(57)【要約】  近年、生体の免疫力を亢進してがんなどの疾患を治療するサイトカイン医薬による免疫賦活療法が期待されているが、サイトカイン医薬の活性が弱いために治療効果が十分得られないケースや、投与量が多くなることで重篤な副作用が引き起こされる例や、患者のコスト負担が高くなる例が問題となっている。そのため治療活性の増強がサイトカイン医薬を用いた免疫賦活治療の重要な課題であり、サイトカイン医薬の効果を増強したり、それにより使用量を抑えることができる免疫賦活剤の補助剤が求められている。本発明の課題は、サイトカイン医薬の効果を増強できる安価で安全な疫賦活療法補助療法剤を提供することにある。発明者らは、体内に移植したβ−リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）が免疫細胞を活性・遊走・集積させる機能を利用することにより、サイトカインに医薬よる免疫賦活療法の効果を増強できることを見出し本発明を完成するに至った。
2012105223.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の体内に移植されて用いられるβ−リン酸三カルシウムを有効成分とする組成物と、サイトカイン医薬組成物とを備えた免疫賦活療法キット。
【請求項２】
体内が、皮下であることを特徴とする請求項１記載の免疫賦活療法キット。
【請求項３】
β−リン酸三カルシウムが病変近傍に移植されることを特徴とする請求項１又は２記載の免疫賦活療法キット。
【請求項４】
病変近傍が、病変から０．１〜１５ｃｍの距離にある領域であることを特徴とする請求項３記載の免疫賦活療法キット。
【請求項５】
サイトカイン医薬組成物が造血系増殖因子含有組成物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の免疫賦活療法キット。
【請求項６】
造血系増殖因子がＦｌｔ３ ligand（fms-related tyrosine kinase 3 ligand）、ＳＣＦ（stem cell factor）、又はインターロイキン（Interleukin）であることを特徴とする請求項５記載の免疫賦活療法キット。
【請求項７】
β−リン酸三カルシウムが、気孔率５０％以下の緻密体であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の免疫賦活療法キット。
【請求項８】
β−リン酸三カルシウムが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、及びマクロファージを活性化、誘導、又は集積することを特徴とする請求項７記載の免疫賦活療法キット。
【請求項９】
β−リン酸三カルシウムが、錠剤又は柱状体であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の免疫賦活療法キット。
【請求項１０】
β−リン酸三カルシウムが、粒径０．０５〜２５μｍの粒子又は顆粒であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の免疫賦活療法キット。
【請求項１１】
対象の体内に移植されて用いられるβ−リン酸三カルシウムを有効成分とする、サイトカイン医薬組成物を用いる疫賦活療法の効果増強剤。
【請求項１２】
体内が、皮下であることを特徴とする請求項１１記載の疫賦活療法の効果増強剤。
【請求項１３】
β−リン酸三カルシウムが病変近傍に移植されることを特徴とする請求項１１又は１２記載の免疫賦活療法の効果増強剤。
【請求項１４】
病変近傍が、病変から０．１〜１５ｃｍの距離にある領域であることを特徴とする請求項１３記載の免疫賦活療法の効果増強剤。
【請求項１５】
サイトカイン医薬組成物が造血系増殖因子含有組成物であることを特徴とする請求項１１〜１４のいずれか記載の免疫賦活療法の効果増強剤。
【請求項１６】
造血系増殖因子含有組成物がＦｌｔ３ ligand（fms-related tyrosine kinase 3 ligand）、ＳＣＦ（stem cell factor）、又はインターロイキン（Interleukin）であることを特徴とする請求項１５記載の免疫賦活療法の効果増強剤。
【請求項１７】
β−リン酸三カルシウムが、気孔率５０％以下の緻密体であることを特徴とする請求項１１〜１６のいずれか記載の免疫賦活療法の効果増強剤。
【請求項１８】
β−リン酸三カルシウムが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、及びマクロファージを活性化、誘導、又は集積することを特徴とする請求項１７記載の免疫賦活療法の効果増強剤。
【請求項１９】
β−リン酸三カルシウムが、錠剤又は柱状体であることを特徴とする請求項１１〜１８のいずれか記載の免疫賦活療法の効果増強剤。
【請求項２０】
β−リン酸三カルシウムが、粒径０．０５〜２５μｍの粒子又は顆粒であることを特徴とする請求項１１〜１８のいずれか記載の免疫賦活療法の効果増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫賦活療法の効果増強剤（免疫賦活剤）や疫賦活療法キット、より詳しくは、対象の体内に移植されて用いられるβ−リン酸三カルシウム（ＴＣＰ：Tricalciumphosphate）を有効成分とする、サイトカイン医薬組成物を用いる免疫賦活療法の効果増強剤や、β−リン酸三カルシウムを含む組成物とサイトカイン医薬組成物とからなる免疫賦活療法キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫は表面のバリアを越えて外から体内に侵入した細菌やウィルスを排除し、生体を防御するシステムである。免疫応答の誘起と制御は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、抗体、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）などによって複合的に行われる。まず、ＡＰＣに取り込まれ、プロセシングを受けた外来抗原は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ及びクラスII分子に結合した状態でヘルパーＴ細胞に提示される。ＭＨＣに結合した外来抗原がヘルパーＴ細胞により認識されると、Ｔ細胞の活性化が起こり、サイトカインが分泌され、抗原で刺激されたＢ細胞が抗体産生細胞へと分化するのを助けると共に、キラーＴ細胞の分化を促す。Ｂ細胞から分泌された抗体、及び活性化されたＴ細胞によって、抗原を提示する細胞が排除され、外来抗原を排除する細胞性・体液性の反応が進行する。そして、免疫は体外から進入する病原菌だけでなく、元来は自己の細胞であった、がん化した細胞や、ウィルスや細菌が感染した細胞など、異常な自己の細胞に対してもはたらいている。従来の化学療法による治療は、疾患にかかった異常な細胞と正常な細胞とに同等に影響を与え、それにより時に強い副作用が起こることが問題であった。そこで、このような生体が本来持つ免疫システムを利用し、免疫力を高く維持することにより疾患を治療又は予防する、免疫賦活療法の開発が進められている。【０００３】
