(57)【要約】  遺伝子スイッチおよび該遺伝子スイッチを含む遺伝子回路が作動することにより発現される転写調節因子によって発現調節される遺伝子配列とその上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列とを少なくとも含む発現ベクターをセレクタ(selector)として使用することを特徴とする、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法並びに、該選択方法に使用する発現ベクターを提供し、それにより、遺伝子スイッチや遺伝子回路の選択方法であって、短時間で行うことができ且つ選択効率が高く漏出の少ない効果的な選択方法を可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子スイッチ発現配列、および該遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチにより発現が誘導される転写調節因子をコードする遺伝子配列を有する遺伝子回路を保持する発現ベクター、並びに、該転写調節因子により発現調節される遺伝子配列を有する発現ベクターを導入した細胞を使用し、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下または非存在下で、該発現調節される遺伝子配列の発現下で細胞死を誘導し得る化合物を添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および／または、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下または非存在下で、該発現調節される遺伝子配列の非発現下で細胞死を誘導し得る化合物を添加して細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項２】
前記転写調節因子により発現調節される遺伝子配列を有する発現ベクターが、該転写調節因子により発現調節される第1の遺伝子配列および第2の遺伝子配列の2つの遺伝子配列を有する発現ベクターであり、ここで第1の遺伝子配列は第2の遺伝子配列とは異なるタンパク質をコードする遺伝子配列である、請求項1に記載の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項３】
前記転写調節因子により発現調節される遺伝子配列を有する発現ベクターが、該転写調節因子により発現調節される第1の遺伝子配列を有する発現ベクターおよび該転写調節因子により発現調節される遺伝子配列であって第2の遺伝子配列を有する発現ベクターであり、ここで第1の遺伝子配列は第2の遺伝子配列とは異なるタンパク質をコードする遺伝子配列である、請求項1に記載の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項４】
下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)アルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動する転写調節因子をコードする遺伝子配列、
を導入した細胞を使用し、
(1)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写抑制因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の非存在下でアルキル化剤を添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、または、
(2)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写活性化因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、アルキル化剤を添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、
を含む、請求項1に記載の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項５】
前記アルキル化DNA修復酵素がアルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)である請求項4に記載の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項６】
細胞がアルキル化剤高感受性大腸菌株である請求項4または請求項5に記載の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項７】
遺伝子のアルキル化を引き起こす化合物がメタンスルホン酸(MMS)である請求項4から6のいずれか1項に記載の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項８】
下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動するCIタンパク質をコードする遺伝子配列、
を導入したアルキル化剤高感受性大腸菌株を使用し、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の非存在下で、メタンスルホン酸(MMS)を添加して該大腸菌株を15分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項９】
下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列およびAPエンドヌクレアーゼ(APE1)をコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の2つの遺伝子配列の上流に該2つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動するCIタンパク質をコードする遺伝子配列、
を導入したアルキル化剤高感受性大腸菌株を使用し、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の非存在下で、メタンスルホン酸(MMS)を添加して該大腸菌株を15分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項１０】
下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)アルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子配列およびチミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の2つの遺伝子配列の上流に該2つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動する転写調節因子をコードする遺伝子配列、
を導入した細胞を使用し、
(1)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写抑制因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、変異原性ヌクレオシドを添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および、該化合物の非存在下でアルキル化剤を回収した細胞に添加してインキュベーションした後に生細胞を回収すること、または、
(2)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写活性化因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、アルキル化剤を添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および、該化合物の非存在下で変異原性ヌクレオシドを回収した細胞に添加してインキュベーションした後に生細胞を回収すること、
を含む、請求項1に記載の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項１１】
下記配列(a-1)および(b-1)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a-1)アルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子配列、
(b-1)前記(a-1)の遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
下記配列(a-2)および(b-2)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a-2)チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b-2)前記(a-2)の遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動する転写調節因子をコードする遺伝子配列、
を導入した細胞を使用し、
(1)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写抑制因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、変異原性ヌクレオシドを添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および、該化合物の非存在下でアルキル化剤を回収した細胞に添加してインキュベーションした後に生細胞を回収すること、または、
(2)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写活性化因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、アルキル化剤を添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および、該化合物の非存在下で変異原性ヌクレオシドを回収した細胞に添加してインキュベーションした後に生細胞を回収すること、
を含む、請求項1に記載の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項１２】
アルキル化DNA修復酵素がアルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)であり、かつチミジンキナーゼがヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼである請求項10または請求項11に記載の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項１３】
細胞がアルキル化剤高感受性大腸菌株である請求項10から12のいずれか1項に記載の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項１４】
遺伝子のアルキル化を引き起こす化合物がメタンスルホン酸(MMS)であり、変異原性ヌクレオシドが6-(β-D-2-デオキシリボ-フラノシル)-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド[4,5-c][1,2]オキザジン-7-オン(dP)である請求項10から13のいずれか1項に記載の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項１５】
下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列およびヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の2つの遺伝子配列の上流に該2つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動するCIタンパク質をコードする遺伝子配列、
を導入したアルキル化剤高感受性大腸菌株を使用し、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、6-(β-D-2-デオキシリボ-フラノシル)-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド[4,5-c][1,2]オキザジン-7-オン(dP)を添加して該大腸菌株を5分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収し、次いで、該化合物の非存在下で、メタンスルホン酸(MMS)を添加して該細胞を15分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項１６】
下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列、ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、およびAPエンドヌクレアーゼ(APE1)をコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の3つの遺伝子配列の上流に該3つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動するCIタンパク質をコードする遺伝子配列、
を導入したアルキル化剤高感受性大腸菌株を使用し、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、6-(β-D-2-デオキシリボ-フラノシル)-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド[4,5-c][1,2]オキザジン-7-オン(dP)を添加して該大腸菌株を5分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収し、次いで、該化合物の非存在下で、メタンスルホン酸(MMS)を添加して該細胞を15分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項１７】
アルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子配列およびチミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、並びに前記2つの遺伝子配列の上流に該2つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列を少なくとも含む発現ベクターの、請求項10に記載の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法における使用。
【請求項１８】
前記発現ベクターにおいてアルキル化DNA修復酵素がアルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)であり、かつチミジンキナーゼがヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼである発現ベクターの、請求項17に記載の使用。
【請求項１９】
前記発現ベクターがAPエンドヌクレアーゼ(APE1)をコードする遺伝子配列をさらに含む発現ベクターである、請求項18に記載の使用。
【請求項２０】
配列表の配列番号1から6のいずれか1に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドからなり、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択に使用される発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の開発方法に関する。より詳しくは、本発明は、遺伝子スイッチおよび該遺伝子スイッチを有する遺伝子回路の作用により発現調節される遺伝子の発現または非発現により引き起こされる細胞死または細胞死の回避を指標にして遺伝子スイッチおよび遺伝子回路を選択することを特徴とする遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の開発方法に関する。具体的には、本発明は、遺伝子スイッチおよび該遺伝子スイッチを含む遺伝子回路が作動することにより発現される転写調節因子によって発現調節される遺伝子配列とその上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列とを少なくとも含む発現ベクターをセレクタ(selector)として使用することを特徴とする、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法に関する。また、本発明は、前記選択方法に使用する発現ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現の制御システムは、タンパク質生産、代謝工学、そして合成生物学の基本手段として極めて重要である。遺伝子発現の制御システムを用いたバイオテクノロジは、有用タンパク質の大量生産、代謝工学、そしてホールセル(Whole Cell)型のバイオセンサなど、さまざまな分野で使用されている。天然から得られたものにせよ、人工的に創られたものにせよ、望む特性をもつ遺伝子発現の制御システムを要求に応じて、そして迅速に制作する技術が求められている。【０００３】
自然界には、さまざまな転写および／または翻訳制御機構、そしてセンサ機構がある。近年、遺伝子発現の制御システムとして遺伝子スイッチが報告されている(非特許文献1-5)。遺伝子スイッチは、さまざまな情報を入力として、特定遺伝子の発現と非発現(ON/OFF)変換行う分子装置である。さまざまな遺伝子スイッチを集積して遺伝子回路を構成することにより、オシレータやカウンタ、論理回路などを細胞内に構成できるようになりつつある。細胞内に構築する遺伝子回路では、複数の遺伝子スイッチ機構が協同して働き、統合的機能がはじめて成立する。そのためには、その回路をなす全てのスイッチが、それぞれある定められた特性をもって働くことが求められる。任意の遺伝子回路を自由に設計することを可能とするためには、機能や特性の異なる膨大な遺伝子スイッチが必要となる。【０００４】
例えば、遺伝子スイッチは、有用タンパク質の大量生産に応用できる。有用タンパク質の生産においては、大腸菌などの宿主細胞に異種生物から得た標的タンパク質を強制発現させる手法がしばしば用いられる。しかし、宿主細胞にとって毒性を示すタンパク質は多い。このようなタンパク質を生産させる場合、宿主細胞を充分な数まで増殖させて、適宜時機をもって発現を「誘導」して強制発現させる。このときに、次の2つの条件が求められる。すなわち、(1)非誘導時の基底発現レベルが充分低いこと(すなわち、厳密であること、「漏れ」が小さいこと)、(2)発現が誘導(ON)されたときに充分な遺伝子発現がなされること(すなわち、ON/OFF時の発現レベル比が大きいこと)、の2つである。これを実現するために、様々なプロモータ系、例えばpETシステム(Novagen社製)などが開発されているが、未だに最適な遺伝子スイッチの探索が続いている。【０００５】
遺伝子スイッチはまた、代謝工学の手段として使用できる。代謝工学では、複数の酵素遺伝子を1つの宿主細胞の中で同時に発現させ、ある目的物質の生合成経路を構築する。構築した人工の生合成経路において最高の成果、例えば、バイオマスあたりの最終生成物の収量最大化、副産物の最少化などを目指すとき、個々の遺伝子の発現レベルをきめ細やかに、できれば独立に調節することおよび検討することが肝要である。そのため、望み通りのON/OFF切り替え特性をもつ多数の遺伝子スイッチが必要となる。特に複数の遺伝子の発現調節をひとつの細胞で同時に行う場合、遺伝子スイッチに求められる機能は、(1)互いに直交性を示すこと、すなわち1つの遺伝子スイッチの誘導物質が別の遺伝子スイッチを誤作動させないこと、(2)それぞれの遺伝子スイッチによる発現量を、連続的に調節できること、などが挙げられる。【０００６】
遺伝子スイッチはまた、バイオセンサとして使用できる。細胞は、多くの化学情報および／または物理情報を感知し、それに応じて適当な遺伝子群を発現させる。この「物質感知」システムの下流に緑色蛍光タンパク質(GFP)などのレポータ遺伝子を繋いだ細胞センサ(Whole Cell Sensor)が開発されている。これらを上手く改変するなどして、任意の物質(あるいは物理刺激)に対するセンサの開発が求められている。【０００７】
上記のような遺伝子スイッチやセンサシステムを多数創出できれば、それらの組み合わせにより、情報の統合および／または演算(判断)機能を付した複雑な遺伝子回路を創作できる。しかし、遺伝子回路内に含まれる遺伝子スイッチには、電子回路では漏電にあたるスイッチの漏れや混線という問題があり、複数の遺伝子スイッチを同時に用いると正しく働かない。遺伝子スイッチのスイッチ特性、例えばON/OFF閾値やダイナミックレンジなどは、これらを組み合わせて複雑な遺伝子回路(geneticcircuits)を設計する場合、(1)発現起動を起こす応答閾値を任意に変化させること、(2)非誘導状態における発現「漏出」の抑制、(3)細胞内の他因子との直交性の担保、が強く求められる。複雑な遺伝子回路にこれらの要件をデノボ(de novo)デザインすることは、極めて困難な作業である。そのため、細胞工学における回路の集積限界はきわめて低い現状にある。これらの問題を克服するために、遺伝子スイッチの改良が求められている。【０００８】
一方、たとえ複雑な回路であっても、全体でみれば、入力条件によって遺伝子起動状態を規定する、ひとつの遺伝子スイッチとみなせる。すなわち、遺伝子回路が、ある条件で下流遺伝子(セット)の発現を起動し、それ以外では抑制する。【０００９】
したがって、遺伝子回路の構築において、遺伝子発現がONであるべきときに起動状態にあるものおよび／またはOFFであるべき局面で抑制状態にあるものを選択(ON選択／OFF選択)すれば、任意の出力特性をもつ遺伝子回路の選別および／または取得が可能である。このON選択／OFF選択を、簡単に、そして連続して行うことができれば、さまざまな遺伝子スイッチ(あるいは遺伝子回路)を迅速に開発できる。遺伝子スイッチの機能選択には、種々の入力条件において、ON状態とOFF状態のどちらも選択する必要がある(非特許文献6-12)。つまり、ONセレクタと、OFFセレクタの2つのマーカーを出力側、すなわち遺伝子回路の下流側につなぐことによって、遺伝子スイッチあるいはその集積回路である遺伝子回路の機能選択が可能になる。分子遺伝学においては、様々なONセレクタ、OFFセレクタが知られている。【００１０】
最近、このONセレクタとOFFセレクタの機能をひとつの遺伝子に実施させる試みがなされている(非特許文献10-13)。ONセレクタとOFFセレクタの機能をいずれも有するセレクタはデュアルセレクタと呼ばれる。独立したONセレクタとOFFセレクタを使用する「オペロンタイプ」の選択法では、どちらかのセレクタ遺伝子に遺伝子変異が頻発し、その結果擬陽性が多発するという問題があるが、デュアルセレクタはそのような問題がない。遺伝子スイッチの機能選択のためのデュアルセレクタの報告は少ないが、テトラサイクリン耐性遺伝子tetAを用いた系(非特許文献10-11)、クロラムフェニコール耐性遺伝子CATを用いた系(非特許文献12)などの抗生物質耐性を細胞に与える遺伝子を用いた系や、大腸菌の走化性遺伝子cheZを用いた系(非特許文献13)が報告されている。tetAを用いた系は、tetAの転写を制御することで細胞の殺菌機構を利用し、細胞の生死を測定することによりデュアル選択を行う。cheZを用いた系は、cheZの翻訳を制御して、細胞の運動性の有無によりデュアル選択を行う。【００１１】
ON選択／OFF選択用に使用される選択系は今までに様々なものが開発されているが、いずれも、細胞中に導入した遺伝子回路が正しく出力したときに細胞が増殖できるという、いわゆる選択増殖によって選択を実現するものである。このような選択系はひとつの選択操作に細胞増殖過程を含むため、1回の選択操作におよそ12時間から24時間を要する。そのため、遺伝子回路の選択、特に複雑な遺伝子回路の選択には、多くの日数を必要とする。このように従来の手法は、選択操作に時間がかかるという問題や、選択効率が選択条件に左右されるという問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Galvao, TC and de Lorenzo, V, Transcriptional regulators a la carte: engineering new effector specificities in bacterial regulatory proteins. Curr Opin Biotechnol, 17, 34-42 (2006)
【非特許文献２】Lutz, R and Bujard, H, Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements. Nucleic Acids Res, 25, 1203-10 (1997)
