(57)【要約】  目的タンパクの発現を向上させる手段・方法を提供すること。  下記の（ｉ）〜（iii）いずれか１つに記載のペプチド及び有用タンパク質を共発現可能な形質転換体に、前記ペプチド及び有用タンパク質を発現させる工程を有することを特徴とする有用タンパク質の高発現方法。  （ｉ）配列番号１（ＡＫＤＧＴＫＥＫＡＧＥ）で表されるアミノ酸配列を有するペプチド  （ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有するペプチド  （iii）前記（ｉ）又は（ii）に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチド【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ｉ）〜（iii）いずれか１つに記載のペプチド及び有用タンパク質を共発現可能な形質転換体に、前記ペプチド及び有用タンパク質を発現させる工程を有することを特徴とする
有用タンパク質の高発現方法。
（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド
（ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有し、ペプチドの１、５及び９番目の少なくとも２つに非極性の側鎖を有するアミノ酸残基を有し、３、７及び１１番目の少なくとも２つに負電荷基が存在するアミノ酸残基を有し、かつ、２、６及び８番目の少なくとも２つに正電荷基が存在するアミノ酸残基を有するペプチド
（iii）前記（ｉ）又は（ii）に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチド
【請求項２】
１、５及び９番目の少なくとも２つに存在する非極性の側鎖を有するアミノ酸残基が、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ、Ｍ、Ｆ、及びＰよりなる群から選ばれたアミノ酸の残基である、請求項１に記載の有用タンパク質の高発現方法。
【請求項３】
３、７及び１１番目の少なくとも２つに存在する負電荷基が存在するアミノ酸残基が、Ｄ又はＥで表されるアミノ酸の残基である、請求項１又は２に記載の有用タンパク質の高発現方法。
【請求項４】
２、６及び８番目の少なくとも２つに存在する正電荷基が存在するアミノ酸残基が、Ｋ、Ｒ及びＨよりなる群から選ばれたアミノ酸の残基である、請求項１〜３いずれか１つに記載の有用タンパク質の高発現方法。
【請求項５】
下記の（ｉ）〜（iii）いずれか１つに記載のペプチド及び有用タンパク質を共発現可能であることを特徴とする形質転換体。
（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド
（ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有し、ペプチドの１、５及び９番目の少なくとも２つに非極性の側鎖を有するアミノ酸残基を有し、３、７及び１１番目の少なくとも２つに負電荷基が存在するアミノ酸残基を有し、かつ、２、６及び８番目の少なくとも２つに正電荷基が存在するアミノ酸残基を有するペプチド
（iii）前記（ｉ）又は（ii）に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチド
【請求項６】
下記の（ｉ）〜（iii）いずれか１つに記載のペプチドをコードするＤＮＡを含むことを特徴とする発現ベクター。
（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド
（ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有し、ペプチドの１、５及び９番目の少なくとも２つに非極性の側鎖を有するアミノ酸残基を有し、３、７及び１１番目の少なくとも２つに負電荷基が存在するアミノ酸残基を有し、かつ、２、６及び８番目の少なくとも２つに正電荷基が存在するアミノ酸残基を有するペプチド
（iii）前記（ｉ）又は（ii）に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチド
【請求項７】
前記発現ベクターが、更に有用タンパク質をコードするＤＮＡを含む、請求項６に記載の発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用タンパク質（目的タンパク質）を発現させる際に、大量に発現させるシステムの構築に関するもので、有用タンパク質やその代謝物の安定した高生産を可能にするものである。具体的には、本発明は目的タンパク質の発現を向上させる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組み換え技術の発展と共に、高等生物の有用タンパク質を、大腸菌や酵母などの微生物を利用して生産することが可能となってきた。有用タンパク質やその代謝物の安定した高生産を可能とするため、高い発現能力を有するプロモーターを、他の種からクローニングしたり、遺伝子配列を改変することで強力なプロモーターを開発し、それらがタンパク質の高発現に応用されている（特許文献１）。また、ｍＲＮＡ分解酵素の欠損株を用いて、目的遺伝子のｍＲＮＡの安定性を向上させることによる、タンパク質の新規大量生産方法も開発されている（特許文献２）。【０００３】
一方、発現の際、発現誘導剤などを用いて大量にタンパク質を発現させると、細胞内で封入体を形成することがあり、むやみに強発現させることはできないという問題点がある。
その様な問題を解決するため、発現したタンパク質を生体外へ分泌させたり、違う宿主に発現させることで、タンパク質収率を向上させる報告もある（特許文献３）。しかし、これらの技術は、特定の宿主に対する発明であり、宿主が異なるとその技術が使えない。【０００４】
そこで、本発明者らは、細胞内に目的タンパク質を過剰に発現させることに起因する封入体形成を抑止し、どのような宿主に対しても目的タンパク質の発現を向上させる手法を提供することを検討した。そして、本発明者らは、植物と一部の生物に、乾燥ストレス耐性遺伝子として知られているLate Embryogenesis Abundant Protein（ＬＥＡタンパク質）があることに着目し、これを封入体形成の抑止に利用することを検討した。ＬＥＡタンパク質は、約１１個のアミノ酸配列が繰り返し存在する特徴的なタンパク質であり、塩・乾燥ストレスに対応し、タンパク質の構造を保持する役割を持つと言われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−８１２２２号公報
【特許文献２】特開２００２−２３８５７６号公報
