(57)【要約】  本発明は、細胞を生きたまま解析し、分別し、培養するに当たって、より簡便に、リアルタイムに作業ができ、培養細胞から不要細胞を除去・純化させながら培養できるようにし、さらに、培養細胞から所望の細胞を解析分別し、その細胞の純度、回収率、バイアビリティーを高めることを目的とする。  光照射によりクマリニルメチル骨格を含む光解離性基が結合解離して、細胞接着性材料が離脱し、細胞非接着性材料が残ることを特徴とする細胞接着性光制御基材を用いることにより、細胞像を検出、解析し、所望の細胞の位置情報を得ることができる。さらに、そのようにして得られた位置情報に基づいて、細胞を生きたまま解析し、分別することを可能とするものである。
2012141202.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光照射によりクマリニルメチル骨格を含む光解離性基が結合解離して、細胞接着性材料が離脱し、細胞非接着性材料が基材上に残ることを特徴とする細胞接着性光制御基材。
【請求項２】
基材側から順に、細胞非接着性材料にクマリニルメチル骨格を含む光解離性基を介して細胞接着性材料を結合した細胞接着性光制御材料を基材に成膜してなる細胞接着性光制御基材。
【請求項３】
光照射によりクマリニルメチル骨格を含む光解離性基が結合解離して、照射された部分の表面が細胞接着性材料から細胞非接着性材料に非可逆的に変化することを特徴とする細胞接着性光制御基材。
【請求項４】
前記光解離性基が下記一般式（５）で表される２価のクマリニルメチル骨格を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材。
【化１】
2012141202.tif 000040
[式中Ｒ4は２価で、Ｏ、ＣＯ、ＣＯ2、ＯＣＯ、ＯＣＯ2、ＯＣＯＮＨ、ＯＣＯＮＲ、ＮＨＣＯ2、ＮＨ、ＳＯ3及び(ＯＰＯ(ＯＨ))1〜3ＯＰＯ2からなる群から選択される基を表し；Ｒ5は水素、ハロゲン基及びアルコキシ基からなる群から選択される基であり；Ｒ６は
水素、ヒドロキシ基、アルコキシ基及びジアルキルアミノ基からなる群から選択される基を表すか、あるいは存在せず；Ｒ７は水素又はハロゲン基を表すか、あるいは存在せず；Ｒ８は水素又はハロゲン基を表し；Ｒ９は水素を表すか、あるいは存在せず；一般式（５）で表される式中の２価の位置は、Ｒ４の位置を共通として、一方をＲ６又はＲ７のベンゼン骨格の位置、又はＲ９のクマリニルメチルの位置である。]
【請求項５】
前記細胞接着性光制御材料が一般式（４）で表される細胞接着性基と一般式（５）で表される光解離性基をベンゼン骨格のＲ６の位置又はＲ７の位置、あるいはクマリニルメチルのＲ９の位置で直接又は間接に結合した構造を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞接着性光制御基材。
【化２】
2012141202.tif 000041
[式中、Ｘはカルボン酸、モノ若しくはポリカルボン酸アルキル基、アミノ基、モノ若しくはポリアミノアルキル基、アミド基、モノ若しくはポリアミドアルキル基、ヒドラジド基、モノ若しくはポリヒドラジドアルキル基、アミノ酸基、ポリペプチド基及び核酸基からなる群から選択される基を表す。]
【化３】
2012141202.tif 000042
[ここで、式中Ｒ4は２価で、Ｏ、ＣＯ、ＣＯ2、ＯＣＯ、ＯＣＯ2、ＯＣＯＮＨ、ＯＣＯＮＲ、ＮＨＣＯ2、ＮＨ、ＳＯ3及び(ＯＰＯ(ＯＨ))1〜3ＯＰＯ2からなる群から選択される基を表し；Ｒ5は水素、ハロゲン基及びアルコキシ基からなる群から選択される基を表し；Ｒ６は水素、ヒドロキシ基、アルコキシ基及びジアルキルアミノ基からなる群から選択される基を表すか、あるいは存在せず；Ｒ７は水素又はハロゲン基を表すか、あるいは存在せず；Ｒ８は水素又はハロゲン基を表し；Ｒ９は水素を表すか、あるいは存在せず；一般式（５）としての２価の位置は、Ｒ４の位置を共通として、一方をＲ６又はＲ７のベンゼン骨格の位置、又はＲ９のクマリニルメチルの位置である。]
【請求項６】
前記細胞接着性光制御材料が、下記一般式（６）で表される光解離性基と細胞接着性基とがベンゼン骨格で二価の連結基Ｒ１０を介して結合した構造、又は下記一般式（７）で表される光解離性基と細胞接着性基とがベンゼン骨格で二価の連結基Ｒ１１を介して結合した構造、又は下記一般式（８）で表される光解離性基と細胞接着性基とがクマリニルメチルの位置で二価の連結基Ｒ１２を介して結合した構造のいずれかを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞接着性光制御基材。
【化４】
2012141202.tif 000043
【化５】
2012141202.tif 000044
【化６】
2012141202.tif 000045
[ここで、一般式（６）、（７）及び（８）中、Ｘはカルボン酸、モノ若しくはポリカルボン酸アルキル基、アミノ基、モノ若しくはポリアミノアルキル基、アミド基、モノ若しくはポリアミドアルキル基、ヒドラジド基、モノ若しくはポリヒドラジドアルキル基、アミノ酸基、ポリペプチド基及び核酸基からなる群から選択される基を表し；式中Ｒ4は２価で、Ｏ、ＣＯ、ＣＯ2、ＯＣＯ、ＯＣＯ2、ＯＣＯＮＨ、ＯＣＯＮＲ、ＮＨＣＯ2、ＮＨ、ＳＯ3及び(ＯＰＯ(ＯＨ))1〜3ＯＰＯ2からなる群から選択される基を表し；Ｒ5は水素、ハロゲン基及びアルコキシ基からなる群から選択される基を表し；Ｒ６は水素、ヒドロキシ基、アルコキシ基及びジアルキルアミノ基からなる群から選択される基を表し；Ｒ７は水素又はハロゲン基を表し；Ｒ８は水素又はハロゲン基を表し；Ｒ９は水素を表し；２価の連結基Ｒ10は、Ｏ(ＣＨ2)m、Ｏ(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m、ＯＣＯ(ＣＨ2)m、ＯＣＯＣＨ2Ｏ(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m、ＯＣＨ2ＣＯ2(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m(ＣＨ2)m’、ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’ (ＯＣＨ2ＣＨ2)m、ＯＣＨ2ＣＯＮＣＨ３ＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’ (ＯＣＨ2ＣＨ2)m、及びＯＣＨ2ＣＯＮ(ＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’(ＯＣＨ2ＣＨ2)mX) ＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’ (ＯＣＨ2ＣＨ2)m（Ｒ10中、m、m'は０〜２０の整数）からなる群から選択される基を表し；２価の連結基Ｒ11は、ＣＨ2ＮＨ(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m(ＣＨ2)m’、ＣＨ2Ｎ((ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m(ＣＨ2)m’ X) (ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m(ＣＨ2)m’、ＣＨ2ＮＨＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’(ＯＣＨ2ＣＨ2)m、ＣＨ2Ｎ(ＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’(ＯＣＨ2ＣＨ2)mX) ＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’(ＯＣＨ2ＣＨ2)m、ＣＨ2Ｎ(ＣＨ３)、及びＣＨ2Ｎ(ＣＨ３) ＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’(ＯＣＨ2ＣＨ2)m（Ｒ11中、m、m'は０〜２０の整数）からなる群から選択される基を表し；２価の連結基Ｒ12は、ＣＨ2ＯＣＯ(ＣＨ2)m’、又は(ＣＨ2)m’’(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ２)m’（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ（Ｒ12中、m、m'、m''は０〜２０の整数）である基を表す。]
【請求項７】
前記細胞接着性光制御材料が、下記一般式（９）で表される光解離性基と細胞接着性基がクマニルメチル骨格のＲ４の位置で二価の連結基Ｒ１３を介して結合した構造を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞接着性光制御基材。
【化７】
2012141202.tif 000046
[ここで、式中Ｘはカルボン酸、モノ若しくはポリカルボン酸アルキル基、アミノ基、モノ若しくはポリアミノアルキル基、アミド基、モノ若しくはポリアミドアルキル基、ヒドラジド基、モノ若しくはポリヒドラジドアルキル基、アミノ酸基、ポリペプチド基及び核酸基からなる群から選択される基を表し；Ｒ4は２価で、Ｏ、ＣＯ、ＣＯ2、ＯＣＯ、ＯＣＯ2、ＯＣＯＮＨ、ＯＣＯＮＲ、ＮＨＣＯ2、ＮＨ、ＳＯ3及び(ＯＰＯ(ＯＨ)1〜3ＯＰＯ2からなる群から選択される基を表し；Ｒ5は水素、ハロゲン基及びアルコキシ基からなる群から選択される基を表し；Ｒ６は水素、ヒドロキシ基、アルコキシ基及びジアルキルアミノ基からなる群から選択される基を表すか、あるいは存在せず；Ｒ７は水素又はハロゲン基を表すか、あるいは存在せず；Ｒ８は水素又はハロゲン基を表し；Ｒ９は水素を表すか、あるいは存在せず；２価の連結基Ｒ1３は、(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m(ＣＨ2)m’、又は(ＣＨ2)m(Ｃ2ＨＮ３) (ＣＨ2) m’、（m、m'は０〜２０の整数）である基を表す。]
【請求項８】
前記細胞接着性光制御材料が、一般式（４）で表される細胞接着性基と一般式（５）で表される光解離性基をベンゼン骨格のＲ６又はＲ７の位置又はクマリニルメチル位のＲ９の位置、あるいはＲ４で直接あるいは間接に結合した前記構造を、前記細胞非接着性材料に直接あるいは間接に結合した構造を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞接着性光制御基材。
【化８】
2012141202.tif 000047
【化９】
2012141202.tif 000048
[ここで、一般式（４）中、Ｘはカルボン酸、モノ若しくはポリカルボン酸アルキル基、アミノ基、モノ若しくはポリアミノアルキル基、アミド基、モノ若しくはポリアミドアルキル基、ヒドラジド基、モノ若しくはポリヒドラジドアルキル基、アミノ酸基、ポリペプチド基及び核酸基からからなる群から選択される基を表し；一般式（５）中、Ｒ4は２価で、Ｏ、ＣＯ、ＣＯ2、ＯＣＯ、ＯＣＯ2、ＯＣＯＮＨ、ＯＣＯＮＲ、ＮＨＣＯ2、ＮＨ、ＳＯ3及び(ＯＰＯ(ＯＨ))1〜3ＯＰＯ2からからなる群から選択される基を表し；Ｒ5は水素、ハロゲン基及びアルコキシ基からからなる群から選択される基を表し；Ｒ６は水素、ヒドロキシ基、アルコキシ基及びジアルキルアミノ基からなる群から選択される基を表すか、あるいは存在せず；Ｒ７は水素又はハロゲン基であるか、あるいは存在せず；Ｒ８は水素又はハロゲン基を表し；Ｒ９は水素を表すか、あるいは存在しない。]
【請求項９】
前記細胞接着性光制御材料が、下記一般式（１０）、（１１）又は（１２）のいずれかで表される（メタ）アクリル酸エステル重合体構造を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞接着性光制御基材。
【化１０】
2012141202.tif 000049
【化１１】
2012141202.tif 000050
【化１２】
2012141202.tif 000051
[一般式（１０）、（１１）及び（１２）中、Ｘはカルボン酸、モノ若しくはポリカルボン酸アルキル基、アミノ基、モノ若しくはポリアミノアルキル基、アミド基、モノ若しくはポリアミドアルキル基、ヒドラジド基、モノ若しくはポリヒドラジドアルキル基、アミノ酸基、ポリペプチド基及び核酸基からからなる群から選択される基を表し；Ｒ１は水素又はメチル基を表し；Ｒ4は２価で、Ｏ、ＣＯ、ＣＯ2、ＯＣＯ、ＯＣＯ2、ＯＣＯＮＨ、ＯＣＯＮＲ、ＮＨＣＯ2、ＮＨ、ＳＯ3及び(ＯＰＯ(ＯＨ))1〜3ＯＰＯ2からなる群から選択される基を表し；Ｒ5は水素、ハロゲン基及びアルコキシ基からなる群から選択される基を表し；Ｒ６は水素、ヒドロキシ基、アルコキシ基及びジアルキルアミノ基からなる群から選択される基を表し；Ｒ７は水素又はハロゲン基を表し；Ｒ８は水素又はハロゲン基を表し；Ｒ９は水素を表し；２価の連結基Ｒ10は、Ｏ(ＣＨ2)m、Ｏ(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m、ＯＣＯ(ＣＨ2)m、ＯＣＯＣＨ2Ｏ(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m、ＯＣＨ2ＣＯ2(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m(ＣＨ2)m’、ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’(ＯＣＨ2ＣＨ2)m、ＯＣＨ2ＣＯＮＣＨ３ＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’ (ＯＣＨ2ＣＨ2)m、及びＯＣＨ2ＣＯＮ(ＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’(ＯＣＨ2ＣＨ2)mX) ＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’(ＯＣＨ2ＣＨ2)m（Ｒ10中、m、m'は０〜２０の整数）からなる群から選択される基を表し；２価の連結基Ｒ11は、ＣＨ2ＮＨ(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m(ＣＨ2)m’、ＣＨ2Ｎ((ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m(ＣＨ2)m’X) (ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m(ＣＨ2)m’、ＣＨ2ＮＨＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３) (ＣＨ2)m’ (ＯＣＨ2ＣＨ2)m、ＣＨ2Ｎ(ＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’(ＯＣＨ2ＣＨ2)mX) ＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’(ＯＣＨ2ＣＨ2)m、ＣＨ2Ｎ(ＣＨ３)、及びＣＨ2Ｎ(ＣＨ３)ＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３) (ＣＨ2)m’ (ＯＣＨ2ＣＨ2)m（Ｒ11中、m、m'は０〜２０の整数）からなる群から選択される基を表し；２価の連結基Ｒ12は、ＣＨ2ＯＣＯ(ＣＨ2)m’、又は(ＣＨ2)m’’ (Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ２)m’（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ（Ｒ12中、m、m'、m''は０〜２０の整数）である基を表し；２価の連結基Ｒ１４はアルキレン、(ＣＨ２)p’ＣＯ(ＯＣＨ２ＣＨ２)p、(ＣＨ2)p’’(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)p’ＣＯ(ＯＣＨ2ＣＨ2)p、（p、p'、p''は1〜20の整数）からなる群から選択される基を表す。]
【請求項１０】
前記細胞接着性光制御材料が、下記一般式（１３）、（１４）及び（１５）で表される（メタ）アクリル酸エステル重合体構造を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞接着性光制御基材。
【化１３】
2012141202.tif 000052
【化１４】
2012141202.tif 000053
【化１５】
2012141202.tif 000054
[ここで、一般式（１３）、（１４）及び（１５）中、Ｘはカルボン酸、モノ若しくはポリカルボン酸アルキル基、アミノ基、モノ若しくはポリアミノアルキル基、アミド基、モノ若しくはポリアミドアルキル基、ヒドラジド基、モノ若しくはポリヒドラジドアルキル基、アミノ酸基、ポリペプチド基及び核酸基からなる群から選択される基を表し；Ｒ１は水素又はアルキル基を表し；Ｒ4は２価で、Ｏ、ＣＯ、ＣＯ2、ＯＣＯ、ＯＣＯ2、ＯＣＯＮＨ、ＯＣＯＮＲ、ＮＨＣＯ2、ＮＨ、ＳＯ3及び(ＯＰＯ(ＯＨ))1〜3ＯＰＯ2からなる群から選択される基を表し；Ｒ5は水素、ハロゲン基及びアルコキシ基からなる群から選択される基を表し；Ｒ６は水素、ヒドロキシ基、アルコキシ基及びジアルキルアミノ基からなる群から選択される基を表し；Ｒ７は水素又はハロゲン基を表し；Ｒ８は水素又はハロゲン基を表し；Ｒ９は水素を表し；２価の連結基Ｒ1３は、(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m(ＣＨ2)m’、又は(ＣＨ2)ｍ(Ｃ2ＨＮ3)（ＣＨ2）ｍ’、（m、m'は０〜２０の整数）である基を表し；２価の連結基Ｒ１５は、(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)ｐＯＣＯＣＨ2Ｏ（pは１〜２０の整数）である基を表し；Ｒ１６は、(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)ｐＣＯＣＨ2ＮＨＣＨ２、(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＣＯＣＨ２Ｎ(ＣＨ３)ＣＨ２、(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＣＯ(ＣＨ２)p’(Ｎ３Ｃ２Ｈ)ＣＨ２ＮＨＣＨ２、(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＣＯ(ＣＨ２)p’(Ｎ３Ｃ２Ｈ)ＣＨ２Ｎ(ＣＨ３)ＣＨ２、（p、p'は１〜２０の整数）からなる群から選択される基を表し；Ｒ１７は(ＣＨ2)ｐＣＯ２ＣＨ2（ｐは１〜２０の整数）である基を表す。]
【請求項１１】
前記細胞接着性光制御材料が、下記一般式（１）若しくは（２）及び（１０）；下記一般式（１）若しくは（２）及び（１１）；下記一般式（１）若しくは（２）及び（１２）；下記一般式（１）若しくは（２）及び（１３）；下記一般式（１）若しくは（２）及び（１４）；下記一般式（１）若しくは（２）及び（１５）；下記一般式（１）、（１０）及び（２）；下記一般式（１）、（１１）及び（２）；下記一般式（１）、（１２）及び（２）；下記一般式（１）、（１３）及び（２）；下記一般式（１）、（１４）及び（２）；下記一般式（１）、（１５）及び（２）で表される（メタ）アクリル酸エステルの共重合体のいずれかを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞接着性光制御基材。
【化１６】
2012141202.tif 000055
【化１７】
2012141202.tif 000056
【化１８】
2012141202.tif 000057
【化１９】
2012141202.tif 000058
【化２０】
2012141202.tif 000059
【化２１】
2012141202.tif 000060
【化２２】
2012141202.tif 000061
【化２３】
2012141202.tif 000062
