(57)【要約】  微生物に過酸化水素耐性を付与するために有用な遺伝子及びその利用法の提供。  以下の（ａ）〜（ｃ）から選ばれるタンパク質をコードする過酸化水素耐性付与遺伝子。  （ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質  （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質  （ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）から選ばれるタンパク質をコードする過酸化水素耐性付与遺伝子。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質
【請求項２】
以下の（ｄ）〜（ｆ）から選ばれるポリヌクレオチドからなる過酸化水素耐性付与遺伝子。
（ｄ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）（ｄ）の塩基配列と85％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項３】
請求項１又は２記載の遺伝子を微生物に導入するか又は微生物が有する当該遺伝子を改変することを特徴とする当該微生物に対する過酸化水素耐性の付与又は強化方法。
【請求項４】
遺伝子の改変が、請求項１又は２記載の遺伝子の発現増強である請求項３記載の方法。
【請求項５】
請求項１又は２記載の遺伝子が導入又は改変されてなる微生物。
【請求項６】
微生物がグラム陽性細菌である請求項５記載の微生物。
【請求項７】
グラム陽性細菌がラクトバチルス属細菌である請求項６記載の微生物。
【請求項８】
ラクトバチルス属細菌がラクトバチルス・カゼイである請求項７記載の微生物。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項記載の微生物を含有する飲食品。
【請求項１０】
請求項５〜８のいずれか１項記載の微生物を含有する医薬品。
【請求項１１】
請求項１又は２記載の遺伝子の有無及び／又はその発現量を測定することを特徴とする過酸化水素耐性微生物のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項２記載のポリヌクレオチド又はその一部を含む組換えベクター。
【請求項１３】
請求項１２記載の組換えベクターを含む宿主微生物。
【請求項１４】
請求項２記載のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする核酸断片。
【請求項１５】
請求項２記載のポリヌクレオチド又はその一部を含むDNAアレイ又はDNAチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物に過酸化水素耐性を付与する遺伝子及びその利用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの好気性微生物は酸素代謝を司る呼吸鎖を有し、酸素存在下でエネルギーを獲得し、良好な生育が可能である。また、酸素の一部はその代謝の過程で、スーパーオキシドアニオンや過酸化水素を発生するが、それらを消去するスーパーオキシドジスムターゼや、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ等によって、それらを無毒化しその毒性を回避する機構を有している。【０００３】
嫌気性微生物の中でも有用菌として知られている乳酸菌は通性嫌気性菌に属し、呼吸鎖やカタラーゼを持たないとされているが、多くの乳酸菌は酸素存在下でも生育が可能で、酸素耐性を有している。以前より、乳酸菌の酸素耐性機構についていくつかの研究がなされており、その中で、酸素を代謝する酵素として、NADHオキシダーゼやピルビン酸オキシダーゼ等が知られている。NADHオキシダーゼは、水生成型と過酸化水素生成型の２つの型が報告されており、水生成型は酸素を4電子還元し水へと無毒化する。一方、過酸化水素生成型は2電子還元で過酸化水素を発生するが、ストレプトコッカス・ミュータンス等の乳酸菌ではこの過酸化水素をAlkylhydroperoxide reductaseによって水へと変換し、2成分性のペルオキシダーゼとして機能していることが報告されている。
また、酸素から発生するスーパーオキシドアニオンや過酸化水素を消去する、スーパーオキシドジスムターゼや、カタラーゼ、NADHペルオキシダーゼ等を持つものも報告されている。【０００４】
乳酸菌ラクトバチルス・プランタルムWCFS1においては、チオレドキシンレダクターゼ遺伝子の発現を強めることによって、過酸化水素等の酸化ストレスに対してより抵抗になることから、チオレドキシンレダクターゼが酸化ストレス抵抗性に重要な働きをすることが提案されている（非特許文献１）。
また、嫌気性グラム陰性細菌バクテロイデス・フラジリスにおいては、チオレドキシン−チオレドキシンレダクターゼ系がチオール／ダイサルファイドの酸化還元反応を司る唯一のシステムであると考えられており、チオレドキシンレダクターゼの欠損により、菌は嫌気的環境下にあってもシステインやジチオスレイトールなどの還元剤の添加なくしては生育できないことが報告されている（非特許文献２）。
また、大腸菌においては、細胞内を還元状態へ保つために必須なグルタチオン−グルタチオンレダクターゼ系や、チオレドキシン−チオレドキシンレダクターゼ系が存在しており、それらに関わる遺伝子破壊株は過酸化水素等の酸化ストレスに感受性になることが報告されている。【０００５】
一方、乳酸菌ラクトコッカス・ラクチスにおいてはチオレドキシンレダクターゼを破壊することで、好気条件下では生育が阻害されることが報告されているが（非特許文献３）、好気条件下での生育阻害は、ジチオスレイトールの添加で回復すること、また24時間培養すると野生株と同程度の菌体量になることから、酸素耐性との関係は不明である。【０００６】
また、ストレプトコッカス・ミュータンスではNADHオキシダーゼ、Alkylhydroperoxidereductase(ahpC)をダブルノックアウトした変異株が酸素耐性を有することから、さらに別の鉄結合性を有するタンパク質である遺伝子が酸素耐性に関わる遺伝子であると報告されている（特許文献１）。しかし、これらの遺伝子はすべての微生物が有する遺伝子ではなく、未だ酸素耐性機構は不明な点が多い。またここに挙げた様に、酸素耐性に関わる遺伝子は複数あり、１つの遺伝子のみで酸素耐性能を発揮するものではないことから、簡便に実用に供することは困難であった。【０００７】
また、本発明者らは、ラクトバチルス・カゼイ及びラクトバチルス・ラムノーサスに存在するfnr遺伝子が、好気条件下での菌の生育に特に必要な遺伝子であり、酸素耐性付与遺伝子であることを報告している（特許文献２）。
しかしながら、酸化ストレスにおいて、代謝の過程で発生する過酸化水素に対する耐性も重要であり、ラクトバチルス属の微生物において、NADHペルオキシダーゼやカタラーゼなど過酸化水素消去に関わる遺伝子は報告があるが、過酸化水素に対して直接抵抗性を示すような遺伝子はこれまでに見出されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−３２７２９２号公報
