(57)【要約】  β−グルコシダーゼを生産することのできるシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体およびその製造方法を提供する。  糸状菌由来のβ−グルコシダーゼをコードする構造遺伝子配列、該構造遺伝子を発現させるためのプロモーター配列およびターミネーター配列を、染色体中に有するか、または、染色体外遺伝子として有することを特徴とするシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属酵母の形質転換体である。また、糸状菌由来のβ−グルコシダーゼをコードする構造遺伝子配列、該構造遺伝子を発現させるためのプロモーター配列およびターミネーター配列を含むベクターによりシゾサッカロミセス属酵母を形質転換することを特徴とするシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属酵母の形質転換体の製造方法である。
2012060389.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌由来のβ−グルコシダーゼをコードする構造遺伝子配列並びに該構造遺伝子を発現させるためのプロモーター配列およびターミネーター配列を、染色体中に有するか、または、染色体外遺伝子として有することを特徴とするシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属酵母の形質転換体。
【請求項２】
前記β−グルコシダーゼがＢＧＬ１である請求項１記載のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体。
【請求項３】
前記糸状菌が、アスペルギルス（Aspergillus）属の微生物である請求項１または２記載のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体。
【請求項４】
前記β−グルコシダーゼが、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるか、または該アミノ酸配列に１個以上のアミノ酸の欠失、置換または付加が入ったアミノ酸配列からなり、β-D-グルコピラノシド結合の加水分解反応を触媒する活性を有するβ−グルコシダーゼである請求項１〜３のいずれか一項記載のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体。
【請求項５】
前記β−グルコシダーゼをコードする構造遺伝子配列の５’末端側に、シゾサッカロミセス属酵母内で機能する分泌シグナルの構造遺伝子配列を有する、請求項１〜４のいずれか一項記載のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体。
【請求項６】
糸状菌由来のβ−グルコシダーゼをコードする構造遺伝子配列並びに該構造遺伝子を発現させるためのプロモーター配列およびターミネーター配列を含むベクターによりシゾサッカロミセス属酵母を形質転換することを特徴とするシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属酵母の形質転換体の製造方法。
【請求項７】
前記β−グルコシダーゼをコードする構造遺伝子配列の５’末端側に、シゾサッカロミセス属酵母内で機能する分泌シグナルの構造遺伝子配列を有する、請求項６記載のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体の製造方法。
【請求項８】
前記糸状菌由来のβ−グルコシダーゼをコードする構造遺伝子が、シゾサッカロミセス属酵母の染色体の１カ所以上に組み込まれる、請求項６または７記載のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体の製造方法。
【請求項９】
染色体への組み込みが相同組換えにより行われる、請求項８記載のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体の製造方法。
【請求項１０】
ベクターをトランスポゾン遺伝子Ｔｆ２部位に組み込む、請求項９記載のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか一項記載の形質転換体を培養して得られる菌体からβ−グルコシダーゼを取得することを特徴とするβ−グルコシダーゼの製造方法。
【請求項１２】
請求項５記載の形質転換体を培養して得られる培養液からβ−グルコシダーゼを取得することを特徴とするβ−グルコシダーゼの製造方法。
【請求項１３】
請求項１１または１２記載の製造方法で得られたβ−グルコシダーゼを用いることを特徴とするセルロースの分解方法。
【請求項１４】
請求項５記載の形質転換体をセルロースの存在下に培養することを特徴とするセルロースの分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シゾサッカロミセス属酵母の形質転換体およびその製造方法に関し、詳しくは、β−グルコシダーゼを生産することのできるシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
木材や稲ワラ、もみ殻、雑草などのセルロース系バイオマスから、発酵原料としての糖、ひいてはバイオエタノールなどのバイオマス燃料を生産するためには、植物細胞壁の主要な構成成分であるセルロースを分解する必要がある。セルロースの分解には、濃硫酸糖化法や希硫酸糖化法といった酸糖化法、酵素を利用した酵素糖化法などの方法があり、近年のバイオテクノロジーの隆盛を背景に、酵素糖化法の研究開発が盛んに行われている。セルロースの酵素糖化には、セルラーゼと総称される一群の酵素が利用される。まず、セルロース鎖をランダムに切断する活性を有するエンドグルカナーゼ（ＥＧ）が、セルロースの非結晶領域を分解し、グルコース末端を露出させる。露出したグルコース末端は、セロビオハイドラーゼ（ＣＢＨ）により分解され、セロビオースが遊離する。そして、遊離したセロビオースをβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）が分解することで、グルコースが遊離する。【０００３】
結晶セルロースを分解して糖化するための種々のセルラーゼやヘミセルラーゼを生産できることや、それらの酵素を細胞外に大量に分泌することができることから、セルロースの酵素糖化には、アスペルギルス属やトリコデルマ属といった糸状菌が広く利用されている。【０００４】
また、これら糸状菌のセルラーゼを異種株で発現させることも試みられており、非特許文献１には、糸状菌のひとつであるアスペルギルス・アクリータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）のβ−グルコシダーゼＩ（ＢＧＬＩ）をコードする遺伝子によって出芽酵母サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を形質転換し、得られた形質転換体にこれらの酵素を発現させたことが開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６２（８），１６１５−１６１８，１９９８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、酵素糖化法の場合、酵素によるセルロースの加水分解反応が進行し、グルコースが反応系内に蓄積すると、蓄積したグルコースがβ−グルコシダーゼを阻害し、セロビオースが蓄積し、さらに、蓄積したセロビオースがエンドグルカナーゼとセロビオハイドラーゼを阻害する結果、セルロースの完全分解が出来なくなるという問題がある。そのため、β−グルコシダーゼの高機能化が望まれていた。
一方、アスペルギルス属やトリコデルマ属よりも、シゾサッカロミセス属酵母の方が遺伝子解析が進んでおり、種々の有用な変異株や遺伝子導入用ベクターが確立している、タンパク質の工業的大量生産に適しているといった利点があるが、シゾサッカロミセス属酵母は、固有のβ−グルコシダーゼ遺伝子を有しておらず、セロビオースを資化することができない。
なお、非特許文献１には、出芽酵母に生産させたβ−グルコシダーゼのグルコース阻害については全く触れられていない。【０００７】
そこで本発明の目的は、β−グルコシダーゼを生産することのできるシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体およびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、糸状菌由来のβ−グルコシダーゼをコードする構造遺伝子配列等を染色体中に有するか、または、染色体外遺伝子として有するシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体とすることで、上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
