(57)【要約】核酸増幅法によって増幅された多重鎖核酸を、特殊な装置を必要とすることなく、簡便かつ高精度に核酸を検出する方法、および核酸検出デバイスを提供する。発色性のロイコ型色素と多重鎖核酸との接触で生じる呈色反応を利用して、核酸を可視光で検出する方法、および該方法に用いる核酸検出デバイスを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
発色性のロイコ型色素を多重鎖核酸と接触させる工程を含み、
ロイコ型色素と多重鎖核酸との相互作用によって呈する色調を可視光で検出することを特徴とする多重鎖核酸の検出方法。
【請求項２】
ロイコ型色素が、一般式（Ｉ）：
【化１】
2012039422.tif 000012
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に置換又は無置換のアリール基を表す。Ｌは、−ＳＯ３Ｒ４、−ＮＯ３、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｘ、−ＮＨＲ５、−Ｎ（ＣＯＲ６）（ＣＯＲ７）、−ＳＲ８、−ＳＳＲ９、−ＯＲ１０、−ＮＨＳＮＨ２、−ＯＨ、又は、−Ｈを表す。ここで、Ｒ４はアルカリ金属又は水素原子を表す。Ｘはハロゲン原子を表す。Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、アルキル基、アリール基、アシル基、アルケニル基、又はアルキニル基を表す。）
で表される化合物であって、
ロイコ型色素と多重鎖核酸との相互作用によってロイコ型色素の脱離基が解離し、脱離基の解離によって可視光で検出可能な色調を呈することを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記一般式（Ｉ）で表される化合物が、
一般式（ＩＩ）：
【化２】
2012039422.tif 000013
（式中、Ｌは前記と同じ。Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、置換又は無置換のアリール基を表す。Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６及びＲ１７は、それぞれ独立に、ハロゲン原子、カルボキシル基、スルホ基、ニトロ基、シアノ基、アミド基、アミノ基、アルキル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルキルアミノ基、アリールアミノ基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルスルホニル基、又はアリールスルホニル基を表す。）
で表される化合物であることを特徴とする請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
ロイコ型色素が、トリアリールメタン系色素と求核剤との反応物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の検出方法。
【請求項５】
トリアリールメタン系色素が、ゲンチアナバイオレット、クリスタルバイオレット、メチルグリーン、マラカイトグリーン、ビクトリアブルー、パラロザニリン及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる１以上の色素である請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
求核剤が、亜硫酸イオン、亜硫酸水素イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、シアニドイオン、ハロゲン化物イオン、窒素求核剤、硫黄求核剤、アルカリ金属アルコキシド、アルカリ金属水酸化物、及びヒドリド求核剤からなる群から選ばれる１以上の求核剤である、請求項４又は５に記載の検出方法。
【請求項７】
（ｄ）ロイコ型色素を保持する担体、
（ｅ）検体が担体（ｄ）を通過する経路、及び
（ｆ）検体とロイコ型色素との相互作用によって呈する色調を可視光で検出し、多重鎖核酸の存在を判定する部位、
を有する、多重鎖核酸検出デバイス又はキット。
【請求項８】
ロイコ型色素が一般式（Ｉ）：
【化３】
2012039422.tif 000014
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、置換又は無置換のアリール基を表す。Ｌは、−ＳＯ３Ｒ４、−ＮＯ３、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｘ、−ＮＨＲ５、−Ｎ（ＣＯＲ６）（ＣＯＲ７）、−ＳＲ８、−ＳＳＲ９、−ＯＲ１０、−ＮＨＳＮＨ２、−ＯＨ、又は、−Ｈを表す。ここで、Ｒ４はアルカリ金属又は水素原子を表す。Ｘはハロゲン原子を表す。Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、アルキル基、アリール基、アシル基、アルケニル基、又はアルキニル基を表す。）
で表される化合物であって、
ロイコ型色素と多重鎖核酸との相互作用によってロイコ型色素の脱離基が解離し、脱離基の解離によって可視光で検出可能な色調を呈することを特徴とする請求項７に記載のデバイス又はキット。
【請求項９】
担体（ｄ）が、トリアリールメタン系色素と求核剤との混合液を保持することを特徴とする、請求項７又は８に記載のデバイス又はキット。
【請求項１０】
トリアリールメタン色素が、ゲンチアナバイオレット、クリスタルバイオレット、メチルグリーン、マラカイトグリーン、ビクトリアブルー、パラロザニリン及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる１以上の色素である請求項９に記載のデバイス又はキット。
【請求項１１】
求核剤が、亜硫酸イオン、亜硫酸水素イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、シアニドイオン、ハロゲン化物イオン、窒素求核剤、硫黄求核剤、アルカリ金属アルコキシド、アルカリ金属水酸化物、及びヒドリド求核剤からなる群から選ばれる１つ以上の求核剤である、請求項９又は１０に記載のデバイス又はキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多重鎖核酸の検出方法、及び、多重鎖核酸検出デバイス又はキットの技術分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学の研究分野、遺伝子検査等の臨床応用分野において、ターゲット核酸を特異的に増幅する方法は非常に重要な技術となっている。【０００３】
核酸増幅法としては、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）が最も汎用されているが、複雑な温度制御が必要であるため、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（ｌｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）法などの等温増幅法も開発されている。【０００４】
ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法などにより増幅された核酸は二本鎖であり、検出法には蛍光色素を利用する方法が盛んに研究されている。【０００５】
最も一般的な方法は、増幅反応後の溶液をアガロース電気泳動にかけ、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ＢｒｏｍｉｄｅやＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎなどの蛍光性インターカレーターを結合させ、特異的な蛍光を観察する方法である（非特許文献１）。しかし、電気泳動後に蛍光性インターカレーターで検出する方法は、３０分〜１時間程度の泳動時間を要する上、蛍光を検出するためのＵＶ照射装置や蛍光検出器等の高価な機械が必要である。【０００６】
他のＤＮＡの混在の可能性が無く、増幅産物の有無のみを判別する場合には、ＰＣＲ開始前の反応液に予め、蛍光性インターカレーターを添加し、増幅反応後の蛍光検出を行うことで、電気泳動を省略することは可能である（特許文献１）。しかし、蛍光性インターカレーターはプライマー等の一本鎖核酸に結合するためバックグラウンドシグナルが増強され、検出感度の低下を招く問題がある。これに対し、一本鎖核酸と結合した蛍光性インターカレーターに優先的に反応する化合物で処理することで、バックグラウンドシグナルを低減する方法（特許文献２）、及び、一本鎖核酸と比べて二本鎖核酸との反応特異性を向上させた蛍光色素（特許文献３）が開発されているが、蛍光検出を行う点に変わりはない。【０００７】
あるいは、蛍光標識されたプライマーを用いて核酸増幅反応を行うことで、蛍光偏光で検出する方法（特許文献４）も開発されているが、蛍光プライマーは一般に高価であり、また、増幅産物に取り込まれなかった蛍光標識プライマーの分離操作が必要となるため煩雑であるなどの問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平５−２３７０００号公報
【特許文献２】国際公開第２００２／１０３０５３号
【特許文献３】特開２００３−２４０７８０号公報
【特許文献４】特開平９−１８７２７５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．１，６．１５（１９８９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、核酸増幅反応によって増幅された多重鎖核酸を、複雑な操作や特殊な装置を必要とせずに、簡便かつ迅速に可視光で検出する多重鎖核酸の検出方法、及び多重鎖核酸検出デバイス又はキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、多重鎖核酸を発色性のロイコ型色素と接触させることにより、ロイコ型色素の脱離基が解離して呈色し、核酸を可視光で検出できることを見出した。さらには、この原理を利用した多重鎖核酸検出デバイス又はキットの作製が可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１２】
すなわち、本発明は、発色性のロイコ型色素を多重鎖核酸と接触させる工程を含み、ロイコ型色素と多重鎖核酸との相互作用によって呈する色調を可視光で検出することを特徴とする多重鎖核酸の検出方法に関する。【００１３】
ロイコ型色素は、一般式（Ｉ）：
【化１】
2012039422.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に置換又は無置換のアリール基を表す。Ｌは、−ＳＯ３Ｒ４、−ＮＯ３、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｘ、−ＮＨＲ５、−Ｎ（ＣＯＲ６）（ＣＯＲ７）、−ＳＲ８、−ＳＳＲ９、−ＯＲ１０、−ＮＨＳＮＨ２、−ＯＨ、又は、−Ｈを表す。ここで、Ｒ４はアルカリ金属又は水素原子を表す。Ｘはハロゲン原子を表す。Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、アルキル基、アリール基、アシル基、アルケニル基、又はアルキニル基を表す。）で表される化合物であって、ロイコ型色素と多重鎖核酸との相互作用によってロイコ型色素の脱離基が解離し、脱離基の解離によって可視光で検出可能な色調を呈することが好ましい。【００１４】
前記一般式（Ｉ）で表される化合物は、
一般式（ＩＩ）：
【化２】
2012039422.tif 000003
（式中、Ｌは前記と同じ。Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、置換又は無置換のアリール基を表す。Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６及びＲ１７は、それぞれ独立に、ハロゲン原子、カルボキシル基、スルホ基、ニトロ基、シアノ基、アミド基、アミノ基、アルキル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルキルアミノ基、アリールアミノ基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルスルホニル基、又はアリールスルホニル基を表す。）で表される化合物であることが好ましい。【００１５】
ロイコ型色素は、トリアリールメタン系色素と求核剤との反応物であることが好ましい。【００１６】
トリアリールメタン系色素が、ゲンチアナバイオレット、クリスタルバイオレット、メチルグリーン、マラカイトグリーン、ビクトリアブルー、パラロザニリン及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる１以上の色素であることが好ましい。【００１７】
求核剤が、亜硫酸イオン、亜硫酸水素イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、シアニドイオン、ハロゲン化物イオン、窒素求核剤、硫黄求核剤、アルカリ金属アルコキシド、アルカリ金属水酸化物、及びヒドリド求核剤からなる群から選ばれる１以上の求核剤であることが好ましい。【００１８】
また、本発明は、（ｄ）ロイコ型色素を保持する担体、（ｅ）検体が担体（ｄ）を通過する経路、及び（ｆ）検体とロイコ型色素との相互作用によって呈する色調を可視光で検出し、多重鎖核酸の存在を判定する部位、を有する、多重鎖核酸検出デバイス又はキットに関する。【００１９】
ロイコ型色素は、一般式（Ｉ）：
【化３】