【特許文献２】国際公開第２００９／１５０８５６号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】L. Mariela Serrano et al. Microbial Cell Factories 6:29(2007)
【非特許文献２】Edson R. Rocha et al. J. Bacteriol. 189: 8015-8023(2007)
【非特許文献３】Karin Vido et al. J. Bacteriol. 187: 601-610(2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、微生物に過酸化水素に対する耐性を付与する遺伝子及びその利用法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029（FERM BP-1366）のゲノム遺伝子について検討したところ、過酸化水素曝露下においてもヒドロキシルラジカルの生成を抑制する遺伝子があり、該遺伝子を利用することにより、微生物に過酸化水素に対する耐性を付与、又は微生物が本来有する過酸化水素に対する耐性を強化できることを見出した。【００１２】
すなわち、本発明は以下の発明に係るものである。
１）以下の（ａ）〜（ｃ）から選ばれるタンパク質をコードする過酸化水素耐性付与遺伝子。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質
２）以下の（ｄ）〜（ｆ）から選ばれるポリヌクレオチドからなる過酸化水素耐性付与遺伝子。
（ｄ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）（ｄ）の塩基配列と85％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
３）上記遺伝子を微生物に導入するか又は微生物が有する当該遺伝子を改変することを特徴とする当該微生物に対する過酸化水素耐性の付与又は強化方法。
４）上記遺伝子が導入又は改変されてなる微生物。
５）上記微生物を含有する飲食品。
６）上記微生物を含有する医薬品。
７）上記遺伝子の有無及び／又はその発現量を測定することを特徴とする過酸化水素耐性微生物のスクリーニング方法。
８）上記ポリヌクレオチド又はその一部を含む組換えベクター。
９）上記組換えベクターを含む宿主微生物。
１０）上記ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする核酸断片。
１１）上記ポリヌクレオチド又はその一部を含むDNAアレイ又はDNAチップ。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の遺伝子又はポリヌクレオチドを利用することにより、微生物に過酸化水素耐性を付与すること、微生物が有する過酸化水素耐性を強化すること、過酸化水素耐性の微生物をスクリーニングすることができる。当該過酸化水素耐性が付与又は強化された微生物は、過酸化水素曝露下においてもヒドロキシルラジカルの生成が制御され、核酸、タンパク質、脂質等の細胞構成成分の障害が抑制される。
また、本発明の遺伝子が導入又は改変された微生物を用いることにより、所望の酸化ストレスに対して抵抗性を有する飲食品、医薬品の製造が可能となる。また、酸素存在下で生菌数を高く維持することが可能になることから、製品製造時の嫌気装置、製品の嫌気保存容器が不要となり、コストを抑えた製造が可能となる。また、一般に生菌数が高くなるほど、微生物の生理効果は増大することから、微生物が有する生理効果を効果的に発揮させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】酸化ストレスによるCDS2657遺伝子の発現量の変化を示すグラフ。
【図２】CDS2657遺伝子破壊株の過酸化水素耐性（生存率）を示すグラフ。
【図３】CDS2657遺伝子破壊株の過酸化水素消去活性を示すグラフ
【図４】CDS2657タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターン。Ｍ：marker、ＣＬ：cell lysate、ＦＴ：Flow through、Ｗ：wash、Ｅ１＆Ｅ２：elution
【図５】CDS2657遺伝子高発現株の生育に対する過酸化水素の影響を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において、アミノ酸配列および塩基配列の同一性（相同性）は、遺伝情報処理ソフトウェアGENETYX（ゼネティックス社製）を用いたLipman-Person法(Lipman, D. J. and Pearson,W. R. 1985. Rapid and sensitive protein similarity searches. Science227:1435-1441)によるホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いることが出来る。具体的には、例えばラクトバチルス・カゼイ YIT 9029の遺伝子を既知の遺伝子と相同性比較して解析することにより算出したものであり、パラメーターとしては、Unit Size to compare=2, Pick up Location=5とし、結果を％表示させて行う。
【００１６】
また、遺伝子とは、2本鎖DNAのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖DNAを包含する趣旨であり、またその長さに何ら制限されるものではない。また、ポリヌクレオチドとしては、RNA、DNAを例示でき、DNAは、cDNA、ゲノムDNA、合成DNAを包含する。
【００１７】
本発明の過酸化水素耐性付与遺伝子は、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029から見出されたCDS2657遺伝子、並びに当該遺伝子から演繹される遺伝子であり、過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質をコードするものである。
当該CDS2657遺伝子は、それによりコードされるタンパク質の機能が解明されていない(hypothetical protein)、所謂機能未知の遺伝子である。
【００１８】
本発明の過酸化水素耐性付与遺伝子は、具体的には、以下の（ａ）〜（ｃ）から選ばれるタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質
【００１９】
ここで、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質はラクトバチルス・カゼイYIT 9029由来のタンパク質である。
配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列には、1若しくは数個、好ましくは1〜10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への1〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００２０】
