(57)【要約】本発明の目的は、生体内でHSP発現を誘導できる熱ショックタンパク質発現誘導剤、HSP発現誘導剤を含有する飲食品、医薬品、化粧料、及び、HSP発現誘導方法を提供することである。ゼルンボン（Zerumbone）又はその類縁体などの特定の植物由来化合物は、生体内で熱ショックタンパク質発現を誘導する作用に優れており、熱ショックタンパク質発現誘導剤の有効成分として利用できる。
2012043808.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゼルンボン及びその類縁体、カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ルテイン、フェニルエチルイソチオシアネート、ならびに、ウルソール酸からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする、熱ショックタンパク質発現誘導剤。
【請求項２】
ゼルンボン及びその類縁体が、下記一般式（1）で示される不飽和脂環化合物であることを特徴とする、請求項１に記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤、
一般式(1)
【化１】
2012043808.tif 000007
［一般式(1)中、R1〜R14は、同一又は異なって、水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を示し、R15及びR16は、水素原子、水酸基、又は一緒になって酸素原子を示す］。
【請求項３】
一般式(1)中、R1、R7、R11、及びR12がメチル基であり、R2〜R6、R8〜R10、及びR13〜R14が水素原子であり、R15及びR16がそれぞれ水素原子、又は一緒になって酸素原子である、請求項２に記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤。
【請求項４】
熱ショックプロテインが、ヒートショックプロテイン70ファミリータンパク質である、請求項１〜３のいずれかに記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤。
【請求項５】
筋萎縮の予防又は回復、筋肉疲労の抑制、抗ストレス、認知症の予防又は改善、鬱の予防又は改善、慢性疲労の予防又は改善、血流改善、冷え性の改善、むくみの改善、肩こりの改善、リウマチの予防又は改善、網膜障害の予防又は改善、運動能力の向上、持久力の向上、免疫増強、或いは抗ロコモティブシンドロームの用途に適用される、請求項１〜４のいずれかに記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤。
【請求項６】
筋萎縮の予防又は回復、筋肉疲労の抑制、抗ストレス、慢性疲労症候群の予防又は改善、リウマチの予防又は改善、運動能力の向上、持久力の向上、或いは抗ロコモティブシンドロームの用途に適用される、請求項１〜５のいずれかに記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤を含有する飲食品、医薬品又は化粧料。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤を適用することを特徴とする、熱ショックタンパク質発現誘導方法。
【請求項９】
請求項７に記載の飲食品、医薬品又は化粧料を適用することを特徴とする、熱ショックタンパク質発現誘導方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかに記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤を適用することを特徴とする、筋萎縮の予防又は回復、筋肉疲労の抑制、抗ストレス、認知症の予防又は改善、鬱の予防又は改善、血流改善、冷え性の改善、むくみの改善、肩こりの改善、リウマチの予防又は改善、網膜障害の予防又は改善、運動能力の向上、持久力の向上、免疫増強、或いはロコモティブシンドロームの予防又は改善方法。
【請求項１１】
請求項７に記載の飲食品、医薬品又は化粧料を適用することを特徴とする、筋萎縮の予防又は回復、筋肉疲労の抑制、抗ストレス、認知症の予防又は改善、鬱の予防又は改善、血流改善、冷え性の改善、むくみの改善、肩こりの改善、リウマチの予防又は改善網膜障害の予防又は改善、運動能力の向上、持久力の向上、免疫増強、或いはロコモティブシンドロームの予防又は改善方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱ショックタンパク質発現誘導剤に関する。より詳細には、本発明は、生体内で熱ショックタンパク質発現を誘導でき、タンパク質の高次構造の異常に起因する各種疾患や症状、或いは熱ショックタンパク質が関与する各種疾患や症状の予防又は改善に有効に使用される熱ショックタンパク質発現誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物は生育環境に適応するための様々な防御機構を備えている。例えば、生育温度が５〜１０℃高くなると、熱変性により細胞タンパク質の立体構造が変化し始めるが、「シャペロン」と呼ばれるタンパク質群によりこれを修復するメカニズムが知られている。シャペロンによる「タンパク質の品質管理」は、生命の維持や寿命に多大な影響を与える。例えば、約３０年と言う非常に長い寿命を持つげっ歯類であるハダカデバネズミは、マウス（寿命は２〜３年）に比べてタンパク質の品質管理機構が有意に優れていることが知られている。【０００３】
シャペロン機能を果たす代表的なタンパク質として熱ショックタンパク質（Heat shock protein；以下、HSPと表記することもある）が知られている。HSPは、哺乳類では現在、十数種類が報告されており、その分子量に応じて、HSP20ファミリー、HSP40ファミリー、HSP70ファミリー、HSP90ファミリー等に分類されている。HSPは、ストレスタンパク質とも呼ばれており、環境ストレス、病的ストレス、心理ストレス等に対応して生体内で発現が増強されるが、非ストレス下の通常細胞にも恒常的に一定量は発現している。生体内で発現したHSPは、合成直後のまだ高次構造を形成していないポリペプチドや、種々のストレスを受けて高次構造の一部が変化し、本来の生理機能の消失しかけたタンパク質と特異的に結合し、ATPの加水分解の際に生じるエネルギーを利用することにより、結合相手のタンパク質の高次構造を本来の構造に戻し、生理機能を回復させる役割を果たしている。このようにHSPは、生体防御や生体の恒常性維持に寄与しており、生体内でHSPの発現を誘導できれば、タンパク質の高次構造の異常に起因する各種疾患や症状、或いはHSPが関与する各種疾患や症状の予防又は改善に有効になる。【０００４】
従来、生体内でHSP発現を誘導する物質として、特定構造のコレステリルグルコピラノシド（特許文献１）、２糖のヒアルロン酸オリゴ糖（特許文献２）、テトラメチル−ノナデカテトラエン−２−オン（特許文献３）、２−シクロペンテン−１−オン（特許文献４）、特定構造のヒドロキシルアミン誘導体（特許文献５）が報告されている。しかしながら、これらの物質は、いずれも、天然化合物ではなく、化学合成した物質、又は天然物の分解により得られる物質であり、従来、食経験のある安全性の高い天然化合物又はその類縁体の中から、生体内でHSP発現を誘導する物質は見出されていない。そこで、このような天然化合物又はその類縁体の中から、生体内でHSP発現を誘導できる物質を探索できれば、より有用性が高く、簡便で安全な手法により、生体防御機能や生体の恒常性の維持の強化、ひいては各種疾患や症状の予防又は改善、更には寿命延長等の健康の維持又は改善が可能になる。【０００５】
