(57)【要約】  本発明は、下記計算式（１）で示されるセルロースＩ型結晶化度が５０％以下及び／又は比表面積が１８０ｍ2／ｇ以上であるセルロースを、酵素配合剤により糖化処理する糖の製造方法及びグルコースの生成量を増加させる方法であって、該酵素配合剤は、エンドグルカナーゼを該酵素配合剤の総タンパク質量中２０％以上含むものであり、該セルロースは、セルロース含有原料を粉砕機による粉砕処理して得る、糖の製造方法及びグルコースの生成量を増加させる方法に関する。  セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００    （１）〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、Ｉ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記計算式（１）で示されるセルロースＩ型結晶化度が５０％以下及び／又は比表面積が１８０ｍ2／ｇ以上であるセルロースを酵素配合剤により糖化処理する糖の製造方法であって、
該酵素配合剤は、エンドグルカナーゼを該酵素配合剤の総タンパク質量中２０％以上含むものであり、該セルロースは、セルロース含有原料を粉砕機による粉砕処理して得る、糖の製造方法。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００    （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、Ｉ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
【請求項２】
前記セルロースの分子量が１３万以下である、請求項１に記載の糖の製造方法。
【請求項３】
前記粉砕機が、媒体式粉砕機である、請求項１又は２に記載の糖の製造方法。
【請求項４】
前記セルロース含有原料を、前記糖化処理前にアルカリ処理する、請求項１〜３のいずれかに記載の糖の製造方法。
【請求項５】
前記アルカリ処理が、アルカリ溶液を用いた浸漬処理である、請求項４に記載の糖の製造方法。
【請求項６】
前記エンドグルカナーゼが、Trichoderma属由来のエンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）、エンドグルカナーゼII（ＥＧII）から選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜５のいずれかに記載の糖の製造方法。
【請求項７】
前記酵素配合剤が、更に、セロビオハイドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、β−グルコシダーゼからなる群から選ばれる１種以上を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の糖の製造方法。
【請求項８】
前記酵素配合剤が、更に、酵素としてセロビオハイドロラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを含み、β−グルコシダーゼを含まない、請求項１〜７のいずれかに記載の糖の製造方法。
【請求項９】
前記糖化処理の処理温度が、１０〜９０℃である、請求項１〜８のいずれかに記載の糖の製造方法。
【請求項１０】
前記糖化処理の処理時間が、５〜１６８時間である、請求項１〜９のいずれかに記載の糖の製造方法。
【請求項１１】
前記セルロース含有原料が、パルプ類、紙類、植物茎・葉・果房類、植物殻類、及び木材類からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜１０のいずれかに記載の糖の製造方法。
【請求項１２】
前記セルロース含有原料における、該原料から水を除いた残余の成分中のセルロース含有量が、２０質量％以上である、請求項１〜１１のいずれかに記載の糖の製造方法。
【請求項１３】
下記計算式（１）で示されるセルロースＩ型結晶化度が５０％以下及び／又は比表面積が１８０ｍ2／ｇ以上であるセルロースを酵素配合剤により糖化処理する、グルコースの生成量を増加させる方法であって、
該酵素配合剤は、エンドグルカナーゼを該酵素配合剤の総タンパク質量中２０％以上含むものであり、該セルロースは、セルロース含有原料を粉砕機による粉砕処理して得る、グルコースの生成量を増加させる方法。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００    （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、Ｉ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖の製造方法、及びグルコースの生成量を増加させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロース含有原料は、セルロースエーテルの原料、化粧品、食品、バイオマス材料等の工業原料に用いられる。特に近年、環境問題への取り組み等からバイオマス材料から糖を製造し、それを発酵法等でエタノールや乳酸等へ変換する試みがなされている（特許文献１参照）。
セルロース含有原料を糖化する方法としては、硫酸等の酸を用いる酸糖化法とセルラーゼ等の酵素を用いる酵素糖化法が知られており、より環境にやさしい酵素糖化法が望まれている。セルラーゼは機能の異なるエンドグルカナーゼ（ＥＧ）、セロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）及びβ-グルコシダーゼ（ＢＧ）の３種の酵素に大別され、バイオマスからグルコースを生成するためにはこれら３種のセルラーゼが必要とされている。市販セルラーゼ製剤では、Trichoderma reesei由来のセルラーゼの糖化効率が良いとされているが、そのタンパク質構成比はＣＢＨ約８０％、ＥＧが約２０％であるとされ、ＢＧの比率の低さが指摘されている。そこで糖化効率の向上を目的として、T. reesei由来のセルラーゼ製剤（セルクラスト１.５Ｌ）に対し、ＢＧ活性の比率を高めることにより、全酵素量を約半分にできる等、ＢＧ活性の重要性も指摘されている（非特許文献１参照）。
さらに酵素糖化法としては、特定のセルラーゼを用いる方法（特許文献２参照）、過酸化水素を用いて熱水処理をしたセルロース又はヘミセルロースを酵素処理する方法（特許文献３及び４参照）等の糖化の効率化検討が行われている。
しかし、これらの方法は、糖化効率、生産性において未だ満足できるものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００６−２２３１５２号公報
【特許文献２】特開２００３−１３５０５２号公報
【特許文献３】特開２００７−７４９９２号公報
【特許文献４】特開２００７−７４９９３号公報
【非特許文献１】バイオマスエネルギー利用の最新技術、シーエムシー出版、２００１年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、糖を効率的に得ることができる、生産性に優れた糖の製造方法、及びグルコースの生成量を増加させる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、特定の結晶化度及び／又は比表面積を有するセルロースを、特定の酵素配合剤を用いて糖化処理することで、前記課題を解決できることを見出した。
すなわち、本発明は、下記［１］及び［２］である。
［１］下記計算式（１）で示されるセルロースＩ型結晶化度が５０％以下及び／又は比表面積が１８０ｍ2／ｇ以上であるセルロースを酵素配合剤により糖化処理する糖の製造方法であって、該酵素配合剤は、エンドグルカナーゼを該酵素配合剤の総タンパク質量中２０％以上含むものであり、該セルロースは、セルロース含有原料を粉砕機による粉砕処理して得る、糖の製造方法。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００    （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、Ｉ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
［２］下記計算式（１）で示されるセルロースＩ型結晶化度が５０％以下及び／又は比表面積が１８０ｍ2／ｇ以上であるセルロースを酵素配合剤により糖化処理する、グルコースの生成量を増加させる方法であって、該酵素配合剤は、エンドグルカナーゼを該酵素配合剤の総タンパク質量中２０％以上含むものであり、該セルロースは、セルロース含有原料を粉砕機による粉砕処理して得る、グルコースの生成量を増加させる方法。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００    （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、Ｉ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
【発明の効果】
【０００６】
本発明の糖の製造方法によれば、糖を効率良く生産することができるため、生産性を向上させることができる。また、本発明のグルコースの生成量を増加させる方法によれば、グルコースが効率良く生成することができるため、グルコースの生成量を顕著に増加させ、生産性を向上させることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、上記計算式（１）で示されるセルロースＩ型結晶化度が５０％以下及び／又は比表面積が１８０ｍ2／ｇ以上であるセルロースを酵素配合剤により糖化処理する糖の製造方法であって、該酵素配合剤は、エンドグルカナーゼを該酵素配合剤の総タンパク質量中２０％以上含むものであり、該セルロースは、セルロース含有原料を粉砕機による粉砕処理して得る、糖の製造方法である。
また、本発明は、上記計算式（１）で示されるセルロースＩ型結晶化度が５０％以下及び／又は比表面積が１８０ｍ2／ｇ以上であるセルロースを、酵素配合剤により糖化処理するグルコースの生成量を増加させる方法であって、該酵素配合剤は、エンドグルカナーゼを該酵素配合剤の総タンパク質量中２０％以上含むものであり、該セルロースは、セルロース含有原料を粉砕機による粉砕処理して得る、グルコースの生成量を増加させる方法である。
以下、本発明を詳細に説明するが、本明細書において、セルロースＩ型結晶化度を単に「結晶化度」ということがある。
