(57)【要約】  本発明は、甲状腺髄様癌などの癌の治療、緩和ケアまたは予防用医薬組成物に関する。詳細には、本発明は、オクトレオチドで修飾されたリポソームを含む、甲状腺髄様癌などの癌の治療、緩和ケアまたは予防用医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オクトレオチドで修飾されたリポソームを含む、癌の治療、緩和ケアまたは予防用医薬組成物。
【請求項２】
リポソームにおけるオクトレオチドの濃度が０．８ｍｏｌ％超である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
リポソームがポリ（エチレングリコール）でさらに修飾されている、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項４】
生理食塩水をコントロールとした場合の延命率を表す％ＩＬＳが１００以上である、請求項１〜３のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項５】
リポソームにイリノテカンが封入されている、請求項１〜４のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項６】
イリノテカンの投与量が２０ｍｇ／ｋｇ体重以下である、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
癌が甲状腺髄様癌である、請求項１〜６のいずれか１項記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甲状腺髄様癌などの癌の治療、緩和ケアまたは予防用医薬組成物に関する。詳細には、本発明は、オクトレオチドで修飾されたリポソームを含む、甲状腺髄様癌などの癌の治療、緩和ケアまたは予防用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
甲状腺髄様癌（ＭＴＣ）は、甲状腺のＣ細胞の癌化に起因する稀な癌である。ＭＴＣは外科的切除によって処置されているが、これにより患者のクオリティオブライフ（ＱＯＬ）が低下することが問題となっていた。【０００３】
カンプトテシンの誘導体であるイリノテカン（ＣＰＴ−１１）がＭＴＣに対する効力を有する可能性が示唆されているが、ＣＰＴ−１１は半減期が短く、重篤な副作用を示すので、その使用は制限されていた（非特許文献１）。【０００４】
抗癌剤をリポソームに封入すると、受動的標的化によって腫瘍における薬物の蓄積が増加し、副作用が軽減され得ることが知られている。さらに、リポソームをリガンドで修飾することによって、リポソームの治療効果を増強し得る。例えば、ソマトスタチン受容体（ＳＳＴＲ）の高親和性リガンドであるオクトレオチド（Ｏｃｔ）で修飾したリポソームにカンタリジン、ジヒドロタンシノンなどの抗癌剤を封入して、乳癌、胃癌を処置する試みがなされている（非特許文献２、３）。【０００５】
本発明者らは、Ｏｃｔ修飾したＣＰＴ−１１封入リポソームを作製し、これがＳＳＴＲを発現するＭＴＣ由来の細胞株に対する細胞毒性をインビトロで示すことを報告した（非特許文献４）。しかし、インビボでＭＴＣを処置するために有効な方法は確立されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ohno, R. et al., J. Clin. Oncol., 8:1907-1912 (1990)
【非特許文献２】Chang, C.C. et al., Food Chem. Toxicol., 46:3116-3121 (2008)
【非特許文献３】Chen, C.H. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 72:1586-1594 (2008)
【非特許文献４】岩瀬由布子ら、日本薬学会、第１３０年会、要旨集、２８ＣＥ−ｐｍ０３（２０１０年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、甲状腺髄様癌などの癌の治療、緩和ケアまたは予防用医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は：
［１］オクトレオチドで修飾されたリポソームを含む、癌の治療、緩和ケアまたは予防用医薬組成物；
［２］リポソームにおけるオクトレオチドの濃度が０．８ｍｏｌ％超である、［１］の医薬組成物；
［３］リポソームがポリ（エチレングリコール）でさらに修飾されている、［１］または［２］の医薬組成物；
［４］生理食塩水をコントロールとした場合の延命率を表す％ＩＬＳが１００以上である、［１］〜［３］のいずれかの医薬組成物。
［５］リポソームにイリノテカンが封入されている、［１］〜［４］のいずれかの医薬組成物；
［６］イリノテカンの投与量が２０ｍｇ／ｋｇ体重以下である、［５］の医薬組成物；
［７］癌が甲状腺髄様癌である、［１］〜［６］のいずれかの医薬組成物、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、オクトレオチドで修飾されたリポソームを含む、甲状腺髄様癌などの癌の治療、緩和ケアまたは予防用医薬組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】細胞内取り込みに対するＯｃｔ濃度の効果を示す図である。値は、平均±ＳＤである（ｎ＝３）。＊は、ＳＬと比較した有意差（p<0.05）を表す。
【図２】競合阻害試験の結果を示す図である。
【図３】競合阻害試験の結果を示す図である。
【図４】薬物未封入リポソームを用いた細胞毒性試験の結果を示す図である。
