(57)【要約】  メイラード反応などの培地栄養成分の相互作用等による栄養成分のロスを少なくする培地の製造方法を提供する。微生物を培養するための培地の製造方法であって、（１）糖源原料を含有する溶液を殺菌する工程、（２）窒素源原料を含有する溶液を殺菌する工程、（３）前記工程（１）および（２）で得られた２つの溶液を混合する工程、を含むことを特徴とする方法を用いる。
2012132335.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を培養するための培地の製造方法であって、
（１）糖源原料を含有する溶液を殺菌する工程、
（２）窒素源原料を含有する溶液を殺菌する工程、
（３）前記工程（１）および（２）で得られた２つの溶液を混合する工程、
を含むことを特徴とする前記製造方法。
【請求項２】
微生物を培養するための培地の製造方法であって、
（１）窒素源を含まず、糖を含む溶液を殺菌する工程、
（２）糖を含まず、窒素源を含む溶液を殺菌する工程、
（３）前記工程（１）および（２）で得られた２つの溶液を混合する工程、
を含むことを特徴とする前記製造方法。
【請求項３】
微生物を培養するための培地の製造方法であって、
（１）糖のみを含む溶液を殺菌する工程、
（２）窒素源のみを含む溶液を殺菌する工程、
（３）糖および窒素源を含まず、無機塩、ビタミン、脂肪酸、緩衝剤、消泡剤から成る群より選択される少なくとも１種を含む溶液を殺菌する工程、
（４）前記工程（１）〜（３）で得られた３つの溶液を混合する工程、
を含むことを特徴とする前記製造方法。
【請求項４】
糖源原料又は糖が、非還元糖である請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
非還元糖が、ショ糖、トレハロース、ケストース、メレチトース、ゲンチアノース、ネオビフルコース、フンギテトラオースおよびビフルコースからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
非還元糖がショ糖である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項７】
窒素源原料又は窒素源が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、尿素、カゼイン加水分解物、コーンスティープリカー、大豆、大豆加水分解物、ピーナッツミール、綿実ミール、魚粉、魚肉エキス、牛肉エキスおよび酵母エキスからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
糖源原料を含有する溶液の殺菌又は糖を含む溶液の殺菌が、回分殺菌および／または連続殺菌により行われる、請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
窒素源原料を含有する溶液の殺菌又は窒素源を含む溶液の殺菌が、回分殺菌および／または連続殺菌により行われる、請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
糖および窒素源を含まず、無機塩、ビタミン、脂肪酸、緩衝剤、消泡剤から成る群より選択される少なくとも１種を含む溶液の殺菌が、回分殺菌および／または連続殺菌により行われる、請求項３〜９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法により製造された培地。
【請求項１２】
請求項１１に記載の培地を用いることを特徴とする、微生物の培養方法。
【請求項１３】
微生物が乳酸菌である、請求項１２に記載の培養方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の培養方法により培養された微生物。
【請求項１５】
請求項１３に記載の培養方法により培養された乳酸菌。
【請求項１６】
免疫調整剤を製造するための培地の製造方法であって、
（１）糖源原料を含有する溶液を殺菌する工程、
（２）窒素源原料を含有する溶液を殺菌する工程、
（３）前記工程（１）および（２）で得られた２つの原料を混合する工程、
を含むことを特徴とする前記製造方法。
【請求項１７】
免疫調整剤を製造するための培地の製造方法であって、
（１）窒素源を含まず、糖を含む溶液を殺菌する工程、
（２）糖を含まず、窒素源を含む溶液を殺菌する工程、
（３）前記工程（１）および（２）で得られた２つの溶液を混合する工程、
を含むことを特徴とする前記製造方法。
【請求項１８】
免疫調整剤を製造するための培地の製造方法であって、
（１）糖のみを含む溶液を殺菌する工程、
（２）窒素源のみを含む溶液を殺菌する工程、
（３）糖および窒素源を含まず、無機塩、ビタミン、脂肪酸、緩衝剤、消泡剤から成る群より選択される少なくとも１種を含む溶液を殺菌する工程、
（４）前記工程（１）〜（３）で得られた３つの溶液を混合する工程、
を含むことを特徴とする前記製造方法。
【請求項１９】
糖源原料又は糖が非還元糖である請求項１６〜１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
非還元糖が、ショ糖、トレハロース、ケストース、メレチトース、ゲンチアノース、ネオビフルコース、フンギテトラオースおよびビフルコースからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２１】
非還元糖がショ糖である、請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２２】
窒素源原料又は窒素源が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、尿素、カゼイン加水分解物、コーンスティープリカー、大豆、大豆加水分解物、ピーナッツミール、綿実ミール、魚粉、魚肉エキス、牛肉エキスおよび酵母エキスからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１６〜２１のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２３】
糖源原料を含有する溶液の殺菌又は糖を含む溶液の殺菌が、回分殺菌および／または連続殺菌により行われる、請求項１６〜２２のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２４】
