(57)【要約】微細藻類を培地で培養して得た培養物を中温度で反応させ、次いで、アルコールを添加して、前記中温度より低い温度で反応させ、得られる反応物から脂肪酸エステルを採取することを特徴とする脂肪酸エステルの製造法。
2012099172.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）微細藻類を培地で培養して得た培養物を中温度で反応させ、
（b）次いで、アルコールを添加して、前記中温度より低い温度で反応させ、
（c）得られる反応物から脂肪酸エステルを採取することを特徴とする脂肪酸エステルの製造法。
【請求項２】
前記(a)の反応の温度が40℃以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記(a)の反応の温度が70℃以下である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記(a)の反応のpHが弱酸性から弱アルカリである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記(b)の反応の温度が５℃以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記(b)の反応の温度が６０℃以下である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記(b)の反応のアルコール濃度が５％以上である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記(b)の反応のアルコール濃度が７０％以下である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記(b)の反応に添加するアルコールが、炭素数５以下の低級アルコールである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記(b)の反応に添加するアルコールが、炭素数６以上の高級アルコールである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記(a)及び(b)の二段階反応後にさらに有機溶剤処理することにより、脂肪酸エステルを抽出し、その抽出物から脂肪酸エステルを採取する請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
二段階反応後に遠心分離した沈殿物を有機溶剤処理する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記有機溶剤処理がメタノール、エタノール、2-プロパノール、アセトン、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、クロロホルム、酢酸メチル、酢酸エチル、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル、又はヘキサンで行われる、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記微細藻類が緑色植物門に属する藻類である請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記微細藻類が緑藻綱、トレボキシア藻綱、又はプラシノ藻綱に属する藻類である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記微細藻類が緑藻綱に属する藻類である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、藻類を用いた脂肪酸エステルの製造法に関する。脂肪酸エステルは、食品添加物、化学製品、化粧品、医薬品などの様々な分野に利用される。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸エステルは、動物、植物、魚類及び廃液油由来の油脂からエステル交換反応法により工業生産されている。これらのエステル交換反応としては、酸、アルカリ、金属類又はリパーゼ等の触媒を利用する方法が知られている。例えば、非特許文献１〜４に記載された方法を挙げることができる。一方、触媒を利用する方法以外には、超臨界法が用いられている。例えば、非特許文献５〜７に記載された方法を挙げることができる。【０００３】
エステル交換反応による脂肪酸エステルの工業生産においては、油脂として魚油、動物油、植物油、廃液油等が使用されている。脂肪酸エステルのエステル交換反応による製造法に用いる油脂源として、よく用いられるのは大豆やパームヤシ等の高等植物に由来する油脂である。これらは種子から圧搾又は溶剤抽出によって工業的に得ることが容易な油脂である。これに対して、微細藻類に含まれる油脂は、乾燥重量当たりでは、大豆やパーム油種子に匹敵する含量となるが、藻類の培養液当たりの乾燥藻体重量は、1%に満たない。藻体を分離し、脱水をして、細胞を破砕して油脂を取り出し、さらに精製する工程は煩雑かつ困難である。藻類から精製された油脂から、酸、アルカリ又はリパーゼを用いて脂肪酸エステルを生産すること(特許文献１、非特許文献８〜９)は可能である。また、特許文献２から４には、微細藻類にアルコールを添加し、油脂を細胞内で直接エステル交換するが、いずれの方法もエステル交換反応に酸やアルカリ触媒を必要とする。【０００４】