一方、ハナショウガに含まれる天然成分であるゼルンボン（Zerumbone）、その類縁体であるホップに含まれるフムレン、カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ルテイン、フェニルエチルイソチオシアネート及びウルソール酸は、既に食経験もある安全性の高い化合物であることが知られているが、HSP発現誘導作用についてはこれまで一切報告されてない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４３２２３２９号公報
【特許文献２】特許第４１９５１０７号公報
【特許文献３】特許第４０３５５９１号公報
【特許文献４】特開２００９−１０８０４８号公報
【特許文献５】特表２００１−５０４４４１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、生体内でHSPの発現を誘導できるHSP発現誘導剤を提供することを目的とする。より詳細には、本発明は、生体内でHSP発現を誘導し、タンパク質の高次構造の異常に起因する各種疾患や症状、或いはHSPが関与する各種疾患や症状の予防乃至改善に有効なHSP発現誘導剤を提供することを目的とする。また、本発明は、HSP発現誘導剤を含有する飲食品、医薬品、化粧料、更に、HSP発現誘導方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、ゼルンボン（Zerumbone）又はその類縁体など特定の植物由来化合物は、生体内でHSP発現を誘導する作用に優れており、HSP発現誘導剤の有効成分として利用できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。即ち、本発明は、下記に掲げる態様を有する。
項１．ゼルンボン及びその類縁体、カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ルテイン、フェニルエチルイソチオシアネート、ウルソール酸、ならびに、ビタミンＡからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする、熱ショックタンパク質発現誘導剤。
項２．ゼルンボン及びその類縁体、カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ルテイン、フェニルエチルイソチオシアネート、ならびに、ウルソール酸からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、項１に記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤。
項３．ゼルンボン及びその類縁体、カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、ルテイン、フェニルエチルイソチオシアネート、ならびに、ウルソール酸からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、項１又は２に記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤。
項４．ゼルンボン及びその類縁体からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、項１〜３のいずれかに記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤。
項５．ゼルンボン及びその類縁体が、下記一般式（1）で示される不飽和脂環化合物であることを特徴とする、項１〜４のいずれかに記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤、
一般式(1)【０００９】
【化１】
2012043808.tif 000003
［一般式(1)中、R1〜R14は、同一又は異なって、水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を示し、R15及びR16は、水素原子、水酸基、又は一緒になって酸素原子を示す］。
項６．一般式(1)中、R1、R7、R11、及びR12がメチル基であり、R2〜R6、R8〜R10、及びR13〜R14が水素原子であり、R15及びR16が水素原子、又は一緒になって酸素原子である、項４に記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤。
項７．ゼルンボン及びその類縁体からなる群より選択される少なくも１種を１日あたりの投与量として１〜１００ｍｇ含有する、項１〜６のいずれかに記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤。
項８．ゼルンボン及びその類縁体からなる群より選択される少なくも１種を２〜１００重量％含有する、項１〜７のいずれかに記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤。
項９．前記有効成分を含む植物抽出物を含有する、項１〜８のいずれかに記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤。
項１０．前記植物抽出物が、ハナショウガ、白ウコン、ホップ、チョウジ及びラベンダーからなる群より選択される少なくも１種の抽出物である、項９に記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤。
項１１．前記植物抽出物が、ゼルンボン及びその類縁体からなる群より選択される少なくも１種を含むハナショウガ抽出物である、項９又は１０に記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤。
項１２．熱ショックプロテインが、ヒートショックプロテイン70ファミリータンパク質である、項１〜１１のいずれかに記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤。
項１３．筋萎縮の予防又は回復、筋肉疲労の抑制、抗ストレス、認知症の予防又は改善、鬱の予防又は改善、慢性疲労症候群の予防又は改善、血流改善、冷え性の改善、むくみの改善、肩こりの改善、リウマチの予防又は改善、網膜障害の予防又は改善、運動能力の向上、持久力の向上、免疫増強、或いは抗ロコモティブシンドロームの用途に適用される、項１〜１２のいずれかに記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤。
項１４．筋萎縮の予防又は回復、筋肉疲労の抑制、抗ストレス、慢性疲労症候群の予防又は改善、リウマチの予防又は改善、運動能力の向上、持久力の向上、或いは抗ロコモティブシンドロームの用途に適用される、項１〜１３のいずれかに記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤。
項１５．項１〜１４のいずれかに記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤を含有する飲食品、医薬品又は化粧料。
項１６．項１〜１４のいずれかに記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤を含有する飲食品又は医薬品。
項１７．項１〜１４のいずれかに記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤を適用することを特徴とする、熱ショックタンパク質発現誘導方法。
