(57)【要約】この発明は、浸潤先進部の膵臓癌細胞周囲に存在する葉酸リセプターβ（ＦＲβ）（＋）マクロファージの細胞表面ＦＲβ蛋白質と免疫学的に特異的に結合する抗体にトキシンもしくは細胞障害剤を結合してなる抗癌性分子標的薬を、薬学的に許容可能な担体とともに含む、被験者において浸潤性膵臓癌の増殖又は転移を抑制するための医薬組成物、並びに、ＦＲβ（＋）マクロファージが先進部の膵臓癌細胞周囲に分布するとき、該癌組織が浸潤性でありかつ転移性であると判定することを特徴とする、膵臓癌の悪性度又は浸潤性膵臓癌の存在を測定するための診断剤及びキットに関する。
2012128377.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
浸潤先進部の膵臓癌細胞周囲に存在する葉酸リセプターβ（ＦＲβ）（＋）マクロファージの細胞表面ＦＲβ蛋白質と免疫学的に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントにトキシンもしくは細胞障害剤を結合してなる抗癌性分子標的薬を、薬学的に許容可能な担体とともに含む、被験者において浸潤性膵臓癌の増殖及び／又は転移を抑制するための医薬組成物。
【請求項２】
抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、多重特異性抗体又はそれらのフラグメントである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
抗体が、ヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
抗体又はそのフラグメントが、以下の（１）〜（４）に示される抗体又はそのフラグメントのうちの少なくとも１つである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（１）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号８、配列番号９及び配列番号１０であり、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３である抗体又はそのフラグメント
（２）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０であり、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３である抗体又はそのフラグメント
（３）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０であり、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３である抗体又はそのフラグメント
（４）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０であり、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号４１、配列番号４２及び配列番号４３である抗体又はそのフラグメント
【請求項５】
抗体又はそのフラグメントが、ヒトＦＲβタンパク質の配列番号１のアミノ酸配列の２７位〜６５位、１３０位〜１６６位、及び２０６位〜２３３位からなる群から選択される領域のエピトープと特異的に結合する抗体又はそのフラグメントである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
トキシンが細菌由来トキシンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
細菌由来トキシンが、シュードモナス毒素、ジフテリア毒素又はブドウ球菌毒素である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
抗癌性分子標的薬がイムノトキシンである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
細胞障害剤が、抗腫瘍剤、腫瘍増殖抑制剤、腫瘍細胞アポトーシス誘導剤又は放射性核種である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
転移がリンパ節転移又は血行性転移である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
被験者がヒトである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
被験者からの膵臓癌組織サンプルを、ＦＲβ（＋）マクロファージの細胞表面ＦＲβ蛋白質と特異的に結合する、かつ標識された若しくは標識されていない、抗体又はそのフラグメントと接触させ、該ＦＲβ蛋白質と該抗体又はそのフラグメントとの複合体の形成に基づいてＦＲβ（＋）マクロファージが該組織中の先進部の膵臓癌細胞周囲に存在するかどうかを調べ、ＦＲβ（＋）マクロファージが該先進部の膵臓癌細胞周囲に分布するとき、該組織が浸潤性でありかつ転移性であると判定することを特徴とする、膵臓癌の悪性度又は浸潤性膵臓癌の存在を検査する方法。
【請求項１３】
抗体が、モノクローナル抗体又はそのフラグメントである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
抗体又はそのフラグメントが、以下の（１）〜（５）に示される抗体又はそのフラグメントのうちの少なくとも１つである、請求項１２又は１３に記載の方法。
（１）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号８、配列番号９及び配列番号１０であり、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３である抗体又はそのフラグメント
（２）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０であり、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３である抗体又はそのフラグメント
（３）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０であり、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３である抗体又はそのフラグメント
（４）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０であり、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号４１、配列番号４２及び配列番号４３である抗体又はそのフラグメント
（５）ヒトＦＲβタンパク質の配列番号１のアミノ酸配列の２７位〜６５位、１３０位〜１６６位、及び２０６位〜２３３位からなる群から選択される領域のエピトープと特異的に結合する抗体又はそのフラグメント
【請求項１５】
浸潤先進部の膵臓癌細胞周囲に存在するＦＲβ（＋）マクロファージの細胞表面ＦＲβ蛋白質と免疫学的に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを含む、膵臓癌の悪性度又は浸潤性膵臓癌の存在を測定するための診断剤又はキット。
【請求項１６】
ＦＲβ（＋）マクロファージの細胞表面ＦＲβ蛋白質と免疫学的に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントと、標識とを結合した複合体を含む、被験者において浸潤性膵臓癌の存在を画像診断するための診断剤又はキット。
【請求項１７】
標識が、発蛍光団、色素又は放射性同位元素である、請求項１０に記載の診断剤又はキット。
【請求項１８】
抗体又はそのフラグメントが、以下の（１）〜（５）に示される抗体又はそのフラグメントのうちの少なくとも１つである、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の診断剤又はキット。
（１）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号８、配列番号９及び配列番号１０であり、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３である抗体又はそのフラグメント
（２）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０であり、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３である抗体又はそのフラグメント
（３）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０であり、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３である抗体又はそのフラグメント
（４）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０であり、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号４１、配列番号４２及び配列番号４３である抗体又はそのフラグメント
（５）ヒトＦＲβタンパク質の配列番号１のアミノ酸配列の２７位〜６５位、１３０位〜１６６位、及び２０６位〜２３３位からなる群から選択される領域のエピトープと特異的に結合する抗体又はそのフラグメント
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者において膵臓癌の増殖及び／又は転移を抑制するための医薬組成物に関する。
本発明はまた、浸潤性膵臓癌の組織診断及び画像診断への応用、具体的には該診断用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓癌は、早期診断が困難でありかつ有効な診断法がない癌のひとつである。膵臓癌の推定発症年齢は４０歳〜６０歳であるといわれており、最近の報告によれば、初期の腫瘍細胞が親クローンとなるまでに約１０年を要し、その後５年以内に転移性のサブクローンとなり、さらに１〜２年以内に他の臓器への転移が起こると推定されている（非特許文献１）。
また治療面からも、膵臓癌は、既存の抗癌剤が効きにくい癌であり、外科切除や放射線療法も行われているが、未だに有効な治療法が確立されていない。
膵臓癌患者の約８０％がステージＩＶの末期癌状態で発見されており、５年生存率は約１０％以下と低い。また、膵臓癌は、上腸管膜動脈、大動脈、下大静脈などの大血管への癌浸潤、並びに、肝臓、肺などの臓器への転移を起こし易く、これが、早期診断の難しさとともに、治療を困難にする原因となっている。例えば、手術不能な膵臓癌患者に対する化学療法での５０％生存率は、５−ＦＵの場合４．４ヶ月、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）の場合５．７ヶ月であるという報告がされている（非特許文献２）。
ところで、葉酸リセプターβ（ＦＲβ）が炎症部位や癌組織の浸潤マクロファージに特異的に発現しているという報告が、本発明者らによってなされている（特許文献１、特許文献２、非特許文献３及び非特許文献４）。このマクロファージは、腫瘍関連性マクロファージと呼ばれ、血管新生因子を放出し、かつ、腫瘍免疫を抑制するという性質をもつ。特許文献１は、ＦＲβに結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含む固形癌治療剤を開示しており、固形癌として、腫瘍関連性マクロファージが集積する、悪性グリオーマ、乳がんなどの癌が記載されている（特許文献１）。また、ＦＲβが関節リウマチなどの炎症性疾患や急性骨髄性白血病に関連する細胞表面で発現されること、並びに、そのような疾患の治療剤としての、細胞毒素と抗ＦＲβモノクローナル抗体とのコンジュゲートが記載されている（特許文献２、非特許文献５及び非特許文献６）。ＦＲβの発現は、末梢血単球や常在組織マクロファージではほとんどみられないことも知られている。
葉酸リセプター（ＦＲ）には、α、β、γ及びδがあり、特にαは卵巣癌、乳癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肺癌などの癌の上皮腫瘍膜表面に存在すること、ＦＲαとＦＲβの蛋白質間の配列同一性は約７０％であることなどが知られている（特許文献３及び特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−７７０２６号公報
【特許文献２】再表２００５−１０３２５０号公報
【特許文献３】特表２００９−５２１２０６号公報
【特許文献４】特表２０１０−５０３３８６号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｙａｃｈｉｄａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４６７：１１１５−１１１７，２０１０
【非特許文献２】Ｂｕｒｒｉｓ，Ｈ．Ａ．ＩＩＩ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１５：２４０３−２４１３，２００７
【非特許文献３】Ｐｕｉｇ−Ｋｒｏｇｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６９：９３９５−９４０３，２００９
【非特許文献４】Ｔａｎａｋａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：３８−４７，２００８