代表的な組換え可能な藻類であるシネコシスティスは、アセチルCoAカルボキシラーゼ、チオエステラーゼの発現によって大量に脂肪酸を生産することが可能であること（非特許文献１０）、及び、ジアシルグリセロールアセチルトランスフェラーゼの発現によってトリグリセリドを生産すること（特許文献５）が知られている。従って、シネコシスティスの油脂から、酸、アルカリ又はリパーゼなどの触媒を用いて脂肪酸エステルを生産することは容易である。また、シネコシスティスに、ピルビン酸デカルボキシラーゼとアルコールデヒドロゲナーゼを発現し、エタノールを生産させ、エタノールアセチルトランスフェラーゼによって細胞内で脂肪酸エステルを生産できること(特許文献６)が知られているが、遺伝子組み換え技術を利用せずに、藻類細胞内で油脂から脂肪酸エステルを製造する方法は知られていない。【０００５】
一般的に、藻類は、細胞膜の脂質や油脂の分解にリパーゼを利用している (非特許文献１１)。また、珪藻において、シリカ飢餓によるリパーゼ活性の増加と油脂から脂肪酸への分解が確認されているが(非特許文献１２)、それにアルコール類を添加して藻類細胞中で脂肪酸エステルを生産することはこれまで報告はない。【０００６】
またクロレラを高温処理することで、細胞を破砕し有機物を抽出することは知られていたが（特許文献７、８、９）、細胞内の油脂を直接脂肪酸エステルに変換する報告はない。また、クロレラを４０〜５５℃に保って自己消化させることで、低分子の核酸関連物質が増加することも知られていたが（特許文献１０）、この処理法によって脂肪酸エステルを生産する報告はこれまでにない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開２０１０／０００４１６号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００８０２４１９０２号
【特許文献３】中国特許出願公開第１０１５８０８５７号
【特許文献４】米国特許出願公開第２００９０１５８６３８号
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１０００８１１７８号
【特許文献６】国際公開２０１０／０１１７５４号
【特許文献７】特開平９−７５０９４号
【特許文献８】国際公開２００６／０９５９６４号
【特許文献９】米国特許出願公開第２００７０２０２５８２号
【特許文献１０】特開昭６２−２７８９７７号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】U. Schuchardt. et al.1998. J. Brazilian Chemical Society, 9 (3), 199-210
【非特許文献２】H. Fukuda, A. kondo, H. Noda. 2001. J. Bioeng, 92, 405-416
【非特許文献３】T. Samukawa et al. 2000. J. Biosci and Bioeng, 90, 180-183
【非特許文献４】L.A. Nelson et al. 1996. J. Am. Oil Soc. Chem, 73, 1191-1195
【非特許文献５】S. Saka, D. Kusdiana. 2001. Fuel, 80, 225-231
【非特許文献６】D. Kusdiana, S. Saka. 2001. J. Chem. Eng. Japan, 34, 383-387
【非特許文献７】D. Kusdiana, S. Saka. 2001. Fuel, 80, 693-698
【非特許文献８】N. Nagle, P. Lemke. 1990. Applied Biochem and Biotech, 24, 355-361
【非特許文献９】A. Robles Medina et al. 1999. J. Biotech, 70, 379-391
【非特許文献１０】X. Liu et al. 2009. PNAS, 24, 1-6
【非特許文献１１】K. Hoehne-reitan et al. 2007. Aqua. Nutri, 13, 45-49
【非特許文献１２】N. Nagle et al. 1989. Energy from Biomass and wastes, 12, 1107-1115
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、より効率のよい脂肪酸エステルの製造法を提供するものであり、特には、従来、主として動物、植物、魚類及び廃液由来の油脂を基質として行われてきた酸又はアルカリ触媒を用いた脂肪酸エステル製造法に対し、触媒の添加を必要としない、より安価な脂肪酸エステルの製造法を提供するものである。
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、アルコールと反応させる前に、藻類培養物を中温度で反応させることにより、酸又はアルカリを添加することなく、藻類細胞内で効率よく脂肪酸エステルを生産できることを見出した。この知見に基づき本発明は完成された。
（１）（a）微細藻類を培地で培養して得た培養物を中温度で反応させ、
（b）次いで、アルコールを添加して、前記中温度よりも低い温度で反応させ、
（c）得られる反応物から脂肪酸エステルを採取することを特徴とする脂肪酸エステルの製造法。