本発明のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体およびその製造方法は下記［１］〜［１４］である。［１］糸状菌由来のβ−グルコシダーゼをコードする構造遺伝子配列並びに該構造遺伝子を発現させるためのプロモーター配列およびターミネーター配列を、染色体中に有するか、または、染色体外遺伝子として有することを特徴とするシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属酵母の形質転換体。［２］前記β−グルコシダーゼがＢＧＬ１である［１］記載のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体。［３］前記糸状菌が、アスペルギルス（Aspergillus）属の微生物である［１］または［２］記載のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体。［４］前記β−グルコシダーゼが、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるか、または該アミノ酸配列に１個以上のアミノ酸の欠失、置換または付加が入ったアミノ酸配列からなり、β-D-グルコピラノシド結合の加水分解反応を触媒する活性を有するβ−グルコシダーゼである［１］〜［３］のいずれか記載のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体。［５］前記β−グルコシダーゼをコードする構造遺伝子配列の５’末端側に、シゾサッカロミセス属酵母内で機能する分泌シグナルの構造遺伝子配列を有する、［１］〜［４］のいずれか記載のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体。［６］糸状菌由来のβ−グルコシダーゼをコードする構造遺伝子配列並びに該構造遺伝子を発現させるためのプロモーター配列およびターミネーター配列を含むベクターによりシゾサッカロミセス属酵母を形質転換することを特徴とするシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属酵母の形質転換体の製造方法。［７］前記β−グルコシダーゼをコードする構造遺伝子配列の５’末端側に、シゾサッカロミセス属酵母内で機能する分泌シグナルの構造遺伝子配列を有する、［６］記載のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体の製造方法。［８］前記糸状菌由来のβ−グルコシダーゼをコードする構造遺伝子が、シゾサッカロミセス属酵母の染色体の１カ所以上に組み込まれる、［６］または［７］記載のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体の製造方法。［９］染色体への組み込みが相同組換えにより行われる、［８］記載のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体の製造方法。［１０］ベクターをトランスポゾン遺伝子Ｔｆ２部位に組み込む、［９］記載のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体の製造方法。［１１］［１］〜［４］のいずれか記載の形質転換体を培養して得られる菌体からβ−グルコシダーゼを取得することを特徴とするβ−グルコシダーゼの製造方法。［１２］［５］記載の形質転換体を培養して得られる培養液からβ−グルコシダーゼを取得することを特徴とするβ−グルコシダーゼの製造方法。［１３］［１１］または［１２］記載の製造方法で得られたβ−グルコシダーゼを用いることを特徴とするセルロースの分解方法。［１４］［５］記載の形質転換体をセルロースの存在下に培養することを特徴とするセルロースの分解方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、β−グルコシダーゼを生産することのできるシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体およびその製造方法を提供することができる。
また、本発明のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体は、グルコース阻害に対する耐性が高いβ−グルコシダーゼを産生することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、発現ベクターpSL6AaBGL1の構成図である。
【図２】図２は、発現ベクターpSL6P3AaBGL1の構成図である。
【図３】図３は、試験例７の至適温度試験の結果を表すグラフであり、試験例６で得られた粗精製β−グルコシダーゼの各温度における活性を示す。
【図４】図４は、試験例７の至適ｐＨ試験の結果を表すグラフであり、試験例６で得られた粗精製β−グルコシダーゼの各ｐＨにおける活性を示す。
【図５】図５は、試験例７の熱安定性試験の結果を表すグラフであり、試験例６で得られた粗精製β−グルコシダーゼを各温度で１０分間処理した後の活性を示す。
【図６】図６は、試験例７のｐＨ安定性試験の結果を表すグラフであり、試験例６で得られた粗精製β−グルコシダーゼを各ｐＨで、３７℃、２４時間処理した後の活性を示す。
【図７】図７は、試験例８のセロビオースによる形質転換体の培養試験の結果を表すグラフである。（Ａ）がYPD培地での培養結果を示し、（Ｂ）がYP+cellobiose培地での培養結果を示す。
【図８】図８は、試験例９のグルコース阻害試験の結果を表すグラフである。
【図９】図９は、試験例１０のSDS-PAGEの結果を表す写真である。
【図１０】図１０は、試験例１０の熱安定性試験の結果を表すグラフである。
【図１１】図１１は、試験例１０のグルコース阻害試験の結果を表すグラフである。
【図１２】図１２は、試験例１１のN−結合型糖鎖除去の結果を表す写真である。
【図１３】図１３は、試験例１１の熱安定性試験の結果を表すグラフである。
【図１４】図１４は、試験例１１のグルコース阻害試験の結果を表すグラフである。
【図１５】図１５は、試験例１２の、ASP3326株由来のBGL1の活性増強効果を表すグラフである。
【図１６】図１６は、試験例１２の、ASP3326株由来、ASP3396株由来およびASP3397株由来のBGL1の活性増強効果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［形質転換体］
本発明の形質転換体は、糸状菌由来のβ−グルコシダーゼをコードする構造遺伝子配列並びに該構造遺伝子を発現させるためのプロモーター配列およびターミネーター配列を、染色体中に有するか、または、染色体外遺伝子として有することを特徴とするシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属酵母の形質転換体である。
【００１３】
（宿主）
本発明の形質転換体の宿主は、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属酵母である。本発明に用いるシゾサッカロミセス属酵母は野生型であってもよく、用途に応じて特定の遺伝子を欠失または失活させた変異型であってもよい。特定の遺伝子を欠失または失活させる方法としては、公知の方法を用いることができる。具体的には、Latour法（Ｎｕｃｒｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２００６）３４：ｅ１１、国際公開第２００７／０６３９１９号等に記載）を用いることにより遺伝子を欠失させることができる。また、変異剤を用いた突然変異分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年、学会出版センター）や、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を利用したランダム変異法（ピーシーアール・メソッズ・アプリケーション（ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．）、１９９２年、第２巻、ｐ．２８−３３。）等により遺伝子の一部に変異を導入することにより該遺伝子を失活させることができる。特定遺伝子を欠失または失活させたシゾサッカロミセス属酵母宿主としては、例えば、国際公開第２００２／１０１０３８号、国際公開第２００７／０１５４７０号等に記載されている。
【００１４】
