(57)【要約】  可溶性および熱安定性の両方の性質が同時に向上している亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質、当該タンパク質をコードする遺伝子、当該タンパク質の製造方法およびその利用を提供するために、特定のアミノ酸配列を有する亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質および当該タンパク質をコードする遺伝子を用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなる、請求項２に記載の遺伝子。
（ｃ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１に記載のタンパク質を宿主内で発現させる工程と、上記宿主内で発現させたタンパク質を溶液中に可溶化させる工程と、を有する亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法。
【請求項５】
上記発現させる工程は、請求項２または３に記載の遺伝子を含むベクターを宿主へ導入する工程を包含する請求項４に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法。
【請求項６】
上記可溶化させる工程は、上記タンパク質を発現している宿主を、０（ｗ／ｖ）または０（ｗ／ｖ）よりも多く０．１％（ｗ／ｖ）以下の界面活性剤、および、０（ｗ／ｖ）または０（ｗ／ｖ）よりも多く５０ｍＭ以下のＮａＣｌの少なくとも一方を含有する溶液中で破砕する工程を包含することを特徴とする請求項４または５に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法。
【請求項７】
上記界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ−２０またはＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００であることを特徴とする請求項６に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法。
【請求項８】
上記タンパク質を発現している宿主、または、上記タンパク質を発現している宿主の破砕物を加熱する工程を包含することを特徴とする請求項４〜７の何れか１項に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法。
【請求項９】
上記加熱する工程は、上記タンパク質を発現している宿主、または、上記タンパク質を発現している宿主の破砕物を、４０℃〜５０℃へ加熱する工程であることを特徴とする請求項８に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のタンパク質、または、請求項４〜９の何れか１項に記載の方法によって製造される亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を酵素として用いて、ＨＰＯ３２−と、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋と、Ｈ２Ｏとを反応させることを特徴とするＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの製造方法。
【請求項１１】
上記反応は、４０℃〜５０℃にて行われることを特徴とする請求項１０に記載のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの製造方法。
【請求項１２】
上記反応は、亜ヒ酸塩、硝酸塩、硫酸塩またはＮａＣｌの存在下で行われることを特徴とする請求項１０または１１に記載のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法およびその利用に関する。更に具体的には、本発明は、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法、ＮＡＤＨの製造方法、およびＮＡＤＰＨの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質（ＰｔｘＤ）は、バクテリアの一部が有するタンパク質であり、ＮＡＤ＋依存的またはＮＡＤＰ＋依存的に亜リン酸を酸化して、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生成する酵素である。以下に、ＮＡＤ＋依存的またはＮＡＤＰ＋依存的に亜リン酸を酸化する場合の反応式を記載する。【０００３】
【化１】
2012147556.tif 000002
【０００４】
【化２】
2012147556.tif 000003
【０００５】
上記化学反応は、生体反応を利用した物質生産において非常に重要な補因子として機能するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを効率よく生産することができるために注目されているが、これらの化学反応を工業的に利用するには至っていない。つまり、現状では、亜リン酸を用いてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを工業的に大量に製造できる状況には至っていない（例えば、非特許文献１および２参照）。従来から、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの生産には、ギ酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼなども用いられてきた。しかしながら、これらの酵素は、反応性に富んだ基質を用いるので、その結果、反応系が不安定になるという問題点を有している。また、これらの酵素は、反応性に富んだ生成物が生じるので、その結果、反応系が不安定になるという問題点を有している。なお、反応系を不安定にする主な原因は、ｐＨの変動である。一方、亜リン酸デヒドロゲナーゼは、基質および生成物が共に反応性が低いとともに、基質が安価であるという利点を有しているため、工業的に利用することが可能になれば、上述した酵素に代わって広く利用され得る可能性を有している。具体的に、亜リン酸デヒドロゲナーゼの場合には、亜リン酸およびリン酸の両方に緩衝作用があるために、反応系を安定化させることが可能である。【０００６】
ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨを工業的に大量に製造するためには、大量の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質が必要である。それ故に、従来から、大腸菌などの宿主内で異種生物由来の野生型亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を強制発現させた後に当該タンパク質を精製することによって大量の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を得ようとする試みがなされている。【０００７】
しかしながら、当該技術では、野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を大腸菌などで強制発現させたときに、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の多くが水溶液に対して不溶性になり、回収不可能になる。それ故に、強制発現した場合にも水溶液に対して高い溶解性を示す亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質が求められている。【０００８】
また、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨを工業的に大量に製造する場合には反応系の温度が上昇するので、熱安定性が高い亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を用いる必要がある。しかしながら、従来の野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質は熱安定性が低い（具体的には、４０℃で多くの酵素が失活する）。それ故に、高温条件下であっても高い活性を維持することが可能な亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質が求められている。【０００９】
このような状況下において、上述した性質が改善された亜リン酸デヒドロゲナーゼの変異体をスクリーニングする試みがなされている。【００１０】
例えば、非特許文献３には、変異が導入された亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を大腸菌内で強制発現することによって、可溶性画分に含まれる変異型の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の量を増加させる技術が開示されている。なお、非特許文献３に記載されているデータからは、可溶性画分に含まれる変異型の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の量が増加した理由が、当該タンパク質の溶解性が上昇したことによるのか、当該タンパク質の発現量が上昇したことによるのかは判断できない。また、非特許文献４および５には、熱安定性が高い変異型の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質が開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, No.17, 3257-3259
【非特許文献２】The Journal of Biological Chemistry, Vol.276, No.20, Issue of May 18, 2001, 17429-17436
