(57)【要約】  本発明の課題は、遺伝子工学的手法を用いずにＷｎｔシグナルに対する活性化と阻害の制御を容易にかつ素早く行うことで、胚の発生や分化を制御する方法を提供することである。その解決手段としての本発明は、Ｗｎｔシグナルに対して活性化作用を有する低分子有機化合物と阻害作用を有する低分子有機化合物を用い、生体外において、受精卵に対する一方の作用と他方の作用を組み合わせて胚の発生および／または分化を制御する方法である。Ｗｎｔシグナルに対して阻害作用を有する低分子有機化合物として代表的な化合物は、２−ヒドロキシ−３，６−ジメチル−４−（３−フェニルプロピオロイルオキシ）安息香酸メチルである。
2012117968.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｗｎｔシグナルに対して活性化作用を有する分子量が１０００以下の有機化合物と阻害作用を有する分子量が１０００以下の有機化合物を用い、生体外において、受精卵に対する一方の作用と他方の作用を組み合わせて胚の発生および／または分化を制御する方法。
【請求項２】
Ｗｎｔシグナルに対して活性化作用を有する分子量が１０００以下の有機化合物が６−ブロモインジルビン−３’−オキシムである請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｗｎｔシグナルに対して阻害作用を有する分子量が１０００以下の有機化合物が下記の一般式（１）で表される有機化合物またはその薬学的に許容される塩である請求項１または２記載の方法。
【化１】
2012117968.tif 000012
〔式中、Ｒ１〜Ｒ５のうちの１つはカルボキシル基または低級アルコキシカルボニル基を示し、１つは水酸基または低級アルコキシ基を示し、残りの３つは同一または異なって水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子、水酸基、低級アルコキシ基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基のいずれかを示す。Ｘは酸素原子または−ＮＲ６−（Ｒ６は水素原子または低級アルキル基）を示す。Ｐｈは置換されていてもよいフェニル基を示す〕
【請求項４】
下記の一般式（１）で表される有機化合物またはその薬学的に許容される塩。
【化２】
2012117968.tif 000013
〔式中、Ｒ１〜Ｒ５のうちの１つはカルボキシル基または低級アルコキシカルボニル基を示し、１つは水酸基または低級アルコキシ基を示し、残りの３つは同一または異なって水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子、水酸基、低級アルコキシ基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基のいずれかを示す。Ｘは酸素原子または−ＮＲ６−（Ｒ６は水素原子または低級アルキル基）を示す。Ｐｈは置換されていてもよいフェニル基を示す〕
【請求項５】
下記の一般式（１）で表される有機化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分とするＷｎｔシグナル阻害剤。
【化３】
2012117968.tif 000014
〔式中、Ｒ１〜Ｒ５のうちの１つはカルボキシル基または低級アルコキシカルボニル基を示し、１つは水酸基または低級アルコキシ基を示し、残りの３つは同一または異なって水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子、水酸基、低級アルコキシ基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基のいずれかを示す。Ｘは酸素原子または−ＮＲ６−（Ｒ６は水素原子または低級アルキル基）を示す。Ｐｈは置換されていてもよいフェニル基を示す〕
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚の発生や分化を制御する方法に関する。より詳細には、Ｗｎｔシグナルに対して活性化作用を有する低分子有機化合物と阻害作用を有する低分子有機化合物を用いて胚の発生や分化を制御する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｗｎｔは生物種を超えて保存されている分子量が約４万の分泌性糖タンパク質であり、胚の発生や分化に関わる因子であることが知られている。Ｗｎｔが細胞に作用することで活性化される細胞内シグナル伝達機構はＷｎｔシグナル経路と呼ばれ、Ｗｎｔシグナルに対する活性化と阻害の制御は、胚の発生や分化の制御を可能にすることが期待されており、すでに遺伝子工学的手法による方法が提案されている（例えば非特許文献１）。