(57)【要約】  本発明の課題は、アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチド（ＡＰＰ−ＳＰ）に対する抗体を提供することである。  本発明は、アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチドに対する抗体を提供する。
2012093732.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチドに対する抗体。
【請求項２】
前記シグナルペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを用いて得られる、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
モノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
請求項４に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項６】
受領番号（ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１１９８）で示される、ハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチドに対する抗体に関する。また、本発明は、アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチドに対するモノクローナル抗体及びこれを産生するハイブリドーマにも関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内においてペプチドそのものがホルモンや神経伝達物質などの様々な機能を有することが広く一般に知られている。そのようなペプチドの中には複数の生理的役割を担うペプチドが近年報告されている。従来、シグナルペプチドと呼ばれる短いペプチド領域は、新規合成タンパク質を小胞体に移行させる役割しか担わないと考えられていたが、近年、他の生理的役割が相次いで報告されている（非特許文献１）。【０００３】
例えば、カルレティキュリン（ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）のシグナルペプチドの一部が主要組織適合複合体（ＭＨＣ）により細胞表面に提示されることが明らかにされている（非特許文献２）。この現象の生理学的意義については、細胞内タンパク質の発現量または正常なシグナルペプチドの産生割合をモニターするための機構の一部である可能性が考えられているが、結論は出ていない。
また、カルシトニン（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）のシグナルペプチドの一部がＭＨＣにより非小細胞性肺がん細胞の表面に提示され、細胞傷害性Ｔ細胞がこのシグナルペプチドをエピトープとして認識することが示されており、がんワクチンの開発につながると期待されている（非特許文献３）。【０００４】
以上のように、シグナルペプチドがタンパク質を小胞体に導く単なるシグナルとしてだけではなく、新規な生理的・病理的意義を持つことが明らかとなってきており、未だ研究が進んでいないシグナルペプチドが何らかの重要な生理的現象、例えば原因不明の難病の要因として関与している可能性は否定できない。
かかる難病の一つとして、アルツハイマー病が挙げられる。アルツハイマー病は脳における神経細胞の脱落、アミロイドβの蓄積、神経原繊維変化を病理的特長とする進行性認知症である。この病理的特長から、アミロイドβが根本原因であるという仮説が普及し、長年にわたりアルツハイマー病の診断・治療方法が研究されてきたが、治療方法はもとより、未だ発病メカニズムさえ明らかにされていない。このような現状を鑑みて、最近ではアミロイドβ原因説が間違っているのではないかという意見も出つつある（非特許文献４）。さらに、アミロイドβ以外の因子がアルツハイマー病発症に関与することを示唆する報告がある。【０００５】
非特許文献５において、アミロイド前駆体タンパク質のＮ末端から２８６残基までの領域が神経細胞の変性を促すことが開示されており、アミロイドβ以外のアルツハイマー病の原因物質としての可能性を筆者らは言及している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Trends in Cell Biology、１９９８、ｖｏｌ．８、ｐｐ．４１０−４１５
【非特許文献２】Science、１９９２、ｖｏｌ．２５５、ｐｐ．１２６４−１２６６
【非特許文献３】Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、２００８、ｖｏｌ．２９、ｎｏ．１０５、ｐｐ．１０１１９−１０１２４
【非特許文献４】Nature、２００８、ｖｏｌ．４５６、ｐｐ．１６１−１６４