【非特許文献３】Cox, RS 3rd, et al., Programming gene expression with combinatorial promoters. Mol Syst Biol, 3, 145 (2007)
【非特許文献４】Eddy, SR, Noncoding RNA genes., Curr Opin Genet Dev., 9, 695-9 (1999)
【非特許文献５】Garst, AD, Batey RT., A switch in time: Detailing the life of a riboswitch., Biochim Biophys Acta. 1789, 584-91 (2009)
【非特許文献６】Yokobayashi, Y, et al., Directed evolution of a genetic circuit. Proc Natl Acad Sci U S A,99, 16587-91 (2002)
【非特許文献７】Yokobayashi, Y, et al., A dual selection module for directed evolution of genetic circuits. Nat. Computing, 4, 245-54 (2005)
【非特許文献８】Tang, SY, et al., AraC regulatory protein mutants with altered effector specificity. J AmChem Soc, 130, 5267-71 (2008)
【非特許文献９】Lynch, SA and Gallivan, JP, A flow cytometry-based screen for synthetic riboswitches. Nucleic Acids Res, 37, 184-92 (2009)
【非特許文献１０】Nomura, Y and Yokobayashi, Y, Dual selection of a genetic switch bya single selection marker. Biosystems, 90, 115-20 (2007)
【非特許文献１１】Muranaka, N, et al., An efficient platform for genetic selection and screening of gene switches in Escherichia coli. Nucleic Acids Res, 37, e39 (2009)
【非特許文献１２】Rackham, O and Chin, JW, A network of orthogonal ribosome mRNA pairs. Nat. Chem. Biol., 1,159-66 (2005)
【非特許文献１３】Topp, S and Gallivan, JP, Random walks to synthetic riboswitches--a high-throughput selection based on cell motility. Chembiochem, 9, 210-3 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
遺伝子スイッチやバイオセンサの機能は、複数の要素が複雑に協同して行う高次分子機能であり、望みの機能特性をもつ遺伝子スイッチを合理的に設計するのは極めて困難である。さらに、それらが組み合わさって構築される遺伝子回路の合理的設計はより大きな困難性を伴う。そこで、多数の遺伝子スイッチ変異体を作成してライブラリとし、その中から所望の機能する変異体の選別および取得を行う必要がある。【００１４】
本発明者らは既に、ヒトヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ(hsvTK)に着目し、そして、hsvTKを遺伝子回路の出力側、すなわち下流側で作動させてON選択および／またはOFF選択を行うことにより、所望の特性および／または機能を有する遺伝子スイッチや遺伝子回路を、高速、簡便、かつ確実に取得する方法を完成し、特許出願している（特願2009-262909号）。この手法は、ON選択およびOFF選択のどちらにおいても、遺伝子スイッチや遺伝子回路の選択に極めて高い選択効率を示した。特にこの手法のOFF選択は、30分間程度の短時間で選択を行うことができるため有用性が高い。しかし、この手法のON選択は24時間程度の時間がなお必要であり改良の余地がある。【００１５】
本発明の課題は、遺伝子スイッチや遺伝子回路の選択を短時間で行うことができ、且つ選択効率の高い効果的な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、アルキル化DNA修復酵素であるアルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)を遺伝子回路の出力側、すなわち下流側で作動し得るように設計した発現ベクターをセレクタとして使用し、該発現ベクターと遺伝子回路を発現する発現ベクターとを導入した細胞においてDNAアルキル化による細胞死を誘導する条件下で遺伝子スイッチを作動させて生細胞を回収することにより、ON選択を短時間で実施し得ることを見出した。さらに、このON選択方法と、本発明者らが先に開発したOFF選択方法、すなわちhsvTKを遺伝子回路の出力側で作動し得るように設計した発現ベクターをセレクタとして使用するOFF選択方法とを組み合わせて使用することにより、ON選択およびOFF選択のいずれをも短時間、おおよそ5-30分で実施できる遺伝子スイッチや遺伝子回路の選択方法を見出した。本発明はこれら研究成果に基づいて完成したものである。【００１７】
即ち、本発明は以下に関する：
1.遺伝子スイッチ発現配列、および該遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチにより発現が誘導される転写調節因子をコードする遺伝子配列を有する遺伝子回路を保持する発現ベクター、並びに、該転写調節因子により発現調節される遺伝子配列を有する発現ベクターを導入した細胞を使用し、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下または非存在下で、該発現調節される遺伝子配列の発現下で細胞死を誘導し得る化合物を添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および／または、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下または非存在下で、該発現調節される遺伝子配列の非発現下で細胞死を誘導し得る化合物を添加して細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法、
2.前記転写調節因子により発現調節される遺伝子配列を有する発現ベクターが、該転写調節因子により発現調節される第1の遺伝子配列および第2の遺伝子配列の2つの遺伝子配列を有する発現ベクターであり、ここで第1の遺伝子配列は第2の遺伝子配列とは異なるタンパク質をコードする遺伝子配列である、前記1.の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法、
3.前記転写調節因子により発現調節される遺伝子配列を有する発現ベクターが、該転写調節因子により発現調節される第1の遺伝子配列を有する発現ベクターおよび該転写調節因子により発現調節される遺伝子配列であって第2の遺伝子配列を有する発現ベクターであり、ここで第1の遺伝子配列は第2の遺伝子配列とは異なるタンパク質をコードする遺伝子配列である、前記1.の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法、
4.下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)アルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動する転写調節因子をコードする遺伝子配列、
を導入した細胞を使用し、
(1)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写抑制因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の非存在下でアルキル化剤を添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、または、
(2)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写活性化因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、アルキル化剤を添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、
を含む、前記1.の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法、
5.前記アルキル化DNA修復酵素がアルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)である前記4.の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法、
6.細胞がアルキル化剤高感受性大腸菌株である前記4.または前記5.の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法、
7.遺伝子のアルキル化を引き起こす化合物がメタンスルホン酸(MMS)である前記4.から6.のいずれかの遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法、
8.下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動するCIタンパク質をコードする遺伝子配列、
を導入したアルキル化剤高感受性大腸菌株を使用し、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の非存在下で、メタンスルホン酸(MMS)を添加して該大腸菌株を15分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法、
9.下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列およびAPエンドヌクレアーゼ(APE1)をコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の2つの遺伝子配列の上流に該2つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動するCIタンパク質をコードする遺伝子配列、
を導入したアルキル化剤高感受性大腸菌株を使用し、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の非存在下で、メタンスルホン酸(MMS)を添加して該大腸菌株を15分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法、
10.下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)アルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子配列およびチミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の2つの遺伝子配列の上流に該2つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動する転写調節因子をコードする遺伝子配列、
を導入した細胞を使用し、
(1)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写抑制因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、変異原性ヌクレオシドを添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および、該化合物の非存在下でアルキル化剤を回収した細胞に添加してインキュベーションした後に生細胞を回収すること、または、
(2)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写活性化因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、アルキル化剤を添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および、該化合物の非存在下で変異原性ヌクレオシドを回収した細胞に添加してインキュベーションした後に生細胞を回収すること、
を含む、前記1.の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法、
11.下記配列(a-1)および(b-1)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a-1)アルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子配列、
(b-1)前記(a-1)の遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
下記配列(a-2)および(b-2)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a-2)チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b-2)前記(a-2)の遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動する転写調節因子をコードする遺伝子配列、
を導入した細胞を使用し、
(1)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写抑制因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、変異原性ヌクレオシドを添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および、該化合物の非存在下でアルキル化剤を回収した細胞に添加してインキュベーションした後に生細胞を回収すること、または、
(2)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写活性化因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、アルキル化剤を添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および、該化合物の非存在下で変異原性ヌクレオシドを回収した細胞に添加してインキュベーションした後に生細胞を回収すること、
を含む、前記1.の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法、
12.アルキル化DNA修復酵素がアルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)であり、かつチミジンキナーゼがヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼである前記10.または前記11.に記載の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法、
13.細胞がアルキル化剤高感受性大腸菌株である前記10.から12.のいずれかに記載の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法、
14.遺伝子のアルキル化を引き起こす化合物がメタンスルホン酸(MMS)であり、変異原性ヌクレオシドが6-(β-D-2-デオキシリボ-フラノシル)-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド[4,5-c][1,2]オキザジン-7-オン(dP)である前記10.から13.のいずれかの遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法、
15.下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列およびヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の2つの遺伝子配列の上流に該2つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動するCIタンパク質をコードする遺伝子配列、
を導入したアルキル化剤高感受性大腸菌株を使用し、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、6-(β-D-2-デオキシリボ-フラノシル)-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド[4,5-c][1,2]オキザジン-7-オン(dP)を添加して該大腸菌株を5分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収し、次いで、該化合物の非存在下で、メタンスルホン酸(MMS)を添加して該細胞を15分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法、
16.下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列、ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、およびAPエンドヌクレアーゼ(APE1)をコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の3つの遺伝子配列の上流に該3つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動するCIタンパク質をコードする遺伝子配列、
を導入したアルキル化剤高感受性大腸菌株を使用し、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、6-(β-D-2-デオキシリボ-フラノシル)-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド[4,5-c][1,2]オキザジン-7-オン(dP)を添加して該大腸菌株を5分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収し、次いで、該化合物の非存在下で、メタンスルホン酸(MMS)を添加して該細胞を15分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法、
17.アルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子配列およびチミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、並びに前記2つの遺伝子配列の上流に該2つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列を少なくとも含む発現ベクターの、前記10.の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法における使用、
18.前記発現ベクターにおいてアルキル化DNA修復酵素がアルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)であり、かつチミジンキナーゼがヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼである発現ベクターの、前記17.の使用、
19.前記発現ベクターがAPエンドヌクレアーゼ(APE1)をコードする遺伝子配列をさらに含む発現ベクターである、前記18.の使用、
20.配列表の配列番号1から6のいずれか1に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドからなり、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択に使用される発現ベクター。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、遺伝子スイッチ発現配列、および該遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチにより発現が誘導される転写調節因子をコードする遺伝子配列を有する遺伝子回路を保持する発現ベクター、並びに、該転写調節因子により発現調節される遺伝子配列を有する発現ベクターを導入した細胞を使用し、該発現調節される遺伝子配列の発現下で細胞死を誘導し得る化合物の存在下で該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および／または、該発現調節される遺伝子配列の非発現下で細胞死を誘導し得る化合物の存在下で細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収することを特徴とする、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法を提供できる。具体的には、前記発現調節される遺伝子配列がアルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子配列、例えばアルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列である前記遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法を提供できる。あるいは、前記発現調節される遺伝子配列がアルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子配列およびチミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、例えばAAGおよびhsvTKである前記遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法を提供できる。さらに本発明によれば、チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列およびアルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子配列、並びに前記2つの遺伝子配列の上流に該2つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列を少なくとも含む発現ベクターであって、本発明に係る遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法に使用される発現ベクターを提供できる。【００１９】
本発明に係る方法は従来の方法と異なり、細胞中に導入した遺伝子回路が正しく出力しなければ短時間で細胞死が生じ、正しく出力したときに細胞が生存できるという特性を有する選択系を使用することを特徴とする。このような選択系は選択操作が短時間、具体的には10分間から60分間程度で実施できるため、遺伝子回路の選択、特に複雑な遺伝子回路の選択も従来の方法と比較して短時間で実施できる。【００２０】
したがって、本発明によれば、所望の特性および／または機能を有する遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択および取得を、従来の方法と比較して短時間で実施できる。本発明に係る方法は、効率が極めて高く、且つ迅速であるため、厳密性のより高い遺伝子回路を高速に開発する基盤(platform)として、合成生物学の良き手段として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】4種類のモデル遺伝子回路の模式図とその機能を示す図である。左パネルは、遺伝子回路の模式図を示す。右パネルは、活性化物質N-アシル-L-ホモセリンラクトン(AHL)の有無による各モデル遺伝子回路によるCIタンパク質発現(CI expression)の有無を説明する。
【図２−Ａ】モデル遺伝子回路である回路Aのプラスミドマップである。
【図２−Ｂ】モデル遺伝子回路である回路Bのプラスミドマップである。
【図２−Ｃ】モデル遺伝子回路である回路Cのプラスミドマップである。
【図２−Ｄ】モデル遺伝子回路である回路Dのプラスミドマップである。
【図３】定常的にヒトヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ(hsvTK)を発現させるために用いるpTrc-hsvtkの遺伝子構造を示す模式図である。(実験例1および実験例3)
