(57)【要約】  脂肪細胞の培養方法では、播種された脂肪細胞を、培養底面（１４）と培養底面（１４）に対して垂直方向に配置された壁（１２）と接着させながら培養し、脂肪細胞を培養液中に浮遊させずに、球状で肥大化した脂肪滴を細胞内に生成させた成熟脂肪細胞を得る。この方法では、培養底面（１４）に対して垂直に壁（１２）が形成された培養容器（１０）を用いる。細胞または細胞の凝集塊は、壁（１２）と培養底面（１４）の２箇所以上で接着させた状態で、細胞内に球状で肥大した脂肪滴を有する球状の成熟脂肪細胞を培養する。これにより、生体内に近い形の脂肪細胞を得る。
2012124353.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養底面と培養底面に対して垂直方向に配置された壁とを有する培養容器を用いて、培養する脂肪細胞を、前記培養底面と前記壁とに接着させ、培養液中に浮遊させることなく、球状で肥大化した脂肪滴が蓄積された球状の成熟脂肪細胞を得ることを特徴とする脂肪細胞の培養方法。
【請求項２】
前記培養する脂肪細胞が０．５×１０３μｍ３未満の脂肪滴を有することを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記培養する脂肪細胞が骨髄間質細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞から分化させた脂肪細胞であることを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項４】
前記培養する脂肪細胞が前駆脂肪細胞であることを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項５】
前記前駆脂肪細胞を、９０％コンフルエント状態になるまで増殖させた後、分化誘導させる工程を含む請求項４に記載の培養方法。
【請求項６】
前記分化誘導工程が、（１）デキサメタゾン、インスリンを含む培地で培養した後、（２）デキサメタゾンを含まず、インスリンを含む培地で培養し、（３）インスリン、デキサメタゾンを含まない培地で培養する工程を含む請求項５に記載の培養方法。
【請求項７】
前記培養容器に対し、０．１×１０４個／ｃｍ２〜１×１０６個／ｃｍ２播種密度で細胞を播種する工程を有する請求項１乃至６のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項８】
前記培養容器において、培養底面に対して垂直方向に配置された壁の高さが、１０μｍ〜５００μｍであることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項９】
前記培養容器において、培養底面に対して垂直方向に配置された壁が連続している請求項１乃至８のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項１０】
前記培養容器において、培養底面に対して垂直方向に配置された壁が連続していない請求項１乃至８のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項１１】
前記培養容器において、培養底面に対して前記垂直方向に配置された壁により区画化された領域が形成されていることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項１２】
前記区画化された領域が規則的に配列していることを特徴とする請求項１１に記載の培養方法。
【請求項１３】
前記培養容器において、培養底面に対して垂直方向に配置された壁の任意の１つと該壁に向かい合う他の壁との最も近い距離が１０μｍ以上である請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項１４】
前記区画化された領域の底面積の内接円の直径が側壁の高さの、０．１倍〜４倍の範囲である請求項１１または１２に記載の培養方法。
【請求項１５】
球状の肥大化した脂肪滴の体積が０．５×１０３μｍ３〜３×１０６μｍ３である請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項１６】
脂肪滴の最小直径（短径）を最大直径（長径）で割った値が、０．４〜１．０である形状である１乃至１５のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項１７】
前記培養容器の底面が、透明であることを特徴とする請求項１乃至１６のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項１８】
前記培養容器において、極性官能基を有する培養底面及び培養底面に対して垂直方向に配置された壁であることを特徴とする請求項１乃至１６のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項１９】
前記培養容器において、培養底面及び培養底面に対して垂直方向に配置された壁の表面に無機物がコートされている請求項１７の培養方法。
【請求項２０】
前記培養容器において、培養底面及び培養底面に対して垂直方向に配置された壁の表面に、コラーゲン、フィブロネクチンに代表される、細胞外マトリクスがコートされている、請求項１７乃至１９のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項２１】