【０００８】
〔セルロース〕
本発明で用いるセルロースは、セルロースＩ型結晶化度が５０％以下及び／又は比表面積が１８０ｍ2／ｇ以上のものである。
ここで、セルロースＩ型結晶化度とは、セルロースの結晶領域量の全量に対する割合のことである。また、セルロースＩ型とは、天然セルロースの結晶形のことである。結晶化度は、セルロースの物理的、化学的性質とも関係し、その値が大きいほど、セルロースの結晶性が高く、非結晶部分が少ないため、硬度、密度等は増すが、伸び、柔軟性、水や溶媒に対する溶解性、化学反応性は低下する。
【０００９】
本発明におけるセルロースＩ型結晶化度は、Ｘ線回折法による回折強度値からＳｅｇａｌ法により算出したもので、下記計算式（１）により定義される。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００    （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、Ｉ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
【００１０】
本発明で用いるセルロースのセルロースＩ型結晶化度としては、５０％以下である。結晶化度が５０％以下であれば、セルロースの化学反応性が向上し、エンドグルカナーゼを含む酵素配合剤による酵素処理により、グルコースもしくは、セロビオース、セロトリオースといったオリゴ糖等の混合物を効率良く得ることができる。また、セルロースエーテルの製造において、アルカリを加えた際にアルカリセルロース化が容易に進行してセルロースエーテル化反応の反応転化率を向上させることができる。
そのため、上記観点から、結晶化度としては、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、より好ましくは１５％以下、更に好ましくは１０％以下、更に好ましくは分析でＩ型結晶が検出されない０％である。なお、計算式（１）で定義されたセルロースＩ型結晶化度では計算上マイナスの値になる場合があるが、マイナスの値の場合のセルロースＩ型結晶化度は０％とする。
【００１１】
また、本発明で用いるセルロースの比表面積は、比表面積が１８０ｍ2／ｇ以上である。比表面積が１８０ｍ2／ｇ以上であれば、セルロースの化学反応性が向上し、エンドグルカナーゼを含む酵素配合剤により効率良く糖化処理を行なうことができる。
そのため、上記観点から、比表面積としては、好ましくは２００ｍ2／ｇ以上、より好ましくは２５０ｍ2／ｇ以上、より好ましくは２７０ｍ2／ｇ以上、更に好ましくは２９０ｍ2／ｇ以上である。また、当該セルロースの比表面積の上限値としては、特に制限はないが、生産性の観点から、好ましくは５００ｍ2／ｇ以下である。なお、ここでいう比表面積は、実施例に記載の方法で測定された値である。
【００１２】
また、本発明で用いるセルロースの分子量は、１３万以下であることが好ましい。分子量が１３万以下であれば、セルロースの化学反応性が向上し、エンドグルカナーゼを含む酵素配合剤により効率良く糖化処理を行なうことができる。
そのため、上記観点から、分子量としては、より好ましくは１１万以下、より好ましくは９万以下、更に好ましくは７万以下、更に好ましくは５万以下である。また、当該セルロースの分子量の下限値としては、特に制限はないが、生産性の観点から、好ましくは１０００以上である。なお、ここでいう分子量は、実施例に記載の方法で測定された値である。
【００１３】
なお、本発明で用いるセルロースは、上述の結晶化度又は比表面積のいずれかの範囲に属するものであればよいが、セルロースの化学反応性を向上させ、エンドグルカナーゼを含む酵素配合剤により効率良く糖化処理を行なう観点から、上述の結晶化度及び比表面積のいずれの好適範囲にも属するセルロースが好ましく、更に上述の分子量の好適範囲にも属するセルロースがより好ましい。
【００１４】
〔セルロース含有原料〕
上述の特定の結晶化度及び／又は比表面積を有するセルロースは、セルロース含有原料を粉砕機による粉砕処理して得る。
セルロース含有原料は、該原料から水を除いた残余の成分中のセルロース含有量が好ましくは２０質量％以上、より好ましくは４０質量％以上、更に好ましくは６０質量％以上のものである。また、セルロース含有原料における、当該セルロース含有量の上限値としては、セルロース含有原料から水を除いた残余の成分中、通常９９質量％以下である。なお、本発明において、セルロース含有量とは、セルロース量及びヘミセルロース量の合計量を意味する。
【００１５】
セルロース含有原料としては、特に制限は無く、例えば、各種木材チップ、剪定枝材、間伐材、枝木材等の木材類；木材から製造されるウッドパルプ、綿の種子の周囲の繊維から得られるコットンリンターパルプ等のパルプ類；新聞紙、ダンボール、雑誌、上質紙等の紙類；バガス（サトウキビの搾りかす）、パーム空果房（ＥＦＢ）、稲ワラ、とうもろこし茎等の植物茎・葉・果房類；籾殻、パーム殻、ココナッツ殻等の植物殻類等が挙げられる。これらの中でも、パルプ類、紙類、植物茎・葉・果房類、植物殻類、及び木材類が好ましく、パルプ類、紙類、及び植物茎・葉・果房類がより好ましく、パルプ類、及びバガスが更に好ましい。
なお、これらのセルロース含有原料は、粉末状のものであっても、シート状のものであってもよい。
市販のパルプの場合、水を除いた残余の成分中のセルロース含有量は、一般には７５〜９９質量％であり、他の成分としてはリグニン等を含む。また、市販のシート状パルプのセルロースＩ型結晶化度は、通常６０％以上である。
セルロース含有原料中の水分含量（粉砕処理直前のセルロース含有原料中の水分含量）は、好ましくは２０質量％以下、より好ましくは１５質量％以下、更に好ましくは１０質量％以下である。セルロース含有原料中の水分含量が２０質量％以下であれば、容易に粉砕できるとともに、後述する粉砕処理により結晶化度を容易に低下させることができ、その後の糖の生産を効率良く行うことができる。
【００１６】
〔粉砕処理〕
本発明では、上述のセルロース含有原料を粉砕機による粉砕処理することで、上述の結晶化度及び／又は比表面積を有するセルロースを得る。粉砕機による粉砕処理を行うことで、効率的に特定の結晶化度及び／又は比表面積を有するセルロースを得ることができる。
粉砕処理で用いる粉砕機としては、糖化効率を高める観点、及びグルコースの生成量を高める観点から、媒体式粉砕機が好ましい。媒体式粉砕機には、容器駆動式粉砕機と媒体撹拌式粉砕機とがある。
【００１７】
容器駆動式粉砕機としては転動ミル、振動ミル、遊星ミル、遠心流動ミル等が挙げられる。これらの中でも、粉砕効率が高く、生産性の向上が図れるとの観点から、振動ミルが好ましく、ロッドを充填した振動ミルがより好ましい。
振動ミルとしては、中央化工機社製の振動ミル、吉田製作所社製の小型振動ロッドミル１０４５型、ドイツのフリッチュ社製の振動カップミルＰ−９型、日陶科学社製の小型振動ミルＮＢ−Ｏ型等が挙げられる。
【００１８】
媒体撹拌式粉砕機としてはタワーミル等の塔型粉砕機；アトライター、アクアマイザー、サンドグラインダー等の撹拌槽型粉砕機；ビスコミル、パールミル等の流通槽型粉砕機；流通管型粉砕機；コボールミル等のアニュラー型粉砕機；連続式のダイナミック型粉砕機等が挙げられる。これらの中でも、粉砕効率が高く、生産性の向上が図れるとの観点から、撹拌槽型粉砕機の媒体攪拌式ミルが好ましい。媒体撹拌式粉砕機を用いる場合の攪拌翼の先端の周速は、好ましくは０．５〜２０ｍ／ｓ、より好ましくは１〜１５ｍ／ｓである。
なお、粉砕機の種類は「化学工学の進歩  第３０集  微粒子制御」（社団法人  化学工学会東海支部編、１９９６年１０月１０日発行、槇書店）を参照することができる。
処理方法としては、バッチ式、連続式のどちらでもよい。
【００１９】
媒体としては、ボール、ロッド、チューブ等が挙げられる。この中で、粉砕効率が高く、生産性の向上が図れるとの観点から、ボール、ロッドが好ましく、処理時間短縮の観点からロッドがより好ましい。媒体の材質としては、特に制限はなく、例えば、鉄、ステンレス、アルミナ、ジルコニア、炭化珪素、チッ化珪素、ガラス等が挙げられる。
【００２０】
媒体として用いるロッドは、棒状の媒体であり、断面が四角形、六角形等の多角形、円形、楕円形等のものを用いることができる。
ロッドの外径は、好ましくは０．５〜２００ｍｍ、より好ましくは１〜１００ｍｍ、更に好ましくは５〜５０ｍｍの範囲である。ロッドの長さは、粉砕機の容器の長さよりも短いものであれば特に限定されない。ロッドの大きさが上記の範囲であれば、所望の粉砕力が得られるとともに、ロッドのかけら等が混入してセルロース含有原料が汚染されることなく本発明で用いるセルロースを得ることができる。
【００２１】
媒体として用いるボールの外径は、好ましくは１〜１００ｍｍ、より好ましくは３〜５０ｍｍ、更に好ましくは６〜３０ｍｍである。ボールの外径が上記の範囲であれば、所望の粉砕力が得られる。
【００２２】
媒体の充填率は、粉砕機の機種により好適な範囲が異なるが、好ましくは１０〜９７％、より好ましくは１５〜９５％の範囲である。充填率がこの範囲内であれば、セルロースと媒体との接触頻度が向上するとともに、媒体の動きを妨げずに、粉砕効率を向上させることができる。ここで充填率とは、粉砕機の容積に対する媒体の見かけの体積をいう。
粉砕機の処理時間としては、粉砕機の種類、媒体の種類、大きさ及び充填率等により一概に決定できないが、結晶化度を低下させる観点から、好ましくは０．０１〜５０ｈｒ、より好ましくは０．０５〜２０ｈｒ、更に好ましくは０．１〜１０ｈｒである。処理温度は、特に制限はないが、熱による劣化を防ぐ観点から、好ましくは５〜２５０℃、より好ましくは１０〜２００℃である。
【００２３】
上記の粉砕処理を経ることで、前記セルロース含有原料から、セルロースＩ型結晶化度が５０％以下及び／又は比表面積が１８０ｍ2／ｇ以上のセルロースを効率良く得ることができる。
得られるセルロースの平均粒径は、このセルロースを工業原料として用いる際の化学反応性及び取扱い性の観点から、好ましくは２５〜１５０μｍ、より好ましくは３０〜１００μｍである。平均粒径が２５μｍ以上であれば、セルロースを水等の液体と接触させたときに「ママコ（ダマ）」になることを抑えることができる。
【００２４】