さらに宿主となるシゾサッカロミセス属酵母には、形質転換体を選択するためのマーカーを有するものを用いることが好ましい。例えば、ある遺伝子が欠落していることにより特定の栄養成分が生育に必須である宿主を使用することが好ましい。目的遺伝子配列を含むベクターにより形質転換をして形質転換体を作製する場合、ベクターにこの欠落している遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を組み込んでおくことにより、形質転換体は宿主の栄養要求性が消失する。この宿主と形質転換体の栄養要求性の相違により、両者を区別して形質転換体を得ることができる。
例えば、オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ura4遺伝子）が欠失または失活してウラシル要求性となっているシゾサッカロミセス属酵母を宿主とし、ura4遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を有するベクターにより形質転換した後、ウラシル要求性が消失したものを選択することにより、ベクターが組み込まれた形質転換体を得ることができる。宿主において欠落により栄養要求性となる遺伝子は、形質転換体の選択に用いられるものであればura4遺伝子には限定されず、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（leu1遺伝子）等であってもよい。
【００１５】
シゾサッカロミセス属酵母としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、シゾサッカロミセス・ジャポニカス（Schizosaccharomyces japonicus）、シゾサッカロミセス・オクトスポラス（Schizosaccharomyces octosporus）等が挙げられる。上記シゾサッカロミセス属酵母のうち、種々の有用な変異株が利用できることから、シゾサッカロミセス・ポンベが好ましい。
【００１６】
（形質転換体）
本発明の形質転換体は、β−グルコシダーゼをコードする構造遺伝子配列並びに該構造遺伝子を発現させるためのプロモーター配列およびターミネーター配列を含む発現カセットを染色体中に有するか、または、染色体外遺伝子として有する。上記発現カセットを染色体中に有するとは、シゾサッカロミセス属酵母の染色体中の１カ所以上に発現カセットが組み込まれていることであり、染色体外遺伝子として有するとは、発現カセットを含むプラスミドを細胞内に有するということである。形質転換体の継代培養が容易であることから、上記発現カセットを染色体中に有することが好ましい。
なお、発現カセットとは、β−グルコシダーゼを発現するために必要なＤＮＡの組み合わせであり、β−グルコシダーゼ構造遺伝子とシゾサッカロミセス属酵母内で機能するプロモーターとターミネーターとを含む。
【００１７】
上記発現カセットには、さらに、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。好ましい発現カセットは、糸状菌由来のβ−グルコシダーゼ構造遺伝子、プロモーター、ターミネーター、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域を全て含む発現カセットである。さらに、栄養要求性相補マーカーなどの遺伝子を有していてもよい。
【００１８】
また、シゾサッカロミセス属酵母の細胞外に分泌されるβ−グルコシダーゼが増大し、β−グルコシダーゼの回収、精製が容易になることから、β−グルコシダーゼ構造遺伝子の５’末端側に、シゾサッカロミセス属酵母内で機能する分泌シグナル配列をコードする塩基配列（分泌シグナルの構造遺伝子）を有することが好ましい。β−グルコシダーゼ構造遺伝子の５’末端側とは、β−グルコシダーゼ構造遺伝子の５’末端側上流であって、β−グルコシダーゼ構造遺伝子の５’末端に隣接する位置である。また、β−グルコシダーゼの活性に影響しないＮ末側の数アミノ酸をコードする塩基配列が除かれ、その位置にシグナル配列をコードする遺伝子を導入されていてもよい。
【００１９】
プロモーターとターミネーターは、宿主であるシゾサッカロミセス属酵母内で機能して糸状菌由来のβ−グルコシダーゼを発現できるものであればよい。シゾサッカロミセス属酵母内で機能するプロモーターとしては、シゾサッカロミセス属酵母が本来有するプロモーター（転写開始活性が高いものが好ましい）やシゾサッカロミセス属酵母が本来有しないプロモーター（ウイルス由来のプロモーターなど）を使用することができる。なお、プロモーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
シゾサッカロミセス属酵母が本来有するプロモーターとしては、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、チアミンの代謝に関与するnmt1遺伝子プロモーター、グルコースの代謝に関与するフルクトース−１、６−ビスホスファターゼ遺伝子プロモーター、カタボライト抑制に関与するインベルターゼ遺伝子のプロモーター（国際公開第９９／２３２２３号参照）、熱ショック蛋白質遺伝子プロモーター（国際公開第２００７／２６６１７号参照）などが挙げられる。
シゾサッカロミセス属酵母が本来有しないプロモーターとしては、例えば、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、特開平１０−２３４３７５号公報に記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモーターが挙げられ、hCMVプロモーター、SV40プロモーターが好ましい。
シゾサッカロミセス属酵母内で機能するターミネーターとしては、シゾサッカロミセス属酵母が本来有するターミネーターやシゾサッカロミセス属酵母が本来有しないターミネーターを使用することができる。なお、ターミネーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
ターミネーターとしては、例えば、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、特開平１０−２３４３７５号公報に記載されているヒト由来のターミネーターが挙げられ、ヒトリポコルチンＩのターミネーターが好ましい。
【００２０】
（β−グルコシダーゼ）
β-グルコシダーゼ(EC.3.2.1.21)とはβ-D-グルコピラノシド結合の加水分解反応を特異的に触媒する酵素の総称として用いられる。特にセロビオースをグルコースに分解することからセロビアーゼとも呼ばれ、広く細菌、糸状菌、植物および動物に分布する。それぞれの生物種内に、β−グルコシダーゼをコードする遺伝子が複数存在することが多く、例えば、糸状菌の１種であるアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）では、bgl1〜bgl7の存在が報告されている（Ｓｏｙ  ｐｒｏｔｅｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｊａｐａｎ  １２，７８−８３，２００９、特開２００８−０８６３１０号公報）。これらのうち、活性の高さ等から、BGL1をコードするbgl1が好ましい。
【００２１】
本発明の形質転換体が有するβ−グルコシダーゼの構造遺伝子は、糸状菌由来のものである。糸状菌とは、菌類のうち、菌糸と呼ばれる管状の細胞から構成される真核細胞微生物である。糸状菌としては、例えば、アスペルギルス属（Aspergillus)、トリコデルマ属（Trichoderma)属、フサリウム属（Fusarium）、ペニシリウム属（Penicillium)およびアクレモニウム属（Acremonium）等が挙げられる。本発明にかかるβ−グルコシダーゼの構造遺伝子は、β−グルコシダーゼを産生する糸状菌であればいずれの糸状菌由来のものであってもよいが、酵素活性の高さなどから、アスペルギルス属の糸状菌由来のβ−グルコシダーゼが好ましい。アスペルギルス属の糸状菌としては、例えば、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・アクリータス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・パルベルレンタス（Aspergillus pulverulentus）を挙げることができる。結晶セルロース分解力が高く、単糖生成力に優れていることから、アスペルギルス・アクリータス（Aspergillus aculeatus）由来のβ−グルコシダーゼをコードする遺伝子が好ましく、アスペルギルス・アクリータス（Aspergillus aculeatus）由来のBGL1（AaBGL1）をコードする遺伝子がより好ましい。
坂本禮一郎博士論文（Aspergillus aculeatus No. F-50のセルラーゼ系に関する研究、大阪府立大学、１９８４年）によれば、Aspergillus aculeatusから精製した野生型のAaBGL1の分子量は約１３３ＫＤａ、至適ｐＨは４．０で、安定ｐＨ範囲は３〜７（２５℃、２４時間）である。
