(57)【要約】  本発明の目的は、水分散性の被保護対象物質を液体状態で含みつつ外部刺激から保護することができる構造体及び方法を提供することである。  被保護対象物質の保護構造体は、水分散性の被保護対象物質を含有する不連続相を構成する水相と、この水相が分散された油相と、自発的に閉鎖小胞体を形成する両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体、又は水酸基を有する重縮合ポリマー粒子と、からなるＷ／Ｏエマルション構造を有する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水分散性の被保護対象物質を含有する不連続相を構成する水相と、この水相が分散された油相と、自発的に閉鎖小胞体を形成する両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体、又は水酸基を有する重縮合ポリマー粒子と、からなるＷ／Ｏエマルション構造を有する被保護対象物質の保護構造体。
【請求項２】
前記被保護対象物質は、１種以上の酵素物質又は色素を含有する請求項１記載の保護構造体。
【請求項３】
前記被保護対象物質は、１種以上の酵素物質を含有し、
前記保護構造体は、前記閉鎖小胞体を含有する請求項２記載の保護構造体。
【請求項４】
ある水相に含有される酵素物質が、他の水相に含有される酵素物質と異なる請求項３記載の保護構造体。
【請求項５】
ある水相に含有される酵素物質は、他の水相に含有される酵素物質を、同一の水相に存在する場合には阻害する活性を有する請求項４記載の保護構造体。
【請求項６】
請求項１から５いずれか記載の保護構造体を、自発的に閉鎖小胞体を形成する両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体、又は水酸基を有する重縮合ポリマー粒子によって水相中に分散させて、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションを形成することで、前記被保護対象物質を外部刺激から保護する方法。
【請求項７】
前記外部刺激は、前記Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションの外水相のｐＨ及び塩濃度、前記外水相に含まれかつ前記被保護対象物質を分解又は機能低下させる物質、前記外水相に照射される光、電場、電磁波、及び音波からなる群より選ばれる１種以上である請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項３から５いずれか記載の保護構造体を、自発的に閉鎖小胞体を形成する両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体によって水相中に分散させて、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションを形成し、
外水相に含有される基質を、前記酵素物質による酵素反応に供する工程を有する酵素反応方法。
【請求項９】
請求項３から５いずれか記載の保護構造体を、自発的に閉鎖小胞体を形成する両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体によって水相中に分散させて、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションを形成し、
外水相に含有される基質を、前記酵素物質による酵素反応に供し、基質の反応産物を生成する工程を有する反応産物の製造方法。
【請求項１０】
請求項３から５いずれか記載の保護構造体における前記水相に対する前記油相の量を増減することで、前記酵素物質による酵素反応の速度を調節する方法。
【請求項１１】
請求項３から５いずれか記載の保護構造体と、自発的に閉鎖小胞体を形成する両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体を含有する小胞体液と、を収容する酵素物質の使用キット。
【請求項１２】
洗剤として用いられる請求項１１記載の使用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被保護対象物質の保護構造体及びその用途、並びに被保護対象物質の保護方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素等の被保護対象物質は、洗剤、繊維産業、糖化工業、医薬品、農薬、醸造、化粧品等の多種多様な分野で使用され、研究が進められている。しかし、酵素の問題点は、失活しやすい点である。このため、実験室で酵素を取り扱うときは、粉体もしくは高濃度水溶液を−２０℃で保存、長期保存するときは−８０℃の低温で保存し、使う前には必ずその活性を確認することが必要である。【０００３】
他方、実験室外（例えば流通段階、家庭）では、酵素は通常常温で保管されており、また活性を確認することができない。酵素を実験室外で有用に使用するためには、飛散の少ない顆粒状に形成するか、使用時に可能な液体状態にして、常温でも保存できることが要求される。【０００４】
