(57)【要約】  低濃度のターゲット分子を高感度に検出可能な技術を提供する。ビーズ（４１）、（４１’）を１個のみ収容可能な複数の収容部（１３）が、疎水性の上面を有する側壁（１２）によって互いに隔てられて形成されている下層部（１０）と、下層部（１０）における収容部（１３）が形成されている面に対向している上層部（２０）との間の空間（３０）に、ビーズ（４０）、（４１’）を含む親水性溶媒（４２）を導入するビーズ導入工程と、上記ビーズ導入工程の後に空間（３０）に疎水性溶媒（４３）を導入する疎水性溶媒導入工程とを含む。
2012121310.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビーズを１個のみ収容可能な複数の収容部が、疎水性の上面を有する側壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、当該下層部における当該収容部が形成されている面に対向している上層部との間の空間に、当該ビーズを含む親水性溶媒を導入するビーズ導入工程と、
上記ビーズ導入工程の後に上記空間に疎水性溶媒を導入する疎水性溶媒導入工程とを含むことを特徴とするビーズ封入方法。
【請求項２】
上記ビーズ導入工程の後であって上記疎水性溶媒導入工程より前に、上記空間内を脱気する脱気工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のビーズ封入方法。
【請求項３】
上記親水性溶媒は、水、親水性アルコール、親水性エーテル、ケトン、ニトリル系溶媒、ジメチルスルホキシド、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドからなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物であることを特徴とする請求項１又は２に記載のビーズ封入方法。
【請求項４】
上記疎水性溶媒は、飽和炭化水素、不飽和炭化水素、芳香族炭化水素、シリコーンオイル、パーフルオロカーボン、ハロゲン系溶媒、及び疎水性イオン液体からなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のビーズ封入方法。
【請求項５】
ターゲット分子を特異的に捕捉するビーズと、当該ターゲット分子とを反応させる反応工程と、
上記反応工程の後に、上記ビーズを用いて請求項１〜４のいずれかに記載のビーズ封入方法を行なうビーズ封入工程と、
上記ビーズ封入工程の後に、上記収容部の各々に上記ターゲット分子を捕捉したビーズが収容されているか否かを検出する検出工程とを含むことを特徴とする、ターゲット分子を検出する方法。
【請求項６】
上記ビーズには、上記ターゲット分子に特異的に結合する分子が結合していることを特徴とする請求項５に記載のターゲット分子を検出する方法。
【請求項７】
複数の収容部が疎水性の上面を有する側壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、
上記下層部における上記収容部が形成されている面に対して空間を隔てて対向している上層部とを備えていることを特徴とするアレイ。
【請求項８】
上記収容部の各々は、底面が親水性であることを特徴とする請求項７に記載のアレイ。
【請求項９】
上記上層部における上記下層部に対向する面が疎水性であることを特徴とする請求項７又は８に記載のアレイ。
【請求項１０】
上記上層部及び上記下層部の少なくとも一方に、上記空間に流体を導入するための貫通孔が形成されていることを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載のアレイ。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれかに記載のアレイと、
ビーズとを備え、
上記収容部の各々は、上記ビーズを１個のみ収容可能であることを特徴とするキット。
【請求項１２】
請求項７〜１０のいずれかに記載のアレイと、
上記収容部の各々から、ターゲット分子を捕捉したビーズが収容された場合に発せられる光を検出するイメージセンサとを備えることを特徴とするターゲット分子検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビーズ封入方法、ターゲット分子を検出する方法、アレイ、キット及びターゲット分子検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、核酸等の生体分子を個々識別した態様で観察することにより種々の測定を行なう方法として、一分子測定が知られている。この一分子測定を行なうための手法がいくつか知られている。【０００３】
特許文献１には、一分子酵素活性検出に用いられるマイクロチャンバが記載されている。このマイクロチャンバは、液滴を封入することができ、この液滴により充填可能な容量が１０００ｆＬ（フェムトリットル）以下である容器部を有する。容器部は、第１の部材と第２の部材とを貼り合わせることにより、少なくとも第１の部材又は第２の部材が有する窪みによって構成される。この液滴中で酵素反応を行うことにより、反応生成物の分子数が極めて少数でも濃度を高くすることができるため、酵素一分子の活性を検出することができる。【０００４】
非特許文献１には、液滴がオイルで覆われており、外部から液滴に直接アクセス可能なフェムトリットルオーダーの液滴のアレイを用いて、一分子酵素アッセイを行なう方法が記載されている。このアレイでは、親水性表面に高さ１７ｎｍの疎水性領域が形成されることにより、親水性領域のパターンが形成されている。【０００５】
非特許文献２には、一分子の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いてタンパク質を検出する方法が記載されている。この方法では、タンパク質特異的な抗体で覆われた微細なビーズによって微量のタンパク質を捕捉し、ビーズとタンパク質との複合体を蛍光標識させる。この複合体を含むビーズを遠心力によって反応チャンバーに導入し、タンパク質を捕捉しているビーズの数を数えることによって、タンパク質を定量測定する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】日本国公開特許公報「特開２００４−３０９４０５号公報（２００４年１１月４日公開）」
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】S. Sakakihara et al., Lab Chip, 2010, 10, 3355-3362
【非特許文献２】David M Rissin et al., Nature Biotechnology: doi: 10.1038/nbt.1641
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
低濃度の疾病マーカー等を検出し、疾病、感染症等の早期発見を行なうために、バイオセンシング技術のさらなる高感度化が求められている。例えば、体積１ｍｍ３の腫瘍に含まれる１００万個の癌細胞からマーカータンパク質（各細胞から１００分子ずつ）が５Ｌの血中に分泌された場合、このタンパク質の血中濃度は３０ａＭ程度である。このような非常に低濃度のターゲット分子を検出しうる技術が求められている。【０００９】
このようなターゲット分子を検出するために、上述した一分子酵素アッセイを用いて一分子単位の感度で検出する方法が考えられる。すなわち、ターゲット分子を特異的にフェムトリットルオーダーの液滴（超微小液滴）に封入した後、酵素によって標識された抗体等をターゲット分子に接続し、上述した方法で標識酵素の活性を検出する方法である。ターゲット分子を特異的に超微小液滴に封入する方法としては、ターゲット分子に特定的に結合する別の抗体等で標識されたビーズ等を用いる方法が考えられる。この方法では、ビーズにターゲット分子を結合させた後、ビーズを超微小溶液に封入する。【００１０】
ここで、溶液中に極わずかにしか存在しないターゲット分子、例えば上述したような３０ａＭ程度のターゲット分子等を効率的に検出するためには、１００万個程度の非常に多数の超微小液滴アレイを用意し、このアレイにビーズを捕捉する必要がある。【００１１】
しかし、非特許文献２に記載の方法では、ビーズを強い遠心力によりアレイに導入する必要があり、時間と労力を要する。また、非特許文献２に記載の方法で用いているアレイの数は５万個程度であり、１００万個程度のアレイに適用することは極めて困難である。そのため、非特許文献２に記載の方法では、多数のビーズをアレイに効率よく封入させることが困難である。また、特許文献１及び非特許文献１には、このような問題を解決する方法は記載されていない。【００１２】
