(57)【要約】  簡略な設備と手順でありながら膵疾患を高感度で検査する。被検体から採取された膵液および／または膵液を含む体液に含まれるＳ１００Ｐの濃度を免疫クロマトグラフィ法によって測定する膵臓検査方法を提供する。また、抗Ｓ１００Ｐ抗体を保持する免疫クロマトグラフィ装置と、膵液に含まれる蛋白質分解酵素の活性を阻害する蛋白質分解酵素阻害剤が収容された採取容器とを備える膵臓検査キットを提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体から採取された膵液および／または膵液を含む体液に含まれるＳ１００Ｐの濃度を免疫クロマトグラフィ法によって測定する膵臓検査方法。
【請求項２】
前記膵液が、膵管内から採取された膵液である請求項１に記載の膵臓検査方法。
【請求項３】
前記膵液を含む体液が、十二指腸内から採取された体液である請求項１に記載の膵臓検査方法。
【請求項４】
前記膵液を含む体液が、十二指腸液である請求項３に記載の膵臓検査方法。
【請求項５】
前記膵液および／または膵液を含む体液が、生理的に分泌された膵液および／または該膵液を含む体液である請求項１から請求項４のいずれかに記載の膵臓検査方法。
【請求項６】
前記膵液および／または膵液を含む体液が、膵液分泌促進剤の投与により分泌させられた膵液および／または該膵液を含む体液である請求項１から請求項４のいずれかに記載の膵臓検査方法。
【請求項７】
前記膵液に含まれる蛋白質分解酵素の活性を阻害する蛋白質分解酵素阻害剤が収容された採取容器に採取された前記膵液および／または膵液を含む体液を使用する請求項１から請求項６のいずれかに記載の膵臓検査方法。
【請求項８】
被検物質を標識物質によって標識する第１の抗体および該第１の抗体と複合体を形成した前記被検物質を吸着させる第２の抗体として、Ｓ１００Ｐの互いに異なるエピトープを認識する２つの抗Ｓ１００Ｐ抗体を保持する免疫クロマトグラフィ装置を備える膵臓検査キット。
【請求項９】
膵液に含まれる蛋白質分解酵素の活性を阻害する蛋白質分解酵素阻害剤が収容された採取容器をさらに備える請求項８に記載の膵臓検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵臓検査方法および膵臓検査キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）が膵癌の早期発見の手がかかりとして注目されている。膵癌やＩＰＭＮの診断は、内視鏡検査や生検によって行われている。しかし、早期の膵癌やＩＰＭＮを内視鏡画像から発見することは難しく、生検においては膵臓から組織を採取するという作業そのものが難しい。したがって、これらの方法では十分な検査精度が得られない。
一方、膵癌やＩＰＭＮにおいて、Ｓ１００蛋白質ファミリーの１つであるＳ１００Ｐが高い割合で過剰に発現することが知られている（例えば、非特許文献１，２参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Kenoki Ohuchida、外９名、“S100P Is an Early Developmental Marker of Pancreatic Carcinogenesis”、Clinical Cancer Research、2006年9月15日、第12巻、第18号、pp.5411-5416
【非特許文献２】Mads Gronborg、外８名、“Comprehensive Proteomic Analysis of Human Pancreatic Juice”、Journal of Proteome Research、2004年9月17日、第3巻、第5号、pp.1042-1055
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