【特許文献３】特開２００８−１９３９５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、目的タンパク質の発現を向上させる手段・方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために、本発明者らは、ＬＥＡタンパク質の基本配列である１１アミノ酸からなるペプチドを目的タンパク質と共発現させると、目的タンパク質の発現量が増大することを知見し、本技術を有用タンパク質やその代謝物の安定した高生産に利用するという発明を完成するに至った。【０００８】
上記課題は、下記の＜１＞、＜５＞及び＜６＞に記載の手段によって解決された。好ましい実施態様である＜２＞〜＜４＞、＜７＞とともに以下に記載する。
＜１＞  下記の（ｉ）〜（iii）いずれか１つに記載のペプチド及び有用タンパク質を共発現可能な形質転換体に、前記ペプチド及び有用タンパク質を発現させる工程を有することを特徴とする有用タンパク質の高発現方法、
（ｉ）配列番号１（ＡＫＤＧＴＫＥＫＡＧＥ）のアミノ酸配列を有するペプチド
（ii）配列番号１（ＡＫＤＧＴＫＥＫＡＧＥ）のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有し、ペプチドの１、５及び９番目の少なくとも２つに非極性の側鎖を有するアミノ酸残基を有し、３、７及び１１番目の少なくとも２つに負電荷基が存在するアミノ酸残基を有し、かつ、２、６及び８番目の少なくとも２つに正電荷基が存在するアミノ酸残基を有するペプチド
（iii）前記（ｉ）又は（ii）に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチド
＜２＞  １、５及び９番目の少なくとも２つに存在する非極性の側鎖を有するアミノ酸残基が、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ、Ｍ、Ｆ、及びＰからなる群から選ばれたアミノ酸の残基である、＜１＞に記載の有用タンパク質の高発現方法、
＜３＞  ３、７及び１１番目の少なくとも２つに存在する負電荷基が存在するアミノ酸残基が、Ｄ又はＥで表されるアミノ酸の残基である、＜１＞又は＜２＞に記載の有用タンパク質の高発現方法、
＜４＞  ２、６及び８番目の少なくとも２つに存在する正電荷基が存在するアミノ酸残基が、Ｋ、Ｒ及びＨからなる群から選ばれたアミノ酸の残基である、＜１＞〜＜３＞いずれか１つに記載の有用タンパク質の高発現方法、
＜５＞  下記の（ｉ）〜（iii）いずれか１つに記載のペプチド及び有用タンパク質を共発現可能であることを特徴とする形質転換体、
（ｉ）ＡＫＤＧＴＫＥＫＡＧＥのアミノ酸配列を有するペプチド
（ii）ＡＫＤＧＴＫＥＫＡＧＥのアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有し、ペプチドの１、５及び９番目の少なくとも２つに非極性の側鎖を有するアミノ酸残基を有し、３、７及び１１番目の少なくとも２つに負電荷基が存在するアミノ酸残基を有し、かつ、２、６及び８番目の少なくとも２つに正電荷基が存在するアミノ酸残基を有するペプチド
（iii）前記（ｉ）又は（ii）に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチド
＜６＞  下記の（ｉ）〜（iii）いずれか１つに記載のペプチドをコードするＤＮＡを含むことを特徴とする発現ベクター、
（ｉ）ＡＫＤＧＴＫＥＫＡＧＥのアミノ酸配列を有するペプチド
（ii）ＡＫＤＧＴＫＥＫＡＧＥのアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有し、ペプチドの１、５及び９番目の少なくとも２つに非極性の側鎖を有するアミノ酸残基を有し、３、７及び１１番目の少なくとも２つに負電荷基が存在するアミノ酸残基を有し、かつ、２、６及び８番目の少なくとも２つに正電荷基が存在するアミノ酸残基を有するペプチド
（iii）前記（ｉ）又は（ii）に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチド
＜７＞  前記発現ベクターが、更に有用タンパク質をコードするＤＮＡを含む、＜６＞に記載の発現ベクター。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、ＬＥＡタンパク質の繰り返し配列の一部である１１アミノ酸又は、その置換、付加、欠失体を細胞内で目的タンパク質と共発現させることで、細胞内で目的タンパク質を高生産させることを目的としてなされたものである。
本発明によれば、様々な宿主に対して、目的タンパク質と特定のペプチドを共発現させることで、目的タンパク質を高効率に発現・生産することができた。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の形質転換体の、ＧＦＰの発現の程度を示す図である。
【図２】実施例２の結果を示す図である。
【図３】実施例３の結果を示す図である。
【図４】実施例４の結果を示す図である。
【図５】実施例５の結果を表す図である。
【図６】実施例６の結果を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の有用タンパク質（目的タンパク質ともいう。）の高発現方法は、下記の（ｉ）〜（iii）いずれか１つに記載のペプチド及び有用タンパク質を共発現可能な形質転換体に、前記ペプチド及び有用タンパク質を発現させる工程を有することを特徴とする。
（ｉ）配列番号１（ＡＫＤＧＴＫＥＫＡＧＥ）のアミノ酸配列を有するペプチド
（ii）配列番号１（ＡＫＤＧＴＫＥＫＡＧＥ）のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有し、ペプチドの１、５及び９番目の少なくとも２つに非極性の側鎖を有するアミノ酸残基を有し、３、７及び１１番目の少なくとも２つに負電荷基が存在するアミノ酸残基を有し、かつ、２、６及び８番目の少なくとも２つに正電荷基が存在するアミノ酸残基を有するペプチド
（iii）前記（ｉ）又は（ii）に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチド
なお、本発明において、有用タンパク質と、少なくとも（ｉ）〜（iii）で表されるいずれか１つのペプチドとを共発現させればよく、有用タンパク質と、（ｉ）〜(iii)で表されるペプチドの２つ以上とを共発現させてもよく、特に限定されない。
【００１２】
ＬＥＡタンパク質は、塩ストレス耐性、乾燥ストレス耐性に関与するタンパク質として知られているが、本発明者らは、タンパク質を大量発現している細胞内も発現タンパク質による一種のストレス状態であると仮説を立て、ＬＥＡタンパク質を共発現させることで、封入体を形成することなく、目的タンパク質の発現効率を上げるということを着想したものである。その着想に基づき、細胞内でＬＥＡタンパク質の主配列を繰り返した遺伝子を、目的タンパク質の遺伝子と共発現するように、それぞれプロモーターの下流に挿入したベクターを構築した。その形質転換細胞を用いて、発現誘導剤を過剰に加えることにより、細胞内に大量に目的タンパク質及びＬＥＡタンパク質を発現させ、封入体形成の抑制及び目的タンパク質の発現効率の向上を検討した。
