(57)【要約】  連続発酵により化学品を製造する方法であって、  （ａ）発酵槽内の培養液中で細胞を培養することにより、原料を発酵させて化学品を生成すること、  （ｂ）分離膜モジュールを用いて前記培養液をろ過すること、  （ｃ）ろ過における非透過液を前記発酵槽内に保持しつつ、前記化学品を含んだ透過液を培養液から分離すること、および  （ｄ）前記分離膜モジュールに液体を供給しながら、前記分離膜モジュールの中の気体線速度が０．１５ｃｍ／ｓ以上７０ｃｍ／ｓ以下になるように、前記分離膜モジュールの下部および前記発酵槽と前記分離膜モジュールとを連通する配管の少なくとも一方から気体を供給することを備える化学品の製造方法。
2012077742.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
連続発酵により化学品を製造する方法であって、
（ａ）発酵槽内の培養液中で細胞を培養することにより、原料を発酵させて化学品を生成すること、
（ｂ）分離膜モジュールを用いて前記培養液をろ過すること、
（ｃ）ろ過における非透過液を前記発酵槽内に保持しつつ、前記化学品を含んだ透過液を培養液から分離すること、および
（ｄ）前記分離膜モジュールに液体を供給しながら、前記分離膜モジュールの中の気体線速度が０．１５ｃｍ／ｓ以上７０ｃｍ／ｓ以下になるように、前記分離膜モジュールの下部および前記発酵槽と前記分離膜モジュールとを連通する配管の少なくとも一方から気体を供給すること
を備える化学品の製造方法。
【請求項２】
前記（ｄ）において、前記気体が酸素を含有する、請求項１に記載の化学品の製造方法。
【請求項３】
前記工程（ｄ）とは別に、前記発酵槽に気体を供給する工程（ｅ）をさらに備え、
前記工程（ｄ）による気体の供給を間欠的に行い、
前記工程（ｄ）による気体の供給を行っていないときには、前記工程（ｄ）による気体の供給を行っているときよりも、前記（ｅ）による気体の供給速度を増大させる、請求項２に記載の化学品の製造方法。
【請求項４】
前記（ｂ）のろ過を間欠的に行う、請求項１から３のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【請求項５】
前記細胞が細菌である請求項１から４のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【請求項６】
前記細菌が、エシェリシア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、プロビデンシア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、コリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはセラチア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｅｒｒａｔｉａ）のいずれかに属する細菌である請求項５に記載の化学品の製造方法。
【請求項７】
前記細菌が、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、プロビデンシア・レトゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）またはセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）のいずれかである請求項６に記載の化学品の製造方法。
【請求項８】
前記細胞が酵母であることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【請求項９】
化学品が、アミノ酸である請求項１から８のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【請求項１０】
アミノ酸が、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−チロシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−バリンまたはＬ−ロイシンである請求項９に記載の化学品の製造方法。
【請求項１１】
化学品が有機酸である、請求項１から８のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【請求項１２】
化学品が乳酸である、請求項１１に記載の化学品の製造方法。
【請求項１３】
化学品がカダベリンである、請求項１から８のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、連続発酵による化学品の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物や培養細胞の培養を伴う物質生産方法である発酵法は、大きく（１）回分発酵法（Ｂａｔｃｈ発酵法）および流加発酵法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈｏｒ Ｓｅｍｉ−Ｂａｔｃｈ発酵法）と（２）連続発酵法（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ発酵法）とに分類することができる。上記（１）の回分発酵法および流加発酵法は、設備的には簡素であり、短時間で培養が終了し、また、純菌培養による生産物発酵においては培養菌以外の雑菌による汚染が起きる可能性が低いというメリットがある。しかし、時間の経過とともに培養液中の生産物濃度が高くなり、生産物阻害や浸透圧の上昇などの影響により生産性および収率が低下する。このため、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持するのは困難である。【０００３】
一方、連続発酵法は、発酵槽内における目的物質の蓄積を回避する事により、上述の回分および流加発酵法に比べ長時間にわたって高収率かつ高生産性を維持できる。従来の連続培養は、発酵槽へ新鮮培地を一定速度で供給し、これと同量の培養液を槽外へ排出することによって、発酵槽内の液量を常に一定に保つ培養法である。回分培養では初発基質濃度が消費されると培養が終了するが、連続培養では理論的には無限に培養を持続できる。【０００４】
しかし、従来の連続培養では培養液とともに微生物も槽外に排出され、発酵槽内の微生物濃度を高く維持することは難しい。槽内の微生物を高濃度に保つことができれば、発酵容積当たりの発酵生産効率を向上させることができるが、そのためには、微生物を発酵槽内に保持、あるいは還流させる必要がある。【０００５】
微生物を発酵槽内に保持あるいは還流させる方法としては、排出された培養液を遠心分離により固液分離し、沈殿物である微生物を発酵槽に返送する方法や、ろ過することで固形分である微生物を分離し、培養液上清のみを槽外に排出する方法があげられる。しかし、遠心分離による方法は動力コストが高く、現実的ではない。ろ過による方法は、前述のようにろ過するために高い圧力を要することから、実験室レベルでの検討がほとんどであった。【０００６】
そこで、連続発酵法において微生物または培養細胞を分離膜で分離し、濾液から生産物を回収すると同時に、分離された微生物や培養細胞を培養液に保持または還流させることで、培養液中の微生物や培養細胞濃度を高く維持する方法が提案されている。例えば、セラミックス膜を用いた連続発酵装置において、膜分離連続発酵に関する技術が開示されている(特許文献１−３)。【０００７】
一方、最近では、有機高分子分離膜を用いた連続培養装置により、連続培養する技術が提案されている（特許文献４、５参照）。当該提案では、微生物もしくは培養細胞を培養するための槽と、目的とする発酵生産物と微生物、培養細胞との膜分離を行うための槽とを有した連続培養装置を用いることで、回分培養法、流加培養法に比較して高い生産速度で様々な化学品を生産することが可能となった。【０００８】
このような分離膜を用いた連続発酵技術においては、コストダウンの観点から透水性能の優れた分離膜で膜面積を減らし、装置をコンパクト化する等によって設備費、膜交換費および設置面積の低減を試みている。このようなコストの観点から、体積に対してろ過面積が広い中空糸膜が注目されている。【０００９】
しかし、中空糸膜を含め、このような分離膜は、ろ過運転を通じてろ過面にＳＳ（Ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ Ｓｏｌｉｄ）や吸着物が付着することでろ過能力が低下し、必要なろ過液量が得られなくなることがある。微生物や培養細胞の目詰まりの抑制方法については、多孔性分離膜の洗浄やろ過条件の設定などに関する技術が、いくつか提案されている。【００１０】
例えば、多孔性分離膜の洗浄方法としては、多孔性分離膜を温水で逆洗浄する方法（特許文献７）、多孔性分離膜をろ過の透過水で逆洗浄する方法（特許文献８）などが開示されている。【００１１】
また、気体供給によるスクラビングの適用が考えられる。スクラビング洗浄は、水処理の用途で適用例があり、例えば特許文献９では、モジュール内に気体を導入すると同時に膜のろ水側に、気体または液体を導入して洗浄する方法を提案している。【００１２】
一方、高濃度微生物を用いた水処理のメンブレンバイオリアクター（ＭＢＲ）で、気体洗浄方法を適用したケースがある。例えば、モジュールの下部に設けた原水供給口からガスを混入した原水を供給する方法（特許文献１０）などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開平５−９５７７８号公報
【特許文献２】特開昭６２−１３８１８４号公報
【特許文献３】特開平１０−１７４５９４号公報
【特許文献４】国際公開第０７／０９７２６０号パンフレット
【特許文献５】特開２００８−２１２１３８号公報
【特許文献７】特開２０００−３１７２７３号公報
【特許文献８】特開平１１−２１５９８０号公報
【特許文献９】特許３９４８５９３号公報
【特許文献１０】特開２００５−８８００８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
特許文献７および８における分離膜の洗浄方法は、発酵終了後の培養液から発酵生産物をろ過回収する場合の多孔性分離膜洗浄方法である。このような洗浄方法を、濾過処理後に微生物または培養細胞を培養液に保持する連続発酵方法に適用した場合、培養液が希釈されるので発酵の生産性を高く維持することが困難である。【００１５】
また、特許文献９の技術は、対象原水の濁度が０．１〜５度の河川表流水を処理する方法であり、培養液のろ過とは目詰まりの原因物質が異なることから、連続発酵における目詰まりの抑制およびろ過性能の低下の抑制には、充分な効果を発揮することができない。【００１６】
特許文献１０では、膜面洗浄効果だけを追求した条件で気体の供給を行っており、過剰に供給された気体による発酵成績への影響および生産物のろ過分離への影響については考慮されていない。すなわち、特許文献１０の技術をそのまま化学品の製造に適用することはできない。【００１７】
このように従来の技術では、膜分離技術を用いた連続発酵運転に対する適切なスクラビング洗浄方法について検討されておらず、膜面洗浄を行って分離膜のろ過性を維持しながら、かつ、発酵による化学品の生産性を高めるための方法が求められていた。【００１８】
本発明の目的は、簡便な操作方法で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵法による化学品の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、膜モジュールの下部、または発酵槽と膜モジュールとを連通する配管から、気体を０．１５ｃｍ／ｓ以上、７０ ｃｍ／ｓの範囲の線速度で供給することで、膜の閉塞を低減して長期間安定した膜運転を行うとともに、発酵性能を向上させられることを見出した。これにより、長期間安定した化学品の生産が可能となった。本発明は上記知見に基づいて成されたものであり、以下の方法を提供する。【００２０】
（１）連続発酵により化学品を製造する方法であって、
（ａ）発酵槽内の培養液中で細胞を培養することにより、原料を発酵させて化学品を生成すること、
（ｂ）分離膜モジュールを用いて前記培養液をろ過すること、
（ｃ）ろ過における非透過液を前記発酵槽内に保持しつつ、前記化学品を含んだ透過液を培養液から分離すること、および
（ｄ）前記分離膜モジュールに液体を供給しながら、前記分離膜モジュールの中の気体線速度が０．１５ｃｍ／ｓ以上７０ｃｍ／ｓ以下になるように、前記分離膜モジュールの下部および前記発酵槽と前記分離膜モジュールとを連通する配管の少なくとも一方から気体を供給すること
を備える化学品の製造方法。【００２１】
（２）前記（ｄ）において、前記気体が酸素を含有する、（１）に記載の化学品の製造方法。【００２２】
（３）前記工程（ｄ）とは別に、前記発酵槽に気体を供給する工程（ｅ）をさらに備え、
前記工程（ｄ）による気体の供給を間欠的に行い、
前記工程（ｄ）による気体の供給を行っていないときには、前記工程（ｄ）による気体の供給を行っているときよりも、前記（ｅ）による気体の供給速度を増大させる、（２）に記載の化学品の製造方法。【００２３】
（４）前記（ｂ）のろ過を間欠的に行う、（１）から（３）のいずれかに記載の化学品の製造方法。【００２４】
（５）前記細胞が細菌である（１）から（４）のいずれかに記載の化学品の製造方法。【００２５】
（６）前記細菌が、エシェリシア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、プロビデンシア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、コリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはセラチア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｅｒｒａｔｉａ））のいずれかに属する細菌である（５）に記載の化学品の製造方法。【００２６】
（７）前記細菌が、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、プロビデンシア・レトゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）またはセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）のいずれかである（６）に記載の化学品の製造方法。【００２７】
（８）前記細胞が酵母であることを特徴とする（１）から（４）のいずれかに記載の化学品の製造方法。【００２８】
（９）化学品が、アミノ酸である（１）から（８）のいずれかに記載の化学品の製造方法。【００２９】
（１０）アミノ酸が、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−チロシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−バリンまたはＬ−ロイシンである（９）に記載の化学品の製造方法。【００３０】
（１１）化学品が有機酸である、（１）から（８）のいずれかに記載の化学品の製造方法。【００３１】
（１２）化学品が乳酸である、（１１）に記載の化学品の製造方法。【００３２】
（１３）化学品がカダベリンである、（１）から（８）のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によって、分離膜のろ過性を長時間にわたり安定させることが可能となり、かつ、発酵成績を高めることが可能となり、更には発酵系の外部から発酵系の内部へ、培養に必要とした微生物以外の雑菌による汚染が起きる可能性を低下させることが可能となり、広く発酵工業において、発酵生産物である化学品を低コストで安定に生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明で用いられる膜分離連続発酵装置の一例を示す概略側面図である。
【図２】比較例１および実施例１〜４の菌体濃度の変化図である。
【図３】比較例１および実施例１〜４の生産速度の変化図である。
【図４】比較例１および実施例１〜４の対糖収率の変化図である。
【図５】比較例１および実施例１〜４の膜間差圧の変化図である。
【図６】比較例３および実施例５〜８の菌体濃度の変化図である。
【図７】比較例３および実施例５〜８の生産速度の変化図である。
【図８】比較例３および実施例５〜８の対糖収率の変化図である。
【図９】比較例３および実施例５〜８の膜間差圧の変化図である。
【図１０】比較例５および実施例９〜１３の菌体濃度の変化図である。
【図１１】比較例５および実施例９〜１３の生産速度の変化図である。
【図１２】比較例５および実施例９〜１３の対糖収率の変化図である。
【図１３】比較例５および実施例９〜１３の膜間差圧の変化図である。
【図１４】プラスミドｐＴＲＳ１１の配列マップ
【発明を実施するための形態】
【００３５】
１．連続発酵装置
連続発酵装置の一例について、図１を参照して説明する。図１は、本実施形態の連続発酵装置の概略側面図である。
【００３６】
図１に示すように、連続発酵装置１００は、発酵槽１、分離膜モジュール２、および発酵槽１と分離膜モジュール２とを接続する配管を備えている。発酵槽１と分離膜モジュール２とは、接続されることで循環系を形成している。
【００３７】
