(57)【要約】  野生型又は所望の変異遺伝子の発現を許容し、特定の優性変異遺伝子の発現のみを選択的かつ効果的に抑制することのできるRNAi分子を開発し、その設計方法及び当該RNAi分子を有効成分として含む優性変異遺伝子発現抑制剤の提供を目的とする。  転写産物上に不連続接合点を生じる優性変異遺伝子において、不連続接合点に隣接するセンス鎖領域の3’側の塩基から3’末端までの塩基長を所定の長さとなるように設定したRNAi分子を含む優性変異遺伝子発現抑制剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ASPスコア値が０．４以上であるRNAi分子を有効成分として含む、優性変異遺伝子の発現抑制剤であって、
前記ASPスコアは、以下の式から算出され、
ASPスコア＝[（対照RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量の相対比）−（対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）]×（１−対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）
（式中、対照RNAi分子は、前記正常型遺伝子及び変異遺伝子の発現に影響を及ぼさないRNAi分子である）
前記RNAi分子が
標的である優性変異遺伝子の転写産物上に生じる少なくとも一つの不連続接合点、及び該転写産物の連続する１６〜３０塩基の配列に一致する塩基配列を含むRNAiセンス鎖領域、並びにそれに相補的な塩基配列を含むRNAiアンチセンス鎖領域を含み、かつ
前記RNAiセンス鎖領域上のいずれか一の不連続接合点に隣接する3’側の塩基から下流側に向かって４〜１５番目のいずれか一の塩基が該RNAiセンス鎖領域の3’末端塩基を構成する、
前記遺伝子発現抑制剤。
【請求項２】
ASPスコア値が０．４以上であるRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを有効成分として含む、優性変異遺伝子の発現抑制剤であって、
前記ASPスコアは、
以下の式から算出され、
ASPスコア＝[（対照RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量の相対比）−（対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）]×（１−対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）
（式中、対照RNAi分子は、前記正常型遺伝子及び変異遺伝子の発現に影響を及ぼさないRNAi分子である）
前記RNAi分子が
標的である優性変異遺伝子の転写産物上に生じる少なくとも一つの不連続接合点、及び該転写産物の連続する１６〜３０塩基の配列に一致する塩基配列を含むRNAiセンス鎖領域、並びにそれに相補的な塩基配列を含むRNAiアンチセンス鎖領域を含み、かつ
前記RNAiセンス鎖領域上のいずれか一の不連続接合点に隣接する3’側の塩基から下流側に向かって４〜１５番目のいずれか一の塩基が該RNAiセンス鎖領域の3’末端塩基を構成する、
前記遺伝子発現抑制剤。
【請求項３】
RNAiセンス鎖領域及びRNAiアンチセンス鎖領域の3’末端にさらにTT又はUUを付加する、請求項１又は２に記載の抑制剤。
【請求項４】
RNAi分子がsiRNAである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抑制剤。
【請求項５】
RNAi分子がshRNAである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抑制剤。
【請求項６】
優性変異遺伝子における変異が塩基の欠失、塩基の挿入、スプライス部位を破壊し得る塩基の置換、遺伝子の重複、遺伝子の転座、及び染色体の逆位からなる一群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抑制剤。
【請求項７】
優性変異遺伝子が機能獲得型である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抑制剤。
【請求項８】
優性変異遺伝子が疾患の発症に関与する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抑制剤。
【請求項９】
疾患が悪性新生物である、請求項８に記載の抑制剤。
【請求項１０】
悪性新生物が非小細胞肺癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型EGFR遺伝子であるか、悪性新生物が大腸癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型CTNNB1遺伝子であるか、悪性新生物が胃癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型CDH1遺伝子であるか、悪性新生物が乳癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型BRCA1遺伝子若しくは変異型BRCA2遺伝子であるか、悪性新生物が多腺性自己免疫性内分泌不全症I型で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型AIRE遺伝子であるか、悪性新生物が自己免疫性リンパ増殖症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型TNFRSF6/APT1/FAS遺伝子であるか、悪性新生物が慢性骨髄性白血病又は急性リンパ性白血病で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がBCR-ABLキメラ遺伝子であるか、悪性新生物がバーキットリンパ腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がc-myc-IgH-キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が未分化型大細胞リンパ腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がNPM-ALK-キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が肺癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がEML4-ALK-キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が隆起性皮膚線維肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がPDGFB-COL1A1キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が先天性線維肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がETV6-NTRK3キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が低悪性線維粘液肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がFUS-CREB3L2キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が骨外性粘液型軟骨肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がEWS-CHNキメラ遺伝子であるか、悪性新生物がユーイング肉腫若しくは線維形成性小細胞腫瘍で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がEWSR1遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子であるか、悪性新生物が胞巣型横紋筋肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がSYT遺伝子若しくはSSX遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子であるか、悪性新生物が炎症性筋線維芽細胞性腫瘍で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がALK遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子であるか、悪性新生物が脂肪肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がCHOP遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子であるか、又は悪性新生物が軟部明細胞肉腫若しくは悪性線維性組織球腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がATF1遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子である、請求項９に記載の抑制剤。
【請求項１１】
悪性新生物が非小細胞肺癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型EGFR遺伝子である、請求項１０に記載の抑制剤。
【請求項１２】
RNAi分子のセンス鎖領域が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５３、５５、５９、６１、６３、６５、６７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３又は１４５で示されるヌクレオチドからなる、請求項１１に記載の抑制剤。
【請求項１３】
悪性新生物が慢性骨髄性白血病又は急性リンパ性白血病で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がBCR-ABLキメラ遺伝子である、請求項１０に記載の抑制剤。
【請求項１４】
RNAi分子のセンス鎖領域が、配列番号９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１又は１１３で示されるヌクレオチドからなる、請求項１３に記載の抑制剤。
【請求項１５】
疾患がヒト常染色体優性変異疾患である、請求項８に記載の抑制剤。
【請求項１６】
ヒト常染色体優性変異疾患が先天性夜盲症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がRHO遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が難聴遺伝子領域DFNA2で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がKCNQ4遺伝子若しくはGJB遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がワールデンブルグ症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がMITF遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が非症候性難聴で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がDIAPH1/DFNA1遺伝子若しくはPOU4F3遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が肥大型心筋症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がTNNT2遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が家族性肥大型心筋症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がMYBPC3遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が心尖部肥大型心筋症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がTNNI3遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がシャルコー・マリー・トゥース病1A型で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がPMP22遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がシャルコー・マリー・トゥース病1B型で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がMPZ遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がQT延長症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がKCNQ1遺伝子若しくはKCNH2遺伝子若しくはSCN5A遺伝子若しくはANK2遺伝子若しくはKCNE1遺伝子若しくはKCNE2遺伝子若しくはKCNJ2遺伝子若しくはCAV3遺伝子若しくはSCN48遺伝子若しくはAKAP9遺伝子若しくはANTA1遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がQT短縮症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がKCNH2遺伝子若しくはKCNJ2遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がブルガタ症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がSCN5A遺伝子若しくはGPD1L遺伝子若しくはCACNA1C遺伝子若しくはCACNB2B遺伝子若しくはSCN1B遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がカテコラミン誘発性多形性心室頻拍で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がRYR2遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が心伝導障害で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がSCN5A遺伝子若しくはSCN1B遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が筋萎縮性側索硬化症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がTDP43遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がヌーナン症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がPTPN11遺伝子であるか、又はヒト常染色体優性変異疾患が低カルシウム血症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がCaR遺伝子である、請求項１５に記載の抑制剤。
【請求項１７】
疾患が筋硬直性ジストロフィーで、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がDMPK遺伝子であるか、疾患が脊髄性筋萎縮症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がSMN1遺伝子であるか、疾患が先天性筋無力症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がCHRNE遺伝子であるか、疾患が前頭側頭葉型痴呆症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がMAPT遺伝子であるか、又は疾患が成長ホルモン単独欠損症II型で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がGH1遺伝子である、請求項８に記載の抑制剤。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抑制剤を有効成分として少なくとも一つ含有する医薬組成物。
【請求項１９】
センス鎖領域が、配列番号８３又は８５で示されるヌクレオチドからなるRNAi分子、及び／又はそのヌクレオチドをコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクター、並びに／あるいはセンス鎖領域が、配列番号８９で示されるヌクレオチドからなるRNAi分子、及び／又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを有効成分としてさらに含有する、請求項１１又は１２に従属する請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
センス鎖領域が、配列番号８９で示されるヌクレオチドからなるRNAi分子、及び／又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを含む、点突然変異型EGFR遺伝子発現抑制剤。
【請求項２１】
転写産物上に不連続接合点を有する優性変異遺伝子の発現を選択的に抑制するRNAi分子の設計方法であって、
（ａ）該転写産物上の不連続接合点に隣接する5’側及び3’側の塩基をそれぞれ第１及び第２基準塩基として設定する工程、
（ｂ）前記転写産物において、前記第２基準塩基に対応する塩基から下流側に向かって４〜１５番目の塩基がRNAiセンス鎖の3’末端塩基に対応するように設定する工程、
（ｃ）前記優性変異遺伝子において、その転写産物の第１及び第２基準塩基を含む連続する１６〜３０塩基を含む塩基配列をRNAiセンス鎖領域として設定する工程、
（ｄ）設定されたRNAiセンス鎖領域の塩基配列に相補的な塩基配列を含む塩基配列をRNAiアンチセンス鎖領域として設定する工程
を含む、前記設計方法。
【請求項２２】
（ｅ）ASPスコア値が０．４以上あるRNAi分子を選別する工程をさらに含む、請求項２１に記載の設計方法であって、
ASPスコアは、以下の式から算出される、前記設計方法。
ASPスコア＝[（対照RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量の相対比）−（対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）]×（１−対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）
（式中、対照RNAi分子は、前記正常型遺伝子及び変異遺伝子の発現に影響を及ぼさないRNAi分子である）
【請求項２３】
RNAiセンス鎖領域及びRNAiアンチセンス鎖領域の3’末端にさらにTT又はUUを付加する、請求項２１又は２２に記載の設計方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、優性変異遺伝子の発現を選択的に、かつ効果的に抑制することのできるRNAi分子を含む優性変異遺伝子発現抑制剤、該発現抑制剤を含む医薬組成物、及び前記RNAi分子の設計方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、化合物及び抗体と並ぶ新たな医薬又は診断薬として、生体内で特定の遺伝子の発現を制御する機能性核酸が注目され、その医療応用に向けての様々な研究及び開発が世界各国で進められている。【０００３】
機能性核酸には、RNAi（RNA interference: RNA干渉）を介した遺伝子サイレンシングによって標的遺伝子の発現を転写後に抑制するsiRNA（small interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）及びmiRNA（micro RNA)や、転写因子等の標的物質と特異的に結合して、その機能を抑制する核酸アプタマー、標的mRNAに結合してその翻訳を抑制するアンチセンス核酸、転写因子結合ドメイン等の調節領域をデコイ配列として包含し、標的物質を捕捉することによりその転写因子による遺伝子発現を抑制するデコイDNA、標的遺伝子のmRNA前駆体におけるポリアデニル化を特異的に阻害して不安定化させた後、それを分解に導くU1アダプター等が知られている。いずれも次世代の医薬又は診断薬として期待されているが、中でもsiRNAやshRNAによるRNAiは、その標的特異性、応用性の広さ、及び作用効果の確実性から、所望の遺伝子発現を抑制できる強力な遺伝子発現制御ツールとして脚光を浴びている。【０００４】
RNAiの応用であり、所望のアレルの発現を特異的に抑制できるアレル特異的遺伝子サイレンシング（allele-specific RNAi: ASP-RNAi）は、野生型遺伝子の発現に影響を及ぼすことなく、疾患を引き起こす標的優性変異遺伝子の発現を特異的に抑制できることから、疾患治療法上極めて有用と考えられている。例えば、常染色体優性遺伝疾患の一つとして知られる難治性の進行性骨化性線維異形成症（Fibrodysplasia Ossificans Progressiva:FOP）は、原因遺伝子であるALK2（Activin-like kinase 2:アクチビン様キナーゼ２）遺伝子上の６１７番目のG（グアニン）がA（アデニン）に置換した点突然変異又は１０６７番目のGがAに置換した点突然変異によってもたらされる。これらの点突然変異のいずれかを有する変異遺伝子は、優性であるため、野生型ALK2遺伝子を持つヘテロ接合体であってもFOPを発症してしまう（非特許文献１〜３）。しかし、FOPの発症や進行を抑制する有効な方法は、現在のところまだ知られていない。ここで、ASP-RNAiにより、優性変異遺伝子の発現のみを抑制し、野生型遺伝子の発現を許容することができれば、FOPをはじめとする常染色体優性遺伝疾患の発症を抑制することができ、また既に発症している患者であれば、その進行を阻止することが可能となる。このように、ASP-RNAiは、RNAiの中でも特に医薬又は診断薬としての有用性が高い。【０００５】