しかしながら、遺伝子工学的手法による方法は、遺伝子の改変に手間がかかることに加え、作用発現までに一定の時間を要するため時々刻々と進む胚の変化に対して所望する段階で素早く制御を行うことができない。また、いったん改変した遺伝子をもとに戻すことは困難であるし、遺伝子の改変によって改変部位の周辺遺伝子の機能異常を引き起こしたり、用いるベクターが細胞に対して悪影響を及ぼしたりするといった恐れを否定できない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ａｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１２４０−１２４５（２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、遺伝子工学的手法を用いずにＷｎｔシグナルに対する活性化と阻害の制御を容易にかつ素早く行うことで、胚の発生や分化を制御する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の点に鑑みてなされた本発明は、請求項１記載の通り、Ｗｎｔシグナルに対して活性化作用を有する分子量が１０００以下の有機化合物と阻害作用を有する分子量が１０００以下の有機化合物を用い、生体外において、受精卵に対する一方の作用と他方の作用を組み合わせて胚の発生および／または分化を制御する方法である。
また、請求項２記載の方法は、請求項１記載の方法において、Ｗｎｔシグナルに対して活性化作用を有する分子量が１０００以下の有機化合物が６−ブロモインジルビン−３’−オキシムである。
また、請求項３記載の方法は、請求項１または２記載の方法において、Ｗｎｔシグナルに対して阻害作用を有する分子量が１０００以下の有機化合物が下記の一般式（１）で表される有機化合物またはその薬学的に許容される塩である。
【化１】
2012117968.tif 000003
〔式中、Ｒ１〜Ｒ５のうちの１つはカルボキシル基または低級アルコキシカルボニル基を示し、１つは水酸基または低級アルコキシ基を示し、残りの３つは同一または異なって水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子、水酸基、低級アルコキシ基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基のいずれかを示す。Ｘは酸素原子または−ＮＲ６−（Ｒ６は水素原子または低級アルキル基）を示す。Ｐｈは置換されていてもよいフェニル基を示す〕
また、本発明は、請求項４記載の通り、上記の一般式（１）で表される有機化合物またはその薬学的に許容される塩である。
また、本発明は、請求項５記載の通り、上記の一般式（１）で表される有機化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分とするＷｎｔシグナル阻害剤である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、遺伝子工学的手法を用いずにＷｎｔシグナルに対する活性化と阻害の制御を容易にかつ素早く行うことで、胚の発生や分化を制御する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】実施例１におけるＩＭＵ１００３によるゼブラフィッシュの受精卵を用いた胚の発生・分化の制御実験の結果を示す顕微鏡写真である。
【図２】実施例２におけるＩＭＵ１００３のＷｎｔシグナル阻害作用の評価実験の結果を示す顕微鏡写真である。
【図３】実施例３における参考例３〜参考例５の有機化合物のＷｎｔシグナル阻害作用の評価実験の結果を示す顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、Ｗｎｔシグナルに対して活性化作用を有する分子量が１０００以下の有機化合物と阻害作用を有する分子量が１０００以下の有機化合物を用い、生体外において、受精卵に対する一方の作用と他方の作用を組み合わせて胚の発生および／または分化を制御する方法である。本発明においては、遺伝子工学的手法を用いずにＷｎｔシグナルに対する活性化剤として機能する低分子有機化合物と阻害剤として機能する低分子有機化合物を用いてＷｎｔシグナルに対する活性化と阻害の制御を行うので、遺伝子の改変に伴う困難性や危険性を回避して胚の発生や分化を容易にかつ素早く制御することが可能となる。従って、本発明の方法を利用すれば、例えば再生医療への応用といった展開を図ることができる他、胚の発生や分化を制御する薬剤の効率的な探索を行うといったことができる。
【０００９】
