(57)【要約】  本発明は、下記工程（１）〜（３）を含む、胃癌患者におけるテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を用いた化学療法の治療効果を予測する方法：  （１）該患者から採取された生体試料に含まれるＥＧＦＲの発現量を測定する工程、  （２）上記工程（１）で得られたＥＧＦＲの発現量を、予め設定した対応するカットオフポイントと比較する工程、及び  （３）上記工程（２）における比較の結果、ＥＧＦＲの発現量が該カットオフポイントよりも高い場合、該患者に対してテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びＥＧＦＲ阻害剤を併用した化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測し、ＥＧＦＲの発現量が該カットオフポイント以下の場合、該患者に対するテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を単独で用いた化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（１）〜（３）を含む、胃癌患者におけるテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を用いた化学療法の治療効果を予測する方法：
（１）該患者から採取された生体試料に含まれるＥＧＦＲの発現量を測定する工程、
（２）上記工程（１）で得られたＥＧＦＲの発現量を、予め設定した対応するカットオフポイントと比較する工程、及び
（３）上記工程（２）における比較の結果、ＥＧＦＲの発現量が該カットオフポイントよりも高い場合、該患者に対してテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びＥＧＦＲ阻害剤を併用した化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測し、ＥＧＦＲの発現量が該カットオフポイント以下の場合、該患者に対するテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を単独で用いた化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
【請求項２】
テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の各有効成分のモル比が、テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム＝１：０．４：１である請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＥＧＦＲ阻害剤が、セツキシマブである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
化学療法が、術後補助化学療法である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法において、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びＥＧＦＲ阻害剤を併用した化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された胃癌患者を治療するために用いる、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びＥＧＦＲ阻害剤からなる抗腫瘍剤。
【請求項６】
テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の各有効成分のモル比が、テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム＝１：０．４：１である請求項５記載の抗腫瘍剤。
【請求項７】
ＥＧＦＲ阻害剤が、セツキシマブである請求項５又は６に記載の抗腫瘍剤。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法において、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を単独で用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された胃癌患者を治療するために用いる、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤からなる抗腫瘍剤。
【請求項９】
テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の各有効成分のモル比が、テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム＝１：０．４：１である請求項８記載の抗腫瘍剤。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法によりテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びＥＧＦＲ阻害剤を併用した化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された胃癌患者に対し、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びＥＧＦＲ阻害剤を併用した化学療法を実施することを特徴とする、胃癌の治療方法。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法によりテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を単独で用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された胃癌患者に対し、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を単独で用いた化学療法を実施することを特徴とする、胃癌の治療方法。