(57)【要約】【課題】本発明は、改善されたタンパク質結晶形成促進特性と操作性とを有するタンパク質結晶化条件探索剤及びタンパク質結晶化条件探索方法を提供することを目的とする。【解決手段】フッ素原子と水酸基とを有する水膨潤性層状ケイ酸塩を含み、前記フッ素原子は水酸基との同形置換により前記ケイ酸塩に共有結合している、タンパク質結晶化条件探索剤。タンパク質結晶化条件探索剤とタンパク質が溶解している溶液とを混合する工程を含む、結晶化条件探索方法。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フッ素原子と水酸基とを有する水膨潤性層状ケイ酸塩を含み、前記フッ素原子は水酸基との同形置換により前記ケイ酸塩に共有結合していることを特徴とする、タンパク質結晶化条件探索剤。
【請求項２】
前記フッ素原子と水酸基とのモル比率がそれぞれ３％〜１５％、８５％〜９７％である、請求項１に記載のタンパク質結晶化条件探索剤。
【請求項３】
前記フッ素原子と水酸基とのモル比率がそれぞれ４％〜１２％、８８％〜９６％である、請求項２に記載のタンパク質結晶化条件探索剤。
【請求項４】
前記ケイ酸塩がスメクタイトである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質結晶化条件探索剤。
【請求項５】
前記ケイ酸塩がサポナイトである、請求項４に記載のタンパク質結晶化条件探索剤。
【請求項６】
分散液剤である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質結晶化条件探索剤。
【請求項７】
固形剤である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質結晶化条件探索剤。
【請求項８】
前記固形剤が支持体上に塗布した薄膜である、請求項７に記載のタンパク質結晶化条件探索剤。
【請求項９】
前記支持体がカバーガラス、スライドガラス、プレート、ブリッジ又はロッドである請求項８に記載のタンパク質結晶化条件探索剤。
【請求項１０】
ナノグラム単位からマイクログラム単位までの量のタンパク質の結晶化条件を探索するための結晶化条件探索剤である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質結晶化条件探索剤。
【請求項１１】
遺伝子組換え技術により合成した発現タンパク質の結晶化条件を探索するための結晶化条件探索剤である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質結晶化条件探索剤。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質結晶化条件探索剤とタンパク質が溶解している溶液とを混合する工程を含む、タンパク質結晶化条件探索方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質結晶化条件探索剤とタンパク質が溶解している溶液とを混合し、結晶化タンパク質を回収する請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質結晶化条件探索剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質結晶化条件探索剤及びこれを用いたタンパク質結晶化条件探索方法に関する。より詳しくは、改善されたタンパク質結晶形成促進特性と操作性とを有するタンパク質結晶化条件探索剤及びこれを用いたタンパク質結晶化条件探索方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
構造生物学分野における技術革新は、タンパク質の構造と機能との関係の理解を深め、タンパク質の構造に基づく創薬の発展をもたらしている。タンパク質のＸ線結晶構造解析において、タンパク質の結晶化は必須の工程である。結晶化は、過飽和溶液中において結晶核が形成する過程と、結晶核が結晶へ成長する過程とを経る。【０００３】
構造解析における障害は、結晶化工程にある。結晶化条件が未知のタンパク質において結晶化を行う際、まず結晶化条件の探索が必須となる。タンパク質結晶化条件の探索は、第１次スクリーニングと第２次スクリーニングとから成る。第１次スクリーニングは、対象となるタンパク質の結晶化条件の広範囲な探索によってそのタンパク質の結晶化開始条件を決定することを目的とする物理条件及び化学条件の探索工程である。例えばこの工程にて結晶化に効果的なタンパク質濃度、沈殿剤の種類や濃度、緩衝液の種類やｐＨ等を見極め、結晶化の開始が可能な条件を見出す。一方、第２次スクリーニングは、第１次スクリーニングを通じて選定された結晶化開始条件の改変によって対象となるタンパク質の最終結晶化条件を決定することを目的とする物理条件及び化学条件の精緻な探索工程である。第２次スクリーニングにおける結晶化開始条件の改変は、該結晶化開始条件を構成する物理条件及び化学条件の部分的な変更か、該結晶化開始条件に含まれていなかった新たな物理条件及び化学条件の選択的な付加により行われる。例えば沈殿剤の濃度、緩衝液のｐＨ等の条件を刻む、あるいは第１次スクリーニングで用いなかった添加剤や界面活性剤を用いる、さらにはその種類や濃度等の条件を刻み、最終的に最適な結晶化条件、具体的にはできるだけ大きく高品質な単結晶を得るための条件を見出す。いずれのスクリーニングも、対象となるタンパク質に応じて無数の物理条件及び化学条件の組み合わせの試行錯誤的な条件検討を必要とする。例えば沈殿剤の種類、溶液のｐＨ、タンパク質溶液の濃度、温度といった多次元的な条件検討を経る。結晶化条件を決定し、得られた結晶は、Ｘ線照射により構造解析を行う。Ｘ線の照射の前に、結晶はクライオプロテクタントを含む不凍液に浸漬されることがある。また、浸漬工程を省略することを望む場合、第１次又は第２次スクリーニングにおいてクライオプロテクタントを含む沈殿剤溶液を用いてタンパク質の結晶化を試みる。いずれにしても、各スクリーニングは、所望の結晶が得られるまで繰り返される。【０００４】
しかし、一般的にタンパク質は結晶核を自発的に形成しにくいため、結晶化しにくい。加えて、新規タンパク質の結晶化条件は全く予想のつかないものであり、結晶化条件が既知のタンパク質に対しても新たな結晶化条件は予想のつかないものである。このような状況にあって、従来の第１次スクリーニングは、結晶のみならず結晶性沈殿物すら生成せず、結晶化開始条件を決定することができないことがあった。タンパク質の結晶化条件は溶媒や温度といった設定条件のわずかな変化で結晶核形成の有無が変化してしまうため、従来の第２次スクリーニングは、第１次スクリーニングにより選定した結晶化開始条件の改変に伴って、結晶が得られなくなることがあった。溶媒や温度といった設定条件の改変によるタンパク質の結晶核形成の制御は困難であるため、従来の第２次スクリーニングは、所望の大きさ及び個数の結晶を生成しない傾向があった。また、従来の第２次スクリーニングは、結晶化開始条件よりも低過飽和の条件であって、結晶核形成は起こらないが結晶成長は起こる潜在性を有する準安定領域と呼ばれる条件において、結晶を生成しなかった。準安定領域においてタンパク質結晶が形成した場合、その結晶は十分に高品質である傾向があることが周知である。クライオプロテクタントはタンパク質の結晶核形成を抑制するため、第１次及び第２次スクリーニングにおけるクライオプロテクタントを含む試薬の使用は、タンパク質を結晶化しない傾向があった。以上のように、従来のスクリーニングシステムは、負荷の多い条件検討にもかかわらず、結局目的の結晶が得られなかったり貴重な試料であるタンパク質を浪費したりする傾向があった。従って、簡便で、経済的であり且つ信頼性が高いタンパク質結晶化条件の探索方法の開発が要求されている。【０００５】
これに応えて、層状ケイ酸塩を用いたタンパク質結晶化の効率化の試みが提案されてきた。特許文献１は、層状ケイ酸塩を用いたタンパク質結晶化条件探索用のスクリーニングチップであって、該ケイ酸塩が支持体上に膜状に塗布されているスクリーニングチップを開示する。しかし、特許文献１の層状ケイ酸塩は、多様なタンパク質の結晶化条件を探索することを前提とするスクリーニングにおいて広範なタンパク質の結晶核形成を十分に促進しないという問題があった。また、均一な薄膜ではないため、容易に脱離する虞がある。しかも、特許文献１の発明は、スクリーニングチップの使用者が層状ケイ酸塩の最適な種類及び塗布量を選定することを必要とする。そのような条件検討は、多量のタンパク質溶液を消費する。また、スクリーニングチップとタンパク質溶液との非接触部分にケイ酸塩が存在するため、タンパク質溶液の広範な浸透が過飽和度の低下及びタンパク質の変性を引き起こす傾向がある。【０００６】
