(57)【要約】  下記（ｉ）または（ｉｉ）から選択されるペプチド：（ｉ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチド；および、（ｉｉ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列において、アミノ末端から数えて１番目乃至１１番目のＸａａ以外の、１個以上２８個以下のアミノ酸が保存的アミノ酸置換、欠失、付加又は挿入してなるアミノ酸配列を有するペプチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ｉ）または（ｉｉ）から選択されるペプチド：
（ｉ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチド；および、
（ｉｉ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列において、アミノ末端から数えて１番目乃至１１番目のＸａａ以外の、１個以上２８個以下のアミノ酸が保存的アミノ酸置換、欠失、付加又は挿入してなるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項２】
アミノ末端から数えて１番目乃至１１番目のＸａａが、それぞれ、システインを除く任意のアミノ酸である、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
アミノ末端から数えて１番目乃至１１番目のＸａａが、それぞれ、プロリンを除く任意のアミノ酸である、請求項１または２記載のペプチド。
【請求項４】
保存的アミノ酸置換が、疎水性アミノ酸グループ、中性親水性アミノ酸グループ、酸性アミノ酸グループ、塩基性アミノ酸グループ、主鎖の方角に影響を与えるアミノ酸のグループ、および、芳香族アミノ酸グループから選択されるいずれかのグループ内において行われることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項５】
アミノ末端から数えて１番目のＸａａが、グルタミン、メチオニン、ヒスチジン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン、トリプトファン、イソロイシン、アスパラギン酸およびスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項１乃至４のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項６】
アミノ末端から数えて２番目のＸａａが、トリプトファン、ロイシン、グリシン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギンおよびスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項１乃至５のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項７】
アミノ末端から数えて３番目のＸａａが、アルギニン、ロイシン、アラニン、ヒスチジン、スレオニン、バリン、グルタミン、グルタミン酸およびセリンからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項１乃至６のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項８】
アミノ末端から数えて４番目のＸａａが、グルタミン酸、アルギニン、リジン、イソロイシン、グルタミン、トリプトファン、チロシン、グリシンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項１乃至７のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項９】
アミノ末端から数えて５番目のＸａａが、リジン、グルタミン酸、メチオニン、アラニン、グルタミン、グリシン、スレオニン、ヒスチジンおよびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項１乃至８のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項１０】
アミノ末端から数えて６番目のＸａａが、メチオニン、トリプトファン、チロシン、セリン、フェニルアラニン、グルタミンおよびアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸である、請求項１乃至９のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項１１】
アミノ末端から数えて７番目のＸａａが、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、セリン、リジン、アルギニン、ヒスチジンおよびアスパラギンからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項１乃至１０のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項１２】
アミノ末端から数えて８番目のＸａａが、リジン、グルタミン酸、アラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、アルギニンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項１乃至１１のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項１３】
アミノ末端から数えて９番目のＸａａが、アスパラギン、セリン、チロシン、グルタミン酸、アラニン、グリシン、リジンおよびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項１乃至１２のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項１４】
アミノ末端から数えて１０番目のＸａａが、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、フェニルアラニン、アスパラギン、バリンおよびロイシンからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項１乃至１３のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項１５】
アミノ末端から数えて１１番目のＸａａが、イソロイシン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ロイシン、アラニン、メチオニン、フェニルアラニンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項１乃至１４のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項１６】
配列表の配列番号１乃至１６のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を有する、請求項１乃至１５のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項１７】
請求項１乃至１６のいずれか一つに記載のペプチドに化学的修飾または生物学的修飾が施されてなる該ペプチドの誘導体。
【請求項１８】
下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド：
（ｉ）請求項１乃至１６のいずれか一つに記載のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド；
（ｉｉ）請求項１乃至１６のいずれか一つに記載のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでなるヌクレオチド；および、
（ｉｉｉ）請求項１乃至１６のいずれか一つに記載のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１８記載のヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項２０】
請求項１８記載のヌクレオチドまたは請求項１９記載のベクターが導入された細胞。
【請求項２１】
下記工程（ｉ）および（ｉｉ）を含んでなる請求項１乃至１６のいずれか一つに記載のペプチドの製造方法：
（ｉ）請求項２０記載の細胞を培養する工程；および、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた培養物から該ペプチドを回収する工程。
【請求項２２】
請求項１乃至１６のいずれか一つに記載のペプチドおよび／または請求項１７記載のペプチドの誘導体を含んでなるペプチド・ライブラリー。
【請求項２３】
ペプチドおよび／またはペプチドの誘導体が、請求項２１記載の工程（ｉ）および（ｉｉ）を含んでなる方法により調製されたものであることを特徴とする、請求項２２記載のライブラリー。
【請求項２４】
ライブラリーにおいて、表現型（phenotype）である該ペプチド又はペプチド誘導体および該表現型に対応する遺伝型（genotype）であるヌクレオチドが直接的または間接的にリンクしていることを特徴とする、請求項２２または２３記載のライブラリー。
【請求項２５】
ヌクレオチドが請求項１８に記載のヌクレオチドである、請求項２２乃至２４のいずれか一つに記載のライブラリー。
【請求項２６】
ファージ・ディスプレイ・ライブラリー、リボゾーム・ディスプレイ・ライブラリー若しくは核酸ディスプレイ・ライブラリーである、請求項２２乃至２５のいずれか一つに記載のライブラリー。
【請求項２７】
下記（ｉ）および（ｉｉ）の工程を含んでなる、標的分子に結合する、請求項１乃至１６のいずれか一つに記載のペプチドまたは請求項１７記載のペプチド誘導体の同定方法：
（ｉ）請求項２２乃至２６のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドまたはペプチド誘導体と該標的分子とを接触させる工程；および、
（ｉｉ）該標的分子に結合するペプチドまたはペプチド誘導体を回収する工程。
【請求項２８】
下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）の工程を含んでなる、標的分子に結合する、請求項１乃至１６のいずれか一つに記載のペプチドまたは請求項１７記載のペプチド誘導体の製造方法：
（ｉ）請求項２２乃至２６のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドまたはペプチド誘導体と該標的分子とを接触させる工程；および、
（ｉｉ）該標的分子に結合するペプチドまたはペプチド誘導体を回収する工程；および、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）において回収された該ペプチドまたはペプチド誘導体に含まれるペプチドを化学合成、遺伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳により調製する工程。
【請求項２９】
下記（ｉ）および（ｉｉ）の工程を含んでなる、請求項１乃至１６のいずれか一つに記載のペプチドまたは請求項１７記載のペプチドの誘導体が標的分子に結合するか否かを判定する方法：
（ｉ）請求項１乃至１６のいずれか一つに記載の被検ペプチドまたは請求項１７記載の被検ペプチド誘導体と該標的分子とを接触させる工程；および、
（ｉｉ）被検ペプチドまたは被検ペプチド誘導体が該標的分子に結合する場合、該ペプチドまたは被検ペプチド誘導体は陽性であると決定する工程。
【請求項３０】
下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）の工程を含んでなる、標的分子に結合する、請求項１乃至１６のいずれか一つに記載のペプチドまたは請求項１７記載のペプチドの誘導体の製造方法：
（ｉ）請求項１乃至１６のいずれか一つに記載の被検ペプチドまたは請求項１７記載の被検ペプチド誘導体と該標的分子とを接触させる工程； 
（ｉｉ）被検ペプチドまたは被検ペプチド誘導体が該標的分子に結合する場合、該ペプチドまたは被検ペプチド誘導体は陽性であると決定する工程；および、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）において被検ペプチドまたはペプチド誘導体が陽性と判定された場合、該ペプチドまたはペプチド誘導体に含まれるペプチドを化学合成、遺伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳により調製する工程。
【請求項３１】
請求項１８に記載のヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド・ライブラリー。
【請求項３２】
ヌクレオチドがファージミド、コスミドもしくはプラスミドまたはその断片である、請求項３１記載のライブラリー。
【請求項３３】
ヌクレオチドが原核もしくは真核細胞内、または、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ上もしくはウイルス粒子中に存在する、請求項３１または３２記載のヌクレオチド・ライブラリー。
【請求項３４】
請求項１乃至１６のいずれか一つに記載のペプチド、請求項１７記載のペプチドの誘導体、請求項１８記載のヌクレオチド、請求項１９記載のベクターまたは請求項２０記載の細胞を含むことからなる組成物。
【請求項３５】
請求項１乃至１６のいずれか一つに記載のペプチド、請求項１７記載のペプチドの誘導体、請求項１８記載のヌクレオチド、請求項１９記載のベクターまたは請求項２０記載の細胞を含むことからなる試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド、該ペプチドの誘導体、該ペプチドまたは該誘導体に含まれるペプチドに対応するヌクレオチド、ヌクレオチドを含むベクター、該ベクターまたはヌクレオチドが導入された細胞、該細胞を培養する工程を含んでなるペプチドまたはその誘導体の製造方法、該ペプチドおよび／またはその誘導体を含んでなるペプチド・ライブラリー、標的分子に結合するペプチドおよび／またはその誘導体の同定方法、標的分子に結合するペプチドまたはその誘導体の製造方法、被検ペプチドまたはその誘導体が標的分子に結合するか否かを判定する方法、該ヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド・ライブラリー、該ペプチドもしくはその誘導体、該ヌクレオチド、該ベクターまたは該細胞を含むことからなる組成物、該ペプチドもしくはその誘導体、該ヌクレオチド、該ベクターまたは該細胞を含むことからなる試薬等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＡＣＩはＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであり、Ｂ細胞のキーレギュレーターとして働くことが知られている。ＴＡＣＩはその細胞外領域にシステインリッチドメイン（cysteine-rich domains：以下「ＣＲＤｓ」という）を二つ持ち、二つのリガンド（ＡＰＲＩＬとＢＡＦＦ）に結合する。天然にはオルタナティブ・スプライシング（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ）によりＮ末端側ＣＲＤが欠損したＴＡＣＩも存在し、Ｃ末端側ＣＤＲ（ＴＡＣＩ＿ｄ２）単独で両リガンドに対し細胞外領域全体（ＴＡＣＩ＿ｄ１ｄ２）と同等の結合活性を示すことが報告されている（特許文献１、非特許文献）。【０００３】
しかし、ＴＡＣＩ＿ｄ２またはその改変体が内在性リガンド以外の分子に対して高い結合活性を示すか否かは現在まで明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００６／０５２４９３号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】メリッサ A. スタロバスニック著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２８０巻（８号），７２１８乃至７２２７頁、２００５年刊行（Melissa A. Starovasnik、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ｖｏｌ．２８０（Ｎｏ．８），  ｐｐ７２１８−７２２７（２００５））
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明者らは、ＴＡＣＩ＿ｄ２またはその改変体について鋭意検討した結果、内在性リガンド以外の分子に対して高い結合活性を示すペプチドを含むライブラリーを作成する等して、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は
（１）
下記（ｉ）または（ｉｉ）から選択されるペプチド：
（ｉ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチド；および、
（ｉｉ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列において、アミノ末端から数えて１番目乃至１１番目のＸａａ以外の、１個以上２８個以下のアミノ酸が保存的アミノ酸置換、欠失、付加又は挿入してなるアミノ酸配列を有するペプチド、
（２）
アミノ末端から数えて１番目乃至１１番目のＸａａが、それぞれ、システインを除く任意のアミノ酸である、（１）記載のペプチド、
（３）