【図５】ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＴＳＣ２／ｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６Ｋシグナルカスケードを示す図である。
【図６】Ａｋｔ、ＴＳＣ２及びｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化に対するＯｃｔ−ＣＬの効果を示す図である。
【図７】腫瘍サイズに対するＣＰＴ−１１封入リポソームの効果を示す図である。
【図８】体重に対するＣＰＴ−１１封入リポソームの効果を示す図である。
【図９】生存率に対するＣＰＴ−１１封入リポソームの効果を示す図である。
【図１０】腫瘍サイズに対するＣＰＴ−１１封入リポソームの効果を示す図である。
【図１１】体重に対するＣＰＴ−１１封入リポソームの効果を示す図である。
【図１２】生存率に対するＣＰＴ−１１封入リポソームの効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、甲状腺髄様癌などの癌の治療、緩和ケアまたは予防用医薬組成物を提供する。
【００１２】
本明細書において使用する用語「甲状腺髄様癌」（本明細書において「ＭＴＣ」ともいう）は、甲状腺のカルシトニン分泌濾胞傍細胞（Ｃ細胞）に由来する悪性内分泌腺腫瘍を指す。ＭＴＣは甲状腺癌の約３〜５％を占める。ＭＴＣの７５％は散発性であり、残りの２５％は家族性である（多発性内分泌腫瘍ＩＩＡ型（ＭＥＮ２Ａ）、多発性内分泌腫瘍ＩＩＢ型（ＭＥＮ２Ｂ）および家族性甲状腺髄様癌（ＦＭＴＣ））。ＭＴＣ上にはソマトスタチン受容体が発現されていることが知られている。
【００１３】
本明細書において使用する用語「ソマトスタチン受容体」（本明細書において「ＳＳＴＲ」ともいう）は、成長ホルモン分泌抑制因子であるソマトスタチンをリガンドとする受容体を指す。ＳＳＴＲは７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体であり、ＭＴＣに加えて、神経内分泌腫瘍、胃腸膵腫瘍、下垂体腫瘍、カルチノイド腫瘍などで過剰発現されている（下記参照）。ＳＳＴＲにソマトスタチンアナログが結合すると、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ＴＳＣ２、ｍＴＯＲ、ｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化を介してシグナルが伝達され、細胞周期が抑制される（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＴＳＣ２／ｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６Ｋシグナルカスケード）（Grozinsky-Glasberg, S. et al., Endocr. Relat. Cancer, 15:701-720 (2008)；Theodoropoulou, M. et al., Cancer Res., 66:1576-1582 (2006)）。
【００１４】
ソマトスタチン受容体には、５つのサブタイプ（ｓｓｔ１〜５）があり、オクトレオチドはｓｓｔ２、ｓｓｔ３、ｓｓｔ５のサブタイプのソマトスタチン受容体に対して高い親和性を有する（Patel, Y. C., Frontiers in Neuroendocrinology, 20:157-198 (1999)）。胚発生中の神経管閉鎖に伴って遊走する神経堤細胞（neural crest cells）は、ソマトスタチンに対する免疫活性および副腎由来の特性（カテコールアミン陽性）を有する。これは神経堤細胞の発生初期にのみ出現する事象であり（Maxwell, G. D. et al., Developmental Biology, 108:203-209 (1985)；Garcia-Arraras, J. E. et al., Cell and Tissue Research, 295:33-41 (1999)）、その多くは生後に消失する。そのソマトスタチン受容体を消失した細胞は、癌の発生時に再びソマトスタチン受容体を発現する。以下の癌がそのサブタイプ（ｓｓｔ２、ｓｓｔ３、ｓｓｔ５）に対する選択性を有することが知られている：甲状腺髄様癌（Ｃ細胞）；下垂体不活性型腺腫；下垂体成長ホルモン腺腫；腎細胞癌；胃腸膵管系腫瘍（クロム親和性細胞）；褐色細胞腫；神経芽細胞腫／髄芽腫／髄膜腫；リンパ腫；傍神経節腫（Reubi, J. C. et al., European Journal of Nuclear Medicine, 28:836-846 (2001)）；乳癌（エストロジェン受容体を有する細胞）（Reubi, J. C. et al.（上記）；Orlando, C. et al., Endocrine-Related Cancer, 11:323-332 (2004)）；小細胞肺癌（Reubi, J. C. et al.（上記）；Papotti, M. et al., Virchows Archiv, 439:787-797 (2001)）；肝臓癌（Reubi, J. C. et al.（上記）；Blaker, M. et al., Journal of Hepatology, 41:112-118 (2004)）；眼球内ブドウ膜メラノーマ（Filali, M. K. E. et al., Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology, 246:1585-1592 (2008)）；転移性肉腫（Friedberg, J. W. et al., Cancer, 86:1621-1627 (1999)）；メラノーマ（Lum, S. S. et al., World Journal of Surgery, 25:407-412 (2001)）；癌組織周囲の内皮細胞（Denzler, B. et al., Cancer, 85:188-198 (1999)）；急性骨髄性白血病（移動能を有する急性骨髄性白血病細胞）（Oomen, S. P. M. A. et al., Leukemia, 15:621-627 (2001)）。従って、本発明は、このようなソマトスタチン受容体を発現する任意の癌に対して有効である。