ところが、上記のような点突然変異による塩基置換の変異遺伝子と野生型遺伝子とでは、その遺伝子間の塩基配列は、わずか１〜数塩基しか相違しないため、従来の一般的な設計法に基づくRNAi分子では、変異遺伝子に対する特異性が低く、野生型遺伝子の発現まで抑制してしまう。また、不連続接合点を含む転写産物を生じる優性変異遺伝子のように、変異遺伝子と野生型遺伝子の塩基配列の間に明瞭な相違が存在する場合であっても、従来法によって設計されたRNAi分子では、必ずしも変異遺伝子に対する特異性が高いとはいえず、しばしば野生型遺伝子の発現も抑制し得る。このようにASP-RNAiを実現させるためには、極めて変異遺伝子に対する特異性の高いsiRNA又はshRNAの開発が不可欠となってくる。その一方で、siRNA等の設計においては、突然変異部位（置換部位、欠失部位、挿入部位等）を含む周辺の塩基配列を標的領域としなければならないことから、設計領域が必然的に制限される。それ故、公知の有効なsiRNAの標的配列選択方法を適用しても、特異性が高く、かつ効果的なsiRNA等を必ずしも設計できないという問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Shore EM., et al., 2006, Nature Genetics, Vol. 38: 525-527
【非特許文献２】Nakajima M., et al., 2007, Journal of Human Genetics, Vol.52: 473-475
【非特許文献３】Furuya H., et al., 2008, American Journal of Medical Genetics Part A, Vol. 146A: 459-463
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、野生型遺伝子又は所望の優性変異遺伝子の発現を許容し、転写産物上に不連続接合点を生じる特定の標的優性変異遺伝子の発現のみを選択的かつ効果的に抑制することのできるRNAi分子を開発し、当該分子を有効成分として含有する優性変異遺伝子発現抑制剤及び当該RNAi分子の設計方法の提供を目的とする。【０００８】
本発明は、優性変異遺伝子の発現により発症する遺伝性疾患を治療する治療剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、転写産物上に不連続接合点を生じる優性変異遺伝子の発現を選択的に、かつ効果的に抑制することができるsiRNA等のRNAi分子の構造的一般法則性を見出した。すなわち、不連続接合点に隣接するセンス鎖領域の3’側の塩基からその3’末端までの塩基長を所定の長さとなるように設定したRNAi分子は、優性変異遺伝子の発現を選択的、かつ効果的に抑制する一方で、野生型遺伝子の発現に対しては、抑制効果をほとんど示さないか又は低減することが明らかとなった。本発明は、上記知見に基づいて完成されたものであり、以下を提供する。【００１０】
（１）ASPスコア値が０．４以上であるRNAi分子を有効成分として含む、優性変異遺伝子の発現抑制剤であって、前記ASPスコアは、以下の式から算出され、
ASPスコア＝[（対照RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量の相対比）−（対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）]×（１−対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）
（式中、対照RNAi分子は、前記正常型遺伝子及び変異遺伝子の発現に影響を及ぼさないRNAi分子である）
前記RNAi分子が標的である優性変異遺伝子の転写産物上に生じる少なくとも一つの不連続接合点、及び該転写産物の連続する１６〜３０塩基の配列に一致する塩基配列を含むRNAiセンス鎖領域、並びにそれに相補的な塩基配列を含むRNAiアンチセンス鎖領域を含み、かつ前記RNAiセンス鎖領域上のいずれか一の不連続接合点に隣接する3’側の塩基から下流側に向かって４〜１５番目のいずれか一の塩基が該RNAiセンス鎖領域の3’末端塩基を構成する、前記遺伝子発現抑制剤。【００１１】
（２）ASPスコア値が０．４以上であるRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを有効成分として含む、優性変異遺伝子の発現抑制剤であって、前記ASPスコアは、以下の式から算出され、
ASPスコア＝[（対照RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量の相対比）−（対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）]×（１−対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）
（式中、対照RNAi分子は、前記正常型遺伝子及び変異遺伝子の発現に影響を及ぼさないRNAi分子である）
前記RNAi分子が標的である優性変異遺伝子の転写産物上に生じる少なくとも一つの不連続接合点、及び該転写産物の連続する１６〜３０塩基の配列に一致する塩基配列を含むRNAiセンス鎖領域、並びにそれに相補的な塩基配列を含むRNAiアンチセンス鎖領域を含み、かつ前記RNAiセンス鎖領域上のいずれか一の不連続接合点に隣接する3’側の塩基から下流側に向かって４〜１５番目のいずれか一の塩基が該RNAiセンス鎖領域の3’末端塩基を構成する、前記遺伝子発現抑制剤。【００１２】
（３）RNAiセンス鎖領域及びRNAiアンチセンス鎖領域の3’末端にさらにTT又はUUを付加する、（１）又は（２）に記載の抑制剤。【００１３】
（４）RNAi分子がsiRNAである、（１）〜（３）のいずれかに記載の抑制剤。【００１４】
（５）RNAi分子がshRNAである、（１）〜（３）のいずれかに記載の抑制剤。【００１５】
（６）優性変異遺伝子における変異が塩基の欠失、塩基の挿入、スプライス部位を破壊し得る塩基の置換、遺伝子の重複、遺伝子の転座、及び染色体の逆位からなる一群から選択される、（１）〜（５）のいずれかに記載の抑制剤。【００１６】
（７）優性変異遺伝子が機能獲得型である、（１）〜（６）のいずれかに記載の抑制剤。【００１７】
（８）優性変異遺伝子が疾患の発症に関与する、（１）〜（７）のいずれかに記載の抑制剤。【００１８】
（９）疾患が悪性新生物である、（８）に記載の抑制剤。【００１９】
（１０）悪性新生物が非小細胞肺癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型EGFR遺伝子であるか、悪性新生物が大腸癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型CTNNB1遺伝子であるか、悪性新生物が胃癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型CDH1遺伝子であるか、悪性新生物が乳癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型BRCA1遺伝子若しくは変異型BRCA2遺伝子であるか、悪性新生物が多腺性自己免疫性内分泌不全症I型で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型AIRE遺伝子であるか、悪性新生物が自己免疫性リンパ増殖症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型TNFRSF6/APT1/FAS遺伝子であるか、悪性新生物が慢性骨髄性白血病又は急性リンパ性白血病で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がBCR-ABLキメラ遺伝子であるか、悪性新生物がバーキットリンパ腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がc-myc-IgH-キメラ遺伝子、悪性新生物が未分化型大細胞リンパ腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がNPM-ALK-キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が肺癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がEML4-ALK-キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が隆起性皮膚線維肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がPDGFB-COL1A1キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が先天性線維肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がETV6-NTRK3キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が低悪性線維粘液肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がFUS-CREB3L2キメラ遺伝子であるか、悪性新生物が骨外性粘液型軟骨肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がEWS-CHNキメラ遺伝子であるか、悪性新生物がユーイング肉腫若しくは線維形成性小細胞腫瘍で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がEWSR1遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子であるか、悪性新生物が胞巣型横紋筋肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がSYT遺伝子若しくはSSX遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子であるか、悪性新生物が炎症性筋線維芽細胞性腫瘍で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がALK遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子であるか、悪性新生物が脂肪肉腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がCHOP遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子であるか、又は悪性新生物が軟部明細胞肉腫若しくは悪性線維性組織球腫で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がATF1遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子である、（９）に記載の抑制剤。【００２０】
（１１）悪性新生物が非小細胞肺癌で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子が変異型EGFR遺伝子である、（１０）に記載の抑制剤。【００２１】
（１２）RNAi分子のセンス鎖領域が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５３、５５、５９、６１、６３、６５、６７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３又は１４５で示されるヌクレオチドからなる、（１１）に記載の抑制剤。【００２２】
（１３）悪性新生物が慢性骨髄性白血病又は急性リンパ性白血病で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がBCR-ABLキメラ遺伝子である、（１０）に記載の抑制剤。【００２３】
（１４）RNAi分子のセンス鎖領域が、配列番号９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１又は１１３で示されるヌクレオチドからなる、（１３）に記載の抑制剤。【００２４】
（１５）疾患がヒト常染色体優性変異疾患である、（８）に記載の抑制剤。【００２５】
（１６）ヒト常染色体優性変異疾患が先天性夜盲症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がRHO遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が難聴遺伝子領域DFNA2で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がKCNQ4遺伝子若しくはGJB遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がワールデンブルグ症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がMITF遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が非症候性難聴で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がDIAPH1/DFNA1遺伝子若しくはPOU4F3遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が肥大型心筋症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がTNNT2遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が家族性肥大型心筋症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がMYBPC3遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が心尖部肥大型心筋症で、その標的となる前記優性変異遺伝子がTNNI3遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がシャルコー・マリー・トゥース病1A型で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がPMP22遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がシャルコー・マリー・トゥース病1B型で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がMPZ遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がQT延長症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がKCNQ1遺伝子若しくはKCNH2遺伝子若しくはSCN5A遺伝子若しくはANK2遺伝子若しくはKCNE1遺伝子若しくはKCNE2遺伝子若しくはKCNJ2遺伝子若しくはCAV3遺伝子若しくはSCN48遺伝子若しくはAKAP9遺伝子若しくはANTA1遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がQT短縮症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がKCNH2遺伝子若しくはKCNJ2遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がブルガタ症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がSCN5A遺伝子若しくはGPD1L遺伝子若しくはCACNA1C遺伝子若しくはCACNB2B遺伝子若しくはSCN1B遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がカテコラミン誘発性多形性心室頻拍で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がRYR2遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が心伝導障害で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がSCN5A遺伝子若しくはSCN1B遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患が筋萎縮性側索硬化症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がTDP43遺伝子であるか、ヒト常染色体優性変異疾患がヌーナン症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がPTPN11遺伝子であるか、又はヒト常染色体優性変異疾患が低カルシウム血症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がCaR遺伝子である（１５）に記載の抑制剤。【００２６】
（１７）疾患が筋硬直性ジストロフィーで、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がDMPK遺伝子であるか、疾患が脊髄性筋萎縮症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がSMN1遺伝子であるか、疾患が先天性筋無力症候群で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がCHRNE遺伝子であるか、疾患が前頭側頭葉型痴呆症で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がMAPT遺伝子であるか、又は疾患が成長ホルモン単独欠損症II型で、かつその標的となる前記優性変異遺伝子がGH1遺伝子である、（８）に記載の抑制剤。【００２７】
（１８）（１）〜（１７）のいずれかに記載の抑制剤を有効成分として少なくとも一つ含有する医薬組成物。【００２８】
（１９）センス鎖領域が、配列番号８３又は８５で示されるヌクレオチドからなるRNAi分子、及び／又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクター、並びに／あるいはセンス鎖領域が、配列番号８９で示されるヌクレオチドからなるRNAi分子、及び／又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを有効成分としてさらに含有する、（１１）又は（１２）に従属する（１８）に記載の医薬組成物。【００２９】
（２０）センス鎖領域が、配列番号８９で示されるヌクレオチドからなるRNAi分子、及び／又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを含む、点突然変異型EGFR遺伝子発現抑制剤。【００３０】
（２１）転写産物上に不連続接合点を有する優性変異遺伝子の発現を選択的に抑制するRNAi分子の設計方法であって、（ａ）該転写産物上の不連続接合点に隣接する5’側及び3’側の塩基をそれぞれ第１及び第２基準塩基として設定する工程、（ｂ）前記転写産物において、前記第２基準塩基に対応する塩基から下流側に向かって４〜１５番目の塩基がRNAiセンス鎖の3’末端塩基に対応するように設定する工程、（ｃ）前記優性変異遺伝子において、その転写産物の第１及び第２基準塩基を含む連続する１６〜３０塩基を含む塩基配列をRNAiセンス鎖領域として設定する工程、（ｄ）設定されたRNAiセンス鎖領域の塩基配列に相補的な塩基配列を含む塩基配列をRNAiアンチセンス鎖領域として設定する工程
を含む、前記設計方法。【００３１】
（２２）（ｅ）ASPスコア値が０．４以上あるRNAi分子を選別する工程をさらに含む、(２１)に記載の設計方法であって、
ASPスコアは、以下の式から算出される、前記設計方法。【００３２】
ASPスコア＝[（対照RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量の相対比）−（対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）]×（１−対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）
（式中、対照RNAi分子は、前記正常型遺伝子及び変異遺伝子の発現に影響を及ぼさないRNAi分子である）
（２３）RNAiセンス鎖領域及びRNAiアンチセンス鎖領域の3’末端にさらにTT又はUUを付加する、（２１）又は（２２）に記載の設計方法。【００３３】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010-222847号、2011-044347号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の優性変異遺伝子発現抑制剤によれば、野生型遺伝子や標的以外の優性変異遺伝子の発現に大きな影響を及ぼすことなく、標的優性変異遺伝子の発現を選択的に、また効果的に抑制することが可能となる。【００３５】
本発明の優性変異遺伝子発現抑制剤の有効成分であるRNAi分子の設計方法によれば、疾患の原因となる、あらゆる転写産物上に不連続接合点を有する優性突然優性変異遺伝子に対して設計が可能であり、応用性の高い設計方法を提供できる。【００３６】
本発明の医薬組成物によれば、遺伝性疾患において、野生型遺伝子の発現を維持しながら、疾患原因となる標的優性変異遺伝子の発現を選択的に抑制することにより、その疾患を治癒することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】欠失変異の種類を説明する概念図である。実線白抜きボックス（0102、0103）は遺伝子（0101）のエクソン内コード領域（0102）又はエクソンの全部又は一部（0103）を、実線斜線ボックス（0104、0105）は遺伝子の非コード領域（5’非コード領域：0104；3’非コード領域：0105）を、ボックスに挟まれた実線（0106、0107）はイントロンの全部（0106）又は一部（0107）を示す。破線で示す領域は、欠失領域（0108、0109、0110、0111）で、破線白抜きボックス（0108、0112）は遺伝子のエクソン内コード領域の欠失領域（0108）又は欠失エクソン（0112）を、ボックス間の破線（0113、0114）は欠失イントロンの全部（0113）又は一部（0114）を示す。そして矢印（0115）は転写開始点を示す。
