(57)【要約】  新規な関節リウマチの検査方法、及びそのような検査方法に使用される関節リウマチ検査用キットを提供する。  本発明に係る関節リウマチの検査方法は、被検動物の血漿中又は血清中におけるタリン量を測定する工程を含むことを特徴とする。この測定は、例えば、タリンに結合する抗体を用いた免疫学的手法により行われる。本発明に係る関節リウマチ検査用キットは、このような検査方法に使用するためのものであり、例えば、タリンに結合する抗体を固着させた固相担体を含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検動物の血漿中又は血清中におけるタリン量を測定する工程を含む関節リウマチの検査方法。
【請求項２】
前記被検動物より採取された血液から血漿又は血清を得る工程をさらに含む請求項１記載の関節リウマチの検査方法。
【請求項３】
タリンに結合する抗体を用いて、前記血漿中又は血清中のタリン量を測定する請求項１又は２記載の関節リウマチの検査方法。
【請求項４】
前記被検動物がヒトである請求項１から３のいずれか１項記載の関節リウマチの検査方法。
【請求項５】
関節リウマチの診断又は関節リウマチ治療薬の治療効果の判定のために行われる請求項１から４のいずれか１項記載の関節リウマチの検査方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項記載の関節リウマチの検査方法に使用するための関節リウマチ検査用キット。
【請求項７】
タリンに結合する抗体を固着させた固相担体を含む請求項６記載の関節リウマチ検査用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチの検査方法、及びそのような検査方法に使用される関節リウマチ検査用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＲＡ）は、関節の滑膜組織を病変の主座とする慢性炎症性疾患であり、有病率が人口の約１％を占める疾患である。関節リウマチは、その初期には滑膜炎を来し、次第に軟骨や骨が侵され、進行すると関節が破壊され変形する。また、症状の経過は、関節炎の寛解・再燃を繰り返し、完治する例や急速に進行する例など多彩である。【０００３】
関節リウマチの診断は主に症状によってなされるが、近年、患者の血清中に含まれる自己抗体をマーカーとした診断方法が注目されている。そのような自己抗体としては、リウマトイド因子（変性ＩｇＧに対する自己抗体）、抗環状シトルリン化ペプチド抗体（抗ＣＣＰ抗体）等が知られている（非特許文献１参照）。【０００４】
しかしながら、これまでの報告では、リウマトイド因子の感度は７５〜８０％、特異度は５０〜７０％、抗ＣＣＰ抗体の感度は５０〜７５％、特異度は８５〜９５％であり、必ずしも満足のいくものではなかった（非特許文献２，３参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍａｒｔｉｎｕｓ  Ａ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．  Ｔｈｅｒ．，  ４：  ８７−９３，  ２００２
【非特許文献２】Ａｖｏｕａｃ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｈｅｕｍ．  Ｄｉｓ．  ６５：  ８４５−８５１，  ２００６
【非特許文献３】ｖａｎ  Ｖｅｎｒｏｏｉｊ  ＷＪ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １１４３：  ２６８−２８５，  ２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明は、これまでに知られていない新規マーカーの探索を行い、見出された新規マーカーをもとに関節リウマチの検査方法及び関節リウマチ検査用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
関節リウマチ患者では、血中のリンパ球が活性化されて血管内皮細胞との細胞接着が亢進するのと同時にリンパ球遊走も亢進する結果、血管外にリンパ球が浸潤し、この浸潤リンパ球が様々な炎症を引き起こすことが知られている。そこで本件発明者は、新規マーカーの探索を行うにあたり、細胞と基質とが接着する領域、特にリンパ球内では細胞接着領域に主に集中して発現される高分子細胞骨格タンパク質であるタリン（Ｔａｌｉｎ）に着目した。【０００８】
タリンは、ＦＥＲＭ領域を含む分子量４７ｋＤａのＮ末端領域と、一束のαヘリックスからなる分子量１９０ｋＤａのＣ末端領域とから構成されるタンパク質である。ＦＥＲＭ領域はさらに、Ｎ末端側からＦ１ドメイン、Ｆ２ドメイン、Ｆ３ドメインの３つのサブ領域に分けられている。生体内では、カルパイン（Ｃａｌｐａｉｎ）によって切断されたＮ末端領域のポリペプチド、その中でもＦ３ドメインがインテグリンβサブユニットに結合し、インテグリンの細胞内から細胞外へのシグナル伝達を増強させ、細胞接着や細胞遊走を亢進することが知られている。【０００９】
