(57)【要約】  試料と核酸修飾剤とを酸性多糖及び／又はヌクレオチド類存在下で接触させる工程を含む、試料に含まれる核酸の修飾方法、試料に含まれる生細胞由来の核酸を選択的に検出する方法であって、以下の工程を含む方法：（ａ）試料と核酸修飾剤とを酸性多糖及び／又はヌクレオチド類存在下で接触させる工程を含む、試料に含まれる核酸の修飾方法により試料に含まれる核酸を修飾する工程；及び（ｂ）工程（ａ）後の試料より修飾されていない核酸を選択的に検出する工程、これらの方法に使用するキット及び組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料と核酸修飾剤とを酸性多糖及び／又はヌクレオチド類存在下で接触させる工程を含む、試料に含まれる核酸の修飾方法。
【請求項２】
核酸修飾剤が光活性化により核酸を修飾する化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
核酸修飾剤がエチジウムモノアジド及びプロピジウムモノアジドから選択される化合物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
酸性多糖がアルギン酸ナトリウム及びコンドロイチン硫酸Ｂから選択される酸性多糖であるか、あるいはヌクレオチド類がＤＮＡ及びｄＮＴＰから選択されるヌクレオチド類である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
試料に含まれる生細胞由来の核酸を選択的に検出する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）請求項１記載の方法により試料に含まれる核酸を修飾する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）後の試料より修飾されていない核酸を選択的に検出する工程。
【請求項６】
核酸修飾剤が光活性化により核酸を修飾する化合物である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
核酸修飾剤がエチジウムモノアジド及びプロピジウムモノアジドから選択される化合物である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
酸性多糖がアルギン酸ナトリウム及びコンドロイチン硫酸Ｂから選択される酸性多糖であるか、あるいはヌクレオチド類がＤＮＡ及びｄＮＴＰから選択されるヌクレオチド類である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｂ）が核酸増幅法により実施される、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｂ）がリアルタイムＰＣＲにより実施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１記載の方法により試料中の核酸を修飾するためのキットであって、
（ａ）核酸修飾剤；及び
（ｂ）（ａ）の核酸修飾剤とともに使用される酸性多糖及び／又はヌクレオチド類； 
を含有するキット。
【請求項１２】
核酸修飾剤が光活性化により核酸を修飾する化合物である、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
核酸修飾剤がエチジウムモノアジド及びプロピジウムモノアジドから選択される化合物である、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
酸性多糖がアルギン酸ナトリウム及びコンドロイチン硫酸Ｂから選択される酸性多糖であるか、あるいはヌクレオチド類がＤＮＡ及びｄＮＴＰから選択されるヌクレオチド類である、請求項１１に記載のキット。
【請求項１５】
請求項５記載の方法により試料中の生細胞由来の核酸を選択的に検出するためのキットであって、
（ａ）核酸修飾剤； 
（ｂ）（ａ）の核酸修飾剤とともに使用される酸性多糖及び／又はヌクレオチド類；及び 
（ｃ）核酸検出用試薬；
を含有するキット。
【請求項１６】
核酸修飾剤が光活性化により核酸を修飾する化合物である、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
核酸修飾剤がエチジウムモノアジド及びプロピジウムモノアジドから選択される化合物である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
酸性多糖がアルギン酸ナトリウム及びコンドロイチン硫酸Ｂから選択される酸性多糖であるか、あるいはヌクレオチド類がＤＮＡ及びｄＮＴＰから選択されるヌクレオチド類である、請求項１５に記載のキット。
【請求項１９】
（ａ）核酸修飾剤；及び
（ｂ）酸性多糖及び／又はヌクレオチド類；
を含む組成物。
【請求項２０】
核酸修飾剤が光活性化により核酸を修飾する化合物である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
核酸修飾剤がエチジウムモノアジド及びプロピジウムモノアジドから選択される化合物である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
酸性多糖がアルギン酸ナトリウム及びコンドロイチン硫酸Ｂから選択される酸性多糖であるか、あるいはヌクレオチド類がＤＮＡ及びｄＮＴＰから選択されるヌクレオチド類である、請求項１９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸検出法の実施において試料に含有される核酸由来のシグナルの低減に有効な核酸の修飾方法、当該方法に使用するキット、及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸検出技術は、現在では医学、生物学分野では一般的な研究手法であり、定性的、定量的な測定において汎用されている。特にＰＣＲ法に代表される核酸増幅法との組合せにより、ごくわずかな細胞や微生物の存在をこれら細胞、微生物に特有の核酸を標的として検出することが可能となったことから、高感度分析法として基礎研究、産業界にわたって広く利用されるようになった。更に特定配列の核酸を人為的に混入して物質、物品を標識することにより、流通経路の追跡や真贋判定への利用も実施されている。【０００３】
一方、核酸増幅法を利用した検出法は、検出作業時の核酸増幅反応で生成する増幅核酸による他試料の分析への干渉という問題を引き起こしている。核酸増幅反応では対数的な核酸増幅により莫大な分子数の増幅産物が生成することから、他試料、試薬類、試験器具、試験環境へ混入した増幅産物を鋳型として起こる増幅のために誤った分析結果が生じる恐れがある。【０００４】
このような増幅産物由来の人為的な増幅を防止する観点から、試料、試薬類、試験器具等の厳密な取り扱い、試験環境の清浄化等の一般的注意に加え、増幅核酸の他試験への干渉を防止する手法が開発されてきた。例えば、デオキシウラシル３リン酸を含む反応液で核酸増幅を行うことでウラシル−Ｎ−グリコシラーゼに感受性の増幅核酸を生成させる方法が知られている。試料や反応液を増幅反応前にウラシル−Ｎ−グリコシラーゼで処理することにより、他試験に由来する増幅核酸を分解することができる。また、核酸に光活性化されたソラーレン類化合物を共有結合させることにより修飾し、前記核酸が核酸増幅反応において鋳型として機能することを妨げる方法も報告されている（非特許文献１）。【０００５】
核酸を核酸増幅反応の鋳型とならないよう修飾する技術は微生物検出においても利用されている。細胞死の後、数日から３週間までは死細胞に由来するＤＮＡが試料中に残留すると言われており、通常の操作で試料から抽出されたＤＮＡには、生細胞、死細胞の双方に由来するＤＮＡが含まれる。従って、例えば殺菌処理を施した試料における殺菌処理の効果は、核酸を指標とする微生物検出法には十分に反映されない。【０００６】