【図２】欠失変異における不連続接合点を説明する概念図（１）である。Aは野生型遺伝子を、A’はその野生型遺伝子の転写産物を、Bは変異遺伝子を、そしてB’はその変異遺伝子の転写産物を、それぞれ示す。また、Cは、変異遺伝子Bを野生型遺伝子Aと対比させたときの欠失領域（b領域）を破線で示したものである。この図では、B’上のa領域とｃ領域の接合点（J）が、不連続接合点となる。
【図３】欠失変異における不連続接合点を説明する概念図（２）である。Aは野生型遺伝子を、A’はその野生型遺伝子の転写産物を、Bは変異遺伝子を、そしてB’はその変異遺伝子の転写産物を、それぞれ示す。実線白抜きボックス（0301、0302）はエクソンを、ボックス間の実線（0303、0304）はイントロンの全部（0303）又は一部（0304）を、星印（0305）は5’スプライス部位を示す。破線で示す領域(0306)は、変異遺伝子における欠失領域である。この図では、変異遺伝子の転写産物B’において、第１エクソン（0301）の一部（0307）由来の領域とイントロンの一部（0304）由来の領域との接合点（J1）、及びイントロンの一部（0304）由来の領域と第２エクソン（0302）由来の領域との接合点（J2）の二箇所が、不連続接合点となる。
【図４】欠失変異における不連続接合点を説明する概念図（３）である。Aは野生型遺伝子を、A’はその野生型遺伝子の転写産物を、Bは変異遺伝子を、そしてB’はその変異遺伝子の転写産物を、それぞれ示す。また、Cは、変異遺伝子Bを野生型遺伝子Aと対比させたときの欠失領域（0406）を破線で示したものである。この図では、変異遺伝子の転写産物B’において、第１エクソン（0401）と第３エクソン（0403）との接合点（J）が、不連続接合点となる。
【図５】挿入変異における不連続接合点を説明する概念図である。Aは野生型遺伝子を、A’はその野生型遺伝子の転写産物を、Bは変異遺伝子を、そしてB’はその変異遺伝子の転写産物を、それぞれ示す。図中のａ領域及びｂ領域における白抜きボックスはエクソン内のコード領域を、斜線ボックスはエクソン内の非コード領域を、またｃ領域（網掛けボックス）は、変異遺伝子における挿入部分を、それぞれ示す。この図では、変異遺伝子の転写産物B’における野生型エクソンａ領域由来の領域とｃ領域である挿入部分由来の領域との二箇所の接合点（J1、J2）が不連続接合点となる。
【図６】RNAi分子の構造の概念図を示す。（A）二本鎖RNAi分子（siRNA）の場合及び（２）一本鎖RNAi分子（shRNA）の場合をそれぞれ示す。
【図７】実施形態１のRNAi分子の設計方法フローを示す。
【図８−１】A:野生型EGFR遺伝子と欠失変異型EGFR遺伝子del(E764-A750)における欠失部位周辺の塩基配列及びアミノ酸配列の対比を示した図である。野生型EGFR遺伝子の塩基配列において、黒枠で囲んだ領域がこの変異型EGFR遺伝子の欠失領域である。この変異遺伝子の転写産物における不連続接合点に相当する位置を矢頭で示す。B: 野生型の非標的EGFR遺伝子と欠失変異型EGFR遺伝子del(E764-A750)に対するEGFR-siRNAの発現抑制効果を、それぞれのsiControlのルシフェラーゼ活性を1.0としたときの相対値として算出した。ルシフェラーゼ活性は、RNAiによる発現抑制を受けない外来性コントロールであるβ-ガラクトシダーゼの発現量で補正している。
【図８−２】C: 野生型の非標的EGFR遺伝子と欠失変異型EGFR遺伝子del(E764-A750)に対するEGFR-siRNAのASPスコア値を示す。ASPスコア値０．４の境界線を破線で示す。
【図９−１】A:野生型EGFR遺伝子と欠失変異型EGFR遺伝子del(L747-T751)-L747Sにおける欠失部位周辺の塩基配列及びアミノ酸配列の対比を示した図である。野生型EGFR遺伝子の塩基配列において、黒枠で囲んだ領域がこの変異型EGFR遺伝子の欠失領域である。この変異遺伝子の転写産物における不連続接合点に相当する位置を矢頭で示す。B: 野生型の非標的EGFR遺伝子と欠失変異型EGFR遺伝子del(L747-T751)-L747Sに対するEGFR-siRNAの発現抑制効果を、それぞれのsiControlのルシフェラーゼ活性を1.0としたときの相対値として算出した。各サンプルのルシフェラーゼ活性は、RNAiによる発現抑制を受けない外来性コントロールであるβ-ガラクトシダーゼの発現量で補正している。
【図９−２】C: 野生型の非標的EGFR遺伝子と欠失変異型EGFR遺伝子del(L747-T751)-L747Sに対するEGFR-siRNAのASPスコア値を示す。ASPスコア値０．４の境界線を破線で示す。
【図１０−１】A:野生型EGFR遺伝子と欠失／挿入変異型EGFR遺伝子del(L747-E749)-A750P(G)における欠失部位周辺の塩基配列及びアミノ酸配列の対比を示した図である。野生型EGFR遺伝子の塩基配列において、黒枠で囲んだ領域がこの変異型EGFR遺伝子の欠失領域であり、また変異型EGFR遺伝子において太字で示した塩基が挿入塩基である。この変異遺伝子の転写産物における不連続接合点に相当する位置を矢頭で示す。この欠失／挿入変異型では、不連続接合点が二箇所存在する。B: 野生型の非標的EGFR遺伝子と欠失／挿入変異型EGFR遺伝子del(L747-E749)-A750P(G)に対するEGFR-siRNAの発現抑制効果を、それぞれのsiControlのルシフェラーゼ活性を1.0としたときの相対値として算出した。各サンプルのルシフェラーゼ活性は、RNAiによる発現抑制を受けない外来性コントロールであるβ-ガラクトシダーゼの発現量で補正している。
【図１０−２】C: 野生型の非標的EGFR遺伝子と欠失／挿入変異型EGFR遺伝子del(L747-E749)-A750P(G)に対するEGFR-siRNAのASPスコア値を示す。ASPスコア値０．４の境界線を破線で示す。
【図１１−１】Ａ:野生型EGFR遺伝子と欠失／挿入変異型EGFR遺伝子del(L747-E749)-A750P(A)における欠失部位周辺の塩基配列及びアミノ酸配列の対比を示した図である。野生型EGFR遺伝子の塩基配列において、黒枠で囲んだ領域がこの変異型EGFR遺伝子の欠失領域であり、また変異型EGFR遺伝子において太字で示した塩基が挿入塩基である。この変異遺伝子の転写産物における不連続接合点に相当する位置を矢頭で示す。この欠失／挿入変異型では、不連続接合点が二箇所存在する。B: 野生型の非標的EGFR遺伝子と欠失／挿入変異型EGFR遺伝子del(L747-E749)-A750P(A)に対するEGFR-siRNAの発現抑制効果を、それぞれのsiControlのルシフェラーゼ活性を1.0としたときの相対値として算出した。各サンプルのルシフェラーゼ活性は、RNAiによる発現抑制を受けない外来性コントロールであるβ-ガラクトシダーゼの発現量で補正している。
【図１１−２】C: 野生型の非標的EGFR遺伝子と欠失／挿入変異型EGFR遺伝子del(L747-E749)-A750P(A)に対するEGFR-siRNAのASPスコア値を示す。ASPスコア値0.4の境界線を破線で示す。
【図１２−１】A: フィラデルフィア染色体（９番染色体長腕(9q34)に座位するABL遺伝子と、２２番染色体長腕(22q11)に座位するBCR遺伝子との相互転座）から発現するBCR-ABLキメラ遺伝子と野生型ABL遺伝子における転座部位周辺配列の塩基配列及びアミノ酸配列の対比を示した図である。野生型ABL遺伝子の塩基配列において、黒枠で囲んだ領域が転座した領域であり、BCR−ABLキメラ遺伝子の塩基配列において、黒枠で囲んだ領域が転座によってBCR遺伝子と連結したABL遺伝子の領域である。このキメラ遺伝子の転写産物における不連続接合点に相当する位置を矢頭で示す。B: 野生型の非標的ABL遺伝子とBCR-ABLキメラ遺伝子に対するBCR-ABL-siRNAの発現抑制効果を、それぞれのsiControlのルシフェラーゼ活性を1.0としたときの相対値として算出した。ルシフェラーゼ活性は、RNAiによる発現抑制を受けない外来性コントロールであるβ-ガラクトシダーゼの発現量で補正している。
【図１２−２】C: 野生型の非標的ABL遺伝子とBCR-ABLキメラ遺伝子に対するBCR-ABL-siRNAのASPスコア値を示す。ASPスコア値０．４の境界線を破線で示す。
【図１３−１】A: フィラデルフィア染色体（9番染色体長腕(9q34)に座位するABL遺伝子と、２２番染色体長腕(22q11)に座位するBCR遺伝子との相互転座）から生じるBCR-ABLキメラ遺伝子と野生型BCR遺伝子における転座部位周辺配列の塩基配列及びアミノ酸配列の対比を示した図である。野生型BCR遺伝子の塩基配列において、黒枠で囲んだ領域が転座した領域であり、BCR−ABLキメラ遺伝子の塩基配列において、黒枠で囲んだ領域が転座によってABL遺伝子と連結したBCR遺伝子の領域である。このキメラ遺伝子の転写産物における不連続接合点に相当する位置を矢頭で示す。B:野生型の非標的BCR遺伝子とBCR-ABLキメラ遺伝子に対するBCR-ABL-siRNAの発現抑制効果を、それぞれのsiControlのルシフェラーゼ活性を1.0としたときの相対値として算出した。ルシフェラーゼ活性は、RNAiによる発現抑制を受けない外来性コントロールであるβ-ガラクトシダーゼの発現量で補正している。
【図１３−２】C: 野生型の非標的BCR遺伝子とBCR-ABLキメラ遺伝子に対するBCR-ABL-siRNAのASPスコア値を示す。ASPスコア値０．４の境界線を破線で示す。
【図１４】ヒト非小細胞肺癌由来株化細胞（PC3細胞）のEGFR del(L747-E749)-A750P変異に対するEGFR-siRNA（si747/49-3D19）を導入したときの、変異遺伝子特異的RNAi効果を示す電気泳動図である。
【図１５】PC3細胞に対するEGFR-siRNA（si747/49(A)-8D19）を導入したときの変異遺伝子特異的RNAi効果を示す電気泳動図である。
【図１６】PC3細胞にEGFR-siRNA（si747/49-3D19）を導入したときの、その細胞増殖抑制作用をPC3細胞の全細胞数によって示した図である。
【図１７】PC3細胞にEGFR-siRNA（si747/49-3D19）を導入したときの、siRNAにおける細胞毒性作用を示した図である。
【図１８】PC3細胞にEGFR-siRNA（si747/49-3D19）を導入したときの、PC3細胞における細胞増殖及び生存活性を示した図（１）である。
【図１９】PC3細胞にEGFR-siRNA（si747/49(A)-8D19）を導入したときの、その細胞増殖抑制作用をPC3細胞の全細胞数によって示した図である。
【図２０】PC3細胞にEGFR-siRNA（si747/49-3D19）を導入したときの、PC3細胞における細胞増殖及び生存活性を示した図（２）である。
【図２１】PC3細胞にEGFR-siRNA（si747/49-3D19）を導入したときの、PC3細胞の細胞死（アポトーシス）を示した図である。
【図２２】A:野生型EGFR遺伝子と点突然変異型（置換変異型）EGFR遺伝子T790M変異に対して設計したsiRNAのセンス鎖領域における置換部位周辺の塩基配列及びアミノ酸配列の対比を示した図である。変異型EGFR遺伝子の塩基配列において、太字で示した塩基がこの変異型EGFR遺伝子の置換部位である。B: 野生型の非標的EGFR遺伝子と置換変異型EGFR遺伝子T790Mに対するEGFR-siRNAの発現抑制効果を、それぞれのsiControlのルシフェラーゼ活性を1.0としたときの相対値として算出した。ルシフェラーゼ活性は、RNAiによる発現抑制を受けない外来性コントロールであるβ-ガラクトシダーゼの発現量で補正している。
【図２３】変異型EGFR del(L747-E749)-A750Pを有するヒト非小細胞肺癌由来株化細胞であるPC3細胞、変異型EGFR del(E746-A750)を有するヒト非小細胞肺癌由来株化細胞であるPC9細胞、及び野生型EGFRを有するヒト子宮頸癌由来株化細胞であるHeLa細胞に様々な濃度の抗癌剤ゲフィチニブで曝露したときの各細胞おける細胞増殖及び生存活性を示した図である。ＡはPC3細胞を、ＢはPC9細胞を、ＣはHeLa細胞を示す。各図の値は、それぞれ無処置の細胞における細胞生存活性を100%としたときの相対値で示している。
【図２４】PC3細胞、PC9細胞、及びHeLa細胞に様々な濃度のEGFR-siRNAを投与したときの各細胞おける細胞増殖及び生存活性を示した図である。ＡはPC3細胞を、ＢはPC9細胞を、ＣはHeLa細胞をsiRNAで処理したときの結果を示す。各図の値は、それぞれ無処置の細胞における細胞生存活性を100%としたときの相対値で示している。
【図２５】Ａ：皮下移植したPC3細胞由来の腫瘍（矢印）にsiRNA等を投与後３週（９週齢）目のヌードマウスを示す。ａはsiRNAを投与していない個体を、ｂはsiControlを投与した個体を、ｃはEGFR-siRNA（si747/49-3D19）を投与した個体を、示す。Ｂ：siRNAを投与していない個体群（ａ１〜ａ３）、siControlを投与した個体群（ｂ１〜ｂ３）、及びEGFR-siRNA（si747/49-3D19）を投与した個体群（ｃ１〜ｃ３）から、siRNA等を投与後３週（９週齢）目に摘出したPC3細胞由来の腫瘍を示す。
【図２６】ヌードマウスに皮下移植したPC3細胞に対してEGFR-siRNA（si747/49-3D19）を投与したときの、腫瘍体積の時間経過を示した図である。★印は、siRNAを投与していない個体の腫瘍体積と比較して有意な差（p＜0.05）があることを、また＃印は、siControlを投与した個体の腫瘍体積と比較して有意な差（p＜0.05）があることを、示している。
【図２７】ヌードマウスに皮下移植したPC3細胞に対してEGFR-siRNA（si747/49-3D19）を投与したときの、腫瘍湿重量を示した図である。★印は、siRNAを投与していない個体の腫瘍体積と比較して有意な差（p＜0.05）があることを、また＃印は、siControlを投与した個体の腫瘍体積と比較して有意な差（p＜0.05）があることを、示している。
【図２８】Ａ：皮下移植したPC3細胞由来の腫瘍（矢印）にsiRNA等を投与後３週（９週齢）目のヌードマウスを示す。Ｂ：各個体群(１群５匹)から、siRNA等を投与後３週（９週齢）目に摘出したPC3細胞由来の腫瘍を示す。
【図２９】ヌードマウスに皮下移植したPC3細胞に対してEGFR-siRNA（si747/49(A)-8D19）を投与したときの、腫瘍体積の時間経過を示した図である。★印は、siRNAを投与していない個体の腫瘍体積と比較して有意な差（p＜0.05）があることを、また＃印は、siControlを投与した個体の腫瘍体積と比較して有意な差（p＜0.05）があることを、示している。
【図３０】ヌードマウスに皮下移植したPC3細胞に対してEGFR-siRNA（si747/49(A)-8D19）を投与したときの、腫瘍湿重量を示した図である。★印は、siRNAを投与していない個体の腫瘍体積と比較して有意な差（p＜0.05）があることを、また＃印は、siControlを投与した個体の腫瘍体積と比較して有意な差（p＜0.05）があることを、示している。
【図３１】EGFR-siRNAのマウス個体に対する副作用の影響を示す。Aは血漿中の全ビリルビン量、Bは血漿中の直接ビリルビン量、Cは血漿中の間接ビリルビン量を、及びDは血漿中のアルカリホスファターゼの量を示す。siEgfrは、従来のsiRNAの構成を有するEGFR-siRNAである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
１．優性変異遺伝子発現抑制剤
１−１．概要
本発明の第１の実施形態は、優性変異遺伝子発現抑制剤である。本発明の抑制剤は、RNAi分子及び／又はそれをコードする発現ベクターを有効成分として含み、優性変異遺伝子の発現を選択的に抑制することを特徴とする。
【００３９】
１−２．RNAi分子の構成と定義
本明細書において、「RNAi分子」とは、生体内においてRNA干渉（RNA interference）を誘導し、標的とする優性変異遺伝子の転写産物の分解を介してその遺伝子の発現を転写後翻訳前に抑制（サイレンシング）することができる分子をいう。RNAi機構を介して遺伝子の発現を抑制できる分子であれば、一本鎖分子又は二本鎖分子のいずれであってもよい。例えば、siRNA（small interfering RNA）のような二本鎖分子、shRNA（short hairpin RNA）又はmiRNA（micro RNA)のような一本鎖分子が挙げられる。RNA干渉については、例えば、Bass B.L., 2000, Cell, 101, 235-238；Sharp P.A., 2001, Genes Dev., 15 ,485-490；Zamore P.D., 2002, Science, 296, 1265-1269；Dernburg ,A.F. & Karpen, G.H., 2002, Cell, 111,159-162を参照されたい。なお、本明細書では、RNAi機構を介した転写後の遺伝子サイレンシングを、以下、「遺伝子の発現抑制」として表す。
【００４０】
本明細書において、RNAi分子は、核酸からなる。ここでいう「核酸」とは、天然型核酸、非天然型核酸及び／又は核酸類似体をいう。
【００４１】
本明細書において、「天然型核酸」とは、ヌクレオチドを構成単位とし、それらがホスホジエステル結合によって連結した自然界に存在する生体高分子をいう。通常は、アデニン、グアニン、シトシン及びウラシルのいずれかの塩基を有するリボヌクレオチドが連結したRNA及び／又はアデニン、グアニン、シトシン及びチミンのいずれかの塩基を有するデオキシリボヌクレオチドが連結したDNAが該当する。本発明のRNAi分子では、特に、RNAが主な構成成分であることが好ましい。
【００４２】
本明細書において、「非天然型核酸」とは、非天然型ヌクレオチドを含む又はそれからなる核酸をいう。ここで「非天然型ヌクレオチド」とは、人工的に構築された又は人工的に化学修飾された自然界に存在しないヌクレオチドであって、前記天然に存在するヌクレオチドに類似の性質及び／又は構造を有するヌクレオチド、又は天然に存在するヌクレオシド若しくは塩基に類似の性質及び／又は構造を有するヌクレオシド若しくは塩基を含むヌクレオチドをいう。例えば、脱塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、2'-デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β-L-デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオシドが挙げられる。さらに、置換五単糖（2'-O-メチルリボース、2'-デオキシ-2'-フルオロリボース、3'-O-メチルリボース、1'，2'-デオキシリボース）、アラビノース、置換アラビノース糖；置換六単糖及びアルファ−アノマーの糖修飾を有するヌクレオシドが含まれる。また、非天然型ヌクレオチドは、人工的に構築された塩基類似体又は人工的に化学修飾された塩基（修飾塩基）を包含するヌクレオチドも含む。「塩基類似体」には、例えば、2-オキソ（1H）-ピリジン-3-イル基、5位置換-2-オキソ（1H）-ピリジン-3-イル基、2-アミノ-6-（2-チアゾリル）プリン-9-イル基、2-アミノ-6-（2-チアゾリル）プリン-9-イル基、2-アミノ-6-（2-オキサゾリル）プリン-9-イル基等が挙げられる。「修飾塩基」には、例えば、修飾化ピリミジン（例えば、5-ヒドロキシシトシン、5-フルオロウラシル、4-チオウラシル）、修飾化プリン（例えば、6-メチルアデニン、6-チオグアノシン）及び他の複素環塩基等が挙げられる。メチルホスホネート型DNA/RNA、ホスホロチオエート型DNA/RNA、ホスホルアミデート型DNA/RNA、2'-O-メチル型DNA/RNA等の化学修飾核酸や核酸類似体も含むこともできる。
【００４３】
本明細書において「核酸類似体」とは、天然型核酸に類似の構造及び／又は性質を有する人工的に構築された化合物をいう。例えば、ペプチド核酸（PNA：Peptide Nucleic Acid）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（PHONA）、架橋化核酸（BNA/LNA：Bridged Nucleic Acid/Locked Nucleic Acid）、モルホリノ核酸等が挙げられる。
【００４４】
また、本発明のRNAi分子を構成する核酸は、必要に応じて、リン酸基、糖及び／又は塩基が核酸用標識物質で標識されていてもよい。核酸用標識物質は、当該分野で公知のあらゆる物質を利用することができる。例えば、放射性同位元素（例えば、32P、3H、14C）、DIG、ビオチン、蛍光色素（例えば、FITC、Texas、cy3、cy5、cy7、FAM、HEX、VIC、JOE、Rox、TET、Bodipy493、NBD、TAMRA）、又は発光物質（例えば、アクリジニウムエスター）が挙げられる。
【００４５】
本明細書において「変異」とは、遺伝子上又は染色体上に生じる塩基配列の物理的又は構造的変異である。遺伝子上に生じる遺伝子変異と、染色体上に生じる染色体変異があるが、本明細書においては、標的優性変異遺伝子の転写産物上に後述する不連続接合点を生じる変異であれば、いずれであってもよい。また、変異は、自然界において生じた突然変異だけでなく、メタンスルホン酸エチル（EMS）やN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジンのような突然変異誘発剤等を用いて人為的に誘発された変異及び分子遺伝学的手法を用いて導入された変異も包含する。
【００４６】
変異の種類には、例えば、遺伝子における塩基の欠失、挿入若しくは置換、遺伝子の重複若しくは転座、又は染色体の逆位に基づく変異が挙げられる。
【００４７】