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により当該併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された胃癌患者に当該併用化学療法を実施するための、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びＥＧＦＲ阻害剤からなる抗腫瘍剤の使用。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により単独化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された胃癌患者に当該単独化学療法を実施するための、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤からなる抗腫瘍剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を少なくとも使用する化学療法に対する治療効果を予測する方法、当該配合剤を用いた化学療法に十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された患者に投与するための抗腫瘍剤、胃癌の治療方法、抗腫瘍剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
進行胃癌に対する化学療法として、５−フルオロウラシル、シスプラチン、イリノテカン、ドセタキセル、テガフール・ウラシル配合剤（商品名：ユーエフティー（登録商標））、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤（商品名：ティーエスワン（登録商標）、以下、テガフール、ギメラシル、オテラシルカリウムがモル比１：０．４：１で配合された製剤をＴＳ−１と称することがある。）などの抗腫瘍剤が臨床応用されてきた。【０００３】
一方、胃癌腫瘍組織を切除後に再発・転移の防止を目的に行われる胃癌の術後補助化学療法としては、１０００症例を超す症例を集積した第III相試験ＡＣＴＳ−ＧＣ研究により、ＴＳ−１投与は手術単独群に比し、全生存期間および無再発生存期間いずれにおいても有意な生存期間の延長が得られたこと、またその安全性にも問題なかったことから、日本における標準治療として認知されるまでに至っている（非特許文献１）。【０００４】
以上のとおり、胃癌に対する術後補助化学療法が精力的に開発されているが、現状においてその治療効果は満足できるものではない。また、術後補助化学療法が奏功するか否かは患者の遺伝的要因によるところが大きいため実際に抗腫瘍剤を投与してみなければわからないといった問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２００７；３５７（１８）：１８１０−２０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、胃癌患者に対して、強い延命効果を奏し、且つ副作用が少ない化学療法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、胃癌患者に対する化学療法について研究を重ねた結果、上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下「ＥＧＦＲ」と称す）の発現量を指標とすることにより、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤にさらにＥＧＦＲ阻害剤を併用すべきか否かが判断できることを見出し、本発明は完成に至った。なお、ＥＧＦＲは、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤における治療効果と関連があることが報告されているが（例えば、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２００８；７４（１−２）：７６−８３．）、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤にさらにＥＧＦＲ阻害剤を併用させる際に、ＥＧＦＲの発現量が指標とできることは知られていない。【０００８】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
項１．
下記工程（１）〜（３）を含む、胃癌患者におけるテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を用いた化学療法の治療効果を予測する方法：
（１）該患者から採取された生体試料に含まれるＥＧＦＲの発現量を測定する工程、
（２）上記工程（１）で得られたＥＧＦＲの発現量を、予め設定した対応するカットオフポイントと比較する工程、及び
（３）上記工程（２）における比較の結果、ＥＧＦＲの発現量が該カットオフポイントよりも高い場合、該患者に対してテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びＥＧＦＲ阻害剤を併用した化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測し、ＥＧＦＲの発現量が該カットオフポイント以下の場合、該患者に対するテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を単独で用いた化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
項２．
テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の各有効成分のモル比が、テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム＝１：０．４：１である項１記載の方法。
項３．
ＥＧＦＲ阻害剤が、セツキシマブである項１又は２に記載の方法。
項４．
化学療法が、術後補助化学療法である項１〜３のいずれか１項記載の方法。
項５．