特許文献２及び３は、層状ケイ酸塩を用いたタンパク質結晶形成制御剤及び制御方法を開示する。しかし、特許文献２及び３の層状ケイ酸塩も、特許文献１のものと同様スクリーニングにおけるタンパク質の結晶核形成の促進が十分でない。また、特許文献２及び３の層状ケイ酸塩は、表面負電荷が弱く且つ水膨潤性が低いため、高濃度の沈殿剤を含有するスクリーニング試薬との接触により凝集及び沈降する傾向がある。【０００７】
非特許文献１は、フッ素含有層状ケイ酸塩を含むリゾチーム結晶形成制御剤を開示する。非特許文献１は、リゾチームの結晶化における層状ケイ酸塩の使用を開示するが、多様なタンパク質の結晶化条件を探索することを前提とするスクリーニングにおける層状ケイ酸塩の使用については記載がない。また、非特許文献１の層状ケイ酸塩もスクリーニングにおけるタンパク質の結晶核形成の促進が十分とはいえない。【０００８】
非特許文献２は、フッ素雲母を含むタンパク質結晶形成制御剤を開示する。このフッ素雲母は、タルクを出発原料として水分非存在下において固体反応法により合成される。しかし、非特許文献２のフッ素雲母は、水酸基を有さないため、結晶核形成速度を調整することができず、結晶核形成を促進しない場合が見られ、結晶化条件探索剤としては十分ではない。また、水に対して非膨潤性であるため、高濃度の沈殿剤を含有する試薬との接触により凝集及び沈降する傾向がある。従って、フッ素雲母の分散液の使用には、均一に分散させるための攪拌を要する。【０００９】
非特許文献３は、層状ケイ酸塩を含む鉱物からなるタンパク質結晶形成制御剤を開示する。非特許文献３の鉱物を構成する層状ケイ酸塩は、タンパク質の結晶核形成の促進が十分とはいえない。【００１０】
非特許文献４は、アミノ基を含有する雲母からなるタンパク質結晶形成制御剤を開示する。非特許文献４の雲母は、ハンギングドロップ法においてウェルの密閉に用いるためのシート状物を形成する。このシート状物は、タンパク質の結晶核形成の促進が十分とはいえない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００５−３５０２９４号公報
【特許文献２】特開２００５−３４３８５６号公報
【特許文献３】特開２００５−３４３７６６号公報
【非特許文献１】稲生  渓太、外９名、「含フッ素ケイ酸塩によるリゾチーム結晶核形成の促進」、[online]、第３２回日本分子生物学会年会、講演要旨集、３Ｐ−０８８９、[２００９年１２月９日検索]
【非特許文献２】Takehara  M.  et  al.,  “Use  of  layer  silicate  for  protein  crystallization:  Effects  of  Micromica  and  chlorite  powders  in  hanging  drops”,  Analytical  Biochemistry,  2008,  373,  p.322-329.
【非特許文献３】McPherson  A.  et  al.,  “Heterogeneous  and  epitaxial  nucleation  of  protein  crystals  on  mineral  surfaces”  Science,  1988,  239,  p.385-387.
【非特許文献４】Tang  L.  Et  al.,  “Effects  of  silanized  mica  surface  on  protein  crystallization”  Acta  Crystallographica  Section  D:  Biological  Crystallography,  2005,  61,  p.53-59.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、タンパク質の結晶化条件を探索するに当り、タンパク質結晶形成促進特性と操作性とが改善されたタンパク質結晶化条件探索剤、及びタンパク質結晶化条件探索方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、かかる事情に鑑み鋭意検討した結果、フッ素原子と水酸基とを有する水膨潤性層状ケイ酸塩を含み、前記フッ素原子は水酸基との同形置換によって前記ケイ酸塩に共有結合しているタンパク質結晶化条件探索剤を創出した。より詳しくは、本発明者らは、前記層状ケイ酸塩のフッ素原子と水酸基とのモル比率がタンパク質の結晶形成に関係し、結晶形成速度、及び結晶形成の確率を制御できることを見出した。本発明によれば、従来では十分に結晶化できなかった溶液条件においても結晶化できることを見出した。更に、本発明者らは、フッ素原子を有する水膨潤性層状ケイ酸塩の強い表面負電荷と優れた水膨潤性とが、タンパク質結晶化条件探索剤の操作性の向上に寄与することを見出した。本発明者らはこれらの知見に基づいて更に鋭意検討を重ね、本発明を成すに至った。【００１４】
即ち、本発明は、フッ素原子と水酸基とを有する水膨潤性層状ケイ酸塩を含み、前記フッ素原子は同形置換により前記ケイ酸塩に共有結合している、タンパク質結晶化条件探索剤を提供する。
また、本発明は、上記のタンパク質結晶化条件探索剤とタンパク質が溶解している溶液とを混合する工程を含む、タンパク質結晶化条件探索方法を提供する。
また、本発明は、前記タンパク質結晶化条件探索剤とタンパク質が溶解している溶液とを混合し、結晶化タンパク質を回収するタンパク質結晶化条件探索剤の使用を提供する。
本発明においてタンパク質の結晶化条件の探索とは、対象となるタンパク質の結晶化条件を探索するために物理条件及び化学条件を設定し、結晶形成の有無、結晶性沈殿物形成の有無、非結晶性沈殿物形成の有無、結晶化成功率、形成した結晶の形成時間、形状、大きさ、結晶核密度（単位面積あたりの結晶の個数）又はＸ線回折データを判断基準として、対象となるタンパク質の結晶化に適する物理条件及び化学条件を決定することをいう。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のタンパク質結晶化条件探索剤によれば、比較的負荷の少ない条件検討により効率的且つ実用的に結晶化条件探索ができる。
また、本発明のタンパク質結晶化条件探索方法によれば、比較的負荷の少ない工程でタンパク質の結晶化に適した条件を効率的且つ実用的に設定できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、調製例１、調製例２及び調製例３のサポナイトのＸ線回折結果を示す図である。図１中、（ａ）は調製例１のサポナイトのＸ線回折パターン、（ｂ）は調製例２のサポナイトのＸ線回折パターン、（ｃ）は調製例３のサポナイトのＸ線回折パターンを示す。
【図２】図２は、調製例１、調製例２及び調製例３のサポナイトの窒素吸着／脱着等温線を示す。図２中、（ａ）は調製例１のサポナイトの等温線、（ｂ）は調製例２のサポナイトの等温線、（ｃ）は調製例３のサポナイトの等温線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書は、本発明の主題を特定して明確に請求する請求項にてまとめられるが、態様に関する以下の説明からより良く理解されるだろう。また、本発明の利点は、タンパク質結晶化のために設計されたあらゆるタンパク質結晶形成制御剤において享受されるが、本発明の添付図面に関連して、タンパク質の結晶化条件を探索するための結晶化条件探索剤の好適な態様として開示される。更に、本発明の他の特徴及び利点は、適宜添付の図面を参照して、態様に関する以下の説明及び特許請求の範囲から明らかである。
【００１８】
本明細書で使用される用語「スクリーニング」とは、対象物の結晶化条件を探索するための物理条件及び化学条件を設定し、結晶形成の有無、結晶性沈殿物形成の有無、非結晶性沈殿物形成の有無、結晶化成功率、形成した結晶の形成時間、形状、大きさ、結晶核密度又はＸ線回折データを判断基準として、対象物の結晶化に適する物理条件及び化学条件を決定する工程を指す。
【００１９】
本明細書で使用される用語「準安定領域」とは、対象物の結晶核形成は起こらないが結晶成長は起こる潜在性を有する過飽和条件の集合を指す。
【００２０】