発酵槽１は、その内部に培養液が入れられるように構成されている。具体的には、発酵槽１は、耐圧性、耐熱性および耐汚れ性に優れる材質で作られる。発酵槽１には、円筒型、多角筒型など様々な形状が適用可能である。発酵槽１は、発酵原料、細胞、その他発酵に必要な固体、液体または気体を注入して撹拌することができ、必要に応じて滅菌でき、さらに密閉することが可能な形状を備えればよい。培養液の撹拌効率の観点からは、発酵槽１は円筒型であることが好ましい。発酵槽１内は、発酵槽１の外部から発酵槽内部に雑菌が入り増殖することを防ぐため、加圧状態に維持されることが好ましい。発酵槽１内の気圧を管理するために、後述の発酵槽圧力計２３等の機構が設けられる。
【００３８】
分離膜モジュール２は、多数の中空糸膜または平膜等の分離膜を備える。分離膜モジュールの詳細については、後述する。
【００３９】
連続発酵装置１００は、制御装置２８を備える。制御装置２８は、各種の演算を行うことができる。また制御装置２８は、各種センサの検知結果、使用者の入力、および各種設定に基づいて、連続発酵装置１００内の各部の動作を制御する。
【００４０】
連続発酵装置１００はさらに、発酵槽気体供給装置２１、発酵槽圧力調整バルブ２２、発酵槽圧力計２３、温度制御部３、撹拌装置４、pH制御部５、レベル制御部６を発酵工程に主に関与する機構として備える。
【００４１】
発酵槽気体供給装置２１は、発酵槽１内に気体を供給する。供給された気体は、回収され、再び発酵槽気体供給装置２１により発酵槽１内に供給されてもよい。
【００４２】
発酵槽圧力調整バルブ２２は、制御装置２８の制御に基づいて、発酵槽圧力計２３が検出した発酵槽１内の気圧が上限に達すると発酵槽１内の空気を外部に放出する。こうして、発酵槽１内の圧力が適切に保たれる。なお、雑菌混入を抑制するために、発酵槽１内の圧力は、外気圧よりも高く保たれることが好ましい。
【００４３】
温度制御部３は、温度センサおよび温度調整部を備える。温度センサは発酵槽１内の培養液の温度を検知する。温度センサによる検知結果が一定の範囲を示すように、制御装置２８による制御を受けて、温度調整部が動作する。こうして、発酵槽１内の温度が一定に維持されることで、発酵または細胞の増殖に適した温度環境が維持される。温度調整部は、加熱および冷却の一方又は両方の機能を有することができる。
【００４４】
撹拌装置４は、発酵槽１内の培養液を撹拌することで、適切な発酵環境を維持する。
【００４５】
pH制御部５は、ｐＨセンサ５１および中和剤供給ポンプ１０を備える。ｐＨセンサ５１は発酵槽１内の培養液のｐＨを検知する。中和剤供給ポンプ１０は中和剤槽と発酵槽１とを接続する配管上に設置されており、中和剤を発酵槽１内に添加する。中和剤供給ポンプ１０は、制御装置２８の制御に基づいて、ｐＨセンサ５１の検知結果が所定の範囲を示すように動作する。なお、中和剤としては酸およびアルカリが用いられる。
【００４６】
レベル制御部６は、レベルセンサ６１および培地供給ポンプ９を備える。培地供給ポンプ９は、培地槽と発酵槽１とを接続する配管上に配置される。制御装置２８の制御に基づいて、発酵槽１内の培養液の液面が所定の下限を下回ったことをレベルセンサ６１の検知結果が示すと、発酵槽１へ培地を供給するように培地供給ポンプ９が稼働し、液面が上限に達したことを示すと、培地供給ポンプ９の動作を停止させる。こうして、発酵槽１内の培養液量が適切に保たれる。
【００４７】
連続発酵装置１００は、発酵槽１と分離膜モジュール２との間で培養液を循環させる循環系を備える。具体的には、連続発酵装置１００は、発酵槽１と分離膜モジュール２の一次側とを連通する管８１、および分離膜モジュール２の分離膜を透過しなかった濃縮液を発酵槽１に戻す管８２を備える。なお、本実施形態では、管８１は分離膜モジュール２の下部に接続されているので、分離膜モジュール２には下部から培養液が供給される。発酵槽１から分離膜モジュール２に培養液を供給する管８１上には、循環ポンプ８が配置される。循環ポンプ８は、発酵槽１から分離膜モジュール２に向かって培養液を送るように稼働する。
【００４８】
また、連続発酵装置１００は、分離膜モジュール２に接続され、ろ液（つまり透過液）を装置外に排出する管８３を備える。この管８３上には、ろ過ポンプ１１が設けられると共に、ろ過ポンプと分離膜モジュール２との間にはろ過バルブ１２が設けられる。
【００４９】
連続発酵装置１００は、分離膜モジュール２を逆圧洗浄する構成を備える。逆圧洗浄とは、分離膜の二次側から一次側に洗浄用液体（以下、「洗浄液」と称することがある。）を通すことによって、分離膜を洗浄することである。連続発酵装置１００は、洗浄液を収容する洗浄液槽、洗浄液槽と分離膜モジュール２との二次側とを接続する管８４、管８４上に設けられた洗浄ポンプ１３、洗浄ポンプ１３と分離膜モジュール２との間に設けられた洗浄バルブ１４を備える。洗浄ポンプ１３により、洗浄液が分離膜モジュール２に向けて送られる。
【００５０】
管８４には、圧力計、流量計、滅菌用装置、滅菌用フィルタなどを設置されていてもよい。
【００５１】
差圧制御部７は、分離膜モジュール２の膜間差圧（TPD:Transmembrane Pressure Difference）を検知することができる。つまり、分離膜モジュール２の一次側（培養液が供給される側）と二次側（透過液すなわちろ液が排出される側）との間での差圧を検知する。
【００５２】
さらに、連続発酵装置１００は、スクラビング（scrubbing）に関与する構成を備える。スクラビングとは、分離膜モジュールの１次側に気体を供給することで、その気体が分離膜モジュール内を通過する際に発生する液体及び気体の揺れによって、分離膜の表面に付着している物質を分離膜の表面から除去する洗浄方法である。
【００５３】
連続発酵装置１００では、特に、分離膜モジュール２に対して、分離膜モジュール２の下部、および発酵槽１と分離膜モジュール２とを連通する配管８１の少なくとも一方から気体が供給される。特に、スクラビングに関与する構成として、気体供給源、気体供給口、および気体供給源からの気体の供給速度を調整することのできる機構が設けられる。
【００５４】
具体的には、連続発酵装置１００は、モジュール気体供給制御バルブ１５、モジュールスクラビング気体供給装置１６、配管気体供給制御バルブ１７、配管スクラビング気体供給装置１８、ポンプ前配管気体供給制御バルブ１９、ポンプ前配管スクラビング気体供給装置２０を備える。
【００５５】
ただし、モジュールスクラビング気体供給装置１６、配管スクラビング気体供給装置１８、およびポンプ前配管スクラビング気体供給装置２０のうち、少なくともいずれか１つの気体供給源が設けられていればよい。つまり、これらの装置のうち１つのみ、２つのみ、または３つ全部が設けられた構成が、本発明の実施の形態に含まれる。モジュール気体供給制御バルブ１５、配管気体供給制御バルブ１７、ポンプ前配管気体供給制御バルブ１９は、それぞれ、モジュールスクラビング気体供給装置１６、配管スクラビング気体供給装置１８、ポンプ前配管スクラビング気体供給装置２０と対を形成する部材である。
【００５６】
モジュールスクラビング気体供給装置１６は、分離膜モジュール２に対して、分離膜の一次側に、つまり培養液が供給される側に、管８６を介して接続される。管８６は、分離膜モジュール２に培養液を供給する管８１とは異なる管である。つまり、モジュールスクラビング気体供給装置１６は、培養液の供給路とは別の流路により、分離膜モジュール２に直接接続される。また、管８６は分離膜モジュール２の下部に接続されている。本書において「下部」とは、分離膜モジュールの底部であってもよいし、底面から分離膜モジュールの高さの１／３までの範囲を指すしてもよい。管８６を介して、モジュールスクラビング気体供給装置１６は、気体を分離膜モジュール２の下部から送り込むことができる。モジュール気体供給制御バルブ１５は、管８６上に配置され、開閉することで気体の供給量を調整することができる。
【００５７】
配管スクラビング気体供給装置１８は、循環ポンプ８の下流で、管８７によって、管８１に接続される。配管気体供給制御バルブ１７は、管８７上に設けられ、開閉することで気体の供給量を調整することができる。配管スクラビング気体供給装置１８は、発酵槽１と分離膜モジュール２とを連通する管８１から気体を供給する。なお、管８１が分離膜モジュール２の上部に接続されていれば、配管スクラビング気体供給装置１８は、分離膜モジュール２の上部から気体を供給することができる。
【００５８】
ポンプ前配管スクラビング気体供給装置２０は、循環ポンプ８の上流で、管８８によって、管８１に接続される。ポンプ前配管気体供給制御バルブ１９は、管８８上に設けられ、開閉することで気体の供給量を調整することができる。ポンプ前配管スクラビング気体供給装置２０は、分離膜モジュール２の下部から気体を供給すると共に、発酵槽１と分離膜モジュール２とを連通する管８１から気体を供給する。なお、管８１が分離膜モジュール２の上部に接続されていれば、ポンプ前配管スクラビング気体供給装置２０は、分離膜モジュール２の上部から気体を供給することができる。
【００５９】
管８６〜８８には、発酵槽１内に雑菌が入らないように、滅菌用装置や滅菌用フィルタなどが設置されてもよい。
【００６０】
気体供給口とは、気体を培養液または液体内に放出する部分である。気体供給口は、膜表面を洗浄できるような気泡を発生させるように形成されていることが好ましい。発生される気泡は微細気泡でもよいし粗大気泡でもよい。気泡の大きさは、分離膜の種類および散気量等の条件によって、気体供給口の形状を変えることで変更される。気体供給口は、塩化ビニル製またはステンレス製の配管に、空気吐出孔を設けることで形成されていてもよいし、多孔性のゴム、セラミック、メンブレンを用いた散気管なども使用することができる。気体供給口の大きさは、規定した量の気体が供給可能で、かつ、発酵液による詰まりが発生しない大きさであればよい。発酵系の中に雑菌が入らないように、気体供給口に滅菌用フィルタなどを設置することもできる。
【００６１】
図１では、管８６〜８８の２つの端部のうち、分離膜モジュール２に近い側の端部に、気体供給口が設けられている。言い換えると、管８６〜８８は、気体供給源から気体供給口までを繋ぐ管である。
【００６２】
このように、図１では、気体供給口は、分離膜モジュールの下部に設けられてもよいし、ポンプを用いて発酵槽から分離膜モジュールへ培養液を供給する構成では、発酵槽とポンプの間、またはポンプと分離膜モジュールの間のいずれに設けられてもよい。
【００６３】
また、スクラビングにより供給される気体の線速度を測定する機構の例として、図１には、流量計９１、９２および９３が示される。流量計９１は、管８６に設けられ、管８６内を通過する気体の流量を測定することができる。流量計９１は、モジュールスクラビング気体供給装置１６により供給される気体の線速度の測定に利用される。また、流量計９２は、管８７に設けられ、管８７内を通過する気体の流量を測定することができる。流量計９２は、配管スクラビング気体供給装置１８により供給される気体の線速度の測定に利用される。また、流量計９3は、管８８に設けられ、管８８内を通過する気体の流量を測定することができる。流量計９3は、ポンプ前配管スクラビング気体供給装置２０により供給される気体の線速度の測定に利用される。
【００６４】
２．分離膜モジュール
分離膜モジュールは、分離膜と、分離膜を収容するケースとを備える。
【００６５】
分離膜モジュールに用いられる分離膜は、有機膜、無機膜のいずれであってもよい。分離膜は、培養液のろ過に使用でき、気体による洗浄に対して耐久性を持つ膜であればよい。例えば、分離膜として、ポリフッ化ビニリデン製、ポリスルホン製、ポリエーテルスルホン製、ポリテトラフルオロエチレン製、ポリエチレン製、ポリプロピレン製、セラミックス製の膜が挙げられる。特に、発酵液による汚れが発生しにくく、かつ洗浄がしやすく、さらに気体による洗浄に対する耐久性に優れているポリフッ化ビニリデン製の分離膜が好ましい。
【００６６】
分離膜は、発酵液の中の細胞を効果的に分離するため、平均細孔径が０.００１μｍ以上１０μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることが好ましい。また、分離膜の形状は、平膜、中空糸膜などいずれの形状のものも採用することができるが、モジュール体積に比べ膜面積が広い中空糸膜が好ましい。膜の平均孔径は、ＡＳＴＭ：Ｆ３１６−８６記載の方法（別称：ハーフドライ法）にしたがって決定される。なお、このハーフドライ法によって決定されるのは、膜の最小孔径層の平均孔径である。
【００６７】
なお、ハーフドライ法による平均孔径の測定の標準測定条件は、以下のとおりである。
使用液体：エタノール
測定温度：２５℃、
昇圧速度：１ｋＰａ／秒
平均孔径［μｍ］は、下記式より求まる。
平均孔径［μｍ］＝（２８６０×表面張力[ｍＮ／ｍ]）／ハーフドライ空気圧力[Ｐａ]
エタノールの２５℃における表面張力は２１．９７ｍＮ／ｍである（日本化学会編、化学便覧基礎編改訂３版、ＩＩ-８２頁、丸善（株）、１９８４年）ので、本発明における標準測定条件の場合は、
平均孔径［μｍ］＝６２８３４．２／（ハーフドライ空気圧力[Ｐａ]）
にて求めることができる。
【００６８】
外圧式中空糸膜の外径は、０．５ｍｍ以上３ｍｍ以下であることが望ましい。外径が０．５ｍｍ以上であることで、中空糸膜中に流れるろ過液の抵抗を比較的小さく抑えられる。また、外径が３ｍｍ以下であることで、発酵液または気体による外圧により中空糸膜がつぶれることを抑制できる。
【００６９】
内圧式中空糸膜の内径は、０．５ｍｍ以上３ｍｍ以下が望ましい。内径が０．５ｍｍ以上であることで、中空糸膜中に流れる発酵液の抵抗を比較的小さく抑えることができる。また、内径が３ｍｍ以下であることで、膜表面積を確保することができるので、使用モジュール本数の増大を抑制することができる。
【００７０】
分離膜モジュールのケースは、耐圧性に優れる材質で作られており、円筒型、多角筒型など、発酵液をモジュールの１次側へ供給することができる形状であれば良い。発酵液の流れやハンドリング製を考慮すると、ケースは円筒型であることが好ましい。
【００７１】
３．化学品の製造方法
本実施形態の製造方法は、連続発酵により化学品を製造する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を備える：
（ａ）発酵槽内の培養液中で細胞を培養することにより、原料を発酵させて化学品を生成すること、
（ｂ）分離膜モジュールを用いて前記培養液をろ過すること、
（ｃ）ろ過における非透過液を前記発酵槽内に保持しつつ、前記化学品を含んだ透過液を培養液から分離すること、
（ｄ）前記分離膜モジュールに液体を供給しながら、前記分離膜モジュールの中の気体線速度が０．１５ｃｍ／ｓ以上７０ｃｍ／ｓ以下になるように、前記分離膜モジュールの下部および前記発酵槽と前記分離膜モジュールとを連通する配管の少なくとも一方から気体を供給すること。
各工程について、以下に説明する。なお、工程（ａ）〜（ｃ）は細胞の連続培養工程または連続発酵工程と言い換えられてもよい。
【００７２】
３−１．化学品の生成工程（ａ）
［細胞］
本書において、「細胞」とは、微生物および培養細胞、ならびに真核細胞および原核細胞を包含する概念である。微生物としては、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母；大腸菌、乳酸菌、コリネ型細菌などの細菌；糸状菌；放線菌等が用いられる。培養細胞は、多細胞生物由来の細胞であり、例えば動物細胞および昆虫細胞などが挙げられる。化学品の製造に用いられる細胞は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
【００７３】
真核細胞は、細胞内に細胞核（核）と呼ばれる構造を持ち、細胞核（以下、単に「核」と称する）を有さない原核生物とは明確に区別される。化学品の製造には、真核細胞のうちで酵母を好ましく用いることができる。化学品の製造に好適な酵母としては、例えば、サッカロミセス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母と、サッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母が挙げられる。
【００７４】
原核細胞は、細胞内に細胞核（核）と呼ばれる構造をもち、細胞核（核）を有する真核生物とは明確に区別される。化学品の製造には、例えば、原核細胞のうちで乳酸菌を好ましく用いることができる。
【００７５】
細胞は、目的とする化学品、原料、培養条件等に応じて選択される。
【００７６】
Ｌ−アミノ酸を生産する細胞として、例えば、発酵工業においてよく使用される大腸菌やコリネ型細菌などの細菌が挙げられる。
【００７７】
具体的には、Ｌ−スレオニン生産菌としては、エシェリシア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、プロビデンシア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、コリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはセラチア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｅｒｒａｔｉａ）に属する細菌等が挙げられる。この中でも特に好ましい種は、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、プロビデンシア・レトゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）およびセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）である。
