(57)【要約】  本発明は、検出用電極と、検出用電極上に配置され、検出対象の微生物の立体構造に相補的な三次元構造の鋳型を備えたポリマー層とを有する検出部を備え、当該鋳型への微生物の捕捉状態に基づいて微生物を検出するセンサーであって、上記ポリマー層は、検出対象とする微生物の存在下でモノマーを重合して微生物を取り込んだ状態のポリマー層を検出用電極上に形成する重合工程、ポリマー層に取り込まれた微生物を部分的に破壊する破壊工程、およびポリマー層を過酸化処理してポリマー層から微生物を放出する過酸化工程を有する製造方法により形成される。
2012121229.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出用電極と、前記検出用電極上に配置され、検出対象の微生物の立体構造に相補的な三次元構造の鋳型を備えたポリマー層とを有する検出部を備え、
前記鋳型への前記微生物の捕捉状態に基づいて前記微生物を検出するセンサーであって、
前記ポリマー層は、検出対象とする微生物の存在下でモノマーを重合して前記微生物を取り込んだ状態の前記ポリマー層を前記検出用電極上に形成する重合工程、前記ポリマー層に取り込まれた微生物を部分的に破壊する破壊工程、および前記ポリマー層を過酸化処理して前記ポリマー層から前記微生物を放出する過酸化工程を有する製造方法により形成される、センサー。
【請求項２】
対電極をさらに備え、
前記検出部と前記対電極とを試料溶液に接触させた状態で、前記検出部の検出用電極と前記対電極間に交流電圧を印加し、誘電泳動により前記試料溶液中の微生物を前記検出部の方向に導く、請求項１に記載のセンサー。
【請求項３】
前記検出部の前記検出用電極を一方の電極とする水晶振動子をさらに備え、
前記水晶振動子の共振周波数の変化から前記ポリマー層の質量の変化を測定して前記微生物の捕捉状態を検出する、請求項１または２に記載のセンサー。
【請求項４】
前記モノマーが、ピロール、アニリン、チオフェンおよびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載のセンサー。
【請求項５】
前記モノマーが、ピロールまたはその誘導体からなる、請求項４に記載のセンサー。
【請求項６】
前記検出用電極の前記ポリマー層の形成面が粗面である、請求項１〜５のいずれかに記載のセンサー。
【請求項７】
前記微生物は、全体または表面の電荷が負電荷過剰の状態にある、請求項１〜６のいずれかに記載のセンサー。
【請求項８】
前記微生物は細菌であり、前記破壊工程において溶菌処理を行なう請求項１〜７のいずれかに記載のセンサー。
【請求項９】
前記細菌は、緑膿菌、アシネトバクターまたは大腸菌である、請求項８に記載のセンサー。
【請求項１０】
検出用電極と、前記検出用電極上に配置され、微生物の立体構造に相補的な三次元構造の鋳型を備えたポリマー層とを有する検出部を備えた微生物を検出するセンサーの製造方法であって、
検出対象とする微生物の存在下でモノマーを重合して前記微生物を取り込んだ状態の前記ポリマー層を前記検出用電極上に形成する重合工程、
前記ポリマー層に取り込まれた微生物を部分的に破壊する破壊工程、および
前記ポリマー層を過酸化処理して前記ポリマー層から前記微生物を放出する工程、を有する製造方法。
【請求項１１】
前記センサーは対電極をさらに備え、
前記重合工程は、前記モノマーの溶液の接触下にある前記検出用電極と前記対電極との間に電圧を印加して、前記モノマーを電解重合する、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記過酸化工程は、中性からアルカリ性の範囲内の溶液の接触下にある前記検出用電極と前記対電極との間に電圧を印加して、前記ポリマー層を過酸化処理する、請求項１０または１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記検出用電極の前記ポリマー層の形成面に粗面化処理を行なう粗面化工程を有する、請求項１０〜１２のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１４】
微生物の立体構造に相補的な三次元構造の鋳型を備えたポリマー層であって、
前記ポリマー層は、前記微生物の存在下でモノマーを重合して前記ポリマー層を形成する重合工程、前記ポリマー層に取り込まれた微生物を部分的に破壊する破壊工程、および前記ポリマー層から前記微生物を放出する過酸化工程を有する製造方法により製造される、ポリマー層。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を検出するためのセンサー、およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療産業、食品産業、農業、畜産、養殖、水処理施設などにおいて、微生物検出への関心が高まっている。食品，医薬品，農薬などに存在する汚染微生物は、微量であるにもかかわらず、人の健康に大きく影響しうる。また、病院、老人介護施設における微生物汚染が社会問題化している。さらに、多様な抗菌商品の流通、需要の高まりに見られるように、一般家庭における衛生管理にも関心が高まっている。たとえば、食品加工工場の場合、出荷される食品の抜き取りでの細菌検査や工場内の環境中の細菌検査を実施しているが、培養法による測定の場合、結果が得られるまでに２４〜４８時間程度要し、出荷するまでの保管コストが高くなる要因となるため、迅速な検出方法が求められている。また、農業分野においても、たとえば水耕栽培の培養液中の細菌数が増加すると発病のリスクが高まる。細菌数を早く把握することで素早く殺菌などの措置が取れるため、迅速な検出方法は有効である。【０００３】