【非特許文献５】Ｎａｇａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．５４：３１２６−３１３４，２００６
【非特許文献６】Ｎａｇａｙｏｓｈｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．５２：２６６６−２６７５，２００５
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、最も予後不良で診断と治療が困難な膵臓癌の増殖及び／又は転移を抑制することを特徴とする浸潤性膵臓癌の治療用組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、膵臓組織内の癌存在の有無を判定するための組織診断又は画像診断用の組成物又はキットを提供することである。
本発明は、以下の特徴を包含する。
（１）浸潤先進部の膵臓細胞周囲に存在する葉酸リセプターβ（ＦＲβ）（＋）マクロファージの細胞表面ＦＲβ蛋白質と免疫学的に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントにトキシンもしくは細胞障害剤を結合してなる抗癌性分子標的薬を、薬学的に許容可能な担体とともに含む、被験者において浸潤性膵臓癌の増殖及び／又は転移を抑制するための医薬組成物。
（２）抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、多重特異性抗体又はそれらのフラグメントである、上記（１）に記載の医薬組成物。
（３）抗体が、ヒト抗体又はヒト化抗体である、上記（１）又は（２）に記載の医薬組成物。
（４）抗体又はそのフラグメントが、以下の（ａ）〜（ｄ）に示される抗体又はそのフラグメントのうちの少なくとも１つである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（ａ）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号８、配列番号９及び配列番号１０であり、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３である抗体又はそのフラグメント
（ｂ）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０であり、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３である抗体又はそのフラグメント
（ｃ）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０であり、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３である抗体又はそのフラグメント
（ｄ）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０であり、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号４１、配列番号４２及び配列番号４３である抗体又はそのフラグメント
（５）抗体又はそのフラグメントが、ヒトＦＲβタンパク質の配列番号１のアミノ酸配列の２７位〜６５位、１３０位〜１６６位、及び２０６位〜２３３位からなる群から選択される領域のエピトープと特異的に結合する抗体又はそのフラグメントである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（６）トキシンが細菌由来トキシンである、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の医薬組成物。
（７）細菌由来トキシンが、シュードモナス毒素、ジフテリア毒素又はブドウ球菌毒素である、上記（６）に記載の医薬組成物。
（８）抗癌性分子標的薬がイムノトキシンである、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の医薬組成物。
（９）細胞障害剤が、抗腫瘍剤、腫瘍増殖抑制剤、腫瘍細胞アポトーシス誘導剤又は放射性核種である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１０）転移がリンパ節転移又は血行性転移である、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１１）被験者がヒトである、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１２）被験者からの膵臓癌組織サンプルを、ＦＲβ（＋）マクロファージの細胞表面ＦＲβ蛋白質と特異的に結合する、かつ標識された若しくは標識されていない、抗体又はそのフラグメントと接触させ、該ＦＲβ蛋白質と該抗体又はそのフラグメントとの複合体の形成に基づいてＦＲβ（＋）マクロファージが該組織中の先進部の膵臓癌細胞周囲に存在するかどうかを調べ、ＦＲβ（＋）マクロファージが該先進部の膵臓癌細胞周囲に分布するとき、該組織が浸潤性でありかつ転移性であると判定することを特徴とする、膵臓癌の悪性度又は浸潤性膵臓癌の存在を検査する方法。
（１３）抗体が、モノクローナル抗体又はそのフラグメントである、上記（１２）に記載の方法。
（１４）抗体又はそのフラグメントが、以下の（ａ）〜（ｅ）に示される抗体又はそのフラグメントのうちの少なくとも１つである、請求項１２又は１３に記載の方法。
（ａ）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号８、配列番号９及び配列番号１０であり、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３である抗体又はそのフラグメント
（ｂ）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０であり、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３である抗体又はそのフラグメント
（ｃ）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０であり、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３である抗体又はそのフラグメント
（ｄ）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０であり、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号４１、配列番号４２及び配列番号４３である抗体又はそのフラグメント
（ｅ）ヒトＦＲβタンパク質の配列番号１のアミノ酸配列の２７位〜６５位、１３０位〜１６６位、及び２０６位〜２３３位からなる群から選択される領域のエピトープと特異的に結合する抗体又はそのフラグメント
（１５）浸潤先進部の膵臓癌細胞周囲に存在するＦＲβ（＋）マクロファージの細胞表面ＦＲβ蛋白質と免疫学的に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを含む、膵臓癌の悪性度又は浸潤性膵臓癌の存在を測定するための診断剤又はキット。
（１６）ＦＲβ（＋）マクロファージの細胞表面ＦＲβ蛋白質と免疫学的に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントと、標識とを結合した複合体を含む、被験者において浸潤性膵臓癌の存在を画像診断するための診断剤又はキット。
（１７）標識が、発蛍光団、色素又は放射性同位元素である、上記（１６）に記載の診断剤又はキット。
（１８）抗体又はそのフラグメントが、以下の（ａ）〜（ｅ）に示される抗体又はそのフラグメントのうちの少なくとも１つである、上記（１５）〜（１７）のいずれかに記載の診断剤又はキット。
（ａ）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号８、配列番号９及び配列番号１０であり、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３である抗体又はそのフラグメント
（ｂ）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０であり、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３である抗体又はそのフラグメント
（ｃ）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０であり、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３である抗体又はそのフラグメント
（ｄ）軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０であり、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号４１、配列番号４２及び配列番号４３である抗体又はそのフラグメント
（ｅ）ヒトＦＲβタンパク質の配列番号１のアミノ酸配列の２７位〜６５位、１３０位〜１６６位、及び２０６位〜２３３位からなる群から選択される領域のエピトープと特異的に結合する抗体又はそのフラグメント
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１１−０６１３６２号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１は、ヒト葉酸受容体（ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）α（「ＦＲα」）とヒトＦＲβのアミノ酸配列のアラインメントを示す。
図２は、ヒトＦＲβ蛋白質のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性−疎水性予測を示すグラフである。
図３は、ヒト膵臓癌組織（Ａ）におけるＣＤ６８発現マクロファージ（Ｂ）、ＣＤ１６３発現マクロファージ（Ｃ）及びＦＲβ発現マクロファージ（Ｄ）の分布を示す。図３Ａはヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色図、図２Ｂ、２Ｃ及び２Ｄはそれぞれ抗ＣＤ６８抗体、抗ＣＤ１６３抗体及び抗ＦＲβ抗体を使用した染色図である。
図４は、膵臓癌先進部のマクロファージの、ＤＡＰＩＩによる核染色（Ａ）、ＣＤ６８陽性マクロファージの蛍光染色（Ａｌｅｘａ５５５（ｒｅｄ）使用）（Ｂ）、ＦＲβ陽性マクロファージの蛍光染色（Ａｌｅｘａ４８８（ｇｒｅｅｎ）使用）（Ｃ）、ＣＤ６８陽性とＦＲβ陽性マクロファージの二重蛍光染色（Ｄ）をそれぞれ示す。
図５は、膵臓癌に浸潤しているＣＤ６８陽性マクロファージ数とＦＲβ陽性マクロファージ数の比較を示す。
図６は、ヌードマウスに移植されたヒト膵臓癌のＦＲβ発現マクロファージの検出を示す。マウスＦＲβ抗体で染色した。図６Ａ及び図６Ｃは移植腫瘍の中心部での、図６Ｂ及び図６Ｄは移植腫瘍の辺縁部でのＦＲβ発現マクロファージのＦＲβ発現を示す。
図７は、ヒト膵臓癌における腫瘍先進部の腫瘍新生血管の周囲に分布するＦＲβ発現マクロファージを示す（Ａ，Ｂ，Ｃ）。図７Ａは、腫瘍中心部でのＣＤ３１によるベッセルの評価を示し、図７Ｂは、腫瘍辺縁部でのＣＤ３１によるベッセルの評価を示す。図７Ｃは、ＦＲβ発現マクロファージ（茶）及びベッセル（赤、矢印）を示す。倍率はいずれも×４００で行った。
図８は、ＦＲβ（＋）マクロファージのＦＲβ高発現と腫瘍新生血管の高密度との関係を示す。
図９は、ＦＲβ（＋）マクロファージのＦＲβ高発現と血行性転移との関係を示す。
図１０は、ヒト膵臓癌患者の手術後生存期間とＦＲβ陽性マクロファージのＦＲβ発現との関係を示す。図１０Ａは、ＣＤ６８陽性マクロファージの高発現グループと低発現グループでの生存率の比較を示し、図１０Ｂは、ＦＲβ陽性マクロファージの高発現グループと低発現グループでの生存率の比較を示す。
図１１は、ヒト膵臓癌（ｃａｐａｎ１−Ｍ９株）を皮下に移植したヌードマウスにおける組換えイムノトキシン（ｄｓＦｖ  ａｎｔｉ−ＦＲβ−ＰＥ３８）の増殖抑制を検討するための実験デザインを示す。コントロールでは、ＶＨ−ＰＥ３８（コントロール群）と生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ群）を使用した。矢印の日にマウスを犠牲にした。
図１２は、図１１に記載の実験デザインに従って治療を実施したときのマウスにおける腫瘍体積の経日変化を示すグラフである。
図１３は、図１１に記載の実験デザインに従って治療を実施したときのマウスの体重が３つのグループ間でほとんど変化がないことを示すグラフである。
図１４は、ヒト正常膵組織におけるＣＤ６８発現マクロファージとＦＲβ発現マクロファージの検出結果を示す。Ａ及びＣは、ＣＤ６８陽性マクロファージの発現は認められたが、Ｂ及びＣは、ＦＲβ陽性マクロファージは有意な差をもってほとんど認められなかったことを示す。
図１５は、蛍光免疫染色でヒト膵癌組織におけるＣＤ６８（＋）マクロファージとＦＲβ（＋）マクロファージとの分布を示す。Ａ、Ｂ及びＣは、ＣＤ６８（＋）マクロファージとＦＲβ（＋）マクロファージとの分布を、膵癌の浸潤性先進部と中心部とで比較した結果を示す。図中、赤色がＣＤ６８（＋）マクロファージ、緑色がＦＲβ（＋）マクロファージを示す。
図１６は、ヒト膵癌組織におけるＣＤ６８（＋）マクロファージとＦＲβ（＋）マクロファージにおけるＣＤ６８の高発現、低発現及びＦＲβの高発現、低発現と、腫瘍微小血管の数量、膵癌患者での血行性転移との比較を示す。