【００２２】
AaBGL1のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるものである。本発明のβ−グルコシダーゼをコードする遺伝子配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるβ−グルコシダーゼをコードする遺伝子配列が好ましい。また、配列番号１で表されるアミノ酸配列に１〜数十個、好ましくは１〜数個、さらに好ましくは１〜９個、のアミノ酸の欠失、置換または付加が入ったアミノ酸配列からなり、β-D-グルコピラノシド結合の加水分解反応を触媒する活性を有するβ−グルコシダーゼをコードする遺伝子配列であってもよい。配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるβ−グルコシダーゼは、１〜数十個のアミノ酸の欠失、置換または付加が入ってもβ-D-グルコピラノシド結合の加水分解反応を触媒する活性を有するものである。
【００２３】
なお、上記の糸状菌由来のβ−グルコシダーゼをコードする遺伝子をそのまま用いてもよいが、シゾサッカロミセス属酵母内での発現量を増大させるために、上記遺伝子配列を、シゾサッカロミセス属酵母での高発現遺伝子において使用頻度の高いコドンに改変することが好ましい。
【００２４】
［形質転換体の製造方法］
本発明のシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属酵母の形質転換体の製造方法は、糸状菌由来のβ−グルコシダーゼをコードする構造遺伝子配列並びに該構造遺伝子を発現させるためのプロモーター配列およびターミネーター配列を含むベクターによりシゾサッカロミセス属酵母を形質転換することを特徴とするものである。
宿主となるシゾサッカロミセス属酵母、β−グルコシダーゼ、糸状菌、構造遺伝子を発現させるためのプロモーター配列およびターミネーター配列については、上記したとおりである。
【００２５】
（ベクター）
本発明におけるベクターは、上記した発現カセットを含むものである。また、選択マーカーを含むことが好ましい。例えば、宿主の栄養要求性に応じて前記栄養要求性相補マーカーを組み込んだベクターを使用することが好ましい。
さらに、本発明におけるベクターは、シゾサッカロミセス属酵母内で機能する分泌シグナル遺伝子を有することが好ましい。分泌シグナル遺伝子の位置は、β−グルコシダーゼ構造遺伝子の５’末端側である。シゾサッカロミセス属酵母内で機能する分泌シグナル遺伝子は、発現した異種蛋白質を宿主細胞外に分泌させる機能を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子である。分泌シグナル遺伝子が結合した異種蛋白質構造遺伝子から、Ｎ末端に分泌シグナルが付加した異種蛋白質が発現する。この異種蛋白質は、宿主内の小胞体やゴルジ装置等で分泌シグナルが切断され、その後分泌シグナルが除去された異種蛋白質が細胞外に分泌される。分泌シグナル遺伝子（および分泌シグナル）はシゾサッカロミセス属酵母内で機能することが必要である。シゾサッカロミセス属酵母内で機能する分泌シグナル遺伝子としては、例えば、国際公開第１９９６／２３８９０号に記載のものを使用できる。
本発明では、β−グルコシダーゼの構造遺伝子の５’末端側にこの分泌シグナルの構造遺伝子を導入することにより、Ｎ末端に上記分泌シグナルが付加されたβ−グルコシダーゼを発現させ、シゾサッカロミセス属酵母の菌体外にβ−グルコシダーゼを分泌させることができる。シゾサッカロミセス属酵母内で機能する分泌シグナルとしては、国際公開第１９９６／２３８９０号に記載のＰ３シグナルが特に好ましい。
【００２６】
本発明におけるベクターは、環状ＤＮＡ構造または線状ＤＮＡ構造を有するベクターである。上記発現カセットが、シゾサッカロミセス属酵母の細胞内で染色体外遺伝子として保持される形質転換体を作製する場合には、ベクターは、シゾサッカロミセス属酵母内で複製されるための配列、即ち、自律複製配列（Autonomously Replicating Sequence: ARS）を含むプラスミドであることが好ましい。
上記発現カセットが、シゾサッカロミセス属酵母の染色体中に組み込まれた形質転換体を作製する場合には、ベクターを線状ＤＮＡ構造で宿主に導入することが好ましい。
【００２７】
上記したように、発現カセットがシゾサッカロミセス属酵母の染色体中に組み込まれた形質転換体の方が、継代培養の点から好ましい。以下、シゾサッカロミセス属酵母の染色体中に組み込まれた形質転換体を作製するためのベクターについて説明する。
染色体中への発現カセットの組み込みは、相同組換えでも非相同組換えによるものであってもよいが、染色体中の任意の位置に組み込むことが可能なことから、相同組換えによるものが好ましい。
【００２８】
ベクターを線状ＤＮＡ構造で宿主に導入する場合、通常用いられるプラスミドＤＮＡのような環状ＤＮＡ構造を有するベクターであれば、制限酵素でベクターを線状に切り開いた後にシゾサッカロミセス属酵母の細胞に導入することが好ましい。この場合、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く位置は、組換え部位内とする。これにより、切り開かれたベクターの両端にそれぞれ組換え部位が部分的に存在することとなり、相同組換えによりベクター全体が染色体の標的部位に組み込まれる。
ベクターは、両端それぞれに組換え部位の一部が存在するような線状ＤＮＡ構造とすることができれば、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く方法以外の方法、たとえばＰＣＲによる酵素的な増幅法や化学合成法、で構築してもよい。
【００２９】
本発明におけるベクターを構築するために、例えば、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等の大腸菌由来のプラスミドを好適に用いることができる。大腸菌由来のプラスミドを用いて構築したベクターは、通常、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域を有する。また、上記のような大腸菌由来のプラスミドを用いない場合であっても、本発明におけるベクターを構築し増幅するために大腸菌を使用する場合は上記「ｏｒｉ」が利用され、「ｏｒｉ」を有するベクターが得られる。
相同組換えに用いる際のベクターは、大腸菌内での複製のために必要であった「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域が除去されていることが好ましい。これにより、上述したベクターを染色体に組み込む際に、その組み込み効率を向上させることができる（特開２０００−２６２２８４号公報参照）。
【００３０】
複製開始領域が除去されたベクターの構築方法は特に限定されないが、特開２０００−２６２２８４号公報に記載されている方法を用いることが好ましい。すなわち、組換え部位内の切断箇所に複製開始領域が挿入された前駆体ベクターを構築しておき、前述のように線状ＤＮＡ構造とすると同時に複製開始領域が切り出されるようにする方法が好ましい。これにより、簡便に複製開始領域が除去されたベクターを得ることができる。
また、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、国際公開第９６／２３８９０号、特開平１０−２３４３７５号公報等に記載された発現ベクターやその構築方法を適用して、発現カセットおよび組換え部位を有する前駆体ベクターを構築し、さらに通常の遺伝子工学的手法で該前駆体ベクターから複製開始領域を除去して相同組換えに用いるベクターを得る方法であってもよい。
【００３１】
ベクター中の発現カセットの数は、１個のみであってもよく、２個以上であってもよい。ベクター中の発現カセットの数が１個であったとしても、シゾサッカロミセス属酵母の染色体の同一箇所に２個以上の発現カセットが組み込まれることがある。また、ベクター中の発現カセットの数が２個以上であれば、シゾサッカロミセス属酵母の染色体の同一箇所に複数の発現カセットが連続して組み込まれる。
【００３２】
本発明におけるベクターは、発現カセットを１〜８個有することが好ましく、特に２〜４個が好ましい。
ベクターが有する発現カセットの数が２個以上であれば、シゾサッカロミセス属酵母の染色体に組み込まれる発現カセットの数を増やし、異種蛋白質の発現量をより多くすることが容易になる。ただし、本発明においては後記標的部位の数が多い場合には１個であっても組み込まれる発現カセットの数を多くすることができる。また、ベクターが有する発現カセットの数が８個以下であれば、ベクターが大きくなりすぎることにより相同組換えによるベクターの組み込み効率が低下してしまうことを抑制しやすい。発現カセットの数が４個以下であれば、組み込み効率をより高くすることができる。
