(57)【要約】  反応完了時間が短く、感度にも優れたイムノクロマトグラフィー用テストストリップの提供。  以下の（１）および（２）を含み、かつ、コンジュゲートパッドのサンプル供給部の下面は不溶性メンブレン担体の上面と接触せず、コンジュゲートパッドのコンジュゲート部の下面は不溶性メンブレン担体の上面と接触していることを特徴とするイムノクロマトグラフィー用テストストリップ。（１）被検出物質を含有する可能性のあるサンプルを供給するサンプル供給部と、前記サンプル供給部よりも下流側に、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを含有するライン状のコンジュゲート部とを有する、コンジュゲートパッド（２）被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された検出部を少なくとも１つ有する、不溶性メンブレン担体
2012043746.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検出物質を含有する可能性のあるサンプルを展開させることにより被検出物質を検出するイムノクロマトグラフィー用テストストリップであって、以下の（１）および（２）を含み、かつ、コンジュゲートパッドのサンプル供給部の下面は不溶性メンブレン担体の上面と接触せず、コンジュゲートパッドのコンジュゲート部の下面は不溶性メンブレン担体の上面と接触していることを特徴とするイムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
（１）被検出物質を含有する可能性のあるサンプルを供給するサンプル供給部と、前記サンプル供給部よりも下流側に、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを含有するライン状のコンジュゲート部とを有する、コンジュゲートパッド
（２）被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された検出部を少なくとも１つ有する、不溶性メンブレン担体
【請求項２】
標識体に固定化された被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原と、検出部に固定化された被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原とは、別のものである、請求項１に記載のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
【請求項３】
ライン状のコンジュゲート部のラインの中心線が、不溶性メンブレン担体の上流側端部よりも下流側に配置されている、請求項１または２に記載のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
【請求項４】
ライン状のコンジュゲート部の全ての下面が不溶性メンブレン担体の上面と接触している、請求項１〜３のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
【請求項５】
ラテラルフロー式である、請求項１〜４のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
【請求項６】
被検出物質がインフルエンザウイルスであり、標識体に固定化された被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原および検出部に固定化された被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体である、請求項１〜５のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
【請求項７】
標識体に固定化された抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体が、抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体のF(ab')2断片である、請求項６に記載のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの製造方法であって、以下の工程を有する製造方法。
（１）コンジュゲートパッドとなるパッド状の多孔質材料の一部に、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを含有するコンジュゲート液をライン状に塗布し、乾燥させてコンジュゲート部を形成し、前記コンジュゲート部以外の一部をサンプル供給部とする、コンジュゲートパッドを作成する工程
（２）被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された検出部を少なくとも１つ有する不溶性メンブレン担体を準備する工程
（３）（２）で準備した不溶性メンブレン担体の上流側に、（１）で得られたコンジュゲートパッドを、サンプル供給部の下面は不溶性メンブレン担体に接触せず、かつ、コンジュゲート部の下面は不溶性メンブレン担体と接触するように積層する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルス等の被検出物質を検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サンプル中の検出すべき被検出物質を抗原抗体反応により検出する方法の一つとして、イムノクロマトグラフィー用テストストリップを用いた測定方法が従来から行われている。イムノクロマトグラフィーは、被検出物質である抗原または抗体に対する抗体または抗原を、クロマトグラフ媒体である不溶性メンブレン担体上に固定化して、固定相である検出部を作成し、コンジュゲート（検出試薬）である上記被検出物質と結合可能な抗体または抗原によって感作された標識体を移動相として用い、被検出物質と移動相であるコンジュゲートとを特異的に反応させ、さらに固定相である検出部において、コンジュゲートと結合した被検出物質を、検出部に固定化された抗体または抗原に特異的に反応させるものである。そして、通常、標識体として、金コロイドなどのコロイド状金属粒子や、カラーラテックス粒子が用いられるので、検出部における色から、サンプル中の被検出物質の存在や、場合によってはその量を検出する。【０００３】
