(57)【要約】  本発明は、ＨＩＶに対してより優れた、あるいは、新たな中和抗体を誘導し得るペプチドを提供し、それによって、ＨＩＶ感染症の予防・治療、あるいは、その選択肢の豊富化を図ることを目的とする。  解決方法として、３本の等価なリンカー構造を持つＣ３対称性を有するテンプレート化合物を介して、ＨＩＶ粒子の膜貫通タンパク質ｇｐ４１のＣ末端側のヘリックス領域Ｃ３４ペプチドの誘導体が３分子結合していることを特徴とするＣ３４の３量体領域を認識するＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドを用いることを特徴とする。
2012137479.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ粒子の膜貫通タンパク質ｇｐ４１のＣ末端側のヘリックス領域Ｃ３４ペプチドの誘導体を合成する工程、及び、３本の等価なリンカー構造を持つＣ３対称性を有するテンプレート化合物と、前述のＣ３４ペプチドの誘導体とを結合することにより、Ｃ３４ペプチドの誘導体の３量体を合成する工程からなることを特徴とするＣ３４の３量体領域を認識するＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドの合成方法。
【請求項２】
ＨＩＶ粒子の膜貫通タンパク質ｇｐ４１のＣ末端側のヘリックス領域Ｃ３４ペプチドの誘導体を合成する工程におけるＣ３４ペプチドの誘導体が、Ｃ３４の天然の配列であるＣ３４ペプチドのＣ末端側に、テンプレート化合物と結合するために必要なライゲーション部位を導入し、該Ｃ３４ペプチドの配列と該ライゲーション部位との間には立体障害による反応性の軽減を防ぐためにスペーサーアミノ酸残基を導入したものであることを特徴とする請求項１に記載のＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドの合成方法。
【請求項３】
３本の等価なリンカー構造を持つＣ３対称性を有するテンプレート化合物として、下記一般式（１）で表される化合物又はその塩を用いることを特徴とする請求項１又は２に記載のＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドの合成方法。
【化１】
2012137479.tif 000015
（式中、Ｘは正の整数を示す）。
【請求項４】
３本の等価なリンカー構造を持つＣ３対称性を有するテンプレート化合物として、下記一般式（２）で表される化合物又はその塩を用いることを特徴とする請求項３に記載のＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドの合成方法。
【化２】
2012137479.tif 000016
【請求項５】
ＨＩＶ粒子の膜貫通タンパク質ｇｐ４１のＣ末端側のヘリックス領域Ｃ３４ペプチドの誘導体を合成する工程におけるＣ３４ペプチドの誘導体が、Ｃ３４ペプチドのＣ末端側に親水性アミノ酸残基を付与し、更に、そのＣ末端側にライゲーション部位を導入し、該親水性アミノ酸残基と該ライゲーション部位との間には立体障害による反応性の軽減を防ぐためにスペーサーアミノ酸残基を導入したものであることを特徴とする請求項１に記載のＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドの合成方法。
【請求項６】
ＨＩＶ粒子の膜貫通タンパク質ｇｐ４１のＣ末端側のヘリックス領域Ｃ３４ペプチドの誘導体を合成する工程におけるＣ３４ペプチドの誘導体が、下記一般式（３）で表される化合物であることを特徴とする請求項５に記載のＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドの合成方法。
【化３】
2012137479.tif 000017
【請求項７】
３本の等価なリンカー構造を持つＣ３対称性を有するテンプレート化合物と、前述のＣ３４ペプチドの誘導体とを結合することにより、Ｃ３４ペプチドの誘導体の３量体を合成する工程が、３本の等価なリンカー構造を持つＣ３対称性を有するテンプレート化合物と、Ｃ３４ペプチドの誘導体とを、緩衝液中で攪拌することにより、３本の等価なリンカー構造を持つＣ３対称性を有するテンプレート化合物と、前述のＣ３４ペプチドの誘導体とを結合させて、Ｃ３４ペプチドの誘導体の３量体を合成することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドの合成方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の合成方法によって合成されることを特徴とするＨＩＶ粒子の膜貫通タンパク質ｇｐ４１のＣ末端側のヘリックス領域Ｃ３４の３量体領域を認識するＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチド。
【請求項９】
３本の等価なリンカー構造を持つＣ３対称性を有するテンプレート化合物を介して、ＨＩＶ粒子の膜貫通タンパク質ｇｐ４１のＣ末端側のヘリックス領域Ｃ３４ペプチドの誘導体が３分子結合していることを特徴とするＣ３４の３量体領域を認識するＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチド。
【請求項１０】
下記一般式（４）で表される化合物又はその塩からなる請求項８又は９に記載のＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチド。
【化４】
2012137479.tif 000018
（式中、Ｘは正の整数を示し、Monomerは下記一般式（５）で表される化合物を示す）。
【化５】
2012137479.tif 000019
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれかに記載のＣ３４の３量体領域を認識するＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドを用いて宿主動物を感作し、該ペプチドに対する抗体を誘導することを特徴とするＣ３４の３量体領域を認識するＨＩＶ立体構造認識抗体の誘導方法。
【請求項１２】
請求項８〜１０のいずれかに記載のペプチドのＣ３４の３量体領域を認識するＨＩＶ立体構造認識抗体、又は、請求項８〜１０のいずれかに記載のペプチドを有効成分とする、ＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療剤。
【請求項１３】
ＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療が、請求項８〜１０のいずれかに記載のペプチドの抗ＨＩＶ活性によるものであることを特徴とする請求項１２に記載のＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療剤。
【請求項１４】
ＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療が、ＨＩＶ立体構造認識抗体の、ＨＩＶ粒子の膜貫通タンパク質ｇｐ４１のＣ末端側のヘリックス領域Ｃ３４の３量体領域への作用により、ｇｐ４１のＣ３４とＮ３６による６量体形成を阻害して、ＨＩＶの標的細胞への侵入を阻止するものであることを特徴とする請求項１２に記載のＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療剤。
【請求項１５】
請求項８〜１０のいずれかに記載のペプチドを有効成分とするＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療用ワクチンであることを特徴とする請求項１２に記載のＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：Human Immunodeficiency Virus）の立体構造を認識する抗体を誘導するペプチド、その合成方法、並びに、該ペプチドによって誘導されたＨＩＶ立体構造認識抗体又は該ペプチドを有効成分とするＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療剤に関する。特に、ＨＩＶの標的細胞内への侵入機構であるＨＩＶワクチンのＨＩＶ粒子の膜貫通タンパク質ｇｐ４１のＣ末端側のヘリックス領域Ｃ３４とＮ３６による６量体の形成に対して、ヘリックス領域Ｃ３４の３量体領域への作用により、該ｇｐ４１のＣ３４とＮ３６による６量体形成を阻害して、ＨＩＶの標的細胞への侵入を阻止するＨＩＶ立体構造を認識する抗体誘導ペプチド、その合成方法、並びに、該ペプチドによって誘導されたＨＩＶ立体構造認識抗体又は該ペプチドを有効成分とするＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
後天性免疫不全症候群（acquired immunodeficiency syndrome；ＡＩＤＳ）は１９８３年Montagnier Lらによって単離・発見されたヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus；ＨＩＶ）により引き起こされる疾患である（非特許文献１参照）。ＨＩＶの起源は、霊長類を自然宿主とするサル免疫不全ウイルス（Simian Immunodeficiency Virus；ＳＩＶ）が、突然変異によってヒトへの感染能力を獲得したことによるものと考えられている。ＨＩＶは空気感染ではなく、主に性的感染、血液感染、母子感染の３つの経路により感染する。性的感染は性分泌液が接触することが最大の原因とされており、血液感染は輸血、傷、注射針の使い回しなどが原因で感染が起る。そのため、倫理的観点からの感染予防が必要とされている。また、母子感染は、出産時の産道における体液の接触、母親の授乳、妊娠中における胎盤を通したウイルスの移動などが原因とされている。【０００３】
ＨＩＶは、レトロウイルスの一種であり、特にヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞を標的にして感染する外来性ウイルスである（非特許文献１参照）。ＨＩＶは、ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞に感染した後、比較的長い潜伏期間を経て活性化し、かかるＴ細胞を破壊する。Ｔ細胞は免疫系において重要な役割を果たしているため、Ｔ細胞の破壊により、体内の免疫能力が著しく低下する。その結果、正常な状態であれば簡単に排除できるような病原体に対しても、十分な抵抗力を発揮することができなくなり、慢性的な免疫不全状態、すなわち、「ＡＩＤＳ発症」と言われる状態に陥る。【０００４】
全世界のＨＩＶ感染者数は、増加のスピードこそ緩やかになったものの、既に３３００万人に達しており、２００７年の新規ＨＩＶ感染者数は２４０万人、ＨＩＶに関連する死亡者数は２００万人であった（非特許文献２参照）。特に、世界最大の人口を有するアジアでは、ＨＩＶの感染拡大が急速である。日本もその例外ではなく、先進国の中では異例であるものの、増加の一途をたどっている。具体的には、２００７年にはＡＩＤＳ患者数が４１８人、ＨＩＶ感染者数が１０８２人となり、初めて１０００人を超え現在も歯止めがかからないのが日本の現状である（非特許文献３参照）。しかしながら、ＨＩＶはその発見当時から盛んに研究が行われ、現在に至るまでの２５年の間に、感染症の診断法の確立、さらには治療法についても、他の感染症と比較して圧倒的な進歩を見せている（非特許文献４及び５参照）。治療薬に関するその精力的な研究開発により、ＡＩＤＳは直接死に至る病ではなくなった。しかし、根本的な治療法は未だ確立されておらず、新たな問題点も出現している。そのため新規な治療薬が望まれている。【０００５】
ＨＩＶは、標的細胞に結合するために必要なｇｐ１２０、ｇｐ４１と呼ばれる外被タンパク質を、宿主細胞由来のウイルス膜上に有している。ウイルス膜の内部には裏打ちタンパク質としてマトリクス（Matrix）タンパク質が存在し、これによりＨＩＶの構造が保たれている。また、ＨＩＶの核様体はカプシド（Capsid）タンパク質に囲まれた正１２面体構造をしており、その内部にＲＮＡゲノム、インテグラーゼ（integrase；ＩＮ）、プロテアーゼ（protease；ＰＲ）、逆転写酵素（reverse transcriptase；ＲＴ）を含んでいる（図１）。ＨＩＶのＲＮＡゲノムは、約９０００ｂｐであり、その遺伝子群は末端反復配列（long terminal repeat；ＬＴＲ）と呼ばれる構造にはさまれて存在している。この遺伝子にコードされる十数種類のウイルスタンパク質が複雑な複製を制御している（非特許文献４及び５参照）。【０００６】
ＨＩＶの標的細胞への侵入から出芽までの一連の増殖サイクルのことをライフサイクルという。このライフサイクルは以下の［１］〜［６］の各段階、すなわち、［１］ウイルスの細胞膜への吸着・膜融合、［２］ＲＮＡゲノムの逆転写、［３］ウイルスＤＮＡの宿主染色体への組み込みと複製、［４］ウイルス構成タンパク質のプロセッシング、［５］ウイルス粒子の構築、［６］出芽の過程に分けられ、ＨＩＶはこれらの過程を経て増殖していく（図２参照）（非特許文献４〜７参照）。【０００７】