【００３３】
ベクターの組換え部位は、シゾサッカロミセス属酵母の染色体における相同組換えの標的部位に対して相同組換えを行わせることのできる塩基配列を有する部位である。また、標的部位は、シゾサッカロミセス属酵母の染色体内で発現カセットを組み込む標的となる部位である。標的部位は、ベクターの組換え部位を該標的部位に対して相同組換えを行わせる塩基配列とすることにより自由に設定することができる。
【００３４】
相同組換えを行わせるには、前記組換え部位の塩基配列と、標的部位の塩基配列との相同性を７０％以上とすることが必要である。また、組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は、相同組換えが起きやすくなる点から、９０％以上とすることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。このような組換え部位を有するベクターを用いることにより、発現カセットが相同組換えにより標的部位に組み込まれる。
【００３５】
組換え部位の長さは、２０〜２０００ｂｐであることが好ましい。組換え部位の長さが２０ｂｐ以上であれば、相同組換えが起きやすくなる。また、組換え部位の長さが２０００ｂｐ以下であれば、ベクターが長くなりすぎて相同組換えが起き難くなることを防ぎやすい。組換え部位の長さは１００ｂｐ以上であることがより好ましく、２００ｂｐ以上であることがさらに好ましい。また、組換え部位の長さは８００ｂｐ以下であることがより好ましく、４００ｂｐ以下であることがさらに好ましい。
【００３６】
（宿主の標的部位）
発現カセットを組み込む標的部位は、シゾサッカロミセス属酵母が有する染色体のうち、（１）別々の染色体に存在する２箇所以上の標的部位であるか、（２）１つ以上の必須遺伝子が間に挟まれるように同一染色体の複数位置に存在する２箇所以上の標的部位であるか、（１）および（２）の両方を満たす複数の標的部位であることが好ましい。これら２箇所以上の標的部位は、実質的に同一の塩基配列を有する部位である。ただし、実質的に同一の塩基配列とは、互いの標的部位の塩基配列の相同性が９０％以上であることを意味する。標的部位同士の相同性は、９５％以上であることが好ましく、９９％以上であることがより好ましい。
上記の必須遺伝子とは、その遺伝子が欠失または失活すると生育できなくなる遺伝子であり、本発明の形質転換体の生育に不可欠な遺伝子を意味する。したがって、この必須遺伝子を挟んで導入された発現カセットは、それが脱落すると必須遺伝子も脱落して形質転換体が生育できなくなる。これにより、形質転換体の培養において、発現カセットが脱落した形質転換体が、発現カセットが脱落していない形質転換体とともに生育するおそれが少なくなり、異種蛋白質の生産効率が低下するおそれが少なくなる。通常は、発現カセットが脱落した形質転換体の方が増殖速度が高いため、上記（２）を満たす標的部位に発現カセットを導入することが好ましい。
【００３７】
このように、標的部位がシゾサッカロミセス属酵母の染色体において分散して存在していることにより、染色体に発現カセットが分散して組み込まれるため、組み込まれた発現カセットが脱落し難くなり、継代における維持安定性が極めて高くなる。そのため、異種蛋白質を安定して高い生産性で製造することができる。
また、このように塩基配列が実質的に同一の標的部位とすることにより、異なる位置に複数の標的部位が存在していても、１種のベクターでそれら標的部位に簡便にベクターを組み込むことができる。
【００３８】
本発明の形質転換方法では、ベクターを組み込む標的部位が５箇所以上であることが好ましい。標的部位が５箇所以上であれば、染色体に組み込まれる発現カセットの数を増加させることが容易になるため、異種蛋白質の生産性がより向上する。
また、標的部位は１０〜６０箇所であることがより好ましい。標的部位が１０箇所以上であれば、染色体に組み込まれる発現カセットの数をさらに増加させやすく、異種蛋白質の生産性がさらに向上する。標的部位が６０箇所以下であれば、染色体に組み込まれる発現カセットが多くなりすぎて異種蛋白質の発現量が少なくなることを抑制しやすい。
【００３９】
標的部位は、１種のベクターでシゾサッカロミセス属酵母の複数の染色体に分散して存在する標的部位に一度に発現カセットを組み込める点から、トランスポゾン遺伝子Ｔｆ２中の塩基配列とすることが好ましい。Ｔｆ２は、シゾサッカロミセス・ポンベでは、３本の染色体それぞれに合計１３箇所存在する、長さ（塩基数）約４９００ｂｐのトランスポゾン遺伝子であり、互いの塩基配列の相同性は９９．７％である（Nathan J. Bowen et al, Genome Res. 2003 13: 1984-1997参照）。
【００４０】
ただし、標的部位は上記のものには限定されない。例えば、トランスポゾン遺伝子Ｔｆ２以外に、前記組換え部位の長さ以上の長さを有する実質的に同一の塩基配列が染色体中に複数有する部位（遺伝子など）を標的部位とすることができる。また、例えば、前記組換え部位の長さ以上の長さを有する実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子（標的部位）を染色体に新たに複数導入して標的部位を形成した後に、それら複数の標的部位にベクターを導入するようにしてもよい。
【００４１】
（形質転換方法）
上記ベクターを用いて、宿主であるシゾサッカロミセス属酵母を形質転換する。形質転換方法は、公知のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換方法をいずれも用いることができる。そのような形質転換方法としては、例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、ガラスビーズ法など従来周知の方法や、特開２００５−１９８６１２号公報記載の方法などを挙げることができる。また、市販の酵母形質転換用キットを用いてもよい。
【００４２】
形質転換を行った後、通常は得られた形質転換体を選抜する。選抜方法としては、例えば、以下に示す方法が挙げられる。前記栄養要求性マーカーにより形質転換体を選択できる培地によりスクリーニングし、得られたコロニーから複数を選択する。次に、それらを別々に液体培養した後、それぞれの培養液における異種蛋白質の発現量を調べ、異種蛋白質の発現量がより多い形質転換体を選抜する。また、それら選抜した形質転換体に対してパルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム解析を行うことにより、染色体に組み込まれたベクターの数や発現カセットの数を調べることができる。
【００４３】
（培養方法）
本発明の形質転換体の培養のための培養液には、公知の酵母培養培地を用いることができ、シゾサッカロミセス属酵母が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、シゾサッカロミセス属酵母の培養を効率良く行えるものであればよい。培養液としては、天然培地を用いてもよく、合成培地を用いてもよい。
【００４４】
炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース等の糖が挙げられる。
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または無機酸のアンモニウム塩、ペプトン、カザミノ酸が挙げられる。
無機塩類としては、例えば、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムが挙げられる。
【００４５】
培養には公知の酵母培養方法を用いることができ、例えば振盪培養、攪拌培養等により行うことができる。
また、培養温度は、２３〜３７℃であることが好ましい。また、培養時間は適宜決定することができる。
また、培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。
【００４６】
形質転換体を培養し、培養液や菌体からβ−グルコシダーゼを分離する場合、公知の蛋白質分離方法を用いることができる。例えば、培養後、菌体を培養液から分離し、菌体を破壊してβ−グルコシダーゼを含む細胞破砕液を得て、その細胞破砕液から公知の蛋白質分離方法、例えば、塩析、カラム精製、クロマトグラフィー、免疫沈降等を用いてβ−グルコシダーゼを取得できる。
また、分泌シグナル遺伝子を結合させたβ−グルコシダーゼ構造遺伝子を有する形質転換体を用いる場合、β−グルコシダーゼが培養液中に分泌されるため、培養液から公知の蛋白質分離方法を用いてβ−グルコシダーゼを取得できる。一定時間培養した培養液から遠心等によりβ−グルコシダーゼを含む培養上清を回収し、残った菌体に再び培養液を加えて培養することを繰り返して、連続的に形質転換体を培養してβ−グルコシダーゼを産生させることもできる。
