(57)【要約】本発明は、長時間にわたってキシロースの醗酵能を維持できる微生物を提供することを目的とする。  本発明はＮＡＤキナーゼ遺伝子及び／又はＦＰＳ１遺伝子の発現機能を喪失させた微生物、前記微生物の製造方法及び前記微生物を用いたエタノールの製造方法を提供する。
2012115277.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＡＤキナーゼ遺伝子の発現機能を喪失させた微生物。
【請求項２】
前記ＮＡＤキナーゼ遺伝子がＵＴＲ１遺伝子及びＹＥＦ１遺伝子から選択される少なくとも１つのものである、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
さらにＦＰＳ１遺伝子の発現機能が喪失した、請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
酵母である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項５】
サッカロミセス・セレビシエである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項６】
キシロース代謝酵素遺伝子が導入された、請求項１〜５のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項７】
前記キシロース代謝酵素遺伝子が、キシロース還元酵素遺伝子、キシリトール脱水素酵素遺伝子及びキシルロースリン酸化酵素遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つのものである、請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
ＮＡＤキナーゼ遺伝子の発現機能を喪失させることにより、キシロース醗酵能力の増加した微生物を作製する方法。
【請求項９】
前記ＮＡＤキナーゼ遺伝子がＵＴＲ１遺伝子及びＹＥＦ１遺伝子から選択される少なくとも１つのものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
さらにＦＰＳ１遺伝子の発現機能を喪失させる工程を含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物が酵母である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物がサッカロミセス・セレビシエである、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記微生物がキシロース代謝酵素遺伝子が導入されたものである、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記キシロース代謝酵素遺伝子が、キシロース還元酵素遺伝子、キシリトール脱水素酵素遺伝子及びキシルロースリン酸化酵素遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つのものである、請求項１３項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の微生物と、キシロース含有原料とを接触させる工程を含む、エタノールの製造方法。
【請求項１６】
ＦＰＳ１遺伝子の発現機能を喪失させた微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＡＤキナーゼ遺伝子の発現機能を喪失させた、微生物に関する。また、本発明は、ＮＡＤキナーゼ遺伝子の機能を喪失させることにより、キシロース醗酵能力の増加した醗酵微生物を作製する方法に関する。さらに、本発明は、前記微生物と、キシロース含有原料とを接触させる工程を含む、エタノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、化石燃料の枯渇や、ＣＯ２ガス削減の必要といった観点から、従来廃棄物であった、コーンコブ、稲ワラ、スイッチグラス、エリアンサス、廃材などといった、バイオマスから燃料としてエタノールを生成する研究が進められている。人類は何千年も前より、デンプンから酵母サッカロミセス・セレビシエによる醗酵でエタノールにする技術を持っていた。デンプンはグルコースがα−１，４結合した多糖であり、様々な生物が持つ加水分解酵素によって容易に分解することができる。また、グルコースは酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の最も好ましいＣ源であり、１分子のグルコースから２分子のエタノールが醗酵により生成される。これに対し、バイオマスは多糖として、セルロース、あるいはヘミセルロースを含んでいる。
このうち、セルロースは、グルコースがβ−１，４結合した多糖であり、結晶構造をとっている。結晶構造を壊すための前処理が必要であることや、セルロースを分解するために必要なセロビオハイドロラーゼＩ、セロビオハイドロラーゼＩＩ、エンドグルカナーゼ等の活性が十分でないこと等の問題はあるが、分解後に生じる糖はグルコースであるため、酵母サッカロミセス・セレビシエで醗酵するには何の問題もない。
これに対し、ヘミセルロースはグルコースの他に、キシロース、アラビノースと言った五炭糖を含んでいるが、従来酵母サッカロミセス・セレビシエはこれらの五炭糖を醗酵することができない。そこで、キシロースを醗酵するために、キシロースを醗酵する能力のある、酵母ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）のキシロース還元酵素、キシリトール脱水素酵素遺伝子を酵母サッカロミセス・セレビシエにて高発現させる方法が、良く用いられてきた（図１）。ピキア・スティピティスのキシロース還元酵素は補酵素として主にＮＡＤＰＨを用いる酵素であり、反応後、一分子のＮＡＤＰが生成する。一方、キシリトールデヒドロゲナーゼは、補酵素として主にＮＡＤを用いる酵素であり、反応後一分子のＮＡＤＨを生じる。従って、図１に示したように、グルコースを醗酵する際には、ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨあるいはＮＡＤ／ＮＡＤＨのバランスは変化しないが、キシロースを醗酵する場合には、ＮＡＤＰあるいは、ＮＡＤＨが増加する方向に傾いてしまう。このことが、キシロースからのエタノール醗酵における収率の低さの原因であると考えられている。
これまでに、補酵素特異性がＮＡＤＨに変換した、変異型キシロースレダクターゼの作製（非特許文献１）、補酵素特異性がＮＡＤＰＨに変換した、変異型キシリトールデヒドロゲナーゼの作製（非特許文献２）、解糖系のグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼの補酵素特異性が、ＮＡＤＰＨである酵素の遺伝子を、別の生物種から導入する実験（非特許文献３）、大腸菌などの細菌が持つトランスヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰＨとＮＡＤあるいは、ＮＡＤＰとＮＡＤＨ間で、水素のやりとりを行う）を発現させること（非特許文献４）などの、試みが行われてきたが、十分な効果は得られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｐｅｔｓｃｈａｃｈｅｒ  Ｂ，Ｎｉｄｅｔｚｋｙ  Ｂ．Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．２００８  Ｍａｒ  １７；７：９．
【非特許文献２】Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｓ，Ｓａｌｅｈ  ＡＡ，Ｐａｃｋ  ＳＰ，Ａｎｎａｌｕｒｕ  Ｎ，Ｋｏｄａｋｉ  Ｔ，Ｍａｋｉｎｏ  Ｋ．Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７  Ｊｕｎ  ３０；１３０（３）：３１６−９．Ｅｐｕｂ  ２００７  Ａｐｒ  ２９．
【非特許文献３】Ｖｅｒｈｏ  Ｒ，Ｌｏｎｄｅｓｂｏｒｏｕｇｈ  Ｊ，Ｐｅｎｔｔｉｌｅ  Ｍ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３  Ｏｃｔ；６９（１０）：５８９２−７．
【非特許文献４】Ｍｉｋａｅｌ  Ａｎｄｅｒｌｕｎｄ  ｅｔ．ａｌ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９  Ｊｕｎｅ  ６５（６）：２３３３−２３４０
【発明の開示】
【０００４】
このような状況下、長時間にわたってキシロースの醗酵能を維持できる微生物の開発が必要とされる。
本発明者らは、キシロース醗酵でのエタノール収率を上げる方策として、細胞内のＮＡＤあるいは、ＮＡＤＰＨを増やすことが重要であると考え、ＮＡＤ（Ｈ）キナーゼに着目し、鋭意研究を行った結果、ＮＡＤ（Ｈ）キナーゼ遺伝子を破壊することにより、
ＮＡＤ＋ＡＴＰ→ＮＡＤＰ＋ＡＤＰ
の反応におけるＮＡＤの減少を阻止できることを見い出した。そこで、ＮＡＤキナーゼ遺伝子を破壊した酵母株を作製し、当該酵母株でキシロースの醗酵を行ったところ、野生型の同一株と比べてエタノール収率が向上することが判明した。
本願発明は、上記知見に基づくものである。
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］  ＮＡＤキナーゼ遺伝子の発現機能を喪失させた微生物。
［２］  前記ＮＡＤキナーゼ遺伝子がＵＴＲ１遺伝子、ＹＥＦ１遺伝子から選択される少なくとも１つのものである、前記［１］に記載の微生物。
［３］  さらにＦＰＳ１遺伝子の発現機能が喪失した、前記［１］又は［２］に記載の微生物。
［４］  酵母である、前記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の微生物。
［５］  サッカロミセス・セレビシエである、前記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の微生物。
［６］  キシロース代謝酵素遺伝子が導入された、前記［１］〜［５］のいずれか１つに記載の微生物。
［７］  前記キシロース代謝酵素遺伝子が、キシロース還元酵素遺伝子、キシリトール脱水素酵素遺伝子及びキシルロースリン酸化酵素遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つのものである、前記［６］に記載の微生物。
［８］  ＮＡＤキナーゼ遺伝子の発現機能を喪失させることにより、キシロース醗酵能力の増加した微生物を作製する方法。
［９］  前記ＮＡＤキナーゼ遺伝子がＵＴＲ１遺伝子、ＹＥＦ１遺伝子から選択される少なくとも１つのものである、前記［８］に記載の方法。
［１０］  さらにＦＰＳ１遺伝子の発現機能を喪失させる工程を含む、前記［８］又は［９］に記載の方法。