【００１５】
本発明は、オクトレオチドで修飾されたリポソームを含む、甲状腺髄様癌などの癌の治療、緩和ケアまたは予防用医薬組成物を提供する。また、本発明は、本発明の組成物を投与する工程を含む、ＭＴＣなどの癌の治療、緩和ケアまたは予防のための方法を提供する。本発明の医薬組成物は、一般に１ナノメートル超の大きさを有する。このような医薬組成物を、本明細書において「ナノ製剤」ともいう。また、１ナノメートル超の大きさを本明細書において「ナノサイズ」ともいう。
【００１６】
本発明において、ＳＳＴＲに結合する物質をリガンドとして使用する。好ましくは、ＳＳＴＲに結合する物質はオクトレオチドである。「オクトレオチド」（本明細書において「Ｏｃｔ」ともいう）は、ソマトスタチンの生物学的活性を示すのに重要な部分である４つのアミノ酸（Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ）をそのままの配列で残した８個のアミノ酸よりなる環状ペプチドであり、ＳＳＴＲに対する高親和性を有し、増加した血漿半減期を示すソマトスタチンアナログである。ＳＳＴＲに結合する物質はオクトレオチドに限定されるものではなく、ＳＳＴＲに結合する能力を有し、本発明の医薬組成物において使用した場合に、ＭＴＣなどの癌の細胞に対する毒性を示す任意の物質を使用することができる。
【００１７】
本発明において使用する用語「リポソーム」は、リン脂質を使用して得られる小胞を指す。本発明において任意のリン脂質を使用することができる。リン脂質の例としては、限定するものではないが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。好ましくは、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）などが使用される。さらに、他の脂質、例えば、コレステロール（Ｃｈｏｌ）を添加してもよい。
【００１８】
１つの実施態様において、本発明によるリポソームは、ポリ（エチレングリコール）でさらに修飾されていてもよい。本明細書において使用する用語「ポリ（エチレングリコール）」（本明細書において「ＰＥＧ」ともいう）は、エチレングリコールが重合したポリエーテルを指す。本発明において任意の分子量のＰＥＧを使用することができるが、ＰＥＧの分子量は、好ましくは５００以上、より好ましくは１０００以上、さらに好ましくは１５００以上であり、好ましくは６０００以下、より好ましくは５０００以下、さらに好ましくは４０００以下である。例えば、ＰＥＧは３４００の平均分子量を有する。
【００１９】
リポソームに対するＯｃｔの比率、すなわち、リポソームにおけるＯｃｔの濃度は、例えば０．８ｍｏｌ％超、好ましくは１．０ｍｏｌ％以上、より好ましくは１．２ｍｏｌ％以上、さらに好ましくは１．４ｍｏｌ％以上、さらにより好ましくは１．６ｍｏｌ％以上である。本発明者らは、より高いＯｃｔ濃度がＭＴＣ細胞に対する細胞毒性に有効であることを見出した。従って、リポソームにおけるオクトレオチドの濃度は、高いことが望ましいが、例えば１０ｍｏｌ％以下、好ましくは８ｍｏｌ％以下、より好ましくは６ｍｏｌ％以下、さらに好ましくは５ｍｏｌ％以下である。Ｏｃｔ修飾したリポソームに関する以前の報告において使用されていたリポソームにおけるＯｃｔの濃度は約０．５ｍｏｌ％であり（非特許文献２、３）、本発明では、より高濃度のＯｃｔを使用することが好ましい。
【００２０】
例えば、ＯｃｔおよびＰＥＧを含むリポソームを、Hattori, Y. et al., J. Control. Release, 136:30-37 (2009)に記載方法に従って、ＤＳＰＣおよびＣｈｏｌを混合し、フィチン酸（ＩＰ−６）を加えて振とうすることによってリポソームを調製し、これにＯｃｔ、ＰＥＧ、ＤＳＰＥの結合体（Ｏｃｔ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）を加えることによって得ることができる（後付け修飾）。あるいは、上記Hattori, Y. et al.に記載の方法に従って、ＤＳＰＥ、Ｃｈｏｌ、Ｏｃｔ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを混合して、フィチン酸（ＩＰ−６）を加えて振とうすることによってＯｃｔおよびＰＥＧを含むリポソームを調製することもできる。
【００２１】
Ｏｃｔでの修飾は上記のような方法に限定されるものではなく、ＯｃｔがＳＳＴＲと結合可能な状態でリポソームに含まれる限り、当技術分野において公知の任意の方法を使用することができる。
【００２２】
また、上記のような方法でリポソームを調製する場合は、リポソーム当たりのＰＥＧの量が、Ｏｃｔが結合したＯｃｔ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥの量によって決定されるが、ＰＥＧを含まないリポソームを調製することや、ＰＥＧの量を任意に増加または減少させることもできる。そのような方法は当技術分野において公知である。
【００２３】
