(57)【要約】  被検物質である糖タンパク質及び／又は糖ペプチドをピラゾロン誘導体、イソキサゾロン誘導体、ヒダントイン誘導体、ローダニン誘導体、マレイミド誘導体等と共に塩基性溶液条件下で加熱し、翻訳後修飾基を切断、並びに標識して分析することにより、セリン残基及び／又はスレオニン残基の翻訳後修飾を解析することが可能になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基性条件下で、翻訳後修飾を受けた糖タンパク質及び／又は糖ペプチドのセリン残基及び／又はスレオニン残基から翻訳後修飾基を選択的に切断し、セリン残基、スレオニン残基、および当該アミノ酸残基より切断された翻訳後修飾基のうち少なくとも１つを標識する標識剤。
【請求項２】
標識剤が、ピラゾロン誘導体、イソキサゾロン誘導体、ヒダントイン誘導体、ローダニン誘導体、マレイミド誘導体のうち少なくとも１つを有効成分として含む、請求項１記載の標識剤。
【請求項３】
ピラゾロン誘導体が、３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロン、１，３−ジメチル−ピラゾロン、３−メチル−１−ｐ−トリル−５−ピラゾロンのいずれか１種、もしくは２種以上を組み合わせたものである、請求項１、２のいずれか１項記載の標識剤。
【請求項４】
翻訳後修飾基がＯ−リン酸基、Ｏ−硫酸基、Ｏ−グリカンのいずれか、もしくは２種以上のものである、請求項１〜３のいずれか１項記載の標識剤。
【請求項５】
Ｏ−グリカンが、Ｏ原子と結合する糖として、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、キシロース、グルコースのいずれかから始まるものである、請求項１〜４のいずれか１項記載の標識剤。
【請求項６】
Ｏ−グリカンが、Ｏ原子と結合する糖として、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、フコース、キシロース、グルコースのいずれかから始まり、さらに糖が結合して伸長したものである、請求項１〜５のいずれか１項記載の標識剤。
【請求項７】
被検物質の糖タンパク質及び／又は糖ペプチドと請求項１〜６のいずれか１項記載の標識剤を溶媒中に溶解、若しくは分散させ、塩基性条件下で加熱することで、被検物質のセリン残基及び／又はスレオニン残基から選択的に翻訳後修飾基を切断し、標識させる、翻訳後修飾基の切断方法。
【請求項８】
切断と同時に翻訳後修飾基が標識される、請求項７記載の翻訳後修飾基の切断方法。
【請求項９】
分離と同時にセリン残基及び／又はスレオニン残基が標識される、請求項７、８のいずれか１項記載の翻訳後修飾基の切断方法。
【請求項１０】
糖タンパク質及び／又は糖ペプチドと標識剤を水中で溶解させた条件下で行う、請求項７〜９のいずれか１項記載の翻訳後修飾基の切断方法。
【請求項１１】
標識剤と共にチオール化合物を利用する、請求項７〜１０のいずれか１項記載の翻訳後修飾基の切断方法。
【請求項１２】
チオール化合物がジチオトレイトールである、請求項１１記載の翻訳後修飾基の切断方法。
【請求項１３】
標識剤がピラゾロン誘導体である、請求項７〜１２のいずれか１項記載の翻訳後修飾基の切断方法。
【請求項１４】
請求項７〜１３のいずれか１項記載の方法で被検物質のセリン残基及び／又はスレオニン残基から翻訳後修飾基を切断し、標識させた当該翻訳後修飾基に対して、液体クロマトグラフィー分析及び／又は質量分析を行うことを特徴とする、翻訳後修飾基の解析方法。
【請求項１５】
請求項７〜１３のいずれか１項記載の方法で被検物質のセリン残基及び／又はスレオニン残基から翻訳後修飾基を切断し、標識させた被検物質に対して、液体クロマトグラフィー分析及び／又は質量分析を行うことを特徴とする、翻訳後修飾基の解析方法。
【請求項１６】
請求項１４、１５の解析を同時に行うことを特徴とする、翻訳後修飾基の解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学、生物学、薬学、創薬、医学等の分野において有用なセリンやスレオニンへの翻訳後修飾基の新規な解析方法に関するものである。特に、本発明は、翻訳後修飾を受けた糖タンパク質及び／又は糖ペプチドのセリンやスレオニンから翻訳後修飾されたＯ−リン酸基、Ｏ−硫酸基、Ｏ−グリカン等を選択的に切断し、標識させる標識剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体内のタンパク質がさまざまな生理活性を示すのは、遺伝子によって翻訳されたタンパク質がリン酸化、硫酸化、或いは糖鎖修飾等の多様な翻訳後修飾がなされた結果と考えられている。その中でリン酸化、硫酸化は一般的な翻訳後修飾であり、多くのタンパク質にとって、この修飾により生物学的活性や機能を持つようになる。その中でグリコシル化は最近、注目を浴び始めている領域であり、修飾された類鎖はさまざまな機能をタンパク質へ付与させる。例えば、いくつかのタンパク質は最初にグリコシル化されない限り正確に折りたたまれない。また、オリゴ糖がアスパラギンに結合されることによってタンパク質に安定性を与え、糖タンパク質の体内動態を制御する例が知られている。さらに、グリコシル化は細胞間の接着のような役割も担うとされている。タンパク質を修飾する糖鎖はＮ−グリカン、Ｏ−グリカン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の３つに大別される。また、その糖鎖を構成する単糖の種類は高等生物の場合、マンノース（Ｍａｎ）、グルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、キシロース（Ｘｙｌ）、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、フコース（Ｆｕｃ）、シアル酸（ＳＡ）とされている。Ｎ−グリカンは、−アスパラギン−Ｘ−スレオニン、或いは−アスパラギン−Ｘ−セリン（Ｘはプロリン（Ｐｒｏ）以外のアミノ酸残基）の配列を持つペプチドのアスパラギン（Ａｓｎ）にＮ−結合型で糖鎖が転移されたものである。Ｏ−グリカンはスレオニン（Ｔｈｒ）やセリン（Ｓｅｒ）残基に、Ｏ−結合で最初の糖が転移されたものである。Ｏ−グリカンの最初の糖はＮ−アセチルガラクトサミンの場合が多いが、他にもマンノース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン等がある。しばしば最初の糖の後に次から次へと糖が転移され、Ｏ−グリカン糖鎖が伸長していく。プロテオグリカンはタンパク質に多本数の極めて長い糖鎖が付加された形をとる。そのアミノ糖（Ｎ−アセチルグルコサミンやＮ−アセチルガラクトサミン）を持つ糖鎖部分をグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）という。グリコサミノグリカンの特徴は２糖が１単位となって、その繰り返し構造により極めて長い糖鎖になっている点が挙げられる。【０００３】