サイトカインは細胞から分泌される、細胞増殖、分化、抑制といった生体の恒常性維持や、免疫系の調節、炎症反応の惹起、抗腫瘍作用など、様々な重要な役割を果たすことが知られている物質であり、具体的にはインターフェロン、インターロイキン、造血系増殖因子、増殖因子など様々な物質が含まれる。近年、サイトカインを利用して生体の免疫力を亢進し、がんなどの疾患を治療する、あるいはがんなどの疾患による免疫力の低下を防ぐ、サイトカインによる免疫賦活療法が期待されている（特許文献１、２）。【０００４】
しかしながら、サイトカインによる免疫賦活の活性が弱いために治療効果が十分得られないケースや、多量のサイトカインの使用が重篤な副作用を引き起こす例が報告されている。また、投与量が多くなることで患者のコスト負担が高くなるケースや、サイトカインが高価であるため、その使用量が制限されるケースなどがある。そのため、治療活性の増強がサイトカインを用いた治療の重要な課題になっており、サイトカインの効果を増強したり、それによりサイトカインの使用量を抑えることができる、免疫賦活剤が求められている。【０００５】
β−リン酸三カルシウム（ＴＣＰ：Tricalcium phosphate）を含むリン酸カルシウム系化合物は、その優れた生体親和性により人工骨、人工歯根などの生体材料として応用研究が盛んに行われている。発明者らは、β−ＴＣＰがマクロファージの活動を活発化させることにより悪性腫瘍を抑制することを明らかにし、β−ＴＣＰの多孔体の粉末をシートにコーティングした癌細胞抑制シートからなる癌細胞抑制剤（特許文献３、非特許文献１）を開発している。しかしながら、β−ＴＣＰとサイトカインを併用することによる免疫賦活効果については全くわかっていなかった。【０００６】
他方、β−リン酸三カルシウムを含むリン酸カルシウム系化合物は、その優れた生体親和性により人工骨、人工歯根などの生体材料として応用研究が盛んに行われている（特許文献４，５）。本発明者らは、多孔体のβ−リン酸三カルシウムがマクロファージの活動を活発化させることにより悪性腫瘍を抑制することを明らかにし、気孔率７５％、粒径２５〜１０５μｍのβ−リン酸三カルシウムの粉末をシートにコーティングした癌細胞抑制シートからなる癌細胞抑制剤（特許文献３、非特許文献１）を開発している。しかしながら、β−リン酸三カルシウムとサイトカイン医薬組成物を併用する効果については全く知られていなかった。【０００７】
その他、これまでに人工的にリンパ節を構築する試みは幾つかあったが、自然のリンパ節と非常に類似した構造を持ち、しかも実際に生体内で強力な免疫機能を発揮する免疫装置の開発の成功は全くなかった。例えば、特許文献６〜８には、コラーゲンスポンジを用いた支持体に支持細胞（ストローマ細胞）を播き、かかる支持体を腎臓の被膜の下に埋め込むことで、人工リンパ節となり、抗体産生、癌細胞の排除などの免疫反応を強力に起こすことが開示されている。しかしこれらはいずれも細胞を使用しており、試験管の細胞培養や、人工材料を用いた構築などの工程が必要であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００５−５３４３３９号公報
【特許文献２】特表２００７−５１８７０９号公報
【特許文献３】特開２０１０−１２６４３４号公報
【特許文献４】特開２０１０−２３３９１４号公報
【特許文献５】特開平７−１１６１７５号公報
【特許文献６】特開２００６−１２９８３９号公報
【特許文献７】特開２００４−２５５１１０号公報
【特許文献８】特開２００８−１６３０１５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J. Cheng et al., J. Biomed.Mater. Res. A, 92(2):542-547 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
近年、がんの治療方法のひとつとして、サイトカインを使用した免疫賦活療法が注目を集めている。しかしながら、免疫賦活活性が弱いために治療効果が十分得られないケースや、投与量が多くなることで多量のサイトカインの使用が重篤な副作用を引き起こす例が報告されている。また、投与量が多くなることで患者のコスト負担が高くなるケースや、サイトカインが高価であるため、その使用量が制限されるケースなどがある。そのため、治療活性の増強がサイトカインを用いた治療の重要な課題になっており、サイトカインの効果を増強したり、それによりサイトカインの使用量を抑えることができる、免疫賦活剤が求められている。本発明の課題は、免疫賦活療法の効果を増強することができる安価で安全な免疫賦活療法補助療法剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明者らは、病変部位近傍に移植されたβ−リン酸三カルシウム緻密体（ここでは気孔率５０％以下のものを指す）により活性・誘導・集積されたＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞などのリンパ球や樹状細胞が活性化し、サイトカインによる免疫賦活療法の効果を増強できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は［１］対象の体内に移植されて用いられるβ−リン酸三カルシウムを有効成分とする組成物と、サイトカイン医薬組成物とを備えた免疫賦活療法キットや、［２］体内が、皮下であることを特徴とする［１］記載の免疫賦活療法キットや、［３］β−リン酸三カルシウムが病変近傍に移植されることを特徴とする［１］又は［２］記載の免疫賦活療法キットや、［４］病変近傍が、病変から０．１〜１５ｃｍの距離にある領域であることを特徴とする［３］記載の免疫賦活療法キットに関する。【００１３】