薬剤が血管内に投与される場合には、体内ではナノサイズよりも小さい分子でしか通過できない毛細血管が大半を占められているため、ナノ製剤は、正常細胞周辺では血管を透過して細胞に簡単には達することはできない。そのため血管内に投与されたナノ製剤は高濃度で血管内に維持されることになる（Igarashi, E., Toxicol Appl Pharmacol, 229:121-34 (2008)）。一方、癌細胞周辺では血管新生が盛んであり、増殖能が高いためにナノサイズの物質でも容易に血管を透過することができる。従って、ナノ製剤は、血管内で癌組織選択性を有している。この標的ナノ製剤は、癌発生の時期の細胞に特に強く発現するソマトスタチン受容体に対して高い親和性を有するペプチド（Ｏｃｔ）を癌細胞の標的として使用し、ナノサイズによる組織選択性により、選択的に癌組織に到達し、なおかつ癌細胞選択性によって癌細胞に取り込まれ、癌細胞との相互作用により長く癌組織に滞留することが可能であるので非標的ナノ製剤に比べて有効性と安全性において有利であり、患者のＱＯＬの改善にも結びつくことが期待される。
【００２４】
１つの実施態様において、本発明によるリポソームには、薬物が封入されていてもよい。薬物を上記のようなリポソームの調製の際に添加することによって、薬物をリポソームに封入することができる。薬物：リポソームの質量比は、適宜決定され、例えば０．１：１以上、好ましくは０．２：１以上、より好ましくは０．４：１以上、であり、例えば１：１以下、好ましくは０．８：１以下、さらに好ましくは０．６：１以下である。
【００２５】
薬物としては、例えばイリノテカン、ドキソルビシンなどの任意の抗癌剤を使用することができる。好ましくは、本発明によるリポソームに封入される薬物は、ＭＴＣなどの癌に対して作用する抗癌剤であり、より好ましくはイリノテカンである。「イリノテカン」（本明細書において「ＣＰＴ−１１」ともいう）は、カンプトテシンの水溶性誘導体であり、カルボキシエステラーゼによって活性型のＳＮ−３８に変換されて、トポイソメラーゼを阻害する。ＣＰＴ−１１の投与に際して、下痢、腸炎、骨髄抑制、吐き気、嘔吐、下血、腸閉塞、間質性肺炎などの副作用が見られることが知られている。薬物の投与量は、例えばＣＰＴ−１１の場合、例えば３０ｍｇ／ｋｇ体重未満、好ましくは２５ｍｇ／ｋｇ体重以下、より好ましくは２０ｍｇ／ｋｇ体重以下、さらに好ましくは１５ｍｇ／ｋｇ体重以下であり、例えば１ｍｇ／ｋｇ体重以上、好ましくは２ｍｇ／ｋｇ体重以上、より好ましくは５ｍｇ／ｋｇ体重以上であり、最も好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。本発明によれば、ＣＰＴ−１１のような薬物の投与量を低下させることができるので、従来の高投与量（３０ｍｇ／ｋｇ体重）に伴う上記の種々の副作用を軽減することができる。
【００２６】
嘔吐は、抗癌剤治療あるいは手術後に発生する。これは患者のＱＯＬの低下の原因となっている。嘔吐は、抗分泌薬と抗嘔吐薬の両方あるいは何れかの薬剤を使用することによって抑制される。Ｏｃｔは、急速に消化管分泌を減らすことができ、鎮痙薬のヒヨスチン・ブチルブロマイドが効かない高度の腸閉塞を持つ患者に特に重要な役割を持っている。Ｏｃｔは、緩和ケア治療薬として使用されており、モルヒネ、ヒヨスチン・ブチルブロマイドやハロペディドールなどの他の緩和ケア薬剤との併用治療も可能である（Ripamonti, C. I. et al., European Journal of Cancer, 44:1105-1115 (2008)）。現在、処方薬として使用されているＯｃｔによる治療では、細胞選択性はあるが、ナノサイズではないので、痛みの部位周辺組織への選択性は期待できない。しかし、Ｏｃｔと併用されている薬剤を封入したＯｃｔ修飾ナノ製剤の作製により、痛みの部位周囲の組織への選択的な集積、Ｏｃｔによる細胞選択性による痛みの部位周辺の組織と細胞への集積により有効な緩和ケア治療薬も可能となる。
【００２７】
本発明の医薬組成物の投与は、全身投与、局所投与のいずれでもよい。投与経路は、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、鼻腔内などの任意の経路であり得る。本発明の医薬組成物は、賦形剤、希釈剤、安定化剤等、製剤の分野で使用される任意の成分をさらに含んでもよい。
【００２８】
本発明の医薬組成物を、インビトロで、例えば、ＭＴＣなどの癌由来細胞株に対する細胞毒性を指標として評価することができる。さらに、本発明の医薬組成物を、インビボで、例えば、動物における腫瘍サイズ、生存率などを調べることによって評価することができる。
【００２９】
本発明の医薬組成物の延命効果を、［（処置群平均生存日数）−（コントロール投与群平均生存日数）／（コントロール投与群平均生存日数）］×１００（％）の式に従って算出される％ＩＬＳ（increase of life-span；延命率）によって評価することができる。例えば、生理食塩水をコントロールとした場合、％ＩＬＳは、例えば１００以上、好ましくは１２０以上、より好ましくは１５０以上、さらに好ましくは１８０以上、さらにより好ましくは２００以上である。
【００３０】
本発明者らは、本発明の組成物を使用して、インビボで、薬物投与終了後でも、腫瘍サイズの増加が抑制され、動物が延命され、ＭＴＣが完全に治癒され得ることを示した。従来、ＭＴＣの処置は外科的切除によって行われていた。イリノテカンのＭＴＣに対する効力は示唆されていたが、その副作用は重篤であり、有効な薬物療法は確立されていなかった。本発明は、ＭＴＣなどの癌の治療、緩和ケアおよび予防に有効な医薬組成物を初めて開示するものである。さらに、本発明者らは、ＯｃｔおよびＰＥＧを含む薬物未封入リポソームがＭＴＣ細胞に対する細胞毒性を示すことを見出した。Ｏｃｔは従来、ソマトスタチン受容体検出用診断薬や、薬物の標的化送達のためのリガンドとして使用されており、薬物未封入Ｏｃｔ修飾リポソーム自体が細胞毒性を示すことは予想外であった。本発明の医薬組成物によって示されるインビボでのＭＴＣに対する効果は、そこに封入されたＣＰＴ−１１の効果がＯｃｔ修飾リポソームによって相加的または相乗的に増強されたものである可能性がある。甲状腺髄様癌（Ｃ細胞）を用いたインビボ担癌動物モデル実験では、遊離の薬剤およびリガンドのないＣＰＴ−１１封入ナノ製剤が部分寛解であるのに比べ、ＣＰＴ−１１封入Ｏｃｔ修飾ナノ製剤は完全寛解した。これは、最適なＯｃｔの修飾率による増強効果によるものと考えられることから、本発明のＯｃｔ修飾ナノ製剤は、他の抗癌剤に対しても同様の効果を有することが期待できる。