その中で、セリンとスレオニンはリン酸化や硫酸化、糖鎖修飾（Ｏ−ＧａｌＮＡｃ型、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ型、Ｏ−Ｆｕｃ型、Ｏ−Ｍａｎ型、Ｏ−Ｘｙｌ型、Ｏ−Ｇａｌ型、Ｏ−Ｇｌｃ型）等の多様な翻訳後修飾を受けるアミノ酸残基であり、これらの翻訳後修飾がシグナル伝達や分化制御などのさまざまな生命の高次機能調節において重要な役割を担っている。例えば、特定のタンパク質のリン酸化を担うキナーゼの阻害剤は既に医薬品として上市されており、また、Ｏ−結合型糖鎖の定性、定量的な変動が種々の疾患の診断に応用されている。セリンとスレオニンの翻訳後修飾のうち、Ｏ−リン酸化、Ｏ−硫酸化、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ化は、それぞれリン酸基、硫酸基、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ基が単独に結合したものであるが、一般に、Ｏ−ＧａｌＮＡｃ化、Ｏ−Ｆｕｃ化、Ｏ−Ｍａｎ化、Ｏ−Ｘｙｌ化等のＯ−結合型糖鎖修飾は、さらに伸長して多様な構造をとることが知られている。【０００４】
ここで、リン酸化セリンおよびリン酸化スレオニンのリン酸化結合部位の切断、標識方法の一つとして、β脱離・マイケル付加（ＢＥＭＡ）法が挙げられる。塩基性条件下に、リン酸基がβ脱離し、不飽和カルボニルが生成され、これがマイケル反応受容体となることを応用したものである（特許文献１、２、非特許文献１参照）。例えば、ジチオトレイトールのようなチオール基を有する化合物を作用させることで、リン酸化部位を標識させられ、ペプチドの精製やオンビーズ、オンチップ上の蛍光標識化等に利用されている（特許文献３参照）。ＢＥＭＡ法はタンパク質のリン酸化に関わる研究に貢献し、広く使われる手法となっているが、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ化を含めた他のセリン、スレオニンの翻訳後修飾基もＢＥＭＡで切断されるため、どの修飾基がどのような状態で存在していたのかを区分することができない問題があった。また、ＢＥＭＡにおけるマイケル供与体としては、チオール基を有する化合物が一般的であり、他のマイケル供与体の応用例はほとんどなく応用範囲が狭いものであった。また、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ化を受けるタンパク質の解析法として、２位にアジド基を有する非天然型のＧｌｃＮＡｃ誘導体によりメタボリックラベルする方法が報告されている（非特許文献２）。さらに、Ｏ−ＧａｌＮＡｃ型（ムチン型）の糖鎖部分の多様な構造を解析する場合、タンパク質から糖鎖を切り出す有効な酵素が発見されていないため、糖鎖を切り出すためには、強アルカリ下のβ脱離が広く用いられる。この場合、遊離した糖鎖も還元末端側から順次β脱離を受け分解（ピーリング反応）を起こし得るため、高濃度の還元剤を加えて、β脱離と同時に還元末端を糖アルコールに還元する。この方法は１９６８年にＣａｒｌｓｏｎによって報告されたものであり、今もＯ−ＧａｌＮＡｃ型糖鎖の遊離の標準的な方法となっている（非特許文献３）。しかしながら、本法には（１）還元剤存在下のβ脱離はペプチド部分の分解を引き起こすため、タンパク質部分の解析を行うことが困難であること、（２）還元により糖鎖の還元末端が失われるため、糖鎖の分離や高感度分析のための誘導体化が困難であること等の問題点があった。従って、以前よりＯ−結合型糖鎖を分解せずに高収率でペプチドやタンパク質から遊離して、分離、高感度化のために誘導体化する方法論の開発が強く求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００７−５１５６２５号公報
【特許文献２】米国特許第７８０３７５１号
【特許文献３】特開２００９−１９００２号公報
【特許文献４】米国特許公開公報２００６−００９９６０４  Ａ１
【特許文献５】米国特許公開公報２００５−０１７６０９３  Ａ１
【特許文献６】米国特許公開公報２００５−００９５７２５  Ａ１
【特許文献７】米国特許公開公報２００５−００１４１９７  Ａ１
【特許文献８】米国特許公開公報２００４−００３８３０６  Ａ１
【特許文献９】米国特許公開公報２００３−０２１９８３８  Ａ１
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nature Biotechnology、19(4), 379-382（2001）
【非特許文献２】Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America, 100(16), 9116-9121（2003）
【非特許文献３】J. Biol. Chem.，243， 616-626（1968）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
タンパク質の構造解析技術が進歩し、種々の翻訳後修飾基を分析する機会が増えているが、従来技術では、セリンやスレオニンへ翻訳後修飾されたＯ−リン酸基のみが上述したＢＥＭＡ法によって解析されてきた。その他のＯ−硫酸基、Ｏ−グリカン等の翻訳後修飾の解析は、このＢＥＭＡ法でそれぞれを切断することができても、その後の標識化ができず、例えば、Ｏ−グリカンがどの位置のアミノ酸残基に結合していたのか、さらにはそのＯ−グリカンの構造を解析することはできなかった。本発明の目的は、このような課題を解決するためものであり、翻訳後修飾を受けた糖タンパク質及び／又は糖ペプチドのセリン残基やスレオニン残基へ翻訳後修飾されたＯ−リン酸基、Ｏ−硫酸基、Ｏ−グリカン等を共通に標識できる標識剤を利用してこれらの翻訳後修飾を選択的に切断し、効率良く解析する方法を提供することにある。更に、本発明の目的は、修飾の種類とペプチド上の修飾位置に関する情報が得られる方法を提供すること、翻訳後修飾部位を化学的に修飾すると同時に、遊離した糖鎖もピーリング反応を起こさずに、分離や検出に有利な任意の誘導体として回収する方法を提供すること、及びＢＥＭＡ法によるペプチド部分の標識のために新たな化合物群を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、塩基性条件下でセリンやスレオニンへ翻訳後修飾されたＯ−リン酸基、Ｏ−硫酸基、Ｏ−グリカン等に対し特定の標識剤を加えて加熱することで、翻訳後修飾基が選択的に切断され、切断された翻訳後修飾基を効率良く標識できることを見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。本発明は、簡便性、選択性において従来法を上回る分析法であり、種々の翻訳後修飾を受けた糖タンパク質及び／又は糖ペプチドのセリン残基及び／又はスレオニン残基から、翻訳後修飾基を選択的に当該アミノ酸残基より切断し、解析を行うことができるようになる。さらに本発明では、切断元である糖タンパク質及び／又は糖ペプチドの解析を行うこともできるようになる。【０００９】