［１１］  前記微生物が酵母である、前記［８］〜［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１２］  前記微生物がサッカロミセス・セレビシエである、前記［８］〜［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１３］  前記微生物がキシロース代謝酵素遺伝子が導入されたものである、前記［８］〜［１２］のいずれか１つに記載の方法。
［１４］  前記キシロース代謝酵素遺伝子が、キシロース還元酵素遺伝子、キシリトール脱水素酵素遺伝子及びキシルロースリン酸化酵素遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つのものである、前記［１３］に記載の方法。
［１５］  前記［１］〜［７］のいずれか１つに記載の微生物と、キシロース含有原料とを接触させる工程を含む、エタノールの製造方法。
［１６］  ＦＰＳ１遺伝子の発現機能を喪失させた微生物。
［１７］  酵母である、前記［１６］に記載の微生物。
［１８］  サッカロミセス・セレビシエである、前記［１６］に記載の微生物。
［１９］  キシロース代謝酵素遺伝子が導入された、前記［１６］〜［１８］のいずれか１つに記載の微生物。
［２０］  前記キシロース代謝酵素遺伝子が、キシロース還元酵素遺伝子、キシリトール脱水素酵素遺伝子及びキシルロースリン酸化酵素遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つのものである、前記［１９］に記載の微生物。
［２１］  ＦＰＳ１遺伝子の発現機能を喪失させることにより、キシロース醗酵能力の増加した微生物を作製する方法。
［２２］  前記微生物が酵母である、前記［２１］に記載の方法。
［２３］  前記微生物がサッカロミセス・セレビシエである、前記［２１］に記載の方法。
［２４］  前記微生物がキシロース代謝酵素遺伝子が導入されたものである、前記［２１］〜［２３］のいずれか１つに記載の方法。
［２５］  前記キシロース代謝酵素遺伝子が、キシロース還元酵素遺伝子、キシリトール脱水素酵素遺伝子及びキシルロースリン酸化酵素遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つのものである、前記［２４］に記載の方法。
［２６］  前記［１６］〜［２０］のいずれか１つに記載の微生物と、キシロース含有原料とを接触させる工程を含む、エタノールの製造方法。
本発明により、優れたキシロース醗酵能を有する微生物が提供される。また、本発明の微生物は、スモールスケールであっても、撹拌を伴うラージスケールであっても、高いキシロース醗酵能を示す。また、本発明の微生物は、連醸醗酵等の長期醗酵に用いた場合であっても、キシロース醗酵能を高レベルで維持することが可能である。また、本発明の微生物の作製方法を用いることにより、広範囲な微生物を宿主として、同様に高いキシロース醗酵能を有する育種を作成することができる。本発明の微生物を用いることにより、キシロース含有原料から効率よくエタノールを製造することができる。また、本発明の微生物を用いると、キシロースを含む原料である限り、例えアミノ酸含有量の低いバイオマスを原料とした場合でも、効率よくエタノールを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
図１：  グルコース及びキシロースの代謝経路を示す図である。
図２：  実施例で用いたプラスミドｐＥＮＴＵＴＲ１の略図である。
図３：  実施例で用いたプラスミドｐＥＮＴＹＥＦ１の略図である。
図４：  実施例で用いたプラスミドｐＹＲＧＦＬＰの略図である。
図５：  実施例で用いたプラスミドｐＹＲＮＦＬＰの略図である。
図６：  実施例で用いたプラスミドｐＥＮＴＵＴＲ１Ｇの略図である。
図７：  実施例で用いたプラスミドｐＥＮＴＹＥＦ１Ｎの略図である。
図８：  本発明の微生物を用いたキシロース醗酵試験の結果を示す（培地：
2012115277.tif 000003
は「ＵＴＲ１遺伝子破壊」を示す。
図９：  本発明の微生物を用いたキシロース醗酵試験の結果を示す（培地：
2012115277.tif 000004
は「ＵＴＲ１遺伝子破壊」を示す。
図１０：  本発明の微生物を用いたキシロース醗酵試験の結果を示す（培地：
2012115277.tif 000005
図１１：  本発明の微生物を用いたキシロース醗酵試験の結果を示す（培地：
2012115277.tif 000006
す。
図１２：  本発明の微生物を用いたキシロース醗酵試験の結果を示す（培地：
2012115277.tif 000007
図１３：  本発明の微生物を用いたキシロース醗酵試験の結果を示す（培地：
2012115277.tif 000008
す。
図１４：  本発明の微生物を用いたキシロース醗酵試験の結果を示す（培地：
2012115277.tif 000009
図１５：  本発明の微生物を用いたキシロース醗酵試験の結果を示す（培地：
2012115277.tif 000010
示す。
図１６：  本発明の微生物を用いたキシロース醗酵試験の結果を示す（培地：
2012115277.tif 000011
遺伝子破壊」を示す。
図１７：  本発明の微生物を用いたキシロース醗酵試験の結果を示す（培地：
2012115277.tif 000012
遺伝子破壊」を示す。
図１８：  本発明の微生物を用いたキシロース醗酵試験の結果を示す（キシリトール生成量、培地：ＣＳＬＸ、宿主：ＨＨ４７２、４５ｍＬスケール、４８時間後）。図
2012115277.tif 000013
図１９：  本発明の微生物を用いたキシロース醗酵試験の結果を示す（グリセロール生成量、培地：ＣＳＬＸ、宿主：ＨＨ４７２、４５ｍＬスケール、４８時間後）。図
2012115277.tif 000014
図２０：  本発明の微生物を用いたキシロース連続醗酵試験の結果を示す（培
2012115277.tif 000015
を示す。
図２１：  本発明の微生物を用いたキシロース連続醗酵試験の結果を示す（キ
2012115277.tif 000016
「ＵＴＲ１遺伝子破壊」を示す。
図２２：  本発明の微生物を用いたキシロース連続醗酵試験の結果を示す（キ
2012115277.tif 000017
は「ＵＴＲ１遺伝子破壊」を示す。
図２３：  本発明の微生物を用いたキシロース連続醗酵試験の結果を示す（グ
2012115277.tif 000018
は「ＵＴＲ１遺伝子破壊」を示す。
図２４：  本発明の微生物を用いたキシロース醗酵試験（２）の結果を示す（培
2012115277.tif 000019
遺伝子破壊」及び「ＹＥＦ１遺伝子破壊」を示す。
図２５：  本発明の微生物を用いたキシロース醗酵試験（２）の結果を示す（培
2012115277.tif 000020
れ「ＵＴＲ１遺伝子破壊」及び「ＹＥＦ１遺伝子破壊」を示す。
図２６：  実施例で用いたプラスミドｐＣＲ４ＦＰＳ１の略図である。
図２７：  実施例で用いたプラスミドｐＹＲ−ＡＦＬＰの略図である。
図２８：  実施例で用いたプラスミドｐＣＲ４ＦＰＳ１ＡＵＲの略図である。
図２９：  本発明の微生物を用いたキシロース醗酵試験の結果を示す（培地：
2012115277.tif 000021
破壊」、「ＹＥＦ１遺伝子破壊」を示す。
図３０：  本発明の微生物を用いたキシロース醗酵試験の結果を示す（培地：
2012115277.tif 000022
ぞれ「ＦＰＳ１遺伝子破壊」、「ＵＴＲ１遺伝子破壊」、「ＹＥＦ１遺伝子破壊」を示す。
図３１：  本発明の微生物を用いた醗酵試験の結果を示す（培地：ＹＰＤ、宿
2012115277.tif 000023
遺伝子破壊」を示す。
図３２：  本発明の微生物を用いた醗酵試験の結果を示す（培地：ＹＰＤ、宿
2012115277.tif 000024
遺伝子破壊」、「ＵＴＲ１遺伝子破壊」、「ＹＥＦ１遺伝子破壊」を示す。
図３３：  本発明の微生物を用いたキシロース醗酵試験（５０ｍｌスケール）の
2012115277.tif 000025
はそれぞれ「ＦＰＳ１遺伝子破壊」、「ＵＴＲ１遺伝子破壊」、「ＹＥＦ１遺伝子破壊」を示す。
図３４：  本発明の微生物を用いたキシロース醗酵試験（５０ｍｌスケール）の
2012115277.tif 000026
はそれぞれ「ＦＰＳ１遺伝子破壊」、「ＵＴＲ１遺伝子破壊」、「ＹＥＦ１遺伝子破壊」を示す。
図３５：  本発明の微生物を用いたキシロース醗酵試験（５０ｍｌスケール）の
2012115277.tif 000027
はそれぞれ「ＦＰＳ１遺伝子破壊」、「ＵＴＲ１遺伝子破壊」、「ＹＥＦ１遺伝子破壊」を示す。
図３６：  本発明の微生物を用いたキシロース醗酵試験（５０ｍｌスケール）の
2012115277.tif 000028
はそれぞれ「ＦＰＳ１遺伝子破壊」、「ＵＴＲ１遺伝子破壊」、「ＹＥＦ１遺伝子破壊」を示す。
図３７：  本発明の微生物を用いたキシロース醗酵試験（５０ｍｌスケール）の
2012115277.tif 000029
はそれぞれ「ＦＰＳ１遺伝子破壊」、「ＵＴＲ１遺伝子破壊」、「ＹＥＦ１遺伝子破壊」を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１１年２月２５日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１１−０４０６５１号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
本発明者らは、ＮＡＤキナーゼ遺伝子の発現を抑制した微生物株を用いた場合、野生型同種株と比べて、キシロース含有原料からのエタノール生産効率が向上することを見出し、本発明を完成させた。さらに、グリセロールチャネルの遺伝子発現を抑制した場合、キシロース含有原料からのエタノール生産効率がより向上することを見出した。以下において、本願発明の各実施態様を記載する。
１．ＮＡＤキナーゼ遺伝子機能喪失微生物
本発明は、ある実施態様において、ＮＡＤキナーゼ遺伝子の発現機能を喪失させた、微生物を提供する。
本発明において「微生物」とは、肉眼でその存在が判別できず、顕微鏡などによって観察できる程度以下の大きさの生物を意味する。微生物の例としては、細菌、藍色細菌、古細菌等の原核生物、並びに糸状菌、酵母、変形菌、担子菌、単細胞性の藻類及び原生動物等の真核生物が挙げられる。