（２）前記(a)の反応の温度が40℃以上である、上記に記載の方法。
（３）前記(a)の反応の温度が70℃以下である、上記に記載の方法。
（４）前記(a)の反応のpHが弱酸性から弱アルカリである、上記に記載の方法。
（５）前記(b)の反応の温度が5℃以上である、上記に記載の方法。
（６）前記(b)の反応の温度が60℃以下である、上記に記載の方法。
（７）前記(b)の反応のアルコール濃度が５％以上である、上記に記載の方法。
（８）前記(b)の反応のアルコール濃度が７０％以下である、上記に記載の方法。
（９）前記(b)の反応に添加するアルコールが、炭素数５以下の低級アルコールであることを特徴とする、上記に記載の方法。
（１０）前記(b)の反応に添加するアルコールが、炭素数６以上の高級アルコールであることを特徴とする、上記に記載の方法。
（１１）前記(a)及び(b)の二段階反応後にさらに有機溶剤処理することにより、脂肪酸エステルを抽出し、その抽出物から脂肪酸エステルを採取する上記に記載の方法。
（１２）上記二段階反応後に遠心分離した沈殿物を有機溶剤処理する上記に記載の方法。
（１３） 上記有機溶剤処理が、メタノール、エタノール、2-プロパノール、アセトン、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、クロロホルム、酢酸メチル、酢酸エチル、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル、又はヘキサンで行われることを特徴とする、上記に記載の方法。
（１４）前記微細藻類が緑色植物門に属する藻類である、上記に記載の方法。
（１５）前記微細藻類が緑藻綱、トレボキシア藻綱、又はプラシノ藻鋼に属する藻類である、上記に記載の方法。
（１６）前記微細藻類が緑藻綱に属する藻類である、上記に記載の方法。
【００１１】
本発明の利用により、効率よく脂肪酸エステルが生産できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】藻類培養物の二段階反応における一段目反応の温度条件の検討
【図２】藻類培養物の二段階反応における一段目反応の時間の検討
【図３】藻類培養物の二段階反応における一段目反応のpHの検討
【図４】藻類培養物の二段階反応における二段目反応のメタノール添加濃度の検討
【図５】藻類培養物の二段階反応における二段目反応の時間の検討
【図６】藻類培養物の二段階反応における二段目反応の温度の検討
【図７】藻類培養物の二段階反応における二段目反応の添加アルコールの検討
【図８】藻類培養物の二段階反応によって生成した脂肪酸アルコールエステルの定性
【図９】Scenedesmus abundans UTEX 1358株での二段階反応の結果
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明で使用する微細藻類とその培養法
本発明における微細藻類（microalgae）は、どのようなものでも用いることが出来るが、スターチ及び/または油脂を藻体内に蓄積する微細藻類であることが好ましい。
【００１４】
藻類（algae）とは、酸素発生型光合成を行う生物のうち、主に地上に生息するコケ植物、シダ植物、種子植物を除いたものを全て指す。藻類には、原核生物であるシアノバクテリア（藍藻）（cyanobacteria）から、真核生物である灰色植物門 （Glaucophyta）、紅色植物門（紅藻）（Rhodophyta）、緑色植物門 （Chlorophyta）、クリプト植物門（クリプト藻）（Cryptophyta）、ハプト植物門（ハプト藻）（Haptophyta）、不等毛植物門（Heterokontophyta）、渦鞭毛植物門（渦鞭毛藻）（Dinophyta）、ユーグレナ植物門（Euglenophyta）、 クロララクニオン植物門（Chlorarachniophyta）に分類される様々な単細胞生物及び多細胞生物が含まれる。微細藻類は、これら藻類から多細胞生物である海藻類を除いた微視的な構造を持つ藻類を指す（バイオディバーシティ・シリーズ（3）藻類の多様性と系統：千原光雄 編 裳華房（1999））。
【００１５】
微細藻類をはじめとする植物は、油脂を貯蔵物質として蓄積するものがあることが知られている（Chisti, Y. 2007. Biotechnol Adv. 25: 294-306）。このような藻類としては、緑色植物門や不等毛植物門に属するものが、よく知られている。緑色植物門の中では、緑藻綱（Chlorophyceae）に属する藻類が挙げられ、緑藻綱に属する藻類としては、クロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)(Bhatnagar A , 2010 Appl Biochem Biotechnol. 161:523-36) セネデスムス・オブリカス(Scenedesmus obliquus) (Shovon, M. et al. 2009. Appl Microbiol Biotechnol. 84:281-91) ネオクロリス・オレオアバンダンス（Neochloris oleoabundans）（Tornabene, T.G. et al. 1983. Enzyme and Microb. Technol. 5: 435-440）ナノクロリス・エスピー（Nannochloris sp.）（Takagi, M. et al. 2000. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 112-117）等を挙げることが出来る。不等毛植物門には黄金色藻綱（Chrysophyceae）、ディクチオカ藻綱（Dictyochophyceae）、ペラゴ藻綱（Pelagophyceae）、ラフィド藻綱(Rhaphidophyceae）、珪藻綱（Bacillariophyceae）、褐藻綱（Phaeophyceae）、黄緑藻綱（Xanthophyceae）、真正眼点藻綱（Eustigmatophyceae）が分類されるが、よく用いられる珪藻綱に属する藻類としては、タラシオシラ・スードナナ（Thalassiosira pseudonana）（Tonon, T et al. 2002. Phytochemistry 61: 15-24）を挙げることが出来る。具体的にはクロレラ・ミヌティッシマとして、Chlorella minutissima UTEX 2314株、セネデスムス・オブリカスとして、具体的には、Scenedesmus obliquus UTEX393株、ネオクロリス・オレオアバンダンスとして、具体的には、Neochloris oleoabundans UTEX 1185株、ナノクロリス・エスピーとしては、Nannochloris sp. UTEX LB 1999株、タラシオシラ・スードナナとしては、Thalassiosira pseudonana UTEX LB FD2株が挙げられる。これらの菌株は、テキサス大学藻類カルチャーコレクション（The University of Texas at Austin, The Culture Collection of Algae (UTEX), 1 University Station A6700, Austin, TX 78712-0183, USA）より入手することができる。
また、高機能性の脂肪酸であるEPA・DHA生産藻類として緑色植物門、不等毛植物門、紅色植物門、又はハプト植物門に属するものが、よく知られている。緑色植物門の中では、緑藻綱、プラシノ藻綱、トレボウクシア藻綱に属する藻類が挙げられ、よく知られる緑藻綱に属する藻類としてはクロレラ・ミヌティッシマ(Chlorella minutissima)(Rema, V et al. 1998. JAOCS. 75: 393-397) 不等毛植物門には珪藻綱（Bacillariophyceae）、真正眼点藻綱（Eustigmatophyceae）に属する藻類が挙げられ、よく用いられる珪藻綱に属する藻類としてはタラシオシラ・スードナナ（Thalassiosira pseudonana）（Tonon, T et al. 2002. Phytochemistry 61: 15-24）、真正眼点藻綱（Eustigmatophyceae）にはナノクロロプシス・オクラータNannochloropsis oculataが挙げられる。
【００１６】
微細藻類の培養については多くの知見があり、Chlorella属、Arthrospira属（Spirulina）、あるいは、Dunaliella salinaなどは、食用として大規模な工業的な培養が行われている（Spolaore, P. et al. 2006. J. Biosci. Bioeng. 101: 87-96）。クラミドモナス・レインハルディには、例えば、0.3×HSM培地（Oyama, Y. et al. 2006. Planta 224: 646-654）を用いることが出来るし、クロレラ・ケッサレリには、0.2×ガンボーグ培地（Izumo, A. et al. 2007. Plant Science 172: 1138-1147）などを用いることが出来る。クロレラ・ブルガリスには、BG-1１培地又はM8培地（Ramkumar、K.M et al. 1998. Biotech. Bioeng. 59: 605-611）などを用いることができる。ネオクロリス・オレオアバンダンスやナノクロリス・エスピーは、modified NORO培地（Yamaberi, K. et al. 1998. J. Mar. Biotechnol. 6: 44-48; Takagi, M. et al. 2000. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 112-117）やBold's Basal Medium（Tornabene, T. G. et al. 1983. Enzyme and Microb. Technol. 5: 435-440; Archibald, P. A. and Bold, H. C. 1970. Phytomorphology 20: 383-389）、ダイゴIMK培地(Ota, M. et al. 2009. Bioresource Technology. 100: 5237-5242)を用いて培養することが出来る。珪藻綱に属する藻類としては、タラシオシラ・スードナナには、F/2培地（Lie, C.-P. and Lin, L.-P. 2001. Bot. Bull. Acad. Sin. 42: 207-214）などを好適に用いることが出来る。また微細藻類の培養には、フォトバイオリアクターを用いることも出来る（WO2003/094598号パンフレット）。
【００１７】