アミノ末端から数えて１番目乃至１１番目のＸａａが、それぞれ、プロリンを除く任意のアミノ酸である、（１）または（２）記載のペプチド、
（４）
保存的アミノ酸置換が、疎水性アミノ酸グループ、中性親水性アミノ酸グループ、酸性アミノ酸グループ、塩基性アミノ酸グループ、主鎖の方角に影響を与えるアミノ酸のグループ、および、芳香族アミノ酸グループから選択されるいずれかのグループ内において行われることを特徴とする、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載のペプチド、
（５）
アミノ末端から数えて１番目のＸａａが、グルタミン、メチオニン、ヒスチジン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン、トリプトファン、イソロイシン、アスパラギン酸およびスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸である、（１）乃至（４）のいずれか一つに記載のペプチド、
（６）
アミノ末端から数えて２番目のＸａａが、トリプトファン、ロイシン、グリシン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギンおよびスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸である、（１）乃至（５）のいずれか一つに記載のペプチド、
（７）
アミノ末端から数えて３番目のＸａａが、アルギニン、ロイシン、アラニン、ヒスチジン、スレオニン、バリン、グルタミン、グルタミン酸およびセリンからなる群から選択されるアミノ酸である、（１）乃至（６）のいずれか一つに記載のペプチド、
（８）
アミノ末端から数えて４番目のＸａａが、グルタミン酸、アルギニン、リジン、イソロイシン、グルタミン、トリプトファン、チロシン、グリシンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸である、（１）乃至（７）のいずれか一つに記載のペプチド、
（９）
アミノ末端から数えて５番目のＸａａが、リジン、グルタミン酸、メチオニン、アラニン、グルタミン、グリシン、スレオニン、ヒスチジンおよびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸である、（１）乃至（８）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１０）
アミノ末端から数えて６番目のＸａａが、メチオニン、トリプトファン、チロシン、セリン、フェニルアラニン、グルタミンおよびアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸である、（１）乃至（９）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１１）
アミノ末端から数えて７番目のＸａａが、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、セリン、リジン、アルギニン、ヒスチジンおよびアスパラギンからなる群から選択されるアミノ酸である、（１）乃至（１０）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１２）
アミノ末端から数えて８番目のＸａａが、リジン、グルタミン酸、アラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、アルギニンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸である、（１）乃至（１１）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１３）
アミノ末端から数えて９番目のＸａａが、アスパラギン、セリン、チロシン、グルタミン酸、アラニン、グリシン、リジンおよびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸である、（１）乃至（１２）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１４）
アミノ末端から数えて１０番目のＸａａが、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、フェニルアラニン、アスパラギン、バリンおよびロイシンからなる群から選択されるアミノ酸である、（１）乃至（１３）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１５）
アミノ末端から数えて１１番目のＸａａが、イソロイシン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ロイシン、アラニン、メチオニン、フェニルアラニンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸である、（１）乃至（１４）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１６）
配列表の配列番号１乃至１６のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を有する、（１）乃至（１５）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１７）
（１）乃至（１６）のいずれか一つに記載のペプチドに化学的修飾または生物学的修飾が施されてなる該ペプチドの誘導体、
（１８）
下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド：
（ｉ）（１）乃至（１６）のいずれか一つに記載のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド；
（ｉｉ）（１）乃至（１６）のいずれか一つに記載のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでなるヌクレオチド；および、
（ｉｉｉ）（１）乃至（１６）のいずれか一つに記載のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌクレオチド、
（１９）
（１８）記載のヌクレオチドを含んでなるベクター、
（２０）
（１８）記載のヌクレオチドまたは（１９）記載のベクターが導入された細胞、
（２１）
下記工程（ｉ）および（ｉｉ）を含んでなる（１）乃至（１６）のいずれか一つに記載のペプチドの製造方法：
（ｉ）（２０）記載の細胞を培養する工程；および、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた培養物から該ペプチドを回収する工程、
（２２）
（１）乃至（１６）のいずれか一つに記載のペプチドおよび／または（１７）記載のペプチドの誘導体を含んでなるペプチド・ライブラリー、
（２３）
ペプチドおよび／またはペプチドの誘導体が、（２１）記載の工程（ｉ）および（ｉｉ）を含んでなる方法により調製されたものであることを特徴とする、（２２）記載のライブラリー、
（２４）
ライブラリーにおいて、表現型（phenotype）である該ペプチド又はペプチド誘導体および該表現型に対応する遺伝型（genotype）であるヌクレオチドが直接的または間接的にリンクしていることを特徴とする、（２２）または（２３）記載のライブラリー、
（２５）
ヌクレオチドが（１８）に記載のヌクレオチドである、（２２）乃至（２４）のいずれか一つに記載のライブラリー、
（２６）
ファージ・ディスプレイ・ライブラリー、リボゾーム・ディスプレイ・ライブラリー若しくは核酸ディスプレイ・ライブラリーである、（２２）乃至（２５）のいずれか一つに記載のライブラリー、
（２７）
下記（ｉ）および（ｉｉ）の工程を含んでなる、標的分子に結合する、（１）乃至（１６）のいずれか一つに記載のペプチドまたは（１７）記載のペプチド誘導体の同定方法：
（ｉ）（２２）乃至（２６）のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドまたはペプチド誘導体と該標的分子とを接触させる工程；および、
（ｉｉ）該標的分子に結合するペプチドまたはペプチド誘導体を回収する工程、
（２８）
下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）の工程を含んでなる、標的分子に結合する、（１）乃至（１６）のいずれか一つに記載のペプチドまたは（１７）記載のペプチド誘導体の製造方法：
（ｉ）（２２）乃至（２６）のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドまたはペプチド誘導体と該標的分子とを接触させる工程；および、
（ｉｉ）該標的分子に結合するペプチドまたはペプチド誘導体を回収する工程；および、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）において回収された該ペプチドまたはペプチド誘導体に含まれるペプチドを化学合成、遺伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳により調製する工程、
（２９）
下記（ｉ）および（ｉｉ）の工程を含んでなる、（１）乃至（１６）のいずれか一つに記載のペプチドまたは（１７）記載のペプチドの誘導体が標的分子に結合するか否かを判定する方法：
（ｉ）（１）乃至（１６）のいずれか一つに記載の被検ペプチドまたは（１７）記載の被検ペプチド誘導体と該標的分子とを接触させる工程；および、
（ｉｉ）被検ペプチドまたは被検ペプチド誘導体が該標的分子に結合する場合、該ペプチドまたは被検ペプチド誘導体は陽性であると決定する工程、
（３０）
下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）の工程を含んでなる、標的分子に結合する、（１）乃至（１６）のいずれか一つに記載のペプチドまたは（１７）記載のペプチドの誘導体の製造方法：
（ｉ）（１）乃至（１６）のいずれか一つに記載の被検ペプチドまたは（１７）記載の被検ペプチド誘導体と該標的分子とを接触させる工程； 
（ｉｉ）被検ペプチドまたは被検ペプチド誘導体が該標的分子に結合する場合、該ペプチドまたは被検ペプチド誘導体は陽性であると決定する工程；および、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）において被検ペプチドまたはペプチド誘導体が陽性と判定された場合、該ペプチドまたはペプチド誘導体に含まれるペプチドを化学合成、遺伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳により調製する工程、
（３１）
（１８）に記載のヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド・ライブラリー、
（３２）
ヌクレオチドがファージミド、コスミドもしくはプラスミドまたはその断片である、（３１）記載のライブラリー、
（３３）
ヌクレオチドが原核もしくは真核細胞内、または、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ上もしくはウイルス粒子中に存在する、（３１）または（３２）記載のヌクレオチド・ライブラリー、
（３４）
（１）乃至（１６）のいずれか一つに記載のペプチド、（１７）記載のペプチドの誘導体、（１８）記載のヌクレオチド、（１９）記載のベクターまたは（２０）記載の細胞を含むことからなる組成物、および、
（３５）
（１）乃至（１６）のいずれか一つに記載のペプチド、（１７）記載のペプチドの誘導体、（１８）記載のヌクレオチド、（１９）記載のベクターまたは（２０）記載の細胞を含むことからなる試薬、
等に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、所望の標的分子に結合するペプチドを選抜するのに有用なペプチド・ライブラリーを提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１（Ａ）】標的分子である各蛋白質に対してパニングを行うことにより得られたＴＡＣＩ＿ｄ２変異体が、それぞれの蛋白質に結合することを示す図。パニングに用いた標的分子は、図１（Ａ）の（１）および（２）はそれぞれＢＳＡおよびｈＥｐｈＡ２である。  図１（Ａ）の（１）および（２）はポリクローンの例である。
【図１（Ｂ）】標的分子である各蛋白質に対してパニングを行うことにより得られたＴＡＣＩ＿ｄ２変異体が、それぞれの蛋白質に結合することを示す図。パニングに用いた標的分子は、図１（Ｂ）の（３）および（４）はそれぞれｈＥＧＦＲ／ＦｃおよびｈＥｒｂＢ２／Ｆｃである。  図１（Ｂ）の（３）および（４）はポリクローンの例である。
【図１（Ｃ）】標的分子である各蛋白質に対してパニングを行うことにより得られたＴＡＣＩ＿ｄ２変異体が、それぞれの蛋白質に結合することを示す図。パニングに用いた標的分子は、図１（Ｃ）の（５）および（６）はそれぞれｈＶＥＧＦ、および（６）ｈＴＮＦ−αである。図１（Ｃ）の（５）および（６）はシングルクローンの例である。
【００１０】
【図２（Ａ）】組換えヒトＥｐｈＡ２に結合するＴＡＣＩ＿ｄ２変異体＃１乃至＃３（以下、α−ＥｐｈＡ２  ＴＡＣＩ＿ｄ２  ＃１乃至＃３）と野生型ＴＡＣＩ＿ｄ２の特異性を比較した図。固相化蛋白質には、図２（Ａ）の（１）および（２）ではそれぞれｈＥｐｈＡ２およびＢＳＡを用いた。
【図２（Ｂ）】組換えヒトＥｐｈＡ２に結合するＴＡＣＩ＿ｄ２変異体＃１乃至＃３（以下、α−ＥｐｈＡ２  ＴＡＣＩ＿ｄ２  ＃１乃至＃３）と野生型ＴＡＣＩ＿ｄ２の特異性を比較した図。固相化蛋白質には、図２（Ｂ）の（３）および（４）ではそれぞれｈＢＡＦＦおよびｍＥｐｈＡ２／Ｆｃを用いた。
【００１１】
【図３（Ａ）】α−ＥｐｈＡ２  ＴＡＣＩ＿ｄ２  ＃１乃び＃２のヒトＥｈｐＡ２発現細胞への結合性を比較した図。  図３（Ａ）の（１）および（２）には、それぞれα−ＥｐｈＡ２  ＴＡＣＩ＿ｄ２  ＃１(α−ＥｐｈＡ２  ＃１）およびα−ＥｐｈＡ２  ＴＡＣＩ＿ｄ２  ＃２（α−ＥｐｈＡ２  ＃２）についてアッセイした結果を示す。  比較対象の細胞には、それぞれヒトＥｐｈＡ２発現細胞（ａ）およびヒトＥｒｂＢ２発現細胞（ｂ）を用いた。α−ＥｐｈＡ２  ＴＡＣＩ＿ｄ２  ＃１および＃２（α−ＥｐｈＡ２  ＃１、およびα−ＥｐｈＡ２  ＃２）は、ヒトＥｐｈＡ２発現細胞に特異的に結合した。
【図３（Ｂ）】α−ＥｐｈＡ２  ＴＡＣＩ＿ｄ２  至＃３および野生型ＴＡＣＩ＿ｄ２のヒトＥｈｐＡ２発現細胞への結合性を比較した図。  図３（Ｂ）の（３）および（４）には、それぞれα−ＥｐｈＡ２  ＴＡＣＩ＿ｄ２  ＃３(α−ＥｐｈＡ２  ＃３）および野生型ＴＡＣＩ＿ｄ２（ＷＴ）についてアッセイした結果を示す。  比較対象の細胞には、それぞれヒトＥｐｈＡ２発現細胞（ａ）およびヒトＥｒｂＢ２発現細胞（ｂ）を用いた。
【図４】標的分子に特異的に結合するＴＡＣＩ＿ｄ２変異体の有するアミノ酸配列の一覧。＊印を付した箇所は、該当するアミノ酸Ｓｅｒが存在しない（欠失している）ことを示す。ＷＴは野生型のアミノ酸配列を示す。Ｘ（を付した箇所）は配列番号１で示されるアミノ酸配列におけるＸａａ（の位置）に相当する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、ペプチド、ペプチド誘導体、ペプチド・ライブラリー、ヌクレオチド、ベクター、細胞、ペプチドおよび／またはその誘導体の製造方法、所望の性質を有するペプチドおよび／またはその誘導体の同定方法、所望の性質を有するペプチドおよび／またはその誘導体の製造方法、被検ペプチドまたはその誘導体が標的分子に結合するか否かを判定する方法、ヌクレオチド・ライブラリー、組成物、試薬等を提供する。本発明の様々な態様について以下に述べるが、本発明の態様はそれらに限定されるものではない。
【００１３】
１．ペプチド
本発明はペプチドを提供する。
【００１４】
本発明の「ペプチド」は、「ポリペプチド」、「蛋白質」をもその意味に包含する。また、本発明において、かかる「ペプチド」は、「ペプチドの誘導体に含まれるペプチド」をもその意味に包含する。
【００１５】
本発明の一つの態様において、ペプチドは、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する。該アミノ酸配列において  アミノ末端から数えて１番目乃至１１番目のＸａａは、それぞれ、任意のアミノ酸であるが、好適にはシステインを除く任意のアミノ酸であり、より好適にはシステインおよびプロリンを除く任意のアミノ酸である。
【００１６】
