(57)【要約】  医薬品や農薬等の中間体として有用な光学活性アミノ化合物を、ケトン化合物から安価で効率よく製造するための方法を提供する。  アミノ供与体としてＬ−アラニンよりもグルタミン酸に高い活性を示し、かつ、（Ｓ）１−ベンジル−３−ピロリジノンを９３％以上の高い光学純度で生成する新規アミノ基転移酵素活性を有するポリペプチド、これをコードする遺伝子、その遺伝子を高発現する形質転換体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）の理化学的性質を有するポリペプチド：
（１）作用：アミノ基供与体の存在下で１−ベンジル−３−ピロリジノンに作用して光学純度９３％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを生成するアミノ基転移反応を触媒する。
【請求項２】
さらに下記（２）の理化学的性質を有する請求項１のポリペプチド：
（２）基質特異性：
（ａ）アミノ基供与体：（Ｓ）−１−フェネチルアミンに対し活性を示し、Ｌ―アラニンよりＬ−グルタミン酸に高い活性を示し、かつ、β−アラニン、４−アミノ酪酸に対し実質的に活性を示さない、
（ｂ）アミノ基受容体：ピルビン酸より２−ケトグルタル酸に対し高い活性を示す。
【請求項３】
さらに以下の（３）から（６）の理化学的性質を有する請求項１または２に記載のポリペプチド：
（３）至適ｐＨ：７．０〜８．０、
（４）至適温度：３０〜５０℃、
（５）熱安定性：３０〜５０℃で３０分間処理したとき、処理前の７０％以上の残存活性を保持する、
（６）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、約４８ｋＤａ。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属）に属する微生物から得られたポリペプチドである、請求項１から３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）から得られたポリペプチドである、請求項１から３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＮＫ０４−２５（ＮＩＴＥ  ＢＰ−９５４）から得られたポリペプチドである、請求項１から３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
以下の（ａ）から（ｇ）のいずれかに記載のポリペプチド：
（ａ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、アミノ基供与体の存在下で１−ベンジル−３−ピロリジノンに作用して光学純度９３％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを生成する活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、アミノ基供与体として（Ｓ）−１−フェネチルアミンに対し活性を示し、Ｌ―アラニンよりＬ−グルタミン酸に高い活性を示し、かつ、β−アラニン、４−アミノ酪酸に対し実質的に活性を示さず、アミノ基受容体としてピルビン酸より２−ケトグルタル酸に対し高い活性を有するポリペプチド、
（ｄ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、至適ｐＨが７．０〜８．０であり、至適温度が３０〜５０℃であり、３０〜５０℃で３０分間処理したとき処理前の７０％以上の残存活性を保持する、分子量がドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において約４８ｋＤａであるポリペプチド、
（ｅ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミノ基供与体の存在下で１−ベンジル−３−ピロリジノンに作用して光学純度９３％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを生成する活性を有するポリペプチド、
（ｆ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミノ基供与体として（Ｓ）−１−フェネチルアミンに対し活性を示し、Ｌ―アラニンよりＬ−グルタミン酸に高い活性を示し、かつ、β−アラニン、４−アミノ酪酸に対し実質的に活性を示さず、アミノ基受容体としてピルビン酸より２−ケトグルタル酸に対し高い活性を有するポリペプチド、
（ｇ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、至適ｐＨが７．０〜８．０であり、至適温度が３０〜５０℃であり、３０〜５０℃で３０分間処理したとき処理前の７０％以上の残存活性を保持する、分子量がドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において約４８ｋＤａであるポリペプチド。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項９】
下記（Ａ）から（Ｃ）のいずれかに記載の請求項８に記載のＤＮＡ：
（Ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項８または９に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１２】
ケトン化合物に、アミノ基供与体の存在下、請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項１１に記載の形質転換体の培養物を作用させることを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法。
【請求項１３】
一般式（１）：
【化１】
2012043653.tif 000011
（式中、Ｒ１及びＲ２は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアラルキル基もしくは置換されていてもよいアリール基を示し、Ｒ１とＲ２の両者が互いに結合して環を形成していてもよい。但し、Ｒ１とＲ２は構造が異なる。）で表されるケトン化合物に、アミノ基供与体の存在下、請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項１１に記載の形質転換体の培養物を作用させることを特徴とする、一般式（２）：
【化２】
2012043653.tif 000012
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記式（１）と同じ。＊は不斉炭素原子を示す。）で表される光学活性アミノ化合物の製造方法。
【請求項１４】
アミノ化合物のエナンチオマー混合物にアミノ基受容体の存在下、請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項１１に記載の形質転換体の培養物を作用させることを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法。
【請求項１５】
一般式（３）：
【化３】
2012043653.tif 000013
（式中、Ｒ１及びＲ２は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアラルキル基もしくは置換されていてもよいアリール基を示し、Ｒ１とＲ２の両者が互いに結合して環を形成していてもよい。但し、Ｒ１とＲ２は構造が異なる。）で表わされるアミノ化合物のエナンチオマー混合物に、アミノ基受容体の存在下、請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項１１に記載の形質転換体の培養物を作用させることにより、一般式（４）：
【化４】
2012043653.tif 000014
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記式（３）と同じ。＊は不斉炭素原子を示す）で表わされる光学活性アミノ化合物を得ることを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法。
【請求項１６】
前記式（１）で表されるケトン化合物が、１−テトラロン、２−テトラロン、５−メトキシ−２−テトラロン、６−メトキシ−２−テトラロン、７−メトキシ−２−テトラロン、８−メトキシ−２−テトラロン、１−ベンジル−３−ピロリジノン、１−Ｂｏｃ−３−ピロリジノン、１−Ｃｂｚ−３−ピロリジノン、１−ベンジル−３−ピペリジノン、１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノン、１−Ｃｂｚ−３−ピペリジノン、アセトフェノン、３，４−ジメトキシフェニルアセトン、からなる群から選ばれる１以上のケトン化合物である、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記式（３）で表されるアミノ化合物が、１−アミノテトラリン、２−アミノテトラリン、５−メトキシ−２−アミノテトラリン、６−メトキシ−２−アミノテトラリン、７−メトキシ−２−アミノテトラリン、８−メトキシ−２−アミノテトラリン、１−ベンジル−３−アミノピロリジン、１−Ｂｏｃ−３−アミノピロリジン、１−Ｃｂｚ−３−アミノピロリジン、１−ベンジル−３−アミノピペリジン、１−Ｂｏｃ−３−アミノピペリジン、１−Ｃｂｚ−３−アミノピペリジン、１−フェネチルアミン、３，４−ジメトキシアンフェタミン、からなる群から選ばれる１以上のアミノ化合物である、請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１８】
アミノ基供与体が、１−フェネチルアミン、２−ブチルアミン、２−ペンチルアミン、２−ヘプチルアミン、３−ヘプチルアミン、ｎ−エチルアミン、ｎ−プロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｎ−アミルアミン、イソプロピルアミン、イソブチルアミン、グリシン、アラニン、グルタミン酸、３−アミノ−１−フェニルブタン、ベンジルアミン、β−フェネチルアミン、シクロヘキシルアミンおよびそれらの光学活性体からなる群より選ばれた化合物である、請求項１２または１３に記載の製造方法。
【請求項１９】
アミノ基受容体が、２−ケトグルタル酸またはピルビン酸である、請求項１４または１５に記載の製造方法。
【請求項２０】
アミノ基供与体から生成するケトン化合物（Ｘ）のカルボニル基を他の官能基に変換する活性を持つ少なくとも１つの酵素を、請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチドと同一反応系中で利用することにより、ケトン化合物（Ｙ）を、アミノ基供与体の存在下、アミノ基が結合する炭素原子が不斉点である対応する光学活性アミノ化合物（Ｚ）へ変換することを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法。
【請求項２１】
下記（Ｉ）から（ＩＩＩ）のポリペプチドおよび酵素を同一反応系中で利用することにより、ケトン化合物（Ｙ）を、アミノ基供与体の存在下、アミノ基が結合する炭素原子が不斉点である対応する光学活性アミノ化合物（Ｚ）へ変換することを特徴とする、請求項２０に記載の製造方法：
（Ｉ）請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチド、
（ＩＩ）還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）もしくは還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を補酵素とし、前記ポリペプチド（Ｉ）の作用によってアミノ基供与体のα−アミノ酸より生じるケトン化合物（Ｘ）のα−ケト酸をα−アミノ酸へ還元する能力を有し、かつ前記ケトン化合物（Ｙ）に対し作用しないα−アミノ酸脱水素酵素、
（ＩＩＩ）前記α−アミノ酸脱水素酵素（ＩＩ）の作用によって前記ＮＡＤＨから生じる酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）をＮＡＤＨに変換する能力、または前記α−アミノ酸脱水素酵素（ＩＩ）の作用によって前記ＮＡＤＰＨから生じる酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ+）をＮＡＤＰＨに変換する能力を有する酵素。
【請求項２２】
前記（ＩＩ）、（ＩＩＩ）の酵素が、それぞれ下記の（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）の酵素である、請求項２１に記載の製造方法：
（ＩＩ’）還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を補酵素とし、前記ポリペプチド（Ｉ）の作用によってアミノ基供与体のα−グルタミン酸より生じるケトン化合物（Ｘ）の２-ケトグルタル酸をα−グルタミン酸へ還元する能力を有し、かつ前記ケトン化合物（Ｙ）に対し作用しないα−アミノ酸脱水素酵素、
（ＩＩＩ’）前記α−アミノ酸脱水素酵素（ＩＩ’）の作用によって前記ＮＡＤＨから生じる酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）をＮＡＤＨに変換する能力を有する酵素。
【請求項２３】
前記（Ｉ）から（ＩＩＩ）のポリペプチドおよび酵素をコードする各ＤＮＡを宿主細胞に導入することにより得られる形質転換体および／またはその培養物を酵素源として用いることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の製造方法。
【請求項２４】
前記（Ｉ）から（ＩＩＩ）のポリペプチドおよび酵素をコードする各ＤＮＡを別々に含有する複数の組換えベクター、もしくは前記（Ｉ）から（ＩＩＩ）のポリペプチドおよび酵素をコードする各ＤＮＡの全てを含有する１つの組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより得られる、前記（Ｉ）から（ＩＩＩ）のポリペプチドおよび酵素を同一形質転換体内で発現する形質転換体および／またはその培養物を酵素源として用いることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の製造方法。
【請求項２５】
前記（ＩＩ）の酵素がグルタミン酸脱水素酵素であり、前記（ＩＩＩ）の酵素がグルコース脱水素酵素もしくはギ酸脱水素酵素である、請求項２１から２４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２６】
前記（ＩＩ）の酵素が、牛肝臓もしくは酵母もしくはバクテリア由来の酵素である、請求項２１から２５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２７】