【非特許文献３】Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening, 2006, 9, 237-245
【非特許文献４】Biotechnology and Bioengineering, Vol.99, No.2, February 1, 2008, 268-274
【非特許文献５】Applied and Environmental Microbiology, Oct. 2005, 5728-5734
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、従来の変異型の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質では、可溶性および熱安定性の両方の性質を同時に向上させることができなかった。【００１３】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、可溶性および熱安定性の両方の性質が同時に向上している亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法およびその利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
タンパク質内のアミノ酸の変異がタンパク質の立体構造へ及ぼす影響は予測し難い。例えば、熱安定性に寄与する変異および可溶性に寄与する変異を１つのタンパク質内へ同時に導入した時に、熱安定性に寄与する変異によって可溶性に寄与する変異の効果が打ち消されたり、可溶性に寄与する変異によって熱安定性に寄与する変異の効果が打ち消されたり、各々の変異が互いの効果を打ち消しあったりする場合が多々ある。つまり、熱安定性に寄与する変異および可溶性に寄与する変異の両方を同時に１つのタンパク質内へ導入したとしても、熱安定性および可溶性の両方の性質が向上したタンパク質が得られるわけではない。【００１５】
そこで、本発明者らは、独自のスクリーニング方法によって、安定性および可溶性の両方の性質が向上した亜リン酸デヒドロゲナーゼを自然界から単離することによって、本発明を完成させるに至った。【００１６】
本発明のタンパク質は、上記課題を解決するために、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質である。つまり、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。【００１７】
上記構成によれば、熱安定性および可溶性の両方の性質が向上したタンパク質を容易に利用することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、水溶液に対する可溶性が高い亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を大量に入手することができるという効果を奏する。【００１９】
本発明は、耐熱性の高い亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を大量に入手することができるという効果を奏する。【００２０】
本発明は、各種阻害物質によって活性を阻害されることがない亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を大量に入手することができるという効果を奏する。【００２１】
本発明は、従来の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質よりも反応効率が高い亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を大量に入手することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の実施例にてスクリーニングされた菌の系統樹である。
【図２】本発明の亜リン酸デヒドロナーゼタンパク質を大腸菌内で強制発現させた場合の、亜リン酸デヒドロナーゼタンパク質の所在を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図３】本発明の亜リン酸デヒドロナーゼタンパク質の耐熱性を示すグラフである。
【図４】本発明の亜リン酸デヒドロナーゼタンパク質の活性に及ぼす各種阻害剤の効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書において「Ａ〜Ｂ」との記載は、「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。
【００２４】
〔１．タンパク質および遺伝子〕
本実施の形態のタンパク質（亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質）は、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質である。つまり、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【００２５】
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸」の詳細については、後述する。
【００２６】
本実施の形態のタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と、８５．０％以上、より好ましくは９０．０％以上、より好ましくは９５．０％以上、より好ましくは９８．０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
【００２７】
本実施の形態のタンパク質は、水溶液に対する可溶性が高いとともに、耐熱性が高いという極めて優れた性質を有するタンパク質である。
【００２８】
本実施の形態の遺伝子は、上記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質をコードする遺伝子である。本実施の形態の遺伝子は上記タンパク質をコードしていればよく、如何なるコドンの組み合わせによって形成された遺伝子であってもよい。
【００２９】
更に具体的には、本実施の形態の遺伝子は、以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなる遺伝子であり得る。つまり、
（ｃ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００３０】
「ストリンジェントな条件」の詳細については、後述する。
【００３１】
〔２．亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法〕
本実施形態の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法は、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質を宿主内で発現させる工程と、上記宿主内で発現させたタンパク質を溶液中に可溶化させる工程と、を有する製造方法である。つまり、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【００３２】
まず、（ａ）または（ｂ）のタンパク質を宿主内で発現させる工程について説明する。
【００３３】
上述した配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質とは、本発明者がスクリーニングして入手した亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質である（実施例参照）。
【００３４】
宿主内で発現されるタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。このとき、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加される部位は特に限定されず、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された後のタンパク質が亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有していれば、タンパク質中のどの部位であってもよい。ここで「１若しくは数個のアミノ酸」が意図するアミノ酸の数は特に限定されないが、１０個以内のアミノ酸であることが好ましく、８個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、６個以内のアミノ酸であることが最も好ましい。
【００３５】
宿主内で発現されるタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と、８５．０％以上、より好ましくは９０．０％以上、より好ましくは９５．０％以上、より好ましくは９８．０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
【００３６】
なお、アミノ酸配列の相同性は、公知の方法で求めることができる。具体的には、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（株式会社ゼネティックス社製）を、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮのマニュアルに従って使用し、配列番号１に示すアミノ酸配列と比較対象のアミノ酸配列とのホモロジーサーチ（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｓｅａｒｃｈ）により、一致するアミノ酸配列の割合（％）として相同性を計算することができる。
【００３７】
