(57)【要約】【課題】  簡便に製造することができ、微小かつ均一な粒子径を有する脂質膜構造体や封入する物質（目的物質）の数および脂質膜の枚数が制御された脂質膜構造体、その製造方法ならびに１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法を提供する。【解決手段】  陽イオン性界面活性剤が修飾されてなる脂質膜を１枚膜としてまたは複数膜の最外膜として有する脂質膜構造体。本発明に係る脂質膜構造体やその製造方法によれば、微小かつ均一な脂質膜構造体や、封入する物質（目的物質）の数および脂質膜の枚数が制御された脂質膜構造体を得ることができる。
2012117971.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
陽イオン性界面活性剤が修飾されてなる脂質膜を１枚膜としてまたは複数膜の最外膜として有する脂質膜構造体。
【請求項２】
陽イオン性界面活性剤が次式（化１）
【化１】
2012117971.tif 000022
［式中：
Ｒ１はアルキル基であり、
Ｒ２は疎水基である。］
の陽イオン性界面活性剤である、請求項１に記載の脂質膜構造体。
【請求項３】
Ｒ１が炭素数が１２以上のアルキル基であり、かつＲ２が次式（化２）
【化２】
2012117971.tif 000023
または次式（化３）
【化３】
2012117971.tif 000024
の基である、請求項２に記載の脂質膜構造体。
【請求項４】
Ｒ１が炭素数が１６のアルキル基であり、かつＲ２が次式（化４）
【化４】
2012117971.tif 000025
の基である、請求項２に記載の脂質膜構造体。
【請求項５】
負帯電性脂質膜構造体である、請求項１から請求項４のいずれかに記載の脂質膜構造体。
【請求項６】
リポソームである、請求項１から請求項５のいずれかに記載の脂質膜構造体。
【請求項７】
陽イオン性界面活性剤が修飾されてなる脂質膜を１枚膜としてまたは複数膜の最外膜として有する脂質膜構造体を製造する方法であって、下記（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の工程を有する前記方法；
（ｉ）脂質と陽イオン性界面活性剤とを混合して陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを調製する工程、
（ｉｉ）脂質フィルムに陽イオン性界面活性剤を加えて陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを調製する工程、
（ｉｉｉ）１枚膜または複数膜の脂質膜を有する脂質膜構造体の１枚膜または複数膜の最外膜に陽イオン性界面活性剤を修飾する工程。
【請求項８】
（ｉ）脂質と陽イオン性界面活性剤とを混合して陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを調製する工程または（ｉｉ）脂質フィルムに陽イオン性界面活性剤を加えて陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを調製する工程を有する場合において、下記（ｉｖ）の工程を有する、請求項７に記載の方法；
（ｉｖ）前記調製した脂質フィルムを水和させて脂質膜構造体を調製する工程。
【請求項９】
１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法であって、下記（ｉ）または（ｉｉ）の工程を有する前記方法；
（ｉ）脂質と陽イオン性界面活性剤とを混合して陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを調製する工程、
（ｉｉ）脂質フィルムに陽イオン性界面活性剤を加えて陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを調製する工程。
【請求項１０】
下記（ｉｖ）の工程を有する、請求項９に記載の方法；
（ｉｖ）前記調製した脂質フィルムを水和させて脂質膜構造体を調製する工程。
【請求項１１】
陽イオン性界面活性剤が次式（化５）
【化５】
2012117971.tif 000026
［式中：
Ｒ１はアルキル基であり、
Ｒ２は疎水基である。］
の陽イオン性界面活性剤である、請求項７から請求項１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ１が炭素数が１２以上のアルキル基であり、かつＲ２が次式（化６）
【化６】
2012117971.tif 000027
または次式（化７）
【化７】
2012117971.tif 000028
の基である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ１が炭素数が１６のアルキル基であり、かつＲ２が次式（化８）
【化８】
2012117971.tif 000029
の基である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質膜構造体、脂質膜構造体の製造方法および１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法に関し、より詳細には、陽イオン性界面活性剤が修飾されてなる脂質膜を１枚膜としてまたは複数膜の最外膜として有する脂質膜構造体、当該脂質膜構造体の製造方法および１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、薬剤、あるいは核酸などの物質を、生物個体の標的部位に確実に送達するためのベクターの開発が盛んに行われている。これまでに開発されたベクターは、ウイルスベクターと非ウイルスベクターとに大別される。ウイルスベクターは、一般に、目的の遺伝子を標的細胞の核内へ導入する遺伝子導入能が優れているが、大量生産の困難性、抗原性、毒性などの問題があるため、このような問題点が少ない非ウイルスベクターとして、リポソームに代表される脂質膜構造体が注目を集めている。【０００３】
リポソームは、人工的に調製される脂質二重層からなる脂質膜を基本構成とする脂質膜構造体であり、様々な物質を内包して標的細胞内に送り込む能力を有している。リポソームは、その表面に抗体、タンパク質、糖鎖などの機能性分子を導入することにより、標的部位に対する指向性を向上させることができるという利点の他、物質が内包されるために生体内の分解作用や代謝作用から保護されるという利点や、標的以外の部位で物質が作用を奏すること（副作用）を防止するという利点を有している。これまでに、リポソームとして、例えば、連続した複数個のアルギニン残基を含むペプチドを表面に有し、核移行能を有するリポソームが開発されている（特許文献１）。【０００４】
また、遺伝子を封入した脂質膜構造体として、Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ−ｌｉｐｉｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＳＰＬＰ）が開発されている（非特許文献１）。ＳＰＬＰは、正帯電性脂質と非イオン性界面活性剤とを含む緩衝液中で遺伝子をインキュベートした後、緩衝液によって透析を行うことにより製造される、粒子径６０−７０ｎｍの微小な脂質膜構造体である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／０３２５９３号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｊ．Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、第６巻、第２号、第２７１−２８１頁、１９９９年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一般に、粒子を癌や炎症といった疾患部位へ効率的に送達させるためには、粒子径は１００ｎｍ〜１５０ｎｍ程度であることが好ましい（Ｌｉｕ Ｄ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．、第１１０４巻、第１号、第９５−１０１頁、１９９２年；Ａｋｉｎｃ Ａ．ら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、第１７巻、第５号、第８７２−８７９頁、２００９年）。しかしながら、特許文献１に記載されたリポソームは、図１上段に示すように、脂質フィルムを調製した後、これを水和させ、攪拌または超音波処理する方法（水和法）により簡便に製造することができるが、封入する物質（目的物質）の数や脂質膜の枚数を制御することが困難であるため、粒子径が平均約３００ｎｍと過大になってしまい、疾患部位へ効率的に送達させるのは困難である。【０００８】
また、非特許文献１に記載されたＳＰＬＰは、疾患部位へ効率的に送達可能な程度に微小であるが、透析操作に長時間を要することや、緩衝液のｐＨなどの僅かな条件の変化によって脂質膜構造体への遺伝子の封入効率が顕著に低下することなどから、実用化が困難である（Ｊｅｆｆｓ Ｌ．Ｂ．、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．、第２２巻、第３号、第３６２−７２頁、２００５年）。【０００９】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、簡便に製造することができ、微小かつ均一な粒子径を有する脂質膜構造体や封入する物質（目的物質）の数および脂質膜の枚数が制御された脂質膜構造体、その製造方法ならびに１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究の結果、図１下段に示すように、陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを用いて水和法を行うことにより、微小かつ均一な粒子径を有するリポソームや封入する物質（目的物質）の数および脂質膜の枚数が制御されたリポソームが得られること、および１の目的物質を１枚の脂質膜で封入することができること、ならびに陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質膜を１枚膜としてまたは複数膜の最外膜として有するリポソームのトランスフェクション活性が顕著に向上することを見出し、下記の各発明を完成した。【００１１】
（１）陽イオン性界面活性剤が修飾されてなる脂質膜を１枚膜としてまたは複数膜の最外膜として有する脂質膜構造体。【００１２】
（２）陽イオン性界面活性剤が次式（化１）
【化１】
2012117971.tif 000003
［式中：Ｒ１はアルキル基であり、Ｒ２は疎水基である。］の陽イオン性界面活性剤である、（１）に記載の脂質膜構造体。【００１３】
（３）Ｒ１が炭素数が１２以上のアルキル基であり、かつＲ２が次式（化２）
【化２】
2012117971.tif 000004
または次式（化３）
【化３】
2012117971.tif 000005
の基である、（２）に記載の脂質膜構造体。【００１４】
（４）Ｒ１が炭素数が１６のアルキル基であり、かつＲ２が次式（化４）
【化４】
2012117971.tif 000006
の基である、（２）に記載の脂質膜構造体。【００１５】
（５）負帯電性脂質膜構造体である、（１）から（４）のいずれかに記載の脂質膜構造体。【００１６】
（６）リポソームである、（１）から（５）のいずれかに記載の脂質膜構造体。【００１７】
（７）陽イオン性界面活性剤が修飾されてなる脂質膜を１枚膜としてまたは複数膜の最外膜として有する脂質膜構造体を製造する方法であって、下記（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の工程を有する前記方法；（ｉ）脂質と陽イオン性界面活性剤とを混合して陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを調製する工程、（ｉｉ）脂質フィルムに陽イオン性界面活性剤を加えて陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを調製する工程、（ｉｉｉ）１枚膜または複数膜の脂質膜を有する脂質膜構造体の１枚膜または複数膜の最外膜に陽イオン性界面活性剤を修飾する工程。【００１８】
（８）（ｉ）脂質と陽イオン性界面活性剤とを混合して陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを調製する工程または（ｉｉ）脂質フィルムに陽イオン性界面活性剤を加えて陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを調製する工程を有する場合において、下記（ｉｖ）の工程を有する、（７）に記載の方法；（ｉｖ）前記調製した脂質フィルムを水和させて脂質膜構造体を調製する工程。【００１９】
（９）１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法であって、下記（ｉ）または（ｉｉ）の工程を有する前記方法；（ｉ）脂質と陽イオン性界面活性剤とを混合して陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを調製する工程、（ｉｉ）脂質フィルムに陽イオン性界面活性剤を加えて陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを調製する工程。【００２０】
（１０）下記（ｉｖ）の工程を有する、（９）に記載の方法；（ｉｖ）前記調製した脂質フィルムを水和させて脂質膜構造体を調製する工程。【００２１】
（１１）陽イオン性界面活性剤が次式（化５）
【化５】
2012117971.tif 000007
［式中：Ｒ１はアルキル基であり、Ｒ２は疎水基である。］の陽イオン性界面活性剤である、（７）から（１０）のいずれかに記載の方法。【００２２】
（１２）Ｒ１が炭素数が１２以上のアルキル基であり、かつＲ２が次式（化６）
【化６】
2012117971.tif 000008
または次式（化７）
【化７】
2012117971.tif 000009
の基である、（１１）に記載の方法。【００２３】
（１３）Ｒ１が炭素数が１６のアルキル基であり、かつＲ２が次式（化８）
【化８】
2012117971.tif 000010
の基である、（１１）に記載の方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明に係る脂質膜構造体やその製造方法によれば、微小かつ均一な脂質膜構造体や、封入する物質（目的物質）の数および脂質膜の枚数が制御された脂質膜構造体を得ることができる。また、微小かつ均一な脂質膜構造体によれば、腫瘍や肝臓実質などの疾患部位へ効率的に送達させることができ、脂質膜の枚数が制御された脂質膜構造体によれば、標的部位へ効率的に送達させることができる。例えば、本発明に係る脂質膜構造体の脂質膜の枚数が３枚である場合は、３回の膜融合により核やミトコンドリアに、脂質膜の枚数が１枚である場合は、１回の膜融合により細胞質に、それぞれ目的物質を効率的に送達させることができる。さらに、本発明に係る脂質膜構造体は、目的物質を損傷させずに標的部位へ送達して、標的部位において目的物質の機能を発揮させることができるうえ、細胞毒性が低く、安全に生体に適用することができる。一方、本発明に係る脂質膜構造体を製造する方法によれば、上述の特徴を有する脂質膜構造体を、穏やかな調製条件で、簡便に、かつ廉価に製造することができる。さらに、本発明に係る１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法によれば、目的物質のサイズに応じた脂質膜構造体を得ることができる他、この方法を１または複数回行うことにより、目的の枚数の脂質膜を有する脂質膜構造体を得ることができる。なお、本発明に係る脂質膜構造体を製造する方法および１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法は、脂質の種類を問わず行うことができることから、標的とする部位や細胞腫などに応じて脂質膜の脂質組成を適宜選択することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】従来のリポソームおよび本願発明に係る陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質膜を有する脂質膜構造体における製造方法、封入された物質（目的物質）の数ならびに脂質膜の枚数の概要を示す図である。
【図２】本発明に係る、陽イオン性界面活性剤が修飾されてなる脂質膜の一態様を示す図である。
【図３】ベンジルドデシルジメチルアンモニウムブロマイド（ＢＢ−１）、ベンジルテトラデシルジメチルアンモニウムブロマイド（ＢＢ−２）、ベンジルヘキサデシルジメチルアンモニウムブロマイド（ＢＢ−３）、ベンジルオクタデシルジメチルアンモニウムブロマイド（ＢＢ−４）、トンゾニウムブロマイド（ＴＢ）およびｎ−Ｏｃｔｙｌ β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＯＧ）の構造を示す図である。