すなわち、本発明は、塩基性条件下で、翻訳後修飾を受けた糖タンパク質及び／又は糖ペプチドのセリン残基及び／又はスレオニン残基から翻訳後修飾基を選択的に切断し、セリン残基、スレオニン残基、および当該アミノ酸残基より選択的に切断された翻訳後修飾基のうち少なくとも１つを標識する標識剤を提供するものである。また、本発明は、被検物質の糖タンパク質及び／又は糖ペプチドと標識剤を溶媒中に溶解、若しくは分散させ、塩基性条件下で加熱することで、被検物質のセリン残基及び／又はスレオニン残基から翻訳後修飾基を選択的に切断する、翻訳後修飾基切断方法を提供するものである。さらに、本発明は、その翻訳後修飾基切断方法を利用して、糖タンパク質及び／又は糖ペプチドのセリン残基及び／又はスレオニン残基の翻訳後修飾基を解析する方法を提供するものである。本発明は、従来技術では困難であった、セリンやスレオニンへ翻訳後修飾されたＯ−リン酸基、Ｏ−硫酸基、Ｏ−グリカン等を総合的に解析することを可能とする世界に類のない新規な発想による極めて重要な発明と考えている。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、簡単な操作、穏和な条件で、有害な試薬を用いずに糖タンパク質からＯ−リン酸基、Ｏ−硫酸基、Ｏ−グリカン等を遊離するのと同時に、遊離した糖鎖およびペプチドの両者をそれぞれ同じ、または別々の試薬で標識することができるようになる。このような標識により、その後の分離の容易さ及び／又は検出における高感度化等に寄与するため、標識された糖鎖およびペプチドを容易に精製することができるようになる。また標識された糖鎖およびペプチドを液体クロマトグラフィーや質量分析装置により、高感度に構造解析、定量分析を行うことが可能になり、セリンとスレオニンの翻訳後修飾を総合的に解析することができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１において、Ｏ-ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有するモデル糖ペプチドを、塩基性条件下にＰＭＰ, ＤＰ，ＭＴＰとそれぞれ加熱したときに得られるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルの結果を示す図である。
【図２】実施例１において、想定される反応経路を示す図である。
【図３】実施例２において、Ｏ−ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有するモデル糖ペプチドから種々の条件下で切り出したＯ−結合型糖鎖のプロファイルを示す図である。Ａ：還元的β脱離（Ｃａｒｌｓｏｎ法）、Ｂ：β−Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ），４℃、２４時間、Ｃ：β−Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ），室温、２４時間、Ｄ：ジメチルアミン、５０℃、１６時間、Ｅ：ジメチルアミン、７０℃、１６時間、Ｆ：塩基性条件下ＰＭＰ、７０℃、１６時間
【図４】実施例３において、実施例１で得られたＤＰによりそれぞれ標識されたペプチドのＴＯＦ／ＴＯＦスペクトルを示す図である。
【図５】実施例３において、実施例１で得られたＰＭＰによりそれぞれ標識されたペプチドのＴＯＦ／ＴＯＦスペクトルを示す図である。
【図６】実施例３において、実施例１で得られたＭＴＰによりそれぞれ標識されたペプチドのＴＯＦ／ＴＯＦスペクトルを示す図である。
【図７】実施例４において、Ｏ-ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有するモデル糖ペプチドを塩基性条件下でＤＴＴ、ＤＰ、ＤＴＴ／ＤＰと共に加熱したときの生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図である。
【図８】実施例４において、Ｏ-ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有するモデル糖ペプチドを塩基性条件下でＤＴＴ／ＤＰと共に加熱したときの想定される反応経路を示す図である。
【図９】実施例５において、ウシフェチュイン、ブタ胃ムチンを塩基性条件下にＤＰと加熱したときに得られるＯ−結合型糖鎖プロファイルを示す図である。図中の○印はガラクトースを意味し、薄い色の□印はＮ−アセチルガラクトサミンを意味し、濃い色の□印(黒塗りの□印)はＮ−アセチルグルコサミンを意味し、△印はフコースを意味し、◇印はＮ−アセチルノイラミン酸を意味する。
【図１０】実施例６において、リン酸化モデルペプチド（左図）およびＯ−ＧｌｃＮＡｃ化モデルペプチド（右図）を塩基性条件下にそれぞれＰＭＰ，ＤＰと加熱したときの生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図である（上図が原料、下図が生成物をそれぞれ示す。）。
【図１１】実施例７において、Ｏ-ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有するモデル糖ペプチドを塩基性条件下にＤＴＴ，ＤＰ、ＤＴＴとＤＰとそれぞれ加熱したときの反応成績物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図である。
【図１２】実施例７において、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ型糖鎖を有する糖ペプチドに、塩基性条件下にピラゾロン誘導体（ＤＰ）とジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加え、70℃で１６時間加熱したときのマススペクトルを示す図である。
【図１３】ウシフェチュイン、ブタ顎下腺ムチンを塩基性条件下にＤＰと加熱したときに得られるＯ−結合型糖鎖プロファイルを示す図である。図中の○印はガラクトースを意味し、薄い色の□印はＮ−アセチルガラクトサミンを意味し、濃い色の□印(黒塗りの□印)はＮ−アセチルグルコサミンを意味し、△印はフコースを意味し、◇印はＮ−アセチルノイラミン酸を意味する。
