(57)【要約】  透明基板上に心筋細胞集団を配置し、心筋拍動細胞に与えた強制拍動刺激に対する心筋細胞の応答から心筋細胞の品質を評価する。透明基板上に心筋細胞集団を配置し、ネットワークを構成する細胞には薬物が作用するように薬物を含む液体の流れに曝す。ネットワークの隣接する心筋拍動細胞の比較から得られるゆらぎ計測から薬物による心毒性の程度を評価する。
2012043820.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板、
該基板上に配置した複数個の安定した拍動を行う評価対象の心筋細胞あるいは該心筋細胞を含む細胞集団、
前記基板上に前記細胞集団の周辺を囲むように形成された細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給しおよび／または排出する培養液供給／排出チャネル、
前記細胞集団の一つの細胞あるいは細胞集団の局所部分を載置している微小電極、
前記壁で囲われた細胞培養液を満たすための領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測する電位計測手段、ならびに
前記微小電極へ送る電気刺激を制御し、前記電位計測手段で計測した電位データを記録する、制御／記録手段
を備えた細胞品質評価装置であって、
前記微小電極へ送る前記電気刺激のインターバルを段階的に変化させて、
１）前記心筋細胞あるいは前記細胞集団が前記電気刺激のインターバルによる強制拍動刺激に応答して前記強制拍動刺激と同じインターバルで応答するかどうかを確認し、かつ、その応答がどの強制拍動刺激の周波数の範囲で対応するかどうかを計測し、拍動が追従できることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること、および
２）前記電気刺激による強制拍動刺激インターバル（ＲＲ）に対して細胞の拍動の追従が確認できた周波数の範疇で、強制拍動刺激に対するＦＰＤの変化が、ＦＰＤ／（ＲＲ）1/3からＦＰＤ／（ＲＲ）1/2の間にあることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること
を可能にする、細胞品質評価装置。
【請求項２】
基板、
該基板上に配置した複数個の安定した拍動を行う評価対象の心筋細胞あるいは該心筋細胞を含む細胞集団、
前記基板上に前記細胞集団の周辺を囲むように形成された細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給しおよび／または排出する培養液供給／排出チャネル、
前記細胞集団の一つの細胞あるいは細胞集団の局所部分を載置している微小電極、
前記壁で囲われた細胞培養液を満たすための領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測する電位計測手段、ならびに
前記微小電極へ送る電気刺激を制御し、前記電位計測手段で計測した電位データを記録する、制御／記録手段
を備えた細胞品質評価装置を用いて、
前記微小電極へ送る前記電気刺激のインターバルを段階的に変化させて、
１）前記心筋細胞あるいは前記細胞集団が前記電気刺激のインターバルによる強制拍動刺激に応答して前記強制拍動刺激と同じインターバルで応答するかどうかを確認し、かつ、その応答がどの強制拍動刺激の周波数の範囲で対応するかどうかを計測し、拍動が追従できることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること、および
２）前記電気刺激による強制拍動刺激インターバル（ＲＲ）に対して細胞の拍動の追従が確認できた周波数の範疇で、前記強制拍動刺激に対するフィールド・ポテンシャル・デュレーション（ＦＰＤ）の変化が、ＦＰＤ／（ＲＲ）1/3からＦＰＤ／（ＲＲ）1/2の間にあることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること
を含む、細胞品質評価方法。
【請求項３】
心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測するように構成されている、心筋毒性検査装置。
【請求項４】
フィールド・ポテンシャル波形のうちカリウムイオンの細胞からの流出のピーク位置のナトリウムイオン流出ピークからの経過時間（フィールドポテンシャルデュレーション：ＦＰＤ）のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測するように構成されている、請求項３に記載の心筋毒性検査装置。
【請求項５】
ＦＰＤおよび該ＦＰＤのゆらぎの大きさを算出し、該算出したＦＰＤおよび該ＦＰＤのゆらぎの大きさの組み合わせを指標とするように構成されている、請求項３または４に記載の心筋毒性検査装置。
【請求項６】
前記ＦＰＤのゆらぎの大きさが該ＦＰＤの短期変動（ＳＴＶ）である、請求項３〜５のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
【請求項７】
透明基板、
前記透明基板上に形成された壁で囲まれた領域であって、細胞培養液で満たされている領域、
前記細胞培養液で満たされている領域内に配置された複数個の安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団、
前記細胞培養液で満たされている領域内に設けられた、前記細胞集団の一つの心筋細胞あるいは前記細胞集団の局所部分を載置している微小電極、
前記細胞培養液で満たされている領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている前記心筋細胞の電位を計測する電位計測手段、
前記電位計測手段で計測した被検薬物加入前後における前記心筋細胞の電位データを記録する記録手段
を備える、請求項３〜６のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
【請求項８】
前記安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団が、拍動を伝えることが可能な複数個の心筋細胞および線維芽細胞を含む細胞ネットワークである、請求項３〜７のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
【請求項９】
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団からなるペースメーカー領域、
該透明基板上に配置され、該細胞集団と連携して前記細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された心筋細胞および線維芽細胞を含む細胞ネットワーク、
前記透明基板上に前記細胞集団および前記細胞ネットワークの周辺を囲むように形成された細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給しおよび／または排出する培養液供給／排出チャネル、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加えるための薬剤供給チャネル、
前記細胞集団の一つの細胞あるいは細胞集団の局所部分を載置している微小電極、
前記細胞ネットワークの個々の細胞をそれぞれ載置している微小電極、
前記壁で囲われた細胞培養液を満たすための領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測する電位計測手段、ならびに
前記微小電極へ送る電気刺激を制御し、前記電位計測手段で計測した電位データを記録する、制御／記録手段
を備える、請求項３〜８のいずれか一項に記載の心筋毒性検査装置。
【請求項１０】
前記安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞を載置するための少なくとも１つの微小電極から該微小電極上に載置される細胞に一定のインターバルで強制拍動刺激を与えることができるように構成されている、請求項３〜９のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
【請求項１１】
前記直列配列された細胞ネットワークの端点に局所に刺激を与えるための電極が配置されている、請求項８〜１０のいずれか一項記載の心毒性検査装置。
【請求項１２】
前記細胞ネットワークが、リング状に配置されて形成されており、
該リングの一部を欠損させて、その点に局所に刺激を与える電極が配置されている、請求項８〜１１のいずれか一項記載の心毒性検査装置。
【請求項１３】
前記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、前記細胞ネットワークの前記細胞の拍動が発生する領域から観察電極までの伝達時間あるいは伝達速度のゆらぎを隣接する拍動の比較によって計測するように構成されている、請求項８〜１２のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
【請求項１４】
前記心筋細胞を適切な温度に維持する温度制御機構を有する請求項１〜１３のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
【請求項１５】
前記微小電極が、複数の微小電極からなる多電極アレイを構成している、請求項１〜１４のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
【請求項１６】
心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測することを特徴とする心筋毒性検査方法。
【請求項１７】
複数個の安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団を準備する工程、
培養容器内の底面に多電極アレイが配された該培養容器中で前記細胞集団を培養する工程、
前記培養している前記細胞集団へ被検薬物を添加し、前記多電極アレイを用いて前記培養細胞集団の細胞電位を測定する工程であって、前記薬物の添加の前後において、前記培養細胞集団の細胞電位を測定し、該細胞電位のデータを取得する工程、ならびに
前記取得した細胞電位のデータから、フィールド・ポテンシャル（ＦＰ）波形のうちナトリウムイオンの細胞への流入ピークからカリウムイオンの細胞からの流出ピークまでの経過時間（細胞外電位持続時間）（ＦＰＤ）および該ＦＰＤのゆらぎの大きさを算出し、該算出したＦＰＤおよび該ＦＰＤのゆらぎの大きさの組み合わせを指標として用いて前記薬物の心筋毒性を評価する工程、
を含む、請求項１６に記載の薬物の心筋毒性検査方法。
【請求項１８】
請求項８〜１５のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置を使用して、前記細胞に作用する薬剤が前記細胞培養液に加えられたときに、前記心筋細胞集団の発生する拍動が前記細胞ネットワーク領域の前記細胞を伝播する速度を遅延させるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋細胞に対する毒性を検査する請求項１６または１７に記載の心筋毒性検査方法。
【請求項１９】
請求項８〜１５のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置を用いて前記細胞に作用する薬剤が前記細胞培養液に加えられたときに、前記心筋細胞集団の発生する拍動が前記細胞ネットワーク領域の前記細胞を伝播する速度を遅延させるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋細胞に対する毒性を検査する方法であって、下記のうちの少なくとも１つの工程を含む請求項１６〜１８のいずれか一項記載の方法：
(i)前記細胞ネットワークの前記細胞を載置するための少なくとも１つの微小電極から該微小電極上に載置される細胞に一定のインターバルで強制拍動刺激を与える工程；
(ii)前記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測する工程；
(iii)フィールド・ポテンシャル波形のうちカリウムイオンの細胞からの流出のピーク位置のナトリウムイオン流出ピークからの経過時間（フィールドポテンシャルデュレーション）のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測する工程；
(iv)前記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、前記細胞ネットワークの前記細胞の拍動が発生する領域から観察電極までの伝達時間あるいは伝達速度のゆらぎを隣接する拍動の比較によって計測する工程；
(v)前記細胞が載った各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形の各々について微分することによって細胞電位を計測する工程；
(vi)前記細胞が載置された各電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形を重ね合わせて合成フィールド・ポテンシャル波形を合成し、心電図データと比較可能な細胞集団全体としての拍動伝達の乱れ具合を計測する工程；
(vii)前記細胞の配置された微小電極の電位を一定に保つフィードバック電位制御機構を用いて、該電位制御機構が供給する電流量を解析する工程；および
(viii)前記細胞への周期的強制拍動刺激開始後、３０秒以上経過してから計測を開始する工程。
【請求項２０】
前記ＦＰＤのゆらぎの大きさが該ＦＰＤの短期変動（ＳＴＶ）である、請求項１６〜１９のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋毒性検査および心筋細胞評価のための方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の状態の変化や、細胞の薬物等に対する応答を観察するのに多用されているのはバイオアッセイである。従来のバイオアッセイでは、一般的に培養細胞を用いることが多い。この系では複数の細胞を用いてアッセイを行うので、細胞集団の値の平均値をあたかも１細胞の特性であるかの様に観察してきた。【０００３】
しかし、実際には細胞は集団の中で細胞周期が同調しているものはまれであり、各々の細胞が異なった周期でタンパク質を発現している。このため、刺激に対する応答の結果を解析するときにゆらぎの問題が常に付きまとう。【０００４】
すなわち、細胞の反応機構自体が普遍的に持つ応答のゆらぎが存在するために、常に、平均的なレスポンスしか得ることができない。これらの問題を解決するために、同調培養等の手法が開発されているが、常に同じステージにある細胞群を使用することは、常にそのような細胞を供給し続けなければならないということで、バイオアッセイを広く一般に広める障害となっている。【０００５】
また、細胞に対する刺激（シグナル）は、細胞周辺の溶液に含まれるシグナル物質、栄養、溶存気体の量によって与えられるものと、他の細胞との物理的接触・細胞間インタラクションによるものの２種類があることからも、ゆらぎについての判断が難しいのが実情であった。【０００６】
細胞の物理的接触・細胞間インタラクションの問題は、バイオアッセイを組織断片のような細胞塊で行うことである程度解決できる。しかし、この場合、培養細胞と異なり、常に均一な素性の細胞塊を得ることができない。そのため、得られるデータがばらついたり、集団の中に情報が埋もれてしまったりする問題がある。【０００７】
細胞群の細胞の１つ１つを最小構成単位とする情報処理モデルの計測のために、本願の発明者らは特開２００６‐９４７０３（特許文献１）等に示すように、細胞を特定の空間配置の中に閉じ込めておくための複数の細胞培養区画を構成し、隣接する区画間は細胞の通り抜けることができない溝またはトンネルでお互いを連結するとともに、必要に応じて、溝またはトンネルあるいは細胞培養区画に、細胞の電位変化を計測するための複数の電極パターンを持つ構造の集合細胞マイクロアレー（バイオアッセイチップ）を提案した。【０００８】
また、心臓の複雑な機能を反映して取得される心電図の評価法として、通常の非線形ダイナミクス計測に使われている手法を応用して心電図解析をする手法が提案されている。例えば、もっとも一般に使われている心電図解析はポワンカレプロッティング法である（非特許文献１）。プロット中の1点は、隣接する２つの拍動データの情報を示しており例えばＸ軸にある時点の拍動レートを、Ｙ軸に1つ前の拍動レートを示すこととなる。これによって心臓の拍動のゆらぎについてグラフ上の点の分布を定量化することによって見積もるものである。その他の心臓の拍動のゆらぎを計測する手法としては、相関次元法（correlation dimension）、非線形予測法（nonlinear predictability）（非特許文献２）、近似エントロピー法（非特許文献３）などがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００６‐９４７０３号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Brennan M,Palaniswami M, Kamen P. Do existing measures of Poincare plot geometry reflect non-linear features of heart rate variability? Biomedical Engineering, IEEE Transactions on, Proc. IEEE Transactions on Biomedical Engineering, 2001, 48, 1342-1347
【非特許文献２】Kanters JK, Holstein-Rathlou NH, Agner E (1994). "Lack of evidence for low-dimensional chaos in heart rate variability". Journal of Cardiovascular Electrophysiology 5 (7): 591-601.PMID 7987529.