Ｗｎｔシグナルに対して活性化作用を有する分子量が１０００以下の有機化合物としては、例えばＷｎｔシグナル経路の１つであるβ−カテニンを介して遺伝子発現を制御するβ−カテニン経路のシグナルに対して活性化作用を有するグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤として知られている６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（分子量：３５６．１７、例えばＭｅｉｊｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０：１２５５−１２６６（２００３））が挙げられるが、これに限定されるものではなく、その他のＧＳＫ３阻害剤として知られている有機化合物などであってもよい。
【００１０】
Ｗｎｔシグナルに対して阻害作用を有する分子量が１０００以下の有機化合物としては、例えば本発明者らによって見出された下記の一般式（１）で表される有機化合物またはその薬学的に許容される塩が挙げられる。
【化２】
2012117968.tif 000004
〔式中、Ｒ１〜Ｒ５のうちの１つはカルボキシル基または低級アルコキシカルボニル基を示し、１つは水酸基または低級アルコキシ基を示し、残りの３つは同一または異なって水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子、水酸基、低級アルコキシ基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基のいずれかを示す。Ｘは酸素原子または−ＮＲ６−（Ｒ６は水素原子または低級アルキル基）を示す。Ｐｈは置換されていてもよいフェニル基を示す〕
【００１１】
ここで、低級アルキル基とは、炭素数が１〜６の直鎖または分岐鎖のアルキル基を意味し、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などが挙げられる。低級アルコキシ基とは、炭素数が１〜６の直鎖または分岐鎖のアルコキシ基を意味し、具体的には、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基などが挙げられる。低級アルコキシカルボニル基とは、その低級アルコキシ部が上記と同義のアルコキシカルボニル基を意味し、具体的には、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基などが挙げられる。ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられる。低級アルキルアミノ基とは、その低級アルキル部が上記と同義のアルキルアミノ基を意味し、具体的には、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基などが挙げられる。ジ低級アルキルアミノ基とは、その低級アルキル部が上記と同義のジアルキルアミノ基を意味し、具体的には、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基などが挙げられる。置換されていてもよいフェニル基が有していてもよい置換基としては、低級アルキル基、水酸基、低級アルコキシ基、ニトロ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、トリフルオロメチル基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基などが挙げられる。低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子、低級アルコキシカルボニル基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基は上記と同義である。
【００１２】
上記の一般式（１）で表される有機化合物の中で代表的な化合物としては、下記の化学式を有する２−ヒドロキシ−３，６−ジメチル−４−（３−フェニルプロピオロイルオキシ）安息香酸メチル（分子量：３２４．３３）が挙げられる。
【化３】
2012117968.tif 000005
【００１３】
上記の一般式（１）で表される有機化合物は、例えば、下記の化学反応式に従って、フェニル基が置換されていてもよいフェニルプロピン酸と、フェノール誘導体またはアニリン誘導体から脱水縮合を行うことで合成することができる。
【化４】
2012117968.tif 000006
〔式中、Ｒ１〜Ｒ５、Ｘ、Ｐｈは上記と同義である〕
【００１４】
上記の一般式（１）で表される有機化合物が塩の形態をとり得る場合、その薬学的に許容される塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウムなどとの無機塩、炭素数が１〜６の直鎖または分岐鎖の低級アルキルアミンや低級アルコールアミンなどとの有機塩、リジン、アルギニン、オルニチンなどとの塩基性アミノ酸塩の他、アンモニウム塩などが挙げられる。
【００１５】
