(57)【要約】  本発明は、ヒトＰＧＥ２受容体サブタイプＥＰ４に結合し、ＥＰ４の機能を阻害する抗体又はその機能的断片の提供を目的とする。さらに、該抗体又はその機能的断片を含む医薬の提供を目的とする。ヒトＰＧＥ２受容体サブタイプＥＰ４をマウスに免疫し、ＥＰ４による細胞内ｃＡＭＰ上昇を抑制するモノクローナル抗体をスクリーニングした。また、取得したモノクローナル抗体のＣＤＲの配列決定を行った。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＧＥ２受容体サブタイプＥＰ４の細胞外ドメインに結合し、ＥＰ４の機能を阻害する抗体又はその機能的断片。
【請求項２】
前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項３】
前記抗体が国際寄託受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０２（ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４）、  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０３（ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１）のハイブリドーマから産生されることを特徴とする請求項２に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項４】
前記ＥＰ４の機能が、細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させることである、請求項１乃至３のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項５】
ＥＰ４の細胞外ドメインに特異的に結合し、その相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列について、下記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のいずれかを満たすことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
（Ａ）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
（Ｃ）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
【請求項６】
ＥＰ４の細胞外ドメインに特異的に結合し、その重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列について、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかを満たすことを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（ｂ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
（ｃ）配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
【請求項７】
ＥＰ４の細胞外ドメインに結合し、ＥＰ４の機能を阻害する抗体又はその機能的断片であって、請求項３乃至６のいずれかに記載の抗体と同一のエピトープに結合する、抗体又はその機能的断片。
【請求項８】
ヒト化抗体又はキメラ抗体であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項９】
ヒト抗体であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項１０】
抗体断片、一本鎖抗体、又はダイアボディであることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項１１】
配列番号１、配列番号３、配列番号１１、配列番号１３、配列番号４１、配列番号４２であらわされる請求項５又は６に記載の抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターが導入された細胞。
【請求項１４】
請求項１乃至１０のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を含む医薬組成物。
【請求項１５】
ＥＰ４の機能異常によって発症及び/又は進展する疾患の予防あるいは治療に用いられる、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
治療対象疾患が、免疫疾患であることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
治療対象疾患が、腫瘍であることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
治療対象疾患が、疼痛であることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１乃至１０のいずれかに記載の抗ＥＰ４抗体又はその機能的断片が担体に固定化されてなる抗体固定化担体。
【請求項２０】
ＥＰ４発現細胞を含む血液を接触させて、前記体液からＥＰ４発現細胞を除去するために用いられることを特徴とする請求項１９に記載の抗体固定化担体。
【請求項２１】
請求項１乃至１０のいずれかに記載の抗ＥＰ４抗体を含む細胞表面上のＥＰ４発現量を測定するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトプロスタグランジンＥ２受容体サブタイプＥＰ４に対するモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロスタグランジン（ＰＧ）は、トロンボキサンと共にプロスタノイドと称される生理活性物質で、プロスタン酸骨格を持つ脂質である。プロスタグランジンなどのプロスタノイドは、ホスホリパーゼＡ２により膜リン脂質から遊離されるアラキドン酸から生合成される。プロスタグランジンは、その５員環に付く酸素原子と二重結合の相違により、Ａ〜Ｊの各群に区別される。また、プロスタン酸骨格側鎖の二重結合の数によって、１〜３群に区別される。例えば、プロスタグランジンＥ（ＰＧＥ）には、プロスタン酸骨格側鎖に存在する二重結合の数が相違する、ＰＧＥ１、ＰＧＥ２、ＰＧＥ３の各群が存在する。
ＰＧは、アラキドン酸からシクロオキシゲナーゼＩ（ＣＯＸ-Ｉ）あるいはシクロオキシゲナーゼＩＩ（ＣＯＸ-ＩＩ）により生合成されるＰＧＧ２からＰＧＨ２が生じ、その後、酸素原子間の結合の切断の相違により、ＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２αなどが生じる。さらに、ＰＧＥ２からは、ＰＧＡ２、ＰＧＣ２などが生産されていく。各ＰＧの生成反応は、特異的な酵素の作用によって生じており、これらの酵素には組織特異性が存在し、各組織の機能に応じたＰＧを産生しているものと考えられている。【０００３】
ＰＧの中でもＰＧＥは、様々な重要な生物活性を担っているとされており、その特異的受容体を介して血管拡張、血圧降下、子宮収縮の他、免疫系の調節などに関与していると考えられている。ＰＧＥ２の受容体は、他のＰＧ受容体と同様に、７回膜貫通Ｇタンパク質共役型受容体である。ＰＧＥ２受容体は、ＥＰと略称され、４種類のサブタイプ（ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、ＥＰ４）の存在が明らかにされている。各サブタイプは生体内において、ＥＰ１が細胞内Ｃａ２＋の上昇、ＥＰ２及びＥＰ４がｃＡＭＰの上昇、ＥＰ３がｃＡＭＰの減少に関与している（非特許文献１）。４種類のサブタイプは、タンパク質構造上高い相同性を有している。【０００４】
ＥＰ４に選択性の高い低分子化合物アンタゴニストを、実験的自己免疫性脳脊髄炎あるいは接触過敏症を誘導したマウスに投与すると、所属リンパ節内のＴＨ１及びＴＨ１７細胞の両方の蓄積が減少し、疾患の進行が抑制されることが報告された（非特許文献２）。樹状細胞においては、ＰＧＥ２はＥＰ４の活性化を介したｃＡＭＰの上昇によりＩＬ−２３の産生を亢進させることが示されている。また、ＴＨ１７細胞においては、ＰＧＥ２はＩＬ−２３と協調してＴＨ１７細胞の増殖にかかわることが示されている。ＴＨ１７細胞においても、ＥＰ４の活性化を介したｃＡＭＰ上昇が細胞内情報伝達に重要な役割を果たしていることが示されている（非特許文献３）。このような報告から、ＰＧＥ２受容体、特にＥＰ４選択的アンタゴニストが、ＴＨ１あるいはＴＨ１７が関与する免疫異常に起因する疾患、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、炎症性腸疾患及び接触性皮膚炎などの治療に効果的であることが示唆されている（非特許文献２）。【０００５】
多くの癌細胞が正常細胞と比較してＣＯＸ−ＩＩを過剰発現していることが報告されている。さらにＰＧＥ２が癌組織あるいは周辺組織に対して作用し、癌の進行に関与することが示されている。例えば、ＰＧＥ２は難治性の炎症性乳癌細胞あるいは肺癌細胞の転移組織への浸潤に関わることが示されている（非特許文献４、５）。またＰＧＥ２はＥＰ４を介して非小細胞肺癌細胞、大腸癌細胞、炎症性乳癌細胞、Ｂリンパ球、前立腺癌細胞、黒色腫の増殖に関与することが知られている。
ＮＫ細胞は、直接癌細胞を攻撃する作用を有するが、ＰＧＥ２はその作用を阻害することが知られている。ＰＧＥ２のＮＫ細胞活性阻害の機構としては、ＥＰ４の活性化を介した細胞内のｃＡＭＰ上昇が示されている（非特許文献６）。さらに、癌免疫を抑制すると考えられているＴｒｅｇ細胞がＥＰ４を介して活性化することが知られており、癌細胞に対する生体内の免疫機構を低下させる可能性が示されている（非特許文献７）。このような報告から、ＰＧＥ２が癌の進展に重要であることが明らかである。そこでＰＧＥ２の産生にかかわるＣＯＸの、非選択的阻害剤による臨床研究が試みられているが、副作用により充分な治療成績をあげることができていない。ＰＧＥ２受容体、特にＥＰ４選択的アンタゴニストが直接的に癌細胞の増殖を抑制し、かつ自己の癌免疫機構を賦活化させることができることから、ＥＰ４受容体に選択的に結合する抗体は、様々な癌、例えば、乳癌、大腸癌、肺癌、前立腺癌、皮膚癌、Ｂリンパ腫の治療に効果的であることが期待される。【０００６】
従来より、非特異的なＣＯＸ阻害剤は疼痛の軽減に応用されている。しかしながら非特異的阻害剤については胸やけ、消化不良、吐き気、腹部膨満、下痢、胃痛、消化性潰瘍、消化管出血といった副作用を発生することが知られている。近年、ＣＯＸ―ＩＩ選択的阻害剤（例えばセレコキシブ、ロフェコキシブ）が疼痛治療を目的として開発された。しかしＣＯＸ―ＩＩ選択的阻害剤は特定の患者において重篤な心血管系障害を発症させる可能性が示唆されており、異なる作用機序で疼痛を軽減する薬剤が望まれている。ＣＯＸにより産生されるＰＧのうち、ＰＧＥ２は痛覚の過敏性を増強させることが知られている。特に、ＰＧＥ２受容体の中でＥＰ４が痛覚の過敏性の増強に関わることが複数の動物試験で証明されている。例えばラット脊髄後根神経節（ＤＲＧ）では、炎症性疼痛モデルにおいてＥＰ４の発現が増強し、ＥＰ４の比較的選択的アンタゴニスト（ＡＨ２３８４８）が同モデルでの疼痛の感受性を軽減することが知られている（非特許文献８）。また、ＥＰ４のノックアウトマウスを用いた解析でも同様の結果が得られている（非特許文献９）。このような報告から、ＥＰ４の機能を選択的に遮断する医薬品は免疫異常を伴う疾患、癌、疼痛治療に有効で、かつ副作用が少ないものとなりうることが示唆される。
ＥＰ４の機能を選択的に遮断する方法としては、低分子化合物によるアンタゴニストが複数報告されているが、医薬品として開発に成功しているものはない。低分子化合物のアンタゴニストは、ＰＧＥ２受容体サブタイプ（ＥＰ１〜４）に対する結合選択性やトロンボキサンあるいはその他のプロスタノイド受容体への結合親和性の軽減といった改良の余地がある。充分な受容体選択性がなければＣＯＸ阻害剤同様の副作用が発生する懸念がある。
ＥＰ４受容体に選択的に結合する抗体は、低分子化合物と比較して受容体選択性が高いことが期待される。さらに抗体医薬は、低分子化合物と比べて一般的に血中半減期が長いため、一回の投与で長期に薬効を保持することが期待され、慢性疾患（例えば関節リウマチ、大腸炎、癌など）においては有用である。【０００７】
膜タンパク質（受容体）に対する抗体医薬の主要な作用機序は、当該タンパク質を発現する細胞を抗体が認識した後、補体依存性細胞溶解作用（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）に基づき除去するものが一般的であった。しかしながら、ＣＤＣやＡＤＣＣはマクロファージ等の炎症細胞の活性化を伴い、免疫異常に起因する疾患や疼痛治療には必ずしも適切とはいえない。したがって、ＥＰ４を選択的に阻害しうるモノクローナル抗体を免疫異常に起因する疾患や疼痛治療に応用する場合には、ＣＤＣやＡＤＣＣによらない機能性抗体が望ましい。すなわち、ＥＰ４依存的細胞内情報伝達を選択的に遮断する抗体が望ましい。【０００８】
これまで特許第３１１８４６０号（特許文献１）においてＥＰ４に対する抗体の取得法に関する記載があるが、低用量でＥＰ４特異的にその機能を抑制しかつ、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３には結合しない具体的な抗体の報告はいまだにない。また、特許第３１１８４６０号に記載されている一般的なモノクローナル抗体の取得法では、７回膜貫通型受容体に対する機能性抗体を取得することは一般的に困難であることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第３１１８４６０号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８２，１１６１３−１１６１７  ２００７
【非特許文献２】Ｙａｏら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１５，６３３−６４０  ２００９
【非特許文献３】Ｓａｋａｔａら、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ .,１１２（１）:１?５. ２０１０
【非特許文献４】Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ＦＭ  Ｃａｎｃｅｒ. ２０１０ Ｊｕｎ １;１１６（１１ Ｓｕｐｐｌ）:２８０６−１４.
【非特許文献５】Ｍａｒｔｉｎｅｔ Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ. ２０１０ Ｓｅｐ １５;８０（６）:８３８−４５.
【非特許文献６】Ｓｈａｒｍａ ＳＤ,   Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ. ２０１０ Ｍａｒ;９（３）:５６９−８０.