「欠失」とは、野生型遺伝子の塩基配列の一部が失われた変異をいう。ここで、「野生型遺伝子」とは、同種遺伝子のアレル集団内において自然界に最も多く存在し、かつそれがコードするタンパク質又は機能性核酸が本来の機能を有するものである。「機能性核酸」とは、ノンコーディングRNAとも呼ばれ、タンパク質をコードせずにそれ自身で様々な機能を有するRNAである。例えば、転移RNA（tRNA）、リボソームRNA（rRNA）、核内低分子RNA（snRNA）、核小体低分子RNA（snoRNA）、及びマイクロRNA（miRNA）等が該当する。本発明において、一遺伝子における欠失部位は、その欠失遺伝子の転写産物上に不連続接合点をもたらす部位であれば、その欠失塩基数や位置は特に限定はしない。１〜５０塩基、１〜４０塩基、１〜３０塩基、又は１〜２０塩基程度の欠失が一般的ではあるが、欠失によって生じる転写産物が結果的にその変異遺伝子を有する個体に優性変異をもたらす範囲であれば、例えば、野生型遺伝子の塩基配列の70％以上、80％以上、又は90％以上が欠失していても構わない。一遺伝子における欠失部位の例としては、図１Aで示すような、１つのエクソン（0101）のコード領域（0102）において、転写開始点（0115）を含まない破線で示した一部領域（0108）が欠失した場合、図１Bで示すような、一以上のイントロンを含む遺伝子において、転写開始点（0115）を含まない一以上のエクソンの全領域（0112）を含む領域（0109）が欠失した場合（一以上のイントロンの全領域及び／又は一部領域を含んでいてもよい；図１Bでは、欠失部位が１つのエクソンの全領域（0112）に加えて、その両側に位置する２つのイントロンの一部（0114）を含む）、図１Cで示すような、一以上のイントロンを含む遺伝子において、少なくとも１つのイントロンの全領域（0113）を含む２つのエクソンの一部（すなわち、上流エクソンの3’側の一部と下流エクソンの5’側の一部）間の領域（0110）が欠失した場合、図１Dで示すような、上流エクソンの3’側の一部とそのエクソンの下流に位置するイントロンの5’側の一部を含む領域が欠失した場合（その間に位置する一以上の他のエクソン及びイントロンの全領域を含んでいてもよい；図１Dでは、１つのエクソンの全領域（0112）及びその両側に位置する一方のイントロンの全領域（0113）と他方のイントロンの一部領域（0114）を含む）が挙げられる。一方、スプライス部位を含まないイントロンの一部領域の欠失や一以上のイントロンの全部領域の欠失は、転写産物上に不連続接合点を生じないため本発明の欠失には該当しない。
【００４８】
「挿入」とは、野生型遺伝子の塩基配列中に一以上の塩基が挿入された変異をいう。本発明において、遺伝子内における塩基の挿入の位置は、エクソン内であれば特に限定はしない。一方、イントロン内に挿入された場合には、通常、遺伝子発現後にそのイントロンはスプライシングによって除かれ、転写産物上に不連続接合点を生じない。それ故、原則として、イントロン内への塩基の挿入は、本発明の挿入には含まないものとする。ただし、イントロン内の挿入であっても、挿入によって後述するスプライス部位が破壊された場合、挿入された塩基の数が膨大であることによって、そのイントロンがスプライシングにより正常に除去されない場合、又は挿入された塩基の中にエクソンに相当する配列が含まれた結果、スプライシング後の転写産物上に新たなエクソンが挿入される場合のように、転写産物上に不連続接合点を生じるときには、本発明の挿入に含むものとする。挿入される塩基数は、特に限定はされない。例えば、前述のように一塩基挿入であってもよいし、トランスポゾンのように数百塩基以上の挿入であってもよい。
【００４９】
「置換」とは、野生型遺伝子の塩基が他の塩基と置き換わった変異をいう。置換変異では、通常、野生型遺伝子と変異遺伝子を対比させた場合において、双方の遺伝子及びその転写産物の塩基配列にギャップは生じない。それ故、スプライス部位を破壊し得る置換以外では、通常、その遺伝子の転写産物上に不連続接合点を生じ得ない。一方、スプライス部位を破壊し得る置換であれば、転写産物において、そのスプライス部位の支配下にあるイントロンのスプライシングによる除去が阻害される結果、転写産物上に不連続接合点、すなわち後述するように、野生型遺伝子と変異遺伝子の転写産物の塩基配列間にギャップを生じる。したがって、本発明における置換は、スプライス部位を破壊し得る置換のみを対象とする。ここでいうスプライス部位とは、遺伝子配列において正常なスプライシングを行なう上で必要な部位をいう。例えば、pre-mRNAスプライシングの場合であれば、イントロンの5’末端周辺に位置する5’スプライス部位（ドナー部位）、イントロンの3’末端周辺に位置する3’スプライス部位（アクセプター部位）及びイントロン内に位置するブランチポイント等のイントロン内の所定の位置する一般的な部位が該当する。この他、スプライシングに必要なイントロン内の他の塩基やエクソン内に位置する塩基も包含する。また、tRNAスプライシングやセルフスプライシングの場合であれば、スプライシングに必要なRNA配列内の高次構造の形成に必須の塩基が該当する。置換される塩基数は、スプライス部位を破壊することができれば、特に限定しない。例えば、上記5’スプライス部位におけるG（グアニン）のように、pre-mRNAスプライシングに必須の塩基であれば、一塩基置換の点突然変異であってよい。
【００５０】
「重複」とは、染色体中に同一の遺伝子が複数個存在する変異をいう。通常、遺伝子の重複は、その遺伝子を含む染色体の一部領域の重複に伴い発生する。本発明においては、遺伝子の一部のみが重複し、それに基づき、その転写産物上に不連続接合点が生じる遺伝子を生じさせる重複が対象となる。
【００５１】
「転座」とは、遺伝子又は染色体の一部が同一又は異なる染色体上にその位置を変えた変異をいう。本発明においては、転座によって遺伝子の一部が異なる位置に移動した結果、その転座した遺伝子の一部を含む転写産物上に不連続接合点がを生じるものが対象となる。例えば、転座の結果生じたキメラ遺伝子、すなわち異なる二以上の遺伝子が部分的に融合した遺伝子であれば、その転写産物は、その融合の基となった各遺伝子のいずれの転写産物と対比しても不連続接合点を有することとなる。
【００５２】
「逆位」とは、染色体の一部の方向が逆になった変異をいう。本発明においては、逆位によって遺伝子の一部の方向が逆になった結果、その逆になった遺伝子の一部を含む転写産物上に不連続接合点が生じるものを対象とする。
【００５３】
「変異遺伝子」とは、野生型遺伝子の塩基配列と異なる塩基を含む遺伝子をいう。本発明において、変異遺伝子は、染色体上に先天的に存在するものの他、後天的に獲得されたものも含む。変異遺伝子は、個体を構成する全ての細胞中に存在する必要はなく、一部の細胞、組織又は器官にのみ存在するものであってもよい。例えば、一の個体において、正常細胞中には存在せず、癌細胞中にのみ存在する変異遺伝子が挙げられる。
【００５４】
本明細書において「優性変異遺伝子」とは、個体においてその変異に基づく形質が表現型として顕在化する変異遺伝子をいう。結果としてその個体に異常な表現型を優性でもたらす変異遺伝子であれば、その変異遺伝子がコードしているタンパク質又は機能性RNAの活性の有無は問わない。例えば、機能獲得型変異（gain of function mutation）又は機能喪失型変異（loss of function mutation）のいずれであってもよい。機能獲得型変異は、タンパク質に量的上昇（過剰発現：overexpression）又は活性上昇（構成的活性化：constitutive active又は機能亢進型：hyper active）を示す形質をもたらすハイパーモルフ変異（hypermorph mutation）、新規機能活性を示す形質をもたらすネオモルフ変異（neomorph mutation）、及び野生型遺伝子由来のタンパク質と拮抗又はそれを抑制し、野生型遺伝子の形質発現を抑制するアンチモルフ変異（antimorph mutation: dominant negative）を含む。また、機能喪失型変異は、遺伝子が形質発現能を完全に失ったアモルフ変異（amorph mutation）及び遺伝子の形質発現能の低下をもたらすハイポモルフ変異（hypomorph mutation）が挙げられる。機能喪失型変異の場合、通常は劣性となるものが多いが、本明細書においては、その効果が優性となるもののみを対象とする。好ましくは機能獲得型の優性突然変異である。
【００５５】
本明細書において「不連続接合点」とは、変異遺伝子における転写産物の塩基配列を野生型遺伝子の転写産物の塩基配列と対比したときに、少なくとも１塩基以上のギャップ（このギャップは、転写産物の塩基配列端部に位置していてもよい）の存在により、変異遺伝子の転写産物と野生型遺伝子の転写産物との間で対応する塩基の連続性が途絶える、変異遺伝子の転写産物上の塩基の接合部をいう。不連続接合点は、一の変異遺伝子の転写産物中に一箇所以上あってもよい。
【００５６】
この不連続性は、変異遺伝子の変異に基づくものである。例えば、図２で示すように、変異が一エクソン内の塩基の欠失である場合、野生型遺伝子Aにおいてｂで示す領域が欠失した変異遺伝子Bの転写産物B’では、野生型遺伝子の転写産物A’との塩基配列を対比したとき、a及びｃで示す領域の塩基配列は対応するが、野生型遺伝子の転写産物におけるa領域の3’末端の塩基とｃ領域の5’末端の塩基間で、その連続性が途絶える。この場合、変異遺伝子の転写産物B’におけるa領域の3’末端の塩基とc領域の5’末端の塩基の接合部（J）が不連続接合点となる。
【００５７】
また、図３で示すように、変異遺伝子Bにおける欠失（欠失部位を破線で示したCを参照）が、第１エクソン(0301)の3’末端側の一部の塩基と第１イントロン(0303)の5’末端側の一部の塩基からなる領域(0306)である場合、変異遺伝子Bの5’スプライス部位(0305)の欠失により、pre-mRNAスプライシングのよる第１イントロンの除去が阻害され、結果として第１イントロン(0303)の3’末端側の一部の塩基(0304)を含む転写産物B’が生じる。この転写産物B’と野生型遺伝子Aの転写産物A’との塩基配列を対比したときには、5’側では第１エクソン(0301)の3’欠失末端の塩基で、また3’側では第２エクソン(0302)の5’末端の塩基で、その連続性が途絶える。したがって、この場合には、第１エクソン(0301)の3’欠失末端の塩基と5’末端側の一部がトランケ―トした第１イントロン(0304)の5’欠失末端の塩基の接合部（J1）、及び第１イントロン(0304)の3’末端の塩基と第２エクソン(0302)の5’末端の塩基の接合部（J2）の二箇所が不連続接合点となる。
【００５８】
さらに、図４で示すように、変異遺伝子Bにおける欠失（欠失部位を破線で示したCを参照）が第１イントロン（0404）の3’末端側の一部の塩基と第２エクソン（0402）の5’ 末端側の一部の塩基からなる領域(0406)の欠失である場合、変異遺伝子Bの第１イントロンの3’スプライス部位(0407)の欠失により、第２エクソン（0402）の3’末端側の一部の領域（0408）は、スプライシングによって除去され、その転写産物B’は、第１エクソン（0401）と第３エクソン（0403）が連結された状態となる場合がある。この転写産物B’と野生型遺伝子Aの転写産物A’との塩基配列を対比したとき、第１エクソン（0401）の3’末端の塩基と第３エクソン（0403）の5’末端の塩基間で、その連続性が途絶える。したがって、この場合には、その第１エクソン（0401）の3’末端の塩基と第３エクソン（0403）の5’末端の塩基の接合部（J）が不連続接合点となる。
【００５９】
また、例えば、図５で示すように、変異遺伝子Bにおける変異が１つのエクソン内への塩基の挿入である場合には、挿入されたc領域を含む変異遺伝子Bの転写産物B’と野生型遺伝子Aの転写産物A’との塩基配列を対比させると、転写産物B’におけるa領域の3’末端とc領域の5’末端、及びc領域の3’末端とb領域の5’末端で、その連続性が途絶える。この場合、変異遺伝子の転写産物B’におけるa領域の3’末端の塩基とc領域の5’末端の塩基の接合部（J1）、及びc領域の3’末端の塩基とb領域の5’末端の塩基の接合部（J2）の２箇所が不連続接合点となる。
【００６０】
本実施形態において、標的となる遺伝子の種類、及びその遺伝子が由来する生物種は、特に限定はしない。あらゆるタンパク質又は機能性核酸をコードする遺伝子が本実施形態の抑制剤の標的となり得る。また、生物種は、動物、植物のいずれであってもよく、それらのあらゆる種類を包含する。動物であれば、好ましくは脊椎動物、より好ましくは魚類、鳥類又は哺乳動物である。魚類の中でさらに好ましくは水産資源用魚種（例えば、サケ科、スズキ科、タラ科、ニシン科、ヒラメ科、カレイ科、アジ科、イカナゴ科、タイ科及びメバル科の魚種）である。鳥類の中でさらに好ましくは食用種（例えば、ニワトリ、ガチョウ、アヒル、カモ、合鴨、七面鳥、ウズラ、ダチョウ等）である。哺乳動物の中でさらに好ましくは家畜（ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）、実験用動物（げっ歯類、ウサギ、イヌ、サル）、競争馬、愛玩動物（イヌ、ネコ、ウサギ、サル、げっ歯類）又はヒトである。一層好ましい生物種は、ヒトである。一方、植物であれば、好ましくは種子植物、より好ましくは被子植物、さらに好ましくは食用植物種（例えば、イネ科（例えば、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、トウモロコシ、コーリャン、アワ）、マメ科（例えば、ダイズ、アズキ、グリーンピース）、ナス科（例えば、トマト、ナス、ジャガイモ、トウガラシ、ピーマン）、ヒルガオ科（例えば、サツマイモ）、バラ科（例えば、イチゴ、アーモンド、モモ、プラム、ウメ、バラ、サクラ）、アブラナ科（例えば、ダイコン、カブ、アブラナ）、アカザ科（例えば、ホウレンソウ、テンサイ）、セリ科、タデ科、ウリ科、キク科、ユリ科、サトイモ科、ブドウ科、ミカン科、ブナ科、ヤシ科等に属する食用の植物種）、繊維資源用植物種（例えば、ワタ、アサ等）、木材資源用植物種（例えば、スギ、ヒノキ、モミ、ツガ、マツ、イチイ、サクラ、カエデ、カシ、ナラ、ブナ、ニレ、ケヤキ、クルミ、ホウ、カツラ、チーク、ラワン、黒檀、マホガニー、ポプラ、ユーカリ等）である。
【００６１】
前記変異が関与する形質も、特に限定はしないが、好ましくはその発現を抑制したい形質である。例えば、疾患の発症に関与する変異、異常形態に関与する変異等が挙げられる。ここでいう疾患は、例えば、後天的に特定の細胞内のゲノムDNA中に生じた突然変異による疾患や常染色体優性変異疾患を含む。
【００６２】
後天的に特定の細胞内のゲノムDNA中に生じた突然変異による疾患には、例えば、新生物（腫瘍）、特に悪性新生物（悪性腫瘍、いわゆる癌であって、白血病を含む）が挙げられる。後天的に特定の細胞内のゲノムDNAに生じた塩基配列の挿入又は欠失によって発生する悪性新生物の具体的な例としては、上皮成長因子受容体（EGFR）遺伝子の変異を原因とする非小細胞肺癌（NSCLC）、CTNNB1遺伝子の変異を原因とする大腸癌、CDH1遺伝子の変異を原因とする胃癌、BRCA1遺伝子又はBRCA2遺伝子の変異を原因とする乳癌、AIRE遺伝子の変異を原因とする多腺性自己免疫性内分泌不全症I型、TNFRSF6/APT1/FAS遺伝子の変異を原因とする自己免疫性リンパ増殖症候群等が挙げられる。また、後天的に特定の細胞内のゲノムDNA中に生じた転座を伴う遺伝子の突然変異によって生じる悪性新生物の、より具体的な例としては、BCR遺伝子とABL遺伝子のキメラ遺伝子を原因とする慢性骨髄性白血病(CML)及び急性リンパ性白血病(ALL)、c-myc遺伝子とIgH遺伝子のキメラ遺伝子を原因とするバーキットリンパ腫、NPM遺伝子とALK遺伝子のキメラ遺伝子を原因とする未分化型大細胞リンパ腫、EML4遺伝子とALK遺伝子のキメラ遺伝子を原因とする肺癌、PDGFB遺伝子とCOL1A1遺伝子のキメラ遺伝子を原因とする隆起性皮膚線維肉腫、ETV6遺伝子とNTRK3遺伝子のキメラ遺伝子を原因とする先天性線維肉腫、FUS遺伝子とCREB3L2遺伝子のキメラ遺伝子を原因とする低悪性線維粘液肉腫、EWS遺伝子とCHN遺伝子のキメラ遺伝子を原因とする骨外性粘液型軟骨肉腫、EWS1遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子を原因とするユーイング肉腫、SYT遺伝子若しくはSSX遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子を原因とする胞巣型横紋筋肉腫、ALK遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子を原因とする炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、CHOP遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子を原因とする脂肪肉腫、ATF1遺伝子を転座パートナーとするキメラ遺伝子を原因とする軟部明細胞肉腫若しくは悪性線維性組織球腫等が挙げられる。
【００６３】
また、スプライシング異常を伴う疾患であれば、DMPK遺伝子の変異を原因とする筋硬直性ジストロフィー、SMN1遺伝子の変異を原因とする脊髄性筋萎縮症、CHRNE遺伝子の変異を原因とする先天性筋無力症候群、MAPT遺伝子の変異を原因とする前頭側頭葉型痴呆症、GH1遺伝子の変異を原因とする成長ホルモン単独欠損症II型等が挙げられる。
【００６４】
また、ヒト常染色体優性変異疾患であれば、RHO遺伝子の変異を原因とする先天性夜盲症、KCNQ4遺伝子若しくはGJB遺伝子の変異を原因とする難聴遺伝子領域DFNA2、MITF遺伝子の変異を原因とするワールデンブルグ症候群、DIAPH1/DFNA1遺伝子若しくはPOU4F3遺伝子の変異を原因とする非症候性難聴、TNNT2遺伝子の変異を原因とする肥大型心筋症、MYBPC3遺伝子の変異を原因とする家族性肥大型心筋症、TNNI3遺伝子の変異を原因とする心尖部肥大型心筋症、MPZ遺伝子の変異を原因とするシャルコー・マリー・トゥース病1B型、PMP22遺伝子の変異を原因とするシャルコー・マリー・トゥース病1A型、KCNQ1遺伝子若しくはKCNH2遺伝子若しくはSCN5A遺伝子若しくはANK2遺伝子若しくはKCNE1遺伝子若しくはKCNE2遺伝子若しくはKCNJ2遺伝子若しくはCAV3遺伝子若しくはSCN48遺伝子若しくはAKAP9遺伝子若しくはANTA1遺伝子の変異を原因とするQT延長症候群、KCNH2遺伝子若しくはKCNJ2遺伝子の変異を原因とするQT短縮症候群、SCN5A遺伝子若しくはGPD1L遺伝子若しくはCACNA1C遺伝子若しくはCACNB2B遺伝子若しくはSCN1B遺伝子の変異を原因とするブルガタ症候群、RYR2遺伝子の変異を原因とするカテコラミン誘発性多形性心室頻拍、SCN5A若しくはSCN1B遺伝子の変異を原因とする心伝導障害、TDP43遺伝子の変異を原因とする筋萎縮性側索硬化症、PTPN11遺伝子の変異を原因とするヌーナン症候群、又はCaR遺伝子の変異を原因とする低カルシウム血症等が挙げられる。
【００６５】
１−３．RNAi分子の構造
本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子は、標的である優性変異遺伝子の転写産物上に生じる少なくとも一つの不連続接合点を含むRNAiセンス鎖領域、及びそれに相補的な塩基配列を含むRNAiアンチセンス鎖領域を含む。
【００６６】
一例として、本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子の構造における概念図を図６に示す。この図で示すように、RNAi分子は、二本鎖分子（図６A）又は一本鎖分子（図６B）を包含する。この他、前記RNAiセンス鎖領域及びそれに相補的な塩基配列を含むRNAiアンチセンス鎖領域を含む環状分子(例えば、ダンベル型核酸)を含み得る。
【００６７】
（各RNAi分子に共通する構成要素）
本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子は、いずれの形態の場合にも、RNAiセンス鎖領域（0601）、RNAiアンチセンス鎖領域（0602）及び不連続接合点（0603）を必須の構成要素として含む。以下、RNAi分子に共通する構成要素について説明をする。
【００６８】
「RNAiセンス鎖領域」（0601）とは、標的優性変異遺伝子の転写産物の塩基配列に一致する塩基配列で構成され、その転写産物上に生じる不連続接合点（0603）（図６において、センス鎖領域（0601）では斜線領域と白抜き領域の接合部として表す）を少なくとも一つ含む。また、センス鎖領域（0601）の塩基長は、その転写産物の連続する１６〜３０塩基、１８〜２５塩基又は１９〜２３塩基である。さらに、前記不連続接合点（0603）に隣接する3’側の塩基（0604）を基準（後述する第２基準塩基に相当する）とし、その基準塩基から数えて下流側に向かって３〜１６番目の塩基、好ましくは４〜１５番目の塩基（0605）、より好ましくは４〜１３番目の塩基が該RNAiセンス鎖領域の3’末端塩基を構成する。不連続接合点（0603）が一の転写産物中に複数存在する場合には、いずれか一の不連続接合点に隣接する3’側の塩基を基準塩基とすればよい。
【００６９】
「RNAiアンチセンス鎖領域」（0602）とは、前記RNAiセンス鎖領域（0601）に完全に相補する塩基配列で構成される。したがって、その塩基配列中には、前記基準塩基、すなわち不連続接合点（0603）に隣接する3’側の塩基に相補的な塩基（0607）を含む。RNAiアンチセンス鎖領域は、本実施形態のRNAi分子が二本鎖分子（図６A）の場合には、RNAiセンス鎖領域を含むポリヌクレオチド鎖とは異なる他方のポリヌクレオチド鎖に含まれるが、一本鎖分子（図６B）の場合には、RNAiセンス鎖領域と同一のポリヌクレオチド鎖に逆方向で含まれる。
【００７０】
「不連続接合点」(0603)については、既に詳述したことから、ここではその説明を省略する。
【００７１】
本実施形態のRNAi分子は、ASPスコア値が０．４以上であることを特徴とする。「ASPスコア」（Allele-SPecificity score）とは、ASP-RNAiにおいて重要な要素である対立遺伝子識別能力を数値化したものであり、さらには、正常型遺伝子に対するRNAi分子の非特異的な発現抑制の影響、すなわち、RNAi分子が正常型遺伝子に与える副作用を数値化したものと見なすこともできる。ASPスコア値は、下記式によって導き出される。
【００７２】
ASPスコア＝[（対照RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した正常型遺伝子の標準化した発現量の相対比）−（対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）]×（１−対照RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量に対する前記RNAi分子で処理した変異遺伝子の標準化した発現量の相対比）
式中、対照RNAi分子は、本実施形態の有効成分であるsiRNA分子のネガティブコントロールとなるRNAi分子で、前記正常型遺伝子及び変異遺伝子の発現に影響を及ぼさないRNAi分子であり、それ故、上記式では、対照RNAi分子で処理した標準化した遺伝子の発現量を１００％とみなす。例えば、標的となる遺伝子が存在しない任意の塩基配列を含むRNAi分子が該当する。上記式において、標準化後の発現量の相対比が「１．０」を超えた場合、それは発現抑制効果が無いものとみなし、その相対比を「１．０」として算出する。
【００７３】
