(57)【要約】  4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ(4-hydroxybenzoate decarboxylase)活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネバクテリウム グルタミカムに導入された、フェノール生産能を有する形質転換体。この形質転換体を、還元条件下、4-ヒドロキシベンゾエート又はその塩を含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のフェノールを回収する工程とを含むフェノールの製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ(4-hydroxybenzoate decarboxylase)活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に導入された、フェノール生産能を有する形質転換体。
【請求項２】
4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、バチラス サブチリス（Bacillus subtilis）、バチラス アトロファエウス（Bacillus atrophaeus）、バチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイ（Bacillus subtilis subsp. spizizenii）、シトロバクター コセリ（Citrobacter koseri）、エンテロバクター アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター クロアカエ（Enterobacter cloacae）、エンテロバクター ホルメシェイ（Enterobacter hormaechei）、エンテロバクター サカザキ（Enterobacter sakazakii）、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）、エシェリヒア フェルグソニー（Escherichia fergusonii）、パエニバチラス ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）、又はパントエア アナナティス（Pantoea ananatis）由来の遺伝子である請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が下記の(a)又は(b)のDNAである請求項１に記載の形質転換体。(a)   配列番号16、配列番号23、配列番号26、配列番号29、配列番号32、配列番号35、配列番号38、配列番号41、配列番号44、配列番号47、配列番号50、又は配列番号53の塩基配列からなるDNA(b)  (a)の何れかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
【請求項４】
宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、その染色体上に存在するフェノール2-モノオキシゲナーゼ（phenol 2-monooxygenase）活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、請求項１〜３の何れかに記載の形質転換体。
【請求項５】
宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、その染色体上に存在する4-ヒドロキシベンゾエート ヒドロキシラーゼ(4-hydroxybenzoate hydroxylase)活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、請求項１〜４の何れかに記載の形質転換体。
【請求項６】
宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルミカムR（FERM  P−18976）、ATCC13032、又はATCC13869である請求項１〜３の何れかに記載の形質転換体。
【請求項７】
宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルミカムR（FERM  P−18976）、ATCC13032、又はATCC13869の染色体上に存在するフェノール2-モノオキシゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、請求項１〜３の何れかに記載の形質転換体。
【請求項８】
宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルミカムR（FERM  P−18976）、ATCC13032、又はATCC13869の染色体上に存在する4-ヒドロキシベンゾエート ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、請求項１〜３の何れかに記載の形質転換体。
【請求項９】
コリネバクテリウム グルタミカム PHE21（受託番号：NITE BP-996）、PHE21-2、PHE21-3、PHE21-4、PHE21-5、PHE21-6、PHE21-7、PHE21-8、PHE21-9、PHE21-10、PHE21-11、PHE21-12、PHE22-1、PHE22-2、PHE22-3、PHE22-4、PHE22-5、PHE22-6、PHE22-7、PHE22-8、PHE22-9、PHE22-10、PHE22-11、PHE22-12、PHE23-1、PHE23-2、PHE23-3、PHE23-4、PHE23-5、PHE23-6、PHE23-7、PHE23-8、PHE23-9、PHE23-10、PHE23-11、又はPHE23-12の形質転換体。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れかに記載の形質転換体を、還元条件下、4-ヒドロキシベンゾエート又はその塩を含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のフェノールを回収する工程とを含むフェノールの製造方法。
【請求項１１】
反応工程において、形質転換体が実質的に増殖しない請求項１０に記載のフェノールの製造方法。
【請求項１２】
還元条件下の反応液の酸化還元電位が−２００〜−５００ミリボルトである請求項１０又は１１に記載のフェノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、フェノール生産技術に関する。さらに詳しくは、フェノール生産機能を付与するために特定の遺伝子操作が施されたコリネバクテリウム  グルタミカムの形質転換体、及びこの形質転換体を用いた効率的なフェノールの製造技術に関する。
【背景技術】
【０００２】  地球温暖化、及び化石資源枯渇問題を背景に、再生可能資源を原料とした化学品の製造は、バイオ燃料製造と並び、新産業バイオリファイナリーとして低炭素社会実現の重要な方策であることが認識され、大きな注目が集まっている。  しかし、再生可能資源を原料としたバイオフェノール生産は、乳酸やエタノールの生産と比較して、原料となる糖類から代謝反応段数が大変多いために生産性が低く、また生産物であるフェノールにより菌の増殖が阻害されたり、フェノールによる細胞毒性がある等の理由により、これまで工業的生産が不可能とされていた。【０００３】  フェノールの重要な用途として、フェノール樹脂が挙げられる。フェノール樹脂は、フェノールとアルデヒド類との付加縮合反応により生成し、プラスチックの中でも最も古い歴史のある樹脂であり、その優れた耐熱性、耐久性等の特長から、現在でも自動車用金属代替材料、半導体封止材料、回路基板など様々な用途に用いられている。また、これまでフェノール樹脂は、原料のフェノールとアルデヒド類の反応性が極めて高く、得られる高分子が複雑な三次元網目構造になるため、ポリマーの精密構造設計やナノマテリアルへの展開が困難であり、高付加価値の用途への利用が難しいとされてきた。しかしながら、近年、高分子の物性理論やシミュレーションの急速な発展により、ネットワーク構造を精密化すればフェノール樹脂から高機能性材料の創製が可能となってきた。このような背景から日本におけるフェノール樹脂生産量も年々増加している。【０００４】  フェノールの現在の工業的生産法（クメン法）は、石油由来のベンゼンとプロピレンを原料とし、多量の溶剤類及び多量の熱エネルギーを必要とする、典型的な化学工業の高エネルギー消費型プロセスである。従って、地球環境保全や温室効果ガス削減の観点から、二酸化炭素排出が少ない省エネルギー型で、再生可能資源から製造でき、低廃棄物排出の環境調和型プロセスの開発、即ちバイオフェノール製造技術確立が急務となっている。  これまで自然界においてフェノール生産菌は報告されていない。【０００５】  遺伝子組み換え菌によるフェノールの生産技術について述べれば、非特許文献１は、クロストリディウム ヒドロキシベンゾイカム(Clostridium hydroxybenzoicum)の細胞縣濁液又は細胞抽出液を用いて、2 mM の4-ヒドロキシベンゾエートを50 時間で完全にフェノールに変換する技術を開示している。  また、特許文献１は、エンテロバクター クロアカエ（Enterobacter cloacae）の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ遺伝子を導入した形質転換菌を用いて4-ヒドロキシベンゾエートからフェノールを製造する技術を開示している。  しかし、非特許文献１及び特許文献１の方法は、実用上十分に効率よくフェノールを製造することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−０５０９１４号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol.52, 2002, 801-807.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  本発明は、4-ヒドロキシベンゾエートを原料として効率よくフェノールを製造できる微生物、及び4-ヒドロキシベンゾエートを原料として効率よくフェノールを製造できる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、以下の知見を得た。(i)  コリネバクテリウム  グルタミカムに４-ヒドロキシベンゾエート  デカルボキシラーゼ遺伝子を導入した形質転換体は、効率よく、4-ヒドロキシベンゾエートからフェノールを生産できる。(ii)  この形質転換体において、宿主のコリネバクテリウム  グルタミカムの染色体上に存在するフェノール2-モノオキシゲナーゼ遺伝子が破壊又は欠損しているときは、一層効率よくフェノールを生産できる。(iii)  この形質転換体は、還元条件下の反応液中で実質的に増殖しない状態で反応させる場合、特に、フェノール生産効率が高い。【００１０】  本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の形質転換体及びフェノールの製造方法を提供する。項１．  4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ(4-hydroxybenzoate decarboxylase)活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に導入された、フェノール生産能を有する形質転換体。項２．  4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、バチラス サブチリス（Bacillus subtilis）、バチラス アトロファエウス（Bacillus atrophaeus）、バチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイ（Bacillus subtilis subsp. spizizenii）、シトロバクター コセリ（Citrobacter koseri）、エンテロバクター アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター クロアカエ（Enterobacter cloacae）、エンテロバクター ホルメシェイ（Enterobacter hormaechei）、エンテロバクター サカザキ（Enterobacter sakazakii）、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）、エシェリヒア フェルグソニー（Escherichia fergusonii）、パエニバチラス ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）、又はパントエア アナナティス（Pantoea ananatis）由来の遺伝子である項１に記載の形質転換体。項３．  4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が下記の(a)又は(b)のDNAである項１に記載の形質転換体。(a)   配列番号16、配列番号23、配列番号26、配列番号29、配列番号32、配列番号35、配列番号38、配列番号41、配列番号44、配列番号47、配列番号50、又は配列番号53の塩基配列からなるDNA(b)  (a)の何れかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA項４．  宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、その染色体上に存在するフェノール2-モノオキシゲナーゼ（phenol 2-monooxygenase）活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、項１〜３の何れかに記載の形質転換体。項５．  宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、その染色体上に存在する4-ヒドロキシベンゾエート ヒドロキシラーゼ(4-hydroxybenzoate hydroxylase)活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、項１〜４の何れかに記載の形質転換体。項６．  宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルミカムR（FERM  P−18976）、ATCC13032、又はATCC13869である項１〜３の何れかに記載の形質転換体。項７．  宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルミカムR（FERM  P−18976）、ATCC13032、又はATCC13869の染色体上に存在するフェノール2-モノオキシゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、項１〜３の何れかに記載の形質転換体。項８．  宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルミカムR（FERM  P−18976）、ATCC13032、又はATCC13869の染色体上に存在する4-ヒドロキシベンゾエート ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、項１〜３の何れかに記載の形質転換体。項９．  コリネバクテリウム グルタミカム PHE21（受託番号：NITE BP-996）、PHE21-2、PHE21-3、PHE21-4、PHE21-5、PHE21-6、PHE21-7、PHE21-8、PHE21-9、PHE21-10、PHE21-11、PHE21-12、PHE22-1、PHE22-2、PHE22-3、PHE22-4、PHE22-5、PHE22-6、PHE22-7、PHE22-8、PHE22-9、PHE22-10、PHE22-11、PHE22-12、PHE23-1、PHE23-2、PHE23-3、PHE23-4、PHE23-5、PHE23-6、PHE23-7、PHE23-8、PHE23-9、PHE23-10、PHE23-11、又はPHE23-12の形質転換体。項１０．  項１〜９の何れかに記載の形質転換体を、還元条件下、4-ヒドロキシベンゾエート又はその塩を含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のフェノールを回収する工程とを含むフェノールの製造方法。項１１．  反応工程において、形質転換体が実質的に増殖しない項１０に記載のフェノールの製造方法。項１２．  還元条件下の反応液の酸化還元電位が−２００〜−５００ミリボルトである項１０又は１１に記載のフェノールの製造方法。