項１８．項１５に記載の飲食品、医薬品又は化粧料、或いは項１６に記載の飲食品又は医薬品を適用することを特徴とする、熱ショックタンパク質発現誘導方法。
項１９．項１〜１４のいずれかに記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤を適用することを特徴とする、筋萎縮の予防又は回復、筋肉疲労の抑制、抗ストレス、認知症の予防又は改善、鬱の予防又は改善、血流改善、冷え性の改善、むくみの改善、肩こりの改善、リウマチの予防又は改善、網膜障害の予防又は改善、運動能力の向上、持久力の向上、免疫増強、或いはロコモティブシンドロームの予防又は改善方法。
項２０．項１５に記載の飲食品、医薬品又は化粧料、或いは項１６に記載の飲食品又は医薬品を適用することを特徴とする、筋萎縮の予防又は回復、筋肉疲労の抑制、抗ストレス、認知症の予防又は改善、鬱の予防又は改善、血流改善、冷え性の改善、むくみの改善、肩こりの改善、リウマチの予防又は改善、網膜障害の予防又は改善、運動能力の向上、持久力の向上、免疫増強、或いはロコモティブシンドロームの予防又は改善方法。
項２１．熱ショックタンパク質発現誘導剤を製造するための、ゼルンボン及びその類縁体、カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ルテイン、フェニルエチルイソチオシアネート、ウルソール酸、ならびに、ビタミンＡからなる群より選択される少なくとも１種の使用。
項２２．熱ショックタンパク質発現誘導剤を製造するための、ゼルンボン及びその類縁体、カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ルテイン、フェニルエチルイソチオシアネート、ウルソール酸、ならびに、ビタミンＡからなる群より選択される少なくとも１種を含有する植物抽出物の使用。
項２３．前記植物抽出物が、ハナショウガ、白ウコン、ホップ、チョウジ及びラベンダーからなる群より選択される少なくも１種の抽出物である、項２２に記載の使用。
項２４．前記植物抽出物が、ゼルンボン及びその類縁体からなる群より選択される少なくも１種を含むハナショウガ抽出物である、項２２又は２３に記載の使用。
項２５．熱ショックタンパク質発現誘導作用を有する飲食品、医薬品又は化粧品を製造するための、ゼルンボン及びその類縁体、カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ルテイン、フェニルエチルイソチオシアネート、ウルソール酸、ならびに、ビタミンＡからなる群より選択される少なくとも１種の使用。
項２６．熱ショックタンパク質発現誘導作用を有する飲食品、医薬品又は化粧品を製造するための、ゼルンボン及びその類縁体、カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ルテイン、フェニルエチルイソチオシアネート、ウルソール酸、ならびに、ビタミンＡからなる群より選択される少なくとも１種を含有する植物抽出物の使用。
項２７．前記植物抽出物が、ハナショウガ、白ウコン、ホップ、チョウジ及びラベンダーからなる群より選択される少なくも１種の抽出物である、項２６に記載の使用。
項２８．前記植物抽出物が、ゼルンボン及びその類縁体からなる群より選択される少なくも１種を含むハナショウガ抽出物である、項２６又は２７に記載の使用。
項２９．熱ショックタンパク質を発現誘導させる方法において使用するための、ゼルンボン及びその類縁体、カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ルテイン、フェニルエチルイソチオシアネート、ウルソール酸、ならびに、ビタミンＡからなる群より選択される少なくとも１種。
項３０．熱ショックタンパク質を発現誘導させる方法において使用するための、ゼルンボン及びその類縁体、カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ルテイン、フェニルエチルイソチオシアネート、ウルソール酸、ならびに、ビタミンＡからなる群より選択される少なくとも１種を含有する植物抽出物。
項３１．前記植物抽出物が、ハナショウガ、白ウコン、ホップ、チョウジ及びラベンダーからなる群より選択される少なくも１種の抽出物である、項３０に記載の植物抽出物。
項３２．前記植物抽出物が、ゼルンボン及びその類縁体からなる群より選択される少なくも１種を含むハナショウガ抽出物である、項３０又は３１に記載の植物抽出物。
項３３．筋萎縮を予防又は回復、筋肉疲労を抑制、抗ストレス、認知症を予防又は改善、鬱を予防又は改善、血流を改善、冷え性を改善、むくみを改善、肩こりを改善、リウマチを予防又は改善、網膜障害の予防又は改善、運動能力を向上、持久力を向上、免疫を増強、或いはロコモティブシンドロームを予防又は改善する方法において使用するための、ゼルンボン及びその類縁体、カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ルテイン、フェニルエチルイソチオシアネート、ウルソール酸、ならびに、ビタミンＡからなる群より選択される少なくとも１種。
項３４．筋萎縮を予防又は回復、筋肉疲労を抑制、抗ストレス、認知症を予防又は改善、鬱を予防又は改善、血流を改善、冷え性を改善、むくみを改善、肩こりを改善、リウマチを予防又は改善、網膜障害の予防又は改善、運動能力を向上、持久力を向上、免疫を増強、或いはロコモティブシンドロームを予防又は改善する方法において使用するための、ゼルンボン及びその類縁体、カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ルテイン、フェニルエチルイソチオシアネート、ウルソール酸、ならびに、ビタミンＡからなる群より選択される少なくとも１種を含有する植物抽出物。
項３５．前記植物抽出物が、ハナショウガ、白ウコン、ホップ、チョウジ及びラベンダーからなる群より選択される少なくも１種の抽出物である、項３４に記載の植物抽出物。
項３６．前記植物抽出物が、ゼルンボン及びその類縁体からなる群より選択される少なくも１種を含むハナショウガ抽出物である、項３４又は３５に記載の植物抽出物。
項３７．熱ショックタンパク質を発現誘導させる方法において使用するための項１５に記載の飲食品、医薬品又は化粧料、或いは項１６に記載の飲食品又は医薬品。
項３８．筋萎縮を予防又は回復、筋肉疲労を抑制、抗ストレス、認知症を予防又は改善、鬱を予防又は改善、血流を改善、冷え性を改善、むくみを改善、肩こりを改善、リウマチを予防又は改善、網膜障害の予防又は改善、運動能力を向上、持久力を向上、免疫を増強、或いはロコモティブシンドロームを予防又は改善する方法において使用するための項１５に記載の飲食品、医薬品又は化粧料、或いは項１６に記載の飲食品又は医薬品。
項３９．項１〜１４のいずれかに記載の熱ショックタンパク質発現誘導剤を、飲食品、医薬品又は化粧料に含有させることにより、当該飲食品、医薬品又は化粧料に熱ショックタンパク質発現誘導機能を付与させる方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、生体内でのHSP発現を効果的に誘導することができるので、生体防御機能や生体の恒常性の維持の強化、ひいては各種疾患や症状の予防又は改善、更には寿命延長等の健康の維持又は改善が可能になる。【００１１】