【図４】大腸菌のチミジンキナーゼ(TK)欠損株はdP存在下でも生育するが、hsvTKを発現させることによりその生存率が著しく低下することを示す図である。図中、「●」はhsvTKを発現させたTK欠損大腸菌株(hsvTK+)を、「○」はhsvTKを発現させていないTK欠損大腸菌株(hsvTK-)を表す。図の縦軸は生菌数(Cell Count)、横軸はdPの濃度(dP conc.)を表す。(実験例1)
【図５】TK欠損大腸菌株の生存率は5FdUの濃度依存的に低下するが、hsvTKを発現させることによりその生存率の低下が抑制されることを示す図である。図中、「●」はhsvTKを発現させたTK欠損大腸菌株(hsvTK+)を、「○」はhsvTKを発現させていないTK欠損大腸菌株(hsvTK-)を表す。図の縦軸は生菌数(Cell Count)、横軸は5FdUの濃度(5FdU conc.)を表す。(実験例2)
【図６】hsvTKを発現させたTK欠損大腸菌株は、dPの添加(図中、dPショックと記す)により、該添加から5分以内に細胞死を引き起こすことを示す図である。図中、「●」はdPの添加(図中、＋dPと記す)を、「○」はdPの非添加(図中、no dPと記す)を示す。図の縦軸は生菌数(Cell Count)、横軸は時間(分)(time [min])を表す。(実験例3)
【図７】図1に示したモデル遺伝子回路が設計どおりに作動することを確認した結果を示す図である。図中、各記号は図1に示したモデル遺伝子回路を表し、「●」は回路A、「○」は回路B、「▲」は回路C、「△」は回路Dを表す。パネル(a)は、該モデル遺伝子回路とグリーン蛍光タンパク質(GFPuv)発現プラスミドとを共発現させたTK欠損大腸菌株において、様々な濃度のAHLの存在下で、GFPuvの発現を測定した結果を示す。パネル(a)の縦軸は相対的蛍光強度(Relative Fluorescence)、横軸はAHL濃度(AHL conc.)を表す。パネル(b)は該遺伝子回路とhsvTK発現プラスミドとを共発現させたTK欠損大腸菌株において、様々な濃度のAHLの存在下で、5FdUを添加することによりON選択を実施し、生菌数を計数した結果を示す。パネル(c)は、該遺伝子回路とhsvTK発現プラスミドとを共発現させたTK欠損大腸菌株において、様々な濃度のAHLの存在下で、dPを添加することによりOFF選択を実施し、生菌数を計数した結果を示す。パネル(b)およびパネル(c)の縦軸は生菌数(CellCount)、横軸はAHL濃度(AHL conc.)を表す。(実験例4)
【図８】OFF選択とON選択を組み合わせたデュアル選択の工程およびその結果を説明する模式図である。パネル(a)は寒天培地を用いたデュアル選択法の概略を、パネル(b)は液体培地中で行うデュアル選択法の工程を説明する。パネル(c)は、3種類の遺伝子回路をそれぞれ有する3種類のTK欠損大腸菌株を混合した混合細胞をパネル(a)に示した方法でデュアル選択した結果である。各細胞の割合を、デュアル選択前、ON選択後、およびデュアル選択後に計測した結果を示す。(実験例5)
【図９−Ａ】図1に示したモデル遺伝子回路の回路Aおよび回路BをPCRにより識別する方法を説明する模式図である。回路Aおよび回路Bともに同じプライマセットによってCI構造遺伝子の一部を含む回路の一定領域がPCR増幅される。回路AはCI構造遺伝子の野生型を含み、一方、回路BはCI構造遺伝子の欠失変異型を含むため、回路Bを鋳型としたPCR産物(367bp)は、回路Aを鋳型としたPCR産物(639bp)よりもその長さが短い。そのため、両者の混合物のPCR解析において2つの異なった長さのバンドが与えられる。そのバンド強度比から、両者の存在比が定まる。
【図９−Ｂ】図1に示したモデル遺伝子回路の回路Aを導入したTK欠損大腸菌株(Switch1)および回路Bを導入したTK欠損大腸菌株(Switch2)を混合し、OFF選択後、ON選択を実施した結果を示す図である。各選択工程後、PCRによりSwitch1およびSwitch2を検出した。図中、レーン(Lane)1はSwitch1、レーン2はSwitch2、レーン3は混合細胞、レーン4は混合細胞をOFF選択したもの、レーン5はOFF選択後の細胞をON選択したものの結果を示す。(実験例7)
【図１０】各種セレクタプラスミドの模式図である。
【図１１】プラスミドpCI-gfpのプラスミドマップである。
【図１２−Ａ】野生型AAG遺伝子を含むONセレクタプラスミドpTrc-aag(WT)のプラスミドマップである。
【図１２−Ｂ】野生型AAG遺伝子とApe1遺伝子とを含むONセレクタプラスミドpTrc-aag-ape1のプラスミドマップである。
【図１２−Ｃ】Ape1遺伝子を含むプラスミドpTrc-ape1のプラスミドマップである。
【図１３−Ａ】野生型AAG遺伝子とヒトヘルペスウイルス遺伝子とを含むデュアルセレクタプラスミドpCI-aag-hsvTK(セレクタプラスミドVer.1)のプラスミドマップである。
【図１３−Ｂ】野生型AAG遺伝子、ヒトヘルペスウイルス遺伝子、およびApe1遺伝子を含むデュアルセレクタプラスミドpCI-aag-hsvTK-ape1(セレクタプラスミドVer.2)のプラスミドマップである。
【図１３−Ｃ】AAG(L180F)変異体遺伝子、ヒトヘルペスウイルス遺伝子、およびApe1遺伝子を含むデュアルセレクタプラスミドpCI-aag-hsvTK-ape1(セレクタプラスミドVer.2.1)のプラスミドマップである。
【図１３−Ｄ】野生型AAG遺伝子、ヒトヘルペスウイルス遺伝子、およびApe1遺伝子を含むデュアルセレクタプラスミドpCI-aag-hsvTK-ape1(セレクタプラスミドVer.3)のプラスミドマップである。
【図１４】AAG遺伝子がONセレクタとして機能することを示す図である。AAGの有するアルキル化DNA修復酵素活性が失われたAAG(E125A)変異体の遺伝子を含むプラスミドを導入したアルキル化剤感受性大腸菌株MV2157(□)は、MMSの処理により、MMS濃度依存的に大腸菌株の生存率が顕著に減少した(パネル(a))。また、生存率の低下はMMS処理後15分間で既に観察された(パネル(b))。一方、AAG遺伝子を含むプラスミドを導入したMV2157(○)は、AAG(E125A)変異体の遺伝子を含むプラスミドを導入したものと比較して、最大で103倍の生菌数を示した。大腸菌株の生存率は、AAG遺伝子を含むプラスミドに加えてAPE1を含むプラスミドを導入することにより、さらに増加した(●)。(実施例2)
【図１５−Ａ】AAGをONセレクタとして用いたON選択により、短時間のMMS処理で遺伝子回路の選択を実施できたことを示す図である。図中、「λPR ON(●)」は、セレクタプラスミドVer.2(pCI-aag-hsvTK-ape1)および回路Cを導入したMV2157大腸菌株を、「λPR ON(□)」はセレクタプラスミドVer.2(pCI-aag-hsvTK-ape1)および回路Dを導入したMV2157大腸菌株示す。(実施例3)
【図１５−Ｂ】セレクタプラスミドVer.2(pCI-aag-hsvTK-ape1)および回路Cを導入したMV2157大腸菌株に、さらにプラスミドpCI-ape1を導入してApe1の発現量を増加すると、大腸菌の生存率が増加したことを示す図である。(実施例3)
【図１６】AAGのアミノ酸配列において第180番目のロイシンがフェニルアラニンに置換している変異体(AAG(L180F))を発現する大腸菌が、野生型AAGを発現する大腸菌よりも有意に高いMMS耐性を示したことを説明する図である。(実施例4)
【図１７】セレクタプラスミドの遺伝子群が起動状態にあるときに、セレクタプラスミドVer 2.1(pCI-aag(L180F)-hsvTK-ape1)を導入した大腸菌は、MMS処理に対して、セレクタプラスミドVer.2(pCI-aag-hsvTK-ape1)を導入した大腸菌と比較して顕著に高い生存率を示したことを説明する図である。図中、NDは検出されなかったことを意味する。(実施例4)
【図１８−Ａ】hsvTK遺伝子をOFFセレクタとして用いたOFF選択とAGG遺伝子をONセレクタとして用いたON選択を組み合わせたデュアル選択の工程を説明する模式図である。(実施例5)
【図１８−Ｂ】図18-Aに示したデュアル選択の工程の各段階における細胞集団のAHLの存在および非存在条件下におけるそれぞれの蛍光タンパク質」の出力パターンを示す図である。OFF選択の実施後は、AHL添加で蛍光を示すコロニ、すなわち回路Cを有し、hsvTKを発現するスイッチ株がほぼ払拭されていたが、これに対し、AHL非添加で蛍光を示さないコロニ、すなわち回路Dを有し、hsvTKを発現しないスイッチ株が多数存在した。OFF選択に続いてON選択を行った後は、回路Dを有するスイッチ株はAHLの添加の有無に関らずAAGを発現しないため細胞死が誘導され、回路Bを有するスイッチ株はAHLの非存在下でAAGを発現するためにMMSによる細胞死を免れて生存した。(実施例5)
【図１９】セレクタプラスミドに含まれる遺伝子群の非発現状態(OFF)から発現状態(ON)の切り替え時間が短いとき、すなわちAHLを含まない培地での培養が1時間であるとき、回路Aを含み完全長AAGを発現する細胞は殆ど淘汰され、一方、回路Bを含みAAG欠失体を発現する細胞のみが選抜されたことを示す図である。この「選り分け」は、選択操作間の時間感覚が十分長いとき、すなわちAHLを含まない培地での培養が6時間であるときにはみられなかった。図中、NCはネガティブコントロール、すなわちここではMMMS処理をしてないサンプルである。(実施例6)
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、特性の異なる多くの遺伝子スイッチのライブラリから、遺伝子スイッチおよび該遺伝子スイッチを有する遺伝子回路の作用により発現調節される遺伝子の発現または非発現により引き起こされる細胞死または細胞死の回避を指標にして、所望の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路を選択することを特徴とする遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の開発方法に関する。
【００２３】
用語「遺伝子スイッチ」は、転写活性化ドメインを含有する分子であって、該分子を活性化し得る物質(活性化物質)が結合する部位を有する分子、好ましくはタンパク質を意味する。このような分子は、活性化物質の結合により活性化され、その機能を変化させる。すなわち、活性化物質の結合により、遺伝子スイッチの標的配列へのその結合が左右され、その結果、目的の遺伝子の発現が阻害または誘導される。「遺伝子スイッチ」は、言い換えれば、転写活性化ドメインを含有する分子であって、該分子を活性化し得る物質が結合する部位を有し、該物質の結合により標的配列への結合が生じる若しくは解除される分子を意味する。用語「遺伝子スイッチ発現配列」は、遺伝子スイッチをコードする核酸配列を意味する。
【００２４】
用語「遺伝子スイッチの活性化物質」は、遺伝子スイッチに結合することにより遺伝子スイッチの機能を変化させ、その結果、遺伝子または多数の遺伝子の直接的または間接的な発現の調節を誘導する物質、例えばそのような化合物を意味する。「遺伝子スイッチの活性化物質」は、「遺伝子スイッチを活性化する化合物」と言うこともできる。活性化物質は、遺伝子スイッチにより異なる。遺伝子スイッチと活性化物質との組み合わせは、例えば、ビブリオ(vibrio)菌由来のホモセリンラクトンセンサでありN-アシル-L-ホモセリンラクトン(AHL)受容体タンパク質であるLuxRとAHL、AraCタンパク質とアラビノースなどが例示できる
【００２５】
用語「遺伝子スイッチの標的配列」は、標的遺伝子をコードする遺伝子またはその活性部分の翻訳開始の5'上流に位置する核酸配列であって、標的遺伝子の転写を制御する核酸配列を意味する。遺伝子スイッチの標的配列は、プロモータ活性を有する。すなわち、「遺伝子スイッチの標的配列」は、プロモータ配列であり得る。好ましくは、エンハンサ活性を有している調節核酸配列が、遺伝子スイッチの標的配列に間接的にまたは直接的に結合されている。遺伝子スイッチの標的配列に遺伝子スイッチが作用しないと、標的遺伝子は発現されない。すなわち、遺伝子スイッチの標的配列への遺伝子スイッチの作用は、遺伝子スイッチ活性化物質の添加により調節され、それにより標的遺伝子の発現を制御している。
【００２６】
用語「プロモータ」は遺伝子の転写開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するDNA上の領域をいい、RNAポリメラーゼの結合により転写を開始する核酸配列である。プロモータは、使用する宿主細胞の種によって適宜選択して使用される。細菌を宿主として使用する場合、プロモータとして、大腸菌などの宿主細胞中で発現できるものであれば特に限定されず、いずれを使用してもよい。例えば、λPRプロモータ、PLプロモータ、trpプロモータ、およびlacプロモータなどの、大腸菌やファージに由来するプロモータを例示できる。tacプロモータなどの人為的に設計改変されたプロモータを使用してもよい。酵母を宿主とする場合、プロモータとして、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、いずれを使用してもよい。例えば、gal1プロモータ、gal10プロモータ、ヒートショックタンパク質プロモータ、MFα1プロモータ、PHO5プロモータ、PGKプロモータ、GAPプロモータ、ADHプロモータ、およびAOX1プロモータなどを例示できる。動物細胞を宿主とする場合は、組換えベクターが該細胞中で自律複製可能であると同時に、プロモータ、RNAスプライス部位、目的遺伝子、ポリアデニル化部位、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、所望により複製起点が含まれていてもよい。プロモータとして、SRαプロモータ、SV40プロモータ、LTRプロモータ、およびCMVプロモータなどを使用することができ、また、サイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモータなどを使用してもよい。
【００２７】
用語「遺伝子回路」は、遺伝子スイッチをコードする核酸配列と遺伝子スイッチの標的配列との組み合わせを含み、遺伝子発現を可能にする、調節可能な遺伝子発現システムを意味する。より具体的には、遺伝子スイッチをコードする核酸配列と、該遺伝子スイッチが作用するプロモータなどの調節DNAエレメントを有する転写翻訳調節領域とを含む核酸を意味する。
【００２８】
遺伝子回路の構築において、遺伝子発現がONであるべきときに起動状態にあるものを選択すること(ON選択)および／またはOFFであるべき局面で抑制状態にあるものを選択すること(OFF選択)により、任意の出力特性をもつ遺伝子回路を選別／取得できる。このON選択／OFF選択を連続して行うことで、さまざまな遺伝子スイッチ(あるいは遺伝子回路)を迅速に開発できる。
【００２９】
用語「ON選択」は、遺伝子発現がONであるべきときに起動状態にあるものを選択することを意味する。言い換えれば、用語「ON選択」は、遺伝子スイッチがON(起動状態)である条件下でOFF(抑制状態)にある遺伝子スイッチを淘汰除去することによる選択を意味する。ON選択を行うには、選択対象である遺伝子スイッチおよび遺伝子回路のライブラリの制御下に、「発現しないと宿主細胞が生存できない」遺伝子(ONセレクタ)を配置する。遺伝子スイッチがON(起動状態)である条件下で起動せずに下流のONセレクタを発現できない遺伝子スイッチおよび遺伝子回路は、それを導入した細胞とともに淘汰除去される。すなわち、ON選択では、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の作用により発現調節される遺伝子の発現がONであるときに細胞死が回避される。短期間に細胞死を引き起こす物質として、アルキル化剤、有機溶媒、紫外線／放射線、熱、酸／アルカリ、酸化剤などがある。これらに対する耐性を与える遺伝子をセレクタとして用いれば、「そのとき出力がONだったものだけが生き残る」体系を構築できる。
【００３０】
用語「OFF選択」は、遺伝子発現がOFFであるべき局面で抑制状態にあるものを選択することを意味する。言い換えれば、用語「OFF選択」は、遺伝子スイッチがOFF(抑制状態)である条件下で、遺伝子発現を許す遺伝子スイッチ、すなわち漏出のある遺伝子スイッチ、を除去する選択を意味する。OFF選択を行うには、選択対象である遺伝子スイッチおよび遺伝子回路のライブラリの制御下に、「発現すると、宿主細胞の細胞死を起こす」遺伝子(OFFセレクタ)を配置する。遺伝子スイッチがOFF(抑制状態)である条件下で、下流のOFFセレクタを誤って発現させる遺伝子スイッチおよび漏出のある遺伝子回路は、宿主とともに淘汰除去される。すなわち、OFF選択では、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の作用により発現調節される遺伝子の発現がOFFであるときに細胞死が回避される。短期間に細胞死を引き起こす物質として、遺伝子変性剤、アルキル化剤、有機溶媒、紫外線／放射線、熱、酸／アルカリ、酸化剤などがある。これらによる細胞死に関与する遺伝子、またはこれらに対する感受性を高める遺伝子をセレクタとして用いれば、「そのとき出力がOFFだったものだけが生き残る」体系を構築できる。
【００３１】
用語「デュアル選択」は、ON選択とOFF選択とを組み合わせて実施することを意味する。デュアル選択において、ON選択とOFF選択はいずれを先に実施してもよい。デュアル選択は、単回のみ実施してもよいし、複数回実施してもよい。好ましくはデュアル選択を複数回連続して実施することが適当である。複数回実施することにより、所望の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路を遺伝子スイッチおよび遺伝子回路のライブラリから高い濃縮率で取得できる。
【００３２】
用語「セレクタ」は、遺伝子スイッチおよび該遺伝子スイッチを有する遺伝子回路の選択のために使用される手段を意味し、例えば遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の作用により発現調節される遺伝子配列または該遺伝子配列を有する発現ベクターをいう。
【００３３】
用語「ONセレクタ」は、ON選択に使用される手段を意味し、例えば「発現しないと宿主細胞が生存できない」遺伝子または該遺伝子を含む発現ベクターをいう。
【００３４】
用語「OFFセレクタ」は、OFF選択に使用される手段を意味し、例えば「発現すると、宿主細胞の細胞死を起こす」遺伝子または該遺伝子を含む発現ベクターをいう。
【００３５】
用語「デュアルセレクタ」は、ONセレクタの機能およびOFFセレクタの機能の両方を有するセレクタを意味する。したがって、デュアルセレクタは、ON選択およびOFF選択の両方に使用される。デュアルセレクタとして、「発現しないと宿主細胞が生存できない」遺伝子と「発現すると、宿主細胞の細胞死を起こす」遺伝子の両方を含む発現ベクターを例示できる。
【００３６】
用語「発現ベクター」は、宿主細胞に外部遺伝子を運搬するDNA、言い換えればベクターDNAであって、宿主細胞中で目的遺伝子を発現させ得るDNAをいう。ベクターDNAは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターDNAは、天然に存在するDNAを抽出して得られたベクターDNAの他、複製に必要な部分以外のDNAの部分が一部欠落しているベクターDNAでもよい。代表的なベクターDNAとして例えば、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターDNAを挙げることができる。プラスミドDNAとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなどを例示できる。バクテリオファージDNAとして、λファージなどが挙げられる。ウイルス由来のベクターDNAとして、例えばレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、SV40、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルスなどの動物ウイルス由来のベクター、あるいはバキュロウイルスなどの昆虫ウイルス由来のベクターを挙げることができる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクターDNAなどを例示できる。あるいは、これらを組み合わせて作成したベクターDNA、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメントを組み合わせて作成したベクターDNA（コスミドやファージミドなど）を例示できる。ベクターDNAには、目的遺伝子が発現されるように目的遺伝子を組み込むことが必要であり、少なくとも目的遺伝子と調節DNAエレメント、例えばプロモータとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列を組み合わせて自体公知の方法によりベクターDNAに組み込むことができる。このような遺伝子配列として、例えば、リボソーム結合配列、ターミネータ、シグナル配列、エンハンサなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー（ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子など）を例示できる。これらから選択した1種類または複数種類の遺伝子配列をベクターDNAに組み込むことができる。
【００３７】
ベクターDNAに目的遺伝子を組み込む方法は、自体公知の遺伝子工学的技術を適用できる。例えば、目的遺伝子を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターDNAと混合し、リガーゼにより再結合する方法が用いられる。あるいは、目的遺伝子に適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても所望のベクターDNAが得られる。
【００３８】
宿主細胞への発現ベクターの導入方法は、宿主細胞にベクターDNAを導入して宿主細胞中で目的遺伝子を発現させ得る導入方法であれば特に限定されず、宿主細胞の種により適宜選択した公知の方法のいずれを使用してもよい。例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法などを例示できる。
【００３９】
本発明はより具体的には、遺伝子スイッチ発現配列、および該遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチにより発現が誘導される転写調節因子をコードする遺伝子配列を有する遺伝子回路を保持する発現ベクター、並びに、該転写調節因子により発現調節される遺伝子配列を有する発現ベクターを導入した細胞を使用し、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下または非存在下で、該発現調節される遺伝子配列の発現下で細胞死を誘導し得る化合物を添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および／または、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下または非存在下で、該発現調節される遺伝子配列の非発現下で細胞死を誘導し得る化合物を添加して細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法に関する。
【００４０】
用語「転写調節因子」は、本明細書においては調節DNAエレメントに、より具体的にはプロモータに作用して働くタンパク質性因子を意味する。転写調節因子は転写抑制因子（リプレッサとも称される）および転写活性化因子（アクチベータとも称される）に大別することができる。転写抑制因子は調節DNAエレメントに作用して遺伝子の転写を抑制し遺伝子の発現量を低減させる。転写活性化因子は調節DNAエレメントに作用して遺伝子の転写を促進し遺伝子の発現量を増加する。転写抑制因子および転写活性化因子のいずれも本発明で使用することができる。転写抑制因子および転写活性化因子は公知の各因子をいずれも使用することができる。好ましい転写抑制因子としてCIタンパク質を例示できる。CIタンパク質は、プロモータPLおよびプロモータPRの各プロモータ領域（すなわちOLおよびOR）に結合して、各プロモータからの転写の開始を強力に阻止する。その他、使用できる好ましい転写調節因子として、LacI、 TetR、 AraC、 CAP、 LacI、 LuxRなどがある。
【００４１】
本発明において、転写調節因子により発現調節される遺伝子配列を有する発現ベクターは、該転写調節因子により発現調節される第1の遺伝子配列および該転写調節因子により発現調節される第2の遺伝子配列の2つの遺伝子配列を有する発現ベクターであり得る。あるいは、転写調節因子により発現調節される遺伝子配列を有する発現ベクターは、該転写調節因子により発現調節される第1の遺伝子配列を有する発現ベクターと該転写調節因子により発現調節される第2の遺伝子配列を有する発現ベクターとの2つの発現ベクターの組み合わせであり得る。ここで、第1の遺伝子配列は第2の遺伝子配列とは異なるタンパク質をコードする遺伝子配列である。第1の遺伝子配列と第2の遺伝子配列は、一方がON選択のための遺伝子配列であるとき、他方はOFF選択のための遺伝子配列であることが好ましい。すなわち、一方の遺伝子配列の発現による細胞死の回避、および、他方の遺伝子配列の非発現による細胞死の回避を指標にする選択により、本発明に係る遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法を効率よく実施できる。