【非特許文献３】Storella RJ, Wood HW, Mills KM et al. (1994). "Approximate entropy and point correlation dimension of heart rate variability in healthy subjects". Integrative Physiological & Behavioral Science 33 (4): 315-20.PMID 10333974.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従来のバイオアッセイでは、細胞を組織断片として扱うか、培養細胞のように１細胞として扱うかのいずれかであった。細胞の数が多すぎると上記従来技術の項で述べたように、得られる情報が平均的なものになってしまい、薬剤などに対するレスポンスが正確に得られない問題がある。細胞を１細胞ずつ用いる場合は、本来、多細胞組織の細胞として機能している細胞を、引き離された独立した状態の細胞として使用するために、細胞同士のインタラクションの影響が現れなくなることとなり、やはり正確な薬剤レスポンスすなわちバイオアッセイデータを得る上で問題がある。【００１２】
心筋細胞および線維芽細胞について見ると隣接する心筋細胞あるいは線維芽細胞からの拍動の伝播が、１細胞単位で細胞電位、細胞形態が正確に計測できるとともに、心筋細胞に対する薬物の毒性検査が１細胞の細胞電位、細胞形態として正確に計測できるデバイスやシステムを開発することが重要である。【００１３】
ヒトiPS細胞あるいはヒトES細胞などのヒト幹細胞から分化誘導した心筋細胞について、これらの細胞を創薬スクリーニングあるいは再生医療に使うためには、この心筋細胞が、ヒト心臓にある心筋細胞と同じ品質であるかどうかを細胞の機能面から定量的に評価する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題に鑑み、本発明は、以下の装置および方法を提供する。
（１）基板、
該基板上に配置した複数個の安定した拍動を行う評価対象の心筋細胞あるいは該心筋細胞を含む細胞集団、
上記基板上に上記細胞集団の周辺を囲むように形成された細胞培養液を満たすための壁、
上記細胞培養液を上記壁で囲われた領域内に供給しおよび／または排出する培養液供給／排出チャネル、
上記細胞集団の一つの細胞あるいは細胞集団の局所部分を載置している微小電極、
上記壁で囲われた細胞培養液を満たすための領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている細胞電位を計測する電位計測手段、ならびに
上記微小電極へ送る電気刺激を制御し、上記電位計測手段で計測した電位データを記録する、制御／記録手段
を備えた細胞品質評価装置であって、
上記微小電極へ送る上記電気刺激のインターバルを段階的に変化させて、
１）上記心筋細胞あるいは上記細胞集団が上記電気刺激のインターバルによる強制拍動刺激に応答して上記強制拍動刺激と同じインターバルで応答するかどうかを確認し、かつ、その応答がどの強制拍動刺激の周波数の範囲で対応するかどうかを計測し、拍動が追従できることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること、および
２）上記電気刺激による強制拍動刺激インターバル（ＲＲ）に対して細胞の拍動の追従が確認できた周波数の範疇で、強制拍動刺激に対するＦＰＤの変化が、ＦＰＤ／（ＲＲ）1/3からＦＰＤ／（ＲＲ）1/2の間にあることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること
を可能にする、細胞品質評価装置。
（２）基板、
該基板上に配置された、安定した拍動を行う評価対象の心筋細胞を保持するための複数の細胞保持部を含む心筋細胞集団保持領域、
上記基板表面と、上記心筋細胞集団保持領域の周囲に形成された壁とによって規定される、細胞培養液を満たすための空間領域、
上記細胞培養液を上記空間領域内に供給しおよび／または排出するための培養液供給／排出チャネル、
上記透明基板上に設けられ、上記心筋細胞集団保持領域の細胞保持部の一つまたは一部の細胞保持部において心筋細胞を載置するための微小電極、
上記細胞培養液を満たすための上記空間領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている細胞電位を計測する電位計測手段、ならびに
上記微小電極へ送る電気刺激を制御し、上記電位計測手段で計測した電位データを記録する、制御／記録手段
を備えた細胞品質評価装置であって、
上記微小電極へ送る上記電気刺激のインターバルを段階的に変化させて、
１）上記心筋細胞あるいは上記細胞集団が上記電気刺激のインターバルによる強制拍動刺激に応答して上記強制拍動刺激と同じインターバルで応答するかどうかを確認し、かつ、その応答がどの強制拍動刺激の周波数の範囲で対応するかどうかを計測し、拍動が追従できることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること、および
２）上記電気刺激による強制拍動刺激インターバル（ＲＲ）に対して細胞の拍動の追従が確認できた周波数の範疇で、強制拍動刺激に対するＦＰＤの変化が、ＦＰＤ／（ＲＲ）1/3からＦＰＤ／（ＲＲ）1/2の間にあることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること
を可能にする、心筋品質評価装置。
（３）基板、
該基板上に配置した複数個の安定した拍動を行う評価対象の心筋細胞あるいは該心筋細胞を含む細胞集団、
上記基板上に上記細胞集団の周辺を囲むように形成された細胞培養液を満たすための壁、
上記細胞培養液を上記壁で囲われた領域内に供給しおよび／または排出する培養液供給／排出チャネル、
上記細胞集団の一つの細胞あるいは細胞集団の局所部分を載置している微小電極、
上記壁で囲われた細胞培養液を満たすための領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている細胞電位を計測する電位計測手段、ならびに
上記微小電極へ送る電気刺激を制御し、上記電位計測手段で計測した電位データを記録する、制御／記録手段
を備えた細胞品質評価装置を用いて、
上記微小電極へ送る上記電気刺激のインターバルを段階的に変化させて、
１）上記心筋細胞あるいは上記細胞集団が上記電気刺激のインターバルによる強制拍動刺激に応答して上記強制拍動刺激と同じインターバルで応答するかどうかを確認し、かつ、その応答がどの強制拍動刺激の周波数の範囲で対応するかどうかを計測し、拍動が追従できることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること、および
２）上記電気刺激による強制拍動刺激インターバル（ＲＲ）に対して上記細胞の拍動の追従が確認できた周波数の範疇で、上記強制拍動刺激に対するフィールド・ポテンシャル・デュレーション（ＦＰＤ）の変化が、ＦＰＤ／（ＲＲ）1/3からＦＰＤ／（ＲＲ）1/2の間にあることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること
を含む、細胞品質評価方法。
（４）基板、
該基板上に配置された、安定した拍動を行う評価対象の心筋細胞を保持するための複数の細胞保持部を含む心筋細胞集団保持領域、
上記基板表面と、上記心筋細胞集団保持領域の周囲に形成された壁とによって規定される、細胞培養液を満たすための空間領域、
上記細胞培養液を上記空間領域内に供給しおよび／または排出するための培養液供給／排出チャネル、
上記透明基板上に設けられ、上記心筋細胞集団保持領域の細胞保持部の一つまたは一部の細胞保持部において心筋細胞を載置するための微小電極、
上記細胞培養液を満たすための上記空間領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている細胞電位を計測する電位計測手段、ならびに
上記微小電極へ送る電気刺激を制御し、上記電位計測手段で計測した電位データを記録する、制御／記録手段
を備えた細胞品質評価装置を用いて、
上記微小電極へ送る上記電気刺激のインターバルを段階的に変化させて、
１）上記心筋細胞あるいは上記細胞集団が上記電気刺激のインターバルによる強制拍動刺激に応答して上記強制拍動刺激と同じインターバルで応答するかどうかを確認し、かつ、その応答がどの強制拍動刺激の周波数の範囲で対応するかどうかを計測し、拍動が追従できることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること、および
２）上記電気刺激による強制拍動刺激インターバル（ＲＲ）に対して細胞の拍動の追従が確認できた周波数の範疇で、強制拍動刺激に対するＦＰＤの変化が、ＦＰＤ／（ＲＲ）1/3からＦＰＤ／（ＲＲ）1/2の間にあることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること
を含む、心筋品質評価方法。【００１５】
本発明はまた、以下の心筋毒性検査装置、心筋毒性検査チップ、および心筋毒性検査方法を提供する。
［１］透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団、
該透明基板上に配置され、該細胞集団と連携して上記細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された心筋細胞および線維芽細胞を含む細胞ネットワーク、
上記透明基板上に上記細胞集団および上記細胞ネットワークの周辺を囲むように形成された細胞培養液を満たすための壁、
上記細胞培養液を上記壁で囲われた領域内に供給しおよび／または排出する培養液供給／排出チャネル、
上記細胞に作用する薬剤を上記細胞培養液に加えるための薬剤供給チャネル、
上記細胞集団の一つの細胞あるいは細胞集団の局所部分を載置している微小電極、
上記細胞ネットワークの個々の細胞をそれぞれ載置している微小電極、
上記壁で囲われた細胞培養液を満たすための領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている細胞電位を計測する電位計測手段、ならびに
上記微小電極へ送る電気刺激を制御し、上記電位計測手段で計測した電位データを記録する、制御／記録手段
を備える、心筋毒性検査装置。
［２］透明基板、
該透明基板上に配置された、安定した拍動を行う心筋細胞を保持するための複数の細胞保持部（ＣＨＧ）を含む心筋細胞集団保持領域、
上記細胞保持部の１細胞と連携して上記心筋細胞集団の拍動を伝える細胞を保持するための、直列配列された複数の細胞保持部（ＣＨｎ）を含む細胞ネットワーク領域であって、該細胞保持部（ＣＨｎ）が心筋細胞または線維芽細胞を保持する、細胞ネットワーク領域、
上記透明基板表面と、上記心筋細胞集団保持領域および上記細胞ネットワーク領域の周囲に形成された壁とによって規定される、細胞培養液を満たすための空間領域、
上記細胞培養液を上記空間領域内に供給しおよび／または排出するための培養液供給／排出チャネル、
上記細胞に作用する薬剤を上記細胞培養液に加えるための薬剤供給チャネル、
上記透明基板上に設けられ、上記心筋細胞集団保持領域の細胞保持部（ＣＨＧ）の一つまたは一部の細胞保持部において心筋細胞を載置するための微小電極、
上記透明基板上に設けられ、上記細胞ネットワーク領域の複数の細胞保持部（ＣＨｎ）において個々の細胞を載置するための複数の微小電極、
上記細胞培養液を満たすための上記空間領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている細胞電位を計測する電位計測手段、ならびに
上記微小電極へ送る電気刺激を制御し、上記電位計測手段で計測した電位データを記録する、制御／記録手段
を備える、心筋毒性検査装置。
［３］上記細胞ネットワークの上記細胞を載置するための少なくとも１つの微小電極から該微小電極上に載置される細胞に一定のインターバルで強制拍動刺激を与えることができるように構成されている、上記［１］または［２］記載の心筋毒性検査装置。
［４］上記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測するように構成されている、上記［１］〜［３］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
［５］フィールド・ポテンシャル波形のうちカリウムイオンの細胞からの流出のピーク位置のナトリウムイオン流出ピークからの経過時間（フィールドポテンシャルデュレーション）のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測するように構成されている、上記［１］〜［３］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
［６］上記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、上記細胞ネットワークの上記細胞の拍動が発生する領域から観察電極までの伝達時間あるいは伝達速度のゆらぎを隣接する拍動の比較によって計測するように構成されている、上記［１］〜［３］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
［７］上記細胞が載った各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形の各々について微分することによって細胞電位を計測するように構成されている、上記［１］〜［３］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
［８］上記細胞が載置された各電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形を重ね合わせて合成フィールド・ポテンシャル波形を合成し、心電図データと比較可能な細胞集団全体としての拍動伝達の乱れ具合を計測するように構成されている、上記［１］〜［３］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
［９］上記細胞の配置された微小電極の電位を一定に保つフィードバック電位制御機構を備え、該電位制御機構が供給する電流量を解析するように構成されている、上記［１］〜［３］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
［１０］上記細胞への周期的強制拍動刺激開始後、３０秒以上経過してから計測を開始するように構成されている、上記［１］〜［３］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
［１１］上記透明基板上に配置した上記細胞の状態を光学的に計測するための光学系および光学カメラをさらに備え、
上記光学カメラで取得された画像のデータが上記制御／記録手段に記録される、上記［１］〜［１０］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
［１２］上記細胞保持部（ＣＨＧ，ＣＨｎ）の各々が、上記透明基板上に設けられた細胞非接着性の壁で囲まれた空間として規定され、該壁が上記細胞が通り抜けることの出来ない１以上の間隙を有する、上記［２］〜［１１］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
［１３］上記心筋細胞集団保持領域と上記細胞ネットワーク領域との間に、上記細胞培養液の流れを阻害するとともに上記心筋細胞集団保持領域の複数の細胞保持部（ＣＨＧ）のうち一つに収容された細胞と上記細胞ネットワーク領域の端部の細胞保持部（ＣＨｎ）の細胞とが連携するための開口部を有する障壁が設けられた、上記［２］〜［１２］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
［１４］透明基板、
該透明基板上に配置された複数個の細胞保持部（ＣＨＧ）を含む心筋細胞集団保持領域、
該心筋細胞集団保持領域の細胞保持部（ＣＨＧ）の１細胞と連携して上記心筋細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された細胞保持部（ＣＨｎ）を含む細胞ネットワーク領域であって、該細胞保持部（ＣＨｎ）が心筋細胞または線維芽細胞を保持する、細胞ネットワーク領域、
上記透明基板表面と、上記心筋細胞集団保持領域および上記細胞ネットワーク領域の周囲に形成された壁とによって規定される、細胞培養液を満たすための空間領域、
上記細胞培養液を上記壁で囲われた空間領域内に供給しおよび／または排出するための培養液供給／排出手段、
上記細胞に作用する薬剤を上記細胞培養液に加えるための薬剤供給手段、
上記透明基板上に設けられ、上記心筋細胞集団保持領域の細胞保持部（ＣＨＧ）の一つにおいて心筋を載置している微小電極、
上記透明基板上に設けられ、上記細胞ネットワーク領域の複数の細胞保持部（ＣＨｎ）において上記心筋細胞または線維芽細胞を載置している複数の微小電極、
上記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、
Ｘ−Ｙ方向に駆動されるとともに上記透明基板を載置するステージ、ならびに
上記ステージ上に載置された上記透明基板上の細胞の状態を光学的に計測する手段、
を備える、心筋毒性検査装置。
［１５］透明基板、
該透明基板上に配置された、心筋細胞を保持するための複数個の細胞保持部（ＣＨＧ）を含む心筋細胞集団保持領域、
該細胞集団の１細胞と連携して上記心筋細胞集団の拍動を伝えるための、直列配列された複数個の細胞保持部（ＣＨｎ）を含む細胞ネットワーク領域であって、該細胞保持部（ＣＨｎ）が心筋細胞または線維芽細胞を保持する、細胞ネットワーク領域、
上記透明基板表面と、上記心筋細胞集団保持領域および上記細胞ネットワーク領域の周囲に形成された壁とによって規定される、細胞培養液を満たすための領域、
上記透明基板上に設けられ、上記心筋細胞集団保持領域の細胞保持部（ＣＨＧ）の一つにおいて心筋細胞を載置している微小電極、
上記透明基板上に設けられ、上記細胞ネットワーク領域の複数の細胞保持部（ＣＨｎ）において上記心筋細胞または線維芽細胞を載置している複数の微小電極、
上記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、および
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線、
を備える、心筋毒性検査チップ。