【００３１】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
実施例１：Ｏｃｔ修飾リポソームの特徴付け
（１）リポソームの調製および修飾
ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ、日油）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ、和光純薬）（モル比５５：４５；質量比８０ｍｇ：３２ｍｇ）をエタノールに溶解し、７０℃に設定したロータリーエバポレーターを使用してエタノールをわずかに残して除去した。これに、トリエタノールアミンでｐＨ６．５に調整した８０ｍＭフィチン酸（ＩＰ−６）溶液（ナカライテスク）を加え、得られた混合物を７０℃で温めながら５分間激しく振とうして、リポソームを得た。得られたリポソームを再度エバポレーターにかけ、残りのエタノールを除去した。超音波処理によりリポソームサイズを約１５０ｎｍにした。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０を使用したゲルろ過により外液をＨＢＳ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に置換し、リポソーム画分を集めた。リン脂質テストワコー（和光純薬）を用いて、集めたリポソーム画分のＤＳＰＣ濃度を測定した。求めたＤＳＰＣ濃度およびＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌのモル比（５５：４５）に基づいて総脂質量を算出した。【００３３】
調製したリポソーム溶液に、イリノテカン（「ＣＰＴ−１１」、ヤクルト本社）水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を、ＣＰＴ−１１：総脂質＝０．６：１（質量比）になるように加え、６０℃で６０分インキュベートして、ＣＰＴ−１１を封入した。ドキソルビシン（「ＤＸＲ」、和光純薬）封入リポソームの場合は、ＤＸＲ：総脂質＝０．２：１（質量比）になるようにＤＸＲを加え、６０℃で２５分インキュベートして封入した。インキュベーション終了後、５分間氷冷し反応を停止した。未封入の薬物をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０を使用したゲルろ過により除去して、未修飾リポソーム（「ＣＬ」）を得た。【００３４】
オクトレオチド−ポリ（エチレングリコール）３４００−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（Ｏｃｔ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、神戸天然物化学）水溶液を、リポソーム総脂質量の０．２５、０．８、１．０、１．２、１．４または１．６ｍｏｌ％となるように上記で得られたＣＬに加え、得られた混合物を６０℃で２０分間加温し（後付け修飾）、Ｏｃｔ修飾リポソーム（Ｏｃｔ−ＣＬ）として「０．２５Ｏｃｔ−ＣＬ」、「０．８Ｏｃｔ−ＣＬ」、「１．０Ｏｃｔ−ＣＬ」、「１．２Ｏｃｔ−ＣＬ」、「１．４Ｏｃｔ−ＣＬ」、および「１．６Ｏｃｔ−ＣＬ」を得た。
（４．４Ｏｃｔ−ＣＬの調製法です。）
４．４Ｏｃｔ−ＣＬは、ＤＳＰＣ、ＣｈｏｌおよびＯｃｔ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（モル比５５：４５：８．８；質量比５．６８ｍｇ：２．２８ｍｇ：６ｍｇ）を用い、リポソームの調製およびＤＸＲの封入はＣＬと同様の方法で行った (先付け修飾)。【００３５】
ＰＥＧ化非Ｏｃｔ修飾リポソーム（「ＳＬ」）を、Ｏｃｔ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥの代わりにメトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、日油）を１．６ｍｏｌ％となるように加えて調製した。【００３６】
薬物未封入リポソームを、薬物（ＣＰＴ−１１、ＤＸＲ）封入を行わなかった以外、上記の薬物封入リポソームと同じ手順で調製した。【００３７】
（２）Ｏｃｔ修飾リポソームの特徴付け
得られたＯｃｔ修飾リポソーム（０．２５Ｏｃｔ−ＣＬ、０．８Ｏｃｔ−ＣＬおよび１．６Ｏｃｔ−ＣＬ）ならびに未修飾リポソーム（ＣＬ）およびＰＥＧ化非Ｏｃｔ修飾リポソーム（ＳＬ）について、サイズ（ｎｍ）およびゼータ電位（ｍＶ）（ＥＬＳ−Ｚ２（大塚電子）使用）ならびにＣＰＴ−１１封入効率（％）を測定した。リポソーム中の薬物の濃度を、１％Ｔｒｉｔｏｎによるリポソームの破壊後、ＤＸＲについては４８０ｎｍでＵＶ−１７００  ＰｈａｒｍａＳｐｅｃ（島津製作所）を使用して、ＣＰＴ−１１については励起波長３７５ｎｍおよび蛍光波長５３５ｎｍでＷａｌｌａｃ  ＡＲＶＯ  ＳＸ１４２０マルチラベルカウンター（PerkinElmer）を使用して測定した。結果を平均±ＳＤ（ｎ＝３）で表１に示す。【００３８】
【表１】
2012035794.tif 000002
【００３９】