項１〜４のいずれか１項に記載の方法において、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びＥＧＦＲ阻害剤を併用した化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された胃癌患者を治療するために用いる、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びＥＧＦＲ阻害剤からなる抗腫瘍剤。
項６．
テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の各有効成分のモル比が、テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム＝１：０．４：１である項５記載の方法。
項７．
ＥＧＦＲ阻害剤が、セツキシマブである項５又は６に記載の方法。
項８．
項１〜４のいずれか１項に記載の方法において、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を単独で用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された胃癌患者を治療するために用いる、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤からなる抗腫瘍剤。
項９．
テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の各有効成分のモル比が、テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム＝１：０．４：１である項８記載の方法。
項１０．
項１〜４のいずれか１項に記載の方法によりテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びＥＧＦＲ阻害剤を併用した化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された胃癌患者に対し、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びＥＧＦＲ阻害剤を併用した化学療法を実施することを特徴とする、胃癌の治療方法。
項１１．
項１〜４のいずれか１項に記載の方法によりテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を単独で用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された胃癌患者に対し、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を単独で用いた化学療法を実施することを特徴とする、胃癌の治療方法。
項１２．
項１〜４のいずれか１項に記載の方法により当該併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された胃癌患者に当該併用化学療法を実施するための、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びＥＧＦＲ阻害剤からなる抗腫瘍剤の使用。
項１３．  
項１〜４のいずれか１項に記載の方法により単独化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された胃癌患者に当該単独化学療法を実施するための、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤からなる抗腫瘍剤の使用。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の予測方法は、胃癌患者においてより延命効果の高い化学療法の選択を可能にするものである。つまり、胃癌におけるテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤単剤による化学療法では相対的に延命効果が低い患者に対し、強い延命効果を奏するテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びＥＧＦＲ阻害剤の併用化学療法を提供することができる。【００１０】
また、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びＥＧＦＲ阻害剤の併用化学療法よりも、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤単剤の化学療法の方が高い治療効果を示す胃癌患者においては、不要なＥＧＦＲ阻害剤を省くことができるため、患者の負担を軽減できると共に、医療経済的にも好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＥＧＦＲのＩＨＣスコアと症例数を示す。
【図２】ＥＧＦＲのＩＨＣスコアとＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの発現量（ＥＧＦＲ／ＡＣＴＢ，ｌｏｇ２変換値）を示す。
【図３】ＥＧＦＲ高発現群及び低発現値群でのカプランマイヤー生存曲線を示す。
【図４】ＳＣ−４胃癌株におけるＩＨＣ法による画像を示す（ＥＧＦＲ陽性細胞（矢印），ｘ４００）。
【図５】ＳＣ−４胃癌株で得られた腫瘍体積の経日的な変化のグラフを示す。
【図６】最終効果判定日Ｄａｙ１５におけるＲＴＶのグラフおよびＩＵＴ手順におけるＩＵＴ検定結果を示す。
【図７】ＳＣ−２胃癌株におけるＩＨＣ法による画像を示す（ＥＧＦＲ陽性細胞（矢印），ｘ４００）。
【図８】ＳＣ−２胃癌株を用いた腫瘍体積の経日的な変化のグラフを示す。
【図９】最終効果判定日Ｄａｙ１５におけるＲＴＶのグラフおよびＩＵＴ手順におけるＩＵＴ検定結果をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（ｉ）本発明の予測方法
本発明の予測方法は、胃癌患者においてテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示すか否かを、当該患者のＥＧＦＲの発現量に基づき予測するものである。