【００７８】
また、Ｌ−リジン生産菌としては、エシェリシア属、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する細菌等が挙げられる。この中でも特に好ましい細菌は、エシェリシア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバムおよびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムである。
【００７９】
Ｌ−グルタミン酸生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバムおよびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムが好ましい。
【００８０】
Ｌ−トリプトファン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）およびエシェリシア・コリ等が挙げられる。
【００８１】
Ｌ−イソロイシン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムおよびセラチア・マルセセンス等が挙げられる。
【００８２】
Ｌ−グルタミン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムおよびフラボバクテリウム・リゲンス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｉｇｅｎｓｅ）等が挙げられる。
【００８３】
Ｌ−アルギニン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、セラチア・マルセセンス、エシェリシア・コリおよびバチルス・サブチリス等が挙げられる。
【００８４】
Ｌ−アラニン生産菌としては、ブレビバクテリウム・フラバムおよびアルスロバクター・オキシダンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）等が挙げられる。
【００８５】
Ｌ−ヒスチジン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・アモニアジェネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、セラチア・マルセセンス、エシェリシア・コリ、バチルス・サブチリスおよびストレプトマイセス・コエリコラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）等が挙げられる。
【００８６】
Ｌ−プロリン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、カルチア・カテナフォルマ（Ｋｕｒｔｈｉａ  ｃａｔｅｎａｆｏｒｍａ）、セラチア・マルセセンスおよびエシェリシア・コリ等が挙げられる。
【００８７】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムまたはエシェリシア・コリ等が挙げられる。
【００８８】
Ｌ−アスパラギン酸生産菌としては、ブレビバクテリウム・フラバム、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｈｅｒｉｕｍ）、エシェリシア・コリおよびシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）等が挙げられる。
【００８９】
Ｌ−チロシン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムおよびエシェリシア・コリ等が挙げられる。
【００９０】
Ｌ−メチオニン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカムが好ましい。
【００９１】
セリン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムおよびアルスロバクター・オキシダンス等が挙げられる。
【００９２】
Ｌ−セリン生産菌としては、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等が挙げられる。
【００９３】
Ｌ−バリン生産菌としては、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、セラチア・マルセセンスおよびクレブシェラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等が挙げられる。
【００９４】
Ｌ−ロイシン生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムおよびセラチア・マルセセンス等が挙げられる。
【００９５】
Ｌ−アミノ酸の生産能力を持つ微生物は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。一例として、特開平２−２１９５８２号公報に記載されているＬ−スレオニン生産性の向上したプロビデンシア・レトゲリ、および特表平３−５００４８６号公報に記載されているＬ−アラニン生産性の向上したコリネバクテリウム・グルタミカム等が挙げられる。
【００９６】
培養液中に含まれるＬ−アミノ酸の分離および精製は、従来知られているろ過、濃縮、蒸留および晶析などの方法を組み合わせて行うことができる。
【００９７】
乳酸を製造する場合、真核細胞であれば酵母、原核細胞であれば乳酸菌を用いることが好ましい。このうち酵母は、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を細胞に導入した酵母が好ましい。特に、５０％以上の対糖収率を示す乳酸菌が好ましく、さらには８０％以上の対糖収率を示す乳酸菌が好ましい。対糖収率とは、消費したグルコース量に対する乳酸の生産量の比率（重量比）である。
【００９８】
乳酸菌としては、例えば、野生型株では、乳酸を合成する能力を有するラクトバチラス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチラス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、テトラゲノコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、カルノバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バゴコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｇｅｎｕｓ  Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、オエノコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アトポビウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびスポロラクトバチルス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌が挙げられる。
【００９９】
また、乳酸の対糖収率が高い乳酸菌、または得られる乳酸の光学純度が高い乳酸菌を選択して用いることができる。例えば、Ｄ−乳酸を選択して生産する能力を有する乳酸菌としてはスポロラクトバチルス属に属するＤ−乳酸生産菌が挙げられ、好ましい具体例として、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）またはスポロラクトバチルス・イヌリナス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｎｕｌｉｎｕｓ）が使用できる。さらに好ましくは、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス ＡＴＣＣ ２３４９２、ＡＴＣＣ ２３４９３、ＡＴＣＣ ２３４９４、ＡＴＣＣ２３４９５、ＡＴＣＣ ２３４９６、ＡＴＣＣ ２２３５４９、ＩＡＭ１２３２６、ＩＡＭ１２３２７、ＩＡＭ １２３２８、ＩＡＭ １２３２９、ＩＡＭ １２３３０、ＩＡＭ １２３３１、ＩＡＭ １２３７９、ＤＳＭ ２３１５、ＤＳＭ ６４７７、ＤＳＭ ６５１０、ＤＳＭ ６５１１、ＤＳＭ ６７６３、ＤＳＭ ６７６４、ＤＳＭ ６７７１などとスポロラクトバチルス・イヌリナスＪＣＭ ６０１４などが挙げられる。
【０１００】
また、Ｌ−乳酸の対糖収率が高い乳酸菌としては、例えば、ラクトバシラス・ヤマナシエンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｙａｍａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ラクトバシラス・アニマリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバシラス・アジリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｉｌｉｓ）、ラクトバシラス・アビアリエス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｖｉａｒｉｅｓ）、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・デルブレッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｋｉｉ）、ラクトバシラス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバシラス・ルミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｕｍｉｎｉｓ）、ラクトバシラス・サリバリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバシラス・シャーピイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｈａｒｐｅａｅ）、ラクトバシラス・デクストリニクス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｘｔｒｉｎｉｃｕｓ）、およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）などが挙げられ、これらを選択して、Ｌ−乳酸の生産に用いることが可能である。
【０１０１】
また、Ｄ−乳酸を製造する場合、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＤＬＤＨともいうことがある）の酵素活性が増強された野生型株の細胞を用いることも好ましい。酵素活性を増強させる方法としては、従来知られている薬剤変異による方法も用いることができる。また、細胞に、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組み込むことによりＤ−乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を増強することもできる。つまり、化学品の生成には、組換え細胞も好適に用いられる。
【０１０２】
組換え細胞を用いてＤ−乳酸を製造する場合、宿主細胞としては、原核細胞である大腸菌、乳酸菌、および真核細胞である酵母などが好ましく、酵母が特に好ましい。
【０１０３】
Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子としては、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、およびバシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）由来の遺伝子が好ましく、バシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）由来の遺伝子がさらに好ましい。
【０１０４】
また、Ｌ−乳酸を製造する場合、乳酸生産能力を人為的に付与された、あるいは乳酸生産能力を人為的に増強された細胞を用いることができる。例えば、細胞に、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子（以下、「Ｌ−ＬＤＨ」と称することがある）が導入することで、Ｌ−乳酸生産能力を付与、あるいは増強することができる。Ｌ−乳酸生産能力を付与、あるいは増強する方法としては、従来知られている薬剤変異による方法を用いることができる。細胞にＬ−ＬＤＨを組み込むことによりＬ−乳酸生産能力を増強することもできる。つまり、組換え細胞も好適に用いられる。
【０１０５】
組換え細胞を用いてＬ−乳酸を製造する場合、宿主細胞としては、原核細胞である大腸菌および乳酸菌；および真核細胞である酵母などが好ましい。酵母は特に好ましく用いられる。また、酵母のうちサッカロマイセス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母が好ましく、サッカロマイセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）がさらに好ましい。
【０１０６】
Ｌ−ＬＤＨは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）およびピルビン酸を、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）およびＬ−乳酸に変換する活性を持つタンパク質をコードしていればよく、特定の配列には限定されない。例えば、Ｌ−ＬＤＨとして、対糖収率の高い乳酸菌由来、ほ乳類由来、またはカエル由来の遺伝子を用いることができる。ほ乳類由来の遺伝子としては、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来のＬ−ＬＤＨを好適に用いることができる。また、カエル由来の遺伝子としては、特にコモリガエル科（Ｐｉｐｉｄａｅ）に属するカエル由来のＬ−ＬＤＨを用いることが好ましく、コモリガエル科に属するカエルの中でも、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ＬＤＨを好ましく用いることができる。
【０１０７】
ヒトまたはカエル由来のＬ−ＬＤＨには、遺伝的多型性の遺伝子、および変異誘発などによる変異型の遺伝子も含まれる。遺伝的多型性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものである。また、変異誘発とは、人工的に遺伝子に変異を導入することをいう。変異誘発は、例えば、部位特異的変異導入用キット（Ｍｕｔａｎ―Ｋ（タカラバイオ社製））を用いる方法、およびランダム変異導入用キット（ＢＤ Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ ＰＣＲ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製））を用いる方法などにより実行される。また、ヒトまたはカエル由来のＬ−ＬＤＨは、ＮＡＤＨとピルビン酸をＮＡＤ＋とＬ−乳酸に変換する活性を持つタンパク質をコードしているならば、塩基配列の一部に欠失または挿入が存在していても構わない。
【０１０８】
ピルビン酸を製造する場合について述べる。ピルビン酸を生産する細胞としては、例えば、シュードモナス属（Ｇｅｎｕｓ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、コリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリシア属（Ｇｅｎｕｓ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アシネトバクター属（Ｇｅｎｕｓ  Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する細菌が挙げられる。また、シュードモナス・フルオレエセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・アエロギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などの細菌がより好ましい。さらに、突然変異または遺伝子組換えによって、性質の一部が改変された細菌が用いられてもよい。例えば、酸化的リン酸化によるＡＴＰ生産に直接関与するＡＴＰａｓｅ遺伝子を変異、または欠失させた細菌も好ましく用いられる。
【０１０９】