【非特許文献７】Ｓｈａｒｍａ Ｓら  Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ２００５ Ｊｕｎ １５;６５（１２）:５２１１−２０
【非特許文献８】Ｌｉｎ Ｃ.-Ｒ.ら Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２００６ ３１９:３ （１０９６−１１０３）
【非特許文献９】Ｐｏｐｐ Ｌ.らＥｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｉｎ．２００９  １３:７ （６９１−７０３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、免疫異常に起因する疾患、腫瘍、疼痛の治療薬として有用なヒトＰＧＥ２受容体のＥＰ４サブタイプに対する抗体と当該抗ヒトＥＰ４抗体を含む医薬組成物等の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ヒトＰＧＥ２受容体のＥＰ４サブタイプに対するモノクローナル抗体の作製を試みたところ、ＥＰ４サブタイプの細胞外ドメインに特異的に結合し、かつＥＰ４の機能（例えば、細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させる機能）を抑制する抗体の取得に成功し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（２１）である。
（１）ＰＧＥ２受容体サブタイプＥＰ４の細胞外ドメインに結合し、ＥＰ４の機能を阻害する抗体又はその機能的断片。
（２）前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする上記（１）に記載の抗体又はその機能的断片。
（３）上記抗体が国際寄託受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０２、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０３のハイブリドーマから産生されることを特徴とする上記（２）に記載の抗体又はその機能的断片。
（４）上記ＥＰ４の機能が、細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させることである、上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
（５）ＥＰ４の細胞外ドメインに特異的に結合し、その相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列について、下記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のいずれかを満たすことを特徴とする上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
（Ａ）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
（Ｃ）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
（６）ＥＰ４の細胞外ドメインに特異的に結合し、その重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列について、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかを満たすことを特徴とする上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（ｂ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
（ｃ）配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
（７）ＥＰ４の細胞外ドメインに結合し、ＥＰ４の機能を阻害する抗体又はその機能的断片であって、上記（３）乃至（６）のいずれかに記載の抗体と同一のエピトープに結合する、抗体又はその機能的断片。
（８）ヒト化抗体又はキメラ抗体であることを特徴とする上記（１）乃至（７）のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
（９）ヒト抗体であることを特徴とする上記（１）乃至（７）のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
（１０）抗体断片、一本鎖抗体、又はダイアボディであることを特徴とする上記（１）乃至（９）のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
（１１）配列番号１、配列番号３、配列番号１１、配列番号１３、配列番号４１、配列番号４２であらわされる上記（５）又は（６）に記載の抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする核酸。
（１２）上記（１１）に記載の核酸を含むベクター。
（１３）上記（１２）に記載のベクターが導入された細胞。
（１４）上記（１）乃至（１０）のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を含む医薬組成物。
（１５）ＥＰ４の機能異常によって発症及び／又は進展する疾患の予防または治療に用いられる（１４）に記載の医薬組成物。
（１６）治療対象疾患が、免疫疾患であることを特徴とする上記（１５）に記載の医薬組成物。
（１７）治療対象疾患が、腫瘍であることを特徴とする上記（１５）に記載の医薬組成物。
（１８）治療対象疾患が、疼痛であることを特徴とする上記（１５）に記載の医薬組成物。
（１９）上記（１）乃至（１０）のいずれかに記載の抗ＥＰ４抗体又はその機能的断片が担体に固定化されてなる抗体固定化担体。
（２０）ＥＰ４発現細胞を含む血液を接触させて、前記体液からＥＰ４発現細胞を除去するために用いられることを特徴とする上記（１９）に記載の抗体固定化担体。
（２１）上記（１）乃至（１０）のいずれかに記載の抗ＥＰ４抗体を含む細胞表面上のＥＰ４発現量を測定するキット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、ＥＰ４特異的にその機能を抑制する抗体が初めて提供される。【００１４】
本発明により、ＥＰ４に関連する本発明の医薬はＥＰ４に関連する免疫疾患、腫瘍および疼痛の治療又は予防が可能となる。特に、低分子化合物に比べ、ＥＰ４サブタイプに対して結合選択性の高い本発明の抗体を使用することで、副作用などの少ない治療効果を提供することができる。【００１５】
本発明の抗体固定化担体により、癌、自己免疫疾患などを罹患している患者の血液から、ＥＰ４発現細胞を選択的に除去することが出来る。【００１６】
本発明のＥＰ４発現量を測定キットにより、癌、自己免疫疾患などを罹患している患者の血液からＥＰ４発現細胞を検出し、疾病の状態を評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、親株 Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞並びにヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株に対する、マウスアイソタイプコントロール抗体並びにＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４，  ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１の結合を解析したフローサイトメトリーの結果である。
【図２】図２は、親株 Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞並びにヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株に対する、マウスアイソタイプコントロール抗体並びにＮＢＧ０１６−ｍＡｂ９の結合を解析したフローサイトメトリーの結果である。
【図３】図３は、ＰＧＥ２誘発のｃＡＭＰ上昇に対するマウスアイソタイプコントロール抗体並びにＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４，  ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１による抑制効果を解析した結果である。
【図４】図４は、ＰＧＥ２誘発のｃＡＭＰ上昇に対するマウスアイソタイプコントロール抗体並びにＮＢＧ０１６−ｍＡｂ９による抑制効果を解析した結果である。
【図５】図５は、ヒトＥＰ１〜４、マウスＥＰ１〜４遺伝子導入２９３ＦＴ細胞に対するＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４の結合を解析したフローサイトメトリーの結果である。
【図６】図６は、ヒトＥＰ１〜４、マウスＥＰ１〜４遺伝子導入２９３ＦＴ細胞に対するＮＢＧ０１６−ｍＡｂ９の結合を解析したフローサイトメトリーの結果である。
【図７】図７は、ヒト末梢血液のリンパ球分画に対するマウスアイソタイプコントロール抗体並びにＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４，ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１の結合を解析したフローサイトメトリーの結果である．
【図８】図８は、ヒト末梢血液のリンパ球分画に対するマウスアイソタイプコントロール抗体並びにＮＢＧ０１６−ｍＡｂ９の結合を解析したフローサイトメトリーの結果である。
【図９】図９は、ヒト単球系ＴＨＰ１細胞株をＰＭＡで処理後、抗ＥＰ４抗体で免疫染色した結果である。
【図１０】図１０は、親株 Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞並びにヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株に対する、抗体遺伝子未導入細胞の培養上清並びにリコンビナント抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ９遺伝子発現細胞の培養上清の結合を解析したフローサイトメトリーの結果である。
【図１１】図１１は、親株 Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞並びにヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株に対する、マウスアイソタイプコントロール抗体並びにリコンビナント抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４、リコンビナント抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１の結合を解析したフローサイトメトリーの結果である。
【図１２】図１２（Ａ）は、親株 Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞並びにヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株に対する、マウスアイソタイプコントロール抗体並びにマウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１の結合を解析したフローサイトメトリーの結果である。また図１２（Ｂ）は、ＰＧＥ２誘発のｃＡＭＰ上昇に対するマウスアイソタイプコントロール抗体並びにマウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１による抑制効果を解析した結果である。
【図１３】図１３は、親株 Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞並びにヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株に対する、抗体遺伝子未導入細胞の培養上清並びにヒトキメラ型抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４遺伝子発現細胞の培養上清、ヒトキメラ型抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１遺伝子発現細胞の培養上清の結合を解析したフローサイトメトリーの結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、ヒトＰＧＥ２受容体サブタイプＥＰ４の細胞外ドメインに結合し、ＥＰ４の機能を抑制する抗体又はその機能的断片、及び、これらの抗体又はその機能的断片を含む医薬である。
【００１９】
ＥＰ４タンパク質の定義
本発明の抗原となるＥＰ４タンパク質としては、ＥＰ４タンパク質をコードするｃＤＮＡなどから調製された組換えタンパク質などを使用することができる。あるいは、ＥＰ４を細胞表面に発現する適当な細胞などを抗原として使用してもよい。ヒトＥＰ４タンパク質をコードする核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公開されたデータベースなどから検索できる（例えば、アクセッション番号：ＮＭ＿０００９５８）。この遺伝子配列などに基づいて作製したプローブ又はＰＣＲ増幅用のプライマーペアなどを使用して、適当なＤＮＡライブラリーからＥＰ４をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡなど）を調製することができる。あるいは人工ＤＮＡ合成法で、全ｃＤＮＡを調整することができる。その一例として、配列番号２１にヒトＥＰ４に対応するアミノ酸配列を示す。ヒトＥＰ４には、配列番号２１に示すもの以外にアミノ酸置換体等の各種のバリアントが知られている。本発明における「ヒトＥＰ４」には、ＥＰ４としての機能を有する限り、前記バリアントが含まれる。
ヒトＥＰ４の細胞内および細胞外ドメインは、配列番号２１に示すアミノ酸配列における以下の部分に相当すると考えられている。左側がアミノ酸番号、右側が各ドメインである。なお各ドメイン間の境界については、多少の前後（１〜５アミノ酸残基、好ましくは、１〜３アミノ酸残基、より好ましくは１〜２アミノ酸残基）が生じ得る。
【００２０】
１〜  １９：Ｎ末端ドメイン
４４〜５４：細胞内第１ループドメイン
８０〜９６：細胞外第１ループドメイン
１１６〜１３５：細胞内第２ループドメイン
１６１〜１８４：細胞外第２ループドメイン
２１２〜２６７：細胞内第３ループドメイン
２９６〜３１２：細胞外第３ループドメイン
３３３〜４８８：Ｃ末端ドメイン
【００２１】
抗体又は機能性抗体の定義
本発明のＥＰ４の機能を抑制する抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが含まれ、該抗体の機能的断片には、Ｆａｂ又はＦ(ａｂ’)２などの抗体断片、又は、単一鎖抗体などが含まれ、抗体の一部をなすポリペプチド（あるいは、ポリペプチド複合体）、であってＥＰ４の機能を抑制するものであれば、如何なるものも本発明の範囲に含まれる。
【００２２】
ＥＰ４に対する特異的機能性抗体の定義と評価方法
ＥＰ４の機能としては、例えば、細胞内におけるｃＡＭＰの上昇、  Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）の活性化などの機能を挙げることができる。これらの細胞内の変化が癌細胞の増殖、Ｔリンパ球の細胞増殖、サイトカイン産生を制御することが知られている。本発明の抗体がヒトＰＧＥ２受容体サブタイプＥＰ４の細胞外ドメインに特異的に結合することは次のように示すことができる。ヒトＥＰ４タンパク質をコードする核酸配列を発現ベクターに挿入し、ベクターを適当な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入する。非破壊状態のアミノ酸の挿入、欠失、置換等を有しないＥＰ４発現宿主細胞又はＥＰ４非発現宿主細胞と、本発明の抗体とを接触させ一定時間反応させる。過剰な抗体を洗浄後、細胞をＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法あるいはフローサイトメトリー法で細胞に結合している抗体量を測定する。非発現宿主細胞と比較してＥＰ４発現宿主細胞に本発明の抗体がより多く結合することでＥＰ４の細胞外ドメインへの結合を示すことができる。さらに、ヒト又はマウス由来ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３もしくはＥＰ４タンパク質をコードする核酸配列を挿入した発現ベクターを構築し、上述と同様に受容体発現宿主細胞を解析する。本発明の抗体はヒトＥＰ４発現宿主細胞への結合がその他の受容体細胞発現細胞と比較して多い、好ましくは、ヒトＥＰ４以外の受容体発現細胞への結合が認められないことを示すことができる。
【００２３】
本発明の抗体が、ＥＰ４の機能を阻害する抗体であることは次のように示すことができる。ヒトＥＰ４タンパク質をコードする核酸配列を発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入する。ヒトＥＰ４発現宿主細胞と抗体を０．０１〜３０μｇ／ｍＬで接触させたのちＰＧＥ２を１０-１２〜１０-６Ｍの濃度でさらに接触させる。その後、細胞内のｃＡＭＰの上昇を適切な方法で測定する。本発明の抗体を添加した場合は、用量依存的にＰＧＥ２により誘発されたｃＡＭＰの上昇を抑制することができる。
また、ヒトＥＰ４を天然に発現している細胞株（例えばヒトマクロファージ細胞）に抗体を０．０１〜１０μｇ/ｍＬで接触させたのちＰＧＥ２を１０-１２〜１０-６Ｍの濃度でさらに接触させる。その後炎症刺激（例えばリポポリサッカライド（ＬＰＳ））時のサイトカインやケモカイン産生を調べる。ＰＧＥ２は、ＬＰＳ刺激によるサイトカイン産生をＥＰ４あるいはＥＰ２を介して抑制することが知られている。本発明の抗体は、ＥＰ４を介したＰＧＥ２によるサイトカイン産生抑制を回復することを指標にＥＰ４の機能阻害を評価することができる。同様に、ヒト末梢血樹状細胞からのＰＧＥ２によるＩＬ−２３産生増強作用の阻害効果を指標に本抗体のＥＰ４機能阻害を評価することができる。