【発明の効果】
【００１１】  本発明の形質転換体を用いることにより、4-ヒドロキシベンゾエートからフェノールを高効率で製造することができる。  一般に微生物はフェノールのような溶剤の細胞毒性により生育が阻害されるため、微生物を用いてフェノールを製造することは困難であったが、本発明方法によれば、微生物を用いて、実用上十分に効率良くフェノールを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例で用いたプラスミドの構成を示す図である。
【図２】各種の微生物の好気条件下における増殖に及ぼすフェノールの影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】  以下、本発明を詳細に説明する。（Ｉ）フェノール生産能を有する形質転換体  本発明のフェノール生産能を有する形質転換体は、4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネバクテリウム  グルタミカムに導入された形質転換体である。
【００１４】宿主  宿主として用いられるコリネバクテリウム グルタミカムとは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）〕に定義されている一群の微生物である。  具体的には、コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R（FERM P-18976）、ATCC13032、ATCC13869、ATCC13058、ATCC13059、ATCC13060、ATCC13232、ATCC13286、ATCC13287、ATCC13655、ATCC13745、ATCC13746、ATCC13761、ATCC14020、ATCC31831、MJ-233（FERM BP-1497）又はMJ-233AB-41（FERM BP-1498）等の菌株が挙げられる。中でも、R（FERM P-18976）株、ATCC13032株、及びATCC13869株が好ましく、R（FERM P-18976）株がより好ましい。  なお、分子生物学的分類により、ブレビバクテリウム フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）、コリネバクテリウム リリウム（Corynebacterium lilium）等のコリネ型細菌もコリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に菌名が統一されている〔Liebl, W. et al., Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum" DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns. Int J Syst Bacteriol. 41:255-260. (1991)、駒形和男ら, コリネフォルム細菌の分類, 発酵と工業, 45:944-963 (1987)〕ため、本発明に含まれる。  また、コリネバクテリウム グルタミカムは、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。例えば、ラクテート（乳酸）デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase：LDH）、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ（phosphoenolpyrvate carboxylase）、マレートデヒドロゲナーゼ（malate dehydrogenase）などの遺伝子の破壊株が挙げられる。このような遺伝子破壊株を宿主として用いることにより、フェノールの生産性を向上させたり、副生成物の生成を抑制したりすることができる。  中でも、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。この遺伝子破壊株は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されていることにより、ピルビン酸から乳酸への代謝経路が遮断されている。中でも、コリネバクテリウム グルタミカムR（FERM P-18976）のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が特に好ましい。  このような遺伝子破壊株は、遺伝子工学的手法により常法に従い作製できる。例えば、ＷＯ２００５／０１０１８２Ａ１に、乳酸デヒドロゲナーゼ破壊株、及びその作製方法が記載されている。
【００１５】4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子（bsdBCD又はdca）  4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼは、4-ヒドロキシベンゾエートの脱炭酸によるフェノールの生成反応を触媒する酵素である。  4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の由来は特に限定されないが、バチラス サブチリス（Bacillus subtilis）、バチラス メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチラス リッケニフォーミス（Bacillus licheniformis）、バチラス アトロファエウス（Bacillus atrophaeus）、バチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイ（Bacillus subtilis subsp. spizizenii）のようなバチラス属細菌由来の遺伝子；シトロバクター コセリ（Citrobacter koseri）のようなシトロバクター属細菌由来の遺伝子；エンテロバクター アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター クロアカエ（Enterobacter cloacae）、エンテロバクター ホルメシェイ（Enterobacter hormaechei）、エンテロバクター サカザキ（Enterobacter sakazakii）のようなエンテロバクター属細菌由来の遺伝子；エシェリヒア コリ（Escherichia coli）、エシェリヒア フェルグソニー（Escherichia fergusonii）のようなエシェリヒア属細菌由来の遺伝子；パエニバチラス ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）のようなパエニバチラス属細菌由来の遺伝子；パントエア アナナティス（Pantoea ananatis）のようなパントエア属細菌由来の遺伝子などが挙げられる。中でも、バチラス属細菌、特にバチラス サブチリス由来の遺伝子、エンテロバクター属細菌、特にエンテロバクター クロアカエ由来の遺伝子、エシェリヒア属細菌、特にエシェリヒア コリ由来の遺伝子が好ましい。  なお、4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子は、由来により異なる種々の略称が用いられている。例えば、バチラス サブチリス由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ遺伝子はbsdBCDと略称されている。本明細書では、4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ遺伝子を、由来を問わず「dca」と略称することがある。
【００１６】  バチラス サブチリス由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号16の塩基配列からなるDNAが、バチラス アトロファエウス由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号23の塩基配列からなるDNAが、バチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号26の塩基配列からなるDNAが、シトロバクター コセリ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号29の塩基配列からなるDNAが、エンテロバクター アエロゲネス由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号32の塩基配列からなるDNAが、エンテロバクター クロアカエ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号35の塩基配列からなるDNAが、エンテロバクター ホルメシェイ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号38の塩基配列からなるDNAが、エンテロバクター サカザキ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号41の塩基配列からなるDNAが、エシェリヒア コリ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号44の塩基配列からなるDNAが、エシェリヒア フェルグソニー由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号47の塩基配列からなるDNAが、パエニバチラス ポリミキサ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号50の塩基配列からなるDNAが、パントエア アナナティス由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子としては、配列番号53の塩基配列からなるDNAが挙げられる。
【００１７】  また、本発明では、配列番号16、配列番号23、配列番号26、配列番号29、配列番号32、配列番号35、配列番号38、配列番号41、配列番号44、配列番号47、配列番号50、又は配列番号53の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。  本発明において「ストリンジェントな条件」は、一般的な条件、例えば、Molecular  Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition,1989,Vol2,p11.45に記載された条件を指す。具体的には、完全ハイブリッドの融解温度(Ｔｍ)より5〜10℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合を指す。
【００１８】  4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性は、「Genomics,  86, 342-351, 2005 “Materials and Methods”」に記載の方法で測定できる。簡単に説明すると、試験用液に被験酵素を添加し、100mM MES, pH6.0、1 mM DTT、5 mM 4-ヒドロキシベンゾエートと酵素を含む反応液を調製し、270 nmにおける吸光度の傾き(初速度)を測定する。4-ヒドロキシベンゾエートを添加しない系についても同様に反応を行い、バックグラウンド値とする。両測定値の差を4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性とする。  また、本発明では、配列番号16、配列番号23、配列番号26、配列番号29、配列番号32、配列番号35、配列番号38、配列番号41、配列番号44、配列番号47、配列番号50、又は配列番号53の塩基配列と同一性が90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上の塩基配列からなり、かつ4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。  本発明において、塩基配列の同一性は、GENETYX ver.8（GENETYX 株式会社ゼネティックス製）により算出した値である。
【００１９】  配列番号16、配列番号23、配列番号26、配列番号29、配列番号32、配列番号35、配列番号38、配列番号41、配列番号44、配列番号47、配列番号50、又は配列番号53の塩基配列からなるDNAの類縁体は、例えば、これらの塩基配列に基づき常法に従い設計したプライマー又はプローブを用いたPCR又はハイブリダイゼーションにより、他生物種のDNAライブラリーから選択することができ、これにより高確率で4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAが得られる。
【００２０】形質転換のためのベクターの構築  PCRで増幅した4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素をコードするDNAは、それぞれ、宿主で増幅できる適切なベクターにクローニングすればよい。  プラスミドベクターとしては、コリネバクテリウム  グルタミカム内で自律複製機能を司る遺伝子を含むものであれば良い。その具体例としては、ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）2256由来のpAM330〔特開昭58-67699〕、〔Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903（1984）〕 及び 〔Yamaguchi, R. et al., Determination of the complete nucleotide sequence of the Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330 and the analysis of its genetic information. Nucleic Acids Symp. Ser. 16:265-267（1985）〕、コリネバクテリウム グルタミカム ATCC13058由来のpHM1519 〔Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903（1984）〕及びpCRY30 〔Kurusu, Y. et al., Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57:759-764 （1991）〕、コリネバクテリウム グルタミカム T250由来のpCG4〔特開昭57-183799〕、〔Katsumata, R. et al., Protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA. J. Bacteriol.、159:306-311 （1984）〕、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50〔特開昭62-166890〕、pEK0、pEC5、pEKEx1 〔Eikmanns, B.J. et al., A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and promoter probing. Gene, 102:93-98 （1991）〕などが挙げられる。
【００２１】  好ましいプロモーターとしては、コリネバクテリウム  グルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3-フォスフェートデヒドロゲナーゼA遺伝子(gapA)のプロモーターPgapA、マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（mdh）のプロモーターPmdh、ラクテートデヒドロゲナーゼA遺伝子（ldhA）のプロモーターPldhAなどが挙げられ、中でも、PgapAが好ましい。  好ましいターミネーターとしては、大腸菌rRNAオペロンのrrnB T1T2 ターミネーター、大腸菌のtrpA ターミネーター、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）のtrp ターミネーターなどが挙げられ、中でも、rrnB T1T2 ターミネーターが好ましい。
