(57)【要約】  下記一般式（Ｉ）：【化１】2012036257.tif 000060［式中、Ｘは、フェニレン基；Ｙは、水素原子、または−（ＣＨ２）ｍＲ１；ｍは０〜４のいずれかの整数；Ｒ１は、−ＮＲ５ＣＯＲ２、−ＮＲ５ＳＯ２Ｒ２、または−ＮＲ３Ｒ４；Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アリール基、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシ基等；Ｒ３およびＲ４は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基等；Ｒ５は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基等；Ｚは、水素原子またはＣ１〜Ｃ６アルキル基を示す。］で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分とする、血小板の機能を維持するための組成物。
2012036257.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）：
【化１】
2012036257.tif 000050
［式中、Ｘは、フェニレン基；
Ｙは、水素原子、または−（ＣＨ２）ｍＲ１；
ｍは０〜４のいずれかの整数；
Ｒ１は、
【化２】
2012036257.tif 000051
Ｒ２は、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシ基；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、あるいはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい；
Ｒ５は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、またはＣ１〜Ｃ６アルキルスルホニル基；
Ｚは、水素原子またはＣ１〜Ｃ６アルキル基を示す。］
で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分とする、血小板の機能を維持するための組成物。
【請求項２】
前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物が、
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、または
Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド、
である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
血小板の機能を維持するための試薬または血小板を含む血液製剤への添加剤である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に、下記一般式（Ｉ）：
【化３】
2012036257.tif 000052
［式中、Ｘは、フェニレン基；
Ｙは、水素原子、または−（ＣＨ２）ｍＲ１；
ｍは０〜４のいずれかの整数；
Ｒ１は、
【化４】
2012036257.tif 000053
Ｒ２は、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシ基；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、あるいはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい；
Ｒ５は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、またはＣ１〜Ｃ６アルキルスルホニル基；
Ｚは、水素原子またはＣ１〜Ｃ６アルキル基を示す。］
で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を添加することを特徴とする、血小板を調製するための方法。
【請求項５】
前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物が、
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、または
Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド、
である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記培養系における培養温度が３５〜３８℃であることを特徴とする、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に、下記一般式（Ｉ）：
【化５】
2012036257.tif 000054
［式中、Ｘは、フェニレン基；
Ｙは、水素原子、または−（ＣＨ２）ｍＲ１；
ｍは０〜４のいずれかの整数；
Ｒ１は、
【化６】
2012036257.tif 000055
Ｒ２は、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシ基；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、あるいはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい；
Ｒ５は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、またはＣ１〜Ｃ６アルキルスルホニル基；
Ｚは、水素原子またはＣ１〜Ｃ６アルキル基を示す。］
で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を添加した培養物。
【請求項８】
前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物が、
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、または
Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド、
である、請求項７に記載の培養物。
【請求項９】
下記一般式（Ｉ）：
【化７】
2012036257.tif 000056
［式中、Ｘは、フェニレン基；
Ｙは、水素原子、または−（ＣＨ２）ｍＲ１；
ｍは０〜４のいずれかの整数；
Ｒ１は、
【化８】
2012036257.tif 000057
Ｒ２は、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシ基；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、あるいはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい；
Ｒ５は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、またはＣ１〜Ｃ６アルキルスルホニル基；
Ｚは、水素原子またはＣ１〜Ｃ６アルキル基を示す。］
で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物が添加された、血小板を含む血液製剤。
【請求項１０】
前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物が、
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、または
Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド、
である、請求項９に記載の血液製剤。
【請求項１１】
下記一般式（Ｉ）：
【化９】
2012036257.tif 000058
［式中、Ｘは、フェニレン基；
Ｙは、水素原子、または−（ＣＨ２）ｍＲ１；
ｍは０〜４のいずれかの整数；
Ｒ１は、
【化１０】
2012036257.tif 000059
Ｒ２は、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシ基；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、あるいはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい；
Ｒ５は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、またはＣ１〜Ｃ６アルキルスルホニル基；
Ｚは、水素原子またはＣ１〜Ｃ６アルキル基を示す。］
で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を、血小板を含む血液製剤に添加することを特徴とする、血液製剤における血小板の機能を維持するための方法。
【請求項１２】
前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物が、
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、または
Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド、
である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−ヒドロキシホルムアミド誘導体を利用した、血小板の機能を維持するための組成物、血小板を調製するための方法、血小板を含む血液製剤、並びに血液製剤における血小板の機能を維持するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
白血病に代表される血液関連疾患の治療に対し、治療に必要な量の血球細胞を安定に増殖させて供給することは極めて重要なことであるため、これまでに多くの研究者によって、造血幹細胞又は造血前駆細胞を効率的に増殖させようとする試みがなされてきた。【０００３】
血球細胞の中で巨核球は、血小板前駆細胞、すなわち血小板を産生せしめる細胞でありｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ（胞体突起）構造を経て血小板を産生することが知られており、治療的な応用において重要な位置づけにある。血小板は血液凝固（止血）において必須であるため、白血病、骨髄移植、抗癌治療などにおける需要が極めて高い。【０００４】
血小板の生産においては、これまでドナーからの献血により採取する方法の他、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）を投与する方法の利用や、臍帯血又は骨髄細胞から巨核球を分化させる方法の利用などが試みられてきた。最近では、造血前駆細胞を生体外において増殖させ、これらの前駆細胞から血小板を調製する方法なども試みられるようになった。例えば、本発明者らは、ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）から造血前駆細胞を内包するネット様構造物を調製し、このネット様構造物から比較的大量かつ効率的に血小板の産生を行う方法（特許文献１）や、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）からインビトロの培養系により、成熟巨核細胞および血小板を効率的に調製する方法（特許文献２）等を報告している。【０００５】
このように、血小板自体を細胞外において調製する方法の研究は進展しているものの、調製された血小板の機能は安定性に乏しいことから、長期保存に耐えうる機能的血小板を大量に調製しうる方法の開発が必要とされている。【０００６】
血小板と細胞外マトリックスとの結合は、血液凝固（止血、血栓形成など）が誘導される上で重要な過程である。この過程は、血小板受容体ＧＰＩｂが、αサブユニット（ＧＰＩｂα）を介してフォン・ウィルブランド因子（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＷＦ）と結合することよって、開始されると考えられている。しかしながら、３７℃付近の条件下においては、メタロプロテアーゼのＡＤＡＭ１７（ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  １７）がＧＰＩｂαの細胞外領域をシェディング（Ｓｈｅｄｄｉｎｇ、切断して除去）してしまうことにより、ＧＰＩｂαとＶＷＦとの会合が阻害され、血小板の血液凝固機能が失われてしまうことが報告されている（非特許文献１及び非特許文献２）。【０００７】
このためインビトロにおいて調製した血小板の機能を保持するためには、少なくともＡＤＡＭ１７の活性を抑制する必要があることが予想される。実際、本発明者らによって、メタロプロテアーゼ活性を直接阻害する阻害剤（ＧＭ６００１等）、あるいは、ＡＤＡＭ１７等のメタロプロテアーゼ活性の活性化を間接的に阻害するｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を、タイミング良く添加することにより、インビトロにおいて調製した血小板の機能を保持することができることが報告されている（特許文献３）。【０００８】
しかしながら、ＧＭ６００１等の阻害剤はＡＤＡＭ１７のみならず、他のメタロプロテアーゼ（特に造血機能に必須なＭＭＰ９やＭＭＰ１４）の活性も阻害してしまうため、これら阻害剤を利用したインビトロでの血小板の調製においては、これら阻害剤を血小板産生が最も観察される一定時期に添加することが必要であった。一貫性及び再現性が乏しい細胞培養においてそのタイミングを見計らうといった煩雑な作業を要するため、これら阻害剤を利用した血小板の調製方法は、機能的血小板を大量に調製するという点、特に血小板産生系のプラント化においては、未だ十分なものではなかった。【０００９】
さらに、非選択的なメタロプロテアーゼ阻害剤は，膜型及び遊離型メタロプロテアーゼやＡＤＡＭ等、すべてのメタロプロテアーゼ活性を阻害してしまう為に、生体内部での使用によって、各種の副作用（臓器毎に作用する必須ＭＭＰあるいはＡＤＡＭを阻害する事による弊害）が発揮される危険性が生じると考えられている。実際に、非選択的なメタロプロテアーゼ阻害剤は、筋骨格シンドロームと呼ばれる重篤な副作用を引き起こすため、これら多くの阻害剤の開発は中止に至っている（非特許文献３）。また、ＧＭ６００１のようなヒドロキサム酸構造を有する阻害剤は、変異原性を有することが示唆されている（非特許文献４）。従って、かかる阻害剤を用いた方法によって得られた血小板は、安全性という点においても、未だ十分なものではなかった。【００１０】
一方、現在のところ、生体から調製した血小板を保存する方法としては、２０℃から２４℃において攪拌しながら保存する方法以外に有効な方法が存在しないことから、血小板の機能を保持するためにＡＤＡＭ１７のメタロプロテアーゼ活性を抑制する方法を利用する場合も、かかる室温（２０℃から２４℃）条件下において血小板の調製を行うことが有効であるとも考えられる。しかしながら、これまでのところ、室温条件下において、臍帯血又は骨髄細胞から巨核球に分化させることが可能であるかどうか、また、ＥＳ細胞等に由来する造血前駆細胞から血小板を産生させることが可能であるかどうかについては何ら検証がなされていない。【００１１】
以上のように、血小板の機能を維持するための組成物の有効成分として実用化可能な化合物は未だ見出されておらず、このため、機能的に安定した血小板をインビトロにおいて取得するための方法、特に安全性の高い血小板の大量生産に適した方法が確立されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開２００８／０４１３７０号
【特許文献２】国際公開２００９／１２２７４７号
【特許文献３】国際公開２００９／１１９１０５号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、９５巻、６６０〜６７０ページ
【非特許文献２】Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、２００３年、１０２巻、４２２９〜４２３５ページ
【非特許文献３】Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．、２００６年、６９巻、６７７〜６８７ページ
【非特許文献４】Ｓｋｉｐｐｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９８０年、４０巻、４７０４〜４７０８ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＡＤＡＭ１７のメタロプロテアーゼ活性を特異的に抑制し、ＧＰＩｂαのシェディングを抑制することによって、血小板の機能を維持することを可能とする化合物を同定することにある。さらなる本発明の目的は、同定した化合物を利用して血小板の機能を維持する組成物を提供すること、効率的に血小板を産生すること、および血液製剤の品質維持の向上を図ることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等に由来する造血前駆細胞から巨核球への分化誘導や、該巨核球からの血小板産生は、２５℃の室温条件での培養では行うことができず、３７℃付近の培養条件が好ましいことを見出した。そこで、本発明者らは、次に、３７℃付近の培養において生じるＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂαのシェディングを特異的に抑制しうる化合物の探索を行った。その結果、特定の構造を有するＮ−ヒドロキシホルムアミド誘導体が、ＡＤＡＭ１７に対して特異的な阻害作用を有し、血小板を産生させる培養系やヒト末梢血由来の血小板に添加した場合、ＧＰＩｂαのシェディングが抑制され、３７℃付近の温度条件下においても血小板の機能が維持されることを見出した。本発明者らは、同定したＮ−ヒドロキシホルムアミド誘導体のこのような作用から、当該誘導体が効率的な血小板の産生や血小板を含む血液製剤の品質維持の向上などにおいて極めて有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１６】
本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）下記一般式（Ｉ）：【００１７】
【化１】
2012036257.tif 000003
【００１８】
［式中、Ｘは、フェニレン基；
Ｙは、水素原子、または−（ＣＨ２）ｍＲ１；
ｍは０〜４のいずれかの整数；
Ｒ１は、【００１９】
【化２】
2012036257.tif 000004
【００２０】
Ｒ２は、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシ基；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、あるいはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい；
Ｒ５は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、またはＣ１〜Ｃ６アルキルスルホニル基；
Ｚは、水素原子またはＣ１〜Ｃ６アルキル基を示す。］
で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分とする、血小板の機能を維持するための組成物。
（２）前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物が、
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、または
Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド、
である、（１）に記載の組成物。
（３）血小板の機能を維持するための試薬または血小板を含む血液製剤への添加剤である、（１）または（２）に記載の組成物。
（４）巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に、下記一般式（Ｉ）：【００２１】
【化３】
2012036257.tif 000005
【００２２】
［式中、Ｘは、フェニレン基；
Ｙは、水素原子、または−（ＣＨ２）ｍＲ１；
ｍは０〜４のいずれかの整数；
Ｒ１は、【００２３】
【化４】
2012036257.tif 000006
【００２４】
Ｒ２は、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシ基；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、あるいはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい；
Ｒ５は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、またはＣ１〜Ｃ６アルキルスルホニル基；
Ｚは、水素原子またはＣ１〜Ｃ６アルキル基を示す。］
で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を添加することを特徴とする、血小板を調製するための方法。
（５）前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物が、
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、または
Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド、
である、（４）に記載の方法。
（６）前記培養系における培養温度が３５〜３８℃であることを特徴とする、（４）または（５）に記載の方法。
（７）巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に、下記一般式（Ｉ）：【００２５】
【化５】
2012036257.tif 000007
【００２６】
［式中、Ｘは、フェニレン基；
Ｙは、水素原子、または−（ＣＨ２）ｍＲ１；
ｍは０〜４のいずれかの整数；
Ｒ１は、【００２７】
【化６】
2012036257.tif 000008
【００２８】
Ｒ２は、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシ基；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、あるいはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい；
Ｒ５は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、またはＣ１〜Ｃ６アルキルスルホニル基；
Ｚは、水素原子またはＣ１〜Ｃ６アルキル基を示す。］
で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を添加した培養物。
（８）前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物が、
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、または
Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド、
である、（７）に記載の培養物。
（９）下記一般式（Ｉ）：【００２９】
【化７】
2012036257.tif 000009
【００３０】
［式中、Ｘは、フェニレン基；
Ｙは、水素原子、または−（ＣＨ２）ｍＲ１；
ｍは０〜４のいずれかの整数；
Ｒ１は、【００３１】
【化８】
2012036257.tif 000010
【００３２】
Ｒ２は、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシ基；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、あるいはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい；
Ｒ５は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、またはＣ１〜Ｃ６アルキルスルホニル基；
Ｚは、水素原子またはＣ１〜Ｃ６アルキル基を示す。］
で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物が添加された、血小板を含む血液製剤。
（１０）前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物が、
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、または
Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド、
である、（９）に記載の血液製剤。
（１１）下記一般式（Ｉ）：【００３３】
【化９】
2012036257.tif 000011
【００３４】
［式中、Ｘは、フェニレン基；
Ｙは、水素原子、または−（ＣＨ２）ｍＲ１；
ｍは０〜４のいずれかの整数；
Ｒ１は、【００３５】
【化１０】
2012036257.tif 000012
【００３６】
Ｒ２は、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシ基；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、あるいはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい；
Ｒ５は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、またはＣ１〜Ｃ６アルキルスルホニル基；
Ｚは、水素原子またはＣ１〜Ｃ６アルキル基を示す。］
で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を、血小板を含む血液製剤に添加することを特徴とする、血液製剤における血小板の機能を維持するための方法。
（１２）前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物が、
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、または
Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド、
である、（１１）に記載の方法。
【発明の効果】
【００３７】
本発明において見出されたＮ−ヒドロキシホルムアミド誘導体によれば、ＡＤＡＭ１７のメタロプロテアーゼ活性を特異的に抑制し、ＧＰＩｂαのシェディングを抑制することによって、３７℃付近の温度条件下においても血小板の機能を維持することが可能である。従って、当該誘導体によれば、インビトロにおいて、機能的に安定した血小板を大量に生産することが可能であり、また、血小板を含む血液製剤の品質の安定化を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】室温条件下における、ＥＳ細胞等由来の造血前駆細胞から巨核球／血小板への誘導方法を示す概略図である。
【図２】室温条件下での培養において、ＥＳ細胞由来の造血前駆細胞から産生された巨核球数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数／ｗｅｌｌである。
【図３】室温条件下での培養において、ＥＳ細胞由来の造血前駆細胞から産生された血小板の総数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数／ｗｅｌｌである。
【図４】室温条件下での培養において、臍帯血由来のＣＤ３４(＋）細胞から産生された巨核球数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数／ｗｅｌｌである。
【図５】室温条件下での培養において、臍帯血由来のＣＤ３４(＋）細胞から産生された血小板の総数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数／ｗｅｌｌである。
【図６】＜プロトコール１＞は、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞由来の造血前駆細胞から巨核球／血小板への誘導する過程において、本発明にかかる化合物（Ｓ−４５２８２又はＳ−４５４５７）等を添加した時期を示す。＜プロトコール２＞は、ヒトの末梢血から洗浄血小板を調製し、本発明にかかる化合物（Ｓ−４５２８２又はＳ−４５４５７）等を添加したことを示す。
【図７】ＧＭ６００１又はＳ−４５２８２を２日間培養系に添加した際（２ｄａｙｓ）の、各化合物のＥＳ細胞由来血小板に対する機能維持効果について検証した結果を示すグラフである。縦軸は血小板総数（ＣＤ４１（＋））を１００とした時の、ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（＋）およびＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（−）の割合（％）を表す。
【図８】ＧＭ６００１又はＳ−４５２８２を２日間培養系に添加した際（２ｄａｙｓ）に得られたＥＳ細胞由来血小板の総数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数／ｗｅｌｌである。
【図９】ＧＭ６００１又はＳ−４５２８２を８日間培養系に添加した際（８ｄａｙｓ）の、各化合物のＥＳ細胞由来血小板に対する機能維持効果について検証した結果を示すグラフである。縦軸は血小板総数（ＣＤ４１（＋））を１００とした時の、ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（＋）およびＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（−）の割合（％）を表す。
【図１０】ＧＭ６００１又はＳ−４５２８２を８日間培養系に添加した際（８ｄａｙｓ）に得られたＥＳ細胞由来血小板の総数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数／ｗｅｌｌである。
【図１１】ＧＭ６００１、Ｓ−４５２８２、又はＳ−４５４５７を８日間培養系に添加した際に得られたＥＳ細胞由来血小板数（ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ（＋）及びＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ（−）の数）を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数／ｗｅｌｌである。
【図１２】ＧＭ６００１、Ｓ−４５２８２、又はＳ−４５４５７を８日間培養系に添加した際の、各化合物のＥＳ細胞由来血小板に対する機能維持効果について検証した結果を示すグラフである。縦軸は血小板総数（ＣＤ４１（＋））を１００とした時の、ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（＋）の割合（％）を表す。
【図１３】ＧＭ６００１、又はＳ−４５４５７を８日間培養系に添加した際に得られたＥＳ細胞由来血小板の総数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数／ｗｅｌｌである。値は、平均値＋標準誤差（ｎ＝４）である。
【図１４】Ｓ−４５４５７の濃度依存的なＥＳ細胞由来血小板に対する機能維持効果を示すグラフである。縦軸は血小板総数を１００とした時の、ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（＋）の割合（％）を表す。値は、平均値＋標準誤差（ｎ＝４）である。＃（シャープ）は、ｐ＜０．１を示す。
【図１５】ＧＭ６００１、又はＳ−４５４５７を８日間培養系に添加した際に得られたｉＰＳ細胞由来血小板の総数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数／ｗｅｌｌである。値は、平均値＋標準誤差（ｎ＝４）である。
【図１６】Ｓ−４５４５７の濃度依存的なｉＰＳ細胞由来血小板に対する機能維持効果を示すグラフである。縦軸は血小板総数を１００とした時の、ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（＋）の割合（％）を表す。＊（アスタリスク）、＊＊（アスタリスク２つ）は、それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１を示す。
【図１７】Ｓ−４５４５７の濃度依存的な末梢血由来血小板に対する機能維持効果を示すグラフである。縦軸は血小板総数を１．００とした時の、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（＋）の割合（比率）を表す。値は、平均値＋標準誤差（ｎ＝４）である。＊＊（アスタリスク２つ）は、ｐ＜０．０１を示す。
【図１８】Ｓ−４５４５７又はｐ３８阻害剤の末梢血由来血小板に対する機能維持効果を示すドットプロット図である。
【図１９】ＧＭ６００１、Ｓ−４５４５７、又はｐ３８阻害剤の末梢血由来血小板に対する機能維持効果を示すグラフである。縦軸は血小板総数を１．０とした時の、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（＋）の割合（比率）を表す。値は、平均値＋標準誤差（ｎ＝４）である。
【図２０】ＧＭ６００１、Ｓ−４５４５７、又はｐ３８阻害剤を８日間培養系に添加した際に得られたＥＳ細胞由来血小板の総数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数／ｗｅｌｌである。
【図２１】ＧＭ６００１、Ｓ−４５４５７、又はｐ３８阻害剤を８日間培養系に添加した際の、各化合物のＥＳ細胞由来血小板に対する機能維持効果について検証した結果を示すグラフである。縦軸は血小板総数を１００とした時の、ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（＋）の割合（％）を表す。
【図２２】ＧＭ６００１、Ｓ−４５４５７、又はＳ−４５２８２の末梢血由来血小板に対する機能維持効果について検証した結果を示すグラフである。縦軸は血小板総数を１００とした時の、ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（＋）の割合（％）を表す。
【図２３】ＧＭ６００１、Ｓ−４５４５７、Ｓ−４５２８２、又はｐ３８阻害剤の末梢血由来ＰＲＰに対する機能維持効果について検証した結果を示すグラフである。縦軸は血小板総数（ＣＤ４１（＋））を１００とした時の、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ（＋）及びＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ（−）の割合（％）を表す。
【図２４】ＧＭ６００１、Ｓ−４５４５７、Ｓ−４５２８２、又はｐ３８阻害剤の末梢血由来血小板に対する機能維持効果を示すドットプロット図である。
【図２５】Ｓ−４５４５７の濃度依存的な末梢血由来血小板に対する機能維持効果を示すドットプロット図である。
【図２６】Ｓ−４５４５７を添加し調製した血小板の接着能を経時的に評価した結果を示すグラフである。
【図２７】Ｓ−４５４５７を添加し調製した血小板の接着能を評価した結果を示すグラフである。
【図２８】レーザー照射時（０秒）及びその２０秒後の、Ｓ−４５４５７を添加し調製した血小板を注入したマウスにおける血栓形成を示す顕微鏡写真である。
【図２９】Ｓ−４５４５７を添加し調製した血小板の血栓形成への寄与を表すグラフである。縦軸は、各サンプルを輸血したマウスの腸間膜毛細血管に誘発した閉塞性血栓を観察し、血栓形成に関与した血小板の総数（マウス＋ヒト）に占めるヒト血小板の数の割合（％）である。値は２０血管の観察で得られた割合の平均値＋標準誤差である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明の組成物は、
下記一般式（Ｉ）：
【００４０】
【化１１】
2012036257.tif 000013
【００４１】
［式中、Ｘは、フェニレン基；
Ｙは、水素原子、または−（ＣＨ２）ｍＲ１；
ｍは０〜４のいずれかの整数；
Ｒ１は、
【００４２】
【化１２】
2012036257.tif 000014
【００４３】
Ｒ２は、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシ基；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、あるいはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい；
Ｒ５は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、またはＣ１〜Ｃ６アルキルスルホニル基；
Ｚは、水素原子またはＣ１〜Ｃ６アルキル基を示す。］
で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分とする、血小板の機能を維持するための組成物である。
【００４４】
前記一般式（Ｉ）で表される化合物における「Ｃ１〜Ｃ６」、「Ｃ６〜Ｃ１４」は、それぞれ、炭素数が１〜６、６〜１４の範囲内にあることを意味する。
【００４５】
Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５およびＺにおける「置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基」の「Ｃ１〜Ｃ６アルキル基」とは、直鎖または分岐状のＣ１〜Ｃ６アルキル基を意味し、具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｔｅｒｔ−アミル基、３−メチルブチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基等が挙げられる。
【００４６】
前記、「置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基」における置換基とは、水酸基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、カルボキシル基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル基等が挙げられる。これらは、全ての可能な位置で一個以上置換しうる。複数個置換する場合は、それらの置換基は同一であっても異なっていてもよいし、同一の炭素原子に置換していてもよいし異なる炭素原子に置換していてもよい。
【００４７】
「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を意味する。
【００４８】
「Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基」とは、アルキル部分が、前記「Ｃ１〜Ｃ６アルキル基」と同義であるアルコキシ基を意味し、たとえば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ｔｅｒｔ−アミルオキシ基、３−メチルブトキシ基、ネオペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基などの直鎖または分岐状のアルコキシ基が挙げられる。
【００４９】
「Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル基」とは、オキシカルボニル部分を除いたアルキル部分が直鎖または分岐状のＣ１〜Ｃ６アルキル基であるものを意味し、たとえば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｎ−ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ｓｅｃ−ブトキシカルボニル基、ｎ−ペンチルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−アミルオキシカルボニル基、３−メチルブトキシカルボニル基、ネオペンチルオキシカルボニル基、ｎ−ヘキシルオキシカルボニル基等が挙げられる。
【００５０】
Ｒ３およびＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって形成する「含窒素複素環」としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に少なくとも１個の窒素原子を含み、さらに酸素原子、硫黄原子および窒素原子から選ばれるヘテロ原子を１または２個含んでいてもよい５〜７員の含窒素複素環が挙げられる。該含窒素複素環の好適な例としては、ピペリジン環、ピペラジン環、モルホリン環、チオモルホリン環、ピロリジン環、イミダゾリジン環等が挙げられる。
【００５１】
Ｒ２における「置換されていてもよいアリール基」の「アリール基」とは、芳香族炭素環を表わし、Ｃ６〜Ｃ１４の芳香族炭素環が好ましく、たとえば、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
【００５２】
前記、「置換されていてもよいアリール基」における芳香環上の置換基とは、水酸基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、カルボキシル基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル基等が挙げられる。これらは、全ての可能な位置で一個以上置換しうる。複数個置換する場合は、それらの置換基は同一であっても異なっていてもよいし、同一の炭素原子に置換していてもよいし異なる炭素原子に置換していてもよい。ここで、「ハロゲン原子」、「置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル基」、「Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基」および「Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル基」は前記と同じ意味を示す。
【００５３】
Ｒ５における「Ｃ１〜Ｃ６アルキルスルホニル基」とは、アルキル部分が、前記「Ｃ１〜Ｃ６アルキル基」と同義であるアルキルスルホニル基を意味し、たとえば、メタンスルホニル基、エタンスルホニル基などがあげられる。
【００５４】
一般式（Ｉ）で表される化合物において、不斉炭素が存在する場合には、そのラセミ体、ジアステレオ異性体および個々の光学活性体のいずれも本発明に包含されるものであり、また幾何異性体が存在する場合には（Ｅ）体、（Ｚ）体およびその混合物のいずれも本発明に包含されるものである。
【００５５】
一般式（Ｉ）で表される化合物の塩としては、薬理学的に許容される塩であればとくに制限されず、たとえば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、有機酸との塩、無機酸との塩およびアミノ酸との塩等が挙げられる。無機塩基との塩の例としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩等が挙げられる。有機塩基との塩の例としては、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、エタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、ジベンジルエタノールアミン塩等が挙げられる。有機酸との塩の例としては、ギ酸塩、酢酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、シュウ酸塩、グリコール酸塩、フェニル酢酸塩、メタンスルホン酸塩等が挙げられる。無機酸との塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、スルファミン酸塩、硝酸塩等が挙げられる。また、アミノ酸との塩の例としては、グリシン塩、アラニン塩、アルギニン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩等が挙げられる。
【００５６】
一般式（Ｉ）で表される化合物はプロドラッグの形態をとり得る。プロドラッグの例としては、一般式（Ｉ）の化合物のカルボキシル基のメチルエステル、エチルエステル、アミノアルキルエステル誘導体、一般式（Ｉ）の化合物の水酸基およびアミン官能基のアセテート、ホルメート、およびベンゾエート誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物は、種々の方法で製造できるが、以下に示す製造方法により、効率よく製造することができる。なお、以下の製造方法において使用される「保護基」の具体例としては、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ｏ−メチルベンジル基、ｐ−ニトロベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｏ−クロロベンジル基、２，４−ジクロロベンジル基、ｐ−ブロモベンジル基、アリル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｏ−メチルベンジルオキシカルボニル基、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基、ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル基、２，４−ジクロロベンジルオキシカルボニル基、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリエチルシリル基、トリメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、メトキシメチル基、テトラヒドロピラニル基、カルボニルの保護基（たとえば、エタンジオール、プロパンジオール、メルカプトエタノール、メルカプトプロパノール、エタンジチオール、プロパンジチオールなどによる保護基）等が挙げられる。
【００５８】
前記一般式（Ｉ）で表される化合物は、例えば下記の工程１〜工程２における反応により製造することができる。
【００５９】
【化１３】
2012036257.tif 000015
【００６０】
（式中、Ｘ、ＹおよびＺは前記と同じ意味を示す。）。
【００６１】
＜工程１＞
工程１においては、ヒドロキシルアミンまたはその塩を化合物（II）に付加し、一般式（III）で表される化合物を製造する。この付加反応では、ヒドロキシルアミンが塩（塩酸塩や酢酸塩など）の場合、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなどの無機塩基の存在下に行なわれる。反応溶媒としては、反応を著しく阻害しない溶媒であればとくに限定されないが、水、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、アセトニトリル、１，４−ジオキサン、ジエチルエーテルまたはそれらの混合溶媒などが好ましい。
【００６２】
反応温度はとくに限定されず、通常、０〜１００℃で行なわれ、反応時間は、２時間から１週間が好ましい。
【００６３】
＜工程２＞
工程２においては、工程１で得られた化合物（III）を、一般式（IV）で表される中間体と縮合し、一般式（Ｉ）で表される化合物を製造する。中間体（IV）は、ギ酸の混合酸無水物（ギ酸と酢酸の混合酸無水物など）、ギ酸ペンタフルオロフェニルまたはギ酸とカルボジイミド（ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミドまたは水溶性カルボジイミド）から得られる活性中間体である。反応を円滑に行なうためにトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、ルチジン、コリジン、ジメチルアミノピリジンなどの有機塩基を共存させてもよい。これらの場合の幾つか（とくにカルボジイミドから活性中間体を得る場合）は１−ヒドロキシベンゾトリアゾールおよび／または４−ジメチルアミノピリジンを加えることにより反応が促進される。反応溶媒としては、反応を著しく阻害しない溶媒であればとくに限定されないが、クロロホルム、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、シクロペンチルメチルエーテル、１，４−ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジンなどが好ましい。反応温度はとくに限定されず、通常、０〜１００℃で行なわれ、反応時間は、１〜２４時間が好ましい。なお、本工程において、原料の化学的性質により、ヒドロキシルアミノ基の水酸基にもＣＨＯ基が付加する場合があるが、これは、酸性、塩基性または中性条件下において低級アルコールで処理することにより目的物である化合物（Ｉ）に変換できる。低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノールなどが好ましい。補助溶媒を使用してもよく、その場合使用する補助溶媒はとくに限定されない。
【００６４】
Ｘ、Ｙ、およびＺの性質によっては、前記工程１〜工程２の反応において事前に保護基を使用することおよび事後に保護基の除去を行なうことが必要であることは言うまでもない。保護されていない場合、次工程あるいは次次工程の収率が低下したり、中間体の取り扱いが困難な場合がある。
【００６５】
前記化合物（II）は、以下に示すように、工程３〜工程５により製造することができる。
【００６６】
【化１４】
2012036257.tif 000016
【００６７】
（式中、Ｘ、Ｙ、およびＺは前記と同じ；Ｅは、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ハロゲン原子、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシアミノ基などの脱離性官能基；Ｍ１は、Ｌｉ、ＣｅＣｌ２、ＮａＢＨ３、ＬｉＢＨ３、ＬｉＢＥｔ３、ＫＢＥｔ３、ＬｉＢ［ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ２Ｈ５]３、ＫＢ[ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ２Ｈ５]３、Ａｌ [ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ２Ｈ５]２などを表す。Ｅｔはエチル基を表す。）。
【００６８】
＜工程３＞
工程３においては、一般式（Ｖ）で表される化合物を塩基によりアニオンにしたのち、一般式（VI）で表される化合物と反応させて化合物（VII）を製造する。使用する塩基としては、リチウムジイソプロピルアミド、リチウム（ビストリメチルシリル）アミド、リチウムテトラメチルピペラジド、ナトリウム（ビストリメチルシリル）アミド、カリウム（ビストリメチルシリル）アミド、ｎ−ブチルリチウム、ｓｅｃ−ブチルリチウム、ｔｅｒｔ−ブチルリチウム等が挙げられる。これらの塩基は、単独で用いるか、または場合によって２つ以上を組み合わせて使用する。反応溶媒としては、反応を著しく阻害しない溶媒であればとくに限定されないが、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロピラン、ジエチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルまたはそれらの混合溶媒などが好ましい。
【００６９】
反応温度は、通常−１００〜４０℃で行なわれ、反応時間は、１〜１２時間が好ましい。なお、この工程においては、化合物（VI）の化学的性質により化合物（II）が得られる場合があるが、本製造目的を斟酌すると問題にならない。
【００７０】
＜工程４＞
工程４においては、工程３で得られた化合物（VII）を一般式（VIII）で表される化合物と反応させ、一般式（IX）で表される化合物を製造する。反応溶媒としては、化合物（VIII）が水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化ホウ素リチウムの場合には、メタノール、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、ジクロロメタン、クロロホルムまたはそれらの混合溶媒などが好ましく、化合物（VIII）が前記２種以外の場合は、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロピラン、ジエチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルまたはそれらの混合溶媒などが好ましい。反応温度は、通常−１００〜３０℃で行なわれ、反応時間は、１〜１２時間が好ましい。