本明細書で使用される用語「層状ケイ酸塩」とは、二次元的な層構造を有する化合物であって、その層構造が少なくともケイ素原子と電気的に陰性な配位子とから構成される化合物を指す。層状ケイ酸塩は、四面体層及び／若しくは八面体層の単独層、又はこれらの混合層を有してもよい。四面体シートはケイ素イオン（Ｓｉ４＋）またはアルミニウムイオン（Ａｌ３＋）を４つの酸素イオン（Ｏ２−）が囲んだ構造をとり、３つの頂点を隣の四面体と共有しその構造がヘキサゴナルネットワークをとり、シート状に連なっている。八面体シートはマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、またはアルミニウムイオンを６つの酸素イオン（Ｏ２−）、または水酸化物イオン（ＯＨ−）が囲んだ八面体が稜を共有して２次元的に広がったものである。四面体シートと八面体シートと組み合うときは四面体シートの頂点の酸素イオンが共有される。また、水酸化物イオンはフッ素イオン（Ｆ−）により同形置換されることがある。
【００２１】
本明細書で使用される用語「同形置換」とは、結晶構造を有するある化合物を構成するある原子が、化合物の結晶構造を変化させることなく、イオン半径の同一もしくは類似した他の原子に置き換わる反応を指す。
【００２２】
本発明のタンパク質結晶化条件探索剤（以下、単に「結晶化条件探索剤」という。）は、フッ素原子と水酸基とを特定割合で有する水膨潤性層状ケイ酸塩を含む。該フッ素原子は、同形置換により層状ケイ酸塩に共有結合している。層状ケイ酸塩は、タンパク質と接触することによって、結晶核として機能する該タンパク質の凝集体を生成する。層状ケイ酸塩の層構造、フッ素原子及び水酸基は、タンパク質の結晶核形成を促進させることができる。層状ケイ酸塩のフッ素原子及び水膨潤性は、結晶化条件探索剤に均一な分散性及び成膜性を付与する。本発明の結晶化条件探索剤は、ナノグラム単位からマイクログラム単位までの量のタンパク質の結晶化のための結晶化条件の探索に好適である。
【００２３】
前記結晶化条件探索剤は、層状ケイ酸塩のみから構成されてもよく、層状ケイ酸塩と他の成分との混合物から構成されてもよい。他の成分としては、例えば、純水、沈殿剤、緩衝剤、添加剤、有機溶媒及びこれらの混合成分が挙げられる。結晶化条件探索剤は、単一又は複数の層状ケイ酸塩を含んでよい。
【００２４】
本発明の結晶化条件探索剤に用いる層状ケイ酸塩としては特に制限はないが、好ましくはモンモリロナイト、タルク、フロゴパイト、マイカ、カオリン、クロライト、パイロフィライト、バーミキュライト、エンデライト、クリソタイル、バイデライト、ハロイサイト、ノントロナイト、セリサイト、ディッカイト、アンチゴライト、ヘクトライト（フッ素ヘクトライト）、ソーコナイト、カネマイト、マカタイト、オクトシリケート、マガディアイト、ケニアイト、スチブンサイト及びサポナイトが挙げられる。より好ましくはマイカ、モンモリロナイト、スチブンサイト、ヘクトライト及びサポナイトであり、特に好ましくはサポナイトである。
【００２５】
前記層状ケイ酸塩としては、天然品又は合成品が挙げられる。天然品は夾雑物を含んでよいが、核形成の厳密な結晶化制御の観点から、夾雑物は除去されることが好ましい。合成品は、高純度であり且つ合成時に同形置換効率を自在に制御することができる。したがって核形成において厳密な制御を可能とする。
【００２６】
前記層状ケイ酸塩は、任意の平均粒径を有してよい。平均粒径は、均一分散性の観点から、２〜５０μｍであることが好ましい。平均粒径は、水を分散媒としたレーザー式粒度分布測定により決定してよい。
【００２７】
前記層状ケイ酸塩は、任意の陽イオン交換容量を有してよい。陽イオン交換容量は、少なくとも１０ｍｅｑ／１００ｇであることが好ましく、少なくとも６０ｍｅｑ／１００ｇであることが更に好ましい。好適な範囲の陽イオン交換容量は、核形成促進に好適な負電荷を層状ケイ酸塩に付与する。
【００２８】
前記層状ケイ酸塩は、比表面積は、１〜１０００ｍ２／ｇであることが好ましく、１０〜５００ｍ２／ｇであることがより好ましく、１００〜２００ｍ２／ｇであることが更に好ましい。比表面積は、核形成促進に好適な表面電荷密度を層状ケイ酸塩に付与する。
【００２９】
前記層状ケイ酸塩は、水膨潤性を有するため、高濃度の沈殿剤を含む試薬中において自然沈降しにくい。従って、改善された均一分散性、均一分散状態の長期安定性及び再分散性を有する分散液型の結晶化条件探索剤の提供を可能とする。また、水膨潤性層状ケイ酸塩は、優れた成膜性を有するため、均一な薄膜状の結晶化条件探索剤の提供を可能とする。
【００３０】
前記層状ケイ酸塩は、スメクタイト族が好ましい。スメクタイト族は２：１型の層構造を有している。スメクタイト族の使用は、改善された均一性及び操作性を有する結晶化条件探索剤の提供を可能とする。
【００３１】
前記層状ケイ酸塩は、前記スメクタイト族の中でも、サポナイトであることがより好まし。サポナイトは、四面体層のシリコン原子がアルミニウム原子に置換された層構造を有しているため、永久負電荷を有する。
サポナイトは、結晶化条件探索剤にメソ細孔に起因する核形成促進特性を付与する。サポナイトの使用は、結晶化条件探索剤に、単一品でより多様なタンパク質の結晶核形成を促進することを可能とし、且つ改善された均一性及び操作性を付与することを可能とする。
【００３２】
前記層状ケイ酸塩は、水酸基はその結合形態は問わない。例えば、層状ケイ酸塩は、共有結合により水酸基を結合していてもよい。層状ケイ酸塩は、水酸基を含有する化合物を直接的に又は間接的に結合してもよい。
【００３３】
好適な態様において、前記水酸基は、層状ケイ酸塩の結晶構造内に共有結合している。フッ素原子と水酸基を有する層状ケイ酸塩は、タンパク質溶液中においてタンパク質を吸着し、結晶核として機能するタンパク質の凝集体を生成する。また、水酸基のフッ素原子とのモル比率は合成時の仕込みフッ素原料の添加量によって制御できる。
【００３４】
前記フッ素原子は、同形置換により層状ケイ酸塩の結晶構造内に共有結合している。また、フッ素原子を同形置換させた層状ケイ酸塩は、陽イオン交換容量が比較的大きくなるため、層状ケイ酸塩の表面電荷密度を増加させる。従って、同形置換によりフッ素原子を導入した層状ケイ酸塩は、タンパク質溶液中においてタンパク質を高密度に吸着し、結晶核として機能するタンパク質の凝集体を効果的に生成する。
また、フッ素原子を同形置換させることで層状ケイ酸塩の永久負電荷が同形置換していないものに比べ増加し、層状ケイ酸塩の粒子間に強い静電的反発力を作用させる。従って、結晶化条件探索剤は、高濃度の沈殿剤を含む試薬と接触しても凝集しにくく、改善された均一性を有する。
【００３５】
フッ素原子と水酸基とを有する層状ケイ酸塩は、通常の方法により合成することができる。合成方法としては、例えば、水熱合成法、溶融合成法、高圧合成法、固体反応法、火炎溶融法及び変質法が挙げられる。これらの中でも、フッ素源を用いた水熱合成が好ましい。フッ素源を用いた水熱合成は、同形置換により生成物にフッ素原子と水酸基とを容易に導入することができる。また、フッ素源を用いた高圧合成法、固体反応法、火炎溶融法及び変質法により、フッ素原子と水酸基とを有する層状ケイ酸塩を合成してもよい。更に、フッ素含有層状ケイ酸塩に水酸基を導入することによって、フッ素原子と水酸基とを有する層状ケイ酸塩を合成してもよい。
【００３６】
前記層状ケイ酸塩中のフッ素原子、及び水酸基のモル比率は、タンパク質の結晶化成功率、結晶化速度、結晶核密度、及び結晶の大きさに影響を与える。特に、フッ素原子のモル比率と核形成頻度との間には正の相関関係があり、フッ素原子のモル比率と結晶の大きさとの間には負の相関関係がある。フッ素含有量、及びフッ素原子と水酸基のモル比率は、合成した試料を蒸留水に分散後、濾過、あるいは遠心分離を数回行うことによって遊離フッ素及び可溶性イオンを洗浄除去した層状ケイ酸塩を用いて、蛍光Ｘ線装置（Ｒｉｇａｋｕ社製、ＲＩＸ１０００）により定量、算出してよい。
【００３７】