本発明のより一層好適な態様において、該アミノ酸配列中、アミノ末端から数えて１番目のＸａａ（配列番号１の１１番目のアミノ酸に相当する）は、グルタミン、メチオニン、ヒスチジン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン、トリプトファン、イソロイシン、アスパラギン酸およびスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸である；  アミノ末端から数えて２番目のＸａａ（配列番号１の１３番目のアミノ酸に相当する）は、トリプトファン、ロイシン、グリシン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギンおよびスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸である；  アミノ末端から数えて３番目のＸａａ（配列番号１の１４番目のアミノ酸に相当する）は、アルギニン、ロイシン、アラニン、ヒスチジン、スレオニン、バリン、グルタミン酸およびセリンからなる群から選択されるアミノ酸である；  アミノ末端から数えて４番目のＸａａ（配列番号１の１５番目のアミノ酸に相当する）は、グルタミン酸、アルギニン、リジン、イソロイシン、グルタミン、トリプトファン、チロシン、グリシンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸である；  アミノ末端から数えて５番目のＸａａ（配列番号１の１６番目のアミノ酸に相当する）は、リジン、グルタミン酸、メチオニン、アラニン、グルタミン酸、グリシン、スレオニン、ヒスチジンおよびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸である；  アミノ末端から数えて６番目のＸａａ（配列番号１の１７番目のアミノ酸に相当する）は、トリプトファン、チロシン、セリン、フェニルアラニン、グルタミンおよびアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸である；  アミノ末端から数えて７番目のＸａａ（配列番号１の２０番目のアミノ酸に相当する）は、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、セリン、リジン、アルギニン、ヒスチジンおよびアスパラギンからなる群から選択されるアミノ酸である；  アミノ末端から数えて８番目のＸａａ（配列番号１の２５番目のアミノ酸に相当する）は、リジン、グルタミン酸、アラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、アルギニンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸である；  アミノ末端から数えて９番目のＸａａ（配列番号１の２８番目のアミノ酸に相当する）は、アスパラギン、セリン、チロシン、グルタミン酸、アラニン、グリシン、リジンおよびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸である；  アミノ末端から数えて１０番目のＸａａ（配列番号１の３１番目のアミノ酸に相当する）は、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、フェニルアラニン、アスパラギン、バリンおよびロイシンからなる群から選択されるアミノ酸である；  アミノ末端から数えて１１番目のＸａａ（配列番号１の３２番目のアミノ酸に相当する）は、イソロイシン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ロイシン、アラニン、メチオニン、フェニルアラニンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸である；  また、アミノ末端から数えて１番目乃至１１番目のＸａａは、本段落に記載された各群から選択されるアミノ酸が、保存的アミノ酸置換されたもの（本発明の他の部分に詳述されている）で��ってもよい。
【００１７】
また、本発明のある態様において、ペプチドは、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列にある、アミノ末端から数えて１番目乃至１１番目のＸａａ以外のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列を有する。アミノ末端から数えて１番目乃至１１番目のＸａａ以外の、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列において置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸の数は、１個以上２８個以下であればよく、その下限は１個である。その上限は２８個、２６個、２４個、２２個、２０個、１８個、１６個、１４個、１２個、１０個、８個、６個、５個、４個、３個、２個であり、最小１個である。
【００１８】
かかるアミノ酸配列において  アミノ末端から数えて１番目乃至１１番目のＸａａは、それぞれ、任意のアミノ酸であるが、好適にはシステインを除く任意のアミノ酸であり、より好適にはシステインおよびプロリンを除く任意のアミノ酸であり、より一層好適には、前記の各群から選択されるアミノ酸であるか、あるいは該アミノ酸が保存的アミノ酸置換されたものである。
【００１９】
「保存的アミノ酸置換（conservative amino acid substitution）」とは、機能的に等価または類似のアミノ酸との置換を意味する。ペプチドにおける保存的アミノ酸置換は、該ペプチドのアミノ酸配列に静的変化をもたらす。例えば、同様の極性を有する一つまたは二つ以上のアミノ酸は機能的に等価に作用し、かかるペプチドのアミノ酸配列に静的変化をもたらす。一般に、あるグループ内の置換は構造および機能について保存的であると考えることができる。しかしながら、当業者には自明であるように、特定のアミノ酸残基が果たす役割は当該アミノ酸を含む分子の三次元構造における意味合いにおいて決定され得る。例えば、システイン残基は、還元型の（チオール）フォームと比較してより極性の低い、酸化型の（ジスルフィド）フォームをとることができる。アルギニン側鎖の長い脂肪族の部分は構造的および機能的に重要な特徴を構成し得る。また、芳香環を含む側鎖（トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン）はイオン−芳香族相互作用または陽イオン−ｐｉ相互作用に寄与し得る。かかる場合において、これらの側鎖を有するアミノ酸を、酸性または非極性グループに属するアミノ酸と置換しても、構造的および機能的には保存的であり得る。プロリン、グリシン、システイン（ジスルフィド・フォーム）等の残基は主鎖の立体構造に直接的な効果を与える可能性があり、しばしば構造的ゆがみなしに置換することはできない。
【００２０】
保存的アミノ酸置換は、以下に示すとおり、側鎖の類似性に基づく特異的置換（レーニンジャ、生化学、改訂第２版、１９７５年刊行、７３乃至７５頁：L. Lehninger, Biochemistry, 2ndedition, pp73-75, Worth Publisher, New   York (1975)）および典型的置換を含む。
(１)非極性アミノ酸グループ：アラニン（以下、「Ａｌａ」または単に「Ａ」と記す）、バリン（以下、「Ｖａｌ」または単に「Ｖ」と記す）、ロイシン（以下、「Ｌｅｕ」または単に「Ｌ」と記す）、イソロイシン（以下、「Ｉｌｅ」または単に「Ｉ」と記す）、プロリン（以下、「Ｐｒｏ」または単に「Ｐ」と記す）、フェニルアラニン（「Ｐｈｅ」または単に「Ｆ」と記す）、トリプトファン（以下、「Ｔｒｐ」または単に「Ｗ」と記す）、メチオニン（以下、「Ｍｅｔ」または単に「Ｍ」と記す）
（２）非荷電極性アミノ酸グループ：グリシン（以下、「Ｇｌｙ」または単に「Ｇ」と記す）、セリン（以下、「Ｓｅｒ」または単に「Ｓ」と記す）、スレオニン（以下、「Ｔｈｒ」または単に「Ｔ」と記す）、システイン（以下、「Ｃｙｓ」または単に「Ｃ」と記す）、チロシン（以下、「Ｔｙｒ」または単に「Ｙ」と記す）、アスパラギン（以下、「Ａｓｎ」または単に「Ｎ」と記す）、グルタミン（以下、「Ｇｌｎ」または単に「Ｑ」と記す）
（３）酸性アミノ酸グループ：アスパラギン酸（以下、「Ａｓｐ」または単に「Ｄ」と記す）、グルタミン酸（以下、「Ｇｌｕ」または単に「Ｅ」と記す）
（４）塩基性アミノ酸グループ：リジン（以下、「Ｌｙｓ」または単に「Ｋ」と記す）、アルギニン（以下、「Ａｒｇ」または単に「Ｒ」と記す）、ヒスチジン（以下、「Ｈｉｓ」または単に「Ｈ」と記す）
また、天然界に存在するアミノ酸は、その共通する側鎖の性質に基づいて次のようなグループに分けることができる。
（１）疎水性アミノ酸グループ：ノルロイシン（Ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ
（２）中性親水性アミノ酸グループ：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性アミノ酸グループ：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性アミノ酸グループ：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）主鎖の方角に影響を与えるアミノ酸のグループ：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族アミノ酸グループ：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
以下に、保存的置換の例を示すが、本発明の保存的アミノ酸置換はこれらに限定されるものではない。
【００２１】
Ａｌａは、例えば、Ｖａｌ，Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ノルロイシン、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐと置換し得る。
【００２２】
Ａｒｇは、例えば、Ｌｙｓ、Ｈｉｓと置換し得る。
【００２３】
Ａｓｎは、例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙと置換し得る。
【００２４】
Ａｓｐは、例えば、Ｇｌｕと置換し得る。
【００２５】
Ｃｙｓは、例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎと置換し得る。
【００２６】
Ｇｌｎは、例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎと置換し得る。
【００２７】
Ｇｌｕは、例えば、Ａｓｐと置換し得る。
【００２８】
Ｇｌｙは、例えば、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕと置換し得る。
【００２９】
Ｈｉｓは、例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇと置換し得る。
【００３０】
Ｉｌｅは、例えば、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、ノルロイシンと置換し得る。
【００３１】
Ｌｅｕは、例えば、ノルロイシン、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔと置換し得る
Ｌｙｓは、例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓと置換し得る。
【００３２】
Ｍｅｔは、例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、ノルロイシンと置換し得る。
【００３３】
ノルロイシンは、例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐと置換し得る。
【００３４】
Ｐｈｅは、例えば、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔと置換し得る。
【００３５】
Ｐｒｏは、例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙと置換し得る。
【００３６】
Ｓｅｒは、例えば、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒと置換し得る。
【００３７】
Ｔｈｒは、例えば、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎと置換し得る。
【００３８】
Ｔｒｐは、例えば、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔと置換し得る。
【００３９】
Ｔｙｒは、例えば、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒと置換し得る。
【００４０】
Ｖａｌは、例えば、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、ノルロイシン、Ｐｒｏと置換し得る。
【００４１】
かかるアミノ酸から構成されるアミノ酸配列を有する本発明のペプチドの有するアミノ酸配列の例としては、以下のものを挙げることができるが、本発明のペプチドの有するアミノ酸配列はこれらに限定されるものではない。
【００４２】
SLSCRKEQGKQYWREKMDCECASKCGNHPDICAYFCEN（配列表の配列番号１：図４の１）
SLSCRKEQGKQYLLREWDCDSCASECGSHPHYCAYFCEN（配列表の配列番号２：図４の２）
SLSCRKEQGKMYLLKEWDCASCASACGNHPHYCAYFCEN（配列表の配列番号３：図４の３）
SLSCRKEQGKHYLLKEYDCDSCASECGYHPDYCAYFCEN（配列表の配列番号４：図４の４）
SLSCRKEQGKSYGAIMYDCSSCASYCGEHPWHCAYFCEN（配列表の配列番号５：図４の５）
SLSCRKEQGKEYGAIAWDCSSCASYCGAHPFECAYFCEN（配列表の配列番号６：図４の６）
SLSCRKEQGKNYIHQQWDCASCASECGGHPNYCAYFCEN（配列表の配列番号７：図４の７）
SLSCRKEQGKWYMTWESDCKSCASWCGSHPFDCAYFCEN（配列表の配列番号８：図４の８）
SLSCRKEQGKMYDLYGFDCRSCASMCGKHPDLCAYFCEN（配列表の配列番号９：図４の９）
SLSCRKEQGKMYMVWTQDCKSCASWCGAHPVACAYFCEN（配列表の配列番号１０：図４の１０）
SLSCRKEQGKIYNQYGFDCKSCASWCGKHPDMCAYFCEN（配列表の配列番号１１：図４の１１）
SLSCRKEQGKIYMTWHDDCHSCASLCGSHPLFCAYFCEN（配列表の配列番号１２：図４の１２）
SLSCRKEQGKDYMVFGQDCHSCASWCGKHPVACAYFCEN（配列表の配列番号１３：図４の１３）
SLSCRKEQGKQYMAGHFDCNSCASRYGHHPLMCAYFCEN（配列表の配列番号１４：図４の１４）
SLSCRKEQDKTYIEYGFDCRSCASGCGGHPLMCAYFCEN（配列表の配列番号１５：図４の１５）
SLSCRKEQGKSYTSEWFDCASCASKYGKHPLVCAYFCEN（配列表の配列番号１６：図４の１６）
本発明において、アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはその混合物（ＤＬ−アミノ酸）であるが、特に明記しない限りＬ−アミノ酸を意味する。
【００４３】
また、本発明において、アミノ酸は、上記以外のアミノ酸（以下、便宜的に「異常アミノ酸」と総称する。）であってよい。異常アミノ酸としては、例えば、天然のペプチドや蛋白質において見出されるセレノシステイン、Ｎ−ホルミルメチオニン、ピロリジン、ピログルタミン酸、シスチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、チロキシン、Ｏ−ホスホセリン、デスモシン、β−アラニン、サルコシン、オルニチン、クレアチン、γアミノ酪酸、オパイン、テアニン、トリコロミン酸、カイニン酸、ドウモイ酸、アクロメリン酸等を挙げることができ、非天然アミノ酸としては、Ａｃ−アミノ酸、Ｂｏｃ−アミノ酸、Ｆｍｏｃ−アミノ酸、Ｔｒｔ−アミノ酸、Ｚ−アミノ酸等のＮ末端保護アミノ酸、アミノ酸ｔ−ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、フルオレニルエステル等のＣ末端保護アミノ酸、ジアミン、ωアミノ酸、βアミノ酸、γアミノ酸、アミノ酸のＴｉｃ誘導体、アミノフォスフォン酸を含むその他のアミノ酸等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
【００４４】
本発明のペプチドは、化学合成、遺伝子組換え、イン・ビトロ翻訳等、ペプチドや蛋白質を製造する方法として当業者に周知の方法により調製することができる。また、本発明のライブラリー等から本発明の同定方法により選抜されたペプチドも、それらの方法により調製することができる。
【００４５】
化学合成法としては、例えば、t-ブトキシカルボニル（t-Butoxycarbonyl：Boc）法、９−フルオレニルメトキシカルボニル(9-Fluorenylmethoxycarbonyl：Fmoc)法等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。Fmoc法は、脱保護条件が温和であり、樹脂からのペプチドの切り出しが簡便であること等の特長を有している（Fmoc solid phase peptide synthesis: a practical approach, ed. by W. C. Chan, P. D. White Eds., Oxford University Press, New York, 2000.）。
【００４６】
本発明において、「ペプチドの誘導体」および「ペプチド誘導体」とは、本発明のペプチドに化学的な修飾または生物学的な修飾が施されたものを意味する。化学的な修飾とは、本発明のペプチド中またはペプチド上において、化学反応、すなわち原子−原子間の結合の生成若しくは切断により、元のペプチドとは異なる物質に変化させることを意味する。生物学的修飾とは、本発明のペプチド中またはペプチド上において、生物学的反応、すなわち生物に由来する蛋白質（酵素、サイトカイン等）、核酸（リボザイム等）、細胞、組織、器官若しくは非ヒト個体を利用して、またはそれらの直接的または間接的な作用により、元のペプチドとは異なる物質を生じさせることを意味する。
【００４７】