窒素源原料を含有する溶液の殺菌又は窒素源を含む溶液の殺菌が、回分殺菌および／または連続殺菌により行われる、請求項１６〜２３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２５】
糖および窒素源を含まず、無機塩、ビタミン、脂肪酸、緩衝剤、消泡剤から成る群より選択される少なくとも１種を含む溶液の殺菌が、回分殺菌および／または連続殺菌により行われる、請求項１８〜２４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２６】
請求項１６〜２５のいずれかに記載の製造方法により製造された培地。
【請求項２７】
請求項２６に記載の培地を用いることを特徴とする、免疫調整剤の製造方法。
【請求項２８】
免疫調整剤が抗アレルギー剤である、請求項２７に記載の製造方法。
【請求項２９】
免疫調整剤がＩＬ−１２誘導活性剤である、請求項２７に記載の製造方法。
【請求項３０】
請求項２７に記載の製造方法により製造された免疫調整剤。
【請求項３１】
請求項２８に記載の製造方法により製造された抗アレルギー剤。
【請求項３２】
請求項２９に記載の製造方法により製造されたＩＬ−１２誘導活性剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を培養するための培地および免疫調整剤を製造するための培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
培地の殺菌は、雑菌による汚染すなわちコンタミネーションを防止する目的で行われる。しかし、培地の殺菌は、殺菌中の熱による有害反応により培地中に含まれる栄養成分のロスを引き起こす。栄養成分のロスを起こす反応としては、培地栄養成分の相互作用や耐熱性の低い成分の破壊が知られている。特に、培地栄養成分の相互作用として、メイラード（Ｍａｉｌｌａｒｄ）反応と呼ばれる褐変現象があり、培地の着色のみならず培地成分の破壊をもたらす。これらの反応は培地中のカルボニル基とアミノ酸及びタンパク質のアミノ基の組合せによって生じる（非特許文献１、９６ページ参照）。【０００３】
また、従来技術における培地の組成としては、例えばＷＯ２００６／０７３１４５号公報（特許文献１）が開示されている。【０００４】
一方、雑菌の死滅と栄養成分の破壊の活性化エネルギーの関係より、オートクレーブ殺菌やバッチ殺菌などの回分殺菌よりも、高温短時間（ＵＨＴ）殺菌が可能な連続殺菌において、雑菌の死滅に十分な殺菌価で栄養成分の破壊を抑制することが可能である。さらに連続殺菌はスケールアップによる影響を受けにくいという利点を有する（非特許文献１、９６〜１０２ページ参照）。【０００５】
しかし、工業的に連続殺菌機を持つ設備は少なく、バッチ殺菌を採用する場合がほとんどである。また、微生物を人が摂取した際に期待されるＩＬ−１２誘導活性機能などの免疫調整機能を有する微生物を生産する際の培地の殺菌方法の知見は見当たらない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００６／０７３１４５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「発酵工学の基礎、実験室から工場まで」、Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ、Ａ．Ｗｈｉｔａｋｅｒ著、１９８８年、株式会社  学会出版センター
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、メイラード反応などの培地栄養成分の相互作用等による栄養成分のロスを少なくし、および／または、バッチ殺菌などにより培地を回分殺菌する方法と高温短時間殺菌などにより培地を連続殺菌する方法を提供する。また、本発明は、微生物を人が摂取した際に期待される、ＩＬ−１２誘導活性機能などの免疫調整機能を有する微生物を生産する際の培地の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、窒素源原料を含有する溶液と、糖源原料を含有する溶液とを、別個に殺菌したのち、これらを混合することにより、上記課題を解決することを見出した。【００１０】
また、本発明者らは、糖を含む溶液と、窒素源を含む溶液とを、別個に殺菌したのち、これらの溶液を混合することにより、上記課題を解決することを見出した。【００１１】
即ち、本発明は、微生物を培養するための培地の製造方法であって、（１）糖源原料を含有する溶液を殺菌する工程、（２）窒素源原料を含有する溶液を殺菌する工程、（３）前記工程（１）および（２）で得られた２つの溶液を混合する工程、を含むことを特徴とする前記製造方法である。
また、本発明は、微生物を培養するための培地の製造方法であって、（１）窒素源を含まず、糖を含む溶液を殺菌する工程、（２）糖を含まず、窒素源を含む溶液を殺菌する工程、（３）前記工程（１）および（２）で得られた２つの溶液を混合する工程、を含むことを特徴とする前記製造方法である。
また、本発明は、微生物を培養するための培地の製造方法であって、（１）糖のみを含む溶液を殺菌する工程、（２）窒素源のみを含む溶液を殺菌する工程、（３）糖および窒素源を含まず、無機塩、ビタミン、脂肪酸、緩衝剤、消泡剤から成る群より選択される少なくとも１種を含む溶液を殺菌する工程、（４）前記工程（１）〜（３）で得られた３つの溶液を混合する工程、を含むことを特徴とする前記製造方法である。
また、本発明は、糖源原料又は糖が、非還元糖である、上記の製造方法である。
また、本発明は、非還元糖が、ショ糖、トレハロース、ケストース、メレチトース、ゲンチアノース、ネオビフルコース、フンギテトラオースおよびビフルコースからなる群から選択される少なくとも１種である、上記の製造方法である。
また、本発明は、非還元糖がショ糖である、上記の製造方法である。
また、本発明は、窒素源原料又は窒素源が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、尿素、カゼイン加水分解物、コーンスティープリカー、大豆、大豆加水分解物、ピーナッツミール、綿実ミール、魚粉、酵母エキスおよび魚肉エキスからなる群より選択される少なくとも１種である、上記の製造方法である。
また、本発明は、糖源を含む溶液の殺菌又糖を含む溶液の殺菌が、回分殺菌および／または連続殺菌により行われる、上記の製造方法である。
また、本発明は、窒素源原料を含有する溶液の殺菌又は窒素源を含む溶液の殺菌が、回分殺菌および／または連続殺菌により行われる、上記の製造方法である。