【図４】核酸ナノ粒子、界面活性剤が修飾されていない脂質膜を有するリポソーム（ａ；コントロール）、ＢＢ−１が修飾された脂質膜を有するリポソーム（ｂ、ｃ）、ＢＢ−２が修飾された脂質膜を有するリポソーム（ｄ、ｅ）、ＢＢ−３が修飾された脂質膜を有するリポソーム（ｆ、ｇ）、ＢＢ−４が修飾された脂質膜を有するリポソーム（ｈ、ｉ）およびＯＧが修飾された脂質膜を有するリポソーム（ｊ、ｋ）について、粒子径を測定した結果を示す図（ＡおよびＢ）、ならびにゼータ電位を測定した結果を示す図（ＣおよびＤ）である。
【図５】核酸ナノ粒子、ＴＢ未修飾リポソーム（ａ）、ならびにＴＢの修飾濃度が１１、１６．５、２２、２７．５および５５ｍｏｌ％であるＴＢ修飾リポソーム（ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆ）について、粒子径を測定した結果を示す図（Ａ）、ゼータ電位を測定した結果を示す図（Ｂ）、ならびに１の核酸ナノ粒子を１枚の脂質膜で封入したリポソームの粒子径を説明する模式図（Ｃ）である。
【図６】ＴＢ未修飾空リポソーム（ｇ）、ならびにＴＢの修飾濃度が１１、１６．５、２７．５、５５および１１０ｍｏｌ％であるＴＢ修飾空リポソーム（ｈ、ｉ、ｊ、ｋおよびｌ）について、粒子径を測定した結果を示す図（Ａ）およびゼータ電位を測定した結果を示す図（Ｂ）である。
【図７】Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＰＬＵＳ（ＬＦＮ ＰＬＵＳ；Ａ、Ｂ）、ＴＢ未修飾リポソーム（Ｃ、Ｄ）、１１ｍｏｌ％ＴＢ修飾リポソーム（Ｅ、Ｆ）、１６．５ｍｏｌ％ＴＢ修飾リポソーム（Ｇ、Ｈ）および２２ｍｏｌ％ＴＢ修飾リポソーム（Ｉ、Ｊ）により、Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ(ＥＧＦＰ)−ルシフェラーゼ融合タンパク質遺伝子がコードされたプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）をトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞における、ルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す図（右図）および細胞生存率を算出した結果を示す図（左図）である。
【図８】Ｎｉｔｒｏ−２−１，３−Ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ（ＮＢＤ）で標識したＴＢ修飾リポソーム（ａ）、ＴＢ未修飾リポソーム（ｂ）、多重膜リポソーム（ＭＬＶ；ｃ）および１枚膜リポソーム（ＳＵＶ；ｄ）について、ＮＢＤの蛍光強度を連続して測定した結果を示す図（上図）、ならびにＮＢＤで標識したリポソームにハイドロサルファイトナトリウムを添加した際の、ＮＢＤの消光効果を説明する模式図（下図）である。
【図９】ＴＢ修飾正帯電性脂質フィルム（ａ）、ＴＢ未修飾正帯電性脂質フィルム（ｂ）、ＴＢ修飾負帯電性脂質フィルム（ｃ）およびＴＢ未修飾負帯電性脂質フィルム（ｄ）に負帯電性二枚膜リポソームの封入を行った各サンプルについて、ＮＢＤの蛍光強度を連続して測定した結果を示す図である。
【図１０】１の２枚膜リポソームを１枚の脂質膜で封入して、３枚膜リポソームを調製する過程の概要を示す図である。
【図１１】ＬＦＮ ＰＬＵＳ、４枚膜リポソームおよびＴＢ修飾３枚膜リポソームにより、ＥＧＦＰ−ルシフェラーゼ融合タンパク質遺伝子がコードされたｐＤＮＡをトランスフェクションしたＪＡＷＳＩＩ細胞における、ルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す図である。
【図１２】ＰＬＬ安定化２枚膜リポソーム（ａ）およびＢＳＡ安定化２枚膜リポソーム（ｂ）をそれぞれ封入したＴＢ修飾３枚膜リポソームを調製する過程の概要を示す図である。
【図１３】ＰＬＬ安定化２枚膜リポソーム（ａ）およびＢＳＡ安定化２枚膜リポソーム（ｂ）をそれぞれ封入したＴＢ修飾３枚膜リポソーム、ならびに負帯電性２枚膜リポソームについて、ＮＢＤの蛍光強度を連続して測定した結果を示す図である。
【図１４】ＬＦＮ ＰＬＵＳ、ならびに負帯電性２枚膜リポソーム（ａ）、ＰＬＬ安定化２枚膜リポソーム（ｂ）およびＢＳＡ安定化２枚膜リポソーム（ｃ）をそれぞれ封入したＴＢ修飾３枚膜リポソームにより、ＥＧＦＰ−ルシフェラーゼ融合タンパク質遺伝子がコードされたｐＤＮＡをトランスフェクションしたＪＡＷＳＩＩ細胞における、ルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す図である。
【図１５】本発明のリポソームを透過型電子顕微鏡で観察したときの写真を示す。図中、スケールバーは５０ｎｍを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明に係る脂質膜構造体、脂質膜構造体の製造方法および１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法について詳細に説明する。本発明に係る脂質膜構造体は陽イオン性界面活性剤が修飾されてなる脂質膜を１枚膜としてまたは複数膜の最外膜として有する。
【００２７】
本発明において、「脂質膜」とは、脂質膜構造体が有する、脂質を主な構成成分とする膜をいう。本発明における脂質膜は、脂質分子が疎水性部分同士を会合させて二層に並んで形成する脂質二重層（ｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒ）からなるものでもよく、疎水性部分を内側または外側に向けて形成する一重層からなるものでもよい。
【００２８】
本発明における脂質膜構造体の好ましい形態としては、脂質二重層からなる脂質膜を有する閉鎖小胞を挙げることができ、そのような脂質膜構造体としては、例えば、リポソームを挙げることができる。
【００２９】
本発明において、脂質膜構造体が有する脂質膜の枚数は１枚であってもよく、２以上の複数枚であってもよい。本発明に係る脂質膜構造体が複数膜を有する場合、少なくとも最外膜に陽イオン性界面活性剤が修飾されてなる脂質膜を有するが、最外膜のみならず、最外膜以外の１または複数の膜が陽イオン性界面活性剤が修飾されてなる脂質膜であってもよい。
【００３０】
本発明において、「陽イオン性界面活性剤」は、界面活性剤のうち、陽イオン性の親水基を有するものをいい、イオン価は特に限定されないが、１価であることが好ましい。陽イオン性界面活性剤としては、具体的には、例えば、トリメチルテトラデシルアンモニウムクロライド、セチルトリメチルアンモニウムブロマイドなどのアルキルトリメチルアンモニウム塩、ドデシルエチルジメチルアンモニウムブロマイド、エチルヘキサデシルジメチルアンモニウムブロマイドなどのジアルキルジメチルアンモニウム塩、ベンジルドデシルジメチルアンモニウムブロマイド、ベンジルテトラデシルジメチルアンモニウムブロマイド、ベンジルヘキサデシルジメチルアンモニウムブロマイド、ベンジルオクタデシルジメチルアンモニウムブロマイド、塩化ベンザルコニウムなどのアルキルジメチルベンジルアンモニウム塩、トンゾニウムブロマイド、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化デカリニウム、第１級アミン塩、第２級アミン塩、Ｎメチルビスヒドロキシエチルアミン脂肪酸エステル塩酸塩などの第３級アミン塩などに由来する陽イオンを挙げることができるが、このうち、下記式（化１）
【化１】
2012117971.tif 000011
［式中：Ｒ１はアルキル基であり、Ｒ２は疎水基である。］で示される陽イオン性界面活性剤が好ましく、上記式（化１）において、Ｒ１が炭素数が１２以上のアルキル基であり、かつＲ２が次式（化２）
【化２】
2012117971.tif 000012
またはＲ２が次式（化３）
【化３】
2012117971.tif 000013
で示される陽イオン性界面活性剤であることがさらに好ましい。
【００３１】
なお、本発明における「疎水基」としては、例えば、上記式（化２）および（化３）で示される基のほか、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基などのアルキル基、アルケニル基、ビニール基、フェニル基やナフチル基などのアリール基といった炭化水素基や複素環、または親水基と疎水基が組み合わされて、全体として疎水性である基を挙げることができる。
【００３２】
本発明において、陽イオン性界面活性剤が修飾されてなる脂質膜の態様としては、例えば、図２に示すように、脂質膜を構成する脂質分子の間隙に陽イオン性界面活性剤が位置する態様の他、脂質膜を構成する脂質分子に、共有結合、水素結合、イオン結合、疎水結合、あるいはファンデルワールス結合により陽イオン性界面活性剤が結合する態様などを挙げることができる。
【００３３】
また、本発明において、脂質膜構造体は、正帯電性、非帯電性、両（正負）帯電性および負帯電性のいずれでもよいが、負帯電性であることが好ましい。なお、本発明における「負帯電性脂質膜構造体」とは、全体として負帯電性である脂質膜構造体をいい、例えば、脂質膜の構成脂質として正帯電性脂質や両（正負）帯電性脂質、非帯電性脂質を含むため、または陽イオン性界面活性剤が修飾されているために、局所的に正帯電性や両（正負）帯電性、非帯電性であるものであっても、全体として負帯電性であれば「負帯電性脂質膜構造体」に包含される。
【００３４】
本発明における脂質膜構造体を構成する脂質は、正帯電性脂質、両（正負）帯電性脂質や非帯電性脂質を含む中性脂質、負帯電性脂質のいずれでもよく、脂質の種類としては、例えば、リン脂質、糖脂質、ステロール、長鎖脂肪族アルコールあるいはグリセリン脂肪酸エステルなどを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。
【００３５】
リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンなど）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロールなど）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレオイルグリセロフォスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）など）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸（ＰＡ）、カルジオリピン、またはこれらの水素添加物、卵黄、大豆その他の動植物に由来する天然脂質（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチンなど）などを挙げることができ、これらのうちの１種または２種以上を用いることができる。
【００３６】
糖脂質としては、スフィンゴミエリン、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリドなどのグリセロ糖脂質、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシドなどのスフィンゴ糖脂質などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。
【００３７】
ステロールとしては、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロールなどの動物由来のステロール、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロールなどの植物由来のステロール（フィトステロール）、チモステロール、エルゴステロールなどの微生物由来のステロールなどを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。また、これらのステロールは、一般には脂質二重層を物理的または化学的に安定させるために、あるいは膜の流動性を調節するために用いることができる。
【００３８】
長鎖脂肪酸または長鎖脂肪族アルコールとしては、炭素数１０〜２０の脂肪酸またはそのアルコールを使用することができる。そのような長鎖脂肪酸または長鎖脂肪族アルコールとしては、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、アラキジン酸、マルガリン酸、ツベルクロステアリン酸などの飽和脂肪酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、アラキドン酸、バクセン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エレオステアリン酸などの不飽和脂肪酸、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、リノリルアルコールなどを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。
【００３９】
グリセリン脂肪酸エステルとしては、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリドを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。
【００４０】
正帯電性脂質としては、上述した脂質の他、例えば、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロライド（ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＤＯＤＡＣ）、Ｎ−（２，３−オレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（Ｎ−（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ、ＤＯＴＭＡ）、ジドデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｄｏｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ ｐｒｏｐａｎｅ、ＤＯＴＡＰ）、３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモールコレステロール（３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）−ｃａｒｂａｍｏｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ、ＤＭＲＩＥ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ−Ｎ−［２（ｓｐｅｒｍｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｕｍ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、ＤＯＳＰＡ）などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。
【００４１】
また、両（正負）帯電性脂質や非帯電性脂質を含む中性脂質としては、上述した脂質の他、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミドなどを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。また、負帯電性脂質としては、上述した脂質の他、例えば、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−スクシニルＰＥ）、ホスファチジルエチレングリコール、コレステリルヘミスクシネート（ＣＨＥＭＳ）などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。
【００４２】
本発明に係る脂質膜構造体の脂質膜には、上述した脂質の他に、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエンなどの抗酸化剤、ステアリルアミン、オレイルアミンなどの正荷電を付与する荷電物質、ジセチルホスフェートなどの負電荷を付与する荷電物質、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質などの膜タンパク質、脂質膜構造体に細胞透過能や核移行能を付与するペプチドを結合または含有させることができ、その結合量や含有量は適宜調節することができる。
【００４３】
本発明に係る陽イオン性界面活性剤が修飾されてなる脂質膜を１枚膜としてまたは複数膜の最外膜として有する脂質膜構造体は、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結・融解法などの公知の方法を用いて製造することができるが、特に、図１下段に示すように、陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを調製して水和法を行うことにより、簡便に製造することができる。なお、本発明において、「脂質フィルム」は、脂質を有機溶剤に溶解させた後、有機溶剤を蒸発除去することにより、容器の底面または側面に張り付くようなかたちで形成される、脂質分子を主な構成成分とする膜をいう。