オクトレオチド（Ｏｃｔ）濃度の増加にともなって（０〜１．６ｍｏｌ％）、リポソームのゼータ電位が低下した。このことは、リポソームがＯｃｔで修飾されたことを示唆する。リポソームの修飾後の最終Ｏｃｔ濃度を、１％Ｔｒｉｔｏｎにおける１：１，０００希釈後にＯｃｔ−ＥＩＡキット（Peninsula Laboratories）を使用して測定したところ、それぞれのＯｃｔ修飾リポソームにおけるＯｃｔの量は理論値の７０％より多かった。ＣＰＴ−１１封入効率はＣＬ以外の全てのリポソームにおいて＞８２％であった。全てのタイプのリポソームの平均直径およびその中に封入されたＣＰＴ−１１の量は、暗所４℃で少なくとも１ヶ月変化しなかった。【００４０】
実施例２：細胞内取り込みに対するＯｃｔ濃度の効果
ソマトスタチン受容体（ＳＳＴＲ）を高発現するヒト甲状腺髄様癌細胞株であるＴＴ細胞（European Collection of Cell Cultures（ECACC）から入手）を、６ウェルプレートに、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地中、１０４細胞／ウェルの密度で播種し、７２時間培養した。細胞に、ＤＸＲ量として５０μｇ／ｍｌの０．２５Ｏｃｔ−ＣＬ、０．８Ｏｃｔ−ＣＬ、１．０Ｏｃｔ−ＣＬ、１．２Ｏｃｔ−ＣＬ、１．４Ｏｃｔ−ＣＬ、１．６Ｏｃｔ−ＣＬ、４．４Ｏｃｔ−ＣＬまたはＳＬを含む培地（２ｍｌ／ウェル）を添加し、３７℃で１または２時間インキュベートした。なお、ＣＰＴ−１１は下記の波長で励起されないので、本実施例ではＣＰＴ−１１の代わりにＤＸＲを封入したリポソームを使用した。培地を除去し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、次いで、リポソームの細胞内取り込みを、４８８ｎｍアルゴンイオンレーザーを備えたＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Becton-Dickinson）およびＣＥＬＬ  Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Becton-Dickinson Immunocytometry System）を使用して分析した。２時間の培養後の相対平均蛍光強度を図１に示す。図１において、０．２５、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６、４．４およびＳＬはそれぞれ０．２５Ｏｃｔ−ＣＬ、０．８Ｏｃｔ−ＣＬ、１．０Ｏｃｔ−ＣＬ、１．２Ｏｃｔ−ＣＬ、１．４Ｏｃｔ−ＣＬ、１．６Ｏｃｔ−ＣＬ、４．４Ｏｃｔ−ＣＬおよびＳＬについての結果を示し、＊は、ＳＬとの統計的有意差を示す（ｐ＜０．０５）。【００４１】
図１に示すように、Ｏｃｔ修飾されていないＳＬと比較して、０．２５Ｏｃｔ−ＣＬおよび０．８Ｏｃｔ−ＣＬの細胞内取り込みはむしろ低かった。また、０．２５Ｏｃｔ−ＣＬと０．８Ｏｃｔ−ＣＬとの間には有意な差はなかった。一方、１．４Ｏｃｔ−ＣＬ、１．６Ｏｃｔ−ＣＬおよび４．４Ｏｃｔ−ＣＬの細胞内取り込みは他と比較して有意に高かった。すなわち、従来技術において使用されていたような低いＯｃｔ濃度（約０．５％）では、Ｏｃｔ修飾による細胞内取り込み増強効果は観察されず、細胞毒性の発揮において高いＯｃｔ濃度（１．６ｍｏｌ％）でのＯｃｔ修飾が有効であることが示された。【００４２】
２時間インキュベートした後の１．６Ｏｃｔ−ＣＬの蛍光強度は１時間後の２倍に増加したが、ＳＬではそのような増加は観察されなかった。すなわち、Ｏｃｔ−ＣＬの細胞内取り込みはインキュベーション時間依存的に増加することが示された。【００４３】
実施例３：競合阻害試験
実施例２において観察された細胞内取り込みがソマトスタチン受容体（ＳＳＴＲ）を介しているかどうかを調べるために、競合阻害試験を行った。詳細には、２０倍モル過剰量（８４ｎｍｏｌ／ｍｌ）の遊離Ｏｃｔ（Acris Antibodies GmbH）の存在下での、ＤＸＲを封入した１．６Ｏｃｔ−ＣＬ（Ｏｃｔ：４．２ｎｍｏｌ／ｍｌ）の３７℃で２時間のＴＴ細胞内取り込みを、フローサイトメトリーにより調べた。その結果、過剰量の遊離Ｏｃｔは１．６Ｏｃｔ−ＣＬの細胞内取り込みに影響を与えなかった。この理由は明らかではないが、上記の結果によって、Ｏｃｔ修飾リポソームのＳＳＴＲに対する親和性が遊離Ｏｃｔより高いことが示唆された。【００４４】
次に、２倍容量（２５８μＬ）の薬物を封入していない空の１．６Ｏｃｔ−ＣＬ（Ｅｍｐｔｙ  １．６Ｏｃｔ−ＣＬ）、またはコントロールとして空のＳＬ（Ｅｍｐｔｙ  ＳＬ）の存在下での、ＤＸＲを封入した１．６Ｏｃｔ−ＣＬの３７℃で２時間のＴＴ細胞内取り込みを、フローサイトメトリーにより調べた。その結果、いずれの場合でも阻害が観察されたが、Ｅｍｐｔｙ  Ｏｃｔ−ＣＬ存在下での細胞内取り込みは、Ｅｍｐｔｙ  ＳＬ存在下での約半分であり、Ｅｍｐｔｙ  Ｏｃｔ−ＣＬによる細胞内取り込みの有意に高い競合的阻害が示された（図２（Ｂ））。この競合的阻害を模式的に図２（Ａ）に示す。さらに、共焦点レーザー顕微鏡観察により、封入した薬物（ＤＸＲ）は核内に取り込まれていることが示された（図３）。このように、薬剤を封入した１．６Ｏｃｔ−ＣＬの核内への取り込みが、Ｏｃｔ修飾依存性であることが示された。【００４５】
実施例３：細胞毒性試験
（１）ＣＰＴ−１１封入リポソームを用いた細胞毒性試験
ＴＴ細胞を９６ウェルプレートに１０４細胞／ウェルの密度で播種し、そこに種々の濃度の遊離ＣＰＴ−１１、１．６Ｏｃｔ−ＣＬまたはＳＬを添加し、４８時間、７２時間および９６時間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄した後、発色試薬（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８、同仁化学研究所）を１ウェル（１００μＬ）当たり１０μＬ添加し、４５０ｎｍで吸光度を測定し、ＩＣ５０（μＭ）を算出した。結果を表２に示す。【００４６】
【表２】
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【００４７】