【００４２】
用語「転写調節因子により発現調節される遺伝子配列」は、転写調節因子が作用する調節DNAエレメントの下流に配置され、転写調節因子の作用によりその発現が促進または抑制される遺伝子配列を意味する。遺伝子配列の発現とは、遺伝子の情報がmRNAに転写され、さらに該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列として翻訳される一連の過程を意味する。発現が促進されれば遺伝子によりコードされるタンパク質が産生されてその量が増大し、発現が抑制されれば遺伝子によりコードされるタンパク質は産生されずその量は減少する。
【００４３】
本発明において使用される「転写調節因子により発現調節される遺伝子配列」は、短期間に細胞死を引き起こす物質、例えば遺伝子変性剤、アルキル化剤、有機溶媒、紫外線／放射線、熱、酸／アルカリ、酸化剤などに対する耐性を与える遺伝子の配列、あるいは、該物質による細胞死に関与する遺伝子や該物質に対する感受性を高める遺伝子の配列であればいずれも使用できる。具体的には、アルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子配列やチミジンキナーゼ(以下、TKと略称することがある)をコードする遺伝子配列が好ましく例示できる。本発明において使用されるこのような遺伝子配列は、これら例示に限らず、細胞においてその細胞死または細胞死の回避に関与する遺伝子の配列である限りにおいていずれの遺伝子配列も使用できる。
【００４４】
用語「アルキル化DNA修正酵素をコードする遺伝子配列」は、本発明においてはアルキル化されたDNAにおいてアルキル化されたヌクレオチドに作用して切断する酵素をコードする核酸配列をいう。アルキル化DNA修正酵素により切断された後のデオキシリボース鎖はAPエンドヌクレアーゼ(APE1)によりさらに切断され、次いで切断された部位のDNAは、DNAポリメラーゼおよびリガーゼにより相補鎖の情報に基づいて修復される。
【００４５】
ゲノムDNAでアルキル化が生じると、アルキル化されたヌクレオチドはDNA複製の阻害や遺伝子変異を起こし、その結果、細胞死が引き起こされる。例えば、アルキル化剤であるメタンスルホン酸(MMS)で細胞を処理すると、MMSは細胞膜を通過し、ゲノムDNA中のアデニンの3位をメチル化する。メチル化されたままのアデニンはDNA複製の阻害や遺伝子変異を起こすために細胞死を引き起こす。
【００４６】
アルキル化DNA修正酵素をコードする遺伝子配列として、アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列やO6-メチルグアニン-DNAトランスフェラーゼ(MGMT)をコードする遺伝子配列、より好ましくはAAGをコードする遺伝子配列を例示できる。あるいは、3-アルキルアデニンの修復酵素をコードする遺伝子配列として、例えば大腸菌由来のものならば、AlkA（グリコシラーゼ）やAlkB（アルキルトランスフェラーゼ）などをコードする遺伝子配列を挙げることができる。さらに、このような遺伝子の変異体であって、酵素活性が強化されたアルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子配列や、アルキル化剤に対する耐性を有するアルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子配列が好ましく使用できる。例えば、AAGのアミノ酸配列において第180番目のロイシンがフェニルアラニンに置換している変異体(AAG(L180F))をコードする遺伝子配列を好ましく例示できる。この変異体は、アルキル化剤であるメチルスルホン酸(MMS)に対する耐性を有する変異体として取得されたAAG変異体である(Chen, et al., DNA Repair, 7, 1731 (2008))。
【００４７】
アルキル化DNA修正酵素をコードする遺伝子配列を、「転写調節因子により発現調節される遺伝子配列」として使用する場合、該遺伝子配列の下流に、APエンドヌクレアーゼ(APE1)をコードする遺伝子配列を配置することが好ましい。アルキル化DNA修復の工程において、アルキル化DNA修正酵素が作用した後にAPE1が作用することによりDNAの修復が進行することから、アルキル化DNA修正酵素をコードする遺伝子配列とAPE1をコードする遺伝子配列とを組み合わせて使用することにより、DNAアルキル化による細胞死の回避をより明確に実施できるため好ましい。
【００４８】
アルキル化DNA修正酵素をコードする遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されるプロモータ配列は、遺伝子スイッチや遺伝子回路の遺伝子産物の作用によりアルキル化DNA修正酵素をコードする遺伝子配列を発現させ得るものであれば特に限定されず、公知のプロモータ配列を使用することができる。
【００４９】
用語「チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列」は、デオキシチミジンのリン酸化反応を触媒する酵素をコードする遺伝子配列を意味する。TKはDNA合成の調節因子として重要な役割を果たす。DNA合成の直接の前駆物質であるデオキシチミジン三リン酸(dTTP)の細胞内での供給は、デノボ(de novo)経路とサルベージ(salvage)経路により担われている。デノボ経路はデオキシチミジン一リン酸(dTMP)合成を経てdTTPを合成するが、この経路は5-フルオロウラシルを加えると停止することが知られている(Cohen, SS, et al., The Mode of Action of 5-Fluorouracil and Its Derivatives. Proc Natl Acad Sci U S A, 44, 1004-12 (1958); Yagil, E, et al.,Phosphorolysis of 5-fluoro-2'-deoxyuridine in Escherichia coli and its inhibition by nucleosides. J Bacteriol, 108, 760-4 (1971))。5-フルオロウラシルやその誘導体は、細胞内で代謝され、5-フルオロ-2'-デオキシウリジン一リン酸(5FdUMP)となる。5FdUMPはdTMP合成酵素(ThyA)の阻害剤であり、これが存在すると細胞内のdTMP合成が阻害される。この状況下では、細胞の増殖は、外因性のデオキシチミジン(dT)を用いてdTTPを合成するサルベージ経路に依存する。もし細胞がTKを持っていれば、サルベージ経路によりdTからdTMPを合成することができ生存できるが、TKが無いと増殖は完全に止まる。細胞のTK欠損株にTKを導入すると、そのサルベージ経路は復活する。このようなメカニズムを利用して、チミジンキナーゼやその関連酵素活性の活性機能選択法が研究されてきている(Black, ME, et al., Creation of drug-specific herpes simplex virus type1 thymidine kinase mutants for gene therapy. Proc Natl Acad Sci U S A,93,3525-9 (1996))。
【００５０】
一方、チミジンキナーゼのようなヌクレオチド代謝酵素によって様々なヌクレオシドアナログが細胞内で活性化して細胞死を引き起こすことが知られており、チミジンキナーゼは遺伝子治療のための自殺遺伝子としても長く検討されてきている(Black, ME, et al., Identification of important residues within theputative nucleoside binding site of HSV-1 thymidine kinase by random sequence selection: analysis of selected mutants in vitro. Biochemistry, 32, 11618-26 (1993); Dube, DK, et al., Selection of new biologically active molecules from random nucleotide sequences. Gene, 137, 41-7 (1993))。
【００５１】
チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列は、特に限定されず、哺乳動物細胞やウイルス由来のチミジンキナーゼをコードする遺伝子配列を挙げることができ、ヒトヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼをコードする遺伝子配列を好ましく例示できる。
【００５２】
チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列は、チミジンキナーゼをコードする遺伝子を発現させる機能を有し、且つ、試験される遺伝子スイッチや遺伝子回路の遺伝子産物が作用するプロモータ配列であれば特に限定されず、公知のプロモータ配列を使用することができる。
【００５３】
本発明において、「転写調節因子により発現調節される遺伝子配列」は、該遺伝子配列の発現下で細胞死を誘導し得る物質、好ましくは化合物、または該遺伝子配列の非発現下で細胞死を誘導し得る物質、好ましくは化合物と組み合わせて使用される。
【００５４】
用語「発現調節される遺伝子配列の発現下で細胞死を誘導し得る化合物」は、該遺伝子配列によりコードされるタンパク質が産生されたときに細胞死を引き起こすことができる化合物を意味する。
【００５５】
例えば、チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列の発現下で細胞死を誘導し得る化合物として、変異原性ヌクレオシドを挙げることができる。変異原性ヌクレオシドはチミジンのサルベージ経路を経由してゲノムに取り込まれ遺伝子変異を生じて細胞死を誘導する。変異原性ヌクレオシドは、遺伝子に取り込まれたときに遺伝子に変異を生じて細胞死を誘導するものであれば特に限定されず、天然に存在する変異原性ヌクレオシドであってもよく、人工的に作成されたものであってもよい。具体的には、人工ヌクレオシドである6-(β-D-2-デオキシリボ-フラノシル)-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド[4,5-c][1,2]オキザジン-7-オン(dP)を好ましく例示できる。dPは、他のヌクレオシドと同様、チミジンのサルベージ経路を経由してゲノムに取り込まれる。他の多くの毒性ヌクレオシドは染色体DNA合成のチェーンターミネータ(chain terminator)であるが、dPはゲノムに取り込まれて遺伝子変異を頻発する変異原性ヌクレオシドである(Negishi, K, et al., Binding specificities of the mismatch binding protein, MutS, to oligonucleotides containing modified bases. Nucleic Acids Res Suppl, 221-2( 2001))。したがって、チミジンキナーゼを発現する細胞は、dPの添加により細胞死が誘導されるが、チミジンキナーゼを欠損した細胞では、dPの添加により細胞死は誘導されない。dPの遺伝毒性(genotoxicity)は低く、37μMのdPを与えてはじめて、大腸菌細胞集団の80%が死ぬ程度である(Negishi, K, et al., Saturation of DNA mismatch repair and error catastrophe by a base analogue in Escherichiacoli. Genetics, 161, 1363-71 (2002))。しかし、チミジンキナーゼを発現する細胞は、dPの添加により染色体が物理的に破壊されることはないが、遺伝子情報が不可逆的に劣化するため、5分間から15分間という短時間で増殖能を失う。
【００５６】
変異原性ヌクレオシドの濃度は、遺伝子に取り込まれたときに遺伝子に変異を生じて細胞死を誘導する濃度であれば特に限定されず、簡単な繰り返し実験により決定できる。例えば、dPは、50nM−1μM、より好ましくは100nMの濃度で使用する。変異原性ヌクレオシドで処理するときの細胞濃度は特に限定されず、簡単な繰り返し実験により決定できる。例えば、105細胞/mL〜109細胞/mL、より好ましくは106細胞/mL〜108細胞/mL、さらに好ましくは107細胞/mL程度が適当である。また、細胞は、対数増殖期にあるものの方が薬剤に対する感受性が高いので、対数増殖期にあるものを使用することが好ましい。変異原性ヌクレオシドと細胞とのインキュベーション時間は、特に限定されず、簡単な繰り返し実験により決定できる。変異原性ヌクレオシドによる変異に起因する細胞死は、極めて短時間で惹起されるため、例えば、dPを用いる場合、dPと細胞とのインキュベーションは5分間−12時間、好ましくは5分間−60分間、より好ましくは5分間−30分間、更に好ましくは30分間でよい。変異原性ヌクレオシドで細胞を処理するときに使用する培地は、標準的に使用されている培地、例えばLB培地やM9-グルコース培地を挙げることができる。
【００５７】
用語「発現調節される遺伝子配列の非発現下で細胞死を誘導し得る化合物」は、該遺伝子配列によりコードされるタンパク質が産生されなかったときに細胞死を引き起こすことができる化合物、言い換えれば細胞死の誘導がこのようなタンパク質により阻害される化合物を意味する。
【００５８】
例えば、アルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子配列の非発現下で細胞死を誘導し得る化合物として、アルキル化剤を挙げることができる。アルキル化剤は、メチル基、エチル基、プロピル基などのアルキル基と称する分子構造を持つ化合物を含み、DNAをアルキル化する機能、すなわちDNAに作用してアルキル基を持つ高分子に変化させる機能を有する薬剤を意味する。DNAがアルキル化、例えばメチル化するとDNAが担持する遺伝子情報は破壊され、細胞死が引き起こされる。アルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子配列が発現すると、アルキル化剤によりアルキル化されたDNAが修復されるため細胞死は回避される。
【００５９】
アルキル化剤は、DNAをアルキル化する作用を有するものであれば特に限定されず、公知のアルキル化剤をいずれも使用できる。具体的には、アルキル化剤としてメタンスルホン酸(MMS)を好ましく例示できる。MMSは細胞膜を通過し、ゲノムDNA中のアデニンの3位をメチル化する。メチル化されたままのアデニンはDNA複製の阻害や遺伝子変異を起こすために細胞死を引き起こす。その他、使用できる好ましいアルキル化剤の例として、ヨウ化メチル、エチルメタンスルホン酸(EMS)、 Nメチル-N'-ニトロ-ニトロソグアニジン(MNNG)などを挙げることができる。
【００６０】
アルキル化剤の濃度は、DNAをアルキル化する作用を示す濃度であれば特に限定されず、簡単な繰り返し実験により決定できる。例えば、MMSは、0.1％−0.4％、好ましくは0.2％−0.3％、より好ましくは0.2％の濃度、言い換えれば、10mM−50mM、好ましくは20mM−40ｍM、より好ましくは20ｍMで使用する。アルキル化剤で処理するときの細胞濃度は、低すぎるとアルキル化DNA修復酵素の有無に関らずアルキル化剤による細胞死が引き起こされるため、例えば、106細胞/mL〜108細胞/mL、より好ましくは106細胞/mL〜107細胞/mL、さらに好ましくは107細胞/mL程度が適当である。また、細胞は、対数増殖期にあるものの方が薬剤に対する感受性が高いので、対数増殖期にあるものを使用することが好ましい。アルキル化剤と細胞とのインキュベーション時間は、特に限定されず、簡単な繰り返し実験により決定できる。アルキル化剤によるDNAのアルキル化に起因する細胞死は短時間で惹起されるため、例えば、MMSを用いる場合、MMSと細胞とのインキュベーションは15分間−45分間、好ましくは15分間−30分間、より好ましくは30分間でよい。アルキル化剤により細胞中のDNAのアルキル化を処理する条件は、アルキル化剤の濃度、細胞濃度、インキュベーション時間の組み合わせにより決定される。具体的には、アルキル化剤としてMMSを使用する場合、MMS濃度が0.2%程度であれば、細胞数は106細胞/mL〜107細胞/mLが適当である。さらにインキュベーション時間は、MMS濃度が0.2%程度であり、且つ細胞数が107細胞/mLであれば、5分間−45分間、例えば30分間が適当である。アルキル化剤で細胞を処理するときに使用する培地は、アルキル化剤の作用を充分に得るために必須物質のみから構成される最少培地、例えば大腸菌であればM9培地を使用することが好ましい。
【００６１】
本発明において、用語「細胞」は、生物体の構造上・機能上の基本単位であり、遺伝情報を担う核酸分子を有し、外界を隔離する膜構造およびその内部の細胞質から成る生活体を意味する。本発明において使用される細胞は、原核細胞および単離された真核細胞のいずれであってもよいが、細胞周期が短く増殖速度の速い原核細胞が好ましい。このような性質を有する細胞は、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の迅速な選択方法に有用である。さらに好ましくは、大腸菌が使用される。より好ましくは本発明において使用する細胞死を誘導する化合物に対して高い感受性を示すように改変された細胞が使用される。例えば、好ましい改変細胞として、チミジンキナーゼ欠損細胞、アルキル化剤感受性細胞、アルキル化剤高感受性のチミジンキナーゼ欠損細胞などを挙げることができる。具体的には、チミジンキナーゼ欠損大腸菌株、アルキル化剤感受性大腸菌株、アルキル化剤高感受性のチミジンキナーゼ欠損大腸菌株などを例示できる。このような改変細胞は、公知のものをいずれも使用することができる。チミジンキナーゼ欠損大腸菌株などのチミジンキナーゼ欠損細胞は、チミジンキナーゼを欠損するためdPの添加による細胞死を回避することができるが、チミジンキナーゼを発現させるとdPの添加により細胞死を起こす。したがって、チミジンキナーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターをセレクタとして使用してdPの添加により引き起こされる細胞死を指標に遺伝子スイッチや遺伝子回路の選択を行う場合には、該発現ベクターを導入する細胞としてチミジンキナーゼ欠損細胞を使用することが好ましい。アルキル化剤感受性大腸菌株などのアルキル化感受性細胞は、アルキル化剤の作用に対する感受性が高いためアルキル化剤の添加により容易に細胞死を起こすが、メチル化DNA修復酵素を発現させるとアルキル化剤の添加による細胞死が回避される。したがって、メチル化DNA修復酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクターをセレクタとして使用してアルキル化剤の添加により引き起こされる細胞死を指標に遺伝子スイッチや遺伝子回路の選択を行う場合には、該発現ベクターを導入する細胞としてアルキル化剤感受性細胞を使用することが好ましい。アルキル化剤高感受性のチミジンキナーゼ欠損大腸菌株などのアルキル化剤高感受性のチミジンキナーゼ欠損細胞は、チミジンキナーゼを欠損するため、dPの添加による細胞死を回避することができるが、チミジンキナーゼを発現させるとdPの添加により細胞死を起こし、また、アルキル化剤の作用に対する感受性が高いため、アルキル化剤の添加により容易に細胞死を起こすが、メチル化DNA修復酵素を発現させるとアルキル化剤の添加による細胞死が回避される。したがって、メチル化DNA修復酵素をコードする遺伝子およびチミジンキナーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターをセレクタとして使用してdPの添加により引き起こされる細胞死およびアルキル化剤の添加により引き起こされる細胞死の回避を指標に遺伝子スイッチや遺伝子回路の選択を行う場合には、アルキル化剤感受性細胞またはチミジンキナーゼ欠損細胞を使用することが好ましく、アルキル化剤高感受性のチミジンキナーゼ欠損細胞を使用することがさらに好ましい。
【００６２】
用語「細胞死」は、本発明において、増殖能などの細胞としての機能を消失している状態を意味する。例えば、大腸菌などの細胞を固形培地上で培養したとき、一個の細胞から増殖して可視的に計数できる一定以上の大きさの細胞集落(コロニ)を形成できる能力を消失している状態を本発明において細胞死という。用語「細胞死」には、生理的または病理的な要因により生じた不要な細胞や障害細胞などを積極的に除去する能動的細胞死(アポトーシス)および外的要因への反応による受動的細胞死(ネクローシス)も含まれ得る。
【００６３】
用語「生細胞」は、増殖能などの細胞としての機能を正常に保持している細胞を意味する。例えば、大腸菌などの細胞を固形培地上で培養したとき、一個の細胞から増殖して可視的に計数できる一定以上の大きさの細胞集落(コロニ)を形成できる能力を有する細胞を意味する。
【００６４】
用語「生細胞を回収する」は、細胞を培養して得られた培養物から生存している細胞を取り出すことをいう。生細胞の回収は、簡便には、生細胞を含む培養物を遠心処理して上清を除き、次いで適当な等張緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水で洗浄することにより実施できる。
【００６５】
本発明の一態様において、アルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子配列を含む発現ベクターと遺伝子スイッチや遺伝子回路を含む発現ベクターとをアルキル化剤感受性細胞に発現させ、アルキル化剤の存在下における該遺伝子の発現による細胞死若しくは細胞死の回避、または、アルキル化剤の存在下における該遺伝子の非発現による細胞死若しくは細胞死の回避を指標とする遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法を提供する。前記アルキル化剤感受性細胞は、アルキル化剤の存在下で細胞死を引き起こすが、アルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子の発現が誘導されると生存する。このような、アルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子の発現誘導によるアルキル化剤感受性細胞の生存を利用して、アルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子の発現を制御するように配置した遺伝子スイッチや遺伝子回路の選択を実施できる(ON選択)。
【００６６】
アルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子配列を含む発現ベクターは、(a)アルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子配列、および(b)前記(a)の遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列を少なくとも保持する発現ベクターであることが好ましい。また、遺伝子スイッチや遺伝子回路を含む発現ベクターは、(c)前記(b)のプロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、(d)遺伝子スイッチ発現配列、(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、および(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動する転写調節因子をコードする遺伝子配列を少なくとも保持する発現ベクターであることが好ましい。
【００６７】
より具体的には、本発明の一態様は、下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)アルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動する転写調節因子をコードする遺伝子配列、
を導入した細胞を使用し、
(1)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写抑制因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の非存在下でアルキル化剤を添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、または、