１９８５年に最初の抗ＨＩＶ薬として開発されたアジドチミジン（ＡＺＴ）は、逆転写酵素の競合阻害薬であり、上記のライフサイクルを阻害することによって、ＨＩＶの増殖を抑制する薬剤である。このＡＺＴが開発されて以降、ＨＩＶのライフサイクルがより詳細に明らかとなり、抗ＨＩＶ薬の開発も飛躍的に進んできた（非特許文献８及び９参照）。その結果、現在では臨床応用されている抗ＨＩＶ薬は１５種類以上にも及び、作用機序の違う抗ＨＩＶ薬を併用するHighly Active Anti Retroviral Therapy（ＨＡＡＲＴ）が可能となった。このＨＡＡＲＴは、現在、ＨＩＶ感染者及びＡＩＤＳ患者の治療の主流となっており、一定の効果を上げている。しかし、体内ウイルス量を極力抑制し続けるためには、長期にわたった薬剤の投与が必要となり、その結果薬剤耐性株の出現、重篤な副作用、さらに高額な治費が必要となるといった問題点もある。特に薬剤耐性ウイルスの出現は深刻である。薬剤耐性ウイルスの出現の原因としては、薬剤の長期服用のほか、ＨＩＶはＤＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡの修復機構を持たないため、非常に変異を起こし易い（易変異性）ことが挙げられる。【０００８】
そこで、治療費の負担が軽く、かつ耐性ＨＩＶウイルスにも有効なＨＩＶ感染症の予防剤・治療剤の開発が望まれている。前述のＨＩＶのライフサイクルの［１］「ウイルスの細胞膜への吸着・膜融合」に着目したＨＩＶ感染症の予防・治療剤の候補として、ＨＩＶの外被タンパク質であるｇｐ１２０やｇｐ４１をターゲットとしたものの開発が進められている。ｇｐ１２０やｇｐ４１は、ＨＩＶが宿主細胞へ侵入する際の膜融合に関与する。感染前にはｇｐ４１はその大半がｇｐ１２０によって被われているが（図３の左図参照）、感染時には露出する（図３の右図参照）。ｇｐ４１のＮ末端側領域はＮ３６、Ｃ末端側領域はＣ３４と呼ばれ、Ｎ３６とＣ３４はそれぞれ３量体構造を形成している。ＨＩＶの宿主細胞との膜融合の機構を図４に示す。ＨＩＶは宿主細胞へ侵入する際、まず、ｇｐ１２０が宿主細胞のＣＤ４へ結合し、次にコレセプターと結合する。その後、ｇｐ４１が宿主細胞に突き刺さり、立体構造変化を起こす。そして３本のＮ３６を３本のＣ３４が外側から取り囲むように結合し、計６本のペプチド鎖が会合した6-helical bundleを形成することにより、ＨＩＶ膜と宿主細胞の膜が近づき、膜融合が成立する（図４参照）。【０００９】
ＨＩＶのこのような侵入機構に基づき、ｇｐ１２０やｇｐ４１を標的とし、かつ、抗ＨＩＶ活性を有する抗体がいくつか誘導されている。現在、ｇｐ４１に対する抗体として２Ｆ５抗体（非特許文献１０〜１３）と４Ｅ１０抗体（非特許文献１２〜１４）などが、また、ｇｐ１２０に対する抗体として２Ｇ１２抗体（非特許文献１５）とｂ１２抗体（非特許文献１６）などが、比較的強い抗ＨＩＶ活性（ＨＩＶ中和活性）を示すヒトモノクローナル抗体として見いだされている。また、特許文献１には、ｇｐ１２０に対する抗体を、ＨＩＶの感染を阻止するためや、ＨＩＶのライフサイクルに必須な段階を不活性化させるために用いることが記載されている。しかしながら、ＨＩＶゲノムは著しく易変異性であるためか、前述の抗体はある特定のＨＩＶ株に対して抗ＨＩＶ活性を示したものの、それ以外の株に対してはそれほど抗ＨＩＶ活性を示さなかったことから、現在のところ臨床応用にまでは至っていない。【００１０】
また、本発明者らは、これまでに、ｇｐ４１のＣ３４ペプチドと相互作用するＮ３６ペプチドの３量体構造を特異的に認識する中和抗体を誘導するペプチド抗原の合成に成功している（特許文献２）。このペプチド抗原は、３本の等価なリンカー構造を持つＣ３対称性を有するテンプレート化合物のそれぞれのリンカー構造に、Ｎ３６ペプチドの誘導体が１つずつ結合した抗原分子である。このＮ３６ペプチド三量体抗原を用いて誘導した中和抗体は、Ｎ３６ペプチド単量体を用いて誘導した中和抗体と比較して、Ｎ３６ペプチド３量体に対する特異性が高く、抗ＨＩＶ活性も３倍高かった。前述の特許文献２におけるＮ３６ペプチド三量体抗原により誘導された抗体は、Ｎ３６ペプチドの３量体に特異的に結合し、Ｎ３６ペプチドとＣ３４ペプチドによる6-helical bundle形成を阻害することによって、ＨＩＶ膜融合を阻害すると考えられる。また、臨床治験が行われた既知の抗ＨＩＶ活性ペプチドとして、Ｃ３４ペプチド誘導体単量体fuzeon（T-20/DP178）が知られている（非特許文献１７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００９−０８０１１８号公報
【特許文献２】ＷＯ／２０１０／１３４３０５パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Sinoussi, B. F., Montagnier, L. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science 20, 868-871 (1983)
【非特許文献２】WHO, World Health Statistics 2008
【非特許文献３】厚生労働省 エイズ動向委員会報告 「エイズ発生動向報告」2008年発行
【非特許文献４】山本 直樹 編 ヒトレトロウイルス研究の最前線 シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社2002年2月22日発行
【非特許文献５】Koyanagi, Y. Outline of the HIV replication and its celluiar: the track of an invader in cell. Virus 55, 251-258 (2005)
【非特許文献６】Carter, C. A., Ehrlich, L. S. Cell biology of HIV-1 infection of macrophages. Annu. Rev. Macrobiol. 62, 425-443 (2008)
【非特許文献７】Eckert, D. M., Kim, P. S. Mechanisms of viral membrane fusion and its inhibition. Annu. Rev. Biochem. 70, 777-810 (2001)
【非特許文献８】Baba, M. Recent progress of anti-HIV-1 reseach. Virus 54, 59-66 (2004)
【非特許文献９】Kwong, P. D., Wyatt, R., Robinson, J. Sructure of an HIV gp120 envelope glycoprotein in complex with the CD4 receptor and a newtralizing human antibody. Nature 393, 648-659 (1997)
【非特許文献１０】Conley, A. J., Kessler, J. A. II, Boots, L. J., Tung, J. S., Arnold, B. A., Keller, P. M., Shaw, A. R., and Emini, R. A. Neutralization of divergent human immunodeficiency virus type 1 variants and primary isolates by IAM-41-2F5, an anti-gp41 human monoclonal antibody Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 91, 3348-3352 (1994)
【非特許文献１１】Ofek, G., Tang, M., Sambor, A., Katinger, H., Mascola, J. R., Wyatt, R., and Kwong, P. D. Structure and mechanistic analysis of theanti-human immunodeficiency virus type 1 antibody 2F5 in complex with its gp41 epitope. J. Virol. 78, 10724-10737 (2004)
【非特許文献１２】Alam, S. M., McAdams, M., Boren, D., Rak, M., Scearce, R. M., Gao, F., Camacho, Z. T., Gewirth, D., Kelsoe, G., Chen, P., and Haynes, B. F. The role of antibody polyspecificity and lipid reactivity in binding ofbroadly neutralizing anti-HIV-1 envelope human monoclonal antibodies 2F5 and 4E10 to glycoprotein 41 membrane proximal envelope epitopes. J. Immunol. 178, 4424-4435 (2007)
【非特許文献１３】Nelson, J. D., Brunel, F. M., Jensen, R., Crooks, E. T., Cardoso, R. M. F., Wang, M., Hessell, A., Wilson, I. A., Binley, J. M., Dawson, P. E., Burton, D. R., and Zwick, M. B. An affinity-enhanced neutralizing antibody against the membrane-proximal external region of human immunodeficiency virus type 1 gp41 recognizes an epitope between those of 2F5 and 4E10. J. Virol.81, 4033-4043 (2007)
【非特許文献１４】Cardoso, R. M. F., Zwick, M. B., Stanfield, R. L., Kunert,R., Binley, J. M., Katinger, H., Burton, D. R., and Wilson, I. A. Broadly neutralizing anti-HIV antibody 4E10 recognizes a helical conformation of a highly conserved fusion-associated motif in gp41. Immunity 22, 163-173 (2005)
【非特許文献１５】Trkola, A., Purtscher, M., Muster, T., Ballaun, C., Buchacher, A., Sullivan, N., Srinivasan, K., Sodroski, J., Moore, J. P., and Katinger, H. Human monoclonal antibody 2G12 defines a distinctive neutralization epitope on the gp120 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 70, 1100-1108 (1996)
【非特許文献１６】Pantophlet, R., Saphire, E. O., Poignard, P., Parren, P. W. H. I., Wilson, I.A., and Burton, D. R. Fine mapping of the interaction of neutralizing and nonneutralizing monoclonal antibodies with the CD4 binding site of human immunodeficiency virus type 1 gp120. J. Virol. 77, 642-658 (2003)
【非特許文献１７】Akira Otaka, Miki Nakamura, Daisuke Nameki, Eiichi Kodama, Susumu Uchiyama, Syota Nakamura, Hiroaki Nakano, Hirokazu Tamamura, Yuji Kobayashi, Masao Matsuoka, and Nobutaka Fujii Remodeling of gp41-C34 Peptide Leads to Highly Effective Inhibitors of the Fusion of HIV-1 with Target Cells.  Angew. Chem. Int. Ed., 41(16), 2937-2940 (2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ＨＩＶワクチンの開発においてはこれまでの感染症に対して有効であった弱毒化ワクチン、生ワクチンといった方法がＨＩＶの易変異性ゆえに危険視されたこともあり使うことができないという問題があり、また、通常抗体誘導を行う際には、そのタンパク質における部分配列を合成しその配列特異的な抗体を誘導することを目的としているが、部分配列を用いて誘導された抗体はアミノ酸配列に特異的に結合し得るが、中和標的の立体構造に対しての特異性や結合活性は概して低いという問題がある。このように変異の激しいＨＩＶに対しても問題を生じることなく用いることができ、しかも、ＨＩＶの標的細胞への侵入機構としての中和標的の立体構造に対しての特異性や結合活性においても優れた特異性及び結合活性を有する抗体、或いはワクチン等のＨＩＶ感染症の予防・治療剤の開発に有効なＨＩＶ抗体誘導ペプチドが求められている。このようなペプチドとして、本発明者らは、これまでに、ＨＩＶのｇｐ４１のＮ３６ペプチドの３量体構造を特異的に認識する中和抗体を誘導するペプチド抗原の開発を行った（特許文献２参照）。【００１４】