β−グルコシダーゼを含有する培養液や細胞破砕液からβ−グルコシダーゼを分離せずに、該培養液や細胞破砕液を直接分解対象であるセルロースに接触させてもよい。
【００４７】
［セルロースの分解方法］
本発明のセルロースの分解方法は、上記本発明のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体を培養して得られる菌体や培養液から取得したβ−グルコシダーゼを用いる。また、分泌シグナル遺伝子を結合させたβ−グルコシダーゼ構造遺伝子を有する形質転換体を使用する場合、セルロースが存在する培養液中で形質転換体を培養し、培養液に分泌されるβ−グルコシダーゼで培養液中のセルロースを分解することもできる。
分解対象となるセルロースの形態に特に制限はなく、精製セルロースであっても、木材や稲ワラ、もみ殻、雑草などのバイオマス中に含まれるセルロースであってもよい。
【００４８】
形質転換体をセルロース存在下で培養することにより分泌されるβ−グルコシダーゼでセルロースを分解する場合、培養条件は、シゾサッカロミセス属酵母の一般的な培養条件を採用することができる。培養液の好適なｐＨは、３．０〜８．０であり、好適な培養温度は、２３〜３７℃である。形質転換体が産生したものを分離・精製したβ−グルコシダーゼを用いてセルロースを分解する場合、反応条件は公知のβ−グルコシダーゼの反応条件を採用することができる。β−グルコシダーゼによる分解反応液中の好適なｐＨは、３．０〜８．０であり、好適な反応温度は、２０〜６５℃である。
具体的なセルロースの分解方法としては、例えば、形質転換体を培養し、培養液や菌体からβ−グルコシダーゼを分離もしくは精製して、セルロースを含むバイオマスと、エンドグルカナーゼ、セロビオハイドラーゼとともにインキュベーションする方法が挙げられる。また、β−グルコシダーゼを分泌する形質転換体を使用する場合は、さらに、上記バイオマスと培養した上記形質転換体を混合してインキュベーションする方法、上記バイオマスの存在下で、上記形質転換体を培養する方法が挙げられる。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例および比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。【００５０】
［試験例１］発現ベクターの作製
既知のAspergillus aculeatus F-50由来β−グルコシダーゼ１ (Kawaguchi,T. et.al., "Gene"vol. 173 (2), pp. 287-288(1996)) (以下、AaBGL1と称する。)のペプチド配列からSchizosaccharomyces pombeの高発現型コドンで置き換えた遺伝子配列を設計した(配列番号２参照。以下、AaBGL1遺伝子と称する。)。開始コドン前にKpnI, BspHI認識配列を付加した。終止コドン後にXbaI, SacI認識配列を付加した。この配列を含んだプラスミド（ジーンアート社、レーゲンスブルク、ドイツ、にて合成）を制限酵素BspHI, XbaIで消化した。
一方、これとは別にpSL6lacZを制限酵素AarI,XbaIで消化し、アルカリフォスファターゼ処理した。この処理後、アガロースゲル上で電気泳動し、ベクターpSL6断片と、上記のAaBGL1遺伝子断片をアガロースゲルから切出し、ライゲーションした後、大腸菌DH5α（タカラバイオ社製）に導入して形質転換した。得られた形質転換体よりベクターを調製し、目的とする発現ベクターpSL6AaBGL1(図１、配列番号３参照)を取得した。制限酵素地図の作製から目的とするベクターであることを確認した。
また、分泌シグナルであるP3シグナルをＮ末端に付加したAaBGL1の作製のため、pSL6AaBGL1を鋳型としてIn-fusionプライマーを用いてPCR法によりAaBGL1遺伝子断片を増幅した。一方、pSL6P3lacZを制限酵素AflII, XbaIで消化した。この断片とPCRによって得られた上記AaBGL1遺伝子断片とをIn-fusion法により環状化した後、大腸菌DH5αに導入して形質転換した。得られた形質転換体よりベクターを調製し、目的とする発現ベクターpSL6P3AaBGL1(図２、配列番号４参照)を取得した。制限酵素地図の作製および部分塩基配列の確認から目的とするベクターであることを確認した。【００５１】
［試験例２］形質転換体の作製
宿主としてSchizosaccharomycespombeのロイシン要求株（遺伝子型：h-、leu1-32、東京大学大学院理学系研究科付属遺伝子実験施設・飯野雄一教授より供与）(ATCC38399)をYES(0.5% 酵母エキス, 3% グルコース, 0.1mg/ml SPサプリメント)培地で0.6×107細胞数/mlになるまで生育させた。集菌、洗浄後1.0×108細胞数/mlになるように0.1M 酢酸リチウム(pH5.0)に懸濁した。その後、懸濁液100μlに上記で得られたベクターpSL6AaBGL1またはpSL6P3AaBGL1を制限酵素NotIで消化したもの1μgを加え、さらに50% (w/v) ポリエチレングリコール (PEG4000)水溶液を290μl加えてよく撹拌した後、30℃で60分間、42℃で5分間、室温で10分間の順にインキュベートした。遠心によりPEG4000を除去し、洗浄後150μlの滅菌水に懸濁し、最少寒天培地に塗布した。
３日後、形質転換体(AaBGL1発現株)が得られた。pSL6AaBGL1を用いて形質転換したものをASP3325株とした。pSL6P3AaBGL1を用いて形質転換したものをASP3326株とした。【００５２】
［試験例３］形質転換体の培養
上記で得られたAaBGL1発現株をYES培地で30℃で1日間培養した。この培養液100μlを5ml YPD培地(1% 酵母エキス,2% ペプトン, 2%グルコース)に植継ぎ、30℃で2日間培養した。この培養液を遠心分離し培養上清を得た。【００５３】
［試験例４］活性測定によるAaBGL1の確認
上記で得られたAaBGL1発現株の培養上清を用いて、酵素希釈サンプルを調製し、下記方法にしたがって活性測定を行った。（活性測定法）
20mM p-ニトロフェニル-β-D-グルコシド(以下、pNPGと略す)10μlに1M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)10μl と水130μlを加え、酵素希釈サンプル50μlを添加して、37℃で10分間反応させた。2% 炭酸ナトリウム液100μlに反応液100μlを加えて反応停止させ、遊離したp-ニトロフェノール量を波長450nmで比色定量した。
1分間当たり、1μmolに相当するp-ニトロフェノールを生成する酵素量を1Uとした。
その結果、ASP3326株由来の酵素稀釈サンプルの活性が0.85U/ml、ASP3325株由来の酵素稀釈サンプルの活性が0.12U/mlであり、P3シグナルを付加したAaBGL1発現株(ASP3326株)由来の酵素稀釈サンプルの活性は、P3シグナルを付加していない株（ASP3325株）由来のものに対して約7倍であった。【００５４】
［試験例５］P3シグナル付加AaBGL1発現株(ASP3326株)のフェドバッチ培養
100mlYES培地にASP3326株を植菌し、30℃でOD660＝10程度になるまで前培養した。次いで、ジャーファーメンターを用いて1000ml YPD培地に前培養液を加え、グルコースが1%以下で下記表１記載の組成の流加培地をグルコースが枯渇しない条件で流加し、30℃で2日間培養した。pHは1.5N NaOH, 1.5M KOH溶液の添加制御で4.5に保った。培養後、遠心分離により培養上清を得た。【００５５】
流加培地組成
【表１】
2012060389.tif 000003
【００５６】
ビタミンストック溶液組成
【表２】
2012060389.tif 000004
【００５７】
ビオチンストック溶液組成
【表３】
2012060389.tif 000005
【００５８】
メタルストック溶液組成
【表４】
2012060389.tif 000006
【００５９】
［試験例６］精製
上記で得られた培養上清1000mlに80%飽和となるように固形硫安を添加し、夾雑物を塩析した。次いで、50,000MWCOの限外ろ過膜を用いて10mM 酢酸緩衝液(pH5.0)により濃縮、脱塩し粗精製酵素を得た。【００６０】
［試験例７］性状解析
上記粗精製酵素を用いて、下記方法に従い、酵素の性状解析を行った。
（至適温度）
1mM pNPGを基質として、50mM 酢酸緩衝液(pH4.5)を用いて各温度で10分間反応させた。その結果、至適温度は約65℃であった。(図３)
（至適pH）
1mM pNPGを基質として、各種pHの緩衝液(50mM グリシン-塩酸緩衝液、50m 酢酸緩衝液、50mM リン酸緩衝液)を用いて37℃で10分間反応させた。その結果、至適pHは3.0から5.0であった。(図４)