培養は、本培養の体積に対し、1-50%の前培養液を添加して行うことが多い。初発のpHは7-9の中性付近が好ましく、培養中はpH調整を行わないことが多いが、必要に応じてすることもある。培養温度は、25-35℃が好ましく、特に28℃付近が一般的によく用いられる温度であるが、培養温度は、用いる藻類に適した温度であれば構わない。培養液には、空気を吹き込むことが多く、通気量としては、1分間の培養液体積当たりの通気量0.1-2vvm（volume per volume per minute）がよく用いられる。さらにCO2を吹き込むことも、生育を早めるために行われるが、通気量に対して、0.5-5%程度吹き込むのが好ましい。光の照射強度も微細藻類の種類によって、至適が異なるが、1,000-30,000 lux程度がよく用いられる。光源は、屋内では白色の蛍光灯を用いることが一般的であるが、これに制限されない。屋外にて太陽光で培養することも可能である。必要に応じて、培養液を適切な強度で撹拌、あるいは循環することもある。 また、藻類は、窒素源が枯渇すると油脂を藻体内に蓄積することが知られており（Thompson GA Jr. 1996. Biochim. Biophys. Acta 1302: 17-45）、窒素源の濃度をより制限した培地を本培養に用いることもできる。
【００１８】
本発明において微細藻類の培養物とは、藻体を含む培養液、培養液から回収した藻体を包含する。
【００１９】
藻体を培養液から回収する方法は、一般的な遠心分離や濾過、あるいは、凝集剤（flocculant）を用いた重力による沈降などの方法で可能である（Grima, E. M. et al. 2003. Biotechnol. Advances 20: 491-515）。
【００２０】
特に本発明においては、中温度で反応させる前に、微細藻類を遠心分離等で濃縮しておくことが好ましい。藻体の濃縮には、溶液成分を除去して、微細藻類の乾燥重量の溶液あたりの濃度として25g/L以上、好ましくは250g/L以上にすること(遠心分離などの方法により培地から分離した藻体を液体に懸濁して所望の濃度にすることを含む)、及び、沈殿させて藻体を培地から分離して用いることを含む。
【００２１】
＜２＞本発明の微細藻類の培養物の反応方法と反応物
本発明においては、微細藻類の培養物を中温度とアルコール添加後の中低温度（前記中温度より低い温度）の二段階反応で処理し（即ち、二段階反応に付し）、その微細藻類の処理物（反応物）を、脂肪酸エステルを採取するために用いる。
【００２２】
本発明において、微細藻類の反応物とは、微細藻類の培養物を中温度とアルコール添加後の中低温度の二段階反応に付した反応液を意味する。処理物は、その後の脂肪酸エステルの採取を妨げない限り、二段階反応に付した反応液をさらに抽出もしくは分画及び／又は別の処理に付してもよい。本発明の処理物中には、脂肪酸エステルの他に副生物が生じるが、その中でも油脂のエステル交換反応によって生成したグリセロールは、Ｌ-アミノ酸生産能を有する細菌によるＬ−アミノ酸の生産や化成品に利用してもよい。
【００２３】
二段階反応の二段目の反応は、脂肪酸エステルを生成する反応である。また、一段目の反応は、二段目の脂肪酸エステルの生成反応を促進するように微細藻類の培養物の状態を変化させる反応である。
本発明において、二段階反応における温度は、中温度反応とアルコール添加後の中低温度反応後の反応物中の脂肪酸エステルが増加するのに十分な温度であればよく、一段目の反応後、温度を低下させて二段目の反応を行う。ここでの一段目反応の温度の下限としては、通常には40℃以上、好ましくは45℃以上、さらに好ましくは50℃以上、上限としては、通常には70℃以下、好ましくは65℃以下、さらに好ましくは60℃以下である。二段目反応の温度の下限としては、通常には5℃以上、好ましくは20℃以上、さらに好ましくは30℃以上、上限としては、通常には60℃以下、好ましくは50℃以下、さらに好ましくは45℃以下である。
【００２４】
本発明において、二段階反応での一段目反応は、上記藻類の培養方法で得られた培養物をそのまま反応させてもよいが、前述のように濃縮して用いてもよい。例えば、一旦遠心分離した後、沈殿した藻体を反応物として用いてもよい。
【００２５】
また一段目反応前に、反応中のｐＨを弱酸性又は弱アルカリに調整してもよい。
【００２６】
ここで弱酸性のpHは、好ましくは3.0〜6.5、さらに好ましくは4.0〜6.0である。さらに、弱アルカリのpHは、好ましくは7.5から12.0、さらに好ましくは9.0〜11.0である。
【００２７】
二段目反応の前にアルコールを添加する方法としては、一段目反応の反応液にアルコールを添加してもよいし、一段目反応の反応液の液相を遠心分離などにより除去した後に二段目反応用の反応液を加えてもよい。
【００２８】
二段目反応の前に添加するアルコールの濃度は、少なくても５％以上、好ましくは１０％以上、さらに好ましくは２０％以上で反応させることが好ましい。また、上限として、通常７０％以下、好ましくは６０％、さらに好ましくは５０％以下であることが好ましい。
【００２９】
また、添加するアルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、エチレングリコールなどの炭素数５以下の低級アルコール又はヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノールなど炭素数６以上の高級アルコールを用いてもよい。
【００３０】
