(57)【要約】【課題】  核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）を等温条件下で検出する方法、特に短鎖核酸をも直接検出することが可能な方法を提供すること。【解決手段】  本発明の試料中の標的核酸を検出する方法は、（ａ）５’から３’の方向に、第１の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び標的核酸に相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチドを用意する工程、（ｂ）前記試料に含まれる標的核酸をプライマーとして、前記ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位を認識するエンドヌクレアーゼの存在下に核酸増幅反応を行う工程、及び  （ｃ）前記核酸増幅反応によって得られる、第１の任意の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを検出する工程を含む。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸を検出する方法であって、
（ａ）５’から３’の方向に、第１の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び標的核酸に相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチドを用意する工程、
（ｂ）前記試料に含まれる標的核酸をプライマーとして、前記ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位を認識するエンドヌクレアーゼの存在下に核酸増幅反応を行う工程、及び
（ｃ）前記核酸増幅反応によって得られる、第１の任意の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを検出する工程
を含んでなる方法。
【請求項２】
試料中の標的核酸を検出する方法であって、
（ａ）５’から３’の方向に、第１の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び標的核酸に相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチド、及び５’から３’の方向に、第１の任意の配列と実質的に相同的な配列を有する第２の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び前記第１の任意の配列と実質的に相同的な配列を含む第２のオリゴヌクレオチドを用意する工程、
（ｂ）前記試料に含まれる標的核酸をプライマーとして、前記ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位を認識するエンドヌクレアーゼの存在下に核酸増幅反応を行う工程、及び
（ｃ）前記核酸増幅反応によって得られる、第２の任意の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを検出する工程
を含んでなる方法。
【請求項３】
（ｄ）濃度が既知の前記標的核酸、前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記エンドヌクレアーゼの存在下に核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応によって得られる、第１の任意の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを測定する工程；
（ｅ）前記工程（ｄ）を、異なる濃度の標的核酸について同様に行い、測定結果から検量線を作成する工程；
（ｆ）前記検量線に基づいて、検出されるべき標的核酸の濃度を決定する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｄ）において、更に前記第２のオリゴヌクレオチドの存在下に核酸増幅反応を行う、請求項３記載の方法。
【請求項５】
核酸増幅反応が等温で実施される、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記エンドヌクレアーゼがニッキングエンドヌクレアーゼである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ニッキングエンドヌクレアーゼが、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ及びＮｔ．ＢｓｍＡＩからなる群から選択される酵素である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
核酸増幅反応において、鎖置換機能を有するＤＮＡポリメラーゼが使用される、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
核酸増幅反応において用いられるＤＮＡポリメラーゼが、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた変異体を含む）、バチルス・ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルス・カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼが使用される、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
第１のオリゴヌクレオチドの３’末端が修飾されている、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
第２のオリゴヌクレオチドの３’末端が修飾されている、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
試料中の標的核酸を検出するためのキットであって、
５’から３’の方向に、第１の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び標的核酸に相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項１３】
試料中の標的核酸を検出するためのキットであって、
５’から３’の方向に、第１の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び標的核酸に相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチドと、
５’から３’の方向に、第１の任意の配列と実質的に相同的な配列を有する第２の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び前記第１の任意の配列と実質的に相同的な配列を含む第２のオリゴヌクレオチドとを含むキット。
【請求項１４】
第１のオリゴヌクレオチドの３’末端が修飾されている、請求項１２又は１３記載のキット。
【請求項１５】
第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドの３’末端が修飾されている、請求項１３記載のキット。
【請求項１６】
更にＤＮＡポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼを含む、請求項１２〜１５のいずれか１項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子解析等において有用な核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の検出方法に関する。特には、短鎖の核酸であっても検出することのできる、標的核酸の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）の検出は微生物の存在の評価、感染症の診断、遺伝子多型の評価、疾患のプロファイリング等、医学や生物学をはじめ食品の検査、環境評価、法医学等の幅広い分野、用途において重要である。さらに近年、生命活動において重要な役割を担う短鎖の核酸（ｍｉＲＮＡ等）が多数発見されており、このような短鎖の核酸を検出することのできる手法の必要性が高まっている。【０００３】
核酸の高感度かつ特異的な検出法としてＰＣＲ増幅法が一般的に行われている（米国特許第４６８３１９５号、米国特許第４６８３２０２号、米国特許第４８００１５９号等）。ＰＣＲ法においては、例えば、二本鎖鋳型ＤＮＡの一本鎖への解離（変性）、一本鎖鋳型ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖合成（伸長）の３工程からなる反応により核酸の増幅が行われる。通常のＰＣＲ法においてはサーマルサイクラーを使用して、変性工程、アニーリング工程、伸長工程を異なる温度で行っている。このため、このような反応を行う高価な温度サイクル制御装置が必要であり、フィールド検査やポイントオブケア（ベッドサイド）診断、安価な検査ができないという問題がある。また、３種類の異なる温度で反応を行なうので、温度制御が煩雑であり、またサイクル数に比例して時間のロスが増大するという問題もあった。更に、指数関数的な増幅には複数のプライマーを必要とし、プライマー結合配列を確保できない短鎖の核酸を直接検出することは不可能である。そこで、前処理として標的核酸にプライマー配列を付加する他の反応を組み合わせて増幅を行うことも提案されているが、付加反応の工程が加わることで検出操作がより煩雑かつ長時間になり、使用する試薬も増えるだけでなく、この工程により、サンプルを一部もしくはすべて失うことによる感度の低下や定量性が失われる危険性があり、また、異なる配列に対する付加工程の効率のバラつきによって、複数サンプル間の量比の情報も失われる危険性がある。【０００４】
そこで、ＰＣＲ法に代わる核酸増幅方法とし、等温状態で実施することができる方法が開発されている。このような方法としては、例えば、Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｍ．Ｃ．Ｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｇ．Ｎａｄｅａｕ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｄ．Ｓｈａｎｋ“Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｙ  ａ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ／ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９６（１９９２）や特公平７−１１４７１８号公報に記載の鎖置換型増幅法（ＳＤＡ法；ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、国際公開第００／２８０８２号パンフレットに記載のＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、国際公開第０２／１６６３９号パンフレットに記載のＩＣＡＮ法（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）等がある。【０００５】
Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒらに記載されたＳＤＡ法においては、検出標的核酸が含まれない系でも検出反応が起こる場合があり、感度、特異性の評価には疑問がある。また、特公平７−１１４７１８号公報に記載のＳＤＡ法においては、最終的にＤＮＡが増幅される系において、ＤＮＡポリメラーゼと制限エンドヌクレアーゼが介する二本鎖の置換により、試料中の目的核酸（およびその相補鎖）の増幅が可能となる。この方法では、４種類のプライマーが必要とされ、その内の２種類は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むように設計する必要がある。この方法を直接短鎖核酸の増幅のために用いることはできなかった。【０００６】
また、前記ＬＡＭＰ法においても、４種類のプライマーが必要とされ、それらが６個所の領域を認識することにより、目的遺伝子の増幅が可能となる。すなわち、この方法では、まず、第一のプライマーが鋳型鎖にアニーリングして伸長反応が起こり、次に、第一のプライマーよりも上流側に設計された第二のプライマーによる鎖置換反応により第一のプライマーによる伸長鎖が鋳型鎖から分離する。この時に、剥ぎ取られた第一のプライマー伸長産物の構成に起因して伸長鎖の５’末端部分でステムループ構造が形成されるものであって、この方法を直接短鎖核酸の増幅のために用いることはできなかった。【０００７】
また、Ｙ．Ｗｅｉｚｍａｎｎ，Ｍ．Ｋ．Ｂｅｉｓｓｅｎｈｉｒｔｚ，Ｚ．Ｃｈｅｇｌａｋｏｖ，Ｒ．Ｎｏｗａｒｓｋｉ  ａｎｄ  Ｉ．Ｗｉｌｌｎｅｒ“Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｓｐｏｔｌｉｇｈｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ＤＮＡ  ｍａｃｈｉｎｅ”Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４５，７３８４−７３８８（２００６）には、ニッキング能と鎖置換能を持つＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応において、検出標的核酸と結合する配列をプライマーに用いて酵素活性を持つＤＮＡ（デオキシリボザイム）を合成し，さらにデオキシリボザイムによるペルオキシダーゼ反応で生成される分子をシグナルとして検出を行っている。この方法においても、短鎖核酸の検出は行っていなかった。【０００８】
【特許文献１】米国特許第４６８３１９５号
【特許文献２】米国特許第４６８３２０２号
【特許文献３】米国特許第４８００１５９号等
【特許文献４】特公平７−１１４７１８号公報
【特許文献５】国際公開第００／２８０８２号パンフレット
【特許文献６】国際公開第０２／１６６３９号パンフレット
【非特許文献１】Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｍ．Ｃ．Ｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｇ．Ｎａｄｅａｕ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｄ．Ｓｈａｎｋ“Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｙ  ａ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ／ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９６（１９９２）
