(57)【要約】  ４−ＨＰＰＤ阻害剤感受性イネと４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性イネとを用いたＱＴＬ解析等により、４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性遺伝子が、イネの第２染色体短腕に座乗する鉄・アスコルビン酸依存性酸化還元酵素遺伝子と推定される遺伝子（ＨＩＳ１遺伝子）であることを同定した。さらに、ＨＩＳ１遺伝子との相同遺伝子（ＨＳＬ１遺伝子）が、イネの第６染色体に座乗していることも明らかにした。そして、これら遺伝子を利用して、効率的に、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性が高められた植物体を作出すること、および植物における４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定することが可能であることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードする下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを含む、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与するための薬剤
（ａ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１又は１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と６０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードする下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターが導入された形質転換植物細胞であって、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体を再生しうる形質転換植物細胞
（ａ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１又は１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と６０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２に記載の形質転換植物細胞から再生された、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体。
【請求項４】
請求項３に記載の植物体の子孫又はクローンである、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体の繁殖材料。
【請求項６】
４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体の製造方法であって、
（Ｉ）４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードする下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを植物細胞に導入する工程と、
（ａ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１又は１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と６０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（II)工程（Ｉ）において前記ＤＮＡまたは該ＤＮＡが挿入されたベクターが導入された形質転換植物細胞から植物体を再生する工程と、
を含む方法。
【請求項７】
４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードする下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを含む、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与するための薬剤
（ａ）請求項１に記載のＤＮＡの転写産物と相補的な二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｂ）請求項１に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｃ）請求項１に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【請求項８】
４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードする下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターが導入された形質転換植物細胞であって、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物体を再生しうる形質転換植物細胞
（ａ）請求項１に記載のＤＮＡの転写産物と相補的な二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｂ）請求項１に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｃ）請求項１に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換植物細胞から再生された、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物体。
【請求項１０】
請求項９に記載の植物体の子孫又はクローンである、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物体。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物体の繁殖材料。
【請求項１２】
４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物体の製造方法であって、
（Ｉ）４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードする下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを植物細胞に導入する工程と、
（ａ）請求項１に記載のＤＮＡの転写産物と相補的な二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｂ）請求項１に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｃ）請求項１に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ
（II)工程（Ｉ）において前記ＤＮＡまたは該ＤＮＡが挿入されたベクターが導入された形質転換植物細胞から植物体を再生する工程と、
を含む方法。
【請求項１３】
植物における４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定する方法であって、被験植物における下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ又はその発現制御領域の塩基配列を解析することを特徴とする方法
（ａ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１又は１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と６０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項１４】
植物における４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定する方法であって、被験植物における下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡの発現又は増幅産物若しくは発現産物の分子量を検出することを特徴とする方法
（ａ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１又は１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と６０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項１５】
４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物を育種する方法であって、
（ａ）４−ＨＰＰＤ阻害剤に対し抵抗性の植物品種と任意の品種とを交配させる工程、
（ｂ）工程（ａ）における交配により得られた個体における、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を、請求項１３または１４に記載の方法により判定する工程、および
（ｃ）４−ＨＰＰＤ阻害剤に対し抵抗性を有すると判定された個体を選抜する工程、を含む方法。
【請求項１６】
４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物を育種する方法であって、
（ａ）４−ＨＰＰＤ阻害剤に対し感受性の植物品種と任意の品種とを交配させる工程、
（ｂ）工程（ａ）における交配により得られた個体における、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を、請求項１３または１４に記載の方法により判定する工程、および
（ｃ）４−ＨＰＰＤ阻害剤に対し感受性を有すると判定された個体を選抜する工程、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を植物に付与するための薬剤、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性が高められた植物体を再生しうる形質転換植物細胞、その細胞から再生された植物体、並びにそれらの製造方法に関する。また本発明は、植物における４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定する方法、及び該判定を利用した４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性が高められた植物の育種方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオエタノール燃料の需要増に伴い、海外からの飼料用穀物の輸入価格が高騰し、日本国内の畜産経営を圧迫している。そこで、飼料の国内生産及び自給率の向上を目的とし、休耕田等を利用した水稲以外の転作作物の作付けが行われている。しかしながら、排水不良等の問題から、これら転作作物の栽培に適した水田には限りがあるため、飼料としてのイネの利用や、高い生産性を備えた飼料イネ専用品種（多収品種）の開発が進められている。かかる多収品種において、その特性である多収性や安定した栽培性を発揮させつつ、家畜の嗜好性や栄養価を向上させるためには、栽培田の雑草防除が重要な栽培管理技術となる（非特許文献１）。また、多収品種やイネに限らず、安定的で経済的な作物の生産には、低コストで省力的であり、簡便な雑草防除が求められており、それには選択性の高い除草剤の開発・施用が効果的であるため（非特許文献２）、施用除草剤に対する抵抗性作物の開発や栽培が必要とされている。【０００３】
一方、栽培田の雑草防除においては、低薬量で広範囲の雑草に効き、人体や環境にも影響が少ないことから、スルホニルウレア（ＳＵ）系除草剤が広く普及している。しかしながら、ＳＵ系除草剤に対して耐性を有するイヌホタルイ等の雑草の発生が確認されており、イネ等の栽培管理における問題となっている。【０００４】
昨今、かかる問題の解決策として、ベンゾビシクロン（ＢＢＣ）やメソトリオンやテフリルトリオン等のＳＵ系除草剤耐性植物にも効果を示す除草剤成分が開発され、実用化されている。ＢＢＣ、メソトリオン、テフリルトリオンはいずれも、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（４−ＨＰＰＤ）の機能を阻害する薬剤（４−ＨＰＰＤ阻害剤）であり、この酵素の機能を阻害することにより、カロチノイド合成系を間接的に阻害し、葉緑素の崩壊を引き起こすことにより、植物を白化、枯死に至らせる（図１  参照）。これら阻害剤については、食用米品種に対する安全性は十分に確認されているため、イネの栽培において急速に普及しつつある。【０００５】
しかしながら、多収品種については、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が、開発段階等において十分に検討されていなかったこともあり、多収品種である飼料用イネの７品種において、４−ＨＰＰＤ阻害剤に弱く、場合によっては枯死に至る可能性があることが報告されている（非特許文献１及び３）。【０００６】
４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を確実に識別できる方法や、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を高めることができる方法が開発されれば、例えば、図２に示すように、食用米品種、飼料用米品種の輪作体系における、前年作の「こぼれ種」の発芽リスク（漏生籾、苗の問題）の制御に４−ＨＰＰＤ阻害剤を活用でき、ひいては飼料用米品種等の生産拡大が期待できる。また、これらの方法を利用することで、必要に応じてイネ等の作物の栽培の区分管理技術にも活用することができる。さらに、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を識別するマーカーとなる遺伝子が見出されば、イネを含む作物を効率的に育種することが可能となる。【０００７】
このため、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を植物に付与するための技術や、植物における４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定するための技術の開発が強く望まれている。しかしながら、これら目的を効率的に達成し得る技術は、いまだ開発されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】関野  景介ら、「飼料用イネ１９品種の水稲用除草剤ベンゾビシクロン感受性」、日本作物学会紀事、２００９年３月２５日、２２７巻、別号、１２０〜１２１ページ
【非特許文献２】Ｔｅｒｒｙ  Ｒ．Ｗｒｉｇｈｔら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．、２０１０年１１月２３日、１０７巻、４７号、２０２４０〜２０２４５ページ