上記の問題を解決する手法として、核酸修飾剤と核酸増幅法を組み合わせた生細胞・死細胞の識別方法が報告されている（非特許文献２、特許文献１）。この核酸に基づく検出法は、核酸修飾剤としてエチジウムモノアジド（ＥＭＡ）やプロピジウムモノアジド（ＰＭＡ）を使用し、リアルタイムＰＣＲなどの核酸増幅法を組み合わせて生細胞と死細胞を増幅の有無又は速度を指標として区別する方法である。例えばＥＭＡは、可視光下で活性化されて核酸に共有結合し、核酸増幅反応を阻害することが報告されている。一方、試料中に遊離状態のまま残った未結合のＥＭＡは、水分子と反応することによって同時に不活性化される。無傷の細胞膜や細胞壁によってＥＭＡが侵入しなかった生細胞由来の核酸は、ＥＭＡの作用を受けない。一方、ＥＭＡが侵入した死細胞由来の核酸はＥＭＡにより修飾され、後の核酸増幅反応が阻害される。従って、生細胞と死細胞の混合物からなる試料を前記の核酸修飾剤で処理することにより、生細胞由来の核酸が選択的に増幅されるようになる。現在までに、大腸菌Ｏ１５７、ネズミチフス菌、リステリア菌、カンピロバクター・ジェジュニ及びレジオネラなど多くの微生物について、死細胞と区別した生細胞の検出がこのような手法で実施されている。しかし、高濃度の核酸修飾剤は、死細胞由来の核酸に確実に結合する一方、生細胞に対しダメージを与えることが報告されている。【０００７】
このように、核酸修飾法はいろいろな用途を有していることから、更に効率よく核酸を修飾する方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許４１２７８４７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｓｅａｒｃｈ）、第１９巻、第９９〜１０７頁、１９９１年
【非特許文献２】アプライド  アンド  エンバイロメンタル  マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、第７３巻、８０２８−８０３０頁、２００７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、検出を防止することが望まれる核酸を効率よく修飾する方法を提供し、種々の核酸ベースの検出技術の正確性を向上させることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、試料と、核酸修飾剤とを酸性多糖及び／又はヌクレオチド類存在下で接触させる工程を含む、試料に含まれる核酸の修飾方法により、従来よりも効率よく核酸の修飾を実施できることを見出し、本発明を完成させた。【００１２】
すなわち本発明を概説すれば、
［１］試料と核酸修飾剤とを酸性多糖及び／又はヌクレオチド類存在下で接触させる工程を含む、試料に含まれる核酸の修飾方法、
［２］核酸修飾剤が光活性化により核酸を修飾する化合物である、［１］に記載の方法、
［３］核酸修飾剤がエチジウムモノアジド及びプロピジウムモノアジドから選択される化合物である、請求項［２］に記載の方法、
［４］酸性多糖がアルギン酸ナトリウム及びコンドロイチン硫酸Ｂから選択される酸性多糖であるか、あるいはヌクレオチド類がＤＮＡ及びｄＮＴＰから選択されるヌクレオチド類である、［１］に記載の方法、
［５］試料に含まれる生細胞由来の核酸を選択的に検出する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）［１］記載の方法により試料に含まれる核酸を修飾する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）後の試料より修飾されていない核酸を選択的に検出する工程、
［６］核酸修飾剤が光活性化により核酸を修飾する化合物である、［５］に記載の方法、
［７］核酸修飾剤がエチジウムモノアジド及びプロピジウムモノアジドから選択される化合物である、［６］に記載の方法、
［８］酸性多糖がアルギン酸ナトリウム及びコンドロイチン硫酸Ｂから選択される酸性多糖であるか、あるいはヌクレオチド類がＤＮＡ及びｄＮＴＰから選択されるヌクレオチド類である、［５］に記載の方法、
［９］工程（ｂ）が核酸増幅法により実施される、［５］に記載の方法、
［１０］工程（ｂ）がリアルタイムＰＣＲにより実施される、［９］に記載の方法、
［１１］［１］記載の方法により試料中の核酸を修飾するためのキットであって、
（ａ）核酸修飾剤；及び
（ｂ）（ａ）の核酸修飾剤とともに使用される酸性多糖及び／又はヌクレオチド類； 
を含有するキット、
［１２］核酸修飾剤が光活性化により核酸を修飾する化合物である、［１１］に記載のキット、
［１３］核酸修飾剤がエチジウムモノアジド及びプロピジウムモノアジドから選択される化合物である、［１２］に記載のキット、
［１４］酸性多糖がアルギン酸ナトリウム及びコンドロイチン硫酸Ｂから選択される酸性多糖であるか、あるいはヌクレオチド類がＤＮＡ及びｄＮＴＰから選択されるヌクレオチド類である、［１１］に記載のキット、
［１５］［５］記載の方法により試料中の生細胞由来の核酸を選択的に検出するためのキットであって、
（ａ）核酸修飾剤； 
（ｂ）（ａ）の核酸修飾剤とともに使用される酸性多糖及び／又はヌクレオチド類；及び 
（ｃ）核酸検出用試薬；
を含有するキット、
［１６］核酸修飾剤が光活性化により核酸を修飾する化合物である、［１５］に記載のキット、
［１７］核酸修飾剤がエチジウムモノアジド及びプロピジウムモノアジドから選択される化合物である、［１６］に記載のキット、
［１８］酸性多糖がアルギン酸ナトリウム及びコンドロイチン硫酸Ｂから選択される酸性多糖であるか、あるいはヌクレオチド類がＤＮＡ及びｄＮＴＰから選択されるヌクレオチド類である、［１５］に記載のキット、
［１９］
（ａ）核酸修飾剤；及び
（ｂ）酸性多糖及び／又はヌクレオチド類；
を含む組成物、
［２０］核酸修飾剤が光活性化により核酸を修飾する化合物である、［１９］に記載の組成物、
［２１］核酸修飾剤がエチジウムモノアジド及びプロピジウムモノアジドから選択される化合物である、［２０］に記載の組成物、及び
［２２］酸性多糖がアルギン酸ナトリウム及びコンドロイチン硫酸Ｂから選択される酸性多糖であるか、あるいはヌクレオチド類がＤＮＡ及びｄＮＴＰから選択されるヌクレオチド類である、［１９］に記載の組成物、に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法により、試料と核酸修飾剤とを接触させる処理において、核酸の修飾効率を向上させることが可能であり、食品衛生検査や臨床検査の正確性向上に極めて有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に本発明について詳細に説明する。
【００１５】
（１）本発明の核酸の修飾方法
本発明の核酸の修飾方法は、試料と核酸修飾剤とを酸性多糖及び／又はヌクレオチド類存在下で接触させる工程を含む、試料に含まれる核酸の修飾方法である。
【００１６】
本発明の方法の対象となる試料は、核酸が存在する可能性のあるすべての試料である。例えば、食品、農産物、水産物、生物の組織や体液（血液、尿、髄液、胸水等）、細胞培養液、化成品（医薬、農薬、試薬等）、工業用水、市水、地下水、河川水、貯水、雨水、排水又は土壌が挙げられる。特に、食品としては、飲料、菓子、乳製品、機能性食品等が含まれる。本発明においては、試料は、前記のような製品、生体試料又は環境試料そのものであってもよく、これらを溶解、けん濁、希釈、濃縮又は精製などの前処理をしたものであってもよい。前記前処理としては、加熱処理、濾過、遠心分離等が挙げられる。また前処理として、試料中に存在するタンパク質及び脂肪等の夾雑物を低減させる処理、例えばタンパク質分解酵素及び脂質分解酵素による酵素処理、を施してもよい。
【００１７】