表２に示すように、いずれの場合も細胞毒性は経時的に増加した。９６時間でのＳＬについてのＩＣ５０値は、遊離ＣＰＴ−１１のものとほぼ同じであった。一方、１．６Ｏｃｔ−ＣＬの細胞毒性は、４８時間では遊離ＣＰＴ−１１より低かったが、９６時間では遊離ＣＰＴ−１１の約１／２と遊離ＣＰＴ−１１を上回った。すなわち、いずれの薬物封入リポソームについても細胞毒性は見られたが、Ｏｃｔ修飾した薬物封入リポソームを使用した場合、長時間のインキュベーション後に細胞毒性が増強されることが示された。これは、受容体を介したエンドサイトーシス機構によって細胞内取り込みが促進され、活性型のＳＮ−３８への変換によって発揮されるＣＰＴ−１１の細胞毒性が増強されるためであることが確認されている（データは示さず。）。【００４８】
（２）薬物未封入リポソームを用いた細胞毒性試験
上記結果から、ＣＰＴ−１１に加えて、標的化のためのリガンドとしてのＯｃｔで修飾したリポソーム自体が細胞毒性を有している可能性が示唆された。そこで次に、細胞毒性に対するリガンド（Ｏｃｔ）の効果を評価するために、ＣＰＴ−１１未封入のリポソームを用いて細胞毒性試験を行った。詳細には、９６ウェルプレートに播種したＴＴ細胞に、各種濃度（Ｏｃｔ量として０．０４２〜８．４μＭ）の薬物を封入していないＰＥＧ化非Ｏｃｔ修飾リポソーム（Ｅｍｐｔｙ  ＳＬ）、薬物を封入していない１．６ｍｏｌ％Ｏｃｔ修飾リポソーム（Ｅｍｐｔｙ  １．６Ｏｃｔ−ＣＬ）、薬物を封入していない４．４ｍｏｌ％Ｏｃｔ修飾リポソーム（Ｅｍｐｔｙ  ４．４Ｏｃｔ−ＣＬ）、コントロールとしての遊離Ｏｃｔを添加し、９６時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄した後、発色試薬を添加し、４５０ｎｍで吸光度を測定した。ここで、Ｅｍｐｔｙ  ４．４Ｏｃｔ−ＣＬを、最初からＯｃｔ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥをＤＳＰＥ：Ｃｈｏｌ：Ｏｃｔ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ＝５５：４５：８．８（モル比）となるように加えた以外、実施例１と同様に調製した。これは、Ｏｃｔ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥの低い水溶性の故に、１．６ｍｏｌ％より高い濃度での後付け修飾が困難であったからである。【００４９】
結果を図４に示す。図４において、各濃度について４つの棒は、それぞれ左から遊離Ｏｃｔ、Ｅｍｐｔｙ  １．６Ｏｃｔ−ＣＬ、Ｅｍｐｔｙ  ４．４Ｏｃｔ−ＣＬ、Ｅｍｐｔｙ  ＳＬについての細胞生存率（％）を示す。いずれの濃度でも、遊離のＯｃｔに細胞毒性が観察された。リポソームの中では、より高濃度のＯｃｔで修飾されたＥｍｐｔｙ  ４．４Ｏｃｔ−ＣＬが、いずれの濃度でも特に高い細胞毒性を示し、これは遊離Ｏｃｔのものより高かった。この結果は、リポソームにおける高濃度のＯｃｔが細胞毒性を示すことを示唆する。【００５０】
（３）Ａｋｔ、ＴＳＣ２およびｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化に対するＯｃｔ−ＣＬの効果
Ｏｃｔは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＴＳＣ２／ｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６Ｋシグナルカスケード（図５）のＴＳＣ２、ｍＴＯＲおよびｐ７０Ｓ６Ｋタンパク質のリン酸化に関与することが知られている。上記のＯｃｔによる細胞毒性とＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＴＳＣ２／ｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６Ｋシグナルカスケードとの関係を調べるために、この経路のＡｋｔ、ＴＳＣ２およびｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化に対するＥｍｐｔｙ  １．６Ｏｃｔ−ＣＬの効果を調べた。詳細には、ＴＴ細胞をＥｍｐｔｙ  １．６Ｏｃｔ−ＣＬ（Ｏｃｔ濃度として０．４２μＭ）またはＥｍｐｔｙ  ＳＬ（Ｅｍｐｔｙ  １．６Ｏｃｔ−ＣＬの脂質量に相当する量）で２４時間処理した後、細胞抽出液（タンパク質量：４０μｇ／レーン）中のＡｋｔ（分子量６０  ｋＤａ）、ＴＳＣ２（分子量２００  ｋＤａ）およびｐ７０Ｓ６Ｋタンパク質（分子量７０  ｋＤａ、８５  ｋＤａ）を電気泳動し、一次抗体としてのＡｋｔ−抗体、ＴＳＣ２−抗体、ｐ７０Ｓ６Ｋ−抗体、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ−抗体、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＴＳＣ２−抗体およびｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ７０Ｓ６Ｋ−抗体（Cell Signaling Technology、すべて１０００倍希釈）および二次抗体としてのヤギ抗ウサギ−ＨＲＰ（Santa Cruz Biotechnology、２５００倍希釈）を使用して検出を行った。【００５１】