【００４４】
次に、本発明は脂質膜構造体を製造する方法を提供する。本発明に係る脂質膜構造体を製造する方法は、陽イオン性界面活性剤が修飾されてなる脂質膜を１枚膜としてまたは複数膜の最外膜として有する脂質膜構造体を製造する方法であって、
（ｉ）脂質と陽イオン性界面活性剤とを混合して陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを調製する工程、
（ｉｉ）脂質フィルムに陽イオン性界面活性剤を加えて陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを調製する工程、
（ｉｉｉ）１枚膜または複数膜の脂質膜を有する脂質膜構造体の１枚膜または複数膜の最外膜に陽イオン性界面活性剤を修飾する工程、
以上（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の工程を有する。なお、本発明に係る脂質膜構造体を製造する方法において、上述した本発明に係る脂質膜構造体の構成と同等または相当する構成については再度の説明を省略する。
【００４５】
工程（ｉ）において、脂質と陽イオン性界面活性剤とを混合して陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを調製する方法としては、例えば、脂質を有機溶媒に溶解させて得た溶液（脂質溶液）と陽イオン性界面活性剤を有機溶媒に溶解させて得た溶液（陽イオン性界面活性剤溶液）とを混合した後に、脂質溶液に陽イオン性界面活性剤を添加して混合ないし溶解させた後に、陽イオン性界面活性剤溶液に脂質を添加して混合ないし溶解させた後に、あるいは脂質と陽イオン性界面活性剤とを同時に有機溶媒に溶解させた後に、それぞれ有機溶剤を蒸発させて除去する方法を挙げることができる。
【００４６】
なお、本発明において、脂質および陽イオン性界面活性剤を溶解させる有機溶媒としては、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサンなどの炭化水素類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素類、メタノール、エタノールなどの低級アルコール類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類などを、単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００４７】
工程（ｉｉ）において、脂質フィルムに陽イオン性界面活性剤を加えて陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを調製する方法としては、例えば、脂質フィルムに陽イオン性界面活性剤溶液を添加した後、溶媒を蒸発させて除去する方法を挙げることができる。
【００４８】
工程（ｉｉｉ）において、１枚膜または複数膜の脂質膜を有する脂質膜構造体の１枚膜または複数膜の最外膜に陽イオン性界面活性剤を修飾する方法としては、例えば、１枚膜または複数膜の脂質膜を有する脂質膜構造体に陽イオン性界面活性剤を添加する方法を挙げることができる。
【００４９】
また、本発明に係る脂質膜構造体を製造する方法が、工程（ｉ）または工程（ｉｉ）を有する場合には、
（ｉｖ）前記調製した脂質フィルムを水和させて脂質膜構造体を調製する工程、
以上（ｉｖ）の工程を有することもできる。
【００５０】
工程（ｉｖ）において、脂質フィルムを水和させて脂質膜構造体を調製する方法としては、例えば、脂質フィルムに水などの液体を添加して水和させた後、攪拌または超音波処理する方法、すなわち水和法を挙げることができる。
【００５１】
次に、本発明は、１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法を提供する。本発明に係る１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法は、
（ｉ）脂質と陽イオン性界面活性剤とを混合して陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを調製する工程、
（ｉｉ）脂質フィルムに陽イオン性界面活性剤を加えて陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを調製する工程、
以上（ｉ）または（ｉｉ）の工程を有する。なお、本発明に係る１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法において、上述した本発明に係る脂質膜構造体または脂質膜構造体の製造方法の構成と同等または相当する構成については再度の説明を省略する。
【００５２】
また、本発明に係る１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法は、
（ｉｖ）前記調製した脂質フィルムを水和させて脂質膜構造体を調製する工程、
以上（ｉｖ）の工程を有することもできる。
【００５３】
本発明において、「目的物質」とは、脂質膜構造体に封入される予定の物質または封入された物質をいう。本発明において目的物質はいかなる物質でもよく、例えば、薬剤、核酸、ペプチド、タンパク質、糖またはこれらの複合体などの種々の生理活性物質やリポソーム、ミセルなどの脂質膜構造体を挙げることができ、診断、治療などの目的に応じて適宜選択することができる。目的物質は、例えば、脂質膜構造体の製造にあたり脂質膜を水和する際に使用される水性溶媒に添加することにより、脂質膜構造体内部の水相に封入することができる。
【００５４】
例えば、本発明に係る１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法において、１枚の脂質膜を有するリポソームを目的物質とすれば、２枚の脂質膜を有するリポソームを得ることができ、２枚の脂質膜を有するリポソームを目的物質とすれば、３枚の脂質膜を有するリポソームを得ることができる。なお、目的物質の脂質膜構造体には、種々の機能性分子によって修飾をしてもよく、修飾物質としては、例えば、標的部位への移行性や細胞透過能を向上させるペプチド、脂質膜構造体の安定性を向上させるＰＬＬやＢＳＡ、荷電物質などを挙げることができる。
【００５５】
本発明に係る脂質膜構造体は、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン緩衝液，酢酸緩衝液などの適当な水性溶媒に分散させて使用することができる。分散液には、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤などの添加剤を適宜添加してもよい。また、本発明に係る脂質膜構造体は、前記の分散液を乾燥させた状態で保存することができる。さらに、本発明に係る脂質膜構造体は、経口投与することができる他、静脈、腹腔内、皮下、経鼻などへの非経口投与も可能である。
【００５６】
なお、これまでに記載した本発明の脂質膜構造体、脂質膜構造体の製造方法および１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法においては、脂質フィルムに加える陽イオン性界面活性剤の量を総脂質に対して１０〜３０ｍｏｌ％の範囲とすることで、製造される、あるいは目的物質が封入される脂質膜構造体の粒子径を、おおよそ５０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲で制御することも可能である。また、核酸などの粒子を封入するときは、封入される粒子のサイズに応じ前記の範囲で陽イオン界面活性剤の量を調節することが好ましい。
【００５７】
以下、本発明に係る脂質膜構造体、脂質膜構造体の製造方法および１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００５８】
＜実施例１＞陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質膜を有するリポソームの粒子径の検討
（１）核酸ナノ粒子の調製
［１−１］プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の調製
１０ｍｇ／ｍＬのカナマイシン水溶液１０μＬを添加したＬＢ培地１０ｍＬに、ＣＭＶプロモーターの下流にＥｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）−ルシフェラーゼ融合タンパク質遺伝子がコードされたプラスミドＤＮＡを有する大腸菌（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を植菌して、３７℃にて８−９時間振とう培養を行うことにより、第１大腸菌懸濁液を調製した。【００５９】
続いて、１０ｍｇ／ｍＬのカナマイシン水溶液１ｍＬを添加したＬＢ培地１Ｌに、第１大腸菌懸濁液５ｍＬを添加した後、３７℃にて約１６時間振とう培養を行うことにより、第２大腸菌懸濁液を調製した。【００６０】
次に、第２大腸菌懸濁液について、４℃、４０００×ｇの条件下で１５分間遠心分離を行った後、上清を除去して大腸菌ペレットを調製した。続いて、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ Ｋｉｔを用いて、添付の仕様書に従ってＤＮＡの抽出および精製を行い、粗精製ｐＤＮＡ水溶液を調製した。【００６１】
続いて、粗精製ｐＤＮＡ水溶液１７．５ｍＬにイソプロパノール１７．５ｍＬを添加した後、直ちに、４℃、１５０００×ｇの条件下で３０分間遠心分離を行った。上清を慎重に除去した後、エンドトキシン未含有水で調製した７０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液７．５ｍＬを添加し、再度４℃、１５０００×ｇの条件下で３０分間遠心分離を行った。上清を慎重に除去して、得られたペレットを適度に乾燥させた後、適量の滅菌水を添加して溶解させ、これを精製ｐＤＮＡ水溶液とした。続いて、精製ｐＤＮＡ水溶液から適量をとり、これを滅菌水で２００倍に希釈した後、２６０ｎｍで吸光度測定を行って、精製ｐＤＮＡ水溶液の濃度を測定した。濃度の測定結果に基づき、滅菌水で希釈することにより、精製ｐＤＮＡ水溶液の濃度を１．０ｍｇ／ｍＬに調製した。その後、エッペンドルフチューブに１００μＬずつ分注し、−２０℃で保存した． 【００６２】
［１−２］核酸ナノ粒子の調製
陽イオン性ポリマーであるＰｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ（ＰＬＬ；分子量２７４００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を滅菌水に溶解して、１．０ｍｇ／ｍＬのＰＬＬ水溶液を調製した。続いて、ＰＬＬ水溶液および本実施例（１）［１−１］の精製ｐＤＮＡ水溶液を、１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３５−７．４０）で希釈することにより、０．１ｍｇ／ｍＬのＰＬＬ溶液および０．１ｍｇ／ｍＬのｐＤＮＡ溶液を調製した。【００６３】
ボルテックスしながら、ＰＬＬ溶液に同量のｐＤＮＡ溶液を穏やかに滴下することにより、ＰＬＬとｐＤＮＡとが静電的相互作用により結合して凝縮した粒子（核酸ナノ粒子）を含む溶液（核酸ナノ粒子溶液；終濃度０．０５ｍｇ／ｍＬ）を調製した。【００６４】
［１−３］核酸ナノ粒子の粒子径およびゼータ電位の測定
本実施例（１）［１−２］の核酸ナノ粒子について、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて、動的光散乱法により粒子径を、電気泳動法によりゼータ電位をそれぞれ測定した。【００６５】
（２）脂質フィルムの調製
［２−１］界面活性剤溶液の調製
陽イオン性界面活性剤であるベンジルドデシルジメチルアンモニウムブロマイド（ＢＢ−１；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ベンジルテトラデシルジメチルアンモニウムブロマイド（ＢＢ−２；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ベンジルヘキサデシルジメチルアンモニウムブロマイド（ＢＢ−３；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ベンジルヘキサデシルジメチルアンモニウムブロマイド（ＢＢ−３；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）およびベンジルオクタデシルジメチルアンモニウムブロマイド（ＢＢ−４；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ならびに非イオン性界面活性剤であるｎ−Ｏｃｔｙｌ β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＯＧ；東京化成工業社）をそれぞれ３．０３ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにエタノールに溶解することにより、ＢＢ−１溶液、ＢＢ−２溶液、ＢＢ−３溶液、ＢＢ−４溶液およびＯＧ溶液を調製した。なお、ＢＢ−１、ＢＢ−２、ＢＢ−３およびＢＢ−４の構造を図３最上段に、ＯＧの構造を図３最下段にそれぞれ示す。【００６６】
［２−２］混合脂質溶液の調製
両（正負）帯電性脂質であるジオレオイルグリセロフォスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社）をエタノール：クロロホルム＝１：１（ｖ／ｖ）となるように混合したエタノール／クロロホルム溶液に１５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解することにより、ＤＯＰＥ溶液を調製した。また、負帯電性脂質であるコレステリルヘミスクシネート（ＣＨＥＭＳ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）をエタノールに１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解することにより、ＣＨＥＭＳ溶液を調製した。【００６７】
ＤＯＰＥ溶液７．５μＬとＣＨＥＭＳ溶液２５μＬとを混合して、ｍｏｌ比がＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ＝９：２である混合脂質溶液（終濃度０．５５ｍｍｏｌ／Ｌ）を１１サンプル調製し、それぞれａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊおよびｋとした。【００６８】
［２−３］脂質フィルムの調製
本実施例（２）［２−２］のａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊおよびｋに、本実施例（２）［２−１］のＢＢ−１溶液、ＢＢ−２溶液、ＢＢ−３溶液、ＢＢ−４溶液およびＯＧ溶液を下記のとおり添加して、界面活性剤の脂質に対するｍｏｌ％（修飾濃度）が０、１１および１６．５である界面活性剤／混合脂質溶液を調製した。【００６９】
修飾濃度（ｍｏｌ％）
ａ；添加せず（コントロール）          ０
ｂ；ＢＢ−１溶液  ５    μＬ        １１
ｃ；ＢＢ−１溶液  ７．５μＬ        １６．５
ｄ；ＢＢ−２溶液  ５    μＬ        １１
ｅ；ＢＢ−２溶液  ７．５μＬ        １６．５
ｆ；ＢＢ−３溶液  ５    μＬ        １１
ｇ；ＢＢ−３溶液  ７．５μＬ        １６．５
ｈ；ＢＢ−４溶液  ５    μＬ        １１
ｉ；ＢＢ−４溶液  ７．５μＬ        １６．５
ｊ；ＯＧ溶液      ５    μＬ        １１
ｋ；ＯＧ溶液      ７．５μＬ        １６．５【００７０】
続いて、真空ポンプを用いた減圧乾燥処理によって乾燥を行った後、２５０μＬずつクロロホルムを添加して再溶解させ、再度、減圧乾燥処理を行うことにより、界面活性剤が修飾されていない脂質フィルム（ａ）、ＢＢ−１が修飾された脂質フィルム（ｂおよびｃ）、ＢＢ−２が修飾された脂質フィルム（ｄおよびｅ）、ＢＢ−３が修飾された脂質フィルム（ｆおよびｇ）、ＢＢ−４が修飾された脂質フィルム（ｈおよびｉ）ならびにＯＧが修飾された脂質フィルム（ｊおよびｋ）を調製した。【００７１】
（３）核酸ナノ粒子を封入したリポソームの調製