イムノクロマトグラフィー用テストストリップの構成としては、特許文献１に示されている通り、サンプルを供給するためのサンプルパッド、移動相であるコンジュゲートを配置させるためのコンジュゲートパッド、サンプルとコンジュゲートの複合体を展開するとともに、検出のための検出部を有する不溶性メンブレン担体、及び不溶性メンブレン担体を展開してきたサンプルを吸収するための吸収パッドが配置されているのが一般的である。
しかしながら、従来の上記構成のイムノクロマトグラフィー用テストストリップは、コンジュゲートパッドからコンジュゲートがリリースされ難いため、反応が完了するまでに時間がかかったり、或いは、バックグラウンドが上昇し易いといった問題点がある。
また、コンジュゲートパッドは、コンジュゲートを均一に含浸させ、乾燥させたものであるが、コンジュゲートを含浸させる工程を経るため、製造の自動化が難しく、さらに、コンジュゲートの含浸が不均一なり易く、性能にばらつきが生じる恐れがあるといった問題点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第６３５２８６２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、反応完了時間が短く、感度にも優れたイムノクロマトグラフィー用テストストリップを提供することにある。また、本発明の他の目的は、液を含浸させる工程を含まず、自動化が容易であり、かつ、均一な性能を有する上記イムノクロマトグラフィー用テストストリップが得られる製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップは、被検出物質を含有する可能性のあるサンプルを展開させることにより被検出物質を検出するものであって、以下の（１）および（２）を含み、かつ、コンジュゲートパッドのサンプル供給部の下面は不溶性メンブレン担体の上面と接触せず、コンジュゲートパッドのコンジュゲート部の下面は不溶性メンブレン担体の上面と接触していることを特徴とする。
（１）被検出物質を含有する可能性のあるサンプルを供給するサンプル供給部と、前記サンプル供給部よりも下流側に、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを含有するライン状のコンジュゲート部とを有する、コンジュゲートパッド
（２）被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された検出部を少なくとも１つ有する、不溶性メンブレン担体
イムノクロマトグラフィー用テストストリップを上記構成とすることで、コンジュゲートパッドからのコンジュゲートのリリース性が優れたものとなり、短時間で反応が完了するとともに、感度にも優れたものとなる。
尚、本発明において、抗原または抗体を固定化させるとは、標識体または不溶性メンブレン担体に物理的あるいは化学的に抗原または抗体を担持させることである。
また、上記コンジュゲート部は、サンプル展開方向、即ち、コンジュゲートパッドのサンプル供給部の中心と不溶性メンブレン担体の上流側端部の中心を結ぶ線に対して直行する方向にライン状に配置されているのが好ましい。
さらに、本発明でいう検出とは、定性的な検出だけでなく、定量が可能な被検出物質については定量的な検出も含む。【０００７】
上記イムノクロマトグラフィー用テストストリップにおいて、標識体に固定化された被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原と、検出部に固定化された被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原とは、別のものであることが好ましい。即ち、標識体に固定化された被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原と、検出部に固定化された被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原とは、各々被検出物質の別の部位を認識する抗体または抗原であることが好ましい。標識体及び検出部に別の抗体または抗原を固定させることで、感度がより優れたものとなる。【０００８】
上記ライン状のコンジュゲート部のラインの中心線は、不溶性メンブレン担体の上流側端部よりも下流側に配置されていることが好ましい。コンジュゲート部の中心線を不溶性メンブレン担体の上流側端部よりも下流側に配置することで、コンジュゲート部の下面の半分以上が不溶性メンブレン担体と接触し、コンジュゲートのリリース性がより優れたものとなる。さらに、上記ライン状のコンジュゲート部の全ての下面が不溶性メンブレン担体の上面と接触していることが好ましい。【０００９】
上記ライン状のコンジュゲート部のラインの中心線は、コンジュゲートパッドの上流側端部よりも１０〜２０ｍｍ下流側に配置されていることが好ましい。【００１０】
また、上記イムノクロマトグラフィー用テストストリップの製造方法も本発明の一つである。本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの製造方法は、コンジュゲートパッドとなるパッド状の多孔質材料の一部に、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを含有するコンジュゲート液をライン状に塗布し、乾燥させてコンジュゲート部を形成し、多孔質材料のコンジュゲート部以外の一部をサンプル供給部として、コンジュゲートパッドを作成した後、コンジュゲートパッドを、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された検出部を少なくとも１つ有する不溶性メンブレン担体の上流側に、サンプル供給部の下面は不溶性メンブレン担体に接触せず、かつ、コンジュゲート部の下面は不溶性メンブレン担体と接触するように積層することを特徴とする。
上記製造方法は、コンジュゲートを多孔質材料に含浸させる工程を含有せず、自動化が容易な液の塗布によりコンジュゲート部を形成しているので、全体として製造の自動化が可能であり、かつ、液の塗布料は制御が比較的容易であり、得られるイムノクロマトグラフィー用テストストリップの性能を均一に維持し易い。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップは、コンジュゲート部がライン状に形成されており、かつ、コンジュゲート部と不溶性メンブレン担体が特定の位置関係にあるため、イムノクロマトグラフィー用テストストリップをコンジュゲートパッド及び不溶性メンブレン担体とから構成することができ、また、コンジュゲートパッドからのコンジュゲートのリリース性が優れたものとなり、短時間で反応が完了するとともに、感度にも優れたものとなる。