また、本発明は、糖および窒素源を含まず、無機塩、ビタミン、脂肪酸、緩衝剤、消泡剤から成る群より選択される少なくとも１種を含む溶液の殺菌が、回分殺菌および／または連続殺菌により行われる、上記の製造方法である。
また、本発明は、上記の製造方法により製造された培地である。
また、本発明は、上記の製造方法により製造された培地を用いることを特徴とする、微生物の培養方法である。
また、本発明は、微生物が乳酸菌である、上記の培養方法である。
また、本発明は、上記の培養方法により培養された微生物である。
また、本発明は、上記の培養方法により培養された乳酸菌である。
また、本発明は、免疫調整剤を製造するための培地の製造方法であって、（１）糖源原料を含有する溶液を殺菌する工程、（２）窒素源原料を含有する溶液を殺菌する工程、（３）前記工程（１）および（２）で得られた２つの原料を混合する工程、を含むことを特徴とする前記製造方法である。
また、本発明は、免疫調整剤を製造するための培地の製造方法であって、（１）窒素源を含まず、糖を含む溶液を殺菌する工程、（２）糖を含まず、窒素源を含む溶液を殺菌する工程、（３）前記工程（１）および（２）で得られた２つの溶液を混合する工程、を含むことを特徴とする前記製造方法である。
また、本発明は、免疫調整剤を製造するための培地の製造方法であって、（１）糖のみを含む溶液を殺菌する工程、（２）窒素源のみを含む溶液を殺菌する工程、（３）糖および窒素源を含まず、無機塩、ビタミン、脂肪酸、緩衝剤、消泡剤から成る群より選択される少なくとも１種を含む溶液を殺菌する工程、（４）前記工程（１）〜（３）で得られた３つの溶液を混合する工程、を含むことを特徴とする前記製造方法である。
また、本発明は、糖源原料又は糖が非還元糖である、上記の製造方法である。
また、本発明は、非還元糖が、ショ糖、トレハロース、ケストース、メレチトース、ゲンチアノース、ネオビフルコース、フンギテトラオースおよびビフルコースからなる群から選択される少なくとも１種である、上記の製造方法である。
また、本発明は、非還元糖がショ糖である、上記の製造方法である。
また、本発明は、窒素源原料又は窒素源が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、尿素、カゼイン加水分解物、コーンスティープリカー、大豆、大豆加水分解物、ピーナッツミール、綿実ミール、魚粉、酵母エキスおよび魚肉エキスからなる群より選択される少なくとも１種である、上記の製造方法である。
また、本発明は、糖源を含む溶液の殺菌又は糖を含む溶液の殺菌が、回分殺菌および／または連続殺菌により行われる、上記の製造方法である。
また、本発明は、窒素源原料を含有する溶液の殺菌又は窒素源を含む溶液の殺菌が、回分殺菌および／または連続殺菌により行われる、上記の製造方法である。
また、本発明は、糖および窒素源を含まず、無機塩、ビタミン、脂肪酸、緩衝剤、消泡剤から成る群より選択される少なくとも１種を含む溶液の殺菌が、回分殺菌および／または連続殺菌により行われる、上記の製造方法である。
また、本発明は、上記の製造方法により製造された培地である。
また、本発明は、上記の培地を用いることを特徴とする、免疫調整剤の製造方法である。
また、本発明は、免疫調整剤が抗アレルギー剤である、上記の製造方法である。
また、本発明は、免疫調整剤がＩＬ−１２誘導活性剤である、上記の製造方法である。
また、本発明は、上記の製造方法により製造された免疫調整剤である。
また、本発明は、上記の製造方法により製造された抗アレルギー剤である。
また、本発明は、上記の製造方法により製造されたＩＬ−１２誘導活性剤である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、メイラード反応などの培地栄養成分の相互作用等による栄養成分のロスを少なくし、および／または、バッチ殺菌などにより培地を回分殺菌する方法と高温短時間殺菌などにより培地を連続殺菌する方法が提供される。本発明による培地は、培地自体の色調が良好であり、また、優れた微生物の培養能を有する。また、本発明による培地を用いることにより、ＩＬ−１２誘導活性剤などの免疫調整剤を効率よく製造することができる。さらに、本発明の培地を用いることにより、色調が良好な微生物や免疫調整剤を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】培養中の濁度の推移を示すグラフである。
【図２】ＩＬ−１２誘導活性を示すグラフである。
【図３】培養中の濁度の推移を示すグラフである。
【図４】ＩＬ−１２誘導活性を示すグラフである。
【図５】培養中の濁度の推移を示すグラフである。
【図６】４．２ｔスケールで培養した菌体のＩＬ−１２誘導活性を示すグラフである。
【図７】培養中の濁度の推移を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明に用いられる糖源原料や糖としては、特に制限はなく、還元糖、還元性を有しない非還元糖のいずれも用いることができるが、非還元糖が好ましい。
【００１５】
還元糖としては、たとえば、グルコース、ピラノース、アルドヘキソース、フラノース、ケトピラノース、ケトヘキソースおよびケトフラノース等を挙げることができる。
【００１６】
非還元糖としては、たとえば、ショ糖（スクロース）、トレハロース、ケストース、メレチトース、ゲンチアノース、ネオビフルコース、フンギテトラオースおよびビフルコースなどを挙げることができ、なかでもショ糖が好ましい。
【００１７】
本発明に用いる窒素源原料又は窒素源としては、培地に窒素原子を供給できるものであれば特に制限はないが、アミノ酸、ペプチド、タンパク質または尿素などを挙げることができる。培地原料として用いられる天然の窒素源としては、カゼイン加水分解物、コーンスティープリカー、大豆及び大豆加水分解物、ピーナッツミール、綿実ミール、魚粉、魚肉エキス、牛肉エキス、酵母エキスなどを挙げることができる。
【００１８】
カゼイン加水分解物としては、特に制限はないが、たとえば、牛乳カゼインをペプシンまたはパンクレアチンで消化したものを挙げることができ、オルガノテクニー（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ）社から販売されている「商品名：カゼインペプトンプラス」などを挙げることができる。
【００１９】