本発明で使用される核酸修飾剤は、その作用により核酸を検出できない形態に修飾し得る物質である。すなわち、核酸の有している相補鎖とのハイブリッド形成能の変化、相補鎖複製における鋳型としての機能の変化、本来の配列の変化、ならびに核酸の断片化のいずれか、もしくはこれらの複数の組合せを引き起こす物質が例示される。従って、本発明における核酸の修飾には、核酸修飾剤の核酸塩基対へのインターカレート、核酸への核酸修飾剤の共有結合、核酸の架橋結合、核酸塩基の置換、核酸修飾剤による核酸の切断が含まれる。本発明に好適な核酸修飾剤としては、ＥＭＡ（ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｍｏｎｏａｚｉｄｅ）、ＰＭＡ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｍｏｎｏａｚｉｄｅ）、エチジウムジアジド、ソラーレン化合物［ソラーレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）、４’−ＡＭＤＭＩＰ（４’−ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ−４，５’−ｄｉｍｅｔｈｙｌｉｓｏｐｓｏｒａｌｅｎ）、ＡＭＩＰ（５−ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌｉｓｏｐｓｏｒａｌｅｎ）、５−ＭＩＰ（５−ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｐｓｏｒａｌｅｎ）、８−メトキシソラーレン等］及びヨウ化プロピジウムが例示される。また、商品名、ＳＹＴＯ  Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ、ＢＯＤＩＰＹ（４，４−ｄｉｆｌｕｏｒ−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ）、ＹＯ−ＰＲＯ−１染料、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８アネキシンＶ、Ｃ４−ＢＯＤＩＰＶ５００／５１０ＣＹ及びＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（以上モレキュラープローブ社製）として市販されている試薬を使用することができる。前記核酸修飾剤は、１種類で又は複数種類を混合して使用することができる。更に、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  ＢａｃＬｉｇｈｔ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ、ＶｉａＧｒａｍ  Ｒｅｄ＋Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｒａｍ  Ｓｔａｉｎ、Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（モレキュラープローブ社製）のような市販キットに含まれている修飾剤を使用することもできる。
【００１８】
本発明で使用される核酸修飾剤の濃度及び試料と接触させる時間は、試料に応じて適宜設定することが可能であり、例えば、試料に複数の濃度の核酸修飾剤を加えて、一定の時間接触させ、反応後の核酸の修飾を分析することによって決定することができる。ＥＭＡを使用する場合、例えば終濃度１〜１００μＭ、１分〜４８時間、好ましくは５〜７０μＭ、３分〜１０時間、より好ましくは１０〜５０μＭ、５分〜５時間の条件で核酸を修飾することができる。また、試料と核酸修飾剤を接触させる工程は使用する核酸修飾剤に適した条件で行えばよい。
【００１９】
光活性化を受ける核酸修飾剤、例えばＥＭＡ、ＰＭＡ、ソラーレン化合物等を本発明の方法に使用する場合には、試料と核酸修飾剤を接触させた後、光照射処理を実施する。特に本発明を限定するものではないが、光活性化を受ける核酸修飾剤を使用する場合には、通常、試料に核酸修飾剤を添加して核酸と核酸修飾剤とを遮光下、低温（例えば室温〜０℃）で接触させた後、光照射処理が行われる。光照射処理に使用される光の波長は、核酸修飾剤の活性化に適したものであれば特に限定はないが、例えば、３５０〜７００ｎｍの波長の単波長光又は３５０〜７００ｎｍの波長を含む多波長光が使用できる。光照射処理の光強度及び照射時間は、使用する核酸修飾剤、光源及び試料に応じて適宜設定することが可能であり、例えば、光源の強度や試料と光源の距離を変化させ、処理後の核酸の修飾を分析することによって決定することができる。ＥＭＡを使用する場合、例えば１〜１０００Ｗのランプを使用し、試料との距離を１〜５０ｃｍに設定し１〜２０分間照射する条件で光照射処理を実施できる。更に、消費電力が少なく強光度のＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ）ランプが開発されており、本発明に使用できる。また、光照射処理は低温（例えば氷上）で実施することが好ましい。
【００２０】
本発明の方法に使用する酸性多糖は、フコース硫酸含有多糖、デキストラン硫酸、カラギーナン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ラムナン硫酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）などに代表される硫酸基を含有する硫酸化多糖類、ヒアルロン酸、アルギン酸、ペクチンなどのポリウロン酸及びこれらの塩が含まれる。前記酸性多糖の塩としては、例えば、デキストラン硫酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、ヘパリンナトリウム、デキストラン硫酸カリウム、ヘパリンリチウムなどのアルカリ金属塩などが挙げられる。前記酸性多糖は天然物でもよく、化学的又は酵素的な合成物でもよい。更に酸性多糖を含有する未精製物、部分精製物又は精製物のいずれでもよい。前記酸性多糖は、１種類で又は複数種類を混合して使用することができる。
【００２１】
本発明の方法に使用する酸性多糖の濃度は、使用する酸性多糖及び試料に応じて適宜設定して添加することが可能であり、例えば、酸性多糖の濃度を変化させ、処理後の核酸の修飾を分析することによって決定することができる。例えばアルギン酸ナトリウムを使用する場合、１μｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１０μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１００μｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬの濃度である。また、例えばコンドロイチン硫酸Ｂを使用する場合、１０μｇ／ｍＬ〜１０００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１００μｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度である。
【００２２】
上記の酸性多糖の存在下に核酸修飾剤を試料に作用させた場合には、試料中の遊離の核酸のみならず、核酸修飾剤が接触可能な環境にある非遊離の核酸、例えば生体分子等に結合した核酸や細胞膜透過性の亢進した死細胞に含まれる核酸、特にＤＮＡの修飾される割合が向上する。このため、核酸検出法におけるこれらの核酸やＤＮＡに由来する干渉を低減させることが可能となる。ここで、「酸性多糖の存在下に核酸修飾剤を試料に作用させる」とは、「試料に酸性多糖を人為的に添加したうえ、核酸修飾剤を作用させる行為」を意味する。
【００２３】