本実施例（２）のａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊおよびｋに、本実施例（１）［１−２］の核酸ナノ粒子溶液を２５０μＬずつ添加して、室温にて１５分間静置することにより、各脂質フィルムを水和させた。続いて、バスタイプソニケータ（ＡＵ−２５Ｃ；アイワ医科工業社）を用いて超音波処理を行うことにより、核酸ナノ粒子が封入されたリポソーム（核酸ナノ粒子封入リポソーム）として、界面活性剤が修飾されていない脂質膜を有するリポソーム（ａ）、ＢＢ−１が修飾された脂質膜を有するリポソーム（ｂ、ｃ）、ＢＢ−２が修飾された脂質膜を有するリポソーム（ｄ、ｅ）、ＢＢ−３が修飾された脂質膜を有するリポソーム（ｆ、ｇ）、ＢＢ−４が修飾された脂質膜を有するリポソーム（ｈ、ｉ）およびＯＧが修飾された脂質膜を有するリポソーム（ｊ、ｋ）を調製した。【００７２】
（４）リポソームの粒子径およびゼータ電位の測定
本実施例（３）のａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊおよびｋについて、本実施例（１）［１−３］に記載の方法により、粒子径およびゼータ電位を測定した。【００７３】
本実施例（１）［１−２］〜（４）の実験を３回以上繰り返し、各サンプルについて得られた結果の平均値および標準偏差（ＳＤ）を算出した。その結果を下記表１に示す。また、粒子径の測定結果について、グラフ化したものを図４ＡおよびＢに、ゼータ電位の測定結果について、グラフ化したものを図４ＣおよびＤにそれぞれ示す。【００７４】
【表１】
2012117971.tif 000014
【００７５】
表１、図４ＡおよびＢに示すように、リポソームの粒子径は、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈおよびｉはａと比較して小さいのに対し、ｊおよびｋはａと比較してほとんど同じであった。また、同種の界面活性剤が修飾された脂質膜を有するリポソームにおいて比較すると、ｂ＞ｃ、ｄ＞ｅ、ｆ＞ｇおよびｈ＞ｉであるのに対し、ｊ≒ｋであった。【００７６】
これらの結果から、陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質膜を有するリポソームは、界面活性剤が修飾されていない脂質膜を有するリポソームと比較して粒子径が小さいこと、および陽イオン性界面活性剤の修飾濃度が大きいほど粒子径が小さくなることが明らかになった。一方、非イオン性界面活性剤が修飾された脂質膜を有するリポソームは、界面活性剤が修飾されていない脂質膜を有するリポソームと比較して、非イオン性界面活性剤の修飾濃度にかかわらず、粒子径がほとんど同じであることが明らかになった。【００７７】
すなわち、陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを用いて水和法を行うことにより、微小な粒子径を有するリポソームが得られることが明らかになった。【００７８】
また、表１および図４Ａに示すように、界面活性剤の修飾濃度が同じであるリポソーム同士を比較すると、粒子径はｂ＞ｄ＞ｆ≒ｈおよびｃ＞ｅ＞ｇ≒ｉであった。これらの結果から、脂質膜に修飾された陽イオン性界面活性剤が有するアルキル基の炭素数が１６より小さい場合は、炭素数が大きいほどリポソームの粒子径が小さくなるのに対し、炭素数が１６より大きい場合は、リポソームの粒子径はそれ以上減少せず、ほぼ一定となることが明らかになった。【００７９】
また、表１、図４ＣおよびＤに示すように、ゼータ電位について、核酸ナノ粒子が正であるのに対し、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊおよびｋはいずれも負であった。これらの結果から、陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質膜を有するリポソームは、修飾濃度が少なくとも１１ｍｏｌ％および１６．５ｍｏｌ％の場合は、界面活性剤が修飾されていない脂質膜を有するリポソームおよび非イオン性界面活性剤が修飾された脂質膜を有するリポソームと同様に、構成脂質に由来する負帯電性が維持された負帯電性リポソームとなることが明らかになった。【００８０】
＜実施例２＞トンゾニウムブロマイド（ＴＢ）が修飾された脂質膜を有するリポソームの粒子径の検討
（１）核酸ナノ粒子の調製
実施例１（１）［１−２］および［１−３］に記載の方法により、核酸ナノ粒子を調製して、粒子径およびゼータ電位を測定した。【００８１】
（２）脂質フィルムの調製
［２−１］界面活性剤溶液の調製
陽イオン性界面活性剤であるトンゾニウムブロマイド（ＴＢ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を３．０３ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにエタノールに溶解することにより、ＴＢ溶液を調製した。なお、ＴＢの構造を図３中段に示す。【００８２】
［２−２］混合脂質溶液の調製
実施例１（２）［２−２］に記載の方法により、混合脂質溶液を６サンプル調製し、それぞれａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆとした。【００８３】
［２−３］脂質フィルムの調製
本実施例（２）［２−２］のａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆについて、実施例１（２）［２−３］に記載の方法により、脂質フィルムの調製を行った。ただし、ＢＢ−１溶液、ＢＢ−２溶液、ＢＢ−３溶液、ＢＢ−４溶液およびＯＧ溶液に代えて、本実施例（２）［２−１］のＴＢ溶液を用いた。また、ＴＢ溶液を添加した量およびＴＢの修飾濃度は下記のとおりとした。【００８４】
修飾濃度（ｍｏｌ％）
ａ；添加せず（コントロール）            ０
ｂ；ＴＢ溶液    ５    μＬ            １１
ｃ；ＴＢ溶液    ７．５μＬ            １６．５
ｄ；ＴＢ溶液  １０    μＬ            ２２
ｅ；ＴＢ溶液  １２．５μＬ            ２７．５
ｆ；ＴＢ溶液  ２５    μＬ            ５５【００８５】
（３）核酸ナノ粒子を封入したリポソームの調製、ならびに粒子径およびゼータ電位の測定
本実施例（２）［２−３］のａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆについて、実施例１（３）に記載の方法により、核酸ナノ粒子封入リポソームとして、ＴＢが修飾されていない脂質膜を有するリポソーム（ＴＢ未修飾リポソーム；ａ）ならびにＴＢが修飾された脂質膜を有するリポソーム（ＴＢ修飾リポソーム；ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆ）を調製した。その後、実施例１（１）［１−３］に記載の方法により、粒子径およびゼータ電位を測定した。【００８６】
本実施例（１）〜（３）の実験を３回以上繰り返し、各サンプルについて得られた結果の平均値および標準偏差（ＳＤ）を算出した。その結果を下記表２に示す。また、粒子径の測定結果について、グラフ化したものを図５Ａに、ゼータ電位の測定結果について、グラフ化したものを図５Ｂにそれぞれ示す。【００８７】
【表２】
2012117971.tif 000015
【００８８】
表２および図５Ａに示すように、リポソームの粒子径は、ａ＞ｂ＞ｃ＞ｄ≒ｅ≒ｆであった。【００８９】
これらの結果から、ＴＢ修飾リポソームは、ＴＢ未修飾リポソームと比較して、粒子径が小さくなることが明らかになった。また、ＴＢの修飾濃度が少なくとも２２ｍｏｌ％より小さい場合は、修飾濃度が大きいほど、リポソームの粒子径が小さくなるのに対し、少なくとも２２ｍｏｌ％より大きい場合は、リポソームの粒子径はそれ以上減少せず、ほぼ一定となることが明らかになった。【００９０】
さらに、表２および図５Ａに示すように、ｄ、ｅおよびｆの粒子径は、約１３０ｎｍであり、核酸ナノ粒子の粒子径である約１００ｎｍにかなり近い値であった。ここで、図５Ｃに示すように、脂質膜の厚さは約４ｎｍであり、これに内水相の厚さを合わせると約１５ｎｍであることから、１の核酸ナノ粒子を１枚の脂質膜で封入したリポソームの粒子径は、約１００ｎｍ＋約１５ｎｍ×２＝約１３０ｎｍとなると考えられる。このことから、ｄ、ｅおよびｆは、１の核酸ナノ粒子を１枚の脂質膜で封入したリポソームであることが明らかになった。すなわち、ＴＢが少なくとも２２ｍｏｌ％程度修飾された脂質フィルムを用いて水和法を行うことにより得られたリポソームは、１の目的物質が１枚の脂質膜で封入されたリポソームであることが明らかになった。【００９１】
以上の結果から、陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを用いて水和法を行うことにより、１の目的物質を１枚の脂質膜で封入することができることが明らかになった。【００９２】
また、表２および図５Ｂに示すように、ゼータ電位は、核酸ナノ粒子は正であるのに対し、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆはいずれも負であった。これらの結果から、ＴＢの修飾濃度が５５ｍｏｌ％より小さいＴＢ修飾リポソームは、ＴＢ未修飾リポソームと同様に、構成脂質に由来する負帯電性が維持された負帯電性リポソームとなることが明らかになった。【００９３】
（４）核酸ナノ粒子を封入していないリポソーム（空リポソーム）の調製、ならびに粒子径およびゼータ電位の測定
［４−１］混合脂質溶液の調製
実施例１（２）［２−２］に記載の方法により、混合脂質溶液を６サンプル調製し、それぞれｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋおよびｌとした。【００９４】
［４−２］脂質フィルムの調製
本実施例（４）［４−１］のｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋおよびｌについて、本実施例（２）［２−３］に記載の方法により、脂質フィルムの調製を行った。ただし、ＴＢ溶液を添加した量およびＴＢの修飾濃度は下記のとおりとした。【００９５】
修飾濃度（ｍｏｌ％）
ｇ；添加せず（コントロール）            ０
ｈ；ＴＢ溶液    ５    μＬ            １１
ｉ；ＴＢ溶液    ７．５μＬ            １６．５
ｊ；ＴＢ溶液  １０    μＬ            ２７．５
ｋ；ＴＢ溶液  １２．５μＬ            ５５
ｌ；ＴＢ溶液  ２５    μＬ          １１０【００９６】
［４−３］空リポソームの調製、ならびに粒子径およびゼータ電位の測定
本実施例（４）［４−１］のｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋおよびｌについて、実施例１（３）に記載の方法において、核酸ナノ粒子溶液を滅菌水に代えて、核酸ナノ粒子を封入していないリポソーム（空リポソーム）として、ＴＢが修飾されていない脂質膜を有するリポソーム（ＴＢ未修飾空リポソーム；ｇ）ならびにＴＢが修飾された脂質膜を有するリポソーム（ＴＢ修飾空リポソーム；ｈ、ｉ、ｊ、ｋおよびｌ）を調製した。その後、実施例１（１）［１−３］に記載の方法により、粒子径およびゼータ電位を測定した。【００９７】
本実施例（４）［４−１］〜［４−３］の実験を３回以上繰り返し、各サンプルについて得られた結果の平均値および標準偏差（ＳＤ）を算出した。その結果を表３に示す。また、粒子径の測定結果について、グラフ化したものを図６Ａに、ゼータ電位の測定結果について、グラフ化したものを図６Ｂにそれぞれ示す。【００９８】
【表３】
2012117971.tif 000016
【００９９】
表３および図６Ａに示すように、空リポソームの粒子径は、ｈ、ｉ、ｊ、ｋおよびｌのいずれも、ｇの粒子径と比較して小さかった。また、ｈ＞ｉ＞ｋ＞ｊ＞ｌであった。これらの結果から、ＴＢ修飾空リポソームは、ＴＢ未修飾空リポソームと比較して、粒子径が小さくなることが明らかになった。【０１００】
すなわち、陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを用いて水和法を行うことにより、目的物質が封入されているか否かにかかわらず、微小な粒子径を有するリポソームが得られることが明らかになった。【０１０１】
また、図６Ｂに示すように、ゼータ電位は、ｇ、ｈ、ｉおよびｊはいずれも負であるのに対し、ｋおよびｌは正であった。これらの結果から、ＴＢの修飾濃度が少なくとも５５ｍｏｌ％以上であるＴＢ修飾空リポソームは、正帯電性リポソームとなるのに対し、ＴＢの修飾濃度が５５ｍｏｌ％より小さいＴＢ修飾空リポソームは、ＴＢ未修飾空リポソームと同様に、構成脂質に由来する負帯電性が維持された負帯電性リポソームとなることが明らかになった。【０１０２】
＜実施例３＞ＴＢ修飾リポソームのトランスフェクション活性の検討
（１）Ｒ８／ＴＢ修飾リポソームの調製
［１−１］ＴＢ修飾リポソームおよびＴＢ未修飾リポソームの調製
実施例２（１）、（２）［２−１］、［２−２］、［２−３］および（３）に記載の方法により、核酸ナノ粒子封入リポソームとして、ＴＢ未修飾リポソーム、修飾濃度１１ｍｏｌ％、１６．５ｍｏｌ％および２２ｍｏｌ％のＴＢ修飾リポソーム（１１ｍｏｌ％ＴＢ修飾リポソーム、１６．５ｍｏｌ％ＴＢ修飾リポソームおよび２２ｍｏｌ％ＴＢ修飾リポソーム）を調製した。【０１０３】
［１−２］Ｒ８の修飾
リポソームに一定の細胞透過能を付与することが知られているペプチドであるＲ８（ＲＲＲＲＲＲＲＲ；配列番号６）（小暮健太郎、薬学雑誌、第１２７巻、第１０号、第１６８５−１６９１頁、２００７年）のＣ末にステアリン酸（ＳＴＲ）が付加されたペプチド修飾脂肪酸（ＳＴＲ−Ｒ８）をＫＵＲＯＢＯ社より購入し、滅菌水に２．０ｍｇ／ｍＬとなるよう溶解してＳＴＲ−Ｒ８溶液を調製した。【０１０４】
本実施例（１）［１−１］の各リポソームを含む溶液１００ｍＬに、ＳＴＲ−Ｒ８溶液を２．３３ｍＬずつ添加して混和した後、室温にて３０分間インキュベーションすることにより、リポソームの全脂質の５ｍｏｌ％にＲ８を修飾した。【０１０５】
（２）トランスフェクション活性の検討
［２−１］培地の調製
抗生物質を含有しないＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）を常法に従って調製した後、クリーンベンチ内で濾過滅菌を行い、これをＤＭＥＭ（−）培地とした。また、ＤＭＥＭに２０％（ｖ／ｖ）となるようＦｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を添加し、これをＤＭＥＭ（＋）培地とした。ＤＭＥＭ（−）培地およびＤＭＥＭ（＋）培地は使用時まで４ ℃で保存した。【０１０６】
［２−２］リポソーム含有培地の調製
本実施例（１）［１−２］の各リポソームについて、ｐＤＮＡ０．０４μｇ相当量およびｐＤＮＡ０．１μｇ相当量を本実施例（２）［２−１］のＤＭＥＭ（−）培地に添加して、０．２５ｍＬのリポソーム含有培地を調製し、ａ−１、ａ−２、ｂ−１、ｂ−２、ｃ−１、ｃ−２、ｄ−１およびｄ−２とした。各リポソーム含有培地に含まれるリポソームの種類およびｐＤＮＡ量は下記のとおりである。【０１０７】
リポソームの種類                         ｐＤＮＡ量
ａ−１；ＴＢ未修飾リポソーム                      ０．０４μｇ
ａ−２；ＴＢ未修飾リポソーム                      ０．１  μｇ
ｂ−１；１１ｍｏｌ％ＴＢ修飾リポソーム            ０．０４μｇ
ｂ−２；１１ｍｏｌ％ＴＢ修飾リポソーム            ０．１  μｇ
ｃ−１；１６．５ｍｏｌ％ＴＢ修飾リポソーム        ０．０４μｇ
ｃ−２；１６．５ｍｏｌ％ＴＢ修飾リポソーム        ０．１  μｇ
ｄ−１；２２ｍｏｌ％ＴＢ修飾リポソーム            ０．０４μｇ
ｄ−２；２２ｍｏｌ％ＴＢ修飾リポソーム            ０．１  μｇ【０１０８】
［２−３］ＨｅＬａ細胞の前培養
ヒト子宮頸癌由来のＨｅＬａ細胞懸濁液０．５ｍＬ（４×１０４ 個相当）を２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種したものを１２枚調製し、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、ＫおよびＬとした。これらに本実施例（２）［２−１］のＤＭＥＭ（＋）培地を添加して、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で２４時間前培養した。【０１０９】
［２−４］ＨｅＬａ細胞へのトランスフェクション