しかし、ＨＩＶに対してより優れた、あるいは、新たな中和抗体を誘導し得るペプチドが、ＨＩＶ感染症の予防・治療のため、あるいは、予防・治療の選択肢の豊富化のために求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討する中で、ｇｐ４１のヘリックス領域の中でも重要なＣ３４と呼ばれる部分の３量体を化学合成し、ＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドとして用いることにより、抗ＨＩＶ活性やＨＩＶ感染に対する中和活性に優れた抗体を誘導し得ることを見いだし、本発明を完成するに至った。【００１６】
すなわち、本発明は、［１］ＨＩＶ粒子の膜貫通タンパク質ｇｐ４１のＣ末端側のヘリックス領域Ｃ３４ペプチドの誘導体を合成する工程、及び、３本の等価なリンカー構造を持つＣ３対称性を有するテンプレート化合物と、前述のＣ３４ペプチドの誘導体とを結合することにより、Ｃ３４ペプチドの誘導体の３量体を合成する工程からなることを特徴とするＣ３４の３量体領域を認識するＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドの合成方法や、［２］ＨＩＶ粒子の膜貫通タンパク質ｇｐ４１のＣ末端側のヘリックス領域Ｃ３４ペプチドの誘導体を合成する工程におけるＣ３４ペプチドの誘導体が、Ｃ３４の天然の配列であるＣ３４ペプチドのＣ末端側に、テンプレート化合物と結合するために必要なライゲーション部位を導入し、該Ｃ３４ペプチドの配列と該ライゲーション部位との間には立体障害による反応性の軽減を防ぐためにスペーサーアミノ酸残基を導入したものであることを特徴とする上記［１］に記載のＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドの合成方法や、［３］３本の等価なリンカー構造を持つＣ３対称性を有するテンプレート化合物として、下記一般式（１）で表される化合物又はその塩を用いることを特徴とする上記［１］又は［２］に記載のＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドの合成方法や、【００１７】
【化１】
2012137479.tif 000003
（式中、Ｘは正の整数を示す）
［４］３本の等価なリンカー構造を持つＣ３対称性を有するテンプレート化合物として、下記一般式（２）で表される化合物又はその塩を用いることを特徴とする上記［３］に記載のＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドの合成方法や、【００１８】
【化２】
2012137479.tif 000004
［５］ＨＩＶ粒子の膜貫通タンパク質ｇｐ４１のＣ末端側のヘリックス領域Ｃ３４ペプチドの誘導体を合成する工程におけるＣ３４ペプチドの誘導体が、Ｃ３４ペプチドのＣ末端側に親水性アミノ酸残基を付与し、更に、そのＣ末端側にライゲーション部位を導入し、該親水性アミノ酸残基と該ライゲーション部位との間には立体障害による反応性の軽減を防ぐためにスペーサーアミノ酸残基を導入したものであることを特徴とする上記［１］に記載のＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドの合成方法や、［６］ＨＩＶ粒子の膜貫通タンパク質ｇｐ４１のＣ末端側のヘリックス領域Ｃ３４ペプチドの誘導体を合成する工程におけるＣ３４ペプチドの誘導体が、下記一般式（３）で表される化合物であることを特徴とする上記［５］に記載のＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドの合成方法や、【００１９】
【化３】
2012137479.tif 000005
［７］３本の等価なリンカー構造を持つＣ３対称性を有するテンプレート化合物と、前述のＣ３４ペプチドの誘導体とを結合することにより、Ｃ３４ペプチドの誘導体の３量体を合成する工程が、３本の等価なリンカー構造を持つＣ３対称性を有するテンプレート化合物と、Ｃ３４ペプチドの誘導体とを、緩衝液中で攪拌することにより、３本の等価なリンカー構造を持つＣ３対称性を有するテンプレート化合物と、前述のＣ３４ペプチドの誘導体とを結合させて、Ｃ３４ペプチドの誘導体の３量体を合成することを特徴とする上記［１］〜［６］のいずれかに記載のＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドの合成方法に関する。【００２０】
また、本発明は、［８］上記［１］〜［７］のいずれかに記載の合成方法によって合成されることを特徴とするＨＩＶ粒子の膜貫通タンパク質ｇｐ４１のＣ末端側のヘリックス領域Ｃ３４の３量体領域を認識するＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドや、［９］３本の等価なリンカー構造を持つＣ３対称性を有するテンプレート化合物を介して、ＨＩＶ粒子の膜貫通タンパク質ｇｐ４１のＣ末端側のヘリックス領域Ｃ３４ペプチドの誘導体が３分子結合していることを特徴とするＣ３４の３量体領域を認識するＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドや、［１０］下記一般式（４）で表される化合物又はその塩からなる上記［８］又は［９］に記載のＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチド【００２１】
【化４】
2012137479.tif 000006
（式中、Ｘは正の整数を示し、Monomerは下記一般式（５）で表される化合物を示す）。【００２２】
【化５】
2012137479.tif 000007
に関する。【００２３】
さらに、本発明は、［１１］上記［８］〜［１０］のいずれかに記載のＣ３４の３量体領域を認識するＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドを用いて宿主動物を感作し、該ペプチドに対する抗体を誘導することを特徴とするＣ３４の３量体領域を認識するＨＩＶ立体構造認識抗体の誘導方法に関する。【００２４】
また、本発明は、［１２］上記［８］〜［１０］のいずれかに記載のペプチドのＣ３４の３量体領域を認識するＨＩＶ立体構造認識抗体、又は、上記［８］〜［１０］のいずれかに記載のペプチドを有効成分とする、ＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療剤や、［１３］ＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療が、上記［８］〜［１０］のいずれかに記載のペプチドの抗ＨＩＶ活性によるものであることを特徴とする上記［１２］に記載のＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療剤や、［１４］ＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療が、ＨＩＶ立体構造認識抗体の、ＨＩＶ粒子の膜貫通タンパク質ｇｐ４１のＣ末端側のヘリックス領域Ｃ３４の３量体領域への作用により、ｇｐ４１のＣ３４とＮ３６による６量体形成を阻害して、ＨＩＶの標的細胞への侵入を阻止するものであることを特徴とする上記［１２］に記載のＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療剤や、［１５］上記［８］〜［１０］のいずれかに記載のペプチドを有効成分とするＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療用ワクチンであることを特徴とする上記［１２］に記載のＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療剤に関する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、ＨＩＶの標的細胞への侵入機構としての中和標的の立体構造に対して優れた特異性及び結合活性を有する抗体或いはワクチンの開発に有効なＨＩＶ抗体誘導ペプチドを提供することができる。該ＨＩＶ抗体誘導ペプチドの提供により、ＨＩＶ立体構造認識抗体やワクチンの製造が可能となり、該ペプチド、該ワクチン或いはＨＩＶ立体構造認識抗体を有効成分とするＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療剤を提供することができる。ＨＩＶワクチンの開発においてはこれまでの感染症に対して有効であった弱毒化ワクチン、生ワクチンといった方法がＨＩＶの易変異性ゆえに危険視されたこともあり使うことができないという問題があったが、本発明のＨＩＶ抗体誘導ペプチドは、変異の激しいＨＩＶを標的とするアミノ酸配列だけではなく、ＨＩＶの標的細胞への侵入機構としての中和標的の立体構造に対しての特異性や結合活性を有する抗体或いはワクチンの開発に有効なＨＩＶ抗体誘導ペプチドを提供するものであるから、上記のような従来のＨＩＶワクチンの開発における問題を解決して、ＨＩＶ感染症に対して、安全かつ有効なＨＩＶ抗体やＨＩＶワクチンを提供することができ、ＨＩＶ感染症に対して、安全かつ有効なＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療剤を提供することができる。【００２６】
また、特許文献２におけるＮ３６ペプチド誘導体の場合、その３量体の抗ＨＩＶ活性は、その単量体に比べて３倍高い程度であるのに対し、本発明におけるＣ３４ペプチド誘導体の場合、その３量体の抗ＨＩＶ活性は、その単量体に比べて２０倍〜１００倍にも向上する。従って、本発明のＨＩＶ抗体誘導ペプチドを有効成分とするＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療剤は、ペプチドそのものが高い抗ＨＩＶ活性を示すことから、抗体誘導を介さない状況、例えば抗体が誘導される前から、その効果を発揮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＨＩＶの模式図を示す図である。
【図２】ＨＩＶのライフサイクルを示す図である。
【図３】ＨＩＶの外被タンパク質を示す図である。
【図４】ＨＩＶ膜融合の機構を示す図である。
【図５】ネイティブケミカルライゲーション反応の概要を示す図である。
【図６】Ｃ３４ペプチド誘導体３量体（C34 Trimer）の形成機構を示す図である。
【図７】Ｃ３４ペプチド誘導体３量体（C34 Trimer）のデザインを示す図である。
【図８】Ｃ３４ペプチド誘導体１（Ｃ３４誘導体１）の合成に関する図である。
【図９】Ｃ３４ペプチド誘導体２（Ｃ３４誘導体２）の合成に関する図である。
【図１０】テンプレート化合物の合成に関する図である。
【図１１】テンプレート化合物の合成スキームを示す図である。
【図１２】Ｃ３４ペプチド誘導体３量体（C34 Trimer）形成の反応経過を示す図である。
【図１３】Ｃ３４ペプチド誘導体３量体（C34 Trimer）の合成に関する図である。
【図１４】Ｃ３４ペプチド誘導体３量体（C34 Trimer）の２次構造解析の結果を示す図である。図（Ａ）中の実線は、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体のＣＤスペクトルを表し、図（Ａ）中の破線は、Ｃ３４ペプチド誘導体単量体のＣＤスペクトルを表す。図（Ｂ）中の破線は、Ｃ３４ペプチド誘導体単量体とＮ３６ペプチド誘導体単量体との混合物のＣＤスペクトルを表し、図（Ｂ）中の実線は、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体とＮ３６ペプチド誘導体単量体との混合物のＣＤスペクトルを表し、図（Ｂ）中の点線は、Ｎ３６ペプチド誘導体単量体のＣＤスペクトルを表す。
【図１５】Ｃ３４ペプチド誘導体３量体（C34 Trimer）等を免疫して得られた血清の抗体価を示す図である。図（Ａ）には、マイクロプレートにＣ３４ペプチド誘導体単量体をコーティングした場合の結果を示し、図（Ｂ）には、マイクロプレートにＣ３４ペプチド誘導体３量体をコーティングした場合の結果を示す。また、図（Ａ）及び（Ｂ）のグラフ中の黒四角は、Ｃ３４ペプチド誘導体単量体で誘導して得られた血清を用いた場合の結果を示し、黒丸は、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体で誘導して得られた血清を用いた場合の結果を示す。
【図１６】Ｃ３４ペプチド誘導体３量体で誘導された抗血清のＨＩＶ感染に対する中和活性を示す図である。“uninf.”は、非感染細胞の場合の結果を表し、“ｃｒ１”〜“ｃｒ３”は、免疫する１週間前の血清（コントロール）を用いた場合の結果を表し、“ｍ１”〜“ｍ３”は、Ｃ３４ペプチド誘導体単量体で誘導された血清を用いた場合の結果を表し、“ｔ１”〜“ｔ３”は、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体で誘導された血清を用いた場合の結果を表す。