前記培養容器において、培養底面及び培養底面に対して垂直方向に配置された壁の表面に、合成物質がコートされている請求項１７乃至１９のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項２２】
培養底面と培養底面に対して垂直方向に配置された壁とからなる細胞培養位置を複数有する培養容器において、前記培養底面と前記培養底面に対して垂直に配置された壁とに接着させて、培養液中に浮遊させることなく培養された、球状かつ０．５×１０３μｍ３〜３×１０６μｍ３の体積に肥大化した脂肪滴を蓄積した複数の成熟脂肪細胞からなる成熟脂肪細胞群。
【請求項２３】
請求項２１に記載の成熟脂肪細胞群の成熟脂肪細胞に薬物を作用させることにより、当該薬物の脂肪組織に対する影響を試験する薬物スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪細胞の培養に関し、特に、細胞内に球状の脂肪滴を有する脂肪細胞を、試験等に利用しやすいように培養する培養方法、成熟脂肪細胞群及び薬物スクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、脂肪組織は、栄養分の貯蔵・放出だけでなく、レプチンなどの種々の生理活性物質を放出している重要な器官であることが明らかになりつつある。糖尿病や種々の成人病の重要な原因器官としても認識されつつある。従って、脂肪細胞は、これらの治療に供する薬物のターゲットとして研究されている。このような薬物の開発やスクリーニング試験には、培養した脂肪細胞の利用が不可欠である。【０００３】
生体内において、脂肪組織内に含まれる繊維芽細胞様の前駆体細胞、または前駆脂肪細胞は、まず、細胞内に微小な脂肪滴が形成される。そして、次第に蓄積され肥大化した脂肪滴が蓄積し、球状の成熟した脂肪細胞（成熟脂肪細胞）が形成される。前駆脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化の過程は脂肪細胞組織形成に重要であるので、本過程における薬剤の影響を調べることは有意義である。【０００４】
例えば、特許文献１では、単層細胞系で、より生体内に近い状態で内臓脂肪細胞を培養し、検定するための培地が開示されている。しかし、単層細胞系を用いる単層培養法では、完全に脂肪細胞が成熟するまで分化誘導を行うことは難しかった。詳細には、初期段階では脂肪細胞をフラスコ底面に接着させて培養する。脂肪細胞が分化することによって油滴が蓄積し肥大化すると、脂肪細胞は形態が変化し、丸い形状となって浮き上がってくる。このため、フラスコ接着面から成熟脂肪細胞が剥がれやすくなり、結果として、脂肪細胞内に油滴が多胞状に蓄積した分化の中間段階の細胞しか観察されなかった。従って、長期にわたる分化培養や最終分化までの観察、あるいは成熟脂肪細胞でしか放出しないような生理活性物質等の実験は困難であった。【０００５】
かかる問題を解決する方法として、特許文献２では、単胞性脂肪細胞の培養方法を開示している。脂肪細胞は、細胞質内に含まれる中性脂肪によって培養液中で浮遊する。特許文献２の単胞性脂肪細胞の培養方法では、この浮遊性を逆に利用して、培地を１００％充満させたフラスコの内側上面（天井面）に脂肪細胞を接着させて培養する方法（天井培養）を利用する技術を開示している。この方法を用いて単胞性脂肪細胞を数日間天井培養すると、大部分の細胞は、細胞質の一部を伸長あるいは拡張させ、フラスコ天井面にしっかりと接着し、大型の脂肪滴の周辺に種々の大きさの脂肪滴を有する成熟脂肪細胞へと形態変化する。【０００６】
また、非特許文献１，２によると、２個以上の細胞の集合体である凝集塊の大きさに関して研究されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００７／１２５８５９号パンフレット
【特許文献２】特開２０００−８３６５６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Rachel Glicklisら著, "Modeling Mass Transfer in Hepatocyte Spheroids via Cell Viability, Spheroid Size, and Hepatocellualr Functions", Publised online in Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com), 23 April, 2004
【非特許文献２】Franziska Hirschhaeuserら著、"Multicelluar tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again", Jornal of Biotechnology 148, 2010, pp. 3-15