本発明の方法に使用するヌクレオチド類は、本発明に使用されるヌクレオチド類とは、核酸を構成するリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドやそれらの類似物を構成成分とする物質を指す。特に本発明を限定するものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、モノリボヌクレオチド（例えばモノリボヌクレオシド３リン酸：ＮＴＰ）、モノデオキシリボヌクレオチド（例えばモノデオキシリボヌクレオシド３リン酸：ｄＮＴＰ）が本発明に使用される。天然のリボヌクレオチドの類似物であるイノシンヌクレオチド、デオキシイノシンヌクレオチド、デオキシウリジンヌクレオチドやそれらの３リン酸、前記類似物を含有するＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチドも本発明に使用することができる。なお、ＮＴＰには、モノアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）、モノチミジン３リン酸（ＴＴＰ）、モノシチジン３リン酸（ＣＴＰ）、モノグアノシン３リン酸（ＧＴＰ）、モノウリジン３リン酸（ＵＴＰ）が含まれる。また、ｄＮＴＰには、モノデオキシアデノシン３リン酸（ｄＡＴＰ）、モノデオキシチミジン３リン酸（ｄＴＴＰ）、モノデオキシシチジン３リン酸（ｄＣＴＰ）、モノデオキシグアノシン３リン酸（ｄＧＴＰ）が含まれる。なお、本発明におけるヌクレオチド類は前記の物質の塩（例えばアルカリ金属塩）を包含する。前記ヌクレオチド類は天然物でもよく、化学的又は酵素的な合成物でもよい。更にヌクレオチド類を含有する未精製物、部分精製物又は精製物のいずれでもよい。前記ヌクレオチド類は、１種類で又は複数種類を混合して使用することができる。本発明の一態様として、ＤＮＡ及びｄＮＴＰから選択されるヌクレオチド類が使用できる。本発明に使用されるＤＮＡとしては、特に本発明を限定するのもではないが、入手の容易な動物由来のＤＮＡ（仔牛胸腺ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ等）や微生物由来ＤＮＡ（細菌ゲノムＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ等）が例示される。仔牛胸腺ＤＮＡやλファージのＤＮＡ（λＤＮＡ）、ｄＮＴＰは試薬として市販されており、本発明に好適である。
【００２４】
本発明の方法に使用するヌクレオチド類の濃度は、使用するヌクレオチド類及び試料に応じて適宜設定して添加することが可能であり、例えば、ヌクレオチド類の濃度を変化させ、処理後の核酸の修飾を分析することによって決定することができる。例えばλＤＮＡを使用する場合、１０ｎｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの濃度である。また、例えばデオキシＮＴＰを使用する場合、１０μＭ〜５００ｍＭ、好ましくは１００μＭ〜１００ｍＭ、より好ましくは１ｍＭ〜５０ｍＭの濃度である。
【００２５】
上記のヌクレオチド類の存在下に核酸修飾剤を試料に作用させた場合には、試料中の遊離の核酸のみならず、核酸修飾剤が接触可能な環境にある非遊離の核酸、例えば生体分子等に結合した核酸や細胞膜透過性の亢進した死細胞に含まれる核酸、特にＤＮＡの修飾される割合が向上する。このため、核酸検出法におけるこれらの核酸やＤＮＡに由来する干渉を低減させることが可能となる。ここで、「ヌクレオチド類の存在下に核酸修飾剤を試料に作用させる」とは、「試料にヌクレオチド類を人為的に添加したうえ、核酸修飾剤を作用させる行為」を意味する。
【００２６】
本発明の方法、キット及び組成物において、上記酸性多糖の１種またはそれ以上及び上記ヌクレオチド類の１種またはそれ以上を併用してもよい。
【００２７】
（２）本発明による生細胞由来の核酸の選択的検出方法
生存可能で増殖可能な細胞と不可逆的に損傷した死細胞とを識別するために重要なのは、細胞膜の完全性である。本発明の核酸修飾方法によれば、細胞膜への選択性を有する核酸修飾剤を使用して、核酸修飾剤が侵入し得る、細胞壁、細胞膜の透過性が亢進した細胞内の核酸をも修飾することができる。一方、核酸修飾剤が侵入できない生細胞内の核酸は修飾を受けない。従って、本発明を利用して試料に含まれる生細胞由来の核酸を選択的に検出する方法が提供される。
【００２８】
本明細書において「生細胞」とは、生命活動を維持している細胞、すなわち代謝能力や増殖能力を維持した細胞を意味する。また、生細胞は細胞の構造や形態にも実質的な損傷はない。一方、細胞壁及び／又は細胞膜が損傷し、生命活動を維持する能力が低下した死細胞は、当該細胞の生育に適した条件にあっても正常に増殖しない。このような死細胞は細胞外の物質が細胞内に侵入し得る状態にある。
【００２９】
細胞が存在する可能性のある試料について本発明の核酸の修飾方法を適用すれば、生細胞内の核酸のみ核酸修飾剤の作用を受けず、核酸検出法、例えば核酸増幅法により検出される状態を保つ。従って、本発明の方法を利用して生細胞、例えば微生物の生細胞の存在を、死細胞の存在に関わらず特異的に検出することが可能となる。
【００３０】
本発明の方法の対象となる細胞は、真核細胞又は原核細胞のいずれでもよく、酵母、真菌、細菌などの微生物、動物細胞、植物細胞が含まれる。細菌には、グラム陽性菌及びグラム陰性菌のいずれもが含まれる。グラム陽性菌としては、バチルス属細菌（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ等）、スタフィロコッカス属細菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ等）、リステリア属細菌（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ等）、クロストリジウム属細菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ等）、ストレプトコッカス属細菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ等）、マイコバクテリウム属細菌等が挙げられる。また、グラム陰性菌としては、エシェリヒア属細菌［Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）等］、サルモネラ属細菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ等）、ビブリオ属細菌（Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ等）、クロノバクター属細菌（旧Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉ等）、レジオネラ属細菌（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ等）、シュードモナス属細菌等が挙げられる。
【００３１】
本発明の方法は前記のとおり種々の試料を対象として実施することができる。ただし、選択性を保つ観点から、試料について細胞膜の損傷を招くような処理は避ける必要がある。
【００３２】
本発明の試料に含まれる生細胞由来の核酸を検出する方法は、以下の（ａ）、（ｂ）の工程により実施される。
（ａ）本発明の核酸修飾方法により試料に含まれる核酸を修飾する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）後の試料より修飾されていない核酸を選択的に検出する工程。
【００３３】
本発明の方法の工程（ａ）は、前記（１）の記載のとおり、試料と核酸修飾剤とを酸性多糖及び／又はヌクレオチド類の存在下で接触させることにより、試料中の核酸の修飾を実施する工程である。例えば、試料に核酸修飾剤と酸性多糖及び／又はヌクレオチド類を添加し、適切な条件下に置くことにより核酸を修飾することができる。本発明の方法において、前記（１）に記載する光活性化を受ける核酸修飾剤を使用する場合には、光照射処理を工程（ａ）と同時に又は工程（ａ）の後に実施することができる。また、工程（ａ）と光照射処理を、複数回、例えば２〜５回繰り返して実施しても良い。すなわち、核酸修飾剤の添加と光照射処理を繰り返し実施することができる。工程（ａ）と光照射処理を繰り返す場合には、国際公開第２００９／０２２５５８号パンフレットに記載のように、試料中に含まれる生細胞が増殖するのに適切な培地を光照射処理の後に試料に添加し、生細胞を培養する工程を組み合わせることができる。