非特許文献１では、膵臓の組織や膵液中に含まれる膵細胞からＲＮＡを抽出し、Ｓ１００Ｐ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルからＳ１００Ｐの発現量を測定している。この方法では膵癌およびＩＰＭＮを高精度で検出できる。しかしながら、煩雑な多段階の工程が必要であり、検査には高額な費用と長い時間とが必要となる。非特許文献２では、膵液をＴＯＦ−ＭＳ（飛行時間型質量分析法）で解析することよりＳ１００Ｐの発現量を測定しており、比較的大掛かりな設備が必要となる。すなわち、これらの方法で検査を実施できる施設は限られており、また、通常の臨床検査には不向きであるという不都合がある。【０００５】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡略な設備と手順でありながら膵疾患を高感度で検査することができる膵臓検査方法および膵臓検査キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の第１の態様は、被検体から採取された膵液および／または膵液を含む体液に含まれるＳ１００Ｐの濃度を免疫クロマトグラフィ法によって測定する膵臓検査方法である。
本発明の第１の態様によれば、被検体内から採取した膵液および／または膵液を含む体液に含まれるＳ１００Ｐの濃度は、膵臓腫瘍、ＩＰＭＮ、慢性膵炎を含む膵疾患が存在する場合には高い確率で上昇するので、測定したＳ１００Ｐの濃度の値から膵疾患の有無を高感度で検査することができる。この場合に、Ｓ１００Ｐの濃度の測定に、操作が簡便で特別な設備を必要としない免疫クロマトグラフィ法を用いることにより、簡略な設備と手順でありながら膵疾患を高感度で検査することができる。【０００７】
上記第１の態においては、前記膵液が、膵管内から採取された膵液であってもよい。
このようにすることで、純度の高い膵液を用いることによって、被検体内において発現されたＳ１００Ｐの濃度をより正確に測定することができる。
上記第１の態においては、前記膵液を含む体液が、十二指腸内から採取された体液であってもよく、該体液が十二指腸液であってもよい。
十二指腸内において、膵液を胆汁や十二指腸の分泌液と混合された状態で十二指腸液として採取することができる。このようにすることで、膵液を採取する際の被検体への侵襲を低減することができる。【０００８】
上記第１の態においては、前記膵液および／または膵液を含む体液が、膵液分泌促進剤の使用などの積極的な排出刺激をせずに、生理的に分泌された膵液および／または該膵液を含む体液であってもよい。
このようにすることで、検査に伴う被検体への負担を軽減することができる。
上記第１の態においては、前記膵液および／または膵液を含む体液が、膵液分泌促進剤の投与により分泌させられた膵液および／または該膵液を含む体液であってもよい。
このようにすることで、十分な量の膵液および／または膵液を含む体液を検査に用いることができる。【０００９】
上記第１の態においては、前記膵液に含まれる蛋白質分解酵素（プロテアーゼ）の活性を阻害するプロテアーゼ阻害剤が収容された採取容器に採取された前記膵液および／または膵液を含む体液を使用してもよい。
このようにすることで、採取および検査の過程で膵液に含まれる蛋白質分解酵素によってＳ１００Ｐが分解されてしまうことを防ぎ、検査精度を向上することができる。【００１０】
本発明の第２の態様は、被検物質を標識物質によって標識する第１の抗体および該第１の抗体と複合体を形成した前記被検物質を吸着させる第２の抗体として、Ｓ１００Ｐの互いに異なるエピトープを認識する２つの抗Ｓ１００Ｐ抗体を保持する免疫クロマトグラフィ装置を備える膵臓検査キットである。
上記第２の態様においては、膵液に含まれるプロテアーゼの活性を阻害するプロテアーゼ阻害剤が収容された採取容器をさらに備えていてもよい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、簡略な設備と手順でありながら膵疾患を高感度で検査することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施形態に係る膵臓検査キットが備える採取容器の全体構成図である。
