(57)【要約】本発明はＲＡＮＫＬの作用を遮断する化合物を含む癌免疫増強剤の提供としており、本発明は抗ＲＡＮＫＬ中和抗体等のＲＡＮＫＬのアンタゴニストを有効成分として含む癌免疫増強剤である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＡＮＫＬのアンタゴニストを有効成分として含む癌免疫増強剤。
【請求項２】
ＲＡＮＫＬのアンタゴニストが抗ＲＡＮＫＬ中和抗体である、請求項１記載の癌免疫増強剤。
【請求項３】
抗ＲＡＮＫＬ中和抗体がクローンＯＹＣ１である、請求項２記載の癌免疫増強剤。
【請求項４】
Ｔリンパ球の癌免疫応答を増強させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の癌免疫増強剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の癌免疫増強剤を含む、癌免疫療法剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌免疫を増強するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
１．Ｔリンパ球による癌免疫応答とその問題点
最近、癌に対する免疫応答を誘導することで癌を治療する方法が開発されつつある。その１つが、癌で発現する抗原（癌関連抗原）を認識するＴリンパ球の免疫応答を利用した方法である。この方法で問題となる点の１つは、癌関連抗原が本来、自分自身が発現するタンパク質（自己抗原）である点である。
自己抗原に対する免疫応答は個体にとって有害であるため、ヒトはそれを抑制する機構を備えている。そのため自己抗原の１つとみなされる癌関連抗原に対する免疫応答も、同じ機構により、その効率が低くなると考えられている。
自己抗原に対する免疫応答を抑制する機構の１つが、自己抗原に応答可能なＴリンパ球を発生途中で除く機構である。Ｔリンパ球のほとんどが胸腺で分化する。その際、自己抗原を認識するＴリンパ球は、分化・成熟の途中で細胞死が誘導され、その結果、免疫応答を起こす前に除去される。
この除去機構に必要な細胞の１つが、胸腺髄質上皮細胞（ｍＴＥＣ：ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｔｈｙｍｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）である。胸腺髄質上皮細胞は、胸腺の構造を形成する上皮細胞に属するが、他の上皮細胞にない特色を持つ。すなわち胸腺髄質上皮細胞は、通常は末梢組織で特異的に発現する自己抗原群を異所的に発現することで、自己抗原を認識するＴリンパ球の除去を行っている（非特許文献１）。
また胸腺髄質上皮細胞は、自己抗原の１つとして癌関連抗原も発現していることが判明している（非特許文献２）。すなわち、胸腺髄質上皮細胞は癌に応答するＴ細胞を胸腺内で除去することで、癌に対する個体の免疫応答に対して、逆に不利な働きをしていると予想されている。しかしながら、成体において胸腺髄質上皮細胞の機能抑制を行う方法がなく、そのため胸腺髄質上皮細胞の機能抑制が癌の増大を抑制できるのかも不明である。
２．ＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ  ｌｉｇａｎｄ）の生理活性と疾患治療への応用
ＲＡＮＫＬはＴＮＦファミリーに属するサイトカインであり、そのレセプターであるＲＡＮＫに結合することで細胞の分化などを誘導する。ＲＡＮＫＬは、特に、破骨細胞分化に必須の因子として、骨吸収における必要性がよく知られており、その機能を抑制する中和抗体はヒト骨粗鬆症の治療薬として利用されつつある（非特許文献３）。また乳腺上皮細胞の分化・成熟への関与や、さらには乳腺上皮細胞に由来する乳癌の初期発生段階にも重要であることも報告された（非特許文献４）。
一方、これまでに本発明者により、胸腺髄質上皮細胞がＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ  ｌｉｇａｎｄ）の作用により分化すること（非特許文献５）、またＲＡＮＫＬによる胸腺髄質上皮細胞の分化誘導活性には、細胞内シグナル伝達因子であるＴＲＡＦ６（ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ６）が必要であることが判明している（非特許文献６）。
またＲＡＮＫＬの作用を遮断することを介して、癌の骨転移に重要な破骨細胞を抑制し、癌の骨転移を抑制する試みもなされている（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｋｙｅｗｓｋｉ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．；Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６；２４：５７１−６０６．