前記（ＩＩＩ）の酵素が、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）もしくはチオバシラス・エスピー（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）に属する微生物由来の酵素である、請求項２１から２６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２８】
下記（α）から（γ）のポリペプチドおよび酵素を同一反応系中で利用することにより、ケトン化合物（Ｙ）を、アミノ基供与体の存在下、アミノ基が結合する炭素原子が不斉点である対応する光学活性アミノ化合物（Ｚ）へ変換することを特徴とする、請求項２０に記載の製造方法：
（α）請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチド、
（β）還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）もしくは還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を補酵素とし、前記ポリペプチド（α）の作用によってアミノ基供与体のα−アミノ酸より生じるケトン化合物（Ｘ）のα−ケト酸を２−ヒドロキシ酸へ還元する能力を有し、かつ前記ケトン化合物（Ｙ）に対し作用しないα−ケト酸還元酵素、
（γ）前記α−ケト酸還元酵素（β）の作用によって前記ＮＡＤＨから生じる酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）をＮＡＤＨに変換する能力、または前記α−ケト酸還元酵素（β）の作用によって前記ＮＡＤＰＨから生じる酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ+）をＮＡＤＰＨに変換する能力を有する酵素。
【請求項２９】
前記（β）、（γ）の酵素が、下記（β’）、（γ’）の酵素である、請求項２８に記載の製造方法：
（β’）還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を補酵素とし、前記ポリペプチド（α）の作用によってアミノ基供与体のα−グルタミン酸より生じるケトン化合物（Ｘ）の２−ケトグルタル酸を２−ヒドロキシグルタル酸へ還元する能力を有し、かつ前記ケトン化合物（Ｙ）に対し作用しないα−ケト酸還元酵素、
（γ’）前記α−ケト酸還元酵素（β’）の作用によって前記ＮＡＤＨから生じる酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）をＮＡＤＨに変換する能力を有する酵素。
【請求項３０】
前記（α）から（γ）のポリペプチドおよび酵素をコードする各ＤＮＡを宿主細胞に導入することにより得られる形質転換体および／またはその培養物を酵素源として用いることを特徴とする、請求項２８または２９に記載の製造方法。
【請求項３１】
前記（α）から（γ）のポリペプチドおよび酵素をコードする各ＤＮＡを別々に含有する複数の組換えベクター、もしくは前記（α）から（γ）のポリペプチドおよび酵素をコードする各ＤＮＡの全てを含有する１つの組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより得られる、前記（α）から（γ）のポリペプチドおよび酵素を同一形質転換体内で発現する形質転換体および／またはその培養物を酵素源として用いることを特徴とする、請求項２８または２９に記載の製造方法。
【請求項３２】
前記（β）の酵素がマンデル酸脱水素酵素あるいはヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素であり、前記（γ）の酵素がグルコース脱水素酵素もしくはギ酸脱水素酵素である、請求項２８から３１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項３３】
前記（β）の酵素が、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）もしくはワイセラ・コンフューサ（Ｗｅｉｓｓｅｌａ  ｃｏｎｆｕｓａ）に属する微生物由来の酵素である、請求項２８から３２のいずれか１項に記載の製造方法。 
【請求項３４】
前記（γ）の酵素が、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）もしくはチオバシラス・エスピー（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）に属する微生物由来の酵素である、請求項２８から３３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項３５】
前記ケトン化合物（Ｙ）が一般式（１）：
【化５】
2012043653.tif 000015
（式中、Ｒ１及びＲ２は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアラルキル基もしくは置換されていてもよいアリール基を示し、Ｒ１とＲ２の両者が互いに結合して環を形成していてもよい。但し、Ｒ１とＲ２は構造が異なる。）で表され、前記対応する光学活性アミノ化合物（Ｚ）が一般式（２）：
【化６】
2012043653.tif 000016
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記式（１）と同じ。＊は不斉炭素原子を示す。）で表される、請求項２０から３４のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ基転移反応により、ケトン化合物を効率よく光学活性アミノ化合物に変換しうる酵素および該酵素を用いた光学活性アミノ化合物の製造方法に関する。得られる光学活性アミノ化合物は、医薬品や農薬等の中間体として利用しうる。
【技術背景】
【０００２】
アミノ基転移酵素を用いた光学活性アミンの製法に関して、これまでにα−アミノ酸の製法については多くの報告があるが、α−アミノ酸以外の光学活性アミン化合物の製法については報告例が少ない。近年、α−アミノ酸以外の光学活性アミンを生成するアミノ基転移酵素が見出され、一般的な光学活性アミンの効率的な製法としての利用が期待されている。
【０００３】
しかし、これまでに知られているα―アミノ酸以外の光学活性アミンを生成するアミノ基転移酵素は課題が多い（非特許文献１）。
【０００４】
例えば、α−アミノ酸をアミノ基供与体として用い、副生成するα−ケト酸を酵素的に除去することが有用であるが、アミノ基供与体として作用するα−アミノ酸は実質的に、高価で、溶解度の低いアラニンに限定されている。
【０００５】
また、α−アミノ酸以外の光学活性アミノ化合物の中でも、特に医薬品中間体として有用な（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを９３％ｅ．ｅ．以上の高光学純度で生成するアミノ基転移酵素は見出されていない（特許文献１，２、非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−１８５１３３号公報
【特許文献２】ＷＯ２００６／１２６４９８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８，  ３２４−３３２（２０１０）
【非特許文献２】Ａｄｖ．  Ｓｙｎｔｈ．  Ｃａｔａｌ．  ３５０，  ８０７−８１２（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、医薬品や農薬等の中間体として有用な光学活性アミノ化合物を、ケトン化合物から効率よく製造するための方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、様々な土壌分離菌を対象としたスクリーニングを行なった結果、アミノ基転移触媒活性を持ち、（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを９３％ｅ．ｅ．以上の高い光学純度で生成し、かつ、アミノ基供与体として、安価で、溶解度の高いグルタミン酸に高い活性を示す微生物を見出した。また、その微生物から該活性を有するポリペプチドの単離精製に成功した。さらに、該ポリペプチドをコードする遺伝子を遺伝子組換えの手法で取得し、その塩基配列を明らかにした。さらに、該遺伝子を用いて当該酵素を産生する形質転換体を育種することで、より高活性な該形質転換体を作製し、光学活性なアミノ化合物を工業的に製造し得る方法を確立した。【００１０】
即ち、本発明は、下記（１）から（６）の理化学的性質を有するポリペプチドである：
（１）作用：アミノ基供与体の存在下で１−ベンジル−３−ピロリジノンに作用して光学純度９３％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを生成するアミノ基転移反応を触媒する。【００１１】
（２）基質特異性：
（ａ）アミノ基供与体：（Ｓ）−１−フェネチルアミンに対し活性を示し、Ｌ−アラニンよりＬ−グルタミン酸に高い活性を示し、かつ、β−アラニン、４−アミノ酪酸に対し実質的に活性を示さない。【００１２】
（ｂ）アミノ基受容体：ピルビン酸より２−ケトグルタル酸に高い活性を示す。【００１３】
（３）至適ｐＨ：７．０〜８．０、
（４）至適温度：３０〜５０℃、
（５）熱安定性：ｐＨ８．０、３０〜５０℃で３０分間処理したとき、処理前の全活性の７０％以上の残存活性を保持する。【００１４】
（６）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、約４８ｋＤａ。【００１５】
また、本発明は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミノ基供与体の存在下で１−ベンジル−３−ピロリジノンに作用して光学純度９３％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを生成する活性を有するポリペプチドである。【００１６】
または、本発明は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミノ基供与体として（Ｓ）−１−フェネチルアミンに対し活性を示し、Ｌ−アラニンよりＬ−グルタミン酸に高い活性を示し、かつ、β−アラニン、４−アミノ酪酸に対し実質的に活性を示さず、アミノ基受容体としてピルビン酸より２−ケトグルタル酸に高い活性を示すポリペプチドである。【００１７】
または、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、アミノ基供与体の存在下で１−ベンジル−３−ピロリジノンに作用して光学純度９３％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを生成する活性を有するポリペプチドである。【００１８】
または、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、アミノ基供与体として（Ｓ）−１−フェネチルアミンに対し活性を示し、Ｌ−アラニンよりＬ−グルタミン酸に高い活性を示し、かつ、β−アラニン、４−アミノ酪酸に対し実質的に活性を示さず、アミノ基受容体としてピルビン酸より２−ケトグルタル酸に高い活性を示すポリペプチドである。【００１９】
また、本発明は、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、及び、このベクターにより形質転換された形質転換体でもある。【００２０】
また、本発明は、ケトン化合物に、アミノ基供与体の存在下、前記ポリペプチド、あるいは前記形質転換体の培養物を作用させることを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法である。【００２１】
また、アミノ化合物のエナンチオマー混合物にアミノ基受容体の存在下、前記ポリペプチド、または前記形質転換体の培養物を作用させることを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法である。【００２２】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１０−２１６５４６号に記載された全ての内容を包含する。
【発明の効果】
【００２３】
安価で溶解度の高いグルタミン酸に対し高い活性を示し、光学活性アミノ化合物を高い光学純度で生成するポリペプチドを単離、および、該ポリペプチド産生能の高い形質転換体の取得により、目的の光学活性アミノ化合物を安価で効率良く製造することが可能となった。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書において記述されている、ＤＮＡの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）」等の成書に記載されている方法により行なうことができる。また、酵素活性の単位は特に明記しない限り、１分間に１μｍｏｌの生成物を与える酵素量を１Ｕとする。
【００２５】
１．本発明のポリペプチドの理化学的諸性質
本発明のポリペプチドは、以下の理化学的性質を有するポリペプチドである
（１）作用：アミノ基供与体の存在下で１−ベンジル−３−ピロリジノンに作用して光学純度９３％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを生成するアミノ基転移反応を触媒する。
【００２６】
（２）基質特異性：
（ａ）アミノ基供与体：（Ｓ）−１−フェネチルアミンに対し活性を示し、Ｌ−アラニンよりＬ−グルタミン酸に高い活性を示し、かつ、β−アラニン、４−アミノ酪酸に対し実質的に活性を示さない。
【００２７】
（ｂ）アミノ基受容体：ピルビン酸より２−ケトグルタル酸に高い活性を示す。
【００２８】
（３）至適ｐＨ：７．０〜８．０、
（４）至適温度：３０〜５０℃、
（５）熱安定性：ｐＨ８．０、３０〜５０℃で３０分間処理したとき、処理前の全活性の７０％以上の残存活性を保持する。
【００２９】
（６）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、約４８ｋＤａ。
【００３０】
（基質特異性の測定方法−１：（Ｓ）−１−フェネチルアミンに対する活性）
本発明のポリペプチドは、（Ｓ）−１−フェネチルアミンに対し活性を示す。ここで、活性を示すとは、以下の方法でアミノ基転移活性を測定した場合において、１分間に生成するアセトフェノンの量が粗精製ポリペプチド液１ｍｌに対し０．０１μｍｏｌ以上、好ましくは０．１μｍｏｌ以上、より好ましくは１μｍｏｌ以上であることを意味する。
【００３１】
上記アミノ基転移酵素活性は、以下の方法により測定することができる（「活性測定法Ａ」とする）。
【００３２】
酵素液０．２ｍＬに下記組成を有する基質溶液０．８ｍＬを添加し、３０℃で６０分間反応させた後、６規定塩酸を５０μＬ添加して反応を停止させた。この反応液を、下記条件による高速液体クロマトグラフィーで分析し、生成したアセトフェノンを定量した（以下、「活性測定法Ａ」とする）。
【００３３】
「活性測定法Ａ」
［基質溶液組成］
（Ｓ）−１−フェネチルアミン            ２５ｍＭ