(2)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写活性化因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、アルキル化剤を添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、
を含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法に関する。
【００６８】
好ましい本発明の一態様は、下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動する転写抑制因子をコードする遺伝子配列、
を導入したアルキル化剤高感受性大腸菌株を使用し、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の非存在下で、メタンスルホン酸(MMS)を添加して該大腸菌株をインキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法に関する。
【００６９】
さらに好ましい本発明の一態様は、下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動するCIタンパク質をコードする遺伝子配列、
を導入したアルキル化剤高感受性大腸菌株を使用し、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の非存在下で、メタンスルホン酸(MMS)を添加して該大腸菌株を15分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法に関する。
【００７０】
別の好ましい本発明の一態様は、下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列およびAPエンドヌクレアーゼ(APE1)をコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の2つの遺伝子配列の上流に該2つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動する転写調節因子をコードする遺伝子配列、
を導入したアルキル化剤高感受性大腸菌株を使用し、
(1)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写抑制因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の非存在下で、メタンスルホン酸(MMS)を添加して該大腸菌株をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、または、
(2)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写活性化因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、MMSを添加して該大腸菌株をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、
を含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法に関する。
【００７１】
好ましい本発明の一態様は、下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列およびAPエンドヌクレアーゼ(APE1)をコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の2つの遺伝子配列の上流に該2つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動する転写抑制因子をコードする遺伝子配列、
を導入したアルキル化剤高感受性大腸菌株を使用し、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の非存在下で、メタンスルホン酸(MMS)を添加して該大腸菌株をインキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法に関する。
【００７２】
さらに好ましい本発明の一態様は、下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列およびAPエンドヌクレアーゼ(APE1)をコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の2つの遺伝子配列の上流に該2つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動するCIタンパク質をコードする遺伝子配列、
を導入したアルキル化剤高感受性大腸菌株を使用し、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の非存在下で、メタンスルホン酸(MMS)を添加して該大腸菌株を15分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法に関する。
【００７３】
本発明においてはまた、チミジンキナーゼをコードする遺伝子の発現配列を含む発現ベクターと遺伝子スイッチや遺伝子回路を含む発現ベクターとをチミジンキナーゼ欠損細胞に発現させ、変異原性ヌクレオシドの存在下における該遺伝子の発現による細胞死、または、変異原性ヌクレオシドの存在下における該遺伝子の非発現による細胞死の回避を指標とする遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法が使用される。前記チミジンキナーゼ欠損細胞は、変異原性ヌクレオシドの存在下で、該発現ベクターに含まれたチミジンキナーゼをコードする遺伝子の発現が誘導されると細胞死を起こすが、遺伝子の発現が誘導されないと生存する。このような、チミジンキナーゼをコードする遺伝子の発現によるチミジンキナーゼ欠損細胞の細胞死、すなわち該遺伝子の非発現による該細胞の生存を利用して、チミジンキナーゼをコードする遺伝子の発現を制御するように配置した遺伝子スイッチや遺伝子回路の選択を実施できる(OFF選択)。
【００７４】
チミジンキナーゼをコードする遺伝子の発現配列を含む発現ベクターは、(a)チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、および(b)前記(a)の遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列を少なくとも保持する発現ベクターであることが好ましい。また、遺伝子スイッチや遺伝子回路を含む発現ベクターは、(c)前記(b)のプロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、(d)遺伝子スイッチ発現配列、(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、および(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動する転写調節因子をコードする遺伝子配列を少なくとも保持する発現ベクターであることが好ましい。
【００７５】
より具体的には、本発明において、下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動する転写調節因子をコードする遺伝子配列、
を導入したチミジンキナーゼ欠損細胞を、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、変異原性ヌクレオシドを添加してインキュベーションし、インキュベーション後に生細胞を回収することにより、下流の遺伝子配列を発現させない遺伝子スイッチおよび遺伝子回路を含む細胞を取得することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法をOFF選択に使用できる。
【００７６】
本発明では、ON選択およびOFF選択のどちらも、遺伝子スイッチや遺伝子回路の選択において極めて高い選択効率を示す。ON選択およびOFF選択は、それぞれ単独で実施することができる。また、ON選択およびOFF選択を組み合わせて実施することもできる。すなわち、OFF選択により選択された遺伝子スイッチおよび遺伝子回路について、さらにON選択を実施することができる。また、その逆に、ON選択により選択された遺伝子スイッチおよび遺伝子回路について、さらにOFF選択を実施することができる。所望の機能をもつ遺伝子スイッチの取得には、ON選択およびOFF選択の2つの操作を連続して行うことが好ましく、さらにかかる2つの連続操作を複数回実施することが好ましい。
【００７７】
本発明に係る遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法において、ONセレクタおよびOFFセレクタの両方を担持する発現ベクターを導入した細胞を使用することにより、ON選択およびOFF選択を連続して実施することができる。
【００７８】
すなわち、本発明の一態様は、下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)アルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子配列およびチミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の2つの遺伝子配列の上流に該2つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動する転写調節因子をコードする遺伝子配列、
を導入した細胞を使用し、
(1)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写抑制因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、変異原性ヌクレオシドを添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および、該化合物の非存在下でアルキル化剤を回収した細胞に添加してインキュベーションした後に生細胞を回収すること、または、
(2)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写活性化因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、アルキル化剤を添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および、該化合物の非存在下で変異原性ヌクレオシドを回収した細胞に添加してインキュベーションした後に生細胞を回収すること、
を含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法に関する。
【００７９】
好ましい本発明の一態様は、下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列およびヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の2つの遺伝子配列の上流に該2つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動する転写抑制因子をコードする遺伝子配列、
を導入したアルキル化剤高感受性大腸菌株を使用し、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、6-(β-D-2-デオキシリボ-フラノシル)-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド[4,5-c][1,2]オキザジン-7-オン(dP)を添加して該大腸菌株をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および、該化合物の非存在下でメタンスルホン酸(MMS)を回収した細胞に添加してインキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法に関する。
【００８０】
さらに好ましい本発明の一態様は、下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列およびヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の2つの遺伝子配列の上流に該2つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動するCIタンパク質をコードする遺伝子配列、
を導入したアルキル化剤高感受性大腸菌株を使用し、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、6-(β-D-2-デオキシリボ-フラノシル)-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド[4,5-c][1,2]オキザジン-7-オン(dP)を添加して該大腸菌株を5分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収し、次いで、該化合物の非存在下で、メタンスルホン酸(MMS)を添加して該細胞を15分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法に関する。
【００８１】
別の好ましい本発明の一態様は、下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列、ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、およびAPエンドヌクレアーゼ(APE1)をコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の3つの遺伝子配列の上流に該3つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動する転写調節因子をコードする遺伝子配列、
を導入したアルキル化剤高感受性大腸菌株を使用し、
(1)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写抑制因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、6-(β-D-2-デオキシリボ-フラノシル)-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド[4,5-c][1,2]オキザジン-7-オン(dP)を添加して該大腸菌株をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および、該化合物の非存在下でメタンスルホン酸(MMS)を回収した細胞に添加してインキュベーションした後に生細胞を回収すること、または、
(2)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写活性化因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、MMSを添加して該大腸菌株をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および、該化合物の非存在下でdPを回収した細胞に添加してインキュベーションした後に生細胞を回収すること、
を含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法に関する。
【００８２】
好ましい本発明の一態様は、下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列、ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、およびAPエンドヌクレアーゼ(APE1)をコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の3つの遺伝子配列の上流に該3つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動する転写抑制因子をコードする遺伝子配列、
を導入したアルキル化剤高感受性大腸菌株を使用し、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、6-(β-D-2-デオキシリボ-フラノシル)-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド[4,5-c][1,2]オキザジン-7-オン(dP)を添加して該大腸菌株をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および、該化合物の非存在下で、メタンスルホン酸(MMS)を添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法に関する。
【００８３】
さらに好ましい本発明の一態様は、下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列、ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、およびAPエンドヌクレアーゼ(APE1)をコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の3つの遺伝子配列の上流に該3つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動するCIタンパク質をコードする遺伝子配列、
を導入したアルキル化剤高感受性大腸菌株を使用し、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、6-(β-D-2-デオキシリボ-フラノシル)-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド[4,5-c][1,2]オキザジン-7-オン(dP)を添加して該大腸菌株を5分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収し、次いで、該化合物の非存在下で、メタンスルホン酸(MMS)を添加して該細胞を15分間から30分間インキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法に関する。
【００８４】
また、本発明に係る遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法において、ONセレクタを担持する発現ベクターおよびOFFセレクタを担持する発現ベクターの両方のベクターを導入した細胞を使用することにより、ON選択およびOFF選択を連続して実施することができる。
【００８５】
すなわち、本発明の一態様は、下記配列(a-1)および(b-1)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a-1)アルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子配列、
(b-1)前記(a-1)の遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
下記配列(a-2)および(b-2)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a-2)チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b-2)前記(a-2)の遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動する転写調節因子をコードする遺伝子配列、
を導入した細胞を使用し、
(1)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写抑制因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、変異原性ヌクレオシドを添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および、該化合物の非存在下でアルキル化剤を回収した細胞に添加してインキュベーションした後に生細胞を回収すること、または、
(2)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写活性化因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、アルキル化剤を添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および、該化合物の非存在下で変異原性ヌクレオシドを回収した細胞に添加してインキュベーションした後に生細胞を回収すること、
を含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法に関する。
【００８６】
好ましい本発明の一態様は、下記配列(a-1)および(b-1)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a-1)アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列、
(b-1)前記(a-1)の遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
下記配列(a-2)および(b-2)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a-2)ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b-2)前記(a-2)の遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動する転写抑制因子をコードする遺伝子配列、
を導入したアルキル化剤高感受性大腸菌株を使用し、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、6-(β-D-2-デオキシリボ-フラノシル)-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド[4,5-c][1,2]オキザジン-7-オン(dP)を添加して該大腸菌株をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および、該化合物の非存在下でメタンスルホン酸(MMS)を回収した細胞に添加してインキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法に関する。
【００８７】
さらに好ましい本発明の一態様は、下記配列(a-1)および(b-1)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a-1)アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列、
(b-1)前記(a-1)の遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
下記配列(a-2)および(b-2)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a-2)ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b-2)前記(a-2)の遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動するCIタンパク質をコードする遺伝子配列、
を導入したアルキル化剤高感受性大腸菌株を使用し、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、6-(β-D-2-デオキシリボ-フラノシル)-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド[4,5-c][1,2]オキザジン-7-オン(dP)を添加して該大腸菌株を5分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収し、次いで、該化合物の非存在下でメタンスルホン酸(MMS)を回収した細胞に添加してインキュベーションした後に15分間から60分間生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法に関する。
【００８８】
別の本発明の一態様は、下記配列(a-1)および(b-1)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a-1)アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列およびAPエンドヌクレアーゼ(APE1)をコードする遺伝子配列、