また、本発明のHSP発現誘導剤は、ゼルンボン又はその類縁体をはじめとする食経験のある天然化合物を有効成分として使用しており、使用における安全性が高いという利点もある。また、このように高い安全性を備えているが故に、本発明のHSP発現誘導剤は、日常的に長期間に亘って摂取又は投与できるので、生体内のHSPの発現量を高い状態で保ち、シャペロン機構を活性化した状態を維持することも可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施例１において、各濃度のゼルンボン存在下でのHSP27、HSP40、HSP70、HSP90a、及びHSP90bの発現量を測定した結果を示す図である。図１中、「ZER」はゼルンボンを示す。また、図１の縦軸は、コントロール（ゼルンボン0μM）における各HSPの発現量を１とした場合の各HSPの発現量の相対値である。
【図２】図２は、実施例３において、ゼルンボン0、50μMで処理した細胞の培養液を用いて、新たなマウス肝臓細胞の培養を3、6時間行い、HSP70の発現量を測定した結果を示す図である。図２中、「ZER」はゼルンボンを示す。また、図２の縦軸は、コントロール（ゼルンボン0μM）におけるHSP70の発現量を１とした場合のHSP70の発現量の相対値である。
【図３】図３は、実施例４において、ゼルンボンがストレスに及ぼす影響を検討した結果を示す図である。
【図４−１】図４−１は、実施例５において、ゼルンボンが筋肉に及ぼす影響を検討した結果を示す図である。図４−１に示す結果は、マウスへの被験物の前投与後に尾懸垂試験を実施することにより得られた図である。
【図４−２】図４−２は、実施例５において、ゼルンボンが筋肉中のHSP72のmRNAの発現量に及ぼす影響を検討した結果を示す図である。
【図５−１】図５−１は、実施例６において、ゼルンボンが筋肉に及ぼす影響を検討した結果を示す図である。図５−１に示す結果は、尾懸垂試験を実施した後に、マウスへの被験物投与を行うことにより得られた図である。
【図５−２】図５−２は、実施例６において、ゼルンボンが筋肉中のHSP72のmRNAの発現量に及ぼす影響を検討した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書中、数値限定を表す記号「〜」は、特に記載のない限り、その数値範囲において、当該記号の両側の数値を含むことを意図して用いられる。
【００１４】
本発明のHSP発現誘導剤は、ゼルンボン及びその類縁体、カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ルテイン、フェニルエチルイソチオシアネート、ウルソール酸、ならびに、ビタミンＡからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする。これらは、単独で含有されていてもよく、２種以上が含有されていてもよい。
【００１５】
本発明において、ゼルンボン及びその類縁体としては、下記一般式(1)で示される不飽和脂環化合物が挙げられる。
一般式(1)
【００１６】
【化２】
2012043808.tif 000004
一般式(1)中、R1〜R14は、同一又は異なって、水素原子、又は炭素数１〜５のアルキル基を示し、R15及びR16は、水素原子、水酸基、又は一緒になって酸素原子を示す。
【００１７】
炭素数１〜５のアルキル基としては、具体的には、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、sec-ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、sec-ペンチル基、tert-ペンチル基等が例示される。
【００１８】
一般式(1)中、R1〜R14は、同一又は異なって、好ましくは、水素原子、又は炭素数１〜３のアルキル基；更に好ましくは水素原子、又は炭素数１〜２のアルキル基；より好ましくは水素原子、又はメチル基が挙げられる。
【００１９】
また、HSP発現をより効果的に誘導するという観点からは、一般式(1)中、R1、R7、R11、及びR12が、炭素数１〜５のアルキル基、好ましくは炭素数１〜３のアルキル基、更に好ましくは炭素数１〜２のアルキル基、より好ましくはメチル基であり；且つ、R2〜R6、R8〜R10、及びR13〜R14が水素原子であることが望ましい。
【００２０】
一般式(1)中、R1、R7、R11、及びR12がメチル基であり、R2〜R6、R8〜R10、及びR13〜R14が水素原子であり、R15及びR16が一緒になって酸素原子である不飽和脂環化合物は、ゼルンボンと称される公知の化合物である。ゼルンボンは、ショウガ属ショウガ科に属するハナショウガの葉又は根茎部に含まれる天然化合物であり、長年の食経験もあり、高い安全性を備えている化合物である。一般式(1)中、R1、R7、R11、及びR12がメチル基であり、R2〜R6、R8〜R10、及びR13〜R14が水素原子であり、R15及びR16が水素原子である不飽和脂環化合物は、フムレンと称される公知の化合物であり、クワ科植物、マツ科植物、ホップ、チョウジ油、ラベンダー油等に含まれる。
【００２１】
本発明において、一般式(1)で示される不飽和脂環化合物は、薬学的に許容される、又は可食可能な塩の形態であってもよい。
【００２２】
一般式(1)で示される不飽和脂環化合物は、有機化学合成、酵素反応合成、天然物からの抽出等の公知の方法で製造することができる。例えば、ゼルンボンは、ハナショウガから抽出処理することにより得ることができる。ハナショウガからゼルンボンを抽出処理により取得するには、例えば、ハナショウガの葉、根茎部、又は全草、好ましくは根茎部に対して、水蒸気蒸留又は溶媒抽出を行えばよい。溶媒抽出としては、抽出溶媒としてエタノールを使用して行うことができる。水蒸気蒸留又は溶媒抽出により得られた抽出物を、クロロホルム−水の２層溶媒を用いた向流分配、ゲルクロマトグラフィー等の精製工程に供することによって、高純度のゼルンボンを得ることができる。なお、ハナショウガからゼルンボンを抽出・精製処理する際の具体的手法については、Biosci, Biotechnol. Biochem., 63 (10), 1811-1812, 1999に記載されており、かかる公知の手法に従って行うことができる。
【００２３】
カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ルテイン、フェニルエチルイソチオシアネート、ウルソール酸、ビタミンＡとしては、αカロテン、βカロテン、γカロテン、δカロテン、εカロテン、リコペン、ゼアキサンチン、αクリプトキサンチン、βクリプトキサンチン、ルテイン、フェニルエチルイソチオシアネート、ウルソール酸、レチノールが例示される。
【００２４】
本発明のHSP発現誘導剤には、必要に応じて、可食可能な或いは薬学的又は香粧学的に許容される担体や添加剤等の任意の成分を含有させることができる。このような担体や添加剤としては水性媒体、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、界面活性剤、浸透圧調節剤、湿潤化剤、ｐＨ調整剤、甘味料、香料、着色料等が例示される。これらは当業者により公知であり、適宜選択して使用される。これらの成分は当業者であれは適宜選択可能である。
【００２５】
また、本発明のHSP発現誘導剤は、前記ゼルンボン及びその類縁体、カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ルテイン、フェニルエチルイソチオシアネート、ウルソール酸、ならびに、ビタミンＡ以外のHSP発現誘導作用を備える物質やその他の生理活性物質等を含有していてもよい。
【００２６】