【非特許文献３】丸山  清明ら、「飼料用イネなどが一部の除草剤に弱いことが判明」、［ｏｎｌｉｎｅ］、２０１０年３月２６日、独立行政法人  農業・食品産業技術総合研究機構  中央農業総合研究センター、プレスリリース、［２０１０年９月２９日検索］、インターネット〈ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｎａｒｃ．ｎａｒｏ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｐｒｅｓｓ／ｈ２２／０３２６／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ〉
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を効率的に植物に付与しうる技術を提供すること、および植物における４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を効率的に判定しうる技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成すべく、まず、植物における４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性に関与する遺伝子の同定を試みた。具体的には、本発明者らは、まず、４−ＨＰＰＤ阻害剤感受性イネと４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性イネとを用いた量的遺伝子座（ＱＴＬ）解析を行った。その結果、４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性決定遺伝子座がイネの第２染色体短腕に座乗していることが判明した。次いで、本発明者らは、ＱＴＬ解析で特定された遺伝子座にある鉄・アスコルビン酸依存性酸化還元酵素遺伝子と推定される遺伝子に、レトロトランスポゾンＴｏｓ１７が挿入された日本晴系統を用いて表現型（４−ＨＰＰＤ阻害型感受性）を調査したところ、Ｔｏｓ１７挿入ホモ個体が４−ＨＰＰＤ阻害剤に感受性を示すことを見出した。見出された鉄・アスコルビン酸依存性酸化還元酵素遺伝子を、シロイナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）及びイネに導入したところ、これらの形質転換植物が４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を示したことから、この遺伝子が、植物に４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性をもたらす原因遺伝子（以下、４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  Ｎｏ．１（ＨＩＳ１）とも称する）であることが裏付けられた。また、イネのＨＩＳ１遺伝子と高い相同性を有する遺伝子は、オオムギ、ソルガム、トウモロコシなどにおいても存在していた。【００１１】
さらに、本発明者らは、ＰＣＲ解析により、４−ＨＰＰＤ阻害剤感受性イネと４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性イネにおけるＨＩＳ１遺伝子の構造の比較を行った。その結果、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対して感受性を示すイネ品種においては、ＨＩＳ１遺伝子の第４〜５エクソンにかけて挿入や欠失が生じていたことから、ＨＩＳ１遺伝子の機能の抑制が植物に４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性をもたらすものと考えられた。【００１２】
また、イネにおいて、ＨＩＳ１遺伝子と最も相同性の高いイネ遺伝子（ＨＳＬ１遺伝子）が第６染色体に座乗していることを明らかにした。さらに、このＨＳＬ１遺伝子をイネに導入したところ、この形質転換イネも、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を示すことも明らかにした。【００１３】
これら知見に基づき、本発明者らは、ＨＩＳ１遺伝子またはその相同遺伝子を利用することにより、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性が高められた植物体を作出することが可能であり、また、当該遺伝子を標的として、植物における４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１４】
本発明は、より詳しくは、以下のものである。
（１）  ４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードする下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを含む、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与するための薬剤
（ａ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１又は１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
（２）  ４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードする下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターが導入された形質転換植物細胞であって、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体を再生しうる形質転換植物細胞
（ａ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１又は１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と６０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
（３）  （２）に記載の形質転換植物細胞から再生された、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体。
（４）  （３）に記載の植物体の子孫又はクローンである、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体。
（５）  （３）又は（４）に記載の４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体の繁殖材料。
（６）  ４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体の製造方法であって、
（Ｉ）４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードする下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを植物細胞に導入する工程と、
（ａ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１又は１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と６０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（II)工程（Ｉ）において前記ＤＮＡまたは該ＤＮＡが挿入されたベクターが導入された形質転換植物細胞から植物体を再生する工程と、
を含む方法。
（７）  ４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードする下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを含む、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与するための薬剤
（ａ）（１）に記載のＤＮＡの転写産物と相補的な二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｂ）（１）に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｃ）（１）に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（８）  ４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードする下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターが導入された形質転換植物細胞であって、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物体を再生しうる形質転換植物細胞
（ａ）（１）に記載のＤＮＡの転写産物と相補的な二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｂ）（１）に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｃ）（１）に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（９）  （８）に記載の形質転換植物細胞から再生された、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物体。
（１０）  （９）に記載の植物体の子孫又はクローンである、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物体。
（１１）  （９）又は（１０）に記載の４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物体の繁殖材料。
（１２）  ４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物体の製造方法であって、
（Ｉ）４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードする下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを植物細胞に導入する工程と、
（ａ）（１）に記載のＤＮＡの転写産物と相補的な二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｂ）（１）に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｃ）（１）に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ
（II)工程（Ｉ）において前記ＤＮＡまたは該ＤＮＡが挿入されたベクターが導入された形質転換植物細胞から植物体を再生する工程と、
を含む方法。
（１３）  植物における４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定する方法であって、被験植物における下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡ又はその発現制御領域の塩基配列を解析することを特徴とする方法
（ａ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１又は１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と６０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
（１４）  植物における４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定する方法であって、被験植物における下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡの発現又は増幅産物若しくは発現産物の分子量を検出することを特徴とする方法
（ａ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１又は１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と６０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
（１５）  ４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物を育種する方法であって、
（ａ）４−ＨＰＰＤ阻害剤に対し抵抗性の植物品種と任意の品種とを交配させる工程、
（ｂ）工程（ａ）における交配により得られた個体における、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を、（１３）または（１４）に記載の方法により判定する工程、および
（ｃ）４−ＨＰＰＤ阻害剤に対し抵抗性を有すると判定された個体を選抜する工程、を含む方法。
（１６）  ４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物を育種する方法であって、
（ａ）４−ＨＰＰＤ阻害剤に対し感受性の植物品種と任意の品種とを交配させる工程、
（ｂ）工程（ａ）における交配により得られた個体における、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を、（１３）または（１４）に記載の方法により判定する工程、および
（ｃ）４−ＨＰＰＤ阻害剤に対し感受性を有すると判定された個体を選抜する工程、を含む方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明において同定された遺伝子を利用することにより、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性が高められた植物を効率的に作出することが可能となった。また、本発明において同定された遺伝子を標的として、植物における４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を効率的に判定することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】チロシン代謝経路及びカロチノイド生合成経路と、４−ＨＰＰＤ阻害剤との概要と関連を示す図である。
【図２】食用米品種、飼料用米品種の輪作体系における、前年作の「こぼれ種」の発芽リスクの制御に関する概要を示す図である。
【図３】アグロバクテリウム法によるシロイヌナズナの形質転換に用いた、ｎｏｓプロモーター（ｎｏｓ−Ｐ）でドライブされるカナマイシン抵抗性遺伝子（ＮＰＴII）、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ−Ｐ）でドライブされるハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ｈｙｇＲ）、及びＣａＭＶ３５ＳプロモーターでドライブされるＡＫ０６５５８１（ＨＩＳ１）の各発現カセット、並びに境界配列（ＲＢ：右境界配列、ＬＢ：左境界配列）を連結したバイナリーベクター（ｐＩＧ１２１−Ｈｍ／ＨＩＳ１）の概要を示す図である。
