(57)【要約】変換ストリッピング法により高精度に化学物質を定量する方法およびそのために用いられるセンサチップを提供する。試料溶液に含有される化学物質を定量する方法であって、ストリッピングゲルが保護ゲルにより覆われたセンサチップを用意する工程（ａ）、試料溶液を供給し、センサチップ表面を試料溶液により被覆する工程（ｂ）、ポテンシオスタットにより第１作用電極に電位を印加し、かつ第２作用電極をストリッピング電極に電気的に接続し、第１作用電極、第２作用電極およびストリッピング電極の各表面上において所定の化学反応を生じさせる工程（ｃ）、第１作用電極および第２作用電極に電位が印加されない状態でストリッピング電極に電位を印加し、流れた電流量を測定する工程（ｄ）、および電流量に基づいて酸化還元物質の濃度を算出し、算出された濃度に基づいて化学物質を定量する工程（ｅ）、を具備する。
2012114389.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料溶液に含有される化学物質を定量する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｅ）を具備する：
センサチップを用意する工程（ａ）、ここで、
前記センサチップは、基板、一対の作用電極、対極、ストリッピング電極、ストリッピングゲル、および保護ゲルを具備し、
一対の作用電極は、第１作用電極および第２作用電極から構成され、
前記ストリッピング電極の表面は銀を具備し、
前記ストリッピングゲルは、前記ストリッピング電極を覆い、
前記ストリッピングゲルは、一対の作用電極および対極のいずれをも覆わず、
前記ストリッピングゲルは、基準電解質および、疎水性もしくは親水性イオン液体を含有し、
前記ストリッピングゲルは、水を含有せず、
前記疎水性もしくは親水性イオン液体は不揮発性であり、
前記疎水性もしくは親水性イオン液体は、陽イオンおよび陰イオンから構成され、
前記基準電解質は、前記陽イオンおよびハロゲン化物イオンから構成され、
前記保護ゲルは、前記ストリッピングゲルを覆い、
前記保護ゲルは、疎水性イオン液体を含有するが、前記基準電解質も水も含有せず、
センサチップの表面に、前記試料溶液を供給し、前記表面を前記試料溶液により被覆する工程（ｂ）、ここで、
前記試料溶液は、前記化学物質および酸化還元物質を含有するか、または酸化還元物質により修飾された化学物質を含有し、
ポテンシオスタットにより前記第１作用電極に電位を印加し、かつ前記第２作用電極を前記ストリッピング電極に電気的に接続し、第１作用電極、前記第２作用電極、および前記ストリッピング電極の各表面上において以下の化学式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）によって表される反応をそれぞれ生じさせる工程（ｃ）、
第１作用電極：
酸化還元物質（還元体）  →  酸化還元物質（酸化体）  ＋  ｅ−・・・（Ｉ）
第２作用電極：
酸化還元物質（酸化体）  ＋ｅ−  →  酸化還元物質（還元体）・・（ＩＩ）
ストリッピング電極：
銀＋ハロゲン化物イオン−  →ハロゲン化銀↓＋ｅ−・・（ＩＩＩ）
ここで、前記ハロゲン化銀は、前記ストリッピング電極の表面上に堆積し、
前記第１作用電極および前記第２作用電極に電位が印加されない状態でストリッピング電極に電位を印加し、ストリッピング電極を流れた電流量を測定する工程（ｄ）、および
前記電流量に基づいて前記酸化還元物質（還元体）の濃度を算出し、前記算出された濃度に基づいて前記化学物質を定量する工程（ｅ）。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記センサチップは、注入口を有するカバーをさらに具備し、
前記カバーと前記センサチップとの間には空間が形成されており、
前記工程（ｂ）において、前記試料溶液は前記注入口を介して前記センサチップの表面に供給される。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
前記カバーはさらに空気孔を具備し、
前記工程（ｂ）において、前記空間に満たされていた空気が、前記空気孔から排出される。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）の後には、前記空間に試料溶液が満たされる。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、
前記疎水性イオン液体を構成する陽イオンおよび前記陰イオンは、それぞれ以下の群Ｉおよび群ＩＩから選択される。
群Ｉ：
（１）１−Ｒ１−２−Ｒ２−３−Ｒ３−イミダゾリウムイオン（Ｒ１はメチル基またはブチル基を表し、Ｒ２は水素またはメチル基を表し、Ｒ３はアルキル基を表し、Ｒ３はヘテロ原子を含んでもよい）、
（２）Ｎ−Ｒ４−イソキノリウムイオン（Ｒ４はアルキル基を表し、ヘテロ原子を含んでもよい）、
（３）Ｎ−Ｒ５−ピリジニウムイオン（Ｒ５はアルキル基を表し、ヘテロ原子を含んでもよい）、
（４）Ｎ，Ｎ−Ｒ６，Ｒ７−ピロリジニウムイオン（Ｒ６はメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、またはブチル基を表し、Ｒ７はアルキル基を表し、Ｒ７はヘテロ原子を含んでもよい）、
（５）Ｎ，Ｎ−Ｒ８，Ｒ９−ピペリジニウムイオン、または
（Ｒ８はメチル基またはブチル基を表し、Ｒ９はアルキル基を表し、Ｒ９はヘテロ原子を含んでもよい）
（６）Ｒ１０，Ｒ１１，Ｒ１２，Ｒ１３−アンモニウムイオン
（Ｒ１０，Ｒ１１，Ｒ１２，Ｒ１３は独立してアルキル基、フェニル基、またはベンジル基であり、ヘテロ原子を含んでもよい)
群ＩＩ：
（１）ビストリフルオロメタンスルフォニルイミドイオン、
（２）トリフレートイオン、または
（３）ビスペンタフルオロエタンスルフォニルイミドイオン
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、
前記疎水性イオン液体は、以下から選択される：
１,３−ジメチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
