(57)【要約】試料中に存在する全てのプロテインＳの活性を、すなわち、総プロテインＳの活性を測定することが出来る、試料中の総プロテインＳの活性測定試薬及び活性測定方法を提供する。  本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬は、活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有するものである。  また、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法は、試料中の総プロテインＳの活性を測定する方法であって、当該総プロテインＳ活性の測定反応時に、界面活性剤を存在させることを特徴とするものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の総プロテインＳの活性を測定する方法であって、当該総プロテインＳ活性の測定反応時に、界面活性剤を存在させることを特徴とする、試料中の総プロテインＳの活性測定方法。
【請求項２】
プロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させる、請求項１記載の試料中の総プロテインＳの活性測定方法。
【請求項３】
総プロテインＳ活性の測定反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる、請求項１又は請求項２記載の試料中の総プロテインＳの活性測定方法。
【請求項４】
プロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の試料中の総プロテインＳの活性測定方法。
【請求項５】
試料中の総プロテインＳ活性の測定が、次の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む方法により行われるものである、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の試料中の総プロテインＳの活性測定方法。
（ａ）  活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
（ｂ）  次に、前記（ａ）の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
（ｃ）  次に、この試料に含まれる総プロテインＳの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量より、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
【請求項６】
試料中の総プロテインＳ活性の測定が、次の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む方法により行われるものである、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の試料中の総プロテインＳの活性測定方法。
（ａ）  試料と、少なくとも活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させることにより、試料にプロテインＳが含まれる場合には活性化プロテインＣが活性上昇する。
（ｂ）  次に、前記（ａ）の成分及び活性化血液凝固第Ｖ因子の存在下、活性化プロテインＣが触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が、前記（ａ）における活性化プロテインＣの活性上昇により、促進される。
（ｃ）  次に、活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（ｂ）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減される。
（ｄ）  次に、前記（ｃ）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
（ｅ）  次に、前記（ｄ）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
【請求項７】
活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有する試料中の総プロテインＳの活性測定試薬。
【請求項８】
界面活性剤が、プロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に存在させるものである、請求項７記載の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬。
【請求項９】
リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質である、請求項７又は請求項８記載の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬。
【請求項１０】
ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質が、プロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に存在させるものである、請求項７〜請求項９のいずれか１項に記載の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬。
【請求項１１】
次の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む試料中の総プロテインＳ活性の測定のためのものである、請求項７〜請求項１０のいずれか１項に記載の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬。
（ａ）  活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
（ｂ）  次に、前記（ａ）の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
（ｃ）  次に、この試料に含まれる総プロテインＳの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量より、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
【請求項１２】
次の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む試料中の総プロテインＳ活性の測定のためのものである、請求項７〜請求項１１のいずれか１項に記載の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬。
（ａ）  試料と、少なくとも活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させることにより、試料にプロテインＳが含まれる場合には活性化プロテインＣが活性上昇する。
（ｂ）  次に、前記（ａ）の成分及び活性化血液凝固第Ｖ因子の存在下、活性化プロテインＣが触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が、前記（ａ）における活性化プロテインＣの活性上昇により、促進される。
（ｃ）  次に、活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（ｂ）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減される。
（ｄ）  次に、前記（ｃ）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
（ｅ）  次に、前記（ｄ）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の総プロテインＳの活性を測定することができる活性測定試薬及び活性測定方法に関するものである。
本発明は、特に、臨床検査、分子生物学、及び医学などの生命科学分野等において有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
プロテインＳは、生体内の血液凝固系の制御機構において中心的に機能する血漿タンパク質である。
このプロテインＳは、主に血液中に存在するものであって、活性化プロテインＣの補欠因子（補助因子）であり、活性化プロテインＣの活性を上昇させることができ、血液中での活性化プロテインＣの働きに欠かせないものである。
なお、活性化プロテインＣは、ヒトにおける血液凝固を促進する活性化血液凝固第Ｖ因子（第Ｖａ因子；ＦＶａ）、及び活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子（第ＶＩＩＩａ因子；ＦＶＩＩＩａ）を分解することにより、血液凝固反応を抑制する役割を担った因子である。
プロテインＳは、Ｃ４ｂ結合タンパク質（補体第４因子ｂ結合タンパク質；Ｃ４ｂＢＰ）と１対１で特異的に結合し、複合体を形成する。つまり、Ｃ４ｂ結合タンパク質は、プロテインＳのリガンドとなる。
このプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体形成反応は、下に示した通りであるが、この反応は可逆反応である。
【化１】
2012124798.tif 000002
そして、ヒト血液中においては、通常、プロテインＳに比べてＣ４ｂ結合タンパク質のモル濃度は小さく、また解離定数も小さいため、血液中には「プロテインＳ」及び「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体」のみ存在する。つまり、上記の反応の平衡は、完全に右に寄っていることになる。
通常、健常者の血液中（血漿中）のプロテインＳは、その約６０％が「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体」（すなわち、結合型）であり、その約４０％は「遊離状態のプロテインＳ」（すなわち、遊離型）である。
なお、遊離のプロテインＳ（すなわち、遊離型）のみが、活性化プロテインＣに対する補酵素活性を示し、活性化プロテインＣの活性を上昇させることができるのである。
なお、本明細書において、「プロテインＳ」又は「Ｃ４ｂ結合タンパク質」等の語は、特に複合体（若しくは結合型）又は遊離（若しくは遊離型）等の記載が無い場合は、それぞれこれらの物質の複合体（又は結合型）及び遊離状態（又は遊離型）のものの総称を意味するものとする。
下に、プロテインＣ及びプロテインＳによる血液凝固系の制御機構の模式図を示した。
【化２】
2012124798.tif 000003
プロテインＣは生体内において、トロンビン・トロンボモジュリン複合体により限定分解され活性化ペプチドが遊離することにより活性化され、活性化プロテインＣとなる。
活性化プロテインＣは、ヒトおける血液凝固を促進する活性化血液凝固第Ｖ因子、及び活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子を分解することにより、血液凝固反応を抑制する役割を担ったセリンプロテアーゼである。
プロテインＳは、活性化プロテインＣの補欠因子（補助因子）であり、プロテインＳの存在により、活性化プロテインＣの活性は上昇し、活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応及び活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子の分解反応は促進される。
血液凝固反応を抑制する働きを持つプロテインＳの活性の低下又は異常は、生体内において血栓症を引き起こす原因となりうる。
実際、プロテインＳの先天性異常症者は、高い頻度で深部静脈血栓症、表在性静脈炎若しくは肺梗塞などの静脈性血栓症、又は心不全の原因となる冠状動脈血栓症などの動脈性血栓症等を発症することになる。
また、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、ビタミンＫ欠乏症又は肝機能低下症等においても、プロテインＳの活性の低下又は異常が認められる。
即ち、血漿等の試料中のプロテインＳの活性を測定することにより、プロテインＳの活性の低下又は異常を把握することができ、引いては血栓症等の疾患の発症の予測、早期発見及び治療効果の判定等に重要な役割を果たすものである。
試料中のプロテインＳの活性を測定する方法として、試料を蛇毒からのプロテインＣ−活性化剤と共に、活性化プロテインＣの形成下にインキュベートし、血液凝固第ＸＩＩ因子、血液凝固第ＶＩＩ因子又は血液凝固第ＩＩ因子（プロトロンビン）の活性化剤を添加し、かつ血液凝固因子及びその活性剤により媒介される、プロトロンビンからのトロンビンの形成の減少を、色素原トロンビン基質を使用して測光測定する方法が開示されている（特許文献１参照。）。
別の試料中のプロテインＳの活性を測定する方法として、血漿試料にプロテインＣを活性化するプロテインＣ活性化物質又は活性化プロテインＣを添加し、次に活性化血液凝固第ＩＸ因子を加えインキュベートし、生成するトロンビンの量を知られた方法で測定し、これをプロテインＳ活性が既知の標品を測定して得た値と比較して、試料中のプロテインＳの活性を測定する方法が開示されている（特許文献２参照。）。
また、別の試料中のプロテインＳの活性を測定する方法として、試料を、活性化プロテインＣ、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、リン脂質及びカルシウムイオンとインキュベートし、次にこの混合物を、活性化血液凝固第ＩＩ因子（トロンビン）、活性化血液凝固第ＩＸ因子及び活性化血液凝固第Ｘ因子とインキュベートし、次にこのインキュベーション混合物へ活性化血液凝固第Ｘ因子特異性基質を添加し、この基質の開裂によって生成したシグナルの量を測定することよりなる、試料中のプロテインＳの活性を測定する方法が開示されている（特許文献３参照。）。
これら従来の試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、その測定反応に使用する血液凝固反応の成分（因子）の少なくとも一つは、試料に含まれている成分（因子）をそのまま用いているものであった。すなわち、試料に含まれている成分に依存しているものであった。
従って、このような試料に含まれている成分（因子）をそのまま用いる従来の試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、その成分（因子）〔例えば、活性化血液凝固第Ｘ因子〕がその試料提供者において欠損又は低下しているときには、前記測定反応の反応成分（因子）の少なくとも一つが十分量存在しない訳であるから、測定反応は十分に進行せず、得られるプロテインＳ活性値は、場合により本来の値よりかい離し、誤差を含むものになるという問題を有するものであった。
すなわち、測定値が、血液凝固反応に係わる成分（因子）の試料中の存在量（濃度）又はその変異により、影響を受けてしまうことが起こるという問題を有するものであった。
そこで、本発明者らは、試料に由来しない、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有する試料中のプロテインＳの活性測定試薬、並びに、試料に由来しない、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させ、次に、前記の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定し、次に、試料に含まれるプロテインＳの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量を求めることにより、試料中に含まれていたプロテインＳの活性値を得る試料中のプロテインＳの活性測定方法を発明し、開示した（特許文献４及び非特許文献１参照。）。
しかしながら、従来の試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬は、いずれも遊離のプロテインＳ（遊離型）の活性を測定するものであった。
つまり、従来の試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬はいずれも、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕を、すなわち、総プロテインＳの活性を測定することは出来ないものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭６２−２１２５６９号公報
【特許文献２】特表平４−５０６６０３号公報
【特許文献３】特表平６−５０４６８２号公報
【特許文献４】特開２００４−３３７１４３号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ，２００４，Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．３，ｐ．３５０−３５２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕についてその活性を、すなわち、総プロテインＳの活性を測定することが出来る、試料中の総プロテインＳの活性測定試薬及び活性測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬について検討を重ねたところ、総プロテインＳ活性の測定反応時に、界面活性剤を存在させることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の発明よりなる。
（１）  試料中の総プロテインＳの活性を測定する方法であって、当該総プロテインＳ活性の測定反応時に、界面活性剤を存在させることを特徴とする、試料中の総プロテインＳの活性測定方法。
（２）  プロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させる、前記（１）記載の試料中の総プロテインＳの活性測定方法。
（３）  総プロテインＳ活性の測定反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる、前記（１）又は（２）記載の試料中の総プロテインＳの活性測定方法。