なお、粉砕機に供給するセルロース含有原料として粉末状の原料を用いる場合、粉砕機中に粉砕原料を効率的に分散させる観点から、該原料の平均粒径が１ｍｍ以下の範囲にあるものが好ましい。この平均粒径が１ｍｍ以下であれば、粉砕機中に供給する際に、粉砕機中に粉砕原料を効率的に分散させることができ、長時間を要することなく所定の粒径に到達することができる。一方、この平均粒径の下限としては、生産性の観点から、０．０３ｍｍ以上が好ましい。これらの観点から、この平均粒径としては、０．０３〜０．７ｍｍがより好ましく、０．０５〜０．５ｍｍが更に好ましい。なお、平均粒径は、レーザー回析／散乱式粒度分布測定装置を用いて、粒径測定前に超音波で１分間処理し、測定時の分散溶媒として水を用い、温度２５℃にて測定した値である。
【００２５】
また、粉砕機に供給するセルロース含有原料としてシート状の原料を用いる場合、粉砕機へセルロース含有原料を投入する際には、予めチップ状に粗粉砕しておくことが好ましい。チップ状にしたセルロース含有原料の大きさとしては、好ましくは１〜５０ｍｍ角、より好ましくは１〜３０ｍｍ角である。当該範囲角のチップ状に粗粉砕することにより、粉砕処理を効率良く容易に行うことができる。
セルロース含有原料をチップ状に粗粉砕する方法としては、シュレッダー又はロータリーカッターを使用する方法が挙げられる。
ロータリーカッターを使用する場合、得られるチップ状セルロース含有原料の大きさは、スクリーンの目開きを変えることにより、制御することができる。スクリーンの目開きは、好ましくは１〜５０ｍｍ、より好ましくは１〜３０ｍｍである。スクリーンの目開きが１ｍｍ以上であれば、セルロース含有原料が綿状化することがなく取扱い性が向上する。スクリーンの目開きが５０ｍｍ以下であれば、後の粉砕機処理に用いるセルロース含有原料として適度な大きさを有するために負荷を低減することができる。
を有するために負荷を低減することができる。
【００２６】
〔アルカリ処理〕
また、本発明の製造方法においては、前記セルロース含有原料を、糖化効率を高める観点、及びグルコースの生成量を高める観点から、後述する糖化処理前にアルカリ処理することが好ましく、前記粉砕処理前にアルカリ処理することがより好ましい。
また、このアルカリ処理は、糖化効率を高める観点、及びグルコースの生成量を高める観点から、アルカリ溶液を用いた浸漬処理であることが好ましい。
【００２７】
浸漬処理におけるアルカリ溶液中のアルカリ化合物の濃度は、糖化効率を高める観点、グルコースの生成量を高める観点から、好ましくは０．１〜６０質量％、より好ましくは０．１〜５０質量％、更に好ましくは０．１〜４０質量％である。
浸漬処理におけるアルカリ溶液の使用量は、原料セルロースの乾燥重量に対して、好ましくは５０〜９９質量％、より好ましくは６０〜９９質量％、更に好ましくは８０〜９９質量％である。
アルカリ処理の処理時間としては、好ましくは０．５〜５０時間、より好ましくは１〜２４時間、更に好ましくは１．５〜１０時間である。
【００２８】
アルカリ処理に用いられるアルカリ化合物としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等のアルカリ金属水酸化物；水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等のアルカリ土類金属水酸化物；酸化ナトリウム、酸化カリウム等のアルカリ金属酸化物；酸化マグネシウム、酸化カルシウム等のアルカリ土類金属酸化物；硫化ナトリウム、硫化カリウム等のアルカリ金属硫化物；硫化マグネシウム、硫化カルシウム等のアルカリ土類金属硫化物等が挙げられる。
これらの中でも、アルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物が好ましく、アルカリ金属水酸化物がより好ましく、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムが更に好ましい。なお、これらのアルカリ化合物は、単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２９】
浸漬処理した後、セルロース含有原料を、アルカリ化合物の除去、糖化効率の向上及びグルコースの生成量向上の観点から、後述の糖化処理前に、酢酸等で中和又は水洗し、凍結乾燥することが好ましい。
【００３０】
〔糖化処理〕
本発明では、上述の粉砕処理をしたセルロースに対し、特定の酵素配合剤を作用させて糖化処理をし、糖を得る。ここで、糖化処理後にエタノール発酵や乳酸発酵に使用する場合等を考慮すると単糖まで分解することが好ましい。
本発明で用いる酵素配合剤は、エンドグルカナーゼを該酵素配合剤の総タンパク質中２０％以上含むものである。このような酵素配合剤を用いることで、従来の酵素配合剤に比べて、糖化処理の効率性を向上させることができ、β−グルコシダーゼ活性を増強する必要がないため、配合の自由度が向上できる。
エンドグルカナーゼの含有量としては、酵素配合剤の総タンパク質中２０％以上であるが、好ましくは２５〜１００％、より好ましくは３３〜９０％、更に好ましくは５０〜９０％である。エンドグルカナーゼの含有量が、酵素配合剤の総タンパク質中２０％未満の場合、エンドグルカナーゼによる働きが十分に発揮されず、糖化効率が劣るため好ましくない。
【００３１】
〔エンドグルカナーゼ〕
エンドグルカナーゼは、セルロースのβ−１，４−グルカンのグリコシド結合を加水分解する酵素であるセルラーゼの一種である。本発明で用いるエンドグルカナーゼとしては、特に制限はないが、セルロースの糖化効率の観点から、Trichoderma属由来のエンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）、エンドグルカナーゼII（ＥＧII）が好ましく、これらの酵素は異種宿主により発現させて用いてもよい。異種宿主により発現させる調製法は、特に制限はないが、例えば実施例記載の方法が挙げられる。
【００３２】
本発明で用いられるエンドグルカナーゼは、市販のセルラーゼ製剤や、動物、植物、微生物由来のセルラーゼを精製したものを用いてもよい。精製方法については、特に制限はないが、例えば、実施例記載の方法が挙げられる。
このような精製対象となるセルラーゼとしては、例えば、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社）等のトリコデルマ  リーゼ（Trichoderma reesei）由来のセルラーゼ製剤やバチルス  エスピー（Bacillus sp.）KSM-N145（FERM P-19727）株由来のセルラーゼ、又はバチルス  エスピー（Bacillus sp.）KSM-N252（FERM P-17474）、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）KSM-N115（FERM P-19726）、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）KSM-N440（FERM P-19728）、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）KSM-N659（FERM P-19730）等の各株由来のセルラーゼ、更にはトリコデルマ  ビリデ（Trichoderma viride）、アスペルギルス  アクレアタス（Aspergillus acleatus）、クロストリジウム  サーモセラム（Clostridium thermocellum）、クロストリジウム  ステルコラリウム（Clostridium stercorarium）、クロストリジウム  ジョスイ（Clostridium josui）セルロモナス  フィミ（Cellulomonas fimi）、アクレモニウム  セルロリティクス（Acremonium cellulolyticus）、イルペックス  ラクテウス（Irpex lacteus）、アスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）、フミコーラ  インソレンス（Humicola insolens）由来のセルラーゼ混合物やパイロコッカス  ホリコシ（Pyrococcus horikoshii）由来の耐熱性セルラーゼ等が挙げられる。これらの中で、好ましくはトリコデルマ  リーゼ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ  ビリデ（Trichoderma viride）、あるいはフミコーラ  インソレンス（Humicola insolens）由来のセルラーゼ、例えばセルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社）、ＴＰ−６０（明治製菓株式会社）、あるいはウルトラフロＬ（ノボザイムズ社）が挙げられる。
【００３３】
〔その他の酵素〕
本発明で用いられる酵素配合剤は、エンドグルカナーゼ以外の酵素を含んでもよい。ただ、糖化処理の効率性を向上させる観点から、更に、セロビオハイドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、β−グルコシダーゼからなる群から選ばれる１種以上の酵素を含むものが好ましい。
また、グルコースを効率的に製造するためには、セロビオハイドロラーゼの作用で生成するセロビオースを分解するβ-グルコシダーゼを添加又は増強する必要があることが知られているが、本発明で用いられる酵素配合剤であれば、β-グルコシダーゼを含まなくても、グルコースを効率的に製造することができる。
セロビオハイドロラーゼは、セルラーゼの一種であり、セルロースを分解し二糖のセロビオースを主に生成する酵素であり、セロビオハイドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）とセロビオハイドロラーゼII（ＣＢＨII）の２種が知られている。
セロビオハイドロラーゼは、エンドグルカナーゼと同じく市販のセルラーゼ製剤や、動物、植物、微生物由来のセルラーゼを精製したものを用いられ、精製方法についても、特に制限はなく、例えば、実施例記載の方法が挙げられる。
【００３４】
ヘミセルラーゼは、ヘミセルロースを分解する酵素であり、キシラナーゼ、マンナナーゼ等が含まれる。