１−エチル−３−メチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
１−エチル−３−メチルイミダゾリウム トリフレート
１−エチル−３−メチルイミダゾリウム ビスペンタフルオロエタンスルフォニルイミド
１,３−ジエチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
１,３−ジエチルイミダゾリウム トリフレート
１−ブチル−３−エチルイミダゾリウム トリフレート
１,２−ジメチル−３−エチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム トリフレート
１−イソプロピル−３−メチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
１,２−ジメチル−３−プロピルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
Ｎ，Ｎ−プロピルメチルピロリジニウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
プロピルトリメチルアンモニウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
Ｎ，Ｎ−メチルプロピルピペリジニウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド、または
Ｎ−ブチルピリジニウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、
前記親水性イオン液体を構成する陽イオンおよび前記陰イオンは、それぞれ以下の群Ｉおよび群ＩＩＩから選択される。
群Ｉ： 
（１）１−Ｒ１−２−Ｒ２−３−Ｒ３−イミダゾリウムイオン（Ｒ１はメチル基またはブチル基を表し、Ｒ２は水素またはメチル基を表し、Ｒ３はアルキル基を表し、Ｒ３はヘテロ原子を含んでもよい）、
（２）Ｎ−Ｒ４−イソキノリウムイオン（Ｒ４はアルキル基を表し、ヘテロ原子を含んでもよい）、
（３）Ｎ−Ｒ５−ピリジニウムイオン（Ｒ５はアルキル基を表し、ヘテロ原子を含んでもよい）、
（４）Ｎ，Ｎ−Ｒ６，Ｒ７−ピロリジニウムイオン（Ｒ６はメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、またはブチル基を表し、Ｒ７はアルキル基を表し、Ｒ７はヘテロ原子を含んでもよい）、
（５）Ｎ，Ｎ−Ｒ８，Ｒ９−ピペリジニウムイオン、または
（Ｒ８はメチル基またはブチル基を表し、Ｒ９はアルキル基を表し、Ｒ９はヘテロ原子を含んでもよい）
（６）Ｒ１０，Ｒ１１，Ｒ１２，Ｒ１３−アンモニウムイオン
（Ｒ１０，Ｒ１１，Ｒ１２，Ｒ１３は独立してアルキル基、フェニル基、またはベンジル基であり、ヘテロ原子を含んでもよい)
群ＩＩＩ：
（４）テトラフルオロボレートイオン、または
（５）ハライドイオン。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、
前記親水性イオン液体は、以下から選択される：
１−エチル−３−メチルイミダゾリウム  テトラフルオロボレート、
１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム  テトラフルオロボレート、
１−メチル−３−プロピルイミダゾリウム  テトラフルオロボレート、
１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム  ヨージド、
１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウム  ブロマイド、
１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウム  クロライド、
１−オクチル−３−メチルイミダゾリウム  クロライド、または
Ｎ−ヘキシルピリジニウム  クロライド。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、
前記ストリッピングゲルが前記保護ゲルによって完全に隠されるように、前記保護ゲルは前記ストリッピングゲルの全体を覆っている。
【請求項１０】
変換ストリッピング法のためのセンサチップであって、以下を具備する：
基板、
一対のくし型作用電極、
対極、
ストリッピング電極、および
ストリッピングゲル、
ここで、
前記ストリッピング電極の表面は銀を具備し、
前記ストリッピングゲルは、前記ストリッピング電極を覆い、
前記ストリッピングゲルは、一対のくし型作用電極および対極のいずれをも覆わず、
前記ストリッピングゲルは、基準電解質および、疎水性もしくは親水性イオン液体を含有し、
前記疎水性もしくは親水性イオン液体は、陽イオンおよび陰イオンを含有し、
前記基準電解質は、前記陽イオンおよびハロゲン化物イオンを含有し、
前記保護ゲルは、前記ストリッピングゲルを覆い、
前記保護ゲルは、疎水性イオン液体を含有するが、前記基準電解質も水も含有しない。
【請求項１１】
請求項１０に記載のセンサチップであって、
前記センサチップは、注入口を有するカバーをさらに具備し、
前記カバーと前記センサチップとの間には空間が形成されている。
【請求項１２】
請求項１１に記載のセンサチップであって、
前記カバーはさらに空気孔を具備する。
【請求項１３】
請求項１０に記載のセンサチップであって、
前記疎水性イオン液体を構成する陽イオンおよび前記陰イオンは、それぞれ以下の群Ｉおよび群ＩＩから選択される。
群Ｉ：
（１）１−Ｒ１−２−Ｒ２−３−Ｒ３−イミダゾリウムイオン（Ｒ１はメチル基またはブチル基を表し、Ｒ２は水素またはメチル基を表し、Ｒ３はアルキル基を表し、Ｒ３はヘテロ原子を含んでもよい）、
（２）Ｎ−Ｒ４−イソキノリウムイオン（Ｒ４はアルキル基を表し、ヘテロ原子を含んでもよい）、
（３）Ｎ−Ｒ５−ピリジニウムイオン（Ｒ５はアルキル基を表し、ヘテロ原子を含んでもよい）、
（４）Ｎ，Ｎ−Ｒ６，Ｒ７−ピロリジニウムイオン（Ｒ６はメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、またはブチル基を表し、Ｒ７はアルキル基を表し、Ｒ７はヘテロ原子を含んでもよい）、