（４）  プロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる、前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の試料中の総プロテインＳの活性測定方法。
（５）  試料中の総プロテインＳ活性の測定が、次の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む方法により行われるものである、前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の試料中の総プロテインＳの活性測定方法。
（ａ）  活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
（ｂ）  次に、前記（ａ）の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
（ｃ）  次に、この試料に含まれる総プロテインＳの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量より、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
（６）  試料中の総プロテインＳ活性の測定が、次の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む方法により行われるものである、前記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の試料中の総プロテインＳの活性測定方法。
（ａ）  試料と、少なくとも活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させることにより、試料にプロテインＳが含まれる場合には活性化プロテインＣが活性上昇する。
（ｂ）  次に、前記（ａ）の成分及び活性化血液凝固第Ｖ因子の存在下、活性化プロテインＣが触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が、前記（ａ）における活性化プロテインＣの活性上昇により、促進される。
（ｃ）  次に、活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（ｂ）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減される。
（ｄ）  次に、前記（ｃ）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
（ｅ）  次に、前記（ｄ）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
（７）  活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有する試料中の総プロテインＳの活性測定試薬。
（８）  界面活性剤が、プロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に存在させるものである、前記（７）記載の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬。
（９）  リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質である、前記（７）又は（８）記載の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬。
（１０）  ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質が、プロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に存在させるものである、前記（７）〜（９）のいずれか１項に記載の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬。
（１１）  次の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む試料中の総プロテインＳ活性の測定のためのものである、前記（７）〜（１０）のいずれか１項に記載の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬。
（ａ）  活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
（ｂ）  次に、前記（ａ）の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
（ｃ）  次に、この試料に含まれる総プロテインＳの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量より、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
（１２）  次の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む試料中の総プロテインＳ活性の測定のためのものである、前記（７）〜（１１）のいずれか１項に記載の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬。
（ａ）  試料と、少なくとも活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させることにより、試料にプロテインＳが含まれる場合には活性化プロテインＣが活性上昇する。
（ｂ）  次に、前記（ａ）の成分及び活性化血液凝固第Ｖ因子の存在下、活性化プロテインＣが触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が、前記（ａ）における活性化プロテインＣの活性上昇により、促進される。
（ｃ）  次に、活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（ｂ）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減される。
（ｄ）  次に、前記（ｃ）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
（ｅ）  次に、前記（ｄ）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬及び活性測定方法は、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕についてその活性を、すなわち、総プロテインＳの活性を測定することが出来るものである。
つまり、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬及び活性測定方法は、「遊離のプロテインＳ（遊離型）」の活性に加えて、「プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）」に含まれるプロテインＳが遊離のプロテインＳ（遊離型）となった場合に発現する活性もあわせて測定することが出来るものである。
これにより、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬及び活性測定方法は、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕について、そのタンパク質量に相応するプロテインＳの活性値を得ることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】試料中の総プロテインＳの活性値の測定結果と試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定結果との相関を示した図である。
【図２】試料中の総プロテインＳの活性値の測定結果と試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定結果との比較を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．総論
（１）試料中の総プロテインＳの活性測定方法
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法は、試料中の総プロテインＳの活性を測定する方法であって、当該総プロテインＳ活性の測定反応時に、界面活性剤を存在させることを特徴とする、試料中の総プロテインＳの活性測定方法である。
なお、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、プロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させることが好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、総プロテインＳ活性の測定反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、プロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが好ましい。
更に、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法は、試料中の総プロテインＳ活性の測定が、次の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む方法により行われるものであることが好ましい。
（ａ）  活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
（ｂ）  次に、前記（ａ）の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
（ｃ）  次に、この試料に含まれる総プロテインＳの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量より、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
また、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、試料中の総プロテインＳ活性の測定が、次の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む方法により行われるものであることが好ましい。
（ａ）  試料と、少なくとも活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させることにより、試料にプロテインＳが含まれる場合には活性化プロテインＣの活性が上昇する。
（ｂ）  次に、前記（ａ）の成分及び活性化血液凝固第Ｖ因子の存在下、活性化プロテインＣが触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が、前記（ａ）における活性化プロテインＣの活性の上昇により、促進される。
（ｃ）  次に、活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（ｂ）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減される。
（ｄ）  次に、前記（ｃ）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
（ｅ）  次に、前記（ｄ）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
（２）試料中の総プロテインＳの活性測定試薬
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬は、活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有する試料中の総プロテインＳの活性測定試薬である。
なお、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、界面活性剤が、プロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に存在させるものであることが好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質であることが好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質が、プロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に存在させるものであることが好ましい。
更に、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬は、次の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む試料中の総プロテインＳ活性の測定のためのものであることが好ましい。
（ａ）  活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
（ｂ）  次に、前記（ａ）の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
（ｃ）  次に、この試料に含まれる総プロテインＳの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量より、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
また、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬は、次の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む試料中の総プロテインＳ活性の測定のためのものであることが好ましい。
（ａ）  試料と、少なくとも活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させることにより、試料にプロテインＳが含まれる場合には活性化プロテインＣの活性が上昇する。
（ｂ）  次に、前記（ａ）の成分及び活性化血液凝固第Ｖ因子の存在下、活性化プロテインＣが触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が、前記（ａ）における活性化プロテインＣの活性の上昇により、促進される。
（ｃ）  次に、活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（ｂ）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減される。
（ｄ）  次に、前記（ｃ）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
（ｅ）  次に、前記（ｄ）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
２．試料中の総プロテインＳの活性測定の方法
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法における測定の方法、及び本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬を用いる測定の方法として、次の（１）又は（２）に記載の方法等を挙げることができ、これらの方法等により行うことが好ましい。
（１）
（ａ）  活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子（第Ｖａ因子；ＦＶａ）、活性化血液凝固第Ｘ因子（第Ｘａ因子；ＦＸａ）、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
なお、これらの成分と試料との接触は、１回に全ての成分との接触を行わせて、下記の反応系の全ての反応を１段階に行ってもよく（１ステップ法）、また、前記成分を分け、接触を複数段階に分けて行うことにより下記の反応系の反応を複数段階に分けて行ってもよい（多ステップ法）。
（ｂ）  前記（ａ）における接触により、前記の各成分による下記の反応が進行する。
そして、この一連の反応によりトロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
即ち、前記の一連の反応により、トロンビンの基質がトロンビンにより分解等の作用を受け、この結果生じるシグナルの量（例えば、吸光度等）を測定する。
（ｃ）  試料にプロテインＳが含まれている場合には、活性化プロテインＣがリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性が上昇し、これにより活性化血液凝固第Ｖ因子の分解が促進されるので、その結果トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制されて、シグナルの生成が抑制される。
このシグナル生成の抑制度は、試料に含まれていた総プロテインＳの活性値に応じて大きくなる。
従って、前記（ｂ）においてシグナル量を測定することにより、生成が抑制されたシグナル量を測定することになり、これにより試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得ることができる。
【化３】
2012124798.tif 000004
（２）
活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子（第Ｖａ因子；ＦＶａ）、活性化血液凝固第Ｘ因子（第Ｘａ因子；ＦＸａ）、プロトロンビン及びトロンビンの基質より構成される次の反応系を用いて試料中のプロテインＳの活性値を測定する方法であって、
（ａ）  試料と、少なくとも活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させる。
これにより、試料にプロテインＳが含まれる場合にはリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化プロテインＣの活性が上昇する。