またカビおよび酵母なども好ましく用いられる。例えば、サッカロミセス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルロプシス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｔｏｌｕｒｏｐｕｓｉｓ）、カンジダ属（Ｇｅｎｕｓ  Ｃａｎｄｉｄａ）、またはシゾフィリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）に属するカビおよび酵母を用いることができる。さらに好ましくは、サッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・コプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｐｓｉｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、トルロプシス・グラブラータ（Ｔｏｌｕｒｏｐｕｓｉｓ  ｇｌａｂｒａｔａ）、またはシゾフィリウム・コムネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）などに属するカビおよび酵母を用いてピルビン酸を製造することが出来る。
【０１１０】
培養液に含まれるピルビン酸の分離および精製は、ろ過および陰イオン交換カラムを用いた方法により行うことができる。例えば、特開平６−３４５６８３に示される弱塩性イオン交換体を用いた精製法を好適に用いることができる。
【０１１１】
コハク酸を製造する場合について述べる。コハク酸を生産する細胞としては、例えば、アナエロビオスピリラム（Ｇｅｎｕｓ  Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属やアクチノバシラス（Ｇｅｎｕｓ  Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌を好適に利用することができる。具体的には、米国特許第５１４３８３３号明細書に記載のアナエロビオスピリラム サクシニシプロデュセンス（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、およびＪａｍｅｓ.Ｂ.Ｍｃｋｉｎｌａｙ（ジェームズ.Ｂ.マッキンリー）らが開示しているアクチノバシラス・サクシノジェネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）を挙げることができる（Ａｐｐｌ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.（アプライド  マイクロバイアル  アンド  マイクロバイオロジー）,７１,６６５１−６６５６（２００５）。また、コリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）やブレビバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などのコリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）；およびエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ）なども利用可能である。コリネ型細菌では、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）などが好適である。
【０１１２】
また、遺伝子組換えによってコハク酸の生産能力が改善された微生物を用いることで、コハク酸の生産性を向上させることも可能である。このような微生物としては、例えば、特開２００５−２７５３３号公報に記載の乳酸脱水素酵素（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を欠損したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、非特許文献１に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、米国特許第５７７０４３５号明細書に記載のピルビン酸−ギ酸開裂酵素（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｆｏｒｍａｔｅｌｙａｓｅ）と乳酸脱水素酵素（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の欠損株である大腸菌ＡＦＰ１１１株などを使用することができる。
【０１１３】
イタコン酸を製造する場合について述べる。イタコン酸を生産する細胞としては、例えばカビあるいは酵母を好ましく用いることができる。更に好ましくは、アスペルギルス属（Ｇｅｎｕｓ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、あるいはウスティラゴ属（Ｇｅｎｕｓ  Ｕｓｔｉｌａｇｏ）に属するカビ、およびカンジダ属（Ｇｅｎｕｓ Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｇｅｎｕｓ  Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）に属する酵母が挙げられる。中でも、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・イタコニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｉｔａｃｏｎｉｃｕｓ）、ウスティラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、ウスティラゴ・シノドンティス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓ）、およびウスティラゴ・ラベンホルスティナ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｒａｂｅｎｈｏｒｓｔｉｎａ）のカビ、あるいはカンジダ・アンタルクティカ（Ｃａｎｄｉａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）を、イタコン酸の生産に好ましく用いることができる。
【０１１４】
カダベリンを製造する場合について述べる。カダベリンを生産することが可能な細胞でとしては、リジン脱炭酸酵素および／またはリジン・カダベリンアンチポーターの酵素活性が増強された微生物が好ましい。更に好ましくは、リジン脱炭酸酵素および／またはリジン・カダベリンアンチポーターをコードする遺伝子を組み込んだ組換え微生物が挙げられる。更に好ましくは、リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子が１または２種類以上組み込まれている組換え微生物が挙げられる。
【０１１５】
カダベリンを製造する場合、組換え微生物としては大腸菌およびコリネ型細菌が好ましく、リジン脱炭酸酵素活性を有し、かつホモセリン栄養要求性またはＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性の少なくともいずれか１つの特徴を有しているコリネ型細菌がさらに好ましいる。更には、微生物は、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損していることが好ましく、遺伝子挿入変異生成によりホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損していることが更に好ましい。また、コリネ型細菌の属が、コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属からなる群より選ばれる少なくとも１つの属であることが好ましい。更に好ましくは、コリネバクテリア・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｕｔｅｒｉｕｍ  ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である。
【０１１６】
［培地］
発酵原料（以下、単に「原料」と称する。）とは、発酵によって目的の化学品を生じる物質である。原料は、細胞、培養条件、および目的とする化学品等に応じて、変更可能である。
【０１１７】
培養に用いられる培地は、原料を含むと共に、細胞の生育を促し、目的とする発酵生産物である化学品を良好に生産させ得る成分を含む。本書では、特に限定しない限り、「培地」とは液体培地を指す。培地は、例えば、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸、およびビタミンなどの有機微量栄養素を含有する。
【０１１８】
上記の炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトースおよびラクトース等の糖類；これら糖類を含有する澱粉、澱粉加水分解物、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ケーンジュース；甜菜糖蜜またはケーンジュースからの抽出物もしくは濃縮液；甜菜糖蜜またはケーンジュースのろ過液；シラップ（ハイテストモラセス）；甜菜糖蜜またはケーンジュースからの精製もしくは結晶化された原料糖；菜糖蜜またはケーンジュースからの精製もしくは結晶化された精製糖；酢酸やフマル酸等の有機酸；エタノールなどのアルコール類；並びにグリセリンなどが使用される。ここで糖類とは、多価アルコールの最初の酸化生成物であり、アルデヒド基またはケトン基をひとつ持ち、アルデヒド基を持つ糖をアルドース、ケトン基を持つ糖をケトースと分類される炭水化物のことを指す。
【０１１９】
また、上記の窒素源としては、例えば、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源が使用され、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。
【０１２０】
また、上記の無機塩類としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜使用することができる。
【０１２１】
［培養液］
培養液とは、培地およびその中で培養されている細胞を含み、培養の結果として生成された化学品を含み得る。
【０１２２】
分離膜モジュールにより得られるろ液には、実質的に細胞は含まれないが、説明の便宜上、ろ液も培養液と称することがある。
【０１２３】
［培養］
連続発酵装置１００では、発酵槽１内へ原料を導入しつつ、発酵槽１内から培養液を引き抜くことで、連続培養が行われる。
【０１２４】
培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って、細胞濃度を高くした後に、連続培養を開始しても良い。この際、必要に応じて、細胞の引き抜きを行うこともできる。化学品の製造では、細胞濃度を高くした後に、高濃度の細胞を接種し、培養開始とともに連続培養を行っても良い。
【０１２５】
原料の導入について説明する。図１では、培養実行中に培地供給ポンプ９が稼働することで、発酵槽１内に培地が導入され、その結果として原料が導入される。
【０１２６】
培養実行中、原料の導入は停止されずに常に行われていてもよいし、状況に応じて原料の導入と停止とが切り替えられてもよい。例えば、上述したように、培地の導入の開始および停止が、レベルセンサ６１の検出結果に基づいて行われてもよいし、図示しないタイマの計測結果に基づいて一定の時間毎に行われてもよい。なお、原料の導入が自動で行われる形態だけでなく、手動で行われる形態も、本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１２７】
次に、培養液の引き抜きについて説明する。培養液中の細胞の濃度は、培養液の環境が微生物または培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが、効率よい生産性を得るのに好ましい。
【０１２８】
連続発酵装置１００は、循環系によって培養液を引き抜くことで、化学品の回収を行いつつ、細胞濃度が高く維持しながら、連続培養を行うことができる。循環系を用いた培養液の引き抜きの詳細については、後述する。
【０１２９】
発酵槽１には、分離膜モジュール２につながる管８１の他に、引き抜き用の流路が接続されていてもよく、培養液の引き抜きが、この引き抜き用の流路を通じて行われてもよい。このとき、培養液の液体部分だけでなく、細胞も引き抜かれてもよい。
【０１３０】
培養中に、発酵槽１に新たな細胞が導入されてもよい。細胞の導入は、手動で行われてもよいし、自動的に行われてもよい。
【０１３１】
発酵槽においては、原料の供給と培養液の引き抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はない。また、原料の供給および培養液の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。
【０１３２】
連続培養操作は、管理上、通常、単一の発酵槽で行うことが好ましい。しかしながら、細胞を増殖させつつ生産物を生成する連続発酵培養法であれば、発酵槽の数は問わない。発酵槽の容量が小さい等の理由から、複数の発酵槽を用いることもあり得る。その場合、複数の発酵槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても、高い生産性が得られる。
【０１３３】
図１の連続発酵装置１００においては、発酵装置１内の培養液は、撹拌装置４によって撹拌され、さらに、温度制御部３、ｐＨ制御部５、レベル制御部６、発酵槽気体供給装置２１等によって、発酵に適した条件が維持される。
【０１３４】
細胞の培養は、通常、ｐＨが３以上１０以下で、温度が１５℃以上６５℃以下の範囲で行うことができる。培養液のｐＨは、無機の酸あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって、上記範囲内のあらかじめ定められた範囲内に調整される。連続発酵装置１００においては、制御装置２８の制御の下、ｐＨ制御部５によってｐＨが自動制御され、温度制御部３によって温度が自動制御される。
【０１３５】
３−２．培養液のろ過工程（ｂ）
ろ過工程により、培養液から連続的に化学品を回収することができ、かつ培養を継続することができる。具体的には、図１においては、循環ポンプ８によって、培養液が発酵槽１から引き抜かれ、管８１を通って分離膜モジュール２に供給される。培養液は、分離膜モジュール２によって、濃縮液と透過液とに分離される。
【０１３６】
図１のポンプ８はクロスフロー循環ポンプに該当し、分離膜モジュール２ではクロスフローろ過が行われる。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、膜ろ過方法として全量ろ過が採用されてもよい。ただし、連続発酵運転では膜に付着する微生物等の汚れの量が多いので、この汚れを効果的に除去するためには、クロスフローろ過を行うことが好ましい。クロスフローろ過によって、培養液の剪断力で汚れを除去することができるからである。クロスフローにさらにスクラビングを組み合わせることによって、より高い洗浄効率を実現することができる。
【０１３７】
ろ過の駆動力は、発酵槽と分離膜モジュールとの液位差（水頭差）にを利用するサイホンによって得られてもよいし、クロスフロー循環ポンプにより発生する膜間差圧によって得られてもよい。また、ろ過の駆動力として、分離膜モジュールのろ液側に吸引ポンプが設置されてもよい。図１の形態では、ろ過ポンプ１１が吸引ポンプに該当する。
【０１３８】
クロスフロー循環ポンプを使用する場合には、吸引ポンプの圧力により膜間差圧を制御することができる。さらに、分離膜モジュールの一次側に導入する気体または液体の圧力によっても膜間差圧を制御することができる。分離膜モジュールの一次側の圧力とろ液側の圧力との差を膜間差圧として検出し、この膜間差圧に基づいて、ポンプの制御等を行うことができる。
【０１３９】
図１の構成では、循環ポンプ８によって、発酵槽１から分離膜モジュール２へ培養液が供給される。また、差圧制御部７によって検知された膜間差圧に応じて、循環ポンプ８およびろ過ポンプ１１の動作が制御されることで、分離膜モジュール２に供給される培養液の量が適切に調整される。
【０１４０】
ろ過は連続的に行うこともできるし、間欠的に行うこともできる。間欠的にろ過を行う場合、例えばろ過を５〜１２０分間継続して実行する毎に、所定の時間（例えば０．１〜１０分間）ろ過を停止することができる。より好ましくは、ろ過を５〜１０分間継続するごとに、０．２５〜３分間ろ過を停止する。後述するように、スクラビングは、ろ過停止中に行っても良いし、ろ過中に行っても良い。
【０１４１】
３−３．分離および循環工程（ｃ）
培養液中の細胞は分離膜を透過しないので、分離膜モジュール２を通過した濃縮液（透過しなかった液体）では、細胞濃度が高められている。濃縮液が管８２を通って発酵槽１に戻されることで、発酵槽１内に細胞が保持される。分離膜モジュール２の分離膜を透過したろ液は、管８３を通って装置外に排出される。
【０１４２】
こうして、発酵槽１内の細胞濃度は高く保たれ、かつ化学品が連続的に培養系から分離される。
【０１４３】
３−４．第１の気体供給工程（ｄ）
第１の気体供給工程（ｄ）は、図１の構成においてはスクラビング洗浄として実行される。上述したように、図１に示す構成では、モジュールスクラビング気体供給装置１６、配管スクラビング気体供給装置１８、およびポンプ前配管スクラビング気体供給装置２０のうち、いずれか１つまたは２つ以上の装置によって、スクラビング用の気体が供給される。気体の供給によって、分離膜モジュール２内の分離膜から、汚れが除去される。
【０１４４】