Ｗｎｔシグナルに対する活性化剤として機能する低分子有機化合物と阻害剤として機能する低分子有機化合物を生体外において受精卵に作用させる方法としては、飼育水や所定の培地を用いて飼育した受精卵に、時間を前後して２種類の低分子有機化合物を所定の濃度（例えば１ｐＭ〜１Ｍ）で添加する方法が挙げられる。例えば、受精後、所定の時間が経過した受精卵にＷｎｔシグナルに対する阻害剤として機能する低分子有機化合物を添加することでその時点ではＷｎｔシグナルに対して阻害作用を与えた後、今度はＷｎｔシグナルに対する活性化剤として機能する低分子有機化合物を添加することでその時点ではＷｎｔシグナルに対して活性化作用を与えるといった操作を行うことで、受精卵の任意の胚の発生や分化の段階においてＷｎｔシグナルに対する活性化と阻害を容易にかつ素早く行うことができるので、胚の発生や分化を自由に制御することが可能となる。
【００１６】
なお、Ｗｎｔシグナルの異常な活性化は、大腸癌などの病態に関与することが知られている（例えばＫｏｒｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：１７８４−１７８７（１９９７）やＭｏｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：１７８７−１７９０（１９９７））。従って、上記の一般式（１）で表される有機化合物またはその薬学的に許容される塩は、癌の予防や治療に用いることもできる。この場合、ヒトを含む哺乳動物への投与は、自体公知の製剤化を行って錠剤や注射剤などの形態で経口的や非経口的に行えばよい。
【実施例】
【００１７】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は、以下の記載に何ら限定して解釈されるものではない。【００１８】
実施例１：ＩＭＵ１００３によるゼブラフィッシュの受精卵を用いた胚の発生・分化の制御実験
（実験方法）
（１）実験当日、ゼブラフィッシュ受精卵（野生型）を準備し、使用まで飼育水（脱塩素水）中で２８℃で飼育した。
（２）受精後５．５時間（５０％−ｅｐｉｂｏｌｙ）の受精卵をＥｍｂｒｙｏ  Ｍｅｄｉｕｍ（１３．７ｍＭのＮａＣｌ，０．５ｍＭのＫＣｌ，２５μＭのＮａ２ＨＰＯ４，４４μＭのＫＨ２ＰＯ４，１．３ｍＭのＣａＣｌ２，１ｍＭのＭｇＳＯ４，４．２ｍＭのＮａＨＣＯ３，ｐＨ７．２）で数回洗浄した。
（３）１ウェルあたり受精卵が５個となるように、丸底９６ウェルプレートにＥｍｂｒｙｏ  Ｍｅｄｉｕｍに懸濁した受精卵を入れた。
（４）２−ヒドロキシ−３，６−ジメチル−４−（３−フェニルプロピオロイルオキシ）安息香酸メチル（以下、ＩＭＵ１００３）をＥｍｂｒｙｏ  Ｍｅｄｉｕｍに溶解し、４００μＭの溶液を５０μＬ準備した。
（５）（３）の各ウェル中のＥｍｂｒｙｏ  Ｍｅｄｉｕｍを除去し、（４）のＩＭＵ１００３溶液４５μＬと置換した。
（６）３０分間、２８℃で飼育した。
（７）受精後６時間（ｓｈｉｅｌｄ  ｓｔａｇｅ）の受精卵に４μＭの６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（以下、ＢＩＯ）のＥｍｂｒｙｏ  Ｍｅｄｉｕｍ溶液４５μＬを添加した（ＩＭＵ１００３の終濃度：２００μＭ、ＢＩＯの終濃度：２μＭ）。
（８）２８℃で一夜飼育した。
（９）受精後３０時間に実体顕微鏡下で観察し、Ｗｎｔシグナルの活性化による後方化（体軸の前後軸の尾の方向の性質が強くなり、頭の方向の性質が弱くなること）を指標に活性評価を行った。【００１９】
（実験結果）
図１に示す（２μＭ  ＢＩＯ＋２００μＭ  ＩＭＵ１００３）。また、図１には、実験方法の（５）における（４）のＩＭＵ１００３溶液のかわりにＥｍｂｒｙｏ  Ｍｅｄｉｕｍを用いた場合の結果（２μＭ  ＢＩＯ）と、（５）における（４）のＩＭＵ１００３溶液と（７）におけるＢＩＯ溶液のかわりにＥｍｂｒｙｏ  Ｍｅｄｉｕｍを用いた場合の結果（Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔｅｄ）をあわせて示す（いずれも倍率は２０倍）。図１から明らかなように、ＢＩＯの添加によってＷｎｔシグナルの活性化に起因する後方化により顕著な尾部の形成と眼の形成不全が観察されたが（２μＭ  ＢＩＯ）、ＩＭＵ１００３を添加してからＢＩＯを添加することで、Ｗｎｔシグナルの阻害に起因する前方化（体軸の前後軸の頭の方向の性質が強くなり、尾の方向の性質が弱くなること）が優位となり、際立った後方化が消失して眼の形成が観察された（２μＭ  ＢＩＯ＋２００μＭ  ＩＭＵ１００３）。以上の結果から、ＢＩＯのＷｎｔシグナル活性化作用が確認されるとともに、ＩＭＵ１００３のＷｎｔシグナル阻害作用が確認され、両者を組み合わせて用いることで胚の発生・分化を素早く制御できることがわかった。なお、ＢＩＯとＩＭＵ１００３は、Ｗｎｔシグナルに対する作用に起因する表現型変化以外には特別な表現型変化を引き起こすことはなく、また、毒性による受精卵の傷害を招くこともなかった。【００２０】