本発明のHSP発現誘導剤の適用形態（投与経路）としては、例えば、経口摂取、または、経皮、経粘膜、静脈、皮下、筋肉内、関節内、経腸からの投与等が挙げられ、HSPの発現を誘導する身体部位に応じて適宜設定される。本発明のHSP発現誘導剤の適用形態として、好ましくは経口または経皮から適用されることが望ましく、さらに好ましくは経口からの摂取が挙げられる。
【００２７】
本発明のHSP発現誘導剤の形態も制限されないが、散剤、錠剤、顆粒剤、丸剤等の固形形態；クリーム状、軟膏状、ムース状、ゲル状等の半固形形態、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等の液状形態が挙げられる。また、これらの形態は、マイクロカプセル、ソフトカプセル、ハードカプセル等に充填されて、カプセル剤の形態とすることもできる。また、本発明のHSP発現誘導剤は、発泡製剤の形態とすることもできる。これらの形態の製造方法は、当業界で公知の方法に従って行うことができ、また、これらの形態は、本発明のHSP発現誘導剤の適用形態に応じて適宜決定すればよい。また、それを利用することで、種々の飲料形態、食品形態に添加することを可能とする。
【００２８】
本発明のHSP発現誘導剤の適用量については、適用の目的（対象疾患や症状の種類等）適用対象部位、適用者の性別や年齢等に応じて適宜設定すればよいが、通常成人１日当たりの適用量として、前記ゼルンボン及びその類縁体、カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ルテイン、フェニルエチルイソチオシアネート、ウルソール酸、ならびに、ビタミンＡからなる群より選択される少なくとも１種が総量で１〜１００ｍｇ、好ましくは２〜５０ｍｇ、さらに好ましくは３〜２０ｍｇ、特に好ましくは５〜１０ｍｇが例示される。本発明のHSP発現誘導剤は、上記適用量を、一日に１回、又は２〜５回程度に分けて、対象部位に適用すればよい。また、適用対象はヒトに制限されず、ヒト以外の哺乳動物や所謂ペットや家禽等の様々な動物が挙げられる。
【００２９】
本発明のHSP発現誘導剤において、前記ゼルンボン及びその類縁体、カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ルテイン、フェニルエチルイソチオシアネート、ウルソール酸、ならびに、ビタミンＡからなる群より選択される少なくとも１種の配合割合については、前記適用量の投与又は摂取が可能になる範囲に適宜設定すればよい。例えば、本発明のHSP発現誘導剤において前記ゼルンボン及びその類縁体、カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ルテイン、フェニルエチルイソチオシアネート、ウルソール酸、ならびに、ビタミンＡからなる群より選択される少なくとも１種の配合割合は総量で２０〜１００重量％、好ましくは４０〜１００重量％、より好ましくは６０〜１００重量％である。また、これらの有効成分は植物から抽出・精製処理して得ることが可能であり、この過程で得られる抽出物そのものを本発明のHSP発現誘導剤とすることもできる。例えば、前記ゼルンボンやその類縁体はハナショウガ、白ウコン、ホップ、チョウジ、ラベンダー等から抽出・精製処理して得ることもできるが、この過程で得られる抽出物そのものを本発明のHSP発現誘導剤とすることもできる。また、当該抽出物に前記任意の成分を配合して、本発明のHSP発現誘導剤としてもよい。必要に応じて含有させることができる前記任意の成分の配合量は、目的とする形態や嗜好等に適合するよう、本発明の効果を妨げない範囲で、適宜調整すればよい。
【００３０】
本発明のHSP発現誘導剤はそれ自体が、飲食品、医薬品（医薬部外品を含む）又は化粧料の形態であってもよい。その好ましい形態として内服用の医薬品（内服用の医薬部外品を含む）及び飲食品が挙げられる。
【００３１】
本発明のHSP発現誘導剤を飲食品として調製する場合、上記有効成分の他に、甘味料、着色料、保存料、増粘剤、安定剤、ゲル化剤、糊剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防かび剤（防ばい剤）、イーストフード、ガムベース、香料、酸味料、調味料、乳化剤、ｐＨ調整剤、かんすい、膨脹剤、栄養強化剤、その他飲食品素材等を混合して、所望の形態に調製すればよい。本発明のHSP発現誘導剤を飲食品形態にする場合、その形態については、特に制限されるものではない。一例として、ゲル状剤、顆粒、細粒、カプセル、錠剤、粉末、液剤、半固形剤等のサプリメントタイプの食品；炭酸飲料、清涼飲料、乳飲料、アルコール飲料、果汁飲料、茶類、栄養飲料等の飲料；粉末ジュース、粉末スープ等の粉末飲料；ガム、タブレット、キャンディー、クッキー、グミ、せんべい、ビスケット、ゼリー等の菓子類；パン、麺類、シリアル、ジャム、調味料等が例示される。これらの食品は、HSP発現誘導用の飲食品として使用され、例えば、一般の飲食品の他、栄養補助食品、機能性食品、特定保健用食品、病者用食品等のニュートラシューティカルとしても使用できる。
【００３２】
本発明のHSP発現誘導剤を医薬品（医薬部外品を含む）として調製する場合、上記有効成分の他に、必要に応じて、他の薬効成分、薬学的に許容される担体や添加剤等を任意に配合してもよい。薬学的に許容される担体及び添加剤としては、具体的には、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、湿潤化剤、緩衝剤、保存剤、香料等が例示される。本発明のHSP発現誘導剤を医薬品として調製する場合、その形態については、特に制限されるものではない。一例として、注射剤、外用剤、吸入剤、座剤、フィルム剤、トローチ剤、液剤、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、点眼剤、洗眼剤、点鼻剤等を挙げることができる。これらの中でも、経口投与に適した形態（即ち、内服用医薬品）が好ましく、かかる形態として具体的にはトローチ剤、液剤、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤等を挙げることができる。これらの医薬品（医薬部外品を含む）は、HSP発現誘導用医薬品として使用される。
【００３３】
本発明のHSP発現誘導剤を化粧料（機能性化粧料を含む）又は外用医薬部外品として調製するには、上記有効成分に加えて、薬学的又は香粧学的に許容される担体（水、油性成分等）を配合して、所望の形態に調製すればよい。上記化粧料は、皮膚に適用可能である限り、その形態については、特に制限されるものではない。一例として、液状、乳液状、粉末状、固形状、懸濁液状、クリーム状、軟膏状、ムース状、顆粒状、錠剤状、ゲル状、ゼリー状、ペースト状、ジェル状、エアゾール状、スプレー状、リニメント剤、パック剤等の形態を挙げることができる。これらの化粧料は、HSP発現誘導作用を有する化粧料として使用される。
【００３４】
更に、本発明のHSP発現誘導剤は、飲食品、医薬品（医薬部外品を含む）又は化粧料への添加剤としても使用でき、本発明のHSP発現誘導剤を含有する飲食品、医薬品（医薬部外品を含む）、化粧料によれば、本発明のHSP発現誘導剤に起因する効果が得られる。言い換えると、本発明のHSP発現誘導剤を飲食品、医薬品（医薬部外品を含む）又は化粧料に含有させることにより、これらに、HSP発現誘導機能を付与することができる。なかでも、本発明のHSP発現誘導剤は、内服用の医薬品（内服用の医薬部外品を含む）及び飲食品へのHSP発現誘導機能の付与に好適に用いられる。
【００３５】
本発明のHSP発現誘導剤が添加剤として使用される場合も、対象となる飲食品、医薬品（医薬部外品を含む）、化粧料の形態等は限定されず、前述した飲食品、医薬品（医薬部外品を含む）、化粧料の形態等が例示される。