かかる「誘導体」は、元のペプチドとは異なる物質であれば特に限定されるものではないが、例えば、天然に生じる糖鎖または人工的に創出された糖鎖を含むもの、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリマーを含むもの、合成化合物または天然化合物を含むもの、標識されたもの、固相化に必要な部分を含むもの、アミノ末端側にシグナルペプチドが連結しているもの、精製または単離を行う際に利用するタグを含むもの、および、表現型であるペプチドおよび該表現型に対応する遺伝型が直接的または間接的にリンクしているもの、ならびに、それらのうち二つ以上を組み合わせたもの等をあげることができる。
【００４８】
本発明のペプチド誘導体は、本発明のペプチドを原料として、化学反応、生化学反応、翻訳後修飾等、ペプチドや蛋白質を化学的または生物学的に修飾する方法として当業者に周知の方法に供することにより、調製することができる。また、本発明のライブラリー等から本発明の同定方法により選抜されたペプチドの誘導体も、それらの方法により調製することができる。また、所望の翻訳語修飾能を有する細胞を用いた遺伝子組換えによっても、かかる翻訳後修飾が施された本発明のペプチド誘導体を調製することができる。さらに、イン・ビトロ翻訳系に修飾アミノ酸を添加することにより、該修飾アミノ酸を含む本発明のペプチド誘導体を調製することができる。
【００４９】
ＰＥＧ化の方法としては、例えば、ペプチドまたは蛋白質とＮ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｍｉｄｅ  Ｅｓｔｅｒ（ＮＨＳ）−ＰＥＧとを反応させる方法等をあげることができるが、それに限定されるものではない。
【００５０】
本発明のペプチドおよびその誘導体は、好適な態様において、標的分子に結合する。
【００５１】
本発明のペプチドおよびその誘導体がとり得る形態としては、例えば、単離された形態（凍結乾燥標品、溶液等）、他の分子に結合した形態（固相化された形態、融合蛋白質、異分子との会合体、標的分子と結合した形態等）、他のペプチド等をも含む物理的集合（本発明のペプチド・ライブラリーを含む）、細胞表面上（大腸菌や酵母の細胞表面上等）に発現または提示（ディスプレイと同義）された形態（本発明の細胞を含む）、ウイルス粒子上に発現または提示（ディスプレイと同義）された形態等をあげることができるが、それらに限定されるものではなく、使用、保存等の目的に適合した形態を任意に選択することができる。
【００５２】
２．ヌクレオチド
本発明はヌクレオチドを提供する。
【００５３】
本発明において、「ヌクレオチド」は、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり、「核酸」または「遺伝子」とも呼ばれる。本発明のヌクレオチドとしては、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プライマー、ベクター等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。また、本発明のヌクレオチドは、一本鎖ヌクレオチド、二本鎖ヌクレオチドおよび三本以上のヌクレオチドの会合体のいずれであってもよく、ＤＮＡおよびＲＮＡからなるハイブリッド一本鎖ヌクレオチド、該ヌクレオチドとその相補鎖からなる二本鎖、一本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＲＮＡからなるハイブリッド二本鎖、二本鎖ＲＮＡ、分子内に二本鎖構造部分を有し得る一本鎖ヌクレオチド等をも包含する。さらに、本発明のヌクレオチドは、天然に生じる塩基またはモノヌクレオチド以外の（人工的に創出された）塩基もしくはモノヌクレオチドを一つまたは二つ以上含んでいてもよい。
【００５４】
本発明の好適なヌクレオチドとしては、本発明のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド、本発明のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでなるヌクレオチド等をあげることができる。かかる好適なヌクレオチドは、本発明のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列以外の塩基配列および／または非ヌクレオチド部分を含んでいてもよく、化学的または生物学的な修飾（本発明の他の部分に記載されている）が施されていてもよい。それらはいずれも「ヌクレオチド」に包含される。
【００５５】
また、本発明のヌクレオチドは、本発明のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌクレオチドをも包含する。
【００５６】
本発明においては、本発明のペプチドの有するアミノ酸配列が、あるヌクレオチドの塩基配列の一部または全部によりコードされている場合、かかるヌクレオチドを「（かかる）ペプチドに対応するヌクレオチド」とよび、かかるペプチドを「（かかる）ヌクレオチドに対応するペプチド」とよぶ。
【００５７】
本発明のペプチドに対応するヌクレオチドとしては、例えば、本発明のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド、本発明のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでなるヌクレオチド、本発明のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌクレオチド等をあげることができるが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
本発明のヌクレオチドに対応するペプチドとしては、本発明のヌクレオチドの塩基配列の一部もしくは全部によりコードされるアミノ酸配列からなるペプチドを含んでなるペプチド、本発明のヌクレオチドの塩基配列の一部または全部によりコードされるアミノ酸配列を含んでなるペプチド、本発明のヌクレオチドの塩基配列の一部または全部によりコードされるアミノ酸配列からなるペプチド、それらのペプチドのいずれか一つの誘導体等をあげることができるが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
本発明においては、「表現型に対応する遺伝型」なる表現も「ペプチドに対応するヌクレオチド」と同じ意味に用いられる。同様に、「遺伝型に対応する表現型」なる表現も「ヌクレオチドに対応するペプチド」と同じ意味に用いられる。
【００６０】
本発明のヌクレオチドの化学的または生物学的な修飾物が本発明のペプチドを含んでいる場合、かかる修飾物は、前述の本発明の「ペプチドの誘導体」の意味に包含される。
【００６１】
本発明のより好適なヌクレオチドとしては、前述の好適なヌクレオチドのうち、標的分子に結合する本発明のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド、標的分子に結合する本発明のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでなるヌクレオチド、標的分子に結合する本発明のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌクレオチド等をあげることができる。
【００６２】
本発明において、アミノ酸配列をコードする塩基配列を設計するに際しては、各アミノ酸に対応するコドンを一種または二種以上使用することができる。それゆえ、あるペプチドまたは蛋白質が有する単一のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、複数のバリエーションを有し得る。かかるコドンの選択に際しては、該ペプチドに対応する遺伝型、すなわち該塩基配列を含むヌクレオチドが導入される細胞（宿主細胞）のコドン使用（codon usage）に応じて適宜コドンを選択したり、複数のコドンの使用の頻度もしくは割合を適宜調節したりすることができる。例えば、大腸菌を細胞（宿主細胞）として用いる場合は、大腸菌において使用頻度が高いコドンを使用して塩基配列を設計することができる。
【００６３】
本発明のヌクレオチドは、化学合成、遺伝子組換え等、ヌクレオチドを製造する方法として当業者に周知の方法により調製することができる。また、本発明のライブラリー等から本発明の同定方法により回収（選抜、濃縮、単離を含む）されたペプチドに対応するヌクレオチドも、それらの方法により調製することができる。
【００６４】
本発明のヌクレオチドがとり得る形態としては、例えば、単離された形態（凍結乾燥標品、溶液等）、他の分子に結合した形態（固相化された形態等）、該ヌクレオチドを含む組換えベクター（本発明のベクター）、該ヌクレオチドまたは該ベクターが導入された細胞（本発明の細胞）、ウイルスもしくはウイルス粒子に含まれる形態（本発明のベクターとして含まれる形態を含む）、他のヌクレオチド等をも含む物理的集合（本発明のヌクレオチド・ライブラリーを含む）等をあげることができるが、それらに限定されるものではなく、使用、保存等の目的に適合した形態を任意に選択することができる。
【００６５】
３．ベクター
本発明は組換えベクター（以下、単に「ベクター」ともよぶ）を提供する。
【００６６】
本発明のベクターは、本発明のヌクレオチドを含み、且つ本発明のヌクレオチドを細胞、微生物または個体に導入するための手段であれば特に限定されないが、好適には、ファージミド、コスミド、プラスミド等の核酸ベクターをあげることができる。
【００６７】
本発明のベクターは、原核細胞または真核細胞に感染するウイルスまたはウイルス性ベクターであってもよい。
【００６８】
本発明において、「ファージミド」とは、プラスミド複製起点の他に、一本鎖バクテリオファージから誘導された第二の複製起点を含む細菌プラスミドを意味する。かかるファージミドを有する細胞は、Ｍ１３またはそれに類似のヘルパーバクテリオファージによる重感染において、一本鎖複製モードを介してファージミドを複製することができる。すなわち、バクテリオファージ被覆タンパク質により被覆された感染性粒子の中に、一本鎖ファージミドＤＮＡがパッケージされる。このようにして、ファージミドＤＮＡを、感染細菌中にクローン二本鎖ＤＮＡプラスミドとして、ファージミドを、重感染した細胞の培養上清からバクテリオファージ状の粒子として、それぞれ形成することができる。バクテリオファージ状の該粒子を、Ｆ性線毛を有する細菌にかかるＤＮＡを感染させるために該細菌中に注入することにより、粒子自体をプラスミドとして再形成することができる。
【００６９】
本発明のペプチドに対応するヌクレオチドおよびバクテリオファージ被覆蛋白質（coat protein）遺伝子を含んで構成される融合遺伝子を該ファージミドに挿入して細菌に感染させ、該細胞を培養すれば、かかるペプチドを、該細菌上またはファージ様粒子上に発現もしくは提示（ディスプレイと同義）させるか、または、該被覆蛋白質との融合蛋白質としてファージ粒子中もしくは該細菌の培養上清中に産生することができる。
【００７０】
例えば、本発明のペプチドに対応するヌクレオチドおよびバクテリオファージ被覆タンパク質遺伝子ｇｐＩＩＩを含んで構成される融合遺伝子をファージミドに挿入し、Ｍ１３またはそれに類似のヘルパーファージとともに大腸菌に重感染させれば、該ペプチドおよび該被覆蛋白質を含んで構成される融合蛋白質として、該大腸菌の培養上清中に産生させることができる。
【００７１】
ファージミドの代わりに、環状または非環状の各種ベクター、好適にはウイルスベクターを用いても、当業者に周知の方法に従って、該ベクターに含まれる本発明のヌクレオチドの塩基配列によりコードされるペプチドを、該ベクターが導入された細胞あるいはウイルス様粒子上に発現もしくは提示（ディスプレイと同義）させるか、または該細胞の培養上清中に産生することができる。
【００７２】
本発明のベクター（組換えベクター）は、遺伝子組換え等当業者に周知の方法により調製することができる。
【００７３】
本発明のベクターがとり得る形態としては、例えば、単離された形態（凍結乾燥標品、溶液等）、他の分子に結合した形態（固相化された形態等）、細胞に導入された形態（本発明の組換え細胞を含む）、他のベクター等をも含む物理的集合（本発明のヌクレオチド・ライブラリーの特定の態様を含む）等をあげることができるが、それらに限定されるものではなく、使用、保存等の目的に適合した形態を任意に選択することができる。
【００７４】
４．細胞
本発明は、その一つの態様において、組換え細胞（以下、単に「細胞」ともよぶ）を提供する。
【００７５】
本発明の細胞は、本発明のペプチドに対応するヌクレオチドを含み且つ該ペプチドを発現する細胞である。かかる細胞の宿主細胞としては、真核細胞（株化細胞、初代培養細胞、継代培養細胞を含む）および原核細胞のいずれであっても特に限定されるものではない。
【００７６】
原核細胞としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）等の細菌細胞をあげることができるが、これらに限定されるものではない。
【００７７】
真核細胞としては、例えば、動物細胞、昆虫細胞、酵母、真菌等をあげることができ、動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（グルツマン、セル、23巻、１９８１年刊行、１７５乃至１８２頁：Gluzman, Y., Cell (1981), vol.23, pp175-182：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション番号  ATCC CRL-1650）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション番号  ATCC CRL-1658）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（Chinese hamster ovary cell：ＣＨＯ細胞：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション番号  ATCC CCL-61）、ＣＨＯ細胞のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（ウルラオプとチャシン、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー、７７巻、１９８０年刊行、４１２６乃至４２２０頁：Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980), vol.77, pp4126-4220）等をあげることができるが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
本発明の細胞は、本発明のヌクレオチドまたはベクターを宿主細胞へ導入することにより調製することができるが、好適には、本発明のベクターをトランスフェクション、形質転換、形質導入等で宿主細胞へ導入することにより調製することができる。
【００７９】
本発明の細胞の調製に適用し得るベクターとしては、例えば、かかる原核細胞と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列、転写開始点、（翻訳の）開始コドンと終止コドン等から選択されるものの塩基配列を一つ以上含むプラスミド、コスミド、ファージミド等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。また、かかるヌクレオチドまたはベクターは、該ベクターまたはヌクレオチドが導入された細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与し得る塩基配列を含んでいてもよい。かかるベクターまたはヌクレオチドを宿主細胞に導入し、得られた細胞を培養することにより、本発明のペプチドを発現させることができる。
【００８０】
本発明のペプチドの翻訳後修飾に適した宿主細胞も、本発明の細胞として使用することができる。かかる宿主細胞が適用された本発明の細胞は、本発明のペプチド誘導体を調製する方法（のある態様）において使用することができる。
【００８１】
本発明の細胞がとり得る形態としては、例えば、単離された形態（冷凍標品、凍結乾燥標品、溶液等）、他の分子に結合した形態（固相化された形態等）、本発明のヌクレオチドまたはベクターが導入された細胞（本発明の細胞に含まれる）、本発明のペプチドが表面に発現または提示（ディスプレイと同義）されている細胞（本発明の細胞に含まれる）、他の細胞等をも含む物理的集合（本発明のヌクレオチド・ライブラリーおよびペプチド・ライブラリーの特定の態様を含む）等をあげることができるが、それらに限定されるものではなく、使用、保存等の目的に適合した形態を任意に選択することができる。
【００８２】
５．ペプチドの製造方法
本発明は、また他の態様として、本発明のペプチドの製造方法を提供する。
【００８３】
本発明のペプチドは、前述のとおり、化学合成、遺伝子組換え、イン・ビトロ翻訳等、ペプチドや蛋白質を製造する方法として当業者に周知の方法により調製することができる。また、本発明のライブラリー等から本発明の同定方法により回収（選抜、濃縮、単離を含む）されたペプチドも、それらの方法により調製することができる。
【００８４】
本発明のペプチドの製造方法は、ある態様において、次の工程（１−１）および（１−２）を含んでなる：
（１−１）本発明のペプチドに対応するヌクレオチドを含み且つ該ペプチド等を発現する細胞（本発明の細胞）を培養する工程；および、
（１−２）該培養物から該ペプチドを回収する工程。
【００８５】
また、本発明のペプチドの製造方法は、他の態様において、次の工程（２−１）および（２−２）を含んでなる：
（２−１）標的分子に結合する本発明のペプチドのアミノ酸配列を決定する工程；および、
