(57)【要約】  外来遺伝子をユリに導入することによる、花弁に青い色素（デルフィニジン）を含有するユリの生産方法の提供。本発明に係る方法は、以下のステップ：ユリに、配列番号１若しくは配列番号１１に示す塩基配列等のフラボノイド３’，５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列から成るカンパニュラ由来のＦ３’５’Ｈ遺伝子を導入するとともに、配列番号３又は配列番号１６に示す塩基配列等のフラボノイド３’−水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ）活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列から成るユリ由来のＦ３’Ｈ遺伝子の断片を導入して、ユリ花弁内で、シアニジン合成に働く内因性Ｆ３’Ｈの発現を抑制しながら、該導入されたＦ３’５’Ｈ遺伝子の働きによりデルフィニジンを合成させることを含む、花弁にデルフィニジンを含有するユリを生産する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
ユリに、配列番号１若しくは配列番号１１に示す塩基配列又は配列番号１若しくは配列番号１１に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し且つフラボノイド３’，５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列から成るカンパニュラ由来のＦ３’５’Ｈ遺伝子を導入するとともに、配列番号３又は配列番号１６に示す塩基配列又は配列番号３又は配列番号１６に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し且つフラボノイド３’−水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ）活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列から成るユリ由来のＦ３’Ｈ遺伝子の断片を導入して、ユリ花弁内で、シアニジン合成に働く内因性Ｆ３’Ｈの発現を抑制しながら、該導入されたＦ３’５’Ｈ遺伝子の働きによりデルフィニジンを合成させること、
を含む、花弁にデルフィニジンを含有するユリを生産する方法。
【請求項２】
前記内因性Ｆ３’Ｈの発現の抑制は、ＲＮＡｉ法により行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カンパニュラ由来のＦ３’５’Ｈ遺伝子が、配列番号１又は配列番号１１に示す塩基配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し且つＦ３’５’Ｈ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列から成る、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記カンパニュラ由来のＦ３’５’Ｈ遺伝子が、配列番号１又は配列番号１１に示す塩基配列から成る、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ユリ由来のＦ３’Ｈ遺伝子の断片が、配列番号３又は配列番号１６に示す塩基配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し且つＦ３’Ｈ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列から成る、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記ユリ由来のＦ３’Ｈ遺伝子の断片が、配列番号３又は配列番号１６に示す塩基配列から成る、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
配列番号１３に示す塩基配列又は配列番号１３に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し且つジヒドロフラボノール4-還元酵素（ＤＦＲ）活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列から成るユリ由来のＤＦＲ遺伝子の断片を導入して、ユリ花弁内で、シアニジン合成に働く内因性ＤＦＲの発現を抑制し、同時にアイリス由来の外来ＤＦＲ遺伝子を導入することをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
前記内因性ＤＦＲの発現の抑制は、ＲＮＡｉ法により行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
配列番号２４に示すユリＤＦＲプロモーター配列を使用することをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１、２、４、６又は８のいずれか１項に記載の方法により生産された花弁にデルフィニジンを含有するユリ、又はその組織若しくはその部分又はその栄養増殖体若しくはその子孫。
【請求項１１】
前記組織若しくはその部分が、切り花である、請求項１０に記載のユリ、又はその組織若しくはその部分又はその栄養増殖体若しくはその子孫。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来遺伝子をユリに導入することによる、花弁に青い色素（デルフィニジン）を含有するユリの生産方法に関する。より詳しくは、本発明は、デルフィニジン合成に必要なカンパニュラ由来のフラボノイド３’，５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）遺伝子をユリに導入するとともに、赤い色素（シアニジン）合成に働く内因性フラボノイド３’−水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ）の発現をＲＮＡｉ法で抑制するために、ユリのＦ３’Ｈ遺伝子の断片を導入して、ユリ花弁でデルフィニジンを合成させて、花弁に青い色素を含有するユリを生産する方法、及び該方法により生産されたユリに関する。
【背景技術】
【０００２】
今日まで、カーネーション（特許文献１参照）、キク（特許文献１参照）、バラ（特許文献１、特許文献２参照）、コチョウラン（特許文献３参照）、シンビジウム（特許文献３参照）において、外来遺伝子を導入することによりデルフィニジンを植物細胞に作らせる方法は、報告されている。
しかしながら、導入された外来遺伝子の働きによってユリ花弁内でデルフィニジンを合成し、青色の花弁をもつユリの作出に成功した例は未だ報告されていない。【０００３】
植物の品種改良としては、（１）オシベとメシベを掛け合わせる交雑、（２）自然に又は人為的に生じる突然変異、（３）遺伝子組換え等の方法がある。このうち、（３）遺伝子組換えの技術を利用すると、対象種の有する遺伝的な制約に束縛されることなく、有用な遺伝子を該植物において発現させることができ、これにより該植物に、本来有していない新しい形質を付与することができる。遺伝子組換え技術を用いて作製された遺伝子組換え植物は、現在、世界中で広範囲に栽培されている。【０００４】
花色の色素成分としては、アントシアニン、カロテノイド、ベタレイン等がある。
アントシアニンは、フラボノイドと総称される二次代謝物の一員で、図１に示すように、フェニルアラニンからクマロイルーＣｏＡを経て多くの酵素の働きにより合成される。アントシアニンの色はその構造に依存する。すなわち、アントシアニンの発色団であるアントシアニジンのＢ環の水酸基の数が多くなる程、より青くなり、主要なアントシアニジンであるデルフィニジン、シアニジン、ペラルゴニジンはこの順に水酸基が多い。【０００５】
多くの青い花にはデルフィニジンに由来するアントシアニンが蓄積している。また、アントシアニンを修飾する芳香族アシル基（クマロイル基、カフェオイル基など）の数が多くなるとアントシアニンの色は、より青くなり（すなわち、吸収極大値が長波長にシフトし）、アントシアニンの安定性が増すことが知られている。特に複数の芳香族アシル基が結合したアントシアニンはポリアシル化アントシアニンと呼ばれ、リンドウやチョウマメなどの青い花弁に含まれる（非特許文献１参照）。【０００６】
アントシアニンの生合成に関わる酵素やそれらをコードする遺伝子は、既に多くの植物から単離されている（非特許文献１参照）。アントシアニンの色は、それが局在する液胞のｐＨ、他のフラボノイド、金属イオンなどにも依存する。すなわち、アントシアニンは液胞のｐＨが低いと赤く、中性だと青く変化する。また、フラボン、フラボノールは、コピグメントとも呼ばれ、アントシアニンと共存するとアントシアニンを青く見せる効果がある。さらに、鉄やアルミニウムイオンは、アントシアニンのＢ環の水酸基に配位することにより、アントシアニンを青くすることが知られている。【０００７】
植物は多様な色の花を咲かせるが、すべての色の花を咲かせることができる種は、少ない。これは種によって合成できる色素が遺伝的に決まっているからである。例えば、バラ、カーネーション、キク、ユリ、ガーベラなどには青や紫色の品種がない。その主な理由は、これらの植物は、デルフィニジンを合成するために必要なフラボノイド３’，５’−水酸化酵素（以下、「Ｆ３’５’Ｈ」ともいう。）遺伝子を持っていないからである。そこで、Ｆ３’５’Ｈ遺伝子を発現させることによりデルフィニジンを生産させ、花の色を青くしようとする試みはいくつか報告されている。【０００８】