【図１４】新規ピラゾロン試薬による糖鎖標識後のＭＡＬDI−ＴＯＦスペクトルを示す図である（上段が化合物５、中段が化合物１０、下段が化合物１４で標識）。
【図１５】アルギニン付加ピラゾロン試薬の合成経路を示す反応スキームである。
【図１６】アルギニン付加ピラゾロン試薬の合成経路を示す他の反応スキームである。
【図１７】ビオチン付加ピラゾロン試薬の合成経路を示す反応スキームである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、翻訳後修飾を受けた糖タンパク質及び／又は糖ペプチドの中で、セリン残基及び／又はスレオニン残基が係わる翻訳後修飾の解析を実施するための技術に関するものである。その対象となる糖タンパク質及び／又は糖ペプチドの由来は全く限定されるものではなく、例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、チンパンジーあるいはそれらの免疫不全動物等の動物、或いは植物が挙げられるが、本発明の成果をヒトの治療に用いる場合はヒト、ブタ、チンパンジー由来の細胞を用いる方が望ましい。上述のように、本発明は、翻訳後修飾を受けた糖タンパク質及び／又は糖ペプチドの中のアミノ酸として水酸基有するセリン残基及び／又はスレオニン残基へ修飾された翻訳後修飾基を解析するための手段を提供するものである。そのような翻訳後修飾基も特に限定されるものではないが、例えば、アミノ酸側のＯ原子を介して、リン酸基、硫酸基、グリカン等が挙げられるが、本発明ではそれらのいずれか１種でも良く、２種以上のものでも良い。特に、アミノ酸側のＯ原子を介して結合したグリカン（以後、アミノ酸側のＯ原子を介して結合したグリカンをＯ−グリカンと呼ぶときがある。同様に、アミノ酸側のＯ原子を介して結合したリン酸基、硫酸基をそれぞれＯ−リン酸基、Ｏ−硫酸基と呼ぶことがある。）としては、Ｏ原子と結合する糖として、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、キシロース、グルコースのいずれかから始まるものや、さらにＯ原子と結合する糖として、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、フコース、キシロース、グルコースのいずれかから始まり、さらに糖が結合して伸長したものでも良い。
【００１３】
本発明では、こうしたセリン残基及び／又はスレオニン残基に対して修飾された翻訳後修飾基をセリン残基及び／又はスレオニン残基から切断することが必要である。その切断反応は常法に従ってβ脱離反応を行えば良く、その条件は特に限定されるものではないが、例えば、翻訳後修飾された糖タンパク質及び／又は糖ペプチド溶媒中に溶解、若しくは分散させ、塩基性条件下で加熱する方法が挙げられる。β脱離条件として、たとえば１０ｍＭ〜１Ｍの水酸化リチウムまたは水酸化ナトリウムまたは水酸化バリウム中で、４℃〜６０℃程度で１０分〜２４時間程度静置する。
【００１４】
本発明は、このセリン、スレオニンの翻訳後修飾をβ脱離で遊離する際に生成した二重結合に対してマイケル付加により標識する。本マイケル付加は一般に、ワンポットで行われ、β脱離時にたとえば２０ｍＭ〜１Ｍ程度のピラゾロン誘導体等のマイケル付加反応供与体を添加することで行われる。また、遊離した翻訳後修飾基側も標識させることができるものである。本発明とは、セリン残基及び／又はスレオニン残基側だけを標識しても良く、両者を標識することでも良く、さらに、セリン残基及び／又はスレオニン残基側と翻訳後修飾基側とを異なった試薬で標識することでも良い。そのようなマイケル付加反応の際に用いる試薬は特に限定されるものではないが、例えば、チオール化合物、ピラゾロン誘導体、イソキサゾロン誘導体、ヒダントイン誘導体、ローダニン誘導体、マレイミド誘導体等が挙げられ、本発明ではそれらのいずれか１種でも良く、２種以上のものを併用しても良い。その中でピラゾロン誘導体、イソキサゾロン誘導体、ヒダントイン誘導体、ローダニン誘導体、マレイミド誘導体等についてはマイケル付加反応と同時に標識化できるため本発明として好都合である。本発明の標識剤とは、こうした試薬を含む製剤を意味している。本発明では、さらにピラゾロン誘導体が本発明の標識剤として有用で、これらはピラゾロン基を有した化合物であれば特に限定されないが、例えば、３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）、１，３−ジメチル−ピラゾロン（ＤＰ）、３−メチル−１−ｐ−トリル−５−ピラゾロン（ＭＴＰ）、３-メチル−１−（キノリン−８−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５（４Ｈ）−オン等が挙げられる。イソキサゾロン誘導体としては、例えば３（２Ｈ）−イソキサゾロン、５−メチル−３（２Ｈ）−イソキサゾロン、２，５−ジメチル３（２Ｈ）−イソキサゾロン等が挙げられる。ヒダントイン誘導体としては、例えば２，４−イミダゾリジンジオン、３−メチル−２，４−イミダゾリジンジオン、３−（２−プロピン−１−イル）−２，４−イミダゾリジンジオン等があげられる。ローダニン誘導体としては、２−チオキソ−４−チアゾリジノン、３−メチル−２−チオキソ−４−チアゾリジノン等があげられる。
【００１５】
本発明では、上述した標識剤と共にチオール化合物を併用することでも良い。その際に用いられるチオール化合物はチオール基を有した化合物であれば特に限定されるものでないが、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−アミノエタンチオール、チオコリン、２−（ピリジン−４−イル）エタンチオール等が挙げられる。その組み合わせによって、上述したようにセリン残基及び／又はスレオニン残基側だけを標識する場合、両者を標識する場合が起こり、目的に合わせて適宜選択できる。このことを、標識剤として上述した１，３−ジメチル−ピラゾロン（ＤＰ）とジチオトレイトール（ＤＴＴ）を例に取り具体的に説明する。翻訳後修飾基を糖鎖としたとき、ＤＰを加えたときに標識されるが、ＤＴＴを加えた場合には標識されず、ＤＰとＤＴＴの両者を加えた場合には、ＤＰ標識体のみが検出される。また、タンパク質、或いはペプチド側は、ＤＴＴを添加したときにＤＴＴ標識体が検出され、ＤＰを添加したときにはＤＰ標識体として検出された。ＤＴＴとＤＰを併用した場合には、ＤＴＴ標識体のみがペプチドと反応し、ＤＰはタンパク質、或いはペプチドに反応しないことが経験的に分かっている。
【００１６】
本発明における被検物質の糖タンパク質及び／又は糖ペプチドからの翻訳後修飾基を切断する際の反応液の状態は特に限定されるものではないが、溶媒中に溶解させた状態でも良く、分散させた状態でも良い。本発明では、糖タンパク質及び／又は糖ペプチドと標識剤を水中で溶解させた条件下で行う方法が反応を効率良く進められ好都合である。また、さらに反応を効率良く進めるために反応液を撹拌しても良い。