酵素を液体状態で扱うために、エマルションを利用することが考えられる。エマルションに使用される界面活性剤により酵素が失活することを抑制するため、従来の家庭用洗剤等では酵素安定化剤を添加、もしくは酵素を吸着固定化、保護カプセル等に包む等の対策がとられている（例えば特許文献１）。しかし、それでも使用時の酵素活性が著しく落ちてしまうのが現状である。【０００５】
また、酵素物質に限らず、光等の外部刺激により退色等の機能低下をしてしまう色素等も、液体状態で維持しながら、外部刺激から保護しなければならない点で共通である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００９−５３２５６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、水分散性の被保護対象物質を液体状態で含みつつ外部刺激から保護することができる構造体及び方法を提供することを目的とする。【０００８】
また、本発明は、酵素物質を液体状態で含みつつ酵素活性の維持に優れる酵素物質の保護構造体を提供することを別の目的とする。また、本発明は、かかる酵素物質の保護構造体を用いた酵素反応方法、反応産物の製造方法、酵素反応の速度を調節する方法、及び酵素物質の使用キットを提供することを別の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、酵素物質等の被保護対象物質を含有する水相を、自発的に閉鎖小胞体を形成する両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体、又は重縮合ポリマー粒子で油相中に分散させると、外部刺激から保護されることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的に、本発明は以下のようなものを提供する。【００１０】
（１）  水分散性の被保護対象物質を含有する不連続相を構成する水相と、この水相が分散された油相と、自発的に閉鎖小胞体を形成する両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体、又は水酸基を有する重縮合ポリマー粒子と、からなるＷ／Ｏエマルション構造を有する被保護対象物質の保護構造体。【００１１】
（２）  前記被保護対象物質は、１種以上の酵素物質又は色素を含有する（１）記載の保護構造体。【００１２】
（３）  前記被保護対象物質は、１種以上の酵素物質を含有し、
前記保護構造体は、前記閉鎖小胞体を含有する（２）記載の保護構造体。【００１３】
（４）  ある水相に含有される酵素物質が、他の水相に含有される酵素物質と異なる（３）記載の保護構造体。【００１４】
（５）  ある水相に含有される酵素物質は、他の水相に含有される酵素物質を、同一の水相に存在する場合には阻害する活性を有する（４）記載の保護構造体。【００１５】
（６）  （１）から（５）いずれか記載の保護構造体を、自発的に閉鎖小胞体を形成する両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体、又は水酸基を有する重縮合ポリマー粒子によって水相中に分散させて、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションを形成することで、前記被保護対象物質を外部刺激から保護する方法。【００１６】
（７）  前記外部刺激は、前記Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションの外水相のｐＨ及び塩濃度、前記外水相に含まれかつ前記被保護対象物質を分解又は機能低下させる物質、前記外水相に照射される光、電場、電磁波、及び音波からなる群より選ばれる１種以上である（６）記載の方法。【００１７】
（８）  （３）から（５）いずれか記載の保護構造体を、自発的に閉鎖小胞体を形成する両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体によって水相中に分散させて、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションを形成し、
外水相に含有される基質を、前記酵素物質による酵素反応に供する工程を有する酵素反応方法。【００１８】
（９）  （３）から（５）いずれか記載の保護構造体を、自発的に閉鎖小胞体を形成する両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体によって水相中に分散させて、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションを形成し、
外水相に含有される基質を、前記酵素物質による酵素反応に供し、基質の反応産物を生成する工程を有する反応産物の製造方法。【００１９】
（１０）  （３）から（５）いずれか記載の保護構造体における前記水相に対する前記油相の量を増減することで、前記酵素物質による酵素反応の速度を調節する方法。【００２０】