また、本発明は［５］サイトカイン医薬組成物が造血系増殖因子含有組成物であることを特徴とする［１］〜［４］のいずれか記載の免疫賦活療法キットや、［６］造血系増殖因子がＦｌｔ３ ligand（fms-related tyrosine kinase 3 ligand）、ＳＣＦ（stem cell factor）、又はＩＬ−１２（Interleukin-12）やＩＬ−１５（Interleukin-15）等のインターロイキン（Interleukin）であることを特徴とする［５］記載の免疫賦活療法キットや、［７］β−リン酸三カルシウムが、気孔率５０％以下の緻密体であることを特徴とする［１］〜［６］のいずれか記載の免疫賦活療法キットや、［８］β−リン酸三カルシウムが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞及びマクロファージを活性化、誘導、又は集積することを特徴とする［７］記載の免疫賦活療法キットや、［９］β−リン酸三カルシウムが、錠剤又は柱状体であることを特徴とする［１］〜［８］のいずれか記載の免疫賦活療法キットや、［１０］β−リン酸三カルシウムが、粒径０．０５〜２５μｍの粒子又は顆粒であることを特徴とする［１］〜［８］のいずれか記載の免疫賦活療法キットに関する。【００１４】
また、本発明は［１１］対象の体内に移植されて用いられるβ−リン酸三カルシウムを有効成分とする、サイトカイン医薬組成物を用いる疫賦活療法の効果増強剤や、［１２］体内が、皮下であることを特徴とする［１１］記載の疫賦活療法の効果増強剤や、［１３］β−リン酸三カルシウムが病変近傍に移植されることを特徴とする［１１］又は［１２］記載の免疫賦活療法の効果増強剤や、［１４］病変近傍が、病変から０．１〜１５ｃｍの距離にある領域であることを特徴とする［１３］記載の免疫賦活療法の効果増強剤や、［１５］サイトカイン医薬組成物が造血系増殖因子含有組成物であることを特徴とする［１１］〜［１４］のいずれか記載の免疫賦活療法の効果増強剤や、［１６］造血系増殖因子含有組成物がＦｌｔ３ ligand（fms-related tyrosine kinase 3 ligand）、ＳＣＦ（stem cell factor）、又はＩＬ−１２（Interleukin-12）やＩＬ−１５（Interleukin-15）等のインターロイキン（Interleukin）であることを特徴とする［１５］記載の免疫賦活療法の効果増強剤に関する。【００１５】
また、本発明は［１７］β−リン酸三カルシウムが、気孔率５０％以下の緻密体であることを特徴とする［１１］〜［１６］のいずれか記載の免疫賦活療法の効果増強剤や、［１８］β−リン酸三カルシウムが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、及びマクロファージを活性化、誘導、又は集積することを特徴とする［１７］記載の免疫賦活療法の効果増強剤や、［１９］β−リン酸三カルシウムが、錠剤又は柱状体であることを特徴とする［１１］〜［１８］のいずれか記載の免疫賦活療法の効果増強剤や、［２０］β−リン酸三カルシウムが、粒径０．０５〜２５μｍの粒子又は顆粒であることを特徴とする［１１］〜［１８］のいずれか記載の免疫賦活療法の効果増強剤に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、対象の体内に移植されて用いられるβ−リン酸三カルシウムを有効成分とする免疫賦活療法の効果増強剤を提供することができ、免疫賦活療法の効果を増強することができる安価で安全な疫賦活療法補助療法剤により疾患を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】免疫細胞とβ−ＴＣＰ顆粒（サイズ２５〜７５μｍ）の結合を走査型電子顕微鏡にて観察した結果を示す。
【図２】β−ＴＣＰ緻密体（緻密体錠剤：φ５×２ｍｍ）を、走査型電子顕微鏡にて観察した結果を示す。直径２μｍの粒子は、マーカーとして用いられている。
【図３】β−ＴＣＰ緻密体（緻密体棒剤：φ０．９×５ｍｍ）を、走査型電子顕微鏡にて観察した結果を示す。
【図４】β−ＴＣＰ緻密体（錠剤）を正常マウスの皮下に移植して２週間経過後、組織サンプルをＨＥ染色し、顕微鏡にて観察した。リンパ球が集積し、天然のリンパ節と似た構造となっていることを示す図である。
【図５】β−ＴＣＰ緻密体（顆粒）サイズ０．０５〜１０５μｍを正常マウスの皮下に移植して２週間経過後、組織サンプルをＨＥ染色し、顕微鏡にて観察した。サイズ７５μｍ以上のβ−ＴＣＰ顆粒はマクロファージを誘導し（Ｎ＝１３）、７５μｍ以下の顆粒はリンパ球を集め（Ｎ＝１１）、サイズ０．０５〜２５μｍの微小顆粒はリンパ球集塊を形成すること（図中矢印）を示す図である
【図６】円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤φ５×２ｍｍを皮下に移植した正常マウスの組織サンプルを、抗ＣＤ４５Ｒ抗体を用いてＢ細胞を免疫組織染色し、顕微鏡にて観察した。β−ＴＣＰ緻密体によりＢ細胞が誘導されることを示す図である（左：弱拡×４、右：強拡 ×４０ 矢印部）。
【図７】円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤φ５×２ｍｍを皮下に移植した正常マウスの組織サンプルを、抗ＣＤ３抗体を用いてＴ細胞を免疫組織染色し、顕微鏡にて観察した。β−ＴＣＰ緻密体によりＴ細胞が誘導されることを示す図である（左：弱拡×４、右：強拡 ×４０ 矢印部）。
【図８】円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤φ５×２ｍｍを皮下に移植した正常マウスの組織サンプルを、抗ＣＤ４９ｂ抗体を用いてＮＫ細胞を免疫組織染色し、顕微鏡にて観察した。β−ＴＣＰ緻密体によりＮＫ細胞が誘導されることを示す図である（左：弱拡×４、右：強拡 ×４０ 矢印部）。
【図９】円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤φ５×２ｍｍを皮下に移植した正常マウスの組織サンプルを、抗ＣＤ１１ｃ抗体を用いて樹状細胞を免疫組織染色し、顕微鏡にて観察した。β−ＴＣＰ緻密体により樹状細胞が誘導されることを示す図である（左：弱拡×４、右：強拡 ×４０ 矢印部）。
【図１０】円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤φ５×２ｍｍを皮下に移植した正常マウスの組織サンプルを、抗Ｆ４／８０Ｒ抗体を用いてマクロファージを免疫組織染色し、顕微鏡にて観察した。β−ＴＣＰ緻密体によりマクロファージが誘導されることを示す図である（左：弱拡×４、右：強拡 ×４０ 矢印部）。