【非特許文献２】Ｙ．Ｗｅｉｚｍａｎｎ，Ｍ．Ｋ．Ｂｅｉｓｓｅｎｈｉｒｔｚ，Ｚ．Ｃｈｅｇｌａｋｏｖ，Ｒ．Ｎｏｗａｒｓｋｉ  ａｎｄ  Ｉ．Ｗｉｌｌｎｅｒ“Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｓｐｏｔｌｉｇｈｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ＤＮＡ  ｍａｃｈｉｎｅ”Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４５，７３８４−７３８８（２００６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的は、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）を等温条件下で高感度で検出する方法、特に短鎖核酸をも直接検出することが可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明者らは鋭意検討し、特定のオリゴヌクレオチドを用い、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの存在下に核酸増幅反応を行うことによって、上記目的を達成し得ることを見出し、本発明を完成させた。【００１１】
すなわち、本発明は、試料中の標的核酸を検出する方法であって、（ａ）５’から３’の方向に、第１の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び標的核酸に相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチドを用意する工程、（ｂ）前記試料に含まれる標的核酸をプライマーとして、前記ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位を認識するエンドヌクレアーゼの存在下に核酸増幅反応を行う工程、及び（ｃ）前記核酸増幅反応によって得られる、第１の任意の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを検出する工程を含んでなる方法を提供するものである。
また、本発明は、試料中の標的核酸を検出する方法であって、（ａ）５’から３’の方向に、第１の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び標的核酸に相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチド、及び５’から３’の方向に、第１の任意の配列と実質的に相同的な配列を有する第２の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び前記第１の任意の配列と実質的に相同的な配列を含む第２のオリゴヌクレオチドを用意する工程、（ｂ）前記試料に含まれる標的核酸をプライマーとして、前記ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位を認識するエンドヌクレアーゼの存在下に核酸増幅反応を行う工程、及び（ｃ）前記核酸増幅反応によって得られる、第２の任意の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを検出する工程を含んでなる方法を提供する。
また、本発明の方法は、（ｄ）濃度が既知の前記標的核酸、前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記エンドヌクレアーゼの存在下に核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応によって得られる、第１の任意の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを測定する工程；（ｅ）前記工程（ｄ）を、異なる濃度の標的核酸について同様に行い、測定結果から検量線を作成する工程；（ｆ）前記検量線に基づいて、検出されるべき標的核酸の濃度を決定する工程を含んでもよい。
また、前記工程（ｄ）において、更に前記第２のオリゴヌクレオチドの存在下に核酸増幅反応を行ってもよい。【００１２】
本発明の標的核酸を検出する方法は、核酸増幅反応が等温で実施されることが好ましい。
前記エンドヌクレアーゼとしてはニッキングエンドヌクレアーゼを用いることができる。
本発明において用いられるニッキングエンドヌクレアーゼとしては、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ及びＮｔ．ＢｓｍＡＩが挙げられる。
本発明の標的核酸を検出する方法における核酸増幅反応においては、好ましくは鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼが使用される。
本発明の標的核酸を検出する方法においては、核酸増幅反応において用いられるＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた変異体を含む）、バチルス・ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、又はバチルス・カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼが使用される。
好ましくは、前記第１のオリゴヌクレオチドの３’末端は修飾されている。
また、好ましくは前記第２のオリゴヌクレオチドの３’末端は修飾されている。
また、本発明は、試料中の標的核酸を検出するためのキットであって、５’から３’の方向に、第１の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び標的核酸に相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチドを含むキットを提供する。
また、本発明は、試料中の標的核酸を検出するためのキットであって、５’から３’の方向に、第１の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び標的核酸に相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチドと、５’から３’の方向に、第１の任意の配列と実質的に相同的な配列を有する第２の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び前記第１の任意の配列と実質的に相同的な配列を含む第２のオリゴヌクレオチドとを含むキットを提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の標的核酸を検出する方法によれば、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）を等温条件下でも検出することができ、特に短鎖核酸をも直接検出することが可能である。また、本発明の方法によれば、標的核酸を容易に定量することが可能である。また、本発明の方法は、種々の不純物が含まれる試料中の標的核酸を検出、定量することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の標的核酸の検出方法の作用機序を模式的に示す図である。
【図２】本発明の標的核酸の検出方法の作用機序を模式的に示す図である。
【図３】配列変換ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図４】配列変換ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図５】配列変換ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図６】配列変換ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図７】配列変換ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図８】配列変換ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図９】配列変換ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図１０】配列変換ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図１１】配列変換ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図１２】配列変換ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図１３】配列変換ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図１４】配列変換ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図１５】配列変換ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図１６】配列変換ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図１７】配列変換ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図１８】配列変換ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図１９】配列変換ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図２０】配列変換ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図２１】配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図２２】配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図２３】配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図２４】配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図２５】配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図２６】配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図２７】配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図２８】配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図２９】配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図３０】配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図３１】配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図３２】配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図３３】配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図３４】２種の標的核酸を含む溶液中で、それぞれの標的核酸に対する検出を同時に行うことが可能であることを確認した結果を示すグラフである。
【図３５】標的核酸の濃度によって、蛍光強度がある値に達するまでの時間が変化することを確認した結果を示すグラフである。
【図３６】図３５の結果から作成した検量線である。
【図３７】標的核酸以外の核酸を含む場合にも検出が可能であることを確認した結果を示すグラフである。
【図３８】配列変換ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【図３９】配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを用いて実施した核酸の検出の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の試料中の標的核酸を検出する方法について説明する。
まず、本発明の試料中の標的核酸を検出する方法の第一の実施態様について説明する。
本発明の試料中の標的核酸を検出する方法は、（ａ）５’から３’の方向に、第１の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び標的核酸に相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチドを用意する工程、（ｂ）前記試料に含まれる標的核酸をプライマーとして、前記ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位を認識するエンドヌクレアーゼの存在下に核酸増幅反応を行う工程、及び（ｃ）前記核酸増幅反応によって得られる、第１の任意の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを検出する工程を含んでなる。【００１６】
まず、工程（ａ）について図面を参照しつつ説明する。図１は、本発明の標的核酸を検出する方法の第１の実施態様の作用機序を示す図である。まず、５’から３’の方向に、第１の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び標的核酸に相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチド（以下、本明細書において配列変換ＤＮＡともいう）について説明する。配列変換ＤＮＡは、５’から３’の方向に、第１の任意の配列（Ａ）、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位（Ｂ）及び標的核酸に相補的な配列（Ｃ）を含む。【００１７】
本発明の標的核酸を検出する方法においては、配列変換ＤＮＡを用意する。配列変換ＤＮＡにおける第１の任意の配列は、５’末端側に第１の任意の配列を有する。第１の任意の配列は、後述するように、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応の鋳型となる部位であり、どのような配列のものであってもよいが、その塩基数も、特に制限はないが、扱いやすさの点から５〜５０塩基程度、又は５〜３０塩基程度、又は１０〜２０塩基長程度でよい。【００１８】
ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位（Ｂ）について説明する。本明細書において「ニッキング反応」とは、二本鎖核酸のいずれか一方の鎖のみを切断する反応を意味する。従って、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位（Ｂ）は、特定の配列を有する二本鎖ＤＮＡの一方の鎖のみを切断するエンドヌクレアーゼによって認識される部位であり、後述するように、ＤＮＡポリメラーゼの作用によりＤＮＡの伸長が開始された後、伸長されたオリゴヌクレオチドの部分が切断されるようになっている。本発明において用いられるエンドヌクレアーゼは、ニッキング反応に用い得るものであれば特に制限なく用いることができる。このような反応に用いられる多くのエンドヌクレアーゼが認識配列とともに知られており、当業者であれば、これらのエンドヌクレアーゼの中から適宜選択して使用することができる。このようなエンドヌクレアーゼとしては、例えば、ニッキングエンドヌクレアーゼ、制限酵素等が挙げられる。
制限酵素は、通常は二本鎖の両方の鎖を切断する酵素であるが、例えば、制限酵素によって切断されない化学修飾を二本鎖核酸の一方の鎖に施すことにより、他方の鎖のみを切断するニッキング反応に用いられることができる（例えば、特許文献４参照）。具体例として、例えば、一方の鎖のホスホジエステル結合の酸素原子を硫黄原子に置換することにより、ニッキング反応に用いることが可能となる。
ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼとしてはニッキングエンドヌクレアーゼが用いられる。ニッキングエンドヌクレアーゼを用いることにより、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖のホスホジエステル結合が開裂して、開裂部位の５’側にリン酸基が生じ、３’側にはヒドロキシル基が生じる。ニッキングエンドヌクレアーゼとしては、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩが挙げられる。【００１９】
標的核酸に相補的な配列（Ｃ）は、検出しようとする標的核酸の配列、塩基数等を考慮して設計すればよいが、本発明の標的核酸を検出する方法は短鎖の核酸も検出することが可能である。
例えば、標的核酸としてヒトのマイクロＲＮＡ配列に相当する配列、ＴＧＧＣＴＣＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧ（配列番号：１）（ｈｓａ−ｍｉＤ−２４）を検出しようとする場合、配列変換ＤＮＡのＣの部分の配列としては、ＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＡＧＣＣＡ（配列番号：２）、ＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣ（配列番号：３）等が用いられる。また、標的核酸としてヒトのマイクロＲＮＡ配列に相当する配列、ＡＧＣＡＧＣＡＴＴＧＴＡＣＡＧＧＧＣＴＡＴＣＡ（配列番号：４）（ｈｓａ−ｍｉＤ−１０７）を検出しようとする場合、配列変換ＤＮＡのＣの部分の配列としては、ＴＧＡＴＡＧＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣ（配列番号：５）、ＴＧＡＴＡＧＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＣＴ（配列番号：６）等が用いられる。また、標的核酸としてヒトのマイクロＲＮＡ配列に相当する配列、ＡＧＣＴＡＣＡＴＴＧＴＣＴＧＣＴＧＧＧＴＴＴＣ（配列番号：７）（ｈｓａ−ｍｉＤ−２２１）を検出しようとする場合、配列変換ＤＮＡのＣの部分の配列としては、ＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣＡＧ（配列番号：８）、ＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣ（配列番号：９）、ＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＡＴＧＴＡＧＣＴ（配列番号：１０）等が用いられる。
また、本発明の試料中の標的核酸を検出する方法は、例えば、癌や感染症の診断に用いることができる。例えば、癌や感染症の原因となる細菌やウイルスの保持している特定の核酸や、癌に特異的な塩基配列を含む核酸の検出（定量）を行なうことにより、癌や感染症の診断が可能となる。感染症の診断を行う場合、感染症の原因となる細菌やウイルスが有する、特異的な核酸配列を検出することにより、診断が可能である。また、癌細胞と正常細胞とで転写量が異なるＲＮＡを検出（定量）して行なう癌の診断も可能である。すなわち、細菌やウイルスの核酸を、その細菌やウイルスに特異的な塩基配列が３’末端になるように制限酵素などにより切断し、切断された核酸を標的核酸として用い、この標的核酸に相補的な配列を含むように、配列変換ＤＮＡを設計することにより実施が可能である。また、細菌やウイルスの核酸の特異的配列に相補的な配列を有する、アダプターに用いるための適切なヘアピン構造をとるＤＮＡを設計し、その際に、アダプター用ヘアピンＤＮＡの配列の３’ 末端部分に相補的な配列を含むように、配列変換ＤＮＡを設計することにより、特定の配列を含むか否かを検出することが可能になる。
なお、本明細書において、塩基配列を記載する場合、核酸の５’側端から３’側端の方向に記載した。【００２０】
なお、配列変換ＤＮＡの３’末端側には、３’末端側より伸長反応が起こらないように、３’末端を修飾しておくことが好ましい。このような修飾の例としては、例えば、ＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ、ＦＡＭ等が挙げられる。その他、ビオチン化、蛍光色素、リン酸化、チオール化、アミノ化等による修飾であってもよい。【００２１】
配列変換ＤＮＡにおいては、第１の任意の配列（Ａ）とニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位（Ｂ）との間、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位（Ｂ）と標的核酸に相補的な配列（Ｃ）との間、標的核酸に相補的な配列（Ｃ）の３’末端側に、反応に影響を与えない介在配列を含んでいてもよい。また、第１の任意の配列（Ａ）とニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位（Ｂ）の配列の塩基が一部重複していてもよく、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位（Ｂ）の配列と標的核酸に相補的な配列（Ｃ）の塩基が一部重複していてもよい。配列変換ＤＮＡは、公知の方法、例えば、ホスホアミダイト法、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等を用いて合成することができる。【００２２】
本発明の標的核酸を検出する方法の工程（ｂ）は、試料に含まれる標的核酸をプライマーとして、前記ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位を認識するエンドヌクレアーゼの存在下に核酸増幅反応を行う工程である。
図１に示すように、検出しようとする標的核酸（Ｄ）が試料中に存在する場合、その標的核酸（Ｄ）は、それと相補的な配列（Ｃ）にハイブリダイズし、この標的核酸がプライマーとして作用し、ＤＮＡポリメラーゼが作用し、核酸増幅反応が行われる。核酸増幅反応の反応条件は、利用する核酸増幅反応に従って、当業者であれば適宜決定することができる。【００２３】
本発明の標的核酸を検出する方法において用いられる試料としては、本発明において検出しようとする標的核酸が含まれている可能性のあるあらゆる試料を用いることができ、これらの試料から調製、あるいは単離したものでもよい。このような核酸を含む試料には特に限定はないが、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織（例えば、癌組織、リンパ節等）、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物等）のような生体由来試料、ウイロイド、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、ウイルス又は細菌のような微生物が混入もしくは感染している可能性のある試料（食品、生物学的製剤等）、又は土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料等が挙げられる。また、このような試料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物を試料として用いてもよい。このような調製物としては、例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の核酸、又は特定の核酸分子群、例えば、ｍＲＮＡを富化した試料等が挙げられる。また、本発明の標的核酸を検出する方法において用いられる試料としては、上述したような生物又は天然由来のものに限定されず、合成オリゴヌクレオチドを含む試料も用いられる。
また、本発明の標的核酸を検出する方法において、検出対象となる核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡのどちらでもよい。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれ、ＲＮＡには、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ａＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び合成ＲＮＡのいずれもが含まれるが、これらに限定されるものではなく、ＤＮＡ又はＲＮＡに分類される全てのオリゴヌクレオチドが検出対象となる。また、ＤＮＡ及びＲＮＡで構成されるキメラオリゴヌクレオチドや非天然塩基を含むオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ及びＲＮＡ以外の核酸分子も本発明における検出対象である。本発明においては、短鎖の核酸であっても高感度で検出することが可能である。【００２４】
本発明の標的核酸を検出する方法は、前記ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するニッキングエンドヌクレアーゼの存在下に核酸増幅反応を行なうものであり、ニッキングエンドヌクレアーゼについては前述した通りである。【００２５】
本発明においては、核酸増幅反応は等温下で行なうことが好ましい。ここで、「等温」とは、酵素及びプライマー（本発明においては、試料中の標的核酸がプライマーとして機能する）が実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。更に、「ほぼ一定の温度条件」とは、設定された温度を正確に保持することのみならず、酵素及びプライマーの実質的な機能を損なわない程度の温度変化であれば許容されることを意味する。一定の温度条件下における核酸増幅反応は、使用する酵素の活性を維持できる温度（反応が進行するにつれ、酵素活性が減衰する場合であっても、本発明の方法を実施できる温度であればよいことを意味する）に保つことにより実施することができる。また、この核酸増幅反応において、プライマーとしての標的核酸が第１のオリゴヌクレオチドにアニーリングするように、ストリンジェンシーのレベルを設定することが好ましい。従って、反応温度は、好ましくは、約２０℃〜約７５℃であり、更に好ましくは、約３５℃〜約６５℃とする。【００２６】
核酸増幅反応に用いられるＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性（鎖置換能）を有するものであることが好ましく、常温性、中温性又は耐熱性のいずれのものも好適に用いることができる。また、このＤＮＡポリメラーゼは、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものであることが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた変異体を含む）、バチルス・ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルス・カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。【００２７】
核酸増幅反応に用いられるその他の試薬としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の金属塩、ｄＮＴＰミックス等の基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液を使用することができる。さらに、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）やベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）等の添加物、国際公開第９９／５４４５５号パンフレットに記載の酸性物質、陽イオン錯体等を使用してもよい。【００２８】
次に、工程（ｃ）について説明する。工程（ｃ）は、工程（ｂ）における核酸増幅反応によって得られる、第１の任意の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを検出する工程である。本発明の標的核酸を検出する方法について図面を参照しつつ説明する。図１に示すように、検出しようとする標的核酸（Ｄ）が試料中に存在する場合、その標的核酸（Ｄ）は、それと相補的な配列変換ＤＮＡの（Ｃ）の部位にハイブリダイズし、この標的核酸（Ｄ）がプライマーとして作用し、ＤＮＡポリメラーゼが作用し、核酸増幅反応が行われ、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応の産物としての配列（Ｅ）が生成する。次いで、配列（Ｅ）が生成したことで、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位（Ｂ）が二本鎖になり、ニッキングエンドヌクレアーゼがこれを認識して（Ｅ）を切断してオリゴヌクレオチド（Ｆ）を生成し、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼによって生成したオリゴヌクレオチド（Ｆ）が配列変換ＤＮＡから遊離する。ＤＮＡポリメラーゼは、この反応を繰り返し、オリゴヌクレオチド（Ｆ）は線形的（比例的）に増幅される。本明細書において、このオリゴヌクレオチド（Ｆ）（以下に説明する、第二の実施態様におけるオリゴヌクレオチドも同様に）をシグナルＤＮＡともいう。
本発明の標的核酸を検出する方法においては、このようにして生成されたシグナルＤＮＡを検出する。すなわち、図１に示す標的核酸（Ｄ）が存在しない場合には、図１及び図２に示す核酸増幅反応が進行しないため、シグナルＤＮＡは生成されないが、標的核酸（Ｄ）が存在すると、シグナルＤＮＡが生成され、このシグナルＤＮＡを検出することにより、標的核酸（Ｄ）の存在することがわかる。本発明の標的核酸を検出する方法においては、標的核酸（Ｄ）が微量に存在すれば、上述のシグナルＤＮＡが増幅されるので、感度の高い検出法である。【００２９】
上記反応幅反応によって得られた増幅産物であるシグナルＤＮＡの存在は、当該技術分野において公知の方法により検出できる。例えば、ゲル電気泳動によれば、エチジウムブロマイドでゲルを染色することによって増幅産物を検出することができ、増幅産物であるオリゴヌクレオチドの配列及び長さについても、検出しようとするオリゴヌクレオチドと相補的な配列のオリゴヌクレオチドとをハイブリダイゼーションした上でゲル電気泳動する方法によって確認できる。また、増幅産物を検出するための検出系としては、蛍光偏光、イムノアッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移、酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミンなど）、ケミルミネッセンス、又はバイオルミネッセンスなどを用いることができる。更に、Ｔａｑｍａｎプローブや分子ビーコンを利用して検出することもできる。ビオチンなどで標識した標識ヌクレオチドを使用することによって増幅物を検出することもできる。この場合、増幅産物中のビオチンは、蛍光標識アビジン又は酵素標識アビジンなどを用いて検出することができる。また、当業者に公知の酸化還元型インターカレーターを使用することで、電極により増幅産物を検出することもできる。また、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）を用いて増幅産物を検出してもよい。【００３０】