[ここで、一般式（１）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）、（１４）、（１５）及び（２）中、Ｘはカルボン酸、モノ若しくはポリカルボン酸アルキル基、アミノ基、モノ若しくはポリアミノアルキル基、アミド基、モノ若しくはポリアミドアルキル基、ヒドラジド基、モノ若しくはポリヒドラジドアルキル基、アミノ酸基、ポリペプチド基及び核酸基からなる群から選択される基を表し；式中Ｒ１は水素又はメチル基を表し；ｎは１〜２０の整数を表し；Ｒ２は１〜２０のアルキレン基又は１〜２０のポリオキシエチレン基を表し；Ｒ4は２価で、Ｏ、ＣＯ、ＣＯ2、ＯＣＯ、ＯＣＯ2、ＯＣＯＮＨ、ＯＣＯＮＲ、ＮＨＣＯ2、ＮＨ、ＳＯ3及び(ＯＰＯ(ＯＨ))1〜3ＯＰＯ2からなる群から選択される基を表し；Ｒ5は水素、ハロゲン基及びアルコキシ基からなる群から選択される基を表し；Ｒ６は水素、ヒドロキシ基、アルコキシ基及びジアルキルアミノ基からなる群から選択される基を表し；Ｒ７は水素又はハロゲン基を表し；Ｒ８は水素又はハロゲン基を表し；Ｒ９は水素を表し；２価の連結基Ｒ10は、Ｏ(ＣＨ2)m、Ｏ(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m、ＯＣＯ(ＣＨ2)m、ＯＣＯＣＨ2Ｏ(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m、ＯＣＨ2ＣＯ2(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m(ＣＨ2)m’、ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’(ＯＣＨ2ＣＨ2)m、ＯＣＨ2ＣＯＮＣＨ３ＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’ (ＯＣＨ2ＣＨ2)m、及びＯＣＨ2ＣＯＮ(ＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’(ＯＣＨ2ＣＨ2)mX) ＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’(ＯＣＨ2ＣＨ2)m（Ｒ10中、m、m'は０〜２０の整数）からなる群から選択される基を表し；２価の連結基Ｒ11は、ＣＨ2ＮＨ(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m(ＣＨ2)m’、ＣＨ2Ｎ((ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m(ＣＨ2)m’X) (ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m(ＣＨ2)m’、ＣＨ2ＮＨＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’(ＯＣＨ2ＣＨ2)m、ＣＨ2Ｎ(ＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’(ＯＣＨ2ＣＨ2)mX) ＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’(ＯＣＨ2ＣＨ2)m、ＣＨ2Ｎ(ＣＨ３)、及びＣＨ2Ｎ(ＣＨ３)ＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’(ＯＣＨ2ＣＨ2)m（Ｒ11中、m、m'は０〜２０の整数）からなる群から選択される基を表し；２価の連結基Ｒ12は、ＣＨ2ＯＣＯ(ＣＨ2)m’、又は(ＣＨ2)m’’(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ２)m’（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ（Ｒ12中、m、m'、m''は０〜２０の整数）である基を表し；２価の連結基Ｒ1３は、(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m(ＣＨ2)m’、又は(ＣＨ2)ｍ(Ｃ2ＨＮ3)（ＣＨ2）ｍ’、（m、m'は０〜２０の整数）である基を表し；２価の連結基Ｒ１４はアルキレン、(ＣＨ２)p’ＣＯ(ＯＣＨ２ＣＨ２)p、(ＣＨ2)p’’(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)p’ＣＯ(ＯＣＨ2ＣＨ2)p、（p、p'、p''は1〜20の整数）からなる群から選択される基を表し；２価の連結基Ｒ１５は、(ＣＨ2ＣＨ2)ｐＯＣＯＣＨ2Ｏ（pは１〜２０の整数）である基を表し；２価の連結基Ｒ１６は、(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)ｐＣＯＣＨ2ＮＨＣＨ２、(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＣＯＣＨ２Ｎ(ＣＨ３)ＣＨ２、(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＣＯ(ＣＨ２)p’(Ｎ３Ｃ２Ｈ)ＣＨ２ＮＨＣＨ２、(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＣＯ(ＣＨ２)p’(Ｎ３Ｃ２Ｈ)ＣＨ２Ｎ(ＣＨ３)ＣＨ２、（p、p'は１〜２０の整数）からなる群から選択される基を表し；２価の連結基Ｒ１７は(ＣＨ2)ｐＣＯ２ＣＨ2（pは１〜２０の整数）である基を表す。]
【請求項１２】
前記細胞接着性光制御材料が、側鎖にアルコキシシランを含む（メタ）アクリル酸エステルを共重合してなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞接着性光制御基材。
【請求項１３】
前記細胞接着性光制御材料を、下記一般式（１６）、（１７）又は（１８）で表されるアルコキシシランを基材上に成膜した後、下記一般式（５７）で表される細胞接着性基Ｘを含むアジド化合物との反応により、細胞接着性基Ｘを末端に形成することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞接着性光制御基材。
【化２４】
2012141202.tif 000063
【化２５】
2012141202.tif 000064
【化２６】
2012141202.tif 000065
[ここで、一般式（１６）、（１７）及び（１８）中、Ｒ２は１〜２０のアルキレン基、１〜２０のポリオキシエチレン基、(ＣＨ２)qＣＯＮＨ(ＣＨ２)q’、（q、q'は０〜２０の整数）からなる群から選択される基を表し；Ｒ3は水素又はアルキル基を表し；Ｒ4は２価で、Ｏ、ＣＯ、ＣＯ2、ＯＣＯ、ＯＣＯ2、ＯＣＯＮＨ、ＯＣＯＮＲ、ＮＨＣＯ2、ＮＨ、ＳＯ3及び(ＯＰＯ(ＯＨ))1〜3ＯＰＯ2からなる群から選択される基を表し；Ｒ5は水素、ハロゲン基及びアルコキシ基からなる群から選択される基を表し；Ｒ６は水素、ヒドロキシ基、アルコキシ基及びジアルキルアミノ基からなる群から選択される基を表し；Ｒ７は水素又はハロゲン基を表し；Ｒ８は水素又はハロゲン基を表し；Ｒ９は水素を表し；２価の連結基Ｒ18は、ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＮＣＨ３ＣＯＣＨ２Ｏ、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＣＨ）ＣＯＣＨ２Ｏからなる群から選択される基を表し；２価の連結基Ｒ19は、ＣＨ２ＮＨＣＨ２、ＣＨ２ＮＣＨ３ＣＨ２、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＣＨ）ＣＨ２からなる群から選択される基を表し；２価の連結基Ｒ20は、(ＣＨ２)ｑ、（qは０〜２０の整数）を表す。]
【化２７】
2012141202.tif 000066
[ここで、式中Ｘはカルボン酸、モノ若しくはポリカルボン酸アルキル基、アミノ基、モノ若しくはポリアミノアルキル基、アミド基、モノ若しくはポリアミドアルキル基、ヒドラジド基、モノ若しくはポリヒドラジドアルキル基、アミノ酸基、ポリペプチド基及び核酸基からなる群から選択される基を表し；２価の連結基Ｒ21は(ＣＨ２)q’(ＯＣＨ２ＣＨ２)q(q、q'は０〜２０の整数)である基を表す。]
【請求項１４】
前記細胞接着性光制御材料が、下記一般式（２４）、（２５）、（２６）、又は（２７）で表されるアルコキシシランであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞接着性光制御基材。
【化２８】
2012141202.tif 000067
【化２９】
2012141202.tif 000068
【化３０】
2012141202.tif 000069
【化３１】
2012141202.tif 000070
[ここで、一般式（２４）、（２５）、（２６）、及び（２７）中、Ｒ3は水素又はアルキル基を表し；Ｒ4は２価で、Ｏ、ＣＯ、ＣＯ2、ＯＣＯ、ＯＣＯ2、ＯＣＯＮＨ、ＯＣＯＮＲ、ＮＨＣＯ2、ＮＨ、ＳＯ3及び(ＯＰＯ(ＯＨ))1〜3ＯＰＯ2からなる群から選択される基を表し；Ｒ5は水素、ハロゲン基及びアルコキシ基からなる群から選択される基を表し；Ｒ６は水素、ヒドロキシ基、アルコキシ基及びジアルキルアミノ基からなる群から選択される基を表し；Ｒ８は水素又はハロゲン基を表し；Ｒ９は水素を表し；２価の連結基Ｒ３１は(ＣＨ２)ｒを表し；２価の連結基Ｒ３２は、ＣＨ２ＮＨＣＨ２、又はＣＨ２ＮＣＨ３ＣＨ２を表し；２価の連結基Ｒ３３は、(ＣＨ２)ｒを表し；２価の連結基Ｒ２１は(ＣＨ２)q’(ＯＣＨ２ＣＨ２)qである基を表し；Ｘは、カルボン酸、モノ若しくはポリカルボン酸アルキル基、アミノ基、モノ若しくはポリアミノアルキル基、アミド基、モノ若しくはポリアミドアルキル基、ヒドラジド基、モノ若しくはポリヒドラジドアルキル基、アミノ酸基、ポリペプチド基及び核酸基からなる群から選択される基を、Ｙはアジド基、アミノ基、エポキシ基、シアネート基からなる群から選択される基を表す。（rは０〜２０の整数）(q、q'は０〜２０の整数)]
【請求項１５】
下記一般式（２２）および（２３）で表される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞接着性光制御基材に用いる前記細胞接着性光制御材料の中間体材料。
【化３２】
2012141202.tif 000071
【化３３】
2012141202.tif 000072
[ここで、一般式（２２）および（２３）中、Ｒ4は２価で、Ｏ、ＣＯ、ＣＯ2、ＯＣＯ、ＯＣＯ2、ＯＣＯＮＨ、ＯＣＯＮＲ、ＮＨＣＯ2、ＮＨ、ＳＯ3及び(ＯＰＯ(ＯＨ))1〜3ＯＰＯ2からなる群から選択される基を表し；Ｒ5は水素、ハロゲン基及びアルコキシ基からなる群から選択される基を表し；Ｒ６は水素、ヒドロキシ基、アルコキシ基及びジアルキルアミノ基からなる群から選択される基を表し；Ｒ８は水素又はハロゲン基を表し；Ｒ９は水素を表し；２価の連結基Ｒ３１は(ＣＨ２)ｒを表し；２価の連結基Ｒ３２は、ＣＨ２ＮＨＣＨ２、又はＣＨ２ＮＣＨ３ＣＨ２を表し；Ｘは、カルボン酸、モノ若しくはポリカルボン酸アルキル基、アミノ基、モノ若しくはポリアミノアルキル基、アミド基、モノ若しくはポリアミドアルキル基、ヒドラジド基、モノ若しくはポリヒドラジドアルキル基、アミノ酸基、ポリペプチド基及び核酸基からなる群から選択される基を表す。（ｒは０〜２０の整数）]
【請求項１６】
前記細胞接着性材料が、前記細胞接着性基に、細胞との接着を促す細胞外マトリックス、あるいは細胞の表面抗原と結合する抗体、又は該抗体を結合させるためのタンパク質を結合又は接着させた材料であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞接着性光制御基材。
【請求項１７】
前記細胞外マトリックスがコラーゲン群；フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ニドジェン、テネイノシン、トロンボスポンジ、フォンビルブランド、オステオポンチン及びフィブリノーゲンを含む非コラーゲン性糖タンパク質群；エラスチン群；プロテオグリカン群からなる群から選択される材料であることを特徴とする請求項１６に記載の細胞接着性光制御基材。
【請求項１８】
前記抗体を結合させるタンパク質が、アビジン／ビオチン、プロテインＡ及びプロテインＧからなる群から選択される材料であることを特徴とする請求項１６に記載の細胞接着性光制御基材。
【請求項１９】
前記基材がガラス製培養容器であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞接着性光制御基材。
【請求項２０】
前記細胞接着性材料が下記一般式（４）で表される細胞接着性基を含み、式中Ｘが共有結合性官能基を含み、この共有結合性官能基は、共有結合反応を行う特性を有する官能基であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞接着性光制御基材。
【化３４】
2012141202.tif 000073
【請求項２１】
前記共有結合性官能基が、アミノ基、水酸基、アルデヒド基又はケトン基に対して共有結合反応を行う特性を有する官能基であることを特徴とする請求項２０に記載の細胞接着性光制御基材。
【請求項２２】
前記共有結合性官能基が、カルボン酸の活性エステル基；活性化したカルボン酸；ひずみの大きな三員環官能基；水酸基と反応する官能基；又はアルデヒド基やケトン基と反応する官能基を含む官能基であることを特徴とする請求項２１に記載の細胞接着性光制御基材。
【請求項２３】
カルボン酸の活性エステル基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルを含み；活性化したカルボン酸がカルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸無水物及びカルボン酸アジドを含み；ひずみの大きな三員環官能基がエポキシド基、アジリジン基、アジリジニウム基及びエピスルホニウム基を含み；水酸基と反応する官能基がｐ−トルエンスルホニル基を含み；アルデヒド基やケトン基と反応する官能基が１、３−ジオール、ヒドラジン及びヒドロキシルアミンエーテルを含むことを特徴とする請求項２２に記載の細胞接着性光制御基材。
【請求項２４】
前記共有結合性官能基が、細胞表面に存在する化合物の構成要素である細胞表面官能基に対して共有結合反応を行う特性を有する官能基であることを特徴とする請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の細胞接着性光制御基材。
【請求項２５】
前記共有結合性官能基が、細胞外マトリックス、細胞表面抗原と結合する抗体又は抗体を結合させるためのタンパク質に対して共有結合反応を行う特性を有する官能基であることを特徴とする請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の細胞接着性光制御基材。
【請求項２６】
前記抗体が、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）、ヒト白血球型抗原（HLA）、上皮細胞接着分子（EpCAM）、p24（CD9）を含む細胞表面抗原に対する抗体であることを特徴とする請求項１６又は２５に記載の細胞接着性光制御基材。
【請求項２７】
前記抗体が、ヒトMHCクラスIa分子であるHLA-A、B、C分子、マウスH-2分子又はCD9分子を含む動物種特異的な細胞表面抗原に対する抗体であることを特徴とする請求項２６に記載の細胞接着性光制御基材。
【請求項２８】
前記抗体が、クローンW6/32、クローンB9.12.1、クローンMZ3、クローンM1/42又はクローンhrk29の抗体であることを特徴とする請求項２７に記載の細胞接着性光制御基材。
【請求項２９】
細胞接着性材料を基材に結合してなる細胞接着性基材において、前記細胞接着性材料としてヒトMHCクラスIa分子であるHLA-A、B、C分子、マウスH-2分子、CD9分子を含む動物種特異的な細胞表面抗原に対する抗体を用いることを特徴とする、動物種特異的な細胞接着性基材。
【請求項３０】
請求項１〜１４，１６〜２９のいずれか１項に記載の細胞接着性光制御基材において、前記いずれかの基材を回転体に固定する部材を備え、前記回転体を回転することにより、前記いずれかの基材の面に対し概ね垂直な方向に遠心力を作用させる機能を有し、前記遠心力により、前記いずれかの基材の面上に細胞を沈降かつ又は圧接させる機能を有することを特徴とする、細胞接着装置。
【請求項３１】
請求項１〜１４、１６〜２９のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材において、前記いずれかの基材の面に対し概ね垂直な方向に遠心力を作用させることにより、前記いずれかの基材の面上に細胞を沈降かつ又は圧接させることを特徴とする、細胞接着方法。
【請求項３２】
請求項１〜２９のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材を用いて細胞を取り扱う工程において、アミノ基を含まない緩衝液、特に好ましくはアミノ基を含まずかつCa2+やMg2+を含むHBSS(+)を緩衝液として用いることを特徴とする、細胞取り扱い方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は再生医療や幹細胞研究分野に係わり、特に細胞の解析分別・培養技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
再生医療の分野においては、体細胞中に含まれる極僅かな体性幹細胞や前駆細胞を同定、単離し、体性幹細胞や前駆細胞を培養し分化誘導して体細胞を作製する作業が行われている。また、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多能性幹細胞を体性幹細胞や体細胞へと分化誘導する試みがなされている。しかしながら、これらｉＰＳ細胞やＥＳ細胞は均一なものではなく、また、そこから分化誘導される細胞も均一なものではなく、様々な細胞が生じてくる。また、多能性幹細胞は通常フィーダー細胞と呼ばれる細胞と共培養されることが多いため、培養の結果得られる産物中には、多能性幹細胞やそれから分化誘導した細胞だけでなく、フィーダー細胞が混入する可能性がある。再生医療に供する細胞又は組織には、体細胞としての均一性や体性幹細胞を含むこと、また、がん細胞やがん幹細胞、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多能性幹細胞、そしてフィーダー細胞を含まないことが要求される。【０００３】
このように再生医療の分野では、細胞を解析し、分別し、培養する技術はますます重要性を増している。複数種類からなる細胞群を分別するためにはそれを識別する解析技術が必要である。更には識別した複数種類からなる細胞群から単一種類の細胞に分別する必要がある。単一種類の細胞に分別できて初めて、その分子生物学的性質や細胞生物学的性質を解析することが可能となる。また、単一種類の細胞の分別や解析ができるようになって初めて分化誘導を厳密にコントロールする技術を開発できる様になる。研究開発の途中段階において、不要な細胞を除去できれば単一種類の細胞を高純粋に得られるため、１００％の分化誘導効率を達成するのと等価な実験系を構築でき、研究開発加速に極めて有効である。【０００４】
細胞を生きたまま解析する装置としては、光学顕微鏡や蛍光標識された細胞を観察する蛍光顕微鏡、蛍光イメージング装置などが周知であるが、これらの装置は細胞を分別することはできない。一方、細胞を生きたまま分別する装置としては、細胞表面の抗原と磁気ビーズに付与した抗体との抗原抗体反応により目的の細胞を分別収集する装置があるが、この装置は細胞を解析することはできず、また、純度や回収率などに課題がある。細胞を分別する装置としてレーザマイクロダイセクション装置もあるが、これは主にパラフィン包埋された組織切片からの死細胞の単離に使われている。【０００５】
細胞を生きたまま解析し、分別する装置としては、フローサイトメトリの原理を応用したソーティング装置が周知である。この装置はシース流に乗せたサンプル流中の細胞１つ１つにレーザ光を当て、散乱光や蛍光を観察することで細胞を解析・識別し、その情報をもとに細胞一つ一つを含む液滴に電荷を与え、電場を掛けて分別する装置である。多色のレーザ光を照射することで多くの蛍光マーカーを解析することができるが、蛍光補正や光軸調整、液滴の安定形成、電荷を与えるタイミングの調整が煩雑である。培養基材上で培養した細胞にフローサイトメトリを適用するためには一旦培養基材から細胞を取り出さなければならない。また細胞を予め個々の細胞に分離しておく必要がある。そのためにトリプシン処理などを行うと細胞に少なからずダメージを与える。またトリプシン処理により細胞表面のたんぱく質が分解されるため、細胞表面抗原を解析する上で支障をきたすおそれがある。更にはソーティングされた細胞は、ソーティングの際の衝撃によりバイアビリティーが低下するなどの課題がある。【０００６】
細胞を生きたまま解析し、分別し、培養する技術としては、特許文献１に記載の方法がある（以下第1の従来例）。この技術は、光照射によってその物性が変化する光応答性材料を成膜した細胞培養基材を用い、細胞接着性表面に細胞を接着する。培養した細胞をモニターにより識別し、所望の細胞の位置を特定し、所望の細胞位置へ光パターン照射し、所望の細胞を培養基材から剥離するための装置に係わるものである。ここで記載されている「光照射によってその物性が変化する光応答性材料」は、光照射により構造が異性化し、その分極率、親水−疎水性が変化して、細胞を培養基材から剥離する機能を有するものを挙げており、特にこれらの物性変化は可逆的であることが好ましいとされている。【０００７】
細胞培養下において細胞接着パターンの形成とサイズ変更が可能な、細胞を固定化した基板の作成方法として、特許文献５に記載の方法がある（以下第2の従来例）。この技術の第１の態様は、光分解性保護基によって末端官能基が保護された化合物を基板上に固定化し、光分解性保護基の一部を光照射により脱離して末端官能基を露出させ、露出した末端官能基に細胞を吸着させる。第2の態様は第1の態様と類似であるが、光解離性保護基に細胞接着抑制物質を吸着させ、細胞接着抑制物質が吸着した光分解性保護基の一部を光照射により脱離して末端官能基を露出させ、露出した末端官能基に細胞を吸着させる。第3の態様は第2の態様と類似であるが、露出した末端官能基に細胞接着促進物質を吸着させ、細胞接着促進物質に細胞を吸着させる。【０００８】
第2の従来例における、光分解性保護基によって末端官能基が保護された化合物は、光照射によって光分解性保護基が脱離し、末端官能基が露出する化合物とされる。光分解性保護基は細胞が吸着しないか、又は細胞接着促進物質が吸着しない保護基とされ、そのような保護基の例として、親水性の高いものや、水素結合アクセプターを持った基を有する中性化合物が言及されている。細胞接着抑制物質の具体例として血清アルブミンなどが例示されている。末端官能基は細胞を吸着しやすい官能基とされ、具体例として、カルボキシル基やアミノ基などの荷電した官能基が例示されている。細胞接着促進物質の具体例としては、フィブロネクチンなどが例示されている。【０００９】
第2の従来例のいずれの態様においても基板上に固定した化合物に細胞を接着するために２〜３時間程度の時間を必要としている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第３９７５２６６号公報
【特許文献２】特許第３４７２７２３号公報
【特許文献３】特開２００４−１７０９３０号公報
【特許文献４】特開２００８−１６７６９５号公報
【特許文献５】特開２００６−６２１４号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】石原一彦、生体材料、18(1)、 33(2000).