【図１１】円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤φ５×２ｍｍを皮下に移植した正常マウスの組織サンプルを、抗Ｄ２−４０抗体を用いてリンパ管内皮細胞を免疫組織染色し、顕微鏡にて観察した。β−ＴＣＰ緻密体によりリンパ管形成が誘導されることを示す図である（左：弱拡×４、右：強拡 ×４０ 矢印部）。
【図１２】円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤又は同サイズのプラスティック片をヌードマウスの皮下へ移植し、それと同時にＦｌｔ３ ligand発現プラスミド又は発現ベクターをＤａｙ０にマウス尾静脈に単回投与し、以降週２回腫瘍体積を測定した、実験の概略を示す図である。
【図１３】ヌードマウスに円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤又は同サイズのプラスティック片を皮下に移植した日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ０にＦｌｔ３ ligand発現プラスミド又は発現ベクターをマウス尾静脈に単回投与し、以降週２回腫瘍体積を測定した結果を示す。＊は、Ｄａｙ２１、２４、２８においてＦｌｔ３ ligand発現プラスミド及びβ−ＴＣＰの群（第４群）の腫瘍体積が、プラスチック片及び発現ベクターのコントロール群（第１群）に対し、Tukey's testにより有意に小さいことを表す。また、＊＊は、Ｄａｙ３１においてＦｌｔ３ ligand発現プラスミド及びβ−ＴＣＰの群（第４群）の腫瘍体積が、他の全ての群（第１、２、３群）に対し、Tukey's testにより有意に小さいことを表す。
【図１４】ヌードマウスに円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤を皮下に移植した日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ０にサイトカイン：インターロイキン（ＩＬ）−１５発現プラスミドをマウス尾静脈に単回投与し、２週間後の腫瘍径を観察した結果を示す。＊は、ＩＬ−１５＋β−ＴＣＰ群の腫瘍径が、対照動物（腫瘍移植のみ）及びＩＬ−１５単独投与動物に対し明らかなサイズの減少が観察されたことを表す。
【図１５】ヌードマウスに円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤を皮下に移植した日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ０にStemCell Factor（ＳＣＦ）発現プラスミドをマウス尾静脈に単回投与し、Ｄａｙ１０に腫瘍体積を測定した結果を示す。＊は、ＳＣＦ＋β−ＴＣＰ群の腫瘍体積が、コントロール群（腫瘍移植のみ）に対し、Tukey's testにより有意に小さいことを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の免疫賦活療法キットとしては、体内に移植されて用いられる、換言すれば体内に移植するためのβ−リン酸三カルシウム（以下、「β−ＴＣＰ」という）を有効成分とする組成物と、サイトカイン医薬組成物とを備えたものであれば特に制限されず、また本発明のサイトカイン医薬組成物を用いる免疫賦活療法の効果増強剤としては、β−ＴＣＰを有効成分とする組成物であれば特に制限されず、本発明の一形態として、対象の体内にβ−リン酸三カルシウムを有効成分とする組成物を移植した後に、サイトカイン医薬組成物を投与する免疫賦活療法や、サイトカイン医薬組成物を用いる免疫賦活療法の効果増強剤製造のための、対象の体内に移植されて用いられるβ−リン酸三カルシウムの使用を挙げることができる。上記β−ＴＣＰはＣａ３（ＰＯ４）２で表される組成物の一結晶形態であって、常温において安定であり生体親和性のある化合物である。β−ＴＣＰとしては、市販のβ−ＴＣＰ粉末やβ−ＴＣＰブロック、例えば人工骨として利用されるβ−ＴＣＰブロックなどを用いてもよいし、公知の方法（特開２００４−２６６４８など）により製造してもよく、またα−ＴＣＰ粉末から製造する（特開２００６−８９３１１など）こともできる。また、本発明のβ−ＴＣＰ組成物は、実質的にβ−ＴＣＰ組成からなるものや、界面活性剤や水などを混入して製造されたものでもよいが、β−ＴＣＰブロックを粒子又は顆粒状に加工したβ−ＴＣＰの粉末の他、β−ＴＣＰ粉末を打錠により緻密化、あるいは焼結により脱泡の上緻密化した、高強度、高密度、低気孔率である、多結晶体のβ−ＴＣＰ緻密体、中でも気孔率５０％以下のβ−ＴＣＰ緻密体であることが好ましい。本発明において、β−ＴＣＰ緻密体とは気孔率５０％以下のβ−ＴＣＰをいう。また本発明において、粉末、粒子、顆粒はいずれも粒状の形態を指し、実質的な区別はない。
【００１９】
かかるβ−ＴＣＰ緻密体を構成する多結晶体の粒子サイズとして、好ましくは０．００１〜５０μｍ、より好ましくは０．０１〜２０μｍ、さらに好ましくは０．７５〜１０．０μｍであり、平均の多結晶体の粒子サイズは好ましくは１．８０μｍである。さらに、多結晶体の粒子の隙間は好ましくは０．００１〜１０μｍ、より好ましくは０．００５〜５μｍ、０．０１〜１．０μｍであり、平均の多結晶体の粒子の隙間は好ましくは０．０５〜０．２μｍ、より好ましくは０．１μｍである。かかる多結晶体の粒子の隙間の大きさや数により、β−ＴＣＰ緻密体の気孔が定められる。
【００２０】