2012039422.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、置換又は無置換のアリール基を表す。Ｌは、−ＳＯ３Ｒ４、−ＮＯ３、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｘ、−ＮＨＲ５、−Ｎ（ＣＯＲ６）（ＣＯＲ７）、−ＳＲ８、−ＳＳＲ９、−ＯＲ１０、−ＮＨＳＮＨ２、−ＯＨ、又は、−Ｈを表す。ここで、Ｒ４はアルカリ金属又は水素原子を表す。Ｘはハロゲン原子を表す。Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、アルキル基、アリール基、アシル基、アルケニル基、又はアルキニル基を表す。）で表される化合物であって、ロイコ型色素と多重鎖核酸との相互作用によってロイコ型色素の脱離基が解離し、脱離基の解離によって可視光で検出可能な色調を呈することが好ましい。【００２０】
担体（ｄ）は、トリアリールメタン系色素と求核剤との混合液を保持することが好ましい。【００２１】
トリアリールメタン色素が、ゲンチアナバイオレット、クリスタルバイオレット、メチルグリーン、マラカイトグリーン、ビクトリアブルー、パラロザニリン及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる１以上の色素であることが好ましい。【００２２】
求核剤が、亜硫酸イオン、亜硫酸水素イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、シアニドイオン、ハロゲン化物イオン、窒素求核剤、硫黄求核剤、アルカリ金属アルコキシド、アルカリ金属水酸化物、及びヒドリド求核剤からなる群から選ばれる１つ以上の求核剤であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の方法によれば、特別な検出機器を使用することなく、多重鎖核酸とロイコ型色素との接触により生じる呈色反応によって、核酸合成又は増幅の有無を目視検出することができる。また、本発明に係る核酸検出デバイスは、多重鎖核酸を含む検体をデバイス上に添加するだけで、呈色反応により迅速に被験物質を目視検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の核酸検出用クロマト型デバイスの一例を示す概略図である。
【図２】本発明の核酸検出用フィルター型デバイスの一例を示す概略図である。
【図３】本発明の核酸検出用吸引型デバイスの一例を示す概略図である。
【図４】本発明の核酸検出用流路型デバイスの一例を示す概略図である。
【図５】本発明の核酸検出用チューブ型デバイスの一例を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明を詳細に記載する。
【００２６】
１．核酸の検出方法
本発明は、発色性のロイコ型色素を多重鎖核酸と接触させる工程を含み、ロイコ型色素と多重鎖核酸との相互作用によって呈する色調を可視光で検出することを特徴とする多重鎖核酸の検出方法に関する。
【００２７】
検出対象である多重鎖核酸には二本鎖核酸、三本鎖核酸、又は、四本鎖核酸などが含まれる。核酸としてはＤＮＡ又はＲＮＡのほか、これらの化学修飾体が数多く知られており、さらにＰＮＡと呼ばれるポリペプチド鎖を主鎖に有する核酸類縁体なども知られているが、多重鎖核酸にはこれらがすべて含まれる。より好ましく用いられる核酸は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッド鎖、及びＰＮＡなどの人工核酸の二本鎖などである。ただし、一本鎖核酸であっても、複数混在する等、色素による染色が可能である場合、上記の検出方法で確認することが可能となる。
【００２８】
発色性のロイコ型色素とは、ロイコ型色素であって顕色剤を反応させた際に発色状態となるものを意味する。ロイコ型色素とは無色又は淡色の色素であり、顕色剤との反応や、光等の物理刺激によりその構造を変化し色調の変化を示す色素を意味する。顕色剤としては、酸化剤やアルコールなどが知られているが、上記の検出方法では、多重鎖核酸が顕色剤として用いられる。
【００２９】
上記の検出方法では、多重鎖核酸に発色性のロイコ型色素を添加し、多重鎖核酸とロイコ型色素を接触させ相互作用させることにより色調の変化を示すことを検出原理としている。相互作用とは、多重鎖核酸との可逆的な結合により、ロイコ型色素に何らかの物理化学的な影響が生じることを意味する。
【００３０】
ロイコ型色素としては、一般式（Ｉ）：
【化４】
2012039422.tif 000005
で表される化合物であって、多重鎖核酸との相互作用によってロイコ型色素の脱離基が解離し、脱離基の解離によって可視光で検出可能な色調を生じる化合物が好ましい。
【００３１】
前記一般式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立して置換又は無置換のアリール基を表す。アリール基としては、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基等が挙げられる。これらアリール基は、更に、アミノ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、カルボニル基、カルボキシル基、スルホン酸基、アルキル基等の官能基、及び／又はハロゲン原子のような他の原子で置換されていてもよい。
【００３２】
Ｌは脱離基を表し、具体的には、−ＳＯ３Ｒ４、−ＮＯ３、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｘ、−ＮＨＲ５、−Ｎ（ＣＯＲ６）（ＣＯＲ７）、−ＳＲ８、−ＳＳＲ９、−ＯＲ１０、−ＮＨＳＮＨ２、−ＯＨ、又は、−Ｈを表す。
【００３３】
Ｒ４はアルカリ金属又は水素原子を表す。Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等のハロゲン原子を表す。Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、アルキル基、アリール基、アシル基、アルケニル基、アルキニル基を表し、これらの置換基はさらに、他の一般的な官能基や原子、例えばアミノ基などのヘテロ官能基やハロゲン原子等によって置換されていてもよい。
【００３４】
ロイコ型色素は、酸化還元などの反応により発色する色素であり、発色状態にある色素と求核剤との反応物であってもよい。例えば、トリアリールメタン系の発色状態にある色素に求核剤を反応させることで、ロイコ型色素に変換できる。この場合、単一のトリアリールメタン系色素を用いても、使用する求核剤を変えれば、異なる構造を有するロイコ型色素が得られる。
【００３５】
色素としては、酸化還元などの反応により発色し、多重鎖核酸との相互作用により可視光で検出可能な色調を呈するものあれば特に制限はないが、トリアリールメタン系色素、キサンテン系色素、キノリン系色素、フェノチアジン系色素、フェノキサジン系色素及びこれらの混合物が挙げられる。この中でも、トリアリールメタン系色素であることが好ましい。
【００３６】
トリアリールメタン系色素としては、一般式（ＩＩ）：
【化５】
2012039422.tif 000006