本件発明者は、関節リウマチ患者の血漿又は血清中におけるタリンの存在について検討した。その結果、意外にも、関節リウマチ患者においてはタリンが血漿又は血清中に優位に存在することを見出した。また、関節リウマチ治療薬によって関節リウマチが低疾患活動性又は寛解に至った場合には、タリン量が有意に低下することを見出した。
本発明は、このような知見に基づいて完成されたものであり、具体的には以下のとおりである。【００１０】
（１）  被検動物の血漿中又は血清中におけるタリン量を測定する工程を含む関節リウマチの検査方法。
（２）  上記被検動物より採取された血液から血漿又は血清を得る工程をさらに含む上記（１）記載の関節リウマチの検査方法。
（３）  タリンに結合する抗体を用いて、上記血漿中又は血清中のタリン量を測定する上記（１）又は（２）記載の関節リウマチの検査方法。
（４）  上記被検動物がヒトである上記（１）から（３）のいずれか１項記載の関節リウマチの検査方法。
（５）  関節リウマチの診断又は関節リウマチ治療薬の治療効果の判定のために行われる上記（１）から（４）のいずれか１項記載の関節リウマチの検査方法。
（６）  上記（１）から（５）のいずれか１項記載の関節リウマチの検査方法に使用するための関節リウマチ検査用キット。
（７）  タリンに結合する抗体を固着させた固相担体を含む上記（６）記載の関節リウマチ検査用キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、新規な関節リウマチの検査方法、及びそのような検査方法に使用される関節リウマチ検査用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｈ−１８抗体及びＨ−３００抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による関節リウマチ診断（実施例１）のＲＯＣ曲線を示す図である。
【図２】Ｈ−１８抗体及びＭ５４２４６Ｍ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による関節リウマチ診断（実施例２）のＲＯＣ曲線を示す図である。
【図３】抗ＣＣＰ抗体を用いた関節リウマチ診断（比較例１）のＲＯＣ曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜関節リウマチの検査方法＞
本発明に係る関節リウマチの検査方法は、被検動物の血漿中又は血清中におけるタリン量を測定する工程を含むものである。この検査方法は、被検動物より採取された血液から血漿又は血清を得る工程をさらに含んでいてもよい。
【００１４】
被検動物としては、関節リウマチに罹患し得る動物であれば特に制限はなく、目的に応じて選択することができる。例えば、ヒト、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ネコ、ウサギ、モルモット等が挙げられるが、その中でもヒトが好ましい。
【００１５】
また、血漿及び血清の取得方法は特に限定されず、従来公知の方法、例えば血液から臨床検査用検体として取得する血漿、血清の分離方法に準じることができる。例えば、血液をＥＤＴＡ管やヘパリン管等に採り、遠心分離することにより、血漿を得ることができる。また、血液を試験管等に採り、遠心分離することにより、血清を得ることができる。
【００１６】
本発明に係る関節リウマチの検査方法では、このようにして得られた血漿中又は血清中におけるタリン量を測定する。ここで、「タリン量」とは、タリンのタンパク質量を意味する。タリンが複数のアイソフォームを有する場合、そのいずれを測定してもよい。例えばヒトの場合、タリン１、タリン２の２種類のアイソフォームが存在する。タリン１のｍＲＮＡ配列、アミノ酸配列をそれぞれ配列番号１，２に示す。また、タリン２のｍＲＮＡ配列、アミノ酸配列をそれぞれ配列番号３，４に示す。
【００１７】
被検動物の血漿中又は血清中におけるタリン量は、タリンに結合する抗体を用いて、免疫化学的方法により測定することができる。
【００１８】
タリンに結合する抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、場合によっては、抗体のフラグメント、例えばＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２を用いることができる。これらの抗体は、従来公知の方法により作製することができる。
市販品としては、Ｈ−１８抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー社）、Ｈ−３００抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー社）、ＴＡ２０５抗体（アブカム社）、Ｍ５４２４６Ｍ抗体（バイオデザイン社）等が挙げられる。