本発明の、試料中の標的核酸を検出する方法は、試料中の標的核酸を定量することに用いることもできる。すなわち本発明は、前記方法において、更に（ｄ）濃度が既知の前記標的核酸、前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記エンドヌクレアーゼの存在下に核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応によって得られる、第１の任意の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを測定する工程；（ｅ）前記工程（ｄ）を、異なる濃度の標的核酸について同様に行い、測定結果から検量線を作成する工程；（ｆ）前記検量線に基づいて、検出されるべき標的核酸の濃度を決定する工程を含む、方法を提供する。
すなわち、本発明は、濃度が既知の標的核酸を含む系において、前記に説明した方法を実施し、この方法を異なる濃度の標的核酸を含む系において実施し、測定結果から検量線を作成する（工程（ｅ））ことを含む方法が提供される。次いで、工程（（ｅ））において求められた検量線に基づいて、検出しようとする標的核酸の濃度を決定する（工程（ｆ））。
検量線は、例えば、蛍光を測定することにより、標的核酸を検出する場合、蛍光強度から検量線を作成することができる。【００３１】
次に、本発明の試料中の標的核酸を検出する方法の第二の実施態様について説明する。
本発明の試料中の標的核酸を検出する方法の第二の実施態様は、試料中の標的核酸を検出する方法であって、（ａ）５’から３’の方向に、第１の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び標的核酸に相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチド、及び５’から３’の方向に、第１の任意の配列と実質的に相同的な配列を有する第２の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び前記第１の任意の配列と実質的に相同的な配列を含む第２のオリゴヌクレオチドを用意する工程、（ｂ）前記試料に含まれる標的核酸をプライマーとして、前記ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位を認識するエンドヌクレアーゼの存在下に核酸増幅反応を行う工程、及び（ｃ）前記核酸増幅反応によって得られる、第２の任意の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを検出する工程を含んでなる。【００３２】
まず、工程（ａ）について図面を参照しつつ説明する。図１及び図２は、本発明の標的核酸を検出する方法の作用機序を示す図である。図１については前述した通りである。本発明の標的核酸を検出する方法において用いられる第２のオリゴヌクレオチド（以下、本明細書においてシグナル増幅ＤＮＡともいう）は、５’から３’の方向に、第１の任意の配列と実質的に相同的な配列を有する第２の任意の配列（Ａ’）、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位（Ｂ）及び前記第１の任意の配列と実質的に相同的な配列（Ｃ’）を含む（図２参照）。【００３３】
本発明の標的核酸を検出する方法においては、配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを用意する。配列変換ＤＮＡにおける第１の任意の配列は、５’末端側に第１の任意の配列を有する。第１の任意の配列は、後述するように、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応の鋳型となる部位であり、どのような配列のもであってもよいが、その塩基数も、特に制限はないが、扱いやすさの点から５〜５０塩基程度、又は５〜３０塩基程度、又は１０〜２０塩基長程度でよい。【００３４】
ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位（Ｂ）、制限酵素については前述した通りである。ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼとしてはニッキングエンドヌクレアーゼが用いられ、前述したのと同様である。【００３５】
次に、第２のオリゴヌクレオチド（シグナル増幅ＤＮＡ）について説明する。シグナル増幅ＤＮＡは、５’末端側に、第１の任意の配列と実質的に相同的な配列を有する第２の任意の配列を有する。この第２の任意の配列は、後述するように、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応の鋳型となる部位であり、第１の任意の配列と実質的に相同的な配列を有するものである。また、本発明の標的核酸を検出する方法においては、この第２の任意の配列を鋳型として伸長された、この部分に相補的な鎖を検出するものである。その点については後述する。第２の任意の配列と第１の任意の配列とは実質的に相同的な配列を有しており、このため、例えば、後述するような分子ビーコンを用いて増幅産物を検出する場合には、第１の任意の配列に対して相補的な配列のオリゴヌクレオチド、第２の任意の配列に対して相補的な配列の両者を検出することが可能となる。
なお、実質的に相同的とは、完全に同一の配列を有することであってもよいが、例えば、後述するような分子ビーコンを用いて増幅産物を検出する場合に、増幅反応によって生成する第１の任意の配列に相補的な配列と、第二の任意の配列に相補的な配列とが同一の分子ビーコンによって検出できる程度に、１〜５個、又は１〜４個、又は１〜３個、又は１〜２個、又は１個の塩基が欠失、置換又は付加されていてもよく、また、いずれかに分子ビーコンとの反応を阻害しない程度の配列が付加されていてもよい。【００３６】
シグナル増幅ＤＮＡにおける、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位（Ｂ）は、上述した、配列変換ＤＮＡにおいて説明したものと同様である。配列変換ＤＮＡに含まれるニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位と、シグナル増幅ＤＮＡに含まれるエンドヌクレアーゼ認識部位とは同一であってもよく、異なるものであってもよいが、本発明の標的核酸を検出する方法は、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位を認識するエンドヌクレアーゼの存在下に実施するので、配列変換ＤＮＡとシグナル増幅ＤＮＡとで、同一のエンドヌクレアーゼ認識部位を有している場合には、１種類のエンドヌクレアーゼのみ用いて反応を行うことができるので、同一であることが好ましい。【００３７】
前記第１の任意の配列と実質的に相同的な配列（Ｃ’）は、前記第１の任意の配列（Ａ）からＤＮＡポリメラーゼの作用により生成したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする配列を意味する。従って、第１の任意の配列と実質的に相同的な配列（Ｃ’）は、第１の任意配列（Ａ）と全て同一であることが好ましいが、例えば、塩基長は必ずしも同じである必要はなく、後述する反応において、プライマーとして機能すれば特に制限はなく、１〜５個、又は１〜４個、又は１〜３個、又は１〜２個、又は１個の塩基が欠失、置換又は付加されていてもよい。【００３８】
なお、シグナル増幅ＤＮＡの３’末端側には、３’末端側より伸長反応が起こらないように、３’末端を修飾しておくことが好ましい。このような修飾の例としては、配列変換ＤＮＡについて説明したのと同様である。【００３９】
シグナル増幅ＤＮＡにおいては、第２の任意の配列（Ａ’）とニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位（Ｂ）との間、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位（Ｂ）と第１の任意の配列と実質的に相同的な配列（Ｃ’）との間、第１の任意の配列と実質的に相同的な配列（Ｃ’）の３’末端側に、反応に影響を与えない介在配列を含んでいてもよい。また、第２の任意の配列（Ａ’）とニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位（Ｂ）の配列の塩基が一部重複していてもよく、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位（Ｂ）の配列と第１の任意の配列と実質的に相同的な配列（Ｃ'）の塩基が一部重複していてもよい。シグナル増幅ＤＮＡは、公知の方法、例えば、ホスホアミダイト法、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等を用いて合成することができる。【００４０】
本発明の標的核酸を検出する方法の工程（ｂ）は、試料に含まれる標的核酸をプライマーとして、前記ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位を認識するエンドヌクレアーゼの存在下に核酸増幅反応を行う工程であって、前述した、第一の実施態様と同様である。【００４１】
本発明の標的核酸を検出する方法において用いられる試料、検出対象となる核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡのどちらでもよい。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれ、ＲＮＡには、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ａＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び合成ＲＮＡのいずれもが含まれるが、これらに限定されるものではなく、ＤＮＡ又はＲＮＡに分類される全てのオリゴヌクレオチドが検出対象となる。また、ＤＮＡ及びＲＮＡで構成されるキメラオリゴヌクレオチドや非天然塩基を含むオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ及びＲＮＡ以外の核酸分子も本発明における検出対象である。本発明においては、短鎖の核酸であっても高感度で検出することが可能である。【００４２】
本発明の標的核酸を検出する方法は、前記ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するニッキングエンドヌクレアーゼの存在下に核酸増幅反応を行なうものであり、ニッキングエンドヌクレアーゼについては前述した通りである。【００４３】
本発明においては、核酸増幅反応は等温下で行なうことが好ましい。ここで、「等温」とは、酵素及びプライマー（本発明においては、試料中の標的核酸がプライマーとして機能する）が実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。更に、「ほぼ一定の温度条件」とは、設定された温度を正確に保持することのみならず、酵素及びプライマーの実質的な機能を損なわない程度の温度変化であれば許容されることを意味する。一定の温度条件下における核酸増幅反応は、使用する酵素の活性を維持できる温度（反応が進行するにつれ、酵素活性が減衰する場合であっても、本発明の方法を実施できる温度であればよいことを意味する）に保つことにより実施することができる。また、この核酸増幅反応において、プライマーとしての標的核酸が第１のオリゴヌクレオチドにアニーリングするように、ストリンジェンシーのレベルを設定することが好ましい。従って、反応温度は、好ましくは、約２０℃〜約７５℃であり、更に好ましくは、約３５℃〜約６５℃とする。【００４４】
核酸増幅反応に用いられるＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性（鎖置換能）を有するものであることが好ましく、常温性、中温性又は耐熱性のいずれのものも好適に用いることができる。また、このＤＮＡポリメラーゼは、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものであることが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた変異体を含む）、バチルス・ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルス・カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。【００４５】
核酸増幅反応に用いられるその他の試薬としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の金属塩、ｄＮＴＰミックス等の基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液を使用することができる。さらに、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）やベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）等の添加物、国際公開第９９／５４４５５号パンフレットに記載の酸性物質、陽イオン錯体等を使用してもよい。【００４６】
次に、本発明の、試料中の標的核酸を検出する方法における工程（ｃ）について説明する。工程（ｃ）は、工程（ｂ）における核酸増幅反応によって得られる、第１の任意の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを検出する工程である。
本発明の標的核酸を検出する方法について図面を参照しつつ説明する。図１に示すように、検出しようとする標的核酸（Ｄ）が試料中に存在する場合、その標的核酸（Ｄ）は、それと相補的な配列変換ＤＮＡの（Ｃ）の部位にハイブリダイズし、この標的核酸（Ｄ）がプライマーとして作用し、ＤＮＡポリメラーゼが作用し、核酸増幅反応が行われ、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応の産物としての配列（Ｅ）が生成する。次いで、配列（Ｅ）が生成したことで、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位（Ｂ）が二本鎖になり、ニッキングエンドヌクレアーゼがこれを認識して（Ｅ）を切断してオリゴヌクレオチド（Ｆ）を生成し、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼによって生成したオリゴヌクレオチド（Ｆ）が配列変換ＤＮＡから遊離する。ＤＮＡポリメラーゼは、この反応を繰り返し、オリゴヌクレオチド（Ｆ）は線形的（比例的）に増幅される。
次いで、図２に示すように、上記のようにして線形的に増幅したオリゴヌクレオチド（Ｆ）は、第１の任意の配列（Ａ）と相補的な配列を有するので、シグナル増幅ＤＮＡの（Ｃ’）の部位、すなわち配列変換ＤＮＡの第１の任意の配列（Ａ）と実質的に相同的な（Ｃ’）の部位とハイブリダイズする。図２に示すように、オリゴヌクレオチド（Ｆ）がシグナル増幅ＤＮＡの（Ｃ’）の部位とハイブリダイズすることにより、プライマーとして機能し、ＤＮＡポリメラーゼが作用し、核酸増幅反応が行われ、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応の産物としての配列（Ｇ）が生成する。次いで、配列（Ｇ）が生成したことで、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位（Ｂ）が二本鎖になり、ニッキングエンドヌクレアーゼがこれを認識して（Ｇ）を切断してオリゴヌクレオチド（Ｈ）を生成し、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼによって生成したオリゴヌクレオチド（Ｈ）がシグナル増幅ＤＮＡから遊離する。なお、オリゴヌクレオチド（Ｈ）はオリゴヌクレオチド（Ｆ）と相同的な配列を有しており、以下、ともにシグナルＤＮＡともいう。