【００７１】
なお、工程４の反応中あるいは反応後に、生成した化合物（IX）の水酸基が自然脱離し、一部あるいは全部が化合物（II）になる場合がある。一部の場合、それらを分離することなく工程５を行なうことができ、全部の場合、工程５を省略することができる。
【００７２】
＜工程５＞
工程５においては、工程４で得られた化合物（IX）を脱水反応により化合物（II）を製造する。脱水反応は、水酸基を活性化する試薬と有機塩基の組み合わせにより行なわれ、水酸基を活性化する試薬としては、塩化メタンスルホニル、塩化ｐ−トルエンスルホニル、塩化ベンゼンスルホニル、塩化メタンスルホニル、塩化チオニル、塩化スルフリル、五塩化リン等が挙げられる。有機塩基としては、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ジアザビシクロウンデセン、ジアザビシクロノネン、ピリジン、ジメチルアミノピリジン、ルチジン、コリジン等が挙げられる。好適な組み合わせとして、塩化メタンスルホニルとトリエチルアミンがあげられる。また、別の脱水試薬として、トリフェニルホスフィン−ジエチルアゾジカルボキシラート、トリフェニルホスフィン−ジイソプロピルアゾカルボキシラート、トリｎ−ブチルホスフィン−ジエチルアゾジカルボキシラート、トリｎ−ブチルホスフィン−ジイソプロピルアゾカルボキシラート等が挙げられる。反応溶媒としては、反応を著しく阻害しない溶媒であればとくに限定されないが、クロロホルム、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、アセトニトリル、１，４−ジオキサン、ジメチルホルムアミドなどが好ましい。反応温度はとくに限定されず、通常、０〜１００℃で行なわれ、反応時間は、１〜２４時間が好ましい。
【００７３】
Ｘ，Ｙ、およびＺの性質によっては、前記工程３〜工程５の反応において事前に保護基などを使用することおよび事後に保護基などの除去を行なうことが必要であることは言うまでもない。
【００７４】
前記化合物（Ｖ）は、以下に示すように、工程６により製造することができる。
【００７５】
【化１５】
2012036257.tif 000017
【００７６】
（式中、Ｚは前記と同じ；Ｊ１はハロゲン原子、メタンスルホニルオキシ基、ｐ−トルエンスルホニルオキシ基、ベンゼンスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基または水酸基を表す。）。
【００７７】
＜工程６＞
工程６においては、一般式（Ｘ）で表される化合物またはその塩と一般式（XI）で表される化合物を無機塩基の存在下縮合させ、化合物（Ｖ）を製造する。好適な無機塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。ただし、Ｊ１が水酸基の場合は、一般式（Ｘ）で表される化合物またはその塩の水酸基を試薬により活性化し、一般式（XI）で表される化合物を縮合させ、化合物（Ｖ）を製造する。水酸基の活性化に適した試薬としては、アゾジカルボン酸ジエチル（ＤＥＡＤ）−トリフェニルホスフィン、アゾジカルボン酸ジイソプロピル−トリフェニルホスフィン、シアノメチレントリブチルホスホラン、シアノメチレントリメチルホスホラン、ブチルリチウム−クロロジフェニルホスフィン等が挙げられる。また、ブチルリチウム−クロロジフェニルホスフィンで活性化する場合は、２，６−ジメチル−１，４−ベンゾキノン、テトラフルオロ−１，４−ベンゾキノンなどのキノン類を添加する。
【００７８】
反応溶媒としては、反応を著しく阻害しない溶媒であればとくに限定されないが、水、メタノール、エタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、ジクロロメタン、１，４−ジオキサン、２−メトキシエタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドまたはそれらの混合溶媒などが好ましい。反応温度はとくに限定されず、通常、−８０〜１２０℃で行なわれ、反応時間は、１〜２４時間が好ましい。
【００７９】
また、前記化合物（II）は、以下に示すように、工程７〜工程１１によっても製造することができる。
【００８０】
【化１６】
2012036257.tif 000018
【００８１】
（式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｅ、Ｍ1およびＪ1は前記と同じ、Ｐ１は水酸基の保護基を表す。）。
【００８２】
＜工程７＞
工程７においては、工程３と同様にして、一般式（XII）で表される化合物を塩基によりアニオンとした後、化合物（VI）と反応させて化合物（XIII）を製造する。
【００８３】
＜工程８＞
工程８においては、工程４と同様にして、一般式（XIII）で表される化合物を一般式（VIII）で表される化合物と反応させ、化合物（XIV）を製造する。
【００８４】
ＸおよびＹの性質によっては、前記工程７〜工程８の反応において事前に保護基などを使用することおよび事後に保護基などの除去を行うことが必要であることは言うまでもない。
【００８５】
＜工程９＞
工程９においては、工程５と同様にして、化合物（XIV）を脱水反応により化合物（XV）を製造する。
【００８６】
なお、工程９において保護基Ｐ１が自然脱離し、一部あるいは全部が化合物（XVI）になる場合がある。一部の場合、それらを分離することなく工程１０を行なうことができ、全部の場合、工程１０を省略する事ができる。
【００８７】
＜工程１０＞
工程１０においては、一般式（XV）で表される化合物に使用されている保護基Ｐ１の種類にあわせて、公知の方法によりその脱保護を行い、一般式（XVI）で表される化合物を製造する。
【００８８】
＜工程１１＞
工程１１においては、工程６と同様にして、化合物（XVI）と一般式（X）で表される化合物またはその塩を縮合させ、化合物（II）を製造する。
【００８９】
前述した方法で製造される本発明のＮ−ヒドロキシホルムアミド誘導体は遊離化合物、その塩、その水和物もしくはエタノール和物などの各種溶媒和物または結晶多形の物質として単離精製される。一般式（Ｉ）の化合物の薬理学的に許容される塩は常法の造塩反応により製造することができる。単離精製は抽出分別、結晶化、各種分画クロマトグラフィーなどの化学操作を適用して行なわれる。また、光学異性体は適当な原料化合物を選択することにより、またはラセミ化合物の光学分割により立体化学的に純粋な異性体として得ることができる。
【００９０】
本発明の組成物は、前記化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物(以下、「前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等」とも称する）を有効成分とする、血小板の機能を維持するための組成物である。本発明において「血小板の機能を維持する」とは、主として、血小板の止血や血栓形成といった血液凝固に関する機能を維持することを意味する。当該機能は、本発明の組成物により、ＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂαのシェディング（Ｓｈｅｄｄｉｎｇ、切断して除去）を抑制することによって達成することができる。
【００９１】
「血小板の機能の維持」は、例えば、国際公開２００９／１１９１０５号や後述の試験例１５に記載されているような、フローチャンバーシステムを用いて血小板のＶＷＦに対する接着能を評価する方法、血小板減少マウスを用いて血小板の生体内寿命を評価する方法、トロンビン存在下フィブリノーゲンコートカバーグラス上の血小板の形状を観察する方法、あるいは、後述の試験例１６に記載したような、レーザー照射とヘマトポルフィリン等とを用いて血栓形成モデル動物を作製し、このモデル動物内における血小板の動態を単一レベルで観察する生体分子イメージング手法等を用いて、評価することができる。
【００９２】
ＡＤＡＭ１７（ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  １７）は、構造上ディスインテグリンドメインを有し、メタロプロテアーゼ活性を有するタンパク質である。ＧＰＩｂα以外にも膜結合型のＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ、腫瘍壊死因子−α）をシェディングし、遊離型のＴＮＦ−αを産生することから、ＴＡＣＥ（ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ、ＴＮＦ−α変換酵素）とも称されるタンパク質である。典型的には、ヒト由来のＡＤＡＭ１７として、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＮＰ＿００３１７４．３（Ｎｏ．ＮＭ＿００３１８３．４）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。
【００９３】
また、ＧＰＩｂα（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｂ  ａｌｐｈａ、糖タンパク質Ｉｂα）は、血小板の膜タンパク質であり、フォン・ウィルブランド因子（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ、ＶＷＦ）の受容体として機能している。また、ＧＰＩｂαはヒト体内において血小板のみに発現しているため、ＣＤ４２ｂ抗原とも称され、血小板の表面マーカーとしても用いられている。典型的には、ヒト由来のＧＰＩｂαとして、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００１６４．５（Ｎｏ．ＮＭ＿０００１７３．５）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。
【００９４】
ＡＤＡＭ１７及びＧＰＩｂαの典型例としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている各々のＲｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅを例示したが、蛋白質のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得る。従って、本発明の組成物の作用機序に関わる、ＡＤＡＭ１７及びＧＰＩｂαには、このような天然の変異体も含まれることを理解されたい。
【００９５】
本発明における「ＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂαのシェディングの抑制」には、ＡＤＡＭ１７によるシェディングの完全な抑制（阻害）および部分的な抑制の双方が含まれる。また、後述の実施例において示すように、本発明の組成物の存在下における血小板総数に対するＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（＋）血小板数の割合を算出し、本発明の組成物の非存在下におけるその割合と比較して、大きい値である場合には、本発明の組成物がＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂαのシェディングを抑制すると評価することができる。本発明の組成物によるＧＰＩｂαのシェディングの抑制の程度としては、本発明の組成物の存在下におけるＣＤ４２ｂ（＋）血小板数の割合が８０％以上であることが好ましく、より大きいほどより好ましい（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上）。
【００９６】
なお、本発明の組成物によるＧＰＩｂαのシェディングを抑制する能力を、後述の試験例３において示す方法を用いて評価した場合には、５０％抑制濃度（ＩＣ50）が０．０１ｎｍｏｌ／Ｌ〜１００ｎｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。
【００９７】
本発明の組成物の有効成分たる前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物としては、例えば、Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−ジメチルアミノメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、
Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝−２−メトキシアセトアミド、
Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド、
Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシ−アミノ）エチル］ベンジル｝ベンズアミド、
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−モルホリン−４−イルメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、
Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−［１−（４−モルホリン−４−イルメチルフェニル）−２−（４−ペント−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）エチル］ホルムアミド、
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−ジメチルアミノフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（３−ジメチルアミノフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（２−ジメチルアミノフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−ピペリジン−１−イルメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（３−ピペリジン−１−イルメチルフェニル）エチル］ヒドロキシホルムアミド、
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（３−モルホリン−４−イルメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−｛４−［（エチルメチルアミノ）メチル］フェニル］エチル｝−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、
Ｎ−（２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−｛３−［（エチルメチルアミノ）メチル］フェニル｝エチル）−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、
Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝−Ｎ−メチルメタンスルホンアミド、
Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝−４−メチルベンゼンスルホンアミド、
Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝−４、Ｎ−ジメチルベンゼンスルホンアミド、
Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝−Ｎ−メチルスルホニルメタンスルホンアミド、
Ｎ−｛２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−［４−（２−ジメチルアミノエチル）フェニル］エチル｝−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、
Ｎ−｛２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−［４−（２−モルホリン−４−イルエチル）フェニル］エチル｝−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、
Ｎ−（２−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］フェニル｝エチル）メタンスルホンアミド、
Ｎ−｛２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−［４−（３−ジメチルアミノプロピル）フェニル］エチル｝−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、
Ｎ−｛２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−［４−（３−ジエチルアミノプロピル）フェニル］エチル｝−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、
Ｎ−｛２−（４−ブト−２−イニルオキシ−ベンゼンスルホニル）−１−［４−（３−モルホリン−４−イルプロピル）フェニル］エチル｝−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、
Ｎ−｛２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−［４−（４−モルホリン−４−イルブチル）−フェニル］−エチル｝−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、
Ｎ−｛４−［１−（ホルミルヒドロキシアミノ）−２−（４−ペント−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド、または、
Ｎ−｛４−［１−（ホルミルヒドロキシアミノ）−２−（４−オクト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミドが挙げられる。後述の試験例４に示すように、ＡＤＡＭ１７に対して高い特異性を有するという観点から、Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド、またはＮ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミドが好ましい。
【００９８】
なお、Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミドは、後述の実施例における「Ｉ−１」又は「Ｓ−４５２８２」であり、Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミドは、後述の実施例における「Ｉ−４」又は「Ｓ−４５４５７」である。
【００９９】
本発明の組成物の形態としては、例えば、研究開発目的（例えば、インビトロやインビボの研究開発）に用いられる試薬や医薬品添加剤が挙げられる。
【０１００】
本発明の組成物は、ＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂαのシェディングを抑制することにより血小板の機能を維持する作用を有するため、血小板の機能を維持するための試薬（例えば、巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に使用する試薬や生産した血小板に添加してその機能を維持するための試薬）や献血等用の血小板を含む血液製剤に添加される医薬品添加物として好適に用いることができる。本発明における組成物を上記添加物や試薬として用いる場合には、有効成分たる前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等の他に、例えば、安定化剤や溶剤等が含有されていてもよい。
【０１０１】
本発明の組成物の製品（例えば、試薬や医薬品添加物）またはその説明書は、血小板の機能を維持するために用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。血小板の機能を維持するために用いられる旨の表示においては、本発明の組成物の有効成分である前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等が血小板の機能を維持する効果を発揮するに至るまでの機序についての情報を含むことができる。機序としては、例えば、ＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂαのシェディングを抑制することにより、血小板の機能を維持することに関する情報が挙げられる。また、血小板の機能を維持するために用いられる旨の表示においては、血小板の製造又は保存のため等に用いられること、に関する情報を含むことができる。
【０１０２】
前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等は、上記本発明の組成物を製造するための有効成分となる。従って、本発明は、上記本発明の組成物を製造するために用いられる、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等、および前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等を用いることを特徴とする、上記本発明の組成物の製造方法をも提供するものである。
【０１０３】
また、本発明は、巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等を添加した培養物を提供するものである。さらに、本発明は、巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等を添加することを特徴とする、血小板を調製するための方法を提供するものである。
【０１０４】
本発明における「巨核球」は、血小板前駆細胞、巨核細胞とも称され、その細胞質を分離することにより、血小板を産生する細胞である。
【０１０５】
本発明において「巨核球に分化し得る細胞」は、巨核球に分化誘導することができる細胞であれば特に制限されることはなく、例えば、受精卵、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）といった万能幹細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞、巨核芽球、脂肪細胞が挙げられる。造血幹細胞や造血前駆細胞は、骨髄や臍帯血等から採取されるものであってもよい。さらに、これらの中では、胚を壊すことがないため倫理的な問題がなく、本発明によって調製された血小板を輸血する患者とヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）の型を適合させ易いという観点から、ｉＰＳ細胞が好ましい。また、ｉＰＳ細胞の培養を開始してから２５〜３５日まで、ｉＰＳ細胞由来の巨核球は増加し続けることが可能であり、かかる巨核球から産生される血小板数も、３因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４）を用いて樹立したｉＰＳ細胞と比較して、２〜１０倍になるという観点から、４因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ）を用いて樹立したｉＰＳ細胞がより好ましい。なお、かかる巨核球及び血小板産生数の増加は、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子の再活性化によって引き起こされるということは本発明者等によって確認されている。
【０１０６】
さらに、本発明の方法に用いる上記細胞が由来する動物種としては特に制限はなく、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジなどが挙げられるが、好ましくは、マウス、ラット、ヒトであり、より好ましくはマウス又はヒトであり、特に好ましくは、ヒトである。
【０１０７】
本発明において「巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系」としては、例えば、血小板に至る途中の段階で胚様体（分化誘導した中胚葉系未分化細胞を含む細胞集団）を形成させる培養系（Ｅｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００２年、９９巻、１２８１９−１２８２４ページ等）、造血前駆細胞を内包するネット様構造物（ｓａｃ構造体）を形成させる培養系（特許文献１〜３等参照）、臍帯血由来の造血前駆細胞から血小板を産生させる培養系（Ｒｏｂｅｒｔら、「Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｂａｌｐｈａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．」、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２０１０年５月２６日オンライン版等参照）等を挙げることができる（その他、Ｆｕｊｉｍｏｔｏら、Ｂｌｏｏｄ、２００３年、１０２巻、４０４４−４０５１ページ：Ｈｉｒｏｙａｍａら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、２００６年、３４巻、７６０−７６９ページ：Ｇａｕｒら、Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．、２００５年、４巻、４３６−４４２ページ等参照）。これらの中では、ネット様構造物内に造血前駆細胞が濃縮されて存在しており、生体外において効率的に巨核球や血小板等を産生させることができるため、ネット様構造物を形成させる培養系が好ましい。
【０１０８】
本発明にかかる培養系の培養条件としては、巨核球の培養および血小板の産生に適した条件であれば特に制限はないが、培養温度としては、３５〜３８℃であることが好ましく、より好ましくは３７℃である。前記培養温度が前記下限未満であると、巨核球や血小板の産生数が少なくなる傾向にあり、前記上限を超えると細胞の培養や維持が困難となる傾向にある。