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、スクリーニング試験では、同条件下、評価する薬物の量、または濃度などを変量し、その効果を測定するものである。そのため、使用する培養容器の材質、形状等も同一にする必要がある。培養容器としては、プラスチック製シャーレ、ガラス製シャーレ、ウェルプレート（マイクロプレート）などがあり、ウェルプレートには、例えば、６ウェル、１２ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェルの規格化されたウェルプレートがある。さらに、このような培養容器の仕様に合致する、自動培養装置、自動分析装置、または多検体同時測定が可能な評価装置が開発されている。従って、産業上、かかる培養容器の仕様と同形状、同操作、かつ、観察性の観点から透明性の高い培養容器を用いる細胞培養方法が求められている。一方、特許文献２では、天井面で脂肪細胞を培養するものであるため、各種標準培養容器とは著しく異なる形態の培養容器とならざるを得ない。その結果、天井培養で用いる培養容器を、規格化されたウェルプレートを用いる分析装置及び培養装置において利用することができないという問題がある。あるいは、天井培養で用いる培養容器を、規格化されたウェルプレートを用いる測定装置において利用することができないため、この測定装置を用いるスクリーニング試験が行えないという問題がある。【００１０】
そこで本発明は、培養底面と培養底面に対して垂直方向に配置された壁を有する培養容器を用いて、脂肪細胞を試験等に利用しやすいように培養する細胞培養方法を提供することを目的とする。すなわち、従来用いられている培養、検査・評価装置に適用可能なウェルプレート（規格化されたウェルプレート）等と互換可能な培養容器を用いて、脂肪細胞の培養する細胞培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係る脂肪細胞の培養方法の一態様は、播種された脂肪細胞を、培養底面と培養底面に対して垂直方向に配置された壁と接着させながら培養し、脂肪細胞を培養液中に浮遊させずに、球状で肥大化した脂肪滴を細胞内に生成させた球状の成熟脂肪細胞を得ることを特徴とする脂肪細胞の培養方法である。培養方法では、培養底面に対して垂直に壁が形成された培養容器を用いる。細胞１個、または、２個以上の細胞の集合体である凝集塊の一部を壁と培養底面の２箇所以上で接着させた状態で、細胞内に球状の脂肪滴を有するとともに、立体的な形状の脂肪滴が肥大化した球状の成熟脂肪細胞を得る。【００１２】
本発明に係る脂肪細胞の培養方法の一態様において、前記脂肪滴の体積が０．５×１０３μｍ３〜３×１０６μｍ３の範囲であること、または、前記脂肪滴の最小直径（短径）を最大直径（長径）で割った値が、０．４〜１．０の範囲であることが好ましい。
本発明にかかる、２個以上の細胞の集合体である凝集塊の大きさは、非特許文献１、２に基づくと、凝集体の中心部まで栄養分や酸素を供給させ、生存させるためには、培地と接着する最外層からの距離が２５０μｍ以内の大きさの凝集体好ましい。ウェル内の細胞の状態を均一に保つためには、凝集体は均一な５００μｍ以下の直径を有する球または半球状の凝集体がより好ましい。【００１３】
前記培養底面に対して垂直な壁を有する培養容器の表面に、プラズマ処理、または、無機物をコートすることにより、細胞接着性タンパク（コラーゲンなど）の接着性を高めるための親水化処理がされていることが好ましく、さらに、培養底面と培養底面に対して垂直方向に配置された壁を有する培養容器の表面に、コラーゲンまたはフィブロネクチンに代表される、細胞外マトリックスがコートされたものであること、または、合成物質がコートされていることが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、培養底面と培養底面に対して垂直方向に配置された壁を有する培養容器を用いて、脂肪細胞を試験等に利用しやすいよう、特に従来用いられている培養、検査・評価装置に適用可能なウェルプレート等と互換可能な形態で培養することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施の形態に係る培養容器の構成を示す平面図である。
【図２】図１の培養容器のＩＩ−ＩＩ断面図である。
【図３Ａ】図１の培養容器を用いて細胞を培養する状態を示す模式図である。
【図３Ｂ】一つの脂肪細胞が区画化された領域で培養される様子を示す図である。
【図３Ｃ】図３Ｂの脂肪細胞が肥大化した状態を示す図である。
【図４】本発明の実施の形態に係る培養容器の他の構成を示す平面図である。
【図５】図４の培養容器のＶ−Ｖ断面図である。
【図６Ａ】本発明の実施の形態に係る培養容器のさらに他の構成例を示す平面図である。
【図６Ｂ】図６Ａの培養容器で脂肪細胞を培養する状態を上から見た模式図である。
【図６Ｃ】図６ＢのＶＩ−ＶＩ断面図である。
【図７Ａ】本発明の実施の形態に係る培養容器のさらに他の構成例を示す平面図である。
【図７Ｂ】図７ＡのＶＩＩ−ＶＩＩ断面図である。
【図８】本発明の実施の形態に係る培養容器のさらに他の構成を示す平面図である。
【図９】図８の培養容器のＩＸ−ＩＸ断面図である。
【図１０】比較例１の分化２０日後の細胞の対物レンズ４０倍の位相差顕微鏡写真である。
【図１１】実施例１の分化２０日後の細胞の対物レンズ４０倍の位相差顕微鏡写真である。
【図１２】実施例２の分化２０日後の細胞の対物レンズ４０倍の位相差顕微鏡写真である。
【図１３Ａ】実施例２の染色した細胞のスライス画像を撮影した写真（底部：Z軸方向  ０μｍ）である。
【図１３Ｂ】実施例２の染色した細胞のスライス画像を撮影した写真（Ｚ軸方向  １０μｍ）である。
【図１３Ｃ】実施例２の染色した細胞のスライス画像を撮影した写真（Ｚ軸方向  ２０μｍ）である。
【図１３Ｄ】実施例２の染色した細胞のスライス画像を撮影した写真（Ｚ軸方向  ３０μｍ）である。
【図１３Ｅ】実施例２の染色した細胞のスライス画像を撮影した写真（Ｚ軸方向  ４０μｍ）である。