【図２Ａ】本発明の一実施形態に係る膵臓検査キットが備える免疫クロマトグラフィ装置の内部構成を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ａの免疫クロマトグラフィ装置の外観を示す図である。
【図３】図１の採取容器の使用方法を説明する図である。
【図４】図１の採取容器の変形例を示す図である。
【図５】図１の採取容器のもう１つの変形例を示す図である。
【図６】実施例１において、膵液・十二指腸液中のＳ１００Ｐ濃度を測定した結果を表すグラフである。
【図７】実施例１において、純粋膵液中のＳ１００Ｐ濃度を測定した結果を表すグラフである。
【図８】実施例３において、５種類の膵疾患について膵液・十二指腸液中のＳ１００Ｐ濃度を測定した結果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に、本発明の一実施形態に係る膵臓検査キットおよび該膵臓検査キットを使用した膵臓検査方法について図１から図５を参照して説明する。
本実施形態に係る膵臓検査キットは、図１に示されるように、シリンジの外筒２内にプロテアーゼ阻害剤Ａが収容されてなる採取容器１と、図２Ａおよび図２Ｂに示されるように、抗Ｓ１００Ｐ抗体を保持する免疫クロマトグラフィ装置２０とを備えている。
【００１４】
採取容器１のシリンジは、外筒２と、該外筒２の内部空間を分画しつつ外筒２内において摺動可能に設けられたガスケット３と、該ガスケット３を押し引きするプランジャ４とを備えている。プロテアーゼ阻害剤Ａは、ガスケット３により吸引口２ａ側に分画された空間内に配置されている。吸引口２ａはキャップ５などによって密封されている。
【００１５】
プロテアーゼ阻害剤Ａは、水を主成分とする膵液および／または膵液を含む体液に容易に溶解する水溶性のものが用いられる。プロテアーゼ阻害剤Ａとしては、例えば、スルホニル系化合物であるフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、アミジノファニルメタンスルフォニルフルオライト（ＡＰＭＳＦ）、４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルフォニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ）、トシル系化合物である１−クロロ−３−トシルアミド−７−アミノ−２−ヘプタノン塩酸塩（ＴＬＣＫ―ＨＣＬ）、または、ペプチド系の阻害剤であるアプロチニン、ロイペプチン等が好適に用いられる。これらのプロテアーゼ阻害剤Ａは、主にセリンプロテアーゼを不可逆的に阻害するものであり、膵液に多く含まれるプロテアーゼであるアミラーゼ、トリプシン、エラスターゼなどを強力に阻害する。
【００１６】
プロテアーゼ阻害剤Ａは、１種類のみが外筒２内に収容されていてもよいし、２種類以上が外筒２内に収容されていてもよい。また、プロテアーゼ阻害剤Ａは、リパーゼなどの他の消化酵素の活性を阻害する阻害剤とともに収容されていてもよい。
プロテアーゼ阻害剤Ａは、凍結乾燥された粉体である。これにより、プロテアーゼ阻害剤Ａは、さらに容易に膵液および／または膵液を含む体液に溶解させられる。
【００１７】
採取容器１により採取される被検液の採取量は、採取容器１の内容量に応じて、または、検査に必要な被検液の量に応じて予め所定量に設定されている。外筒２内に収容されるプロテアーゼ阻害剤Ａの重量は、採取すべき所定量の被検液に溶解させられたときにプロテアーゼ阻害剤Ａの濃度が所望の数値になるように決定される。
【００１８】
免疫クロマトグラフィ装置２０は、図２Ａに示されるように、被検液が展開される担体２１と、担体２１の両端にそれぞれ配置されたサンプルパッド２２および吸収パッド２３とを備えている。