（５）Ｎ，Ｎ−Ｒ８，Ｒ９−ピペリジニウムイオン、または
（Ｒ８はメチル基またはブチル基を表し、Ｒ９はアルキル基を表し、Ｒ９はヘテロ原子を含んでもよい）
（６）Ｒ１０，Ｒ１１，Ｒ１２，Ｒ１３−アンモニウムイオン
（Ｒ１０，Ｒ１１，Ｒ１２，Ｒ１３は独立してアルキル基、フェニル基、またはベンジル基であり、ヘテロ原子を含んでもよい)
群ＩＩ：
（１）ビストリフルオロメタンスルフォニルイミドイオン、
（２）トリフレートイオン、または
（３）ビスペンタフルオロエタンスルフォニルイミドイオン
【請求項１４】
請求項１０に記載のセンサチップであって、
前記疎水性イオン液体は、以下から選択される：
１,３−ジメチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド、
１−エチル−３−メチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド、
１−エチル−３−メチルイミダゾリウム トリフレート、
１−エチル−３−メチルイミダゾリウム ビスペンタフルオロエタンスルフォニルイミド、
１,３−ジエチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド、
１,３−ジエチルイミダゾリウム トリフレート、
１−ブチル−３−エチルイミダゾリウム トリフレート、
１,２−ジメチル−３−エチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド、
１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド、
１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム トリフレート、
１−イソプロピル−３−メチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド、
１,２−ジメチル−３−プロピルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド、
Ｎ，Ｎ−プロピルメチルピロリジニウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド、
プロピルトリメチルアンモニウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド、
Ｎ，Ｎ−メチルプロピルピペリジニウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド、または
Ｎ−ブチルピリジニウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド。
【請求項１５】
請求項１０に記載のセンサチップであって、
前記親水性イオン液体を構成する陽イオンおよび前記陰イオンは、それぞれ以下の群Ｉおよび群ＩＩＩから選択される。
群Ｉ：
（１）１−Ｒ１−２−Ｒ２−３−Ｒ３−イミダゾリウムイオン（Ｒ１はメチル基またはブチル基を表し、Ｒ２は水素またはメチル基を表し、Ｒ３はアルキル基を表し、Ｒ３はヘテロ原子を含んでもよい）、
（２）Ｎ−Ｒ４−イソキノリウムイオン（Ｒ４はアルキル基を表し、ヘテロ原子を含んでもよい）、
（３）Ｎ−Ｒ５−ピリジニウムイオン（Ｒ５はアルキル基を表し、ヘテロ原子を含んでもよい）、
（４）Ｎ，Ｎ−Ｒ６，Ｒ７−ピロリジニウムイオン（Ｒ６はメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、またはブチル基を表し、Ｒ７はアルキル基を表し、Ｒ７はヘテロ原子を含んでもよい）、
（５）Ｎ，Ｎ−Ｒ８，Ｒ９−ピペリジニウムイオン、または
（Ｒ８はメチル基またはブチル基を表し、Ｒ９はアルキル基を表し、Ｒ９はヘテロ原子を含んでもよい）
（６）Ｒ１０，Ｒ１１，Ｒ１２，Ｒ１３−アンモニウムイオン
（Ｒ１０，Ｒ１１，Ｒ１２，Ｒ１３は独立してアルキル基、フェニル基、またはベンジル基であり、ヘテロ原子を含んでもよい)
群ＩＩＩ：
（４）テトラフルオロボレートイオン、または
（５）ハライドイオン。
【請求項１６】
請求項１０に記載のセンサチップであって、
前記親水性イオン液体は、以下から選択される：
１−エチル−３−メチルイミダゾリウム  テトラフルオロボレート、
１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム  テトラフルオロボレート、
１−メチル−３−プロピルイミダゾリウム  テトラフルオロボレート、
１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム  ヨージド、
１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウム  ブロマイド、
１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウム  クロライド、
１−オクチル−３−メチルイミダゾリウム  クロライド、または
Ｎ−ヘキシルピリジニウム  クロライド。
【請求項１７】
請求項１０に記載のセンサチップであって、
前記ストリッピングゲルが前記保護ゲルによって完全に隠されるように、前記保護ゲルは前記ストリッピングゲルの全体を覆っている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変換ストリッピング法により化学物質を定量する方法およびそれに用いられるセンサチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１は、変換ストリッピング法を開示している。変換ストリッピング法は、溶液に含有される化学物質を高感度で電気化学的に定量することを可能にする。【０００３】
図１は、特許文献１に開示された、変換ストリッピング法のためのシステムを示す。【０００４】
当該システムは、一対のくし型作用電極１、ストリッピング電極２、参照極３、対極４、溶液５、ストリッピング液６、塩橋７、イオン伝導体８、ポテンショスタット９、レコーダ１０、およびスイッチボックス１１を具備する。【０００５】
