(57)【要約】  キチン分解酵素活性タンパク質発現遺伝子および該遺伝子によりコードされるキチン分解酵素活性タンパク質、並びに該キチン分解酵素活性タンパク質を用いるキチンの分解方法およびＮ−アセチルグルコサミンの製造方法を提供する。配列番号１に示された塩基配列において、塩基番号１〜１４６４に示される塩基配列からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡと９０％以上の塩基配列相同性を有する塩基配列からなり、キチン分解酵素活性を有するタンパク質をコードするものであることを特徴とするＤＮＡ、配列番号２に示されたアミノ酸配列または該アミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列のいずれかを含み、キチン分解酵素活性を有することを特徴とするタンパク質および、該タンパク質を用いるキチンの分解方法およびＮ−アセチルグルコサミンの製造方法に関する。
2012111810.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示された塩基配列において、塩基番号１〜１４６４に示される塩基配列またはその配列の１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列で示されるＤＮＡ配列を含む、キチン分解酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号３に示された塩基配列において、塩基番号１〜１５２７に示される塩基配列またはその配列の１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列で示されるＤＮＡ配列を含む、キチン分解酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株由来のＤＮＡであることを特徴とする、請求項１または２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号２または４に示されたアミノ酸配列または該アミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列のいずれかを含むことを特徴とする、キチン分解酵素。
【請求項５】
請求項１または２に記載の ＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列または該アミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列のいずれかを含むことを特徴とする、請求項４に記載のキチン分解酵素。
【請求項６】
請求項１または２に記載のＤＮＡを導入した形質転換微生物またはキチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株から産生されるものであることを特徴とする、請求項５に記載のキチン分解酵素。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか一項に記載のキチン分解酵素を活性成分として含有することを特徴とする、キチン分解剤。
【請求項８】
請求６に記載のキチン分解酵素を産生する微生物またはその培養液を含むものであることを特徴とする、請求項７に記載のキチンの分解剤。
【請求項９】
キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株または、請求項１に記載のＤＮＡを導入した形質転換微生物またはその培養液を含むものであることを特徴とする、請求項８に記載のキチンの分解剤。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか一項に記載のキチン分解剤を用いることを特徴とするキチンの分解方法。
【請求項１１】
請求項７〜９のいずれか一項に記載のキチン分解剤を用いることを特徴とする、Ｎ−アセチルグルコサミンの製造方法。
【請求項１２】
請求項１に記載のＤＮＡを含む形質転換用プラスミド。
【請求項１３】
プラスミドpCold I-cshchiGであることを特徴とする、請求項１２記載のプラスミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なキチン分解酵素遺伝子およびその遺伝子によりコードされるキチン分解酵素に関するものである。より詳細には、エンド型キチナーゼのようにキチンをランダムに加水分解する活性を有し、しかも、これまで知られているエンド型キチナーゼでは２量体のジアセチル−Ｎ−キトビオースで停止していた分解反応を、単量体のＮ−アセチルグルコサミンまで分解することができる活性を有するキチン分解酵素遺伝子およびその遺伝子によりコードされるキチン分解酵素に関するものである。【０００２】
また本発明は、該キチン分解酵素を用いるキチンの分解方法およびＮ−アセチルグルコサミンの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
キチンはカニ、エビなどの甲殻類の殻などに含まれる多糖であり、自然界においてセルロースに次ぐ豊富なバイオマスである。
このキチンは多糖の状態で、医薬品、農薬、食品、化粧品などの素材として、様々な産業で利用されている。さらに、キチンを加水分解して得られるＮ−アセチルグルコサミンおよびそのオリゴ糖も、免疫賦活作用、エリシター作用など種々の生理活性を示し、同様に、医薬品、食品、化粧品などの有効成分として利用されている。【０００４】
キチンの加水分解は、一般的に、強酸を用いた化学分解法が用いられているが、この方法は、多量の廃液を生じ環境に対する負荷が大きいことから、この問題を解決する方法として、キチン分解酵素を用いる方法が検討されている。
これまでにも、種々のキチン分解酵素産生微生物が見出されており、それらの微生物あるいはその培養液や単離された酵素などを用いたキチン分解方法が提案されている。（特許文献１〜５）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−３５７６２０号公報
【特許文献２】特許第３０２６３１２号公報
【特許文献３】特許第２３１１８５７３号公報
【特許文献４】特許第４１１０２４３号公報