担体２１は、被検液を展開可能なものであればよく、例えば、ニトロセルロース製のメンブレンフィルターなどが好適に用いられる。担体２１には、第１の抗体が保持された帯状の標識領域２１ａと、該標識領域２１ａから間隔をあけた位置において第２の抗体が固相化された帯状の吸着領域２１ｂとが設けられている。第１の抗体および第２の抗体は、Ｓ１００Ｐの互いに異なるエピトープを認識する抗Ｓ１００Ｐ抗体である。
【００１９】
第１の抗体は、所定の色を呈する物質、例えば、金コロイドや白金コロイド等の金属コロイド、または、彩色されたポリスチレンラテックス等の合成ラテックスや天然ゴムラテックスなどからなるラテックスコロイド（標識物質）によって標識されている。
第１の抗体を標識する標識物質は、酵素や放射性物質などであってもよい。
【００２０】
サンプルパッド２２は、吸水性に優れた材料、例えば、多孔質ポリエチレンや多孔質ポリプロピレン等の多孔質合成樹脂からなるシートまたはフィルム、もしくは、濾紙や綿布などのセルロース製の紙、織布または不織布等からなる。
吸収パッド２３は、液体を迅速に吸収して保持できる材質、例えば、綿布、濾紙や、ポリエチレンやポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等からなる。
【００２１】
これらの担体２１、サンプルパッド２２および吸収パッド２３は、図２Ｂに示されるように、プラスチック製のケース２４によって外装されている。ケース２４は、サンプルパッド２２に対応する位置において滴下窓２４ａが開口し、吸着領域２１ｂに対応する位置において観察窓２４ｂが開口している。
【００２２】
このように構成された免疫クロマトグラフィ装置２０を使用するには、操作者は、滴下窓２４ａからサンプルパッド２２に被検液を滴下する。滴下された被検液はサンプルパッド２２から吸収パッド２３に向かって担体２１を移動することにより展開される。展開の途中に、被検液に含まれるＳ１００Ｐは、標識領域２１ａにおいて第１の抗体と結合して複合体を形成する。その後、該複合体は吸着領域２１ｂにおいて第２の抗体と結合することにより吸着領域２１ｂに吸着される。そして、複合体が吸着領域２１ｂに集積することにより吸着領域２１ｂは所定の色を呈する。したがって、操作者は、観察窓２４ｂ内に所定の色のバンドが出現したか否か、または、バンドの色の濃さから、Ｓ１００Ｐの有無または濃度を測定することができる。
【００２３】
次に、このように構成された膵臓検査キットを使用した膵臓検査方法について説明する。
本実施形態に係る膵臓検査方法は、被検体の十二指腸内から膵液を含む十二指腸液を採取容器内に採取し、採取した膵液を含む十二指腸液中のＳ１００Ｐの濃度を免疫クロマトグラフィ装置２０を使用して測定することにより行われる。十二指腸液の採取方法および採取容器は例示するカテーテルおよびシリンジに限定されず、膵液および／または膵液を含む体液が採取できればよい。
【００２４】
具体的には、まず、十二指腸内に挿入した内視鏡のチャネルを介してカテーテルを十二指腸内の乳頭部近傍に配置し、図３に示されるように、カテーテル６の基端を外筒２の吸引口２ａに接続し、プランジャ４を引っ張る。これにより、乳頭部から十二指腸内に分泌された膵液を胆汁や十二指腸分泌液とともに十二指腸液として吸引して外筒２内に採取することができる。
【００２５】
十二指腸液を吸引する前に、膵臓における膵液の分泌および乳頭部から十二指腸内への膵液の排出を促進する処置、例えば、セクレチンなどの膵液分泌促進剤の被検体への投与を行ってもよい。また、このような処置を行わずに、生理的な条件で十二指腸内に排出された膵液および／または該膵液を含む十二指腸液を採取してもよい。
【００２６】