ASPスコアによれば、変異遺伝子に対する「特異性」と「抑制効果」の両者を反映できる。例えば、あるRNAi分子のASPスコア値が低い場合には、そのRNAi分子が、たとえ変異遺伝子の発現を強く抑制できる場合であっても、特異性が低いゆえに同時に野生型遺伝子の発現までも強く抑制してしまうこと、すなわち野生型遺伝子に対する副作用が強いことを意味する。ASPスコア値が０．４以上であれば、そのRNAi分子は、変異遺伝子の発現を抑制し、かつ野生型遺伝子に対する副作用がないか又は比較的弱い効果を有することから、ASP-RNAiとして機能し得る。
【００７４】
ASPスコアの算出のための正常型遺伝子と変異遺伝子の発現量の測定については、各発現量を同一の方法によって測定するのであれば、当該分野で公知のいずれの方法を用いてもよく、特に限定しない。また、標準化は、RNAi分子による発現抑制を受けない内部または外来性コントロール遺伝子の発現量に基づいて行なえばよい。好ましくは、Ohnishi Y.ら（2006, Journal of RNAi and Gene Silencing, Vol. 2: 154-160）によって開発されたレポーター遺伝子発現プラスミドを用いて、後述する実施例１に記載の条件で、ホタルとウミシイタケのルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子の発現と、コントロールとしてRNAi分子による発現抑制を受けないβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の発現に基づいて、野生型遺伝子と変異遺伝子の発現量を測定することである。
【００７５】
（二本鎖RNAi分子の構成要素）
本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子がsiRNAのような二本鎖分子の場合、前記図６Aに示すように、上記RNAi分子共通構成要素であるRNAiセンス鎖領域（0601）、RNAiアンチセンス鎖領域（0602）及び不連続接合点（0603）に加えて、任意でさらにそれぞれのポリペプチド鎖の3’末端に3’末端付加塩基（0606）を含むことができる。「3’末端付加塩基」（0606）は、TT（チミン‐チミン）又はUU（ウラシル‐ウラシル）の２塩基で構成される。この塩基を付加したRNAi分子は、RNAi抑制効率を高めることができる（Tuschl T et al., 1999, Genes Dev, 13(24):3191-7）。
【００７６】
（一本鎖RNAi分子の構成要素）
本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子がshRNAのような一本鎖分子の場合、前記図６Bに示すように、上記RNAi分子共通構成要素であるRNAiセンス鎖領域（0601）、RNAiアンチセンス鎖領域（0602）及び不連続接合点（0603）に加えて、さらにRNAiセンス鎖領域（0601）と、それとは逆向きのRNAiアンチセンス鎖領域（0602）とを連結する短いスペーサー配列（0608）を含む。スペーサー配列は、通常３〜２４塩基、好ましくは、４〜１５塩基からなる任意の塩基配列とすることができる。したがって、RNAi分子が一本鎖の場合、分子全体として、３５塩基（１６×２＋３）〜８４塩基（３０×２＋２４）からなる。RNAi分子内では、RNAiセンス鎖領域とRNAiアンチセンス鎖領域が互いに塩基対合し、その間に位置するスペーサー配列がループ構造を形成することによって、分子全体がヘアピン型のステム−ループ構造をなし得る。前記構造を有する一本鎖RNAi分子が細胞内に導入されると、細胞質内でDicerと呼ばれるエンドヌクレアーゼの働きによって二本鎖siRNAに加工され、そのうちRNAiアンチセンス鎖領域がRISC（RNA-induced silencing complex）複合体に取り込まれた後、前述の二本鎖RNAi分子と同様のRNAi機構によって標的遺伝子の転写後翻訳前発現を抑制することができる。一本鎖分子におけるRNAiセンス鎖領域（0601）とRNAiアンチセンス鎖領域（0602）は、前記二本鎖RNAi分子と同様に、それぞれの領域の3’末端に3’末端付加塩基を含むこともできる。一本鎖分子における5’末端、及び／又は3’末端には、任意の配列を付加することもできる。例えば、5’末端及び／又は3’末端にステムループ構造を形成し得る塩基配列を付加することもできる。
【００７７】
１−４．発現ベクターの構成
本明細書において「発現ベクター」とは、本実施形態の阻害剤に含まれる有効成分であって、前記RNAi分子をコードするDNAを発現可能なように発現用ベクター内に挿入したベクターである。
【００７８】
本実施形態の発現ベクターは、RNAi分子がsiRNAのような二本鎖分子の場合、RNAiセンス鎖領域及びRNAiアンチセンス鎖領域のそれぞれをコードするDNA断片を、異なる二つの発現用ベクターに挿入していてもよく、また一つの発現用ベクター内に独立に発現制御されるDNA断片として挿入していてもよい。一方、RNAi分子がshRNAのような一本鎖分子の場合、当該一本鎖RNA分子をコードするDNA断片が発現用ベクター内の所定の位置に挿入されていればよい。
【００７９】
本明細書において、「発現用ベクター」とは、本実施形態の発現ベクターにおける骨格部分、すなわち、本実施形態の発現ベクターにおいて実施形態１のRNAi分子をコードするDNA断片以外の部分をいう。発現用ベクターの種類は、特に限定はしないが、プラスミド又はウイルスが好ましい。これらは、導入する宿主に応じて適宜選択すればよい。例えば、導入する宿主がヒトの場合には、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルス、あるいは非ウイルスベクターを基礎とするベクターのような公知の発現ベクターを使用することができる。また、導入する宿主が植物の場合には、pBI系若しくはpRI系のバイナリーベクター等のプラスミドやカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）、インゲンマメゴールデンモザイクウイルス（BGMV）、タバコモザイクウイルス（TMV）等のウイルスを利用することができる。さらに、導入する宿主が大腸菌の場合には、例えば、pBI系、pPZP系、pSMA系、pUC系、pBR系、pBluescript系（stratagene社）等のプラスミドを利用することができる。この他、各ライフサイエンスメーカーから市販されている様々な各種宿主用発現ベクターを利用してもよい。
【００８０】
前記発現用ベクターは、プロモーター、エンハンサー、若しくはターミネーターのような調節領域、又は選抜マーカー遺伝子のような標識領域を含むことができる。それぞれの種類は、特に限定されない。発現ベクターを導入する宿主に応じて当該分野で公知のものを適宜選択すればよい。
【００８１】
大腸菌中で動作可能なプロモーターとしては、例えば、lac、trp若しくはtacプロモーター又はファージ由来のT7、T3、SP6、PR若しくはPLプロモーター等が挙げられる。酵母で動作可能なプロモーターとしては、例えば、酵母解糖系遺伝子由来のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、TPI1、ADH2-4cプロモーター等が挙げられる。植物細胞で動作可能なプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Pnos）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来PRタンパク質プロモーター等が挙げられる。昆虫細胞で動作可能なプロモーターとしては、例えば、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーター、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモーター、バキュロウイルス即時型初期遺伝子１プロモーター、バキュロウイルス39K遅延型初期遺伝子プロモーター等が挙げられる。そして、ヒトをはじめとする動物細胞内で動作可能なプロモーターとしては、RNAポリメラーゼII(PolII)系のプロモーターやRNAポリメラーゼIII(Pol III)系のプロモーターが好適に用いられる。好ましくは、Pol III系のプロモーター、特に好ましくはU6及びH1等のプロモーターである。また、いずれの宿主の場合にも、生体内の特定の部位でのみ発現を誘導する部位特異的プロモーターを使用することもできる。なお、異なる二つの発現用ベクターのそれぞれにRNAiセンス鎖領域及びRNAiアンチセンス鎖領域をコードするDNA断片を挿入した場合、各RNA鎖が同程度の量で発現するように、プロモーターは、同一のプロモーター又は同程度の発現活性を有する異なるプロモーターを用いることが好ましい。
【００８２】
１−５．RNAi分子の設計と製造
本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子の設計方法について説明をする。本設計方法は、図７で示すように、基準塩基設定工程（0701）、3’末端塩基設定工程（0702）、RNAiセンス鎖領域設定工程（0703）、及びRNAiアンチセンス鎖領域設定工程（0704）を含む。以下、それぞれの工程について説明をする。
【００８３】
「基準塩基設定工程」（0701）とは、標的とする優性変異遺伝子において、その転写産物上の不連続接合点に隣接する5’側及び3’側の塩基をそれぞれ第１及び第２基準塩基として設定する工程である。優性変異遺伝子の転写産物中に不連続接合点が二箇所以上存在する場合には、いずれか一の不連続接合点を選択する。その場合、選択された不連続接合点に隣接する5’側及び3’側の塩基がそれぞれ第１及び第２基準塩基となる。
【００８４】
「3’末端塩基設定工程」（0702）とは、前記第２基準塩基に対応する塩基を起点に、下流側に向かって４〜１５番目、好ましくは４〜１４番目又は４〜１３番目の塩基がRNAiセンス鎖領域の3’末端塩基に対応するように設定する工程である。
【００８５】
「RNAiセンス鎖領域設定工程」（0703）とは、優性変異遺伝子の転写産物の塩基配列において、第１及び第２基準塩基を含む連続する１６〜３０塩基をRNAiセンス鎖領域として設定する工程である。前記3’末端塩基設定工程により3’末端の塩基が決定していることから、転写産物の塩基配列上において、その3’末端の塩基に対応する塩基から数えて、上流に向かって、第１及び第２基準塩基を含むようにして、１６〜３０塩基をRNAiセンス鎖領域として設定すればよい。本工程によってRNAi分子の優性変異遺伝子に対する標的領域が定まる。
【００８６】
「RNAiアンチセンス鎖領域設定工程」（0704）とは、設定されたRNAiセンス鎖領域の塩基配列に相補的な塩基配列を含む塩基配列をRNAiアンチセンス鎖領域として設定する工程である。
【００８７】
以上の工程は、本実施形態の抑制剤に含まれるRNAi分子の形態 (例えば、一本鎖RNAi分子、二本鎖RNAi分子又は環状型RNAi分子等)にかかわらず共通する工程である。次に、3’末端付加工程及びスペーサー連結工程、ASPスコア選抜工程を説明する。  「3’末端付加工程」は、前記で設計したRNAiセンス鎖領域及びRNAiアンチセンス鎖領域のそれぞれの3’末端にTT（チミン‐チミン）又はUU（ウラシル‐ウラシル）を付加することを特徴とする。本工程は、任意工程であるため、必要に応じて追加すればよい。
【００８８】
「スペーサー連結工程」は、一本鎖RNAi分子又は環状型RNAi分子に特有で、かつ必須の工程である。本工程は、前記で設計したRNAiセンス鎖領域の3’末端（本工程に先立ち、RNAiセンス鎖領域が3’末端付加工程を経た場合であれば、RNAiセンス鎖領域の3’末端に付加されたTT又はUUの3’末端）とRNAiアンチセンス鎖領域の5’末端を（すなわち、RNAiセンス鎖領域とは逆方向で）それぞれスペーサー配列の3’末端と5’末端に連結して、一本鎖分子又は環状型RNAi分子にする工程である。スペーサー配列は、３〜２４塩基、好ましくは４〜１５塩基からなる任意の塩基配列でよい。好ましくは、スペーサー配列内で塩基対合を形成しない塩基配列である。
【００８９】
「ASPスコア選別工程」は、上記工程によって調製されたRNAi分子のうち、ASPスコア値が０．４以上あるRNAi分子のみを選別する工程である。
【００９０】
ASPスコアは、上記式から算出すればよい。
【００９１】
本実施形態のRNAi分子は、前述の方法によって設計された塩基配列に基づいて、化学的合成法によって合成することができる。RNAi分子の化学合成は、各ライフサイエンスメーカー（例えば、シグマアルドリッチ社、ベックス社、タカラバイオ社、インビトロジェン社等）が受託製造サービスを行っており、それらを利用することもできる。また、本実施形態のRNAi分子は、前述の方法によって設計された塩基配列を一旦DNA配列に変換し、その配列に基づいてDNAを化学合成したものをクローニングした後に、当該分野で公知のin vitro RNA転写法によってRNAとして調製することができる。in vitro RNA転写法は、例えば、Sambrook, J. et. al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照すればよい。また、Ui-Teiらの方法（Nucleic Acids Res., 32:936-948, 2004）、Reynoldsらの方法（Nat. Biotechnol., 22:326-330, 2004）、Amarzguiouiらの方法（Biochem. Biophys. Res. Commun., 316: 1050-1058, 2004）を参考にすることができる。
【００９２】
１−６．発現ベクターの調製
本実施形態の抑制剤に含まれる発現ベクターの調製方法は、基本的には、当該分野で公知の方法、例えば、Sambrook, J. et. al., (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual Second Ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載の方法に従って調製することができる。
【００９３】
具体的な例を挙げると、まず、前述の「１−５．RNAi分子の設計と製造」の項で説明した方法に従い、RNAi分子の塩基配列を決定する。続いて、それに対応するDNA配列に基づき、センス鎖DNA及びアンチセンス鎖DNAを化学合成法等によってそれぞれ合成する。このとき各鎖の両末端に適当な制限部位を付加するか、各鎖のアニーリング後に適当なコヘシブ末端が形成されるようにしておくことが好ましい。DNA合成は、ライフサイエンス関連メーカー各社が受託合成サービスを行っており、それを利用することもできる。合成後の両鎖を混合してアニーリングさせ、二本鎖DNA断片を調製した後、末端に制限部位を付加していた場合には、必要に応じてその制限酵素で切断する。さらに、各鎖の5’末端を必要に応じてT4ポリヌクレオチドキナーゼ等でリン酸化する。続いて、発現用ベクターのプロモーター下流の対応する制限部位に前記調製した二本鎖DNA断片を連結する。DNA断片は、一旦適当なクローニングベクターに連結してクローン化した後、それから切り出したものを発現用ベクターに連結してもよい。
【００９４】
また、3’末端付加塩基を有するRNAi分子を発現させるためには、予めRNAiセンス鎖領域及びRNAiアンチセンス鎖領域のそれぞれの3’末端にTTを挿入しておくことに留意する。本工程は、任意工程であるため、必要に応じて追加すればよい。
【００９５】
１−７．変異型EGFR遺伝子発現抑制剤
本実施形態の優性変異遺伝子発現抑制剤の一例として、変異型EGFR（上皮成長因子受容体）遺伝子の発現を特異的に抑制するRNAi分子（EGFR-RNAi分子）を有効成分とする変異型EGFR遺伝子発現抑制剤が挙げられる。ここでいう変異型EGFR遺伝子とは、後天的に発生する優性変異遺伝子で、非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer；NSCLC）の原因となる遺伝子である。EGFRの細胞外ドメインに上皮成長因子（EGF）等のリガンドが結合すると、通常は細胞内ドメインのチロシンキナーゼ活性化され、自己リン酸化作用が作動する。変異型EGFR遺伝子では、EGFR遺伝子の特定の塩基に置換、欠失、挿入が生じ、下流の細胞内シグナル伝達経路が構成的に活性化状態にある機能獲得型となることによって発生すると考えられている（Paez G.J. et al., Science, 2004, 304；1497-1500）。
【００９６】
本実施形態の変異型EGFR遺伝子発現抑制剤は、このような変異型EGFR遺伝子において、置換以外の欠失及び挿入等の変異に基づく遺伝子の発現を特異的に抑制することができる。
【００９７】
本実施形態の変異型EGFR遺伝子発現抑制剤の具体的な例としては、図８−１、９−１、１０−１、及び１１−１の各Aで示すように、ヒトEGFR遺伝子の一部塩基が欠失したdel(E746-A750）変異及びdel(L747-T751)-L747S変異、また一部塩基の欠失と挿入が生じたdel(L747-E749)-A750P変異のそれぞれに対するEGFR-RNAi分子を有効成分とする変異型EGFR遺伝子発現抑制剤が挙げられる。なお、del(L747-E749)-A750P変異については、後述するように、コードするアミノ酸配列が同一であっても、塩基配列の欠失と挿入の相違によって、GとAの一塩基の違いを有する2種類の変異が存在する。本明細書では、del(L747-E749)-A750P変異において、それらの変異の違いを区別する必要がある場合には、以降、便宜的にGを有する変異をdel(L747-E749)-A750P(G)変異（図１０−１A）とし、またAを有する変異をdel(L747-E749)-A750P(A)変異（図１１−１A）とする。より具体的な変異型EGFR遺伝子発現抑制剤としては、例えば、del(E746-A750）の発現抑制剤として、センス鎖領域が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９又は２１で示される一本鎖若しくは二本鎖のRNAi分子、又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターが挙げられる。また、del(L747-T751)-L747Sの発現抑制剤としては、例えば、センス鎖領域域が、配列番号２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７又は４９で示される一本鎖若しくは二本鎖のRNAi分子、又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターが挙げられる。さらに、del(L747-E749)-A750P(G)の発現抑制剤としては、例えば、センス鎖領域が、配列番号５３、５５、５９、６１、６３、６５又は６７で示される一本鎖若しくは二本鎖のRNAi分子、又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターである。あるいは、del(L747-E749)-A750P(A)の発現抑制剤としては、例えば、センス鎖領域が、配列番号１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３又は１４５で示される一本鎖若しくは二本鎖のRNAi分子、又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターである。
【００９８】
１−８．BCR-ABLキメラ遺伝子発現抑制剤
本実施形態の優性変異遺伝子発現抑制剤の一例として、フィラデルフィア染色体における転座変異によって生じたBCR-ABLキメラ遺伝子の発現を特異的に抑制するRNAi分子（BCR-ABL-RNAi分子）を有効成分とするBCR-ABLキメラ遺伝子発現抑制剤が挙げられる。ここでいうBCR-ABLキメラ遺伝子とは、後天的に発生する優性変異遺伝子で、慢性骨髄性白血病(CML)又は急性リンパ性白血病(ALL)の原因遺伝子とみなされている。
【００９９】
フィラデルフィア染色体(Ph染色体)は、慢性骨髄性白血病(CML)の90%以上、及び急性リンパ性白血病(ALL)の約20%の症例で見出され、９番染色の一部が２２番染色に転座した構造を有する腫瘍特異的な染色体である。この転座によって、９番染色体長腕(9q34)に座位するABL遺伝子と２２番染色体長腕(22q11)に座位するBCR遺伝子とが相互転座してBCR-ABLキメラ遺伝子が形成される結果、チロシンキナーゼ活性の亢進したp210又はp190タンパク質が生産される。本実施形態のBCR-ABLキメラ遺伝子発現抑制剤は、このようなBCR-ABLキメラ遺伝子の発現を特異的に抑制することができる。
【０１００】
本実施形態のBCR-ABLキメラ遺伝子発現抑制剤の具体的な例としては、図１２−１及び１３−１のAで示すように、BCR-ABLキメラ遺伝子に対するBCR-ABL-RNAi分子を有効成分とするBCR-ABLキメラ遺伝子発現抑制剤が挙げられる。より具体的には、例えば、センス鎖領域が、配列番号９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１又は１１３で示される一本鎖若しくは二本鎖のRNAi分子、又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターである。
【０１０１】
１−９．効果
本実施形態の遺伝子発現抑制剤によれば、有効成分のRNAi分子は、非標的遺伝子の発現に対しては、ほとんど影響を及ぼすことなく、標的遺伝子の発現を選択的、かつ効率的に抑制することができる。
【０１０２】
本実施形態の抑制剤によれば、細胞内に導入する際に、RNAi分子を有効成分とする場合にはそのRNAi分子がそのままで、また発現ベクターを有効成分とする場合にはその発現ベクターに含まれるDNAにコードされたRNAi分子が発現した後に、標的とする優性変異遺伝子に作用して、RNAiサイレンシング機構によってその発現を抑制することができる。したがって、抑制剤がRNAi分子を含む場合には、投与した細胞等に比較的短時間でそのRNAiによる抑制効果を付与することができる。一方、抑制剤が発現ベクターを含む場合には、投与後の細胞内で発現ベクターが維持されている限り前記効果を継続的に付与し続けることができる。したがって、これらを併用することで、効果的に優性変異遺伝子の発現を抑制することができる。
【０１０３】
本実施形態の抑制剤を用いれば、後述する医薬組成物に加えることで、様々な疾患を治療又は軽減することができる。
【０１０４】
２．医薬組成物
本発明の第２の実施形態は、医薬組成物である。
【０１０５】
２−１．構成
本発明の医薬組成物は、有効成分として前記実施形態１の優性変異遺伝子発現抑制剤を含有する。優性変異遺伝子発現抑制剤は、標的とする優性変異遺伝子に対するRNAi分子又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを、単独で含んでいても良いし、同一遺伝子を標的とする一以上の異なるRNAi分子及び／又は一以上の異なるRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを含んでいてもよい。