また、ライン状のコンジュゲート部のラインの中心線を不溶性メンブレン担体の上流側端部よりも下流側に配置することにより、上記リリース性及び感度がより優れたものとなる。
本発明の製造方法は、従来のコンジュゲートパッドのようにコンジュゲート液をパッド全体に含浸させる工程を含まないことから、コンジュゲートパッドの製造の自動化が容易となる。また、コンジュゲートがライン状に塗布されて形成されることから、コンジュゲートの量および塗布位置の調整がし易く、これらを均一とすることができ、その結果均一な性能を有する上記イムノクロマトグラフィー用テストストリップが得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップを示す（デバイス作製例２，３，４）
【図２】本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップを示す（デバイス作製例７）
【図３】参考例のイムノクロマトグラフィー用テストストリップを示す（デバイス作製例５）
【図４】従来のイムノクロマトグラフィー用テストストリップを示す（デバイス作製例１）
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（被検出物質）
本発明において、被検出物質としては、ウイルス、及び一般に抗原抗体反応を利用して測定し得るタンパク質などの生理活性物質等が挙げられる。
上記ウイルスとしては、例えば、インフルエンザＡ型ウイルスやインフルエンザＢ型ウイルスなどのインフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス等が挙げられ、上記タンパク質としては、例えば、ヒトヘモグロビン、Ｂ型肝炎ウイルス抗体、Ｃ型肝炎ウイルス抗体、ヒト免疫不全ウイルス抗体等が挙げられる。中でも、インフルエンザウイルスを被検出物質とするのが好ましく、後述する検出部を複数個所形成して、インフルエンザＡ型ウイルスおよびインフルエンザＢ型ウイルスを被検出物質とするのがより好ましい。
【００１４】
（サンプル）
本発明において、被検出物質を含有する可能性のあるサンプルとしては、体液などの主に生体（生物）由来の物質やそれらから被検出物質を抽出した抽出液等が挙げられる。生体（生物）由来の物質としては、具体的には、血液、尿、便、鼻孔・鼻腔・咽頭・鼻咽頭などを由来とする鼻汁液や鼻汁吸引液、喀痰やスワブ検体として収集された分泌液、唾液等が挙げられる。中でも、被検出物質をインフルエンザウイルスとする場合、サンプルとしては、鼻孔・鼻腔・咽頭・鼻咽頭などを由来とする鼻汁液や鼻汁吸引液、喀痰やスワブ検体として収集された分泌液等が好ましい。上記の生体（生物）由来物質やその抽出液は、そのままサンプルとして用いてもよく、適宜希釈液によって希釈してサンプルとしてもよい。また、適宜濾過したものをサンプルとして用いてもよい。
【００１５】
（被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原）
本発明で用いられる被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原は、被検出物質に結合可能な抗体または抗原であり、被検出物質がウイルスや抗原の場合は抗体、被検出物質が抗体の場合は抗原が好ましい。被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原は、後述する標識体および検出部に固定化される。標識体および検出部に固定化される抗体または抗原は同一であってもよいが、標識体と検出部とで別のものであることが好ましい。標識体に固定化される抗体または抗原と、検出部に固定化される抗体または抗原とで、別のものを用いることにより、得られるイムノクロマトグラフィー用テストストリップにおいて、コンジュゲートと結合した被検出物質と検出部の抗体または抗原との反応と、コンジュゲートと結合した被検出物質と未反応のコンジュゲートとの反応とが競合するのを抑制することができるとともに、コンジュゲートと結合した被検出物質と検出部の抗体または抗原との反応性を上げることができ、結果としてイムノクロマトグラフィー用テストストリップの感度が良好になる。なお、別のものとは、種類が異なることをいい、抗体の場合は異なるエピトープを認識する抗体であり、抗原の場合は異なるエピトープを有する抗原をいう。
さらに、標識体および検出部に固定化される抗体はモノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体を用いることで、反応の特異性を上げることができる。
被検出物質がインフルエンザウイルスの場合、標識体及び検出部に固定化される抗体は、インフルエンザウイルスを検出できる抗体であればいずれでもよいが、抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体、抗インフルエンザＢ型ウイルスモノクローナル抗体等の抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体が好ましい。
また、これらの抗体の分子全体のほかに、抗原抗体反応活性を有する抗体の機能性断片も本発明では同じく抗体として取り扱う。抗体の機能性断片としては、動物への免疫工程を経て得られたもののほか、遺伝子組み換え技術を使用して得られたものや、キメラ抗体が挙げられる。抗体の機能性断片としては、例えば、F(ab')2  、Fab’などが挙げられる。これらの機能性断片は前記抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理することにより製造できる。本発明ではこのうちでも特に、標識体に固定化される抗体としてF(ab')2を用いるのが好ましい。標識体に機能性断片化抗体であるF(ab')2を用いることにより、例えば、標識体に抗体が結合されたコンジュゲートの大きさを小さくすることができ、コンジュゲートパッド及び不溶性メンブレン担体中における展開性に優れたものとなる。また、被検出物質によっては、機能性断片化抗体を用いることにより、反応の特異性を上げることが可能となる。
【００１６】
（標識体）
本発明で用いられる標識体は、従来からイムノクロマトグラフィー用テストストリップに用いられている公知の標識体を用いることができる。例えば、金コロイド粒子や白金コロイド粒子などのコロイド状金属粒子、カラーラテックス粒子、磁性粒子などが好ましく、特に金コロイド粒子が好ましい。
