(57)【要約】  操作が簡便でかつ安全な、細胞内のｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体に結合する生理活性物質の生物試料中の濃度の測定方法および測定キットを提供する。  細胞内のｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体、サイクリックヌクレオチド応答性カルシウムチャンネルおよびイクオリン発光たんぱく質を共発現させた遺伝子組み換え細胞を含む組成物を提供することで、生物試料中に含まれる該受容体に結合する生理活性物質の量の測定を可能にした。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇｓと共役するＧＰＣＲ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞。
【請求項２】
Ｇｓと共役するＧＰＣＲが、ＧＬＰ−１受容体またはＶ２Ｒである、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネルがＣＮＧカルシウムチャンネルである、請求項１または請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
カルシウム感受性タンパク質が、アポイクオリンである、請求項１−３のいずれかに記載の細胞。
【請求項５】
Ｖ２Ｒが配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネルが、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する改変ＣＮＧカルシウムチャンネルであり、カルシウム感受性タンパク質が、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する改変アポイクオリンである、請求項１−４のいずれかに記載の細胞。
【請求項６】
ＧＬＰ−１受容体が配列番号８で示されるアミノ酸配列を有し、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネルが、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する改変ＣＮＧカルシウムチャンネルであり、カルシウム感受性タンパク質が、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する改変アポイクオリンである、請求項１−４のいずれかに記載の細胞。
【請求項７】
請求項１−６のいずれかに記載の細胞を含む、生物試料中の、活性型ＧＬＰ−１量またはＡＶＰ量の測定用キット。
【請求項８】
尿崩症またはＳＩＡＤＨの診断用、低張または高張輸液の選択の判定用またはＧＬＰ-１関連治療薬の効果判定用である、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
細胞が凍結細胞である、請求項７または請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
さらに、カルシウム感受性タンパク質の発光基質を含む、請求項７−９のいずれかに記載のキット。
【請求項１１】
カルシウム感受性タンパク質の発光基質が、セレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
下記工程（１）〜（３）：
（１）請求項１−６のいずれかに記載の細胞、カルシウム感受性タンパク質の発光基質、Ca2+不含の培地、および被験者の血液由来のサンプルを含む混合物を調製する；
（２）（１）で調製した混合物にCa2+含有溶液を添加する；および
（３）該細胞より発生するカルシウム感受性タンパク質の発光を測定する、
を含む、尿崩症またはＳＩＡＤＨの診断方法、低張または高張輸液の選択の判定方法またはＧＬＰ-１関連治療薬の効果判定方法。
【請求項１３】
下記工程（Ａ’）〜（Ｃ’）：
（Ａ’）請求項１−６のいずれかに記載の細胞、カルシウム感受性タンパク質の発光基質、Ca2+不含の培地、請求項１−６のいずれかに記載の細胞に発現するＧＰＣＲのアゴニストおよび被験化合物を含む混合物を調製する；
（Ｂ’）（Ａ’）で調製した混合物にCa2+含有溶液を添加する；および
（Ｃ’）該細胞より発生するカルシウム感受性タンパク質の発光を測定する、
を含む、Ｇｓと共役するＧＰＣＲのアンタゴニストをスクリーニングする方法。
【請求項１４】
下記工程（Ａ’’）〜（Ｃ’’）：
（Ａ’’）請求項１−６のいずれかに記載の細胞、カルシウム感受性タンパク質の発光基質、Ca2+含有の培地、請求項１−６のいずれかに記載の細胞に発現するＧＰＣＲのアゴニストおよび被験化合物を含む混合物を調製する；
（Ｂ’’）（Ａ’’）で調製した混合物にフォルスコリンを添加する；および
（Ｃ’’）該細胞より発生するカルシウム感受性タンパク質の発光を測定する、を含むＧｓと共役するＧＰＣＲのアンタゴニストをスクリーニングする方法。
【請求項１５】
Ｇｓと共役するＧＰＣＲが、ＧＬＰ−１受容体またはＶ２Ｒである、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内のｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネルおよびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、該細胞を含む組成物、該組成物の該受容体に結合する生理活性物質が関連する疾患の診断への使用、並びに該組成物を用いた該疾患の診断方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
生理活性物質が結合する受容体は、創薬標的となり得る。特に、Ｇタンパク質共役型受容体（以下、ＧＰＣＲとも称す）等のセカンドメッセンジャーとして細胞内のｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体は創薬標的として重要である。これまでにもこのような受容体に結合する多くの薬剤が開発されてきた。このようなＧＰＣＲの例としては、アルギニンバソプレッシン（以下、ＡＶＰとも称す）、Gulcagon-like peptide-1（以下、ＧＬＰ-1とも称す）が結合する受容体等が挙げられる。【０００３】
下垂体によって産生されるアルギニンバソプレッシンは、９アミノ酸よりなる分子量１０００のペプチドホルモンである。ＡＶＰは、循環血液量の減少、血漿浸透圧の上昇等により、腎臓における水の再吸収を行う、重要な水・電解質の調節ホルモンの一種である。血漿中のＡＶＰを測定することで、ＡＶＰの分泌が減少した病態である尿崩症、逆に分泌の亢進がみられるＡＶＰ分泌不適合症侯群などの水・電解質代謝異常症の診断等に広く臨床応用されている。また、ＡＶＰの測定は、内分泌疾患にとどまらず、肺小細胞ガンの予後や、急性心不全のマーカとしても用いられている。ＡＶＰを測定する方法として、化学標識したＡＶＰにサンプル中のＡＶＰとを競合させて、競合阻害率でＡＶＰ量を定量するＥＬＩＳＡキットが広く利用されている。しかし、競合法を用いたＥＬＩＳＡ法は、感度に乏しく、血液中の微量のサンプルの測定には限界がある。また、ＡＶＰは、低分子ペプチドであるため、高感度化が可能な複数の抗原決定基に対するサンドイッチ抗体をもちいて測定するサンドイッチＥＬＩＳＡ法が使えないため、高感度に血漿中のＡＶＰを測定できない。従って、血漿中のＡＶＰを測定する方法として、1973年にRobertsonらにより開発された、アイソトープ標識したＡＶＰをもちいるラジオイムノアッセイ法が現在も広く臨床現場で用いられている(非特許文献１)。
ＡＶＰの受容体としては、Ｖ１ａ受容体、Ｖ１ｂ受容体およびＶ２受容体（以下、Ｖ２Ｒとも称す）が知られており、選択的バソプレッシンＶ２受容体拮抗剤としてトルバプタン（tolvaptan）が、低ナトリウム血症（心不全、肝硬変、および抗利尿ホルモン不適合分泌症候群（ＳＩＡＤＨ））に有効であることが報告されている（非特許文献２）。【０００４】
消化管ホルモンの一種であるインクレチンは、食事刺激により、腸管から分泌され、膵ベータ細胞からのインシュリン分泌を増強させる。インクレチンホルモンの活性本体としては、ＧＬＰ−１とＧＩＰ(Gastric inhibitory peptide or Glucose-dependent insulinotropic polypeptide)が知られている。その中で、血糖調節因子として最も注目されているのが、ＧＬＰ−１ペプチドである。
ＧＬＰ−１はグルコース依存的なインスリン分泌を促進するのみならず、膵アルファ細胞からのグルカゴン分泌抑制、さらには胃排泄抑制にも関与している。また、中枢では視床下部に作用して食欲を抑制し、結果として体重増加を抑制できる。これら一連の生理作用は、２型糖尿病治療において望ましい効果をもたらすため、ＧＬＰ−１作用増強を目的とする創薬が広く実施されている。
ＧＬＰ−１は腸管L細胞から分泌され、プロセシングを受けてＧＬＰ−１(7-37)、あるいはＧＬＰ−１(7-36アミド)へと変化する。両者はＧＬＰ−１受容体に対して同等な生理活性を有するが、血中では活性型ＧＬＰ−１の80%以上が、ＧＬＰ−１(7-36アミド)体である。これらのＧＬＰ−１ペプチドが、“活性型ＧＬＰ−１”とされる。活性型ＧＬＰ−１は、速やかにジペプジルペプチダーゼ-IV(DPP-IV)によりＮ末端部分で切断されて、ＧＬＰ−１(9-37, 9-36アミド)へと不活性化されるため、ＧＬＰ−１作用増強を狙ったDPP-IV阻害薬が開発され、臨床で広く使用されている（非特許文献３）。さらに、DPP-IV耐性ＧＬＰ−１誘導体も開発され、臨床薬として使用され始めている。また、次世代糖尿病薬として、ＧＬＰ−１の分泌増強作用を狙った薬剤の臨床試験も進行している（非特許文献４）。これらＧＬＰ−１作用増強薬の効果判定において、血中活性型ＧＬＰ−１濃度の正確で迅速な測定方法の需要増加が近い将来において見込まれる。
また最近、空腹時における活性型ＧＬＰ−１血中濃度が、アジア人では欧米人のそれと比較して著しく低いことが報告されており、血中活性型ＧＬＰ−１濃度の人種差・個人差を検出することができる高感度測定法が必要になると思われる（非特許文献５）。
血中分解を受ける前の活性型ＧＬＰ−１濃度を測定する方法としては、２抗体サンドイッチ法によるEIA(Enzyme Immuno Assay)キットが既に上市されている。既存キットは、ＧＬＰ−１の分解を阻害するＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の効果判定などに使用されている。既存EIA法での最低検出感度は、活性型ＧＬＰ−１(7-36アミド)での場合、およそ1-2pM(3.3-6.6pg/ml)程度であり、ＧＬＰ−１(7-37)体でも同様である。アジア人の空腹時における活性型GLP-1濃度は1pM以下であることから、空腹時における活性型ＧＬＰ−１を正確に測定するためには、さらなる高感度が必要であり、既存キットではサンプルの濃縮精製が必要となる（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Robertson, G.L., et al.: J. Clin. Invest.,52:2340, 1973
【非特許文献２】Plosker G.L., Drugs. 70(4):443-54, 2010
【非特許文献３】Chronic administration of alogliptin, a novel, potent, and highly selective dipeptidyl peptidase-4 inhibitor, improves glycemic control and beta-cell function in obese diabetic ob/ob mice. European Journal of Pharmacology 588, 325-332 (2008) Moritoh, Y. et al.
【非特許文献４】Targeting GPR120 and other fatty acid-sensing GPCRs ameliorates insulin resistance and inflammatory diseases Trends in Pharmacol. Sci. 32,543-550 (2011) Talukdar, S. et al.
【非特許文献５】Little enhancement of meal-induced glucagon-like pepide 1 secretion in Japanese: Comparison of type 2 diabetes patients and healthy controls. Journal of Diabetes investigation 1, 56-59 (2010) Yabe, D. et al.