２−ケトグルタル酸                      ２５ｍＭ
ピリドキサルリン酸                      ２．５ｍＭ
トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）        ０．１Ｍ
【００３４】
［高速液体クロマトグラフィーによる測定条件］
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ８−ＭＳ  (ナカライテスク社製)
溶離液：蒸留水２０００ｍＬ／アセトニトリル５００ｍＬ／メタノール５００ｍｌ／ＫＨ２ＰＯ４  ６．１ｇ／Ｈ３ＰＯ４  ２．５ｇ
流速：１ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：３０℃
【００３５】
（基質特異性の測定方法−２：ω−アミノ酸に対する活性）
本発明のポリペプチドは、β−アラニン、４−アミノ酪酸、５−アミノ吉草酸、６−アミノカプロン酸、±２，４−ジアミノ酪酸、Ｌ−オルニチン、Ｌ−リジンおよびプレットシンをアミノ基供与体とした場合には、実質的に活性を示さない。ここで、実質的に活性を示さないとは、以下の方法によりアミノ基転移活性を測定した場合において、上記アミノ化合物をアミノ基供与体として用いた場合の活性が（Ｓ）−１−フェネチルアミンを用いた場合の１／１００以下、好ましくは１／１０００以下、更に好ましくは１／１００００以下であることを意味する。
【００３６】
上記のアミノ基供与体を用いた際のアミノ基転移酵素活性は、以下の方法により測定することができる。
【００３７】
酵素液１００μＬに最終濃度が下記基質溶液組成となるように各試薬を添加し、反応液を４００μＬに調製する。３０℃で６０分間反応させた後、３規定塩酸を２０μＬ加えて反応を停止させる。次に、得られた反応液２０μＬに０．２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液８０μＬ、３．３ｍｇ／ｍＬダブシルクロリドのアセトン溶液２００μＬをそれぞれ加え、７０℃で１０分間反応させる。この反応液５０μＬに酢酸２０μＬを加えて攪拌し、下記条件による高速液体クロマトグラフィーで分析し、ダブシル化したグルタミン酸を定量する。なお、使用する酵素の活性は、本測定方法において、生成グルタミン酸量が２．８ｍＭ以下となるように調整する。
【００３８】
［基質溶液組成］
各種アミノ化合物                          １４ｍＭ
２−ケトグルタル酸                        １４ｍＭ
ピリドキサルリン酸                      ０．５ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）        ０．１Ｍ
【００３９】
［高速液体クロマトグラフィーによる測定条件］
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＲＳ（ＹＭＣ社製）
溶離液：アセトニトリル／４５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．１）＝３５／６５（体積比）
流速：０．９ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：３０℃
【００４０】
（基質特異性の測定方法−３：２-ケトグルタル酸およびピルビン酸に対する活性）
本発明のポリペプチドは、２-ケトグルタル酸に代えて、ピルビン酸をアミノ基受容体としても活性を示し、ピルビン酸より２−ケトグルタル酸をアミノ基受容体として高い活性を示す。ピルビン酸より２−ケトグルタル酸をアミノ基受容体として高い活性を示すとは、前述の「活性測定法Ａ」において、２-ケトグルタル酸に換えてピルビン酸をアミノ基受容体として測定した場合のアミノ基転移活性が、２−ケトグルタル酸をアミノ基受容体として測定した活性の１／２以下、望ましくは１／５以下の活性を示すことを言う。
【００４１】
（基質特異性の測定方法−４：Ｌ−アラニンおよびＬ−グルタミン酸に対する活性）
本発明のポリペプチドは、Ｌ−アラニンよりＬ−グルタミン酸をアミノ基供与体として高い活性を示す。Ｌ−アラニンよりＬ−グルタミン酸をアミノ基供与体として高い活性を示すとは、以下の方法でアミノ基転移活性を測定した場合において、Ｌ−グルタミン酸をアミノ基供与体として測定した場合のアミノ基転移活性が、Ｌ−アラニンをアミノ基供与体として測定した活性の２倍以上、望ましくは５倍以上、より望ましくは１０倍以上の活性を示すことを言う。
【００４２】
上記のアミノ基供与体を用いた際のアミノ基転移酵素活性は、以下の方法により測定することができる。
【００４３】
酵素液２００μＬに最終濃度が下記基質溶液組成となるように各試薬を添加し、反応液を４００μＬに調製する。３０℃で９０分間反応させた後、６規定塩酸を１５μＬ加えて反応を停止させる。次に、得られた反応液を生成した下記条件による高速液体クロマトグラフィーで分析する。
【００４４】
［基質溶液組成］
１−ベンジル−３−ピロリジノン            ２９ｍＭ
各種アミノ化合物                        ２９０ｍＭ
ピリドキサルリン酸                      ０．５ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）        ０．１Ｍ
【００４５】
［高速液体クロマトグラフィーによる分析条件］
カラム：Ｆｉｎｅｐａｋ  ＳＩＬ  Ｃ１８−Ｔ  （日本分光社製）
溶離液：蒸留水  ９４５ｍＬ／アセトニトリル  ５５５ｍＬ／ＫＨ２ＰＯ４  ７．５ｇ／ＳＤＳ  ２．１６ｇ（Ｈ３ＰＯ４でｐＨ３．６に調製）
流速：１ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：４０℃
【００４６】
（１−ベンジル−３−ピロリジノンへの立体選択性の測定方法）
本発明のポリペプチドは、アミノ基供与体の存在下で１−ベンジル−３−ピロリジノンに作用して光学純度９３％ｅ．ｅ．以上、好ましくは９５％ｅ．ｅ．以上、より好ましくは９７％ｅ．ｅ．以上、最も好ましくは９８％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを生成するアミノ基転移反応を触媒する活性を示す。
【００４７】
上記のアミノ基供与体を用いた際のアミノ基転移酵素活性は、以下の方法により測定することができる。
【００４８】
酵素液２００μＬに最終濃度が下記基質溶液組成となるように各試薬を添加し、反応液を４００μＬに調製する。３０℃で９０分間反応させた後、６規定塩酸を１５μＬ加えて反応を停止させる。次に、得られた反応液を生成した下記条件による高速液体クロマトグラフィーで分析する。
【００４９】
［基質溶液組成］
１−ベンジル−３−ピロリジノン            ５７ｍＭ
（Ｓ）−１―フェネチルアミン              ５７ｍＭ
ピリドキサルリン酸                      ０．５ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）        ０．１Ｍ
【００５０】
［高速液体クロマトグラフィーによる分析条件］
＜定量分析＞
カラム：Ｆｉｎｅｐａｋ  ＳＩＬ  Ｃ１８−Ｔ  （日本分光株社製）
溶離液：蒸留水  ９４５ｍＬ／アセトニトリル  ５５５ｍＬ／ＫＨ２ＰＯ４  ７．５ｇ／ＳＤＳ  ２．１６ｇ（Ｈ３ＰＯ４でｐＨ３．６に調製）
流速：１ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：４０℃
＜光学純度分析＞
反応液を適量の炭酸ナトリウムで塩基性にしたのち、ジニトロベンゾイルクロライドで誘導体化した後、以下の条件で分析する。
【００５１】
カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＩＡ（ダイセル化学工業社製）
溶離液：ヘキサン／エタノール／ジエチルアミン／アセトニトリル＝８００／２００／１／５（体積比）
流速：０．８ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：３０℃
【００５２】
（至適ｐＨ）
アミノ基転移反応の至適ｐＨは、前述の「活性測定法Ａ」に記載の方法でアミノ基転移活性を、ｐＨ４．０〜１０の範囲で測定することで決定することができる。ただし、上記測定方法において、測定を行うｐＨに応じて基質溶液における緩衝液は下記のものを用いる。至適ｐＨとは上記測定にて最も高い活性値を示すｐＨとする。
【００５３】
ｐＨ４．０〜６．０  ：０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ６．０〜８．５  ：０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液
ｐＨ８．０〜９．０  ：０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液
ｐＨ９．０〜１０    ：０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液
【００５４】
（至適温度）
アミノ基転移反応の至適温度は、前述の「活性測定法Ａ」に記載の方法でアミノ基転移活性を、３０〜７０℃の範囲で測定し、最大の活性値を示した温度と定義する。
【００５５】
（熱安定性）
ポリペプチドの熱安定性は、０．５ｍＭピリドキサルリン酸、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中、温度３０〜７０℃それぞれで３０分間処理した後、前述の「活性測定法Ａ」に記載の方法でアミノ基転移活性を測定し、熱処理前の活性を１００％としたとき、熱処理後７０％以上の残存活性を有する範囲とする。
【００５６】
（分子量）
ポリペプチドの分子量は、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において標準タンパク質の移動度との比較により算出する。
【００５７】
２．本発明のポリペプチドの単離
本発明の実施形態のポリペプチドは、上記性質を示すポリペプチドであれば、いかなるポリペプチドであっても含まれるが、例えば、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物から取得できる。本発明の実施形態のポリペプチドの起源となる微生物としては、好ましくは当業者が公的保存機関（例えばＮＢＲＣ等）より容易に入手可能なアルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）が挙げられ、さらに好ましくは、アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＮＫ０４−２５が挙げられる。この、アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＮＫ０４−２５は、２０１０年６月１１日付けで、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−９５４として、独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託され、その後、２０１１年９月１２日付で、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−９５４として、ＮＩＴＥ  Ｐ−９５４より移管された。
【００５８】
（培地成分）
本発明のポリペプチドを有する微生物のための培養培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の炭素原、窒素原、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地が用いられ得る。
【００５９】
なお、前記微生物を培養する際に、本ポリペプチドの誘導物質として、プロピルアミン、１−ブチルアミン、２−ブチルアミン、２−ペンチルアミン、イソプロピルアミン、イソブチルアミン、７−メトキシ−２−アミノテトラリン、１−フェネチルアミン、１−ベンジル−３−アミノピロリジンなどのアミノ化合物を培地に添加し、培養することもできる。前記誘導物質は、単独でまたは２種類以上を混合して用いてもよい。前記誘導物質の添加量は、特に制限されるものではないが、菌の生育阻害などの観点から、通常培地組成中１重量％以下が好ましい。また、前記誘導物質の添加時期は、特に制限されるものではなく、培養開始時、または、培養途中のいずれでもよい。また、前記誘導物質の効果を高めるために、前記誘導物質以外の通常の炭素原、窒素原、無機塩類、有機栄養素を少なくすることが有効な場合がある。
【００６０】
（ポリペプチドの精製）
本発明の実施形態のポリペプチドを生産する微生物からの該ポリペプチドの精製は、当業者に周知のタンパク質精製法により行ない得る。例えば、当該微生物の培養液から遠心分離、あるいは、濾過により菌体を集め、得られた菌体を、超音波破砕機あるいはグラスビーズ等を用いた物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残さを除いて無細胞抽出液を調製し、この無細胞抽出液を、分別沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等に供することにより、ポリペプチドを単離できる。
【００６１】
３．本発明のポリペプチドのアミノ酸配列
本発明のポリペプチドとしては以下の（ａ）〜（ｇ）のポリペプチドを挙げることができる。
【００６２】
（ａ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、アミノ基供与体の存在下で１−ベンジル−３−ピロリジノンに作用して光学純度９３％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを生成する活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、アミノ基供与体として（Ｓ）−１−フェネチルアミンに対し活性を示し、Ｌ―アラニンよりＬ−グルタミン酸に高い活性を示し、かつ、β−アラニン、４−アミノ酪酸に対し実質的に活性を示さず、アミノ基受容体としてピルビン酸より２−ケトグルタル酸に対し高い活性を有するポリペプチド、
（ｄ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、至適ｐＨが７．０〜８．０であり、至適温度が３０〜５０℃であり、３０〜５０℃で３０分間処理したとき処理前の７０％以上の残存活性を保持する、分子量がドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において約４８ｋＤａであるポリペプチド、
（ｅ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミノ基供与体の存在下で１−ベンジル−３−ピロリジノンに作用して光学純度９３％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを生成する活性を有するポリペプチド、