【００３６】
飲食品、医薬品（医薬部外品を含む）、化粧料における本発明のHSP発現誘導剤の配合量も制限されず、適用の目的（対象疾患や症状の種類等）、適用対象部位、適用者の性別や年齢、飲食品、医薬品（医薬部外品を含む）又は化粧料の形態、これらの投与又は摂取方法や回数、嗜好等に応じて適宜設定される。従って、本発明のHSP発現誘導剤の飲食品、医薬品（医薬部外品を含む）又は化粧料への配合量は制限されないが、例えば、本発明のHSP発現誘導剤は、成人１日当たりの適用量が、前記ゼルンボン及びその類縁体、カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ルテイン、フェニルエチルイソチオシアネート、ウルソール酸、ならびに、ビタミンＡからなる群より選択される少なくとも１種が総量で１〜１００ｍｇ、好ましくは２〜５０ｍｇ、さらに好ましくは３〜２０ｍｇ、特に好ましくは５〜１０ｍｇとなるよう配合することが例示される。また、前述したように、前記ゼルンボンやその類縁体はハナショウガ、白ウコン、ホップ、チョウジ、ラベンダー等から抽出・精製処理して得ることをはじめ、これらの成分は植物から抽出・精製処理して得ることができ、この過程で得られる抽出物そのものを本発明のHSP発現誘導剤としてもよく、この抽出物そのものを本発明のHSP発現誘導剤とする場合には、飲食品、医薬品（医薬部外品を含む）、化粧料に対して、抽出物を成人１日当たりの適用量として、０．０５〜１ｇ、好ましくは０．１〜０．６ｇの範囲で配合することが望ましい。
【００３７】
本発明のHSP発現誘導剤において、発現誘導の対象となるHSPには、HSP20、HSP27、HSP28等のHSP20ファミリータンパク質；HSP40、HSP47等のHSP40ファミリータンパク質；HSP70、HSP72、HSP73等のHSP70ファミリータンパク質；HSP90ａ、HSP90b等のHSP90ファミリータンパク質等のいずれもが含まれる。これらの中でも、HSP27、HSP40、HSP70、HSP72、HSP90a、HSP90bは、本発明のHSP発現誘導剤において好適な発現誘導対象である。また、HSPの代表的な例とされる、HSP70ファミリータンパク質、とりわけHSP70及びHSP72は種々の生理機能が報告されており、生体防御や生体の恒常性維持に重要な役割を果たすため、本発明のHSP発現誘導剤において特に好適な発現誘導対象である。更に、HSP72は、細胞外に分泌され、サイトカイン様の作用をも示し、NK（ナチュラル・キラー）細胞、NKT（胸腺外分化T）細胞、活性化T細胞、特異抗体産生等の自然免疫と獲得免疫を広範に活性化させることができるので、本発明のHSP発現誘導剤において好適な発現誘導対象である。
【００３８】
本発明のHSP発現誘導剤は、HSP発現誘導によって、環境ストレス、病的ストレス、心理ストレス等で生じる細胞障害（細胞変性、細胞損傷等）又は細胞死を抑制し、当該細胞障害又は細胞死に起因する疾患や症状を予防又は改善することができる。また、本発明のHSP発現誘導剤は、タンパク質の高次構造の異常に起因する各種疾患や症状、或いはHSPが関与する各種疾患や症状の予防又は改善に有効である。
【００３９】
例えば、HSP70ファミリータンパク質は、血流障害を予防又は改善、各種臓器や組織の保護、抗酸化、酸素運搬能力の向上、神経系機能の回復、運動能力の向上、免疫増強、抗炎症、その他の健保効果等の効果が知られている。
【００４０】
そのため、本発明のHSP発現誘導剤は、HSP70ファミリータンパク質による血流障害の予防又は改善効果に基づいて、美肌、美白、保湿、粘膜保護、冷え性改善、むくみ改善、血栓予防、肩こり改善、腰痛改善、創傷治癒力増強、自然治癒力増強、便秘改善、消化促進、心筋梗塞・心不全の予防又は改善、心筋梗塞の予防又は改善、虚血・再還流障害の予防又は改善、育毛、抜け毛予防等の用途に有効である。また、本発明のHSP発現誘導剤は、HSP70ファミリータンパク質による各種臓器や組織の保護効果、即ち、肝臓、消化器官、腎臓、網膜等の臓器や組織に対する保護効果に基づいて、二日酔いの防止、肝不全の予防又は改善、肝機能増強、胃腸粘膜の保護、腎不全の予防又は改善、網膜障害の予防又は改善、多発性硬化症の予防又は改善、嚢胞性線維症の予防又は改善等の用途にも有効である。また、本発明のHSP発現誘導剤は、HSP70ファミリータンパク質による抗酸化効果に基づいて、抗老化、糖尿病の予防又は改善、インスリン抵抗性の改善等の用途にも有効である。また、本発明のHSP発現誘導剤は、HSP70ファミリータンパク質による酸素運搬能力の向上効果に基づいて、持久力の向上、運動能力の向上等の用途にも有効である。本発明のHSP発現誘導剤は、HSP70ファミリータンパク質による神経系機能の回復効果に基づいて、認知症の予防又は改善、ぼけの予防又は改善、鬱の予防又は改善、アルツハイマー病の予防又は改善、抗ストレス、意欲増進、快眠、睡眠導入等の用途にも有効である。本発明のHSP発現誘導剤は、HSP70ファミリータンパク質による運動能力の向上効果に基づいて、筋肉痛の予防又は改善、運動時の筋損傷の抑制、筋肉疲労の抑制、筋萎縮（例えば、ギブス固定時の筋萎縮）の予防又は改善、寿命の延長、抗ロコモティブシンドローム等の用途にも有効である。また、本発明のHSP発現誘導剤は、HSP70ファミリータンパク質による抗炎症効果に基づいて、急性膵炎、炎症性腸疾患、リウマチの予防又は改善、関節炎の予防又は改善等の用途にも有効である。本発明のHSP発現誘導剤は、HSP70ファミリータンパク質による免疫増強効果に基づいて、癌の予防又は改善、感染症の予防又は改善等の用途にも有効である。更に、本発明のHSP発現誘導剤は、HSP70ファミリータンパク質が有する他の健保効果に基づいて、感染症の予防又は改善、抗メタボリックシンドローム、抗肥満、高脂血症の予防又は改善、デトックス、体臭・加齢臭の改善等の用途にも有効である。
【００４１】
上記用途の中でも、筋萎縮の予防又は回復、筋肉疲労の抑制、抗ストレス、認知症の予防又は改善、鬱の予防又は改善、慢性疲労症候群の予防又は改善、血流改善、冷え性の改善、むくみの改善、肩こりの改善、リウマチの予防又は改善、網膜障害の予防又は改善、運動能力の向上、持久力の向上、免疫増強、抗ロコモティブシンドローム等の用途が本発明のHSP発現誘導剤の適用目的として好ましく、特に筋萎縮の予防又は回復、筋肉疲労の抑制、抗ストレス、慢性疲労症候群の予防又は改善、リウマチの予防又は改善、運動能力の向上、持久力の向上、抗ロコモティブシンドロームの用途が好適である。
【００４２】
また、このことから、前記飲食品、医薬品（医薬部外品を含む）又は化粧料は、本発明のHSP発現誘導剤に基づくこれらの効果、詳細には、前記ゼルンボン及びその類縁体、カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ルテイン、フェニルエチルイソチオシアネート、ウルソール酸、ならびに、ビタミンＡからなる群より選択される少なくとも１種に基づくこれらの効果を備えている。
【００４３】
また、このことから、本発明はHSP発現誘導方法を提供する。本発明のHSP発現誘導は、本発明はHSP発現誘導剤、或いは、前記飲食品、医薬品（医薬部外品を含む）又は化粧料を適用することにより実施できる。例えば、本発明のHSP発現誘導方法は、HSPの発現誘導を求める動物に、本発明のHSP発現誘導剤、或いは前記飲食品、医薬品（医薬部外品を含む）又は化粧料を投与し又は摂取させることにより実施できる。本発明のHSP発現誘導方法における、本発明のHSP発現誘導剤、或いは前記飲食品、医薬品（医薬部外品を含む）又は化粧料の投与量、投与回数、投与方法、投与部位等は前述に従う。