【図４】アグロバクテリウム法によるシロイヌナズナ及びイネの形質転換に用いた、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（３５Ｓ  Ｐｒｏ）でドライブされるハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ｍＨＰＴ）、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（３５Ｓ  Ｐｒｏ）でドライブされるＡＫ０６５５８１（ＨＩＳ１）の各発現カセット、並びに境界配列（ＲＢ：右境界配列、ＬＢ：左境界配列）を連結したバイナリーベクター（３５ｓＨＩＳ１  ｐＺＨ２Ｂ）の概要を示す図である。
【図５】アグロバクテリウム法によるトマトの形質転換に用いた、ｎｏｓプロモーター（ＮＯＳｐｒｏ）でドライブされるカナマイシン抵抗性遺伝子（ＮＰＴ２）、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（３５Ｓ  Ｐｒｏ）でドライブされるＡＫ０６５５８１（ＨＩＳ１）の各発現カセット、並びに境界配列（ＲＢ：右境界配列、ＬＢ：左境界配列）を連結したバイナリーベクター（３５ｓＨＩＳ１  ｐＺＫ３）の概要を示す図である。
【図６】アグロバクテリウム法によるシロイヌナズナ及びイネの形質転換に用いた、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（３５Ｓ  Ｐｒｏ）でドライブされるハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ｍＨＰＴ）、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（３５Ｓ  Ｐｒｏ）でドライブされるＡＫ２４１９４８（ＨＳＬ１）の各発現カセット、並びに境界配列（ＲＢ：右境界配列、ＬＢ：左境界配列）を連結したバイナリーベクター（３５ｓＨＳＬ１  ｐＺＨ２Ｂ）の概要を示す図である。
【図７】アグロバクテリウム法によるトマトの形質転換に用いた、ｎｏｓプロモーター（ＮＯＳｐｒｏ）でドライブされるカナマイシン抵抗性遺伝子（ＮＰＴ２）、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（３５Ｓ  Ｐｒｏ）でドライブされるＡＫ２４１９４８（ＨＳＬ１）の各発現カセット、並びに境界配列（ＲＢ：右境界配列、ＬＢ：左境界配列）を連結したバイナリーベクター（３５ｓＨＳＬ１  ｐＺＫ３）の概要を示す図である。
【図８】イネ染色体上にあるＱＴＬ解析によって特定された４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性遺伝子（ＡＫ０６５５８１）とその相同遺伝子とを示す図である。
【図９】標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した組換えＡ．ｔｈａｌｉａｎａ（エコタイプＣｏｌｕｍｂｉａ）の４−ＨＰＰＤ阻害剤（ベンゾビシクロン（ＢＢＣ））に対する抵抗性を示す写真である。なお図中、「Ｃｏｌ」は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ野生型（エコタイプＣｏｌｕｍｂｉａ）の結果であることを示し、「♯１」及び「♯３」は、標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した組換えシロイナズナＡ．ｔｈａｌｉａｎａ（エコタイプＣｏｌｕｍｂｉａ）の結果であることを示す。
【図１０】標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した組換えイネ（４−ＨＰＰＤ阻害剤感受性品種：関東２３９号）の４−ＨＰＰＤ阻害剤（ベンゾビシクロン）に対する抵抗性を示す写真である。なお図中、「関東２３９号」は、関東２３９号（野生型）の結果であることを示し、「ＢＢＣ２１−２３Ｂ」及び「ＢＢＣ２１−２３Ｃ」は、標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した関東２３９号（組換えイネ）の結果であることを示す。
【図１１】標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した組換えイネ（関東２３９号）の４−ＨＰＰＤ阻害剤（ベンゾビシクロン）に対する抵抗性を示す写真である。なお図中、「日本晴」及び「関東２３９号」は、各々日本晴（野生型）（４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種）及び関東２３９号（野生型）の結果であることを示し、「ＢＢＣ２１−１Ａ、２、３、３Ｄ、３Ｆ、３−３、９、１５」は、標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した関東２３９号（組換えイネ）の結果であることを示す（図１２〜１５においても同様）。また、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｄａｔｅ」及び「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｄａｔｅ」は、各々「４−ＨＰＰＤ阻害剤を添加した固形（寒天）培地に種を播いた日」及び「該種から発育した植物体の生育状況を調べた日」を示す（図１２〜１５及び２２においても同様）。
【図１２】標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した組換えイネ（関東２３９号）の４−ＨＰＰＤ阻害剤（メソトリオン）に対する抵抗性を示す写真である。
【図１３】標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した組換えイネ（関東２３９号）の４−ＨＰＰＤ阻害剤（テフリルトリオン）に対する抵抗性を示す写真である。
【図１４】標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した組換えイネ（関東２３９号）の４−ＨＰＰＤ阻害剤（テンボトリオン）に対する抵抗性を示す写真である。
【図１５】標的遺伝子（ＡＫ０６５５８１）を導入した組換えイネ（関東２３９号）の４−ＨＰＰＤ阻害剤（ＮＴＢＣ）に対する抵抗性を示す写真である。
【図１６】各イネ品種におけるＨＩＳ１遺伝子の各エクソン領域を増幅したＰＣＲパターンを示す電気泳動写真である。なお図中、「１」は日本晴、「２」はコシヒカリ、「３」はカサラス、「４」は北陸１９３号、「５」はタカナリ、「６」はモミロマンの結果であることを示し、「Ｍ」はサイズマーカーを示す。また、「エクソン１」は配列番号：３に記載の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号：４に記載の塩基配列からなるプライマーを用いたＰＣＲにより増幅されたＨＩＳ１遺伝子のエクソン１の領域を示し、「エクソン２」は配列番号：５に記載の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマーを用いたＰＣＲにより増幅されたＨＩＳ１遺伝子のエクソン２の領域を示し、「エクソン３」は配列番号：７に記載の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号：８に記載の塩基配列からなるプライマーを用いたＰＣＲにより増幅されたＨＩＳ１遺伝子のエクソン３の領域を示し、「エクソン４」は配列番号：９に記載の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号：１０に記載の塩基配列からなるプライマーを用いたＰＣＲにより増幅されたＨＩＳ１遺伝子のエクソン４の領域を示し、「エクソン５」は配列番号：１１に記載の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号：１２に記載の塩基配列からなるプライマーを用いたＰＣＲにより増幅されたＨＩＳ１遺伝子のエクソン５の領域を示す。また、「エクソン４前半」は配列番号：１３に記載の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号：１４に記載の塩基配列からなるプライマーを用いたＰＣＲにより増幅されたＨＩＳ１遺伝子のエクソン４内部の前半領域を示す。さらに図中、矢頭はそれぞれ１００ｐｂ、２００ｂｐ、５００ｂｐの大きさであることを示す。
【図１７】日本晴のＨＩＳ１遺伝子と、モミロマン及びタカナリの対応遺伝子との構造を比較した結果を示す概要図である。
【図１８】日本晴のＨＩＳ１遺伝子と、カサラスの対応遺伝子との構造を比較した結果を示す概要図である。
【図１９】ＨＩＳ１遺伝子とその相同遺伝子（ＨＳＬ１遺伝子）、各々がコードするタンパク質のアミノ酸配列を比較し、相同性を示す図である。
【図２０】ＨＩＳ１遺伝子が座乗する遺伝子座（第２染色体）とその相同遺伝子（ＨＳＬ１遺伝子：Ｏｓ０６ｇ０１７６７００／Ｏｓ０６ｇ０１７８５００）が座乗する遺伝子座（第６染色体）との各組織における発現パターンを示す図である。
【図２１】ＨＩＳ１遺伝子及びその相同遺伝子は、イネ科（単子葉）植物に固有の遺伝子群に属することを示す系統樹である。なお、図中の「ＨＳＬ」は、「ＨＩＳ１−ＬＩＫＥ」の略称であり、ＨＩＳ１の相同遺伝子であることを示す。
【図２２】ＨＩＳ１遺伝子と高い相同性をもつ遺伝子（ＨＳＬ１；ＡＫ２４１９４８）を導入した組換えイネ（関東２３９号）の４−ＨＰＰＤ阻害剤（ベンゾビシクロン）に対する抵抗性を示す写真である。なお図中、「関東２３９号」は、関東２３９号（野生型）の結果であることを示し、「２３−１」、「２３−２１」及び「２３−２５」は、相同遺伝子（ＡＫ２４１９４８）を導入した関東２３９号（組換えイネ）の結果であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
＜４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与するための薬剤＞
本発明の４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与するための薬剤は、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明の抵抗性ＤＮＡと称することがある）、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを含むことを特徴とする。
【００１８】
本発明における「４−ＨＰＰＤ阻害剤」とは、４−ＨＰＰＤ（４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ）の機能を阻害する薬剤（４−ＨＰＰＤ阻害剤）を意味する。４−ＨＰＰＤ阻害剤は、図１に示すように、４−ＨＰＰＤの機能を阻害することにより、カロチノイド合成系を間接的に阻害し、葉緑素の崩壊を引き起こして植物を白化させ、枯死に至らせる。本発明における「４−ＨＰＰＤ阻害剤」としては、例えば、ベンゾビシクロン（ＢＢＣ）、メソトリオン、テフリルトリオン、テンボトリオン、（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルベンゾイル）−シクロヘキサン−１，３ジオン（２−（２−ｎｉｔｒｏ−４−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１，３−ｄｉｏｎｅ；ＮＴＢＣ）といったトリケトン系４−ＨＰＰＤ阻害剤、ピラゾレート、ベンゾフェナップ、ピラゾキシフェンといったピラゾール系４−ＨＰＰＤ阻害剤が挙げられる。本発明の抵抗性ＤＮＡを用いて植物に抵抗性を付与する対象となる４−ＨＰＰＤ阻害剤としては、ＢＢＣ、メソトリオン、テフリルトリオン、テンボトリオン、ＮＴＢＣといったトリケトン系４−ＨＰＰＤ阻害剤が好ましく、ＢＢＣが特に好ましい。
【００１９】
なお、前述の４−ＨＰＰＤ阻害剤といった除草剤は、その成分が化合物としてきわめて多様であるが、作用機序の面から、下記の通り、いくつかのグループに分類できる（「農薬からアグロバイオギュレーター−病害虫雑草制御の現状と将来」、日本、シーエムシー出版、２０１０年１月  参照）。
(I)  アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）阻害型除草剤
脂質合成の最初の段階に関与するＡＣＣａｓｅを阻害するこの除草剤グループは、細胞膜合成を阻害し、植物を生育障害に至らしめる。このグループに属する除草剤はさらに（１）４−アリールオキシフェノキシプロピオン酸系、（２）シクロヘキサンジオン・オキシム系、（３）ジオン系に分類される。
(II)  アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）阻害型除草剤
ＡＬＳを標的とするこの除草剤のグループは、ＡＬＳ活性を阻害し分岐アミノ酸生成を阻害することで、植物を生育障害に至らしめる。このグループに属する除草剤はさらに（１）スルホニルウレア系、（２）トリアゾリノン系、（３）トリアゾロピリミジン系、（４）ピリミジニルサリチル酸系、（５）イミダゾリノン系に分類される。
(III)  ４−ＨＰＰＤ代謝阻害型除草剤
チロシン代謝経路の４−ＨＰＰＤ代謝を阻害するこの除草剤グループは、植物のカロテノイド合成系を間接的に阻害し、植物を白化・枯死に至らしめる。このグループに属する除草剤はさらに（１）シクロヘキサンジオン系、（２）ピラゾール系、（３）ビシクロ系（４）、イソオキサゾール系、（５）トリケトン系に分類される。また、（１）シクロヘキサンジオン系としては、例えばベンゾイルシクロヘキサン−１，３−ジオン誘導体が挙げられ、（２）ピラゾール系としては、例えば、ピラゾレート、ベンゾフェナップ、ピラゾキシフェンが挙げられ、（３）ビシクロ系としては、例えば、３−置換ベンゾイル−ビシクロ［４、１、０］ヘプタン−２、４−ジオン誘導体が挙げられ、（４）イソオキサゾール系としては、例えばイソオキサフルトールが挙げられ、（５）トリケトン系としては、例えば、ＢＢＣ、メソトリオン、テフリルトリオン、テンボトリオンが挙げられる。
（IV)  プロトポルフィリノーゲン−IXオキシダーゼ（ＰＰＯ）阻害剤除草剤
このグループの除草剤は葉緑素合成を阻害し、細胞膜崩壊から枯死に至らしめる。このグループに属する除草剤はさらに（１）ジフェニルエーテル系、（２）ジアリル系、（３）ピラゾール系に分類される。
（V)  超長鎖脂肪酸伸長酵素（ＶＬＣＦＡＥ）阻害型除草剤
このグループの除草剤は植物脂質生合成系のうちＣ２０以上の超長鎖脂肪酸生合成系酵素を阻害し、植物を枯死に至らしめる。
（VI)  フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）阻害型除草剤
カロテノイド生合成経路のＰＤＳ酵素を阻害するこの除草剤グループは、植物の葉緑素崩壊を引き起こし、植物を白化・枯死に至らしめる。
（VII)  ＰＳ  II阻害型除草剤
このグループの阻害剤は、プラストキノン（ＰＱ）に結合し、その結果ＰＱが関わる光化学系  II（ＰＳ  II）から光化学系  I（ＰＳ  I）への電子伝達が阻害され、植物体内での炭素固定機能が不能となり植物が枯死する。
（VIII)  合成オーキシン型除草剤
このグループの阻害剤は、植物体内に低濃度で存在し植物の生長を調節する天然オーキシンのように振る舞い、植物の分化・成長が不正常となり結果的に枯死する。