（２−２）該アミノ酸配列からなるペプチドを化学合成または遺伝子組換えにより調製する工程。
【００８６】
さらに、本発明のペプチドの製造方法は、また他の態様において、次の工程（３−１）および（３−２）を含んでなる：
（３−１）本発明のペプチドに対応する対応するｍＲＮＡを調製する工程；および、
（３−２）前記（３−１）で得られたｍＲＮＡを鋳型として、イン・ビトロ翻訳により、該ペプチドを調製する工程。
【００８７】
また、これらの製造方法には、事前の工程として、本発明の同定方法を適宜組合せることができる。すなわち、まず、本発明の同定方法に含まれる工程を実施し、次いで本発明の製造方法に含まれる工程を実施することができる。本発明のペプチドの製造方法は、そのような、本発明の同定方法（の各工程）をさらに含むことからなる方法をも包含する。
【００８８】
そのような本発明のペプチドの製造方法は、例えば、次の工程（４−１）乃至（４−３）を含んでなる：
（４−１）本発明のペプチド・ライブラリーに含まれるペプチドと標的分子とを接触させる工程；
（４−２）該標的分子に結合するペプチドを回収する工程；および
（４−３）回収されたペプチドを、化学合成、遺伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳により調製する工程。
【００８９】
同様に、これらの製造方法には、事前の工程として、本発明の判定方法を適宜組合せることができる。すなわち、まず、本発明の判定方法に含まれる工程を実施し、次いで本発明の製造方法に含まれる工程を実施することができる。本発明のペプチド等の製造方法は、そのような、本発明の判定方法（の各工程）をさらに含むことからなる方法をも包含する。
【００９０】
そのような本発明のペプチド等の製造方法は、例えば、次の工程（５−１）乃至（５−３）を含んでなる：
（５−１）本発明の被検ペプチドと標的分子とを接触させる工程；
（５−２）被検ペプチドが該標的分子に結合する場合、該ペプチドは陽性であると決定する工程；および、
（５−３）前記（５−２）において被検ペプチドは陽性であると決定された場合、該ペプチドを化学合成、遺伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳により調製する工程。
【００９１】
また、本発明はペプチドの誘導体（ペプチド誘導体）の製造方法を提供する。本発明のペプチド誘導体は、該誘導体に含まれるペプチドを上記の方法（ペプチドの製造方法）により調製した後、化学反応、生化学反応、翻訳後修飾等に供することにより、調製することができる。
【００９２】
本発明のペプチド誘導体の製造方法としては、例えば、上記の（１−１）および（１−２）、（２−１）および（２−２）、（３−１）および（３−２）、（４−１）乃至（４−３）、または、（５−１）乃至（５−３）等の各工程に加え、本発明のペプチドを原料として本発明のペプチド誘導体を調製する工程（以下、「誘導体調製工程」という。）をも含んでなる方法をあげることができるが、それらに限定されるものではない。
【００９３】
また、所望の翻訳後修飾能を有する細胞を本発明のペプチドの製造方法において用いることにより、所望の翻訳後修飾が施されたペプチドとして、本発明のペプチド導体を調製することもできる。かかる場合、例えば、所望の翻訳後修飾能を有する細胞を、上記工程の（１−１）および（１−２）における細胞として、または、（２−２）、（４−３）および（５−３）における遺伝子組換えに適用される細胞（または宿主細胞）として、それぞれ用いることにより、所望の翻訳後修飾が施されたペプチド誘導体を調製することができるが、本発明の（ペプチド誘導体の製造方法の態様として）ペプチドの翻訳後修飾体を調製する方法は、それらに限定されるものではない。
【００９４】
６．ライブラリー
本発明はライブラリーを提供する。
【００９５】
本発明において、「ライブラリー」とは、類似するが、同一ではない分子の物理的集合（コレクション）を意味する。かかる集合は、例えば、一つの容器中に共存するが、異なる容器あるいは固相支持体上の異なる場所に、グループとしてまたは個々の分子として、物理的に分離されて存在してもよい。複数のライブラリーが同一の集合に含まれていてもよい。
【００９６】
本発明のライブラリーは、同一ではない本発明のペプチドおよび／またはヌクレオチドの物理的集合であれば何ら限定されるものではないが、例えば、ファージ・ディスプレイ・ライブラリー、リボゾーム・ディスプレイ・ライブラリー、核酸ディスプレイ・ライブラリー等をあげることができる。
【００９７】
「ファージ・ディスプレイ」とは、繊維状ファージ（filamentous phage）等の被覆蛋白質（coat protein）に外来のペプチドまたは蛋白質を連結し、融合蛋白質としてファージ様粒子上に発現または提示（ディスプレイと同義）させる技術（方法およびそのための手段）を意味する。また、かかる技術を利用した、該ペプチドまたは蛋白質に対応するヌクレオチドの回収（選抜、濃縮、単離を含む）も「ファージ・ディスプレイ」の意味に包含される。ファージ・ディスプレイ・ライブラリーは、かかる技術において使用される、本発明のライブラリーの一態様である。
【００９８】
「リボゾーム・ディスプレイ」とは、イン・ビトロ翻訳において、翻訳反応中に形成される、ｍＲＮＡ−リボソーム−ペプチドまたは蛋白質、の三者を含んでなる複合体としての形態で、ペプチドまたは蛋白質を発現または提示（ディスプレイと同義）させる技術（方法およびそのための手段）を意味する。ここで、ペプチドまたは蛋白質は、該ｍＲＮＡの翻訳産物である。また、かかる技術による、該ペプチドまたは蛋白質に対応するヌクレオチドの回収（選抜、濃縮、単離を含む）も「リボゾーム・ディスプレイ」の意味に包含される。リボゾーム・ディスプレイ・ライブラリーは、かかる技術において使用される、本発明のライブラリーの他の一態様である。
【００９９】
「核酸ディスプレイ」とは、ヌクレオチド（核酸と同義）と、該ヌクレオチドに対応するペプチドまたは蛋白質を含んでなる複合体としての形態で、ペプチドもしくは蛋白質を発現または提示（ディスプレイと同義）させる技術（方法およびそのための手段）を意味する（キーフェとスゾスタク、ネイチャー、４１０巻、７１５乃至７１８頁、２００１年刊行：Keefe, A.D and Szostak, J.W., Nature, vol.410 (2001), pp715-718）。また、かかる技術による、該ペプチドまたは蛋白質に対応するヌクレオチドの回収（選抜、濃縮、単離を含む）も「核酸ディスプレイ」の意味にされ包含する。核酸ディスプレイ・ライブラリーは、かかる技術において使用される、本発明のライブラリーのまた他の一態様である。
【０１００】
核酸ディスプレイとしては、例えば、ｍＲＮＡディスプレイをあげることができるが、それに限定されるものではない。（Yamaguchi, J. et al., Nucleic Acids Research, vol.37, No.16 e108, pp1-13 (2009)）
ｍＲＮＡディスプレイは、ｍＲＮＡとその翻訳産物であるペプチドまたは蛋白質が介在部分を挟んで連結してなる複合体としての形態で、ペプチドまたは蛋白質を提示（ディスプレイと同義）させる技術である（キーフェとスゾスタク、ネイチャー、４１０巻、７１５乃至７１８頁、２００１年刊行：Keefe, A.D and Szostak, J.W., Nature, vol.410 (2001), pp715-718）。
【０１０１】
本発明においては、同一ではない本発明のペプチドおよび／またはヌクレオチドの物理的集合を含む細胞の物理的集合、微生物（ウイルス、ファージ、ファージ様分子、それらのいずれかの粒子等を含む）の物理的集合、および、天然に生じるかまたは人工的に創出されたベクター（ファージミド、コスミド、プラスミド等を含む）の物理的集合、ならびに、それらの断片の物理的集集合、および、科学的および／または生物学的な修飾物の物理的集合も、「ライブラリー」の意味に包含される。
【０１０２】
前述のとおり、本発明において、アミノ酸配列コードする塩基配列を設計するに際しては、各アミノ酸に対応するコドンを一種または二種以上使用することができる。それゆえ、あるペプチドまたは蛋白質が有する単一のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、複数のバリエーションを有し得る。かかるコドンの選択に際しては、該ペプチドに対応する遺伝型、すなわち該塩基配列を含むヌクレオチドが導入される細胞（宿主細胞）のコドン使用（codon usage）に応じて適宜コドンを選択したり、複数のコドンの使用の頻度もしくは割合を適宜調節したりすることができる。よって、本発明のヌクレオチド・ライブラリーには、単一のアミノ酸配列をコードする塩基配列のヌクレオチドは、複数のバリエーションを有し得る。すなわち、本発明のヌクレオチド・ライブラリーには、あるペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むヌクレオチドの物理的集合が含まれていてもよい。かかる特定のペプチドに対応するヌクレオチドの物理的集合は、それら自体で一つのヌクレオチド・ライブラリーを形成し得る。
【０１０３】
本発明のライブラリーには、類似するが、同一ではない分子が複数含まれる。ライブラリーに含まれる類似分子の種類（の数）のことを「ライブラリーの多様性」という。例えば、１００種の類似分子からなるライブラリーの多様性は１０２である。本発明において、ライブラリーの多様性は、特に限定されるものではないが、その数値が高いほど好ましい。
【０１０４】
本発明の同定方法および該同定方法の工程を含むペプチドの製造方法において使用されるペプチド・ライブラリーの多様性は、１×１０５以上、以上２×１０５以上、５×１０５以上、１×１０６以上、２×１０６以上、５×１０６以上、１×１０７以上、２×１０７以上、５×１０７以上、１×１０８以上、２×１０８以上、５×１０８以上、１×１０９以上、２×１０９以上、５×１０９以上、１×１０１０以上、２×１０１０以上、５×１０１０以上、１×１０１１以上、２×１０１１以上、５×１０１１以上、１×１０１２以上、２×１０１２以上、５×１０１２以上、１×１０１３以上、２×１０１３以上、５×１０１３以上、１×１０１４以上、２×１０１４以上、５×１０１４以上、１×１０１５以上、２×１０１５以上、５×１０１５以上、１×１０１６以上、２×１０１６以上、５×１０１６以上、または、１×１０１７以上である。かかるライブラリーの多様性は、実測値に限定されるものではなく、理論値であってもよい。
【０１０５】
７．同定方法
本発明は、標的分子に結合するペプチドおよび／またはペプチド誘導体の同定方法を提供する。
【０１０６】
・  標的分子 
本発明において「標的分子」とは、本発明のペプチドが結合する、ヒトもしくは非ヒト動物の個体に内在する物質または生体内に取り込まれ得る外因性の物質を意味する。本発明の標的分子は、好適には、かかる個体が罹患し得る疾患の発症もしくは増悪に直接または間接的に関与し得るか、または、かかる疾患と相関もしくは逆相関を示す、内在するかあるいは外因性の酵素、受容体、該受容体のリガンド、サイトカイン等の液性因子、その他の生体高分子、シグナル伝達物質、細胞、病原体、毒素、または、それらのいずれか一つもしくはそれ以上に由来する物質、例えば、その断片、分解物、代謝産物、加工物等である。また、本発明の標的分子は、鉱物、ポリマー、プラスチック、合成低分子化合物等の非天然物質であってもよい。
【０１０７】
本発明の標的分子は、本発明のペプチド・ライブラリーから該標的分子に結合するペプチドを選抜する際に使用される。かかる標的分子は、全長分子若しくはその断片、または任意のアミノ酸、ペプチド、蛋白質、糖鎖、ポリマー、担体等が付加された誘導体であってもよい。また、かかる標的分子は固相化されていてもよい。
【０１０８】
・  標的分子の調製
本発明の標的分子は、疾患に罹患した組織、細胞から単離、精製して使用することができる。また、本発明の標的分子は、化学合成、遺伝子組換え、イン・ビトロ翻訳等、ペプチドまたは蛋白質の製造方法として当業者に周知の方法により調製することができる。このようにして得られた標的分子から、必要に応じて、前述のような誘導体を調製してもよい。
【０１０９】
本発明において、ペプチドまたは蛋白質は、イン・ビトロ翻訳、すなわち、かかるペプチドまたは蛋白質に対応するＤＮＡ、ｃＤＮＡ等のヌクレオチドもしくは該ヌクレオチドを含むベクターを、転写および翻訳に必要な酵素、基質、エネルギー物質等を含む溶液中で保温することによりイン・ビトロで所望のペプチドまたは蛋白質を合成する方法、遺伝子組換え、すなわち、該ヌクレオチド若しくはベクターを原核もしくは真核の細胞（宿主細胞）へ導入し、得られた組換え細胞を培養した後、該培養物から所望のペプチドまたは蛋白質を回収する方法、化学合成等により調製することができる。
【０１１０】
標的分子が細胞膜に存在する蛋白質またはそのドメインである場合、かかる蛋白質またはドメインの細胞外領域と免疫グロブリン（Ｉｇ）の定常領域とが連結してなる融合蛋白質を適切な宿主−ベクター系において発現させることにより、分泌蛋白質として当該分子を調製することもできる。
【０１１１】
標的分子に対応するヌクレオチドは、例えば、発現クローニング法により取得することができるが、これに限定されるものではない。発現クローニング法は、ペプチドまたは蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むｃＤＮＡの発現ライブラリーを構築し、かかるｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、該ｃＤＮＡの全長または一部を特異的に増幅するプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という：サイキ他、サイエンス、２３９巻、４８７乃至４８９頁、１９８８年刊行：Saiki, R. K., et al., Science (1988), vol.239, pp487-489）を行うことにより、ペプチドまたは蛋白質に対応するｃＤＮＡをクローニングする方法である。
【０１１２】
イン・ビトロ翻訳に適用し得るキットや試薬としては、例えば、ロシュ・ダイアグノスティックス社製のラピッドトランスレーションシステム（ＲＴＳ）等を挙げることができる。
【０１１３】
遺伝子組換えの宿主細胞としては、本発明の細胞を調製するための宿主細胞として適用可能な原核または真核の細胞を適宜選択することができる。
【０１１４】
遺伝子組換えにおいて得られた組換え細胞（ヌクレオチドまたはベクターが導入された細胞）は、当業者に周知の方法に従って培養することができ、該培養物中またはかかる細胞内に所望のペプチドまたは蛋白質を産生させることができる。
【０１１５】
かかる培養に用いられる培地は、宿主細胞に応じて慣用されるものから適宜選択することができる。宿主細胞が大腸菌の場合、例えば、ＬＢ培地に必要に応じて、アンピシリン等の抗生物質やＩＰＴＧを添加して培養に供することができる。
【０１１６】
かかる培養により、組換え細胞の内外に産生された所望のペプチドまたは蛋白質は、その物理的、化学的および／または生物学的性質等を利用した公知の分画手法を適宜組み合わせることにより、精製および単離することができる。
【０１１７】
かかる分画手法としては、例えば、塩析、蛋白質沈殿剤による処理、透析、限外濾過、分子ふるい（ゲル濾過）クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等をあげることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１１８】
また、ペプチドまたは蛋白質に、予め、精製するために有用な部分を連結または付加させることにより、効率よく所望のペプチドまたは蛋白質を精製することができる。例えば、予め６残基からなるヒスチジンタグを連結しておくことにより、ニッケル・アフィニティー・クロマトグラフィーにより効率よく所望のペプチドまたは蛋白質を精製することができる。また、予めＩｇＧのＦｃ領域を連結しておくことにより、プロテインＡ・アフィニティー・クロマトグラフィーにより効率よく所望のペプチドまたは蛋白質を精製することができる
（３）標的分子とペプチドおよび／またはペプチド誘導体との接触
本発明の同定方法は、ペプチドおよび／またはその誘導体と標的分子とを接触させる工程を含む。ここで、該ペプチドおよび／またはその誘導体は、ペプチド・ライブラリーに含まれていてもよい。すなわち、本発明の同定方法は、ペプチド・ライブラリーに含まれるペプチドおよび／またはその誘導体と標的分子とを接触させる工程を含んでもよい。
【０１１９】
本発明において「接触させる」とは、二つまたはそれ以上の物質を、当該物質のうち二つ以上の間で相互作用可能な距離まで接近させることを意味する。かかる相互作用としては、例えば、共有結合、配位結合、金属−金属間結合、イオン結合、金属結合、水素結合、ファンデルワールス結合等（以下、「化学結合」という。）、クーロン力による結合、イオン間相互作用、水素結合、双極子相互作用、ファンデルワールス力等の静電的相互作用に基づく相互作用（以下、「分子間力」という。）、その他の相互作用、電荷移動相互作用、渡環相互作用、疎水相互作用、ペプチドと生体分子との会合等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。本発明において「二つまたはそれ以上の物質」とは、標的分子および被検物質を含んでいれば、特に限定されるものではない。被検物質としては、標的分子に結合する物質であれば特に限定されるものではないが、例えば、本発明のペプチド、該ペプチドの誘導体、それらのいずれかが固相化された担体、それらのいずれかが発現もしくは提示（ディスプレイと同義）された細胞、ウイルス粒子またはウイルス様粒子（ファージ、ファージミドを含む）等をあげることができる。かかる被検物質は、ファージ・ディスプレイ、リボゾーム・ディスプレイ、核酸ディスプレイ等により、真核または原核の細胞表面上に、ウイルス粒子またはウイルス様粒子上に、あるいはリボゾームまたは核酸にリンクした形で、発現または提示（ディスプレイと同義）されていてもよい。