【非特許文献６】Analysis of glucagon-like peptide 1; what to measure? Clinica Chimica Acta 412, 1191-1194 (2011) Heijboer, A.C. et al.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、特別な技術や設備を要するラジオアイソトープを使用せずに、従来法に比較し簡便に操作できる、生理活性物質の測定用組成物および臨床診断用組成物等を提供することである。また、本発明の更なる目的は、該組成物を用いた、該生理活性物質の関連する疾患の診断方法等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、細胞内のｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質の相互作用に着目し、細胞内のｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体の例としてＶ２ＲおよびＧＬＰ−１が結合する受容体（以下、ＧＬＰ−１受容体とも称す）に着目した。そして、これら受容体にリガンドが結合することで生成されるｃＡＭＰが惹起するカルシウムイオンの細胞内への流入量を、カルシウム感受性タンパク質を用いて測定した。それにより本発明者は、リガンドの量を測定することに成功し、本発明を完成させた。【０００８】
一つの側面において、本発明は、細胞内のｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体（以下、“ｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体”とも称す）、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、並びに該細胞を含む組成物およびキットを提供する。
一つの側面において、本発明は、“ｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体”、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞を含む、インビトロでの該“ｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体”に結合する生理活性物質の量の測定用、該“ｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体”アゴニストまたはアンタゴニストの活性測定用、該生理活性物質が関連する疾患の診断用、または上記疾患の薬物治療を受けているヒトの治療効果及び予後の判定用の組成物およびキット等を提供する。
一つの側面において、本発明は、下記工程（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）“ｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体”、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、カルシウム感受性タンパク質の発光基質、Ca2+不含の培地、および被験者由来の生物試料を含む混合物を調製する；
（Ｂ）（Ａ）で調製した混合物にCa2+含有溶液を添加する；および
（Ｃ）該細胞より発生するカルシウム感受性タンパク質の発光を測定する、
を含む、生物試料中の該“ｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体”に結合する生理活性物質の量の測定方法、該生理活性物質が関連する疾患を診断する方法、該生理活性物質が関連する疾患を発症する危険性を判定する方法または、該生理活性物質が関連する疾患の治療の有効性を判定する方法等を提供する。
一つの側面において、本発明は、下記工程（Ａ’）〜（Ｃ’）：
（Ａ’）“ｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体”、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、カルシウム感受性タンパク質の発光基質、Ca2+不含の培地、および被験化合物を含む混合物を調製する；
（Ｂ’）（Ａ’）で調製した混合物にCa2+含有溶液を添加する；および
（Ｃ’）該細胞より発生するカルシウム感受性タンパク質の発光を測定する、
を含む、該“ｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体”アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法を提供する。
一つの側面において、本発明は、下記工程（Ａ’’）〜（Ｃ’’）：
（Ａ’’）“ｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体”、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、カルシウム感受性タンパク質の発光基質、Ca2+含有の培地、該“ｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体”に結合する生理活性物質および被験化合物を含む混合物を調製する；
（Ｂ’’）（Ａ’’）で調製した混合物にフォルスコリンを添加する；および
（Ｃ’’）該細胞より発生するカルシウム感受性タンパク質の発光を測定する、を含む該“ｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体”アンタゴニストをスクリーニングする方法等を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ラジオアイソトープを使用することに伴う煩雑な操作を要せず、簡便且つ安全な操作で、細胞内のｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体に結合する生理活性物質の量を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ヒトＶ２Ｒ、改変ＣＮＧチャンネルおよび改変イクオリンを発現するＣＨＯ細胞株から発せられる発光が、ＡＶＰの濃度に依存的であることを示す図である。
【図２】低用量のＡＶＰにおける、ヒトバソプレッシン受容体（ヒトＶ２Ｒ）、改変ＣＮＧチャンネルおよび改変イクオリンを発現するＣＨＯ細胞株から発せられる発光量を示す図である。
【図３】ヒトＶ２Ｒ、改変ＣＮＧチャンネルおよび改変イクオリンを発現するＣＨＯ細胞株から発せられる発光量に対する、培養時間の影響を示す図である。
【図４】ヒトＶ２Ｒ、改変ＣＮＧチャンネルおよび改変イクオリンを発現するＣＨＯ細胞株から発せられる発光量に対する、導入するＶ２Ｒ発現プラスミド量の影響を示す図である。
【図５】ヒトＶ２Ｒ、改変ＣＮＧチャンネルおよび改変イクオリンを発現するＣＨＯ細胞株の細胞濃度と発光量の関係を示す図である。
【図６】ヒトＶ２Ｒ、改変ＣＮＧチャンネルおよび改変イクオリンを発現するＣＨＯ細胞株の細胞濃度と発光量の関係を、各ブランク値を１とした相対値で表した図である。
【図７】ヒトＶ２Ｒ、改変ＣＮＧチャンネルおよび改変イクオリンを発現するＣＨＯ細胞株から発せられる発光量に対する、添加するCaCl2の濃度の影響を示す図である。
【図８】本発明により提供されるキットが、ＡＶＰを定量できることを示す図である。
【図９】本発明により提供されるキットとラジオイムノアッセイをもちいたAVPキットの測定範囲を比較した図である。
【図１０】本発明により提供されるキットをもちいて、正常人血漿とＡＶＰ高値血漿を測定した図である。
【図１１】ヒトＶ２Ｒ、改変ＣＮＧチャンネルおよび改変イクオリンを発現するＣＨＯ細胞株から発せられる発光量の経時変化を示す図である。０〜５pg/mLのＡＶＰに対する発光量の経時変化を示したものである。
【図１２】プラスミドpmCNGα2を示した図である。
【図１３】プラスミドpcDNA mt s AEQを示した図である。
【図１４】カルシウム含培地でバソプレッシンアンタゴニスト（OPC-41061）と細胞を培養後、１０−７MのAVPを添加し、化合物濃度と発光量を示した図である。
【図１５】カルシウム含培地で各濃度のAVPと細胞を培養後、一定濃度の１０−７MのAVPを添加し、AVP濃度と発光量を示した図である。
【図１６】カルシウム含培地でバソプレッシンアンタゴニスト（OPC-41061）と細胞を培養後、１０−７MのAVPを添加後、さらに、10-4Mのフォルスコリンを添加し、化合物濃度と発光量を示した図である。
【図１７】ヒトＧＬＰ−１受容体、改変ＣＮＧチャンネルおよび改変イクオリンを発現するＣＨＯ細胞株から発せられる発光が、活性型ＧＬＰ−１の濃度に依存的であることを示す図である。
【図１８】ヒトＧＬＰ−１受容体、改変ＣＮＧチャンネルおよび改変イクオリンを発現するＣＨＯ細胞株から発せられる発光量に対する、培養時間の影響を示す図である。
【図１９】ヒトＧＬＰ−１受容体、改変ＣＮＧチャンネルおよび改変イクオリンを発現するＣＨＯ細胞株から発せられる発光量に対する、導入するＧＬＰ−１受容体発現プラスミド量の影響を示す図である。
【図２０】ヒトＧＬＰ−１受容体、改変ＣＮＧチャンネルおよび改変イクオリンを発現するＣＨＯ細胞株の細胞濃度と発光量の関係を示す図である。
【図２１】ヒトＧＬＰ−１受容体、改変ＣＮＧチャンネルおよび改変イクオリンを発現するＣＨＯ細胞株の細胞濃度と発光量の関係を、各ブランク値を１とした相対値で表した図である。
【図２２】本発明により提供されるキットが、活性型ＧＬＰ−１を定量できることを示す図である。
【図２３】本発明により提供されるキットとEIAアッセイをもちいた活性型ＧＬＰ−１既存キットの測定範囲を比較した図である。
【図２４】本発明により提供されるキットにおける、インクレチン関連ペプチドのうち、活性型ＧＬＰ−１に対する特異性を検討した図である。
【図２５】本発明により提供されるキットを用いて、ヒト血漿中における活性型ＧＬＰ−１のＤＰＰ−ＩＶ酵素による分解を測定した図である。
【図２６】ＧＬＰ−１受容体アゴニスト糖尿病治療薬バイエッタ（エキセナチド）、および活性型ＧＬＰ−１（７−３６アミド）を細胞株に添加した場合の、エキセナチド、ＧＬＰ−１濃度と発光量を示した図である。
【図２７】ＧＬＰ−１受容体アンタゴニストExendinフラグメント(9-39)と細胞を培養後、終濃度10pMのＧＬＰ−１（７−３６アミド）を添加し、Exendinフラグメント(9-39)濃度と発光量を示した図である。
【図２８】プラスミドpmCNGα2を示した図である。
【図２９】プラスミドpcDNA mt sAEQを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．生理活性物質が結合する“ｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体”、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、並びに該細胞を含む組成物およびキット
本発明は、生理活性物質が結合する“ｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体”、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、並びに該細胞を含む組成物およびキットを提供する。
生理活性物質は、生物に対して生理作用ないしは薬理作用を発揮する物質である。生理活性物質の例としては、生理活性アミン類、神経伝達物質となるアミノ酸類、生理活性ペプチド類（例えば、バソプレッシン、インクレチン等）、脂質メディエーター類、ケモカイン類が挙げられる。バソプレッシンの例としては、ＡＶＰが挙げられる。インクレチンホルモンの例としては、ＧＬＰ−１関連ペプチド類（例えば、ＧＬＰ−1、ＧＬＰ-1の分解産物、ＧＬＰ−２、オキシントモヂュリン、グルカゴン）、ＧＬＰ−１様生理活性ペプチド薬（エキセナチド、リナグルチド）が挙げられる。
“ｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体”は、リガンドである生理活性物質が受容体に結合することにより、該受容体が発現する細胞内でｃＡＭＰ濃度が変化する受容体である。“ｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体”の例としては、ｃＡＭＰがセカンドメッセンジャーである受容体、例えばｃＡＭＰがセカンドメッセンジャーであるＧＰＣＲが挙げられる。ｃＡＭＰがセカンドメッセンジャーであるＧＰＣＲの例としては、ＧｓがカップルするＧＰＣＲが挙げられる。
ＧｓがカップルするＧＰＣＲの例には、バソプレッシンＶ２受容体、ＧＬＰ−１受容体が挙げられる。
本発明は、一つの実施態様として、ＧｓがカップルするＧＰＣＲ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、並びに該細胞を含む組成物およびキットを提供する。