【非特許文献５】Nature、２００９、ｖｏｌ．４５７、ｐｐ．９８１−９８９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献５ではアミロイド前駆体タンパク質のＮ末端から２８６残基目までのタンパク質が神経変性を促進させることを示しているが、この領域内のどの部分が神経変性の本質的な原因部分であるかまでは示されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このアミロイド前駆体タンパク質のＮ末端から１７残基までには配列番号１で示されるシグナルペプチド（Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg Ala：ＡＰＰ−ＳＰ）が含まれている。したがって、ＡＰＰ−ＳＰがアルツハイマー病の発症に寄与している可能性があり、今後、アルツハイマー病の診断、治療などに利用するためにも、アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチド（ＡＰＰ−ＳＰ）に対する抗体は有用性が期待できる。
本発明は、アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチド（ＡＰＰ−ＳＰ）に対する抗体を提供することを目的の１つとする。【０００９】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）
アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチドに対する抗体。
（２）
前記シグナルペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドである、（１）に記載の抗体。
（３）
配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを用いて得られる、（１）又は（２）に記載の抗体。
（４）
モノクローナル抗体である、（１）〜（３）のいずれかに記載の抗体。
（５）
（４）に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（６）
受領番号（ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１１９８）で示される、ハイブリドーマ。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチド（ＡＰＰ−ＳＰ）に対する抗体を提供することができる。本発明の孔ＡＰＰ−ＳＰ抗体は、アルツハイマー病の診断、治療などに利用し得るという可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１における、抗体価の測定結果を示す。
【図２】競合ＥＬＩＳＡの測定結果を示す。
【図３】抗ＡＰＰ−ＳＰモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡの測定結果を示す。
【図４】ｒａｎｄｏｍ ＡＰＰ−ＳＰ（配列番号２）に対するＥＬＩＳＡの測定結果を示す。
【図５】ドットブロット法における測定結果を示す。
【図６】参考例における、抗体価の測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について、その好ましい態様を具体的に説明する。なお。本発明は、以下の発明を実施するための形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１３】
本発明の抗体は、アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチド（ＡＰＰ−ＳＰ）に対する抗体であり、該抗体は、アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチドを特異的に認識する抗体であることが好ましい。
本発明において、「アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチド」（又は、「ＡＰＰ−ＳＰ」と表記する場合がある。）とは、（ａ）配列番号１で記載されるアミノ酸配列で示されるペプチドを意味する。当該配列中、Ｍｅｔ（Ｍ）と記載する場合には、フリーのメチオニン又はＳ−メチルメチオニンを意味し、アミノ酸は、ＩＵＰＡＣの命名法に従い、１文字又は３文字表記により表わす。
【００１４】
アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチドは、天然由来の単離されたペプチドであってもよく、従来公知の方法により製造されるペプチドであってもよい。ペプチド合成の分野において、配列番号１からなるアミノ酸配列を有するペプチドは、従来公知の方法により化学合成することもでき、微生物などを用いて組み換え技術により合成することもできるペプチドである。