【特許文献５】特開２００８−２５３２５２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kazuaki Sato et al.; J. Gen. Appl. Microbiol., 55, 147~153 (2009)
【非特許文献２】Kazuaki Sato et al.; Biosci. Biotechnol. Biochem., 74(3), 90856-1~5 (2010)
【非特許文献３】International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,59,2129-2130 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、これまでに知られているキチン分解酵素は、概して反応性が低く、また、高分子のキチンを単糖のＮ−アセチルグルコサミンに分解するには、少なくとも２種類の酵素を用いて、２段階で分解する必要があった。
このため、分解能が強く、かつ、高分子のキチンから１段階でＮ−アセチルグルコサミンに分解できるような、分解特性に優れた酵素の開発が望まれていた。【０００８】
キチン分解酵素については、エンド型のキチナーゼとエキソ型のＮ-アセチルグルコサミニダーゼの２種類があることが知られている。前者はキチンをランダムに分解し、最終生産物はＮ−アセチルグルコサミンの２糖（ジアセチル−Ｎ−キトビオース）である。後者は、非還元末端より順次Ｎ−アセチルグルコサミンを切り出す反応を触媒するが、基質は低分子のオリゴ糖に限られ高分子キチンに対しては作用しない。
したがって、キチンからＮ−アセチルグルコサミンを製造するためには、少なくともこの２種類の酵素を用いる必要があり、しかも複雑な酵素反応系となるため反応の制御が難しいという問題点があった。【０００９】
本発明者らは、先に、長野県上田市の上田城の堀水より、強力なキチン分解能を有する新属新種のキチン分解細菌キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株（ＮＢＲＣ１０４９７０、ＮＣＩＭＢ１４５０９、ＤＳＭ２３２７７）を分離同定し、報告した。（非特許文献１〜３）【００１０】
本発明者らは、本菌株が有するキチン分解酵素遺伝子の解析を鋭意行った。その結果、これまでに報告されているキチン分解酵素遺伝子とは塩基配列の相同性が低い遺伝子を見出すことができた。
さらに、該遺伝子によりコードされるタンパク質は、従来報告されているキチン分解酵素と異なる特性を有する新規な酵素であることを確認した。
すなわち、本発明のキチン分解酵素は、従来のエンド型キチナーゼと同様に、高分子キチンに作用してランダムに分解する活性を示す一方、従来のエンド型キチナーゼでは分解できなかった、Ｎ−アセチルグルコサミンの２糖（ジアセチル−Ｎ−キトビオース）をも分解できるという優れた特性を有している。【００１１】
本発明の目的は、新規なキチン分解酵素をコードする遺伝子およびその遺伝子によりコードされるキチン分解酵素を提供することである。
より詳細には、従来のキチン分解酵素では分解できなかった、１段階で高分子のキチンから単糖体のＮ−アセチルグルコサミンまで分解することができる、優れた分解特性を有する、新規なキチン分解酵素をコードする遺伝子、その遺伝子によりコードされるキチン分解酵素、並びに、該キチン分解酵素を用いたキチン分解方法およびＮ−アセチルグルコサミンの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねる中、先に長野県上田市の上田城の堀水より分離同定した、新種のキチン分解細菌キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株の遺伝子解析を行い、新規なキチン分解酵素遺伝子を単離し、そのＤＮＡの塩基配列を同定することに成功した。さらに、該遺伝子により発現されるキチン分解酵素が、極めて優れたキチン分解能を示すことを確認し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。【００１３】
より詳細には、本発明は、
[１]  配列番号１に示された塩基配列において、塩基番号１〜１４６４に示される塩基配列またはその配列の１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列で示されるＤＮＡ配列を含む、キチン分解酵素をコードするＤＮＡ、および
[２]  配列番号３に示された塩基配列において、塩基番号１〜１５２７に示される塩基配列またはその配列の１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列で示されるＤＮＡ配列を含む、キチン分解酵素をコードするＤＮＡ、および
[３]   キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株由来のＤＮＡであることを特徴とする、[１]または[２]に記載のＤＮＡ、
に関する。【００１４】
また、本発明は、
[４]  配列番号２または４に示されたアミノ酸配列または該アミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列のいずれかを含むことを特徴とする、キチン分解酵素、
[５]  [１]または[２]に記載の ＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列または該アミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列のいずれかを含むことを特徴とする、[４]に記載のキチン分解酵素、および、
[６]   [１] または[２]に記載のＤＮＡを導入した形質転換微生物またはキチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株から産生されるものであることを特徴とする、[５]に記載のキチン分解酵素、
に関する。【００１５】
また、本発明は、
[７]  [４]〜[６]のいずれか一項に記載のキチン分解酵素を活性成分として含有することを特徴とする、キチン分解剤、
[８]   [６]に記載のキチン分解酵素を産生する微生物またはその培養液を含むものであることを特徴とする、[７]に記載のキチンの分解剤、および、