上記実施態様は別として、ＧｑがカップルするＧＰＣＲとカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞を用いても、理論上、ＧｑがカップルするＧＰＣＲに結合するリガンドの量を定量できる。詳細には、リガンドがＧｑ共役型ＧＰＣＲに結合することにより惹起される小胞体のＩＰ３チャネルから細胞質へのカルシウムイオンの流入をカルシウム感受性タンパク質で検出して、リガンドの量を定量できる。しかしながら、上記実施態様が提供する、ＧｓがカップルするＧＰＣＲ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞を用いれば、リガンドの量をより高感度に定量できる。例えば、ＧｑがカップルするＧＰＣＲであるＶ１ａ（またはＶ１ｂ）およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞を用いて、ＡＶＰを検出するシステムに比較し、ＧｓがカップルするＧＰＣＲであるＶ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞を用いて、ＡＶＰを検出するシステムは、ＡＶＰをより高感度に検出できる。
生理活性物質は疾患に関連し得る。本明細書において、生理活性物質が関連する疾患とは、生理活性物質が関係する疾患であれば、特に限定はされない。生理活性物質が関連する疾患の例には、該生理活性物質の量が異常に多いか少ないことが原因で発症する疾患、該生理活性物質の量が異常に多いか少ないことが原因で病態が進行する疾患、該生理活性物質が正常な機能を発揮しないことが原因で発症する疾患、該生理活性物質が正常な機能を発揮しないことが原因で病態が進行する疾患が含まれる。生理活性物質が関連する疾患の例には、抗利尿ホルモン（以下、ＡＤＨとも称す）不適合分泌症候群、尿崩症、２型糖尿病が挙げられる。
一つの実施態様として、本発明により提供される、生理活性物質が結合する“ｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体”、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、並びに該細胞を含む組成物およびキットは、生理活性物質が関連する疾患の診断用の細胞、組成物およびキットであり得る。
【００１２】
２．Ｖ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、並びに該細胞を含む組成物およびキット
本発明は、一つの実施態様として、Ｖ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、並びに該細胞を含む組成物およびキットを提供する。
【００１３】
Ｖ２Ｒは、ＡＶＰが結合する受容体の一種であり、アデニル酸シクラーゼを活性化してｃＡＭＰを増加させる受容体である。Ｖ２Ｒの由来は哺乳類であれば特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ウシ、ラットであり得る。また、Ｖ２Ｒは、適宜、そのアミノ酸配列において、１個または数個（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個）のアミノ酸が改変（付加、置換、欠失等）されてもよく、または、Ｖ２Ｒは、天然のＶ２Ｒに対して、アミノ酸配列の同一性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＡＶＰが結合し、アデニル酸シクラーゼを活性化してｃＡＭＰを増加させる機能を有するタンパク質であってもよい。
Ｖ２Ｒは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。さらに、Ｖ２Ｒは、配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＡＶＰが結合し、アデニル酸シクラーゼを活性化してｃＡＭＰを増加させる機能を有するタンパク質であり得る。
また、本明細書において、ＡＶＰは哺乳類由来であれば特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ウシ、ラット由来であり得る。ＡＶＰは、適宜、そのアミノ酸配列において、１個または数個（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個）のアミノ酸が改変（付加、置換、欠失等）されてもよく、天然のＡＶＰに対して、アミノ酸配列の同一性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、Ｖ２Ｒに結合し、アデニル酸シクラーゼを活性化してｃＡＭＰを増加させる機能を有するタンパク質であってもよい。
【００１４】
ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネルは、ｃＡＭＰの濃度変化に応答してカルシウムイオンの細胞への流入量を変化させるチャンネルであり、ｃＡＭＰの濃度増加に応答して細胞内へのカルシウムイオン流入量を増大させるチャンネルを含む。ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネルの例としては、ＣＮＧ（cyclic nucleotide gated ion channel）カルシウムチャンネルがある。ＣＮＧカルシウムチャンネルは、そのアミノ酸配列において、１個または数個（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個）のアミノ酸が改変（付加、置換、欠失等）されていてもよく、例えば、ｃＧＭＰに比較しｃＡＭＰにより感受性を示すように改変（置換、付加、欠失を含む）されてもよい。ＣＮＧカルシウムチャンネルは、天然のＣＮＧカルシウムチャンネルに対して、アミノ酸配列の同一性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ｃＡＭＰの濃度増加に応答して細胞内へのカルシウムイオン流入量を増大させるタンパク質あり得る。改変の例としては、マウスＣＮＧカルシウムチャンネルにおける４６０番目のシステインのトリプトファンへの置換、マウスＣＮＧカルシウムチャンネルにおける５８３番目のグルタミン酸のメチオニンへの置換、ウシＣＮＧカルシウムチャンネルにおける５３７番目のトレオニンのセリン、メチオニン、バリンまたはアラニンへの置換、およびそれらの組合せ等が挙げられる。上記に挙げた置換は、その由来とする動物種に限定されず、他の動物種の対応する部位でのアミノ酸の置換にも適用される。例えば、ウシＣＮＧカルシウムチャンネルにおける５３７番目のトレオニンに対応するマウスＣＮＧカルシウムチャンネルのトレオニンを、セリン、メチオニン、バリンまたはアラニンへ置換することができる。置換は、１以上の位置で行うことができ、例えば、マウスＣＮＧカルシウムチャンネルにおける４６０番目のシステインのトリプトファンへの置換を行うと共に、５８３番目のグルタミン酸のメチオニンへの置換を行うこともできる。
ＣＮＧカルシウムチャンネルは、α−サブユニットおよび／またはβ−サブユニットからなることができ、その構成は任意であり、例えば、α２サブユニット、α３サブユニット、α４サブユニットおよびβ１ｂサブユニットからなる群から選択される少なくとも１つのサブユニットからなる構成をとることができる。そして、サブユニットは、それぞれ上記のように改変され得る。
ＣＮＧカルシウムチャンネルの由来は哺乳類であれば特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ウシ、ラット、ブタであり得る。ＣＮＧカルシウムチャンネルは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。さらに、ＣＮＧカルシウムチャンネルは、配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ｃＡＭＰの濃度増加に応答して細胞内へのカルシウムイオン流入量を増大させるタンパク質であり得る。
【００１５】
カルシウム感受性タンパク質は、カルシウムに応答して構造が変化するタンパク質を含み、カルシウムを感受して発光するタンパク質、所謂カルシウムセンサーとして機能するタンパク質を含む。
カルシウム感受性タンパク質の例としては、イクオリン（aequorin）、cameleon（インビトロジェン）、Case12（Evrogne社）、カルシウムに感受性のあるカルモジュリンとそれに結合するミオシン軽鎖キナーゼの一部の配列と二つの色の異なるＧＦＰを結合したタンパク質、ＧＦＰのアミノ酸配列の１４４番と１４６番の間にカルモジュリンを結合したカルシウム感受性タンパク質、および特開２００２−１５３２７９に記載されているプローブナンバーＧ３−８５、Ａ１−２のタンパク質、または、存在する場合には、これらのアポタンパク質（例えば、アポイクオリン）が挙げられる。
カルシウム感受性タンパク質は、適宜目的に応じそのアミノ酸配列が改変（付加、置換、欠失等）されてもよく、発光量を増加させる為および／またはＳＮ比を良くする為に改変されてもよい。改変には、アミノ酸配列における、１個または数個（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個）のアミノ酸の付加、置換、欠失および天然のカルシウム感受性タンパク質のアミノ酸配列との同一性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であってカルシウムを感受して発光するタンパク質への改変が含まれる。例えば、カルシウム感受性タンパク質は、その遺伝子をヒト型のコドン頻度に最適化し、ミトコンドリア移行シグナルを有するように改変され得る。
カルシウム感受性タンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。さらに、カルシウム感受性タンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列との同一性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、カルシウムを感受して発光するタンパク質であり得る。
【００１６】
本発明により提供されるＶ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞において、Ｖ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質は、それぞれ、細胞に一過性または安定的に発現する。
細胞は、特に限定されず、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、３Ｔ３細胞等の細胞株であり得る。
例えば、本発明により提供されるＶ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞は、Ｖ２Ｒが配列番号１で示されるアミノ酸配列からなり、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネルが、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる改変ＣＮＧカルシウムチャンネルであり、カルシウム感受性タンパク質が、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなる改変アポイクオリンであり、各タンパク質を安定的に発現させたＣＨＯ細胞であり得る。さらに、例えば、本発明により提供されるＶ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞は、Ｖ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、カルシウム感受性タンパク質のそれぞれが、配列番号１−３のアミノ酸配列に対して、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、それぞれが、Ｖ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、またはカルシウム感受性タンパク質の機能を保持したタンパク質を安定的に発現させたＣＨＯ細胞であり得る。
また、Ｖ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質からなる群から選択される１以上のタンパク質を天然に発現する細胞を用いてもよく、該細胞に発現していないタンパク質を一過的または安定的に発現させることで、本発明により提供されるＶ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞を調製することもできる。このような例として、Ｖ２Ｒを内在的に発現する腎臓由来の細胞に、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネルおよびカルシウム感受性タンパク質を、それぞれ、一過性または安定的に強制発現させた細胞、ＣＮＧカルシウムチャンネルを内在的に発現する嗅組織由来の細胞に、Ｖ２Ｒおよびカルシウム感受性タンパク質を、それぞれ、一過性または安定的に強制発現させた細胞が挙げられる。
【００１７】
本発明により提供されるＶ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞は凍結保存することができる。凍結保存は、細胞凍結保存液にて、−２０℃から−８０℃で、例えば−８０℃で保存され得る。細胞凍結保存液は、限定はされないが、セルバンカー（登録商標）（日本全薬工業）、バンバンカー（登録商標）（株式会社リンフォテック）、Cellvation（登録商標）（CELOX LABORATORIES, Inc.）、CryoStor（登録商標）（BIOLIFE SOLUTIONS）等が含まれる。同一ロットの細胞を大量に凍結保存することにより、組成物間またはキット間での細胞に由来する測定誤差を大幅に抑制することができ、測定結果の再現性を良好なものとすることができる。また、本発明により提供されるＶ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞は、凍結保存し、それを温浴等で解凍した後にも、ヒト血中に存在するＡＶＰを検出するのに十分な感受性を保持する。また、解凍後に適切な容器に播種し、適切な培地中で培養を約３時間程度行うだけで、ＡＶＰの検出のために添加される試薬や、ヒト血液由来の成分により、細胞の状態が悪くなることはない。