【００３４】
また、工程（ａ）の後に、核酸修飾剤を除去する工程を実施することができる。核酸修飾剤を除去する方法としては公知の固液分離方法を使用できるが、例えば試料を遠心分離して細胞を含む沈殿と核酸修飾剤を含む上清とを分離し、上清を除去する方法が挙げられる。この場合、核酸修飾剤を除去した後、細胞を洗浄する工程を追加することも可能である。
【００３５】
また、工程（ａ）の後に、生細胞を溶解する工程及び／又は核酸を抽出する工程を実施することができる。細胞溶解方法、核酸抽出方法としては、熱処理による細胞の破壊（熱抽出）の他、プロテイナーゼＫ／フェノール抽出法、プロテイナーゼＫ／フェノール／クロロホルム抽出法、アルカリ溶解法、アルカリ−ＳＤＳ法、溶菌酵素法のような種々の方法が挙げられる。これらは、後述の工程（ｂ）で実施する核酸の検出方法により、適した細胞溶解方法及び／又は核酸抽出方法を選択すればよい。
【００３６】
本発明の方法の工程（ｂ）において、工程（ａ）後の試料より修飾されていない核酸を選択的に検出することにより、生細胞の核酸を特異的に検出することができる。すなわち、核酸に基づく生細胞の検出において、死細胞の核酸によるノイズを低減させることが可能となり、試料中の生細胞の存在を感度良く、正確に検出することが可能である。
【００３７】
前記工程（ｂ）の修飾されていない核酸を選択的に検出する方法は、工程（ａ）の核酸の修飾方法により適宜選択することができる。例えば、死細胞（ならびに遊離の）ＤＮＡが選択的に修飾される結果、当該ＤＮＡを鋳型とする核酸増幅反応が阻害される場合は、核酸の検出方法として核酸増幅法（ＤＮＡ増幅法）を選択することができる。ＤＮＡ増幅法としては、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、ＲＣＡ法、ＳＭＡＰ法が例示される。核酸増幅反応後の反応液をゲル電気泳動法など通常の分析方法に供して増幅核酸の量及び塩基長を分析することにより、修飾されていない核酸を選択的に検出することができる。更にリアルタイムに核酸を検出・定量する方法も使用でき、例えば、インターカレーター法、ＴａｑＭａｎ法、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ法、Ｃｙｃｌｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ法、ハイブリダイゼーションプローブ法が例示される。これらの核酸増幅法やリアルタイム検出法は数多くの総説により解説され、当業者は市販されている多数のキットから選択することが可能である。
【００３８】
前記の核酸増幅法やリアルタイム検出法において、検出の対象とする核酸のターゲット領域は、検出しようとする細胞に応じて適宜設定することができる。ターゲット領域は、細胞の染色体のゲノム配列から設定してもよく、ミトコンドリアゲノム、葉緑体ゲノム、プラスミドなどのエピソームの配列を設定してもよい。また、試料に検出対象の細胞と異なる種類の細胞が含まれる場合には、ターゲット領域は、検出対象の細胞に特異的な配列を設定することが好ましい。また、複数種の細胞に共通する配列を設定してもよい。更に、ターゲット領域は１領域であっても、複数領域であってもよい。検出対象の細胞に特異的なターゲット領域と、広汎な細胞が有するターゲット領域を設定することもできる。ターゲット領域の長さとしては、４０〜５０００塩基長、好ましくは６０〜１０００塩基長、特に好ましくは７０〜２００塩基長である。
【００３９】
前記の核酸増幅法又はリアルタイム検出法に使用するプライマー又はプローブは、核酸増幅法又はリアルタイム検出法に応じて、前記のターゲット領域に基づき設計することができる。
【００４０】
微生物を標的として本発明の方法を実施し、試料中において生存している微生物を検出することができる。核酸増幅法において標的（ターゲット）とする遺伝子・核酸領域には特に限定はなく、特異性や検出感度を考慮して適宜選択すればよい。検出対象の微生物が病原性細菌である場合には、非病原性の同種もしくは同属の微生物と区別するため、病原遺伝子からターゲット領域を設定することができる。例えば、大腸菌Ｏ−１５７由来のベロ毒素１型又は２型遺伝子、毒素原性大腸菌由来の耐熱性エンテロトキシン遺伝子（ＳＴｈ）又は易熱性エンテロトキシン遺伝子（ＳＴｐ）、サルモネラ属細菌由来の侵入性因子関連遺伝子（ｉｎｖＡ）、腸炎ビブリオ由来の耐熱性溶血毒遺伝子（ｔｄｈ）、バチルス・セレウス由来のセレウリド遺伝子（ＣＲＳ）、リステリア属細菌由来のインターナリンＡ遺伝子（ｉｎｔＡ）、エンテロバクター・サカザキ由来の外膜タンパクＡ遺伝子（ｏｍｐＡ）、カンピロバクター由来の細胞膨化致死毒素遺伝子（ｃｄｔ）等が挙げられる。また、微生物検出に汎用されるリボソームＲＮＡ（１６ＳｒＲＮＡ、２３ＳｒＲＮＡ）をコードする遺伝子やそのスペーサー領域をターゲットとして使用できる。
【００４１】
また、工程（ｂ）の検出方法としてリアルタイムＰＣＲ法を採用する場合の分析方法を以下に例示する。リアルタイムＰＣＲ法では蛍光シグナル変化のモニターを行う。ＰＣＲ増幅産物が得られると蛍光シグナル強度が増し、増幅曲線が描かれる。一般にＰＣＲの増幅サイクル数１〜１０程度までの蛍光強度の変化はノイズレベルでありゼロに等しく、サンプルブランク（ベースライン）と見なし、それに比べて有意的に蛍光シグナル差が認められる蛍光シグナル強度を閾値（スレッシュホールド値）として設定する。増幅曲線がそのスレッシュホールド値を上回るＰＣＲサイクル数をサイクルスレシュホールド値（Ｃｔ値）という。従って、ＰＣＲ反応溶液に初期のＤＮＡ鋳型量が多い程、Ｃｔ値は小さな値となり、鋳型ＤＮＡ量が少ない程、Ｃｔ値は大きな値となる。また、全体の核酸量が同じでも、ターゲット領域に核酸の修飾が生じている割合が多くなる程、Ｃｔ値は大きな値となる。また、増幅産物の融解温度を分析する融解曲線解析（Ｔｍ解析）により、増幅産物がターゲット領域に由来するものかどうかを確認することができる。
【００４２】
（３）本発明のキット及び組成物
本発明のキットは前記（１）の本発明の方法により試料中の核酸を修飾するためのキットであって、
（ａ）核酸修飾剤；及び
（ｂ）（ａ）の核酸修飾剤とともに使用される酸性多糖及び／又はヌクレオチド類；
を含有するキットである。
また本発明の別のキットとしては前記（２）の本発明の方法により試料中の生細胞由来の核酸を選択的に検出するためのキットが挙げられ、
（ａ）核酸修飾剤；
（ｂ）（ａ）の核酸修飾剤とともに使用される酸性多糖及び／又はヌクレオチド類；及び
（ｃ）核酸検出用試薬；
を含有するキットである。
本発明のキットに含まれる核酸修飾剤、酸性多糖及びヌクレオチド類は、前記（１）に記載される。本発明のキットに含まれる核酸検出用試薬は、前記（２）に記載される核酸検出方法に使用される試薬である。例えば、核酸検出法としてＰＣＲ法を採用する場合は、核酸検出用試薬として、反応緩衝液、ターゲット領域を増幅するためのプライマー対、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド又はマグネシウム塩等が含まれる。更に、核酸検出方法に応じてインターカレーター色素［ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ等］、検出プローブや検出反応に必要な酵素（例えばＲＮａｓｅＨ等）が含まれる。
【００４３】
