(57)【要約】  ATPの枯渇を効果的に改善することを作用機序とするインフルエンザ感染症の治療剤または予防剤であって、ジクロロ酢酸ジイソプロピルアミン（DADA）、DADAとグルコン酸またはその塩、またはDADAとグルコン酸またはその塩およびビタミンB1類を含有する薬剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジクロロ酢酸ジイソプロピルアミンを含有するインフルエンザウイルス感染症の治療剤または予防剤。
【請求項２】
さらに、グルコン酸またはその塩を含有する請求項１に記載の治療剤または予防剤。
【請求項３】
さらに、ビタミンB1類を含有する請求項２に記載の治療剤または予防剤。
【請求項４】
インフルエンザウイルスが、季節性のインフルエンザウイルスＡ型もしくはＢ型、新型インフルエンザウイルス(インフルエンザウイルス H1N1 2009)または高病原性インフルエンザウイルスである請求項１から３のいずれか１項に記載の治療剤または予防剤。
【請求項５】
哺乳動物に請求項１から４のいずれか１項に記載された剤の有効量を投与することを特徴とするインフルエンザウイルス感染症の治療法または予防法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジクロロ酢酸ジイソプロピルアミン（Diisopropylamine dichloroacetate：以下、単にDADAという場合がある。）を含有するインフルエンザの治療剤または予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは急性の呼吸器感染症であり、特に小児や高齢者では重症化する傾向が強く、中でも小児ではインフルエンザ脳症と多臓器不全の発症頻度が高い。このようにインフルエンザ罹患者が重症化する機序は、ウイルス感染により過剰生産された炎症性サイトカイン・活性酸素が血管内皮を障害すること（サイトカイン・ストーム）が主要因と考えられている。すなわち、インフルエンザ脳症では脳の血管内皮の透過性亢進による急速な脳浮腫であり、多臓器不全は全身の血管内皮細胞の透過性亢進による末梢循環不全であると考えられる（非特許文献1）。しかし、血管内皮の障害は程度の差こそあれウイルス罹患者に共通するものであり、特に小児で重症化が起こりやすい説明にはならない。【０００３】
一方、脂肪酸代謝酵素であるカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ（Carnitine palmitoyltrasferase 2：CPT2）には日本人に特有の多型が存在しており、この多型が存在すると高熱時に酵素が熱失活するために全身組織の脂肪酸代謝障害が起きて、結果として全身性のATPの枯渇を来たすことを、本発明者らははじめて見出し、実際に証明している（非特許文献2）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Wang S. et al. J. Infect. Dis. 202(7):991-1001, 2010
【非特許文献２】Yao D. et al. Hum. Mutat. 29(5): 718-727, 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一般的に小児は脂肪のエネルギー比率（総エネルギー量に占める脂肪エネルギーの比率）が高いことが知られていることから、インフルエンザで日本人患児が重症化する主要因は、ミトコンドリアの脂肪酸代謝系酵素の熱失活による全身性のATPの枯渇によるものと、本発明者らは推定するに至った。特に脂肪酸代謝障害によって症状の現れ易い組織は、エネルギー源の約70%を脂肪酸代謝に依存している血管内皮細胞である(Zeina Dagher et al. Circ. Res. 88:1276-1282, 2001)ことから、インフルエンザ罹患時に、先天性、あるいは後天性に脂肪酸代謝障害を持つ患者（児）で末梢循環不全が起こり易いことは、かかる理由によるものであることを本発明者らは帰納によりはじめて結論づけるに至った。【０００６】