【００１３】
本発明で指標であるＥＧＦＲは、細胞膜を貫通して存在するチロシンキナーゼ型の受容体タンパク質であり、上皮成長因子のシグナルを伝達して細胞の増殖や成長を制御することが知られている。ヒトＥＧＦＲの塩基配列及びアミノ酸配列は、それぞれアクセッション番号ＮＭ００５２２８及びＮＰ００５２１９としてＧｅｎＢａｎｋに登録されており、本発明においては、これらの配列情報を利用することができる。好ましくは、本発明においてヒトＥＧＦＲの塩基配列及びアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１及び配列番号２で示され、これを利用することができる。
【００１４】
本発明の対象となる患者は、胃癌患者である。本発明において「胃癌」には、原発性胃癌のほか、局所的に再発した胃癌や他の組織（例えば、リンパ節）に転移した転移性胃癌も含まれるが、好ましくは原発性胃癌である。なお、ここで胃癌患者には、胃癌腫瘍組織を現に有する患者のみならず、胃癌腫瘍組織の切除を受けた患者も含む。
【００１５】
本発明における「テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤」とは、テガフール、ギメラシル及びオテラシルカリウムの３剤配合剤を意味する。「テガフール」（一般名、化学名：５−フルオロ−１−（２−テトラヒドロフリル）−２，４−（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン）とは公知の化合物であり、生体内で活性化を受けて抗腫瘍活性の本体である５−フルオロウラシルを放出する薬剤である。テガフールは、公知の方法、例えば特公昭４９−１０５１０号に記載されている方法に従って製造できる。
【００１６】
また、「ギメラシル」（一般名、化学名：２，４−ジヒドロキシ−５−クロロピリジン）も、公知の化合物であり、それ自身は抗腫瘍活性を有さないが、５−フルオロウラシルが生体内において代謝されて不活性化されることを抑制するものであり、抗腫瘍効果を増強させることができる。
【００１７】
また、「オテラシルカリウム」（一般名、化学名：モノポタシウム  １，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−１，３，５−トリアジン−６−カルボキシレート）も公知の化合物であり、それ自身は抗腫瘍活性を有さないが、主に消化管に分布してその部位での５−フルオロウラシルの活性化を抑制することにより消化管障害を抑制するものである。
【００１８】
本発明における「テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤」の各有効成分の割合は、それぞれの配合目的を奏する範囲であれば特に制限されず、例えば、特許第２６１４１６４号公報に記載されている公知の配合剤と同様の範囲で良く、テガフール１モルに対して、ギメラシルを０．１〜５モル程度、好ましくは０．２〜１．５モル程度とすればよく、オテラシルカリウムを０．１〜５モル程度、好ましくは０．２〜２モル程度とすればよい。特に好ましくは、テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム（モル比）＝１：０．４：１である。なお、テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム（モル比）＝１：０．４：１のテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤は、「ティーエスワン」（商品名、大鵬薬品工業）として入手することができる。
【００１９】
本発明における「ＥＧＦＲ阻害剤」は、ＥＧＦＲの発現や活性を阻害する薬剤であれば特に制限されず、ゲフィチニブ、エルロチニブ等のＥＧＦＲを標的とした低分子化合物、セツキシマブ、パニツムマブ等の抗ＥＧＦＲ抗体、ＥＧＦＲに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー等のいずれであってもよく、このうち抗ＥＧＦＲ抗体が好ましく、セツキシマブが特に好ましい。
【００２０】
「セツキシマブ」とは、ＥＧＦＲを特異的に認識するヒト・マウスキメラ化モノクローナル抗体であり、ＥＧＦＲの活性化・二量体化を阻害することにより、結腸直腸癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌、胃癌等に腫瘍増殖抑制効果を奏することが知られている。なお、セツキシマブは、公知の方法、例えば特公平０６−０５１６８９号公報に記載の方法により製造できる。
【００２１】
テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びＥＧＦＲ阻害剤は、テガフール、ギメラシル、オテラシルカリウム及びＥＧＦＲ阻害剤を配合剤（複数の有効成分を含有する製剤）として一の剤型に製剤化したもの（１剤型形態）でも、上記有効成分を単剤として複数の剤型に製剤化したもの（多剤型形態）であってもよい。このうち、テガフール、ギメラシル及びオテラシルカリウムは配合剤として製剤化し、ＥＧＦＲ阻害剤は単剤として製剤化した多剤型形態で用いることが好ましい。
【００２２】
抗腫瘍剤の投与形態に特に制限は無く、治療目的に応じて適宜選択でき、具体的には経口剤（錠剤、被覆錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤など）、注射剤、坐剤、貼付剤、軟膏剤等が例示できる。このうち、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤は経口剤の形態が好ましい。各抗腫瘍剤は、それぞれの投与形態に応じ薬理学的に許容される担体を用いて、通常公知の方法により調製することができる。斯かる担体としては、通常の薬剤に汎用される各種のもの、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を例示できる。
【００２３】