（１１）  （３）から（５）いずれか記載の保護構造体と、自発的に閉鎖小胞体を形成する両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体を含有する小胞体液と、を収容する酵素物質の使用キット。【００２１】
（１２）  洗剤として用いられる（１１）記載の使用キット。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、１種以上の被保護対象物質を含有する不連続相を構成する水相を、自発的に閉鎖小胞体を形成する両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体、又は水酸基を有する重縮合ポリマー粒子で分散したので、被保護対象物質を液体状態で含みつつ外部刺激から保護することができる。【００２３】
また、１種以上の酵素物質を含有する不連続相を構成する水相を、自発的に閉鎖小胞体を形成する両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体で包囲して分散したので、酵素物質を液体状態で含みつつ酵素活性を維持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】比較例における酵素活性を示すグラフである。
【図２】本発明の一実施例に係る酵素物質の保護構造体における酵素活性を示すグラフである。
【図３】図２の酵素物質の保護構造体における酵素活性の変化を示すグラフである。
【図４】本発明の別の実施例に係る酵素物質の保護構造体における酵素活性を示すグラフである。
【図５】図４の酵素物質の保護構造体における酵素活性の変化を示すグラフである。
【図６】本発明のさらに別の実施例に係る酵素物質の保護構造体における酵素活性の変化を示すグラフである。
【図７】図６の酵素物質の保護構造体における別の酵素活性の変化を示すグラフである。
【図８】図６の酵素物質の保護構造体における酵素活性を示す図である。
【図９】図６の酵素物質の保護構造体における別の酵素活性を示す図である。
【図１０】本発明のさらに別の実施例に係る酵素物質の保護構造体における酵素活性の変化を示すグラフである。
【図１１】比較例に係る色素水溶液の経時的退色を示すＵＶ−ＶＩＳスペクトルである。
【図１２】本発明のさらに別の実施例に係る色素の保護構造体の内水相の色素水溶液の経時的退色を示すＵＶ−ＶＩＳスペクトルである。
【図１３】本発明の参考例に係るＷ／Ｏ／Ｗエマルションにおける外水相のｐＨの経時的推移を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明の実施形態を説明するが、これが本発明を限定するものではない。
【００２６】
＜被保護対象物質の保護構造体＞
本発明に係る酵素物質の保護構造体は、水分散性の被保護対象物質を含有する不連続相を構成する水相と、この水相が分散された油相と、自発的に閉鎖小胞体を形成する両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体、又は水酸基を有する重縮合ポリマー粒子と、からなるＷ／Ｏエマルション構造を有する。かかる保護構造体は、油相によって外部から保護されており、また、外側に外水相を有するＷ／Ｏ／Ｗエマルションを安定に形成することができ、その場合にも油相が保護層を果たす。なお、閉鎖小胞体又は重縮合ポリマー粒子による乳化は、閉鎖小胞体又は重縮合ポリマー粒子が水相と油相との境界領域に介在することによると推測される。
【００２７】
水分散性の被保護対象物質は、水溶性又は親水性を有し、外部刺激から保護すべきものであれば、特に限定されない。例えば、酵素物質、色素、フリーラジカル含有物質等が挙げられる。酵素物質であれば、至適範囲外のｐＨ及び塩濃度、酵素物質の分解又は機能低下物質等の外部刺激による失活から、色素であれば、ｐＨ及び塩濃度、光等の外部刺激による退色や沈殿等から、それぞれ保護することができる。
【００２８】
色素としては、特に限定されず、メチレンブルー、ニューメチレンブルー、ニュートラルレッド、インジゴカルミン、アシッドレッド、サフラニンＴ、フェノサフラニン、カプリブルー、ナイルブルー、ジフェニルアミン、キシレンシアノール、ニトロジフェニルアミン、フェロイン、Ｎ−フェニルアントラニル酸等の酸化還元色素が挙げられる。
【００２９】
一実施形態に係る酵素物質の保護構造体では、酵素物質によって代謝されない観点で、閉鎖小胞体が用いられることが好ましい。自発的に閉鎖小胞体を形成する両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体は、界面活性剤と異なり酵素物質の失活を促さず、また酵素物質を含有する水相は油相によって外部から保護されている。これにより、酵素物質を液体状態で含みつつ酵素活性を維持することができる。
【００３０】