本発明の目的は、多数のビーズをアレイに効率よく封入させる技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の課題を解決するために、本発明に係るビーズ封入方法は、ビーズを１個のみ収容可能な複数の収容部が、疎水性の上面を有する側壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、当該下層部における当該収容部が形成されている面に対向している上層部との間の空間に、当該ビーズを含む親水性溶媒を導入するビーズ導入工程と、上記ビーズ導入工程の後に上記空間に疎水性溶媒を導入する疎水性溶媒導入工程とを含むことを特徴とする。【００１４】
上記の課題を解決するために、本発明に係るアレイは、複数の収容部が疎水性の上面を有する側壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、上記下層部における上記収容部が形成されている面に対して空間を隔てて対向している上層部とを備えていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係るビーズ封入方法を用いれば、多数のビーズをアレイに効率よく封入させることができるので、低濃度のターゲット分子を高感度に検出可能な技術に寄与することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】（ａ）〜（ｅ）は、本発明に係るビーズ封入方法を説明するための模式図であり、アレイ１の側方断面図を示す。
【図２】本発明に係るターゲット分子検出装置の一実施形態を模式的に示す図である。
【図３】本発明の一実施例においてビーズを封入したアレイの蛍光像を表す図である。
【図４】従来の方法によってターゲット分子を検出した場合における蛍光強度を示すグラフである。
【図５】（ａ）〜（ｆ）は、本発明の他の実施例においてビーズを封入したアレイの顕微鏡画像を表す図である。
【図６】本発明の他の実施例において、ストレプトアビジンの濃度と、ストレプトアビジンを捕捉したビーズの数の割合との関係を示すグラフである。
【図７】本発明の一実施例において親水／疎水パターンガラスを作製する方法を説明するための図である。
【図８】フローセル構造を有するアレイを用いた場合（実施例３）と、フローセル構造を有しないアレイを用いた場合（比較例２）との、ビーズのトラップ効率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の一実施形態について、詳細に説明する。
【００１８】
〔ビーズ封入方法〕
本実施形態に係るビーズ封入方法について、図１（ａ）〜（ｅ）を参照して説明する。図１（ａ）〜（ｅ）は、本発明に係るビーズ封入方法を説明するための模式図であり、アレイ１の側方断面図を示す。
【００１９】
本実施形態では、下層部１０と上層部２０とを備えたアレイ１にビーズ４１、４１’を封入する場合について説明する。下層部１０は、ビーズ４１、４１’を１個のみ収容可能な複数の収容部１３が、疎水性の上面を有する側壁１２によって互いに隔てられて形成されている。また、上層部２０は、下層部１０における収容部１３が形成されている面に対向している。
【００２０】
ビーズは、平均粒子径１μｍ〜４μｍであることが好ましい。これにより、アレイへの効率的な封入とアレイの高密度化とを達成することができる。なお、「平均粒子径」とは、ここでは電子顕微鏡観察又は動的光散乱法を用いて測定した数値をいう。
【００２１】
本実施形態では、ターゲット分子を特異的に捕捉するビーズを用いる場合について説明するが、本発明は特にこれに限定されない。本実施形態では、封入するビーズは、ターゲット分子を捕捉していないビーズ４１と、ターゲット分子を捕捉したビーズ４１’との混合物である。
【００２２】
ターゲット分子を特異的に捕捉するビーズとして、例えば、ターゲット分子を特異的に捕捉するための分子が結合されているビーズを用いることができる。ターゲット分子を特異的に捕捉するための分子は、ビーズの表面にある修飾基に、例えばリンカーを介して結合させてもよい。例えば、アミノ基修飾ビーズの表面にあるアミノ基に、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（Ｎ―ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）等を持つ架橋剤を介して共有結合させることにより結合させることができる。
【００２３】
「ターゲット分子」とは、検出対象である分子（標的分子）、すなわちここではビーズに捕捉させることによって検出しようとする分子をさす。ターゲット分子としては、例えばタンパク質、核酸、糖等の生体分子、ならびにウイルス粒子そのものなどが挙げられる。
【００２４】
ターゲット分子を特異的に捕捉するための分子（以下、「ターゲット捕捉分子」ともいう。）としては、ターゲット分子に応じて選択すればよく、例えばタンパク質、抗体、核酸等を用いることができる。なお、ターゲット捕捉分子は、ビーズ１個あたり１０万分子以上結合されていることが好ましい。例えばターゲット捕捉分子が抗体の場合には、解離定数がｎＭオーダー程度であるが、上述した構成であれば、ビーズとターゲット分子とを反応させる際のターゲット捕捉分子の濃度を充分に高くすることができる（例えば、ビーズの濃度が８×１０６粒子／ｍＬの場合、ターゲット捕捉分子が約１ｎＭとなる）。
【００２５】
本実施形態に係るビーズ封入方法は、ビーズ導入工程と、脱気工程と、疎水性溶媒導入工程とを含む。各工程について、以下に詳細に説明する。
【００２６】
（ビーズ導入工程）
ビーズ導入工程について、図１（ａ）〜（ｂ）を参照して説明する。
【００２７】
ビーズ導入工程は、下層部１０と上層部２０との間の空間３０に、ビーズ４１、４１’を含む親水性溶媒４２を導入する工程である。親水性溶媒４２を導入する方法としては、下層部１０と上層部２０との間の空間３０に、下層部１０と上層部２０とが対向する面に平行な方向に導入すればよい。例えば、上層部２０及び下層部１０の少なくとも一方に形成されている貫通孔（図示せず）から、空間３０内に導入してもよい。
【００２８】
親水性溶媒４２としては、例えば、水、親水性アルコール、親水性エーテル、ケトン、ニトリル系溶媒、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）からなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物等を好適に用いることができる。親水性アルコールとしては、例えばエタノール、メタノール、プロパノール、グリセリン等が挙げられる。親水性エーテルとしては、例えばテトラヒドロフラン、ポリエチレンオキサイド、１，４−ジオキサン等が挙げられる。ケトンとしては、例えばアセトン、メチルエチルケトン等が挙げられる。ニトリル系溶媒としては、例えばアセトニトリル等が挙げられる。
【００２９】
親水性溶媒４２は、ビーズ４１、４１’の他に、例えばビーズ４１’に捕捉されたターゲット分子を特異的に検出するための物質をさらに含んでいてもよい。このような物質としては、例えば、ビーズ４１’に捕捉されたターゲット分子又はこれに特異的に結合した分子に結合した所定の酵素によって分解されて、蛍光物質を遊離する蛍光基質などであってもよい。ターゲット分子に特異的に結合する分子としては、例えば二次抗体、核酸等であってもよい。また、所定の酵素としては、例えばβ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ等が挙げられる。蛍光基質としては、例えばＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｄｉ−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＦＤＧ）、Ａｍｐｌｅｘ  ｒｅｄ（登録商標）等が挙げられる。
【００３０】
（脱気工程）
脱気工程について、図１（ｃ）を参照して説明する。
【００３１】
脱気工程は、ビーズ導入工程の後であって疎水性溶媒工程より前に、下層部１０と上層部２０との間の空間３０内を脱気する工程である。脱気する方法としては、例えば、アレイ１を減圧環境下において放置する方法等を好適に用いることができる。具体的には、約０．１気圧の減圧デシケータ内にアレイ１を約３０秒放置する方法などである。