【００１８】
上記に説明した本発明により提供されるＶ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞を含む組成物は、インビトロでのＡＶＰ量の測定用、低張または高張輸液の選択の判定用、Ｖ２Ｒアゴニストまたはアンタゴニストの活性測定用、ＡＶＰ関連疾患の診断用、ＡＶＰ関連疾患を発症する危険性の高いヒトの判定用、および／または治療を受けているヒトの治療効果の判定用に使用され得る。
よって、本発明は、更なる一つの実施態様として、Ｖ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞を含む、インビトロでのＡＶＰ量の測定用、低張または高張輸液の選択の判定用、Ｖ２Ｒアゴニストまたはアンタゴニストの活性測定用、ＡＶＰ関連疾患の診断用、ＡＶＰ関連疾患を発症する危険性の高いヒトの判定用、またはＡＶＰ関連疾患の治療を受けているヒトの治療効果の判定用の組成物、キットを提供する。
Ｖ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞については、上記で説明したとおりである。
ＡＶＰ関連疾患は、ＡＶＰの産生または作用が異常である疾患を含む。ＡＶＰ関連疾患の例には、抗利尿ホルモン（以下、ＡＤＨとも称す）不適合分泌症候群（以下、ＳＩＡＤＨとも称す）、尿崩症が挙げられる。
ＳＩＡＤＨは、ＡＶＰの分泌が不適切に多いか、あるいは腎臓のＡＶＰに対する感受性が異常に高まっているために発症する病気である。ＳＩＡＤＨは、単独の病気としておこることは通常なく、別の疾患の合併症あるいは部分症状として発症する。例えば、ＳＩＡＤＨは、肺疾患（例えば、肺炎、肺結核）、中枢神経疾患（例えば、髄膜炎）、異所性抗利尿ホルモン産生腫瘍（例えば、肺癌（例えば、肺小細胞癌）、膵癌）などの疾患に伴って、または、薬剤処置（例えば、ビンクリスチン、クロフィブラート）に伴って発症する。ＳＩＡＤＨの診断は、例えば下記の診断規準（表１）に基づいてなされる。
【００１９】
【表１】
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尿崩症は、ＡＶＰの合成または作用が低下し多尿となる疾患である。尿崩症には、中枢性尿崩症と腎性尿崩症が含まれる。中枢性尿崩症の診断は、例えば、1．多尿の確認(3L /日以上)、2．尿検査：尿糖陰性、尿浸透圧低値、3．5％高張食塩水負荷テストによるＡＶＰ分泌機能障害の確認、4．画像診断（MRI)による視床下部・下垂体領域の病変検索、5．デスモプレシン投与による尿濃縮能の確認、によってなされる。
【００２０】
インビトロにおいて、ＡＶＰの量は、以下の現象を利用して測定され得る。
生物試料中にＡＶＰが存在する場合、ＡＶＰは本発明により提供される細胞上のＶ２Ｒに作用することによりｃＡＭＰを増加させる。これにより、ＣＮＧカルシウムチャンネルが活性化され、カルシウムの細胞内流入が増加するので、カルシウム感受性タンパク質が発光する。つまり、サンプル中のＡＶＰの存在は、カルシウム感受性タンパク質の発光というアウトプットとして表れる。
【００２１】
本発明の一つの実施態様においては、上記の現象を利用し、本発明により提供される組成物を用いることで、生物試料中におけるＡＶＰの量を測定することができる。
本明細書において、生物試料には、血液、尿、および血液または血液から調製された試料等の生物由来の試料が含まれ、例えばヒトの血液、ヒトの血液から調製された試料、ヒトの尿、ヒトの尿から調製された試料が含まれる。生物試料は適切な水溶液により適宜希釈されてもよい。例えば、ヒト尿の試料を生理食塩水にて４〜２０倍に希釈して、本発明により提供される組成物に用いてもよい。
【００２２】
本発明により提供される組成物を用い、上記の現象を利用し、ヒトの血中または尿中におけるＡＶＰの量を測定することにより、被験者がＡＶＰ関連疾患（例えば、尿崩症、ＳＩＡＤＨ）に罹患しているか否かを診断することができる。
例えば、被験者がＳＩＡＤＨを発症していると疑われる場合、上記の（１）で説明した現象を利用し、本発明により提供される組成物を用いて、被験者の血液試料を添加した場合のカルシウム感受性タンパク質の発光量と、被験者の血液試料と同量の正常人の血液試料（標準品）を添加した場合のカルシウム感受性タンパク質の発光量を測定することにより、ＳＩＡＤＨか否かを診断することができる。例えば、被験者の血液試料を添加した場合の発光量が、正常人の血液試料（標準品）を添加した場合の発光量より高ければ、被験者の血中におけるＡＶＰの濃度が正常人に比較し高いと判断でき、被験者はＳＩＡＤＨであるとの診断の根拠となる。
また、例えば、被験者が尿崩症を発症していると疑われる場合、上記の（１）で説明した現象を利用し、本発明により提供される組成物を用いて、被験者の血液試料を添加した場合のカルシウム感受性タンパク質の発光量と、被験者の血液試料と同量の正常人の血液試料（標準品）を添加した場合のカルシウム感受性タンパク質の発光量を測定することにより、尿崩症か否かを診断することができる。例えば、被験者の血液試料を添加した場合の発光量が、正常人の血液試料（標準品）を添加した場合の発光量より低ければ、被験者の血中におけるＡＶＰの濃度が正常人に比較し低いと判断でき、被験者は尿崩症であるとの診断の根拠となる。
発光量の測定については、一定時間の積算値を測定することが好ましく、例えば、５秒間、１０秒間、１５秒間、２０秒間、３０秒間、４０秒間、５０秒間、１分間の積算値を測定することができる。
【００２３】
本発明により提供される組成物を用いＳＩＡＤＨと診断された患者に輸液を投与する場合には、高張輸液が選択され、本発明により提供される組成物を用い尿崩症と診断された患者に輸液を投与する場合には、低張輸液が選択される。よって、本発明により提供される組成物は、患者に低張輸液または高張輸液のどちらを投与するかを判断するために用いられる。
【００２４】
また、本発明により提供される組成物を利用して、ヒトの血中または尿中におけるＡＶＰ量を測定することにより、ＡＶＰ関連疾患を発症する危険性の高いヒト、例えば、ＳＩＡＤＨまたは尿崩症を発症する危険性の高いヒトを判定することができる。
例えば、健康診断のときに、本発明により提供される組成物を用いて血中のＡＶＰの濃度が、ＳＩＡＤＨを発症している患者の数値よりも低く、正常人の数値よりも高ければ、ＳＩＡＤＨを発症する危険性の高いヒトと判定でき、血中のＡＶＰの濃度が尿崩症を発症している患者の数値よりも高く、正常人の数値よりも低ければ、尿崩症を発症する危険性の高いヒトと判定できる。また、血中のＡＶＰの濃度が経時的に徐々に増加していれば、ＳＩＡＤＨを発症する危険性の高いヒトと判定でき、血中のＡＶＰの濃度が、経時的に徐々に低下していれば、尿崩症を発症する危険性の高いヒトと判定できる。
【００２５】
また、さらに、本発明により提供される組成物を利用してヒトの血中または尿中におけるＡＶＰを測定することにより、ＡＶＰ関連疾患の治療を受けているヒト、例えば、ＳＩＡＤＨまたは尿崩症を発症し、その治療を受けているヒトの治療の有効性を判断できる。
例えば、本発明により提供される組成物を用いて、治療の前と後の両方で同一個体より採取した血液サンプルにおける、ＡＶＰの濃度、該濃度の経時変化を測定することにより、治療の有効性の有無を判定できる。例えば、本発明により提供される組成物を用いて血中のＡＶＰの濃度が治療前に比較し治療後に低下していれば、ＳＩＡＤＨの治療が有効であったと判定でき、血中のＡＶＰ濃度が、治療前に比較し上昇していれば、尿崩症の治療が有効であったと判定できる。
【００２６】
本発明により提供される組成物を用いて、Ｖ２Ｒアゴニストまたはアンタゴニストの活性を測定することができる。例えば、本発明により提供される組成物にＶ２ＲアゴニストをＡＶＰ非存在下で添加し、カルシウム感受性タンパク質の発光量を定量することにより、Ｖ２Ｒアゴニストの活性を測定できる。また、例えば、本発明により提供される組成物にＶ２ＲアンタゴニストをＡＶＰ存在下で添加し、カルシウム感受性タンパク質の発光量を定量することにより、Ｖ２Ｒアンタゴニストの活性を測定できる。
【００２７】
本発明は、更なる一つの実施態様として、本発明により提供されるＶ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞を含む組成物に加えて、細胞培養液、検出液、カルシウム感受性タンパク質の発光基質またはその水溶液、細胞培養用プレートまたは試験管、ＡＶＰまたはその水溶液および正常人コントロール血清からなる群から選択される少なくとも１つを含み得るキットを提供する。
キットの調製は当業者が適宜することができ、限定はされないが、例えば、キットを構成する物質、組成物を個別に梱包し、それらを纏めて一つの箱等の容器に入れて、キットを調製することができる。
本発明により提供されるＶ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞を含む組成物は、適宜調製され得、限定はされないが、例えば、３Ｘ１０６cells/mlの濃度で水溶液に懸濁して調製される。
細胞培養液は、本発明により提供される細胞を維持できるものであれば限定されず、Ca2+不含またはCa2+、Mg2+不含であり得る。
検出液は、CaCl2、トリパンブルー、イクオリンを発光させうるカルシウムと置換可能な陽イオン（例えば、カドミウムイオン、ストロンチウムイオン）、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、硫酸イオンおよび／または炭酸イオンを含み得る。CaCl2およびトリパンブルーの濃度は、当業者が適宜設定でき、例えば、CaCl2の濃度は９〜１００ｍＭ、トリパンブルーの濃度は、０．００１〜０．０１０％である。例えば、検出液は、９ｍＭ CaCl2、０．００２％トリパンブルーを含む水溶液である。カルシウム感受性タンパク質の発光量を測定する時のCaCl2の最終濃度は、３〜３３ｍＭとすることができる。また、例えば、検出液にカルシウムと置換可能な陽イオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、硫酸イオンおよび／または炭酸イオンを溶解させることで、検出液がカルシウムと置換可能な陽イオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、硫酸イオンおよび／または炭酸イオンを含み得る。
カルシウム感受性タンパク質の発光基質は、イクオリンの発光基質であるセレンテラジンまたはセレンテラジンの誘導体を含み、セレンテラジンの誘導体には、ViviRen（登録商標、プロメガ社：8-Benzyl-2-(4-hydroxybenzyl)-6-(4-hydroxyphenyl)imidazo[1,2-a]pyrazin-3-butyryloxymethyl ester）が含まれる。カルシウム感受性タンパク質の発光基質（例えばViviRen）の濃度は適宜設定され得る。例えば、カルシウム感受性タンパク質の発光基質の水溶液は、４ｍＭ ViviRen（Promega）水溶液である。
細胞培養用プレートの例としては、ルミノメーターで発光量を測定できるものであり、細胞培養ができる９６穴プレートが挙げられる。
試験管は、特に限定されず、当業者が適宜選択できる。例えば、カルシウム感受性タンパク質から発せられる発光を測定する装置に適した試験管を用いることができる。
ＡＶＰは、Ｖ２Ｒのアゴニストとして使用できるものであればよく、ポジティブコントロールとして使用され得る。ＡＶＰは、限定はされないが、ヒト由来のＡＶＰであり得る。ＡＶＰの濃度は当業者が適宜調整できる。
正常人コントロール血清は、ネガティブコントロールとして使用され得るものであり、当業者が適宜調製できる。
本発明により提供されるキットは、上述した本発明により提供される組成物と同じ用途に用いることができる。
【００２８】
本発明により提供される組成物またはキットは、また、患者の臨床症状および／または他の検査結果を考慮して、医師がＡＶＰ関連疾患（例えば、ＳＩＡＤＨ、尿崩症）と他の疾患を鑑別するための診断補助にも有用である。例えば、ＳＩＡＤＨの症状を示す患者の血液試料中のＡＶＰの量を本発明により提供される組成物またはキットを用いて測定することは、ＳＩＡＤＨと心不全等との鑑別診断に有用であり得、また、尿崩症の症状を示す患者の血液試料中のＡＶＰの量を本発明により提供される組成物またはキットを用いて測定することは、尿崩症と心因性多飲症等との鑑別診断に有用であり得る。
【００２９】
一つの実施態様として、本発明により提供されるＶ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞を含む組成物は、感度よく、ＡＶＰ、Ｖ２ＲアゴニストまたはＶ２Ｒアンタゴニストを検出できる。
よって、一つの好ましい実施態様として、本発明により提供されるキットには、生物試料よりＡＶＰ、Ｖ２ＲアゴニストまたはＶ２Ｒアンタゴニストを濃縮する為の器具または装置（例えば、カラム（例えば、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カラムなどのＣ１８カラム）、限外ろ過装置等）を含まない。
【００３０】
３．ＧＬＰ−１受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、並びに該細胞を含む組成物およびキット