【０１０９】
さらに、本発明にかかる「巨核球に分化し得る細胞」を培養する際（特に、巨核球を分化誘導する過程において）、フィーダー細胞と共培養することが好ましい。ここで使用する「フィーダー細胞」としては、「巨核球に分化し得る細胞」の分化誘導に寄与するものであれば特に制限はないが、例えば、マウス胚線維芽細胞、好ましくは、１０Ｔ１／２細胞株、ＯＰ９細胞などを用いることができる。不死化した株化細胞以外の細胞としては、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（ヒト骨髄から直接調製し培養して得た細胞）を挙げることができ、当該間葉系幹細胞をフィーダー細胞として用いた場合でも、ヒトＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞からの巨核球成熟および血小板産生が可能である。マトリゲルなどの細胞外基質上で培養した場合でも、効率は下がるが、血小板を誘導することが可能である。「フィーダー細胞」を用いる際には、放射線を照射するなどして、細胞の増殖を抑止することが好ましい。
【０１１０】
前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等の前記培養系への添加量（濃度）は、０．０１〜１００μＭであることが好ましい。前記添加量が前記下限未満であると血小板におけるＧＰＩｂαの切断の抑制が困難になる傾向にあり、前記上限を超えると細胞の増殖を抑制する傾向にある。また、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等を前記培養系に添加する時期としては、血液細胞分化の不均一性の状況下にも関わらず培養過程における均一性の確保、均質な製品の確保を行う観点から、造血前駆細胞から血小板の産生に至る全期間であることが好ましく、巨核球から血小板の産生に至る期間に限定されないという点で、ＧＭ６００１とは大きく異なる。
【０１１１】
以下に、本発明の培養系に好適に用いられるネット様構造物を形成させる方法を一例として、本発明の血小板を調製するための方法をより具体的に説明する。
【０１１２】
先ず、ネット様構造物（ｓａｃ構造体）を形成させる方法について説明する。ネット様構造物を調製するために適した培養条件は、用いるＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞によって異なるが、例えば、培地としては、最終濃度１５％のＦＢＳを添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を用い、その他無血清の場合においても適宜増殖因子およびサプリメント等を加えたものを使用することができる。さらに、ネット様構造物を効率的に形成させるために、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を０〜１００ｎｇ／ｍｌ、０〜３００ｎｇ／ｍｌ程度、より好ましくは、２０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ程度加えるのがよい。培養の環境としては、用いるＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の種類によって異なるが、好ましくは、５％ＣＯ２、３５〜３８℃、より好ましくは３７℃の条件である。ネット様構造物が形成されるまでの培養期間は、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の種類によって異なるが、フィーダー細胞上に播いてから、１５日目（１４〜１６日後）くらいにその存在を確認することができる。
【０１１３】
形成されたネット様構造物は、濾胞状構造になっており、内部には、造血前駆細胞、特にＣＤ３４陽性の細胞が濃縮された状態で存在している。ネット様構造物の内部に存在する造血前駆細胞は、物理的な手段、例えば、滅菌済みの篩状器具（例えば、セルストレイナーなど）に通すことにより、分離することができる。
【０１１４】
次に、ネット様構造物から分離した造血前駆細胞から血小板を調製する方法について説明する。分離して得られた造血前駆細胞をフィーダー細胞上に播き、巨核球及び血小板を産生させるのに適した条件で培養を行う。ここで「巨核球及び血小板を産生させるのに適した条件」とは、例えば、トロンボポイエチン（ＴＰＯ、１０〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ程度）の存在下で、又は幹細胞因子（ＳＣＦ、１０〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ程度）、ヘパリン（Ｈｅｐａｒｉｎ、１０〜１００Ｕ／ｍＬ、好ましくは２５Ｕ／ｍｌ程度）及びＴＰＯ（１０〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ程度）の存在下で、７〜１５日間程度培養することが挙げられる。培養環境としては、好ましくは、５％ＣＯ２、３５〜３８℃、より好ましくは３７℃の条件である。
【０１１５】
また、かかる培養系において、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等をこの培養系に添加する時期としては、造血前駆細胞をフィーダー細胞上にまき直す際に添加することが好ましく、培養開始後２２日目（２０日〜２３日目、ネット様構造物のまき直しから６日〜１０目目）頃に前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等を添加することがより好ましい。
【０１１６】
さらに、本発明の方法においては、巨核球から放出された血小板が豊富に存在する培養液の画分（例えば、ネット様構造物を形成させる方法においては、ヒトｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞の培養後２２〜２８日目程度の画分）を回収し、白血球除去フィルター（例えば、テルモ社、旭化成メディカル社などから購入可能）などを使用して血小板以外の成分（巨核球、その他の血液細胞）の除去を行うことにより、血小板を調製することができる。
【０１１７】
前述の通り、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等は、ＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂαのシェディングを抑制し、血小板の機能を維持する作用を有する。従って、本発明は、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等が添加された血小板を含む血液製剤、並びに、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等を、血小板を含む血液製剤に添加することを特徴とする、血液製剤における血小板の機能を維持するための方法をも提供するものである。
【０１１８】
また、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等は、血小板を含む血液製剤を製造するための有効成分となる。従って、本発明は、上記本発明の血液製剤を製造するために用いられる医薬品添加物として、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等をも提供するものである。
【０１１９】
本発明における血液製剤に含まれる血小板としては特に制限されることはなく、前述の本発明の血小板を調製するための方法によって得られた血小板であってもよく、また採血によって得られた末梢血等由来の血小板であってもよい。血液製剤を調製するにあたっては、血小板が保存に対して不安定であることなどを考慮して、血小板の安定化に資する他の成分を含有せしめることもできる。血小板を安定化させる条件は、当該技術分野の専門家において周知の方法を選択することが可能である。例えば、血小板の機能を保持するために必要な溶液中（例えば、ＡＣＤ−Ａ液（クエン酸ナトリウム／クエン酸／ブドウ糖から調製される液）など、場合によっては、新鮮凍結血漿などを適宜添加する）に、適当な濃度（例えば、１×１０８〜１×１０１０血小板／ｍＬ程度、好ましくは、１×１０９血小板／ｍＬ程度）で懸濁し製剤化することができる。なお、血小板を含む製剤を収納する容器は、ガラスのように血小板を活性化する材質のものを避けることが好ましい。前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等の添加量（濃度）は、０.０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。前記添加量が前記下限未満であると血小板は接着機能を保持できないとする傾向にあり、前記上限を超えると最大効果となる。
【実施例】
【０１２０】
以下、実施例及び試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、後述する試験例において用いた巨核球や血小板の産生、並びにこれらの解析は下記に示す方法を用いて行った。【０１２１】
＜ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、及びフィーダー細胞の調製＞
ヒトＥＳ細胞（ｈＥＳ  ｃｅｌｌｓ）は、京都大学再医科学研究所が樹立し、同研究所から供与されたＫｈＥＳ細胞株（ＫｈＥＳ−３）を用いた。【０１２２】
また、ヒトｉＰＳ細胞（ｈｉＰＳ  ｃｅｌｌｓ）は、東京大学でヒト由来の皮膚細胞にＯｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びｃ−Ｍｙｃを導入して樹立したｉＰＳ細胞株（ＴｋＤＡ３−４）を、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。そして、ＴｋＤＡ３−４細胞を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、２０％  ノックアウト血清代替添加物（ＫＳＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、及び５ｎｇ／ｍｌ  塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、Ｕｐｓｔａｔｅ社製）を添加したダルベッコ変法イーグル培地とハムＦ−１２培地(ＳＩＧＭＡ社製）との混合培地（混合比率１：１）中、放射線照射したマウス線維芽細胞上で培養し、３日毎に継代して、未分化状態を維持したものを使用した。【０１２３】
さらに、理研バイオリソースセンターから購入したマウス胎児由来の線維芽細胞  Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株（以下、「１０Ｔ１／２細胞」とも称する）を１０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを添加したイーグル基礎培地（ＢＭＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で培養した。そして、細胞数８×１０６個／１０ｃｍディッシュになるように調整した１０Ｔ１／２細胞に５０Ｇｙの放射線照射を行ったものをフィーダー細胞として用いた。【０１２４】
＜巨核球及び血小板の産生、並びにこれらの解析＞
前記フィーダー細胞上に、ヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞を細胞数５×１０４〜１×１０５個／１０ｃｍディッシュになるように播き、１５％  ＦＢＳ（製品名：ＣＥＬＬｅｃｔ（ＴＭ）  ＧＯＬＤ、ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＩＴＳサプリメント（１０μｇ／ｍｌ  インスリン、５．５ｍｇ／ｍｌ  ヒトトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ  亜セレン酸ナトリウム）（Ｓｉｇｍａ社製）、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、０．４５ｍＭ  α−モノチオグリセロール（ＭＴＧ、Ｓｉｇｍａ社製）、２０ｎｇ／ｍｌ  血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ社製）中で培養した。また、この培養はＣＯ２インキュベーター（製品名：ＨＥＲＡ  ＣＥＬＬ  １５０ｉ、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２、２１％Ｏ２（大気酸素）下で実施した。そして、３日毎に培地交換を行い、内部に造血前駆細胞を含んだｓａｃ構造体（ネット様構造物）が多数確認される１５日目まで、かかる条件で培養した。【０１２５】
次に、ｓａｃ構造体をディッシュから剥がして破砕し、３％  ＦＢＳを含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に懸濁した後、４０μｍセルストレイナー（ＢＤ社製）を通過させた。通過した溶液を４４０×ｇ、１０分間遠心分離して造血前駆細胞を回収し、細胞数をカウントした。新たに、６ウェル（ｗｅｌｌ）プレートに用意した５０Ｇｙ放射線照射済みの１０Ｔ１／２細胞（６×１０５個／６ウェルプレート１枚）上に造血前駆細胞を２〜３×１０４個／ウェルで播き、１５％  ＦＢＳ（製品名：ＣＥＬＬｅｃｔ（ＴＭ）  ＧＯＬＤ、ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＩＴＳサプリメント（１０μｇ／ｍｌ  インスリン、５．５ｍｇ／ｍｌ  トランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ  亜セレン酸ナトリウム）（Ｓｉｇｍａ社製）、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ社製）、０．４５ｍＭ  ＭＴＧ（Ｓｉｇｍａ社製）、１００ｎｇ／ｍｌ  ヒトトロンボポイエチン（ヒトＴＰＯ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製）、５０ｎｇ／ｍｌ  ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製）及び２５Ｕ／ｍｌ  ヘパリンを添加したＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ社製）中でさらに８日間培養し、巨核球／血小板を誘導した。【０１２６】
そして、誘導した巨核球／血小板を抗凝固剤液（Ａｃｉｄ  Ｃｉｔｒａｔｅ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ、ＡＣＤ）にて回収した後、ブレーキ無し、９００ｒｐｍで１０分間遠心した。遠心して得られた上清を更にブレーキ無し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を除去した。そして、このようにして得られた沈殿物における巨核球や血小板の数は、抗体で染色し、フローサイトメトリーにて解析した。【０１２７】
なお、フローサイトメトリーはＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製のＦＡＣＳ  Ａｒｉａを用い、巨核球や血小板を染色するために用いた抗体として、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）修飾抗ヒトＣＤ４２ａ（ＧＰＩＸ）抗体、ＰＥ修飾抗ヒトＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）抗体、ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）標識抗ＣＤ４１ａ（インテグリンαＩＩｂｂｅｔａ３複合体、ＨＩＰ８  ｃｌｏｎｅ）抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。また、巨核球や血小板の絶対数を正確に測定するために、細胞をこれらの抗体によって染色し、ＴｒｕＣｏｕｎｔビーズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）も用いて、フローサイトメトリーにて解析を行った。【０１２８】
（試験例１）  室温条件下におけるＥＳ細胞由来の造血前駆細胞から巨核球／血小板への誘導
室温条件下での培養（２５℃での培養）によって、巨核球／血小板の誘導が可能であるかどうかを調べるため、前述の通りにして得られたＥＳ細胞由来の造血前駆細胞を、図１に示した条件にて巨核球／血小板の誘導を試みた。すなわち、造血前駆細胞を巨核球／血小板に誘導する前述の８日間の培養過程において、
コントロール：３７℃で８日間培養
２日間の室温培養：３７℃で６日間培養した後、２５℃で２日間培養、
室温培養：２５℃で８日間培養、
という条件下で各々培養を行い、前述の通り回収して、フローサイトメトリーにて巨核球及び血小板の数を測定した。得られた結果は図２及び図３に示す。【０１２９】
図２及び図３に示した結果から明らかなように、２５℃で８日間培養したものに関しては、殆ど巨核球も血小板も得ることはできなかった。また、フローサイトメトリー解析の２日前から２５℃において培養したものは、巨核球及び血小板を得ることはできたものの、コントロールの半分程度の量しかなかった。【０１３０】
（試験例２）  室温条件下における臍帯血由来ＣＤ３４(＋）細胞から巨核球／血小板への誘導
室温条件下での培養（２４〜２５℃での培養）で、臍帯血由来ＣＤ３４(＋）細胞から血小板の誘導が可能であるかどうかを調べた。【０１３１】
先ず、臍帯血（ＣＢ）からビーズカラムを用いて１０６個のＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４＋細胞の選別及び単離を行った。得られた臍帯血由来ＣＤ３４（＋）細胞４×１０４個を、前記フィーダー細胞上に播き、ｍｅｄｉｕｍ  Ａ（１５％  ＦＢＳ（製品名：ＣＥＬＬｅｃｔ（ＴＭ）  ＧＯＬＤ、ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＩＴＳサプリメント（１０μｇ／ｍｌ  インスリン、５．５ｍｇ／ｍｌ  トランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ  亜セレン酸ナトリウム）（Ｓｉｇｍａ社製）、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ社製）、０．４５ｍＭ  ＭＴＧ（Ｓｉｇｍａ社製）、及びサイトカインカクテル（２ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製）、７．５ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製）、１１ｎｇ／ｍｌ  ＦＬＴ−３）を添加したＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ社製））中で４日間培養した。培養４日目にｍｅｄｉｕｍ  Ａと同じ量のｍｅｄｉｕｍ  Ｂを臍帯血由来ＣＤ３４（＋）細胞に追加した。なお、ｍｅｄｉｕｍ  Ｂはｍｅｄｉｕｍ  Ａと異なり、サイトカインカクテルとして、３０ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、１ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、７．５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６及び１３．５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−９が添加されている。また、ｍｅｄｉｕｍ  Ａとｍｅｄｉｕｍ  Ｂとは添加しているサイトカインカクテルが異なる以外は同じ組成である。【０１３２】
そして、このようにして培養した７日目の臍帯血由来ＣＤ３４（＋）細胞をｍｅｄｉｕｍ  Ｂで４×１０５個／ｍＬになるように調整して、更に７日間３７℃で培養（コントロール）又は更に７日間２４〜２５℃で培養（室温培養）し、培養１４日目にフローサイトメトリーにて巨核球及び血小板の数を測定した。得られた結果を図４及び図５に示す。【０１３３】
図４及び図５に示した結果から明らかなように、約２５℃で７日間培養したものに関しては、先に示したＥＳ細胞由来の造血前駆細胞と同じく、殆ど巨核球も血小板も得ることはできなかった。従って、試験例１及び試験例２において示した結果から、ＥＳ細胞や臍帯血由来ＣＤ３４（＋）細胞等の巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系において、培養温度が３７℃付近であることが好ましく、２５℃付近の室温条件下の培養では巨核球及び血小板を産生させることができないことが明らかになった。【０１３４】
しかしながら、かかる血小板を産生させる培養系において培養温度を３７℃付近にしてしまうと、血小板表面上にあり、血液凝固において重要な因子であるＧＰＩｂαがＡＤＡＭ１７によりシェディングされてしまうため、止血機能を発揮しない血小板が得られにくいという問題がある。また、ＡＤＡＭ１７を含むメタロプロテアーゼを対象とした阻害剤（例えば、ＧＭ６００１）を培養系に添加してＧＰＩｂαのシェディングを抑制することもできるが、かかる場合においては造血機能に必須であるＡＤＡＭ１７以外のメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１４）をも阻害してしまうため、血小板産生が最も観察される一定時期のみに添加する必要性があり、血小板を産生させる培養系のプラント化等を実施する際には好ましくない。さらに、ＧＭ６００１のような非特異的メタロプロテアーゼ阻害剤は、生体に投与すると安全性の面で懸念があるために、かかる阻害剤が混入している血小板を血液製剤として用いることも好ましくない。【０１３５】
そこで、下記実施例において示す、ＡＤＡＭ１７を特異的に阻害する化合物を設計、合成した。なお、以下に示す１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）または重ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）を溶媒とし、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部標準として、ＥＣＡ４００型スペクトルメーター（４００ＭＨｚ、日本電子株式会社製）で測定したものである。化学シフトの測定結果は、δ値をｐｐｍで示し、結合定数のＪ値をＨｚで示した。略号のｓはｓｉｎｇｌｅｔ、ｄはｄｏｕｂｌｅｔ、ｔはｔｒｉｐｌｅｔ、ｑはｑｕａｒｔｅｔ、ｄｄはｄｏｕｂｌｅｔ  ｄｏｕｂｌｅｔ、ｍはｍｕｌｔｉｐｌｅｔ、ｂｒはｂｒｏａｄを意味する。低分解能質量スペクトル（高速原子衝撃法：ＦＡＢ−ＭＳ）測定には、日本電子ＪＭＳ−ＨＸ−１１０Ａ型を、質量スペクトル（エレクトロスプレーイオン化法：ＥＳＩ-ＭＳ）測定には、サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）のＥｘａｃｔｉｖｅをそれぞれ使用した。【０１３６】
（実施例１）
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド（I−１）【０１３７】
【化１７】
2012036257.tif 000019
【０１３８】
（１−１）：１−ブト−２−イニルオキシ−４−メタンスルホニルベンゼン（Ｖ−１）
１−ブロモ−２−ブチン２．１２ｇ（１５．９ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド溶液（３０ｍＬ）に４−メチルスルホニルフェノール２．８８ｇ（１５．９ｍｍｏｌ）を加えて溶解させた後、炭酸カリウム２．６４ｇ（１９．１ｍｍｏｌ）を加えた。６時間撹拌した後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。１−ブト−２−イニルオキシ−４−メタンスルホニルベンゼン（Ｖ−１）３．３９ｇ（１５．１１ｍｍｏｌ）を粗精製物として得た（収率９５％）。物性値を以下に示す。
MS
(FAB) m/z : 225 (M+H)+.
1H-NMR(CDCl3):δ 7.88(2H, m), 7.10(2H, m),
4.73(2H, m), 3.04(3H, s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz).。【０１３９】
（１−２）：｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）アセチル］ベンジル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（VII−１）
前記（１−１）で得た化合物（Ｖ−１）１．３６ｇ（６．０８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（７０ｍＬ）溶液に、アルゴン雰囲気下−７８℃でリチウムジイソプロピルアミドの２．０Ｍヘキサン−ヘプタン−エチルベンゼン溶液３．６５ｍＬ（７．２９ｍｍｏｌ）を加え、３０分間撹拌した後、リチウムヘキサメチルジシラジドの１．０Ｍ−テトラヒドロフラン溶液１２．１６ｍＬ（１２．１６ｍｍｏｌ）と、４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノメチル）安息香酸メチル（VI−１）１．６１ｇ（６．０８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液５ｍＬを加えた。−７８℃にて５分間撹拌した後、徐々に室温まで昇温し、１時間撹拌した。飽和食塩水を加えた後、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧下留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１→１：１）にて精製し、｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）アセチル］ベンジル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（VII−１）２．０２ｇ（４．４１ｍｍｏｌ）を無色飴状物質として得た（収率７２％）。物性値を以下に示す。
MS
(FAB) m/z : 480 (M+Na)+.