本発明のキットには、更に試料や核酸修飾剤を希釈するための試薬、核酸修飾反応の緩衝液、本発明の方法を記載した説明書、試料から夾雑物などを除去・洗浄するための試薬、陽性対照、陰性対照等を含んでも良い。
【００４４】
本発明の組成物は、前記（１）の本発明の核酸の修飾方法又は（２）の本発明の生細胞由来の核酸を選択的に検出する方法に使用されるもので、（ａ）核酸修飾剤及び（ｂ）酸性多糖及び／又はヌクレオチド類を含む組成物である。本発明の組成物に含まれる核酸修飾剤、酸性多糖及びヌクレオチド類は、前記（１）に記載される。
【００４５】
以上詳細に説明したように、本発明により酸性多糖及び／又はヌクレオチド類を有効成分とする核酸修飾剤の作用増強方法や、酸性多糖及び／又はヌクレオチド類を有効成分とする核酸修飾剤の作用増強剤が提供される。この方法や増強剤は試料中の目的の核酸の修飾に有用であり、種々の工業分野に適用できる。
【実施例】
【００４６】
次に実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４７】
実施例１  酸性多糖の効果
酸性多糖（アルギン酸ナトリウム又はコンドロイチン硫酸Ｂ）を添加した大腸菌ゲノムＤＮＡサンプルを用いて、ＥＭＡ処理を１回実施して、ＬａｃＺ遺伝子をターゲット領域にしたリアルタイムＰＣＲ法により検出感度を比較した。【００４８】
（１）試料の調製
大腸菌Ｋ−１２から調製したゲノムＤＮＡを、ＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）により１×１０８コピー／３０μＬに調製し、検体液とした。また、酸性多糖として、アルギン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ａｌｇｉｎａｔｅ  ８０−１２０ｃｐ、和光純薬社製、カタログ番号：１９４−１３３２１、以下「ＡｌｇＮａ」と記載することがある）１００μｇ、１０μｇ、コンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸、シグマ社製、カタログ番号：Ｃ３７８８）４８０μｇをそれぞれ加え、また対照として酸性多糖を加えない検体液を用意し、その後すべての検体液を滅菌水で５０μＬに調製した。なお、コピー数は核酸の重量から算出したコピー数である。【００４９】
（２）ＥＭＡ処理
ＥＭＡ（シグマ−アルドリッチ社製、ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ  ｍｏｎｏａｚｉｄｅ：カタログ番号：Ｅ２０２８）を５ｍＭとなるようにＤＭＳＯで完全に溶解し、−２０℃に保存した。使用する際はこれを融解し、３００μＭになるように滅菌水で希釈した。このＥＭＡ水溶液を、前記ゲノムＤＮＡの各検体液５０μＬに５μＬずつ添加し、遮光下で、４℃、１５分間放置した。その後、各検体液を氷上に置き、検体液から２０ｃｍの距離に設置した５００Ｗの写真照明用ランプ（ＰＲＳ５００Ｗ：１００Ｖ、５００Ｗ、岩崎電気社製）を用いて５分間光を照射した（以上の、ＥＭＡ溶液の添加から光照射にわたる工程を、「ＥＭＡ処理」と記載することがある）。【００５０】
また、（１）に記載のとおり調製したうえ、ＥＭＡ処理を行わない検体液を用意した。ＥＭＡ処理した検体液、ＥＭＡ処理を行わない検体液のそれぞれを１００μＬになるように滅菌水で希釈した。【００５１】
（３）ＬａｃＺ遺伝子をターゲット領域にしたＰＣＲ（増幅鎖長：７０ｂｐ）
下記の組成によりＰＣＲ反応液（全量２０μＬ）を調製した。
・ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製、カタログ番号：ＲＲ０４１Ａ）：１０μＬ
・４ｐｍｏｌ／μＬ、ＬａｚＺ−Ｆ  ＤＮＡ（配列番号１）：１μＬ
・４ｐｍｏｌ／μＬ、ＬａｃＺ−Ｒ  ＤＮＡ（配列番号２）：１μＬ
・滅菌水：７μＬ
・鋳型ＤＮＡ（前記の希釈された検体液）：１μＬ【００５２】
実施例１−（２）で調製した各検体溶液１μＬを鋳型ＤＮＡとして用いた。すなわち、２０μＬの反応液中に大腸菌ゲノム１０６コピーの鋳型ＤＮＡを含む。対照として希釈された検体液に換えて滅菌水１μＬを添加した反応液を調製した。ターゲット領域のＬａｃＺ遺伝子を増幅するため、９５℃で３０秒の保温の後、９５℃で５秒及び６０℃で３０秒を１サイクルとした４０サイクルの反応を行う条件でＰＣＲを実施した。前記反応にはリアルタイムＰＣＲ装置Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社製、機種番号：ＴＰ８００）又はＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＳｙｓｔｅｍＩＩ（タカラバイオ社製、機種番号：ＴＰ９００）を使用し、ＰＣＲ増幅曲線において、スレッシュホールド値を超えるサイクル数（以下「Ｃｔ値」）を測定した。また、ＰＣＲ後に増幅産物の融解曲線解析（Ｔｍ解析）を、６０℃から９５℃まで温度上昇させる条件で実施した。【００５３】
（４）試験結果
実施例１−（３）のＰＣＲで得られたＣｔ値及びＴｍ解析値を表１に示す。【００５４】
【表１】
2012102208.tif 000002
【００５５】
表１より、ＥＭＡ処理なしの各検体液のＣｔ値に変動がないことから、酸性多糖添加によるＰＣＲ阻害がないことが確認できた。ＥＭＡ処理した群の結果を比べると酸性多糖を添加しない場合と比較して酸性多糖を添加している検体液のＣｔ値が１〜５程度遅い。このことから、酸性多糖添加によりＥＭＡのＤＮＡ修飾が促進され、ＰＣＲの効率が低下していると考えられた。また、増幅産物のＴｍ解析値はすべて８３．４±０．５の範囲であり、非特異的な増幅が起こっていないことを確認した。【００５６】
実施例２  ＥＭＡ処理３回での酸性多糖の効果
（１）試料の調製
大腸菌ＪＭ１０９から調製したゲノムＤＮＡを、ＴＥバッファーにより１０倍ずつ段階希釈し、１×１０８〜１×１０３コピー／３０μＬで前記ゲノムを含むＤＮＡ溶液を調製した。その他は、実施例１−（１）と同様の方法で、大腸菌ゲノムＤＮＡ検体液を調製した。【００５７】
（２）ＥＭＡ処理
実施例２−（１）で調製した大腸菌ゲノムＤＮＡ検体液について、実施例１−（２）と同様にＥＭＡ処理を行った。更に、処理後検体液にＥＭＡ水溶液を５μＬずつ添加し、可視光を照射するＥＭＡ処理を２回繰り返し、合計３回ＥＭＡ処理を行った。従って、３回のＥＭＡ処理終了後の検体液量は６５μＬとなった。【００５８】
ＥＭＡ処理した検体液及び対照としてＥＭＡ処理を行わない検体液を用意し、１００μＬになるように滅菌水で調製した。【００５９】
（３）ＬａｃＺ遺伝子をターゲット領域にしたＰＣＲ
実施例２−（２）で調製した各検体液の希釈液１μＬを鋳型ＤＮＡとして、ＬａｃＺ遺伝子をターゲット領域にしたＰＣＲを実施例１−（３）と同様に実施した。なお、２０μＬの反応液中には大腸菌ゲノム１０６コピー〜１０コピーの鋳型ＤＮＡが含まれる。【００６０】
（４）試験結果
実施例２−（３）のＰＣＲで得られたＣｔ値及びＴｍ解析値を表２に示す。なお、表中の「−」は、ＰＣＲによるＬａｃＺ遺伝子の増幅が検出されなかったことを示す。【００６１】
【表２】
2012102208.tif 000003
【００６２】
表２より、ＥＭＡ処理した結果を比べると、酸性多糖を添加していない検体液を含む反応液では１０６〜１０３コピーのゲノムを含むものでＬａｃＺ遺伝子が検出されるが、アルギン酸ナトリウムを添加しているものについては、１０５〜１０コピーの範囲でＬａｃＺ遺伝子の増幅は見られなかった。酸性多糖添加によりＥＭＡによるＤＮＡ修飾が促進され、ＰＣＲの効率が低下していると考えられた。なお、増幅産物のＴｍ解析値は８３．４±０．５で、各群検体液での差はなかった。【００６３】
実施例３  大腸菌の生菌及び死菌の識別における酸性多糖の効果
（１）試料の調製