好適な態様において、前記層状ケイ酸塩中のフッ素原子と水酸基に占めるフッ素原子のモル比率は好ましくは３％〜１５％である。より好ましくは４％〜１２％であり、最も好ましくは５〜１０％である。また、水酸基のモル比率は好ましくは８５％〜９７％であり、より好ましくは８８％〜９６％であり、最も好ましくは９０％〜９５％である。この範囲において、層状ケイ酸塩は核形成促進効果を有するため、結晶化条件探索剤を用いた第１次スクリーニングにおける結晶化成功率を向上することができる。また、該モル比率を適宜に調節することによって、結晶化成功率、結晶形成速度、結晶の大きさ及び結晶核密度を制御できる。結晶化条件探索剤のフッ素原子のモル比率が少なすぎる（水酸基のモル比率が大きすぎる）と、層状ケイ酸塩は効果的に結晶核形成を促進しないため、第１次及び第２次スクリーニングにおいて所望の結晶を得られないことがある。また、フッ素原子のモル比率が大きすぎる（水酸基のモル比率が小さすぎる）と結晶の大きさが小さくなること、またはＸ線回折用等の高品質な結晶を得られないことがある。なお、本発明の結晶化条件探索剤を用いた第１次スクリーニングにより選定された結晶化開始条件が既に所望のタンパク質結晶を形成する場合、第２次スクリーニングを行わなくてもよい。また、結晶化開始条件が既に見出されている場合、第２次スクリーニングのみに本発明の結晶化条件探索剤を適用してもよい。
【００３８】
前記結晶化条件探索剤は、層状ケイ酸塩以外の層状無機化合物を含有してよい。層状無機化合物としては、例えば、層状金属水酸化物及び層状複水酸化物が挙げられる。
【００３９】
前記結晶化条件探索剤は、任意のタンパク質結晶形成制御剤を含有してよい。好適な結晶形成制御剤は、特開２００７−５５９３１号公報、国際公開２００４／０４１８４７号公報、国際公開０２／０８８４３５号公報及び特開平８−２９４６０１号公報に開示される。これらの好適な結晶形成制御剤は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４０】
前記結晶化条件探索剤は、タンパク質の溶解度を下げるための任意の沈殿剤を含んでよい。沈殿剤としては、例えば、塩、水溶性高分子化合物、有機溶媒及びこれらの混合成分が挙げられる。
塩としては、例えば、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、硝酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、酒石酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、リン酸アンモニウム、硫酸リチウム、塩化コバルト、硫酸亜鉛及びマロン酸ナトリウムが挙げられる。
水溶性高分子化合物としては、例えば、分子量４００〜２００００のポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールモノアルキルエーテル及びポリエチレンイミンが挙げられる。
有機溶媒としては、例えば、エタノール、メタノール、アセトン、２−メチル−２，４−ペンタンジオール、イソプロパノール、ブタノール、ジオキサン、ジメチルスルホキシド及びジメチルホルムアミドが挙げられる。
【００４１】
前記結晶化条件探索剤は、界面活性剤を含んでよい。界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ドデシルジメチルアミン−Ｎ−オキシド、Ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトシド、Ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、Ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、Ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド、ポリオキシエチレン−オクチルフェニルエーテル、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド及びスクロースモノラウレートが挙げられる。
【００４２】
前記結晶化条件探索剤は、クライオプロテクタントを含んでよい。クライオプロテクタントとしては、例えば、グリセロール、エチレングリコール、スクロース及びトレハロースが挙げられる。
【００４３】
前記結晶化条件探索剤は、任意の添加剤を含んでよい。添加剤としては、例えば、リガンド、阻害剤、補酵素、基質、アミノ酸、ゲル、抗体及びこれらの混合物が挙げられる。好適なアミノ酸は、国際公開２００８／１０２４６９号公報に開示される。また、好適なゲルは、特開２００７−４５６６８号公報に開示される。これらの好適なアミノ酸及びゲルは、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４４】
前記結晶化条件探索剤は、タンパク質の結晶化に悪影響を及ぼさない範囲で、イオン液体を含んでよい。好適なイオン液体は、Russell  A.  Judge  et  al.,“The  Effect  of  Ionic  Liquids  on  Protein  Crystallization  and  X-ray  Diffraction  Resolution”,CRYSTAL  GROWTH  &  DESIGN,2009,Vol.9,No.8,p.3463-3469.に記載される。この好適なイオン液体は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４５】
前記結晶化条件探索剤は、任意の試薬を含んでよい。好適な試薬は、特開２００６−８３１２６号公報に開示される。この好適な試薬は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４６】
前記結晶化条件探索剤の剤型は、いずれでもよい。例えば、固形剤、分散液剤及び粘土状の半固形剤が挙げられる。好適な態様において、結晶化条件探索剤は、粉末状の層状ケイ酸塩を分散媒に添加した分散液剤か、層状ケイ酸塩を支持体上に塗布した薄膜状の固形剤である。フッ素原子を有する水膨潤性層状ケイ酸塩の分散液剤は、高濃度の沈殿剤等を含有する試薬中において凝集及び沈降しにくい。薄膜状の固形剤は、分散液を作製する必要がないため、結晶化条件の探索における操作性を改善することができる。
【００４７】
薄膜状の固形剤を担持する支持体はいずれでもよいが、好ましくはカバーガラス、スライドガラス、プレート、ブリッジ又はロッドであり、特に好ましくはブリッジである。ブリッジに塗布した薄膜状の固形剤は、シッティングドロップ蒸気拡散法による迅速な結晶化条件の探索を可能とする。
【００４８】
前記結晶化条件探索剤は、通常の分散媒を用いることができる。分散媒としては、例えば、純水、緩衝液、沈殿剤溶液、界面活性剤溶液、アルコール、有機溶媒、キレート剤溶液、還元剤溶液、クライオプロテクタント溶液、イオン液体、ミネラルオイル及びこれらの混合溶媒が挙げられる。
【００４９】
好適な態様において、前記分散媒は非イオン性の水溶性高分子化合物の水溶液である。非イオン性の水溶性高分子化合物としては、ポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールモノアルキルエーテルが挙げられる。この分散媒の使用は、層状ケイ酸塩粒子の凝集及び沈降を効果的に防止し、攪拌せずに均一な分散液を分取することを可能とする。
従って、前記分散媒の使用は、手動による効率的な結晶化条件探索の実施を可能とするだけでなく、攪拌装置を具備しない公知の結晶化自動化装置との組み合わせによる効率的な結晶化条件の探索を可能とする。好適な自動化装置は、特開２０１０−１５１８２１号公報、特開２００６−２８１１３９号公報、特開２００３−１４５９６号公報、特開２００４−１９４６４７号公報及び特表２００３−５０２６５２号公報に開示されている。これらの好適な自動化装置は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５０】
別の好適な態様において、前記結晶化条件探索剤は固形剤である。固形剤としては、例えば、粉末、顆粒、厚膜、薄膜、錠剤及び凍結乾燥剤が挙げられる。厚膜状又は薄膜状の固形剤は、自立膜であっても支持体状に担持された膜であってもよい。厚膜状又は薄膜状の結晶化条件探索剤は、一切の攪拌を必要としないため、改善された操作性を有する。更に、厚膜状又は薄膜状の結晶化条件探索剤は、界面活性剤を含む試薬を用いても泡立つことがないため、改善された均一性を有する。従って、厚膜状又は薄膜状の結晶化条件探索剤は大規模なハイスループットスクリーニングに好適である。
【００５１】
前記厚膜状又は薄膜状の固形剤は、任意の成膜方法により形成してよい。好適な成膜方法は、特開２００８−１１９６５９号公報、特開２００８−１８２９９号公報、特開２００６−１５０１６０号公報、特開２００５−１６３０５８号公報及び特開２００１−２２０２４４号公報に開示される。これらの好適な成膜方法は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５２】