本発明において、一段目反応（中温での処理）は、少なくても5分以上、好ましくは10分以上、さらに好ましくは20分以上反応させることが好ましい。一段目反応は、通常120分以下、さらに好ましくは60分以下であることが好ましい。さらに、二段目反応（中低温での処理）は、下限としては、少なくても１０分以上、好ましくは３０分以上、さらに好ましくは１２０分以上、上限としては、通常１５時間以下、好ましくは１０時間以下、さらに好ましくは５時間以下であることが好ましい。
【００３１】
二段階反応後の反応物から脂肪酸エステルを抽出する方法は、一般的な藻類から油脂を抽出する方法が適用可能であり、例えば、有機溶剤処理や超音波処理、ビーズ破砕処理、酸処理、アルカリ処理、酵素処理、水熱処理、超臨界処理、マイクロ波処理、電磁場処理、あるいは、圧搾処理などの方法がある。細胞外に脂肪酸エステルを溶出させ、該溶出物から脂肪酸エステルを採取する処理をすることが好ましい。
【００３２】
本発明において、二段階反応後の有機溶剤処理は、メタノール、エタノール、2-プロパノール、アセトン、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、クロロホルム、酢酸メチル、酢酸エチル、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル、ヘキサンなどが挙げられる。
【００３３】
二段階反応後、反応液は、遠心分離によって、沈殿物と上清液に分離することが好ましい。また二段階反応後、有機溶剤を加え、水層と有機溶剤層の二層での抽出法を用いてもよい。
【００３４】
本発明において、触媒の添加を必要としない理由は、一段目反応により、微細藻類の細胞中のリパーゼが脂質に作用しやすい状態になり、そのリパーゼによって、油脂、セラミド（Ceramide）、リン脂質 (Phospholipid)や糖脂質 (Glycolipid)が外部より添加したアルコールとエステル交換反応するためと考えられる。
【００３５】
一般的にリパーゼによるエステル交換反応は、アルコール類以外の有機溶剤の添加によって促進される。従って、二段目反応において反応促進に有効な量の有機溶剤を加えてもよい。このような有機溶剤としては、例えば、ヘキサン、ヘプタン、イソオクタンクロロホルム、酢酸エチル、石油エーテルなどがある。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例にて、本発明を更に具体的に説明する。本実施例には、テキサス大学藻類カルチャーコレクション（The University of Texas at Austin, The Culture Collection of Algae (UTEX), 1 University Station A6700, Austin, TX 78712-0183, USA）より入手したChlorella kessleri 11h株（UTEX 263）及びScenedesmus abundans UTEX 1358株を用いた。【００３７】
＜実施例１＞微細藻類 Chlorella kessleri 11h株の培養
Chlorella kessleri 11h株を、800mLの0.2×ガンボーグB5培地（日本製薬）を入れた1000mL容メディウムビンにて30℃、光強度7,000 lux（TOMY社製培養装置CL-301）、400mL/minで空気と3% CO2の混合ガスを吹き込みながら、7日間培養し、これを前培養液とした。尚、光源には、蛍光灯からの白色光を用いた。0.2×ガンボーグB5 培地800mLを入れた1000mL容メディウムビンに、前培養液16mLを添加し、培養温度30℃、光強度7,000 luxにて、400 mL/minで空気と3% CO2の混合ガスを吹き込みながら、14日間培養を行った。【００３８】
(0.2×ガンボーグB5培地)
KNO3             500 mg/L
MgSO4・7H2O        50 mg/L
NaH2PO4・H2O       30 mg/L
CaCl2・2H2O        30 mg/L
（NH4）2SO4        26.8 mg/L
Na2-EDTA           7.46 mg/L
FeSO4・7H2O        5.56 mg/L
MnSO4・H2O         2 mg/L
H3BO3              0.6 mg/L
ZnSO4・7H2O        0.4 mg/L
KI                0.15 mg/L
Na2MoO2・2H2O      0.05 mg/L
CuSO4・5H2O        0.005 mg/L
CoCl2・6H2O        0.005 mg/L
120℃ 15分          オートクレーブ殺菌【００３９】
＜実施例２＞藻類の二段階反応における一段目反応の温度条件の検討
実施例１で得られた培養液を遠心分離し、その沈殿物に滅菌水を加え、１倍懸濁液を調製した。その懸濁液のpHを1N HCl溶液で4.5に調整後、1.5ml容量のエッペンチューブに1ml入れ、45℃、50℃、55℃、60℃の各温度、静置で10minプレインキュベーションした。次に、各サンプルを上記と同じ温度にて1000rpm、30minインキュベートした後、各サンプルを遠心分離し、それらの沈殿物に200μlの10％メタノール溶液を加えた。各サンプルを42℃、1000rpm、5hrインキュベートし、油脂とメタノールのエステル交換反応を行った。得られたサンプルから脂質の抽出を行い、脂肪酸メチルエステルの測定を行った。それらの測定結果を図１に示した。45℃、30minの誘導後、42℃、5hrでは、ほとんど脂肪酸メチルエステルの生成が確認されないが、50℃以上30minの誘導処理後、42℃、5ｈｒ処理では、脂肪酸メチルエステルの生成が確認され、５５℃の誘導温度で、最もその収率が増加した。【００４０】