【非特許文献２】Ｇｏｔｔｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００４；１９９：１５５−６６．
【非特許文献３】Ｓｔｏｌｉｎａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．；Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．２００７；６０２：１４３−５０．
【非特許文献４】Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｓｕａｒｅｚ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔｕｒｅ．２０１０；４６８：１０３−７．
【非特許文献５】Ａｋｉｙａｍａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．；Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００８  Ｓｅｐ  １９；２９（３）：４２３−３７．
【非特許文献６】Ａｋｉｙａｍａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００５；３０８：２４８−５１．
【非特許文献７】Ｄｏｕｇａｌｌ  ＷＣ  ｅｔ  ａｌ．；Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｐａｌｌｉａｔ  Ｃａｒｅ．２００７；１：３１７−２２．
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、成体においてＲＡＮＫＬの作用を遮断することで癌に対する免疫応答を強化し、癌の増大を抑制すること、及びＲＡＮＫＬの作用を遮断する化合物を含む癌免疫増強剤の提供を目的とする。
これまでＲＡＮＫＬが乳癌上皮細胞に直接作用することで、乳癌の発生を惹起することが報告され、ＲＡＮＫＬの作用を抑制するＲＡＮＫ−Ｆｃタンパク質は、乳癌の発生を抑制することが報告されている（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｓｕａｒｅｚ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔｕｒｅ．２０１０；４６８：１０３−７）。しかしながら、これらの作用は正常細胞から癌へと変化する作用点における効果は示唆するものの、既に癌化した細胞の増殖を抑制するものではない。さらにこの作用は乳癌上皮細胞に直接作用しており、癌に対する免疫応答は関与していない。
またＲＡＮＫＬの作用を遮断することを介して、癌の骨転移に重要な破骨細胞を抑制し、癌の骨転移を抑制する試みもなされているが（Ｄｏｕｇａｌｌ  ＷＣ  ｅｔ  ａｌ．；Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｐａｌｌｉａｔ  Ｃａｒｅ．２００７；１：３１７−２２）、この作用にもＴリンパ球による免疫応答の惹起は無関係であり、さらに骨転移しない癌には適用できない。
本発明者らは、ＲＡＮＫＬの作用を、あるいはそのシグナル伝達機構を抑制することで、胸腺髄質上皮細胞の生存、維持、機能に必要又は関与する因子を抑制又は阻害し得ることを見出した。その作用を介して、通常は細胞死で除去される癌に応答するＴリンパ球を、胸腺で生存させ、結果として個体の癌免疫応答能を高め、癌の増大を抑制することが可能になる。この作用においては、ＲＡＮＫＬが癌に直接作用することは必要ない。従って、ＲＡＮＫＬが癌に直接作用しない癌治療に応用可能となる。
本発明者らはさらに鋭意検討を行い、ＲＡＮＫＬの作用を遮断することにより胸腺髄質上皮細胞の増殖が低下し、癌免疫応答が亢進し、癌の増大が抑制されるか否かについて検討を行った。すなわち、本発明者らは、ＲＡＮＫＬに対する抗体を使用してＲＡＮＫＬ作用を中和、抑制することで、胸腺髄質上皮細胞の機能を抑制できるのか検証した。胸腺が十分発達した生後６〜８週令のマウスにＲＡＮＫＬの中和抗体を皮下投与し、２週間後に胸腺の解析を行った。その結果、ＲＡＮＫＬ中和抗体を投与した群では成熟した胸腺髄質上皮細胞が大幅に減少していることを、フローサイトメーター及び免疫組織染色で確認した。さらに胸腺髄質上皮細胞の機能を制御する遺伝子群の発現も大きく減少していることを確認した。これらのことは、ＲＡＮＫＬ中和抗体の投与により、胸腺髄質上皮細胞の機能を効果的に抑制できることを示している。さらにＲＡＮＫＬの中和抗体の投与はコントロール抗体の投与と比較して、癌の増大を有意に抑制した。また、ＲＡＮＫＬ中和抗体を投与したマウスでは平均生存日数が増加した。