【００３２】
本発明において、脱気工程は必須の工程ではないが、脱気工程を行なうことにより、収容部１３内の空気が除去され、ビーズ４１、４１’を含む親水性溶媒４２を収容部１３内に効率よく導入することができる。したがって、ビーズ４１、４１’を収容部１３内に効率よく封入させることが可能になるため、脱気工程を行なうことがより好ましい。
【００３３】
（疎水性溶媒導入工程）
疎水性溶媒導入工程について、図１（ｄ）〜（ｅ）を参照して説明する。
【００３４】
疎水性溶媒導入工程は、下層部１０と上層部２０との間の空間３０に疎水性溶媒４３を導入する工程である。疎水性溶媒導入工程は、ビーズ導入工程の後に行われる工程であり、脱気工程の後に行われることがより好ましい。
【００３５】
疎水性溶媒４３は、ビーズ導入工程で用いた親水性溶媒４２と混ざり合いにくい溶媒であればよい。疎水性溶媒４３として、例えば飽和炭化水素、不飽和炭化水素、芳香族炭化水素、シリコーンオイル、パーフルオロカーボン、ハロゲン系溶媒、及び疎水性イオン液体からなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物等を好適に用いることができる。飽和炭化水素としては、例えばアルカン、シクロアルカンなどが挙げられる。アルカンとしては、例えばデカン、ヘキサデカン等が挙げられる。不飽和炭化水素としては、例えばスクアレン等が挙げられる。芳香族炭化水素としては、例えばベンゼン、トルエン等が挙げられる。パーフルオロカーボンとしては、例えばフロリナート（登録商標）ＦＣ４０（SIGMA社製）等が挙げられる。ハロゲン系溶媒としては、例えばクロロホルム、塩化メチレン、クロロベンゼン等が挙げられる。疎水性イオン液体とは少なくとも水中では解離しないイオン液体をさし、例えば１―Ｂｕｔｙｌ―３―ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ等が挙げられる。イオン液体とは、室温において液体で存在する塩をさす。
【００３６】
疎水性溶媒導入工程を行なうことにより、収容部１３の各々に、疎水性溶媒４３により覆われたドロップレット（液滴）を効率よく形成させることができる。また、各ドロップレット内にビーズ４１、４１’を効率よく封入することができる。
【００３７】
本実施形態では、下層部１０と上層部２０との間の空間３０を用いてビーズ４１、４１’を導入することにより、大きな面積（例えば１ｃｍ２以上の面積）に多数作製した収容部１３の各々に、ビーズを高い効率で封入することができる。
【００３８】
本実施形態によれば、多数の収容部を有する大面積のドロップレットアレイを実現することが可能である。例えば、１００万個以上の収容部を有するアレイであっても、効率よくビーズ４１、４１’を各収容部に封入することが可能である。したがって、本実施形態であれば、ターゲット分子を高感度に検出することができるため、０．１ａＭ程度の非常に低濃度のターゲット分子であっても検出することが可能となる。
【００３９】
〔ターゲット分子を検出する方法〕
次に、本実施形態に係るターゲット分子を検出する方法について、説明する。
【００４０】
本実施形態に係るターゲット分子を検出する方法は、反応工程と、ビーズ封入工程と、検出工程とを含む。
【００４１】
本実施形態では、ビーズとして、ターゲット分子を特異的に捕捉するビーズを用いる。例えば、ビーズは、ターゲット分子を特異的に捕捉するための分子が結合されているものであってもよい。なお、ビーズ、ターゲット分子、及びターゲット分子を特異的に捕捉するための分子については、本実施形態に係るビーズ封入方法において例示したものと同様のものを好適に用いることができる。
【００４２】
反応工程は、ビーズとターゲット分子とを反応させる工程である。例えばビーズを含む溶液と、ターゲット分子を含む溶液とを混合させることにより反応させることができる。
【００４３】
ビーズ封入工程は、反応工程において反応させたビーズを用いて上述したビーズ封入方法を行なう工程である。すなわち、ビーズ封入工程は、ビーズ導入工程と、疎水性溶媒導入工程とを含む工程、または、ビーズ導入工程と、脱気工程と、疎水性溶媒導入工程とを含む工程である。なお、ビーズ導入工程、脱気工程及び疎水性溶媒導入工程については、上述した「ビーズ封入方法」における各工程と同様に行なうことができるため、ここでは説明を省略する。
【００４４】
検出工程は、ビーズ封入工程の後に、収容部１３の各々にターゲット分子を捕捉したビーズ４１’が収容されているか否かを検出する工程である。
【００４５】
ターゲット分子を捕捉したビーズ４１’が収容されているか否かを検出する方法としては、例えば抗原抗体反応、ストレプトアビジン−ビオチン反応、核酸の相補的な結合等、公知の分子認識反応を好適に用いることができる。例えば、ターゲット分子又はこれに特異的に結合した分子に結合した所定の酵素によって、蛍光基質が分解されて遊離した蛍光物質を検出する方法が挙げられる。蛍光物質の検出方法としては、蛍光顕微鏡、イメージセンサ等を用いて各収容部における蛍光強度を検出する方法などが挙げられる。
【００４６】
また、検出工程においては、各収容部１３にビーズ４１又はビーズ４１’が収容されているか否かをも検出することが好ましい。各収容部１３にビーズ４１又はビーズ４１’が収容されているか否かを検出する方法としては、例えば顕微鏡下においてビーズ４１又はビーズ４１’の有無を観察することにより検出することができる。また、ビーズ４１、４１’の有無を検出する方法として、ビーズによる散乱光を検出する方法、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）による電位計測を利用する方法などもある。
【００４７】
検出工程の結果、ビーズ４１又はビーズ４１’が収容されている収容部１３の数と、ターゲット分子を捕捉したビーズ４１’が収容されている収容部１３の数とを用いて、ビーズの全数のうちターゲット分子を捕捉したビーズの数の割合を算出することができる。これにより、ターゲット分子の濃度を定量化することが可能となる。
【００４８】
本実施形態であれば、多数の収容部を有する大面積のドロップレットアレイを実現させることが可能であり、１００万個以上の収容部を有するアレイであっても、効率よくビーズ４１、４１’を各収容部に封入することが可能である。したがって、本実施形態であれば、ターゲット分子を高感度に検出することができるため、１０ａＭ程度の非常に低濃度のターゲット分子であっても検出することが可能となる。
【００４９】
〔アレイ〕
次に、本実施形態に係るアレイ１の構成について、図１（ａ）を参照して詳細に説明する。アレイ１は、本実施形態に係るビーズ封入方法に用いるためのアレイであってもよいし、本実施形態に係るターゲット分子を検出する方法に用いるためのアレイであってもよい。
【００５０】
アレイ１は、下層部１０と、上層部２０とを備えている。
【００５１】
下層部１０は、板状部材１１と疎水性の上面を有する側壁１２とを備えている。下層部１０には、複数の収容部１３が側壁１２によって互いに隔てられて形成されている。
【００５２】
板状部材１１は親水性表面を有していることが好ましい。「親水性表面」とは、親水性溶媒との親和性が疎水性溶媒との親和性よりも高い表面を指す。板状部材１１としては、固体材料であればよいが、例えばガラス、シリコン、高分子樹脂等を用いることができる。
【００５３】
側壁１２は、板状部材１１の表面上、好ましくは親水性表面上に設けられている、複数の収容部１３の各々を隔てる構造物である。側壁１２は、疎水性の上面を有している。「疎水性」とは、ここでは「親油性」と同じ意味で用いられ、疎水性溶媒との親和性が親水性溶媒との親和性よりも高いことをいう。
【００５４】
なお、側壁１２は、その上面、すなわち上層部２０と対向する面が疎水性であればよく、側面、すなわち収容部１３内の内壁は、疎水性であっても親水性であってもよい。
【００５５】
例えば、側壁１２は、親水性の構造物と、その上面に形成されている疎水性層とにより構成されていてもよい。親水性の構造物には、例えばガラス、シリコン、高分子樹脂等を用いることができる。疎水性層には、例えば撥水性の樹脂、フッ素系高分子樹脂等を用いることができる。フッ素系高分子樹脂としては、例えばアモルファスフッ素樹脂等が挙げられる。アモルファスフッ素樹脂は、高い疎水性を有し、かつ、生体試料に対する毒性が低いという理由で、好ましく用いられる。
【００５６】