【００１５】
本発明で得られたＡＰＰ−ＳＰを認識する抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。近年の研究結果によると（例えば、非特許文献５参照）、アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチド部分を含むＮ末端領域が神経細胞の変性を促すことが示されており、アルツハイマー病の原因物質として注目されているＡＰＰ−ＳＰを抗原とする抗体は、将来、アルツハイマー病の解析、診断、治療などに活用できることが期待できる。
【００１６】
本発明のＡＰＰ−ＳＰに対する抗体は、抗原として、ＡＰＰ−ＳＰを含む抗原を用いて得られる抗体であり、例えば、抗原として、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、又は
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド、
を用いることができる。
好適には、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として用いることにより、得られる抗体は、ＡＰＰ−ＳＰを認識する。
【００１７】
抗原抗体反応は、上記抗原を用いて、従来公知のように、被免疫動物に抗原となる物質を投与することにより行うことができる。
抗原となる物質を投与して、被免疫動物における免疫反応を惹起することにより、本発明のＡＰＰ−ＳＰに対する抗体を産生させることができる。
【００１８】
被免疫動物としては、特に限定されるものではないが、実験動物として用いられる、モルモット、ラット、マウス、ウサギ及びヒツジ等が挙げられる。
【００１９】
抗原の投与方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内及び皮内等の投与経路が挙げられる。抗原の投与スケジュールとしては、特に限定されるものではないが、例えば、２週間の投与間隔で、抗原を約２〜１０回投与することにより、ＡＰＰ−ＳＰに対する抗体を産生させることができる。
投与スケジュールに併せて適宜、被免疫動物から血清サンプルを採取して抗体の産生量を確認して、十分に免疫反応が惹起されているか確認することもできる。
最終免疫後、被免疫動物から血清を採取し、従来公知の方法により精製して抗ＡＰＰ−ＳＰ抗体を得ることができる。
初回免疫、追加免疫のための抗原の投与量は、特に限定されるものではないが、ＡＰＰ−ＳＰに相当する抗原の投与量として、例えば、マウス１匹当たり１０〜２００μｇとすることができる。
【００２０】
抗原を投与する際に、アジュバンドを同時投与してもよい。斯かるアジュバントとしては、免疫反応を高力価で惹起することのできる従来公知のアジュバントを用いることができる。例えば、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、水酸化アルミニウム等が挙げられる。
【００２１】
本発明の抗体の製造方法により、ポリクローナル抗体を得ることができるが、続いて、従来公知の方法により抗体を精製して、純度の高い抗体とすることができる。
また、抗体を産生した被免疫動物の脾臓又はリンパ節等から抗体産生細胞を採取することにより、ハイブリドーマを製造することができ、また、モノクローナル抗体を得ることもできる。
【００２２】
本発明のＡＰＰ−ＳＰに対する抗体を得るためには、次のような抗原溶液を用いることができる。
抗原溶液としては、ＡＰＰ−ＳＰに対する抗体を得るための抗原を含む溶液であり、抗原として、
（ａ）配列番号１からなるアミノ酸配列からなるペプチド、又は
（ｂ）配列番号１からなるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド、
を用いる場合には、該ペプチドとＰＥＧ系界面活性剤を含むペプチドミセル凝集体溶液を抗原溶液として用いることができる。
【００２３】
本発明において、「ＰＥＧ系界面活性剤」としては、分子内にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構造を有する界面活性剤であれば特に限定されるものではない。
ＰＥＧ系界面活性剤としては、親水性部分構造としてのＰＥＧと、疎水性部分構造としての、コレステロール骨格、炭素数８〜２０の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素骨格、等とが、ＰＥＧ末端のアルコール性水酸基とエーテル結合、エステル結合等を介して、共有結合している化合物が挙げられる。
ＰＥＧ部分の繰り返し構造（エチレングリコール構造）の重合度としては、例えば、７０以下であり、６０以下であってもよい。
【００２４】
ＰＥＧ系界面活性剤としては、例えば、下記式で表される群から選択される少なくとも１種の化合物等が挙げられる。
【化１】
2012093732.tif 000003