本発明の標的核酸を検出する方法においては、このようにして生成されたシグナルＤＮＡを検出する。すなわち、図１に示す標的核酸（Ｄ）が存在しない場合には、図１及び図２に示す核酸増幅反応が進行しないため、シグナルＤＮＡは生成されないが、標的核酸（Ｄ）が存在すると、シグナルＤＮＡが生成され、このシグナルＤＮＡを検出することにより、標的核酸（Ｄ）の存在することがわかる。本発明の標的核酸を検出する方法においては、標的核酸（Ｄ）が微量に存在すれば、上述のシグナルＤＮＡが指数的に増幅されるので、非常に感度の高い検出法である。【００４７】
上記反応によって得られた増幅産物であるオリゴヌクレオチド（Ｈ）の存在は、当該技術分野において公知の方法により検出できる。例えば、ゲル電気泳動によれば、エチジウムブロマイドでゲルを染色することによって増幅産物を検出することができ、増幅産物であるオリゴヌクレオチドの配列及び長さについても、検出しようとするオリゴヌクレオチドと相補的な配列のオリゴヌクレオチドとをハイブリダイゼーションした上でゲル電気泳動する方法によって確認できる。また、増幅産物を検出するための検出系としては、蛍光偏光、イムノアッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移、酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミンなど）、ケミルミネッセンス、又はバイオルミネッセンスなどを用いることができる。更に、Ｔａｑｍａｎプローブや分子ビーコンを利用して検出することもできる。ビオチンなどで標識した標識ヌクレオチドを使用することによって増幅物を検出することもできる。この場合、増幅産物中のビオチンは、蛍光標識アビジン又は酵素標識アビジンなどを用いて検出することができる。また、当業者に公知の酸化還元型インターカレーターを使用することで、電極により増幅産物を検出することもできる。また、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）を用いて増幅産物を検出してもよい。
本発明の第二の実施態様は、標的核酸を非常に感度良く検出することができる。第一の実施態様においても標的核酸を感度よく検出可能であるが、第二の実施態様は、更に感度が向上したものとなる。【００４８】
第二の実施態様は、試料中の標的核酸を定量することに用いることもできる。すなわち本発明は、前記方法において、更に（ｄ）濃度が既知の前記標的核酸、前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記エンドヌクレアーゼの存在下に核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応によって得られる、第１の任意の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを測定する工程；（ｅ）前記工程（ｄ）を、異なる濃度の標的核酸について同様に行い、測定結果から検量線を作成する工程；（ｆ）前記検量線に基づいて、検出されるべき標的核酸の濃度を決定する工程を含む、方法を提供する。【００４９】
次に、本発明の試料中の標的核酸を検出するためのキットについて説明する。
本発明の試料中の標的核酸を検出するためのキットは、５’から３’の方向に、第１の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び標的核酸に相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチドを含む。また、本発明の試料中の標的核酸を検出するためのキットは、５’から３’の方向に、第１の任意の配列と実質的に相同的な配列を有する第２の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び前記第１の任意の配列と実質的に相同的な配列を含む第２のオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。すなわち、本発明は、試料中の標的核酸を検出するためのキットであって、５’から３’の方向に、第１の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び標的核酸に相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチドと、５’から３’の方向に、第１の任意の配列と実質的に相同的な配列を有する第２の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び前記第１の任意の配列と実質的に相同的な配列を含む第２のオリゴヌクレオチドとを含むキットをも提供する。【００５０】
すなわち、本発明の標的核酸を検出するためのキットは、上述した本発明の標的核酸を検出する方法において用いられる第１のオリゴヌクレオチド（配列変換ＤＮＡ）を含むか、又は及び第２のオリゴヌクレオチド（シグナル増幅ＤＮＡ）を含んでなる。第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドの詳細については上述した通りである。
本発明の試料中の標的核酸を検出するためのキットは、更にＤＮＡポリメラーゼ及びニッキングエンドヌクレアーゼを含んでいてもよい。ＤＮＡポリメラーゼ及びニッキングエンドヌクレアーゼについては上述した通りである。本発明のキットは、更に試料溶液を調製するために用いられるバッファー等の他の試薬等を含んでいてもよい。
本発明の試料中の標的核酸を検出するためのキットは、本発明の標的核酸を検出する方法を実施するために用いられる。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
以下の実施例において、特に記載しない限り、核酸増幅反応は、増幅産物を検出するためのＦＡＭ−ＤＡＢＣＹＬ修飾分子ビーコンを１００ｎＭ濃度で含む１×ＮＥバッファー２（１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，１  ｍＭ  ＤＴＴ（ｐＨ７．９、２５oＣ）の溶液２５μＬ中で、リアルタイムＰＣＲマシン  Ｍｘ３００５Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、３７℃で行った。また、特に記載しない限り、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ，  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ０．０８単位、及びＮｔ．ＡｌｗＩ  ０．１単位を用いて反応を行った。また、特に記載しない限り、Ｍｘ３００５Ｐのゲイン設定は×１とした。また、以下の実施例において用いたオリゴヌクレオチド及び分子ビーコンは常法にて作成した。以下の実施例において、図中、ｂｌａｎｋと記載のあるものは、バッファーのみを用いた場合の結果を示す。また、測定結果を表すグラフにおいては、横軸は、測定のサイクル数を表し、縦軸は蛍光強度を表す。【００５２】
実施例１
配列変換ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
配列変換ＤＮＡを用いて、標的核酸を検出する実験を行った。標的核酸としては、ヒトのｍｉｃｒｏ  ＲＮＡであるｈｓａ−ｍｉＲ−２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１に相当する配列をそれぞれ有する、以下の３種のオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）を用いた。
ＴＧＧＣＴＣＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧ（配列番号：１）
ＡＧＣＡＧＣＡＴＴＧＴＡＣＡＧＧＧＣＴＡＴＣＡ（配列番号：４）
ＡＧＣＴＡＣＡＴＴＧＴＣＴＧＣＴＧＧＧＴＴＴＣ（配列番号：７）
配列番号：１の標的核酸を検出するために用いた配列変換ＤＮＡは以下の配列を有する。
ＴＧＡＴＡＧＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＣＴＣＡＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＡＧＣＣＡ−（ＴＡＭＲＡ）（配列番号：１１、以下、Ｃ２（２２）という）
配列番号：４の標的核酸を検出するために用いた配列変換ＤＮＡは以下の配列を有する。
ＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＡＴＡＧＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣ−（ＴＡＭＲＡ）（配列番号：１２、以下、Ｃ３（１９）という）
配列番号：７の標的核酸を検出するために用いた配列変換ＤＮＡは以下の配列を有する。
ＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＡＧＣＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡ−（ＴＡＭＲＡ）（配列番号：１３、以下、Ｃ１（１５）という）
Ｃ２（２２）、Ｃ３（１９）及びＣ１（１５）は、いずれもニッキングエンドヌクレアーゼＮｔ．ＡｌｗＩの認識部位であるＧＡＴＣＣを含んでおり、Ｎｔ．ＡｌｗＩにより切断されるのは、ＣＡＧＡＧＡＴＣＣの相補配列であるＧＧＡＴＣＴＣＴＧの３’末端側である。【００５３】
標的核酸  １００ｎＭ（最終濃度、本明細書において以下同様）及び配列変換ＤＮＡ  １００ｎＭを反応系に入れて増幅反応を行った。結果は３０秒毎に測定し、２５５サイクルの測定を行った。なお、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。バッファーのみで行った実験の結果は図中において、「ｂｌａｎｋ」と記載した。
なお、測定に用いた分子ビーコンは以下の通りである。
配列番号：１の核酸の検出に用いた分子ビーコン
（ＦＡＭ）−ＣＧＣＧＡＴＧＡＴＡＧＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＣＴＴＣＧＣＧ−（ＤＡＢＣＹＬ）（配列番号：１４）
配列番号：４の核酸の検出に用いた分子ビーコン
（ＦＡＭ）−ＣＧＣＧＡＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧ−（ＤＡＢＣＹＬ）（配列番号：１５）
配列番号：７の核酸の検出に用いた分子ビーコン
（ＦＡＭ）−ＣＧＣＧＡ−ＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＡＧＣＣＡＴＣＧＣＧ−（ＤＡＢＣＹＬ）（配列番号：１６）
結果を図３に示す。図３において、縦軸は蛍光強度であり、横軸はサイクル数を表す。図３から明らかなように、Ｃ２（２２）、Ｃ３（１９）及びＣ１（１５）を用いた場合、いずれにおいても蛍光強度が上昇し、標的核酸がプライマーとして機能し、ＤＮＡポリメラーゼの作用により、核酸の増幅が起こることがわかった。従って、この反応系により、配列番号：１、配列番号：４及び配列番号：７の標的核酸の検出を行うことができることがわかった。本実験例においては、標的核酸を１００ｎＭという高濃度で含む系であり、標的核酸が、このように高濃度で含まれていれば、増幅産物であるオリゴヌクレオチドが検出可能な量まで十分に速く増幅されるので、この反応系により、標的核酸が試料中に存在しているかどうかの検出が可能であることが示された。【００５４】
実施例２
配列変換ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
次いで、標的核酸の濃度を３０ｎＭとし、配列変換ＤＮＡの濃度を３０ｎＭと代えた以外は実施例１と同様に実験を行った。配列変換ＤＮＡとしては、実施例１で用いた以外に以下のものを用いた。また、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。
配列番号：１の標的核酸を検出するために用いた配列変換ＤＮＡは以下の配列を有する。
ＴＧＡＴＡＧＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＣＴＣＡＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣ−（ＴＡＭＲＡ）（配列番号：１７、以下、Ｃ２（１５）という）
配列番号：７の標的核酸を検出するために用いた配列変換ＤＮＡは以下の配列を有する。
ＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＡＧＣＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣＡＧ−（ＴＡＭＲＡ）（配列番号：１８、以下、Ｃ１（１２）という）
配列番号：７の標的核酸を検出するために用いた配列変換ＤＮＡは以下の配列を有する。
ＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＡＧＣＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣ−（ＴＡＭＲＡ）（配列番号：１９、以下、Ｃ１（１０）という）
なお、本実験においては、Ｍｘ３００５Ｐのゲイン設定は×８とし、測定は６０秒毎に２５５サイクルまで行った。
結果を図４に示す。図４から明らかなように、Ｃ２（２２）及びＣ２（１５）を用いた場合にも蛍光強度が上昇し、標的核酸がプライマーとして機能し、増幅産物であるオリゴヌクレオチドが検出可能な量まで十分に速く増幅されることがわかった。従って、Ｃ２（２２）及びＣ２（１５）を用いて配列番号：１の標的核酸が試料中に存在するかどうかの検出が可能であることがわかった。また、この反応系においても、Ｃ３（１９）を用いて配列番号：４の標的核酸が試料中に存在するかどうかの検出が可能であり、Ｃ１（１５）、Ｃ１（１２）及びＣ１（１０）を用いて配列番号：７の標的核酸が試料中に存在するかどうかの検出が可能であることがわかった。【００５５】
実施例３
配列変換ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
次いで、標的核酸の濃度を１０ｎＭとし、配列変換ＤＮＡの濃度を１０ｎＭと代えた以外は実施例１と同様に実験を行った。配列変換ＤＮＡとしては、Ｃ１（１５）、Ｃ２（２２）及びＣ３（１９）を用いた。なお、本実験においては、Ｍｘ３００５Ｐのゲイン設定は×８とし、測定は６０秒毎に２５５サイクルまで行い、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。結果を図５に示す。図５から明らかなように、本実験においても蛍光強度が上昇し、標的核酸がプライマーとして機能し、増幅産物であるオリゴヌクレオチドが検出可能な量まで十分に速く増幅されるので、この反応系により標的核酸が試料中に存在するかどうかの検出は可能であった。【００５６】
実施例４
配列変換ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
次いで、標的核酸の濃度を３０ｎＭとし、配列変換ＤＮＡの濃度を３０ｎＭと代えた以外は実施例１と同様に実験を行い、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。配列番号：７の標的核酸を検出するための配列変換ＤＮＡとしては、以下の配列を有するＣ１（２３）を用いた。
ＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＡＧＣＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＡＴＧＴＡＧＣＴ−（ＴＡＭＲＡ）（配列番号：２２）
実験は、３本のＰＣＲチューブ内で同時に行い、それぞれについて測定を行った。なお、本実験においては、Ｍｘ３００５Ｐのゲイン設定は×８とし、測定は１２０秒毎に２５５サイクルまで行った。結果を図６に示す。また、ＦＡＭ−ＤＡＢＣＹＬ修飾分子ビーコンの濃度は６０ｎＭとした。図６においては、３本のＰＣＲチューブの結果を、それぞれ、Ｃ１（２３）−１、Ｃ１（２３）−２及びＣ１（２３）−２と示した。図６から明らかなように、配列変換ＤＮＡとしてＣ１（２３）を用いた場合にも蛍光強度が上昇し、標的核酸がプライマーとして機能し、増幅産物であるオリゴヌクレオチドが検出可能な量まで十分に速く増幅されることがわかった。従って、Ｃ１（２３）を用いて配列番号：１の標的核酸が試料中に存在するかどうかの検出が可能であることがわかった。また、３本のＰＣＲチューブにおいてほとんど同じ結果が得られたことから、良好な再現性を得ることが可能であることがわかった。【００５７】
実施例５
配列変換ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
標的核酸として配列番号：１で表されるオリゴヌクレオチドを、配列番号：１の標的核酸を検出するための配列変換ＤＮＡとして配列番号：１１で表わされるＣ２（２２）を用いた以外は実施例４と同様に実験を行い、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。結果を図７に示す。図７に示すように、配列変換ＤＮＡとしてＣ２（２２）を用いた場合にも、３本のＰＣＲチューブでほぼ同じ結果を示し、この場合にも良好な再現性を得ることが可能であることがわかった。【００５８】
実施例６
配列変換ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
標的核酸として配列番号：４で表されるオリゴヌクレオチドを、配列番号：４の標的核酸を検出するための配列変換ＤＮＡとして、以下の配列を有するＣ３（２３）（配列番号：２３）を用いた以外は実施例４と同様に実験を行い、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。結果を図８に示す。図８に示すように、配列変換ＤＮＡとしてＣ３（２３）を用いた場合にも、３本のＰＣＲチューブでほぼ同じ結果を示し、この場合にも良好な再現性を得ることが可能であることがわかった。
ＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＡＴＡＧＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＣＴ−（ＴＡＭＲＡ）（配列番号：２３）【００５９】
実施例７
配列変換ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
次いで、標的核酸の濃度を１０ｎＭ又は０Ｍとし、配列変換ＤＮＡの濃度を１０ｎＭと代えた以外は実施例１と同様に実験を行い、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。配列番号：７の標的核酸を検出するために用いた配列変換ＤＮＡとしては、配列番号：２２で表わされるＣ１（２３）を用いた。
なお、本実験においては、Ｍｘ３００５Ｐのゲイン設定は×１とし、測定は６０秒毎に２５５サイクルまで行った。結果を図９に示す。また、ＦＡＭ−ＤＡＢＣＹＬ修飾分子ビーコンの濃度は１００ｎＭとした。図９から明らかなように、配列変換ＤＮＡとしてＣ１（２３）を用いた場合にも蛍光強度が上昇し、標的核酸がプライマーとして機能し、増幅産物であるオリゴヌクレオチドが検出可能な量まで十分に速く増幅されることがわかった。また、配列変換ＤＮＡを含まない場合には、標的核酸が存在しても、増幅反応が起こらないことが示された。【００６０】
実施例８
配列変換ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
標的核酸として配列番号：１で表されるオリゴヌクレオチドを、配列番号：１の標的核酸を検出するための配列変換ＤＮＡとして配列番号：１１で表わされるＣ２（２２）を用いた以外は実施例７と同様に実験を行い、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。結果を図１０に示す。図１０に示すように、配列変換ＤＮＡとしてＣ２（２２）を用いた場合にも、蛍光強度が上昇し、標的核酸がプライマーとして機能し、増幅産物であるオリゴヌクレオチドが検出可能な量まで十分に速く増幅されることがわかった。また、配列変換ＤＮＡを含まない場合には、標的核酸が存在しても、増幅反応が起こらないことが示された。【００６１】
実施例９
配列変換ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
標的核酸として配列番号：４で表されるオリゴヌクレオチドを、配列番号：４の標的核酸を検出するための配列変換ＤＮＡとして、配列番号：２３で表わされるＣ３（２３）を用いた以外は実施例７と同様に実験を行い、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。結果を図１１に示す。図１１に示すように、配列変換ＤＮＡとしてＣ３（２２）を用いた場合にも、蛍光強度が上昇し、標的核酸がプライマーとして機能し、増幅産物であるオリゴヌクレオチドが検出可能な量まで十分に速く増幅されることがわかった。また、配列変換ＤＮＡを含まない場合には、標的核酸が存在しても、増幅反応が起こらないことが示された。【００６２】
実施例１０
配列変換ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
標的核酸として配列番号：１で表されるオリゴヌクレオチドを、配列番号：１の標的核酸を検出するための配列変換ＤＮＡとして、配列番号１７で表わされるＣ２（１５）を用いた以外は実施例７と同様に実験を行い、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。結果を図１２に示す。図１２に示すように、配列変換ＤＮＡとしてＣ２（１５）を用いた場合にも、蛍光強度が上昇し、標的核酸がプライマーとして機能し、増幅産物であるオリゴヌクレオチドが検出可能な量まで十分に速く増幅されることがわかった。また、配列変換ＤＮＡを含まない場合には、標的核酸が存在しても、増幅反応が起こらないことが示された。【００６３】
実施例１１
配列変換ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
標的核酸として配列番号：４で表されるオリゴヌクレオチドを、配列番号：４の標的核酸を検出するための配列変換ＤＮＡとして、配列番号１２で表わされるＣ３（１９）を用いた以外は実施例７と同様に実験を行い、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。結果を図１３に示す。図１３に示すように、配列変換ＤＮＡとしてＣ３（１９）を用いた場合にも、蛍光強度が上昇し、標的核酸がプライマーとして機能し、増幅産物であるオリゴヌクレオチドが検出可能な量まで十分に速く増幅されることがわかった。また、配列変換ＤＮＡを含まない場合には、標的核酸が存在しても、増幅反応が起こらないことが示された。【００６４】
実施例１２
配列変換ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
標的核酸として配列番号：１で表されるオリゴヌクレオチドを、１００ｎＭ、１０ｎＭ及び０ｎＭ用い、配列番号：１の標的核酸を検出するための配列変換ＤＮＡとして配列番号：１１で表わされるＣ２（２２）を１００ｎＭ用い、ＤＮＡポリメラーゼとして、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性欠損変異体）を０．０５単位用い、結果を６０秒毎に測定した以外は、実施例１と同様に実験を行い、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。結果を図１４に示す。図１４に示すように、標的核酸を含まない系、バッファーのみの系においては、増幅反応が起こらないことが示された。標的核酸を含む場合、標的核酸がプライマーとして機能し、増幅産物であるオリゴヌクレオチドが検出可能な量まで十分に速く増幅されることがわかった。増幅産物は、標的核酸の量が多いほど早く検出された。
実施例１２においては、増幅産物を検出するためのＦＡＭ−ＤＡＢＣＹＬ修飾分子ビーコンの濃度を１００ｎＭとし、実施例１３〜１８においては、増幅産物を検出するためのＦＡＭ−ＤＡＢＣＹＬ修飾分子ビーコンの濃度を６０ｎＭとし、また実施例１２〜１８においては、Ｍｘ３００５Ｐのゲイン設定は×８とした。【００６５】
実施例１３
配列変換ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
標的核酸として配列番号：７で表わされるオリゴヌクレオチドを、０ｎＭ、３０ｎＭの濃度で用い、配列番号：７の標的核酸を検出するための配列変換ＤＮＡとして配列番号で表わされるＣ１（２３）を３０ｎＭ用いた以外は、実施例１２と同様に実験を行った。比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。結果を図１５に示す。図１５に示すように、標的核酸を含まない系、バッファーのみの系においては、増幅反応が起こらないことが示された。標的核酸を含む系では、標的核酸がプライマーとして機能し、増幅産物であるオリゴヌクレオチドが検出可能な量まで十分に速く増幅されることがわかった。【００６６】
実施例１４
配列変換ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
標的核酸として配列番号：１で表わされるオリゴヌクレオチドを、０ｎＭ、３０ｎＭの濃度で用い、配列番号：１の標的核酸を検出するための配列変換ＤＮＡとして配列番号：１１で表わされるＣ２（２２）を用いた以外は、実施例１３と同様に実験を行った。比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。結果を図１６に示す。図１６に示すように、標的核酸を含まない系、バッファーのみの系においては、増幅反応が起こらないことが示された。標的核酸を含む系では、標的核酸がプライマーとして機能し、増幅産物であるオリゴヌクレオチドが検出可能な量まで十分に速く増幅されることがわかった。【００６７】
実施例１５
配列変換ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
標的核酸として配列番号：４で表わされるオリゴヌクレオチドを、０ｎＭ、３０ｎＭの濃度で用い、配列番号：４の標的核酸を検出するための配列変換ＤＮＡとして配列番号：２３で表わされるＣ３（２３）を用いた以外は、実施例１３と同様に実験を行った。比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。結果を図１７に示す。図１７に示すように、標的核酸を含まない系、バッファーのみの系においては、増幅反応が起こらないことが示された。標的核酸を含む系では、標的核酸がプライマーとして機能し、増幅産物であるオリゴヌクレオチドが検出可能な量まで十分に速く増幅されることがわかった。【００６８】
実施例１６
配列変換ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
配列番号：７の標的核酸を検出するための配列変換ＤＮＡとして配列番号：１３で表わされるＣ１（１５）を用いた以外は、実施例１３と同様に実験を行った。比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。結果を図１８に示す。図１８に示すように、標的核酸を含まない系、バッファーのみの系においては、増幅反応が起こらないことが示された。標的核酸を含む系では、標的核酸がプライマーとして機能し、増幅産物であるオリゴヌクレオチドが検出可能な量まで十分に速く増幅されることがわかった。【００６９】
実施例１７
配列変換ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
標的核酸として配列番号：１で表わされるオリゴヌクレオチドを用い、配列番号：１の標的核酸を検出するための配列変換ＤＮＡとして配列番号：１７で表わされるＣ２（１５）を用いた以外は、実施例１３と同様に実験を行った。比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。結果を図１９に示す。図１９に示すように、標的核酸を含まない系、バッファーのみの系においては、増幅反応が起こらないことが示された。標的核酸を含む系では、標的核酸がプライマーとして機能し、増幅産物であるオリゴヌクレオチドが検出可能な量まで十分に速く増幅されることがわかった。【００７０】
実施例１８
配列変換ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
標的核酸として配列番号：４で表わされるオリゴヌクレオチドを用い、配列番号：４の標的核酸を検出するための配列変換ＤＮＡとして配列番号：１７で表わされるＣ３（１９）を用いた以外は、実施例１３と同様に実験を行った。比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。結果を図２０に示す。図２０に示すように、標的核酸を含まない系、バッファーのみの系においては、増幅反応が起こらないことが示された。標的核酸を含む系では、標的核酸がプライマーとして機能し、増幅産物であるオリゴヌクレオチドが検出可能な量まで十分に速く増幅されることがわかった。【００７１】
実施例１９
配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
配列変換ＤＮＡとしてＣ２（２２）を１００ｎＭ、シグナル増幅ＤＮＡとして以下の配列を有するＡ２（２３）を１００ｎＭ用いた、及び用いなかった以外は、実施例１と同様に操作を行った。ここで、標的核酸としては、配列番号：１で表わされる核酸１０ｎＭを用いた。また、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。測定は６０秒毎に２５５サイクルまで行った。
Ａ２（２３）の配列
ＴＧＡＴＡＧＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＣＴＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＡＴＡＧＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＣＴ−（ＴＡＭＲＡ）（配列番号：２０）
配列番号２０で表わされるＡ２（２３）はニッキングエンドヌクレアーゼＮｔ．ＡｌｗＩの認識部位であるＧＡＴＣＣを含んでおり、Ｎｔ．ＡｌｗＩにより切断されるのはＣＡＧＡＧＡＴＣＣの相補配列であるＧＧＡＴＣＴＣＴＧの３’末端側である。
測定結果を図２１に示す。