水相に含まれる酵素物質は、１種であっても、複数種であってもよい。後者の場合、異なる種類の酵素物質が同じ水相中に併存していてもよいし、別々の水相中に分かれて存在していてもよい。後者の場合、ある水相に含有される酵素物質（便宜上、第１酵素物質と言う）が、他の水相に含有される酵素物質（便宜上、第２酵素物質と言う）と異なることになり、第１酵素物質及び第２酵素物質が作用しあうことを抑制できる。このことは、第１酵素物質（例えば、タンパク質分解酵素）が、第２酵素物質と同一の水相に存在する場合に第２酵素物質を阻害する活性を有する場合において特に有用である。これにより、第１酵素物質及び第２酵素物質の酵素活性を、阻害されずに、同時に同一系で発揮することができる。
【００３１】
酵素物質は、任意のものから用途に応じて適宜選択されてよい。例えば、酵素物質の保護構造体を洗剤等に利用する場合、酵素物質はタンパク質分解酵素、糖分解酵素等の分解酵素であればよく、酵素物質の保護構造体を合成等に用いる場合、酵素物質は合成酵素であればよい。
【００３２】
水相は、酵素に加え、任意成分をさらに含んでいてもよい。任意成分としては、酵素安定化剤（例えば、ホウ素化合物、カルシウムイオン源、ビヒドロキシ化合物、ギ酸）が挙げられる。
【００３３】
両親媒性物質としては、特に限定されないが、下記の一般式１で表されるポリオキシエチレン硬化ひまし油の誘導体、もしくは一般式２で表されるジアルキルアンモニウム誘導体、トリアルキルアンモニウム誘導体、テトラアルキルアンモニウム誘導体、ジアルケニルアンモニウム誘導体、トリアルケニルアンモニウム誘導体、又はテトラアルケニルアンモニウム誘導体のハロゲン塩の誘導体が挙げられる。
【００３４】
一般式１
【化１】
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【００３５】
式中、エチレンオキシドの平均付加モル数であるＥは、３〜１００であってよいが、特に限定されない。
【００３６】
一般式２
【化２】
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【００３７】
式中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して炭素数８〜２２のアルキル基又はアルケニル基であり、Ｒ３及びＲ４は、各々独立して水素又は炭素数１〜４のアルキル基であり、ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩである。
【００３８】
両親媒性物質としては、リン脂質やリン脂質誘導体等を採用してもよい。リン脂質としては、下記の一般式３で示される構成のうち、炭素鎖長１２のＤＬＰＣ（１，２−Ｄｉｌａｕｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏ−ｒａｃ−１−ｃｈｏｌｉｎｅ）、炭素鎖長１４のＤＭＰＣ（１，２−Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏ−ｒａｃ−１−ｃｈｏｌｉｎｅ）、炭素鎖長１６のＤＰＰＣ（１，２−Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏ−ｒａｃ−１−ｃｈｏｌｉｎｅ）が採用可能である。
【００３９】
一般式３
【化３】
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【００４０】
また、下記の一般式４で示される構成のうち、炭素鎖長１２のＤＬＰＧ（１，２−Ｄｉｌａｕｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏ−ｒａｃ−１−ｇｌｙｃｅｒｏｌ）のＮａ塩又はＮＨ４塩、炭素鎖長１４のＤＭＰＧ（１，２−Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏ−ｒａｃ−１−ｇｌｙｃｅｒｏｌ）のＮａ塩又はＮＨ４塩、炭素鎖長１６のＤＰＰＧ（１，２−Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏ−ｒａｃ−１−ｇｌｙｃｅｒｏｌ）のＮａ塩又はＮＨ４塩を採用してもよい。
【００４１】
一般式４
【化４】
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【００４２】
さらに、リン脂質として卵黄レシチン又は大豆レシチン等を採用してもよい。
【００４３】
また、以下の一般式５で示されるポリグリセリン脂肪酸エステルを用いてもよい。ポリグリセリン脂肪酸エステルとしては、特に特定されないが、炭素数が１２〜３６の脂肪酸と重合度が６以上、特に６〜１０のポリグリセリンとのエステルを挙げることができる。ポリグリセリンとエステルを形成する脂肪酸は飽和、不飽和、直鎖状又は分枝鎖状のいずれの脂肪酸でも良く、具体的にはカプリン酸、ラウリン酸、イソトリデカン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、ベヘニン酸またはリシノール酸などを例示することができる。
【００４４】
一般式５
【化５】
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【００４５】
式中、ＲはＨ、又は飽和あるいは不飽和の脂肪酸を指す。