［１６］上記［１］〜［１４］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置または上記［１５］に記載の心筋毒性検査チップを使用して、上記細胞に作用する薬剤が上記細胞培養液に加えられたときに、上記心筋細胞集団の発生する拍動が上記細胞ネットワーク領域の上記細胞を伝播する速度を遅延させるか否かを評価して上記細胞に作用する薬剤の心筋細胞に対する毒性を検査する心筋毒性検査方法。
［１７］上記［１］または［２］記載の心筋毒性検査装置を用いて前記細胞に作用する薬剤が前記細胞培養液に加えられたときに、前記心筋細胞集団の発生する拍動が前記細胞ネットワーク領域の前記細胞を伝播する速度を遅延させるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋細胞に対する毒性を検査する方法であって、下記のうちの少なくとも１つの工程を含む方法：
(i)上記細胞ネットワークの上記細胞を載置するための少なくとも１つの微小電極から該微小電極上に載置される細胞に一定のインターバルで強制拍動刺激を与える工程；
(ii)上記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測する工程；
(iii)フィールド・ポテンシャル波形のうちカリウムイオンの細胞からの流出のピーク位置のナトリウムイオン流出ピークからの経過時間（フィールドポテンシャルデュレーション）のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測する工程；
(iv)上記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、上記細胞ネットワークの上記細胞の拍動が発生する領域から観察電極までの伝達時間あるいは伝達速度のゆらぎを隣接する拍動の比較によって計測する工程；
(v)上記細胞が載った各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形の各々について微分することによって細胞電位を計測する工程；
(vi)上記細胞が載置された各電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形を重ね合わせて合成フィールド・ポテンシャル波形を合成し、心電図データと比較可能な細胞集団全体としての拍動伝達の乱れ具合を計測する工程；
(vii)上記細胞の配置された微小電極の電位を一定に保つフィードバック電位制御機構を用いて、該電位制御機構が供給する電流量を解析する工程；および
(viii)上記細胞への周期的強制拍動刺激開始後、３０秒以上経過してから計測を開始する工程。
［１８］上記微小電極の近傍に配置された、細胞電位計測におけるノイズ除去のための差分用の参照電極をさらに備える、上記［１］〜［１４］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
［１９］上記微小電極が、刺激電極および計測電極からなる、上記［１８］記載の心筋毒性検査装置。
［２０］心筋細胞が培養されている心筋細胞培養計測領域に、薬剤を連続して底面から導入して上方の液面から排出する機構と、その導入する薬剤の温度をモニターして適切な温度に維持する機構と、導入される薬液の濃度を計測するために光学的に透明な領域を持つ管と、波長２８０ナノメートルから８００ナノメートルの範囲で吸光分光定量計測が可能である上記［１９］記載の心毒性検査装置。
［２１］上記微小電極が透明である、上記［１］〜［１４］、［１８］〜［２０］のいずれか一項に記載の心筋毒性検査装置。
［２２］上記微小電極の抵抗値を減少させるために、光学系により観察する領域以外の領域に配された透明電極配線上に金属レイヤーを付加してある、上記［２１］記載の心毒性検査装置［２３］培養されている上記複数の心筋細胞が上記基板上に直線状に配置されて心筋細胞ネットワークを形成しており、
上記直線状心筋細胞ネットワークの端点に局所に刺激を与えるための電極が配置されている、上記［１］〜［１４］、［１８］〜［２２］のいずれか一項記載の心毒性検査装置。
［２４］さらに、上記直線状心筋細胞ネットワークの過半数の心筋細胞が載ることができる１つの直線状の計測電極を備える、上記［２３］記載の心毒性検査装置。
［２５］培養されている上記複数の心筋細胞が上記基板上にリング状に配置されて心筋細胞ネットワークを形成しており、
上記リング状心筋細胞ネットワークのリングの一部を欠損させて、その点に局所に刺激を与える電極が配置されている、上記［１］〜［１４］、［１８］〜［２２］のいずれか一項記載の心毒性検査装置。
［２６］さらに、上記リング状心筋細胞ネットワークの過半数の心筋細胞が載ることができる１つのリング状の計測電極を備える、上記［２５］記載の心毒性検査装置。
［２７］上記［１］〜［２６］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置を使用して、上記細胞に作用する薬剤が上記細胞培養液に加えられたときに、上記心筋細胞集団の発生する拍動が上記細胞ネットワーク領域の上記細胞を伝播する速度を遅延させるか否かを評価して上記細胞に作用する薬剤の心筋細胞に対する毒性を検査する心筋毒性検査方法。
［２８］上記［１］〜［１４］、［１８］〜［２６］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置を用いて上記細胞に作用する薬剤が上記細胞培養液に加えられたときに、上記心筋細胞集団の発生する拍動が上記細胞ネットワーク領域の上記細胞を伝播する速度を遅延させるか否かを評価して上記細胞に作用する薬剤の心筋細胞に対する毒性を検査する方法であって、下記のうちの少なくとも１つの工程を含む方法：
(i)上記細胞ネットワークの上記細胞を載置するための少なくとも１つの微小電極から該微小電極上に載置される細胞に一定のインターバルで強制拍動刺激を与える工程；
(ii)上記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測する工程；
(iii)フィールド・ポテンシャル波形のうちカリウムイオンの細胞からの流出のピーク位置のナトリウムイオン流出ピークからの経過時間（フィールドポテンシャルデュレーション）のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測する工程；
(iv)上記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、上記細胞ネットワークの上記細胞の拍動が発生する領域から観察電極までの伝達時間あるいは伝達速度のゆらぎを隣接する拍動の比較によって計測する工程；
(v)上記細胞が載った各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形の各々について微分することによって細胞電位を計測する工程；
(vi)上記細胞が載置された各電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形を重ね合わせて合成フィールド・ポテンシャル波形を合成し、心電図データと比較可能な細胞集団全体としての拍動伝達の乱れ具合を計測する工程；
(vii)上記細胞の配置された微小電極の電位を一定に保つフィードバック電位制御機構を用いて、該電位制御機構が供給する電流量を解析する工程；および
(viii)上記細胞への周期的強制拍動刺激開始後、３０秒以上経過してから計測を開始する工程。
［２９］心毒性評価のために、評価したい薬剤を添加した後に、上記［１］〜［１４］、［１８］〜［２６］のいずれか一項記載の装置で得られた細胞外電位信号のFPD値の延長の平均値をX軸に、FPD値のゆらぎであるSTV値をY軸にプロットして、その相対位置から評価する、上記［２７］または［２８］記載の心筋毒性検査方法。
［３０］透明基板、
上記透明基板上に形成された壁で囲まれた領域であって、細胞培養液で満たされている領域、
上記細胞培養液で満たされている領域内に配置された複数個の安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団、
上記細胞培養液で満たされている領域内に設けられた、上記細胞集団の一つの心筋細胞あるいは上記細胞集団の局所部分を載置している微小電極、
上記細胞培養液で満たされている領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている上記心筋細胞の電位を計測する電位計測手段、
上記電位計測手段で計測した被検薬物加入前後における上記心筋細胞の電位データを記録する記録手段、ならびに
上記電位データから、フィールド・ポテンシャル（ＦＰ）波形のうちナトリウムイオンの細胞への流入ピークからカリウムイオンの細胞からの流出ピークまでの経過時間（細胞外電位持続時間）（ＦＰＤ）および該ＦＰＤのゆらぎの大きさを算出し、該算出したＦＰＤおよびＳＴＶを指標として用いて上記被検薬物の心筋毒性を評価する解析手段
を備える、心筋毒性検査装置。
［３１］透明基板、
上記透明基板表面に形成された壁で囲まれた領域であって、細胞培養液を満たすための領域、
該透明基板上の上記壁で囲まれた領域内の、複数個の安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団を保持するための心筋細胞集団保持領域、
上記透明基板上の上記心筋細胞集団保持領域に設けられた心筋細胞を載置するための微小電極、
上記透明基板上の上記細胞培養液を満たすための上記領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている上記心筋細胞の電位を計測する電位計測手段、
上記電位計測手段で計測した被検薬物適用前後における上記心筋細胞の電位データを記録する記録手段、ならびに
上記電位データからフィールド・ポテンシャル（ＦＰ）波形のうちナトリウムイオンの細胞への流入ピークからカリウムイオンの細胞からの流出ピークまでの経過時間（細胞外電位持続時間）（ＦＰＤ）および該ＦＰＤのゆらぎの大きさを算出し、該算出したＦＰＤおよびＳＴＶを指標として用いて上記被検薬物の心筋毒性を評価する解析手段
を備える、心筋毒性検査装置。
［３２］上記ＦＰＤのゆらぎの大きさが該ＦＰＤの短期変動（ＳＴＶ）である、上記［３０］または［３１］記載の心筋毒性検査装置
［３３］上記心筋細胞の載置された上記微小電極の電位を一定に保つフィードバック電位制御機構をさらに備える、上記［３０］または［３１］記載の心筋毒性検査装置。
［３４］上記透明基板上に配置した上記心筋細胞の状態を光学的に計測するための光学系および光学カメラをさらに備え、上記光学カメラで取得された画像のデータが上記記録手段に記録される、上記［３０］〜［３３］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
［３５］上記心筋細胞を適切な温度に維持する温度制御機構を有する上記［３０］〜［３４］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置
［３６］上記解析手段において、ＦＰＤのゆらぎの大きさを、隣接するフィールド・ポテンシャル（ＦＰ）信号波形の比較によって計測するように構成されている、上記［３０］〜［３３］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
［３７］上記解析手段において、上記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、上記細胞ネットワークの上記細胞の拍動が発生する領域から観察電極までの伝達時間あるいは伝達速度のゆらぎを隣接する拍動の比較によって計測するように構成されている、上記［３０］〜［３３］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
［３８］上記解析手段において、上記細胞が載った各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形の各々について微分することによって細胞電位を計測するように構成されている、上記［３０］〜［３３］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
［３９］上記解析手段において、上記細胞が載置された各電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形を重ね合わせて合成フィールド・ポテンシャル波形を合成し、心電図データと比較可能な細胞集団全体としての拍動伝達の乱れ具合を計測するように構成されている、上記［３０］〜［３３］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
［４０］上記微小電極が、複数の微小電極からなる多電極アレイを構成している、上記［３０］〜［３４］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
［４１］上記細胞への周期的強制拍動刺激開始後、３０秒以上経過してから計測を開始するように構成されている、上記［３０］〜［３５］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
［４２］上記微小電極の近傍に配置された、細胞電位計測におけるノイズ除去のための差分用の参照電極をさらに備える、上記［３０］〜［３７］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
［４３］上記微小電極が、刺激電極および計測電極からなる、上記［４２］記載の心筋毒性検査装置。
［４４］上記細胞培養液を上記壁で囲まれた領域内に供給し、および／または排出する培養液供給／排出チャネルを備える、上記［３０］〜［３９］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
［４５］上記壁で囲まれた上記心筋細胞が培養されている領域内に被検薬物を連続して底面から導入して上方の液面から排出するための薬物導入／排出チャネルと、該導入する薬物の温度をモニターして適切な温度に維持する温度制御機構とを備え、上記チャネルの一部が、導入される該薬液の濃度を計測可能なように光学的に透明であり、波長２８０ナノメートルから８００ナノメートルの範囲で吸光分光定量計測を可能とする、上記［３０］〜［３９］のいずれか一項記載の心毒性検査装置。
［４６］上記微小電極が透明である、上記［３０］〜［３１］のいずれか一項に記載の心筋毒性検査装置。
［４７］上記微小電極の抵抗値を減少させるために、光学系により観察する領域以外の領域に配された透明電極配線上に金属レイヤーを付加してある、上記［４３］記載の心毒性検査装置。
［４８］培養されている上記複数の心筋細胞が上記基板上に直線状に配置されて心筋細胞ネットワークを形成しており、
上記直線状心筋細胞ネットワークの端点に局所に刺激を与えるための電極が配置されている、上記［３０］〜［４４］のいずれか一項記載の心毒性検査装置。
［４９］さらに、上記直線状心筋細胞ネットワークの過半数の心筋細胞が載ることができる１つの直線状の計測電極を備える、上記［４５］記載の心毒性検査装置。
［５０］培養されている上記複数の心筋細胞が上記基板上にリング状に配置されて心筋細胞ネットワークを形成しており、
上記リング状心筋細胞ネットワークのリングの一部を欠損させて、その点に局所に刺激を与える電極が配置されている、上記［３０］〜［４４］のいずれか一項記載の心毒性検査装置。
［５１］さらに、上記リング状心筋細胞ネットワークの過半数の心筋細胞が載ることができる１つのリング状の計測電極を備える、上記［４７］記載の心毒性検査装置。
［５２］上記［３０］〜［４８］のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置を用いて心筋細胞に作用する薬物の毒性を検査する方法であって、
細胞培養液中で培養されている複数の安定した拍動を行う心筋細胞を含む心筋細胞集団に被検薬物を添加する工程、および
上記薬物の上記細胞培養液への添加の前後における、上記心筋細胞集団の発生する拍動の変化を評価する工程
を含み、
上記拍動の変化を評価する際に、ＦＰＤ波形の延長と該ＦＰＤのゆらぎの大きさの増加を指標とすることを特徴とする、方法。
［５３］複数個の安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団を準備する工程、
培養容器内の底面に多電極アレイが配された該培養容器中で上記細胞集団を培養する工程、
上記培養している上記細胞集団へ被検薬物を添加し、上記多電極アレイを用いて上記培養細胞集団の細胞電位を測定する工程であって、上記薬物の添加の前後において、上記培養細胞集団の細胞電位を測定し、該細胞電位のデータを取得する工程、ならびに
上記取得した細胞電位のデータから、フィールド・ポテンシャル（ＦＰ）波形のうちナトリウムイオンの細胞への流入ピークからカリウムイオンの細胞からの流出ピークまでの経過時間（細胞外電位持続時間）（ＦＰＤ）および該ＦＰＤのゆらぎの大きさを算出し、該算出したＦＰＤおよび該ＦＰＤのゆらぎの大きさの組み合わせを指標として用いて上記薬物の心筋毒性を評価する工程、
を含む、薬物の心筋毒性検査方法。
［５４］上記ＦＰＤのゆらぎの大きさが該ＦＰＤの短期変動（ＳＴＶ）である、上記［１９］または［５３］に記載の方法。
［５５］上記薬物の心筋毒性を評価する工程において、上記薬物の添加後のＦＰＤ波形の延長とＳＴＶの増加を指標として該薬物の心筋毒性を評価する、上記［５３］に記載の方法。
［５６］上記ＦＰＤ波形の延長が所定の閾値を超えるＦＰＤ頻度とＳＴＶの増加が所定の閾値を超えるＳＴＶ頻度とを用いて二次元プロットを作成し、該二次元プロットに基づいて上記薬物の心筋毒性の評価を行う、上記［５５］に記載の方法。
［５７］上記二次元プロットにおいて、複数の薬物のプロットの相対位置から該薬物の心筋毒性を評価する、上記［５６］に記載の方法。【００１６】
本発明は、より簡潔には、以下の装置および方法を提供する。
（１）基板、
該基板上に配置した複数個の安定した拍動を行う評価対象の心筋細胞あるいは該心筋細胞を含む細胞集団、
上記基板上に上記細胞集団の周辺を囲むように形成された細胞培養液を満たすための壁、
上記細胞培養液を上記壁で囲われた領域内に供給しおよび／または排出する培養液供給／排出チャネル、
上記細胞集団の一つの細胞あるいは細胞集団の局所部分を載置している微小電極、
上記壁で囲われた細胞培養液を満たすための領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている細胞電位を計測する電位計測手段、ならびに
上記微小電極へ送る電気刺激を制御し、上記電位計測手段で計測した電位データを記録する、制御／記録手段
を備えた細胞品質評価装置であって、
上記微小電極へ送る上記電気刺激のインターバルを段階的に変化させて、