実施例２：ＩＭＵ１００３のＷｎｔシグナル阻害作用の評価実験
実施例１の実験方法の（５）において各種濃度のＩＭＵ１００３溶液を準備し、実施例１と同様の実験を行なった。結果を図２に示す（倍率は２０倍）。図２から明らかなように、２μＭのＢＩＯと１０μＭのＩＭＵ１００３の組み合わせではＷｎｔシグナルの活性化が優位であって後方化が観察されたが、２μＭのＢＩＯと２０μＭのＩＭＵ１００３の組み合わせではＢＩＯもＩＭＵ１００３も添加しない未処理の場合とほぼ同じ表現型となり、２μＭのＢＩＯと４０μＭのＩＭＵ１００３の組み合わせではＷｎｔシグナルの阻害が優位であって前方化が観察された。以上の結果から、ＩＭＵ１００３は濃度依存的にＷｎｔシグナルを阻害することが明らかとなった。【００２１】
参考例１：２−ヒドロキシ−３，６−ジメチル−４−（３−フェニルプロピオロイルオキシ）安息香酸メチル（ＩＭＵ１００３）の合成方法
アルゴン雰囲気下、無水トルエンを入れたフラスコに、フェニルプロピン酸（０．７７０ｇ，５．２７ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸無水物（０．７３３ｍＬ，５．２７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合液に、２，４−ジヒドロキシ−３，６−ジメチル安息香酸メチル（０．９０８ｇ，４．６３ｍｍｏｌ）を加えた後、室温で５時間撹拌した。得られた反応混合液からトルエンを減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけて精製し、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルにて再結晶を行い、無色結晶（ｍｐ：１０９．５〜１１０．０℃）として下記の化学式を有する目的物（分子量：３２４．３３）を得た（収率：７８％）。
【化５】
2012117968.tif 000007
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１１．９０（１Ｈ，ｓ），７．６５（２Ｈ，ｄ），７．５１（１Ｈ，ｔ），７．４１（３Ｈ，ｔ），６．５４（１Ｈ，ｓ），３．９７（３Ｈ，ｓ），２．５２（３Ｈ，ｓ），２．１３（３Ｈ，ｓ）
ＩＲ（ＣＨＣｌ３）ｃｍ−１：３０２０，２４００，１７２５，１５２０【００２２】
参考例２：２−ヒドロキシ−３，６−ジメチル−４−（３−（４−クロロフェニル）プロピオロイルオキシ）安息香酸メチルの合成方法
アルゴン雰囲気下、無水トルエンを入れたフラスコに、４−クロロフェニルプロピン酸（０．２００ｇ，１．１１ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸無水物（０．１５６ｍＬ，１．１２ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合液に、２，４−ジヒドロキシ−３，６−ジメチル安息香酸メチル（０．１９０ｇ，０．９７１ｍｍｏｌ）を加えた後、室温で１２時間撹拌した。得られた反応混合液からトルエンを減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけて精製し、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルにて再結晶を行い、無色結晶（ｍｐ：１３０．５〜１３１．５℃）として下記の化学式を有する目的物（分子量：３５８．７７）を得た（収率：５４％）。
【化６】
2012117968.tif 000008
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１１．９０（１Ｈ，ｓ），７．５８（２Ｈ，ｄ），７．４２（２Ｈ，ｄ），６．５３（１Ｈ，ｓ），３．９７（３Ｈ，ｓ），２．５２（３Ｈ，ｓ），２．１１（３Ｈ，ｓ）
ＩＲ（ＣＨＣｌ３）ｃｍ−１：３０２５，２３９５，１７２５，１５２０【００２３】
参考例３：２−ヒドロキシ−３，６−ジメチル−４−（３−（４−メチルフェニル）プロピオロイルオキシ）安息香酸メチルの合成方法
アルゴン雰囲気下、無水トルエンを入れたフラスコに、４−メチルフェニルプロピン酸（０．３６２ｇ，１．８５ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸無水物（０．３１５ｍＬ，１．８６ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合液に、２，４−ジヒドロキシ−３，６−ジメチル安息香酸メチル（０．３１８ｇ，１．６２ｍｍｏｌ）を加えた後、室温で１２時間撹拌した。得られた反応混合液からトルエンを減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけて精製し、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルにて再結晶を行い、無色結晶（ｍｐ：１１６．０〜１１８．５℃）として下記の化学式を有する目的物（分子量：３３８．３５）を得た（収率：６６％）。