更に好適な態様において、前記結晶化条件探索剤は、支持体上に塗布した薄膜状の固形剤である。薄膜状の固形剤は、層状ケイ酸塩の塗布面にムラがないため支持体から容易に脱離することがないだけでなく、結晶核形成を厳密に制御することができる。薄膜状の固形剤は、更に改善された均一性及び操作性を有する。薄膜は、支持体のタンパク質と接触する部分のみに形成することが好ましい。この構成により、層状ケイ酸塩の使用量を低減することができるだけでなく、タンパク質溶液の広範な浸透によるタンパク質の過剰な浪費及び水分の急激な減少を防ぐことができる。
【００５３】
更に好適な態様において、支持体はカバーガラス、スライドガラス、プレート、ブリッジ又はロッドである。好適な支持体は、特開２００２−１７９５００号公報、特開２００２−２３３７０２号公報、特表２００６−５００９６０号公報、米国特許第５４１９２７８号明細書及び米国特許第５０９６６７６号明細書に開示される。これらの好適な支持体は、参照によって本明細書に組み込まれる。この構成は、手動による効率的なスクリーニングの実施を可能とするだけでなく、攪拌装置を具備しない公知の結晶化自動化装置との組み合わせによる効率的なスクリーニングの実施を可能とする。
【００５４】
前記結晶化条件探索剤が対象とするタンパク質の種類は、特に制限されない。タンパク質としては、例えば、酸性タンパク質、塩基性タンパク質、中性タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、膜タンパク質、酵素、抗体、受容体、転写因子、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質同士の複合体、タンパク質と核酸との複合体、タンパク質と低分子化合物との複合体、タンパク質と補酵素との複合体、タンパク質と糖類との複合体、タンパク質と金属との複合体及び酵素と基質との複合体が挙げられ、好ましくは酸性タンパク質、塩基性タンパク質、中性タンパク質である。これらのタンパク質は、任意の分子量及び等電点を有してよい。
【００５５】
前記タンパク質は、純水や緩衝液に対し、可溶性であっても不溶性であってもよい。不溶性タンパク質は、任意の可溶化剤を用いて溶解してよい。好適な可溶化剤は、特開２００７−３１４５２６号公報、特表２００１−５１９８３６号公報、特開平５−１２５０９２号公報及び特開平５−３２６８９号公報に開示される。これらの好適な可溶化剤は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５６】
前記タンパク質は、天然のタンパク質であっても人工のタンパク質であってもよい。タンパク質は、種々の方法により合成した人工のものでもよい。人工のタンパク質としては、例えば、遺伝子組換え技術により合成した発現タンパク質、化学合成法により合成したタンパク質及び発酵法により合成したタンパク質が挙げられる。発現タンパク質は、任意の発現系を用いて合成したものでもよい。発現系としては、例えば、大腸菌発現系、酵母発現系、昆虫細胞発現系、哺乳類細胞発現系及び無細胞発現系が挙げられる。好適な発現系は、特開２０１０−６３３８６号公報、特開２０１０−１１８５１号公報、特開２００８−１９３９５３号公報、特表２００８−５３８５０３号公報、特表２００７−５０１００７号公報、特表２００６−５０２６９１号公報、特表２００６−５０８６８４号公報、特表２００５−５１７３８５号公報、特表２００４−５０６４２８号公報及び特表２００３−５１１０６７号公報に開示される。これらの好適な発現系は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５７】
前記発現タンパク質は、適宜にタグタンパク質を融合してよい。好適なタグタンパク質は、特開２０１０−７５０９０号公報、特表２００４−５３２０２５号公報、特開２００３−２８９８８２号公報及び特開２００３−３８１９５号公報に開示される。これらの好適なタグタンパク質は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５８】
前記タンパク質を溶解する溶媒は特に制限するものではない。タンパク質の溶解溶媒としては、例えば、純水、緩衝液、沈殿剤溶液、界面活性剤溶液、アルコール溶液、有機溶媒、キレート剤溶液、還元剤溶液、クライオプロテクタント溶液、イオン液体及びこれらの混合溶液が挙げられる。好ましくは、溶解溶媒は緩衝液である。緩衝成分としては、例えば、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、カコジル酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、イミダゾール、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、グッド緩衝剤及びこれらの混合成分が挙げられる。緩衝液は任意のｐＨであり得、例えば、ｐＨ３．５〜１０．０の範囲である。
【００５９】
本発明の結晶化条件探索方法は、上記のフッ素原子と水酸基とを有する水膨潤性層状ケイ酸塩を含む結晶化条件探索剤と、タンパク質が溶解している溶液とを混合する工程を含む。
【００６０】
タンパク質溶液の濃度は、タンパク質が溶解している限りにおいて特に制限されない。結晶化を効果的に促進する観点から、タンパク質初濃度は高いことが好ましく、好ましくは２ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは５ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬであり、飽和溶解度付近の濃度であることが特に好ましい。
【００６１】
前記タンパク質溶液に対する結晶化条件探索剤の添加量は特に制限されないが、タンパク質溶液中における層状ケイ酸塩の最終濃度を少なくとも０．０１％（ｗ／ｖ）とすることが好ましく、０．０１％〜１．０％（ｗ／ｖ）とすることがより好ましい。高い核形成頻度を得るためには、層状ケイ酸塩の最終濃度を０．０１％〜０．５％（ｗ／ｖ）とすることが好ましく、０．０５％〜０．３％（ｗ／ｖ）とすることがより好ましく、０．１％〜０．２％（ｗ／ｖ）とすることが更に好ましい。
【００６２】
前記タンパク質は、結晶化の手法は特に制限はない。結晶化方法としては、例えば、バッチ法、蒸気拡散法、透析法、自由界面拡散法、濃縮法、光照射法、振動法及び撹拌法が挙げられる。蒸気拡散法としては、ハンギングドロップ法、シッティングドロップ法及びサンドイッチドロップ法を好適に用いられる。蒸気拡散法は、微量のタンパク質を用いたスクリーニングを容易且つ迅速に行うことを可能とする。好適な結晶化方法は、特開２０１０−１３４２０号公報、特開２０１０−１２２０号公報、特開２００３−３０６４９７号公報、特許第４０２９９８７号公報及び特開平６−１１６０９８号公報に開示される。これらの好適な結晶化方法は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６３】
前記タンパク質は、任意の容器を用いて結晶化してよい。好適な容器は、特開２００９−１７２５３０号公報、特開２００８−３０９６１７号公報、特開２００８−１２６１３５号公報、特開２００７−１７８８号公報、特開２００６−１２４２３８号公報、特開２００６−３０８６０７号公報、特表２００５−５０２５７１号公報、特表２００５−５１５１５１号公報、特表２００６−５２５８６４号公報、特開２００４−３０７３３５号公報、特開２００３−２４８００４号公報、特表２００２−５２８７０１号公報、特表２００２−５３６２５５号公報、特開平１１−１３０６００号公報、米国特許第５，０９６，６７６号明細書、米国特許第５，１３０，１０５号明細書、米国特許第５，２２１，４１０号明細書及び国際公開０１／０８８２３１号公報に開示される。これらの好適な容器は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６４】
前記タンパク質は、任意の温度条件によって結晶化してよい。温度は４〜３７℃であることが好ましく、４〜２０℃であることが更に好ましい。
【００６５】