【００２２】形質転換  形質転換方法は、公知の方法を制限無く使用できる。このような公知の方法として、例えば塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、電気穿孔法などが挙げられる。中でも、コリネバクテリウム  グルタミカムには、電気パルス法が好適であり、電気パルス法は、公知の方法 〔Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric. Biol. Chem. 54:443-447 （1990）〕 及び 〔Vertes A.A. et al., Presence of mrr- and mcr-like restriction systems in Coryneform bacteria. Res. Microbiol. 144:181-185 （1993）〕により行うことができる。
【００２３】  形質転換体は、微生物の培養に通常使用される培地を用いて培養すればよい。この培地としては、通常、炭素源、窒素源、無機塩類及びその他の栄養物質等を含有する天然培地又は合成培地等を用いることができる。  炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、アラビノース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、ソルビトール、グリセリン等の糖質又は糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸又はグルコン酸等の有機酸；エタノール、プロパノール等のアルコール等が挙げられる。また、所望によりノルマルパラフィン等の炭化水素等も用いることができる。炭素源は、１種を単独で使用でき、又は２種以上を混合して使用してもよい。培地中のこれら炭素源の濃度は、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。  窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等が挙げられる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ベプトン、NZ−アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、１種を単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。培地中の窒素源濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。  無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、又は炭酸カルシウム等が挙げられる。これら無機塩は、１種を単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。培地中の無機塩類濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（ｗ／ｖ％）とすればよい。  栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、又は動植物若しくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、例えば、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。  培地のｐＨは約５〜８が好ましい。
【００２４】  好ましい微生物培養培地としては、A培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。  培養温度は約１５〜４５℃とすればよく、培養時間は約１〜７日間とすればよい。
【００２５】宿主染色体遺伝子の破壊又は欠失  宿主のコリネバクテリウム グルタミカムは、その染色体上に存在するフェノール2-モノオキシゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子（poxF）が、破壊され、または欠失していることが好ましく、これにより一層効率良くフェノールを製造することができる。  また、宿主のコリネバクテリウム グルタミカムは、その染色体上に存在する4-ヒドロキシベンゾエート ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子(pobA)が破壊され、または欠失していることが好ましく、これにより、一層効率良くフェノールを製造することができる。  poxF及びpobAの双方が破壊され、または欠失していることが特に好ましい。  遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能する酵素タンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型又は破壊型の遺伝子に置換することができる。欠失型又は破壊型の遺伝子によってコードされる酵素タンパク質は、生成したとしても、野生型酵素タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失している。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子欠失又は破壊は既に確立しており、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。  具体的には、実施例１の項目に記載の方法により、poxFが破壊又は欠失したコリネバクテリウム  グルタミカムを得ることができる。また、同様の方法でpobAが破壊又は欠失したコリネバクテリウム  グルタミカムを得ることができる。
【００２６】（ＩＩ）フェノールの製造方法  上記説明した本発明の形質転換体を、4-ヒドロキシベンゾエートを含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のフェノールを回収する工程とを含む方法によりフェノールを製造することができる。
【００２７】微生物の増殖  反応に先立ち、形質転換体を好気条件下で、温度約２５〜３８℃で、約１２〜４８時間培養して増殖させることが好ましい。
【００２８】培養用培地  反応に先立つ形質転換体の好気的培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地を用いることができる。  炭素源として、糖類（グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖；スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖；澱粉のような多糖；糖蜜等）、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。  炭素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。
【００２９】  窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ−アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。窒素源の培地中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。  無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、１種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（ｗ／ｖ％）とすればよい。
【００３０】  栄養物質としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、動植物又は微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地中の濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。  さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。  培地のｐＨは約６〜８が好ましい。
【００３１】  具体的な好ましいコリネバクテリウム  グルタミカム用培地としては、A培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。
【００３２】反応液  反応液は、フェノール前駆体(フェノール原料)を含有する水、緩衝液、無機塩培地などを用いることができる。  前駆体としては4-ヒドロキシベンゾエートを用いる。4-ヒドロキシベンゾエートとしては、ナトリウム塩、カリウム塩のような塩；炭素数１〜４のアルコールとのエステルなどが挙げられる。中でも、塩が好ましく、ナトリウム塩がより好ましい。前駆体は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。  反応液中の4-ヒドロキシベンゾエートの濃度は、約0.5〜20（ｗ／ｖ％）が好ましく、約1〜10（ｗ／ｖ％）がより好ましく、約2〜5（ｗ／ｖ％）がさらにより好ましい。4-ヒドロキシベンゾエートは、芳香族化合物であるため細胞生存阻害作用を有するが、4-ヒドロキシベンゾエート濃度が上記範囲であれば、効率良く、フェノールを製造できる。  緩衝液としては、リン酸バッファー、トリスバファー、炭酸バッファーなどが挙げられる。緩衝液の濃度は、約10〜150 mMが好ましい。  無機塩培地としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等の無機塩の１種又は２種以上を含む培地が挙げられる。中でも、硫酸マグネシウムを含む培地が好ましい。無機塩培地として、具体的には、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（ｗ／ｖ％）とすればよい。  反応液のｐＨは約６〜８が好ましい。反応中は、アンモニア水溶液、水酸化ナトリウム水溶液などを用いて、ｐＨコントローラー (例えば、エイブル株式会社製、型式：DT-1023）で、反応液のｐＨを中性付近、特に約７にコントロールしながら反応させることが好ましい。
【００３３】反応条件  反応温度、即ち反応中の形質転換体の生存温度は、約２０〜５０℃が好ましく、約２５〜４７℃がより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良くフェノールを製造できる。  また、反応時間は、約１〜７日間が好ましく、約１〜３日間がより好ましい。  培養は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、バッチ式が好ましい。
【００３４】＜還元条件＞  反応は、好気的条件で行ってもよく、還元条件で行ってもよいが、還元条件で行うことが好ましい。還元条件では、コリネバクテリウム グルタミカムは実質的に増殖せず、一層効率的にフェノールを生産させることができる。  還元条件は、反応液の酸化還元電位で規定される。反応液の酸化還元電位は、約−２００ｍＶ〜−５００ｍＶが好ましく、約−２５０ｍＶ〜−５００ｍＶがより好ましい。  反応液の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬（還元状態であれば、青色から無色への脱色）で推定できるが、正確には酸化還元電位差計（例えば、BROADLEY  JAMES社製、ORP Electrodes）を用いて測定できる。
【００３５】  還元条件にある反応液の調整方法は、公知の方法を制限なく使用できる。例えば、反応液調製用の液体媒体として、蒸留水などの代わりに反応液用水溶液を使用してもよく、反応液用水溶液の調整方法は、例えば硫酸還元微生物などの絶対嫌気性微生物用の培養液調整方法（Pfennig, N. et al.,（1981）：The dissimilatory sulfate-reducing bacteria，In The Prokaryotes，A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria Ed．By Starr，M．P．et al., p.926-940，Berlin，Springer Verlag．）や「農芸化学実験書  第三巻、京都大学農学部  農芸化学教室編、1990年第26刷、産業図書株式会社出版」などが参考となり、所望する還元条件下の水溶液を得ることができる。  具体的には、蒸留水などを加熱処理や減圧処理して溶解ガスを除去することにより、還元条件の反応液用水溶液を得ることができる。この場合、約10 mmHg以下、好ましくは約5 mmHg以下、より好ましくは約3 mmHg以下の減圧下で、約1〜60分程度、好ましくは約5〜40分程度、蒸留水などを処理することにより、溶解ガス、特に溶解酸素を除去して還元条件下の反応液用水溶液を作成することができる。  また、適当な還元剤（例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオン、硫化ソーダ等）を添加して還元条件の反応液用水溶液を調整することもできる。  これらの方法を適宜組み合わせることも有効な還元条件の反応液用水溶液の調整方法である。
【００３６】  反応中も反応液を還元条件に維持することが好ましい。反応途中での還元条件を維持するために、反応系外からの酸素の混入を可能な限り防止することが望ましく、具体的には、反応系を窒素ガス等の不活性ガスや炭酸ガス等で封入する方法が挙げられる。酸素混入をより効果的に防止する方法としては、反応途中において本発明の好気性細菌の菌体内の代謝機能を効率よく機能させるために、反応系のｐＨ維持調整液の添加や各種栄養素溶解液を適宜添加する必要が生じる場合もあるが、このような場合には添加溶液から酸素を予め除去しておくことが有効である。
【００３７】フェノールの回収  上記のようにして培養することにより、反応液中にフェノールが生産される。反応液を回収することによりフェノールを回収できるが、さらに、公知の方法でフェノールを反応液から分離することもできる。そのような公知の方法として、蒸留法、膜透過法、有機溶媒抽出法等が挙げられる。
【実施例】
【００３８】  以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例1  フェノール生産遺伝子のクローニングと発現(1) 微生物からの染色体DNAの抽出  コリネバクテリウム グルタミカム （Corynebacterium glutamicum） R (FERM P-18976)からの染色体DNA抽出は、A培地 [(NH2)2CO  2 g、(NH4)2SO4  7 g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 gを蒸留水1 Lに溶解] に、炭素源として、最終濃度4%になるように50% (w/v)グルコース溶液を添加し、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで33℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット（商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製）を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００３９】  バチラス サブチリス（Bacillus subtilis）NBRC 14144からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.802培地 [polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水1 Lに溶解] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００４０】  バチラス アトロファエウス（Bacillus atrophaeus）JCM 9070からの染色体DNA抽出は、JCM Medium No.22培地 [peptone 10 g, beef extract 10 g, NaCl 5 gを蒸留水1 Lに溶解] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００４１】  バチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイ（Bacillus subtilis subsp. spizizenii）NBRC 101239からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.802培地 [polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水1 Lに溶解]に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００４２】  シトロバクター コセリ（Citrobacter koseri）ATCC BAA-895の染色体DNA（Catalog No. BAA-895D-5）はATCC（American Type Culture Collection）より入手した。