外筒２内に所定量まで膵液と胆汁、十二指腸分泌液との混合液（以下、膵液・十二指腸液という。）を採取した後、吸引口２ａからカテーテル６を取り外し、外筒内２の膵液・十二指腸液を吸引口２ａから免疫クロマトグラフィ装置２０の滴下窓２４ａに滴下する。その後、膵液・十二指腸液が十分に担体２１上に展開されるまで、例えば、５分から１５分間待つ。以上の手順により、膵液・十二指腸液中のＳ１００Ｐの有無、つまり、膵癌またはＩＰＭＮなどの膵疾患の有無を、観察窓２４ｂ内のバンドの出現の有無として検査することができる。なお、膵臓検査キットに緩衝液などからなる希釈液が付属され、該希釈液によって膵液・十二指腸液を希釈した後に滴下窓２４ａに滴下してもよい。
【００２７】
観察窓２４ｂ内にバンドが観察された場合は、バンドの呈色の濃さを目視または免疫クロマトグラフィ用の読み取り機で測定することにより、Ｓ１００Ｐの濃度を測定する。健常な人の膵液・十二指腸液から予め得られたバンドの呈色の濃さを基準値とし、この基準値と測定されたバンドの呈色の濃さとを比較することにより被検体の膵疾患の有無を判定してもよい。この場合、基準値の設定は、膵管内から採取した純粋膵液と膵液・十二指腸液とのいずれを用いるかによって異なり、また、採取量や採取に要する時間、膵液分泌促進剤を用いるか否かによっても異なる。したがって、様々な条件の下で被検液である膵液および／または膵液を含む体液を採取した場合の基準値が必要となる。
【００２８】
この場合に、本実施形態によれば、膵液および／または膵液を含む体液中に含まれるＳ１００Ｐの濃度と膵疾患の有無との間には高い相関があり、膵疾患が存在する場合には高い割合で膵液および／または膵液を含む体液中のＳ１００Ｐの濃度が上昇する。したがって、膵疾患の有無を高い感度で検査することができる。
【００２９】
さらに、膵液・十二指腸液は、カテーテル６から外筒２内に流入させられた後に外筒２内において迅速にプロテアーゼ阻害剤Ａと混合させられる。これにより、膵液・十二指腸液中に含まれるＳ１００Ｐの分解が迅速に抑制されるので、正確なＳ１００Ｐの濃度を測定することができ、検査感度をさらに向上することができる。特に膵液は他の消化液に比べてプロテアーゼの活性が高いので、外筒２内に採取された膵液・十二指腸液中のプロテアーゼ阻害剤Ａの濃度が十分に高くなるようプロテアーゼ阻害剤Ａの収容量を設定することにより、検査精度を効果的に向上することができる。
【００３０】
また、十二指腸に排出された膵液を十二指腸液として採取して検査に用いることにより、膵管内にカテーテル６を挿入して膵管内の純粋膵液を採取する場合と比べて侵襲を低減しながら簡便に膵液を採取することができる。また、免疫クロマトグラフィ装置２０の操作に特別な設備や長い時間を必要としないので、例えば、比較的規模の小さいかかりつけの病院等でも、安価にかつ短時間で高感度な検査を実施することができる。
【００３１】
なお、本実施形態においては、乳頭部から十二指腸内に排出されて胆汁、十二指腸分泌液と混合された膵液を検査に使用することとしたが、これに代えて、膵管内から採取された純粋膵液を検査に使用してもよい。純粋膵液は、造影しながらカテーテルを乳頭部から膵管内に挿入して吸引したり、バルーンカテーテルやチューブを膵管内に一定時間留置したりすることにより採取することができる。
このようにすることで、膵管内から採取された純粋膵液は、十二指腸液によって希釈されることがないので、被検体内でのより正確なＳ１００Ｐの濃度を測定することができる。
【００３２】
また、本実施形態においては、プロテアーゼ阻害剤Ａとして、凍結乾燥された粉体のものを用いることとしたが、これに代えて、緩衝液などに溶解された液体のものを用いてもよい。このようにすることで、膵液・十二指腸液の採取量が少量であっても、プロテアーゼ阻害剤Ａを容易に均一に膵液・十二指腸液と混合させることができる。
【００３３】
また、本実施形態においては、採取容器１としてシリンジを用いた構成のものを例示したが、採取容器１の構成はこれに限定されるものではなく、接続されたカテーテル内を介して膵液および／または膵液を含む体液を吸引可能であり、膵液および／または膵液を含む体液が接触させられ膵液に含まれるプロテアーゼの活性を阻害するプロテアーゼ阻害剤が収容されている構成であればよい。例えば、採取容器１として、図４に示されるように、トラップ型の容器を用いもよく、図５に示されるように、内部が真空状態の容器を用いてもよい。