Ｆ３’５’Ｈが欠損しているペチュニアにおいてＦ３’５’Ｈ遺伝子を発現させるとデルフィニジンに由来するアントシアニン量が増加する（非特許文献２、非特許文献３参照）。また、シアニジンを蓄積するタバコ（Nicotiana tabacum）においてＦ３’５’Ｈ遺伝子を発現させるとデルフィニジンが合成され、花色はやや青みを帯びる（非特許文献３参照）。カンパニュラ、トルコギキョウ、ペチュニア由来のＦ３’５’Ｈ遺伝子をタバコで発現させた場合、カンパニュラ由来のＦ３’５’Ｈ遺伝子が最も効率良くデルフィニジンを生産した（非特許文献４参照）。また、チョウマメとバーベナのＦ３’５’Ｈ遺伝子をバーベナで発現させた場合、チョウマメ由来の遺伝子を発現させた場合の方がデルフィニジン生産量が多く、花色も明瞭に変化した（非特許文献５参照）。ペチュニア、リンドウ、チョウマメ、サイネリア、トルコギキョウ、パンジー、ラベンダーなどに由来するＦ３’５’Ｈ遺伝子をバラにおいて発現させたところ、パンジー由来のＦ３’５’Ｈ遺伝子を発現させた場合にのみ、総アントシアニジンの数１０％のデルフィニジンが生成され、バラではパンジー由来のＦ３’５’Ｈ遺伝子が良好に機能することが示された（特許文献４参照）。【０００９】
キク品種インプルーブドレーガン、ダークスプレンデッドレーガンにおいては、バラのカルコンシンターゼプロモーターを用いてパンジー由来のＦ３’５’Ｈ遺伝子を転写させることにより、デルフィニジンが５０％以上蓄積し、花色が青く変化した遺伝子組換えキクが得られた（特許文献５参照）。キク品種94-765においては、カンパニュラ、バーベナ、サイネリア、パンジー、ペチュニア、ロベリアなどに由来するＦ３’５’Ｈ遺伝子をキク由来のフラバノン３−水酸化酵素遺伝子由来のプロモーターとタバコアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’非翻訳領域を利用して発現したところ、カンパニュラ、バーベナ、サイネリア、パンジー由来のＦ３’５’Ｈ遺伝子が比較的良好に機能し、総アントシアニジンの２５％以上のデルフィニジンが生成された。キクでは、これらのうちカンパニュラ由来のＦ３’５’Ｈ遺伝子が最も良好に機能し、７５％以上のデルフィニジンが生成された（非特許文献１６参照）。【００１０】
以上の報告例から、植物において異種（外来）Ｆ３’５’Ｈ遺伝子を発現させ、デルフィニジンを生産させた例は報告されているものの、どの植物由来のＦ３’５’Ｈ遺伝子をどのプロモーターを利用して着目の植物に導入すれば、該着目の植物の花弁内で、該導入されたＦ３’５’Ｈ遺伝子が実際に発現するかを予想することは困難であり、デルフィニジン花弁内で生産させるためには試行錯誤や実験を重ねる必要がある。【００１１】
また、前記した報告例はいずれも、双子葉植物を対象にした研究成果である。高等植物の中でも双子葉植物と単子葉植物は大きく異なる。
まず、双子葉植物と単子葉植物は、さまざまな形態上の違いがある。これは、単子葉植物が、その起源において大きな形態の進化が起こったことを示している。単子葉植物には、以下の特徴がある：子葉が1枚である；子葉の基部が胚の他の部分を包み込むさやとなる；茎の断面に維管束が散在している；茎は伸長し終わった後はそれ以上太くならない(形成層が発達しない)；葉脈が平行線状(平行脈)である;主根はあまり発達せずひげ根になる；花被片・雄しべ・心皮の数が３の倍数である;花びらと萼片の区別が付かない（http://www.fukuoka-edu.ac.jp/~fukuhara/keitai/9-1.html参照）。
さらに、単子葉植物と双子葉植物は、遺伝子発現制御に大きな差がある（非特許文献６、非特許文献７参照）ので、遺伝子組換え単子葉植物の作出には困難が伴う。但し、単子葉植物の中でもトウモロコシやイネについては研究開発が進んでおり、遺伝子組換えトウモロコシはすでに多くの国で商業化されている。【００１２】
このように、単子葉の花き植物に関しては、異種（外来）Ｆ３’５’Ｈ遺伝子を花弁内で一時的に発現させた報告例があるものの（特許文献３参照）、遺伝子組換えの単子葉花き植物を開発したという報告例は少なく、ましてやＦ３’５’Ｈ遺伝子を導入した単子葉花き植物を開発した報告例、すなわち、異種Ｆ３’５’Ｈ遺伝子導入の結果としてデルフィニジン花弁内で蓄積させ、花色を変化させた単子葉花き植物を開発したという報告例は未だない。【００１３】
尚、非特許文献８には、青い花色のユリを開発すべく、青い色素合成に関連する遺伝子を赤い花色のユリに導入したところ、青い色素含量が半分以上になったユリが得られたと記載されている。しかしながら、非特許文献８において青い色素が分析されたユリ植物の組織又は部分は、葉柄である。ここで、葉においてアントシアニンが合成されても花ではアントシアニンが合成されない植物は多く（アラビドプシスなど）、葉におけるアントシアニンと花のアントシアニンの分子種は異なる場合があることも知られている。例えば、Sarracenia purpureaとSarracenia psitticinaの葉にはシアニジンに由来するアントシアニンのみが含まれるが、これらの花にはシアニジンとデルフィニジンに由来するアントシアニンが含まれている（非特許文献１７参照）。また、アントシアニン生合成の制御も組織により異なるであろう。例えば、アサガオにおいては、遺伝子cは白い花を与えるが、茎はアントシアニンで着色し、種は黒色である。一方、遺伝子caは白い花を与えるが、茎は着色せず、種は白色である。
したがって、ユリにおいて、外来遺伝子導入により葉柄でデルフィニジンが半分以上になったという報告は、該外来遺伝子導入により花弁内でデルフィニジンが蓄積されたユリを作出することができる青い花色のユリの生産方法が確立されたことを意味するものではない。【００１４】
また、花の色を青く変化させるためには、デルフィニジンの含有率を、総アントシアニジン量の５０％以上、好ましくは６９％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％%に上昇させる必要がある。これを達成するためには単にＦ３’５’Ｈ遺伝子を過剰発現させるだけでは不十分なことが多く、追加の遺伝子操作を含むさらなる工夫が必要とされる。【００１５】
例えば、カーネーションの場合には、ジヒドロフラボノール４−還元酵素(ＤＦＲ)が欠損している白いカーネーションに、Ｆ３’５’Ｈ遺伝子とペチュニアＤＦＲ遺伝子の両者を発現させることによりデルフィニジンがほぼ１００％になり、花色も青く変化した組換えカーネーションが得られている（特許文献６参照、本願図１参照）。また、バラにおいては、パンジー由来のＦ３’５’Ｈ遺伝子とアイリス由来のＤＦＲ遺伝子を過剰発現させるとともに、バラのＤＦＲ遺伝子の発現を抑制することにより、デルフィニジン含有率がほぼ１００％になり、花色が青く変化した組換えバラが得られている（特許文献２参照）。また、キクにおいては、パンジー由来のＦ３’５’Ｈ遺伝子を過剰発現させるとともに、キクの内因性Ｆ３’Ｈ遺伝子の発現を抑制することにより、デルフィニジンの含有率を上昇させている（特許文献５参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ９４／２８１４０号公報（ＰＣＴ／ＡＵ９４／００２６５、特表平８−５１１６８３号公報）
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００５／０１７１４７号公報（ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１１９５８）
【特許文献３】特開２００８−２５３２５０号公報
【特許文献４】国際公開ＷＯ２００４／０２０６３７号公報（ＰＣＴ／ＡＵ０３／０１１１１）
【特許文献５】国際公開ＷＯ２００９／０６２２５３号公報（ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１６９４）
【特許文献６】国際公開ＷＯ９６／３６７１６号公報（ＰＣＴ／ＡＵ９６／００２９６）
【特許文献７】国際公開ＷＯ２００７／０９４５２１号公報（ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０５３３４２）
【特許文献８】国際公開２００８／１５６２１４号公報（ＰＣＴ／ＪＰ２００８／０６１６０３）
【特許文献９】近日公開予定の特願２００８−２７６０２９明細書
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Plant J. (2008) 54, 737-749
【非特許文献２】Nature (1993) 366, 276-279
【非特許文献３】FEBS Lett. (1999) 461, 241-245
【非特許文献４】Biosci. Biotechnol. Biochem., (2003) 67(1), 161-165
【非特許文献５】Plant Biotechnology (2006) 23, 5-11
【非特許文献６】蛋白質核酸酵素vol. 34 (1989) 1873-1878
【非特許文献７】Trends in Genetics, (1088) Vol. 4, p. 13-18
【非特許文献８】平成１８年新潟県農業総合研究所年報Ｉ−２６  （３２）トップブランド農産物開発事業  青いユリの作出
【非特許文献９】Plant Cell Reports (2004) 22: 415-421
【非特許文献１０】Plant Cell Reports (2004) 22: 359-364
【非特許文献１１】Theor. Appl. Genet. (1999) 99, 383-390
【非特許文献１２】Plant Cell Physiol. (1996) 37, 49-59
【非特許文献１３】CLONTECH, Molecular Breeding, (2003), 11: 287-293
【非特許文献１４】J. Japan Soc. Hort. Soc. (2008) 77: 94-102
【非特許文献１５】Plant J. (2008) 54: 949-962