このような状況から、微生物汚染を簡単に検出できる技術の必要性が近年急速に高まっている。また、医療現場においては、感染症の原因の病原菌を速やかに特定する必要があることから、病原菌を迅速かつ高感度で検出できる技術が求められている。微生物の検出・特定方法としては、たとえば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロッティング法などの方法が存在する。これらは、たとえば、抗体（一次抗体）と、微生物固有のタンパク質とを抗原−抗体反応させた後、さらに標識した二次抗体を抗体（一次抗体）と反応させ二次抗体の化学発光やＡＴＰの加水分解反応のモニターにより検出を行なう方法である。【０００４】
また、特許文献１には、分子鋳型を備えたポリマーの電気化学的性質を利用して、微生物由来のアニオン分子（ＡＴＰ、アミノ酸など）を検出する方法について記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−５８２３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上述の方法はいずれも微生物そのものを検出する方法ではない。また、ＥＬＩＳＡ法などでは、微生物固有のタンパク質等に対する抗体を作製する必要があり容易ではない。【０００７】
本発明は、迅速かつ簡便で、高感度に微生物を検出できる新規な微生物検出用センサー、およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、検出用電極と、検出用電極上に配置され、検出対象の微生物の立体構造に相補的な三次元構造の鋳型を備えたポリマー層とを有する検出部を備え、当該鋳型への微生物の捕捉状態に基づいて微生物を検出するセンサーである。上記ポリマー層は、検出対象とする微生物の存在下でモノマーを重合して微生物を取り込んだ状態のポリマー層を検出用電極上に形成する重合工程、ポリマー層に取り込まれた微生物を部分的に破壊する破壊工程、およびポリマー層を過酸化処理してポリマー層から微生物を放出する過酸化工程を有する製造方法により形成される。【０００９】
上記センサーの好ましい形態は、対電極をさらに備え、検出部と対電極とを試料溶液に接触させた状態で、検出部の検出用電極と対電極間に交流電圧を印加し、誘電泳動により試料溶液中の微生物を検出部の方向に導くように構成されている。交流電圧の印加時間は、試料溶液中の微生物が検出部の方向に導かれるようであれば、特に限定はない。【００１０】
上記センサーの好ましい形態は、検出部の検出用電極を一方の電極とする水晶振動子をさらに備え、水晶振動子の共振周波数の変化からポリマー層の質量の変化を測定して微生物の捕捉状態を検出する。【００１１】
上記センサーにおいて、上記モノマーは、好ましくは、ピロール、アニリン、チオフェンおよびそれらの誘導体からなる群から選択される。【００１２】
上記センサーにおいて、上記検出用電極の上記ポリマー層の形成面は、好ましくは粗面である。【００１３】
上記センサーにおいて、上記微生物として、全体または表面の電荷が負電荷過剰の状態にある微生物が好ましい。たとえば、上記微生物は細菌であり、この場合、上記破壊工程は溶菌処理を行なう工程である。上記細菌として、たとえば、緑膿菌、アシネトバクター、大腸菌が例示される。【００１４】
また、本発明は、検出用電極と、検出用電極上に配置され、微生物の立体構造に相補的な三次元構造の鋳型を備えたポリマー層とを有する検出部を備えた微生物を検出するセンサーの製造方法であって、検出対象とする微生物の存在下でモノマーを重合して微生物を取り込んだ状態のポリマー層を検出用電極上に形成する重合工程、ポリマー層に取り込まれた微生物を部分的に破壊する破壊工程、およびポリマー層を過酸化処理してポリマー層から微生物を放出する工程、を有する製造方法である。【００１５】
上記製造方法の好ましい形態において、上記センサーは対電極をさらに備え、上記重合工程は、上記モノマーの溶液の接触下にある上記検出用電極と上記対電極との間に電圧を印加して、上記モノマーを電解重合する工程である。【００１６】
上記製造方法の好ましい形態において、上記放出工程は、中性からアルカリ性の範囲内の溶液の接触下にある上記検出用電極と上記対電極との間に電圧を印加して、上記ポリマー層を過酸化処理する工程である。【００１７】
上記製造方法の好ましい形態は、上記検出用電極のポリマー層の形成面に粗面化処理を行なう粗面化工程を有する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のセンサーによると、迅速かつ簡便で、高感度に微生物を検出することが可能である。また、本発明のセンサーの製造方法によると、迅速かつ簡便で、高感度に微生物を検出することができるセンサーが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明にかかるセンサーのポリマー層の好ましい作製工程を模式的に示し、（ａ）は重合工程前、（ｂ）重合工程後、（ｃ）は破壊工程後、（ｄ）は過酸化工程後の断面図である。
【図２】本発明のセンサーにおいて、鋳型へ標的微生物が捕捉される様子の概略を示す模式図であり、（ａ）は標的微生物である場合、（ｂ）は標的微生物でない場合を示す図である。
【図３】本発明にかかるＱＣＭセンサーの概略構成を示す模式図である。
【図４】緑膿菌の電子顕微鏡写真である。
【図５】アシネトバクターの電子顕微鏡写真である。
【図６】実施例１の重合工程後のポリピロール層表面の電子顕微鏡写真を示す図である。
【図７】実施例１の重合工程における時間と電流の関係、および時間と水晶振動子の共振周波数の関係を示すグラフである。
【図８】実施例１の時間と質量変化の関係を示すグラフである。