魚肉エキスとしては、魚肉から採取されたものであれば特に制限はないが、たとえば、マルハ社から販売されている「商品名：Ｂａｃｔｅｒｉｏ−Ｎ−ＫＳ（Ｂ）」などを挙げることができる。
【００２０】
牛肉エキスとしては、特に制限はないが、Ｐｒｉｍａｔｏｎｅ  ＲＬ社から販売されている「商品名：Ｍｅａｓｔ  Ｐｅｐｔｏｎｅ」などを挙げることができる。
【００２１】
酵母エキスとしては、酵母培養液から抽出されるものであれば特に制限はないが、たとえば、富士食品工業社から販売されている「商品名：ＹＰ２１ＣＭ」、日本製紙ケミカル社から販売されている「商品名：ＳＫ酵母エキスＨＵＰ−２」、オルガノテクニー（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ）社から販売されている「商品名：イーストペプトンスタンダードタイプＦ」などを挙げることができる。
【００２２】
本発明において、糖源原料、糖、窒素源原料および窒素源を除く、他の培地の成分としては、通常培地に用いられるものであれば特に制限はないが、たとえば、無機塩、ビタミン、脂肪酸、緩衝剤、消泡剤などを挙げることができる。
【００２３】
無機塩としては、硫酸マグネシウム、リン酸水素二カリウム、炭酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸鉄などを挙げることができる。
【００２４】
ビタミンとしては、アスコルビン酸、チアミン、ビオチン、パントテン酸ナトリウム、葉酸、ニコチン酸アミド、リボフラビン、ナイアシン、ピリドキシン、イノシトールなどを挙げることができる。
【００２５】
脂肪酸としては、パームヤシ、ナタネ油等に含まれる高級脂肪酸モノグリセリド、中鎖脂肪酸モノグリセリド、ポリグリセリン脂肪酸エステルなどを挙げることができ、ポリグリセリン酸脂肪酸エステルとしては、モノオレイン酸デカグリセリン、モノジオレイン酸ジグリセリン、デカオレイン酸デカグリセリンなどを挙げることができる。
【００２６】
緩衝剤としては、酢酸ナトリウムなどの有機酸、リン酸水素二カリウム、炭酸カルシウムなどの無機酸、大理石などを挙げることができる。
【００２７】
消泡剤としては、デカグリセリンモノオレイン酸エステルなどの、ポリグリセリン脂肪酸エステルを挙げることができる。
【００２８】
本発明において、培地の各成分を溶解するための溶媒としては、水を挙げることができ、精製水、イオン交換水、蒸留水、滅菌水、水道水などを用いることができる。
【００２９】
本発明において、「糖源原料を含有する溶液」とは、上述の糖に加えて、任意に、無機塩、ビタミン、脂肪酸、緩衝剤、消泡剤などの他の培地成分を含有することができ、さらに、本願発明の効果を奏することができる限りにおいて許容される量の窒素源を任意に含む溶液を意味する。
【００３０】
ここで、本願発明の効果を奏することができる限りにおいて許容される窒素源の量としては、本願発明の効果を奏することができる量であれば特に制限はないが、「糖源原料を含有する溶液」の全量に対して通常１０重量％以下、好ましくは５重量％以下、より好ましくは１重量％以下、さらにより好ましくは０．１重量％以下、またさらにより好ましくは０．０１重量％以下、最も好ましくは０％を挙げることができる。
【００３１】
本発明において、「窒素源原料を含有する溶液」とは、上述の窒素源に加えて、任意に、無機塩、ビタミン、脂肪酸、緩衝剤、消泡剤などの他の培地成分を含有することができ、さらに、本願発明の効果を奏することができる限りにおいて許容される量の糖を任意に含む溶液を意味する。
【００３２】
ここで、本願発明の効果を奏することができる限りにおいて許容される糖の量としては、本願発明の効果を奏することができる量であれば特に制限はないが、「窒素源原料を含有する溶液」の全量に対して通常１０重量％以下、好ましくは５重量％以下、より好ましくは１重量％以下、さらにより好ましくは０．１重量％以下、またさらにより好ましくは０．０１重量％以下、最も好ましくは０％を挙げることができる。
【００３３】
本発明において、「窒素源を含まず、糖を含む溶液」とは、糖および他の培地成分（窒素源を除く）を含む溶液を意味する場合と、糖のみを含む溶液を意味する場合とがある。
【００３４】
同様に、本発明において、「糖を含まず、窒素源を含む溶液」とは、窒素源および他の培地成分（糖を除く）を含む溶液を意味する場合と、窒素源のみを含む溶液を意味する場合とがある。
【００３５】
本発明において、「糖源原料を含有する溶液」、「窒素源原料を含有する溶液」および窒素源、糖、その他の成分等を含む溶液を殺菌する工程としては、溶液に存在する菌を不活化（殺菌）する工程であれば特に制限はないが、加熱殺菌として、通常、回分殺菌する工程、または連続殺菌する工程を挙げることができる。
【００３６】
回分殺菌においては、オートクレーブを用いて殺菌、またはスチームインジェクション方式などによるバッチ殺菌などいずれも行うことができる。連続殺菌においては、プレート方式やチューブ方式などによる高温短時間（ＵＨＴ) 殺菌などを行うことができる。
【００３７】
回分殺菌する場合の温度としては、殺菌する対象に含まれる培地成分に応じて適宜決定されるが、通常８０〜１５０℃、好ましくは１００〜１３０℃の範囲である。
【００３８】
回分殺菌する場合の時間としては、殺菌する対象に含まれる培地成分に応じて適宜決定されるが、通常５〜１８０分、好ましくは１５〜１００分の範囲である。
【００３９】
連続殺菌する場合の温度としては、殺菌する対象に含まれる培地成分に応じて適宜決定されるが、通常８０〜２００℃、好ましくは１００〜１６０℃の範囲である。
【００４０】
連続殺菌する場合の時間としては、殺菌する対象に含まれる培地成分に応じて適宜決定されるが、通常５〜１8０秒、好ましくは１０〜１００秒の範囲である。
【００４１】
さらに、回分殺菌または連続殺菌いずれの殺菌を行う場合においても、殺菌対象の培地の容量として、数ｍＬ〜数Ｌのラボスケールのみならず、１〜１００ｔの範囲の様な、パイロットプラントあるいはコマーシャルプラントスケールでの殺菌が可能となる。
【００４２】
上記の、オートクレーブ殺菌および高温短時間（ＵＨＴ) 殺菌のいずれにおいても、殺菌価に特に制限はないが、通常Ｆ０＝１〜５０、好ましくはＦ０＝１０〜３０程度の範囲を挙げることができる。なお、殺菌価の管理方法としては、たとえばサーモプロセッサを用いるものを挙げることができる。
【００４３】