[９]  キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株または、[１]に記載のＤＮＡを導入した形質転換微生物またはその培養液を含むものであることを特徴とする、[８]に記載のキチンの分解剤、
に関する。【００１６】
また、本発明は、
[１０]  [７]〜[９]のいずれか一項に記載のキチン分解剤を用いることを特徴とする、キチンの分解方法、および、
[１１]  [７]〜[９]のいずれか一項に記載のキチン分解剤を用いることを特徴とする、Ｎ−アセチルグルコサミンの製造方法、
に関する。【００１７】
さらに、本発明は、
[１２]   [１]に記載のＤＮＡを含む形質転換用プラスミド、および、
[１３]   プラスミドpCold I-cshchiGであることを特徴とする、[１２]記載のプラスミド、
に関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の遺伝子によりコードされるタンパク質は、高分子キチンをエンド型に分解する作用を有しており、しかも、従来のエンド型キチナーゼでは分解できなかった２量体のジアセチル−Ｎ−キトビオースも分解し、最終産物としてＮ−アセチルグルコサミンを生じさせる。よって、本発明の遺伝子によりコードされるタンパク質は、高分子のキチンから、複雑な工程や操作を要する事なく、１段階で単糖体のＮ−アセチルグルコサミンまで分解することができ、効率的なＮ−アセチルグルコサミンの製造方法に極めて有用である。
また、Ｎ−アセチルグルコサミンは、加水分解することにより、容易にグルコサミンを製造することができることから、本発明のキチン分解酵素は、グルコサミンの効率的な製造方法としても極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ＣｓｈｃｈｉＧ発現用プラスミドpCold I-cshchiGの構造を示すマップ図である。
【図２】図２は、大腸菌で発現させた酵素ＣｓｈｃｈｉＧを精製後にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果である。図中、レーン１は分子量マーカー、レーン２は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株／pColdI-粗酵素抽出液、レーン３は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株／pColdI-cshchiG粗酵素抽出液、レーン４は精製後の組換えタンパク質ＣｓｈｃｈｉＧの結果をそれぞれ示す。
【図３】図３は、精製酵素ＣｓｈｃｈｉＧを用いて、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の２〜５量体および高分子キチンを長時間分解した結果生じた生成物を薄層クロマトグラフィーで分析した結果である。図中、Ｓは標準化合物、レーン１は（ＧｌｃＮＡｃ）２反応前、レーン２は（ＧｌｃＮＡｃ）２反応後、レーン３は（ＧｌｃＮＡｃ）３反応前、レーン４は（ＧｌｃＮＡｃ）３反応後、レーン５は（ＧｌｃＮＡｃ）４反応前、レーン６は（ＧｌｃＮＡｃ）４反応後、レーン７は（ＧｌｃＮＡｃ）５反応前、レーン８は（ＧｌｃＮＡｃ）５反応後、レーン９はコロイダルキチン反応前、レーン１０はコロイダルキチン反応後の結果をそれぞれ示す。
【図４】図４は、精製酵素ＣｓｈｃｈｉＧを用いて、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の５量体を分解した際に生じる生成物の時間経過を薄層クロマトグラフィーで分析した結果である。図中、Ｓは標準化合物、レーン１は反応１分後、レーン２は反応５分後、レーン３は反応１０分後、レーン４は反応１５分後、レーン５は反応３０分後、レーン６は反応６０分後、レーン７は反応２４時間後の結果をそれぞれ示す。
【図５】図５は、キチン分解細菌キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株（ＮＢＲＣ１０４９７０、ＮＣＩＭＢ１４５０９、ＤＳＭ２３２７７）のＮＢＲＣの生物遺伝資源受託証を示す。
【図６】図６は、キチン分解細菌キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株（ＮＢＲＣ１０４９７０、ＮＣＩＭＢ１４５０９、ＤＳＭ２３２７７）のＮＣＩＭＢにおける検索結果（http://www.ncimb.com/results.php?parent=culture）を示す。
【図７】図７は、キチン分解細菌キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株（ＮＢＲＣ１０４９７０、ＮＣＩＭＢ１４５０９、ＤＳＭ２３２７７）のＤＳＭＺにおける検索結果（http://old.dsmz.de/microorganisms/html/strains/strain.dsm023277.html）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、新規なキチン分解細菌由来の、新規なキチン分解酵素遺伝子およびその遺伝子によりコードされるキチン分解酵素に関する。
なお、本発明においては、該キチン分解酵素を単にキチナーゼと称することもある。
【００２１】
本発明者らは、先に、長野県上田市の上田城の堀水より分離同定した、新種のキチン分解細菌キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株が産生するキチン分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の解析に鋭意努力し、該キチン分解酵素遺伝子を単離し、そのＤＮＡの塩基配列を同定することができた。
【００２２】
すなわち、まず、フォスミドベクターpCC1FOSを用いて、該キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株の遺伝子ライブラリーを構築した。
次いで、キチナーゼに対する蛍光基質を添加した選択培地を用いて、ライブラリーの５，０００クローンの中から、１０クローンを選択した。
さらに、この選択クローンからフォスミドDNAを調製し、ゲノム・シーケンサーFLXシステム（Genome Sequnecer FLX system）を用いて核酸配列を解析した。
【００２３】