用いるヘミセルラーゼとしては、特に制限はなく、市販の製剤や、動物、植物、微生物由来のものが用いられ、例えば、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）KSM-N546（FERM P-19729）由来のキシナラーゼのほか、アスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）、トリコデルマ  ビリデ（Trichoderma viride）、フミコーラ  インソレンス（Humicola insolens）、バチルス  アルカロフィルス（Bacillus alcalophilus）由来のキシラナーゼ、更にはサーモマイセス（Thermomyces）、オウレオバシジウム（Aureobasidium）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、クロストリジウム（Clostridium）、サーモトガ（Thermotoga）、サーモアスクス（Thermoascus）、カルドセラム（Caldocellum）、サーモモノスポラ（Thermomonospora）属由来のキシラナーゼ等が挙げられる。また上記のセルラーゼ混合物中に含まれるヘミセルラーゼ活性を持つ酵素を利用することもできる。
【００３５】
β−グルコシダーゼは、セルラーゼの一種であり、セロビオースを分解し最終的にグルコースを生成する酵素である。
用いるβ−グルコシダーゼとしては、特に制限はなく、市販の製剤や、動物、植物、微生物由来のものが用いられ、例えば、アスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）由来の酵素（例えば、メガザイム社製β-グルコシダーゼ）やアグロバクテリウム（Agrobacterium）、サーモトガ  マリチマ（Thermotoga maritima）、トリコデルマ  リーゼ（Trichoderma reesei）、ペニシリウム  エメルソニイ（Penicillium emersonii）由来の酵素等が挙げられる。
【００３６】
セルロースを上述の特定の酵素配合剤で糖化処理する際の反応条件は、セルロースの結晶化度、比表面積、分子量、用いる酵素配合剤中の成分により、適宜選択することができる。
糖化処理の際のｐＨとしては、用いる酵素の種類により適当なｐＨを選ぶことが好ましく、好ましくはｐＨ２〜１０、より好ましくはｐＨ３〜７、更に好ましくはｐＨ４〜６、より更に好ましくはｐＨ５付近（ｐＨ４．７〜５．３）である。
糖化処理の処理温度としては、用いる酵素の種類により適当な温度を選ぶことが好ましく、好ましくは１０〜９０℃、より好ましくは２０〜７０℃、更に好ましくは３５〜６０℃、より更に好ましくは４５〜５５℃である。
糖化処理の処理時間としては、好ましくは５〜１６８時間、より好ましくは２４〜１２０時間、更に好ましくは４８〜９６時間である。
【００３７】
エンドグルカナーゼを該酵素配合剤の総タンパク質量中２０％以上含む酵素配合剤を使用し、パルプ由来の結晶化度５０％以下及び／又は比表面積が１８０ｍ2／ｇ以上のセルロースを基質とする場合は、０．５〜２０％（ｗ／ｖ）の基質懸濁液に対して、酵素配合剤をタンパク質０．０００１７〜２．５％（ｗ／ｖ）となる様に添加し、ｐＨ２〜１０（用いる酵素の種類により適当なｐＨを選ぶことが好ましく、セルクラスト１．５Ｌを用いる場合、より好ましくはｐＨ３〜７、更に好ましくはｐＨ４〜６、より更に好ましくはｐＨ５付近（ｐＨ４．７〜５．３））の緩衝液中、反応温度１０〜９０℃（用いる酵素の種類により適当な温度を選ぶことが好ましく、セルクラスト１．５Ｌを用いる場合、より好ましくは２０〜７０℃、更に好ましくは３５〜６０℃、より更に好ましくは４５〜５５℃）の条件下で糖化処理することが、糖を効率良く得る観点から好ましい。
【００３８】
上述した実施形態に関し、本発明は、下記［１］の糖の製造方法を開示する。
［１］下記計算式（１）で示されるセルロースＩ型結晶化度が５０％以下、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、より好ましくは１５％以下、更に好ましくは１０％以下、更に好ましくは分析でＩ型結晶が検出されない０％、及び／又は比表面積が１８０ｍ2／ｇ以上、好ましくは１８０ｍ2／ｇ以上５００ｍ2／ｇ以下、より好ましくは２００ｍ2／ｇ以上５００ｍ2／ｇ以下、より好ましくは２５０ｍ2／ｇ以上５００ｍ2／ｇ以下、より好ましくは２７０ｍ2／ｇ以上５００ｍ2／ｇ以下、更に好ましくは２９０ｍ2／ｇ以上５００ｍ2／ｇ以下であるセルロースを酵素配合剤により糖化処理する糖の製造方法であって、
該酵素配合剤は、エンドグルカナーゼを該酵素配合剤の総タンパク質量中２０％以上、好ましくは２５〜１００％、より好ましくは３３〜９０％、更に好ましくは５０〜９０％含むものであり、該セルロースは、セルロース含有原料を粉砕機による粉砕処理して得る、糖の製造方法。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００    （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、Ｉ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
【００３９】
本発明は、さらに下記〔２〕〜〔１２〕の糖の製造方法であることが好ましい。
［２］前記セルロースの分子量が１３万以下、より好ましくは１０００以上１３万以下、より好ましくは１０００以上１１万以下、より好ましくは１０００以上９万以下、更に好ましくは１０００以上７万以下、更に好ましくは１０００以上５万以下である、上記［１］に記載の糖の製造方法。
［３］前記粉砕機が、媒体式粉砕機である、上記［１］又は［２］に記載の糖の製造方法。
［４］セルロース含有原料を、前記糖化処理前にアルカリ処理する、より好ましくは前記粉砕処理前にアルカリ処理をする、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の糖の製造方法。
［５］前記アルカリ処理が、アルカリ溶液を用いた浸漬処理である、上記［４］に記載の糖の製造方法。
［６］前記エンドグルカナーゼが、Trichoderma属由来のエンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）、エンドグルカナーゼII（ＥＧII）から選ばれる少なくとも１種である、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の糖の製造方法。
［７］前記酵素配合剤が、更に、セロビオハイドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、β−グルコシダーゼからなる群から選ばれる１種以上を含む、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の糖の製造方法。
［８］前記酵素配合剤が、更に、酵素としてセロビオハイドロラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを含み、β−グルコシダーゼを含まない、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の糖の製造方法。
［９］前記糖化処理の処理温度が、１０〜９０℃、より好ましくは２０〜７０℃、更に好ましくは３５〜６０℃、より更に好ましくは４５〜５５℃である、上記［１］〜［８］のいずれかに記載の糖の製造方法。
［１０］前記糖化処理の処理時間が、５〜１６８時間、より好ましくは２４〜１２０時間、更に好ましくは４８〜９６時間である、上記［１］〜［９］のいずれかに記載の糖の製造方法。
［１１］前記セルロース含有原料が、パルプ類、紙類、植物茎・葉・果房類、植物殻類、及び木材類からなる群から選ばれる少なくとも１種である、上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の糖の製造方法。
［１２］前記セルロース含有原料における、該原料から水を除いた残余の成分中のセルロース含有量が、２０質量％以上、より好ましくは２０質量％以上９９質量％以下、更に好ましくは４０質量％以上９９質量％以下、より更に好ましくは６０質量％以上９９質量％以下である、上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の糖の製造方法。
【００４０】
本発明は、さらに下記［１３］のグルコースの生成量を増加させる方法を開示する。
［１３］下記計算式（１）で示されるセルロースＩ型結晶化度が５０％以下、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、より好ましくは１５％以下、更に好ましくは１０％以下、更に好ましくは分析でＩ型結晶が検出されない０％、及び／又は比表面積が１８０ｍ2／ｇ以上、好ましくは１８０ｍ2／ｇ以上５００ｍ2／ｇ以下、より好ましくは２００ｍ2／ｇ以上５００ｍ2／ｇ以下、より好ましくは２５０ｍ2／ｇ以上５００ｍ2／ｇ以下、より好ましくは２７０ｍ2／ｇ以上５００ｍ2／ｇ以下、更に好ましくは２９０ｍ2／ｇ以上５００ｍ2／ｇ以下であるセルロースを酵素配合剤により糖化処理するグルコースの生成量を増加させる方法であって、
該酵素配合剤は、エンドグルカナーゼを該酵素配合剤の総タンパク質量中２０％以上、好ましくは２５〜１００％、より好ましくは３３〜９０％、更に好ましくは５０〜９０％含むものであり、該セルロースは、セルロース含有原料を粉砕機による粉砕処理して得る、グルコースの生成量を増加させる方法。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００    （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、Ｉ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
【実施例】
【００４１】
機械的に処理したセルロース含有原料のＸ線回折強度、水分含量、比表面積、平均分子量、及びセルロース含有量の測定は、下記に記載の方法により行った。また、粉砕パルプ又は粉末パルプ等の各種セルロースの糖化反応は、下記に記載の条件により行った。
（１）Ｘ線回折強度の測定
Ｘ線回折強度は、リガク社製の「Rigaku RINT 2500VC X-RAY diffractometer」を用いて以下の条件で測定し、上記計算式（１）に基づいてセルロースＩ型結晶化度を算出した。
測定条件は、Ｘ線源：Ｃｕ／Ｋα−ｒａｄｉａｔｉｏｎ，管電圧：４０ｋｖ，管電流：１２０ｍＡ，測定範囲：２θ＝５〜４５°で測定した。測定用サンプルは面積３２０ｍｍ２×厚さ１ｍｍのペレットを圧縮し作製した。Ｘ線のスキャンスピードは１０°／ｍｉｎで測定した。
（２）水分含量の測定