【図１３Ｆ】実施例２の染色した細胞のスライス画像を撮影した写真（Ｚ軸方向  ５０μｍ）である。
【図１３Ｇ】実施例２の染色した細胞のスライス画像を撮影した写真（上部：Ｚ軸方向  ６０μｍ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。ただし、本発明が以下の実施の形態に限定される訳ではない。説明の明確化のため、以下の記載及び図面は、適宜、省略、及び簡略化がなされている。各図面において同一の構成または機能を有する構成要素および相当部分には、同一の符号を付し、その説明は省略する。
【００１７】
実施形態１
実施形態１では、培養底面と培養底面に対して垂直方向に配置された壁を有する培養容器を用いて、脂肪細胞を試験等に利用しやすいように培養する細胞培養方法を、次のようにして実現する。（１）脂肪細胞を培養液中に浮遊させずに、生体内に存在する成熟脂肪細胞に類似した形態で培養する。即ち、球状で肥大化した脂肪滴を細胞内に有した状態で培養する。（２）試験等に利用しやすい培養容器を用いる。
【００１８】
具体的には、生体内で脂肪組織は、一個の脂肪細胞の細胞膜内に球状の脂肪滴が蓄積し、複数の球状の脂肪細胞が凝集した状態を呈している。本実施形態では、このような生体内の脂肪細胞に、より近い形状の成熟脂肪細胞を得る細胞培養方法を実現する。例えば、実験で使われる脂肪細胞は、プレートやフラスコなどの底に接着して成長させるために、球体ではなく、二次元の状態に近いものとなっていた。また、成熟化段階、即ち細胞膜内に存在する脂肪滴の体積の割合が高くなると、脂肪滴の浮力により、細胞が培養容器から剥離するため培養ができず、成熟脂肪細胞を得ることは困難であった。このように、脂肪細胞の形態の違いが大きいため、本来生体内で脂肪細胞が分泌する物質などが生体外と異なっているという問題があった。そこで、本実施形態では、脂肪細胞を培養底面と、培養底面に対して垂直な壁との両方に接着させた状態で培養することによって、脂肪細胞を立体的かつ培養容器に接着させた状態で、従来の培養方法に比べ球体に近い成熟脂肪細胞または細胞塊を得ることを実現する。
【００１９】
さらに、試験等、例えばスクリーニング試験や薬物の開発において利用されている培養容器や観察するための器具（顕微鏡など）に適用可能な状態で脂肪細胞を培養することを実現する。例えば、既存の顕微鏡観察に用いることができるように透明な材質のプラスチックを用いることによって、細胞を別の容器に移すことなく、培養に供した容器を用いて観察することができるようにする。
【００２０】
以降の説明では、まず、実施形態１に係る培養容器について説明し、その後、細胞培養方法について説明する。
【００２１】
１．培養容器
図１は、本実施の形態に係る培養容器の構成を示す平面図であり、図２は図１のＩＩ−ＩＩ断面図である。図１に示すように、培養容器１０は培養底面１４に対して垂直な壁（以下適宜、垂直な壁を「壁」とも称する）１２を備える。脂肪細胞を培養底面１４と壁１２とに接着させて培養する。このため、培養底面１４と壁１２との交点近傍が細胞培養位置となる。培養容器１０は、脂肪細胞が接着することができる細胞培養位置を複数備えているのが好ましい。ここで、培養底面１４（培養面）は、細胞を培養する空間における底になる部分（培養空間における底部）を意味する。
【００２２】
図１において、培養容器１０において、培養底面１４は垂直に形成された壁１２で区画化された領域（培養領域）１１を有している。向かい合う壁１２の距離(対抗する壁の間の距離）ａ、壁１２の幅ｂ、高さｃを図１に示す。この区画化された領域１１と壁１２とによって形成される空間が細胞培養位置（培養する空間）となる。
【００２３】
培養底面１４に垂直に形成させる壁１２の形状は特に制限されるものではない。例えば、連続した壁であってもよく、非連続の壁であってもよい。また、その壁の形状が平面であってもよく、湾曲していてもよい。さらに、多角形、円柱状であってもよく、その形状は培養底面１４に対して垂直であれば、特に限定されない。脂肪細胞の機能を再現させるためには、脂肪滴が蓄積された細胞１個〜数十個が一定した場所に存在することができるように、培養容器１０は、壁１２により区画化された領域１１を有しているものが好ましい。
向かい合う壁１２の距離ａは、７０μｍ〜３００μｍが好ましい。壁１２の幅ｂは特に限定されないが、壁１２の上に細胞が接着しないよう、２０μｍ以下であることが好ましく、１５μｍ以下であるのがより好ましい。
【００２４】
壁１２の高さｃは、壁１２によって区画化された領域１１で培養する細胞が壁１２へ乗り上げ、隣接する領域（壁１２によって区画化された領域１１）へ移動しなければよく、５０μｍ〜５００μｍが好ましい。例えば、壁１２の高さｃは、相当直径７０μｍの脂肪滴を有する脂肪細胞を形成させる場合、５０μｍ〜１５０μｍが好ましい。また、例えば相当直径１５０μｍの脂肪細胞を形成させる場合、５０μｍ〜３００μｍが好ましい。
【００２５】
培養底面１４に対して垂直な壁１２は、実質的に培養底面１４に対して垂直であればよい。例えば、培養底面１４と壁１２とのなす角（なす角は、脂肪細胞が接着する区画化された領域１１と反対側の角度）が８８°から９０°、あるいは、８５°から９０°であってもよい。
培養底面１４と壁１２とがなす角度は、細胞が乗り上げない角度でなければならないため、側面の上部から５０％以上の部分は８０°〜９０°が好ましく、特に、８５°〜９０°であることが好ましい。
【００２６】