宿主内で発現されるタンパク質は、上述したタンパク質と、他のタンパク質またはタグとの融合タンパク質であってもよい。上記他のタンパク質およびタグとしては特に限定されず、所望のタンパク質（例えば、ＧＳＴタンパク質など）またはタグ（例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグなど）を用いることが可能である。
【００３８】
上述したように、本実施形態の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法は、上述したタンパク質を宿主内で発現させる工程を有している。
【００３９】
上記宿主としては特に限定されず、適宜、所望の宿主を用いることが可能である。例えば、大腸菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなど）等の細菌、酵母（例えば、出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅなど）、昆虫細胞、線虫（例えば、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓなど）、アフリカツメガエル（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓなど）の卵母細胞、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）や各種ヒト培養細胞などを用いることが可能であるが、これらに限定されない。
【００４０】
上記発現させる工程は、（ａ）または（ｂ）のタンパク質を宿主内で発現させ得る工程であればよく、その具体的な構成は特に限定されない。例えば、上記発現させる工程は、（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含むベクターを宿主へ導入する工程を包含し得る。当該ＤＮＡの具体的な塩基配列は特に限定されず、タンパク質中の各アミノ酸に対して、様々なコドン配列を用いることが可能である。当該ＤＮＡは、例えば、以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡであり得る。つまり、
（ｃ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００４１】
上述した配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡとは、本発明者がスクリーニングして入手した亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子であって、上述した配列番号１のアミノ酸からなるタンパク質をコードしているＤＮＡである。
【００４２】
上記ベクターに含まれるＤＮＡは、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルタを洗浄することが意図されるが、ハイブリダイゼーションさせるポリヌクレオチドによって、高ストリンジェンシーでの洗浄条件は適宜変更され、例えば、哺乳類由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％  ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ中にて６５℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、ＲＮＡを用いる場合は、０．１％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、オリゴヌクレオチドを用いる場合は、０．１％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にてハイブリダイゼーション温度での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましい。また、上記ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている周知の方法で行うことができる。
【００４４】
（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含むベクターとしては特に限定されず、宿主に応じて適宜選択することができる。上記ベクターは、導入されるべき宿主に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有することが可能である。プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）などが挙げられる。また、上記プロモーターとしては、ＩＰＴＧなどによって発現を誘導することが可能な発現誘導性プロモーターであってもよい。
【００４５】
上記ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、アンピシリン、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。上記選択マーカーを用いれば、ベクターが宿主に導入されたか否か、さらには、所望のタンパク質が宿主中で確実に発現しているか否かを確認することができる。
【００４６】
上記ベクターを宿主へ導入する方法は特に限定されず、適宜、周知の方法を用いることが可能である。例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。更に具体的には、エシェリヒア属に属する宿主微生物にベクターを導入する場合は、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡを導入する方法や、エレクトロポレーション法を用いる方法が適用され得る。
【００４７】
次いで、宿主内で発現させたタンパク質を可溶化させる工程について説明する。
【００４８】
上記宿主内で発現させたタンパク質を可溶化させる工程は、タンパク質を発現している宿主を溶液中で破砕する工程を包含し得る。上記宿主内で発現させたタンパク質を可溶化させる工程は、タンパク質を発現している宿主を溶液中で破砕する工程に加えて、更に、破砕物を遠心分離する工程を包含していてもよい。上記構成によれば、溶液中にタンパク質を大量に可溶化させることができるので、当該溶液から、所望のタンパク質を大量かつ高純度にて精製することができる。
【００４９】
宿主を破砕するための溶液としては特に限定されないが、例えば、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（登録商標）またはＳＤＳなど）、ＮａＣｌ、または、これらの両方を含む溶液であり得る。
【００５０】
上記溶液における界面活性剤の濃度は特に限定されないが、例えば、０（ｗ／ｖ）または０（ｗ／ｖ）よりも多く１．０％（ｗ／ｖ）以下であることが好ましく、０（ｗ／ｖ）または０（ｗ／ｖ）よりも多く０．５％（ｗ／ｖ）以下であることが更に好ましく、０（ｗ／ｖ）または０（ｗ／ｖ）よりも多く０．３％（ｗ／ｖ）以下であることが更に好ましく、０（ｗ／ｖ）または０（ｗ／ｖ）よりも多く０．１％（ｗ／ｖ）以下であることが更に好ましく、０（ｗ／ｖ）または０（ｗ／ｖ）よりも多く０．０１％（ｗ／ｖ）以下であることが最も好ましい。なお、上述した数値範囲の下限値は、０．０１％（ｗ／ｖ）または０．００１％（ｗ／ｖ）であってもよい。本実施形態において、宿主内で発現されるタンパク質は、元々、溶液に対する可溶性が高い。それ故に、低濃度の界面活性剤であっても、十分に溶液中に可溶化させることが可能である。
【００５１】
界面活性剤は、様々な化学反応を阻害する恐れがある。例えば、界面活性剤が存在すると、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を用いてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨなどを製造するときに、化学反応が阻害される恐れがある。本実施形態における亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法であれば、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を可溶化させるための界面活性剤の濃度は低くて良いので、製造された亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質中に混入する界面活性剤の量を低く抑えることができる。その結果、製造された亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を用いて、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨなどを製造するときに、効率よく大量のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを製造することができる。
【００５２】
上記溶液におけるＮａＣｌの濃度は特に限定されないが、例えば、０ｍＭまたは０ｍＭよりも多く１５０ｍＭ以下であることが好ましく、０ｍＭまたは０ｍＭよりも多く１００ｍＭ以下であることが更に好ましく、０ｍＭまたは０ｍＭよりも多く５０ｍＭ以下であることが更に好ましく、０ｍＭまたは０ｍＭよりも多く４０ｍＭ以下であることが更に好ましく、０ｍＭまたは０ｍＭよりも多く２０ｍＭ以下であることが更に好ましく、０ｍＭまたは０ｍＭよりも多く１０ｍＭ以下であることが更に好ましく、０ｍＭであることが最も好ましい。なお、上述した数値範囲の下限値は、０．０１ｍＭまたは０．００１ｍＭであってもよい。本実施形態において、宿主内で発現されるタンパク質は、元々、溶液に対する可溶性が高い。それ故に、低濃度のＮａＣｌであっても、十分に溶液中に可溶化させることが可能である。
【００５３】