スクラビング開始時には、モジュール気体供給制御バルブ１５、配管気体供給制御バルブ１７、およびポンプ前配管気体供給制御バルブ１９の少なくとも１つが、制御装置２８の制御により、または手動により開かれる。スクラビング停止時には、同様に、制御装置２８の制御または手動により、これらのバルブが閉じられる。
【０１４５】
スクラビング時には、分離膜モジュールへの液体の供給が行われる。スクラビングによる洗浄効果と、分離膜モジュールにおける液体の流れによる洗浄効果とが合わさることで、高い洗浄効果が得られる。
【０１４６】
特に図１の構成では、スクラビング時に、分離膜モジュール２に発酵槽１から培養液が供給される。具体的には、スクラビング用の気体が供給されているときに、循環ポンプ８が稼働する。このとき、ろ過ポンプ１１が停止され、かつろ過バルブ１２が閉じられていてもよい。ろ過は停止されていてもよい。また、ろ過ポンプ１１が稼働し、かつろ過バルブ１２が開かれていてもよい。
【０１４７】
こうして、培養液の流れによる剪断力とスクラビングによる洗浄効果とにより、高い洗浄効果が得られる。なお、気体供給時に分離膜モジュールに供給される液体は、培養液に限定されるものではない。培養液以外には、例えば細胞の入っていない培地等、発酵を阻害しないような液体を用いることができる。
【０１４８】
スクラビングに用いられる気体としては、ガスボンベ、ブロアー、コンプレッサー、あるいは配管によって供給される圧縮ガスなどを使用することができる。つまり、モジュールスクラビング気体供給装置１６、配管スクラビング気体供給装置１８、およびポンプ前配管スクラビング気体供給装置２０としては、気体を圧縮し、その一方で、一定の圧力でその気体を供給することが可能な装置、または、圧縮された気体を収容しており、一定の圧力でその気体を供給することが可能なタンクが用いられる。
【０１４９】
発酵槽１内で好気性発酵が行われる場合は、スクラビングによって供給される気体は、酸素を含有する気体であることが好ましく、純酸素であってもよい。また、酸素の濃度は、発酵に悪影響のない気体、例えば、空気、窒素、二酸化炭素、メタン、または前記気体らの混合気体などを混合することで、調整可能である。酸素の供給速度を上げるときは、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、培養液を加圧する、撹拌速度を上げる、あるいは通気速度を上げるなどの手段を用いることができる。
【０１５０】
一方で、発酵槽１内で嫌気性発酵が行われる場合は、酸素の供給速度を下げる必要があれば、二酸化炭素、窒素、メタンおよびアルゴンなど、酸素を含まないガスを空気に混合して供給することも可能である。
【０１５１】
分離膜モジュールに供給される気体の線速度は、膜モジュールの断面積あたりの気体の供給量であって、下記の式（１）から求められる。
【０１５２】
気体線速度（m/s） ＝ 気体供給量（m3/s）×１００÷（分離膜モジュール内部断面積（m2）×（１００−膜充填率（％））    ・・・（１）
例えば、分離膜モジュールが内周半径Ｒの筒状の容器と、その容器内に収容された外周半径ｒのａ本の中空糸膜とを備える場合は、分離膜モジュール内部断面積はπＲ２であり、膜充填率は（ａ×ｒ２÷Ｒ２×１００）で表される。平膜モジュールの場合も、容器の横断面積（つまりモジュール内部断面積）、平膜の横断面積、および平膜の数に基づいて、膜充填率が算出される。
【０１５３】
図１の構成では、制御装置２８は、流量計９１、９２および９３で計測された気体供給量を、上記式（１）に当てはめることで、分離膜モジュール２に供給される気体の線速度を求めることができる。また、制御装置２８は、気体の線速度が上記範囲になるようにバルブ１５、１７および１９の開閉を調整することができる。
【０１５４】
モジュールスクラビング気体供給装置１６のみによってスクラビング用の気体が供給される場合、気体の供給速度は、流量計９１の検知結果に基づいて、バルブ１５が開閉されることで調整される。また、配管スクラビング気体供給装置１８により気体が供給される場合、気体の供給速度は、流量計９２の検知結果に基づいてバルブ１７が開閉されることで調整される。また、ポンプ前配管スクラビング気体供給装置２０により気体が供給される場合、気体の供給速度は、流量計９３の検知結果に基づいてバルブ１８が開閉されることで調整される。
【０１５５】
なお、気体線速度の調整は、制御装置２８および自動バルブによって自動制御されてもよいし、手動バルブを用いて手動制御されてもよい。
【０１５６】
気体の線速度が０．１５ｃｍ／ｓ以上であることで、スクラビングの効果、ならびに気体供給のによる培養液の撹拌および酸素供給等の効果が得られる。連続発酵装置１００は、上述したように、発酵槽１の中から外に空気を逃がすためのバルブ２２および排気口を備えるが、気体線速度が大きすぎると、培養液の発泡量が多くなるので、泡が排気口から溢れてコンタミ（contamination）が発生したり、泡によってレベルセンサが発酵槽１内の液面の位置を誤検知したりといった問題が起きやすいので、気体の線速度は７０ｃｍ／ｓ以下が好ましい。
【０１５７】
スクラビング洗浄の効果とは、分離膜の表面に付着した細胞等の汚れを除去することである。さらに、スクラビング洗浄により、発酵効率を向上させることも可能である。スクラビングにより供給された気体は、培養液と接触し、配管の中で発酵液と接触しながら流れ、分離膜モジュールの中で、分離膜に接触して膜を揺らし、分離膜モジュールから発酵槽まで、配管の中で発酵液と接触しながら流れて発酵槽に入り、発酵槽中で撹拌された後、発酵液面の上部にある空間に上昇し、発酵液との接触が終わる。一方、発酵槽に直接気体が供給された場合は、発酵槽中で撹拌された後、すぐに発酵液面の上部にある空間に上昇し、発酵液との接触が終わる。
【０１５８】
スクラビングの実行条件、すなわちスクラビング実行のタイミング、頻度、１回のスクラビング当たりの時間等は、具体的に限定されるものではない。スクラビングの実行条件は、膜間差圧、膜間差圧の変化、発酵槽内の圧力、供給する気体の種類、培養される細胞の種類、製造される化学品の種類、および原料の種類等の様々な条件に応じて変更可能である。例えば、スクラビングは、連続して行っても良いし、前回のスクラビング終了から所定時間が経過する毎に行われてもよいし、分離膜モジュール２への培養液の供給量、つまりろ過量または膜間差圧が所定の値に達する毎に行われてもよい。スクラビング開始時および終了時を決定するために、連続発酵装置１００は、図示しないタイマ等の計測器が設けられていてもよい。
【０１５９】
例えば、スクラビング洗浄頻度は、０．１回／時間以上３６０回／時間以下が好ましく、より好ましくは１２回／時間以上１２０回／時間以下である。スクラビング洗浄頻度が３６０回／時間以下であることで、培養液の発泡による不具合、ろ過膜への損傷、および運転コストの上昇などの問題が発生しにくい。また、スクラビングの洗浄頻度が０．１回／時間以上であることで、洗浄効果を充分に得ることができ、発酵槽内の圧力を充分に高く維持できるので雑菌混入を抑制することができる。
【０１６０】
１回のスクラビング洗浄時間は、スクラビング洗浄頻度、膜間差圧、膜間差圧の変化、発酵槽内の圧力、化学品の生産速度により決定される。
【０１６１】
スクラビング洗浄を間欠的に行う場合の洗浄時間は、５秒以上１時間以下／回の範囲であり、より好ましくは１０秒以上６００秒以下／回である。スクラビング洗浄時間が１時間以内であることで、ろ過膜の損傷および乾燥、並びに運転コストの上昇などの問題の発生が抑制される。また、スクラビング洗浄時間が５秒以上であることで、洗浄効果を充分に得ることができると共に、発酵槽内の圧力低下を抑制することができるので、雑菌の混入を抑制することができる。なお、スクラビング洗浄時間に応じて、気体の線速度を調整することが可能である。
【０１６２】
３−５．第２の気体供給工程
化学品の製造方法は、工程（ｄ）とは別に、発酵槽に気体を供給する工程をさらに備えてもよい。図１の構成では、発酵槽１へ気体を供給する工程は、発酵槽気体供給装置２１および撹拌装置４によって実行可能である。
【０１６３】
特に、スクラビング洗浄が間欠的に行われる場合、スクラビングのための気体の供給を停止している間に、発酵槽へ気体を供給することで、微生物の生育に必要な気体の供給量を維持することができる。つまり、連続発酵装置１００においてスクラビングが間欠的に実行される場合、スクラビング停止時には、制御装置２８により、発酵槽気体供給装置２１および撹拌装置４等の他の機構による発酵槽１への気体の供給速度が、スクラビング実行時におけるこれら他の機構による発酵槽１への気体の供給速度よりも大きくなるように、制御される。供給速度をどの程度大きくするかは、発酵の条件等に応じて変更可能である。
【０１６４】
３−６．逆圧洗浄
化学品の製造方法は、分離膜モジュールの分離膜を逆圧洗浄する工程をさらに備えてもよい。図１の構成では、分離膜モジュール２の２次側に洗浄用配管８４が接続されているので、洗浄ポンプ１３を用いて分離膜モジュール２に洗浄液を投入することができる。
【０１６５】
逆圧洗浄実行時には、ろ液を溜めるろ液槽に洗浄液が流入しないように、ろ過が停止される。すなわち、ろ過バルブ１２が閉じ、かつろ過ポンプ１１が停止する。この状態で、洗浄バルブ１４が開き、洗浄ポンプ１３が稼働することで、逆圧洗浄が行われる。
【０１６６】
逆圧洗浄を停止するときには、洗浄バルブ１４が閉じ、洗浄ポンプ１３が停止する。この状態でろ過バルブ１２が開き、ろ過ポンプ１１が稼働することで、ろ過が実行される。
【０１６７】
これらの制御は、制御装置２８により実行可能である。逆圧洗浄の開始時および終了時を決定するために、連続発酵装置１００は、図示しないタイマ等の計測器を備えてもよい。
【０１６８】
逆圧洗浄に使用される洗浄液としては、発酵に悪影響がなく、かつ、分離膜の洗浄ができる液体、例えば、水、ろ過液、発酵培地または発酵培地に添加する成分の一部、または、塩酸、硫酸、硝酸、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、次亜塩素酸ナトリウムの水溶液またはそれらの混合液体などが挙げられる。
【０１６９】
４．化学品
本書に述べる製造方法によって得られる化学品は、細胞が培養液中に生産する物質である。化学品としては、例えば、アルコール、有機酸、ジアミン、アミノ酸および核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。また、上記製造方法は、酵素、抗生物質および組換えタンパク質のような物質の生産に適用することも可能である。
【０１７０】
例えば、アルコールとしては、エタノール、１，３−ブタンジオール、１,４−ブタンジオールおよびグリセロール等が挙げられる。
【０１７１】
また、有機酸としては、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、アミノ酸およびクエン酸等を挙げることができる。また、ジアミンとしてはカダベリン、核酸であればイノシン、グアノシンおよびシチジン等を挙げることができる。
【０１７２】
アミノ酸としては、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−チロシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−バリンおよびＬ−ロイシン等が挙げられ、特に、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジンおよびＬ−グルタミン酸が好適である。
【実施例】
【０１７３】
以下、実施例を示して本発明についてより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されない。以下の実施例で用いた連続発酵装置の概略構成は、スクラビング洗浄に関する構成以外は、図１に示すとおりである。また、以下の例では、化学品として、Ｌ−スレオニンおよびＬ−リジンを連続発酵により製造した。【０１７４】
［Ａ．Ｌ−スレオニン濃度の測定方法］
培養液中に含まれるＬ−スレオニン濃度の測定は、次の方法で行った。測定するＬ−スレオニンを含む培養液を２５μＬ取り、そこに１５０μｌのＮａＨＣＯ３（７５ｍＭ）および内標として２５μｌのＬ−メチオニン（２ｇ／Ｌ）を加える。上記の溶液に、さらに９００μｌのエタノールおよび１５０μｌの０．２Ｍジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）を加え混合する。上記の溶液を３７℃の温度で１時間静置後、下記条件でＨＰＬＣ分析を行った。【０１７５】
・カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  Ｃ１８  ＴＹＰＥ  ＳＧ１２０（資生堂）
・移動相：０．１％（ｗ／ｖ）Ｈ３ＰＯ４：アセトニトリル＝７：３（流速１．２ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：ＵＶ（３６０ｎｍ）
・温度：２３℃
検量線は、濃度既知のＬ−スレオニンを標品として分析を行い、横軸にＬ−スレオニン濃度、縦軸にＬ−スレオニン面積／Ｌ−メチオニン（内標）面積の面積比をプロットして作成した。【０１７６】
［Ｂ．Ｌ−リジン濃度の測定方法］
培養液中に含まれるＬ−リジン濃度の測定は、次の方法で行った。測定するＬ−リジンを含む培養液を２５μＬ取り、そこに４００μＬのＮａＨＣＯ３（７５ｍＭ）および内標として２５μＬの１，４−ブタンジオール（２ｇ／Ｌ）を加えた。上記の溶液に、１５０μｌの０．２ＭＤＮＦＢを添加後、３７℃で１時間反応させた。【０１７７】
その溶液５０μｌをアセトニトリル１ｍＬに溶解し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した上清１０μｌを以下の条件でＨＰＬＣにより分析した。【０１７８】
・カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  Ｃ１８  ＴＹＰＥ  ＳＧ１２０（資生堂）
・移動相：０．１％（ｗ／ｗ）リン酸水溶液：アセトニトリル＝４５：５５（流速１ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：ＵＶ（３６０ｎｍ）
・温度：２３℃
検量線は、濃度既知のＬ−リジンを標品として分析を行い、横軸にＬ−リジン濃度、縦軸にＬ−リジン面積／１，４−ブタンジオール（内標）面積の面積比をプロットして作成した。【０１７９】
［Ｃ．Ｌ−乳酸濃度のの測定方法］
培養液中に含まれるＬ−乳酸濃度の測定は、次の方法で行った。Ｌ−乳酸を含む培養液を１００ｕＬ取り、下記に示す条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することで確認した。   【０１８０】
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＳＰＲ−Ｈ（島津社製）   
移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）   
反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭビストリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）   
検出方法：電気伝導度   
温度：４５℃。   【０１８１】
検量線は、濃度既知のＬ−乳酸を標品として分析を行い、横軸にＬ−乳酸濃度、縦軸に検出ピーク面積をプロットして作成した。【０１８２】
［Ｄ．グルコース濃度の測定方法］
また、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。【０１８３】
菌体濃度については、適当な希釈を行った発酵液のＯＤ６００ｎｍの吸収を測定することで行った。【０１８４】
［Ｅ．中空糸モジュールの製作］
東レ（株）製加圧式ポリフッ化ビニリデン中空糸膜モジュール“ＨＦＳ１０２０”を解体して、接着固定されていない部分のみを切り出した。こうして切り出されたポリフッ化ビニリデン中空糸膜をケース内に収容することで、分離膜モジュールとしての中空糸膜モジュールを作製した。ケースとしては、ポリカーボネート樹脂の成型品を用いた。作製されたた中空糸膜モジュールの容量は0.02Lであり、有効ろ過面積は200平方cmであった。全ての実施例および比較例で、同型のモジュールが用いられた。【０１８５】
［Ｆ．連続発酵によるＬ−リジンの製造に用いられる遺伝子組換え株の作製］
Ｌ−リジン生産能力をもつ微生物として、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２（以下、ＡＴＣＣ１３０３２株と略す。）のホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＨＯＭ）遺伝子破壊株の作製を行った。具体的には、特開２００８−２１２１３８に記載の方法により、遺伝子改変を行った。得られた菌株を、コリネバクテリウム・グルタミカム  ｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株（以下、ｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株と略す。）と称する。ｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株を用いて、後述するようにＬ−リジンの連続発酵を行った。【０１８６】