（式中、ｍは、０〜１０の整数であり、ｎは、１０〜７０の整数である。ｘは、３０〜６０の整数である。）
式中、ｎやｘが繰返し構造の重合度を意味する。
【００２５】
上記式で表される群から選択される少なくとも１種の化合物で表わされるＰＥＧ系界面活性剤としては、上記式において、ｘが５０であるＣＳ−０５０、ｍが１であり、ｎが６０であるＰＥＧ６０、ｎが３６であるＰＥＧ３６、ｎが２４であるＰＥＧ２４、ｎが１２であるＰＥＧ１２等が挙げられる。
【００２６】
上記ペプチドと、ＰＥＧ系界面活性剤を含む溶液との混合は、特に限定されるものではなく、上記ペプチドを、ＰＥＧ系界面活性剤を含む溶液中に混合すればよい。
次いで、アジュバントを混合して、ペプチドミセル凝集体溶液として、上記ペプチドを抗原として被免疫動物に投与することにより、抗ＡＰＰ−ＳＰ抗体を得ることができる。
【００２７】
アジュバントとしては、例えば、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、水酸化アルミニウム等が挙げられる。
アジュバントを混合する際に、超音波処理装置を用いてエマルジョンを形成させることが好適である。
【００２８】
ペプチドミセル凝集体溶液は、ペプチドミセル凝集体の粒度分布を揃えるために整粒してもよく、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーやメンブレンフィルターによる濾過等の方法により粒度を揃えることができる。
【００２９】
ペプチドミセル凝集体の粒度は、５μｍ〜２００μｍであってもよく、５μｍ〜１００μｍであってもよい。
ペプチドミセル凝集体の粒度は日機装社製の動的光散乱粒度計測装置を用いて測定することができる。
【００３０】
従来公知の方法として、ペプチドに対する抗体を作製しようとする場合には、キャリアタンパク質にペプチドを多数共有結合させた抗原が用いられる。
該ペプチドと、キャリアタンパク質の結合は、従来公知の方法により形成することができる。
キャリアタンパク質としては、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）等が挙げられる。
【００３１】
キャリアタンパク質に、上記ペプチドを結合させる場合には、上記ペプチドのＮ末端にシステインなどを付加し、キャリアタンパク質と結合するリンカーを用いることができる。
【００３２】
斯かるリンカーとしては、キャリアタンパク質と、システインを付加したペプチドとを共有結合できるリンカーであれば特に限定されるものではないが、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステル（ＮＨＳエステル）、マレイミド、カルボジイミド等の官能基を有するリンカーが挙げられる。
【００３３】
本発明において、キャリアタンパク質に抗原部位を担持させてＡＰＰ−ＳＰに対する抗体を得る場合には、実施例に開示するように、抗原として、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドのようにＡＰＰ−ＳＰの全長ペプチドを有するペプチドを用いた場合には、ＡＰＰ−ＳＰに対する抗体を得ることができなかった。
【００３４】
本発明の抗体を得るためには、抗原の投与方法としては、特に限定されるものではないが、抗体価を測定して、所望の抗体価が得られるまで抗原を投与してもよい。
抗体価は、吸光度により測定することができる。抗体価は、被免疫動物から適宜採取した血液サンプルを用いて測定することができ、遠心分離等することにより夾雑物を除いた血清サンプルを用いることが好ましい。
抗体価は、特に限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：酵素免疫測定法）等の従来公知の方法により、測定することができる。
【００３５】
追加免疫により所望の抗体価を示す血清が得られた場合には、従来公知の方法により精製して、抗ＡＰＰ−ＳＰ抗体を得ることができる。
抗体の精製には、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のクロマト精製や、塩析などの方法を用いることができ、このように血清サンプルから得られる抗体は、ＡＰＰ−ＳＰを認識するポリクローナル抗体である。
ポリクローナル抗体の抗原特異性については、ＥＬＩＳＡ等の方法により確認することができる。
【００３６】
ＡＰＰ−ＳＰを認識する抗体が得られることが分かった場合、従来公知の方法で、被免疫動物の脾臓又はリンパ節等から抗体産生細胞を採取することができる。得られた抗体産生細胞を用いて細胞融合を行うことによりハイブリドーマ(融合細胞)を得ることができる。抗体産生細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを融合させることにより、ハイブリドーマを得ることができる。
抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な細胞株を使用することができる。