その解析において、既知のキチナーゼ酵素の遺伝子と相同性を示す１５種の遺伝子を見出した。そのうち、ファミリー１８のエンド型キチナーゼに相同性を示すものが１２種、ファミリー１９のエンド型キチナーゼが１種、ファミリー２０のエキソ型キチナーゼが１種、キチン結合ドメインを含むものの酵素活性ドメインが欠失したものが１種であることを確認した。
【００２４】
そして、１３種のエンド型キチナーゼの中で既知のキチナーゼ遺伝子との相同性が最も低いものが、配列番号1に示された塩基配列からなるＤＮＡであった。このＤＮＡを発現ベクターに挿入して大腸菌に形質転換し、この形質転換大腸菌が産生する組換えタンパク質を精製し、キチン分解活性を示すことを確認した。さらに、該キチン分解酵素活性タンパク質に必須なアミノ酸配列部分をコードする遺伝子が、配列番号１に示された塩基配列において、塩基番号１〜１４６４に示される塩基配列からなるＤＮＡであることを見出した。
【００２５】
本遺伝子は、これまでに報告されているエンド型キチナーゼ遺伝子と比較しても塩基配列の相同性が低く、その構造において新規なものである。
また、該遺伝子によりコードされるタンパク質は、高分子キチンをエンド型に分解する作用を有しており、しかも、従来のエンド型キチナーゼでは分解できなかった、２量体のジアセチル−Ｎ−キトビオースも分解し、最終産物としてＮ−アセチルグルコサミンを生じさせる、極めて優れた酵素活性を示す。
【００２６】
このような反応性を示す酵素はこれまで全く報告されておらず、本酵素を用いることにより、キチンから１段階でＮ−アセチルグルコサミンを製造することができることから、Ｎ−アセチルグルコサミンの製造において、極めて有用である。
【００２７】
本発明の酵素は、キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株の培養液から単離精製することもできるが、配列番号１に示された塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１に示された塩基配列において、塩基番号１〜１４６４に示される塩基配列を含むＤＮＡを、適当な微生物に導入した形質転換微生物（以下、本発明のキチン分解酵素産生微生物という）に産生させることにより、効率的に得ることができる。また、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号３に示される塩基配列を含むＤＮＡとすることができる。
【００２８】
本発明のキチン分解酵素遺伝子は、配列番号１または３に示される塩基配列を含む核酸（典型的にはＤＮＡ）、および該配列の１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列で示され、かつキチン分解酵素活性を有するタンパク質をコードする配列を含む核酸を包含する。かかる塩基配列は、例えば、配列番号１または３に示される塩基配列を、１〜３０個、１〜５０個、１〜１００個または１〜２００個の塩基で欠失、置換もしくは付加した塩基配列である。
また、配列番号１または３に示される塩基配列からなる核酸であってもよい。
【００２９】
また、本発明のキチン分解酵素遺伝子は、配列番号１または３で示される塩基配列と、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の相同性を有し、かつキチン分解酵素活性を有するタンパク質をコードする配列を含む核酸（典型的にはＤＮＡ）であってもよい。また、配列番号１または３で示される塩基配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子も含まれる。
【００３０】
本明細書で用いる「ストリンジェントな条件」という用語は、当該技術分野において周知のパラメータであり、本発明におけるストリンジェントな条件は、例えば、６５℃での、３．５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）、フィコール０．０２％、ポリビニルピロリドン０．０２％、ウシ血清アルブミン０．０２％、ＮａＨ２ＰＯ４２５ｍＭ（ｐＨ７）、ＳＤＳ０．０５％、ＥＤＴＡ２ｍＭからなるハイブリダイゼーションバッファーによるハイブリダイゼーションを指す。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが移された膜は、２×ＳＳＣにて室温において、次いで０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳにて６８℃までの温度において洗浄する。
あるいは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、市販のハイブリダイゼーションバッファーを用いて、製造者によって記載されたハイブリダイゼーションおよび洗浄条件で行ってもよい。
【００３１】
このような遺伝子転換微生物としては、遺伝子工学分野で用いられる微生物で、病原性のない微生物であればどのようなものでもよいが、遺伝子工学分野で汎用されている病原性のない大腸菌が好ましい。
【００３２】
また、形質転換に用いるＤＮＡとしては、上記、配列番号１に示された塩基配列において、塩基番号１〜１４６４に示される塩基配列からなるＤＮＡまたは、該ＤＮＡと９０％以上の塩基配列相同性を有する塩基配列からなり、キチン分解酵素活性を有するタンパク質をコードするものであることを特徴とするＤＮＡを用いることができる。
【００３３】
形質転換には、配列番号１に示される塩基配列を含む核酸（典型的にはＤＮＡ）を用いてもよく、好ましくは配列番号３に示される塩基配列を含む核酸である。また、配列番号１または３に示される塩基配列、または該配列の１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列で示される塩基配列を含む核酸を用いてもよい。
【００３４】
また、配列番号１または３で示される塩基配列と、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の相同性を有し、かつキチン分解酵素活性を有するタンパク質をコードする配列を含む核酸（典型的にはＤＮＡ）を用いてもよい。また、配列番号１または３で示される塩基配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子を用いてもよい。
【００３５】