【００１３】
そして、様々な繰り返し数のＬＥＡ由来のタンパク質を共発現させ試行錯誤をした結果、本発明者等は、上記の発現系において、ＬＥＡタンパク質の主配列である１１アミノ酸からなるペプチドのみを共発現させたとき、目的タンパク質の発現が向上することを見出したものである。なお、前記の目的タンパク質の発現の向上は、封入体の形成が抑制されたためであると推測される。
【００１４】
本目的に用いる上記（ｉ）に示すペプチドは、ＬＥＡタンパク質中に含まれる配列のものである。ＬＥＡタンパク質は、線虫のCaenorhabditis elegansや細菌類のHaemophilus influenzae、Dienococcus radioduransにも、植物と同じように存在し、ＬＥＡタンパク質中に１１アミノ酸の繰り返し配列が存在し、そのアミノ酸配列には配列の規則性が存在する。また、一次構造と発現パターンの違いからグループ１〜６に分類され、中でも機能的に特徴があるグループ３のＬＥＡタンパク質の配列のものが好ましい。
【００１５】
以下に、本発明で使用する（ｉ）〜（iii）のペプチド（以下、（ｉ）〜（iii）のペプチドを総称して、「ＬＥＡペプチド」ともいう。）について、以下に詳述する。
＜（ｉ）ＡＫＤＧＴＫＥＫＡＧＥのアミノ酸配列を有するペプチド＞
上記（ｉ）に示すペプチドは、上述の通り、グループ３に属するＬＥＡタンパク質の主配列である１１アミノ酸からなるペプチドの一種である。
【００１６】
＜（ii）ＡＫＤＧＴＫＥＫＡＧＥのアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有し、ペプチドの１、５及び９番目の少なくとも２つに非極性の側鎖を有するアミノ酸残基を有し、３、７及び１１番目の少なくとも２つに負電荷基が存在するアミノ酸残基を有し、かつ、２、６及び８番目の少なくとも２つに正電荷基が存在するアミノ酸残基を有するペプチド＞
（ii）に示すペプチドは、（ｉ）に示す配列番号１のペプチド（ＡＫＤＧＴＫＥＫＡＧＥ）のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有する。
該アミノ酸配列は、１、５及び９番目の少なくとも２つに非極性の側鎖を有するアミノ酸残基を有する。非極性の側鎖を有するアミノ酸残基は、Ａ（アラニン）、Ｖ（バリン）、Ｌ（ロイシン）、Ｉ（イソロイシン）、Ｗ（トリプトファン）、Ｍ（メチオニン）、Ｆ（フェニルアラニン）、及びＰ（プロリン）よりなる群から選択されたアミノ酸の残基であることが好ましい。Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ及びＭよりなる群から選択されたアミノ酸の残基であることがより好ましく、Ａ、Ｖ、Ｌ及びＩよりなる群から選択されたアミノ酸の残基であることが更に好ましい。また、１、５及び９番目の少なくとも２つに非極性の側鎖を有するアミノ酸残基が、少なくとも１番目及び９番目に非極性の側鎖を有するアミノ酸残基を有することが好ましく、１、５及び９番目に非極性の側鎖を有するアミノ酸残基を有することが更に好ましい。
また、１、５及び９番目のアミノ酸残基が、非極性の側鎖を有するアミノ酸残基以外である場合には、正又は負に荷電していないことが好ましい。
【００１７】
また、（ii）に示すペプチドは、３、７及び１１番目の少なくとも２つに負電荷基が存在するアミノ酸残基を有する。負電荷基が存在するアミノ酸残基は、Ｄ（アスパラギン酸）又はＥ（グルタミン酸）で表されるアミノ酸の残基あることが好ましい。３、７及び１１番目のアミノ酸残基のいずれもが、負電荷基が存在するアミノ酸残基であることがより好ましい。
【００１８】
更に、（ii）に示すペプチドは、２、６及び８番目の少なくとも２つに正電荷基が存在するアミノ酸残基を有する。正電荷基が存在するアミノ酸残基は、Ｋ（リジン）、Ｒ（アルギニン）及びＨ（ヒスチジン）よりなる群から選ばれたアミノ酸の残基であることが好ましい。２、６及び８番目のいずれもが、正電荷基が存在するアミノ酸残基であることがより好ましい。
【００１９】
なお、（ii）に示すペプチドの４及び１０番目は特に限定されず、いずれのアミノ酸残基であってもよいが、正電荷基及び負電荷基を有していないことが好ましい。
【００２０】
（ii）に示すペプチドの具体例としては、ＡＫＤＧＴＫＥＫＡＧＥの５番目のＴをＬに置換したＡＫＤＧＬＫＥＫＡＧＥ（配列番号２）が挙げられる。
【００２１】
＜（iii）前記（ｉ）又は（ii）に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチド＞
（iii）に示すペプチドは、（ｉ）又は（ii）に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、本発明の効果を有する限り、欠失及び／又は付加されたアミノ酸の数は特に限定されないが、１〜３個のアミノ酸が欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列であることが好ましく、１又は２個のアミノ酸が欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列であることがより好ましく、１個のアミノ酸が欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列であることが更に好ましい。
１又は複数個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列としては、末端のアミノ酸が欠損したアミノ酸配列が例示され、より具体的には、ＡＫＤＧＴＫＥＫＡＧ（配列番号３）、ＫＤＧＴＫＥＫＡＧＥ（配列番号４）、ＡＫＤＧＬＫＥＫＡＧ（配列番号５）、ＫＤＧＬＫＥＫＡＧＥ（配列番号６）が例示される。
また、１又は複数個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列としては、末端にアミノ酸が付加したアミノ酸が例示され、ＡＫＤＧＴＫＥＫＡＧＥＡ（配列番号７）、ＶＡＫＤＧＴＫＥＫＡＧＥ（配列番号８）、ＡＫＤＧＬＫＥＫＡＧＥＡ（配列番号９）、ＶＡＫＤＧＬＫＥＫＡＧＥ（配列番号１０）が例示される。
【００２２】
本発明の有用タンパク質の高発現方法は、前記（ｉ）〜（iii）いずれか１つに記載のペプチド（ＬＥＡペプチド）及び有用タンパク質を共発現可能な形質転換体に、前記ペプチド及び有用タンパク質を発現させる工程を有する。
【００２３】
本発明者らの検討では、ＬＥＡタンパク質の繰り返し配列の一部である１１個のアミノ酸配列、あるいは、該アミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成るペプチド（ＬＥＡペプチド）を用いることに意義があるのであって、ＬＥＡタンパク質の繰り返し配列の全体を有するタンパク質を用いて共発現させると、本発明とは異なり、発現が抑制される結果が得られる。
【００２４】