【図９】実施例１の溶菌工程および過酸化工程後の過酸化ポリピロール層表面の電子顕微鏡写真である。
【図１０】実施例１から溶菌条件を変更させた場合の、溶菌工程および過酸化工程後の過酸化ポリピロール層表面の電子顕微鏡写真である。
【図１１】実施例１の過酸化工程における時間と電流の関係、および時間と水晶振動子の共振周波数の関係を示すグラフである。
【図１２】実施例１のセンサーを用いた微生物検出時の交流電圧印加時間と水晶振動子の共振周波数の関係を示すグラフである。
【図１３】実施例２の重合工程後のポリピロール層表面の電子顕微鏡写真を示す図である。
【図１４】実施例２の重合工程における時間と電流の関係、および時間と水晶振動子の共振周波数の関係を示すグラフである。
【図１５】実施例２の溶菌工程および過酸化工程後の過酸化ポリピロール層表面の電子顕微鏡写真である。
【図１６】実施例２の過酸化工程における時間と電流の関係、および時間と水晶振動子の共振周波数の関係を示すグラフである。
【図１７】実施例２のセンサーを用いた微生物検出時の交流電圧印加時間と水晶振動子の共振周波数の関係を示すグラフである。
【図１８】実施例３のセンサーを用いた微生物検出時の交流電圧印加時間と水晶振動子の共振周波数の関係を示すグラフである。
【図１９】実施例４のセンサーを用いた微生物検出時の交流電圧印加時間と水晶振動子の共振周波数の関係を示すグラフである。
【図２０】実施例５のセンサーに、緑膿菌を含む試料溶液を添加した検出実験における交流電圧印加時間と水晶振動子の共振周波数の関係を示すグラフである。
【図２１】実施例５のセンサーに、大腸菌を含む試料溶液を添加した検出実験における交流電圧印加時間と水晶振動子の共振周波数の関係を示すグラフである。
【図２２】実施例５のセンサーに、アシネトバクターを含む試料溶液を添加した検出実験における交流電圧印加時間と水晶振動子の共振周波数の関係を示すグラフである。
【図２３】実施例５のセンサーに、セラチア菌を含む試料溶液を添加した検出実験における交流電圧印加時間と水晶振動子の共振周波数の関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明のセンサーは、検出用電極と、検出用電極上に配置され、微生物の立体構造に相補的な三次元構造の鋳型を備えたポリマー層とを有する検出部を備え、鋳型への微生物の捕捉状態に基づいて微生物を検出するものである。
【００２１】
本発明のセンサーのポリマー層は、検出対象とする微生物（以下、「標的微生物」ともいう）の存在下でモノマーを重合して微生物を取り込んだ状態のポリマー層を検出用電極上に形成する重合工程と、ポリマー層に取り込まれた微生物を部分的に破壊する破壊工程と、ポリマー層を過酸化処理してポリマー層から微生物を放出する過酸化工程とを有する製造方法により形成される。
【００２２】
以下、図面を参照しながら、本発明の好ましい実施形態を説明する。
［センサーにおけるポリマー層の作製］
図１は、本発明にかかるセンサーのポリマー層の好ましい作製工程を模式的に示す断面図である。図１では、モノマーとしてピロールを用いる場合の実施形態を示す。まず、図１（ａ）に示すように、検出用電極１１に接触する環境下に、微生物１３およびピロールを含む溶液１２を準備する。重合工程（Ｓｔ１）では、検出用電極１１を陽極とし、対電極（不図示）を陰極とする電気分解を行い、ピロールの酸化的重合反応により、検出用電極１１上にポリピロール（図１（ｂ）中「ＰＰｙ」は、ポリピロールの略である）からなるポリマー層１４を形成する。形成されたポリマー層１４には、微生物１３が取り込まれる。ピロールは、重合工程で検出用電極１１に電子を放出するためにそれ自体は陽電荷を有し、この陽電荷を補償するために、全体または表面の電荷が負電荷過剰の状態にある微生物１３がポリマー層１４中に取り込まれると考えられる。
【００２３】
次に、破壊工程（Ｓｔ２）において、図１（ｃ）に示すように、ポリマー層１４に取り込まれた微生物１３の一部を破壊する破壊工程を行なう。破壊工程は、たとえば、分解酵素の添加、温度調整、超音波処理、オゾン処理、残留塩素の存在、バクテリオファージ処理により行なうことができる。破壊工程は、微生物１３が細菌である場合は、リゾチームなどの分解酵素を用いた溶菌処理（以下、溶菌処理による破壊工程を「溶菌工程」ともいう）により行なうことができる。かかる破壊工程により、微生物１３の形状が変化し、微生物１３がポリマー層１４から放出されやすくなる。
【００２４】
その後、過酸化工程（Ｓｔ３）において、ポリマー層１４を過酸化する。ポリマー層１４を構成するポリピロールが過酸化されると過酸化ポリピロール（図１（ｄ）中「Ｏｐｐｙ」は、過酸化ポリピロールの略である）となり電気的に中性となるため、微生物１３がポリマー層１４から放出される。ポリマー層１４中の微生物１３が存在した領域は、微生物１３の立体構造に相補的な三次元構造を有する鋳型１５となる。この過酸化工程（Ｓｔ３）は、ポリマー層１４の硬化をも引き起こし、微生物１３の鋳型１５を安定化させる。過酸化工程（Ｓｔ３）は、溶液１２を中性からアルカリ性の範囲内に調製して、検出用電極１１と対電極（不図示）間に電圧を印加することにより行なうことが好ましい。このように形成された鋳型１５を備えたポリマー層１４と、検出用電極１１との積層体が、本発明のセンサーにおける検出部１７を構成する。
【００２５】
形成される鋳型の三次元構造は、過酸化反応の溶液組成、過酸化反応を引き起こすための電圧に依存して変動し得る。一般に、過酸化反応が徐々に進行するような条件下では、検出対象の微生物１３により緊密な三次元構造を有する鋳型が形成される。
【００２６】