アミノ酸の欠失、置換、付加は、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が1塩基置換等の天然に生じる変異や、部位特異的変異導入法や突然変異処理等によって遺伝子に人為的に導入される変異等により生じ得るものが包含される。斯かるアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このポリヌクレオチドを常法により発現させる手法が挙げられる。
また、アミノ酸の置換としては、例えば、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換を挙げることができる。
【００２１】
また、（ａ）のアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列としては、配列番号２に示すアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、当該アミノ酸配列と85％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を意味する。
【００２２】
本発明において、「過酸化水素耐性付与」とは、微生物の過酸化水素に対する感受性を低下させること、すなわち、過酸化水素存在下でも微生物を生育可能ならしめること、及び／又は生育した微生物を過酸化水素存在下においても死滅させないことを意味する。具体的には微生物が内的又は外的に過酸化水素に曝露された場合でも、ヒドロキシルラジカルの生成が制御され、当該ヒドロキシルラジカルによって引き起こされる、核酸、タンパク質、脂質等の細胞構成成分の障害が抑制されることを意味する。
【００２３】
本発明の過酸化水素耐性付与遺伝子は、好適には、以下の（ｄ）〜（ｆ）から選ばれるポリヌクレオチドからなる遺伝子が挙げられる。
（ｄ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）（ｄ）の塩基配列と85％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ過酸化水素耐性付与能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００２４】
ここで、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドはラクトバチルス・カゼイ YIT 9029由来のDNA（CDS2657遺伝子）であり、当該微生物に過酸化水素耐性を付与し、過酸化水素存在下での生育を可能とする。
【００２５】
本発明において、「ストリンジエントな条件下」とは、例えばMolecular cloning - a Laboratory manual 2nd edition(Sambrookら、1989)に記載の条件等が挙げられる。例えば、6XSSC（1XSSCの組成：0.15 M 塩化ナトリウム、0.015 M クエン酸ナトリウム、pH7.0）、0.5％ SDS、5Xデンハート及び100mg/mLニシン精子DNAを含む溶液に当該塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとともに65℃で8〜16時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００２６】
また、（ｄ）の塩基配列と85％以上の同一性を有する塩基配列としては、配列番号１に示す塩基配列において相当する配列を適切にアライメントした時、当該塩基配列と85％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上の同一性を有する塩基配列を意味する。
【００２７】
本発明の遺伝子は、配列番号１の塩基配列を参考にプライマーを作製し、ラクトバチルス・カゼイ YIT9029のDNAをテンプレートとする常法のPCR法で容易に得ることができる。
すなわち、例えば、いずれかの遺伝子のN末端開始コドンを含む配列からなるオリゴヌクレオチドA、及び該遺伝子の終始コドンを含む配列と相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドBを化学合成し、これらのオリゴヌクレオチドAとBを１セットにし、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029のDNAをテンプレートとしてPCR反応を行なうことにより得ることができる。また、こうして得られる遺伝子断片を効率よくプラスミドベクター等にクローニングを行なうために、オリゴヌクレオチドプライマーの5'末端側に制限酵素切断のための配列を付加して用いることもできる。ここで、プライマーとしては、本発明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたヌクレオチド等が一般的に使用できるが、既に取得された本発明遺伝子やその断片も良好に利用できる。当該ヌクレオチドとしては、配列番号１に対応する部分ヌクレオチド配列であって、10〜50個の連続した塩基、好ましくは15〜35個の連続した塩基等が挙げられる。
また、PCRの条件は、例えば2000塩基対の長さのDNA断片を得る場合には、94℃2分、（95℃10秒、52℃10秒、72℃2分）x30サイクル、72℃7分が挙げられる。
【００２８】
また、その当該塩基配列に従い、DNA合成機により人工的に合成して得ることもできる。
【００２９】
本発明の遺伝子は、過酸化水素耐性付与に関与する遺伝子であることから、これを微生物に導入する、或いは微生物が有する当該遺伝子を改変することにより、当該微生物の過酸化水素に対する耐性を付与、又は微生物が本来有する過酸化水素に対する耐性を強化することができる。
本発明の遺伝子の導入は、当該遺伝子を、元来有しない微生物に導入することにより行うことができる。遺伝子を導入する方法としてはDNAの取り込み能を利用したコンピテンス法、プロトプラストを利用したプロトプラストPEG法及び高電圧パルスを利用したエレクトロポレーション法等を利用すればよく、特にエレクトロポレーション法が好ましい。また、遺伝子を微生物染色体に組み込む場合には、相同組換えを利用した方法、部位特異的に組み込む方法を用いることができる。
【００３０】
本発明の遺伝子の改変には、発現増強が挙げられる。
遺伝子の発現を増強するには、本発明の遺伝子を運ぶ組換えプラスミドを対象とする微生物に導入すること、該遺伝子を染色体の別の場所に部位特異的組換えによって組み込むことによって微生物内での該遺伝子のコピー数を増加させること、該遺伝子の発現を制御する制御領域を改変したり、制御遺伝子を改変することによって発現を増加させる方法等によって行えばよいが、特に該遺伝子のコピー数を増加させる方法が好ましい。具体的には、１個の微生物細胞あたり複数個のコピー数を持つプラスミドに、対象とする遺伝子をその遺伝子の本来のプロモーター配列とリボソーム結合部位を含めてクローニングするか、別の遺伝子から分離した、あるいは化学合成によって作成したプロモーターとリボソーム結合部位の下流に該遺伝子のポリペプチドをコードする領域だけをつなげてクローニングした組換えプラスミドを作成し、微生物細胞内にエレクトロポレーション法などによって導入することによって、微生物細胞内での該遺伝子のコピー数を上げることができる。