で表される化合物であることがより好ましい。式中、Ｌは前記と同様である。Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、置換又は無置換アリール基を表す。
【００３７】
置換アリール基とは、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アルコキシ基、ハロゲン原子で置換されたアルコキシ基、アリール基で置換されたアルコキシ基、アリールオキシ基、アルキル基、ハロゲン原子で置換されたアルキル基、ヒドロキシ基で置換されたアルキル基、カルボキシ基のエステルで置換されたアルキル基、シアノ基で置換されたアルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、複素環基、アミノ基、アルキルアミノ基、アリールアミノ基、アルキルスルホニル基で置換されたアミノ基、アシル基で置換されたアミノ基、メルカプト基、アルキルチオ基、ハロゲン原子で置換されたアルキルチオ基、アリールチオ基、カルボキシ基又はそのエステル若しくはそのアミド、カルボニル基（オキソ基）、ホルミル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基、チオカルボニル基（チオキソ基）、シアノ基、ニトロ基、スルホン酸基、アルキルスルホニル基、ハロゲン原子で置換されたアルキルスルホニル基、及びアリールスルホニル基から選択される１又は複数の基を置換基として有するアリール基を示す。
【００３８】
Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６及びＲ１７は、それぞれ独立に、例えば、ハロゲン原子、カルボキシル基、スルホ基、ニトロ基、シアノ基、アミド基、アミノ基、アルキル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルキルアミノ基、アリールアミノ基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基等を表す。
【００３９】
当該色素は、多重鎖核酸との相互作用により反応式（ＩＩＩ）：
【化６】
2012039422.tif 000007
で表される機構で呈色すると考えられるが、呈色機構は特に限定されるものではない。
【００４０】
トリアリールメタン系色素の具体例としては、メチルグリーン、マラカイトグリーン、クリスタルバイオレット、パラロザニリン、ゲンチアナバイオレットＢ、ゲンチアナバイオレットＲ、ナイトブルー、ビクトリアブルーＢ、ビクトリアブルーＲなどのロイコ型誘導体が挙げられる。この中でも、クリスタルバイオレット、ゲンチアナバイオレット、メチルグリーン、マラカイトグリーンが好ましく、クリスタルバイオレット、ゲンチアナバイオレットがより好ましい。
【００４１】
トリアリールメタン系色素の他に、キノリン系色素である４−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）キノリン、フェノチアジン系色素であるフェノチアジン、ベンゾイルロイコメチレンブルー、フェノキサジン系色素であるフェノキサジンなどのロイコ型誘導体が挙げられる。ただし、多重鎖核酸と接触し発色すればこれらの色素に限定されない。
【００４２】
発色状態にある色素と反応し、ロイコ型色素に変換させる求核剤としては、例えば、亜硫酸ナトリウム等の亜硫酸イオン含有物、亜硫酸水素ナトリウム等の亜硫酸水素イオン含有物、硝酸ナトリウム等の硝酸イオン含有物、亜硝酸ナトリウム等の亜硝酸イオン含有物、ナトリウムシアニド等のシアニドイオン含有物、ハロゲン化物イオン、窒素求核剤、硫黄求核剤、アルカリ金属アルコキシド、アルカリ金属水酸化物、ヒドリド求核剤等の求核剤が使用可能であるが、ロイコ型に変換可能であり、多重鎖核酸との相互作用により発色型に再変換可能であれば特に限定されない。
【００４３】
ハロゲン化物イオンとしては、例えば、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等が挙げられる。
【００４４】
窒素求核剤としては、例えば、アンモニア、メチルアミン、ｎ−プロピルアミン、ジメチルアミン、ベンジルアミン、Ｎ−メチルベンジルアミン、アニリン、ｎ−ヘプチルアミン、１−アミノデカン、１，３−ジアミノプロパンなどのアミン系求核剤；アセチルアミド等のアミド系求核剤；ジアセチルイミド、ジホルミルイミド、フタルイミド、フタルイミドの金属塩等のイミド系求核剤；ベンゼンスルホニルアミド、ｐ−ニトロベンゼンスルホニルアミド、ｏ−ニトロベンゼンスルホニルアミド、ｍ−ニトロベンゼンスルホニルアミド、ｐ−トルエンスルホニルアミド等のスルホニルアミド系求核剤等が挙げられる。
【００４５】
硫黄求核剤としては、例えば、チオール、ジスルフィド、又はチオ尿素が挙げられる。
【００４６】
アルカリ金属アルコキシドとしては、例えば、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム第３級ブトキシド等が挙げられる。
【００４７】
アルカリ金属水酸化物としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が挙げられる。
【００４８】
ヒドリド求核剤とは、求核剤として水素供与することができる試薬を意味し、例えば、トリアセトキシヒドロほう酸ナトリウム、水素化ほう素ナトリウム、テトラヒドロほう酸リチウム、ピリジンボラン錯体、テトラヒドロフランボラン錯体、２−ピコリンボラン錯体、硫化ジメチル−ボラン錯体、シアノ水素化ほう素ナトリウム、水素化トリエチルほう素リチウム、水素化リチウムアルミニウム、Ｒｅｄ−Ａｌ〔水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウム〕、Ｌ−Ｓｅｌｅｃｔｒｉｄｅ〔水素化トリ（ｓｅｃ−ブチル）ほう素リチウム〕、Ｋ−Ｓｅｌｅｃｔｒｉｄｅ〔水素化トリ（ｓｅｃ−ブチル）ほう素カリウム〕、ＤＩＢＡＬ−Ｈ（水素化ジイソブチルアルミニウム）等が挙げられる。
【００４９】
求核剤としては、具体的には、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ｎ−プロピルアミン、メルカプトエタノール、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが好ましく、亜硫酸ナトリウム、メルカプトエタノール、水酸化ナトリウムがより好ましい。
【００５０】
色素と求核剤との組み合わせとしては、クリスタルバイオレットと亜硫酸ナトリウム、ゲンチアナバイオレットと亜硫酸ナトリウム、クリスタルバイオレットと水酸化ナトリウム、メチルグリーンと２−メルカプトエタノール、メチルグリーンと亜硫酸ナトリウム、マラカイトグリーンと亜硫酸ナトリウムの組み合わせが好ましく、これらの中でも、クリスタルバイオレットと亜硫酸ナトリウム、ゲンチアナバイオレットと亜硫酸ナトリウム、メチルグリーンと亜硫酸ナトリウムの組み合わせがより好ましい。
【００５１】