水分含量は、赤外線水分計（ケット科学研究所社製、「ＦＤ−６１０」）を使用し、１５０℃にて測定を行った。
（３）比表面積の測定
セルロースの比表面積を、水蒸気吸着法により測定した。原料を８０℃で８時間、真空脱気を行い、吸着温度：２９８．１５Ｋ、飽和蒸気圧：３．１６９ｋｐａ、吸着質：純粋、吸着質断面積：０．１２５ｎｍ2の条件で、水蒸気による吸着等温線を測定した。比表面積は、ＢＥＴ法により算出した。
（４）平均分子量の測定
セルロースの重合度を、ＩＳＯ−４３１２法に記載の銅アンモニア法により測定した。そして、このセルロースの重合度にグルコースの分子量１６２を乗じたものを、セルロースの平均分子量とした。
（５）セルロース含有量の測定
原料をエタノール・ベンゼン混合溶剤（１：１）で６時間ソックスレー抽出を行い、更にエタノールで４時間ソックスレー抽出行って、抽出後のサンプルを６０℃で真空乾燥した。得られた試料２．５gに水１５０ｍＬ、亜塩素酸ナトリウム１．０ｇ及び酢酸０．２ｍＬを加え、７０〜８０℃で１時間加温した。引き続き亜塩素酸ナトリウム及び酢酸を加えて加温する操作を繰り返し行い、試料が白く脱色するまで３〜４回処理を繰り返した。白色の残渣をグラスフィルター（１Ｇ−３）でろ過し、冷水及びアセトンで洗浄した後、１０５℃で恒量になるまで乾燥し、残渣重量を求め、下記式によりセルロース含有量（セルロース含有原料から水を除いた残余の成分中のセルロース含有量）を算出した。
セルロース含有量（質量％）＝［残渣重量（ｇ）／２．５ｇの脱脂試料に相当する原料の乾燥重量（ｇ）］×１００【００４２】
（６）糖化反応
０．０５ｇの粉末パルプ又は粉砕パルプ等の各種セルロース基質を１ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、蓋つきスクリュー管（No.5、φ27×55ｍｍ、マルエム社）に懸濁し、適量の酵素を加えて５０℃で振とう攪拌（１５０ｒｐｍ、タイテック社製恒温振とう機「ＢＲ−１５ＣＦ」）しながら、所定の時間で反応させた。反応終了後、遠心分離（１７，０００×ｇ、５分間）によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量を、以下に示すＨＰＬＣ法によって定量した。
（７）ＨＰＬＣ法による糖の定量
Dionex社のDX500クロマトグラフィーシステム；カラム：CarboPac PA1（Dionex社  ４×２５０ｍｍ）、検出器：ED40パルスドアンペロメトリー検出器、溶離液：Ａ液；１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、Ｂ液；１Ｍ酢酸ナトリウムを含む１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、Ｃ液；超純水を用いた。注入から初期濃度Ａ液１０％：Ｃ液９０％、０〜１５分Ａ液９５％：Ｂ液５％のリニアグラジエントにより糖を分析した。標準として０．０１％（ｗ／ｖ）のグルコース（和光純薬工業社製）、キシロース（和光純薬工業社製）、キシロビオース（和光純薬工業社製）、セロビオース（生化学工業社製）を用いた。
（８）タンパク質の定量
ＤＣプロテインアッセイキット（Bio Rad社製）を使用し、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質とした検量線よりタンパク質量を計算した。
（９）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５，１９７０）らの方法に従い、レディーゲルＪ-１２．５％（バイオラッド社製）を用いて、２０ｍＡ／ゲルで約９０分間電気泳動を行った。マーカーはＳＤＳ−ＰＡＧＥスタンダードＬｏｗ（バイオラッド社製）を、泳動後の染色はＢｉｏ−Ｓａｆｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（バイオラッド社製）を用いた。
（１０）精製又は調製酵素の確認
セルクラスト１．５Ｌより精製したセロビオハイドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）、エンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）、エンドグルカナーゼII（ＥＧII）、セロビオハイドロラーゼII（ＣＢＨII）及び異種発現ＥＧＩは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ａｕ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｐｒｏｔ／）に記載のそれぞれの酵素（Endoglucanase EG-1（P07981）、ＥＧ２：Endoglucanase EG-II（P07982）、ＣＢＨ１：Exoglucanase 1（P62694）、ＣＢＨ２：Exoglucanase 2（P07987））の分子量及び部分アミノ酸配列と比較することにより確認した。【００４３】
実施例及び比較例で用いた各種タンパク質は、以下のように精製及び調製して得た。なお、以下の記載において、特に断りがない限り、和光純薬工業社製のものを用いた。
（１）セロビオハイドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）の精製
以下の操作は１０℃以下で行った。セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）を脱イオン水で２倍に希釈した後、脱塩カラムEcono-Pac 10DGカラム（バイオラッド社製）を用いて、１０ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ５．０)に置換を行った。得られた酵素溶液１００ｍＬを、予め１０ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ５．０)で平衡化した陰イオン交換体（ａ）SuperQトヨパール650M（φ2.5ｃｍ×25ｃｍ、東ソー社製）に供し、２５０ｍＬの同緩衝液でカラム内を洗浄後、０〜０．３Ｍの塩化ナトリウム２０００ｍＬによる直線濃度勾配溶出を行った。
陰イオン交換体（ａ）に吸着した吸着画分を、ＵＦ膜（PBCC  分画分子量：５０００、ミリポア社製）により、１９ｍＬに濃縮した。濃縮した吸着画分３ｍＬを、「セファクリルS200HR（φ2.5ｃｍ×100ｃｍ、ＧＥサイエンス社製）」を用いてゲルろ過を行った。溶出画分について、SDS-PAGEでほぼ単一であることを確認できたパス画分を、ＵＦ膜を用いて濃縮し、脱塩カラムにて１０ｍＭクエン酸緩衝液(ｐＨ５．０)に置換し、セロビオハイドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）を得た。【００４４】
（２）エンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）の精製
上記陰イオン交換体（ａ）を素通りしたパス画分を、ＵＦ膜を用いて５０ｍＬに濃縮し、続いて１０ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ５．０)にて平衡化した陽イオン交換体（ｂ）SPトヨパール650M（φ2.5ｃｍ×26ｃｍ、東ソー社製）に供した。３００ｍＬの同緩衝液でカラム内を洗浄後、０〜０．３Ｍの塩化ナトリウム１５００ｍＬによる直線濃度勾配溶出を行った。
陽イオン交換体（ｂ）を素通りしたパス画分を、ＵＦ膜を用いて濃縮した後、脱塩カラムを用いて、２０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液(ｐＨ７．８)に置換した。このパス画分４０ｍＬを同緩衝液で平衡化した陰イオン交換体（ｃ）SuperQトヨパール650M（φ2.5ｃｍ×25ｃｍ）に供し、２５０ｍＬの同緩衝液でカラム内を洗浄後、０〜０．３Ｍの塩化ナトリウム２０００ｍＬによる直線濃度勾配溶出を行った。
陰イオン交換体（ｃ）に吸着した吸着画分をプールし、ＵＦ膜にて１２ｍＬに濃縮を行った。濃縮した吸着画分１２ｍＬを、「セファクリルS200HR（φ2.5ｃｍ×100ｃｍ、ＧＥサイエンス社製）」を用いて、ゲルろ過を行った。溶出画分について、SDS-PAGEでほぼ単一であることを確認できた画分を、ＵＦ膜を用いて濃縮し、脱塩カラムにて１０ｍＭクエン酸緩衝液(ｐＨ５．０)に置換し、エンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）を得た。【００４５】
（３）エンドグルカナーゼII（ＥＧII）の精製
上記陰イオン交換カラム（ｃ）を素通りしたパス画分を、ＵＦ膜にて濃縮後、脱塩カラムにて１０ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ４．５)に置換した。このパス画分１６ｍＬを、同緩衝液にて平衡化した陽イオン交換体（ｄ）SPトヨパール650M（φ2.5ｃｍ×26ｃｍ）に供し、３００ｍＬの同緩衝液でカラム内を洗浄後、０〜０．１Ｍの塩化ナトリウム１０００ｍＬによる直線濃度勾配溶出を行った。溶出画分について、SDS-PAGEにてほぼ単一であることを確認できたパス画分を、ＵＦ膜にて濃縮し、脱塩カラムにて１０ｍＭクエン酸緩衝液(ｐＨ５．０)に置換し、エンドグルカナーゼII（ＥＧII）を得た。【００４６】
（４）セロビオハイドロラーゼII（ＣＢＨII）の精製
上記陽イオン交換カラム（ｄ）に吸着した吸着画分を、ＵＦ膜にて濃縮し、脱塩カラムにて１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に置換し、セロビオハイドロラーゼII（ＣＢＨII）を得た。【００４７】
上記のセルクラスト１．５Ｌの総タンパク質量中、ＣＢＨＩは７０％、ＣＢＨIIは１１％、ＥＧＩは４％、ＥＧIIは５％であった。【００４８】
（５）異種発現エンドグルカナーゼＩ（異種発現ＥＧＩ）の調製
以下の手順により、異種発現ＥＧＩを調製した。
〔Trichoderma reesei cDNAの合成〕