溶液５は、定量される化学物質および酸化還元物質を含有する。ストリッピング液６は、基準電解質および支持電解質を含有する。【０００６】
図２は、特許文献１に開示された、変換ストリッピング法に用いられるセンサチップ１０１ａを示す。【０００７】
センサチップ１０１ａは、複数の電極２〜４を表面に具備する。さらに、容器６４がセンサチップ１０１ａの表面を覆う。容器６４は第１貫通開口部６４ａおよび第２貫通開口部６４ｂを具備する。溶液５およびストリッピング液６が、第１貫通開口部６４ａおよび第２貫通開口部６４ｂにそれぞれ供給される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第３２８９０５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ストリッピング液６の乾燥が、基準電解質の濃度を変化させる。このことは、化学物質の定量の精度を低下させる。
本発明の目的は、変換ストリッピング法により高精度に化学物質を定量する方法およびそのために用いられるセンサチップを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、試料溶液に含有される化学物質を定量する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｅ）を具備する：
センサチップ（３００）を用意する工程（ａ）、ここで、
前記センサチップ（３００）は、基板（３０）、一対の作用電極（３１ａ／３１ｂ）、対極（３３）、ストリッピング電極（３４）、ストリッピングゲル（３５）、および保護ゲル（３６）を具備し、
一対の作用電極（３１ａ／３１ｂ）は、第１作用電極（３１ａ）および第２作用電極（３１ｂ）から構成され、
前記ストリッピング電極（３４）の表面は銀を具備し、
前記ストリッピングゲル（３５）は、前記ストリッピング電極（３４）を覆い、
前記ストリッピングゲル（３５）は、一対の作用電極（３１ａ／３１ｂ）および対極（３３）のいずれをも覆わず、
前記ストリッピングゲル（３５）は、基準電解質および、疎水性もしくは親水性イオン液体を含有し、
前記ストリッピングゲル（３５）は、水を含有せず、
前記疎水性もしくは親水性イオン液体は不揮発性であり、
前記疎水性もしくは親水性イオン液体は、陽イオンおよび陰イオンから構成され、
前記基準電解質は、前記陽イオンおよびハロゲン化物イオンから構成され、
前記保護ゲル（３６）は、前記ストリッピングゲル（３５）を覆い、
前記保護ゲル（３６）は、疎水性イオン液体を含有するが、前記基準電解質も水も含有せず、
センサチップの表面に、前記試料溶液を供給し、前記表面を前記試料溶液により被覆する工程（ｂ）、ここで、
前記試料溶液は、前記化学物質および酸化還元物質を含有するか、または酸化還元物質により修飾された化学物質を含有し、
ポテンシオスタットにより前記第１作用電極（３１ａ）に電位を印加し、かつ前記第２作用電極（３１ｂ）を前記ストリッピング電極（３４）に電気的に接続し、第１作用電極（３１ａ）、前記第２作用電極（３１ｂ）、および前記ストリッピング電極（３４）の各表面上において以下の化学式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）によって表される反応をそれぞれ生じさせる工程（ｃ）、
第１作用電極（３１ａ）：
酸化還元物質（還元体）  →  酸化還元物質（酸化体）  ＋  ｅ−・・・（Ｉ）
第２作用電極（３１ｂ）：
酸化還元物質（酸化体）  ＋ｅ−  →  酸化還元物質（還元体）・・（ＩＩ）
ストリッピング電極３４：
銀＋ハロゲン化物イオン−  →ハロゲン化銀↓＋ｅ−・・（ＩＩＩ）
ここで、前記ハロゲン化銀は、前記ストリッピング電極（３４）の表面上に堆積し、
前記第１作用電極（３１ａ）および前記第２作用電極（３１ｂ）に電位が印加されない状態でストリッピング電極（３４）に電位を印加し、ストリッピング電極（３４）を流れた電流量を測定する工程（ｄ）、および
前記電流量に基づいて前記酸化還元物質（還元体）の濃度を算出し、前記算出された濃度に基づいて前記化学物質を定量する工程（ｅ）。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、変換ストリッピング法により高精度に化学物質を定量する方法およびそのために用いられるセンサチップを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、特許文献1に開示された、変換ストリッピング法のためのシステムを示す。
【図２】図２は、特許文献1に開示された、変換ストリッピング法に用いられるセンサチップを示す。
【図３】図３は、本発明の実施形態によるセンサチップ３００を示す。
【図４】図４は、参考実施例および比較例における第１作用電極５０および第２作用電極６０を示す。
【図５】図５は、参考実施例および比較例による電気化学測定セル７０を示す。
【図６】図６は、第１作用電極５０および第２作用電極６０を用いたサイクリックボルタモグラムを示す。
【図７】図７は、生理食塩水中で測定した、サイクリックボルタモグラムを示す。
【図８】図８は、サイクル数に対する酸化電流のピーク値のプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、図３を参照しながら本発明の実施形態が説明される。
【００１４】
（工程（ａ））
まず、センサチップ３００が用意される。
図３は、実施の形態１によるセンサチップ３００を示す。センサチップ３００は、基板３０、一対のくし型作用電極３１ａ／３１ｂ、参照極３２、対極３３、ストリッピング電極３４、ストリッピングゲル３５、保護ゲル３６、およびカバー３７を具備している。カバー３７は、試料溶液を注入するための注入口３８および空気孔３９を具備する。
一対のくし型作用電極３１ａ／３１ｂは、第１作用電極３１ａおよび第２作用電極３１ｂから構成される。
参照極３２は、必要に応じて具備される。高い定量精度を考慮すれば、センサチップ３００は参照極３２を具備することが好ましい。
【００１５】
基板３０は、電極領域３０ａおよび接続領域３０ｂを具備する。化学物質の定量時に、カバー３７が電極領域３０ａを覆う。一方、カバー３７は接続領域３０ｂを覆わない。