このように、ＲＡＮＫＬの中和抗体を成体に投与してＲＡＮＫＬの作用を抑制することで、成体の胸腺髄質上皮細胞の生存、維持、機能を阻害できること、および癌の増大を抑制できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］  ＲＡＮＫＬのアンタゴニストを有効成分として含む癌免疫増強剤。
［２］  ＲＡＮＫＬのアンタゴニストが抗ＲＡＮＫＬ中和抗体である、［１］の癌免疫増強剤。
［３］  抗ＲＡＮＫＬ中和抗体がクローンＯＹＣ１である、［２］の癌免疫増強剤。
［４］  Ｔリンパ球の癌免疫応答を増強させる、［１］〜［３］のいずれかの癌免疫増強剤。
［５］  ［１］〜［４］のいずれかの癌免疫増強剤を含む、癌免疫療法剤。
本発明のＲＡＮＫＬアンタゴニストを有効成分として含む組成物は、生体において抗癌免疫を増強し、発癌、癌の進展を防ぐことができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１１−０７９１６７号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
図１Ａは、フローサイトメーターによる胸腺髄質上皮細胞の解析（ＲＡＮＫＬ中和抗体；Ｎ＝３，コントロール；Ｎ＝２）の結果を示す図である（その１）。
図１Ｂは、フローサイトメーターによる胸腺髄質上皮細胞の解析（ＲＡＮＫＬ中和抗体；Ｎ＝３，コントロール；Ｎ＝２）の結果を示す図である（その２）。ａはｍＴＥＣｈｉを、ｂはｍＴＥＣｌｏを、ｃはｃＴＥＣを示す。図中、アスタリスクは有意差検定の結果有意差が認められたことを示す。
図２は、免疫組織染色による胸腺髄質上皮細胞の解析（Ｎ＝３）の結果を示す図である図２ＡはＫｅｒａｔｉｎ−５（緑）及びＵＥＡ−１（赤）（成熟した胸腺髄質上皮細胞のマーカー）の存在を示し、図２Ｂは、Ａｉｒｅ（緑）（髄質上皮細胞の機能分子）及びＥｐＣＡＭ（赤）（髄質上皮細胞のマーカー）の存在を示す。
図３は、リアルタイムＰＣＲによる胸腺髄質上皮細胞の機能因子の解析（Ｎ＝３）の結果を示す図である。図３Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、それぞれＡｉｒｅ、Ｓｐｔ１、Ｃｓｎｂ及びＣｏｌ２の結果を示す。図中、アスタリスクは有意差検定の結果有意差が認められたことを示す。
図４は、ＲＡＮＫＬ中和抗体を処理したマウスへの癌移植実験の結果を示す図である。図中、アスタリスクは有意差検定の結果有意差が認められたことを示す。
図５は、ＲＡＮＫＬ中和抗体を処理したマウスへの癌移植後の生存曲線を示す図である。
図６は、ＲＡＮＫＬ中和抗体を投与したマウスの胸腺リンパ球の癌免疫増強効果を腫瘍の大きさの変化で示す図である。図中、アスタリスクは有意差検定の結果有意差が認められたことを示す。
図７は、ＲＡＮＫＬ中和抗体を投与したマウスの脾臓リンパ球の癌免疫増強効果を腫瘍の大きさの変化で示す図である。図中、アスタリスクは有意差検定の結果有意差が認められたことを示す。
図８は、ＲＡＮＫＬ中和抗体を投与したマウスの脾臓リンパ球の癌免疫増強効果を体重当りの腫瘍の重量で示す図である。図中、アスタリスクは有意差検定の結果有意差が認められたことを示す。
図９は、ＲＡＮＫＬ中和抗体（抗ＲＡＮＫＬ抗体）及びコントロールＩｇＧを投与した、癌細胞移植マウスにおける癌の増大を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。
ＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ  ｌｉｇａｎｄ）は、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであるＲＡＮＫ（ＮＦ−κＢの受容体アクティベーター）のリガンドであり、細胞内ドメイン（ＲＡＮＫＬのＮ末端から第１番目から４８番目のアミノ酸からなるドメイン）、膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを有する２型貫通タンパク質である（特表２００２−５０９４３０号公報、特許公報３５２３６５０号）。
本発明は、ＲＡＮＫＬの作用を特異的に阻害し得るＲＡＮＫＬのアンタゴニストを有効成分として含む組成物である。ＲＡＮＫＬのアンタゴニストは、ＲＡＮＫＬの作用を阻害し、胸腺髄質上皮細胞（ｍＴＥＣ：ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｔｈｙｍｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）の増殖、分化を抑制し、その機能を阻害する。その結果、癌に対する個体の免疫応答が上昇する。