【００１９】
タリン量の測定は、公知のエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ケミルミネッセントイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フルオロイムノアッセイ、ラテックス凝集法等の方法を採用して実施できる。具体的には、例えば、抗体及び標識抗原を用いる競合法、抗原に対する認識部位が異なる２種類のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体（あるいはモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体）を組み合わせて用いるサンドイッチＥＩＡ法、抗体を固着させたラテックス粒子を用いるラテックス凝集法等が挙げられる。
【００２０】
これら測定法においては、必要に応じて、抗原又は抗体を適当な固相担体に固着させることができる。固相担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリル酸エステル、ナイロン、ポリアセタール、フッ素樹脂等の合成樹脂、セルロース、アガロース等の多糖類、ガラス、金属等が挙げられる。この固相担体は、マイクロプレート状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試験管等の種々の形状とすることができる。
【００２１】
上述のような免疫化学的方法において、抗体や抗原は必要に応じて標識したものが使用される。このような標識としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、発光物質（アクリジニウムエステル、イソルミノール、ルシフェリン等）のほか、放射性同位元素（１２４Ｉ、１４Ｃ、３Ｈ）、蛍光物質（フルオレッセインイソチオシアネート等）等が挙げられる。このほか、ビオチン標識とストレプトアビジンとを組み合わせて用いる方法も採用できる。
【００２２】
以上のようにして被検動物の血漿中又は血清中におけるタリン量を測定・定量することにより、関節リウマチへの罹患を簡便に診断することができる。すなわち、血漿中又は血清中におけるタリン量が所定の閾値よりも多い場合には、関節リウマチに罹患していると判断することができる。この所定の閾値は、例えば、関節リウマチに罹患していない対照動物の血漿又は血清における平均値等に基づいて設定することができる。
【００２３】
また、関節リウマチ治療薬の投与前後におけるタリン量を測定・定量することにより、該治療薬による治療効果を簡便に判定することができる。すなわち、関節リウマチ治療薬の投与後におけるタリン量が投与前におけるタリン量よりも有意に低下していれば、その治療薬が有効であると判定することができる。
【００２４】
ここで、関節リウマチ治療薬としては、従来公知の治療薬及び今後開発される全ての治療薬を含めることができる。従来公知の関節リウマチ治療薬としては、例えば生物学的製剤、非ステロイド性抗炎症薬（消炎鎮痛薬）、ステロイド薬、免疫抑制剤等が挙げられる。
生物学的製剤としては、キメラ型抗ＴＮＦ−α抗体製剤、可溶性ＴＮＦレセプターや、完全ヒト型抗ＴＮＦ−α抗体製剤、抗ＩＬ−６レセプター抗体製剤等が挙げられる。非ステロイド性抗炎症薬としては、プロスタグランジン産生抑制剤が挙げられ、関節の痛みや腫れを軽減化させることはできるが、疾患自体の進行や骨・関節の破壊を抑制することは困難といわれている。ステロイド薬は、優れた抗炎症効果により、関節リウマチの特効薬として利用されているが、その副作用も問題である。免疫抑制剤は、関節リウマチ患者の免疫異常を改善させることにより関節リウマチの炎症を抑制し、寛解導入を目的とするものであり、関節リウマチの進行を阻止する可能性があることから、疾患修飾性抗リウマチ薬ともいわれている。効果発現までに時間を要することから遅効性抗リウマチ薬とも呼ばれている。
上記のように、関節リウマチ治療薬は多種類存在するが、治療薬の効果の程度を判定し、最も効果的な治療薬を選択するためにも、本発明に係る検査方法は有用である。
【００２５】
＜関節リウマチ検査用キット＞
本発明に係る関節リウマチ検査用キットは、本発明に係る関節リウマチの検査方法に使用するためのものである。この診断用キットには、例えば、タリンに結合する抗体を固着させた固相担体が含まれる。また、標識された２次抗体や発色基質等が含まれていてもよい。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。なお、以下の実施例１，２、比較例１では、関節リウマチ患者（ＲＡ患者）１７例、コントロール１４例（変形性関節症患者８例、全身性エリテマトーデス患者１例、糖尿病患者１例、健常者４例）を被検者とした。また、以下の実施例３では、ＲＡ患者５例を被検者とした。【００２７】