１）上記心筋細胞あるいは上記細胞集団が上記電気刺激のインターバルによる強制拍動刺激に応答して上記強制拍動刺激と同じインターバルで応答するかどうかを確認し、かつ、その応答がどの強制拍動刺激の周波数の範囲で対応するかどうかを計測し、拍動が追従できることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること、および
２）上記電気刺激による強制拍動刺激インターバル（ＲＲ）に対して細胞の拍動の追従が確認できた周波数の範疇で、強制拍動刺激に対するＦＰＤの変化が、ＦＰＤ／（ＲＲ）1/3からＦＰＤ／（ＲＲ）1/2の間にあることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること
を可能にする、細胞品質評価装置。
（２）基板、
該基板上に配置した複数個の安定した拍動を行う評価対象の心筋細胞あるいは該心筋細胞を含む細胞集団、
上記基板上に上記細胞集団の周辺を囲むように形成された細胞培養液を満たすための壁、
上記細胞培養液を上記壁で囲われた領域内に供給しおよび／または排出する培養液供給／排出チャネル、
上記細胞集団の一つの細胞あるいは細胞集団の局所部分を載置している微小電極、
上記壁で囲われた細胞培養液を満たすための領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている細胞電位を計測する電位計測手段、ならびに
上記微小電極へ送る電気刺激を制御し、上記電位計測手段で計測した電位データを記録する、制御／記録手段
を備えた細胞品質評価装置を用いて、
上記微小電極へ送る上記電気刺激のインターバルを段階的に変化させて、
１）上記心筋細胞あるいは上記細胞集団が上記電気刺激のインターバルによる強制拍動刺激に応答して上記強制拍動刺激と同じインターバルで応答するかどうかを確認し、かつ、その応答がどの強制拍動刺激の周波数の範囲で対応するかどうかを計測し、拍動が追従できることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること、および
２）上記電気刺激による強制拍動刺激インターバル（ＲＲ）に対して細胞の拍動の追従が確認できた周波数の範疇で、上記強制拍動刺激に対するフィールド・ポテンシャル・デュレーション（ＦＰＤ）の変化が、ＦＰＤ／（ＲＲ）1/3からＦＰＤ／（ＲＲ）1/2の間にあることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること
を含む、細胞品質評価方法。
（３）心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測するように構成されている、心筋毒性検査装置。
（４）フィールド・ポテンシャル波形のうちカリウムイオンの細胞からの流出のピーク位置のナトリウムイオン流出ピークからの経過時間（フィールドポテンシャルデュレーション：ＦＰＤ）のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測するように構成されている、上記（３）に記載の心筋毒性検査装置。
（５）ＦＰＤおよび該ＦＰＤのゆらぎの大きさを算出し、該算出したＦＰＤおよび該ＦＰＤのゆらぎの大きさの組み合わせを指標とするように構成されている、上記（３）または（４）に記載の心筋毒性検査装置。
（６）上記ＦＰＤのゆらぎの大きさが該ＦＰＤの短期変動（ＳＴＶ）である、上記（３）〜（５）のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
（７）透明基板、
上記透明基板上に形成された壁で囲まれた領域であって、細胞培養液で満たされている領域、
上記細胞培養液で満たされている領域内に配置された複数個の安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団、
上記細胞培養液で満たされている領域内に設けられた、上記細胞集団の一つの心筋細胞あるいは上記細胞集団の局所部分を載置している微小電極、
上記細胞培養液で満たされている領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている上記心筋細胞の電位を計測する電位計測手段、
上記電位計測手段で計測した被検薬物加入前後における上記心筋細胞の電位データを記録する記録手段
を備える、上記（３）〜（６）のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
（８）上記安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団が、拍動を伝えることが可能な複数個の心筋細胞および線維芽細胞を含む細胞ネットワークである、上記（３）〜（７）のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
（９）透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団からなるペースメーカー領域、
該透明基板上に配置され、該細胞集団と連携して上記細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された心筋細胞および線維芽細胞を含む細胞ネットワーク、
上記透明基板上に上記細胞集団および上記細胞ネットワークの周辺を囲むように形成された細胞培養液を満たすための壁、
上記細胞培養液を上記壁で囲われた領域内に供給しおよび／または排出する培養液供給／排出チャネル、
上記細胞に作用する薬剤を上記細胞培養液に加えるための薬剤供給チャネル、
上記細胞集団の一つの細胞あるいは細胞集団の局所部分を載置している微小電極、
上記細胞ネットワークの個々の細胞をそれぞれ載置している微小電極、
上記壁で囲われた細胞培養液を満たすための領域内に設けられた比較電極、
上記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と上記比較電極に接続された引き出し線とを用いて上記微小電極に載置されている細胞電位を計測する電位計測手段、ならびに
上記微小電極へ送る電気刺激を制御し、上記電位計測手段で計測した電位データを記録する、制御／記録手段
を備える、上記（３）〜（８）のいずれか一項に記載の心筋毒性検査装置。
（１０）上記安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞を載置するための少なくとも１つの微小電極から該微小電極上に載置される細胞に一定のインターバルで強制拍動刺激を与えることができるように構成されている、上記（３）〜（９）のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
（１１）上記直列配列された細胞ネットワークの端点に局所に刺激を与えるための電極が配置されている、上記（８）〜（１０）のいずれか一項記載の心毒性検査装置。
（１２）上記細胞ネットワークが、リング状に配置されて形成されており、
該リングの一部を欠損させて、その点に局所に刺激を与える電極が配置されている、上記（８）〜（１１）のいずれか一項記載の心毒性検査装置。
（１３）上記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、上記細胞ネットワークの上記細胞の拍動が発生する領域から観察電極までの伝達時間あるいは伝達速度のゆらぎを隣接する拍動の比較によって計測するように構成されている、上記（８）〜（１２）のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
（１４）上記心筋細胞を適切な温度に維持する温度制御機構を有する上記（１）〜（１３）のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
（１５）上記微小電極が、複数の微小電極からなる多電極アレイを構成している、上記（１）〜（１４）のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置。
（１６）心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測することを特徴とする心筋毒性検査方法。
（１７）複数個の安定した拍動を行う心筋細胞を含む細胞集団を準備する工程、
培養容器内の底面に多電極アレイが配された該培養容器中で上記細胞集団を培養する工程、
上記培養している上記細胞集団へ被検薬物を添加し、上記多電極アレイを用いて上記培養細胞集団の細胞電位を測定する工程であって、上記薬物の添加の前後において、上記培養細胞集団の細胞電位を測定し、該細胞電位のデータを取得する工程、ならびに
上記取得した細胞電位のデータから、フィールド・ポテンシャル（ＦＰ）波形のうちナトリウムイオンの細胞への流入ピークからカリウムイオンの細胞からの流出ピークまでの経過時間（細胞外電位持続時間）（ＦＰＤ）および該ＦＰＤのゆらぎの大きさを算出し、該算出したＦＰＤおよび該ＦＰＤのゆらぎの大きさの組み合わせを指標として用いて上記薬物の心筋毒性を評価する工程、
を含む、上記（１６）に記載の薬物の心筋毒性検査方法。
（１８）上記（８）〜（１５）のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置を使用して、上記細胞に作用する薬剤が上記細胞培養液に加えられたときに、上記心筋細胞集団の発生する拍動が上記細胞ネットワーク領域の上記細胞を伝播する速度を遅延させるか否かを評価して上記細胞に作用する薬剤の心筋細胞に対する毒性を検査する上記（１６）または（１７）に記載の心筋毒性検査方法。
（１９）上記（８）〜（１５）のいずれか一項記載の心筋毒性検査装置を用いて上記細胞に作用する薬剤が上記細胞培養液に加えられたときに、上記心筋細胞集団の発生する拍動が上記細胞ネットワーク領域の上記細胞を伝播する速度を遅延させるか否かを評価して上記細胞に作用する薬剤の心筋細胞に対する毒性を検査する方法であって、下記のうちの少なくとも１つの工程を含む上記（１６）〜（１８）のいずれか一項記載の方法：
(i)上記細胞ネットワークの上記細胞を載置するための少なくとも１つの微小電極から該微小電極上に載置される細胞に一定のインターバルで強制拍動刺激を与える工程；
(ii)上記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測する工程；
(iii)フィールド・ポテンシャル波形のうちカリウムイオンの細胞からの流出のピーク位置のナトリウムイオン流出ピークからの経過時間（フィールドポテンシャルデュレーション）のゆらぎの大きさを、隣接する拍動信号の比較によって計測する工程；
(iv)上記細胞が載置された各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形のゆらぎの大きさを、上記細胞ネットワークの上記細胞の拍動が発生する領域から観察電極までの伝達時間あるいは伝達速度のゆらぎを隣接する拍動の比較によって計測する工程；
(v)上記細胞が載った各微小電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形の各々について微分することによって細胞電位を計測する工程；
(vi)上記細胞が載置された各電極から取得される心筋拍動のフィールド・ポテンシャル波形を重ね合わせて合成フィールド・ポテンシャル波形を合成し、心電図データと比較可能な細胞集団全体としての拍動伝達の乱れ具合を計測する工程；
(vii)上記細胞の配置された微小電極の電位を一定に保つフィードバック電位制御機構を用いて、該電位制御機構が供給する電流量を解析する工程；および
(viii)上記細胞への周期的強制拍動刺激開始後、３０秒以上経過してから計測を開始する工程。
（２０）上記ＦＰＤのゆらぎの大きさが該ＦＰＤの短期変動（ＳＴＶ）である、上記（１６）〜（１９）のいずれか一項記載の方法。
【発明の効果】
【００１７】
心筋細胞および線維芽細胞の薬剤に対する応答の変化を細胞のゆらぎ計測から正確に評価することができる。【００１８】
従来、フィールド・ポテンシャル・デュレーション（ＦＰＤ）（後述の説明を参照）および隣接する心筋細胞の隣接する拍動の揺らぎの大きさ（例えば、短期変動：STV:Short-term variability）のそれぞれを独立に指標とすることはあっても、両者を組み合わせて心筋毒性の検査することはなかった。本発明の心筋毒性検査方法に従って、ＦＰＤ波形の延長だけでなく、心筋細胞の隣接する拍動の揺らぎの大きさ（ＳＴＶ）の増加も組み合わせて評価することにより、より正確な心筋毒性の評価が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施例に係る心筋毒性検査装置の構造の１例を模式的に示した斜視図である。
【図２】図１に示す心筋毒性検査装置の細胞保持部ＣＨの構成の１例を模式的に示す斜視図である。
【図３】図３は、図１に示す心筋毒性検査装置の細胞保持部ＣＨに保持された細胞を光学的に検出する光学系を説明する図である。
【図４】（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、細胞電位の計測に関する信号を示す図である。それぞれ、横軸に時間を、縦軸に微小電極２と比較電極２Ｃとの間に得られる細胞電位を示す。
【図５】（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、細胞の拍動に伴う体積変化を光学系によって計測した結果に関する信号を示す図である。
【図６】（ａ）は培養液に薬物が含まれない通常状態における標的細胞のＮａ＋イオン、Ｃａ２＋イオン、Ｋ＋イオン成分の流入出量に伴う細胞電位変化を示す図であり、（ｂ）は培養液に薬物が含まれた状態における標的細胞のＮａ＋イオン、Ｃａ２＋イオン、Ｋ＋イオン成分の流入出量に伴う細胞電位変化を示す図である。
【図７】心筋毒性検査装置の細胞を光学的に検出する光学系および可動電極の配置の一例を説明する図である。
【図８】細胞の電気信号の発生を説明する模式図である。
【図９】（ａ）は薬剤の添加による細胞電位変化の一例を示す図であり、（ｂ）は各拍動時の細胞電位変化について、隣接した２つの拍動の相同性を評価するポアンカレプロットの一例を示す図である。
【図１０】（ａ）は１細胞レベルでの細胞配置技術を用いた心筋細胞の環状ネットワークによって作成したリエントリー回路の一例を示す模式図であり、（ｂ）は実際に微小電極上に細胞を配置した一例を示す顕微鏡写真である。
【図１１】（ａ）は一定の幅の細胞集団を用いて心筋細胞の環状ネットワークによるリエントリー回路の一例を示す模式図であり、（ｂ）は実際に微小電極上に細胞を配置した一例を示す顕微鏡写真であり、（ｃ）は実際に微小電極アレイ上に環状に細胞集団を配置した一例を示す顕微鏡写真である。
【図１２】（ａ）は環状電極を用いたリエントリー回路計測装置の一例を示す模式図であり、（ｂ）は実際に電極で計測した、正常拍動データと異常拍動データを示したグラフである。
【図１３】（ａ）は１細胞の電位計測を行う電極と細胞の配置の一例を示す模式図であり、（ｂ）は実際に電極で計測した孤立１細胞の電極上の写真とその拍動電気データ、（ｃ）は計測した細胞集団の電極上での写真と細胞集団の中の１細胞の拍動電気データを示したグラフである。
【図１４】本発明でカメラ受光素子を１細胞の電位計測に用いた実施例を説明する模式図である。
【図１５】本発明の細胞計測システムで複数試料を計測できる機構の一例を説明する模式図である。
【図１６】本発明の細胞計測システムで計測できる心臓情報を説明する模式図である。
【図１７】本発明の細胞計測システムで計測できる細胞のフィールド・ポテンシャル信号波形の薬物の添加に対する変化を説明するグラフの一例である。
【図１８】本発明の細胞計測システムで計測できる細胞のフィールド・ポテンシャル信号波形のカリウムイオン放出のピーク位置のナトリウムイオン放出時間からの経過時間（ＦＰＤ：フィールド・ポテンシャル・デュレーション）について、カリウムイオンチャンネル阻害剤Ｅ４０３１の添加に対する変化の平均値の一例を説明するグラフの一例である。
【図１９】本発明の細胞計測システムで計測できる細胞のフィールド・ポテンシャル信号波形のカリウムイオン放出のピーク位置のナトリウムイオン放出時間からの経過時間（ＦＰＤ：フィールド・ポテンシャル・デュレーション）について、そのゆらぎの大きさについて隣接する拍動の短期変動をポワンカレプロッティングに基づいて定量的に評価する方法のひとつを説明するグラフおよび式の一例である。
【図２０】本発明の細胞計測システムで計測できる細胞のフィールド・ポテンシャル信号波形のカリウムイオン放出のピーク位置のナトリウムイオン放出時間からの経過時間（ＦＰＤ：フィールド・ポテンシャル・デュレーション）について、そのゆらぎの大きさをポワンカレプロッティングに基づいて定量的に評価する方法のひとつを説明するグラフおよび式の一例である。
【図２１】本発明の細胞計測システムで計測できる心筋細胞のフィールド・ポテンシャル信号波形のカリウムイオン放出のピーク位置のナトリウムイオン放出時間からの経過時間（ＦＰＤ：フィールド・ポテンシャル・デュレーション）について、そのＥ４０３１の添加によって起こるゆらぎの大きさの一例をポワンカレプロッティングで表示したもの（ａ）と、これについてＳＴＶをまとめたもの（ｂ）である。
【図２２】本発明の細胞計測システムで計測できる心筋細胞にさまざまな心毒性を持つことが知られている薬剤と比較薬剤を添加した場合のＦＰＤとＳＴＶについて示したものである。
【図２３】本発明の細胞計測システムで計測できる心筋細胞ネットワークの形状の違い、ならびに位置の違いによる薬剤添加に対するＦＰＤのポワンカレプロッティングの一例を示したものである。（ａ）は実際の細胞ネットワークの一例を示した顕微鏡写真、（ｂ）は（ａ）のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄの点での変化を計測したグラフを示したものである。
【図２４】本発明の細胞計測システムで計測できる心筋細胞ネットワークの形状の違い、ならびに位置の違いによる薬剤添加に対するペースメーカー領域から局所への伝達時間のポワンカレプロッティングの一例を示したものである。（ａ）は実際の細胞ネットワークの一例を示した顕微鏡写真、（ｂ）は（ａ）のＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄの点での変化を計測したグラフを示したものである。（ｃ）は、ＳＴＶの算出式である。
【図２５】本発明の細胞計測システムで計測できる心筋細胞ネットワーク計測において、従来のin vitro計測法、in vivo計測法との関係、1細胞のFP波形と細胞ネットワークのFP合成波形との関係を模式的に示した図である。
【図２６】本発明の細胞計測システムで計測できる心筋細胞ネットワーク計測において各電極から得られた細胞のFP波形から細胞電位を見積もる機能と細胞ネットワークのFP合成波形から心電図比較波形を合成する機能を有する装置の構成を模式的に示した図である。