図６に示すように、Ｅｍｐｔｙ  １．６Ｏｃｔ−ＣＬを添加した場合、ｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化が低下したが、ＡｋｔおよびＴＳＣ２のリン酸化には影響がなかった。Ｅｍｐｔｙ  ＳＬは、今回検討したＡｋｔ、ＴＳＣ２およびｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化に影響を与えなかった。このことは、Ｅｍｐｔｙ  Ｏｃｔ−ＣＬによる細胞毒性はＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＴＳＣ２／ｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６Ｋシグナルカスケードにおけるリン酸化の低下に関連することを示唆する。また、このリン酸化の低下が、Ｅｍｐｔｙ  ＳＬではおきないことから、リポソームを構成する脂質による影響ではなく、リガンドであるＯｃｔに関連することを示唆する。【００５２】
実施例４：インビボにおけるＣＰＴ−１１封入リポソームの効果
ＣＰＴ−１１を封入したＯｃｔ修飾リポソームのインビボにおける効果を調べるために以下の実験を行った。ＴＴ細胞１０7個をマウス（ＩＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウス、６週齢、メス、オリエンタル酵母）に移植して、１００〜２５０ｃｍ３の腫瘍体積の腫瘍を形成させた。各群４匹のマウスに、ＣＰＴ−１１量として１０ｍｇ／ｋｇ体重の未修飾リポソーム（ＣＬ）、１．６ｍｏｌ％Ｏｃｔ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥで修飾したリポソーム（１．６Ｏｃｔ−ＣＬ）、１．６ｍｏｌ％Ｏｃｔ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥおよび０．９％ｍｏｌ％ＰＥＧ−ＤＳＰＥで修飾したリポソーム（１．６Ｏｃｔ−ＳＬ）を投与した。投与は尾静脈より２回（１日目、４日目）行った。コントロールとして、生理食塩水、遊離ＣＰＴ−１１（３０ｍｇ／ｋｇ）を３回（１日目、４日目、７日目）投与した。腫瘍サイズおよび体重を経時的に測定した。結果をそれぞれ図７および８に示す。図７、８において、白丸、三角、灰四角、黒丸、白四角はそれぞれＣＬ、１．６Ｏｃｔ−ＣＬ、遊離ＣＰＴ−１１、生理食塩水、１．６Ｏｃｔ−ＳＬについての結果を示す。図７において、実線の矢印はＣＬ、１．６Ｏｃｔ−ＣＬ、１．６Ｏｃｔ−ＳＬの投与を、破線の矢印は遊離ＣＰＹ−１１、生理食塩水の投与を示し、＊はＣＬに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。また、生存時間および累積生存率をそれぞれ表３および図９に示す。図９において、丸、四角、三角はそれぞれＣＬ、１．６Ｏｃｔ−ＣＬ、１．６Ｏｃｔ−ＳＬについての結果を示す。表３における％ＩＬＳを、生理食塩水をコントロールとして、［（処置群平均生存日数）−（コントロール投与群平均生存日数）／（コントロール投与群平均生存日数）］×１００（％）の式に従って算出した。表３中のメジアンはＮ匹の動物からなるそれぞれの群についての生存時間（日）の中央値を表す。【００５３】
【表３】
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【００５４】
測定期間中、体重に有意な差は見られなかった。遊離ＣＰＴ−１１を投与した場合は、生理食塩水を投与した場合と同様に、腫瘍サイズが増加し、延命効果は見られなかった。ＣＬの場合もほぼ同様の結果が得られた。一方、Ｏｃｔ修飾したリポソーム（１．６Ｏｃｔ−ＣＬ、１．６Ｏｃｔ−ＳＬ）を投与した場合は、いずれも腫瘍サイズの増加が有意に抑制され、生存時間および生存率が有意に増加した。特に１．６Ｏｃｔ−ＣＬ投与群では、半数の動物が、薬物投与終了後でも３００日以上生存し、腫瘍が完全に治癒されたことが示唆された。【００５５】
遊離ＣＰＴ−１１はインビトロでは細胞毒性を示したが（実施例３、表２、図４など）、インビボではコントロールとして使用した生理食塩水と同様な効果しか示さなかった。このように、インビトロでの結果からインビボにおける効果を予測することは困難であった。本発明者らは、これまでに有効な薬物療法が確立されていないＭＴＣを、Ｏｃｔ修飾リポソームを使用してインビボで治療できることを初めて示した。また、Ｏｃｔ修飾リポソームを使用した場合のＣＰＴ−１１の投与量は、遊離ＣＰＴ−１１の投与量よりかなり低かった（１／３）。すなわち、本発明によれば、ＣＰＴ−１１の投与量を低下させ、副作用を軽減できることが示された。【００５６】
同様に、ＣＰＴ−１１量として１０ｍｇ／ｋｇ体重の１．６Ｏｃｔ−ＣＬおよび２．５％ｍｏｌ％ＰＥＧ−ＤＳＰＥで修飾したリポソーム（２．５Ｏｃｔ−ＳＬ）ならびにコントロールとしての生理食塩水を、１００ｃｍ３の腫瘍体積の腫瘍を有する各群６匹のマウスに尾静脈より２回（１日目、４日目）投与して、腫瘍サイズ、体重および生存率を経時的に測定した。結果をそれぞれ図１０、１１および１２に示す。図１０、１１および１２において、白三角、丸、黒三角はそれぞれ１．６Ｏｃｔ−ＣＬ、ＳＬ、生理食塩水についての結果を示す。図１０において、＊および＃はそれぞれＳＬおよび１．６Ｏｃｔ−ＣＬに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。この場合にも、１．６Ｏｃｔ−ＣＬ投与群で、薬物投与終了後でも、腫瘍サイズの増加がほぼ完全に抑制された。Ｏｃｔ修飾されていないＳＬについても腫瘍サイズの抑制は観察されたが、１．６Ｏｃｔ−ＣＬ投与群での抑制効果の方が有意に高かった。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明により、オクトレオチドで修飾されたリポソームを含む、甲状腺髄様癌などの癌の治療、緩和ケアまたは予防用医薬組成物が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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