上記アモルファスフッ素樹脂としては、例えば、ＣＹＴＯＰ（登録商標）、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ２４００、およびＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ１６００から選択した少なくとも１つを好適に用いることができる。中でも、微細加工が容易であるという理由で、ＣＹＴＯＰ（登録商標）が最も好ましい。
【００５７】
また例えば、側壁１２は、疎水性の材料により構成されていてもよい。側壁１２として、例えばフッ素系高分子樹脂、パラキシリレン系高分子樹脂等を用いることができる。フッ素系高分子樹脂としては、例えばアモルファスフッ素樹脂等が挙げられる。アモルファスフッ素樹脂としては上述の樹脂を好適に用いることができる。
【００５８】
側壁１２は、板状部材１１上に複数の収容部１３が形成されるように構成されていればよく、例えば収容部１３が形成される位置に孔が形成されている板形状の構造物であってもよい。
【００５９】
板状部材１１の表面からの側壁１２の高さ（垂直方向の厚み）は、収容部１３に収容されたビーズ４１、４１’が、後述する疎水性溶媒導入工程において収容部１３から排出されない程度の高さであればよい。例えば収容部１３に収容されたビーズ４１、４１’の大部分、好ましくは全てが側壁１２の上面よりも下に収まる高さであってもよい。
【００６０】
なお、側壁１２の高さは、ビーズ４１、４１’を収容部１３に効率よく収容するという観点から、ビーズ４１、４１’の平均粒子径の１倍以上であることが好ましい。また側壁１２の高さは、ビーズ４１、４１’を１個のみ収容部１３に収容させるという観点から、ビーズ４１、４１’の平均粒子径の１．５倍以下であることが好ましい。
【００６１】
複数の収容部１３の各々は、ビーズ４１、４１’を１個のみ収容可能な凹部であり、互いに側壁１２によって隔てられている。収容部１３は、板状部材１１の表面の一部を底面としており、底面が親水性である。
【００６２】
収容部１３は、ビーズ４１、４１’が１個のみ収容される形状及び大きさであればよい。収容部１３の底面及び側面によって囲まれた領域の形状は、例えば円柱形状、角柱形状等であってもよい。
【００６３】
各収容部１３の水平方向の幅Ａ（水平方向の断面が円であればその直径、正方形であればその一辺の長さなど）は、ビーズ４１、４１’の平均粒子径よりも大きければよいが、例えばビーズ４１、４１’の平均粒子径の１．５倍〜２倍であることが好ましい。各収容部１３の深さは、本実施形態では側壁１２の高さと同じである。なお、本発明における収容部の深さは、ビーズを収容部に効率よく収容するという観点から、ビーズの平均粒子径の１倍以上であることが好ましい。また本発明における収容部の深さは、ビーズを１個のみ収容部に収容させるという観点から、ビーズの平均粒子径の１．５倍以下であることが好ましい。
【００６４】
本実施形態では、収容部１３の底面が親水性であり、かつ側壁１２の上面が疎水性である。これにより、後述するビーズ導入工程において、ビーズ４１、４１’を含む親水性溶媒４２を効率よく収容部１３の中に導入することができるとともに、後述する疎水性溶媒導入工程において疎水性溶媒４３が収容部１３に入り込むことを防止することができる。したがって、ビーズ４１、４１’を含む液滴を含む収容部１３を、疎水性溶媒によって効率よく密閉することができる。
【００６５】
上層部２０は、板状部材２１と、疎水性層２２とを備えている。疎水性層２２は、板状部材２１における、下層部１０に対向する面上に設けられている。板状部材２１としては、例えばガラス、シリコン、高分子樹脂等を用いることができる。また、疎水性層２２としては、例えば撥水性の樹脂、フッ素系高分子樹脂等を用いることができる。フッ素系高分子樹脂としては、例えばアモルファスフッ素樹脂等が挙げられる。
【００６６】
上層部２０は、下層部１０における収容部１３が形成されている面に対して空間３０を隔てて対向している。すなわち、側壁１２と疎水性層２２との間に空間３０があいている。この空間３０は、流路を構成する。この構成により、アレイ１はフローセル構造となっている。
【００６７】
空間３０は、下層部１０と上層部２０との間に、下層部１０と上層部２０とが互いに対向する面と平行な方向に流体を流すための流路として用いられうる。
【００６８】
側壁１２の上面と疎水性層２２板状部材２１との間の距離、すなわち空間３０の垂直方向の幅は、少なくともビーズ１４、１４’の平均粒子径より大きければよく、１０〜１５０μｍであることが好ましい。
【００６９】
下層部１０又は上層部２０には、空間３０に流体を導入するための貫通孔（図示せず）が形成されていてもよい。例えば、下層部１０は、収容部１３が形成されている領域と、収容部１３が形成されていない領域とを有していてもよい。そして、下層部１０における収容部１３が形成されていない領域、又は上層部２０におけるこの領域と対向する部分に、貫通孔が形成されていてもよい。
【００７０】
本実施形態においては、空間３０の上面が疎水性層２２の表面であり、空間３０の下面が側壁１２の上面及び収容部１３である。したがって、空間３０のうち、収容部１３の底面以外の部分は全て疎水性となっている。これにより、後述するビーズ導入工程において、ビーズ４１、４１’を含む親水性溶媒４２を効率よく各収容部１３内に導入することができる。また、後述する疎水性溶媒導入工程において、各収容部１３内に疎水性溶媒４３を入り込ませることがない。したがって、疎水性溶媒４３を空間３０内に導入することにより、各収容部１３にビーズ４１、４１’が封入されたドロップレットを効率よく形成させることができる。
【００７１】
本実施形態に係るアレイ１の一例としては、例えば１００万個以上の収容部が形成されたアレイである。このような大面積のアレイであっても、本実施形態に係るビーズ封入方法又はターゲット分子を検出する方法を用いることにより、効率よくビーズを各収容部に封入することが可能である。したがって、本実施形態であれば、ターゲット分子を高感度に検出することができるため、０．１ａＭ程度の非常に低濃度のターゲット分子をも検出可能なアレイを提供することができる。
【００７２】
〔キット〕
次に、本実施形態に係るキットの構成について説明する。
【００７３】
本実施形態に係るキットは、アレイ１とビーズ４１とを少なくとも備える。アレイ１としては、上述した構成のアレイ１を好適に用いることができる。アレイ１の収容部１３の各々は、このキットが備えるビーズ４１を１個のみ収容可能であるように構成されている。
【００７４】
このキットが備えるビーズ４１は、ターゲット分子を特異的に捕捉するものであってもよく、例えばターゲット分子に特異的に結合する分子が結合したものであってもよい。ターゲット分子、及びこれに特異的に結合する分子としては、前述したものを好適に用いることができる。
【００７５】
また、このキットは、ターゲット分子を特異的に検出するための物質をさらに備えていてもよい。ターゲット分子を特異的に検出するための物質としては、上述したものを好適に用いることができる。また、キットは、水溶性溶媒、疎水性溶媒等をさらに備えていてもよい。
【００７６】
〔ターゲット分子検出装置〕
次に、本実施形態に係るターゲット分子検出装置５０の構成について、図２を参照して説明する。図２は、本発明に係るターゲット分子検出装置の一実施形態を模式的に示す図である。
【００７７】
本実施形態に係るターゲット分子検出装置５０は、アレイ１と、イメージセンサ５１と、光源５２とを備える。アレイ１としては、上述した構成を好適に用いることができるため、ここでは説明を省略する。
【００７８】
イメージセンサ５１は、収容部１３の各々から、ターゲット分子を捕捉したビーズが収容された場合に発せられる光を検出するセンサである。例えば、ターゲット分子又はこれに特異的に結合した分子に結合した所定の酵素によって、蛍光基質が分解されて発せられる蛍光を検出するセンサであってもよい。イメージセンサ５１としては、例えばＣＭＯＳイメージセンサ等を好適に用いることができる。
【００７９】
光源５２は、アレイ１に光を照射する光源である。なお、図２では、光源５２はアレイ１の上に設けられているが、本発明は特にこれに限定されず、例えばアレイ１の横から光を照射するものであってもよい。
【００８０】
なお、アレイ１とイメージセンサ５１との間には、干渉フィルタ、ライトガイドアレイ等が設けられていてもよい。また、光源５２とアレイ１との間には励起フィルタ等が設けられていてもよい。
【００８１】
本実施形態であれば、アレイ１とイメージセンサ５１とが直結されているため、顕微鏡等の他の装置を用いることなく、各収容部１３にターゲット分子を捕捉したビーズが収容されているか否かを容易に検出することができる。したがって、簡便かつ高速に検出することが可能になる。また、安価な商品として提供することができる。