検出対象の微生物１３としては、全体または表面の電荷が負電荷過剰の状態にある微生物であれば特に限定されることはなく、大腸菌のEscherichia属、緑膿菌などのPseudomonas属、Acinetobacter calocoaceticusなどのAcinetobacter属を始め、Serratia属、Klebsiella属、Enterobacter属、Citrobacter属、Burkholderia属、Sphingomonadase属、Chromobacterium属、Salmonella属、Vibrio属、Legionella属、Campylobacter属、Yersinia属、Proteus属、Neisseria属、Staphylococcus属、Streptococcus属、Enterococcus属、Clostridium属、Corynebacterium属、Listeria属、Bacillus属、Mycobacterium属、Chlamydia属、Rickettsia属、Haemophilus属の細菌が例示される。また、ウイルスとしては、A型肝炎ウィルス、アデノウィルス、ロタウィルス、ノロウィルスが、真菌としてはカンジダが、原虫としてはクリプトスポリジウムが例示される。微生物の全体または表面の電荷は、ｐＨなどの溶液１２の水質により変化する。たとえば、微生物の表面にはカルボキシル基、アミノ基、リン酸基などの種々の官能基があるが、それらの官能基を含む表面はｐＨが高くなると負に帯電する。そのため、鋳型を形成する際や測定する際に、負電荷過剰の状態にするために、たとえば、溶液１２をアルカリ性にするなどしても良い。
【００２７】
図１においては、モノマーとしてピロールを用い、ポリマー層としてポリピロール層を形成する場合について説明したが、ポリマー層の原料となるモノマーとしてはピロールに限定されることはなく、他には、アニリン、チオフェン、それらの誘導体等が例示される。
【００２８】
検出用電極１１の材料は特に限定されることはなく、金電極、金とクロムとの多層電極、金とチタンとの多層電極、銀電極、銀とクロムとの多層電極、銀とチタンとの多層電極、鉛電極、白金電極、カーボン電極等が例示される。検出用電極１１のポリマー層１４が形成される面には、粗面化処理が施されていることが好ましい。検出用電極１１のポリマー層１４が形成される面が粗面であることにより、ポリマー層１４との密着性が向上し、また電極の表面積が拡大するという効果がある。たとえば、検出用電極１１として金電極を用いた場合、金電極表面にプラズマエッチングを施し、その後金ナノ粒子を固定することにより粗面化処理する粗面化工程を行なうことができる。
【００２９】
［鋳型への標的微生物の捕捉］
図２は、鋳型へ標的微生物が捕捉される様子の概略を示す模式図である。図２（ａ）は試料溶液中の微生物１３ａが標的微生物である場合を示し、図２（ｂ）は試料溶液中の微生物１３ｂが標的微生物でない場合を示す。図２（ａ），（ｂ）に示すように、まず、ポリマー層１４と検出用電極１１とからなる検出部１７と、対電極１６とに接触する環境下に、試料溶液を準備する。そして、検出用電極１１と対電極１６間との間に交流電圧を印加し、誘電泳動により試料溶液中の微生物を検出部１７の方向に移動させる。なお、微生物が誘電泳動により検出用電極１１の方に向かって移動するように、対電極１６の構成、印加電圧の調整、試料溶液の調製を行なう。微生物が検出用電極１１の方向に移動すると、鋳型１５の三次元構造と相補的な立体構造の微生物１３ａは鋳型１５内に捕捉されるが（図２（ａ））、鋳型１５と相補的でない微生物１３ｂは鋳型１５内に捕捉されない（図２（ｂ））。また、微生物以外の、たとえば、泥、鉄さびといった濁質が水に含まれていた場合であっても、それらも鋳型１５と三次元的形状、荷電状態等が異なり相補的でないため、捕捉されない。そのため、標的微生物と他の濁質の識別が可能である。微生物と他の濁質との分離は、誘電泳動によっても可能である（微生物を電極に集めるが他の濁質は集めないような条件で誘電泳動を行うことができる）が、誘電泳動で微生物と他の濁質を分離するためには、水の導電率などの水質の変化に応じて、周波数などの誘電泳動の条件を変える必要がある。本発明のセンサの場合、対象物の形状で識別できるため、水質の影響を受けにくい。
【００３０】
［標的微生物の検出］
微生物１３ａが鋳型１５内に捕捉されると、ポリマー層１４および検出用電極１１からなる積層体に、たとえば、質量変化、導電特性変化、電気容量変化、光反射率変化、温度変化等が生じる。本発明のセンサーにおいては、このような変化を検出して、微生物の鋳型１５への捕捉状態を検出する。そして、捕捉状態に基づいて標的微生物の検出が可能となる。このような検出により、標的微生物の迅速かつ高感度の検出が達成され得る。質量変化の検出方法の具体例として、水晶振動子の共振周波数の変化を検出する検出方法が挙げられる。以下、本発明のセンサーの好ましい一例である、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）センサーについ説明する。
【００３１】
（ＱＣＭセンサー）
図３は、ＱＣＭセンサーの概略構成を示す模式図である。ＱＣＭセンサー３３は、溶液を保持するセル２７と、セル２７の底部に配置された水晶振動子３２と、発振回路２２と、周波数カウンタを有するコントローラ２１とを備える。水晶振動子３２は、図１に示した工程により作製された検出部１７と、水晶片２４と、対電極（第２対電極）２３とが順に積層されてなる。ＱＣＭセンサー３３は、さらに、試料溶液３１内に浸漬される対電極（第１対電極）１６と、参照電極３０とを備え、検出部１７の検出用電極１１と対電極１６とに接続された交流電源２９を備える。
【００３２】