本実施例（２）［２−３］のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、ＫおよびＬの培地を除去し、０．５ｍＬずつＰＢＳを添加して洗浄した。次に、ＡおよびＢについて、市販のトランスフェクション試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＰＬＵＳ（ＬＦＮ ＰＬＵＳ）を用いて、添付の仕様書に従い、実施例１（１）［１−１］の精製ｐＤＮＡ水溶液のｐＤＮＡ０．０４μｇ相当量およびｐＤＮＡ０．１μｇ相当量をそれぞれトランスフェクションした。また、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪには、ａ−１、ａ−２、ｂ−１、ｂ−２、ｃ−１、ｃ−２、ｄ−１、ｄ−２をそれぞれ添加し、ＫおよびＬには実施例１（１）［１−１］の精製ｐＤＮＡ水溶液のｐＤＮＡ０．０４μｇ相当量およびｐＤＮＡ０．１μｇ相当量をそれぞれ添加して、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で３時間インキュベートすることにより、リポソームを用いたトランスフェクションを行った。【０１１０】
その後、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、ＫおよびＬの培地を本実施例（２）［２−１］のＤＭＥＭ（＋）培地に交換し、同環境下でさらに２１時間後培養した。【０１１１】
（３）ルシフェラーゼ活性の測定および細胞生存率の算出
本実施例（２）［２−４］のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、ＫおよびＬの培地を除去した後、０．５ｍＬずつＰＢＳを添加して細胞を洗浄し、ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を７５μＬずつ添加した。パラフィルムを用いて２４ウェルプレートに封をした後、−８０℃にて３０分間以上インキュベートした。その後、４℃、１５０００×ｇの条件下で５分間遠心分離を行って、上清を５０μＬずつ回収し、各サンプルの細胞ライセートとした。【０１１２】
回収した細胞ライセート２０μＬに ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を５０μＬずつ添加した後、ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ；ＡＴＴＯ社）を用いて、添付の仕様書に従って発光量を測定した。また、細胞ライセートのタンパク質濃度を、ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて、添付の仕様書に従って測定した。これらの結果に基づき、下記式（１）を用いて、ルシフェラーゼ活性の値を求めた。【０１１３】
式（１）；ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／ｍｇ）＝発光量（ＲＬＵ／２０μＬ）×５０／タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）【０１１４】
また、Ａ、Ｃ、Ｅ、ＧおよびＩに対してはＫを、Ｂ、Ｄ、Ｆ、ＨおよびＪに対してはＬをそれぞれ１００％として、下記式（２）を用いて細胞生存率を算出した。【０１１５】
式（２）；細胞生存率（％）＝｛Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩまたはＪのタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）／ＫまたはＬのタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）｝×１００【０１１６】
本実施例（１）および（２）［２−２］〜（３）の実験を３回以上繰り返し、各サンプルについて得られた結果の平均値および標準偏差（ＳＤ）を算出した。ルシフェラーゼ活性の測定結果を下記表４に、細胞生存率の算出結果を表５にそれぞれ示す。また、ルシフェラーゼ活性について、グラフ化したものを図７左図に、細胞生存率の算出結果について、グラフ化したものを図７右図にそれぞれ示す。【０１１７】
【表４】
2012117971.tif 000017
【０１１８】
【表５】
2012117971.tif 000018
【０１１９】
表４および図７左図に示すように、０．０４μｇのＤＮＡをトランスフェクションした場合のルシフェラーゼ活性は、Ｃ＜Ａ＜Ｅ＜Ｇ＜Ｉであった。また、０．１μｇのＤＮＡをトランスフェクションした場合のルシフェラーゼ活性は、Ｄ＜Ｆ＜Ｈ＜Ｂ＜Ｊであった。【０１２０】
これらの結果から、０．０４μｇのＤＮＡをトランスフェクションする場合、ＴＢ修飾リポソームは、ＴＢ未修飾リポソームおよび市販のトランスフェクション試薬と比較して、細胞の核へ遺伝子を導入する活性（トランスフェクション活性）が高いことが明らかになった。また、０．１μｇのＤＮＡをトランスフェクションする場合も、ＴＢ修飾リポソームは、ＴＢ未修飾リポソームと比較して、トランスフェクション活性が高いことが明らかになった。さらに、０．１μｇのＤＮＡをトランスフェクションする場合、２２ｍｏｌ％ＴＢ修飾リポソームは市販のトランスフェクション試薬と比較してトランスフェクション活性が高いことが明らかになった。【０１２１】
すなわち、陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質膜を１枚膜としてまたは複数膜として有するリポソームのトランスフェクション活性が顕著に向上することが明らかになった。【０１２２】
また、表５および図７右図に示すように、細胞生存率はＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、ＫおよびＬのいずれも８０％より大きかった。これらの結果から、修飾濃度が少なくとも１１ｍｏｌ％、１６．５ｍｏｌ％および２２ｍｏｌ％であるＴＢ修飾リポソームはいずれも細胞毒性がないことが明らかになった。【０１２３】
＜実施例４＞リポソームの脂質膜の枚数についての検討
（１）脂質フィルムの調製
蛍光色素であるＮｉｔｒｏ−２−１，３−Ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ（ＮＢＤ）が結合したＤＯＰＥ（ＮＢＤ標識ＤＯＰＥ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社）をエタノールに０．１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解することにより、ＮＢＤ標識ＤＯＰＥ溶液を調製した。【０１２４】
続いて、実施例１（２）［２−２］に記載の方法により調製した混合脂質溶液にＮＢＤ標識ＤＯＰＥ溶液を添加して、全脂質のうち１ｍｏｌ％がＮＢＤ標識ＤＯＰＥであるＮＢＤ混合脂質溶液を４サンプル調製し、ａ、ｂ、ｃおよびｄとした。【０１２５】
次に、ａ、ｂ、ｃおよびｄについて、実施例２（２）［２−３］に記載の方法において、ＴＢ溶液を添加した量およびＴＢの修飾濃度を下記のとおりとして、ＴＢが修飾された脂質フィルム（ａ）ならびにＴＢが修飾されていない脂質フィルム（ｂ、ｃおよびｄ）を調製した。【０１２６】
修飾濃度（ｍｏｌ％）
ａ；ＴＢ溶液  １０    μＬ            ２２
ｂ；添加せず                            ０
ｃ；添加せず                            ０
ｄ；添加せず                            ０【０１２７】
（２）ＴＢ修飾リポソームおよびＴＢ未修飾リポソームの調製
本実施例（１）のａおよびｂについて、実施例１（３）に記載の方法により、ＮＢＤで標識した核酸ナノ粒子封入リポソームとして、ＴＢ修飾リポソーム（ａ）およびＴＢ未修飾リポソーム（ｂ）を調製した。【０１２８】
（３）多重膜リポソーム（ＭＬＶ）の調製
本実施例（１）のｃに、１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）２５０μＬを添加して、室温にて１５分間静置することにより、脂質フィルムを水和させた。続いて、ボルテックスを１分間行うことにより、ＮＢＤで標識した多重膜リポソーム（ＭＬＶ）を調製した。【０１２９】
（４）１枚膜リポソーム（ＳＵＶ）の調製
本実施例（１）のｄに、１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）２ｍＬを添加して、室温にて１５分間静置することにより、脂質フィルムを水和させた。続いて、バスタイプソニケータ（ＡＵ−２５Ｃ；アイワ医科工業社）を用いて１分間超音波処理を行った。さらに、プローブタイプソニケーターを用いて、氷水冷却下にて１０分間超音波処理を行った。次に、全量を２．０ｍＬ容量のエッペンドルフチューブへ移して、４℃、１５０００ｒｐｍの条件下で５分間遠心分離行い、超音波処理によって発生したチタンナノ粒子を沈降させた。下層の１００μＬを残して上清を回収し、別のエッペンドルフチューブへ移した。この遠心分離および上清回収の操作を計３回行うことにより、ＮＢＤで標識した１枚膜リポソーム（ＳＵＶ）を調製した。【０１３０】
（５）蛍光強度測定
１ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ１０）に０．５ｍｏｌ／Ｌとなるようハイドロサルファイトナトリウム（和光純薬社）を溶解してハイドロサルファイトナトリウム溶液を調製した。【０１３１】
本実施例（２）のａおよびｂ、本実施例（３）のｃ、ならびに本実施例（４）のｄについて、ルミノメーターを用いてＮＢＤの蛍光強度を２００秒間連続して測定した。その間の測定開始から１０秒経過時に、ハイドロサルファイトナトリウム溶液を各サンプルに２．７５μＬずつ添加して５秒間混和した。さらに、測定開始から１０５秒経過時に１０％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液を各サンプルに１２．５μＬずつ添加して５秒間混和した。その結果を下記表６に示す。また、蛍光強度の測定結果を図８上図に示す。【０１３２】
【表６】
2012117971.tif 000019
【０１３３】
なお、ハイドロサルファイトナトリウムは還元作用によってＮＢＤの発色団を還元し、その蛍光を消失させる消光剤である。図８下図に示すように、ハイドロサルファイトナトリウムは脂質膜透過性をもたないため、本実施例において、リポソーム溶液に添加したハイドロサルファイトナトリウムはリポソームの最外膜の脂質二重層のうち外水相と接触する側の層に存在するＮＢＤの蛍光のみを消失させる。従って、リポソームが有する脂質膜の枚数が多いほど、ハイドロサルファイトナトリウム添加後の蛍光強度が大きいと考えられる。【０１３４】
表６および図８上図に示すように、ハイドロサルファイトナトリウム添加後、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加するまでの間の蛍光強度はｃ＞ｂ＞ｄ＞ａであった。これらの結果から、ＴＢ修飾リポソームは、ＴＢ未修飾リポソームおよび従来の方法により調製したリポソームであるＭＬＶよりも、脂質膜の枚数が少ないことが明らかになった。【０１３５】
すなわち、陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを用いて水和法を行うことにより得られたリポソームでは、脂質膜の枚数が抑制されることが明らかになった。【０１３６】
なお、１枚膜リポソームであるＳＵＶと比較してＴＢ修飾リポソームの蛍光強度が小さいのは、ＴＢ修飾リポソームにおいては、脂質膜にＴＢが修飾されていることにより脂質分子のｆｌｉｐ−ｆｌｏｐが起こり、内水相と接触する側に存在していたＮＢＤがリポソーム表面へ露出して消光されたためであると考えられる。【０１３７】
＜実施例５＞ＴＢ修飾脂質膜でのリポソームの封入
（１）負帯電性２枚膜リポソームの調製
既報（国際公開ＷＯ２００７／０３７４４４号パンフレット）に従って、負帯電性２枚膜リポソームを調製した。具体的には、まず、エタノール：クロロホルム＝１：１（ｖ／ｖ）となるように混合したエタノール／クロロホルム溶液に、負帯電性脂質であるホスファチジン酸（ＰＡ）を１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解することにより、ＰＡ溶液を調製した。また、実施例１（２）［２−２］に記載の方法により、ＤＯＰＥ溶液およびＣＨＥＭＳ溶液を、実施例４（１）に記載の方法によりＮＢＤ標識ＤＯＰＥ溶液をそれぞれ調製した。【０１３８】
ＤＯＰＥ溶液６０μＬ、ＣＨＥＭＳ溶液２００μＬおよびＰＡ溶液１２０μＬを混合して、ｍｏｌ比がＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ：ＰＡ＝９：２：１．２である負帯電性混合脂質溶液（計１５２．５ｎｍｏｌ）を調製した。ここに、ＮＢＤ標識ＤＯＰＥ溶液を添加して、全脂質のうち１ｍｏｌ％がＮＢＤ標識ＤＯＰＥであるＮＢＤ負帯電性混合脂質溶液（計１５２．５ｎｍｏｌ）を調製した。【０１３９】
ＮＢＤ負帯電性混合脂質溶液について、実施例４（４）に記載の方法によりＳＵＶを調製した。このＳＵＶを含む溶液に、半量（ｖ／ｖ）の、実施例１（１）［１−１］および［１−２］に記載の方法により調製した核酸ナノ粒子溶液を穏やかに添加した後、５秒間ボルテックスを行うことにより、核酸ナノ粒子を封入してＮＢＤで標識した負帯電性２枚膜リポソームを調製した。【０１４０】
（２）脂質膜でのリポソームの封入
［２−１］正帯電性混合脂質溶液の調製
非帯電性脂質であるコレステロール（Ｃｈｏｌ）およびを正帯電性脂質である１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｏ ｐｒｏｐａｎｅ；ＤＯＴＡＰ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社）をそれぞれエタノールおよびエタノール／クロロホルム＝１：１（ｖ／ｖ）となるように混合したエタノール／クロロホルム溶液に１５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解することにより、Ｃｈｏｌ溶液およびＤＯＴＡＰ溶液を調製した。また、実施例１（２）［２−２］に記載の方法により、ＤＯＰＥ溶液を調製した。【０１４１】
ＤＯＰＥ溶液２９．４μＬ、ＤＯＴＡＰ溶液２２μＬおよびＣｈｏｌ溶液２２μＬを混合して、ｍｏｌ比がＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ：Ｃｈｏｌ＝３：４：３である正帯電性混合脂質溶液（計１３７．５ｎｍｏｌ）を２サンプル調製し、それぞれａおよびｂとした。【０１４２】
［２−２］負帯電性混合脂質溶液の調製
本実施例（１）に記載の方法により、ｍｏｌ比がＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ：ＰＡ＝９：２：１．２である負帯電性混合脂質溶液を２サンプル調製し、それぞれｃおよびｄとした。【０１４３】
［２−３］負帯電性脂質フィルムおよび正帯電性脂質フィルムの調製
本実施例（２）［２−１］のａおよびｂ、ならびに本実施例（２）［２−２］のｃおよびｄについて、実施例２（２）［２−３］に記載の方法において、ＴＢ溶液を添加した量およびＴＢの修飾濃度を下記のとおりとして、ＴＢが修飾された正帯電性脂質フィルム（ａ；ＴＢ修飾正帯電性脂質フィルム）、ＴＢが修飾されていない正帯電性脂質フィルム（ｂ；ＴＢ未修飾正帯電性脂質フィルム）、ＴＢが修飾された負帯電性脂質フィルム（ｃ；ＴＢ修飾負帯電性脂質フィルム）およびＴＢが修飾されていない負帯電性脂質フィルム（ｄ；ＴＢ未修飾負帯電性脂質フィルム）を調製した。【０１４４】
修飾濃度（ｍｏｌ％）
ａ；ＴＢ溶液  １０    μＬ            ２２
ｂ；添加せず                            ０
ｃ；ＴＢ溶液  １０    μＬ            ２２
ｄ；添加せず                            ０【０１４５】
［２−４］リポソームの封入
本実施例（２）［２−３］のＴＢ修飾正帯電性脂質フィルム（ａ）、ＴＢ未修飾正帯電性脂質フィルム（ｂ）、ＴＢ修飾負帯電性脂質フィルム（ｃ）およびＴＢ未修飾負帯電性脂質フィルム（ｄ）に、本実施例（１）の負帯電性２枚膜リポソームを含む溶液を２５０μＬずつ添加して、室温にて１５分間インキュベーショトすることにより、負帯電性２枚膜リポソームの封入を行った。【０１４６】
（３）蛍光強度測定
本実施例（２）［２−４］のａ、ｂ、ｃ、ｄおよび本実施例（１）の負帯電性２枚膜リポソームについて、実施例４（５）に記載の方法により、蛍光強度測定を行った。その結果を下記表７に示す。また、ａ、ｂおよび負帯電性２枚膜リポソームについての結果をグラフ化したものを図９Ａに、ｃ、ｄおよび負帯電性２枚膜リポソームについての結果をグラフ化したものを図９Ｂにそれぞれ示す。【０１４７】
【表７】
2012117971.tif 000020
【０１４８】
なお、ａ、ｂ、ｃ、ｄはＮＢＤで標識したリポソーム（標識リポソーム）をＮＢＤで標識していない脂質膜（未標識脂質膜）で封入することを意図して調製したリポソームである。従って、ハイドロサルファイトナトリウムの添加によりＮＢＤの蛍光が減少した場合は、標識リポソームが未標識脂質膜で封入されていないか、または標識リポソームの脂質膜と未標識脂質膜とが膜融合を生じたと考えられる。一方、ハイドロサルファイトナトリウムの添加によるＮＢＤの蛍光減少の程度が標識リポソームよりも小さい場合は、標識リポソームが未標識脂質膜で封入されたと考えられる。【０１４９】