本発明は、一つの実施態様として、ＧＬＰ−１受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、並びに該細胞を含む組成物およびキットを提供する。
【００３１】
ＧＬＰ−１受容体は、ＧＬＰ−１ペプチドが結合する受容体の一種であり、アデニル酸シクラーゼを活性化してｃＡＭＰを増加させる受容体である。ＧＬＰ−１受容体の由来は哺乳類であれば特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ウシ、ラットであり得る。また、ＧＬＰ−１受容体は、適宜、そのアミノ酸配列において、１個または数個（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個）のアミノ酸が改変（付加、置換、欠失等）されてもよく、または、ＧＬＰ−１受容体は、天然のＧＬＰ−１受容体に対して、アミノ酸配列の同一性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＧＬＰ−１が結合し、アデニル酸シクラーゼを活性化してｃＡＭＰを増加させる機能を有するタンパク質であってもよい。
ＧＬＰ−１受容体は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。さらに、ＧＬＰ−１受容体は、配列番号８に示されるアミノ酸配列との同一性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＧＬＰ−１が結合し、アデニル酸シクラーゼを活性化してｃＡＭＰを増加させる機能を有するタンパク質であり得る。
また、本明細書において、ＧＬＰ−１関連ペプチドは哺乳類由来であれば特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ウシ、ラット、ウサギ由来であり得る。ＧＬＰ−１は、適宜、そのアミノ酸配列において、１個または数個（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個）のアミノ酸が改変（付加、置換、欠失等）されてもよく、さらに当該ペプチド中アミノ酸に脂肪酸などの修飾基を導入したものでもよく、天然ＧＬＰ−１に対して、アミノ酸配列の同一性が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＧＬＰ−１受容体に結合し、アデニル酸シクラーゼを活性化してｃＡＭＰを増加させる機能を有するタンパク質であってもよい。また、ＧＬＰ−１様生理活性ペプチド薬は哺乳類由来に限定されず、例えば、トカゲ由来でも良く、天然ＧＬＰ−１に対してアミノ酸配列の同一性が５０、６０、７０、８０、９０、９５または９８％以上であるタンパク質であって、ＧＬＰ−１受容体に結合し、アデニル酸シクラーゼを活性化してｃＡＭＰを増加させる機能を有するタンパク質であってもよい。ＧＬＰ−１様生理活性ペプチド薬の例としては、エキセナチド、リナグルチドが挙げられる。
【００３２】
ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネルおよびカルシウム感受性タンパク質については、上記「２．Ｖ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、並びに該細胞を含む組成物およびキット」で説明したものを使用することができる。
【００３３】
本発明により提供されるＧＬＰ−１受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞において、ＧＬＰ−１受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質は、それぞれ、細胞に一過性または安定的に発現する。細胞は、特に限定されず、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、３Ｔ３細胞等の細胞株であり得る。例えば、本発明により提供されるＧＬＰ−１受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞は、ＧＬＰ−１受容体が配列番号８で示されるアミノ酸配列からなり、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネルが、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる改変ＣＮＧカルシウムチャンネルであり、カルシウム感受性タンパク質が、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなる改変アポイクオリンであり、各タンパク質を安定的に発現させたＣＨＯ細胞であり得る。さらに、例えば、本発明により提供されるＧＬＰ−１受容体細胞は、ＧＬＰ−１受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、カルシウム感受性タンパク質のそれぞれが、配列番号８，２，３のアミノ酸配列に対して、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、それぞれが、ＧＬＰ−１受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、またはカルシウム感受性タンパク質の機能を保持したタンパク質を安定的に発現させたＣＨＯ細胞であり得る。
また、ＧＬＰ−１受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質からなる群から選択される１以上のタンパク質を天然に発現する細胞を用いてもよく、該細胞に発現していないタンパク質を一過的または安定的に発現させることで、本発明により提供されるＧＬＰ−１受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞を調製することもできる。このような例として、ＧＬＰ−１受容体を内在的に発現する膵臓由来の細胞に、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネルおよびカルシウム感受性タンパク質を、それぞれ、一過性または安定的に強制発現させた細胞、ＣＮＧカルシウムチャンネルを内在的に発現する嗅組織由来の細胞に、ＧＬＰ−１受容体およびカルシウム感受性タンパク質を、それぞれ、一過性または安定的に強制発現させた細胞が挙げられる。
【００３４】
本発明により提供されるＧＬＰ−１受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞は凍結保存することができる。凍結保存は、上記「２．Ｖ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、並びに該細胞を含む組成物およびキット」で説明したＶ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞と同様に実施できる。
本発明により提供されるＧＬＰ−１受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞は、凍結保存し、それを温浴等で解凍した後にも、ヒト血中に存在するＧＬＰ−１を検出するのに十分な感受性を保持する。また、解凍後に適切な容器に播種し、適切な培地中で培養を数時間程度行うだけで、ＧＬＰ−１の検出のために添加される試薬や、ヒト血液由来の成分により、細胞の状態が悪くなることはない。
【００３５】
本発明は、ＧＬＰ−１受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞を含む、インビトロでの活性型ＧＬＰ−１量の測定用、ＧＬＰ−１受容体アゴニストまたはアンタゴニストの活性測定用、またはＧＬＰ−１関連疾患の治療を受けているヒトの治療効果の判定用の組成物、キットを提供する。
ＧＬＰ−１受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞については、上記で説明したとおりである。
ＧＬＰ−１関連疾患は、２型糖尿病などＧＬＰ−１の作用増強がその治療に望ましい疾患を含む。
２型糖尿病治療において、ＧＬＰ−１作用の増強を目的にして、ＧＬＰ−１分解酵素の一つであるＤＰＰ−ＩＶの阻害剤が使用される。あるいは、ＤＰＰ−ＩＶによる分解に耐性を持つＧＬＰ−１類似体がその治療に使用される。
【００３６】
インビトロにおいて、ＧＬＰ−１の量は、以下の現象を利用して測定され得る。
生物試料中に活性型ＧＬＰ−１が存在する場合、活性型ＧＬＰ−１は本発明により提供される細胞上のＧＬＰ−１受容体に作用することによりｃＡＭＰを増加させる。これにより、ＣＮＧカルシウムチャンネルが活性化され、カルシウムの細胞内流入が増加するので、カルシウム感受性タンパク質が発光する。つまり、サンプル中の活性型ＧＬＰ−１の存在は、カルシウム感受性タンパク質の発光というアウトプットとして表れる。
【００３７】
本発明の一つの実施態様においては、上記の現象を利用し、本発明により提供される組成物を用いることで、生物試料中における活性型ＧＬＰ−１の量を測定することができる。
生物試料については、上記「２．Ｖ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、並びに該細胞を含む組成物およびキット」で説明したとおりである。
【００３８】
また、さらに、本発明により提供される組成物を利用してヒトの血中または尿中における活性型ＧＬＰ−１を測定することにより、ＧＬＰ−１関連疾患の治療を受けているヒト、例えば、２型糖尿病を発症し、活性型ＧＬＰ−１量を増加させる治療を受けているヒトの治療の有効性を判断できる。
例えば、本発明により提供される組成物を用いて、治療の前と後の両方で同一個体より採取した血液サンプルにおける、活性型ＧＬＰ−１濃度、該濃度の経時変化を測定することにより、治療の有効性の有無を判定できる。例えば、本発明により提供される組成物を用いて血中の活性型ＧＬＰ−１濃度が、治療前に比較し上昇していれば、活性型ＧＬＰ−１量を増加させる治療薬（例えば、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤）が有効であったと判定できる。
【００３９】
本発明により提供される組成物を用いて、ＧＬＰ−１アゴニストまたはアンタゴニストの活性を測定することができる。例えば、本発明により提供される組成物にＧＬＰ−１アゴニストをＧＬＰ−１非存在下で添加し、カルシウム感受性タンパク質の発光量を定量することにより、ＧＬＰ−１アゴニストの活性を測定できる。また、例えば、本発明により提供される組成物にＧＬＰ−１アンタゴニストをＧＬＰ−１存在下で添加し、カルシウム感受性タンパク質の発光量を定量することにより、ＧＬＰ−１アンタゴニストの活性を測定できる。
【００４０】
本発明は、ＧＬＰ−１受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞を含む組成物に加えて、細胞培養液、検出液、カルシウム感受性タンパク質の発光基質またはその水溶液、細胞培養用プレートまたは試験管、ＧＬＰ−１またはその水溶液、正常人コントロール血漿から選択される少なくとも１つを含み得るキットを提供する。
キットの調製は当業者が適宜することができ、限定はされないが、例えば、キットを構成する物質、組成物を個別に梱包し、それらを纏めて一つの箱等の容器に入れて、キットを調製することができる。
ＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１受容体のアゴニストとして使用できるものであればよく、ポジティブコントロールとして使用され得る。ＧＬＰ−１は、限定はされないが、ヒト由来のＧＬＰ−１であり得る。ＧＬＰ−１の濃度は当業者が適宜調整できる。
その他のキットに含まれる物質については、上記「２．Ｖ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、並びに該細胞を含む組成物およびキット」を参考に調製することができる。
本発明により提供されるキットは、上述した本発明により提供される組成物と同じ用途に用いることができる。
【００４１】
一つの実施態様として、本発明により提供されるＧＬＰ−１受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞を含む組成物は、感度よく、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１受容体アゴニストまたはＧＬＰ−１受容体アンタゴニストを検出できる。
よって、一つの好ましい実施態様として、本発明により提供されるキットには、生物試料よりＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１受容体アゴニストまたはＧＬＰ−１受容体アンタゴニストを濃縮する為の器具または装置（例えば、カラム（例えば、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カラムなどのＣ１８カラム）、限外ろ過装置等）を含まない。
さらに、一つの実施態様として、本発明により提供されるキットは、活性型ＧＬＰ−１（７−３６）および活性型ＧＬＰ−１（７−３７）の両方の合計量を一回の操作で測定できる。
【００４２】
４．Ｖ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞を用いたバイオアッセイ法