本発明のキチン分解酵素は、エンド型キチナーゼ活性を有しており、高分子キチンをエンド型に分解する作用を示し、しかも、従来のエンド型キチナーゼでは分解できなかった、２量体のジアセチル−Ｎ−キトビオースも分解できる酵素活性を示し、最終産物としてＮ−アセチルグルコサミンを生じさせる、極めて優れた活性特性を示すものである。
【００３６】
また、本発明のキチン分解酵素活性タンパク質は、配列番号２または４に示されたアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列のいずれかを含むことを特徴とするタンパク質である。かかるアミノ酸配列は、例えば、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列を、１〜３個、１〜５個、１〜１０個または１〜２０個のアミノ酸で置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列である。
本発明のキチン分解酵素活性タンパク質は、本発明のキチン分解酵素産生微生物を、適当な培養液中で培養し、その培養液等から通常の方法により分離、精製することにより得ることができる。
【００３７】
本発明のキチン分解酵素は、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、および該アミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を有し、かつキチン分解酵素活性を有するタンパク質を包含する。また、本発明のキチン分解酵素は、配列番号２または４で示されるアミノ配列と、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の相同性を有し、かつキチン分解酵素活性を有するタンパク質を包含する。
また、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
【００３８】
本発明のキチン分解酵素は、高分子キチンをエンド型に分解する作用を有しており、本酵素を用いることにより、キチンから１段階でＮ−アセチルグルコサミンを製造することができることから、Ｎ−アセチルグルコサミンの製造において、極めて有用なものである。
【００３９】
本発明のキチン分解酵素を用いて、キチンを適当な大きさのオリゴ糖に分解する場合、あるいは、Ｎ−アセチルグルコサミンを製造する場合、精製した酵素を用いてもよいが、酵素を含有する組成物として用いることもできる。
そのような組成物としては、例えば、上記本発明のキチン分解酵素産生微生物もしくはその培養液を含む組成物、または、上記本発明のキチン分解酵素産生微生物の培養液もしくはその粗精製液などを挙げることができる。
【００４０】
Ｎ−アセチルグルコサミンは、甘味料としても利用可能であり、また、軟骨補充効果を示すことも知られており、老齢者の関節の健康を目的としたサプリメントなどに使用されている。さらに、体内でヒアルロン酸に変換されることから、肌のうるおいを保つ成分としての効果にも注目されている。
本発明のキチン分解酵素活性タンパク質は、このように機能性健康食品あるいは医薬品組成物の有効成分として有用なＮ−アセチルグルコサミンを、これまでのように、複数の酵素を組み合わせることなく、一段階で、極めて簡便に、製造することができる。
【実施例】
【００４１】
以下に、本発明の実施の態様について実施例および試験例を挙げて説明するが、本発明は以下の例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４２】
キチナーゼ遺伝子（ｃｓｈｃｈｉＧ）の単離
（１）キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株ゲノムライブラリーの構築
キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株菌体よりＤＮＡ分離キット（Nexttec（登録商標） Genomic DNA Isolation kit for Bacteria (Nexttec) ）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。
ゲノムDNA溶液に対して、超音波破砕機 (Sonics ＆ Materials社、Vibra cell（登録商標）) を用いてＤＮＡの平均サイズを４０ｋｂｐ程度まで断片化した。
この断片化したＤＮＡより、フォスミド（fosmid）ベクターpCC1FOS を用いてフォスミド・ライブラリー作成キット（CopyControl（登録商標）Fosmid Library Production Kit (EPICENTRE BIOTECHNOLOGY) ）を用いてゲノムライブラリーを作成した。【００４３】
（２）キチン分解酵素活性を示すクローンの選抜
SAY3株のゲノムライブラリーを構成する大腸菌ＥＰＩ３００株クローンをキチン分解酵素活性検出用合成基質４−メチルウンベリフェリル（4-metylumbelliferyl (4MU)）- GlcNAc (1 mM) または４ＭＵ−（ＧｌｃＮＡｃ）３（１ｍＭ）を含有したＭ９合成培地（３６μｇ／ｍｌクロラムフェニコール含有）に塗布し、摂氏３７度で一晩培養した。
キチン分解酵素活性を示すクローンは４ＭＵを遊離することからこれを指標として、ＵＶ照射下でコロニー周辺に青色の蛍光を発するキチン分解酵素活性を示すクローンを選抜した。【００４４】
（３）選抜クローンの塩基配列解読
シーケンス用テンプレートのフォスミドＤＮＡ（fosmid DNA）の調製は、キアゲン・ラージコンストラクトキット（QIAGEN Large-Construct Kit (QIAGEN) ）を用いて行った。
キチナーゼ活性を示した１０個のクローンから調製した組換えフォスミドＤＮＡ（fosmid DNA）をそれぞれ4 ×10−６ gずつ混合し、タカラバイオ株式会社による受託サービス(BAC / Fosmidなどの多クローン配列解析) に供した。
用いたシーケンサーは、ゲノム・シーケンス  ＦＬＸ（Genome Sequence FLX (ロシュダイアグノスティクス) ）である。【００４５】
（４）塩基配列の解析