図１７は、ヒト膵癌組織におけるＣＤ６８（＋）マクロファージとＦＲβ（＋）マクロファージの血管新生因子（ＶＥＧＦ）の発現を解析した結果を示す。Ａは、ＦＲβ（＋）マクロファージでのＶＥＧＦの発現を示し、Ｂは、ＣＤ６８（＋）マクロファージでのＶＥＧＦの発現を示す。Ｃは、ＡとＢの結果を数量化したグラフである。
図１８は、タイプ（ＣＤ６８，ＣＤ１６３，ＦＲβ）別浸潤性マクロファージの数量の比較（Ａ）と、各種マクロファージ別にみた膵癌患者の生存曲線（Ｂ，Ｃ，Ｄ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明をさらに詳細に説明する。
＜定義＞
本明細書で使用される「葉酸受容体β」又は「ＦＲβ」という用語は、被験者のがん関連マクロファージの細胞表面に発現される受容体蛋白質を意味する。本発明では、このマクロファージは、浸潤性膵臓癌の周囲に分布し局在するＭ１及び／又はＭ２マクロファージである。
本明細書で使用される「被験者」という用語には、ヒトを含む霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジなどの家畜動物、イヌ、ネコなどのペット動物などの哺乳動物が含まれる。好ましい被験者はヒトである。
本明細書で使用される「ＦＲβ蛋白質と免疫学的に特異的に結合する抗体」という用語は、抗体がＦＲβ蛋白質又はその天然変異体以外の蛋白質と結合しないか、又は、実質的に結合しないことを意味する。
本明細書で使用する「転移」という用語は、膵臓癌が浸潤性となり、リンパ管内や血管内に浸潤し、リンパ節や膵臓以外の臓器若しくは器官に定着し腫瘍を生じさせることを意味する。
＜ＦＲβ抗体＞
本発明で使用される「浸潤先進部の膵臓癌細胞周囲に存在する葉酸リセプターβ（ＦＲβ）（＋）マクロファージの細胞表面ＦＲβ蛋白質と免疫学的に特異的に結合する抗体」は、ＦＲβ蛋白質を認識して該蛋白質に結合することができる抗体又はそのフラグメントであり、以下に述べるように、抗体の種類や形態は問わないものとする。これらの抗体は、浸潤先進部の膵臓癌細胞周囲に存在するＦＲβ（＋）マクロファージの細胞表面ＦＲβ蛋白質と特異的に結合することを可能にする。
本発明において、上記抗体は、上記マクロファージのＦＲβと免疫学的反応により結合するが、ＦＲβ又はそれと９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性をもつその変異蛋白質以外の蛋白質とは実質的に結合しない。この点で、上記抗体は、ＦＲのアイソフォームの１つであるＦＲα（例えばヒトＦＲαはヒトＦＲβとの間に約７０％のアミノ酸配列同一性がある（特表２００８−５０００２５））と結合しない。
本発明の抗体は、いずれの免疫グロブリン（Ｉｇ）クラス（ＩｇＡ，ＩｇＧ，ＩｇＥ，ＩｇＤ，ＩｇＭ，ＩｇＹなど）及びサブクラス（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２など）のものであってもよい。また、免疫グロブリンの軽鎖は、κ鎖又はλ鎖のいずれであってもよい。
具体的には、本発明の抗体は、例えば、上記クラス又はサブクラスの完全構造を有する抗体又は、それらのフラグメント、例えば組換え抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、ＳｃＤｂ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｄｉａｂｏｄｙ），ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖなど）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などの抗体、或いは、それらのフラグメントである。
本発明で使用可能な抗体のフラグメントは、７以上、より好ましくは８〜１２若しくはそれ以上の連続アミノ酸を有するＦＲβ蛋白質抗原エピトープと結合可能である。
抗体フラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂｃなどを含む。このようなフラグメントの作製方法は当技術分野で公知であり、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼによる抗体分子の消化、或いは公知の遺伝子工学的手法により得ることができる。
以下、本発明において使用するための抗体の作製方法について詳述する。
本発明において使用可能な抗体を作製するにあたり、最初に免疫原（抗原）として使用するＦＲβ蛋白質又はその断片を調製する。
ここで断片は、７〜１０又はそれ以上、例えば１１〜２５、の連続アミノ酸からなる配列を有するものである。免疫原として使用することができるＦＲβ蛋白質の由来は、標的とするＦＲβと特異的に結合することができる抗体を誘導できるものであるものであれば特に限定されない。
ＦＲβと特異的に結合することができる抗体を誘導するために、ＦＲα（ＦＲβと蛋白質レベルで約７０％の配列同一性を有する。）とＦＲβとのアラインメントをとり、連続する約７〜２０アミノ酸からなる配列部分で互いに同一性の低いＦＲβ蛋白質の部分配列からなる（ポリ）ペプチドを免疫原として選択することができる。この場合さらに、ＦＲβ蛋白質の表面構造を、例えばＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの親水性−疎水性予測やＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎのアミノ酸配列からの二次構造予測（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９７４，１３：２２２−２４４）を利用して予測し、該蛋白質の表面に露出する上記（ポリ）ペプチド配列を免疫原として選択することが好ましい。
ＦＲβとＦＲαのアラインメント図、ＦＲβのＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの親水性−疎水性予測図を、それぞれ図１、図２に示した。ＦＲβは、ＧＰＩアンカー型蛋白質である（Ｍ．Ｎ．Ｐｒｉｏｌｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １９９９，１８：４０３５−４０４８）。そのシグナル配列は、Ｃ末端側の約３０アミノ酸残基からなる疎水性領域からなる。すなわち、この領域は、図１のＣ末端側のＨＶＮＡＧ・・ＱＬＷＬＬＧの配列からなり、また、図２から、このＣ末端側の配列が疎水性に富む領域であることがわかる。一般にＧＰＩアンカー型蛋白質は、ＧＰＩアンカーを介して膜に結合しており、膜貫通ドメイン及び細胞内領域をもたないが、図２から、ＦＲβは全体的に親水性に富む蛋白質であり、蛋白質部分は細胞外に露出して存在している。図１のＦＲβ（配列番号１）とＦＲα（配列番号３）のアミノ酸配列のアラインメントから、互いに配列同一性の低い部分、例えば配列番号１のアミノ酸配列の２７位〜６５位の領域、１３０位〜１６６位の領域、及び２０６位〜２３３位の領域からなる群から選択される領域の少なくとも８〜１２個の連続するアミノ酸残基、例えば約１０〜約２０個の連続するアミノ酸残基、からなる配列からなるペプチドを選択し、該ペプチドと特異的に結合する抗体、すなわち該ペプチドと結合しＦＲαなどの他の蛋白質と実質的に結合しない抗体、を作製することができる。
本発明の抗体を作製するためのＦＲβ蛋白質又はその断片に関するヒトを含む哺乳動物ＦＲβのアミノ酸又は塩基配列情報は、例えばヒトＦＲβのアミノ酸又は塩基配列（それぞれ配列番号１、配列番号２）に基づき、当該技術分野で公知の蛋白質及び遺伝子等のデータバンクである、例えばＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ、米国）、ＥＭＢＬ（ＥＢＩ、欧州）などから入手可能である。ＧｅｎＢａｎｋに登録されたＦＲβのアミノ酸配列及び塩基配列のアクセッション番号は、いくつかの公知のバリアント（ｖａｒｉａｎｔ）からなり、例えばＮＭ＿０００８０３（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １）、ＮＭ＿００１１１３５３４（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ２）、ＮＭ＿００１１１３５３５（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ３）などである。該ＦＲβ蛋白質又はその断片は、上記の配列情報に基づいて公知のペプチド合成技術や遺伝子組換え技術を利用して製造することができる。
同種又は異種動物におけるＦＲβの変異体又はオーソログの検索は、例えばカーリン（Ｋａｒｌｉｎ）及びアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）（１９９３）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７）に記載されたアルゴリズムや、その改良法であるカーリン及びアルトシュル（１９９０）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４）のアルゴリズムを用いて行うことができる。この種のアルゴリズムは、アルトシュルら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。また、ギャップが導入されたアライメントを得るためには、アルトシュルら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載されたＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを用いることができる。
ペプチド合成技術には、液相法と固相法が含まれる。これらの方法は、固相を使用するか否かの違いだけであるが、固相法の方が生成物の回収が容易であるという利点を有する。そのため、固相法を有利に使用できる。いずれの方法でも、蛋白質を構成する約５〜１０個の（保護）アミノ酸からなる多数のペプチドを合成し、それらを段階的に伸長してポリペプチドを合成し、最後に保護基を除去して目的の蛋白質を生成し、精製することを含む。ペプチド合成法は、例えば日本生化学編、生化学実験講座１巻、タンパク質の化学ＩＶ−化学修飾とペプチド合成−東京化学同人に記載されている。
遺伝子組換え技術による方法は、例えば、ＦＲβ蛋白質をコードするＤＮＡを適当なベクターに連結し、該ベクターを適当な宿主細胞に導入し形質転換し、適当な培地で宿主細胞を培養し、ＦＲβ蛋白質を生産することができる。この手法は当業者に周知であり、使用するベクター、宿主細胞、形質転換法、培養法、蛋白質の精製法などの技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９８）などに詳しく記載されている。
抗体産生細胞には、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞などの昆虫細胞、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅなどの酵母細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）由来細胞、胎仔ハムスター腎細胞、ヒト胎児腎臓株２９３、正常イヌ腎臓細胞株、正常ネコ腎臓細胞株、サル腎細胞、アフリカミドリザル腎細胞、ＣＯＳ細胞、非腫瘍化マウス筋芽細胞Ｇ８細胞、線維芽細胞株、骨髄腫細胞株、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＬＭＴＫ細胞、マウスｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ヒト子宮頸癌細胞、バッファローラット肝細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、マウス乳癌細胞、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、およびＦＳ４細胞などの哺乳類細胞が包含される。
上記のようにして製造したＦＲβ蛋白質又はその断片を免疫原として非ヒト動物を免疫し、以下に記載する方法によって本発明に係る抗体を製造することができる。或いは、該抗体をコードする重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを、免疫した非ヒト動物の脾臓細胞、リンパ系細胞等のｍＲＮＡから作製し、このＤＮＡを使用してキメラ抗体等の種々の形態の合成抗体をコードするＤＮＡを合成することができる。
本発明で使用しうる抗体類には、非限定的に、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体（例えば、キメラ抗体、単鎖抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体など）、ヒト抗体などが含まれる。
ポリクローナル抗体は、上記のようにして作製した免疫原を、哺乳動物、例えばウサギ、ラット、マウスなどに免疫して、抗血清を得ることによって製造することができる。具体的には、上記免疫原を、必要に応じて免疫原性を高めるためのアジュバントと共に、哺乳動物に静脈内、皮下又は腹腔内投与する。アジュバントとしては、市販の完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩（Ａｌｕｍ）、ムラミルペプチド（細菌細胞壁関連ペプチドの一種）等を使用することができる。その後、数日から数週間の間隔で、１〜７回の免疫を行い、最後の免疫日から１〜７日後に、ＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法などによって抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血して抗血清を得ることができる。このようにして取得した抗血清は、そのまま使用してもよいし、或いは、ＦＲβ蛋白質又はその断片ペプチドを固定化した親和性カラム（例えばアガロースゲルカラム使用）に抗血清をアプライし、カラムに結合する抗体を回収することを含む精製処理を行った後に使用してもよい。