さらに、ヒト膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、頭頸部癌、皮膚癌、肺癌、口腔癌、前立腺癌、また多発性骨髄腫に由来する癌細胞株（例えば、ＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞、ＨＣＡ−７細胞あるいはＨＴ−２９細胞など）をＰＧＥ２と接触させることで細胞の増殖性が高まる。これらの細胞に本発明の抗体をあらかじめ接触させたのち、ＰＧＥ２による細胞の増殖性の増加が低減することを指標に機能阻害を評価することができる。
【００２４】
本発明の抗体は、ヒトＥＰ４のみに結合し、マウスＥＰ４には反応しない。したがって動物試験による免疫異常や疼痛に関する薬効の評価は困難である。一方、抗腫瘍効果については、上記のヒト癌組織から樹立されたＥＰ４を高発現している細胞を、免疫不全マウスに一匹あたり１０6〜１０7個の細胞数で接種する。接種直後より本発明の抗体０．１〜０．５ｍｇ／匹をマウスに腹腔内あるいは皮下投与する。アイソタイプコントロール抗体投与群と比較して本発明の抗体投与群が有意に腫瘍形成、転移頻度を軽減することで抗腫瘍効果を示すことができる。
【００２５】
本発明の抗体の詳細な定義
本発明の抗体及びその機能的断片の例として、例えば、国際寄託における受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０２（ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４）、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０３（ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１）のハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体の他、後述の実施例に示される方法で調製されるモノクローナル抗体が挙げられる。
さらに、本発明の抗体及びその機能的断片として、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体、配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体、配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体、配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体、配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体、及びこれらの抗体の機能的断片、並びに、これらの抗体を構成する重鎖及び／又は軽鎖の各アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する重鎖及び／又は軽鎖からなる抗体、及びこれらの抗体の機能的断片であって、ＥＰ４の機能を抑制するものを挙げることができる。
【００２６】
本発明の抗体と同一のエプトープの定義
さらに本発明の抗体及びその機能的断片としては、実施例において単離されたいずれかのモノクローナル抗体とエピトープが重複する（または同一の）抗体が特に好ましい。このような抗体を、本発明においては実質的に同じ部位に結合する抗体と呼ぶ。２つの抗体が抗原蛋白質と実質的に同じ部位に結合するかどうかは、例えば競合実験により決定することができる。具体的には、実施例の抗ＥＰ４抗体とＥＰ４との結合が、第二の抗ＥＰ４抗体によって競合阻害を受けるとき、第一の抗体と第二の抗体は実質的に同じ抗原部位に結合していると判断される。このように、実施例で単離した抗体のＥＰ４結合部位と実質的に同じ部位に結合する抗体であって、ＥＰ４の機能を阻害する作用を有する抗体は本発明に含まれる。
【００２７】
本発明の抗体の取得方法
本発明の抗ＥＰ４抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはそれら機能的断片であってもよい。医薬組成物として均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体が好ましい。「モノクローナル」というのは、実質的に均一な抗体の集団より得られた抗体の特性を示唆するものであって、抗体が特定の方法により製造されることを限定するものではない。例えば、本発明において用いられるモノクローナル抗体を、例えばハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５（１９７５））、又は、組換え方法（米国特許第４，８１６，５６７号）により製造してもよい。本発明において使用するモノクローナル抗体は、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１））。本発明におけるモノクローナル抗体には、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラス由来であり、鎖の残りの部分が別の種、又は別の抗体クラス若しくはサブクラス由来である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、抗体変異体、並びにその機能的断片が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【００２８】
本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合、例えば、哺乳類宿主動物に対して、免疫原及びアジュバントの混合物をインジェクトすることにより調製することができる。通常は、免疫原としての抗原及び／又はアジュバントを宿主動物の皮下又は腹腔内へ複数回インジェクトする。アジュバントの例には、完全フロイト及びモノホスホリル脂質Ａ合成−トレハロースジコリノミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）が含まれる。免疫原処理の後、血中に産生されたＥＰ４に対する抗体を、ＥＰ４結合特異性及び、ＥＰ４の機能抑制作用などを指標にして、所望の抗体を取得することができる。
【００２９】
また、本発明の抗体がモノクローナル抗体の場合、例えば、ハイブリドーマ法を用いて調製することができる。
この方法には以下に示す４つの工程が含まれる：（ｉ）宿主動物又は、宿主動物由来にヒトＥＰ４タンパク質を免疫する、（ｉｉ）モノクローナル抗体分泌性（又は潜在的に分泌性）のリンパ球を回収する、（ｉｉｉ）リンパ球を不死化細胞に融合させる、（ｉｖ）所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞を選択する。マウス、ラット、モルモット、ハムスター、又は他の適当な宿主動物が、免疫動物として選択され免疫原がインジェクトされる。
免疫後、宿主動物から得られたリンパ球はハイブリドーマ細胞を樹立するために、ポリエチレングリコールなどの融合剤を用いて不死化細胞株と融合する。融合細胞としては、例えば、ラットもしくはマウスのミエローマ細胞株が使用される。細胞融合を行った後、融合しなかったリンパ球及び不死化細胞株の成長又は生存を阻害する一又は複数の基質を含む適切な培地中で細胞を生育させる。通常の技術では、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く親細胞を使用する。この場合、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンがＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害し、ハイブリドーマの成長を許容する培地（ＨＡＴ培地）に添加される。このようにして得られたハイブリドーマから、所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、該ハイブリドーマが生育する培地から、常法に従い、目的のモノクローナル抗体を取得することができる。
このようにして調製したハイブリドーマをインビトロ培養し、あるいは、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの腹水中でインビボ培養し、目的の抗体を培養上清、あるいは、腹水から調製することができる。
【００３０】
本発明の核酸は、本発明の抗体における重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードするものである。本発明の核酸である重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする核酸をベクターに挿入し、これを細胞内で発現させてもよい。
ベクターの種類としては特に限定はなく、その後に導入される宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。これらを抗体として発現させるために適当な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入し、組換型の抗体を調製することもできる。
【００３１】
本発明のキメラ抗体の定義と生産方法
本発明の抗ＥＰ４抗体の実施形態には、遺伝子組換え抗体が含まれる。遺伝子組換え抗体としては、特に限定はされないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体及びヒト抗体等が挙げられる。ここで、キメラ抗体とは、異なる動物種由来の可変領域と定常領域を連結した抗体、特に、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に連結した抗体であり（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，６８５１−６８５５，（１９８４）等を参照）、キメラを作製する場合、そのように連結した抗体が得られるよう、当業者に周知の遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。ここで、マウス由来抗体の可変領域として、重鎖可変領域は、例えば、配列番号２又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましく、軽鎖可変領域は、例えば、配列番号４又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましい。本発明のキメラ重鎖又はキメラ軽鎖をベクターに挿入する。ベクターの種類としては特に限定はなく、その後に導入される宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。これらを抗体として発現させるために適当な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入し、組換型の抗体を調製することもできる。
【００３２】
本発明のヒト型抗体の定義と生産方法
本発明のキメラ抗体には、ヒト（型）化抗体が含まれる。ヒト型化抗体は、フレームワーク領域はヒト由来で、ＣＤＲはマウス由来の領域からなる抗体のことである。ヒト型化抗体は、まず、マウス抗体の可変領域からそのＣＤＲをヒト可変領域に移植し、重鎖及び軽鎖可変領域を再構成した後、これらヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結することで作製することができる。このようなヒト型化抗体の作製法は、当分野において周知である（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１−９１７（１９８７）；Ｑｕｅｅｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００２９−１００３３（１９８９）等を参照）。ここで、本発明の抗ＥＰ４抗体に使用されるマウス由来ＣＤＲ配列としては、限定はされないが、例えば、重鎖ＣＤＲ１〜３として配列番号５〜７に示されるアミノ酸配列が、軽鎖ＣＤＲ１〜３として配列番号８〜１０に示されるアミノ酸配列あるいは軽鎖ＣＤＲ１〜３として配列番号１８〜２０に示されるアミノ酸配列が挙げられる。
ヒト型化抗体重鎖又はヒト型化抗体軽鎖を宿主細胞内において発現させるために、ヒト型化抗体重鎖又はヒト型化抗体軽鎖をベクターに挿入してもよい。ベクターの種類としては特に限定はなく、その後に導入される宿主細胞の種類等によって適宜選択することができる。これらを抗体として発現させるために適当な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入し、宿主細胞内で抗体を再構築させて、組換型の抗体を調製することもできる。
【００３３】
本発明のヒト抗体の定義と生産方法
ヒト抗体（完全ヒト抗体）とは、可変領域の抗原結合部位である超過変領域（Ｈｙｐｅｒ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）、可変領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。ただし、超可変部位は他の動物由来であってもよい。ヒト抗体は、公知の技術により当業者であれば容易に作製することができる。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体の重鎖及び軽鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（１９９７）１６，１３３−１４３；Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，（１９９８）２６，３４４７−３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｓｐｅｃｔｓ，（１９９９）１０，６９−７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｙ．，Ｍａｔｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（２０００）９７，７２２−７２７等を参照）や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．，（２００２）４３（７），２３０１−８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，（２００２）１（２），１８９−２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，（２００２）１０９（３），４２７−４３１等を参照）により取得することができる。  
【００３４】
本発明の抗体の機能的断片
本発明の抗体の機能的断片としては、抗ＥＰ４抗体の一部分の領域を意味し、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、一本鎖抗体（重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域等）、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ（ｓｃＦｖ二量体）、ｄｓＦｖ（ジスルフィド安定化可変領域）、並びに、ＣＤＲを少なくとも一部に含むペプチド等が挙げられる。Ｆａｂは、抗体分子をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、重鎖のＮ末端側約半分と軽鎖全体とがジスルフィド結合で結合した、抗原結合活性を有する抗体断片である。
Ｆａｂの作製は、抗体分子をパパインで処理して断片を取得する他、例えば、ＦａｂをコードするＤＮＡを挿入した適当な発現ベクターを構築し、これを適当な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入後、細胞内でＦａｂを発現させることで実施することができる。
また、Ｆ（ａｂ’）２は、抗体分子をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、抗原結合活性を有する抗体断片である。Ｆ（ａｂ’）２は、抗体分子ペプシンで処理して断片を取得する他、後述するＦａｂをチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させて作製することも可能で、さらに、Ｆａｂと同様に遺伝子工学的手法によっても作製することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した、抗原結合活性を有する抗体断片である。Ｆａｂ’も、Ｆａｂ等と同様に遺伝子工学的な手法により作製することができる。
【００３５】
ｓｃＦｖは、１本の重鎖可変領域（ＶＨ）と１本の軽鎖可変領域（ＶＬ）とを適当なペプチドリンカーを用いて連結した、ＶＨ−リンカー−ＶＬないしはＶＬ−リンカー−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。ｓｃＦｖは、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを取得し、遺伝子工学的手法により作製することができる。
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一抗原結合活性であっても、又は、一方を異なる抗原結合活性であってもよい。ｄｉａｂｏｄｙは、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを取得し、重鎖可変領域と軽鎖可変領域をペプチドリンカーで結合したｓｃＦｖを発現するｃＤＮＡを構築して、遺伝子工学的手法により作製することができる。
ｄｓＦｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は、Ｒｅｉｔｅｒらにより示された方法などにより、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。ｄｓＦｖは、抗体の重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築して遺伝子工学的手法により作製することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、重鎖又は軽鎖のＣＤＲ（ＣＤＲ１〜３）の少なくとも１領域以上を含むように構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。ＣＤＲを含むペプチドは、抗体の重鎖又は軽鎖のＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、発現ベクターに挿入する。ベクターの種類としては特に限定はなく、その後に導入される宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。これらを抗体として発現させるために適当な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入し製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）及びｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
【００３６】
本発明の抗体の精製
本発明の抗体の精製方法としては特に限定はなく、公知の手法を採用することができる。例えば、前記ハイブリドーマ又は前記組換え細胞の培養上清を回収し、各種クロマトグラフィー、塩析、透析、膜分離等の公知の手法を組み合わせて、本発明の抗体を精製することができる。抗体のアイソタイプがＩｇＧである場合には、プロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって簡便に精製することもできる。
【００３７】
本発明の抗体を含む医薬
本発明の抗体又はその機能的断片は、これらを有効成分とした医薬として使用することができる。このような本発明の医薬は、ＥＰ４に関連する免疫疾患、腫瘍および疼痛の治療又は予防のために使用することができる。
【００３８】
ＥＰ４に関連する免疫疾患とは例えば乾癬；多発性硬化症；関節リウマチ；全身性エリテマトーデス；クローン病等の炎症性腸疾患；Ｉ型糖尿病とその合併症（例えば糖尿病性網膜症、糖尿病性細小血管症、糖尿病性腎障害、黄斑変性等）；多発性筋炎；シェーグレン症候群；喘息アトピー性皮膚炎及び接触性皮膚炎；免疫不全疾患；臓器移植等を指す。
【００３９】
本発明の医薬は、疼痛すなわち侵害受容性疼痛及び神経障害性疼痛の治療又は予防のために使用することができる。侵害受容性疼痛とは例えば、体性及び内臓性の侵害受容器の活性化に起因する疼痛、例えば関節における病的変形及び慢性関節痛（例えば関節リウマチを含む関節炎、変形性関節症、リウマチ様脊椎炎、骨関節炎、痛風性関節炎及び若年性関節炎等）（疾患の緩和と関節構造維持を含む）；腰痛および頸部痛；筋骨格痛；筋炎；骨折；捻挫、挫傷；線維筋痛症に付随する疼痛；腫瘍及び腫瘍治療に関連する疼痛；インフルエンザ又は他のウイルス感染症（感冒等）に付随する疼痛；リウマチ熱；内臓痛；機能性の腸疾患（例えば過敏性腸症候群、非心臓性胸痛、非潰瘍性消化不良等）に付随する疼痛；心筋虚血に付随する疼痛；歯痛；術後および歯科処置後の疼痛；産後痛；一次性頭痛（例えば片頭痛、緊張型頭痛、群発頭痛とその他の一次性頭痛）；二次性頭痛（例えば頭頸部外傷による頭痛、頭頸部血管障害による頭痛、非血管性頭蓋内疾患による頭痛、薬物乱用等物質又はその離脱による頭痛、感染症による頭痛、ホメオスターシスの障害による頭痛、頭蓋骨，頸，眼，耳，鼻，副鼻腔，歯，口あるいはその他の顔面・頭蓋の構成組織の障害に起因する頭痛あるいは顔面痛薬物誘発性頭痛及び片頭痛に付随する疼痛等）等を指す。
神経障害性疼痛とは例えば物理的外傷や切断；幻肢痛；慢性炎症症状に起因する疼痛；帯状疱疹後神経痛；糖尿病性神経障害；非特異的腰痛；背部痛；坐骨神経痛；腫瘍とその治療に関連する神経障害；ＨＩＶ関連神経障害；手根管症候群；慢性アルコール中毒；甲状腺機能低下症；三叉神経痛；三叉神経・自律神経性頭痛；尿毒症；ビタミン欠乏症；多発性硬化症；線維筋痛症；毒素等に付随する疼痛等を指す。
【００４０】
本発明の医薬は、腫瘍の治療又は予防に有用である。腫瘍の治療とは、腫瘍の成長、散開、転移の全面又は部分的阻止又は腫瘍細胞の全面又は部分的駆除のみならず、腫瘍に付随する症状（疼痛、食欲不振、体重減少等）の部分的または全面的解消を含む。
腫瘍の治療又は予防としては、良性の腫瘍の異常増殖およびポリープ、悪性の腫瘍の異常増殖およびポリープ、新生物を対象とする。
良性の腫瘍の異常増殖及びポリープとは例えば扁平上皮細胞乳頭腫；基底細胞腫瘍；移行細胞乳頭腫；腺腫；ガストリノーマ；胆管細胞腺腫；肝細胞腺腫；腎管状腺腫；膨大細胞腫；グロムス腫瘍；メラノサイト母斑；線維腫；粘液腫；脂肪腫；平滑筋腫；横紋筋腫；良性奇形腫；血管腫；骨腫；軟骨腫および髄膜腫等を指す。
悪性の腫瘍の異常増殖及びポリープ、例えば肝細胞癌；胆管細胞癌；腎細胞癌；扁平上皮癌；基底細胞癌；移行細胞癌；腺癌；悪性ガストリノーマ；悪性黒色腫；線維肉腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；悪性奇形腫；血管肉腫；カポジ肉腫；骨肉腫；軟骨肉腫；リンパ管肉腫；悪性髄膜腫；非ホジキンリンパ腫；ホジキンリンパ腫；白血病及び脳腫瘍等を含む。
新生物は、上皮細胞由来新生物（上皮癌腫）、基底細胞癌腫、腺癌腫、並びに、口唇癌、口腔癌、食道癌、小腸癌及び胃癌のような胃腸癌、結腸癌、直腸癌、肝癌、膀胱癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頚癌、肺癌、乳癌、並びに、扁平上皮細胞癌及び基底細胞癌のような皮膚癌、前立腺癌、腎細胞癌腫を含み、また、全身の上皮、間葉又は血液細胞を冒す他の既知の癌を含む。
本発明の抗体と、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する化合物とを含む、抗体−薬剤複合体を提供することができる。また、遺伝子組換え技術を用い、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する化合物としてのタンパク質トキシンを、遺伝子上で抗体遺伝子と融合させて、１つのタンパク質として発現させて得られたものは、一般に、イムノトキシンと称される。抗腫瘍活性を有する化合物としては、例えば、ドキソルビシン、マイトマイシンＣなどが挙げられる。抗体−薬剤複合体の作製方法としては、限定はされないが、例えば、ジスルフィド結合やヒドラゾン結合によって抗体と薬剤とをカップリングする方法などが挙げられる。
【００４１】
本発明の抗体を含む医薬組成物
本発明には、医薬又は医薬組成物も含まれる。本発明の医薬の有効成分としては、上述の本発明の抗体又はその機能的断片のほか、生理学的に許容されるその塩を用いてもよい。塩としては、例えば、酸性基が存在する場合には、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ金属及びアルカリ土類金属塩；アンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）ピペラジン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、エタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミン、Ｌ−グルカミン等のアミンの塩；又はリジン、δ−ヒドロキシリジン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸との塩を形成することができる。塩基性基が存在する場合には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸の塩；メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、酢酸、プロピオン酸塩、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、ケイ皮酸、乳酸、グリコール酸、グルクロン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、サリチル酸等の有機酸との塩；又はアスパラギン酸、グルタミン酸などの酸性アミノ酸との塩などを挙げることができる。
【００４２】
本発明の医薬は、有効成分である本発明の抗体又はその機能的断片自体を投与してもよいが、一般的には、有効成分である抗体又はその機能的断片の他、１又は２以上の製剤用添加物を含む医薬組成物の形態で投与することが望ましい。本発明の医薬の有効成分としては、発明の抗体又はその機能的断片の２種以上を組み合わせて用いることができ、上記医薬組成物には、公知の他の薬剤を併せて配合してもよい。
医薬組成物の種類は特に限定されず、剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。なお、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解又は懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明の化合物を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。経口投与用又は非経口投与用の任意の製剤形態で提供される。例えば、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤又は液剤等の形態の経口投与用医薬組成物、静脈内投与用、筋肉内投与用、若しくは皮下投与用などの注射剤、点滴剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、吸入剤、坐剤などの形態の非経口投与用医薬組成物として調製することができる。注射剤や点滴剤などは、凍結乾燥形態などの粉末状の剤形として調製し、用時に生理食塩水などの適宜の水性媒体に溶解して用いることもできる。また、高分子などで被覆した徐放製剤を脳内に直接投与することも可能である。
医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合、又は医薬組成物の製造方法は、組成物の形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。製剤用添加物としては無機又は有機物質あるいは固体又は液体の物質を用いることができ、一般的には、有効成分重量に対して１重量％から９０重量％の間で配合することができる。具体的には、その様な物質の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。
【００４３】
経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分例えば乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式又は乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤及び顆粒剤をそのまま、あるいはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒又は錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸−メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま、あるいはグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。
【００４４】
注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０ 、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。
【００４５】
直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジ及びモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜等で被覆すればよい。
【００４６】
本発明の医薬の投与量及び投与回数は特に限定されず、治療対象疾患の悪化・進展の防止及び／又は治療の目的、疾患の種類、患者の体重や年齢、疾患の重篤度などの条件に応じて、医師の判断により適宜選択することが可能である。一般的には、経口投与における成人一日あたりの投与量は０．０１〜１０００ｍｇ（有効成分重量）程度であり、一日１回又は数回に分けて、あるいは数日ごとに投与することができる。注射剤として用いる場合には、成人に対して一日量０．００１〜４００ｍｇ（有効成分重量）を連続投与又は間欠投与することが望ましい。
【００４７】
本発明の医薬は、植込錠及びマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。担体として、例えば、エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、当業者によって容易に調製することができる。また、リポソームの懸濁液も薬剤的に受容可能な担体として使用することができる。有用なリポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノール（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製される。
【００４８】
本発明の医薬は、医薬組成物としてキットの形態で、容器、パック中に投与の説明書と共に含めることができる。本発明の医薬組成物がキットとして供給される場合、該組成物のうち異なる構成成分が別々の容器中に包装され、使用直前に混合される。このように構成成分を別々に包装するのは、活性構成成分の機能を失うことなく長期間の貯蔵を可能にするためである。
キット中に含まれる試薬は、構成成分の活性を長期間有効に持続し、容器内側に吸着することなく、また、構成成分を変質することのない材質で製造された容器中に供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性を示すガスの存在下で封入されたバッファーなどを含んでもよい。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために通常用いられる他の何れかの適切な材料によって構成される。
【００４９】
また、キットには使用説明書が添付されてもよい。本キットの使用説明は、紙などに印刷され、及び／又はフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体に保存されて使用者に供給されてもよい。詳細な使用説明は、キット内に実際に添付されていてもよく、あるいは、キットの製造者又は分配者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェブサイトに掲載されていてもよい。
【００５０】
さらに、本発明には、本発明の医薬又は医薬組成物を患者等に投与し、ＥＰ４に関連する免疫疾患、腫瘍および疼痛等を予防又は治療する方法が含まれる。
ここで「治療」とは、ＥＰ４の機能異常（例えば、機能の異常亢進など）に起因して発症する疾患等に罹患した哺乳動物において、その病態の進行及び悪化を阻止又は緩和することを意味し、これによって該疾患の進行及び悪化を阻止又は緩和することを目的とする処置のことである。
また、「予防」とは、ＥＰ４の機能異常（例えば、機能の異常亢進など）に起因して発症する疾患等に罹患するおそれがある哺乳動物について、該疾患の発症又は罹患を予め阻止することを意味し、これによって該疾患の諸症状等の発症を予め阻止することを目的とする処置のことである。
【００５１】
治療の対象となる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウサギなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。
【００５２】
本発明の抗体固定化担体
本発明には、抗体固定化担体が含まれる。本発明の抗体固定化担体は、本発明の抗ヒトＥＰ４抗体が担体に固定化されてなるものである。好ましい実施形態では、本発明の抗体固定化担体は、ＥＰ４発現細胞を含む血液を接触させて、前記体液からＥＰ４発現細胞を除去するために用いられる。担体に固定化される抗ヒトＥＰ４抗体は、１種類のみでもよいし、２種以上でもよい。
本発明の抗体固定化担体の具体的形態としては、例えば、本発明の抗体が水不溶性担体に固定され、容器に充填されたものが挙げられる。ここで、水不溶性担体としてはいかなる材質も使用可能であるが、成型性、滅菌性や細胞毒性が低いという点で好ましいものを列記すると、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン等の金属材料が挙げられる。
担体の形状としては、粒状、綿状、織布、不織布、スポンジ状多孔質体、平板状、などが挙げられるが、体積当たりの表面積が大きいという点で粒状、綿状、織布、不織布、スポンジ状多孔質体が好ましい。例えば、抗体が固定された水不溶性担体を予め容器に充填した多孔質体フィルターに末梢血液を通過させ、疾患に関わるＥＰ４発現細胞を効率よく除去することができる。
本発明の抗体固定化担体と他の構成要素とを組み合わせて、ＥＰ４発現細胞除去用キットを作製することができる。当該他の構成要素としては、抗凝固剤、体外循環回路が挙げられる。
【００５３】
本発明の抗ＥＰ４抗体を含む診断用キット