かかる推論を基に、本発明者らは、脂肪酸代謝改善薬あるいは脂肪酸代謝の代替的なエネルギー産生系である糖代謝の代謝改善薬が、インフルエンザウイルス感染症の治療または予防薬剤の有効成分と成り得るのではないかと思いつくに至った。そこで、更に、体内代謝においては脂肪酸代謝と糖代謝は相互に密接に関係していることから、どちらか一方が低下した場合には他方が活性化されて体内のATPレベルを保つ方向に維持されるので、糖代謝改善薬が当該目的に有用ではないかと思いつくに至った。【０００７】
なお、糖代謝改善薬としては、例えば、ジクロロ酢酸ジイソプロピルアミン（DADA）、オクトチアミン（Octothiamine）、ベンフォチアミン（Benfothiamine）、等が知られている。特にDADAは、糖代謝改善効果の他に、ビタミンB1類（特にベンフォチアミン）およびグルコン酸との組合せによる抗疲労効果が知られている（特開2010-138170号公報）。ただし、DADAがインフルエンザウイルス感染症の治療または予防に有効であることは、従来、全く知られていない。【０００８】
すなわち、本発明は、インフルエンザウイルス感染の重症化とそれによる死は、ウイルス感染を引き金にして引き起こされた全身性のATPの枯渇状態の現れであり、ATPの枯渇状態を改善することで重症化と死は防げるという新しい作用機序に基づいた、インフルエンザの治療または予防手段を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、前記の課題を解決するものとして、以下を提供する。
（1）ジクロロ酢酸ジイソプロピルアミン(DADA)を含有するインフルエンザウイルス感染症の治療剤または予防剤。
（2）さらに、グルコン酸またはその塩を含有する前記（1）に記載の治療剤または予防剤。
（3）さらに、ビタミンB1類を含有する前記（2）に記載の治療剤または予防剤。
（4）インフルエンザウイルスが、季節性のインフルエンザウイルスＡ型もしくはＢ型、新型インフルエンザウイルス(インフルエンザウイルス H1N1 2009)または高病原性インフルエンザウイルスである前記（1）から（3）のいずれかに記載の治療剤または予防剤。
（5）哺乳動物に前記（1）から（4）のいずれかに記載された剤の有効量を投与することを特徴とするインフルエンザウイルス感染症の治療法または予防法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、インフルエンザウイルス感染による全身性のATPの枯渇を原因とする症状の重症化を効果的に予防または治療することが可能となる。また本発明の薬剤は、インフルエンザ感染に伴う体重減少の抑制、食欲減退の抑制、ATP枯渇の抑制にも効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】試験例１の結果であり、Ａはマウスの生存率の変化、Ｂは体重の変化を示す。
【図２】試験例２の結果であり、Ａはマウスの生存率の変化、Ｂは体重の変化を示す。
【図３】試験例３の結果であり、Ａはマウスの生存率の変化、Ｂは体重の変化を示す。
【図４】試験例３の結果であり、Ａはマウスの摂食量の変化、Ｂは摂水量の変化を示す。
【図５】試験例４の結果であり、Ａはマウスの生存率の変化、Ｂは体重の変化を示す。
【図６】試験例４の結果であり、Ａはマウスの摂食量の変化、Ｂは摂水量の変化を示す。
【図７】試験例５の結果であり、Ａはマウスの生存率の変化、Ｂは体重の変化を示す。
【図８】試験例５の結果であり、Ａはマウスの摂水量の変化、Ｂは摂食量の変化を示す。
【図９】試験例６の結果であり、血糖値、血中乳酸値、血中β-ヒドロキシ酪酸値および血中ATP値のそれぞれの測定値である。
【図１０】試験例７の結果であり、脳、心臓、肝臓、および筋肉のそれぞれにおけるATP量の測定値である。
【図１１】試験例８の結果であり、脳、心臓、肝臓および筋肉のそれぞれにおけるPDH（Pyruvate dehydrogenase）活性の測定値である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の薬剤に使用されるDADAは、市販品（例えば、第一三共株式会社製、Lot. XVA8056等）を使用することができる。