【非特許文献１６】日本植物生理学会2010年年会要旨集  ポスター番号  P1C012(600) http://www.jspp.org/13member/2010abstract/pdf/07.pdf
【非特許文献１７】HORTSCIENCE  （2001） 36:384
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
植物において、青色の発色には、ほとんどの場合、アントシアニン系色素のデルフィニジンが関与している。デルフィニジンの合成にはＦ３’５’Ｈが必須であるが、ユリにはこの酵素が無い。そのため、青い花色のユリは存在しない。遺伝子導入によって青い花色のユリを作出するために、ユリにおいて高発現するＦ３’５’Ｈが求められている。他方、シアニジンを合成しているユリに関しては、シアニジンの合成を抑制しなければ、デルフィニジンの含量は上昇しない。
本発明の課題は、ユリの花弁細胞内で特定種由来のＦ３’５’Ｈ遺伝子を高発現させるとともに、ユリ内因性シアニジン合成を抑制することにより、花弁細胞内で高い含量割合で青色の色素であるデルフィニジンを合成するユリの生産方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討し、実験を重ねた結果、アントシアニン系色素のほぼ全てをシアニジンが占めているピンクの花色を持ったオリエンタルユリ品種「アカプルコ」にカンパニュラ由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子を導入するとともに、ユリのＦ３’Ｈ遺伝子断片の導入によるＲＮＡｉ法を用いてシアニジンの合成を抑制したところ、花弁細胞内の全アントシアニン系色素の８０％がデルフィニジンになることを見出し、本発明を完成するに至った。【００２０】
すなわち、本発明は以下のとおりのものである。
［１］以下のステップ：
ユリに、配列番号１若しくは配列番号１１に示す塩基配列又は配列番号１若しくは配列番号１１に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し且つフラボノイド３’，５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列から成るカンパニュラ由来のＦ３’５’Ｈ遺伝子を導入するとともに、配列番号３又は配列番号１６に示す塩基配列又は配列番号３又は配列番号１６に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し且つフラボノイド３’−水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ）活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列から成るユリ由来のＦ３’Ｈ遺伝子の断片を導入して、ユリ花弁内で、シアニジン合成に働く内因性Ｆ３’Ｈの発現を抑制しながら、該導入されたＦ３’５’Ｈ遺伝子の働きによりデルフィニジンを合成させること、
を含む、花弁にデルフィニジンを含有するユリを生産する方法。【００２１】
［２］前記内因性Ｆ３’Ｈの発現の抑制は、ＲＮＡｉ法により行われる、前記［１］に記載の方法。【００２２】
［３］前記カンパニュラ由来のＦ３’５’Ｈ遺伝子が、配列番号１又は配列番号１１に示す塩基配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し且つＦ３’５’Ｈ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列から成る、前記［１］又は［２］に記載の方法。【００２３】
［４］前記カンパニュラ由来のＦ３’５’Ｈ遺伝子が、配列番号１又は配列番号１１に示す塩基配列から成る、前記［１］又は［２］に記載の方法。【００２４】
［５］前記ユリ由来のＦ３’Ｈ遺伝子の断片が、配列番号３又は配列番号１６に示す塩基配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し且つＦ３’Ｈ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列から成る、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。【００２５】
［６］前記ユリ由来のＦ３’Ｈ遺伝子の断片が、配列番号３又は配列番号１６に示す塩基配列から成る、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。【００２６】
［７］配列番号１３に示す塩基配列又は配列番号１３に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し且つジヒドロフラボノール4-還元酵素（ＤＦＲ）活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列から成るユリ由来のＤＦＲ遺伝子の断片を導入して、ユリ花弁内で、シアニジン合成に働く内因性ＤＦＲの発現を抑制し、同時にアイリス由来の外来ＤＦＲ遺伝子を導入することをさらに含む、前記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。【００２７】
［８］前記内因性ＤＦＲの発現の抑制は、ＲＮＡｉ法により行われる、前記［７］に記載の方法。【００２８】
［９］配列番号２４に示すユリＤＦＲプロモーター配列を使用することをさらに含む、前記［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。【００２９】
［１０］前記［１］〜［９］のいずれかに記載の方法により生産された花弁にデルフィニジンを含有するユリ、又はその組織若しくはその部分又はその栄養増殖体若しくはその子孫。【００３０】
［１１］前記組織若しくはその部分が、切り花である、前記［１０］に記載のユリ、又はその組織若しくはその部分又はその栄養増殖体若しくはその子孫。
【発明の効果】
【００３１】
本発明に係る花弁にデルフィニジンを含有するユリを生産する方法により、ユリ花弁細胞内で青色の色素であるデルフィニジンを高い含有割合で蓄積させることが可能となり、これまで存在しなかった青い花を咲かせるユリを作出できるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】アントシアニンの生合成経路。
【図２】バイナリーベクターTr3のマップ。
【図３】バイナリーベクターTr7〜Tr11のマップ。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、以下のステップ：
ユリに、配列番号１若しくは配列番号１１に示す塩基配列又は配列番号１若しくは配列番号１１に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し且つフラボノイド３’，５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列から成るカンパニュラ由来のＦ３’５’Ｈ遺伝子を導入するとともに、配列番号３又は配列番号１６に示す塩基配列又は配列番号３又は配列番号１６に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し且つフラボノイド３’−水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ）活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列から成るユリ由来のＦ３’Ｈ遺伝子の断片を導入して、ユリ花弁内で、シアニジン合成に働く内因性Ｆ３’Ｈの発現を抑制しながら、該導入されたＦ３’５’Ｈ遺伝子の働きによりデルフィニジンを合成させること、
を含む、花弁にデルフィニジンを含有するユリを生産する方法に、関する。
【００３４】
前記した配列番号１又は配列番号１１に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し且つフラボノイド３’，５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列として、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトを用いて計算したときに、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するＤＮＡを挙げることができる。
【００３５】
同様に、前記した配列番号３又は配列番号１６に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し且つフラボノイド３’−水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ）活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列として、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトを用いて計算したときに、配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するＤＮＡを挙げることができる。
【００３６】