（４）選抜
本発明の同定方法は所望の性質を有するペプチドおよび／またはペプチド誘導体、好適には標的分子に結合するペプチドおよび／またはペプチド誘導体を選抜する工程を含む。
【０１２０】
本発明において「結合」とは、ある条件の下において、二つまたはそれ以上の物質が、それらの間で相互作用（本発明の他の部分に記載されている）が生じ得る程度に、互いに近接しているか、あるいは会合した状態になることを意味する。
【０１２１】
本発明においては、ある条件の下で、標的分子と被検物質とを接触させ、次いで該標的分子に非特異的に吸着した被検物質および該標的分子に結合又は吸着しなかった被検物質を、被検物質を含む画分から除去した後も、該画分中に被検物質が存在していれば、かかる被検物質は該標的分子に「結合」すると解することができる。
【０１２２】
二つまたはそれ以上の物質の間に単なる非特異的な吸着しか生じていない場合、それらの物質の間に「結合」は生じていないと解することができる。また、二つまたはそれ以上の物質を接触させても、それらの間で相互作用（本発明の他の部分に記載されている）が生じ得る程度に、互いに近接しないか、あるいは会合した状態にならない場合、それらの物質の間に「結合」は生じていないと解することができる。
抗体と抗原の「結合」を測定する方法としては、フローサイトメトリー等により測定を行う蛍光抗体法（直接法、間接法）、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ（均一法、不均一法）、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ等が広く使用されている。これらの方法において、被検抗体および抗原を本発明のペプチドまたはその誘導体および標的分子に置き換えれば、抗体と抗原の「結合」の測定と同様に、ペプチドまたはその誘導体と標的分子の「結合」の有無を測定することができる。
また、「結合」の有無は、結合活性または親和性の指標を測定することにより、決定することができる。結合親和性の指標としては、解離定数、結合定数等をあげることができる。
【０１２３】
以下で表される化学平衡状態にある分子ＡおよびＡに結合する物質Ｂの化学的解離について、
【化１】
2012105616.tif 000002
解離定数（dissociation constant：Ｋｄ）は次の式により算出することができる：
Ｋｄ＝［Ａ］［Ｂ］／［ＡＢ］
ここで［Ａ］、［Ｂ］および［ＡＢ］は、Ａ、ＢおよびＡＢ（会合体）の濃度をそれぞれ意味する。Ｋｄは解離したＡおよびＢと解離していないＡＢとの比を意味するものであり、Ｋｄの逆数は結合定数（Ｋａ）である。
【０１２４】
本発明において用いられる「解離定数（dissociation constant）」は、主に、ある標的分子に結合するためのペプチドおよび／またはペプチド誘導体の平衡（equilibrium）解離定数を意味する。
【０１２５】
本発明において、解離定数は、解離した物質（ペプチド、ペプチド誘導体、標的分子等）および解離していない物質（ペプチドおよび／またはペプチド誘導体−標的分子会合体等）の濃度を測定することにより、算出することができる。解離定数の測定−算出方法としては、当業者に周知の方法であれば特に限定されるものではないが、例えば、表面プラズモン共鳴を用いた方法、等温滴定カロリメトリー法等をあげることができる。
【０１２６】
表面プラズモン共鳴を用いた方法においては、標的分子とそれに結合するペプチドおよび／またはその誘導体の相互作用を、次のとおり測定−算出することができる：複数のペプチド濃度において、表面プラズモン共鳴により、一連の結合・解離反応を検出する；得られた一連の結合・解離反応を解析する；得られた各種速度定数から解離定数を算出する。
【０１２７】
表面プラズモン共鳴の測定−算出システムとしては、例えば、ビアコア（Biacore）・システム（GE Healthcare社）等をあげることができるが、これに限定されるものではない。ビアコア・システムを用いた場合の手順は次の通りである：ビアコア・システムのセンサーチップ上に標的分子をアミンカップリングで固定化する；複数のペプチド濃度において、該標的分子とペプチドとを接触させる；両者の相互作用を表面プラズモン共鳴により検出する；一連の結合・解離反応を、横軸を時間とし、縦軸を結合量（RU）とする、センサーグラムとして描き出す；複数のペプチド濃度で描き出されたセンサーグラムから、BIAevaluationソフトウェア（GE Healthcare社製）を用いて、1:1 ラングミュアーモデルにフィッティングさせ、各種速度パラメーターを算出する；各種速度パラメーターから解離定数を算出する。
【０１２８】
等温滴定カロリメトリー法においては、標的分子とそれに結合するペプチドおよび／またはその誘導体の相互作用を、次のとおり測定−算出することができる：標的分子を含む溶液にペプチド溶液を滴下する（逆でも可）；相互作用により発生した熱量を測定し、結合等温線を描く；結合等温線から解離定数（ＫＤ）、反応の結合比（Ｎ）、エンタルピー変化（ΔＨ）、エントロピー変化（ΔＳ）が得られる。
【０１２９】
分子間相互作用に伴う微小な熱変化（発熱変化もしくは吸熱変化）をダイレクトに測定するシステムとしては、例えば、ＭｉｃｒｏＣａｌ・システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）等をあげることができるが、これに限定されるものではない。ＭｉｃｒｏＣａｌ・システムを用いた場合の手順は次の通りである： 一定温度に保たれたサンプルセルにリガンド溶液を滴定し攪拌する；分子間相互作用により結合量に正比例した熱の発生または吸収が起こり、サンプルセル中の溶液温度が変化する；セルフィードバックネットワーク（ＣＦＢ）がリファレンスセルとの温度差（ΔＴ）を感知する；ΔＴが０になるようにリファレンスセルまたはサンプルセルを加熱する；ΔＴ＝０を保持するために要したフィードバック電力を測定することで、相互作用による発熱量または吸熱量を得る；発生熱量を縦軸に、標的分子とペプチドのモル比を横軸にとり、結合等温線から解離定数を算出する。
【０１３０】
本発明の同定方法および／または判定方法（後述）においては、例えば、標的分子に対して１００μＭ以下、５０μＭ以下、２０μＭ以下、１０μＭ以下、５μＭ以下、２μＭ以下、１μＭ以下、５００ｎＭ（０．５μＭ）以下、２００ｎＭ以下、１００ｎｍ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、５００ｐＭ（０．５ｎＭ）以下、２００ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下、１０ｐＭ以下、５ｐＭ以下、２ｐＭ以下、または、１ｐｎＭ以下、の解離定数を示す被検物質を、標的分子に結合する、すなわち陽性と決定することができるが、解離定数の基準値、および「結合」の有無を決定する基準はこれらに限定されるものではない。
【０１３１】
本発明の同定方法において、「選抜」の工程は、標的分子に結合する被検物質を回収する工程でもあり、その産物中に標的分子に結合する被検物質が含有されているかまたは濃縮されていれば、かかる産物は、該標的分子に結合する物質のみからなるもの、および、該標的分子には結合しない物質が混在しているもののいずれであってもよい。また、かかる産物中に含有または濃縮された、標的分子に結合する被検物質は、単一のものであっても、２種以上の混合物であってもよい。
【０１３２】
本発明の同定方法における選抜工程、すなわち回収工程とは、標的分子に結合する物質が含まれるかまたは濃縮された画分を回収する工程を意味する。かかる工程は、本発明の技術分野において当業者に周知の分画−精製方法であれば特に限定されるものではないが、標的分子に結合した物質と、標的分子には結合しなかった物質および標的分子に非特異的に吸着した物質とを標的分子（を含む画分）から分離する工程、標的分子に結合した物質を溶出する（標的分子から分離する）工程等を含んでいてもよい。かかる工程においては、結合の有無につき解離定数等の判定基準を設けなくてもよい。
【０１３３】
本発明においては、本発明の同定方法に含まれる「選抜」を「パニング」と呼ぶことがある。本発明において、「パニング」とは、本発明のペプチドおよび／またはペプチド誘導体と標的分子とを接触させ、該標的分子に結合するペプチドおよび／またはペプチド誘導体を回収（選抜、濃縮、単離を含む）することを意味する。
【０１３４】
パニングには当業者に周知の方法を適用することができ、例えば、固相パニング法、液相パニング法をあげることができるが、これに限定されるものではない。固相パニング法では、例えば、標的分子を固相化し、次いで液相に含まれるペプチドと該標的分子とを接触させ、次いで標的分子に結合しなかったペプチドおよび非特異的に結合したペプチドを除去した後、該標的分子に結合したペプチドを選択的に固相（に結合した該標的分子）から分離させることにより、所望の結合活性を有するペプチドを選抜することができるが、固相パニング法の操作はこれに限定されるものではない。液相パニング法では、例えば、溶液中でペプチドと該標的分子とを接触させ、次いで標的分子に結合しなかったペプチドおよび非特異的に結合したペプチドを除去した後、該標的分子に結合したペプチドを選択的に該標的から分離させることにより、所望の結合活性を有するペプチドを選抜することができるが、液相パニング法の操作はこれに限定されるものではない。
【０１３５】
本発明の同定方法において、表現型（phenotype：表現形質と同義）に対応する遺伝型（genotype：遺伝形質と同義）がリンクしたライブラリーを用いることにより、標的分子に結合するペプチド（「ペプチド誘導体に含まれるペプチド」をも含む）に対応するヌクレオチドを効率よく選抜し、それゆえ該ペプチドを効率よく調製することが可能になる。表現型とそれに対応する遺伝型（以下、単に「表現型と遺伝型」という）のリンクは、直接的および間接的のいずれであってもよい。
【０１３６】
表現型と遺伝型が「直接的にリンクした」とは、表現型と遺伝型の挙動が一致していることを意味する。表現型と遺伝型の間に、他の部分が介在している等、一定の距離があっても、両者の挙動が一致していれば「直接的にリンクした」の意味に包含される。すなわち、両者が物理的に隣接していることは必須ではない。
【０１３７】
本発明において、表現型と遺伝型の「挙動が一致している」とは、本発明のペプチド、ヌクレオチド、ベクター、細胞、製造方法、同定方法、判定方法、ペプチド・ライブラリー、ヌクレオチド・ライブラリー、組成物、試薬等の態様おいて、両者の挙動が一致していることを意味する。それらの態様において、経時的に、一時的に、ある時点まで、もしくは、ある時点以降、内的要因、外的要因、それらの組合せもしくはその他の要因により、「挙動の一致」が全体的または部分的に失われても、「挙動が一致している」の意味に包含される。
【０１３８】
表現型と遺伝型が直接的にリンクしたものとしては、例えば、リボゾーム・ディスプレイ・ライブラリー、核酸ディスプレイ・ライブラリー、本発明のペプチドに対応するヌクレオチドが直接的または間接的にリンクしていることを特徴とするペプチドおよび／またはその誘導体、かかるペプチドおよび／またはその誘導体を含んでなるペプチド・ライブラリー等をあげることができる。
【０１３９】
表現型と遺伝型が「間接的にリンクした」とは、両者の挙動は必ずしも一致していないが、特定の表現型から該表現型に対応する遺伝型へアクセスできることを意味する。表現型と遺伝型が間接的にリンクしたものとしては、例えば、ファージ・ディスプレイ・ライブラリー、発現クローニングに用いられるｃＤＮＡライブラリー等をあげることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１４０】
ファージ・ディスプレイ・ライブラリーに含まれる各クローンにおいて、表現型としてのペプチドまたはその誘導体と、それに対応する遺伝型としてのヌクレオチドの挙動は、一致していないが、該ライブラリーに含まれるペプチドおよび／またはその誘導体と標的分子とを接触させ、標的分子に結合しなかったか、または標的分子に非特異的に吸着したファージ様粒子を除去した後、標的分子に結合したファージ様粒子を選択的に溶出させること等の工程を経ることにより、標的分子に結合するペプチドおよび／またはその誘導体（ファージ様粒子上に発現または提示された）を選抜することができるとともに、対応する遺伝型、すなわち、かかるペプチドまたはその誘導体（に含まれるペプチド）に対応するヌクレオチドを精製、単離し、その塩基配列を決定することができる。このような表現型からそれに対応する遺伝型へのアクセス上のメリットは、ファージ・ディスプレイ等の、表現型と遺伝型が「間接的にリンクした」場合に限定されるものではなく、「直接的にリンクした」場合にも享受できる。
【０１４１】
本発明の同定方法に含まれる工程は、２回以上繰り返して行うことができる。とりわけ、選抜の工程で回収されたペプチドおよび／またはペプチド誘導体から、あらためてペプチド・ライブラリーを構築して、接触および選抜の工程を行うことにより、標的分子に結合するペプチドおよび／またはその誘導体を、より高度に濃縮することが可能となる。それらの操作をさらに繰り返すことにより、標的分子に結合するペプチドおよび／またはその誘導体はより一層高度に濃縮され、最終的にそれらを単離する効率を上げることできる。さらに、標的分子に結合するペプチドおよび／またはその誘導体がより一層高度に濃縮されることで、よりアフィニティーの高いバインダーの単離が可能となる。
【０１４２】
また、標的分子に結合するペプチドおよび／またはその誘導体の高度な濃縮は、本発明の同定方法に含まれる工程において、標的に結合したペプチドおよび／またはその誘導体と非特異的に結合したものとをより強力に分離することによっても可能となる。そのような分離方法としては、例えば、非特異的に結合したペプチド等を除去する工程の回数を増やすことや、非特異的に結合したペプチドの除去に用いる試薬（界面活性剤等）をより強力なものに変更すること等が挙げられる。
【０１４３】
本発明のペプチドまたはその誘導体は、単量体、ホモもしくはヘテロの二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、または、九個以上の単量体から構成される多量体、のいずれの形態をもとり得る。
【０１４４】
標的分子一分子または標的部位一箇所に結合する本発明のペプチドまたはその誘導体の分子数は、１、２、３、４、５、６、７、８、または９以上のいずれでもよく、かかるプチドまたはその誘導体は、単量体、ホモもしくはヘテロの二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、または、九個以上の単量体から構成される多量体のいずれの形態で標的分子に結合してもよい。
【０１４５】
本発明のペプチドまたはその誘導体一分子あたりが結合する標的分子の分子数または標的部位数は、１、２、３、４、５、６、７、８、または９以上のいずれでもよい。
【０１４６】
８．組成物
本発明は組成物を提供する。
【０１４７】
本発明の組成物は、本発明のペプチド、ペプチドの誘導体、ヌクレオチド、ベクターまたは細胞を含むことからなる。
【０１４８】
本発明のペプチドまたはその誘導体（本発明の細胞表面上に提示されたものを含む）を含むことからなる組成物は、該ペプチドまたはその誘導体が結合する標的分子を検出するために使用することができる。
【０１４９】
本発明のヌクレオチド、ベクターまたは細胞を含むことからなる組成物は、該ヌクレオチド、該ベクターまたは該細胞に含まれる本発明のヌクレオチドの有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するペプチドを調製するために使用することができる。また、かかる組成物は、該ヌクレオチドを含むヌクレオチド、ベクター、細胞等を検出するためにも使用することができる。
【０１５０】
かかる組成物には、必要に応じて、緩衝剤、塩類、金属、防腐剤、界面活性剤、凍結または凍結乾燥等の調製方法により本発明のペプチド、ペプチドの誘導体、ヌクレオチド、ベクターまたは細胞が蒙るダメージを軽減または防止するための物質等を含有せしめることができる。
【０１５１】
９．試薬
本発明は試薬を提供する。
【０１５２】
本発明の試薬は、本発明のペプチド、ペプチドの誘導体、ヌクレオチド、ベクターまたは細胞を含むことからなる。
【０１５３】
本発明のペプチドまたはその誘導体を含むことからなる試薬は、該ペプチドまたはその誘導体が結合する標的分子を検出するために使用することができる。
【０１５４】
例えば、腫瘍組織内に存在するＨＥＲ２タンパク質の量は免疫組織化学解析(ＩＨＣ)と呼ばれる検査により測定される。検査結果は０（陰性）から３＋（強陽性）までの範囲で判定される。ＩＨＣで腫瘍が３＋である患者はハーセプチンによる治療から恩恵をうける可能性が高く、腫瘍が０または１＋である患者はこの治療の恩恵をうける可能性は低いと考えられる。腫瘍が２＋である患者は，腫瘍がＨＥＲ２陽性であるかどうかをより正確に決定するために、蛍光イン・サイチュー・ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ法）と呼ばれる追加の検査を受けることが多い。ＦＩＳＨ法は遺伝子のコピー数を測定する方法であり、ＨＥＲ２遺伝子を多コピー含む腫瘍はＦＩＳＨ法によりＨＥＲ２陽性であると決定される。
【０１５５】
本発明のヌクレオチド、ベクターまたは細胞を含むことからなる試薬は、該ヌクレオチドを含むヌクレオチド、ベクター、細胞等を検出するために使用することができる。
【０１５６】
本発明の試薬は組成物であってもよい。
【０１５７】
かかる試薬を含むキットも、本発明の試薬に包含される。
【０１５８】