【図１７】Ｃ３４ペプチド誘導体３量体のＨＩＶ感染に対する抗ＨＩＶ活性を示す図である。“Ｃ３４”は、Ｃ３４天然ペプチド単量体を用いた場合の結果を表し、“Ｃ３４ ＲＥＧ”は、Ｃ３４ペプチド誘導体単量体を用いた場合の結果を表し、“ｔｒｉＣ３４ ｅ”は、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体を用いた場合の結果を表す。横軸は、各ペプチドの濃度（μＭ）を示し、縦軸は各場合におけるｐ２４量（ｎｇ／ｍＬ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
１．ＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドの合成方法
本発明のＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドの合成方法（以下、単に「本発明のペプチドの合成方法」とも表示する。）は、ＨＩＶ粒子の膜貫通タンパク質ｇｐ４１のＣ末端側のヘリックス領域Ｃ３４ペプチドの誘導体（以下、単に「Ｃ３４ペプチド誘導体」とも表示する。）を合成する工程、及び、３本の等価なリンカー構造を持つＣ３対称性を有するテンプレート化合物（以下、単に「本発明におけるテンプレート化合物」とも表示する。）と、前述のＣ３４ペプチド誘導体とを結合することにより、Ｃ３４ペプチド誘導体の３量体を合成する工程からなることを特徴とするＣ３４の３量体領域を認識するＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドを合成する方法からなる。
【００２９】
本発明におけるＣ３４ペプチド誘導体とは、Ｃ３４ペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）において、１又は２個以上（好ましくは２〜１５個、より好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドの合成に用い得るペプチドを意味する。かかるＣ３４ペプチド誘導体としては、Ｃ３４ペプチドのＣ末端側に、本発明におけるテンプレート化合物とライゲーションし得るライゲーション部位（好適にはチオエステル基）を配置したペプチドを好適に例示することができ、中でも、Ｃ３４ペプチドの配列とＣ末端側とライゲーション部位との間に、立体障害による反応性の軽減を防止するためのスペーサーアミノ酸残基（好適にはＧｌｙ残基）を１〜２０アミノ酸残基（好適には１〜１０アミノ酸残基、より好適には１〜５アミノ酸残基、特に好適には１アミノ酸残基）導入したペプチドや、Ｃ３４ペプチドの配列とＣ末端側とライゲーション部位との間に、水溶性を増強するための親水性アミノ酸残基（好適にはＡｒｇ残基、Ｇｌｕ残基）を１〜２０アミノ酸残基（好適には２〜１８アミノ酸残基、より好適には３〜１２アミノ酸残基、特に好適には６アミノ酸残基）導入したペプチドをより好適に例示することができ、中でも、上記のスペーサーアミノ酸残基及び親水性アミノ酸残基を共に導入したペプチドをさらに好適に例示することができ、中でも、Ｃ３４ペプチドの配列、親水性アミノ酸残基、スペーサーアミノ酸残基、ライゲーション部位をＮ末端側からこの順で配置したペプチドをより好適に例示することができ、中でも、下記の一般式（３）で表される化合物を特に好適に例示することができる。
【００３０】
【化６】
2012137479.tif 000008
【００３１】
なお、ある特定のＣ３４ペプチド誘導体が、ＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドの合成に用い得るペプチドであるかどうかは、そのペプチドがＣ３４の３量体領域を認識するＨＩＶ立体構造認識抗体を誘導し得るかどうかを調べることによって確認することができる。
【００３２】
本発明のペプチドの合成方法において、Ｃ３４ペプチド誘導体を合成する工程において、Ｃ３４ペプチド誘導体を合成するには、Fmoc solid-phase peptide synthesis （ＳＰＰＳ）を用いることができる（Hirokazu Tamamura et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry 6 (1998)1033-1041や、“Solid phase peptide synthesis - a practical approach” by E Atherton & R C Sheppard IPI PRESS参照）。すなわち、固相合成法により、主鎖アミノ基の保護基である９−fluorenylmethoxycarbonyl（Ｆｍｏｃ）基の選択的脱保護と縮合反応の操作を繰り返し、最後に樹脂からの脱樹脂、脱保護を行なうことにより、目的とするペプチドを合成することができる。
【００３３】
本発明において、Ｃ３４ペプチド誘導体の３量体を合成する工程には、本発明におけるテンプレート化合物が用いられる。本発明におけるテンプレート化合物としては、下記一般式（１）（式中、Ｘは正の整数を示す）で表される化合物又はその塩を好適に例示することができる。
【００３４】
【化７】
2012137479.tif 000009
【００３５】
上記Ｘとしては、天然のｇｐ４１タンパク質におけるＣ３４の３量体の構造により近い、Ｃ３４ペプチド誘導体の３量体を得る観点から、１〜１０の範囲内の整数であることが好ましく、２〜８の範囲内の整数であることがより好ましく、２〜６の範囲内の整数であることがさらに好ましく、３〜５の範囲内の整数であることがより好ましく、４であることが特に好ましい。かかるテンプレート化合物を用いると、Ｃ３４ペプチド誘導体を簡便に、かつ、天然構造に類似した構造に３量体化することができる。本発明におけるテンプレート化合物の末端のＣｙｓ部分は、Ｃ３４ペプチド誘導体とのネイティブケミカルライゲーションに利用することができる。
【００３６】
本発明におけるテンプレート化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩などの塩の形態であってもよい。例えば、酸付加塩としては、塩酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩などの鉱酸塩や、シュウ酸塩、若しくは酒石酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。また、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、若しくはカルシウム塩などの金属塩や、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩若しくはエタノールアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。また、本発明におけるテンプレート化合物は、本発明に用い得る限り、１又は２個以上の任意の置換基を有していてもよい。２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。本発明に用い得る限り、置換基の存在位置は限定されず、置換可能な任意の部位に存在することができる。置換基の種類は特に限定されない。本発明におけるテンプレート化合物は、例えば後述の実施例１（３）記載の方法により作製することができる。
【００３７】
本発明におけるＣ３４ペプチド誘導体を、本発明におけるテンプレート化合物と結合することにより、Ｃ３４ペプチド誘導体の３量体を合成する工程において、Ｃ３４ペプチド誘導体の３量体を形成するには、ネイティブケミカルライゲーション反応を用いることができる（Dawson, P. E., Muir, T. W., Clark-Lewis, I., and Kent, S. B. H. (1994) Synthesis of proteins by native chemical ligation. Science 266, 776-779.；  Dawson, P. E., Churchill, M. J., Ghadiri, M. R., and Kent, S. B. H. (1997) Modulation of reactivity in native chemical ligation through the use of thiol additives. J. Am. Chem. Soc. 119, 4325-4329.）。すなわち、ネイティブケミカルライゲーション反応は、Ｃ末端がチオエステル化されたペプチドとＣｙｓがＮ末端に導入されたペプチドを用いて、２つのペプチドセグメントを縮合させ、長いペプチド鎖を得る方法として汎用されている。まず、Ｃ末端のチオエステルがチオフェノールとエステル交換反応を起こし、より反応性の高いチオエステルに変換される（図５ａ）。次に、Ｎ末端Ｃｙｓのチオール基が活性エステルのカルボニル基に求核攻撃して（図５ｂ）、その後自発的なＳ，Ｎアシル転位により、天然と同じ部位にアミド結合が形成される（図５ｃ及びｄ）。ＮＣＬ法では、ペプチドのＣ末端をコンジュゲーションに利用することができ、かつ反応は中性付近という緩和な条件で行うことができるので、本発明のペプチドの合成方法には特に適している。本発明におけるＣ３４ペプチド誘導体と、本発明におけるテンプレート化合物は、図６に示すような機構で反応して、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体が生成したと考えられる。
【００３８】
上記のネイティブケミカルライゲーション反応の方法としては、本発明におけるテンプレート化合物と、本発明で合成したＣ３４ペプチド誘導体とを、緩衝液中、より好ましくはtris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride（ＴＣＥＰ・ＨＣｌ）（７７３μｇ、２．６７μｍｏｌ）及びチオフェノール（９μＬ、８９μｍｏｌ）を溶解した０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（６０μＬ、ｐＨ８．５、６Ｍ尿素及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含む）中で攪拌することにより、３本の等価なリンカー構造を持つＣ３対称性を有するテンプレート化合物と、前述のＣ３４ペプチドの誘導体とを結合させて、Ｃ３４ペプチドの誘導体の３量体を合成する方法を好適に例示することができる。かかるネイティブケミカルライゲーション反応は、Ｃ３４ペプチド誘導体のＣ末端側のライゲーション部位（好適にはチオエステル基）と、本発明におけるテンプレート化合物のＣｙｓに特異的に起こり、反応の経過をＨＰＬＣ、ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いて追跡し、反応終了を検知することができる。
【００３９】
２．ＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチド
本発明のＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチド（以下、単に「本発明のペプチド」とも表示する。）としては、３本の等価なリンカー構造を持つＣ３対称性を有するテンプレート化合物を介して、ＨＩＶ粒子の膜貫通タンパク質ｇｐ４１のＣ末端側のヘリックス領域Ｃ３４ペプチドの誘導体が３分子結合していることを特徴とするＣ３４の３量体領域を認識するＨＩＶ立体構造認識抗体誘導ペプチドである限り特に制限されないが、下記一般式（４）（式中、Ｘは正の整数を示し、Ｍｏｎｏｍｅｒは下記一般式（５）で表される化合物を示す。）で表されるペプチド（Ｃ３４ペプチド誘導体の３量体）を好適に例示することができる。なお、ＭｏｎｏｍｅｒはＧの部分で、一般式（４）の化合物のＭｏｎｏｍｅｒ以外の部分と結合している。
【００４０】
【化８】
2012137479.tif 000010
【００４１】
【化９】
2012137479.tif 000011
【００４２】
上記一般式（４）におけるＸとしては、天然のｇｐ４１タンパク質におけるＣ３４の３量体の構造により近い、Ｃ３４ペプチド誘導体の３量体を得る観点から、１〜１０の範囲内の整数であることが好ましく、２〜８の範囲内の整数であることがより好ましく、２〜６の範囲内の整数であることがさらに好ましく、３〜５の範囲内の整数であることがより好ましく、４であることが特に好ましい。
【００４３】
３．ＨＩＶ立体構造認識抗体の誘導方法、及び、ＨＩＶ立体構造認識抗体