＜実施例３＞藻類の二段階反応における一段目反応の時間の検討
実施例１で得られた培養液を遠心分離し、その沈殿物に滅菌水を加え、１倍懸濁液を調製した。その懸濁液のpHを1N HCl溶液で4.5に調整後、1.5ml容量のエッペンチューブに1ml入れ、55℃静置で10minプレインキュベーションした後、55℃、1000rpm、10min、20min、30min、40min、50min又は60minインキュベートした後、各サンプルを遠心分離し、それらの沈殿物に200μlの10％メタノール溶液を加えた。各サンプルを42℃、1000rpm、5hrインキュベートし、油脂とメタノールのエステル交換反応を行った。得られたサンプルから脂質の抽出を行い、脂肪酸メチルエステルの測定を行った。それらの測定結果を図２に示した。55℃、10minの誘導温度と比較して、55℃、20minで脂肪酸メチルエステル生産の収率が増加した。一方で、55℃、30min以降の誘導温度では、誘導時間の増加に伴って、収率が減少する傾向を示した。【００４１】
＜実施例４＞藻類の二段階反応における一段目反応のpHの検討
実施例１で得られた培養液を遠心分離し、その沈殿物に滅菌水を加え、１倍懸濁液を調製した。その懸濁液を1N HCl溶液又は1N NaOHで各pHに調整後、1.5ml容量のエッペンチューブに1ml入れ、55℃静置で5minプレインキュベーションした後、55℃、1000rpm、20minインキュベートした後、各サンプルを遠心分離し、それらの沈殿物に200μlの10％メタノール溶液を加えた。各サンプルを42℃、1000rpm、5hrインキュベートし、油脂とメタノールのエステル交換反応を行った。得られたサンプルから脂質の抽出を行い、脂肪酸メチルエステルの測定を行った。それらの測定結果を図３に示した。3.0から10.5のpH範囲で脂肪酸メチルエステルの生産が確認され、その中でも弱酸性領域のpH4.5と弱アルカリ領域のpH 10.5の2条件で、高い収率を示した。【００４２】
＜実施例５＞藻類の二段階反応のメタノール添加濃度の検討
実施例１で得られた培養液を遠心分離し、その沈殿物に滅菌水を加え、１倍懸濁液を調製した。その懸濁液のpHを1N HCl溶液で4.5に調整後、1.5ml容量のエッペンチューブに1ml入れ、55℃静置で5minプレインキュベーションした後、55℃、1000rpm、20minインキュベートした後、遠心分離し、沈殿物に200μlの5から50％メタノール溶液を加えた。各サンプルを42℃、1000rpm、5hrインキュベートし、油脂とメタノールのエステル交換反応を行った。得られたサンプルから脂質の抽出を行い、脂肪酸メチルエステルの測定を行った。それらの測定結果を図４に示した。30％までのメタノール添加濃度では、その添加濃度の増加に伴って、脂肪酸メチルエステル生産の収率が増加した。一方で、35％以上の高濃度メタノール溶液では、濃度の増加に伴って収率が低下した。【００４３】
＜実施例６＞藻類の二段階反応の二段目反応の時間の検討
実施例１で得られた培養液を遠心分離し、その沈殿物に滅菌水を加え、１倍懸濁液を調製した。その懸濁液のpHを1N HCl溶液で4.5に調整後、1.5ml容量のエッペンチューブに1ml入れ、55℃静置で5minプレインキュベーションした後、55℃、1000rpm、20minインキュベートした後、遠心分離し、沈殿物に200μlの30％メタノール溶液を加えた。各サンプルを42℃、1000rpm、各時間インキュベートし、油脂とメタノールのエステル交換反応を行った。得られたサンプルから脂質の抽出を行い、脂肪酸メチルエステルの測定を行った。それらの測定結果を図５に示した。３０minの反応時間と比較して、６０min、９０min、１２０min、２４０minの時間の経過と伴に脂肪酸メチルエステル生産の収率が緩やかに増加した。一方で、360min以降の反応温度では、反応時間の経過に伴って、収率が緩やかに減少する傾向を示した。【００４４】
＜実施例７＞藻類の二段階反応の二段目反応の温度の検討
実施例１で得られた培養液を遠心分離し、その沈殿物に滅菌水を加え、１倍懸濁液を調製した。その懸濁液のpHを1N HCl溶液で4.5に調整後、1.5ml容量のエッペンチューブに1ml入れ、55℃静置で5minプレインキュベーションした。次に、各サンプルを55℃、1000rpm、20minインキュベートした後、遠心分離し、沈殿物に200μlの30％メタノール溶液を加えた後、各温度で、1000rpm、2hrインキュベートし、油脂とメタノールのエステル交換反応を行った。得られたサンプルから脂質の抽出を行い、脂肪酸メチルエステルの測定を行った。それらの測定結果を図６に示した。5℃の反応温度でも脂肪酸エステルの生産が確認され、さらに温度の上昇に伴って脂肪酸エステルの収率が35℃の反応温度まで増加した。一方、40℃以上の反応温度では、温度の上昇に伴って収率が低下する傾向を示した。【００４５】
＜実施例８＞藻類の二段階反応の添加アルコールの検討