1H-NMR (CDCl3)
: δ 7.93(2H, br d, J
= 8.2 Hz), 7.81(2H, m), 7.40(2H, br d, J = 8.2 Hz), 7.07 (2H, m), 4.72(2H, m),
4.70(2H, s), 4.39(2H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz), 1.57(9H, s).。【０１４０】
（１−３）：｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−ヒドロキシエチル］ベンジル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（IX−１）
前記（１−２）で得た化合物（VII−１）２．０２ｇ（４．４１ｍｍｏｌ）のメタノール（５０ｍＬ）溶液に、０℃で水素化ホウ素ナトリウム１６７ｍｇ（４．４１ｍｍｏｌ）を加えた。２時間３０分間撹拌した後、飽和食塩水と飽和塩化アンモニウム水溶液を加えた。メタノールを減圧下留去した後、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−ヒドロキシエチル］ベンジル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（IX−１）２．０４ｇ（４．４１ｍｍｏｌ）を無定形状固体の粗精製物として得た（収率９９％）。物性値を以下に示す。
MS
(FAB) m/z : 482 (M+Na)+.。【０１４１】
（１−４）：｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）ビニル］ベンジル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（II−１ａ）
前記（１−３）で得た化合物（IX−１）２．０４ｇ（４．４１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン３．１ｍＬ（２２．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（４５ｍＬ）溶液に０℃で塩化メタンスルホニル０．７ｍＬ（８．８ｍｍｏｌ）を加えた。３時間３０分間撹拌した後、飽和食塩水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：酢酸エチル＝３：１）で精製し、｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）ビニル］ベンジル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（II−１ａ）１．７７ｇ（４．００ｍｍｏｌ）を無色無定形状固体として得た（収率９１％）。物性値を以下に示す。
1H-NMR (CDCl3) : δ 7.87(2H, d, J
= 8.7 Hz), 7.61(1H, d, J = 15 Hz), 7.43(2H, J = 8.2 Hz), 7.30(2H, d, J = 8.2
Hz), 7.10(2H, d, J = 8.7 Hz), 6.82 (1H, d, J = 15 Hz), 4.88(1H, m), 4.71(2H,
m), 4.33(2H, m), 1.86(3H, m), 1.45(9H, s).。【０１４２】
（１−５）：４−［（Ｅ）−２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）ビニル］ベンジルアミン塩酸塩（II−１ｂ）
前記（１−４）で得た化合物（II−１ａ）２９５ｍｇ（０．６７ｍｍｏｌ）のメタノール（５ｍＬ）溶液に、０℃で４Ｍ−塩酸／ジオキサン２ｍＬを加えて１０分間撹拌した後、室温まで昇温し、２時間撹拌した。溶媒を減圧下留去した後、メタノール２０ｍＬを加えて再び、溶媒を減圧下留去し、４−［（Ｅ）−２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）ビニル］ベンジルアミン塩酸塩（II−１ｂ）を無色固体として得た。物性値を以下に示す。
1H-NMR (DMSO-d6) : δ 7.85(2H, d, J
= 8.7 Hz), 7.78(2H, d, J = 8.2 Hz), 7.52(2H,d, J = 8.2 Hz), 7.20(2H, d, J = 8.7
Hz), 4.87(2H, m), 4.05(2H, m), 1.83(3H, m).。【０１４３】
（１−６）：｛４−［（Ｅ）−２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）ビニル］ベンジル｝ジエチルアミン（II−１ｃ）
前記（１−５）で得た化合物（II−１ｂ）のメタノール（６ｍＬ）溶液に、０℃でアセトアルデヒド１ｍＬ、トリアセトキシヒドロほう酸ナトリウム２１２ｍｇ（１．００ｍｍｏｌ）および酢酸３滴をそれぞれ加えた後、室温にて１時間３０分間撹拌した。飽和食塩水と飽和重曹水を加えた後、溶媒を減圧下留去した。クロロホルムで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝２０：１→１０：１）にて精製し、｛４−［（Ｅ）−２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）ビニル］ベンジル｝ジエチルアミン（II−１ｃ）１１１．７ｍｇ（０．２８ｍｍｏｌ）を淡黄色無定形状固体として得た（２段階収率４２％）。物性値を以下に示す。
MS
(FAB) m/z : 398 (M+H)+.。【０１４４】
（１−７）：Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］ヒドロキシルアミン（III−１）
前記（１−６）で得た化合物（II−１ｃ）１０８ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（８ｍＬ）溶液に、５０％ヒドロキシルアミン溶液（３ｍＬ）を加え、室温にて２５時間攪拌した。反応溶液を減圧下留去した後、水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシ−ベンゼンスルホニル）−１−（４−ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］ヒドロキシルアミン（III−１）９２．９ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）を淡黄色無定形状固体として得た（収率８１％）。物性値を以下に示す。
1H-NMR (CDCl3) : δ 7.84(2H, m),
7.27(2H, m), 7.20(2H, m), 7.07(2H, m), 4.72(2H, m), 3.75(1H, m), 3.51(2H, s),
3.33(1H, m), 2.49(4H, m), 1.87(3H, s), 1.03(6H, m).。【０１４５】
（１−８）：Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド（Ｉ−１）
ギ酸１ｍＬを０℃に冷却し、無水酢酸０．３ｍＬを滴下した後、３０分間撹拌することでギ酸―酢酸の混合酸無水物溶液を調製した。前記（１−７）で得た化合物（III−１）９２ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（３ｍＬ）溶液に、０℃で、先に調製したギ酸―酢酸の混合酸無水物溶液０．６ｍＬを加え、室温で４時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、トルエンで共沸した。得られた油状物をクロロホルム２ｍＬおよびメタノール１０ｍＬに溶解し、１２時間撹拌した。この溶液を減圧濃縮し、得られた油状物をクロロホルムに溶解し、飽和重曹水を加えて中和した。クロロホルムで抽出した後、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９５：５→７５：２５）により精製し、Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド（Ｉ−１）５３．９ｍｇ（０．１１ｍｍｏｌ）を淡黄色無定形状固体として得た（収率５２％）。物性値を以下に示す。
MS
(FAB) m/z : 459(M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.32(0.6H, s),
8.10(0.4H, s), 7.80-7.86(2H, m), 7.21-7.30(4H, m), 7.06-7.14(2H, m), 5.65(0.6H,
m), 5.36(0.4H, m), 4.74(2H, br s), 4.20(0.4H, m), 4.05(0.6H, br t, J = 13 Hz),
3.48-3.57(3H, m), 2.46(4H, m), 1.87(3H, br s), 0.99(6H, m).。【０１４６】
（実施例２）
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−ジメチルアミノメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド（Ｉ−２）【０１４７】
【化１８】
2012036257.tif 000020
【０１４８】
実施例１と同様の操作により、上記の化合物（Ｉ−２）を得た。
MS
(FAB) m/z : 431 (M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.28(0.6H, s),
8.14(0.4H, s), 7.79-7.91(2H, m), 7.04-7.32(6H, m), 5.69(0.6H, m), 5.35(0.4H,
m), 4.74(2H, br s), 4.18(0.4H, m), 4.07(0.6H, m), 3.47(1H, m), 3.33(2H, m),
2.11(6H, s), 1.87(3H, s).。【０１４９】
（実施例３）
Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝−２−メトキシアセトアミド（Ｉ−３）【０１５０】
【化１９】
2012036257.tif 000021
【０１５１】
（３−１）：Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）ビニル］ベンジル｝−２−メトキシアセトアミド（II−３）
前記実施例１（１−５）で得た化合物（II−１ｂ）２８３ｍｇ（０．７５ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（５ｍＬ）に、室温でメトキシアセチルクロリド０．２ｍＬ（１．８５ｍｍｏｌ）を滴下した。２日後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した後、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝２０：１→１０：１）にて精製し、化合物（II−３）２９６ｍｇ（０．７１ｍｍｏｌ）を淡黄色固体として得た（収率９４％）。物性値を以下に示す。
MS
(FAB) m/z : 414 (M+H)+.。【０１５２】
（３−２）：Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝−２−メトキシ−アセトアミド（Ｉ−３）
前記（３−１）で得た化合物（II−３）を用い、前記実施例１と同様な方法（１−７および１−８）により、Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝−２−メトキシアセトアミド（Ｉ−３）を得た。物性値を以下に示す。
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.32(0.6H, s),
8.09(0.4H, s), 7.77-7.88(2H, m), 7.20-7.31(4H, m), 7.06-7.16(2H, m), 5.65(0.6H,
m), 5.37(0.4H, m), 4.75(2H, br s), 4.39-4.47(2H, m), 4.16(0.4H, m), 4.03(0.6H,
br t), 3.93(0.8H, br s), 3.90(1.2H, br s), 3.46(1H, m), 3.40(3H, br s),
1.87(3H, br s).。【０１５３】
（実施例４）
Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド（Ｉ−４）【０１５４】
【化２０】
2012036257.tif 000022
【０１５５】
実施例３と同様の操作により、上記の化合物（Ｉ−４）を得た。
MS
(FAB) m/z : 481 (M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.42(0.6H, s),
7.87(0.4H, s), 7.78-7.88(2H, m), 7.30-7.35(4H, m), 7.06-7.17(2H, m), 5.65(0.6H,
m), 5.39(0.4H, m), 4.75(2H, m), 4.28(2H, m), 4.15(0.4H, m), 4.00(0.6H, br t, J
= 12 Hz), 3.45(1H, m), 2.91(1.2H, s), 2.89(1.8H, s), 1.87(3H, m).。【０１５６】
（実施例５）
Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝ベンズアミド（Ｉ−５）【０１５７】
【化２１】
2012036257.tif 000023
【０１５８】
実施例３と同様の操作により、上記の化合物（Ｉ−５）を得た。
MS
(FAB) m/z : 507 (M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.31(0.6H, s),
8.08(0.4H, s), 7.73-7.87(4H, m), 7.51(1H, m), 7.42(2H m), 7.27-7.33(3H, m),
7.07-7.14(2H, m), 5.65(0.6H, m), 5.37(0.4H, m), 4.73(2H, m), 4.54-4.62(2H, m),
4.15(0.4H, m), 4.00(0.6H, m), 3.45(1H, m), 1.86(3H, br s).。【０１５９】
（実施例６）
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−モルホリン−４−イルメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド（Ｉ−６）【０１６０】
【化２２】
2012036257.tif 000024
【０１６１】
（６−１）：ｔｅｒｔ−ブチル−（４−メタンスルホニルフェノキシ）ジメチルシラン（XII−６）
４−メチルスルホニルフェノール１０ｇ（５８．０７ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１５０ｍＬ）にイミダゾール９．９ｇ（１４５．１８ｍｍｏｌ）を加えて溶解させた後、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシラン１０．５ｇ（６９．７ｍｍｏｌ）を加えて撹拌した。反応終了後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で３回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１→３：１）にて精製し、ｔｅｒｔ−ブチル−（４−メタンスルホニルフェノキシ）ジメチルシラン（XII−６）１５．９７ｇ（５５．７５ｍｍｏｌ）を得た（収率９６％）。物性値を以下に示す。
1H-NMR (CDCl3) : δ 7.83(1H, m),
7.81(1H, m), 6.97(1H, m), 6.95(1H, m), 3.04(1H, s), 1.56(9H, s), 0.25(6H, s).。【０１６２】
（６−２）：  ２−［４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニロキシ）ベンゼンスルホニル］−１−（４−モルホリン−４−イルメチルフェニル）エタノン（XIII−６）
前記（６−１）で得たｔｅｒｔ−ブチル−（４−メタンスルホニルフェノキシ）ジメチルシラン（XII−６）２．０ｇ（６．９８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液に、アルゴン雰囲気下−７８℃でリチウムジイソプロピルアミドの２．０Ｍヘキサン−ヘプタン−エチルベンゼン溶液４．１９ｍＬ（８．３７ｍｍｏｌ）を加え、リチウムヘキサメチルジシラジドの１．０Ｍ−テトラヒドロフラン溶液６．９８ｍＬ（６．９８ｍｍｏｌ）と、４−モルホリン−４−イルメチル安息香酸メチル（IX−６）１．６ｇ（６．９８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液５ｍＬを加えた。その後、撹拌しながら徐々に室温まで昇温した。反応終了後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧下留去した。２−［４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニロキシ）ベンゼンスルホニル］−１−（４−モルホリン−４−イルメチルフェニル）エタノン（XIII−６）３．７４ｇを粗精製物として得た。【０１６３】
（６−３）：２−［４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニロキシ）ベンゼンスルホニル］−１−（４−モルホリン−４−イルメチルフェニル）エタノール（XIV−６）
前記（６−２）で得た化合物（XIII−６）３．７４ｇ（６．９８ｍｍｏｌ）のメタノール（５０ｍＬ）溶液に、０℃で水素化ホウ素ナトリウム  ２６４ｍｇ（６．９８ｍｍｏｌ）を加えた。１時間撹拌した後、飽和食塩水を加えた。メタノールを減圧下留去した後、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル→酢酸エチル：メタノール＝１０：１）で精製し、２−［４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニロキシ）ベンゼンスルホニル］−１−（４−モルホリン−４−イルメチルフェニル）エタノール（XIV−６）を２．１９ｇ（４．４８ｍｍｏｌ）得た。物性値を以下に示す。
1H-NMR (CDCl3) : δ 7.83(2H, m),
7.25-7.30(4H, m), 6.98(2H, m), 5.22(1H, d, J = 7.7 Hz), 3.68(4H, m), 3.46(3H,
m), 3.30(1H, dd, J= 1.5, 14 Hz), 2.40(4H, m), 0.99(9H, s), 0.25(6H, s)．。【０１６４】
（６−４）：  ４−［（Ｅ）−２−（４−モルホリン−４−イルメチルフェニル）エテンスルホニル］フェノール（XVI−６）
前記（６−３）で得た２−［４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニロキシ）ベンゼンスルホニル］−１−（４−モルホリン−４−イルメチルフェニル）エタノール（XIV−６）２．１９ｇ（４．４８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（４５ｍＬ）にトリエチルアミン３．１０ｍＬを加え、０℃にて撹拌した。塩化メタンスルホニル０．６１ｍＬ（８．９１ｍｍｏｌ）を加えた後、室温にて８時間撹拌した。さらにトリエチルアミン３．１０ｍＬ、塩化メタンスルホニル０．６１ｍＬをそれぞれ加え、４時間撹拌した。飽和食塩水を加えてクロロホルムで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：２→酢酸エチル→酢酸エチル：メタノール＝１０：１）で精製し、４−［（Ｅ）−２−（４−モルホリン−４−イルメチルフェニル）エテンスルホニル］フェノール（XVI−６）を０．７５７ｇ（２．１１ｍｍｏｌ）得た（収率４７％）。物性値を以下に示す。
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.01(1H, d, J
= 8.7 Hz), 7.81(1H, d, J = 8.7 Hz), 7.61(1H, d, J = 15 Hz), 7.35-7.47(5H, m),
6.92(1H, d, J = 6.9 Hz), 6.81(1H, d, J = 15 Hz), 3.71(4H, m), 3.51(2H, m),
2.44(4H, m).。【０１６５】
（６−５）：  ４−｛４−［（Ｅ）−２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）ビニル］ベンジル］モルホリン（II−６）
前記（６−４）で得た４−［（Ｅ）−２−（４−モルホリン−４−イルメチルフェニル）エテンスルホニル］フェノール（XVI−６）１８７ｍｇ（０．５２０ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液に炭酸カリウム１０８ｍｇ（０．７８０ｍｍｏｌ）および１−ブロモ−２−ブチン０．０９４ｍＬ（１．０４ｍｍｏｌ）を加え、４時間撹拌した。飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：クロロホルム＝１：１→１：２→酢酸エチル）で精製し、４−｛４−［（Ｅ）−２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）ビニル］ベンジル］モルホリン（II−６）を０．０２３８ｇ（０．０５７８ｍｍｏｌ）得た（収率１１％）。物性値を以下に示す。
1H-NMR (CDCl3) : δ 7.87(2H, d, J
= 8.7 Hz), 7.63(1H, d, J = 15.5 Hz), 7.35-7.44(4H, m), 7.07(2H, d, J = 8.7 Hz),
6.83(1H, d, J = 15.5 Hz), 4.71(2H, m), 3.69(4H, m), 3.50(2H, s), 2.43(4H, m),
1.86(3H, s).。【０１６６】
（６−６）：  Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−モルホリン−４−イルメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド（Ｉ−６）
前記（６−５）で得た化合物（II−６）を用い、前記と同様な方法（１−７および１−８）により、Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド（Ｉ−６）を得た。物性値を以下に示す。
MS
(FAB) m/z : 473 (M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.45(0.6H, s),
8.11(0.4H, s), 7.80-7.88(2H, m), 7.23-7.32(4H, m), 7.07-7.16(2H, m), 5.63(0.6H,
m), 5.38(0.4H, m), 4.75(2H, m), 4.19(0.4H, m), 4.03(0.6H, m), 3.64-3.71(4H, m),
3.40-3.51(2H, m), 2.39(4H, m), 1.87(3H, m).。【０１６７】