モノクローナル抗体は、以下のようにして作製することができる。すなわち、上記のようにして免疫感作した非ヒト哺乳動物から得た抗体産生細胞（例えば脾臓細胞、リンパ系細胞など）と不死化ミエローマ細胞（「骨髄腫細胞」ともいう。）から融合法によってハイブリドーマを調製し、ハイブリドーマをクローン化し、免疫に用いたＦＲβ蛋白質又はその断片ペプチド抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンをヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地（「ＨＡＴ培地」）を用いて選択することによって製造することができる。ハイブリドーマの製造方法は、例えばＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎら（Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−９６）の方法に準じて行うことができる。非ヒト哺乳動物の例は、マウス、ラットなどのげっ歯類である。また、ミエローマ細胞としては、免疫感作した動物と同じ動物由来の細胞が好ましく使用され、例えばマウスミエローマ細胞、ラットミエローマ細胞などが挙げられる。特に、マウスミエローマ細胞株には、例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１株、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３株、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４株などが含まれる。抗体産生細胞とミエローマ細胞の融合は、平均分子量約１，５００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用するか、或いは電気的融合法を用いて行うことができる。
キメラ抗体、組換え抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体などは、ＦＲβ蛋白質又はその断片で免疫感作した非ヒト動物の脾臓細胞とミエローマ細胞から作製された特定のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ由来の該抗体をコードするＤＮＡから製造することができる。
具体的には、上記ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴカラムと親和的に結合するｍＲＮＡを全ＲＮＡから回収し、ｃＤＮＡを合成し、特定のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡをクローニングするか、或いは、公知のイムノグロブリン遺伝子配列に基づいてＰＣＲ法で増幅的に、抗体をコードするＤＮＡを合成し、該ＤＮＡ配列を決定する。ヒト、マウス等の動物の抗体の重鎖（Ｈ鎖）と軽鎖（Ｌ鎖）における、可変領域並びに相補性決定領域（ＣＤＲｓ）及びフレームワーク領域（ＦＲｓ）の配列及び位置を、例えばＫａｂａｔのＥＵナンバリングインデックス（Ｋａｂａｔ  ＥＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．Ｖｏｌ．１，Ｂｅｔｈｅｓｄａ（ＭＤ）：ＮＩＨ，１９９１）に従って決定することができる。
遺伝子組換え技術を用いて組換え抗体の作製法をさらに具体的に説明する。
作製したハイブリドーマからモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞といった宿主に導入して、宿主において組換え抗体を生産させることができる（Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ．，ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ．，１９９７  ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，２０００  ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ，Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．，１９９３  ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ）。或いは、トランスジェニック動物作製技術を用いて目的抗体の遺伝子座が内在性遺伝子座の領域に置換的に組み込まれたトランスジェニックなマウス、ウシ、ヤギ、ヒツジ又はブタを作製し、ＦＲβ蛋白質又はその断片ペプチドを抗原として免疫したのち、そのトランスジェニック動物の血液や乳汁などからその抗体遺伝子に由来する抗体を取得することも可能である。また、上記トランスジェニック動物のなかには、内因性抗体遺伝子を欠失したかつヒト抗体遺伝子を保有するマウスやウシなどのヒト抗体産生動物も知られているので、このような動物を利用する場合には、ヒトＦＲβに結合する完全ヒト抗体を得ることができる（例えばＷＯ  ９６／９６３４０９６、ＷＯ  ９６／３３７３５、ＷＯ９８／２４８９３など）。さらにまた、該動物の抗体産生細胞（例えばＢ細胞）とミエローマ細胞から作製したハイブリドーマをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する場合には、上記のような手法で、モノクローナル抗体を産生することもできる。
作製されたモノクローナル抗体は、当技術分野において公知の方法、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧカラムによるクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、硫安塩析法、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより精製することができる。
キメラ抗体は、Ｈ鎖及びＬ鎖における可変領域と定常領域がそれぞれ異なる動物由来のものである抗体を指す。例えば、Ｈ鎖及びＬ鎖における可変領域がマウス抗体由来である一方、定常領域がヒト抗体由来であるような抗体がキメラ抗体であり、この抗体をコードするＤＮＡは、マウス抗体をコードするＤＮＡ配列中の定常領域をコードするＤＮＡ配列を、ヒト定常領域をコードするＤＮＡ配列で置換した塩基配列を有する。キメラ抗体は、例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４５２−４５４に記載される技術を用いて製造することができる。
ヒト化抗体は、Ｈ鎖及びＬ鎖における、ＣＤＲ領域が非ヒト動物由来のものである一方、定常領域及びフレームワーク領域がヒト由来のものである抗体を指す。例えば、Ｈ鎖及びＬ鎖におけるＣＤＲ領域（ＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）がマウス抗体由来である一方、定常（Ｃ）領域及びフレームワーク領域（ＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３及びＦＲ４）がヒト抗体由来であるような抗体がヒト化抗体であり、この抗体をコードするＤＮＡは、マウス抗体をコードするＤＮＡ配列中の定常領域及びフレームワーク領域をコードするＤＮＡ配列を、ヒト定常領域及びフレームワーク領域をコードするＤＮＡ配列で置換した塩基配列を有する。ヒト化抗体を作製するための手法は、所謂、ＣＤＲ移植法と呼ばれるものであり、本発明で使用される抗体のうち特にヒトに投与可能な抗体は、ＣＤＲ移植法で作製されうるし（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５，１９８６；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９，１９８８；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６，１９９２；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６，１９８８）、或いは、後述するように、ヒト抗体産生非ヒト動物（例えばマウス）の使用（上記）やファージディスプレイ法などを利用して完全ヒト抗体を作製することができる。
ファージディスプレイ法は、繊維状ファージＭ１３、Ｔ７ファージなどのファージを利用して、ファージコート蛋白質と外来ポリペプチド（例えば、組換えＦＲβ抗体）を融合した形で発現させることでファージ表面に提示させる方法である（Ｃ．Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１など）。ファージコート蛋白質としては、Ｍ１３ファージではｇ３ｐやｇ８ｐを外来ポリペプチドの提示のために利用しうるし、また、Ｔ７ファージではｇ１０ｐを利用しうる。組換えＦＲβ抗体として、Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）とＬ鎖可変領域（ＶＬ）とをリンカー（例えば（ＧＧＧＧＳ）３）で結合した単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、多重特異性抗体（２以上の異なるＶＨと２以上の異なるＶＬとの組み合わせを含む抗体）などの合成抗体、（ヒト）抗体の（組換え）Ｈ鎖（ＶＨとＣＨ）、Ｌ鎖（ＶＬとＣＬ）又はそれらの組み合わせなどが含まれる。
上記の方法で製造可能な本発明で使用されうる抗体の具体例として、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない。また、以下の抗体類に加えて、該抗体類の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のそれぞれの相補性決定領域を含む、キメラ抗体、単鎖抗体、多重特異性抗体などの組換え抗体も本発明の組成物、キット、診断剤に有効成分として含めることができる。
配列番号１のアミノ酸配列の２７位〜６５位の領域、１３０位〜１６６位の領域、及び２０６位〜２３３位の領域からなる群から選択される領域の少なくとも８〜１２個の連続するアミノ酸残基、例えば約１０〜約２０個の連続するアミノ酸残基、からなる配列からなるペプチドと特異的に結合する抗体又はそのフラグメント。
抗ヒトＦＲβマウスモノクローナル抗体３６ｂ由来の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（配列番号４、対応する塩基配列：配列番号５）、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（配列番号６、対応する塩基配列：配列番号７）を含む抗体又はそのフラグメント。
抗ヒトＦＲβマウスモノクローナル抗体３６ｂ由来の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（それぞれ配列番号８、配列番号９、配列番号１０）、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（それぞれ配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３）を含む抗体又はそのフラグメント。
抗ヒトＦＲβマウスモノクローナル抗体９４ｂ由来の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（配列番号１４、対応する塩基配列：配列番号１５）、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（配列番号１６、対応する塩基配列：配列番号１７）を含む抗体又はそのフラグメント。
抗ヒトＦＲβマウスモノクローナル抗体９４ｂ由来の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（それぞれ配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０）、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（それぞれ配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３）を含む抗体又はそのフラグメント。
抗マウスＦＲβラットモノクローナル抗体ＣＬ５由来の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（配列番号２４、対応する塩基配列：配列番号２５）、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（配列番号２６、対応する塩基配列：配列番号２７）を含む抗体又はそのフラグメント。
抗マウスＦＲβラットモノクローナル抗体ＣＬ５由来の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（それぞれ配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０）、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（それぞれ配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３）を含む抗体又はそのフラグメント。