（IX)  ＥＰＳＰ合成酵素（ＥＰＳＰＳ）阻害型除草剤
このグループの阻害剤は、シキミ酸回路のＥＰＳＰＳと結合し、ＥＰＳＰの合成を阻害する。その結果トリプトファン、フェニルアラニン、チロシンが生合成されず、植物は枯死する。
【００２０】
本発明の抵抗性ＤＮＡの例として、日本晴由来の鉄・アスコルビン酸依存性酸化還元酵素遺伝子と推定される遺伝子（ＨＩＳ１遺伝子；Ｏｓ０２ｇ０２８０７００）の塩基配列を配列番号：１に、前記ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【００２１】
また、本発明の抵抗性ＤＮＡの別の例として、日本晴由来の遺伝子（ＨＩＳ１−ＬＩＫＥ（ＨＳＬ）１遺伝子；Ｏｓ０６ｇ０１７６７００／Ｏｓ０６ｇ０１７８５００（ＡＫ２４１９４８）の塩基配列を配列番号：１６に、前記ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１７に示す。
【００２２】
本発明の抵抗性ＤＮＡの1つの態様は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（典型的には、配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ）である。
【００２３】
また、本発明の抵抗性ＤＮＡの別の態様は、配列番号：１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（典型的には、配列番号：１６に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ）である。
【００２４】
現在の技術水準においては、当業者であれば、かかるＤＮＡの塩基配列情報が得られた場合、その塩基配列に対して種々の改変を行い、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードする変異遺伝子の製造を行うことが可能である。また、自然界においても、塩基配列が変異することは起こり得ることである。従って、本発明の抵抗性ＤＮＡには、前記活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。ここで「複数」とは、ＨＩＳ１タンパク質又はＨＳＬ１タンパク質のアミノ酸配列全体においては、通常、５０アミノ酸以内、好ましくは３０アミノ酸以内、より好ましくは１０アミノ酸以内、特に好ましくは数個のアミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。
【００２５】
さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、特定の抵抗性ＤＮＡが得られた場合、そのＤＮＡの塩基配列情報を利用して、同種若しくは他の植物から、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードする相同遺伝子を単離することが可能である。このような相同遺伝子を取得するための植物としては、単子葉植物が好ましく、イネ科植物が特に好ましい。イネ科植物としては、例えば、イネ（例えば、４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種である、日本晴、コシヒカリ、きたあおば、アキヒカリ、あきたこまち、ふくひびき、べこあおば、べこごのみ、夢あおば、北陸１９３号、リーフスター、たちすがた、クサノホシ、ホシアオバ、ニシアオバ、タチアオバ、まきみずほ、モグモグあおば、はまさり、ミナミユタカ）、オオムギ、ソルガム、トウモロコシなどが挙げられる。
【００２６】
相同遺伝子を取得するための方法としては、例えば、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３，１９７５）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０−１３５４，１９８５、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７−４９１，１９８８）が挙げられる。相同遺伝子を単離するためには、通常、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件としては、６Ｍ  尿素、０．４％  ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示できる。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ  尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１ｘＳＳＣの条件を用いれば、より相同性の高い遺伝子の単離を期待することができる。本発明の抵抗性ＤＮＡには、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号：１又は１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡが含まれる。
【００２７】
取得された相同遺伝子がコードするタンパク質は、通常、配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上（例えば、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上）の配列の相同性である。配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＸ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４−２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７，１９９３）に基づいている。ＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。本発明の抵抗性ＤＮＡには、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡが含まれる。このようなＤＮＡとしては、例えば、オオムギ由来の遺伝子（ＨｖＨＣＰ１（ＡＦ５２７６０６））、トウモロコシ由来の遺伝子（ＺｍＨＳＬ１（ＢＴ０６２８４２）、ＺｍＨＳＬ２（ＮＭ＿００１１５３４６４））、ソルガム由来の遺伝子（ＳｂＨＳＬ１（ＸＭ＿００２４３６５４６））が挙げられる（図２１  参照）。
【００２８】
特定の遺伝子がコードするタンパク質が４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するか否かは、例えば、後述の実施例に記載するように、当該遺伝子を植物に導入することにより、作出した植物に前記抵抗性が付与されているか否かを検定することにより判定することができる（実施例２  参照）。すなわち、０．０３μＭのＢＢＣを含む寒天培地で白化するシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ：エコタイプＣｏｌｕｍｂｉａ）を用いる場合においては、前記遺伝子をシロイヌナズナに導入することにより作出した形質転換体が、前記ＢＢＣ濃度の存在下において白化せずに生育できれば、前記遺伝子がコードするタンパク質は４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有していると判定できる。また、０．１μＭのＢＢＣを含む寒天培地で白化するＢＢＣ感受性イネ品種「関東２３９号」を用いる場合においては、前記遺伝子を関東２３９号に導入することにより作出した形質転換体が、前記ＢＢＣ濃度の存在下において白化せずに生育できれば、前記遺伝子がコードするタンパク質は４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有していると判定できる。さらに、ＢＢＣ以外のトリケトン系４−ＨＰＰＤ阻害剤（メソトリオン、テフリルトリオン、テンボトリオン、ＮＴＢＣ等）を用いる場合においては、前記遺伝子を関東２３９号に導入することにより作出した形質転換体が、１μＭのメソトリオン、２．５μＭのテフリルトリオン、０．５μＭのテンボトリオン又は１μＭのＮＴＢＣの存在下において白化せずに生育できれば、前記遺伝子がコードするタンパク質は４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有していると判定できる。
【００２９】
本発明の抵抗性ＤＮＡとしては、その形態に特に制限はなく、ｃＤＮＡの他、ゲノムＤＮＡ、および化学合成ＤＮＡが含まれる。これらＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、植物からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣなどが利用できる）を作成し、これを展開して、ＨＩＳ１遺伝子（例えば、配列番号：１に記載のＤＮＡ）又はＨＳＬ１遺伝子（例えば、配列番号：１６に記載のＤＮＡ）の塩基配列を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、ＨＩＳ１遺伝子又はＨＳＬ１遺伝子に特異的なプライマーを作製し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。また、ｃＤＮＡは、例えば、植物から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。また、市販のＤＮＡ合成機を用いれば、目的のＤＮＡを合成により調製することも可能である。
【００３０】
＜４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与するための薬剤＞
また、本発明は、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与するための薬剤を提供する。後述の実施例において示す通り、ＨＩＳ１遺伝子がコードするタンパク質の機能が抑制されることにより、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が抑制される。従って、本発明の４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与するための薬剤は、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを含むことを特徴とする。
【００３１】
４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡの一つの態様は、上記した内因性の本発明の抵抗性ＤＮＡの転写産物と相補的なｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ）をコードするＤＮＡである。標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するｄｓＲＮＡを細胞内に導入することにより、導入した外来遺伝子および標的内因性遺伝子の発現がいずれも抑制される、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉、ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）と呼ばれる現象を引き起こすことができる。細胞に約４０〜数百塩基対のｄｓＲＮＡが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮａｓｅIII様のヌクレアーゼが、ＡＴＰ存在下で、ｄｓＲＮＡを３’末端から約２１〜２３塩基対ずつ切り出し、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ）が生じる。このｓｉＲＮＡに、特異的なタンパク質が結合して、ヌクレアーゼ複合体（ＲＩＳＣ：ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体はｓｉＲＮＡと同じ配列を認識して結合し、ＲＮａｓｅIII様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部で標的遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）を切断する。また、この経路とは別にｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｓＲＰ）のプライマーとして作用し、ｄｓＲＮＡが合成される。このｄｓＲＮＡが再びダイサーの基質となって、新たなｓｉＲＮＡを生じて作用を増幅する経路も考えられている。
【００３２】
本発明のｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡは、標的遺伝子、すなわち内因性の本発明の抵抗性ＤＮＡの転写産物（ｍＲＮＡ）のいずれかの領域に対するアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスＤＮＡと、該ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンスＲＮＡをコードしたセンスＤＮＡを含み、該アンチセンスＤＮＡおよび該センスＤＮＡより、それぞれアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡを発現させることができる。また、これらのアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡよりｄｓＲＮＡを作成することができる。
【００３３】
本発明のｄｓＲＮＡの発現システムをベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡを発現させる場合と、異なるベクターからそれぞれアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡを発現させる場合がある。同一のベクターからアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスＤＮＡおよびセンスＤＮＡの上流にそれぞれｐｏｌIII系のような短いＲＮＡを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスＲＮＡ発現カセットとセンスＲＮＡ発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入する構成である。
【００３４】
また、異なる鎖上に対向するように、アンチセンスＤＮＡとセンスＤＮＡとを逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスＲＮＡコード鎖とセンスＲＮＡコード鎖とが対となった一つの二本鎖ＤＮＡ（ｓｉＲＮＡコードＤＮＡ）が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとを発現し得るようにプロモーターを対向して備える。この場合には、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンスＲＮＡコード鎖、センスＲＮＡコード鎖）の３'末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、Ａ（アデニン）塩基を４つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモーターの種類は異なっていることが好ましい。