（ｆ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミノ基供与体として（Ｓ）−１−フェネチルアミンに対し活性を示し、Ｌ―アラニンよりＬ−グルタミン酸に高い活性を示し、かつ、β−アラニン、４−アミノ酪酸に対し実質的に活性を示さず、アミノ基受容体としてピルビン酸より２−ケトグルタル酸に対し高い活性を有するポリペプチド、
（ｇ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、至適ｐＨが７．０〜８．０であり、至適温度が３０〜５０℃であり、３０〜５０℃で３０分間処理したとき処理前の７０％以上の残存活性を保持する、分子量がドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において約４８ｋＤａであるポリペプチド。
【００６３】
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列としては、配列表の配列番号２に示す塩基配列によってコードされる、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を挙げることができる。
【００６４】
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８９）等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、前述した理化学的諸性質を有するかぎり上記のポリペプチドに包含される。
【００６５】
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において、アミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加される場所は特に制限されないが、高度保存領域を避けるのが好ましい。ここで、高度保存領域とは、由来の異なる複数の酵素（ポリペプチド）ついて、アミノ酸配列を最適に整列させて比較した場合に、複数の配列間でアミノ酸が一致している位置を表す。高度保存領域は、配列番号１に示したアミノ酸配列と、前述した他の微生物由来のアミノ基転移酵素（ポリペプチド）のアミノ酸配列とを、ＧＥＮＥＴＹＸ等のツールを用いて比較することにより確認することができる。
【００６６】
欠失、置換、挿入もしくは付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。ここでは、以下に挙げる各群の同一群内のアミノ酸を同族アミノ酸とする。
【００６７】
（第１群：中性非極性アミノ酸）Ｇｌｙ，  Ａｌａ，  Ｖａｌ，  Ｌｅｕ，  Ｉｌｅ，  Ｍｅｔ，  Ｃｙｓ，  Ｐｒｏ，  Ｐｈｅ
（第２群：中性極性アミノ酸）Ｓｅｒ，  Ｔｈｒ，  Ｇｌｎ，  Ａｓｎ，  Ｔｒｐ，  Ｔｙｒ
（第３群：酸性アミノ酸）Ｇｌｕ，  Ａｓｐ
（第４群：塩基性アミノ酸）Ｈｉｓ，  Ｌｙｓ，  Ａｒｇ。
【００６８】
上記の記載で「複数個のアミノ酸」とは、例えば、６０個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、さらに好ましくは５個、４個、３個、または２個以下のアミノ酸を意味する
【００６９】
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列との配列同一性は、５０％以上が好ましいが、７０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、８５％以上がさらに好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が最も好ましい。
【００７０】
アミノ酸配列の配列同一性は、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列と評価したいアミノ酸配列とを比較し、両方の配列でアミノ酸が一致した位置の数を比較総アミノ酸数で除して、さらに１００を乗じた値で表される。
【００７１】
アミノ基供与体の存在下で１−ベンジル−３−ピロリジノンに作用して光学純度９３％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを生成する活性を有する限り、配列番号１に記載のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。たとえば、ヒスチジンタグやＨＡタグのような、タグ配列を付加することができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また、アミノ基転移の上記活性を有する限り、ペプチド断片であってもよい。
【００７２】
４．本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニング
本発明のＤＮＡは、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡであり、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で上記ポリペプチドを発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。本発明のＤＮＡは配列表の配列番号２に従い、当業者であれば化学合成法により容易に入手できる。他の方法としては、精製された上記ポリペプチドが取得できれば、当業者であれば公知の方法により、該ポリペプチドの起源となる微生物より上記ＤＮＡを取得することができる。
【００７３】
以下に、本発明の実施形態のＤＮＡを取得する方法として、上記アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＮＫ０４−２５を用いた例を記載するが、本発明はこれに限定されない。
【００７４】
まず、該微生物の無細胞抽出液より精製した上記ポリペプチドを、適当なエンドペプチダーゼにより消化し、逆相ＨＰＬＣにより切断された断片を精製後、例えば、「ＰＰＳＱ−３３Ａ型全自動タンパク質一次構造分析機（島津製作所社製）」等によりアミノ酸配列の一部または全部を決定する。このようにして得られたアミノ酸配列情報をもとにして、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅するためのＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）プライマーを合成する。次に、通常のＤＮＡ単離法、例えば、Ｖｉｓｓｅｒ等の方法（Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ５３，  ４１５  （２０００））により、該ポリペプチドの起源となる微生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅し、その塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、例えば、「ＡＢＩ３１００型  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）」等を用いて行うことができる。
【００７５】
該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、インバースＰＣＲ法（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １６，  ８１８６  （１９８８））によりその全体の配列を決定することができる。
【００７６】
このようにして得られるポリペプチドのＤＮＡとして、例えば、配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡを挙げることができる。
【００７７】
以下に、配列表の配列番号２に示す塩基配列について説明する。
【００７８】
５．本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のＤＮＡを挙げることができる。
【００７９】
（Ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ。
【００８０】
ここで、「配列表の配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。
【００８１】
ハイブリダイゼーションは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）」等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡをあげることができる。好ましくは６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、更に好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡである。
【００８２】
以上のようにハイブリダイゼーション条件を記載したが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００８３】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号２に示されるＤＮＡと、配列同一性が７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、最も好ましくは９０％以上のＤＮＡをあげることができ、コードされるポリペプチドが、上記のアミノ基転移活性を有する限り、上記ＤＮＡに包含される。
【００８４】
ここで、ＤＮＡの配列同一性（％）とは、対比される２つのＤＮＡを最適に整列させ、核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。
【００８５】
ＤＮＡの配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ８，  １９９４年９月，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍｅｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  ＵＳＡ  ５３７１１；  Ｒｉｃｅ，  Ｐ．  （１９９６）  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ＥＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｐｅｔｅｒ  Ｒｉｃｅ，  Ｔｈｅ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ，  Ｈｉｎｘｔｏｎ  Ｈａｌｌ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＣＢ１０  １ＲＱ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）、及び、ｔｈｅ  ＥｘＰＡＳｙ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ分子生物学用サーバー（Ｇｅｎｅｖａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｖａ，  Ｇｅｎｅｖａ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
【００８６】
ここで、配列表の配列番号２に記載の塩基配列に１若しくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたＤＮＡとは、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８９）」等に記載の公知の方法に準じて調製することができる。
【００８７】
配列表の配列番号２に示した塩基配列において、塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加される場所は特に制限されないが、高度保存領域を避け、フレームシフトが生じないようにするのが好ましい。ここで、高度保存領域とは、由来の異なる複数のポリペプチドについて、塩基配列を最適に整列させて比較した場合に、複数の配列間で塩基が一致している位置を表す。高度保存領域は、配列番号２に示した塩基配列と、公知の微生物由来のアミノ基転移酵素遺伝子の塩基配列とをＧＥＮＥＴＹＸ等のツールを用いて比較することで確認することができる。
【００８８】
欠失、置換、挿入もしくは付加により改変された塩基配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種類以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。
【００８９】
上記の記載の複数個の塩基とは例えば１５０個、好ましくは１００個、より好ましくは５０個、さらに好ましくは２０個、１０個、５個、４個、３個、または２個以下の塩基、を意味する。
【００９０】
６．ベクター
本発明の実施形態のＤＮＡを宿主微生物内に導入し、それをその導入された宿主微生物内で発現させるために用いられるベクターＤＮＡとしては、適切な宿主微生物内で該ＤＮＡがコードするポリペプチドを発現できるものであればいずれでもよい。このようなベクターＤＮＡとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられる。また、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用され得る。
【００９１】
このようなベクターは、作動可能に連結されたプロモーター（ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等）の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含むベクターとして好適に用いられ得る。例えば、ｐＵＣ１８（東洋紡社製）、ｐＵＣ１９（東洋紡社製）、ｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報）などが挙げられる。
【００９２】
制御因子とは、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
【００９３】
また、作動可能に連結とは、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【００９４】
各種生物において利用可能なベクター、プロモーター等に関しては、「微生物学基礎講座８遺伝子工学（共立出版、１９８７）」などに詳細に記述されている。
【００９５】
７．宿主および形質転換体