後述する実施例でも示すように、ＮａＣｌは、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の活性を阻害する効果を有している。それ故に、可能な限りＮａＣｌの濃度を低下させた溶液中に亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を可溶化させることが好ましいといえる。なお、従来の亜リン酸デヒドロゲナーゼは可溶性が低いので、タンパク質を可溶化させるために界面活性剤に加えて高濃度のＮａＣｌを用いていた。一方、本実施形態における亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法であれば、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を可溶化させるためのＮａＣｌの濃度は低くて良いので、製造された亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質中に混入するＮａＣｌの量を低く抑えることができる。その結果、製造された亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を用いて、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨなどを製造するときに、効率よく大量のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを製造することができる。
【００５４】
上記溶液は、公知の緩衝剤によって、そのｐＨが調節され得る。上記緩衝剤としては特に限定されないが、６．０〜８．５のｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有する任意の緩衝剤を使用することができる。このｐＨ範囲の緩衝剤としては、リン酸塩、トリス、ビス−トリスプロパン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−モルフォリノエタンスルホン酸１水和物（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（piperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid)）（ＰＩＰＥＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid）（ＨＥＰＥＳ）、および３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）などが挙げられる。溶液中の緩衝剤の濃度は特に限定されないが、例えば、２０〜２００ｍＭであり得る。
【００５５】
本実施形態の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法は、上記タンパク質を発現している宿主、または、上記タンパク質を発現している宿主の破砕物を加熱する工程を包含することが可能である。後述する実施例に示すように、本実施形態の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質は耐熱性が高い。それ故に、上記加熱する工程によって、亜リン酸デヒドロゲナーゼの活性を失うこと無く、他の不要な酵素の活性を失わせることが可能である。つまり、本実施形態の製造方法によって得られる亜リン酸デヒドロゲナーゼに不要な酵素の活性が混入することを防止することができる。
【００５６】
上記加熱する工程を行うための具体的な方法は特に限定されないが、例えば、タンパク質を発現している宿主を含む培養液を加熱することが可能であり、タンパク質を発現している宿主を培養液から分離した後で当該宿主を加熱することも可能であり、タンパク質を発現している宿主を培養液から分離した後で当該宿主を破砕し、当該破砕物を加熱することも可能である。
【００５７】
上記加熱する工程は、上記タンパク質を発現している宿主、または、上記タンパク質を発現している宿主の破砕物を、３５℃〜５５℃に加熱することが好ましく、４０℃〜５２．５℃に加熱することが更に好ましく、４０℃〜５０℃に加熱することが更に好ましく、４０℃〜４５℃に加熱することが最も好ましい。
【００５８】
加熱する時間は特に限定されないが、例えば、０分間〜６０分間であることが好ましく、１５分間〜３０分間であることが更に好ましい。
【００５９】
上記加熱する工程では、発現している亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質とプロテアーゼ阻害剤とを共存させることが好ましい。上記構成によれば、たとえプロテアーゼが存在したとしても、当該プロテアーゼによって亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質が分解されることを防止することができる。
【００６０】
上記プロテアーゼ阻害剤としては特に限定されず、適宜、公知のプロテアーゼ阻害剤を用いることが可能である。上記プロテアーゼ阻害剤としては、例えば、低分子量インヒビター（例えば、ジイソプロピルフルオロリン酸、フェニルメタンスルホニルフルオリド、ｐ−メルクリ安息香酸、ヨード酢酸、ジアゾアセチル−ＤＬ−ノルロイシンメチルエステル、ホスホラミドなど）、ペプチド性インヒビター（例えば、ロイペプチン、アンチパイン、キモスタチン、ペプスタチンなど）、タンパク質性インヒビター（例えば、α２マクログロブリン、カルパスタチンなど）を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００６１】
〔３．ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの製造方法〕
本実施形態のＮＡＤＨの製造方法は、本発明の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法によって製造される亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を酵素として用いて、ＨＰＯ３２−とＮＡＤ＋とＨ２Ｏとを反応させる方法である。なお、具体的な反応式については、〔背景技術〕の欄の（反応式１）を参照のこと。
【００６２】
本実施形態のＮＡＤＰＨの製造方法は、本発明の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法によって製造される亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を酵素として用いて、ＨＰＯ３２−とＮＡＤＰ＋とＨ２Ｏとを反応させる方法である。なお、具体的な反応式については、〔背景技術〕の欄の（反応式２）を参照のこと。
【００６３】
上記反応を行う時の温度は特に限定されないが、例えば、３５℃〜５５℃であることが好ましく、４０℃〜５２．５℃であることが更に好ましく、４０℃〜５０℃であることが更に好ましく、４０℃〜４５℃であることが最も好ましい。後述する実施例に示すように、本発明の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法によって製造される亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質は、従来の亜リン酸デヒドロゲナーゼと比較して、至適温度が非常に高い。それ故に、上記構成によれば、効率よく大量のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを製造することができる。また、上記構成によれば、反応温度が高いので、反応系に不要な酵素が混入していたとしても、混入した不要な酵素の活性のみを失わせることができる。
【００６４】
なお、反応系を上記温度へ調節する場合には、反応系に対して外部から温度を加えることによって温度を調節してもよいが、化学反応が進むにつれて発生する反応熱などによって温度を調節してもよい。つまり、本発明の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法によって製造される亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を用いれば、反応系を冷却する必要がないという利点もある。
【００６５】
上記反応は、亜ヒ酸塩、硝酸塩、硫酸塩またはＮａＣｌの存在下で行われることも可能である。後述する実施例に示すように、従来の亜リン酸デヒドロゲナーゼは、亜ヒ酸塩、硝酸塩、硫酸塩またはＮａＣｌの存在によって、大幅に活性が低下する。一方、本発明の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法によって製造される亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質は、亜ヒ酸塩、硝酸塩、硫酸塩またはＮａＣｌが存在しても、大幅に活性が低下することはない。それ故に、本実施形態のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの製造方法であれば、たとえ亜ヒ酸塩、硝酸塩、硫酸塩またはＮａＣｌが存在したとしても、効率よくＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを製造することができる。
【００６６】
反応系における亜ヒ酸塩、硝酸塩、硫酸塩またはＮａＣｌの濃度は特に限定されないが、例えば、１００ｍＭ以下であることが好ましく、７０ｍＭ以下であることが更に好ましく、５０ｍＭ以下であることが更に好ましく、４０ｍＭ以下であることが最も好ましいが、これらに限定されない。なお、その下限値は特に限定されないが、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭまたは０ｍＭであり得る。
【００６７】
〔４．ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを製造するためのキット〕
本実施形態のキットは、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを製造するためのキットである。