本発明の抗ＥＰ４抗体は、診断用キットの形態で提供することができる。本発明の診断用キットは抗体を含むが、その他に、標識物質、又は２次抗体もしくはその標識物含めることができる。抗体の標識物質とは、酵素、放射性同位体、蛍光化合物及び化学発光化合物等によって標識されたものを意味する。本発明の診断用キットは、上記の構成要素のほか、本発明の検出を実施するための他の試薬、例えば標識物が酵素標識物の場合は、酵素基質（発色性基質等）、酵素基質溶解液、酵素反応停止液、あるいは検体用希釈液等を含んでいてもよい。また、各種バッファー、滅菌水、各種細胞培養容器、各種反応容器（エッペンドルフチューブ等）、ブロッキング剤（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ），Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ，Ｇｏａｔ血清等の血清成分）、洗浄剤、界面活性剤、各種プレート、アジ化ナトリウム等の防腐剤、及び実験操作マニュアル（説明書）等を含んでいてもよい。測定法としては、例えばＥＬＩＳＡ法、ＥＩ法、ＲＩＡ法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、化学発光免疫測定法（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、フローサイトメトリー法が考えられるが、なかでも特に、フローサイトメトリー法が、簡便かつ高感度という点で好ましい。また、その他の細胞表面抗原を認識する抗体キットと組み合わせて使用することができる。
本発明の診断用キットを、癌、自己免疫疾患などを罹患している患者の血液細胞と反応させ、ＥＰ４発現細胞の血液中での割合を検出することができる。その他の細胞表面抗原抗体と組み合わせることにより特定の細胞集団（例えば樹状細胞、ＴＨ１７細胞、Ｔｒｅｇ細胞）でのＥＰ４発現細胞の割合を検出することができる。ＥＰ４発現細胞の割合の増減を評価することで、疾病の状態を評価することができる。
以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００５４】
（１）ヒトＥＰ４  発現ベクター ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４０-ｈＥＰ４ の作製
ＧｅｎＢａｎｋに登録済みのヒトＥＰ４遺伝子(登録番号ＮＭ＿０００９５８)の、ＯＲＦ配列から終止コドンを除いた配列の ５’末端に５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＧＡＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧＴＧＡＣ−３’配列（配列番号３０）を、３’末端に５’−ＧＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴＣＣＣＣ−３’配列（配列番号３１）を付加したＤＮＡを合成し、 ｐＤＯＮＲ２２１ベクター（インビトロジェン社製）にＧａｔｅｗａｙシステム（インビトロジェン社）を使用して組み込み、ｐＤＯＮＲ−ｈＥＰ４とした。インサートの塩基配列は常法に従って決定し、配列に誤りがないことを確認した。次にＧａｔｅｗａｙシステムにより、ヒトＥＰ４遺伝子を含む配列をｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０ ベクター（インビトロジェン社製）に組み替え、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０−ｈＥＰ４ を得た。このプラスミドから発現するヒトＥＰ４は、Ｃ末端にＶ５と６×ＨＩＳタグが付加された融合タンパク質である。ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０−ｈＥＰ４のプラスミドＤＮＡは、常法に従って大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換して増幅し、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＨｉＰｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｆｉｌｔｅｒ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いて使用説明書に従い調製した。【００５５】
（２）ヒトＥＰ４発現２９３ＦＴ細胞の調製
１００ｍｍのコラーゲンＩコート細胞培養用ディッシュに播種した２９３ＦＴ 細胞（インビトロジェン社製）に、上述のｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４０-ｈＥＰ４ プラスミドＤＮＡ１０μｇを、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社製）２５μＬを用いて、使用説明書に従い遺伝子導入した。遺伝子導入２４時間後に細胞をＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、インビトロジェン社製） で洗浄し、酵素不含細胞解離バッファー（インビトロジェン社製）によって細胞培養用ディッシュから剥がし取り、遠心操作により回収した。ＥＰ４遺伝子導入２９３ＦＴ細胞および遺伝子未導入２９３ＦＴ細胞は、Ｃｙｔｏｆｉｘ/Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｋｉｔ（ＢＤ社製）を用いて細胞膜透過処理を施し、抗Ｖ５タグ抗体(インビトロジェン社製)と混合してインキュベートした(４℃、１時間)。洗浄バッファー（０．１％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ，インビトロジェン社製）)で３回洗浄した後、２次抗体のＡｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体(インビトロジェン社製)によって染色(４℃、１時間)し、再度洗浄バッファーで３回洗浄した後、フローサイトメーターＱｕａｎｔａ ＳＣ ＭＰＬ(ベックマン・コールター社製)で解析した。その結果、遺伝子導入２９３ＦＴ細胞のみがＡｌｅｘａ４８８蛍光陽性を示したことから、ヒトＥＰ４を発現していることが確認できた。
そこで、このヒトＥＰ４発現２９３ＦＴ細胞を感作抗原として使用した。【００５６】
（３）免疫
抗原免疫は １２９/Ｏｌａ 系統の７週齢のメスマウスに対して行った。（２）で記載したヒトＥＰ４ 発現２９３ＦＴ細胞を生理食塩水に懸濁した後、１０〜１４日の間隔を空けて５回腹腔内投与を行った。【００５７】
（４）ハイブリドーマの作製
５回目の免疫から３日後にマウスの脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。脾細胞とマウスミエローマＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＥＣＡＣＣ）とをポリエチレングリコール４０００（メルク社製）を用いて、常法に従って細胞融合させた。融合細胞は、１００単位／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ＮＣＴＣ-１０９培地（以上インビトロジェン社製）を含むＧＩＴ培地（和光純薬社製）に懸濁し、９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルの割合で播種、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。融合の翌日からは、上述の培地にＨＡＴ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を加えた培地に交換して、融合後１３日間培養を継続した。その結果、約７００クローンのハイブリドーマのコロニーを得た。【００５８】
（５）ヒトＥＰ４安定発現ＮＳ０細胞株の構築
（１）で述べたｐＤＯＮＲ−ｈＥＰ４からｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１ベクター（インビトロジェン社製）へＧａｔｅｗａｙシステムによる配列の組み換えを行い、ｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１-ｈＥＰ４ プラスミドを得た。このプラスミドから発現するヒトＥＰ４は、Ｃ末端にＶ５と６×ＨＩＳタグが付加された融合タンパク質である。
１０％のウシ胎児血清と、１００単位／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（インビトロジェン社製）を含む ＲＰＭＩ培地で培養した、マウスミエローマＮＳ０細胞（理化学研究所細胞バンク）１×１０７細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ＬＴＸ  （インビトロジェン社製）３５μＬとＰｌｕｓＲｅａｇｅｎｔ(インビトロジェン社製) １４μＬを使って、使用説明書に従ってｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１−ｈＥＰ４プラスミド １４μｇを遺伝子導入した。遺伝子導入の翌日からは、２．５μｇ／ｍＬ の抗生物質ブラストシジン(インビトロジェン社製)を加えたＲＰＭＩ培地で、３日目ごとに培地を交換しながら２週間培養した。形成されたコロニーからペニシリンキャップ法により、ブラストシジン耐性 ＮＳ０細胞をクローニングした。
得られたブラストシジン耐性 ＮＳ０細胞を、ＦｃＢｌｏｃｋ（ベクトン・ディッキンソン社製）で４℃１５分間ブロッキングした後、（２）と同様の方法でフローサイトメトリーによりＥＰ４融合タンパク質の発現を確認した。その結果、得られたブラストシジン耐性 ＮＳ０細胞がヒトＥＰ４を安定発現していることが確認できた。【００５９】
（６）抗ＥＰ４抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
（５）で作製したヒトＥＰ４安定発現ＮＳ０細胞株 ２×１０５細胞を、（２）と同様の方法で染色しフローサイトメーターによる解析を行った。細胞膜透過処理は施さず、１次抗体として、（４）で得られたハイブリドーマの培養上清５０μＬを使用した。その結果、２１ウェルの上清でＡｌｅｘａ４８８蛍光陽性の反応が見られた。陽性だったウェルの細胞は限界希釈法によりクローニングし、２週間後の培養上清についても同様の方法で、フローサイトメトリーによるヒトＥＰ４安定発現ＮＳ０細胞株との結合試験を行った。同様のクローニングと結合試験を再度繰り返し、最終的に２クローンの抗ＥＰ４抗体産生ハイブリドーマを得た。これらのハイブリドーマを、それぞれＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１と名付けた。
得られたハイブリドーマ細胞 ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１は、２０１０年６月２９日（原寄託日）付で、茨城県つくば市東１丁目１番地１ つくばセンター中央第６ （郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９７８及びＦＥＲＭ  Ｐ−２１９７９として、寄託された。その後、ブダペスト条約に基づき、原寄託より国際寄託に移管された（「原寄託についての受託証」及び「生存に関する証明書」の通知日；２０１１年９月５日）。受託番号はそれぞれＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０２及びＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０３である。【００６０】
(７）抗ＥＰ４抗体の精製
ハイブリドーマ細胞 ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１それぞれを、無血清のＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｍｅｄｉｕｍ (インビトロジェン社製)中で、細胞の約９割が死滅するまで培養を継続し、抗体を産生させた。この培養上清１００ｍＬから遠心操作（１，５００ｒｐｍ、１５分間）により細胞をとり除いた後、ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰカラム(ＧＥヘルスケア・ジャパン社製)に通すことでＩｇＧを精製・濃縮した。得られた精製ＩｇＧについて、Ｉｓｏ Ｓｔｒｉｐ マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いてサブクラスと軽鎖の種類を決定したところ、共に（ＩｇＧ２ａ、κ）であった。以降、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１とはこれらの精製抗体のことを指し、ハイブリドーマもしくは細胞と記載した場合はこれらの抗体を産生するハイブリドーマのことを指す。
（２）、（３）、（４）、（６）と同様に、サブクラスの異なる抗ＥＰ４抗体産生ハイブリドーマ細胞を取得した。このハイブリドーマの培養上清から、（７）と同様にしてサブクラスと軽鎖の種類が（ＩｇＧ１、κ）である精製ＩｇＧを得た。この精製抗体をＮＢＧ０１６−ｍＡｂ９とした。【００６１】
（８）ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株の作製
ｐＤＯＮＲ-ｈＥＰ４ から、Ｇａｔｅｗａｙ システムで ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴ ベクター(インビトロジェン社製)に ヒトＥＰ４ 遺伝子を乗せ換え、 ｐＥＦ-ＦＲＴ-ｈＥＰ４ を得た。このプラスミドから発現するヒトＥＰ４は、Ｃ末端にＶ５と６×ＨＩＳタグを付加した融合タンパク質である。
１０％のウシ胎児血清と、１００単位／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを含むＨａｍ’ｓ Ｆ-１２培地(インビトロジェン社製)で培養した、Ｆｌｐ-Ｉｎ-ＣＨＯ 細胞(インビトロジェン社製)に、リポフェクトアミン２０００を用いてｐＥＦ-ＦＲＴ-ｈＥＰ４ プラスミドとｐＯＧ４４プラスミド(インビトロジェン社製)を同時に遺伝子導入した。遺伝子導入の翌日から、５００μｇ／ｍＬ の抗生物質ハイグロマイシン(インビトロジェン社製)を加えたＨａｍ’ｓ Ｆ-１２培地に培地を交換し、３日目ごとに培地を交換しながら２週間培養した。形成されたコロニーから、ペニシリンキャップ法によりハイグロマイシン耐性細胞をクローニングした。
（２）に記載した方法で、２次抗体としてはフィコエリスリン（ＰＥ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマン・コールター社）を使用し、得られたハイグロマイシン耐性細胞と抗Ｖ５タグ抗体との結合をフローサイトメーターで解析した。その結果、得られたハイグロマイシン耐性 Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞がＰＥ陽性を示したことから、ヒトＥＰ４を安定発現していることが確認できた。この細胞を以下、ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株と記載する。【００６２】
（９) 抗ヒトＥＰ４抗体とヒトＥＰ４発現細胞の結合試験
抗ヒトＥＰ４抗体と、ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株の結合試験を（６）に記載した方法でフローサイトメトリーにより実施した。ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株もしくは親株Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞を５×１０５使用し、１次抗体としては１μｇのＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１もしくはマウスアイソタイプコントロール抗体（ＢｉｏＲｅｇｅｎｄ社製）を、２次抗体としてはＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。
図１にその結果を示す。親株Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞を灰色に塗りつぶしたヒストグラムで、ヒトＥＰ４安定発現株細胞を黒の実線で示している。ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１が共に、ヒトＥＰ４安定発現ＣＨＯ細胞株にのみ結合していることから、これらの抗体がヒトＥＰ４に特異的に結合することが示された。
同様にしてＮＢＧ０１６−ｍＡｂ９についても、ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株との結合試験を行った。結果を図２に示す。この結果よりＮＢＧ０１６−ｍＡｂ９もヒトＥＰ４に特異的に結合することが示された。【００６３】
（１０）ＰＧＥ２によるｃＡＭＰ産生に対する抗体の阻害試験
ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株もしくは親株Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞を、アセチルサリチル酸１ｍＭを含む培地で１８時間培養した後、細胞解離バッファーで細胞培養ディッシュから回収して、ＣｕｌｔｕｒＰｌａｔｅ-９６(パーキンエルマー社製)に１ウェルあたり２，５００個分注した。各ウェルにＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１もしくはマウスアイソタイプコントロール抗体を０．０５〜３０μｇ／ｍＬになるように加え、室温で１５分間静置した。次にＰＧＥ２(Ｃａｙｍａｎ社製)を５×１０−１１Ｍになるように加え、さらに室温で３０分間静置した。細胞内で産生されたｃＡＭＰ量は、ＬＡＮＣＥ Ｕｌｔｒａ ｃＡＭＰ Ｋｉｔ（パーキンエルマー社製）を用いて、使用説明書に従った反応を行い、プレートリーダーＡＲＶＯ  １４２０  ＨＴＳ(パーキンエルマー社製)で測定した。