本発明で用いるＲＡＮＫＬアンタゴニストとして、ＲＡＮＫＬに結合し、ＲＡＮＫＬがその受容体であるＲＡＮＫに結合するのを阻止する物質が挙げられる。このような物質としては、例えば、ＲＡＮＫＬを中和してＲＡＮＫＬの作用を阻害する抗ＲＡＮＫＬ中和抗体が挙げられる。該中和抗体を抗ＲＡＮＫＬアンタゴニスト抗体ともよぶ。該抗ＲＡＮＫＬ中和抗体は、好ましくはＲＡＮＫＬの細胞外ドメインに結合する。本発明の抗体が認識し、結合するＲＡＮＫＬの由来動物種は限定されないが、好ましくはｈｕｍａｎ  ＲＡＮＫＬ（ｈＲＡＮＫＬ）又はｍｕｒｉｎｅ  ＲＡＮＫＬ（ｍＲＡＮＫＬ）、さらに好ましくはｈＲＡＮＫＬである。また、ＲＡＮＫＬのアンタゴニストとして、ＲＡＮＫＬのデコイ受容体として知られているオステオプロテゲリンＯＰＧやＲＡＮＫの細胞外ドメインからなる可溶型ＲＡＮＫ、それらを用いたＩｇＧのＦｃ領域などとの融合蛋白質及びそれらの断片であって、ＲＡＮＫＬに結合し、ＲＡＮＫＬがその受容体であるＲＡＮＫに結合するのを阻止するものが挙げられる。さらに、ＲＡＮＫＬのアンタゴニストとして、ＲＡＮＫＬの構造が類似した化合物、ＯＰＧに構造が類似した化合物又は可溶型ＲＡＮＫの構造が類似した化合物であって、ＲＡＮＫＬに結合し、ＲＡＮＫＬがその受容体であるＲＡＮＫに結合するのを阻止するものが挙げられる。
本発明の抗ＲＡＮＫＬ中和抗体として、抗マウスＲＡＮＫＬ抗体としては、例えば、オリエンタル酵母工業のｃｌｏｎｅ，ＯＹＣ１（オリエンタル酵母工業株式会社カタログＮｏ．４７１０４００１）が挙げられ、抗ヒトＲＡＮＫＬ抗体としては、オリエンタル酵母工業のｃｌｏｎｅ，７Ｈ１２−４Ｇ（オリエンタル酵母工業株式会社カタログＮｏ．４７１０２０００）が挙げられる。これらの抗ＲＡＮＫＬ抗体はオリエンタル酵母工業より入手可能である。
本発明の抗ＲＡＮＫＬ抗体は、公知の方法により、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得ることができ、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマに産生されるもの、及び遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、公知の手法により、以下のようにして作製できる。すなわち、膜型若しくは可溶型ＲＡＮＫＬ又はその断片ペプチドを感作抗原として用いて、公知の免疫方法により免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、公知のスクリーニング法により、モノクローナル抗体を産生する細胞をスクリーニングすることによって作製することができる。免疫に用いるＲＡＮＫＬとしては、マウス由来のＲＡＮＫＬ又はヒト由来のＲＡＮＫＬの細胞外ドメイン又はその断片を用いればよい。ＲＡＮＫＬを免疫する際、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン等のキャリアタンパク質と結合させて用いてもよい。また、モノクローナル抗体としては、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものも用いることができる（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０；１９２：７６７−７７５．参照）。この際、抗体重鎖（Ｈ鎖）又は軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖及びＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（国際公開第ＷＯ  ９４／１１５２３号パンフレット）。また、トランスジェニック動物を使用することにより、組換え型抗体を産生することもできる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生されるタンパク質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得ることができる（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９４；１２：６９９−７０２）。
得られた抗体がＲＡＮＫＬの作用を阻害し、胸腺髄質上皮細胞の増殖、分化を阻害するか否かは例えば、後述の実施例に記載のマウスを用いた方法で確認することができる。