本発明の実施形態のＤＮＡを発現させるために用いる宿主生物は、各ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターにより形質転換され、ＤＮＡを導入したポリペプチドを発現することができる生物であれば、特に制限はされない。利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリイウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発されている細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発されている放線菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、及びキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの宿主ベクター系の開発されている酵母、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの宿主ベクター系の開発されているカビ、などが挙げられる。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Ｎａｔｕｒｅ３１５，５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。これらのうち、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。
【００９６】
本発明のＤＮＡを含むポリペプチド発現ベクターは、公知の方法により宿主微生物に導入できる。例えば、宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、市販のＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入できる。
【００９７】
８．光学活性アミノ化合物の製造方法
次に、本発明の実施形態のポリペプチドまたは当該ポリペプチドの生産能を持つ微生物を用いて光学活性アミノ化合物を製造する方法について説明する。
【００９８】
本発明の実施形態のポリペプチドの生産能を持つ微生物としては、例えば、前記アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＮＫ０４−２５、及び、実施形態のＤＮＡを含むベクターを導入された形質転換体が挙げられる。
【００９９】
本発明の光学活性アミノ化合物の製造方法としては、目的とするアミノ化合物と同じ骨格のケトン化合物に、アミノ基供与体からアミノ基を転移させ、生成する光学活性アミノ化合物を採取する方法（以下、製造方法Ｉとする）と、アミノ化合物のエナンチオマー混合物のうち、一方のエナンチオマーのアミノ基を選択的にアミノ基受容体に転移させ、残存するエナンチオマー（光学活性アミノ化合物）を採取する方法（以下、製造方法ＩＩという）が挙げられる。
【０１００】
まず、製造方法Ｉについて説明する。
【０１０１】
（製造方法Ｉ）
製造方法Ｉは、ケトン化合物に、アミノ基供与体の存在下、本発明のポリペプチド、あるいは本発明のポリペプチドの生産能を持つ形質転換体の培養物を作用させ、光学活性アミノ化合物を製造する方法である。
【０１０２】
本製造方法は、例えば、一般式（１）：
【化１】
2012043653.tif 000002
【０１０３】
で表されるケトン化合物に、アミノ基供与体の存在下、前記ポリペプチドあるいは該ポリペプチドの生産能を持つ微生物の培養物を作用させることにより、一般式（２）：
【化２】
2012043653.tif 000003
【０１０４】
で表される光学活性アミノ化合物の製造方法である。
【０１０５】
前記式（１）および（２）において、Ｒ１およびＲ２は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアラルキル基もしくは置換されていてもよいアリール基を示し、Ｒ１とＲ２の両者が互いに結合して環を形成していてもよい。但し、Ｒ１とＲ２は構造が異なる。
【０１０６】
Ｒ１とＲ２は、好ましくは炭素数１から２０の置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアラルキル基もしくは置換されていてもよいアリール基であり、より好ましくは、炭素数１から１０の置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアラルキル基もしくは置換されていてもよいアリール基である。
【０１０７】
アリール基としては、フェニル基、ナフチル基、ピリジル基、チエニル基、オキサジアゾリル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、フリル基、ピロリル基、フェノキシ基、ナフトキシ基、ピリジルオキシ基、チエニルオキシ基、オキサジアゾリルオキシ基、イミダゾリルオキシ基、チアゾリルオキシ基、フリルオキシ基、ピロリルオキシ基等が挙げられる。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、イソプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、メトキシ基、エトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ビニル基、アリル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等が挙げられる。アラルキル基としては、ベンジル基等が挙げられる。
【０１０８】
これらの基は更に置換されていてもよく、その置換基としては、ハロゲン原子、窒素原子、硫黄原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基やメチレンジオキシ等が挙げられる。また、環の形成は置換基を介してもよい。
【０１０９】
上記ケトン化合物の具体的な化合物としては、例えば、１−テトラロン、２−テトラロン、５−メトキシ−２−テトラロン、６−メトキシ−２−テトラロン、７−メトキシ−２−テトラロン、８−メトキシ−２−テトラロン、１−ベンジル−３−ピロリジノン、１−Ｂｏｃ−３−ピロリジノン、１−Ｃｂｚ−３−ピロリジノン、１−ベンジル−３−ピペリジノン、１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノン、１−Ｃｂｚ−３−ピペリジノン、アセトフェノン、３，４−ジメトキシフェニルアセトンなどが挙げられる。
【０１１０】
（アミノ基供与体）
アミノ基供与体としては、本発明のポリペプチドが作用するアミン化合物であればいかなるものでも使用できる。具体例としては１−フェネチルアミン、２−ブチルアミン、２−ペンチルアミン、２−ヘプチルアミン、３−ヘプチルアミン、ｎ−エチルアミン、ｎ−プロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｎ−アミルアミン、イソプロピルアミン、イソブチルアミン、グリシン、アラニン、グルタミン酸、３−アミノ−１−フェニルブタン、ベンジルアミン、β−フェネチルアミン、シクロヘキシルアミンおよびそれらの光学活性体が挙げられる。なかでも、１−フェネチルアミン、特に、安価で、かつ、溶解度が高い点ではグルタミン酸が好ましい。
【０１１１】
（ポリペプチドの形態）
製造方法Ｉにおいては、前記ケトン化合物に、アミノ基供与体の存在下、前記本発明のポリペプチドまたは当該ポリペプチドの生成能を有する微生物の培養物を作用させる。
【０１１２】
ここで、「培養物」とは、菌体を含む培養液、培養菌体、又はその処理物を意味する。ここで「その処理物」とは、例えば、無細胞抽出液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、又はそれら菌体の磨砕物等を意味する。さらにこれらポリペプチド及び培養物は、公知の手段により固定化ポリペプチドあるいは固定化菌体の形態として用いることもできる。固定化は、当業者に周知の方法（例えば架橋法、物理的吸着法、包括法等）で行なうことができる。
【０１１３】
（反応平衡、生成物阻害の解消による反応性の改善）
アミノ基転移反応を用いたアミノ化反応は一般的に可逆反応であるため、一般的に平衡点で見かけ上反応が停止する。これらの反応平衡を解消する公知の方法を組み合わせることで本発明のポリペプチドを用いた反応を改善することができる。
【０１１４】
例えば、ＷＯ２００７／１３９０５５Ａに記載のように、アミノ基供与体としてアラニンを用いて、副生成するピルビン酸を乳酸脱水素酵素と補酵素再生用のグルコース脱水素酵素を共役させることでアミノ基転移酵素に作用しない乳酸へ変換し、反応平衡を解消する方法が有効である。同様に、アミノ基供与体としてアラニンを用いて、副生成するピルビン酸を、ピルビン酸デカルボキシラーゼで除く方法（ＷＯ２００７／０９３３７２Ａ１）、アラニン脱水素酵素を用いる方法（ＵＳ２００９／０１１７６２７Ａ１，  Ｅｖｏｎｉｋ  Ｄｅｇｕｓｓａ  ＧｍｂＨ）、過酸化水素で除く方法（ＵＳ２００８／０２１３８４５Ａ１）、アセト酪酸合成酵素を用いる方法（Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７２（１１），  ３０３０−３０３３  （２００８））なども有効である。
【０１１５】
あるいは、アミノ基供与体としてグルタミン酸を用いて、副生成する２−ケトグルタル酸をマンデル酸脱水素酵素あるいはヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素と補酵素再生用のグルコース脱水素酵素もしくはギ酸脱水素酵素を共役させることでアミノ基転移酵素に作用しない２−ヒドロキシグルタル酸へ変換し、反応平衡を解消する方法が有効である。同様に、アミノ基供与体としてグルタミン酸を用いて、副生成する２−ケトグルタル酸をグルタミン酸脱水素酵素と補酵素再生用のグルコース脱水素酵素もしくはギ酸脱水素酵素を共役させることでグルタミン酸へ変換し、反応平衡を解消する方法が有効である。
【０１１６】
また、反応平衡だけでなく、アミノ基供与体から副生成するケトン化合物による生成物阻害の解消にもこれらの手法は有効な手段となる。
【０１１７】
（基質濃度）
反応に用いる基質の濃度としては、ケトン化合物は、反応液組成中、０．１〜８０重量％、好ましくは１〜５０重量％であり、また、アミノ基供与体は、キラルアミンの場合は、ケトン化合物に対し、８０〜１２００モル％、好ましくは１００〜６００モル％の濃度になるように用いることが好ましい。なお、前記アミノ基供与体としてラセミ体のアミノ化合物の場合は、一方の立体が上記の濃度となるように使用することもできる。
【０１１８】
（反応ｐＨ）
本発明のポリペプチドを作用させる際のｐＨは、ポリペプチドの至適ｐＨの観点から、下限は、好ましくはｐＨ６．０以上であり、より好ましくはｐＨ７．０以上であり、上限は、好ましくはｐＨ９．０以下であり、より好ましくはｐＨ８．０以下であることが望ましい。複数のポリペプチド（酵素）を共役させる場合には使用する全ての酵素が安定的かつ高活性に作用するｐＨを選択することが好ましい。
【０１１９】
（反応温度）
本発明のポリペプチドを作用させる際の温度は、ポリペプチドの至適温度および熱安定性の観点から、好ましくは２５℃以上であり、より好ましくは３０℃以上であり、好ましくは６０℃以下であり、より好ましくは５０℃以下である。複数のポリペプチド（酵素）を共役させる場合には使用する全ての酵素が安定的かつ高活性に作用する反応温度を選択することが好ましい。
【０１２０】
（溶媒）
反応溶媒は、通常、イオン交換水、緩衝液等の水性媒体を使用するが、有機溶媒を含んだ系でも反応を行なうことができる。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等のアルコール系溶媒、ペンタン、ヘキサン等の脂肪族炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒、塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒、その他、アセトニトリル等を適宜使用できる。
【０１２１】
（２相系）
必要に応じて、上記の有機溶媒を水への溶解度以上に加えて２相系で反応を行なうこともできる。有機溶媒を反応系に共存させることで、選択率、変換率、収率などが向上する場合も多い。
【０１２２】
（反応時間）
反応は、通常、１時間〜１週間、好ましくは１〜７２時間であり、そのような時間で反応が終了する反応条件を選択することが好ましい。
【０１２３】
（抽出精製）
上記の反応により、光学活性アミノ化合物が生成する。生成した光学活性アミノ化合物は、反応混合液から抽出、蒸留、再結晶、カラム分離など公知の方法によって単離することができる。
【０１２４】
例えば、ｐＨを酸性に調節後、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、ヘキサン、オクタン、ベンゼン等の炭化水素系溶媒、塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素系溶媒等、一般的な溶媒により生成した光学活性アミノ化合物を水相に残したまま、未反応の基質およびアミノ基転移反応により生じたアミノ基供与体に対応するケトン化合物を選択的に除くことができる。  生成した光学活性アミノ化合物および未反応のアミノ基供与体は、例えば、ｐＨを塩基性に調節し、同様に一般的な有機溶媒で抽出することができる。生成した光学活性アミノ化合物と未反応のアミノ基供与体は、例えば、蒸留により分離することができる。
【０１２５】
次に本発明の製造方法ＩＩについて説明する。
【０１２６】
（製造方法ＩＩ）
本製造方法は、アミノ化合物のエナンチオマー混合物にアミノ基受容体の存在下、本発明のポリペプチド、または本発明のポリペプチドの生産能を持つ形質転換体の培養物を作用させる光学活性アミノ化合物の製造方法である。
【０１２７】
本製造方法は、例えば、一般式（３）：
【化３】
2012043653.tif 000004
【０１２８】
で表わされるアミノ化合物のエナンチオマー混合物に、アミノ基受容体の存在下、前記ポリペプチドあるいは該ポリペプチドの産生能を持つ微生物の培養物を作用させることにより、一般式（４）：
【化４】
2012043653.tif 000005
【０１２９】
で表わされる光学活性アミノ化合物を得ることができる。
【０１３０】
前記式（３）及び（４）におけるＲ１、Ｒ２は、前記式（１）及び（２）におけるＲ１、Ｒ２と同じである。
【０１３１】
上記光学活性アミノ化合物の具体的な化合物としては、例えば、１−アミノテトラリン、２−アミノテトラリン、５−メトキシ−２−アミノテトラリン、６−メトキシ−２−アミノテトラリン、７−メトキシ−２−アミノテトラリン、８−メトキシ−２−アミノテトラリン、１−ベンジル−３−アミノピロリジン、１−Ｂｏｃ−３−アミノピロリジン、１−Ｃｂｚ−３−アミノピロリジン、１−ベンジル−３−アミノピペリジン、１−Ｂｏｃ−３−アミノピペリジン、１−Ｃｂｚ−３−アミノピペリジン、１−フェネチルアミン、３，４−ジメトキシアンフェタミン、などが挙げられる。