(b-1)前記(a-1)の2つの遺伝子配列の上流に該2つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
下記配列(a-2)および(b-2)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a-2)ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b-2)前記(a-2)の遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動する転写調節因子をコードする遺伝子配列、
を導入したアルキル化剤高感受性大腸菌株を使用し、
(1)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写抑制因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、6-(β-D-2-デオキシリボ-フラノシル)-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド[4,5-c][1,2]オキザジン-7-オン(dP)を添加して該大腸菌株をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および、該化合物の非存在下でメタンスルホン酸(MMS)を回収した細胞に添加してインキュベーションした後に生細胞を回収すること、または、
(2)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写活性化因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、MMSを添加して該大腸菌株をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および、該化合物の非存在下でdPを回収した細胞に添加してインキュベーションした後に生細胞を回収すること、
を含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法に関する。
【００８９】
好ましい本発明の一態様は、下記配列(a-1)および(b-1)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a-1)アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列およびAPエンドヌクレアーゼ(APE1)をコードする遺伝子配列、
(b-1)前記(a-1)の2つの遺伝子配列の上流に該2つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
下記配列(a-2)および(b-2)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a-2)ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b-2)前記(a-2)の遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動する転写抑制因子をコードする遺伝子配列、
を導入したアルキル化剤高感受性大腸菌株を使用し、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、6-(β-D-2-デオキシリボ-フラノシル)-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド[4,5-c][1,2]オキザジン-7-オン(dP)を添加して該大腸菌株をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および、該化合物の非存在下でメタンスルホン酸(MMS)を回収した細胞に添加してインキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法に関する。
【００９０】
さらに好ましい本発明の一態様は、下記配列(a-1)および(b-1)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a-1)アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列およびAPエンドヌクレアーゼ(APE1)をコードする遺伝子配列、
(b-1)前記(a-1)の2つの遺伝子配列の上流に該2つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
下記配列(a-2)および(b-2)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a-2)ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b-2)前記(a-2)の遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動するCIタンパク質をコードする遺伝子配列、
を導入したアルキル化剤高感受性大腸菌株を使用し、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下で、6-(β-D-2-デオキシリボ-フラノシル)-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド[4,5-c][1,2]オキザジン-7-オン(dP)を添加して該大腸菌株を5分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収し、次いで、該化合物の非存在下でメタンスルホン酸(MMS)を回収した細胞に添加して15分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法に関する。
【００９１】
本発明はまた、上記本発明に係る遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法においてセレクタとして使用される発現ベクターに関する。本発明においてセレクタとして使用される発現ベクターは、アルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子配列、および該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列を少なくとも含む。好ましくは、アルキル化DNA修復酵素をコードする遺伝子配列およびチミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、並びにこれら2つの遺伝子配列の上流に該2つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列を少なくとも含む発現ベクターを例示できる。さらに好ましくは、このような発現ベクターであって、アルキル化DNA修正酵素をコードする遺伝子配列の下流に、APエンドヌクレアーゼ(APE1)をコードする遺伝子配列が配置された発現ベクターを例示できる。
【００９２】
より具体的には、本発明においてセレクタとして使用される発現ベクターは、アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)をコードする遺伝子配列、および該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列を少なくとも含む。好ましくは、AAGをコードする遺伝子配列およびヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、並びにこれら2つの遺伝子配列の上流に該2つの遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列を少なくとも含む発現ベクターを例示できる。さらに好ましくは、このような発現ベクターであって、アルキル化DNA修正酵素をコードする遺伝子配列の下流に、APエンドヌクレアーゼ(APE1)をコードする遺伝子配列が配置された発現ベクターを例示できる。
【００９３】
本発明においてセレクタとして使用されるより具体的な発現ベクターとして、配列表の配列番号1から6に記載の各塩基配列で表される発現ベクターDNAを例示できる。配列番号1に記載の各塩基配列で表される発現ベクターDNAは、アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)遺伝子およびヒトヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(hsvTK)遺伝子を含む発現ベクターDNA(Ver.1と称する)である。配列番号2に記載の各塩基配列で表される発現ベクターDNAは、アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)遺伝子、ヒトヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(hsvTK)遺伝子、およびAPエンドヌクレアーゼ(APE1)を含む発現ベクターDNA(Ver.2と称する)である。配列番号3に記載の各塩基配列で表される発現ベクターDNAは、アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ変異体(AAG(L180F))遺伝子、ヒトヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(hsvTK)遺伝子、およびAPエンドヌクレアーゼ(APE1)を含む発現ベクターDNA(Ver.2.1と称する)である。配列番号4に記載の各塩基配列で表される発現ベクターDNAは、アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)遺伝子、ヒトヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(hsvTK)遺伝子、およびAPエンドヌクレアーゼ(APE1)を含む発現ベクターDNA(Ver.3と称する)である。配列番号5に記載の各塩基配列で表される発現ベクターDNAは、アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)遺伝子を含む発現ベクターDNAである。配列番号6に記載の各塩基配列で表される発現ベクターDNAは、アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)遺伝子およびAPエンドヌクレアーゼ(APE1)を含む発現ベクターDNAである。配列番号1から4に記載の各塩基配列で表される発現ベクターDNAは、デュアルセレクタとして使用できることから、本発明において好ましく使用される。これらの中で、配列番号3に記載の塩基配列で表される発現ベクターDNAは、アルキル化剤であるメタンスルホン酸に対する耐性を有する変異体として取得されたAAG変異体遺伝子を含むため、特に好ましく使用される。
【００９４】
遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法の対象となり得る遺伝子スイッチのライブラリの作製は、エラープローン  ポリメラーゼ連鎖反応(Error-Prone PCR, Leung, DW, et al., A method for random mutagenesis of a defined DNA segment using a modified polymerase chain reaction. Techniques, 1, 11-5 (1989))、サチュレーション変異導入法(Miyazaki, K, et al., Exploring nonnatural evolutionary pathways by saturation mutagenesis: Rapid improvement of protein function. J. Mol. Evol., 49, 716-20 (1999).)、DNAシャッフリング(DNA shuffling, Stemmer, WPC., Rapid evolution of a protein in-vitro by DNA shuffling. Nature, 370, 389-91 (1994))など、既に確立された公知のランダム変異導入法により実施できる。
【００９５】
本発明に係る遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法は、回路セレクタに求められる要素である選択操作の迅速さを特徴とする。具体的には、ON選択およびOFF選択ともに、作用時間を5分〜60分程度まで短縮できる(実施例3および実験例3参照)。これは、本方法が、従来の選択方法のように細胞の「生育阻害」の誘導を選択指標とする方法ではなく、不可逆的な細胞死を選択指標とする方法であり、細胞の増殖に要する時間を必要としないためである。実際、細胞の生育速度差や生育移動能の差に基づく選択法(非特許文献6,7,10-12,13)は、ON選択およびOFF選択のいずれも一操作に一晩を要する。選択操作時間の短縮は、ON選択およびOFF選択を複数回繰り返す回路選択には極めて望ましい特質である。とくに、振動回路や遅延時間の短いスイッチなどの開発などを目的とする場合、本発明に係る方法のような迅速性の高い選択手法が必須である。
【００９６】
上記本発明に係る遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法は、回路選択に求められるもう一つの要素である高い選択効率を特徴とする。実際、セレクタプラスミドVer.2(pCI-aag-hsvTK-ape1)を導入した細胞を使用して、dPでの1時間処理によるOFF選択を実施し、続いてMMSでの30分間処理によりON選択を実施したところ、1回のデュアル選択で、所望の遺伝子回路を有する細胞を40倍−166倍濃縮することができた(実施例5参照)。また、セレクタプラスミドVer.2.1(pCI-aag(L180F)-hsvTK-ape1)を導入した細胞を使用して、dPでの1時間処理によるOFF選択を実施し、続いてMMSでの30分間処理によりON選択を実施したところ、1回のデュアル選択で、所望の遺伝子回路を有する細胞を409倍−1,935倍濃縮することができた(実施例5参照)。このように、本発明に係るON選択およびOFF選択を組み合わせたデュアル選択により、極めて高い効率で遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択を実施できる。
【００９７】
さらに、本発明に係る遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法により、極めて短時間で遺伝子スイッチや遺伝子回路の選択が実施できることから、発現タイミングに対する機能選択や時間軸に沿った選択を行なえること、例えば遺伝子スイッチの切り替え時間(遅延時間)に対しての選択などを行なうことが可能である。実際、セレクタプラスミドVer.2.1(pCI-aag(L180F)-hsvTK-ape1)を導入した細胞を使用して、AHLを含む培地で前培養を実施し、その後AHLを含まない培地で培養し、続いて、ON選択を実施することにより、完全長CIを発現し得る遺伝子回路を保持する細胞とCIのC末端欠失体(以下、CItrucと称する)を発現し得る遺伝子回路を保持する細胞とを混合した細胞集団から、CItrucを発現し得る遺伝子回路を選択することができた(実施例6参照)。このように、本発明に係る方法により、時間軸に沿った多段階のON選択およびOFF選択を繰り返すことにより、遺伝子回路の調整(tuning)も可能になる。
【００９８】
本発明に係る遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法は、例えば、有用タンパク質の大量生産のための遺伝子スイッチ、代謝工学ツールとしての遺伝子スイッチ、およびバイオセンサとしての遺伝子スイッチ機構の選択および開発に使用することができる。また、本方法は、ランダム変異の蓄積による細胞の情報的な死(エラーカタストロフィ)に基づく選択法であり、ある特定の生化学作用を攻撃するものではなく、細胞機能のあらゆる部位が攻撃対象となるため、耐性化(細胞側の適応)が極めておこりにくい。このため、堅牢な選択プラットフォームを提供できる。
【００９９】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明する。実施例を示す前に、本発明者らが既に開発し、本発明において利用するヒトヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ(hsvTK)をセレクタとして使用する遺伝子スイッチや遺伝子回路の選択方法を実験例1-7に示す。本発明は以下に示す実施例や実験例によって何ら限定されるものではない。
【０１００】
まず、下記実施例および実験例に使用した材料および方法について簡単に述べる。
【０１０１】
6-(β-D-2-デオキシリボ-フラノシル)-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド[4,5-c][1,2]オキザジン-7-オン(dP)および5-フルオロ-2'-デオキシウリジン(5FdU)は、それぞれベリーアンドアソシエーツ(Berry & Associates (MI))社およびシグマアンドアルドリッチ(Sigma & Aldorich)社より購入した。オリゴヌクレオチドは、ファスマック株式会社(FASMAC Co., Ltd.)が合成したものを使用した。
【０１０２】
チミジンキナーゼ欠損大腸菌株である大腸菌JW1226株はKEIOコレクション(Baba, T, et al., Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol, 2, 2006 0008 (2006))より入手した。特に記載しない限り、培養培地は、2% (w/v) LBブロスを含むLB培地(インビトロジェン社製)を使用した。細胞は、ガラス試験管内で37℃にて増殖させた。
【０１０３】
アルキル化剤感受性大腸菌株MV2157 (アルキルアデニン修復系欠損株(alkA,tag欠損株：thr-1 leuB6 proA2 his4 thi1argE3 lacY1 galK2 rpsL supE44 ara-14 xyl-15 mtl-1 txs-33 alkA1 tag-1)) は、特に記載しない限り、LB培地中またはLB固体培地上で、37℃で培養した。
【０１０４】
hsvTK発現ベクターpPL-hsvtkおよびGFPuv発現ベクターpPL-gfpuvの作成は、pET-hsvtk(Black, ME, et al., Creation of drug-specific herpes simplex virus type 1 thymidine kinase mutants for gene therapy. Proc Natl AcadSci U S A, 93, 3525-9 (1996))、あるいはpGFPuv(クロンテック社製)からそれぞれの読み取り枠をPLプロモータの下流に融合し、pACYC184ベースのプラスミドに導入することにより実施した。
【０１０５】
4つのモデル遺伝子回路を作製した(図1)。回路Aおよび回路Bは、N-アシル-L-ホモセリンラクトン(AHL)を入力し、それをリプレッサタンパク質CIとして出力する回路である。CIタンパク質は転写抑制因子であり、PRプロモータやPLプロモータの下でタンパク質発現を抑制する。したがって、この回路は、その出力状態がONであればCIタンパク質を発現し、細胞内のPRプロモータやPLプロモータの制御下にある遺伝子発現を強く抑制する。回路AはAHL受容体タンパク質LuxRをTrcプロモータによって常時発現しており、AHLの濃度に応じてLuxプロモータ下流に配置したCIタンパク質を発現する。回路Bは、AHL受容体タンパク質LuxRをTrcプロモータによって常時発現しており、AHLの濃度に応じてLuxプロモータ下流に配置したCItrucを発現する。このCItrucはCIタンパク質のC末端が欠失したものであり、標的配列への結合能が低下しており、その結果、転写抑制能が低下している。これら回路において、LuxRとLuxプロモータは同じ方向をむいており、両者の間には、強い転写ターミネータがある。回路Cは、回路BからCIタンパク質のリボゾーム結合部位(RBS)を除いたものであり、CIタンパク質の翻訳効率は消失している。そのため回路Cは、AHL濃度に拘らずCIタンパク質を発現しない。一方、回路Dは、回路BからLuxR下流の転写ターミネータを除去したものであり、最上流のTrcプロモータのリードスルーにより、CI遺伝子を定常的に発現する。このため回路Dは、AHL濃度に拘らずCIタンパク質を常に発現している。
【０１０６】
回路Aのプラスミドマップは図2-Aに示し、その核酸配列を配列番号9に記載する。回路Aは、pLux-CI-gfpに基づいて、gfp遺伝子をPCRによって除き、Bluntendを利用してCI遺伝子を挿入することにより作製した。pTrcの漏出発現(leaky expression)によりLuxRが常に発現しており、AHLに応答してCIタンパク質を発現する。PRプロモータ下流の遺伝子発現を抑制するために、AHLの入力に対してインバーター回路として働く。
【０１０７】
回路Bのプラスミドマップは図2-Bに示し、その核酸配列を配列番号10に記載する。路Bは、pLux-CI-gfpに基づいて、gfp遺伝子をPCRによって除き、CI遺伝子内あるHindIIIサイトと下流にあるHindIIIサイトとを利用して、CItrucの遺伝子を挿入することにより作製した。Trcの漏出発現(leaky expression)によりLuxRが常に発現しており、AHLに応答してCItrucを発現する。PRプロモータ下流の遺伝子発現を抑制するために、AHLの入力に対してインバーター回路として働く。CItrucは完全長CIタンパク質と比較して、そのC末端が欠失しているために、リプレッサ活性は低く、不安定である。
【０１０８】
回路Cのプラスミドマップは図2-Cに示し、その配列を配列番号11に記載する。回路Cは、回路BのDNAに基づいて、CI遺伝子の前のRBSを除くようにPCRを行い、NcoIサイトによって繋いだ。 CI遺伝子の上流にRBSがないために、CIタンパク質が翻訳されず発現しない。ON回路として使用される。
【０１０９】
回路Dのプラスミドマップは図2-Dに示し、その配列を配列番号12に記載する。回路Dは、回路BのDNAに基づいて、 CI遺伝子上流のターミネータ配列およびLuxプロモータを除くようにPCRを行い、EcoRIサイトによって繋いだ。CI遺伝子上流のターミネータ配列およびLuxプロモータ配列がないために、trcプロモータからのリードスルーによってCItrucが常に発現する。OFF回路として使用される。
【実験例１】
【０１１０】
遺伝子スイッチおよび遺伝子回路のOFF選択法を確立した。
【０１１１】
まず、低濃度のdP培地における変異頻度を指標に、TK、チミジン一リン酸キナーゼ(Tmk)、ヌクレオチド二リン酸キナーゼ(Ndk)の過剰発現を行ったところ、他のヌクレオシドアナログ同様、DNAへのdP取り込みの律速はTKが触媒する最初のリン酸化反応であることを見いだした(未公開データ)。次に、由来の異なるいくつかのtk遺伝子を試したところ、hsvTKが最も高いdP取り込み効率を示した。
【０１１２】
大腸菌のTK欠損株JW1226を用い、ヒトヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ(hsvTK)をpTrc-hsvtk(図3)を導入することによって発現させ、dP濃度と細胞の生存率(生菌数)の関係を調べた。
【０１１３】
まず、pTrc-hsvtkを導入したJW1226細胞を、100μg/mLのアンピシリンを含む2mLのLB培地中で37℃にて一晩培養した。次いで、培養物を、dP(最終濃度が0-100nM)の入った1mLの新鮮なLB培地で1000倍に希釈し(106細胞/mL)、37℃にて12時間振蕩撹拌した。培養後、アンピシリン100μg/mLを含むLB-寒天(1.5%w/v)プレート上に播種した。37℃にて12時間インキュベーション後、生育したコロニの数を生菌数として計数した。
【０１１４】
hsvTKを発現させたTK欠損大腸菌株(hsvTK+)では、dPの濃度依存的に、細胞の生菌数は大きく低下した(図4)。一方、hsvTKのかわりにコントロールプラスミド(pTrc99A：hsvTKの構造遺伝子を抜いたベクター)を導入したTK欠損大腸菌株(hsvTK-)では、試験した全ての選択条件下で、生存率の減少は認められなかった。
【０１１５】
このように、ごく低濃度(10-100nM)のdPをhsvTK+の培養中に加えることにより、hsvTKを発現する細胞だけを選択的に殺すことができることが明らかになった。
【０１１６】
hsvTKの発現の有無によるTK欠損細胞株のdP存在下の生存率の変化を利用して、hsvtk遺伝子発現回路を制御するように設定した遺伝子スイッチや遺伝子回路の機能の選択が可能である。すなわち、遺伝子スイッチや遺伝子回路が作動せずに下流のhsvtk遺伝子が発現しないとTK欠損細胞株のdP存在下の生存率が上がる。したがって、TK欠損細胞株のdP存在下の生存率が高いものを選択することにより、hsvtk遺伝子を発現させないOFF状態の遺伝子スイッチや遺伝子回路を選択できる。