【００３４】
また、採取容器は、採取されてきた膵液および／または膵液を含む体液が、容器内に予め収容されたプロテアーゼ阻害剤Ａと迅速に接触させられる構成であればよく図１、図４および図５に例示されている採取容器１以外の採取容器を採用することとしてもよい。また、例示したカテーテル以外の採取手段、例えば、吸引、吸収、回収などにより膵液および／または膵液を含む体液を採取する構成であってもよい。採取容器の構成は、採取手段に応じて選択することができる。
【００３５】
図４に示される採取容器１は、カテーテル６に接続される吸引口２ａと、排気ポンプ等に接続されたチューブ７に接続される排気口２ｂとを備え、排気口２ｂから排気することによって、吸引口２ｂから膵液・十二指腸液が流入して貯留するようになっている。
図５に示される採取容器１は、例えば、ゴムなどの弾性部材からなる栓８によって開口が塞がれ、カテーテル６に接続された中空針９を栓８に貫通させることにより、膵液・十二指腸液が内部に吸引されるようになっている。
このようにしても、膵液および／または膵液を含む体液に含まれるプロテアーゼの活性を、採取後迅速に阻害し、採取された膵液に含まれるＳ１００Ｐの検査精度を向上することができる。
【００３６】
ここで、従来の体液の採取容器の場合、カテーテルの基端に採取容器を接続して膵液および／または膵液を含む体液を貯留しながら吸引し、吸引が終了した後に膵液および／または膵液を含む体液を分注してプロテアーゼ阻害剤を添加するため、吸引の最中にも採取容器内において蛋白質の分解が進行してしまい、採取した膵液および／または膵液を含む体液から正確な検査結果を得ることが難しいという問題があった。
これに対して、本実施形態に係る採取容器１によれば、採取した膵液および／または膵液を含む体液中に含まれるプロテアーゼの活性を迅速に抑制することにより、Ｓ１００Ｐのみならず膵液および／または膵液を含む体液中に含まれる他の蛋白質についても検出精度を向上することができ、他の蛋白質をマーカとした膵臓検査にも有効に用いることができる。
【００３７】
また、本実施形態においては、Ｓ１００Ｐの濃度を免疫クロマトグラフィ法によって測定することとしたが、固相化された抗体を用いて簡便に測定できる方法であれば他の測定方法を使用してもよい。例えば、小型の表面プラズモン共鳴装置（ＳＰＲ）やマイクロフルイディスクスなどを使用して測定してもよい。
【実施例】
【００３８】
次に、上述した実施形態に係る膵臓検査方法の実施例について説明する。
〔実施例１〕
本発明に係る膵臓検査方法の検査感度を以下の実験により評価した。
被検体として３１人の膵癌患者群および７人のＩＰＭＮ患者群からカテーテル吸引により被検液である膵液および膵液を含む体液を採取した。患者から採取した被検液を採取後迅速に凍結保存した後、各被検液中に含まれるＳ１００Ｐの濃度をサイクレックス社製のＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。対照群として、６人の良性の膵のう胞患者（ＭＣＮ、ＳＣＮ）についても同様の方法で被検液の採取および測定を行った。各患者の疾患は病理診断によって診断した。【００３９】
被検液としては、膵管内から採取した純粋膵液および膵液・十二指腸液を用いた。膵液・十二指腸液については、生理的に分泌および排出された膵液（以下、膵液・十二指腸液（−）という。）を含む十二指腸液およびセクレチン投与による膵液の分泌促進後に採取した十二指腸液（以下、膵液・十二指腸液（＋）という。）を用いた。さらに、膵液・十二指腸液（−），（＋）については、プロテアーゼ阻害剤が収容された採取容器（阻害剤（＋））および空の採取容器（阻害剤（−））を使用して採取したものを測定した。その測定結果を図６および図７に示す。【００４０】