好ましくは、微生物は、糖に対する醗酵能を有する種であり、より好ましくは、酵母である。酵母は、出芽酵母又は分裂酵母のいずれであってもよい。ある実施態様では、酵母は、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１９５１、ＮＢＲＣ１９５２、ＮＢＲＣ１９５３、ＮＢＲＣ１９５４、Ｘ２１８０−１Ａ（ＡＴＣＣ２６７８６）、ＣＢ１１（Ｂｅｒｋｌｅｙ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ）、Ｗ３０３−１Ａ（ＢＹ４８４８）等の出芽酵母であってもよい。別の実施態様では、酵母は、シゾサッカロマイセス・ジャポニクス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（Ｈａｓｅｇａｗａｅａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ））、シゾサッカロマイセス・オクトスポルス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ（Ｏｃｔｏｓｐｏｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ））及びシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等の分裂酵母であってもよい。
本発明において「ＮＡＤキナーゼ遺伝子」とは、ＮＡＤキナーゼタンパク質をコードする遺伝子を意味し、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれであってもよい。ＮＡＤキナーゼとは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）にリン酸を付加して、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）に変換する活性（以下、「ＮＡＤキナーゼ活性」）を有する酵素である（Ｍａｇｎｉ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｍｉｎｉ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６（７）：７３９−４６）。
本明細書中で使用される場合、「ＮＡＤキナーゼ遺伝子」はサッカロマイセス・セレビシエ由来のＮＡＤキナーゼタンパク質（配列番号２又は４）をコードする遺伝子（配列番号１又は３）に限定されず、ＮＡＤキナーゼ活性を示す、ＮＡＤキナーゼと同じファミリーに属するホモログタンパク質をコードする遺伝子でもよい。ＮＡＤキナーゼと同じファミリーに属するタンパク質は多くの植物において見出されており、ファミリー内全体で高度に保存されている。ＮＡＤキナーゼは、細胞代謝に重要な酵素であるため、その遺伝子はファミリー内全体で高度に保存されており、複数の微生物のＮＡＤキナーゼ又はそのホモログタンパク質の遺伝子については既に塩基配列が解析され、その配列情報がデータベースに登録されている（表１参照）。
【表１】
2012115277.tif 000030
サッカロマイセス・セレビシエを用いて本発明の微生物を作製する場合、ＮＡＤキナーゼ遺伝子は、好ましくはＵＴＲ１遺伝子（配列番号１）およびＹＥＦ１遺伝子（配列番号３）である。
一実施形態において、ＮＡＤキナーゼ遺伝子は、ＮＡＤキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列において１または複数個の塩基が欠失、挿入、置換、または付加された変異体であってもよい。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的または非保存的なアミノ酸の欠失、挿入、置換および／または付加を生成し得る。本明細書中で使用される場合、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列をコードする遺伝子、または当該アミノ酸配列において１もしくは複数個（例えば、１〜４０個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個など）または１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子もまた、「ＮＡＤキナーゼ遺伝子」に包含される。
本発明において、「ＮＡＤキナーゼ遺伝子の発現機能を喪失させた」とは、ＮＡＤキナーゼ遺伝子から本来の酵素機能を有するＮＡＤキナーゼが発現されないことを意味する。このような状態の例としては、ＮＡＤキナーゼ遺伝子の発現産物が全く生成されない状態だけでなく、当該遺伝子の発現産物（例えば、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はタンパク質）は発現されるが、それら発現産物が本来の正常な機能を有しない状態が挙げられる。このようなＮＡＤキナーゼ遺伝子の機能喪失は、ＮＡＤキナーゼ遺伝子又はその転写調節領域若しくはプロモーター領域を含む発現制御領域上における１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、及び／又は挿入等によって生じさせることができる。なお、前記欠失、置換、及び／又は挿入を行う部位や、欠失、置換、及び／又は挿入される配列は、ＮＡＤキナーゼ遺伝子の正常な機能が喪失しうる限り、特に限定されないが、好ましくは、ＮＡＤキナーゼの酵素活性部位をコードする遺伝子配列の少なくとも１つが欠失していることが好ましい。
本発明の微生物は、特に真核生物の場合、前記ＮＡＤキナーゼの発現機能が、染色体上の少なくとも一方のアレル（ヘテロ接合型）で喪失していれば効果がある場合もあるが、好ましくは、両アレルで喪失していること（ホモ接合型）が好ましい。
また、本発明の微生物は、ＮＡＤキナーゼ遺伝子に加えて、あるいは、単独でＦＰＳ１遺伝子が機能を喪失していてもよい。
本明細書中で使用される場合、「ＦＰＳ１遺伝子」はサッカロマイセス・セレビシエ由来のＦＰＳ１タンパク質（配列番号２４）をコードする遺伝子（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ：ＹＬＬ０４３Ｗ、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ：ＮＭ＿００１１８１８６３．１、配列番号２３）に限定されず、グリセロールチャネルとしての機能を発揮するタンパク質をコードする遺伝子でもよい。
一実施形態において、配列番号２４のアミノ酸配列をコードする遺伝子、または当該アミノ酸配列において１もしくは複数個（例えば、１〜４０個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個など）または１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子もまた、「ＦＰＳ１遺伝子」に包含される。
本発明において、「ＦＰＳ１遺伝子の発現機能を喪失させた」とは、ＦＰＳ１遺伝子から本来の酵素機能を有するＦＰＳ１タンパク質が発現されないことを意味する。このような状態の例としては、ＦＰＳ１遺伝子の発現産物が全く生成されない状態だけでなく、当該遺伝子の発現産物（例えば、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はタンパク質）は発現されるが、それら発現産物が本来のグリセロールチャネルとしての機能を有しない状態が挙げられる。このようなＦＰＳ１遺伝子の機能喪失は、ＦＰＳ１遺伝子又はその転写調節領域若しくはプロモーター領域を含む発現制御領域上における１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、及び／又は挿入等によって生じさせることができる。なお、前記欠失、置換、及び／又は挿入を行う部位や、欠失、置換、及び／又は挿入される配列は、ＦＰＳ１遺伝子のグリセロールチャネルとしての機能が喪失しうる限り、特に限定されないが、好ましくは、ＦＰＳ１タンパク質の活性部位をコードする遺伝子配列の少なくとも１つが欠失していることが好ましい。
本発明の微生物は、特に真核生物の場合、前記ＦＰＳ１の発現機能が、染色体上の少なくとも一方のアレル（ヘテロ接合型）で喪失していれば効果がある場合もあるが、好ましくは、両アレルで喪失していること（ホモ接合型）が好ましい。
２．キシロース醗酵能力の増加した醗酵微生物を作製する方法
本発明は、宿主微生物のＮＡＤキナーゼ遺伝子の発現機能を喪失させることにより、キシロース醗酵能力の増加した醗酵微生物を作製する方法を提供する。
また、上記方法は、さらにＦＰＳ１遺伝子の発現機能を喪失させる工程を含んでいてもよい。あるいは、宿主微生物のＮＡＤキナーゼ遺伝子の発現機能を喪失させることなく、単独でＦＰＳ１遺伝子の発現機能を喪失させることにより、キシロース醗酵能力の増加した醗酵微生物を作製することも可能である。
ＮＡＤキナーゼ遺伝子又はＦＰＳ１遺伝子の発現機能を喪失させる方法としては、ジーンターゲティング又はＲＮＡｉ等のノックアウト又はノックダウン技術が挙げられる。
（１）ジーンターゲティング
ジーンターゲティングは、相同組換えを利用して染色体上の特定遺伝子に変異を導入する手法である（Ｃａｐｅｃｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２８８−１２９２，１９８９）。
まず、ＮＡＤキナーゼ遺伝子又はＦＰＳ１遺伝子の機能を喪失させるためのターゲティングベクターを構築する。ターゲティングベクターを構築するに当たり、対象動物のゲノムＤＮＡライブラリーを調製する。このゲノムＤＮＡライブラリーは、多型等により組換え頻度が低下しないよう、ジーンターゲティングの対象となる微生物種と同系統の微生物、好ましくは、同種の微生物に由来するゲノムＤＮＡから作製したライブラリーを用いることが好ましい。そのようなライブラリーとしては、市販のものを用いてもよい。あるいは、ＮＡＤキナーゼ又はＦＰＳ１のｃＤＮＡ若しくはその部分配列をプローブとしてスクリーニングを行い、ＮＡＤキナーゼ又はＦＰＳ１のゲノム遺伝子のＤＮＡ配列をクローニングしてもよく、あるいは、ＮＡＤキナーゼ又はＦＰＳ１のｃＤＮＡ若しくはその部分配列に基づいてプライマーを作成し、ゲノムのＮＡＤキナーゼ遺伝子又はＦＰＳ１遺伝子をＰＣＲ増幅することにより調製することができる。ゲノムＤＮＡライブラリーの調製方法の詳細については、以下を参照できる。”Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１”、”Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９８７−１９９７”
次に、クローニングされたゲノムＤＮＡを、シークエンシング、サザンブロッティング、制限酵素消化等によって解析してエクソン（真核生物の場合）の位置及び制限酵素サイトを同定する。このような解析により得られた配列情報を基に変異導入部位等を決定する。