【非特許文献２】Y. Arima et al.、 J. Meter. Chem.、 17、 4079(2007).
【非特許文献３】Y. Arima et al.、 Biomaterials 28、 3074(2007).
【非特許文献４】M. N. Yousaf et al.、 PNAS 98(11)、 5992(2001).
【非特許文献５】古田寿昭、光学、34(4)、 213(2005).
【非特許文献６】J. Edahiro et al.、 Biomacromolecules、 6(2)、 970(2005).
【非特許文献７】J. Nakanishi et al.、 Analytical Sciences、 24、 67 (2008).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
前記の第1の従来例（特許第３９７５２６６号公報）に記載のある光照射によってその物性が変化する光応答性材料として、光により可逆的に構造変化する材料は、２つの異性体の片方に１００％持っていくことは困難であり、それは細胞接着性の選択性低下を招く。また、実施例にあるような長波長の光で反応する材料は、例えば、蛍光観察を行うと励起光に反応し、接着性が変化するため、蛍光観察と接着性維持を両立できない。更には、当該技術では細胞を培養基材から剥離できても、細胞間の接着を剥離することは考慮されていない。従って、培養基材中に存在する孤立した細胞あるいは細胞塊を丸ごと剥離することになり、接着している複数種類の細胞からなる細胞塊を単一細胞に分別することはできないという課題が残る。【００１３】
また第1の従来例における明細書中には材料に細胞を接着させるための具体的条件が記載されていない。また実施例には材料に細胞を接着させる実験そのものが記載されていない。つまりこの技術においては細胞接着にかかわる具体的な配慮はなされていない。【００１４】
前記の第2の従来例（特開２００６−６２１４号公報）は、第1の態様においては、光分解性保護基が細胞を一切吸着せず、それが脱離して露出した末端官能基が細胞を極めて良好に吸着する必要がある。細胞接着性がそのように劇的な変化を示す光分解性保護基は知られておらず、実際、この第1の態様に対応する実施例は記載されていない。従ってこの第1の態様を実施することは困難である、という課題がある。第2の態様においては光解離性保護基に細胞接着抑制物質を吸着させる工程が必要となる。また光分解性保護基が脱離して露出した末端官能基に細胞が極めて良好に吸着する必要がある。細胞接着性がそのように極めて高い末端官能基は知られておらず、実際、この第２の態様に対応する実施例も記載されていない。従ってこの第2の態様は工程が多く煩雑であり、実施することも困難である、という課題がある。第３の態様においては、光解離性保護基に細胞接着抑制物質を吸着させる工程と、露出した末端官能基に細胞接着促進物質を吸着させる工程が必要となる。また細胞接着抑制物質は光解離性保護基に吸着させただけの不安定な構造であるため、細胞接着促進物質を吸着させる際、条件によっては光解離性保護基に吸着させた細胞接着抑制物質が脱着し、細胞接着促進物質に置換されるという目的外の副反応が起きる可能性がある。この副反応が起きると、目的外の領域が細胞接着性領域に変化し、細胞接着の選択性が低下する恐れがある。従ってこの第３の態様は工程が多く煩雑であり、条件によっては細胞接着の選択性が低い、という課題がある。またいずれの態様においても基板上に固定した化合物に細胞を接着するために、２〜３時間程度の時間をかけている。一般的に当業者は細胞が基材に接着するためにこの程度の時間は必要とみなしている。しかし解析のために細胞を分別・単離する用途においては、工程の一部に過ぎない細胞接着は迅速簡便に行う必要があり、２〜３時間かけることは許容できない。換言すると従来例の細胞接着時間は長すぎる、という課題がある。【００１５】
本発明は以上の従来技術に鑑み、細胞を生きたまま解析し、分別し、培養するための細胞接着性光制御基材を提供するものである。【００１６】
本発明が解決しようとする課題は、細胞を生きたまま解析し、分別し、培養するに当たって、より簡便に、リアルタイムに作業ができ、培養細胞から不要細胞を除去・純化させながら培養できるようにすることであり、また、培養細胞から所望の細胞を解析分別し、その細胞の純度、回収率、バイアビリティーを従来以上に高めることにある。【００１７】
さらに本発明が解決しようとする第2の課題は、細胞を生きたまま解析し、分別し、培養するに当たって、細胞接着を確実かつ短時間に行うことにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明では上記従来技術の課題を解決するために以下の手段を取った。【００１９】
つまり、本発明の細胞接着性光制御基材は、基材側から順に、細胞非接着性材料に光解離性基を介して細胞接着性材料を結合した細胞接着性光制御材料を基材に成膜してなる。【００２０】
また、本発明の細胞接着性光制御基材は、光照射により光解離性基が結合解離して、細胞接着性材料が離脱し、細胞非接着性材料が残るものである。【００２１】
また、本発明の細胞接着性光制御基材は、光照射により光解離性基が結合解離して、照射された部分の表面が細胞接着性材料から細胞非接着性材料に非可逆的に変化するものである。【００２２】
また、本発明の細胞接着性光制御基材は、基材側から順に、細胞非接着性材料に光解離性基を介して細胞結合性材料を結合した細胞結合性光制御材料を基材に成膜してなる。ここで細胞結合性材料とは共有結合などにより細胞と強固に結合する材料、あるいは、動物種に特異的な抗体である。【００２３】
また、本発明の細胞接着性光制御基材を用いた細胞の解析分別方法は、以下の工程を含む。【００２４】
基材側から順に細胞非接着性材料に光解離性基を介して細胞接着性材料または細胞結合性材料を結合した細胞接着性光制御材料を基材に成膜してなる細胞接着性光制御基材、あるいは光照射により光解離性基が結合解離して、細胞接着性材料が離脱し、細胞非接着性材料が残ることを特徴とする細胞接着性光制御基材、あるいは光照射により光解離性基が結合解離して、照射された部分の表面が細胞接着性材料から細胞非接着性材料に非可逆的に変化することを特徴とする細胞接着性光制御基材に細胞を播種、培養する工程。【００２５】
所望の細胞領域への第１の光照射により所望の細胞を基材から剥離回収する工程。【００２６】
また、本発明の細胞接着性光制御基材を用いた細胞の解析分別方法は、以下の工程を含む。【００２７】
基材側から順に細胞非接着性材料に光解離性基を介して細胞接着性材料または細胞結合性材料を結合した細胞接着性光制御材料を基材に成膜してなる細胞接着性光制御基材、あるいは光照射により光解離性基が結合解離して、細胞接着性材料が離脱し、細胞非接着性材料が残ることを特徴とする細胞接着性光制御基材、あるいは光照射により光解離性基が結合解離して、照射された部分の表面が細胞接着性材料から細胞非接着性材料に非可逆的に変化することを特徴とする細胞接着性光制御基材に第１の光照射をし、細胞接着領域と細胞非接着領域を設ける工程。【００２８】
また、本発明の細胞接着性光制御基材を用いた細胞の解析分別方法は、以下の工程を含む。【００２９】
上記解析分別方法の工程において、細胞接着性光制御基材に細胞を播種した後、細胞接着性光制御基材の方向に、特に好ましくは同基材表面に対し垂直に、遠心力を作用させる工程。【００３０】
また、本発明の細胞接着性光制御基材を用いた細胞の解析分別装置は、基材側から順に細胞非接着性材料に光解離性基を介して細胞接着性材料をまたは細胞結合性材料を結合した細胞接着性光制御材料を基材に成膜してなる細胞接着性光制御基材、あるいは光照射により光解離性基が結合解離して、細胞接着性材料が離脱し、細胞非接着性材料が残ることを特徴とする細胞接着性光制御基材、あるいは光照射により光解離性基が結合解離して、照射された部分の表面が細胞接着性材料から細胞非接着性材料に非可逆的に変化することを特徴とする細胞接着性光制御基材と、基材上の細胞接着性光制御材料を光反応させるための第１の光照射手段と、を備えている。【００３１】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１１−０８７６４７号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００３２】
細胞を生きたまま解析し、分別し、培養するに当たって、より簡便に、リアルタイムに作業ができ、培養細胞から不要細胞を除去・純化させながら培養できるようになる。また、培養細胞から所望の細胞を解析分別し、その細胞の純度、回収率、バイアビリティーを高めることができる。また解析をより確実かつ短時間に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】培養中の細胞を解析し、所望の細胞を分別する方法（実施例１、２）の概要を示す図である。
【図２】個々に分離された細胞を解析し、所望の細胞を分別する方法（実施例３、５，６，７）の概要を示す図である。
【図３】個々に分離された細胞を解析し、所望の細胞を分別する方法（実施例４）の概要を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明を実施するための形態を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
本発明の一実施の形態は、基材側から順に細胞非接着性材料に光解離性基を介して細胞接着性材料を結合した細胞接着性光制御材料を基材に成膜してなる細胞接着性光制御基材とした。この細胞接着性光制御材料は、光照射により光解離性基が結合解離し、細胞接着性材料を基材から離脱させることができる。光結合解離は細胞非接着性材料と光解離性基の間又は光解離性基と細胞接着性材料の間のどちらでも良い。光照射により、細胞非接着性材料を基材に残す。光反応した光解離性基の残部分は細胞非接着性基として働く。この非可逆的光解離反応により細胞接着性から細胞非接着性へと効率よくかつ確実に変化させることができ、接着選択性を良くすることができる。ここで、細胞接着性材料は、共有結合などにより細胞と強固に結合する材料、あるいは、動物種に特異的な抗体などを含む細胞結合性材料をも含む。本発明において、細胞接着性材料という場合、共有結合などにより細胞と強固に結合する材料も、抗体等の細胞と結合する細胞結合性材料も含む。
【００３６】
上記の細胞接着性光制御基材を用いることにより、特定の細胞の解析分別を行うことができる。ここで、解析分別とは細胞を解析し、他の細胞と分別することをいう。
【００３７】
細胞非接着性材料としては、細胞膜と類似の構造を持ち、生体適合性のあるホスホリルコリン基を有する材料が挙げられる。細胞非接着性材料は、例えば、下記一般式（１）で表されるホスホリルコリン基を有する（メタ）アクリル酸エステル重合体である。
【化１】
2012141202.tif 000003
【００３８】
式中Ｒ1は水素又はメチル基を表し、ｎは１〜２０の数を表す。
【００３９】
また、下記一般式（２）で表される（メタ）アクリル酸エステル重合体も細胞非接着性材料として使用できる。
【化２】
2012141202.tif 000004
【００４０】
式中、Ｒ1は一般式（１）と同じであり、Ｒ2は１〜２０のアルキレン基又は１〜２０のポリオキシエチレン基を表す。
【００４１】
細胞非接着性材料として、上記一般式（１）と（２）で表される（メタ）アクリル酸エステル重合体の共重合体であっても良い。更には、細胞非接着性材料として、下記一般式（３）で表されるアルコキシシランも使用することができる。
【化３】
2012141202.tif 000005
【００４２】
式中、Ｒ2は一般式（１）及び（２）と同じであり、Ｒ3は水素又はアルキル基を表す。
【００４３】
細胞接着性材料としては、末端に細胞接着性基を有する材料が挙げられる。細胞接着性基としては、下記一般式（４）で表される基が挙げられる。
【化４】
2012141202.tif 000006
【００４４】
式中Ｘはカルボン酸、モノ若しくはポリカルボン酸アルキル基、アミノ基、モノ若しくはポリアミノアルキル基、アミド基、モノ若しくはポリアミドアルキル基、ヒドラジド基、モノ若しくはポリヒドラジドアルキル基、アミノ酸基、ポリペプチド基、又は核酸基を表す。
【００４５】
一般式（４）の細胞接着性基Ｘを変えることにより様々な細胞に対する接着性のバリエーションを得ることができる。更に、該細胞接着性材料は、上記一般式（４）で表される基に、細胞との接着を促す細胞外マトリックスや細胞の表面抗原と結合し得る抗体及び該抗体を結合させるためのタンパク質などを結合又は接着させた材料も含む。細胞外マトリックスとしてはコラーゲン群、非コラーゲン性糖タンパク質群（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ニドジェン、テネイノシン、トロンボスポンジ、フォンビルブランド、オステオポンチン、フィブリノーゲンなど）、エラスチン群、プロテオグリカン群などである。抗体を結合させるタンパク質としては、アビジン／ビオチン、プロテインＡやプロテインＧなどがある。
【００４６】
光解離性基は特定の波長の光に反応し、解離し得る。光解離性基の光反応波長は、細胞毒性を示さない３６０ｎｍ以上で、かつ、光学顕微鏡観察用入射光や蛍光観察用励起光波長よりも短波長とする必要がある。これにより、細胞観察時に細胞観察用の光により細胞の接着性の変化を起こさなくすることができる。このような光解離性基としては、Ｏ−ニトロベンジル基やヒドロキシフェナシル基、クマリニルメチル基などが挙げられるが、細胞毒性を示さない点、光反応波長域や光反応効率が高いことから、クマリニルメチル骨格を含む材料が良い。特に、リンカーとして下記一般式（５）で表される２価のクマリニルメチル骨格を含むものが好適に使用できる。
【化５】
2012141202.tif 000007
【００４７】
ここで、式中、Ｒ4は２価で、Ｏ、ＣＯ、ＣＯ2、ＯＣＯ、ＯＣＯ2、ＯＣＯＮＨ、ＯＣＯＮＲ、ＮＨＣＯ2、ＮＨ、ＳＯ3若しくは(ＯＰＯ(ＯＨ))1〜3ＯＰＯ2を、Ｒ5は水素、ハロゲン基若しくはアルコキシ基を表し、Ｒ６は水素、ヒドロキシ基、アルコキシ基若しくはジアルキルアミノ基を表すか、あるいは存在せず、Ｒ７は水素若しくはハロゲン基を表すか、あるいは存在せず、Ｒ８は水素若しくはハロゲン基を表し、Ｒ９は水素を表すか、あるいは存在せず、リンカーとしての一般式（５）の２価の位置は、Ｒ４の位置を共通として、一方をＲ６又はＲ７のベンゼン骨格の位置、あるいはＲ９のクマリニルメチルの位置とする。上記Ｒ６、Ｒ７及びＲ９における「存在せず」はその意味で用いている。
【００４８】
更に言えば、リンカーとしての一般式（５）の２価の位置を、（Ｒ４の位置とＲ６のベンゼン骨格の位置）から、（Ｒ４の位置とＲ７のベンゼン骨格の位置）あるいは（Ｒ４の位置とＲ９のクマリニルメチルの位置）とし、残った置換基を適切に選択することにより、細胞毒性の少ないより長波長の光で効率良くＲ４を光反応させることが出来る。
【００４９】
光解離性基と細胞接着性材料は、一般式（４）で表される細胞接着性基と一般式（５）で表される２価の光解離性基の一方の結合位置とを直接又は間接的に結合した構造を有する。光解離はＲ４の位置で起こる。例えば、ベンゼン骨格のＲ６の位置で結合させる場合には、下記一般式（６）で表されるように、２価の連結基Ｒ10を介して結合させればよい。また、ベンゼン骨格のＲ７の位置で結合させる場合には、下記一般式（７）で表されるように、２価の連結基Ｒ１１を介して結合させればよい。更にまた、Ｒ９のクマリニルメチルの位置で結合させる場合には、下記一般式（８）で表されるように、２価の連結基Ｒ１２を介して結合させればよい。
【化６】
2012141202.tif 000008
【００５０】
ここで、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8及びＲ9は一般式（５）と同じである。
【００５１】
２価の連結基Ｒ10としては、Ｏ(ＣＨ2)m、Ｏ(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m、ＯＣＯ(ＣＨ2)m、ＯＣＯＣＨ2Ｏ(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m、ＯＣＨ2ＣＯ2(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m(ＣＨ2)m’、ＯＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’(ＯＣＨ2ＣＨ2)m、ＯＣＨ2ＣＯＮＣＨ３ＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’(ＯＣＨ2ＣＨ2)m、ＯＣＨ2ＣＯＮ(ＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’(ＯＣＨ2ＣＨ2)mX) ＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’(ＯＣＨ2ＣＨ2)m、（m、m'は０〜２０の整数）などが利用できる。
【化７】
2012141202.tif 000009
【００５２】
ここで、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8及びＲ9は一般式（５）と同じである。
【００５３】
２価の連結基Ｒ11としては、ＣＨ2ＮＨ(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m(ＣＨ2)m’、ＣＨ2Ｎ((ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m(ＣＨ2)m’X) (ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m(ＣＨ2)m’、ＣＨ2ＮＨＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’(ＯＣＨ2ＣＨ2)m、ＣＨ2Ｎ(ＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)ｍ‘(ＯＣＨ2ＣＨ2)mX) ＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ2)m’(ＯＣＨ2ＣＨ2)m、ＣＨ２Ｎ(ＣＨ３)、ＣＨ2Ｎ(ＣＨ3)ＣＨ2（Ｃ2ＨＮ3）(ＣＨ２)m’(ＯＣＨ2ＣＨ2)ｍ（m、m'は０〜２０の整数）などが利用できる。
【化８】
2012141202.tif 000010
【００５４】
ここで、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は一般式（５）と同じである。
【００５５】