さらに、本発明の抗ＲＡＮＫＬ抗体は、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体をも含み、いずれも公知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡを得て、ヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、ヒト以外の動物抗体由来のＣＤＲとヒト抗体由来のフレームワーク領域を有する。ヒト化抗体は公知の方法により作製することができる（欧州特許出願公開番号ＥＰ  １２５０２３号公報、ＷＯ  ９６／０２５７６号公報参照）。ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体ともいう。キメラ抗体及びヒト化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
ヒト抗体は、例えばヒト抗体遺伝子座を導入し、ヒト由来抗体を産生する能力を有するトランスジェニック動物に抗原を投与することにより得ることができる。該トランスジェニック動物としてマウスが挙げられ、ヒト抗体を産生し得るマウスの作出方法は、例えば、米国特許第７，１４５，０５６号明細書（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標））；米国特許第５，６１２，２０５号明細書、米国特許第５，９８１，１７５号明細書、米国特許第５，８１４，３１８号明細書、米国特許第５，５４５，８０６号明細書（ＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標））；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１６，１３３−１４３，１９９７（ＴｒａｎｓＣｈｒｏｍｏＭｏｕｓｅ（商標））；Ｉｓｈｉｄａ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，４，８５−９５，２００２（ＫＭＭｏｕｓｅ（商標））等に記載されている。また、ヒト抗体断片を表面に提示するファージを利用したファージディスプレイ法によっても作製することができる。すなわち、ヒトＢ細胞からヒト抗体重鎖及び軽鎖を得て、ＣＤＲ領域に人工的な配列を加え、ファージディスプレイ法によりヒト可変領域を発現するファージのライブラリーを作製し、所望の結合性を有するヒト抗体を選択する。ファージディスプレイ法によるヒト抗体の作製については、国際公開第１９９２／０１５６７９号国際公開パンフレット等に記載されている。
抗ＲＡＮＫＬ抗体は、完全抗体だけでなく、その機能的断片も含む。抗体の機能的断片とは、抗体の一部分（部分断片）であって、抗体の抗原への作用を１つ以上保持するものを意味し、具体的にはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、及びこれらの重合体等が挙げられる［Ｄ．Ｊ．Ｋｉｎｇ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，１９９８  Ｔ．Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ］。
また、モノクローナル抗体を用いる場合、１種類のみのモノクローナル抗体を用いてもよいが、認識するエピトープが異なる２種類以上のモノクローナル抗体を用いてもよい。
本発明の組成物は、上記の抗ＲＡＮＫＬ抗体を有効成分として含む癌免疫増強剤、癌免疫活性化剤又は癌免疫賦活化促進剤である。該組成物は、生体における癌免疫反応を上昇させ、癌の発症や進展を阻害し、癌の治療又は予防効果を発揮し得る。すなわち、前記組成物は癌免疫療法剤として用いることができる。
抗ＲＡＮＫＬ抗体は、胸腺髄質上皮細胞の働きを抑制する。胸腺髄質上皮細胞は自己抗原を認識するＴリンパ球を除去する働きを有する。従って、胸腺髄質上皮細胞は自己の体内に形成された癌関連抗原に対するＴリンパ球を排除する。抗ＲＡＮＫＬ抗体は胸腺髄質上皮細胞の働きを抑制する結果、癌関連抗原に対するＴリンパ球が排除されないので、癌に対する免疫反応が生じる。すなわち、抗ＲＡＮＫＬ抗体は直接癌細胞に作用するのではなく、Ｔリンパ球による癌免疫応答を亢進し、Ｔリンパ球を介して、癌免疫を増強することにより、癌治療又は予防効果を発揮する。従って、抗ＲＡＮＫＬ抗体を含む組成物を、Ｔリンパ球による癌免疫応答を増強し亢進する、癌免疫増強剤として用いることができる。抗ＲＡＮＫＬ抗体により癌免疫応答が亢進するＴリンパ球は、胸腺で発生後に脾臓などの２次リンパ組織に移動し局在するが、２次リンパ組織に局在するＴリンパ球が効率的に癌に対する免疫反応を生じる。