（実施例７）
Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−［１−（４−モルホリン−４−イルメチルフェニル）−２−（４−ペント−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）エチル］ホルムアミド（Ｉ−７）【０１６８】
【化２３】
2012036257.tif 000025
【０１６９】
実施例６と同様の操作により、上記の化合物（Ｉ−７）を得た。
MS
(FAB) m/z : 487 (M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.44(0.6H, s),
8.11(0.4H, s), 7.78-7.88(2H, m), 7.26-7.32(4H, m), 7.06-7.16(2H, m), 5.63(0.6H,
dd, J = 3.6, 12.3 Hz), 5.38(0.4H, dd, J = 3.0, 10.1 Hz), 4.75(2H, m),
4.18(0.4H, dd, J = 10.1, 15.7 Hz), 4.03(0.6H, dd, J = 12.3, 14.6 Hz), 3.72(2H,
q, J = 6.9 Hz), 3.64-3.70(4H, m), 3.41-3.48(3H, m), 2.36-2.43(4H, m), 1.24(3H,
t, J = 6.9 Hz).。【０１７０】
スキーム１〜４に従い、実施例１〜７と同様の方法にて、以下の化合物（Ｉ−８〜Ｉ−２８）を得た。【０１７１】
（実施例８）
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−ジメチルアミノフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド（Ｉ−８）【０１７２】
【化２４】
2012036257.tif 000026
【０１７３】
MS
(ESI) m/z : 417(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.40(0.5H, s),
8.04(0.5H, s), 7.73-7.89(2H, m), 7.02-7.22(4H, m), 6.62(2H, d, J = 8.7 Hz),
5.49-5.58(0.5H, m), 5.22-5.31(0.5H, m), 4.73(2H, d, J = 9.2 Hz), 3.98-4.23(1H,
m), 3.37-3.55(1H, m), 2.93(3H, s), 2.91(3H, s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz).。【０１７４】
（実施例９）
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（３−ジメチルアミノフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド（Ｉ−９）【０１７５】
【化２５】
2012036257.tif 000027
【０１７６】
MS
(ESI) m/z : 417(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.45(0.5H, s),
8.07(0.5H, s), 7.77-7.89(2H, m), 7.04-7.21(4H, m), 6.57-6.68(2H, m),
5.54-5.62(0.5H, m), 5.27-5.34(0.5H, m), 4.69-4.77(2H, m), 4.00-4.25(1H, m),
3.41-3.54(1H, m), 2.90-2.95(6H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz).。【０１７７】
（実施例１０）
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（２−ジメチルアミノフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド（Ｉ−１０）【０１７８】
【化２６】
2012036257.tif 000028
【０１７９】
MS
(ESI) m/z : 417(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.31(0.6H, s),
8.08(0.4H, s), 7.88(0.6H, d, J = 9.2 Hz), 7.83(0.4H, d, J = 8.7 Hz), 7.07-7.42(6H,
m), 6.57-6.68(2H, m), 6.04(0.4H, dd, J = 2.7, 10 Hz), 5.88(0.6H, dd, J = 2.7,
11 Hz), 4.71-4.78(2H, m), 3.99-4.08(1H, m), 3.39-3.51(1H, m), 2.61(2.4H, s),
2.54(3.6H, s), 1.86(3H, t, J = 2.3 Hz).。【０１８０】
（実施例１１）
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（４−ピペリジン−１−イルメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド（Ｉ−１１）【０１８１】
【化２７】
2012036257.tif 000029
【０１８２】
MS
(ESI) m/z : 471(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.28(0.6H, s),
8.10(0.4H, s), 7.77-7.89(2H, m), 7.04-7.30(6H, m), 5.61-5.69(0.6H, m),
5.31-5.39(0.4H, m), 4.69-4.78(2H, m), 3.99-4.26(1H, m), 3.35-3.53(3H, m),
2.37(4H, br s), 1.87(3H, br s), 1.35-1.59(6H, m).。【０１８３】
（実施例１２）
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（３−ピペリジン−１−イルメチルフェニル）エチル］ヒドロキシホルムアミド（Ｉ−１２）【０１８４】
【化２８】
2012036257.tif 000030
【０１８５】
MS
(ESI) m/z : 471(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.38(0.5H, s),
8.10(0.5H, s), 7.77-7.89(2H, m), 7.04-7.30(6H, m), 5.70(0.5H, dd, J = 3.7, 11
Hz), 5.30-5.38(0.5H, m), 4.69-4.77(2H, m), 4.01-4.27(1H, m), 3.23-3.60(3H, m),
2.30(4H, br s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz), 1.31-1.55(6H, m).。【０１８６】
（実施例１３）
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（３−モルホリン−４−イルメチルフェニル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド（Ｉ−１３）【０１８７】
【化２９】
2012036257.tif 000031
【０１８８】
MS
(ESI) m/z : 473(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.46(0.5H, s),
8.10(0.5H, s), 7.78-7.90(2H, m), 7.06-7.31(6H, m), 5.65(0.5H, dd, J = 3.7, 12
Hz), 5.35-5.42(0.5H, m), 4.70-4.78(2H, m), 3.98-4.26(1H, m), 3.68(4H, dd, J =
4.6, 4.6 Hz), 3.39-3.54(3H, m), 2.36-2.44(4H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz).。【０１８９】
（実施例１４）
Ｎ−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−｛４−［（エチルメチルアミノ）メチル］フェニル］エチル｝−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド（Ｉ−１４）【０１９０】
【化３０】
2012036257.tif 000032
【０１９１】
MS
(ESI) m/z : 445(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.35(0.5H, s),
8.11(0.5H, s), 7.78-7.89(2H, m), 7.06-7.28(6H, m), 5.65(0.5H, dd, J = 3.7, 12
Hz), 5.32-5.40(0.5H, m), 4.71-4.77(2H, m), 3.99-4.24(1H, m), 3.38-3.53(3H, m),
2.38(3H, q, J = 7.3 Hz), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz), 1.05(3H, t, J = 7.3 Hz).。【０１９２】
（実施例１５）
Ｎ−（２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−｛３−［（エチルメチルアミノ）メチル］フェニル｝エチル）−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド（Ｉ−１５）【０１９３】
【化３１】
2012036257.tif 000033
【０１９４】
MS
(ESI) m/z : 445(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.37(0.5H, s),
8.11(0.5H, s), 7.78-7.90(2H, m), 7.06-7.34(6H, m), 5.70(0.5H, dd, J = 3.7, 12
Hz), 5.32-5.40(0.5H, m), 4.70-4.78(2H, m), 4.00-4.22(1H, m), 3.29-3.59(3H, m),
2.38(3H, q, J = 6.9 Hz), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz), 1.03(3H, t, J = 6.9 Hz).。【０１９５】
（実施例１６）
Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝−Ｎ−メチルメタンスルホンアミド（Ｉ−１６）【０１９６】
【化３２】
2012036257.tif 000034
【０１９７】
MS
(ESI) m/z : 495(M＋H)+.
1H-NMR (DMSO-d6) : δ 8.22(0.5H, br
s), 8.11(0.5H, br s), 7.75-7.86(2H, m), 7.09-7.42(4H, m), 7.13(2H, d, J = 9.2
Hz), 5.70(0.5H, br s), 5.40(0.5H, br s), 4.83-4.89(2H, m), 4.18(2H, s),
3.86-4.16(2H, m), 2.94(3H, s), 2.63(3H, s), 1.84(3H, t, J = 2.3 Hz).。【０１９８】
（実施例１７）
Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝−４−メチルベンゼンスルホンアミド（Ｉ−１７）【０１９９】
【化３３】
2012036257.tif 000035
【０２００】
MS
(ESI) m/z : 557(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.37(0.6H, br
s), 8.03(0.4H, br s), 7.69-7.88(4H, m), 7.04-7.33(8H, m), 5.61(0.6H, dd, J =
3.6, 12 Hz), 5.31-5.39(0.4H, m), 4.70-4.83(2H, m), 3.92-4.17(3H, m),
3.36-3.51(1H, m), 2.43(3H, s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz).。【０２０１】
（実施例１８）
Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝−４、Ｎ−ジメチルベンゼンスルホンアミド（Ｉ−１８）【０２０２】
【化３４】
2012036257.tif 000036
【０２０３】
MS
(ESI) m/z : 571(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.47(0.6H, br
s), 8.11(0.4H, br s), 7.78-7.89(2H, m), 7.70(2H, d, J = 8.2 Hz), 7.35(2H, d, J
= 8.2 Hz), 7.23-7.32(4H, m), 7.06-7.17(2H, m), 5.64(0.6H, dd, J = 3.6, 12 Hz),
5.36-5.43(0.4H, m), 4.71-4.78(2H, m), 3.96-4.22(3H, m), 3.38-3.52(1H, m),
2.58(1.2H, s), 2.54(1.8H, s), 2.45(3H, s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz).。【０２０４】
（実施例１９）
Ｎ−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝−Ｎ−メチルスルホニルメタンスルホンアミド（Ｉ−１９）【０２０５】
【化３５】
2012036257.tif 000037
【０２０６】
MS
(ESI) m/z : 559(M＋H)+.
1H-NMR (DMSO-d6) : δ 8.12(0.5H, br
s), 8.21(0.5H, br s), 7.80(2H, br s), 7.35-7.44(1H, m), 7.32(2H, d, J = 9.2
Hz), 7.31(1H, s), 7.14(2H, d, J = 9.2 Hz), 5.41(0.5H, br s), 5.71(0.5H, br s),
4.87(2H, q, J = 2.3 Hz), 4.83(2H, s), 4.00-4.16(1H, m), 3.84-3.98(1H, m),
3.25(6H, s), 1.84(3H, t, J = 2.3 Hz).。【０２０７】
（実施例２０）
Ｎ−｛２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−［４−（２−ジメチルアミノエチル）フェニル］エチル｝−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド（Ｉ−２０）【０２０８】
【化３６】
2012036257.tif 000038
【０２０９】
MS
(ESI) m/z : 445(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.30(0.5H, s),
8.14(0.5H, s), 7.76-7.89(2H, m), 7.00-7.24(6H, m), 5.71(0.5H, dd, J = 3.7, 11
Hz), 5.29-5.36(0.5H, m), 4.69-4.76(2H, m), 4.02-4.21(1H, m), 3.42-3.59(1H, m),
2.43-2.54(2H, m), 2.10-2.28(2H, m), 2.19(6H, s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz).。【０２１０】
（実施例２１）
Ｎ−｛２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−［４−（２−モルホリン−４−イルエチル）フェニル］エチル｝−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド（Ｉ−２１）【０２１１】
【化３７】
2012036257.tif 000039
【０２１２】
MS
(ESI) m/z : 487(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.44(0.5H, s),
8.10(0.5H, s), 7.77-7.89(2H, m), 7.05-7.27(6H, m), 5.62(0.5H, dd, J = 3.7, 12
Hz), 5.32-5.39(0.5H, m), 4.69-4.78(2H, m), 3.96-4.23(1H, m), 3.71(4H, dd, J =
4.1, 4.6 Hz), 3.39-3.53(1H, m), 2.69-2.77(2H, m), 2.43-2.56(6H, m), 1.87(3H, t,
J = 2.3 Hz).。【０２１３】
（実施例２２）
Ｎ−（２−｛４−［２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］フェニル｝エチル）メタンスルホンアミド（Ｉ−２２）【０２１４】
【化３８】
2012036257.tif 000040
【０２１５】
MS
(ESI) m/z : 495(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.39(0.5H, s),
8.07(0.5H, s), 7.78-7.89(2H, m), 7.05-7.30(6H, m), 5.65(0.5H, dd, J = 3.7, 12
Hz), 5.33-5.41(0.5H, m), 4.70-4.78(2H, m), 3.95-4.21(1H, m), 3.31-3.52(3H, m),
2.80-2.91(5H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz).。【０２１６】
（実施例２３）
Ｎ−｛２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−［４−（３−ジメチルアミノプロピル）フェニル］エチル｝−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド（Ｉ−２３）【０２１７】
【化３９】
2012036257.tif 000041
【０２１８】
MS
(ESI) m/z : 459(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.06-8.13(1H,
m), 7.74-7.88(2H, m), 7.02-7.24(6H, m), 5.64-5.75(0.5H, m), 5.22-5.32(0.5H, m),
4.68-4.76(2H, m), 4.02-4.22(1H, m), 3.40-3.58(1H, m), 2.51(2H, dd, J = 7.3, 7.8
Hz), 2.17(2H, dd, J = 7.3, 7.8 Hz), 2.08(3H, s), 2.06(3H, s), 1.87(3H, t, J =
2.3 Hz), 1.52-1.66 (2H, m).。【０２１９】
（実施例２４）
Ｎ−｛２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−［４−（３−ジエチルアミノプロピル）フェニル］エチル｝−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド（Ｉ−２４）【０２２０】
【化４０】
2012036257.tif 000042
【０２２１】
MS
(ESI) m/z : 487(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.29(0.5H, s),
8.07(0.5H, m), 7.75-7.89(2H, m), 7.04-7.24(6H, m), 5.64(0.5H, dd, J = 3.7, 11
Hz), 5.28-5.37(0.5H, m), 4.69-4.77(2H, m), 4.00-4.23(1H, m), 3.41-3.55(1H, m),
2.33-2.60(6H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz), 1.61-1.72(2H, m), 0.91-1.01(6H, m).。【０２２２】
（実施例２５）
Ｎ−｛２−（４−ブト−２−イニルオキシ−ベンゼンスルホニル）−１−［４−（３−モルホリン−４−イルプロピル）フェニル］エチル｝−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド（Ｉ−２５）【０２２３】
【化４１】
2012036257.tif 000043
【０２２４】
MS
(ESI) m/z : 501(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.37(0.5H, s),
8.08(0.5H, s), 7.76-7.89(2H, m), 7.04-7.24(6H, m), 5.64(0.5H, dd, J = 3.7, 12
Hz), 5.29-5.38(0.5H, m), 4.68-4.77(2H, m), 3.98-4.23(1H, m), 3.67(4H, br s),
3.40-3.53(1H, m), 2.52-2.63(2H, m), 2.24-2.46(6H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz),
1.65-1.76(2H, m).。【０２２５】
（実施例２６）
Ｎ−｛２−（４−ブト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）−１−［４−（４−モルホリン−４−イルブチル）−フェニル］−エチル｝−Ｎ−ヒドロキシホルムアミド（Ｉ−２６）【０２２６】
【化４２】
2012036257.tif 000044
【０２２７】
MS
(ESI) m/z : 515(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.41(0.5H, s),
8.10(0.5H, s), 7.77-7.89(2H, m), 7.05-7.24(6H, m), 5.57-5.66(0.5H, m),
5.31-5.38(0.5H, m), 4.69-4.77(2H, m), 3.97-4.23(1H, m), 3.67(4H, dd, J = 4.1,
4.6 Hz), 3.40-3.53(1H, m), 2.52-2.63(2H, m), 2.24-2.46(6H, m), 1.87(3H, t, J =
2.3 Hz), 1.39-1.63(4H, m).。【０２２８】
（実施例２７）
Ｎ−｛４−［１−（ホルミルヒドロキシアミノ）−２−（４−ペント−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド（Ｉ−２７）【０２２９】
【化４３】
2012036257.tif 000045
【０２３０】