本発明において、殺菌された２つないし３つの各溶液は、これらを混合することにより、本発明の培地を製造することができる。混合の方法としては、特に制限はないが、たとえば、殺菌された各溶液を培養容器に投入し、攪拌装置により攪拌することにより混合される。
【００４４】
また、殺菌された各溶液を混合する場合において、苛性ソーダ等のアルカリ剤を徐々に添加して、ｐＨを４．０〜８．０、好ましくは６．０〜７．５程度に調整し、本発明の培地とすることができる。ただし、規定範囲内のｐＨとなる場合は、ｐＨ調整を行う必要はない。
【００４５】
本発明の培地で培養される微生物としては、特に制限はないが、たとえば、乳酸菌、ビフィドバクテリウムに属する菌、酵母、カビ（麹菌）などを挙げることができる。
【００４６】
本発明の培地を用いて製造される免疫調整剤としては、免疫調整作用があるものであれば特に制限はないが、たとえば、抗アレルギー剤、ＩＬ−１２誘導活性剤等を挙げることができる。本発明の免疫調整剤の製造方法としては、本発明の培地を用いて、微生物を培養し、培養終了後に免疫調整剤を単離する方法が挙げられる。また、使用態様によっては、免疫調整剤を単離することなく、培養物を濾過および／または乾燥して、あるいは培養液をそのまま用いる場合もある。
【００４７】
本発明の免疫調整剤は、抗アレルギー剤、ＩｇＥ産生抑制剤、アトピー軽減・治療・予防剤、花粉症軽減・治療・予防剤、通年性アレルギー軽減・治療・予防剤、喘息軽減・治療・予防剤、ハウスダスト軽減・治療・予防剤などとして使用可能である。
【００４８】
本発明を用いて製造した微生物は、免疫調整剤として、生菌体、乾燥生菌体、殺菌体、菌体破砕物などとして提供できる。これらの免疫調整剤等を添加した飲料、食品、サプリメントなどとして、提供することもできる。
【００４９】
ここで、免疫調整剤の製造において用いられる微生物としては、特に制限はないが、たとえば、乳酸菌、ビフィズス菌、酵母、カビ（麹菌）などを挙げることができる。なかでも、乳酸菌が好ましい。特に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する乳酸菌が好ましい。好ましくは、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）種、特に、ラクトバチルス・アシドフィルス  Ｌ−９２株（日本国  独立行政法人  産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター寄託、ラクトバチルス・アシドフィルスＣＬ−９２株、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９８１）が好ましい。また、ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＬ−００６２株（日本国  独立行政法人  産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター寄託、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９８０）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＣＰ−３４株（日本国  独立行政法人  産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター寄託、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３８３）なども例示できる。
【００５０】
本発明の培養方法において用いられる乳酸菌としては、例えば、ラクトバチルス・デルブリュッキィ  ブルガリカスがあり、下記に例示できる。
【００５１】
乳酸菌としては、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属、エンテロコッカス属、ロイコノストック属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、ペディオコッカス属およびワイセラ属等を例示できる。
【００５２】
前記ラクトバチルス属に属する乳酸菌としては、ラクトバチルス・アミロボラス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ゼアエ、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・ガリナーラム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・デルブルッキ  サブスピーシーズ  ブルガリカス、およびラクトバチルス・ジョンソニー種等を例示できる。
【００５３】
前記ビフィドバクテリウム属に属する細菌としては、ビフィドバクテリウム・ブレーべ、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・カテニュラータム、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュラータム、およびビフィドバクテリウム・マグナム種等を例示できる。
【００５４】
前記エンテロコッカスに属する細菌としては、エンテロコッカス・フェカリス、およびエンテロコッカス・フェシウム種等を例示できる。
【００５５】
前記ストレプトコッカス属に属する細菌としては、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトコッカス・ラクチス、ストレプトコッカス・ダイアセチラクチス、およびストレプトコッカス・フェカリス種等を例示できる。
【００５６】
前記ロイコノストック属に属する細菌としては、ロイコノストック・メゼンテロイデス、およびロイコノストック・ラクティス種等を例示できる。
【００５７】
前記ラクトコッカス属に属する細菌としては、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトコッカス・プランタラム、およびラクトコッカス・ラフィノラクティス種等を例示できる。
【００５８】
前記ペディオコッカス属に属する細菌としては、ペディオコッカス・ペントサセウス、およびペディオコッカス・ダムノサス種等を例示できる。
【００５９】