（ｂ）  活性化プロテインＣの前記（ａ）における活性の上昇により、活性化プロテインＣがリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が、界面活性剤の共存下で促進される。
（ｃ）  活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（ｂ）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減する。
（ｄ）  前記（ｃ）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
なお、このシグナル生成の抑制度は、試料に含まれていた総プロテインＳの活性に応じて大きくなる。
（ｅ）  前記（ｄ）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定する。
以上の通り前記の反応により生成したシグナル量を測定し、すなわち生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
【化４】
2012124798.tif 000005
３．試料
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬において、試料とは、プロテインＳを含有する可能性がある物質である。
この試料として、例えば、生体試料（ヒト又は動物などに由来する試料）等を挙げることができる。
生体試料としては、例えば、血液、血漿、唾液、汗、尿、涙、髄液、腹水、羊水などの生体の液体；肝臓、心臓、脳、骨、毛髪、皮膚、爪、筋肉、神経組織などの臓器、組織、細胞などの抽出液等を挙げることができる。
４．活性化プロテインＣ
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬において用いる活性化プロテインＣは、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
また、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬における測定反応中に、プロテインＣ活性化物質等によりプロテインＣより活性化プロテインＣを生成させて、これを本発明における活性化プロテインＣとして用いてもよい。
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬において、活性化プロテインＣは、試料と接触することにより、試料中にプロテインＳが含まれている場合には、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、この活性化プロテインＣの活性が上昇する。
そして、活性化プロテインＣは、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、活性化血液凝固第Ｖ因子を分解する反応の触媒となる。
よって、プロテインＳが存在することにより、活性化プロテインＣが活性化血液凝固第Ｖ因子を分解する反応は促進される。
前記の活性化プロテインＣ等と試料を接触させることと、活性化プロテインＣを活性化血液凝固第Ｖ因子等と接触させることは、同時に行ってもよい。
また、活性化プロテインＣをリン脂質とともに試料と接触させ、少なくとも１分間以上、好ましくは５分間以上、室温又は３７℃等においてインキュベートした後に、活性化血液凝固第Ｖ因子及びカルシウムイオンと接触させ、インキュベートして、活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応を行わせてもよい。
この活性化プロテインＣを用いる際の濃度は、活性化血液凝固第Ｖ因子と接触させ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｖ因子を分解させる際には、通常、１ｐＭ〜１００ｎＭにあることが好ましい。
しかしながら、測定の感度を高く得るには、活性化プロテインＣ濃度が高い方が好ましいので、前記の活性化プロテインＣ濃度としては、１０ｐＭ〜１０ｎＭにあることがより好ましく、１００ｐＭ〜１ｎＭにあることが特に好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、前記の活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に活性化プロテインＣが前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、活性化プロテインＣを、１ｐＭ〜２００ｎＭ含有させることが好ましく、１０ｐＭ〜２０ｎＭ含有させることがより好ましく、１００ｐＭ〜２ｎＭ含有させることが特に好ましい。
５．界面活性剤
本発明の総プロテインＳの活性測定方法においては、当該総プロテインＳ活性の測定反応時に、界面活性剤を存在させる。
また、本発明の総プロテインＳの活性測定試薬においては、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質とともに、界面活性剤を含有する。
この界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤又は陽イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上を適宜存在させればよい。
この界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
なお、この界面活性剤が非イオン性界面活性剤の場合、そのＨＬＢ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ−Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  Ｂａｌａｎｃｅ）は、１０〜２０の範囲のものが好ましく、１２〜１８の範囲のものがより好ましく、１３〜１６の範囲のものが特に好ましい。
この界面活性剤は、非イオン性界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００〔ポリオキシエチレン（ｎ＝９，１０）ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル、ＨＬＢ：１３．５〕、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４〔ポリオキシエチレン（ｎ＝７，８）ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル、ＨＬＢ：１２．４〕、ＮＰ−１０〔ポリオキシエチレン（ｎ＝１０）ノニルフェニルエーテル、ＨＬＢ：１６．５〕、ＮＰ−１１〔ポリオキシエチレン（ｎ＝１１）ノニルフェニルエーテル〕、ＮＰ−１２〔ポリオキシエチレン（ｎ＝１２）ノニルフェニルエーテル〕、ＮＰ−１３〔ポリオキシエチレン（ｎ＝１３）ノニルフェニルエーテル〕、ＮＰ−１５〔ポリオキシエチレン（ｎ＝１５）ノニルフェニルエーテル、ＨＬＢ：１８．０〕、ＢＴ−９〔ポリオキシエチレン（ｎ＝９）２級アルキルエーテル、ＨＬＢ：１３．５〕、又はＢＴ−１２〔ポリオキシエチレン（ｎ＝１２）２級アルキルエーテル、ＨＬＢ：１４．５〕等が好ましい。
また、両イオン性界面活性剤としては、ＡＭ−３０１〔ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン水溶液〕等が好ましい。
そして、陰イオン性界面活性剤としては、サルコシネート  ＬＮ〔ラウロイルサルコシンナトリウム〕等が好ましい。
更に、陽イオン性界面活性剤としては、ＣＡ−２３５０〔塩化セチルトリメチルアンモニウム〕等が好ましい。
なお、総プロテインＳ活性の測定反応時に界面活性剤を存在させる際の濃度は、特に限定されるものではないが、０．００００１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、０．０００１〜１％（Ｗ／Ｖ）がより好ましく、０．００１〜０．１％（Ｗ／Ｖ）が更に好ましく、０．００５〜０．０５％（Ｗ／Ｖ）が特に好ましい。
そして、非イオン性界面活性剤においては０．００１〜０．０１％（Ｗ／Ｖ）が非常に好ましく、両イオン性界面活性剤においては０．００１〜０．０１％（Ｗ／Ｖ）が非常に好ましく、陰イオン性界面活性剤においては０．００１〜０．１％（Ｗ／Ｖ）が非常に好ましく、陽イオン性界面活性剤においては０．００００１〜０．００１％（Ｗ／Ｖ）が非常に好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、総プロテインＳ活性の測定反応時に界面活性剤が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に界面活性剤を含有させることが好ましい。
例えば、この活性測定試薬に界面活性剤を０．００００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）含有させることが好ましく、０．０００１〜２％（Ｗ／Ｖ）含有させることがより好ましく、０．００１〜０．２％（Ｗ／Ｖ）含有させることが更に好ましく、０．００５〜０．１％（Ｗ／Ｖ）含有させることが特に好ましい。
そして、非イオン性界面活性剤においては０．００１〜０．０２％（Ｗ／Ｖ）、両イオン性界面活性剤においては０．００１〜０．０２％（Ｗ／Ｖ）、陰イオン性界面活性剤においては０．００１〜０．２％（Ｗ／Ｖ）、陽イオン性界面活性剤においては０．００００１〜０．００２％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含有させることが非常に好ましい。
なお、本発明の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させることが、試料中の総プロテインＳの活性測定のために好ましい。
６．リン脂質
（１）総論
本発明の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、総プロテインＳ活性の測定反応時に、リン脂質を存在させる。
このリン脂質は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの、その他の動物由来のもの、植物由来のもの、微生物由来のもの又は人工的に合成したもの等を挙げることができる。
総プロテインＳ活性の測定反応時に、リン脂質を存在させる際の濃度は、通常、０．０３μＭ〜１００μＭにあることが好ましく、０．３μＭ〜５０μＭにあることがより好ましく、３μＭ〜３０μＭにあることが特に好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、総プロテインＳ活性の測定反応時に、リン脂質が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、この活性測定試薬にリン脂質を０．０３μＭ〜２００μＭ含有させることが好ましく、０．３μＭ〜１００μＭ含有させることがより好ましく、３μＭ〜６０μＭ含有させることが特に好ましい。
このリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール若しくはジホスファチジルグリセロールなどのグリセロリン脂質や、又はスフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質等を挙げることができる。
なお、このリン脂質としては、総プロテインＳ活性の測定反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが、試料中の総プロテインＳの活性測定のために好ましい。
また、このホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる場合、この３種類のリン脂質の組成としては、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が１０％（Ｗ／Ｖ）以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が２０％（Ｗ／Ｖ）以上であることが好ましい。
特に、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が３０％（Ｗ／Ｖ）以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が３０％（Ｗ／Ｖ）以上であることが好ましい。
（２）活性化プロテインＣによる触媒反応に用いるリン脂質
本発明の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、及びこの活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時には、その活性化プロテインＣの活性上昇反応及び活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応に必要なリン脂質を存在させる。
このリン脂質は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの、その他の動物由来のもの、植物由来のもの、微生物由来のもの又は人工的に合成したもの等を挙げることができる。
前記の活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時にリン脂質を存在させる際の濃度は、通常、０．１μＭ〜１００μＭにあることが好ましく、１μＭ〜５０μＭにあることがより好ましく、１０μＭ〜３０μＭにあることが特に好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、リン脂質が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、この活性測定試薬にリン脂質を０．１μＭ〜２００μＭ含有させることが好ましく、１μＭ〜１００μＭ含有させることがより好ましく、１０μＭ〜６０μＭ含有させることが特に好ましい。
このリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール若しくはジホスファチジルグリセロールなどのグリセロリン脂質や、又はスフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質等を挙げることができる。
なお、このリン脂質としては、前記の活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが、試料中の総プロテインＳの活性測定のために好ましい。
また、このホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる場合、この３種類のリン脂質の組成としては、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が１０％（Ｗ／Ｖ）以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が２０％（Ｗ／Ｖ）以上であることが好ましい。
特に、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が３０％（Ｗ／Ｖ）以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が３０％（Ｗ／Ｖ）以上であることが好ましい。
（３）活性化血液凝固第Ｘ因子による触媒反応に用いるリン脂質
本発明の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、活性化血液凝固第Ｖ因子の存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時には、その反応に必要なリン脂質を存在させる。
このリン脂質は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの、その他の動物由来のもの、植物由来のもの、微生物由来のもの又は人工的に合成したもの等を挙げることができる。
前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時にリン脂質を存在させる際の濃度は、通常、０．１μＭ〜１００μＭにあることが好ましく、０．５μＭ〜５０μＭにあることがより好ましく、１μＭ〜１０μＭにあることが特に好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時に、リン脂質が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、この活性測定試薬にリン脂質を０．１μＭ〜２００μＭ含有させることが好ましく、０．５μＭ〜１００μＭ含有させることがより好ましく、１μＭ〜２０μＭ含有させることが特に好ましい。
このリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール若しくはジホスファチジルグリセロールなどのグリセロリン脂質や、又はスフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質等を挙げることができる。
なお、このリン脂質としては、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時に、ホスファチジルコリン及びホスファチジルセリン、又はホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが、前記反応の促進の効果が高くなるため好ましい。
また、このホスファチジルコリン及びホスファチジルセリンよりなるリン脂質を存在させる場合、この２種類のリン脂質の組成としては、ホスファチジルコリンの組成比が８５％（Ｗ／Ｖ）〜５０％（Ｗ／Ｖ）であり、かつホスファチジルセリンの組成比が１５％（Ｗ／Ｖ）〜５０％（Ｗ／Ｖ）であることが好ましい。
特に、ホスファチジルコリンの組成比が８０％（Ｗ／Ｖ）〜７０％（Ｗ／Ｖ）であり、かつホスファチジルセリンの組成比が２０％（Ｗ／Ｖ）〜３０％（Ｗ／Ｖ）であることが好ましい。
あるいは、このホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる場合、この３種類のリン脂質の組成としては、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が１０％（Ｗ／Ｖ）以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が２０％（Ｗ／Ｖ）以上であることが好ましい。