【００４３】  エンテロバクター アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）NBRC 13534からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.802培地 [polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水1 Lに溶解]に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００４４】  エンテロバクター クロアカエ（Enterobacter cloacae）NBRC 13535からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.802培地 [polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水1 Lに溶解]に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００４５】  エンテロバクター ホルメ��ェイ（Enterobacter hormaechei）ATCC 49162からの染色体DNA抽出は、Tryptic Soy Broth培地 [Tryptic Soy Broth (Becton, Dickinson and Company製  Catalog No. 211825) 30 gを蒸留水1 Lに溶解]に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００４６】  エンテロバクター サカザキ（Enterobacter sakazakii）ATCC BAA-894からの染色体DNA（Catalog No. BAA-894D-5）はATCC（American Type Culture Collection）より入手した。  エシェリヒア コリ（Escherichia coli） W NBRC 13500からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.802培地 [polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水1 Lに溶解]に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００４７】  エシェリヒア フェルグソニー（Escherichia fergusonii）NBRC 102419からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.802培地 [polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水1 Lに溶解]に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００４８】  パエニバチラス ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）NBRC 15309からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.802培地 [polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水1 Lに溶解]に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００４９】  パントエア アナナティス（Pantoea ananatis）LMG 20103からの染色体DNA抽出は、BCCM/LMG BacteriCulture Medium No.1培地 [beef extract 1 g, yeast extract 2 g, peptone 5 g, NaCl 5 gを蒸留水1 Lに溶解]に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００５０】(2) クローニングベクターの構築クローニングベクターpCRB22の構築  コリネバクテリウム カゼイ JCM12072由来のプラスミドpCASE1のDNA複製起点（以降、pCASE1-oriと記す）配列、及びクローニングベクターpHSG298（タカラバイオ株式会社製）をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。  PCRに際して、pCASE1-ori配列、クローニングベクターpHSG298をそれぞれクローン化するべく、配列番号1（pCASE1-ori配列）、配列番号2（クローニングベクター−pHSG298）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【００５１】  pCASE1-ori配列増幅用プライマー（a-1）；  5’- AT AGATCT AGAACGTCCGTAGGAGC -3’     （配列番号3）（b-1）；  5’- AT AGATCT GACTTGGTTACGATGGAC -3’    （配列番号4）  尚、プライマー（a-1）及び（b-1）には、BglII制限酵素部位が付加されている。  クローニングベクターpHSG298増幅用プライマー（a-2）；  5’- AT AGATCT AGGTTTCCCGACTGGAAAG -3’   （配列番号5）（b-2）；  5’- AT AGATCT CGTGCCAGCTGCATTAATGA -3’  （配列番号6）  尚、プライマー（a-2）及び（b-2）には、BglII制限酵素部位が付加されている。【００５２】  鋳型DNAは、Japan. Collection of Microorganisms (JCM)より入手したコリネバクテリウム カゼイ JCM12072から抽出したトータルDNA及びクローニングベクターpHSG298（タカラバイオ株式会社製）を用いた。  実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。【００５３】
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*) pCASE1-ori配列を増幅する場合はプライマー（a-1）と（b-1）の組み合わせ、クローニングベクターpHSG298を増幅する場合はプライマー（a-2）と（b-2）の組み合わせで行った。【００５４】
2012063860.tif 000003
【００５５】  上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、pCASE1-ori配列の場合約1.4-kb、クローニングベクターpHSG298の場合、約2.7-kbのDNA断片が検出できた。【００５６】  上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウム  カゼイ株由来のプラスミドpCASE1-ori配列含む約1.4-kb DNA断片10μl及びクローニングベクターpHSG298を含む約2.7-kb DNA断片10μlを各々制限酵素BglIIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製）1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションA液とした。  得られたライゲーションA液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。  培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素BglIIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpHSG298約2.7-kbのDNA断片に加え、pCASE-ori配列の約1.4-kb DNA断片が認められた。  pCASE1-ori配列を含むクローニングベクターをpCRB22と命名した。【００５７】クローニングベクターpCRB207の構築  コリネバクテリウム グルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）をコードするgapA遺伝子のプロモーター配列（以降、PgapAと記す）を含むDNA断片、及びクローニングベクターpKK223-3（ファルマシア社製）由来rrnBT1T2双方向ターミネーター配列（以降、ターミネーター配列と記す）を含むDNA断片を以下の方法により増幅した。  PCRに際して、PgapA配列及びターミネーター配列をそれぞれクローン化するべく、配列番号7（PgapA配列）、配列番号8（ターミネーター配列）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【００５８】  PgapA配列増幅用プライマー（a-3）；  5’- CTCT GTCGAC CCGAAGATCTGAAGATTCCTG -3’（配列番号9）（b-3）；  5’- CTCT GTCGAC GGATCC CCATGG TGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG -3’                                                     （配列番号10）  尚、プライマー（a-3）には、SalI制限酵素部位が、プライマー（b-3）には、SalI、BamHI及びNcoI制限酵素部位が付加されている。【００５９】  ターミネーター配列増幅用プライマー（a-4）；  5’- CTCT GCATGC CCATGG CTGTTTTGGCGGATGAGAGA -3’                                                   （配列番号11）（b-4）；  5’- CTCT GCATGC TCATGA AAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG -3                                                    （配列番号12）  尚、プライマー（a-4）には、SphI及びNcoI制限酵素部位が、プライマー（b-4）には、SphI及びBspHI制限酵素部位が付加されている。【００６０】  鋳型DNAは、コリネバクテリウム グルタミカム R (FERM P-18976)から抽出した染色体DNA及びpKK223-3プラスミド（ファルマシア社製）を用いた。  実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。【００６１】
2012063860.tif 000004
*) PgapA配列を増幅する場合はプライマー(a-7)と(b-7)の組み合わせ、ターミネーター配列を増幅する場合はプライマー(a-8) と (b-8) の組み合わせで行った。【００６２】
2012063860.tif 000005
【００６３】  上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、PgapA配列の場合約0.6-kb、ターミネーター配列の場合、約0.4-kbのDNA断片が検出できた。【００６４】  上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウム グルタミカム R由来PgapA配列を含む約0.6-kb DNA断片10μlとクローニングベクターpCRB22約4.1-kbを各々制限酵素SalIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションB液とした。  得られたライゲーションB液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。  培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素SalIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB22約4.1-kbのDNA断片に加え、PgapA配列の約0.6-kb DNA断片が認められた。  PgapA配列を含むクローニングベクターをpCRB206と命名した。【００６５】  上記PCRにより増幅したpKK223-3プラスミド由来ターミネーター配列を含む約0.4-kb DNA断片10μlを制限酵素NcoI及びBspHIで、上述のクローニングベクターpCRB206  2μlを制限酵素NcoIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションC液とした。  得られたライゲーションC液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。  培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB206約4.7-kbのDNA断片に加え、ターミネーター配列の約0.4-kb DNA断片が認められた。  rrnBT1T2ターミネーター配列を含むクローニングベクターをpCRB207と命名した。【００６６】クローニングベクターpCRB209の構築  コリネバクテリウム グルタミカムR由来のgapA（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase A）遺伝子のプロモーター（以降、PgapAと記す）配列を含むDNA断片を以下の方法により増幅した。  PCRに際して、pCRB207配列をクローン化するべく、配列番号13（pCRB207）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【００６７】  pCRB207配列増幅用プライマー（a-5）； 5’- CTCT CATATG CTGTTTTGGCGGATGAGAG -3’    (配列番号14)（b-5）； 5’- CTCT CATATG GTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG -3’(配列番号15)尚、プライマー（a-5）及び（b-5）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【００６８】  鋳型DNAは、gapAプロモーター及びrrnBT1T2ターミネーター配列を含有するクローニングベクターpCRB207を用いた。  実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ���製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（宝酒造株式会社製）を用いて下記の条件で行った。2012063860.tif 000006
【００６９】
2012063860.tif 000007