図３Ａは、図１の培養容器を用いて細胞を培養する状態を示す模式図である。図３Ａでは、培養容器を側面から透視してみた図である。培地８で培養容器１０を満たす。壁１２によって区画化された領域１１で、脂肪細胞９が細胞塊を形成して培養される様子を示している。図３Ａから３Ｃ中、図１，２と同様に、向かい合う壁の距離をa、壁１２の幅ｂ、高さｃを示す。この場合、細胞塊を形成する脂肪細胞のうち、いずれかの脂肪細胞が培養底面１４へ接着し、同じ脂肪細胞または他のいずれかの脂肪細胞が壁１２へ接着していればよい。言い換えると、細胞塊全体として、培養底面１４と壁とに接着していればよい。
図３Ｂは、一つの脂肪細胞９が区画化された領域１１で、一方の壁１２と培養底面１４の２箇所で接着した状態で肥大化した状態を示す。図３Ｃは、脂肪細胞が培養領域を構成している複数の壁と培養底面１４の３箇所以上と接着した状態で肥大化した状態を示す。このように、区画化された培養領域に１個脂肪細胞が培養される場合において、１個の脂肪細胞が、培養底面１４と壁１２に２箇所以上接着していれば良い。
【００２７】
なお、図４及び図５に示すように、壁１２によって区画化された領域１１において、培養底面１４に対して垂直に形成された壁１２が非連続であってもよい。非連続である壁１２と壁１２との間の幅ｄは、培養細胞が最初に播種された区画化された領域１１から隣接する領域（区画化された領域１１）に移動できない程度であればよい。例えば、培養細胞の相当直径が２０μｍであれば、５〜１５μｍであることが好ましい。ここで、図４は、本実施の形態に係る他の培養容器の構成を示す平面図であり、図５は図４のＶ−Ｖ断面図である。
【００２８】
培養面に形成される壁１２は、図６Ａのような形状であっても構わない。図６Ｂは、脂肪細胞９が壁１２に接着した状態を上から見た図であり、図６Ｃは、図６ＢのＶＩ−ＶＩ断面を示す図である。図６Ｂ，図６Ｃでは、左側の壁１２には、一つの脂肪細胞が接着し、右側の壁１２には、複数の脂肪細胞９からなる細胞塊が接着している例を示している。
さらに、培養面に形成される壁１２は、図７Ａ，図７Ｂに示すように、連続した壁１２が、培養面の一端から他端まで形成される場合であってもよい。図７Ｂは、図７ＡのＶＩＩ−ＶＩI断面を示す図である。
壁１２は、図面に示した形状に限られることはない。壁１２は、脂肪細胞が壁１２の側壁に接着しやすい形状であることが好ましい。
【００２９】
また、図８及び図９に示すように、本実施の形態に係る培養容器は、所定数の複数の培養底面に対して垂直な壁１２を有する培養面をもったスポットを有していてもよい。ここで、図８は、本実施の形態に係るさらに他の細胞培養部の構成を示す平面図であり、図９は図８のＩＸ−ＩＸ断面図である。図８及び図９では、図１及び図２に示す、培養底面に対して垂直な壁を有する容器の構造を用いている例を示す。図８には、複数の側壁２４と培養底面に対して垂直な壁１２により区画化された領域１１が規則的に配列しているスポット２３を示した。側壁２４の高さｅは、培養液や反応液等の上清液が乾燥せず保持できる容量であればよく、適宜設定すればよい。側壁２４を有することにより、各スポット２３で異なる培地を用いることも可能となる。また、図８及び図９において、側壁２４を有する構成例を示したが、側壁２４を備えていない構成であってもよい。
【００３０】
培養底面に対して垂直な壁を作製する方法としては、特に限定されないが、例えば、モールドを用いた転写成形、３次元光造形、精密機械切削、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザ加工、放電加工等の方法が挙げられる。培養容器の用途、要求される加工精度、コスト等を考慮してこれらの製造方法を適宜選択することが好ましい。
【００３１】
モールドを用いて転写成形する方法の具体例としては、金属構造体を型として樹脂成形で培養面に対して垂直な壁をもつ凹凸構造を形成する方法が挙げられる。この方法は金属構造体の形状を高い転写率で樹脂へ再現することが可能であり、また汎用の樹脂材料を使用することにより材料コストを低くできるので好ましい。このような金属構造体の型を用いる方法は、低コストであり、高い寸法精度を満足できる点で優れている。
【００３２】
上記金属構造体の製造方法としては、例えば、フォトリソグラフィによって作製されたレジストパターンや３次元光造形によって作製された樹脂パターンへのメッキ処理、精密機械切削、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザ加工、放電加工等が挙げられる。用途、要求される加工精度、コスト等を考慮して適宜選択すればよい。
【００３３】
上記で得られた金属構造体を型として用いて樹脂へ凹凸構造を成形する方法としては、例えば、射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、ホットエンボス成形、押出成形によるロール転写等の方法を挙げることができる。生産性及び型転写性の観点から射出成形を採用することが好ましい。
【００３４】
培養容器を構成する材料としては、自己支持性を有するものであれば特に制限されず、例えば、合成樹脂、シリコン、ガラス等が挙げられる。コスト面や顕微鏡観察による細胞視認性の観点から、透明な合成樹脂を材料とすることが好ましい。透明な合成樹脂としては、例えば、ポリメタクリル酸メチル、メタクリル酸メチル−スチレン共重合体、等のアクリル系樹脂、ポリスチレン、アクリル・スチレン系共重合樹脂等のスチレン系樹脂、シクロオレフィン等のオレフィン系樹脂、ポリエチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等のエステル系樹脂、ポリジメチルシロキサン等のシリコーン系樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、シリコン樹脂等が挙げられる。このような樹脂には、透明性を損なわない範囲で着色剤、拡散剤、増粘剤等の各種添加剤を含んでいてもよい。