特に、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が３０％（Ｗ／Ｖ）以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が３０％（Ｗ／Ｖ）以上であることが好ましい。
なお、このプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際のリン脂質としては、前記の活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に用いたリン脂質をそのまま用いることができる。
しかしながら、先に述べたとおり、適したリン脂質の組成がそれぞれの反応により異なるので、各々の反応に適した組成のリン脂質をその反応時に存在させて用いることが好ましい。
なお、このプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際に、先に加えた前記の活性化プロテインＣの活性上昇反応及び活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応に適した組成のリン脂質が、このプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に適した組成のリン脂質と共存したとしても、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては全く支障はない。
７．カルシウムイオン
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時、及び活性化血液凝固第Ｘ因子及び活性化血液凝固第Ｖ因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時には、カルシウムイオンを存在させる。
このカルシウムイオンとしては、カルシウムイオン自体はもちろんのこと、又はカルシウムの塩等のカルシウムイオンを含む化合物であれば、特に制限なく用いることができる。
このカルシウムイオンを含む化合物としては、例えば、フッ化カルシウム、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、乳酸カルシウム又はシアン化カルシウム等を挙げることができる。
このカルシウムイオンを用いる際の濃度は、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応の際、活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応の際、そして活性化血液凝固第Ｘ因子及び活性化血液凝固第Ｖ因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際には、通常、０．１ｍＭ〜１００ｍＭにあることが好ましく、１ｍＭ〜１０ｍＭにあることが特に好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、前記の活性化プロテインＣの活性上昇反応時、活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時及びトロンビン生成反応時にカルシウムイオンが前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、カルシウムイオン又はカルシウムイオンを含む化合物を、この活性測定試薬に０．１ｍＭ〜２００ｍＭ含有させることが好ましく、１ｍＭ〜２０ｍＭ含有させることが特に好ましい。
８．活性化血液凝固第Ｖ因子
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬において用いる活性化血液凝固第Ｖ因子（第Ｖａ因子；ＦＶａ）は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。
また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬において、活性化血液凝固第Ｖ因子は、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、活性化プロテインＣにより分解される。
そして、試料中にプロテインＳが含まれている場合そのプロテインＳの存在により、活性化プロテインＣの活性が上昇して、この分解反応は促進される。
また、活性化血液凝固第Ｖ因子は、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒する、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応を促進するものである。
よって、試料中にプロテインＳが含まれていると、活性化プロテインＣの活性が上昇して、活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されて、活性化血液凝固第Ｖ因子の存在量（濃度）は少なくなる。
そうすると、活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第Ｖ因子の促進効果が小さくなるので、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は抑制される。
前記の活性化血液凝固第Ｖ因子と活性化プロテインＣ等とを接触させることと、活性化血液凝固第Ｖ因子と活性化血液凝固第Ｘ因子及びプロトロンビン等とを接触させることは、同時に行ってもよい。
しかしながら、活性化血液凝固第Ｖ因子を、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンとともに活性化プロテインＣと接触させ、少なくとも１分間以上、好ましくは５分間以上、室温又は３７℃等においてインキュベートした後に、活性化血液凝固第Ｘ因子及びプロトロンビン等と接触させ、インキュベートして、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応を行わせることが好ましい。
この活性化血液凝固第Ｖ因子を用いる際の濃度は、活性化プロテインＣと接触させ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｖ因子を分解する反応を行わせる際には、通常、０．５ｐＭ〜５ｎＭにあることが好ましい。
しかしながら、この活性化血液凝固第Ｖ因子の濃度が高いと、試料に由来する成分（因子）等による血液凝固反応が進行してしまい、フィブリンが析出したり又は多大な発色が生じて正確な測定が行えなくなるので、前記の活性化血液凝固第Ｖ因子濃度としては、５ｐＭ〜５００ｐＭにあることがより好ましく、２０ｐＭ〜２００ｐＭにあることが特に好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、前記の活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に活性化血液凝固第Ｖ因子が前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、活性化血液凝固第Ｖ因子を、０．５ｐＭ〜１０ｎＭ含有させることが好ましく、５ｐＭ〜２ｎＭ含有させることがより好ましく、２０ｐＭ〜１ｎＭ含有させることが特に好ましい。
９．活性化血液凝固第Ｘ因子
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬において用いる活性化血液凝固第Ｘ因子（第Ｘａ因子；ＦＸａ）は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。
また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬において、活性化血液凝固第Ｘ因子は、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応を触媒する。
この活性化血液凝固第Ｘ因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は、活性化血液凝固第Ｖ因子の存在により促進される。
よって、先に述べたように、試料中にプロテインＳが含まれていると、活性化プロテインＣの活性が上昇し、これにより活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進され、このため活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第Ｖ因子の促進効果が小さくなるので、前記のトロンビンを生成させる反応は抑制される。
この活性化血液凝固第Ｘ因子を用いる際の濃度は、活性化血液凝固第Ｖ因子及びプロトロンビン等と接触させ、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる際には、通常、０．１ｐＭ〜３００ｐＭにあることが好ましい。
しかしながら、この活性化血液凝固第Ｘ因子の濃度が高いと、先の活性化血液凝固第Ｖ因子の場合と同様、試料に由来する成分（因子）等による血液凝固反応が進行してしまい、フィブリンが析出したり又は多大な発色が生じて正確な測定が行えなくなるので、前記の活性化血液凝固第Ｘ因子濃度としては、１ｐＭ〜１００ｐＭにあることがより好ましく、１０ｐＭ〜５０ｐＭにあることが特に好ましい。
また、本発明の試料中のプロテインＳの活性測定試薬においては、前記のトロンビン生成反応時に活性化血液凝固第Ｘ因子が前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、活性化血液凝固第Ｘ因子を、０．１ｐＭ〜６００ｐＭ含有させることが好ましく、１ｐＭ〜２００ｐＭ含有させることがより好ましく、１０ｐＭ〜１００ｐＭ含有させることが特に好ましい。
１０．プロトロンビン
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬において用いるプロトロンビンは、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。
また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬において、プロトロンビンは、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒する反応の基質となり、トロンビンになる。
この活性化血液凝固第Ｘ因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は、活性化血液凝固第Ｖ因子の存在により促進される。
よって、先に述べたように、試料中にプロテインＳが含まれていると、活性化プロテインＣの活性が上昇し、これにより活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進され、このため活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第Ｖ因子の促進効果が小さくなるので、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は抑制され、生成されるトロンビンの量（濃度）は低減される。
このプロトロンビンを用いる際の濃度は、活性化血液凝固第Ｖ因子及び活性化血液凝固第Ｘ因子と接触させ、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる際には、通常、１ｎＭ〜５０μＭにあることが好ましく、５０ｎＭ〜５μＭにあることがより好ましく、そして１００ｎＭ〜１μＭにあることが特に好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、前記のトロンビン生成反応時にプロトロンビンが前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、プロトロンビンを、この活性測定試薬に１ｎＭ〜１００μＭ含有させることが好ましく、５０ｎＭ〜１０μＭ含有させることがより好ましく、１００ｎＭ〜２μＭ含有させることが特に好ましい。
１１．トロンビンの基質
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬において用いるトロンビンの基質は、トロンビンのプロテアーゼとしての触媒作用を（トロンビンの基質として）受けることにより何らかのシグナルを生じるもの、又はトロンビンによる触媒反応に加え更に他の反応を続けることにより何らかのシグナルが生じるものであれば、特に制限なく用いることができる。
この何らかのシグナルが生じるということであるが、これはトロンビンの触媒作用を受けることにより光学的、電気的、磁気的若しくは他のエネルギー等におけるシグナル（信号）の生成又は変化を検出することができるということを意味する。
例えば、トロンビンの触媒作用を受けることにより、吸光虔、透過率若しくは蛍光強度が変化するもの、光の吸収曲線が変化するもの、又は発光するもの等を挙げることができる。
この一例としては、遊離したときに吸光度、透過率若しくは蛍光強度、又は光の吸収曲線が変化するような化合物を結合したペプチド又はタンパク質、或いは遊離したときに発光するような化合物を結合したペプチド又はタンパク質等であって、トロンビンの触媒作用により前記の化合物が前記のペプチド又はタンパク質より遊離するような物質等を挙げることができる。
このような物質においては、トロンビンの触媒作用を受け、前記化合物が遊離することにより、吸光度、透過率若しくは蛍光強度又は光の吸収曲線の変化或いは発光等として検出できるので、トロンビンの触媒作用すなわちトロンビンの酵素活性を、生成したシグナル（吸光度、透過率若しくは蛍光強度又は光の吸収曲線の変化或いは発光等）の量を測定することにより求めることができる。
このような物質としては、例えば、「Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩」〔テストチーム（登録商標）発色基質Ｓ−２２３８〕（製造元：Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社〔イタリア国〕、販売元：積水メディカル社〔日本国〕）、「Ｈ−Ｄ−ヘキサハイドロチロシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二酢酸塩」〔ＳＰＥＣＴＲＯＺＹＭＥ（登録商標）ＴＨ〕（ＡＭＥＲＩＣＡＮ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ社・コスモバイオ社）、「ベンゾイル−フェニルアラニル−バリニル−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・塩酸塩」〔Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｉ，Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ〕（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社・コスモバイオ社）、「トシル−グリシル−プロリル−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド」〔ＣＨＲＯＭＯＺＹＭＥ  ＴＨ〕（ＰＥＮＴＡＰＨＡＲＭ社）、「Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−アルギニル−３−カルボキシ−４−ヒドロキシ−アニリン」（第一三共社）、「ベンゾイル−フェニルアラニル−バリニル−アルギニル−ＡＭＣ・塩酸塩」〔Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ＩＩＩ，Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ〕（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社・コスモバイオ社）、「ｔ−ブトキシカルボニル−アスパラギル（Ｏ−ベンジル）−プロリル−アルギニル−ＭＣＡ」（ペプチド研究所）、又は「ｔ−ブトキシカルボニル−バリニル−プロリル−アルギニル−ＭＣＡ」（ペプチド研究所）等を挙げることができる。なお、特に「Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩」が好ましい。
前記の活性化血液凝固第Ｖ因子と活性化血液凝固第Ｘ因子とプロトロンビン等とを接触させることと、生成したトロンビンとこのトロンビンの基質とを接触させることは、同時に行ってもよいし、別々の段階として分けて行ってもよい。
なお、いずれにしても、生成したトロンビンにトロンビンの基質を接触させ、少なくとも１分間以上、好ましくは５分間以上、室温又は３７℃等においてインキュベートして、トロンビンの基質からシグナルを生じさせる。
このトロンビンの基質を用いる際の濃度は、このトロンビンの基質がトロンビンの触媒作用を受ける際に、通常、５μＭ〜１００ｍＭにあることが好ましく、５０μＭ〜１０ｍＭにあることが特に好ましい。
そして、本発明の試料中のプロテインＳの活性測定試薬においては、トロンビンの触媒作用を受ける際にこのトロンビンの基質が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、このトロンビンの基質を、５μＭ〜２００ｍＭ含有させることが好ましく、５０μＭ〜２０ｍＭ含有させることが特に好ましい。
１２．シグナル量の測定
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬におけるトロンビンの基質は、プロトロンビンより生成したトロンビンの触媒作用を受けることによりシグナルを生じる。
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、このトロンビンの基質より生成したシグナルの量を測定する。
なお、試料中にプロテインＳが含まれている場合、このシグナルの量は、試料中の総プロテインＳの活性値に応じて生成が抑制されたシグナルの量である。
この生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）の測定は、そのシグナルに応じて適宜行えばよい。