投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、通常、経口投与では、成人に対して、抗体量として、１日約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇであり、これらを１回、又は数回に分けて投与することができる。また、非経口投与では、１回約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇを皮下注射、筋肉注射又は静脈注射によって投与することができる。
組成物は、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用してもよい。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。
本発明の組成物の治療又は予防の対象となる癌は、限定されないが、胃癌、肺癌、肝癌、結腸癌、肛門・直腸がん、食道癌、膵癌、乳癌、腎癌、皮膚癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、副腎癌、脳・神経腫瘍、白血病、リンパ腫、中皮腫等が挙げられる。
さらに抗ＲＡＮＫＬ抗体を含む本発明の組成物を投与した癌患者のＴリンパ球は、それらの作用により、抗癌免疫活性が亢進しており、このＴリンパ球をさらに増やすことにより、癌治療に用いることができる。すなわち癌患者に抗ＲＡＮＫＬ抗体を含む本発明の組成物を投与し、既存の免疫活性化療法を併用して、癌患者の体内で癌に対するＴリンパ球を増やす。また投与後にリンパ球を該患者から採取し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでリンパ球を増やした後に、該リンパ球を前記患者に投与してもよい。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【０００７】
胸腺髄質上皮細胞におけるＲＡＮＫＬ中和抗体の効果
（１）  マウスへの投与方法
ネンブタール麻酔下ＣＤ４０欠損または野性型（Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｃ１，日本クレア）の６週齢雌マウスにＲＡＮＫＬ中和抗体（３例）オリエンタル酵母工業のｃｌｏｎｅ，ＯＹＣ１（オリエンタル酵母工業株式会社カタログＮｏ．４７１０４００１）および中和能の無いマウスＲＡＮＫＬ抗体（コントロール抗体）（２例）オリエンタル酵母工業のｃｌｏｎｅ，ＯＹＣ２（オリエンタル酵母工業株式会社カタログＮｏ．４７１０３００１）を５ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した。二週間後、マウスより胸腺を摘出し、以下、（２）フローサイトメーター、（３）凍結切片の免疫染色および（４）Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法を用いて発現解析を行った。
（２）  フローサイトメーターによる解析
胸腺の一部（約２０ｍｇ）を１ｍｌのＰＢＳを含むシャーレ中にて数カ所ハサミで切り込みを入れ、１ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地を含む１．５ｍｌチューブに移して１０分間４℃でローテーターにてゆっくりと撹拌した。上清を上記のＰＢＳと共に別の１５ｍｌチューブに回収した。０．１２５％Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ／Ｄｉｓｐａｓｅ（Ｒｏｓｈｅ）、０．０１％ＤＮａｓｅＩを含むＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍｌを加え、３７℃にて１５分間インキュベートした。この間、５分毎にピペッティングした。上清を先ほどの１５ｍｌチューブに移し、新しい０．１２５％Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ／Ｄｉｓｐａｓｅ、０．０１％ＤＮａｓｅＩを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を加えた。これを４回繰り返し、ばらばらにほぐれた胸腺の細胞集団を得た。１×１０７個の細胞を１００μｌのＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（２％  ＦＣＳ含有ＰＢＳ）に懸濁し、抗ＣＤ１６／３２抗体で氷上２０分間ブロッキング処理を行った。