【００１６】
一対のくし型電極３１ａ／３１ｂ、参照極３２、対極３３、およびストリッピング電極３４は、電極領域３０ａに形成されている。これらの各電極は、リード線を有する。全てのリード線は互いに接触しておらず、電極領域３０ａでは絶縁膜によって覆われており、試料溶液との接触を防いでいる。全てのリード線の一端は、接続領域３０ｂに延伸している。接続領域３０ｂは、図３に示すポテンショスタット４２のコネクタに挿入される。
【００１７】
基板３０の形状の例は、長方形、正方形、および楕円形である。基板３０の表面は絶縁層（図示せず）を具備する。基板３０の表面は、電極の形成を考慮すれば、平滑であることが好ましい。
【００１８】
一対のくし型作用電極３１ａ／３１ｂは電極領域３０ａであれば、ストリッピングゲル３５、保護ゲル３６および他の電極と接触しない限りどこに配置してもよいが、電極領域３０ａの中心付近に配置されることが好ましい。一対のくし型作用電極３１ａ／３１ｂの材料の例は、電気化学反応に対する安定性を考慮して、金、白金、およびグラッシーカーボンである。一対のくし型作用電極３１ａ／３１ｂは、互いに対向し、かつ噛み合っている。
【００１９】
参照極３２もまた、電極領域３０ａのどこに配置してもよいが、一対のくし型作用電極３１ａ／３１ｂの近傍にあることが好ましい。参照極３２は、電気化学測定時に一定の電位を有する。参照極３２の例は、銀／塩化銀電極である。
【００２０】
対極３３は電極領域３０ａのどこにでも配置され得る。対極３３の形状も制限されない。対極３３の面積は、一対のくし型電極３１ａ／３１ｂの面積およびストリッピング電極３４の面積のおよそ２０〜３０倍であることが好ましい。一対のくし型作用電極３１ａ／３１ｂと同様、対極３３の材料の例は、電気化学反応に対する安定性を考慮して、金、白金、およびグラッシーカーボンである。
【００２１】
ストリッピング電極３４は表面に銀を具備する。
【００２２】
ストリッピングゲル３５は、ストリッピング電極３４を覆う。ストリッピングゲル３５は、一対のくし型作用電極３１ａ／３１ｂの近傍に配置され、その間の抵抗を低下させることが好ましい。ストリッピングゲル３５は好ましくは薄膜である。
【００２３】
ストリッピングゲル３５および保護ゲル３６は、ストリッピング電極３４以外の他の電極３１〜３３を覆わない。万一、ストリッピングゲル３５もしくは保護ゲル３６が他の電極３１〜３３のうちの１つを覆う場合、ストリッピングゲル３５もしくは保護ゲル３６が当該1つの電極に電気的に接続される。これは、化学物質の定量を不可能にすることをもたらす。
【００２４】
注入口３８および空気孔３９は、カバー３７の上面、側面のどこにあってもよい。注入口３８および空気孔３９の形状も制限されない。カバー３７は、電極領域３０ａを覆い、試料溶液が接続領域３０ｂおよびチップの外に流出することを防ぐ。カバー３７は必要に応じて設けられる。カバー３７によらずに、試料溶液はセンサチップ３００の表面に塗布され得る。
【００２５】
次に、ストリッピングゲル３５が詳細に説明される。
ストリッピングゲル３５は、基準電解質を含有する疎水性もしくは親水性イオン液体をゲル化して得られる。すなわち、ストリッピングゲル３５は基準電解質および疎水性もしくは親水性イオン液体を含有する。疎水性もしくは親水性イオン液体は支持電解質として機能する。疎水性もしくは親水性イオン液体をゲル化する方法は特に限定されない。例として、高分子化合物がゲル化のために用いられる。高分子化合物の例は、フッ化ビニリデン‐ヘキサフルオロプロピレン共重合体、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、またはポリブチルアクリレートである。
【００２６】
次に、保護ゲル３６が詳細に説明される。
保護ゲル３６は、ストリッピングゲル３５を覆う。すなわち、ストリッピングゲル３５は、保護ゲル３６およびストリッピング電極３４の間に挟まれる。図３に示すように、ストリッピングゲル３５が保護ゲル３６によって完全に隠されるように、保護ゲル３６はストリッピングゲル３５の全体を覆うことが好ましい。
保護ゲル３６は、ストリッピングゲル３５と同様、疎水性イオン液体をゲル化して得られる。保護ゲル３６は、基準電解質を含有しない。ストリッピングゲル３５と同様、疎水性イオン液体は支持電解質として機能する。保護ゲル３６は、親水性イオン液体を含有しない。
【００２７】
疎水性のイオン液体は、以下の陽イオンおよび以下の陰イオンから構成される。
陽イオン：
（１）１−Ｒ１−２−Ｒ２−３−Ｒ３−イミダゾリウムイオン（Ｒ１は水素または１以上６以下の炭素数を有する低級アルキル基であり、Ｒ２は水素またはメチル基であり、Ｒ３はアルキル基であり、Ｒ３はヘテロ原子を含んでもよい）、
（２）Ｎ−Ｒ４−イソキノリウムイオン（Ｒ４はアルキル基であり、ヘテロ原子を含んでもよい）、
（３）Ｎ−Ｒ５−ピリジニウムイオン（Ｒ５はアルキル基であり、ヘテロ原子を含んでもよい）、
（４）Ｎ，Ｎ−Ｒ６，Ｒ７−ピロリジニウムイオン（Ｒ６は水素または１以上６以下の炭素数を有する低級アルキル基であり、Ｒ７はアルキル基であり、Ｒ７はヘテロ原子を含んでもよい）、
（５）Ｎ，Ｎ−Ｒ８，Ｒ９−ピペリジニウムイオン（Ｒ８は水素または１以上６以下の炭素数を有する低級アルキル基であり、Ｒ９はアルキル基であり、Ｒ９はヘテロ原子を含んでもよい）、または
（６）Ｒ１０，Ｒ１１，Ｒ１２，Ｒ１３−アンモニウムイオン
（Ｒ１０，Ｒ１１，Ｒ１２，Ｒ１３は独立してアルキル基、フェニル基、ベンジル基であり、ヘテロ原子を含んでもよい)
陰イオン：
（１）ビストリフルオロメタンスルフォニルイミドイオン、
（２）トリフレートイオン、または
（３）ビスペンタフルオロエタンスルフォニルイミドイオン
【００２８】
より具体的には、疎水性イオン液体は、以下に例示される。
１,３−ジメチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド、
１−エチル−３−メチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド、
１−エチル−３−メチルイミダゾリウム トリフレート、