【００３５】
また、異なるベクターからアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスＤＮＡおよびセンスＤＮＡの上流にそれぞれｐｏｌIII系のような短いＲＮＡを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスＲＮＡ発現カセットとセンスＲＮＡ発現カセットとをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させる構成である。
【００３６】
本発明に用いるｄｓＲＮＡとしては、ｓｉＲＮＡが好ましい。「ｓｉＲＮＡ」は、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖ＲＮＡを意味する。標的遺伝子の発現を抑制することができ、かつ、毒性を示さなければ、その鎖長に特に制限はない。ｄｓＲＮＡの鎖長は、例えば、１５〜４９塩基対であり、好適には１５〜３５塩基対であり、さらに好適には２１〜３０塩基対である。
【００３７】
本発明のｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、標的配列のインバーテッドリピートの間に適当な配列（イントロン配列が望ましい）を挿入し、ヘアピン構造を持つダブルストランドＲＮＡ（ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ'ｈａｉｒｐｉｎ'  ＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ））を作るようなコンストラクト（Ｓｍｉｔｈ，Ｎ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，４０７：３１９，２０００、Ｗｅｓｌｅｙ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２７：５８１，２００１、Ｐｉｃｃｉｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：Ｅ５５，２００１）を用いることもできる。
【００３８】
本発明のｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡは、標的遺伝子の塩基配列と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は上述した手法（ＢＬＡＳＴプログラム）により決定できる。
【００３９】
ｄｓＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合した二重鎖ＲＮＡの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においては、ｄｓＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合する二重鎖ＲＮＡ領域中に、バルジおよびミスマッチの両方が含まれていてもよい。
【００４０】
４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡの他の態様は、内因性の本発明の抵抗性ＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ（アンチセンスＤＮＡ）である。アンチセンスＤＮＡが標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などが挙げられる。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上「新生化学実験講座２  核酸IV  遺伝子の複製と発現」、日本生化学会編，東京化学同人、ｐｐ．３１９−３４７、１９９３）。本発明で用いられるアンチセンスＤＮＡは、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、標的遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むＤＮＡも、本発明で利用されるアンチセンスＤＮＡに含まれる。使用されるアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。
【００４１】
アンチセンスＤＮＡは、本発明の抵抗性ＤＮＡ（例えば、配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）の配列情報を基にホスホロチオネート法（Ｓｔｅｉｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：３２０９−３２２１，１９８８）などにより調製することが可能である。調製されたＤＮＡは、後述する公知の方法で、植物へ導入できる。アンチセンスＤＮＡの配列は、植物が持つ内因性の本発明の抵抗性ＤＮＡの転写産物と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の相補性を有する。効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスＤＮＡの長さは、少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスＤＮＡの長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い。
【００４２】
４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡの他の態様は、内因性の本発明の抵抗性ＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡである。リボザイムには、グループIイントロン型や、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子、蛋白質核酸酵素，３５：２１９１，１９９０）。
【００４３】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５のＣ１５の３’側を切断するが、活性にはＵ１４が９位のＡと塩基対を形成することが重要とされ、１５位の塩基はＣの他にＡまたはＵでも切断されることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ．ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２２８：２２５，１９８８）。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的になるように設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することが可能である（Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ．ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２３９：２８５，１９８８、小泉誠および大塚栄子，蛋白質核酸酵素，３５：２１９１，１９９０、Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７０５９，１９８９）。
【００４４】
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２３：３４９，１９８６）。このリボザイムも、標的特異的なＲＮＡ切断を起こすように設計できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｓａｓａｋｉ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：６７５１，１９９２、菊池洋，化学と生物  ３０：１１２，１９９２）。標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる（Ｙｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８６：１２７１，１９９２）。このようなリボザイムを用いて標的となる内因性の本発明の抵抗性ＤＮＡの転写産物を特異的に切断し、該ＤＮＡの発現を抑制することができる。
【００４５】
＜本発明にかかるＤＮＡが挿入されるベクター＞
上記本発明のＤＮＡ（本発明の抵抗性ＤＮＡ、又は４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ）が挿入されるベクターとしては、植物細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。本発明にかかるベクターは、本発明のＤＮＡを恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターを含有しうる。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、イネのアクチンプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーターなどが挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入によって発現するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーターやタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーター、低温によって誘導されるイネのｌｉｐ１９遺伝子のプロモーター、高温によって誘導されるイネのｈｓｐ８０遺伝子とｈｓｐ７２遺伝子のプロモーター、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナのｒａｂ１６遺伝子のプロモーター、紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。また、イネキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーターはサリチル酸などの特定の化合物によって、ｒａｂ１６は植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。
【００４６】
本発明の薬剤は、本発明のＤＮＡや該ＤＮＡが挿入されたベクター自体であってもよく、他の成分が混合されているものであってもよい。このような他の成分としては特に制限はなく、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、保存剤が挙げられる。また、後述のアグロバクテリウムを介する方法により本発明の形質転換植物細胞を調製する場合においては、前記ＤＮＡが導入されたアグロバクテリウムを含有するものであってもよい。
【００４７】
＜本発明の形質転換植物細胞＞
本発明の４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体を再生しうる形質転換植物細胞は、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードし、前記本発明の抵抗性ＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターが導入されることにより形質転換された植物細胞である。
【００４８】
また、本発明の４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物体を再生しうる形質転換植物細胞は、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードする前記ＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターが導入されることにより形質転換された植物細胞である。
【００４９】
本発明の植物細胞の由来する植物としては特に制限はなく、例えば、イネ、オオムギ、コムギ、ソルガム、トウモロコシ、クリーピングベントグラスなどのイネ科植物、シロイヌナズナなどのアブラナ科植物、トマトなどのナス科植物、ダイズ、アルファルファ、ミヤコグサなどのマメ科植物、ワタなどのアオイ科植物、テンサイ等のアカザ科植物が挙げられる。
【００５０】
これら植物において、特に、４−ＨＰＰＤ阻害剤に感受性の品種が、本発明の４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を高める適用対象として好ましい。４−ＨＰＰＤ阻害剤に感受性のイネ品種としては、例えば、ハバタキ、タカナリ、モミロマン、ミズホチカラ、ルリアオバ、おどろきもち、兵庫牛若丸、カサラス、関東２３９号、が挙げられるが、これらに制限されない。
【００５１】
また、これら植物において、特に、４−ＨＰＰＤ阻害剤に抵抗性の品種が、本発明の４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を高める適用対象として好ましい。４−ＨＰＰＤ阻害剤に抵抗性のイネ品種としては、例えば、日本晴、コシヒカリ、きたあおば、アキヒカリ、あきたこまち、ふくひびき、べこあおば、べこごのみ、夢あおば、北陸１９３号、リーフスター、たちすがた、クサノホシ、ホシアオバ、ニシアオバ、タチアオバ、まきみずほ、モグモグあおば、はまさり、ミナミユタカが挙げられるが、これらに制限されない。
【００５２】
本発明の植物細胞には、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。さらに、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス、未熟胚、花粉などが含まれる。
【００５３】
植物細胞へ本発明の抵抗性ＤＮＡが挿入されたベクターを導入する方法としては、例えば、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。
【００５４】
＜本発明の植物体、およびその繁殖材料、並びに前記植物体の製造方法＞
本発明は、前記形質転換植物細胞から再生された植物体（以下、形質転換植物体とも称する）を提供する。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。
【００５５】
例えば、イネにおいて、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｋ．Ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  Ｉ  ａｎｄ  Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ  Ｅｄｓ．）ｐｐ６６−７４，１９９５）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Ｔｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００，１５０３−１５０７，１９９２）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９５７−９６２，１９９１）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６：２７１−２８２，１９９４）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。