【００４６】
両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体は、上記の両親媒性物質を分散媒（本実施形態では油相）中に添加し、撹拌することで製造できる。かかる小胞体は、エマルション形成前では平均粒子径２００ｎｍ〜８００ｎｍ程度であるが、Ｗ／Ｏエマルション構造においては平均粒子径８〜５００ｎｍ程度である。
【００４７】
水酸基を有する重縮合ポリマーは、天然高分子又は合成高分子のいずれであってもよく、乳化剤の用途に応じて適宜選択されてよい。ただし、安全性に優れ、一般的に安価である点で、天然高分子が好ましく、乳化機能に優れる点で以下に述べる糖ポリマーがより好ましい。
【００４８】
糖ポリマーは、セルロース、デンプン等のグルコシド構造を有するポリマーである。例えば、リボース、キシロース、ラムノース、フコース、グルコース、マンノース、グルクロン酸、グルコン酸などの単糖類の中からいくつかの糖を構成要素として微生物が産生するもの、キサンタンガム、アラビアゴム、グアーガム、カラヤガム、カラギーナン、ペクチン、フコイダン、クインシードガム、トラントガム、ローカストビーンガム、ガラクトマンナン、カードラン、ジェランガム、フコゲル、カゼイン、ゼラチン、デンプン、コラーゲンなどの天然高分子、メチルセルロース、エチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、セルロース結晶体、デンプン・アクリル酸ナトリウムグラフト重合体、疎水化ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの半合成高分子、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸塩、ポリエチレンオキシドなどの合成高分子が挙げられる。
【００４９】
分散は、用いる重縮合ポリマーに応じ常法に沿って行えばよく、例えば、デンプン等の場合には、常温水に充分に分散する一方、キタンサンガム等の場合には、熱水に添加することが一般的である。
【００５０】
両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体及び重縮合ポリマー粒子は、幅広い水相及び油相の組み合わせを乳化させることができる（詳細は特許第３８５５２０３号公報）。このため、油相は特に限定されず、軽油、Ａ重油、Ｃ重油、タール、バイオディーゼル燃料、再生重油、廃食油、天然物油剤（植物油、鉱物油）等のあらゆるものであってよいが、酵素活性を阻害しにくい観点では、流動パラフィン、スクワラン等の非極性油が好ましい。
【００５１】
また、水相及び油相の比率は、酵素物質の溶解度、最終的な酵素物質の必要量、両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体や重縮合ポリマー粒子の乳化能力等に応じて許容される範囲、一般的には水相：油相が５：９５〜５０：５０（質量比）から設定し得る。ここで、油相の比率が高い程、後述のＷ／Ｏ／Ｗエマルションに分散するＷ／Ｏエマルション粒子における油相の厚みが大きくなり、例えば酵素の反応速度が低下する一方、油相の比率が低い程、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションに分散するＷ／Ｏエマルション粒子における油相の厚みが小さくなり、例えば酵素の反応速度が上昇する。このため、例えば、必要とされる酵素の反応速度に応じて、水相及び油相の比率は適宜設定されてよい。
【００５２】
酵素物質等の被保護対象物質の保護構造体は、例えば、両親媒性物質又は重縮合ポリマーを添加して撹拌して分散液を調製し、この分散液に被保護対象物質を所定の比率で添加し、油液と撹拌することで製造できる。詳細な手順は、従来公知の方法（例えば特許第３８５５２０３号公報）に従えばよい。
【００５３】
＜被保護対象物質の保護方法＞
本発明は、以上の保護構造体を、自発的に閉鎖小胞体を形成する両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体、又は水酸基を有する重縮合ポリマー粒子によって水相中に分散させて、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションを形成することで、被保護対象物質を外部刺激から保護する方法も包含する。
【００５４】
外部刺激は、特に限定されないが、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションの外水相のｐＨ及び塩濃度、外水相に含まれかつ被保護対象物質を分解又は機能低下させる物質、外水相に照射される光、電場、電磁波、及び音波（特に超音波）からなる群より選ばれる１種以上であってよい。
【００５５】
被保護対象物質、両親媒性物質、重縮合ポリマーは、前述の通りであるため、説明を省略する。
【００５６】
＜酵素物質の使用キット＞