１−エチル−３−メチルイミダゾリウム ビスペンタフルオロエタンスルフォニルイミド、
１,３−ジエチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド、
１,３−ジエチルイミダゾリウム トリフレート、
１−ブチル−３−エチルイミダゾリウム トリフレート、
１,２−ジメチル−３−エチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド、
１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド、
１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム トリフレート、
１−イソプロピル−３−メチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド、
１,２−ジメチル−３−プロピルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド、
Ｎ，Ｎ−プロピルメチルピロリジニウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド、
プロピルトリメチルアンモニウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド、
Ｎ，Ｎ−メチルプロピルピペリジニウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド、および
Ｎ−ブチルピリジニウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
【００２９】
親水性のイオン液体は、以下の陽イオンおよび以下の陰イオンから構成される。
陽イオン：
（１）１−Ｒ１−２−Ｒ２−３−Ｒ３−イミダゾリウムイオン（Ｒ１は水素または１以上６以下の炭素数を有する低級アルキル基であり、Ｒ２は水素またはメチル基であり、Ｒ３はアルキル基であり、Ｒ３はヘテロ原子を含んでもよい）、
（２）Ｎ−Ｒ４−イソキノリウムイオン（Ｒ４はアルキル基であり、ヘテロ原子を含んでもよい）、
（３）Ｎ−Ｒ５−ピリジニウムイオン（Ｒ５はアルキル基であり、ヘテロ原子を含んでもよい）、
（４）Ｎ，Ｎ−Ｒ６，Ｒ７−ピロリジニウムイオン（Ｒ６は水素または１以上６以下の炭素数を有する低級アルキル基であり、Ｒ７はアルキル基であり、Ｒ７はヘテロ原子を含んでもよい）、
（５）Ｎ，Ｎ−Ｒ８，Ｒ９−ピペリジニウムイオン、または
（Ｒ８は水素または１以上６以下の炭素数を有する低級アルキル基であり、Ｒ９はアルキル基であり、Ｒ９はヘテロ原子を含んでもよい）
（６）Ｒ１０，Ｒ１１，Ｒ１２，Ｒ１３−アンモニウムイオン
（Ｒ１０，Ｒ１１，Ｒ１２，Ｒ１３は独立してアルキル基、フェニル基、ベンジル基であり、ヘテロ原子を含んでもよい)
陰イオン：
（４）テトラフルオロボレートイオン
（５）ハライドイオン
【００３０】
より具体的には、親水性イオン液体は、以下に例示される。
１−エチル−３−メチルイミダゾリウム  テトラフルオロボレート
１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム  テトラフルオロボレート
１−メチル−３−プロピルイミダゾリウム  テトラフルオロボレート
１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム  ヨージド
１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウム  ブロマイド
１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウム  クロライド
１−オクチル−３−メチルイミダゾリウム  クロライド
Ｎ−ヘキシルピリジニウム  クロライド
【００３１】
基準電解質は、上記陽イオンおよびハロゲン化物イオンから構成される。ハロゲン化物イオンとは、塩化物イオン、臭化物イオン、またはヨウ化物イオンである。
溶解度の観点から、基準電解質は、ストリッピングゲルを構成する疎水性もしくは親水性イオン液体のカチオンと同一または類似のカチオンを有することが好ましい。例えば、イオン液体が１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムビストリフルオロメタンスルフォニルイミドである場合は、基準電解質は１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムハライドであることが好ましい。
【００３２】
（センサチップの作製方法）
本実施形態によるセンサチップを作製する手順が以下、説明される。
【００３３】
（電極の形成）
フォトレジストにより被覆された絶縁性基板が、パターン作製用のマスクを通して紫外光に照射され、続いてアルカリ現像を行う。パターンが形成された基板上に、金属がスパッタされる。有機溶媒中で残りのフォトレジストが溶解され、不要な金属を除去する。基板の全面が絶縁膜により被覆される。電極上の絶縁膜がドライエッチングによって除去され、一対のくし型作用電極３１ａ／３１ｂ、参照極３２、対極３３、およびストリッピング電極３４を形成する。銀／塩化銀電極は、銀／塩化銀のペーストを参照電極３２上に塗布して形成される。
【００３４】
（ストリッピングゲル３５の形成）
ストリッピングゲル３５は、以下のように形成され得る。
まず、密閉容器中においてフッ化ビニリデン−ヘキサフルオロプロピレン共重合体が超音波照射によって、氷冷しながらアセトンに溶解され、アセトン溶液を調製する。1−ブチル−3−メチルイミダゾリウムヨージドを含有する1−ブチル−3−メチルイミダゾリウムビストリフルオロメタンスルフォニルイミドがアセトン溶液に添加される。その後、アセトン溶液は攪拌され、ストリッピング電極３４上に滴下される。最後に、アセトンは蒸発されて、ストリッピングゲル３５を形成する。
【００３５】
（保護ゲル３６の形成）
保護ゲル３６は、以下のように形成され得る。