上記遺伝子が形質転換された宿主細胞内では、ＬＥＡペプチドにより目的タンパク質の翻訳・修飾が促進され、かつ成熟した目的タンパク質を保護するため、その発現量の向上が可能となる。発現量の評価法として、細胞から目的タンパク質を抽出して、ポリアクリルアミド電気泳動にて発現量を比較することが出来る。例えば、ＧＦＰの場合は、その蛍光量からタンパク質量を評価することができる。その結果、ＬＥＡペプチド共発現により、ＧＦＰの発現量増大が認められ、宿主細胞において目的タンパク質の大量生産が可能となる。本発明の方法は、広く普遍性を有し、目的のタンパク質は特定のものには限定されない。
【００２５】
＜形質転換体・発現ベクター＞
本発明の形質転換体は、前記（ｉ）〜（iii）いずれか１つに記載のペプチド及び有用タンパク質を共発現可能であることを特徴とする。また、本発明の発現ベクターは、前記（ｉ）〜（iii）いずれか１つに記載のペプチドをコードするＤＮＡを含むことを特徴とする。
形質転換体は、ＬＥＡペプチド及び有用タンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）を含む発現ベクターを宿主細胞に導入して得られる。また、これらのＤＮＡ（遺伝子）を含む核酸構築物を宿主細胞に導入してもよい。宿主細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよく、具体的には、宿主細胞としては、大腸菌、放線菌、枯草菌等の細菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、植物細胞等の任意の細胞（好ましくは培養細胞）が例示される。本発明において用いる宿主細胞は、大腸菌、昆虫細胞、動物細胞であることが好ましく、大腸菌又は昆虫細胞であることがより好ましい。
ここで、「核酸構築物」とは、自立複製能を有しないゲノム導入用の組換えＤＮＡ断片を意味する。核酸構築物は、プロモーターの制御下にＬＥＡペプチドをコードする遺伝子及び有用タンパク質をコードする遺伝子を含むことが好ましい。核酸構築物としては、トランスポゾンやCre-loxPシステムに基づくものが例示される。
【００２６】
宿主細胞を形質転換するには、一般的に行われている遺伝子導入法、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、アグロバクテリウム法、プロトプラスト融合法等を用いればよい。形質転換体の選択は、常法に従って行うことができるが、通常は使用した組換えベクターに組み込まれた選択マーカー等を利用して行うことができる。
【００２７】
本発明において、宿主細胞には、ＬＥＡペプチドをコードするＤＮＡ（遺伝子）とともに、有用タンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）を導入し、それらを共発現させる。上記遺伝子は、１つの発現ベクター又は１つの核酸構築物中に組み込んで導入してもよいし、別々の発現ベクター又は核酸構築物中に組み込んで導入してもよい。
【００２８】
本発明の発現ベクターは、ＬＥＡペプチドをコードするＤＮＡを含んでいればよく、有用タンパク質をコードするＤＮＡを含んでいる態様に限定されるものではない。本発明の発現ベクターは、プロモーターの下流にＬＥＡペプチドをコードするＤＮＡを導入した発現ベクターであり、ＬＥＡペプチドの発現を制御可能な発現ベクターとすることが好ましい。
本発明の発現ベクターは、他の領域に、更にプロモーター領域を有していてもよく、該プロモーターの領域下流に有用タンパク質をコードするＤＮＡを導入可能であるか、該ＤＮＡが導入されていることが好ましい。
【００２９】
上述のように、１つの発現ベクターにＬＥＡペプチドをコードするＤＮＡと、有用タンパク質をコードするＤＮＡを組み込む場合、ＬＥＡペプチドをコードするＤＮＡ及び有用タンパク質をコードするＤＮＡは、別々のプロモーターの制御下に配置してもよいが、オペロンを構成するように１つのプロモーターの制御下に配置してもよい。
なお、後述する実施例においては、２つのプロモーターを有する発現ベクターを使用し、ベクターの１つ目のプロモーターの下流にＬＥＡペプチドの遺伝子配列を導入し、もう一方のプロモーターの下流に目的とするタンパク質（有用タンパク質）の遺伝子を導入し、共発現を可能としている。
なお、上述したように、ＬＥＡペプチドの遺伝子を導入したベクターと、有用タンパク質の遺伝子を導入したベクターとの両方を用いて、宿主細胞内で共発現させてもよいが、導入及び発現制御の観点から、１つの発現ベクターを使用して、同一のベクターにＬＥＡペプチドの遺伝子及び有用タンパク質（目的タンパク質）の遺伝子を導入することが好ましい。
【００３０】
発現ベクターを作製するためには、ＬＥＡペプチドをコードする遺伝子をインサートＤＮＡとして発現ベクターに組み込めばよい。発現ベクターには、プロモーター（好ましくは構成性又は一過性の過剰発現をもたらすプロモーター）、ターミネーター、リボソーム結合部位などの宿主生物における発現に必要な各種エレメントが含まれることが好ましい。
また発現ベクターにはプロモーターを制御する遺伝子がさらに含まれてもよい。プロモーターは、その発現ベクターを導入すべき宿主細胞中でその制御下の遺伝子の発現を誘導できる任意のものであってよい。例えば大腸菌中で発現させるのであれば、Ｔ７プロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等を使用でき、動物細胞中で発現させるのであれば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等を使用でき、植物で発現させるのであれば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ユビキチンプロモーター等を利用できる。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。【００３２】
（実施例１）
以下の例では、大腸菌（Escherichia coli）を宿主として、ＬＥＡペプチドとＧＦＰとを共発現させ、ＧＦＰの発現量の向上を検討した。【００３３】
［発現ベクターの作製］
発現ベクターにはNovagen社のpRSFDuetを用いた。このベクターには二つのＴ７プロモーターと、それぞれのプロモーターの下流にマルチクローニングサイトが存在する。一つ目のＴ７プロモーター（以下プロモーターＡ）の下流にＧＦＰ遺伝子を、二つ目のＴ７プロモーター（以下プロモーターＢ）の下流にＬＥＡペプチドの遺伝子を挿入する。【００３４】
プロモーターＢの下流にあるNdeI及びXhoI切断部位を、制限酵素NdeI、XhoIで切断し、以下に示す遺伝子（配列番号１１及び配列番号１２）で構築した２本鎖ＤＮＡ断片を、ライゲーション酵素を用いて挿入することで、不要な遺伝子配列を除去した。【００３５】
配列番号１１：5'−TATGGATATCTAAC−3'
配列番号１２：5'−TCGAGTTAGATATCCA−3'【００３６】
挿入した遺伝子配列にはEcoRV切断配列が入っており、EcoRVで切断後、下に示す遺伝子（配列番号１３及び１４）で構築した２本鎖ＤＮＡ断片を、ライゲーション酵素を用いて挿入することで、ＬＥＡペプチドの遺伝子配列をプロモーターＢの下流へ挿入した。【００３７】