【図２７】本発明の細胞計測システムで計測できる心筋細胞ネットワーク計測において、環状に配置した心筋細胞ネットワーク（Ａ）の各電極から得られた細胞のFP波形（Ｂ）および、これを合成した合成ＦＰ波形（Ｃ）の一例を示す。この例では、ＰＭ領域から正常に拍動シグナルが伝達する例を示している。
【図２８】本発明の細胞計測システムで計測できる心筋細胞ネットワーク計測において、環状に配置した心筋細胞ネットワーク（Ａ）の各電極から得られた細胞のFP波形（Ｂ）および、これを合成した合成ＦＰ波形（Ｃ）の一例を示す。この例では、ＰＭ領域から拍動シグナルが異常に伝達する例を示している。
【図２９】本発明の細胞計測システムで計測できる心筋細胞ネットワーク計測において、心筋細胞の拍動周波数（Beating Frequency）とＦＰＤの関係一例を示すグラフである。
【図３０】本発明の細胞計測システムで計測できる心筋細胞ネットワーク計測において、心筋細胞に強制拍動を与えたときのＦＰＤの時間変化の一例を示すグラフである。
【図３１】本発明の細胞計測システムで計測できる心筋細胞ネットワーク計測において、心筋細胞に強制拍動を与えてＦＰＤを計測する場合の細胞ネットワーク配置の例を示す顕微鏡写真である。
【図３２】本発明の細胞計測システムで計測できる心筋細胞ネットワーク計測において、心筋細胞のＦＰ計測に微量電極電位のフィードバック制御を用いて微小電極を一定電位に保つ機構を用いた機構の一例を示す模式図である。
【図３３】本発明の細胞計測システムで計測できる心筋細胞ネットワーク計測において、心筋細胞集団の一部領域に強制拍動刺激を与えたときの、心筋細胞集団の拍動周期の応答の関係の一例を示すグラフである。
【図３４】本発明の細胞計測システムで計測できる心筋細胞ネットワーク計測において、心筋細胞集団の一部領域に強制拍動刺激を与えたときの、ＦＰＤの長さの変化の一例を示すグラフである。（ａ）は、強制拍動刺激によって引き起こされるＦＰ波形の変化とＦＰＤの長さの変化の関係の一例を、（ｂ）は、強制拍動刺激の刺激インターバルの変化に応じたＦＰＤの長さの変化の一例を示すグラフである。
【図３５】本発明の細胞計測システムで計測できる心筋細胞ネットワーク計測において、心筋細胞集団の一部領域に強制拍動刺激を与えたときの、細胞集団の応答の一例について図３３および図３４に示した結果をまとめた表である。
【図３６】図３６は、本発明の心筋毒性検査装置の全体構成の一例を示すブロック図である。
【図３７】図３７は、本発明の１つの実施形態に係る心筋毒性検査装置の測定部の拡大図である。
【図３８】図３８は、多電極アレイチップ（ａ，ｂ，ｄ）を用いて心筋細胞（ｂ）に対する薬物の毒性評価を行う際の、チップの電極と測定ウインドウとの対応関係（ａ〜ｃ）および分析に用いるデータの表示例（ｅ）を示す図である。
【図３９】図３９は、Diltiazem, DL-sotalol, E-4031 及び DDWについて本発明の一実施形態に係る心毒性検査方法により生成した2次元プロットを示す。
【図４０ａ】本発明の電極電位計測に置けるノイズ除去のための比較電極と微小電極の間の差分回路を模式的に示したものである。（ａ）原理を示した回路の一例の模式図である。
【図４０ｂ】本発明の電極電位計測に置けるノイズ除去のための比較電極と微小電極の間の差分回路を模式的に示したものである。（ｂ）この差分回路を組み込んだ増幅回路の一例の回路図である。
【図４０ｃ】本発明の電極電位計測に置けるノイズ除去のための比較電極と微小電極の間の差分回路を模式的に示したものである。（ｃ）回路によってノイズが低減された例を示す図である。
【図４１】本発明の心毒性評価法の総合的評価法の例を模式的に示す図である。（ａ）細胞のＦＰＤのデータからX軸にFPD延長の程度を、Y軸にFPDの時間的ゆらぎの大きさをプロットする。（b）は、その結果の平均をX-Y図にプロットしたものの一例を示す。
【図４２】本発明の心毒性を計測するシステムの構成の一例を示す模式図である。
【図４３】本発明の心毒性を計測するシステム中の細胞培養計測チャンバーの構成の一例を示す模式図と写真である。
【図４４】細胞培養計測プレートの断面を模式的に示した図である。
【図４５】多電極基板に配置されている電極配置の電極配線の構成を模式的に説明する図である。
【図４６】多電極基板上の電極配置の例を示した模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
図１は本発明の実施例に係る心筋毒性検査装置の構造の１例を模式的に示した斜視図である。図２は、図１に示す心筋毒性検査装置の細胞保持部ＣＨの構成の１例を模式的に示す斜視図である。図３は、図１に示す心筋毒性検査装置の細胞保持部ＣＨに保持された細胞を光学的に検出する光学系を説明する図である。
【００２１】
図１および２を参照して、心筋毒性検査装置１００は、透明基板１の上に構築されている部品を主体として構成される。透明基板１は光学的に透明な材料、例えば、ガラス基板あるいはシリコン基板である。微小電極２は、例えば、ＩＴＯによる透明電極とされ、透明基板１上に配置される。２’は微小電極２の引き出し線である。３１，３２，３３及び３４はアガロースゲルによる壁であり、微小電極２の周辺に間隙４１，４２，４３及び４４を介して配置される。アガロースゲルによる壁３１，３２，３３及び３４は中心部が切り欠かれて細胞収納部となる空間を形成している。アガロースゲルによる壁３１，３２，３３及び３４により形成される細胞収納部となる空間の透明基板１上には、必要により、微小電極２が配置される。微小電極２の有無に係らず、細胞収納部に一つの細胞１０が収納できる。図２では、アガロースゲルによる壁３１，３２，３３及び３４により形成される細胞収納部となる空間の透明基板１上に、微小電極２が配置され、その上に心筋細胞１０が収納されている。微小電極２に引き出し線２’が接続されて引き出されている様子を示す。微小電極２の細胞載置面および微小電極２を設けないで透明基板１に、直接、細胞を載置する場合の細胞載置面にはコラーゲン等の細胞が電極表面および透明基板に接着するのを助ける素材を塗っておくのがよい。アガロースゲルによる壁３１，３２，３３及び３４により形成される細胞収納部内の細胞は、アガロースゲルは細胞にとっては非接着性であるため、この壁３１，３２，３３及び３４の高さを細胞と同程度としても、壁を乗り越えて細胞１０が移動することはない。また、アガロースゲルによる壁３１，３２，３３及び３４中心部が切り欠かれて形成される細胞収納部の周辺の間隙４１，４２，４３及び４４は細胞の大きさより小さいものとされるから、この間隙４１，４２，４３及び４４をすり抜けて細胞１０が移動することはない。
【００２２】
図１において、細胞保持部ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨｎはそれぞれ細胞収納部に一つの心筋細胞あるいは線維芽細胞１０１、１０２、１０３および１０ｎを保持するとともに、図では明確でないが、それぞれ、微小電極２を備えていて、引き出し線２’１、２’２、２’３および２’ｎが引き出されている。これらの心筋細胞または線維芽細胞は直列配列された細胞連絡チャネルＣＣＣを構成する。ここで、ｎは例えば２０である。また、これら２０個の直列配列された心筋細胞および線維芽細胞の配分は、ランダムでよいが、細胞保持部ＣＨ１の細胞およびＣＨ２０の細胞は心筋細胞であったほうがよい。この細胞連絡チャネルＣＣＣの左端には３×３の細胞保持部ＣＨＧが形成されていて、それぞれの細胞保持部ＣＨに心筋細胞１０が保持されてなる細胞集団１０Ｇを含む心筋細胞集団保持領域が存在する。この細胞集団１０Ｇは安定した拍動を行うペースメーカーとして機能するものである。細胞集団１０Ｇでは、細胞集団１０Ｇの一つの細胞保持部ＣＨのみに微小電極２が備えられ、引き出し線２’Ｇが引き出されている。また、細胞集団１０Ｇの右側の中央の細胞保持部ＣＨが細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞保持部ＣＨ１に対向するように構成されている。細胞集団１０Ｇの右側と細胞連絡チャネルＣＣＣの左端部との間に障壁１１ａが設けられる。この障壁１１ａの中央部の下部には小さい開口１１ｂが形成される。この開口１１ｂの両側には対向する細胞集団１０Ｇの右側の中央の細胞保持部ＣＨと細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞保持部ＣＨ１があり、それぞれの細胞収納部の周辺の間隙４を介してそれぞれに保持されている細胞の物理的接触・細胞間インタラクションが可能なように構成されている。細胞集団１０Ｇの下部に比較電極２Ｃが設けられ、引き出し線２’Ｃが引き出されている。
【００２３】
７は周辺を取り巻く壁であり、細胞集団１０Ｇ、細胞連絡チャネルＣＣＣおよび比較電極２Ｃを取り巻いている。８１および８２は壁７の内部の領域に、細胞の培養液を供給し、および、壁７の内部の領域から、細胞の培養液を排出するためのパイプであり、図の例では、基板１の底面近くまで延伸されたパイプ８１から培養液が供給され、基板１の底面近くまで延伸されたパイプ８２から培養液が排出される。培養液を供給するパイプ８１の培養液の出口の近くにパイプ８３が結合され、このパイプ８３を介して細胞に作用させたい薬剤が供給される。したがって、細胞１０はパイプ８１により壁７の内部の領域に供給される細胞の培養液に曝されながら、微小電極２の上に安定して保持される。細胞を培養液に曝す必要がなくなったときは、パイプ８２により壁７の内部の領域から培養液を排出すればよい。また、培養液を新しいものと交換するときは、培養液を排出した後、あるいは、排出しながら、培養液を供給すればよい。一方、細胞に薬剤を作用させたいときは、パイプ８２により培養液を排出しながら、パイプ８３を介して細胞に作用させたい薬剤を培養液に加えて、パイプ８１により培養液とともに供給すればよい。このとき、細胞集団１０Ｇと細胞連絡チャネルＣＣＣとの間に障壁１１ａを設けたことにより、薬剤を含む培養液がパイプ８１により壁７の内部の領域に供給されるとき、細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞が薬剤の影響を受ける程度に比し、細胞集団１０Ｇの細胞が薬剤の影響を受ける程度は低いものとなる。すなわち、パイプ８１により薬剤を含む培養液が供給されるとき、この培養液は障壁１１ａの両側の壁７との隙間および障壁１１ａの上面を乗り越えて細胞集団１０Ｇにも供給されるから細胞集団１０Ｇの細胞も薬剤の影響を受ける。しかし、その影響は細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞に対するものと比較すれば間接的であるので、ペースメーカーとしての機能に影響を及ぼすほどのものではない。なお、パイプ８１、パイプ８２およびパイプ８３の構成、配置は計測の仕方により任意に変更してよい。例えば、パイプ８１およびパイプ８３は分離されたものとしてもよいし、パイプ８２は省略して、パイプ８１を供給、排出の両方に使用するものとしてもよい。
【００２４】
ＰＣはパソコン（電位計測手段，制御／記録手段）であり、細胞保持部ＣＨの微小電極２の引き出し線２’と比較電極２Ｃの引き出し線２’との間で細胞電位を計測し記録する。また、パソコン９には操作者の操作信号Ｍｓが加えられる。
【００２５】
心筋毒性検査装置１００は光学観察装置２００のＸＹステージ１５に載せて細胞連絡チャネルＣＣＣの任意の細胞１０の拍動を、光学系により観察することが出来る。ＸＹステージ１５は、光学的に透明であるとともに、操作者の操作信号Ｍｓに応じてパソコンＰＣが与える信号に応じてＸ−Ｙ駆動装置１６により、任意の位置に移動される。図３では、細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞１０ｎの拍動の状態を観察する例を示している。１２は培養液を示す。
【００２６】
２２は位相差顕微鏡あるいは微分干渉顕微鏡の光源であり、一般にハロゲン系のランプが用いられる。２３は位相差等の実体顕微鏡観察の光源の光から特定の波長のもののみを透過させるバンドパスフィルタである。例えば細胞１０ｎの観察の場合には、波長７００ｎｍ近傍の狭帯域の光を用いることで細胞１０ｎの損傷を防ぐことができる。２４はシャッターで、ＸＹステージ１５を移動させる場合など、画像計測をしていない間は光の照射を遮断する機能を有する。２５はコンデンサレンズであり、位相差観察をする場合は位相差リングを導入し、微分干渉観察をする場合は、偏光子を導入する。ＸＹステージ１５上には基板１上に形成されている心筋毒性検査装置１００が載置されＸ−Ｙ駆動装置１６によって前記ＸＹステージ１５を移動させることで前記心筋毒性検査装置１００の任意の位置を観察し、計測することができる。前記心筋毒性検査装置１００内の細胞１０ｎの拍動の状態は、対物レンズ１７で観察される。対物レンズ１７の焦点位置はパソコンＰＣによる信号に応じて駆動装置１８によってＺ軸方向に移動させることができる。対物レンズ１７の倍率は４０倍以上のものが使用できる。対物レンズ１７で観察されるのは、光源２２から透過された光による細胞１０ｎの位相差像あるいは微分干渉像である。前記バンドパスフィルタ２３を透過するのと同波長の光を反射するダイクロイックミラー１９およびバンドパスフィルタ２０によって、位相差顕微鏡像あるいは微分干渉顕微鏡像のみがカメラ２１によって観察される。カメラ２１によって観察された画像信号はパソコンＰＣに導入される。また、図示していないが、画像はパソコンと接続されたモニタまたはディスプレイにより表示され得る。
【００２７】
図１に示す心筋毒性検査装置１００の構造の主要なサイズの例を示すと以下のようである。これは、細胞の大きさを１０μｍφとした例である。透明基板１の大きさは１００ｍｍ×１５０ｍｍ、微小電極２は８μｍ×８μｍの大きさ、アガロースゲルによる壁３１，３２，３３及び３４の個々の大きさは２０μｍ×２０μｍ×１０μｍ（高さ）、間隙４１，４２，４３及び４４の幅２μｍ、アガロースゲルによる壁３１，３２，３３及び３４により形成される細胞収納部となる空間は１２μｍφの円柱状、壁７の外形は５ｍｍ×５ｍｍとし高さは５ｍｍである。障壁１１ａの高さは１ｍｍである。尚、ここでは、微小電極２は８μｍ×８μｍの正方形としたが、アガロースゲルによる壁３１，３２，３３及び３４の全体と間隙４１，４２，４３及び４４の幅とで構成する細胞の収納部となる１０μｍφの円状の電極としてもよい。
【００２８】
以下、本発明の心筋毒性検査装置１００の構成例とこれを用いた具体的な計測例を説明する。
【００２９】
図４（ａ）、図４（ｂ）および図４（ｃ）は、細胞電位の計測に関する信号を示す図である。それぞれ、横軸に時間を、縦軸に微小電極２と比較電極２Ｃとの間に得られる細胞電位を示す。図４（ａ）は細胞集団１０Ｇの拍動による細胞電位である。ここでは、図１に示す細胞集団１０Ｇの一つから引き出された引き出し線２’Ｇと比較電極２Ｃから引き出された引き出し線２’Ｃとの間の電位である。図に示すように、安定した拍動を示し、ペースメーカーとして機能しうることがわかる。図４（ｂ）は培養液に薬物が含まれない通常状態における標的細胞の拍動による細胞電位である。ここでは、計測の標的細胞を細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞１０ｎとし、細胞１０ｎから引き出された引き出し線２’ｎと比較電極２Ｃから引き出された引き出し線２’Ｃとの間の電位が計測されている。図４（ａ）の波形と比較して明らかなように、細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞１０による拍動の伝達に要する時間Δｔだけ遅れていることが観察される。これに対して、図４（ｃ）は培養液に薬物が含まれた状態における標的細胞の拍動による細胞電位である。ここでも、計測の標的細胞を細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞１０ｎとし、図４（ｂ）との比較が明確になるようにしている。図４（ａ）、図４（ｂ）、の波形と比較して明らかなように、細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞１０による拍動の伝達に要する時間Δｔだけの遅れではなく、時間Δｔ＋αの遅れとなっていることが観察される。これは、細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞に対する薬物の作用によるＮａイオン阻害の大きさが＋αの遅れの増大として表れていることを意味する。すなわち、心筋細胞に対する薬物の毒性をＮａイオン阻害として評価することが出来る。
なお、観察に使用する微小電極を観察電極と言う場合がある。
【００３０】
図５（ａ）、図５（ｂ）および図５（ｃ）は、細胞の拍動に伴う体積変化を光学系によって計測した結果に関する信号を示す図である。図５（ａ）は細胞集団１０Ｇの細胞の拍動に伴う体積変化である。細胞集団１０Ｇの細胞の一つの拍動を図３に示す形で光学的に検出したものである。細胞の拍動に伴う収縮および拡張がパルス状に現れる変化として認められる。この波形の周期は、図４（ａ）に示す拍動に伴う細胞電位の変化の周期と同じである。図５（ｂ）は培養液に薬物が含まれない通常状態における標的細胞の拍動に伴う体積変化を上段に示し、下段にこれを電気信号として評価するために時間微分値として処理したときの波形を示す。ここでも、計測の標的細胞を細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞１０ｎとし、細胞１０ｎの拍動を図３に示す形で光学的に検出したものである。図５（ａ）の波形と比較して明らかなように、細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞１０による拍動の伝達に要する時間Δｔだけ遅れていることが観察される。これに対して、図５（ｃ）は培養液に薬物が含まれた状態における標的細胞の拍動に伴う体積変化を評価するための説明図であり、図５（ａ）、図５（ｂ）に比し時間軸を拡大した形で示す。上段は図５（ｂ）の上段の波形に対応する波形であり、図５（ａ）の波形と比較して明らかなように、細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞１０による拍動の伝達に要する時間Δｔよりもさらにβだけ遅れが増大していることが観察される。標的細胞の拍動に伴う体積変化が薬物により受ける影響は、この遅延の増大以上に体積変化の傾きが小さくなることが特徴的である。図５（ｃ）の下段に参考波形として示した薬物を含まない培養液での体積変化と比較してみるとこのことがよく分かる。図５（ｃ）の中段には、上段の波形を評価するために時間微分値として処理したときの波形を示す。この時間微分値を図５（ｂ）の下段のそれと比較すると分かるように、ピーク値が小さくなるとともに、傾きが緩やかになっている。これは、薬物により心筋の収縮速度が低下して、心拍出量が低下したことを意味する。すなわち、心筋細胞に対する薬物の毒性を収縮速度の低下として評価することが出来る。