その結果を図３に示す。マウスアイソタイプコントロール抗体を加えても、ＰＧＥ２により誘導されたｃＡＭＰ産生量に関して有意な阻害効果が見られなかったのに対し、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１を加えた場合には、抗体濃度依存的にｃＡＭＰ産生阻害効果が見られた。データ解析ソフトウェア  ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ ８．１（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ社製）を用いてロジスティック関数による解析を行ったところ、ＩＣ５０値はＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４では０．１５μｇ／ｍＬ（約１．０ｎＭ）、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１では０．２４μｇ／ｍＬ（約１．６ｎＭ）であった。この結果からＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１はヒトＥＰ４に対するアンタゴニスト活性を有する機能性抗体であり、ヒトＥＰ４に対するアンタゴニスト活性を有する既存の物質（例えば低分子化合物）に比して同等以上の強い受容体機能阻害活性を有していることが示された。
同様にしてＮＢＧ０１６−ｍＡｂ９について、ＰＧＥ２を１．５×１０−１０Ｍ添加して行った試験の結果を図４に示す。上述の解析を行ったところ、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ９のＩＣ５０値は４．６μｇ／ｍＬ（約２８．８ｎＭ）であった。この結果から、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ９もヒトＥＰ４に対するアンタゴニスト活性を有する機能性抗体であることが示された。【００６４】
（１１）ヒトＥＰ１〜４、マウスＥＰ１〜４の発現ベクター作製
ヒトＥＰ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００９５５）、ヒトＥＰ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００９５６）ヒトＥＰ３ａ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ８３８５７）、マウスＥＰ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１３６４１）、マウスＥＰ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００８９６４）、マウスＥＰ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１１１９６）、マウスＥＰ４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００８９６５）の終止コドンを除くＯＲＦ配列の５’末端に、ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧＴＧＡＣ配列（配列番号３２）を付加したＤＮＡ断片を、ＫＯＤ  ＦＸ(東洋紡績社製)を用いて常法に従ってＰＣＲ増幅した。増幅したＤＮＡは、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター(インビトロジェン社製)に組み込み、それぞれｐＥＮＴＲ−ｈＥＰ１、ｐＥＮＴＲ−ｈＥＰ２、ｐＥＮＴＲ−ｈＥＰ３、ｐＥＮＴＲ−ｍＥＰ１、ｐＥＮＴＲ−ｍＥＰ２、ｐＥＮＴＲ−ｍＥＰ３、ｐＥＮＴＲ−ｍＥＰ４とした。インサートの塩基配列は常法に従って決定し、配列に誤りがないことを確認した。これら７種類のプラスミドと、（１）で作製したｐＤＯＮＲ−ｈＥＰ４プラスミドを用いて、ＧａｔｅｗａｙシステムによりそれぞれのインサートをｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７ベクター(インビトロジェン社製)に組み替えた。その結果、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７−ｈＥＰ１、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７−ｈＥＰ２、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７−ｈＥＰ３、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７−ｈＥＰ４、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７−ｍＥＰ１、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７−ｍＥＰ２、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７−ｍＥＰ３、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７−ｍＥＰ４を得た。これらのプラスミドからは、それぞれのＰＧＥ２受容体のＣ末端にＣｙｃｌｅ  ３  Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）を付加した融合タンパク質が発現される。【００６５】
（１２）抗ＥＰ４抗体の結合特異性試験
（１１）で作製したｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７−ｈＥＰ１、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７−ｈＥＰ２、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７−ｈＥＰ３、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７−ｈＥＰ４、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７−ｍＥＰ１、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７−ｍＥＰ２、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７−ｍＥＰ３、ｐｃＤＮＡ-ＤＥＳＴ４７−ｍＥＰ４、各１０μｇを、リポフェクトアミン２０００を使用して２９３ＦＴ細胞に遺伝子導入した。その翌日に細胞をＨＢＳＳで洗浄し、酵素不含細胞解離バッファーによって細胞培養用ディッシュから剥がし取り、遠心操作により回収した。これらの細胞をＥＰ一過性発現２９３ＦＴ細胞と記載する。
本発明の抗ＥＰ４抗体と、ＥＰ一過性発現２９３ＦＴ細胞の結合試験を（６）に記載した方法でフローサイトメトリーにより実施した。８種類のＰＧＥ２受容体サブタイプそれぞれの一過性発現２９３ＦＴ細胞は５×１０５個使用し、１次抗体としては１μｇの抗ＥＰ４抗体 ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１もしくはマウスアイソタイプコントロール抗体（ＢｉｏＲｅｇｅｎｄ社製）を、２次抗体としてはＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。
例としてＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４の結果を図５に示す。ＧＦＰ由来の蛍光陽性細胞が存在することから、それぞれのＰＧＥ２受容体が２９３ＦＴ細胞上に発現していることが確認できた。しかし８種類の細胞の中でＰＥ蛍光陽性を示したのは、ヒトＥＰ４の発現細胞のみであった。ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１も同様の結果であったことから、本発明の抗ＥＰ４抗体はヒト型のＥＰ４に強い特異性を有することが分かった。ＰＧＥ２受容体サブタイプ結合特異性が、ヒトＥＰ４に対するアンタゴニスト活性を有する既存の物質よりも高いことが示された。
同様にＮＢＧ０１６−ｍＡｂ９の結合特異性を調べた結果を図６に示す。８種類のＰＧＥ２受容体サブタイプをそれぞれ発現する細胞のうち、ＰＥ蛍光陽性を示したのはヒトＥＰ４の発現細胞のみであった。この結果から、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ９もヒト型のＥＰ４に強い特異性を有することが分かった。【００６６】
（１３）ヒトリンパ球と抗ＥＰ４抗体の結合性試験
凍結ヒト末梢血単核細胞（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．社製）は、使用説明書に従ってＣＴＬ−Ａｎｔｉ−Ａｇｇｒｅｇａｔｅ−Ｗａｓｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．社製）を使用して解凍、調製した。
ヒトリンパ球と本発明の抗ＥＰ４抗体の結合性試験は、（６）に記載した方法でフローサイトメトリーにより実施した。調製したヒト末梢血単核細胞９×１０５個に、１次抗体としてＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１もしくはマウスアイソタイプコントロール抗体を１．５μｇ使用し、２次抗体にはＡｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。フローサイトメーターによる解析の際には、前方散乱光と側方散乱光のドットプロットに基づき、細胞集団をリンパ球画分と単核球・マクロファージ画分とに区分して、リンパ球画分のＡｌｅｘａ４８８蛍光強度を調べた。
フローサイトメトリーによる解析結果を図７に示す。マウスアイソタイプコントロール抗体による結果を灰色で塗りつぶしたヒストグラムで、抗ＥＰ４抗体による結果を黒の実線で示している。抗ＥＰ４抗体と反応させた場合にのみ、ヒトリンパ球画分の大部分がＡｌｅｘａ４８８陽性を示したことから、ヒトリンパ球と抗ＥＰ４抗体が結合していることが分かる。この結果より、本発明の抗ＥＰ４抗体はヒトの内在性ＥＰ４に結合する能力を有していることが明らかとなった。
ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ９についても同様に、ヒトリンパ球との結合確認実験を行った。ヒト新鮮末梢血から Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ  ＳＨＩＥＬＤ社製）を使用して、使用説明書に従いヒト末梢血単核細胞を単離した後、抗ヒトＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を使用してＣＤ１４陰性の細胞画分を分取し、ヒトリンパ球画分とした。以降の結合確認実験は２次抗体としてフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗マウスＩｇＧ抗体(ベックマン・コールター社製)を用いて、上述の通り行った。図８に示した通り、ヒトリンパ球の大部分がＮＢＧ０１６−ｍＡｂ９と結合しており、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ９もまたヒトの内在性ＥＰ４に結合できることがわかった。【００６７】
（１４）ＰＭＡ刺激ＴＨＰ１の抗ＥＰ４抗体による免疫染色
ヒト単球系ＴＨＰ１細胞株は、ＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３?ａｃｅｔａｔｅ、シグマ・アルドリッチ社製）１００ｎＭを含むＲＰＭＩ培地で、４ウェルカルチャースライド（ベクトン・ディッキンソン社製）に１ウェルあたり１．５×１０５細胞になるように播種し、３日間培養してマクロファージ様に分化させた。培地を除いてからＰＢＳで３回洗浄し、１％パラホルムアルデヒド溶液２００μＬにより細胞を固定（４℃で３０分間静置）した。再度ＰＢＳで３回洗浄した後、ヒトガンマグロブリン(和光純薬社製)１ｍｇ／ｍＬを含む１％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ，和光純薬社製）を３００μＬ加えてブロッキングした(室温、２０分間静置)。次に０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＭＰバイオ社製）を含むＰＢＳ(以下、免染洗浄バッファーと記載する)で３回洗浄してから、１ｍｇ／ｍＬに調製したＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１もしくはマウスアイソタイプコントロール抗体を２００μＬ加えて、４℃で１時間インキュベートした。免染洗浄バッファーで３回洗浄後、２次抗体のＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体によって染色(４℃、１時間)した。免染洗浄バッファーで３回洗浄したスライドは、最後にＰｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ (ＰＩ)を含むＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 社製）で封入した。作製したスライドは蛍光顕微鏡を用いて観察した。
免疫染色したＴＨＰ１細胞の蛍光顕微鏡観察像を図９に示す。左の像は、マウスアイソタイプコントロール抗体での染色像で、中央にＰＩで染められた細胞核(灰色)のみが観察できる。右の像は抗ＥＰ４抗体での染色像で、細胞核の周辺にＦＩＴＣの蛍光(白色)が粒状に観察された。この結果から、ＴＨＰ１細胞株をＰＭＡによって分化させたマクロファージ様細胞の細胞膜表面上の天然型ＥＰ４に本発明の抗体が結合することが分かった。【００６８】
（１５）ＰＧＥ２によるサイトカイン抑制効果の抗ＥＰ４抗体による阻害
ＰＧＥ２は、マクロファージにおいてＬＰＳ刺激によるサイトカイン産生をＥＰ４あるいはＥＰ２を介して抑制することが知られている。本発明の抗体が、ＥＰ４を介したＰＧＥ２によるサイトカイン産生抑制を回復させるかを、ＥＰ４受容体を発現しているＰＭＡ分化ＴＨＰ1を用いて調べた。ＴＨＰ１細胞株は、ＰＭＡ  １００ｎＭを含むＲＰＭI培地で４８ウェル細胞培養プレートに１ウェルあたり２．５×１０５細胞播種した。３日間培養後、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１、マウスアイソタイプコントロール抗体３．０μｇ／ｍＬを含むＲＰＭＩ培地に培地交換し、３０分間インキュベートした。次に、ＰＧＥ２を２０ｎＭになるように加えてさらに３０分間インキュベートした。さらにＬＰＳを１００ｎｇ／ｍＬになるように加えてから１８時間培養した。培養上清を回収し、ＴＮＦα  Ｈｕｍａｎ  ＤｕｏＳｅｔ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を使用して使用説明書に従い、培養上清中のＴＮＦαの量を測定した。
一方、培養上清を回収した後の細胞には、ＲＰＭＩ培地で１０倍希釈したアラマーブルー（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ社製）を０．５ｍＬ加えた。４時間インキュベートした後に、励起波長５３５ｎｍ、検出波長５９５ｎｍの条件でプレートリーダーＡＲＶＯ  １４２０  ＨＴＳで蛍光測定した。このアラマーブルーでの測定結果を基に、各ウェル間の相対的な生存細胞数比を求め、生存細胞数比当たりのＴＮＦα生産量を算出した。本発明の抗体が、どの程度ＰＧＥ２によるサイトカイン産生抑制を回復するかは、以下の基準に基づいて算出した。すなわち、ＬＰＳ刺激のみを加えたウェルのＴＮＦα量を回復率１００％、ＬＰＳ刺激とＰＧＥ２を加えたウェルのＴＮＦα量を回復率０％として、ＬＰＳ刺激とＰＧＥ２と当該抗体を加えた場合の回復率を算出した。【００６９】
試験結果を表１に示した。マウスアイソタイプコントロール抗体を加えても、ＰＧＥ２によるＴＮＦα産生抑制に有意な変化は見られなかった。しかしＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１を加えた場合には、ＰＧＥ２によるＴＮＦα産生抑制を約５０％程度回復することが分かった。独立した２回の試験で同様の結果を得た。以上よりＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１はヒト内在性ＥＰ４に対してアンタゴニスト活性を有する機能性抗体であることが明らかになった。【００７０】
【表１】
2012043634.tif 000002
【００７１】
（１６）抗ＥＰ４抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡの単離、解析
抗ＥＰ４抗体を産生するハイブリドーマ（ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１）約１×１０７個よりＲｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （キアゲン社製）を用いて、添付の使用説明書に従ってＴｏｔａｌ ＲＮＡの抽出を行った。５’/３’ ＲＡＣＥキット、２ｎｄ ジェネレーション（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）にて５’−ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法によるＰＣＲを行い、重鎖または軽鎖の可変領域の増幅を行った。３’プライマーはマウス定常領域γ１とκに相当するプライマーを使用した。重鎖可変領域増幅のための３’ プライマーは５’−ＡＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＣＧＡＴＧ−３’（配列番号３３）と５’−ＧＧＣＴＧＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣ−３’（配列番号３４）である。軽鎖可変領域増幅のための３’プライマーは５’−ＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣ−３’（配列番号３５）と５’−ＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧ−３’（配列番号３６）である。次に、得られた増幅断片をアガロースゲルによって電気泳動し、バンドを切り出し、ゲルを溶かし出すことによってＤＮＡの精製を行った。精製したＤＮＡをＴ−Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０（タカラバイオ社製）に組み込み、塩基配列を解析してアミノ酸配列を決定した。シーケンス反応はＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．１（アプライドバイオシステムズ社）を使用し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）により塩基配列を決定した。  塩基配列を解析した結果、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４の重鎖可変領域をコードする核酸配列として配列番号１、軽鎖可変領域をコードする核酸配列として配列番号３であった。また重鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号２、軽鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号４が得られた。