例えば、シグナルが、吸光度、透過率若しくは蛍光強度又は光の吸収曲線の変化或いは発光等である場合には、吸光度、透過率、蛍光強度又は発光強度などを測定する等により行う。
より具体的には、トロンビンの基質が、前記の「Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩」、「Ｈ−Ｄ−ヘキサハイドロチロシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二酢酸塩」、「ベンゾイル−フェニルアラニル−バリニル−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・塩酸塩」、又は「トシル−グリシル−プロリル−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド」等の、ペプチドにｐ−ニトロアニリンを結合させた物質である場合には、トロンビンの触媒作用により遊離したｐ−ニトロアニリンが波長４０５ｎｍ近辺に有する光の吸収を、波長４０５ｎｍ又はその近辺の波長において吸光度を測定することにより行う。
この場合、吸光度の測定は、主波長のみの一波長測定でもよいし、又は主波長と副波長において測定する二波長測定でもよい。
そして、この吸光度の測定は、エンドポイント法でもよいし、又はレート法でもよい。
１３．試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料中にプロテインＳが含まれていると、活性化プロテインＣの活性が上昇して、活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されて、活性化血液凝固第Ｖ因子の存在量（濃度）は少なくなる。
そうすると、活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第Ｖ因子の促進効果が小さくなるので、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は抑制される。
これにより、トロンビンの生成が低減するので、このトロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応も抑制されて、生成するシグナルの量は抑制される。
すなわち、試料中に含まれる総プロテインＳの活性値に応じて、このシグナル生成の抑制度は大きくなる。
従って、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料と活性化プロテインＣ等とを接触させ前記の通りの反応を行わせることによって生成したシグナル量を測定して、すなわち生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
この生成が抑制されたシグナル量を測定した後、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得ることは、適宜行えばよいが、例えば以下のようにして行うことができる。
総プロテインＳの活性値が分かっている試料の少なくとも一つと、総プロテインＳの活性値が「ゼロ」であることが分かっている試料（生理食塩水又は純水等）について、前記の通り測定操作を行い、生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）を求める。
そして、この生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）と試料中に含まれる総プロテインＳの活性値との関係を、数式又はグラフ等に表して、検量線を作成する。
この検量線は、すなわち、シグナル生成の抑制度と試料中に含まれる総プロテインＳの活性値との関係を表したものである。
次に、総プロテインＳの活性値が未知の試料について、前記の通り同様に測定操作を行い、生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）を求める。
このシグナル量を前記の検量線に当てはめ、相当する総プロテインＳの活性値を求める。
これにより、総プロテインＳの活性値が未知の試料における生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）より、その試料の総プロテインＳの活性値を得ることができる。
なお、前記の検量線は、シグナル量（生成が抑制されたシグナル量）すなわちシグナル生成の抑制度と、試料中に含まれる総プロテインＳの活性値との関係を表したものであるが、この検量線におけるシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）は、測定されたシグナル量そのものでもよいが、そのシグナル量の値を基に算出した数値であってもよい。
つまり、前記の検量線は、測定されたシグナル量の値を基に算出した数値と、試料中に含まれる総プロテインＳの活性値との関係を表したものであってもよい。
なお、この場合であっても、測定されたシグナル量の値を基に算出した数値は、生成が抑制されたシグナル量に対応したものである。
この測定されたシグナル量の値を基に算出した数値としては、例えば、測定されたシグナル量の単位時間当たりの変化量の数値、又は測定されたシグナル量の値を時間に対して一次微分して算出した数値、若しくは二次微分して算出した数値等を挙げることができる。
例として、測定により得られた吸光度の１分間当たりの変化量、又は測定により得られた吸光度を時間に対して一次微分して得た吸光度変化の速度、若しくは測定により得られた吸光度を時間に対して二次微分して得た吸光度変化の加速度等を挙げることができる。
１４．タンパク質
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくは卵白アルブミンなどのアルブミン、カゼイン、又はゼラチン等のタンパク質を前記の活性測定反応時に存在させることが好ましく、又は前記の活性測定試薬に含有させることが好ましい。
このタンパク質を存在させる濃度は、通常、０．１μＭ〜１ｍＭにあることが好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、このタンパク質が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、このタンパク質を、０．１μＭ〜２ｍＭ含有させることが好ましい。
１５．塩
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、ハロゲン元素とアルカリ金属の塩又はハロゲン元素とアルカリ土類金属の塩等の塩を前記の活性測定反応時に存在させることが好ましく、又は前記の活性測定試薬に含有させることが好ましい。
ハロゲン元素とアルカリ金属の塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、臭化ナトリウム又は臭化カリウム等を挙げることができる。
また、ハロゲン元素とアルカリ土類金属の塩としては、例えば、塩化マグネシウム、フッ化マグネシウム又は臭化マグネシウム等を挙げることができる。
この塩を存在させる濃度は、通常、５ｍＭ〜１Ｍにあることが好ましく、５０ｍＭ〜２５０ｍＭにあることが特に好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、この塩が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、この塩を、５ｍＭ〜２Ｍ含有させることが好ましく、５０ｍＭ〜５００ｍＭ含有させることが特に好ましい。
１６．希釈液
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、試料を希釈液により希釈した後に、前記の活性測定反応を行わせることが、試料中の総プロテインＳの活性測定のために好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、希釈液を前記の活性測定試薬に含有させることが、試料中の総プロテインＳの活性測定のために好ましい。
この希釈液のｐＨは、特に限定はないが、ｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０（２０℃）のｐＨ範囲のものであることが好ましく、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５（２０℃）のｐＨ範囲のものであることがより好ましい。
なお、この希釈液には、ｐＨを前記のｐＨ範囲に保つため、前記のｐＨ範囲に緩衝能を有する緩衝剤を適宜存在させ又は含有させることが好ましい。
また、この希釈液には、必要に応じて適宜、タンパク質、塩、界面活性剤、防腐剤、安定化剤、活性化剤、又は糖類等の成分を含有させることができる。
この希釈液としては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、又は緩衝液等を挙げることができる。
この希釈液により試料を希釈する際の希釈倍率であるが、特に限定はないものの、試料中の総プロテインＳの活性測定のためには、２倍〜６０倍が好ましく、５倍〜４０倍がより好ましく、１０倍〜２０倍が特に好ましい。
１７．ｐＨ
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、前記の活性測定反応を、ｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０（２０℃）の範囲で行うことが好ましく、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５（２０℃）の範囲で行うことが特に好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、前記の活性測定反応が、ｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０（２０℃）のｐＨ範囲で行われるようなｐＨであることが好ましく、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５（２０℃）のｐＨ範囲で行われるようなｐＨであることが特に好ましい。
なお、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、活性測定反応におけるｐＨ又は活性測定試薬のｐＨを前記のｐＨ範囲に保つため、前記のｐＨ範囲に緩衝能を有する緩衝剤を適宜存在させ又は含有させることが好ましい。
１８．他の成分
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、必要に応じて適宜、防腐剤、安定化剤、活性化剤、又は糖類等の前記記載した成分以外の成分を前記の活性測定反応時に存在させ、又は前記の活性測定試薬に含有させることができる。
１９．測定手法
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬における、試料中の総プロテインＳの活性の測定は、用手法により行ってもよく、又は自動分析装置等の装置を使用して行ってもよい。
２０．測定段階
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬おいて、前記詳述した活性測定反応は、１回に全ての成分と試料との接触を行わせて、全ての反応を１段階に行ってもよく（１ステップ法）、また、成分を分け、接触を複数段階に分けて行うことにより活性測定反応を複数段階に分けて行ってもよい（多ステップ法）。
複数段階に分ける場合、特に制限はないが、例えば次のように行うことができる。
（１）２ステップ法−１
（ａ）  試料、活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン及び活性化血液凝固第Ｖ因子を接触させる。
（ｂ）  次に、前記（ａ）のものに、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を接触させる。
（２）２ステップ法−２
（ａ）  試料、活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させる。
（ｂ）  次に、前記（ａ）のものに、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質を接触させる。
（３）３ステップ法
（ａ）  試料、活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させる。
（ｂ）  次に、前記（ａ）のものに、活性化血液凝固第Ｖ因子を接触させる。
（ｃ）  更に、前記（ｂ）のものに、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を接触させる。
２１．試料中の総プロテインＳの活性測定試薬
本発明の試料中のプロテインＳの活性測定試薬は、活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有するものである。
必要に応じて前記成分以外の成分を含んでいても構わない。
２２．試料中の総プロテインＳの活性測定試薬の構成
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬おいて、前記詳述した活性測定反応の各成分は、全て一つの試薬中に含有させてもよく（１試薬系）、また、各成分を２試薬又は３試薬等の複数の試薬に分けて含有させてもよい（複数試薬系）。
各成分を複数の試薬に分けて含有させる場合、特に制限はないが、例えば次のように含有させることができる。
（１）２試薬系−１
（ａ）第１試薬：活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン及び活性化血液凝固第Ｖ因子
（ｂ）第２試薬：活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質
（２）２試薬系−２
（ａ）第１試薬：活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオン
（ｂ）第２試薬：活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質
（３）３試薬系
（ａ）第１試薬：活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオン
（ｂ）第２試薬：活性化血液凝固第Ｖ因子
（ｃ）第３試薬：活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質
（４）４試薬系
（ａ）第１試薬：活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオン
（ｂ）第２試薬：活性化血液凝固第Ｖ因子
（ｃ）第３試薬：活性化血液凝固第Ｘ因子
（ｄ）第４試薬：プロトロンビン及びトロンビンの基質
【実施例】
【００１０】
以下、本発明を実施例により更に説明する。なお、本発明はこれらにより限定されるものではない。
〔実施例１〕（本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬−１）
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬の効果を確認した。
１．総プロテインＳの活性測定試薬
（１）第１試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．５（２０℃）に調整して、第１試薬を調製した。
活性化血液凝固第Ｘ因子（精製ウシ活性化血液凝固第Ｘ因子；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ社、米国）    １００ｐＭ
リン脂質
塩化カルシウム    １０．０ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム      ０．１５Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン    ５０ｍＭ
なお、リン脂質は、ホスファチジルセリン（ブタ脳ホスファチジルセリン；ＰＳ；ＤＯＯＳＡＮ  Ｓｅｒｄａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．６ｍｇ、ホスファチジルコリン（ブタ肝臓ホスファチジルコリン；ＰＣ；ＤＯＯＳＡＮ  Ｓｅｒｄａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．４ｍｇ、及びホスファチジルエタノールアミン（ブタ肝臓ホスファチジルエタノールアミン；ＰＥ；ＤＯＯＳＡＮ  Ｓｅｒｄａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）１．０ｍｇをそれぞれ試験管に採取し、エバポレーターにて溶媒であるクロロフォルムを蒸発させた後、蒸留水を添加し１分間激しく撹拌した後、６０℃で１０分間超音波処理を行って調製したホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が３：２：５（すなわち、３０％（Ｗ／Ｖ）：２０％（Ｗ／Ｖ）：５０％（Ｗ／Ｖ））のリン脂質を、１５μＭの濃度となるように含有させた。〔なお、このホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が３：２：５のリン脂質を、以下「リン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝３：２：５）」ということがある。〕
（２）第２試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．５（２０℃）に調整して、第２試薬を調製した。
プロトロンビン（精製ヒトプロトロンビン；Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国）    １．５μＭ
テストチーム（登録商標）発色基質Ｓ−２２３８（トロンビンの基質〔トロンビンの発色基質〕；製造元：Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社〔イタリア国〕、販売元：積水メディカル社〔日本国〕）    １．５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム      ０．１５Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン    ５０ｍＭ