【００３５】
培養容器は、容器表面の親水性、生体適合性、細胞親和性等を向上させることを目的として、培養表面に（培養底面１４、壁１２の側壁、壁１２の上面）表面処理を行い、官能基を有する改質層及び／又はコーティング層が配されていてもよい。上記改質層を設ける方法としては、自己支持性を失う方法や１００μｍ以上の極端な表面荒れを起こす方法でなければ特に制限はないが、例えば、薬品処理、溶剤処理、表面グラフト重合によるグラフトポリマーの導入等の化学的処理、コロナ放電、オゾン処理、プラズマ処理等の物理的処理等の方法が挙げられる。またコーティング層を設ける方法としては、特に制限されるものではないが、例えば、スパッタ、蒸着等のドライコーティング、無機材料コーティング、ポリマーコーティング等のウェットコーティング等の方法が挙げられる。培養底面１４と壁１２の側壁の境界部分や壁１２に囲まれた空間、隣接する壁１２の隙間に気泡が混入させることなく培養液を注入するためには、親水性を付与することが望ましく、均一な親水性膜を形成させる方法として、無機蒸着が好ましい。
【００３６】
また、細胞親和性を考慮した場合には、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等の細胞親和性タンパク質をコーティングすることがより好ましい。コラーゲン水溶液等を均一にコートするために、上述の親水性膜を形成させた後、コートすることが好ましい。生体内環境を模倣して細胞外マトリックス表面での培養が望ましいため、上記のように均一な親水性無機膜を配した後に、培養細胞に適した細胞外マトリックスからなる有機膜を配することが特に好ましい。
【００３７】
上記の各表面処理はそれぞれ単独で行っても良いし、必要に応じて適宜組み合わせて行ってもよい。
【００３８】
さらに加えて、培養底面１４に対して垂直な壁を有する培養容器の底部が、透明であることが好ましい。これは、脂肪細胞を培養後、培養した脂肪細胞を顕微鏡観察する場合に、培養容器をそのまま用いることを可能にする。これにより、培養した脂肪細胞を、顕微鏡観察を可能とする容器等に移す必要がなくなる。そのため、試験等の手順を簡略化・時間の削減を実現する。加えて、培養した脂肪細胞を別の容器へ移動するときに生じる、当該脂肪細胞の損傷を防止することができる。
【００３９】
２．細胞培養方法
本実施形態では、培養底面１４に対して垂直な壁１２を有する培養容器１０として、上述した図１の形状を用いる。脂肪細胞を培養底面１４と壁１２に接着させた状態で培養する。この培養方法により、細胞内に球状の脂肪滴を有する立体的な形状の成熟脂肪細胞を得る。ここで、立体的なとは、球状の脂肪滴が蓄積された球状の形態、即ち、生体内の脂肪細胞の形状により近づけることを指す。
本明細書では、細胞培養方法を説明するにあたって、次の用語を用いる。
【００４０】
用語「脂肪細胞」は、細胞内に脂肪滴を有する細胞である。脂肪細胞は、動物の繊維芽細胞由来の細胞で、細胞質内に脂肪を蓄積するように分化し、脂肪組織を形成する。脂肪細胞は、単胞性脂肪細胞（白色脂肪細胞）と多胞性脂肪細胞（褐色脂肪細胞）とに分類される。単胞性脂肪細胞は、大型の脂肪滴が存在し、核や細胞小器官は辺縁に圧迫されている、貯蔵型の細胞である。多胞性脂肪細胞は、小型あるいは中型の脂肪滴が多数存在し、細胞小器官が発達している、代謝型の細胞である。
脂肪細胞は、骨髄間質細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞から分化させた細胞を含む。ここで言う骨髄間質細胞は、骨髄中に存在する網目構造をした組織のことをいう。間葉系幹細胞は、骨細胞や脂肪細胞などの間葉組織に存在する幹細胞で、間葉（脂肪細胞、骨等）の細胞に分化することができる細胞のことをいう。間葉系幹細胞は、骨髄や脂肪組織から分離することができる。動物の発生初期段階である胚盤胞期の胚の一部に属する内部細胞塊より作られる幹細胞細胞株のことである。生体外にて、理論上すべての組織に分化する分化多能性を保ちつつ、ほぼ無限に増殖させる事ができる。誘導多能性幹細胞とは万能細胞の一種であり、胚性幹細胞と同様に増殖して各種の細胞へと分化することが可能な細胞である。ｉＰＳ細胞は皮膚細胞などから作り出すことができる。
用語「脂肪滴」は、細胞質内に存在する脂肪の少滴で、脂肪細胞への分化過程などにみられる。細胞が成熟するに従い、この小滴が結合し、次第に大きな球状の脂肪滴が形成される。
【００４１】
用語「成熟脂肪細胞」は、脂肪滴が蓄積された脂肪細胞を指す。成熟脂肪細胞には、脂肪滴が形成された細胞であれば、脂肪滴の大きさは問わないため、肥大化した脂肪滴を含む脂肪細胞と、肥大化した脂肪滴より小さい脂肪滴を含む脂肪細胞とが含まれる。例えば、本明細書では、微小な脂肪滴とは、０．５×１０３μｍ３未満の脂肪滴のことをいい、前駆脂肪細胞から最終的に分化した肥大化した成熟細胞になる前の脂肪細胞のことをいう。本明細書では、培養する脂肪細胞として、微小な脂肪滴が蓄積された成熟脂肪細胞を含む。このような微小な脂肪滴が蓄積された成熟脂肪細胞を培養して、肥大化した脂肪滴が蓄積された成熟脂肪細胞を得る。