Trichoderma reesei QM9414(NBRC31329)をＰＤＡ寒天培地で２８℃、７日間培養して胞子を十分形成させた。その胞子の１白金耳を、液体培地［０．５０％（ｗ／ｖ）ＫＣフロック（日本製紙ケミカル社製）、０．１４％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム、０．０３％（ｗ／ｖ）尿素、０．２５（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ（日本製薬社製）、０．２０（ｗ／ｖ）リン酸一カリウム、０．０３％（ｗ／ｖ）塩化カルシウム・二水和物、０．０３％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・七水和物、５．０ｐｐｍ硫化鉄・七水和物、１．６ｐｐｍ硫酸マンガン・五水和物、１．６ｐｐｍ硫酸亜鉛・七水和物、２．０ｐｐｍ塩化コバルト・六水和物）］５０ｍＬを含む５００ｍＬ容ひだ付き三角フラスコに接種して、２８℃、１６０ｒｐｍで６日間振とう培養した。
培養終了後、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）によって得られた菌体から、TRIzol（登録商標） Reagent（invitrogen社製）を用いて、プロトコールに従いtotal RNAを分離した。得られたtotal RNAから、cDNA Synthesis Kit (M-MLV Version) (TaKaRa社製)を用いて、プロトコールに従いTrichoderma reesei cDNAを合成した。【００４９】
〔EGＩ遺伝子断片の取得〕
得られたcDNAを鋳型として、swissprotデータベースに公開されているT. reesei (Taxonomy ID:51453)のエンドグルカナーゼＩ遺伝子配列を元に設計したプライマー[フォワードプライマー（atggcgccctcagttacactgccg）、リバースプライマー（ttaaaggcattgcgagtagtagtcgtt）]を用いてＰＣＲを行った。
具体的には、鋳型cDNA０．５μＬ、５０μＭフォワードプライマー０．５μＬ、５０μＭリバースプライマー０．５μＬ、PrimeSTAR（登録商標） Max DNA Polymerase(TaKaRa社製)２５μＬ、滅菌脱イオン水２３．５μＬを混合した後、DNA Engine PTC-200（MJ Japan製）によりＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、７２℃で８秒間を１サイクルとして３０サイクル反応させ、増幅した遺伝子断片をHigh Pure PCR Product Purification kit（Roche社製）にて精製した。【００５０】
〔EGＩ遺伝子とamyBプロモーター及びターミネーターの連結化〕
得られたEGＩ遺伝子とA. oryzae由来α-アミラーゼ遺伝子（amyB）由来のプロモーター及びターミネーター領域の各PCR断片を鋳型DNAとして、amyBプロモーター領域を元に設計したフォワードプライマー（配列番号１：gtgaattcgagctcggtaccattacgcactacccgaatcg）及びamyBターミネーター領域を元に設計したリバースプライマー（配列番号２：tgattacgccaagcttgagttgtacctagaggagac）を用いてＰＣＲを行った。
具体的には、各ＰＣＲ断片３．０μＬ、５０μＭフォワードプライマー０．４μＬ、５０μＭリバースプライマー０．４μＬ、PrimeSTAR（登録商標） Max DNA Polymerase(TaKaRa社製)２５μＬ、滅菌脱イオン水１５．２μＬを混合した後、GeneAmp PCR System 9700（PE Applied Biosystems社製）でＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、７２℃で２０秒間を１サイクルとして３０サイクル反応させ、増幅した遺伝子断片をHigh Pure PCR Product Purification kit（Roche社製）にて精製した。【００５１】
〔プラスミドの構築と大量調製〕
pPTRIベクター（TaKaRa社製）を含む溶液に、Hind III及びKpn Iを添加し、３７℃で一晩制限酵素反応を行った。７０℃で１５分間制限酵素の失活処理を行った後、High Pure PCR Product Purification kit（Roche社製）にて精製した。線状化したpPTRIベクターに対して、連結化したＥＧＩ断片を３倍量（モル比）加えて混合し、In-FusionTM  Advantage PCR Cloning Kit（Clontech社製）を用いてIn-fusion反応（３７℃で１５分間、５０℃で１５分間）を行った。反応終了液（総量１０μＬ）にＴＥバッファー（ｐＨ８．０）で４０μＬ添加した。この混合液３μＬに大腸菌コンピテントセルDH5α株（TOYOBO社製）５０μＬを加えて形質転換を行い、X-gal及びIPTGを添加したＬＢ寒天培地（１００ｐｐｍアンピシリン含有）に塗沫した後、３７℃で１８時間培養を行った。生育したコロニーのうち白色コロニーを釣菌し、Quick TaqTM HS DyeMix（TOYOBO）を用いてコロニーダイレクトＰＣＲによるプラスミドのインサートチェックを行った。アガロース電気泳動解析により、目的のインサートサイズのバンドを確認できた形質転換コロニーを、１００ｐｐｍアンピシリン含有ＬＢ液体培地に植菌し、坂口フラスコを用いて一晩振とう培養（３７℃、１２０ｒｐｍ）を行った。この培養液を遠心（６０００×ｇ、４℃、１５分間）して菌体を回収した後、QIAfilter Plasmid Midi Kit（QIAGEN社製）を用いてプラスミドの抽出及び精製を行った。【００５２】
〔A. oryzaeの形質転換〕
形質転換用宿主として、A. oryzae RIB40株（正式名称：Aspergillus oryzae (Ahlburg) Cohn var brunneus Murakami）をNITEより購入（NBRC100959）したものを用いた。本株をＰＤＡ寒天平板培地上で、２５℃、７日間復元培養した後、ＰＤＡスラント培地上で、２５℃、７日間継代培養したものを冷蔵保存し、形質転換用の宿主として用いた。A. oryzae RIB40株を宿主に用いて、構築したプラスミドによる形質転換を行い、０．２ｐｐｍピリチアミンを含有する再生用ＣＤ寒天培地を用いて、３０℃、７日間培養した。ＣＤ寒天培地上に生育してきた形質転換コロニーを、ＣＤ寒天培地で２回、３０℃、７日間継代培養した。【００５３】
〔A. oryzae形質転換株の液体培養〕
A. oryzae形質転換株を白金耳でＣＤ寒天培地上に接種し、３０℃で５〜７日間培養した後、胞子懸濁液を調製した。ヘマチトメーター（トーマ血球計算盤）を用いて胞子濃度を計測した後、約５×１０5個の胞子を５０ｍＬの液体培地［５％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ（日本製薬社製）、２．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス（Difco社製）、０．５％（ｗ／ｖ）リン酸一カリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・七水和物、１０％（ｗ／ｖ）マルトース）に接種し、５００ｍＬ容バッフル付きフラスコを用いて、培養温度３０℃、回転数１５０ｒｐｍで約５日間振とう培養を行った。このようにして、最終的に７００ｍＬ分の培養液を調製した。【００５４】
〔培養液からの異種発現ＥＧＩの精製〕
フィルターろ過（ポアサイズ０．４５μｍ、NALGENE社製）した培養液７００ｍＬを平膜（Polyethersulfone、76mm、30,000cutoff、ミリポア社製）で２００ｍＬに濃縮し、さらに、遠心式フィルターAmicon Ultra（30,000cutoff、ミリポア社製）で１５ｍＬに濃縮した。この濃縮液１５ｍＬを、脱塩カラムEcono-Pac 10DGカラム（バイオラッド社製）を用いて、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に置換した。得られた酵素溶液のうち５ｍＬを、予め１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した陰イオン交換体DEAE-650M（φ1.46ｃｍ×3ｃｍ、東ソー社製）に供し、１５ｍＬの同緩衝液でカラム内を洗浄後、０〜０．５Ｍの塩化ナトリウム４０ｍＬによる直線濃度勾配溶出を行った。陰イオン交換体を素通りしたパス画分を、脱塩カラムにて１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に置換し、異種発現エンドグルカナーゼＩ（異種発現ＥＧＩ）を得た。【００５５】
製造例１〜６
〔シュレッダー処理〕
シート状木材パルプ（Borregard社製、「Blue Bear Ultra Ether」、８００ｍｍ×６００ｍｍ×１．５ｍｍ、セルロース含有量９６質量％、水分含量７質量％）、をシュレッダー（明光商会社製、「ＭＳＸ２０００−ＩＶＰ４４０Ｆ」）にかけ、約１０ｍｍ×５ｍｍ×１．５ｍｍのチップ状パルプにした。【００５６】
〔振動ミル処理〕
得られたチップ状パルプを振動ミル（中央化工機社製、「ＭＢ−１」、容器全容量３．５Ｌ）に１００ｇ投入し、ロッドとして、直径３０ｍｍ、長さ２１８ｍｍ、材質ステンレス、断面形状が円形のロッド１３本を振動ミルに充填（充填率５７％）して、振幅８ｍｍ、円回転１２００ｃｐｍの条件で、０．５〜８時間処理を行い、パルプＡ〜Ｆを得た。得られたパルプの結晶化度、比表面積、分子量を表１に示す。【００５７】
比較製造例１
製造例１〜６と同様にして得たチップ状パルプを、二軸押出機（スエヒロＥＰＭ社製、「ＥＡ−２０」）に２ｋｇ／ｈｒで投入し、せん断速度６６０ｓｅｃ-1、スクリュー回転数３００ｒｐｍ、外部から冷却水を流しながら、１パス処理した。なお、前記二軸押出機は、完全噛み合い型同方向回転二軸押出機であり、２列に配置されたスクリューは、スクリュー径４０ｍｍのスクリュー部と、互い違い（９０°）に１２ブロックを組み合わせたニーディングディスク部とを有し、２本のスクリューは、同じ構成を有するものである。得られたパルプＧの結晶化度、比表面積、分子量を表1に示す。【００５８】
【表１】
2012077684.tif 000002
【００５９】
製造例７
粉末パルプ（日本製紙ケミカル社製「Ｗ−４００Ｇ」、４００メッシュパス９０以上、セルロース含有量９９質量％、水分含量１質量％）（パルプＨ）を媒体撹拌式ミル（アトライタ、三井鉱山（株）製、「ＭＡ１Ｄ−Ｘ」、容器全容量：５．５Ｌ）に５００ｇ投入し、媒体として、直径１０ｍｍ、材質ジルコニア、ジルコニアボール：１１ｋｇをアトライタに充填（充填率５９％）して、回転数３０７ｒｐｍの条件で、２時間処理を行い、パルプＩを得た。粉砕前のパルプＨ、粉砕後のパルプＩの結晶化度、比表面積、分子量を表２に示す。【００６０】