【００５６】
また、オオムギに関する形質転換植物体を作出する手法としては、Ｔｉｎｇａｙら（Ｔｉｎｇａｙ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１１：１３６９−１３７６，１９９７）、Ｍｕｒｒａｙら（Ｍｕｒｒａｙ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ２２：３９７−４０２，２００４）、およびＴｒａｖａｌｌａら（Ｔｒａｖａｌｌａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ２３：７８０−７８９，２００５）に記載された方法を挙げることができる。
【００５７】
ソルガム植物体を再生させる方法としては、例えば、アグロバクテリウム法やパーティクルガン法により、未熟胚やカルスに遺伝子導入して植物体を再生させる方法、超音波によって遺伝子導入した花粉を用いて受粉する方法が好適に用いられる（Ｊ．Ａ．Ａｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３７：３４１−３４８，２００１、Ａ．Ｍ．Ｃａｓａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１２１２−１１２１６，１９９３、Ｖ．Ｇｉｒｉｊａｓｈａｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ２４：５１３−５２２，２００５、Ｊ．Ｍ．ＪＥＯＵＮＧ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｒｅｄｉｔａｓ  １３７：２０−２８，２００２、Ｖ  Ｇｉｒｉｊａｓｈａｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ２４（９）：５１３−５２２，２００５、Ｚｕｏ−ｙｕ  Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４４：７８９−７９８，２０００、Ｓ．Ｇｕｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ２８（３）：４２９−４４４，２００９、ＺＹ  Ｚｈａｏ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  ３４３：２３３−２４４，２００６、ＡＫ  Ｓｈｒａｗａｔ  ａｎｄ  Ｈ  Ｌｏｒｚ，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ，４（６）：５７５−６０３，２００６、Ｄ  Ｓｙａｍａｌａ  ａｎｄ  Ｐ  Ｄｅｖｉ  Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ，４１（１２）：１４８２−１４８６，２００３、Ｚ  Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ，３（６）：５９１−５９９，２００５）。
【００５８】
さらに、シロイヌナズナであれば、Ａｋａｍａら（Ａｋａｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １２：７−１１，１９９２）の方法が挙げられ、本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００５９】
一旦、ゲノム内に本発明のＤＮＡが導入された植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。従って、本発明には、本発明のＤＮＡが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
【００６０】
また、本発明は、（Ｉ）前記本発明の抵抗性ＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを植物細胞に導入する工程、および（II)工程（Ｉ）において前記ＤＮＡまたは該ＤＮＡが挿入されたベクターが導入された形質転換植物細胞から植物体を再生する工程を含むことを特徴とする、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体の製造方法をも提供するものである。
【００６１】
さらに、本発明は、（Ｉ）４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するＲＮＡをコードする前記ＤＮＡ、または該ＤＮＡが挿入されたベクターを植物細胞に導入する工程、および（II)工程（Ｉ）において前記ＤＮＡまたは該ＤＮＡが挿入されたベクターが導入された形質転換植物細胞から植物体を再生する工程、を含むことを特徴とする、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物体の製造方法をも提供するものである。
【００６２】
＜植物における４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定する方法＞
本発明の、植物における４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定する方法は、被験植物における、本発明の抵抗性ＤＮＡ若しくは対応する感受性ＤＮＡ（以下、本発明の検出対象ＤＮＡと称する）、又はその発現制御領域の塩基配列を解析することを特徴とする。なお、「感受性ＤＮＡ」とは４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡのことである。
【００６３】
本発明の検出対象ＤＮＡは、典型的には、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡである。
（ａ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１又は１６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：２又は１７に記載のアミノ酸配列と６０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
なお、（ａ）から（ｄ）におけるＤＮＡの意味は、原則として、前記の通りであるが、本発明の検出対象ＤＮＡにおいては、特に、内因性のＤＮＡを意味し、また、抵抗性ＤＮＡおよび感受性ＤＮＡの双方が含まれる意味である。
【００６４】
後述の実施例において示すように、４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種である日本晴におけるＨＩＳ１遺伝子と比較して、４−ＨＰＰＤ阻害剤感受性品種であるモミロマン、タカナリ、カサラスにおける対応遺伝子の配列においては、塩基の挿入や欠失が認められる。従って、本発明の検出対象ＤＮＡの塩基配列を解析することによって、植物における４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定することができる。
【００６５】
また、後述の実施例において示すように、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性は劣性遺伝することから、本発明の検出対象ＤＮＡの発現量、並びにその発現量を制御する領域（エンハンサー、プロモータ−、サイレンサー、インスレーター）の塩基配列を解析することによって、植物における４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定することもできる。
【００６６】
本発明の検出対象ＤＮＡ又はその発現制御領域の塩基配列の解析に際しては、本発明の検出対象ＤＮＡまたはその発現制御領域をＰＣＲにより増幅した増幅産物を用いることができる。前記ＰＣＲを実施する場合において、用いられるプライマーは、本発明の検出対象ＤＮＡまたはその発現制御領域を特異的に増幅できるものである限り制限はなく、本発明の検出対象ＤＮＡまたはその発現制御領域の配列情報（例えば、配列番号：１）に基づいて適宜設計することができる。好適なプライマーとしては、配列番号：１３に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号：１４記載の塩基配列からなるプライマーが挙げられる。これらプライマーを適宜組み合わせて、本発明の検出対象ＤＮＡまたはその発現制御領域の特定の塩基配列を増幅することができる。
【００６７】
なお、被験植物の４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性の判定においては、例えば、「対照の塩基配列」と比較する工程を含むことができる。被験植物における本発明の検出対象ＤＮＡ又はその発現制御領域の塩基配列と比較する「対照の塩基配列」は、イネであれば、典型的には、４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種（例えば、日本晴、コシヒカリ、きたあおば、アキヒカリ、あきたこまち、ふくひびき、べこあおば、べこごのみ、夢あおば、北陸１９３号、リーフスター、たちすがた、クサノホシ、ホシアオバ、ニシアオバ、タチアオバ、まきみずほ、モグモグあおば、はまさり、ミナミユタカ）または４−ＨＰＰＤ阻害剤感受性品種（例えば、ハバタキ、タカナリ、モミロマン、ミズホチカラ、ルリアオバ、おどろきもち、兵庫牛若丸、カサラス、関東２３９号）における本発明の検出対象ＤＮＡ又はその発現制御領域の塩基配列である。
【００６８】
なお、本発明の感受性ＤＮＡの例として、タカナリ又はモミロマン由来の鉄・アスコルビン酸依存性酸化還元酵素遺伝子と推定される遺伝子（変異ＨＩＳ１遺伝子）の塩基配列を配列番号：１５に示す。
【００６９】
決定した被験植物における本発明の検出対象ＤＮＡ又はその発現制御領域の塩基配列と、４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種におけるそれらの塩基配列（例えば、配列番号：１、配列番号：１６）または４−ＨＰＰＤ阻害剤感受性品種におけるそれらの塩基配列（例えば、配列番号：１５）とを比較することにより、被験植物が４−ＨＰＰＤ阻害剤に対して抵抗性を有するか感受性を有するかを評価することができる。例えば、４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種における塩基配列（例えば、配列番号：１）と比較して、塩基配列において大きな相違がある場合（特に、新たな終止コドンの出現やフレームシフトにより、コードするタンパク質の分子量やアミノ酸配列に大きな変化が生じる場合）、被験植物は４−ＨＰＰＤ阻害剤に対して感受性を有している蓋然性が高いと判定される。
【００７０】
なお、本発明の判定方法における、被験植物からのＤＮＡの調製は、常法、例えば、ＣＴＡＢ法を用いて行うことができる。ＤＮＡを調製するための植物としては、成長した植物体のみならず、種子や幼植物体を用いることもできる。また、塩基配列の決定は、常法、例えば、ジデオキシ法やマキサム-ギルバート法などにより行なうことができる。塩基配列の決定においては、市販のシークエンスキットおよびシークエンサーを利用することができる。
【００７１】
被験植物における本発明の検出対象ＤＮＡまたはその発現制御領域の塩基配列が、対照の塩基配列と相違するか否かは、上記した直接的な塩基配列の決定以外に、種々の方法により間接的に解析することができる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用したＲＦＬＰ法やＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）、アレル特異的オリゴヌクレオチド（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法、リボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法が挙げられる。
【００７２】
本発明の、植物における４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定する別の方法は、被験植物における前記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つのＤＮＡの発現又は増幅産物若しくは発現産物の分子量を検出することを特徴とする。
【００７３】
後述の実施例において示すように、４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種である日本晴、コシヒカリ、北陸１９３号におけるＨＩＳ１遺伝子の第４エクソン前半領域は、４−ＨＰＰＤ阻害剤感受性品種であるモミロマンやタカナリにおけるそれらよりも長い。従って、本発明の検出対象ＤＮＡの増幅産物または発現産物の分子量を検出することによって、植物における４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定することができる。
【００７４】
また、後述の実施例において示すように、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性は劣性遺伝することから、本発明の検出対象ＤＮＡの発現を検出することによって、植物における４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定することができる。
【００７５】
ここで「ＤＮＡの発現の検出」には、転写レベルにおける検出および翻訳レベルにおける検出の双方を含む意である。また、「発現の検出」には、発現の有無の検出のみならず、発現の程度の検出も含む意である。
【００７６】
本発明の検出対象ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）の増幅は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により実施することができる。
【００７７】
本発明にかかるＤＮＡの転写レベルにおける検出は、常法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法やノーザンブロッティング法により実施することができる。前記ＰＣＲを実施する場合において用いられるプライマーは、本発明の検出対象ＤＮＡを特異的に増幅できるものである限り制限はなく、既に決定された本発明の抵抗性ＤＮＡ若しくは感受性ＤＮＡの配列情報（例えば、配列番号：１、配列番号：１６、配列番号：１５）に基づいて適宜設計することができる。好適なプライマーとしては、配列番号：３〜１４のいずれかに記載の塩基配列からなるプライマーが挙げられる。また、これらプライマーを適宜組み合わせて、本発明の検出対象ＤＮＡの特定の塩基配列を増幅することができる。
【００７８】