発色性のロイコ型色素を多重鎖核酸と接触させる工程では、発色性のロイコ型色素が多重鎖核酸と接触して、両者に反応が生じれば、どのように接触させてもよい。
【００５２】
ロイコ型色素と多重鎖核酸との相互作用によって呈する色調の可視光下での検出では、紫外線のような、可視光ではない光を照射することなく、一般的な実験室における照明のような可視光下で色調を検出する。可視光であれば、紫外線照射する場合のように特別な装置が必要ではなく、簡便に検出することができる。
【００５３】
多重鎖核酸検出の最も簡単な方法は、ロイコ型色素と多重鎖核酸との接触による色調の変化を目視で観察することである。ここで、目視での観察とは、ロイコ型色素と多重鎖核酸が結合した場合の色調の変化、又は、多重鎖核酸と結合していないロイコ型色素の色調の変化を目視で観察することをいう。可視光下での色調の変化に基づき、多重鎖核酸の存在の有無を確認できる。
【００５４】
色調の変化とは、具体的には、可視光下で色の種類が変化すること（可視光波長）、又は、色の濃淡が変化すること（反射率）などが挙げられるが、可視光で検出できるものであればこれらに限定されない。色の種類の変化としては、例えば、赤紫色から水色への変化、及び黄色から赤紫色への変化が挙げられる。
【００５５】
また、試料溶液の可視光領域の吸光度を測定することによっても、核酸を検出することができる。ここで、可視光とは特に３８０ｎｍ〜８００ｎｍの波長の光を指す。測定波長は使用する色素によって適宜設定すればよい。また、吸光度測定により、試料中の核酸濃度を定量することも可能である。その他、色素と核酸による不溶性の沈殿物を生じる場合、フィルターやメンブレンを用いて検出してもよいし、遠心分離により沈殿を検出することも可能である。また、核酸の有無の判定を容易にするように他の色調の色素を混合しても良い。
【００５６】
上記の検出方法では、検体に含まれる多重鎖核酸を検出することができるが、検体は多重鎖核酸を含んでいれば特に限定されない。核酸増幅法の反応液だけでなく、微生物や動物細胞、或いは植物細胞からの抽出液でも構わないし、食品からの抽出液も好適に使用できる。
【００５７】
核酸増幅法としてはＰＣＲ法に代表される核酸配列を増幅させるものであればどのようなものでもかまわない。例えば、ＰＣＲ法以外に、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＣＰＴ（Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）法、Ｑ−Ｂｅｔａ  Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）法、及びＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）法等の公知の方法が例示できるが、これらに限定されるものではない。Ｑ−Ｂｅｔａ  Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ法、ＲＣＡ法、ＮＡＳＢＡ法、ＳＤＡ法、ＴＭＡ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法などは一定温度で増幅反応を行う方法であり、その他のＰＣＲ法やＬＣＲ法などは温度サイクリングで増幅反応を行うものである。また、ＲＮＡを逆転写酵素等によりＤＮＡに逆転写し、このＤＮＡを鋳型として上記の核酸増幅法を使用すれば間接的にＲＮＡを検出することが可能である。
【００５８】
核酸増幅法の増幅産物である多重鎖核酸を検出する際は、核酸増幅反応後の反応液にロイコ型色素を添加することが好ましいが、核酸増幅反応の前に、あらかじめロイコ型色素を反応液に添加してもよい。
【００５９】
また、ロイコ型色素は、多重鎖核酸を含む検体に単独で添加してもよいし、安定化剤との混合物の形で添加することも可能である。
【００６０】
安定化剤とは、ロイコ型色素が発色することを防ぐ化合物を意味し、例えば、還元剤やアミン、チオール化合物等であるが、発色を防止できればこれらに限定されない。安定化剤は単独で添加しても良いし、複数を組み合わせて添加しても良い。
【００６１】
さらに、ロイコ型色素は、多重鎖核酸を含む検体に直接添加しても良いし、発色状態にある色素を求核剤等で処理してロイコ型色素に変換後に添加しても良い。あるいは、発色状態にある色素と求核剤の混合物を添加してもよい。例えば、クリスタルバイオレットと亜硫酸ナトリウムとを混合してロイコ型に変換後、この混合液を用いて多重鎖核酸を目視検出可能である。発色状態にある色素と求核剤の混合液は、ロイコ型色素が不安定で単離困難である場合、特に有効な使用法となる。
【００６２】
核酸を含む検体へのロイコ型色素の添加量は、着色が確認できれば特に限定されるものではないが、終濃度は、通常１０％以下であり、好ましくは１％以下であり、さらに好ましくは０．１％以下である。
【００６３】
核酸検出後の着色した検体液は、他の分子生物学的な操作にそのまま使用することも可能である。そのような分子生物学的な操作には、制限酵素処理、シーケンス反応、ＰＣＲの様な酵素反応や、電気泳動による確認操作等が含まれる。
【００６４】
２．核酸検出デバイス及びキット
本発明は、また、（ｄ）ロイコ型色素を保持する担体、（ｅ）検体が担体（ｄ）を通過する経路、及び（ｆ）検体とロイコ型色素との相互作用によって呈する色調の変化を可視光で検出し、多重鎖核酸の存在を判定する部位を有する多重鎖核酸検出デバイス又はキットに関する。
【００６５】
ロイコ型色素を保持した担体（ｄ）の素材としては、色素を保持でき、核酸を含む検体が通過できるものであれば特に限定はない。好ましい具体例としては、不織布、濾紙、ガラスファイバー濾紙、ガラス繊維布、ガラスフィルター、ニトロセルロースフィルター、ポリエチレンやポリプロピレン等からなる多孔質材などが挙げられる。担体（ｄ）へのロイコ型色素の固定は、物理的吸着又は化学的結合等、公知の方法で行うことができる。物理的吸着としては、例えば、一定量の色素溶液に担体を含浸した後に乾燥する乾燥吸着等が挙げられる。
【００６６】
担体（ｄ）に保持されるロイコ型色素の量は、色調の変化を可視光で検出することが可能であれば特に制限されないが、核酸を含む検体との混合後の色素の終濃度が、好ましくは１０％以下であり、より好ましくは１％以下であり、さらに好ましくは０．１％以下である。
【００６７】
ロイコ型色素を保持する担体（ｄ）を検体が通過する際に、検体中に多重鎖核酸が含まれる場合、多重鎖核酸とロイコ型色素との相互作用により、ロイコ型色素から脱離基が解離して色調の変化が生じる。ここで、相互作用とは、例えば、ペプチド結合やジスルフィド結合のような共有結合、イオン結合、配位結合、ファンデルワールス結合、π−π相互作用のような非共有結合が挙げられるが、これに限定されない。
【００６８】
担体（ｄ）における多重鎖核酸とロイコ型色素との相互作用は、多重鎖核酸と担体との親和性や、担体の吸湿性によっても影響を受ける。したがって、これらの担体は、多重鎖核酸の非特異的吸着や、吸湿性を調整するために、表面を親水性重合体や界面活性剤で被覆したり、含浸させたりしてもよい。
【００６９】