【表２】
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【００６１】
実施例１〜６
製造例１〜６で得られたパルプＡ〜Ｆに対し、エンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）からなる酵素標品による糖化反応を行った。具体的には、パルプＡ〜Ｆ０．０５ｇを１ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、タンパク質０．００５％（ｗ／ｖ）相当の酵素標品）に懸濁し、５０℃で振とう攪拌しながら反応時間５時間、２４時間、４８時間及び７０時間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離したグルコース量をＨＰＬＣ法によって定量した。結果を表３に示す。【００６２】
比較例１〜３
比較製造例１で得られたパルプＧに対し、それぞれセルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）、セロビオハイドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）、及びエンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）からなる酵素標品による糖化反応を、実施例１〜６と同じ方法で行い、反応終了後のグルコース量を定量した。結果を表３に示す。【００６３】
比較例４〜１５
製造例１で得られたパルプＡ〜Ｆに対して、それぞれセルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）、及びセロビオハイドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ））からなる酵素標品による糖化反応を、実施例１〜６と同じ方法で行い、反応終了後のグルコース量を定量した。結果を表３に示す。【００６４】
【表３】
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【００６５】
実施例７〜９
製造例３で得られたパルプＣに対し、それぞれエンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）、エンドグルカナーゼII（ＥＧII）、及び異種発現エンドグルカナーゼＩ（異種発現ＥＧＩ）からなる酵素標品による糖化反応を行った。具体的には、パルプＣ０．０５ｇを１ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、タンパク質０．００５％（ｗ／ｖ）相当の酵素標品）に懸濁し、５０℃で振とう攪拌しながら反応時間５時間、２４時間、４８時間及び７２時間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離したグルコース量をＨＰＬＣ法によって定量した。結果を表４に示す。【００６６】
比較例１６〜１８
製造例３で得られたパルプＣに対して、それぞれセルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）、セロビオハイドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）、及びセロビオハイドロラーゼII（ＣＢＨII）からなる酵素標品による糖化反応を、実施例７〜９と同じ方法で行い、反応終了後のグルコース量を定量した。結果を表４に示す。【００６７】
【表４】
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【００６８】
実施例１０〜１５
製造例４で得られたパルプＤに対し、エンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）とセルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）を組み合わせた酵素標品による糖化反応を行った。具体的には、パルプＤ０．０５ｇを１ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、タンパク質０．００１２５〜０．００４１７％（ｗ／ｖ）相当のＥＧＩ及びタンパク質０．０００８３〜０．００３７５％（ｗ／ｖ）相当のセルクラスト１．５Ｌ）に懸濁し、５０℃で振とう攪拌しながら反応時間６時間、２４時間、４８時間及び７２時間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離したグルコース量をＨＰＬＣ法によって定量した。結果を表５に示す。【００６９】
実施例１６〜２１
製造例４で得られたパルプＤに対し、エンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）とセロビオハイドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）を組み合わせた酵素標品による糖化反応を行った。具体的には、パルプＤ０．０５ｇを１ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、タンパク質０．００１２５〜０．００４１７％（ｗ／ｖ）相当のＥＧＩ及びタンパク質０．０００８３〜０．００３７５％（ｗ／ｖ）相当のＣＢＨＩ）に懸濁し、５０℃で振とう攪拌しながら反応時間６時間、２４時間、４８時間及び７２時間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離したグルコース量をＨＰＬＣ法によって定量した。結果を表５に示す。【００７０】
実施例２２〜２７
製造例４で得られたパルプＤに対し、異種発現エンドグルカナーゼＩ（異種発現ＥＧＩ）とセルクラスト１．５Ｌ(ノボザイムズ製）を組み合わせた酵素標品による糖化反応を行った。具体的には、パルプＤ０．０５ｇを１ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、タンパク質０．００１２５〜０．００４５％（ｗ／ｖ）相当の異種発現ＥＧＩ及びタンパク質０．０００５〜０．００３７５％（ｗ／ｖ）相当のセルクラスト１．５Ｌ）に懸濁し、５０℃で振とう攪拌しながら反応時間６時間、２４時間、４８時間及び７２時間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離したグルコース量をＨＰＬＣ法によって定量した。結果を表５に示す。【００７１】
実施例２８〜３３
製造例４で得られたパルプＤに対し、異種発現エンドグルカナーゼＩ（異種発現ＥＧＩ）とセロビオハイドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）を組み合わせた酵素標品による糖化反応を行った。具体的には、パルプＤ０．０５ｇを１ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、タンパク質０．００１２５〜０．００４５％（ｗ／ｖ）相当の異種発現ＥＧＩ及びタンパク質０．０００５〜０．００３７５％（ｗ／ｖ）相当のＣＢＨＩ）に懸濁し、５０℃で振とう攪拌しながら反応時間６時間、２４時間、４８時間及び７２時間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離したグルコース量をＨＰＬＣ法によって定量した。結果を表５に示す。【００７２】
比較例１９〜２０
製造例４で得られたパルプＤに対し、それぞれセルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）、及びセロビオハイドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）からなる酵素標品による糖化反応を行った。具体的には、パルプＤ０．０５ｇを１ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、タンパク質０．００５％（ｗ／ｖ）相当の酵素標品）に懸濁し、５０℃で振とう攪拌しながら反応時間６時間、２４時間、４８時間及び７２時間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離したグルコース量をＨＰＬＣ法によって定量した。結果を表５に示す。【００７３】
【表５】
2012077684.tif 000006
【００７４】
実施例３４
製造例４で得られたパルプＤに対し、エンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）、及びキシラナーゼＭ１（ＸＹＮ、メガザイムズ社製）の組み合わせよりなる酵素標品による糖化反応を行った。具体的には、パルプＤ０．０５ｇを１ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、タンパク質０．００１１３％（ｗ／ｖ）相当のＥＧＩ、タンパク質０．００３３８％（ｗ／ｖ）相当のセルクラスト１．５Ｌ及びタンパク質０．０００５％（ｗ／ｖ）相当のＸＹＮ）に懸濁し、５０℃で振とう攪拌しながら反応時間６時間、２４時間、４８時間及び７２時間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離したグルコース量をＨＰＬＣ法によって定量した。【００７５】
実施例３５
製造例４で得られたパルプＤに対し、エンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）、セロビオハイドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）、及びキシラナーゼＭ１（ＸＹＮ、メガザイムズ社製）の組み合わせよりなる酵素標品による糖化反応を行った。具体的には、パルプＤ０．０５ｇを１ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、タンパク質０．００３６％（ｗ／ｖ）相当のＥＧＩ、タンパク質０．０００９％（ｗ／ｖ）相当のＣＢＨＩ及びタンパク質０．０００５％（ｗ／ｖ）相当のＸＹＮ）に懸濁し、５０℃で振とう攪拌しながら反応時間６時間、２４時間、４８時間及び７２時間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離したグルコース量をＨＰＬＣ法によって定量した。結果を表６に示す。【００７６】