【００６８】
本実施形態のキットは、本発明の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法によって製造されるタンパク質を備えるものであり得る。また、本実施形態のキットは、本発明の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を所望の宿主内で発現させるためのベクターを備えるものであってもよい。これらの構成の詳細については既に説明したので、ここではその説明を省略する。
【００６９】
本発明の遺伝子は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子である。
【００７０】
本発明の遺伝子は、以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなる遺伝子であってもよい。つまり、
（ｃ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００７１】
本発明の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法は、本発明のタンパク質を宿主内で発現させる工程と、上記宿主内で発現させたタンパク質を溶液中に可溶化させる工程と、を有し得る。
【００７２】
本発明の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法では、上記発現させる工程は、本発明の遺伝子を含むベクターを宿主へ導入する工程を包含し得る。
【００７３】
本発明の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法では、上記可溶化させる工程は、上記タンパク質を発現している宿主を、０（ｗ／ｖ）または０（ｗ／ｖ）よりも多く０．１％（ｗ／ｖ）以下の界面活性剤、および、０（ｗ／ｖ）または０（ｗ／ｖ）よりも多く５０ｍＭ以下のＮａＣｌの少なくとも一方を含有する溶液中で破砕する工程を包含し得る。
【００７４】
本発明の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法では、上記界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ−２０またはＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００であってもよい。
【００７５】
本発明の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法は、上記タンパク質を発現している宿主、または、上記タンパク質を発現している宿主の破砕物を加熱する工程を包含し得る。
【００７６】
本発明の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法では、上記加熱する工程は、上記タンパク質を発現している宿主、または、上記タンパク質を発現している宿主の破砕物を、４０℃〜５０℃へ加熱する工程であってもよい。
【００７７】
本発明のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの製造方法では、本発明のタンパク質、または、本発明の製造方法によって製造される亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を酵素として用いて、ＨＰＯ３２−と、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋と、Ｈ２Ｏとを反応させる。
【００７８】
本発明のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの製造方法では、上記反応は、４０℃〜５０℃にて行われ得る。
【００７９】
本発明のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの製造方法では、上記反応は、亜ヒ酸塩、硝酸塩、硫酸塩またはＮａＣｌの存在下で行われ得る。
【実施例】
【００８０】
〔１．耐熱性を指標とした亜リン酸デヒドロゲナーゼのスクリーニング〕
４５℃の環境下においても生育し得、かつ、亜リン酸依存的なＮＡＤＨ生産能を有する微生物をスクリーニングした。以下に、スクリーニングの詳細について説明する。【００８１】
採取した土壌を無菌水へ溶解した後、０．４ｍＬの溶解物を、０．５ｍＭの亜リン酸を含有するＭＯＰＳ液体培地（０．５ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ、２２．２ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ、４０ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ［ｐＨ７．２］、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、９．５２ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、４ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ、２ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、０．５２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２８ｍＭ  Ｋ２ＳＯ４、０．０１ｍＭ  ＦｅＳＯ４、０．０００５ｍＭ  ＣａＣｌ２、２０μＭ  ｔｈｉａｍｉｎｅ）３．６ｍＬに対して加え、４５℃にて７日間の集積培養を行った。【００８２】
７日間の集積培養の後、当該培養物を、０．５ｍＭの亜リン酸を含むＭＯＰＳ寒天培地（０．５ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ、２２．２ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ、４０ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ［ｐＨ７．２]、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、９．５２ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、４ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ、２ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、０．５２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２８ｍＭ  Ｋ２ＳＯ４、０．０１ｍＭ  ＦｅＳＯ４、０．０００５ｍＭ  ＣａＣｌ２、２０μＭ  ｔｈｉａｍｉｎｅ、１．５％  Ａｇａｒ）、２ｍＭのリン酸を含むＭＯＰＳ寒天培地、および、亜リン酸およびリン酸を含まないＭＯＰＳ寒天培地に植菌し、４５℃にて１〜３日間の培養を行った。その後、０．５ｍＭの亜リン酸を含むＭＯＰＳ寒天培地上に出現した微生物のコロニーを、複数個、単離した。【００８３】
各コロニーを形成する微生物を、０．５ｍＭの亜リン酸を含有するＭＯＰＳ液体培地を用いて培養し、各微生物について、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するか否か検討した。【００８４】
以下に、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性の測定方法について説明する。【００８５】
グリセロール溶液中にて凍結保存している各微生物を、４ｍＬの２×ＹＴ液体培地に植菌し、４５℃にて一晩培養した。１ｍＬの培養液を１．５ｍＬ容量のチューブ内へ入れ、当該チューブを１２０００ｒｐｍにて５分間遠心分離した後、上清を捨てて菌体のペレットを得た。【００８６】
培地由来のリン酸を除くために、上記菌体のペレットを１ｍＬのＭＯＰＳ（０）溶液（リン成分を含まないＭＯＰＳ培地）中に懸濁し、当該懸濁液を１２０００ｒｐｍにて５分間遠心分離した後、上清を捨てて菌体のペレットを得た。当該洗浄操作をもう一度行った後、得られた菌体のペレットを１ｍＬのＭＯＰＳ（０）溶液中に懸濁した後、１００μＬの当該懸濁液を１０ｍＬのＭＯＰＳ−亜リン酸（０．５ｍＭ）液体培地に植菌して、４５℃にて培養した。【００８７】
２４〜７２時間の培養を行って、ＯＤ６００の値が１．５〜２．０に達した時に、全培養液を５０ｍＬの容量のチューブに移し、当該チューブを６０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離処理にかけた。遠心分離処理の後、上清を捨てて菌体のペレットを得た。【００８８】
上記菌体のペレットを１０ｍＬのＭＯＰＳ（０）溶液中に懸濁した後で、出力２０％にて、１０分間の超音波破砕（Digital sonifier, BRANSON）を行った。超音波破砕処理を施したＭＯＰＳ（０）溶液を超遠心分離用チューブ（Centrifuge Tubes, BECKMAN, 349622）に分注し、当該チューブを、超遠心分離機（OptimaTM TLX Ultracentrifuge, BECKMAN COULTER）にて、２７０，０００×ｇ、４℃、４５分間の超遠心分離にかけた。【００８９】
超遠心分離後の上清を回収して、当該上清を、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性測定用の粗抽出液とした。当該粗抽出液（タンパク質量：１０μｇ）、ＮＡＤ＋（１ｍＭ）、亜リン酸（１ｍＭ）およびＭＯＰＳ−ＫＯＨｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）を含む、全量１０００μＬの反応液を調製し、当該反応液の温度を４５℃に上昇させて反応を開始させた。所定の時間の間（０〜１８０分）、所定の時間間隔にて１００μＬずつのサンプルを採取し、各サンプルの吸光度（３４０ｎｍ）を測定した。亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性は、１ｍｇのタンパク質が単位時間あたりに生成するＮＡＤＨ量として評価した。【００９０】