本発明における「テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を用いた化学療法」とは、少なくともテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を投与する化学療法を意味し、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を単独で用いた化学療法のみならず、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤と他の抗腫瘍剤を併用した化学療法をも含むものである。
【００２４】
また、「テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びＥＧＦＲ阻害剤を併用した化学療法」とは、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びＥＧＦＲ阻害剤を組み合わせて投与することを含む化学療法を意味し、より好ましくは、モル比がテガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム＝１：０．４：１であるテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤、及びセツキシマブを組み合わせて投与することを含む化学療法である。その併用効果の存する限り、上記薬剤は同時に投与されても、異なる日時に投与されてもよい。
【００２５】
本発明の「テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を単独で用いた化学療法」における投与スケジュールは患者の年齢、性別、病期、転移の有無、治療暦などの条件により適宜選択されるが、例えば、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤（テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム（モル比）＝１：０．４：１）を８０ｍｇ／ｍ２（テガフール換算、体表面積あたり）／ｄａｙ、４週間連日投与し、その後２週間休薬する計６週間を１コースとして、当該コースを１回又は複数回繰り返す投与スケジュールが例示できる。
【００２６】
本発明の「テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びＥＧＦＲ阻害剤を併用した化学療法」における投与スケジュールは患者の年齢、性別、病期、転移の有無、治療暦などの条件により適宜選択されるが、例えば、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤（テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム（モル比）＝１：０．４：１）を８０ｍｇ／ｍ２（テガフール換算、体表面積あたり）／ｄａｙ、４週間連日投与し、その後２週間休薬し、セツキシマブを２５０ｍｇ／ｍ２（体表面積あたり）で１週間毎（計６回）に投与する計６週間を１コースとして、当該コースを１回又は複数回繰り返す投与スケジュール（ただし、各コースの初日におけるセツキシマブの投与量は４００ｍｇ／ｍ２（体表面積あたり）とする）が例示できる。
【００２７】
本発明における化学療法は、当該化学療法の後に腫瘍の摘出を行う術前補助化学療法であっても、腫瘍の摘出の後に当該併用化学療法を行う術後補助化学療法であってもよい。
【００２８】
本発明において「治療効果」は、腫瘍縮小効果や生存期間延長効果などにより評価することができ、生存期間は全生存期間や無増悪生存期間の中央値などにより表すことができる。「テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びＥＧＦＲ阻害剤を併用した化学療法を選択するのに十分な治療効果」とは、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を単独で用いた化学療法による治療効果を上回る程度の治療効果をいい、「テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を単独で用いた化学療法を選択するのに十分な治療効果」とは、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びＥＧＦＲ阻害剤を併用した化学療法による治療効果を上回る程度の治療効果をいう。
【００２９】
本発明の予測方法は、後述の（１）〜（３）の工程を含むものである。
【００３０】
工程（１）は、患者から採取された生体試料に含まれるＥＧＦＲの発現量を測定する工程である。
【００３１】
生体試料としては、癌患者から採取したものであり癌細胞を含む試料であれば特に限定されず、体液（血液、尿等）、組織、その抽出物及び採取した組織の培養物などが例示できる。また、生体試料の採取方法は、生体試料の種類に応じ適宜選択することができる。
【００３２】
本発明におけるＥＧＦＲの発現量としては、ｍＲＮＡの発現量であっても、タンパク質の発現量であってもよいが、測定の簡便性等の観点からタンパク質の発現量が好ましい。
【００３３】
本発明の測定方法は、ｍＲＮＡ又はタンパク質の量を定量できる測定方法であれば特に限定されず、公知の測定方法を使用することができる。このような測定方法としては、ｍＲＮＡの量を測定する場合は、例えばＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ法）、マイクロアレイ法等が挙げられ、タンパク質量を測定する場合は、例えばウェスタンブロット法、免疫組織化学染色法（ＩＨＣ法）等が挙げられる。このうち簡便性等の観点からＩＨＣ法が好ましい。ＩＨＣ法は、抗ＥＧＦＲ抗体を用いて腫瘍細胞の染色強度及び陽性占拠率をもとに０〜３＋の４段階でスコア化して評価することができる慣用の測定法である（Ｃａｎｃｅｒ．  ２００１，９２（５）：１３３１−４６．；Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２０１０，６８（３）：３７５−８２．）。
【００３４】