【００３１】
図６（ａ）は培養液に薬物が含まれない通常状態における標的細胞のＮａ＋イオン、Ｃａ２＋イオン、Ｋ＋イオン成分の流入出量に伴う細胞電位変化を示す。図６（ｂ）は培養液に薬物が含まれた状態における標的細胞のＮａ＋イオン、Ｃａ２＋イオン、Ｋ＋イオン成分の流入出量に伴う細胞電位変化を示す。図６（ａ）、図６（ｂ）を対比してすぐ分かるように、ＱＴ遅延が表われて波形が時間軸方向に伸びている。さらにＫ＋イオンの流入出に伴い、波形が大きく変形している。これを電気信号として評価するために、図に破線で示した“０”と“１００”の間の値に対して、３０％、６０％および９０％の値の継続時間をＡＰＤ３０，ＡＰＤ６０およびＡＰＤ９０として検出する。ここで、ＡＰＤとはAction Potential Durationの頭文字からとった表現である。これらの値の大きさおよび比率を評価すれば、その薬物のＮａ＋イオン、Ｃａ２＋イオン、Ｋ＋イオン成分の流入出量に及ぼす影響を評価できる。
【００３２】
図７は、心筋毒性検査装置の細胞を光学的に検出する光学系および可動電極の配置の一例を説明する図であり、例えば計測する細胞１０ｎの拍動の状態を観察する例を示している。１２は培養液を示す。２２は位相差顕微鏡あるいは微分干渉顕微鏡の光源であり、一般にハロゲン系のランプが用いられる。２２１は細胞の蛍光計測をするための蛍光光源であり、一般に水銀ランプ、単色光レーザー、ＬＥＤ光源などが用いられる。２３は位相差等の実体顕微鏡観察の光源の光から特定の波長のもののみを透過させるバンドパスフィルタであり、２３１は蛍光光源２２１から特定の蛍光を励起する励起波長の光のみを透過させるバンドパスフィルタである。例えば細胞１０ｎの拍動堆積変化情報のような形状変化の観察の場合には、細胞形状を計測するための波長の光だけを透過させるバンドパスフィルタ２０を通過した像をカメラ２１でリアルタイム計測するが、計測に波長７００ｎｍ近傍の狭帯域の光を用いることで細胞１０ｎの損傷を防ぐことができる。２４および２４１はシャッターで、ＸＹステージ１５を移動させる場合など、画像計測をしていない間は光の照射を遮断する機能を有する。２５はコンデンサレンズであり、位相差観察をする場合は位相差リングを導入し、微分干渉観察をする場合は、偏光子を導入する。蛍光計測の場合は、例えば細胞内カルシウム放出の計測を行う場合は、励起波長５００ｎｍ程度、蛍光計測波長６００ｎｍ程度での光を選択的に透過するバンドパスフィルタの組み合わせを用い、蛍光波長の光だけを選択的に透過するバンドパスフィルタ２０１を通過した蛍光像をカメラ２０１で計測する。このとき、細胞ネットワーク中での1細胞単位でのカルシウム放出の時間的前後関係を計測して細胞ネットワーク中での信号伝達の経路を計測する場合には、カメラの計測時間分解能は０．１ｍｓ以上の高速連続画像が取得できるものとなっている。ＸＹステージ１５上には基板１上に形成されている心筋毒性検査装置１００が載置されＸ−Ｙ駆動装置１６によって前記ＸＹステージ１５を移動させることで前記心筋毒性検査装置１００の任意の位置を観察し、計測することができる。前記心筋毒性検査装置１００内の細胞１０ｎの拍動の状態は、対物レンズ１７で観察される。対物レンズ１７の焦点位置はパソコンＰＣによる信号に応じて駆動装置１８によってＺ軸方向に移動させることができる。対物レンズ１７の倍率は４０倍以上のものが使用できる。対物レンズ１７で観察されるのは、光源２２から透過された光による細胞１０ｎの位相差像あるいは微分干渉像である。前記バンドパスフィルタ２３を透過するのと同波長の光を反射するダイクロイックミラー１９２およびバンドパスフィルタ２０によって、位相差顕微鏡像あるいは微分干渉顕微鏡像のみがカメラ２１によって観察される。カメラ２１によって観察された画像信号はパソコンＰＣに導入される。また、この実施例では細胞への刺激を行うための可動電極２７が配置されており、可動電極の座標がＸＹステージと同じ平面上の任意の位置のみならず、高さを任意に調節することができる位置制御機構が備わっている。この位置制御機構を用いて細胞ネットワーク中の特定の1細胞あるいは数細胞の位置に可動電極の先端を移動さ���ることで、任意の特定の細胞あるいは数細胞に刺激を与えることができる。可動電極の素材としては、先端部以外の部分は絶縁被覆されている金属電極、先端の開口サイズが５ミクロン程度以下のガラス電極等の、可動電極先端近傍にある特定の細胞あるいは数細胞のみに電気刺激を与えることができる構成の電極を用いることができる。金属電極を用いる場合は、先端部表面に白金黒などを付加することによって効果的に電気刺激を細胞に伝達することができる。可動電極の先端の位置は、電気刺激に対する細胞の応答の程度によって調整するものとし、細胞に接しても良いし、あるいは、細胞のごく近傍に配置しても良い。また、刺激電極の刺激を適切に標的とする特定の細胞に与えるために電気刺激を与える瞬間にスイッチングによって細胞電位計測のための電極２を接地電極として用いても良いし、あるいは、別途、別の接地電極２８を配置しても良い。さらに、特定の細胞を刺激するために、既存の微小電極２を刺激電極として用いても良い。その場合には、微小電極が接続されているスイッチング回路２９のスイッチングによって、通常は電気信号計測回路３０に接続されているものを、刺激を与える瞬間に、スイッチング切り替えによって、電気刺激回路３１に接続をして矩形波の刺激信号を微小電極２に与えることができる。また、上記可動電極２７を用いて刺激を与える瞬間には、スイッチング回路２９を接地にスイッチングすることができる。他方、可動電極も、刺激電極としてだけでなく、細胞の電気信号を計測する電極として用いたり、接地電極として用いることもできる。その場合は、可動電極はスイッチング回路２９１に接続されており、細胞電位計測、細胞刺激、接地電極としての利用に応じて、それぞれスイッチングによって、電気信号計測回路３０１に接続されて細胞電位を計測したり、電気刺激回路３１１に接続をして矩形波の刺激信号を細胞に与えたり、また、接地させることで、接地電極として用いることができる。電気刺激回路３１、３１１が細胞に与える電気刺激のタイミングは、おもに次の２つの用途で用いることができる。ひとつは自律拍動機能を持った細胞ネットワークにおいて、その正常な心筋細胞ネットワークの拍動インターバルの間に、イレギュラーな刺激を与えるものであり、他方は、自律拍動能を有さない心筋細胞ネットワークに対して拍動インターバルを与えるものである。ともに、計測するのは、拍動インターバルの周期（２つの拍動間の時間差）を５ｍｓ単位で徐々に短くしていったときの、細胞ネットワークの応答の変化を追跡できるものである。そのために、電気刺激回路３１、３１１は、電気信号計測回路３０、３０１などによって得られた拍動周期情報を解析して、その結果に基づいて刺激のタイミングを決定するフィードバック制御を行うことができる。さらに、可動電極２７を電気信号計測のために用いる場合、本システムにおいて微小電極２が無くても同様な計測ができることとなる。これは、システムに構成されている光学計測によって細胞ネットワーク中の各細胞の拍動周期の計測は可能であることから、この拍動周期が安定状態から不整脈などの不安定状態になることはシステムに配置されている光学計測装置のみで計測し、その結果か���必要に応じて、可動電極を用いて特定の細胞の電気的特性のデータを取得するものであり、この場合には、システム上に事前に配置している微小電極数の制約を受けず、光学計測できる範囲で、より自由に大きな細胞ネットワークを構築することができる。
【００３３】
図８に、細胞の電気信号の発生の一例について模式図で示した。最初に、細胞膜にあるナトリウムイオンチャンネルからのナトリウムイオンの細胞内への流入が発生し細胞電位が急激に下がり、次に、少しの遅延を経て、カルシウムイオンの流入による細胞電位の低下が起き、そして、次のステップとして、カリウムイオンの細胞外への排出が起きることで細胞電位の上昇が起きる。細胞電位の変化は、心筋細胞膜に存在する応答特性の異なるさまざまなイオンチャンネルの特性の違いによって引き起こされる。それぞれのイオンチャンネルに起因して引き起こされる電位変化のピークの位置を、各イオンチャンネルの特性時間として解析すると、薬剤の影響によって各イオンチャンネルがブロックされることで、その薬剤の特性に応じてブロックされたイオンチャンネルの種類に応じた電気信号の波形の変化を計測することができ、それによって薬剤のイオンチャンネルへの阻害効果を見積もることができる。薬剤の評価に特に重要なイオンチャンネルは、ＦａｓｔＮａ、ＳｌｏｗＮａ、Ｃａ、ＩＫｒ、ＩＫｓの４つのイオンチャンネルであり、これら4種類のイオンチャンネルのブロックの状態を計測することができる。
【００３４】
図９（ａ）は、図８で示した細胞の電気信号について、実際にカリウムイオンチャンネルを選択的に阻害する試薬Ｅ−４０３１を様々な濃度で添加したときの変化を示したものである。細胞の電位を上げるＫイオンの細胞外への排出機能を担うＩＫｒイオンチャンネルを阻害することから、薬剤濃度が高まるにつれて正方向の細胞電位の変化が徐々に遅延することが分かる。図９（ａ）に示したのは、細胞の応答の特定の1拍動データであるが、実際には隣接する各拍動での応答のゆらぎ幅の大きさが、薬剤の影響を見積もる重要な指標となる。図９（ｂ）がその一例であり、ポアンカレプロットと呼ばれる隣接する拍動データの相関を比較する解析手法である。ここでは、Ｘ軸にｎ回目の拍動時の特定のイオンチャンネルの応答時間の位置を、Ｙ軸に（ｎ＋１）回目の拍動時の同じイオンチャンネルの応答時間の位置を置いたプロットを行う。すると、隣接する拍動同士での特性が同じ場合は、グラフ内の点線で描かれたＹ＝Ｘ上にプロットが並ぶこととなるが、隣接する拍動同士での応答に大きな揺らぎがある場合は、Ｙ＝Ｘから離れた位置までの大きなプロットの分布が観測されることとなる。実際に、この例では、薬剤を添加しないControlに対して、４０ｎＭの添加では応答時間の遅延があるが、隣接した拍動間での相同性は維持されている。他方、４００ｎＭまで薬剤の添加をすると応答時間の更なる遅延に加えて、隣接した拍動間での相同性も崩れ、不安定な拍動周期が発生することとなることが本プロットによって明らかにできる。この結果は、心毒性を示すＱＴ延長計測の結果とも一致しており、ポアンカレプロットによって1細胞レベルでの隣接した各拍動のゆらぎの増大の計測を指標にすることでＱＴ延長の発生を見積もることができる。この現象は、特定のイオンチャンネルが薬剤によってブロックされたときに、そのブロックの程度が軽微な場合は、イオンの排出能力の低下という現象が見えるだけで細胞応答の不安定性はまだ発生しないのに対して、さらに、ブロックの程度が重度になると、機能しているイオンチャンネルの数が極端に減少して、そのために細胞のイオン排出能力について同じ細胞でありながら再現性の低い大きな揺らぎを持った結果が出てくることとなる。そして、このゆらぎの大きさがＱＴ延長の発生し易さの指標として用いることができるものである。
【００３５】
図１０（ａ）は、１細胞レベルでの細胞配置技術を用いた心筋細胞の環状ネットワークによるリエントリー回路薬剤の一例を示す模式図である。心筋細胞のみで細胞の環状ネットワークを作成したものは、正常ネットワークモデルとなり、心肥大などの病理モデルの場合には、細胞ネットワークの中に線維芽細胞を組み込むことで実現される。そして、ネットワーク中に混在する線維芽細胞が心筋細胞ネットワークの伝達速度の遅延や減衰をもたらし、その結果、期外収縮の発生を予測することができる。図１０（ｂ）は、実際に微小電極上に心筋細胞を配置した一例を示す顕微鏡写真である。実際に、この写真に示したように、１細胞単位で微小電極上に配置された場合は、隣接した心筋細胞同士の信号伝達の遅延を計測することができる。そして、この伝達速度は拍動のときに発生する最初の電気信号の大きさに依存することから、Ｎａイオンチャンネルへの阻害効果として、この信号伝達の遅延データを用いることができる。
【００３６】
図１１（ａ）は、一定の幅の細胞集団を用いて心筋細胞の環状ネットワークによるリエントリー回路の一例を示す模式図である。図１０に示した１細胞単位での環状細胞ネットワークでは、心筋細胞の拍動信号はその通過について一意的であり、図９に示したような細胞自体の拍動のゆらぎが無い限り、同一の特性を維持して細胞は拍動信号を隣接細胞間で伝達する。他方、この図１１で示したように、一定の幅で細胞を配置して環状ネットワークを形成した場合、細胞集団はその伝達について実線３５、破線３６、点線３７のように拍動ごとに異なる経路を取る自由度を持つこととなる。特に、図９で説明したように、薬剤の添加によって各心筋細胞の応答特性に大きなゆらぎが発生すると、容易に応答する細胞が環状ネットワークを刺激信号が周回するたびに、その都度異なることから、経路の違いがより顕著となる。これはスパイラル・リエントリーと呼ばれる心臓の致死に至る期外収縮の機構と同じメカニズムとなることから、このような幅を持った細胞集団ベースでの環状ネットワークを特に用いることでスパイラル・リエントリーの計測が可能となる。図１１（ｂ）は実際に微小電極上に細胞集団を配置した一例を示す顕微鏡写真であり、心筋細胞６０％程度に線維芽細胞４０％程度を混ぜた細胞集団を配置している。実際に、このような配置を行うと、隣接電極間での伝達速度の隣接拍動間でのゆらぎは大きくなり、特に薬剤の添加によって、そのゆらぎの増大が顕著となることから、隣接拍動間での伝達速度のゆらぎ幅の変化からスパイラル・リエントリーの発生を見積もることができる。図１１（ｃ）は、さらに実際に微小電極アレイ上に環状に細胞集団を配置した一例を示す顕微鏡写真である。実際のスパイラル・リエントリーの計測には、図７に示した高速蛍光計測カメラを用いることで、細胞集団ネットワーク中での各細胞のカルシウム発火を１細胞レベルで見積もることができ、その結果として細胞の信号伝達がどのような経路で進んでいるのか、各周回での経路の変化を実際に解析することができる。
【００３７】
図１２（ａ）は環状電極を用いたリエントリー回路計測装置の一例を示す模式図である。この例では、１〜３ｍｍの直径のリング状に形成した電極幅５０〜１００ミクロンの環状電極３８を各９６穴ウエルプレート４２の底面に１つ配置し、電極表面にのみ４１のように細胞集団が環状に配置されるように、電極上の除く周囲の底面については、表面にアガロース等の細胞接着性の無い素材をコートしている。この細胞が接着しないようにコートされた領域に、同心円状に参照電極リング３９が配置されており、また、試薬の出入りが行える流路４０が配置されている。このような電極を用いることで簡易に心筋細胞の異常拍動を簡便に計測することができる。図１２（ｂ）は実際に電極で計測した、正常拍動データと異常拍動データを示したグラフである。本実施例では、環状電極を用いたが、図７で示した光学計測システムを用いることで、本環状電極による効果と同じ、異常拍動を光学的に計測することができるシステムを構築することができる。その場合、電気的信号を計測する場合には、図７で示した移動電極を環状細胞ネットワークに接触させることで、電気信号も取得することができる。
【００３８】
図１３（ａ）は１細胞の電位計測を行う微小電極２と細胞の配置の一例を示す模式図であり、直径１０ミクロンから５０ミクロンの微小電極２上に、計測の対象となる細胞を１細胞だけ配置して計測する手法を示したものである。本実施例でも、他の実施例と同様、電極上の細胞がその場所に保持されるように電極周囲には、細胞接着性を阻害するアガロースなどの素材がコートされている。図１３（ｂ）は実際に微小電極２で計測した孤立１細胞の電極上の写真とその拍動電気データを示したものであるが、孤立した一細胞の信号は不安定でありグラフに示したように大きなゆらぎを持って拍動している。他方、図１３（ｃ）で示したように、微小電極２上には、図１３（ｂ）と同様に１細胞が配置されているが、他の細胞と連結された細胞集団となることで、拍動信号グラフを見てもわかるように、拍動周期の安定性が実現される。実際の１細胞レベルでの拍動計測では、図９でも示したように、隣接した各拍動間のゆらぎの大きさが指標となることから、本実施例で示したような、細胞集団化による安定化を実現しながら、１細胞の拍動データが取得できるように、特定の計測したい１細胞のみ微小電極上に配置され、この特定細胞の安定性を維持するために他の心筋細胞を電極上には載らない形で配置されている構成を用いた計測システムが有用である。
【００３９】
図１４は、本発明でカメラ受光素子を１細胞の電位計測に用いた実施例を説明する模式図である。通常、カメラ受光素子は、光電変換面で光信号を電気信号に変換して、この電気信号を計測に用いるものであることから、この光電面を除去して、電気信号アレイ部分を用いることで、２次元での電気信号を取得することが可能となる。これによって、１細胞レベルでのサイズの電極アレイを用いることができるため、例えば細胞集団の中の各細胞の電気信号を同時に計測することが必要な、図１１で示した一定の幅を持つ細胞集団ネットワーク中での信号伝達経路の変化というスパイラル・リエントリーの発生を計測することが可能となる。実際の計測では、画素の計測インターバルは１万分の１秒程度必要であり、１万分の１秒のシャッタースピードの高速カメラのカメラ受光素子を利用する必要がある。この場合、取得された細胞の信号データは、既存のカメラで用いられている画像処理技術をそのまま適用することができ、画像処理用のFPGAを用いた実時間処理が可能となる。また、その実時間処理によって得られたデータに基づいて刺激電極へのフィードバック刺激を行うことも可能となる。
【００４０】
図１５は、本発明の細胞計測システムで複数試料を計測できる機構の一例を説明する模式図である。この実施例のシステムは、分析モジュール、多段インキュベーター、電気解析モジュールとオンラインネットワークで接続されたオンライン解析モジュールとからなる。ここで、分析モジュールには、細胞形状の変化を計測する位相差顕微鏡あるいは微分干渉顕微鏡、そして蛍光顕微鏡とカメラ撮影解析による光学的計測、アガロースを顕微鏡システムを利用してミクロンのスケールで局所溶解できるアガロース加工技術からなっている。多段インキュベーターには、複数の細胞培養槽が配置されており、また、細胞培養槽の中には微小電極チップが配置されており、各細胞の電気信号の計測、電気的刺激がインキュベーター中で並列で連続処理できるようになっている。得られた電気信号については、電気解析モジュールで実時間計測を行い、そのデータはオンラインアクセスが可能なストレージに、光学計測のデータと電気計測データの結果が同じ時間スタンプを持った形で記録されており、この記録データにオンラインで解析モジュールが適宜アクセスすることで解析することができる。