さらに、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１の重鎖可変領域をコードする核酸配列として配列番号１１、軽鎖可変領域をコードする核酸配列としてとして配列番号１３であった。また重鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号１２、軽鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号１４が得られた。【００７２】
以上の結果から、Ｋａｂａｔら((１９９１) Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ, Ｆｉｆｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｕ. Ｓ. Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ,Ｕ. Ｓ. Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ)により定義されるＣＤＲ領域のアミノ酸配列が明らかとなった。
ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４の重鎖ＣＤＲ１〜３はそれぞれ、配列番号５〜７であった。また軽鎖ＣＤＲ１〜３はそれぞれ配列番号８〜１０であった。また、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１の重鎖ＣＤＲ１〜３はそれぞれ、配列番号１５〜１７であった。また軽鎖ＣＤＲ１〜３はそれぞれ配列番号１８〜２０であった。重鎖ＣＤＲについて両クローンは完全一致していた。
ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ９に関しても上述の方法に従って、重鎖可変領域は配列番号３３と配列番号３４のプライマーを、軽鎖可変領域は配列番号３５と配列番号３６のプライマーを用いて増幅し、可変領域の配列を決定した。ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ９の重鎖可変領域をコードする核酸配列として配列番号４１、軽鎖可変領域をコードする核酸配列として配列番号４２であった。また重鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号４３、軽鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号４４が得られた。
ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ９の重鎖ＣＤＲ１〜３はそれぞれ、配列番号４５〜４７であった。また軽鎖ＣＤＲ１〜３はそれぞれ配列番号４８〜５０であった。【００７３】
（１７）抗ＥＰ４抗体遺伝子のクローニング
Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ Ｆｏｒ ＲＴ?ＰＣＲ （ＡＭＶ） （ロシュ・ダイアグノスティックス社製)に付属のＯｌｉｇｏ−ｄＴ Ｐｒｉｍｅｒを用いて、使用説明書に従ってｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型として、本発明の抗ＥＰ４抗体の重鎖および軽鎖遺伝子全長をＰＣＲ増幅した。重鎖及び軽鎖の５’末端側は５’−ＲＡＣＥで判明した塩基配列を参考に、３’末端側は定常領域特異的配列を参考に設計した。重鎖遺伝子増幅のための５’プライマーは５’−ＣＡＣＴＧＡＣＣＣＴＡＣＧＣＧＴＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＡＴＧＧＡＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号３７）、３’プライマーは５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧ−３’ （配列番号３８）である。軽鎖可変領域増幅のための５’プライマーは５’−ＴＴＧＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＣＧＣＧＴＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣＣＣＴＧＣＴ−３’（配列番号３９）と５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号４０）である。得られた重鎖および軽鎖増幅断片は制限酵素ＭｌｕＩとＮｏｔＩで切断し、重鎖はｐＥＨＸ１．１(東洋紡績社製)、軽鎖はｐＥＬＸ２．１(東洋紡績社製)のＭｌｕＩとＮｏｔＩサイトに組み込み、塩基配列を解析してアミノ酸配列を決定した。
塩基配列を解析した結果、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４の重鎖をコードする核酸配列として配列番号２２、軽鎖をコードする核酸配列として配列番号２４となった。また重鎖のアミノ酸配列として配列番号２３、軽鎖のアミノ酸配列として配列番号２５が得られた。
ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１の重鎖をコードする核酸配列として配列番号２６、軽鎖をコードする核酸配列として配列番号２８となった。また重鎖のアミノ酸配列として配列番号２７、軽鎖のアミノ酸配列として配列番号２９が得られた。
重鎖ならびに軽鎖可変領域のアミノ酸配列は上記５’−ＲＡＣＥ法で解析したアミノ酸配列と同一であった。
ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ９に関しても、上述の方法に従ってｃＤＮＡを合成し、それを鋳型としてＮＢＧ０１６―ｍＡｂ９の重鎖および軽鎖遺伝子全長をＰＣＲ増幅した。重鎖遺伝子増幅のための５’プライマーは５’−ＣＡＣＴＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＴＡＣＧＣＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＴＴＣＣ−３’（配列番号５１）、３’プライマーは５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧ−３’ （配列番号５２）である。軽鎖遺伝子増幅のための５’プライマーは５’−ＴＣＣＴＣＡＧＧＴＴＧＣＣＴＣＡＣＧＣＧＴＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧ−３’（配列番号５３）と５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号４０）である。得られた重鎖および軽鎖増幅断片は制限酵素ＭｌｕＩとＮｏｔＩで切断し、重鎖はｐＥＨＸ１．１(東洋紡績社製)、軽鎖はｐＥＬＸ２．１(東洋紡績社製)のＭｌｕＩとＮｏｔＩサイトに組み込み、塩基配列を解析してアミノ酸配列を決定した。
ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ９の重鎖をコードする核酸配列として配列番号５４、軽鎖をコードする核酸配列として配列番号５５となった。また重鎖のアミノ酸配列として配列番号５６、軽鎖のアミノ酸配列として配列番号５７が得られた。【００７４】
（１８）得られた抗体遺伝子配列が抗ＥＰ４抗体をコードしていることの確認
ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１のリコンビナント抗体は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＰｏｗｅｒＥｘｐｒｅｓｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（東洋紡績社製）を用いて生産した。軽鎖遺伝子が挿入されたｐＥＬＸ２．１を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで切断し、アガロースゲルによって電気泳動して軽鎖遺伝子を含む断片を精製した。精製した軽鎖遺伝子断片を、重鎖遺伝子を挿入されたｐＥＨＸ１．１のＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩサイトに組み込み、軽鎖および重鎖両方の遺伝子を保持するプラスミドを作製した。このプラスミドをリポフェクトアミン２０００を用いて２９３ＦＴ細胞に形質導入し、一過性での抗体発現を行った。
形質導入から７２時間後の細胞培養上清を採取し、ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株との結合試験を（６）に記載した方法でフローサイトメトリーにより実施した。コントロールとしては抗体遺伝子未導入の２９３ＦＴ細胞の培養上清を使用した。その結果、培養上清中に分泌されたリコンビナント抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１は、ヒトＥＰ４に対する結合性を保持していた。このことから、（１７）で得られた抗体遺伝子配列は、抗ＥＰ４抗体をコードしていることが確認できた。
ＮＢＧ０１６―ｍＡｂ９のリコンビナント抗体も、上述の方法と同様に生産した。軽鎖遺伝子が挿入されたｐＥＬＸ２．１は制限酵素ＳａｌＩとＳｐｅＩで切断し、アガロースゲルによって電気泳動して軽鎖遺伝子を含む断片を精製した。精製した軽鎖遺伝子断片を、重鎖遺伝子が挿入されたｐＥＨＸ１．１のＳａｌＩ−ＳｐｅＩサイトに組み込み、軽鎖および重鎖両方の遺伝子を保持するプラスミドを作製した。このプラスミドを２９３ＦＴ細胞に形質導入し、一過性での抗体発現を行った。
形質導入から７２時間後の細胞培養上清を採取し、ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株との結合試験を（６）に記載した方法でフローサイトメトリーにより実施した。コントロールとしては抗体遺伝子未導入の２９３ＦＴ細胞の培養上清を使用した。結果を図１０に示す。親株Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞を灰色に塗りつぶしたヒストグラムで、ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株を黒の実線で示している。培養上清中に分泌されたリコンビナント抗体ＮＢＧ０１６―ｍＡｂ９がヒトＥＰ４に対する結合性を保持していたことから、（１７）で得られたＮＢＧ０１６―ｍＡｂ９の抗体遺伝子配列は、抗ＥＰ４抗体をコードしていることが確認できた。【００７５】
（１９）リコンビナント抗ＥＰ４抗体安定発現ＣＨＯ細胞の作製
（１８）で作製した、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１の軽鎖および重鎖の遺伝子を保持するベクターを制限酵素ＳｓｐＩで切断し、エタノール沈殿法で精製した。リポフェクトアミン２０００を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞（理化学研究所細胞バンク）に形質導入し、１０%ウシ胎児血清を含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地で２４時間培養した。２４時間後、１０% ウシ胎児血清および１０μｇ/ｍＬピューロマイシンを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地に交換し、３日毎に培地交換をしながら１２日間培養した。１２日後にペニシリンキャップ法でコロニーを分離した。
分離したＣＨＯ―Ｋ１細胞を２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、１０μｇ/ｍＬ ピューロマイシンを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地で３日間培養した。３日後に１０μｇ/ｍＬピューロマイシンを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（ウシ胎児血清無添加）に交換し、７２時間培養後の培養上清を回収した。
培養上清中のマウスＩｇＧはＥＬＩＳＡ法により検出した。ＰＢＳを用いて培養上清の希釈系列を作製し、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ （Ｎｕｎｃ社製)に分注して４℃で一晩静置した。翌日、３％ ＢＳＡ(Ｓｉｇｍａ社製)を含むＰＢＳを加えて室温で1時間静置してブロッキングした。０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳで洗浄した後、１％ ＢＳＡを含むＰＢＳで４，０００倍に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（ミリポア社製）を加え、室温で１時間静置した。０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳで洗浄した後、発色試薬（Ｓｕｒｅｂｌｕｅ ＴＭＢ ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１００μＬ加えて室温で５分静置した後、１００μＬの１Ｎ硫酸を加えて反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、軽鎖および重鎖の遺伝子を保持するベクターを導入して株化したＣＨＯ−Ｋ１細胞の上清で、ＩｇＧの発現を確認した。【００７６】
(２０)リコンビナント抗ＥＰ４抗体とヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株の結合試験
（１９）で樹立した細胞株培養上清から（７）と同様にして、リコンビナント抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４、リコンビナント抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１を精製した。得られた精製リコンビナント抗ＥＰ４抗体と、ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株の結合試験を（６）に記載した方法でフローサイトメトリーにより実施した。精製リコンビナント抗ＥＰ４抗体もしくはマウスアイソタイプコントロール抗体は細胞５×１０５個あたり１μｇを使用した。２次抗体にはＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。
図１１にその結果を示す。親株Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞を灰色に塗りつぶしたヒストグラムで、ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株を黒の実線で示している。リコンビナント抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４、リコンビナント抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１が共に、ヒトＥＰ４安定発現ＣＨＯ細胞株にのみ結合していることから、精製リコンビナント抗ＥＰ４抗体が、ヒトＥＰ４に対する結合性を保持していることが確認された。【００７７】
（２１）マウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１発現ベクターの作製