【００１３】
DADAの含有量は、好ましくは1〜20000mg、より好ましくは3〜3000mgを1日1〜3回に分けて服用できるように設計すればよい。例えば、本発明の薬剤が1日1回100mL服用する液剤であれば、その液剤におけるDADAの含有量は、好ましくは1〜20000mg/100mL、より好ましくは3〜3000mg/100mLである。
【００１４】
本発明の薬剤の好ましい態様の一つは、DADAと共にグルコン酸またはその塩を含有することである。なお、グルコン酸は風邪またはインフルエンザ用組成物の有効成分の一つ（特開2001-172184号公報）、鳥インフルエンザウイルスを不活性化するための薬剤の一成分として知られている（特開2010-143875号公報）が、インフルエンザウイルス感染症の治療または予防におけるDADAとの併用効果は、従来、全く知られていない。
【００１５】
グルコン酸の塩としては、例えば、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸マグネシウムなどが挙げられ、グルコン酸ナトリウムまたはグルコン酸カルシウムが好ましい。これらの化合物は医薬品添加物辞典2000などに収載されている。
【００１６】
本発明の薬剤におけるグルコン酸またはその塩の含有量は、好ましくは1〜20000mg、より好ましくは3〜3000mgを1日1〜3回に分けて服用できるように設計すればよい。例えば、本発明の薬剤が1日1回100mL服用する液剤であれば、その液剤におけるグルコン酸またはその塩の含有量は、好ましくは1〜20000mg/100mL、より好ましくは3〜3000mg/100mLである。なお、本発明の薬剤において、グルコン酸とグルコン酸塩を併用してもよい。その場合は、グルコン酸とグルコン酸塩との合計の含有量が上記の範囲であればよい。
【００１７】
また、DADAとグルコン酸またはその塩との配合比（重量比）は、本発明の効果が奏される限り特に限定されない。
【００１８】
本発明の薬剤の別の好ましい態様は、DADAと共に、グルコン酸またはその塩およびビタミンB1類を含有することである。
【００１９】
ビタミンB1類としては、塩酸チアミン、硝酸チアミン、ベンフォチアミン、フルスルチアミン、オクトチアミンなどが挙げられ、塩酸チアミンまたはベンフォチアミンが好ましい。これらの化合物は、第１５改正日本薬局方、医薬品添加物規格2003などに収載されている。
【００２０】
本発明の薬剤におけるビタミンB1類の含有量は、好ましくは0.1〜300mg、より好ましくは1〜200mgを1日1〜3回に分けて服用できるように設定すればよい。例えば、本発明の薬剤が1日1回100mL服用する液剤であれば、その液剤におけるビタミンB1類の含有量は、好ましくは0.1〜300mg/100mL、より好ましくは1〜200mg/100mLである。
【００２１】
また、DADAと、グルコン酸またはその塩およびビタミンB1類の合計との配合比（重量比）は、本発明の効果が奏される限り特に限定されない。
【００２２】
本発明の薬剤には、本発明の効果が阻害されない限り、さらに、ビタミンB1類以外のビタミン類、ピルビン酸またはその塩、カフェイン類、ミネラル類、アミノ酸類、生薬類、他の有機酸類、賦形剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、防腐剤、着色剤、安定剤、pH調節剤、溶解補助剤、清涼剤、香料、色素・着色剤などを配合することができる。
【００２３】
本発明の薬剤は、当該分野で公知の方法で製造することができる。例えば、本発明の薬剤が錠剤である場合には、日局製剤総則「錠剤」の項に準じて製造することができる。また、液剤である場合には、日局製剤総則「液剤」の項に準じて製造することができる。
【００２４】
本発明の薬剤は、季節性のＡ型もしくはＢ型インフルエンザ、新型インフルエンザ（インフルエンザウイルス H1N1 2009）の感染症または高病原性インフルエンザの予防または治療に有効である。「予防」とはインフルエンザウイルス感染による症状の発症、またはその重症化を防止することを意味し、インフルエンザ感染の危険性が予期される時期、または感染初期の軽症時に本発明の薬剤を投与する。また「治療」とはインフルエンザウイルス感染による症状、特に重症化症状が軽減または消失することを意味し、インフルエンザウイルス感染が確認された時点で本発明の薬剤を投与する。