２価の連結基Ｒ12としては、ＣＨ2ＯＣＯ(ＣＨ2ＣＨ2)m‘、(ＣＨ2)m’’(Ｃ2ＨＮ３)(ＣＨ２)m’（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ、（m、m'、m''は０〜２０の整数）などが利用できる。
【００５６】
Ｒ10、Ｒ11及びＲ12は光解離性基と細胞接着性基とを結合させる作用のみを有する。
【００５７】
また、光解離性基の向きを逆にすれば、光解離性基と細胞接着性基の間で光解離させることができる。例えば、Ｒ４の位置で結合した構造である下記一般式（９）で表される構造を挙げることができる。
【化９】
2012141202.tif 000011
【００５８】
ここで、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8及びＲ9は一般式（５）と同じである。
【００５９】
２価の連結基Ｒ1３としては、(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m(ＣＨ2)m’、(ＣＨ2)ｍ(Ｃ2ＨＮ3)（ＣＨ2）ｍ’、（m、m’は０〜２０の整数）などが利用できる。
【００６０】
上記のような細胞接着性材料と光解離性基を結合した構造は細胞非接着性材料に直接又は間接に結合させる。
【００６１】
例えば、下記一般式（１０）、（１１）、（１２）、（１３）、（１４）又は（１５）で表される（メタ）アクリル酸エステル重合体の形にして、細胞非接着性材料の中に組み込むことができる。
【化１０】
2012141202.tif 000012
【化１１】
2012141202.tif 000013
【化１２】
2012141202.tif 000014
【００６２】
上記一般式（１０）〜（１２）において、Ｒ1は一般式（１）と同じであり、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8及びＲ9は一般式（５）と同じであり、Ｒ10は一般式（６）と同じであり、Ｒ11は一般式（７）と同じであり、Ｒ12は一般式（８）と同じであり、Ｒ１４はアルキレン、(ＣＨ2)p’ＣＯ(ＯＣＨ2ＣＨ2)ｐ、(ＣＨ2)ｐ’’(Ｃ2ＨＮ3)(ＣＨ2)ｐ’ＣＯ(ＯＣＨ2ＣＨ2)ｐ、（p、p’、p''は１〜２０の整数）などを利用できる。
【化１３】
2012141202.tif 000015
【００６３】
一般式（１３）中、Ｒ1は一般式（１）と同じであり、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8及びＲ9は一般式（５）と同じであり、２価の連結基Ｒ1３は一般式（９）と同じであり、Ｒ１５は、(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)ｐＣＯＣＨ2Ｏ、（pは１〜２０の整数）などが利用できる。
【化１４】
2012141202.tif 000016
【００６４】
一般式（１４）中、Ｒ1は一般式（１）と同じであり、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8及びＲ9は一般式（５）と同じであり、２価の連結基Ｒ1３は一般式（９）と同じであり、Ｒ１６は、(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)ｐＣＯＣＨ2ＮＨＣＨ２、(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＣＯＣＨ２Ｎ(ＣＨ３)ＣＨ２、(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＣＯ(ＣＨ２)p’(Ｎ３Ｃ２Ｈ)ＣＨ２ＮＨＣＨ２、(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＣＯ(ＣＨ２)p’(Ｎ３Ｃ２Ｈ)ＣＨ２Ｎ(ＣＨ３)ＣＨ２、（p、p’は１〜２０の整数）などが利用できる。
【化１５】
2012141202.tif 000017
【００６５】
一般式（１５）中、Ｒ1は一般式（１）と同じであり、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は一般式（５）と同じであり、２価の連結基Ｒ1３は一般式（９）と同じであり、Ｒ１７は(ＣＨ2)ｐＣＯ２ＣＨ2、（ｐは１〜２０の整数）などが利用できる。
【００６６】
本発明の細胞接着性基と光解離性基が結合した構造を細胞非接着性材料に結合させた材料としては、例えば、上記一般式（１）若しくは（２）及び（１０）；上記一般式（１）若しくは（２）及び（１１）；上記一般式（１）若しくは（２）及び（１２）；上記一般式（１）若しくは（２）及び（１３）；上記一般式（１）若しくは（２）及び（１４）；上記一般式（１）若しくは（２）及び（１５）；上記一般式（１）、（２）及び（１０）；上記一般式（１）、（２）及び（１１）；上記一般式（１）、（２）及び（１２）；上記一般式（１）、（２）及び（１３）；上記一般式（１）、（２）及び（１４）；上記一般式（１）、（２）及び（１５）で表される（メタ）アクリル酸エステルの共重合体を挙げることができる。共重合体とすることで、細胞接着性材料と細胞非接着性材料の比率を任意に変えることができ、比率の変化により様々な細胞に対する接着性のバリエーションを与えることになる。また、これらの重合体の側鎖にアルコキシシランを含む（メタ）アクリル酸エステルを共重合すると、基材との接着性をより高めることができる。
【００６７】
これらの系は共重合体の形を取っているが、単独の重合体としての形のものも用いることができる。例えば、上記一般式（１０）〜（１５）のいずれかで表わされる構造を有するものを単独で用いても良い。これらの細胞接着性基と光解離性基が結合した構造を細胞非接着性材料に結合させた材料を基材上に成膜することにより細胞接着性光制御基材を製造することができる。
【００６８】
また、一般式（６）、（７）、（８）、（９）で示される細胞接着性材料と光解離性基を結合した構造をアルコキシシランの形にして、直接又は間接に細胞非接着材料の中に組み込みことができる。
【００６９】
例えば、下記一般式（１６）、（１７）又は（１８）で表されるアルコキシシランの形にして、シランカップリングにより基材上に成膜した後、Huisgen反応を用いて、下記一般式（１９）、（２０）又は（２１）で表される細胞接着性基Ｘを導入した構造を有する化合物が結合した細胞接着性光制御基材を作ることもできる。このようなクリック反応を用いることで、細胞接着性基Ｘによるアルコキシシランの加水分解を防ぐことができる。
【００７０】
この際、一般式（１６）、（１７）又は（１８）で表されるアルコキシシランを基材上に成膜した後、下記一般式（５７）で表される細胞接着性基Ｘを含むアジド化合物との反応により、細胞接着性基Ｘを末端に形成することができる。
【化１６】
2012141202.tif 000018
【００７１】
ここで、式中Ｘはカルボン酸、モノ若しくはポリカルボン酸アルキル基、アミノ基、モノ若しくはポリアミノアルキル基、アミド基、モノ若しくはポリアミドアルキル基、ヒドラジド基、モノ若しくはポリヒドラジドアルキル基、アミノ酸基、ポリペプチド基及び核酸基からなる群から選択される基を表し、２価の連結基Ｒ21は(ＣＨ２)q’(ＯＣＨ２ＣＨ２)q(q、q’は０〜２０の整数)である基を表す。
【化１７】
2012141202.tif 000019
【００７２】
一般式（１６）中、Ｒ2は一般式（２）と同じかあるいは(ＣＨ２)qＣＯＮＨ(ＣＨ２)q’、（q、q’は０〜２０の整数）などであり、Ｒ3は一般式（３）と同じであり、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8及びＲ9は一般式（５）と同じであり、２価の連結基Ｒ１８はＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＮＣＨ３ＣＯＣＨ２Ｏ、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＣＨ）ＣＯＣＨ２Ｏなどを表す。
【化１８】
2012141202.tif 000020
【００７３】
一般式（１７）中、Ｒ2は一般式（２）と同じかあるいは(ＣＨ２)qＣＯＮＨ(ＣＨ２)q’、（q、q’は０〜２０の整数）などであり、Ｒ3は一般式（３）と同じであり、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8及びＲ9は一般式（５）と同じであり、２価の連結基Ｒ１９は、ＣＨ２ＮＨＣＨ２、ＣＨ２ＮＣＨ３ＣＨ２、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＣＨ）ＣＨ２などを表す。
【化１９】
2012141202.tif 000021
【００７４】
一般式（１８）中、Ｒ2は一般式（２）かあるいは(ＣＨ２)qＣＯＮＨ(ＣＨ２)q’、（q、q’は０〜２０の整数）などと同じであり、Ｒ3は一般式（３）と同じであり、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は一般式（５）と同じであり、２価の連結基Ｒ２０は、(ＣＨ２)q、(qは0〜２０の整数)などを表す。
【化２０】
2012141202.tif 000022
【００７５】
一般式（１９）中、Ｒ2は一般式（２）と同じかあるいは(ＣＨ２)ｑＣＯＮＨ(ＣＨ２)q‘、（q、q’は０〜２０の整数）などであり、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8及びＲ9は一般式（５）と同じであり、２価の連結基Ｒ10は一般式（６）と同じである。
【化２１】
2012141202.tif 000023
【００７６】
一般式（２０）中、Ｒ2は一般式（２）と同じかあるいは(ＣＨ２)qＣＯＮＨ(ＣＨ２)q’、（q、q’は０〜２０の整数）などであり、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8及びＲ9は一般式（５）と同じであり、２価の連結基Ｒ11は一般式（７）と同じである。
【化２２】
2012141202.tif 000024
【００７７】
一般式（２１）中、Ｒ2は一般式（２）と同じかあるいは(ＣＨ２)qＣＯＮＨ(ＣＨ２)q’、（q、q’は０〜２０の整数）などであり、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は一般式（５）と同じであり、２価の連結基Ｒ12は一般式（８）と同じである。
【００７８】
また、このようなアルコキシシランの形にするには、シランカップリング反応とクリック反応を有効に使うことができる。例えば、一般式（５）のクマリニルメチル骨格の2価の位置としてＲ４とＲ７の位置を例に説明すると、下記一般式（２２）、（２３）のような中間体と一般式（５７）のアジド化合物と一般式（５８）のアルコキシシランを有効に使うことができる。
【化２３】
2012141202.tif 000025
【化２４】
2012141202.tif 000026
【化２５】
2012141202.tif 000027
【００７９】
ここで、Ｒ３１は(ＣＨ２)ｒなど、Ｒ３２はＣＨ２ＮＨＣＨ２、ＣＨ２ＮＣＨ３ＣＨ２など、Ｒ３３は（ＣＨ２）ｒなど、Ｘは、カルボン酸、モノ若しくはポリカルボン酸アルキル基、アミノ基、モノ若しくはポリアミノアルキル基、アミド基、モノ若しくはポリアミドアルキル基、ヒドラジド基、モノ若しくはポリヒドラジドアルキル基、アミノ酸基、ポリペプチド基及び核酸基からなる群から選択される基を、Ｙはアジド基、アミノ基、エポキシ基、シアネート基からなる群から選択される基を示す（ｒは０〜２０の整数）。
【００８０】
例えば、一般式（２２）と一般式（５８）（Ｙはアジド基）の組み合わせで、一般式（２４）が、
【化２６】
2012141202.tif 000028
【００８１】
一般式（２２）（Ｘはカルボキシル基）と一般式（５８）（Ｙはアミノ基）と一般式（５７）の組み合わせで、一般式（２５）が、
【化２７】
2012141202.tif 000029
【００８２】
一般式（２３）と一般式（５８）（Ｙはアジド基）の組み合わせで、一般式（２６）が、
【化２８】
2012141202.tif 000030
【００８３】
一般式（２３）（Ｘはカルボキシル基）と一般式（５８）（Ｙはアミノ基）と一般式（５７）の組み合わせで、一般式（２７）ができる。
【化２９】
2012141202.tif 000031
【００８４】
これら一般式（２４）、（２５）、（２６）、（２７）の化合物はいったん合成した後、基材表面に成膜しても良いし、基材表面上で順次合成して行っても良い。表面反応で合成した場合は、残ったアミノ基やアジド基はＰＥＧカルボン酸やＰＥＧアルキンなどで細胞非接着性に変換させることができる。
【００８５】
これらの場合もＸで表される細胞接着性材料は細胞との接着を促す細胞外マトリックスや細胞の表面抗原と結合する抗体及び該抗体を結合させるためのタンパク質などを結合又は接着させた材料も含む。
【００８６】
これらの細胞接着性光制御材料を成膜する基材としては透明なプラスチック製培養容器などを使うこともできるが、光学的な性能や耐久性から、好適には透明なガラス製培養容器を使うことができる。
【００８７】
次に本細胞接着性光制御基材を用いて細胞を解析分別する方法を図にて詳細を説明する。
【００８８】
図１は本発明の細胞接着性光制御基材を用いた細胞の解析分別方法の一態様を示したものである。該方法は、（１）、（２）、（３）、(４a)、（５a）の工程からなるか、又は（１）、（２）、（３）、(４b)、（５b）の工程からなる。図１において、各工程は左右の図のセットで示されており、左側図は右側図の１点鎖線で示す部分の断面図である。各工程の説明は以下のとおりである。（１）ガラス製培養容器（透明基材）１に成膜した細胞接着性の細胞接着性光制御材料２上に細胞３を播種、接着、培養する。（２）顕微鏡観察（透過像、位相差像、微分干渉像などを含む）、蛍光観察、散乱光観察、ラマン光観察などにより細胞像を検出し、細胞の特徴量を抽出した後、（３）所望の細胞を同定するとともに該細胞の位置情報を得る。所望の細胞とは、解析分別すべき必要な細胞も不必要な細胞も含む。この際、細胞を蛍光マーカーなどにより標識するが、蛍光マーカー標識などは培養の前でも後でも良い。（４ａ）本態様の例では、（３）に示す細胞４は不要な細胞であり、それ以外の細胞３は必要な細胞である。細胞３と細胞４の境界の細胞４側周辺及び細胞接着性光制御材料６に第２の光照射５を行い、（４a）に矩形で示す部分の細胞４及び細胞接着性光制御材料６を切断する。このときの第２の光照射５としてはレーザ光を好適に用いることができる。（５ａ）細胞４が存在する基材上の面積が広い場合は細胞４が存在する領域８に対して第１の光照射７を行い、細胞接着性光制御材料を細胞非接着性に変化させ、残りの細胞４をガラス製培養容器１から剥離、培養液と共に回収する。細胞４が存在する基材上の面積が狭い場合はすべての細胞４及び細胞接着性光制御材料８に対して第２の光照射５を行うことにより切断・破壊してもよい。その後培養を続け、逐次不要細胞４を除去することで純化しながら基材上に残った細胞３の培養を続けることができる。
【００８９】
一方、図１の工程（４ｂ）は、解析のために細胞４を分別・単離したい場合（細胞４が必要な場合）の工程である。細胞３と細胞４の境界の細胞３側周辺及び細胞接着性光制御材料６に対して第２の光照射５を行い、細胞３及び細胞接着性光制御材料６を切断する。
【００９０】
第２の光照射５としてはレーザ光を好適に用いることができる。その後、（５ｂ）細胞４が存在する基材上の領域８に対して第１の光照射７を行い、細胞接着性光制御材料を細胞非接着性に変化させ、細胞４をガラス製培養容器１から剥離、培養液と共に回収する。回収し分別細胞を解析することができる。
【００９１】
図２は本発明の細胞接着性光制御基材を用いた細胞の解析分別方法の別の一態様を示したものである。該方法は、（１）、（２）、（３）、(４)、（５）及び（６）の工程からなる。図２において、各工程は左右の図のセットで示されており、左側図は右側図の１点鎖線で示す部分の断面図である。（１）ガラス製培養容器１に成膜した細胞接着性の細胞接着性光制御材料に対して、図に示すように第１の光照射７を行い、細胞接着領域６９と細胞非接着領域８を設ける。細胞接着領域６９と細胞非接着領域８は光の照射パターンを変えることにより任意のパターンに設定できる。図２に示す例では、細胞接着領域６９を細胞１個分の面積として格子状に並べた。つまり、細胞接着領域６９が格子状に並ぶように第１の光照射７を行った。この際、細胞接着領域を同定できるように、アドレスを割り当てることが望ましい。
【００９２】
（２）次いで、既に培養された細胞塊をトリプシンなどの処理により個々の細胞に分離し、基材上に播種し、接着させる。（３）顕微鏡観察（透過像、位相差像、微分干渉像などを含む）、蛍光観察、散乱光観察、ラマン光観察などにより細胞像を検出し、細胞の特徴量を抽出した後、（４）所望の細胞を同定するとともに該細胞の位置情報を得る。所望の細胞とは、解析分別すべき必要な細胞も不必要な細胞も含む。この際、細胞を蛍光マーカーなどにより標識するが、蛍光マーカー標識などは播種の前でも後でも良い。図２に示す例では、細胞３の他に別の細胞（例えば細胞４及び細胞９）が存在したとする。（５）すべてのアドレス（細胞接着領域６９）に細胞が接着していない場合には、細胞が接着していないアドレスの領域に対して第１の光照射７を行い、細胞非接着性にする（図に示す参照符号１０の領域）。（６）次いで、所望の細胞、ここでは細胞４が存在する領域１１に対して第１の光照射７を行い、細胞４をガラス製培養容器１から剥離し、培養液と共に回収する。この（６）の工程を逐次繰り返すことで、さらに細胞３及び９を分別単離する
ことができる。
【００９３】
図３は本発明の細胞接着性光制御基材を用いた細胞の解析分別方法の更に別の一態様を示したものである。該方法は、（１）、（２）、（３）、(４)、（５）及び（６）の工程からなる。図３において、各工程は左右の図のセットで示されており、左側図は右側図の１点鎖線で示す部分の断面図である。（１）ガラス製培養容器１に成膜した細胞接着性の細胞接着性光制御材料に対して、所定の間隔を空けて、行方向及び列方向に第２の光照射（例えばレーザ光により光照射）５を行い、隣接する細胞接着性光制御材料を切断する（図３において、切断線は符号６で示される）。また、所定の位置に対して第１の光照射７を行い、細胞接着領域６９と細胞非接着領域８を設ける。この際、細胞接着領域を同定できるように、アドレスを割り当てることが望ましい。
【００９４】