図６および図７において、横軸は患者の症例を示し、縦軸は純粋膵液中または十二指腸液中のＳ１００Ｐの濃度を示している。各ドットは、各患者から上記条件で採取された膵液または十二指腸液中のＳ１００Ｐの濃度を示している。【００４１】
次に、対照群から得られたＳ１００Ｐの濃度の最も高い値をカットオフ値とし、膵癌患者およびＩＰＭＮ患者から得られたＳ１００Ｐの濃度がカットオフ値を超えた場合に、その患者が膵癌またはＩＰＭＮの検査に陽性であると判定した。そして、各検査条件において、３１人の膵癌患者群および７人のＩＰＭＮ患者群のうち正常に検査が済んだ患者の合計に対して陽性と判定された患者の割合を陽性率として算出した。その結果を表１に示す。上述の条件で正常に採取できなかった被検液のデータは、表１、図６および図７に示す統計から除外されている。【００４２】
【表１】
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【００４３】
表１から分かるように、いずれの検査条件においても高い陽性率が得られた。すなわち、膵液・十二指腸液または純粋膵液に含まれるＳ１００Ｐの濃度を測定することにより膵癌またはＩＰＭＮの有無を高感度で検査することができ、本発明の膵臓検査方法は膵癌またはＩＰＭＮの検査に有用であることが確認された。【００４４】
また、膵液・十二指腸液を用いた検査においては、プロテアーゼ阻害剤入りの本発明に係る採取容器を使用することにより検査感度を大幅に高めることができることが確認された。すなわち、プロテアーゼ阻害剤入りの採取容器は、膵液とともに分泌された豊富なプロテアーゼによるＳ１００Ｐの分解を阻害することにより、特に分泌促進を行う場合の検査に対して有効であることが確認された。【００４５】
〔実施例２〕
次に、実施例１で用いたＥＬＩＳＡに使用されている２種類の抗Ｓ１００Ｐ抗体（ＭＢＬ社製）を第１の抗体および第２の抗体として用いて本実施例に係る免疫クロマトグラフィ装置を作成した。該免疫クロマトグラフィ装置によって実施例１に用いた被検液を検査することにより、ＥＬＩＳＡ法と免疫クロマトグラフィ法とからそれぞれ得られる検査結果の相関を確認した。【００４６】
担体をニトロセルロース膜で作成し、第１の抗体を金コロイドで標識し、本実施例に係る免疫クロマトグラフィ装置を作成した。そして、作成した免疫クロマトグラフィ装置を使用して実施例１の被検液を検査し、バンドの呈色の有無および呈色の濃さを測定した。【００４７】
測定された免疫クロマトグラフィ装置の呈色の濃さを３つの階級に区分したところ、ＥＬＩＳＡ法で定量した濃度との間に相関があることが確認された。本実施例の検査に要した時間は約１５分であった。すなわち、免疫クロマトグラフィ法を用いることにより、短時間で十分に感度の高い検査結果を得られることが確認された。【００４８】
〔実施例３〕
実施例１の結果を元に、セレクチン投与による分泌促進を行わず、プロテアーゼ阻害剤を採取容器内に予め収容しておく方法にて、膵癌患者４１例、ＩＰＭＮ患者１７例、良性膵のう胞（ＳＣＮ、ＭＣＮ）患者６例、慢性膵炎患者４例、膵内分泌腫瘍患者３例について、膵液・十二指腸液を採取し、Ｓ１００Ｐの濃度を測定した。膵液・十二指腸液の採取およびＳ１００Ｐ濃度の測定は実施例１と同様の方法で行った。その測定結果を図８に示す。図８において、縦軸は対数表示となっている。【００４９】
良性膵のう胞患者６例から得られたＳ１００Ｐの濃度の測定値のうち最も高い値をカットオフ値に設定し、各症例における陽性率を算出した。その結果、膵疾患の陽性率は、膵癌では９０％、ＩＰＭＮでは９０％、慢性膵炎では１００％、膵内分泌腫瘍では１００％であった。
以上の実験結果から、膵液を含む十二指腸液中のＳ１００Ｐ濃度を測定することにより上記の様々な膵疾患を高感度に検出できることが確認された。
【符号の説明】
【００５０】
１  採取容器
２  外筒
２ａ  吸引口
２ｂ  排気口
３  ガスケット
４  プランジャ
５  キャップ
６  カテーテル
７  チューブ