【０１３２】
（アミノ基受容体）
本方法においては、ケトン化合物をアミノ基受容体として用いる。当該ケトン化合物としては、アミノ基受容体としての活性があればいかなるケトン化合物であってもよいが、好ましくは、２−ケトグルタル酸あるいはグリオキシル酸である。
【０１３３】
製造方法ＩＩにおいては、アミノ化合物のエナンチオマー混合物に、上記アミノ基受容体の存在下、前記本発明のポリペプチドまたは当該ポリペプチドの生成能を有する形質転換体の培養物を作用させる。
【０１３４】
ここで、アミノ化合物のエナンチオマー混合物とは、エナンチオマーとその鏡像体の混合物を表す。通常は、ラセミ体が安価で入手しやすく、ラセミ体を用いることが好ましい。ただし、ラセミ体に限定されず、例えば、エナンチオマーがその鏡像体よりも若干過剰に含まれる混合物を用いて、製造方法ＩＩにより、その光学純度を高めることも好ましく行い得る。
【０１３５】
なお、培養物の意味するところは、前述の製造方法Ｉの場合と同様である。
【０１３６】
また、アミノ化合物の濃度は、反応液組成中、０．１〜８０重量％、好ましくは１〜５０重量％である。アミノ基受容体の濃度は、アミノ化合物に対し、３０〜１００モル％、好ましくは５０〜６０モル％で用いることが好ましい。反応ｐＨ、反応温度、反応溶媒は製造方法Ｉと同様の条件が用いられ得る。
【０１３７】
上記の反応により、光学活性アミノ化合物が生成する。生成した光学活性アミノ化合物は、製造方法Ｉと同様の方法で反応混合液から単離することができる。
【実施例】
【０１３８】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。【０１３９】
（実施例１）アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ.）ＫＮＫ０４−２５由来アミノ基転移活性を有するポリペプチドの取得、精製
（Ｓ）−１−フェネチルアミンをアミノ基供与体として１−ベンジル−３−ピロリジノンをアミノ化する微生物である、アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ.）ＫＮＫ０４−２５（ＮＩＴＥ  ＢＰ−９５４）を土壌より分離した。上記の反応を触媒するアミノ基転移活性をもつポリペプチドの精製、その構造遺伝子のクローニング、及び構造遺伝子を含む組換えベクターの構築を行った。以下、本ポリペプチドをＴＡＴと記載する。【０１４０】
（アミノ基転移活性測定方法）
酵素液０．２ｍＬに下記組成を有する基質溶液０．８ｍＬを添加し、３０℃で６０分間反応させた後、６規定塩酸を５０μＬ添加して反応を停止させた。この反応液を、下記条件による高速液体クロマトグラフィーで分析し、生成したアセトフェノンを定量した。本反応条件において、１分間に１μｍｏｌのアセトフェノンが生成する活性を、１Ｕと定義した。【０１４１】
［基質溶液組成］
（Ｓ）−１−フェネチルアミン            ２５ｍＭ
２−ケトグルタル酸                      ２５ｍＭ
ピリドキサルリン酸                      ２．５ｍＭ
トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）        ０．１Ｍ
［高速液体クロマトグラフィーによる測定条件］
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ８−ＭＳ  (ナカライテスク社製)
溶離液：蒸留水２０００ｍＬ／アセトニトリル５００ｍＬ／メタノール５００ｍｌ／ＫＨ２ＰＯ４  ６．１ｇ／Ｈ３ＰＯ４  ２．５ｇ
流速：１ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：３０℃【０１４２】
上記アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＮＫ０４−２５を大試験管に５ｍＬの２ＹＴ培地（組成：１６ｇ／Ｌ  トリプトン（ベクトン  ディッキンソン社製）、１０ｇ／Ｌ  イーストエキス（ベクトン  ディッキンソン社製）、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ７．０））に植菌し、３０℃で１日培養し、前培養液を得た。【０１４３】
次に、５リットル容ミニジャー中で３．０ＬのＮ培地（組成：５ｇ／Ｌ  ポリペプトン（日本製薬社製）、３ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース、２ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ  イーストエキス（ベクトン  ディッキンソン社製）、６滴  アデカノールＬＧ−１０９（日本油脂製）、０．５ｇ／Ｌ  （Ｓ）−１−フェネチルアミン（ｐＨ７．０））に、得られた前培養液を植菌し、通気量０．３ｖｖｍ、撹拌回転数３５０ｒｐｍ、３０℃で２７時間培養した。【０１４４】
ついで、遠心分離により培養液から菌体を集め、０．５ｍＭ  ジチオトレイトール、０．５ｍＭ  ピリドキサルリン酸、０．１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリドを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。得られた懸濁液を超音波破砕により破砕した。次に、該破砕物中の固形物を遠心分離により除去し、無細胞抽出液を調製した。【０１４５】
得られた無細胞抽出液を６０℃で３０分間保持し、ついで生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清に４０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、これを溶解させ、ついで生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清に７０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、これを溶解させて、ついで遠心分離により生じた沈殿を回収した。【０１４６】
この沈殿を０．５ｍＭ  ジチオトレイトール、０．５ｍＭ  ピリドキサルリン酸、０．１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリドを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶解させ、さらに同緩衝液に対し透析を行なった。これを、同じ緩衝液で平衡化させたＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＤＥＡＥ−６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（９０ｍＬ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウムのリニアグラジエント（０．１Ｍから０．５Ｍまで）により活性画分を溶出させた。【０１４７】
溶出させた活性画分を集めて、これに、終濃度１．５Ｍとなるように硫酸アンモニウムを溶解し、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、０．５ｍＭ  ジチオトレイトール、０．５ｍＭ  ピリドキサルリン酸、０．１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリドを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）であらかじめ平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｂｕｔｙｌ−６５０Ｓ（東ソー株式会社製）カラム（２０ｍＬ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウムのリニアグラジエント（１．０Ｍから０．４Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を用い０．５ｍＭ  ジチオトレイトール、０．５ｍＭ  ピリドキサルリン酸、０．１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリドを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に緩衝液交換を行ない、電気泳動的にほぼ単一な精製酵素標品を得た。【０１４８】
（実施例２）ＴＡＴ遺伝子のクローニング
（ＰＣＲプライマーの作成）
実施例１で得られた精製ＴＡＴのＮ末端アミノ酸配列をＰＰＳＱ−３３Ａ型全自動タンパク質一次構造分析機（島津製作所製社製）により決定した。また、上記で得られた精製ＴＡＴを８Ｍ尿素存在下で変性させた後、アクロモバクター由来のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業社製）で消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列をＮ末端アミノ酸配列と同様の方法で決定した。このアミノ酸配列から予想される塩基配列を考慮し、ＴＡＴ遺伝子の一部をＰＣＲにより増幅するためのプライマー１（配列表の配列番号３）、および、プライマー２（配列表の配列番号４）を合成した。【０１４９】
（ＰＣＲによるＴＡＴ遺伝子の増幅）
上記アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ.）ＫＮＫ０４−２５の培養液から、Ａｕｓｕｂｅｌ等の方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ, １９８７）に記載の方法に従って染色体ＤＮＡを抽出した。得られた染色体ＤＮＡを鋳型に、上記で合成したプライマー１および２を用いてＰＣＲを行った。その結果、遺伝子の一部と考えられる約４５０ｂｐのＤＮＡ断片を取得した。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。
このＤＮＡ断片を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）およびＡＢＩ  ３１００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてその塩基配列を決定した。その塩基配列を配列表の配列番号５に示した。【０１５０】
（ｉｎｖｅｒｓｅ−ＰＣＲ法によるＴＡＴ遺伝子の全長配列の決定）
上記で得たアルスロバクター・エスピー  ＫＮＫ０４−２５の染色体ＤＮＡを制限酵素ＡａｔＩＩ、ＡｐａＬＩまたはＰｓｔＩを用いて完全消化し、得られた消化物をＴ４ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ社製）を用いて各々分子内環化させた。これを鋳型として用い、上記で判明したＴＡＴ遺伝子の部分塩基配列情報をもとに、ｉｎｖｅｒｓｅ−ＰＣＲ法（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １６，  ８１８６  （１９８８））により、染色体ＤＮＡ上のＴＡＴ遺伝子の全塩基配列を決定した。ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ  ＨＳ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。  決定した塩基配列を配列表の配列番号２に示した。また、該塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示した。【０１５１】
（実施例３）ＴＡＴ遺伝子を含む組換えプラスミドの作製
実施例２で決定した塩基配列に基づき、ＴＡＴ遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加したプライマー３（配列表の配列番号６）と、ＴＡＴ遺伝子の終始コドンの直後にＥｃｏＲＩ部位を付加したプライマー４（配列表の配列番号７）とを合成した。実施例２で得たアルスロバクター・エスピー  ＫＮＫ０４−２５の染色体ＤＮＡを鋳型とし、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＴＡＴ遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加し、かつ終始コドンの直後にＥｃｏＲＩ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを取得した。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このＤＮＡをＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＴＴＡＴを得た。【０１５２】
（実施例４）組換え大腸菌の作製
実施例３で得た組換えプラスミドｐＮＴＴＡＴを用いて、大腸菌  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え大腸菌Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＴＡＴ）を得た。比較例として、上記プラスミドｐＵＣＮＴを用いて、大腸菌Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え大腸菌  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１  （ｐＵＣＮＴ）を得た。【０１５３】
（実施例５）組換え大腸菌を用いたＴＡＴ遺伝子の発現
実施例４で得た形質転換体Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＴＡＴ）、および、比較例であるＥ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ＹＴ培地（組成：１６ｇ／Ｌ  トリプトン（ベクトン  ディッキンソン社製）、１０ｇ／Ｌ  イーストエキス（ベクトン  ディッキンソン社製）、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ７．０））で培養し、集菌後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。【０１５４】
この無細胞抽出液のトランスアミナーゼ活性を実施例１に示した（Ｓ）−１−フェネチルアミンと２−ケトグルタル酸を基質とした活性測定法により測定した。その結果、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＴＡＴ）の無細胞抽出液では、５．０Ｕ／ｍｌの活性が見られた。Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）の無細胞抽出液では活性は見られなかった。【０１５５】
（実施例６）ＴＡＴの理化学的性質１