配列番号１３：S-LEA：5'−GCGAAAGACGGGACGAAAGAAAAAGCAGGAGAA−3'
配列番号１４：AS-LEA：5'−TTCTCCTGCTTTTTCTTTCGTCCCGTCTTTCGC−3'【００３８】
［発現タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子の増幅とプラスミドへの挿入］
ＧＦＰ遺伝子がコードされているプラスミドベクター pQBI 63（和光純薬工業（株））を、ＧＦＰ増幅のための鋳型ＤＮＡとして用いて、ＧＦＰ遺伝子のＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。【００３９】
ＰＣＲはPrimestar Polymerase（タカラバイオ社）を用いて、第１ステップ：９４℃で２分、第２ステップ：９４℃で１５秒（変性）、５５℃で３０秒（アニーリング）及び６８℃で１分（伸長）のサイクルを３０サイクル、第３ステップ：６８℃で１０分のステップで行った。【００４０】
使用したプライマー配列は以下の通りである（配列番号１５及び１６）。Fw-BamHI-GFPは、5'末端にBamHI切断部位を含み、かつその下流にＧＦＰ遺伝子の5'末端から２１ｂｐに相補的な配列を含む。Rev-HindIII-GFPは、5'末端にHindIII切断部位を含み、かつその下流にＧＦＰ遺伝子の終始コドンを含めて２１ｂｐに相補的な配列を含む。【００４１】
配列番号１５：Fw-BamHI-GFP：CGG GGA TCC ATG GCT AGC AAA GGA GAA GAA
配列番号１６：Rev-HindIII-GFP：GCC AAG CTT TCA GTT GTA CAG TTC ATC CAT【００４２】
増幅したＤＮＡ断片は、BamHI及びHindIIIによって切断し、アガロース電気泳動によりＤＮＡ断片の分画を行い、約８００ｂｐのＧＦＰ遺伝子のＤＮＡ断片を回収した。ＬＥＡペプチド遺伝子が挿入済みの、プラスミドＤＮＡのプロモーターＡの下流にあるBamHI及びHindIII切断部位を、制限酵素BamHI、HindIIで切断処理をし、その後、ライゲーション酵素を用いて回収したＧＦＰ遺伝子を挿入した。そして、発現プラスミド構築後、シーケンサーによりＤＮＡ配列を確認した。【００４３】
［ＬＥＡペプチド、タンパク質の共発現とその評価］
構築したＬＥＡペプチド、ＧＦＰ共発現遺伝子を用いて、ＬＥＡペプチド共発現によるＧＦＰの発現効率の向上を、以下のように評価した。【００４４】
構築したプラスミドＤＮＡ１００ｎｇを、コンピテント化した大腸菌BL21（DE3）株５０μｌと混ぜ、ヒートショック法にて形質転換し、ＬＢ（トリプトン１０ｇ／ｌ、乾燥酵母エキス５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／ｌ、アンピシリンナトリウム１００ｍｇ／ｌ）プレート培地に播種した。【００４５】
１２時間培養後、コロニーが形成され形質転換体を得た。その後、ＬＢ液体培地３ｍｌにコロニーを植菌し、３７℃で１４時間前培養した。前培養によって得られた培養液５００μｌを、ＬＢ培地５０ｍｌに植菌し、３７℃で６００ｎｍの吸光度が０．５になるまで培養した。吸光度が０．５まで培養を行った培養液に、発現誘導剤ＩＰＴＧを終濃度が０．１ｍＭになるように加え、３７℃でＬＥＡペプチド及びＧＦＰの発現を誘導した。発現誘導後、各時間に集菌し、吸光度及び蛍光強度を測定することで、菌体数に対するＧＦＰの発現強度を評価した。結果は図１に示したとおり、本発明のもの（GFPLEA*1）はコントロール（GFP）に比べ、約２倍量発現していることが分かる。【００４６】
上記実施例ではＬＥＡ繰返し配列中の出現頻度の高いアミノ酸を選んだ、ＡＫＤＧＴＫＥＫＡＧＥ配列を選択している。ＬＥＡは植物によく見られ、乾燥ストレスを受けた場合に発現し、保水機能で細胞の乾燥を防ぐといわれている。本ペプチドの作用機序としては目的遺伝子の転写量が変わらないことから、生成されたタンパク質の凝集を抑止しすることで、目的タンパク質の生成量を向上させていると考えられる。【００４７】
（実施例２）
実施例２では、実施例１で発現させたＬＥＡペプチド（ＬＥＡ−Ｉ）を、以下のＬＥＡ−II〜ＬＥＡ−Ｖのように変更した以外は、実施例１と同様にして形質転換体を作製し、ＧＦＰの発現量を評価した。
ＬＥＡ−IIは、ＬＥＡ−Ｉの５番目のアミノ酸（Ｔ）を疎水性アミノ酸（Ｌ）に変更し、ＬＥＡ−IIIは、ＬＥＡ−Ｉの２、６、８番目の塩基性アミノ酸（Ｋ）をグリシン（Ｇ）に変更し、ＬＥＡ−IVは、３、７、１１番目の酸性アミノ酸（Ｄ又はＥ）をグリシンに変更し、ＬＥＡ−Ｖは、１、９番目の疎水性アミノ酸（Ａ）を親水性アミノ酸（Ｓ）に変更した。結果は図２に示した。なお、図２中、ＧＦＰとは、ＧＦＰのみを発現させたものである。
実施例２−１：ＬＥＡ−Ｉ（配列番号１）：ＡＫＤＧＴＫＥＫＡＧＥ
実施例２−２：ＬＥＡ−II（配列番号２）：ＡＫＤＧＬＫＥＫＡＧＥ
比較例２−１：ＬＥＡ−III（配列番号１７）：ＡＧＤＧＴＧＥＧＡＧＥ
比較例２−２：ＬＥＡ−IV（配列番号１８）：ＡＫＧＧＴＫＧＫＡＧＧ
比較例２−３：ＬＥＡ−Ｖ（配列番号１９）：ＳＫＤＧＴＫＥＫＳＧＥ【００４８】
なお、ＬＥＡ−II〜ＬＥＡ−Ｖを発現させるために使用した遺伝子配列（配列番号２０〜２７）を以下に示す。
配列番号２０：S-LEA−II：5'−GCGAAAGACGGGCTGAAAGAAAAAGCAGGAGAA−3'
配列番号２１：AS-LEA−II：5'−TTCTCCTGCTTTTTCTTTCAGCCCGTCTTTCGC−3'
配列番号２２：S-LEA-III：5'−GCGGGAGACGGGCTGGGAGAAGGAGCAGGAGAA−3'
配列番号２３：AS-LEA-III：5'−TTCTCCTGCTCCTTCTCCCAGCCCGTCTCCCGC−3'
配列番号２４：S-LEA−IV：5'−GCGAAAGGAGGGCTGAAAGGAAAAGCAGGAGGA−3'
配列番号２５：AS-LEA−IV：5'−TCCTCCTGCTTTTCCTTTCAGCCCTCCTTTCGC−3'
配列番号２６：S-LEA−V：5'−TCCAAAGACGGGACGAAAGAAAAAAGCGGAGAA−3'
配列番号２７：AS-LEA−V：5'−TTCTCCGCTTTTTTCTTTCGTCCCGTCTTTGGA−3'【００４９】
本発明よると、上記実施例で示したように、ＬＥＡタンパク質の基本配列である１１アミノ酸からなるペプチドを目的タンパク質と共発現させることで、正しいフォールディングの目的タンパク質の発現量を増大させることができた。本目的に用いるペプチドは、１、５、９番目の少なくとも２つに疎水基、３、７、１１番目の少なくとも２つに負電荷基、２、６、８番目の少なくとも２つに正電荷基を配置するアミノ酸配列であればよい。【００５０】
（実施例３）