検体が担体（ｄ）を通過する経路（ｅ）とは、本発明のデバイス又はキットにアプライされた検体が移動する経路のことをいう。経路とは、検体の移動が誘導されるようなものであれば特に限定されず、溝が形成されていても良いが、必ずしも必要ではない。経路（ｅ）は、担体（ｄ）及び判定部位（ｆ）と連結しており、検体は、経路（ｅ）に沿って、担体（ｄ）及び判定部位（ｆ）へ移動することができる。経路（ｅ）の素材としては、多重鎖核酸を含む検体が通過できるものであれば特に限定はない。
【００７０】
検体と色素との相互作用による色調の変化を可視光下で検出し、多重鎖核酸の存在を判定する判定部位（ｆ）とは、担体（ｄ）を通過した検体が経路（ｅ）を移動して到達する部位をいう。
【００７１】
判定部位（ｆ）における色調の変化を可視光で検出することにより、多重鎖核酸の有無をＵＶ照射装置や蛍光検出器等の特別な機器を使用することなく判定することができる。
【００７２】
判定部位（ｆ）の素材としては、多重鎖核酸を含む検体が通過又は吸収され得るものであれば特に限定はない。好ましい具体例としては、不織布、濾紙、ガラスファイバー濾紙、ガラス繊維布、ガラスフィルター、ニトロセルロースフィルター、ポリエチレンやポリプロピレン等からなる多孔質材などが挙げられる。これらの素材は、適度な吸湿速度を有するとともに、多重鎖核酸が着色して発色した際の目視確認性に優れるなどの利点を有する。
【００７３】
さらに、多重鎖核酸の量に応じた呈色の度合いを示す対比表を作成すれば、検体中の多重鎖核酸濃度を推定することも可能である。また、濃度を規定した標準核酸を用いて検量線を作成しておけば、分光光度計や色差計、反射計等の汎用的な分析機器を使用して、試料中の多重鎖核酸量を定量することも可能である。
【００７４】
多重鎖核酸検出デバイス又はキットへの、検体のアプライ方法には特に制限はないが、検体は、例えば滴下や浸漬、又は吸引や遠心でアプライされる。また、検体の添加後、別途溶媒で展開することも可能である。溶媒で展開する場合、使用する溶媒は色素の色調に影響を与えるものでなければ特に限定されるものではないが、水や緩衝液などが挙げられる。本発明の多重鎖核酸検出デバイス又はキットには試料添加部位を別に設けてもよい。また、検体を、ロイコ型色素を保持した担体（ｄ）に直接アプライすることも可能である。
【００７５】
なお、上記の担体（ｄ）にはロイコ型色素を単独で保持させても良いし、ロイコ型色素と安定化剤とを保持させることもできる。安定化剤としてはアミン、チオール、還元剤等が使用できるが、ロイコ型色素の自然発色を抑制できればこれに限定されない。さらに、ロイコ型色素を直接担体に保持させるのではなく、発色状態にある色素と反応してロイコ型に変化させる化合物を混合し担体に共存させることも可能である。発色状態にある色素と反応してロイコ型に変化させる化合物としては、亜硫酸イオン、亜硫酸水素イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、シアニドイオン、ハロゲン化物イオン、窒素求核剤、硫黄求核剤、アルカリ金属アルコキシド、アルカリ金属水酸化物、ヒドリド求核剤等の求核剤が挙げられるが、これらに限定されない。また、担体（ｄ）の下流及び／又は上流側に安定化剤や他種の色素を保持した担体を配置することも出来る。この場合、担体（ｄ）と（ｅ）とは、互いに接触していてもよいし、非接触であってもよい。また、両担体の中間及び／又はその前後に別の担体を配置することもできる。さらに必要であれば検体をアプライする領域や呈色を判定する領域等を別に備えることも可能である。
【００７６】
担体を配置するための基材となる部材は、担体を保持できるものであれば特に限定されず、例えばプラスチック、紙、ガラスなどの材質を用いることができる。また、表面に粘着性を有していてもよい。
【００７７】
上記の多重鎖核酸検出デバイス又はキットによれば、多重鎖核酸とロイコ型色素との反応による発色により、多重鎖核酸を迅速かつ簡便に検出することが可能である。
【００７８】
本態様における多重鎖酸検出デバイス又はキットの形態の具体例を、図１〜４に示す。
【００７９】
図１には、クロマト型多重鎖核酸検出デバイスを示す。この検出デバイスは、ロイコ型色素を保持した担体１、試料添加部位２、判定部位３を基材となる部材４の上に、粘着剤等を用いて張り合わせたものである。
【００８０】
図２には、フィルター型多重鎖核酸検出デバイスを示す。図２のデバイスでは、検体は支持体５の内部にアプライされ、担体１に保持されたロイコ型色素に接触しながら、検体収容容器６に収容される。上記構成によれば、検体収容容器６に収容された検体溶液の色調により、検体に含まれる多重鎖核酸の有無又は量を判定することができる。検体のフィルター型担体中の通過を、遠心や、加圧等によって行えば、非常に迅速にかつ簡便に多重鎖核酸の有無又は量を判定できる。
【００８１】
図３には、吸引型多重鎖核酸検出デバイスを示す。図３に示した検出デバイスは、ロイコ型色素を保持した担体１、及び、吸引用具からなる支持体７により構成される。図３では、吸引用具からなる支持体としてマイクロピペット用のチップを例示しており、この場合には上部口にマイクロピペッターを装着して吸引口から検体を吸引する。本形態はマイクロピペット用のチップに限定されるものではなく、パスツールピペットや、駒込ピペットなどのピペット類、キャピラリー、注射器等が好適に使用できる。この構成によれば、それぞれの担体を備える吸引用具を使用して検体を吸引することにより、多重鎖核酸の有無を、色素の色調によって、極めて迅速かつ簡便に目視検出することが可能である。
【００８２】
図４には、流路型多重鎖核酸検出デバイスを示す。図４に示した流路型デバイスは、ロイコ型色素を保持した担体１が流路を切ったチップ８に配置されることを特徴とする。このチップには、核酸精製や核酸増幅などを目的とした仕組みが備わっていてもよい。本形態の検出デバイスにおいて、試料添加部位９にアプライされた検体は、流路１０を移動して担体１を通過し、最後に判定部位１４に到達する。多重鎖核酸の有無又は量は、判定部位１４における呈色を可視光下で観察し、目視で判定することにより、判断できる。なお、流路１０の形状は特に限定されず、例えば直線や曲線であってもよい。図４に示すように、チップ８の上に流路と担体の複数の組み合わせを保持し、流路の長さにより、検体が判定部位１４に到達するまでの流路１０の通過時間に差をつける工夫をすることも可能である。チップ８が核酸増幅を目的とする仕組みを有する場合、検体の通過時間の差により核酸の増幅量に差をつけ、段階的な核酸の増幅、及びその産物の検出を行うことができる。
【００８３】
３．核酸検出デバイス及びキット
本発明は、また、（ｇ）ロイコ型色素を保持し、外力により開口し、ロイコ型色素を放出する開口部を備えた担体、（ｈ）放出されたロイコ型色素を判定部位へ導く経路、及び（ｉ）導入された検体を保持し、担体（ｇ）から経路（ｈ）を経由して導入されたロイコ型色素と保持された検体との反応により生じる色調の変化を可視光で検出し、多重鎖核酸の存在を判定する判定部位を有する多重鎖核酸検出デバイス又はキットに関する。