実施例３６
製造例４で得られたパルプＤに対し、エンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）及びキシラナーゼＭ１（ＸＹＮ、メガザイムズ社製）の組み合わせよりなる酵素標品による糖化反応を行った。具体的には、パルプＤ０．０５ｇを１ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、タンパク質０．００４５％（ｗ／ｖ）相当のＥＧＩ及びタンパク質０．０００５％（ｗ／ｖ）相当のＸＹＮ）に懸濁し、５０℃で振とう攪拌しながら反応時間６時間、２４時間、４８時間及び７２時間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離したグルコース量をＨＰＬＣ法によって定量した。結果を表６に示す。【００７７】
比較例２１〜２３
製造例４で得られたパルプＤに対し、それぞれセルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）、セロビオハイドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）、及びキシラナーゼＭ１（ＸＹＮ、メガザイムズ社製）からなる酵素標品による糖化反応を行った。具体的には、パルプＤ０．０５ｇを１ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、タンパク質０．００５％（ｗ／ｖ）相当の酵素標品）に懸濁し、５０℃で振とう攪拌しながら反応時間６時間、２４時間、４８時間及び７２時間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離したグルコース量をＨＰＬＣ法によって定量した。結果を表６に示す。【００７８】
【表６】
2012077684.tif 000007
【００７９】
実施例３７〜３９
製造例７で得られたパルプＩに対し、エンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）及びセロビオハイドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）の組み合わせよりなる酵素標品による糖化反応を行った。具体的には、パルプＩ０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、タンパク質０．０２５〜０．０７５％（ｗ／ｖ）相当のＥＧＩ及びタンパク質０．０２５〜０．０７５％（ｗ／ｖ）相当のＣＢＨＩ）に懸濁し、５０℃で振とう攪拌しながら反応時間９４時間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離したグルコース量をＨＰＬＣ法によって定量した。結果を表７に示す。【００８０】
比較例２４
粉砕前のパルプＨに対し、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）からなる酵素標品による糖化反応を行った。具体的には、パルプＨ０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、タンパク質０．１％（ｗ／ｖ）相当のセルクラスト１．５Ｌ）に懸濁し、５０℃で振とう攪拌しながら反応時間９４時間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離したグルコース量をＨＰＬＣ法によって定量した。結果を表７に示す。【００８１】
比較例２５〜２７
パルプＩの代わりに、粉砕前のパルプＨを用いた以外は、実施例３７〜３９と同様にして、酵素反応を行い、反応終了後にグルコース量を定量した。結果を表７に示す。【００８２】
比較例２８
パルプＨの代わりに、製造例７で得られたパルプＩを用いた以外は、比較例２６と同様にして、酵素反応を行い、反応終了後にグルコース量を定量した。結果を表７に示す。【００８３】
【表７】
2012077684.tif 000008
【００８４】
実施例４０
製造例７で得られたパルプＩに対し、エンドグルカナーゼII（ＥＧII）及びセロビオハイドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）の組み合わせよりなる酵素標品による糖化反応を行った。具体的には、パルプＩ０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、タンパク質０．０１２５％（ｗ／ｖ）相当のＥＧII及びタンパク質０．０１２５％（ｗ／ｖ）相当のＣＢＨＩ）に懸濁し、５０℃で振とう攪拌しながら反応時間６時間、２４時間、４８時間及び７２時間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離したグルコース量をＨＰＬＣ法によって定量した。結果を表８に示す。【００８５】
比較例２９
製造例７で得られたパルプＩに対し、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）からなる酵素標品による糖化反応を行った。具体的には、パルプＩ０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、タンパク質０．０２５％（ｗ／ｖ）相当のセルクラスト１．５Ｌ）に懸濁し、５０℃で振とう攪拌しながら反応時間６時間、２４時間、４８時間及び７２時間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離したグルコース量をＨＰＬＣ法によって定量した。結果を表８に示す。【００８６】
【表８】
2012077684.tif 000009
【００８７】
実施例４１〜４４
製造例４で得られたパルプＤに対し、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）、エンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）、セロビオハイドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）及びキシラナーゼＭ１（ＸＹＮ、メガザイムズ社製）の組み合わせよりなる酵素標品による糖化反応を行った。具体的には、パルプＤ０．０５ｇを１ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、タンパク質０．００３３８〜０．００３７５％（ｗ／ｖ）相当のセルクラスト１．５Ｌ、タンパク質０．００１１３〜０．００３６％（ｗ／ｖ）相当のＥＧＩ、タンパク質０．０００９％（ｗ／ｖ）相当のＣＢＨＩ及びタンパク質０．０００５％（ｗ／ｖ）相当のＸＹＮ）に懸濁し、５０℃で振とう攪拌しながら反応時間１６８時間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した糖量（グルコース、セロビオース、キシロース及びキシロビオースの合計量）をＨＰＬＣ法によって定量した。結果を表９に示す。【００８８】
比較例３０
製造例４で得られたパルプＤに対し、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）からなる酵素標品による糖化反応を行った。具体的には、粉砕パルプ０．０５ｇを１ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、タンパク質０．００５％（ｗ／ｖ）相当のセルクラスト１．５Ｌ）に懸濁し、５０℃で振とう攪拌しながら反応時間１６８時間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した糖量（グルコース、セロビオース、キシロース及びキシロビオースの合計量）をＨＰＬＣ法によって定量した。結果を表９に示す。【００８９】
【表９】
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【００９０】
製造例８
〔アルカリ処理〕
１ｇのサトウキビバガス（セルロース含有量７１．３質量％、水分含量５０質量％）を１００ｍｌの５Ｎ水酸化ナトリウム中で３時間撹拌した。酢酸にて中和後、３回水洗し、凍結乾燥を行い、凍結乾燥物を得た。
〔振動ミル処理〕
得られた凍結乾燥物を振動ミル（中央化工機社製、「ＭＢ−１」、容器全容量３．５Ｌ）に１００ｇ投入し、ロッドとして、直径３０ｍｍ、長さ２１８ｍｍ、材質ステンレス、断面形状が円形のロッド１３本を振動ミルに充填（充填率５７％）して、振幅８ｍｍ、円回転１２００ｃｐｍの条件で、１時間処理を行い、バガスａを得た。得られたバガスａの結晶化度は０％であった。【００９１】
実施例４５、比較例３１、３２
製造例８で得られたバガスａに対し、それぞれエンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）、及びセロビオハドロラーゼ（ＣＢＨＩ）からなる酵素標品による糖化処理を行った。具体的には、バガスａ０．５ｇを１ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、タンパク質０．００５％（ｗ／ｖ）相当の酵素標品）に懸濁し、５０℃で振とう撹拌しながら反応時間１時間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離機によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離したグルコース量をＨＰＬＣ法によって定量した。結果を表１０に示す。【００９２】
【表１０】
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【００９３】
以上のとおり、実施例の糖の製造方法によれば、比較例の方法に比べて、糖を効率良く生産することができることが分かる。特に、グルコースの生成量が顕著に増加していることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明の糖の製造方法は、生産性に優れ、糖（特にグルコース）を効率的に得ることができる。得られた糖はエタノールや乳酸等の発酵生産等に有用である。
【配列表】
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【国際調査報告】
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