ＤＮＡデータバンクオフジャパン（DNA Data Bank of Japan (DDBJ) ）のＢＬＡＳＴ (http：//www.ddbj.nig.ac.jp/sear ch/blast-j.html) 、ナショナルセンター  フォー  バイオテクノォジー  インフォメーション（National Center for Biotechnology Information (NCBI)のＯＲＦファインダー（ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)）、およびジェネティックス（GENETYX (株式会社ジェネティックス) ）を用いて、上記（３）で解読した塩基配列の中からキチン分解酵素関連遺伝子を探索した。
キチン分解酵素と考えられるＯＲＦに関しては、シグナル配列推定プログラムシグナルＰ（SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)）を用いて、シグナル配列の有無を判定した。また、ピーファム（pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/) ）およびケイジー（cazy (http://www.ca zy.org/)）を用いて、糖質加水分解酵素のファミリー（family）を推定した。
その結果、ファミリー１８のエンド型キチナーゼが１２種、ファミリー１９のエンド型キチナーゼが１種、ファミリー２０のエキソ型キチナーゼが１種と、キチン結合ドメインを含むものの酵素活性ドメインが欠失したポリペプチドが１種であると推定された。【００４６】
（５）キチナーゼ遺伝子（ｃｓｈｃｈｉＧ）の選定
１３種のエンド型キチナーゼ遺伝子について、既知のエンド型キチナーゼとの相同性を比較した結果、最も相同性の低い遺伝子をｃｓｈｃｈｉＧと名付けた。
【実施例２】
【００４７】
キチナーゼ（ｃｓｈｃｈｉＧ）遺伝子構造の解析
実施例１、（４）と同様にして、塩基配列を解析した結果、ｃｓｈｃｈｉＧ遺伝子のタンパク質コード領域は１，４６４塩基から構成され、４８７個のアミノ酸残基からなる分子量５１．４ｋＤａのポリペプチドをコードするものである事を確認した。
推定アミノ酸配列を解析したところ、Ｎ末端側からキチン結合ドメインが２回繰り返して出現し、さらにｆａｍｉｌｙ１８キチナーゼの活性ドメイン類似の配列が現れた。活性ドメインの配列類似性は、データベース上の最も類似性の高い、ストレプトミセス(Streptomyces sp.)のＡＣＴＥキチナーゼに対しても３８％と低いものであった。
【実施例３】
【００４８】
大腸菌を宿主としたｃｓｈｃｈｉＧ遺伝子の発現
常法に従い、キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株のゲノムＤＮＡを鋳型に用いて、タンパク質相当部分をコードする遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。
ＰＣＲプライマーに用いるために設計したオリゴヌクレオチド配列は以下の通りである。センスプライマー（配列番号５）には制限酵素Ｂａｍ  ＨＩの認識配列、アンチセンスプライマー(配列番号６）にはＨｉｎｄ  ＩＩＩ認識配列を５’末端側に付加した（下線部分）。
各プライマーの相同配列位置は、センスプライマーが配列番号１に示された塩基配列において塩基番号１〜１８に示される塩基配列であり、アンチセンスプライマーが塩基番号１４４７〜１４６４に示される塩基配列である。
センスプライマー          5’- GCGGATCCATGGCCGCGCATGCCGCG -3’
アンチセンスプライマー    5’- GCAAGCTTTCAGAACTCGCCGAAGAT -3’  
常法にしたがって、得られたPCR増幅ＤＮＡ断片をＢａｍ  ＨＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで二重消化し、同じ酵素で二重消化した大腸菌用発現ベクターpCold I（タカラバイオ）と連結して，発現用プラスミドpCold I-cshchiGを作成した（図１）。
ｃｓｈｃｈｉＧ遺伝子断片が、読み取り枠を合わせて正しく設計通りに発現ベクターに挿入されていることを塩基配列シークエンスにより確認した。
【実施例４】
【００４９】
組換えＣｓｈｃｈｉＧタンパク質の発現と精製
上記実施例３で構築した発現用プラスミドpCold I-cshchiGを保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を５ｍｌのＬＢ培地（５０×１０−６ｇ／ｍｌ  ampicillin含有）を用いて、一晩摂氏３７度で前培養した。
その前培養液１ｍｌを５０ｍｌのＬＢ培地（５０×１０−６ｇ／ｍｌ  ampicillin含有）に移植して摂氏３７度、２００ｒｐｍで振とう培養を行った。
濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が０．４〜０．５に達した時点でその培養液を摂氏１５度、３０分間静置した。
その後、終濃度０．５ｍＭとなるようにイソプロピル−１−チオ−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（isopropyl-1-thio-beta-D-galactopyranoside(IPTG))を添加し、摂氏１５度、２００ｒｐｍで２４時間、コールドショック発現を行った。
遠心（８０００ｒｐｍ、１５分間、摂氏４度）により、回収した菌体を１ｍｌの２０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（Tris-HCl buffer）（ｐＨ８．０）に懸濁し、氷上で超音波破砕を計４分間（３０秒間破砕、３０秒間冷却を８サイクル）行った（Astrason Model 2020、 MISONIX）。
破砕液を遠心（８０００ｒｐｍ、３０分間、摂氏４度）した後、上清を可溶性タンパク質画分として得た。
可溶性画分に含まれる組換えタンパク質をN末端側に融合された６ｘＨｉｓタグを利用して、アフィニティーカラム（His GlaviTrap（登録商標）affinity columns (GE Healthcare )） により精製した。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のゲルをクーマシー・ブリリアント・ブルー（Coomassie Brilliant Blue (CBB)）により染色し、組換えタンパク質が精製されていることを確認した（図２）。