本発明において、染色体上に導入する変異（欠失、置換、及び／又は挿入）はＮＡＤキナーゼ遺伝子又はＦＰＳ１遺伝子の正常な機能が損なわれる限り特に限定されず、これらの変異は、ＮＡＤキナーゼ遺伝子又はＦＰＳ１遺伝子のイントロン領域、エクソン領域あるいはＮＡＤキナーゼ遺伝子又はＦＰＳ１遺伝子の発現制御領域に存在していてよい。前記変異は、ＮＡＤキナーゼ遺伝子又はＦＰＳ１遺伝子のエクソン領域に存在することが好ましく、さらに好ましくは、ＮＡＤキナーゼ遺伝子又はＦＰＳ１遺伝子の少なくとも１つのエクソンが欠失した変異、最も好ましくは全てのエクソンが欠失した変異である。このような変異であれば、確実にＮＡＤキナーゼ遺伝子又はＦＰＳ１遺伝子の機能を欠損させることができるからである。
ターゲティングベクターは、変異導入部位の３’及び５’側の相同領域（それぞれ３’アーム及び５’アーム）に加え、組み換え体のセレクション用の選択マーカーを含んでいてもよい。選択マーカーの例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等のポジティブセレクションマーカー、ＬａｃＺ、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）及びルシフェラーゼ遺伝子などの破壊対象遺伝子の発現レポーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）、ジフテリア毒素Ａフラグメント（ＤＴＡ）等のネガティブセレクションマーカー等が挙げられる。特に、本発明は、微生物を宿主とするため、栄養要求性を相補する遺伝子、例えばＵＲＡ３を用いれば、ウラシルを含まない寒天培地でセレクションが可能であり、宿主の栄養要求性によっては、使用が可能である。また、シクロヘキシミドに対する薬剤耐性遺伝子（ＹＡＰ１）を用いれば、シクロヘキシミドを含んだ培地でセレクションを行うことができる。これらのセレクションマーカーを３’アーム及び５’アームの間に挿入した配列を用いることにより、ターゲット遺伝子を破壊することもできる。ベクターは相同領域の外側に、ベクターを直鎖化するための適当な制限酵素切断部位を含んでいてもよい。
図６に、実施例で用いたサッカロマイセス・セレビシエのＵＴＲ１遺伝子のノックアウトに用いたターゲティングベクターの例を示す。このコンストラクトは、ＵＴＲ１タンパク質のＮ末端側及びＣ末端側の各アミノ酸配列をコードするＵＴＲ１ゲノム遺伝子配列をそれぞれ５’アーム（「ＵＴＲ１−Ｎ」）及び３’アーム（「ＵＴＲ１−Ｃ」）とし、５’アームと３’アームとの間にポジティブセレクションマーカーとしてジェネティシン耐性遺伝子（「Ｇ４１８Ｒ」）が挿入されている。
この、ＵＴＲ１−Ｎ−Ｇ４１８Ｒ−ＵＴＲ１−Ｃからなる断片を、制限酵素によりベクターから切り出して精製した後、酵母に形質転換し、相同組換えによりジェネティシン耐性を獲得した株を取得し、さらにＰＣＲにて、ＵＴＲ１遺伝子が破壊されていることを確認する。
このようなターゲティングベクターは、市販のプラスミドベクター（例えば、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）やｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）等）をベースにして構築することができる。
（２）ＲＮＡ干渉
上記以外にも、ＮＡＤキナーゼ遺伝子又はＦＰＳ１遺伝子の発現機能を欠損させる方法として、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）等を用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡｉ）法が挙げられる。ＲＮＡｉは、複数の段階を経て行われるマルチステッププロセスである。最初に、ＲＮＡｉ発現ベクターから発現した二本鎖ＲＮＡ（Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）又はヘアピン状のｓｈＲＮＡ（Ｓｍａｌｌ  Ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）がＤｉｃｅｒによって認識され、２１〜２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡｓに分解される。次に、ｓｉＲＮＡｓはＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＮＡ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ：ＲＩＳＣ）と呼ばれるＲＮＡｉ標的複合体に組み込まれ、ＲＩＳＣとｓｉＲＮＡｓとの複合体がｓｉＲＮＡの配列と相補的な配列を含む標的ｍＲＮＡに結合し、ｍＲＮＡを分解する。標的ｍＲＮＡは、ｓｉＲＮＡに相補的な領域の中央で切断され、最終的に標的ｍＲＮＡが速やかに分解されてタンパク発現量が低下する。最も効力の高いｓｉＲＮＡ二重鎖は、１９ｂｐの二重鎖の各３’末端にウリジン残基２個の突出部分を持つ２１ヌクレオチド長の配列であることが知られている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ，１５，１８８−２００（２００１））。
従って、ＮＡＤキナーゼ遺伝子又はＦＰＳ１遺伝子のノックダウン微生物を得るには、まず、表１に示されるようなＮＡＤキナーゼ遺伝子又はＦＰＳ１遺伝子配列（例えば、配列番号２３）（これらに限定されない）の一部と相補的な配列を含むヌクレオチドを、適切なＲＮＡｉ発現ベクターにｄｓＲＮＡ又はｓｈＲＮＡとして発現可能な状態で挿入してＲＮＡｉベクターを作製する。次に、前記ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体をセレクションすることによりＮＡＤキナーゼ遺伝子又はＦＰＳ１遺伝子のノックダウン微生物を得ることができる。
ｄｓＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの設計及び合成は、市販のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３９４型で行うことも可能であり、あるいは第三者機関（例えば、ＴＡＫＡＲＡ  Ｂｉｏ）に委託することもできる。
ＮＡＤキナーゼ遺伝子又はＦＰＳ１遺伝子の発現機能の喪失は、正常なＮＡＤキナーゼ遺伝子又はＦＰＳ１遺伝子の発現量の低下として確認することができる。ＮＡＤキナーゼ遺伝子又はＦＰＳ１遺伝子の発現量は、本発明の微生物の抽出物を用いたＲＴ−ＰＣＲ法及びアガロースゲル電気泳動、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法、ノーザンブロッティング法、マイクロアレイ解析並びに質量分析法等によって測定することができる。これらの測定方法に用いるプライマー又はプローブは、当該ＮＡＤキナーゼ遺伝子又はＦＰＳ１遺伝子の配列に基づいて設計及び合成することができる。ＮＡＤ遺伝子の発現産物が正常であるかどうかは、当該発現産物の配列解析を行うことにより確認することができる。
本発明の微生物は、ＮＡＤキナーゼ遺伝子又はＦＰＳ１遺伝子の発現機能が喪失していることを特徴とするが、さらに、キシロース代謝酵素遺伝子が発現可能な状態で導入されていてもよい。キシロース代謝酵素遺伝子は、キシロースを分解してエタノールを生成する一連の化学反応のうち、いずれかの反応を触媒する活性（以下、「キシロース代謝活性」）を有するタンパク質（以下、「キシロース代謝酵素」）をコードする遺伝子を意味する。キシロース代謝酵素遺伝子の例としては、キシロース還元酵素遺伝子、キシリトール脱水素酵素遺伝子、キシルロースリン酸化酵素遺伝子が挙げられる。
このようなキシロース代謝酵素遺伝子は、例えば、ピキア・スティピティス、サッカロマイセス・セレビシエ、大腸菌、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・アシドフィラス、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ等に由来するものであってもよい。
本発明の微生物には、前記キシロース代謝酵素のうち、キシロース還元酵素遺伝子、キシリトール脱水素酵素遺伝子又はキシルロースリン酸化酵素遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つが導入されていることが好ましく、これら遺伝子の２つ以上、あるいは、３つ全ての遺伝子が導入されていてもよい。
キシロース還元酵素遺伝子、キシリトール脱水素酵素遺伝子又はキシルロースリン酸化酵素遺伝子の例としては、以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【表２】
2012115277.tif 000031
【表３】
2012115277.tif 000032
【表４】
2012115277.tif 000033
キシロース還元酵素は、キシロース分解において、以下の反応を触媒する酵素である。
Ｘｙｌｏｓｅ＋ＮＡＤＰＨ→Ｘｙｌｉｔｏｌ＋ＮＡＤＰ
キシリトール脱水素酵素は、キシロース分解において、以下の反応を触媒する酵素である。
Ｘｙｌｉｔｏｌ＋ＮＡＤ→Ｘｙｌｕｌｏｓｅ＋ＮＡＤＨ
キシルロースリン酸化酵素は、キシロース分解において、以下の反応を触媒する酵素である。
Ｘｙｌｕｌｏｓｅ＋ＡＴＰ→Ｘｙｌｕｌｏｓｅ−５Ｐ＋ＡＤＰ
一実施形態において、キシロース代謝酵素遺伝子（例えば、キシロース還元酵素、キシリトール脱水素酵素又はキシルロースリン酸化酵素等）は、キシロース代謝活性を有するタンパク質をコードするものである限り、上記キシロース代謝酵素遺伝子の変異体であってもよい。変異体の例としては、上記キシロース代謝酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列において１または複数個の塩基が欠失、挿入、置換、または付加された変異体であってもよい。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的または非保存的なアミノ酸の欠失、挿入、置換および／または付加を生成し得る。本明細書中で使用される場合、配列番号１０、１２又は１４のアミノ酸配列をコードする遺伝子（例えば、配列番号９、１１又は１３）、または当該アミノ酸配列において１もしくは複数個（例えば、１〜４０個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個など）または１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子もまた、「キシロース代謝酵素遺伝子」に包含される。
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸を容易に改変させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を改変させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した改変体が所望の活性を有するか否かを容易に決定し得る。