形成した結晶は、顕微鏡を用いて観察してよい。顕微鏡としては、例えば、実体顕微鏡、光学顕微鏡、偏光顕微鏡、電子顕微鏡が挙げられる。また、結晶は、肉眼で観察してもよいし、結晶検出装置を用いて観察してもよい。好適な結晶検出装置は、特開２００７−４５６６３号公報、特開２００５−９９４９号公報、特開２００６−２４２６９０号公報、特開２００４−３２３３３６号公報及び特開２００７−２４８２８０号公報に開示される。これらの好適な結晶検出装置は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６６】
前記形成した結晶は、Ｘ線回折装置により分析してよい。Ｘ線回折は、結晶化条件探索剤の結晶への付着の有無に関わらず行うことができる。本発明の結晶化条件探索剤はＸ線回折実験に悪影響を及ぼすものではなく、結晶化条件探索剤が付着した結晶を用いても良好なＸ線回折像を取得することができる。
【００６７】
前記形成した結晶は、新たな結晶化条件の探索を実施するための種結晶として使用してよい。
また、本発明の結晶化条件探索剤は、タンパク質結晶形成制御剤又はタンパク質結晶形成促進剤として使用してもよい。さらに、本発明の結晶化条件探索剤は、タンパク質結晶化を用いた工業的なタンパク質精製に適用してもよいし、タンパク質以外の他の生体高分子の結晶化に適用してもよい。これらの用途には、本発明の結晶化条件探索剤を造核剤や結晶核形成剤として作用させる場合も包含される。
【実施例】
【００６８】
以下、調製例、試験例、比較試験例に基づいて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はその要旨を越えない限りこれらに限定されるものではない。【００６９】
調製例１
Ｎａ型サポナイト理論化学式Ｎａ０．３３（Ｍｇ３）（Ａｌ０．３３Ｓｉ３．６７）Ｏ１０（ＯＨ）２に基づき、水ガラス（北越化学工業株式会社製）、硫酸マグネシウム（関東化学株式会社製）及び硫酸アルミニウム（関東化学株式会社製）を、モル比率がＳｉ：Ｍｇ：Ａｌ＝３．６７：３：０．３３となるように反応させ、水和ゲル１．５Ｌを調製した。この水和ゲルにフッ化ナトリウム（関東化学株式会社製）を溶解させた水溶液０．５Ｌを加え、２Ｌの反応ゲルを調製した。反応ゲルを３Ｌオートクレーブ容器に入れ、２５０℃にて４時間水熱合成を行った。水熱合成後の生成物（１Ｌ）を濾紙で吸引濾過して、水分を除去した。得られたケーキに水２Ｌを加えて攪拌することにより再分散し、これを再濾過した。再分散及び再濾過操作を３回繰り返すことで未反応物を洗浄除去した。得られたケーキを乾燥することによって、フッ素原子と水酸基とを有する合成サポナイト（以下、調製例１のサポナイトと呼ぶことがある）を得た。【００７０】
調製例２
調製例１においてフッ化ナトリウムの配合量を変えたこと以外は調製例１と同じ方法で、フッ素原子と水酸基とを有する合成サポナイト（以下、調製例２のサポナイトと呼ぶことがある）を得た。【００７１】
調製例３
調製例１においてフッ化ナトリウムの代わりに水酸化ナトリウム（関東化学株式会社製）を配合したこと以外は調製例１と同じ方法で、水酸基を有する合成サポナイト（以下、調製例３のサポナイトと呼ぶことがある）を得た。【００７２】
図１に、Ｘ線回折装置（Ｒｉｇａｋｕ社製、ＭｉｎｉＦｌｅｘ）による解析結果を示す。図１において、（ａ）は調製例１のサポナイトのＸ線回折パターン、（ｂ）は調製例２のサポナイトのＸ線回折パターン、（ｃ）は調製例３のサポナイトのＸ線回折パターンを示す。２θ／θ＝７．８〜８．８°におけるｄ（００１）ピークの存在は、各試料が１０．０〜１１．３Åの層間距離を有する層状化合物であることを示す。２θ／θ＝６０．７〜６０．９°（１．５３Å）におけるｄ（０６０）ピークの存在は、各試料が３−八面体型の層構造を有するサポナイトであることを示す。２θ／θ＝３９．０°におけるピークの非存在は、各試料が遊離したフッ化ナトリウムを含有しないことを示す。従って、調製例１及び調製例２のサポナイトは、フッ素原子と水酸基とを有し、該フッ素原子は同形置換により各サポナイトに共有結合していることが分かる。【００７３】
表１に、調製例１、調製例２及び調製例３のサポナイトのフッ素原子、及び水酸基のモル比、及びモル比率を示す。フッ素含有量は、蛍光Ｘ線測定装置（Ｒｉｇａｋｕ社製、ＲＩＸ１０００）によって得られたフッ素原子の含有量である。表１より、調製例１、及び調整例２のサポナイトは、それぞれ０．８６質量％、０．５３質量％のフッ素原子を含むことが分かる。さらに蛍光Ｘ線分析の結果から「粘土ハンドブック第３版」に記載の方法にて調整例のサポナイト化学式を算出することで、フッ素原子と水酸基の化学式中のモル比を得た。また、フッ素原子と水酸基の合計モル比を１００％としたときのモル比率を表１に示す。【００７４】
【表１】
2012133695.tif 000003
【００７５】
図２に、液体窒素温度条件下における窒素吸着／脱着等温線を示す。図２において、（ａ）は調製例１のサポナイトの等温線、（ｂ）は調製例２のサポナイトの等温線、（ｃ）は調製例３のサポナイトの等温線を示す。各試料の等温線は、ＩＵＰＡＣ分類におけるＩＶ型に相当する形状を有し、それは典型的な層状化合物であることを示す。相対圧が０．４０から１．００の範囲に見られるＨ２ヒステリシスループは、直径２〜５０ｎｍのメソ細孔の存在を示す。これらのメソ細孔は、サポナイトのカードハウス構造に由来すると考えられる。このカードハウス構造は、扁平なナノ粒子の端面と側面との不規則的な積み重ねにより形成される。【００７６】
表２に調製例１、調製例２及び調製例３のサポナイトの陽イオン交換容量、比表面積及び表面電荷密度の分析結果を示す。陽イオン交換容量は、酢酸アンモニウムを用いたショーレンバーガー（Ｓｃｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ）法に基づいて測定した。窒素吸着等温線は、窒素吸着量測定装置（Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、ＡＵＴＯＳＯＲＢ−１）を用いて求めた。各試料の水分は、吸着した窒素の体積（窒素吸着量）の測定に際し、２００℃において３時間脱気することによって除去した。比表面積は、図２の窒素吸着等温線における相対圧が０．０５０から０．３０の範囲における吸着した窒素の体積のデータを用いて、ブルナー・エメット・テラー（Ｂｒｕｎａｕｅｒ−Ｅｍｍｅｔｔ−Ｔｅｌｌｅｒ：ＢＥＴ）法によって決定した。表面電荷密度は、比表面積に対する陽イオン交換容量と定義した。【００７７】
【表２】
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【００７８】
表２より、フッ素原子のモル比率の増加に伴い、各試料の陽イオン交換容量は増加し、比表面積は減少することが分かる。従って、フッ素原子のモル比率の増加に伴い、各試料の表面電荷密度は増加することが分かる。これは、フッ素が同形置換されたサポナイトは負電荷が強く、且つ表面電荷密度が大きいことを示す。【００７９】
（実施例１）リゾチームを用いた結晶化促進の評価
試験例１−１
鶏卵白リゾチームの第１次スクリーニングに薄膜状の調製例１のサポナイトを適用した。所定の濃度のリゾチーム溶液を用い、シッティングドロップ蒸気拡散法により結晶化を行った。【００８０】
沈殿剤溶液として、市販のスクリーニングキットであるＣｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｉ（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いた。このキットは、表３に示す５０種類の沈殿剤溶液を含む。
タンパク質溶液として、鶏卵白リゾチーム（和光純薬工業（株）製）を、０．１５０ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．０２０ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、８ｍｇ／ｍＬリゾチーム溶液を調製した。【００８１】
【表３】
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【００８２】
純水に調製例１のサポナイトを添加し、０．２％（ｗ／ｖ）サポナイト分散液を調製した。５μＬの分散液をマイクロブリッジ（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）の上に滴下し、室温で脱気して乾燥することによって、マイクロブリッジ上にサポナイトの薄膜を形成した。【００８３】