（熱安定性）
1mM pNPGを基質として、50mM 酢酸緩衝液(pH4.5)を用いて各温度で10分間処理した後反応させた。その結果、約60℃まで安定であった。(図５)
（pH安定性）
1mM pNPGを基質として、各種pHの緩衝液(50mM グリシン-塩酸緩衝液、50mM 酢酸緩衝液、50mM リン酸緩衝液)を用いて37℃で24時間処理した後反応させた。その結果、pH3.0から8.0付近で安定であった。(図６)
（分子量）
SDS-PAGEを行って分子量を調べた。用いた分子量マーカーは、インビトロジェン社製BenchMark(登録商標)Protein Ladderを使用した。その結果、分子量は約220,000であった。
（各種糖による阻害）
各種糖質(0.1mM,1.0mM, 10mM)を含む1mM pNPGを基質として活性測定法に従って反応させた。その結果を表５に示す。表５中、各数値は、糖質がない状態での活性を１００としたときの酵素活性の比率（％）を示す。【００６１】
【表５】
2012060389.tif 000007
【００６２】
表５より明らかなように、上記で得られた粗精製のAaBGL1は、マンノース, ガラクトース、キシロース、フルクトース、ソルビトール、ラクトース、スクロースでは実質的に阻害されず、グルコース、マルトースで阻害された。【００６３】
（基質特異性）
各種基質を使用して活性測定法に準じて測定した。0.5%(w/v)濃度のICOS 、セロビオース、1mM濃度のpNPG、pNP-cellobioseそれぞれに対する比活性および相対活性(%)を表６にまとめて表示する。（pNP-cellobioseを基質とした活性測定法）
2mM p-ニトロフェニル-β-D-セロビオシド(以下、pNP-cellobiose)100μlに1M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)10μlと水40μlを加え、酵素希釈サンプル50μlを添加して、37℃で10分間反応させた。2% 炭酸ナトリウム液100μlに反応液100μlを加えて反応停止させ、遊離したp-ニトロフェノール量を波長450nmで比色定量した。
1分間当たり、1μmolに相当するp-ニトロフェノールを生成する酵素量を1Uとした。（セロビオースを基質とした活性測定法）
1% セロビオース溶液100μl に1M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)10μlを加え、酵素希釈サンプル90μlを添加して、37℃で10分間反応させた。1N 塩酸50μlを加え反応停止させ、1M Tris溶液：2N 水酸化ナトリウム溶液が４：１の中和液50μlで反応液を中和させ、グルコスタット法（和光純薬工業  グルコースキット  グルコースCII−テストワコー）を用いて反応液中のグルコース量を測定した。
1分間当たり、1μmolに相当するグルコースを生成する酵素量を1Uとした。
（ICOSを基質とした活性測定法）
1% 不溶性セロオリゴ糖(以下、ICOS)溶液100μl に1M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)10μlを加え、酵素希釈サンプル90μlを添加して、37℃で10分間反応させた。1N 塩酸50μlを加え反応停止させ、1M Tris溶液：2N 水酸化ナトリウム溶液が４：１の中和液50μlで反応液を中和させ、グルコスタット法（和光純薬工業  グルコースキット  グルコースCII−テストワコー）を用いて反応液中のグルコース量を測定した。
1分間当たり、1μmolに相当するグルコースを生成する酵素量を1Uとした。【００６４】
【表６】
2012060389.tif 000008
【００６５】
［試験例８］セロビオースによる培養
5ml YPD培地(1% 酵母エキス, 2% ペプトン,2% グルコース)および5ml YP+cellobiose培地(1% 酵母エキス, 2% ペプトン,2% セロビオース)を用いてP3シグナル付加AaBGL1発現株 (ASP3326株)を30℃で３日間培養した。その培養液のOD660、グルコース濃度、エタノール濃度を測定した結果、グルコースでの培養と同等の生育曲線を示し、セロビオースからグルコースが蓄積せずにエタノール発酵することが確認できた。図７(Ａ)がYPD培地での結果を表し、図７(Ｂ)がYP+cellobiose培地での結果を表す。ODが培養液のOD660、EtOHが培養液のエタノール濃度、Glcが培養液のグルコース濃度を示す。【００６６】
［試験例９］Novozyme188とのグルコース阻害の比較
グルコース阻害について、β−グルコシダーゼの市販品であるNovozyme188標品（Novozyme社製）と、試験例６で得た粗精製酵素との比較検討を行った。1mM pNPGを基質としてグルコースを0−100mM反応液中に加えて活性測定法に従いグルコース阻害活性を測定した。反応温度は３７℃、ｐＨは４．５、時間は１０分であった。その他の反応条件は、試験例４の活性測定法と同様であった。結果を図８に示す。
図８から明らかなように、試験例６で得られたAaBGL1は、Novozyme188よりもグルコース阻害に対する耐性が高く、試験例６で得られたAaBGL1では20mM グルコースを加えても50%以上の活性があった。酵素活性が５０％（相対活性が０．５）になるグルコース濃度（I50値）は、試験例６で得られたAaBGL1では25mM、Novozyme188では7mMだった。【００６７】
［試験例１０］糖鎖欠損株での発現検討
シゾサッカロミセス・ポンベのARC129株 (遺伝子型：h-leu1-32 ura4-C190T pmr1::ura4+、九州大学大学院農学研究院・竹川薫教授より供与)およびARC130株 (遺伝子型：h-leu1-32 ura4-C190T pmr1::ura4(FOA) gms1::ura4+、九州大学大学院農学研究院・竹川薫教授より供与)を試験例２の形質転換法でpSL6P3AaBGL1を用いて形質転換し、AaBGL1発現株を取得した。ARC129形質転換体をASP3396株とした。ARC130形質転換体をASP3397株とした。
上記で得られたAaBGL1発現株とASP3326株、ARC032株（遺伝子型：h-、AaBGL1非発現株、東京大学大学院理学系研究科付属遺伝子実験施設・飯野雄一教授より供与）を試験例３の培養法に従い培養し、培養上清を取得した。各培養上清を用いて、下記試験を行った。【００６８】
（SDS-PAGE）
培養上清1mlに0.1mlのトリクロロ酢酸を加え、氷上で30分間冷却後、15,000rpm、4℃で20分遠心させ、TCA沈澱サンプルを回収、洗浄後、SDS-PAGEサンプルバッファーに溶解させ、4-12%アクリルアミドゲルを用いてSDS-PAGEを行い、クマシーブリリアントブルーで染色した。
得られた結果を図９に示す。図９の各レーンは、左から分子量マーカー（Ｍ）、ARC032株、ASP3326株、ASP3396株、ASP3397株を培養した培養上清由来のタンパク質である。
図９から明らかなように、Aspergillus aculeatus F-50由来βーグルコシダーゼ１の分子量が糖鎖欠損株由来のASP3396株では160,000、ASP3397株では130,000に低下した。（活性測定）
ASP3326株、ASP3396株、ASP3397株をそれぞれ培養した後の培養上清中のβ−グルコシダーゼ活性を、試験例４の活性測定法に従い、pNPGを基質として測定した。
その結果、ASP3326株は0.85U/ml、ASP3396は1.53U/ml、ASP3397は2.98U/mlの活性を示した。（熱安定性）
各培養上清を用いて試験例７の熱安定性の測定法を50−75℃の間で実施した。結果を図１０に示す。
図１０から明らかなように、ASP3326株、ASP3396株、ASP3397株の３株とも60℃まで安定であり、分子量の違いによる影響は見られない。（グルコース阻害）
各培養上清を用いて1mM pNPGを基質としてグルコースを0−100mM反応液中に加えて活性測定法に従いグルコース阻害活性を測定した。結果を図１１に示す。
図１１から明らかなように、ASP3326、ASP3396、ASP3397の３株とも同様のグルコース阻害活性を示したことから、糖鎖による影響はないと考えられる。【００６９】
［試験例１１］N−結合型糖鎖除去後の精製酵素の検討
試験例１０と同様にしてASP3326株、ASP3396株、ASP3397株をそれぞれ培養した後の培養上清に、80％飽和の硫酸アンモニウムを加え、遠心分離後の沈殿物を回収した。各沈殿物を10mM クエン酸リン酸緩衝液(pH7.0)に溶解した後、100,000MWCOの限外ろ過膜(ミリポア社製)を用いて10mM クエン酸リン酸緩衝液(pH7.0)に平衡化した。さらに、NaClの塩濃度勾配（0−1M）でHiTrap QXLカラム(GE Healthcare社製)を用いて陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、β−グルコシダーゼ活性のピークの画分を回収し精製サンプルとした。（N−結合型糖鎖除去）