生体試料は、これらの測定方法に応じて、適切な処理をされることにより調製される。また、測定に用いられるプライマー、プローブ又は抗体を含む試薬として、後述される本発明に係る試薬を用いることができる。
【００３５】
工程（２）は、上記工程（１）で得られたＥＧＦＲの発現量を、予め設定した対応するカットオフポイントと比較する工程である。
【００３６】
カットオフポイントは、予め測定しておいたＥＧＦＲの発現量から種々の統計解析手法により求めることができる。このようなカットオフポイントとして、以下のいずれかの値として特定することができる。
【００３７】
１．胃癌患者におけるＥＧＦＲの発現量における平均値又は中央値；
２．胃癌患者におけるＥＧＦＲの発現量と所定の治療効果との関係から感度と特異度の和が最大となるようＲＯＣ分析に基づき求められる値が例示できる。なお、ＲＯＣ分析（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）とは、臨床検査診断に頻用されている、感度と特異度の和が最大となる閾値を求める分析手法である。
【００３８】
より具体的には、下記実施例にて詳述されるように、カットオフポイントの上記算出法に基づいて、例えば、ＩＨＣ法によりＥＧＦＲタンパク質の発現量を測定する場合では、ＥＧＦＲのカットオフポイントは０〜２＋が好ましく、１＋が特に好ましい。
【００３９】
工程（３）は、上記工程（２）における比較の結果、ＥＧＦＲの発現量が該カットオフポイントよりも高い場合、該患者に対してテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びＥＧＦＲ阻害剤を併用した化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測し、ＥＧＦＲの発現量が該カットオフポイント以下の場合、該患者に対するテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を単独で用いた化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程である。
（ｉｉ）本発明の試薬
本発明の試薬は、上記の本発明の予測方法に用いるための試薬であり、ＥＧＦＲのｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズするプライマー又はプローブ、又はＥＧＦＲのタンパク質を特異的に認識する抗体を含むものである。
【００４０】
本発明のプライマー又はプローブは、配列番号１に示される塩基配列内の少なくとも１５塩基長の連続した塩基配列と特異的にハイブリダイズする、１５塩基長以上の塩基配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ又はプライマーである。かかるプライマー又はプローブの配列長は１５塩基長以上であるが、ＥＧＦＲのｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズするものであれば特に制限されるものではない。
【００４１】
ここで特異的にハイブリダイズするとは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されないことをいう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、常法に従ってハイブリッドを形成する核酸の融解温度（Ｔｍ）などに基づいて決定することができる。具体的なハイブリダイズ状態を維持できる洗浄条件として通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件、より厳格には「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度の条件、さらに厳格には「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件が挙げられる。
【００４２】
なお、ポリヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列の少なくとも１５塩基長の連続する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有することが好ましいが、上記特異的なハイブリダイゼーションが可能であれば、完全に相補的である必要はない。かかるポリヌクレオチドとして、好ましくは配列番号１に示される塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補ポリヌクレオチドと比較して、塩基配列において７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するポリヌクレオチドである。ここで、塩基配列の同一性は、同一性検索、配列アラインメントプログラム、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣｌｕｓｔａｌＷなどにて計算することができる。
【００４３】
なお、これらのポリヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列の全塩基長に基づいて、例えば市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って作製することができる。また配列番号１に示される塩基配列の全塩基長を鋳型としてＰＣＲ法によって調製することもできる。
【００４４】