シッティングドロップのセットアップに際し、２４ウェルプレート（ＴＰＰ社製）のウェルに各沈殿剤溶液を４００μＬ添加し、薄膜を形成したマイクロブリッジを入れた。マイクロブリッジに形成した薄膜上で、リゾチーム溶液５μＬと表３に記載の沈殿剤溶液５μＬとを混合した。ウェルの入り口に高真空グリース（ダウコーニング・東レ（株）製）を塗布し、カバーガラス（松浪硝子工業（株）製）を用いて密封し、２０±１℃で１ヶ月静置した。１ヶ月静置後、偏光顕微鏡観察（倍率４０倍）により結晶の有無を調べた。【００８４】
試験例１−２
試験例１−１において調製例１のサポナイトの代わりに調製例２のサポナイトを使用したこと以外は、試験例１−１と同じ方法で試験した。【００８５】
比較試験例１−１
試験例１−１において調製例１のサポナイトの代わりに調製例３のサポナイトを使用したこと以外は、試験例１−１と同じ方法で試験した。【００８６】
比較試験例１−２
試験例１−１においてマイクロブリッジ上に０．２％（ｗ／ｖ）サポナイト分散液の代わりに純水を滴下し、サポナイトを塗布しないマイクロブリッジを使用したこと以外は、試験例１−１と同じ方法で試験した。【００８７】
試験例１−１、試験例１−２、比較試験例１−１及び比較試験例１−２の結果を表４に示す。表４に示す番号は、使用した５０種類の沈殿剤溶液のうち結晶化した溶液の番号である。結晶化成功率は、使用した５０種類の沈殿剤溶液のうち結晶化した溶液の割合を示す。【００８８】
【表４】
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【００８９】
表４より、比較試験例１−１及び比較試験例１−２と比べて、試験例１−１及び試験例１−２の結晶化成功率は大きいことが分かる。これは、フッ素原子と水酸基とを有するサポナイトが、リゾチームの結晶化条件の探索において結晶化成功率を向上させることを示す。
この現象は、フッ素原子と水酸基とを有するサポナイトが、結晶核として作用するリゾチームの凝集体を効率的に形成する場として機能したことに起因すると考えられる。【００９０】
表４において、試験例１−１は、比較試験例１−２において結晶化しない３つの沈殿剤溶液（番号１７、番号２０及び番号４０）で結晶を形成することが分かる。表４において、試験例１−２は、比較試験例１−２において結晶化しない４つの沈殿剤溶液（番号１５、番号１７、番号２１及び番号２９）で結晶を形成することが分かる。このことから、フッ素原子と水酸基とを有するサポナイトを第１次スクリーニングに用いることによって、サポナイト非存在下において発見されない結晶化開始条件を発見することができる。表４において、試験例１−１は、比較試験例１−１において結晶化しない２つの沈殿剤溶液（番号２０及び番号４０）で結晶を形成することが分かる。表４において、試験例１−２は、比較試験例１−１において結晶化しない３つの沈殿剤溶液（番号１５、番号２１及び番号２９）で結晶を形成することが分かる。このことから、フッ素原子と水酸基とを有するサポナイトを第１次スクリーニングに用いることによって、フッ素原子を含まないサポナイトの存在下において発見されない結晶化開始条件を見いだすことができる。【００９１】
なお、表４において、試験例１−１及び試験例１−２は、比較試験例１−２において結晶化した２つの沈殿剤溶液（番号３０及び番号３４）で結晶を形成しないことが分かる。これは、サポナイトの添加に伴いリゾチームが吸着し、ドロップ内の過飽和度が著しく低下したことが原因であると考えられる。【００９２】
（実施例２）サポナイトのリゾチーム結晶成長に対する影響
試験例２−１
鶏卵白リゾチームのＸ線回折測定用の結晶を得ることを目的に調製例１のサポナイトの分散液を適用した。分散液は、クライオプロテクタントを含む。所定の濃度のリゾチーム溶液及び分散液を用い、ハンギングドロップ蒸気拡散法により結晶化を行った。【００９３】
クライオプロテクタントを含む沈殿剤溶液として、１．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム及び３０％（ｗ／ｖ）グリセロールを含む０．２ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．７）を作製した。
タンパク質溶液として、鶏卵白リゾチーム（和光純薬工業株）製）を０．０２０ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．７）に溶解し、５５ｍｇ／ｍＬリゾチーム溶液を調製した。
クライオプロテクタントを含む沈殿剤溶液を用い、調製例１のサポナイトを０．２％（ｗ／ｖ）の濃度で分散させた分散液を調製した。【００９４】
ハンギングドロップのセットアップに際し、シリコンコーティング処理を施したカバーガラス（松浪硝子工業（株）製）上でリゾチーム溶液５μＬと分散液５μＬとを混合した。２４ウェルプレート（ＴＰＰ社製）のウェルにクライオプロテクタントを含む沈殿剤溶液を４００μＬ添加した。カバーガラスを逆さの状態にして、高真空グリース（ダウコーニング・東レ（株）製）によりウェルを密封し、２０±１℃で１ヶ月静置した。【００９５】
リゾチーム結晶のＸ線回折データは、高エネルギー加速器研究機構物質構造科学研究所、放射光科学研究施設（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｙ）のビームラインＢＬ６Ａステーションにおいて収集された。サポナイトを含むドロップから、結晶凍結用のマウントループ（ハンプトンリサーチ社製、クライオループ）を用いて、サポナイトを付着している結晶をすくった。結晶を−１７３℃の窒素気流中にて冷却し、波長０．９７８００Åの放射光Ｘ線を照射した。ＣＤカメラで取得されたＸ線回折像は、プログラムパッケージソフトであるＤＰＳ／ＭＯＳＦＬＭを用いて解析した。【００９６】
試験例２−２
試験例２−１において調製例１のサポナイトの代わりに調製例２のサポナイトを使用したこと以外は、試験例５−１と同じ方法で試験した。【００９７】
比較試験例２−１
調製例１のサポナイトの代わりに調製例３のサポナイトを使用したこと以外は、試験例２−１と同じ方法で試験した。【００９８】
比較試験例２−２
試験例２−１において調製例１のサポナイトを０．２％（ｗ／ｖ）の濃度で分散させた分散液を使用する代わりに、サポナイトを添加していない沈殿剤溶液を使用したこと以外は、試験例２−１と同じ方法で試験した。【００９９】
試験例２−１、試験例２−２、比較試験例２−１及び比較試験例２−２の結果を表５に示す。【０１００】
【表５】
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【０１０１】
いずれの試験例及び比較試験例も、形成した結晶の空間群及び単位格子定数が同じであることが分かる。これは、サポナイトがリゾチームの結晶の空間群及び単位格子定数に影響を与えないことを示す。比較試験例２−２と比べて、試験例２−２のモザイシティ範囲は小さいことが分かる。更に、試験例２−２の完全性は、比較試験例２−２とほぼ同一であることが分かる。これらの結果は、試験例２−２のサポナイトがリゾチームの結晶成長に悪影響を及ぼさず、高品質な結晶を形成することを示す。以上より、結晶化条件の探索における第２次スクリーニング工程において、本結晶化条件探索剤を添加しても、タンパク質結晶のＸ線回折データを取得することが可能であることがわかる。【０１０２】
（実施例３）各種タンパク質溶液（分散液）からのタンパク質の結晶化における結晶化条件探索剤の影響
試験例３−１
１１種類のタンパク質におけるそれぞれのタンパク質の結晶化条件の探索例として調製例１のサポナイトの分散液を適用した。所定濃度のそれぞれのタンパク質溶液及び分散液を用い、ハンギングドロップ蒸気拡散法により結晶化を行った。【０１０３】