以下の例では、大腸菌（Escherichia coli）を宿主として、ＬＥＡペプチドとルシフェラーゼ（Luc）とを共発現させ、その発現量の向上を検討した。【００５１】
［発現ベクターの作製］
発現ベクターにはNovagen社のpRSFDuetを用いた。このベクターには二つのＴ７プロモーターと、それぞれのプロモーターの下流にマルチクローニングサイトが存在する。一つ目のＴ７プロモーター（以下プロモーターＡ）の下流にルシフェラーゼ遺伝子を、二つ目のＴ７プロモーター（以下プロモーターＢ）の下流にＬＥＡペプチドの遺伝子を挿入した。【００５２】
プロモーターＢの下流にあるNdeI及びXhoI切断部位を、制限酵素NdeI、XhoIで切断し、以下に示す遺伝子（配列番号１１及び１２）で構築した２本鎖ＤＮＡ断片を、ライゲーション酵素を用いて挿入することで、不要な遺伝子配列を除去した。【００５３】
配列番号１１：5'−TATGGATATCTAAC−3'
配列番号１２：5'−TCGAGTTAGATATCCA−3'【００５４】
挿入した遺伝子配列にはEcoRV切断配列が入っており、EcoRVで切断後、下に示す遺伝子（配列番号１３及び１４）で構築した２本鎖ＤＮＡ断片を、ライゲーション酵素を用いて挿入することで、ＬＥＡペプチドの遺伝子配列をプロモーターＢの下流へ挿入した。【００５５】
配列番号１３：S-LEA：5'−GCGAAAGACGGGACGAAAGAAAAAGCAGGAGAA−3'
配列番号１４：AS-LEA：5'−TTCTCCTGCTTTTTCTTTCGTCCCGTCTTTCGC−3'【００５６】
［発現タンパク質（Luc）遺伝子の増幅とプラスミドへの挿入］
ルシフェラーゼ遺伝子がコードされているプラスミドベクターを、ルシフェラーゼ増幅のための鋳型ＤＮＡとして用いて、ルシフェラーゼ遺伝子のＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。【００５７】
ＰＣＲはPrimestar Polymerase（タカラバイオ社）を用いて、第１ステップ：９４℃で２分、第２ステップ：９４℃で１５秒（変性）、５５℃で３０秒（アニーリング）及び６８℃で２分（伸長）のサイクルを３０サイクル、第３ステップ：６８℃で１０分のステップで行った。【００５８】
使用したプライマー配列は以下の通りである（配列が番等２８及び２９）。Fw-BamHI-Lucは、5'末端にBamHI切断部位を含み、かつその下流にルシフェラーゼ遺伝子の5'末端から２１ｂｐに相補的な配列を含む。Rev-HindIII-Lucは、5'末端にHindIII切断部位を含み、かつその下流にルシフェラーゼ遺伝子の終始コドンを含めて１８ｂｐに相補的な配列を含む。【００５９】
配列番号２８：Fw-BamHI-Luc：GCC GGA TCC GAT GGA AGA CGC CAA AAA CAT A
配列番号２９：Rev-HindIII-Luc：GCC AAG CTT TTA CAA TTT GGA CTT TCC GCC【００６０】
増幅したＤＮＡ断片は、BamHI及びHindIIIによって切断し、アガロース電気泳動によりＤＮＡ断片の分画を行い、約１，９００ｂｐのルシフェラーゼ遺伝子のＤＮＡ断片を回収した。ＬＥＡペプチド遺伝子が挿入済みの、プラスミドＤＮＡのプロモーターＡの下流にあるBamHI及びHindIII切断部位を、制限酵素BamHI、HindIIIで切断処理をし、その後、ライゲーション酵素を用いて回収したルシフェラーゼ遺伝子を挿入した。そして、発現プラスミド構築後、シーケンサーによりＤＮＡ配列を確認した。【００６１】
［ＬＥＡペプチド、タンパク質の共発現とその評価］
構築したＬＥＡペプチド、ルシフェラーゼ共発現遺伝子を用いて、ＬＥＡペプチド共発現によるルシフェラーゼの発現効率の向上を、以下のように評価した。【００６２】
構築したプラスミドＤＮＡ１００ｎｇを、コンピテント化した大腸菌BL21（DE3）株５０μｌと混ぜ、ヒートショック法にて形質転換し、ＬＢ（トリプトン１０ｇ／ｌ、乾燥酵母エキス５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／ｌ、カナマイシン５０ｍｇ／ｌ）プレート培地に播種した。【００６３】
１２時間培養後、コロニーが形成され形質転換体を得た。その後、ＬＢ液体培地３ｍｌにコロニーを植菌し、３７℃で１４時間前培養した。前培養によって得られた培養液５００μｌを、ＬＢ培地５０ｍｌに植菌し、３７℃で６００ｎｍの吸光度が０．５になるまで培養した。吸光度が０．５まで培養を行った培養液に、発現誘導剤ＩＰＴＧを終濃度が０．１ｍＭになるように加え、３７℃でＬＥＡペプチド及びルシフェラーゼの発現を誘導した。発現誘導後、各時間に遠心分離にて集菌し、SoluLyse：タンパク質抽出溶液（Genlantis社）に溶解した。１０分間反応後、再度遠心分離を行い、その上精にルシフェラーゼを含む可溶画分を得た。【００６４】
精製したルシフェラーゼは、ルシフェリンとの反応による発光強度でその触媒量を評価した。Molecular Probes社のATP検出キットの20×Reaction buffer ０．５ｍｌ、０．１Ｍ DTT solution ０．１ｍｌ、１０ｍＭ Luciferin ０．５ｍｌ、miliQ水 ８．９ｍｌを混合して標準反応溶液を作製した。プラスチック試験管に１ｍＭのATP ５μｌ、精製したタンパク質抽出液を５μｌ加え、光を遮断した状態で標準反応溶液９０μｌを加え、GENE LIGHT 55（（株）マイクロテック・ニチオン、型番：GL-100）で発光量を測定した。結果は図３に示したとおり、本発明のもの（Luc-LEA）はコントロール（Luc）に比べ、約１．３−１．５倍量発現していることが分かる。【００６５】
（実施例４）
以下の例では、大腸菌（Escherichia coli）を宿主として、ＬＥＡペプチドとＧＦＰ−ＨＦＢＩＩ融合タンパク質を共発現させ、その発現量の向上を検討した。ＨＦＢＩＩは非常に強い疎水領域を有する糸状菌由来の膜タンパク質である。【００６６】
［発現ベクターの作製］
発現ベクターにはNovagen社のpRSFDuetを用いた。このベクターには二つのＴ７プロモーターと、それぞれのプロモーターの下流にマルチクローニングサイトが存在する。一つ目のＴ７プロモーター（以下プロモーターＡ）の下流にＨＦＢＩＩ−ＧＦＰ遺伝子を、二つ目のＴ７プロモーター（以下プロモーターＢ）の下流にＬＥＡペプチドの遺伝子を挿入した。【００６７】
プロモーターＢの下流にあるNdeI及びXhoI切断部位を、制限酵素NdeI、XhoIで切断し、以下に示す遺伝子（配列番号１１及び１２）で構築した２本鎖ＤＮＡ断片を、ライゲーション酵素を用いて挿入することで、不要な遺伝子配列を除去した。【００６８】
配列番号１１：5'−TATGGATATCTAAC−3'
配列番号１２：5'−TCGAGTTAGATATCCA−3'【００６９】
挿入した遺伝子配列にはEcoRV切断配列が入っており、EcoRVで切断後、下に示す遺伝子（配列番号１３及び１４）で構築した２本鎖ＤＮＡ断片を、ライゲーション酵素を用いて挿入することで、ＬＥＡペプチドの遺伝子配列をプロモーターＢの下流へ挿入した。【００７０】
