(57)【要約】  本発明の課題は、転写型遺伝子サイレンシングを発動させるためのｓｉＲＮＡを用い、台木と穂木の接ぎ木を介して植物の形質転換を行う方法を提供することである。その解決手段としての本発明の台木と穂木の接ぎ木を介して行う植物の形質転換方法は、転写型遺伝子サイレンシングを発動させるためのｓｉＲＮＡを穂木において産生せしめ、穂木において産生されたｓｉＲＮＡを接ぎ木を介して台木に輸送し、転写型遺伝子サイレンシングを台木において発動させることによって台木の形質転換を行うことを特徴とする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
台木と穂木の接ぎ木を介して行う植物の形質転換方法であって、転写型遺伝子サイレンシングを発動させるためのｓｉＲＮＡを穂木において産生せしめ、穂木において産生されたｓｉＲＮＡを接ぎ木を介して台木に輸送し、転写型遺伝子サイレンシングを台木において発動させることによって台木の形質転換を行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
転写型遺伝子サイレンシングを発動させるためのｓｉＲＮＡを穂木において産生せしめる方法として、標的遺伝子のプロモーター領域に相同な配列を有するｓｉＲＮＡを産生することができる、ＣｏＹＭＶプロモーターを用いたベクターを導入したアグロバクテリウムを穂木に感染させる方法を用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
植物の形質転換個体の取得方法であって、請求項１記載の方法によって台木の形質転換を行った後、台木の主根の側根からの再分化個体を形質転換個体として取得することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、台木と穂木の接ぎ木を介して行う植物の形質転換方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の品種改良の手段として、特定の標的遺伝子の発現を抑制することで植物の形質転換を行う方法が有効であることは当業者に周知の通りであり、近年、その方法の一つとして、遺伝子の発現機能を阻害する遺伝子サイレンシングが注目されている。遺伝子サイレンシングは、遺伝子の転写レベルで作用する転写型遺伝子サイレンシング（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ：ＴＧＳ）と、転写後に作用する転写後型遺伝子サイレンシング（Ｐｏｓｔ−Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ：ＰＴＧＳ）に分類されるが、いずれもｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ）によって発動できることが知られている。ｓｉＲＮＡは、２０〜２５ｂｐの低分子ＲＮＡであり、細胞内で形成された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ：ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ＲＮＡ）がダイサーによって分断されて生成し、ヘリカーゼによって一本鎖に解離したものは、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成して標的のｍＲＮＡに結合し、これを切断することができるものであって、ｓｉＲＮＡはこの機能によってＰＴＧＳを発動する。また、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子のプロモーター領域のメチル化を誘導し（ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ：ＲｄＤＭ）、さらにその領域のヒストンタンパク質の修飾などにも関与して、その領域をリモデリング化することで、ＴＧＳを発動する。ＴＧＳはエピジェネティック変異と称され、サイレンシングが体細胞分裂や減数分裂を経ても維持されて後代へ遺伝することが知られている。【０００３】
ｓｉＲＮＡは、伴細胞（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｃｅｌｌ）から篩管（ｐｈｌｏｅｍ）への原形質連絡輸送を介して長距離輸送されることが知られており、こうした輸送は接ぎ木を介しても行われる。ｓｉＲＮＡのこの性質を利用して、ＰＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡを穂木において産生せしめ、穂木において産生されたｓｉＲＮＡを接ぎ木を介して台木に輸送し、ＰＴＧＳを台木において発動させることによって台木の形質転換を行う方法が非特許文献１に記載されている。しかしながら、ＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡを用いた場合の報告はこれまで存在せず、その作用は未だ不明のままである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍｏｌｎａｒ  Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２８：８７２−８７５．