好ましい改変体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチド活性を変化させない。
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。
上記に挙げられる本発明に係るポリヌクレオチドを使用すれば、形質転換体または細胞においてキシロース代謝酵素活性を有するポリペプチドを合成することができる。
キシロース代謝酵素遺伝子は、宿主細胞において発現可能な発現ベクターに組み込まれた状態で、導入されることが好ましい。発現ベクターは、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の要素を含みうる。
（ｉ）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；
（ｉｉ）該プロモーターに結合した、キシロース代謝酵素遺伝子；及び
（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
を含むように構成される。
このようなベクターとしては、例えば、ｐＹＥ２２ｍ（酵母用：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，１２２１−１２２８，１９９５）、ＹＣｐ５０（酵母用：Ｘ７０２７６）、ＹＩｐ１（酵母用：Ｘ７０４８０）が挙げられる。
宿主細胞中での遺伝子発現を調節するためのプロモーター／ターミネーターとしては、宿主細胞中で機能する限り、任意の組み合わせでよい。例えば、酵母で利用する場合はＴＤＨ３ｐ、ＰＹＫ１ｐ、ＰＧＫ、ＧＡＰ、ＴＰＩ、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ２、ＰＨＯ５、ＣＵＰ１、ＭＦα１等のプロモーターを用いることができるが、これに限定されるものではない。構成的高発現プロモーターとしては、ＴＤＨ３、ＴＰＩ１、ＰＧＫ１、ＰＧＩ１、ＰＹＫ１、ＡＤＨ１等のプロモーターを使用することができる。
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、栄養要求性マーカー（ＵＲＡ３、ＬＥＵ２）、薬剤耐性マーカー（ハイグロマイシン耐性、ジェネチシン耐性）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Ｍａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，３３７  １９８４）、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ，ＰＤＲ４）（それぞれ猪腰淳嗣ら，生化学，６４，６６０，１９９２；Ｈｕｓｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｇｅｎｅ，１０１，１４９，１９９１）等が利用可能である。
宿主細胞の形質転換方法としては、一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、原核生物の場合、エレクトロポレーション法（Ｍａｃｋｅｎｘｉｅ  Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６，４６５５−４６６１，２０００）やヒートショック法が利用できる。また、酵母の場合は、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５  ｐ１９２９（１９７８））、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，ｐ１６３（１９８３））、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５  ｐ１９２９（１９７８）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００  Ｅｄｉｔｉｏｎ：Ａ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ等に記載の方法で実施可能であるが、これらに限定されない。
その他、一般的なクローニング技術に関しては、″Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１″、″Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）″等を参照することができる。
３．エタノールの製造方法
上記のようにして作製された本発明の微生物は、同種の野生型微生物と比べて、キシロース醗酵能が増加している。ここで、キシロース醗酵とは、キシロースを資化することにより、エタノールを生成することを意味する。即ち、キシロース醗酵とは、キシロースからのエタノール醗酵を意味する。また、エタノール醗酵とは、醗酵過程を通じてエタノールを生成する反応を意味する。
したがって、本発明の微生物をキシロース含有原料の存在下で培養した場合、同種の野生型微生物を同一条件下で培養した場合よりも、副生成物であるｘｙｌｉｔｏｌとｇｌｙｃｅｒｏｌの生成量が減少し、その結果としてより多くのエタノールが生成される。
このことから、本発明は、別の実施態様において、本発明の微生物と、キシロース含有原料とを接触させる工程を含む、エタノールの製造方法を提供する。
本発明の微生物とキシロース含有材料とを接触させる工程は、本発明の微生物と、キシロース含有材料とを混合することにより達成できる。好ましくは、本発明の微生物は、活性な状態でキシロース含有材料と接触させる。
本発明の微生物を活性な状態でキシロース含有材料と接触させる方法の例としては、本発明の微生物が増殖可能な培養条件において、かつ、キシロース含有原料の存在下で、本発明の微生物を培養する方法が挙げられる。このような、培養条件は、微生物種によって異なるが、例えば、酵母であれば、キシロース含有原料を添加したＹＰＤ培地（イーストエキストラクト１０ｇ／Ｌ、ポリペプトン２０ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ）、ＳＸ培地（キシロース５０ｇ／ｌ、６．７ｇ／ｌ  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅアミノ酸抜き、アデニン２０ｍｇ／ｌ、ヒスティディン２０ｍｇ／ｌ、ロイシン１００ｍｇ／ｌ、トリプトファン２０ｍｇ／ｌ）等の適切な培地中で３０℃にて培養することができる。
あるいは、本発明の微生物は、キシロース含有原料の存在下で培養を行う前に、本発明の微生物が増殖可能な培養条件において培養して菌体を増殖させ、その後、キシロース含有原料の存在下で、本発明の微生物を用いて醗酵を行なってもよい。
但し、培養条件は、上記に限定されるものではない。当業者であれば、適宜、微生物種に応じた適切な培養条件を選択し、実際に培養を行うことができる。
キシロースの醗酵能は、本発明の微生物とキシロース含有原料とを接触させ、一定時間が経過した後に系のエタノール生成量を測定することにより確認することができる。
また、キシロース醗酵能は、キシロース資化量に対するエタノール収率としても測定することができる。キシロース資化量に対するエタノール収率は、以下のように計算できる。
まず、キシロース（Ｃ５Ｈ１０Ｏ５）からのエタノール（Ｃ２Ｈ５ＯＨ）生成は、下記の反応式で表される。
６Ｃ５Ｈ１０Ｏ５→１０Ｃ２Ｈ５ＯＨ＋１０ＣＯ２＋１０ＡＴＰ
この反応式並びにキシロース分子量（１５０）及びエタノール分子量（４６）から、キシロース資化量とエタノール生成量との間に、以下の式で表される関係が成り立つ。
エタノール生成量＝キシロース資化量ｘ｛（１０ｘ４６）／（６ｘ１５０）｝
そこで、「キシロース資化量ｘ｛（１０ｘ４６）／（６ｘ１５０）｝＝キシロース資化量ｘ０．５１」の量のエタノールが生成された場合を、１００％のエタノール収率と定めることができる。
キシロース資化量及びエタノール生成量は、本発明の微生物とキシロース含有原料とを含む醗酵系の成分を、高速液体クロマトグラフィー等の公知の分析手法によって分析することにより、容易に測定することができる。
「キシロース含有原料」は、キシロースを含む原料であれば、特に限定されないが、好ましくは、キシロースを含む生物由来の原料、即ち、「キシロース含有バイオマス」である。バイオマスは、日本国農林水産省が発行した「バイオマス・ニッポン総合戦略」において、「再生可能な、生物由来の有機性資源で化石資源を除いたもの」と定義されている。
よって、この定義に基づき、「キシロース含有バイオマス」は、「再生可能な、生物由来の有機性資源で化石資源を除いたものであって、キシロースを含むもの」と定義することができる。
キシロース含有バイオマスの具体例としては、サトウキビ、トウモロコシ、テンサイ、ジャガイモ、サツマイモ、麦、モロコシ（＝こうりゃん）、ソルガムなどの非可食部や、廃木材、パルプ廃液、バガス、もみ殻、コーンコブ、稲ワラ、スイッチグラス、エリアンサス、ネピアグラスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【０００７】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。
試験方法：
本実施例で用いた試験項目および試験方法を以下に示す。特に断りのない限り、本実施例における試験方法はこれに準じた。
＜ＵＴＲ１およびＹＥＦ１遺伝子の取得＞
酵母サッカロミセス・セレビシエのＵＴＲ１遺伝子は既にクローニングされており、その塩基配列が報告されている（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ登録番号：ＹＪＲ０４９Ｃ）。また、酵母サッカロミセス・セレビシエのＹＥＦ１遺伝子も既にクローニングされており、その塩基配列はＧｅｎｂａｎｋに登録されている（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１１７８８５６）。従って、ＵＴＲ１遺伝子（ゲノム配列：配列番号１）及びＹＥＦ１遺伝子（ゲノム配列：配列番号３）は、その塩基配列情報をもとに、それぞれの遺伝子を持つ、酵母サッカロミセス・セレビシエから調製した染色体ＤＮＡをＰＣＲの鋳型に使用して、ＰＣＲによって増幅、単離することにより得ることができる。具体的に本実施例では、酵母サッカロミセス・セレビシエＸ２１８０−１Ａ（ＡＴＣＣ２６７８６）（ＭＡＴａ  ＳＵＣ２  ｍａｌ  ｍｅｌ  ｇａｌ２  ＣＵＰ１）の染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマーＵＴＲ１Ｆ１とＵＴＲ１Ｒ１を用いてＵＴＲ１を、プライマーＹＥＦ１Ｆ１とＹＥＦ１Ｒ１を用いてＹＥＦ１を、ＰＣＲによって取得した。取得したＤＮＡ断片は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＥＮＴＲＴＭ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔｓを用いて、ベクター、ｐＥＮＴＲＴＭ／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）に挿入し、プラスミドｐＥＮＴＵＴＲ１（図２）あるいはｐＥＮＴＹＥＦ１（図３）を得た。ＤＮＡシークエンスにより挿入した両遺伝子の配列を確認した。両遺伝子の取得のために用いる染色体ＤＮＡは、上記に示した株に限定するものではなく、サッカロミセス・セレビシエに属する酵母であればいずれの酵母から調製されたものであってもよい。染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲによる目的遺伝子の増幅およびその後の単離は、ＰＣＲプライマーの調製を含め、当業者に周知な方法で行うことができる。