前記した配列番号１又は配列番号１１に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し且つフラボノイド３’，５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列は、配列番号１又は配列番号１１に示す塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であり且つフラボノイド３’，５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列であることもできる。ここで、ＤＮＡ又は塩基配列における「１若しくは数個」とは、前記酵素活性を有する範囲であれば、配列番号１に示す塩基配列において塩基が、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは1〜５個、さらに好ましくは４個、よりさらに好ましくは１〜３個、欠失、置換若しくは付加されていてもよいことを意味する。また、「欠失」、「置換」、「付加」とは、配列番号１に示す塩基配列によりコードされる蛋白質（又はポリペプチド）（配列番号２）と同様の性質を有する蛋白質をコードする塩基配列を生じるものをいう。
【００３７】
同様に、前記した配列番号３又は配列番号１６に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し且つフラボノイド３’−水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ）活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列は、塩基配列３又は配列番号１６に示す塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であり且つフラボノイド３’−水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ）活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列であることもできる。ここで、ＤＮＡ又は塩基配列における「１若しくは数個」とは、前記酵素活性を有する範囲であれば、配列番号３又は配列番号１６に示す塩基配列において塩基が、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは1〜５個、さらに好ましくは４個、よりさらに好ましくは１〜３個、欠失、置換若しくは付加されていてもよいことを意味する。また、「欠失」、「置換」、「付加」とは、配列番号３又は配列番号１６に示す塩基配列によりコードされる蛋白質（又はポリペプチド）（配列番号４又は又は配列番号１７）と同様の性質を有する蛋白質をコードする塩基配列を生じるものをいう。
【００３８】
前記した配列番号１又は配列番号１１に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し且つフラボノイド３’，５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列は、配列番号１又は配列番号１１に示す塩基配列の相補鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ且つフラボノイド３’，５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列であることができる。
同様に、前記した配列番号３又は配列番号１６に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し且つフラボノイド３’−水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ）活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列は、塩基配列３に示す塩基配列の相補鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ且つフラボノイド３’−水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ）活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列であることができる。
【００３９】
ここで、塩基又はＤＮＡ（配列）における「ストリンジェントな条件」とは、配列番号１又は１１又は３又は１６に示す塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖にハイブリダイズさせるＤＮＡに応じて、ハイブリダイゼーション時の、好ましくはさらに洗浄時の温度及び塩濃度を適宜決定することにより設定し得るが、ストリンジェントな条件としては、例えば、ザンブルーク（Sambrook）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.）」〔（Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕等に記載の条件が挙げられる。具体的には、例えば、（ｉ）６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍＬ 変性断片化サケ精子ＤＮＡと５０％ ホルムアミドを含む溶液中、プローブと共に４２℃で一晩保温し、（ｉｉ）非特異的にハイブリダイズしたプローブを洗浄により除去するステップ、ここで、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の４０℃下、よりストリンジェントには、３０℃下、さらにストリンジェントには、２５℃下、よりさらにストリンジェントには、１０℃下、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、２５℃以上、よりストリンジェントには、３７℃以上、さらにストリンジェントには、４２℃以上、よりさらにストリンジェントには、５０℃以上、より一層ストリンジェントには、６０℃以上等の条件下で洗浄を行う、という条件が挙げられる。Ｔｍは、例えば、下記式：Ｔｍ＝81.5+16.6（log[Na+]）+0.41（%G+C）-（600/N）（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチド中のグアニン及びシトシン残基の含有量である）により求められる。ハイブリダイゼーションの操作は、例えば、前記成書を参照して行えばよい。尚、本明細書において記載する操作は、当該成書を参照することにより適宜実施することができる。
【００４０】
前記した配列番号３又は配列番号１６に示す塩基配列又は配列番号３又は配列番号１６に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し且つフラボノイド３’−水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ）活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列から成るユリ由来のＦ３’Ｈ遺伝子の断片を導入による、ユリ花弁内でのシアニジン合成に働く内因性Ｆ３’Ｈ発現の抑制は、アンチセンス法、センス法（コサプレッション法）、ＲＮＡｉ法等、いずれでも構わないが、好ましくは、ＲＮＡｉ法である。
【００４１】
本発明は、配列番号１３に示す塩基配列又は配列番号１３に示す塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し且つジヒドロフラボノール4-還元酵素（ＤＦＲ）活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列から成るユリ由来のＤＦＲ遺伝子の断片を導入して、ユリ花弁内で、シアニジン合成に働く内因性ＤＦＲの発現を抑制し、同時にアイリス由来の外来ＤＦＲ遺伝子を導入することをさらに含む前記方法にも関する。該内因性ＤＦＲの発現の抑制は、好ましくは、ＲＮＡｉ法により行われる。
【００４２】
本発明は、配列番号２４に示すユリＤＦＲプロモーター配列を使用することをさらに含む前記方法にも関する。
【００４３】
尚、配列番号１、１１、３及び１６に関して前記した、塩基配列における１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加、配列同一性、ハイブリダイズ条件の定義は、配列番号１３及び２４にも同様に適用され、例えば、配列番号１３及び２４に示す塩基配列に代えて、これらと少なくとも９０、９５又は９９％の配列同一性を有する塩基配列も本発明の範囲内にある。
【００４４】
本発明に係る花弁にデルフィニジンを含有するユリを生産する方法により生産された花弁にデルフィニジンを含有するユリ、又はその組織若しくはその部分又はその栄養増殖体若しくはその子孫も、本発明の範囲内である。該組織若しくはその部分は、好ましくは切り花であることができる。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲がこれら実施例により限定されることを意図するものではない。【００４６】
［参考例１：ツルニチニチソウＦ３’５’Ｈ遺伝子のユリでの発現］
プラスミドpNAVFH（非特許文献９参照、ツルニチニチソウのＦ３’５’Ｈ遺伝子を植物で発現させるためのバイナリーベクター）を、アグロバクテリウム系統EHA101に導入した。この組換えアグロバクテリウムを用いてユリ品種アカプルコ（花はピンク色）を形質転換した。ユリの形質転換は、公知の方法、例えば、非特許文献１０に記載された方法で行なったが、これに限定されるものではない。
導入したＦ３’５’Ｈ遺伝子がユリにおいて機能し、デルフィニジンの蓄積をもたらすかどうかを花弁において調べるのは、形質転換されたユリの組織培養植物体を取得してから２年〜３年を要する。培養葉柄にアントシアニンの着色が見られることに着目しこの葉柄のアントシアニンを分析することにより、少なくとも導入遺伝子が全く又はほとんど機能しなかったことは、迅速に判定することができる。得られた19系統の形質転換ユリの組織培養植物体を取得した。これらのアントシアニンの着色が見られる葉柄約0.5gを回収し、特許文献２に記載された方法を用いてアントシアニジン分析を行なった。その結果、デルフィニジンが検出された系統は認められなかった。【００４７】