【００４２】
用語「分化する」は、それが得られた細胞型よりもよく分化した細胞型の産生を指す。したがって、本用語は部分的に分化および終末分化した細胞型を包含する。
用語「分化誘導」は、生物の発生分化で、特定の組織や化学物質が、自然にもしくは人為的に別の組織や細胞の分化を引き起こすことを指す。分化誘導を引き起こす物質を、「分化誘導物質」という。
【００４３】
用語「接着培養」は、細胞を培養容器に接着させて培養することをいう。
用語「継代培養」は、細胞培養において、細胞の一部を新しい培養容器に移し、再び培養することをいう。
【００４４】
細胞培養方法では、培養底面１４に対して垂直な壁１２を有する培養面、例えば、上述したような、壁１２により区画化された領域１１を有するような、３次元の形状の培養面を用いる。脂肪細胞を培養底面１４と壁１２の側面に接着させた状態にして培養する。そのため、細胞の分化が進み、脂肪滴が大きくなっても、細胞が培養面から剥がれて浮き上がってくることを抑制する。加えて、細胞の形状を立体的な形状にする。このように、細胞を区画化された領域１１に接着して培養することにより、細胞内に球状の脂肪滴を有する立体的な形状の、成熟した脂肪細胞を得る。
この細胞培養方法では、例えば、特許文献２に開示されているような、培養容器（フラスコ）の天井面に接着させて培養することなく、例えば、ウェルプレート上で細胞を培養することができる。
【００４５】
本実施形態の細胞培養方法において、脂肪細胞（成熟脂肪細胞）、細胞培養方法の工程等は、次の特徴を有していてもよい。
培養によって得られる肥大化した成熟脂肪細胞は、直径が２０μｍ〜１８０μｍの球状の脂肪滴、即ち、脂肪滴の体積が４×１０３μｍ３〜３×１０６μｍ３の範囲であって、脂肪滴の最小直径（短径）を最大直径（長径）で割った値（演算値）が０．４〜１．０の範囲であることが好ましい。
【００４６】
細胞培養方法は、培養底面１４に対して垂直な壁１２を有する培養容器で脂肪細胞を増殖させた後、分化誘導する構成を含む場合がある。分化誘導する構成とは、増殖に用いている培地から、分化誘導因子を含む培地に交換して培養する過程をいう。具体的には、インスリンを含む培地で培養する工程（物質）を含む。
また、培養する脂肪細胞が２層以上になる場合、具体的には、脂肪細胞が培養底面１４を完全に覆っていて、増殖するスペースが無くなり、脂肪細胞が層状になる場合には、９０％以上のコンフルエントの状態から分化誘導を開始する。
【００４７】
細胞の播種密度は、細胞が生存するもしくは増殖することができる数であればよく、０．１×１０４個／ｃｍ２〜１０×１０４個／ｃｍ２密度で播種し、９０％コンフルエントになるまで増殖させ分化誘導培地を用いて分化誘導させた後、分化誘導工程を行うことが好ましい。また、分化している細胞であって、かつ、増殖しない細胞については、１０×１０４個／ｃｍ２〜１×１０６個／ｃｍ２で播種することが好ましい。
【００４８】
上述した細胞培養方法により、細胞内に球状の脂肪滴を有する立体的な形状の成熟細胞を得る。これは、生体内と同様に一個の脂肪細胞が、球体で存在し、その球体のものが集まっている状態に近づけることを可能にする。これにより、生体内の形状に近い脂肪細胞を提供することができる。さらに、上述したような培養底面１４に対して垂直な壁１２を有する培養容器１０を用いることにより、細胞を通常利用されるウェルプレート、シャーレなどと同様の形状の容器を用い、かつ、天井培養やゲル内で培養するゲル培養といった複雑な操作を行うことなく、成熟した脂肪細胞が培養できる方法を提供することを可能する。加えて、該培養方法により薬剤スクリーニング等に好適な成熟脂肪細胞群を提供することができる。
【００４９】
さらに、脂肪細胞が特異的に産生するサイトカインのひとつであるアディポネクチンが多く分泌される成熟した脂肪細胞を培養することができる方法を提供することを可能にする。
【実施例】
【００５０】
［実施例１−３、比較例１］
１．培養容器
培養底面に対して垂直な壁を形成させた培養面として、上述した図１，２に示した培養面をもつ１ｃｍ×１ｃｍのフィルムをウェルプレート形状の培養容器の底面に貼り付けて、株化脂肪前駆細胞（３Ｔ３−Ｌ１）を培養した。
実施例はこのフィルムの部分を、比較例はフィルムのない平らな部分を培養面とした。【００５１】
１−１．実施例１及び２
実施例１及び２で用いる、培養底面１４に対して垂直な壁１２を有する培養面として、次の区画化された領域１１を有する２種類のフィルムを用意した。実施例１は、図１の距離ａが２００μｍ、図２の高さｃが５０μｍであり、実施例２は図１の距離ａが２００μｍ、図２の高さｃが１００μｍである。【００５２】
１−２．比較例１
比較例１は、１ｃｍ×１ｃｍのフィルム以外の平らな部分を培養面とした。【００５３】
２．細胞培養及び観察
２−１．実施例１及び２
株化脂肪前駆細胞（３Ｔ３−Ｌ１）を２５ｃｍ２  フラスコで継代培養し、７０％コンフルエントになったところで、各ウェルに細胞を播種した。
ここで、コンフルエントは、培養面全体に占める細胞の占める面積の割合をいう。例えば、２５ｃｍ２の面積をもつフラスコを用いた場合、その面積の５０％を細胞が占めていれば、５０％コンフルエントという。７０％コンフルエントは、培養面全体の７０％が細胞に覆われている状態を指す。ここでは、単に「コンフルエントになる」というように、数値を記載していない場合、９０％以上のコンフルエントになることをいう。【００５４】