【００４４】
また、本発明は、本発明のHSP発現誘導剤を、飲食品、医薬品（医薬部外品を含む）又は化粧料に含有させることにより、当該飲食品、医薬品又は化粧料にHSP発現誘導機能を付与させる方法を提供する。当該方法も前述に従い実施できる。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、特に言及しない限り「％」は「重量％」を示す。【００４６】
実施例１：ゼルンボンにより発現誘導されるHSPプロファイルの検討
１．試験方法
マウス肝臓細胞Hepa1c1c7(大日本住友製薬社製)を1x105 cells/mlの密度で24-well plate (IWAKI社製)に播き、10容量%FBS (BIOLOGICAL INDUSTRIES社製)含有DMEM(GIBCO社製)培地中で、37℃、5％CO2の条件下で一晩前培養した。PBSで細胞を洗浄後、無血清のDMEM培地に交換し、dimethyl sulfoxide (DMSO)に溶解したゼルンボンを終濃度0, 10, 25, 50 μMで添加し（DMSOの終濃度は0.5％）、37℃、5％CO2の条件下で3時間培養した。【００４７】
ゼルンボン添加から３時間後に、PBSで細胞を洗浄し、RNeasyキット(QIAGEN社製)によってtotal RNAを回収した。500 ngに相当するtotal RNA溶液をreverse transcriptase (TAKARA社製)で逆転写し、cDNAを得た。これをリアルタイムPCR装置 (APPLIED BIOSYSTEMS社製)で増幅し、HSP27, HSP40, HSP70, HSP90a, HSP90b mRNAの発現量を定量した。また、内部標準として、hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HPRT)を用いた。リアルタイムPCRに使用したプライマーとPCR条件とは以下の通りである。【００４８】
＜プライマー配列＞
HPRT
F: 5’-GTAATGATCAGTCAACGGGGAC-3’（配列番号１）
R: 5’-CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA-3（配列番号２）
HSP27
F: 5’-TGCTTCACCCGGAAATACAC-3’ （配列番号３）
R: 5’-CTCGAAAGTAACCGGAATGG-3（配列番号４）
HSP40
F: 5’-TTACAAGGCGAGGAGAAGAC-3’ （配列番号５）
R: 5’-TTGACAATCTGACCTGGATG-3’ （配列番号６）
HSP70
F: 5’-TGGTGCTGACGAAGATGAAG-3’ （配列番号７）
R: 5’-AGGTCGAAGATGAGCACGTT-3’ （配列番号８）
HSP90a
F: 5’-AAAGGCAGAGGCTGACAAGA-3’ （配列番号９）
R: 5’-AGGGGAGGCATTTCTTCAGT-3’ （配列番号１０）
HSP90b
F: 5’-GCGGCAAAGACAAGAAAAG-3’ （配列番号１１）
R: 5’-GAAGTGGTCCTCCCAGTCAT-3’ （配列番号１２）【００４９】
＜PCR条件＞
95℃-3 min
[95℃-10 sec/60℃-1 min] × 99 cycles【００５０】
２．試験結果
コントロール（DMSO濃度0.5％、ゼルンボン0μM）における各HSPの発現量を１として、各条件でのHSPの発現量の相対値を算出した結果を図１に示す。この結果から、ゼルンボン存在下で、HSP90a、HSP90b、HSP70、HSP40、HSP27の発現が顕著に増加することが確認された。特に、HSP90b、HSP70、HSP40については、50μMのゼルンボンの存在下で、コントロールに比べ5倍を遙かに超える発現量が認められた。【００５１】
実施例２：ゼルンボン以外の植物由来成分または他の成分のHSP発現誘導作用の検討
１．試験方法
実施例１に記載の試験方法に準じ、ゼルンボン以外の植物由来成分、ビタミン類または微量金属のHSP70発現誘導作用を検討した。各成分の終濃度は、表１に示したとおりである。【００５２】
２．試験結果
表１に記載の通り、植物由来成分としては、βカロテン、αカロテン、リコペン、ゼアキサンチン、βクリプトキサンチン、ルテイン、フムレン、フェニルエチルイソチオシアネート及びウルソール酸が、ビタミンとしては、ビタミンＡが、金属としては、亜鉛において、HSP70誘導能が認められた。【００５３】
【表１】
2012043808.tif 000005
【００５４】
この結果より、上記以外のファイトケミカルと称される種々の植物栄養素、例えば、カロテノイドやテルペノイド、フラボノイド等に代表されるポリフェノール、スルフォラファンやアリルまたはベンジルイソチオシアネート等の有機硫黄化合物、カプサイシンやジンゲノールに代表される長鎖アルキルフェノール誘導体や多糖類についても同様の作用が期待される。【００５５】
実施例３：ゼルンボンで処理した細胞培養液によるHSP70の発現誘導の検討
１．試験方法
マウス肝臓細胞Hepa1c1c7(大日本住友製薬社製)を1x105 cells/mlの密度で24-well plate (IWAKI社製)に播き、10容量%FBS (BIOLOGICAL INDUSTRIES社製)含有DMEM(GIBCO社製)培地中で、37℃、5％CO2の条件下で一晩前培養した。PBSで細胞を洗浄後、無血清のDMEM培地に交換し、ゼルンボンを終濃度0, 50μMで添加し、37℃、5％CO2の条件下で14時間培養した。【００５６】
14時間の培養後にPBSで細胞を洗浄した後、3mLの培地を加え、メンブレンカルチャーインサート（孔径0.45μm、FALCON社製）上で一晩前培養したマウス肝臓細胞Hepa1c1c7（大日本住友製薬社製）（1x105 cells/mL）に添加し、37℃、5％CO2の条件下で3または6時間培養した。各時間培養後、メンブレンカルチャーインサート上の細胞を回収し、HSP70 mRNAの発現量を上記実施例１と同じ手法で測定した。【００５７】
２．試験結果
得られた結果を図２に示す。この結果から、ゼルンボン処理した細胞上清液を、別に一晩前培養したマウス肝臓細胞に添加しても、HSP70の発現が誘導されることが明らかになった。即ち、本結果から、ゼルンボンを細胞に処理することで、HSP70発現を誘導する物質が細胞外に放出されていることが示唆された。【００５８】
以上の結果から、ゼルンボンによって誘導されるHSP70の発現量（即ち、シャペロン増強効果）は、即発的、遅発的であることが期待され、それにより長期的な効果が循環器系を通して全身に波及し得ると考えられる。【００５９】
実施例４：ゼルンボンがストレスに及ぼす影響の検討【００６０】
１．試験方法
7週齢のSD系雄性ラット（日本チャールズリバー社製）を体重及び水泳時間の平均値が均等になるように群分けした。群分け後、水浸ストレス試験を開始し、各群に被験物を12時間毎に経口投与した。水浸ストレス試験2、5日目の被験物投与1時間後、水泳時間を測定した。水泳試験終了後、全血を採取し、その血漿中のHSP70（HSP72）の濃度をHSP70 high sensitivity EIA kit (Enzo Life Sciences社製)を用いて測定した。測定は、添付の手順書に従い実施した。また、ストレスの指標とされる血漿中モノアミン濃度を市販のELISAキットを用いて測定した。なお、投与した被験物としては、水浸ストレスを負荷した「ストレス群」にはカルボキシメチルセルロース（CMC）（和光純薬工業社製）0.25%調製液を、水浸ストレス負荷し、且つゼルンボン投与を行なった「ストレス＋ゼルンボン群」には、上記と同じ終濃度となるようにCMCで懸濁したゼルンボン（和光純薬工業社製）調製液を用いた。ゼルンボンの投与量は、一回あたり50mg/kgとした。【００６１】