以上のようにして、４５℃の条件下においても生育し得、かつ、亜リン酸依存的にＮＡＤＨ生産能を有する微生物をスクリーニングした。なお、スクリーニングされた微生物の数は、５菌株であった。【００９１】
〔２．スクリーニングした微生物の分類、および、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の取得〕
上述した５菌株の粗抽出液中の亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性はほぼ同程度であるとともに、当該５菌株は形態学的および生理学的に似ていた。それ故に、上記５菌株は、全て近縁種の菌であると考えられた。そこで、そこで、５菌株中で最も増殖に優れた菌株（４５０６株）を以降の解析に用いた。【００９２】
まず、４５０６株を、１６Ｓ  ｒＲＮＡ（16S ribosomal RNA）の塩基配列に基づいて分類するとともに、各菌株の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列を決定した。具体的な方法について、以下に詳細に説明する。【００９３】
文献（J.R.Marchesi,et al.,Applied and Environmental Microbiology,64,p.795-799（1998））に従って、上記スクリーニングによって得られた４５０６株から染色体ＤＮＡを抽出し、当該染色体ＤＮＡを用いて１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅した。【００９４】
まず、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲによって増幅した。当該ＰＣＲには、プライマーとして、後述するプライマー１およびプライマー２を用い、東洋紡社製のＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いてＰＣＲ反応を行った。具体的なＰＣＲ反応条件としては、７２℃にて５分間保温した後で、９５℃の１分間の変性工程、５５℃の１分間のアニーリング工程および７２℃の１．５分間の伸長工程の３つの工程からなる反応サイクルを３０サイクル行った。
・プライマー１：５’−AGAGTTTGATCCTGGCTCAG−３’（配列番号５）
・プライマー２：５’−GTCCCGCAACGAGCGCAAC −３’（配列番号６）
以上のようにして増幅した１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列を、DYEnamic ET Terminator（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。具体的な方法は、DYEnamic ET Terminatorに添付のプロトコールに従った。【００９５】
以上のようにして決定した１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列を系統樹作成ツールであるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ２によって解析することにより、上述した４５０６株を分類した。なお、当該解析の具体的な方法は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ２に添付のプロトコールに従った。【００９６】
図１に、スクリーニングされた４５０６株の系統樹を示す。この結果より、４５０６株はＲａｌｓｔｏｎｉａ属のバクテリアであることが明らかとなった。このことから当該菌株をＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ４５０６と名付けた。【００９７】
図１中の「Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ．  ４５０６」が、スクリーニングされた４５０６株である。また、「Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ．  ５＿７＿４７ＦＡＡ」、「Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ  ＣＨ３４」、「Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＷＮ２０７２」および「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ  ＷＭ８８」は、周知の菌株であるとともに、その亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子および亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質も周知であるか、または、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子および亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の存在が予測されていた。【００９８】
「Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ．  ５＿７＿４７ＦＡＡ」は、分類学上、４５０６株と近縁であるとともに、その亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の存在が予測されていた。但し、当該亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がコードするタンパク質が実際に亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有しているか否かは実証されていないとともに、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の３’末端側の塩基配列（換言すれば、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質のＣ末端側のアミノ酸配列）は、未知であった（例えば、「http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/308920199」参照）。勿論、「5747FAA」の推定上の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がコードする亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の各種性質（例えば、可溶性および熱安定性など）については、全く解析されていなかった。【００９９】
スクリーニングにおいて４５０６株は４５℃で生育したため、本菌が有する亜リン酸デヒドロゲナーゼは耐熱性を有することが予想されたため、当該菌株から亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のスクリーニングを試みた。【０１００】
４５０６株の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｐｔｘＤ）は、既知のものとは異なると考えられたため、周知の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の高度保存領域に基づいて設計したプライマーを用いたＰＣＲによって遺伝子の内部領域を取得するとともに、インバースＰＣＲによって遺伝子の５’領域および３’領域を取得することによって、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の全長配列の取得を取得した。以下に、当該方法について、更に詳細に説明する。【０１０１】
まず、周知のｐｔｘＤにおいて高度に保存された２箇所のアミノ酸配列（P stutzeri WM88の76-82番目、261-267番目）に基づいて、縮重プライマー（ＰＴＸＤ１およびＰＴＸＤ２）を作製した。以下に、これらの縮重プライマーの塩基配列を示す。
・ＰＴＸＤ１：５’−AARGGNTAYGAYAAYTTYGAY−３’（配列番号７）
・ＰＴＸＤ２：５’−RTCYTCCATYTCRTANACRTC−３’（配列番号８）
上記縮重プライマーを用いて、４５０６株の染色体を鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、約６００ｂｐの増幅されたＤＮＡ断片を取得した。【０１０２】
増幅されたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ  Ｔ−ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（Promega社）へクローニングして、増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。決定された塩基配列から、増幅されたＤＮＡ断片が、ｐｔｘＤの内部配列であることが確認された。【０１０３】
決定された塩基配列に基づいてインバースＰＣＲ用のプライマー（ＰＴＸＤ３およびＰＴＸＤ４）を作製した。以下に、これらのプライマーの塩基配列を示す。
・ＰＴＸＤ３：５’−TCGTGGATGAGAATGCGGTGATAGC−３’（配列番号９）
・ＰＴＸＤ４：５’−ATAGTCAGTTCAGCGGTCGGGATCG−３’（配列番号１０）