配列番号１３：S-LEA：5'−GCGAAAGACGGGACGAAAGAAAAAGCAGGAGAA−3'
配列番号１４：AS-LEA：5'−TTCTCCTGCTTTTTCTTTCGTCCCGTCTTTCGC−3'【００７１】
［発現タンパク質ＨＦＢＩＩ−ＧＦＰ遺伝子の増幅とプラスミドへの挿入］
ＨＦＢＩＩ−ＧＦＰ遺伝子がコードされているプラスミドベクターを、ＨＦＢＩＩ−ＧＦＰ増幅のための鋳型ＤＮＡとして用いて、ＨＦＢＩＩ−ＧＦＰ遺伝子のＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。【００７２】
ＰＣＲはPrimestar Polymerase（タカラバイオ社）を用いて、第１ステップ：９４℃で２分、第２ステップ：９４℃で１０秒（変性）、５５℃で１５秒（アニーリング）及び７２℃で２分（伸長）のサイクルを３０サイクル、第３ステップ：６８℃で１０分のステップで行った。【００７３】
使用したプライマー配列（配列番号３０及び１６）は以下の通りである。Fw-BamHI-HFBIIは、5'末端にBamHI切断部位を含み、かつその下流にHFBII−GFP遺伝子の5'末端から２１ｂｐに相補的な配列を含む。Rev-HindIII-GFPは、5'末端にHindIII切断部位を含み、かつその下流にHFBII−GFP遺伝子の終始コドンを含めて２１ｂｐに相補的な配列を含む。【００７４】
配列番号３０：Fw-BamHI-HFBII：CGG GGA TCC GCT GTC TGC CCT ACC GGC CTC
配列番号１６：Rev-HindIII-GFP：GCC AAG CTT TCA GTT GTA CAG TTC ATC CAT【００７５】
増幅したＤＮＡ断片は、BamHI及びHindIIIによって切断し、アガロース電気泳動によりＤＮＡ断片の分画を行い、約１，０００ｂｐのＨＦＢＩＩ−ＧＦＰ遺伝子のＤＮＡ断片を回収した。ＬＥＡペプチド遺伝子が挿入済みの、プラスミドＤＮＡのプロモーターＡの下流にあるBamHI及びHindIII切断部位を、制限酵素BamHI、HindIIIで切断処理をし、その後、ライゲーション酵素を用いて回収したＨＦＢＩＩ−ＧＦＰ遺伝子を挿入した。そして、発現プラスミド構築後、シーケンサーによりＤＮＡ配列を確認した。【００７６】
［ＬＥＡペプチド、タンパク質の共発現とその評価］
構築したＬＥＡペプチド、ＨＦＢＩＩ−ＧＦＰ共発現遺伝子を用いて、ＬＥＡペプチド共発現によるＨＦＢＩＩ−ＧＦＰの発現効率の向上を、以下のように評価した。【００７７】
構築したプラスミドＤＮＡ１００ｎｇを、コンピテント化した大腸菌BL21（DE3）株５０μｌと混ぜ、ヒートショック法にて形質転換し、ＬＢ（トリプトン１０ｇ／ｌ、乾燥酵母エキス５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／ｌ、カナマイシン５０ｍｇ／ｌ）プレート培地に播種した。【００７８】
１２時間培養後、コロニーが形成され形質転換体を得た。その後、ＬＢ液体培地３ｍｌにコロニーを植菌し、３７℃で１４時間前培養した。前培養によって得られた培養液５００μｌを、ＬＢ培地５０ｍｌに植菌し、３７℃で６００ｎｍの吸光度が０．５になるまで培養した。吸光度が０．５まで培養を行った培養液に、発現誘導剤ＩＰＴＧを終濃度が０．１ｍＭになるように加え、３７℃でＬＥＡペプチド及びＨＦＢＩＩ−ＧＦＰの発現を誘導した。発現誘導後、４時間後に遠心分離にて集菌し、発現誘導4時間後に集菌し、吸光度及び蛍光強度を測定することで、菌体数に対するＧＦＰの発現強度を評価した。【００７９】
精製したＨＦＢＩＩ−ＧＦＰは、結果は図４に示したとおり、本発明のものはコントロール（ＬＥＡペプチドを発現していない（HFBII-GFP））に比べ、約１．３倍量発現していることが分かる。【００８０】
（実施例５）
実施例５では、昆虫細胞での共発現を行った。
［細胞の培養］
Sf-9細胞はInvitrogenから購入し、Grace's Insect Cell Culture Medium（Invitrogen）に１０％  ＦＢＳ（大日本製薬（株））と５０Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、５０μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを含む培地を用いて、２７℃で培養し、数日ごとに培地を交換した。細胞の継代は、セルスクレーパー（BD Falcon）で細胞を剥離させた後、８００ｒｐｍで５分間遠心し、培地を吸引した後、細胞数５×１０5個になるように新しい培地を加え懸濁し、５０ｍｌのカルチャーボトル（BD Falcon）で培養した。細胞の保存は１０％  ＤＭＳＯを含む培地で１×１０6cells/mlの細胞懸濁液を作製し、−８０℃のディープフリーザで凍結保存した。凍結の際には、BICELL（日本フリーザー（株））を用いて温度を徐々に−８０℃まで低下させた。解凍の際には、３７℃の恒温槽で急速解凍し、培地で洗浄することでＤＭＳＯの除去を行った。【００８１】
［発現ベクターの作製］
pFastBacDualプラスミド（Invitrogen）をＬＥＡペプチドと目的タンパク質（ＧＦＰ）を共発現させるベクターに使用した。このプラスミドベクターにはタンパク質発現用に二つのプロモーター（ポリへドリンプロモーター、p10プロモーター）を有しており、それぞれの下流にＬＥＡペプチドの遺伝子とＧＦＰ遺伝子を挿入した。【００８２】
［発現タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子の増幅とプラスミドへの挿入］
ＧＦＰ遺伝子がコードされているpQBI 63（和光純薬工業（株））を、ＧＦＰ遺伝子増幅のための鋳型ＤＮＡとして用いて、ＰＣＲにより増幅した。【００８３】
ＰＣＲはPrimestar Polymerase（タカラバイオ（株））を用いて、第１ステップ：９４℃で２分、第２ステップ：９４℃で１５秒（変性）、５５℃で３０秒（アニーリング）及び６８℃で１分（伸長）のサイクルを３０サイクル、第３ステップ：６８℃で１０分のステップで行った。【００８４】
使用したプライマー配列（配列番号１５及び１６）は以下の通りである。Fw-BamHI-GFPは、5'末端にBamHI切断部位を含み、かつその下流にＧＦＰ遺伝子の5'末端から２１ｂｐに相補的な配列を含む。Rev-HindIII-GFPは、5'末端にHindIII切断部位を含み、かつその下流にＧＦＰ遺伝子の終始コドンを含めて２１ｂｐに相補的な配列を含む。【００８５】
配列番号１５：Fw-BamHI-GFP：CGG GGA TCC ATG GCT AGC AAA GGA GAA GAA
配列番号１６：Rev-HindIII-GFP：GCC AAG CTT TCA GTT GTA CAG TTC ATC CAT【００８６】