細胞接着領域６９と細胞非接着領域８は光の照射パターンを変えることにより任意のパターンに設定できるが、ここでは細胞接着領域６９を細胞１個分の面積として格子状に並べた。（２）次いで、既に培養された細胞塊をトリプシンなどの処理により個々の細胞に分離し、基材上に播種し、接着させる。（３）顕微鏡観察（透過像、位相差像、微分干渉像などを含む）、蛍光観察、散乱光観察、ラマン光観察などにより細胞像を検出し、細胞の特徴量を抽出した後、（４）所望の細胞を同定するとともに該細胞の位置情報を得る。所望の細胞とは、解析分別すべき必要な細胞も不必要な細胞も含む。この際、細胞を蛍光マーカーなどにより標識するが、蛍光マーカー標識などは播種の前でも後でも良い。図３に示す例では、細胞３の他に細胞４及び細胞９が存在したとする。
【００９５】
（５）すべての細胞接着領域（アドレス）６９に細胞が接着していない場合には、細胞が接着していないアドレス１０の領域に対して第１の光照射７を行い細胞非接着性にする。（６）次いで、所望の細胞、ここでは細胞４が存在する領域１１に対して第１の光照射７を行い、細胞４をガラス製培養容器１から剥離し、培養液と共に回収する。この（６）の工程を逐次繰り返すことで、さらに細胞３及び９を分別単離することができる。図２との違いは、図２に示す方法では、細胞接着性材料の上層に細胞外マトリックスやフィーダー細胞のような繊維状あるいは膜状物質がある場合、第１の光照射７だけでは細胞接着性材料が領域毎に切断されないが、図３に示す方法では、第２の光照射５を行うことにより領域間を切断することにある。
【００９６】
本発明の細胞接着性光制御基材（例えば、細胞接着性光制御材料を透明基材上に成膜したもの）を用いた細胞の解析分別方法を実施する装置は少なくとも以下の（１）、（２）、（３）、（４）、（６）及び（７）を備えている。
【００９７】
（１）該細胞接着性光制御基材
（２）該基材を載せるステージ
（３）細胞像を取得する光学検出手段
（４）細胞像から位置情報を得る手段
（５）細胞間及び細胞接着性光制御材料を切断又は破壊するための第２の光照射手段
（６）該基材上の細胞接着性光制御材料を光反応させ、細胞非接着性に変化させるための
第１の光照射手段
（７）各手段の動作を制御する手段
上記（３）の細胞像を取得する光学検出手段は周知の光学系を用いることができる。細胞像を取得する際は、細胞接着性光制御材料の光解離性基に影響を与えない波長の光を照射して行う。例えば、光源として、広域の発光スペクトルが得られるランプ又はＬＥＤを用い、少なくとも光反応波長以下の波長の光を除去するための短波長カットフィルターを通して光照射し、透過光、反射光などをＣＣＤなどの２次元センサで検出する。細胞からの蛍光像の場合、励起光として、光反応波長より長波長帯の光で、目的の蛍光色素の吸収波長帯の光をバンドパス干渉フィルターなどで分光して照射する。前記波長帯のレーザ光を使うこともできる。蛍光は励起光カットフィルター、蛍光波長透過フィルター（バンドパス干渉フィルターなど）などの波長フィルターを通して、ＣＣＤなどの２次元センサで検出する。励起光を細く絞り、２次元に走査する方式にすれば、光電子増倍管で蛍光像を計測することも可能である。複数の波長フィルターを切り替えて測定すれば、複数の蛍光波長の蛍光像を得ることができ、複数の蛍光体に対応することができる。プリズム、回折格子などの分散素子を通し、ラインセンサなどで検出すれば、より細かな波長スペクトル像を得ることもできる。
【００９８】
上記（５）の第２の照射手段は、光源に赤外レーザ又は紫外レーザを用い、上記（４）の手段により得られた位置情報をもとにレーザ走査によって実施することができる。レーザ走査の際にはＸＹ偏向器を用い、目的の位置に光照射する。また、上記（４）の手段により得られた位置情報を反映したフォトマスクを通して一括光パターン照射することもできる。その場合、実験の度に固定したフォトマスクを作成することがないよう、パターンジェネレーターとして空間光変調デバイスを通して基材上にレーザを集光する光学系が好適である。空間光変調デバイスとしては反射型又は透過型空間光変調デバイスを用いることができる。反射型空間光変調デバイスとしてはデジタルミラーデバイスを使うことができ、また、透過型空間光変調デバイスとしては液晶空間光変調デバイスを使うことができる。ここで、デジタルミラーデバイスや液晶空間光変調デバイスは使えるレーザ波長が主として可視光から近赤外光領域である。従って、レーザ光源として水の吸収の強い近赤外レーザを使うことができる。また、紫外領域に波長を設定する場合には可視から近赤外レーザ光を空間光変調デバイスを通した後、非線形結晶や強誘電体結晶などの波長変換デバイスを通して、波長が１／２、１／３になる第二高調波、第三高調波を使えばよい。
【００９９】
上記（６）の第１の光照射手段は、光源に細胞接着性光制御材料の光反応波長を用いる。広域の発光スペクトルが得られるランプ又はＬＥＤなどを用い、波長フィルターで３６０ｎｍ以下の波長の光、場合によっては蛍光励起波長以上の波長の光をカットするか、あるいは、光反応波長のレーザを使うことができる。上記（４）の手段により得られた位置情報をもとに、ＸＹ偏向器を用いて光走査し、目的の位置に光照射するか、あるいは、上記（４）の手段により得られた位置情報を反映したフォトマスクを通して一括光パターン照射することもできる。その場合、実験の度に固定したフォトマスクを作成することがないよう、パターンジェネレーターとして空間光変調デバイスを通して基材上に集光する光学系が好適である。空間光変調デバイスとしては反射型又は透過型空間光変調デバイスを用いることができる。反射型空間光変調デバイスとしてはデジタルミラーデバイス、また、透過型空間光変調デバイスとしては液晶空間光変調デバイスを使うことができる。
【０１００】
上記（３）、（５）及び（６）の光学系はできる限り共通の部品を用いることが望ましい。
【０１０１】
本発明の使用法は大別して、（１）所望の目的細胞を含む細胞集団を容器に捕捉、解析した上で分取する場合と、（２）所望の目的以外の細胞集団を容器に捕捉、解析し、目的細胞を含む細胞集団は捕捉せずにそのまま回収する場合が考えられる。ここで容器とは、細胞を無菌的に収納可能なディッシュやマイクロプレート等の容器を指し、好ましくは細胞接着性光制御基材を内部の底面上に有する。幹細胞研究や再生医療の分野では異なる動物種に由来する細胞を共培養する場合がある。例えばマウス繊維芽細胞をフィーダー細胞として、ヒトｉＰＳ細胞を共培養する例や、同じくマウス繊維芽細胞をフィーダー細胞として、ヒト表皮幹細胞を共培養する例などが挙げられる。これらの例ではヒトｉＰＳや表皮幹細胞、あるいはそれらに由来するヒト細胞と、マウス細胞とを分別する必要が生じる。目的細胞としてヒト由来細胞、目的以外の細胞としてマウス由来細胞を設定する場合は、例えば上記（１）の場合は細胞接着性光制御基材に目的細胞であるヒト由来細胞群を結合させ、上記（２）の場合は細胞接着性光制御基材に目的以外の細胞であるマウス由来細胞群を結合させればよい。いずれの場合も、ヒト（あるいはマウス）由来細胞を結合できる細胞接着性光制御基材（以下、基材と略す）を提供できると好都合である。
【０１０２】
この目的のためには、例えば動物種に特異的な抗原に対する抗体を、細胞接着性基Ｘに結合した細胞接着性材料を用いることにより、特定の動物種に由来する細胞を結合する基材を提供できる。ただしこの抗体を選定する上で特別な特性が必要となる。上記目的の場合は例えばヒトｉＰＳ細胞だけでなく、それから分化誘導した各種ヒト細胞もくまなく捕捉して解析する必要がある。一方、抗体は通常は特定の抗原に対する特異的な反応性（特異性）が極めて高い。即ち、細胞の性質がわずかに変化し、その抗原の発現量や構造が微妙に変化しただけで、抗体の細胞に対する反応性が鋭敏に影響を受け、同じ動物種由来の細胞であっても結合できない細胞が出てくる恐れがある。即ち、上記目的には特異性が極めて高い通常の抗体はかえって不都合であり、むしろ目的とする動物種に共通の抗原に対する幅広い（その意味において特異性の低い）特性が好都合である。さらに、目的外の動物種の類似の抗原に対しては反応性が極めて低い（その意味において特異性の高い）必要もある。この様な動物種特異的な細胞表面抗原の候補として、本発明では主要組織適合遺伝子複合体（MHC）について検討した。MHCは主要組織適合性抗原、ヒトの場合はヒト白血球型抗原（HLA）とも称し、それがコードする糖タンパク質はMHC抗原、MHC分子と称する。MHCクラス分子の内、MHCクラスI分子はほとんど全ての有核細胞の表面に存在し、そのうちクラスIaには、ヒトではHLA-A、B、Cの3種類、マウスではH-2K、2D、2Lの3種類がある。MHCクラスI分子は自己と他者を区別する標識として機能する。HLA-A、B、C分子はヒトHLAクラスI分子の非多型性決定基に相当し、全てのヒト有核細胞の表面に発現するとされる。抗ヒトHLA-A、B、C抗体として、クローンW6/32並びにクローンB9.12.1が市販されている。抗マウスH-2抗体であるクローンM1/42はマウスMHCすなわちH-2分子のa、b、d、j、k、s、uという多くのハプロタイプと反応する。従って、上記の抗体はそれぞれ全てのヒト細胞、あるいは多くのマウス細胞と結合すると考えられる。
【０１０３】
これら抗体を本発明の目的に適用できるかどうかは、目的細胞と反応するだけでなく、その反応性が高いことと、目的外細胞との交差反応性が低い必要がある。実験的に検討した結果、上記抗体の中でも、クローンW6/32及びクローンB9.12.1は株化ヒト細胞であるHCT116との反応性が高いばかりでなく、株化マウス細胞であるNIH/3T3との反応性が極めて低いことが判明し、本目的に好適に使えることが判明した。一方、クローンM1/42はヒト細胞HCT116との交差反応性はきわめて低いものの、マウス細胞NIH/3T3との反応性が必ずしも十分高くはないという課題が判明した。このように、本目的に特定の抗体が利用可能であるかどうかは、抗体に添付されるデータシート等の公知情報だけでは判断できず、細胞との反応性を実験的に評価した後に、初めて利用できるかどうかが判明する、すなわち抗体の性能は予測困難な状況にある。
【０１０４】
上記クローンM1/42の反応性についての課題に対して以下の検討を行った。すなわち、目的をやや限定し、マウス繊維芽細胞をフィーダー細胞として、ヒトｉＰＳ細胞などを共培養する系において、マウス繊維芽細胞を捕捉するために使用可能な抗体を探索した。繊維芽細胞の表面抗原としてはCD9、CD10、CD29、CD44、CD47、CD49b、CD54、CD81、CD90、CD91、CD121a、CD248、FSP1、SFAなどが知られている。このうち抗マウスCD9抗体であるクローンMZ3の反応性を確認した結果、マウス細胞NIH/3T3との反応性が極めて高く、またヒト細胞HCT116との反応性が極めて低いことが判明し、本目的に好適に使えることが判明した。なお、抗体は後述する方法によって、細胞非接着性材料に光解離性基を介して結合した。
【０１０５】
一方、市販抗ヒトEpCAM抗体（クローン名Ber-EP4）や、本願発明者らが開発した抗ヒトEpCAM抗体（クローン名hrk29、コスモバイオ社から販売）及び抗ヒトCD9抗体（仮称C1D3-G4D9）は、多くのヒト細胞（HeLa、HCT116、CaR-1）との反応性が高いことも判明した。これらの抗体もヒト細胞用の汎用性の高い抗体として好適に使用できる可能性がある。
【０１０６】
前述の使用法（１）、即ち容器に目的細胞を含む細胞集団を結合して捕捉する使用法の場合、本発明の一構成においては上記のごとく選定した抗ヒトHLA-A、B、C抗体を用いることにより、ヒトに由来する細胞を捕捉して結合し、かつ、マウス等に由来する細胞を結合しない細胞接着性光制御基材を提供できる。この構成は、ヒト細胞の詳細解析を行う目的において必要となるヒト細胞だけを効率よく捕捉出来、不要な動物由来細胞を事前に効率よく除去できる、という効果がある。抗マウスH-2抗体を同様に用いることにより、マウスに由来する細胞を結合し、かつ、ヒト等に由来する細胞を結合しない、細胞接着性光制御基材も提供できる。
【０１０７】
前述の使用法（２）、即ち容器に目的以外の細胞集団を結合して除去し、目的細胞を含む細胞集団は結合せずにそのまま回収する場合、上記後者の構成を適用することにより、マウスに由来する細胞を結合し、かつ、ヒト等に由来する細胞を結合しない容器を提供できる。また、さらに異なる構成においては、抗マウスCD9抗体を同様に用いることにより、マウスフィーダー細胞を結合し、かつ、ヒトに由来する細胞を結合しない容器を提供できる。後2者の容器を用いることにより、ヒト細胞の詳細解析を行う目的において不要な動物由来細胞を事前に効率よく除去でき、必要となるヒト細胞だけを効率よく回収出来る、という効果がある。
【０１０８】
なお、共培養した複数の細胞を全て捕捉することが好ましい場合もある。この場合には複数の細胞に対する抗体を混合して用いることができる。例えば抗ヒトHLA-A、B、C抗体と抗マウスH-2抗体、あるいは抗ヒトHLA-A、B、C抗体と抗マウスCD9抗体とを混合して用いることができる。想定される細胞に対する抗体を３以上併用することももちろん可能である。これらの構成により、あらゆる種類の細胞を捕捉した上で解析を行い、必要に応じて光照射により分取したい場合に、捕捉を漏れなく行える、という効果がある。
【０１０９】
全ての細胞を捕捉する目的に適する方法として、以下の構成を採用することもできる。即ち、細胞接着性材料として、細胞との結合が極めて強固であり、換言すると結合定数が例えば107M以上と極めて大きく、実質的に不可逆的に細胞と結合する材料（以下細胞結合性材料）を用いる。細胞結合性材料の例としては、末端に細胞結合性基を有する材料が挙げられる。細胞結合性基の一例としては、前記一般式（４）を含む材料のうち、式中Ｘとして、共有結合性官能基を有するものが挙げられる。ここで共有結合性官能基とは、細胞表面に存在する化合物の構成要素である官能基（以下細胞表面官能基）と共有結合反応を行うことが可能な官能基である。細胞結合性基の他の一例としては、前記一般式（４）を含む材料のうち、式中Ｘに、細胞の表面抗原に対する抗体を結合させた材料も挙げられる。
【０１１０】
第２の従来例（特開２００６−６２１４号公報）における末端官能基や、末端官能基に吸着させる細胞接着促進物質と、本願発明における細胞結合性基との主な相違点は以下の通りである。末端官能基や細胞接着促進物質の場合は、細胞がその表面に備える細胞接着因子などの機能を利用して、末端官能基や細胞接着促進物質に対して接着を行う、即ち細胞が主体となって接着を行う。一方、細胞結合性基の場合は逆に細胞結合性基が共有結合性官能基や抗体を利用して、細胞表面の化合物と共有結合や抗原抗体反応を行う、即ち細胞結合性基が主体となって接着を行う。換言すると、細胞との接着において、第２の従来例における末端官能基や細胞接着促進物質は受動的、本願の細胞結合性基は積極的な作用を有する。第２の従来例における末端官能基や細胞接着促進物質を用いる場合は、接着力が一般に弱い課題があるほか、細胞が接着機能を発揮するために因子の産生や分泌、細胞表面の分子の配列などの機能発現を待つ必要があるため、接着に時間がかかるという課題がある。一方、本願における細胞結合性基を用いる場合は、接着力が高いばかりでなく、細胞側の機能の発現に依存しないため、接着時間が短い、という特長がある。
【０１１１】
共有結合性官能基の具体例としては以下が挙げられる。例えば細胞表面には各種の細胞表面たんぱく質（細胞膜たんぱく質）が存在し、たんぱく質には多数のアミノ基が存在するため、細胞表面にはアミノ基が広く存在する。細胞表面のアミノ基に対する共有結合性官能基の代表的な例としては、カルボン酸の活性エステル基、具体的にはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルやＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルなどが挙げられる。アミノ基に対する共有結合性官能基の他の例としては、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸無水物、カルボン酸アジドなどの活性化したカルボン酸も使用可能である。またエポキシド基、アジリジン基、アジリジニウム基、エピスルホニウム基などのひずみの大きな三員環官能基なども使用可能である。さらにｐ−トルエンスルホニル基なども使用可能である。また細胞表面には各種の糖鎖も存在する。糖鎖を構成する糖類はアルデヒド基又はケトン基を有する異性体構造を取りうるため、細胞表面にはアルデヒド基やケトン基も広く存在する。細胞表面のアルデヒド基やケトン基に対する共有結合性官能基の例としては、１、３−ジオール、ヒドラジン、ヒドロキシルアミンエーテルなどが挙げられる。ｐ−トルエンスルホニル基は、水酸基等と反応し、細胞表面の水酸基を有するたんぱく質や糖類などの各種化合物とも共有結合可能である。
【０１１２】
細胞接着性材料として、上記のごとく細胞との結合が極めて強固な細胞結合性材料を用いる構成により、細胞接着性光制御基材はこの官能基を介して、細胞表面の官能基と極めて強固に結合することができる、という効果がある。特に、細胞表面の官能基に対する共有結合性官能基を末端に有する細胞結合性材料を用いる構成により、細胞接着性光制御基材はこの官能基を介して、細胞表面の官能基と共有結合により極めて強固に結合することができる、という効果がある。これらの構成における基材と細胞との間に形成される共有結合は強固であるため、基材に細胞が接触するだけで細胞が基材の表面に固定化され、細胞側の接着機能発現を待つ必要も無い。従って、細胞接着性光制御基材に対する細胞の接着時間が短縮されるという効果もある。
【０１１３】
ここで、細胞接着性材料として細胞結合性材料を用い、この細胞結合性材料が細胞表面のアミノ基に対する共有結合性官能基を末端に有するものである場合、この材料は細胞だけでなく抗体も共有結合により結合することができる。なぜなら、抗体にもアミノ基が多数存在するためである。従って、アミノ基に対する共有結合性官能基を末端に有する細胞接着性材料を有する細胞接着性光制御材料をまず作製した後、それに対して抗体を添加して反応させることにより、抗体を結合した細胞接着性光制御材料を作製することができる。
【０１１４】
関連して、この材料は細胞や抗体だけでなく、細胞外マトリックスなどのたんぱく質も共有結合により結合することができる。なぜなら、細胞外マトリックスたんぱくにもアミノ基が多数存在するためである。従って、アミノ基に対する共有結合性官能基を末端に有する細胞接着性材料を有する細胞接着性光制御材料をまず作製した後、それに対して細胞外マトリックスを添加して反応させることにより、細胞外マトリックスを結合した細胞接着性光制御材料を作製することができる。同様に、アビジンやストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、などの、抗体を結合する際に汎用されるたんぱく質も共有結合により結合することができる。