インバースＰＣＲのテンプレートとしては、４５０６株の０．５μｇの染色体を０．５μＬの制限酵素Ｐｓｔ  Ｉを用いて１２時間消化した後に、Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅを用いて自己環状化させて更に精製したものを、インバースＰＣＲの反応溶液の全体積に対して２０％量用いた。ＰＴＸＤ３とＰＴＸＤ４とを用いたインバースＰＣＲによって、約２．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。【０１０４】
上記ＤＮＡ断片をｐＧＥＭ  Ｔ―ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒへクローニングした後、当該ＤＮＡ断片の両末端側の塩基配列を決定し、ｐｔｘＤの５’領域および３’領域を決定した。これらの配列に基づいて、ｐｔｘＤの全長配列を取得するためのプライマー（ＰＴＸＤ５およびＰＴＸＤ６）を作製した。以下に、これらのプライマーの塩基配列を示す。
・ＰＴＸＤ５：５’−CGGGATCCGATGAAGCCCAAAGTCGTCCTC−３’（配列番号１１）
・ＰＴＸＤ６：５’−CGGAATTCGCCGCCTTTACTCCCGGATAC −３’（配列番号１２）
ＰＴＸＤ５およびＰＴＸＤ６を用いて、４５０６株の染色体を鋳型としてＰＣＲを行い、約１ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を、上記と同様の方法にて決定した。【０１０５】
上記亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列を配列番号２に示す。また、当該亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がコードする亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。なお、上述した「http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/308920199」に記載されている塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列の部分配列と完全に一致していた。【０１０６】
〔３．大腸菌を用いた亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の発現〕
周知の方法によって、プラスミドであるｐＥＴ２１ｂ（Novagen社製）へ、上述した配列番号２に示す塩基配列、または、P stutzeri WM88の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（配列番号４）を挿入した（配列番号４の塩基配列によってコードされているタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３に示す）。これによって、配列番号１に示す亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質のＣ末端にＨｉｓタグが連結している融合タンパク質（図２の「ＰｔｘＤ４５０６」参照）、または、P stutzeri WM88の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質のＣ末端にＨｉｓタグが連結している融合タンパク質（図２の「ＰｔｘＤＰｓｔ」参照）の発現ベクターを作成した。【０１０７】
周知の方法によって、上記発現ベクターの各々を用いて、コンピテントセルであるＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）（Novagen社製）を形質転換した。【０１０８】
上記形質転換体を、２００ｍＬのＬＢ培地（培地１Ｌあたり、１０ｇのｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ、５gのｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、および、５ｇのＮａＣｌを含む）へ植菌し、ＯＤ６００が０．５になるまで３７℃にて培養した。その後、当該培養物に対して濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（isopropyl thiogalactoside）を加え、２８℃にて更に３時間の培養を行った。【０１０９】
上記培養物を、６，０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離処理にかけ、沈殿物である菌を回収した。当該菌を破砕用バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ：７．４）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ）へ懸濁した後、当該懸濁物に対して超音波処理を施すことによって、菌を破砕した。この後、菌の破砕液に対して最終濃度が０．１％になるようにＴｗｅｅｎ２０（登録商標）を加えて、氷上で１５分間静置した。なお、図２において、当該破砕された菌を含む破砕用バッファーを「Ｔ」として示す。【０１１０】
破砕された菌を含む破砕用バッファーに対して、１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間の条件にて遠心分離処理を施した。遠心分離処理の後、上清と沈殿物とに分けた。なお、図２において、当該上清を「Ｓ」として示し、当該沈殿物を「Ｉ」として示す。【０１１１】
上記上清をＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥヘルスケア社製）へ供し、当該カラムに添付されたプロトコールにしたがって、配列番号１に示す亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質のＣ末端にＨｉｓタグが連結している融合タンパク質を精製した。【０１１２】
上述した、破砕された菌を含む破砕用バッファー（Ｔ）、上清（Ｓ）および沈殿物（Ｉ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離した後、アクリルアミドゲルをＣＢＢステインワン（ナカライ社製）にて染色して、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の量を測定した。【０１１３】
その結果を図２に示す。【０１１４】
P stutzeri WM88の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質のＣ末端にＨｉｓタグが連結している融合タンパク質の場合には、融合タンパク質の約１８．４％が上清（Ｓ）中に存在し、融合タンパク質の約８１．６％が沈殿物（Ｉ）中に存在していた。一方、配列番号１に示す亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質のＣ末端にＨｉｓタグが連結している融合タンパク質の場合には、融合タンパク質の約９１．４％が上清（Ｓ）中に存在し、融合タンパク質の約８．６％が沈殿物（Ｉ）中に存在していた。以上の結果から、配列番号１に示す亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質のＣ末端にＨｉｓタグが連結している融合タンパク質は、劇的に可溶性が上昇していることが明らかになった。【０１１５】
〔４．亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の耐熱性〕
〔３．大腸菌を用いた亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の発現〕にてＨｉｓＴｒａｐカラムを用いて精製したＰｔｘＤ４５０６およびＰｔｘＤＰｓｔについて、耐熱性を検討した。以下に、耐熱性の測定方法について説明する。【０１１６】
精製したＰｔｘＤ４５０６およびＰｔｘＤＰｓｔの各々を、最終濃度が０．２ｍｇ／ｍＬになるように５０ｍＭ  ＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．４）へ加え、酵素溶液を調製した。１００μＬの上記酵素溶液を１．５ｍＬの容量のチューブへ入れ、蒸発を防ぐために、当該酵素溶液に対して１００μＬのｍｉｎｅｒａｌ  ｏｉｌを添加した。当該チューブを、１０℃〜６０℃の温度で１２時間維持した。経時的に１０μＬ（２μｇ)の酵素溶液をサンプリングして、当該酵素溶液に対して、１ｍＭのＮＡＤ＋および１ｍＭの亜リン酸を含む２０ｍＭのＭＯＰＳ―ＫＯＨ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）４９０μＬを加えて、合計５００μＬの反応系で、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性の測定を行った。【０１１７】
図３に測定結果を示す。【０１１８】
図３に示すように、ＰｔｘＤＰｓｔは、約３５℃にて比活性が最も高く、３５℃よりも低い温度であっても、３５℃よりも高い温度であっても、急激に比活性が低下することが明らかになった。つまり、ＰｔｘＤＰｓｔは、最適温度が低い（約３５℃）とともに、反応に適した温度の範囲が非常に狭いことが明らかになった。【０１１９】
一方、ＰｔｘＤ４５０６は、約５０℃にて比活性が最も高く、５０℃よりも低い温度であっても、５０℃よりも高い温度であっても、広い温度範囲において高い比活性を維持できることが明らかになった。具体的には、ＰｔｘＤ４５０６は、３５℃〜５５℃における比活性の平均値が高く、４０℃〜５２．５℃における比活性の平均値が更に高く、４０℃〜５０℃における比活性の平均値が更に高いことが明らかになった。このことは、高温になりやすい物質生産工程（例えば、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ生産工程）においても、融合タンパク質ＰｔｘＤ４５０６が、安定して大量の物質を生産し得ることを示している。また、このことは、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造工程において、亜リン酸デヒドロゲナーゼを加熱したとしても、その活性が失われないことを示している。【０１２０】