まず、セル２７内に試料溶液３１を添加する。そして、交流電源２９により検出用電極１１と対電極１６との間に交流電圧を印加することによって、試料溶液３１内に含まれる微生物が誘電泳動により検出部１７の方向に移動させる。これと同時に、発振回路２２により検出用電極１１と対電極２３との間に交流電圧を印加し、水晶片２４を振動させる。ポリマー層１４の鋳型１５に微生物が捕捉されると、検出部１７の質量に変化が生じ、水晶片２４の共振周波数が変化する。コントローラ２１内の周波数カウンタは、発振回路２２からの信号を受けて、共振周波数値を測定する。共振周波数値の変化から微生物の捕捉状態が検出される。
【００３３】
図３に示すＱＣＭセンサー３３を用いて、検出用電極１１表面の粗面化処理、および図１に示した工程にしたがって、検出用電極１１上にポリマー層を形成することができる。これらの場合は、検出用電極１１、水晶片２４、対電極２３がこの順で積層された水晶振動子をセル２７の底部に配置し、交流電源２９に代えて直流電源を接続して行なう。ＱＣＭセンサー３３を用いたポリマー層の形成においては、ポリマー層形成時に併せて水晶振動子の共振周波数変化をモニターすることにより、ポリマー層の形成の進行状況を確認することができる。検出対象の微生物が複数種類存在する場合には、それぞれの本発明にかかる鋳型を個々に形成して、それらを組合せることにより、或いは単一の鋳型の中に複数の微生物に対応した鋳型が同時に形成されることにより、同時に複数種類の微生物を検出することも可能である。
【００３４】
本発明のセンサーによると、たとえば、数分〜数１０分で細菌を検出することも可能であり、培養法と比較してはるかに迅速に検出することができる。また、蛍光染色に必要な染色試薬や、ＡＴＰで菌数を測定するのに必要なＡＴＰ抽出試薬などを使用せずに検出することができるため、浄水器、ウォーターサーバーあるいは自動製氷装置などの機器への組み込みや自動化が容易である。また、水質検査、食品検査での細菌検査ツールとして、浄水場や、飲料品・食品工場での利用が可能である。更に具体的には、貯水タンクや配管経路などの装置内の細菌を自動的に検知し、ユーザーに報知したり、自動的に殺菌・洗浄などの対策をしたりすることができる。また、浄水場での上水の配管ラインに装置として組み込んで配水される水の細菌を検知することも可能である。
【００３５】
上述のセンサーにおけるポリマー層は、センサーの構成要素以外にも、微生物の立体構造に相補的な三次元構造の鋳型を有することを利用した微生物捕捉装置、微生物形状認識装置、微生物追跡装置、また、多孔質体であることを利用した触媒担体などに用いることも可能である。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例によって説明する。以下の実施例は、本発明を例示するものであって、本発明を制限するものではない。【００３７】
以下の実施例において、ポリマー層の作製は電気化学測定システム（Ｍｏｄｅｌ８４２Ｂ、ＡＬＳ社製）を用いて行ない、検出用電極には金電極（水晶振動子の一方の電極１１に対応）、参照電極にはＡｇ／ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ）、対電極（第１対電極）にはＰｔ棒（直径１ｍｍ、長さ４ｃｍ、（株）ニラコ製）を用いた。下記において、電位はこの参照電極の電位に対する値を記載している。また、両方の面に金電極が設けられた水晶振動子（電極面積０．１９６ｃｍ２、基本振動周波数９ＭＨｚ、ＡＴカット、角型、（株）セイコー・イージーアンドジー製）を用いた。【００３８】
実施例１，４では検出対象の微生物として、緑膿菌（Pseudomonas  aeruginosa、ゼータ電位：−３３．８７ｍＶ）を用い、実施例２ではアシネトバクター（Acinetobactor  calcoaceticus、ゼータ電位：−２８．１４ｍＶ）、実施例３では大腸菌（Escherichia  coli）、実施例５では緑膿菌（Pseudomonas  aeruginosa）、大腸菌（Escherichia  coli）、アシネトバクター（Acinetobactor  calcoaceticus）、セラチア菌（Serratia  marcescens）用いた。図４、図５はそれぞれ緑膿菌、アシネトバクターの電子顕微鏡写真を示す。図４、図５に示す顕微鏡写真から、緑膿菌の形状は俵形であり、アシネトバクターの形状はそれよりも球状に近い形状であることがわかる。【００３９】
［実施例１］
＜センサーの作製＞
（金電極の粗面化工程）
金電極の表面に、過酸化ポリピロール層との密着性向上のため以下の手順にしたがい水晶振動子積層体の金電極表面の粗面化処理を行なった。
１．プラズマエッチング装置（ＳＥＤＥ／ｍｅｉｗａ  ｆｏｓｉｓ）により、金電極表面に３０秒間エッチングを行なった。
２．水晶振動子を、図３に示すようなＱＣＭセンサー３３のセル２７の底部に設置した。その後、３０ｎｍのクエン酸保護金ナノ粒子（０．０５７４ｗｔ％）を含んだ溶液５００μＬをセル２７に添加し、室温で２４時間放置した。
３．金電極を純水で洗浄後、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム溶液（０．１Ｍ）９ｍＬ、塩化金（III）酸四塩化物（０．０１Ｍ）２５０μＬ、ＮａＯＨ（０．１Ｍ）５０μＬ、アスコルビン酸（０．１Ｍ）５０μＬを混合して出来た溶液（成長液）５００μＬをセル２７に添加し、室温で２４時間静置した。
４．セル２７内の溶液を除去し、金電極を超純水で洗浄した。【００４０】
（微生物の鋳型を備えた過酸化ポリピロール層の作製）
以下の手順に従って金電極上に過酸化ポリピロール層を作製した。
１．緑膿菌、リン酸緩衝液(０．２Ｍ、ｐＨ２．５６）を含む０．１Ｍのピロール水溶液を調製して修飾溶液とした。
２．上記で粗面化処理を施した金電極が配置されているＱＣＭセンサー３３のセル２７内に、修飾溶液を添加し、修飾溶液内に第１対電極および参照電極を差し込んだ。