【０１０６】
例えば、本実施形態の医薬組成物の有効成分が変異型EGFR遺伝子発現抑制剤であって、その抑制剤が二以上の異なるEGFR-RNAi分子を含む場合には、前記del(E746-A750）変異遺伝子を標的とするEGFR-RNAi分子（例えば、センス鎖領域が配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９又は２１で示される塩基配列を含む）、del(L747-T751)-L747S変異遺伝子を標的とするEGFR-RNAi分子（例えば、センス鎖領域が配列番号２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７又は４９で示される塩基配列を含む）、del(L747-E749)-A750P(G)変異遺伝子を標的とするEGFR-RNAi分子（例えば、センス鎖領域が配列番号５３、５５、５９、６１、６３、６５又は６７で示される塩基配列を含む）及びdel(L747-E749)-A750P(A)変異遺伝子を標的とするEGFR-RNAi分子（例えば、センス鎖領域が配列番号、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３又は１４５で示される塩基配列を含む）からなる群より選択される二以上のRNAi分子を含むことができる。
【０１０７】
また、変異型EGFR遺伝子発現抑制剤がEGFR-RNAi分子とEGFR-RNAi分子発現ベクター（例えば、そのEGFR-RNAi分子及び／又は異なるEGFR-RNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結したもの）を含むこともできる。
【０１０８】
さらに、実施形態の医薬組成物は、製薬上許容可能な範囲内で、かつ前記実施形態１の優性変異遺伝子発現抑制剤中のRNAi分子及び／又は発現ベクターを失活させない範囲において他の有効成分を包含することのできる、いわゆる複合製剤であってもよい。
【０１０９】
ここでいう他の有効成分は、前記実施形態１の優性変異遺伝子発現抑制剤と同一の遺伝子を標的とするが、前記実施形態１の有効成分とは異なる構成を有するRNAi分子及び／又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを含む発現抑制剤とすることができる。一例として、変異型EGFR遺伝子を標的遺伝子とする場合、前記実施形態１に記載の構成を有するEGFR-RNAi分子及び／又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを含む優性変異遺伝子発現抑制剤に加えて、例えば、センス鎖領域が、配列番号８３又は８５で示されるRNAi分子、及び／又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを含む優性アレル発現抑制剤が挙げられる。この他、前記の優性アレル発現抑制剤とは異なる優性変異遺伝子発現抑制剤であって、後述の実施例４で説明するセンス鎖領域が配列番号８９で示されるRNAi分子及び／又はそのRNAi分子をコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターを有効成分として含む抑制剤を含有することもできる。このような、同一遺伝子の異なる変異部位を標的として、それぞれの変異に基づく遺伝子の発現を抑制する抑制剤を有効成分とする複合製剤は、標的遺伝子の変異部位が明らかでない場合に有用である。前記抑制剤の有効成分であるRNAi分子は、標的変異遺伝子に対する特異性が高いことから、混合しても他の遺伝子の発現を抑制するような副作用やRNAi分子及び／又は発現ベクターを失活させる可能性がほとんどないという利点を有する。
【０１１０】
また、他の有効成分は、前記実施形態１の優性変異遺伝子発現抑制剤と異なる薬理作用を有する薬剤であってもよい。例えば、抗生物質等が挙げられる。
【０１１１】
本発明の医薬組成物は、有効成分であるRNAi分子及び／又は発現ベクターの媒体を含む。媒体には、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアレルアルコール、ポリオキシ化イソステアレルアルコール及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類のような溶媒が挙げられる。このような媒体は、殺菌されていることが望ましく、必要に応じて血液と等張に調整されていることが好ましい。
【０１１２】
本発明の医薬組成物において、医薬組成物中の有効成分であるRNAi分子及び／又は発現ベクターの含有量は、治療対象となる疾患の原因遺伝子の種類、その遺伝子の発症作用機序、RNAi分子の作用効果及び安定性、発現ベクターの発現量、医薬組成物の剤形、使用する担体の種類、及び投与方法、投与する被検体の状態等の様々な条件によって異なる。これらは、当該分野の公知技術に基づいて適宜選択すればよい。本発明のRNAi分子又は発現ベクターの含有量の具体例は、他の医薬の併用を必要としないヒト成人男子（体重60 kg）に対して注射液によって投与する場合、注射液一投与単位あたり約0．01％(w/v)〜約20％(w/v)、好ましくは約0.1％(w/v)〜約10％(w/v)で含まれていればよい。具体的には、例えば、１回1mLの注射剤中にはsiRNAが通常1μg〜200μg含まれていればよい。また、本発明の医薬組成物の薬理効果を得る上で、本発明の核酸の大量投与が必要な場合、被検体に対する負担軽減のために数回に分割して投与することもできる。
【０１１３】
本発明の医薬組成物は、必要に応じてさらに製薬上許容可能な担体を含むことができる。「製薬上許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤等が挙げられる。
【０１１４】
賦形剤としては、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖（より具体的には、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む）、金属塩（例えば、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム）、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコール（PEG）、プルロニック、カオリン、ケイ酸、あるいはそれらの組み合わせが例として挙げられる。
【０１１５】
結合剤としては、トウモロコシ、コムギ、コメ、若しくはジャガイモのデンプンを用いたデンプン糊、単シロップ、グルコース液、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック及び／又はポリビニルピロリドン等が例として挙げられる。
【０１１６】
崩壊剤としては、前記デンプンや、乳糖、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド又はそれらの塩が例として挙げられる。
【０１１７】
充填剤としては、前記糖及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウム）が例として挙げられる。
【０１１８】
乳化剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが例として挙げられる。
【０１１９】
流動添加調節剤及び滑沢剤としては、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが例として挙げられる。
【０１２０】
このような担体は、主として前記剤形形成を容易にし、また剤形及び薬剤効果を維持する他、優性変異遺伝子発現抑制剤の有効成分であるRNAi分子が生体内の核酸分解酵素による分解を受け難くするために用いられるものであり、必要に応じて適宜使用すればよい。上記の添加剤の他、必要であれば矯味矯臭剤、可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、界面活性剤、安定剤、吸収促進剤、増量剤、付湿剤、保湿剤、吸着剤、崩壊抑制剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤等を含むこともできる。
【０１２１】
本発明の医薬組成物は、前記RNAi分子が有する薬理効果を失わない範囲において、他の薬剤を含有することもできる。例えば、注射剤の場合であれば、抗生物質を所定量含有していても良い。
【０１２２】
本実施形態の医薬組成物の剤形は、抑制剤中の有効成分であるRNAi分子又は発現ベクター、さらには他の付加的な有効成分を不活化させない形態であれば特に限定しない。RNAは、一般に不安定であることから、RNAi分子を投与する場合には生体内で分解され難い剤形が好ましい。例えば、液体、固体又は半固体のいずれであってもよい。具体的な剤形としては、例えば、注射剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、点鼻剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、シップ剤及び座剤等の非経口剤形又は液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、トローチ剤等の経口剤形が挙げられる。RNAi分子又は発現ベクターを有効成分とする抑制剤を含む本実施形態の医薬組成物の場合、剤形は注射剤であることが好ましい。
【０１２３】
また、本実施形態の医薬組成物又は前記実施形態１の優性変異遺伝子発現抑制剤をナノ粒子(例えば、Davis ME， et al.，Nature， 2010, 464:1067-1070に記載の標的ナノ粒子伝達システムを含む)、リポソーム（例えば、膜透過ペプチド結合リポソーム、SNALPsを含む）、コレステロール結合体の形態に調製してもよい。Castanotto D. & Rossi JJ.， Nature，2009， 457, 426−433に記載のRNAi伝達システムを利用することもできる。
【０１２４】
２−２．投与方法
本実施形態の医薬組成物は、目的とする疾患の治療のために製薬上有効な量を生体に投与することができる。投与する対象となる生体は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【０１２５】
本明細書において「製薬上有効な量」とは、本発明の医薬組成物に含まれる抑制剤の有効成分であるRNAi分子及び／又は発現ベクターが、対象とする疾患を治療する又は症状を軽減する上で必要な用量（具体的には疾患原因である優性変異遺伝子の形質発現を抑制することができる用量）であって、かつ投与する生体に対して有害な副作用（例えば、野生型遺伝子等の発現抑制等）がほとんどないか又は全くない用量をいう。その具体的な量は、標的とする遺伝子の種類、優性変異遺伝子の形質発現効果、使用する剤形、被検体（ヒトの場合には被験者）の情報及び投与経路によって異なる。ヒトに投与する場合には、製薬上有効な量の範囲及び好適な投与経路は、一般に細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータに基づいて策定される。最終的な投与量は、個々の被験者に応じて医師の判断により決定され、調整される。その際に、勘案される被験者の情報には、病気の進行度若しくは重症度、全身の健康状態、年齢、体重、性別、食生活、薬剤感受性及び治療に対する耐性等が含まれる。
【０１２６】
本発明のRNAi分子は、全身投与又は局所的投与のいずれであってもよい。疾患の種類、発症箇所又は進行度等に応じて適宜選択することができる。発症箇所が局部的な疾患であれば、注射などにより発症箇所及びその周辺に直接投与する局所的投与が好ましい。治療すべき箇所（組織又は器官）に本発明のRNAi分子を十分量投与することができ、また他の組織に影響を及ぼしにくいからである。一方、転移性癌のように治療箇所を特定できない場合や発症が全身性の疾患の場合には、限定はしないが、静脈注射等による全身投与が好ましい。血流を介して本発明のRNAi分子を全身に行き渡らせることで、診断で発見できない病変部にも投与が可能となるからである。
【０１２７】
本発明のRNAi分子は、含有される有効成分が失活しないあらゆる適当な方法で投与することができる。例えば、非経口（例えば、注射、エアロゾル、塗布、点眼、点鼻）又は経口のいずれであってもよい。好ましくは、注射である。
【０１２８】
注射による投与の場合、注入部位は、特に限定しない。標的分子に対して本発明のRNAi分子又は発現ベクターから生産されるRNAi分子がその機能を発揮し、医薬組成物の目的を達し得ればいずれの部位であってもよい。例えば、静脈内、動脈内、肝臓内、筋肉内、関節内、骨髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、腸内又は舌下等が挙げられる。好ましくは、静脈内注射又は動脈内注射等の血管内への注射である。前述のように血流を介して本発明の医薬組成物を全身に行き渡らせることが可能であり、また侵襲性も比較的低いからである。例えば、前述のDavisらの標的ナノ粒子伝達システム等を用いて、血管内注射によりRNAi分子を全身に投与してもよい。
【０１２９】
２−３．用法
本発明の医薬組成物は、疾患の治療用として使用される。例えば、常染色体優性遺伝疾患のような優性変異遺伝子の発現を原因とする疾患において適用することで、その変異遺伝子の発現を選択的に抑制し、同時に正常な機能を有する遺伝子タンパク質をコードする野生型遺伝子の形質を顕在化できることから、従来その治療が困難であった遺伝病や癌等の治療の他、動植物の品種改良等に利用することができる。したがって、本実施形態の医薬組成物の対象となる疾患は、抑制剤に含まれるRNAi分子又は発現ベクターから発現されるRNAi分子が、標的とする優性変異遺伝子の優性形質に基づく疾患である。このような疾患の具体例としては、例えば、後天的に特定の細胞内のゲノムDNA中に生じた突然変異による疾患や常染色体優性変異疾患を含む。これらの疾患の具体的な例については、前述の通りである。したがって、本実施形態の医薬組成物は、治療対象となる疾患に応じて、その原因遺伝子である優性変異遺伝子に対するRNAi分子又はそれをコードするDNAを含む発現ベクターを有効成分として用いることで、様々な疾患に対して適用できる。
【実施例】
【０１３０】
＜実施例1：EGFR遺伝子に対するsiRNAのASP-RNAi効果の検討＞
変異型EGFR（上皮成長因子受容体）遺伝子の発現を特異的に抑制するsiRNA（EGFR-siRNA）を設計し、変異遺伝子（癌原因遺伝子）に対する発現抑制効果、すなわちASP-RNAi(アレル特異的遺伝子サイレンシング:allele-specific RNAi)効果について検証した。【０１３１】
機能獲得型の変異型EGFR遺伝子は、非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer；NSCLC）の原因遺伝子である。それ故、本発明のEGFR-siRNAがそのような機能獲得型の変異型EGFR遺伝子の発現のみを特異的に抑制するASP-RNAi効果を有していれば、非小細胞肺癌に対する効果的な治療剤となり得る。【０１３２】
（１）変異型EGFR遺伝子の種類 
非小細胞肺癌患者では、EGFR遺伝子（アクセッションNo.NM_005228）内に疾患と関連する様々な変異（機能獲得型変異）が見つかっている。例えば、図８−１Aで示すような2235番目から2249番目（開始コドンのAを１番目とする。以下、同じ）の塩基配列が欠失した「del(E746-A750）変異」（前記遺伝子の欠失変異に伴い、開始メチオニンを１番目としたときに746番目のグルタミン酸から750番目までのアラニンが欠失した変異タンパク質を生じる）、図９−１Aで示すような2240番目から2251番目までの塩基配列が欠失した「del(L747-T751)-L747S変異」（前記遺伝子の欠失変異に伴い、747番目のロイシンから751番目のトレオニンが欠失し、また747番目のロイシンがセリンに置換された変異タンパク質を生じる）、図１０−１Aで示すような2238番目から2248番目の塩基配列が欠失し、その欠失部位に新たに２塩基が挿入された「del(L747-E749)-A750P(G)変異」（前記遺伝子の欠失／挿入変異に伴い、747番目のロイシンから749番目までのグルタミン酸が欠失し、750番目のアラニンがプロリンに置換された変異タンパク質を生じる）、さらに図１１−１Aで示すような開始コドンのAから2238番目に相当する塩基、すなわちE746をコードするコドン（GAG）の三番目の塩基が「G」（Pao et al., 2005, PloS Medicine, Vol. 2, Issue 3: e73）ではなく「A」（Paez et al.,2004、 Science, vol.304, 1497-1500）である「del(L747-E749)-A750P（A）変異」等がある。そして、その他、点突然変異も挙げられる。【０１３３】
そこで、実施形態１に記載のRNAi分子の設計方法に準じて設計し、調製したEGFR-siRNAが、これらの変異遺伝子の発現を特異的に抑制することができるか否かについて検証した。【０１３４】
（２）EGFR-siRNAの設計と調製
上記del(E746-A750）変異、del(L747-T751)-L747S変異及びdel(L747-E749)-A750P変異については、その変異遺伝子産物（変異mRNA）上で、それぞれ図８−１A、９−１A, 10−１A及び11-１Aにおいて矢頭で示した位置に相当する箇所が本明細書に記載の不連続接合点に相当する。すなわち、del(E746-A750）変異遺伝子及びdel(L747-T751)-L747S変異遺伝子の転写産物では不連続接合点がそれぞれ一箇所、またdel(L747-E749)-A750P変異遺伝子の転写産物では二箇所存在することとなる。そこで、この不連続接合点に隣接する5’側及び3’側の塩基をそれぞれ第１及び第２基準塩基とした（基準塩基設定工程）。del(L747-E749)-A750P変異遺伝子の転写産物は、２つの不連続接合点を有し、かつそれらが僅か１塩基（L747-E749)-A750P(A)の場合）又は２塩基（L747-E749)-A750P(G)の場合）を挟んで近接している。それ故、ここでは、形式的に3’側に位置する不連続接合点に隣接する5’側及び3’側の塩基をそれぞれ第１及び第２基準塩基とした。次に、第２基準塩基に対応する塩基から3’末端までの塩基数を一つずつずらして、RNAiセンス鎖領域の3’末端塩基を設定した（3’末端塩基設定工程）。続いて、各変異遺伝子において、その転写産物の第１及び第２基準塩基を含む連続する１９塩基を含む塩基配列をRNAiセンス鎖領域として設定した（RNAiセンス鎖領域設定工程）。また、設定されたRNAiセンス鎖領域の塩基配列に相補的な塩基配列を含む塩基配列をRNAiアンチセンス鎖領域とした（RNAiアンチセンス鎖領域設定工程）。【０１３５】
本実施例で設計し、使用したEGFR-siRNAの具体的な塩基配列を表１〜４に示す。
【表１】
2012043633.tif 000002
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【０１３６】
表１にはdel(E746-A750)変異遺伝子に対して、表２にはdel(L747-T751)-L747S変異遺伝子に対して、表３にはdel(L747-E749)-A750P(G)変異遺伝子、そして表４にはdel(L747-E749)-A750P(A)変異遺伝子に対して、それぞれ設計したsiRNAのセンス鎖領域（ss）及びアンチセンス鎖領域（as）の塩基配列を示している。各表で示す塩基配列は、記載便宜上、センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域の3’末端におけるUUからなる3’末端付加塩基を除いている。また、表中の配列番号は、配列表の番号に対応する。【０１３７】
各表のEGFR-siRNA名については、例えば、表１の「si746/50-3D19」は、del(E746-A750)変異の第２基準塩基を起点として3’末端までの塩基数が３つであり、RNAiセンス鎖領域が１９塩基からなるsiRNAであること表している。すなわち、「si746/50-3D19」の「si746/50」において、「si」はsiRNAを、「746/50」はdel(E746-A750)変異の746〜750を、及び「3D19」において、「D」は欠失変異であることを、「3」は第２基準塩基を起点として3’末端までの塩基数が３つであることを、そして、「19」はRNAiセンス鎖領域が１９塩基からなることを、それぞれ表す。ただし、表４に示したdel(L747-E749)-A750P(A)変異遺伝子に対するsiRNA名については、表３に示したdel(L747-E749)-A750P(G)変異遺伝子に対するsiRNAと区別するために、上記基準において「si747/49-3D19」に対しては「si747/49(A) -3D19」のように「(A)」を加えて、del(L747-E749)-A750P(G)変異遺伝子に対するsiRNAと区別するようにした。また、各表のセンス鎖領域（ss）における「＾」は、不連続接合点を示し、また、アンチセンス鎖領域（as）における「＾」は、センス鎖領域内の不連続接合点に対応する位置を示す。各表のセンス鎖領域（ss）において、下線を付した塩基は、第２基準塩基を示している。また、del(L747-E749)-A750P(G)変異における挿入塩基（２塩基）を太字で示している。【０１３８】
各siRNAの合成は、シグマアルドリッチ社に委託した。合成されたsiRNAは、センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域のアニーリング処理が施されており、それを直接実験に使用した。【０１３９】
（３）レポーター遺伝子発現プラスミドの構築
前記（１）で調製したEGFR-siRNAのRNAi効果の評価の選定のために、ホタル・ルシフェラーゼ（Photinus luciferase）遺伝子を発現するpGL3-TK （Ohnishi Y., et al., 2006, Journal of RNAi and Gene Silencing, Vol. 2: 154-160）と及びウミシイタケ・ルシフェラーゼ（Renilla luciferase）遺伝子を発現するphRL-TK プラスミド（Promega社）を用いて、siRNAの標的となる優性変異遺伝子と非標的の野生型遺伝子のレポーター遺伝子発現プラスミドの構築を行った。【０１４０】