【００８２】
本願には、以下の発明が含まれる。
【００８３】
本発明に係るビーズ封入方法は、ビーズを１個のみ収容可能な複数の収容部が、疎水性の上面を有する側壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、当該下層部における当該収容部が形成されている面に対向している上層部との間の空間に、当該ビーズを含む親水性溶媒を導入するビーズ導入工程と、上記ビーズ導入工程の後に上記空間に疎水性溶媒を導入する疎水性溶媒導入工程とを含むことを特徴とする。
【００８４】
また、本発明に係るビーズ封入方法では、上記ビーズ導入工程の後であって上記疎水性溶媒導入工程より前に、上記空間内を脱気する脱気工程をさらに含むことが好ましい。
【００８５】
また、本発明に係るビーズ封入方法では、上記親水性溶媒は、水、親水性アルコール、親水性エーテル、ケトン、ニトリル系溶媒、ジメチルスルホキシド、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドからなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物であることが好ましい。
【００８６】
また、本発明に係るビーズ封入方法では、上記疎水性溶媒は、飽和炭化水素、不飽和炭化水素、芳香族炭化水素、シリコーンオイル、パーフルオロカーボン、ハロゲン系溶媒、及び疎水性イオン液体からなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物であることが好ましい。
【００８７】
上記の課題を解決するために、本発明に係るターゲット分子を検出する方法は、ターゲット分子を特異的に捕捉するビーズと、当該ターゲット分子とを反応させる反応工程と、上記反応工程の後に、上記ビーズを用いて上述したいずれかのビーズ封入方法を行なうビーズ封入工程と、上記ビーズ封入工程の後に、上記収容部の各々に上記ターゲット分子を捕捉したビーズが収容されているか否かを検出する検出工程とを含むことを特徴とする。
【００８８】
また、本発明に係るターゲット分子を検出する方法では、上記ビーズには、上記ターゲット分子に特異的に結合する分子が結合していることが好ましい。
【００８９】
本発明に係るアレイは、複数の収容部が疎水性の上面を有する側壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、上記下層部における上記収容部が形成されている面に対して空間を隔てて対向している上層部とを備えていることを特徴とする。
【００９０】
また、本発明に係るアレイでは、上記収容部の各々は、底面が親水性であることが好ましい。
【００９１】
また、本発明に係るアレイでは、上記上層部における上記下層部に対向する面が疎水性であることが好ましい。
【００９２】
また、本発明に係るアレイでは、上記上層部及び上記下層部の少なくとも一方に、上記空間に流体を導入するための貫通孔が形成されていることが好ましい。
【００９３】
上記の課題を解決するために、本発明に係るキットは、上述したいずれかのアレイと、ビーズとを備え、上記収容部の各々は、上記ビーズを１個のみ収容可能であることを特徴とする。
【００９４】
上記の課題を解決するために、本発明に係るターゲット分子検出装置は、上述したいずれかのアレイと、上記収容部の各々から、ターゲット分子を捕捉したビーズが収容された場合に発せられる光を検出するイメージセンサとを備えることを特徴とする。
【００９５】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。
【実施例】
【００９６】
各実施例で用いた材料及び方法について説明する。【００９７】
（材料）
各実施例では、ターゲット分子として、β−ガラクトシダーゼでラベルされたストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＳＩＧＭＡ社より購入）（以下、単に「ストレプトアビジン」ともいう。）を用いた。また、ビーズとして、平均粒子径３μｍのアミノビーズ（材質：ポリスチレン；ｍｉｃｒｏｍｅｒ−ＮＨ２−３μｍ；Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社より購入）をビオチン化したビオチン化ビーズを用いた。【００９８】
（ビオチン化ビーズの作製）
以下の方法により、アミノビーズのアミノ基にＮＨＳ−ＰＥＯ４−Ｂｉｏｔｉｎを反応させ、アミノビーズをビオチン化した。【００９９】
まず、アミノビーズ２５０μＬにバッファーＡ（１００ｍＭリン酸バッファー，ｐＨ８．０）を７５０μＬ加えた。【０１００】
次に、１００００ｒｐｍ，１０分，４℃で遠心してアミノビーズを集め、５００μＬのバッファーＡに懸濁した（懸濁液Ａ）。そして、懸濁液ＡにＮＨＳ−ＰＥＯ４−Ｂｉｏｔｉｎ（２μｇ／５０μＬ  ＤＭＳＯ）を５０μＬ加え、少なくとも３時間、ゆるやかに混合しながら２５℃で反応させた（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄでチューブをｍｉｘした）。【０１０１】
次に、得られたビオチン化ビーズを洗浄した。１００００ｒｐｍ，１０分，４℃で遠心してビオチン化ビーズを集め、水相をピペットマンで取り除いた。このビオチン化ビーズの沈殿に１ｍＬのバッファーＡを加え、懸濁させた。これを６回繰り返し、未反応のＮＨＳ−ＰＥＯ４−Ｂｉｏｔｉｎを除いた。そして、５００μＬのバッファーＡに懸濁した（懸濁液Ｂ）。この懸濁液Ｂを４℃で保存した。【０１０２】
次に、懸濁液Ｂにおけるビオチン化ビーズの濃度を調べた。血球計算盤を用いて、一定体積内のビオチン化ビーズの個数をカウントすることにより、ビオチン化ビーズの濃度を算出した（約３．０×１０８ビーズ／ｍＬ）。なお、カウントしやすくするために、例えば、懸濁液ＢをバッファーＡにより５倍程度に希釈してカウントした。【０１０３】
以上の方法により、ビオチン化ビーズを得た。【０１０４】
（ストレプトアビジンの捕捉）
次に、以下の方法により、ビオチン化ビーズを用いてストレプトアビジンを捕捉した。【０１０５】
まず、ビオチン化ビーズを希釈した（８×１０６ビーズ／５００μＬ）。また、β−ガラクトシダーゼでラベルされたストレプトアビジンを、バッファーＢ（１００ｍＭリン酸バッファー，ｐＨ８．０，０．１％  ＴＷＥＥＮ２０（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を含む）により目的の濃度の２倍の濃度に希釈した（全量５００μＬ）。【０１０６】
そして、ビオチン化ビーズ５００μＬと、希釈したストレプトアビジン５００μＬとをチューブ内で混合し（全量１ｍＬ）、ゆるやかにチューブを上下させ、２５℃で３０分反応させた。【０１０７】
次に、１００００ｒｐｍ，１０分，４℃で遠心して反応後のビーズ（ストレプトアビジンとビオチン化ビーズとの複合体と、未反応のビオチン化ビーズとの混合物）を集め、水相をピペットマンで取り除いた。このビーズの沈殿に１ｍＬのバッファーＡを加え、懸濁した。これを４回繰り返すことによって洗浄し、未反応のターゲット分子を除いた。【０１０８】
次に、洗浄後のビーズの沈殿に、バッファーＣ（１００ｍＭリン酸バッファー，ｐＨ７．５，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を１５μＬ加えて懸濁した。ビーズの濃度は最終的に約６．５×１０６ビーズ／１５μＬ  バッファーＣとなった。【０１０９】
（アレイの作製）
次に、以下の方法により、図１（ａ）〜（ｅ）に示すアレイ１と同様のフローセル構造のアレイを作製した。以下の説明において、アレイ１における構成要素と同じ機能を有する構成要素には同じ符号を付して説明する。【０１１０】
まず、親水／疎水パターンガラス（下層部１０）と、上面ガラス（上層部２０）（縦２４ｍｍ×横２６ｍｍ×厚さ５ｍｍ、ＳｉＯ２、直径１ｍｍの貫通孔あり）とを準備した。【０１１１】
（親水／疎水パターンガラスの作製）
親水／疎水パターンガラスを作製するために具体的に用いた方法を、図７を参照して説明する。図７は、本発明の一実施例において親水／疎水パターンガラスを作製する方法を説明するための図である。【０１１２】
本実施例では、フォトリソグラフィとドライエッチングとにより、ガラス上に親水／疎水パターンを作製した。親水／疎水パターンの作製では、ＣＹＴＯＰ（登録商標）塗布工程、フォトリソグラフィ工程、エッチング・レジスト除去工程の３つの工程を行なった。【０１１３】