２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明は、ＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡを用い、台木と穂木の接ぎ木を介して植物の形質転換を行う方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の点に鑑みてなされた本発明の台木と穂木の接ぎ木を介して行う植物の形質転換方法は、請求項１記載の通り、ＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡを穂木において産生せしめ、穂木において産生されたｓｉＲＮＡを接ぎ木を介して台木に輸送し、ＴＧＳを台木において発動させることによって台木の形質転換を行うことを特徴とする。
また、請求項２記載の方法は、請求項１記載の方法において、ＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡを穂木において産生せしめる方法として、標的遺伝子のプロモーター領域に相同な配列を有するｓｉＲＮＡを産生することができる、ＣｏＹＭＶプロモーターを用いたベクターを導入したアグロバクテリウムを穂木に感染させる方法を用いることを特徴とする。
また、本発明の植物の形質転換個体の取得方法は、請求項３記載の通り、請求項１記載の方法によって台木の形質転換を行った後、台木の主根の側根からの再分化個体を形質転換個体として取得することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡを用い、台木と穂木の接ぎ木を介して植物の形質転換を行う方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例におけるｓｉＲＮＡ産生ベクター（ｓｉｌｅｎｃｅｒ）とその標的遺伝子産生ベクター（ｔａｒｇｅｔ）のコンストラクトの主要部の概略図である。
【図２】同、接ぎ木個体のＴＧＳ発動の観察結果である。
【図３】同、台木の主根からの側根の分岐部分のＴＧＳ発動の観察結果である。
【図４】同、側根の先端のＴＧＳ発動の観察結果である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の台木と穂木の接ぎ木を介して行う植物の形質転換方法は、ＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡを穂木において産生せしめ、穂木において産生されたｓｉＲＮＡを接ぎ木を介して台木に輸送し、ＴＧＳを台木において発動させることによって台木の形質転換を行うことを特徴とするものである。
【００１０】
本発明において、ＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡを穂木において産生せしめる方法としては、標的遺伝子のプロモーター領域に相同な配列を有するｓｉＲＮＡを産生することができるベクターを、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ  ＥＨＡ１０５株などのアグロバクテリウムに導入した後、ｓｉＲＮＡ産生ベクターを保持したアグロバクテリウムを穂木として用いる植物の葉片に自体公知の方法で感染させ、ベクター内のＴ−ＤＮＡの挿入によって目的とする形質転換が行われた細胞から再分化個体を取得し、この再分化個体を育成して穂木として用いる方法が挙げられる（必要であれば例えばＢｕｒｏｗ，Ｍ．Ｄ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．８：１２４−１３９．１９９０やＲａｔｃｈｌｉｆ，Ｆ．ＣＧ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １１：１２０７−１２１６．１９９９などを参照のこと）。
【００１１】
ｓｉＲＮＡ産生ベクターとしては、プロモーターとターミネーターの間に、標的遺伝子のプロモーター領域のセンス鎖配列（部分的であってもよい）とそのアンチセンス鎖配列との逆位方向反復塩基配列（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）構造を組み込んだ構成を有するものが挙げられる（逆位方向反復塩基配列構造の間にスペーサーを連結してもよい）。穂木において産生されたｓｉＲＮＡを篩管を通して台木に効率的に輸送するためには、プロモーターは、篩管輸送の起点である伴細胞で特異的に機能するプロモーター、例えば、ＣｏＹＭＶ（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｔｔｏｌｅ  ｖｉｒｕｓ）プロモーターを用いることが望ましい。なお、ターミネーターとしては、植物体内でターミネーターとして機能する例えばＮＯＳターミネーターなどが挙げられる。
【００１２】