（３）第３試薬−ａ
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第３試薬−ａを調製した。
リン脂質
塩化カルシウム    ２．５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム      ０．１Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン    ５０ｍＭ
なお、リン脂質は、ホスファチジルセリン（ブタ脳ホスファチジルセリン；ＰＳ；ＤＯＯＳＡＮ  Ｓｅｒｄａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．５ｍｇ、及びホスファチジルコリン（ブタ肝臓ホスファチジルコリン；ＰＣ；ＤＯＯＳＡＮ  Ｓｅｒｄａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．５ｍｇをそれぞれ試験管に採取し、エバポレーターにて溶媒であるクロロフォルムを蒸発させた後、蒸留水を添加し１分間激しく撹拌した後、６０℃で１０分間超音波処理を行って調製したホスファチジルセリン及びホスファチジルコリンの組成比が１：１（すなわち、５０％（Ｗ／Ｖ）：５０％（Ｗ／Ｖ））のリン脂質を、２０μＭの濃度となるように含有させた。〔なお、このホスファチジルセリン及びホスファチジルコリンの組成比が１：１のリン脂質を、以下「リン脂質（ＰＳ：ＰＣ＝１：１）」ということがある。〕
（４）第３試薬−ｂ
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第３試薬−ｂを調製した。
界面活性剤
リン脂質
塩化カルシウム    ２．５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム      ０．１Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン    ５０ｍＭ
なお、界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（和光純薬工業社、日本国）を０．００６％（Ｗ／Ｖ）の濃度となるように含有させた。
また、リン脂質は、前記のリン脂質（ＰＳ：ＰＣ＝１：１）を、２０μＭの濃度となるように含有させた。
（５）第３試薬−ｃ
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第３試薬−ｃを調製した。
リン脂質
塩化カルシウム    ２．５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム      ０．１Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン    ５０ｍＭ
なお、リン脂質は、ホスファチジルセリン（ブタ脳ホスファチジルセリン；ＰＳ；ＤＯＯＳＡＮ  Ｓｅｒｄａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．４ｍｇ、ホスファチジルコリン（ブタ肝臓ホスファチジルコリン；ＰＣ；ＤＯＯＳＡＮ  Ｓｅｒｄａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．４ｍｇ、及びホスファチジルエタノールアミン（ブタ肝臓ホスファチジルエタノールアミン；ＰＥ；ＤＯＯＳＡＮ  Ｓｅｒｄａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．４ｍｇをそれぞれ試験管に採取し、エバポレーターにて溶媒であるクロロフォルムを蒸発させた後、蒸留水を添加し１分間激しく撹拌した後、６０℃で１０分間超音波処理を行って調製したホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が１：１：１（すなわち、３３．３３％（Ｗ／Ｖ）：３３．３３％（Ｗ／Ｖ）：３３．３３％（Ｗ／Ｖ））のリン脂質を、２４μＭの濃度となるように含有させた。〔なお、このホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が１：１：１のリン脂質を、以下「リン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝１：１：１）」ということがある。〕
（６）第３試薬−ｄ
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第３試薬−ｄを調製した。
界面活性剤
リン脂質
塩化カルシウム    ２．５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム      ０．１Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン    ５０ｍＭ
なお、界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（和光純薬工業社、日本国）を０．００６％（Ｗ／Ｖ）の濃度となるように含有させた。
また、リン脂質は、前記のリン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝１：１：１）を、２４μＭの濃度となるように含有させた。
（７）第４試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第４試薬を調製した。
活性化プロテインＣ（精製ヒト活性化プロテインＣ；Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国）    １６．５ｎＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン    ５０ｍＭ
（８）第５試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第５試薬を調製した。
活性化血液凝固第Ｖ因子（精製ヒト活性化血液凝固第Ｖ因子；Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国）６．０ｎＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン    ５０ｍＭ
２．試料
次の（１）及び（２）をそれぞれ試料として用いた。
（１）  精製された遊離のプロテインＳと精製された遊離のＣ４ｂ結合タンパク質とを１：１（モル比）で混合して調製した総プロテインＳ活性値が１０μｇ／ｍＬ当量の試料
（２）  精製された遊離のプロテインＳと精製された遊離のＣ４ｂ結合タンパク質とを１：１（モル比）で混合して調製した総プロテインＳ活性値が２０μｇ／ｍＬ当量の試料
３．試料中の総プロテインＳの活性値の測定
各試料の総プロテインＳの活性値の測定を、次のようにして行った。
（１）  前記２の試料のそれぞれについて、その０．５μＬと前記１の（３）の第３試薬−ａの１９３．５μＬを混合した。
（２）  次に、これに前記１の（７）の第４試薬の４μＬを添加混合し、３７℃で５分間インキュベートした。
（３）  次に、これに前記１の（８）の第５試薬の２μＬを添加混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。
（４）  次に、この１８０μＬを分取し、前記１の（１）の第１試薬の１８０μＬ及び前記１の（２）の第２試薬の１８０μＬを入れて３７℃でインキュベートしておいたキュベットに添加混合して、３７℃でインキュベートした。
（５）  前記（４）における添加混合の後、波長４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。
（６）  なお、前記（１）において、前記１の（３）の第３試薬−ａに替えて、前記１の（４）の第３試薬−ｂを用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、第３試薬−ｂを用いた場合の波長４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。
（７）  また、前記（１）において、前記１の（３）の第３試薬−ａに替えて、前記１の（５）の第３試薬−ｃを用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、第３試薬−ｃを用いた場合の波長４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。
（８）  そして、前記（１）において、前記１の（３）の第３試薬−ａに替えて、前記１の（６）の第３試薬−ｄを用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、第３試薬−ｄを用いた場合の波長４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。
４．試料中の総プロテインＳの活性値の算出
前記３において測定した波長４０５ｎｍにおける吸光度の変化（反応のタイムコース）の値を微分して、試料中の総プロテインＳの活性値を求めた。
なお、予め、総プロテインＳ活性値が既知の試料について、前記３の通り測定を行い、測定した波長４０５ｎｍにおける吸光度の変化（反応のタイムコース）の１分間当りの吸光度変化量を時間に対して直線式（微分直線）を求め、この直線の傾きをこの既知の総プロテインＳ活性値に対してプロットして検量線を作成した。
そして、前記２の試料を前記３の通り測定を行って得た、波長４０５ｎｍにおける吸光度の変化（反応のタイムコース）の１分間当りの吸光度変化量を、時間に対して直線式（微分直線）を求め、この直線の傾きを前記の検量線に当てはめて、試料中の総プロテインＳの活性値を算出した。
すなわち、測定により得られた吸光度より吸光度変化の加速度（吸光度の二次微分値）を求め、検量線に当てはめることにより、試料中の総プロテインＳの活性値を算出した。
なお、本特許出願の明細書及び図面においては、精製ヒトプロテインＳ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国）の１μｇ／ｍＬが有する総プロテインＳ活性値を、総プロテインＳ活性値１μｇ／ｍＬ当量と定義した。
よって、本特許出願の明細書及び図面においては、総プロテインＳの活性は、「μｇ／ｍＬ当量」を用いて表している。
５．測定結果
前記の通りに試料中の総プロテインＳの活性値の測定を行って得られた結果を表１に示した。
なお、この表において、「比率（％）」として表した値は、試料の総プロテインＳ活性値に対する、測定値（試料を測定して得た総プロテインＳ活性値）の比率をパーセント表示で示したものである。
【表１】
2012124798.tif 000006
この表より、第３試薬−ａを用いた場合には、すなわち、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させず、かつホスファチジルコリン及びホスファチジルセリン（１：１）よりなるリン脂質を存在させた場合には、前記の比率〔試料の総プロテインＳ活性値に対する、測定値（試料を測定して得た総プロテインＳ活性値）の比率〕が、総プロテインＳ活性値が１０μｇ／ｍＬ当量の試料においては０．８％、そして総プロテインＳ活性値が２０μｇ／ｍＬ当量の試料においては３３．２％であることが分かる。
また、この表より、第３試薬−ｂを用いた場合には、すなわち、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させ、かつホスファチジルコリン及びホスファチジルセリン（１：１）よりなるリン脂質を存在させた場合には、前記の比率〔試料の総プロテインＳ活性値に対する、測定値（試料を測定して得た総プロテインＳ活性値）の比率〕が、総プロテインＳ活性値が１０μｇ／ｍＬ当量の試料においては６５．４％、そして総プロテインＳ活性値が２０μｇ／ｍＬ当量の試料においては６２．８％であることが分かる。
また、この表より、第３試薬−ｃを用いた場合には、すなわち、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させず、かつホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミン（１：１：１）よりなるリン脂質を存在させた場合には、前記の比率〔試料の総プロテインＳ活性値に対する、測定値（試料を測定して得た総プロテインＳ活性値）の比率〕が、総プロテインＳ活性値が１０μｇ／ｍＬ当量の試料においては５０．４％、そして総プロテインＳ活性値が２０μｇ／ｍＬ当量の試料においては５０．０％であることが分かる。
また、この表より、第３試薬−ｄを用いた場合には、すなわち、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させ、かつホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミン（１：１：１）よりなるリン脂質を存在させた場合には、前記の比率〔試料の総プロテインＳ活性値に対する、測定値（試料を測定して得た総プロテインＳ活性値）の比率〕が、総プロテインＳ活性値が１０μｇ／ｍＬ当量の試料においては７８．７％、そして総プロテインＳ活性値が２０μｇ／ｍＬ当量の試料においては８９．１％であることが分かる。
これらのことより、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させることにより、試料中の総プロテインＳ活性を、より正確に測定することができることが確かめられた。
すなわち、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬の効果が確かめられた。
また、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に存在させるリン脂質が、ホスファチジルコリン及びホスファチジルセリンよりなるリン脂質よりも、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質の方が、より正確に試料中の総プロテインＳ活性を測定することができることが確かめられた。
〔実施例２〕（本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬−２）
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬の効果を確認した。
１．総プロテインＳの活性測定試薬
（１）第１試薬
第１試薬として、前記の実施例１の１の（１）の第１試薬を用いた。
（２）第２試薬
第２試薬として、前記の実施例１の１の（２）の第２試薬を用いた。
（３）第３試薬−１
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第３試薬−１を調製した。
リン脂質
塩化カルシウム    ２．５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム      ０．１Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン    ５０ｍＭ
なお、リン脂質は、前記のリン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝１：１：１）を、２４μＭの濃度となるように含有させた。
（４）第３試薬−２〜第３試薬−１９
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第３試薬−２から第３試薬−１９までを調製した。
界面活性剤
リン脂質
塩化カルシウム    ２．５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム      ０．１Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン    ５０ｍＭ
なお、リン脂質は、前記のリン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝１：１：１）を、２４μＭの濃度となるように含有させた。
また、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、ＮＰ−１０、ＮＰ−１１、ＮＰ−１２、ＮＰ−１３、ＢＴ−９及びＢＴ−１２、陰イオン性界面活性剤のサルコシネート  ＬＮ、陽イオン性界面活性剤のＣＡ−２３５０、並びに両性界面活性剤のＡＭ−３０１のそれぞれを、次の通り記載の濃度となるように各々の試薬に含有させた。