本発明のＨＩＶ立体構造認識抗体の誘導方法（以下、単に「本発明の誘導方法」とも表示する。）としては、本発明のペプチドを用いて、宿主動物を感作し、該ペプチドに対する抗体（以下、単に「本発明の抗体」とも表示する。）を誘導する方法である限り特に制限されない。ペプチドを用いて、それに対する抗体を誘導する方法は、従来公知の方法を用いることができる。本発明の誘導方法により誘導される本発明における抗体は、Ｃ３４の３量体領域を認識するＨＩＶ立体構造認識抗体である。本発明の抗体は、ヒト抗体を含む。ここで本発明において「ヒト抗体」とは、ヒト由来の抗体遺伝子の発現産物である抗体を意味する。ヒト抗体は、ヒト抗体遺伝子座を導入し、ヒト由来抗体を産生する能力を有するトランスジェニック動物に本発明のペプチドを投与することにより得ることができる。該トランスジェニック動物の例として例えばマウスが挙げられる。ヒト抗体を産生し得るマウスとして、例えば、内在性マウスイムノグロブリン（Ｉｇ）重鎖及びマウスκ軽鎖を欠損しており、かつ、ヒトＩｇ重鎖遺伝子を含む１４番染色体断片（ＳＣ２０）及びヒトＩｇκ鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を同時に保持するマウスを挙げることができる。このマウスはヒトＩｇ重鎖遺伝子座を持つ系統Ａのマウスと、ヒトＩｇκ鎖トランスジーンを持つ系統Ｂのマウスとの交配により作製される。系統Ａは、内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、子孫伝達可能な１４番染色体断片（ＳＣ２０）を保持するマウス系統（Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2000 Vol97:722）である。また、系統Ｂは内在性マウスＩｇ重鎖及びκ軽鎖欠損の両者についてホモ接合体であり、ヒトＩｇκ鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を保持するマウス系統（Nat Biotechnol., 1996 Vol14:845）である。
【００４４】
また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびその機能的断片のいずれであっても、Ｃ３４の３量体領域を認識するＨＩＶ立体構造認識抗体である限り、本発明における抗体である。本発明の抗体の機能的断片とは、本発明の抗体が特異的に結合する抗原に対して、特異的に結合する抗体の断片を意味し、より具体的にはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、disulphide-linked ＦＶ、Single-Chain ＦＶ（ｓｃＦＶ）およびこれらの重合体等が挙げられる（D.J.King,Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies,1998 T.J.International Ltd）。このような抗体断片は慣用法、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼによる抗体分子の消化、あるいは公知の遺伝子工学的手法により得ることができる。
【００４５】
本発明のポリクローナル抗体は、例えば、以下に述べる方法によって製造することができる。本発明のペプチドを、必要に応じて免疫賦活剤（Freund's Adjuvant等）とともに、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等の非ヒト哺乳動物に免疫することにより得られる。本発明のモノクローナル抗体は、免疫感作動物から得た抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、ハイブリドーマをクローン化し、免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって取得することができる。該ハイブリドーマの調製は、ケーラーおよびミルシュタインらの方法（Nature, 1975 Vol.256:495-497）およびそれに準じて行うことができる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェル中の培養上清の免疫抗原に対する反応性を、例えばＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ、蛍光抗体法などの免疫学的方法を用いて測定することにより行なうことができる。
【００４６】
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロで培養して培養上清から単離することができる。また、マウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等の腹水中等でのインビボで培養し、腹水から単離することもできる。また、ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主（例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入し、遺伝子組換え技術を用いて組換型抗体を調製することができる（P.J.Delves,ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES,1997 WILEY、P.Shepherd and C.Dean,Monoclonal Antibodies,2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS、J.W.Goding,Monoclonal Antibodies:principles and practice,1993 ACADEMIC PRESS）。
【００４７】
さらに、トランスジェニック動物作製技術を用いて目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックなウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタを作製し、そのトランスジェニック動物のミルク中からその抗体遺伝子に由来する抗体を大量に取得することも可能である。
【００４８】
産生された抗体は、当該分野において周知の方法、例えばプロテインＡカラムによるクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、硫安塩析法、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより精製することができる。
【００４９】
４．ＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療剤
本発明のＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療剤（以下、単に「本発明の剤」とも表示する。）は、本発明の抗体又は本発明のペプチドを有効成分としている限り特に制限されない。本発明のペプチドが誘導する本発明の抗体は、優れた抗ＨＩＶ活性や、ＨＩＶ感染に対する優れた中和活性を有しているため、本発明の剤は、ＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療剤として好適に用いることができる。また、本発明の剤には、本発明のペプチドを有効成分とするＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療用ワクチンが含まれる。
【００５０】
本発明の剤に含有される本発明の抗体や本発明のペプチドを有効成分としてＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療剤を調製する場合には、ペプチドや抗体を有効成分とした感染症の予防及び／又は治療剤において通常採用される製剤形態を採用することができる。例えば、ペプチドや抗体を有効成分とした感染症の予防及び／又は治療剤あるいはワクチンにおいて通常採用される製剤の形態、或いは、補助剤、添加剤を用いることができる。
【００５１】
本発明の剤中の本発明の抗体や本発明のペプチドの含有量としては、所望のＨＩＶ感染症の予防効果や治療効果が得られる限り特に制限されないが、例えば、剤の全量に対して０．００００１〜９０質量％、好ましくは０．０００１〜７０質量％、より好ましくは０．００１〜５０質量％とすることができる。
【００５２】
本発明の剤の投与方法としては、所望のＨＩＶ感染症の予防効果や治療効果が得られる限り特に制限されないが、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等を例示することができる。また本発明の剤の投与量や投与回数や投与濃度は、投与対象の体重等に応じて、適宜調節することができる。
【００５３】
本発明におけるＨＩＶ感染症とは、ＨＩＶに感染した状態である限り、その症状の有無や程度は特に制限されず、急性期の状態、無症候期の状態、ＡＩＤＳの状態のいずれも含まれる。また、本発明の剤が有するＨＩＶ感染症の予防効果には、ＨＩＶの感染自体を予防する効果、及び、ＡＩＤＳの発症を予防する効果のいずれも含まれ、本発明の剤が有するＨＩＶ感染症の治療効果には、ＨＩＶ感染に由来する症状を軽減する効果が含まれ、中でも、ＡＩＤＳの症状を軽減する効果を好適に含む。
【００５４】
また、本発明の剤の投与対象となる哺乳動物としては、特に制限されないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を好適に例示することができ、中でもヒトをより好適に例示することができる。
【００５５】
なお、本発明の他の態様として、ＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療に使用するための本発明の抗体又はペプチドや、本発明の抗体又はペプチドをＨＩＶ感染症の予防及び／又は治療に使用する方法や、本発明の抗体又はペプチドを対象に投与することにより、ＨＩＶ感染症を予防及び／又は治療する方法も例示することができる。これらの発明における文言の内容やその好ましい態様は、前述したとおりである。
【００５６】
以下、本発明を参考例や実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例の範囲に限定されることはない。
【実施例１】
【００５７】
［Ｃ３４ペプチド誘導体３量体の設計・合成］
（１）Ｃ３４ペプチド誘導体３量体の設計
目的とする抗原分子であるＣ３４ペプチド誘導体３量体は、Ｃ３４ペプチドを模倣したペプチド（Ｃ３４ペプチド誘導体）と、それを３個配置させるテンプレート化合物に分けて合成し、それらをコンジュゲーションさせたデザインとした（図７）。Ｃ３４ペプチドはＮ３６ペプチドと６へリックスバンドル（6-helical bundle）を形成する際に、Ｃ３４ペプチドのＮ末端側からＮ３６ペプチドに相互作用していくと考えられている。したがって、より早期の段階でＨＩＶの膜融合を阻害する抗体を誘導するためには、Ｃ３４ペプチドのＮ末端側領域を認識する抗体の方が重要であると推定した。そこで、Ｃ３４ペプチドのＮ末端側領域をより天然に近い状態で保持するために、Ｃ３４のＣ末端側をＣ３対称性テンプレート化合物とのコンジュゲーション部位とした（図７）。【００５８】
（２）Ｃ３４ペプチド誘導体の設計・合成
Ｃ３４ペプチド誘導体３量体の構成フラグメント用のＣ３４ペプチド誘導体としてＣ３４ペプチド誘導体１（Ｃ３４誘導体１）を設計し（図８）、Ｃ３４ペプチド単量体を模倣した比較例用抗原分子としてＣ３４ペプチド誘導体２（Ｃ３４誘導体２）を設計した（図９）。Ｃ３４誘導体１については、水溶性を向上させるために、親水性アミノ酸であるＡｒｇ（Ｒ）とＧｌｕ（Ｅ）の繰り返し配列を、Ｃ３４天然アミノ酸配列のＣ末端側に付与した。また、テンプレート化合物とのコンジュゲーションの際の立体障害軽減のため、スペーサーとしてＧｌｙ（Ｇ）を、親水性アミノ酸の繰り返し配列のＣ末端に導入した。さらに、Ｃ３対称性テンプレートとのコンジュゲーションに必要なライゲーション部位を導入するために、Ｃ末端をチオエステル化した設計とした（図８）。一方、Ｃ３４誘導体２については、テンプレート化合物とのコンジュゲーションを行わないため、Ｃ３４誘導体１において、ライゲーション部位を導入しない配列とした（図９）。【００５９】
Ｃ３４誘導体１及びＣ３４誘導体２の合成及び同定は、具体的には、以下のような方法で行った。ペプチド合成用としてＦｍｏｃ保護アミノ酸を含む化学試薬をNovabiochem社、国産化学株式会社、及び渡辺化学工業株式会社から購入し、NovaSyn（登録商標）ＴＧＲ樹脂（０．２３ｍｍｏｌ／ｇ、０．２０ｍｍｏｌスケール）を用いて、Ｃ３４関連ペプチドを合成した。次いで、マニュアルに従って固相ペプチドを合成した。また、側鎖保護アミノ酸としては、Ｌｙｓに対してＢｏｃを用い、Ａｒｇに対してＰｂｆを用い、Ａｓｐ及びＧｌｕに対してＯＢｕｔを用い、Ａｓｎ及びＧｌｎに対してＴｒｔを用い、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒに対してＢｕｔを用いた。ペプチドは全てＦｍｏｃ−化学法により調製した。各サイクルは、（ｉ）脱保護（２０％ピペリジン／ＤＭＦ）１５分間と、（ii）ＤＭＦ中、５当量のＦｍｏｃ−アミノ酸（Ｆｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨ）、ＨＯＢｔ及びＤＩＰＣＩとのカップリング９０分間とからなる。カイザーニンヒドリン（Kaiser ninhydrin）試験によりカップリング効率を調べた結果が陰性であったことから、遊離アミノ基の存在量が０．０５％未満であることが示唆された。カイザー試験の結果が弱陽性の場合には、Ｆｍｏｃアミノ酸（３当量）、ＨＯＢｔ（３当量）、ＤＩＰＥＡ（６当量）及びＨＢＴＵ（２．９当量）からなる混合物を用いてカップリングステップを繰り返した（ダブルカップリング）。保護ペプチドの構築完了後、樹脂を十分に洗浄し（ＤＭＦ及びＭｅＯＨ）、６時間真空乾燥させた。【００６０】
［Ｃ３４誘導体２］Ｃ３４誘導体２を合成するため、ＴＦＡ、チオアニソール、エタンジチオール、ｍ−クレゾール、Ｈ２Ｏ及びトリイソプロピルシランの混合液（１０／０．７５／０．７５／０．２５／０．２５／０．１，ｖ／ｖ）（４０ｍＬ）を用い、室温で９０分間処理することにより、樹脂から合成ペプチドを切り出した。この反応混合液をろ過し、樹脂をＴＦＡで洗浄した（５０ｍＬ×３回）。ろ液及び洗浄液を真空蒸発させ、ペプチドを沈殿させて冷Ｅｔ２Ｏで３回洗浄した。得られた粗ペプチドを逆相ＨＰＬＣで精製し、Ｃ３４誘導体２を得た。【００６１】