実施例５で得た無細胞抽出液を用いて、ＴＡＴの１−ベンジル−３−ピロリジノンに対する活性と生成（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンの光学純度について調べた。【０１５６】
（１−ベンジル−３−ピロリジノンに対する活性と生成（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンの光学純度測定方法）
光学活性（Ｓ）−１−フェネチルアミンと１−ベンジル−３−ピロリジノンとに作用してアセトフェノンと（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンとを生成するアミノ基転移反応を触媒する活性を調べた。実施例５で得られた無細胞抽出液に、最終濃度が下記基質溶液組成となるように各試薬を添加した。３０℃で２時間反応させた後、反応液を下記条件のＨＰＬＣにて分析した。【０１５７】
その結果、変換率１００％で（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンが生成し、その光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。【０１５８】
［基質溶液組成］
１−ベンジル−３−ピロリジノン              ５７ｍＭ
（Ｓ）−１―フェネチルアミン                ５７ｍＭ
ピリドキサルリン酸                        ０．５ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）          ０．１Ｍ【０１５９】
［高速液体クロマトグラフィーによる測定条件］
＜定量分析＞
カラム：Ｆｉｎｅｐａｋ  ＳＩＬ  Ｃ１８−Ｔ  （日本分光社製）
溶離液：蒸留水  ９４５ｍＬ／アセトニトリル  ５５５ｍＬ／ＫＨ２ＰＯ４  ７．５ｇ／ＳＤＳ  ２．１６ｇ（Ｈ３ＰＯ４でｐＨ３．６に調製）
流速：１ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：４０℃
＜光学純度分析＞
反応液を適量の炭酸ナトリウムで塩基性にしたのち、ジニトロベンゾイルクロリドで誘導体化した後、以下の条件で分析する。【０１６０】
カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＩＡ（ダイセル化学工業株式会社製）
溶離液：ヘキサン／エタノール／ジエチルアミン／アセトニトリル＝８００／２００／１／５（体積比）
流速：０．８ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：３０℃【０１６１】
（実施例７）ＴＡＴの理化学的性質２
実施例５で得た無細胞抽出液を用いて、ＴＡＴのアミノ基転移活性について、実施例１に示した（Ｓ）−１−フェネチルアミンと２−ケトグルタル酸を基質とした活性測定法により測定した。【０１６２】
（１）至適ｐＨ：
ｐＨ４．０〜１０の範囲で、上記と同様にしてアミノ基転移活性を測定し、ＴＡＴの至適ｐＨを調べた（ただし、測定するｐＨに応じて緩衝液は下記のものを用いた）。その結果、ｐＨ７での反応が最も活性が高く、ｐＨ７．０を１００としたときの相対活性で７０以上の値を示したｐＨはｐＨ７．０およびｐＨ８．０であった。【０１６３】
［緩衝液］
ｐＨ４．０、５．０の場合      ：０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ６．０、７．０の場合      ：０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液
ｐＨ８．０の場合              ：０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液
ｐＨ９．０、１０の場合        ：０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液【０１６４】
（２）至適温度：
温度３０、４０、５０、６０、７０℃の範囲で、前記の活性測定方法と同様にアミノ基転移活性を測定し、ＴＡＴの至適温度を調べた。その結果、４０℃での反応が最も活性が高く、４０℃を１００としたときの相対活性で７０以上の値を示した温度は３０、４０、５０℃であった。【０１６５】
（３）熱安定性：
酵素液を、０．５ｍＭピリドキサルリン酸、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中、温度３０、４０、５０、６０、７０℃で３０分間処理した後、前記の活性測定方法でアミノ基転移活性を測定し、ＴＡＴの熱安定性を調べた。その結果、処理前を１００としたときの相対活性で７０以上の値を示した温度は３０、４０、５０℃であった。【０１６６】
（実施例８）ＴＡＴの理化学的性質３
実施例５で得た無細胞抽出液を用いて、ＴＡＴの分子量について調べた。【０１６７】
１０％ポリアクリルアミドゲル（アトー社製）を用い、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を行った。標準タンパク質としてＰｅｒｆｅｃｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍａｒｋｅｒｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用い、この標準タンパク質の移動度と比較し、ＴＡＴの分子量は約４８ｋＤａと算出した。【０１６８】
（実施例９）ＴＡＴの理化学的性質４：アミノ基供与体特異性
実施例５で得た無細胞抽出液を用いて、ＴＡＴのアミノ基供与体に対する基質特異性について調べた。【０１６９】
酵素液１００μＬに最終濃度が下記基質溶液組成となるように各試薬を添加し、０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で反応液の体積を４００μＬに調製した。３０℃で６０分間反応させた後、３規定塩酸を２０μＬ加えて反応を停止させた。次に、得られた反応液２０μＬに０．２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液８０μＬ、３．３ｍｇ／ｍＬダブシルクロリドのアセトン溶液２００μＬをそれぞれ加え、７０℃で１０分間反応させた。この反応液５０μＬに酢酸２０μＬを加えて攪拌し、下記条件による高速液体クロマトグラフィーで分析し、ダブシル化したグルタミン酸を定量した。なお、使用する酵素の活性は、本測定方法において、生成グルタミン酸量が２．８ｍＭ以下となるように調製した。【０１７０】
その結果を、ベンジルアミンをアミノ基供与体として用いたときの活性を１００とした相対活性として表１に示す。表１に示すように、ベンジルアミン、±２-ブチルアミン、ｎ−ブチルアミンに活性を示した。【０１７１】
［基質溶液組成］
各種アミノ化合物                          １４ｍＭ
２−ケトグルタル酸                        １４ｍＭ
ピリドキサルリン酸                      ０．５ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）        ０．１Ｍ
［高速液体クロマトグラフィーによる測定条件］
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ８−ＭＳ  (ナカライテスク社製)
溶離液：蒸留水２０００ｍＬ／アセトニトリル５００ｍＬ／メタノール５００ｍｌ／ＫＨ２ＰＯ４  ６．１ｇ／Ｈ３ＰＯ４  ２．５ｇ
流速：１ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：３０℃
【表１】
2012043653.tif 000006
【０１７２】
（実施例１０）ＴＡＴの理化学的性質５：アミノ基供与体特異性２
実施例５で得た無細胞抽出液を用いて、ＴＡＴについて代表的なω―アミノ酸トランスアミナーゼの基質に対する反応性について調べた。【０１７３】
酵素液１００μＬに最終濃度が下記基質溶液組成となるように各試薬を添加し、０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で反応液の体積を４００μＬに調製した。３０℃で６０分間反応させた後、３規定塩酸を２０μＬ加えて反応を停止させた。次に、得られた反応液２０μＬに０．２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液８０μＬ、３．３ｍｇ／ｍＬダブシルクロリドのアセトン溶液２００μＬをそれぞれ加え、７０℃で１０分間反応させた。この反応液５０μＬに酢酸２０μＬを加えて攪拌し、下記条件による高速液体クロマトグラフィーで分析し、ダブシル化したグルタミン酸を定量した。なお、使用する酵素の活性は、本測定方法において、生成グルタミン酸量が２．８ｍＭ以下となるように調整した。【０１７４】
その結果を、（Ｓ）−１−フェネチルアミンをアミノ基供与体として用いたときの活性を１００とした相対活性として表２に示す。表２に示すように、本ポリペプチドはβ−アラニン、４−アミノ酪酸、５−アミノ吉草酸、６−アミノカプロン酸、±２，４−ジアミノ酪酸、Ｌ−オルニチン、Ｌ−リジンおよびプトレッシンに対し活性を示さなかった。【０１７５】
［基質溶液組成］
各種アミノ化合物                          １４ｍＭ
２−ケトグルタル酸                        １４ｍＭ
ピリドキサルリン酸                      ０．５ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）        ０．１Ｍ【０１７６】
［高速液体クロマトグラフィーによる測定条件］
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＲＳ（ＹＭＣ社製）
溶離液：アセトニトリル／４５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．１）＝３５／６５（体積比）
流速：０．９ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：３０℃
【表２】
2012043653.tif 000007
【０１７７】
（実施例１１）ＴＡＴの理化学的性質６：アミノ基供与体特異性３
実施例５で得られた無細胞抽出液を用いて、ＴＡＴのアミノ基供与体に対する基質特異性について調べた。酵素液２００μＬに最終濃度が下記基質溶液組成となるように各試薬を添加し、０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で反応液の体積を４００μＬに調製した。３０℃で９０分間反応させた後、６規定塩酸を１５μＬ加えて反応を停止させる。次に、得られた反応液を生成した下記条件による高速液体クロマトグラフィーで分析した。【０１７８】
その結果を、Ｌ−アラニンをアミノ基供与体として用いたときの活性を１００とした相対活性として表３に示す。表３に示すように、Ｌ−アラニンよりＬ−グルタミン酸に対し高い活性を示した。【０１７９】
［基質溶液組成］
１−ベンジル−３−ピロリジノン            ２９ｍＭ
各種アミノ化合物                        ２９０ｍＭ
ピリドキサルリン酸                      ０．５ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）        ０．１Ｍ【０１８０】
［高速液体クロマトグラフィーによる定量分析条件］
＜定量分析＞
カラム：Ｆｉｎｅｐａｋ  ＳＩＬ  Ｃ１８−Ｔ  （日本分光社製）
溶離液：蒸留水  ９４５ｍＬ／アセトニトリル  ５５５ｍＬ／ＫＨ２ＰＯ４  ７．５ｇ／ＳＤＳ  ２．１６ｇ（Ｈ３ＰＯ４でｐＨ３．６に調製）
流速：１ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：４０℃
＜光学純度分析＞
反応液を適量の炭酸ナトリウムで塩基性にしたのち、ジニトロベンゾイルクロライドで誘導体化した後、以下の条件で分析した。【０１８１】
カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＩＡ（ダイセル化学工業社製）
溶離液：ヘキサン／エタノール／ジエチルアミン／アセトニトリル＝８００／２００／１／５（体積比）
流速：０．８ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：３０℃
【表３】
2012043653.tif 000008
【０１８２】
（実施例１２）ＴＡＴの理化学的性質７：アミノ基受容体特異性
実施例５で得た無細胞抽出液を用いて、ＴＡＴのアミノ基受容体に対する基質特異性について調べた。【０１８３】
酵素液１００μＬに最終濃度が下記基質溶液組成となるように各試薬を添加し、０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で反応液の体積を４００μＬに調製した。３０℃で６０分間反応させた後、６規定塩酸を５０μＬ添加して反応を停止させた。この反応液を、下記条件による高速液体クロマトグラフィーで分析し、生成したアセトフェノンを定量した。【０１８４】
その結果を、２−ケトグルタル酸をアミノ基受容体として用いたときの活性を１００とした相対活性として表４に示す。表４に示すように、２-ケトグルタル酸に高い活性を示し、グリオキシル酸、ピルビン酸にも活性を示した。【０１８５】
［基質溶液組成］
各種ケトン化合物                        １４ｍＭ
（Ｓ）−１−フェネチルアミン                      １４ｍＭ
ピリドキサルリン酸                    ０．５ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）      ０．１Ｍ
［高速液体クロマトグラフィーによる測定条件］
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ８−ＭＳ  (ナカライテスク社製)
溶離液：蒸留水２０００ｍＬ／アセトニトリル５００ｍＬ／メタノール５００ｍｌ／ＫＨ２ＰＯ４  ６．１ｇ／Ｈ３ＰＯ４  ２．５ｇ
流速：１ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：３０℃
【表４】
2012043653.tif 000009
【０１８６】
（実施例１３）ラクトバシラス  パラカゼイ  サブエスピー  パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＪＣＭ１１８１由来Ｄ−ヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素遺伝子（ＲＬＣ）のクローニング