MS
(ESI) m/z : 495(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.29(0.6H, s),
8.00(0.4H, s), 7.75-7.88(2H, m), 7.23-7.35(4H, m), 7.05-7.16(2H, m), 5.66(0.6H,
dd, J = 3.7, 12 Hz), 5.31-5.41(0.4H, m), 4.71-4.80(2H, m), 4.26(2H, br s),
3.95-4.18(1H, m), 3.39-3.50(1H, m), 2.89(3H, br s), 2.24(2H, tq, J = 1.8, 7.3
Hz), 1.14(3H, t, J = 7.3 Hz).。【０２３１】
（実施例２８）
Ｎ−｛４−［１−（ホルミルヒドロキシアミノ）−２−（４−オクト−２−イニルオキシベンゼンスルホニル）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド（Ｉ−２８）【０２３２】
【化４４】
2012036257.tif 000046
【０２３３】
MS
(ESI) m/z : 537(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3)
: δ 8.35(0.6H, s),
8.03(0.4H, s), 7.76-7.88(2H, m), 7.27-7.36(4H, m), 7.06-7.17(2H, m), 5.66(0.6H,
dd, J = 3.7, 12 Hz), 5.34-5.42(0.4H, m), 4.72-4.82(2H, m), 4.23-4.33(2H, m),
3.94-4.18(1H, m), 3.38-3.51(1H, m), 2.90(1.2H, s), 2.89(1.8H, s), 2.22(2H, tt,
J = 2.3, 7.3 Hz), 1.45-1.55(2H, m), 1.23-1.38(4H, m), 0.87(3H, t, J = 7.3 Hz).。【０２３４】
（試験例３）  ＡＤＡＭ１７阻害実験
実施例１〜７において得られたＮ−ヒドロキシホルムアミド誘導体のＡＤＡＭ１７に対する阻害作用の有無を調べた。【０２３５】
すなわち、先ず、ＡＤＡＭ１７の塩基配列はモス（Ｍｏｓｓ）らにより報告されている（Ｍｏｓｓら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７年、３８５巻、７３３−７３６ページ  参照）ので、ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１細胞から定法にしたがってＡＤＡＭ−１７のｃＤＮＡを取得し、これを発現ベクターに組み込み、次いでこのベクターを哺乳動物細胞あるいは昆虫細胞に形質転換し、ＡＤＡＭ１７を発現させ取得した。【０２３６】
次に、得られたＡＤＡＭ１７を酵素として用い、また基質としては、膜結合型ＴＮＦのＡＤＡＭ１７切断配列を含んだ蛍光合成基質  Ｎｍａ（Ｎ−メチルアントラニル酸）−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｄｎｐ（ジニトロフェニル）−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２を用いて、被験物質存在下または非存在下におけるＡＤＡＭ１７の活性を以下のようにして測定した。【０２３７】
すなわち、アッセイバッファーＡ（２００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、１０μｍｏｌ／Ｌ硫酸亜鉛、２ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミンを含む、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））にて調製した１４ｕｎｉｔｓの酵素液（２５℃の条件下で１ｐｍｏｌの基質を１分間で分解する酵素量を１ｕｎｉｔと定義した）９０μＬ、およびアッセイバッファーＢ（２００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、１０μｍｏｌ／Ｌ硫酸亜鉛、０．０５％ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８を含む、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））にて２０μｍｏｌ／Ｌに調製した蛍光合成基質９０μＬを混合し、３７℃で１．５時間反応させた。この後、蛍光強度計（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ）にて、励起波長３５５ｎｍ、測定波長４６０ｎｍの条件で測定し、酵素活性を求めた。そして、被験化合物の存在下および非存在下の酵素活性より阻害率を求め、５０％抑制濃度（ＩＣ５０）を算出した。得られた結果を表１に示す。【０２３８】
【表１】
2012036257.tif 000047
【０２３９】
表１に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物（Ｎ−ヒドロキシホルムアミド誘導体）であるＩ−１〜Ｉ−７はいずれも低濃度にてＡＤＡＭ１７の酵素活性を阻害することが確認された。【０２４０】
（試験例４）  各種評価試験
次に実施例１〜７において得られたＮ−ヒドロキシホルムアミド誘導体の中から、ＡＤＡＭ１７に対する阻害効果の高かった化合物  Ｉ−１（以下、「Ｓ−４５２８２」とも称する）及びＩ−４（以下、「Ｓ−４５４５７」とも称する）について、下記の方法にて、その阻害剤としての特異性と細胞におけるＴＡＣＥ阻害活性を調べた。比較のために非選択的なメタロプロテアーゼ阻害剤であるＧＭ６００１（ＥＭＤ／Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、製品番号３６４２０５）も評価した。【０２４１】
＜酵素阻害試験＞
この試験において用いた酵素は下記の通りである
Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  １（ＭＭＰ−１）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、製品番号：４４４２０８）
Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ２（ＭＭＰ−２）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、製品番号：４４４２１３）
Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ３（ＭＭＰ−３）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、製品番号：４４４２１７）
Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ８（ＭＭＰ−８）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、製品番号：４４４２２９）
Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ９（ＭＭＰ−９）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、製品番号：４４４２３１）
Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  １３（ＭＭＰ−１３）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製、製品番号：ＣＣ０６８）
Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  １４（ＭＭＰ−１４）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、製品番号：４７５９３５）
Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  １７（ＭＭＰ−１７）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、製品番号：４７５９４０）
Ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  １０（ＡＤＡＭ１０）（フナコシ社製、商品コード：９３６−ＡＤ−０２０）
Ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  １７（ＡＤＡＭ１７、ＴＡＣＥ）（試験例３の通り、科研製薬にて遺伝子組み換え法を用いて作製したものを使用した。なお、試験例３の通り、２５℃の条件下で１ｐｍｏｌの基質を１分間で分解する酵素量を１ｕｎｉｔと定義した。）。【０２４２】
また、この試験で用いた基質は下記の通りである
４４４２２１基質（ＤＮＰ−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｎｍａ）−ＮＨ２、カスタム合成）：励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ
ＴＡＣＥ基質（試験例３で用いたものと同じ）：  励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ
３１６８基質（ＭＯＣＡｃ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）−ＮＨ２、ペプチド研究所社製）：  励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４０５ｎｍ
３１６３基質（ＭＯＣＡｃ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ２、ペプチド研究所社製）：  励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４０５ｎｍ。【０２４３】
そして、前記酵素及び基質を用いて酵素反応を行った。すなわち、酵素によっては製造元の情報に従い予めＡＰＭＡ（終濃度１ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌｍｅｒｃｕｒｉｃ  ａｃｅｔａｔｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ａ９５６３）で活性化させた後、蛍光専用９６ｗｅｌｌプレートにアッセイバッファーＡ（２００ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウム、５ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化カルシウム、１０μｍｏｌ／Ｌ  硫酸亜鉛、２ｍｇ／ｍＬ  牛血清アルブミンを含む、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））にて調製した酵素液９０μＬに、アッセイバッファーＢ（２００ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウム、５ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化カルシウム、１０μｍｏｌ／Ｌ  硫酸亜鉛、０．０５％ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８を含む、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））にて２０μｍｏｌ／Ｌに調製した基質９０μＬを混合し、２５℃もしくは３７℃で数時間反応させた。そして、反応前後の蛍光強度を蛍光強度計にて測定し、酵素活性を求め、試験物質の存在下および非存在下の酵素活性より阻害率を求め、５０％抑制濃度（ＩＣ５０）を算出した。各酵素の反応条件は表２に示す。【０２４４】
【表２】
2012036257.tif 000048
【０２４５】
＜細胞におけるＴＡＣＥ阻害試験＞
ＴＨＰ−１細胞（ヒト急性単球型白血病由来の細胞、ＡＴＣＣカタログ番号：ＴＩＢ２０２）を１０ｖ／ｖ％  ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、９６ウェル培養プレートに、２００μＬ／ｗｅｌｌ（１×１０５個）ずつ分注し、ＰＭＡ（終濃度５０ｎｍｏｌ／Ｌ）添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて４０〜４８時間培養し、ＴＨＰ−１細胞をマクロファージ様細胞へと分化させた。分化後に、培地を捨て、細胞をＴＨＰ−１洗浄バッファー（ＲＰＭＩ１６４０、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４））で洗浄した。細胞の洗浄後、ＴＨＰ−１アッセイバッファー（ＲＰＭＩ１６４０、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、０．０１ｗ／ｖ％  ＰＦ−６８、１０ｖ／ｖ％  ＦＢＳ）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。そして、試験物質（Ｉ−１又はＩ−４）含有ＴＨＰ−１アッセイバッファーをさらに５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、タッピングによって混合し、ＣＯ２インキュベーター内にて３０〜４５分間プレインキュベートした後、ＬＰＳ入りＴＨＰ−１１アッセイバッファーを５０μＬ／ｗｅｌｌ加えた（ＬＰＳの最終濃度は１μｇ／ｍＬとなる）。更に、プレートをタッピングすることで混合し、ＣＯ２インキュベーター内にて６時間インキュベートした。インキュベート終了後、培養上清中のヒトＴＮＦ−α濃度を市販キット（Ｈｕｍａｎ  ＴＮＦ−α  ＣｙｔｏＳｅｔ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社製）、または、Ｈｕｍａｎ  ＴＮＦ−α  Ｒｅａｄｙ−Ｓｅｔ−Ｇｏ！（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製））で測定した。【０２４６】
これらの試験方法で得られた結果を表３に示す。【０２４７】
【表３】
2012036257.tif 000049
【０２４８】
表３に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物であるＩ−１及びＩ−４は共にＡＤＡＭ１７以外のメタロプロテアーゼと比較して、ＡＤＡＭ１７に対して高い特異性を有していることが確認された。マクロファージ様細胞に発現したＴＡＣＥに対する阻害活性も確認された。また、両化合物は、ＡＤＡＭ１０もＡＤＡＭ１７に比べると若干弱いものの抑制した。ＡＤＡＭ１０は、ＡＤＡＭ１７と同一の基質をも切断する酵素であり（Ｃａｅｓｃｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊ．、２００９年、４２４巻、７９〜８８ページ  参照）、その阻害は血小板機能の保存に有用であることが示唆されている（Ｂｅｎｄｅｒら、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ＧＰVI  ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ  ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ．」、Ｂｌｏｏｄ、２０１０年７月１９日電子版  参照）。然るに、本発明にかかる化合物であるＩ−１及びＩ−４はＡＤＡＭ１７特異的阻害剤であり、同様の基本骨格を有する他の本発明にかかる化合物（例えば、Ｉ−２、Ｉ−３、Ｉ−５、Ｉ−６）もＡＤＡＭ１７特異的阻害剤であることが示唆された。一方、ヒドロキサム酸構造を有するＧＭ６００１は、従来知られているように非特異的にメタロプロテアーゼを強く阻害したが、ＡＤＡＭ１７に対する阻害活性は弱いものであった。【０２４９】
（試験例５）  ＧＭ６００１及びＳ−４５２８２のＥＳ細胞由来血小板に対する機能維持効果についての検証
前述の通りにして得られたＥＳ細胞由来の造血前駆細胞を、図６に示した条件下（プロトコール１）で血小板の誘導を行った。すなわち、造血前駆細胞を巨核球／血小板に誘導する前述の８日間の培養過程において、
２ｄａｙｓ：フローサイトメトリー解析にかける２日前（図６において示す「ｄ２２」）にＧＭ６００１、Ｓ−４５２８２、又はＤＭＳＯを添加して培養、又は
８ｄａｙｓ：ＥＳ細胞由来の造血前駆細胞を播き直してから８日間（図６において示す「ｄ１５」以降）、ＧＭ６００１（５０μＭ）、Ｓ−４５２８２（５μＭ又は５０μＭ）、又はＤＭＳＯを添加して培養
という条件下で各々培養を行い、前述の通り回収して、フローサイトメトリーにて、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(＋）の数、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(−）の数、及び血小板の総数を測定した。得られた結果を図７〜図１０に示す。なお、ＣＤ４１（インテグリンαIIｂ）は血小板の表面マーカーであるため、ＣＤ４１（＋）は血小板であることを示している。また、ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）(＋）は、ＧＰＩｂαが表面に存在している血小板であることを示し、ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）(−）は、ＡＤＡＭ１７によってＧＰＩｂαがシェディングされてしまった血小板であることを示す。また図中「ＧＭ」は５０μＭ  ＧＭ６００１（溶媒：ＤＭＳＯ）を添加した結果を示し、「４５２８２」は各濃度のＳ−４５２８２（溶媒：ＤＭＳＯ）を添加した結果を示す。【０２５０】
図７及び図９に示した結果から明らかなように、ＧＭ６００１及びＳ−４５２８２は各々ＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂαのシェディングを阻害していることが確認された。さらに、Ｓ−４５２８２は５μＭでも５０μＭ  ＧＭ６００１に相当する阻害効果を有していることも明らかになった。【０２５１】
また、図８及び図１０に示した結果から明らかなように、５０μＭのＧＭ６００１と５μＭのＳ−４５２８２の２日間添加では、ほぼ同数の血小板が得られるが、８日間添加した場合においては、ＧＭ６００１は５μＭのＳ−４５２８２と比べて血小板数が少なく、５０μＭのＧＭ６００１は細胞毒性を有していることが明らかになった。【０２５２】
（試験例６）  Ｓ−４５４５７及びＳ−４５２８２のＥＳ細胞由来血小板に対する機能維持効果についての検証
前述の通りにして得られたＥＳ細胞由来の造血前駆細胞を、図６に示した条件下（プロトコール１）で血小板の誘導を行った。すなわち、ＥＳ細胞由来の造血前駆細胞を播き直してから８日間（図６において示す「ｄ１５」以降）、ＧＭ６００１（５０μＭ）、Ｓ−４５４５７（５μＭ又は５０μＭ）、Ｓ−４５２８２（５μＭ）、又はＤＭＳＯを添加して培養を行い、前述の通り回収して、フローサイトメトリーにて、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(＋）の数、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(−）の数、及び血小板の総数を測定した。得られた結果は図１１及び図１２に示す。なお、図中「４５４５７」は各濃度のＳ−４５４５７（溶媒：ＤＭＳＯ）を添加した結果を示す。【０２５３】
図１１及び図１２に示した結果から明らかなように、Ｓ−４５４５７も、ＧＭ６００１及びＳ−４５２８２同様にＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂαのシェディングを阻害していることが確認された。【０２５４】
（試験例７）  Ｓ−４５４５７の血小板に対する機能維持効果における濃度依存性についての検証
前述の通りにして得られたＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞由来の造血前駆細胞を、図６に示した条件下で血小板の誘導を行った。すなわち、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞由来の造血前駆細胞を播き直してから８日間（図６において示す「ｄ１５」以降）、ＧＭ６００１（５０μＭ）、Ｓ−４５４５７（１．５〜５０μＭ）、又はＤＭＳＯを添加して培養を行い、前述の通り回収して、フローサイトメトリーにて、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(＋）の数、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(−）の数、及び血小板の総数を測定した。４回実施して得られた結果を図１３〜１６に示す。なお、血小板総数に占めるＣＤ４２ｂ（＋）の比率における統計処理は、角変換した値を分散分析で実施し、Ｄｕｎｎｅｔ法でＤＭＳＯ群と試験物質群の群間差を多重比較した。【０２５５】
図１４及び１６に示した結果から明らかなように、ＥＳ細胞を用いた培養系（図１４）と同様にｉＰＳ細胞を用いた培養系(図１６)においても、本発明にかかる化合物であるＳ−４５４５７を添加することによって、その添加した濃度依存的にＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂαのシェディングを阻害していることが確認された。さらに、図１３及び１５に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物であるＳ−４５４５７はＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞、並びにこれらから分化誘導される細胞に対する毒性は低いことも確認された。【０２５６】
（試験例８）  Ｓ−４５４５７のヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果における濃度依存性についての検証
前述のような培養系を用いて得られた血小板だけでなく、採血によって得られた末梢血由来の血小板においても、本発明にかかる化合物は機能維持効果を発揮するのかを検証した。すなわち、図６に示した＜プロトコール２＞の通り、先ず、採血して得られたヒト末梢血にその１／１０量のＡＣＤを加え、ブレーキ無し、９００ｒｐｍで１０分間遠心した。遠心して得られた上清を更にブレーキ無し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を除去した。得られた沈殿物をＴｙｒｏｄｅ−ＨＥＰＥＳバッファー（カルシウム含まず）に懸濁し、懸濁液中の血小板数を数え、５×１０７〜１×１０８個/Ｔｙｒｏｄｅ−ＨＥＰＥＳバッファー（カルシウム含まず）２００μＬになるように血小板を含む懸濁液（洗浄血小板、Ｗａｓｈｅｄ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ）を調製した。次に、このように調製して得られた洗浄血小板に１００μＭ  ＣＣＣＰ（Ｃａｒｂｏｎｙｌ  ｃｙａｎｉｄｅ  ｍ−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｈｙｄｒａｚｏｎｅ）と共に、５０μＭ  ＧＭ６００１、１．５〜５０μＭ  Ｓ−４５４５７、又はＤＭＳＯを添加し、３７℃で２４時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(＋）の数、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(−）の数を測定した。なお、ＣＣＣＰの添加により、血小板表面上のＧＰＩｂαのシェディングは亢進されることが知られている（Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、２００３年、１０２巻、４２２９〜４２３５ページ  参照）。得られた結果を図１７に示す。統計処理は、試験例７と同様である。【０２５７】