【０１１７】
こうして、OFF状態にある遺伝子スイッチ／回路のみを拾い上げる、優れた選択手法が確立できた。
【実験例２】
【０１１８】
遺伝子スイッチおよび遺伝子回路のON選択法を確立した。
【０１１９】
大腸菌のTK欠損株JW1226を用い、ヒトヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ(hsvTK)をpTrc-hsvtk(図3)を導入することによって発現させ、5FdU濃度と細胞の生存率(生菌数)の関係を調べた。
【０１２０】
まず、pTrc-hsvtkを導入したJW1226細胞をOD600が0.002(およそ106細胞/mL)になるように1mLのポジティブ選択培地で希釈し、37℃にて12時間、200rpmで回転させながら培養した。ポジティブ選択培地は、トリプトン(Tryptone)2% w/v、NaCl 0.5% w/v、dT 10μg/mL、アデノシン 1μg/mL、5FdU 0-25μg/mLを含む培地を用いた。培養後、得られた培養物の一部を採取し、アンピシリンを含むLBプレートに植菌して、生育したコロニの数を生菌数として計数した。
【０１２１】
hsvTKを発現させていないTK欠損大腸菌株(hsvTK-)は、5FdU濃度の上昇と共に生菌数が低下した(図5)。一方、hsvTKを発現させたTK欠損大腸菌株(hsvTK+)は、hsvTK-に比べて、その下がり方は緩やかであった。5FdU濃度が25μg/mLのとき、hsvTK+はhsvTK-よりも4.8×107倍の生存率を示した。
【０１２２】
このように、5FdU存在下のTK欠損大腸菌株の生存率は、hsvTKの発現の有無により著しく変化することが確認できた。
【０１２３】
hsvTKの発現の有無によるTK欠損細胞株の5FdU存在下での生存率の変化を利用して、hsvtk遺伝子発現回路を制御するように設定した遺伝子スイッチや遺伝子回路の機能の選択が可能である。すなわち、遺伝子スイッチや遺伝子回路が作動して下流のhsvTKの発現が惹起されるとTK欠損細胞株の5FdU存在下での生存率が上がる。したがって、TK欠損細胞株の5FdU存在下での生存率が高いものを選択することにより、hsvTKの発現を惹起し得るON状態の遺伝子スイッチや遺伝子回路の選択が可能になる。
【０１２４】
このように、hsvtk遺伝子を導入したTK欠損細胞を用いて、ON状態にある遺伝子スイッチおよび遺伝子回路のみを拾い上げる選択手法が確立できた。
【実験例３】
【０１２５】
実験例1で確立したOFF選択法の迅速性を検討した。
【０１２６】
まず、pTrc-hsvtk(図3)の導入によってhsvTKを定常発現するようにしたTK欠損細胞を、ODが0.05(およそ3×107細胞/mL)になるまで37℃にて200rpmで震盪培養した。1mLずつ分取し、dPを加えて(最終濃度1μM)、37℃で培養を続けた。5、30、60分経ったところで、20μL(およそ106細胞)採取し、アンピシリンを含むLBプレートに植菌して、生育したコロニの数を生菌数として計数した。
【０１２７】
dPショックを与えたサンプルは、どの作用時間においても、生菌数はほぼゼロであった(図6)。一方、dPショックを与えないと、生菌数は増加した。このことから、OFF選択は、長くとも5分以内の操作で充分完了することが分った。
【実験例４】
【０１２８】
実験例1および2で確立した、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路のOFF選択法およびON選択法の有効性を、モデル遺伝子回路を用いて検証した。
【０１２９】
回路A-DはそれぞれプラスミドpBR322に挿入して使用した。回路A−Dが設計どおりに作動するか確認するため、これらの回路を有するプラスミドをスクリーニングプラスミドであるpPL-gfpuvとともに、大腸菌JW1226で共発現させた（図1）。PLはCIタンパク質によって抑制されるプロモータであり、CIタンパク質の発現レベルが低いとき、蛍光を出力する。つまり、回路Aあるいは回路Bと共存するとき、pPL-gfpuvはAHL入力を反転させて蛍光出力する。100μg/mLのアンピシリンを含み、且つAHL濃度の異なるLB培地で、37℃にて12時間培養した。その培養液の細胞密度(OD600=2)をそろえ、各AHL濃度の培地における蛍光値を測定した(Fluoroskan Ascent (Thermo)、励起(Excitation)フィルタ: 390nm (半値幅20nm)、蛍光(Emission)フィルタ:510nm(半値幅10nm))。
【０１３０】
結果を図7のパネル(a)に示す。回路Cを持つ細胞はAHL濃度に依存せず、常時、高い蛍光強度を示した。また、回路Dを持つ細胞は、AHL濃度に依存せず、低い(バックグラウンドレベルの)蛍光強度を常に示した。一方、回路Aと回路Bを形質転換した細胞は、AHL濃度依存的に、GFPuvの蛍光強度が低下した。これは、AHL濃度が上昇するにつれてCIタンパク質の発現量が増加し、そのCIタンパク質の作用によって、PLプロモータ下のgfpuv遺伝子の発現が抑制されたからである。しかし、そのAHLスイッチングの応答閾値は、回路Bを持つ細胞のほうが、回路Aを持つ細胞よりも高かった。
【０１３１】
これら4つの遺伝子回路を用いて、実験例2で確立したON選択法の検証を行った。具体的には、これら4つの回路をそれぞれ、PLプロモータ制御下におかれたhsvTKとともに同一のTK欠損細胞に共導入し、AHL濃度の違う培地の中でON選択を行った。
【０１３２】
結果を図7のパネル(b)に示す。回路Aでは、AHL濃度10nM以上で急激に生存率が下がった。これはAHLと複合体を形成したLuxRによってCIタンパク質の発現が亢進し、その結果、CIタンパク質によりhsvTKの発現が効果的に抑制されたためサルベージ経路が起動しないことに起因する。図7のパネル(a)とパネル(b)が相似パターンを示していることから、細胞の生存率が、hsvTKの発現の起動状態と1:1に対応していることがわかる。回路Bも回路Aと同様の結果を示したが、回路Bによる生存率はとくに高いAHL濃度域において高かった。これは、C末端を欠失したCIタンパク質のhsvTKの発現抑制能が野生型CIタンパク質と比較して低いからである。また、回路Aおよび回路Bのいずれも、回路Cよりも100倍程度低い生存率を示した。これは、Luxプロモータが漏れやすい(leaky)こと、つまりCIタンパク質の発現が、高AHL条件下のOFF状態であっても、LuxプロモータがCIタンパク質を少量発現させること、およびそれによって、CIプロモータ下流のhsvTKが部分的な抑制を受けていることに起因する。
【０１３３】
さらに、これら4つの遺伝子回路を用いて、実験例1で確立したOFF選択法の検証を行った。具体的には、これら4つの回路をそれぞれ、PLプロモータ制御下におかれたhsvTKとともに同一のTK欠損細胞に共導入し、AHL濃度の違う培地の中でOFF選択を行った。
【０１３４】
結果を図7のパネル(c)に示す。回路Aおよび回路Bでは、AHL濃度依存的に生菌数は増加した。これは、AHLと複合体を形成したLuxRによってCIタンパク質の発現が亢進し、その結果、CIタンパク質によりhsvTKの発現が効果的に抑制されたため、dPの取り込みが阻害され、細胞はdP存在下でもその影響を受けずに生存したことに起因する。
【０１３５】
上記結果から、作成した4つの遺伝子回路が、実験例1および2で確立したOFF選択法およびON選択法において、設計どおりに作動することが明らかになった。
【実験例５】
【０１３６】
実験例1および2で確立した、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路のOFF選択法およびON選択法を用いて、所望の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択を検討した。ON選択およびOFF選択は固形培地を用いて実施した。本検討では、ON選択に続いてOFF選択を連続して行った(デュアル選択)。デュアル選択の工程およびその結果を図8に示した。
【０１３７】
具体的には、実験例4で作成した遺伝子回路B、CおよびDを混合し、その中から、回路B、すなわち活性化物質AHLの添加によりCIタンパク質を充分量発現し、AHL添加のときにCIタンパク質を発現しない回路を検出する検討を行った。まず、回路BとpPL-hsvtkを保持するTK欠損大腸菌株(Switch2細胞と称する)、回路CとpPL-hsvtkを保持するTK欠損大腸菌株(ON細胞と称する)、および回路DとpPL-hsvtkを保持するTK欠損大腸菌株(OFF細胞と称する)を作成し、これらをほぼ1:1:1で混合した。この細胞プールに対してON選択を行い、次いでOFF選択を行った(図8の(a))。ON選択は、AHLを含まないLB培地に混合細胞を植菌し、37℃で12時間培養した後、その培養物を10μg/mLの5FdU、10μg/mLのdT、および10μg/mLのウリジンを含んだトリプトン固体培地に植菌して37℃でさらに20時間温置することによって実施した。ON選択で生き残って形成されたコロニを、LB液体培地で回収し、1μMのAHLを含むLB培地に植菌し37℃で3時間培養した。その培養物を20μL(およそ106細胞)採取しOFF選択を行った。すなわち、100nMのdPおよび1μMのAHLを含むLB固体培地に植菌し、コロニを形成させた。その後、細胞群を回収し、プラスミドを抽出した。抽出したプラスミドをXL10 GoldにpPL-gfpuvと共形質転換し、遺伝子回路の活性をGFPuvの蛍光により評価した。形質転換体は、1μMのAHL添加および非添加の固体培地に植菌した。12時間後に2枚の固体培地上でGFPuvを発現する細胞数と発現しない細胞数を比較し選択効率を測定した。
【０１３８】
最初のON選択により、回路Bを保持するSwitch2細胞と回路CをもつON細胞が選択された。さらにOFF選択を行うことにより、回路CをもつON細胞はほぼ消失し、回路Bを保持するSwitch2細胞のみが回収された(図8の(c))。
【実験例６】
【０１３９】
実験例1および2で確立した、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路のOFF選択法およびON選択法を用いて、デュアル選択により所望の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択を検討した。OFF選択およびON選択は液体培地を用いて実施した(図8の(b))。デュアル選択を液体培地中で行うことは、操作時間の短縮とオートメーション化には不可欠な要件である。
【０１４０】
具体的には、実験例4で作成した遺伝子回路B、CおよびDを混合し、その中から、回路B、すなわち活性化物質AHLの添加によりCIタンパク質を充分量発現し、AHL添加のときにCIタンパク質を発現しない回路を、その他の回路(C,D)との混合物中から濃縮／取得する検討を行った。まず、実験例5で作成したOFF細胞、ON細胞、およびSwitch2細胞を1000:1000:1または10000:10000:1の割合で混合した。ON細胞、OFF細胞、およびSwitch2細胞はそれぞれ、回路C、回路Dおよび回路BとpPL-hsvtkとを保持する。これらの混合細胞についてOFF選択およびON選択を実施した。より具体的には、混合細胞を一晩培養した後に、100μg/mLのアンピシリンおよび30μg/mLのクロラムフェニコールを含む1mLのLB培地に希釈して、最終OD600が0.002になるように細胞密度を調製した。AHL(1μM)およびdP(100nM)の存在下で1時間インキュベーションすることによりOFF選択を実施した。次いで、OFF選択により得られた細胞を遠心処理にて回収し、1mLの0.9% w/v NaCl溶液で2回洗浄して、1mLのLB培地に再懸濁し、37℃で2時間培養した。その10μLを採取し、AHLを含まない1mLのポジティブ選択培地に加え、200rpmで回転させながら20時間培養することによりON選択を実施した。その後、細胞群を回収し、プラスミドを抽出した。抽出したプラスミドをXL10 GoldにpPL-gfpuvと共形質転換し、遺伝子回路の活性をGFPuvの蛍光により評価した。形質転換体は、1μMのAHL添加および非添加の固体培地に植菌した。12時間後に2枚の固体培地上でGFPuvを発現する細胞数と発現しない細胞数を比較し選択効率を測定した。
【０１４１】
結果を表1に示す。OFF細胞、ON細胞、およびSwitch2細胞を1000:1000:1の割合で混合したとき、デュアル選択後前の混合細胞に含まれるSwitch2細胞の割合は、0.05％であったが、デュアル選択後には83.6％に濃縮されており、濃縮率は1.67×103倍であった。また、OFF細胞、ON細胞、およびSwitch2細胞を10000:10000:1の割合で混合したとき、デュアル選択後前の混合細胞に含まれるSwitch2細胞の割合は、0.005％であったが、デュアル選択後には82.0％に濃縮されており、濃縮率は1.64×104倍であった。
【０１４２】
【表１】
2012060407.tif 000002
【０１４３】
上記デュアル選択は、まずOFF選択を実施した後でON選択を実施している。選択法の順番を反対にしても、同様の選択結果が得られる(未公開データ)。
【０１４４】
このように、本発明に係るOFF選択およびON選択を用いることにより、多くの非機能遺伝子スイッチおよび遺伝子回路、すなわちOFF細胞およびON細胞、の中にごくわずかに含まれる機能遺伝子スイッチおよび遺伝子回路、すなわちSwitch2細胞、を高効率且つ短時間で選択することができ、さらに、濃縮することができることが検証された。
【実験例７】
【０１４５】
実験例1および2で確立した、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路のOFF選択法およびON選択法を用いて、デュアル選択により、出力特性(応用閾性)の異なる遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の分離選択を検討した。
【０１４６】
具体的には、回路AとpPL-hsvtkを保持するTK欠損大腸菌株(Switch1細胞と称する)、回路BとpPL-hsvtkを保持するTK欠損大腸菌株(Switch2細胞)を1：1の割合で混合し、10nMのAHLを用いてOFF選択を行い、続いてAHLの非存在下で5FdUを用いてON選択を行った。それぞれの選択過程後の培養液を用いてPCRを実施し、それぞれの回路を含む細胞比を測定した。図9-Aに示すように、回路Aと回路BはPCRにより識別することができる。回路Aおよび回路Bはともに同じプライマセットによってCI構造遺伝子の一部を含む回路の一定領域がPCR増幅される。回路AはCI構造遺伝子の野生型を含み、一方、回路BはCI構造遺伝子の欠失変異型を含むため、回路Bを鋳型としたPCR産物(367bp)は、回路Aを鋳型としたPCR産物(639bp)よりもその長さが短い。そのため、両者の混合物のPCRにおいて2つの異なった長さのバンドが与えられる。そのバンド強度比から、両者の存在比が定まる。
【０１４７】
結果を図9-Bに示す。選択前の混合細胞では、Switch1細胞とSwitch2細胞のどちらのバンドもほぼ同じ強度で確認することができた(図9-Bのレーン3)。OFF選択後は、Switch1細胞のバンドがより濃くなっていた(図9-Bのレーン4)。10nMのAHLを用いる条件では、Switch1細胞の方がSwitch2細胞よりも、hsvTKの発現を厳格に抑制する(図7のパネル(a))。続くON選択後はSwitch1細胞とSwitch2細胞のバンドの強度は、いずれもOFF選択後のバンドの強度と同等であった(図9-Bのレーン5)。
【０１４８】
Switch1細胞とSwitch2細胞の差異は、保持する回路の違いである。Switch1細胞は、全長CIタンパク質をコードする遺伝子を含む回路Aを保持し、Switch2細胞は、C末端を欠失したCIタンパク質をコードする遺伝子を含む回路Bを保持する。いずれの回路もAHLの濃度依存的にCIタンパク質の発現をON/OFFする遺伝子回路として作用するが、CIタンパク質の発現抑制能は、回路Aの方が回路Bよりも高いため、デュアル選択により、回路Aを保持するSwitch1細胞が効率よく濃縮された。
【実施例１】
【０１４９】
ONセレクタとして使用するプラスミド(ONセレクタプラスミド)、並びにONセレクタおよびOFFセレクタのいずれとしても使用できるプラスミド(デュアルセレクタプラスミド)を作製した(図10)。【０１５０】
まず、セレクタプラスミドの作製の基となるプラスミドpCI-gfpを作製した、本プラスミドのプラスミドマップを図11に示し、その配列を配列番号8に記載する。pCI-gfpは、CIタンパク質がgfp遺伝子の転写を抑制するように、ラムダファージ由来PRプロモータ下流にgfpuv遺伝子が挿入してある。pCI-gfpは、Plux-cI-gfp内のPRプロモータ-gfp遺伝子部位をPCRにより取得し、pAC-aid中のClaI-HindIIIサイトを利用して挿入した。gfpuvの発現と、CIタンパク質による抑制は確認した。【０１５１】
ONセレクタプラスミドおよびそのコントロールプラスミドを作製した。
1.  pTrc-aag(WT)
2.  pTrc-aag(E125A)
3.  pTrc-aag(L180F)
4.  pTrc-aag-ape1
5.  pTrc-ape1【０１５２】
pTrc-aag(WT)は野生型AAG遺伝子を含むプラスミドである。そのプラスミドマップは図12-Aに示し、その核酸配列を配列番号5に記載する。AAG遺伝子をpTrcベクタに導入したものであり、IPTG-inductionできる。3-メチルアデニン修復酵素欠損株でMMS耐性の獲得が確認されている。【０１５３】
pTrc-aag(E125A)はAAG変異体であるAAG(E125A)をコードする遺伝子を含むプラスミドである。AAG(E125A)はAAGのアミノ酸配列において第125番目のグルタミン酸がアラニンに置換している変異体であり、グリコシダーゼ活性が消失しているため、AAGが有するアルキル化DNA修復機能を失っている。【０１５４】
pTrc-aag(L180F)はAAG変異体であるAAG(L180F)をコードする遺伝子を含むプラスミドである。AAG(L180F)はAAGのアミノ酸配列において第180番目のロイシンがフェニルアラニンに置換している変異体であり、MMS耐性変異体として見出された(Chen et al., DNA Repair, 7,1731(2008))。【０１５５】
pTrc-aag-ape1は、野生型AAG遺伝子とApe1遺伝子とを含むプラスミドである。そのプラスミドマップは図12-Bに示し、その核酸配列を配列番号6に記載する。APE1をPCRにより取得し、EcoRI-HindIIIによってpTrc-aag(WT)のaag遺伝子下流に挿入した。Trcプロモータの下流にAAG(wt)遺伝子とApe1遺伝子を配置した。IPTGによって両者の発現を誘導できる。両遺伝子とも、AGGAGGをATG上流に導入してある。クローニングサイトはNcoI-EcoRI、および、EcoRI-HindIIIである。3-メチルアデニン修復酵素欠損株でMMS耐性の獲得が確認されている。pTrc-aagよりも高いMMS耐性を獲得していることが確認されている。【０１５６】
pTrc-ape1はApe1遺伝子を含むプラスミドである。そのプラスミドマップは図12-Cに示し、その配列を配列番号7に記載する。【０１５７】
デュアルセレクタプラスミドを4種類作製した。
1.  pCI-aag-hsvTK  (セレクタプラスミドVer.1と称する)
2.  pCI-aag-hsvTK-ape1  (セレクタプラスミドVer.2と称する)
3.  pCI-aag(L180F)-hsvTK-ape1  (セレクタプラスミドVer.2.1と称する)
4.  pCI-aag-hsvTK-ape1  (セレクタプラスミドVer.3と称する)【０１５８】
pCI-aag-hsvTK(セレクタプラスミドVer.1)のプラスミドマップは図13-Aに示し、その配列を配列番号1に記載する。pCI-gfpに基づいて、そのgfp部分を切り出し、PCRにより取得した野生型AAGおよびhsvTKで置換した。PCRで取得したAAおよびhsvTK部分の配列は確認済みである。pCI-aag-hsvTKは、pCI-gfpのPRプロモータ下流のNcoI-HindIIIサイトに、AAG(wt)およびhsvTKをタンデムで配置させてある。両者とも、AGGAGG-を開始コドン上流に結合させている。AAGはNcoI-XbaIで切り出し可能であり、hsvTKはXbaI-HindIIIで切り出し可能である。AAGの終始コドン前のXbaIとhsvTK上流のSpeIサイトによって融合させることも可能である。dPキナーゼ（OFFセレクタ）としての機能は確認済みであり、MMS選択におけるONセレクタ機能も確認済みである。【０１５９】
pCI-aag-hsvTK-ape1(セレクタプラスミドVer.2)のプラスミドマップは図13-Bに示し、その配列を配列番号2に記載する。pCI-aag-hsvTK(セレクタプラスミドVer.1)のhsvTK下流からとCm耐性遺伝子の下流からPCRによってベクターを準備した。ape1遺伝子をPCRにより取得し、BamHIサイトとbluntによってCm耐性遺伝子下流に挿入した。ape1遺伝子の上流にAGGAGGを付加して翻訳されるようにした。AGGAGGの上流にXhoIサイトを付加し、ape1上流にプロモータ配列などを挿入できるようにした。APE1のみを切り出すことはblunt endを利用して導入したために不可能である。dPキナーゼ（OFFセレクタ）としての機能は確認済みであり、MMS選択におけるONセレクタ機能も確認済みである。【０１６０】
pCI-aag(L180F)-hsvTK-ape1(セレクタプラスミドVer.2.1)のプラスミドマップは図13-Cに示し、その配列を配列番号3に記載する。pCI-aag-hsvTK-ape1(セレクタプラスミドVer.2)のNcoI-SpeIサイトを利用して、PCRにより取得したAAG(L180F)を導入した。dPキナーゼ（OFFセレクタ）としての機能は確認済みであり、MMS選択におけるONセレクタ機能も確認済みである。【０１６１】
pCI-aag-hsvTK-ape1(セレクタプラスミドVer.3)のプラスミドマップは図13-Dに示し、その配列を配列番号4に記載する。pCI-aag-hsvTK-ape1(セレクタプラスミドVer.2)のAPE1遺伝子の上流にあるXhoI-BamHIサイトを利用して、PCRにより取得したlacIqプロモータ配列を導入した。APE1上流にlacIqプロモータ配列を挿入したことにより、APE1の発現量が増加する。dPキナーゼ（OFFセレクタ）としての機能は確認済みであり、MMS選択におけるONセレクタ機能も確認済みである。しかし、セレクタプラスミドVer.2と比較して、ONセレクタとしての機能向上は確認できなかった。
【実施例２】
【０１６２】
AAG遺伝子のONセレクタ機能を検討した。まず、アルキル化剤感受性大腸菌株MV2157にAAGおよびその変異体を含むプラスミド、具体的には実施例1で作製したpTrc-aag(WT)、pTrc-aag(E125A)およびpTrc-aag-ape1を別々に導入し、MMSの存在／非存在下におけるその生存率を比較した。pTrc-aag(E125A)を導入した大腸菌株はネガティブコントロールとして使用した。【０１６３】
具体的には、各種プラスミドを導入した大腸菌株をそれぞれ2 mLのLB培地に植菌し、37℃で12時間培養した。ついでLB液体培地に1μL植菌し、37℃で3時間培養した。MMSを終濃度0-40mMとなるように添加し、37℃で15-60分間培養した。その培養液をLB固体培地に植菌し、コロニ数から生菌数を測定した。MMSを添加した試料の生菌数を、添加していない試料の生菌数で割った値を生存率と定義した。【０１６４】
種々のMMS濃度(10-40 mM)で30分処理すると、AAGを発現していない大腸菌株の生存率はおよそ5-6桁低下した(図14のパネル(a))。一方、AAGを発現する大腸菌株の生存率の低下の程度は小さく、AAG非発現大腸菌株と比較して高い生存率、具体的にはMMS濃度10-20 mMの条件下で最大である103倍の生存率を示した。細胞の生存率の低下は、AAGとApe1を共発現させるとさらに小さくなる。なお、さらにMMS濃度をあげると(〜40mM)全ての株がほぼ死滅した。MMSはDNA以外にも、細胞内のタンパク質などのアルキル化を起こしてしまうため、DNA修復の有無にかかわらず細胞死をひきおこすと考えることができる。【０１６５】
次に、MMS濃度を20 mMに固定し、MMS処理後の生存率の経時変化を観察した(図14のパネル(b))。どの時間点においても、生存率はAAG-APE1株＞AAG株＞＞コントロール株という順位であった。60分間MMS処理をすると、AAGを発現した細胞の生存率も大きく低下した。【０１６６】
これらの結果から、15-60分間という短期間のMMS処理により、AAGを発現する細胞を〜1000倍程度濃縮できることが明らかになった。このような高い濃縮効率が安定して得られる「濃度20 mMのMMSで30分間処理」する条件を、ON選択を以下の実施例で実施する場合の標準選択条件として採用した。