ゲル中のバンドの泳動距離から推定した分子量は約５４ｋＤａであり、予想された組換えタンパク質の分子量５４．３ｋＤａによく一致した。このタンパク質をＣｓｈｃｈｉＧと名付けた。
【実施例５】
【００５０】
組換え酵素ＣｓｈｃｈｉＧのキチン分解酵素活性
精製した組換えＣｓｈｃｈｉＧ酵素のキチン分解酵素活性を、反応中に高分子基質キチンの分解により新たに生成した還元糖量をシェールズ（Schales）法により定量することにより評価した。
反応液（２ｍｌ）は、０．２５％コロイダルキチン、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）、適当量の酵素からなり、摂氏３７度で３０分間インキュベートして反応を進行させ、摂氏１００度、３分間の熱処理により酵素反応を停止させた。
そこにシェールズ（Schales）試薬（フェリシアン化カリウム０．５ｇを０．５Ｍ炭酸ナトリウム溶液１リットルに溶解させたもの）を２．７ｍｌ加え、摂氏１００度、１５分間処理してＦｅ３＋の還元反応を終了させた。
遠心（４，０００ｒｐｍ、２０分間）により基質沈殿を除去した上清部の吸光度（Ｏ．Ｄ．４２０）を測定し、還元糖量を測定した。
コントロールには、上記反応液から酵素を除去したものを用いた。活性（１Ｕ）は、１分間に１×１０−６ｍｏｌの  Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に相当する還元糖量を生成する酵素量と定義した。
組換え酵素ＣｓｈｃｈｉＧは明らかにコロイダルキチン分解活性を示し、タンパク質量当たりの活性は０．２１Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎであった。
【実施例６】
【００５１】
反応生成物の分析
基質には、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の２〜５量体またはコロイダルキチンを用いた。反応液  （５０×１０−６ｌ）  は２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）、１０ｍＭ  ＧｌｃＮＡｃオリゴ糖（または０．０２５％コロイダルキチン）、適当量の酵素から成り、摂氏３７度で一晩反応させた後、摂氏１００度、５分間の熱処理で反応を停止させた。
その後、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心で回収した上清１０×１０−６ｌをシリカゲル薄層プレート  (TLC plastic sheets 20 x 20 cm silica gel 60 F254: MERCK) にスポットした。
展開溶媒にはＮ−プロパノール：滅菌水：酢酸エチル：３０％アンモニア水＝６０：２８：３０：１２（ｖ／ｖ）を用いた。
ＧｌｃＮＡｃオリゴ糖の展開スポット検出には、アニリン−ジフェニルアミンアセトン溶液（１０ｇ／ｌアニリン：１０ｇ／ｌジフェニルアミン−アセトン溶液：８５％リン酸＝５：５：１（ｖ／ｖ））を用いた。
長時間反応の結果、ＧｌｃＮＡｃ２〜５量体からはＧｌｃＮＡｃのみのスポットが検出され、酵素ＣｓｈｃｈｉＧは最終生成物としてＧｌｃＮＡｃ単量体を与えることがわかった。
また、高分子のコロイダルキチンを基質とした場合にもＧｌｃＮＡｃを生じることがわかった（図３）。
続いて、ＧｌｃＮＡｃ５量体を基質に用いた上記反応液を作成し、経時的に反応を停止しＴＬＣで生成物を分析した（図４）。
その結果、反応初期には５量体が、先ず２量体と３量体に分解され、その後３量体は２量体と単量体に、生じた２量体はさらに単量体に分解され、最終的に全て単量体にまで分解された。
反応初期にＧｌｃＮＡｃ単量体が生じることなく、２量体と３量体を生じたことから、酵素ＣｓｈｃｈｉＧは明らかにエンド型の分解活性を示すことが確認された。
【実施例７】
【００５２】
酵素ＣｓｈｃｈｉＧの活性中心アミノ酸残基の決定
酵素ＣｓｈｃｈｉＧの活性中心アミノ酸残基を探索するため、点突然変異を導入した変異型組換え酵素を作成し、キチン分解活性を測定した。
ファミリー１８キチナーゼにおいて、活性中心を構成するＡｓｐ  Ｘ  Ａｓｐ  Ｘ  Ｇｌｕの配列が保存されていること、および、左端のＡｓｐと右端のＧｌｕが活性発現に必須なアミノ酸残基であることが報告されている。ＣｓｈｃｈｉＧタンパク質のアミノ酸配列を調べたところ、Ｎ末端から配列番号４の３１３番目よりＡｓｐ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕという類似のアミノ酸配列が保存されていた。そこで、点突然変異導入の手法により、Ａｓｐ３１３とＡｓｐ３１５をそれぞれＡｓｎに、Ｇｌｕ３１７をＧｌｎに置換した３種類の変異型酵素を作成した。既報によれば、キチナーゼ活性の発現には、ＡｓｐとＧｌｕが有する側鎖のカルボキシル基が重要な役割を果たしている。活性中心であるＡｓｐ、Ｇｌｕが、カルボキシル基にアミノ基が結合したＡｓｎ、Ｇｌｎに置換された場合、活性は消失するはずである。なお、配列番号４の３１３番目、３１５番目および３１７番目のアミノ酸は、それぞれ配列番号２の２９２番目、２９４番目および２９６番目のアミノ酸に対応する。【００５３】
点突然変異の導入は、ＣｓｈｃｈｉＧ発現プラスミドpCold I-cshchiG ＤＮＡをテンプレートに用い、QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Tachnologies社)を用いて行った。作製後、ｃｓｈｃｈｉＧ遺伝子領域の塩基配列を解読し、設計した変異が正しく導入されていることを確認した。変異型ｃｓｈｃｈｉＧ酵素の発現と精製は、野生型ｃｓｈｃｈｉＧと同様に行った。
精製した野生型ｃｓｈｃｈｉＧと３種の変異型酵素Ｄ３１３Ｎ（Ａｓｐ３１３をＡｓｎに置換）、Ｄ３１５Ｎ（Ａｓｐ３１５をＡｓｎに置換）、Ｅ３１７Ｑ（Ｇｌｕ３１７をＧｌｎに置換）を用いて、各種キチン関連基質の分解活性を調査した。その結果、変異型酵素Ｅ３１７Ｑにおいてのみ、いずれの基質に対してもほとんど活性が消失した（表１）。【００５４】
【表１】
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可溶性キトサンに対する分解活性は、反応によって新たに生じた還元糖量を定量し、Ｎ−アセチルグルコサミンの還元糖相当量で示した。