ストリッピングゲル３５の場合と同様に、密閉容器中においてフッ化ビニリデン−ヘキサフルオロプロピレン共重合体が超音波照射によって、氷冷しながらアセトンに溶解され、アセトン溶液を調製する。1−ブチル−3−メチルイミダゾリウムビストリフルオロメタンスルフォニルイミドがアセトン溶液に添加される。その後、アセトン溶液は攪拌され、ストリッピングゲル３５上に滴下される。最後に、アセトンは蒸発されて、保護ゲル３６を形成する。
【００３６】
（工程（ｂ））
上述されたセンサチップ３００の表面に試料溶液が供給され、前記表面を前記試料溶液により被覆する。試料溶液は、本発明により定量される化学物質を含有する。当該化学物質の例は、抗原、抗体、核酸、細胞、細菌、ウィルス、ハプテン、糖類である。
【００３７】
好ましくは、カバー３７がセンサチップ３００に設けられる。注入口３８から供給された試料溶液は、センサチップ３００の表面を覆う。カバー３７とセンサチップ３００との間の空間における空気は、空気孔３９から排出される。
より好ましくは、試料溶液は、カバー３７とセンサチップ３００との間の空間を満たす。これにより、試料溶液の容量を一定にすることが可能になる。
【００３８】
試料溶液は、定量される化学物質および酸化還元物質を含有する。本発明では、試料溶液は、還元状態の酸化還元物質を含有する。定量される化学物質および酸化還元物質は別々の物質であり得る。例えば、定量される化学物質は酵素であり、かつ、酸化還元物質はフェロシアン化カリウムのような電子メディエータである。または、定量される化学物質は、酸化還元物質により修飾され得る。フェロセンカルボン酸（以下、「ＦｃＣＯＯＨ」）により修飾されたタンパク質が例示される。
【００３９】
変換ストリッピング法は、工程（ｃ）および工程（ｄ）を具備する。
（工程（ｃ））
工程（ｃ）においては、スイッチ４１ａおよび４１ｂは、いずれも各端子Ａに接続され、第１作用電極３１ａに一定電位が印加される。さらに、第２作用電極３１ｂはストリッピング電極３４に電気的に接続され、一対のくし型作用電極３１ａ・３１ｂの間におけるレドックスサイクルを形成する。
酸化還元物質がフェロセンカルボン酸である場合、くし型作用電極３１ａ・３１ｂおよびストリッピング電極３４上では、以下の化学式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）に示される反応が生じる。
くし型作用電極３１ａ：
Ｆｃ２＋ＣＯＯＨ（還元体）  →  Ｆｃ３＋ＣＯＯＨ（酸化体）  ＋  ｅ−・・・（Ｉ）
くし型作用電極３１ｂ：
Ｆｃ３＋ＣＯＯＨ（酸化体）  ＋ｅ−  →  Ｆｃ２＋ＣＯＯＨ（還元体）・・（ＩＩ）
ストリッピング電極３４：
Ａｇ＋Ｘ−  →  ＡｇＸ↓＋ｅ−・・・（ＩＩＩ）
ＸはＩ、Ｂｒ、またはＣｌである。
ハロゲン化銀が、銀からなるストリッピング電極３４の表面上に堆積される。
【００４０】
（工程（ｄ））
工程（ｄ）では、スイッチ４１ａおよび４１ｂは、いずれも端子Ｂに接続される。第１作用電極３１ａおよび第２作用電極３１ｂのいずれにも、電位は印加されない。ポテンショスタット４２により、ストリッピング電極３４が掃引され、以下の化学式（ＩＶ）に示されるように、工程（ｃ）時に析出したハロゲン化銀が試料溶液に溶解する。
ストリッピング電極３４：
ＡｇＸ＋ｅ−  →  Ａｇ＋Ｘ−・・・（ＩＶ）
【００４１】
ストリッピングゲル３５は水を含有しない。疎水性および親水性イオン液体は不揮発性である。そのため、工程（ｃ）および工程（ｄ）において、従来技術とは異なり、ストリッピングゲル３５の乾燥は抑制される。
【００４２】
ストリッピングゲル３５は試料溶液と直接接触しない。そのため、ストリッピングゲル３５に含有された基準電解質の溶出は抑制される。これにより、基準電解質の濃度は維持される。その結果、化学物質の定量はより正確になる。このことが、本発明を特徴付ける。
【００４３】
工程（ｃ）において一定電位の印加時間が長いほど、ハロゲン化銀の析出量が増加するので、より高い感度が達成される。
【００４４】
（工程（ｅ））
工程（ｄ）の溶解時において流れる電流量は、ハロゲン化銀の析出量に比例する。ハロゲン化銀の析出量は、酸化還元物質（還元体）の濃度および工程（ｃ）において電位が印加された時間の積に比例する。すなわち、以下の等式が充足される。
（ハロゲン化銀の析出量）＝（酸化還元物質（還元体）の濃度）・（工程（ｃ）において電位が印加された時間）
【００４５】
従って、工程（ｄ）において流れた電流量から、酸化還元物質（還元体）の濃度が算出される。酸化還元物質（還元体）の濃度に基づいて、化学物質が定量される。言うまでもないが、一般的な手法の場合と同様に、電流量から化学物質が定量される際には、予め用意された検量線が用いられる。
【００４６】
（参考実施例）
以下、本発明の参考実施例が説明される。
【００４７】
まず、第一作用電極５０を調製した。
図４（ａ）は、本参考実施例による第一作用電極５０を示す。第一作用電極５０は、銀プレート５１、ストリッピングゲル５２、および保護ゲル５３を具備した。
【００４８】
（第一作用電極５０の作製）
第一作用電極５０は、以下のように作製した。
【００４９】
密閉容器中において、５０ｍｇのフッ化ビニリデンーヘキサフルオロプロピレン共重合体(Aldrich製)が、超音波照射によって氷冷しながらアセトンに溶解され、アセトン溶液を調製した。当該共重合体は、４７万の平均分子量を有していた。
【００５０】
１００ｍＭの1−ブチル−3−メチルイミダゾリウムヨージド(和光純薬工業製)を含有した５０μｌの1−ブチル−3−メチルイミダゾリウムビストリフルオロメタンスルフォニルイミド(東京化成工業製)を、アセトン溶液に添加し、よく攪拌した。このようにして、第１ストック溶液を調製した。
【００５１】
第１ストック溶液の場合と同様に、５０μｌの1−ブチル−3−メチルイミダゾリウムビストリフルオロメタンスルフォニルイミドを、アセトン溶液に添加し、よく攪拌した。このようにして、第２ストック溶液を調製した。
【００５２】
１０μｌの第１ストック溶液を銀プレート５１上に滴下した。銀プレート５１は、３．０ｍｍの直径を有していた。アセトンを乾燥させ、銀プレート５１の表面にストリッピングゲル５２を形成した。次に、ストリッピングゲル５２を覆うように、４０μｌの第２ストック溶液を滴下した。アセトンを乾燥させ、保護ゲル５３を形成した。このようにして、第一作用電極５０を得た。