ミエローマ細胞としては、例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１、ＳＰ２／０−Ａｇ１４等が挙げられる。
【００３７】
細胞融合させた後、スクリーニングすることにより、ハイブリドーマのみ選択的に増殖させることができる。スクリーニングの方法としては、ＨＡＴ培地等で培養することが好ましい。この時、ハイブリドーマの増殖を助けるため、胸腺細胞等のフィーダー細胞と一緒に培養してもよい。得られたハイブリドーマが産出する抗体の抗原特異性は、培養上清をＥＬＩＳＡ等の公知の方法により測定して確認することで、所望の抗体産出が確認できたハイブリドーマのみを選択することができる。次いで、得られたハイブリドーマをクローニングすることにより、混在する目的以外の細胞を除き、単クローンからなるハイブリドーマを得ることができる。クローニングの方法としては、例えば、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法等が挙げられる。得られたハイブリドーマは従来公知の方法により凍結保存することができる。クローニング後のハイブリドーマから、従来公知の方法によりモノクローナル抗体を製造することができる。例えば、マウスの腹腔内でハイブリドーマを増殖させ、モノクローナル抗体を含む腹水を精製して製造することができる。また、無血清培地でハイブリドーマを培養し、その培養上清を精製することで製造することもできる。
【００３８】
本発明において得られる抗体は、マウスを被免疫動物として用いた場合、マウス抗体であるが、従来公知の方法により、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体とすることができる。特に、ＡＰＰ−ＳＰを認識するキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体は、アルツハイマー病の治療に有効な抗体である。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００４０】
実施例１：抗ＡＰＰ−ＳＰモノクローナル抗体の作製
（１）ペプチド（ＡＰＰ−ＳＰ）の合成
ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｌｔｄ．(Ｓｈａｎｇｈａｉ)に委託して、Ｆｍｏｃ固相合成法によりヒトアミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチド（ＡＰＰ−ＳＰ、配列番号１）の化学合成を行った。
化学合成したペプチド（ＡＰＰ−ＳＰ）は、ＯＤＳカラムを用い、移動相として０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する水／アセトニトリル（ＭｅＣＮ）を用いた濃度勾配法により精製した。【００４１】
（２）抗原溶液の作製と免疫作業
（１）で化学合成したＡＰＰ−ＳＰを、ＰＥＧ系界面活性剤として、下記式（Ｉ）で示されるＰＥＧ６０（ｐｏｌｙｐｕｒｅ社製）を用いて０．８ｍｇ／ｍＬ ＡＰＰ−ＳＰ、１％ ＰＥＧ６０となるよう調製して、ＡＰＰ−ＳＰが可溶化した混合水溶液を得た。【００４２】
式（Ｉ）：
【化２】
2012093732.tif 000004
【００４３】
得られた調製溶液と等量のアジュバントを混合し、超音波処理してエマルジョンとしての抗原溶液を得た。
抗原溶液を、表１に示す投与スケジュールでメスのマウスＢＡＬＢ／ｃの腹腔内に投与した。採血１〜７は眼底より行なった。なお、前記アジュバントとして初回免疫時（０日）はフロイントの完全アジュバント（シグマ社製）を、追加免疫時（１４日以降）にはフロイントの不完全アジュバント（シグマ社製）を用いた。【００４４】
【表１】
2012093732.tif 000005
【００４５】
（３）抗体価の測定
（２）で行った免疫結果を評価するため、表１に示した採血で得た血清を用いてＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）を以下のように行った。
（１）で化学合成したＡＰＰ−ＳＰと、ＰＥＧ６０とを、２．５ｍｇ／ｍＬ ＡＰＰ−ＳＰ、１％ＰＥＧ６０となるように調製して得られた調製溶液を、０．４５μｍフィルターでろ過した。