［Ｃ３４誘導体１］Ｃ３４誘導体１を合成するため、ＴＦＥ、酢酸及びジクロロメタンの混合液（１／１／３、ｖ／ｖ）（６７ｍＬ）を用い、室温で１２０分間処理することにより、樹脂から合成ペプチドを切り出した。この反応混合液をろ過し、樹脂をジクロロメタンで３回洗浄した。ろ液及び洗浄液を真空蒸発させ、ペプチドを固体として沈殿させた。未精製の保護ペプチド（５２２ｍｇ）を、ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中、エチル３−メルカプトプロピオン酸（２０当量）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１０当量）、及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣＩ・ＨＣｌ）（１０当量）により、０℃で１．５時間、チオエステル化した。この反応混合液を室温で一晩攪拌し、減圧下で濃縮した。この残留物にＨ２Ｏ（５０ｍＬ）を加え、得られた沈殿物をＨ２Ｏで３回洗浄した。得られたペプチド（６９２ｍｇ）を、ＴＦＡ／チオアニソール／ｍ−クレゾール／Ｈ２Ｏ／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）（８．８１／０．５０／０．３２／０．３２／０．０５、ｖ／ｖ）（３０ｍＬ）により、室温で２時間処理した。真空蒸発を行い、未精製のペプチド−チオエステルを冷Ｅｔ２Ｏ（５０ｍＬ）で沈殿させ、冷Ｅｔ２Ｏで３回洗浄し、逆相ＨＰＬＣにより精製し、Ｃ３４誘導体１を得た。【００６２】
精製したＣ３４誘導体１及びＣ３４誘導体２の両ペプチドを凍結乾燥させ、ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより同定を試みた。ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳは以下のように行った。１Ｈ ＮＭＲスペクトルはBruker AV500分光計を用いて記録した。化学シフトは、内部標準としてのＭｅ４Ｓｉ（ＣＤＣｌ３中）に対するδ（ｐｐｍ）で示した。JMS-T1000LC AccuTOF、及びBrucker Daltonics microTOF-2focusを用い、低分解能及び高分解能の質量スペクトルをポジティブ及びネガティヴ検出モードで記録した。フラッシュクロマトグラフィーには、Wakogel C-200（和光純薬工業株式会社製）及びsilica gel 60 N（関東化学株式会社製）を使用した。分析用ＨＰＬＣとして、Cosmosil 5C18-ARIIカラム（４．６×２５０ｍｍ、ナカライテスク株式会社製）を、JASCO PU-2089 plus（日本分光株式会社（英称ＪＡＳＣＯ）製）上、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを含むＣＨ３ＣＮの直線勾配を流速１ｃｍ３／ｍｉｎ-１で用い、その溶出物を２２０ｎｍの紫外線で検出した。分取ＨＰＬＣとして、Cosmosil 5C18-AR IIカラム（１０×２５０ｎｍ、ナカライテスク株式会社製）を、JASCO PU-2089 plus（ＪＡＳＣＯ社製）上、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを含むＣＨ３ＣＮの適切な勾配モードを流速３ｃｍ３／ｍｉｎ-１で用いた。このような条件で、Ｃ３４誘導体１及びＣ３４誘導体２についてＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析した結果を以下に示す。Ｃ３４誘導体２：Ｃ２１９Ｈ３４１Ｎ６６Ｏ７７Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値５１５９．５、実測値５１６０．１（５．３ｍｇ、収率１％）。Ｃ３４誘導体１：Ｃ２２４Ｈ３４９Ｎ６６Ｏ７８Ｓ２［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値５２７５．５、実測値５２７５．６（１１．３ｍｇ、収率１％）。このように、Ｃ３４誘導体２、Ｃ３４誘導体１のいずれも、収率１％で得られた。【００６３】
（３）テンプレート化合物の設計・合成
テンプレート化合物はＣ３４ペプチドのＣ末端に導入することとした。テンプレート化合物は、天然のＣ３４ペプチド３量体構造を高く反映できるように、Ｃ３対称性の特徴を持たせた。また、このテンプレート化合物のリンカーには、水溶性向上のためにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を導入し、また、Ｃ３４誘導体１のＣ末端チオエステルとの縮合に必要なＣｙｓを導入した（図１０）。このテンプレート化合物の合成を、図１１に示したスキームで行った。具体的には、以下のような方法で行った。【００６４】
１）化合物２の合成
図１１における化合物２の合成は以下のように行った。トリス−［３−｛２−（ビス−［２−エトキシ］）−エタノイル｝−プロピルオキシ］−ニトロメタン（４３９ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ)を含む乾燥ＴＨＦ溶液（４ｍＬ）を、ＮａＨ（ミネラルオイル中６０％分散物２０８ｍｇ、５．２１ｍｍｏｌ）を含む乾燥ＴＨＦ（２ｍＬ）に、０℃で１０分間かけて添加した。この混合液を０℃で１０分間攪拌した。この反応混合液に、（３−ブロモ−プロピル）−カルバミン酸tert−ブチルエステル（９９２ｍｇ、４．１７ｍｍｏｌ）を含む乾燥ＴＨＦ溶液（１．５ｍＬ）を０℃で１０分間かけて添加した。この反応混合液を室温で一晩攪拌し、セライトパッドでろ過した。このろ過溶液を減圧下で濃縮し、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（５０／１）を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィーに付し、標題の化合物２を無色油として得た（４２５ｍｇ、収率８８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１．４４（ｓ，２７Ｈ），１．４８（ｍ，６Ｈ），１．７６（ｑ，６Ｈ），１．９５−１．９９（ｍ，６Ｈ），３．２２−３．２５（ｍ，６Ｈ），３．４４（ｔ，６Ｈ），３．５２−３．６６（ｍ，４２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）δ＝１５６．０（３Ｃ），９４．１，７８．７（３Ｃ），７０．６（３Ｃ），７０．５（３Ｃ），７０．５（３Ｃ），７０．１（３Ｃ），７０．１（３Ｃ），６９．５（３Ｃ），６６．５（３Ｃ），３８．５（３Ｃ），３２．２（３Ｃ），２９．６（３Ｃ），２８．４（９Ｃ），２４．０（３Ｃ），２２．２（３Ｃ）；Ｃ５２Ｈ１０２Ｎ４ＮａＯ２０［Ｍ＋Ｎａ］＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値１１２５．６９８５，実測値１１２５．６９８０【００６５】
２）化合物３の合成
図１１における化合物３の合成は以下のように行った。４ＭのＨＣｌ／１，４−ジオキサン（１ｍＬ）に化合物２（１１８ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を加えた溶液を室温で５時間攪拌した。減圧下で濃縮し、粗化合物３を無色油として得（１０４ｍｇ）、精製せずに次のステップに供した。【００６６】
３）化合物４の合成
図１１における化合物４の合成は以下のように行った。乾燥ＤＭＦ（０．４５ｍＬ）に化合物３(９５．９ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０．１７ｍＬ、１．１８ｍｍｏｌ)を加えた混合液を室温で１０分間攪拌し、この反応混合液に、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（１８３ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（６０．３ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を含む乾燥ＤＭＦ溶液（０．４０ｍＬ）を添加し、室温で１０分間攪拌した。この混合液に、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ（７５．５  ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を添加し、室温で一晩攪拌した。得られた混合液を酢酸エチルで希釈した後、飽和水性ＮａＨＣＯ３及び塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。減圧下で濃縮し、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（３０／１）を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィーに付し、化合物４を無色油として得た（１４７ｍｇ、収率５８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１．４５−１．４９（ｍ，６Ｈ），１．５７−１．６０（ｍ，６Ｈ），１．７３（ｑ，６Ｈ），１．９２−１．９６（ｍ，６Ｈ），３．２９（ｍ，６Ｈ），３．４３（ｔ，６Ｈ），３．５２−３．６２（ｍ，４２Ｈ），４．９８（ｓ，３Ｈ），７．１９−７．４１（ｍ，４５Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）δ＝１７０．２（３Ｃ），１４４．５（３Ｃ），１２９．６（２７Ｃ），１２８．０（１８Ｃ），１２６．８（９Ｃ），９４．１，８０．１（３Ｃ），７０．７（３Ｃ），７０．６（３Ｃ），７０．５（６Ｃ），７０．５（６Ｃ），７０．２（３Ｃ），６９．４（３Ｃ），６７．０（３Ｃ），３７．５（３Ｃ），３４．３（３Ｃ），３２．２（３Ｃ），２９．０（９Ｃ），２８．３（３Ｃ），２４．０（３Ｃ）；Ｃ１１８Ｈ１５９Ｎ７ＮａＯ２３Ｓ３［Ｍ＋Ｎａ］＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値２１６１．０５４７，実測値２１６２１．０５４３【００６７】
４）化合物５の合成
図１１における化合物５（目的とするテンプレート化合物）の合成は以下のように行った。ＴＦＡ、Ｈ２Ｏ、エタンジチオール及びトリイソプロピルシラン（９０／５／２．５／２．５、ｖ／ｖ）の混合液に、化合物４（１０３ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）を加えた溶液を室温で３時間攪拌し、減圧下で濃縮した。残留物にＥｔ２Ｏ（１５ｍＬ）を添加した。得られた沈殿物を遠心分離により回収し、上清を除去した。その後、沈殿物をＥｔ２Ｏで３回洗浄した。分取ＨＰＬＣで精製し、化合物５（目的とするテンプレート化合物）を無色油として得た（２８．８ｍｇ、収率５４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１．４１（ｓ，２７Ｈ），１．４４−１．４８（ｍ，６Ｈ），１．７６（ｑ，６Ｈ），１．９５−１．９７（ｍ，６Ｈ），２．９４−３．０４（ｍ，６Ｈ），３．１９−３．３６（ｍ，６Ｈ），３．４８−３．６３（ｍ，４８Ｈ），４．０７（ｔ，３Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）δ＝１６７．７（３Ｃ），７０．３，６９．６（１５Ｃ），６９．４（３Ｃ），６９．２（３Ｃ），６８．３（３Ｃ），５４．６（３Ｃ），３６．７（３Ｃ），３１．６（３Ｃ），２８．２（３Ｃ），２４．８（３Ｃ），２３．１（３Ｃ）；Ｃ４６Ｈ９４Ｎ７Ｏ１７Ｓ３［Ｍ＋Ｈ］＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値１１１２．５８６８，実測値１１１２．５８５８【００６８】
（４）Ｃ３４ペプチド誘導体３量体の合成
上記の実施例１（２）において合成したＣ３４誘導体１と、上記の実施例１（３）において合成したテンプレート化合物を用意し、次いで、Ｃ３４誘導体１とテンプレート化合物とのコンジュゲートを行った。コンジュゲートには、ネイティブケミカルライゲーション（Native Chemical Ligation；ＮＣＬ）法（Dawson, P. E., Muir, T. W., Clark-Lewis, I., and Kent, S. B. H. (1994) Synthesis of proteins by native chemical ligation. Science 266, 776-779.；  Dawson, P. E., Churchill, M. J., Ghadiri, M. R., and Kent, S. B. H. (1997) Modulation of reactivity in native chemical ligation through the use of thiol additives. J. Am. Chem. Soc. 119, 4325-4329.）を選択した。ＮＣＬ法の概要は図５に示したとおりである。合成したテンプレート化合物とＣ３４誘導体１は、図６に示すような機構で反応して、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体（C34 Trimer）が生成されたと考えられる。【００６９】