【００３１】
また、当該遺伝子を元来有する微生物に対しては、当該遺伝子を発現阻害若しくは発現抑制することにより、当該微生物の過酸化水素耐性を低下させることも可能である。
遺伝子の発現を阻害するには、本発明の遺伝子を破壊、欠損すればよく、この方法としては、全く別のDNA断片を遺伝子の内部に挿入する挿入失活法や段階的な相同組換えによって標的遺伝子の一部又は全部を欠失する段階的二重交叉法を用いればよく、特に段階的二重交叉法が好ましい。
具体的には、標的遺伝子の一部又は全部を欠失する場合には、欠失領域をはさむ両側の領域を染色体DNAから分離するか、あるいはPCR法によって増幅して分離し、例えばpYSSE3のような大腸菌では増殖するが対象とする微生物中では複製が出来ないプラスミドベクターにそれら両DNA断片を本来の向きと同じ向きに並んだ状態でクローニングする。次に、得られる組換えプラスミドDNAを、欠失を起こさせようとする微生物にエレクトロポレーション法等を用いて導入し、生じる抗生物質耐性のクローンから、PCR法等によって目的の欠失領域の上流又は下流のクローニングした領域との相同領域で組換えを起こしてプラスミドが染色体上に挿入したクローンを選択する。こうして得たクローンを、抗生物質を含まない培地で継代培養を繰り返すことによって、プラスミドが再び近接して存在する相同領域間の組換えによって染色体から離脱し、菌の増殖に伴って消失することによって、抗生物質耐性をなくしたクローンを選択する。こうして得たクローンからPCR法等によって標的遺伝子領域を欠失したクローンを分離することができる。
【００３２】
遺伝子の発現を抑制するには、本発明の遺伝子のmRNAの5'末端領域と相補的な短いRNAを合成することによる、いわゆるRNA干渉による方法や、該遺伝子の発現を制御する領域又は制御遺伝子を破壊若しくは欠損等して改変する方法を用いることができ、特に該遺伝子の発現を制御する領域の改変が好ましい。具体的には、遺伝子の転写を制御するプロモーターの配列を改変することによって、該遺伝子のmRNAへの転写量を多くしたり、少なくしたりすることができる。
【００３３】
ここで、遺伝子導入又は改変の対象となる微生物は、特に限定されるものではなく、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、酵母等を用いることができるが、グラム陽性細菌を好適に利用することができ、特に生体への安全性が確認されているラクトバチルス属細菌、ビフィドバクテリウム属細菌等の利用が好ましい。ラクトバチルス属細菌の中でも、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ゼアエ、ラクトバチルス・ラムノーサス等のラクトバチルス・カゼイグループに属する細菌の利用が好ましく、特にラクトバチルス・カゼイを好適に利用することができる。
【００３４】
ビフィドバクテリウム属細菌は偏性嫌気性菌であり、酸素や低ｐＨ、高酸度に弱く、製造時の増殖や保存時の生残性等、取扱いに困難な点が多い。ビフィドバクテリウム属細菌はヒトにとって有用な生理効果を示すことから、育種改良により過酸化水素に対して耐性を有する変異株を取得したり、酸素不透過性容器を使用する等の工夫をして、飲食品や医薬品への応用が進んでいるが、培養が困難であったり、保存中に生菌数が低下するといった様々な問題がある。ビフィドバクテリウム属細菌は、本願発明の過酸化水素耐性付与遺伝子を有さないことが明らかになっているので、本願発明の遺伝子導入又は改変の対象となる微生物として好適に利用することができる。
【００３５】
斯くして得られる遺伝子導入又は改変された微生物は、過酸化水素耐性が付与又は増強されているため、当該微生物が元来有する種々の生理効果を効果的に発揮する飲食品や医薬品として利用することができる。
【００３６】
遺伝子導入又は改変された本発明の微生物を飲食品や医薬品とする場合、菌体は、生菌又は加熱菌体（死菌体）のいずれでもよく、又凍結乾燥したものであってもよく、あるいはこれら微生物を含む培養物、菌体処理物として利用することもできるが、生菌の状態で利用することが好ましい。
【００３７】
医薬品として使用する場合は、本発明の微生物を固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散在、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００３８】
また、遺伝子導入又は改変された本発明の微生物は、上記のような製剤とするだけでなく、飲食品に配合して使用することもできる。飲食品に配合する場合は、そのまま、または種々の栄養成分と共に含有せしめればよい。この飲食品は、過酸化水素耐性が付与又は増強された微生物を含むため、当該微生物が元来有する種々の生理作用を効果的に発揮する保健用食品又は食品素材として利用できる。具体的に本発明の方法により得られた微生物を飲食品に配合する場合は、飲食品として使用可能な添加剤を適宜使用し、慣用の手段を用いて食用に適した形態、すなわち、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工食品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工食品、パン、菓子、バター、粉乳に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、清涼飲料、茶飲料等の飲料に添加して使用してもよい。なお、飲食品には、動物の飼料も含まれる。
【００３９】
さらに飲食品としては、本発明の微生物を利用した発酵乳、乳酸菌飲料、発酵豆乳、発酵果汁、発酵植物液等の発酵飲食品の例が挙げられる。これら発酵飲食品の製造は常法に従えばよい。例えば発酵乳を製造する場合は、まず、殺菌した乳培地に本発明の微生物を単独又は他の微生物と同時に接種培養し、これを均質化処理して発酵乳ベースを得る。次いで、別途調製したシロップ溶液を添加混合し、ホモゲナイザー等で均質化し、更にフレーバーを添加して最終製品に仕上げればよい。このようにして得られる発酵乳は、シロップ（甘味料）を含有しないプレーンタイプ、ソフトタイプ、フルーツフレーバータイプ、固形状、液状等のいずれの形態の製品とすることもできる。
【００４０】
本発明の方法により得られた微生物は、高い過酸化水素耐性を有することから、飲食品中での菌の生残性が高いため、保存中の生菌数の低下や死滅速度の増加が抑制され、製品規格の維持が容易となり、ラクトバチルス属細菌等の微生物が有する整腸作用等の一般的な生理効果を効果的に発揮させることができる。また、抗がん作用、ヘリコバクター・ピロリの除菌作用等の特異的な生理効果を元来有するラクトバチルス属細菌やビフィドバクテリウム属細菌に対して、本発明の方法により過酸化水素耐性を付与又は増強することで、該菌株を様々な飲食品に利用することが可能になると共に、該菌株の生残性が改善することで該菌株が有する生理効果を増強させることが可能となる。
【００４１】