抗マウスＦＲβラットモノクローナル抗体ＣＬ１０由来の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（配列番号３４、対応する塩基配列：配列番号３５）、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（配列番号３６、対応する塩基配列：配列番号３７）を含む抗体又はそのフラグメント。
抗マウスＦＲβラットモノクローナル抗体ＣＬ１０由来の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（それぞれ配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０）、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（それぞれ配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３）を含む抗体又はそのフラグメント。
上記抗体は、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域、或いはフレームワーク領域又は定常領域に、１〜３個、好ましくは１又は２個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加（もしくは挿入）の変異を含むことができる。そのような具体例は、以下のとおりである。
抗ヒトＦＲβマウスモノクローナル抗体９４ｂ由来の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（配列番号１４、対応する塩基配列：配列番号１５）、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（配列番号１６、対応する塩基配列：配列番号１７）において配列番号１６の６３位のグリシン（塩基配列ｇｇｃ）をシステイン（Ｃｙｓ；塩基配列ｔｇｔ）に変異させた配列を含む抗体又はそのフラグメント。
抗ヒトＦＲβマウスモノクローナル抗体９４ｂ由来の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（配列番号１４、対応する塩基配列：配列番号１５）において配列番号１４の１２５位のグリシン（塩基配列ｇｇａ）をシステイン（Ｃｙｓ；塩基配列ｔｇｔ）に変異させた配列、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（配列番号１６、対応する塩基配列：配列番号１７）を含む抗体又はそのフラグメント。
抗マウスＦＲβラットモノクローナル抗体ＣＬ１０由来の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（配列番号３４、対応する塩基配列：配列番号３５）、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（配列番号３６、対応する塩基配列：配列番号３７）において配列番号３６の６３位のグリシン（塩基配列ｇｇｃ）をシステイン（Ｃｙｓ；塩基配列ｔｇｔ）に変異させた配列を含む抗体又はそのフラグメント。
抗マウスＦＲβラットモノクローナル抗体ＣＬ１０由来の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（配列番号３４、対応する塩基配列：配列番号３５））において配列番号３４の１２６位のセリン（塩基配列ｔｃｔ）をシステイン（Ｃｙｓ；塩基配列ｔｇｔ）に変異させた配列、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（配列番号３６、対応する塩基配列：配列番号３７）を含む抗体又はそのフラグメント。
ヒト化抗体は、例えば上記抗体のＨ鎖及びＬ鎖の各ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３、並びに、ヒト由来のＨ鎖及びＬ鎖の各フレームワーク及び定常領域の配列を含む。該フレームワーク領域及び定常領域のそれぞれのアミノ酸配列は、ＦＲβ蛋白質との結合特異性を変更することなく、１〜３個、好ましくは１又は２個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加（もしくは挿入）の変異を含むことができる。具体的なヒト化抗体の例を以下に記載する。
軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（それぞれ配列番号８、配列番号９、配列番号１０）、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（それぞれ配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３）を含むヒト化抗体又はそのフラグメント。
軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（それぞれ配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０）、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（それぞれ配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３）を含むヒト化抗体又はそのフラグメント。
軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（それぞれ配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０）、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（それぞれ配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３）を含むヒト化抗体又はそのフラグメント。
軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（それぞれ配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０）、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（それぞれ配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３）を含むヒト化抗体又はそのフラグメント。
後述の実施例に記載されるように、上記の抗体９４ｂＶＨ又は９４ｂＶＬ或いは抗体ＣＬ１０ＶＨ又はＣＬ１０ＶＬにＣｙｓ置換変異を導入して変異型ＶＨ及び変異型ＶＬを作製し、これらの変異型ＶＨにトキシンポリペプチド（例えば緑膿菌由来外毒素（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ｅｘｏｔｏｘｉｎ（ＰＥ））を融合させてイムノトキシンＶＨを作製し、さらにこれらに、それぞれ変異型ＶＬを結合して、イムノトキシンを作製することができる。例えば、抗ヒトＦＲβイムノトキシンＶＨＰＥのアミノ酸配列が配列番号４４であり、変異型ＶＬのアミノ酸配列が配列番号４５であるイムノトキシン、或いは、抗マウスＦＲβイムノトキシンＶＨＰＥのアミノ酸配列が配列番号４６であり、変異型ＶＬのアミノ酸配列が配列番号４７であるイムノトキシンである。
本発明の抗体類は、浸潤先進部の膵臓癌細胞周囲に存在するＦＲβマクロファージの細胞表面ＦＲβ蛋白質と免疫学的に特異的に結合するものであり、解離定数（Ｋｄ）が、例えば１×１０−７Ｍ以下、１×１０−８Ｍ以下、１×１０−９Ｍ以下、１×１０−１０Ｍ以下、１×１０−１１Ｍ以下、１×１０−１２Ｍ以下、１×１０−１３Ｍ以下、１×１０−１４Ｍ以下、又は１×１０−１５Ｍ以下である。
＜抗癌性分子標的薬＞
本発明では、上記の抗体類に、トキシン（「毒素」とも称する。）もしくは細胞障害剤を結合してなる抗癌性分子標的薬が、浸潤性膵臓癌の治療薬の有効成分として、或いは該治療薬の製造のために、使用される。
トキシンもしくは細胞障害剤が、浸潤先進部の膵臓癌細胞周囲に存在するＦＲβマクロファージを死滅させるか又は障害する能力をもつ。これによって、膵臓癌の増殖及び／又は転移を抑制することが可能になる。
トキシンには、非限定的に細菌由来毒素、植物由来毒素などの毒素を含み、また内毒素、外毒素などの毒素を含み、例えばジフテリア毒素、シュードモナス毒素、緑膿菌外毒素（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ）リシンＡ鎖（ｒｉｃｉｎ  Ａ  ｃｈａｉｎ）又は脱糖鎖リシンＡ鎖（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｒｉｃｉｎ  Ａ  ｃｈａｉｎ）、緑膿菌外毒素ＰＥ３８、リボゾーム不活性化蛋白質（ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン（ａｌｐｈａ−ｓａｒｃｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、アスペルギリン（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｎ）、リストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、リボヌクレアーゼ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）、エポドフィロトキシン（ｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、ジフテリアトキシン（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ）、ジフテリアＡ鎖、ブドウ球菌エンテロトキシンなどの細菌由来の毒素が含まれる。
腫瘍細胞に対する細胞障害剤には、抗腫瘍剤、腫瘍増殖抑制剤、細胞周期停止誘導剤、ＤＮＡ合成阻害剤、転写阻害剤、翻訳・蛋白質合成阻害剤、細胞分裂阻害剤、腫瘍細胞アポトーシス誘導剤、放射性核種などが含まれる。
細胞障害剤には、非限定的に、例えばヤマゴボウ抗ウイルス性蛋白質、アブリン、リシン及びそのＡ鎖、アルトレタミン、アクチノマイシンＤ、プリカマイシン、プロマイシン、グラミシジンＤ、ドキソルビシン、コルヒチン、サイトカラシンＢ、シクロホスファミド、エメチン、マイタンシン、アムサクリン、シスプラチン、エトポシド、エトポシドオルトキノン、テニポシド、ダウノルビシン、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ミトキサントラオン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒａｏｎｅ）、ビサントレン、ブレオマイシン、メトトレキセート、ビンデシン、ビノレルビン、ポドフィロトキシン、アドリアマイシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ＢＣＮＵ、タキソール、タルセバ、アバスチン、マイトマイシン、修飾シュードモナスエンテロトキシンＡ、カリチェアミシン、５−フルオロウラシル、シクロホスファミド、並びに、ＴＮＦ−αやＮＦ−βなどのサイトカインなどが含まれる。
放射性核種には、非限定的に、例えば鉛−２１２、ビスマス−２１２、アスタチン−２１１、ヨウ素−１３１、スカンジウム−４７、レニウム−１８６、レニウム−１８８、サマリウム−１５３、イットリウム−９０、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、臭素−７７、インジウム−１１１、リン−３２、およびホウ素−１０またはアクチニドなどの核分裂性核種を含む放射性同位元素である。ラベル化は、例えばタンパク質のシステイン残基、リジン残基などのアミノ酸残基を介して行うことができる。ラベル化の手法については、例えばＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）に記載されている。
本発明の抗癌性分子標的薬が上記抗体とトキシンからなる、すなわちイムノトキシンであるとき、これらの成分は融合蛋白質の形態をとることができる。この場合、トキシンは、抗体蛋白質の、例えば、可変領域のフレームワーク領域もしくはＣ末端領域、あるいは、定常領域のＣＨ３領域もしくはＣ末端領域に、必要に応じてリンカー（例えばペプチド）を介して、結合することができる。一方、本発明の抗癌性分子標的薬が上記抗体と細胞障害剤からなるとき、これらの成分は、結合のための官能基を介して共有結合又は非共有結合によって結合することができる。例えば、抗体分子中の反応性基、例えばアミノ基、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基、等の官能基を利用し、反応性基を有するトキシン又は細胞障害剤と反応させることによって分子標的薬を製造しうる。例えばＮ−スクシンイミジルエステル基、Ｎ−スルホスクシンイミジルエステル基、カルボキシル基、アミノ基、メルカプト基、ジスルフィド基などが含まれる。結合には、二官能性カップリング剤、活性エステル、アルデヒド類、ビスアジド、イソシアネートなどのカップリング剤を利用しうる。
＜医薬組成物＞
本発明はまた、上記の抗癌性分子標的薬を、薬学的に許容可能な担体とともに含む、被験者において浸潤性膵臓癌の増殖及び／又は転移を抑制するための医薬組成物を提供する。