【００２５】
さらに、本発明の薬剤は後記試験例に示したように、インフルエンザ感染に伴う体重の減少、食欲の減退およびATPの枯渇を効果的に抑制する。従って、本発明の薬剤はまた、インフルエンザ感染性体重減少抑制剤、インフルエンザ感染性食欲減退抑制剤、インフルエンザ感染性ATP枯渇抑制剤でもある。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例および試験例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、本願発明は以下の例に限定されるものではない。【００２７】
なお、以下の例で使用した試薬および実験機器は以下のとおりである。
（1）ケタラール(Ketamine）：筋注用500 mg[第一三共プロファーマ株式会社]Lot.GYA0015
（2）セラクタール(Xylazine)：2% 注射液 [バイエル薬品株式会社] Lot. KP05XAK
（3）PBS (ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水)：[Nacalai Tesque株式会社] Lot. L7H4885
（4）生理食塩水：大塚生食注 [株式会社大塚製薬工場] Lot. M9F98
（5）DADA（Diisopropylamine dichloroacetate）:[第一三共株式会社] Lot. XVA8056
（6）塩酸チアミン（ビタミンB1）：[和光純薬工業株式会社] Lot. WK8618
（6）ピルビン酸ナトリウム：[和光純薬工業株式会社] Lot. CDJ4337
（7）ベンフォチアミン：[第一三共株式会社] Lot. XTA8056
（8）グルコン酸カルシウム：[Nacalai Tesque株式会社] Lot. M9B3882
（9）グルコン酸ナトリウム：[Nacalai Tesque株式会社] Lot. M8T2159
（10）0.5% CMC溶液：0.5（w/v）%カルボキシメチルセルロース400溶液：[和光純薬工業株式会社] Lot. STR3766
（11）注射器：テルモシリンジ[テルモ株式会社] Lot. 081116F
（12）注射針：30G 1/2[Becton Dickinson株式会社] Lot. 305106
（13）ゾンデ針：DISPOSABLE経口ゾンデ[Fuchigami株式会社] Cat. 4202
実施例１（DADA混合剤１の調製）
生理食塩水100 mLに、
・DADA 0.5 g
・塩酸チアミン0.075 g
・ピルビン酸ナトリウム1.0 g
・グルコン酸カルシウム0.94 g
を添加混合し、DADA混合剤１を調製した。
実施例２（DADA混合剤２の調製）
生理食塩水100 mLに、
・DADA 0.5 g
・ベンフォチアミン0.075 g
・ピルビン酸ナトリウム1.0 g
・グルコン酸カルシウム0.94 g
を添加混合し、DADA混合剤２を調製した。
実施例３（DADA混合剤３の調製）
0.5% CMC溶液 100 mLに、
・DADA 0.5 g
・塩酸チアミン0.075 g
・ピルビン酸ナトリウム1.0 g
・グルコン酸カルシウム0.94 g
を添加混合し、DADA混合剤３を調製した。
実施例４（DADA 混合剤４の調製）
0.5% CMC溶液100 mLに、
・DADA 0.5 g
・塩酸チアミン0.075 g
・ピルビン酸ナトリウム1.0 g
・グルコン酸ナトリウム2.1 g
を添加混合し、DADA混合剤４を調製した。
実施例５（DADA混合剤５の調製）
0.5% CMC溶液100 mLに、
・DADA 0.5 g
・ベンフォチアミン0.075 g
・ピルビン酸ナトリウム1.0 g
・グルコン酸カルシウム0.47 g
を添加混合し、DADA混合剤５を調製した。
実施例６（DADA混合剤６の調製）
0.5% CMC溶液100 mLに、
・DADA 0.5 g
・ベンフォチアミン0.075 g
・グルコン酸カルシウム0.47 g