３．修飾溶液中において定電位電解(＋０．９７５Ｖ、９０秒間)することで金電極上にポリピロールを析出させ、ポリピロール層を作製した（重合工程）。重合工程においては、水晶振動子の共振周波数のモニターも行なった。
４．作製したポリピロール層にリゾチーム（１０ｍｇ／ｍＬ）を滴下し、１２０分間振盪し、その後非イオン性界面活性剤（商品名：ｔｒｉｔｏｎ）の１０％溶液を添加し、８０分間振盪した（溶菌工程）。
５．超純水で数回のポリピロール層の洗浄を行った後、セル２７内に０．１ＭのＮａＯＨ溶液を添加し、定電位＋９７５ｍＶを１２０秒間印加して過酸化処理を施し過酸化ポリピロール層を得た（過酸化工程）。過酸化工程においては、水晶振動子の共振周波数のモニターも行なった。【００４１】
（結果）
図６は、重合工程後のポリピロール層表面の電子顕微鏡写真を示す。ポリピロール層の表面に緑膿菌が取り込まれた様子が観察された。図７は、重合工程における時間と電流の関係、および時間と水晶振動子の共振周波数の関係を示すグラフである。定電位電解開始時点の時間を０秒とする。また、図８は、図７に示した共振周波数の変化量から水晶振動子の質量変化量を算出し、時間と質量変化の関係を示すグラフである。これらのグラフから、電解時間に比例して水晶振動子表面の質量が増加し、９０秒間で十分な質量変化、すなわち十分なポリピロール層の重合が達成されることがわかる。【００４２】
図９は、溶菌工程および過酸化工程後の過酸化ポリピロール層表面の電子顕微鏡写真を示す。過酸化ポリピロール層の表面に緑膿菌が観察されず、したがって過酸化ポリピロール層の表面から緑膿菌が放出されたことがわかる。図１０は、上記実施例１とは、溶菌工程におけるリゾチームを滴下した後の振盪時間、および非イオン性界面活性剤を添加した後の振盪時間の条件を変更して作製した過酸化ポリピロール層表面の電子顕微鏡写真を示す。図１０（ａ）は、リゾチームを滴下した後の振盪時間が３０分で非イオン性界面活性剤を添加した後の振盪時間が２０分とした場合、図１０（ｂ）は、リゾチームを滴下した後の振盪時間を６０分、非イオン性界面活性剤を添加した後の振盪時間を４０分とした場合、図１０（ｃ）はリゾチームを滴下した後の振盪時間が９０分で非イオン性界面活性剤を添加した後の振盪時間が６０分とした場合の電子顕微鏡写真を示す。図１０（ａ）〜（ｃ）から、これらの条件においては緑膿菌の放出が十分ではなく、したがって実施例１の溶菌工程の条件が好適な条件であることがわかる。【００４３】
図１１は、過酸化工程における時間と電流の関係、および時間と水晶振動子の共振周波数の関係を示すグラフである。過酸化工程における定電位印加時点の時間を０秒とする。電流値は時間とともに低下し過酸化処理が進行していることがわかる。また、共振周波数は増加し、電極表面の質量が低下していることがわかる。これは、緑膿菌が放出されたことによるものであると理解される。【００４４】
＜微生物の検出＞
（検出実験）
上述のようにして作製した、緑膿菌鋳型を有する過酸化ポリピロール層が表面に形成された水晶振動子をセルの底部に備えたＱＣＭセンサーを用いて微生物の検出を行なった。セル内に微生物を含む試料溶液を添加した。その後、金電極と第１対電極間に交流電圧を印加し、誘電泳動により微生物を過酸化ポリピロール層の表面へ濃縮させた。波形発生装置(７０７５、日置電機（株）製)により、交流電圧(波形：正弦波、電圧：２Ｖｐｐ、周波数：１０ＭＨｚ）を発生させた。さらに増幅器(ＨＡＳ４１０１,（株）エヌエフ回路設計ブッロク製)で電圧を１０倍に増幅し、２０Ｖｐｐとして印加した。また、電圧印加時の水晶振動子の共振周波数をモニタリングした。【００４５】
（結果）
図１２は、交流電圧印加時間と水晶振動子の共振周波数の関係を示すグラフである。図１２に示す結果から、緑膿菌を含む試料溶液を添加した検出実験では、共振周波数が大きく減少することが分かった。共振周波数の減少は水晶振動子表面の質量の増加を意味しており、緑膿菌に誘電泳動力が作用し過酸化ポリピロール層の鋳型に取り込まれることで水晶振動子表面の質量が増加したものと考えられる。一方、形状の異なるアシネトバクターに対してはブランクと同様にほとんど変化が見られなかった。よって、鋳型の形状とは異なるアシネトバクターは緑膿菌ほど容易に過酸化ポリピロール層に取り込まれていないと考えられ、センサーは細菌の種類を高精度に認識していると判断できる。【００４６】
［実施例２］
＜センサーの作製＞
実施例１の緑膿菌に代えて、アシネトバクターを用いた点以外は、実施例１と同様に金電極の粗面化工程を行ない、さらに上述の重合工程、溶菌工程、過酸化工程を行なった。【００４７】
（結果）
図１３は、重合工程後のポリピロール層表面の電子顕微鏡写真を示す。ポリピロール層の表面にアシネトバクターが取り込まれた様子が観察された。図１４は、重合工程における時間と電流の関係、および時間と水晶振動子の共振周波数の関係を示すグラフである。定電位電解開始時点の時間を０秒とする。このグラフから、電解時間に比例して水晶振動子表面の質量が増加したことがわかる。【００４８】
図１５は、溶菌工程および過酸化工程後の過酸化ポリピロール層表面の電子顕微鏡写真を示す。過酸化ポリピロール層の表面にアシネトバクターが観察されず、したがって過酸化ポリピロール層の表面からアシネトバクターが放出されたことがわかる。【００４９】
図１６は、過酸化工程における時間と電流の関係、および時間と水晶振動子の共振周波数の関係を示すグラフである。過酸化工程における定電位印加時点の時間を０秒とする。電流値は時間とともに低下し過酸化処理が進行していることがわかる。また、共振周波数は増加し、電極表面の質量が低下していることがわかる。これは、アシネトバクターが放出されたことによるものであると理解される。【００５０】
＜微生物の検出＞