一方、翻訳レベルにおける検出は、常法、例えば、ウェスタンブロッティング法により、実施することができる。ウェスタンブロッティングに用いる抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、これら抗体の調製方法は、当業者に周知である。
【００７９】
また、本発明の検出対象ＤＮＡの発現は、本発明の検出対象ＤＮＡの発現制御領域の下流にレポーター遺伝子を発現可能に連結したベクターを構築し、当該ベクターを植物細胞に導入し、レポーター活性を検出することにより、判定することもできる。
【００８０】
遺伝子発現の検出の結果、被験植物において、本発明の検出対象ＤＮＡの発現量が４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種（例えば、イネにおいては、日本晴、コシヒカリ、きたあおば、アキヒカリ、あきたこまち、ふくひびき、べこあおば、べこごのみ、夢あおば、北陸１９３号、リーフスター、たちすがた、クサノホシ、ホシアオバ、ニシアオバ、タチアオバ、まきみずほ、モグモグあおば、はまさり、ミナミユタカ）の発現量よりも有意に低ければ（例えば、本発明の検出対象ＤＮＡが実質的に発現していなければ）、また、本発明の検出対象ＤＮＡの増幅産物または発現産物の分子量が４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種（例えば、日本晴、コシヒカリ、きたあおば、アキヒカリ、あきたこまち、ふくひびき、べこあおば、べこごのみ、夢あおば、北陸１９３号、リーフスター、たちすがた、クサノホシ、ホシアオバ、ニシアオバ、タチアオバ、まきみずほ、モグモグあおば、はまさり、ミナミユタカ）における分子量と有意に異なれば、被験植物は４−ＨＰＰＤ阻害剤に対して感受性を有している蓋然性が高いと判定される。実際、後述の実施例において示すように４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種（日本晴、コシヒカリ、北陸１９３号）の抵抗性ＤＮＡと比較して、４−ＨＰＰＤ阻害剤感受性品種（モミロマン、タカナリ）における感受性ＤＮＡの分子量は有意に小さい。
【００８１】
＜本発明の植物を育種する方法＞
本発明は、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物を育種する方法を提供する。かかる育種方法は、（ａ）４−ＨＰＰＤ阻害剤に対し抵抗性の植物品種と任意の植物品種とを交配させる工程、（ｂ）交配により得られた個体における、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を、上記本発明の判定方法により判定する工程、および（ｃ）４−ＨＰＰＤ阻害剤に対し抵抗性を有すると判定された品種を選抜する工程を含む。
【００８２】
また、本発明は、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性が高められた植物を育種する方法を提供する。かかる育種方法は、（ａ）４−ＨＰＰＤ阻害剤に対し感受性の植物品種と任意の植物品種とを交配させる工程、（ｂ）交配により得られた個体における、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を、上記本発明の判定方法により判定する工程、および（ｃ）４−ＨＰＰＤ阻害剤に対し感受性を有すると判定された品種を選抜する工程を含む。
【００８３】
４−ＨＰＰＤ阻害剤に対し抵抗性の植物品種と交配させる「任意の植物品種」としては、例えば、４−ＨＰＰＤ阻害剤感受性品種、４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種と４−ＨＰＰＤ阻害剤感受性品種との交配により得られた個体が挙げられるが、これらに制限されない。また、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対し感受性の植物品種と交配させる「任意の植物品種」としては、例えば、４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種、４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種と４−ＨＰＰＤ阻害剤感受性品種との交配により得られた個体が挙げられるが、これらに制限されない。４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性は劣性遺伝することから、交配により得られた個体が４−ＨＰＰＤ阻害剤に対し感受性を示すためには、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対し感受性型のＨＩＳ１遺伝子をホモで保有することが好ましい。
【００８４】
本発明の育種方法を利用すれば、４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性又は感受性の品種を、種子や幼植物の段階で選抜することが可能となり、当該形質を有する品種の育成を、短期間で行うことが可能となる。
【実施例】
【００８５】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、下記実施例は下記の通りに実験、解析を行った。【００８６】
＜ＱＴＬ解析＞
コシヒカリ／ハバタキ染色体断片置換系統、および、たちすがた／／たちすがた／モミロマンのＢＣ１Ｆ４を供試した。すなわち、抵抗性品種コシヒカリを遺伝的背景とし、その染色体断片の一部をインド型感受性品種ハバタキの染色体に置き換えたコシヒカリ／ハバタキ染色体断片置換系統群（ＫＨＳＬ）を解析した。なお、ＫＨＳＬは３２系統で構成され、ハバタキの全１２染色体のすべてについて解析が可能となっている（ＫＨＳＬについては、村田和優ら、「コシヒカリを遺伝的背景としたインド型品種ハバタキの染色体断片置換系統群の作出と評価」、育種学研究、２００９年３月２７日、第１１巻、別１号、６６ページ  参照のこと）。また、感受性品種モミロマンに抵抗性品種たちすがたを１回戻し交雑して得られたＢＣ１Ｆ４系統群９４系統もＳＳＲマーカー８０種を用いて解析した（用いたＳＳＲマーカーについては  「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ２２４０  ｎｅｗ  ＳＳＲ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｒｉｃｅ  （Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）」、ＤＮＡ  Ｒｅｓ、２００２年、９巻、６号、１９９〜２０７ページ  、並びにｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ／  参照のこと）。【００８７】
＜Ｔｏｓ１７挿入系統を用いた連鎖解析＞
イネにおいて発見されたレトロトランスポゾンであるＴｏｓ１７は、組織培養によって活性化され、ゲノム内に自らのコピーを転移させる。転移先が遺伝子の内部であった場合、その遺伝子は破壊され、突然変異を引き起こすことが知られている（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６年、９３巻、７７８３〜７７８８ページ  参照）。本実施例においては、この現象を利用して組織培養により作出された変異を蓄積したイネの集団（ミュータントパネル、データベース名：Ｔｏｓ１７ミュータントパネルデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｓ．ｎｉａｓ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／〜ｍｉｙａｏ／ｐｕｂ／ｔｏｓ１７／））を利用した。Ｔｏｓ１７ミュータントパネルデータベースから、ＱＴＬ解析で特定された遺伝子座にあるＢＢＣ感受性との関与が強く疑われる、鉄・アスコルビン酸酸化還元酵素遺伝子と推定される遺伝子の転写部位にＴｏｓ１７が挿入された２系統を選び出した。そして、これら２系統の各１５個体を栽培して得られた自殖種子を用いて、表現型（ＢＢＣ感受性）と遺伝子型（Ｔｏｓ１７の挿入）について調査した。【００８８】
＜遺伝子クローンの取得＞
ＱＴＬ解析で特定された遺伝子座にある鉄・アスコルビン酸依存性酸化還元酵素遺伝子と推定されるｍＲＮＡ（ＡＫ０６５５８１）をイネジーンバンクから入手した。【００８９】
＜ベクター構築および形質転換＞
ｎｏｓプロモーターでドライブされるカナマイシン抵抗性遺伝子（ＮＰＴ２）又はＣａＭＶ３５Ｓプロモーターでドライブされるハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ｍＨＰＴ）と、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターでドライブされるＡＫ０６５５８１（ＨＩＳ１遺伝子）又はＡＫ２４１９４８（ＨＳＬ１遺伝子）の各発現カセットとを連結したバイナリーベクターを構築し（図３〜７  参照）、アグロ法の形質転換に供試した。【００９０】
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの形質転換は、エコタイプ「Ｃｏｌｕｍｂｉａ」を用いて、Ｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐ法にて行った（Ｗｅｉｇｅｌ  ａｎｄ  Ｇｌａｚｅｂｒｏｏｋ，  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （２００２）  ｐ１３１−１３２  参照）。すなわち先ず、抗生物質を含む液体培地（ＬＢまたはＹＥＢ）においてアグロバクテリウムを振とう培養し、およそ１６時間後に培養液のうち２ｍｌを抗生物質を含む液体培地（ＬＢまたはＹＥＢ）に加え、さらに振とう培養した。そして、そのおよそ１６時間後、培養液を４℃、８０００ｒｐｍにて１０分間、遠心処理をし、上澄み液を捨て、得られた沈殿物を５％スクロースを含む液５００ｍｌに懸濁した。そして、形質転換の直前に形質転換用試薬  ｓｉｌｗｅｔ（登録商標：ＳＩＬＷＥＴ  Ｌ−７７、製品番号：ＢＭＳ−ＳＬ７７５５、バイオメディカルサイエンス社製）を最終濃度０．０２５％になるように加えた。次いで、得られたアグロバクテリウム懸濁液に、既に開花、受粉している花芽を除去したアラビドプシスを３０〜１２０秒間浸した。その後、およそ１６時間静置した後、植物体を生育させ、種子を得た。【００９１】
イネの形質転換は、ＢＢＣ感受性イネ品種関東２３９号を用いて、「Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．、２０１０年、２９巻、１１号、１２８７〜１２９５ページ」に記載の方法の一部を改変して行った。すなわち先ず、滅菌した完熟種子をＮ６Ｄ培地に置床し３０℃で７日間培養し、アグロバクテリウムを感染させ、アセトシリンゴン（ＡＳ）を含むＮ６培地（２Ｎ６−ＡＳ培地）暗黒条件下で３日間、２５℃共培養した。その後、感染した組織は、カルベニシリンを含むＮ６Ｄ培地で４〜６週間（１８時間日長）、４０ｍｇ／L  ハイグロマイシン（Ｈｙｇ）存在下で培養し、Ｈｙｇ耐性カルスを再分化させた。【００９２】
トマトの形質転換は、品種「マイクロトム」を供試し、図５及び７に示すベクター（３５ＳＨＩＳ１  ｐＺＫ３、３５ＳＨＳＬ１  ｐＺＫ３）を用いて、アグロバクテリウム法で実施した。なお、原品種マイクロトムは、２５℃のインキュベータで、０．３μＭのベンゾビシクロン（ＢＢＣ）を含む寒天培地で種子を発芽させると、約２週間後に葉部の白化が明瞭に確認できる。【００９３】
前記トマトの形質転換の結果、ＨＩＳ１遺伝子又はＨＳＬ１遺伝子が導入された複数の再分化植物体を得られた。また、再分化した植物体はＰＣＲによって導入遺伝子を確認した。【００９４】
＜組換え体のＢＢＣ抵抗性検定＞
作出したＡ．ｔｈａｌｉａｎａ組換え体（Ｔ２世代）およびイネ組換え体（Ｔ０世代）のＢＢＣ抵抗性検定には、株式会社エス・ディー・エス  バイオテック保有のＢＢＣ原体を後述の濃度にて用いた。【００９５】
＜組換え体のトリケトン系４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性の検定＞
作出したイネ組換え体（Ｔ１及びＴ２世代）のトリケトン系４−ＨＰＰＤ阻害剤、すなわちメソトリオン、テフリルトリオン、テンボトリオン及びＮＴＢＣ抵抗性検定には市販の各試薬を後述の濃度にて用いた。【００９６】
＜ＰＣＲ＞
ＨＩＳ１（ＡＫ０６５５８１）の５つの各エクソン領域内を特異的に増幅するプライマーを設計しＰＣＲに供試した。なお、ＰＣＲは、表１において示す塩基配列からなるプライマーを用いて、９４℃  ３０秒、５５℃  ３０秒、７２℃  ３０秒の３５サイクルにて行った。また、鋳型ＤＮＡとしては、ＢＢＣ感受性イネ品種（モミロマン、タカナリ、カサラス）およびＢＢＣ抵抗性イネ品種（日本晴、コシヒカリ、北陸１９３号）の葉からＣＴＡＢ法を用いて抽出したゲノムＤＮＡを用いた。【００９７】
【表１】
2012090950.tif 000002
【００９８】
（実施例１）  ４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性遺伝子座の特定
ジャポニカ型イネの中で、４−ＨＰＰＤ阻害剤の一種であるＢＢＣに対する感受性を有する品種は知られていない。一方、ジャポニカ型とインディカ型の交雑により育成されたイネ品種にはＢＢＣ感受性が出現することがある。【００９９】
そこで、ＢＢＣ抵抗性イネ品種「コシヒカリ」と感受性イネ品種「ハバタキ」とを用いた、コシヒカリ／ハバタキ染色体断片置換系統（ＫＨＳＬ）のＱＴＬ解析を前記の通り行った。その結果、第２染色体短腕領域がハバタキ型に置換されたＫＨＳＬ（ＫＨＳＬ０４）のみが感受性を示したことから、ＢＢＣ抵抗性を決定する遺伝子座はコシヒカリの第２染色体短腕上にあることが明らかになった（表２  参照）。なお、表２にはＫＨＳＬのＱＴＬ解析の結果の一部を示す。また、表２中「Ａ」はマーカーがコシヒカリ由来であることを示し、「Ｂ」はマーカーがハバタキ由来であることを示す。【０１００】
【表２】
2012090950.tif 000003
【０１０１】
さらに、ＢＢＣ抵抗性イネ品種「たちすがた」と感受性イネ品種「モミロマン」とを用いた、たちすがた／／たちすがた／モミロマンのＢＣ１Ｆ４のＱＴＬ解析を前記の通り行った。その結果、前記同様にＢＢＣ抵抗性を決定する遺伝子座はたちすがたの第２染色体短腕上にあることが明らかになり、異なるイネ品種を供試したＱＴＬ解析で特定された遺伝子座は同一領域であり、イネ品種「日本晴」データベース情報によると、１１種の候補遺伝子が存在することが確認された（表３  参照）。【０１０２】
【表３】
2012090950.tif 000004
【０１０３】
また、１１種の候補遺伝子の塩基配列及び推定アミノ酸配列はいずれも、ＢＢＣで影響を受けるチロシン代謝経路およびカロテノイド生合成経路（図１  参照）の酵素及びその遺伝子と相同性がないことも明らかになった。【０１０４】
なお、イネ品種「日本晴」データベース情報によると、ＢＢＣで活性阻害を受けるＨＰＰＤ酵素をコードする既知遺伝子ともっとも相同性の高いイネ遺伝子は第２染色体短腕上にあるが、ＱＴＬ解析で特定された遺伝子座とは異なっていた（図８  参照）。【０１０５】