を添加混合し、DADA混合剤６を調製した。
実施例７（DADA混合剤７の調製）
0.5% CMC溶液100 mLに、
・DADA 0.5 g
・グルコン酸カルシウム0.47 g
を添加混合し、DADA混合剤７を調製した。
実施例８（DADA混合剤８の調製）
0.5% CMC溶液100 mLに、
・DADA 0.5 g
を添加し、DADA混合剤８を調製した。
試験例１
3週齢のメス(C57B6/6J, Japan SLC, Inc) のマウスを用いてウイルス感染試験を行った。これらのマウスの個々の体重を測定した後、平均体重がほぼ均一なるように4群（15匹/1群）に群分けした。そのうちの3群（計45匹）を感染群とし、ウイルス感染を実施した。ウイルス感染は、ケタラール麻酔（ケタラール62.6 mg/kg + セラクタール12.4 mg/kg）を施行したマウスへ、インフルエンザウイルス（Influenza A/PR/8/34: H1N1、(財)阪大微生物病研究会から供与）を60 pfu（15 μL：片鼻7.5 μLずつ）経鼻感染した。残りの１群（15匹）は非感染群とし、ウイルスの代わりにPBSを15 μL経鼻投与した。【００２８】
各感染群のマウスへの各薬剤の投薬は、ウイルスを感染させた翌日から毎日（朝晩２回、各0.1 mL）、生理食塩水（コントロール）、DADA混合剤１（実施例１）、DADA混合剤２（実施例２）をそれぞれ腹腔内投薬した。非感染群のマウスへの投薬も同様に、生理食塩水を腹腔内投薬した。これらのマウスの生存率・体重を測定（毎朝）した。【００２９】
結果は図１（A：生存率、B：体重）に示したとおりである。コントロール群（ウイルス感染＋生理食塩水投与群）は感染から１２日後に50％が死亡し、感染量60 pfuは半数致死量であることが確認された。【００３０】
ウイルス感染後にDADA混合剤１（実施例１）、DADA混合剤２（実施例２）をそれぞれ投与した各群は、コントロール群と比較して良好な生存率および体重減少の改善効果が観察された。
試験例２
3週齢のメス（C57B6/6J, Japan SLC, Inc）のマウスを用いてウイルス感染試験を行った。これらのマウスの個々の体重を測定した後、平均体重がほぼ均一なるように4群（15匹/1群）に群分けした。そのうちの3群（計45匹）を感染群とし、ウイルス感染を実施した。ウイルス感染は、ケタラール麻酔（ケタラール62.6 mg/kg + セラクタール12.4 mg/kg）を施行したマウスへ、インフルエンザウイルス（Influenza A/PR/8/34: H1N1）を60 pfu（15 μL: 片鼻7.5 μLずつ）経鼻感染した。残りの１群（15 匹）は非感染群とし、ウイルスの代わりにPBSを15 μL経鼻投与した。【００３１】
各感染群のマウスへの投薬は、ウイルスを感染させた翌日から毎日（朝晩２回、0.1 mL）、0.5% CMC溶液（コントロール）、DADA混合剤３（実施例３）、DADA混合剤４（実施例４）をそれぞれ経口投薬した。非感染群のマウスへの投薬も同様に、0.5 % CMC溶液を経口投薬した。これらのマウスの生存率・体重を測定（毎朝）した。【００３２】
結果は図２（A：生存率、B：体重）に示したとおりである。DADA混合剤３（実施例３）、DADA混合剤４（実施例４）は、それぞれ経口投与であっても、コントロール群と比較して良好な生存率および著明な体重減少の改善効果が観察された。体重減少の改善効果は経口投与した試験例２において、腹腔内投薬の試験例１に比べてより明確な傾向にあった。
試験例３
3週齢のメス（C57B6/6J, Japan SLC, Inc）のマウスを用いてウイルス感染試験を行った。これらのマウスの個々の体重を測定した後、平均体重がほぼ均一なるように４群（15 匹/1群）に群分けした。そのうちの３群（計45匹）を感染群とし、ウイルス感染を実施した。ウイルス感染は、ケタラール麻酔（ケタラール62.6 mg/kg + セラクタール12.4 mg/kg）を施行したマウスへ、インフルエンザウイルス（Influenza A/PR/8/34: H1N1）を60 pfu（15 μL:片鼻7.5 μLずつ）経鼻感染した。残りの１群（15匹）は非感染群とし、ウイルスの代わりにPBSを15 μL経鼻投与した。【００３３】