また、ビフィドバクテリウム属細菌を利用した飲食品において、保存時の生残性を高める目的で、ガラスやアルミコーティング紙等の酸素不透過性の包剤で構成された容器が主に用いられてきたが、本発明の方法により得られた過酸化水素耐性が付与又は強化されたビフィドバクテリウム属細菌は、高い生残性を有し、厳密な嫌気状態を必要としないため、酸素透過性の高い樹脂（ポリスチレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート等）も容器素材として使用できる。これらの樹脂を用いた容器は、酸素不透過性の包剤で構成された容器と比較して、コストが低く、成型の自由度が高いというメリットを有する。
【００４２】
本発明の遺伝子は、過酸化水素耐性微生物のスクリーニングのために使用することもできる。
すなわち、本発明の遺伝子の有無及び／又はその発現量を測定することにより、過酸化水素耐性の微生物をスクリーニングすることができる。
ここで、遺伝子の有無及び／又はその発現量の測定は、本発明の遺伝子や遺伝子由来のmRNAを検出し得るプローブやプライマーを用いて、微生物における標的とする遺伝子の有無、コピー数や発現量をサザーンハイブリダイゼーション法やDNAマイクロアレイやRT-PCR法により行うことができる。そして、標的遺伝子やその発現の有無により、目的の微生物を選択すればよい。
【００４３】
（ｄ）〜（ｆ）で示されるポリヌクレオチド又はその一部（断片）を含む本発明の組換えベクターは、大腸菌及び対象とする微生物において該ベクターの導入を選択できるような遺伝子マーカーを有している任意のベクター（例えば、pHY400、pSA1、pYSSE3等）を用いてインビトロライゲーション法等の公知の方法により得ることができる。
【００４４】
また、上記の組換えベクターを含む宿主微生物は、公知の方法、すなわち、当該組換えベクターを宿主微生物に導入する場合はエレクトロポレーション法等の方法により、微生物染色体に組み込む場合は該微生物と相同なDNA領域を持つ組換えベクターをエレクトロポレーション法等により導入した後に相同組換えにより染色体に組み込まれたものをＰＣＲ法等によって確認する等の方法を用いることにより得ることができる。
【００４５】
また、（ｄ）〜（ｆ）で示されるポリヌクレオチド又はその一部（断片）を含む本発明のDNAアレイ又はDNAチップは、フォトリソグラフィー法等の公知の方法により作製することができる。このDNAアレイ又はDNAチップを用いることにより、本発明の遺伝子を発現する微生物をスクリーニングすることができる。
【００４６】
尚、上述した微生物の遺伝子導入又は改変や微生物のスクリーニングを効率よく行うためには、本発明のポリヌクレオチド又はその一部を含む組換えベクター、本発明のポリヌクレオチドの一部断片からなるPCR及びRT-PCR用プライマー、本発明のポリヌクレオチド又はその一部を増幅することができるPCR及びRT-PCR用プライマー、本発明のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド又はその一部からなるハイブリダイゼーション用の核酸断片を用いることが好ましい。
ここで、使用されるプライマー等の核酸断片としては、本発明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたヌクレオチド等が一般的に使用できるが、当該ヌクレオチドとしては、配列番号１に示す塩基配列に対応する部分ヌクレオチド配列であって、10〜50個の連続した塩基、好ましくは15〜35個の連続した塩基が好ましい。
以下、実施例によって本発明の内容をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００４７】
実施例１  酸素・過酸化水素ストレスによるCDS2657遺伝子発現量の変化
CDS2657遺伝子について、酸素または過酸化水素のストレスを与えたときの発現量をリアルタイムPCRを用いて解析した。
（１）酸化ストレスの付加
酸素ストレスは、100mlの嫌気MRS培地で7時間培養した後2つに分け、一方を300ml容三角フラスコに入れて、タイテック社製振とう恒温槽を用いて160rpmで30分振とうして与えた。過酸化水素ストレスは、100mlのMRS培地を好気静置で7時間培養した後2つに分け、一方には0.5mMとなるよう過酸化水素を添加し30分継続して培養することで与えた。【００４８】
（２）RNAの調製
MRS培地で培養した培養液2mlを2倍量のRNAprotect Bacteria Reagent(QIAGEN)に添加して攪拌後室温で5分間インキュベートし、RNAを安定化した。5000 x gで10分間遠心して集菌した後、15mg/mlのリゾチームを含むTEバッファー200μlに懸濁し、1mg/mlのＮ-アセチルムラミデイスSG(生化学工業)10μlを加えて、時々ボルテックスで撹拌しながら室温で10分インキュベートした。RNeasy Mini Kit(QIAGEN)のBuffer RLTを700μl添加して懸濁し、5000 x gで5分間遠心して上清を採取した。以後RNeasy Mini Kit(QIAGEN)、RNAprotect Bacteria Reagent(QIAGEN)に添付のプロトコールに従って精製した。精製途中でRNase-Free DNase Set(QIAGEN)を用いてDNase処理を行い、混入しているDNAを分解した。
調製したRNAは2100 Bioanalyzer(Agilent)を用いて品質を確認した。【００４９】
（３）リアルタイムPCRによる遺伝子発現定量解析
標的遺伝子（CDS2657遺伝子）の発現量を定量するためリアルタイムPCRを行った。1μgのtotal RNAを鋳型とし、PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit（タカラバイオ）を用いて逆転写反応（30℃ 10min, 42℃ 50min, 95℃ 5min）を行いcDNAを調製した。希釈したcDNA溶液を鋳型とし、SYBR Premix Ex Taq(タカラバイオ)とプライマーを添加し、7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems)を用いて、95℃ 30secした後 95℃ 5sec, 60℃ 34secを40サイクル反応させた。また、遺伝子の発現量は16SrRNAを内部標準とし、サンプル間の補正を行った。結果は、非ストレスサンプルの発現量に対するストレスサンプルの発現量の相対値で表した。使用したプライマーは表１に示す。【００５０】
【表１】
2012121150.tif 000002
【００５１】
（４）結果
CDS2657遺伝子は、酸素または過酸化水素ストレスにより、発現促進が認められたが、その結果は過酸化水素でより顕著であった（図１）。
図１中の値は3回の独立した実験の平均値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。【００５２】
実施例２  CDS2657遺伝子破壊株の分離
（１）遺伝子破壊方法