標識体の粒径は、用いる標識体に応じて適当な粒径の標識体を用いるのが好ましい。例えば、標識体として金コロイド粒子を用いる場合、その粒径としては２０〜６０ｎｍが好ましく、特に４５〜５５ｎｍが好ましい。上記の金コロイド粒子は、一般に知られている方法、例えば、加熱したテトラクロロ金（III）酸水溶液にクエン酸三ナトリウム水溶液を滴下攪拌することによって製造することができる。
【００１７】
（コンジュゲート）
本発明で用いられるコンジュゲートは、上記のような標識体に被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化されたものである。被検出物質がインフルエンザウイルスの場合、コンジュゲートは、金コロイド粒子に抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体が固定化されたものが好ましい。
被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原を標識体へ固定化させる方法としては、物理吸着、化学結合等が挙げられ、物理吸着により固定化させるのが一般的である。例えば、抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を金コロイド粒子へ固定化させる場合、通常緩衝液に金コロイド粒子及び抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を添加し、物理吸着によって固定化させ。この際、抗体濃度は２０〜１００μｇ／ｍＬに調製されるのが好ましい。緩衝液とそのｐＨは、例えば、０．５〜５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６〜７）、０．５〜５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８〜９．５）等が好ましい。
また、金コロイド粒子などの標識体上の、抗体または抗原が結合していない領域は、ＢＳＡなどでブロッキングするのが好適である。
【００１８】
（コンジュゲートパッド）  
本発明で用いられるコンジュゲートパッドは、サンプルが展開可能であり、かつ、コンジュゲートを保持可能なパッド状の多孔質材料からなり、その一部にサンプル供給部とライン状のコンジュゲート部とを有する。また、サンプル供給部とコンジュゲート部との間には、コンジュゲートを含まない多孔質材料部分が存在しており、サンプル供給部に供給されたサンプルは、多孔質材料を展開してコンジュゲート部に到達するようにされているのが好ましい。
上記サンプル供給部は、被検出物質を含有する可能性のあるサンプルを供給する部位であり、多孔質材料の一部に形成されており、サンプル供給部がコンジュゲートパッドの上流側となる。
上記コンジュゲート部は、コンジュゲートを含有する部位であり、上記サンプル供給部よりも下流側の多孔質材料上にライン状に形成される。ライン状のコンジュゲート部は、サンプル展開方向、即ち、コンジュゲートパッドのサンプル供給部の中心と後述する不溶性メンブレン担体の上流側端部の中心を結ぶ線に対して直行する方向にライン状に配置されているのが好ましい。また、ライン状のコンジュゲート部は、コンジュゲートパッドのサンプル展開方向の長さの中央よりも下流側に配置されることが望ましい。イムノクロマトグラフィー用テストストリップの一般的な大きさを考慮すると、ライン状のコンジュゲート部のラインの中心線が、コンジュゲートパッドの上流側端部よりも１０〜２０ｍｍ下流側に配置されているのが好ましく、１２〜１８ｍｍ下流側に配置されているのがより好ましい。
尚、コンジュゲートパッドのコンジュゲート部よりも下流側の全てがコンジュゲート部である必要はなく、コンジュゲート部のさらに下流側にはコンジュゲートを含まない多孔質材料部分が存在していてもよい。
また、ライン状のコンジュゲート部のライン幅は、被検出物質の検出に必要な量のコンジュゲートを含有させられる程度の幅があればよく、３〜５ｍｍが望ましい。
【００１９】
コンジュゲートパッドは、その下流側の端部の下面が後述する不溶性メンブレン担体の上面に接触するように不溶性メンブレン担体と積層される。コンジュゲートパッドは、サンプル供給部の下面は不溶性メンブレン担体の上面と接触せず、コンジュゲート部の下面は不溶性メンブレン担体の上面と接触するように、不溶性メンブレン担体と積層される。積層は、コンジュゲートパッドの下面と不溶性メンブレン担体の上面とが接触していればよく、固定化する必要はない。コンジュゲート部の下面と不溶性メンブレン担体の上面との接触部分は、コンジュゲート部下面の一部分であってもよいが、望ましくは半分以上である。また、コンジュゲート部下面の全面が不溶性メンブレン担体の上面と接触することも望ましい態様である。半分以上の接触とは、換言すれば、ライン状のコンジュゲート部のラインの中心線が不溶性メンブレン担体の上流側端部よりも下流側に配置されることである。なお、コンジュゲート部の下面と不溶性メンブレン担体の上面とが全く接触しない場合には、コンジュゲート部からのコンジュゲートのリリース性及びコンジュゲートの展開性が悪くなってバックグラウンドが上昇し、検出部の視認性が低下する。
コンジュゲートパッドのコンジュゲート部よりも上流側の部分には、サンプル供給部が形成されており、この部分はいわゆる従来のイムノクロマトグラフィー用テストストリップに設けられているサンプルパッドの役割を担う部分に相当する。被検出物質を含有する可能性のあるサンプルがコンジュゲートパッドのサンプル供給部に供給されると、サンプルは、上流側のサンプル供給部から、コンジュゲートを含まない多孔質材料部分を通って下流側のコンジュゲート部へと流れる。コンジュゲート部では、サンプル中の被検出物質（インフルエンザウイルス）とコンジュゲート（抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体が固定化された金コロイド粒子）とが複合体（凝集体）を形成する。その後、サンプルはコンジュゲート部の下面に接触して配置されている不溶性メンブレン担体へと展開される。
【００２０】
上記コンジュゲートパッドを構成する多孔質材料としては、紙、セルロース混合物、ニトロセルロース、ポリエステル、アクリロニトリルコポリマー、ガラス、レーヨン等のような不織繊維からなるパッドが挙げられる。中でもガラス繊維からなるパッド（グラスファイバー製パッド）が好ましい。
【００２１】
（不溶性メンブレン担体）