本発明に係る酵素物質の使用キットは、前述の保護構造体と、自発的に閉鎖小胞体を形成する両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体を含有する小胞体液と、を収容する。小胞体液は小胞体が水中に分散した分散水であり、保護構造体及び小胞体液を混合すると、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションを形成することができる。Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションにおける外側の水相（外水相）に、酵素物質の基質を含有させることで、失活が抑制されながら、酵素反応を進行することができる。
【００５７】
使用キットにおいて、保護構造体及び小胞体液は、同一系中に併存していてもよく、分離して別々に保管されていてもよい。前者は、酵素反応が進行し得る条件が整っているため、すぐに使用することができる点で有利であり、この場合、保護構造体及び小胞体液はＷ／Ｏ／Ｗエマルションの状態であってもよく、その前段階であってもよい。後者は、酵素反応が進行するのに適切な条件が整っていないため、酵素の保存性がさらに優れる。
【００５８】
小胞体液は、両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体の他に任意成分をさらに含有してもよい。任意成分としては、酵素反応に関与する物質、例えば基質、酵素安定化剤（例えば、ホウ素化合物、カルシウムイオン源、ビヒドロキシ化合物、ギ酸）が挙げられる。
【００５９】
このような使用キットは、保護構造体及び小胞体液（必要に応じて水を追加してよい）を混合することで、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションを形成し、酵素反応条件下におくことで、外水相に含有される基質を酵素物質による酵素反応に供させることができる。小胞体は、界面活性剤と異なり酵素物質の失活を促さず、また酵素物質を含有する水相は油相によって外部から保護されているので、酵素物質を液体状態で含みつつ、酵素活性を維持することができる。
【００６０】
本発明の使用キットは、酵素物質を液体状態で含みつつ酵素活性を維持することができるため、種々の用途に利用できる。用途は、特に限定されないが、衣類等の洗濯、化学合成、酵素物質の研究等であってよい。前述のように、本発明の保護構造体では、同一の水相に存在する場合には阻害する活性を有する酵素物質同士であっても、各々を異なる水相に含有させることで、阻害しあわずに酵素活性を発揮することができる。このため、酵素活性を充分に奏し、また複数の酵素反応を並行して行うことができる。
【００６１】
本発明は、保護構造体を、自発的に閉鎖小胞体を形成する両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体によって水相中に分散させて、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションを形成し、外水相に含有される基質を、酵素物質による酵素反応に供する工程を有する酵素反応方法も提供する。
【００６２】
また、本発明は、保護構造体を、自発的に閉鎖小胞体を形成する両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体によって水相中に分散させて、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションを形成し、外水相に含有される基質を、酵素物質による酵素反応に供し、基質の反応産物を生成する工程を有する反応産物の製造方法も提供する。例えば、合成の複数段階の各々に関与する酵素を併用すれば、出発物質から合成物まで、中間生成物を取り扱うことなく、完結して製造することができる。なお、生成された産物は、エマルションを解乳化することで外水相に取り出すことができる。
【００６３】
本発明は、保護構造体における水相に対する油相の量を増減することで、酵素物質による酵素反応の速度を調節する方法も提供する。前述のとおり、酵素物質による反応速度は、Ｗ／Ｏエマルションにおける油相の厚みに反比例することが分かっており、油相の厚みは水相に対する油相の量を増減することで調節することで、酵素反応の速度を調節することができる。
【実施例】
【００６４】
＜α−アミラーゼ＞
（比較例１）
α−アミラーゼ「ＳＤＨ６６６５」（和光純薬社製）を０．０１質量％になるようにイオン交換水に溶解させ、その酵素水溶液１００μＬに、０．１質量％アミロース「ＥＣ２３２６８５９」（和光純薬社製）３ｍＬ及びクエン酸を適量添加し、３７℃で５分間保持した。その後、反応停止剤である塩酸溶液を添加して反応を止めた後、遠心分離（５０００ｒｐｍ、２分間）して反応液を抽出した。この反応液及び反応前の液にヨウ素０．１質量％水溶液１滴を添加し、紫外可視分光光度計「Ｖ−５７０」（日本分光社製）を用いて、スペクトルを測定した（図１）。すると、図１に示されるように、最大吸収波長が反応前（実線）には６２１ｎｍであったのに対し、反応後（点線）には５７０ｎｍにシフトしており、α−アミラーゼが酵素活性を有することが確認された。なお、酵素それ自体は周知のように常態では急激に失活していくものであるので、失活を充分に抑制できる環境下で上記酵素反応を行った。【００６５】