配列番号１内部の配列の５'末端側に制限酵素BamH I切断部位を含む配列を付加したオリゴヌクレオチド 5'-cgcggatccggttcttgtgccattggaaa-3'（配列番号７）、及び配列番号１内部の配列と相補的な配列から選択した配列の５'末端側に制限酵素Pst I切断部位を含む配列を付加したオリゴヌクレオチド 5'-aaactgcagtgtcatcacgcagagccaac-3'（配列番号８）をプライマーとし、KOD Plus DNAポリメラーゼ（TOYOBO社製、製品番号KOD-201）を用いて本酵素に添付の方法に従って、ラクトバチルス・カゼイYIT9029のDNAをテンプレートとしてPCR反応を行った。こうして増幅されるDNA断片はCDS2657遺伝子のアミノ末端とカルボキシル末端の両側を欠いた部分配列である。生成物を等量のトリス−イーディーティーエー（10mM Tris(pH8.0)−1mM EDTA, TEと呼ぶ）飽和フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール（25：24：1）と混合し、よく攪拌した後、15,000 × g 5分の遠心を行って、2層に分離した。上層の水層を回収し、その10分の1量の3M酢酸ナトリウム溶液（pH5.2）と3倍量の99.5%エタノールを加え、-20℃に30分間以上置いた後に、4℃で15,000 x g 15分間の遠心を行った。上清を捨て、沈殿物に70%エタノールを加えて洗浄し、15,000 x g 5分間の遠心をした後エタノールを捨て、沈殿物を真空乾燥した。【００５３】
この沈殿物を100μlのKバッファー（タカラバイオ社製）反応液中で制限酵素BamH IとPst I（タカラバイオ社製）で切断（37℃で20時間）した後、前述のTE飽和フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール処理（溶媒混合から水層回収まで）を２回繰り返し、回収した水層に10分の1量の3M酢酸ナトリウム溶液（pH5.2）と3倍量の99.5%エタノールを加え、-20℃に30分間以上置いた後に、4℃で15,000 x g 15分間の遠心を行った。上清を捨て、沈殿物に70%エタノールを加えて洗浄し、15,000 x g 5分間の遠心をした後エタノールを捨て、沈殿物を真空乾燥した。【００５４】
プラスミドベクターとして、プラスミドpUC19に由来する大腸菌用複製領域と、大腸菌とラクトバチルスの両方で機能するプラスミドpAMβ1に由来するエリスロマイシン耐性遺伝子を持つpYSSE3（Yasuda et. al. 2008. Appl. Environ. Microbiol. 74:4746-4755.）を用いた。pYSSE3 DNAを100μlのKバッファー（タカラバイオ社製）反応液中で制限酵素BamH IとPst I（タカラバイオ社製）で切断（37℃で20時間）した後、10倍濃度のCIPバッファー（TOYOBO社製）20μlと水を加えて容量を200μlとし、カーフインテスティンフォスファターゼ（TOYOBO社製）3μlを加えて37℃で2時間インキュベートした。その後、前述のTE飽和フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール処理とエタノール沈澱処理を行い、沈殿物を真空乾燥した。【００５５】
上記CDS2657遺伝子の内部配列からなるDNA断片と制限酵素切断したプラスミドベクターをそれぞれおよそ0.01〜0.1μgずつ混合し、これに等容量のDNAライゲーションキットVer.2.1（タカラバイオ社製）I液を加えて16℃で30分間インキュベートした後、氷中に置いた。【００５６】
次に、溶解後氷中に置いたJM109コンピテントセル（TOYOBO社製）100μlに上記反応液5μlを加え、軽く混合して氷中で30分間インキュベートした後、42℃に30秒間さらしヒートショックを与え、再び氷中に戻した。この菌液にSOC培地（TOYOBO社製）を1mL加え37℃で1時間培養した後にエリスロマイシン（注射用エリスロマイシン、ダイナボット社製）を500μg／mLの濃度で加えたLB寒天培地（１L中に10g バクトトリプトン、5g バクトイーストエキストラクト、5g 塩化ナトリウム、15g 寒天を含む）に塗布して、37℃でインキュベートした。【００５７】
生成したエリスロマイシン耐性のコロニーを500μg／mLのエリスロマイシンを添加したＬＢ培地で生育し、ウィザードプラスSVミニプレップDNAピューリフィケーションシステム（プロメガ社製）を用いて組換えプラスミドDNAを抽出した。【００５８】
ラクトバチルス・カゼイYIT 9029へのDNA導入には、該微生物をMRS培地（ディフコ社製）に生育し、対数増殖期にある培養液を5,000 x g 4℃で5分間遠心して集菌し、菌体を氷冷した20mM HEPES(pH7.0)と10%グリセロールでそれぞれ1回ずつ洗浄し、洗浄菌体を（初めの培養液のクレット値）x 2μlの10%グリセロールに懸濁した。菌懸濁液40μlと組換えプラスミドDNA溶液2μlを混合し、2mm幅のエレクトロポレーション用キュベットに入れ、ジーンパルサーII（バイオラッド社製）を用いて、1.5kV, 200Ω、キャパシタンス25μFでエレクトロポレーションを行った。この液にMRS培地1mLを加え、37℃で１時間培養後、エリスロマイシンを20μg／mLの濃度で加えたMRS寒天培地に塗布し、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）を用いて嫌気状態にし、37℃で2日又は3日間インキュベートした。【００５９】
生育したエリスロマイシン耐性コロニーの一部をとり、50μlのTEに懸濁後、94℃で2.5分間処理し、その一部をテンプレートとして用い、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029染色体のCDS2657遺伝子下流の配列から選ばれたプライマーと、プラスミドベクターにあって、クローニングしたCDS2657遺伝子内部断片の近傍にある配列から選ばれたプライマーを用いて、PCR解析を行うことにより、導入したプラスミドがラクトバチルス・カゼイYIT 9029染色体のCDS2657遺伝子内部の組換えプラスミド上のCDS2657遺伝子断片と相同な領域に組み込まれて、CDS2657遺伝子が分断（破壊）されていることを確認した。こうして得たクローンをラクトバチルス・カゼイ MS105株とした。【００６０】
実施例３  CDS2657遺伝子破壊株の過酸化水素耐性
（１）実施例２で取得したラクトバチルス・カゼイ MS105株をMRS培地にて一晩培養後、集菌し、50mM リン酸カリウムバッファー（pH6.8）で2回洗浄後、同バッファーに10倍希釈となるように懸濁した。3mlの懸濁液をアルミキャップをした小試験管に注ぎ、終濃度1、3mMとなるよう過酸化水素を添加した。37℃で3時間インキュベート後、菌数を測定し、過酸化水素添加前の菌数に対する生存率を求めた。【００６１】
（２）結果
ラクトバチルス・カゼイ MS105株は、野生株よりも生存率が2オーダー程度低く、過酸化水素に対する感受性が高まった（図2）。【００６２】
実施例４  CDS2657遺伝子破壊株の過酸化水素消去活性