各感染群のマウスへの各薬剤投薬は、ウイルスを感染させた翌日から毎日（朝晩２回、各0.1 mL）、0.5% CMC溶液（コントロール）、DADA混合剤５（実施例５）、DADA混合剤６（実施例６）をそれぞれ経口投薬した。非感染群のマウスへの投薬も同様に、0.5 % CMC溶液を経口投薬した。これらのマウスの生存率・体重の変化と餌の摂食量・水の摂水量を測定（毎朝）した。【００３４】
結果は図３（A：生存率、B：体重）および図４（A：摂食量、B：摂水量）に示したとおりである。DADA混合剤５（実施例５）およびDADA混合剤６（実施例６）をそれぞれ投与した群は、コントロールと比較して良好な生存率および体重減少の改善効果が観察され、摂食量と摂水量においてもコントロールと比較して有意な差は認められなかった。
試験例４
3週齢のメス（C57B6/6J, Japan SLC, Inc）のマウスを用いてウイルス感染試験を行った。これらのマウスの個々の体重を測定した後、平均体重がほぼ均一なるように５群（15匹/1群）に群分けした。そのうちの４群（計60匹）を感染群とし、ウイルス感染を実施した。ウイルス感染は、ケタラール麻酔（ケタラール62.6 mg/kg + セラクタール12.4 mg/kg）を施行したマウスへ、インフルエンザウイルス（Influenza A/PR/8/34: H1N1）を60 pfu（15 μL:片鼻7.5 μLずつ）経鼻感染した。残りの１群（15匹）は非感染群とし、ウイルスの代わりにPBSを15 μL経鼻投与した。【００３５】
各感染群のマウスへの各薬剤の投薬は、ウイルスを感染させた翌日から毎日（朝晩2回、各0.1 ml）、0.5% CMC溶液（コントロール）、DADA混合剤６（実施例６）、DADA混合剤７（実施例７）、DADA混合剤８（実施例８）をそれぞれ経口投薬した。非感染群のマウスへの投薬も同様に、0.5 % CMC溶液を経口投薬した。これらのマウスの生存率・体重の変化と餌の摂食量・水の摂水量を測定（毎朝）した。【００３６】
結果は図５（A：生存率、B：体重）および図６（A：摂食量、B：摂水量）に示したとおりである。DADAのみを含有するDADA混合液８（実施例８）は、生存率についてコントロールと比較して良好な結果が得られた。そして、DADAとグルコン酸塩とビタミンB1類を含有するDADA混合剤６（実施例６）およびDADAとグルコン酸塩を含有するDADA混合剤７（実施例７）についても、生存率についてコントロールと比較して良好な結果が得られ、さらに、体重、摂食量および摂水量について、非感染群とほぼ同等の良好な推移を示した。【００３７】
以上の結果から、DADAがそれ単独でインフルエンザの治療、予防薬の有効成分となり得ることが確認された。さらに、DADA＋グルコン酸またはその塩、あるいはDADA＋グルコン酸またはその塩＋ビタミンB1類の複合投与が特に優れた効果を有することが確認された。
試験例５
3週齢のメス（C57B6/6J, Japan SLC, Inc）のマウスを用いてウイルス感染試験を行った。これらのマウスの個々の体重を測定した後、平均体重がほぼ均一なるように３群（15匹/1群）に群分けした。そのうちの２群（計30匹）を感染群とし、ウイルス感染を実施した。ウイルス感染は、ケタラール麻酔（ケタラール62.6 mg/kg + セラクタール12.4 mg/kg）を施行したマウスへ、インフルエンザウイルス（Influenza A/PR/8/34: H1N1）を試験例１−４までの50% 生存率を示す60 pfu から200 pfu に増加してウイルスの体内代謝に与える影響がより強くでる条件で試験を実施した。経鼻感染は15 μL:片鼻7.5 μLずつ投与して実施した。残りの１群（15匹）は非感染群とし、ウイルスの代わりにPBSを15 μL経鼻投与した。【００３８】
各感染群のマウスへの各薬剤の投薬は、ウイルスを感染させた翌日から毎日（朝晩2回、各0.1 ml）、0.5% CMC溶液（コントロール）およびDADA混合剤６（実施例６）をそれぞれ経口投薬した。非感染群のマウスへの投薬も同様に、0.5 % CMC溶液を経口投薬した。感染から１週間マウスの生存率・体重の変化と餌の摂食量・水の摂水量を測定（毎朝）し、７日目にマウスを断頭にて屠殺し、各種臓器と血液を採取して下記の試験（試験例６−８）を実施した。【００３９】