ろ過液を純水で３５０倍希釈し、９６穴マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）に１００μＬずつ添加し、室温で一晩静置した。ウェル内の溶液を破棄し、３％ ＢＳＡ（シグマ社製、Ａｌｂｕｍｉｎ、ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ、ｍｉｎｉｍｕｍ  ９６％、ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｐｏｗｄｅｒ）、０．１％ ＮａＮ３、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．０）を２５０μＬ添加し、３時間静置した。ウェル内の溶液を破棄し、１％ ＢＳＡ、０．０５％ ＮａＮ３、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．５）で１０００倍希釈した採血１〜７で得られた血清を１００μＬ添加し、１時間静置した。ＰＢＳＴ（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）でウェル内を６回洗浄後、１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４０００倍希釈したＨＲＰ ｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ ｃｈａｉｎ)（ＭＢＬ社製）を１００μＬ添加し、１時間静置した。ＰＢＳＴでウェル内を６回洗浄後、ＴＭＢ＋（Ｄａｋｏ社製）を１００μＬ添加し、３０分間暗室で静置した。２規定硫酸を１００μＬ添加後、４５０ｎｍと６５０ｎｍの吸光度を測定した。４５０ｎｍから６５０ｎｍの吸光度を差し引いた値を縦軸として、得られた結果を図１に示す。
図１の結果より、マウス体内において、ヒトアミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチド（ＡＰＰ−ＳＰ）に結合性を有する抗体産生が行なわれていることが確認できた。【００４６】
（４）抗ＡＰＰ−ＳＰモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
株式会社ベックスに委託して、（３）抗体価の測定において、抗体価の上昇がみられたマウスのＢ細胞をもとにハイブリドーマを作製した。
ＡＰＰ−ＳＰに対する抗体価の上昇が確認された免疫開始後９４日目のマウスの脾臓を摘出して調製したＢ細胞と、ミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１とを、５０％ＰＥＧ１５００（ロシュ社製）の作用によって細胞融合させた。融合後の細胞を、あらかじめフィーダー細胞を加えた９６穴プレート１０枚へ蒔き、ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択的に増殖させた。
反応性が確認されたウェル内の細胞を２４穴プレートにて拡大培養させた。拡大培養後、（３）と同様にしてＥＬＩＳＡを行い、陽性が示されたハイブリドーマを選択し、クローニングを行なった。クローニングは限界希釈法を２回繰り返すことにより行い、最終的にＡＰＰ−ＳＰに反応を示すモノクローナル抗体を産生する１種類のクローンを得た（以下、このクローンを１２Ａ３ハイブリドーマと呼ぶ）。かかる１２Ａ３ハイブリドーマは、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ、日本国  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に２０１２年１月６日に特許手続上の微生物の寄託等の国際的承認に関するブタペスト条約に基づいた国際寄託され受領されている（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１１９８）。【００４７】
（５）１２Ａ３ハイブリドーマが産生する抗ＡＰＰ−ＳＰモノクローナル抗体の評価
抗ＡＰＰ−ＳＰモノクローナル抗体のＡＰＰ−ＳＰに対する反応特異性を調べるため、競合ＥＬＩＳＡを行なった。具体的には、（３）と同様の方法で、一次抗体反応には、１２Ａ３ハイブリドーマを培養させた培養上清を３倍希釈で使用し、この溶液に０．２％ ＰＥＧ６０を含む場合（競合−）と、１００μｇ／ｍＬ ＡＰＰ−ＳＰ、０．２％ ＰＥＧ６０を含む場合（競合＋）とを用意し比較した。図２に結果を示すように、ＡＰＰ−ＳＰを競合させた場合、シグナル強度が９２％減少したため、本モノクローナル抗体のＡＰＰ−ＳＰに対する結合性を確認することが出来た。
また、マウスモノクローナル抗体サブクラス判定キット（ロシュ社製）を用いて１２Ａ３ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のサブクラスを解析したところ、ＩｇＧ２ａであることが示された。【００４８】
（６）抗ＡＰＰ−ＳＰモノクローナル抗体の製造
メスのマウスＢＡＬＢ／ｃ ３匹にプリスタン（シグマ社製）を１匹あたり０．５ｍＬ腹腔内に投与した。１週間後、あらかじめ培養しておいた１２Ａ３ハイブリドーマを１匹あたり１×１０７個腹腔内に投与した。１週間後、腹水を採取し、遠心操作により上清を回収した。３匹から９．５ｍＬの上清液が得られた。得られた上清液に５０％になるよう飽和硫酸アンモニウム溶液を滴下し、４℃で１時間撹拌させた。