【００１７】
本発明では、こうして得られた被検物質のセリン残基やスレオニン残基から翻訳後修飾基を切断し、標識させた当該翻訳後修飾基、或いは被検物質のセリン残基やスレオニン残基から翻訳後修飾基を切断し、標識させた被検物質のいずれか、若しくは両者を液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーを用いて分析することができる。さらには、目的分子の種類に応じて適宜の方法を使用することができるが、例えば、質量分析（MS）や核磁気共鳴（NMR）を用いることができそれら以外にも、紫外吸光光度計（UV）、エバポレイテイブ光散乱検出器（ELS）、電気化学検出器等を用いることができる。本発明においてはそれらのいずれかの方法で分析しても良く、２つ以上の方法を組み合わせて分析しても良い。
【００１８】
本発明により、被検物質の糖タンパク質及び／又は糖ペプチドの翻訳後修飾を高感度に構造解析、定量分析を行うことが可能になり、セリンとスレオニンの翻訳後修飾を総合的に解析することができるようになる。
【実施例】
【００１９】
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。【００２０】
［実施例１］
(実験詳細１)
Ｏ−ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有する糖ペプチドは既報に従い合成した。糖ペプチドの水溶液（４μｇ/ｍＬ、５μＬ）に４５μＬの水、５０μＬの０．６Ｍ ＮａＯＨ、１００μＬの０．５Ｍ  ３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）のメタノール溶液または０．５Ｍ  １、３−ジメチル５−ピラゾロン（ＤＰ）の水溶液または０．５Ｍ  ３−メチル−１−ｐ−トリル−５−ピラゾロン（ＭＴＰ）のメタノール溶液を加え、７０℃で１６時間静置した。反応後、０．３Ｍ塩酸で中和し、反応液を直接２、５−ジヒロド安息香酸（１０ｍｇ/ｍＬ）と混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（/ＴＯＦ）（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ  ＩＩ、ブルカー社）により解析を行った。【００２１】
(実験詳細２)
次に、そのＯ−ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有する糖ペプチドに、塩基性条件下に３種類の異なるピラゾロン誘導体を加え、７０℃で１６時間加熱、分解した。具体的には、Ｏ−ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有する糖ペプチドの水溶液（４μｇ/ｍＬ、５μＬ）に１０μＬの１Ｍ  ＮａＢＨ４（１００ｍＭ  ＮａＯＨ溶液）、水５μＬを添加し、５０℃で１５時間静置した（Ａ）。糖ペプチドの水溶液（４μｇ/ｍＬ、５μＬ）に１２μＬの水および３．４μＬのβ―エリミネーションリエージェントミックス（シグマ社）を加え、４℃または室温で２４時間静置した（Ｂ、Ｃ）。糖ペプチドの水溶液（４μｇ/ｍＬ、５μＬ）に１８μＬのジメチルアミンを加え、５０℃または７０℃で１６時間静置した（Ｄ、Ｅ）。糖ペプチドの水溶液（４μｇ/ｍＬ、５μＬ）に４５μＬの水、５０μＬの０．６Ｍ ＮａＯＨ、１００μＬの０．５Ｍ  ３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）のメタノール溶液を加え、７０℃で１６時間静置した（Ｆ）。それぞれ反応後に中和し、Ａは１％酢酸メタノール溶液を加え繰り返し乾固した。Ａ−Ｅは、それぞれＤｏｗｅｘ５０ｘ８およびＺｉｐＴｉｐＣ１８により糖鎖部分を精製し、２、５−ジヒロド安息香酸（１０ｍｇ/ｍＬ）をマトリクスとして、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（/ＴＯＦ）（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ  ＩＩ、ブルカー社）により解析を行った。Ｆは実験詳細１に記載の方法で糖鎖の分析を行った。得られたマススペクトルの結果を図１に示す。いずれも原料である糖ペプチドのシグナルが著しく低下し、新たに添加したピラゾロン誘導体によって標識されたペプチドおよび糖鎖のシグナルが出現した。想定される反応を図２に示した。【００２２】
［実施例２］
既存の様々な方法により、Ｏ−ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有する糖ペプチドから糖鎖を遊離したときに得られる糖鎖のプロファイルを比較した。得られたマススペクトルの結果を図３に示す。用いた糖ペプチドはシアリルＴと呼ばれる３糖構造（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ）を主に持ち、微量のＴ抗原（Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ）と呼ばれる２糖構造を含むことが分かっている。糖鎖の分解を防ぐために、還元剤（ＮａＢＨ４）存在下にβ脱離と同時に糖鎖の還元末端を糖アルコールに還元するＣａｒｌｓｏｎ法で得られた糖鎖プロファイルを図３Ａに示す。シアリルＴとＴ抗原のピークが認められ、分解物に相当するピークは微量しか存在しない。シグマ社から市販されているβエリミネーションキットを用い、推奨されている２種類の条件で糖鎖を遊離したときの結果を図３Ｂ，Ｃに示した。また、ジメチルアミンを用いる方法（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，８２，２４２１−２４２５）も２種類の条件で行った（図３Ｄ，Ｅ）。いずれの場合も、ピーリング反応により生じた分解物が非常に大きな割合を占め、還元を施さない場合は著しく糖鎖プロファイルが損なわれる結果が得られた。還元を施さない場合には、糖鎖プロファイルが損なわれる傾向にあることは、最近のヒトプロテオーム機構の論文においても指摘されている（Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２０１０、９、７１９−７２７）。塩基性条件下にＰＭＰを加えた場合、シアリルＴがＰＭＰ標識体と微量のＴ抗原のＰＭＰ標識体のみが検出され、分解物のピークは全く検出されなかった（図３Ｆ）。【００２３】
これらの結果から、塩基性条件下にＯ−結合型糖鎖をβ脱離によって遊離しても、ピラゾロン誘導体が存在すれば、速やかに糖鎖と反応して安定な標識体を与え、分解産物をほとんど与えないことが示された。【００２４】