（７）で精製したＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１はサブクラスがＩｇＧ２ａであった。そこで、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１のサブクラスをＩｇＧ１に改変し、マウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１を作製した。マウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１遺伝子はＯｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ＰＣＲ法で以下の通り作製した。ＮＢＧ０１６―ｍＡｂ２１の重鎖遺伝子を鋳型として、５’−ＣＡＣＴＧＡＣＣＣＴＡＣＧＣＧＴＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＡＴＧＧＡＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号３７）と５’−ＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＴＴＴＴＡＧＣＧＣＴＡＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣ−３’（配列番号５８）を用い、ＮＢＧ０１６―ｍＡｂ２１の可変領域遺伝子をＰＣＲ増幅した。一方で、マウスＩｇＧ１を産生するハイブリドーマのＴｏｔａｌ  ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型にして、５’−ＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＡＧＣＧＣＴＡＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣ−３’（配列番号５９）と５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧ−３’（配列番号３８）を用い、マウスＩｇＧ１のＣＨ１から定常領域遺伝子までをＰＣＲ増幅した。増幅して得られた重鎖可変領域遺伝子とＣＨ１―定常領域遺伝子断片を混合し、配列番号３７と配列番号３８のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。増幅して得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＭｌｕＩとＮｏｔＩで切断し、発現ベクターｐＥＨＸ１．１のＭｌｕＩ−ＮｏｔＩサイトに挿入した。得られた発現ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで切断し、ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１の軽鎖遺伝子断片（ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ断片）を挿入してマウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１発現ベクターとした。【００７８】
（２２）マウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１安定発現株作製方法
８ｍＭグルタミンを含むＥＸ−ＣＥＬＬ  ＣＤ  ＣＨＯ培地（ＳＡＦＣＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）で培養した浮遊ＣＨＯ−ＫＩ細胞（東洋紡績社）（２.５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を２４穴プレートの２ウェルに１ｍｌずつ分注した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  １３６μｌ、リポフェクトアミン２０００  １５μｌ、および制限酵素ＳｓｐＩで切断したマウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１発現ベクター４μｇを混合し、室温で２０分放置した後、ＣＨＯ−Ｋ１を入れたウェルに６８μｌずつ添加し、ＣＯ２インキュベーターで２４時間インキュベートした。２４時間後の細胞を８ｍＭグルタミンを含むＥＸ−ＣＥＬＬ  ＣＤ  ＣＨＯ培地８ｍｌに細胞を懸濁し、６穴プレートの２ウェルに４ｍｌずつ分注した。一方のウェルに１０ｍｇ／ｍｌのピューロマイシンを３μｌ、もう一方のウェルに４μｌ添加し、３日または４日毎に培地を交換しながら１８日間培養した。増殖したウェルの細胞を回収して、５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにＣｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  （１ｌ当たりＥＸ−ＣＥＬＬ  ＣＤ  ＣＨＯ培地７００ｍｌ、浮遊ＣＨＯ−ＫＩ細胞培養上清３００ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ  ピューロマイシン１ｍｌまたは０．７５ｍｌを混合した培地）に懸濁して、９６穴プレートに２００μｌずつ分注した。１週間後にＣｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍを１００μｌ添加し、さらに1週間培養した。数回継代培養した後、薬剤耐性細胞（４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を２４穴プレートに５００μｌ入れ、５日間培養した。５日後にＭｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＥＩＡ  Ｋｉｔ  （タカラバイオ社製）を用いて上清中の抗体量を定量して抗体生産細胞をスクリーニングした。この細胞をマウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１安定発現ＣＨＯ細胞株とした。【００７９】
（２３）マウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１の精製
マウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１安定発現ＣＨＯ細胞株を、８ｍＭ  グルタミン、７．５μｇ／ｍｌ  ピューロマイシンを含むＥＸ−ＣＥＬＬ  ＣＤ  ＣＨＯ培地で１０日間培養して抗体を産生させた。この培養上清２００ｍＬから（７）と同様にして精製ＩｇＧを得た。以降、得られた精製ＩｇＧをマウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１とした。【００８０】
（２４）マウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１とヒトＥＰ４の結合試験 
マウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１と、ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株の結合試験を（９）と同様に実施した。結果を図１２（Ａ）に示す。親株Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞を灰色に塗りつぶしたヒストグラムで、ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株を黒の実線で示している。マウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１がヒトＥＰ４安定発現ＣＨＯ細胞株にのみ結合していることから、作製したマウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１が、ヒトＥＰ４に対する結合性を保持していることが確認された。【００８１】
（２５）ＰＧＥ２によるｃＡＭＰ産生に対するマウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１の阻害試験
マウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１が、ＰＧＥ２による ｃＡＭＰ産生を阻害するかを（１０）と同様に調べた。細胞と抗体を室温で１５分間反応させた後、ＰＧＥ２を１．５×１０−１０Ｍになるように加え、さらに室温で３０分間静置した。ｃＡＭＰ量は、ＬＡＮＣＥ Ｕｌｔｒａ ｃＡＭＰ Ｋｉｔ（パーキンエルマー社製）を用いて、使用説明書に従った反応を行って測定した。
その結果を図１２（Ｂ）に示す。マウスアイソタイプコントロール抗体を加えても、ＰＧＥ２により誘導されたｃＡＭＰ産生量に関して有意な阻害効果が見られなかったのに対し、マウスＩｇＧ１型抗体ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１を加えた場合には、その抗体濃度に依存的なｃＡＭＰ産生阻害効果が見られた。ＩＣ５０値は１．１μｇ／ｍＬ（約６．９ｎＭ）であった。この結果からＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１をマウスＩｇＧ１型抗体に改変してもＥＰ４に対するアンタゴニスト活性を保持していることが示された。【００８２】
（２６）ヒトキメラ型抗体ＮＢＧ０１６―ｍＡｂ１４および２１の作製
ＮＢＧ０１６―ｍＡｂ１４および２１のＣＨ１領域以降をヒト抗体遺伝子に置換したヒトキメラ型抗体は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＰｏｗｅｒＥｘｐｒｅｓｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（東洋紡績社製）を用いて生産した。ＮＢＧ０１６―ｍＡｂ１４および２１の重鎖可変領域遺伝子を、５’−ＣＡＣＴＧＡＣＣＣＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＡＴＧＧＡＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号６０）と５’−ＧＧＣＴＧＴＴＧＴＧＣＴＡＧＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴ−３’（配列番号６１）を用いてＰＣＲ増幅した。得られた重鎖遺伝子断片は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＮｈｅＩで切断し、発現ベクターｐＥＨγＸ１．１のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｈｅＩサイトに挿入した。一方で、ＮＢＧ０１６―ｍＡｂ１４および２１の軽鎖可変領域遺伝子を５’−ＡＴＴＧＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣＣＣＴＧＣＴ−３’（配列番号６２）と５’−ＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＡＣＴＴＴＧＴＣＣＣＣ−３’（配列番号６３）を用いてＰＣＲ増幅した。得られた軽鎖遺伝子断片は制限酵素ＢｓｉＷＩとＥｃｏＲＩで切断し、発現ベクターｐＥＬκＸ２．１のＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩサイトに挿入した。
軽鎖遺伝子が挿入されたｐＥＬκ２．１を制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＮｏｔＩ、ＳｃａＩで切断し、アガロースゲルによって電気泳動して軽鎖遺伝子を含む断片を精製した。精製した軽鎖遺伝子断片を、重鎖遺伝子が挿入されたｐＥＨγＸ１．１のＢｇｌＩＩ―ＮｏｔＩサイトに組み込み、軽鎖および重鎖両方の遺伝子を保持するプラスミドを作製した。このプラスミドをリポフェクトアミン２０００を用いて２９３ＦＴ細胞に形質導入し、一過性での抗体発現を行った。
形質導入から７２時間後の細胞培養上清を採取し、ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株との結合試験を（６）に記載した方法でフローサイトメトリーにより実施した。コントロールとしては抗体遺伝子未導入の２９３ＦＴ細胞の培養上清を、２次抗体としてはＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（アブカム社製）を使用した。図１３に結果を示す。親株Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞を灰色に塗りつぶしたヒストグラムで、ヒトＥＰ４ 安定発現ＣＨＯ細胞株を黒の実線で示している。この結果より、培養上清中に分泌されたヒトキメラ型抗体ＮＢＧ０１６―ｍＡｂ１４および２１は、ヒトＥＰ４に対する結合性を保持していることが確認された。
これらの結果から、本発明により提供される抗体をコードする核酸配列を用いて、その機能を保持するリコンビナント抗体（例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体及びヒト抗体等）の生産が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明により提供される抗体は、ヒトＰＧＥ２受容体サブタイプＥＰ４の機能を特異的に抑制することから、ＥＰ４に関連する疾患の予防又は治療方法の提供や、該疾患の予防又は治療剤の開発において重要な役割を果たすことが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年3月13日(2013.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
国際寄託受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０２（ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ１４）、  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０３（ＮＢＧ０１６−ｍＡｂ２１）のハイブリドーマから産生されることを特徴とする抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
ＰＧＥ２受容体サブタイプＥＰ４の細胞外ドメインに結合し、ＥＰ４特異的にその機能を抑制し、かつ、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３には結合しないことを特徴とする抗体であって、その相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列について、下記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のいずれかを満たすことを特徴とする抗体又はその抗原結合断片。
（Ａ）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
（Ｂ）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
（Ｃ）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
【請求項３】
ＰＧＥ２受容体サブタイプＥＰ４の細胞外ドメインに結合し、ＥＰ４特異的にその機能を抑制し、かつ、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３には結合しないことを特徴とする抗体であって、その重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列について、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかを満たすことを特徴とする請求項２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
（ｂ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
（ｃ）配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
【請求項４】
ＰＧＥ２受容体サブタイプＥＰ４の細胞外ドメインに結合し、ＥＰ４特異的にその機能を抑制し、かつ、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３には結合しない抗体であって、請求項１乃至３のいずれかに記載の抗体と受容体との結合を競合阻害する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
ヒト化抗体又はキメラ抗体であることを特徴とする請求項２乃至４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
前記ＥＰ４の機能が、細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させることである、請求項２乃至５のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ‘）２、Ｆｖ、一本鎖抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体若しくはｄｓＦｖであることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の抗原結合断片。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物。
【請求項９】
ＰＧＥ２受容体サブタイプＥＰ４の機能異常によって発症及び/又は進展する疾患の予防あるいは治療に用いられる、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
治療対象疾患が、免疫疾患であることを特徴とする請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
治療対象疾患が、腫瘍であることを特徴とする請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
治療対象疾患が、疼痛であることを特徴とする請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１乃至７のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片が担体に固定化されてなる抗体固定化担体。
【請求項１４】
ＰＧＥ２受容体サブタイプＥＰ４発現細胞を含む血液を接触させて、前記血液から該ＥＰ４発現細胞を除去するために用いられることを特徴とする請求項１３に記載の抗体固定化担体。
【請求項１５】
請求項１乃至７のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、細胞表面上のＰＧＥ２受容体サブタイプＥＰ４発現量を測定するキット。
【請求項１６】
配列番号１、配列番号３、配列番号１１、配列番号１３、配列番号４１、配列番号４２であらわされる請求項２又は３に記載の抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする核酸。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベクターが導入された細胞。
【国際調査報告】
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