【００５３】
（電気化学測定）
電気化学測定は、以下のように行われた。
図５は、参考実施例による電気化学測定セル７０を示す。電気化学測定セル７０は、作用電極７１、参照極７２、対極７３、電解液７４およびポテンショスタット７５を具備した。
作用電極７１は第一作用電極５０であった。参照極７２は銀／塩化銀電極であった。対極７３は白金ワイヤであった。電解液７４は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ  （Ｄ−ＰＢＳ：７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）であった。
【００５４】
ポテンショスタット７５（ＢＡＳ社より入手、商品名「ＡＬＳ−６６０Ａ」）により、第一作用電極５０の電位が、走査速度１０ｍＶ／ｓで２０周掃引された。
【００５５】
図６（ａ）は、前記第一作用電極５０を用いて得たサイクリックボルタモグラムの、１、３、５、７周目の結果を示す。約−０．３８Ｖ（ｖｓ.Ａｇ/ＡｇＣｌ）を中心とする酸化還元電流ピークが見られた。この電流は、以下の式（Ｖ）で示した酸化還元反応に由来する。
【００５６】
【化１】
2012114389.tif 000003
【００５７】
図７の電流５０１は、図５に示される電気化学セル７０を用いて走査速度１０ｍＶ／ｓで得たサイクリックボルタモグラムを示す。このサイクリックボルタモグラムでは、作用電極７１として１．６ｍｍの直径の金プレートが用いられた。電解液は、第一作用電極５０を用いたサイクリックボルタンメトリー測定に用いられた生理食塩水であった。図７に示される電流５０１は、酸化還元反応が生じなかったことを意味する。
【００５８】
（比較例）
以下、本発明の比較例が説明される。
【００５９】
（第二作用電極６０の作製）
第二作用電極６０は、保護ゲルを形成しなかったこと以外、第一作用電極５０の場合と同様に作製された。
【００６０】
図４（ｂ）は、比較例による第二作用電極６０を示す。第二作用電極６０は、銀プレート６１およびストリッピングゲル６２を具備した。第一作用電極５０と違い、保護ゲルは具備しなかった。
【００６１】
（電気化学測定）
電気化学測定は、図５に示した電気化学セル７０を用いて第一作用電極５０の場合と同様に行った。第二作用電極６０を、作用電極７１に用いた。
【００６２】
図６（ｂ）は、前記第二作用電極６０を用いて得たサイクリックボルタモグラムの、１周目８１、３周目８２、５周目８３、および７周目８４の結果を示す。作用電極５０の場合と同様に、約−０．３８Ｖ（ｖｓ.Ａｇ/ＡｇＣｌ）を中心に、反応式（Ｖ）に由来する酸化還元電流ピークが見られた。電流値は、徐々に減少した。
【００６３】
図７の電流６０１は、前記第二作用電極６０のサイクリックボルタンメトリー測定を実施した後の生理食塩水を電解液に用いて走査速度１０ｍＶ／ｓで得たサイクリックボルタモグラムを示す。電流５０１とは違い、電流６０１は、酸化還元反応が生じたことを意味する。
【００６４】
図８は、サイクル数に対して、図６で示したサイクリックボルタモグラムの酸化電流のピーク値をプロットしたものである。プロット５０２、６０２はそれぞれ、第一作用電極５０および第二作用電極６０を用いた結果を示す。
【００６５】
プロット５０２は、ほぼ一定の酸化電流ピーク値を保持した。この結果は、ストリッピングゲル５２に含有されたヨウ化物イオンの濃度が一定に保持されたことを示す。
プロット６０２は、測定サイクル数が増加すると、酸化電流ピーク値は徐々に減少した。この結果は、ストリッピングゲル６２に含有されたヨウ化物イオンが電解液７４に溶出したことを示す。
【００６６】
ストリッピングゲル５２は、保護ゲル５３によって試料溶液と直接接触しない。そのため、ストリッピングゲル５２に含有されたヨウ化物イオンの溶出は抑制された。これにより、ストリッピングゲル５２に含有されるヨウ化物イオンの濃度は一定に維持された。このことが、本発明を特徴付けた。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明は、変換ストリッピング法により高精度に化学物質を定量する方法およびそのために用いられるセンサチップを提供する。
【符号の説明】
【００６８】
１  くし型作用電極
２  ストリッピング電極
２ａ  ストリッピング電極
３  参照電極
４  対極
５  溶液
６  ストリッピング液
７  塩橋
８  イオン伝導体
９  ポテンショスタット
１０  レコーダ
１０１ａ  センサチップ
１１  スイッチボックス
３０  基板
３０ａ  電極領域
３０ｂ  接続領域
３００  センサチップ
３１ａ、３１ｂ  くし型作用電極
３２  参照極
３３  対極
３４  ストリッピング電極
３５  ストリッピングゲル
３６  保護ゲル
３７  カバー
３８  注入口
３９  空気孔
４１  スイッチボックス
４２  ポテンショスタット
４７ａ  くし型作用電極
５０  作用電極
５０１  サイクリックボルタモグラム
５０２  プロット
５１  銀
５２  ストリッピングゲル
５３  保護ゲル
６０  作用電極
６０１  サイクリックボルタモグラム
６０２  プロット
６１  銀
６２  ストリッピングゲル
６４  容器
７０  電気化学セル
７１  作用電極
７２  参照極
７３  対極
７４  電解液
７５  ポテンショスタット
８１  サイクリックボルタモグラム
８２  サイクリックボルタモグラム
８３  サイクリックボルタモグラム
８４  サイクリックボルタモグラム
【図１】
2012114389.tif 000004
【図２】
2012114389.tif 000005
【図３】
2012114389.tif 000006
【図４】
2012114389.tif 000007
【図５】
2012114389.tif 000008
【図６】
2012114389.tif 000009
【図７】
2012114389.tif 000010
【図８】
2012114389.tif 000011
【国際調査報告】
2012114389.tif 000012
2012114389.tif 000013