β−ＴＣＰの気孔率は、細孔に水銀を浸入させるために圧力を加え、圧力と圧入された水銀量から比表面積や細孔分布を求める水銀法や、検量線を用いて密度から測定することもできる。また、気孔率が０％のβ−ＴＣＰ石（測定対象の焼結体と同じ組成、結晶形の気孔をもたないβ−ＴＣＰ焼結体）の真密度ρを測定しておき、測定対象の焼結体の体積と重さから算出した見かけ密度ρ’とから気孔率Ｐ（％）＝（１−ρ’／ρ）×１００として算出することができる。また、気孔率Ｐは、例えば、アキュピック１３３０シリーズ（株式会社島津製作所製）を用いて測定することもできる。β−ＴＣＰブロックの水銀法にて計測した気孔率は、好ましくは５０〜９０％、より好ましくは６０〜８５％、さらに好ましくは７０〜８０％である。粒径７５〜１０５μｍのβ−ＴＣＰ粉末はβ−ＴＣＰブロックを粉砕して作製することもでき、これを水銀法にて計測したそれぞれの粉末の気孔率は、好ましくは５０〜９０％、より好ましくは５５〜８５％、さらに好ましくは５７〜８０％であり、好ましい平均気孔率は６０〜７０％である。また、粒径２５μｍ以下のβ−ＴＣＰミクロン顆粒はβ−ＴＣＰブロックを粒子状に粉砕して作製することもでき、これを水銀法にて計測した気孔率は好ましくは５０％以下、より好ましくは４０％以下、さらに好ましくは３０％以下であり、好ましい平均気孔率は３．５〜４．５％である。β−ＴＣＰ緻密体としては、気孔率が５０％以下であるβ−ＴＣＰ粉末、粒子、顆粒、錠剤、柱状体等を例示することができ、これらはβ−ＴＣＰのみからなるものであっても、β−ＴＣＰを有効成分とし、他の成分を含むものであってもよい。５０％以下のβ−ＴＣＰの気孔率は、４０％以下が好ましく、３０％以下がより好ましく、中でも２０％以下が特に好ましい。また、β−ＴＣＰ粉末を打錠により緻密化したβ−ＴＣＰ緻密体の密度から検量線を用いて算定した気孔率としては、好ましくは５０％以下、より好ましくは４０％以下、さらに好ましくは３０％以下、中でも２０％以下を好適に例示することができる。また、焼結により脱泡の上緻密化したβ−ＴＣＰ緻密体は、密度から検量線を用いて算定した気孔率が、好ましくは５０％以下、より好ましくは４０％以下、さらに好ましくは３０％以下、中でも２０％以下を好適に例示することができる。
【００２１】
焼結による緻密化は、好ましくは６００℃超〜２０００℃、より好ましくは７５０〜１５００℃、さらに好ましくは９００〜１３００℃で、また好ましくは１〜１００時間、より好ましくは１０〜８０時間、さらに好ましくは２０〜５０時間焼結する例を挙げることができる。また、焼結は複数の温度にて複数回に分けて行ってもよい。例えば、錠剤のβ−ＴＣＰ緻密体は以下の方法で製造することもできる。リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム及び水を適切な割合で混合してスラリーを調製し、調製したスラリーを摩砕しながら反応させた後に乾燥させる。次に、乾燥して得られた固形物を粉砕して仮焼し、β−ＴＣＰ粉末が得られる。得られたβ−ＴＣＰ粉末を圧縮形成されることにより柱状体に賦形される。圧縮形成された柱状体を６００℃〜１３００℃で２０時間焼結する。
【００２２】
上記気孔率５０％以下の緻密体であるβ−ＴＣＰ粉末や粒子、顆粒の製造方法としては、例えば、リン酸水素カルシウムと炭酸カルシウムの粉末をモル比で１：１〜３、好ましくは１：１．５〜２．５になるように秤量して混合し、かかるリン酸水素カルシウム−炭酸カルシウム混合物に純水を添加してスラリーを調製し、調製されたスラリーをボールミルにより約２４時間湿式磨砕処理を行うことでメカノケミカル法による反応をすすめ、磨砕処理されたスラリーを、７０〜９０℃、好ましくは７５〜８５℃にて乾燥し、乾燥して得られた固形物を粉砕して得られたβ−ＴＣＰ粉末を７００〜８００℃にて、数時間仮焼することで、β−ＴＣＰ仮焼粉末を作製し、得られたβ−ＴＣＰ仮焼粉末をふるいにかけることで各粒径の分画を得ることができ、分画ごとの気孔率を測定することで、気孔率５０％以下の分画を得ることができる。具体的には、まずふるい目が１０５μｍのふるいを通過し、かつ、ふるい目が７５μｍのふるいにかけ残ったβ−ＴＣＰを分画（Ａ）とし、次にふるい目が７５μｍのふるいを通過し、かつ、ふるい目が２５μｍのふるいにかけ残ったβ−ＴＣＰを分画（Ｂ）とし、さらに２５μｍのふるいを通過したβ−ＴＣＰを分画（Ｃ）とした場合に、分画（Ｃ）は、気孔率が確実に５０％以下のβ−ＴＣＰとなる。
【００２３】
上記β−ＴＣＰ錠剤やβ−ＴＣＰ柱状体の製造方法としては、気孔率が５０％以下の、単一相又はほぼ単一相のβ−ＴＣＰの錠剤や柱状体を製造することができる方法を挙げることができる。具体的には、前述のようにβ−ＴＣＰ仮焼粉末を作製し、得られたβ−ＴＣＰ仮焼粉末を圧縮成形（打錠）することにより錠剤や柱状体に賦形し、かかる賦形されたβ−ＴＣＰ仮焼錠剤や柱状体を４５０〜６５０℃、好ましくは６００℃にて２．５〜３．５時間、好ましくは３時間焼結し、次いで８５０〜９５０℃、好ましくは９００℃で０．５〜１．５時間、好ましくは１時間焼結し、さらに１０００〜１３００℃で０．７５〜１．５時間、好ましくは１時間焼結することで燒結体としてのβ−ＴＣＰの錠剤や柱状体を得る方法を挙げることができ、また上記β−ＴＣＰ仮焼粉末を燒結し、β−ＴＣＰの焼結体としての粉体を得た後に圧縮成形（打錠）してβ−ＴＣＰの錠剤や柱状体を作製してもよい。なお、β−ＴＣＰ柱状体は、β−ＴＣＰ錠剤を柱状に打ち抜くことにより作製してもよい。
【００２４】
本発明のβ−ＴＣＰ組成物には、β−ＴＣＰの他に薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を含んでいてもよく、ゲル状やペースト状、微粒子の懸濁液や、固形状の製剤とすることができるが、好ましくは固形状であり、その形状としては、顆粒状、粉末状、粒子状の他、円板状（短円柱状）、棒状（長円柱状）の錠剤などを挙げることができる。
【００２５】
また、固形状のβ−ＴＣＰ組成物の粒径としては、例えば、β−ＴＣＰブロックを粒子状に加工したβ−ＴＣＰ粉末の場合は、粒径が好ましくは５０〜１２０μｍ、より好ましくは６０〜１１０μｍ、さらに好ましくは７５〜１０５μｍである。また、β−ＴＣＰブロックを粒子状に加工したβ−ＴＣＰミクロン顆粒の場合は、粒径が好ましくは５０μｍ以下、より好ましくは４０μｍ以下、さらに好ましくは３０μｍ以下である。中でも、粒径が０．０５〜５μｍのβ−ＴＣＰミクロン顆粒や、粒径が０．０５〜２５μｍのβ−ＴＣＰミクロン顆粒を好適に例示することができる。本発明において粒径０．０５〜２５μｍの粒子は、２５μｍのふるいを通過したものを指す。円板状又は柱状や棒状の錠剤のβ−ＴＣＰ組成物の大きさとしては、直径が好ましくは０．０１〜３０ｍｍ、より好ましくは０．１〜２０ｍｍ、さらに好ましくは１〜１０ｍｍであり、長さが好ましくは０．１〜４０ｍｍ、より好ましくは０．５〜３０ｍｍ、さらに好ましくは１〜２０ｍｍであるが、中でも直径５ｍｍで長さ２ｍｍの円板状の錠剤や、直径０．９ｍｍで長さ１０ｍｍの柱状の棒剤を好適に例示することができる。
【００２６】