［実施例３］
実施例１で得られたＤＰ、ＰＭＰ、ＭＴＰによりそれぞれ標識されたペプチドのＴＯＦ／ＴＯＦスペクトルをそれぞれ図４、図５、図６に示した。いずれの場合も、良好にペプチド配列情報ならびに糖鎖の修飾位置情報を与えた。この結果から、β脱離反応にピラゾロン誘導体を添加することによって糖鎖、ペプチドともに構造、配列情報が良好に得られることが示された。【００２５】
［実施例４］
Ｏ−ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有する糖ペプチドに、塩基性条件下にピラゾロン誘導体（ＤＰ）とジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加え、70℃で１６時間加熱した。具体的には、Ｏ−ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有する糖ペプチドの水溶液（４μｇ/ｍＬ、５μＬ）に５μＬの０．６Ｍ  ＮａＯＨを添加した。さらに、１０μＬの０．５Ｍ  ＤＴＴまたは１０μＬの０．５Ｍ  ＤＰまたは５μＬの０．５Ｍ  ＤＴＴ＋５μＬの０．５ＭＤＰを加え、７０℃で１６時間静置した。反応後、反応液をそれぞれ希釈し、ＤＨＢと混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（/ＴＯＦ）（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ  ＩＩ、ブルカー社）により解析を行った。そのときのマススペクトルの結果を図７に示す。糖鎖はＤＰを加えたときのみ標識された（図７左上図）が、ＤＴＴを加えた場合には標識されなかった（図７左中図）。ＤＰとＤＴＴの両者を加えた場合には、ＤＰ標識体のみが検出された（図７左下図、図８）。ペプチドはＤＴＴを添加したときにはＤＴＴ誘導体が、ＤＰを添加したときにはＤＰ誘導体として検出された（図７右上図及び中図）。ＤＴＴとＤＰを添加した場合には、ＤＴＴのみがペプチドと反応したもののみが検出され、ＤＰが直接ペプチドに反応したものは検出されなかった（図７右下図、図８）。この結果から、糖鎖とペプチドはそれぞれ別々の試薬により選択的に標識することが可能であることが示された。【００２６】
［実施例５］
Ｏ−結合型糖鎖を持つことで知られるウシフェチュイン、ブタ胃ムチン及びヒトＩｇＡに対し本発明で示すところの技術を用いて、Ｏ−結合型糖鎖のプロファイリングを行った。結果を図９に示す。ウシフェチュインまたはブタ胃ムチンまたはヒトＩｇＡをそれぞれ５０μｇとり、５０μＬの水、１００μＬの０．５Ｍ  ＤＰ溶液、５０μＬの０．６Ｍ  ＮａＯＨを添加し、７０℃で１６時間静置した。反応後に中和し、反応液の１/４量（５０μＬ）をＤｏｗｅｘ５０ｘ８およびＺｉｐＴｉｐＣ１８により糖鎖部分を精製し、一旦乾固した後にＤＨＢに溶解し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（/ＴＯＦ）（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ  ＩＩ、ブルカー社）により解析を行った。いずれの結果も過去に報告されている結果と定性、定量的に同等な結果であった。このことから、本発明が糖タンパク質のＯ−結合型糖鎖の解析に有用であることが示された。また、ウシフェチュインはＯ−結合型糖鎖とＮ−結合型糖鎖の両者を有することが知られているが、本法ではＯ−結合型糖鎖のみが検出され、Ｎ−結合型糖鎖は全く検出されなかった。この結果から、本発明技術はＮ−結合型糖鎖には作用せず、Ｏ−結合型糖鎖に高選択的に作用することが示された。【００２７】
［実施例６］
リン酸化修飾、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ型糖鎖修飾のそれぞれ有する２種類のペプチドに本発明技術を利用したときの結果のマススペクトルである（図１０）。  具体的にはウシβ−カゼインの由来のリン酸化糖ペプチド（ＦＱｐＳＥＥＱＱＱＴＥＤＥＬＱＤＫ）はＡＮＡＳＰＥＣ社から購入した。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド（ＴＡＰＴ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）ＳＴＩＡＰＧ）はＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社から購入した。リン酸化糖ペプチド５０μｇ（５μＬ）に１０μＬの０．５Ｍ  ＰＭＰ、５μＬの０．６Ｍ  ＮａＯＨを加え、７０℃で１６時間静置した。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド５．６μｇ（１０μＬ）に２０μＬの０．５Ｍ  ＤＰ、１０μＬの０．６Ｍ  ＮａＯＨを加え、７０℃で１６時間静置した。反応液を直接ＤＨＢと混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより解析した。その結果、いずれも原料の修飾ペプチドが反応後に著しく低下し、ペプチドはそれぞれ添加したピラゾロン誘導体に高収率で変換された。この結果から、本法がＯ−ＧａｌＮＡｃ型糖鎖同様に、セリンやスレオニンのリン酸化、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ型糖鎖修飾に対しても同様に作用することが示された。【００２８】
［実施例７］
Ｏ−ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有する糖ペプチドの水溶液（４μｇ/ｍＬ、５μＬ）に５μＬの０．６Ｍ  ＮａＯＨを添加した。さらに、１０μＬの０．５Ｍ  ＤＴＴまたは１０μＬの０．５Ｍ  ＤＰまたは５μＬの０．５Ｍ  ＤＴＴ＋５μＬの０．５ＭＤＰを加え、７０℃で１６時間静置した。反応後、反応液をそれぞれ希釈し、ＤＨＢと混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（/ＴＯＦ）（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ  ＩＩ、ブルカー社）により解析を行った。【００２９】