ウイルス感染後７日目までの結果は図７（A：生存率、B：体重）および図８（A：摂水量、B：摂食量）に示したとおりである。感染させるウイルス量を増やしても、感染７日目までの生存率、体重、摂水量、摂食量はDADA混合剤６（実施例６）投与群と非感染群との間で大きな差はなかった。また、感染＋0.5% CMC溶液（コントロール）と比較した場合、DADA混合剤６（実施例６）投与群では体重、摂水量および摂食量の低下が顕著に抑制された。
試験例６
3週齢のメス（C57B6/6J, Japan SLC, Inc）のマウスを用いてウイルス感染試験を行った。これらのマウスの個々の体重を測定した後、平均体重がほぼ均一なるように３群（15匹/1群）に群分けした。そのうちの２群（計30匹）を感染群とし、ウイルス感染を実施した。ウイルス感染は、ケタラール麻酔（ケタラール62.6 mg/kg + セラクタール12.4 mg/kg）を施行したマウスへ、インフルエンザウイルス（Influenza A/PR/8/34: H1N1）を200 pfu（15 μL:片鼻7.5 μLずつ）経鼻感染した。残りの１群（15匹）は非感染群とし、ウイルスの代わりにPBSを15 μL経鼻投与した。【００４０】
各感染群のマウスへの各薬剤の投薬は、ウイルスを感染させた翌日から毎日（朝晩2回、各0.1 ml）、0.5% CMC溶液（コントロール）およびDADA混合剤６（実施例６）をそれぞれ経口投薬した。非感染群のマウスへの投薬も同様に、0.5 % CMC溶液を経口投薬した。感染から１週間後のマウスから末梢血を採取し、血中の血糖、乳酸、ATPおよびβ-ヒドロキシ酪酸を以下の方法により測定した。
1) 血糖値の測定
メディセーフミニGR-102（TERUMO CORPOLATION JAPAN）を用いて測定した。取扱説明書の記載に従い、メディセーフミニGR-102にメディセーフチップを装着し、チップ上に少量の血液を滴下して測定した。
2) 血液乳酸値の測定
ラクテート・プロLT-1710（株式会社ARKRAY）を用いて測定した。取扱説明書の記載に従い、ラクテート・プロLT-1710にラクテート・プロセンサーを装着し、センサー上に血液を滴下して測定した。
3）血液β-血液β-ヒドロキシ酪酸の測定
血中ケトン体の代表例としてβ-ヒドロキシ酪酸値を測定した。β-ヒドロキシ酪酸値の測定は、プレシジョン エクシード（Abott Japan）の装置を用いて行った。取扱説明書の方法に従い、プレシジョン エクシードにβ-ケトン測定電極 II を装着し、センサー上に少量の血液を滴下して測定した。
4)血中ATP値の測定
血中ATP値は、XL-ATP Kitを用い、取扱説明書（http://bio.aprosci.com/pdf/XL_ATP_kit.pdf）の方法に従って測定した。すなわち、血液からATPを抽出した後に、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応により血液中に含有されるATP量を測定した。【００４１】
結果は図９に示したとおりである。血糖値はインフルエンザウイルス感染によって著しい低下を示したが、DADA混合剤６の投与群では非感染群マウスと同等の値を示し、ウイルス感染による影響を解消した。血中乳酸値はインフルエンザウイルス感染によって有意な増加を示したが、DADA混合剤６の投与群では増加は有意に軽減された。血中ケトン体の代表であるβ-ヒドロキシ酪酸はインフルエンザウイルス感染によって著しい増加を示したが、DADA混合剤６の投与群では、この増加を抑制するだけではなく、非感染コントロール群に比較してむしろ低下する傾向が認められた。
試験例７
3週齢のメス（C57B6/6J, Japan SLC, Inc）のマウスを用いてウイルス感染試験を行った。これらのマウスの個々の体重を測定した後、平均体重がほぼ均一なるように３群（15匹/1群）に群分けした。そのうちの２群（計30匹）を感染群とし、ウイルス感染を実施した。ウイルス感染は、ケタラール麻酔（ケタラール62.6 mg/kg + セラクタール12.4 mg/kg）を施行したマウスへ、インフルエンザウイルス（Influenza A/PR/8/34: H1N1）を200 pfu（15 μL:片鼻7.5 μLずつ）経鼻感染した。残りの１群（15匹）は非感染群とし、ウイルスの代わりにPBSを15 μL経鼻投与した。【００４２】
