子の発現が高い組織のほか、低レベルのＥｐｏ発現がみられる組織においても、ＧＦＰ遺伝子の発現によりＥｐｏ遺伝子の発現を容易に確認することができる。例として、脳組織中のＥｐｏ遺伝子の発現を解析した。【０１０５】
実施例２および図１９に示すように、ＧＦＰ遺伝子の発現が脳に認められたことから、大脳基底核部位を免疫組織染色法により解析した（図２１）。具体的には、ＧＦＰ陽性細胞がどのような細胞であるかを確認するため、Ｉ-Ｓａｍ脳組織中のＧＦＰ陽性細胞に対し、神経細胞マーカーであるＮｅｕＮ（神経細胞の核が染める）、又はアストロサイトマーカー（星状細胞）であるＧＦＡＰ（アストロサイトの細胞質を染める）で多重染色した。【０１０６】
多重免疫組織染色の結果、図２１に示されるように、大脳には、ＧＦＰ陽性の細胞が多数存在する。ＮｅｕＮ、ＧＦＡＰによる多重染色の結果、ＧＦＰとＧＦＡＰの両者を発現する細胞が見られ、ＧＦＰ陽性細胞の多くは、神経細胞ではなくグリア細胞であることが確認された。このことから、脳血管関門を介さず、神経細胞に隣接するグリア細胞から産生されたＥｐｏがパラクライン的に働くことで、大きな効果が発揮されている可能性がある。【０１０７】
よって、Ｉ−Ｓａｍを用いて、脳梗塞治療などを想定した神経系の虚血／再還流実験等を行うことで、脳内Ｅｐｏ産生を刺激する薬剤を評価・スクリーニングすることができる。Ｅｐｏの全身投与はヘモグロビンを増加させ、血液の粘稠度を増して脳梗塞の再発を誘発する可能性があるが、脳内Ｅｐｏ産生を特異的に刺激する薬剤であればその可能性は低い。よって、Ｉ−Ｓａｍは安全で効果的な新規脳梗塞治療薬の評価に有用である。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明のマウスによれば、内在性のＥｐｏの影響を受けることなく、組織に内在するＥｐｏ産生能とそれを刺激又は抑制する経路や物質の研究、慢性的な組織低酸素に対する反応解析を行うことができる。また、脳梗塞治療などを想定した神経系の虚血／再還流実験等を行い、脳内Ｅｐｏ産生を刺激する薬剤を、ＧＦＰ発現を指標に評価・スクリーニングすることができる。したがって、本発明のマウスは、赤血球造血因子、定常造血とストレス造血、Ｅｐｏの造血外作用等の研究に加えて、腎性貧血や慢性貧血等のＥｐｏが関連する疾患の治療法の開発等に利用できる。【０１０９】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【受託番号】
【０１１０】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３４７
【配列表フリーテキスト】
【０１１１】
配列番号１：プライマー（ＧＦＰ−ｃｓ）
配列番号２：プライマー（Ｅｐｏ−ＲＴＲ）
配列番号３：プライマー（Ｅｐｏ−５ＵＴＲｓ）
配列番号４：プライマー（Ｅｐｏ−ｓ５）
配列番号５：プライマー（Ｅｐｏ−Ｂ６ａｓ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2012137449.tif 000015
【図１５】
2012137449.tif 000016
【図１６】
2012137449.tif 000017
【図１７】
2012137449.tif 000018
【図１８】
2012137449.tif 000019
【図１９】
2012137449.tif 000020
【図２０】
2012137449.tif 000021
【図２１】
2012137449.tif 000022
【配列表】
2012137449000001.app
【国際調査報告】
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2012137449.tif 000024
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