【実施例３】
【０１６７】
AAG遺伝子のONセレクタ機能を利用して、遺伝子回路の選択を検討した。AAG遺伝子を有するプラスミドとして実施例1で作製したセレクタプラスミドVer.2を使用した(図13-B)。モデル遺伝子回路は回路Cまたは回路Dを使用した。【０１６８】
まず、セレクタプラスミドVer.2と回路Cを導入した大腸菌MV2157(実施例3においてON株と称する)、および、セレクタプラスミドVer.2と回路Cを導入した大腸菌MV2157(実施例3においてOFF株と称する)を作製した。これら大腸菌株をそれぞれ2mLのLB培地に植菌し、37℃で12時間培養した。次いでそれぞれ1μL(約107個)をLB液体培地に植菌して37℃にて3時間培養後、M9最小培地に培地交換し、MMSを0.2％、0.3％、0.4％となるように添加して15〜60分間、37℃にて温置した。MMS処理時の細胞密度はおよそ108 細胞/mLである。培養液を回収してLB固形培地に植菌し、形成されるコロニの数から生菌数を測定した。MMSを添加した試料の生菌数を、添加していない試料の生菌数で割った値を生存率と定義した。【０１６９】
次に、MMS 0.2％添加時のON株およびOFF株の生存率の経時変化を調べた。このとき、ON株にpTrc-ape1を導入したものを作製して同様に比較検討した。それぞれの大腸菌の培養およびMMSでの処理は上記方法と同様の方法で行った。【０１７０】
結果を図15-Aおよび図15-Bに示す。セレクタプラスミドに含まれる遺伝子群はPRプロモータの制御下にあり、CIタンパク質により発現を抑制される。回路DはCItrucを常時発現するのでセレクタ遺伝子はOFF（抑制）状態にある。このためOFF株ではAAG遺伝子は発現せず、その結果、大腸菌の生存率はMMS処理により大きくが低下した(図15-A)。MMSの濃度が高いほど、AAGを発現しないOFF株の生存率は顕著に低下した(図15-A)。また、MMSでの処理時間が長いほど、AAGを発現しないOFF株の生存率は顕著に低下した(図15-A)。一方、回路CはCIタンパク質を発現しないので、セレクタ遺伝子はON（起動）状態にある。このためON株ではAAG遺伝子が発現し、その結果、MMS処理後も生存率はわずかな減少にとどまった(図15-A)。OFF株とON株との生存率差は、条件によっては104 倍以上(MMS 0.4％で30分間処理した場合)に達した。なお、セレクタ遺伝子が起動状態にあってAAGが発現していても、ある程度以上高い濃度のMMS存在下では生存率の減少がみられた。これは、メチル化DNAの量がAAG/Ape1経路のメチル化DNA修復能力を越えたためであるか、あるいは、MMSが細胞中のタンパク質や細胞膜のメチル化をひきおこし、その結果、細胞死が導かれたためであると推察される。【０１７１】
図15-Bに示すように、ON株にpTrc-ape1を導入してape1の発現を積み増すと、その生存率はさらに上がった。Ape1はAAGのターンオーバーを上昇させる効果を有するという報告があり（Baldwin, et al., Biochemistry, 48, 6022 (2009)）、図15-Bに示す結果はApe1のこのような効果によるものであると考えることができる。【０１７２】
AAGの発現の有無によるアルキル化剤感受性大腸菌株のMMS存在下での生存率の変化を利用して、AAG遺伝子発現回路を制御するように設定した遺伝子スイッチや遺伝子回路の機能の選択が可能である。すなわち、遺伝子スイッチや遺伝子回路が作動して下流のAAGの発現が惹起されるとアルキル化剤感受性大腸菌株のMMS存在下での生存率が上がる。したがって、アルキル化剤感受性大腸菌株のMMS存在下での生存率が高いものを選択することにより、AAGの発現を惹起し得るON状態の遺伝子スイッチや遺伝子回路の選択が可能になる。【０１７３】
このように、AAG遺伝子を導入したアルキル化剤感受性大腸菌株を用いて、ON状態にある遺伝子スイッチおよび遺伝子回路のみを拾い上げる選択手法が確立できた。
【実施例４】
【０１７４】
AAG遺伝子のONセレクタ機能の改良を試みた。AAGのMMS耐性変異体として、AAGのアミノ酸配列において第180番目のロイシンがフェニルアラニンに置換している変異体(AAG(L180F))が取得されている(Chen et al., DNA Repair, 7, 1731(2008))。そこで、この変異体(以下、L180F変異体と称する)のセレクタ遺伝子としての機能を検討した。【０１７５】
まず、L180F変異体のMMS耐性の確認を行った。野生型AAG遺伝子を含むプラスミドpTrc-aag(WT)またはL180F変異体遺伝子を含むプラスミドpTrc-aag(L180F)を導入した大腸菌MV2157を2mLのLB培地に植菌し、37℃で12時間培養した。次いでそれぞれ1μL(約106個)をLB液体培地に植菌して37℃にて3時間振盪培養後し、0.2%MMSの存在下または非存在下で37℃にて30分間処理した。その培養液をLB固体培地に植菌し、コロニ数から生菌数を測定した。【０１７６】
その結果、L180F変異体を発現する大腸菌は、野生型AAGを発現する大腸菌よりも有意に高いMMS耐性を示した（図16）。条件によっては，MMS処理を生き残る大腸菌、すなわち後の培養でコロニ形成能を保持する大腸菌の細胞数は、野生型より2桁も高くなる。このように、L180G変異体がMMS耐性を示すことが確認できた。【０１７７】
次に、L180F変異体のセレクタ遺伝子としての機能を検討した。セレクタプラスミドVer.2のAAG遺伝子に部位特異的変異を入れたセレクタプラスミドVer 2.1(実施例1および図13-C参照)、またはセレクタプラスミドVer.2(実施例1および図13-B参照)を大腸菌MV2157に導入した。これら大腸菌をそれぞれ2mLのLB培地に植菌し、37℃で12時間培養した。その後それぞれ1μL(約106個)をLB液体培地に植菌して37℃で2時間振盪培養し、0.2% MMSの存在下または非存在下で37℃にて30分間処理した。その培養液をLB固体培地に植菌し、コロニ数から生菌数を測定した。また、ネガティブコントロールとしてプラスミドpCI-gfpを導入した大腸菌MV2157を同様に処理した。【０１７８】
その結果、図17に示すように、セレクタプラスミドの遺伝子群が起動状態にあるとき、セレクタプラスミドVer 2.1を導入した大腸菌は、セレクタプラスミドVer.2を導入した大腸菌と比較して顕著に高い生存率を示した。具体的には、Ver.2を導入した大腸菌の場合、MMS処理ありの場合の生菌数の、MMS処理なしの場合の生菌数に対する比は0.14であった。一方、同条件下において、Ver.2.1 を導入した大腸菌の場合、MS処理ありの場合の生菌数の、MMS処理なしの場合の生菌数に対する比は0.53であった。【０１７９】
このようにL180G変異体のMMS耐性が高いことから、ONセレクタとしてL180G変異体遺伝子を使用することによりON選択の効率が極めて高くなる。AAG野生型には、実験例1から7で示したhsvTKを用いるdP選択において、その毒性を軽減する活性（dPグリコシラーゼ活性）を有すると考えられる。そのため、AAG野生型をON選択に使用すると、該ON選択に引き続いてOFF選択を行う場合、hsvTKをセレクタとして使用するOFF選択はdPの存在下で実施するため、該OFF選択の効率を低下させる可能性がある。L180F変異体は、dPグリコシラーゼ活性が低いため、hsvTKのセレクタ機能を妨害しないと考えられる。したがって、L180F変異体をONセレクタとして使用することにより、ON選択およびOFF選択を交互に実施する選択システム総体としての効率および有用性は極めて高くなる。
【実施例５】
【０１８０】
AAGをセレクタとして用いるON選択と、hsvTKをセレクタとして用いるOFF選択とを用いて、所望の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路のデュアル選択を実施した。【０１８１】
まず、デュアル選択を試験的に実施した。セレクタプラスミドとしてセレクタプラスミドVer.2(図13-B)を使用し、モデル遺伝子回路としてAHLによってCItrucを発現する回路B、AHLの有無にかかわらずCItrucを発現しない回路C、AHLの有無にかかわらず常にCItrucを発現する回路Dの3種類を用いた(図2-B、2-C、2-D参照)。セレクタプラスミドとモデル遺伝子回路の1種類を大腸菌MV2157に導入した。このように、回路とセレクタプラスミドとを導入した大腸菌株をスイッチ株と呼ぶ。回路B、回路C、または回路Dを有するスイッチ株をそれらの存在比が1：1：1となるように、光学密度（OD)に基づいて混合した。混合した細胞集団を、AHL 1μMを含む液体dP選択培地1mL（LB, 1μM dP）に107細胞程度植菌し、37℃で1時間震盪培養した。遠心処理により集菌し、0.9 % NaCl水溶液で洗浄後、LB液体培地に再懸濁した（OFF選択）。その後、37℃で2時間培養し、遠心処理により集菌してM9最小培地に培地を交換し、MMSを添加して37℃で30分間静置した（ON選択）。続いて、LB培地に培地交換して12時間培養し、培養液よりプラスミドを抽出した。プラスミドはpλ-gfpと共にXL10 Gold登録商標ウルトラコンピテントセルに形質転換した。その後、形質転換した細胞をAHLの添加および非添加の固体培地に植菌し、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する細胞数を比較した。【０１８２】
実施工程の概略図を図18-Aに示す。また、選択開始前、OFF選択後、およびON選択後における細胞集団のAHL添加およびAHL非添加の各条件下におけるGFP発現力パターンを図18-Bに示す。AHL添加およびAHL非添加における回路B、回路C、および回路Dの出力、すなわちCItrucの発現はそれぞれ+/-、-/-、および+/+である。つまり，その下流に位置してCItrucにより抑制されるPRプロモータの制御下にある遺伝子の発現は、それを反転したもの、すなわち-/+、+/+、および-/-である。したがって、AHL添加プレートでGFPによる蛍光を示すのは、回路Cのみであり、AHL非添加プレートでGFPによる蛍光を示すのは回路Bと回路Cである。図18-Bに示すように、OFF選択の実施後は、回路Cを有するスイッチ株、すなわちAHL添加で蛍光を示すコロニがほぼ払拭されていたが、これに対し、回路Dを有するスイッチ株、すなわちAHL非添加で蛍光を示さないコロニが多数存在した。この結果から、OFF選択により、hsvTKを発現しない細胞、すなわち回路Dを有するスイッチ株が生存し、一方、hsvTKを発現する細胞、すなわち回路Cを有するスイッチ株の細胞死が誘導されたことが分かった。また、回路Bを有するスイッチ株はAHL存在下ではhsvTKを発現しないため生存した。OFF選択に続いてON選択を行った後は、回路Dを有するスイッチ株はAHLの添加の有無に関らずAAGを発現しないため細胞死が誘導され、回路Bを有するスイッチ株はAHLの非存在下でAAGを発現するためにMMSによる細胞死を免れて生存した。【０１８３】
次に、デュアル選択による濃縮効率の評価を行った。セレクタプラスミドとしてセレクタプラスミドVer.2(図13-B)を使用し、モデル遺伝子回路として回路B、回路C、回路Dの3種類を用いた(図2-B、2-C、2-D参照)。セレクタプラスミドとモデル遺伝子回路の1種類を大腸菌MV2157に導入した。各スイッチ株はAHLを含む2mLのLB培地に植菌し、37℃で12時間培養した。次いで、回路B、回路C、または回路Dを有するスイッチ株をそれらの存在比が1：100：100となるように、ODに基づいて混合した。混合した細胞集団を、上記同様の方法でOFF選択に付し、続いて37℃で2時間培養し、遠心処理により集菌してM9最小培地に培地を交換し、MMSを0.2％、0.3％、または0.4％の濃度になるように添加して37℃で30分間静置した（ON選択）。その後、LB培地に培地交換して12時間培養し、培養液よりプラスミドを抽出した。プラスミドはpλ-gfpと共にXL10 Gold登録商標ウルトラコンピテントセルに形質転換した。その後、形質転換した細胞をAHLの添加および非添加の固体培地に植菌し、GFPを発現する細胞数を比較した。選択後のスイッチ株の割合を選択前のスイッチ株の割合で割った値を濃縮率と定義した。【０１８４】
デュアル選択による回路の濃縮率を表2に示す。表2は、回路B：回路C：回路D＝1:100:100となるようにスイッチ株を混合した細胞集団について、OFF選択(1μM AHL)に引き続いてON選択(AHL非添加)を実施した後の回路Bの濃縮率を示している。【０１８５】
【表２】
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【０１８６】
表2に示すように、ON選択（30分間）時のMMS濃度が0.2%または0.3%である場合、回路Bが有意に濃縮されていた。一方、MMS 0.4%で処理した場合は全ての細胞が死滅した。これは、選択実験時の細胞密度を反映している。実施例2におけるMMS処理時の細胞密度はおよそ108細胞/mLであったのに対し、本実施例5ではおよそ106 細胞/mLと細胞密度が2桁も低い条件であった。そのため、MMSの実効濃度が高くなったと考えられる。【０１８７】
さらに、デュアル選択による濃縮効率の評価をスイッチ株の混合比率を変えて実施した。このとき、セレクタプラスミドVer.2(図13-B)とセレクタプラスミドVer.2(図13-C)とを使用し、それらによる選択効率の比較を行った。モデル遺伝子回路として回路B、回路C、回路Dの3種類を用いた(図2-B、2-C、2-D参照)。いずれかのセレクタプラスミドとモデル遺伝子回路の1種類を大腸菌MV2157に導入した。各スイッチ株はAHLを含む2mLのLB培地に植菌し、37℃で12時間培養した。次いで、回路B、回路C、または回路Dを有するスイッチ株をそれらの存在比が1：1000：1000となるように、ODに基づいて混合した。混合した細胞集団を、上記同様の方法でOFF選択に付し、続いて37℃で2時間培養し、遠心処理により集菌してM9最小培地に培地を交換し、MMSを0.2％の濃度になるように添加して37℃で30分間静置した（ON選択）。その後、LB培地に培地交換して12時間培養し、培養液よりプラスミドを抽出した。その後、形質転換した細胞をAHLの添加および非添加の固体培地に植菌し、GFPを発現する細胞数を比較した。選択後のスイッチ株の割合を選択前のスイッチ株の割合で割った値を濃縮率と定義した。【０１８８】
デュアル選択による回路の濃縮率を表3に示す。表3は、回路B：回路C：回路D＝1:1000:1000となるようにスイッチ株を混合した細胞集団について、OFF選択(1μM AHL)に引き続いてON選択(AHL非添加)を実施した後の回路Bの濃縮率を示している。【０１８９】
【表３】
2012060407.tif 000004
【０１９０】
表3に示すように、セレクタプラスミドVer.2を用いた場合は回路Bの400倍程度の濃縮が観察された。回路Cは効率的に除去されていたことから、ON選択の効率は十分高い。これに対して、回路Dはかなり生存していた。一方、セレクタプラスミドVer.2.1を用いた場合、ほぼ全てが回路Bとなり、その濃縮率は1935倍と、理論最大濃縮率(2000倍)にほぼ近いスコアを示した。回路Cの残存率もセレクタプラスミドVer2.を使ったときに比べ、有意に低下した。これはAAGに導入されたL180F変異のため、その生菌比が改良されているからであると考えられる。また、セレクタプラスミドVer.2で問題であった回路Dの生存率はより顕著に改善した。このことは、AAGの有するdPグリコシラーゼ活性がL180F変異体では低減されていることによるものであると推察される。【０１９１】
このように、ON選択に30分間およびOFF選択に60分間という極めて短時間で遺伝子スイッチや遺伝子回路の選択の実施が可能になった。
【実施例６】
【０１９２】
実施例4で確率したこの手法の強みの1つは、時間軸に沿った選択を行なえること、例えば遺伝子スイッチの切り替え時間（遅延時間）に対しての選択などを行ない得ることである。そこで、回路Aおよび回路Bを用いた「切り替え時間の選択」を行なった。【０１９３】
まず、セレクタプラスミドVer.2.1(図13-C)と回路Aとを大腸菌MV2157に形質転換した(以下、A細胞と称する)。また、セレクタプラスミドVer.2.1(図13-C)と回路Bとを大腸菌MV2157に形質転換した(以下、B細胞と称する)。回路Aおよび回路BはそれぞれAHLの濃度に応じてLuxプロモータ下流に配置した完全長CIタンパク質およびCItrucを発現する。CItrucはCIタンパク質のC末端が欠失したものであり、標的配列への結合能が低下しており、その結果、PLプロモータの抑制能が低下している。したがって、AHL存在下において回路Aおよび回路Bが作動すると、これら回路の下流に配置されたセレクタプラスミドに含まれる遺伝子群の発現は抑制されるが、その抑制の程度は回路Bに比べて回路Aが強い。【０１９４】
次いでA細胞およびB細胞をそれぞれAHL 1μMを含むLB培地で前培養した。次いで 光学密度(OD)を測定し、細胞数が106細胞程度ずつとなるように、AHLを含まない新鮮なLB培地内に植菌した。その培養液を37℃で振盪培養した。培養開始から1、3、6時間後の培養液にMMSを最終濃度が0.2％となるように添加し、37℃で振盪培養した。 MMS添加後、30分間培養した培養液から遠心処理により集菌し、1/100に希釈後、新鮮なLB培地に植菌した。培地交換後、12時間培養し、その培養液内に含まれる大腸菌を直接PCR反応にかけた。PCR反応後の反応液をゲル電気泳動し、その存在比を分析した。【０１９５】
セレクタプラスミドに含まれる遺伝子群の非発現状態(OFF)から発現状態(ON)の切り替え時間が短いとき、すなわちAHLを含まない培地での培養が1時間であるとき、回路Aを含むA細胞は殆ど淘汰され、回路Bを含むB細胞のみが選抜された。この「選り分け」は、選択操作間の時間感覚が十分長いとき、すなわちAHLを含まない培地での培養が6時間であるときにはみられなかった（図19）。【０１９６】
この結果は、以下のように考察することができる。回路Bの作動により発現されるCItrucの細胞内での半減期が、回路Aの作動により発現される完全長CIタンパク質よりも短いと考えると、その抑制効果が消失してセレクタプラスミドに含まれる遺伝子が発現されるまでの時間は短くなる。AHLを除去しCItrucの再合成を止めると、細胞内でCIによる抑制は早期に解除される。6時間もの間隔をおくと、完全長CIタンパク質を発現する細胞の生存率とCItrucを発現する細胞の生存率とに差はなくなる。AHL除去後の期間が長くなったために、完全長CIタンパク質による抑制も解除されたためと考えられる。あるいは、CItrucは、CIタンパク質が作用するプロモータを完全に抑制するのに必要な細胞濃度が高いため、抑制効果が解除されるのに必要な時間がより短かったためとも考えられる【０１９７】
このように、上記デュアルセレクタプラスミドのONセレクタ機能を使用して「OFF→ONスイッチ時間の短い回路」を簡単に濃縮することができた。デュアルセレクタプラスミドを使用することにより、さらに「分解のはやいエフェクター」「効きはじめの速いエフェクター」「長持ちする（記憶力の高い）回路」「パルス時間の調節」などの様々な機能を有する遺伝子スイッチや遺伝子回路の選択が可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１９８】
本発明によれば、所望の特性および／または機能を有する遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択および取得を、迅速に、且つ高い効率で実施できる方法を提供できる。【０１９９】
本発明は、タンパク質生産、代謝工学、そして合成生物学などの分野まで広く寄与する極めて有用な発明である。
【配列表フリーテキスト】
【０２００】
配列番号1：アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)遺伝子およびヒトヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(hsvTK)遺伝子を含む、pCI-aag-hsvTK(Ver.1)と称する設計された発現ベクターDNA。
配列番号2：アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)遺伝子、ヒトヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(hsvTK)遺伝子、およびAPエンドヌクレアーゼ(APE1)遺伝子を含む、pCI-aag-hsvTK-ape1(Ver.2)と称する設計された発現ベクターDNA。
配列番号3：アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ変異体（(AAG(L180F))）遺伝子、ヒトヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(hsvTK)遺伝子、およびAPエンドヌクレアーゼ(APE1)遺伝子を含む、pCI-aagL180F-hsvTK-ape1(Ver.2.1)と称する設計された発現ベクターDNA。
配列番号4：アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)遺伝子、ヒトヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(hsvTK)遺伝子、およびAPエンドヌクレアーゼ(APE1)遺伝子を含む、pCI-aag-hsvTK-ape1(Ver.3)と称する設計された発現ベクターDNA。
配列番号5：アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)遺伝子を含む、pTrc-aag(wt)と称する設計された発現ベクターDNA。
配列番号6：アルキルアデニンDNAグリコシダーゼ(AAG)遺伝子およびAPエンドヌクレアーゼ(APE1)遺伝子を含む、pTrc-aag(wt)-ape1と称する設計された発現ベクターDNA。
配列番号7：APエンドヌクレアーゼ(APE1)遺伝子を含む、pTrc-ape1と称する設計された発現ベクターDNA。
配列番号8：緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を含む、pCI-gfpと称する設計された発現ベクターDNA。
配列番号9：遺伝子回路Aを保持する設計された発現ベクターDNA。
配列番号10：遺伝子回路Bを保持する設計された発現ベクターDNA。
配列番号11：遺伝子回路Cを保持する設計された発現ベクターDNA。
配列番号12：遺伝子回路Dを保持する設計された発現ベクターDNA。
【図１】
2012060407.tif 000005
【図２−Ａ】
2012060407.tif 000006
【図２−Ｂ】
2012060407.tif 000007
【図２−Ｃ】
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【図２−Ｄ】
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【図３】
2012060407.tif 000010
【図４】
2012060407.tif 000011
【図５】
2012060407.tif 000012
【図６】
2012060407.tif 000013
【図７】
2012060407.tif 000014
【図８】
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【図９−Ａ】
2012060407.tif 000016
【図９−Ｂ】
2012060407.tif 000017
【図１０】
2012060407.tif 000018
【図１１】
2012060407.tif 000019
【図１２−Ａ】
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【図１２−Ｂ】
2012060407.tif 000021
【図１２−Ｃ】
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【図１３−Ａ】
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【図１３−Ｂ】
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【図１３−Ｃ】
2012060407.tif 000025
【図１３−Ｄ】
2012060407.tif 000026
【図１４】
2012060407.tif 000027
【図１５−Ａ】
2012060407.tif 000028
【図１５−Ｂ】
2012060407.tif 000029
【図１６】
2012060407.tif 000030
【図１７】
2012060407.tif 000031
【図１８−Ａ】
2012060407.tif 000032
【図１８−Ｂ】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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