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＜ＰＣＲのための鋳型ＤＮＡ調製方法＞
酵母細胞を５０μｌのＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１２５ｍｇ／ｍｌ  ザイモリアーゼ１００Ｔ、１Ｍ  ソルビトール、４０ｍＭ  リン酸カリウムバッファーｐＨ６．８、１ｍＭ  ジチオスレイトール）に懸濁した。３０℃で１時間インキュベートした後、プロテアーゼＥ  １ｍｇ／ｍｌを５μｌ加え、さらに５５℃で２０分、９９℃で１０分インキュベートした。１５，０００ｒｐｍで１０分遠心を行い、上清を鋳型ＤＮＡとした。
＜ＵＴＲ１あるいはＹＥＦ１遺伝子破壊のためのユニットの作製＞
ＵＴＲ１遺伝子を破壊するために、ｐＥＮＴＵＴＲ１のＵＴＲ１遺伝子をＢｓａＡＩとＦｓｐＩを用いて切断し、そこにプラスミドｐＹＲＧＦＬＰ（図４）よりＰｍｅＩで切り出した、Ｇ４１８耐性マーカー遺伝子（ＰＧＫ１ｐ：：ＫａｎＭＸ）を挿入し、プラスミドｐＥＮＴＵＴＲ１Ｇ（図６）を得た。ＹＥＦ１遺伝子破壊を破壊するためには、ｐＥＮＹＥＦ１のＹＥＦ１遺伝子をＢｓｔＥＩＩとＳｔｕＩを用いて切断し、そこにプラスミドｐＹＲＮＦＬＰ（図５）よりＰｍｅＩで切り出した、Ｎａｔ耐性マーカー遺伝子（ＴＥＦ１ｐ：：Ｎａｔ）を挿入し、プラスミドｐＥＮＴＹＥＦ１Ｎ（図７）を得た。このｐＥＮＴＵＴＲ１ＧあるいはｐＥＮＴＹＥＦ１ＮをＰｍｅＩで切断し、アガロースゲル電気泳動を行い、約３．３ｋｂｐ（ＵＴＲ１のＮ末とＣ末の部分配列を持ち、中央にＧ４１８耐性マーカー遺伝子（ＰＧＫ１ｐ：：ＫａｎＭＸ）を含む）あるいは、約２．１ｋｂｐ（ＹＥＦ１のＮ末とＣ末の部分配列を持ち、中央にＮａｔ耐性マーカー遺伝子（ＴＥＦ１ｐ：：Ｎａｔ）を含む）のＤＮＡ断片を、それぞれアガロースゲルから切り出した。ゲルよりＤＮＡ断片を精製抽出した。精製抽出はｉｌｌｕｓｔｒａＴＭ  ＧＦＸＴＭ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用い、マニュアルに従って行った。
＜酵母株＞
本発明においては、ＵＴＲ１の取得にはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｘ２１８０−１Ａ株を、ＵＴＲ１破壊株の育種には、ＨＨ４６７，４６８，４７２，４７３株を用いた。ＹＥＦ１破壊株の育種には、ＨＨ４７２株を用いた。どの株にも、Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓのキシロース還元酵素遺伝子（ＸＹＬ１：、配列番号９）とキシリトール脱水素酵素遺伝子（ＸＹＬ２：配列番号１１）とＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのキシルロースリン酸化酵素遺伝子（ＸＫＳ１：配列番号１３）の発現ユニットを遺伝子型に示したようなプロモーター制御下で、染色体のある領域に組み込まれている株を用いたが、これに限定するものではない。
（１）  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｘ２１８０−１Ａ（ＡＴＣＣ２６７８６）（ＭＡＴａ  ＳＵＣ２  ｍａｌ  ｍｅｌ  ｇａｌ２  ＣＵＰ１）
（２）  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＨ４６７（ＭＡＴａ  ｌｅｕ２−３，１１２  ｔｒｐ１−１  ｈｉｓ３−１１，１５  ａｄｅ２−１  ｃａｎ１−１００          ｒａｄ５−５３５  ｕｒａ３−１：：ＵＲＡ３：：ＴＤＨ３ｐ：：ＸＹＬ１：：ＴＤＨ３ｐ：：ＸＹＬ２：：ＴＤＨ３ｐ：：ＸＫＳ１）
（３）  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＨ４６８（ＭＡＴａ  ａｄｅ１  ＭＡＬ６１  ＭＡＬ６２  ＭＡＬ６３  ＡＧＴ１  ＭＡＬ１２  ＭＡＬ３１  ＭＡＬ３２  ｕｒａ３：
：ＵＲＡ３：：ＴＤＨ３ｐ：：ＸＹＬ１：：ＴＤＨ３ｐ：：ＸＹＬ２：：ＴＤＨ３ｐ：：ＸＫＳ１）
（４）  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＨ４７２（ＭＡＴａ  ＳＵＣ２  ｍａｌ  ｍｅｌ  ｇａｌ２  ＣＵＰ１  ＧＡＴＩ：：ＴＤＨ３ｐ：：ＸＹＬ１：：ＰＹＫ１ｐ：
：ＸＹＬ２：：ＴＰＩ１ｐ：：ＸＫＳ１）
（５）  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＨ４７３（ＭＡＴａ  ＳＵＣ２  ｍａｌ  ｍｅｌ  ｇａｌ２  ＣＵＰ１  ＹＣＴ１：：ＴＤＨ３ｐ：：ＸＹＬ１：：ＰＹＫ１ｐ：
：ＸＹＬ２：：ＴＰＩ１ｐ：：ＸＫＳ１）
（６）  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＢ１１（Ｂｅｒｋｌｅｙ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ）（ＭＡＴａ  ａｄｅ１  ＭＡＬ６１  ＭＡＬ６２  ＭＡＬ６３  ＡＧＴ１  ＭＡＬ１２  ＭＡＬ３１  ＭＡＬ３２）
（７）  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３−１Ａ（ＢＹ４８４８）（ＭＡＴａ ｕｒａ３−１  ｌｅｕ２−３，１１２  ｔｒｐ１−１  ｈｉｓ３−１１，１５  ａｄｅ２−１  ｃａｎ１−１００  ｒａｄ５−５３５）
上記の株のうち、（６）はＨＨ４６８の親株であり、（７）はＨＨ４６７の親株であり、共に市販されている（（６）：工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌条第４１９８号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４１９８）、（７）：ＮＢＲＰ  ＩＤ  Ｎｏ．ＢＹ４８４８）。また、（１）はＨＨ４７２及びＨＨ４７３の親株であり、市販されている（ＡＴＣＣ  ＩＤ  Ｎｏ．ＡＴＣＣ２６７８６）。各株には遺伝子型を併記している。
＜ＵＴＲ１あるいはＹＥＦ１遺伝子破壊株の育種＞
調製した約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片（ＵＴＲ１のＮ末とＣ末の部分配列を持ち、中央にジェネティシン耐性遺伝子（ＰＧＫ１ｐ：：ＫａｎＭＸ）を含む）、あるいは、約２．１ｋｂｐ（ＹＥＦ１のＮ末とＣ末の部分配列を持ち、中央にＮａｔ耐性マーカー遺伝子（ＴＥＦ１ｐ：：Ｎａｔ）を含む）のＤＮＡ断片で、ＨＨ４６７、４６８、４７２、４７３を形質転換し、ＵＴＲ１破壊株については、ジェネティシン３００μｇ／ｍｌを含むＹＰＤ（イーストエキストラクト１０ｇ／Ｌ、ポリペプトン２０ｇ／Ｌ、グルコース＊２０ｇ／Ｌ（ろ過滅菌添加＊））培地に、ＹＥＦ１破壊株については、ｃｌｏｎＮＡＴ（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ  ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）５０μｇ／ｍｌを含むＹＰＤ（イーストエキストラクト１０ｇ／Ｌ、ポリペプトン２０ｇ／Ｌ、グルコース＊２０ｇ／Ｌ（ろ過滅菌添加＊））培地に塗布した。生育したコロニー数個から、ＵＴＲ１破壊株についてはプライマーｕｐＵＴＲ１＿Ｆ１とｐＰＧＫ６５７−ｒ１、あるいはｄｏｗｎＵＴＲ１＿ＲとＧ４１８＿Ｆ１を使ってＰＣＲを行い、断片が増幅されることで、ＵＴＲ１遺伝子が破壊されていることを確認した。ＹＥＦ１破壊株についてはプライマーＹＥＦ１Ｕ＿ＦとｎａｔＭＸ−ｒ２、あるいはＹＥＦ１Ｄ＿ＲとｎａｔＭＸ−ｆ２を使ってＰＣＲを行い、断片が増幅されることで、ＹＥＦ１遺伝子が破壊されていることを確認した。さらに、形質転換体はＹＰＧｌｙ（イーストエキストラクト１０ｇ／Ｌ、ポリペプトン２０ｇ／Ｌ、  グリセロール２０ｇ／Ｌ）培地に塗布して生育を確認し、呼吸欠損株ではないことを確認した。ここでは、マーカーにジェネティシン耐性あるいは、ｃｌｏｎＮＡＴ耐性マーカー遺伝子を用いた例を示したが、宿主の遺伝子型によって、他のマーカーも使用可能である。宿主の栄養要求性を相補する遺伝子、例えばＵＲＡ３を用いれば、ウラシルを含まない寒天培地で選択することができる。あるいは、シクロヘキシミドに対する薬剤耐性遺伝子、ＹＡＰ１を用いれば、シクロヘキシミドを含んだＹＰＤ培地で選択することができる。
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＜キシロース醗酵試験‐スモールスケール＞
キシロースの醗酵試験には、醗酵試験用培地としてＹＰＸ（イーストエキストラクト１０ｇ／Ｌ、ポリペプトン２０ｇ／Ｌ、キシロース＊５０ｇ／Ｌ（別滅菌後添加＊））、又はＣＳＬＸ（０．５％コーンスティープリカー、尿素＊＊５ｇ／Ｌ、ピリドキサル塩酸＊＊１ｍｇ／Ｌ、塩酸チアミン＊＊１ｍｇ／Ｌ、ビオチン＊＊０．１ｍｇ／Ｌ、パントテン酸＊＊１０ｍｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム１ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛２ｍｇ／Ｌ、キシロース＊５０ｇ／Ｌ、ｐＨ５．０（ろ過滅菌後添加＊＊、別滅菌後添加＊））を用いた。醗酵実験に供試する酵母は、次のように培養した。ＹＰＤ１０ｍｌに一白金時の供試酵母を植菌し、３０℃のインキュベーターで、２０時間、振とう培養した。その培養液から酵母を集菌して、あらたにＹＰＤ２０ｍｌに懸濁し、３０℃で３時間振とう培養した。酵母細胞を集菌し、醗酵試験に用いる培地にて２回洗浄した後、２ｍｌの培地にＯＤ６００＝２０あるいは、ＯＤ６００＝２５となるように植菌して、容量３ｍｌのマイクロチューブに入れて蓋をし、３０℃でインキュベートした。適宜サンプリングして、遠心、ろ過後、高速液体クロマトグラフィーにより成分分析を行った。
＜キシロース醗酵試験‐ラージケール＞