本発明の抗癌性分子標的薬は、増殖を抑制するのみならず、転移、特にリンパ節転移又は血行性転移を抑制することが可能である。これらの転移を抑制することで、膵臓以外の臓器への腫瘍転移を抑制することができる。本発明の分子標的薬は、浸潤性膵臓癌の浸潤先進部に存在するＦＲβ（＋）マクロファージを特異的に結合するため、その周囲の膵臓癌を選択的に攻撃し、正常細胞に及ぼす影響を最小に抑えることができる。
薬学的に許容される担体（又は賦形剤）は、液体及び固体のいずれをも含み、経口製剤又は非経口製剤の種類に応じて適宜選択可能であり、例えば滅菌水、ＰＢＳなどの緩衝液、生理食塩水、リンゲル液、エタノール、グリセロール、植物油、ゼラチン、スクロース、ラクトース、アミロール、デンプン、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロースなどを含む。このような担体の他に、上記医薬組成物にはさらに、必要に応じて、滑沢剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、崩壊剤、可溶化剤、等張化剤、結合剤、緩衝剤、着色剤などの助剤を混合することができる。
本発明の医薬組成物は、経口投与、静脈内投与、動脈内投与、粘膜投与、筋肉内投与、皮下投与、頬投与、腹腔内投与、関節内投与、滑膜内投与、胸骨内投与、鼻腔内投与、ボーラス注射、連続注入、患部への直接投与など投与経路で投与しうる。
該医薬組成物は、上記投与経路に応じて製剤化する。製剤には、非限定的に例えば、注射剤、溶液剤、懸濁剤、錠剤、顆粒剤、粉末剤、噴霧剤、カプセル剤、腸溶製剤、徐放製剤、多層製剤などの種々の剤型に処方しうる。
本発明の医薬組成物中の有効成分である抗癌性分子標的薬は、治療上有効量で単位剤型中に含有される。投与用量は、被験者の性別、年齢、体重、重篤度、投与経路、副作用などの様々な要因に応じて変化させうるが、有効成分量は、１日当たり約１μｇ以上、例えば５０〜１００μｇ又はそれ以上であるが、これらに限定されない。投与回数は、単回又は複数回のいずれでもよい。
本発明の医薬組成物は、膵臓癌の従来の治療剤を併用投与することも可能である。従来の治療剤には、例えばゲムシタビン、５−ＦＵ、シスプラチン、ジェムザール、ＴＳ−１などの医薬品が含まれる。これらの治療剤は、本発明の医薬組成物の投与の前、同時又は後に被験者に投与しうる。
＜膵臓癌の悪性度又は浸潤性膵臓癌の存在の測定法、並びに、該測定のための診断剤及びキット＞
本発明はさらに、別の態様において、被験者からの膵臓癌組織サンプルを、ＦＲβ（＋）マクロファージの細胞表面ＦＲβ蛋白質と特異的に結合する抗体（放射性同位元素、発蛍光団、色素などのラベルで標識された抗体、或いは、非標識抗体）と接触させて、ＦＲβ（＋）マクロファージが該組織中の先進部の膵臓癌細胞周囲に存在するかどうかを調べ、ＦＲβ（＋）マクロファージが該先進部の膵臓癌細胞周囲に分布するとき、該組織が浸潤性でありかつ転移性であると判定することを特徴とする、膵臓癌の悪性度又は浸潤性膵臓癌の存在を検査する方法を提供する。
本明細書で使用する「判定する」という用語は、医師の判断、すなわち医療行為を意図したものではなく、医師に検査結果の情報又はデータを提示し、医師の判断を助けるための手段を意味する。したがって、「判定する」という用語は、「測定する」、「検査する」、「決定する」又は「評価する」などの用語で置き換えることができる。
本発明はさらに、上記検査方法に使用するための、上記抗体又はそのフラグメントを含む膵臓癌の悪性度又は浸潤性膵臓癌の存在を診断（画像診断を包含する。）するための診断剤又はキットも提供する。
画像診断の場合、診断剤又はキットに、上記抗体又はそのフラグメントと標識とを結合した複合体を含めることができる。標識には、上で例示したような発蛍光団、色素、放射性同位元素などが含まれる。
膵臓組織サンプルは、膵臓癌であると疑われる被験者から外科手術によって得られた患部の膵臓組織サンプルである。
本明細書で使用される「浸潤」は、腫瘍の運動性の亢進に伴い、病巣組織の深部、そして組織を超えて原発巣からの離脱を意味する。腫瘍の浸潤性は、腫瘍が転移性となり悪性化したことを示す。
本発明の方法は、癌の先進部が浸潤性となることと、ＦＲβ（＋）マクロファージが集積することとが相関することに基づいている。ＦＲβ（＋）マクロファージの存在を上記抗体又はそのフラグメントを使用して検出することによって、膵臓癌が浸潤性及び転移性であると判定（決定又は同定又は分類又は評価）する。
抗体によるＦＲβマクロファージ（＋）の検出は、ＥＬＩＳＡ、蛍光抗体法、放射免疫法、サンドイッチ法、組織染色法などによって行うことができる。二次抗体に、例えば酵素（例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、発蛍光団（例えばＦＩＴＣ、テトラメチルローダミン、テキサスレッドなど）、色素、放射性同位元素などのラベル（標識）を結合したものを使用して、マクロファージに結合した抗体の複合体を検出する。ラベルの結合には、化学的結合法、ビオチン−（ストレプト）アビジン系を利用する結合法などが含まれる。
画像診断の場合には、薬学的に許容可能な放射性核種や発光体を抗体にラベルし、被験者に該抗体を投与し、ＰＥＴ／ＣＴなどの画像診断技術を使用して画像をとり、膵臓癌の存在を判定又は検査することができる。
本発明のキットには、上記（標識された、又は標識されない）抗体又はそのフラグメント、或いはそれらを含む造影剤、のほかに、測定に使用するためのバッファ、ラベル化二次抗体などの試薬、測定手順を記載した使用説明書などを含めることができる。試薬は、別々の容器に密封される。
【実施例】
【０００８】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
〔実施例１〕
抗ヒトＦＲβマウスモノクローナル抗体及び抗マウスＦＲβラットモノクローナル抗体の製造
［抗原であるＦＲβ発現細胞の調製］
関節リウマチ滑膜またはＢａｌｂ／ｃマウス肝臓からＴｒｉｚｏｌ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて添付説明書に従って全ＲＮＡを抽出後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて添付説明書に従ってｃＤＮＡを合成した。次に、１μｌのリウマチ滑膜、またはＢａｌｂ／ｃマウス肝臓ｃＤＮＡをそれぞれ別個にＢｉｏｎｅｅｒ  ＰＣＲ  ｐｒｅｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）に加え、１０ピコモル量に調整したセンス（ヒトリウマチ滑膜：ａｇａａａｇａｃａｔｇｇｇｔｃｔｇｇａａａｔｇｇａｔｇ（配列番号４８）；マウス肝臓：ｔｃｔａｇａａａｇａｃａｔｇｇｃｃｔｇｇａａａｃａｇ（配列番号４９））およびアンチセンスプライマー（ヒトリウマチ滑膜：ｇａｃｔｇａａｃｔｃａｇｃｃａａｇｇａｇｃｃａｇａｇｔｔ（配列番号５０）；マウス肝臓：ｃｃｃａａｃａｔｇｇａｔｃａｇｇａａｃｔ（配列番号５１））を加え、９４℃２０秒、５８℃３０秒、７２℃６０秒で３０サイクルＰＣＲを行い、その後７２℃５分で反応させることにより、ヒトあるいはマウスＦＲβを増幅した。増幅したＦＲβ遺伝子のＰＣＲ産物をプラスミドＰＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲーションを行った。すなわちＰＣＲ産物２．５μｌにＮａＣｌ溶液を１μＬ、滅菌蒸留水１．５μｌ、ベクタープラスミド（ＰＣＲ２．１−ＴＯＰＯ）１μＬを加えて室温で５分間インキュベートし、その内の２μＬを大腸菌（ＴＯＰ１０Ｆ’）に加えて氷中で３０分反応後、４２℃３０秒の熱処理し、氷中で２分間静置し、２５０μＬのＳＯＣ培地を加えた後、３７℃で１時間シェーカー内で培養した。培養終了後、ＬＢ培地に捲き、３７℃で一晩培養した。
大腸菌培養の為、プレート上より採取した白いコロニーを、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ液体培地に加えて３７℃一晩培養した。大腸菌内のプラスミドの精製はＱｉａｇｅｎプラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）にて行った。組み込まれたＦＲβ遺伝子は、制限酵素ＥｃｏＲＩによる処理後、アガロース電気泳動に展開し、約０．８ｋｂ（７８２ｂｐ）のＦＲβ遺伝子産物を確認後、その部位を切り出し、遺伝子産物の抽出をＱｕｉａｇｅｎ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）にて精製した。次にあらかじめＥｃｏＲＩ処理を行った哺乳細胞発現用ベクターｐＥＲ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．ｐＥＦ−ＢＯＳ，ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９９０；１８（１７）：５３２２）と混和し、Ｔ４  ｌｉｇａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてライゲーションを行った。ライゲーション産物の大腸菌（ＴＯＰ１０Ｆ’）への遺伝子導入ならびに、ＦＲβ遺伝子の確認は上記と同様の手法で行った。
ｐＥＦ−ＢＯＳに組み込まれたＦＲβ遺伝子を確認後、ヒトＦＲβを含むベクターはマウスＢ３００−１９細胞に、マウスＦＲβを含むベクターはラットＲＢＬ２Ｈ３細胞にそれぞれ遺伝子導入を行った。すなわち、あらかじめ１×１０５個に調整した各細胞に、２０μＬのリポフェクタミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）と混和したＦＲβベクター１μｇを加え、細胞に添加した。遺伝子導入されたＢ３００−１９マウス細胞およびラットＲＢＬ２Ｈ３細胞は抗生物質Ｇ４１８耐性を獲得するため、１ｍｇ／ｍＬの濃度のＧ４１８を含む培地にて遺伝子導入された細胞を選択培養した。遺伝子導入された細胞のＦＲβ遺伝子導入の確認はＰＣＲ法にて行った。すなわち、１×１０７個に調整した各細胞をｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にてｃＤＮＡを合成し、１０ピコモル量に調整したセンス（ヒトリウマチ滑膜：ａｇａａａｇａｃａｔｇｇｇｔｃｔｇｇａａａｔｇｇａｔｇ（配列番号４８）；マウス肝臓：ｔｃｔａｇａａａｇａｃａｔｇｇｃｃｔｇｇａａａｃａｇ（配列番号４９））およびアンチセンスプライマー（ヒトリウマチ滑膜：ｇａｃｔｇａａｃｔｃａｇｃｃａａｇｇａｇｃｃａｇａｇｔｔ（配列番号５０）；マウス肝臓：ｃｃｃａａｃａｔｇｇａｔｃａｇｇａａｃｔ（配列番号５１））をＢｉｏｎｅｅｒ  ＰＣＲ  ｐｒｅｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）に加え、９４℃２０秒、５８℃３０秒、７２℃６０秒で３０サイクルＰＣＲを行い、その後７２℃５分で反応させることにより、ヒトあるいはマウスＦＲβを増幅した。増幅後アガロース電気泳動を行い、ＦＲβが示すバンド０．８ｋｂを確認した。
［抗ヒトＦＲβマウスモノクローナル抗体及び抗マウスＦＲβラットモノクローナル抗体の作製］
ＦＲβ発現マウスＢ３００−１９細胞あるいはラットＲＢＬ２Ｈ３細胞を１×１０７個に調整し、フロインド完全アジュバンドと混合し、Ｂａｌｂ／ｃマウス（抗ヒトＦＲβモノクローナル抗体用）あるいはＷｈｉｓｔｅｒ  Ｋｙｏｔｏラット（抗マウスＦＲβモノクローナル抗体用）の尾根部あるいは腹腔内に免疫した。この操作を一週間ごとに２〜４回繰り返した。
モノクローナル抗体の作製は、Ｋｏｌｅｒの方法（Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−９６）に従って行った。すなわち、脾臓あるいは腸骨リンパ節を取りだして単一細胞に解離させ、骨髄腫由来の細胞（ＮＳ−１）と細胞融合させてハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマはＨＡＴ選択培地にて培養し、培養上清中に分泌された抗体を、先のＦＲβ発現細胞との反応性で選別した。
抗体産生が認められたハイブリドーマのクローン化は、９６穴プレートの各穴あたり１細胞となるように調整した限界希釈培養にて行った。
クローン化したハイブリドーマを用いた抗体の採取は、マウス腹水から行った。まず細胞数を１×１０７個に調整してヌードマウス腹腔内に投与し、腹腔の膨張が認められるまで飼育した。腹腔の膨張が認められた個体から腹水を調整し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラム（ＧＥバイオサイエンス）にてモノクローナル抗体を精製した。精製したマウスおよびラットモノクローナル抗体のアイソタイプは、アイソタイピングＥＬＩＳＡキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて決定した。その結果、抗ヒトＦＲβマウスモノクローナル抗体はＩｇＧ２ａタイプのクローン３６ｂとＩｇＧ１タイプの９４ｂの２つが得られ、抗マウスＦＲβラットモノクローナル抗体は、ＩｇＧ２ａタイプのＣＬ５とＣＬ１０の２つが得られた。これら各抗体の抗原に対する反応性はフローサイトメトリーにて解析した。
［抗ヒトＦＲβマウスモノクローナル抗体及び抗マウスＦＲβラットモノクローナル抗体の重鎖遺伝子可変領域（ＶＨ）および軽鎖遺伝子可変領域（ＶＬ）、ならびにＶＨ配列及びＶＬ配列の決定］