実施例１で得られた培養液を遠心分離し、その沈殿物に滅菌水を加え、１倍懸濁液を調製した。その懸濁液のpHを1N HCl溶液で4.5に調整後、1.5ml容量のエッペンチューブに1ml入れ、55℃静置で5minプレインキュベーションした後、55℃、1000rpm、20minインキュベートした後、遠心分離し、沈殿物に200μlの10％メタノール、10％エタノール又は10％ブタノール溶液を加えた。各サンプルを42℃、1000rpm、5hrインキュベートし、油脂とアルコールのエステル交換反応を行った。得られたサンプルから脂質の抽出を行い、脂肪酸アルコールエステルの測定を行った。それらの測定結果を図７に示した。10％メタノールを添加した場合と比較して、10％エタノール添加でもほぼ同等の収率が確認された。また、メタノール及びエタノールを添加した場合と同様に、ブタノール添加によって脂肪酸ブタノールエステルのバンドが複数確認された。【００４６】
＜実施例９＞二段階反応によって生成した脂肪酸アルコールエステルの定性
実施例１で得られた培養液を遠心分離し、その沈殿物に滅菌水を加え、１倍懸濁液を調製した。その懸濁液のpHを1N HCl溶液で4.5に調整後、1.5ml容量のエッペンチューブに1ml入れ、55℃静置で5minプレインキュベーションした後、55℃、1000rpm、20minインキュベートした後、遠心分離し、沈殿物に200μlの10％メタノール、10％エタノール溶液を加えた。各サンプルを42℃、1000rpm、5hrインキュベートし、油脂とアルコールのエステル交換反応を行った。得られたサンプルから脂質の抽出を行い、脂肪酸アルコールエステルの定性を行った。それらの結果を図８に示した。メタノールとエタノールの添加の実験区間で、ほぼ同じ脂肪酸アルコールエステルの組成を示した。ただし、エタノール添加でのミリスチン酸エチルエステルは未解析である(N.A.と表記)。α-リノレン酸アルコールエステル含量が最も多く、それ以外にミリスチン酸メチルエステル、パルミチン酸アルコールエステル、リノール酸アルコールエステル、オレイン酸アルコールエステル及びステアリン酸アルコールエステルが確認された。【００４７】
＜実施例１０＞Scenedesmus abundans UTEX 1358株の培養
Scenedesmus abundans UTEX 1358株を、100mLのModified Bold 3N培地を入れた500mL容三角フラスコにて30℃、光強度7,000 luxの日照条件で（明暗それぞれ11hrのグラディエント法） 、インキュベーター内のCO2濃度を1%に保ちながら、7日間培養し、これを前培養液とした。尚、光源には、蛍光灯からの白色光を用いた。Modified Bold 3N培地100mLを入れた500mL容三角フラスコに、前培養液5mLを添加し、同条件にて、16日間培養を行った。【００４８】
(Modified Bold 3N培地)
NaNO3             750 mg/L
MgSO4・7H2O        75 mg/L
KH2PO4            175 mg/L
K2HPO4             75 mg/L
CaCl2・2H2O        25 mg/L
NaCl               25 mg/L
Na2EDTA・2H2O       4.5 mg/L
FeCl3・6H2O         0.582 mg/L
MnCl2・4H2O         0.246 mg/L
ZnCl2               0.03 mg/L
CoCl2・6H2O         0.012 mg/L
Na2MoO4・2H2O       0.024 mg/L
HEPES              0.036 mg/L
Thiamine           1.1 mg/L
Biotin             0.025 mg/L
VitaminB12           0.12 mg/L
CaCO3                  0.2 mg/L
Green house soil   0.2 tsp/L
pH6.2に調整後、120℃ 15分          オートクレーブ殺菌【００４９】
＜実施例１１＞Scenedesmus abundans UTEX 1358株での二段階反応
実施例１０で得られた100mlの培養液を遠心分離し、その沈殿物に滅菌水を加え、１倍細胞懸濁液を調製した。その懸濁液のpHを1N HCl溶液で4.2に調整後、1.5ml容量のエッペンチューブに1ml入れ、55℃静置で5minプレインキュベーションした後、55℃、1000rpm、20minインキュベートした後、遠心分離し、沈殿物に200μlの20％メタノール溶液を加えた。それを42℃、1000rpm、6hrインキュベートし、油脂とアルコールのエステル交換反応を行った。得られたサンプルから脂質の抽出を行い、脂肪酸メチルエステルの測定を行った。それらの結果を図９に示した。Scenedesmus abundans UTEX 1358株においても、脂肪酸メチルエステルの生産が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明により、効率よく脂肪酸エステルが生産できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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