【０１１５】
細胞接着性材料として、共有結合性官能基を末端に有する細胞結合性材料を用いる場合、官能基を適切に選択することにより、安定性の高い細胞接着性光制御基材を実現することができる。例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルやエポキシド基、ｐ−トルエンスルホニル基などは安定性の高い共有結合性官能基として知られている。
【０１１６】
細胞接着性材料における細胞接着性基Ｘに、抗体を結合して用いる場合、抗体は一般に安定性が高く結合性能を安定に維持可能であるため、細胞接着性光制御材料を基材上に成膜して形成する細胞接着性光制御基材の製造段階において、抗体を細胞接着性光制御基材に結合しておくことができる。同様に、細胞外マトリックスも結合しておくことができる。この場合、細胞接着性光制御基材に保存料を含む緩衝液を満たしたり、保冷したりすることにより、有効期間を長く維持することができる。
【０１１７】
共有結合性官能基や、抗体を製造段階において予め細胞接着性光制御基材に結合しておくことにより、細胞接着性光制御基材を使用者にそのまま使用してもらうことが可能になる。この構成により、使用者が官能基を調製したり抗体を結合したりする手間と時間を省略できる、という効果がある。
【０１１８】
一方、共有結合性官能基を製造段階において予め細胞接着性材料に結合しておくことにより、所望の抗体や細胞外マトリックスを使用者が自ら結合した上で、使用することも可能である。この構成により、使用者が官能基を調製する手間と時間を省略できるとともに、使用する抗体や細胞外マトリックスを使用者が任意に選択できる、という効果がある。
【０１１９】
細胞接着性材料における細胞接着性基Ｘに、動物種特異的な抗体を結合して用いる場合、細胞を分散する分散媒として、培地や緩衝液など、一般に細胞培養において汎用される分散媒を自由に選択可能である。一方、細胞接着性材料における一般式（４）の細胞接着性基Ｘとして共有結合性官能基を用いる場合、分散媒に共有結合性官能基が反応する成分を含まない分散媒が利用できる。アミノ基に対する共有結合性官能基を有する細胞結合性材料を用いる場合、細胞の分散媒としては例えばHBSS(Hanks’ Balanced Salt Solution、Ca2+、Mg2+含有)（以下HBSS(+)と略す）などのアミノ基を含まない緩衝液が好適に使用可能である。HBSS(+)は、細胞接着因子であるCa2+やMg2+を含むため、細胞接着を促進できる、という効果もある。HBSS(+)は、細胞接着工程ばかりでなく、接着した細胞を解析したり、部分的に回収したりするなど、細胞を取り扱う工程全般において、細胞の接着性維持に有効である。一方、細胞接着が終了後、細胞接着性をそれ以上必要としない場合は、例えばトリスヒドロキシメチルアミノメタンのごとくアミノ基を含む緩衝剤や、細胞外マトリックスなどのたんぱく質や、血清含有培地などを導入して反応させることにより、上記共有結合性官能基と反応させ、それ以上の反応性を喪失させることもできる。
【０１２０】
細胞接着性光制御基材に対する細胞の接着時間を短縮するため、本発明においては、以下の手段も講じることが好ましい。即ち、上記のごとき細胞接着性の向上は、細胞が基材に接触して初めて功を奏する。しかし細胞試料を基材に導入しても、細胞は試料液中に懸濁しており、換言するとほとんどの細胞が試料液中に浮遊しているため、直ちに基材と接触できない。試料液中の浮遊細胞が沈降して基材と接触するまでに、概ね30分程度の時間を必要とする。本願発明の一態様のごとく、細胞を基材に一時的に捕捉して解析し、目的細胞のみを剥離して回収する使用形態の場合、細胞が沈降するのを待つ工程に約30分を費やすのは時間効率が悪いという課題がある。そこで、細胞を沈降する工程時間を短縮するために、本発明では遠心力を応用して細胞の沈降を加速することを検討した。典型的な遠心機（日立工機製himac CF7D2型）を用いる場合、スイングローター（RT3S3型）、SBS規格マイクロプレート用のバケット（回転半径170ｍｍ）と組合せ、マイクロプレート型の細胞培養容器を用いることにより、容器底面に形成した細胞接着性光制御基材に対し概ね垂直に遠心力を作用させ、細胞接着性光制御基材に対し細胞を均一に沈降させることができる。上記装置構成にて約４００ｘｇの遠心力を細胞懸濁液に作用させる場合（回転数約1450回転／分）、最短30秒間、長くても90秒間の短時間の遠心操作を行うことにより、懸濁状態の細胞をほとんど全て沈降可能であることが判明した。細胞培養容器としてディッシュ（シャーレ）やフラスコなどを用いる場合は、それらをSBSプレート用バケットに固定する冶具を用いることにより、遠心操作中の容器の移動や破損を防止できる。上記装置構成を用いる場合、加減速に別途時間がかかり、それぞれ約33秒、約41秒である。つまり本発明方式を採用すると、細胞の沈降に要する時間は加減速を含めて約1.5〜３分である。従って、従来の自然沈降に必要な約30分と比較して、細胞沈降に要する時間を1桁以上短縮することができる、という効果がある。
【０１２１】
また、自然沈降の場合は概ね球形の細胞の最下端が容器底部に接触するだけであるため、接触面積が小さく、接着が弱いという課題もある。本発明方式では細胞に遠心力を与えて容器に圧接するため、細胞が変形して偏平化し、接触面積が増大し、広い接着面積により強固に接着できる、という効果もある。
【０１２２】
遠心の有効性は細胞沈降の工程に限らない。細胞沈降工程に続いて、細胞接着の工程が一般に必要であり、両工程を合わせて通常3時間程度の時間を要する。本願発明のごとく細胞接着性材料として共有結合性官能基を末端に有する細胞結合性材料を用いたり、細胞接着性材料における細胞接着性基Ｘに動物種特異的抗体を結合して用いると、結合が強固となるため、細胞接着時間が短縮されるのは前述の通りである。この細胞接着工程において遠心を併用することにより、細胞と容器との接触面積が増大して接着が促進される。即ち、細胞沈降に要する30ないし90秒間で遠心を終了せず、引き続き数分間遠心を継続することにより、細胞接着も促進し、細胞をより強固に容器（に形成した細胞接着性光制御基材）に接着することができる、という効果がある。
【０１２３】
以下、本発明の一態様としての原理検証のための実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０１２４】
［実施例１］
一般式（１）で表されるメタアクリル酸エステル重合体（Ｒ1：ＣＨ3、ｎ：１）と一般式（２）で表されるメタアクリル酸エステル重合体（Ｒ1：ＣＨ3、Ｒ2：ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）と一般式（１４）で表されるメタアクリル酸エステル重合体（Ｒ1：ＣＨ3、Ｒ4：ＯＣＯＮＨ、Ｒ5：Ｂｒ、Ｒ6：ＯＨ、Ｒ８：Ｈ、Ｒ９：Ｈ、Ｒ１３：ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２、Ｒ１６：ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＯＣＨ２ＮＨＣＨ２、Ｘ：ＣＯ2Ｈ、）の３元共重合体を成膜したガラス製培養容器（底面積９.６cm2）を用意する。不要な細胞のモデルとしてＮＩＨ／３Ｔ３細胞（マウス繊維芽細胞由来のセルライン）を１２万個用意し、同細胞専用培地（１０％子牛血清、９０％ＤＭＥＭ）１.６ｍＬに懸濁する。このＮＩＨ／３Ｔ３細胞懸濁液をガラス製培養容器に加え、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータにて１日間培養する。必要な細胞のモデルとしてＨＣＴ１１６細胞（ヒト結腸がん由来のセルライン）を２４万個用意し、同細胞専用培地（１０％ＦＢＳ、９０％McCoy‘s  ５ａ）１.６ｍＬに懸濁する。前記ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を培養したガラス製培養容器から培地を除去し、ＨＣＴ１１６細胞の細胞懸濁液をガラス製培養容器に加え、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータにて１日間培養する。また別途両細胞をそれぞれ単独で同様に培養し、それらの位相差顕微鏡像を取得しておく。ちなみにＨＣＴ１１６細胞は敷石状、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞は紡錘状の細胞形態を示す。前記ガラス製培養容器を本発明の装置に設置し、４５０ｎｍ以下の光をカットして位相差顕微鏡観察を行う。不要細胞（すなわち紡錘状のＮＩＨ／３Ｔ３細胞）の位置をモニターにて確認し、その不要細胞群内周辺をレーザアブレーション領域に設定する（図１（１）（２）（３）（４ａ）（５ａ）参照）。３３７ｎｍのレーザ光をレーザ走査照射して必要細胞（すなわち敷石状のＨＣＴ１１６細胞）と不要細胞の間及び細胞接着性光制御材料を切断する。その後、レーザアブレーション照射で囲まれた内側の領域内の目的外細胞群領域に、光反応用の３７５ｎｍレーザ光走査を行う。ガラス製培養容器を装置から取り出し、不要細胞群を培地と共に回収し、新たな培地を加えて、インキュベータに戻して培養を続けた。これにより、ほとんど全ての不要細胞を除去し、必要細胞を残して培養を継続できる。
【０１２５】
本例はモデル細胞を用いて動作原理を示したが、必要細胞を正常細胞、不要細胞を異常細胞と置き換えて同様の操作を行うことも可能である。具体的には例えば幹細胞の分化誘導研究において異常細胞（目的外の細胞へ分化した細胞や、幹細胞性を維持したままの未分化細胞など）を除去し、正常細胞（目的通りに分化した細胞など）を残して選別分取する目的などに同様に適用可能である。逆に必要細胞を異常細胞、不要細胞を正常細胞と置き換えて同様の操作を行うことも可能である。具体的には例えばがん細胞の研究において、正常細胞（目的外の、がん化していない細胞）を除去し、異常細胞（目的とするがん細胞など）を残して選別分取し濃縮する目的などにも同様に適用可能である。
【０１２６】
上記の例では細胞の観察手法として位相差顕微鏡を用いて細胞の形態を判断基準として細胞を判別する場合について例示したが、他の手法により細胞を判別することもできる。例えば細胞に特異的な蛍光染色試薬を用い、蛍光顕微鏡像を用いて目的細胞と目的外細胞とを判別することも可能である。
【０１２７】
本例では細胞接着性光制御材料の細胞接着性基を適切に選択することや細胞接着性材料と細胞非接着性材料の比を適切にコントロールすることにより、様々な種類の細胞を接着させることが可能になる。また、細胞接着性から非接着性へ光解離反応で効率良く非可逆的に変化するので、細胞と該基材との接着選択性に優れ、更に、細胞間の接着及び細胞接着性光制御材料をレーザ光で切断するので、任意の領域に存在する所望の細胞を回収するにあたり、該細胞の純度、回収率を高めることができる。更にまた、細胞を培養するに当たって、フローサイトメーターあるいはソーティング装置のように、培養基材から細胞を一旦取り出して純化する必要がなく、同じ培養基材上で、不要な目的外細胞をリアルタイムに除去しながら培養することができ、培養・純化の操作が簡単になる。目的細胞と目的外細胞が密着していたり、入り込んでいたりしても、目的細胞と目的外細胞とが空間的に分離され、細胞領域が区画化される。これにより、光解離反応を目的外細胞領域に限定して行うことができ、目的外細胞を選択的に剥がすことができる。一旦剥がれた細胞は、元の場所が細胞非接着性に非可逆的に変化するため、再接着することがなく、目的外細胞を効果的に除くことができる。更にまた、フローサイトメーターあるいはソーティング装置のような、電気的刺激、衝撃がなく、また、光反応波長、位相差顕微鏡観察用光波長、蛍光観察用励起光波長をコントロールすることにより細胞への光毒性も低減できるので、細胞のバイアビリティーを上げることができる。更に、細胞を２次元平面上に並べ、ほぼ同時に各細胞に光を当てて、位相差顕微鏡あるいは蛍光観察をするので、フローサイトメーターのように１次元に細胞を並べて個々の細胞にレーザを当てるための光軸調整が不要になる。
【０１２８】
［実施例２］
一般式（１７）で表されるアルコキシシラン（Ｒ２：ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、Ｒ３：ＣＨ３、Ｒ４：ＯＣＯＯ、Ｒ５：Ｂｒ、Ｒ６：ＯＨ、Ｒ８：Ｈ、Ｒ９：Ｈ、Ｒ１９：ＣＨ２ＮＨＣＨ２）をガラス製培養容器上に成膜し、続いて、Ｃｕイオン存在下、アジド化合物：ＲＧＤペプチドーＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ３をHuisgen反応させた。このガラス製培養容器に実施例１と同様にしてＮＩＨ／３Ｔ３細胞とＨＣＴ１１６細胞を４日間共培養し続けた後、ガラス製培養容器をインキュベータから取り出す。細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞表面マーカー用ブロッキング液（ＪＲＨ社）で１時間処理する。ヒト細胞のマーカーであるＨＬＡ抗原を検出するために、マウス抗ヒトＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ抗体のＦＩＴＣ標識品（BioLegend社、クローンW6/32）と、マウス細胞のマーカーであるＨ−２抗原を検出するために、ラット抗マウスＨ−２抗体のＰＥ（フィコエリスリン）標識品（BioLegend社、クローンM1/42）とを細胞表面マーカー用ブロッキング液で希釈した染色液を加え、室温で１時間反応し、ＰＢＳで洗浄する。細胞の観察及び分別は以下の様に行った。ガラス製培養容器を本発明の装置に設置する。顕微鏡観察及び蛍光観察には、光反応させないために、光源波長の内４５０ｎｍ以下の光をカットする。蛍光観察及び位相差顕微鏡観察にて、ヒト細胞（ＦＩＴＣで標識される、蛍光波長５２０ｎｍ、緑橙色）とマウス細胞（ＰＥで標識される、蛍光波長５７５ｎｍ、橙色）の位置をモニターにて確認し、それぞれの細胞群内のレーザアブレーション領域を設定する（図１（１）（２）（３）（４ｂ）（５ｂ）参照）。３３７ｎｍのレーザ光を走査して、ヒト細胞と、マウス細胞との間及び細胞接着性光制御材料を切断し、それぞれの細胞群の領域を分離する。その後、まず、ヒト細胞領域に、光反応のための３７５ｎｍレーザ光走査を行う。そして、剥離され、培地中に浮遊するヒト細胞を培地と共に回収する。必要に応じて、次に、洗浄し、培地を添加した後、異なる領域、すなわち、マウス細胞領域に、光反応用の３７５ｎｍレーザ光走査を行う。そして、剥離され、培地中に浮遊するマウス細胞を培地と共に回収する。
【０１２９】
本例は、実施例１とは違い、光解離反応を起こさせる領域を逆にすることで、所望の必要細胞を高純度、高回収率、高バイアビリティーで分取するものである。
【０１３０】
本実施例のごとく蛍光観察を行う場合の特有の効果として、極微量の不要細胞が混入していても、必要細胞と不要細胞をそれぞれ選択的に蛍光染色し、蛍光検出によりそれぞれを高感度に検出、識別し、必要細胞のみを高精度に選別分取できる、という効果が挙げられる。また、本実施例では３種以上の細胞の混合物から、必要細胞を２種以上設定して、それぞれ順次回収することも可能である。
【０１３１】
本例はモデル細胞を用いて動作原理を示したが、必要細胞をヒト細胞、不要細胞をマウスフィーダー細胞と置き換えて同様の操作を行うことも可能である。具体的には例えばヒト幹細胞の未分化維持や分化誘導の研究において、不要細胞（マウスフィーダー細胞）を除去し、複数の目的細胞（多能性を維持しているヒト幹細胞と、ヒト幹細胞から分化した各種の分化細胞）を順次選別分取する目的などに適用可能である。この場合、ヒト幹細胞の未分化性の識別には、位相差顕微鏡による細胞形態や、各種幹細胞マーカーを指標とする蛍光染色などを採用可能である。もちろん本実施例で用いたモデル細胞は、実施例１と同様、各種目的に応じてそれぞれ設定可能である。本例のその他の効果は実施例１と同様である。
【０１３２】
［実施例３］
実施例１と同様にして培養した別のガラス製培養容器にＰＢＳを加えて洗浄後、Trypsin／ＥＤＴＡ溶液を加えて、室温で数分放置し、ガラス製培養容器から細胞を剥離させる。その後、Trypsin阻害液を加えて反応を停止させ、ピペッティングにて細胞を遠心管に回収し、数分遠心分離を行い、上清を除いて培地を加え、細胞の懸濁液とした。また、ヒト細胞マーカー、マウス細胞マーカーを指標とすると細胞染色は実施例２と同様にして行った。次に、一般式（１）で表されるメタアクリル酸エステル重合体（Ｒ1：ＣＨ3、ｎ：１）と一般式（２）で表されるメタアクリル酸エステル重合体（Ｒ1：ＣＨ3、Ｒ2：ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）と一般式（１１）で表されるメタアクリル酸エステル重合体（Ｒ1：ＣＨ3、Ｒ4：ＯＣＯＯ、Ｒ5：Ｂｒ、Ｒ6：ＯＨ、Ｒ８：Ｈ、Ｒ９：Ｈ、Ｒ１１：ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２、Ｒ１４：ＣＨ２ＣＨ２、Ｘ：ＣＯ2Ｈ、）の３元共重合体を成膜したガラス製培養容器を用意し、ＰＢＳを添加して、本発明の装置内に設置した。そして、２０μｍ角の細胞接着領域が４０μｍピッチで格子状に並ぶ様に、それ以外の領域を３７５ｎｍレーザ光走査し、反応生成物をＰＢＳと共に除去し、再度、ＰＢＳで洗浄した。このガラス製培養容器に上記細胞懸濁液を播種・揺動した後、３時間静置した。あるいは、接着を加速するために、播種・揺動の後、プレート遠心機等を用いて細胞をガラス製培養容器の底部に沈降させた後、３０分間静置した。接着していない細胞を除くために、培地を交換した後、本容器を本発明の装置内に設置した。細胞の観察及び分別は以下の様に行った。顕微鏡観察及び蛍光観察には、光反応させないために、光源波長の内４５０ｎｍ以下の光をカットする。顕微鏡観察及び蛍光観察による各アドレスの色情報により、ヒト細胞、マウス細胞、細胞無接着の位置を検出する。細胞接着領域の細胞無接着のアドレス領域に光反応用の３７５ｎｍレーザ光走査を行い、回収細胞が再度接着しないようにした後、ヒト細胞のアドレス領域に、光反応用の３７５ｎｍレーザ光走査を行い、剥離したヒト細胞を培地と共に回収する。必要に応じて、次に、培地を添加し、マウス細胞のアドレス領域に、光反応用の３７５ｎｍレーザ光走査を行い、剥離したマウス細胞を培地と共に回収した。
【０１３３】
本実施例では、実施例１、２と同様の効果の他に、細胞を解析・分析するに当たり、個々の細胞を格子状のアドレスに接着させることで、光学的検出、解析分別のスピードを速めることができる。また、このような方法により、化合物による細胞の反応などを観察・解析しながら、即、分別できるようになり、リアルタイムな対応が可能になる、という効果がある。
【０１３４】
［実施例４］