水泳時間の測定
底から40cmの深さまで水を入れた容器内で、ラット強制水泳用尾部クリップRTC2009及び重り（山下技研社製）を取り付けることによって体重の8%に相当する重量を負荷した状態でラットを遊泳させ、10秒以上鼻が水没するまでの時間を測定した。【００６２】
水浸ストレス試験
底より2cmの高さまで水を張ったケージにラットを入れて飼育して継続的な水浸状態におくことで、ラットにストレス負荷を与えた。【００６３】
血漿中モノアミン濃度の測定
血漿中モノアミン濃度としては、アセチルコリン（ACTH）とコルチコステロン（CORT）を測定した。測定は、ACTH ELISA kit（mdbioproducts社製）とAssayMax Corticosterone ELISA kit（ASSAYPRO社製）を用い、添付の手順書に従って測定した。【００６４】
２．試験結果
得られた結果を図３と表２に示す。図３に示される水泳時間においては、水浸ストレスを与えていない「対照群」の水泳時間に比べ、「ストレス群」で有意な減少が認められたが、これは「ストレス＋ゼルンボン群」で有意に抑制された。また、表２に示される血漿中のHSP70（HSP72）濃度に関しては、「対照群」、「ストレス群」に比べて、「ストレス＋ゼルンボン群」で顕著なHSP70（HSP72）濃度の上昇が認められ、群間による有意な差が示された。なお、「対照群」の水泳時間及び血漿中のHSP70濃度は、「ストレス群」及び「ストレス＋ゼルンボン群」の水浸ストレス試験開始日の試験開始前（図３及び表２中、「試験前」と記載）に測定した。【００６５】
【表２】
2012043808.tif 000006
血漿中モノアミン濃度としては、試験5日目において、「対照群」に比べ、「ストレス群」の血漿中ACTH及びCORTの両濃度の上昇が認められたのに対し、「ストレス＋ゼルンボン群」ではその上昇が抑えられた。このことから、本発明のHSP誘導剤は、ストレスだけでなく、鬱病や慢性疲労症候群に効果があることが期待された。また、本発明のHSP誘導剤は、血液を通して全身に寄与するものであることも確認され、ストレス症状が示されやすい脳や眼、肌といった部位での疾患の予防効果が期待される。【００６６】
実施例５：ゼルンボンが筋肉に及ぼす影響の検討１
１．試験方法
12週齢のSD系雄性ラット（日本チャールズリバー社製）を平均体重が均等になるように群分けした。群分け後、各群に被験物を1日2回、12時間毎に1週間経口投与した。その後、尾懸垂試験を5日または8日間実施した。被験物の投与は、尾懸垂期間も継続的に行なった。尾懸垂試験5日目または8日目に、麻酔下でラットからヒラメ筋を採取し、体重当たりのヒラメ筋重量を測定した。さらに、ヒラメ筋中のHSPの変化を検討する目的で、5日目のヒラメ筋中のHSPのmRNA量を測定した。投与した被験物としては、尾懸垂試験を実施していない「対照群」及び尾懸垂試験を実施した「尾懸垂群」にはコーン油（Sigma-Aldrich社製）を、尾懸垂試験を実施し且つゼルンボンを投与した「尾懸垂＋ゼルンボン群」にはゼルンボンをコーン油で溶解したしたものを用いた。ゼルンボンの投与量は、一回あたり50mg/kgとした。【００６７】
尾懸垂試験
75mm×5mキネシオロジーテープ（ドーム社製）を、ラットの尾部に巻き付け、そのテープを飼育ケージ上部に結び、後肢がどこにも触れないようにすることで、後肢筋肉の萎縮を引き起こさせた。【００６８】
筋肉中のHSP mRNA測定方法
筋肉の一部分を切り出し、RNAlater（QIAGEN社製）を用い、RNAを安定化させた。その後、RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit（QIAGEN社製）を用いてtotal RNAを回収した。0.2μg/μLとなるように調整したtotal RNA溶液をHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor（Life Technologies社製）で逆転写し、cDNAを得た。その後、TaqMan Gene Expression Assays （Life Technologies社製）を用い、iCycler IQ（BIO-RAD社製）にてリアルタイムPCRを行い、HSP72のmRNA発現量を測定した。また、内部標準として、HPRTを用いた。各実験は、製品に添付の手順書に従い実施し、HSP72 mRNAの発現量は、HPRTのmRNA量で補正したものを用いた。リアルタイムPCRのプライマーは、Rn01525688_s1及びRn01527840_m1（Life Technologies社製）を用いた。【００６９】
２．試験結果
得られた結果を図４−１及び図４−２に示す。図４−１に示した通り、「対照群」については、試験前後での体重当たりのヒラメ筋重量の変化は認められなかったのに対し、「尾懸垂群」では、有意な体重当たりのヒラメ筋重量の低下が認められた。一方、「尾懸垂＋ゼルンボン群」においては、そのヒラメ筋重量の低下が「尾懸垂群」に比して、有意に抑えられていた。また、図４−２から分かる通り、「尾懸垂＋ゼルンボン群」のHSP72の発現が、「尾懸垂群」よりも高く示されることが確認された。このことより、ゼルンボンが、筋肉の不使用により引き起こされる筋肉の萎縮を抑制または予防することが示された。【００７０】
実施例６：ゼルンボンが筋肉に及ぼす影響の検討２
１．試験方法
12週齢のSD系雄性ラット（日本チャールズリバー社製）を平均体重が均等になるように群分けした。群分け後、尾懸垂試験を10日間実施した。その後、尾懸垂を止めて通常飼育に戻すとともに、各群に被験物を1日2回、12時間毎に経口投与した。被験物投与3日または7日後、麻酔下でラットからヒラメ筋を採取し、体重当たりのヒラメ筋重量を測定した。さらに、3日目のヒラメ筋中のHSPのmRNA量を前述の方法で測定した。投与被験物としては、尾懸垂試験を実施していない「対照群」及び尾懸垂試験を実施した「尾懸垂群」にはコーン油（Sigma-Aldrich社製）を、尾懸垂試験を実施し且つゼルンボンを投与した「尾懸垂＋ゼルンボン群」にはゼルンボンをコーン油で溶解したしたものを用いた。ゼルンボンの投与量は、一回あたり50mg/kgとした。【００７１】
２．試験結果
得られた結果図５−１と図５−２に示す。図５−１に示した通り、尾懸垂後の体重当たりのヒラメ筋は、「対照群」と比して、有意な減少が見られた。その後、3日または7日間通常飼育することで、「尾懸垂群」のヒラメ筋量はなだらかな回復傾向が見られた。それに対し、「尾懸垂＋ゼルンボン群」においては、「尾懸垂群」よりもヒラメ筋量の増加が大きく、また、図５−２から分かる通り、HSP72の発現も高いことが確認された。このことから、ゼルンボンが、萎縮した筋肉において、ゼルンボンはHSP72の発現を増加させ、萎縮した筋肉の回復効果を高めることが示された。【００７２】
以上の結果から、HSPを誘導する植物由来成分は、生体内でのHSP70ファミリーを始めとする種々のHSPの発現を誘導することで、ストレス起因疾患や、筋力低下等のロコモティブシンドロームをはじめとする生体の恒常性の維持の強化、各種疾患や症状の予防又は改善、寿命延長等に有用であることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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