前記ワイセラ属に属する細菌としては、ワイセラ・チバリア、ワイセラ・コンフューザ、ワイセラ・ハロトレランス、ワイセラ・ヘレニカ、ワイセラ・カンドレリ、ワイセラ・キムチイ、ワイセラ・コレエンシス、ワイセラ・ミノール、ワイセラ・パラメセンテロイデス、ワイセラ・ソリ、ワイセラ・タイランデンシス、およびワイセラ・ビリデスセンス種等を例示できる。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本実施例は本発明を限定するものではない。
＜実施例１〜３：糖(ショ糖)の単独殺菌＞
（１）培地の調製（実施例１、比較例１）
表１に記載した配合にしたがって、各成分を精製水に溶解して、５００ｍＬの培地を作製した。この培地をジャーファーメンター（型番：ＢＭＪ−０１、エイブル製）に入れ、オートクレーブ（型番：ＬＢＳ−３２５、トミー製）を用いて、１２１℃で９０分間殺菌した。その後、約５０重量％の苛性ソーダ(食品添加物規格準拠)水溶液を用いて、ｐＨを６．８に調整した（比較例１）。【００６１】
また、表１のうち、ショ糖３５ｇのみを精製水１６５ｍＬに溶解し、ショ糖溶液を得た。また、表１のショ糖以外の成分を精製水を用いて３００ｍＬとなるよう溶解し、ショ糖以外の培地成分の混合溶液を得た。そして、上記のショ糖溶液と、ショ糖以外の培地成分の混合溶液を、それぞれ別個に、オートクレーブを用いて１２１℃で９０分間殺菌したのち、これらを混合して、滅菌水（精製水をオートクレーブを用いて１２１℃２０分間殺菌したもの）でメスアップし、培地５００ｍＬを得た。その後、約５０重量％の苛性ソーダ(食品添加物規格準拠)水溶液を用いて、ｐＨを６．８に調整した（実施例１）。【００６２】
【表１】
2012132335.tif 000003
【００６３】
各培地について、培地の色調の指標として、培地上清の６００ｎｍの光の吸光度（ＯＤ６００）（製品名：Ｎａｎｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｉｍｐｌｅｎ製）を測定した。結果を表２に示す。【００６４】
【表２】
2012132335.tif 000004
【００６５】
表２より、実施例１の培地は、比較例１の培地と比較し、吸光度が低く、褐変が抑えられていることがわかる。【００６６】
（２）乳酸菌の培養（実施例２、比較例２）
上記比較例１および実施例１に示した各培地を用いて、乳酸菌ラクトバチラス  アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）Ｌ−９２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９８１）を培養した。乳酸菌は、ＭＲＳ培地（商品名：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ＭＲＳ  ｂｒｏｔｈ、ＢＤ製）を用いて培養したものを用い、乳酸菌を比較例１および実施例１に示した各培地５００ｍＬに無菌的に１〜５％接種し、ｐＨが４．５以下になるまで（３０時間程度）、３７℃の温度で、攪拌培養した。経時的に培養液をサンプリングし、菌数の指標として、吸光度計（製品名：Ｎａｎｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｉｍｐｌｅｎ製）を用いて濁度（ＯＤ６００）を測定した（図１）。培養終了時の培養液を、遠心分離機（製品名：ユニバーサル冷却遠心機５９１０、久保田商事株式会社製）を用いて、約２５００Ｇで１０分間遠心分離し、その沈殿物（菌体）を捕集した。得られた菌体を精製水５００ｍＬで洗浄後、凍結乾燥装置（型番：ＦＤＵ−８３０、ＥＹＥＬＡ製）を用いて乾燥し、さらに粉末化した。得られた各粉末について、培地あたりの菌体量（ｇ／Ｌ）および色調を測定した。【００６７】
培地あたりの菌体量は、凍結乾燥粉末の重量を測定し、算出した。【００６８】
また、色調は色彩色差計（型番：ＣＭ−３５００ｄ、コニカミノルタ製）を用いてＬａｂ表色系を測定し、Ｌ値を着色の指標とした。結果を表３に示す。【００６９】
【表３】
2012132335.tif 000005
【００７０】
図１および表３より、実施例１の培地を用いて培養した乳酸菌（実施例２）は、比較例１の培地を用いて培養したもの（比較例２）より、乳酸菌の育成速度が高く、また、極めて高い菌体収量を有していた。また、Ｌ値で示される色調も、実施例２の乳酸菌の方がＬ値が高く、比較例２の乳酸菌よりも褐変が小さいことが示された。【００７１】
（３）ＩＬ−１２誘導活性の測定（実施例３、比較例３）
上記の比較例２および実施例２において培養した各乳酸菌を用いて、ＩＬ−１２誘導活性を測定した。【００７２】
脾臓細胞の調整：ＢＡＬＢ／ｃマウス（７〜９週齢、雄、日本チャールスリバー製）にＯＶＡ溶液（ＯＶＡ（ＳＩＧＭＡ製）１ｍｇ、ＰＢＳ（−）１ｍＬ、ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ（ｔｈｅｒｍｏ製）１ｍＬを懸濁したもの）を１匹あたり０．１ｍＬ腹腔内投与し、１０〜１２日間飼育した後、頚椎脱臼してマウスを屠殺後、脾臓を摘出した。脾臓をＲＰＭＩ調整培地（ＲＰＭＩ１６４０培地（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製））に懸濁し、７０μｍセルストレイナー（ＦＡＬＣＯＮ製）を通過させて単細胞化した。赤血球溶解液に懸濁し、遠心分離、上清除去後、生細胞数が５．０×１０6個／ｍＬとなるようＲＰＭＩ調整培地を用いて希釈し、脾臓細胞懸濁液とした。【００７３】
脾臓細胞と乳酸菌粉末の共培養：９６穴平底プレート（ＦＡＬＣＯＮ製）に、１穴あたり前述の脾臓細胞懸濁液、比較例２または実施例２で得られた各乳酸菌粉末、及びＯＶＡをそれぞれ２００μＬ、１μｇ、２０μｇずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で２４時間培養した。【００７４】
ＩＬ−１２の測定：前述の培養液中に誘導産生されたＩＬ−１２を、マウスＩＬ−１２ｐ７０測定キット（商品名：ＯｐｔＥＩＡ  Ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−１２（ｐ７０）  Ｋｉｔ、ＢＤ製）、９６穴イムノアッセイ用プレート（Ｎｕｎｃ製）を用いて測定した（図２、ｎ＝６）。【００７５】
図２より、ショ糖成分と、その他の成分を分けて殺菌したのちにこれらを混合した培地（実施例１）を用いて培養した乳酸菌（実施例２）のＩＬ−１２誘導活性（実施例３）は、培地の全成分を混合して殺菌した培地（比較例１）を用いて培養した乳酸菌（比較例２）のＩＬ−１２誘導活性（比較例３）よりも、顕著に高いことが示された。【００７６】