ラクトバシラス  パラカゼイ  サブエスピー  パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＪＣＭ１１８１より、α−ケト酸還元酵素の一つであるＤ−ヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素（以下ＲＬＣと略す）の遺伝子を、以下の方法でクローニングした。このラクトバシラス  パラカゼイ  サブエスピー  パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＪＣＭ１１８１株は、独立行政法人  理化学研究所  バイオリソースセンター（〒３５１−０１９８ 埼玉県和光市広沢２−１）より当業者が入手可能である。このＲＬＣは、本発明の「α−ケト酸還元酵素（β）」の一実施例である。【０１８７】
（ＰＣＲプライマーの作成）
遺伝子データバンクに登録されている既知のＤ−ヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素の遺伝子配列情報（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  Ｍ２６９２９）を参考に、ＲＬＣ遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加したプライマー５（配列表の配列番号８）と、ＲＬＣ遺伝子の終始コドンの直後にＫｐｎＩ部位を付加したプライマー６（配列表の配列番号９）を合成した。また、ＲＬＣ遺伝子内部に存在するＮｄｅＩ部位を破壊するために１６５番目のＡをＧに置換したプライマー７（配列表の配列番号１０）と８（配列表の配列番号１１）を合成した。【０１８８】
（ＰＣＲによるＲＬＣ遺伝子の増幅）
上記ラクトバシラス  パラカゼイ  サブエスピー  パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＪＣＭ１１８１の培養液から、Ａｕｓｕｂｅｌ等の方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ, １９８７）に記載の方法に従って染色体ＤＮＡを抽出した。得られた染色体ＤＮＡを鋳型に、上記で合成したプライマー５および７を用いてＰＣＲを行った。その結果、遺伝子の一部と考えられる約２００ｂｐのＤＮＡ断片を取得した。さらに、プライマー６および８を用いてＰＣＲを行った。その結果、遺伝子の一部と考えられる約１８００ｂｐのＤＮＡ断片を取得した。ついで、上記ＰＣＲ断片２種類をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）の取り扱い説明書に従い精製し、混合してＰＣＲを実施した。その結果、全長遺伝子に制限酵素部位を付加し、ＮｄｅＩ部位を破壊したと考えられる約２０００ｂｐのＤＮＡ断片を取得した。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴａＫａＲａ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。
このＤＮＡ断片を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）およびＡＢＩ  ３１００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてその塩基配列を決定した。その塩基配列を配列表の配列番号１２に示した。【０１８９】
（実施例１４）ＲＬＣ遺伝子を含む組換えプラスミドの作製
実施例１３で得たＰＣＲ断片を鋳型とし、前記プライマー５（配列表の配列番号８）とプライマー６（配列表の配列番号９）を用いてＰＣＲを行い、ＲＬＣ遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加し、終始コドンの直後にＫｐｎＩ部位を付加し、かつＲＬＣ遺伝子内部のＮｄｅＩ部位を破壊した二本鎖ＤＮＡを取得した。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このＤＮＡをＮｄｅＩ及びＫｐｎＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＫｐｎＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＴＬＣを得た。【０１９０】
（実施例１５）ＲＬＣを発現する組換え大腸菌の作製
実施例１４で作成した組換えプラスミドｐＮＴＬＣを用いて、大腸菌  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え大腸菌Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＬＣ）を得た。【０１９１】
上記の形質転換体Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＬＣ）を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ＹＴ培地（組成：１６ｇ／Ｌ  トリプトン（ベクトン  ディッキンソン社製）、１０ｇ／Ｌ  イーストエキス（ベクトン  ディッキンソン社製）、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ７．０））で培養し、集菌後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。【０１９２】
この無細胞抽出液を、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、２−ケトグルタル酸を終濃度２０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＨを終濃度０．２５ｍＭとなるよう調製した溶液に添加し、３０℃で１分間反応を行った際の、当該反応液の波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から算出した。本反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨをＮＡＤ+に酸化する活性を、１Ｕと定義した。【０１９３】
その結果、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＬＣ）の無細胞抽出液では、３０Ｕ／ｍｌの活性が見られた。【０１９４】
（実施例１６）製造方法Ｉによる光学活性１−ベンジル−３−アミノピロリジンの製造
Ｌ−グルタミン酸と１−ベンジル−３−ピロリジノンを基質として（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンとを生成するアミノ基転移反応を触媒する活性を調べた。【０１９５】
反応（１）
実施例５で得たＴＡＴポリペプチド無細胞抽出液を最終濃度がＴＡＴ５Ｕ／ｍＬになるよう調製し、この酵素液に最終濃度が下記基質溶液組成１となるように各試薬を添加した。３０℃で２時間反応させた後、反応液を下記条件のＨＰＬＣにて分析した。【０１９６】
反応（２）
実施例５で得たＴＡＴポリペプチド無細胞抽出液、実施例１５で得たＲＬＣ酵素無細胞抽出液と市販グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）を最終濃度がＴＡＴ５Ｕ／ｍＬ、ＲＬＣ２Ｕ／ｍＬ、市販グルコース脱水素酵素８Ｕ／ｍＬとなるように混合し、この酵素液に、最終濃度が下記基質溶液組成２となるように各試薬を添加した。３０℃で２時間反応させた後、反応液を下記条件のＨＰＬＣにて分析した。【０１９７】
その結果を、反応（１）で生成した（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジン量を１００とした相対生成量として表５に示す。表５に示すように、ＴＡＴポリペプチドにＲＬＣ酵素とグルタミン酸脱水素酵素を共役させた場合（反応（２））では、反応（１）の約２倍の生成量を示した。【０１９８】
［基質溶液組成１］
１−ベンジル−３−ピロリジノン            ５７ｍＭ
Ｌ−グルタミン酸ナトリウム              １７１ｍＭ
ピリドキサルリン酸                      ０．５ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）        ０．１Ｍ
［基質溶液組成２］
１−ベンジル−３−ピロリジノン            ５７ｍＭ
Ｌ−グルタミン酸ナトリウム              １７１ｍＭ
Ｄ−グルコース                            ５７ｍＭ
ＮＡＤＨ                                ０．６ｍＭ
ピリドキサルリン酸                      ０．５ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）        ０．１Ｍ【０１９９】
［高速液体クロマトグラフィーによる測定条件］
＜定量分析＞
カラム：Ｆｉｎｅｐａｋ  ＳＩＬ  Ｃ１８−Ｔ  （日本分光社製）
溶離液：蒸留水  ９４５ｍＬ／アセトニトリル  ５５５ｍＬ／ＫＨ２ＰＯ４  ７．５ｇ／ＳＤＳ  ２．１６ｇ（Ｈ３ＰＯ４でｐＨ３．６に調製）
流速：１ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：４０℃
【表５】
2012043653.tif 000010
【０２００】
（実施例１７）製造方法Ｉによる光学活性１−ベンジル−３−アミノピロリジンの製造２
実施例４で得たＥ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＴＡＴ）株を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ７．０）で培養し、集菌した。また、実施例１５で得たＥ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＬＣ）株を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ７．０）で培養し、集菌した。【０２０１】
基質である１−ベンジル−３−ピロリジノン１５０ｍｇ、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム１．６ｇ、Ｄ−グルコース１５０ｍｇ、ＮＡＤＨ６ｍｇを入れたフラスコに、上記菌体懸濁液と市販グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）を最終濃度がＴＡＴ５Ｕ／ｍＬ、ＲＬＣ２Ｕ／ｍＬ、市販グルコース脱水素酵素８Ｕ／ｍＬとなるように混合し、ピリドキサルリン酸２ｍｇ、１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１．５ｍＬを入れて、脱イオン水を加えて全体積を３０ｍＬとした。これを、３０℃で、水酸化ナトリウムでｐＨ７．５に調整しながら２４時間攪拌しながら反応させた。反応終了後、反応液をＨＰＬＣにて下記条件で分析した。【０２０２】
その結果、１−ベンジル−３−アミノピロリジンが変換率３６％で生成していた。その立体配置は（Ｓ）体で光学純度は９９％ｅ．ｅ．であった。【０２０３】
［高速液体クロマトグラフィーによる定量分析条件］
＜定量分析＞
カラム：Ｆｉｎｅｐａｋ  ＳＩＬ  Ｃ１８−Ｔ  （日本分光社製）
溶離液：蒸留水  ９４５ｍＬ／アセトニトリル  ５５５ｍＬ／ＫＨ２ＰＯ４  ７．５ｇ／ＳＤＳ  ２．１６ｇ（Ｈ３ＰＯ４でｐＨ３．６に調製）
流速：１ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：４０℃
＜光学純度分析＞
反応液を適量の炭酸ナトリウムで塩基性にしたのち、ジニトロベンゾイルクロライドで誘導体化した後、以下の条件で分析した。【０２０４】
カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＩＡ（ダイセル化学工業社製）
溶離液：ヘキサン／エタノール／ジエチルアミン／アセトニトリル＝８００／２００／１／５（体積比）
流速：０．８ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：３０℃【０２０５】
（実施例１８）製造方法Ｉによる光学活性１−ベンジル−３−アミノピロリジンの製造３
実施例４で得たＥ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＴＴＡＴ）２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ７．０）で培養し、集菌した。【０２０６】
基質である１−ベンジル−３−ピロリジノン１５０ｍｇ、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム１．６ｇ、リン酸二アンモニウム１１０ｍｇ、Ｄ−グルコース１５０ｍｇ、ＮＡＤＨ  ６ｍｇを入れたフラスコに、上記菌体懸濁液を最終濃度がＴＡＴ５Ｕ／ｍＬ、市販グルタミン酸脱水素酵素（ｍｐｂｉｏ社）２Ｕ／ｍＬ、市販グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）３Ｕ／ｍＬとなるように混合し、ピリドキサルリン酸２ｍｇ、１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１．５ｍＬを入れて、脱イオン水を加えて全体積を３０ｍＬとした。これを、３０℃で、水酸化ナトリウムでｐＨ７．５に調整しながら２４時間攪拌しながら反応させた。反応終了後、反応液をＨＰＬＣにて下記条件で分析した。【０２０７】
その結果、１−ベンジル−３−アミノピロリジンが変換率３５％で生成していた。その立体配置は（Ｓ）体で光学純度は９９％ｅ．ｅ．であった。【０２０８】
［高速液体クロマトグラフィーによる定量分析条件］
＜定量分析＞
カラム：Ｆｉｎｅｐａｋ  ＳＩＬ  Ｃ１８−Ｔ  （日本分光社製）
溶離液：蒸留水  ９４５ｍＬ／アセトニトリル  ５５５ｍＬ／ＫＨ２ＰＯ４  ７．５ｇ／ＳＤＳ  ２．１６ｇ（Ｈ３ＰＯ４でｐＨ３．６に調製）
流速：１ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：４０℃
＜光学純度分析＞
反応液を適量の炭酸ナトリウムで塩基性にしたのち、ジニトロベンゾイルクロライドで誘導体化した後、以下の条件で分析した。【０２０９】
カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＩＡ（ダイセル化学工業社製）
溶離液：ヘキサン／エタノール／ジエチルアミン／アセトニトリル＝８００／２００／１／５（体積比）
流速：０．８ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：３０℃
本明細書で引用した全ての刊行物、特許、及び特許出願をそのまま参考として本明細書に取り入れるものとする。
【配列表】
2012043653000001.app
【国際調査報告】
2012043653.tif 000017
2012043653.tif 000018
2012043653.tif 000019
2012043653.tif 000020