【化７】
2012117968.tif 000009
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１１．９０（１Ｈ，ｓ），７．５４（２Ｈ，ｄ），７．２１（２Ｈ，ｄ），６．５３（１Ｈ，ｓ），３．９７（３Ｈ，ｓ），２．５２（３Ｈ，ｓ），２．４１（３Ｈ，ｓ），２．１１（３Ｈ，ｓ）
ＩＲ（ＣＨＣｌ３）ｃｍ−１：３０２０，２４０５，１７２０，１５２０【００２４】
参考例４：２−ヒドロキシ−３，６−ジメチル−４−（３−（４−メトキシフェニル）プロピオロイルオキシ）安息香酸メチルの合成方法
アルゴン雰囲気下、無水トルエンを入れたフラスコに、４−メトキシフェニルプロピン酸（０．２００ｇ，１．１４ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸無水物（０．１５９ｍＬ，１．１５ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合液に、２，４−ジヒドロキシ−３，６−ジメチル安息香酸メチル（０．１９５ｇ，１．００ｍｍｏｌ）を加えた後、室温で１２時間撹拌した。得られた反応混合液からトルエンを減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけて精製し、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルにて再結晶を行い、無色結晶（ｍｐ：１３５．０〜１３６．０℃）として下記の化学式を有する目的物（分子量：３５４．３５）を得た（収率：５８％）。
【化８】
2012117968.tif 000010
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１１．９０（１Ｈ，ｓ），７．６０（２Ｈ，ｄ），６．９２（２Ｈ，ｄ），６．５３（１Ｈ，ｓ），３．９６（３Ｈ，ｓ），３．８６（３Ｈ，ｓ），２．５２（３Ｈ，ｓ），２．１１（３Ｈ，ｓ）
ＩＲ（ＣＨＣｌ３）ｃｍ−１：３０２５，２４００，１７２５，１５１５【００２５】
参考例５：２−ヒドロキシ−４−（３−フェニルプロピオロイルオキシ）安息香酸メチルの合成方法
アルゴン雰囲気下、無水トルエンを入れたフラスコに、４−フェニルプロピン酸（０．４５６ｇ，３．１２ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸無水物（０．４３１ｍＬ，３．０９ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合液に、２，４−ジヒドロキシ−安息香酸メチル（０．４５４ｇ，３．０９ｍｍｏｌ）を加えた後、室温で１２時間撹拌した。得られた反応混合液からトルエンを減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけて精製し、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルにて再結晶を行い、無色結晶（ｍｐ：１１０．０〜１１２．０℃）として下記の化学式を有する目的物（分子量：２９６．２７）を得た（収率：５８％）。
【化９】
2012117968.tif 000011
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１０．９０（１Ｈ，ｓ），７．８９（１Ｈ，ｄ），７．６４（２Ｈ，ｄ），７．５１（１Ｈ，ｔ），７．４２（２Ｈ，ｔ），６．８６（１Ｈ，ｄ），６．７６（１Ｈ，ｄｄ），３．９７（３Ｈ，ｓ） 
ＩＲ（ＣＨＣｌ３）ｃｍ−１：３０２０，２４００，１７１５，１５２０【００２６】
実施例３：参考例２〜参考例５の有機化合物のＷｎｔシグナル阻害作用の評価実験
参考例２〜参考例５の有機化合物のそれぞれについて実施例１と同様の実験を行なった結果、これらの有機化合物はＩＭＵ１００３と同様の現象（Ｗｎｔシグナルの阻害に起因する前方化）を引き起こしたことから、そのＷｎｔシグナル阻害作用を確認することができた。参考例３〜参考例５の有機化合物の評価実験の結果を図１に示す（ＤＭＳＯはコントロールとして使用）。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明は、遺伝子工学的手法を用いずにＷｎｔシグナルに対する活性化と阻害の制御を容易にかつ素早く行うことで、胚の発生や分化を制御する方法を提供することを提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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