本発明の適用対象となる植物は、台木と穂木のいずれについても接ぎ木が成立する植物であれば特段の制限はない。接ぎ木の手法は自体公知の手法であってよい。本発明によれば、ソース力が強い穂木からシンク力が強い台木に接ぎ木を介してｓｉＲＮＡを輸送させることで、台木においてＴＧＳが効果的に発動され、台木を形質転換することができる。台木において発動されたＴＧＳは後代に遺伝するので、台木の主根の篩管に隣接する内鞘細胞（ｐｅｒｉｃｙｃｌｅ  ｃｅｌｌ）が分裂して形成される側根から組織培養を通して再分化個体を取得したり、いわゆる「ひこばえ」が見られる植物（例えばブルーベリーやリンゴなどの果樹）においては根系不定芽体（Ｒｏｏｔ  ｓｕｃｋｅｒ）を再分化個体として取得したりすれば、これらはサイレンシングが維持された形質転換個体であるので、品種改良個体として育成することができる。
【実施例】
【００１３】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。【００１４】
（１）ＴＧＳ発動ｓｉＲＮＡを穂木において産生させるためのｓｉＲＮＡ産生ベクターの作製
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの−３２〜−３４２ｂｐの領域（Ｏｋａｎｏ  Ｙ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ５３：６５−７７．２００８）とそのアンチセンス鎖配列との逆位方向反復塩基配列構造の間にＣＡＴ１（カタラーゼ）遺伝子由来のイントロン（配列長：２０１ｂｐ、Ｏｈｔａ  Ｓ．ら、Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ３１：８０５−８１３．１９９０）をスペーサーとして連結して組み込んだ。このユニットをバイナリーベクターｐＥ２１１３−ＧＵＳ（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ  Ｉ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ３７：４９−５９．１９９６．）のＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ部位のＧＵＳ（ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）遺伝子と入れ換えて３５Ｓ：３５Ｓ−ＩＲを構築した。次に、伴細胞で特異的に機能するプロモーターであるＣｏＹＭＶｐをｐＣＯＩ（Ｍａｔｓｕｄａ、Ｙ．ら、Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ  ２２０：５１−５８．２００２）によりＰＣＲ増幅し、これを３５Ｓ：３５Ｓ−ＩＲのＳａｌＩ／ＢａｍＩＨ部位と入れ換えることで、目的のｓｉＲＮＡ産生ベクター（ＣｏＹＭＶ：３５Ｓ−ＩＲ）を得た（図１のｓｉｌｅｎｃｅｒを参照）。【００１５】
（２）ｓｉＲＮＡ産生ベクターのアグロバクテリウムへの導入
アグロバクテリウムとしてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ  ＥＨＡ１０５株を用い、その単一コロニーをＬＢ培地（組成は表１参照）に抗生物質（５０ｍｇ／ＬのＲｉｆａｍｐｉｃｉｎ）を添加した培地に植え付け、２８℃で２４時間振盪培養し、継代してさらに１２時間振盪培養した。その後、４℃にて６０００ｒｐｍで１０分間遠心し、回収した菌を滅菌水および１０％グリセロールで洗浄した。この菌のペレットを１０％グリセロール１ｍＬで懸濁し、そのうちの４０μＬを（１）で作製したｓｉＲＮＡ産生ベクター０．５〜１．０μｇと混合し、混合液をキュベットに移し、２０ｋＶ／ｃｍ，６ｍｓの条件でエレクトロポレーションすることで、ｓｉＲＮＡ産生ベクターをアグロバクテリウムに導入した。電圧をかけたキュベット内の反応液にＬＢ培地１ｍＬを加え、１．５ｍＬチューブに回収し、２８℃で２４時間培養した。抗生物質（５０ｍｇ／ＬのＲｉｆａｍｐｉｃｉｎおよび５０ｍｇ／ＬのＫａｎａｍｙｃｉｎ）を含むＬＢ寒天培地上に培養液を塗布し、２８℃で３日間培養した。得られたコロニーを新しいＬＢ培地で培養し、アグロバクテリウム感染に用いた。【００１６】
【表１】
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【００１７】
（３）ｓｉＲＮＡ産生ベクターを保持するアグロバクテリウムのタバコ科植物への感染
ＬＢ培地５ｍＬに抗生物質（５０ｍｇ／ＬのＲｉｆａｍｐｉｃｉｎおよび５０ｍｇ／ＬのＫａｎａｍｙｃｉｎ）を添加し、ｓｉＲＮＡ産生ベクターを保持するアグロバクテリウムを２８℃で一晩培養し、継代してさらに１２時間振盪培養した。その後、室温にて３０００ｒｐｍで２０分間遠心し、回収した菌をＯＤ６００＝１．０になるように懸濁液培地（組成は表２参照）に懸濁した。こうして調製したｓｉＲＮＡ産生ベクターを保持するアグロバクテリウムの懸濁液に、明所条件下で無菌的に栽培した発芽後１５日目のＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの個体の葉片を浸漬することでアグロバクテリウム感染を行った後、常法に従って目的とする形質転換が行われた細胞から再分化個体を取得した。【００１８】