８  栓
９  中空針
２０  免疫クロマトグラフィ装置
２１  担体
２１ａ  標識領域（第１の抗体、抗Ｓ１００Ｐ抗体）
２２ｂ  吸着領域（第２の抗体、抗Ｓ１００Ｐ抗体）
２２  サンプルパッド
２３  吸収パッド
２４  ケース
２４ａ  滴下窓
２４ｂ  観察窓
Ａ  蛋白質分解酵素阻害剤
Ｂ  膵液
【図１】
2012137832.tif 000004
【図２Ａ】
2012137832.tif 000005
【図２Ｂ】
2012137832.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
2012137832.tif 000009
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年3月14日(2014.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体から採取された膵液および膵液を含む体液のうち少なくとも一方に含まれるＳ１００Ｐの濃度を、固相化された抗体を用いて測定する膵疾患の検出方法。
【請求項２】
前記Ｓ１００Ｐの濃度を、前記固相化された抗体を用いた免疫クロマトグラフィ法によって測定する請求項１に記載の膵疾患の検出方法。
【請求項３】
前記膵液が、膵管内から採取された膵液である請求項１または請求項２に記載の膵疾患の検出方法。
【請求項４】
前記膵液を含む体液が、十二指腸内から採取された体液である請求項１または請求項２に記載の膵疾患の検出方法。
【請求項５】
前記膵液を含む体液が、十二指腸液である請求項４に記載の膵疾患の検出方法。
【請求項６】
前記膵液および膵液を含む体液が、生理的に分泌された膵液および該膵液を含む体液である請求項１から請求項５のいずれかに記載の膵疾患の検出方法。
【請求項７】
前記膵液および膵液を含む体液が、膵液分泌促進剤の投与により分泌させられた膵液および該膵液を含む体液である請求項１から請求項５のいずれかに記載の膵疾患の検出方法。
【請求項８】
前記膵液に含まれる蛋白質分解酵素の活性を阻害する蛋白質分解酵素阻害剤が収容された採取容器に採取された前記膵液および膵液を含む体液のうち少なくとも一方を使用する請求項１から請求項７のいずれかに記載の膵疾患の検出方法。
【請求項９】
被検物質を標識物質によって標識する第１の抗体および該第１の抗体と複合体を形成した前記被検物質を吸着させる第２の抗体として、Ｓ１００Ｐの互いに異なるエピトープを認識する２つの抗Ｓ１００Ｐ抗体を保持する免疫クロマトグラフィ装置を備える膵臓検査キット。
【請求項１０】
膵液に含まれる蛋白質分解酵素の活性を阻害する蛋白質分解酵素阻害剤が収容された採取容器をさらに備える請求項９に記載の膵臓検査キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
また、本実施形態においては、Ｓ１００Ｐの濃度を免疫クロマトグラフィ法によって測定することとしたが、固相化された抗体を用いて簡便に測定できる方法であれば他の測定方法を使用してもよい。例えば、小型の表面プラズモン共鳴装置（ＳＰＲ）やマイクロフルイディクスなどを使用して測定してもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
〔実施例３〕
実施例１の結果を元に、セクレチン投与による分泌促進を行わず、プロテアーゼ阻害剤を採取容器内に予め収容しておく方法にて、膵癌患者４１例、ＩＰＭＮ患者１７例、良性膵のう胞（ＳＣＮ、ＭＣＮ）患者６例、慢性膵炎患者４例、膵内分泌腫瘍患者３例について、膵液・十二指腸液を採取し、Ｓ１００Ｐの濃度を測定した。膵液・十二指腸液の採取およびＳ１００Ｐ濃度の測定は実施例１と同様の方法で行った。その測定結果を図８に示す。図８において、縦軸は対数表示となっている。
【国際調査報告】
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