増幅したＤＮＡ断片は、BamHI及びHindIIIによって切断し、アガロース電気泳動によりＤＮＡ断片の分画を行い、約８００ｂｐのＧＦＰ遺伝子のＤＮＡ断片を回収した。pFastBacDualプラスミドのポリへドリンプロモーター下流にあるBamHI及びHindIII切断部位を、制限酵素BamHI、HindIIIで切断した。その後、回収したＧＦＰ遺伝子を、ライゲーション酵素を用いて切断したプラスミドへ挿入した。発現プラスミド構築後、シーケンサーによりＤＮＡ配列を確認した。【００８７】
［ＬＥＡペプチド遺伝子の挿入］
ＧＦＰ遺伝子挿入済みのベクターのp10プロモーターの下流にあるXhoI及びKpnI切断部位を、制限酵素XhoI、KpnIで切断した。ＬＥＡペプチドの遺伝子は以下に示す遺伝子（配列番号３１及び３２）で構築した２本鎖ＤＮＡ断片をハイブリダイゼーションさせ、その後、切断したプラスミドとライゲーション酵素を用いて結合することで、ＬＥＡペプチドの遺伝子配列をp10プロモーターの下流へ挿入した。構築後、シーケンサーによりＤＮＡ配列を確認した。【００８８】
配列番号３１：S-LEA：5'−TCG AGA TGG CGA AAG ACG GGA CGA AAG AAA AAG CAG GAG AAT AAG GTA C−3'
配列番号３２：AS-LEA：5'−CTT ATT CTC CTG CTT TTT CTT TCG TCC CGT CTT TCG CCA TC−3'【００８９】
［コントロールベクターの作製］
p10プロモーターからタンパク質発現をしないコントロールベクターを作製した。ＧＦＰ遺伝子挿入済みのベクターのp10プロモーター下流にあるXhoI及びKpnI切断部位を、制限酵素XhoI、KpnIで切断した。以下に示す遺伝子（配列番号３３及び３４）で構築した２本鎖ＤＮＡ断片をハイブリダイゼーションさせ、その後、切断したプラスミドとライゲーション酵素を用いて結合することで、終止コドンを複数有する遺伝子を挿入した。構築後、シーケンサーによりＤＮＡ配列を確認した。【００９０】
配列番号３３：S-ATGXXX：5'−TCG AGA TGT AAT AGG GTA C−3'
配列番号３４：AS-ATGXXX：5'−CCT ATT ACA TC−3'【００９１】
［バクミドＤＮＡの精製］
構築したpFastBacDualベクターから、DH10Bac competent cell（Invitrogen）にＧＦＰ遺伝子及びＬＥＡ遺伝子をトランスポジションにより導入した。１００μｌのDH10Bac competent cellをマイクロテストチューブに移し、５μｌの構築したプラスミドＤＮＡを加え、氷上で３０分放置した。その後、４２℃で４５秒間ヒートショックを行い、９００μｌのS.O.C培地を加えた。これを１５ｍｌチューブに移し、２２５ｒｐｍ、３７℃で４時間培養した。その後、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、７μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、１００μｇ／ｍｌのBluo-gal、４０μｇ／ｍｌのIPTGを含むLBプレートに播種し、３７℃で４８時間培養した。ブルーホワイトアッセイによってホワイトコロニーを選び、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、７μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む１ｍｌのLB培地にて、４８時間培養し、ミニプレップ法によりＤＮＡを抽出・精製した。得られたＤＮＡをバクミドＤＮＡとした。【００９２】
［Sf-9への遺伝子導入］
バクミドＤＮＡのSf-9細胞への導入にはリポフェクション法を用いた。１μｇのバクミドＤＮＡを１００μｌのGrace's Insect Cell Culture Medium（血清・抗生物質無し）に加えた。同様に６μｌのCellfectin Regent（Invitrogen）を１００μｌのGrace's Insect Cell Culture Mediumに加えた。両者を緩やかに混合し、４５分間、室温にて放置した後、０．８ｍｌのGrace's Insect Cell Culture Medium（血清・抗生物質無し）を加え、Sf-9細胞にローディングし、Grace's Insect Cell Culture Medium（血清・抗生物質無し）において２７℃で５時間培養した。その後、Sf-9細胞をGrace's Insect Cell Culture Medium（血清有り）で２回洗浄し、Grace's Insect Cell Culture Medium（血清有り・抗生物質無し）中で、２７℃で７２時間培養した。７２時間後、細胞からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによってＧＦＰ遺伝子の確認を行った。回収した培地をウイルス溶液として４℃で遮光保存した。その後、ウイルス感染を繰り返すことで、感染させるのに十分な濃度のウイルス溶液を得た。ウイルス感染は、４ｍｌのGrace's Insect Cell Culture Mediumと１ｍｌのウイルス溶液を混合し、培養中のSf-9細胞の培地と交換することで行った。インフェクション３日後の細胞を感染細胞として実験に使用した。【００９３】
［ＧＦＰ発現の確認］
ＧＦＰの発現は、蛍光顕微鏡により確認した。露光時間を２ｓに設定し、５０細胞の発現を計測し、１細胞数当たりの蛍光量を評価した。結果は図５に示したとおり、本発明のもの（GFP-LEA）はコントロール（GFP）に比べ、約１．２〜１．３倍量発現していることが分かる。【００９４】
（実施例６）
実施例６では、実施例１で発現させたＬＥＡペプチド（ＬＥＡ−Ｉ）を、以下のＬＥＡｘ１〜ＬＥＡｘ６のように繰り返しした配列に変更した以外は、実施例１と同様にして形質転換体を作製し、ＧＦＰの発現量を評価した。
ＬＥＡｘ１：ＬＥＡ−Ｉ
ＬＥＡｘ２：ＬＥＡ−Ｉを２回繰り返した配列
ＬＥＡｘ３：ＬＥＡ−Ｉを３回繰り返した配列
ＬＥＡｘ４：ＬＥＡ−Ｉを４回繰り返した配列
ＬＥＡｘ６：ＬＥＡ−Ｉを６回繰り返した配列【００９５】
本発明よると、上記実施例で示したように、ＬＥＡタンパク質の基本配列である１１アミノ酸からなるペプチドを目的タンパク質と共発現させることで、正しいフォールディングの目的タンパク質の発現量を増大させることができた。本目的に用いるペプチドは、その配列を繰り返すと効果がなくなることが分かった。
【図１】
2012067220.tif 000002
【図２】
2012067220.tif 000003
【図３】
2012067220.tif 000004
【図４】
2012067220.tif 000005
【図５】
2012067220.tif 000006
【図６】
2012067220.tif 000007
【配列表】
2012067220000001.app
【国際調査報告】
2012067220.tif 000008
2012067220.tif 000009
2012067220.tif 000010
2012067220.tif 000011
2012067220.tif 000012