（１）ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029、ラクトバチルス・カゼイ MS105および、ラクトバチルス・カゼイ MS102(NADH ペルオキシダーゼ破壊株)を使用した。各菌株をMRS培地で7時間培養した後、終濃度0.5mMとなるよう過酸化水素を添加してさらに1時間培養した培養液からOD660 = １で1mlの菌体量となるよう調整して集菌した。菌体を50mM リン酸カリウムバッファー（pH6.8）で2回洗浄後、同バッファー0.1mlに懸濁した。0.1mlの懸濁液と、0.9mlの90%容量で調製した終濃度100mMの過酸化水素溶液を混合した。37℃で1時間インキュベート後、遠心して菌体を除いた上清の残存過酸化水素濃度を測定した。尚、過酸化水素濃度はBIOXYTECH H2O2-560（フナコシ）を用いて測定した。【００６３】
（２）NADHペルオキシダーゼを破壊したラクトバチルス・カゼイ MS102株は、全く過酸化水素を消去できなかったが、ラクトバチルス・カゼイ MS105株は、野生株と同等の過酸化水素消去活性を示した（図3）。図中、100μM過酸化水素溶液中で菌体を1時間インキュベートした後の残存過酸化水素濃度を示す。値は3回の独立した実験の平均値を示した。
このことから、CDS2657遺伝子は過酸化水素消去とは別の機構で過酸化水素耐性に寄与していることが示唆された。【００６４】
実施例５  CDS2657遺伝子のクローニング及びCDS2657タンパク質の発現と精製
（１）pETベクターへのCDS2657遺伝子のクローニング
プライマーセット（2657F:GGAATTCCATATGCAAATCTCAATCAAACC（配列番号９）, 2657R:CGGAATTCTTAGCAAATTTTGCCGCCCA（配列番号１０））を用い、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029のゲノムDNAを鋳型として、KOD-plus-DNA Polymerase(TOYOBO)を用いてPCRを行い、CDS2657遺伝子断片を増幅した。得られたPCR産物を電気泳動し、目的とする大きさのDNA断片をQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)で切り出し、抽出、精製した。さらに、DNA断片をNde I, EcoR Iで消化し、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)を用いて精製した。pET-28b(+)（メルク）はNde I, EcoR Iで消化しQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)を用いて精製した。pET-28b(+)ベクターとCDS2657のDNA断片をDNA Ligation Kit ver.2(タカラバイオ)を用いてライゲーションし、このライゲーション反応液をE. coli JM109（TOYOBO）に導入し形質転換した。得られた形質転換体から常法により抽出したプラスミドを、E. coli BL21(DE3)コンピテントセル（メルク）に導入し、形質転換体を得た。【００６５】
（２）タンパク質の発現および精製
タンパク質の発現はpET System Manual（メルク）に準じて行った。
E. coli BL21(DE3)の形質転換体を、カナマイシンを終濃度30mg/mlとなるよう添加した3mlのLB培地で振とう培養し、OD600が0.6に達したところで培養液を4℃で保存した。培養液を抗生物質を含む新しい200mlのLB培地に接種し、OD600が0.6に達するまで37℃で振とう培養した。終濃度1mMとなるようにIPTGを添加し、さらに37℃で3時間振とう培養し、目的タンパク質を誘導した。培養液を氷中に5分置き、4℃、5000 x gで5分遠心して集菌した。培養液体積の0.25倍量の冷却した20mM Tris-HCl pH8.0で洗浄し、遠心操作により集菌し、精製を開始するまで-80℃で凍結保存した。
cell lysateの調製はBugBuster Protein Extraction Reagent（メルク）を用い、添付のプロトコールに従って行った。タンパク質の精製は、Ni-NTA Fast Start Kit(QIAGEN)を用い、添付のプロトコールに従って行った。精製度を確認するために、精製の各ステップで5mlずつサンプリングを行い、SDS-PAGEに供した。SDS-PAGEはNuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel（インビトロジェン）を使用し、常法に従って行った。
溶出を2回にわけて行ったところ、1回目の溶出サンプルは僅かなマイナーバンドが検出されたものの、ほぼ単一に精製できていたため、2回目の溶出液と合わせたものを精製タンパク質とし、以下の実験に使用した（図4）。【００６６】
実施例６  CDS2657タンパク質の鉄結合性
（１）鉄とは結合しないBSA（SIGMA）と鉄結合性タンパク質であるFerritin(apoferritin from equine spleen, SIGMA）をコントロールとした。
＜アポタンパク質の調製＞
精製したCDS2657タンパク質（200μM）を、10mM EDTA、2mM DTTの反応液中で、37℃、１時間インキュベートした。反応後のCDS2657タンパク質を、水で平衡化したPD-10カラム（GE healthcare）で精製し、EDTAと遊離した鉄イオンを除いた。
＜鉄結合アッセイ＞
アポタンパク質（50μM）とFe(NH4)2(SO4)2・6H2O(10、100、1000μM)を2mM DTT存在下で室温5分インキュベートした（total volume 1mlとした）。尚、鉄を1000μM添加したサンプルは反応液が赤褐色に変化したため、測定サンプルから除外した。水で平衡化したPD-10カラム（GE healthcare）にアプライし、遊離の鉄イオンを除いてタンパク質画分を精製した。タンパク質画分は3mlにメスアップし、ICP発光分光分析装置（バリアンテクノロジーズジャパンリミテッド）を用いて鉄濃度を測定した。【００６７】
（２）結果
CDS2657タンパク質は鉄との結合性を示し、鉄を100μM添加した時には、1分子あたり約2分子の鉄と結合した（表２）。【００６８】
【表２】
2012121150.tif 000003
【００６９】
実施例７  CDS2657タンパク質によるヒドロキシルラジカル生成の抑制
ヒドロキシルラジカルの生成と検出は、Halliwell（Halliwell, B., and J. M. Gutteridge. 1981. Formation of a thiobarbituric acid reactive substance from deoxyribose in the presence of iron salts. FEBS Lett. 128:347-352.）およびYamamoto（Yamamoto, Y., L. B. Poole, R. R. Hantgan, and Y. Kamio. 2002. An iron-binding protein, Dpr, from Streptococcus mutans prevents iron-dependent hydroxyl radical formation in vitro. J. Bacteriol. 184:2931-2939.）が報告している方法に従って行った。すなわち、2価鉄によって非酵素的にヒドロキシルラジカルを生成させ、このヒドロキシルラジカルによってデオキシリボースを分解し、産生したマロンジアルデヒド様物質を、チオバルビツール酸と反応させることで、赤色物質を生成させ、その蛍光量を測定することによってヒドロキシルラジカル生成量を求めた。【００７０】