本発明における体内としては、骨や歯以外の部位であれば特に制限されず、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、胸腔内、脳内を挙げることができ、好ましくは皮下である。また、治療対象である病変の近傍を挙げることもできる。病変の近傍に移植して用いられる場合は、好ましくは病変から１μｍ〜３０ｃｍ、より好ましくは１００μｍ〜２０ｃｍ、さらに好ましくは１ｍｍ〜１５ｃｍの距離にある領域に移植して用いることができる。本発明の治療対象の病変は、骨や歯以外における病変であれば特に制限はされず、がん、アレルギー免疫、感染症その他を例示することができ、中でもがんを好適に挙げることができ、頭蓋骨内組織、肺、皮膚、軟組織、膀胱、胃、すい臓、頭部、頸部、腎臓、前立腺、大腸、小腸、食道、女性器（例えば卵巣、子宮）又は甲状腺のがんを特に好適に例示することができる。
【００２７】
本発明のβ−ＴＣＰの投与方法としては、外科的処置により体内へ直接移植する方法であれば特に制限されず、他の目的の手術の際に、切開箇所に本発明のβ−ＴＣＰを移植することもできる。また生体への負担を軽減する観点から、通常の注射器や固形物の挿入用注射器によって、最小限の開口部から本発明のβ−ＴＣＰ組成物を体内に移植する方法を好適に例示することができる。この場合、本発明のβ−ＴＣＰ組成物としては、β−ＴＣＰ顆粒を含む懸濁液や、ゲル状やペースト状に調製されたβ−ＴＣＰや固形β−ＴＣＰを充填した注射器、例えば棒状（長円柱状）のβ−ＴＣＰ緻密体が充填されたデバイス（導入装置）や、棒状（長円柱状）β−ＴＣＰ緻密体とそのデバイス（導入装置）のセットを挙げることができる。また、投与量は、疾病の種類、病変の大きさ、患者の体重等により適宜選定することができ、好ましくは０．０１ｍｇ〜１００ｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｇ、さらに好ましくは１ｍｇ〜１ｇを例示することができる。
【００２８】
本発明におけるサイトカイン医薬組成物としては、サイトカイン医薬やサイトカイン発現プラスミドを含む組成物であればあれば特に制限されず、サイトカインは、リコンビナントのサイトカインを遺伝子工学技術を用いて作製することも、市販品を入手することもできる。サイトカイン発現プラスミドも、遺伝子工学技術を用いて作製することも、市販品を入手することもできる。サイトカインとしては、インターロイキン（interleukin：ＩＬ）、インターフェロン（interferon：ＩＦＮ）、リンフォカイン（lymphokine）、ケモカイン（chemokine）、腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor：ＴＮＦ−α）やＴＮＦ−βなどの細胞傷害因子、Ｆｌｔ３ ligand（ＦＬＴ３ＬＧ, fms-related tyrosine kinase 3 ligand），コロニー刺激因子（colony stimulating factor：ＣＳＦ），顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ），エリスロポエチン（ＥＰＯ），ＳＣＦ（stem cell factor）などの造血系増殖因子、上皮成長因子（epidermal growth factor：ＥＧＦ），線維芽細胞成長因子（fibroblast growth factor：ＦＧＦ），インスリン様成長因子（insulin like growth factor：ＩＧＦ），神経成長因子（nerve growth factor：ＮＧＦ），血小板由来成長因子（platelet derived growth factor：ＰＤＧＦ），トランスフォーミング成長因子（transforming growth factor：ＴＧＦ）などの成長因子、インスリン様成長因子（Insulin-like growth factors：ＩＧＦ）、レプチンやＴＮＦ−αなどのアディポカイン、などを挙げることができる。中でも、造血幹細胞や造血細胞の維持及び増殖を促す、造血系増殖因子をあげることができ、さらにＦｌｔ３ ligand（ＦＬＴ３ＬＧ, fms-related tyrosine kinase 3 ligand，Ｆｌｋ２ ligandとも呼ばれる）、ＳＣＦ（stem cell factor, ＫＩＴ ligandとも呼ばれる）、ＩＬ−１２（Interleukin-12）やＩＬ−１５（Interleukin-15）を好適に例示することができる。サイトカイン発現プラスミドは、生体内でサイトカインを発現するものであればよく、生体内でサイトカインを発現可能なプロモーター配列やターミネーター配列を有するものが望ましい。また、これらサイトカイン医薬組成物のサイトカインは、天然のアミノ酸配列に置換、挿入、欠失などの変異を施された、変異体でもよい。かかるサイトカイン医薬組成物は薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を含んでいてもよく、経口的又は非経口的に投与することができ、例えば粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射により非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできるが、注射や点滴による非経口投与を好適に例示することができる。
【００２９】
本発明の免疫賦活療法キットや本発明のサイトカイン療法の効果増強剤は、ａ）対象の体内にβ−リン酸三カルシウムを移植するステップ；及びｂ）対象にサイトカイン医薬組成物を投与するステップ；を備えるサイトカイン医薬による免疫賦活療法に用いることもできる。サイトカイン医薬組成物は、β−ＴＣＰが移植されると同時、又はその前後に対象に投与され、投与量や投与回数はサイトカイン医薬の活性の強さ、疾病の種類、患者の体重、投与形態等により適宜選定することができ、例えば、好ましくは１日あたり０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、より好ましくは０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、さらに好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）のサイトカイン発現プラスミドを含むサイトカイン医薬を投与することができる。好ましくは本発明のβ−ＴＣＰが移植されると同時、又はその後にサイトカイン医薬組成物を対象への投与を開始し、一定期間ごとに、複数回投与することができる。また、本発明における免疫賦活療法は、サイトカイン医薬以外の他の薬剤、サプリメントなどの投与と併用してもよく、また手術などの外科療法と併用することもできる。