【表２】
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【００１９】
（４）台木と穂木の接ぎ木
明所条件下の温室にてＭＳ  ａｇａｒ（０．７％）で栽培した発芽後７日目のＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ  １６Ｃ（図１のｔａｒｇｅｔに示されるこの実施例における標的遺伝子産生ベクターである３５Ｓ：ｍＧＦＰが導入された緑色蛍光タンパク質産生形質転換体。Ｊｏｎｅｓ  Ｌ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １１：２２９１−２３０１．１９９９）の個体の胚軸部位（子葉より約５ｍｍ下）を水平に剃刀で切断し、この根側を台木とした。一方、（３）でｓｉＲＮＡ産生ベクターを保持するアグロバクテリウムを感染させた発芽後７日目のＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの個体にも同様の処置を行い、この子葉側を穂木とした。両者の胚軸部位をシリコンチューブ（長さ：２ｍｍ×外径：０．５ｍｍ×内径０．４ｍｍ）内にて密着させて接ぎ木した。全ての操作は無菌的に顕微鏡下で行った。接ぎ木した個体は、無菌シャーレ内のアガロース（３ｍｍキューブ）を利用して正立させた。７日後にチューブを外してロックウール（Ｎｉｔｔｏ  Ｂｏｓｅｋｉ  Ｃｏ．）にて液体肥料（Ｏｔｓｕｋａ  Ｈｏｕｓｅ  Ｎｏｓ．１  ａｎｄ  ２，Ｏｔｓｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を用いて栽培した。【００２０】
（５）ＴＧＳ発動の観察
接ぎ木した７日後に行った。可視光下とＵＶ下において接ぎ木個体を観察した結果を図２に示す（３５ＳＩＲ／１６ｃ：左が可視光下で右がＵＶ下。←は接ぎ木点）。なお、図２には、ｓｉＲＮＡ発現ユニットを含まないベクターを用いて同様の操作を行って得た接ぎ木個体の可視光下とＵＶ下において観察した結果をあわせて示す（Ｅｍｐｔｙ／１６ｃ：左が可視光下で右がＵＶ下。←は接ぎ木点）。また、それぞれの接ぎ木個体のサンプルを７％低融点アガロースブロックに包埋し、ビブラトーム（Ｓｅｒｉｅｓ  １５００  Ｌｅｉｃａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて１００μｍ厚の切片を作製し、共焦点レーザー顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ＦｌｕｏＶｉｅ  １０００，Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ）を用いて台木の主根からの側根の分岐部分を観察した結果を図３に、側根の先端を観察した結果を図４にそれぞれ示す（図３の右側と図４の下側が可視光下で図３の左側と図４の上側がＵＶ下）。図２から明らかなように、ｓｉＲＮＡ産生ベクターを用いて得た接ぎ木個体（３５ＳＩＲ／１６ｃ）は、ｓｉＲＮＡ発現ユニットを含まないベクターを用いて得た接ぎ木個体（Ｅｍｐｔｙ／１６ｃ）と異なり、接ぎ木点付近に若干の緑色蛍光が認められたが、この部分を除けば緑色蛍光は認められず、穂木において産生されたｓｉＲＮＡが篩管を通して長距離輸送されて台木においてＴＧＳを効果的に発動したことがわかった。また、図３と図４から明らかなように、ｓｉＲＮＡ産生ベクターを用いて得た接ぎ木個体では、台木の主根の篩管周辺でＴＧＳが顕著に発動されること（別途の実験による主根の断面のＴＧＳ発動の観察によっても確認済み）、ここから形成される側根は全体にわたってＴＧＳが発動していることがわかった。なお、ＴＧＳが発動している側根の切片を用いた組織培養によって得られたカルス由来の再分化個体について緑色蛍光の有無を確認したところ、ＴＧＳが後代に遺伝し、サイレンシングが維持されていることで、緑色蛍光は認められなかった。なお、比較実験として、台木において産生されたｓｉＲＮＡを接ぎ木を介して穂木に輸送した場合、穂木の展開葉においてＴＧＳ発動が認められたが、ＴＧＳの発動部位は葉身全域ではなく葉脈に沿った箇所に限られていた。腋芽のシンク力を高めるための切り戻しを行っても葉身全域でのＴＧＳ発動は認められなかった。よって、穂木において産生されたｓｉＲＮＡを接ぎ木を介して台木に輸送することによる台木におけるＴＧＳ発動の方が、台木において産生されたｓｉＲＮＡを接ぎ木を介して穂木に輸送することによる穂木におけるＴＧＳ発動よりも効果的であり、サイレンシングが維持された形質転換個体を取得する上においても有利であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００２１】
本発明は、ＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡを用い、台木と穂木の接ぎ木を介して植物の形質転換を行う方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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