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、クローニングベクターpCRB207配列を含む約5.1-kbのDNA断片が検出できた。【００７０】  上記のPCRにより増幅したpCRB207由来遺伝子を含む約5.1-kb DNA断片10μlを制限酵素NdeIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ  （宝酒造株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションD液とした。  得られたライゲーションD液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。  この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素NdeIで切断し、制限酵素サイトの挿入を確認した。  PgapA配列及びrrnBT1T2ターミネーター配列を含むクローニングベクタ−をpCRB209と命名した。【００７１】(3) フェノール生産遺伝子のクローニングバチラス サブチリス由来のフェノール生産遺伝子のクローニング  バチラス サブチリス由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするbsdBCD遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。  PCRに際して、bsdBCD遺伝子をクローン化するべく、配列番号16（バチラスサブチリス bsdBCD遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【００７２】  bsdBCD遺伝子増幅用プライマー（a-6）； 5’- CTCT CATATG AAAGCAGAATTCAAGCGTAAAG -3’（配列番号17）（b-6）； 5’- CTCT CATATG GATCAAGCCTTTCGTTCCG -3’   （配列番号18）  尚、プライマー（a-6）及び（b-6）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。【００７３】バチラス アトロファエウス由来のフェノール生産遺伝子のクローニング  バチラス アトロファエウス由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。  PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号23（バチラス アトロファエウス dca遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【００７４】  dca遺伝子増幅用プライマー（a-9）；  5’- CTCT CATATG AAACTCGTTGTCGGGATG -3’（配列番号24）（b-9）；  5’- CTCT CATATG TCAGGCCTTTCTTTCC -3’  （配列番号25）  尚、プライマー（a-9）及び（b-9）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。【００７５】バチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイ由来のフェノール生産遺伝子のクローニング  バチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。  PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号26（バチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイ dca遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems���社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【００７６】  dca遺伝子増幅用プライマー（a-10）； 5’- CTCT CATATG AAAGCAGAATTCAAGCGTAAAG -3’(配列番号27)（b-10）； 5’- CTCT CATATG TCAAGCCTTTCGTTCCGG -3’    (配列番号28)  尚、プライマー（a-10）及び（b-10）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。【００７７】シトロバクター コセリ由来のフェノール生産遺伝子のクローニング  シトロバクター コセリ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。  PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号29（シトロバクター コセリ dca遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【００７８】  dca遺伝子増幅用プライマー（a-11）； 5’- CTCT CATATG AGACTGATTGTGGGGATG -3’   （配列番号30）（b-11）； 5’- CTCT CATATG TTAACGCTTATCTTCCGCCAG -3’（配列番号31）  尚、プライマー（a-11）及び（b-11）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。【００７９】エンテロバクター アエロゲネス由来のフェノール生産遺伝子のクローニング  エンテロバクター アエロゲネス由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。  PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号32（エンテロバクター アエロゲネス dca遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【００８０】   dca遺伝子増幅用プライマー（a-12）； 5’- CTCT CATATG AAACTGATTATTGGGATGACCG -3’(配列番号33)（b-12）； 5’- CTCT CATATG TTAACGCTTATCTGCCGCC -3’   (配列番号34)  尚、プライマー（a-12）及び（b-12）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。【００８１】エンテロバクター クロアカエ由来のフェノール生産遺伝子のクローニング  エンテロバクター クロアカエ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。  PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号35（エンテロバクター クロアカエ dca遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【００８２】  dca遺伝子増幅用プライマー（a-13）；  5’- CTCT CATATG AGATTGATCGTGGGAATGAC -3’（配列番号36）（b-13）；  5’- CTCT CATATG TTACAGCAATGGCGGAATGG -3’（配列番号37）  尚、プライマー（a-13）及び（b-13）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。【００８３】エンテロバクター ホルメシェイ由来のフェノール生産遺伝子のクローニング  エンテロバクター ホルメシェイ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。  PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号38（エンテロバクター ホルメシェイ dca遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシ���テムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【００８４】  dca遺伝子増幅用プライマー（a-14）； 5’- CTCT CATATG AGATTGATTGTGGGAATGAC -3’ （配列番号39）（b-14）； 5’- CTCT CATATG GAGTCTGGTTTAGTTCTCTGC -3’（配列番号40）  尚、プライマー（a-14）及び（b-14）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。【００８５】エンテロバクター サカザキ由来のフェノール生産遺伝子のクローニング  エンテロバクター サカザキ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。  PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号41（エンテロバクター サカザキ dca遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【００８６】  dca遺伝子増幅用プライマー（a-15）；  5’- CTCT CATATG AGGCTAATTGTCGGAATGAC -3’（配列番号42）（b-15）；  5’- CTCT CATATG TTAACGCTTACCATCCGCC -3’ （配列番号43）  尚、プライマー（a-15）及び（b-15）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。【００８７】エシェリヒア コリ由来のフェノール生産遺伝子のクローニング  エシェリヒア コリ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。  PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号44（エシェリヒア  コリ dca遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【００８８】  dca遺伝子増幅用プライマー（a-16）；  5’- CTCT CATATG AAACTGATCGTCGGGATG -3’（配列番号45）（b-16）；  5’- CTCT CATATG TTAGCGCTTACCTTCCGC -3’（配列番号46）  尚、プライマー（a-16）及び（b-16）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。【００８９】エシェリヒア フェルグソニー由来のフェノール生産遺伝子のクローニング  エシェリヒア フェルグソニー由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。  PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号47（エシェリヒアフェルグソニー dca遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【００９０】  dca遺伝子増幅用プライマー（a-17）；  5’- CTCT CATATG AGACTGATCGTCGGGAT -3’ （配列番号48）（b-17）；  5’- CTCT CATATG TTAGCGCTTATCTGCCGC -3’（配列番号49）  尚、プライマー（a-17）及び（b-17）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。【００９１】パエニバチラス ポリミキサ由来のフェノール生産遺伝子のクローニング  パエニバチラス ポリミキサ由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。  PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号50（パエニバチラス ポリミキサ dca遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【００９２】  dca遺伝子増幅用プライマー（a-18）；5’- CTCT CATATG AAGAAAATCATTGTAGGAATATCGG -3’(配列番号51)（b-18）；5’- CTCT CATATG CTATATCCGCTCTGGAATAGG -3’    (配列番号52)  尚、プライマー（a-18）及び（b-18）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。【００９３】パントエア アナナティス由来のフェノール生産遺伝子のクローニング  パントエア アナナティス由来の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子をコードするdca遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。  PCRに際して、dca遺伝子をクローン化するべく、配列番号53（パントエア アナナティス dca遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【００９４】  dca遺伝子増幅用プライマー（a-19）； 5’- CTCT CATATG AGTAGATTACTGTTAATTTCATTCGTAC -3                                              (配列番号54)（b-19）； 5’- CTCT CATATG TTACTTAGCTAACAGAGGAGGG -3’                                              (配列番号55)  尚、プライマー（a-19）及び（b-19）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。【００９５】  鋳型DNAは、バチラス サブチリスは、NITE（National Institute of Technology and Evaluation） Biological Resource Center（NBRC）より入手したバチラス サブチリス NBRC 14144から抽出した染色体DNAを用いた。  バチラス アトロファエウスは、Japan Collection of Microorganisms（JCM）より入手したバチラス アトロファエウス JCM 9070から抽出した染色体DNAを用いた。  バチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイは、NITE（National Institute of Technology and Evaluation） Biological Resource Center（NBRC）より入手したバチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイNBRC 101239から抽出した染色体DNAを用いた。  シトロバクター コセリは、American Type Culture Collection (ATCC)より入手したシトロバクター コセリ染色体DNA（catalog No. BAA-895D-5）を用いた。  エンテロバクター アエロゲネスは、NITE（National Institute of Technology and Evaluation） Biological Resource Center（NBRC）より入手したエンテロバクター アエロゲネスNBRC 13534から抽出した染色体DNAを用いた。  エンテロバクター クロアカエは、NITE（National Institute of Technology and Evaluation） Biological Resource Center（NBRC）より入手したエンテロバクター クロアカエNBRC 13535から抽出した染色体DNAを用いた。  エンテロバクター ホルメシェイは、American Type Culture Collection (ATCC)より入手したエンテロバクター ホルメシェイATCC 49162から抽出した染色体DNAを用いた。  エンテロバクター サカザキは、American Type Culture Collection (ATCC)より入手したエンテロバクター サカザキ染色体DNA（catalog No. BAA-894D-5）を用いた。  エシェリヒア コリ Wは、NITE（National Institute of Technology and Evaluation） Biological Resource Center（NBRC）より入手したエシェリヒア コリNBRC 13500から抽出した染色体DNAを用いた。  エシェリヒア フェルグソニーは、NITE（National Institute of Technology and Evaluation） Biological Resource Center（NBRC）より入手したエシェリヒア フェルグソニーNBRC 102419から抽出した染色体DNAを用いた。  パエニバチラス ポリミキサは、NITE（National Institute of Technology and Evaluation） Biological Resource Center（NBRC）より入手したパエニバチラス ポリミキサNBRC 15309から抽出した��色体DNAを用いた。  パントエア アナナティスは、BCCM/LMG（Belgian Coordinated Collections of Microorganisms / Laboratory for Microbiology, University of Gent）より入手したパントエア アナナティスLMG 20103から抽出した染色体DNAを用いた。【００９６】  実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。2012063860.tif 000008