本発明は、また、一つの実施態様として、下記工程（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）Ｖ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、カルシウム感受性タンパク質の発光基質、Ca2+不含の培地、および被験者由来の生物試料を含む混合物を調製する；
（Ｂ）（Ａ）で調製した混合物にCa2+含有溶液を添加する；および
（Ｃ）該細胞より発生するカルシウム感受性タンパク質の発光を測定する、
を含む、生物試料中のＡＶＰ量の測定方法、ＡＶＰ関連疾患を診断する方法、ＡＶＰ関連疾患を発症する危険性を判定する方法または、ＡＶＰ関連疾患の治療の有効性を判定する方法、を提供する。
上記工程で用いる試薬、装置、生物試料等の物質および上記工程の条件は、上述した「２．Ｖ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、並びに該細胞を含む組成物およびキット」を参考にして、当業者が適宜調製または設定できる。
Ca2+含有溶液の例としては、CaCl2溶液が挙げられる。
上記方法の工程（Ａ）に記載した物質をいかなる順番で添加するかは、当業者が適宜設定できる。
例えば、本発明は、下記工程：
（１）カルシウム感受性タンパク質の発光基質を添加したCa2+不含の培地中で懸濁したＶ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞を、細胞培養用プレートに播種する工程；
（２）被験者由来の生物試料を細胞に添加し、培養する工程；および
（３）培養細胞にCaCl2溶液を添加し、該細胞より発生するカルシウム感受性タンパク質の発光を測定する工程を含む、生物試料中のＡＶＰ量の測定方法、ＡＶＰ関連疾患を診断する方法、ＡＶＰ関連疾患を発症する危険性を判定する方法、または、ＡＶＰ関連疾患の治療の有効性を判定する方法を提供する。
本発明により提供される細胞の培養は、無菌培養であってもよいが、無菌的な培養である必要はない。例えば、本発明により提供される細胞の培養時間が４時間以内であれば、時間が短いので無菌的な培養である必要はない。
イクオリン等のカルシウム感受性タンパク質の発光はCaCl2溶液の添加後すぐに行われ、当業者により周知の方法で測定できる。例えば、攪拌と測定が自動で連続してできるルミノメーター（PerkinElmer社、ARVO-Sx）を使用し、攪拌後１５−３０秒間の発光値を積算して発光量を測定することができる。発光量の測定に使用できる装置は、当業者が適宜選択できる。
【００４３】
上記方法を実施した結果得られたカルシウム感受性タンパク質の発光量に基づき、生物試料中のＡＶＰ量が測定される。測定されたＡＶＰ量に基づき、ＡＶＰ関連疾患が診断され、ＡＶＰ関連疾患を発症する危険性が判定され、または、ＡＶＰ関連疾患の治療の有効性が判定される。例えば、ＳＩＡＤＨが疑われる被験者の血液試料を添加した場合の発光量が、正常人の血液試料（標準品）を添加した場合の発光量より高ければ、被験者の血中におけるＡＶＰの濃度が正常人に比較し高いと判断でき、被験者はＳＩＡＤＨであると判定される。また、例えば、尿崩症が疑われる被験者の血液試料を添加した場合の発光量が、正常人の血液試料（標準品）を添加した場合の発光量より低ければ、被験者の血中におけるＡＶＰの濃度が正常人に比較し低いと判断でき、被験者は尿崩症であると判定される。
【００４４】
一つの実施態様として、本発明により提供されるＶ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞を含む組成物は、感度よく、ＡＶＰ、Ｖ２ＲアゴニストまたはＶ２Ｒアンタゴニストを検出できる。
よって、一つの好ましい実施態様として、本発明により提供される方法には、生物試料よりＡＶＰ、Ｖ２ＲアゴニストまたはＶ２Ｒアンタゴニストを濃縮する工程（例えば、カラム（例えば、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カラムなどのＣ１８カラム）を使用する工程、限外ろ過装置を使用する工程、遠心濃縮装置を使用する工程等）を含まない。
【００４５】
また、本発明は、更なる一つの実施態様として、下記工程（Ａ’）〜（Ｃ’）：
（Ａ’）Ｖ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、カルシウム感受性タンパク質の発光基質、Ca2+不含の培地、および被験化合物を含む混合物を調製する；
（Ｂ’）（Ａ’）で調製した混合物にCa2+含有溶液を添加する；および
（Ｃ’）該細胞より発生するカルシウム感受性タンパク質の発光を測定する、
を含む、Ｖ２Ｒアゴニストまたはアンタゴニストの活性を測定する方法、またはＶ２Ｒアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法、を提供する。ここで、Ｖ２Ｒアンタゴニストの活性を測定する、またはＶ２Ｒアンタゴニストをスクリーニングする場合は、工程（Ａ’）の混合物にさらにＡＶＰを適量添加する。
上記工程で用いる試薬、装置等の物質および上記工程の条件は、上記「２．Ｖ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、並びに該細胞を含む組成物およびキット」および上記工程（Ａ）−（Ｃ）を含む本発明により提供される方法の記載を参考にして、当業者が適宜調製または設定できる。
当業者は、上記方法を実施した結果得られたカルシウム感受性タンパク質の発光量に基づき、適宜、被験化合物のＶ２Ｒアゴニスト活性またはＶ２Ｒアンタゴニスト活性を定量することができ、また、被験化合物がＶ２Ｒアゴニストであるか否か、Ｖ２Ｒアンタゴニストであるか否かを判断することができる。
【００４６】
本発明は、また、更なる一つの実施態様として、下記工程（Ａ’’）〜（Ｃ’’）：
（Ａ’’）Ｖ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、カルシウム感受性タンパク質の発光基質、Ca2+含有の培地、ＡＶＰおよび被験化合物を含む混合物を調製する；
（Ｂ’’）（Ａ’’）で調製した混合物にフォルスコリンを添加する；および
（Ｃ’’）該細胞より発生するカルシウム感受性タンパク質の発光を測定する、を含むＶ２Ｒアンタゴニストの活性測定方法、またはＶ２Ｒアンタゴニストをスクリーニングする方法、を提供する。
上記工程で用いる試薬、装置等の物質および上記工程の条件は、上述した「２．Ｖ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、並びに該細胞を含む組成物およびキット」の記載および上記工程（Ａ）−（Ｃ）を含む本発明により提供される方法の記載を参考にして、当業者が適宜調製または設定できる。
本方法は、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネルの脱感作を利用して、Ｖ２Ｒアンタゴニストの活性を検出する。具体的には、被験化合物がＶ２Ｒアンタゴニストであれば、ＡＶＰがＶ２Ｒに結合することは阻害される。この状態で、アデニレートサイクラーゼを活性化するフォルスコリン（forskolin）を添加すれば、ｃＡＭＰが生成され、これがｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル（例えば、ＣＮＧカルシウム）を活性化させるので、カルシウム感受性タンパク質が発光する。しかしながら、被験化合物がＶ２Ｒアンタゴニストでなければ、ＡＶＰがＶ２Ｒに結合するので、フォルスコリンを添加する前にｃＡＭＰが生成され、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル（例えば、ＣＮＧカルシウム）は活性化される。この状態で次にフォルスコリンを添加しても、一度活性化されたｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネルは脱感作され、フォルスコリンの添加によって活性化されず、カルシウム感受性タンパク質は発光しない。
１つの実施態様として、本発明により提供される工程（Ａ’’）〜（Ｃ’’）を含む方法は、高濃度域でのＶ２Ｒアンタゴニストの阻害活性を正確に定量できる。
当業者は、上記方法を実施した結果得られたカルシウム感受性タンパク質の発光量に基づき、適宜、被験化合物のＶ２Ｒアンタゴニストの活性を定量することができ、また、被験化合物がＶ２Ｒアンタゴニストであるか否かを判断することができる。
Ｖ２Ｒアンタゴニストは、血圧降下薬、低ナトリウム血症治療薬、ＳＩＡＤＨ治療薬等に利用できるので、上記方法を実施した結果Ｖ２Ｒアンタゴニストと判断された化合物を含む組成物を、血圧降下剤、低ナトリウム血症治療剤、ＳＩＡＤＨ治療剤として調製できる。
【００４７】
５．ＧＬＰ−１受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞を用いたバイオアッセイ法
本発明は、一つの実施態様として、下記工程（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）ＧＬＰ−１受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、カルシウム感受性タンパク質の発光基質、Ca2+不含の培地、および被験者由来の生物試料を含む混合物を調製する；
（Ｂ）（Ａ）で調製した混合物にCa2+含有溶液を添加する；および
（Ｃ）該細胞より発生するカルシウム感受性タンパク質の発光を測定する、
を含む、生物試料中の活性型ＧＬＰ−１量の測定方法、ＧＬＰ−１関連疾患を発症する危険性を判定する方法または、ＧＬＰ−１関連疾患の治療の有効性を判定する方法、を提供する。
上記工程で用いる試薬、装置、生物試料等の物質および上記工程の条件は、上述した「３．ＧＬＰ−１受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、並びに該細胞を含む組成物およびキット」および「４．Ｖ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞を用いたバイオアッセイ法」の記載を参考にして、当業者が適宜調製または設定できる。
上記方法の工程（Ａ）に記載した物質をいかなる順番で添加するかは、当業者が適宜設定できる。
例えば、本発明は、下記工程：
（１）カルシウム感受性タンパク質の発光基質を添加したCa2+不含の培地中で懸濁したＧＬＰ−１受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞を、細胞培養用プレートに播種する工程；
（２）被験者由来の生物試料を細胞に添加し、培養する工程；および
（３）培養細胞にCaCl2溶液を添加し、該細胞より発生するカルシウム感受性タンパク質の発光を測定する工程を含む、生物試料中の活性型ＧＬＰ−１量の測定方法、または、ＧＬＰ−１関連疾患の治療の有効性を判定する方法を提供する。
工程（２）の培養は、無菌培養であってもよいが、無菌的な培養である必要はない。例えば、工程（２）の培養時間が4時間以内であれば、時間が短いので無菌的な培養である必要はない。
工程（３）において、イクオリン等のカルシウム感受性タンパク質の発光はCaCl2溶液の添加後すぐに行われ、当業者により周知の方法で測定できる。例えば、攪拌と測定が自動で連続してできるルミノメーター（PerkinElmer社、ARVO-Sx）を使用し、攪拌後１５−３０秒間の発光値を積算して発光量を測定することができる。発光量の測定に使用できる装置は、当業者が適宜選択できる。
【００４８】
一つの実施態様として、本発明により提供されるＧＬＰ−１受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞を含む組成物は、感度よく、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１受容体アゴニストまたはＧＬＰ−１受容体アンタゴニストを検出できる。
よって、一つの好ましい実施態様として、本発明により提供される方法には、生物試料よりＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１受容体アゴニストまたはＧＬＰ−１受容体アンタゴニストを濃縮する工程（例えば、カラム（例えば、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カラムなどのＣ１８カラム）を使用する工程、限外ろ過装置を使用する工程、遠心濃縮装置を使用する工程等）を含まない。
さらに、一つの実施態様として、本発明により提供される方法は、活性型ＧＬＰ−１（７−３６）および活性型ＧＬＰ−１（７−３７）の両方の合計量を一回の操作で測定できる。
【００４９】
また、本発明は、下記工程（Ａ’）〜（Ｃ’）：
（Ａ’）ＧＬＰ−１受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、カルシウム感受性タンパク質の発光基質、カルシウム不含の培地、および被験化合物を含む混合物を調製する；
（Ｂ’）（Ａ’）で調製した混合物にカルシウム含有溶液を添加する；および
（Ｃ’）該細胞より発生するカルシウム感受性タンパク質の発光を測定する、
を含む、ＧＬＰ−１受容体アゴニストまたはアンタゴニストの活性を測定する方法、またはＧＬＰ−１受容体アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法、を提供する。ここで、ＧＬＰ−１受容体アンタゴニストの活性を測定する、またはＧＬＰ−１受容体アンタゴニストをスクリーニングする場合は、工程（Ａ’）の混合物にさらにＧＬＰ−１を適量添加する。