［参考例２：サイネリアＦ３’５’Ｈ遺伝子のユリでの発現］
サイネリア由来のF3’5’H  cDNA Ci5a18（特許文献９参照）を含むプラスミドpSPB2774をSmaIとXhoIで消化して得られる約1.7kbのDNA断片と、プラスミドpＢＩ221をHindIIIとBamHIで消化して得られるカリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーター（以下、「35Sプロモーター」ともいう。）を含むDNA断片と、プラスミドpSPB176（特許文献７参照）をHindIIIとSalIで消化して得られるDNA断片のうちレプリコンを含むDNA断片とを連結し、プラスミドpSPB3472を得た。このプラスミドをAscIとPacIで消化して得られるDNA断片（35SプロモーターとCi5a18とノパリンシンターゼターミネーターが連結した配列を含む）を、#493をAscIとPacIで消化したDNA断片と連結し、プラスミドpSPB3376を得た。これを参考例１に記載したようにアグロバクテリウムを用いてユリに導入し、65系統の形質転換ユリの組織培養植物体を取得した。このうち23系統のアントシアニンを蓄積した葉柄を取得したが、デルフィニジンを蓄積している系統は得られなかった。【００４８】
［参考例３：リンドウＦ３’５’Ｈ遺伝子のユリでの発現］
リンドウのF3’5’HcDNAを含むプラスミドpGHF48（特許文献４参照）をBamHIとXhoIで消化して得られる約1.7kbのDNA断片を、BamHIとSalIで消化したプラスミドpSPB176と連結して、プラスミドpSPB3329を得た。これをHindIIIとBamHIで消化することによりプロモーター部分を除去した。ここに、pBI221をHindIIIとBamHIで消化して得られるDNA断片（35Sプロモーターを含む）を挿入することによりプラスミドpSPB3473を得た。このプラスミドをAscIとPacIで消化して得られるDNA断片（35SプロモーターとリンドウF3’5’H cDNA とノパリンシンターゼターミネーターが連結した配列を含む）を、pSPB493をAscIとPacIで消化したDNA断片と連結し、プラスミドpSPB3378を得た。これを参考例１に記載したようにアグロバクテリウムを用いてユリに導入し、65系統の形質転換ユリの組織培養植物体を取得した。このうち26系統のアントシアニンを蓄積した葉柄を取得した。デルフィニジンの蓄積比率（全アントシアニジン量のうちのデルフィニジンが占める割合）は最高でも1%に過ぎなかった。【００４９】
［参考例４：ラベンダーＦ３’５’Ｈ遺伝子のユリでの発現］
ラベンダーのF3’5’HcDNAを含むプラスミドpLBG8（特許文献４参照）をBamHIとXhoIで消化して得られる約1.7kbのDNA断片を、BamHIとSalIで消化したプラスミドpSPB176と連結し、プラスミドpSPB2772を得た。これをBamHIとPacIで消化することにより得られるラベンダーF3’5’HcDNAとノパリンシンターゼターミネーターが連結した配列を含むDNA断片を回収した。このDNA断片を、プラスミドpSPB3472（３３７７）をBamHIとPacIで消化して得られるDNA断片のうちレプリコンを含む断片と連結して、pＳＰＢ3471を得た。このプラスミドをAscIとPacIで消化して得られるDNA断片（35SプロモーターとリンドウF3’5’H cDNA とノパリンシンターゼターミネーターが連結した配列を含む）を、pSPB 493をAscIとPacIで消化したDNA断片と連結し、プラスミドpSPB3376を得た。これを参考例１に記載したようにアグロバクテリウムを用いてユリに導入し、23系統の形質転換ユリの組織培養植物体を取得した。このうち20系統のアントシアニンを蓄積した葉柄を取得した。デルフィニジンの蓄積比率（全アントシアニジン量のうちのデルフィニジンが占める割合）は最高でも1%に過ぎなかった。【００５０】
［参考例５：チョウマメＦ３’５’Ｈ遺伝子のユリでの発現］
チョウマメのF3’5’H遺伝子（ＤＮＡデータベースアクセション番号AB234897）はバーベナに導入した場合に、バーベナ自身のF3’5’H遺伝子を導入した場合よりも、良好に機能し、より高いデルフィニジン含有率とより明瞭な花色変化をもたらしたことが報告されている（非特許文献５参照）。プラスミドpSPB748（非特許文献５参照）をEcoRIで消化し、平滑末端化し、BamHIで消化した後、チョウマメ由来のF3’5’HcDNAを含むDNA断片を回収した。一方、pSPB176をSalIで消化し、平滑末端化し、BamHIで消化したDNA断片を得た。これら２つのDNA断片を連結することによりpSPB3166を得た。ハイグロマイシン抵抗性を与える遺伝子を含むバイナリーベクターpBI333（非特許文献１１参照）をAscIとPacIで消化したDNA断片に、pSPB3166をAscIとPacIで消化して得られたF3’5’HcDNAを含むDNA断片を挿入した。得られたバイナリーベクターをpSPB3169とした。このバイナリーで形質転換された植物においてはチョウマメF3’5’H遺伝子がエンハンサーを付加されたカリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーター（非特許文献１２参照）の制御下に転写される。【００５１】
チョウマメのF3’5’H遺伝子をユリに導入するとデルフィニジンが生産されることを期待して、これを参考例１に記載したようにアグロバクテリウムを用いてユリに導入し、23系統の形質転換ユリの組織培養植物体を取得した。このうち6系統のアントシアニンを蓄積した葉柄を取得したが、デルフィニジンを蓄積している系統は得られなかった。【００５２】
［参考例６：パンジーＦ３’５’Ｈ遺伝子のユリでの発現］
いくつかの植物に由来するF3’5’H遺伝子をバラに導入した場合、パンジーに由来するF3’5’H遺伝子（ＤＮＡデータベースアクセッション番号AB332097）だけが良好にデルフィニジンを蓄積し、花の色も明瞭に変化した（特許文献４参照）。また、この遺伝子はキクの花弁でもデルフィニジンを蓄積し、花色を青く変化させた（特許文献５参照）。これらの事実からパンジー由来のF3’5’H遺伝子は異種の植物においてデルフィニジンを生産させるために適していると推定された。【００５３】
パンジーF3’5’HcDNAを含むプラスミドpSPB575（特許文献８参照）をAscIとPacIで消化して得られるDNA断片と、pSPB3166をAscIとPacIで消化して得られたDNA断片とを連結することによりpSPB3138を得た。このバイナリーで形質転換された植物においてはパンジーF3’5’H遺伝子がエンハンサーを付加されたカリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーターの制御下に転写される。
パンジーのF3’5’H遺伝子をユリに導入するとデルフィニジンが生産されることを期待し、これを参考例１に記載したようにアグロバクテリウムを用いてユリに導入し、25系統の形質転換ユリの組織培養植物体を取得した。このうち12系統のアントシアニンを蓄積した葉柄を取得したが、デルフィニジンを蓄積している系統は得られなかった。【００５４】
［実施例１］
（１）カンパニュラゲノムＤＮＡからのＦ３’５’Ｈ遺伝子の単離
カンパニュラ(Campanula medium)の葉からDNAeasy(QIAGEN)を用いて染色体DNAを抽出した。カンパニュラ(Campanula medium)F3’5’H cDNAの塩基配列(ＤＮＡデータベースアクセッション番号14590)をもとに、ヌクレオチドCFH1L：5'-CATGTCTATAGACATATCCACCCTCTTCTATGAAC-3'（配列番号５、下線部が開始コドン）、cCFH1L：5'-GCCTAGACAGTGTAAGAACTTGGAGGCAATCTTGG-3'（配列番号６）を合成した。染色体DNA 100 ngを鋳型にし、前記ヌクレオチドをプライマーとして用いて、PCRを行なった。PCRにはTaKaRa LA PCR （タカラバイオ株式会社）を用い、製造者が推奨する条件で行なった。得られた塩基配列を配列番号１に示す。この塩基配列がコードしているアミノ酸配列番号２は、ＤＮＡデータベースアクセション番号D14590に登録されているものと同じであった。【００５５】
（２）カンパニュラゲノムＤＮＡからのＦ３’５’Ｈ遺伝子を含むバイナリーベクターの構築
プラスミドpBI221（非特許文献１３参照）を制限酵素SmaIとSacIで消化後、Blunting Kit（タカラバイオ株式会社）を用いて平滑末端化し、ライゲーションを行なった。得られたプラスミドを制限酵素BamHIで消化し、平滑末端化した。このDNA断片を、デオキシチミジントリリン酸の存在下においてDNAポリメラーゼと反応させることにより、このDNA断片の3'末端にデオキシチミジンを１塩基付加した。このDNA断片と上述のカンパニュラ染色体DNA由来のPCR断片とを連結した。得られたプラスミドのうち、カンパニュラF3’5’H遺伝子の開始コドンが35Sプロモーターの配列に近い方向に挿入されたものをp35S-CFH-1とした。このプラスミドをPvuIIで消化して、アガロースゲル電気泳動により分離し、カンパニュラF3’5’H遺伝子を含むDNA断片を回収した。【００５６】
プラスミドpNAVFH（非特許文献９参照、ツルニチソウのF3’5’H遺伝子を植物で発現させるためのバイナリーベクター)を制限酵素HindIIIとXbaIで消化し、平滑末端化し、脱リン酸を行なった。これをアガロースゲル電気泳動により分離し、分子量の大きな方のDNA断片を回収した。このDNA断片と上記のカンパニュラF3’5’H遺伝子を含むDNA断片とを連結し、得られたバイナリーベクターをpNARI-CFHとした。【００５７】