標識した抗ＣＤ４５抗体、抗ＴＥＲ−１１９抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体、ＵＥＡ−１レクチンで氷上２０分間染色し、ＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒで二回洗浄後にＦＡＣＳ解析を行った（図１）。解析に当たっては、ＣＤ４５−、ＴＥＲ１１９−の胸腺細胞をＥｐＣＡＭ（胸腺上皮細胞のマーカー）、ＵＥＡ−１（胸腺髄質上皮細胞のマーカー）で染色し、ＥｐＣＡＭ陽性ＵＥＡ−１高陽性（より分化成熟した髄質上皮細胞）の細胞画分（ｍＴＥＣｈｉ）、ＥｐＣＡＭ陽性ＵＥＡ−１低陽性（髄質上皮細胞）の細胞画分（ｍＴＥＣｌｏ）、ＥｐＣＡＭ陽性ＵＥＡ−１陰性（皮質上皮細胞）の細胞画分（ｃＴＥＣ）に分けて解析した。図１Ａにフローサイトメーターによる解析結果を示し、図１Ｂに解析結果をまとめたグラフを示す。図１に示すようにＲＡＮＫＬ中和抗体投与群では成熟した髄質上皮細胞が大きく減少していた。
（３）  凍結切片の免疫染色
胸腺の一部（約４０ｍｇ）をＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ中液体窒素にて凍結し、スライドグラス上に厚さ約５μｍの凍結切片標本を作製した。アセトンにて固定後、ＰＢＳで洗浄し、抗ヤギ抗体を１０％含むＰＢＳ溶液で室温２０分間ブロッキング処理した。抗Ｋｅｒａｔｉｎ−５抗体および抗ＵＥＡ−１抗体、または抗ＥｐＣＡＭ抗体および抗Ａｉｒｅ抗体で室温一時間処理した。ＰＢＳで洗浄後、蛍光（Ａｌｅｘａ４８８およびＡｌｅｘａ５４６）標識した二次抗体で室温４０分間処理し、ＰＢＳにて洗浄後、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ７１０）を用いて蛍光像の撮影を行った（図２）。図２ＡはＫｅｒａｔｉｎ−５及びＵＥＡ−１の結果を示し、Ｋｅｒａｔｉｎ−５は緑色蛍光で、ＵＥＡ−１は赤色蛍光（成熟した胸腺髄質上皮細胞のマーカー）で示されている。コントロールにおいては、赤色蛍光を発する部分が目立つが、ＲＡＮＫＬ中和抗体投与群では緑色蛍光のみ観察され、赤色蛍光はほとんど観察されない。図２ＢはＡｉｒｅ（髄質上皮細胞の機能分子）及びＥｐＣＡＭ（髄質上皮細胞のマーカー）の結果を示し、Ａｉｒｅは緑色蛍光で、ＥｐＣＡＭは赤色蛍光で示されている。コントロールにおいては、緑色蛍光及び赤色蛍光を発する部分が優勢であるが、ＲＡＮＫＬ中和抗体投与群では緑色蛍光及び赤色蛍光を発する部分が激減している。この結果は、ＲＡＮＫＬ中和抗体投与群では成熟した髄質上皮細胞が大きく減少していることを示している。
（４）  定量的Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法を用いた胸腺髄質上皮細胞の機能遺伝子発現解析
−８０℃にて凍結保存していた胸腺の一部（約１０ｍｇ）からＴＲＩＺＯＬ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＮＡを採取した。ＤＮａｓｅＩで３７℃３０分処理し、混入したＤＮＡを除去した。約２μｇのＲＮＡを鋳型としＲａｎｄｏｍ  Ｈｅｘａｍｅｒをプライマーに用いてｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ反応によりｃＤＮＡを調製した。これを鋳型としてＡｉｒｅ、Ｓｐｔ１、Ｃｓｎｂ及びＣｏｌ２の遺伝子発現をＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析した（図３）。成熟した胸腺髄質上皮細胞の“機能因子”の発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで検証した。これらの解析は全てＧＡＰＤＨの発現量の相対値で示した。図３Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、それぞれＡｉｒｅ、Ｓｐｔ１、Ｃｓｎｂ及びＣｏｌ２の結果を示す。図３に示すように、中和抗体投与群ではＡｉｒｅや組織特異的抗原など、成熟した胸腺髄質上皮細胞の機能に必要な因子の発現が大きく減少していた。
（５）  癌細胞の増大に対するＲＡＮＫＬ中和抗体の効果
ネンブタール麻酔下、野性型（Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｃ１、日本クレア）の６週齢雌マウスにＲＡＮＫＬ中和抗体（オリエンタル酵母工業、ｃｌｏｎｅ，ＯＹＣ１）およびコントロール抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ラット精製ＩｇＧ）（各３例）を５ｍｇ／ｋｇの用量で頸部に皮下投与した。二週間後、もう一度同じ用量で二回目の投与を行った。さらに二週間後、ネンブタール麻酔下マウス右脇皮下に培養リンパ腫ＥＬ−４を１×１０６個移植した。移植後五日目から腫瘍の大きさを測定し、その後生存日数を調べた。