本発明で用いられる不溶性メンブレン担体は、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された少なくとも１つの検出部を有する。被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原の不溶性メンブレン担体への固定化は、従来公知の方法で実施することができる。ラテラルフロー式のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの場合には、次のように固定化を行う。上記の抗体または抗原を所定の濃度で含有する液を調製し、次に、ノズルから液を一定の速度で吐出しながら水平方向に移動させることのできる機構を有する装置などを用いて、上記液をライン状に不溶性メンブレン担体に塗布し、乾燥させることにより固定化させることができる。
上記液の抗体または抗原の濃度は０．１〜５ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．５〜２ｍｇ／ｍＬがさらに好適である。また、抗体または抗原の不溶性メンブレン担体への固定化量は、ラテラルフロー式の場合には上記の装置のノズルからの吐出速度を調節することによって最適化でき、０．５〜２μＬ／ｃｍが好適である。
なお、上記ラテラルフロー式のイムノクロマトグラフィー用テストストリップを用いた測定方法は、コンジュゲートパッドの、不溶性担体と接触する部分から供給されるサンプルが、毛細管現象により不溶性メンブレン担体に対して並行方向に移動するように展開する方式の測定方法である。
また、上記の抗体または抗原を所定の濃度で含有する液は、緩衝液に抗体または抗原を添加することにより調製することができる。該緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。緩衝液のｐＨは６．０〜９．５の範囲が好ましく、６．５〜８．５がより好ましく、７．０〜８．０がさらに好ましい。緩衝液には、さらに塩化ナトリウムなどの塩類、スクロースなどの安定剤や保存剤、プロクリンなどの防腐剤等を含んでもよい。塩類は塩化ナトリウムなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のｐＨを調整する目的で添加するものも含まれる。
不溶性メンブレン担体に抗体または抗原を固定化した後、さらに、通常使用されるブロッキング剤を溶液あるいは蒸気状にして抗体または抗原を固定化した部位以外を被覆し、ブロッキングを行うこともできる。
なお、不溶性メンブレン担体には、従来からイムノクロマトグラフィー用テストストリップで用いられているコントロール捕捉試薬を固定化してもよい。該コントロール捕捉試薬は、アッセイの信頼性を担保するための試薬であって、コンジュゲートパッドに含ませたコントロール試薬を捕捉するものである。例えば、コンジュゲートパッドに標識されたKLHをコントロール試薬として含む場合には、抗KLH抗体などがコントロール捕捉試薬に該当する。コントロール捕捉試薬を固定化する位置は、アッセイ系の設計に適合するよう適宜選択することができる。
【００２２】
本発明で用いられる不溶性メンブレン担体を構成するメンブレンとしては、従来からイムノクロマトグラフィー用テストストリップの不溶性メンブレン担体として用いられている公知のメンブレンが使用できる。例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン類、ガラス、セルロースやセルロース誘導体などの多糖類、セラミックス等からなる繊維から構成されるメンブレンがあげられる。具体的には、ザルトリウス社、ミリポア社、東洋濾紙社、ワットマン社などから市販されているガラス繊維ろ紙やセルロースろ紙などが挙げられる。中でも、ザルトリウス社、UniSart CN140が好ましい。また、この不溶性メンブレン担体の孔径と構造を適宜選択することにより、コンジュゲートとサンプル中の被検出物質との複合体が不溶性メンブレン担体中を流れる速度を制御することが可能である。
【００２３】
（吸収パッド）
本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップにおいては、上記不溶性メンブレン担体の下流側端部に吸収パッドを設置するのが好ましい。吸収パッドとは、不溶性メンブレン担体を移動・通過したサンプルを吸収することにより、サンプルの展開を制御する液体吸収性を有する部位である。吸収パッドとしては、従来からイムノクロマトグラフィー用テストストリップに用いられている公知の吸収パッドが用いられ、例えば、ろ紙を用いることができる。好適には、Whatman社、740-Eが用いられる。
【００２４】
（イムノクロマトグラフィー用テストストリップ）
本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップは、上記コンジュゲートパッドと不溶性メンブレン担体を含む。コンジュゲートパッドおよび不溶性メンブレン担体は、コンジュゲートパッドの下面と不溶性メンブレン担体の上面とが接触するように積層されている。ここで、コンジュゲートパッドのサンプル供給部の下面は不溶性メンブレン担体の上面と接触しておらず、コンジュゲートパッドのコンジュゲート部の下面の一部または全部、好ましくは半分以上は、不溶性メンブレン担体の上面と接触するように配置されている。また、上記で述べた通り、不溶性メンブレン担体の下流側端部には、さらに吸収パッドが配置されていることが好ましい。
上記イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、プラスチック製粘着シートのような固相支持体上に配置させることが好ましい。該固相支持体は、サンプル及びコンジュゲートの毛管流を妨げない物質で構成する。また、イムノクロマトグラフィー用テストストリップを固相支持体上に接着剤等で固定化してもよい。この場合、接着剤の成分等においてもサンプル及びコンジュゲートの毛管流を妨げない物質で構成する。なお、不溶性メンブレン担体の機械的強度を上げ且つアッセイ中の水分の蒸発（乾燥）を防ぐ目的でポリエステルフィルムなどをラミネートすることも可能である。該イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、イムノクロマトグラフィー用テストストリップの大きさ、サンプルの添加方法や添加位置、不溶性メンブレン担体の検出部の形成位置、シグナルの検出方法などを考慮した適当な容器（ハウジング）に格納・搭載して使用することができ、このように格納・搭載された状態を「デバイス」という。
また、本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップは、コンジュゲートパッドと不溶性メンブレン担体を含み、さらに測定条件、サンプルに応じて他の試薬や構成を含み得る。他の試薬としては、例えば非特異反応を防止するブロッキング剤が挙げられ、他の構成としては、例えば、試料中における測定に不要な成分を除去するための３rd  padが挙げられる。