（３）ユリＦ３’Ｈ遺伝子断片の単離（pCR2.1-AP24-1の構築）
過去に報告されているF3’Hのアミノ酸配列アラビドプシス（ＤＮＡデータベースアクセション番号（以下同じ）AF271651）、アスター（AF313488）、ダイズ（AF499731）、ストック（AF313491）、イネ（AC021892）、ゼラニウム（AF315465）、シソ（AB045593）、ペチュニア（AF155332）、トレニア（AB057672）を元に、オリゴヌクレオチドF3H2：5'-YTSGCYGGWGTWTTYAACRTHGG-3'アラビドプシスの配列ではLAGVFNIGに相当（配列番号７）、cF3H4：5'-GGRTCNCGRGCWATGGCCCA-3'アラビドプシスの配列ではNIWAIARDPに相当（配列番号８）を合成した。ここで、Yは、CとTの混合物、Wは、AとTの混合物、Sは、CとGの混合物、Rは、AとGの混合物、Hは、A、T、Cの混合物、そしてNは、G、A、T、Cの混合物である。ユリ品種アカプルコ（株式会社山喜農園）の花弁からRNAeasy(QIAGEN社)を用いてRNAを抽出した。このRNAを鋳型に、F3H2とオリゴdＴをプライマーとして用いてRT-PCRを行なった。RT-PCRはRT-PCRキット（invitrogen社）を用いて行なった。増幅されたDNA断片を鋳型にし、F3H2とcF3H4をプライマーにし、前述のようにPCRを行なった。得られたDNA断片を配列番号３とした。この配列を有するＤＮＡ断片を、プラスミドpCR2.1(invitrogen社)に連結した。得られたプラスミドをpCR2.1-AP24-1とした。【００５８】
（４）プラスミドpNARI-Tr3の構築
プラスミドpCR2.1-AP24-1をSpeIとXbaIで切断し、平滑末端化し、アガロースゲル電気泳動により分離した。得られたDNA断片のうち６６５ｂｐの長さののDNA断片を回収した。このDNA断片を、プラスミドpBI221を制限酵素SacIとMluIで切断し、平滑末端化し、脱リン酸化処理を行なって得たDNA断片と連結した。得られたプラスミドをp35S-GUSL-AP24とした。
プラスミドpCR2.1-AP24-1をSpeIとNotIで切断し、平滑末端化し、アガロースゲル電気泳動により分離した。得られたDNA断片のうち６４７ｂｐのDNA断片を回収した。このDNA断片を、プラスミドp35S-GUSL-AP24をSmaIで消化し、脱リン酸化処理を行なって得たDNA断片と連結し、プラスミドp35S-F3'HTr2とした。【００５９】
プラスミドp35S-F3'HTr2をPvuIIで切断し、アガロースゲル電気泳動により分離した約３．３ｋｂのDNA断片を回収した。一方、プラスミドｐNARI-CFHをClaIとNheIで切断し、平滑末端化し、脱リン酸化した後、アガロースゲル電気泳動により、分離した。ここからレプリコンを含むDNA断片を回収し、上記の約３．３ｋｂのDNA断片と連結した。得られたプラスミド又はバイナリーベクターをpNARI-Tr3（以下、単に「Tr3」ともいう。）とした。図２に示すように、このバイナリーベクターは、T-DNA上にハイグロマイシンリン酸化酵素遺伝子を選抜マーカーとして持ち、カンパニュラのF3’5’H遺伝子を構成的に発現し、かつユリのF3’H遺伝子の二本鎖RNAを転写することによりユリのF3’H遺伝子の発現を抑制することを意図している。【００６０】
（５）ユリの形質転換
バイナリーベクターpNARI-CFHとpNARI-Tr3を、アグロバクテリウム系統EHA101に、それぞれ、導入した。この組換えアグロバクテリウムを用いて、参考例１に記載したようにユリ品種アカプルコ（花はピンク色）を形質転換した。pNARI-CFHを含むアグロバクテリウムを用いた場合には、31系統の形質転換されたユリの組織培養物を取得した。アントシアニンを蓄積した葉柄のアントアニジンを分析したところ、4系統が総アントシアニジンのうち５％以上のデルフィニジンを蓄積していた。デルフィニジンの含有率は最高１８％であった。【００６１】
一方、pNARI-Tr3を含むアグロバクテリウムを用いた場合には、４０系統の形質転換されたユリの組織培養植物体を取得した。アントシアニンを蓄積した葉柄のアントアニジンを分析したところ、以下の表１に示すように、１３系統が、総アントシアニジンのうち５％以上のデルフィニジンを蓄積していた。デルフィニジンの含有率は最高６８%であった。これら組換えユリのうちのいくつかを遺伝子組換え植物を栽培できる温室において開花させたところ、花弁におけるデルフィニジンの含有率は最高８０％に達し、元の品種の色が英国王立園芸協会のカラーチャート番号N74Dであるのに対し、花の色は元の品種に比べ青く変化していて、カラーチャートで番号は81Cであった。【００６２】
【表１】
2012036290.tif 000002
【００６３】
また、組換え体では宿主では見られないペラルゴニジンも検出された。これは、F3’H遺伝子の抑制の効果であると推察される。【００６４】
同様にpNARI-Tr3を含むアグロバクテリウムを用いて、ティアラ（株式会社山喜農園）（以下、「TI」ともいう。）、ユリ品種RO94-19（新潟県育成品種）（以下、「RO」ともいう。）、MP8（藤井美和氏より分譲）に形質転換し、それぞれ、形質転換系統として38系統、82系統、12系統を得た。これらの系統においてアントシアニンを蓄積した葉柄のアントアニジンを分析したところ、デルフィニジンの平均含有率は、それぞれ、24％、8％、11％であり、デルフィニジンの含有率の最大値は、それぞれ、68%、53% 、35%であった。
TI（ティアラ）とRO（RO94-19）に関して開花したものの分析値と花色を以下に表２に示す。開花した形質転換ティアラの花弁のデルフィニジンの含有率の最大値は74%であった（個体番号TI Tr3 No. 42)。開花した形質転換RO94-19の花弁のデルフィニジンの含有率の最大値は15%であった（個体番号RO Tr3 No. 9)。【００６５】
【表２】
2012036290.tif 000003
【００６６】
さらに、LC-FTICR-MSの手法（非特許文献１４、非特許文献１５参照）により宿主アカプルコと組換えユリ（以下、「アカプルコTr3-5」ともいう。）のアントシアニンを分析した。この手法を用いるとアントシアニンの精密マススペクトルを測定でき、タンデム質量分析によりMS/MSスペクトルを得ることができる。宿主アカプルコでは、検出m/z 595.166612 (MS/MSのm/z 287.1(100%), 432.8(0.9 %), 449.1 (14.7 %) ()内はピーク強度の相対比)であるシアニジンにラムノースとグルコースが１当量結合したものに相当するピークが主なアントシアニンであった。一方、アカプルコTr3-5は、宿主アカプルコには見られない２つのピーク、すなわち、検出m/zが 611.160529 (MS/MSのm/z 303.1(100%), 449.2(1.1%), 465.1(10.8%))と m/z が611.160902 (MS/MSのm/z 303.1(100%), 449.1(0.7%), 465.1(12.3%))であるデルフィニジンにラムノースとグルコースが１当量結合したものに相当するピークが見られた。さらに、アカプルコTr3-5には、宿主アカプルコには極僅かしか認められないペラルゴニジンにラムノースとグルコースが１当量結合したものに相当するピーク（検出m/zが 579.171847 (MS/MSのm/z 271.1(100%), 417.1(0.8%), 433.1(18.4%))の増加が認められた。【００６７】
［実施例２：カンパニュラＦ３’５’Ｈ  ｃＤＮＡのユリにおける発現］
（１）カンパニュラF3’5’H cDNAの単離
DNAデータベースGenBankに登録されているカンパニュラ（Campanula medium）のF3'5'H cDNA（ＤＮＡデータベースアクセション番号D14590）の翻訳配列に基づいて2種のプライマーCamF1：5’-GTGAAGCCACCATGTCTATAG-3’（配列番号９)とCamR1：5’-GCATTTGCCTAGACAGTGTAAG-3'（配列番号１０）を合成した。市販のカンパニュラの蕾の花弁からRNeasy Mini Plant Kit (QIAGEN社)を用いてRNAを抽出し、RT-PCRキットを用いて1st strand DNAを合成した。この1st strand DNAを鋳型に、プライマーを用いてPCRを実施した。得られたDNA断片をｐCR-TOPO IIにクローニングした。この内、クローン＃４（pSPB2561とした）のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１１と決定した。ＤＮＡデータベースアクセション番号D14590に登録されているF3’5’Hが523（配列番号２）残基から成るのに対し、クローン＃４のｃＤＮＡがコードするF3’5’Hは521残基（配列番号１２）から成り、D14590に登録されているF3’5’Hに対し95%の同一性を示した。【００６８】
実施例１でユリに導入したバイナリーベクターにはカンパニュラの染色体由来のF3’5’H遺伝子が含まれている。この配列（配列番号１）にはイントロンがある。この染色体由来のF3’5’H遺伝子を上記クローン＃4由来の配列（イントロンは含まない）に置き換えたバイナリーベクターを構築した。F3’Hの二本鎖DNAを含まないバイナリーベクターをpNARI-cCFH（以下、「cC」ともいう。）とし、F3’Hの二本鎖DNAを含むバイナリベクターをpNARI-cTr3（以下、「cTr3」ともいう。）とした。