第３試薬−２：  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（和光純薬工業社、日本国）    ０．００５０％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−３：  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（和光純薬工業社、日本国）    ０．００６０％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−４：  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（和光純薬工業社、日本国）    ０．００７０％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−５：  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４（和光純薬工業社、日本国）    ０．００５０％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−６：  ＮＰ−１０（日光ケミカルズ社、日本国）    ０．００２５％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−７：  ＮＰ−１１（日光ケミカルズ社、日本国）    ０．００２５％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−８：  ＮＰ−１１（日光ケミカルズ社、日本国）    ０．００５０％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−９：  ＮＰ−１２（日光ケミカルズ社、日本国）    ０．００２５％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−１０：  ＮＰ−１３（日光ケミカルズ社、日本国）    ０．００５０％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−１１：  ＢＴ−９（日光ケミカルズ社、日本国）    ０．００３％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−１２：  ＢＴ−９（日光ケミカルズ社、日本国）    ０．００６％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−１３：  ＢＴ−１２（日光ケミカルズ社、日本国）    ０．００６％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−１４：  サルコシネート  ＬＮ（日光ケミカルズ社、日本国）    ０．００６％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−１５：  サルコシネート  ＬＮ（日光ケミカルズ社、日本国）    ０．０１０％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−１６：  ＣＡ−２３５０（日光ケミカルズ社、日本国）    ０．０００１％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−１７：  ＣＡ−２３５０（日光ケミカルズ社、日本国）    ０．０００３％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−１８：  ＡＭ−３０１（日光ケミカルズ社、日本国）    ０．００３％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−１９：  ＡＭ−３０１（日光ケミカルズ社、日本国）    ０．００６％（Ｗ／Ｖ）
（５）第４試薬
第４試薬として、前記の実施例１の１の（７）の第４試薬を用いた。
（６）第５試薬
第５試薬として、前記の実施例１の１の（８）の第５試薬を用いた。
２．試料
前記の実施例１の２の（１）及び（２）の各試料を、試料として用いた。
３．試料中の総プロテインＳの活性値の測定及び算出
前記２の試料のそれぞれについて、前記の実施例１の３及び４の記載の通りに総プロテインＳの活性値の測定及び算出を行い、各試料の総プロテインＳの活性値を得た。
なお、前記の実施例１の３の（１）の第３試薬−ａに替えて、前記１の（３）の第３試薬−１及び前記１の（４）の第３試薬−２から第３試薬−１９までを順々に用いた。
４．測定結果
前記の通りに試料中の総プロテインＳの活性値の測定を行って得られた結果を表２に示した。
なお、この表において、「比率（％）」として表した値は、試料の総プロテインＳ活性値に対する、測定値（試料を測定して得た総プロテインＳ活性値）の比率をパーセント表示で示したものである。
【表２】
2012124798.tif 000007
この表より、第３試薬−１を用いた場合には、すなわち、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させない場合には、前記の比率〔試料の総プロテインＳ活性値に対する、測定値（試料を測定して得た総プロテインＳ活性値）の比率〕が、総プロテインＳ活性値が１０μｇ／ｍＬ当量の試料においては５０．４％、そして総プロテインＳ活性値が２０μｇ／ｍＬ当量の試料においては５２．０％であることが分かる。
また、この表より、第３試薬−２から第３試薬−１９までをそれぞれ用いた場合には、すなわち、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させた場合には、前記の比率〔試料の総プロテインＳ活性値に対する、測定値（試料を測定して得た総プロテインＳ活性値）の比率〕が、総プロテインＳ活性値が１０μｇ／ｍＬ当量の試料においては６２．０％〜８８．０％、そして総プロテインＳ活性値が２０μｇ／ｍＬ当量の試料においては６４．０％〜１０４．３％であることが分かる。
これらのことより、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させることにより、試料中の総プロテインＳ活性を、より正確に測定することができることが確かめられた。
すなわち、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬の効果が確かめられた。
そして、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤の全てのタイプの界面活性剤において、この本発明の効果を確かめることができた。
〔実施例３〕（本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬の再現性の検討）
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬により試料中の総プロテインＳ活性値を測定する際の測定の再現性について検討した。
１．総プロテインＳの活性測定試薬
（１）希釈液
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、希釈液を調製した。
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（和光純薬工業社、日本国）    ０．０６％（Ｗ／Ｖ）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）    ０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム    ０．１Ｍ
クエン酸三ナトリウム    １０．６ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  ５０ｍＭ
（２）第１試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第１試薬を調製した。
活性化プロテインＣ（精製ヒト活性化プロテインＣ；Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国）    ３９７ｐＭ
界面活性剤
リン脂質
塩化カルシウム    ２．５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム      ０．１Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン    ５０ｍＭ
なお、界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（和光純薬工業社、日本国）を０．００６％（Ｗ／Ｖ）の濃度となるように含有させた。
また、リン脂質は、前記のリン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝１：１：１）を、２４μＭの濃度となるように含有させた。
（３）第２試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第２試薬を調製した。
活性化血液凝固第Ｖ因子（精製ヒト活性化血液凝固第Ｖ因子；Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国）３５７ｐＭ
界面活性剤
リン脂質
塩化カルシウム    ２．５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム      ０．１Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン    ５０ｍＭ
なお、界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（和光純薬工業社、日本国）を０．００６％（Ｗ／Ｖ）の濃度となるように含有させた。
また、リン脂質は、前記のリン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝１：１：１）を、２４μＭの濃度となるように含有させた。
（４）第３試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．５（２０℃）に調整して、第３試薬を調製した。
活性化血液凝固第Ｘ因子（精製ウシ活性化血液凝固第Ｘ因子；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ社、米国）    ５０ｐＭ
プロトロンビン（精製ヒトプロトロンビン；Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国）    ７３８ｎＭ
テストチーム（登録商標）発色基質Ｓ−２２３８（トロンビンの基質〔トロンビンの発色基質〕；製造元：Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社〔イタリア国〕、販売元：積水メディカル社〔日本国〕）    ７５０μＭ
リン脂質
塩化カルシウム    ５．０ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム      ０．１５Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン    ５０ｍＭ
なお、リン脂質は、前記のリン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝３：２：５）を、７．５μＭの濃度となるように含有させた。
２．試料
ヒトの血漿の４検体を、試料として用いた。
３．試料中の総プロテインＳの活性値の測定
各試料の総プロテインＳの活性値の測定は、日立ハイテクノロジーズ社（日本国）の７１７０Ｓ形汎用自動分析装置を使用して行った。
（１）  前記２の試料それぞれについて、前記１の（１）の希釈液により希釈倍率１５倍で希釈を行った。
（２）  前記（１）で希釈した試料２．０μＬに、前記１の（２）の第１試薬の９８μＬを添加し、３７℃で１．４分間反応させた。
（３）  次に、前記１の（３）の第２試薬の２０μＬを添加し、３７℃で８．３分間反応させた。
（４）  次に、前記１の（４）の第３試薬の２３６μＬを添加し、３７℃で反応させた。
（５）  前記（４）における第３試薬の添加の後、主波長４０５ｎｍ及び副波長５０５ｎｍにおける吸光度の変化を１２．３分間測定した。
（６）  前記（１）〜（５）の操作を繰り返して計５回行い、同時再現性の検討を行なった。
（７）  また、前記（１）〜（５）の操作を連続する３日間のそれぞれの日に行い、日差再現性の検討を行なった。
４．試料中の総プロテインＳの活性値の算出
前記３の（５）において測定した第３試薬添加後の吸光度変化（反応のタイムコース）の値を微分して、試料中の総プロテインＳの活性値を求めた。
なお、予め、総プロテインＳ活性値が既知の試料について、前記３の通り測定を行い、測定した第３試薬添加後の吸光度変化（反応のタイムコース）の１分間当りの吸光度変化量を時間に対して直線式（微分直線）を求め、この直線の傾きをこの既知の総プロテインＳ活性値に対してプロットして検量線を作成した。
そして、前記２の試料を前記３の通り測定を行って得た、第３試薬添加後の吸光度変化（反応のタイムコース）の１分間当りの吸光度変化量を、時間に対して直線式（微分直線）を求め、この直線の傾きを前記の検量線に当てはめて、試料中の総プロテインＳの活性値を算出した。
すなわち、測定により得られた吸光度より吸光度変化の加速度（吸光度の二次微分値）を求め、検量線に当てはめてることにより、試料中の総プロテインＳの活性値を算出した。
５．測定結果
前記の通りに試料中の総プロテインＳの活性値の測定を行って得られた結果を表３に示した。
この表において、同時再現性のデータ、及び日差再現性のデータとも、それぞれの試料毎に、「平均値±標準偏差（ＳＤ）」及び「変動係数（ＣＶ）」を示した。
【表３】
2012124798.tif 000008
この表より、同時再現性における変動係数（ＣＶ）は１．４％〜４．５％の範囲のものであり、測定値のバラツキが小さく、精密に測定できていることが分かる。
また、日差再現性における変動係数（ＣＶ）は２．８％〜５．６％の範囲のものであり、例え測定を行う日が異なったとしてもその測定値のバラツキは小さく、精密に測定できることが分かる。
これらのことより、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬は測定の再現性がよく、精密に測定が行えるものであることが確かめられた。
〔実施例４〕（ＥＬＩＳＡ法による試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定方法及び測定試薬との相関）
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬と、ＥＬＩＳＡ法による試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定方法及び測定試薬との相関を検討した。
Ｉ．本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬による測定
１．総プロテインＳの活性測定試薬
（１）希釈液
希釈液として、前記の実施例３の１の（１）の希釈液を用いた。
（２）第１試薬
第１試薬として、前記の実施例３の１の（２）の第１試薬を用いた。
（３）第２試薬
第２試薬として、前記の実施例３の１の（３）の第２試薬を用いた。
（４）第３試薬
第３試薬として、前記の実施例３の１の（４）の第３試薬を用いた。
２．試料
健常人５０名の血漿を、試料として用いた。
３．試料中の総プロテインＳの活性値の測定及び算出
前記２の試料のそれぞれについて、前記の実施例３の３及び４の記載の通りに総プロテインＳの活性値の測定及び算出を行い、各試料の総プロテインＳの活性値を得た。
この試料中の総プロテインＳの活性値の測定を行って得られた結果を図１に示した。
ＩＩ．ＥＬＩＳＡ法による試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定方法及び測定試薬による測定
１．ＥＬＩＳＡ法による総プロテインＳのタンパク質量の活性測定試薬
ＥＬＩＳＡ法による総プロテインＳのタンパク質量の活性測定試薬として、市販の「アセラクロム  トータルプロテイン  Ｓ  ＴＭＢ」（製造者：ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ  ＳＴＡＧＯ社、フランス国；製造販売者：ロシュ・ダイアグノスティックス社、日本国）を用いた。
なお、この「アセラクロム  トータルプロテイン  Ｓ  ＴＭＢ」は次のものより構成される。
（ａ）  抗体コーティングストリップ（抗総プロテインＳマウスモノクローナル抗体）
（ｂ）  抗体コンジュゲート（ペルオキシダーゼ標識抗総プロテインＳマウスモノクローナル抗体）
（ｃ）基質液（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、及び３０％過酸化水素水）
（ｄ）希釈緩衝液
（ｅ）洗浄液
（ｆ）スタンダード（総プロテインＳ・キャリブレーター）
（ｇ）コントロール（総プロテインＳ・コントロール）
（ｈ）プレートフレーム
（ｉ）プレートカバー
２．試料
前記のＩの２における試料（健常人５０名の血漿）を、試料として用いた。
３．試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定及び算出
「アセラクロム  トータルプロテイン  Ｓ  ＴＭＢ」の添付文書の記載に従い、試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定及び算出を行った。
なお、この「アセラクロム  トータルプロテイン  Ｓ  ＴＭＢ」における操作方法は次の通りである。
（ａ）  検体（クエン酸血漿）を希釈緩衝液で１０１倍に希釈し、試料とする。
（ｂ）  希釈緩衝液で１０１倍に希釈して調製したスタンダードを段階的に希釈し、希釈系列を作成する。
（ｃ）  抗体コーティングストリップの各ウェルに抗体コンジュゲートを５０μＬ分注する。
（ｄ）  試料又は希釈したスタンダード２００μＬをそれぞれ分注し、１８〜２５℃で１時間インキュベーションする。
（ｅ）  各ウェルの内容液を吸引除去し、洗浄液で５回洗浄する。
（ｆ）  洗浄液を吸引除去した後、各ウェルに基質液２００μＬを分注し、１８〜２５℃で５分間インキュベーションする。
（ｇ）  １Ｍ硫酸５０μＬを分注し、プレートを穏やかに揺らして内容物を混和する。１５分間放置した後、１時間以内に波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。
（ｈ）  スタンダードの吸光度と試料の吸光度を比較し、試料中の総プロテインＳ濃度を求める。
このようにして、前記２の各試料の総プロテインＳのタンパク質量を得た。
この試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定を行って得られた結果を図１に示した。
ＩＩＩ．測定結果
前記Ｉにおける試料中の総プロテインＳの活性値の測定結果と、前記ＩＩにおける試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定結果とを、これらの相関の図として図１に示した。
この図において、横軸（ｘ）は前記ＩＩのＥＬＩＳＡ法による試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定結果を表す。この測定値の単位は「μｇ／ｍＬ」である。
また、この図において、縦軸（ｙ）は前記Ｉにおける本発明の活性測定方法及び活性測定試薬による試料中の総プロテインＳの活性値の測定結果を表す。この測定値の単位は「μｇ／ｍＬ当量」である。
この相関の回帰式を求めた結果、回帰式はｙ＝０．９５９ｘ−０．８６０であり、相関係数はｒ＝０．９３であった。（ｘ：前記ＩＩのＥＬＩＳＡ法による総プロテインＳのタンパク質量の測定結果、ｙ：前記Ｉの本発明による総プロテインＳの活性値の測定結果）