【００２５】
（イムノクロマトグラフィー用テストストリップの製造方法）
上記イムノクロマトグラフィー用テストストリップの製造方法は特には限定されないが、パッド状の多孔質材料の一部（コンジュゲート部となる部分）にコンジュゲート液をライン状に塗布し、乾燥させてコンジュゲートパッドを作成した後、このコンジュゲートパッドと検出部を有する不溶性メンブレン担体とを接触させてイムノクロマトグラフィー用テストストリップとすることが好ましい。
例えば、本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの製造方法は、以下の（１）〜（３）の工程を有するものである。
（１）コンジュゲートパッドとなるパッド状の多孔質材料の一部に、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたコンジュゲートを含有するコンジュゲート液をライン状に塗布し、乾燥させてコンジュゲート部を形成し、前記コンジュゲート部以外の一部をサンプル供給部とする、コンジュゲートパッドを作成する工程
（２）被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された検出部を少なくとも１つ有する不溶性メンブレン担体を準備する工程
（３）（２）で準備した不溶性メンブレン担体の上流側に、（１）で得られたコンジュゲートパッドを、サンプル供給部の下面は不溶性メンブレン担体に接触せず、かつ、コンジュゲート部の下面は不溶性メンブレン担体と接触するように積層する工程
上記コンジュゲート液は、通常用いられる緩衝液にコンジュゲートを含有させたものであり、コンジュゲートの濃度はコンジュゲート部に含有させるコンジュゲート量に応じて適宜調整される。
上記コンジュゲート液は、液を一定速度で吐出することのできるノズル等を用いて、コンジュゲートパッドとなるパッド状の多孔質材料の一部（コンジュゲート部となる部分）に、塗布される。塗布は、含浸等よりも塗布量の制御が行い易く、コンジュゲート液を塗布することで、コンジュゲートの量を制御し易くなり、得られるコンジュゲートパッドのコンジュゲート量も均一性に優れたものとなる。その後、加熱乾燥、自然乾燥等により乾燥させてコンジュゲートパッドが得られる。
尚、コンジュゲートパッドはサンプル供給部を有するが、サンプル供給部はコンジュゲートを含まない多孔質材料部分であり、サンプルの展開性、イムノクロマトグラフィー用テストストリップを格納する容器等に応じて、適切な位置に配置することができる。
不溶性メンブレン担体の形成方法、コンジュゲートパッドと不溶性メンブレン担体との積層方法等は上記で述べた通りである。
【００２６】
（その他）
本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製は実施例に記載の方法を適宜、修飾・改変して行うことができる。
コンジュゲートに由来するシグナルを測定する方法としては、公知の方法に従って行えばよく、例えば、吸光度あるいは反射光の強度を測定すればよい。
【実施例】
【００２７】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００２８】
〔抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体の調整〕
以下の試験に用いた抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体（Clone＃622212、Clone＃62241A）および抗インフルエンザＢ型ウイルスモノクローナル抗体（Clone＃612108、Clone＃614216）は、抗原としてリコンビナントインフルエンザ核タンパクを用い、マウスに免疫し、当業者がモノクローナル抗体を製造するために通常行う方法を用いて得られた。【００２９】
〔デバイス作製例１〕従来のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製（３padタイプ）
１）金コロイド粒子標識抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体（コンジュゲート）の作製
抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体および抗インフルエンザＢ型ウイルスモノクローナル抗体を以下に示す抗体濃度と緩衝液条件に調製した。1  OD/mLの金コロイド粒子（粒径50nm）溶液20mLに対し各抗体溶液を1mL添加し、室温で10分間撹拌した。該金コロイド粒子−抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体混合液および該金コロイド−抗インフルエンザＢ型ウイルスモノクローナル抗体混合液、に対し、10%ウシ血清アルブミン（BSA）水溶液を2mL添加し、さらに5分間撹拌後、10℃にて、10,000rpmで45分間遠心し、沈渣（コンジュゲート）を得た。得られたコンジュゲートに対し、Conjugate Dilution Buffer（Scripps社製）を1.2ｍL添加しコンジュゲートを懸濁させた。各コンジュゲートの吸光度を531nm（使用した金コロイド粒子の最大吸収波長）で測定した。吸光度の測定は、以下の試験においても同様に行った。
ｉ)   マウス抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体
Clone＃622212（25μg/mL）、2mMリン酸緩衝液 
ii)   マウス抗インフルエンザＢ型ウイルスモノクローナル抗体
Clone＃612108（35μg/mL）、2mMリン酸緩衝液 【００３０】
２）コンジュゲートパッドの作製
上記１）で調製したコンジュゲートを、8〜20  OD/mLとなるように、1.33％カゼイン、4％スクロース溶液（pH7.5）と混合してコンジュゲート液を作製し、一定体積のグラスファイバー製パッド（日本ポール社、Ｎｏ．8964）に該パッド体積の1.2倍容量滲みこませた。ドライオーブン内で70℃、30分間加温することにより乾燥させ、コンジュゲートパッドとした。また、増感剤などの添加剤を添加する場合には、前記検出試薬に必要量を添加した後、同様の操作を行った。【００３１】
３）抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体が固定化された不溶性メンブレン担体（抗体固定化メンブレン）の作製