ＣＹＴＯＰ（登録商標）塗布工程では、まず、縦２４ｍｍ×横３２ｍｍのガラス（商品名：ＮＥＯ  ＭＩＣＲＯ  ＣＯＶＥＲ  ＧＬＡＳＳ  Ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  Ｎｏ．１；ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ社製）（板状部材１１）上にＣＹＴＯＰ（登録商標）ＣＴＬ−８０９（商品名、ＡＳＡＨＩ  ＧＬＡＳＳ社製）を塗布し、疎水性の樹脂層６１を形成させた。【０１１４】
続いて、フォトリソグラフィ工程では、ポジ型のフォトレジスト６２（商品名：ＡＺ−４９０３、ＡＺ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＵＳＡ社製）を塗布した。次に、目的のパターンのフォトマスク６３を介して上部からＵＶを露光し、アルカリによる現像処理を行なった。この現像処理によって、ＵＶが照射された部分のみ、フォトレジスト６２が溶解し、疎水性の樹脂層６１の面がむき出しになった。【０１１５】
その後、エッチング・レジスト除去工程では、このガラスを、一部が溶解したフォトレジスト６２’を介してＯ２プラズマによりエッチングすることで、樹脂層６１の一部を除去した。これにより、疎水性の側壁１２が形成された。最後に、有機溶媒でフォトレジスト６２’を溶解させることにより、親水／疎水パターンを形成した。【０１１６】
さらに詳しい手順は以下の通りである。図７中、（１）〜（２３）で示す数字は、下記の（１）〜（２３）に対応する。【０１１７】
＜ＣＹＴＯＰ（登録商標）塗布工程（下記プロセスで膜厚約３．３〜３．５μｍのＣＹＴＯＰ（登録商標）層を作製）＞
（１）まず、ガラス（板状部材１１）の洗浄及びＣＹＴＯＰ（登録商標）ＣＴＬ−８０９の塗布を行なった。【０１１８】
（２）次に、このガラスを１０Ｎ  ＫＯＨに一晩浸しておいた。【０１１９】
（３）ＫＯＨに浸したカバーガラスを脱イオン水で１０回以上洗った。【０１２０】
（４）１８０℃のホットプレートでガラスを乾燥させた。【０１２１】
（５）乾燥させたガラスを室温に戻した。【０１２２】
（６）ガラス上にＣＹＴＯＰ（登録商標）ＣＴＬ−８０９を約７０μＬ垂らした。【０１２３】
（７）下記のプログラムＡでスピンコートした。【０１２４】
［プログラムＡ］
Ｓｌｏｐｅ  ５秒
５００ｒｐｍ  １０秒
Ｓｌｏｐｅ  ５秒
２０００ｒｐｍ  ３０秒
Ｓｌｏｐｅ  ５秒
Ｅｎｄ  
（８）ホットプレート上で１８０℃，１時間ベークした。【０１２５】
以上の（６）〜（８）を４回繰り返すことで、深さ３．３〜３．５μｍの疎水性の樹脂層６１が形成された。【０１２６】
＜フォトリソグラフィ工程＞
続いてフォトリソグラフィを行なった。【０１２７】
（９）ポジ型のフォトレジスト６２（ＡＺ−４９０３）を、ＣＹＴＯＰ（登録商標）塗布工程で作製した樹脂層６１上に垂らした。量は、ガラス上で垂らしたレジストが直径約８ｍｍに広がる程度とした。【０１２８】
（１０）下記のプログラムＢでスピンコートした。【０１２９】
［プログラムＢ］
Ｓｌｏｐｅ  ５秒
５００ｒｐｍ  １０秒
Ｓｌｏｐｅ  ５秒
４０００ｒｐｍ  ６０秒
Ｓｌｏｐｅ  ５秒
Ｅｎｄ
（１１）ガラスのエッジに残ったレジストを、１００％ＥｔＯＨを含ませたガーゼでふき取った。【０１３０】
（１２）５５℃  ３分ベークした。【０１３１】
（１３）１１０℃  ５分ベークした。【０１３２】
（１４）フォトマスク６３をアセトンで洗浄し、マスクアライナー（ＳＡＮ−ＥＩ  ＥＬＥＣＴＯＲＩＣ社製）にセットした。【０１３３】
（１５）フォトレジスト６２を塗布したガラスをマスクアライナーの試料台にセットし、試料台をリフトアップすることにより、ガラスとフォトマスク６３とをコンタクトさせた。【０１３４】
（１６）ＵＶを３５秒間照射した（Ｐｏｗｅｒ＝２５６）。【０１３５】
（１７）ガラスをＡＺ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（ＡＺ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＵＳＡ社製）に５分以上浸し、現像した。【０１３６】
（１８）ＭｉｌｌｉＱ（蒸留水）で１０分程すすいだ。【０１３７】
＜エッチング・レジスト除去工程＞
続いて、エッチング及びレジストの除去を行なった。【０１３８】
（１９）ＲＩＥ−１０ＮＲ（Ｓａｍｃｏ社製）を用いて、所定のプロセス条件（Ｏ２  ５０ｓｃｃｍ；Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  １０Ｐａ；Ｐｏｗｅｒ  ５０Ｗ；Ｔｉｍｅ  ３０ｍｉｎ）によりＯ２プラズマエッチングを行なった。【０１３９】
（２０）エッチング後のガラスをアセトンに浸け、１５分間ソニケーションを行なった。【０１４０】
（２１）アセトンを交換し、もう一度１５分間ソニケーションを行なった。【０１４１】
（２２）ＥｔＯＨで１５分間ソニケーションを行なった。【０１４２】
（２３）ＭｉｌｌｉＱ（蒸留水）で洗浄した。【０１４３】
以上の方法により、ガラス上に複数のウェル（収容部１３）を形成させた。各ウェルの底面及び側面によって囲まれた領域は円柱形状であった。各ウェルの水平方向の断面は、直径５μｍの円形状であり、各ウェルを隔てる側壁の高さは約３．３〜３．５μｍであった。また、隣接する２つのウェルの間の距離Ｂは５μｍであった。【０１４４】
（上面ガラスの作製）
また、上面ガラスを以下の方法にて作製した。上面ガラスとして、直径１ｍｍの貫通孔が形成されている厚さ５ｍｍのガラスを用いた。このガラスの一方の面をＣＹＴＯＰ（登録商標）ＣＴＬ−８０９（商品名、ＡＳＡＨＩ  ＧＬＡＳＳ社製）約７０μＬで覆い、下記プログラムＣによりスピンコートした。【０１４５】
［プログラムＣ］
Ｓｌｏｐｅ      ５秒
５００ｒｐｍ    １０秒
Ｓｌｏｐｅ      ５秒
２０００ｒｐｍ  ３０秒
Ｓｌｏｐｅ      ５秒
Ｅｎｄ
その後、ホットプレート上で１８０℃，１時間ベークした。【０１４６】
以上の方法により、一方の面に厚さ１μｍの疎水性層を備えた上面ガラスを作製した。【０１４７】
（親水／疎水パターンガラスと上面ガラスとの貼り合わせ）
次に、パラフィルム（Ｐｅｃｋｉｎｅｙ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ社製）の裏紙に高真空グリース（ＤＯＷ  ＣＯＲＮＩＮＧ  ＴＯＲＡＹ社製）を付し、親水/疎水パターンガラスのうち、親水／疎水パターンが形成された面側であって親水／疎水パターンが形成されていない部分に張り付けた。上面ガラスを、コーティング剤でコートされた面が親水／疎水パターンガラス側になるように、親水／疎水パターンガラスの親水／疎水パターンが形成された面上に貼り付けた。【０１４８】
これにより、親水／疎水パターンガラスと上面ガラスとの間に空間が形成された。この空間の垂直方向の幅、すなわち親水／疎水パターンガラスの側壁の上面と上面ガラスとの間の距離は、約１５０μｍであった。【０１４９】
（ドロップレットへのビーズの封入）
次に、以下の方法により、ストレプトアビジンと反応後のビーズをドロップレットに封入した。【０１５０】
まず、５０ｍＭ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｄｉ−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＦＤＧ）（Ｍａｒｋｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）／ＤＭＳＯをＦＤＧバッファー（１００ｍＭ  ＫＰｉ  ｂｕｆｆｅｒ（ＰＨ＝７．５），１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，４μＬ／ｍＬ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｅｔｈａｎｏｌ）で希釈し、４ｍＭ  ＦＤＧ溶液を準備した。そして、ビーズ（６．５×１０６ビーズ／１５μＬ  バッファーＣ）１５μＬと、４ｍＭＦＤＧ溶液１５μＬとを混ぜ、ビーズ溶液を作製した。【０１５１】
次に、このビーズ溶液３０μＬを、上面ガラスの貫通孔からイエローチップで流路内にロードした（図１（ａ）〜（ｂ））。【０１５２】
次に、各ウェル内の空気を抜くため、脱気を１分行なった（図１（ｃ））。脱気は、０．１気圧の減圧デシケータ内に、アレイを約３０秒放置することにより行った。その後５分間静置し、ビーズをウェルの底に沈めた。【０１５３】