精製サンプル100ngをSDS-PAGEサンプルバッファーに溶解させ未処理サンプルとした。一方で、精製サンプル100ngをEnzymatic Degylcosylation Kit(Sigma)を用いてN−結合型糖鎖を除去し、SDS-PAGEサンプルバッファーに溶解させN−結合型糖鎖処理サンプルとした。両サンプルに対して4-12%アクリルアミドゲルを用いてSDS-PAGEを行い、クマシーブリリアントブルーで染色した。
得られた結果を図１２に示す。図１２の各レーンは、左から分子量マーカー（Ｍ）、ASP3326株の未処理サンプル、N−結合型糖鎖処理サンプル、ASP3396株の未処理サンプル、N−結合型糖鎖処理サンプル、ASP3397株の未処理サンプル、N−結合型糖鎖処理サンプル、分子量マーカー（Ｍ）である。
図１２から明らかなように、Aspergillus aculeatus F-50由来βーグルコシダーゼ１の分子量が糖鎖欠損株由来のASP3396株では160,000、ASP3397株では130,000に低下した。つまり、N−結合型糖鎖を除去することで３株の分子量が95,000に減少した。このことから、分子量の違いはそれぞれの株のN−結合型糖鎖の糖鎖長に由来している。（熱安定性）
各精製サンプルを用いて試験例７の熱安定性の測定法を50−75℃の間で実施した。結果を図１３に示す。
図１３から明らかなように、ASP3326株、ASP3396株、ASP3397株の３株とも60℃まで安定であり、分子量の違いによる影響は見られない。（グルコース阻害）
各培養上清を用いて1mM pNPGを基質としてグルコースを0−100mM反応液中に加えて活性測定法に従いグルコース阻害活性を測定した。結果を図１４に示す。
図１４から明らかなように、ASP3326株、ASP3396株、ASP3397株の３株とも同様のグルコース阻害活性を示したことから、糖鎖による影響はないと考えられる。【００７０】
［試験例１２］イナワラパルプならびにLBKPの糖化試験
試験例１１において調製したASP3326株、ASP3396株、ASP3397株それぞれに由来する糖化酵素（BGL1）ならびにアクセルレースデュエット（Accellerase DUET、Genencor社製セルラーゼ）（Genencor社製）を用いて、以下の糖化試験を行なった。アクセルレースデュエットはパルプ乾燥重量に対して5%(v/w)、BGL1はパルプ乾燥重量１gあたり10Uを添加した。このBGL1はpNPG活性として５U/mlに調整して供した。
糖化用パルプは次のようにして製造した。チップは豪州産ユーカリ・グロブラス（植林後８年後のもの）を使用した。含水率51%のチップを2cm×2cm程度に粉砕し、液比４にて活性アルカリ添加率17%にて160℃、２時間蒸解し、カッパー価20の未晒クラフトパルプ（UKP）を得た。このUKPを以下の漂白シーケンスにて漂白した。漂白シーケンスは、酸素漂白（O）、二酸化塩素漂白（D）、アルカリ抽出+酸素（E/O）、二酸化塩素漂白（D）の４段漂白を実施した。漂白中のパルプ濃度は10％とし、薬品の添加率は対パルプあたりの添加率である。このようにして得られた漂白パルプを以後、LBKPと呼び糖化試験に供した。表７に漂白条件を示す。【００７１】
【表７】
2012060389.tif 000009
【００７２】
100ml容の蓋付きのポリ容器を使用し、イナワラパルプならびにLBKPをパルプ濃度5wt%となるよう、すなわち絶乾2.5g相当を量り、pH5.0の100mMリン酸カリウムバッファーおよび所定の量の酵素液を加えて全量を50.0gとした。アクセルレースデュエットは125μl、BGL1または蒸留水5.0mlを添加した。これを50℃にて、150rpmで振盪しながら60時間まで保持し、経時的に10、20、40、60時間経過の時点で糖化液をパルプごと採取した。その遠心上清を分析試料とし、生成した単糖の量をイオンクロマトグラフィーで分析した。イオンクロマトグラフィー装置はダイオネクス社製モデルGP-40グラジェントポンプにAS-50のオートサンプラーとPED検出器を装着し、ポストカラム法で0.15M水酸化ナトリウムを送液するポンプとしてもGP-40ポンプを使用した。データ処理にはダイオネクス社製PeakNetクロマトグラフィーワークステーションを用いた。分析カラムはダイオネクス社製CarboPacPA14×250mmを使用した。糖の標準試薬としてデオキシグルコース、グルコースは関東化学社製の特級試薬を用いた。溶離液試薬として水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウムは関東化学社製特級試薬を使用した。また、純水にはミリポア製ミリＱ水を用いた。クロマトグラフィーは、溶離液１として純水、溶離液２として0.3N水酸化ナトリウム溶液、溶離液３として0.1N水酸化カリウム溶液、溶離液４として0.15N炭酸ナトリウムを使用した。また、ポストカラム法として内径0.25mm長さ5mのテフロンチューブを使用して0.15N水酸化ナトリウムを0.5ml/分の流量で送液し糖を安定に検出した。グラジェントは、溶離液１の純水を0.1分送液し、0.1分から1.6分まで溶離液１と溶離液２を3%に増加させるグラジェントをおこなった。1.6分から2分まで溶離液１を95%、溶離液２を5%に増加した。さらに2.1分で溶離液１を100%に戻し9分まで溶離液１を100%でオリゴ糖および多糖類を溶出させた。さらに、10.1分から10.6分まで溶離液３でカラムをクリーンアップ後、溶離液１を30%、溶離液４を70%で0.1分間、カラムを充分洗浄し、4.2分間溶離液１で平衡化し15分サイクルの分析をおこなった。結果を表８、図１５および図１６に示す。【００７３】
【表８】
2012060389.tif 000010
表８の第１、第２および第３の欄並びに図１５に示すように、イナワラパルプに対してASP3326株由来のBGL1がアクセルレースデュエットへの活性増強効果を有することが観察された。また、表８の第７、第８、第１０、第１１および第１２の欄並びに図１６に示すように、LBKPに対してASP3326株由来、ASP3396株由来およびASP3397株由来のいずれのBGL1においても、アクセルレースデュエットへの活性増強効果を有することが観察された。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明の、糸状菌由来のβ−グルコシダーゼを産生するシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体は、セルロースの酵素糖化に使用されるβ−グルコシダーゼの製造に利用でき、また、該β−グルコシダーゼを分泌する上記形質転換体をセルロース存在下で培養することによりセルロースを酵素糖化に使用できる。このように、本発明の形質転換体やそれが産生するβ−グルコシダーゼは、セルロース系バイオマスから、発酵原料としての糖、ひいてはバイオエタノールなどのバイオマス燃料を生産するために利用できる。
なお、２０１０年１１月５日に出願された日本特許出願２０１０−２４９０９２号および２０１１年３月２４日に出願された日本特許出願２０１１−０６６５４０号の明細書、特許請求の範囲、図面および要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。
【図１】
2012060389.tif 000011
【図２】
2012060389.tif 000012
【図３】
2012060389.tif 000013
【図４】
2012060389.tif 000014
【図５】
2012060389.tif 000015
【図６】
2012060389.tif 000016
【図７】
2012060389.tif 000017
【図８】
2012060389.tif 000018
【図９】
2012060389.tif 000019
【図１０】
2012060389.tif 000020
【図１１】
2012060389.tif 000021
【図１２】
2012060389.tif 000022
【図１３】
2012060389.tif 000023
【図１４】
2012060389.tif 000024
【図１５】
2012060389.tif 000025
【図１６】
2012060389.tif 000026
【配列表】
2012060389000001.app
【国際調査報告】
2012060389.tif 000027
2012060389.tif 000028
2012060389.tif 000029
2012060389.tif 000030