図２１において、Ｃ２（２２）＆Ａ２（２３）＿１０ｎＭは、配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを含む系、Ｃ２（２２）＿１０ｎＭは配列変換ＤＮＡを含むがシグナル増幅ＤＮＡを含まない系である。図２１から明らかなように、シグナル増幅ＤＮＡを含む系及び含まない系、いずれにおいても蛍光強度が上昇したが、シグナル増幅ＤＮＡを含む方が蛍光強度の上昇が早く確認され、上昇速度も速かった。従って、この反応条件では検出しようとする標的核酸の含有量が１０ｎＭと低い場合には、シグナル増幅ＤＮＡがない系よりも、シグナル増幅ＤＮＡが含まれる系の方が、その検出感度が高いことが示された。【００７２】
実施例２０
配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
標的核酸の濃度を１ｎＭとした以外は実施例１９と同様に操作を行った。また、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。結果を図２２に示す。
図２２から明らかなように、シグナル増幅ＤＮＡを含まない系においては、蛍光強度の上昇はほとんどなく、従って、この反応条件では１ｎＭという低濃度の標的核酸の検出は不可能であった。シグナル増幅ＤＮＡを含む系によって、シグナルＤＮＡがプライマーとして機能することにより、核酸の増幅反応が指数的に進み、蛍光強度の上昇が確認できることがわかった。従って、検出しようとする核酸が１ｎＭと低い濃度においては、配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡの両者を含む系によって、検出が可能であることがわかった。【００７３】
実施例２１
配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
標的核酸として配列番号：７で表されるオリゴヌクレオチド用い、配列番号：７の標的核酸を検出するために用いた配列変換ＤＮＡとしてＣ１（１０）を１００ｎＭ、シグナル増幅ＤＮＡとして以下の配列を有するＡ１（１５）を１００ｎＭ用い、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ，Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔの使用量を０．０１６単位とした以外は、実施例１９と同様に操作を行った。ここで、標的核酸としては、配列番号：７で表わされる核酸１０ｎＭを用いた。また、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。測定は６０秒毎に２５５サイクルまで行った。結果を図２３に示す。
Ａ１（１５）の配列
ＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＡＧＣＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣ−（ＴＡＭＲＡ）（配列番号：２１）
配列番号２１で表わされるＡ１（１５）はニッキングエンドヌクレアーゼＮｔ．ＡｌｗＩの認識部位であるＧＡＴＣＣを含んでおり、Ｎｔ．ＡｌｗＩにより切断されるのは、ＣＡＧＡＧＡＴＣＣの相補配列であるＧＧＡＴＣＴＣＴＧの３’末端側である。
図２３から明らかなように、シグナル増幅ＤＮＡを含む系においても含まない系においても蛍光強度の上昇が観察されたが、シグナル増幅ＤＮＡを含む系の方が含まない系よりも上昇の上限値付近に達するのが早かった（分子ビーコンに対して等量のシグナルＤＮＡが作用すると蛍光強度は飽和し、過剰量のシグナルＤＮＡが増幅されても蛍光強度は増加しない）。これより、検出しようとする標的核酸の濃度が１０ｎＭと低い場合には、配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡの両者を含む系の方が、より迅速に高感度に標的核酸の検出が可能であることがわかった。【００７４】
実施例２２
配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
配列変換ＤＮＡとしてＣ１（１２）を用いた以外は実施例２１と同様に操作を行った。また、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。結果を図２４に示す。
図２４から明らかなように、シグナル増幅ＤＮＡを含む系においても含まない系においても蛍光強度の上昇が観察されたが、シグナル増幅ＤＮＡを含む系の方が含まない系よりも上昇の上限値付近に達するのが早かった（分子ビーコンに対して等量のシグナルＤＮＡが作用すると蛍光強度は飽和し、過剰量のシグナルＤＮＡが増幅されても蛍光強度は増加しない）。これより、検出しようとする標的核酸の濃度が１０ｎＭと低い場合には、配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡの両者を含む系の方が、より迅速に標的核酸の検出が可能であることがわかった。【００７５】
実施例２３
配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
配列番号：７の標的核酸を検出するために用いた配列変換ＤＮＡとしてＣ１（１５）を用いた以外は実施例２１と同様に操作を行った。また、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。結果を図２５に示す。
図２５から明らかなように、シグナル増幅ＤＮＡを含む系においても含まない系においても蛍光強度の上昇が観察されたが、シグナル増幅ＤＮＡを含む系の方が含まない系よりも上昇の上限値付近に達するのが早かった（分子ビーコンに対して等量のシグナルＤＮＡが作用すると蛍光強度は飽和し、過剰量のシグナルＤＮＡが増幅されても蛍光強度は増加しない）。これより、検出しようとする標的核酸の濃度が１０ｎＭと低い場合には、配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡの両者を含む系の方が、より迅速に標的核酸の検出が可能であることがわかった。【００７６】
実施例２４
配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
標的核酸として配列番号：１で表されるオリゴヌクレオチドを用い、配列番号：１の標的核酸を検出するために用いた配列変換ＤＮＡとしてＣ２（２２）を１０ｎＭ、シグナル増幅ＤＮＡとしてＡ２（２３）を３０ｎＭ用いた、及び用いなかった以外は、実施例１９と同様に操作を行った。ここで、標的核酸としては、配列番号：１で表わされる核酸１０ｎＭを用いた。また、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。本実験においては、Ｍｘ３００５Ｐのゲイン設定は×８とし、測定は６０秒毎に２５５サイクルまで行った。結果を図２６に示す。
図２６から明らかなように、シグナル増幅ＤＮＡを含む系においても含まない系においても蛍光強度の上昇が観察されたが、シグナル増幅ＤＮＡを含む系の方が含まない系よりも上昇の上限値付近に達するのが早かった（分子ビーコンに対して等量のシグナルＤＮＡが作用すると蛍光強度は飽和し、過剰量のシグナルＤＮＡが増幅されても蛍光強度は増加しない）。これより、検出しようとする標的核酸の濃度が１０ｎＭと低い場合には、配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡの両者を含む系の方が、より迅速に標的核酸の検出が可能であることがわかった。【００７７】
実施例２５
配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
標的核酸として配列番号：１で表されるオリゴヌクレオチド用い、配列番号：１の標的核酸を検出するために用いた配列変換ＤＮＡとしてＣ２（２２）を１０ｎＭ、シグナル増幅ＤＮＡとしてＡ２（２３）を３０ｎＭ用いた以外は、実施例１９と同様に操作を行った。ここで、標的核酸としては、配列番号：１で表わされる核酸を入れない場合、０．１ｎＭ及び１ｎＭ含む場合について実験を行った。本実験においては、Ｍｘ３００５Ｐのゲイン設定は×８とし、測定は６０秒毎に２５５サイクルまで行った。結果を図２７に示す。
図２７から明らかなように、標的核酸の量が増加するにつれ、蛍光強度の上昇が早く確認されることがわかる。【００７８】
実施例２６
標的核酸として配列番号：１で表されるオリゴヌクレオチド用い、増幅産物を検出するためのＦＡＭ−ＤＡＢＣＹＬ修飾分子ビーコンの濃度を６０ｎＭとし（以下の実施例において同様）、配列番号：１の標的核酸を検出するために用いた配列変換ＤＮＡとしてＣ２（２２）を１０ｎＭ、シグナル増幅ＤＮＡとしてＡ２（２３）を、３０ｎＭ用いた、または用いなかった以外は、実施例１９と同様に操作を行った。標的核酸としては、配列番号：１で表わされるオリゴヌクレオチドの濃度を０ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭとした。なお、ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ，Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ０．０８単位を、ニッキングエンドヌクレアーゼとしては、Ｎｔ．ＡｌｗＩ  ０．１単位を用いた。また、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。本実験においては、Ｍｘ３００５Ｐのゲイン設定は×８とし、測定は６０秒毎に２５５サイクルまで行った。結果を図２８に示す。  図２８から明らかなように、バッファーのみの場合は蛍光強度は増加しなかった。標的核酸の濃度が１０ｎＭの場合には蛍光強度は増加したが、シグナル増幅ＤＮＡを含む系では含まない系よりも上昇の上限値付近に達するのが早かった。標的核酸の濃度が１ｎＭの場合は、シグナル増幅ＤＮＡを含む系では蛍光強度は増加したが、含まない系ではほとんど増加しなかった。これより、検出しようとする標的核酸の濃度が低い場合でも、シグナルＤＮＡを含む場合には、より高感度に標的核酸の検出が可能であることがわかった。【００７９】
実施例２７
標的核酸として配列番号：１で表されるオリゴヌクレオチド用い、配列番号：１の標的核酸を検出するために用いた配列変換ＤＮＡとしてＣ２（２２）を１０ｎＭ、シグナル増幅ＤＮＡとしてＡ２（２３）を、１０ｎＭ用いる以外は、実施例１９と同様に操作を行った。なお、ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性欠損変異体）０．０５単位を用いた。また、標的核酸としては、配列番号：１で表わされる核酸の濃度を０ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭとした。また、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。本実験においては、Ｍｘ３００５Ｐのゲイン設定は×８とし、測定は６０秒毎に１５０サイクルまで行った。結果を図２９に示す。
図２９から明らかなように、標的核酸が含まれない場合には蛍光強度は増加しなかったが、標的核酸が含まれる場合には蛍光強度が増加し、標的核酸の濃度が高い方が、上限値付近に達するのが早かった。【００８０】
実施例２８
標的核酸として配列番号：２４で表されるオリゴヌクレオチド（ＲＮＡ）を用い、配列番号：２４の標的核酸を検出するために用いた配列変換ＤＮＡとしてＣ２（２２）を１０ｎＭ、シグナル増幅ＤＮＡとしてＡ２（２３）を１０ｎＭ用いた以外は、実施例１９と同様に操作を行った。なお、ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性欠損変異体）を０．０５単位用いた。ここで、標的核酸としては、配列番号：２４で表わされる核酸の濃度を、０ｎＭ、１０ｎＭとした。また、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。本実験においては、Ｍｘ３００５Ｐのゲイン設定は×８とし、測定は６０秒毎に２５５サイクルまで行った。結果を図３０に示す。
図３０から明らかなように、標的核酸としてのＲＮＡを含まない場合には蛍光強度がほとんど増加しないが、標的核酸としてのＲＮＡを含む場合、蛍光強度が増加することがわかった。
ＵＧＧＣＵＣＡＧＵＵＣＡＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧ（配列番号：２４）【００８１】
実施例２９
標的核酸として配列番号：４で表されるオリゴヌクレオチドを、配列番号：４の標的核酸を検出するための配列変換ＤＮＡとして、配列番号：２３で表わされるＣ３（２３）を１０ｎＭ用い、シグナル増幅ＤＮＡとして、配列番号：２５で表わされるＡ３（１９）を１０ｎＭ用い、実施例１９と同様に操作を行った。なお、ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性欠損変異体）を０．０５単位用いた。ここで、標的核酸としては、配列番号：４で表わされる核酸の濃度を、０ｎＭ、１０ｎＭとした。また、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。本実験においては、増幅産物を検出するためのＦＡＭ−ＤＡＢＣＹＬ修飾分子ビーコンの濃度を６０ｎＭとし、Ｍｘ３００５Ｐのゲイン設定は×８とし、測定は６０秒毎に２５５サイクルまで行った。結果を図３１に示す。
図３１に示すように、標的核酸を含まない場合には蛍光強度が増加しないが、標的核酸を含む場合、蛍光強度が増加することがわかった。
Ａ３（１９）の配列
ＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧ−（ＴＡＭＲＡ）（配列番号：２５）
Ａ３（１９）はニッキングエンドヌクレアーゼＮｔ．ＡｌｗＩの認識部位であるＧＡＴＣＣを含んでおり、Ｎｔ．ＡｌｗＩにより切断されるのは、ＣＡＧＡＧＡＴＣＣの相補配列であるＧＧＡＴＣＴＣＴＧの３’末端側である。【００８２】
実施例３０
標的核酸として配列番号：７で表されるオリゴヌクレオチド用い、配列番号：７の標的核酸を検出するために用いた配列変換ＤＮＡとしてＣ１（１０）を１０ｎＭ、シグナル増幅ＤＮＡとして以下の配列を有するＡ１（２２）（配列番号：２６）を３０ｎＭ用い、実施例１９と同様に操作を行った。なお、ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ，Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ０．０８単位及びＮｔ．ＡｌｗＩ  ０．１単位を用いた。ここで、標的核酸としては、配列番号：７で表わされる核酸の濃度を、０ｎＭ、１０ｎＭとした。また、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。本実験においては、Ｍｘ３００５Ｐのゲイン設定は×８とし、測定は６０秒毎に２５５サイクルまで行った。結果を図３２に示す。
図３２に示すように、標的核酸を含まない場合には蛍光強度が増加しなかった。また、配列変換ＤＮＡを含み、シグナル増幅ＤＮＡを含まない系では、標的核酸を含む場合でも蛍光強度がほとんど増加しなかったが、配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを含む系では、蛍光強度が増加することがわかった。
Ａ１（２２）の配列
ＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＡＧＣＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＡＧＣＣＡ−（ＴＡＭＲＡ）（配列番号：２６）
Ａ１（２２）はニッキングエンドヌクレアーゼＮｔ．ＡｌｗＩの認識部位であるＧＡＴＣＣを含んでおり、Ｎｔ．ＡｌｗＩにより切断されるのは、ＣＡＧＡＧＡＴＣＣの相補配列であるＧＧＡＴＣＴＣＴＧの３’末端側である【００８３】