その後、Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ（登録商標）ＦＣ４０（ＳＩＧＭＡ社製）２００μＬ〜１０００μＬを、上面ガラスの貫通孔から流路内にロードした（図１（ｄ）〜（ｅ））。【０１５４】
その結果、ウェル部分にのみ水相がトラップされてドロップレットが形成され、ビーズがドロップレット内に封入された。【０１５５】
〔実施例１〕
上述した方法を用いて、ビオチン化ビーズと１ｆＭのストレプトアビジンとを反応させた後、ＦＤＧとともにアレイに導入し、ビーズを各ドロップレットに封入した。アレイとしては、２７４４個の収容部が形成された５１２μｍ×５１２μｍのサブアレイを２０個×２０個にて配置した、合計１０９７６００個の収容部を有する１．０ｃｍ×１．０ｃｍのアレイを用いた。このアレイを蛍光顕微鏡（ＩＸ７１（ＯＬＹＭＰＵＳ社製））にて観察した。【０１５６】
図３は、本発明の一実施例においてビーズを封入したアレイの蛍光像を表す図である。なお、図３は、１個のサブアレイについて示す。図３に示すように、蛍光像において、輝点がいくつか検出された（一視野中に１３８個）。この輝点は、ストレプトアビジンを捕捉したビオチン化ビーズが封入された収容部がある位置を示す。したがって、本発明に係る方法を用いれば、１ｆＭのストレプトアビジンを十分検出可能であることがわかった。【０１５７】
〔比較例１〕
本発明の比較例として、従来のバルク（Ｂｕｌｋ）計測法を用いてターゲット分子を検出した。【０１５８】
実施例１で用いた濃度（１ｆＭ）よりも１２．５倍濃い濃度である１２．５ｆＭストレプトアビジンとＦＤＧとを混ぜ、蛍光分光器によって蛍光を測定した。また、コントロールとして、５００倍の濃度である６．３ｐＭのストレプトアビジンを用いて、同様に実験を行なった。【０１５９】
この結果を図４に示す。図４は、従来の方法によってターゲット分子を検出した場合における蛍光強度を示すグラフである。なお、図４において、グラフａは１２．５ｆＭのストレプトアビジンを用いた場合の結果を示し、グラフｂは６．３ｐＭのストレプトアビジンを用いた場合の結果を示す。【０１６０】
図４に示すように、従来の方法を用いた場合には、１２．５ｆＭのストレプトアビジンを検出することができなかった。したがって、従来の方法では、１２．５ｆＭは検出限界以下であることが示された。【０１６１】
〔実施例２〕
次に、ビオチン化ビーズと、５種類の異なる濃度（１ｆＭ、１００ａＭ、１０ａＭ、１ａＭ、０．１ａＭ）のストレプトアビジンとをそれぞれ反応させた後、ＦＤＧとともにアレイに導入し、ビーズを各ドロップレットに封入した。アレイとしては、実施例１と同様の構成のアレイを用いた。このアレイについて、顕微鏡下、明視野像と蛍光像とを観察した。【０１６２】
（検出結果）
図５（ａ）〜（ｆ）は、本発明の他の実施例においてビーズを封入したアレイの顕微鏡画像を表す図である。なお図５（ａ）、図５（ｃ）及び図５（ｅ）は１個のサブアレイの明視野像を現す図である。また、図５（ｂ）、図５（ｄ）及び図５（ｆ）は、それぞれ図５（ａ）、図５（ｃ）及び図５（ｅ）が示すサブアレイの蛍光像を表す図である。また、図５（ａ）〜（ｂ）は１ｆＭのストレプトアビジンについての結果であり、図５（ｃ）〜（ｄ）は１００ａＭのストレプトアビジンについての結果であり、図５（ｅ）〜（ｆ）は１０ａＭのストレプトアビジンについての結果である。【０１６３】
１ｆＭのストレプトアビジンを用いた場合、１つのサブアレイに封入されたビーズの全数は１７３５個であり、そのうちストレプトアビジンを捕捉したビーズは１３８個であった。１００ａＭのストレプトアビジンを用いた場合、１つのサブアレイに封入されたビーズの全数は２００８個であり、そのうちストレプトアビジンを捕捉したビーズは６個であった。１０ａＭのストレプトアビジンを用いた場合、１つのサブアレイに封入されたビーズの全数は１３６０個であり、そのうちストレプトアビジンを捕捉したビーズは１個であった。【０１６４】
（理論値と実験値との比較）
また、ストレプトアビジンの各濃度において、ビーズの全数に対する、ストレプトアビジンを捕捉したビーズ（アクティブビーズ）の数の割合（％）についての理論値と実験値とを算出した。【０１６５】
理論値は、反応させたビーズの全数に対するストレプトアビジンの分子数の割合（％）として算出した。また、実験値は、アレイに収容されたビーズの数に対するストレプトアビジンを捕捉したビーズの数の割合（％）として算出した。【０１６６】
図６は、本発明の他の実施例において、ストレプトアビジンの濃度と、ストレプトアビジンを捕捉したビーズの数の割合との関係を示すグラフである。図６において、グラフａは理論値を示し、丸い点は実験値を示し、点線で囲まれた丸は、実験値の平均を示す（Ｎ＝２〜３）。グラフｂは、実験値の平均値を直線によって近似したグラフを示す。【０１６７】
図６に示すように、理論値と実験値とがほぼ重なったことから、本実施例の方法は、定量性が高く、ターゲット分子の濃度を正確に測定することが可能であることが示された。以上の結果より、本実施例の方法であれば、０．１ａＭ程度の濃度であっても十分検出可能であることが示された。【０１６８】
〔実施例３〕
実施例１において作製したフローセル構造のアレイを用いて、上述した方法によりビーズ溶液（６．５×１０６ビーズ／３０μＬ）をアレイに導入（ロード）し、ドロップレットに封入（トラップ）させた。このときのトラップ効率（ロードしたビーズの数に対するトラップされたビーズの数の割合（％））を算出した。【０１６９】
この結果を図８に示す。図８は、フローセル構造を有するアレイを用いた場合（実施例３）と、フローセル構造を有しないアレイを用いた場合（比較例２）との、ビーズのトラップ効率を示す図である。【０１７０】
〔比較例２〕
本比較例では、フローセル構造を有しないアレイ（上述した親水／疎水パターンガラスのみからなるアレイ）を用いて、ビーズ（Φ＝３μｍのアミノビーズ；ｍｉｃｒｏｍｅｒ−ＮＨ２−３μｍ；ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製）の封入を行なった。【０１７１】
下記に示す方法により、フローセル構造を有するアレイを用いた場合（実施例３）と同濃度（２．２×１０８ビーズ／ｍＬ＝６．５×１０６ビーズ／３０μＬ）に希釈したビーズ溶液を用いて、親水／疎水パターンガラスにビーズを封入した。【０１７２】
（１）バッファー（１００ｍＭ  ＫＰｉ  ｂｕｆｆｅｒ（ＰＨ＝７．５），１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２μＬ／ｍＬ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｅｔｈａｎｏｌ）でビーズを２．２×１０８ビーズ／ｍＬに希釈した。【０１７３】
（２）ペトリディッシュ（３５ｍｍペトリディッシュ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）の底面に、親水／疎水パターンガラス（上述した方法で作製したもの）を接着させた。接着剤としては、アラルダイト  ＡＲ−Ｒ３０（ＮＩＣＨＩＢＡＮ社製）を用いた。【０１７４】
（３）親水／疎水パターンガラス上を、ビーズ溶液５００μＬで覆った。【０１７５】
（４）脱気した後、５分間インキュベートを行なった。【０１７６】
（５）親水／疎水パターンガラス上にＦＣ４０（Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ（登録商標）ＦＣ４０，ＳＩＧＭＡ社製）を２ｍＬロードし、ビーズを封入した。【０１７７】
（６）ドロップレットの蒸発を防ぐために、油相上を水で覆った。【０１７８】
その後、ドロップレットに閉じ込められたビーズの数をカウントし、トラップ効率（ロードしたビーズの数に対するトラップされたビーズの数の割合（％））を算出した。【０１７９】
この結果を図８に示す。図８に示されるように、フローセル構造を有するアレイを用いた場合には、フローセル構造を有しないアレイを用いた場合よりもトラップ効率が２５倍以上高かった。フローセル構造を有しないアレイを用いた場合、高さ方向に散乱可能な距離が増すので、ビーズが基板に近づきにくくなったと考えられる。【０１８０】
また、フローセル構造を有しないアレイを用いた場合、ビーズ溶液によってアレイの基板一面を覆う必要があり、大量のビーズ溶液（フローセル構造を有するアレイを用いる場合の約１６倍）が必要になる。したがって、フローセル構造を有するアレイを用いれば、少量のビーズ溶液によって効率よくビーズを封入することが可能になる。