*)バチラス サブチリス bsdBCD遺伝子を増幅する場合はプライマー（a-6）と （b-6）の組み合わせ、バチラス アトロファエウスdca遺伝子を増幅する場合はプライマー（a-9）と （b-9）の組み合わせ、バチラス サブチリス 亜種  スピジゼニイ dca遺伝子を増幅する場合はプライマー（a-10）と （b-10）の組み合わせ、シトロバクター コセリ dca遺伝子を増幅する場合はプライマー（a-11）と （b-11）の組み合わせ、エンテロバクター アエロゲネス dca遺伝子を増幅する場合はプライマー（a-12）と （b-12）の組み合わせ、エンテロバクター クロアカエ dca遺伝子を増幅する場合はプライマー（a-13）と （b-13）の組み合わせ、エンテロバクター ホルメシェイ dca遺伝子を増幅する場合はプライマー（a-14）と （b-14）の組み合わせ、エンテロバクター サカザキ dca遺伝子を増幅する場合はプライマー（a-15）と （b-15）の組み合わせ、エシェリヒア コリ W  dca遺伝子を増幅する場合はプライマー（a-16）と （b-16）の組み合わせ、エシェリヒア フェルグソニー dca遺伝子を増幅する場合はプライマー（a-17）と （b-17）の組み合わせ、パエニバチラス ポリミキサ dca遺伝子を増幅する場合はプライマー（a-18）と （b-18）の組み合わせ、パントエア アナナティス dca遺伝子を増幅する場合はプライマー（a-19）と （b-19）の組み合わせで行った。【００９７】
2012063860.tif 000009
【００９８】  上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、バチラス サブチリス bsdBCD遺伝子の場合約2.3-kb、バチラス アトロファエウス bsdBCD遺伝子の場合約2.3-kb、バチラス サブチリス 亜種  スピジゼニイ dca遺伝子の場合約2.3-kb、シトロバクター コセリ dca遺伝子の場合約2.3-kb、エンテロバクター アエロゲネス dca遺伝子の場合約2.3-kb、エンテロバクター クロアカエdca遺伝子の場合約2.3-kb、エンテロバクター ホルメシェイdca遺伝子の場合約2.4-kb、エンテロバクター サカザキ dca遺伝子の場合約2.3-kb、エシェリヒア コリ W dca遺伝子の場合約2.3-kb、エシェリヒア フェルグソニー dca遺伝子の場合約2.3-kb、パエニバチラス ポリミキサ dca遺伝子の場合約2.3-kb、パントエア アナナティス dca遺伝子の場合約2.3-kbのDNA断片が検出できた。【００９９】(4) フェノール生産遺伝子発現プラスミドの構築フェノール生産遺伝子のpCRB209へのクローニング  上記項(3)に示したPCRにより増幅したバチラス サブチリス株由来 bsdBCD遺伝子を含む約2.3-kb DNA断片、バチラス アトロファエウス株由来 dca遺伝子を含む約2.3-kb DNA断片、バチラス サブチリス 亜種  スピジゼニイ株由来 dca遺伝子を含む約2.3-kb DNA断片、シトロバクター コセリ株由来 dca遺伝子を含む約2.3-kb DNA断片、エンテロバクター アエロゲネス株由来 dca遺伝子を含む約2.3-kb DNA断片、エンテロバクター クロアカエ株由来 dca遺伝子を含む約2.3-kb DNA断片、エンテロバクター ホルメシェイ株由来 dca遺伝子を含む約2.4-kb DNA断片、エンテロバクター サカザキ株由来 dca遺伝子を含む約2.3-kb DNA断片、エシェリヒア コリ W株由来 dca遺伝子を含む約2.3-kb DNA断片、エシェリヒア フェルグソニー株由来 dca遺伝子を含む約2.3-kb DNA断片、パエニバチラス ポリミキサ株由来 dca遺伝子を含む約2.3-kb DNA断片、及びパントエア アナナティス株由来 dca遺伝子を含む約2.3-kb DNA断片のそれぞれ10μl及びPgapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB209  2μlを各々制限酵素NdeIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ  （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これを、それぞれライゲーションE液、G液、H液、I液、J液、K液、L液、M液、N液、O液、P液及びQ液とした。【０１００】  得られた12種類のライゲーションE液、G液、H液、I液、J液、K液、L液、M液、N液、O液、P液及びQ液それぞれを、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。  各々培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB209約5.1-kbのDNA断片に加え、バチラス  サブチリス株由来 bsdBCD遺伝子（ライゲーションE液）の場合、長さ約2.3-kbの挿入断片が、バチラス アトロファエウス株由来 dca遺伝子（ライゲーションG液）の場合、長さ約2.3-kbの挿入断片が、バチラス サブチリス 亜種  スピジゼニイ株由来 dca遺伝子（ライゲーションH液）の場合、長さ約2.3-kbの挿入断片が、シトロバ��ター コセリ株由来 dca遺伝子（ライゲーションI液）の場合、長さ約2.3-kbの挿入断片が、エンテロバクター アエロゲネス株由来 dca遺伝子（ライゲーションJ液）の場合、長さ約2.3-kbの挿入断片が、エンテロバクター クロアカエ株由来 dca遺伝子（ライゲーションK液）の場合、長さ約2.3-kbの挿入断片が、エンテロバクター ホルメシェイ株由来 dca遺伝子（ライゲーションL液）の場合、長さ約2.4-kbの挿入断片が、エンテロバクター サカザキ株由来 dca遺伝子（ライゲーションM液）の場合、長さ約2.3-kbの挿入断片が、エシェリヒア コリ W株由来 dca遺伝子（ライゲーションN液）の場合、長さ約2.3-kbの挿入断片が、エシェリヒア フェルグソニー株由来 dca遺伝子（ライゲーションO液）の場合、長さ約2.3-kbの挿入断片が、パエニバチラス ポリミキサ株由来 dca遺伝子（ライゲーションP液）の場合、長さ約2.3-kbの挿入断片が、パントエア アナナティス株由来 dca遺伝子（ライゲーションQ液）の場合、長さ約2.3-kbの挿入断片が認められた。  バチラス サブチリス株由来 bsdBCD遺伝子を含むプラスミドをpCRB209- bsdBCD/BS（図１）、バチラス アトロファエウス株由来 dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-dca/BAE、バチラス サブチリス 亜種  スピジゼニイ株由来 dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-dca/BSS、シトロバクター コセリ株由来 dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-dca/CKO、エンテロバクター アエロゲネス株由来 dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-dca/EAE、エンテロバクター クロアカエ株由来 dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-dca/ECL、エンテロバクター ホルメシェイ株由来 dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-dca/EHO、エンテロバクター サカザキ株由来 dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-dca/ESA、エシェリヒア コリ W株由来 dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-dca/ECK、エシェリヒア フェルグソニー株由来 dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-dca/EFE、パエニバチラス ポリミキサ株由来 dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-dca/PPY、パントエア アナナティス株由来 dca遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-dca/PAMと命名した。【０１０１】(5) コリネバクテリウム グルタミカムの染色体遺伝子破壊用プラスミドの構築コリネバクテリウム グルタミカム株poxF遺伝子破壊用プラスミドの構築  コリネバクテリウム グルタミカム株の染色体上poxF遺伝子のマーカーレス破壊用プラスミドを構築するために必要なDNA断片を以下のPCR法により増幅した。  PCRに際してコリネバクテリウム グルタミカム  Rの配列を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【０１０２】poxF-1領域増幅用プライマー（a-7）； 5’- CTCT TCTAGA TACGTCCTAAACACCCGAC -3’ （配列番号19）（b-7）； 5’- GACCAACCATTGCTGACTTGCGTATCCATAGTCAGGCTTC -3’                                                   （配列番号20）  尚、プライマー（a-7）には、XbaI制限酵素部位が付加されている。poxF-2領域増幅用プライマー（a-8）； 5’- CAAGTCAGCAATGGTTGGTC -3’               (配列番号21)（b-8）； 5’- CTCT TCTAGA TGATCAGTACCAAGGGTGAG -3’   (配列番号22)  尚、プライマー（b-8）には、XbaI制限酵素部位が付加されている。【０１０３】  鋳型DNAは、コリネバクテリウム グルタミカムRから抽出した染色体DNAを用いた。  実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。【０１０４】
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【０１０５】
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上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、コリネバクテリウム  グルタミカムpoxF-1領域の場合約0.8-kb、poxF-2領域の場合約0.8-kbのDNA断片が検出できた。【０１０６】  次に、上記のPCRにより増幅したpoxF-1領域断片とpoxF-2領域断片を1μlずつ混合し、PCRにより2種の断片の結合反応を行った。  実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。【０１０７】
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【０１０８】
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【０１０９】  さらに、得られたpoxF-1及びpoxF-2の結合断片を鋳型とし、PCRによりpoxF欠失断片の増幅を行った。  実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。【０１１０】
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【０１１１】
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上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、poxF欠失断片約1.6-kbが検出できた。【０１１２】  上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウム グルタミカム R由来poxF欠失配列約1.7-kb DNA断片10μlと約4.4-kbのマーカーレス染色体遺伝子導入用プラスミドpCRA725 [J. Mol. Microbiol. Biotechnol., Vol. 8, 243-254(2004) 、（特開2006-124440）] 2μlを各々制限酵素XbaIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションF液とした。  得られたライゲーションF液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。  培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素XbaIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRA725約4.4-kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウム グルタミカム株由来pheA欠失遺伝子（ライゲーションF液）の場合、長さ約1.7-kbの挿入断片が認められた。  コリネバクテリウム グルタミカム株由来poxF欠失遺伝子を含むプラスミドをpCRA725-poxF/CGと命名した。【０１１３】コリネバクテリウム グルタミカム株pobA遺伝子破壊用プラスミドの構築  コリネバクテリウム グルタミカム株の染色体上pobA遺伝子のマーカーレス破壊用プラスミドを構築するために必要なDNA断片を以下のPCR法により増幅した。  PCRに際してコリネバクテリウム グルタミカム Rの配列を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【０１１４】pobA-1領域増幅用プライマー（a-20）； 5’- CTCT TCTAGA GAAACGATCAAGTGCACCAG -3’（配列番号56）（b-20）； 5’- GACACGAGCGTTTATACCTCTAATTGCCACTGGTACGTGG -3’                                                   （配列番号57）  尚、プライマー（a-20）には、XbaI制限酵素部位が付加されている。pobA-2領域増幅用プライマー（a-21）；  5’- GAGGTATAAACGCTCGTGTC -3’           （配列番号58）（b-21）；  5’- CTCT GAGCTC GAGAACACGAACCATACGAG -3 （配列番号59）  尚、プライマー（b-21）には、SacI制限酵素部位が付加されている。【０１１５】  鋳型DNAは、コリネバクテリウム グルタミカムRから抽出した染色体DNAを用いた。  実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。【０１１６】
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【０１１７】
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【０１１８】  上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、コリネバクテリウム グルタミカムコリpobA-1領域の場合約1.0-kb、pobA-2領域の場合約1.0-kbのDNA断片が検出できた。【０１１９】  次に、上記のPCRにより増幅したpobA-1領域断片とpobA-2領域断片を1μlずつ混合し、PCRにより2種の断片の結合反応を行った。  実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。2012063860.tif 000018
【０１２０】
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【０１２１】  さらに、得られたpobA-1及びpobA -2の結合断片を鋳型とし、PCRによりpobA欠失断片の増幅を行った。  実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。2012063860.tif 000020
【０１２２】