Ｏ−ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有する糖ペプチドの水溶液（４μｇ/ｍＬ、１０μＬ）に２０μＬの０．４５Ｍ  ＮａＯＨを添加した。さらに、２０μＬの０．５Ｍ  ＰＭＰまたは２０μＬの０．５Ｍ  ＤＴＴまたは１０μＬの１．０Ｍ  ＤＴＴ＋１０μＬの１．０ＭＤＰＰＭＰを加え、８５℃で１６時間静置した。反応後、反応液をそれぞれ希釈し、ＤＨＢと混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（/ＴＯＦ）（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ  ＩＩ、ブルカー社）により解析を行った。結果を図１１及び図１２に示す。【００３０】
図１２はＯ−ＧｌｃＮＡｃ型糖鎖を有する糖ペプチドに、塩基性条件下にピラゾロン誘導体（ＤＰ）とジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加え、70℃で１６時間加熱したときのマススペクトルである。糖鎖はＤＰを加えたときのみ標識されたが、ＤＴＴを加えた場合には標識されなかった。ＤＰとＤＴＴの両者を加えた場合には、ＤＰ標識体のみが検出された。ペプチドはＤＴＴを添加したときにはＤＴＴ誘導体が、ＤＰを添加したときにはＤＰ誘導体として検出された（図１１、上段および中段）。ＤＴＴとＤＰを添加した場合には、ＤＴＴのみがペプチドと反応したもののみが検出され、ＤＰが直接ペプチドに反応したものは検出されなかった（図１１、下段）。この結果から、糖鎖とペプチドはそれぞれ別々の試薬により選択的に標識することが可能であることが示された。【００３１】
［実施例８］
ウシフェチュインまたはブタ顎下腺ムチンをそれぞれ５０μｇとり、５０μＬの水、１００μＬの０．５Ｍ  ＤＰ溶液、５０μＬの０．６Ｍ  ＮａＯＨを添加し、７０℃で１６時間静置した。反応後に中和し、反応液の１/４量（５０μＬ）をＤｏｗｅｘ５０ｘ８およびＺｉｐＴｉｐＣ１８により糖鎖部分を精製し、一旦乾固した後にＤＨＢに溶解し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（/ＴＯＦ）（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ  ＩＩ、ブルカー社）により解析を行った。結果を図１３に示す。【００３２】
図１３は、Ｏ−結合型糖鎖を有することが知られているウシフェチュイン及びブタ顎下腺ムチンについて、本法を用いて、Ｏ−結合型糖鎖のプロファイリングを行った結果である。いずれも過去に文献等で報告されている結果と定性、定量的に同等な結果が得られたことから、本法が糖タンパク質のＯ−結合型糖鎖の解析に有用であることが示された。また、ウシフェチュインはＯ−結合型糖鎖とＮ−結合型糖鎖の両者を有することが知られているが、本法ではＯ−結合型糖鎖のみが検出され、Ｎ−結合型糖鎖は全く検出されなかった。この結果から、本法はＮ−結合型糖鎖には作用せず、Ｏ−結合型糖鎖に高選択的に作用することが示された。【００３３】
［合成例］
図１４は、新規ピラゾロン試薬により標識された糖鎖のマススペクトルである。ピラゾロン骨格を有する試薬を用いた場合、monoもしくはbis誘導体化される事が確認された。図１５、図１６および図１７は新規ピラゾロン試薬の合成スキームである。【００３４】
（合成例１）
１ｍＭのグルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルラクトサミンおよびキトテトラオースの混合物１０μＬに２０μＬの０．４５Ｍ  ＮａＯＨを添加した。さらに、２０μＬの０．５Ｍ  合成ピラゾロン試薬（化合物５もしくは１０もしくは１４）を加え、８５℃で２時間静置した。反応後、反応液をそれぞれ希釈し、ＤＨＢと混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（/ＴＯＦ）（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ  ＩＩ、ブルカー社）により解析を行った。【００３５】
（合成例２）
３−ヒドラジノ安息香酸（５９２ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ）をジメチルフォルムアミド１０ｍＬに溶解し、二炭酸ジ−ｔ−ブチル（８５４ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ）加え室温で１６時間反応した。反応液を酢酸エチルで抽出し、１０ｍＭ塩酸および水で洗浄した。抽出液を濃縮し、目的物であるＢｏｃ−３−ヒドラジノ安息香酸（９８０ｍｇ、１００％）を得た。【００３６】
Ｂｏｃ−３−ヒドラジノ安息香酸（４９１ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）をメタノール５ｍＬに溶解し、ＷＳＣ（５６０ｍｇ、２．９３ｍｍｏｌ）を加えた（溶液１）。溶液２）メチルアルギニン２塩酸塩（５０９ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）を水２ｍＬに溶解し、トリエチルアミン（３９５ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ）を加えた溶液を溶液１に加え、室温で１６時間反応した。反応液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロフォルム：メタノール、９：１→５：１）で分離し、目的物であるＢｏｃ−３−ヒドラジノベンゾイルアルギニンメチルエステル（４０６ｍｇ、４９％）を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる解析により、目的物の［Ｍ＋Ｈ］+イオンをｍ/ｚ：４２３．４に観測した。【００３７】
Ｂｏｃ−３−ヒドラジノベンゾイルアルギニンメチルエステル（３８６ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）にトリフルオロ酢酸４ｍＬ加え、室温で１時間反応した後溶媒を濃縮し目的物である３−ヒドラジノベンゾイルアルギニンメチルエステルを定量的に得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる解析により、目的物の［Ｍ＋Ｈ］+イオンをｍ/ｚ：３２３．２に観測した。【００３８】
３−ヒドラジノベンゾイルアルギニンメチルエステル（２９ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）をエタノール１ｍＬに溶解し、１Ｍアセト酢酸エチルのエタノール溶液（８０μＬ、０．０８ｍｍｏｌ）さらに酢酸２００μＬ加え６５℃で３０分反応した。反応液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロフォルム：メタノール、９：１→５：１）で分離し、最終目的物である３−アルギニン付加ピラゾロン（２１．７ｍｇ、７０％）を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる解析により、目的物の［Ｍ＋Ｈ］+イオンをｍ/ｚ：３８９．２に観測した。【００３９】