上記工程で用いる試薬、装置等の物質および上記工程の条件は、上述した「３．ＧＬＰ−１受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、並びに該細胞を含む組成物およびキット」および「４．Ｖ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞を用いたバイオアッセイ法」の記載および上記工程（Ａ）−（Ｃ）を含む本発明により提供される方法の記載を参考にして、当業者が適宜調製または設定できる。
当業者は、上記方法を実施した結果得られたカルシウム感受性タンパク質の発光量に基づき、適宜、被験化合物のＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性またはＧＬＰ−１受容体アンタゴニスト活性を定量することができ、また、被験化合物がＧＬＰ−１受容体アゴニストであるか否か、アンタゴニストであるか否かを判断することができる。
ＧＬＰ−１受容体アゴニストは、２型糖尿病の治療薬に利用できるので、上記方法を実施した結果ＧＬＰ−１受容体アゴニストと判断された化合物を含む組成物を２型糖尿病治療剤として調製できる。
【００５０】
本発明は、また、一つの実施態様として、下記工程（Ａ’’）〜（Ｃ’’）：
（Ａ’’）ＧＬＰ−１受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、カルシウム感受性タンパク質の発光基質、Ca2+含有の培地、ＧＬＰ−１および被験化合物を含む混合物を調製する；
（Ｂ’’）（Ａ’’）で調製した混合物にフォルスコリンを添加する；および
（Ｃ’’）該細胞より発生するカルシウム感受性タンパク質の発光を測定する、を含むＧＬＰ−１受容体アンタゴニストの活性測定方法、またはＧＬＰ−１受容体アンタゴニストをスクリーニングする方法、を提供する。
上記工程で用いる試薬、装置等の物質および上記工程の条件は、上述した「３．ＧＬＰ−１受容体、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞、並びに該細胞を含む組成物およびキット」および「４．Ｖ２Ｒ、ｃＡＭＰ依存性カルシウムチャンネル、およびカルシウム感受性タンパク質を発現する細胞を用いたバイオアッセイ法」の記載および上記工程（Ａ）−（Ｃ）を含む本発明により提供される方法の記載を参考にして、当業者が適宜調製または設定できる。
当業者は、上記方法を実施した結果得られたカルシウム感受性タンパク質の発光量に基づき、適宜、被験化合物のＧＬＰ−１受容体アンタゴニストの活性を定量することができ、また、被験化合物がＧＬＰ−１受容体アンタゴニストであるか否かを判断することができる。
【００５１】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００５２】
Ａ．Ｖ２Ｒを発現する細胞に関する実験
１．凍結細胞の構築方法の詳細
ヒト由来のcDNA ライブラリーからPCR法によりヒトＶ２ＲのcDNA配列（Genbank No. NM_001146151.1）（配列番号５）を増幅し、pUC18にクローニングした。pUC18にクローン化したヒトバソプレッシン受容体アイソフォーム2(Ｖ２Ｒ)のcDNAをpEF2ベクターにリクローニングし、pEFhＶ２Ｒを作成した。
マウス臭上皮細胞由来のcDNAライブラリーからサイクリックヌクレオチド依存型のカルシウムチャンネル（Genbank No. BC048775）（配列番号４）をPCR法で増幅し（1994bp）発現ベクター（pCMVSPORT, Invitrogen）にクローニングしてpmCNGα2（図１８）を作成した。更に、cAMPに対する選択性と感度を上昇させるために、460番目のシステイン(C)をトリプトファン(W)に、583番目のグルタミン酸(E)をメチオニン（M）にアミノ酸置換を導入した改変サイクリックヌクレオチド依存型のカルシウムチャンネル（配列番号６）を発現するコンストラクトpmCNGα2MWを点変異PCR法により作成した。また、オリゴDNA伸長法によってヒト型のコドン頻度に最適化し、ミトコンドリア移行シグナルを有する合成アポイクオリンcDNA配列（676bp）（配列番号７）を、KpnI, NheIで制限酵素処理し、KpnI, NheIで処理したpcDNA3.1(Invitrogen)にクローニングし、イクオリン発現ベクターpcDNA mt sAEQ（図１３）を作成した。
CHO細胞株を10cm2シャーレに細胞濃度1.0x105 cells/mlで播種した。翌日、シャーレあたり1μgのpEF2Ｖ２Ｒ、2μgのpmCNGα2MW, 2μgのpcDNA mt sAEQをFuGENE6TM（ロッシュ社）を用いて遺伝子導入した。翌日、シャーレに400μLのベルセン溶液(EDTA)を添加し、細胞をシャーレより剥がし、10 mLの5% cFCS を含むDMEM/F12 培地に懸濁した。得られた懸濁液を1000回転で5分間遠心分離後、ペレットを2-5×106 cells/mLの濃度で1mLのセルバンカーに溶解させ-80℃で保存した。【００５３】
２．凍結細胞をもちいたＡＶＰの濃度依存曲線と最低検出感度
１で調製した凍結細胞１ｍｌ（３ｘ１０６cells/ml）を温浴で溶解させ10mLの洗浄バッファー(カルシウム不含CO2インディペンデント培地、Invitrogen社)に懸濁して、1000rpm 5分遠心後、得られた沈殿に12mLのカルチャーバッファー（5% PEG6000, カルシウム不含CO2インディペンデント培地）を加えて6μL 4mM ViviRen (Promega社)を添加し、50μL/wellで96穴プレートに播種した。さらに、サンプルバッファーで段階希釈したＡＶＰを50μL添加し（n=3）、室温で3時間培養した。3mM CaCl2液を100μL/wellで添加しルミノメーター（PerkinElmer社、ARVO-Sx、以下、実施例において同機種を使用した）で発光量を測定した。図１にＡＶＰの濃度依存曲線を示した。【００５４】
低濃度域について拡大した図２で示したようにブランク値の+3SDの値を有意に分離できるＡＶＰの最低検出感度は、0.63pg/mLで、あった。また、イクオリンは、発光反応を利用しているため、本法では、高いブランク/シグナル比（S/N比）80pg/mL ＡＶＰ  S/N比、約56倍(3194263/56805)が得られた。【００５５】
４．イクオリン発光基質(Viviren)の添加後の培養時間の検討
１で調製した凍結細胞１ｍｌ（３ｘ１０６cells/ml）を温浴で溶解させ12mLの洗浄バッファーに懸濁して、1000rpm 5分遠心後、得られた沈殿に12mLのカルチャーバッファーを加えて6μL 4mM ViviRenを添加し、50μL/wellで96穴プレートに播種した。カルチャーバッファーで段階希釈したＡＶＰを50μL添加し、1,2,3,4,5時間後、3mM CaCl2液を100μL/wellで添加しルミノメーターで発光量を測定した。Viviren添加後4時間で発光量は、プラトーに達することがわかった（図３参照）。【００５６】
５．トランスフェクションするレセプタープラスミド量の検討
CHO細胞を10cm2シャーレに1×105 cells/mL濃度のCHO細胞を10mL播種し、１日培養後、3ug pcDNA mt sAEQ, 1ug pmCNGα2MWと0〜1ugのpEF2 Ｖ２Ｒプラスミドを混合し、600μL DMEM/F12、18μL Fugene6(ロッシュ社)を混合し、トランスフェクションを行った。さらに一晩培養後、培地を除去し、10mL PBSで洗った後、800μLのベルセンを加えて３７℃ 5分間培養した後10mLの洗浄バッファーに懸濁した。1000rpm 5分間遠心した後、沈殿を12mLのカルチャーバッファーに溶解させ、6.5μLの4mM Vivirenを添加した。ＡＶＰの濃度系列を50μL添加した96穴プレートに、50μL/wellで細胞懸濁液を播種した。室温で3時間培養した後、3mM CaCl2液を100μL/wellで添加しルミノメーターで発光量を測定した。
最適な発光量を得るには、受容体プラスミドについて1ug/plate量のトランスフェクションが必要であることが明らかになった（図４参照）。【００５７】
６．細胞濃度の最適化
１で調製した凍結細胞１ｍｌ（３ｘ１０６cells/ml）を温浴で溶解させ10mLのサンプルバッファーに懸濁して、1000rpm 5分遠心後、得られた沈殿に10mLのサンプルバッファーを加えた。細胞濃度を1.0×105 cells/mL〜2×106 cells/mL濃度に調整した細胞系列を作成し、6μL 4mM ViviRenを添加し懸濁した。カルチャーバッファーで段階希釈したＡＶＰを50μL添加した96穴プレートに細胞懸濁液を播種した。3時間培養した後、3mM CaCl2液を100μL/wellで添加しルミノメーターで発光量を測定した。
図５および図６に示すように細胞濃度に依存して発光量は増加した。【００５８】
７．CaCl2検出液の添加濃度の検討
１で調製した凍結細胞１ｍｌ（３ｘ１０６cells/ml）を温浴で溶解させ10mLの洗浄バッファーに懸濁して、1000rpm 5分遠心後、得られた沈殿に12mLのカルチャーバッファーを加えて6μL 4mM ViviRenを添加し、50μL/wellで96穴プレートに播種した。カルチャーバッファーで段階希釈したＡＶＰを50μL添加し、3時間培養した。最終濃度0〜30mM のCaCl2検出液を100μL/wellで添加しルミノメーターで発光量を測定した。
バックグラウンド（0）での値が低く、サンプルで発光量が高い30mM のCaCl2濃度が最適であることが明らかになった（図７参照）。【００５９】
８．AVP溶液を用いた希釈直線性の検討
１で調製した凍結細胞１ｍｌ（３ｘ１０６cells/ml）を温浴で溶解させ10mLの洗浄バッファーに懸濁して、1000rpm 5分遠心後、得られた沈殿に12mLのカルチャーバッファーを加えて6μL 4mM ViviRenを添加し、50μL/wellで96穴プレートに播種した。AVP溶液をサンプルバッファーにて1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 倍に希釈し、3時間培養した。
3時間培養後、3mM CaCl2液を100μL/wellで添加しルミノメーターで発光量を測定した。
図８に示したように、直線性をもって発光量が増加することが確認された。【００６０】
１１．AVP溶液を用いた既存キットとの感度比較
１で調製した凍結細胞１ｍｌ（３ｘ１０６cells/ml）を温浴で溶解させ10mLの洗浄バッファーに懸濁して、1000rpm 5分遠心後、得られた沈殿に12mLのカルチャーバッファーを加えて6μL 4mM ViviRenを添加し、50μL/wellで96穴プレートに播種した。AVP溶液をサンプルバッファーにて1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 倍に希釈し、3時間培養した。
別途、既存の三菱化学メディエンス社のAVP-RIAキットにて測定した値を示した。RIAキットは、放射ラベルしたAVPに対する競合阻害率(B/B0 %)で表記される。したがって、比較上、100-(各濃度の発光量/最大発光量)*100で表記した。既存のRIAキットと比較して、20pg/mL以上の用量においても線形性が保たれ、感度が優れていることが分かった（図９参照）。【００６１】
１２．ヒト臨床検体を用いた検討
１で調製した凍結細胞１ｍｌ（３ｘ１０６cells/ml）を温浴で溶解させ10mLの洗浄バッファーに懸濁して、1000rpm 5分遠心後、得られた沈殿に12mLのカルチャーバッファーを加えて6μL 4mM ViviRenを添加し、50μL/wellで96穴プレートに播種した。標準液となるＡＶＰの希釈系列、正常人血漿、及びAVPを添加して作成した高値血漿を用いた。検体80μLに320μLのカルチャーバッファーを加えて希釈し、50μL/wellでプレートに添加し、3時間培養した。3mM CaCl2液を100μL/wellで添加し、ルミノメーターで発光量を測定した。【００６２】
１３．凍結細胞を用いたキットの発光の経時変化の検討
１で調製した凍結細胞１ｍｌ（３ｘ１０６cells/ml）を温浴で溶解させ10mLの洗浄バッファーに懸濁して、1000rpm 5分遠心後、得られた沈殿に12mLのカルチャーバッファーを加えて6μL 4mM ViviRenを添加し、50μL/wellで96穴プレートに播種した。カルチャーバッファーで段階希釈したＡＶＰを50μL添加し、3時間培養した。3mM CaCl2液を100μL/wellで添加し、３秒撹拌後、１２秒間経時的にルミノメーターで発光量を測定した。その結果、図１１に示すように、CaCl2液添加直後から比較的安定した発光が観察された。
【００６３】
１４．脱感作によるAVP及びV2Rアンタゴニストの検出の検討
１で調製した凍結細胞１ｍｌ（３ｘ１０６cells/ml）を温浴で溶解させ10mLの洗浄バッファーに懸濁して、1000rpm 5分遠心分離した。得られた沈殿に12mLのカルチャーバッファーを加えて6μLの4mM ViviRenを添加し、50μL/wellで96穴プレートに播種した。カルシウム含のカルチャーバッファーで段階希釈したAVP、及びOPC-41061を50μL添加し、3時間培養した。10-7MのAVPを50μL/wellで添加し、ルミノメーターで発光量を測定した(図１４、図１５)。バソプレッシンアンタゴニストであるOPC-41061は、濃度依存的に添加されたAVPの作用を抑制した（図１４）。また、AVPと細胞をカルシウム含培地で反応させた場合は、高濃度のAVP存在下では、一度反応がおこっているため、再度のAVP添加によっては発光が起こらなかった。脱感作により濃度依存的にAVPの添加によって発光量は減少した（図１５）。脱感作によってもAVPを定量できることがわかった。さらに、つづけて、10-4Mのフォルスコリンを50μL/wellで添加し、ルミノメーターで発光量を測定した(図１６)。バソプレッシンアンタゴニストにより添加したAVPの作用が抑制された場合のみ、フォルスコリンによる発光が濃度依存的に検出され、脱感作によってバソプレッシンアンタゴニストが検出できることがわかった。