〔５．亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の反応速度論的解析〕
〔３．大腸菌を用いた亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の発現〕にてＨｉｓＴｒａｐカラムを用いて精製したＰｔｘＤ４５０６およびＰｔｘＤＰｓｔについて、反応速度を比較した。以下に、反応速度の測定方法について説明する。【０１２１】
〔背景技術〕の欄に記載した（反応式１）に基づいて、ＰｔｘＤ４５０６およびＰｔｘＤＰｓｔの反応速度を算出した。【０１２２】
具体的には、（反応式１）に示す反応系において、７．５μｇの融合タンパク質を用い、基質（ＮＡＤ＋）の濃度を０．５ｍｉｃｒｏＭから２００ｍｉｃｒｏＭへと変化させながら、ＮＡＤＨの生産速度を測定した。なお、融合タンパク質ＰｔｘＤ４５０６の反応温度は、４０℃であり、融合タンパク質ＰｔｘＤＰｓｔの反応温度は、２８℃であった。【０１２３】
測定された基質（ＮＡＤ＋）の濃度およびＮＡＤＨの生産速度に基づいて、周知の酵素反応速度論的手法（例えば、「蛋白質・酵素の基礎実験法（改訂第２版）、発行所：株式会社  南江堂」参照）に基づいて、Ｋｍ（μＭ）、Ｖｍａｘ（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍ）、Ｋｃａｔ（ｍｉｎ−１）、Ｋｃａｔ／Ｋｍの値を算出した。なお、上述した各種パラメータは、３回行った実験の各々について算出するとともに、３回行った実験の平均値として算出した。また、Ｋｃａｔは、「Ｋｃａｔ＝Ｖｍａｘ（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）×（ＭＷ／１０３）」の式にて算出した。【０１２４】
実験結果を、下記表１に示す。【０１２５】
【表１】
2012147556.tif 000004
【０１２６】
表１から明らかなように、ＰｔｘＤ４５０６のＫｍは、ＰｔｘＤＰｓｔのＫｍの約１／３であった。また、ＰｔｘＤ４５０６のＶｍａｘは、ＰｔｘＤＰｓｔの約１．４倍であった。また、ＰｔｘＤ４５０６のＫｃａｔは、２３７．４（ｍｉｎ−１）であり、ＰｔｘＤＰｓｔのＫｃａｔは、１６９．６（ｍｉｎ−１）であった。【０１２７】
以上の実験データから、ＰｔｘＤ４５０６のＫｃａｔ／Ｋｍは、ＰｔｘＤＰｓｔのＫｃａｔ／Ｋｍの約４．４倍であることが明らかになった。つまり、ＰｔｘＤ４５０６は、ＰｔｘＤＰｓｔよりも高い反応効率を有することが明らかになった。【０１２８】
〔６．阻害剤存在下における亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の活性〕
〔３．大腸菌を用いた亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の発現〕にてＨｉｓＴｒａｐカラムを用いて精製したＰｔｘＤ４５０６およびＰｔｘＤＰｓｔについて、様々な阻害剤が存在する環境下においても触媒活性を示し得るか否かを検討した。実験方法は、文献「Costas et al., Journal of Biological Chemistry, 2001, 276, 17429-17436」に記載の方法に従った。以下に、簡単に実験方法を説明する。【０１２９】
１００μＬの１００ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．２５）、５０μＬの１０ｍＭ  ＮＡＤ、５μＬの５ｍＭ  亜リン酸塩、５０μＬの４０ｍＭ  各種阻害剤（亜ヒ酸塩（Arsenite）、硝酸塩（Nitrate）、硫酸塩（Sulfate）またはＮａＣｌ）、２９４μＬのＨ２Ｏ、および、１μＬの０．５ｍｇ／ｍＬ  タンパク質含有液（ＰｔｘＤ４５０６含有液、ＰｔｘＤＰｓｔ含有液、または、タンパク質を含有しない液体（ネガティブコントロール））を混合して反応液を生成した。【０１３０】
上記反応液を、６０分間反応させた。なお、ＰｔｘＤ４５０６については、４５℃にて反応を行い、ＰｔｘＤＰｓｔについては、３０℃にて反応を行った。その後、ＯＤ３４０を測定した。タンパク質を含有しない液体（ネガティブコントロール）のＯＤ３４０の値を１００として、各サンプルのＯＤ３４０の相対値を算出した。なお、各実験を４回以上行い、当該４回または５回の実験における相対値の平均値も算出した。【０１３１】
実験結果を、下記表２に示し、表２の数値データをグラフ化した図面を図４に示す。【０１３２】
【表２】
2012147556.tif 000005
【０１３３】
表２および図４から明らかなように、ＰｔｘＤＰｓｔの活性は、亜ヒ酸塩、硝酸塩、硫酸塩またはＮａＣｌの存在下で阻害されることが明らかになった。【０１３４】
一方、ＰｔｘＤ４５０６の活性は、亜ヒ酸塩、硝酸塩、硫酸塩またはＮａＣｌの存在下であっても、高く維持されることが明らかになった。このことは、亜ヒ酸塩、硝酸塩、硫酸塩またはＮａＣｌの存在下（特に、亜ヒ酸塩、硝酸塩または硫酸塩の存在下）において亜リン酸デヒドロゲナーゼを用いる必要がある場合には、ＰｔｘＤ４５０６を用いることが有利であることを示している。なお、亜リン酸デヒドロゲナーゼを用いる必要がある場合の一例としては、ＮＡＤＨを生産する場合、ＮＡＤＰＨを生産する場合、亜リン酸を定量する場合などを挙げることができるが、これらに限定されない。【０１３５】
本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを製造する分野に利用することができる。また、本発明は、亜リン酸を定量する分野に用いることができる。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年9月20日(2012.9.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
以下の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質を宿主内で発現させる工程と、上記宿主内で発現させたタンパク質を溶液中に可溶化させる工程と、を有する亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項５】
上記発現させる工程は、以下の（ａ）若しくは（ｂ）に記載のタンパク質をコードする遺伝子、または、以下の（ｃ）若しくは（ｄ）のＤＮＡからなる遺伝子を含むベクターを宿主へ導入する工程を包含する請求項４に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
上記可溶化させる工程は、上記タンパク質を発現している宿主を、０（ｗ／ｖ）または０（ｗ／ｖ）よりも多く０．１％（ｗ／ｖ）以下の界面活性剤、および、０（ｗ／ｖ）または０（ｗ／ｖ）よりも多く５０ｍＭ以下のＮａＣｌの少なくとも一方を含有する溶液中で破砕する工程を包含することを特徴とする請求項４または５に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法。
【請求項７】
上記界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ−２０またはＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００であることを特徴とする請求項６に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法。
【請求項８】
上記タンパク質を発現している宿主、または、上記タンパク質を発現している宿主の破砕物を加熱する工程を包含することを特徴とする請求項４〜７の何れか１項に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法。
【請求項９】
上記加熱する工程は、上記タンパク質を発現している宿主、または、上記タンパク質を発現している宿主の破砕物を、４０℃〜５０℃へ加熱する工程であることを特徴とする請求項８に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法。
【請求項１０】
請求項４〜９、１３の何れか１項に記載の方法によって製造される亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を酵素として用いて、ＨＰＯ３２−と、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋と、Ｈ２Ｏとを反応させることを特徴とするＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの製造方法。
【請求項１１】
上記反応は、４０℃〜５０℃にて行われることを特徴とする請求項１０に記載のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの製造方法。
【請求項１２】
上記反応は、亜ヒ酸塩、硝酸塩、硫酸塩またはＮａＣｌの存在下で行われることを特徴とする請求項１０または１１に記載のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの製造方法。
【請求項１３】
上記可溶化させる工程は、上記タンパク質を発現している宿主を上記溶液中で破砕する工程と、当該破砕物を遠心分離して上清を取得する工程と、を有することを特徴とする請求項４〜９の何れか１項に記載の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法。
【国際調査報告】
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