（合成例３）
４−ヒドラジノ安息香酸（１．５２ｇ、１０ｍｍｏｌ）をジメチルフォルムアミド１０ｍＬに溶解し、二炭酸ジ−ｔ−ブチル（２．１８ｇ、１０ｍｍｏｌ）加え６５℃で１時間反応した。反応液を酢酸エチルで抽出し、１０ｍＭ塩酸および水で洗浄した。抽出液を濃縮し、目的物であるＢｏｃ−４−ヒドラジノ安息香酸を得た。【００４０】
Ｂｏｃ−４−ヒドラジノ安息香酸（２５２ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）をメタノール１０ｍＬに溶解し、４−(４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル)−４−メチルモルホリニウムクロリド（２９５ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を加えた（溶液１）。溶液２）メチルアルギニン２塩酸塩（２６１ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を水２ｍＬに溶解し、トリエチルアミン（１００μＬ、１．００ｍｍｏｌ）を加えた溶液を溶液１に加え、室温で２時間反応した。反応液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロフォルム：メタノール、９：１→５：１）で分離し、目的物であるＢｏｃ−３−ヒドラジノベンゾイルアルギニンメチルエステル（４１７ｍｇ、９９％）を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる解析により、目的物の［Ｍ＋Ｈ］+イオンをｍ/ｚ：４２３．３に観測した。【００４１】
Ｂｏｃ−４−ヒドラジノベンゾイルアルギニンメチルエステル（４１７ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ）にトリフルオロ酢酸４ｍＬ加え、室温で３０分反応した後溶媒を濃縮し目的物である４−ヒドラジノベンゾイルアルギニンメチルエステルを定量的に得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる解析により、目的物の［Ｍ＋Ｈ］+イオンをｍ/ｚ：３２３．２に観測した。【００４２】
４−ヒドラジノベンゾイルアルギニンメチルエステル（１５９ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）をエタノール５ｍＬに溶解し、１Ｍアセト酢酸エチルのエタノール溶液（４５０μＬ、０．４５ｍｍｏｌ）さらに酢酸１０００μＬ加え６５℃で３０分反応した。反応液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロフォルム：メタノール、９：１→５：１）で分離し、最終目的物である４−アルギニン付加ピラゾロン（１７５ｍｇ、９２％）を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる解析により、目的物の［Ｍ＋Ｈ］+イオンをｍ/ｚ：３８９．２に観測した。【００４３】
（合成例４）
Ｂｏｃ−４−ヒドラジノ安息香酸（１１７ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）をメタノール５ｍＬに溶解し、４−(４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル)−４−メチルモルホリニウムクロリド（１３７ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を加えた。ジメチルスルフォキシド５ｍＬに溶解したビオチンヒドラジド（１）（１００ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を加えた室温で１６時間反応した。反応液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロフォルム：メタノール、９：１→５：１）で分離し、目的物であるＮ−（Ｂｏｃ−４−ヒドラジノベンゾイル）−ビオチンヒドラジド（２）（１２０ｍｇ、６３％）を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる解析により、目的物の［Ｍ＋Ｎａ］+イオンをｍ/ｚ：５１５．４に観測した。【００４４】
Ｎ−（Ｂｏｃ−４−ヒドラジノベンゾイル）−ビオチンヒドラジド（２）（１２０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）にトリフルオロ酢酸４ｍＬ加え、室温で３０分反応した後溶媒を濃縮し目的物であるＮ−（４−ヒドラジノベンゾイル）−ビオチンヒドラジド（３）を定量的に得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる解析により、目的物の［Ｍ＋Ｎａ］+イオンをｍ/ｚ：４１５．２に観測した。【００４５】
Ｎ−（４−ヒドラジノベンゾイル）−ビオチンヒドラジド（３）（３９ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）をエタノール１ｍＬに溶解し、１Ｍアセト酢酸エチルのエタノール溶液（９０μＬ、０．０９ｍｍｏｌ）さらに酢酸２００μＬ加え６５℃で３０分反応した。反応液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロフォルム：メタノール、９：１→５：１）で分離し、最終目的物であるビオチン付加ピラゾロン（４）（３８ｍｇ、９２％）を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる解析により、目的物の［Ｍ＋Ｈ］+イオンをｍ/ｚ：４５９．４に観測した。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は、これまで長く方法論の開発が望まれていたＯ−結合型糖鎖の解析に極めて有効な方法となる。また、従来、リン酸修飾の解析に用いられてきたＢＥＭＡ法に対しても新たな選択肢をもたらすこととなる。本発明により、セリン、スレオニンの翻訳後修飾の総合的な解析が可能となり、生化学、生物学、薬学、創薬、医学等の領域への多大なる貢献が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図８】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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