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【０１２３】  上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、pobA欠失断片約2.0が検出できた。【０１２４】  上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウム グルタミカム R由来pobA欠失配列約2.0 DNA断片10μlと約4.4-kbのマーカーレス染色体遺伝子導入用プラスミドpCRA725 [J. Mol. Microbiol. Biotechnol. Vol. 8, 243-254(2004) 、（特開2006-124440）] 2μlを各々制限酵素XbaI及びSacIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションR液とした。  得られたライゲーションR液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。  培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素XbaI及びSacIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRA725約4.4-kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウム グルタミカム株由来pobA欠失遺伝子（ライゲーションN液）の場合、長さ約2.0-kbの挿入断片が認められた。  コリネバクテリウム グルタミカム株由来pobA欠失遺伝子を含むプラスミドをpCRA725-pobA/CGと命名した。【０１２５】(6) 副生経路遺伝子破壊株の構築コリネバクテリウム グルタミカム株poxF遺伝子破壊株の構築  マーカーレス染色体遺伝子導入用ベクターpCRA725は、コリネバクテリウム グルタミカムR内で複製不能なプラスミドである。pCRA725-poxF/CGを用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol.、Vol. 144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムRを形質転換し、カナマイシン 50μg/mlを含むA寒天培地〔A液体培地、および1.5% 寒天〕に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10%(W/V)スクロース含有BT寒天培地[(NH2)2CO  2g、(NH4)2SO4  7g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 mlを蒸留水1Lに溶解、および1.5% 寒天]に塗付した。【０１２６】  プラスミドpCRA725-poxF/CGが染色体上の相同領域との一重交叉株の場合、pCRA725-poxF/CG上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、バチラス サブチリス（Bacillus subtilis）のsacR-sacB遺伝子の発現によるスクロース含有培地での致死性を示すのに対し、二重交叉株の場合、pCRA725-poxF/CG上のカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、sacR-sacB遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での生育性を示す。従って、マーカーレス染色体遺伝子破壊株は、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示す。  そこで、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示した株を選択した。このコリネバクテリウム グルタミカムR株poxF遺伝子マーカーレス破壊株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ΔpoxFと命名した。【０１２７】コリネバクテリウム グルタミカム株poxF, pobA遺伝子破壊株の構築  マーカーレス染色体遺伝子導入用ベクターpCRA725は、コリネバクテリウム グルタミカムR内で複製不能なプラスミドである。pCRA725-pobA/CGを用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem., Vol. 54, 443-447(1990) 及びRes. Microbiol., Vol. 144, 181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムΔpoxFを形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むA寒天培地〔A液体培地、および1.5% 寒天〕に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10%(W/V)スクロース含有BT寒天培地[(NH2)2CO  2g、(NH4)2SO4  7g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 mlを蒸留水1Lに溶解、および1.5% 寒天]に塗付した。【０１２８】  プラスミドpCRA725-pobA/CGが染色体上の相同領域との一重交叉株の場合、pCRA725-pobA/CG上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、バチラス  サブチリス（Bacillus subtilis）のsacR-sacB遺伝子の発現によるスクロース含有培地での致死性を示すのに対し、二重交叉株の場合、pCRA725-pobA/CG上のカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、sacR-sacB遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での生育性を示す。従って、マーカーレス染色体遺伝子破壊株は、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示す。  そこで、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示した株を選択した。このコリネバクテリウム グルタミカムΔpoxF株にpobA遺伝子のマーカーレス破壊を重ねた株を、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ΔpoxFΔpobAと命名した。【０１２９】(7) フェノール生産遺伝子導入株の構築コリネバクテリウム グルタミカムΔpoxF株へのフェノール生産遺伝子導入  上述のプラスミド12種類（pCRB209-bsdBCD/BS、pCRB209-dca/BAE、pCRB209-dca/BSS、pCRB209-dca/CKO、pCRB209-dca/EAE、pCRB209-dca/ECL、pCRB209-dca/EHO、pCRB209-dca/ESA、pCRB209-dca/ECK、pCRB209-dca/EFE、pCRB209-dca/PPY及びpCRB209-dca/PAM）をそれぞれ用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol.、Vol. 144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムΔpoxF株を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。  この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB209-bsdBCD/BS、pCRB209-dca/BAE、pCRB209-dca/BSS、pCRB209-dca/CKO、pCRB209-dca/EAE、pCRB209-dca/ECL、pCRB209-dca/EHO、pCRB209-dca/ESA、pCRB209-dca/ECK、pCRB209-dca/EFE、pCRB209-dca/PPY及びpCRB209-dca/PAMの導入が認められた。  pCRB209-bsdBCD/BSの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE21、pCRB209-dca/BAEの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE21-2、pCRB209-dca/BSSの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE21-3、pCRB209-dca/CKOの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE21-4、pCRB209-dca/EAEの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE21-5、pCRB209-dca/ECLの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE21-6、pCRB209-dca/EHOの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE21-7、pCRB209-dca/ESAの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE21-8、pCRB209-dca/ECKの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE21-9、pCRB209-dca/EFEの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカ���PHE21-10、pCRB209-dca/PPYの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE21-11、pCRB209-dca/PAMの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE21-12と命名した。尚、本株の遺伝子組換えの概要を、表1にまとめて示した。【０１３０】  コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）PHE21は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818）の独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センターに寄託した（受託日：2010年10月21日、受託番号：NITE BP-996）。【表１】
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【０１３１】コリネバクテリウム グルタミカムΔpoxFΔpobA株へのフェノール生産遺伝子導入  上述のプラスミド12種類（pCRB209-bsdBCD/BS、pCRB209-dca/BAE、pCRB209-dca/BSS、pCRB209-dca/CKO、pCRB209-dca/EAE、pCRB209-dca/ECL、pCRB209-dca/EHO、pCRB209-dca/ESA、pCRB209-dca/ECK、pCRB209-dca/EFE、pCRB209-dca/PPY及びpCRB209-dca/PAM）をそれぞれ用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem., Vol. 54, 443-447(1990) 及びRes. Microbiol. Vol. 144, 181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムΔpoxFΔpobA株を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。  この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB209-bsdBCD/BS、pCRB209-dca/BAE、pCRB209-dca/BSS、pCRB209-dca/CKO、pCRB209-dca/EAE、pCRB209-dca/ECL、pCRB209-dca/EHO、pCRB209-dca/ESA、pCRB209-dca/ECK、pCRB209-dca/EFE、pCRB209-dca/PPY及びpCRB209-dca/PAMの導入が認められた。  pCRB209-bsdBCD/BSの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE22-1、pCRB209-dca/BAEの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE22-2、pCRB209-dca/BSSの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE22-3、pCRB209-dca/CKOの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE22-4、pCRB209-dca/EAEの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE22-5、pCRB209-dca/ECLの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE22-6、pCRB209-dca/EHOの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE22-7、pCRB209-dca/ESAの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE22-8、pCRB209-dca/ECKの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE22-9、pCRB209-dca/EFEの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE22-10、pCRB209-dca/PPYの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE22-11、pCRB209-dca/PAMの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE22-12と命名した。尚、本株の遺伝子組換えの概要を、表2にまとめて示した。【０１３２】
【表２】
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【０１３３】コリネバクテリウム グルタミカム R株へのフェノール生産遺伝子導入  上述のプラスミド12種類（pCRB209-bsdBCD/BS、pCRB209-dca/BAE、pCRB209-dca/BSS、pCRB209-dca/CKO、pCRB209-dca/EAE、pCRB209-dca/ECL、pCRB209-dca/EHO、pCRB209-dca/ESA、pCRB209-dca/ECK、pCRB209-dca/EFE、pCRB209-dca/PPY及びpCRB209-dca/PAM）をそれぞれ用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem., Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol., Vol. 144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカム R株を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。  この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB209-bsdBCD/BS、pCRB209-dca/BAE、pCRB209-dca/BSS、pCRB209-dca/CKO、pCRB209-dca/EAE、pCRB209-dca/ECL、pCRB209-dca/EHO、pCRB209-dca/ESA、pCRB209-dca/ECK、pCRB209-dca/EFE、pCRB209-dca/PPY及びpCRB209-dca/PAMの導入が認められた。  pCRB209-bsdBCD/BSの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE23-1、pCRB209-dca/BAEの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE23-2、pCRB209-dca/BSSの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE23-3、pCRB209-dca/CKOの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE23-4、pCRB209-dca/EAEの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE23-5、pCRB209-dca/ECLの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE23-6、pCRB209-dca/EHOの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE23-7、pCRB209-dca/ESAの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE23-8、pCRB209-dca/ECKの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE23-9、pCRB209-dca/EFEの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE23-10、pCRB209-dca/PPYの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE23-11、pCRB209-dca/PAMの導入が認められた株をコリネバクテリウム グルタミカムPHE23-12と命名した。尚、本株の遺伝子組換えの概要を、表3にまとめて示した。【０１３４】