ニトロセルロースメンブレン（ザルトリウス社、Unisart CN140）の短辺の一端に、2.0mg/mLに調製した下記抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体及び2.5％スクロースを含む20mM  TBS（pH8.0）を、イムノクロマト用ディスペンサー「XYZ3050」（BIO DOT社）を用いて1.0μL/cmとなるよう設定し、ライン状に塗布した。また、同様に、1.0mg/mLに調製した下記抗インフルエンザB型ウイルスモノクローナル抗体及び2.5％スクロースを含む20mM  TBS（pH8.0）をイムノクロマト用ディスペンサーを用いて1.0L/cmとなるよう設定し、ライン状に塗布した。コントロール抗体としては、0.75mg/mLに調整したヤギ抗マウスIgG及び2.5％スクロースを含む10mM  TBS（pH8.0）をイムノクロマト用ディスペンサーを用いて1.0μL/cmとなるよう設定し、ライン状に塗布した。ラインは、テストストリップを組み立てた際に上流側から、インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体（c1）、抗インフルエンザＢ型ウイルスモノクローナル抗体（c2）、コントロール抗体（c3）の順になるように塗布した。
ドライオーブン内で70℃、45分乾燥し、抗体固定化メンブレンとした。前記ヤギ抗マウスIgGは抗体の F(ab')2部分を特異的に認識するものである。
ｉ)   マウス抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体（コンジュゲートに用いた抗体とは異なるエピトープを認識する抗体）
Clone＃62241A
ii)   マウス抗インフルエンザＢ型ウイルス抗体（同上）
Clone＃614216
iii）  ヤギ抗マウスIgG【００３２】
４）サンプルパッドの作製
グラスファイバー製パッド（Lydall社）をサンプルパッドとして用いた。【００３３】
５）イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
プラスチック製粘着シート（a）に上記抗体固定化メンブレン（b）を貼り、次いで、上記２）で作製したコンジュゲートパッド（d）を配置装着し、さらにこのコンジュゲートパッドに重なるようにサンプルパッド（e）を配置装着し、反対側の端には吸収パッド(ｆ)（Whatman社、740-E）を配置装着した。このように各構成要素を重ね合わせた構造物を一定幅に切断してイムノクロマトグラフィー用テストストリップを作製した。該イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、アッセイの際、プラスチック製の専用のハウジング（サンプル供給窓部及び検出窓部を有する、図４中図示せず）に格納・搭載し、イムノクロマトグラフィー用テストデバイスの形態にした。図４に従来のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの模式構成図を示した。【００３４】
〔デバイス作製例２〕本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製（２padタイプ）
１）金コロイド粒子標識抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体（コンジュゲート）の作製
上記１．と同様に作製した。
２）コンジュゲートパッドの作製
上記１）で調製したコンジュゲートを、8〜20   OD/mLとなるように、1.33％カゼイン、4％スクロース溶液（pH7.5）と混合してコンジュゲート液を作製し、一定体積のグラスファイバー製パッド（日本ポール社、Ｎｏ．8964）にパッドの上流端より１５ｍｍの位置に幅５mmのラインを形成するように滲みこませた。ドライオーブン内で70℃、30分間加温することにより乾燥させ、コンジュゲートパッドとした。また、増感剤などの添加剤を添加する場合には、前記検出試薬に必要量を添加した後、同様の操作を行った。上記１．の従来のイムノクロマトグラフィー用テストストリップでは、コンジュゲートパッドとサンプルパッドが別体であったが、本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップでは、サンプルパッドがなく、コンジュゲートパッドの一部にサンプル供給部（図２中図示せず）とライン状のコンジュゲート部（g）が存在する。
３）抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体固定化メンブレンの作製
上記１．と同様に作製した。
４）イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
コンジュゲートパッドの上流端より１５ｍｍの位置に形成されたライン状のコンジュゲート部（g）は、その上流側端部が抗体固定化メンブレン（b）の上流側端部よりも下流になるように、かつ、下流端部から離れた位置に形成されている。すなわち、コンジュゲート部（ｇ）は全面にわたって、その下面が抗体固定化メンブレンの上面と接触している。該イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、デバイス作製例１と同様に、イムノクロマトグラフィー用テストデバイスの形態にした。図１に本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの模式構成図を示した。【００３５】
〔デバイス作製例３〕本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
用いる抗体をWholeの抗体（すなわち、断片化されていない抗体） からその断片であるF(ab')2に置き換えた以外は、デバイス作製例２．と同様に作製した。【００３６】
〔デバイス作製例４〕本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
コンジュゲートパッドの上流端より１５ｍｍの位置に形成されたライン状のコンジュゲート部（g）の中心線は、上流側端部は抗体固定化メンブレン（b）の上流側端部よりも下流になるように配置されているが、コンジュゲート部（g）の上流側端部は抗体固定化メンブレン（b）の上流側端部よりも上流になるように配置されている。すなわち、コンジュゲート部（ｇ）は半分以上の下面が抗体固定化メンブレンの上面と接触しているが、抗体固定化メンブレンと接触しない部分がある。該イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、デバイス作製例１と同様に、イムノクロマトグラフィー用テストデバイスの形態にした。【００３７】