表７および図９Ａに示すように、ハイドロサルファイトナトリウム添加後、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加するまでの間において、負帯電性２枚膜リポソームが一定の蛍光強度を有するのに対し、ａおよびｂは、ハイドロサルファイトナトリウム添加後まもなく蛍光強度が著しく低下して、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加する直前においては、ほとんど蛍光が検出されなかった。これらの結果から、負帯電性２枚膜リポソームを正帯電性脂質膜で封入する場合は、正帯電性脂質膜におけるＴＢの修飾の有無にかかわらず、膜融合が生じてしまうことが明らかになった。【０１５０】
一方、表７および図９Ｂに示すように、ハイドロサルファイトナトリウム添加後、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加するまでの間において、ｃの蛍光強度は負帯電性２枚膜リポソームと比較して大きく、ｄの蛍光強度は負帯電性２枚膜リポソームと比較してほぼ同じであった。これらの結果から、負帯電性２枚膜リポソームを負帯電性脂質膜で封入する場合は、負帯電性脂質膜にＴＢが修飾されていれば封入することができるのに対し、ＴＢが修飾されていなければ封入することができないことが明らかになった。【０１５１】
以上の結果より、陽イオン性界面活性剤が修飾された負帯電性脂質フィルムを用いて水和法を行うことにより、負帯電性脂質膜で負帯電性リポソームを封入することができることが明らかになった。【０１５２】
すなわち、図１０に示すように、既報に従い２枚膜リポソームを得た後、陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを用いて水和法を行うことにより、１の２枚膜リポソームを１枚の脂質膜で封入して、３枚膜リポソームを得ることができることが明らかになった。【０１５３】
＜実施例６＞ＴＢ修飾３枚膜リポソームのトランスフェクション活性の検討
（１）ＴＢ修飾３枚膜リポソームの調製
実施例５（１）に記載の方法により、核酸ナノ粒子を封入した負帯電性２枚膜リポソームを調製した。ただし、ＮＢＤ標識ＤＯＰＥ溶液は添加しなかった。続いて、実施例５（２）［２−２］、［２−３］および［２−４］に記載の方法により、ＴＢ修飾負帯電性脂質フィルムに負帯電性２枚膜リポソームを封入して、これをＴＢ修飾３枚膜リポソームとした。続いて、実施例３（１）［１−２］に記載の方法により、ＴＢ修飾３枚膜リポソームにＲ８の修飾を行った。【０１５４】
（２）４枚膜リポソームの調製
既報（Ａｋｉｔａ Ｈ．ら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第１５号、第３０巻、第２９４０−２９４９頁、２００９年）に記載の方法において、脂質膜の組成をＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ：ＰＡ＝９：２：１．２として、Ｒ８が修飾された４枚膜リポソームを調製した。【０１５５】
（３）トランスフェクション活性の検討
［３−１］培地の調製
α−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ（α−ＭＥＭ）に下記の試薬を下記の終濃度となるよう添加し、これをα−ＭＥＭ（−）培地とした。【０１５６】
Ｌ−グルタミン         ４ｍｍｏｌ／Ｌ
ピルビン酸ナトリウム   １ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ
５ｎｇ／ｍＬ【０１５７】
また、α−ＭＥＭに下記の試薬を下記の終濃度となるよう添加し、これをα−ＭＥＭ（＋）培地とした。【０１５８】
非働化ＦＢＳ             ２０％（ｖ／ｖ）
Ｌ−グルタミン           ４ｍｍｏｌ／Ｌ
ピルビン酸ナトリウム     １ｍｍｏｌ／Ｌ
ペニシリン                 １００Ｕ／ｍＬ
ストレプトマイシン       １００μｇ／ｍＬ【０１５９】
α−ＭＥＭ（−）培地およびα−ＭＥＭ（＋）培地は使用時まで４ ℃で保存した。【０１６０】
［３−２］リポソーム含有培地の調製
本実施例（１）のＴＢ修飾３枚膜リポソームおよび本実施例（２）の４枚膜リポソームについて、ｐＤＮＡ０．０４μｇ相当量を、本実施例（３）［３−１］のα−ＭＥＭ（−）培地に添加して、０．２５ｍＬの３枚膜リポソーム含有培地および４枚膜リポソーム含有培地を調製した。【０１６１】
［３−３］ＪＡＷＳＩＩ細胞の前培養
非分裂細胞であるＪＡＷＳＩＩ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ)を２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に１．６×１０４ 個／ウェルとなるよう播種したものを３枚調製し、Ａ、ＢおよびＣとした。これらに本実施例（３）［３−１］のα−ＭＥＭ（＋）培地を添加して、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で４８時間前培養した。【０１６２】
［３−４］ＪＡＷＳＩＩ細胞へのトランスフェクション
本実施例（３）［３−２］のＡ、ＢおよびＣの培地を除去し、０．５ｍＬずつＰＢＳを添加して洗浄した。次に、Ａについて、ＬＦＮ ＰＬＵＳを用いて、添付の仕様書に従い、実施例１（１）［１−１］の精製ｐＤＮＡ水溶液のｐＤＮＡ０．０４μｇ相当量をトランスフェクションした。また、ＢおよびＣには、本実施例（３）［３−２］の３枚膜リポソーム含有培地および４枚膜リポソーム含有培地をそれぞれ添加して、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で３時間インキュベートすることにより、トランスフェクションを行った。【０１６３】
その後、Ａ、ＢおよびＣの培地を本実施例（３）［３−１］のα−ＭＥＭ（＋）培地に交換し、同環境下でさらに２１時間後培養した。【０１６４】
（４）ルシフェラーゼ活性の測定
本実施例（３）［３−３］のＡ、ＢおよびＣについて、実施例４（３）に記載の方法により、ルシフェラーゼ活性を測定した。【０１６５】
本実施例（１）、（２）および（３）［３−２］〜（４）の実験を３回以上繰り返し、各サンプルについて得られた結果の平均値および標準偏差（ＳＤ）を算出した。その結果を図１１に示す。【０１６６】
図１１に示すように、ルシフェラーゼ活性は、Ａは３．３×１０６（３２５８８３３）、Ｂは１．２×１０５およびＣは７．５×１０５であった。これらの結果から、ＴＢ修飾３枚膜リポソームのトランスフェクション活性は、市販のトランスフェクション試薬よりは低いものの、４枚膜リポソームと比較して、約６倍も高いことが明らかになった。【０１６７】
すなわち、ＨｅＬａ細胞などの分裂細胞においてのみならず、非分裂細胞においても、陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質膜を複数膜の最外膜として有するリポソームのトランスフェクション活性が顕著に向上することが明らかになった。【０１６８】
＜実施例７＞ＴＢ修飾３枚膜リポソームの最適化の検討
（１）ＰＬＬ安定化２枚膜リポソームおよびＢＳＡ安定化２枚膜リポソームの調製
実施例５（１）に記載の方法により負帯電性２枚膜リポソームを含む溶液を調製した。この負帯電性２枚膜リポソームを含む溶液を１００μＬずつ２サンプル調製し、このうち片方に実施例１（１）［１−２］に記載の方法により調製した１．０ｍｇ／ｍＬのＰＬＬ溶液４．０μＬを添加し、残りの片方には、０．５ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を添加した。その後、室温にて１５分間インキュベートすることにより、ＰＬＬを静電気的に結合させて安定化した負帯電性２枚膜リポソーム（ＰＬＬ安定化２枚膜リポソーム）を含む溶液およびＢＳＡを非特異的に吸着させて安定化した負帯電性２枚膜リポソーム（ＢＳＡ安定化２枚膜リポソーム）を含む溶液を調製した。【０１６９】
（２）ＴＢ修飾３枚膜リポソームの調製
実施例５（２）［２−３］に記載の方法により、ＴＢが修飾された負帯電性脂質フィルムを２サンプル調製し、ａおよびｂとした。続いて、実施例５（２）［２−４］に記載の方法において、実施例５（１）の負帯電性２枚膜リポソームを含む溶液に代えて、ａについては本実施例（２）のＰＬＬ安定化２枚膜リポソームを含む溶液を、ｂについてはＢＳＡ安定化２枚膜リポソームを含む溶液をそれぞれ添加して、ＴＢ修飾３枚膜リポソームを調製した。これらのＴＢ修飾３枚膜リポソームの調製過程の概要を図１２に示す。【０１７０】
（３）蛍光強度測定
本実施例（２）のａ、ｂおよび本実施例（１）の負帯電性２枚膜リポソームについて、実施例４（５）に記載の方法により、蛍光強度測定を行った。その結果を下記表８に示す。また、蛍光強度の測定結果を図１３に示す。【０１７１】
【表８】
2012117971.tif 000021
【０１７２】
表８および図１３に示すように、ハイドロサルファイトナトリウム添加後、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加するまでの間において、ａの蛍光強度は負帯電性２枚膜リポソームと比較して小さいのに対し、ｂの蛍光強度は負帯電性２枚膜リポソームと比較して大きかった。【０１７３】
これらの結果から、ＴＢが修飾された負帯電性脂質フィルムを用いて封入する際に、ＰＬＬ安定化２枚膜リポソームは膜融合を生じさせるのに対し、ＢＳＡ安定化２枚膜リポソームは膜融合をほとんど生じさせずに封入することができることが明らかになった。【０１７４】
＜実施例８＞最適化したＴＢ修飾３枚膜リポソームのトランスフェクション活性の検討
（１）ＴＢ修飾３枚膜リポソームの調製
実施例７（１）に記載の方法により、負帯電性２枚膜リポソーム、ＰＬＬ安定化２枚膜リポソームおよびＢＳＡ安定化２枚膜リポソームをそれぞれ含む溶液を調製した。ただし、ＮＢＤ標識ＤＯＰＥ溶液は添加しなかった。【０１７５】
次に、実施例５（２）［２−３］に記載の方法により、ＴＢが修飾された負帯電性脂質フィルムを３サンプル調製し、ａ、ｂおよびｃとした。続いて、実施例５（２）［２−４］に記載の方法において、実施例５（１）の負帯電性２枚膜リポソームを含む溶液に代えて、ａについては負帯電性２枚膜リポソームを含む溶液を、ｂについてはＰＬＬ安定化２枚膜リポソームを含む溶液を、ｃについてはＢＳＡ安定化２枚膜リポソームを含む溶液をそれぞれ添加して、ＴＢ修飾３枚膜リポソームを調製した。【０１７６】
続いて、ａ、ｂおよびｃについて、実施例３（１）［１−２］に記載の方法により、Ｒ８の修飾を行った。【０１７７】
（２）トランスフェクション活性の検討
本実施例（１）のａ、ｂおよびｃを用いて、実施例６（３）［３−１］、［３−２］および［３−３］に記載の方法により、ＪＡＷＳＩＩ細胞へのトランスフェクションを行った。その後、実施例４（３）に記載の方法により、ルシフェラーゼ活性を測定した。【０１７８】
本実施例（１）および（２）の実験を３回以上繰り返し、各サンプルについて得られた結果の平均値および標準偏差（ＳＤ）を算出した。その結果を図１４に示す。【０１７９】
図１４に示すように、ａおよびｂによりトランスフェクションを行った場合のルシフェラーゼ活性は、市販のトランスフェクション試薬と比較して低いのに対し、ｃによりトランスフェクションを行った場合のルシフェラーゼ活性は、市販のトランスフェクション試薬と比較して同等であった。【０１８０】
これらの結果から、ＢＳＡ安定化２枚膜リポソームを封入したＴＢ修飾３枚膜リポソームのトランスフェクション活性は、ＰＬＬ安定化２枚膜リポソームおよび安定化していない負帯電性２枚膜リポソームを封入したＴＢ修飾３枚膜リポソームと比較して高く、市販のトランスフェクション試薬と同等であることが明らかになった。【０１８１】
すなわち、２枚膜リポソームをＢＳＡによって安定化することにより、陽イオン性界面活性剤が修飾された脂質フィルムを用いてその２枚膜リポソームを封入した３枚膜リポソームのトランスフェクション活性が、顕著に向上することが明らかになった。【０１８２】
＜実施例９＞１枚膜リポソームの顕微鏡写真
実施例２（３）で調製した本発明であるＴＢ修飾リポソームｄ／ＨＥＰＥＳ懸濁液１０μＬを、液体窒素を用いて急速凍結し、固定操作を行なわずそのまま透過型電子顕微鏡で観察した。その観察写真の一部を図１５に示す。【０１８３】
顕微鏡視野において観察される粒子（本発明のリポソーム）の平均粒子径は５０〜１００ｎｍの範囲内にあった。この値は、急速凍結によってＴＢ修飾リポソームの内部に封入されている液体が除去されることを考慮すれば、実施例２（３）で測定した粒子径測定のデータと整合する値である。また、観察された粒子は全て内側の黒い輪郭と外側の白い輪郭とを有していた。黒い輪郭は封入されたコア粒子に相当すると考えられる。また白い輪郭部分は約３．５ｎｍの厚みを有していたが、この値は脂質膜一枚の理論的な厚みである４．０ｎｍに近似するものである。【０１８４】
以上の顕微鏡観察結果は、本発明のリポソームが一枚の脂質膜を備えていることを示すものである。
【図１】
2012117971.tif 000030
【図２】
2012117971.tif 000031
【図３】
2012117971.tif 000032
【図４】
2012117971.tif 000033
【図５】
2012117971.tif 000034
【図６】
2012117971.tif 000035
【図７】
2012117971.tif 000036
【図８】
2012117971.tif 000037
【図９】
2012117971.tif 000038
【図１０】
2012117971.tif 000039
【図１１】
2012117971.tif 000040
【図１２】
2012117971.tif 000041
【図１３】
2012117971.tif 000042
【図１４】
2012117971.tif 000043
【図１５】
2012117971.tif 000044
【手続補正書】
【提出日】平成24年10月17日(2012.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質膜を１枚膜としてまたは複数膜の最外膜として有する脂質膜構造体であって、前記陽イオン性界面活性剤が次式（化１）
【化１】
2012117971.tif 000045
［式中：Ｒ１が炭素数が１２以上のアルキル基であり、かつＲ２が次式（化２）
【化２】
2012117971.tif 000046
または次式（化３）
【化３】
2012117971.tif 000047
の基である。］の陽イオン性界面活性剤である、前記脂質膜構造体。
【請求項４】
Ｒ１が炭素数が１６のアルキル基であり、かつＲ２が次式（化４）
【化４】
2012117971.tif 000048
の基である、請求項３に記載の脂質膜構造体。
【請求項５】
負帯電性脂質膜構造体である、請求項３または請求項４に記載の脂質膜構造体。
【請求項６】
リポソームである、請求項３から請求項５のいずれかに記載の脂質膜構造体。
【請求項７】
次式（化５）
【化５】
2012117971.tif 000049
［式中：Ｒ１が炭素数が１２以上のアルキル基であり、かつＲ２が次式（化６）
【化６】
2012117971.tif 000050
または次式（化７）
【化７】
2012117971.tif 000051
の基である。］の陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質膜を１枚膜としてまたは複数膜の最外膜として有する脂質膜構造体を製造する方法であって、下記（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の工程を有する前記方法；
（ｉ）脂質と前記式（化５）の陽イオン性界面活性剤とを混合して前記式（化５）の陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質フィルムを調製する工程、
（ｉｉ）脂質フィルムに前記式（化５）の陽イオン性界面活性剤を加えて前記式（化５）の陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質フィルムを調製する工程、
（ｉｉｉ）１枚膜または複数膜の脂質膜を有する脂質膜構造体の１枚膜または複数膜の最外膜に前記式（化５）の陽イオン性界面活性剤を修飾する工程。
【請求項８】
（ｉ）脂質と前記式（化５）の陽イオン性界面活性剤とを混合して前記式（化５）の陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質フィルムを調製する工程または（ｉｉ）脂質フィルムに前記式（化５）の陽イオン性界面活性剤を加えて前記式（化５）の陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質フィルムを調製する工程を有する場合において、下記（ｉｖ）の工程を有する、請求項７に記載の方法；
（ｉｖ）前記調製した脂質フィルムを水和させて脂質膜構造体を調製する工程。
【請求項９】