大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ社製、カタログ番号：９０５２）５０μＬを、ＬＢ液体培地５ｍＬに植菌し、３７℃恒温水槽で１３〜１６時間１３０ｒｐｍ程度で振とう培養した。これを生菌懸濁液とした。また、この生菌懸濁液７００μＬ程度を１．５ｍＬ容マイクロチューブに入れ、ヒートブロックにて１００℃、５分間加温して死菌懸濁液を調製した。【００６４】
調製した大腸菌の生菌懸濁液を、新しいＬＢ液体培地で１０倍ずつ段階希釈し、１〜１０６倍希釈の生菌懸濁液を調製した。死菌懸濁液は１０２倍に希釈した。各希釈倍率の生菌懸濁液２０μＬに、それぞれ１０２倍希釈した死菌懸濁液１０μＬを加えた。こうして調製した生菌・死菌混合懸濁液に、アルギン酸ナトリウム１００μｇを加えて滅菌水で５０μＬに調製した検体液、ならびにアルギン酸ナトリウムを加えずに滅菌水で５０μＬに調製した検体液を調製した。【００６５】
（２）ＥＭＡ処理及びＤＮＡ抽出工程
実施例３−（１）で調製した各検体液について、実施例２−（２）と同様に３回のＥＭＡ処理を行った。従って、３回のＥＭＡ処理終了後の検体液量は６５μＬとなった。ＥＭＡ処理した検体液及び対照としてＥＭＡ処理を行わなかった検体液をそれぞれ１００μＬになるように滅菌水で希釈し、ヒートブロックにて１００℃、５分間加温して、ＤＮＡの熱抽出を行った。【００６６】
（３）ＬａｃＺ遺伝子をターゲット領域にしたＰＣＲ
実施例３−（２）で調製した各熱抽出液を１５，０００ｒｐｍで２分間遠心し、その上清１μＬを鋳型ＤＮＡとして、ＬａｃＺ遺伝子をターゲット領域にしたＰＣＲを実施例１−（３）と同様に実施した。【００６７】
（４）試験結果
実施例３−（３）のＰＣＲで得られたＣｔ値及びＴｍ解析値について、ＥＭＡ処理した検体液の結果を表３に、ＥＭＡ処理しなかった大腸菌検体液の結果を表４に、更にＣｔ値から算出した標準曲線を示す式と相関係数（Ｒ２）を表５に示す。なお、表中の「−」は、ＰＣＲによるＬａｃＺ遺伝子の増幅が検出されなかったことを示す。また、表５中のＡｌｇＮａはアルギン酸ナトリウムを示す。【００６８】
【表３】
2012102208.tif 000004
【００６９】
【表４】
2012102208.tif 000005
【００７０】
【表５】
2012102208.tif 000006
【００７１】
表４から、ＥＭＡ処理を行わない１０３倍の希釈よりも希釈倍率の高い検体では一定量の死菌懸濁液の添加によりアルギン酸ナトリウムの有無にかかわらずほぼ同じＣｔ値が得られており、アルギン酸ナトリウムを添加してもＣｔ値に変動はないことが示された。また、表３から、ＥＭＡ処理した検体では死菌懸濁液の添加に関係なく、生菌量を反映したＣｔ値が得られていることから、ＥＭＡ処理により死菌のＤＮＡを鋳型とする増幅が抑制されていると考えられた。更に、表５のＲ２の数値から、ＥＭＡ処理時に酸性多糖を添加することにより相関係数の改善が見られ、低鋳型量まで定量的に検出できることが分かった。また、増幅産物のＴｍ解析値はすべて８３．４±０．５の範囲であり、本試験では非特異的な増幅が起こっていないことが確認された。【００７２】
実施例４  ヌクレオチド類の効果
ヌクレオチド類としてλＤＮＡを添加した大腸菌ゲノムＤＮＡサンプルを用いて、ＥＭＡ処理を３回実施して、ＬａｃＺ遺伝子をターゲットにしたリアルタイムＰＣＲ法により検出感度を比較した。【００７３】
（１）試料の調製
大腸菌Ｋ−１２から調製したゲノムＤＮＡを、ＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）により１０倍ずつ段階希釈し、５×１０７コピー〜５×１０コピー／２０μＬに調製し、検体液とした。また、ヌクレオチド類として、λＤＮＡ（タカラバイオ社製、カタログ番号：３０１０）２５０ｎｇをそれぞれ加え、また対照としてヌクレオチド類を加えない検体液を用意し、その後すべての検体液を滅菌水で３０μＬに調製した。なお、コピー数はゲノムＤＮＡの重量から算出したコピー数である。【００７４】
（２）ＥＭＡ処理
実施例２−（２）と同様にして、前記ゲノムＤＮＡの各検体液３０μＬに３μＬずつ添加し、合計３回ＥＭＡ処理を行った。従って、３回のＥＭＡ処理終了後の検体液量は３９μＬとなった。【００７５】
また、実施例４−（１）に記載のとおり調製したうえ、ＥＭＡ処理を行わない検体液を用意した。ＥＭＡ処理した検体液、ＥＭＡ処理を行わない検体液のそれぞれを５０μＬになるように滅菌水で希釈した。【００７６】
（３）ＬａｃＺ遺伝子をターゲットにしたＰＣＲ
下記の組成によりＰＣＲ反応液（全量２０μＬ）を調製した。
・ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製、カタログ番号：ＲＲ０４１Ａ）：１０μＬ
・４ｐｍｏｌ／μＬ、ＬａｚＺ−Ｆ  ＤＮＡ（配列番号１）：１μＬ
・４ｐｍｏｌ／μＬ、ＬａｃＺ−Ｒ  ＤＮＡ（配列番号２）：１μＬ
・滅菌水：７μＬ
・鋳型ＤＮＡ（前記の希釈された検体液）：１μＬ【００７７】
実施例４−（２）で調製した各検体溶液１μＬを鋳型ＤＮＡとして用いた。すなわち、２０μＬの反応液中に大腸菌ゲノム１０６コピー〜１コピーの鋳型ＤＮＡを含む。対照として希釈された検体液に換えて滅菌水１μＬを添加した反応液を調製した。ターゲットのＬａｃＺ遺伝子を増幅するため、９５℃で３０秒の保温の後、９５℃で５秒及び６０℃で３０秒を１サイクルとした４０サイクルの反応を行う条件でＰＣＲを実施した。前記反応にはリアルタイムＰＣＲ装置Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社製、機種番号：ＴＰ８００）又はＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＳｙｓｔｅｍＩＩ（タカラバイオ社製、機種番号：ＴＰ９００）を使用し、ＰＣＲ増幅曲線において、Ｃｔ値、ＥＭＡ処理を行わなかった検体の検量線に基づき定量したコピー数（以下「Ｑｔｙ値」）を算出した。また、ＰＣＲ後に増幅産物の融解曲線解析（Ｔｍ解析）を、６０℃から９５℃まで温度上昇させる条件で実施した。【００７８】
（４）試験結果
実施例４−（３）のＰＣＲで得られたＣｔ値及びＴｍ解析値を表６に示す。なお、表中の「−」は、ＰＣＲによるＬａｃＺ遺伝子の増幅が検出されなかったことを示す。【００７９】
【表６】
2012102208.tif 000007
【００８０】
表６より、２．と４．のＥＭＡ処理したＱｔｙ値を比べると、２．のヌクレオチド類を添加しなかった場合は１０６〜１０４コピーのゲノムＤＮＡが数１０〜数１００コピーとして検出されるが、４．のヌクレオチド類を添加した場合は検出されても数コピー以下であり、ほぼ検出限界以下となった。ヌクレオチド類添加により、ＥＭＡのＤＮＡ修飾が促進され、ＰＣＲの効率が低下していると考えられた。なお、増幅産物のＴｍ解析値は８３．６±０．５で各群、検体液での差はなかった。【００８１】
実施例５  大腸菌の生菌及び死菌の識別におけるヌクレオチド類の効果
（１）試料の調製
大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ社製、カタログ番号：９０５２）５０μＬを、ＬＢ液体培地５ｍＬに植菌し、３７℃恒温水槽で１３〜１６時間１３０ｒｐｍ程度で振とう培養した。これを生菌懸濁液とした。また、この生菌懸濁液７００μＬ程度を１．５ｍＬマイクロチューブに入れ、ヒートブロックにて１００℃、５分間加温して死菌懸濁液を調製した。【００８２】
調製した大腸菌の生菌懸濁液を、新しいＬＢ液体培地で１０倍ずつ段階希釈し、１〜１０６倍希釈の生菌懸濁液を調製した。死菌懸濁液は１０２倍に希釈した。各希釈倍率の生菌懸濁液１５μＬに、それぞれ１０２倍希釈した死菌懸濁液１０μＬを加えた。こうして調製した生菌・死菌混合懸濁液に、ヌクレオチド類としてλＤＮＡ２５０μｇを加えて滅菌水で３０μＬに調製した検体液、ならびにλＤＮＡを加えずに滅菌水で３０μＬに調製した検体液を調製した。【００８３】
（２）ＥＭＡ処理及びＤＮＡ抽出工程