マウスハイブリドーマクローン３６ｂ、９４ｂを１×１０７個にそれぞれ調整し、ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にてｃＤＮＡを合成した。３６ｂおよび９４ｂはＩｇ−Ｐｒｉｍｅ  Ｋｉｔを用いてＶＨおよびＶＬの遺伝子をＰＣＲにて決定した。ＰＣＲ条件は添付の説明書に従って行った。すなわち、９４℃６０秒、５０℃６０秒、７２℃１２０秒で３０サイクルＰＣＲを行い、その後７２℃５分で反応させ、ＶＨおよびＶＬの遺伝子を増幅した。増幅したＶＨおよびＶＬのＰＣＲ産物をプラスミドＰＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲーションし、大腸菌（ＴＯＰ１０Ｆ’）に遺伝子導入した。遺伝子導入した大腸菌よりプラスミドを精製し、３６ｂ、９４ｂのＶＨおよびＶＬの塩基配列を決定した。塩基配列の決定はＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｏｒ  Ｖ３．１  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（ＡＢＩ）を用いてＰＣＲを行い、ＡＢＩ  ３１０  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにて解析した（３６ｂのＶＬ（配列番号５）、３６ｂのＶＨ（配列番号７）、９４ｂのＶＬ（配列番号１５）、９４ｂのＶＨ（配列番号１７））。
ラットハイブリドーマクローンＣＬ５、ＣＬ１０を１×１０７個にそれぞれ調整し、ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にてｃＤＮＡを合成した。次に、Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅ  ＫｉｔおよびラットＶＨ増幅用にデザインしたプライマー（ｃａｃｃａｔｇｇａｇｔｔａｃｔｔｔｔｇａｇ（配列番号５２））を用い、ＶＨおよびＶＬの遺伝子をＰＣＲに増幅させた。増幅したＶＨおよびＶＬのＰＣＲ産物をプラスミドＰＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲーションし、大腸菌（ＴＯＰ１０Ｆ’）に遺伝子導入した。次に、大腸菌よりプラスミドを精製し、ＶＨおよびＶＬの塩基配列を決定した。塩基配列の決定はＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｏｒ  Ｖ３．１  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（ＡＢＩ）を用いてＰＣＲを行い、ＡＢＩ  ３１０  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにて解析した（ＣＬ５のＶＬ（配列番号２５）、ＣＬ５のＶＨ（配列番号２７）、ＣＬ１０のＶＬ（配列番号３５）、ＣＬ１０のＶＨ（配列番号３７））。
〔実施例２〕
組換えイムノトキシン（分子標的薬）の作製
［免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域（ＶＨ）にシステインの変異を導入］
抗ヒトＦＲβマウスモノクローナル抗体９４ｂの免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域（ＶＨ、配列番号１６）の６３番目のアミノ酸グリシン（塩基配列ｇｇｃ）をシステイン（塩基配列ｔｇｔ）に変異させるようにデザインしたプライマーを作製し（センス：ｃａｇａｇｇｃｃｔｇａａｃａｔｔｇｔｃｔｇｇａｇｔｇｇａｔｔｇｇａａｇ（配列番号５３）、アンチセンス：ｃｔｔｃｃａａｔｃｃａｃｔｃｃａｇａｃａｃｔｇｔｔｃａｇｇｃｃｔｃｔｇ（配列番号５４））、Ｑｕｉｃｋ  ｃｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施例１で得た９４ｂのＶＨを含むプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ  ９４ｂＶＨに変異誘発処理を行った。このＰＣＲ反応は、反応液を９５℃３０秒、５５℃６０秒、６８℃４分のサイクルを１２回連続して行った。抗マウスＦＲβラットモノクローナル抗体ＣＬ１０の免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域（ＶＨ、配列番号３６）へのシステインコドンの導入も上記と同様の方法にてプライマーをデザインして行った（センス：ｇｔｃｃｇｃｃａｇｇｃｔｃｃａａｃｇａａｇｔｇｔｃｔｇｇａｇｔｇｇ  ｇｔｃｇｃ（配列番号５５）、アンチセンス：ｇｃｇａｃｃｃａｃｔｃｃａｇａｃａｃｔｔｃｇｔｔｇｇａｇｃｃｔｇｇｃｇｇａｃ（配列番号５６））。
次に、反応後のＤＮＡを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに遺伝子導入し、０．１ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で選択培養した。選択した形質転換体のプラスミドをＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＫＩＴ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。さらに塩基配列をＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（ＡＢＩ）とＡＢＩ３１０シーケンサーにて決定し、６３番目のグリシンがシステイン（塩基配列ｔｇｔ）に変異したことを確認した。
［ｐＲＫ７９ＰＥ３８ベクターに変異を導入したＶＨを挿入］
次に、ＰＥ３８遺伝子を含むｐＲＫ７９ベクターｐＲＫ７９ＰＥ３８に、９４ｂＶＨおよびＣＬ１０ＶＨの変異を導入したＶＨの挿入を以下の方法にて行った。
変異を導入した９４ｂの５’末端部と３’末端部のアニーリングプライマーとしてｔａａｇａａｇｇａｇａｔａｔａｃａｔａｔｇｇａｇｇｔｔｃａｇｃｔｇｃａｇｃａｇｔｃ（配列番号５７）とｇｃｃｃｔｃｇｇｇａｃｃｔｃｃｇｇａａｇｃｔｔｔｔｇａｇｇａｇａｃｔｇｔｇａｇａｇｔｇｇ（配列番号５８）を、ＣＬ１０の５’末端部と３’末端部のアニーリングプライマーとしてａｔａｃａｔａｔｇｇａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａｇｔｃｔｇｇｇ（配列番号５９）とｔｃｃｇｇａａｇｃｔｔｔｔｇａｇｇａｇａｃａｇｔｇａｃｔｇａａｇｃ（配列番号６０）をそれぞれデザインした。アニーリングプライマーにはそれぞれ制限酵素であるＮｄｅＩがあり、この部位でのクローニングにより、ａｔｇを開始コドンとしたタンパク質の発現が可能である。また、もう片方のアニーリングプライマーにはＨｉｎｄＩＩＩ部位が挿入されており、この部位でのクローニングにより、ＶＨとＰＥ遺伝子が結合した融合タンパク質の発現が可能である。
これらのプライマーの組み合わせとｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使って変異を導入したｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−９４ｂＶＨおよびｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＣＬ１０ＶＨプラスミドのＰＣＲを行った。この反応は９４℃２０秒、５５℃３０秒、７２℃６０秒で３０サイクルＰＣＲを行い、その後７２℃５分で反応させた。次に、ＰＣＲ産物を精製し、精製産物に制限酵素ＮｄｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）とＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を加えて反応後、電気泳動に展開し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲルから目的の大きさのＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡに、制限酵素処理した変異導入ＶＨと同様の制限酵素で処理したｐＲＫ７９ＰＥ３８を添加し、さらにＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いてＶＨとｐＲＫ７９ＰＥ３８のライゲーション反応を行った。ライゲーション反応終了、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に遺伝子導入し、０．１ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地にて形質転換体を選択した。選択した形質転換体のプラスミドｐＲＫ７９−ＶＨＰＥをＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＫＩＴ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。さらに塩基配列をＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（ＡＢＩ）とＡＢＩ３１０シーケンサーにて塩基配列を決定した（抗ヒトＦＲβイムノトキシンＶＨＰＥ（配列番号４４）、抗マウスＦＲβイムノトキシンＶＨＰＥ（配列番号４６））。
［免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域にシステイン変異を導入］
抗ヒトＦＲβマウスモノクローナル抗体９４ｂの免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域（ＶＬ、配列番号１５）の１２５番目のアミノ酸をシステイン（塩基配列ｔｇｔ）に変異させるようにデザインしたプライマーを作製した（センス：ｔａａｇａａｇｇａｇａｔａｔａｃａｔａｔｇｇａｃａｔｔｇｔｇａｔｇｔｃａｃａａｔｃ（配列番号６１）（このプライマーには制限酵素ＮｄｅＩ切断可能な塩基ｃａｔａｔｇを含むため、この部位でクローニングすることにより、ａｔｇを開始コドンとしたタンパク質の発現が可能である）アンチセンス：ｇｃｔｔｔｇｔｔａｇｃａｇｃｃｇａａｔｔｃｃｔａｔｔｔｇａｔｔｔｃｃａｇｃｔｔｇｇｔｇｃｃａｃａａｃｃｇａａｃｇｔ（配列番号６２）（このプライマーは１２５番目のアミノ酸をシステイン（ｔｇｔ）に変異させ、終始コドンｔａｇに続いて制限酵素ＥｃｏＲＩ切断可能な塩基ｇａａｔｔｃが来るようにデザインしてある）。同様に抗マウスＦＲβラットモノクローナル抗体ＣＬ１０の免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域（ＶＬ、配列番号３４）に相当する１２６番目のアミノ酸をシステイン（塩基配列ｔｇｔ）に変異させるようにデザインしたプライマーを作製した（ａｔａｃａｔａｔｇｇａｃａｔｔｇｔｇａｔｇｃｃｃａａｔｃｔｃｃａｔｃｃ（配列番号６３）およびｇｃｔｔｔｇｔｔａｇｃａｇｃｃｇａａｔｔｃｃｔａｔｔｔｇａｔｔｔｃｃａｇｃｔｔｇｇｔｇｃｃａｃａａｃｃｇａａｃｇｔ（配列番号６２））。
これらのプライマーの組み合わせとｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−９４ｂＶＬプラスミドのＰＣＲを行った。この反応は９４℃２０秒、５５℃３０秒、７２℃６０秒で３０サイクルＰＣＲを行い、その後７２℃５分で反応させた。次に、ＰＣＲ産物を精製し、精製産物に制限酵素ＮｄｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）とＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を加えて反応後、電気泳動に展開し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲルから目的の大きさのＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡに、制限酵素処理した変異導入ＶＬと同様の制限酵素で処理したｐＲＫ７９ＰＥ３８を添加し、さらにＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いてＶＨとｐＲＫ７９ＰＥ３８のライゲーション反応を行った。ライゲーション反応終了、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に遺伝子導入し、０．１ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地にて形質転換体を選択した。選択した形質転換体のプラスミドｐＲＫ７９−ＶＬＰＥをＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＫＩＴ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。さらに塩基配列をＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（ＡＢＩ）とＡＢＩ３１０シーケンサーにて決定し、変異導入ＶＬの１２６アミノ酸がシステインに変異していることや、終始コドンｔａｇが配置されていることを確認した（抗ヒトＦＲβイムノトキシンＶＬ（配列番号４５）、抗マウスＦＲβイムノトキシンＶＬ（配列番号４７））。
［リコンビナントタンパク質封入体の調製］
上記の変異導入ＶＨを組み込んだプラスミドｐＲＫ７９−９４ｂＶＨＰＥ、ｐＲＫ７９−ＣＬ１０ＶＨＰＥ、変異導入ＶＬを組み込んだプラスミドｐＲＫ７９−ＶＬ９４ｂ、ｐＲＫ７９−ＶＬＣＬ１０を５０ｎｇ調製し、タンパク質発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に遺伝子導入した。遺伝子が導入された大腸菌の選抜は０．１ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地にて３７℃１５〜１８時間の培養で行った。