＜実施例４〜５：窒素源（酵母エキス）の単独殺菌＞
（１）培地の調製その１（実施例４）
表４に示した培地成分のうち、酵母エキス（ＹＰ−２１ＣＭ）２５ｇおよび酵母エキス（ＨＵＰ−２）１０ｇのみを精製水１１５ｍＬに溶解し、酵母エキス溶液を得た。また、酵母エキス以外の培地成分を精製水を用いて３００ｍＬになるよう溶解し、酵母エキス以外の培地成分の混合溶液を得た。そして、上記の酵母エキス溶液をオートクレーブを用いて、１２１℃、２０分間殺菌した。また、酵母エキス以外の培地成分の混合溶液を、オートクレーブを用いて１２１℃で１２０分間殺菌したのち、これらを混合、滅菌水を用いてメスアップして培地５００ｍＬを得た。【００７７】
（２）培地の調製その２（実施例５）
表４に示した培地成分のうち、酵母エキス（ＹＰ−２１ＣＭ）２５ｇおよび酵母エキス（ＨＵＰ−２）１０ｇのみを精製水１１５ｍＬに溶解し、酵母エキス溶液を得た。また、表４に示した培地成分のうち、ショ糖４５ｇのみを精製水５５ｍＬに溶解し、ショ糖溶液を得た。さらに、酵母エキスおよびショ糖以外の培地成分に精製水を加えて２００ｍＬになるよう溶解し、酵母エキスおよびショ糖以外の培地成分の混合溶液を得た。そして、上記の酵母エキス溶液をオートクレーブを用いて、１２１℃、２０分間殺菌した。また、ショ糖溶液をオートクレーブを用いて１２１℃で１２０分間殺菌した。さらに、上記の酵母エキスおよびショ糖以外の培地成分の混合溶液をオートクレーブを用いて１２１℃で１２０分間殺菌した。これら３つの溶液を混合し、滅菌水を用いてメスアップして培地５００ｍＬを得た。
表５に、各培地の殺菌条件を示す。【００７８】
【表４】
2012132335.tif 000006
【００７９】
【表５】
2012132335.tif 000007
【００８０】
（３）乳酸菌の培養（実施例６、７）
上記実施例４および５に示した各培地を用いて、実施例２と同様の方法で、乳酸菌を培養した。但し、濁度は培養液を９６穴平底プレート（Ｎｕｎｃ製）に分注し、マルチプレートリーダー（大日本製薬製）を用いてＯＤ６００を測定した（図３）。
結果を表６に示す。【００８１】
【表６】
2012132335.tif 000008
【００８２】
図３および表６より、酵母エキスのみと、その他の成分を別個に殺菌して得た培地（実施例４）を用いて培養した乳酸菌（実施例６）、および、酵母エキスのみと、ショ糖のみと、その他の成分を別個に殺菌して得た培地（実施例５）を用いて培養した乳酸菌（実施例７）のいずれにおいても、良好な生育速度、菌体収量が得られた。【００８３】
＜実施例８〜９：窒素源（酵母エキス）の単独殺菌における、殺菌方法の比較＞
（１）培地の調製（実施例８、比較例３）
表７に記載した配合にしたがって、各成分を精製水に溶解して、５００ｍＬの培地を作製した。この培地を、ラボ用ＵＨＴシステム（型番：２５ＨＶＨ、西華産業株式会社製）を用いて、１３７℃で３０秒間、瞬間殺菌した。（比較例３）。【００８４】
また、表７に示した培地成分のうち、酵母エキス（ＹＰ−２１ＣＭ）２５ｇおよび酵母エキス（ＨＵＰ−２）１０ｇのみを精製水１１５ｍＬに溶解し、酵母エキス溶液を得た。また、酵母エキス以外の培地成分を精製水を用いて３００ｍＬとなるよう溶解し、酵母エキス以外の培地成分の混合溶液を得た。そして、上記の酵母エキス溶液をチューブ式連続殺菌機（ラボ用ＵＨＴシステム２５ＨＶＨ、西華産業株式会社製）を用いて、１３７℃で３０秒間、瞬間殺菌した。また、酵母エキス以外の培地成分の混合溶液を、オートクレーブを用いて１２１℃で２０分間殺菌した。【００８５】
上記のいずれの殺菌方法においても、殺菌価Ｆ0＝２０程度とした。【００８６】
上記で得られた各殺菌済みの溶液を混合、滅菌水を用いてメスアップし、培地５００ｍＬを得た（実施例８）。
表８に各培地の殺菌条件および殺菌方法を示す。【００８７】
【表７】
2012132335.tif 000009
【００８８】
【表８】
2012132335.tif 000010
【００８９】
（２）乳酸菌の培養
上記比較例３および実施例８に示した培地を用いたほかは、実施例２と同一の条件で乳酸菌を培養した。【００９０】
菌数の指標として、培養終了時の濁度（ＯＤ６００）を測定し、また、得られた各粉末について、培地あたりの菌体収量（ｇ／Ｌ）を測定した。結果を表９に示す。【００９１】
【表９】
2012132335.tif 000011
【００９２】
表９より、実施例８の培地を用いて培養した乳酸菌（実施例９）は、比較例３の培地を用いて培養したもの（比較例４）より、高い菌数および高い菌体収量であることが示された。このように、培地の変性が少ないと思われるＵＨＴ殺菌においても本発明の効果があることが認められた。【００９３】
（３）ＩＬ−１２誘導活性の測定（実施例１７、比較例８）
乳酸菌として上記実施例９または比較例４で得られたものを用いた他は、実施例３と同一の条件でＩＬ−１２誘導活性を測定した（実施例１７、比較例８）。結果を図４に示す。【００９４】
図４より、酵母エキス成分と、その他の成分を分けて殺菌したのちにこれらを混合した培地（実施例８）を用いて培養した乳酸菌（実施例９）のＩＬ−１２誘導活性（実施例１７）は、培地の全成分を混合して殺菌した培地（比較例３）を用いて培養した乳酸菌（比較例４）のＩＬ−１２誘導活性（比較例８）よりも、顕著に高いことが示された。【００９５】
＜実施例１０〜１２：大スケールによる糖（ショ糖）の単独殺菌＞
（１）培地の調製（実施例１０、比較例５）
表１に記載の配合に従って、ジャーファーメンター（北興火工機製）を用いて、各成分を４．２ｔの滅菌水（０．５μｍフィルター除菌後、１２１℃、２０分間滅菌）に溶解した。その後、スチームインジェクション方式による殺菌をバッチ式で行った。殺菌価Ｆ０＝２０を目標とし、サーモプロセッサ（型番：ＣＭＣ８２１、エラブ社製）を用いて殺菌価管理をした（比較例５）。【００９６】
また、表１のうち、ショ糖２９４ｋｇのみを滅菌水を用いて５０重量％となるよう溶解し、ショ糖溶液を得た。また、表１のショ糖以外の成分を滅菌水３１５２Ｌに溶解し、ショ糖以外の培地成分の混合溶液を得た。そして、上記のショ糖溶液と、ショ糖以外の培地成分の混合溶液を、それぞれ別個に、スチームインジェクション方式による回分殺菌を行った。殺菌価Ｆ０＝２０を目標とし、サーモプロセッサを用いて殺菌価管理をした。その後、これらの殺菌後の溶液を混合して培地４．２ｔを得た。その後、約５０重量％の苛性ソーダ(食品添加物規格準拠)水溶液を用いて、ｐＨを６．８に調整した（実施例１０）。【００９７】