実施例５−（１）で調製した各検体液について、実施例４−（２）と同様に３回のＥＭＡ処理を行った。従って、３回のＥＭＡ処理終了後の検体液量は３９μＬとなった。ＥＭＡ処理した検体液及び対照としてＥＭＡ処理を行わなかった検体液をそれぞれ５０μＬになるように滅菌水で希釈し、ヒートブロックにて１００℃、５分間加温して、ＤＮＡの熱抽出を行った。【００８４】
（３）ＬａｃＺ遺伝子をターゲットにしたＰＣＲ
実施例５−（２）で調製した各熱抽出液を１５，０００ｒｐｍで２分間遠心し、その上清１μＬを鋳型ＤＮＡとして、ＬａｃＺ遺伝子をターゲットにしたＰＣＲを実施例４−（３）と同様に実施した。【００８５】
（４）試験結果
実施例５−（３）のＰＣＲで得られたＣｔ値及びＴｍ解析値の結果を表７に、更にＣｔ値から算出した標準曲線を示す式と相関係数（Ｒ２）を表８に示す。なお、表中の「−」は、ＰＣＲによるＬａｃＺ遺伝子の増幅が検出されなかったことを示す。【００８６】
【表７】
2012102208.tif 000008
【００８７】
【表８】
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【００８８】
表７から、ＥＭＡ処理を行わない１０３倍の希釈よりも希釈倍率の高い検体では一定量の死菌懸濁液の添加によりほぼ同じＣｔ値が得られており、λＤＮＡを添加してもＣｔ値に変動はないことが示された。また、表７から、ＥＭＡ処理した検体では死菌懸濁液の添加に関係なく、生菌量を反映したＣｔ値が得られていることから、ＥＭＡ処理により死菌のＤＮＡを鋳型とする増幅が抑制されていると考えられた。更に、表８のＲ２の数値から、ＥＭＡ処理時にヌクレオチド類を添加することにより相関係数の改善が見られ、低鋳型量まで定量的に検出できることが分かった。また、増幅産物のＴｍ解析値はすべて８３．６±０．５の範囲であり、本試験では非特異的な増幅が起こっていないことが確認された。【００８９】
実施例６  ヌクレオチド類の効果
ヌクレオチド類としてｄＮＴＰを添加した大腸菌ゲノムＤＮＡサンプルを用いて、ＥＭＡ処理を実施して、ＬａｃＺ遺伝子又は１６ＳｒＤＮＡをターゲットにしたリアルタイムＰＣＲ法により検出感度を比較した。【００９０】
（１）試料の調製
大腸菌Ｋ−１２から調製したゲノムＤＮＡを、ＴＥバッファーにより１０倍ずつ段階希釈し、１×１０８コピー〜１×１０５コピー／４０μＬに調製し、これらに下記のとおりヌクレオチド類を添加して検体液とした：ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ（タカラバイオ社製、カタログ番号：４０２６〜４０２９）を各２５０μｍｏｌ又は各１２５μｍｏｌ（それぞれデオキシヌクレオチド３リン酸の総量１０００μｍｏｌ又は５００μｍｏｌ）加えた検体液；前記の４種のデオキシヌクレオチド３リン酸をそれぞれ単独で５００μｍｏｌ加えた検体液；ｄＡＴＰ及びｄＧＴＰ各２５０μｍｏｌを加えた検体液；対照として各ｄＮＴＰを加えない検体液。
上記のすべての検体液は滅菌水で５０μＬに調製後、下記（２）の処理に使用した。【００９１】
（２）ＥＭＡ処理
実施例６−（１）で調製した各検体液について、ＥＭＡ水溶液を５μＬ添加すること以外は実施例４−（２）と同様にして１回のみのＥＭＡ処理を行った。【００９２】
また、実施例６−（１）に記載のとおり調製したうえ、ＥＭＡ処理を行わない検体液を用意した。ＥＭＡ処理した検体液、ＥＭＡ処理を行わない検体液のそれぞれを１００μＬになるように滅菌水で希釈した。【００９３】
（３）ＬａｃＺ遺伝子又は１６ＳｒＤＮＡをターゲットにしたＰＣＲ
下記の組成によりＰＣＲ反応液（全量２０μＬ）を調製した。
・ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製、カタログ番号：ＲＲ０４１Ａ）：１０μＬ
・フォワードプライマー：１μＬ
・リバースプライマー：１μＬ
・滅菌水：７μＬ
・鋳型ＤＮＡ（前記の希釈された検体液）：１μＬ【００９４】
なお、フォワードプライマー及びリバースプライマーは、以下の３つの組合せでＰＣＲ反応液に添加した。
（Ａ）ＬａｃＺ遺伝子の一部７０ｂｐを増幅する組合せ。
・４ｐｍｏｌ／μＬ、ＬａｚＺ−Ｆ  ＤＮＡ（配列番号１）：１μＬ
・４ｐｍｏｌ／μＬ、ＬａｃＺ−Ｒ  ＤＮＡ（配列番号２）：１μＬ
（Ｂ）ＬａｃＺ遺伝子の一部１７７ｂｐを増幅する組合せ。
・４ｐｍｏｌ／μＬ、ＬａｚＺ−Ｆ  ＤＮＡ（配列番号１）：１μＬ
・４ｐｍｏｌ／μＬ、ＬａｃＺ−Ｒ＿１７７  ＤＮＡ（配列番号３）：１μＬ
（Ｃ）１６ＳｒＤＮＡの一部９５ｂｐを増幅する組合せ。
・８ｐｍｏｌ／μＬ、１６Ｓ−Ｆ＿９５  ＤＮＡ（配列番号４）：１μＬ
・８ｐｍｏｌ／μＬ、１６Ｓ−Ｒ  ＤＮＡ（配列番号５）：１μＬ【００９５】
実施例６−（２）で調製した各検体溶液１μＬを鋳型ＤＮＡとして用いた。すなわち、２０μＬの反応液中に大腸菌ゲノム１０６コピー〜１０３コピーの鋳型ＤＮＡを含む。これ以外は実施例４−（３）と同様にＰＣＲを実施した。【００９６】
（４）試験結果
実施例６−（３）のＰＣＲで得られたＣｔ値及びＴｍ解析値について、前記（Ａ）のプライマー対の結果を表９に、前記（Ｂ）のプライマー対の結果を表１０に、前記（Ｃ）のプライマー対の結果を表１１及び表１２にそれぞれ示す。なお、表中の「−」は、ＰＣＲによるＬａｃＺ遺伝子又は１６ＳｒＤＮＡの増幅が検出されなかったことを示す。【００９７】
【表９】
2012102208.tif 000010
【００９８】
【表１０】
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【００９９】
【表１１】
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【０１００】
【表１２】
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【０１０１】
表９及び表１０より、ＥＭＡ未処理の場合はｄＮＴＰの添加の有無でＣｔ値に差は認められず、鋳型のコピー数依存的にＣｔ値が低下しているため、ｄＮＴＰの添加はＰＣＲに影響しないことが確認された。また、ＥＭＡ処理をすることによりＥＭＡ未処理の場合と比べてＣｔ値が１０サイクル程度増加し、ヌクレオチド類を添加することで更にＣｔ値が４〜５サイクル増加する又は検出限界以下となることから、ヌクレオチド類添加により、ＥＭＡのＤＮＡ修飾が促進され、ＰＣＲの効率が低下していると考えられた。表１１及び表１２より、１６ＳｒＤＮＡを検出した場合も同様であり、ヌクレオチド類を添加しＥＭＡ処理することで、添加するヌクレオチド類の種類によらず鋳型ＤＮＡの修飾がより促進されることが分かった。なお、増幅産物のＴｍ解析値は（Ａ）のプライマー対は８３．０±０．５、（Ｂ）のプライマー対は８５．５±０．５、（Ｃ）のプライマー対は８２．０±０．５、で検体液での差はなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明により、試料と核酸修飾剤とを接触させる処理において、核酸の修飾効率を向上させることが可能であり、生細胞の核酸の選択的かつ高感度な検出を可能にする方法、当該方法に使用するキット及び組成物が提供され、食品衛生検査や臨床検査の正確性向上に極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１０３】
SEQ ID NO:1:Nucleotide sequence of LacZ-F
SEQ ID NO:2:Nucleotide sequence of LacZ-R
SEQ ID NO:3:Nucleotide sequence of LacZ-R_177
SEQ ID NO:4:Nucleotide sequence of 16S-F_95
SEQ ID NO:5:Nucleotide sequence of 16S-R
【配列表】
2012102208000001.app
【国際調査報告】
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