変異部位を含む合成オリゴDNAの設計、レポーター遺伝子発現プラスミドへの挿入、選定方法については、Ohnishi Y., et al., 2008, PloS One, Vol. 3, Issue 5: e2248に従った。具体的には、非小細胞肺癌の病因となるEGFR遺伝子のdel(E746-A750)、del(L747-T751)-L747S、又はdel(L747-E749)-A750Pの各遺伝子の欠失又は欠失挿入変異部位をそれぞれ含むオリゴDNAのセンス鎖領域及びアンチセンス鎖領域をそれぞれ合成した（シグマアルドリッチ社に委託）。なお、DNA合成の際には、表１〜４における各センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域のU(ウラシル)をT（チミン）に変換した。変異を持たない野生型遺伝子についても同様に、オリゴDNA合成した。それぞれの具体的な塩基配列を表５及び６に示す。これらのセンス鎖領域及びアンチセンス鎖領域は、EGFR遺伝子断片のセンス鎖領域及びアンチセンス鎖領域の両端に制限酵素切断部位を構成するリンカー配列を含んでいる。表中、リンカー配列を下線で示し、EGFR遺伝子における不連続接合点を「＾」で、各表のセンス鎖領域（ss）における第２基準塩基を黒白反転文字で、そして表５においてdel(L747-E749)-A750P(G)変異遺伝子における挿入塩基（２塩基）と、表６においてdel(L747-E749)-A750P(A)変異遺伝子における挿入塩基（１塩基）を太字で示している。なお、EGFR(T790T)及びEGFR(T790M)は、EGFRの点突然変異用合成オリゴDNAであり、小文字表記した塩基が点突然変異部位を示す。    
【表５】
2012043633.tif 000006
【表６】
2012043633.tif 000007
【０１４１】
次に、合成した各鎖オリゴDNAのアニーリング処理を行った。具体的には、最終容量10μLとなるように、センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域の一本鎖オリゴDNA（最終濃度：それぞれ１μM）、10×アニーリングバッファ（インビトロジェン社、最終濃度：1×）及び滅菌水を混合し、80℃で５分間熱処理をした後、室温に３０分間放置し、二本鎖を形成させた。【０１４２】
続いて、二本鎖オリゴDNAを制限酵素処理した前記２種のプラスミドに挿入した。具体的には、pGL3-TK プラスミドとphRL-TK プラスミドを制限酵素XbaI及びNotIで処理した後、正常型アレルはｐGL3−TKプラスミドにおける、また優性変異遺伝子は、phRL-TKプラスミドにおける、各レポーター遺伝子の3’非翻訳領域（3’UTR）内に挿入して、野生型EGFRレポーター遺伝子発現プラスミド及び優性変異型EGFRレポーター遺伝子発現プラスミドを構築した。また、正常型及び優性変異遺伝子に対してレポーター遺伝子を入れ替えたレポーター遺伝子発現プラスミドも同様に構築した。【０１４３】
（４）細胞培養
ヒト由来株化細胞であるHeLa細胞を10%ウシ胎仔血清（FBS；Invitrogen社）及び抗生物質（100ユニット/mL ペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン；Wako社）含有のDMEM培養液（Wako社）を用いて、5% CO2下で37℃にて培養した。【０１４４】
（５）トランスフェクション及びレポーターアッセイ
前記レポーター遺伝子発現プラスミドを用いたレポーターアッセイによって様々なEGFR-siRNAのRNAi効果及びRNAi誘導に好適なRNAi分子の構造的一般法則性について検討した。【０１４５】
遺伝子導入の前日に、HeLa細胞をトリプシン消化により分散させた後、細胞密度1×105cells/cm2となるように調整して９６ウェル培養プレートに播種し、前記HeLa細胞に抗生物質不含のDMEM培養液で培養を行った。２４時間後、３種類のプラスミド、すなわち、（a）野生型EGFRレポーター遺伝子発現プラスミドであるpGL3-TKバックボーンプラスミド（60ng/ウェル）、（ｂ）変異型EGFR遺伝子の各レポーター遺伝子発現プラスミドであるphRL-TKバックボーンプラスミド（20ng/ウェル）及び（c）外来性コントロールとしてRNAiによる発現抑制を受けないβ-ガラクトシダーゼ遺伝子発現プラスミドであるpSV-β-ガラクトシダーゼ対照用プラスミド（Promega社）（10ng/ウェル）を、EGFR優性変異遺伝子を標的として設計した表１〜４で示す様々なEGFR-siRNA（終濃度20nM）と共に導入した。ネガティブコントロールとしては、終濃度20nMのRNAiを誘導しないsiRNA（siControl; QIAGEN社）を用いた。これらの核酸の導入には、リポフェクタミン2000（Invitrogen社）を用いた。トランスフェクション法は、添付されたプロトコールに従った。核酸を導入して２４時間後、Dual-Luciferase reporter assay system （Promega社）のキットに添付された（Dual-Luciferase reporter assay system）細胞溶解バッファ（Passive lysis buffer）を用いて細胞抽出液を調製し、発現したそれぞれのレポーター遺伝子（及び２種のルシフェラーゼ）とコントロールのβ-ガラクトシダーゼの活性をDual-Luciferase reporter assay system（Promega社）及びBeta-Glo assay system（Promega社）を用いてそれぞれ測定した。測定にはFusion Universal Microplate Analyzer（Perkin Elmer社）を用いた。さらに、レポーターに関して、使用した２種のルシフェラーゼ活性の違いによる測定差異の可能性を排除するため、各変異遺伝子del(E746-A750)、del(L747-T751)-L747S、del(L747-E749)-A750P遺伝子に対して、レポーター遺伝子を入れ替えた実験も行った。【０１４６】
（６）結果
del(E746-A750)変異遺伝子に対する各EGFR-siRNAの結果を図８−１Bに、del(L747-T751)-L747S変異遺伝子に対する各EGFR-siRNAの結果を図９−１Bに、そしてdel(L747-E749)-A750P(G)、及びdel(L747-E749)-A750P(A)変異遺伝子に対する各EGFR-siRNAの結果をそれぞれ図１０−１B、及び図１１−１Bに、示す。各図において、非標的の野生型EGFR遺伝子と、標的の変異型EGFR遺伝子のルシフェラーゼ活性を、それぞれのsiControlのルシフェラーゼ活性を1.0としたときの相対値として算出した。各サンプルのルシフェラーゼ活性は、RNAiによる発現抑制を受けない外来性コントロールであるβ-ガラクトシダーゼの発現量で補正している。【０１４７】
第２基準塩基を起点に下流側に向かってRNAiセンス鎖領域の3’末端塩基を一つずつずらしながら導入して、全体のRNAiセンス鎖領域の塩基長を１９塩基に保持した場合、図８−１B及び図９−１Bで示すように、４〜１５番目の塩基をRNAiセンス鎖領域の3’末端塩基に設定したとき（-4D19〜-15D19で示される）に、コントロール（siControl）の発現と比較して、変異型EGFR遺伝子の発現は強く抑制するが、野生型EGFR遺伝子の発現はあまり抑制しないか、コントロールとほとんど変わらないことが明らかとなった。すなわち、これは、ASP-RNAi効果の高い有用なsiRNAであることを意味している。【０１４８】
一方、図１０−１Bでは、２〜９番目の塩基をRNAiセンス鎖領域の3’末端塩基に設定したときに、コントロール（siControl）の発現と比較して、変異型EGFR遺伝子の発現は強く抑制するが、野生型EGFR遺伝子の発現はあまり抑制しないか、又はコントロールとほとんど変わらないことが明らかとなった。この結果は、上記のdel(E746-A750)変異又はdel(L747-T751)-L747S変異の結果と若干のずれがある。しかし、図１０−１A、図１１−１Aで示すように、del(L747-E749)-A750P（G）、(A)には二箇所の不連続接合点が存在し、それぞれ２塩基と１塩基を挟んで双方が近接している。したがって、上述のように本実施例では、形式的に3’側の不連続接合点に隣接する5’側及び3’側の塩基をそれぞれ第１及び第２基準塩基としてsi747/49-2D19〜-9D19そしてsi747/49(A)-3D19〜-11D19を調製したが、これは、5’側の不連続接合点に隣接する5’側及び3’側の塩基をそれぞれ第１及び第２基準塩基とみなすことも可能であり、その場合、si747/49-4D19〜-11D19とsi747/49(A)-4D19〜-12D19となり、del(E746-A750)変異又はdel(L747-T751)-L747S変異の結果と一致する。【０１４９】
したがって、第２基準塩基を起点としてその下流の４〜１５番目の塩基をRNAiセンス鎖領域の3’末端塩基に設定することがASP-RNAi効果の高い有用なEGFR-siRNAを設計する上で好適であることが示唆された。【０１５０】
このように、不連続接合点を含む転写産物を標的とするRNAi分子は、不連続接合点を挟む２塩基（第１及び第２基準塩基）を含みさえすれば、他は任意にその配列を設定してもよいわけではなく、第１及び第２基準塩基がRNAiセンス鎖領域の所定の位置になければ、望ましいASP-RNAi効果が得られないことが示された。この傾向は、多少の振れはみられるものの、後述する実施例５及び図１２及び１３でも示すように、同一遺伝子内の標的領域の塩基配列の差異、又は標的遺伝子の差異にかかわらず認められる現象であることが明らかとなった。【０１５１】
＜実施例２：ヒト非小細胞肺癌由来株化細胞に対するEGFR-siRNAの欠失（又は欠失／挿入）変異遺伝子特異的なRNAi効果＞
前記実施例１で、変異型EGFR、すなわち、del(E746-A750)、del(L747-T751)-L747S、del(L747-E749)-A750Pに対して効果的な発現抑制効果を示したEGFR−siRNAについて、それらが内在性の変異型EGFRに対しても特異的な発現抑制効果（ASP-RNAi効果）を示すか否かを検討した。本実験にはEGFR del(L747-E749)-A750Pを有するヒト肺癌由来のPC3細胞を例として使用した。EGFR−siRNAには、実施例１においてdel(L747-E749)-A750P変異に対して、特に発現抑制効果のあったsi747/49-3D19、及びsi747/49(A)-8D19を用いて内在性変異型EGFRのRNAiノックダウンを行った。【０１５２】
［方法］
（１）細胞培養
ヒト非小細胞肺癌由来株化細胞であるPC3細胞を10%ウシ胎仔血清（FBS；Invitrogen社）含有のEMEM培養液（Wako社）を用いて、5% CO2下で37℃にて培養した。【０１５３】
（２）エレクトロポレーション法によるEGFR-siRNAの導入
前記（１）で培養した細胞をトリプシン消化によって分散させた後、遠心（120G、５分間）によって回収し、約1×106個の細胞をEGFR-siRNA（終濃度5μM）を含む100μLのエレクトロポレーションバッファ（Amaxa Cell Line Nucleofector Solution V、Amaxa社）にて懸濁した。前記エレクトロポレーション用サンプルを３つ調製し、添付されたプロトコールに従ってエレクトロポレーション（プログラム：U-005, 遺伝子導入システムNucleofector, Amaxa社）によって核酸の導入（１つは核酸を入れない対照実験群）を行なった。導入した核酸は、si747/49-3D19、si747/49(A)-8D19と RNAiを誘導しないコントロールsiRNA（QIAGEN社）である。【０１５４】
前記３群の細胞を前記（１）の培養液を用いて、６ウェル培養プレートにて培養を行い、２４時間後に回収した。【０１５５】
（３）cDNA合成
前記（２）で回収した細胞をTRIzol reagent (Invitrogen社)を用いて、添付されたプロトコールに従って全RNAを回収した。その後、SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen社)及びOligo(dT)15 (Promega社)を用いて逆転写酵素反応によってcDNAを合成し、その後RNaseH (Invitrogen社)処理を行った。前記操作は全て添付されたプロトコールに従い行った。【０１５６】
（４）PCR解析
前記（３）で得たcDNAをAmpliTaq Gold DNA Polymerase (アプライドバイオシステム社)とEGFR変異部位周辺配列を特異的に増幅するプライマーを用いてPCR解析を行った。PCRの温度・時間条件は、初期変性（95℃、１０分）後、変性(94℃、３０秒)、アニール(55℃、３０秒)、伸長反応(72℃、３０秒)の3段階を２６回繰返す条件とした。その後、PCR増幅産物を電気泳動法（7%ポリアクリルアミドゲル、100mA、１時間）にて解析した。使用したプライマー配列は、表７に示す。
【表７】
2012043633.tif 000008
【０１５７】
［結果］
si747/49-3D19での結果を図１４に、si747/49(A)-8D19での結果を図１５にそれぞれ示す。どちらのEGFR-siRNAも、野生型EGFR遺伝子の発現を抑制することなく、内在性変異型EGFR遺伝子の発現を特異的、かつ強力に抑制することが実証された。【０１５８】
＜実施例３：ヒト非小細胞肺癌由来株化細胞に対するEGFR-siRNAの細胞死及び細胞増殖能における影響評価＞
実施例２で示した、EGFR-siRNA（si747/49-3D19、及びsi747/49(A)-8D19）を用いた内在性変異型EGFR（del(L747-E749)-A750P）の特異的かつ効果的な発現抑制が細胞増殖や細胞死に対して影響を与え得るか否かを、全細胞数、細胞毒性、細胞増殖・生存活性、細胞死（アポトーシス）に関して、それぞれ検討した。【０１５９】
（１）細胞培養
前記「実施例２（１）」と同様にPC3細胞の培養を行った。【０１６０】
（２）エレクトロポレーション法によるEGFR-siRNAの導入
前記「実施例２（２）」と同様に、エレクトロポレーションを行った。【０１６１】
前記（１）の培養液を用いて、９６ウェル培養プレートにて細胞培養(細胞密度:約3×104個/ウェル)を行い、１日、４日後に各評価実験に供した。si747/49-3D19については、コントロールと共に、２日後、及び６日後についても、同様の評価実験に供した。【０１６２】
１．細胞増殖能（全細胞数）の測定
［方法］
si747/49-3D19導入後のPC3細胞における経時的な細胞数の変化（細胞増殖能）を調べるため、細胞内LDH（Lactate Dehydrogena;乳酸脱水素酵素）量をCytoTox 96（R) Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega社)を用いて測定した。実験は、添付されたプロトコールに従って行った。簡潔には、前記アッセイキットに添付された細胞溶解バッファ（Lysis Solution (10x)）を全サンプル群の培養液に加え、４５分間37℃でインキュベートすることによって全細胞に含有される全てのLDHが放出される。このLDH量を測定することで全細胞数を間接的に算出した。吸光度の測定はBenchMark Plus (BIO-RAD社)を用いた。ネガティブコントロールには、siRNAを加えないサンプル（siRNAなし）とRNAiを誘導しないsiRNA（siControl; QIAGEN社）を添加したサンプルを用いた。【０１６３】
［結果］
図１６に結果を示す。この図では、全細胞数とみなす１日目の「siRNAなし」のLDH量を100％としたときのLDH量の相対値（％）で示した。EGFR-siRNA（si747/49-3D19）は、「siRNAなし」に対しても、また「siControl」に対しても有意にPC3細胞のその全細胞数を減少させた。すなわち、この結果はsi747/49-3D19がPC3細胞の細胞増殖を抑制したことを意味する。また、同時に、構成的活性化により細胞増殖活性を促進するPC3内在性優性変異型EGFR（del(L747-E749)-A750P）遺伝子に対してsi747/49-3D19が特異的かつ効果的に、その発現を抑制したことを示している。【０１６４】
２．細胞毒性評価
［方法］
si747/49-3D19導入後のPC3細胞における細胞毒性を評価するため、細胞毒性によって細胞外に放出され、培養液中に存在するLDH量をCytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega社)を用いて測定した。実験操作は、添付されたプロトコールに従って行い、吸光度の測定は、BenchMark Plus (BIO-RAD社)を用いた。また、使用したネガティブコントロールは、前記細胞増殖能の測定時に使用したものと同じ２つのコントロール（siRNAなし及びsiControl）を用いた。【０１６５】
［結果］
図１７に結果を示す。この図では、１日目の「siRNAなし」の全細胞が含有するLDH量（前記細胞増殖能評価実験と同様に細胞溶解バッファを添加したサンプル）を100％としたときの相対値（％）で示している。si747/49-3D19は、「siRNAなし」や「siControl」と同等又はそれ以上に細胞毒性、又は内在性変異型EGFRの発現抑制による細胞死を誘導しないことが明らかとなった。【０１６６】
３．細胞増殖及び生存活性評価（１）
［方法］
si747/49-3D19導入後のPC3細胞における細胞増殖及び生存活性を評価するために、CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega社)を用いて、生細胞に含まれるNADH（nicotinamide adenine dinucleotide；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）によるMTS還元作用を測定した。実験操作は、添付されたプロトコールに従って行い、吸光度の測定はBenchMark Plus (BIO-RAD社)を用いた。また、使用したネガティブコントロールは、前記細胞増殖能の測定時に使用したものと同じ２つのコントロール（siRNAなし及びsiControl）を用いた。【０１６７】
［結果］
si747/49-3D19の結果を図１８、si747/49(A)-8D19の結果を図１９にそれぞれ示す。この図では、細胞増殖及び生存活性（細胞生存率）を「siRNAなし」の１日目のNADH活性を100％としたときの相対値として示している。si747/49-3D19、及びsi747/49(A)-8D19は、「siRNAなし」及び「siControl」のいずれに対しても有意にその増殖率を抑制し、又は生存率を低下させた。【０１６８】
４．細胞増殖及び生存活性評価(２)
［方法］
si747/49-3D19導入後のPC3細胞における細胞増殖及び生存活性を評価するため、CellTiter-Glo Assay (Promega社)を用いて、細胞の相対的ATP量を測定した。実験操作は添付されたプロトコールに従って行い、発光量の測定はFusion Universal Microplate Analyzer（Perkin Elmer社）を用いた。また、使用したネガティブコントロールは、前記細胞増殖能の測定時に使用したものと同じ２つのコントロール（siRNAなし及びsiControl）を用いた。【０１６９】
［結果］
図２０に結果を示す。細胞増殖及び生存活性（細胞生存率）は、「siRNAなし」の培養１日目の相対的ATP量を100％としたときの、１日目と４日目の相対値を示している。この図が示すように、si747/49-3D19は、培養４日目には「siRNAなし」及び「siControl」のいずれに対しても有意にその増殖率を抑制し、又は生存率を低下させた。【０１７０】
５．細胞死評価
［方法］
si747/49-3D19導入後のPC3細胞おける細胞死（アポトーシス）評価のため、Caspase-Glo 3/7 Assay (Promega社)を用いてcaspase3/7の活性を測定した。実験操作は、添付されたプロトコールに従って行い、発光量の測定は、Fusion Universal Microplate Analyzer （Perkin Elmer社）を用いた。また、使用したネガティブコントロールは、前記細胞増殖能の測定時に使用したものと同じ２つのコントロール（siRNAなし及びsiControl）を用いた。【０１７１】
［結果］
図２１に結果を示す。caspase3/7活性は、「siRNAなし」の培養１日目の活性を100％としたときの、１日目と４日目の相対値を示している。この図が示すように、si747/49-3D19は、培養４日目の「siRNAなし」及び「siControl」のいずれと比較してもcaspase3/7活性に有意な変化を示さなかった。これは、si747/49-3D19による変異型EGFR特異的発現抑制がアポトーシスを誘導しないことを示している。【０１７２】
＜実施例４：ヒト非小細胞肺癌由来株化細胞に対するEGFR-siRNAの点変異遺伝子特異的RNAi効果＞
（１）EGFR遺伝子に対するEGFR−siRNAのASP-RNAi効果の検討
［方法］
実施例１で記載したように、非小細胞肺癌患者では、EGFR遺伝子内に疾患と関連する機能獲得型変異として、点突然変異も知られている（Paez G.J. et al., Science, 2004, 304；1497-1500）。例えば、図２２Aで示すような2369番目の塩基CがTに置換した「T790M変異」（前記遺伝子の点突然変異に伴い、790番目のトリプトファンがメチオニンにアミノ酸変化（T790M）する点突然変異が挙げられる。このような点突然変異による置換変異を有する変異遺伝子は、その転写産物が不連続接合点を有さないことから、本願実施例１の優性変異遺伝子発現抑制剤の対象とはならない。【０１７３】
しかし、野生型のEGFR遺伝子発現に影響を及ぼさず、このような点突然変異による置換変異を有する変異型EGFR遺伝子の発現を特異的に抑制することができ、かつ実施形態１の優性変異遺伝子発現抑制剤とは異なる構成を有する他のsiRNA及び／又はそのsiRNAをコードするDNAを動作可能なように連結した発現ベクターがあれば、それを前記実施例１に記載のEGFR−siRNAと併用することで、より高い抑制効果が期待される。【０１７４】