【００４１】
図１６は、本発明の細胞計測システムで計測できる心臓情報を説明する模式図である。微小電極上での１細胞の電気信号計測によって、Na、Ca、IKｒ、IKｓなどのイオンチャンネルの信号データを計測することができ、隣接する心筋細胞間での信号伝達の速度変化の計測からNaイオンチャンネルの阻害を計測することができる。また、１細胞の形状変化の光学計測によって不整脈の発生の計測および心臓の拍出量の見積もりができる。さらに、環状に細胞ネットワークを配置することによってリエントリーの発生を計測することができ、さらに線維芽細胞を細胞配置に加えることで心肥大などの病理心臓モデルとしての計測がすることができる。
【００４２】
図１７は、本発明の細胞計測システムにおいて、自律拍動している心筋細胞から取得される細胞のフィールド・ポテンシャル（FP）信号波形の薬剤添加に対する変化の一例を例示するグラフである。細胞のフィールド・ポテンシャル信号波形は、図８に示したように細胞に流入するイオン、流出するイオンによって発生する細胞電位の変化を示すものであり、細胞電位の微分値、すなわち単位時間当たりのイオン電流の流れの総和であり、この場合、脱分極に至るプロセスでのナトリウムやカルシウムなどの内向きイオン電流が負に、それに続く再分極プロセスでのカリウムなどの外向きイオン電流が正に取られている。通常、この細胞のFP信号波形については、この図17に示すように隣接する各拍動についての相互の違いに着目するより、複数の隣接する波形を平均化してノイズ成分や隣接した各波形の違いなどの影響を排除した平均値としての１つのFP波形を抽出し、その平均値を反映した１波形の詳細解析によって各イオンチャンネルの状態を見積もるために用いている。しかし、本発明では、隣接するFP信号波形の平均値を取得するのではなく、隣接するFP信号波形の違いのうちイオンチャンネルの応答のゆらぎに依存する部分を比較抽出して、このゆらぎの大きさに基づいてイオンチャンネルのブロックされた量を定量的に推定するものである。これについては、一般にゆらぎの大きさが要素ｎの平方根の逆数[１／(ｎ）1/2］で示されることから、その意味を理解することができる。すなわち、細胞表面にあるイオンチャンネルの数が、例えば104個機能している場合には、イオンチャンネルの総和としての機能のゆらぎの大きさは１％[１／(104）1/2］となるが、薬剤によってブロックされることで102個まで機能しているイオンチャンネルが減少すれば、その機能のゆらぎの大きさは１０％[１／(102）1/2］と急激に増加し、隣接するFP波形は大きな変化を発生させることとなる。すなわち、隣接するFP波形の変化を比較してゆらぎの大きさを見積もることができれば、このゆらぎの大きさからブロックされたイオンチャンネルの総量を見積もることができるのである。
【００４３】
この隣接する波形の変化について、特にカリウムイオンの放出によって発生する外向きイオン電流のピークの場所に着目し、例えばナトリウムイオンの細胞内への流入時間を基準（ゼロ）とし、その時間からカリウムイオンの放出のピークまでの時間をフィールド・ポテンシャル・デュレーション（ＦＰＤ）として定義すると、このＦＰＤの長さの変化は、ナトリウム、カルシュウム等のイオンの出入りに続くカリウムイオンの流入のピークの値となるため、細胞が持っているさまざまなイオンチャンネルが薬剤によってブロックされたことで発生するイオンの出入りの変化の総和としての変化量の指標として着目することができ、また、このＦＰＤの位置のゆらぎは、すべての関係する細胞のイオンチャンネルの隣接するＦＰ波形のゆらぎの総和を反映したものとなる。実際に、図１７のＦＰＤの位置（赤矢頭の位置）を確認すると、カリウムイオンチャンネル阻害剤であるＥ４０３１の添加によってＦＰＤは添加前には425-450msの間であったものが、10nMの添加で642-645ms、100nMの添加で663-694ms、1μMの添加で746-785msというように阻害剤の添加によって単調にＦＰＤの値は増加してゆき、また、隣接するＦＰＤは同じ値ではなく、ゆらぎを反映した異なる値を取ることとなる。
【００４４】
図１８は、実際にカリウムイオンチャンネルを特異的に阻害する機能を持つ薬剤Ｅ４０３１によって細胞のカリウムイオンチャンネルが阻害されたときのＦＰＤの延長についてＥ４０３１濃度依存の実験結果の一例を示したものである。ここでは、カリウムイオンチャンネルの阻害によってイオンの流出が遅延し、ＦＰＤが濃度依存的に延長することが推測できる。この実験結果について、同様に上記ゆらぎ計測をする場合を考える。
【００４５】
図１９は一般に心電図の拍動ゆらぎを計測するポワンカレプロッティングを、ＦＰ波形におけるＦＰＤの値の評価に用いてＦＰＤのゆらぎに着目した場合の、隣接した拍動のＦＰＤがどの程度、相同状態からずれたかを見積もる手法の着目点のうち、隣接する拍動の揺らぎの大きさ（短期変動：STV:Short-term variability）の見積もり方を説明するものである。図１９（ａ）において、Ｘ＝Ｙとなる対角線は、隣接した拍動ＦＰＤｎとＦＰＤｎ+1がまったく同じＦＰＤの大きさを持つ場合に位置するものとなり、２つのＦＰＤの差（ＦＰＤｎ+1−ＦＰＤｎ）の大きさの対角線からの鉛直距離が基準化された隣接拍動自体のゆらぎの大きさとなり、特にｋ個のサンプリング数に対しては、図１９(ｂ)に示す（式１）のような数式で評価することができる。
【００４６】
他方、図２０はポワンカレプロッティングを用いてＦＰＤのゆらぎに着目した場合の、隣接した拍動のＦＰＤがどの程度、相同状態からずれたかを見積もる手法の着目点のうち、隣接した各拍動が拍動の平均値（すべてのサンプルの総和でイオンチャンネルの応答の理想値に相当）からどれだけずれているかという観点での拍動の揺らぎの大きさ（長期変動：LTV:Long-term variability）の見積もり方を説明するものである。図２０（ａ）において、Ｘ＝Ｙとなる対角線上に配置されたＦＰＤの平均値ＦＰＤmeanと隣接した拍動ＦＰＤｎとＦＰＤｎ+1それぞれとの距離の２つのＦＰＤの差［（ＦＰＤｎ+1−ＦＰＤmean）＋（ＦＰＤｎ−ＦＰＤmean）］の大きさの対角線からの鉛直距離が基準化されたものでＦＰＤの平均値からのゆらぎの大きさとなり、特にｋ個のサンプリング数に対しては図２０（ｂ）の（式２）のような数式で評価することができる。これはＸ＝−Ｙの対称性からのずれを示しており、この大きさによって拍動が単なる平均値まわりのゆらぎを行っているのか、あるいは、履歴を持っているものかを見出す指標とすることができる。
【００４７】
図２１には、実際にＥ４０３１を段階的に添加したときの心筋細胞の応答の一例をポワンカレプロッティングで示したＦＰＤのゆらぎと、そのゆらぎを定量的にＳＴＶとしてまとめたものである。イオンチャンネルがＥ４０３１の添加に応じてブロックされてゆくことがＦＰＤの時間の長さの延長によって推定されるとともに、特に高濃度の添加によって急激にＳＴＶの値が増加することがわかる。
【００４８】
図２２は、Ｘ軸に従来のＱＴ延長計測に当たるＦＰＤの延長が心筋細胞を用いて観察された割合（％）を、Ｙ軸にはＳＴＶの増加が観察された割合（％）を取り、心毒性があることが知られている薬剤、心毒性が無いことが知られている薬剤について評価を行ったものである。従来の薬剤の毒性検査については、Ｘ軸にあるＦＰＤのデータの結果のみによって評価していたが、Ｙ軸にあるＳＴＶの結果を加えて評価を行うと、図からもわかるように２次元のグラフ上のマッピングの中で、心毒性が高い高リスク(High risk)、リスクが低い（Low risk）、リスクなし（No risk）の３つの領域の中に、既知の文献結果と同じ分布をすることがわかる。このことから従来のＦＰＤに加えてＳＴＶを加えることで薬剤の心毒性の可能性についてより的確にかつ容易に推測を行うことが可能となることがわかる。
【００４９】
図２３は薬剤の添加に対するＦＰＤについてのＳＴＶの応答の違いを示したものである。図２３（ａ）では、その一例として環状に心筋細胞ネットワークを構築した場合の局所のＦＰＤのポワンカレプロッティング（Ａ，Ｂ）、ならびに2次元に拡がった心筋シートを構築してその局所のポワンカレプロッティング（Ｃ，Ｄ）を計測した結果を（ｂ）に示す。この例ではペーメーカー領域ＰＭからＢ，Ｄは近傍、Ａ，Ｃは遠方に位置している。（ｂ）において薬剤添加前には、ポワンカレプロッティングのＸ＝Ｙの対角線上に分布していたＦＰＤは、低容量の心毒性薬剤添加によって、環状モデル（Ａ，Ｂ）ではともに大きなゆらぎが発生しＳＴＶの増加が観察されるが、2次元シートモデル（Ｃ，Ｄ）ではほとんどゆらぎが発生しない。また中容量の薬剤添加に対しては、環状モデル（Ａ，Ｂ）では拍動が細動状態あるいは停止状態に移行するが、2次元シートモデル（Ｃ，Ｄ）ではＰＭから遠方の領域ＣでＳＴＶの増加が見られるが、近傍の領域Ｄでは、まだＳＴＶの増加量は領域Ｃより低いことが観察される。この例でもわかるようにＦＰＤのＳＴＶ計測による薬物の心毒性の予測に対しては2次元シート状の細胞集団（ネットワーク）より、ペースメーカー領域から線状に配置された細胞集団（ネットワーク）が、より正確に薬物の影響を反映させることがわかる。
【００５０】
図２４は薬剤の添加に対するＰＭ領域からの拍動刺激の伝達速度（Ｖ）についてのＳＴＶの応答の違いを示したものである。これは、心毒性としておこるトルサードポワンツ（ＴｄＰ）は心筋細胞組織での伝達異常であることから、実際にＰＭ領域からの伝達速度がどの程度のゆらぎとして発生するかを確認することで薬物毒性を見積もる手法である。この場合にはＳＴＶの定義については図２４（ｃ）の（式３）に示したように、ＦＰＤに変わって、ＰＭ領域からの伝達時間Ｔ（あるいはＰＭからの距離をこの伝達時間で割った、その観測点での見かけ上の伝達速度Ｖ）を用いて計測することとなる。ＬＴＶについても定義はＳＴＶと同様にＦＰＤを、ＴあるいはＶに変更したものとなる。図２４（ａ）では、その一例として環状に心筋細胞ネットワークを構築した場合の局所の伝達時間Ｔのポワンカレプロッティング（Ａ，Ｂ）、ならびに2次元に拡がった心筋シートを構築してその局所のポワンカレプロッティング（Ｃ，Ｄ）を計測した結果を図２４（ｂ）に示す。この例でも図２３と同じくペーメーカー領域ＰＭからＢ，Ｄは近傍、Ａ，Ｃは遠方に位置している。図２４（ｂ）において薬剤添加前には、ポワンカレプロッティングのＸ＝Ｙの対角線上に分布していたＦＰＤは、低容量の心毒性薬剤添加によって、環状モデル（Ａ，Ｂ）ではともに大きなゆらぎが発生し伝達時間の大きなゆらぎを示すＳＴＶの増加が観察されるが、2次元シートモデル（Ｃ，Ｄ）ではほとんどゆらぎが発生しない。また中容量の薬剤添加に対しては、環状モデル（Ａ，Ｂ）では拍動が細動状態あるいは停止状態に移行するが、2次元シートモデル（Ｃ，Ｄ）ではＰＭから遠方の領域ＣでＳＴＶの増加が見られるが、近傍の領域Ｄでは、まだＳＴＶの増加量は領域Ｃより低いことが観察される。この例でもわかるように伝達時間Ｔ（あるいは各局所での見かけの伝達速度Ｖ）のＳＴＶ計測による薬物の心毒性の予測に対しては2次元シート状の細胞集団（ネットワーク）より、ペースメーカー領域から線状に配置された細胞集団（ネットワーク）が、より正確に薬物の影響を反映させることがわかると同時に、より効果的に空間配置依存的なゆらぎの発生を計測できることがわかる。
【００５１】
図２５は、本発明の心筋細胞ネットワークで各心筋細胞から電気的FP波形を取得するときの、そのFP波形と従来のin vitro計測技術（例えばパッチクランプ法）、従来のin vivo計測技術（例えば心電図）との関係を模式的に図示したものである。本発明の細胞のFP計測で得られた波形は、細胞から出入りする単位時間当たりのイオン流の大きさを示すものであり、細胞の電位変化情報（電気的にはイオン電流）となり、これは、従来の細胞ベースでのin vitro計測で得られる細胞電位とは、図２５に描いているように微分・積分の関係となる。次に、各細胞（あるいは細胞ネットワークの局所）から得られた１電極から計測したFP波形を、細胞ネットワークの複数の領域に配置した複数の電極から得られた各々のFP波形を重ね合わせることで細胞ネットワークの合成FP波形を得ることができるが、これは心臓から得られる電位変化信号波形である心電図のうち心室組織部分の応答にあたるQT領域の心電図データと相同性を持っているものである。
【００５２】
図２６は、上記、図２５で説明を行った従来の技術で計測した情報と、本発明の装置で得られたＦＰデータとの相関関係を見積もるための装置システムの構成を模式的に示したものである。1細胞あるいは細胞ネットワーク上の局所のＦＰを計測できるように配置された複数の微小電極から１電極単位で取得したFPデータを集積し、その各ＦＰデータを微分して細胞電位を見積もることができる機能を有する演算回路、あるいは、各電極データを重ね合わせることによって、心電図の心室部分の心電図波形（Ｑ−Ｔ部分）との比較ができる演算回路を有するものである。特に、重ね合わせ回路を用いて単一の電極のＦＰデータを解析するだけでなく、例えば直列に配置された細胞ネットワーク上に等間隔で配置された複数の微小電極アレイのデータを合成することは、各電極上の細胞のＦＰの結果のみならず細胞間を伝達する状態を反映したデータを表示することとなり、特に、心筋細胞間の伝達異常である不整脈を見積もる上では、伝達の異常が合成ＦＰ波形に反映されることから、この重ね合わせ回路の結果を期外収縮発生の直接予測機構に情報を移動させて、この結果から心電図解析と同様な予測が可能である。他方の微分回路から得られる細胞電位データについても細胞電位依存的に活性化状態が異なるイオンチャンネルの状態を見積もるために用いられる。
【００５３】
図２７および図２８は、実際に上記図２６で述べた演算回路によって各電極からのＦＰデータを重ね合わせた例を示したものである。図２７では、図２７（Ａ）に示したように心筋細胞ネットワークが環状に配置されており、そのネットワークに沿って一定間隔で微小電極が配置されている。ペースメーカー（ＰＭ）領域が電極Ｒ１の位置にある環状心筋細胞ネットワークにおいて拍動シグナルがＲ２→Ｒ８、あるいはＬ１→Ｌ８に伝達するところが図２７（Ｂ）の各電極のＦＰ波形で見ることができる。そしてこれを重ね合わせた波形が下Sの波形となる。図２７（Ｃ）は、実際に長期で計測して合成した結果である。これが実際の心電図のＱＴ領域の波形を推定するために必要な、ＦＰの伝達情報が含まれた合成ＦＰ波形となる。この図からもわかるようにＰＭ領域から正常に拍動シグナルが伝達する場合には、図２７（Ｃ）からもわかるように合成波形もなめらかな波形となる。他方、図２８は図２８（Ｂ）からもわかるようにＰＭ領域からの拍動シグナルが規則正しく伝達しなくなる不整脈状態になると、合成ＦＰとなるＳも非常に乱れた波形となり、心電図に相当する図２８（Ｃ）でも不整脈と同様な形状の波形が合成ＦＰ波形としてみることができる。ここで特記すべきことは、図２８（Ｂ）の各微小電極の１電極データのみから不整脈を予測する場合には、観測する電極によっては（例えばＬ５）顕著な不整脈の発生を予測することは難しく、図２８（Ｂ）Ｓあるいは図２８（Ｃ）に見られるように合成ＦＰ波形とすることでより的確に予測することが可能となることがわかる。
【００５４】
図２９は、心筋細胞の拍動周期に対するＦＰＤの大きさの関係を示したものである。黒丸は、いろいろな自律拍動を持つ心筋細胞でのＦＰＤを本発明の装置システムで計測した結果である。この結果からもわかるように、細胞はその拍動周期に依存してＦＰＤの値を変化させることがわかる。これは自律拍動を用いた心筋細胞による計測を行った場合に、薬剤によって細胞の拍動周期が変化したり拍動停止したり、あるいは不安定化したときに、この副作用によって本来のイオンチャンネルのブロックではない原因によってＦＰＤが変化する可能性があることを示唆している。また、赤×印は強制拍動によって細胞の拍動周期を強制的に変化させたときのＦＰＤの値を示しており、外部からの連続刺激によって一定時間以上、一定の拍動周期を維持すれば、安定したＦＰＤとなることがわかる。
【００５５】
図３０は、実際に自律拍動をしている心筋細胞に本発明のシステムを用いて外部から強制拍動刺激を与えたときの心筋細胞のＦＰＤの時間変化の一例を示したものである。この例でもわかるように、自律拍動インターバルが4秒程度であった細胞が１Ｈｚの強制拍動刺激を与えると直後からＦＰＤの値が大きく変化し、刺激開始後およそ３０秒ほどで550msの位置で安定化することがわかる。また強制拍動刺激終了後においても異なる自律拍動周期を持ち、また、ＦＰＤが徐々に長くなってゆくことも見ることができる。これらの結果からもわかるように、強制拍動刺激を与え始めてからＦＰＤが安定化するまでの刺激開始後30秒後以降に、薬物毒性検査をすることが望ましい。
【００５６】
図３１は、実際に本発明のシステムを用いて外部から強制拍動刺激を与えてＦＰＤ、あるいは伝達時間Ｔ、あるいは伝達速度Ｖを計測する場合の細胞配置の例を示すものである。図３１（ａ）は、少なくとも２つの微小電極を覆うように配置された細胞集団を用いた刺激計測の例である。刺激電極から例えば毎分６０拍の一定のインターバルの強制刺激信号を与えながら隣接する計測電極で細胞のＦＰＤ、あるいは刺激電極の刺激時間から計測電極上の細胞までの拍動信号の伝達時間Ｔ，あるいは計測電極上の細胞までの伝達速度Ｖを計測するものである。図３１（ｂ）は、直線状に配置された心筋細胞ネットワークの端点に配置した刺激微小電極によって強制刺激拍動を与え、この伝達について、一定の間隔で心筋細胞ネットワークに沿って配置された微小電極アレイによって、各電極上の心筋細胞のＦＰＤ，Ｔ，Ｖを計測し、刺激電極の刺激信号に対する各電極のデータのみならず、各記録電極のＦＰの合成ＦＰによる不整脈発生の予測、各電極間でのＴとＶの関係などについて見積もることができる。ただし、ここで示したのはあくまでも細胞配置の一例であり、上記、図２７で示した環状細胞ネットワークのＰＭ領域に強制拍動を与えて同様の計測をすることもできるし、あるいは、刺激電極上の細胞をこの刺激電極を計測電極として用いることで、最小細胞数でのＦＰＤの計測をおこなうことも可能である。
【００５７】
またここまでのすべての実施例について、心筋細胞ネットワークについては一部心筋のみについて言及したが、繊維芽細胞を生体組織と同様な性質となるように添加することが含まれるものである。
【００５８】
図３２は、微小電極２上に配置された細胞のＦＰ計測を行うために、電極２の電位を一定に保つ電位クランプ型のフィードバック制御機構を用いることができる。ここでは、細胞のＦＰは、従来の電極からの信号を増幅して計測するのではなく、電極２の電位を保つために外部の電源から供給される電流をモニターして、この結果を実時間で解析することで見積もるものである。これによって従来のたときの心筋細胞のＦＰＤの時間変化の一例を示したものである。ここで一定に保つ電位としては、通常はゼロを選ぶが、脱分極電位を変化させるなどの細胞状態を変化される場合には、電位を異なるものに調整することも可能である。