腫瘍の大きさは短経ａ  ｍｍ，長径ｂ  ｍｍを電子ノギスで測定し、体積を（ａ×ｂ）３／２×π／６とした。生存率は（生存数／検体数（Ｎ＝３）×１００）％とした（図４）。図４に結果を示す実験においては、野生型マウスにＲＡＮＫＬ中和抗体（白丸）又はコントロール抗体（黒丸）を２週おきに２回投与し、さらに２週間後にマウス癌細胞ＥＬ４を皮下移植した。図４に示すように、ＲＡＮＫＬ中和抗体を投与したマウス群ではコントロール抗体に比べて癌の増大が有意に抑制された。
また各移植マウスの生存の確認を毎日行った（図５）。図５に結果を示す実験においては、野生型マウスにＲＡＮＫＬ中和抗体あるいはコントロール抗体を２週おきに２回投与し、さらに２週間後にマウス癌細胞ＥＬ４を皮下移植後、マウスの生存を確認した。図５において、ＲＡＮＫＬ中和抗体投与群及びコントロール投与群の生存曲線を示す。図５に示すように、ＲＡＮＫＬ中和抗体を投与したマウス群ではコントロール抗体に比べてマウスの生存率が向上した。
【実施例２】
【０００８】
ＲＡＮＫＬ中和抗体のリンパ球を介した癌免疫増強効果
ＲＡＮＫＬ中和抗体を投与したマウスのリンパ球に癌の増大を抑制する効果があることを調べるために、ＲＡＮＫＬ中和抗体を投与したマウスの胸腺リンパ球又は脾臓リンパ球をヌードマウスに移入し、癌抑制効果を調べた。
ネンブタール麻酔下、野性型（Ｂａｌｂ／ｃＡ  ＪＣＬ、日本クレア）の６週齢雌マウスにＲＡＮＫＬ中和抗体（オリエンタル酵母工業、ｃｌｏｎｅ，ＯＹＣ１）及びコントロール抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ラット精製ＩｇＧ）（各３例）を５ｍｇ／ｋｇの用量で頸部に皮下投与した。二週間後、もう一度同じ用量で二回目の投与を行った。最終投与から二週間後に胸腺又は脾臓からリンパ球を分取し、６週齢雌ＢＡＬＢ／ｃＡ  ｎｕ／ｎｕマウス（日本クレア）に静脈注射で移入すると同時に癌細胞株（Ｍｅｔｈ  Ａ；５ｘ１０６細胞）を皮下に移植した。
腫瘍の大きさは短経ａ  ｍｍ，長径ｂ  ｍｍを電子ノギスで測定し、体積を（ａ×ｂ）３／２×π／６とした（図６及び図７）。図６に結果を示す実験においては、野生型マウス（Ｂａｌｂ／ｃＡ  ＪＣＬ、日本クレア）にＲＡＮＫＬ中和抗体、又はコントロール抗体を２週おきに２回投与し、さらに２週間後に胸腺リンパ球を分取、６週齢雌ＢＡＬＢ／ｃＡ  ｎｕ／ｎｕマウス（日本クレア）に静脈注射で移入すると同時に癌細胞株（Ｍｅｔｈ  Ａ；５ｘ１０６細胞）を皮下に移植した。癌細胞移植後、八日目から腫瘍の大きさを測定した。図６に示すように、ＲＡＮＫＬ中和抗体を投与したマウス由来胸腺リンパ球移入群（黒四角）ではコントロール抗体を投与したマウス由来胸腺リンパ球移入群（黒丸）に比べて癌の増大が有意に抑制された。図７、図８、図９に結果を示す実験においては、野生型マウスにＲＡＮＫＬ中和抗体又はコントロール抗体を２週おきに２回投与し、さらに２週間後に脾臓リンパ球を分取、６週齢雌ＢＡＬＢ／ｃＡ  ｎｕ／ｎｕマウス（日本クレア）に静脈注射で移入すると同時に癌細胞株（Ｍｅｔｈ  Ａ）を皮下に移植した．移植後、５日目から腫瘍の大きさを測定した。図７に示すように、ＲＡＮＫＬ中和抗体を投与したマウス由来脾臓リンパ球移入群（白四角）ではコントロール抗体を投与したマウス由来脾臓リンパ球移入群（黒四角）に比べて癌の増大が有意に抑制された。さらに図８に結果を示す実験では、移植後２２日目に癌を採取、癌の重量とマウスの体重を測定し、その比率を決定した。ＲＡＮＫＬ中和抗体を投与したマウス由来リンパ球投与群ではコントロール抗体に比べて体重に対する癌の重量が有意に小さかった。さらに図８及び図９に示すように脾臓リンパ球投与群のうち３例中１例のマウスでは癌がほぼ寛解した。図９において、図９ＡはコントロールＩｇＧを投与したマウスの癌の増大の様子を、図９Ｂは抗ＲＡＮＫＬ抗体を投与したマウスの癌の増大の様子を示す。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
抗ＲＡＮＫＬ中和抗体等のＲＡＮＫＬのアンタゴニストを癌免疫治療剤として用いることができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図２】
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【図９】
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【国際調査報告】
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