さらに、ＢＢＣ抵抗性に関与する遺伝子が座乗する領域を絞り込むため、ＫＨＳＬ０４とコシヒカリとを交雑したＦ２集団、およびモミロマンにたちすがたを１回戻し交雑して得られたＢＣ１Ｆ４系統群から第２染色体短腕に関する解析集団を作出し、２集団を用いて再度の解析を試みた結果、ＢＢＣ抵抗性に関与する遺伝子はＳＳＲマーカーＲＭ１２９８０とＲＭ１２９８３との間に存在することが明らかとなった。そして、絞り込んだ領域に存在する遺伝子をＲＡＰ−ＤＢより検索した結果、グリオキサラーゼ  類似タンパク質（７４１ｂｐ）を除く、１０個の候補遺伝子の存在が確認された。【０１０６】
（実施例２）  ４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性遺伝子の同定
前述の通り、ＱＴＬ解析によって４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を決定する遺伝子がイネ第２染色体短腕上にあることが示唆された。そこで当該遺伝子座にある鉄・アスコルビン酸依存性酸化還元酵素遺伝子と推定される遺伝子に注目し、Ｔｏｓ１７挿入系統を供試して表現型（ＢＢＣ高感受性）と遺伝子型との連鎖関係を明らかにするとともに、ＢＢＣ感受性のＡ．ｔｈａｌｉａｎａ及びイネに当該遺伝子を導入した組換え体を作出し、ＢＢＣ抵抗性付与効果を調査した。【０１０７】
すなわち、ＱＴＬ解析で特定されたＢＢＣ抵抗性決定遺伝子座には、ＢＢＣで活性阻害されるＨＰＰＤ酵素と同様、鉄・アスコルビン酸依存性酸化還元酵素と推定される遺伝子（以下、「標的遺伝子」とも称する）がある（表４  参照）。【０１０８】
【表４】
2012090950.tif 000005
【０１０９】
Ｔｏｓ１７挿入系統の原品種「日本晴」はＢＢＣ抵抗性品種であるが、標的遺伝子の転写部位にＴｏｓ１７が挿入された系統ではＢＢＣ感受性個体が出現する。合計３０個体を供試した連鎖解析により、表現型（ＢＢＣ感受性）と遺伝子型（Ｔｏｓ１７挿入ホモ型）について調査した結果、Ｔｏｓ１７挿入ホモ６個体の後代はすべてＢＢＣ感受性を示した。また、Ｔｏｓ１７挿入ヘテロ１８個体の後代からは、すべてＢＢＣ感受性の個体を分離した。この結果から、鉄・アスコルビン酸酸化還元酵素遺伝子と推定される遺伝子がＢＢＣ抵抗性に深く関与することが示唆された。【０１１０】
そこで、標的遺伝子がＢＢＣ抵抗性遺伝子であることを実証するため、０．０３μＭのＢＢＣを含む寒天培地で白化するＡ．ｔｈａｌｉａｎａ（エコタイプＣｏｌｕｍｂｉａ）に標的遺伝子を導入した組換え体（Ｔ２世代）を作製し、前記ＢＢＣ濃度の存在下におけるこの組換え体の生育状況を調べた。得られた結果を図９に示す。【０１１１】
また、０．１μＭのＢＢＣを含む寒天培地で白化するＢＢＣ感受性イネ品種「関東２３９号」に標的遺伝子を導入した組換え体（Ｔ０世代）を作製し、３００ｇａ．ｉ．／ｈａのＢＢＣで処理した培土におけるこの組換え体の生育状況を調べた。得られた結果を図１０に示す。【０１１２】
さらに、０．１μＭのＢＢＣを含む寒天培地で白化するＢＢＣ感受性イネ品種「関東２３９号」に標的遺伝子を導入した組換え体を作製し、Ｔ１種子又はＴ２種子を得た。これらを２μＭのＢＢＣを含む寒天培地に播種し組換え体の生育状況を調べた。得られた結果を図１１に示す。また、前記種子を１μＭのメソトリオン、２．５μＭのテフリルトリオン、０．５μＭのテンボトリオン又は１μＭのＮＴＢＣを含む寒天培地に播種し組換え体の生育状況を調べた。得られた結果を図１２〜１５に示す。【０１１３】
図９に示した結果から明らかなように、標的遺伝子を導入した前記Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ組換え体は、０．０３μＭのＢＢＣを含む寒天培地で白化せず生育した。また図１０に示した結果から明らかなように、標的遺伝子を導入した前記イネ組換え体は、３００ｇａ．ｉ．／ｈａのＢＢＣで処理した培土で白化せずに生育した。さらに、図１１に示した結果から明らかなように、標的遺伝子を導入した前記イネ組換え体は、２μＭのＢＢＣで処理した寒天培地で白化せずに生育した。なお、この濃度はＢＢＣ抵抗性品種である日本晴を白化させる高濃度である。【０１１４】
また、図１２〜１５に示した結果から明らかなように、標的遺伝子を導入した前記イネ組換え体は、ＢＢＣ以外のトリケトン系４−ＨＰＰＤ阻害剤（メソトリオン、テフリルトリオン、テンボトリオン又はＮＴＢＣ）を含む培地においても白化せずに生育した。すなわち、標的遺伝子を導入したイネ組換え体は、１μＭのメソトリオン、２．５μＭのテフリルトリオン、０．５μＭのテンボトリオン又は１μＭのＮＴＢＣで処理した寒天培地で白化せずに生育した。【０１１５】
これらの結果から、標的遺伝子は４−ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性遺伝子（ＨＩＳ１遺伝子）、すなわち４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることが実証された。【０１１６】
（実施例３）  ＨＩＳ１遺伝子の塩基配列解析による４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性の判定
日本型イネ第２染色体にあるＨＩＳ１遺伝子は特定されたが、ＨＩＳ１遺伝子を増幅するＰＣＲを行うと、ＢＢＣ感受性イネ品種においても増幅産物は得られる。またＢＢＣ感受性イネ品種のなかでカサラスは、ＢＢＣ処理条件によっては感受性・抵抗性の判定が困難な場合がある。そこで、ＨＩＳ１遺伝子の特定領域を増幅するＰＣＲにより、ＨＩＳ１遺伝子の塩基配列とＢＢＣ感受性の程度との関連の有無を判定できるかどうかを調べた。【０１１７】
なお、図には示さないが、モミロマン、タカナリ、カサラスはいずれもＢＢＣ感受性品種であるが、その程度が異なり、カサラスのＢＢＣ感受性と比較して、モミロマン及びタカナリはより強いＢＢＣ感受性を示すことは確認している。【０１１８】
そこで先ずは、ＨＩＳ１遺伝子の５つの各エクソン領域内を特異的に増幅するプライマーを用いたＰＣＲによって、ＢＢＣ感受性品種（モミロマン、タカナリ、カサラス）とＢＢＣ抵抗性品種（日本晴、コシヒカリ、北陸１９３号）とを解析した。得られた結果は図１６に示す。【０１１９】
図１６に示した結果から明らかなように、ＨＩＳ１遺伝子の第４エクソンの前半部分を特異的に増幅するプライマーを用いたＰＣＲにて解析した結果、ＢＢＣ強感受性品種のモミロマン及びタカナリではＢＢＣ抵抗性品種と比較して、ＰＣＲ産物の分子量が小さいことが分かった。【０１２０】
さらに、ＢＢＣ感受性品種  モミロマン及びタカナリと、ＢＢＣ抵抗性品種  日本晴とをゲノムＤＮＡの配列において比較した。得られた結果は図１７に示す。【０１２１】
図１７に示した結果から明らかなように、前述のＰＣＲの解析結果と合致して、モミロマン及びタカナリにおいては、ＨＩＳ１遺伝子の第４エクソンの前半部分において２８ｂｐが欠失していることが分かった。さらに、ＨＩＳ１遺伝子の第４エクソンと第５エクソンとの間のイントロンにおいても、１９ｂｐ及び１６ｂｐの欠失部位があることは明らかになった。また、ＨＩＳ１遺伝子の第５エクソンにおいては、１ｂｐ（アデニン）の欠失と５ｂｐの挿入とがあることも確認された。【０１２２】
また、ＢＢＣ感受性品種  カサラスと、ＢＢＣ抵抗性品種  日本晴とをゲノムＤＮＡの配列において比較した。得られた結果は図１８に示す。【０１２３】
図１８に示した結果から明らかなように、前述のＰＣＲの解析結果と合致して、カサラスにおいては、ＨＩＳ１遺伝子の第４エクソンの前半部分における欠失は認められなかった。しかし、ＨＩＳ１遺伝子の第４エクソンと第５エクソンとの間のイントロンにおいては、ＴＡの挿入と１６ｂ．ｐ．の欠失部位とがあることが明らかになった。また、ＨＩＳ１遺伝子の第５エクソンにおいては、アデニンの欠失、５ｂｐの挿入、及びシトシンの挿入があることも確認された。【０１２４】
従って、かかる結果から、ＨＩＳ１遺伝子の第４エクソンから第５エクソンにかけての塩基の欠失及び／又は挿入によって、ＨＩＳ１遺伝子がコードするタンパク質が有する４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性が抑制されていることが明らかになった。また、モミロマン及びタカナリと、カサラスとの４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する感受性の相違は、ＨＩＳ１遺伝子の第４エクソンの前半部分における欠失の有無等に起因するものだと考えられる。【０１２５】
（実施例４）  ＨＩＳ１遺伝子と相同性を有する遺伝子の解析
次に、ＨＩＳ１遺伝子と相同性を有する遺伝子をデータベースにて探索した。すなわち、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔを用い、ＨＩＳ−１遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をクエリーとしてｔＢＬＡＳＴＮ検索（デフォルト設定）を行った。なお、サーチ対象データはｎｒ／ｎｔ（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）である。【０１２６】
その結果、ＨＩＳ１遺伝子と最も相同性の高いイネ遺伝子（ＨＳＬ１遺伝子）は第６染色体に座乗し、推定アミノ酸配列の相同性は約８６％と高いことが明らかになった（図１９  参照）。また、第６染色体上の相同遺伝子は近傍で多重遺伝子群（クラスター）を形成していることも明らかになった。【０１２７】
しかしながら、これらの第６染色体上の相同遺伝子がコードするタンパク質は、ＨＩＳ１遺伝子に変異が生じている感受性品種においても発現していると推定される。【０１２８】
この点に関しては、図２０に示す通り、ＨＩＳ１遺伝子は主に葉で発現しているが、第６染色体上の相同遺伝子は主に根や登熟中の種子で発現していることから、第６染色体上の相同遺伝子がコードするタンパク質は、潜在的に４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有しているが、葉での発現量が低いためその効果が現れていないという可能性が考えられる
なお図２０は、ＲｉｃｅＸＰｒｏ（イネ遺伝子発現データベース／ｈｔｔｐ：／／ｒｉｃｅｘｐｒｏ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／）を用いて、ＨＩＳ１（Ｏｓ０２ｇ０２８０７００）と第６染色体上の相同遺伝子（Ｏｓ０６ｇ０１７６７００／Ｏｓ０６ｇ０１７８５００）の組織・生育時期別の発現パターンを解析した結果に基づく（Ｓａｔｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１０年１１月２日［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］  参照）。【０１２９】
また、ＨＩＳ１遺伝子の相同遺伝子は単子葉植物のみに散在し、双子葉植物においては確認されないことが明らかになった（図２１  参照）。さらに、ＨＩＳ１遺伝子と相同性がやや低い遺伝子群は、エチレン合成系ＡＣＣオキシダーゼ遺伝子群をはじめ植物全般に分布しているが、機能的には異なると考えられる。なお図２１は、ｔＢＬＡＳＴＮ解析により、ＨＩＳ１と相同性を持つタンパク質のアミノ酸配列を抽出し、得られた配列をもとに、ＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェアを用いて系統樹解析を行い、ＴｒｅｅＶｉｅｗソフトウェアによって描画したものである。【０１３０】
（実施例５）  ＨＳＬ１遺伝子の解析
ＨＩＳ１遺伝子と最も相同性高く、第６染色体に座乗するイネ遺伝子（ＨＳＬ１遺伝子）についても、４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであるかどうかを調べた。【０１３１】
すなわち、０．１μＭのＢＢＣを含む寒天培地で白化するＢＢＣ感受性イネ品種「関東２３９号」に標的遺伝子を導入した組換え体を作製し、Ｔ１種子又はＴ２種子を得た。これらを０．１２μＭのＢＢＣを含む寒天培地に播種し組換え体の生育状況を調べた。得られた結果を図２２に示す。【０１３２】
図２２に示した結果から明らかなように、相同遺伝子を導入したイネ組換え体は０．１２μＭのＢＢＣを含む寒天培地で白化せずに生育した。この濃度はＢＢＣ抵抗性品種「日本晴」が白化しない濃度である。この結果から、耐性の程度は低いものの、ＨＳＬ１遺伝子はＨＩＳ１遺伝子と同様に４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を植物に付与する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることが実証された。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明の４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物を用いて栽培を行えば、栽培田や栽培畑の雑草防除を効率的に行うことができる。また、本発明の植物における４−ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を判定する方法は、例えば、輪作体系における前年作のこぼれ種の発芽リスクの軽減に利用することができる。このように、本発明は、有用植物の収穫量の安定や増大に大きく貢献し得るものである。
【配列表フリーテキスト】
【０１３４】
配列番号３〜１４
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列
【図１】
2012090950.tif 000006
【図２】
2012090950.tif 000007
【図３】
2012090950.tif 000008
【図４】
2012090950.tif 000009
【図５】
2012090950.tif 000010
【図６】
2012090950.tif 000011
【図７】
2012090950.tif 000012
【図８】
2012090950.tif 000013
【図９】
2012090950.tif 000014
【図１０】
2012090950.tif 000015
【図１１】
2012090950.tif 000016
【図１２】
2012090950.tif 000017
【図１３】
2012090950.tif 000018
【図１４】
2012090950.tif 000019
【図１５】
2012090950.tif 000020
【図１６】
2012090950.tif 000021
【図１７】
2012090950.tif 000022
【図１８】
2012090950.tif 000023
【図１９】
2012090950.tif 000024
【図２０】
2012090950.tif 000025
【図２１】
2012090950.tif 000026
【図２２】
2012090950.tif 000027
【配列表】
2012090950000001.app
【国際調査報告】
2012090950.tif 000028
2012090950.tif 000029
2012090950.tif 000030
2012090950.tif 000031
2012090950.tif 000032