容量１００ｍｌのメディウム瓶を用いた醗酵試験では、蓋に内径４ｍｍのシリコンチューブを通した。チューブは培地に漬からない長さに調整した。チューブには逆止弁を取り付け、内圧が高くなった時には、弁から外に気体が抜けて、外圧と同じ気圧に調整できるようにした。醗酵試験に供試する酵母は次のように培養した。ＹＰＤ１０ｍｌに一白金耳の供試酵母を植菌し、３０℃のインキュベーターで、２０時間振とう培養した。その培養液全量を３００ｍｌ三角フラスコに入れたＹＰＤ１００ｍｌに植菌し、３０℃のインキュベーターで２０時間振とう培養した後、遠心して酵母全量を回収し、再び５００ｍｌ三角フラスコに入れたＹＰＤ２００ｍｌに懸濁して３０℃で６時間振とう培養した。酵母細胞を集菌し、醗酵試験用培地にて２回洗浄した後、４５ｍｌの培地にＯＤ６００＝２０になるように植菌した。メディウム瓶は培地の入り量の深さまで水浴につけて３０℃に温度を保ち、滅菌したスターラーバーを入れて、６０ｒｐｍの速度で攪拌しながら醗酵した。適宜１ｍｌづつ醗酵液のサンプリングを行い、遠心、ろ過後、高速液体クロマトグラフィーにより成分の分析を行った。
＜キシロース醗酵試験‐連醸醗酵試験＞
４５ｍｌスケールで行った醗酵試験の酵母を遠心にて回収し、１０ｍｌのＣＳＬＸ培地にＯＤ６００＝１００となるように植菌し、５０ｍｌ容量の蓋つきの滅菌プラスティックチューブに入れて、３０℃で醗酵した。４８時間後に１ｍｌの醗酵液をサンプリングし、遠心、ろ過後、高速液体クロマトグラフィーにて成分の分析を行った。残りの酵母は全量回収し、次の段階の醗酵に用い、同じ手順で醗酵試験を行った。
＜エタノール、キシロース、グリセリロール、キシリトールの測定＞
醗酵液から適宜サンプリングし、遠心、ろ過した後、上清を次の条件にて高速液体クロマトグラフィーで定量した。それぞれ既知濃度の純品サンプルのピーク面積から試験サンプルの各濃度を計算した。
▲１▼  分離カラム及び条件
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＵＧＡＲ  ＳＨ−Ｇ（６．０×５０ｍｍ）＋ＳＨ１０１１（８．０×３００ｍｍ）
溶離液：５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
カラムオーブン：６０℃
検出器：ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）２８０ｎｍ（フルフラール類）
示差屈折率検出器（ＲＩ）  （他の糖類）
▲２▼  装置構成
ＨＰＬＣ本体：日立Ｌ−２０００シリーズ
ポンプ：Ｌ−２１３０
オートサンプラー：Ｌ−２２００
ＤＡＤ検出器：Ｌ−２４５０
ＲＩ検出器：Ｌ−２４９０
カラムオーブン：島津ＣＴＯ−１０Ａ
実施例１：ＹＰＸ培地による、ＵＴＲ１破壊株のキシロース醗酵試験１
宿主として、ＨＨ４６７とＨＨ４６８を用いて、ＵＴＥ１破壊株を育種した。それぞれ親株（ｎ＝１）と、３種類の育種株（ｎ＝２）について、実験方法に示した方法にてＹＰＤで培養した後、ＹＰＸ培地２ｍｌにＯＤ６００＝２０となるように植菌後、マイクロチューブに入れて、３０℃静置で醗酵試験を行った。２４時間後遠心にて菌体を分離し、高速液体クロマトグラフィーにてエタノールとキシロースを定量した。エタノール収率は、キシロース資化量×０．５１のエタノールが生成した場合を、収率１００％とし、百分率で表した。結果を、図８および９に示した。ＵＴＲ１の破壊株はＨＨ４６７とＨＨ４６８のどちらを宿主にした場合でも、親株よりもキシロースからのエタノール生成収率が増加した。また、キシロース資化量は親株とほとんど同じであった。ＵＴＲ１の破壊が、キシロースからのエタノール生成収率増加に効果があることが確認できた。
実施例２：ＹＰＸ培地による、ＵＴＲ１破壊株のキシロース醗酵試験２
宿主として、ＨＨ４７３を用いて、ＵＴＲ１破壊株を育種した。ＨＨ４７３株はＸ２１８０−１Ａから育種した株であり、ＨＨ４６７とＨＨ４６８と異なり、栄養要求性がない株である。それぞれ、一株ずつについて、実験方法に示した方法にてＹＰＤで培養した後、ＹＰＸ培地２ｍｌにＯＤ６００＝２５となるように植菌後マイクロチューブに入れて、３０℃静置で醗酵試験を行った。２４時間あるいは４８時間後に遠心にて菌体を分離し、高速液体クロマトグラフィーにてエタノールとキシロースを定量した。エタノール収率は、キシロース資化量×０．５１のエタノールが生成した場合を、収率１００％とし、百分率で表した。結果を、図１０に示した。ＵＴＲ１の破壊株はアミノ酸の栄養要求性のないＨＨ４７３においても、親株よりもキシロースからのエタノール生成収率が増加した。また、４８時間後の副産物であるキシリトールとグリセロールの値をエタノールと共に示した（図１１）。ＵＴＲ１破壊株では、キシリトールの生成量が親株に比べて、非常に低かった。
次に、ＨＨ４７２株を宿主として、ＵＴＲ１破壊株を取得した。ＨＨ４７２株は発現カセットＴＤＨ３ｐ：：ＸＹＬ１：：ＰＹＫ１ｐ：：ＸＹＬ２：：ＴＰＩ１ｐ：：ＸＫＳ１の挿入された領域が、ＨＨ４７３株とは異なる。
再現性を見るために、親株については、ｎ＝２で、ＵＴＲ１破壊株については、ｎ＝８で、上記と同様に醗酵試験を行った。その結果、ＵＴＲ１破壊株は有意にエタノール収率が高く（図１２）、キシリトール生成量は低かった（図１３）。
実施例３：ＣＳＬＸ培地による、ＵＴＲ１破壊株のキシロース醗酵試験
実施例２で育種したＨＨ４７２を親株とするＵＴＲ１破壊株（ｎ＝８）と親株（ｎ＝２）を用いて、ＣＳＬＸ培地で醗酵試験を行った。実験方法に示した方法にてＹＰＤで培養した後、ＣＳＬＸ培地２ｍｌにＯＤ６００＝２５となるように植菌後、マイクロチューブに入れて、３０℃静置で醗酵試験を行った。２４時間あるいは４８時間後に遠心にて菌体を分離し、高速液体クロマトグラフィーにてエタノール、キシロース、キシリトール、グリセロールを定量した。エタノール収率は、キシロース資化量×０．５１のエタノールが生成した場合を、収率１００％とし、百分率で表した。エタノール生成量と収率を、図１４に示した。ＵＴＲ１の破壊株では、親株よりもキシロースからのエタノール生成収率が有意に増加した。また、副産物であるキシリトールとグリセロールの４８時間後の値をエタノールと共に示した（図１５）。どちらも、親株よりも低かった。バイオマスの分解物にアミノ酸がほとんど含まれないことに鑑みれば、ＹＰＸと比べて約４分の１の量のアミノ酸しか含まれないＣＳＬＸ培地においても同様の効果があったことは、特に重要な結果といえる。この結果から、本発明の微生物は、キシロースを含むバイオマスを原料とするエタノール製造に有用であることが判明した。
実施例４：４５ｍｌスケールでのＣＳＬＸ培地による、ＵＴＲ１破壊株のキシロース醗酵試験
実施例２で育種したＨＨ４７２を親株とするＵＴＲ１破壊株と親株のうち、親株（ｎ＝２）と、ＵＴＲ１破壊株（ｎ＝５）について、実験方法に示した方法にてＹＰＤで培養した後、１００ｍｌのメディウム瓶中のＣＳＬＸ培地４５ｍｌにＯＤ６００＝２０となるように植菌した。３０℃にて、マグネットスターラーで攪拌（６０ｒｐｍ）しながら醗酵試験を行った。３、２０、２７、４４、５１時間後にサンプリングして、遠心にて菌体を分離し、高速液体クロマトグラフィーにてエタノール、キシロース、キシリトール、グリセロールを定量した。エタノール収率は、キシロース資化量×０．５１のエタノールが生成した場合を、収率１００％とし、百分率で表した。各成分の経過を、図１６〜１９に示した。ＵＴＲ１の破壊株は、親株よりもキシリトールとグリセロールの生成量が低下し、エタノール生成量・収率が増加した。また、キシロース資化速度は親株と同じであった。通気はしないが、攪拌を行う醗酵でも、ＵＴＲ１の破壊によりエタノール醗酵の副生成物である、キシリトールとグリセロールの生成量を減少させ、エタノール生成量を増加させられることがわかった。
実施例５：１０ｍｌスケールでのＣＳＬＸ培地による、ＵＴＲ１破壊株の連続キシロース醗酵試験
実施例４で行った、４５ｍｌスケールの醗酵試験の親株（ｎ＝２）と、ＵＴＲ１破壊株（ｎ＝５）を遠心にて回収し、１０ｍｌのＣＳＬＸ培地にＯＤ６００＝１００になるように植菌し、５０ｍｌ容量の蓋つきの滅菌プラスティックチューブに入れて３０℃静置で醗酵した。４８時間後にサンプリングし、遠心、ろ過後、高速液体クロマトグラフィーにてエタノール、キシロース、キシリトール、グリセロールを定量した。エタノール収率は、キシロース資化量×０．５１のエタノールが生成した場合を、収率１００％とし、百分率で計算した。残りの醗酵液の酵母は全量回収し、次の醗酵を同じ手順で行い、醗酵を連続３回続けて行った。図２０にエタノール生成量の収率を、図２１にキシロース資化量を、図２２にキシリトール生成量を、図２３にグリセロール生成量を示した。連続して醗酵を続けても、ＵＴＲ１破壊株は親株よりもエタノール生成量、エタノール収率が共に高かった。特にエタノール収率については、親株が醗酵回数を経るごとに減少傾向にあったのに対し、ＵＴＲ１破壊株では、逆に増加傾向であった。また、副産物であるキシリトールとグリセロールの生成量は連続醗酵を行った場合でも低かった。キシロース資化量は醗酵を経るごとに若干減少したが、この傾向は親株の方でも見られた。この結果より、ＵＴＲ１破壊株は、連続醗酵を行っても、同様の効果が得られることがわかった。バイオマスからエタノールを生産するにあたっては、その生産コストを下げることが非常に重要であることから、連続醗酵可能であることは大きな意味を持つ。
実施例６：ＹＰＸ培地による、ＵＴＲ１破壊株、ＹＥＦ１破壊株、ＵＴＲ１ＹＥＦ１破壊株のキシロース醗酵試験
宿主としてＨＨ４７２を用いて作製したＵＴＲ１破壊株、ＹＥＦ１破壊株、ＵＴＲ１ＹＥＦ１破壊株を育種した。ＨＨ４７２株はＸ２１８０−１Ａから育種した株であり、ＨＨ４６７及びＨＨ４６８とは異なり、栄養要求性がない株である。それぞれ、親株（ｎ＝２）、ＵＴＲ１破壊株（ｎ＝２）、ＹＥＦ１破壊株（ｎ＝３）、ＵＴＲ１ＹＥＦ１破壊株（ｎ＝４）、ついて、実験方法に示した方法にてＹＰＤで培養した後、ＹＰＸ培地２ｍｌにＯＤ６００＝２５となるように植菌後マイクロチューブに入れて、３０℃で静置することで醗酵試験を行った。２４時間あるいは４８時間後に遠心にて菌体を分離し、高速液体クロマトグラフィーにてエタノールとキシロースを定量した。エタノール収率は、キシロース資化量×０．５１のエタノールが生成した場合を、収率１００％とし、百分率で表した。結果を、図２４に示す。ＵＴＲ１破壊株は、親株よりもキシロースからのエタノール生成収率が増加した。ＹＥＦ１破壊株は、親株に比べ、キシロースからのエタノール生成収率がわずかに増加する程度であったが、ＵＴＲ１とＹＥＦの両遺伝子を破壊したＵＴＲ１ＹＥＦ１破壊株は、ＵＴＲ１破壊株よりもさらにエタノール収率が上昇していた。また、４８時間後の副産物であるキシリトールとグリセロールの値をエタノールと共に図２５に示す。ＵＴＲ１ＹＥＦ１破壊株はＵＴＲ１破壊株よりもキシリトールとグリセロールの生成量は少なく、エタノールの生成量は多かった。ＵＴＲ１とＹＥＦ１の両遺伝子を破壊することで、さらに高い効果が得られることが判明した。