［Ｇ．連続発酵によるＬ−乳酸の製造に用いられる遺伝子組換え株の作製］
ＰＤＣ１遺伝子、ＳＥＤ１遺伝子、およびＴＤＨ３遺伝子座にアフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が導入された酵母を作製した。導入された酵母を作製した。ｌｄｈ遺伝子は、配列番号１に記載の塩基配列を有する。アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子のクローニングはＰＣＲ法により行った。ＰＣＲでは、アフリカツメガエルの腎臓由来ｃＤＮＡライブラリー（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いて付属のプロトコールに従い調製したファージミドＤＮＡを鋳型として用いた。【０１８７】
ＰＣＲには、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いた。また、反応バッファーおよびｄＮＴＰ  ｍｉｘ等としては付属のものを使用した。【０１８８】
ＰＣＲ反応液は、１サンプル当たり５０μｌであり、付属のプロトコールに従い調整したファージミドＤＮＡ：５０ｎｇ／サンプル、プライマー：５０ｐｍｏｌ／サンプル、及びＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：１ユニット／サンプルを含むように調整した。反応溶液をＰＣＲ増幅装置ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により９４℃の温度で５分熱変成させた後、９４℃（熱変成）：３０秒、５５℃（プライマーのアニール）：３０秒、６８℃（相補鎖の伸張）：１分が１サイクルである処理を３０サイクル行った。その後、反応液を４℃の温度に冷却した。なお、遺伝子増幅用プライマー（配列番号２，３）には、５末端側にはＳａｌＩ認識配列をふかし、３末端側にはＮｏｔＩ認識配列をそれぞれ付加した。【０１８９】
ＰＣＲ増幅断片を精製し、末端をＴ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）によりリン酸化した後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いて行った。ライゲーション溶液を大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞（タカラバイオ社製）に形質転換し、５０μｇ／ｍＬの抗生物質アンピシリンを含むＬＢプレートに蒔いて一晩培養した。生育したコロニーについて、ミニプレップでプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断し、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が挿入されているプラスミドを選抜した。これら一連の操作は、全て付属のプロトコールに従い行った。【０１９０】
上記アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８ベクターを、制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断し、ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離した。その後、定法に従いアフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子を含む断片を精製した。【０１９１】
得られたｌｄｈ遺伝子を含む断片を、図１４に示す発現ベクターｐＴＲＳ１１のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位にライゲーションした。上記と同様な方法でプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断することにより、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が挿入された発現ベクターを選抜した。以後、このようにして作製したアフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子を組み込んだ発現ベクターをｐＴＲＳ１０２と称する。【０１９２】
このｐＴＲＳ１０２を増幅鋳型として用い、オリゴヌクレオチド（配列番号４，５）をプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子及びＴＤＨ３ターミネーター配列を含む１．３ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。なお、配列番号４を、ＰＤＣ１遺伝子の開始コドンから上流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。【０１９３】
次に、プラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型として用い、オリゴヌクレオチド（配列番号６，７）をプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、酵母選択マーカーであるＴＲＰ１遺伝子を含む１．２ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで、配列番号７は、ＰＤＣ１遺伝子の終始コドンから下流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。【０１９４】
それぞれのＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。ここで得られた各１．３ｋｂ断片、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号４，７）をプライマーセットとしたＰＣＲを行った。その結果、約２．５ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。この断片では、５末端および３末端にそれぞれＰＤＣ１遺伝子の上流および下流の６０ｂｐに相当する配列が付加されており、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子、ＴＤＨ３ターミネーター及びＴＲＰ１遺伝子が連結されている。【０１９５】
上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離し、常法に従い精製した。その後、酵母サッカロミセス・セレビセＮＢＲＣ１０５０５株に形質転換し、トリプトファン非添加培地で培養した。こうして、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている形質転換株を選択した。【０１９６】
上記のようにして得られた形質転換株が、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている酵母であることを、以下のようにして確認した。まず、形質転換株のゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ抽出キット“Ｇｅｎとるくん”（商標，タカラバイオ社製）により調製した。これを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号７，８）をプライマーセットとしたＰＣＲを行うと、約２．８ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られた。これにより、得られた形質転換株が、上記酵母であることが確認された。なお、非形質転換株では、上記ＰＣＲによって約２．１ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られる。【０１９７】
以下、上記アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株を、Ｂ２株と称する。なお、ＰＤＣ１遺伝子の上流及び下流配列は、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓＧｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＵＲＬ:ｈｔｔｐ:／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／）より取得することができる。【０１９８】
続いてこのＢ２株のＳＥＤ１遺伝子座に、配列番号１に記載のｌｄｈ遺伝子を導入した。まず、参考例１で作製したｐＴＲＳ１０２を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号５，９）をプライマーセットとしたＰＣＲを行った。これにより、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子及びＴＤＨ３ターミネーター配列を含む１．３ｋｂのＰＣＲ断片が増幅された。ここで配列番号９を、ＳＥＤ１遺伝子の開始コドンから上流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。【０１９９】
次に、プラスミドｐＲＳ４２３を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号６，１０）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、酵母選択マーカーであるＨＩＳ３遺伝子を含む約１．３ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで、配列番号１０を、ＳＥＤ１遺伝子の終始コドンから下流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。【０２００】
それぞれのＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離し、常法に従い精製した。ここで得られた２種類の約１．３ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号９，１０）をプライマーセットとしたＰＣＲ法によって、５末端および３末端にそれぞれＳＥＤ１遺伝子の上流および下流の６０ｂｐに相当する配列が付加された、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子、ＴＤＨ３ターミネーター及びＨＩＳ３遺伝子が連結された約２．６ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。【０２０１】
上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。その後、この断片をＢ２株に形質転換し、ヒスチジン非添加培地で培養することにより、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が染色体上のＳＥＤ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている形質転換株を選択した。【０２０２】
上記のようにして得られた形質転換株が、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が染色体上のＳＥＤ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている酵母であることの確認は下記のように行った。まず、形質転換株のゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ抽出キット“Ｇｅｎとるくん”（タカラバイオ社製）により調製した。これを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号１１，１２）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、約２．９ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られたことで、得られた形質転換株が、上記遺伝子が導入された酵母であることを確認した。なお、非形質転換株では、上記ＰＣＲによって約１．４ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られる。以下、上記アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が染色体上のＳＥＤ１遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株を、ＳＵ０１４−Ｉ株とする。【０２０３】
続いてＳＵ０１４−Ｉに配列番号１に記載のｌｄｈ遺伝子をＴＤＨ３遺伝子座に導入した。ＴＤＨ３遺伝子座への導入は、ｐＴＲＳ１０２のＴＤＨ３ターミネーターをＡＤＨ１ターミネーターに変更したプラスミドを作製することにより行った。【０２０４】
まず、ＮＢＲＣ１０５０５株からゲノムＤＮＡ抽出キット“Ｇｅｎとるくん”（タカラバイオ社製）によりゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として用い、オリゴヌクレオチド（配列番号１３，１４）をプライマーセットとしたＰＣＲを行った。これにより、ＡＤＨ１プロモーターを含むＰＣＲ断片を増幅した。ここで、配列番号１３の５末端側にはＮｏｔＩ認識配列が付加され、配列番号１４の3末端側にはＨｉｎｄＩＩＩ認識配列をそれぞれ付加した。【０２０５】
ＰＣＲ増幅断片を精製し、末端をＴ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーション溶液を大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞（タカラバイオ社製）に形質転換し、抗生物質アンピシリンを５０μｇ／ｍＬを含むＬＢプレートに蒔いて一晩培養した。生育したコロニーについて、ミニプレップでプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断しすることで、ＡＤＨ１ターミネーターが挿入されているプラスミドを選抜した。作製したプラスミドをｐＵＣ１１８−ＡＤＨ１ｔと称する。【０２０６】
次にｐＵＣ１１８−ＡＤＨ１ｔを制限酵素ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常定法に従いＡＤＨ１ターミネーターを含む断片を精製した。得られたＡＤＨ１ターミネーターを含む断片を、ｐＴＲＳ１０２のＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位にライゲーションし、上記と同様な方法でプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより、ＴＤＨ３ターミネーターがＡＤＨ１ターミネーターに変更されたプラスミドを選抜した。以後、このようにして作製したプラスミドをｐＴＲＳ１５０と称する。【０２０７】
このｐＴＲＳ１５０を鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号１５，１６）をプライマーセットとしたＰＣＲを行った。このＰＣＲによって、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子及びＡＤＨ１ターミネーター配列を含む１．３ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで配列番号１６のプライマーを、ＴＤＨ３遺伝子の開始コドンから上流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。【０２０８】
次に、プラスミドｐＲＳ４２６を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号１７，１８）をプライマーセットとしたＰＣＲを行った。このＰＣＲによって、酵母選択マーカーであるＵＲＡ３遺伝子を含む１．２ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで、配列番号１８のプライマーを、ＴＤＨ３遺伝子の終始コドンから下流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。【０２０９】
それぞれのＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離し、常法に従い精製した。ここで得られた各１．３ｋｂ断片および１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型として用い、オリゴヌクレオチド（配列番号１６，１８）をプライマーセットとして用いたＰＣＲを行った。こうして、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子、ＡＤＨ１ターミネーター及びＵＲＡ３遺伝子が連結された約２．５ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。【０２１０】