１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法であって、下記（ｉ）または（ｉｉ）の工程を有する前記方法；
（ｉ）脂質と次式（化８）
【化８】
2012117971.tif 000052
［式中：Ｒ１が炭素数が１２以上のアルキル基であり、かつＲ２が次式（化９）
【化９】
2012117971.tif 000053
または次式（化１０）
【化１０】
2012117971.tif 000054
の基である。］の陽イオン性界面活性剤とを混合して前記式（化８）の陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質フィルムを調製する工程、
（ｉｉ）脂質フィルムに前記式（化８）の陽イオン性界面活性剤を加えて前記式（化８）の陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質フィルムを調製する工程。
【請求項１０】
下記（ｉｖ）の工程を有する、請求項９に記載の方法；
（ｉｖ）前記調製した脂質フィルムを水和させて脂質膜構造体を調製する工程。
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
Ｒ１が炭素数が１６のアルキル基であり、かつＲ２が次式（化１１）
【化１１】
2012117971.tif 000055
の基である、請求項７から請求項１０のいずれかに記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
技術分野
［０００１］
本発明は、脂質膜構造体、脂質膜構造体の製造方法および１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法に関し、より詳細には、陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質膜を１枚膜としてまたは複数膜の最外膜として有する脂質膜構造体、当該脂質膜構造体の製造方法および１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法に関する。
背景技術
［０００２］
タンパク質、薬剤、あるいは核酸などの物質を、生物個体の標的部位に確実に送達するためのベクターの開発が盛んに行われている。これまでに開発されたベクターは、ウイルスベクターと非ウイルスベクターとに大別される。ウイルスベクターは、一般に、目的の遺伝子を標的細胞の核内へ導入する遺伝子導入能が優れているが、大量生産の困難性、抗原性、毒性などの問題があるため、このような問題点が少ない非ウイルスベクターとして、リポソームに代表される脂質膜構造体が注目を集めている。
［０００３］
リポソームは、人工的に調製される脂質二重層からなる脂質膜を基本構成とする脂質膜構造体であり、様々な物質を内包して標的細胞内に送り込む能力を有している。リポソームは、その表面に抗体、タンパク質、糖鎖などの機能性分子を導入することにより、標的部位に対する指向性を向上させることができるという利点の他、物質が内包されるために生体内の分解作用や代謝作用から保護されるという利点や、標的以外の部位で物質が作用を奏すること（副作用）を防止するという利点を有している。これまでに、リポソームとして、例えば、連続した複数個のアルギニン残基を含むペプチドを表面に有し、核移行能を有するリポソームが開発されている（特許文献１）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
に低下することなどから、実用化が困難である（Ｊｅｆｆｓ  Ｌ．Ｂ．、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．、第２２巻、第３号、第３６２−７２頁、２００５年）。
［０００９］
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、簡便に製造することができ、微小かつ均一な粒子径を有する脂質膜構造体や封入する物質（目的物質）の数および脂質膜の枚数が制御された脂質膜構造体、その製造方法ならびに１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
［００１０］
本発明者らは、鋭意研究の結果、図１下段に示すように、陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質フィルムを用いて水和法を行うことにより、微小かつ均一な粒子径を有するリポソームや封入する物質（目的物質）の数および脂質膜の枚数が制御されたリポソームが得られること、および１の目的物質を１枚の脂質膜で封入することができること、ならびに陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質膜を１枚膜としてまたは複数膜の最外膜として有するリポソームのトランスフェクション活性が顕著に向上することを見出し、下記の各発明を完成した。
［００１１］
（１）陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質膜を１枚膜としてまたは複数膜の最外膜として有する脂質膜構造体。
［００１２］
（２）陽イオン性界面活性剤が次式（化１）
［化１］
2012117971.tif 000056
［式中：Ｒ１はアルキル基であり、Ｒ２は疎水基である。］の陽イオン性界面活性剤である、（１）に記載の脂質膜構造体。
［００１３］
（３）Ｒ１が炭素数が１２以上のアルキル基であり、かつＲ２が次式（化２）
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
［化２］
2012117971.tif 000057
または次式（化３）
［化３］
2012117971.tif 000058
の基である、（２）に記載の脂質膜構造体。
［００１４］
（４）Ｒ１が炭素数が１６のアルキル基であり、かつＲ２が次式（化４）
［化４］
2012117971.tif 000059
の基である、（２）に記載の脂質膜構造体。
［００１５］
（５）負帯電性脂質膜構造体である、（１）から（４）のいずれかに記載の脂質膜構造体。
［００１６］
（６）リポソームである、（１）から（５）のいずれかに記載の脂質膜構造体。
［００１７］
（７）陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質膜を１枚膜としてまたは
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
複数膜の最外膜として有する脂質膜構造体を製造する方法であって、下記（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の工程を有する前記方法；（ｉ）脂質と陽イオン性界面活性剤とを混合して陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質フィルムを調製する工程、（ｉｉ）脂質フィルムに陽イオン性界面活性剤を加えて陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質フィルムを調製する工程、（ｉｉｉ）１枚膜または複数膜の脂質膜を有する脂質膜構造体の１枚膜または複数膜の最外膜に陽イオン性界面活性剤を修飾する工程。
［００１８］
（８）（ｉ）脂質と陽イオン性界面活性剤とを混合して陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質フィルムを調製する工程または（ｉｉ）脂質フィルムに陽イオン性界面活性剤を加えて陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質フィルムを調製する工程を有する場合において、下記（ｉｖ）の工程を有する、（７）に記載の方法；（ｉｖ）前記調製した脂質フィルムを水和させて脂質膜構造体を調製する工程。
［００１９］
（９）１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法であって、下記（ｉ）または（ｉｉ）の工程を有する前記方法；（ｉ）脂質と陽イオン性界面活性剤とを混合して陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質フィルムを調製する工程、（ｉｉ）脂質フィルムに陽イオン性界面活性剤を加えて陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質フィルムを調製する工程。
［００２０］
（１０）下記（ｉｖ）の工程を有する、（９）に記載の方法；（ｉｖ）前記調製した脂質フィルムを水和させて脂質膜構造体を調製する工程。
［００２１］
（１１）陽イオン性界面活性剤が次式（化５）
［化５］
2012117971.tif 000060
［式中：Ｒ１はアルキル基であり、Ｒ２は疎水基である。］の陽イオン性界面
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
膜構造体や、封入する物質（目的物質）の数および脂質膜の枚数が制御された脂質膜構造体を得ることができる。また、微小かつ均一な脂質膜構造体によれば、腫瘍や肝臓実質などの疾患部位へ効率的に送達させることができ、脂質膜の枚数が制御された脂質膜構造体によれば、標的部位へ効率的に送達させることができる。例えば、本発明に係る脂質膜構造体の脂質膜の枚数が３枚である場合は、３回の膜融合により核やミトコンドリアに、脂質膜の枚数が１枚である場合は、１回の膜融合により細胞質に、それぞれ目的物質を効率的に送達させることができる。さらに、本発明に係る脂質膜構造体は、目的物質を損傷させずに標的部位へ送達して、標的部位において目的物質の機能を発揮させることができるうえ、細胞毒性が低く、安全に生体に適用することができる。一方、本発明に係る脂質膜構造体を製造する方法によれば、上述の特徴を有する脂質膜構造体を、穏やかな調製条件で、簡便に、かつ廉価に製造することができる。さらに、本発明に係る１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法によれば、目的物質のサイズに応じた脂質膜構造体を得ることができる他、この方法を１または複数回行うことにより、目的の枚数の脂質膜を有する脂質膜構造体を得ることができる。なお、本発明に係る脂質膜構造体を製造する方法および１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法は、脂質の種類を問わず行うことができることから、標的とする部位や細胞腫などに応じて脂質膜の脂質組成を適宜選択することができる。
図面の簡単な説明
［００２５］
［図１］従来のリポソームおよび本願発明に係る陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質膜を有する脂質膜構造体における製造方法、封入された物質（目的物質）の数ならびに脂質膜の枚数の概要を示す図である。
［図２］本発明に係る、陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質膜の一態様を示す図である。
［図３］ベンジルドデシルジメチルアンモニウムブロマイド（ＢＢ−１）、ベンジルテトラデシルジメチルアンモニウムブロマイド（ＢＢ−２）、ベンジルヘキサデシルジメチルアンモニウムブロマイド（ＢＢ−３）、ベンジルオク
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
ンしたＪＡＷＳＩＩ細胞における、ルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す図である。
［図１５］本発明のリポソームを透過型電子顕微鏡で観察したときの写真を示す。図中、スケールバーは５０ｎｍを示す。
発明を実施するための形態
［００２６］
以下、本発明に係る脂質膜構造体、脂質膜構造体の製造方法および１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法について詳細に説明する。本発明に係る脂質膜構造体は陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質膜を１枚膜としてまたは複数膜の最外膜として有する。
［００２７］
本発明において、「脂質膜」とは、脂質膜構造体が有する、脂質を主な構成成分とする膜をいう。本発明における脂質膜は、脂質分子が疎水性部分同士を会合させて二層に並んで形成する脂質二重層（ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒ）からなるものでもよく、疎水性部分を内側または外側に向けて形成する一重層からなるものでもよい。
［００２８］
本発明における脂質膜構造体の好ましい形態としては、脂質二重層からなる脂質膜を有する閉鎖小胞を挙げることができ、そのような脂質膜構造体としては、例えば、リポソームを挙げることができる。
［００２９］
本発明において、脂質膜構造体が有する脂質膜の枚数は１枚であってもよく、２以上の複数枚であってもよい。本発明に係る脂質膜構造体が複数膜を有する場合、少なくとも最外膜に陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質膜を有するが、最外膜のみならず、最外膜以外の１または複数の膜が陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質膜であってもよい。
［００３０］
本発明において、「陽イオン性界面活性剤」は、界面活性剤のうち、陽イオン性の親水基を有するものをいい、イオン価は特に限定されないが、１価であることが好ましい。陽イオン性界面活性剤としては、具体的には、例えば、トリメチルテトラデシルアンモニウムクロライド、セチルトリメチルアンモニウムブロマイドなどのアルキルトリメチルアンモニウム塩、ドデシルエチルジメチルアンモニウムブロマイド、エチルヘキサデシルジメチルアン
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
［化３］
2012117971.tif 000061
で示される陽イオン性界面活性剤であることがさらに好ましい。
［００３１］
なお、本発明における「疎水基」としては、例えば、上記式（化２）および（化３）で示される基のほか、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基などのアルキル基、アルケニル基、ビニール基、フェニル基やナフチル基などのアリール基といった炭化水素基や複素環、または親水基と疎水基が組み合わされて、全体として疎水性である基を挙げることができる。
［００３２］
本発明において、陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質膜の態様としては、例えば、図２に示すように、脂質膜を構成する脂質分子の間隙に陽イオン性界面活性剤が位置する態様の他、脂質膜を構成する脂質分子に、共有結合、水素結合、イオン結合、疎水結合、あるいはファンデルワールス結合により陽イオン性界面活性剤が結合する態様などを挙げることができる。
［００３３］
また、本発明において、脂質膜構造体は、正帯電性、非帯電性、両（正負）帯電性および負帯電性のいずれでもよいが、負帯電性であることが好ましい。なお、本発明における「負帯電性脂質膜構造体」とは、全体として負帯電性である脂質膜構造体をいい、例えば、脂質膜の構成脂質として正帯電性脂質や両（正負）帯電性脂質、非帯電性脂質を含むため、または陽イオン性界面活性剤が修飾されているために、局所的に正帯電性や両（正負）帯電性、非帯電性であるものであっても、全体として負帯電性であれば「負帯電性脂質膜構造体」に包含される。
［００３４］
本発明における脂質膜構造体を構成する脂質は、正帯電性脂質、両（正負）帯電性脂質や非帯電性脂質を含む中性脂質、負帯電性脂質のいずれでもよ
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
膜構造体に細胞透過能や核移行能を付与するペプチドを結合または含有させることができ、その結合量や含有量は適宜調節することができる。
［００４３］
本発明に係る陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質膜を１枚膜としてまたは複数膜の最外膜として有する脂質膜構造体は、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結・融解法などの公知の方法を用いて製造することができるが、特に、図１下段に示すように、陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質フィルムを調製して水和法を行うことにより、簡便に製造することができる。なお、本発明において、「脂質フィルム」は、脂質を有機溶剤に溶解させた後、有機溶剤を蒸発除去することにより、容器の底面または側面に張り付くようなかたちで形成される、脂質分子を主な構成成分とする膜をいう。
［００４４］