実施例３１
標的核酸として配列番号：７で表されるオリゴヌクレオチド用い、配列番号：７の標的核酸を検出するために用いた配列変換ＤＮＡとしてＣ１（１５）を１０ｎＭ、シグナル増幅ＤＮＡとして、配列番号：２６で表わされるＡ１（２２）（配列番号：２６）を１０ｎＭ用いるか、又は用いずに実施例１９と同様に操作を行った。なお、ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ，Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ０．０８単位及びＮｔ．ＡｌｗＩ  ０．１単位を用いた。ここで、標的核酸としては、配列番号：７で表わされる核酸の濃度を、０、１０ｎＭとした。また、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。本実験においては、Ｍｘ３００５Ｐのゲイン設定は×８とし、測定は６０秒毎に２５５サイクルまで行った。結果を図３３に示す。
図３３に示すように、標的核酸を含まない場合には蛍光強度がほとんど増加しなかった。また、配列変換ＤＮＡを含み、シグナル増幅ＤＮＡを含まない系では、標的核酸を含む場合でも蛍光強度がほとんど増加しなかったが、配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを含む系では、蛍光強度が増加することがわかった。【００８４】
実施例３２
本実施例は、２種の標的核酸を含む場合にも同時に検出が可能かどうかを調べるものである。
標的核酸として配列番号：７で表されるオリゴヌクレオチド用い、配列番号：７の標的核酸を検出するために用いた配列変換ＤＮＡとしてＣ１（２３）を３０ｎＭ、シグナル増幅ＤＮＡとしてＡ１（２２）を３０ｎＭ用いた。また、標的核酸として配列番号：４で表されるオリゴヌクレオチド用い、配列番号：４の標的核酸を検出するために用いた配列変換ＤＮＡとしてＣ３（２３）を３０ｎＭ、シグナル増幅ＤＮＡとしてＡ３（１９）を３０ｎＭ用いた。ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ，Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ０．０８単位及びＮｔ．ＡｌｗＩ  ０．１単位を用い、実施例１９と同様に操作を行った。ここで、標的核酸としては、配列番号：７又は配列番号：４で表わされる核酸の濃度を、０、３０ｎＭとした。また、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。また、配列番号：７で表わされるオリゴヌクレオチドのみを含む場合と、配列番号：４で表わされるオリゴヌクレオチドのみを含む場合についても実験を行った。本実験においては、Ｍｘ３００５Ｐのゲイン設定は×４とし、測定は６０秒毎に２５５サイクルまで行った。結果を図３４に示す。
図３４に示すように、標的核酸を含まない場合、バッファーのみの場合には蛍光強度は増加しなかった。標的核酸として配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドのみを用いた場合、配列変換ＤＮＡとしてＣ１（２３）を用い、シグナル増幅ＤＮＡとしてＡ１（２２）を用いることにより、蛍光強度が増加した。また、標的核酸として配列番号：４で表されるオリゴヌクレオチドのみを用いた場合、配列変換ＤＮＡとしてＣ３（２３）を用い、シグナル増幅ＤＮＡとしてＡ３（１９）を用いることにより、蛍光強度が増加した。また、標的核酸として、配列番号：４で表わされるオリゴヌクレオチド及び配列番号：７で表わされるオリゴヌクレオチドの両者を含む場合、サイクル数の増加に伴い、蛍光強度の増加が見られ、２種の標的核酸を含む場合にも、同時に双方の核酸を検出できることが示された。【００８５】
実施例３３
標的核酸として配列番号：１で表されるオリゴヌクレオチド用い、配列番号：１の標的核酸を検出するために用いた配列変換ＤＮＡとしてＣ２（２２）を１０ｎＭ、シグナル増幅ＤＮＡとしてＡ２（２３）を３０ｎＭ用い、実施例１９と同様に操作を行った。なお、ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ，  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ０．０８単位及びＮｔ．ＡｌｗＩ  ０．１単位を用いた。ここで、標的核酸としては、配列番号：１で表わされる核酸の濃度を、０ｎＭ、２ｎＭ、４ｎＭ、６ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭとした。また、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。本実験においては、Ｍｘ３００５Ｐのゲイン設定は×８とし、測定は６０秒毎に６０サイクルまで行った。結果を図３５に示す。
図３５に示すように、標的核酸を含まない場合、バッファーのみの場合には蛍光強度は増加しなかった。また、標的核酸の濃度が高くなるにつれ、蛍光強度の増加が早くなった。
図３５の結果において、蛍光強度の値が１００００に達するサイクル数を縦軸にし、標的核酸の濃度を横軸にし、検量線を作成した。結果を図３６に示す。図３６に示すように、蛍光強度と標的核酸の濃度との間には一定の関係があり、この検量線を用いることにより、試料中の標的核酸の濃度を定量できることがわかった。【００８６】
実施例３４
標的核酸として配列番号：１で表されるオリゴヌクレオチド用い、配列番号：１の標的核酸を検出するために用いた配列変換ＤＮＡとしてＣ２（２２）を１０ｎＭ、シグナル増幅ＤＮＡとしてＡ２（２３）を３０ｎＭ用い、実施例３２と同様に操作を行った。なお、標的核酸としてのオリゴヌクレオチドの濃度は、０ｎM、２ｎM、１０ｎMとし、それぞれ、配列番号：７で表されるオリゴヌクレオチドを１０ｎM含有させた場合についても同様に実験を行った。本実験においては、Ｍｘ３００５Ｐのゲイン設定は×８とし、測定は６０秒毎に５０サイクルまで行った。結果を図３７に示す。
図３７に示すように、バッファーのみの場合、標的核酸も配列番号：７で表されるオリゴヌクレオチドも含まれない場合には蛍光強度は増加しなかった。標的核酸の濃度を２ｎＭ、１０ｎＭとすると、濃度の増加に伴い蛍光強度が増加した。この蛍光強度は、配列番号：７で表されるオリゴヌクレオチドが混在している場合にもほとんど変化がなかった。このことより、本実験においては、標的核酸以外の核酸が系に混入していても、測定結果に影響がないことを示す。【００８７】
実施例３５
配列変換ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
標的核酸として配列番号：２９で表されるオリゴヌクレオチド用い、配列番号：２９の標的核酸を検出するために用いた配列変換ＤＮＡとして、配列番号：２７で表わされるＢｂｖ＿Ｃ２（１２）を１０ｎＭ用い、標的核酸としては配列番号：２９の標的核酸の濃度を、０、１０ｎＭとした。また、ニッキングエンドヌクレアーゼとして、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩを０．１単位用い、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。本実験においては、Ｍｘ３００５Ｐのゲイン設定は×８とし、測定は６０秒毎に２５５サイクルまで行った。結果を図３８に示す。
なお、Ｂｂｖ＿Ｃ２（１２）は、Ｎｂ．ＢｂｖＣ１の認識部位であるＣＣＴＣＡＧＣを含んでおり、Ｎｂ．ＢｂｖＣ１で切断されるのは、ＣＣＴＣＡＧＣの相補配列であるＧＣＴＧＡＧＧのＧＣとＴＧＡＧＧの間である。
ＴＧＡＴＡＧＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＣＡＣＧＡＴＣＣＴ−（ＴＡＭＲＡ）（配列番号：２７）
図３８から明らかなように、バッファーのみの場合、標的核酸を含まない場合には、蛍光強度は増加しなかったが、標的核酸を含む場合には、蛍光強度が増加した。
配列番号：２９（ＴＡＧＣＴＴＡＴＣＡＧＡＣＴＧＡＴＧＴＴＧＡ）【００８８】
実施例３６
配列変換ＤＮＡ及びシグナル増幅ＤＮＡを用いた標的核酸の検出
標的核酸として配列番号：２９で表されるオリゴヌクレオチド用い、配列番号：２９の標的核酸を検出するために用いた配列変換ＤＮＡとして、Ｂｂｖ＿Ｃ２（１２）を１０ｎＭ用い、シグナル増幅ＤＮＡとして、配列番号：２８で表わされるＢｂｖ＿Ａ２（２２）を３０ｎＭ用い、標的核酸としては配列番号：２９の標的核酸の濃度を、０ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭとした。また、ニッキングエンドヌクレアーゼとして、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩを０．１単位用い、比較として、バッファーのみで同様の操作を行った。本実験においては、Ｍｘ３００５Ｐのゲイン設定は×８とし、測定は６０秒毎に１２０サイクルまで行った。結果を図３９に示す。
なお、Ｂｂｖ＿Ｃ２（１２）、Ｂｂｖ＿Ａ２（２２）は、いずれもＮｂ．ＢｂｖＣＩの認識部位であるＣＣＴＣＡＧＣを含んでおり、Ｎｂ．ＢｂｖＣ１で切断されるのは、ＣＣＴＣＡＧＣの相補配列であるＧＣＴＧＡＧＧのＧＣとＴＧＡＧＧの間である。
ＴＧＡＴＡＧＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＧＡＴＡＧＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＣＴ−（ＴＡＭＲＡ）（配列番号：２８）
図３９から明らかなように、バッファーのみの場合、標的核酸を含まない場合には、蛍光強度は増加しなかったが、標的核酸を含む場合、蛍光強度は増加し、標的核酸が高い方が、蛍光強度が上昇するのが早かった。
以上詳述したように、本発明の標的核酸を検出する方法によれば、標的核酸を高感度で特異的に検出することが可能であり、短鎖の核酸であっても高感度で特異的に検出可能なことが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年11月16日(2012.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
試料中の標的核酸を検出する方法であって、
（ａ）５’から３’の方向に、第１の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び標的核酸に相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチド、及び５’から３’の方向に、第１の任意の配列と実質的に相同的な配列を有する第２の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び前記第１の任意の配列と実質的に相同的な配列を含む第２のオリゴヌクレオチドを用意する工程、
（ｂ）前記試料に含まれる標的核酸をプライマーとして、前記ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位を認識するエンドヌクレアーゼの存在下に核酸増幅反応を行う工程、及び
（ｃ）前記核酸増幅反応によって得られる、第２の任意の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを検出する工程
を含んでなる方法であって、前記エンドヌクレアーゼが、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ又はＮｔ．ＢｓｍＡＩである方法。
【請求項３】
（ｄ）濃度が既知の前記標的核酸、前記第１のオリゴヌクレオチド、前記第２のオリゴヌクレオチド及び前記エンドヌクレアーゼの存在下に核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応によって得られる、第１の任意の配列及び第２の任意配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを測定する工程；
（ｅ）前記工程（ｄ）を、異なる濃度の標的核酸について同様に行い、測定結果から検量線を作成する工程；
（ｆ）前記検量線に基づいて、検出されるべき標的核酸の濃度を決定する工程を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
核酸増幅反応が２０℃以上の温度（５０℃以上を除く）で実施される、請求項２又は３記載の方法。
【請求項６】
前記エンドヌクレアーゼがＮｔ．ＡｌｗＩであり、前記第１のオリゴヌクレオチドが、Ｎｔ．ＡｌｗＩの認識部位であるＧＡＴＣＣを含んでいる、請求項２、３又は５記載の方法。
【請求項７】
前記エンドヌクレアーゼがＮｂ．ＢｂｖＣＩであり、前記第１のオリゴヌクレオチドが、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩの認識部位であるＣＣＴＣＡＧＣを含んでいる、請求項２、３又は５記載の方法。
【請求項８】
核酸増幅反応において、鎖置換機能を有するＤＮＡポリメラーゼが使用される、請求項２、３、５、６又は７記載の方法。
【請求項９】
核酸増幅反応において用いられるＤＮＡポリメラーゼが、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた変異体を含む）、バチルス・ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルス・カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼが使用される、請求項２、３、５、６、７又は８記載の方法。
【請求項１０】
第１のオリゴヌクレオチドの３’末端が修飾されている、請求項２、３、５、６、７、８又は９記載の方法。
【請求項１１】
第２のオリゴヌクレオチドの３’末端が修飾されている、請求項２、３、５、６、７、８、９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
試料中の標的核酸を検出するためのキットであって、
５’から３’の方向に、第１の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び標的核酸に相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチドと、
５’から３’の方向に、第１の任意の配列と実質的に相同的な配列を有する第２の任意の配列、ニッキング反応に用いられるエンドヌクレアーゼの認識部位及び前記第１の任意の配列と実質的に相同的な配列を含む第２のオリゴヌクレオチドとを含むキットであって、前記エンドヌクレアーゼが、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ又はＮｔ．ＢｓｍＡＩである、キット。
【請求項１４】
第１のオリゴヌクレオチドの３’末端が修飾されている、請求項１３記載のキット。
【請求項１５】
第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドの３’末端が修飾されている、請求項１３記載のキット。
【請求項１６】
更にＤＮＡポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼを含む、請求項１３〜１５のいずれか１項記載のキット。
【請求項１７】
核酸増幅反応が２０〜３７℃の温度で実施される、請求項２又は３記載の方法。
【国際調査報告】
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