次に、遠心操作を行い、上清を破棄した。再度、５０％飽和硫酸アンモニウム、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、軽く撹拌した後、遠心操作を行って上清を破棄した。得られた沈殿にＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加、溶解させた。さらに、脱塩カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア社製）を用いてリン酸緩衝液にバッファー交換を行なった。この溶液から、ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ カラム（ＧＥヘルスケア社製）を使用したアフィニティクロマトグラフィーにより、ＩｇＧ画分のみ精製した。溶出液は０．１Ｍ グリシン（ｐＨ２．７）で行い、脱塩カラムＰＤ−１０によりＰＢＳ（ｐＨ７．４）にバッファー交換した。ＵＶ２８０ｎｍの吸光度を測定することにより、１５ｍｇの抗ＡＰＰ−ＳＰモノクローナル抗体が得られたことがわかった。【００４９】
（７）精製後の抗ＡＰＰ−ＳＰモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ評価
（６）で得られた抗ＡＰＰ−ＳＰモノクローナル抗体を用いて、（３）と同様のＥＬＩＳＡを行なった。但し、一次抗体には（６）で得た抗ＡＰＰ−ＳＰモノクローナル抗体を含む溶液を使用した。結果を図３に示す。
このように、精製後、本抗体のＡＰＰ−ＳＰに対する反応性が確認できた。【００５０】
（８）抗ＡＰＰ−ＳＰモノクローナル抗体の特異性評価
本実施例で得られた抗体の反応特異性を評価するため、（７）で反応性を示した抗原ＡＰＰ−ＳＰのアミノ酸配列をシャッフルして作製したｒａｎｄｏｍ ＡＰＰ−ＳＰ（配列番号２）に対する反応性を（７）と同様のＥＬＩＳＡで評価した。結果を図４に示す。この結果より、本抗体はＡＰＰ−ＳＰと同じアミノ酸成分を含むが配列順序が異なるｒａｎｄｏｍ ＡＰＰ−ＳＰには反応性を示さないことから、反応特異性の高さが確かめられた。【００５１】
（９）ドットブロット法における抗ＡＰＰ−ＳＰモノクローナル抗体の評価
本実施例で得られた抗体がドットブロット法においてもＡＰＰ−ＳＰを検出できるか検討した。１ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０ｍｇ／ｍＬ  ＡＰＰ−ＳＰを含む１％ＰＥＧ６０水溶液を、それぞれ１μＬずつニトロセルロース膜（ＧＥヘルスケア社製）に滴下し、乾燥させた。１％スキムミルク、ＴＢＳ ｐＨ７．５、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液に浸し、１時間振盪させた。次に、溶液を捨て、１０μｇ／ｍＬの抗ＡＰＰ−ＳＰモノクローナル抗体を含む０．２％スキムミルク、ＴＢＳ ｐＨ７．５、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液を添加し、１時間振盪させた。その後、抗体溶液を捨て、０．２％スキムミルク、ＴＢＳ ｐＨ７．５、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で３回洗浄操作を行った（１回あたり５分間振盪）。そして、０．２％スキムミルク、ＴＢＳ ｐＨ７．５、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で４０００倍希釈したＡｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を添加し１時間振盪させた。溶液を破棄した後、０．２％スキムミルク、ＴＢＳ ｐＨ７．５、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で３回洗浄操作を行った（１回あたり５分間振盪）。最後に、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液（ＰＩＥＲＣＥ社製）を添加し、３０分間振盪させた。結果を図５に示す。この結果より、本抗体がドットブロット法においてもＡＰＰ−ＳＰを検出可能なことが示された。【００５２】
参考例
（１）ペプチドの合成
ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｌｔｄ．(Ｓｈａｎｇｈａｉ)に委託して、ヒトアミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチド（ＡＰＰ−ＳＰ、配列番号１）のＮ末端にＣｙｓ残基が付加したペプチド（以下、Ｃｙｓ−ＡＰＰ−ＳＰと表記することもある、配列番号３）の化学合成を行った。
ペプチドの化学合成はＦｍｏｃ固相合成法により行なった。化学合成したペプチド（Ｃｙｓ−ＡＰＰ−ＳＰ）は、ＯＤＳカラムを用い、移動相として０．１％ＴＦＡを含有する水／ＭｅＣＮを用いた濃度勾配法により精製した。【００５３】