以下の表３に示すように、pNARI-cCFHを含むアグロバクテリウムを用いた場合には、４２系統の形質転換されたユリの組織培養植物体を取得した。アントシアニンを蓄積した葉柄を取得した。アントシアニンを蓄積した葉柄のアントアニジンを分析したところ、16系統が総アントシアニジンのうち５％以上のデルフィニジンを蓄積していた。デルフィニジンの含有率は最高３６%であった。【００６９】
【表３】
2012036290.tif 000004
【００７０】
以下の表３に示すように、pNARI- cTr3を含むアグロバクテリウムを用いてユリ品種アカプルコ、RO９４−１９、ティアラ、ＭＰ８を形質転換し、形質転換植物を、それぞれ、123系統、46系統、33系統、2系統取得した。アントシアニンを蓄積した葉柄のデルフィニジン含有率の平均は、それぞれ、10％、15％、20％、4％であり、デルフィニジン含有率の最大値は、それぞれ、63％（個体番号AP cTr3 No. 80)、48％、54％、7％であった。分析結果を以下の表４〜６にまとめた。形質転換アカプルコを開花させ、花弁のアントシアニジンを分析したところ、No．80-1とした系統ではデルフィジンの含有率は73％であった。その花色はデルフィニジン含有率が80％であった形質転換アカプルコ（実施例１に記載）と同様であった。【００７１】
【表４】
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【００７２】
【表５】
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【００７３】
【表６】
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【００７４】
［実施例３：Tr3Mの構築とユリの形質転換］
pNARI-Tr3のT-DNA上に含まれるカンパニュラのF3’5’H遺伝子のターミネーターをノパリンシンターゼ遺伝子由来ターミネーターからマノピンシンターゼ遺伝子由来ターミネーター（特許文献１）に置換した。得られたベクターをpTr3Mとした。これを含むアグロバクテリウムを用いてユリ品種アカプルコ、RO94-19、ティアラ、MP8を形質転換し、形質転換植物を、それぞれ、6系統、19系統、71系統、11系統取得した。アントシアニンを蓄積した葉柄デルフィニジン含有率の平均は、それぞれ、38％、34％、7％、22％であり、デルフィニジン含有率の最大値は、それぞれ、72％、70％、54％、65％であった。【００７５】
［実施例４：Tr7の構築と形質転換］
（１）ジヒドロフラボノール4-還元酵素（DFR）遺伝子のユリからの取得
ユリ品種アクティバ（株式会社山喜農園）の花弁に由来するcＤＮＡライブラリーを、Lambda ZAP II ベクターを Eco RI 及びXho I で消化し、脱リン酸化した定方向クローニング用ベクターUni-ZAP XRベクター（アジレントテクノロジー株式会社）を用いて作製した。cＤＮＡライブラリーの作製方法として、例えば、WO01/092509に記載された方法を用いることができる。得られたcＤＮＡライブラリーを標識したゼラニウムのDFR cDNA（Genbank  アクセション番号AB534774、Plant Biotechnology、 27 (2010)  375-383に記載）を用いてスクリーニングすることによりユリDFRのcDNA（配列番号１３）をベクターpBluescriptIIのEcoRIとXhoIの制限酵素部に含むプラスミドpSPB3165を取得した。cDNA ライブラリーのスクリーニングは、例えば、WO01/092509に記載された方法により行うことができる。【００７６】
（２）ユリF3’H cＤＮＡの取得
実施例１で述べたpCR2.1-AP24-1に含まれるF3’H DNA断片を用いて上述のユリの花弁cDNAライブラリーをスクリーニングした。F3’H cDNAを含むプラスミドをpSPB3175とした。このcDNAは完全長ではなかったため、Gene Racerキット（インビトロジェン社）を用い、製造者の推奨する方法で、欠けていた5'側の配列を増幅した。PCR反応のための合成オリゴヌクレオチド LiRG-R3 : 5' TGCTCCGCTATCAACTTATC 3'（配列番号１５）を用いた。得られたDNA断片をpCR-TOPOIIにクローニングし、pSPB3194を得た。このプラスミドからPstIとSspIで消化して得られる約700bpのDNA断片をpSPB3175のPstIとSspIに挿入し、pSPB3198を得た。このプラスミドには合成したユリのF3’H cDNA（配列番号１６）が含まれる。【００７７】
（３）ベクター構築
カンパニュラF3’5’H遺伝子とアイリスのDFR遺伝子をユリで発現し、ユリのF3’H遺伝子とDFR遺伝子の発現を抑制するためのバイナリーベクターTr7を構築した。
ユリDFR遺伝子の発現を抑制するためのカセットは次のように作製した。プラスミドpSPB3165をEcoRIとPstIで消化して得られる約0.5kbのDNA断片（ユリDFR cDNAのN末端付近をコードする配列を含む）をプラスミドpBluescriptSK-(アジレントテクノロジー株式会社）のEcoRIとPstI部位にクローニングした。このプラスミドをBamHIとSalIで消化して得られる約0.5kbのDNA断片（ユリDFR cDNAのN末端付近をコードする配列を含む）とプラスミドpSPB906(WO2005/017147に記載)をBamHIとEcoRIで消化して得られる約3.5kbのDNA断片とプラスミドpSPB176をSalIとEcoRIで消化して得られる約300bpのDNA断片（ノパリンシンターゼターミネーターを含む）を連結することによりプラスミドpSPB3168を得た。上述のプラスミドpSPB3165をBamHIとEcoRVで消化して得られる約0.8kbのDNA断片（ユリDFR cDNAのN末端側の部分をコードする配列を含む）を、BamHIとSmaIで消化したプラスミドpSPB3168と連結することによりプラスミドpSPB3178を得た。本プラスミドは、エンハンサーが付加された３５SプロモーターがユリDFR cDNAの二本鎖RNAを構成的に転写するためのカセットを含んでいる。プラスミドpSPB3178のエンハンサーが付加された35Sプロモーター配列を35Sプロモーター配列に置換したプラスミドをpSPB3456とした。【００７８】
プラスミドpSPB912(WO2005/017147に記載)のエンハンサーが付加された35Sプロモーター配列を35Sプロモーター配列に置換したプラスミドをpSPB3419とした。このプラスミドはアイリスのDFR cDNAを構成的に発現することを目的としている。ユリF3’H遺伝子の発現を抑制するためのカセットは次のように作製した。pSPB3198をHaeIIで消化後、平滑末端化し、さらにBamHIで消化して、F3'H cDNAの5'側を含むDNA断片を回収した。次に、pSPB3194をHaeIIで消化後、平滑末端化し、さらにXhoIで消化して、F3'H cDNAの5'側を含むDNA断片を回収した。これらのDNA断片をBamHIとSalIで消化したpSPB912と連結することによりpSPB3200を得た。pSPB3200のエンハンサーが付加された35Sプロモーター配列を35Sプロモーター配列に置換したプラスミドをpSPB3455とした。pSPB3456、pSPB3419、pSPB3455からぞれぞれ転写カセットを回収し、Tr7の構築に供した。【００７９】
Tr7は、T-DNA上に5個の転写カセット、すなわち、ライトボーダー配列側から、（ｉ）35Sプロモーター配列‐ユリDFR cDNAの二本鎖RNAを転写するために配列-ノパリンシンターゼターミネーター、（ｉｉ）35Sプロモーター配列‐イントロンを含むカンパニュラF3’5’H遺伝子配列-ノパリンシンターゼターミネーター（Tr3に含まれるものと同じ）、（ｉｉｉ）35Sプロモーター配列‐アイリスDFR遺伝子配列-ノパリンシンターゼターミネーター、（ｉｖ）35Sプロモーター配列‐ユリF3'H cDNAの二本鎖RNAを転写するために配列-ノパリンシンターゼターミネーター（Tr7に含まれるものと同じ）、（ｖ）35Sプロモーター配列‐ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子配列-ノパリンシンターゼターミネーター（Tr3に含まれるものと同じ）を含む。Tr７のマップを、図３に示す。【００８０】
（４）形質転換ユリの作製
Tr7を含むアグロバクテリウムを用いてユリ品種アカプルコ、RO94-19、ティアラ、MP8を形質転換し、形質転換植物を、それぞれ、22系統、80系統、32系統、11系統取得した。アントシアニンを蓄積した葉柄デルフィニジン含有率の平均は、それぞれ、15％、13％、6％、28％であり、デルフィニジン含有率の最大値は、それぞれ、78％、88％、56％、87％であった。
RO94-19の形質転換体のうち、系統RO94-19 Tr7 No.52-3の花弁のデルフィニジン含有率は99％であった。【００８１】
［実施例５：Tr8の構築と形質転換］