（１）方法
0.3ml のbasal reaction mixture （10mM potassium phosphate buffer (pH7.4), 63mM NaCl, 4mM 2-deoxyribose）にサンプルを添加し、終濃度10mMとなるようFe(NH4)2(SO4)2・6H2Oを加え、total 2mlで37℃、15分インキュベートした。加熱融解した0.25mlの１％(w/v)thiobarbituric acidと0.25mlの2.8%(w/v) trichloroacetic acidを加えた後、反応液を10分間煮沸し、急冷した。生成した赤色物質を、蛍光分光光度計(Shimadzu)を用いて、532nmで励起し、553nmの蛍光を測定し、サンプル無添加時の蛍光値からの減少をヒドロキシルラジカル生成反応の阻害度として表した（表３）。【００７１】
（２）結果
鉄キレート剤であるdeferoxamine (SIGMA)は、濃度依存的にヒドロキシルラジカル生成を抑制した。CDS2657も同様に濃度依存的にヒドロキシルラジカルの生成を抑制した。一方、鉄結合タンパク質であるferritinはヒドロキシルラジカル生成をほとんど抑制しなかった。【００７２】
【表３】
2012121150.tif 000004
【００７３】
以上のことから、CDS2657タンパク質は、細胞内の鉄を除去し、ヒドロキシルラジカルの生成を抑制することで、過酸化水素耐性に関与することが示唆された。【００７４】
実施例８  CDS2657高発現株の過酸化水素に対する影響
（１）CDS2657高発現株の作製
CDS2657高発現株は、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029中で機能する合成プロモーター配列をマルチクローニングサイトの上流に配置したpLP10ベクター（Yasuda et. al. 2008. Appl. Environ. Microbiol. 74:4746-4755.、Kiwaki et. al. 2002. Biosci. Microflora 20:121-129）にCDS2657遺伝子を挿入したプラスミドをラクトバチルス・カゼイ YIT 9029に導入することで作製した。
CDS2657遺伝子の上流のSD配列から、終止コドンまでを増幅し、制限酵素BamH I切断部位、制限酵素Pst I切断部位をそれぞれ含む配列を付加したプライマーを設計した（2657outF: cgcggatccaatagagaggatggttcgga（配列番号１１）, 2657outR:aaactgcagttagcaaattttgccgcc（配列番号１２））。このプライマーセットを用い、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029のゲノムDNAを鋳型として、KOD-plus-DNA Polymerase(TOYOBO)を用いてPCRを行い、CDS2657遺伝子断片を増幅した。得られたPCR産物を電気泳動し、目的とする大きさのDNA断片を切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)で抽出、精製した。さらに、DNA断片をBamH I, Pst Iで消化し、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)を用いて精製した。pLP10はBamH I, Pst Iで消化しQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)を用いて精製した。pLP10ベクターとCDS2657のDNA断片をDNA Ligation Kit ver.2.1(タカラバイオ)を用いてライゲーションし、このライゲーション反応液をE. coli JM109コンピテントセル（TOYOBO）に導入し形質転換した。【００７５】
得られた形質転換体を500μg／mLのエリスロマイシンを添加したＬＢ培地で生育し、ウィザードプラスSVミニプレップDNAピューリフィケーションシステム（プロメガ社製）を用いて組換えプラスミドDNAを抽出した。
ラクトバチルス・カゼイYIT 9029へのDNA導入には、該微生物をMRS培地（ディフコ社製）に生育し、対数増殖期にある培養液を5,000 x g 4℃で5分間遠心して集菌し、菌体を氷冷した20mM HEPES(pH7.0)と10%グリセロールでそれぞれ1回ずつ洗浄し、洗浄菌体を（初めの培養液のクレット値）x 2μlの10%グリセロールに懸濁した。菌懸濁液40μlと組換えプラスミドDNA溶液2μlを混合し、2mm幅のエレクトロポレーション用キュベットに入れ、ジーンパルサーII（バイオラッド社製）を用いて、1.5kV, 200Ω、キャパシタンス25μFでエレクトロポレーションを行った。この液にMRS培地1mLを加え、37℃で１時間培養後、エリスロマイシンを20μg／mLの濃度で加えたMRS寒天培地に塗布し37℃で2日又は3日間インキュベートした。【００７６】
生育したエリスロマイシン耐性コロニーの一部をとり、50μlのTEに懸濁後、94℃で2.5分間処理し、その一部をテンプレートとして用い、pLP10のマルチクローニングサイトの上流と下流の配列のプライマーを用いてPCR解析を行うことにより、CDS2657断片がpLP10に挿入されたプラスミドが、ラクトバチルス・カゼイYIT 9029に導入されていることを確認した。こうして得たクローンをラクトバチルス・カゼイ MS106株（２０１１年２月２５日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566  日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４７６として寄託）とした。【００７７】
（２）過酸化水素添加による生育への影響
ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029、CDS2657破壊株であるラクトバチルス・カゼイ MS105、pLP10ベクターをラクトバチルス・カゼイ YIT 9029に導入した、ラクトバチルス・カゼイ MS101および、CDS2657を高発現したラクトバチルス・カゼイ MS106を用いた。
各菌株をMRS培地に接種し、好気静置条件下で、37℃で培養した。培養7時間後に、終濃度0、1.5、3mMとなるよう過酸化水素を添加し、好気静置条件下で継続して培養した。7時間から24時間の生育を、Klett-Summerson比色計で測定した濁度の増加量で示した。【００７８】
（３）結果
CDS2657高発現株（MS106）では、過酸化水素を1.5mM、3mM添加しても他の菌株より24時間後の濁度の増加が認められ、過酸化水素を3mM添加した時に、その差は顕著であった（図５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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