そこで、点突然変異型EGFR（上皮成長因子受容体）遺伝子の発現を特異的に抑制するsiRNA（EGFR-siRNA）を設計し、変異遺伝子（癌原因遺伝子）に対する発現抑制効果について検証した。表８にはT790M変異に対して設計したsiRNAのセンス鎖領域（ss）及びアンチセンス鎖領域（as）の塩基配列を示している。塩基配列中、太字で示した塩基が点突然変異部位に相当する。なお、各表で示す塩基配列は、センス鎖及びアンチセンス鎖の3’末端におけるUUからなる3’末端付加塩基を記載便宜上、除いている。また、表中の配列番号は、配列表の番号に対応する。各表のEGFR-siRNA名については、例えば、表８の「si790-9C/U18」は、T790M変異の点突然変異部位を起点にセンス鎖領域の5’末端塩基までの塩基数が９塩基であること、点突然変異によって野生型EGFR遺伝子上の塩基CがU（T）に置換されていること、そしてセンス鎖領域及びアンチセンス鎖領域の塩基数が共に１８塩基であることを示している。
【表８】
2012043633.tif 000009
【０１７５】
（２）レポーター遺伝子発現プラスミドの構築とレポーターアッセイ
前記１で調製したEGFR-siRNAのRNAi効果の評価の選定のために、siRNAの標的となる優性変異遺伝子と非標的の野生型遺伝子のレポーター遺伝子発現プラスミドの構築、細胞培養、トランスフェクション及びレポーターアッセイを行なった。基本的な操作手順は、実施例１に記載の方法に準じた。【０１７６】
［結果］
結果を図２２Bに示す。この図が示すように、si790-9C/U18は、siControlと比較して野生型EGFR遺伝子の発現にも比較的強い抑制効果があることからあまり好ましいsiRNAではなかったが、si790-10C/U18とsi790-11C/U18は、野生型EGFR遺伝子に対する発現抑制効果がほとんどなく、一方、変異型EGFR遺伝子に対しては効果的な抑制作用を有することが明らかとなった。【０１７７】
したがって、si790-10C/U18とsi790-11C/U18は、好適なEGFR-siRNAであることが示された。【０１７８】
＜実施例５：BCR-ABLキメラ遺伝子に対するBCR-ABL-siRNAの転座変異遺伝子特異的RNAi効果＞
フィラデルフィア染色体における転座変異によって生じたBCR-ABLキメラ遺伝子を標的とする本実施形態１の構成を有するsiRNA（BCR-ABL-siRNA）を設計し、白血病原因遺伝子であるBCR-ABLキメラ遺伝子に対する発現抑制効果について検証した。【０１７９】
［方法］
前述のように、BCR-ABLキメラ遺伝子は、フィラデルフィア染色体を有する患者で見出されるCMLやALLの原因遺伝子とみなされており、本発明のBCR-ABL-siRNAが機能亢進型のBCR-ABL遺伝子の発現のみを特異的に抑制することができれば、フィラデルフィア染色体を有する患者でCMLやALLに対する効果的な予防剤又は治療剤となり得る。【０１８０】
（１）BCR-ABLキメラ遺伝子の種類 
Ph転座におけるBCR遺伝子の切断点は、Major-BCR(下流:M-BCR)とminor-BCR(上流:m-BCR)の二箇所に集中していることが知られているが、慢性好中球性白血病／本態性血小板血症では、さらに下流のμ-BCR(p230)の関与が報告されている。それぞれp210BCR/ABL（M-BCR切断点）、p190BCR/ABL（ｍ−BCR切断点）、p230BCR/ABL（μ-BCR切断点）の蛋白が生じ、このうちp210BCR/ABLはCMLのほぼ全例及びPh陽性ALLに、p190BCR/ABLはPh陽性ALLの残り半数の患者に認められる。【０１８１】
そこで、該疾患において最も高頻度にみられるM-BCRを切断点とするBCR−ABLキメラ遺伝子に対して、実施形態１に記載のRNAi分子の設計方法に準じてBCR-ABL-siRNAを設計及び調製し、これらの転座変異遺伝子の発現を特異的に抑制することができるか否かについて検証した。【０１８２】
（２）BCR-ABL-siRNAの設計と調製
上記M-BCRを切断点とするBCR−ABLキメラ遺伝子については、その変異遺伝子産物（変異mRNA）上で、野生型ABL遺伝子と野生型BCL遺伝子のそれぞれに対して図１２−１A、及び１３−１Aにおいて矢頭で示した位置に相当する箇所が本明細書に記載の不連続接合点に相当する。この不連続接合点に隣接する5’側及び3’側の塩基をそれぞれ第１及び第２基準塩基として、実施例１と同様の方法によりBCR-ABL-siRNAの設計し、調製した。【０１８３】
本実施例で設計し、使用したBCR−ABL-siRNAの具体的な塩基配列を表９に示す。表９にM-BCRを切断点とするBCR−ABLキメラ遺伝子に対して設計したsiRNAのセンス鎖領域（ss）及びアンチセンス鎖領域（as）の塩基配列を示している。ただし、各表で示す塩基配列は、記載便宜上、センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域の3’末端におけるUUからなる3’末端付加塩基を除いている。また、表中の配列番号は、配列表の番号に対応する。
【表９】
2012043633.tif 000010
【０１８４】
各siRNAの合成は、シグマアルドリッチ社に委託した。合成されたsiRNAは、センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域のアニーリング処理が施されており、それを直接実験に使用した。【０１８５】
（３）レポーター遺伝子発現プラスミドの構築
レポーター遺伝子発現プラスミドの構築、変異部位を含む合成オリゴDNAの設計、レポーター遺伝子発現プラスミドへの挿入、選定方法については、実施例１の「（３）レポーター遺伝子発現プラスミドの構築」に記載の方法に準じた。使用した合成オリゴDNAの具体的な塩基配列を表１０に示す。
【表１０】
2012043633.tif 000011
【０１８６】
（４）細胞培養
実施例１の「（４）細胞培養」に記載の方法に準じた。【０１８７】
（５）トランスフェクション及びレポーターアッセイ
実施例１の「（５）トランスフェクション及びレポーターアッセイ」に記載の方法に準じた。【０１８８】
［結果］
BCR-ABLキメラ遺伝子に対する各BCR-ABL-siRNAの結果を図１２−１B及び図１３−１Bに示す。各BCR-ABL-siRNAの該遺伝子に対する特異的発現抑制効果を評価するためには、BCR-ABLキメラ遺伝子と二つの野生型遺伝子（ABL遺伝子とBCR遺伝子）に対して評価しなければならない。そのため、各BCR-ABL-siRNAの標的遺伝子特異的発現抑制効果をBCR-ABLキメラ遺伝子と野生型ABL遺伝子（図１２−１B）、そしてBCR-ABLキメラ遺伝子と野生型BCR遺伝子（図１３−１B）の組み合わせで評価した。また前記と同様に、各図において、非標的の野生型ABL又はBCR遺伝子と、標的のBCR-ABLキメラ遺伝子のルシフェラーゼ活性を、それぞれのsiControlのルシフェラーゼ活性を1.0としたときの相対値として算出した。各サンプルのルシフェラーゼ活性は、RNAiによる発現抑制を受けない外来性コントロールであるβ-ガラクトシダーゼの発現量で補正している。【０１８９】
第２基準塩基を起点に下流側に向かってsiRNAセンス鎖領域の3’末端塩基を一つずつずらしながら導入して、全体のRNAiセンス鎖領域の塩基長を１９塩基に保持した場合、図１２−１B及び図１３−１Bで示すように、４〜１３番目の塩基をRNAiセンス鎖領域の3’末端塩基に設定したとき（-4D19〜−13D19で示される）に、コントロール（siControl）の発現と比較して、BCR-ABLキメラ遺伝子の発現は強く抑制するが、野生型ABL又はBCR遺伝子の発現はあまり抑制しないか、コントロールとほとんど変わらないことが明らかとなった。すなわち、これは、ASP-RNAi効果の高い有用なsiRNAであることを示している。【０１９０】
したがって、前述の「実施例１」と同様に、第２基準塩基を起点としてその下流の４〜１５番目の範囲の塩基をRNAiセンス鎖領域の3’末端塩基に設定することが、ASP-RNAi効果の高い、有用なBCR-ABL-siRNAを設計する上で好適であることが示された。【０１９１】
＜実施例６：ヒト非小細胞肺癌由来株化細胞に対するEGFR-siRNA及び抗癌剤ゲフィチニブの細胞生存活性への影響＞
前記実施例１でEGFRのdel(L747-E749)-A750P変異又はdel(E746-A750)変異に対してそれぞれ特異的な発現抑制を示したEGFR−siRNA、及び変異型EGFRを発現する非小細胞肺癌に対して有効とされる抗癌剤ゲフィチニブを用いて、それぞれの細胞増殖及び細胞生存活性に対する影響について検証した。【０１９２】
［方法］
（１）細胞培養
解析には、EGFRのdel(L747-E749)-A750P変異及びdel(E746-A750)変異を有するヒト非小細胞肺癌由来株化細胞であるPC3細胞及びPC9細胞、及び対照用に野生型EGFRを有するヒトHeLa細胞を用いた。PC3細胞の培養は、前記「実施例２：（１）」と、またHeLa細胞の培養は、前記「実施例１：（４）」と同様に行った。PC9細胞は、10%ウシ胎仔血清（FBS；Invitrogen社）含有のRPMI-1640培養液（Wako社）を用いて、5% CO2下で37℃にて培養した。【０１９３】
（２）ゲフィチニブ処理
培養したPC3細胞、PC9細胞及びHeLa細胞を、トリプシン消化によって分散させた後、遠心（120G、５分間）によって回収し、９６ウェル培養プレートにて細胞培養(細胞密度:約1×105個/cm2)を行った。２４時間後、終濃度0、10-3、10-2、10-1、100及び101μMのゲフィチニブ（商品名：イレッサ；アストラゼネカ社）に曝露し、３日後に細胞生存活性を測定した。【０１９４】
（３）エレクトロポレーション法によるPC3細胞へのEGFR-siRNAの導入
前記「実施例２：（２）」と同様の方法で、EGFR-siRNAの細胞導入を行った。具体的には、前記（１）の培養液で培養したPC3細胞をトリプシン消化によって分散させた後、遠心（120G、５分間）によって回収し、約1×106個の細胞を、終濃度100、50、25、10、5、1及び0nMのEGFR-siRNA(si747/49-3D19)又はRNAiを誘導しないsiRNA（siControl; QIAGEN社）を含む100μLのエレクトロポレーションバッファ（Amaxa Cell Line Nucleofector Solution V、Amaxa社）にて懸濁した。添付されたプロトコールに従ってエレクトロポレーション（プログラム：U-005, 遺伝子導入システムNucleofector, Amaxa社）を行い、前記siRNAを細胞に導入した。「実施例２：（１）」に記載の培地で培養し、３日後に細胞生存活性を測定した。【０１９５】
（４）リポフェクション法によるPC9細胞へのEGFR-siRNAの導入
前記（１）９６ウェル培養プレートにて細胞培養(細胞密度:約1×105個/cm2)を行った。終濃度100、50、25、10、5、1及び0nMのEGFR-siRNA (si746/50-4D19)及びRNAiを誘導しないsiRNA（siControl; QIAGEN社）を、リポフェクタミン2000（Invitrogen社）を用いてPC9細胞に導入した。トランスフェクション法は、添付されたプロトコールに従った。培養３日後に細胞生存活性を測定した。【０１９６】
（５）細胞増殖及び生存活性の評価
前記「実施例３；３．細胞増殖及び生存活性評価（１）」と同様の方法で評価した。【０１９７】
［結果］
（１）細胞増殖及び生存活性に対するゲフィチニブの影響
ゲフィチニブによる各細胞の細胞増殖及び生存活性の結果を図２３Ａ〜Ｃに示す。図２３Ａは、del(L747-E749)-A750P変異を有するPC3細胞の、図２３Ｂは、del(E746-A750)変異を有するPC9細胞の、図２３ＣはHeLa細胞の結果である。各図は、それぞれ無処置の細胞における細胞生存活性を100%としたときの相対値を示している。【０１９８】
PC9細胞が10-2μM以上のゲフィチニブ濃度で顕著な細胞増殖抑制及び生存活性低下を示したのに対して、PC3細胞とHeLa細胞は、いずれも1μM以上で濃度依存的な細胞増殖抑制及び生存活性低下を示した。この結果から、PC9細胞が少量のゲフィチニブ投与でもその増殖を抑制できるゲフィチニブ感受性の細胞であるのに対して、PC3細胞は、HeLa細胞も影響を受ける、すなわち野生型EGFRを有する細胞でも抑制されるような高濃度のゲフィチニブを投与しなければその細胞増殖及び生存活性の抑制効果が見られないゲフィチニブ耐性細胞であることが示唆された。【０１９９】
以上より、ゲフィチニブは、del(E746-A750)変異のようなゲフィチニブ感受性のEGFR変異を有する非小細胞肺癌に対しては有効な抗癌剤となり得るが、del(L747-E749)-A750P変異を有し、かつゲフィチニブ耐性を獲得した非小細胞肺癌に対しては、投与個体に有害な副作用を与え得る高濃度のゲフィチニブを投与しなければ効果が得らないことが示された。【０２００】
実際、ゲフィチニブの有効性とEGFRの遺伝子変異には密接な関係が存在することが報告されており（Paez G.J. et al. Science, 2004, 304；1497−1500、Lynch T.J. et al. N  Engl J Med, 2004,350； 2129−2139）、ゲフィチニブ感受性EGFR変異を有する患者は、ゲフィチニブの投与によって劇的な治療効果が得られるが、ゲフィチニブ耐性EGFR変異を有する患者では、ゲフィチニブの投与が間質性肺炎や急性肺障害等の副作用をもたらし得ることが知られており、本実施例の結果も、それを支持している。【０２０１】
（２）細胞増殖及び生存活性に対するEGFR-siRNAの影響
EGFR-siRNAによる各細胞の細胞増殖及び生存活性結果を図２４Ａ〜Ｃに示す。【０２０２】
図２４Ａは、del(L747-E749)-A750P変異を有するPC3細胞に対するEGFR-siRNA（si747/49-3D19）の、図２４Ｂは、del(E746-A750)変異を有するPC9細胞EGFR-siRNA（si746/50-4D19）の、図２４ＣはHeLa細胞に対するEGFR-siRNA（si747/49-3D19）の結果である。各図は、それぞれ無処置の細胞における細胞生存活性を100%としたときの相対値を示している。【０２０３】
この図で示すように、EGFRに変異を有するPC3細胞及びPC9細胞の両者に対して、EGFR-siRNA（si746/50-4D19及びsi747/49-3D19）の顕著な細胞増殖抑制及び生存活性の低下が観察された。一方、いずれものEGFR-siRNAも野生型EGFRを有するHeLa細胞に対しては細胞増殖及び生存活性の抑制効果を示さなかった。【０２０４】
以上の結果から、本発明のEGFR-siRNAは、野生型EGFRの発現にはほとんど影響を及ぼさず（すなわち、副作用の影響がないか、又は限りなく小さく）、かつゲフィチニブ耐性、感受性のどちらのEGFR変異であっても、ゲフィチニブよりも低濃度で極めて特異性の高い細胞増殖抑制及び生存活性低下を誘導できることが立証された。【０２０５】
＜実施例７：ヒト非小細胞肺癌由来株化細胞の異種異所性移植によるモデルマウスの作製とそれに対するEGFR-siRNAの効果＞
細胞レベルで検証したEGFR-siRNAの効果を個体レベルで検証した。【０２０６】
［方法］
ヌードマウスの皮下にPC3細胞を移植し、マウス皮下腫瘍モデルを作出し、そのモデルマウスを用いてEGFR-siRNA投与による腫瘍成長阻害効果を検証した。【０２０７】
（１）ヒト非小細胞肺癌由来PC3細胞の異種異所性移植によるモデルマウスの作出
（ｉ）細胞培養
前記「実施例２：（１）」と同様の方法でPC3細胞を培養した。【０２０８】
（ｉｉ）PC3細胞の移植
培養したPC3細胞を、トリプシン消化によって分散させた後、遠心（120G、５分間）によって回収し、血清及び抗生物質不含の培養液（RPMI-1640、Wako社）で再懸濁し、細胞数1×107cells/mLに調製した。この細胞懸濁液と、BDマトリゲル基底膜マトリックス（ベクトン・ディッキンソン社）を等量混ぜ合わせ、細胞数5×106cells/mLに調製した。これを、免疫不全モデルのヌードマウス（５週齢、BALB/cAJcl-nu/nu、日本クレア株式会社）の右側腹部に100μL(0.5×106cells)で皮下投与した。【０２０９】
（２）マウスの皮下腫瘍へのEGFR-siRNAの投与
（ｉ）EGFR-siRNAの調製と投与
アテロコラーゲンを主成分とする核酸デリバリー媒体であるAteloGene（登録商標） Local Use（株式会社  高研）と、実施例１〜３でPC3細胞に対して効果的な細胞増殖抑制効果を示したsi747/49-3D19、又はsi747/49(A)-8D19との複合体を調製した。調製法は、添付されたプロトコールに従い、EGFR-siRNA（si747/49-3D19、又はsi747/49(A)-8D19）の終濃度は、0.1mg/mLとした。対照実験としてRNAiを誘導しないsiRNA（siControl; QIAGEN社）も同様に調製し、siRNAを含まないアテロコラーゲン液も調製した。【０２１０】
（ｉｉ）皮下腫瘍に対するsiRNAの投与
PC3細胞を移植して１週間後（６週齢）に腫瘍径より腫瘍体積を算出し、約50mm3に達した腫瘍に対して、前記で調製した３つのサンプル、すなわちsiRNA不含のアテロコラーゲン溶液、siControl及びEGFR-siRNAの20μg/200μL溶液を、それぞれ1.0mg/kg体重で腫瘍に直接単回投与した。腫瘍体積は、以下の式を用いて計算した。【０２１１】
体積＝（短径）2×（長径）×0.5
（ｉｉｉ）siRNA投与後の経過観察
siRNA等の投与３週目（９週齢）（図２５A、si747/49-3D19；図２８A、si747/49(A)-8D19）に、前記計算式により腫瘍体積を測定し、さらに腫瘍を取り出して（図２５B、si747/49-3D19；図２８B、si747/49(A)-8D19）、湿重量を計測した。【０２１２】
［結果］
EGFR-siRNAの投与による腫瘍体積の時間経過を図２６（si747/49-3D19投与）、図２９（si747/49(A)-8D19投与）に、摘出した腫瘍の湿重量を図２７（si747/49-3D19投与）、図３０（si747/49(A)-8D19投与）に、それぞれ示す。EGFR-siRNA（si747/49-3D19、又はsi747/49(A)-8D19）を投与した個体群は、アテロコラーゲン溶液のみ及びsiControlを投与した個体群と比較して、皮下腫瘍の肥大が有意に抑制されることが示された。さらに、腫瘍の湿重量もそれらと比較して有意に低下していた。【０２１３】
以上の結果より、本発明のEGFR-siRNAは、細胞レベルのみならず、個体レベルにおいても癌細胞増殖の抑制に有効であることが確認された。本発明のEGFR-siRNAは、ゲフィチニブの投与では副作用が大きく、これまで使用できなかったゲフィチニブ耐性のEGFR変異に対しても、極めて有効に、かつ安全に癌細胞の増殖及び生存活性を抑制することができることが立証された。【０２１４】
非小細胞肺癌患者の癌細胞が変異EGFR遺伝子を有するか否かは、LNA-PNA-PCR clamp法（特許4216266号）等の高感度検出方法によって検査することできる。患者のEGFR遺伝子がdel(E746-A750)変異のようなゲフィチニブ感受性変異を有していた場合には、ゲフィチニブが極めて有効な治療剤となり得る。しかし、del(L747-E749)-A750Pのような変異を有していてもゲフィチニブ耐性を獲得した癌細胞の場合には、有効かつ副作用のない薬剤は、現在まで知られていない。本発明のEGFR-siRNAは、その様な有効な治療方法が確立されていなかったゲフィチニブ耐性のEGFR遺伝子変異を有する非小細胞肺癌患者に対しても、非常に効果的な抗癌剤となり得ることが示された。【０２１５】
＜実施例８：内在性野生型EGFR遺伝子発現抑制による副作用の検証＞
上述の実施例で立証したように、本発明のEGFR-siRNAは変異型のEGFR遺伝子のみを特異的に発現抑制するのに対して、従来のsiRNAは野生型及び変異型のEGFR遺伝子を区別せず両者を強く発現抑制する。そこで、本発明のEGFR-siRNAと従来のsiRNAをマウス個体に投与した場合の副作用の有無について検証した。【０２１６】
［方法］
ICRマウス（雄、10週齢）の腹腔内に各種siRNAを投与した。実験群は、siRNAを投与しないアテロコラーゲン溶液のみの群（siRNAなし）と、RNAiを誘導しないsiRNA（siControl; QIAGEN社）、変異型EGFR遺伝子を特異的に発現抑制するsi747/49-3D19、及びマウス生体内で発現している内在性野生型EGFR遺伝子を発現抑制するsiEgfrをぞれぞれ投与した、計4群である。これらは、前記実施例７と同様の方法で調製し、マウス腹腔内に投与した。なお、本実施例で設計し、使用したsiEgfrの具体的な塩基配列を表１１に示す。
【表１１】
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【０２１７】
投与３日後、各マウスより採血を行い、採取した全血を遠心分離（1200×ｇ、10分）して血漿を得た。続いて、血漿中の全ビリルビン、間接ビリルビン、直接ビリルビンの量をQuantiChromTM Bilirubin Assay Kit (BioAssay Systems社)を用いて、またアルカリホスファターゼの量をラボアッセイTM ALP（Wako社）を用いて、測定した。実験操作は、各キットに添付されたプロトコールに従った。【０２１８】
［結果］
図３１に結果を示す。血漿中の全ビリルビン（A）、直接ビリルビン（B）、間接ビリルビン（C）、及びアルカリホスファターゼ（D）の量に関して、siRNAなし群及びsiControl投与群と比較すると、内在性野生型EGFR遺伝子を発現抑制するsiEgfr投与群では、有意な上昇が観察された。一方、本発明のEGFR-siRNA(si747/49-3D19)投与群では、有意な変化は観察されなかった。この血中パラメーターの有意な上昇は、siEgfrの投与によって内在性野生型EGFRの発現が抑制されたことに起因し、変化した血中パラメーターのデータから肝胆道系の障害が惹起されたことが示唆された。また、内在性野生型EGFR遺伝子が肝細胞の再生に必要であることから（Natarajan et al., 2007, Proc Natl Acad Sci U S A., Vol. 104: 17081-17086）、まとめると、内在性野生型EGFR遺伝子の発現抑制は重篤な副作用をひき起こす危険性があることが示唆された。それに対して、本発明のEGFR-siRNAの投与は、血中パラメーターに全く影響せず、内在性野生型EGFR遺伝子の発現にほとんど影響を及ぼさないことが立証された。この結果は、本発明のEGFR-siRNAが、従来のEGFR-siRNAとは異なり、上記のような肝胆道系の障害等の副作用を生じる危険性がないか、又は極めて低いことを示唆している。これにより、本発明の優性変異遺伝子の発現抑制剤のRNA干渉技術の有用性が立証された。【０２１９】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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