図１７に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物は、ＧＭ６００１と同様に、ヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果、特に３７℃における機能維持効果を有していることが確認された。【０２５８】
（試験例９）  Ｓ−４５４５７及びｐ３８阻害剤のヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果の検証
ｐ３８を阻害することにより、ＧＰＩｂαのシェディングは阻害されることが知られている（Ｍａｔｔｈｉａｓ  Ｃ．ら、ＴＲＡＮＳＦＵＳＩＯＮ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ、ＢＬＯＯＤ、２０１０年３月４日、１１５巻、９号、１８３５〜１８４２ページ  参照）。そこで、ヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果において、ｐ３８阻害剤と本発明にかかる化合物とを比較した。すなわち、試験例８と同様にして調製して得られた洗浄血小板に１００μＭ  ＣＣＣＰと共に、４０μＭ  ｐ３８阻害剤２種（ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、製品番号ＳＢ２０２１９０及びＳＢ２０３５８０）、５０μＭ  Ｓ−４５４５７、又はＤＭＳＯを添加し、３７℃で２４時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて、ＣＤ４１（＋）及びＣＤ４２ｂ(＋）のドットプロット解析を行った。得られた結果を図１８に示す。なお。図１８中、Ｘ軸はＣＤ４１を示し、Ｙ軸はＣＤ４２ｂを示す。また、図中「２０２１９０」「２０３５８０」は４０μＭ  各ｐ３８阻害剤（溶媒：ＤＭＳＯ）を添加した結果を示す。【０２５９】
さらに、試験例８と同様にして調製して得られた洗浄血小板に１００μＭ  ＣＣＣＰと共に、４０μＭ  前記ｐ３８阻害剤２種、５０μＭ  ＧＭ６００１、０．５〜５０μＭ  Ｓ−４５４５７、又はＤＭＳＯを添加し、３７℃で２４時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて解析し、血小板におけるＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(＋）の割合を算出した。得られた結果を図１９に示す。【０２６０】
図１８及び図１９に示した結果から明らかなように、ｐ３８阻害剤の添加におけるＧＰＩｂα（ＣＤ４２ｂ）（＋）細胞の数は、ＤＭＳＯ添加のそれと比較して多いことから、ｐ３８阻害剤もヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果を有していることが確認された。しかしながら、本発明にかかる化合物の添加による効果は、ｐ３８阻害剤の添加による効果よりも優れたものであった。【０２６１】
（試験例１０）  Ｓ−４５４５７及びｐ３８阻害剤のＥＳ細胞由来の血小板に対する機能維持効果についての検証
前述の通りにして得られたＥＳ細胞由来の造血前駆細胞を、図６に示した条件下（プロトコール１）で血小板の誘導を行った。すなわち、ＥＳ細胞由来の造血前駆細胞を播き直してから８日間（図６において示す「ｄ１５」以降）、５０μＭ  ＧＭ６００１、０．１５〜５０μＭ  Ｓ−４５４５７、４０μＭ  前記ｐ３８阻害剤２種、５０μＭ  ＧＭ６００１、又はＤＭＳＯを添加して培養を行い、前述の通り回収して、フローサイトメトリーにて、血小板の総数、血小板におけるＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(＋）の割合を測定、算出した。得られた結果を図２０及び図２１に示す。【０２６２】
図２０に示した結果から明らかなように、ｐ３８阻害剤の添加によって得られた血小板の数は著しく少ないものであり、顕著な細胞毒性が確認された。また、図２１に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物の添加によるＥＳ細胞由来の血小板に対する機能維持効果は認められるが、ｐ３８阻害剤の添加による効果は、全く認められなかった。【０２６３】
（試験例１１）  Ｓ−４５４５７及びＳ−４５２８２のヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果についての検証
Ｓ−４５４５７及びＳ−４５２８２のヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果を調べるため、試験例８と同様にして、洗浄血小板に１００μＭ  ＣＣＣＰと共に、５０μＭ  ＧＭ６００１、５μＭ若しくは５０μＭ  Ｓ−４５４５７、５０μＭ  Ｓ−４５２８２、又はＤＭＳＯを添加し、３７℃で２４時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて、血小板の総数及びＣＤ４２ｂ(＋）の数を測定し、血小板におけるＣＤ４２ｂ(＋）の割合を算出した。得られた結果を図２２に示す。【０２６４】
図２２に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物は、ＧＭ６００１と同様に、ヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果、特に３７℃における機能維持効果を有していることが確認された。【０２６５】
（試験例１２）  ヒト末梢血ＰＲＰに対する機能維持効果についての検証
ヒト末梢血ＰＲＰ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ  ｐｌａｓｍａ、多血小板血漿）を用いて、各化合物が有する血小板に対する機能維持効果の持続性について調べた。すなわち、先ず、採血して得られたヒト末梢血にその１／１０量のＡＣＤを加え、室温下、ブレーキ無し、９００ｒｐｍで１０分間遠心した。次に、このようにして得られた上清（ＰＲＰ）に、５０μＭ  ＧＭ６００１、５０μＭ  Ｓ−４５４５７、５μＭ  Ｓ−４５２８２、４０μＭ  前記ｐ３８阻害剤２種、又はＤＭＳＯを添加し、３７℃で２４時間又は７２時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(＋）の数、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(−）の数を測定し、血小板におけるＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(−）又はＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(＋）の割合を算出した。得られた結果を図２３に示す。また図２３中、「ｆｒｅｓｈ」はヒト末梢血ＰＲＰをインキュベーションせずにフローサイトメトリーにて解析した結果を示す。【０２６６】
図２３に示した結果から、本発明にかかる化合物であるＳ−４５４５７は７２時間インキュベーションしてもＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂα（ＣＤ４２ｂ）のシェディングを抑制し続けられることが明らかになった。また、本発明にかかる化合物であるＳ−４５２８２も５μＭという添加濃度を考慮すると高いヒト末梢血ＰＲＰに対する機能維持効果を有していることが明らかになった。一方、p３８阻害剤の効果は弱いか、あるいはほぼ観察できないレベルしか認められなかった。【０２６７】
（試験例１３）  ヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果の検証
試験例８と同様にして得た洗浄血小板に１００μＭ  ＣＣＣＰと共に、５０μＭ  ＧＭ６００１、５０μＭ  Ｓ−４５４５７、５μＭ  Ｓ−４５２８２、４０μＭ  前記ｐ３８阻害剤２種、又はＤＭＳＯを添加し、３７℃で２４時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて、ＣＤ４１（＋）及びＣＤ４２ｂ(＋）のドットプロット解析を行った。得られた結果を図２４に示す。なお図２４中、Ｘ軸はＣＤ４１を示し、Ｙ軸はＣＤ４２ｂを示す。また図２４中、「ｆｒｅｓｈ」は洗浄血小板をインキュベーションせずにフローサイトメトリーにて解析した結果を示す。【０２６８】
図２４に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物であるＳ−４５４５７はＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂα（ＣＤ４２ｂ）のシェディングを抑制していることが確認された。また、Ｓ−４５４５７には劣るものの、本発明にかかる化合物であるＳ−４５２８２も高いヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果を有していることが確認された。さらに、ｐ３８阻害剤の効果は弱いことが確認された。【０２６９】
（試験例１４）  Ｓ−４５４５７のヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果における濃度依存性についての検証
試験例８と同様にして、洗浄血小板に１００μＭ  ＣＣＣＰと共に、５０μＭ  ＧＭ６００１、０．５〜５０μＭ  Ｓ−４５４５７、又はＤＭＳＯを添加し、３７℃で２４時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて、ＣＤ４１（＋）及びＣＤ４２ｂ(＋）のドットプロット解析を行い、Ｓ−４５４５７のヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果を調べた。得られた結果を図２５に示す。なお図２５中、Ｘ軸はＣＤ４１を示し、Ｙ軸はＣＤ４２ｂを示す。【０２７０】
図２５に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物は、その濃度依存的にＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂα（ＣＤ４２ｂ）のシェディングを抑制していることが確認された。【０２７１】
（試験例１５）  フローチャンバーを用いた、Ｓ−４５４５７による血小板接着能の維持効果の検証
通常、血管壁が損傷すると、血管内皮細胞下のコラーゲン組織の露出が生じ、血漿中のフォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）がコラーゲン組織に結合するようになる。そして、ＶＷＦとＧＰＩｂα（ＣＤ４２ｂ）との相互作用、及び、ＶＷＦとα２ｂβ３インテグリンとの相互作用を介して、血小板は血管に接着するようになると解されている。また、血管に接着した血小板を起点として、ＶＷＦとＧＰＩｂαとの相互作用、並びに、ＶＷＦとα２ｂβ３インテグリンとの相互作用を介して、血小板どうしも接着していき、血栓は発達していくと解されている（Ｒｕｇｇｅｒｉ  ＺＭ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００２年１１月、８巻、１１号、１２２７〜１２３４ページ  参照）。【０２７２】
そこで、試験例１〜１４において示された、本発明にかかる化合物（Ｓ−４５４５７等）によるＧＰＩｂαシェディングに対する抑制効果は、ＶＷＦとＧＰＩｂα（ＣＤ４２ｂ）との相互作用を維持し、血小板の接着能の維持に寄与しているのかを、血栓形成の経過を定量的に評価することのできるフローチャンバーを用いて、評価した。【０２７３】
すなわち、先ず、採血して得られたヒト末梢血にＡＣＤを加え、ブレーキ無し、９００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を回収した。得られた上清に１μＭ  プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）を加え、ブレーキ無し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を除去した。得られた沈殿物をＴｙｒｏｄｅ  ＨＥＰＥＳ  Ｃａ（−）緩衝液中に懸濁し、１００μＭ  ＣＣＣＰを添加し、同時にＤＭＳＯ若しくは１５μＭ  Ｓ−４５４５７とを添加した後、３７℃で２４時間インキュベーションした。なお、この際ＣＣＣＰとＤＭＳＯとを添加してインキュベーションしたものを陰性対照として、何も添加せずインキュベーション処理を行わなかったものを陽性対照として用意した。【０２７４】
そして、インキュベーション後（陽性対照はインキュベーションせずに）、懸濁液に１／２０００に希釈したＴＭＲＥ（テトラメチルローダミンエチルエステル、過塩素酸）を添加し、室温下で１５分間インキュベートして血小板を蛍光標識した。その後、Ｔｙｒｏｄｅ  ＨＥＰＥＳ  Ｃａ（−）緩衝液を加え、ブレーキ無し、１５００ｒｐｍで８分間遠心し、洗浄を行った。【０２７５】
次に、蛍光標識した各血小板サンプルを、アルガトロバン（抗トロンビン薬）にて抗凝固処理を行って採取したヒト末梢血の全血サンプルに、全血血小板の１０％の数になるように加え、混合した。そして、このように調製した血液サンプルを一定の壁剪断速度（１５００Ｓ−１）で、シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ社製）により、ＶＷＦで表面をコ―ティングしたチャンバー内に注入し、この表面上にＶＷＦを介して接着し、血栓を形成する蛍光標識した血小板を倒立ステージエピ蛍光ビデオ顕微鏡システム（ＤＭ  ＩＲＢ、Ｌｅｉｃａ社製）を用いて可視化し、その顕微鏡像を感光性カラーＣＣＤカメラ（Ｌ−６００、Ｌｅｉｃａ社製）を用いてデジタル化し、更にイメージ−Ｊソフトウェア（ＮＩＨイメージ）を用いて、血小板による表面積カバー率を算出した。なお、かかる試験は２回ずつ行い、陽性対照（ｆｒｅｓｈな血小板）における表面積カバー率の最大値を各々１００％にして、各サンプルの生データを換算して、２回の試験から得られた値の平均値を算出した。得られた結果は図２６及び図２７に示す。なお、図２６及び２７中、縦軸は前記平均値を示し、「Ｓ−４５４５７」は１５μＭ  Ｓ−４５４５７を添加して調製した血小板における結果を示し、「ＤＭＳＯ」は陰性対照における結果を示し、「ｆｒｅｓｈ」は陽性対照（ｆｒｅｓｈな血小板）における結果を示す。また、図２６中の横軸はチャンバー内に注入してからの計測時間（単位：分）を示す。【０２７６】
図２６及び図２７に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物（Ｓ−４５４５７）は、陰性対照であるＤＭＳＯを添加してＣＣＣＰと共にインキュベーションした結果と比較して、血小板による表面積カバー率は大きいものであった。然るに、本発明にかかる化合物はＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂαのシェディングを抑制し、ひいてはＧＰＩｂαとＶＷＦとの会合をも可能とし、血小板の接着能を維持することができることが明らかになった。【０２７７】
（試験例１６）  生体分子イメージング手法を用いた、Ｓ−４５４５７による血小板接着能の維持効果の検証
本発明者等によって開発された血栓形成モデル並びに生体分子イメージング手法を用いて、本発明にかかる化合物（Ｓ−４５４５７等）による血小板接着能の維持効果、特に血小板の血管への接着能をインビボにおいて評価した。【０２７８】
なお、本試験例において用いた血栓形成モデルは、レーザー照射とヘマトポルフィリン等とを用いて、活性酸素（ＲＯＳ）を血管内に局所的に発生させ、血管内皮細胞に障害を引き起こすことにより、血小板を血管に接着させ、血栓形成を誘発させるものである。また、本試験例において用いた生体分子イメージング手法は、高速レーザー共焦点顕微鏡及びマルチビーム式の共焦点ユニットを用いて、血流の方向と平行にごく狭い断面に焦点を合わせて高速画像を取得することが可能であるため、血管内を変形しながら流れる血小板等に各々フォーカスを合わせて観察することにより、単一血小板レベルでの生体イメージングを可能とするものである（Ｔａｋｉｚａｗａら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２０１０年１月、１２０巻、１号、１７９〜１９０ページ  参照）。以下、本試験例で用いた血栓形成モデル並びに生体分子イメージング手法について説明する。【０２７９】
先ず、血栓形成モデルマウスに注入するための血小板を調製した。すなわち、採血して得られたヒト末梢血に１０ｖ/ｖ％になるようＡＣＤを加え、ブレーキ無し、９００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を回収した。得られた上清に１μＭ  ＰＧＥ１を加え、ブレーキ無し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を除去した。得られた沈殿物をＴｙｒｏｄｅ  ＨＥＰＥＳ  Ｃａ（−）緩衝液に懸濁し、１００μＭ  ＣＣＣＰと、ＤＭＳＯ又は１５μＭ  Ｓ−４５４５７とを添加した後、３７℃で２４時間インキュベーションした。なお、この際ＣＣＣＰとＤＭＳＯを添加してインキュベーションしたものを陰性対照として、何も添加せずインキュベーション処理を行わなかったものを陽性対照として用意した。インキュベーション後（陽性対照はインキュベーションせずに）、かかる沈殿物における血小板の数を計測し、２ｍｌ  Ｔｙｒｏｄｅ  ＨＥＰＥＳ  Ｃａ（−）緩衝液（１μＭ  ＰＧＥ１含有）中に懸濁した。そして、かかる懸濁液に５μＭ  ＴＭＲＥを添加し、室温下で１５分間インキュベートして血小板を蛍光標識した。その後、Ｔｙｒｏｄｅ  ＨＥＰＥＳ  Ｃａ（−）緩衝液を加え、ブレーキ無し、１５００ｒｐｍで８分間遠心し、洗浄を行った。【０２８０】
次に、血栓形成モデルマウスを調製した。すなわち、予め２Ｇｙの放射線処置によって血小板減少処置を施しておいたＮＯＧマウス（重度複合免疫不全マウス）を麻酔して腹壁に小切開を施し、腸間膜における微小循環及び血栓形成を視覚的に解析できるようにした。さらに、ＮＯＧマウス由来の血球の動態を可視化するために、ＦＩＴＣ−デキストラン（２０ｍｇ／ｋｇ体重）をこのＮＯＧマウスの尾静脈に注入した。そして、前記の通りにして蛍光標識した血小板をこのＮＯＧマウスに、このマウスの循環血小板数の１５％の数になるように注入した。さらに、血栓形成を誘発させるために、ヘマトポルフィリン（１．８ｍｇ／ｋｇ体重）をこのＮＯＧマウスに投与した。なお、このようにマウスを処理することにより、血球動態及び血栓形成は、レーザー照射及びＲＯＳ産生の間可視化されることになる。【０２８１】
そして、レーザー照射の際のかかる可視化画像（シークエンシャル画像）は、回転ディスク共焦点顕微鏡（横河電機株式会社製、ＣＳＵ−Ｘ１）及びＥＭ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ）−ＣＣＤカメラ（ｉＸｏｎ、Ａｎｄｏｒ社製）を用いて、２０秒間、３０フレーム／秒で、先に施した小切開部位（〜３ｍｍ）を通して観察及び撮影することにより得た。なお、かかる観察は、Ｓ−４５４５７を添加して調製した血小板を注入したマウス、陰性対照、陽性対照について、閉塞性血栓を形成した２０本の独立した血管を対象として行った。得られた結果は図２８及び図２９に示す。なお、図２８及び図２９中、「Ｓ−４５４５７」は１５μＭ  Ｓ−４５４５７を添加して調製した血小板を注入したマウスにおける血栓形成を示し、「ＤＭＳＯ」は陰性対照における血栓形成の結果を示し、「ｆｒｅｓｈ」は陽性対照における血栓形成の結果を示す。また、代表例である図２８中の白い矢印は血流の方向を示し、白い三角が指している箇所はヒト由来の血小板が血管に付着している箇所を示し、スケールバーは１０μｍを示す。さらに、図２９中の縦軸は、血栓形成に関与した血小板総数に占めるヒト血小板数の割合（％）であり、値は、２０本の平均＋標準誤差である。【０２８２】
図２８及び図２９に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物（Ｓ−４５４５７）を添加して調製した血小板を注入したマウスにおいては、陰性対照と比較して、ヒト由来の血小板が血栓形成に寄与する割合が大きかった。然るに、本発明にかかる化合物は、ＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂαのシェディングを抑制することにより、血小板の血管への接着能を維持することができることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０２８３】
以上説明したように、本発明によれば、ＡＤＡＭ１７のメタロプロテアーゼ活性を特異的に抑制し、ＧＰＩｂαのシェディングを抑制することによって、血小板の機能を維持することが可能となる。したがって、本発明は、機能的に安定し、安全性の高い血小板を、煩雑な作用を要さず、効率良く大量に生産するための試薬や、血液製剤における血小板の機能を維持し、その品質の安定化を図るための医薬品添加剤などとして有用である。
【図１】
2012036257.tif 000061
【図２】
2012036257.tif 000062
【図３】
2012036257.tif 000063
【図４】
2012036257.tif 000064
【図５】
2012036257.tif 000065
【図６】
2012036257.tif 000066
【図７】
2012036257.tif 000067
【図８】
2012036257.tif 000068
【図９】
2012036257.tif 000069
【図１０】
2012036257.tif 000070
【図１１】
2012036257.tif 000071
【図１２】
2012036257.tif 000072
【図１３】
2012036257.tif 000073
【図１４】
2012036257.tif 000074
【図１５】
2012036257.tif 000075
【図１６】
2012036257.tif 000076
【図１７】
2012036257.tif 000077
【図１８】
2012036257.tif 000078
【図１９】
2012036257.tif 000079
【図２０】
2012036257.tif 000080
【図２１】
2012036257.tif 000081
【図２２】
2012036257.tif 000082
【図２３】
2012036257.tif 000083
【図２４】
2012036257.tif 000084
【図２５】
2012036257.tif 000085
【図２６】
2012036257.tif 000086
【図２７】
2012036257.tif 000087
【図２８】
2012036257.tif 000088
【図２９】
2012036257.tif 000089
【国際調査報告】
2012036257.tif 000090
2012036257.tif 000091
2012036257.tif 000092
2012036257.tif 000093