この図、そして相関の回帰式より、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬による活性値は、試料中の総プロテインＳのタンパク質量と良好な相関性を示すことが分かる。
このように総プロテインＳのタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬により得られる活性値が、正確なものであることが分かる。すなわち、試料中の総プロテインＳの活性を正確に測定出来ている。
そして、このように総プロテインＳのタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬及び活性測定方法が、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕についてその活性を、すなわち、総プロテインＳの活性を測定することが出来るものであることが分かる。
つまり、このように総プロテインＳのタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬及び活性測定方法が、「遊離のプロテインＳ（遊離型）」の活性に加えて、「プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）」に含まれるプロテインＳが遊離のプロテインＳ（遊離型）となった場合に発現する活性もあわせて測定することが出来るものであることが分かる。
すなわち、このように総プロテインＳのタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬及び活性測定方法が、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕について、そのタンパク質量に相応するプロテインＳの活性値を得ることが出来るものであることが分かる。
これらのことより、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬及び活性測定方法が、試料中の総プロテインＳの活性を正確に測定することが出来るものであることが確かめられた。
〔実施例５〕（総プロテインＳの活性値と総プロテインＳのタンパク質量との比較）
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬により得た総プロテインＳの活性値と、ラテックス比濁法による試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定方法及び測定試薬により得た総プロテインＳのタンパク質量とを比較した。
Ｉ．本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬による測定
１．総プロテインＳの活性測定試薬
（１）希釈液
希釈液として、前記の実施例３の１の（１）の希釈液を用いた。
（２）第１試薬
第１試薬として、前記の実施例３の１の（２）の第１試薬を用いた。
（３）第２試薬
第２試薬として、前記の実施例３の１の（３）の第２試薬を用いた。
（４）第３試薬
第３試薬として、前記の実施例３の１の（４）の第３試薬を用いた。
２．試料
次の（１）〜（４）をそれぞれ試料として用いた。
（１）  健常人２１１名の血漿
（２）  プロテインＳの遺伝子変異であるＰＳ−Ｋ１５５Ｅヘテロ接合体（プロテインＳの異常症の一つであるプロテインＳ徳島）であることが判明している７名の血漿
（３）  プロテインＳの遺伝子変異であるＰＳ−Ｋ１５５Ｅホモ接合体（プロテインＳの異常症の一つであるプロテインＳ徳島）であることが判明している１名の血漿
（４）  プロテインＳの遺伝子変異であるＣ２０６Ｆヘテロ接合体（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明している１名の血漿
３．試料中の総プロテインＳの活性値の測定及び算出
前記２の試料のそれぞれについて、前記の実施例３の３及び４の記載の通りに総プロテインＳの活性値の測定及び算出を行い、各試料の総プロテインＳの活性値を得た。
この試料中の総プロテインＳの活性値の測定を行って得られた結果を図２に示した。
ＩＩ．ラテックス比濁法による試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定方法及び測定試薬による測定
１．ラテックス比濁法による総プロテインＳのタンパク質量の活性測定試薬
（１）第１試薬
Ｃ４ｂ結合タンパク質を、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８４７〜８５６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
次に、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡ、０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭ  ＭＥＳ−塩酸緩衝液〔ｐＨ６．２（２０℃）〕を調製した。
ここに、前記の通り調製したＣ４ｂ結合タンパク質を２５μｇ／ｍＬの濃度となるように添加し、第１試薬とした。
（２）第２試薬
（ａ）抗プロテインＳ抗体の調製
本発明者らが、精製した遊離状態のプロテインＳを免疫抗原として、常法に従って抗プロテインＳ抗体の調製を行った。
プロテインＳのＣ４ｂ結合タンパク質との結合部位以外の部位に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングを行い、マウス／マウスのハイブリドーマ（９Ｈ６株）を得た。
このハイブリドーマ（９Ｈ６株）より産生されたマウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体の５ｍｇを、０．５ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。
これに、０．６ｍｇのＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物を溶解した０．０１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを加え、室温で３０分間インキュベートした。
次に、これに、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ水溶液の０．０２ｍＬ、１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬ、及び１Ｍヒドロキシルアミン塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬをそれぞれ加え、３０℃で３０分間インキュベートした。
その後、これを、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいた、セファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行い、メルカプト・サクシニル化したマウス抗プロテインＳモノクローナル抗体を得た。
（ｂ）抗プロテインＳ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
平均粒径０．１９２μｍのラテックス粒子の１０％懸濁液１．０ｍＬと５０ｍＭ  ＭＥＳ−塩酸緩衝液〔ｐＨ６．０（２０℃）〕１．０ｍＬとを混和し、更に３２０ｍＭカルボジイミド（同仁化学研究所；製品番号：３４８−０３６３１）水溶液３２μＬを添加して混和し、氷上で１０分間放置した。
前記の氷上で１０分間放置したラテックス粒子懸濁液１．２ｍＬに、前記（ａ）で調製したメルカプト・サクシニル化したマウス抗プロテインＳモノクローナル抗体を０．０８３ｇ／ｄＬの濃度で５０ｍＭ  ＭＥＳ−塩酸緩衝液〔ｐＨ６．０（２０℃）〕に混和した液１．８ｍＬを加え、４℃で一晩攪拌した。
次に、遠心分離により上清を除去した後、沈殿部を０．８％ＢＳＡを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液〔ｐＨ８．０（２０℃）〕にて懸濁し、３７℃で３時間放置し、ブロッキング処理を行った。
次に、遠心分離により沈殿部を回収した後、これを０．１％ＢＳＡを含む０．０５％アジ化ナトリウム水溶液で再分散し、波長７００ｎｍにおける吸光度が１５．０ＯＤとなるように懸濁した。
これを抗プロテインＳ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液とした。
（ｃ）第２試薬の調製
前記（ｂ）で調製した抗プロテインＳ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液を、０．１％ＢＳＡを含む０．０５％アジ化ナトリウム水溶液で１０倍希釈し、０．１％の「抗プロテインＳ抗体固定化ラテックス粒子」を含有する懸濁液を調製した。
これを第２試薬とした。
２．試料
前記のＩの２の（１）〜（４）の各試料を、試料として用いた。
３．試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定及び算出
（１）測定手順
（ａ）測定は、東芝−１２０ＦＲ自動分析装置（東芝メディカルシステムズ社製）を使用して行った。
まず、測定用セル（キュベット）に、前記２の試料の３μＬを添加した。
次に、これらの測定用セル（キュベット）に、前記１の（１）の第１試薬の１００μＬを添加し、混合した。
そして、これらの測定用セル（キュベット）を、３７℃で静置した。
これにより、前記の試料に含まれていた遊離のプロテインＳと、前記の第１試薬中のＣ４ｂ結合タンパク質との複合体を形成させた。すなわち、試料に含まれていたプロテインＳは、全て「プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）」となった。
（ｂ）前記の第１試薬の添加後４分４０秒目（１６ポイント目）に、これらの測定用セル（キュベット）内の混合液に、更に、前記１の（２）の（ｃ）の第２試薬の１００μＬを添加し、混合した。
（ｃ）前記の第１試薬の添加後５分３５秒目（１９ポイント目）に、これらの測定用セル（キュベット）内の混合液の吸光度（波長７００ｎｍ）を試料盲検として測定した。
そして、これらの測定用セル（キュベット）を、３７℃で静置して、反応を行わせた。
これにより、前記のラテックス粒子に固定化された抗プロテインＳ抗体と、前記の試料に含まれていたプロテインＳとの抗原抗体反応を行わせ、ラテックス粒子の凝集塊を生成させた。
（ｄ）前記の第１試薬の添加後９分４７秒目（３３ポイント目）に、この測定用セル（キュベット）内の反応混合液の吸光度（波長７００ｎｍ）を、前記試料の測定値として測定した。
（ｅ）前記（ｄ）において測定した吸光度（測定値）から前記（ｃ）において測定した吸光度（試料盲検）を差し引き、吸光度差を得た。
なお、この吸光度差は試料に含まれる総プロテインＳタンパク質量（濃度）に比例したものである。
これらの試料の吸光度差より検量線を作成し、実検体（３．２％クエン酸血漿）を同様の方法で測定した際の吸光度差を検量線に当てはめて、試料中の総プロテインＳタンパク質濃度を求めた。
このようにして、前記２の各試料の総プロテインＳのタンパク質量を得た。
この試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定を行って得られた結果を図２に示した。
ＩＩＩ．測定結果
１．図の説明
前記Ｉにおける試料中の総プロテインＳの活性値の測定結果と、前記ＩＩにおける試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定結果とを比較する図を、図２として示した。
この図において、横軸（ｘ）は前記ＩＩのラテックス比濁法による試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定結果を表す。この測定値の単位は「μｇ／ｍＬ」である。
また、この図において、縦軸（ｙ）は前記Ｉにおける本発明の活性測定方法及び活性測定試薬による試料中の総プロテインＳの活性値の測定結果を表す。この測定値の単位は「μｇ／ｍＬ当量」である。
２．健常人の試料の比較
前記Ｉの本発明による総プロテインＳの活性値の測定結果と、前記ＩＩのラテックス比濁法による総プロテインＳのタンパク質量の測定結果との比較を、次のようにして行った。
試料が健常人２１１名の血漿である場合について、前記Ｉの総プロテインＳの活性値の測定結果と、前記ＩＩの総プロテインＳのタンパク質量の測定結果より、プロテインＳの比活性（総プロテインＳ活性値／総プロテインＳタンパク質量）を求めた。
この健常人２１１名の血漿試料のプロテインＳの比活性の平均値と標準偏差（以下、ＳＤということがある）を算出し、平均±２ＳＤ（０．９８±０．２６）の範囲を求めた。
この範囲を外れる試料が１０あったので、この１０の試料を除外した健常人２０１名の試料について、再度、総プロテインＳの活性値の測定結果と、総プロテインＳのタンパク質量の測定結果より求めたプロテインＳの比活性（総プロテインＳ活性値／総プロテインＳタンパク質量）の平均値と標準偏差を算出し、平均±２ＳＤ（０．９９±０．２０）の範囲と平均±３ＳＤ（０．９９±０．３０）の範囲を求めた。
なお、この図は、各々の試料について、試料中の総プロテインＳの活性値を総プロテインＳのタンパク質量で除した比活性を表すものでもある。
この図において、比活性の平均値であるｙ＝０．９９ｘの式の線を実線で表した。
また、この式ｙ＝０．９９ｘの線の上及び下に、平均±２ＳＤを示す線（ｙ＝１．１９ｘ、及びｙ＝０．７９ｘ）を破線でこの図に表した。
そして、この式ｙ＝０．９９ｘの線の上に平均＋３ＳＤを示す線（ｙ＝１．２９ｘ）を点線で、またこの式ｙ＝０．９９ｘの線の下に平均−３ＳＤを示す線（ｙ＝０．６９ｘ）を実線でこの図に表した。
健常人２１１名の血漿の試料の測定結果において、この図２で、前記のｙ＝０．６９ｘ（平均−３ＳＤ）の線よりも下に外れるものが、７つ認められた。
すなわち、総プロテインＳの活性値を総プロテインＳのタンパク質量で除した比活性が０．６９以下の試料が、７つ認められた。
これらの比活性が０．６９以下の７つの試料のうち、すなわち総プロテインＳの活性値と総プロテインＳのタンパク質量が大きく乖離している７つの試料のうち、同意が得られた３つの試料についてプロテインＳ遺伝子の塩基配列を調べたところ、これらの３つの試料のいずれもプロテインＳ遺伝子のＰＳ−Ｋ１５５Ｅ変異（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明した。〔図２において、これらの３つの試料に矢印（↓又は↑）を付した。〕
このことより、試料中の総プロテインＳの活性値及び試料中の総プロテインＳのタンパク質量を測定し、この測定により得た総プロテインＳの活性値と総プロテインＳのタンパク質量とを、比活性を求める等により比較することにより、プロテインＳの遺伝子の変異等のプロテインＳの異常症を検出することが出来ることが確かめられた。
３．プロテインＳの遺伝子変異（プロテインＳの異常症）であることが判明している試料の比較
前記Ｉの２の（２）〜（４）のプロテインＳの遺伝子変異（プロテインＳの異常症）であることが判明している試料（計９名の試料）のそれぞれについて、前記Ｉの本発明による総プロテインＳの活性値の測定結果と、前記ＩＩのラテックス比濁法による総プロテインＳのタンパク質量の測定結果との比較を行う。
図２において、前記Ｉの２の（２）のプロテインＳの遺伝子変異であるＰＳ−Ｋ１５５Ｅヘテロ接合体（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明している７名の血漿の試料を「●」で示した。
また、前記Ｉの２の（３）のプロテインＳの遺伝子変異であるＰＳ−Ｋ１５５Ｅホモ接合体（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明している１名の血漿の試料を「◆」で示した。
そして、前記Ｉの２の（４）のプロテインＳの遺伝子変異であるＣ２０６Ｆヘテロ接合体（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明している１名の血漿の試料を「□」で示した。
プロテインＳの遺伝子変異であることが判明しているこれらの９つの試料（●、◆及び□）はいずれも、前記の図２におけるｙ＝０．６９ｘ（平均−３ＳＤ）の線よりも下に外れていることが分かる。
すなわち、プロテインＳの遺伝子変異であることが判明しているこれらの９つの試料（●、◆及び□）はいずれも、総プロテインＳの活性値を総プロテインＳのタンパク質量で除した比活性が０．６９以下であることが分かる。
つまり、これらの９つの試料は、総プロテインＳの活性値と総プロテインＳのタンパク質量が大きく乖離していることが分かる。
よって、試料中の総プロテインＳの活性値及び試料中の総プロテインＳのタンパク質量を測定し、この測定により得た総プロテインＳの活性値と総プロテインＳのタンパク質量とを、比活性を求める等により比較することにより、プロテインＳの遺伝子の変異等のプロテインＳの異常症を検出することが出来ることが、これらのプロテインＳの遺伝子変異の９つの試料の比較結果からも確かめられた。
【産業上の利用可能性】
【００１１】
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬及び活性測定方法は、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔Ｃ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕についてその活性を、すなわち、総プロテインＳの活性を測定することが出来るものである。
よって、本発明により総プロテインＳ活性値を求めた試料について、別途総プロテインＳのタンパク質量を求め、その試料におけるプロテインＳの比活性（活性値／タンパク質量）を算出することにより、プロテインＳの異常症を検出することができる。
すなわち、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬及び活性測定方法を用いることにより、プロテインＳの異常症を検出し、血栓症等の疾患の予防、診断及び治療等に役立てることができる。
【図１】
2012124798.tif 000009
【図２】
2012124798.tif 000010
【国際調査報告】
2012124798.tif 000011
2012124798.tif 000012
2012124798.tif 000013
2012124798.tif 000014