【００３０】
本発明のサイトカイン医薬品を用いる免疫賦活療法の効果増強剤は、サイトカイン医薬組成物の投与のみによる治療効果と、コントロール又は本発明のβ−ＴＣＰ及びサイトカイン医薬組成物の投与を併用した場合の治療効果とを比較した場合に、本発明のβ−ＴＣＰを併用した方が高い治療効果を得られるという効果を有する。例えば腫瘍マーカーの値の減少や、腫瘍サイズを指標として比較した場合に、サイトカイン療法のみに比べ、サイトカイン療法に加えてβ−ＴＣＰを併用した方が、腫瘍サイズが縮小、あるいは増加しないことを調べることにより、本発明の効果を具体的に確認することができる。
【００３１】
また、本発明のβ−ＴＣＰを移植したマウスは、新たな免疫賦活療法の効果の検証や、候補物質の段階では薬効の弱いサイトカイン医薬品や免疫賦活療法のための組成物のスクリーニングにも用いることもできるという効果を有する。例えば、抗腫瘍効果の検証には多くの場合ヌードマウスが用いられるが、ヌードマウスでは抗腫瘍効果をもたらす可能性のあるエフェクター細胞がＮＫ細胞だけであるのに対し、本発明における実験系では正常なマウスを用いて、ＮＫ細胞だけでなくＴ細胞及びＢ細胞の関与についても検討できるため、よりヒトの臨床（がん患者など）に近い試験を行うことができる。
【００３２】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
［β−ＴＣＰの作製方法］
β−ＴＣＰブロックは、人工骨として製品を購入することもできるが、原料のβ−ＴＣＰと水、界面活性剤、発泡剤を混ぜ、焼結することにより作製することもできる。かかるβ−ＴＣＰブロックは、気孔率７５％や気孔率６０％であった。また、β−ＴＣＰ粉末やβ−ＴＣＰ顆粒については、前記気孔率７５％のβ−ＴＣＰブロックを粉砕し、篩にかけて粒径７５〜１０５μｍのβ−ＴＣＰ粉末（気孔率：６０〜７０％）を得た。また、同様に篩にかけて得られた２５〜７５μｍのβ−ＴＣＰ（気孔率：４０〜５０％）とＰＢＳ溶液を混合後、すぐに液体上部４分の３部分の液体を採取し、１０００ｒｐｍにて３分間の遠心操作で沈殿から０．０５〜２５μｍのβ−ＴＣＰミクロン顆粒（気孔率：３５〜５０％）を、上清から０．０５〜５μｍのミクロン顆粒を採取した（気孔率：２０〜３０％）。また、リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム及び水を適切な割合で混合してスラリーを調製し、調製したスラリーを摩砕しながら反応させた後に乾燥させ、得られた固形物を粉砕して仮焼することでβ−ＴＣＰ粉末が得られ、その粉末を圧縮形成することによりφ５×２ｍｍ錠剤に賦形し、６００〜１５００℃で３０時間焼結することで、円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤を作製した（気孔率：０．１〜２０％）。また、β−ＴＣＰの原料粉末３０ｇ、界面活性剤６．０ｍＬ、水１０ｍＬとを遠心管に注入し、２５０ｒｐｍで４分間処理することで脱泡処理をし、型に注入して自然乾燥させ、離型後、１３００℃にて焼結することで、φ０．９×１０ｍｍの柱状のβ−ＴＣＰ緻密体棒剤を作製した（気孔率:１０〜３０％）。なお、作製した各β−ＴＣＰの気孔率は、水銀法にて、初期圧に対応する直径約１８０μｍの細孔にまで水銀が圧入された時の試料体積に対する値として測定された。【００３４】
作製したβ−ＴＣＰ顆粒（サイズ２５〜７５μｍ）と免疫細胞の結合を走査型電子顕微鏡にて観察した結果を図１に示す。また、作製したβ−ＴＣＰ緻密体錠剤、及び緻密体棒剤を、走査型電子顕微鏡にて観察した結果を図２、図３に示す。また、β−ＴＣＰ緻密体を皮下に移植した正常マウスから組織サンプルを採取し、ＨＥ染色し、顕微鏡にて観察した結果を図４に示す。リンパ球が集積し、天然のリンパ節と似た構造となっていることがわかった。また、サイズ０．０５〜１０５μｍのβ−ＴＣＰ顆粒（気孔率０〜７０％）を皮下に移植したマウスから組織サンプルを採取し、ＨＥ染色し、顕微鏡にて観察した結果を図５に示す。サイズ７５μｍ以上のβ−ＴＣＰ顆粒はマクロファージを誘導し（Ｎ＝１３）、７５μｍ以下の顆粒はリンパ球を集め（Ｎ＝１１）、サイズ０．０５〜２５μｍの微小顆粒はリンパ球集塊を形成した。また、φ５×２ｍｍのβ−ＴＣＰ緻密体（気孔率：１８％）を皮下に移植したマウスの組織サンプルを抗ＣＤ４５Ｒ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４９ｂ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗Ｆ４／８０Ｒ抗体、又は抗Ｄ２−４０抗体を用いて、それぞれＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、マクロファージ、リンパ管を免疫組織染色して顕微鏡にて観察した。結果を図６〜図１１に示す。以上の結果から、皮下に移植された焼結により緻密化したβ−ＴＣＰは、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）、樹状細胞、マクロファージを誘導し、人工リンパ節として利用できることが確認された。抗腫瘍効果の検証には、多くの場合ヌードマウスが用いられる。しかしながらヌードマウスでは抗腫瘍効果をもたらす可能性のあるエフェクター細胞がＮＫ細胞だけであるのに対し、本発明のβ−ＴＣＰを移植したマウスは、Ｔ細胞及びＢ細胞の関与についても検討できるため、よりヒトの臨床（癌患者）に近い状態での試験を行うことができることが確認できた。【００３５】
［β−ＴＣＰを用いたＦｌｔ３ ligandによる免疫賦活療法］
（発現プラスミド）
Ｆｌｔ３ ligand発現プラスミドは、配列番号１及び２のプライマーを用いて、ヒトＦｌｔ３ligand（Accession No.: NM_001459）の細胞外ドメイン領域のｃＤＮＡを正常ヒト白血球よりＲＴ−ＰＣＲ法にて増幅し、発現ベクターpCpG（Invivogen社製）に組み込んだ。塩基配列確認後、大腸菌にてプラスミドを増幅、これを精製して実験に用いた。【００３６】
（方法）
６週齢の雄性ヌードマウス（BALB/c-nu/nu）皮内に２．５×１０６個のヒト大腸癌細胞COLO 205（ＡＴＣＣ社より購入）を移植し、５〜７日後、マウスに形成された腫瘍サイズを計測して腫瘍体積を算出した。腫瘍体積の算出は以下の数式によった。
腫瘍体積＝（長径×短径２）／２  （ｍｍ３）
そして、各群の腫瘍体積が均等になるように群分けを行い、以下の処置群を設定した。