【００８４】
ロイコ型色素を保持し、外力により開口し、ロイコ型色素を放出する開口部を備えた担体（ｇ）の素材としては、ロイコ型色素を一定期間安定に保持できるものであれば特に限定されない。担体（ｇ）にはロイコ型色素が充填されており、ロイコ型色素を放出する開口部は通常は閉じられており、外力により担体（ｇ）が開口した場合にのみロイコ型色素が放出される。ここで、外力とは、担体の開口を可能とするものであれば特に限定されず、例えば指による押し下げや、機械による押し下げが挙げられる。外力による開口の態様は、ロイコ型色素を放出できれば特に限定されないが、例えば、ロイコ型色素を保持する膜の破壊が挙げられる。本態様のデバイス又はキットは、担体（ｇ）の開口を容易にするために針状構造を備えていてもよい。
【００８５】
放出されたロイコ型色素を判定部位へ導く経路（ｈ）とは、上記担体（ｇ）から放出されたロイコ型色素が通過する経路のことをいう。経路（ｈ）の形状・材質は、ロイコ型色素が通過できるものであれば特に限定されない。例えば、放出されたロイコ型色素が、重力により落下して判定部位（ｉ）に到達する場合には、経路（ｈ）はロイコ型色素の落下を阻害しないものであればよい。
【００８６】
導入された検体を保持し、担体（ｇ）から経路（ｈ）を経由して導入されたロイコ型色素と保持された検体との反応により生じた物質を可視光下で観察し、多重鎖核酸の存在を目視で判定する判定部位（ｉ）は、本発明の第一の態様に係る多重鎖核酸の検出デバイス又はキットで説明したとおりである。
【００８７】
本態様における多重鎖核酸検出デバイスの形態の具体例を、図５に示す。
【００８８】
図５には、チューブ型多重鎖核酸検出デバイスを示す。このチューブ型デバイスには、外部からの物理的作用により核酸溶液に色素を添加させる仕組みを持つものも含まれる。例えば、図５においてチューブ１３の蓋部分に、膜によってロイコ型色素１１を保持し、蓋に仕込まれた針状構造１２を介して、例えば指で押すなどの外部からの物理的作用により膜を破ることによってロイコ型色素１１をチューブ下部に滴下し、チューブ下部の検体に含まれる多重鎖核酸を染色することができる。
【００８９】
本発明において、多重鎖核酸検出キットとは、多重鎖核酸を特異的に発色するロイコ型色素を含む溶液からなる検出用ユニットに加え、各種試薬や器具等を備えた形態を指す。上述のデバイスをさらに加えたものもキットとみなす。前記各種試薬には目的核酸を増幅するためのプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、核酸増幅反応に用いられる緩衝液や制限酵素等が含まれる。
【００９０】
これらのデバイスを使用して得られた、多重鎖核酸を含む着色した検体を、他の分子生物学的な操作にそのまま使用することも可能である。そのような分子生物学的な操作には、制限酵素処理、シーケンス反応、ＰＣＲの様な酵素反応や、電気泳動による確認操作等が含まれる。
【００９１】
また、検体を自動的に処理し、塩基配列等を解析する装置に本発明の多重鎖核酸検出デバイスを組み込むことも可能である。例えば、核酸精製・増幅装置に本発明の核酸検出デバイスを組み込むことによって核酸の有無を判定したり、ＤＮＡ自動解析装置に組み込むことによって、確実にＰＣＲで増幅・ラベルされたサンプルのみを選別し、解析を行ったりすることも可能である。
【実施例】
【００９２】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。【００９３】
（実施例１）ロイコ型色素（１）を用いたＰＣＲ産物の検出
（ｉ）ロイコ型色素（１）の合成
クリスタルバイオレット５００ｍｇを水に溶解後、ｎ−プロピルアミン２００ｍｇを添加し、３０分撹拌した。生じた沈殿を乾燥し、ロイコ型色素（１）（１，１−ｔｒｉｓ（４−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）−Ｎ−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ）４５０ｍｇを得た。【００９４】
（ｉｉ）ＰＣＲ産物の調製
鋳型としてｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）を用い、ＰＣＲ増幅により約３３０塩基対が増幅するように以下のプライマーＦ：５’−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡ−３’及びプライマーＲ：５’−ＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧ−３’を設計した。プライマーＦとプライマーＲを各１５ｐｍｏｌと、１０ｎｇのｐＵＣ１９とを０．２ｍｌのＰＣＲ用チューブに入れ、ＥｘＴａｑ  ＰＣＲキット（タカラバイオ社製）の説明書に従い、１００μｌのＰＣＲ反応液を調製した。その後、チューブをサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製））にセットし、９５℃で５分間熱処理後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを３５回行い、目的の約３３０ｂｐの増幅を行い、ポジティブコントロールとした。また、ＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを添加しないで同様の反応を行い、ネガティブコントロールとした。【００９５】
（ｉｉｉ）ＰＣＲ産物の検出
ポジティブコントロール、及びネガティブコントロール５０μｌに、上記で合成したロイコ型色素（１）２μｇを添加し色調変化の観察及び、吸光度（Ａ５９０ｎｍ）の測定を行った。その結果を表１に示した。【００９６】
（比較例１）
ロイコ型色素のかわりにゲンチアナバイオレットを使用した以外は実施例１と同様の方法でＰＣＲ産物の検出を行った。その結果を表１に示した。【００９７】
（実施例２）ロイコ型色素（１）を用いたＬＡＭＰ産物の検出
（ｉ）ＬＡＭＰ法産物の調製
「Ｌｏｏｐａｍｐ（Ｒ）サルモネラ検出試薬キット」（栄研化学社製）を使用し、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応液を調製した。１０μｌのＣｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡ  Ｓａｌと４０μｌのマスターＭｉｘ（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ．ＳａｌとＢｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを容量比で２０：１の割合で別途混合したもの）を混合し、６５℃で１時間反応後、さらに、８０℃で２０分反応することで、核酸が増幅された反応液（ポジティブコントロール）を調製した。また、１０μｌのＣｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡ  Ｓａｌと４０μｌのＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ．Ｓａｌを混合し、６５℃で１時間反応後、さらに、８０℃で２０分反応することで、核酸が増幅されていない反応液（ネガティブコントロール）を調製した。【００９８】