＜実施例１＞
各被検者の血液をＥＤＴＡ管に採り、室温で１０分間、２５００ｒｐｍで遠心分離することにより血漿を得た。【００２８】
この血漿中におけるタリン量をサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。
まず、タリンのＮ末端を認識するＨ−１８抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー社）を１μｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で希釈し、１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように９６穴マイクロプレートに加え、４℃で一晩インキュベートした後、２００μＬ／ｗｅｌｌの洗浄液で３回洗浄した。次いで、各被検者の血漿を１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように９６穴マイクロプレートに加え、２５℃で１時間インキュベートした後、２００μＬ／ｗｅｌｌの洗浄液で３回洗浄した。次いで、一次抗体としてタリンのＮ末端を認識するＨ−３００抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー社）を２μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈し、１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように９６穴マイクロプレートに加え、２５℃で１時間インキュベートした後、２００μＬ／ｗｅｌｌの洗浄液で３回洗浄した。次いで、二次抗体としてＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ抗体（ＫＰＬ社）を２μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈し、１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように９６穴マイクロプレートに加え、２５℃で１時間インキュベートした後、２００μＬ／ｗｅｌｌの洗浄液で３回洗浄した。
次いで、基質を１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように９６穴マイクロプレートに加え、２５℃で１５分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーを用いて波長６３０ｎｍのＯＤ値を測定した。【００２９】
実施例１におけるＲＯＣ曲線を図１に示す。ＲＯＣ解析の結果、図１についてのＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は０．９５４であった。また、ＯＤ＝０．２０をカットオフ値とした場合の陽性、陰性の別を下記表１に示す。【００３０】
【表１】
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【００３１】
この結果から、Ｈ−１８抗体及びＨ−３００抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による関節リウマチ診断は、感度が１４／１７×１００＝８２．４％、特異度が１４／１４×１００＝１００％であった。【００３２】
＜実施例２＞
一次抗体としてタリンのＣ末端を認識するＭ５４２４６Ｍ抗体（バイオデザイン社）を用いたほかは実施例１と同様にして、血漿中におけるタリン量をサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。
実施例２におけるＲＯＣ曲線を図２に示す。ＲＯＣ解析の結果、図２についてのＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は０．８１９であった。また、ＯＤ＝０．０５をカットオフ値とした場合の陽性、陰性の別を下記表２に示す。【００３３】
【表２】
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【００３４】
この結果から、Ｈ−１８抗体及びＭ５４２４６Ｍ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による関節リウマチ診断は、感度が１５／１７×１００＝８８．２％、特異度が１１／１４×１００＝７８．６％であった。【００３５】
＜比較例１＞
各被検者の血液を血清用採血管に採り、室温で１０分間、２，５００ｒｐｍで遠心分離することにより血清を得た。この血清中における抗ＣＣＰ抗体価を、市販キット（メサカップＣＣＰ、ＭＢＬ社）を用いて測定した。