Colo320ＨＳＲ細胞１５万個を同細胞用培地（１０％ＦＢＳ、９０％ＲＰＭＩ１６４０）に懸濁し、コラーゲンコートしたガラス製培養容器に播種して７日間培養した。その後、０.２５％トリプシンＰＢＳ液で剥がし、反応停止後、新鮮な同培地に懸濁した。
【０１３５】
別途、一般式（１）で表されるメタアクリル酸エステル重合体（Ｒ1：ＣＨ3、ｎ：１）と一般式（２）で表されるメタアクリル酸エステル重合体（Ｒ1：ＣＨ3、Ｒ2：ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）と一般式（１２）で表されるメタアクリル酸エステル重合体（Ｒ1：ＣＨ3、Ｒ4：ＯＣＯＯ、Ｒ5：Ｂｒ、Ｒ6：ＯＨ、Ｒ７：Ｈ、Ｒ８：Ｈ、Ｒ１２：ＣＨ2ＣＨ2(Ｃ2ＨＮ３)ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２、Ｒ１４：ＣＨ２ＣＨ２、Ｘ：ＣＯ2Ｈ、）の３元共重合体を成膜し、その上にコラーゲンをコートしたガラス製培養容器を用意し、ＰＢＳを添加して、本発明の装置内に設置した。そして、２０μｍ角の細胞接着領域が４０μｍピッチで格子状に並ぶ様に、まず、碁盤目状に３３７ｎｍのレーザ光をレーザ走査して細胞接着性光制御材料を切断した。次いで、細胞接着領域以外の領域を３７５ｎｍレーザ光走査し、反応生成物をＰＢＳと共に除去し、再度、ＰＢＳで洗浄した。
【０１３６】
ここに上記細胞懸濁液を播種・揺動した後、３時間静置した。あるいは、接着を加速するために、播種・揺動の後、プレート遠心機等を用いて細胞をガラス製培養容器の底部に沈降させた後、３０分間静置した。接着していない細胞を除くために、培地を交換し、細胞の観察及び分別は以下の様に行った。顕微鏡観察には、光反応させないために、光源波長の内４５０ｎｍ以下の光をカットした。顕微鏡観察による各アドレスの細胞画像情報により、Colo320ＨＳＲ細胞の位置を検出した。細胞接着領域の細胞無接着のアドレス領域に光反応用の３７５ｎｍレーザ光走査を行い、回収細胞が再度接着しないようにした後、Colo320 ＨＳＲ細胞のアドレス領域に、光反応用の３７５ｎｍレーザ光走査を行い、剥離したColo320ＨＳＲ細胞を培地と共に回収した。
【０１３７】
本実施例は、実施例１、２と同様の効果の他に、細胞外マトリックスやフィーダー細胞などの繊維状や膜状の物質を細胞との接着に用いる場合の該材料のパターニングに有効に作用する。上層に繊維状又は膜状物質がある場合、第１の光照射だけでは細胞接着性材料が領域毎に切断されない可能性がある。これを第２の光照射で領域間を切断する。
【０１３８】
本実施例では細胞外マトリックスとしてコラーゲンを用い、接着性が低い細胞としてColo320ＨＳＲ細胞をモデルとして用いた。本実施例では他の細胞外マトリックスや接着性が低い細胞も同様に好適に使用可能である。細胞外マトリックスの例としては上記コラーゲン以外にフィブロネクチン、ラミニン、ゼラチンなどがあり、またフィーダー細胞としてはマウス胎児繊維芽（ＭＥＦ）細胞、ＳＴＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＳＮＬ細胞、などに対しガンマ線照射や抗生物質により増殖停止処理をしたものが利用できる。細胞外マトリックスを必要とする細胞の例としては、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、などの多能性幹細胞や、角膜上皮幹細胞、なども挙げられる。
【０１３９】
［実施例５］
実施例３と同様にして培養した別のガラス製培養容器にＰＢＳを加えて洗浄後、Trypsin／ＥＤＴＡ溶液を加えて、室温で数分放置し、ガラス製培養容器から細胞を剥離させる。その後、Trypsin中和液を加えて反応を停止させ、ピペッティングにて細胞を遠心管に回収し、数分遠心分離を行い、上清を除いて培地を加え、細胞の懸濁液とした。また、ヒト細胞マーカー、マウス細胞マーカーを指標とする蛍光染色も実施例３と同様にして行った。次に、一般式（１）で表されるメタアクリル酸エステル重合体（Ｒ1：ＣＨ3、ｎ：１）と一般式（２）で表されるメタアクリル酸エステル重合体（Ｒ1：ＣＨ3、Ｒ2：ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）と一般式（１３）で表されるメタアクリル酸エステル重合体（Ｒ1：ＣＨ3、Ｒ4：ＯＣＯＮＨ、Ｒ5：Ｂｒ、Ｒ７：Ｈ、Ｒ８：Ｈ、Ｒ９：Ｈ、Ｒ１３：ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２、Ｒ１５：ＣＨ2ＣＨ2ＯＣＯＣＨ2Ｏ、Ｘ：ＣＯ2Ｈ）の３元共重合体を成膜したガラス製培養容器を用意し、ＰＢＳを添加して、本発明の装置内に設置した。そして、２０μｍ角の細胞接着領域が４０μｍピッチで格子状に並ぶ様に、それ以外の領域を３６５ｎｍレーザ光走査し、反応生成物をＰＢＳと共に除去し、再度、ＰＢＳで洗浄した。このガラス製培養容器に上記細胞懸濁液を播種・揺動した後、３時間静置した。あるいは、接着を加速するために、播種・揺動の後、プレート遠心機等を用いて細胞をガラス製培養容器の底部に沈降させた後、３０分間静置した。接着していない細胞を除くために、培地を交換した後、本容器を本発明の装置内に設置した。細胞の観察及び分別は以下の様に行った。顕微鏡観察及び蛍光観察には、光反応させないために、光源波長の内４５０ｎｍ以下の光をカットする。顕微鏡観察及び蛍光観察による各アドレスの色情報により、ヒト細胞、マウス細胞、細胞無接着の位置を検出する。細胞接着領域の細胞無接着のアドレス領域に光反応用の３６５ｎｍ光パターン照射を行い、回収細胞が再度接着しないようにした後、ヒト細胞のアドレス領域に、光反応用の３６５ｎｍ光パターン照射を行い、剥離したヒト細胞を培地と共に回収する。必要に応じて、次に、培地を添加し、マウス細胞のアドレス領域に、光反応用の３６５ｎｍ光パターン照射を行い、剥離したマウス細胞を培地と共に回収した。
【０１４０】
本実施例では、実施例１、２と同様の効果の他に、細胞を解析・分析するに当たり、個々の細胞を格子状のアドレスに接着させることで、光学的検出、解析分別のスピードを速めることができる。また、このような方法により、化合物による細胞の反応などを観察・解析しながら、即、分別できるようになり、リアルタイムな対応が可能になる。
【０１４１】
［実施例６］
実施例３と同様に培養した細胞を剥離、回収した後、それぞれ独立に蛍光染色を行い、蛍光染色したHCT116細胞とNIH/3T3細胞を緩衝液（HBSS(+)）に懸濁した細胞懸濁液を得た。以下特記しない限り緩衝液としてHBSS(+)を用いた。
【０１４２】
次に、一般式（１）で表されるメタアクリル酸エステル重合体（Ｒ1：ＣＨ3、ｎ：１）と一般式（２）で表されるメタアクリル酸エステル重合体（Ｒ1：ＣＨ3、Ｒ2：ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）と一般式（１４）で表されるメタアクリル酸エステル重合体（Ｒ1：ＣＨ3，Ｒ4：ＯＣＯＮＨ，Ｒ5：Ｂｒ，Ｒ6：ＯＨ，Ｒ８：Ｈ，Ｒ９：Ｈ，Ｒ１３：ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２，Ｒ１６：ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＯＣＨ２ＮＨＣＨ２，Ｘ：ＣＯ2Ｈ，）の３元共重合体を成膜したガラス部材を底部に設けた培養容器を用意した。
【０１４３】
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride（ＥＤＣ）0.4mgを、活性化緩衝液（0.1M MES、0.5M NaCl、pH6.0）1mLに溶解した反応液を、上記重合体を成膜した培養容器に添加した。さらにsulfo-NHS（N-hydroxysulfosuccinimide）を、終濃度5mMとなるように前記の反応液に添加し、室温で15分間揺動した。反応液を捨て、pH7.4のPBSで3回洗浄することにより、前記の置換基ＸがＣＯ−Ｚ（ただしＺはN-oxysulfosuccinimide基）で表される、共有結合性官能基を有する細胞結合性光制御基材を設けた培養容器を作製した。上記の操作は全て遮光状態で実施した。この細胞結合性光制御基材は共有結合性官能基としてカルボン酸の活性エステル基を有するため、アミノ基と共有結合反応を行う特性を有する。またアミノ基などの求核試薬と反応させない限り安定であり、窒素雰囲気中、空気中、また無菌状態ではPBS中、HBSS(+)中などさまざまな環境で結合性を維持したまま長期保存可能である。
【０１４４】
上記培養容器に緩衝液を添加して、本発明の装置内に設置した。そして、２０μｍ角の細胞接着領域が４０μｍピッチで格子状に並ぶ様に、それ以外の領域を３７５ｎｍレーザ光走査し、反応生成物を緩衝液と共に除去し、再度、緩衝液で洗浄した。この培養容器に上記細胞懸濁液を播種・揺動した後、遠心機のプレート用スイングロータに設置し、固定冶具により固定した後、４００ｘｇの遠心加速度により約2分間遠心することにより、細胞を培養容器の底部に沈降させた後、５分間静置した。なお固定冶具として培養容器をスイングロータに固定できるばかりでなく、培養容器を外光から遮蔽するカバーを有するものを用いることにより、遮光条件を維持しつつ、容易に遠心操作が可能である。この操作により、細胞結合性光制御基材の上に細胞が沈降して接触、圧接し、細胞結合性光制御基材の共有結合性官能基が細胞表面官能基であるアミノ基と共有結合し、細胞が細胞結合性光制御基材と強固かつ迅速に接着する。細胞緩衝液を交換して接着していないごく少数の細胞を除いた後、本容器を本発明の装置内に設置した。上記の操作は全て遮光状態で実施した。細胞の観察及び分別は実施例３と同様に行った。即ち顕微鏡観察及び蛍光観察には、光反応させないために、光源波長の内４５０ｎｍ以下の光をカットする。顕微鏡観察及び蛍光観察による各アドレスの色情報により、ヒト細胞、マウス細胞、細胞無接着の位置を検出する。細胞接着領域の細胞無接着のアドレス領域に光反応用の３７５ｎｍレーザ光走査を行い、回収細胞が再度接着しないようにした後、ヒト細胞のアドレス領域に、光反応用の３７５ｎｍレーザ光走査を行い、剥離したヒト細胞を緩衝液と共に回収する。必要に応じて、次に、緩衝液を添加し、マウス細胞のアドレス領域に、光反応用の３７５ｎｍレーザ光走査を行い、剥離したマウス細胞を緩衝液と共に回収した。
【０１４５】
本実施例では、実施例３と同様の効果の他に、細胞接着工程において、細胞結合性光制御基材を用い、また細胞の分散媒としてアミノ基を含まずCa2+やMg2+を含むHBSS(+)を用いることで、細胞接着時間を短縮し、操作のスピードを速めることができる。また、このような方法により、前処理時間を短縮して即、分別できるようになり、細胞の損傷や変質を抑制し、リアルタイムな対応が可能になる。
【０１４６】
［実施例７］
実施例６と同様に培養した細胞を剥離、回収した後、それぞれ独立に蛍光染色を行い、蛍光染色したHCT116細胞とNIH/3T3細胞を緩衝液（HBSS(+)）に懸濁した細胞懸濁液を得た。以下特記しない限り緩衝液としてHBSS(+)を用いた。
【０１４７】
次に、一般式（１）で表されるメタアクリル酸エステル重合体（Ｒ1：ＣＨ3、ｎ：１）と一般式（２）で表されるメタアクリル酸エステル重合体（Ｒ1：ＣＨ3、Ｒ2：ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）と一般式（１４）で表されるメタアクリル酸エステル重合体（Ｒ1：ＣＨ3，Ｒ4：ＯＣＯＮＨ，Ｒ5：Ｂｒ，Ｒ6：ＯＨ，Ｒ８：Ｈ，Ｒ９：Ｈ，Ｒ１３：ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２，Ｒ１６：ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＯＣＨ２ＮＨＣＨ２，Ｘ：ＣＯ2Ｈ，）の３元共重合体を成膜したガラス部材を底部に設けた培養容器を用意した。
【０１４８】
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride（ＥＤＣ）0.4mgを、活性化緩衝液（0.1M MES、0.5M NaCl、pH6.0）1mLに溶解した反応液を、上記重合体を成膜した培養容器に添加した。さらにsulfo-NHS（N-hydroxysulfosuccinimide）を、終濃度5mMとなるように前記の反応液に添加し、室温で15分間揺動した。反応液を捨て、pH7.4のPBSで3回洗浄することにより、前記の置換基ＸがＣＯ−Ｚ（ただしＺはN-oxysulfosuccinimide基）で表される共有結合性官能基を有する培養容器を作製した。次に、マウス抗ヒトＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ抗体の精製品（BioLegend社、クローンW6/32）100μｇのPBS溶液を培養容器に添加し、室温で30分間揺動した。反応液を捨て、pH7.4のPBSで1回洗浄することにより、前記の置換基ＸがＣＯ−Ｚ（ただしＺは抗体のアミノ基からHを除去した残基）で表される、細胞表面抗原に対する抗体を有する細胞結合性光制御基材を設けた培養容器を作製した。上記の操作は全て遮光状態で実施した。この細胞結合性光制御基材はヒト細胞表面抗原に対する抗体を有するため、抗原抗体反応により、ヒト細胞と強固に結合し、マウス細胞とは結合しない特性を有する。また抗体は安定であり、無菌状態にてPBS中、HBSS(+)中などさまざまな環境で結合性を維持したまま長期保存可能である。
【０１４９】
上記培養容器に緩衝液を添加して、本発明の装置内に設置した。そして、２０μｍ角の細胞接着領域が４０μｍピッチで格子状に並ぶ様に、それ以外の領域を３７５ｎｍレーザ光走査し、反応生成物を緩衝液と共に除去し、再度、緩衝液で洗浄した。この培養容器に上記細胞懸濁液を播種・揺動した後、遠心機のプレート用スイングロータに設置し、固定冶具により固定した後、４００ｘｇの遠心加速度により約５分間遠心することにより、細胞を培養容器の底部に沈降、圧接させた。この操作により、細胞結合性光制御基材の上に細胞が沈降して接触、圧接し、細胞結合性光制御基材の抗体がヒト細胞の表面抗原と抗原抗体反応により結合し、ヒト細胞が細胞結合性光制御基材と強固かつ選択的に接着する。またこの抗体はマウス細胞の表面抗原とは反応しないため、マウス細胞は接着しない。細胞緩衝液を交換して接着していないマウス細胞を除いた後、本容器を本発明の装置内に設置した。上記の操作は全て遮光状態で実施した。細胞の観察及び分別は実施３と同様に行った。即ち顕微鏡観察及び蛍光観察には、光反応させないために、光源波長の内４５０ｎｍ以下の光をカットする。顕微鏡観察及び蛍光観察による各アドレスの色情報により、ヒト細胞、細胞無接着の位置を検出する。細胞接着領域の細胞無接着のアドレス領域に光反応用の３７５ｎｍレーザ光走査を行い、回収細胞が再度接着しないようにした後、ヒト細胞のアドレス領域に、光反応用の３７５ｎｍレーザ光走査を行い、剥離したヒト細胞を緩衝液と共に回収する。
【０１５０】
本実施例では、実施例３と同様の効果の他に、細胞接着工程において、細胞結合性光制御基材として抗体を有するものを用いることで、細胞接着時間を短縮し、操作のスピードを速めることができる。また、ヒト細胞に特異的な抗原に対する抗体を用いることにより、過剰に共存するマウス細胞を予め除去することが可能となり、解析における妨害を低減
可能となる。このような方法により、前処理時間を短縮して即、分別できるようになり、細胞の損傷や変質を抑制し、リアルタイムかつ高精度な対応が可能になる。
【０１５１】
なお、本実施例の変形例として、下記方法も採用可能である。即ち、表面にＣＯＯＨ基を有する市販の基材を底部に設けた容器を用い、上記実施例７と同様に、置換基ＸがＣＯ−Ｚ（ただしＺはN-oxysulfosuccinimide基）で表される共有結合性官能基を有する容器を作製した。次に、抗マウスCD9抗体精製品（クローンMZ3）のPBS溶液を実施例７と同様に容器に添加、反応させ、マウス細胞表面抗原に対する抗体を有する容器を作製した。この容器に細胞懸濁液を播種・揺動した後、遠心することにより、細胞を容器の底部に沈降、圧接させた。この操作により、マウス細胞が抗原抗体反応により選択的に結合し、ヒト細胞は反応しないため接着しない。即ち、この上清液にはヒト細胞のみが含まれる。この上清液を細胞懸濁液として用いて実施例7と同様に細胞の観察及び分別を行うことにより、解析における妨害を低減可能となる。
【０１５２】
以下、実施例１から実施例７と同様の細胞処理操作に使用した、別の細胞接着性光制御材料の実施例を示す。
【０１５３】
［実施例８］
一般式（１４）において、（Ｒ１：ＣＨ３、Ｒ４：ＯＣＯＯ、Ｒ５：Ｂｒ、Ｒ６：ＯＨ、Ｒ８：Ｈ、Ｒ９：Ｈ、Ｒ１３：ＣＨ２ＣＨ２、Ｒ１６：ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２（Ｎ３ＣＨＣ）ＮＣＨ３ＣＨ２、Ｘ：ＣＯ２Ｈ）である材料。
【化３０】
2012141202.tif 000032
【０１５４】
（１）6-bromo-7-hydroxy-4-(hydroxymethyl)-8-((methyl(prop-2-yn-1-yl)amino)methyl)-2H-chromen-2-one の合成
【化３１】
2012141202.tif 000033
【０１５５】
還流冷却器とArgon風船尽きの三方コックを取り付けた50ｍLのナス型フラスコに、マグネティックスターラーバーとparaformaldehyde（446.4mg、14.87mmol）を入れた。フラスコ内をArgon置換した後、ethanol（5mL）とN-methylpropargylamine（1.25mL、14.8mmol）を順次加えた。室温で１時間攪拌して生じた溶液に、6-bromo-7-hydroxy-4-hydroxymethyl-coumarin（1.3668g、5.042mmol）を加えて、オイルバス中で80℃に加熱しながら12時間攪拌を続けた。反応混合物を室温まで冷却後、生じた沈殿を吸引ろ取、ethanolで洗浄、真空デシケータ中で乾燥して、1.3933g（3.956mmol、収率78％）の目的化合物：6-bromo-7-hydroxy-4-(hydroxymethyl)-8-((methyl(prop-2-yn-1-yl)amino)methyl)-2H-chromen-2-oneを淡黄色固体として得た。
【０１５６】
1H NMR δ(CDCl3) 7.62(1H,s), 6.45(1H, t, J 1.5Hz), 4.84(2H, d, J 1.5Hz), 4.19(2H, s), 3.47(2H, d, J 2Hz), 2.48(3H, s), 2.40(1H, t, J 2Hz)