（ｉｉ）ＬＡＭＰ法産物の検出
検体としてＬＡＭＰ法産物を使用した以外は、実施例１と同様に行った。その結果を表１に示した。【００９９】
【表１】
2012039422.tif 000008
【０１００】
実施例１において、ＰＣＲによる核酸増幅が有るポジティブコントロールの場合は、ロイコ型色素の添加後すぐに青紫色に変化した。一方、ＰＣＲによる核酸増幅が無いネガティブコントロールの場合、ロイコ型色素の添加による着色が認められず、核酸増幅の有無を目視にて容易に判別することが可能であった。また、色素による検出に要した時間は１分以内であった。【０１０１】
比較例１では、核酸増幅の有無にかかわらず青紫色を呈してしまい、核酸の有無を判定することは困難であった。【０１０２】
実施例２において、ＬＡＭＰ法による核酸増幅が有るポジティブコントロールの場合は、ロイコ型色素の添加後すぐに青紫色に変化した。一方、ＬＡＭＰ法による核酸増幅が無いネガティブコントロールの場合、ロイコ型色素の添加による着色が認められず、核酸増幅の有無を目視にて容易に判別することが可能であった。また、色素による検出に要した時間は１分以内であった。【０１０３】
（実施例３）メチルグリーンを用いた多重鎖核酸の検出
０．２％メチルグリーン水溶液１００μｌと２−メルカプトエタノール５０μｌを混合し、室温で１０分間反応した。実施例１及び２と同様の方法で、ＰＣＲ産物及びＬＡＭＰ法産物を調製した。それぞれの核酸増幅産物のポジティブコントロール、及びネガティブコントロール５０μｌに、上記の混合液２μｌを添加し、色調変化の観察を行った。その結果を表２に示した。【０１０４】
【表２】
2012039422.tif 000009
【０１０５】
ＰＣＲ、ＬＡＭＰ法による核酸増幅が有るポジティブコントロールの場合は、メチルグリーンと２−メルカプトエタノールからなる混合液を添加後すぐに青緑色に変化した。一方、核酸増幅が無いネガティブコントロールの場合、混合液の添加による着色が認められず、核酸増幅の有無を目視にて容易に判別することが可能であった。また、色素による検出に要した時間は１分以内であった。【０１０６】
（実施例４）ゲンチアナバイオレットＢを用いた多重鎖核酸の検出
０．２％ゲンチアナバイオレットＢの５０％エタノール溶液と、６％亜硫酸ナトリウム水溶液を等容量ずつ混合した。ＰＣＲ反応液とＬＡＭＰ法反応液を実施例１及び２と同様の方法で調製した。それぞれの核酸増幅産物のポジティブコントロール、及びネガティブコントロール５０μｌに、上記で調製した混合液１μｌを添加後の色調変化の観察を行った。その後、５９０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を表３に示した。【０１０７】
【表３】
2012039422.tif 000010
【０１０８】
ＰＣＲ及びＬＡＭＰ法による核酸増幅が有るポジティブコントロールの場合は、混合液の添加後すぐに青紫色に変化した。一方、核酸増幅が無いネガティブコントロールの場合、混合液の添加による着色が認められず、核酸増幅の有無を目視にて容易に判別することが可能であった。また、色素による検出に要した時間は１分以内であった。【０１０９】
（実施例５）吸引型デバイスの作製
実施例１で合成したロイコ型色素（１）の０．２％溶液を調製し、この溶液１μｌを円形に打ち抜いた多孔質ポリエチレンシート（気孔径５０μｍ、厚さ１．５ｍｍ、直径１．５ｍｍ）に含浸した。これを室温で乾燥させて、色素を保持した担体とした。前記担体を、図３に示したように、２００μｌ用のピペットチップの先端に充填し、吸引型デバイスを作製した。【０１１０】
（実施例６）吸引型デバイスによる多重鎖核酸の検出
ＰＣＲ産物とＬＡＭＰ法産物をそれぞれ実施例１及び２と同様の方法で調製し、ポジティブコントロール、及びネガティブコントロールを準備した。実施例５で作製した吸引型デバイスをマイクロピペットに装着し、それぞれの検体１００μｌを吸引し、ピペットチップ内の検体溶液の色調を観察した。その結果を表４に示した。【０１１１】
（実施例７）吸引型デバイスの作製
０．２％ゲンチアナバイオレットと６％亜硫酸ナトリウムを等容量ずつ混合し、この混合液１μｌを円形に打ち抜いた多孔質ポリエチレンシート（気孔径５０μｍ、厚さ１．５ｍｍ、直径１．５ｍｍ）に含浸した。これを室温で乾燥させて、色素を保持した担体とした。前記担体を、図３に示したように、２００μｌ用のピペットチップの先端に充填し、吸引型デバイスを作製した。【０１１２】
（実施例８）吸引型デバイスによる多重鎖核酸の検出
ＰＣＲ産物とＬＡＭＰ法産物をそれぞれ実施例１及び２と同様の方法で調製し、ポジティブコントロール、及びネガティブコントロールを準備した。実施例７で作製した吸引型デバイスをマイクロピペットに装着し、それぞれの検体１００μｌを吸引し、ピペットチップ内の検体溶液の色調を観察した。その結果を表４に示した。【０１１３】
【表４】
2012039422.tif 000011
【０１１４】
実施例６において、ＰＣＲ法及びＬＡＭＰ法による核酸増幅が有る場合、チップ内の検体液は青紫色を呈し、一方、増幅核酸が存在しない場合は、無色透明であった。吸引型デバイスを用いた増幅核酸の検出に要した時間は僅か数秒であり、迅速かつ簡便に目視による判定が可能であった。【０１１５】
実施例８においても、ＰＣＲ法及びＬＡＭＰ法による核酸増幅が有る場合、チップ内の検体液は青紫色を呈し、一方、増幅核酸が存在しない場合は、無色透明であった。吸引型デバイスを用いた増幅核酸の検出に要した時間は僅か数秒であり、迅速かつ簡便に目視による判定が可能であった。【０１１６】
（実施例９）着色後のサンプルを用いた処理の検討
実施例１及び３と同様の方法で、ＰＣＲ産物の着色を行い、着色後のサンプルを用いて、電気泳動、ＰＣＲ、制限酵素処理、シーケンス反応を行った。その結果、本発明による核酸の着色は後処理に影響することなく、全て良好に実施することが可能であった。
【符号の説明】
【０１１７】
１．多重鎖核酸と接触することで発色するロイコ型色素を保持した担体
２．試料添加部位（グラスファイバー濾紙）
３．判定部位（濾紙）
４．基材
５．担体を保持する支持体
６．検体収容容器
７．ピペットチップ
８．流路を有するチップ
９．試料添加部位
１０．流路
１１．色素
１２．針状構造
１３．チューブ
１４．判定部位
【図１】
2012039422.tif 000015
【図２】
2012039422.tif 000016
【図３】
2012039422.tif 000017
【図４】
2012039422.tif 000018
【図５】
2012039422.tif 000019
【配列表】
2012039422000001.app
【国際調査報告】
2012039422.tif 000020
2012039422.tif 000021