上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離し、常法に従い精製した。その後、得られた断片をＳＵ０１４−Ｉ株に形質転換し、ウラシル非添加培地で培養した。こうして、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子がＴＤＨ３遺伝子プロモーターの下流に導入されている染色体を有する形質転換株を選択した。【０２１１】
上記のようにして得られた形質転換株が、カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＴＤＨ３遺伝子プロモーターの下流に導入されている酵母であることを、下記のとおり確認した。まず、形質転換株のゲノムＤＮＡを、ゲノムＤＮＡ抽出キット“Ｇｅｎとるくん”（タカラバイオ社製）により調製した。こうして調整されたゲノムＤＮＡを増幅鋳型として用い、オリゴヌクレオチド（配列番号１９，２０）をプライマーセットとして用いたＰＣＲを行った。このＰＣＲにより約２．８ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られると、形質転換株は上記酵母である。なお、非形質転換株では、上記ＰＣＲによって約２．１ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られる。以下、上記カエル由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子が染色体上のＴＤＨ３遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株をＳＵ０１４−ＩＩ株と称する。【０２１２】
次に、ｐｄｃ５遺伝子に温度感受性変異を有する酵母ＳＷ０１５株と上記得られたＳＵ０１４−ＩＩ株とを接合させ２倍体細胞を得た。ＳＷ０１５株については、国際公開ＷＯ２００７／０９７２６０号公報に記載されている。この２倍体細胞を子嚢形成培地で子嚢形成させた。マイクロマニピュレーターで子嚢を解剖し、それぞれの一倍体細胞を取得した。【０２１３】
得られた一倍体細胞の栄養要求性をそれぞれ調べた。取得した一倍体細胞の中から、ｐｄｃ１遺伝子、ｓｅｄ１遺伝子、ｔｄｈ３遺伝子座にアフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が挿入され、かつ、ｐｄｃ５遺伝子に温度感受性変異を有する（３４℃で生育不能）株の中で、接合型がＭＡＴａであるもの、およびＭＡＴαであるものをそれぞれ選択した。得られた酵母株のうちＭＡＴａの接合型を有する株をＳＵ０１４―８Ａ株、ＭＡＴαの接合型を有する株をＳＵ０１４―３Ｂ株と称する。【０２１４】
得られたＳＵ０１４−８Ａ株とＳＵ０１４−３Ｂ株とを接合させ、栄養要求性のある２倍体栄養要求性株を得た。得られた株をＳＵ０１４とする。【０２１５】
［Ｈ．連続発酵によるＬ−スレオニンの製造］
（比較例１）
図１に示す連続発酵装置を稼働させたＬ−スレオニンの連続発酵を実施した。分離膜には、参考例２で作製した中空糸膜を利用した。Ｌ−スレオニン連続発酵における運転条件として、以下の実施例および比較例に共通の条件は下記のとおりである。【０２１６】
共通条件
・微生物：プロビデンシア・レトゲリＳＧＲ５８８−７７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０５２８）
・培地：Ｌ−スレオニン発酵培地（表１）
・発酵液容量：３．０（Ｌ）
・中空糸膜ＭＤ容量：０．０２（Ｌ）
・温度：３７（℃）
・発酵槽撹拌速度：３５０（ｒｐｍ）
・滅菌：中空糸膜モジュールを含む発酵槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧（２気圧）蒸気滅菌。【０２１７】
・ｐＨ調整：２８％アンモニア水溶液によりｐＨ７に調整
・循環ポンプ流量：３Ｌ／ｍｉｎ
・ろ過速度：１７０ｍｌ／ｈ（一定）【０２１８】
【表１】
2012077742.tif 000003
【０２１９】
また、この比較例に特有の条件（変更条件）は以下のとおりである。【０２２０】
変更条件
・モジュールスクラビング気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管スクラビング気体供給装置（１８）による気体供給量：なし
・ポンプ前配管スクラビング気体供給装置（２０）による気体供給量：なし
・気体線速度：０ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：７５ｍｌ／ｍｉｎ  以下の培地等の条件は実施例および比較例で共通である。なお、目的とする化学物質にかかわらず、発酵における原料のうち炭素源にはグルコースを用いた。窒素源および無機塩類としては、それぞれ後述の物質を用いた。【０２２１】
まず、１００ｍｌのグルコースブイヨン培地（１％グルコース、３％ブイヨン（ニッスイ社製））を投入した５００ｍｌ容の三角フラスコに、寒天培地から掻き取ったプロビデンシア・レトゲリ  ＳＧＲ５８８−７７株を植菌した。これを温度３７℃、回転数１４０ｒｐｍで撹拌しながら培養した（つまり前培養を行った）。得られた前培養液を、３ＬのＬ−スレオニン発酵培地（表１）が投入された連続発酵装置に植菌し、２４時間培養を行った。その後、発酵槽内の培養液量が一定となるように供給量を制御しながら、Ｌ−スレオニン発酵培地を連続供給することで、連続培養を行った。こうして、連続発酵によるＬ−スレオニンの製造を行った。【０２２２】
ろ過液中に含まれるＬ−スレオニン濃度および残存グルコース濃度を、［Ａ］および［Ｄ］に示す方法により測定した。【０２２３】
本比較例での発酵液中の菌体濃度（−）の推移を図２に示し、Ｌ−スレオニン生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）、の推移を図３に示し、対糖収率（％）の推移を図４に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図５に示す。【０２２４】
（比較例２）
以下の条件以外は比較例１と同様の条件下で、連続発酵を行った。【０２２５】
・モジュールスクラビング気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管スクラビング気体供給装置（１８）による気体供給量：２５００ｍｌ／ｍｉｎ
・ポンプ前配管スクラビング気体供給装置（２０）による気体供給量：なし
・気体線速度：８８．５ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：７５ｍｌ／ｍｉｎ
気体線速度は、流量計９３により測定した。【０２２６】
本比較例では発酵槽内の発酵液が著しく発泡し、発酵槽上部にある排気口まで達して外気にふれ、コンタミが発生して連続発酵が不可能であった。【０２２７】
（実施例１）
下記条件以外は比較例１と同様の条件下で連続発酵を行った。【０２２８】
・モジュールスクラビング気体供給装置（１６）による気体供給量：５ｍｌ／ｍｉｎ
・配管スクラビング気体供給装置（１８）による気体供給量：なし
・ポンプ前配管スクラビング気体供給装置（２０）による気体供給量：なし
・気体線速度：０．１８ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：７５ｍｌ／ｍｉｎ
本比較例での発酵液中の菌体濃度（−）の推移を図２に示し、Ｌ−スレオニン生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）、の推移を図３に示し、対糖収率（％）の推移を図４に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図５に示す。【０２２９】
比較例１と比べるとＬ−スレオニン生産速度の立ち上がりが向上し、さらにはＬ−スレオニン生産速度および対糖収率が向上した。更には膜間差圧の上昇速度も比較例１より抑えられ低い値のまま推移しており、膜洗浄効果が現れていることが確認できた。このように簡便な方法により膜面洗浄を行い分離膜のろ過性を維持しながら、かつ、連続発酵による化学品の生産性を高めることが可能となった。【０２３０】
（実施例２）
下記条件以外は、比較例１と同様の条件下で連続発酵を行った。【０２３１】
・モジュールスクラビング気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管スクラビング気体供給装置（１８）による気体供給量：３００ｍｌ／ｍｉｎ
・ポンプ前配管スクラビング気体供給装置（２０）による気体供給量：なし
・気体線速度：１０．４ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：７５ｍｌ／ｍｉｎ
本実施例での発酵液中の菌体濃度（−）の推移を図２に示し、Ｌ−スレオニン生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）、の推移を図３に示し、対糖収率（％）の推移を図４に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図５に示す。【０２３２】
比較例１、実施例１と比べるとＬ−スレオニン生産速度の立ち上がりが更に向上し、さらにはＬ−スレオニン生産速度および対糖収率が向上した。膜間差圧の上昇速度も比較例１より抑えられ低い値のまま推移しており、膜洗浄効果が現れていることが確認できた。【０２３３】
（実施例３）
下記条件以外は、比較例１と同様の条件下で連続発酵を行った。【０２３４】
・モジュールスクラビング気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管スクラビング気体供給装置（１８）による気体供給量：なし
・ポンプ前配管スクラビング気体供給装置（２０）による気体供給量：５００ｍｌ／ｍｉｎ
・気体線速度：１７．４ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：７５ｍｌ／ｍｉｎ
本実施例での発酵液中の菌体濃度（−）の推移を図２に示し、Ｌ−スレオニン生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）、の推移を図３に示し、対糖収率（％）の推移を図４に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図５に示す。【０２３５】
比較例１、実施例１および実施例２と比べるとＬ−スレオニン生産速度の立ち上がりが更に向上し、さらにはＬ−スレオニン生産速度および対糖収率が向上した。膜間差圧の上昇速度も比較例１より抑えられ低い値のまま推移しており、膜洗浄効果が現れていることが確認できた。このようにスクラビングは、その供給位置にはかかわらず、その効果を発揮できていることが確認できた。【０２３６】
（実施例４）
下記条件以外は比較例１と同様の条件下で連続発酵を行った。【０２３７】
・モジュールスクラビング気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管スクラビング気体供給装置（１８）による気体供給量：２０００ｍｌ／ｍｉｎ
・ポンプ前配管スクラビング気体供給装置（２０）による気体供給量：なし
・気体線速度：７０ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：７５ｍｌ／ｍｉｎ
本比較例での発酵液中の菌体濃度（−）の推移を図２に示し、Ｌ−スレオニン生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）、の推移を図３に示し、対糖収率（％）の推移を図４に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図５に示す。【０２３８】
比較例１と比べるとＬ−スレオニン生産速度の立ち上がりが向上し、さらにはＬ−スレオニン生産速度および対糖収率が向上した。更には膜間差圧の上昇速度も比較例１より抑えられ低い値のまま推移しており、膜洗浄効果が現れていることが確認できた。なお、比較例２と比べると、発泡が少なく、コンタミも発生せずに長期間運転が可能であることが確認できた。【０２３９】
［Ｉ．連続発酵によるＬ−リジンの製造］
（比較例３）
図１に示す連続発酵装置を用いて、Ｌ−リジンの連続発酵を実施した。分離膜には、［Ｆ］で作製した中空糸膜を利用した。Ｌ−リジン連続発酵における運転条件として以下の実施例および比較例に共通の条件は下記のとおりである。【０２４０】
共通条件
・微生物：コリネバクテリウム・グルタミカム  ｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株
・培地：Ｌ−リジン発酵培地（表２）
・発酵液容量：３．０（Ｌ）
・中空糸膜ＭＤ容量：０．０２（Ｌ）
・温度：３０（℃）
・発酵槽撹拌速度：３５０（ｒｐｍ）
・滅菌：中空糸膜モジュールを含む発酵槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧（２気圧）蒸気滅菌した。【０２４１】
・ｐＨ調整：２８％アンモニア水溶液によりｐＨ７.３に調整
・循環ポンプ流量：３Ｌ／ｍｉｎ
・ろ過速度：１７０ｍｌ／ｈ（一定）【０２４２】
【表２】
2012077742.tif 000004
【０２４３】
変更条件
・モジュールスクラビング気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管スクラビング気体供給装置（１８）による気体供給量：なし
・ポンプ前配管スクラビング気体供給装置（２０）による気体供給量：なし
・気体線速度：０ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：７５ｍｌ／ｍｉｎ
まず、５ｍｌのＢＹ培地（０．５％イーストエキストラクト（yeast extract）、０．７％ミートエキストラクト（meat extract）、１％ペプトン、０．３％塩化ナトリウム）を投入した試験管に、寒天培地から掻き取ったｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株を植菌した。これを温度３０℃、で２４時間振とう培養した（前々培養）。得られた前々培養液を、表２に示した培地を５０ｍＬ投入した５００ｍＬの三角フラスコに全量植菌し、３０℃で前培養を行った。得られた前培養液を、３ＬのＬ−リジン発酵培地が投入された連続発酵装置に植菌し、２４時間培養を行った。その後、発酵槽内の培養液量が一定となるように供給量を制御しながら、Ｌ−リジン発酵培地を連続供給することで、連続培養を行った。こうして、連続発酵によるＬ−スレオニンの製造を行った。【０２４４】
適宜、ろ過液中の生産されたＬ−リジン濃度および残存グルコース濃度は［Ｂ］および［Ｄ］に示す方法により測定した。【０２４５】
本比較例での発酵液中の菌体濃度（−）の推移を図６に示し、Ｌ−リジン生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）、の推移を図７に示し、対糖収率（％）の推移を図８に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図９に示す。【０２４６】
（比較例４）
以下の条件以外は比較例３と同様の条件下で、連続発酵を行った。【０２４７】
・モジュールスクラビング気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管スクラビング気体供給装置（１８）による気体供給量：なし
・ポンプ前配管スクラビング気体供給装置（２０）による気体供給量：２３００ｍｌ／ｍｉｎ
・気体線速度：８１．３ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：７５ｍｌ／ｍｉｎ
本比較例では発酵槽内の発酵液が著しく発泡し、泡によって液面制御を行うためのレベルセンサが誤作動した。その結果、培地供給が行われなくなり、発酵液が枯渇したので、連続発酵が不可能であった。【０２４８】
（実施例５）
以下の条件以外は比較例３と同様の条件下で連続発酵を行った。【０２４９】
・モジュールスクラビング気体供給装置（１６）による気体供給量：８００ｍｌ／ｍｉｎ
・配管スクラビング気体供給装置（１８）による気体供給量：なし
・ポンプ前配管スクラビング気体供給装置（２０）による気体供給量：なし
・気体線速度：２７．８ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：７５ｍｌ／ｍｉｎ
本比較例での発酵液中の菌体濃度（−）の推移を図６に示し、Ｌ−リジン生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）、の推移を図７に示し、対糖収率（％）の推移を図８に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図９に示す。【０２５０】
比較例３と比べるとＬ−リジン生産速度の立ち上がりが更に向上し、さらにはＬ−リジン生産速度および対糖収率が向上した。膜間差圧の上昇速度も比較例３より抑えられ低い値のまま推移しており、膜洗浄効果が現れていることが確認できた。このように簡便な方法により膜面洗浄を行い分離膜のろ過性を維持しながら、かつ、連続発酵による化学品の生産性を高めることが可能となった。【０２５１】
（実施例６）
以下の条件以外は比較例３と同様の条件下で、連続発酵を行った。【０２５２】