バイナリーベクターTr7とはT-DNA上の発現カセットの順番が異なるバイナリーベクターTr8を作製した。Tr8はT-DNA上に5個の転写カセット、すなわち、ライトボーダー配列側から、（ｉ）35Sプロモーター配列‐イントロンを含むカンパニュラF3’5’H遺伝子配列-ノパリンシンターゼターミネーター（Tr3に含まれるものと同じ）、（ｉｉ）35Sプロモーター配列‐アイリスDFR遺伝子配列-ノパリンシンターゼターミネーター（Tr7に含まれるものと同じ）、（ｉｉｉ）35Sプロモーター配列‐ユリDFR cDNAの二本鎖RNAを転写するために配列-ノパリンシンターゼターミネーター（Tr7に含まれるものと同じ）、（ｉｖ）35Sプロモーター配列‐ユリF3'H cDNAの二本鎖RNAを転写するために配列-ノパリンシンターゼターミネーター（Tr7に含まれるものと同じ）、（ｖ）35Sプロモーター配列‐ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子配列-ノパリンシンターゼターミネーター（Tr3に含まれるものと同じ）を含む。Tr8のマップを図３に示す。Tr8を含むアグロバクテリウムを用いてユリ品種アカプルコ、RO94-19、ティアラを形質転換し、形質転換植物を、それぞれ、66系統、6系統、87系統取得した。アントシアニンを蓄積した葉柄デルフィニジン含有率の平均は、それぞれ、15％、6％、30％(87系統のうち8系統の葉柄を分析)であり、デルフィニジン含有率の最大値は、それぞれ、51％、6％、70％であった。【００８２】
［実施例６：Tr9の構築と形質転換］
カンパニュラF3’5’HcＤＮＡを発現させるバイナリーベクターTr9を構築した。図３にTr9のマップを示す。Tr9は、T-DNA上に5個の転写カセット、すなわち、ライトボーダー配列側から、（ｉ）35Sプロモーター配列‐カンパニュラF3’5’H遺伝子cDNA配列-ノパリンシンターゼターミネーター（cTr3に含まれるものと同じ）、（ｉｉ）35Sプロモーター配列‐ユリDFR cDNAの二本鎖RNAを転写するために配列-ノパリンシンターゼターミネーター（Tr7に含まれるものと同じであるが向きが異なる）、（ｉｉｉ）ノパリンシンターゼターミネーター‐ユリF3'H cDNAの二本鎖RNAを転写するために配列-35Sプロモーター配列（Tr7に含まれるものと同じであるが向きが異なる）、（ｉｖ）ノパリンシンターゼターミネーター‐アイリスDFR遺伝子配列-35Sプロモーター配列（Tr7に含まれるものと同じであるが向きが異なる）、（ｖ）35Sプロモーター配列‐ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子配列-ノパリンシンターゼターミネーター（Tr3に含まれるものと同じ）を含む。Tr9を含むアグロバクテリウムを用いてユリ品種アカプルコ、RO94-19、ティアラを形質転換し、形質転換植物を、それぞれ、8系統、51系統、33系統取得した。アントシアニンを蓄積した葉柄デルフィニジン含有率の平均は、それぞれ、2％、12％(51系統のうち44系統の葉柄を分析)、13％であり、デルフィニジン含有率の最大値は、それぞれ、9％、68％、38％であった。【００８３】
［実施例７：Tr10の構築と形質転換］
Tr10は、T-DNA上に5個の転写カセット、すなわち、ライトボーダー配列側から、（ｉ）35Sプロモーター配列‐カンパニュラF3’5’H遺伝子cDNA配列-ノパリンシンターゼターミネーター（cTr3に含まれるものと同じ）、（ｉｉ）35Sプロモーター配列‐アイリスDFR遺伝子配列-ノパリンシンターゼターミネーター（Tr7に含まれるものと同じ）、（ｉｉｉ）35Sプロモーター配列‐ユリDFR cDNAの二本鎖RNAを転写するために配列-ノパリンシンターゼターミネーター（Tr7に含まれるものと同じであるが向きが異なる）、（ｉｖ）35Sプロモーター配列‐ユリF3'H cDNAの二本鎖RNAを転写するために配列-ノパリンシンターゼターミネーター（Tr7に含まれるものと同じ）、（ｖ）35Sプロモーター配列‐ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子配列-ノパリンシンターゼターミネーター（Tr3に含まれるものと同じ）を含む。図３にTr10のマップを示す。Tr10を含むアグロバクテリウムを用いてユリ品種アカプルコ、RO94-19、ティアラ、MP8を形質転換し、形質転換植物を、それぞれ、41系統、14系統、78系統、10系統取得した。アントシアニンを蓄積した葉柄デルフィニジン含有率の平均は、それぞれ、23％、26％、15％(19系統を分析)、36％であり、デルフィニジン含有率の最大値は、それぞれ、80％、87％、75％、74％であった。
アカプルコの形質転換体系統AP Tr10 No.34-1の花の色は明瞭に変化しており（カラーチャート番号 N78A）、花弁中のデルフィニジン含有率は82％であった。【００８４】
［実施例８：Tr11の構築と形質転換］
（１）ユリDFR遺伝子のプロモーター配列の単離
ユリDFR遺伝子のプロモーター配列の単離は、インバースPCR法によって行った。DNAデータベースGenBankに登録されているユリ品種モントルー（花はピンク色）のDFRのcDNA配列（DNAデータベースアクション番号AB058641）に基づいて4種のプライマーcLD2L：5'-AGGGTCTCTCACAGTAGCCCGAACCGTGTAGCCA-3'（配列番号１８）、LD1L：5'-ACTAGATCTTCCTGGAGCTGATGAACGGCTAACC-3'（配列番号１９）、cLD1L：5'-AACATAGCCACTAGCTCCAGTAACCACCACGGGTC-3'（配列番号２０）、LD3L：5'-AGCAAATCCAGCTTGTTCACTTGGATGACGTATGC-3'（配列番号２１）を合成した。ユリ品種モントルー（株式会社山喜農園）の葉からDNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いてDNAを精製した。得られたDNAを制限酵素EcoRIで切断した後、DNA Ligation Kit <Mighty Mix>（タカラバイオ株式会社）を用いたDNA断片のセルフライゲーション反応によって環状DNAを作製した。この環状DNAを鋳型とし、cLD2LとLD1LをプライマーとしてTaKaRa LA Taq Hot Start Version（タカラバイオ株式会社）を用いて1回目のPCR反応を行った。さらに、増幅されたDNAを鋳型とし、cLD1LとLD3LをプライマーとしてTaKaRa LA Taq Hot Start Versionを用いて2回目のPCR反応を行うことにより、DFRのプロモーター部分を含むDNA断片を得た。得られたDNA断片は、プラスミドpCR2.1(Invitrogen社)に連結した。得られたプラスミドをpCR-LDEとした。さらにこのプラスミドを鋳型として、合成ヌクレオチドAscI-HindIII-LDE6-F （5’-GGCGCGCCAAGCTTGAATTCTTAGCGGAAATTATCC-3'）（配列番号２２）とXbaI-LDE6-R （5’-TCTAGAATCTCTCTCTCTCCCCCTC-3'）（配列番号２３）をプライマーとして用いて、ユリ  ＤＦＲ遺伝子のプロモーター配列（配列番号２４）を増幅した。この配列を含むＤＮＡ断片はHindIIIとXbaIによる消化により回収することができる。【００８５】
（２）ベクター構築とユリの形質転換
Tr11は、T-DNA上に5個の転写カセット、すなわち、ライトボーダー配列側から、（ｉ）ユリDFRプロモーター配列‐カンパニュラF3’5’H遺伝子cDNA配列-ノパリンシンターゼターミネーター、（ｉｉ）35Sプロモーター配列‐アイリスDFR遺伝子配列-ノパリンシンターゼターミネーター（Tr7に含まれるものと同じ）、（ｉｉｉ）35Sプロモーター配列‐ユリDFR cDNAの二本鎖RNAを転写するために配列-ノパリンシンターゼターミネーター（Tr7に含まれるものと同じ）、（ｉｖ）35Sプロモーター配列‐ユリF3'H cDNAの二本鎖RNAを転写するために配列-ノパリンシンターゼターミネーター（Tr7に含まれるものと同じ）、（ｖ）35Sプロモーター配列‐ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子配列-ノパリンシンターゼターミネーター（Tr3に含まれるものと同じ）を含む。図３にTr11のマップを示す。Tr11を含むアグロバクテリウムを用いてユリ品種RO94-19、ティアラ、MP8を形質転換し、形質転換植物を、それぞれ、66系統、120系統、18系統取得した。アントシアニンを蓄積した葉柄デルフィニジン含有率の平均は、それぞれ、40％、14％、38％であり、デルフィニジン含有率の最大値は、それぞれ、100％（52系統を分析）、54％（14系統を分析）、92％（11系統を分析）であった。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明により、ユリにおいて、内在性のフラボノイド合成酵素遺伝子の１つ又は複数の遺伝子の発現を抑制し、F3’5’H遺伝子又はF3’5’H遺伝子とDFR遺伝子を発現させることにより、天然にはないデルフィニジンを生産し、花の色が青く変化したユリを作製することができる。したがって、本発明は、花卉産業等において好適に利用可能である。
【符号の説明】
【００８７】
RB    ライトボーダー
LB    レフトボーダー
35Spro    カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター
NOSter    ノパリン合成酵素ターミネーター
LF3'Hf    ユリのＦ３’Ｈ遺伝子断片
CF3'5'H    カンパニュラＦ３’５’Ｈ遺伝子
Iris DFR    アイリスDFR遺伝子
cCF3'5'H    カンパニュラＦ３’５’Ｈ cDNA
LDFR    ユリDFR
HPT    ハイグロマイシン耐性遺伝子
【図１】
2012036290.tif 000008
【図２】
2012036290.tif 000009
【図３】
2012036290.tif 000010
【配列表】
2012036290000001.app
【国際調査報告】
2012036290.tif 000011
2012036290.tif 000012
2012036290.tif 000013
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