（検出実験）
上述のようにして作製した、アシネトバクター鋳型を有する過酸化ポリピロール層が表面に形成された水晶振動子をセルの底部に備えたＱＣＭセンサーを用いて微生物の検出を行なった。実験条件は、実施例１と同様とした。【００５１】
（結果）
図１７は、交流電圧印加時間と水晶振動子の共振周波数の関係を示すグラフである。図１７に示す結果から、アシネトバクターを含む試料溶液を添加した検出実験では、共振周波数が大きく減少することが分かった。共振周波数の減少は水晶振動子表面の質量の増加を意味しており、アシネトバクターに誘電泳動力が作用し過酸化ポリピロール層の鋳型に取り込まれることで水晶振動子表面の質量が増加したものと考えられる。一方、形状の異なる緑膿菌に対してはブランクと同様にほとんど変化が見られなかった。よって、鋳型の形状とは異なる緑膿菌はアシネトバクターほど容易に過酸化ポリピロール層に取り込まれていないと考えられ、センサーは細菌の種類を高精度に認識していると判断できる。【００５２】
［実施例３］
＜センサーの作製＞
実施例１の緑膿菌に代えて、大腸菌を用いた点以外は、実施例１と同様に金電極の粗面化工程を行ない、さらに上述の重合工程、溶菌工程、過酸化工程を行なった。【００５３】
＜微生物の検出＞
（検出実験）
上述のようにして作製した、大腸菌鋳型を有する過酸化ポリピロール層が表面に形成された水晶振動子をセルの底部に備えたＱＣＭセンサーを用いて微生物の検出を行なった。測定サンプルとしては、緑膿菌・大腸菌・アシネトバクターのそれぞれの溶液を用いた。【００５４】
（結果）
図１８は、交流電圧印加時間と水晶振動子の共振周波数の関係を示すグラフである。図１８に示す結果から、大腸菌を含む試料溶液を添加した検出実験では、共振周波数が大きく減少することが分かった。共振周波数の減少は水晶振動子表面の質量の増加を意味しており、大腸菌に誘電泳動力が作用し過酸化ポリピロール層の鋳型に取り込まれることで水晶振動子表面の質量が増加したものと考えられる。一方、形状の異なる緑膿菌やアシネトバクターに対してはブランクと同様にほとんど変化が見られなかった。よって、鋳型の形状とは異なる緑膿菌やアシネトバクターは大腸菌ほど容易に過酸化ポリピロール層に取り込まれていないと考えられ、センサーは細菌の種類を高精度に認識していると判断できる。【００５５】
［実施例４］
＜センサーの作製＞
緑膿菌を用いて、実施例１と同様に金電極の粗面化工程を行ない、さらに上述の重合工程、溶菌工程、過酸化工程を行なった。【００５６】
＜微生物の検出＞
（検出実験）
上述のようにして作製した、緑膿菌鋳型を有する過酸化ポリピロール層が表面に形成された水晶振動子をセルの底部に備えたＱＣＭセンサーを用いて微生物の検出を行なった。測定サンプルとしては、緑膿菌・大腸菌・アシネトバクター・セラチア菌の各溶液を混合した溶液（ａ）と、大腸菌・アシネトバクター・セラチア菌の各溶液を混合した溶液（ｂ）の２種類を用いた。【００５７】
（結果）
図１９は、交流電圧印加時間と水晶振動子の共振周波数の関係を示すグラフである。図１９に示す結果から、緑膿菌を含む試料溶液を添加した検出実験では、共振周波数が大きく減少することが分かった。共振周波数の減少は水晶振動子表面の質量の増加を意味しており、緑膿菌に誘電泳動力が作用し過酸化ポリピロール層の鋳型に取り込まれることで水晶振動子表面の質量が増加したものと考えられる。一方、形状の異なる大腸菌やアシネトバクターやセラチア菌に対してはブランク（ｃ）と同様にほとんど変化が見られなかった。よって、鋳型の形状とは異なる大腸菌やアシネトバクターやセラチア菌は緑膿菌ほど容易に過酸化ポリピロール層に取り込まれていないと考えられ、センサーは細菌の種類を高精度に認識していると判断できる。【００５８】
［実施例５］
＜センサーの作製＞
緑膿菌、大腸菌、アシネトバクター、及びセラチア菌の全てを含む修飾溶液を用いて、実施例１と同様に金電極の粗面化工程を行ない、さらに上述の重合工程、溶菌工程、過酸化工程を行なった。【００５９】
＜微生物の検出＞
（検出実験）
上述のようにして作製した、４種類の微生物を含む鋳型を有する過酸化ポリピロール層が表面に形成された水晶振動子をセルの底部に備えたＱＣＭセンサーを用いて微生物の検出を行なった。測定サンプルとしては、緑膿菌、大腸菌、アシネトバクター、セラチア菌をそれぞれを含む４種類の溶液を用いた。【００６０】
（結果）
図２０〜図２３は、交流電圧印加時間と水晶振動子の共振周波数の関係を示すグラフである。図２０〜図２３は、緑膿菌、大腸菌、アシネトバクター、セラチア菌をそれぞれを含む試料溶液を添加した検出実験における結果を示し、いずれの試料溶液を添加した場合であっても共振周波数が大きく減少することが分かった。これより、複数種の微生物の鋳型を有するセンサーによって、複数種の微生物が検出されていると判断できる。
【符号の説明】
【００６１】
１１  検出用電極、１２  溶液、１３  微生物、１４  ポリマー層、１５  鋳型、１６  対電極（第１対電極）、１７  検出部、２１  コントローラ、２２  発振回路、２３  対電極（第２対電極）、２４  水晶片、２７  セル、２９  交流電源、３０  参照電極、３１  試料溶液、３２  水晶振動子、３３  ＱＣＭセンサー。
【図１】
2012121229.tif 000003
【図２】
2012121229.tif 000004
【図３】
2012121229.tif 000005
【図７】
2012121229.tif 000006
【図８】
2012121229.tif 000007
【図１１】
2012121229.tif 000008
【図１２】
2012121229.tif 000009
【図１４】
2012121229.tif 000010
【図１６】
2012121229.tif 000011