選択終了後の大腸菌は１０００ｍＬのスーパーブロース培地で３７℃の条件で培養し、可視吸光度６００ｎｍで１．０〜１．５に到達するまで培養した。培養後、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｔｈｉｏ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を終濃度１ｍＭになるように培地に添加し、さらに９０分間３７℃で培養した。培養終了後、遠心分離にて大腸菌を回収後、５０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．４、２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）を用いて２００ｍＬとなるまで懸濁した。懸濁後、卵白リゾチームを最終濃度０．２ｍｇ／ｍＬとなるように加え、室温で１時間反応させて大腸菌の破壊を行った。破壊後、２０，０００×ｇで遠心分離を行い、沈殿を回収した。沈殿物はさらに５０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．４、２．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で２００ｍＬとなるまで懸濁し、卵白リゾチームを最終濃度０．２ｍｇ／ｍＬとなるように加え、室温で１時間反応させた。反応終了後、２０，０００×ｇで遠心分離を行い、沈殿を回収した。沈殿はさらに５０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．４、２．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で２００ｍＬとなるまで懸濁し、十分混和させた後、２０，０００×ｇで遠心分離を行い、沈殿を回収した。この操作を５回繰り返した後の沈殿物をリコンビナントイムノトキシン封入体とし、さらに０．１Ｍ  トリス緩衝液（ｐＨ８．０、６Ｍ  グアニジン塩酸塩、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で溶解させ、最終濃度１０ｍｇ／ｍＬとなるように調節した。
［可溶化したＶＨＰＥとＶＬのカップリングとリフォールディング、精製］
上記で調製した９４ｂ−ＶＨＰＥと９４ｂ−ＶＬ、ＣＬ１０−ＶＨＰＥとＣＬ１０−ＶＬを混和し、リコンビナント二重鎖Ｆｖ抗ＦＲβイムノトキシンを作製した。
まず、０．５ｍＬのＶＨＰＥ、０．２５ｍＬのＶＬを混和し、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を最終濃度１０ｍｇ／ｍＬとなるように加え、室温で４時間の還元処理を行った。処理後、７５ｍＬの０．１Ｍ  トリス緩衝液（ｐＨ８．０、０．５Ｍ  アルギニン、０．９ｍＭ  酸化型グルタチオン、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）に溶解させた。この溶液を１０℃で４０時間放置することによって、ＶＨとＶＬを結合させた。結合終了後、分子量１０，０００カットの遠心濃縮器（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  １０、Ａｍｉｃｏｎ）で５ｍＬまで濃縮し、さらに５０ｍＬのトリス緩衝液（ｐＨ７．４、０．１Ｍ  尿素、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で希釈した。この希釈液をリコンビナントイムノトキシン精製の出発物質とした。
次に、トリス緩衝液（ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で平衡化したイオン交換カラムＨｉ−Ｔｒａｐ  Ｑ（ＧＥ）に、３０ｍＬ／時間の流速で、上記出発物質を吸着させた後、トリス緩衝液（ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で洗浄した。洗浄後、吸着したリコンビナントタイプイムノトキシンの溶出をトリス緩衝液（ｐＨ７．４、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で行った。溶出サンプルはトリス緩衝液（ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で透析した後、イオン交換カラムＰＯＲＯＳ  ＨＱ（ＰＯＲＯＳ）でさらに精製した。すなわち、透析した精製物質を１０ｍＬ／分の流速で吸着させ、トリス緩衝液（ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で洗浄後、上記緩衝液に０Ｍから１．０ＭのＮａＣｌ勾配を設定することにより、リコンビナントタイプイムノトキシンの溶出を行った。精製リコンビナントタイプイムノトキシンの最終調製はＴＳＫ３００ＳＷ（Ｔｏｓｏｈ）ゲル濾過クロマトグラフィーにて行った。まず、７５％の消毒用エタノールで４８時間洗浄することによってＴＳＫ３００ＳＷカラム中のエンドトキシン除去を行った。次に日本薬局方注射用蒸留水で洗浄し、その後日本薬局方生理食塩水でＴＳＫ３００ＳＷカラムの平衡化を行った。平衡化終了後、リコンビナントタイプイムノトキシンを投与し、流速０．２５ｍＬ／分でカラムからの溶出液を採取した。採取後、０．２２μｍの濾過滅菌機で処理し、純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認後、−８０℃で保存した。
［ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度検定］
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動）は０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む１２％ポリアクリルアミドの平板ゲルを用い、移動相には終濃度０．１％のＳＤＳ、１３０ｍＭ  グリシン、２５ｍＭ  トリスを含む水溶液を用いた。各サンプルは終濃度０．１％のＳＤＳを含む１００ｍＭ  トリス緩衝液ｐＨ６．５で調整し、５分間の煮沸処理を行った。煮沸終了後、平板ゲルにサンプルを投与し、３０ｍＡの定電流で電気泳動を展開させた。展開後、０．０５％のクマシーブリリアントブルーＲ溶液（ナカライテスク）でリコンビナントタイプイムノトキシンの染色を行った。
〔実施例３〕
ヒト膵臓癌組織における各種マクロファージの発現
ＣＤ６８発現マクロファージ（浸潤性マクロファージ）は膵臓癌内部ならびに先進部全体に認められるが、ＣＤ１６３発現マクロファージは比較的腫瘍先進部にＦＲβマクロファージは腫瘍先進部に一致して発現し（図３）、ＦＲβ（＋）マクロファージはＣＤ６８も共発現していることが明らかになった（図４）。しかしながら、膵癌に浸潤しているＦＲβ陽性マクロファージの数はＣＤ６８陽性マクロファージの数より有意に少ないことが判明した（図５）。
〔実施例４〕
抗マウスＦＲβラットモノクローナル抗体による膵臓癌先進部でのＦＲβマクロファージの検出
ヒト膵癌細胞（Ｃａｐａｎ−１株）のヌードマウス移植腫瘍をマウスＦＲβ抗体で染色し比較検討した。移植腫瘍の中心部（図６Ａ，６Ｃ）と辺縁部（図６Ｂ，６Ｄ）の比較から、ＦＲβ（＋）マクロファージはヌードマウスでも発現しており、腫瘍先進部に分布していることが判明した。
〔実施例５〕
ヒト膵臓癌におけるＦＲβ（＋）マクロファージの検出と転移との関連性
ヒト膵臓癌の手術症例（ｎ＝７６）によるＦＲβ（＋）マクロファージの発現とリンパ行性転移および血行性転移について検討した結果、ＦＲβ（＋）マクロファージのＦＲβ発現はリンパ行性ならびに血行性転移と強い相関を示した（表１）。その理由として、ＦＲβ（＋）マクロファージは腫瘍先進部の腫瘍新生血管の周囲に分布していることが明らかとなった（図７Ａ，Ｂ，Ｃ）。また、ＦＲβ（＋）マクロファージのＦＲβ高発現と腫瘍新生血管の高密度との関連性が認められた（図８）。さらに、ＦＲβ（＋）マクロファージのＦＲβ高発現グループでは血行性転移が高率に起こることが明らかとなった（図９）。
【表１】
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〔実施例６〕
ヒト膵臓癌におけるＦＲβ（＋）マクロファージの発現と生存期間との関連性
ヒト膵臓癌の手術症例（ｎ＝７６）を用いてＦＲβ（＋）マクロファージの発現と生存期間について検討した。ＣＤ６８陽性マクロファージでは両者間に有意の差は認めなかったが（図１０Ａ）、ＦＲβ（＋）マクロファージの発現では生存期間が有意に低下した（図１０Ｂ）。すなわち、ＦＲβ（＋）マクロファージの発現症例では転移・再発が高率であること、ＦＲβ（＋）マクロファージの発現は血行性転移との関連性が高いこと（実施例５）からも膵臓癌の進展（浸潤及び転移）を促進する役割を担っていることが強く示唆された。
〔実施例７〕
組換えイムノトキシンの浸潤性膵臓癌の増殖抑制
ヌードマウス移植ヒト膵臓癌（Ｃａｐａｎ−１  Ｍ９株）に対する組換えイムノトキシンの増殖抑制を検討した。実験デザインは図１１に示す。１０μｇの組換えイムノトキシンｄｓＦｖ  ａｎｔｉ−ＦＲβ−ＰＥ３８を毎日マウスの腫瘍内に注射し、膵臓腺癌Ｍ９の増殖に対するｄｓＦｖ  ａｎｔｉ−ＦＲβ−ＰＥ３８の効果を観察した。値は、各グループの腫瘍体積の平均±ＳＥＭである。ＶＨ−ＰＥ３８グループとの比較にける危険率ｐは０．００３であった。
その結果、組換えイムノトキシン（ｄｓＦｖ  ａｎｔｉ−ＦＲβ−ＰＥ３８）グループの腫瘍増殖が、コントロール（ｓａｌｉｎｅ，ＶＨ−ＰＥ３８）グループに比較して有意に抑制された（ｐ＝０．００３）（図１２）。しかしながら、マウスの体重変化はこれら３つのグループで差が見られなかった（図１３）。すなわち、組換えイムノトキシンの毒性（副作用）が見られなかったことは、本薬剤がマウスＦＲβ（＋）マクロファージのみを選択的に抑制したことを意味する。
〔実施例８〕
ヒト正常膵組織におけるＣＤ６８発現マクロファージとＦＲβ発現マクロファージの検出を試みた結果、ＣＤ６８発現マクロファージの発現は認められたが（図１４Ａ）、ＦＲβ発現マクロファージは有意な差をもってほとんど認められなかった（図１４Ｂ，１４Ｃ）。
〔実施例９〕
蛍光免疫染色でヒト膵癌組織におけるＣＤ６８（＋）マクロファージとＦＲβ（＋）マクロファージとの分布を検索した。ＣＤ６８（＋）マクロファージは癌先進部（ｂｏｒｄｅｒ  ｌｉｎｅ）より癌組織の中心部に向けて広く分布しているが（図１５Ａ，赤色がＣＤ６８（＋）マクロファージ）、ＦＲβ（＋）マクロファージは癌先進部周辺にのみ分布が見られた（図１５Ａ，緑色がＦＲβ（＋）マクロファージ）。さらに、ヒト膵癌組織におけるＣＤ６８（＋）マクロファージとＦＲβ（＋）マクロファージとの分布を、膵癌の先進部と中心部とで比較検討した。ＣＤ６８マクロファージは癌先進部と中心部にほぼ同等に分布しているが、ＦＲβ（＋）マクロファージは癌先進部周辺にのみ有意に多い分布が認められた（図１５Ｂ，１５Ｃ）。
〔実施例１０〕
ヒト膵癌組織におけるＣＤ６８（＋）マクロファージとＦＲβ（＋）マクロファージにおけるＣＤ６８及びＦＲβの発現の高低と、腫瘍微小血管の数量および膵癌患者での血行性転移との比較を解析した。ＣＤ６８（＋）マクロファージのＣＤ６８発現が低いグループと高いグループとの比較では、腫瘍微小血管の数量及び血行性転移で有意の差が見られなかった。一方、ＦＲβ（＋）マクロファージでは、腫瘍微小血管の数量及び血行性転移で有意の差が認められた（図１６）。
〔実施例１１〕
ヒト膵癌組織におけるＣＤ６８（＋）マクロファージとＦＲβ（＋）マクロファージの血管新生因子（ＶＥＧＦ）の発現を解析した。ＦＲβ（＋）マクロファージはＶＥＧＦを高発現しているが（図１７Ａ）、ＣＤ６８マクロファージは低発現を示した（図１７Ｂ）。数量化した結果、ＦＲβ（＋）マクロファージが有意に高いＶＥＧＦ発現を示した（図１７Ｃ）。すなわち、ＦＲβ（＋）マクロファージは血管新生因子（ＶＥＧＦ）を高発現することで、腫瘍微小血管の高い数量、高率の血行性転移に強く関連している。
〔実施例１２〕
タイプ別浸潤性マクロファージの数量の比較と、各種マクロファージ別にみた膵癌患者の生存曲線を検討した。タイプ別では、ＣＤ６８（＋）マクロファージ，ＣＤ１６３（＋）マクロファージ，ＦＲβ（＋）マクロファージの順に数が少ないことが判明した（図１８Ａ）。膵癌患者の生存曲線の比較では、ＣＤ６８（＋）マクロファージでは有意差が無く（図１８Ｂ（この図は図１０Ａと同じである。）），ＣＤ１６３（＋）マクロファージで有意の差が見られたが（図１８Ｃ），ＦＲβマクロファージで最も有意な差が認められ、膵癌患者でＦＲβ（＋）マクロファージが多くみられると予後不良であることを示している（図１８Ｄ（この図は図１０Ｂと同じである。））。これらの結果は、ＦＲβ（＋）マクロファージが血管新生因子の高発現などを示すことで膵癌の進展（浸潤・転移）に寄与していることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明により、転移性で悪性度が高い浸潤性膵臓癌の増殖及び／又は転移を抑制することが可能になる。また、そのような浸潤性膵臓癌の検出を可能にするためオーダーメイド治療が可能になる。
本発明により、進行性の浸潤性膵臓癌の検出と治療が可能になり、他の癌と比べて極端に検出率が低くかつ生存率が低いこの癌に対し、本発明の分子標的薬が癌の転移を抑制することを可能にする。これは医薬産業上有用である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ−Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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