また、本発明のペプチド、ペプチド誘導体、それらが提示された細胞等は、標的分子等の物質を認識する素子として、かかる物質に対するバイオセンサーに利用することができる。
【０１５９】
１０．判定方法
本発明は、被検物質が、標的分子に結合するか否かを判定する方法をも提供する。
【０１６０】
本発明の判定方法には、本発明の同定方法に含まれる工程と同一または適宜改変した工程を使用することができる。ただし、かかる判定方法に供する被検物質は、ライブラリー等の集合に含まれていなくてもよい。例えば、判定方法に供する被検ペプチドまたは被検ペプチド誘導体は、ペプチド・ライブラリーに含まれるペプチドまたはペプチド誘導体に限定されるものではなく、他のペプチドから分離された単一のペプチドまたはペプチド誘導体、それらを含む混合物等であってもよい。すなわち、本発明の同定方法は、主として、被検物質の物理的集合から所望の性質を有するものを選抜する方法として適しているのに対して、本発明の判定方法は、特定の被検物質が所望の性質を有しているか否かを調べるための検定方法としても適している。
【０１６１】
本発明の判定方法において、例えば、被検物質が標的分子に結合するか否かを決定する工程においては、解離定数等親和性の指標に関する条件を充たしているか否かを判定の基準とすることができる。また、本発明の同定方法と同じ選抜工程において被検物質が標的分子に結合する物質として回収されれば、該被検物質を陽性と判定することができる。
【実施例】
【０１６２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０１６３】
ランダム変異ＴＡＣＩ＿ｄ２ファージライブラリーの作成
１）ランダム変異ＴＡＣＩ＿ｄ２オリゴヌクレオチドの合成
下記のオリゴヌクレオチド（１８３ｂｐ）を合成した。【０１６４】
５’−Ｇ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＡＣＴ  ＧＴＡ  ＧＧＡ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＴＧＧ  ＧＣＣ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＡＧＴ  ＴＧＣ  ＣＧＴ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＧＧＣ  ＡＡＧ  ＮＮＮ  ＴＡＴ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＡＣ  ＴＧＣ  ＮＮＮ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＧＣＧ  ＡＧＣ  ＮＮＮ  ＴＧＴ  ＧＧＡ  ＮＮＮ  ＣＡＴ  ＣＣＴ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＴＧＣ  ＧＣＧ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＴＧＣ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＧ  ＡＧＴ  ＣＣＡ  ＣＧＴ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＧＧＴ  ＣＡ−３’（配列表の配列番号１７：当該塩基配列中の「Ｎ」はＡＴＧＣから選択される任意の塩基を表す。）
上記配列は５‘末端から、５’末ｐｒｉｍｅｒ結合領域、制限酵素ＳｆｉＩ認識配列（ＳｆｉＩサイト）、ランダム変異を加えたＴＡＣＩ＿ｄ２のコード配列、ＮｏｔＩサイト、３‘末端ｐｒｉｍｅｒ結合領域の順に並んでいる。また、ＮＮＮにはＣｙｓ、Ｐｒｏを除く１８種のアミノ酸（Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ）をコードするコドンがほぼ等確率（各３．０％〜８．２％）で含まれている。これによりランダム変異ＴＡＣＩ＿ｄ２の計算上の多様性は６．４×１０１３となる。【０１６５】
２）ランダム変異ＴＡＣＩ＿ｄ２ファージミドベクターを有する大腸菌ＴＧ−１株の作成
前記１）で合成したオリゴヌクレオチド（計２μｇ）を鋳型として、以下の二種類のプライマー（Ｓｉｇｍａ  ｇｅｎｏｓｙｓ社合成）を用いたＰＣＲを行った。【０１６６】
Ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒｗａｒｄ  １：  ＧＣＴＧＣＡＣＡＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＡＧＡＣＴＧＧ（配列表の配列番号１８）
Ｐｒｉｍｅｒ  ｒｅｖｅｒｓｅ  １：  ＴＧＡＣＣＧＡＴＧＧＡＡＣＧＴＧＧＡＣＴＣ（配列表の配列番号１９）
ＤＮＡポリメラーゼにはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（東洋紡績株式会社製）を使用し、アニーリング温度６４℃、伸長温度６８℃、サイクル数１０で説明書に従って反応を行った。ＰＣＲ産物を制限酵素ＮｏｔＩ−ＨＦ（ＮＥＢ社製）およびＳｆｉＩ（ＮＥＢ社製）で消化し、これをインサートとして後述のライゲーションに使用した。
ファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅ  ｖｅｃｔｏｒ（旧Ｐｈａｒｍａｃｉａ社−現ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を制限酵素ＮｏｔＩ−ＨＦ（ＮＥＢ社製）およびＳｆｉＩ（ＮＥＢ社製）で消化した。続いて、大腸菌由来Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）を用いて制限酵素により消化されたベクター断片に脱リン酸化処理を行い、これをベクターとして後述のライゲーションに使用した。
上記のインサートおよびベクターを、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ社製）を用いてライゲーションさせた（ベクターとインサートのモル比は１：３）。このライゲーション産物を用いて、エレクトロポレーション法により大腸菌ＴＧ−１株を形質転換し（ＢＴＸ社製のＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ  ６００を使用、電圧１．９８ｋＶ、電気抵抗１８６オーム）、１００μｇ／ｍＬ  Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ、１％Ｇｌｕｃｏｓｅ、を含むＬＢ培地（以下、ＬＢ／Ａｍｐ／１％Ｇｌｕ）プレートに播種して、３０℃にて１２時間以上培養することにより、３．５×１０１０個の大腸菌コロニーが得られた。【０１６７】
３）ランダム変異ＴＡＣＩ＿ｄ２ファージの大量調製
２）の大腸菌コロニー群から１００μｇ／ｍＬ  Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ、１％Ｇｌｕｃｏｓｅを含む２×ＹＴ培地（以下、２×ＹＴ／Ａｍｐ／１％Ｇｌｕ）を用いてＯＤ６００ｎｍ＝０．３の大腸菌懸濁液を調製した。３７℃にて振とう培養を行いＯＤ６００ｎｍ＝０．５になるまで増殖させ、十分量のＨＹＰＥＲＰＨＡＧＥ  Ｍ１３Ｋ０７  ΔｐＩＩＩ（Ｐｒｏｇｅｎ社製）を加えて３７℃にて３０分間感染させた。次いで、該大腸菌に１００μｇ／ｍＬ  Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍＬ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ、０．２５ｍＭ  ＩＰＴＧ（以下「２×ＹＴ／Ａｍｐ／Ｋａｎ／０．２５ｍＭ  ＩＰＴＧ」という）を加えて２２℃で一晩振とう培養した。回収した培養上清に１／４量の２０％Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ６０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液（以下「２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液」という）を加えてファージを沈殿させた。沈殿したファージをＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（以下「ＰＢＳ」という）で懸濁し、ランダム変異 ＴＡＣＩ提示ファージライブラリーとして以下の実験に用いた。
このファージ溶液を大腸菌ＴＧ−１株に感染させてＬＢ／Ａｍｐ／１％Ｇｌｕプレートに播種し、形成したコロニー数を測定した。かかるファージライブラリーのタイターは１．２×１０１３ｐｈａｇｅ／ｍＬであった。
【実施例２】
【０１６８】
標的分子に結合するＴＡＣＩ＿ｄ２変異体の選別
１）液相パニング法
ＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を用いて、説明書に従い標的蛋白質（標的分子）をビオチン化した。この標的分子に、ＴＡＣＩ＿ｄ２変異体提示ファージを添加して、一晩または２時間反応させた。ＴＡＣＩ＿ｄ２変異体提示ファージとしては、液相パニングの第１ラウンドには、ランダム変異ＴＡＣＩ＿ｄ２提示ファージライブラリーを、第２ラウンド以降には、前のラウンドで得られた大腸菌コロニー群から調製したファージ（ランダム変異ＴＡＣＩ＿ｄ２提示ファージライブラリー）をそれぞれ使用した。この混合溶液にＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製：以下「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ」という）を加えて、Ｄｙｎａｂｅａｄｓにビオチン化標的分子を結合させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（以下「ＰＢＳＴ」という）でＤｙｎａｂｅａｄｓを所定の回数洗浄した後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ表面のビオチン化した標的分子に結合しているＴＡＣＩ＿ｄ２変異体提示ファージを０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ／５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ２．２）で溶出させた。溶出したファージを直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和し、大腸菌ＴＧ−１株へ感染させてＬＢ／Ａｍｐ／１％Ｇｌｕプレートに播種して３０℃にて１２時間以上培養した。【０１６９】
２）固相パニング法
Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｆｌａｔ−ｂｏｔｔｏｍ  ９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）（以下、Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｐｌａｔｅ）に標的蛋白質（標的分子）を加え、４℃にて一晩固相化した。該Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｐｌａｔｅにＴＡＣＩ＿ｄ２変異体提示ファージを添加して、２時間反応させた。ＴＡＣＩ＿ｄ２変異体提示ファージとしては、固相パニングの第１ラウンドにはランダム変異ＴＡＣＩ＿ｄ２変異体提示ファージを、第２ラウンド以降には、前のラウンドで得られた大腸菌コロニー群から調製したファージ（ランダム変異ＴＡＣＩ＿ｄ２提示ファージライブラリー）をそれぞれ使用した。ＰＢＳＴでＭａｘｉｓｏｒｐ  ｐｌａｔｅを所定の回数洗浄した後、Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｐｌａｔｅに固相化された標的分子に結合したＴＡＣＩ変異体提示ファージを０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ／５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ２．２）で溶出させた。溶出したファージを直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和し、大腸菌ＴＧ−１株へ感染させてＬＢ／Ａｍｐ／１％Ｇｌｕプレートに播種して３０℃にて１２時間以上培養した。【０１７０】
３）次ラウンドで使用するファージの調製
次ラウンドのパニングにより得られた大腸菌コロニー群から２×ＹＴ／Ａｍｐ／１％Ｇｌｕを用いてＯＤ６００ｎｍ＝０．３の大腸菌懸濁液を調製した。３７℃にて振とう培養を行いＯＤ６００ｎｍ＝０．５になるまで増殖させ、十分量のヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を加えて３７℃にて３０分間感染させた。ヘルパーファージを感染させた大腸菌に２×ＹＴ／Ａｍｐ／Ｋａｎ／０．２５ｍＭ  ＩＰＴＧを加えて２２℃にて一晩振とう培養した。回収した培養上清に２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液を加えてファージを沈殿させた。沈殿したファージをＰＢＳで懸濁し、次ラウンドのパニングに使用した。【０１７１】
４）標的分子に結合するＴＡＣＩ＿ｄ２変異体の選別
ＩｇＧ−Ｆｒｅｅ，Ｐｒｏｔｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｕｂｍｉｎ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．社製：以下「ＢＳＡ」という）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＥｐｈＡ２，ＣＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製：以下「ｈＥｐｈＡ２」という）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＥＧＦ  Ｒ／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ，ＣＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製：以下「ｈＥＧＦＲ／Ｆｃ」という）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＥｒｂＢ２／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ，ＣＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製：以下「ｈＥｒｂＢ２／Ｆｃ」という）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ１６５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製：以下「ｈＶＥＧＦ」という）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＴＮＦ−α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製：以下「ｈＴＮＦ−α」という）の６種類の組換え蛋白質のいずれか一つを標的分子として、液相もしくは固相パニングを３または４ラウンド行った。
【実施例３】
【０１７２】
パニングより得られたＴＡＣＩ＿ｄ２変異体（群）の標的分子への結合活性評価
１）ｐｈａｇｅ  ＥＬＩＳＡに使用するファージの調製（１）
最終ラウンドのパニングにより得られた大腸菌コロニー群全体から２×ＹＴ／Ａｍｐ／１％Ｇｌｕを用いてＯＤ６００ｎｍ＝０．３の大腸菌懸濁液を調製した。３７℃にて振とう培養を行いＯＤ６００ｎｍ＝０．５になるまで増殖させ、十分量のヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を加えて３７℃にて３０分間感染させた。ヘルパーファージを感染させた大腸菌に２×ＹＴ／Ａｍｐ／Ｋａｎ／０．２５ｍＭ  ＩＰＴＧを加えて２２℃にて一晩振とう培養した。回収した培養上清に２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液を加えてファージを沈殿させ、これをＰＢＳで懸濁した。このファージの原液およびＰＢＳで２倍希釈を数回繰り返したものをｐｈａｇｅ  ＥＬＩＳＡに使用した。【０１７３】
２）ｐｈａｇｅ  ＥＬＩＳＡに使用するファージの調製（２）
最終ラウンドのパニングにより得られた大腸菌コロニー群からシングルコロニーを一つ選び、２×ＹＴ／Ａｍｐ／１％Ｇｌｕに植菌する。３７℃にて振とう培養を行いＯＤ６００ｎｍ＝０．５になるまで増殖させ、十分量のヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を加えて３７℃にて３０分間感染させた。ヘルパーファージを感染させた大腸菌に２×ＹＴ／Ａｍｐ／Ｋａｎ／０．２５ｍＭ  ＩＰＴＧを加えて２２℃にて一晩振とう培養した。回収した培養上清に２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液を加えてファージを沈殿させ、沈殿したファージをＰＢＳで懸濁した。このファージの原液およびＰＢＳで２倍希釈を数回繰り返したものをｐｈａｇｅ  ＥＬＩＳＡに使用した。【０１７４】
３）ｐｈａｇｅ  ＥＬＩＳＡ
Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｐｌａｔｅに標的分子またはネガティブコントロール蛋白質（ＢＳＡを標的分子とした場合はｈＥｐｈＡ２、その他の蛋白質を標的分子とした場合はＢＳＡ）を加え、４℃にて一晩固相化した。この標的蛋白質またはネガティブコントロール用蛋白質を固相化したＭａｘｉｓｏｒｐ  ｐｌａｔｅに、実施例２の１）と２）で調製したＴＡＣＩ変異体提示ファージを添加して２時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（以下、ＴＢＳＴ）でＭａｘｉｓｏｒｐ  ｐｌａｔｅを洗浄した後、５０００倍に希釈したＨＲＰ／Ａｎｔｉ−Ｍ１３  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）（以下、「Ａｎｔｉ−Ｍ１３  ａｎｔｉｂｏｄｙ」という）を添加した。再度ＴＢＳＴで洗浄した後、ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ａ．Ｂ．Ｔ．Ｓ．  Ｋｉｔ（ナカライテスク社製）（以下、「ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ」という）により標的分子に結合したファージ量を波長４０５ｎｍの吸光度として検出した。【０１７５】
図１（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）に示すとおり、パニング操作により、ＴＡＣＩ＿ｄ２ランダム変異ライブラリーから、各標的分子に結合するＴＡＣＩ変異体（群）が選抜または濃縮されていた。
【実施例４】
【０１７６】
野生型ＴＡＣＩ＿ｄ２とｈＥｐｈＡ２結合性ＴＡＣＩ＿ｄ２変異体の特異性の比較
１）ｐｈａｇｅ  ＥＬＩＳＡに使用するファージの調製
ｈＥｐｈＡ２を標的分子とする最終ラウンドのパニング後の大腸菌コロニー群から選んだ３つのクローン（α−ＥｐｈＡ２  ＃１乃至＃３：配列表の配列番号２乃至４、図４の２乃至４にそれぞれ対応する）について、２×ＹＴ／Ａｍｐ／１％Ｇｌｕを用いてＯＤ６００ｎｍ＝０．３の大腸菌懸濁液を調製した。これらの大腸菌をそれぞれ３７℃にて振とう培養を行いＯＤ６００ｎｍ＝０．５になるまで増殖させ、十分量のヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を加えて３７℃にて３０分間感染させた。ヘルパーファージを感染させた大腸菌に２×ＹＴ／Ａｍｐ／Ｋａｎ／０．２５ｍＭ  ＩＰＴＧを加えて２２℃にて一晩振とう培養した。回収した培養上清に２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液を加えてファージを沈殿させ、沈殿したファージをＰＢＳで懸濁させた。このファージの原液、およびＰＢＳによる２倍希釈を数回繰り返して得られたものを、ｐｈａｇｅ  ＥＬＩＳＡに使用した。野生型ＴＡＣＩ＿ｄ２遺伝子を含むｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅベクターを有する大腸菌ＴＧ−１株についても、同様の操作によりファージを調製した。【０１７７】
２）ｐｈａｇｅ  ＥＬＩＳＡ
Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｐｌａｔｅにｈＥｐｈＡ２、ＢＳＡ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ：ヒトＢＡＦＦ（（UniProtKB/Swiss-Prot Accession # Q9Y275）の１３４番目のＡｌａから２８５番目のＬｅｕまでのアミノ酸からなるポリペプチドのＮ末端にヒスチジン・タグ等を連結したもの：以下「ｈＢＡＦＦ」という）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｍｏｕｓｅ  ＥｐｈＡ２／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ，  ＣＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ：マウスＥｐｈＡ２（NCBI Accession No. #AAA82113）の２２番目のＡｌａから５３５番目のＡｌａまでのアミノ酸からなるポリペプチドのＣ末端にヒト免疫グロブリンＧ１（以下、「ｈＩｇＧ１」という）のＦｃ領域（１００番目のＰｒｏから３３０番目のＬｙｓまで）を連結したもの：以下「ｍＥｐｈＡ２／Ｆｃ」という）をそれぞれ加え、４℃で一晩固相化した。これらのＭａｘｉｓｏｒｐ  ｐｌａｔｅにＴＡＣＩ＿ｄ２変異体提示ファージを添加して２時間反応させた。Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｐｌａｔｅをＴＢＳＴで洗浄した後、５０００倍に希釈したＡｎｔｉ−Ｍ１３  ａｎｔｉｂｏｄｙを添加した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｐｌａｔｅを再度ＴＢＳＴで洗浄した後、ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤによりプレートに固相化した蛋白質に結合したファージ量を波長４０５ｎｍの吸光度として検出した。【０１７８】
結果を図２（Ａ）および（Ｂ）に示す。ｈＥｐｈＡ２に結合するＴＡＣＩ＿ｄ２の変異体、α−ＥｐｈＡ２  ＃１乃至＃３が取得された。これらのうち、α−ＥｐｈＡ２  ＃１乃至＃３は、いずれも、野生型ＴＡＣＩ＿ｄ２の内因性リガンドであるｈＢＡＦＦへの結合能を失っていた。また、ｍＥｐｈＡ２への交差反応性は、α−ＥｐｈＡ２  ＃２および＃３は野生型ＴＡＣＩ＿ｄ２と同程度であったが、α−ＥｐｈＡ２  ＃１はそれらと比較して強かった。
【実施例５】
【０１７９】
ｈＥｐｈＡ２結合性ＴＡＣＩ＿ｄ２変異体のヒトＥｐｈＡ２発現細胞への結合の確認
１）細胞培養および培地
ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む、ダルベッコ変法イーグル培地（以下、「ＤＭＥＭ」という：ＧＩＢＣＯ社製）（以下、かかる培地を「ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ」という）を用いて３７℃にて、５％ＣＯ２存在下で培養した。トランスフェクションやフローサイトメトリーに使用する際には、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ）を用いて培養用プレートから剥離させた後、細胞懸濁物を遠心分離して細胞を回収し、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳに再度懸濁して用いた。【０１８０】
２）トランスフェクション
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（インビトロジェン社製）を用いて、説明書に従い、ヒトＥｐｈＡ２遺伝子またはネガティブコントロールとして、ヒトＥｒｂＢ２遺伝子が挿入されたｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０  Ｇａｔｅｗａｙベクター（インビトロジェン社製）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。【０１８１】
３）細胞の調製
トランスフェクションした細胞を回収し、細胞をＦＡＣＳバッファー（５％ＦＢＳを含むＰＢＳ）に懸濁してナイロンメッシュに通した。５×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルで９６  Ｗｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒｏｕｎｄ  Ｂｏｔｔｏｍ  Ｗｉｔｈ  Ｌｉｄ（Ｃｏｓｔｅｒ社製）に分注し、遠心して上清を除去した。この細胞に、実施例４の１）で調製したファージの原液を５０μＬずつ加え、４℃にて３０分間静置した。１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーを添加して遠心により上清を除き、再度２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーを添加して遠心により上清を除いた（以下、細胞の洗浄は同様に行った）。得られた細胞に一次抗体として１００倍に希釈したＡｎｔｉ−Ｍ１３  ａｎｔｉｂｏｄｙを５０μＬ／ウェルで加えて４℃にて３０分間静置した後、細胞を洗浄した。続いて、二次抗体として１０００倍に希釈したＦＬＵＯＲＥＳＣＥＩＮ−ＣＯＮＪＵＧＡＴＥＤ  ＧＯＡＴ  ＩＧＧ  ＦＲＡＣＴＩＯＮ  ＴＯ  ＭＯＵＳＥ  ＩＧＧ（ＣＡＰＰＥＬ社製）を加えて４℃で３０分間静置した後、細胞を洗浄した。得られた細胞を２５０μＬのＦＡＣＳバッファーで懸濁し、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ  ５００  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）に供し、蛍光染色された細胞を検出した。【０１８２】
結果を図３（Ａ）および（Ｂ）に示す。α−ＥｐｈＡ２  ＃１および＃２は、組換え型ｈＥｐｈＡ２ｈだけでなく、細胞表面上に発現したヒトＥｐｈＡ２に対しても結合した。
【実施例６】
【０１８３】
各種標的分子に結合するＴＡＣＩ＿ｄ２変異体の配列解析
実施例３の２）、３）と同様にして、各種標的分子に対する結合が確認されたＴＡＣＩ＿ｄ２変異体ペプチドについて、該ペプチドを発現した大腸菌を単離し２ｘＹＴ培地にて３７℃で一晩培養した。ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、回収した大腸菌から該ペプチドをコードする遺伝子が挿入されたｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅベクターを調製した。該ベクターについて、ｐＣＡＮＴＡＢ−Ｓ１  ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＡＡＣＧＴＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＣＧＣ−３’：配列表の配列番号２０）を用いて塩基配列を決定した。【０１８４】
内在性のＴＡＣＩ結合分子として前記のｈＢＡＦＦを用いた。
（１）上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor：ＥＧＦＲ）
ヒトＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合するＴＡＣＩ＿ｄ２変異体を選抜し、得られたペプチドのアミノ酸配列解析を行った。【０１８５】
ヒトＥＧＦＲとして、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン（UniProtKB/Swiss-Prot Accession # P00533の２５番目のＬｅｕから６４５番目のＳｅｒまで）とｈＩｇＧ１のＦｃ領域（１００番目のＰｒｏから３３０番目のＬｙｓまで）との融合蛋白質（前記のｈＥＧＦＲ／Ｆｃ）を用いた。【０１８６】
得られたペプチド３種のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５番乃至７番（図４の５乃至７）であった。
（２）血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）
ＶＥＧＦとして、ヒトアイソフォームＶＥＧＦ１６５（CAS Registry FileのRegistry Number 1217406-67-1：前記のｈＶＥＧＦ）を使用した。【０１８７】
ヒトＶＥＧＦに結合するＴＡＣＩ＿ｄ２変異体を選抜し、得られたペプチド６種のアミノ酸配列を解析した。その結果、配列表の配列番号８番乃至１３番（図４の８乃至１３）に示すとおりであった。
（３）腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）
ＴＮＦ−αとして、ヒトＴＮＦ（CAS Registry FileのRegistry Number 1228062-30-3：前記のｈＴＮＦ−α）を使用した。【０１８８】
ヒトＴＮＦαに結合するＴＡＣＩ＿ｄ２変異体を選抜し、得られたペプチド３種のアミノ酸配列を解析した。その結果、配列表の配列番号１４番乃至１６番（図４の１４乃至１６）に示すとおりであった。
（４）上記（１）乃至（３）において得られた、標的分子に結合するいずれのＴＡＣＩ＿ｄ２変異体においても、ＴＡＣＩ＿ｄ２構造内部にある７８番目、すなわち配列表の配列番号１のうち１１番目のＰｈｅが、他のアミノ酸へ置換されていた。
【実施例７】
【０１８９】
ＶＥＧＦ結合性ＴＡＣＩ＿ｄ２変異体のＶＥＧＦに対する解離定数の測定
実施例２において得られたｈＶＥＧＦ結合性ＴＡＣＩ＿ｄ２変異体（図４の９番：配列表の配列番号９番）の遺伝子をＰＣＲ法により増幅し、大腸菌発現用ベクターｐＥＴ−３２ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）へ挿入した。このベクターを用いて大腸菌ＯｒｉｇａｍｉＴＭＢ株(ＭＥＲＣＫ社)を形質転換し、ＯＤ６００nm＝０．７となるまで３７℃で振とう培養した。終濃度１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加して該変異体の発現を誘導した後、１６℃で１２時間以上振とう培養した。培養した大腸菌を超音波破砕し、遠心して得られた上清をＨｉｓＴＡＬＯＮＴＭｃｏｌｏｍｎ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にかけて精製した。発現させた該変異体にはＴｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−ｔａｇおよびＨｉｓ−ｔａｇが付加されていたが、これらはＴｈｒｏｍｂｉｎ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｋｉｔを用いて切断し、再度ＨｉｓＴＡＬＯＮＴＭｃｏｌｏｍｎにかけることで除去した。精製した該変異体をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  ＨＲ  １０／３０  ｃｏｌｏｍｕｎ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にかけ、該変異体（単量体）の分子量に相当するピークを回収して、アフィニティー解析に供した。該変異体のアフィニティーはＢｉａｃｏｒｅ  ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた表面プラズモン共鳴法により決定した。センサーチップ上に固定化したｈＶＥＧＦに種々の濃度の該変異体を流し、得られたセンサーグラムから該変異体のｈＶＥＧＦに対する解離定数を決定した。その結果、該変異体のｈＶＥＧＦに対する解離定数は１４μＭであった。
【産業上の利用可能性】
【０１９０】
本発明のペプチド・ライブラリーは、標的分子に結合するペプチドを選抜するのに有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１９１】
配列番号２  −  ヒトＥｐｈＡ２結合性ペプチド  α−ＥｐｈＡ２  ＃１  のアミノ酸配列
配列番号３  −  ヒトＥｐｈＡ２結合性ペプチド  α−ＥｐｈＡ２  ＃２  のアミノ酸配列
配列番号４  −  ヒトＥｐｈＡ２結合性ペプチド  α−ＥｐｈＡ２  ＃３  のアミノ酸配列
配列番号５  −  ヒトＥＧＦＲ結合性ペプチド（１）のアミノ酸配列
配列番号６  −  ヒトＥＧＦＲ結合性ペプチド（２）のアミノ酸配列
配列番号７  −  ヒトＥＧＦＲ結合性ペプチド（３）のアミノ酸配列
配列番号８  −  ヒトＶＥＧＦ結合性ペプチド（１）のアミノ酸配列
配列番号９  −  ヒトＶＥＧＦ結合性ペプチド（２）のアミノ酸配列
配列番号１０  −  ヒトＶＥＧＦ結合性ペプチド（３）のアミノ酸配列
配列番号１１  −  ヒトＶＥＧＦ結合性ペプチド（４）のアミノ酸配列
配列番号１２  −  ヒトＶＥＧＦ結合性ペプチド（５）のアミノ酸配列
配列番号１３  −  ヒトＶＥＧＦ結合性ペプチド（６）のアミノ酸配列
配列番号１４  −  ヒトＴＮＦα結合性ペプチド（１）のアミノ酸配列
配列番号１５  −  ヒトＴＮＦα結合性ペプチド（２）のアミノ酸配列
配列番号１６  −  ヒトＴＮＦα結合性ペプチド（３）のアミノ酸配列
配列番号１７  −  ランダム変異ＴＡＣＩ＿ｄ２オリゴヌクレオチドの塩基配列
配列番号１８  −  ＰＣＲプライマー  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆｏｒｗａｒｄ  １  の塩基配列
配列番号１９  −  ＰＣＲプライマー  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  １  の塩基配列
配列番号２０  −  塩基配列決定用プライマー  ｐＣＡＮＴＡＢ−Ｓ１  ｐｒｉｍｅｒ  の塩基配列 
【図１（Ａ）】
2012105616.tif 000003
【図１（Ｂ）】
2012105616.tif 000004
【図１（Ｃ）】
2012105616.tif 000005
【図２（Ａ）】
2012105616.tif 000006
【図２（Ｂ）】
2012105616.tif 000007
【図３（Ａ）】
2012105616.tif 000008
【図３（Ｂ）】
2012105616.tif 000009
【図４】
2012105616.tif 000010
【配列表】
2012105616000001.app
【国際調査報告】
2012105616.tif 000011
2012105616.tif 000012
2012105616.tif 000013
2012105616.tif 000014