次に、本発明は脂質膜構造体を製造する方法を提供する。本発明に係る脂質膜構造体を製造する方法は、陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質膜を１枚膜としてまたは複数膜の最外膜として有する脂質膜構造体を製造する方法であって、
（ｉ）脂質と陽イオン性界面活性剤とを混合して陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質フィルムを調製する工程、
（ｉｉ）脂質フィルムに陽イオン性界面活性剤を加えて陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質フィルムを調製する工程、
（ｉｉｉ）１枚膜または複数膜の脂質膜を有する脂質膜構造体の１枚膜または複数膜の最外膜に陽イオン性界面活性剤を修飾する工程、
以上（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の工程を有する。なお、本発明に係る脂質膜構造体を製造する方法において、上述した本発明に係る脂質膜構造体の構成と同等または相当する構成については再度の説明を省略する。
［００４５］
工程（ｉ）において、脂質と陽イオン性界面活性剤とを混合して陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質フィルムを調製する方法としては、例えば、脂質を有機溶媒に溶解させて得た溶液（脂質溶液）と陽イオン性界面活性剤を有機溶媒に溶解させて得た溶液（陽イオン性界面活性剤溶液）とを混合し
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
た後に、脂質溶液に陽イオン性界面活性剤を添加して混合ないし溶解させた後に、陽イオン性界面活性剤溶液に脂質を添加して混合ないし溶解させた後に、あるいは脂質と陽イオン性界面活性剤とを同時に有機溶媒に溶解させた後に、それぞれ有機溶剤を蒸発させて除去する方法を挙げることができる。
［００４６］
なお、本発明において、脂質および陽イオン性界面活性剤を溶解させる有機溶媒としては、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサンなどの炭化水素類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素類、メタノール、エタノールなどの低級アルコール類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類などを、単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。
［００４７］
工程（ｉｉ）において、脂質フィルムに陽イオン性界面活性剤を加えて陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質フィルムを調製する方法としては、例えば、脂質フィルムに陽イオン性界面活性剤溶液を添加した後、溶媒を蒸発させて除去する方法を挙げることができる。
［００４８］
工程（ｉｉｉ）において、１枚膜または複数膜の脂質膜を有する脂質膜構造体の１枚膜または複数膜の最外膜に陽イオン性界面活性剤を修飾する方法としては、例えば、１枚膜または複数膜の脂質膜を有する脂質膜構造体に陽イオン性界面活性剤を添加する方法を挙げることができる。
［００４９］
また、本発明に係る脂質膜構造体を製造する方法が、工程（ｉ）または工程（ｉｉ）を有する場合には、
（ｉｖ）前記調製した脂質フィルムを水和させて脂質膜構造体を調製する工程、
以上（ｉｖ）の工程を有することもできる。
［００５０］
工程（ｉｖ）において、脂質フィルムを水和させて脂質膜構造体を調製する方法としては、例えば、脂質フィルムに水などの液体を添加して水和させた後、攪拌または超音波処理する方法、すなわち水和法を挙げることができる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
［００５１］
次に、本発明は、１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法を提供する。本発明に係る１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法は、
（ｉ）脂質と陽イオン性界面活性剤とを混合して陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質フィルムを調製する工程、
（ｉｉ）脂質フィルムに陽イオン性界面活性剤を加えて陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質フィルムを調製する工程、
以上（ｉ）または（ｉｉ）の工程を有する。なお、本発明に係る１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法において、上述した本発明に係る脂質膜構造体または脂質膜構造体の製造方法の構成と同等または相当する構成については再度の説明を省略する。
［００５２］
また、本発明に係る１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法は、
（ｉｖ）前記調製した脂質フィルムを水和させて脂質膜構造体を調製する工程、
以上（ｉｖ）の工程を有することもできる。
［００５３］
本発明において、「目的物質」とは、脂質膜構造体に封入される予定の物質または封入された物質をいう。本発明において目的物質はいかなる物質でもよく、例えば、薬剤、核酸、ペプチド、タンパク質、糖またはこれらの複合体などの種々の生理活性物質やリポソーム、ミセルなどの脂質膜構造体を挙げることができ、診断、治療などの目的に応じて適宜選択することができる。目的物質は、例えば、脂質膜構造体の製造にあたり脂質膜を水和する際に使用される水性溶媒に添加することにより、脂質膜構造体内部の水相に封入することができる。
［００５４］
例えば、本発明に係る１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法において、１枚の脂質膜を有するリポソームを目的物質とすれば、２枚の脂質膜を有するリポソームを得ることができ、２枚の脂質膜を有するリポソームを目的物質とすれば、３枚の脂質膜を有するリポソームを得ることができる。なお、目的物質の脂質膜構造体には、種々の機能性分子によって修飾をしてもよく、修飾物質としては、例えば、標的部位への移行性や細胞透過能を向上
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
させるペプチド、脂質膜構造体の安定性を向上させるＰＬＬやＢＳＡ、荷電物質などを挙げることができる。
［００５５］
本発明に係る脂質膜構造体は、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン緩衝液，酢酸緩衝液などの適当な水性溶媒に分散させて使用することができる。分散液には、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤などの添加剤を適宜添加してもよい。また、本発明に係る脂質膜構造体は、前記の分散液を乾燥させた状態で保存することができる。さらに、本発明に係る脂質膜構造体は、経口投与することができる他、静脈、腹腔内、皮下、経鼻などへの非経口投与も可能である。
［００５６］
なお、これまでに記載した本発明の脂質膜構造体、脂質膜構造体の製造方法および１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法においては、脂質フィルムに加える陽イオン性界面活性剤の量を総脂質に対して１０〜３０ｍｏｌ％の範囲とすることで、製造される、あるいは目的物質が封入される脂質膜構造体の粒子径を、おおよそ５０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲で制御することも可能である。また、核酸などの粒子を封入するときは、封入される粒子のサイズに応じ前記の範囲で陽イオン界面活性剤の量を調節することが好ましい。
［００５７］
以下、本発明に係る脂質膜構造体、脂質膜構造体の製造方法および１の目的物質を１枚の脂質膜で封入する方法について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
実施例
［００５８］
＜実施例１＞陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質膜を有するリポソームの粒子径の検討
（１）核酸ナノ粒子の調製
［１−１］プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の調製
１０ｍｇ／ｍＬのカナマイシン水溶液１０μＬを添加したＬＢ培地１０ｍＬに、ＣＭＶプロモーターの下流にＥｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ    ｌｕｏｒ
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
を図４ＣおよびＤにそれぞれ示す。
［００７４］
［表１］
2012117971.tif 000062
［００７５］
表１、図４ＡおよびＢに示すように、リポソームの粒子径は、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈおよびｉはａと比較して小さいのに対し、ｊおよびｋはａと比較してほとんど同じであった。また、同種の界面活性剤が修飾された脂質膜を有するリポソームにおいて比較すると、ｂ＞ｃ、ｄ＞ｅ、ｆ＞ｇおよびｈ＞ｉであるのに対し、ｊ≒ｋであった。
［００７６］
これらの結果から、陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質膜を有するリポソームは、界面活性剤が修飾されていない脂質膜を有するリポソームと比較して粒子径が小さいこと、および陽イオン性界面活性剤の修飾濃度が大きいほど粒子径が小さくなることが明らかになった。一方、非イオン性界面活性剤が修飾された脂質膜を有するリポソームは、界面活性剤が修飾されていない脂質膜を有するリポソームと比較して、非イオン性界面活性剤の修飾濃度にかかわらず、粒子径がほとんど同じであることが明らかになった。
［００７７］
すなわち、陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質フィルムを用いて水和法を行うことにより、微小な粒子径を有するリポソームが得られることが明らかになった。
［００７８］
また、表１および図４Ａに示すように、界面活性剤の修飾濃度が同じであるリポソーム同士を比較すると、粒子径はｂ＞ｄ＞ｆ≒ｈおよびｃ＞ｅ＞ｇ≒ｉであった。これらの結果から、脂質膜に修飾された陽イオン性界面活性剤が有するアルキル基の炭素数が１６より小さい場合は、炭素数が大きいほ
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
どリポソームの粒子径が小さくなるのに対し、炭素数が１６より大きい場合は、リポソームの粒子径はそれ以上減少せず、ほぼ一定となることが明らかになった。
［００７９］
また、表１、図４ＣおよびＤに示すように、ゼータ電位について、核酸ナノ粒子が正であるのに対し、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊおよびｋはいずれも負であった。これらの結果から、陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質膜を有するリポソームは、修飾濃度が少なくとも１１ｍｏｌ％および１６．５ｍｏｌ％の場合は、界面活性剤が修飾されていない脂質膜を有するリポソームおよび非イオン性界面活性剤が修飾された脂質膜を有するリポソームと同様に、構成脂質に由来する負帯電性が維持された負帯電性リポソームとなることが明らかになった。
［００８０］
＜実施例２＞トンゾニウムブロマイド（ＴＢ）が修飾された脂質膜を有するリポソームの粒子径の検討
（１）核酸ナノ粒子の調製
実施例１（１）［１−２］および［１−３］に記載の方法により、核酸ナノ粒子を調製して、粒子径およびゼータ電位を測定した。
［００８１］
（２）脂質フィルムの調製
［２−１］界面活性剤溶液の調製
陽イオン性界面活性剤であるトンゾニウムブロマイド（ＴＢ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を３．０３ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにエタノールに溶解することにより、ＴＢ溶液を調製した。なお、ＴＢの構造を図３中段に示す。
［００８２］
［２−２］混合脂質溶液の調製
実施例１（２）［２−２］に記載の方法により、混合脂質溶液を６サンプル調製し、それぞれａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆとした。
［００８３］
［２−３］脂質フィルムの調製
本実施例（２）［２−２］のａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆについて、実施例１（２）［２−３］に記載の方法により、脂質フィルムの調製を行った。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
［表２］
2012117971.tif 000063
［００８８］
表２および図５Ａに示すように、リポソームの粒子径は、ａ＞ｂ＞ｃ＞ｄ≒ｅ≒ｆであった。
［００８９］
これらの結果から、ＴＢ修飾リポソームは、ＴＢ未修飾リポソームと比較して、粒子径が小さくなることが明らかになった。また、ＴＢの修飾濃度が少なくとも２２ｍｏｌ％より小さい場合は、修飾濃度が大きいほど、リポソームの粒子径が小さくなるのに対し、少なくとも２２ｍｏｌ％より大きい場合は、リポソームの粒子径はそれ以上減少せず、ほぼ一定となることが明らかになった。
［００９０］
さらに、表２および図５Ａに示すように、ｄ、ｅおよびｆの粒子径は、約１３０ｎｍであり、核酸ナノ粒子の粒子径である約１００ｎｍにかなり近い値であった。ここで、図５Ｃに示すように、脂質膜の厚さは約４ｎｍであり、これに内水相の厚さを合わせると約１５ｎｍであることから、１の核酸ナノ粒子を１枚の脂質膜で封入したリポソームの粒子径は、約１００ｎｍ＋約１５ｎｍ×２＝約１３０ｎｍとなると考えられる。このことから、ｄ、ｅおよびｆは、１の核酸ナノ粒子を１枚の脂質膜で封入したリポソームであることが明らかになった。すなわち、ＴＢが少なくとも２２ｍｏｌ％程度修飾された脂質フィルムを用いて水和法を行うことにより得られたリポソームは、１の目的物質が１枚の脂質膜で封入されたリポソームであることが明らかになった。
［００９１］
以上の結果から、陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質フィルムを用いて水和法を行うことにより、１の目的物質を１枚の脂質膜で封入することができることが明らかになった。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
ム；ｈ、ｉ、ｊ、ｋおよびｌ）を調製した。その後、実施例１（１）［１−３］に記載の方法により、粒子径およびゼータ電位を測定した。
［００９７］
本実施例（４）［４−１］〜［４−３］の実験を３回以上繰り返し、各サンプルについて得られた結果の平均値および標準偏差（ＳＤ）を算出した。その結果を表３に示す。また、粒子径の測定結果について、グラフ化したものを図６Ａに、ゼータ電位の測定結果について、グラフ化したものを図６Ｂにそれぞれ示す。
［００９８］
［表３］
2012117971.tif 000064
［００９９］
表３および図６Ａに示すように、空リポソームの粒子径は、ｈ、ｉ、ｊ、ｋおよびｌのいずれも、ｇの粒子径と比較して小さかった。また、ｈ＞ｉ＞ｋ＞ｊ＞ｌであった。これらの結果から、ＴＢ修飾空リポソームは、ＴＢ未修飾空リポソームと比較して、粒子径が小さくなることが明らかになった。
［０１００］
すなわち、陽イオン性界面活性剤で修飾された脂質フィルムを用いて水和法を行うことにより、目的物質が封入されているか否かにかかわらず、微小な粒子径を有するリポソームが得られることが明らかになった。
［０１０１］
また、図６Ｂに示すように、ゼータ電位は、ｇ、ｈ、ｉおよびｊはいずれも負であるのに対し、ｋおよびｌは正であった。これらの結果から、ＴＢの修飾濃度が少なくとも５５ｍｏｌ％以上であるＴＢ修飾空リポソームは、正帯電性リポソームとなるのに対し、ＴＢの修飾濃度が５５ｍｏｌ％より小さいＴＢ修飾空リポソームは、ＴＢ未修飾空リポソームと同様に、構成脂質に由来する負帯電性が維持された負帯電性リポソームとなることが明らかになった。
［０１０２］
＜実施例３＞ＴＢ修飾リポソームのトランスフェクション活性の検討
【国際調査報告】
2012117971.tif 000065
2012117971.tif 000066
2012117971.tif 000067
2012117971.tif 000068