（実施例１）
水にＨＣＯ−１０の濃度が５質量％になるように加え，２０±５℃に保持して，卓上型クイックホモミキサー「ＬＲ−１９」（みずほ工業社製）を用いて１３００±１００ｒｐｍで３０分間撹拌し、両親媒性物質で形成された閉鎖小胞体の分散液を調製した。流動パラフィンにＨＣＯ−５を０．１質量％になるように加え、マグネチックスターラーで３０分間撹拌した。この分散液に、比較例１で用いた酵素水溶液を質量比で酵素水溶液１０：分散液９０となるように加え、ホモミキサー「Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  ＤＩＡＸ９００」で１６０００ｒｐｍ、５分間撹拌し、酵素物質の保護構造体としてのＷ／Ｏエマルションを調製した。このエマルションをＨＣＯ−１０水分散液に、質量比でエマルション５０：分散液５０になるように加え，ホモミキサーで１６０００ｒｐｍ、５分間撹拌し、酵素を内包したＷ／Ｏ／Ｗ型の複合エマルションを調製した。【００６６】
このＷ／Ｏ／Ｗエマルション１００μＬを添加した点を除き、比較例１と同様の手順でスペクトルを測定した（図２）。図２に示されるように、最大吸収波長が反応前（実線）には６２１ｎｍであったのに対し、反応後（点線）には５２６ｎｍにシフトしており、α−アミラーゼがＷ／Ｏ／Ｗエマルションにおいても酵素活性を有することが確認された。【００６７】
比較例１及び実施例１の基質を添加する前の溶液を４℃で保存し，１週間に亘り毎日、酵素活性を測定した（図３）。図３に示されるように、実施例１では比較例１に比べ、失活が抑制されていることが確認された。【００６８】
＜パパイン＞
（比較例２）
パパイン「ＷＫＰ５５５９」（和光純薬社製）を２．０質量％になるようにイオン交換水に溶解させ、その溶液０．１ｍＬに、１．０質量％カゼイン「ＬＴＱ４３９６」（和光純薬社製）１ｍＬ及びリン酸緩衝液を適量添加し、３７℃で５分間保持した。その後、反応停止剤であるトリクロロ酢酸溶液を添加して反応を止めた後、ろ過し、得たろ液について、反応産物であるフェニルアラニンの量を紫外可視分光光度計「Ｖ−５７０」（日本分光社製）を用いて測定した（図４）。【００６９】
（実施例２）
比較例２で用いた酵素水溶液を用いた点を除き、実施例１と同様の手順でＷ／Ｏ／Ｗ型の複合エマルションを調製した。そして、このエマルションを用いた点を除き、比較例２と同様の手順でフェニルアラニンの量を測定した（図４）。【００７０】
図４に示されるように、実施例２は、比較例２に比べ、初期の反応速度はやや遅かったものの、その差は経時的に縮まり、３０分後には同等になった。これにより、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションにおいても同等の酵素活性が得られることが分かった。【００７１】
また、比較例２及び実施例２の基質を添加する前の溶液を４℃で保存し、２週間に亘り酵素活性を測定した（図５）。パパインはタンパク質分解酵素であり、極めて失活しにくいものであるが、図５に示されるように実施例２は比較例２と同様に失活が抑制されていることが確認された。【００７２】
＜α−アミラーゼ及びパパイン＞
（比較例３）
比較例１及び比較例２の各々で製造した酵素水溶液を５０：５０（質量比）の比率で添加し、撹拌して混合した。【００７３】
（実施例３）
実施例１及び実施例２の各々で製造したＷ／Ｏ／Ｗエマルションを、５０：５０（質量比）の比率で添加し、３分間撹拌して混合した。【００７４】
比較例３及び実施例３の混合液について、前述の条件でパパインの酵素活性を２週間に亘り測定した（図６）。図６に示されるように、パパインは，α−アミラーゼを混合してもパパイン単独の状態（図５）と同様にほとんど失活せず、１４日後でもエマルション及び水溶液のいずれの状態で高い活性を保った。これにより，タンパク質分解酵素であるパパインは、デンプン分解酵素であるα−アミラーゼに酵素活性を阻害されずに保持できることが分かった。【００７５】
また、比較例３及び実施例３の混合液について、前述の条件でα−アミラーゼの酵素活性を２週間に亘り測定した（図７）。エマルション状態のα−アミラーゼはほとんど失活しなかったのに対し、水溶液状態で一液化した系におけるα−アミラーゼの酵素活性は経日すると大幅に低下した。この低下幅は、パパイン非存在下（図３）よりも明らかに大きい。比較例３の結果は、タンパク質分解酵素であるパパインによってα−アミラーゼが分解されたことによると考えられるが、実施例３では、パパイン非存在下（図３）と同様に失活が抑制されており、α−アミラーゼがパパインから保護されていることが確認された。【００７６】
次に、実施例３の混合液に対して、カゼイン及びアミロースの双方を同時に添加した点を除き、前述の条件で酵素活性を確認した。図８は、反応前後の液をヨウ素反応に供した後の紫外吸収スペクトル（α−アミラーゼの酵素活性を示す）であり、図９はフェニルアラニンの量に基づくパパインの酵素活性を示すグラフである。【００７７】