【００６４】
Ｂ．ＧＬＰ−１受容体を発現する細胞に関する実験
１．凍結細胞の構築方法の詳細
ヒト由来のcDNA ライブラリーからPCR法によりヒトＧＬＰ−１受容体のcDNA配列（Genbank No. BC113493）（配列番号９）を増幅し、pUC18にクローニングした。pUC18にクローン化したヒトＧＬＰ−１受容体(GLP-1R)のcDNAをpCIneoベクターにリクローニングし、pCIneoGLP-1Rを作製した。
マウス臭上皮細胞由来のcDNAライブラリーからサイクリックヌクレオチド依存型のカルシウムチャンネル（Genbank No. BC048775）をPCR法で増幅し（1994bp）発現ベクター（pCMVSPORT, Invitrogen）にクローニングしてpmCNGα2を作成した。更に、cAMPに対する選択性と感度を上昇させるために、460番目のシステイン(C)をトリプトファン(W)に、583番目のグルタミン酸(E)をメチオニン（M）にアミノ酸置換を導入した改変サイクリックヌクレオチド依存型のカルシウムチャンネルを発現するコンストラクトpmCNGα2MWを点変異PCR法により作成した。また、オリゴDNA伸長法によってヒト型のコドン頻度に最適化し、ミトコンドリア移行シグナルを有する合成アポイクオリンcDNA配列（676bp）を、KpnI, NheIで制限酵素処理し、KpnI, NheIで処理したpcDNA3.1(Invitrogen)にクローニングし、イクオリン発現ベクターpcDNA mt sAEQを作成した。
CHO細胞株を10cm2シャーレに細胞濃度1.0x105 cells/mlで播種した。翌日、シャーレあたり0.1μgのpCIneoGLP-1R、1μgのpmCNGα2MW, 4μgのpcDNA mt sAEQをFuGENE6TM（ロッシュ社）を用いて遺伝子導入した。翌日、シャーレに400μLのベルセン溶液(EDTA)を添加し、細胞をシャーレより剥がし、10 mLの5% cFCS を含むDMEM/F12 培地に懸濁した。得られた懸濁液を1000回転で5分間遠心分離後、ペレットを2-5×106 cells/mLの濃度で1mLのセルバンカーに溶解させ-80°Cで保存した。【００６５】
２．凍結細胞をもちいたGLP-1の濃度依存曲線と最低検出感度
１で調製した凍結細胞１ｍｌ（３ｘ１０６cells/ml）を温浴で溶解させ10mLの洗浄バッファー(カルシウム不含CO2インディペンデント培地、Invitrogen社)に懸濁して、1000rpm 5分遠心後、得られた沈殿に12mLのカルチャーバッファー（5% PEG6000, カルシウム不含CO2インディペンデント培地）を加えて6μL 4mM ViviRen (Promega社)を添加し、90μL/wellで96穴プレートに播種した。さらに、サンプルバッファーで段階希釈した活性型GLP-1(7-36アミド)を１0μL添加し（n=3）、室温で3時間培養した。100mM CaCl2液を50μL/wellで添加しルミノメーター（PerkinElmer社、ARVO-Sx、以下、実施例において同機種を使用した）で発光量を測定した。図１７に活性型GLP-1の濃度依存曲線を示した。
ブランク値の+3SDの値を有意に分離できる活性型ＧＬＰ−１の最低検出感度は、0.078pg/mLで、あった。また、イクオリンは、発光反応を利用しているため、本法では、高いブランク/シグナル比（S/N比）33pg/mL 活性型ＧＬＰ−１  S/N比、約 ９．３倍( 902623 / 96686 )が得られた。【００６６】
３．イクオリン発光基質(Viviren)の添加後の培養時間の検討
１で調製した凍結細胞１ｍｌ（３ｘ１０６cells/ml）を温浴で溶解させ12mLの洗浄バッファーに懸濁して、1000rpm 5分遠心後、得られた沈殿に12mLのカルチャーバッファーを加えて6μL 4mM ViviRenを添加し、90μL/wellで96穴プレートに播種した。カルチャーバッファーで段階希釈した活性型ＧＬＰ-1を10μL添加し、0,1,2,3,4,5,7時間後、100mM CaCl2液を50μL/wellで添加しルミノメーターで発光量を測定した。Viviren添加後３時間で発光量は、プラトーに達することがわかった（図１８参照）。【００６７】
４．トランスフェクションするレセプタープラスミド量の検討
CHO細胞を10cm2シャーレに0.7×105 cells/mL濃度のCHO細胞を10mL播種し、１日培養後、4ug pcDNA mt sAEQ, 1ug pmCNGα2MWと0〜1ugのpCIneoＧＬＰ−１受容体プラスミドを混合し、600μL DMEM/F12、18μL Fugene6(ロッシュ社)を混合し、トランスフェクションを行った。さらに一晩培養後、培地を除去し、10mL PBSで洗った後、800μLのベルセンを加えて37°C 5分間培養した後10mLの洗浄バッファーに懸濁した。1000rpm 5分間遠心した後、沈殿を12mLのカルチャーバッファーに溶解させ、6μLの4mM Vivirenを添加した。ＧＬＰ−１の濃度系列を10μL添加した96穴プレートに、90μL/wellで細胞懸濁液を播種した。室温で3時間培養した後、100mM CaCl2液を50μL/wellで添加しルミノメーターで発光量を測定した。
最適な発光量を得るには、受容体プラスミドについて0.1ug/plate量のトランスフェクションが必要であることが明らかになった（図１９参照）。【００６８】
５．細胞濃度の最適化
１で調製した凍結細胞１ｍｌ（３ｘ１０６cells/ml）を温浴で溶解させ10mLのサンプルバッファーに懸濁して、1000rpm 5分遠心後、得られた沈殿に10mLのサンプルバッファーを加えた。細胞濃度を1.25×105 cells/mL〜1×106 cells/mL濃度に調整した細胞系列を作成し、6μL 4mM ViviRenを添加し懸濁した。カルチャーバッファーで段階希釈したGLP-1を50μL添加した96穴プレートに細胞懸濁液を播種した。３時間培養した後、100mM CaCl2液を100μL/wellで添加しルミノメーターで発光量を測定した。
図２０および図２１に示すように細胞濃度に依存して発光量は増加した。【００６９】
６．ＧＬＰ−１溶液を用いた希釈直線性の検討
１で調製した凍結細胞１ｍｌ（３ｘ１０６cells/ml）を温浴で溶解させ10mLの洗浄バッファーに懸濁して、1000rpm 5分遠心後、得られた沈殿に12mLのカルチャーバッファーを加えて6μL 4mM ViviRenを添加し、50μL/wellで96穴プレートに播種した。GLP-1溶液をサンプルバッファーにて1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 倍に希釈し、3時間培養した。
3時間培養後、100mM CaCl2液を50μL/wellで添加しルミノメーターで発光量を測定した。
図２２に示したように、直線性をもって発光量が増加することが確認された。【００７０】
７．GLP-1溶液を用いた既存キットとの感度比較
１で調製した凍結細胞１ｍｌ（３ｘ１０６cells/ml）を温浴で溶解させ10mLの洗浄バッファーに懸濁して、1000rpm 5分遠心後、得られた沈殿に12mLのカルチャーバッファーを加えて6μL 4mM ViviRenを添加し、90μL/wellで96穴プレートに播種した。AVP溶液をサンプルバッファーにて1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 倍に希釈し、４時間培養した。
別途、既存のミリポア社のGLP-1(Active)-ELISAキット（EGLP-35K）にて測定した値を示した。ELISAキットは、蛍光強度として、本キットは化学発光強度として測定されるため、比較上、各最大発光量に％対する相対値（％）で表記した。既存のELISAキットと比較して、1pg/mL以下の用量においても線形性が保たれ、感度が優れていることが分かった（図２３参照）。最低検出感度は、それぞれ、既存ELISA キットでは3.73 pg/ml、本キットでは0.078 pg/mlであった。
また、本発明により提供されるキットは、既存のELISAキットと比較して測定可能な活性型ＧＬＰ−１の濃度範囲が大きいことが分かった（図２３参照）。【００７１】
８．ＧＬＰ−１類似ペプチドを用いたキット特異性検討
１で調製した凍結細胞１ｍｌ（３ｘ１０６cells/ml）を温浴で溶解させ10mLの洗浄バッファーに懸濁して、1000rpm 5分遠心後、得られた沈殿に12mLのカルチャーバッファーを加えて6μL 4mM ViviRenを添加し、90μL/wellで96穴プレートに播種した。ＧＬＰ−１類似ペプチド溶液をサンプルバッファーにて1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000, 1/105 倍に希釈し、3時間培養した。本キットにおけるＧＬＰ−１類似ペプチド測定感度を、それぞれのEC50値（pM）で示した（図２４参照）。ＧＬＰ−１受容体に対する弱いアゴニストである前駆体ＧＬＰ−１（１−３７）、オキシントモジュリン、グルカゴンについては、活性型ＧＬＰ−１であるＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６アミド）に比較して、一万倍の高濃度で反応を示した。また、活性型ＧＬＰ−１が生体内で分解されて生成するＧＬＰ−１（９−３６アミド）、他の受容体に作用するインクレチンであるＧＩＰ、ＧＬＰ−２については、１００万倍の高濃度でもほとんど反応しなかった。本キットは、活性型ＧＬＰ−１である、ＧＬＰ−１（７−３６アミド）、およびＧＬＰ−１（７−３７）を極めて高感度に、かつ特異的に測定できることが分った。【００７２】
９．ヒト血漿中での活性型ＧＬＰ−１の測定
１で調製した凍結細胞１ｍｌ（３ｘ１０６cells/ml）を温浴で溶解させ10mLの洗浄バッファーに懸濁して、1000rpm 5分遠心後、得られた沈殿に12mLのカルチャーバッファーを加えて6μL 4mM ViviRenを添加し、50μL/wellで96穴プレートに播種した。正常人血漿、または緩衝液に活性型ＧＬＰ−１（７−３６アミド）を終濃度16.5pg/ml(5pM)になるように添加して作成したＧＬＰ−１含有サンプルを用いた。血漿中のＤＰＰ−ＩＶペプチダーゼの活性を阻害するために、ミリポア社  DPP-IV阻害剤（DPP44-010）を血漿１ｍあたり20uL添加した。１0μL/wellでプレートに添加し、４時間培養した。100mM CaCl2液を50μL/wellで添加し、ルミノメーターで発光量を測定した。結果を図２５に示す。
緩衝液に比較して、ヒト血漿では、ＧＬＰ−１活性は時間とともに消失し、その消失はＤＰＰ−ＩＶ阻害剤によって抑制された。本キットを用いることで、ＤＰＰ−ＩＶ酵素活性によるＧＬＰ−１分解をモニタリングすることができた。【００７３】
１０．ＧＬＰ−１アゴニスト、およびＧＬＰ−１アンタゴニストの検出
１で調製した凍結細胞１ｍｌ（３ｘ１０６cells/ml）を温浴で溶解させ10mLの洗浄バッファーに懸濁して、1000rpm 5分遠心分離した。得られた沈殿に12mLのカルチャーバッファーを加えて6μLの4mM ViviRenを添加し、90μL/wellで96穴プレートに播種した。カルシウム含のカルチャーバッファーで段階希釈したエキセナチドを添加し、3時間培養した。100mM CaCl2液を50μL/wellで添加し、ルミノメーターで発光量を測定した。(図２６) エキセナチドはアメリカオオトカゲ(Gila monster lizard)の唾液腺に含まれるＧＬＰ-1類似ペプチドであり、ＤＰＰ−ＩＶ抵抗性であるため半減期が長く、２型糖尿病治療薬として上市されている。本キットでは、天然ＧＬＰ−１のみならず、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を有する類似体も高感度で測定できることが分った。
次にＧＬＰ−１アンタゴニストの活性測定を実施した。１で調製した凍結細胞１ｍｌ（３ｘ１０６cells/ml）を温浴で溶解させ10mLの洗浄バッファーに懸濁して、1000rpm 5分遠心分離した。得られた沈殿に12mLのカルチャーバッファーを加えて6μLの4mM ViviRenを添加し、90μL/wellで96穴プレートに播種した。
Exendin-4(9-39)を10μL添加し、3時間培養した。10-11MのＧＬＰ-1を10μL/wellで添加し、ルミノメーターで発光量を測定した。ＧＬＰ−１アンタゴニストであるExendin-4(9-39)は、濃度依存的に添加されたＧＬＰ−１のアゴニスト作用を抑制した（図２７）。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明によれば、操作が簡便でかつ安全な細胞内のｃＡＭＰ濃度を変化させる受容体に結合する生理活性物質の量の測定方法および測定キットを提供することが可能になり、該生理活性物質が関連する疾患の診断が可能となる。
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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