・モジュールスクラビング気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管スクラビング気体供給装置（１８）による気体供給量：１０００ｍｌ／ｍｉｎ
・ポンプ前配管スクラビング気体供給装置（２０）による気体供給量：なし
・気体線速度：３４．７ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：７５ｍｌ／ｍｉｎ
本比較例での発酵液中の菌体濃度（−）の推移を図６に示し、Ｌ−リジン生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）、の推移を図７に示し、対糖収率（％）の推移を図８に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図９に示す。【０２５３】
比較例３および実施例５と比べるとＬ−リジン生産速度の立ち上がりが更に向上し、さらにはＬ−リジン生産速度および対糖収率が向上した。膜間差圧の上昇速度も比較例１より抑えられ低い値のまま推移しており、膜洗浄効果が現れていることが確認できた。【０２５４】
（実施例７）
以下の条件以外は比較例３と同様の条件下で、連続発酵を行った。【０２５５】
・モジュールスクラビング気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管スクラビング気体供給装置（１８）による気体供給量：なし
・ポンプ前配管スクラビング気体供給装置（２０）による気体供給量：１２００ｍｌ／ｍｉｎ
・気体線速度：４１．７ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：７５ｍｌ／ｍｉｎ
本比較例での発酵液中の菌体濃度（−）の推移を図６に示し、Ｌ−リジン生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）、の推移を図７に示し、対糖収率（％）の推移を図８に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図９に示す。【０２５６】
比較例３、実施例５および実施例６と比べるとＬ−リジン生産速度の立ち上がりが更に向上し、さらにはＬ−リジン生産速度および対糖収率が向上した。膜間差圧の上昇速度も比較例１より抑えられ低い値のまま推移しており、膜洗浄効果が現れていることが確認できた。このようにスクラビングは、その供給位置にはかかわらず、その効果を発揮できていることが確認できた。【０２５７】
（実施例８）
以下の条件以外は比較例３と同様の条件下で、連続発酵を行った。【０２５８】
・モジュールスクラビング気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管スクラビング気体供給装置（１８）による気体供給量：なし
・ポンプ前配管スクラビング気体供給装置（２０）による気体供給量：１５００ｍｌ／ｍｉｎ
・気体線速度：５２．１ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：７５ｍｌ／ｍｉｎ
本比較例での発酵液中の菌体濃度（−）の推移を図６に示し、Ｌ−リジン生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）、の推移を図７に示し、対糖収率（％）の推移を図８に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図９に示す。【０２５９】
比較例３と比べるとＬ−スレオニン生産速度の立ち上がりが向上し、さらには運転初期におけるＬ−スレオニン生産速度および対糖収率が向上した。更には膜間差圧の上昇速度も比較例３より抑えられ低い値のまま推移しており、膜洗浄効果が現れていることが確認できた。なお、比較例４と比べると、発泡も少なく、液面制御が正常に行われ、長期間運転が可能であることが確認できた。【０２６０】
［Ｊ．連続発酵によるＬ−乳酸の製造］
（比較例５）
図１に示す連続発酵装置を用いて、Ｌ−乳酸の連続発酵を実施した。分離膜には、［Ｆ］で作製した中空糸膜を利用した。Ｌ−乳酸連続発酵における運転条件として共通の条件は下記のとおりである。【０２６１】
共通条件
・微生物：サッカロマイセス・セレビセ  ＳＵ０１４株
・培地：発酵培地（表３）
・発酵液容量：１．０（Ｌ）
・中空糸膜ＭＤ容量：０．００７（Ｌ）
・温度：３２（℃）
・発酵槽撹拌速度：４００（ｒｐｍ）
・滅菌：中空糸膜モジュールを含む発酵槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧（２気圧）蒸気滅菌した。【０２６２】
・ｐＨ調整：５Ｎ水酸化カルシウム水溶液によりｐＨ４．５に調整
・循環ポンプ流量：１．７Ｌ／ｍｉｎ
・ろ過速度：２２５ｍｌ／ｈ（一定）【０２６３】
【表３】
2012077742.tif 000005
【０２６４】
変更条件
・モジュールスクラビング気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管スクラビング気体供給装置（１８）による気体供給量：１ｍＬ／ｍｉｎ
・ポンプ前配管スクラビング気体供給装置（２０）による気体供給量：なし
・気体線速度：０．０３５ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：１２５ｍｌ／ｍｉｎ
まず、５ｍｌのＳＣ培地（グルコース１００ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ６．７ｇ／Ｌ、ロイシンを除く標準１９種アミノ酸１５２ｍｇ／Ｌ、ロイシン７６０ｍｇ／Ｌ、イノシトール１５２ｍｇ／Ｌ、ｐ−アミノ安息香酸１６ｍｇ／Ｌ、アデニン４０ｍｇ／Ｌ、ウラシル１５２ｍｇ／Ｌ）を投入した試験管に、寒天培地から掻き取ったＳＷ−１株を植菌した。これを温度３０℃、で２４時間振とう培養した（前々培養）。得られた前々培養液を、表３に示した培地を５０ｍＬ投入した５００ｍＬの三角フラスコに全量植菌し、３０℃で前培養を行った。得られた前培養液を、１．０ＬのＬ−乳酸発酵培地が投入された連続発酵装置に植菌し、２４時間培養を行った。その後、発酵槽内の培養液量が一定となるように供給量を制御しながら、Ｌ−乳酸発酵培地を連続供給することで、連続培養を行った。こうして、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。【０２６５】
適宜、ろ過液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度は［Ｃ］および［Ｄ］に示す方法により測定した。【０２６６】
本比較例での発酵液中の菌体濃度（−）の推移を図１０に示し、Ｌ−乳酸生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）、の推移を図１１に示し、対糖収率（％）の推移を図１２に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図１３に示す。【０２６７】
（実施例９）
以下の条件以外は比較例５と同様の条件下で、連続発酵を行った。【０２６８】
・モジュールスクラビング気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管スクラビング気体供給装置（１８）による気体供給量：４ｍｌ／ｍｉｎ
・ポンプ前配管スクラビング気体供給装置（２０）による気体供給量：なし
・気体線速度：０．１５ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：１２５ｍｌ／ｍｉｎ
本比較例での発酵液中の菌体濃度（−）の推移を図１０に示し、Ｌ−乳酸生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）、の推移を図１１に示し、対糖収率（％）の推移を図１２に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図１３に示す。【０２６９】
比較例５と比べると対糖収率がやや低下したものの、Ｌ−乳酸の生産速度が向上し、膜間差圧の上昇速度も比較例５より抑えられて低い値のまま推移していた。つまり、膜洗浄効果が現れていることが確認できた。なお、比較例６と比べると、発泡も少なく、液面制御が正常に行われ、長期間運転が可能であることが確認できた。【０２７０】
（実施例１０）
以下の条件以外は比較例５と同様の条件下で、連続発酵を行った。【０２７１】
・モジュールスクラビング気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管スクラビング気体供給装置（１８）による気体供給量：５ｍｌ／ｍｉｎ
・ポンプ前配管スクラビング気体供給装置（２０）による気体供給量：なし
・気体線速度：０．１８ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：１５０ｍｌ／ｍｉｎ
本比較例での発酵液中の菌体濃度（−）の推移を図１０に示し、Ｌ−乳酸生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）、の推移を図１１に示し、対糖収率（％）の推移を図１２に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図１３に示す。【０２７２】
比較例５と比べると対糖収率がやや低下したものの、Ｌ−乳酸の生産速度が向上し、膜間差圧の上昇速度も比較例５より抑えられて低い値のまま推移していた。つまり、膜洗浄効果が現れていることが確認できた。なお、比較例６と比べると、発泡も少なく、液面制御が正常に行われ、長期間運転が可能であることが確認できた。【０２７３】
（実施例１１）
以下の条件以外は比較例５と同様の条件下で、連続発酵を行った。【０２７４】
・モジュールスクラビング気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管スクラビング気体供給装置（１８）による気体供給量：１０ｍｌ／ｍｉｎ
・ポンプ前配管スクラビング気体供給装置（２０）による気体供給量：なし
・気体線速度：０．３５ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：１２５ｍｌ／ｍｉｎ
本比較例での発酵液中の菌体濃度（−）の推移を図１０に示し、Ｌ−乳酸生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）、の推移を図１１に示し、対糖収率（％）の推移を図１２に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図１３に示す。【０２７５】
比較例５と比べると対糖収率がやや低下したものの、Ｌ−乳酸の生産速度が向上し、膜間差圧の上昇速度も比較例５より抑えられて低い値のまま推移していた。つまり、膜洗浄効果が現れていることが確認できた。なお、比較例６と比べると、発泡も少なく、液面制御が正常に行われ、長期間運転が可能であることが確認できた。【０２７６】
（実施例１２）
以下の条件以外は比較例５と同様の条件下で、連続発酵を行った。【０２７７】
・モジュールスクラビング気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管スクラビング気体供給装置（１８）による気体供給量：なし
・ポンプ前配管スクラビング気体供給装置（２０）による気体供給量：１０ｍｌ／ｍｉｎ
・気体線速度：０．３５ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：１２５ｍｌ／ｍｉｎ
本比較例での発酵液中の菌体濃度（−）の推移を図１０に示し、Ｌ−乳酸生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）、の推移を図１１に示し、対糖収率（％）の推移を図１２に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図１３に示す。【０２７８】
比較例５と比べると対糖収率がやや低下したものの、Ｌ−乳酸の生産速度が向上し、膜間差圧の上昇速度も比較例５より抑えられて低い値のまま推移していた。つまり、膜洗浄効果が現れていることが確認できた。なお、比較例６と比べると、発泡も少なく、液面制御が正常に行われ、長期間運転が可能であることが確認できた。また、実施例１１に比べて、同じ気体線速度でもよりモジュールから遠いポンプ前配管から気体を供給する方が、乳酸生産速度がやや向上した。【０２７９】
（実施例１３）
以下の条件以外は比較例５と同様の条件下で、連続発酵を行った。【０２８０】
・モジュールスクラビング気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管スクラビング気体供給装置（１８）による気体供給量：２０ｍｌ／ｍｉｎ
・ポンプ前配管スクラビング気体供給装置（２０）による気体供給量：なし
・気体線速度：０．７１ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：０ｍｌ／ｍｉｎ
本比較例での発酵液中の菌体濃度（−）の推移を図１０に示し、Ｌ−乳酸生産速度（ｇ／Ｌ／ｈ）、の推移を図１１に示し、対糖収率（％）の推移を図１２に示す。また膜間差圧（ｋＰａ）の推移を図１３に示す。【０２８１】
発酵槽に１２５ｍｉｎ／ｍＬで通気した比較例５と比べ、同等のＬ−乳酸生産速度、対糖収率が得られ、更には膜間差圧の上昇速度も比較例５より抑えられて低い値のまま推移しておいた。つまり、膜洗浄効果が現れていることが確認できた。これより、ＭＤ下から通気することで著しく通気量を減らして運転コストを下げるとともに、膜の洗浄効果を得ることができ、長期間安定した連続発酵が可能であった。また、比較例６と比べると、発泡も少なく、液面制御が正常に行われ、長期間運転が可能であることが確認できた。【０２８２】
（比較例６）
以下の条件以外は比較例５と同様の条件下で、連続発酵を行った。【０２８３】
・モジュールスクラビング気体供給装置（１６）による気体供給量：なし
・配管スクラビング気体供給装置（１８）による気体供給量：なし
・ポンプ前配管スクラビング気体供給装置（２０）による気体供給量：２３００ｍｌ／ｍｉｎ
・気体線速度：８１．３ｃｍ／ｓ
・発酵槽気体供給装置（２１）による気体供給量：０ｍｌ／ｍｉｎ
本比較例では発酵槽内の発酵液が著しく発泡し、発酵槽内の発酵液が著しく発泡し、発酵槽上部にある排気口まで達して外気にふれ、コンタミが発生して連続発酵が不可能であった。
【産業上の利用可能性】
【０２８４】
本発明は、気体を分離膜モジュールに供給するという簡便な方法により、培養に必要とした微生物以外の雑菌による汚染が起きる可能性を抑制しつつ、分離膜モジュール運転の長期安定性と発酵成績を向上させることができるため、広く発酵工業において利用され、発酵生産物である化学品を低コストで安定に生産することが可能となる。
【符号の説明】
【０２８５】
１  発酵槽
２  分離膜モジュール
３  温度制御部
４  撹拌装置
５  pH制御部
６  レベル制御部
７  差圧制御部
８  循環ポンプ
９  培地供給ポンプ
１０  中和剤供給ポンプ
１１  ろ過ポンプ
１２  ろ過バルブ
１３  洗浄ポンプ
１４  洗浄バルブ
１５  モジュール気体供給制御バルブ
１６  モジュールスクラビング気体供給装置
１７  配管気体供給制御バルブ
１８  配管スクラビング気体供給装置
１９  ポンプ前配管気体供給制御バルブ
２０  ポンプ前配管スクラビング気体供給装置
２１  発酵槽気体供給装置
２２  発酵槽圧力調整バルブ
２３  発酵槽圧力計
２８  制御装置
５１  ｐHセンサ
６１  レベルセンサ
８１  発酵槽１と分離膜モジュール２の一次側とを連通する管
８２  分離膜モジュール２の分離膜を透過しなかった濃縮液を発酵槽１に戻す管
８３  ろ液を装置外に排出するための分離膜モジュール２に接続された管
８４  洗浄液槽と分離膜モジュール２との二次側とを接続する管
８６  モジュールスクラビング気体供給装置１６と分離膜モジュール２を接続する管
８７  配管スクラビング気体供給装置１８と配管８１を接続する管
８８  ポンプ前配管スクラビング気体供給装置２０と配管８１を接続する管
９１  流量計
９２  流量計
９３  流量計
１００  連続発酵装置
【図１】
2012077742.tif 000006
【図２】
2012077742.tif 000007
【図３】
2012077742.tif 000008
【図４】
2012077742.tif 000009
【図５】
2012077742.tif 000010
【図６】
2012077742.tif 000011
【図７】
2012077742.tif 000012
【図８】
2012077742.tif 000013
【図９】
2012077742.tif 000014
【図１０】
2012077742.tif 000015
【図１１】
2012077742.tif 000016
【図１２】
2012077742.tif 000017
【図１３】
2012077742.tif 000018
【図１４】
2012077742.tif 000019
【配列表】
2012077742000001.app
【国際調査報告】
2012077742.tif 000020
2012077742.tif 000021
2012077742.tif 000022
2012077742.tif 000023