（２）Ｃｙｓ−ＡＰＰ−ＳＰとキーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)との架橋反応による抗原作製
１０ｍｇ／ｍＬ Ｃｙｓ−ＡＰＰ−ＳＰのＤＭＦ溶液と、１％ ＰＥＧ６０、８３ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、０．９Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．２を含む溶液とを、１：４の体積比で混和させた。この混和溶液と１０ｍｇ／ｍＬ ｍａｌｅｉｍｉｄｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＫＬＨとを等量混和し、室温で４時間撹拌した。脱塩カラムを用い、キャリアタンパク質とＡＰＰ−ＳＰとの架橋反応物が含まれると推定される画分のみ分取した。【００５４】
（３）マウスへのＫＬＨ−Ｃｙｓ−ＡＰＰ−ＳＰ投与
（２）で作製した抗原を表２に示す投与スケジュールでマウスに免疫し、採血を行なった。採血で得られた血液から遠心操作により血清画分を得た。
抗原として、０．２ｍｇ／ｍＬの画分と等量のアジュバントを混合し（０．１ｍｇ／ｍＬの濃度となる）、超音波処理してエマルジョンとしての抗原溶液を得た。なお、前記アジュバントとして初回免疫時（０日）はフロイントの完全アジュバント（シグマ社製）を、追加免疫時（１４日以降）にはフロイントの不完全アジュバント（シグマ社製）を用いた。【００５５】
【表２】
2012093732.tif 000006
【００５６】
（４）抗体価の測定
（３）で行った免疫結果を評価するため、表２に示した採血方法で得た血清を用いて、ＥＬＩＳＡを以下のように行った。
１０μｇ／ｍＬ ＡＰＰ−ＳＰを含む０．００２％ Ｔｗｅｅｎ２０溶液をマイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）に１００μＬずつ添加し、室温、静置状態でオーバーナイトさせた。翌日、ウェル内の溶液を破棄し、２５０μＬの３％ ＢＳＡ、０．１％ ＮａＮ３、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、室温で２．５時間静置した。続いて、ウェル内の溶液を破棄し、血清を１％ＢＳＡ、０．０５％ ＮａＮ３、ＴＢＳ ｐＨ７．５で１００倍希釈した溶液（一次抗体希釈溶液）を１００μＬ添加した。１時間静置後、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ ｐＨ７．４， ０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で６回洗浄した。次に、二次抗体としてＨＲＰ ｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ ｃｈａｉｎ)（ＭＢＬ社製）を１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４０００倍希釈し、１００μＬ添加した。１時間静置後、ＰＢＳＴで６回洗浄した。次に、ＴＭＢ＋を１００μＬ添加し、３０分間静置した。２規定硫酸を１００μＬ添加し、酵素反応を止め、４５０ｎｍおよび６５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図６に示す。この結果より、ＡＰＰ−ＳＰに対する抗体が得られないことが示された。【００５７】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年１月７日出願の日本特許出願（特願２０１１−２４６４号）及び２０１１年１月７日出願の日本特許出願（特願２０１１−２４６５号）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明により、アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチド（ＡＰＰ−ＳＰ）に対する抗体を提供することができる。本発明の孔ＡＰＰ−ＳＰ抗体は、アルツハイマー病の診断、治療などに利用することができるという点で、産業上の利用可能性を有する。
【配列表フリーテキスト】
【００５９】
配列番号１は、アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチド（ＡＰＰ−ＳＰ）のアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、ＡＰＰ−ＳＰのアミノ酸配列をシャッフルして作製したｒａｎｄｏｍ ＡＰＰ−ＳＰのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、ＡＰＰ−ＳＰのＮ末端にＣｙｓ残基が付加したペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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