各感染群のマウスへの各薬剤の投薬は、ウイルスを感染させた翌日から毎日（朝晩2回、各0.1 ml）、0.5% CMC溶液（コントロール）およびDADA混合剤６（実施例６）をそれぞれ経口投薬した。非感染群のマウスへの投薬も同様に、0.5 % CMC溶液を経口投薬した。これらのマウスから脳、心臓、筋肉および肝臓を採取し、感染から１週間後の各組織のATPを測定した。各種臓器中のATP値は、XL-ATP Kit を用い、取扱説明書の記載に従って測定した。【００４３】
結果は図１０に、抽出液の蛋白量当たりのATP量として示した。脳では、感染群、非感染群、DADA混合剤６の投与群間で、ATPレベルの差は認められなかった。一方、心臓、肝臓、筋肉においては、インフルエンザウイルス感染によってATPレベルは非感染群に比べて有意な減少傾向が認められ、DADA混合剤６の投与群ではATPレベルの低下が改善され、非感染群と同程度に回復した。
試験例８
3週齢のメス（C57B6/6J, Japan SLC, Inc）のマウスを用いてウイルス感染試験を行った。これらのマウスの個々の体重を測定した後、平均体重がほぼ均一なるように３群（15匹/1群）に群分けした。そのうちの２群（計30匹）を感染群とし、ウイルス感染を実施した。ウイルス感染は、ケタラール麻酔（ケタラール62.6 mg/kg + セラクタール12.4 mg/kg）を施行したマウスへ、インフルエンザウイルス（Influenza A/PR/8/34: H1N1）を200 pfu（15 μL:片鼻7.5 μLずつ）経鼻感染した。残りの１群（15匹）は非感染群とし、ウイルスの代わりにPBSを15 μL経鼻投与した。【００４４】
各感染群のマウスへの各薬剤の投薬は、ウイルスを感染させた翌日から毎日（朝晩2回、各0.1 ml）、0.5% CMC溶液（コントロール）およびDADA混合剤６（実施例６）をそれぞれ経口投薬した。非感染群のマウスへの投薬も同様に、0.5 % CMC溶液を経口投薬した。これらのマウスから脳、心臓、筋肉および肝臓を採取し、感染から１週間後の各組織のピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Pyruvate dehydrogenase：PDH）を、Pyruvate Dehydrogenase Enzyme Activity Microplate Assay Kit MSP18（MitoSciences社）により、取扱説明書の記載（http://www.mitosciences.com/PDF/pyruvate_dehydrogenase_enzyme_activity_microplate_assay_kit_protocol.pdf）に従って各種組織からのサンプル抽出を実施し、測定キットを用いて測定した。  【００４５】
結果は図１１に示したとおりである。各組織のPDH活性は、ATPレベルに類似した傾向を示した。すなわち、脳以外の心臓、肝臓、筋肉ではインフルエンザウイルス感染によってPDH活性は低下し、DADA混合剤６の投与群では、非感染レベルにまで回復する傾向が見られた。この結果は、試験例７で示した感染後の各組織でのATPレベルの改善に、PDHの関与する糖代謝が関与していることを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明により、DADAを有効成分として、インフルエンザ発症、特にその重症化を予防し、または症状の改善に有効な薬剤が提供される。また本発明の薬剤はインフルエンザ感染に伴う体重減少の抑制剤、食欲減退の抑制剤、およびATP枯渇抑制剤としても提供されうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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