各培地について、培地の色調の指標として６００ｎｍの光の吸光度（ＯＤ６００）を測定した。結果を表１０に示す。【００９８】
【表１０】
2012132335.tif 000012
【００９９】
表１０より、実施例１０の培地は、比較例５の培地と比較し、吸光度が低く、褐変が抑えられていることがわかる。【０１００】
（２）乳酸菌の培養（実施例１１、比較例６）
まず、表１１に記載の配合に従って、各成分を滅菌水を用いて溶解した培地で、乳酸菌・ラクトバチラス  アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）Ｌ−９２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９８１）を培養した。【０１０１】
【表１１】
2012132335.tif 000013
【０１０２】
次に、得られた乳酸菌を、上記比較例５および実施例１０に示した各培地４．２ｔに無菌的に１〜５％接種し、ｐＨが４．５以下になるまで（３０時間程度）、３７度の温度で、攪拌培養した。経時的に培養液をサンプリングし、菌体量の指標として濁度（ＯＤ６００）を測定した（図５）。培養終了後、遠心分離機（型番：ＳＣ−１、ウエストファリア製）を用いて培養液を除去し、その沈殿物（菌体）を捕集した。得られた菌体を滅菌水４．２ｔで洗浄後、プレート式連続殺菌機（型番：ＳＲ２−Ｐ１、ＡＰＶ社製）を用いて８５℃、数秒間殺菌し、噴霧乾燥機（機種：ＳＤ−１００Ｒ、ＧＥＡプロセスエンジニアリング製）を用いて粉末化し、色調（Ｌ値）を測定した（表１２）。【０１０３】
【表１２】
2012132335.tif 000014
【０１０４】
図５および表１２より、４．２ｔの大スケールにおいても、実施例１０の培地を用いて培養した乳酸菌（実施例１１）は、比較例５の培地を用いて培養したもの（比較例６）より、乳酸菌の育成速度が高く、また、高い菌体量（OD６００）を有していた。また、Ｌ値で示される色調も、実施例１１の乳酸菌の方がＬ値が高く、比較例６の乳酸菌よりも褐変が小さく、色調のよい乳酸菌末を得ることが示された。【０１０５】
（３）ＩＬ−１２誘導活性の測定（実施例１２、比較例７）
培養終了後、別途、培養液５０ｍＬをラボレベルで遠心分離（３０００×ｇ、１０分間、室温）の後、上清除去し、その沈殿物（菌体）を精製水５０ｍＬで洗浄した。洗浄後、凍結乾燥にて粉末化したものを用いて、実施例３と同様の条件で、ＩＬ−１２誘導活性を測定した（図６）。【０１０６】
図６より、４．２ｔの大スケールにおいても、ショ糖成分と、その他の成分を分けて殺菌したのちにこれらを混合した培地（実施例１０）を用いて培養した乳酸菌（実施例１１）のＩＬ−１２誘導活性（実施例１２）は、培地の全成分を混合して殺菌した培地（比較例５）を用いて培養した乳酸菌（比較例６）のＩＬ−１２誘導活性（比較例７）よりも、高いことが示された。【０１０７】
＜実施例１３〜１６：窒素源（酵母エキス）の単独殺菌＞
（１）培地の調製その１（実施例１３）
表１３に示した培地成分のうち、ショ糖４５ｇのみを精製水５５ｍＬに溶解し、ショ糖溶液を得た。また、ショ糖以外の培地成分を精製水を用いて４００ｍＬとなるよう溶解し、ショ糖以外の培地成分の混合溶液を得た。そして、上記のショ糖溶液をオートクレーブを用いて、１２１℃、２０分間殺菌した。また、ショ糖以外の培地成分の混合溶液を、オートクレーブを用いて１２１℃で２０分間殺菌したのち、これらを混合、滅菌水を用いてメスアップし、培地５００ｍＬを得た。表１４に殺菌条件を示す。【０１０８】
（２）培地の調製その２（実施例１４）
表１３に示した培地成分のうち、酵母エキス（ＹＰ−２１ＣＭ）２５ｇおよび酵母エキス（Ｙｅａｓｔ  ｐｅｐｔｏｎｅ  ＭＡＸ）１０ｇのみを精製水１１５ｍＬに溶解し、酵母エキス溶液を得た。さらに、酵母エキス以外の培地成分を精製水を用いて３５０ｍＬとなるよう溶解し、酵母エキス以外の培地成分の混合溶液を得た。そして、上記の酵母エキス溶液をオートクレーブを用いて、１２１℃、２０分間殺菌した。また、上記の酵母エキス以外の培地成分の混合溶液をオートクレーブを用いて１２１℃で２０分間殺菌した。これらの溶液を混合し、滅菌水を用いてメスアップし、培地５００ｍＬを得た。
表１４に、各培地の殺菌条件を示す。【０１０９】
【表１３】
2012132335.tif 000015
【０１１０】
【表１４】
2012132335.tif 000016
【０１１１】
（３）乳酸菌の培養（実施例１５、１６）
上記実施例１３および１４に示した各培地を用いて、実施例２と同様の方法で、乳酸菌を培養した。但し、濁度は培養液を９６穴平底プレート（Ｎｕｎｃ製）に分注し、マルチプレートリーダー（大日本製薬製）を用いてＯＤ６００を測定した（図７）。【０１１２】
（４）ＩＬ−１２誘導活性の測定
乳酸菌として上記実施例１３または１４で得られたものを用いた他は、実施例３と同一の条件でＩＬ−１２誘導活性を測定した。結果を表１５に示す。【０１１３】
【表１５】
2012132335.tif 000017
【０１１４】
表１４、図７および表１５より、ショ糖のみと、その他の成分を別個に殺菌して得た培地（実施例１３）を用いて培養した乳酸菌（実施例１５）、および、酵母エキスのみと、その他の成分を別個に殺菌して得た培地（実施例１４）を用いて培養した乳酸菌（実施例１６）のいずれにおいても、良好な生育速度、菌体収量が得られ、ＩＬ−１２誘導活性のよい微生物が得られた。【０１１５】
本実施例から、次のことが特に明確となった。
培地栄養成分の相互作用として、メイラード（Ｍａｉｌｌａｒｄ）反応と呼ばれる褐変現象は、ショ糖のような非還元糖と窒素源との混合物の殺菌においては問題はないはずである。しかし、本願発明において開示したように、非還元糖においても窒素源と別殺菌をすることにより、微生物の育成速度が高く、また、高い菌体収量を達成することができ、色調がよく、さらに、免疫調整機能が高い微生物を得られることが明確になった。
【図１】
2012132335.tif 000018
【図２】
2012132335.tif 000019
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2012132335.tif 000023
【図７】
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【国際調査報告】
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