合成基質ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰ）−ＧｌｃＮＡｃ２量体および３量体に対する分解活性は、ｐ−ニトロフェノール遊離量で示した。
各基質に対する野生型酵素の活性を１００％とした場合の相対活性を括弧内に示した。【００５５】
この結果は、酵素ｃｓｈｃｈｉＧ中のＧｌｕ３１７（３１７番目のグルタミン酸）残基が、キチナーゼ活性発現に必須な活性中心であることを証明するものである。【００５６】
なお、本実施例において使用したキチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株は、
ＮＢＲＣ１０４９７０として、NITE Biological Resource Center (NBRC)、〒292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8に、平成20年8月15日付で（図５）、
ＮＣＩＭＢ１４５０９として、National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria、Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, United Kingdomに、2008年8月11日付で（図６、http://www.ncimb.com/results.php?parent=culture）、および
ＤＳＭ２３２７７として、DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH、Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに、2010年3月8日付で(図７、http://old.dsmz.de/microorganisms/html/strains/strain.dsm023277.html）、それぞれ寄託されている。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明のキチン分解酵素活性タンパク質は、高分子キチンをエンド型に分解する、エンド型キチナーゼ活性を示し、しかも、従来のエンド型キチナーゼでは分解できなかった、２量体のジアセチル−Ｎ−キトビオースも分解できる酵素活性を有し、最終産物としてＮ−アセチルグルコサミンを生じさせる、極めて優れた活性特性を示すものであり、キチンの分解方法またはＮ−アセチルグルコサミンの製造方法において極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年11月14日(2012.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示される塩基配列または該塩基配列の１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含む、キチン分解酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号３に示される塩基配列または該塩基配列の１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含む、キチン分解酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
キチン分解酵素が、ジアセチル−Ｎ−キトビオースを分解可能である、請求項１または２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
キチニフィラス・シナノネンシス（Ｃｈｉｔｉｎｉｐｈｉｌｕｓ  ｓｈｉｎａｎｏｎｅｎｓｉｓ）ＳＡＹ３株由来のＤＮＡであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号２または４に示されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列のいずれかを含むことを特徴とする、キチン分解酵素。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列または該アミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列のいずれかを含むことを特徴とする、請求項５に記載のキチン分解酵素。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡを導入した形質転換微生物またはキチニフィラス・シナノネンシス（Ｃｈｉｔｉｎｉｐｈｉｌｕｓ  ｓｈｉｎａｎｏｎｅｎｓｉｓ）ＳＡＹ３株から産生されるものであることを特徴とする、請求項６に記載のキチン分解酵素。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか一項に記載のキチン分解酵素を活性成分として含有することを特徴とする、キチン分解剤。
【請求項９】
請求項７に記載のキチン分解酵素を産生する微生物または該微生物の培養液を含むものであることを特徴とする、請求項８に記載のキチンの分解剤。
【請求項１０】
キチン分解酵素を産生する微生物が、キチニフィラス・シナノネンシス（Ｃｈｉｔｉｎｉｐｈｉｌｕｓ  ｓｈｉｎａｎｏｎｅｎｓｉｓ）ＳＡＹ３株または請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡを導入した形質転換微生物であることを特徴とする、請求項９に記載のキチンの分解剤。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載のキチン分解剤を用いることを特徴とするキチンの分解方法。
【請求項１２】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載のキチン分解剤を用いることを特徴とする、Ｎ−アセチルグルコサミンの製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡを含む形質転換用プラスミド。
【請求項１４】
プラスミドｐＣｏｌｄ  Ｉ−ｃｓｈｃｈｉＧであることを特徴とする、請求項１３記載のプラスミド。
【国際調査報告】
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