本発明の抗体は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識する抗体であれば特に制限されず、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよく、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ及びＣＤＲを含むポリペプチドなどの抗体断片であってもよい。また抗体は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを免疫抗原として調製される抗体であっても、また配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを構成するアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、８アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸、より好ましくは２０アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体であってもよい。かかるポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列やそれをコードする塩基配列に基づき、通常、公知の方法で合成することができる。例えば、アミノ酸合成機による化学的合成手法や、遺伝子工学的手法を挙げることができる。
【００４５】
本発明に係る抗体は、常法に従って製造することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７），  Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．  Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．１２−１１．１３）。例えば、ポリクローナル抗体の場合は、常法に従って大腸菌で発現し精製した上記ポリペプチドを用いて、或いは常法に従ってこれらの部分アミノ酸配列を有するよう合成したポリペプチドを用いて、実験動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、例えばモノクローナル抗体の場合は、常法に従って大腸菌等で発現し精製した上記ポリヌクレオチドを用いて、或いは常法に従ってこれらの部分アミノ酸配列を有するよう合成したポリペプチドを用いて、実験動物に免疫し、該実験動物から得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマ細胞を合成し、該細胞中から得ることができる。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。
【実施例１】
【００４７】
胃癌患者におけるＥＧＦＲ発現量
ステージＩＩ〜ＩＩＩの胃癌患者（１０５９例）において、胃癌腫瘍組織を切除した後、手術単独群とＴＳ−１治療群に分けて、ＴＳ−１治療群においては、ＴＳ−１を８０〜１２０ｍｇ／ｄａｙ（テガフール換算、体表面積１.２５ｍ2未満：８０ｍｇ／ｄａｙ、１.２５ｍ2以上１.５ｍ2未満；１００ｍｇ／ｄａｙ、１.５ｍ2以上；１２０ｍｇ／ｄａｙ）、４週間連日投与し、その後２週間休薬する計６週間を１コースとして、当該コースを術後１年間繰り返し実施した。【００４８】
全症例のうち、手術摘出した胃癌腫瘍組織からホルマリン固定パラフィン包埋病理標本を作成できた７５３例において、パラフィン包埋病理標本からＩＨＣ法によってＥＧＦＲタンパク質の発現量を測定し、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法によってＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの発現量を測定した。図１にＥＧＦＲのＩＨＣスコアと症例数を、図２にＥＧＦＲのＩＨＣスコアとＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの発現量（ＥＧＦＲ／ＡＣＴＢ，ｌｏｇ２変換値）を示す。【００４９】
次に、ＥＧＦＲのＩＨＣスコア（０，  １＋，  ２＋，  ３＋）に基づき、１＋をカットオフポイントとして（０，  １＋）をＥＧＦＲ低発現群（５２６例）、（２＋，  ３＋）をＥＧＦＲ高発現群（２２７例）として分類し、各群における全生存期間を用い生存時間解析を実施した。図３にＥＧＦＲ高発現群及び低発現値群でのカプランマイヤー生存曲線を示す。【００５０】
ＥＧＦＲ高発現群と低発現群における全生存期間についてＬｏｇ−Ｒａｎｋ検定を行ったところ、そのＰ値は０．０１４２と有意であった。Ｃｏｘ  ハザードモデルでの単変量解析においてＥＧＦＲ高発現群と低発現群のＨａｚａｒｄ比は１．３７であり、ＥＧＦＲ高発現群は低発現群に比し有意に予後不良であった。性別・年齢・Ｓｔａｇｅ・ＴＭＮ分類を調整した多変量解析においても、ＥＧＦＲは独立した予後不良因子であった。なお、ＥＧＦＲ高発現群と低発現群に関わらず、ＴＳ−１治療群は手術単独群に比し、全生存期間及び無再発生存期間ともに有意に延長していた。【００５１】
以上から、ＥＧＦＲの発現に関わらず、胃癌患者においてＴＳ−１からなる化学療法が臨床上有用であるが、特にＥＧＦＲ低値の胃癌症例において非常に優れた治療効果をもたらすことが証明された。
【実施例２】
【００５２】
次に、胃癌における新たな併用化学療法の有用性を検証すべく、ヒト胃癌株・ヌードマウス皮下移植系でのｉｎ  ｖｉｖｏ効力試験を実施した。ヒト胃癌由来ＳＣ−４腫瘍を常法に則りヌードマウス皮下に移植し、ＴＳ−１を１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙから公比１．２の３用量の投与量（１０，８．３，６．９）にてＤａｙ１−１４まで連日経口投与を行い、セツキシマブを２０ｍｇ／ｋｇの投与量にて、ｄａｙ１，４，８及び１１に腹腔内投与を行った。また単剤と同様の投与量、投与経路、投与スケジュールにて両薬剤を併用した。経日的に腫瘍の長径と短径をデジタルノギスにて測定することにより腫瘍体積を算出し、同時に副作用の指標としての体重を計測した。薬剤非投与対照群の腫瘍体積に対する薬剤投与群の腫瘍体積の縮小割合（腫瘍体積増加比率（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｔｕｍｏｒ Ｖｏｌｕｍｅ，ＲＴＶ））を計算で求め、ｉｎ  ｖｉｖｏ効力とした。【００５３】