比較例１におけるＲＯＣ曲線を図３に示す。ＲＯＣ解析の結果、図３についてのＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は０．８３８であった。また、抗体価＝６．６０をカットオフ値とした場合の陽性、陰性の別を下記表３に示す。【００３６】
【表３】
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【００３７】
この結果から、抗ＣＣＰ抗体を用いた関節リウマチ診断は、感度が１１／１７×１００＝６４．７％、特異度が１３／１４×１００＝９２．９％であった。【００３８】
以上の結果から分かるように、ＲＡ患者の血中にはタリンが優位に存在し、したがって、血中のタリン量を測定することにより、関節リウマチへの罹患を簡便に検査することが可能である。しかも、その検査方法は、抗ＣＣＰ抗体を用いた既存の方法よりも感度に優れたものである。【００３９】
＜実施例３＞
５名のＲＡ患者に対する関節リウマチ治療薬の治療効果を、タリン量の測定により確認した。タリン量の測定は、実施例１と同様に、Ｈ−１８抗体及びＨ−３００抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によりＯＤ値を測定することにより行った。また、通常の臨床検査と同手法により、ＣＲＰ量、ＭＭＰ−３量の測定も行った。さらに、ヨーロッパリウマチ連盟（ＥＵＬＡＲ）が推奨するＤＡＳ（Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｓｃｏｒｅ）２８のスコアも算出した。ＤＡＳ２８のスコアは、５．１以上が高疾患活動性、３．２以上５．１未満が中疾患活動性、３．２未満が低疾患活動性と判断される。結果を下記表４に示す。【００４０】
【表４】
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【００４１】
症例１は、ＭＴＸ（メトトレキサート）を用いた治療にＡＤＡ（アダリムマブ）を併用することによって、ＥＵＬＡＲの反応性基準に当てはめたときにｇｏｏｄ  ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ（ＤＡＳ２８：５．４３→２．６２）であった一例である。タリン量は、ＭＴＸのみの場合には高値（ＯＤ値：０．５６８）であったが、ＡＤＡを併用することによって正常値（ＯＤ値：０．１３９）となっていた。一方、ＭＭＰ−３量は、ＡＤＡの併用によっても有意な低下を示さず、関節リウマチの病態を反映していなかった。【００４２】
症例２は、ＳＡＳＰ（サラゾスフファピリジン）を用いた治療によっても、ＥＵＬＡＲの反応性基準に当てはめたときにｎｏｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ（ＤＡＳ２８：５．１２→４．２１）であった一例である。タリン量は、ＳＡＳＰ治療によっても高値のまま（ＯＤ値：０．２５８→０．２９４）であった。一方、ＣＲＰ量はＳＡＳＰ治療後に正常値（０．１９ｍｇ／ｄＬ）となっており、関節リウマチの病態を反映していなかった。【００４３】
症例３は、ＭＴＸ（メトトレキサート）を用いた治療にＩＦＸ（インフリキシマブ）を併用したにも関わらず、ｎｏｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ（ＤＡＳ２８：４．８７→３．９５）であった一例である。タリン量は、ＩＦＸの併用によっても高値のまま（ＯＤ値：０．２０５→０．２２３）であった。【００４４】
症例４は、ＢＵＣ（ブシラミン）を用いた治療にＡＤＡ（アダリムマブ）を併用することによって、ｇｏｏｄ  ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ（ＤＡＳ２８：４．５５→２．４５）であった一例である。タリン量は、ＢＵＣのみの場合には高値（ＯＤ値：０．２５８）であったが、ＡＤＡを併用することによって正常値（ＯＤ値：０．１６４）となっていた。【００４５】
症例５は、ＴＣＺ（トシリズマブ）を用いた治療によっても、ｎｏｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ（ＤＡＳ２８：５．０９→４．５０）であった一例である。タリン量は、ＴＣＺ治療によっても高値のまま（ＯＤ値：２．０９３→１．７８７）であった。【００４６】
以上の結果から分かるように、血中のタリン量は、関節リウマチの病態と相関しており、しかも、ＣＲＰやＭＭＰ−３といった他の因子よりも関節リウマチの病態を正確に反映していた。したがって、血中のタリン量を測定することにより、関節リウマチ治療薬による治療効果を簡便且つ正確に判定することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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