〔デバイス作製例５〕（参考例）イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
コンジュゲート部はコンジュゲートパッドの上流端より１２ｍｍの位置に形成され、コンジュゲート部の下流側端部が抗体固定化メンブレンの上流側端部よりも上流に配置されている。すなわち、コンジュゲート部の下面と抗体固定化メンブレンは接触していない。該イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、デバイス作製例１と同様に、イムノクロマトグラフィー用テストデバイスの形態にした。図３に本参考例のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの模式構成図を示した。【００３８】
〔デバイス作製例６〕本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
コンジュゲート部はコンジュゲートパッドの上流端より１２ｍｍの位置に形成され、中心線が抗体固定化メンブレンの上流側端面よりも上流になるように配置されているが、コンジュゲート部の下流側端部は抗体固定化メンブレンの上流側端部よりも下流になるように配置されている。すなわち、コンジュゲート部の下面は半分未満であるが抗体固定化メンブレンと接触している。該イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、デバイス作製例１と同様に、イムノクロマトグラフィー用テストデバイスの形態にした。【００３９】
〔デバイス作製例７〕本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
コンジュゲート部がコンジュゲートパッドの下流側の最端部すなわち、コンジュゲートパッド上流端から１８mmの位置に形成されていること、以外は前記デバイス作製例３．と同様に作製した。図２に本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの模式構成図を示した。【００４０】
【表１】
2012043746.tif 000003
【００４１】
〔実施例１〕
上記デバイス作製例１．〜７．で作製したイムノクロマトグラフィー用テストデバイスを用いて、インフルエンザウイルスの検出試験を行った。
１．試験方法
（１）試料  
以下の抗原を２％BSAを含むPBS（pH7.4）でそれぞれ1/160〜1/2560に希釈したものを模擬試料とした。
インフルエンザウイルスＡ型抗原；Kitakyusyu  159/93株由来
インフルエンザウイルスＢ型抗原；Lee  40株由来
（２）手順
上記（１）で調整した模擬試料115μLをイムノクロマトグラフィー用デバイスのサンプル供給窓部より添加し、15分後に、検出窓部より抗体固定化メンブレン上の赤色の検出スポット有無を観察した。
（３）評価基準
(3-1)検出感度
判定は以下の3段階で行った。
＋  陽性
−  陰性
＋／−  判定保留（わずかに判別できる程度）
（3-2）バックグラウンド強度
判定は以下の3段階で行った。
＋＋  視認性が低下するくらいにバックグラウンド強度が大きい
＋    判定に支障は無い程度だがバックグラウンド強度が大きい
−    バックグラウンドによる影響なし
２．試験結果
結果を表２に示す。
（１）3padと2padによる違い
デバイス作製例１と２の結果を比較すると、本発明の２padタイプの方が、Ａ型抗原およびＢ型抗原のいずれにおいても低濃度での検出が可能であり検出感度が高いことが確認できた。また、バックグラウウンドの強度も小さく、視認性に優れていた。
（２）Whole抗体とF(ab’)2抗体による違い
デバイス作製例２と３の結果を比較すると、抗体の断片を用いたデバイス作製例３の方が、Ａ型抗原およびＢ型抗原のいずれにおいても低濃度での検出が可能であり検出感度が高いことが確認できた。
（３）コンジュゲートパッドラインの位置、不溶性メンブレン担体との重なりの関係
デバイス作製例３〜７の比較により、以下のことが言える。
（i）コンジュゲート部は従来のようにコンジュゲートパッド全体にコンジュゲートを含浸することなく、パッドの一部にライン状に形成した場合の方が十分な検出感度が得られ、ラインの位置が、コンジュゲートパッド上流端より１２〜１８ｍｍの位置で良好な感度が得られた。
（ii）コンジュゲート部と不溶性メンブレン担体との位置関係については、コンジュゲート部の一部がその下面において不溶性メンブレン担体上面と接触する必要があり、コンジュゲート部の中心線が不溶性メンブレン担体上流側端部よりも下流（内側）に配置されることが望ましい。すなわち、コンジュゲート部下面の半分以上が不溶性メンブレン担体と接触することが望ましい。【００４２】
【表２】
2012043746.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップによれば反応完了時間が短く、感度にも優れたイムノクロマトグラフィー用テストストリップを提供することができる。また、本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの製造方法を用いれば、コンジュゲート液を含浸させる工程を含まず、自動化が容易であり、かつ、均一な性能を有する上記イムノクロマトグラフィー用テストストリップが得られる。
【符号の説明】
【００４４】
（ａ）プラスチック製粘着シート
（ｂ）抗体固定化メンブレン
（ｃ１）抗インフルエンザＡ型ウイルスモノクローナル抗体
（ｃ２）抗インフルエンザＢ型ウイルスモノクローナル抗体
（ｃ３）コントロール抗体
（ｄ）コンジュゲートパッド
（ｅ）サンプルパッド
（ｆ）吸収パッド
（ｇ）コンジュゲート部
【図１】
2012043746.tif 000005
【図２】
2012043746.tif 000006
【図３】
2012043746.tif 000007
【図４】
2012043746.tif 000008
【国際調査報告】
2012043746.tif 000009
2012043746.tif 000010
2012043746.tif 000011
2012043746.tif 000012
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