ヒト胃癌由来株ＳＣ−４のＥＧＦＲ発現レベルについては、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法による測定を実施したところ、その値は１．６６（ＥＧＦＲ／ＡＣＴＢ，  ｌｏｇ２変換値）であり、ＩＨＣスコア２＋以上に相当するＥＧＦＲ高発現株であることを確認した。また、ＳＣ−４におけるＥＧＦＲタンパク質の発現量を免疫組織化学染色法（ＩＨＣ法）により測定した。ＩＨＣ法による測定は、カルノア固定パラフィン包埋したＳＣ−４の薄切切片を脱パラフィンした後、Ｄａｋｏ  ＲＥＡＬ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて内因性ペルオキシダーゼの阻止を行い、一次抗体反応（抗ヒトＥＧＦＲマウスモノクローナル抗体（クローンＮｏ．２−１８Ｃ９：Ｄａｋｏ社製））後、ポリマー試薬（ＬＡＢＢＥＬＥＤ  ＰＯＬＹＭＥＲ−ＨＲＰ：Ｄａｋｏ社製）を用いて二次抗体反応を行い発色基質（３  ３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ  Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ＋ＣＨＲＯＭＯＧＥＮ：Ｄａｋｏ社製）にて発色させることにより行った。結果を図４に示す。ＩＨＣ法においても、ＳＣ−４が、ＩＨＣスコア２＋以上に相当するＥＧＦＲ高発現株であることを確認した。【００５４】
単独投与における腫瘍増殖抑制効果はＴＳ−１  １０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙでは  ３９％、セツキシマブ単独投与では２１％であったのに対し、両者を併用することによりその抑制効果は４８％と増強することが確認できた。また単剤での効力、および併用での効力については、Ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ−Ｕｎｉｏｎ  ｔｅｓｔ手順により統計学的に検定を行い、その有意性を確認できた。同様にＴＳ−１  ６．９ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ投与では２８％、セツキシマブ  ２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの併用においては３６％とＩＵＴ手順による併用効果の有意性が確認できた。体重を指標とした副作用面での検討において、セツキシマブとＴＳ−１併用群での体重抑制は１６％を下回るものであり、十分許容範囲内であった。図５に腫瘍体積の経日的な変化のグラフを、図６に最終効果判定日Ｄａｙ１５におけるＲＴＶのグラフおよびＩＵＴ手順におけるＩＵＴ検定結果をそれぞれ示す。
【実施例３】
【００５５】
次に、ＳＣ−４胃癌株で得られた結果の再現性を確認すべく、ＳＣ−２胃癌株を用いたヌードマウス皮下移植系でのｉｎ  ｖｉｖｏ効力試験を実施した。ヒト胃癌由来ＳＣ−２腫瘍を常法に則りヌードマウス皮下に移植し、ＴＳ−１を１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙから公比１．２の３用量の投与量（１０，８．３，６．９）にてＤａｙ１−１４まで連日経口投与を行い、セツキシマブを２０ｍｇ／ｋｇの投与量にて、ｄａｙ１，４，８及び１１に腹腔内投与を行った。また単剤と同様の投与量、投与経路、投与スケジュールにて両薬剤を併用した。経日的に腫瘍の長径と短径をデジタルノギスにて測定することにより腫瘍体積を算出し、同時に副作用の指標としての体重を計測した。薬剤非投与対照群の腫瘍体積に対する薬剤投与群の腫瘍体積の縮小割合（腫瘍体積増加比率（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｔｕｍｏｒ Ｖｏｌｕｍｅ，ＲＴＶ））を計算で求め、ｉｎ  ｖｉｖｏ効力とした。【００５６】
ヒト胃癌由来株ＳＣ−２のＥＧＦＲ発現レベルについては、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法による測定を実施したところ、その値は０．９３（ＥＧＦＲ／ＡＣＴＢ，  ｌｏｇ２変換値）であり、ＩＨＣスコア２＋以上に相当するＥＧＦＲ高発現株であることを確認した。また、実施例２と同様に、ＩＨＣ法によりＥＧＦＲタンパク質の発現量を測定したところ、ＳＣ−２がＩＨＣスコア２＋以上に相当するＥＧＦＲ高発現株であることを確認した（図７）。【００５７】
単独投与における腫瘍増殖抑制効果はＴＳ−１  １０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙでは  ２５％、セツキシマブ単独投与では２０％であったのに対し、両者を併用することによりその抑制効果は３６％と増強することが確認できた。また単剤での効力、および併用での効力については、Ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ−Ｕｎｉｏｎ  ｔｅｓｔ手順により統計学的に検定を行い、その有意性を確認できた。体重を指標とした副作用面での検討において、セツキシマブとＴＳ−１併用群での体重抑制は８％を下回るものであり、十分許容範囲内であった。図８に腫瘍体積の経日的な変化のグラフを、図９に最終効果判定日Ｄａｙ１５におけるＲＴＶのグラフおよびＩＵＴ手順におけるＩＵＴ検定結果をそれぞれ示す。【００５８】
ＥＧＦＲが高発現しているＳＣ−２及びＳＣ−４において有意な併用効果が認めたことから、ＥＧＦＲ高発現の胃癌患者においては、ＴＳ−１およびセツキシマブを併用した化学療法が有用であることが示された。【００５９】
以上の結果から、胃癌患者に対するテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を用いた化学療法において、ＥＧＦＲが予後不良因子であることが見出された。さらにＥＧＦＲ高発現胃癌株においてセツキシマブとＴＳ−１の有意な併用効果が確認できたことより、ＥＧＦＲをバイオマーカーとしたテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を含む胃癌個別化療法が可能であることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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