図８に示されるように、最大吸収波長が反応前（実線）の６２３ｎｍから、反応後（点線）に５２１ｎｍへとシフトしており、基質が単独で存在していた場合（図２）と同様であった。これにより、基質を混合した溶液に一液化したエマルションを反応させても、α−アミラーゼは基質特異性によりアミロースと反応し、酵素分解反応が進行したことが確認された。【００７８】
図９に示されるパパインの酵素活性は、基質が単独で存在していた場合（図４）と同様であった。これにより、基質を混合した溶液に一液化したエマルションを反応させても、パパインは基質特異性によりカゼインと反応し、酵素分解反応が進行したことが確認された。【００７９】
＜水相及び油相の比率＞
（実施例４）
アルカリフォスファターゼ「ＥＣ３．１．３．１」（和光純薬社製）を０．１質量％になるようにイオン交換水に溶解して得た酵素水溶液を用いた点を除き、実施例１と同様の手順で、酵素を内包したＷ／Ｏ／Ｗ型の複合エマルションを調製した。ただし、Ｗ／Ｏエマルションを形成する際における流動パラフィンの分散液の添加比率を、酵素水溶液との合計量に対して、７０、７５、８０、８５、９０質量％とした。【００８０】
各Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションについて、基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウムを用い、紫外可視分光光度計「Ｖ−５７０」（日本分光社製）を用い常法に従って、波長４１０ｎｍにおける吸光度を測定した（図１０）。図１０に示されるように、酵素反応の速度は、Ｗ／Ｏエマルション調製時における油相の添加量に反比例していた。これにより、保護構造体における水相に対する油相の量を増減することで、酵素物質による酵素反応の速度を調節できることが確認された。【００８１】
＜色素＞
（実施例５）
ＨＣＯ−１０の代わりに、内水相の安定化にはポリグリセリンオレイン酸エステルを用い、外水相に対するＷ／Ｏ型エマルションの安定化にはポリグリセンジステアリン酸エステルを用い、酵素水溶液の代わりにメチレンブルー水溶液（水溶液：Ｗ／Ｏ型エマルション＝１：１）を用いた点を除き、実施例１と同様の手順でＷ／Ｏ／Ｗ型の複合エマルションを調製した。なお、メチレンブルーの水溶液は波長６６０ｎｍに吸収極大を持つ着色溶液であるが、発色団が可視光の照射によって光分解をし、溶液の着色が退色することが知られている。【００８２】
比較例として、ポリグリセン脂肪酸エステルの代わりに、従来の界面活性剤を用いて、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションを形成しようと試みたが、安定なものを作製することはできなかった。このため、比較例として、実施例５で用いたメチレンブルー水溶液を用いた。【００８３】
Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションと、比較例のメチレンブルー水溶液とに対し、照射装置「Ｌｕｍｉｎａｌ  Ａｃｅ  ＬＡ−１８０Ｍｅ」(ＨＡＹＡＳＨＩ：１８０Ｗ)を用い、照度４４．３０Ｗ／ｍ２で白色光を照射した。照射直後、１時間後、及び３時間後において、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションの内水相及び比較例におけるメチレンブルー水溶液のＵＶ―ＶＩＳスペクトルを得た。この結果を図１０（比較例）及び１１（実施例５）に示す。【００８４】
照射時間の経過に伴い、比較例では退色が進行したのに対し、実施例５では退色を確認することはほぼできなかった。これにより、本発明のＷ／Ｏ／Ｗエマルションにより、光照射という外部刺激からも被保護対象物質を保護できることが分かった。なお、内水相が油相及び外水相に包囲されている実施例５の方が、比較例よりも、光透過率が低いことは間違いないが、そもそも従来技術では安定なＷ／Ｏ／Ｗエマルションを形成することが難しかったこと、及び、実施例５の照射３時間後においても、比較例の照射１時間後より、退色の程度が小さいことは着目すべき点である。【００８５】
＜拡散の抑制＞
内水相に水酸化ナトリウム水溶液（ｐＨ１０．３）を用い、外水相に純水（ｐＨ８．０）を用い、内水相に対する外水相の比を２．０とし、油相として流動パラフィンの代わりに中鎖トリグリセリンを用い、ＨＣＯ−１０の代わりにジステアリン酸デカグリセリンを用いた点を除き、実施例１と同様の手順でＷ／Ｏ／Ｗエマルションを調製した。【００８６】
調製後において、外水相のｐＨを経時的に測定した結果を図１３に示す。拡散が自由に生じるのであれば、内水相と外水相（比率１：２）が均一混合し、外水相のｐＨは９．０４になるはずであったが、実際には８．０近傍で一定していた。このことから、内水相と外水相との間の拡散が抑制されており、ｐＨ、塩濃度等の外部刺激から内水相中の被保護対象物質を保護できることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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