（２）tert-butyl 3-((((6-bromo-7-hydroxy-8-((methyl(prop-2-yn-1-yl)amino)methyl)-2-oxo-2H-Chromen-4-yl)methoxy)carbonyl)oxy)propanoateの合成
【化３２】
2012141202.tif 000034
【０１５７】
CaCl2管を取り付けた50mLのナス型フラスコに、マグネティックスターラーバーとtert-butyl 3-(((4-nitrophenoxy)carbonyl)oxy)propanoate（100.0mg、0.321mmol）を入れた。CH2Cl2（2mL）、4-dimethylaminopyridine（48.8mg、0.400mmol）、および6-bromo-7-hydroxy-4-(hydroxymethyl)-8-((methyl(prop-2-yn-1-yl)amino)methyl)-2H-chromen-2-one（70.0mg、0.199mmol）を順次加えて、室温で13時間攪拌した。水を加えて反応を停止した後、分離した有機層をAnhydrous magnesuim sulfateで乾燥した。乾燥剤をろ別後、ろ液を濃縮して得られた粗生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（20gのシリカゲル60、Merk社、溶出溶媒は2.4％methanol-dichloromethane）で精製すると、83.1ｍｇ（0.153mmol、収率77％）の目的化合物：tert-butyl 3-((((6-bromo-7-hydroxy-8-((methyl(prop-2-yn-1-yl)amino)methyl)-2-oxo-2H-Chromen-4-yl)methoxy)carbonyl)oxy)propanoateが得られた。
【０１５８】
1H NMR δ(CDCl3) 7.60(1H, s), 6.34(1H, t, J1Hz), 5.26(2H, d, J1Hz), 4.45(2H, t, J6Hz), 4.18(2H, s), 3.47(2H, d, J 2Hz), 2.92(1H, brs), 2.65(2H, t, J6Hz), 2.49(3H, s), 2.42(1H, t, J 2Hz), 1.46(9H, s)
（３）3-((((6-bromo-7-hydroxy-8-((methyl(prop-2-yn-1-yl)amino)methyl)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)  methoxy)carbonyl)oxy)propanoic acidの合成（一般式（２３）において、（Ｒ４：ＯＣＯＯ、Ｒ５：Ｂｒ、Ｒ６：ＯＨ、Ｒ８：Ｈ、Ｒ９：Ｈ、Ｒ３１：ＣＨ２ＣＨ２、Ｒ３２：ＣＨ２ＮＣＨ３ＣＨ２、Ｘ：ＣＯ２Ｈ）である材料の合成）
【化３３】
2012141202.tif 000035
【０１５９】
CaCl2管を取り付けた50mLのナス型フラスコに、マグネティックスターラーバーとtert-butyl 3-((((6-bromo-7-hydroxy-8-((methyl(prop-2-yn-1-yl)amino)methyl)-2-oxo-2H-Chromen-4-yl)  methoxy)carbonyl)oxy)propanoate（83.1mg、0.15mmol）を入れた。フラスコを氷浴で冷却しながら、CH2Cl2（1mL）とtrifluoro-acetic acid（0.5mL）を順次加えて、氷浴中で３時間攪拌した。溶媒を減圧留去すると90.3mg（0.15mmol）の目的化合物：3-((((6-bromo-7-hydroxy-8-((methyl(prop-2-yn-1-yl)amino)methyl)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)  methoxy)carbonyl)oxy)propanoic acidがtrifluoro-acetic acid saltとして得られた。
【０１６０】
1H NMR δ(CDCl3) 7.77(1H, s), 6.40(1H, s), 5.29(2H, s), 4.56(2H, s), 4.49(2H,t, J 6Hz), 3.97(2H, d, J 2Hz), 2.95(1H, s), 2.90(3H, s), 2.73(2H, t, J 6Hz), 2.78(1H, t, J 2Hz)
（４）poly(2- (6-azido-hexanoate) ethyl methacrylate)の合成
【化３４】
2012141202.tif 000036
【０１６１】
Argon風船付きの三方コックを取り付けた10mLのナス型フラスコに、マグネティックスターラーバーと6-azidehexanoic acid(195.2mg、1.24mmol)を入れた。フラスコ内をArgon置換した後、DMF(1.5mL)、65.0mgのpoly(2-hydroxyethyl methacrylate)（PolyHEMA、Average MV 〜300,000、Aldrich 192066-10G）、N,N’-diisopropylcarbodiimide(156.6μL、1.00mmol)および4-dimethylaminopyridine(6.5mg、0.29mmol)を順次加え、室温で３日間攪拌した。生じた沈殿をろ過して除き、ろ液に水を加えると白色沈殿が生成した。得られた白色沈殿を吸引ろ取後、THFに溶解した。この溶液にHexaneを加えて、再沈殿した固体をデカンテーションし、分離すると、目的化合物：poly(2- (6-azido-hexanoate) ethyl methacrylate)が得られた。
【０１６２】
1H NMR δ(CDCl3) 4.28(broad), 4.15(broad), 3.31(broad), 2.40(broad), 1.9-1.4, 1.03(broad), 0.88(broad)
（５）一般式（１４）において、（Ｒ１：ＣＨ３、Ｒ４：ＯＣＯＯ、Ｒ５：Ｂｒ、Ｒ６：ＯＨ、Ｒ８：Ｈ、Ｒ９：Ｈ、Ｒ１３：ＣＨ２ＣＨ２、Ｒ１６：ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２（Ｎ３ＣＨＣ）ＮＣＨ３ＣＨ２、Ｘ：ＣＯ２Ｈ）である材料の合成
Argon風船付きの三方コックを取り付けた5mLのナス型フラスコに、マグネティックスターラーバー、3-((((6-bromo-7-hydroxy-8-((methyl(prop-2-yn-1-yl)amino)methyl)-2-oxo-2H-chromen  -4-yl)methoxy)carbonyl)oxy)propanoic acid（一般式（２３）において、（Ｒ４：ＯＣＯＯ、Ｒ５：Ｂｒ、Ｒ６：ＯＨ、Ｒ８：Ｈ、Ｒ９：Ｈ、Ｒ３１：ＣＨ２ＣＨ２、Ｒ３２：ＣＨ２ＮＣＨ３ＣＨ２、Ｘ：ＣＯ２Ｈ）である材料）(60.8mg、0.12mmol)、CuBr(I)(4.2mg、0.028mmol)、4-dimethylaminopyridine(16.1mg、0.13mmol)を入れた。フラスコ内をArgon置換した後、DMF(1.8mL)、N,N,N’,N’’,N’’-pentamethyldiethylenetriamine(6μL、0.029mmol)、poly(2- (6-azido-hexanoate) ethyl methacrylate)(23.5mg)を順次加え、室温で19時間攪拌した。DMFを減圧除去してからCHCl３(５ｍＬ)を加えると目的化合物：一般式（１４）において、（Ｒ１：ＣＨ３、Ｒ４：ＯＣＯＯ、Ｒ５：Ｂｒ、Ｒ６：ＯＨ、Ｒ８：Ｈ、Ｒ９：Ｈ、Ｒ１３：ＣＨ２ＣＨ２、Ｒ１６：ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２（Ｎ３ＣＨＣ）ＮＣＨ３ＣＨ２、Ｘ：ＣＯ２Ｈ）である材料の沈殿が得られた。
【０１６３】
以下の（６）（７）はガラス製培養容器上での表面反応を利用した作成方法である。
【０１６４】
（６）poly(2- (6-azido-hexanoate) ethyl methacrylate)のガラス基板への成膜
poly(2- (6-azido-hexanoate) ethyl methacrylate)をＤＭＦに溶解し、0.2ｗ／ｖ％溶液とした。次いで、ガラス製培養容器を有機溶媒で洗浄し、更にH2SO4：H2O2＝３：１の混合溶液で洗浄した。上記ポリマ溶液を上記ガラス製培養容器上に滴下し、一晩乾燥することにより上記ポリマの薄膜をガラス表面に成膜した。
【０１６５】
（７）3-((((6-bromo-7-hydroxy-8-((methyl(prop-2-yn-1-yl)amino)methyl)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)  methoxy)carbonyl)oxy)propanoic acidとのクリック反応
1mMの3-((((6-bromo-7-hydroxy-8-((methyl(prop-2-yn-1-yl)amino)methyl)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methoxy)carbonyl)oxy)propanoic acidと1.35ｍＭのdimethylaminopyridineのＤＭＦ溶液に、1mMのN,N,N’,N’’,N’’-pentamethyldiethylenetriamineと1mMのCuBrのＤＭＦ溶液を1.25v%混合した反応液を作成した。この反応溶液を前記azide polymerを成膜したガラス表面に添加し、暗所室温で２４時間反応させることにより、一般式（１４）において、（Ｒ１：ＣＨ３、Ｒ４：ＯＣＯＯ、Ｒ５：Ｂｒ、Ｒ６：ＯＨ、Ｒ８：Ｈ、Ｒ９：Ｈ、Ｒ１３：ＣＨ２ＣＨ２、Ｒ１６：ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２（Ｎ３ＣＨＣ）ＮＣＨ３ＣＨ２、Ｘ：ＣＯ２Ｈ）である材料をガラス製培養容器に成膜した。
【０１６６】
［実施例９］
一般式（２６）において、（Ｒ３：ＣＨ３、Ｒ４：ＯＣＯＮＨ、Ｒ５：Ｂｒ、Ｒ６：ＯＨ、Ｒ８：Ｈ、Ｒ９：Ｈ、Ｒ３１：ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、Ｒ３２：ＣＨ２ＮＣＨ３ＣＨ２、Ｒ３３：ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、Ｘ：ＮＨ２）である材料。
【化３５】
2012141202.tif 000037
【０１６７】
（１）(6-bromo-7-hydroxy-8-((methyl(prop-2-yn-1-yl)amino)methyl)-2-oxo-2H-chromen-4-yl) methyl tert-buty hexane-1,6-diyldicarbamateの合成
【化３６】
2012141202.tif 000038
【０１６８】
CaCl2管を取り付けた30mLのナス型フラスコに、マグネティックスターラーバーとN,N’-carbonyldiimidazole(159.1mg, 0.981 mmol)を入れた。CH2Cl2(3mL)と6-bromo-7-hydroxy-4-(hydroxymethyl)-8-((methyl(prop-2-yn-1-yl)amino)methyl)-2H-chromen-2-one (344.5mg, 0.978mmol)を加え、室温で１時間攪拌した反応混合物に、4-dimethylaminopyridine(136.6mg, 1.12mmol)、および1mLのCH2Cl2に溶かしたtert-buty(6-aminohexyl)carbamate(211.8mg, 0.979mmol)を加え、室温で３時間攪拌した。生じた沈殿をCH2Cl2で洗いながら、ろ別して除き、ろ液を濃縮して得られた粗生成物（988.0ｍｇ）を、フラッシュカラムクロマトグラフィー(50gのシリカゲル60、メルク社、溶出溶媒はdichloromethane/methanol:30/1)で精製すると、376.6mg(0.633mmol,収率65％)の目的化合物：(6-bromo-7-hydroxy-8-((methyl(prop-2-yn-1-yl)amino)methyl)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl tert-buty hexane-1,6-diyldicarbamateが得られた。
【０１６９】
1H NMR δ (DMSO-d6) 7.82 (1H, s), 7.52 (1H, t, J 5Hz), 6.76 (1H, brs), 6.14 (1H, s), 5.24 (2H, s), 4.12 (2H, s), 3.62 (2H, d, J 2Hz), 3.04 (2H, m), 2.90 (2H, m), 2.50 (1H, t, J 2Hz), 2.40 (3H, s), 1.40-1.20 (8H, m), 1.37 (9H,s)
（2） (6-bromo-7-hydroxy-8-((methyl(prop-2-yn-1-yl)amino)methyl)-2-oxo-2H-chromen-4-yl) methyl(6-aminohexyl)carbamateの合成（一般式（２３）において、（Ｒ４：ＯＣＯＮＨ、Ｒ５：Ｂｒ、Ｒ６：ＯＨ、Ｒ８：Ｈ、Ｒ９：Ｈ、Ｒ３１：ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、Ｒ３２：ＣＨ２ＮＣＨ３ＣＨ２、Ｘ：ＮＨ2）である材料の合成）
【化３７】
2012141202.tif 000039
【０１７０】
CaCl2管を取り付けた20mLのナス型フラスコに、マグネティックスターラーバーと(6-bromo-7-hydroxy-8-((methyl(prop-2-yn-1-yl)amino)methyl)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl tert-buty hexane-1,6-diyldicarbamate（15.6mg、0.026mmol）を入れた。フラスコを氷浴で冷却しながら、dichloromethane（0.5ｍL）とtrifluoro acetic acid（0.5mL）を順次加えて、氷浴で３時間攪拌した。溶媒を減圧留去すると26.5mgの目的化合物：(6-bromo-7-hydroxy-8-((methyl (prop-2-yn-1-yl)amino)methyl)-2-oxo-2H-chromen-4-yl) methyl(6-aminohexyl)carbamate（一般式（２３）において、（Ｒ４：ＯＣＯＮＨ、Ｒ５：Ｂｒ、Ｒ６：ＯＨ、Ｒ８：Ｈ、Ｒ９：Ｈ、Ｒ３１：ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、Ｒ３２：ＣＨ２ＮＣＨ３ＣＨ２、Ｘ：ＮＨ2）である材料）がtrifluoro acetic acid saltとして得られた。
【０１７１】
1H NMR δ (DMSO-d6) 8.01 (1H, s), 7.74 (2H, brs), 7.58 (1H, t, d 6Hz), 6.24 (1H, s), 5.29 (2H, s), 4.47 (2H, s), 4.14 (2H, s), 3.84 (1H, s), 3.05 (2H, m), 2.80 (2H, m), 2.71 (3H, s), 1.60 -1.25 (8H, m)
（３）11-azido-undecyl trimethoxysilaneのガラス基板への成膜
ガラス製培養容器を実施例８（６）と同様に洗浄した。次いで、11-azido-undecyl trimethoxy  silane（アルテック株式会社、SI005-m11）の1mM ethanol溶液を滴下し、室温で２４時間反応させた。水洗後、95℃で１５分間乾燥させることにより、上記azide alcohoxy silaneのself-assembled monolayer膜をガラス基板に形成した。
【０１７２】
（４）(6-bromo-7-hydroxy-8- ((methyl (prop-2-yn-1-yl)amino)methyl)-2-oxo-2H-chromen-4-yl) methyl(6-aminohexyl) carbamateとのクリック反応
1mMの(6-bromo-7-hydroxy-8- ((methyl (prop-2-yn-1-yl)amino)methyl)-2-oxo-2H- chromen -4-yl) methyl(6-aminohexyl) carbamateと1.35ｍＭのdimethylaminopyridineのＤＭＦ溶液に、1mMのN,N,N’,N’’,N’’-pentamethyldiethylenetriamineと1mMのCuBrのＤＭＦ溶液を1.25vol%混合した反応液を作成した。この反応溶液を前記azide alcohoxy silaneのself-assembled monolayer膜を形成したガラス表面に添加し、暗所室温で２４時間反応させることにより、一般式（２６）において、（Ｒ３：ＣＨ３、Ｒ４：ＯＣＯＮＨ、Ｒ５：Ｂｒ、Ｒ６：ＯＨ、Ｒ８：Ｈ、Ｒ９：Ｈ、Ｒ３１：ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、Ｒ３２：ＣＨ２ＮＣＨ３ＣＨ２、Ｒ３３：ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、Ｘ：ＮＨ２）である材料のself-assembled monolayer膜をガラス製培養容器に成膜した。
【０１７３】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【符号の説明】
【０１７４】
１  透明基材
２  細胞接着性光制御材料
３、４、９  細胞
５  第２の光照射
６  細胞間及び細胞接着性光制御材料の切断領域
７  第１の光照射
８  光反応により細胞接着性から非接着性へ変化させる領域（細胞非接着領域）
１０、１１  光反応により細胞接着性から非接着性へ変化させる領域
６９  細胞接着領域
【図１】
2012141202.tif 000074
【図２】
2012141202.tif 000075
【図３】
2012141202.tif 000076
【国際調査報告】
2012141202.tif 000077
2012141202.tif 000078
2012141202.tif 000079
2012141202.tif 000080
2012141202.tif 000081
2012141202.tif 000082
2012141202.tif 000083
2012141202.tif 000084