【００５９】
図３３は、実際にヒトＥＳ細胞から心筋細胞に分化させた細胞集団の一部領域に上記記載の本発明のシステムを用いて強制拍動刺激を与えた時の、細胞集団の拍動周期の変化を計測した結果の一例のグラフである。このグラフからもわかるように、正常な心筋細胞集団では、この例のようにたとえば０．６Ｈｚから１．８Ｈｚの強制刺激を与えた時に、この範囲のすべてにおいて線形に、強制刺激に応答して拍動が追従することがわかる。
【００６０】
図３４（ａ）は、実際に強制拍動刺激を与えたところで細胞集団の拍動がその強制拍動刺激のインターバルと同じ周期になることから、この強制拍動刺激状態での心筋細胞集団のＦＰの波形の変化とＦＰＤの長さの変化を示したものである。グラフからもわかるように、強制拍動刺激インターバルを早くすることでＦＰ波形が変化し、ＦＰＤの長さが短くなることがわかる。そこで図３４（ｂ）に示したように、このＦＰＤの変化をグラフで示すと、この短縮が、強制拍動インターバルの周期（ＲＲ）に依存することから、この補正
関係について、既知のヒト心臓においてのＱＴインターバルの長さと心拍との関係の研究（Patrick Davey, How to correct the QT interval for the effects of heart rate in clinical studies. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods 48 (2002) 3 - 9）からFredericiaの補正、すなわち拍動の速さの違いによってＱＴの長さが変化してしまい相対比較できないことから、拍動周期が毎分６０拍の心筋拍動時のＱＴの長さ（ＱＴＣ）に補正するためにＱＴＣ＝ＱＴ／（ＲＲ）1/3として換算するもの、あるいは、Bazettが提唱したＱＴＣ＝ＱＴ／（ＲＲ）1/2として換算するものに一致するかどうかが重要となる。これは、上に説明したようにin vivoでのＱＴの長さは、本システムで計測する細胞ネットワーク全体で計測したＦＰＤの長さの重ね合わせに相当し、それは、すなわち各細胞のＦＰＤ自体が、上記、FredericiaあるいはBazettの補正の範疇に入るべきであることを示唆しているが、実際に、図３４（ｂ）の結果は、ＱＴＣ＝ＱＴ／（ＲＲ）1/2.5 となっており、FredericiaあるいはBazettの補正の間にあることがわかる。また、図３５は図３３および図３４のグラフに示したデータを表にしたものである。
【００６１】
これらの結果は、実際にスクリーニングや再生医療で使用する心筋細胞の品質の確認に、心筋細胞に対して強制拍動刺激を与えたときの心筋細胞の応答を計測することで対応できることを示している。すなわち
１）心筋細胞あるいは心筋細胞集団に対して強制拍動刺激を与え、細胞あるいは細胞集団がその強制拍動刺激に応答して強制拍動刺激と同じインターバルで応答するかどうかを確認し、かつ、その応答がどの強制拍動刺激の周波数の範囲で対応するかどうかを計測し、拍動が追従できることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること、あるいはさらに具体的に、この応答の追従がたとえば少なくても１．８Ｈｚまで追従することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること。
２）上記、強制拍動刺激インターバル（ＲＲ）に対して細胞の拍動の追従が確認できた周波数の範疇で、強制拍動刺激に対するＦＰＤの変化が、ＦＰＤ／（ＲＲ）1/3からＦＰＤ／（ＲＲ）1/2の間にあることを確認することで健全な心筋細胞である十分条件の一つを満たしていると判断すること。
【００６２】
上記手順を用いることで、心筋細胞の品質の管理が可能となる。健全な心筋細胞とは、安定した拍動を行うことが可能な細胞である。ここで評価対象となる細胞集団については、分化誘導を行った細胞集団をそのまま用いても良いし、あるいは、分化誘導を行った心筋細胞を分散し１細胞単位で計測評価しても良いし、あるいは、これら分散した心筋細胞を再度細胞集団化して計測しても良いし、あるいは、これら分散した心筋細胞をヒト心臓由来の線維芽細胞と混合して新たな細胞集団として計測評価しても良い。
これらの心筋細胞は、心筋毒性検査に使用することができる。
【００６３】
図３６は、本発明の一実施形態に係る心筋毒性検査装置（または心筋毒性検査装置システム）の例示的な全体構成を示すブロック図である。本発明の心筋毒性検査装置３０００は、基本的には、測定部３００１および制御・解析部３００２から構成される。測定部３００１と制御・解析部３００２（例：パソコン）との間に、測定部３００１からの電気信号を増幅する増幅器３００４、増幅器３００４からのアナログ信号をデジタル信号に変換するアナログデジタル変換器（ＡＤＣ）３００３が介在する。インターフェース用パソコン３００２は、ＡＤＣからの信号を受けて記録・解析・表示等を行う。測定部３００１は、基本的には、複数の微小電極を含む多電極アレイを備えた培養容器、それを載置するｘ−ｙステージ、光学顕微鏡、レーザー光源、光学カメラ等の光学系を備える。複数の微小電極を含む多電極アレイを備えた培養容器は、微細加工技術により作製することもできるが、市販のもの（例：MED-P515A、アルファメッドサイエンティフィック社、日本）を使用してもよい。
【００６４】
図３７Ａは、本発明の心筋毒性検査装置システム３０００のコアである測定部３００１の拡大図である。図３７Ｂは、本発明のシステムにおいて使用される多電極アレイを備えた多電極チップ（または培養容器）の拡大図である。図３７Ｃは、その電極部分をさらに拡大した図である。複数の微小電極がアレイ状に配置され、それぞれの微小電極に引き出し線（またはリード線）が繋がっており、さらにその上にヒトＥＳ細胞由来の心筋クラスターが載置されているのが確認できる。
【００６５】
図３８は、多電極アレイチップ（図３８ａ，ｂ，ｄ）を用いて心筋細胞（図３８ｂ）に対する薬物の毒性評価を行う際の、チップの電極と測定ウインドウとの対応関係（図３８ａ〜ｃ）および分析に用いるデータの表示例（図３８ｅ）を示す図である。
【００６６】
以下、本発明の心筋毒性検査装置を用いて薬物の心筋毒性検査を行う一例について説明する。
材料と方法
１．細胞培養
ヒトES細胞由来心筋クラスターはセラーティス社から購入した。生状態で受け取り、ガラスキャピラリー（Vitrolife社）を使って回収し、DMEMに20%非動化FBS、1%非必須アミノ酸、1%ペニシリンストレプトマイシン、0.2%ベータメルカプトエタノールを加えた培地中で培養した（全てInvitrogen社より購入）。
【００６７】
２．多電極チップの用意(Day 0-3)
次に、回収したクラスターを多電極チップ（アルファメッドサイエンティフィック社）に配置した。配置した日をDay 0とした。Day3に200 mV以上の細胞外電位 (FP)の1stピークが得られたクラスターをデータ取得に使用した。データ取得には多電極細胞電位計測システム（日京テクノス社）を使用した。
【００６８】
３．薬剤適用(Day 4以降)
薬剤適用前に対象データ（’Before’と呼ぶ）を10分間取得した。薬剤は脱イオン化蒸留水(DDW)、またはDMSOに溶解し、PBSで希釈して適用した。最終濃度はE-4031は0.1 μM 及び 1μM、DL-sotalolは0.1 mM 及び 1 mM、Diltiazemは0.1 mM 及び 1 mMで適用した。取得したデータから細胞外電位持続時間 (FPD)とFPDのSTV (short term variability)を算出した。
【００６９】
４．データ解析
FPの下向きの急峻なピークはNa+流入に相当する。上向きの緩やかなピークはK+の流出に相当する。Na+とK+ピーク間の時間をFPDとした。さらに、FPDの拍動間のバラツキをFPDのSTVとして評価した。STVは以下の式で求めた。
2012043820.tif 000003
FPD間のばらつきの増加はSTVの値の増加として評価できる。拍動レートのばらつきによるFPDへの影響を抑えるため、下のFredericiaの補正式を用いて、FPDとFPDのSTVを補正し、cFPD、cSTVを得た。
2012043820.tif 000004
(RR は FPの直前のNa+ピーク間の時間)
【００７０】
５．２次元プロットの作成手順
薬物の心毒性リスクを評価するため、QT延長やAPDの延長、及びこれらのSTVが単独で利用されている。FPD延長とSTV増加を統合して評価するため、我々は「2次元プロット」を開発した。X軸はFPDがBeforeより10%以上延長したクラスターの頻度(FPDスコア)を表す。Y軸はSTVがBeforeより100%以上増加したクラスターの頻度（STVスコア）を表す。それぞれのクラスターで適用２濃度のうち、いずれかで上記の増加が認められた場合、「延長した（FPD）」「増加した（STV）」とした。このプロットでは、薬物の心毒性の強度に依存した領域に薬物がプロットされる。
【００７１】
６．結果
2次元プロット
図３９は評価した薬物の2次元プロットである。E-4031とDL-sotalolは図の右上にプロットされた。Diltiazemは左上に、DDWは右下にプロットされた。E-4031及びDL-sotalolはIKr阻害剤で、APDとSTVを増加させることがin vivo、in vitro両方で知られている。E-4031は心毒性のリスクが高い理由で開発が中断した薬物であり、心毒性が高い薬物である。DL-sotalolは抗不整脈薬だが、致死性不整脈のリスクが無視できないことから心毒性は高いと考えられる。DiltiazemはCa2+チャネル阻害剤で、APDはin vivoで減少することが知られており、心毒性リスクは低いと考えられている。DDWは心毒性無し、と考えられた。従って、我々の得たプロットでは、図中右上は「心毒性が高い」領域であり、左上および右下は「心毒性が低い」領域と判断した。未知の薬物を本評価法で評価したときに２次元プロットのどの領域にプロットされたかにより、心毒性の高低を評価できる。
【００７２】
図４０（ａ）は、細胞信号のノイズを電子回路的に低減するために、と細胞１０が載っている微小電極２の近傍に細胞が載っていないむき出しの比較電極２cの間の電位の差分値を出力する回路を模式的に示したものである。実際に、この回路を図４０（b）に示すように、増幅回路の初段に組み込むことで、図４０（c）に示したようにノイズが特定の周波数に依存せず低減されることが分かる。このとき、比較電極２cの微小電極に対する位置はより近傍であることが望ましく、たとえば５０μmの距離に配置されているものは十分な機能を果たすが１ｍｍの距離までノイズ低減の機能をもたらすことができる。
【００７３】
図４１は、本発明の心毒性評価の総合的評価法の例を模式的に示した図である。特定の濃度の薬剤を添加した後の心筋細胞の細胞電位計測の結果から得られたFPDの値について、まずFPD延長の程度の集計結果をX軸上の値とし、さらに上述のFPDの時間的ゆらぎの大きさをポワンカレプロッティングからSTVとしてY軸上の値とし、この結果をプロットする。図４１（b）は、様々な薬剤についてその結果X-Y図にプロットしたものの一例である。図からわかるように、FPDの延長とゆらぎ（STV）の増大が小さい領域にある薬剤は、QT延長はあるが心毒性は無いと判断でき、FPDの延長とゆらぎ（STV）の増大が同時に起こる場合（X-Y図面で右上）にTdPなどの心毒性があることを予測することができる。
【００７４】
図４２は、実際に心毒性を計測するためのシステムの構成の一例を示した模式図である。この実施例のシステムは、送液部、細胞培養計測部、細胞解析・刺激部からなっている。
【００７５】
送液部は、細胞培養計測部の中で培養している各細胞培養チャンバーに培養溶液を連続して送液するシリンジポンプ系あるいはペリスタポンプ系あるいはHPLCポンプ系によって送液することができる。また、送液部の配管の外周には温度調整用の抵抗加熱用配線を巻き付け管内の液温を微小K型熱電対やサーミスタ等の熱検知機構で連続モニターすることで、導入する液温を制御する抵抗加熱の程度を調整して、つねに一定の温度での溶液が導入されるようになっている。また、この送液部には、試験する薬剤を添加するために合流配管や切り替え配管などの機構が配管中に配置されており、これによって希望する濃度の薬剤を各細胞培養チャンバーに導入することができる。また、導入される薬液の濃度を定量的に確認するために、液の導入管の一部が光学的に透明であり波長２８０nmから８００nmの範囲で吸光分光計測によって、定量的な評価が可能な機構が付加されていることが望ましい。また、同様に廃液についても廃液管の一部が光学的に透明であり波長２８０nmから８００nmの範囲で吸光分光計測によって、定量的な評価が可能な機構が付加されていることが望ましい。また薬液の制御温度としては、人体の正常温度に近い温度が通常望ましく、その観点からセ氏３０度から４５度の範囲での温度制御ができることが望ましい。
【００７６】
図４３は、本発明の心毒性を計測するシステム中の細胞培養計測チャンバーの構成の一例を示す模式図と写真である。複数の細胞電位計測電極が配置された多電極基板４２０１（図４４を参照）は、培養液の導入機構・排出機構が配置された細胞培養容器４２０２が接着しており、同時に８検体の計測が可能な細胞培養計測プレートとなっている。図４４に細胞培養計測プレートの断面を模式的に示しているように、この細胞培養容器４２０２において、溶液の導入口は、多電極基板４２０１に一番近い底面に扇状に広がる形状で配置されており、他方、液の排出機構は、上部の液面の高さ４２０４を決める位置に液面の界面の方向と同じ向きに扇状に展開している。
【００７７】
図４５は、多電極基板に配置されている電極配置の電極配線の構成を模式的に説明する図である。本発明では、細胞の形状を観察するために、電極にITOなどの透明電極を用いているが、透明電極の特性として通常の金属電極に比べて高い抵抗値を持っているため、特に多電極基板がプレートなどの大きなものとなると、配線が長くなりインピーダンスが非常に大きくなる。これを回避するために、透明電極上に金属レイヤーを透明電極と同じ配線で配置すれば、金属電極の導電性によって抵抗値を下げることができる。実際には、細胞を培養する領域では、光学的観察をすることからガラス基板４３０１上の透明電極４３０２を用いた配線を配置しており、細胞観察をしない領域では透明電極に重なるようにその上に金属レイヤー４３０３が配置されており、その上面が絶縁膜で被覆されている。ここで用いる金属電極素材としては、たとえば金、プラチナ、チタン、銅、アルミ二ムなどを用いれば良い。
【００７８】
図４６は、多電極基板上の電極配置の例を示した模式図である。まず、図４６（ａ）では、細胞培養領域４４０４に直列に配置した心筋細胞ネットワークの一端を局所刺激する刺激電極４４０１と、この刺激電極によって刺激された心筋細胞の興奮伝導を計測する計測電極４４０２と、ノイズ除去のための参照電極４４０３が配置されている。各計測電極４４０２から得られた心筋細胞ネットワークの複数の局所応答の結果を計測することができるとともに、伝達速度のゆらぎを各計測電極間の伝達毒度の比較解析をすることで求めることができる。図４６（b）では、計測電極が一直線に繋がっているものであり、この構成にすることで、心電図のST領域（心室領域）の心電図波形と同様な波形を計測することができる。図４６（c）では、上記、図４６（b）の一部を切り離して、局所の心筋細胞のFP波形を取得することを容易にしたものである。図４６（d）は、リング状電極の上にリング状に細胞を配置して計測するための電極配置の一例である。これらは図１１、図１２に示したようにリング状に配置した心筋細胞ネットワークを計測するものであるが、リング状の計測電極の一部を欠損させ、その部位に局所強制刺激を与えるための刺激電極を配置し、また、ノイズ除去のための参照電極を配置している。さらに図４６（ｅ）では、計測電極も分割して、局所心筋細胞の応答を計測することが可能な配置となっている。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明によれば、iPS細胞等の幹細胞から分化させた心筋細胞について、その心筋細胞が創薬スクリーニングあるいは再生医療のために使うことができる健全な心筋細胞であるかどうかを評価できる。
【符号の説明】
【００８０】
１…透明基板、２…微小電極、２ｃ…比較電極、２’…微小電極２の引き出し線、３１，３２，３３及び３４…アガロースゲルによる壁、４１，４２，４３及び４４…間隙、７…周辺を取り巻く壁、８１，８２，８３…パイプ、ＰＣ…パソコン、Ｍｓ…パソコンの操作信号、１０，１０１，１０２，１０３，−−−，１０ｎ…心筋細胞あるいは線維芽細胞、１５…光学観察装置の透明ステージ、１６…Ｘ−Ｙ駆動装置、１８…Ｚ駆動装置、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨｎ…細胞保持部、ＣＣＣ…細胞連絡チャネル、１０Ｇ…細胞集団、１１ａ…障壁、１１ｂ…開口、１９、１９１、１９２、１９３…ダイクロイックミラー、２０、２０１…バンドパスフィルタ、２１、２１１…カメラ、２２…光源、２２１…蛍光光源、２３、２３１…バンドパスフィルタ、２４、２４１…シャッター、２５…コンデンサレンズ、２６…対物レンズ、２７…可動電極、２８…接地電極、２９、２９１…スイッチング回路、３０、３０１…電気信号計測回路、３１、３１１…電気刺激回路、３２…心筋細胞、３３…線維芽細胞、３４…細胞配置用ピペット、３５…N周回目の伝達経路、３６…（N＋１）周回目の伝達経路、３７…（N＋２）周回目の伝達経路、３８…測定電極、３９…参照電極、４０…送液系、４１…環状に配置した細胞集団、４２…９６穴ウエルプレート、４３…カメラ受光素子、４４…細胞、４５…細胞刺激電極、１００…心筋毒性検査装置、3000…心筋毒性検査装置、3001…測定部、3002…インターフェース用パソコン、3003…アナログデジタル変換器、3004…増幅器、4201…多電極基板、4202…細胞培養容器、4203…溶液の流れ、4204…液面の高さ、4301…ガラス基板、4302…透明電極、4303…金属レイヤー、4304…絶縁膜、4401…刺激電極、4402…計測電極、4403…参照電極、4404…細胞培養領域。
【図４０ａ】
2012043820.tif 000005
【図１】
2012043820.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０ｂ】
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【図４０ｃ】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【国際調査報告】
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