【産業上の利用可能性】
【０１８１】
本発明は、低濃度のターゲット分子を検出するための方法、アレイ、装置等に好適に利用することができる。
【符号の説明】
【０１８２】
１      アレイ
１０    下層部
２０    上層部
１２    側壁
１３    収容部
３０    空間
４１、４１’  ビーズ
４２    親水性溶媒
４３    疎水性溶媒
【図１】
2012121310.tif 000003
【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図３】
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【図５】
2012121310.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成24年12月25日(2012.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビーズを１個のみ収容可能な複数の収容部が、疎水性の上面を有する側壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、当該下層部における当該収容部が形成されている面に対向している上層部との間の空間に、当該ビーズを含む親水性溶媒を導入するビーズ導入工程と、
上記ビーズ導入工程の後に上記空間に疎水性溶媒を導入する疎水性溶媒導入工程とを含むことを特徴とするビーズ封入方法。
【請求項２】
上記ビーズ導入工程の後であって上記疎水性溶媒導入工程より前に、上記空間内を脱気する脱気工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のビーズ封入方法。
【請求項３】
上記親水性溶媒は、水、親水性アルコール、親水性エーテル、ケトン、ニトリル系溶媒、ジメチルスルホキシド、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドからなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物であることを特徴とする請求項１又は２に記載のビーズ封入方法。
【請求項４】
上記疎水性溶媒は、飽和炭化水素、不飽和炭化水素、芳香族炭化水素、シリコーンオイル、パーフルオロカーボン、ハロゲン系溶媒、及び疎水性イオン液体からなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のビーズ封入方法。
【請求項５】
ターゲット分子を特異的に捕捉するビーズと、当該ターゲット分子とを反応させる反応工程と、
上記反応工程の後に、上記ビーズを用いて請求項１〜４のいずれかに記載のビーズ封入方法を行なうビーズ封入工程と、
上記ビーズ封入工程の後に、上記収容部の各々に上記ターゲット分子を捕捉したビーズが収容されているか否かを検出する検出工程とを含むことを特徴とする、ターゲット分子を検出する方法。
【請求項６】
上記ビーズには、上記ターゲット分子に特異的に結合する分子が結合していることを特徴とする請求項５に記載のターゲット分子を検出する方法。
【請求項７】
複数の収容部が疎水性の上面を有する側壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、
上記下層部における上記収容部が形成されている面に対して空間を隔てて対向している上層部とを備えるアレイと、ビーズと、親水性溶媒と、疎水性溶媒とを備え、
上記収容部の各々は、上記ビーズを１個のみ収容可能であることを特徴とする、請求項１に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項８】
上記収容部の各々は、底面が親水性であることを特徴とする請求項７に記載のキット。
【請求項９】
上記上層部における上記下層部に対向する面が疎水性であることを特徴とする請求項７又は８に記載のキット。
【請求項１０】
上記上層部及び上記下層部の少なくとも一方に、上記空間に流体を導入するための貫通孔が形成されていることを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載のキット。
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
請求項７〜１０のいずれかに記載のキットと、
上記収容部の各々から、ターゲット分子を捕捉したビーズが収容された場合に発せられる光を検出するイメージセンサとを備えることを特徴とするターゲット分子検出装置。
【手続補正書】
【提出日】平成25年6月14日(2013.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビーズを１個のみ収容可能な複数の収容部が、疎水性の上面を有する側壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、当該下層部における当該収容部が形成されている面に対向している上層部との間の空間に、当該ビーズを含む親水性溶媒を導入するビーズ導入工程と、
上記ビーズ導入工程の後に上記空間に疎水性溶媒を導入する疎水性溶媒導入工程とを含むことを特徴とするビーズ封入方法。
【請求項２】
上記ビーズ導入工程の後であって上記疎水性溶媒導入工程より前に、上記空間内を脱気する脱気工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のビーズ封入方法。
【請求項３】
上記親水性溶媒は、水、親水性アルコール、親水性エーテル、ケトン、ニトリル系溶媒、ジメチルスルホキシド、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドからなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物であることを特徴とする請求項１又は２に記載のビーズ封入方法。
【請求項４】
上記疎水性溶媒は、飽和炭化水素、不飽和炭化水素、芳香族炭化水素、シリコーンオイル、パーフルオロカーボン、ハロゲン系溶媒、及び疎水性イオン液体からなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のビーズ封入方法。
【請求項５】
ターゲット分子を特異的に捕捉するビーズと、当該ターゲット分子とを反応させる反応工程と、
上記反応工程の後に、上記ビーズを用いて請求項１〜４のいずれかに記載のビーズ封入方法を行なうビーズ封入工程と、
上記ビーズ封入工程の後に、上記収容部の各々に上記ターゲット分子を捕捉したビーズが収容されているか否かを検出する検出工程とを含むことを特徴とする、ターゲット分子を検出する方法。
【請求項６】
上記ビーズには、上記ターゲット分子に特異的に結合する分子が結合していることを特徴とする請求項５に記載のターゲット分子を検出する方法。
【請求項７】
複数の収容部が疎水性の上面を有する側壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、
上記下層部における上記収容部が形成されている面に対して空間を隔てて対向している上層部とを備えるアレイと、ビーズと、親水性溶媒と、疎水性溶媒とを備え、
上記収容部の各々は、上記ビーズを１個のみ収容可能であることを特徴とする、請求項１に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項８】
上記収容部の各々は、底面が親水性であることを特徴とする請求項７に記載のキット。
【請求項９】
上記上層部における上記下層部に対向する面が疎水性であることを特徴とする請求項７又は８に記載のキット。
【請求項１０】
上記上層部及び上記下層部の少なくとも一方に、上記空間に流体を導入するための貫通孔が形成されていることを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載のキット。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれかに記載のキットと、
上記収容部の各々から、ターゲット分子を捕捉したビーズが収容された場合に発せられる光を検出するイメージセンサとを備えることを特徴とするターゲット分子検出装置。
【国際調査報告】
2012121310.tif 000011
2012121310.tif 000012
2012121310.tif 000013
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