【表３】
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【０１３５】実施例２  フェノール生産遺伝子を導入したコリネバクテリウム グルタミカム副生経路破壊株及びR株（野生株）のフェノール生成実験  実施例１において作製したコリネバクテリウム グルタミカムΔpoxF/フェノール生産遺伝子導入株（表1参照）を、カナマイシン50μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO  2g、(NH4)2SO4  7g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁] に塗布し、28℃、20時間暗所に静置した。  上記のプレートで生育したコリネバクテリウム グルタミカムΔpoxF/フェノール生産遺伝子導入株を、カナマイシン50μg/mlを含有したA液体培地10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、28℃にて15時間、好気的に振盪培養を行った。  上記条件で生育したコリネバクテリウム グルタミカムΔpoxF/フェノール生産遺伝子導入株を、カナマイシン50μg/mlを含有したA液体培地500mlの入った容量2Lの三角フラスコに植菌し、28℃にて15時間、好気的に振盪培養を行った。【０１３６】  このようにして培養増殖されたそれぞれの菌体は、遠心分離 (4℃、5,000×g, 15分)により菌体を回収した。得られた菌体を、終菌体濃度10％となるようにBT(-尿素)液体培地〔0.7% 硫酸アンモニウム、0.05% リン酸二水素カリウム、0.05% リン酸水素二カリウム、0.05% 硫酸マグネシウム・7水和物、0.0006% 硫酸鉄・7水和物、0.00042% 硫酸マンガン水和物、0.00002% ビオチン、0.00002% チアミン塩酸塩〕に50ml懸濁した。この菌体懸濁液を容量100mlメディウム瓶に入れ、還元条件下（酸化還元電位；-450 mV）、基質としてソディウム 4-ヒドロキシベンゾエートを250 mMとなるように添加し、33℃に保った水浴中で攪拌しながら反応させた。この時、反応液のpHが7.0を下回らないように2.5Nのアンモニア水を用いてpHコントローラー (エイブル株式会社製、型式：DT-1023）でコントロールしながら反応した。  サンプリングした反応液を遠心分離 (4℃、15,000×g、10分) し、得られた上清液を用いてフェノールの定量を行った。  この結果、コリネバクテリウム グルタミカムPHE21株は、還元条件下における反応において、1時間後に65 mM（6 g/L）、4時間後に180 mM (17 g/L)のフェノールを生成していた（表４）。同条件下におけるコリネバクテリウム グルタミカムPHE21-2〜PHE21-12株の結果も表４に併せて示した。【０１３７】
【表４】
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＊)  表内の表示の略語は以下の通り＜遺伝子起源略語＞BS ；  バチラス サブチリスBAE；  バチラス アトロファエウスBSS；  バチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイCKO；  シトロバクター コセリEAE；  エンテロバクター アエロゲネスECL；  エンテロバクター クロアカエEHO；  エンテロバクター ホルメシェイESA；  エンテロバクター サカザキECK；  エシェリヒア コリ WEFE；  エシェリヒア フェルグソニーPPY；  パエニバチラス ポリミキサPAM；  パントエア アナナティス
【０１３８】  次に、実施例１において作製したコリネバクテリウム グルタミカムΔpoxFΔpobA/フェノール生産遺伝子導入株（表２参照）を、カナマイシン50μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO  2g、(NH4)2SO4  7g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁] に塗布し、28℃、20時間暗所に静置した。  上記のプレートで生育したコリネバクテリウム グルタミカムΔpoxFΔpobA/フェノール生産遺伝子導入株を、カナマイシン50μg/mlを含有したA液体培地10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、28℃にて15時間、好気的に振盪培養を行った。  上記条件で生育したコリネバクテリウム グルタミカムΔpoxFΔpobA/フェノール生産遺伝子導入株を、カナマイシン50μg/mlを含有したA液体培地500mlの入った容量2Lの三角フラスコに植菌し、28℃にて15時間、好気的に振盪培養を行った。【０１３９】  このようにして培養増殖されたそれぞれの菌体は、遠心分離 (4℃、5,000×g, 15分)により菌体を回収した。得られた菌体を、終菌体濃度10％となるようにBT(-尿素)液体培地〔0.7% 硫酸アンモニウム、0.05% リン酸二水素カリウム、0.05% リン酸水素二カリウム、0.05% 硫酸マグネシウム・7水和物、0.0006% 硫酸鉄・7水和物、0.00042% 硫酸マンガン水和物、0.00002% ビオチン、0.00002% チアミン塩酸塩〕に50ml懸濁した。この菌体懸濁液を容量100mlメディウム瓶に入れ、還元条件下（酸化還元電位；-450 mV）、基質としてソディウム 4-ヒドロキシベンゾエートを250 mMとなるように添加し、33℃に保った水浴中で攪拌しながら反応させた。この時、反応液のpHが7.0を下回らないように2.5Nのアンモニア水を用いてpHコントローラー (エイブル株式会社製、型式：DT-1023）でコントロールしながら反応した。  サンプリングした反応液を遠心分離 (4℃、15,000×g、10分) し、得られた上清液を用いてフェノールの定量を行った。  この結果、コリネバクテリウム グルタミカムPHE22-1〜PHE22-12株は、還元条件下における反応において、1時間後に表５に示すようにフェノールを生成していた。  この結果より、poxA遺伝子を破壊することによりフェノール生産性の向上が観察された。【０１４０】
【表５】
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＊)  表内の表示の略語は以下の通り＜遺伝子起源略語＞BS ；  バチラス サブチリスBAE；  バチラス アトロファエウスBSS；  バチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイCKO；  シトロバクター コセリEAE；  エンテロバクター アエロゲネスECL；  エンテロバクター クロアカエEHO；  エンテロバクター ホルメシェイESA；  エンテロバクター サカザキECK；  エシェリヒア コリ WEFE；  エシェリヒア フェルグソニーPPY；  パエニバチラス ポリミキサPAM；  パントエア アナナティス
【０１４１】  さらに、比較例として、実施例１において作製したコリネバクテリウム グルタミカムR株/フェノール生産遺伝子導入株（表３参照）を、カナマイシン50μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO  2g、(NH4)2SO4  7g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁] に塗布し、28℃、20時間暗所に静置した。  上記のプレートで生育したコリネバクテリウム グルタミカムR株/フェノール生産遺伝子導入株を、カナマイシン50μg/mlを含有したA液体培地10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、28℃にて15時間、好気的に振盪培養を行った。  上記条件で生育したコリネバクテリウム グルタミカムR株/フェノール生産遺伝子導入株を、カナマイシン50μg/mlを含有したA液体培地500mlの入った容量2Lの三角フラスコに植菌し、28℃にて15時間、好気的に振盪培養を行った。【０１４２】  このようにして培養増殖されたそれぞれの菌体は、遠心分離 (4℃、5,000×g, 15分)により菌体を回収した。得られた菌体を、終菌体濃度10％となるようにBT(-尿素)液体培地〔0.7% 硫酸アンモニウム、0.05% リン酸二水素カリウム、0.05% リン酸水素二カリウム、0.05% 硫酸マグネシウム・7水和物、0.0006% 硫酸鉄・7水和物、0.00042% 硫酸マンガン水和物、0.00002% ビオチン、0.00002% チアミン塩酸塩〕に50ml懸濁した。この菌体懸濁液を容量100mlメディウム瓶に入れ、還元条件下（酸化還元電位；-450 mV）、基質としてソディウム 4-ヒドロキシベンゾエートを250 mMとなるように添加し、33℃に保った水浴中で攪拌しながら反応させた。この時、反応液のpHが7.0を下回らないように2.5Nのアンモニア水を用いてpHコントローラー (エイブル株式会社製、型式：DT-1023）でコントロールしながら反応した。  サンプリングした反応液を遠心分離 (4℃、15,000×g、10分) し、得られた上清液を用いてフェノールの定量を行った。  この結果、コリネバクテリウム グルタミカムPHE23-1〜PHE23-12株は、還元条件下における反応において、1時間後に表６に示すようにフェノールを生成していた。  この結果より、コリネバクテリウム グルタミカムR株（野生株）よりも、ΔpoxF株（表４）、さらにはΔpoxFΔpobA株（表５）にフェノール生産遺伝子を導入株した方が、フェノール生産性が高いことより、poxF遺伝子の破壊及びpobA遺伝子の破壊によりフェノール生産性に正の効果があることが明らかとなった。【０１４３】
【表６】
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＊)  表内の表示の略語は以下の通り＜遺伝子起源略語＞BS ；  バチラス サブチリスBAE；  バチラス アトロファエウスBSS；  バチラス サブチリス 亜種 スピジゼニイCKO；  シトロバクター コセリEAE；  エンテロバクター アエロゲネスECL；  エンテロバクター クロアカエEHO；  エンテロバクター ホルメシェイESA；  エンテロバクター サカザキECK；  エシェリヒア コリ WEFE；  エシェリヒア フェルグソニーPPY；  パエニバチラス ポリミキサPAM；  パントエア アナナティス
【０１４４】実施例３  フェノール生産用宿主としての適性試験フェノールによる好気増殖への影響  コリネバクテリウム グルタミカム、エシェリヒア コリおよびシュードモナス プチダについて、好気培養におけるフェノールの生育阻害試験を行った。尚、本試験に用いたシュードモナス プチダS12は、溶媒耐性菌として報告されており、これまでに唯一フェノール生産の宿主として用いられた技術が開示されている。  コリネバクテリウム グルタミカムRをA寒天培地[(NH2)2CO  2g、(NH4)2SO4  7g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁]に塗布し、33℃、15時間暗所に静置した。  上記のプレートで生育したコリネバクテリウム グルタミカムRを、A液体培地[(NH2)2CO  2g、(NH4)2SO4  7g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 g、glucose 40 gを蒸留水1Lに溶解] 10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて13時間、好気的に振盪培養を行った。  上記条件で生育したコリネバクテリウム グルタミカムRを、A液体培地100mlに初期菌体濃度OD610=0.05となるように植菌し、同時にフェノールが終濃度0、0.16、0.2、0.24、0.32mMとなるように添加し、33℃にて好気的に振盪培養を行った。菌体の生育はOD610の吸光度を測定することにより行った。【０１４５】  エシェリヒア コリJM109をLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布し、37℃、15時間暗所に静置した。  上記プレートで生育したエシェリヒア コリJM109を、LB液体培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキスおよび0.5% 塩化ナトリウム〕10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、37℃にて13時間、好気的に振盪培養を行った。  上記条件で生育したエシェリヒア コリJM109をLB液体培地100mlに初期菌体濃度OD610=0.05となるように植菌し、同時にフェノール濃度が終濃度0、0.16、0.20mMとなるように添加し、37℃にて好気的に振盪培養を行った。菌体の生育はOD610の吸光度を測定することにより行った。【０１４６】  シュードモナス プチダF1およびS12をLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布し、30℃、15時間暗所に静置した。  上記プレートで生育したシュードモナス プチダF1およびS12を、LB（+グルコース）液体培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウムおよび0.4%グルコース〕10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、30℃にて13時間、好気的に振盪培養を行った。  上記条件で生育したシュードモナス プチダF1およびS12株をLB（+グルコース）液体培地100mlに初期菌体濃度OD610=0.05となるように植菌し、同時にフェノール濃度が終濃度0、0.10、0.20mMとなるように添加し、30℃にて好気的に振盪培養を行った。菌体の生育はOD610の吸光度を測定することにより行った。培地中へのフェノール添加による好気増殖への影響の解析結果を図２に示す。【０１４７】  エシェリヒア コリは、0.16%フェノール存在下で著しく増殖阻害を受け、0.20％フェノールでは完全に増殖が阻害された。  シュードモナス プチダF1及び溶剤耐性菌として報告されていたシュードモナス プチダS12は、ほぼ同じ傾向を示し、0.10%フェノール存在下で著しく増殖阻害を受け0.20％フェノールでは完全に増殖が阻害された。  これに対して、コリネバクテリウム グルタミカムは、エシェリヒア コリが顕著な増殖阻害を受けた0.16%のフェノール存在下においても増殖への影響はほとんどなく、エシェリヒア コリやシュードモナス プチダでは完全に増殖を阻害された0.20%のフェノール存在下においても良好な生育を示した。さらに0.24%のフェノール存在下において増殖が可能であった。  このように、コリネバクテリウム グルタミカムはエシェリヒア コリおよびシュードモナス プチダと比較して、フェノールに対し高い耐性を有し、フェノール生産の宿主として高い適性を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】  本発明方法によれば、微生物を用いて実用的な効率で4-ヒドロキシベンゾエートからフェノールを製造することができる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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