【図１７】
2012121229.tif 000012
【図１８】
2012121229.tif 000013
【図１９】
2012121229.tif 000014
【図２０】
2012121229.tif 000015
【図２１】
2012121229.tif 000016
【図２２】
2012121229.tif 000017
【図２３】
2012121229.tif 000018
【図４】
2012121229.tif 000019
【図５】
2012121229.tif 000020
【図６】
2012121229.tif 000021
【図９】
2012121229.tif 000022
【図１０】
2012121229.tif 000023
【図１３】
2012121229.tif 000024
【図１５】
2012121229.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成25年9月6日(2013.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
上記製造方法の好ましい形態において、上記過酸化工程は、中性からアルカリ性の範囲内の溶液の接触下にある上記検出用電極と上記対電極との間に電圧を印加して、上記ポリマー層を過酸化処理する工程である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
検出対象の微生物１３としては、全体または表面の電荷が負電荷過剰の状態にある微生物であれば特に限定されることはなく、大腸菌のEscherichia属、緑膿菌などのPseudomonas属、Acinetobacter calocoaceticusなどのAcinetobacter属を始め、Serratia属、Klebsiella属、Enterobacter属、Citrobacter属、Burkholderia属、Sphingomonas属、Chromobacterium属、Salmonella属、Vibrio属、Legionella属、Campylobacter属、Yersinia属、Proteus属、Neisseria属、Staphylococcus属、Streptococcus属、Enterococcus属、Clostridium属、Corynebacterium属、Listeria属、Bacillus属、Mycobacterium属、Chlamydia属、Rickettsia属、Haemophilus属の細菌が例示される。また、ウイルスとしては、A型肝炎ウィルス、アデノウィルス、ロタウィルス、ノロウィルスが、真菌としてはカンジダが、原虫としてはクリプトスポリジウムが例示される。微生物の全体または表面の電荷は、ｐＨなどの溶液１２の水質により変化する。たとえば、微生物の表面にはカルボキシル基、アミノ基、リン酸基などの種々の官能基があるが、それらの官能基を含む表面はｐＨが高くなると負に帯電する。そのため、鋳型を形成する際や測定する際に、負電荷過剰の状態にするために、たとえば、溶液１２をアルカリ性にするなどしても良い。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
［実施例１］
＜センサーの作製＞
（金電極の粗面化工程）
金電極の表面に、過酸化ポリピロール層との密着性向上のため以下の手順にしたがい水晶振動子積層体の金電極表面の粗面化処理を行なった。
１．プラズマエッチング装置（ＳＥＤＥ／ｍｅｉｗａ  ｆｏｓｉｓ）により、金電極表面に３０秒間エッチングを行なった。
２．水晶振動子を、図３に示すようなＱＣＭセンサー３３のセル２７の底部に設置した。その後、３０ｎｍのクエン酸保護金ナノ粒子（０．０５７４ｗｔ％）を含んだ溶液５００μＬをセル２７に添加し、室温で２４時間放置した。
３．金電極を純水で洗浄後、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム溶液（０．１Ｍ）９ｍＬ、四塩化金酸（０．０１Ｍ）２５０μＬ、ＮａＯＨ（０．１Ｍ）５０μＬ、アスコルビン酸（０．１Ｍ）５０μＬを混合して出来た溶液（成長液）５００μＬをセル２７に添加し、室温で２４時間静置した。
４．セル２７内の溶液を除去し、金電極を超純水で洗浄した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2012121229.tif 000026
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２】
2012121229.tif 000027
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３】
2012121229.tif 000028
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１７】
2012121229.tif 000029
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１８】
2012121229.tif 000030
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１９】
2012121229.tif 000031
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２２】
2012121229.tif 000032
【国際調査報告】
2012121229.tif 000033
2012121229.tif 000034
2012121229.tif 000035
2012121229.tif 000036