＜まとめ＞
以上記載したように、キシロースからのエタノール醗酵を行うにあたり、ＮＡＤＨ再酸化の反応が律速であることが明らかになり、ＮＡＤキナーゼであるＵＴＲ１及び／又はＹＥＦ１遺伝子の破壊により、エタノール収率を上げることができることがわかった。本発明の微生物は、その合成にＮＡＤやＮＡＤＰＨを必要とするアミノ酸についての栄養要求性がある株でも、ない株でも同様に作製することが可能であり、そのようにして作製された微生物は、キシロース醗酵に用いた際に同様の効果を奏するができる。また、本発明の微生物を用いてキシロース醗酵を行う場合、栄養リッチなＹＰＸのような培地でも、コーンスティープリカーと尿素のような工業上使用される貧栄養の培地（ＣＳＬＸ）であっても、同様に高い醗酵効果が見られる。
実施例７：ＦＰＳ１破壊株の作製
＜ＦＰＳ１遺伝子の取得＞
酵母サッカロミセス・セレビジエーのＦＰＳ１遺伝子（配列番号２３）は、既にその塩基配列が報告されている（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  登録番号：ＹＬＬ０４３Ｗ）。また、同遺伝子にコードされるＦＰＳ１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２４に示す。
ＦＰＳ１遺伝子の塩基配列情報をもとに、酵母サッカロミセス・セレビジエーから調製した染色体ＤＮＡをＰＣＲの鋳型に使用して、ＦＰＳ１遺伝子をＰＣＲによって増幅、単離することにより得ることができる。具体的に本実施例では、酵母サッカロミセス・セレビジエーＸ２１８０−１Ａ（ＡＴＣＣ２６７８６）（ＭＡＴａ  ＳＵＣ２  ｍａｌ  ｍｅｌ  ｇａｌ２  ＣＵＰ１）の染色体ＤＮＡを鋳型として、下記のプライマーＦＰＳ１ＮＦＳＣＸＢとＦＰＳ１ＣＲＢを用いてＦＰＳ１をＰＣＲによって取得した。取得したＤＮＡ断片は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを用いて、ベクター、ｐＣＲ（登録商標）  ４−ＴＯＰＯに挿入し、プラスミドｐＣＲ４ＦＰＳ１（図２６）を得た。ＤＮＡシークエンスにより挿入した両遺伝子の配列を確認した。両遺伝子の取得のために用いる染色体ＤＮＡは、上記に示した株に限定するものではなく、サッカロミセス・セレビジエーに属する酵母であれば何れの酵母から調製されたものであってもよい。染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲによる目的遺伝子の増幅およびその後の単離は、ＰＣＲプライマーの調製を含め、当業者に周知な方法で行うことができる。
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＜ＦＰＳ１遺伝子破壊のためのユニットの作製＞
ＦＰＳ１遺伝子を破壊するためのユニットを作製するには、ｐＣＲ４ＦＰＳ１のＦＰＳ１遺伝子をＳｔｕＩとＨｉｎｃＩＩで切断し、末端を平滑化した。プラスミドｐＹＲＡＦＬＰ（図２７）よりＫｐｎＩとＦｓｐＩで切り出した、ＡＵＲ（オーレオバシジン）耐性マーカー遺伝子（ＴＤＨ３ｐ：：ＡＵＲ１−Ｃ）を、そこに挿入し、プラスミドｐＣＲ４ＦＰＳ１ＡＵＲ（図２８）を得た。このｐＣＲ４ＦＰＳ１ＡＵＲをＰｍｅＩとＮｏｔＩで切断し、アガロースゲル電気泳動を行い、約４．０ｋｂｐのＤＮＡ断片（ＦＰＳ１のＮ末とＣ末の部分配列を持ち、中央にオーレオバシジン耐性マーカー遺伝子（ＴＤＨ３ｐ：：ＡＵＲ１−Ｃ）を含む）を、アガロースゲルから切り出した。ゲルよりＤＮＡ断片を精製抽出した。精製抽出はｉｌｌｕｓｔｒａＴＭ  ＧＦＸＴＭ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用い、マニュアルに従って行った。
＜ＦＰＳ１遺伝子破壊株の育種＞
調製した約４．０ｋｂｐのＤＮＡ断片（ＦＰＳ１のＮ末とＣ末の部分配列を持ち、中央にオーレオバシジン耐性遺伝子（ＴＤＨ３ｐ：：ＡＵＲ１−Ｃ）を含む）を、ＨＨ４７２、ＨＨ４７２のＵＴＲ１遺伝子あるいは、ＹＥＦ１遺伝子、あるいは、その両方を破壊した株に形質転換し、オーレオバシジン２μｇ／ｍｌを含むＹＰＤ（イーストエキストラクト  １０ｇ／Ｌ，ポリペプトン  ２０ｇ／Ｌ，グルコース＊２０ｇ／Ｌ  （ろ過滅菌添加＊））培地に塗布した。生育したコロニー数個から、下記のプライマーＦＰＳ１ＰＦ１とＡＵＲ１＿Ｒを使ってＰＣＲを行い、１６３１ｂｐの断片が増幅されることで、ＦＰＳ１遺伝子が破壊されていることを確認した。さらに、形質転換体はＹＰＧｌｙ（イーストエキストラクト  １０ｇ／Ｌ，ポリペプトン  ２０ｇ／Ｌ，グリセロール  ２０ｇ／Ｌ）培地に塗布して生育を確認し、呼吸欠損株ではないことを確認した。ここでは、マーカーにオーレオバシジン耐性マーカー遺伝子を用いた例を示したが、宿主の遺伝子型によって、他のマーカーも使用可能である。宿主の栄養要求性を相補する遺伝子、例えばＵＲＡ３を用いれば、ウラシルを含まない寒天培地で選択することができる。あるいは、シクロヘキシミドに対する薬剤耐性遺伝子、ＹＡＰ１を用いれば、シクロヘキシミドを含んだＹＰＤ培地で選択することができる。
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実施例８：ＹＰＤおよびＹＰＸ培地による、ＵＴＲ１破壊株、ＹＥＦ１破壊株、ＦＰＳ１破壊株、ＵＴＲ１，ＹＥＦ１破壊株、ＵＴＲ１，ＦＰＳ１破壊株、ＵＴＲ１，ＹＥＦ１，ＦＰＳ１破壊株のキシロース醗酵試験
ＨＨ４７２を宿主として構築した、ＵＴＲ１破壊株、ＹＥＦ１破壊株、ＦＰＳ１破壊株、ＵＴＲ１，ＹＥＦ１破壊株、ＵＴＲ１，ＦＰＳ１破壊株、ＵＴＲ１，ＹＥＦ１，ＦＰＳ１破壊株、６種類の各破壊株と親株であるＨＨ４７２株について、実験方法に示した方法にてＹＰＤで培養した後、ＹＰＸ培地あるいは、ＹＰＤ培地２ｍｌにＯＤ６００＝２５となるように植菌後マイクロチューブに入れて、３０℃静置で醗酵試験（各ｎ＝３）を行った。２４時間あるいは４８時間後に遠心にて菌体を分離（ＹＰＤでの醗酵は２４時間後のみサンプリング）し、高速液体クロマトグラフィーにて、キシロース醗酵の場合はエタノール、キシロース、キシリトール、グリセロールと酢酸を、グルコース醗酵の場合は、エタノールとグルコース、グリセロールと酢酸を定量した。キシロースからのエタノール収率は、キシロース資化量×０．５１のエタノールが生成した場合を、収率１００％とし、百分率で表した。結果を、図２９に示す。ＦＰＳ１の破壊株は、ＵＴＲ１破壊株やＹＥＦ１破壊株と同じように、親株よりもキシロースからのエタノール生成収率が増加した（図２９）。４８時間後の副産物であるキシリトール、グリセロールと酢酸の値をエタノールと共に示す（図３０）。ＦＰＳ１破壊株では、グリセロールと酢酸量が親株より若干増加したが、キシリトールの生成量は親株に比べて低下した。ＵＴＲ１，ＹＥＦ１破壊株、ＵＴＲ１，ＦＰＳ１破壊株、ＵＴＲ１，ＹＥＦ１，ＦＰＳ１破壊株はいずれも、各々の遺伝子の単独破壊株よりも、副産物生成量が減少することから、キシロースからのエタノール収率が増加しており、これら３つの遺伝子をいかに組み合わせて破壊しても、効果的にキシロースからのエタノール収率を増加させることが出来る。
グルコースからのエタノール収率は、キシロース醗酵の場合と同じく、グルコース資化量×０．５１のエタノールが生成した場合を、収率１００％とし、百分率で表した。結果を、図３１および図３２に示す。全ての破壊株は、グルコース醗酵においてもほぼ同じか、あるいは若干エタノール生成収率が上昇し、炭素源がグルコースであっても、これらの破壊株のエタノール生成量は親株と遜色ない。
実施例９：５０ｍｌスケールでのＹＰＸ培地を用いた、ＵＴＲ１破壊株、ＹＥＦ１破壊株、ＦＰＳ１破壊株、ＵＴＲ１，ＹＥＦ１破壊株、ＵＴＲ１，ＦＰＳ１破壊株、ＵＴＲ１，ＹＥＦ１，ＦＰＳ１破壊株によるキシロース醗酵試験
実施例８で育種したＨＨ４７２を親株とする各破壊株と親株について、実験方法に示した方法にてＹＰＤで培養した後、１００ｍｌのメディウム瓶中のＹＰＸ培地５０ｍｌに５０ｍｇ  ｗｅｔ  ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように植菌した。３０℃にて、マグネットスターラーで攪拌（６０ｒｐｍ）しながら醗酵試験を行った。２、８、２２、２９、４６、５１時間後にサンプリングして、遠心にて菌体を分離し、高速液体クロマトグラフィーにてキシロース、エタノール、キシリトール、グリセロールと酢酸を定量した。各成分の経過を、図３３〜３７に示す。すべての破壊株において、親株よりもキシリトールと酢酸の生成量が低下した。グリセロール生成量は、ＦＰＳ１破壊株である、ＦＰＳ１破壊株、ＵＴＲ１，ＦＰＳ１破壊株、ＵＴＲ１，ＹＥＦ１，ＦＰＳ１破壊株では増加したものの、エタノール生成量は、すべての株において、親株を上回った。通気はしないが、攪拌を行う醗酵でも、ＵＴＲ１、ＹＥＦ１、ＦＰＳ１の３つの遺伝子について、各遺伝子の単独破壊であっても、これらをいかに組み合わせて破壊しても、効果的にキシロースからのエタノール収率を増加させることが出来る。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
バイオマスから生じた、５炭糖を炭素源として、エタノール醗酵を行うにあたり、エタノール生成収率を上げることができる。特に、ヘミセルロース含量が多い場合には、有効である。またこの技術は、その生成にＮＡＤが必要な物質を酵母にて生産させる場合、すなわち、アラビノースからのエタノール生成などでも、その収率を上げることができる。
【配列表フリーテキスト】
【０００９】
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ＤＮＡ
配列番号１６：合成ＤＮＡ
配列番号１７：合成ＤＮＡ
配列番号１８：合成ＤＮＡ
配列番号１９：合成ＤＮＡ
配列番号２０：合成ＤＮＡ
配列番号２１：合成ＤＮＡ
配列番号２２：合成ＤＮＡ
配列番号２５：合成ＤＮＡ
配列番号２６：合成ＤＮＡ
配列番号２７：合成ＤＮＡ
配列番号２８：合成ＤＮＡ
［配列表］
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【図１】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２９】
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【図３１】
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【図３２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図３０】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【国際調査報告】
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