ウシ肝臓カタラーゼ、Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ由来プロテイナーゼＫ及びウシ膵臓トリプシンは和光純薬工業株式会社から購入した。ナタ豆由来コンカナバリンＡ、アプロチニン、Ｔｈａｕｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄａｎｉｅｌｌｉｉ由来ソーマチン及びヒト血清アルブミンはシグマアルドリッチジャパン株式会社から購入した。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ由来グルコースイソメラーゼ及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ由来キシラナーゼはハンプトンリサーチ社から購入した。卵白由来アビジンはナカライテスク株式会社から購入した。以上のタンパク質は、精製せずに結晶化を行った。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓＧＫ２４由来Ｌ−乳酸脱水素酵素は、先行技術文献（Koide  S.  et  al.,“Crystallization  of  Allosteric  L-Lactate  Dehydrogenase  from  Thermus  caldophilus  and  Preliminary  Crystallographic  Data”,The  Journal  of  Biochemistry,1991,109,p.6-7.）に従って大腸菌発現系により発現させ精製した。【０１０４】
各タンパク質溶液からの結晶化条件を表６Ａ、６Ｂ及び６Ｃに示す。表６Ａは、各タンパク質の結晶化に用いた各タンパク質溶液の組成を示す。表６Ｂは、各タンパク質の結晶化に用いた各沈殿剤溶液の組成を示す。表６Ｃは、各タンパク質の結晶化に用いた各リザーバー溶液の組成を示す。【０１０５】
【表６Ａ】
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【０１０６】
【表６Ｂ】
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【０１０７】
【表６Ｃ】
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【０１０８】
各タンパク質の結晶化に際し、表６Ａに記載された各タンパク質溶液、表６Ｂに記載された各沈殿剤溶液及び表６Ｃに記載された各リザーバー溶液をそれぞれ作製した。
沈殿剤溶液を用い、調製例１のサポナイトを０．２％（ｗ／ｖ）の濃度で分散させた分散液を調製した。【０１０９】
ハンギングドロップのセットアップに際し、シリコンコーティング処理を施したカバーガラス（松浪硝子工業（株）製）上でタンパク質溶液５μＬと分散液５μＬとを混合した。２４ウェルプレート（ＴＰＰ社製）のウェルにリザーバー溶液を４００μＬ添加した。カバーガラスを逆さの状態にして、高真空グリース（ダウコーニング・東レ（株）製）によりウェルを密封し、２０±１℃で２ヶ月静置した。【０１１０】
形成した結晶を、結晶形成時間により評価した。結晶形成時間は、偏光顕微鏡観察下（倍率４０倍）で最初の結晶が現れるまで、すなわち、１０μｍ〜２０μｍ程度の結晶が現れるまでの経過時間（日数）と定義した。【０１１１】
試験例３−２
試験例３−１において調製例１のサポナイトの代わりに調製例２のサポナイトを使用したこと以外は、試験例３−１と同じ方法で試験した。【０１１２】
比較試験例３−１
試験例３−１において調製例１のサポナイトの代わりに調製例３のサポナイトを使用したこと以外は、試験例３−１と同じ方法で試験した。【０１１３】
比較試験例３−２
試験例３−１において調製例１のサポナイトを０．２％（ｗ／ｖ）の濃度で分散させた分散液を使用する代わりに、サポナイトを添加していない沈殿剤溶液を使用したこと以外は、試験例３−１と同じ方法で試験した。【０１１４】
試験例３−１、試験例３−２、比較試験例３−１及び比較試験例３−２の各タンパク質溶液からの結晶形成時間を表７に示す。表９に記載された数値は、最初の結晶が観察された日数（単位：日）を示す。表７に記載されたＮ．Ｃ．は、２ヶ月静置後に結晶が形成しないことを示す。【０１１５】
【表７】
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【０１１６】
表７のアルブミン、グルコースイソメラーゼ、Ｌ−乳酸脱水素酵素及びトリプシンのそれぞれの結晶化において、比較試験例３−２は結晶を形成しないのに対し、試験例３−１及び試験例３−２は結晶を形成することが分かる。表７のプロテイナーゼＫの結晶化において、比較試験例３−２は結晶を形成しないのに対し、試験例３−１は結晶を形成することが分かる。アプロチニン、アビジン、カタラーゼ、コンカナバリンＡ、ソーマチン及びキシラナーゼの結晶化において、比較試験例３−２と比べて、試験例３−１及び試験例３−２は結晶形成時間を促進することが分かる。これらの結果は、フッ素原子と水酸基とを有するサポナイトが、各タンパク質溶液からのタンパク質の結晶形成時間を促進することを示す。よって、第２次スクリーニングにおいて、フッ素原子と水酸基とを有するサポナイトを添加したり、添加するサポナイトのフッ素置換率を変更したりすることによって、所望の結晶形成時間となるように結晶化開始条件を改変することができる。
この現象は、フッ素原子と水酸基とを有するサポナイトが、結晶核として作用するタンパク質の凝集体を効率的に形成する場として機能したことに起因すると考えられる。【０１１７】
表７のアルブミン及びトリプシンのそれぞれの結晶化において、比較試験例３−２は結晶を形成しないのに対し、比較試験例３−１は結晶を形成することが分かる。カタラーゼ及びソーマチンのそれぞれの結晶化において、比較試験例３−２と比べて、比較試験例３−１は結晶形成時間を促進することが分かる。これらの結果は、水酸基を有するサポナイトが、各タンパク質溶液からタンパク質の結晶化を促進することを示す。
この現象は、水酸基を有するサポナイトが、結晶核として作用するタンパク質の凝集体を形成する場として機能したことに起因すると考えられる。【０１１８】
表７のグルコースイソメラーゼ及びＬ−乳酸脱水素酵素それぞれの結晶化において、比較試験例３−１は結晶を形成しないのに対し、試験例３−１及び試験例３−２は結晶を形成することが分かる。表７のプロテイナーゼＫの結晶化において、比較試験例３−１は結晶を形成しないのに対し、試験例３−１は結晶を形成することが分かる。これは、各タンパク質溶液からの各タンパク質の結晶化促進にサポナイトのフッ素原子の存在が重要であることを示す。よって、第２次スクリーニングにおいて、フッ素原子と水酸基とを有するサポナイトを添加することによって、準安定領域でグルコースイソメラーゼ及びＬ−乳酸脱水素酵素を結晶化させることができる。【０１１９】
表７のアルブミン、コンカナバリンＡ及びソーマチンの各タンパク質溶液からの各タンパク質の結晶化において、比較試験例３−１と比べて、試験例３−１及び試験例３−２では結晶形成時間が顕著に促進されたことが分かる。これは、同形置換によるフッ素原子の導入が、水酸基を有するサポナイトの結晶化促進効果を高めることを示す。【０１２０】
表７のプロテイナーゼＫの結晶化において、試験例３−２は結晶を形成しないのに対し、試験例３−１は結晶を形成することが分かる。これは、プロテイナーゼＫの結晶化促進に、より多いフッ素原子の含有が好適であることを示す。よって、第２次スクリーニングにおいて、フッ素原子のモル比率の高いサポナイトを添加することによって、準安定領域でプロテイナーゼＫを結晶化させることができる。【０１２１】
表７のソーマチンの結晶化において、試験例３−１と比べて、試験例３−２は結晶形成時間を促進することが分かる。これは、ソーマチンの結晶化の促進に調製例２のサポナイトのフッ素原子と水酸基とのモル比率が好適であることを示す。【０１２２】
以上の結果より、準安定領域を含む既存の結晶化条件において結晶化できなかった溶液条件下においても本結晶化条件探索剤を使用することで結晶化の可能性が大幅に向上することがわかる。また、本結晶化条件探索剤は結晶化速度の促進を行うが、速度の促進のみで結晶化を成功させているのではなく、効果的にタンパク質に結晶核を作る場を与え、結晶化させる効果を付与している。さらに本発明の結晶化条件の探索法を用いることで、比較的負荷の少ない条件検討のみで結晶化条件を決定することができることは容易に予想できる。【０１２３】
なお、「発明を実施するための形態」において引用した全ての文書は、関連する部分において、参照として本明細書に組み込まれるが、いかなる文書の引用も、本発明に関する先行技術であることの容認と考えるべきではない。【０１２４】
本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。【０１２５】
本願は、２０１１年３月３１日に日本国で特許出願された特願２０１１−０８０９４４に基づく優先権を主張するものであり、これはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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