Ｃ３４ペプチド誘導体３量体の合成及び同定は、具体的には、以下のような方法で行った。ＴＣＥＰ・ＨＣｌ（７７３μｇ、２．６７μｍｏｌ）及びチオフェノール（９μＬ、８９μｍｏｌ）を、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（６０μＬ、ｐＨ８．５、６Ｍ尿素及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含む）に窒素雰囲気下で溶解し、そこに、化合物５であるテンプレート化合物（１００μｇ、０．０９０μｍｏｌ）、Ｃ３４誘導体１（１．７７ｍｇ、０．３０μｍｏｌ）及びアセトニトリル２０μＬを加えた。３７℃で５時間、攪拌下で反応を行い、反応経過をＨＰＬＣで観察した。反応開始から３時間経過後のＨＰＬＣチャートを図１２に示す。Ｃ３４ペプチド誘導体３量体を単一ピークとして分離した。さらに、逆相ＨＰＬＣにより、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体の精製を行った。逆相ＨＰＬＣでは、アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）の３３〜４３％直線勾配を用いる溶出を４０分間行った。そのＨＰＬＣチャート等を図１３に示す。精製Ｃ３４ペプチド誘導体３量体を収率１７％で得た。この精製Ｃ３４ペプチド誘導体３量体をＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳで同定した。
Ｃ７０３Ｈ１１０８Ｎ２０５Ｏ２４５Ｓ６［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ計算値１６５３３．９，実測値１６５４２．６【００７０】
システイン残基のチオール基をキャップするため、ヨードアセトアミド（７７７μｇ、４．２μｍｏｌ）を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（７４μＬ、ｐＨ７．８、６Ｍ尿素及び５ｍＭ ＥＤＴＡを含む）により、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体（３６８μｇ、０．０２μｍｏｌ）を室温で処理した。しかし、ＨＰＬＣ及びＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析において反応は観察されず、システイン残基のチオール基が非反応性であることが示唆された。２量体又はオリゴマーの形成が、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体のシステイン残基間のジスルフィド架橋によるものか否かを調べるため、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体の分子量を還元条件及び非還元条件にて測定した。その結果、緩衝液条件では、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体の殆どが単量体（単一のＣ３４ペプチド誘導体３量体）として存在していることが示唆された。
【実施例２】
【００７１】
［Ｃ３４ペプチド誘導体３量体の２次構造解析］
Ｃ３４ペプチド誘導体３量体の２次構造解析を行うために、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルの測定を行った。具体的には以下のような方法で行った。上記の実施例１で得られたＣ３４ペプチド誘導体３量体（最終濃度２μＭ）をＰＢＳ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に溶解した。サーモレギュレーターを備えたＪ−７２０円偏光二色性分光計（ＪＡＳＣＯ社製）にこの溶解液をセットし、そのモル楕円率［θ］の波長依存性を、２５℃下、１９５〜２５０ｎｍで観察した。また、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体（最終濃度２μＭ）に代えて、上記の実施例１で得られたＣ３４ペプチド誘導体単量体（Ｃ３４誘導体２）（最終濃度６μＭ）を用いて、同様の方法でＣＤスペクトルを測定した。その結果を図１４（Ａ）に示す。【００７２】
Ｃ３４ペプチド誘導体３量体のＣＤスペクトル（図１４（Ａ）中の実線）、及び、Ｃ３４ペプチド誘導体単量体のＣＤスペクトル（図１４（Ａ）中の破線）のいずれも約２００ｎｍで極小値を示した。約２００ｎｍ付近の負の極大は、ランダムコイル構造の特徴であることから、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体やＣ３４ペプチド誘導体単量体はランダムコイル構造を形成していることが示唆された。以前の文献では、Ｎ３６の単量体（Ｎ３６ＲＥ）、及び、Ｎ３６の３量体（ｔｒｉＮ３６ｅ）が高度なα−ヘリシティを形成し、へリックス含量は、Ｎ３６ＲＥよりもｔｒｉＮ３６ｅの方が多かったことが報告されている（Nakahara, T., Nomura, W., Ohba, K., Ohya, A., Tanaka, T., Hashimoto, C., Narumi, T., Murakami, T., Yamamoto, N., and Tamamura, H. (2010) Remodeling of dynamic structures of HIV-1 envelope proteins leads to synthetic antigen molecules inducing neutralizing antibodies. Bioconjugate Chem. 21, 709-714.；  Chan, D. C., Chutkowski, C. T., and Kim, P. S. (1998) Evidence that a prominent cavity in the coiled coil of HIV type 1 gp41 is an attractive drug target. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 15613-15617.）。これらの結果から、Ｃ３４に由来する単量体ペプチド及び３量体ペプチドは、Ｎ３６由来ペプチドに比べ、ランダムコイル構造を形成する傾向があることが示唆された。【００７３】
さらに、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体とＮ３６ペプチドとの相互作用を評価するために、Ｎ３６由来ペプチドであるＮ３６ペプチド誘導体単量体（以下のＮ３６ＲＥ参照）と、Ｃ３４ペプチド誘導体（３量体又は単量体）との混合物におけるＣＤスペクトルを測定した。【００７４】
【化１０】
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【００７５】
具体的には、以下のような方法で行った。Ｃ３４ペプチド誘導体単量体（最終濃度６μＭ）と、Ｎ３６ペプチド誘導体単量体（最終濃度６μＭ）とを含むＰＢＳ溶解液を用意し、前述したのと同様の方法でＣＤスペクトルを測定した。また、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体（最終濃度２μＭ）と、Ｎ３６ペプチド誘導体単量体（最終濃度６μＭ）とを含むＰＢＳ溶解液についても、同様の方法でＣＤスペクトルを測定した。さらに、Ｎ３６ペプチド誘導体単量体（最終濃度６μＭ）のみを含むＰＢＳ溶解液についても、同様の方法でＣＤスペクトルを測定した。これらの結果を、図１４（Ｂ）に示す。Ｃ３４ペプチド誘導体単量体と、Ｎ３６ペプチド誘導体単量体とのペプチド混合物におけるＣＤスペクトル（図１４（Ｂ）中の破線）や、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体と、Ｎ３６ペプチド誘導体単量体とのペプチド混合物におけるＣＤスペクトル（図１４（Ｂ）中の実線）では、いずれの場合も、極小値が２０８ｎｍと２２２ｎｍの２回出現したことから、両ペプチド混合物がα−ヘリシティを形成していることが示された。また、図１４（Ｂ）の結果から、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体と、Ｎ３６ペプチド誘導体単量体とのペプチド混合物におけるヘリックス含量は、Ｃ３４ペプチド誘導体単量体と、Ｎ３６ペプチド誘導体単量体とのペプチド混合物におけるヘリックス含量よりも少ないことが示された。このことから、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体では、３本のペプチド鎖が共有結合により会合しているために、Ｃ３４ペプチド誘導体単量体と比較して、Ｎ３６との相互作用が比較的困難であることが裏付けられた。
【実施例３】
【００７６】
［Ｃ３４ペプチド誘導体による抗体誘導実験］
Ｃ３４ペプチド誘導体３量体の抗体誘導能を確認するために、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体や、Ｃ３４ペプチド誘導体単量体を用いて抗体誘導実験を試みた。具体的には、以下のような方法で行った。ＢＡＬＢ／ｃ系統の６週齢の雄マウスを三協ラボサービス株式会社から購入し、特定病原体を含まない条件下で動物施設にて飼育した。フロイント不完全アジュバント及びＰＢＳは、和光純薬工業株式会社から購入した製品を用いた。また、ＤＭＳＯ（エンドトキシンフリー）は、Sigma-Aldrich社から購入した製品を用いた。以下の実験プロトコールは東京医科歯科大学の倫理委員会で承諾されたものである。
１００μｇのＣ３４ペプチド誘導体３量体を５０μＬのＰＢＳに溶解した。この溶液にフロイント不完全アジュバント５０μＬを添加し混合した。この混合液を、麻酔下の各マウスに０、７、１４、２１及び２８日目に皮下注射した。採血は、免疫を行う１週間前に行い、また、免疫から５、１２、１９、２６及び３３日目に行った。これらの各血液を、４℃で１０分間、遠心分離（１５００ｒｐｍ）にかけて血清を分離した。この血清を５６℃で３０分間加熱して、補体を不活化させた。各血清は、使用するまで−８０℃で保存した。また、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体に代えて、同重量のＣ３４ペプチド誘導体単量体を用い、かつ、５０μＬのＰＢＳに１μＬのＤＭＳＯに溶解したこと以外は同じ方法で血清を得た。
【実施例４】
【００７７】
［Ｃ３４ペプチド誘導体を免疫して得られた血清の抗体価の評価］
上記の実施例３で得られた血清の抗体価を評価するための系として、ＥＬＩＳＡ法を採用した。すなわち、上記の実施例３で得られた、免疫から３３日目の血清の抗体価及び選択性を、コーティングした合成抗原に対する血清力価で評価した。具体的には、以下の方法で行った。
まずは試薬の準備を行った。Ｔｗｅｅｎ−２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウリン酸）及び３０質量％過酸化水素は和光純薬工業株式会社から購入した。２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）はSigma-Aldrich社から購入した。抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ヤギ）−ＨＲＰ抗体は、EMD Chemicals社（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。次いで、合成ペプチド（Ｃ３４ペプチド誘導体３量体又はＣ３４ペプチド誘導体単量体）を１０μｇ／ｍＬで含むＰＢＳを２５μＬ用い、９６ウエルのマイクロプレートを４℃で一晩コーティングした。コーティングしたマイクロプレートを脱イオン水で１０回洗浄した後、１５０μＬのブロッキングバッファー（５質量％スキムミルクを含む０．０２質量％のＰＢＳＴ（０．０２質量％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ））を用い、３７℃で１時間ブロッキングを行った。このマイクロプレートを脱イオン水で１０回洗浄した。一方、上記の実施例３で得られた各マウス血清を、１質量％スキムミルク含有０．０２質量％ＰＢＳＴで希釈し、２００倍から４０９６００倍までの２倍希釈系列を各血清について作製した。これらの各希釈液を５０μＬずつ前述のマイクロプレートの各ウエルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、これらのマイクロプレートを脱イオン水で１０回洗浄した。次いで、０．０２質量％ＰＢＳＴで２０００倍に希釈したＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体（２次抗体）溶液を各ウエルに２５μＬずつ添加し、４５分間インキュベートした。それからこのマイクロプレートを１０回洗浄した。次いで、ＨＲＰ染色緩衝液２００μＬ（０．５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０、１ｍＬ）、Ｈ２Ｏ２（３μＬ）及びＨ２Ｏ（８．８ｍＬ）の混合液）に１０ｍｇのＡＢＴＳを溶解することにより調製したＨＲＰ基質溶液を各ウエルに２５μＬずつ添加した。３０分間インキュベートした後、０．５ＭのＨ２ＳＯ４を１ウエル当たり２５μＬ添加して反応を停止させ、４０５ｎｍでその溶液の吸光度を測定した。【００７８】