１群：対照群
２群：β−ＴＣＰ移植群
３群：Ｆｌｔ３ ligand発現プラスミド投与群
４群：β−ＴＣＰ移植＋Ｆｌｔ３ ligand発現プラスミド投与群【００３７】
円板状のβ−ＴＣＰ緻密体の錠剤（気孔率：０．１〜１２％）を、形成腫瘍から１５〜２０ｍｍ離れた部位の皮下に移植した。β−ＴＣＰを移植しない１群と３群では、同サイズの、免疫原性をもつ可能性のある異種蛋白を含まないプラスチックキャリアマテリアル（以下「プラスチック片」と呼ぶ）を皮下に移植し、コントロールとした。Ｆｌｔ３ ligand発現プラスミドｈＦＬＥＸの投与は、Liuらの方法（Gene Ther. 1999; 6, 1258-1266）で行い、一回当たり５μｇのプラスミドＤＮＡを１．５ｍＬのＰＢＳ（phosphate buffered saline）に溶解し、Ｄａｙ０にマウス尾静脈に単回投与した。この方法を用いた場合、投与した発現プラスミドは、主に肝臓の細胞に導入されてタンパク質が発現するようになる。ＥＬＩＳＡ法を用いた検証では、投与翌日の血中には高濃度のタンパク質の発現を認め、発現は２週間以上にわたって観察された。【００３８】
Ｆｌｔ３ ligand発現プラスミドｈＦＬＥＸを投与しない１群と２群では、同用量の発現ベクターのみ（Ｆｌｔ３ ligand ｃＤＮＡ配列を含まない空ベクター）をＤａｙ０にマウス尾静脈に単回投与してコントロールとした。そして、実験群を設定後、約１ヶ月にわたり週２回、腫瘍サイズを計測し、腫瘍の増殖に対するβ−ＴＣＰとサイトカイン（Ｆｌｔ３ ligand）の作用を観察した。実験の概略を図１２に、結果を図１３に示す。コントロール及びｈＦＬＥＸ、β−ＴＣＰそれぞれ単独で使用した１〜３群に比べて、β−ＴＣＰ及びｈＦＬＥＸを併用（ＴＣＰ＋ｈＦＬＥＸ）した４群では強い腫瘍増殖抑制の効果が観察された。【００３９】
［β−ＴＣＰを用いたＩＬ−１５による免疫賦活療法］
前記実施例と同様にして、β−ＴＣＰを用いたＩＬ−１５による免疫賦活療法を行った。
６週齢の雄性ヌードマウス（BALB/c-nu/nu）皮内に２．５×１０６個のヒト大腸癌細胞COLO 205（ＡＴＣＣ社より購入）を移植し、５日後（Ｄａｙ０）に円板状のβ−ＴＣＰ緻密体（気孔率：０．１〜１２％）の錠剤を、形成腫瘍から１５〜２０ｍｍ離れた部位の皮下に移植した。そして、以下の処置群を設定し、サイトカイン遺伝子の発現ベクターを投与した。
１群：対照群
２群：ＩＬ−１５発現プラスミド投与群
３群：β−ＴＣＰ移植＋ＩＬ−１５発現プラスミド投与群
サイトカイン遺伝子の発現ベクター投与は、Liuらの方法（Gene
Ther. 1999; 6, 1258-1266）で行い、一回当たり５μｇの発現プラスミド（pORF9-mIL-15、InvivoGen社）を１．５ｍＬのＰＢＳ（phosphate buffered saline）に溶解し、同じくＤａｙ０にマウス尾静脈に単回投与した。この方法を用いた場合、投与した発現ベクターは、主に肝臓の細胞に導入されてタンパク質が発現するようになる。別種サイトカイン遺伝子（Ｆｌｔ３ ligand）を用いた実験では、ＥＬＩＳＡ法により投与翌日の血中には高濃度のタンパク質の発現を認め、発現は２週間以上にわたって観察されているため、ＩＬ−１５も同様に発現していると考えられる。【００４０】
実験結果を図１４に示す。Ｄａｙ１４において、対照動物（腫瘍移植のみ）及びＩＬ−１５遺伝子単独投与動物に比べて、β−ＴＣＰとＩＬ−１５遺伝子の発現ベクターを併用した動物では強い腫瘍増殖抑制の効果（明らかなサイズの減少）が観察された。図１４中の＊は、ＩＬ−１５発現プラスミド＋β−ＴＣＰ群（３群）の腫瘍径が、対照動物（腫瘍移植のみ）及びＩＬ−１５発現ベクター単独投与動物（２群）に比べて明らかにサイズの減少が観察されたことを表す。【００４１】
［β−ＴＣＰを用いたＳＣＦによる免疫賦活療法］
前記実施例と同様にして、β−ＴＣＰを用いたＳＣＦによる免疫賦活療法を行った。６週齢の雄性ヌードマウス（BALB/c-nu/nu）皮内に２．５×１０６個のヒト大腸癌細胞COLO 205（ＡＴＣＣ社より購入）を移植し、５日後、マウスに形成された腫瘍サイズを計測して腫瘍体積を算出した。腫瘍体積の算出は以下の数式によった。
腫瘍体積＝（長径×短径２）／２  （ｍｍ３）
そして、各群の腫瘍体積が均等になるように群分けを行い、以下の処置群を設定した。
１群：対照群
２群：ＳＣＦ発現プラスミド投与群
３群：β−ＴＣＰ移植＋ＳＣＦ発現プラスミド投与群【００４２】
５日後（Ｄａｙ０）に第３群においては円板状のβ−ＴＣＰ緻密体の錠剤を、形成腫瘍から１５〜２０ｍｍ離れた部位の皮下に移植した。ＳＣＦ投与は、Liuらの方法（Gene Ther. 1999; 6, 1258-1266）で行い、一回当たり５μｇの発現プラスミドを１．５ｍＬのＰＢＳ（phosphate buffered saline）に溶解し、Ｄａｙ０にマウス尾静脈に単回投与した。ＳＣＦ発現プラスミドは、市販のｃＤＮＡ（MC204279, ORIGENE社）をテンプレートとして、配列番号３及び４のプライマーを用いてＰＣＲ法にて増幅し、発現ベクターpCpG（InvivoGen社製）に組み込んだ。増幅配列はマウスＳＣＦ ｃＤＮＡ（accession No. NM_013598）の細胞外ドメインに相当する部分である。塩基配列確認後、大腸菌にてプラスミドを増幅、これを精製して実験に用いた。この方法を用いた場合、投与したＳＣＦ遺伝子は、主に肝臓の細胞に導入されてタンパク質が発現するようになる。別種サイトカイン遺伝子（Ｆｌｔ３ ligand）を用いた実験では、ＥＬＩＳＡ法により投与翌日の血中には高濃度のタンパク質の発現を認め、発現は２週間以上にわたって観察されているため、ＳＣＦも同様に発現していると考えられる。【００４３】
Ｄａｙ１０における実験結果を図１５に示す。コントロール群及びＳＣＦ単独投与群に比べてβ−ＴＣＰ及びＳＣＦを併用した群（ＳＣＦ＋ＴＣＰ：３群）において強い増殖抑制効果が観察され、コントロール群（１群）との間には有意差が認められた（Tukey testによる検定、ｐ＜0.05）。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明は、免疫賦活療法や、免疫賦活療法の補助療法、腫瘍治療法などの医療分野などに好適に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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