これらの操作によって、得られた血清の抗体価を測定した。マイクロプレートにＣ３４ペプチド誘導体単量体をコーティングした場合の結果を図１５（Ａ）に示し、マイクロプレートにＣ３４ペプチド誘導体３量体をコーティングした場合の結果を図１５（Ｂ）に示す。図１５（Ａ）及び（Ｂ）のグラフ中の黒四角は、Ｃ３４ペプチド誘導体単量体で誘導して得られた血清を用いた場合の結果を示し、黒丸は、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体で誘導して得られた血清を用いた場合の結果を示す。【００７９】
Ｃ３４ペプチド誘導体単量体に誘導された抗体の５０％結合血清希釈液の濃度は、コーティングしたＣ３４ペプチド誘導体単量体に対して１．０６×１０−３、コーティングしたＣ３４ペプチド誘導体３量体に対して１．３０×１０−３であり、前者の濃度に対する後者の濃度の比率は約１．２倍であった。他方、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体に誘導された抗体の５０％結合血清希釈液の濃度は、コーティングしたＣ３４ペプチド誘導体３量体に対して３．１５×１０−４、コーティングしたＣ３４ペプチド誘導体単量体に対して７．３０×１０−３であり、前者の濃度に対する後者の濃度の比率は約２３倍であった。本評価では精製モノクローナル抗体を使用しなかったにも関わらず、産生された抗体が、単量体又は３量体の各抗原に対する構造選択性を示したことは特筆すべきことである。この結果から、立体構造を伴う抗原を合成することにより、構造特異性を有する抗体の作製が効率よくできることが強く示唆された。
【実施例５】
【００８０】
［Ｃ３４ペプチド誘導体３量体誘導抗血清のＨＩＶ感染に対する中和活性の評価］
Ｃ３４ペプチド誘導体３量体がＨＩＶ感染に対する中和活性（阻害活性）を有しているかどうかを調べるために、上記の実施例３で得られた血清についてｐ２４アッセイを行った。ｐ２４はＨＩＶ−１のコアを構成するカプシドタンパク質であり、ＨＩＶに感染した生物中でＨＩＶが増殖すると、その生物の血清中のｐ２４濃度が上昇することが知られている。ｐ２４アッセイを行なうに際し、まずＨＩＶ−１ウイルスの調製を行なった。具体的には以下のような方法を用いた。【００８１】
HIV-1 molecular cloneであるｐＮＬ４−３（clade B； X4-tropic virus）を用意した。次に、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（ＷＡＫＯ社製）を入れた直径６ｃｍのディッシュに２９３ＦＴ細胞を添加し、６０％コンフルエントになるまで培養した。リン酸カルシウム法により、１０μｇのｐＮＬ４−３を２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間培養した後、培養液の上清を回収し、その上清を直径０．４５μｍのフィルターでろ過したものをウイルス溶液とした。このウイルス溶液を液体窒素で急冷した後、使用するまで−８０℃以下にて保存した。【００８２】
ｐ２４を５０ｎｇ含むＮＬ４−３ウイルスを、４℃で２０分間、２１００ｇでスピノキュレーション（spinoculation）することによりＭＴ−４細胞（５×１０４細胞／２００μＬ）に感染させた。このＭＴ−４細胞から非結合ウイルスを洗浄除去した後、ＭＴ−４細胞を、上記の実施例３で得られた各マウス血清１０μＬを含む培地２００μＬに再懸濁し、次いで、培養した。培養の際、培地の半分を２〜３日毎に交換した。感染から７日目に、培養上清中のｐ２４の量を、ｐ２４ＥＬＩＳＡキット（PerkinElmer社製）を用いて測定した（Ohba, K., Ryo, A., Dewan, M. Z., Nishi, M., Naito, T., Qi, X., Inagaki, Y., Nagashima, Y., Tanaka, Y., Okamoto, T., Terashima, K., and Yamamoto, N. (2009) Follicular dendritic cells activate HIV-1 replication in monocytes/macrophages through a juxtacrine mechanism mediated by P-selectin glycoprotein ligand 1. J. Immunol. 183, 524-532.）。測定は、各血清について３回ずつ行った。【００８３】
培養上清中のｐ２４量（ｐｇ／ｍＬ）を図１６に示す。“uninf.”は、非感染細胞の場合の結果を示し、“ｃｒ１”〜“ｃｒ３”は、免疫する１週間前の血清（コントロール）を用いた場合の結果を示し、“ｍ１”〜“ｍ３”は、Ｃ３４ペプチド誘導体単量体で誘導された血清を用いた場合の結果を示し、“ｔ１”〜“ｔ３”は、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体で誘導された血清を用いた場合の結果を示す。Ｃ３４ペプチド誘導体単量体で免疫したマウスの血清もＣ３４ペプチド誘導体３量体で免疫したマウスの血清も、ウイルス感染に対する同程度の中和活性を示した。Ｃ３４ペプチド誘導体３量体で免疫して得られた血清は、中和活性（実施例５参照）だけではなく、構造特異性（上記実施例４参照）も有していることから、Ｃ３４ペプチド誘導体単量体で免疫したマウスの血清と中和活性は同程度でも含まれる抗体群が質的に異なり、中和のメカニズムも質的に異なる可能性があり、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体で免疫して得られる構造特異的モノクローナル抗体の方が、ｇｐ４１の単なるアミノ酸の違い／変異に対して抵抗性があると思われる。したがって、本発明者らがこれまでに見いだしたＮ３６ペプチド誘導体３量体（Nakahara, T., Nomura, W., Ohba, K., Ohya, A., Tanaka, T., Hashimoto, C., Narumi, T., Murakami, T., Yamamoto, N., and Tamamura, H. (2010) Remodeling of dynamic structures of HIV-1 envelope proteins leads to synthetic antigen molecules inducing neutralizing antibodies. Bioconjugate Chem. 21, 709-714.）と同様に、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体は新たな分類のＨＩＶ−１ワクチンとして有効に機能すると考えられる。
【実施例６】
【００８４】
［Ｃ３４ペプチド誘導体３量体の抗ＨＩＶ活性の評価］
Ｃ３４ペプチド誘導体３量体が抗ＨＩＶ活性を有しているかどうかを調べるために、ＴＺＭ−ｂｌ細胞を用いたウイルス融合阻害アッセイを行った。ＴＺＭ−ｂｌ細胞には、ＨＩＶ−１のＬＴＲ（long terminal repeat）配列に連結されたルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれており、ＨＩＶ−１の感染をルシフェラーゼシグナルに基づいて検出することができる。ウイルス融合阻害アッセイは、具体的には、以下の方法で行った。ｐ２４を５ｎｇ含むＮＬ４−３ウイルス、及び、希釈系列ペプチドと共に、ＴＺＭ−ｂｌ細胞（２×１０４細胞／１００μＬ）を培養した。培養４８時間後、ＴＺＭ−ｂｌ細胞を溶解し、Steady-Glo ルシフェラーゼアッセイ系（Promega社製）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した（Platt, E. J., Wehrly, K., Kuhmann, S. E., Chesebro, B., and Kabat, D. (1998) Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infection by macrophage tropic isolates of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 72, 2855-2864.）。ルシフェラーゼ活性の測定値に基づいて、各ペプチドのＥＣ５０（μＭ）を算出した。また、このウイルス融合阻害アッセイにおける、ＴＺＭ−ｂｌ細胞の生存率の減少に基づいて、各ペプチドのＣＣ５０（μＭ）を算出した。なお、希釈系列ペプチドのペプチドとしては、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体（triC34e）、Ｃ３４ペプチド誘導体単量体（C34REG）の他、Ｃ３４天然ペプチド単量体（C34）（Ｃ３４ペプチド誘導体単量体からＲＥの繰り返し配列とＧ残基を除いたもの）も用いた。【００８５】
このウイルス融合阻害アッセイで算出したＥＣ５０（μＭ）及びＣＣ５０（μＭ）の結果を表１に示す。なお、表１の数値はいずれも、少なくとも３回以上実験を繰り返して得られたデータの平均値を示す。【００８６】
【表１】
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【００８７】
表１のＥＣ５０に示されるように、Ｃ３４ペプチド誘導体単量体（C34REG）でも強力な抗ＨＩＶ活性（ウイルス融合阻害活性）を示したが、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体（triC34e）はさらにその１００倍もの顕著な抗ＨＩＶ活性を示した。３量体ペプチドの方が格別強力な抗ＨＩＶ活性を有していることは特筆すべきであり、３量体形態が阻害剤の活性構造として重要であることが示された。一方、表１のＣＣ５０に示されるように、１５μＭのＣ３４ペプチド誘導体単量体（C34REG）や、５μＭのＣ３４ペプチド誘導体３量体（triC34e）では、細胞毒性は観察されなかった。
【実施例７】
【００８８】
Ｃ３４ペプチド誘導体３量体が抗ＨＩＶ活性を有しているかどうかを調べるために、上記実施例６と同様の方法でＭＴ−４細胞を用いたアッセイを行った。ＭＴ−４細胞(５ ×１０，０００cells)に、ｐ２４を１ｎｇ含むＮＬ４−３ウイルスを感染させ、５％ＣＯ２存在下、４℃で３０分間インキュベートした。遠心沈降後、培養上清を除去し、段階希釈したペプチド溶液を含む１５０μＬの培地を、ＭＴ−４細胞に加えた。５％ＣＯ２存在下、３７℃で３日間インキュベートした。インキュベート後の培養上清中のｐ２４濃度（ｎｇ／ｍＬ）を市販のELISA kit (ZeptoMetrix Corp., Buffalo, NY) を使用して測定した。その結果を図１７及び表２に示す。図１７から分かるように、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体（Ｃ３４ ｔｒｉ）を用いた場合は、Ｃ３４天然ペプチド単量体（Ｃ３４ ｐｅｐｔｉｄｅ）や、Ｃ３４ペプチド誘導体単量体（Ｃ３４ ｍｏｎｏｍｅｒ）を用いた場合と比較して、ｐ２４濃度が顕著に低下した。これらの結果から算出したＥＣ５０（μＭ）を表２に示す。なお、表２の数値はいずれも、少なくとも３回以上実験を繰り返して得られたデータの平均値を示す。Ｃ３４天然ペプチド単量体（Ｃ３４）や、Ｃ３４ペプチド誘導体単量体（Ｃ３４ ＲＥＧ）では１μＭ以上であったのに対し、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体（ｔｒｉＣ３４ｅ）では約５０ｎＭであった。このことから、Ｃ３４ペプチド誘導体３量体（ｔｒｉＣ３４ｅ）は、Ｃ３４天然ペプチド単量体（Ｃ３４）や、Ｃ３４ペプチド誘導体単量体（Ｃ３４ ＲＥＧ）に対して、それぞれ約３０倍或いは約２０倍の優れた抗ＨＩＶ−１活性を有していることが示された。【００８９】
【表２】
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【００９０】
なお、臨床治験が行われた既知の抗ＨＩＶ活性ペプチドとして、Ｃ３４ペプチド誘導体単量体fuzeon（T-20/DP178）が知られている（非特許文献１７）。非特許文献１７には、Ｃ３４天然ペプチド単量体及びfuzeon（DP178）のＭＡＧＩアッセイによる抗ＨＩＶ活性測定結果が示されており、ＥＣ５０値の比較においてfuzeonはＣ３４天然ペプチド単量体の約１０倍の活性を示すことが報告されている。これに対し、本願実施例の実験結果に示されているように、本発明のＣ３４ペプチド誘導体３量体は、アッセイ法は異なるもののＥＣ５０値の比較において、Ｃ３４天然ペプチド単量体に対し約３０倍高い抗ＨＩＶ活性を示している。これらの知見より、本発明のＣ３４ペプチド誘導体３量体は、fuzeonと比較して優れた高活性な抗ＨＩＶ活性を有すると推定される。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明は、ＨＩＶ感染症の予防や治療の分野に特に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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