０．１４５〜１．１６×１０４個／ｃｍ２の密度で細胞を播種した。
培養液は、コンフルエントになるまで、D-MEM(Gibco-Invitrogen, #11965-084 or #12100-046)+10% Donor Calf Serum (Tissue Culture Biologicals, #301D)+Antibiotic-Antimycotic (Gibco-Invitrogen, #15240-062)を用い、２日に１回の頻度で培養液を交換した。【００５５】
細胞がコンフルエントになった後、分化誘導培地に変え、分化誘導を開始した。分化誘導を開始した日を、分化誘導０日とする。分化誘導培地は分化誘導０〜２日目までは、D-MEM＋10% Fetal Bovine Serum (BioWest, #S1820)＋Antibiotic-Antimycotic＋0.25 μM Dexamethasone (Nacalai, #11107-51)＋0.5 mM 3-Isobutyl-1-Metylxanthine (Nacalai, #19624-31)＋4 μg/ml Humulin R (Eli Lilly Japan, 100 U/ml, #HI0210)を用いた。分化誘導２日目〜４日目までは、D-MEM ＋10% Fetal Bovine Serum ＋Antibiotic-Antimycotic ＋4 μg/ml Humulin Rを用いた。分化誘導４日目以降から、D-MEM ＋10% Fetal Bovine Serum＋Antibiotic-Antimycoticを用いた。【００５６】
各ウェルに細胞を播いてから分化２０日日間培養し、倒立顕微鏡を用いて観察を行った。実施例２は、倒立顕微鏡の観察に加えて、分化誘導３１日目に、２．５μＭ  Ｂｏｄｉｐｙ４９３／５０３で脂肪滴を、１μｇ／ｍｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で細胞核を細胞固定せず生きたまま蛍光染色した。共焦点レーザ顕微鏡を用いて、この蛍光染色を施した細胞のＺ軸（高さ）方向スライス画像シークエンスを撮影した（細胞染色のスライス画像シーケンス）。
細胞染色で用いる蛍光染色は、次の特徴を備える。蛍光色素は、光をあてると電子が励起される。しかし、電子は安定な場所へ戻る。戻る時にエネルギーを放出して元に戻るが、エネルギーをロスするため、放出されたエネルギーは光から得たエネルギーよりも小さいエネルギーとして放出される。Ｂｏｄｉｐｙ４９３／５０３は中性脂肪に選択的に溶け込む蛍光色素であり、青の光を吸収して緑の光を放出する。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２はＤＮＡ選択的に結合する蛍光色素であり、紫（ＵＶ）の光を吸収して青の光を放出する。撮影した画像の白黒映像では、緑部分が白となる。【００５７】
２−１．比較例１
実施例１、２の平板部分とした。そのため、培養底面が異なる以外は全く同じ条件となる。
細胞を播いてから分化誘導２０日目に、実施例１，２と同様に、倒立顕微鏡を用いて観察を行った。【００５８】
３．結果
３−１．分化２０日後の細胞
実施例１−３、または比較例１のそれぞれの条件で培養した、分化２０日後の細胞の写真を参照して、培養結果を説明する。【００５９】
・比較例１
図１０に比較例１の分化２０日後の細胞を撮影した写真を示す。図１０において、丸で囲んだ部分が細胞一個である。図１０において、丸で囲んだ細胞の脂肪滴は、５０μｍ程の大きさであった。複数の大きな脂肪滴を含んでいるため、細胞が球状にはならなかった。【００６０】
・実施例１
図１１に実施例１の分化２０日後の細胞を撮影した写真を示す。図１１において、丸で囲んだ部分が細胞一個である。四角で囲んだ部分は細胞が集まって集団になっている。分化２０日後では、区画化された領域の中央付近に細胞が集まっていることが観察される。
分化２０日が経過するまでの観察では、マイクロ容器の中央付近のみでなく、壁(側壁)付近にも細胞が存在し、底を埋め尽くしていた。しかし、細胞が成熟していくと、マイクロ容器の中央付近に細胞が集まってきた。図１１の４０倍の写真では、脂肪滴が重なって見えることから、一つ一つの細胞が中央付近に集中して塊を作っていることが観察された。これは、自己組織的に細胞凝集体を形成していることが推測される。
加えて、一つの細胞の大きさが比較例１と比べて小さい傾向があった。これは、実施例１では、細胞の体積が小さいのではなく、細胞形態が扁平ではなく球状になったためであると推測される。【００６１】
・実施例２
図１２に実施例２の分化２０日後の細胞を撮影した写真を示す。図１２において、四角で囲んだ部分は一つの細胞がマイクロ容器の中央付近に集まり、脂肪細胞の塊を作っていた。【００６２】
３−２．細胞染色のスライス画像
図１３Ａ−１３Ｇに、実施例２について、細胞染色して撮影したスライス画像シーケンスの写真を示す。写真中の右下に示すスケールは、３０μｍの長さを示している。Ｘ軸及びＹ軸を固定し、Ｚ軸方向を移動させて、染色した細胞を上から撮影した。図１３Ａが底部の細胞の写真であり、順に上方の細胞へ移行し、図１３Ｇが上部の細胞である。図１３Ａ−１３Ｇにおいて、白く見える部分が脂肪滴である。図１３Ａ−１３Ｇにおいて、左上、左下、及び右上に見える点線状の斜線がマイクロ容器の壁である。【００６３】
図１３Ｃ（Ｚ＝２０μｍ）の矢印で示した細胞は、細胞質が一つの脂肪滴で占められており、Ｘ−Ｙ平面での直径は２０μｍと認められる。これに対し、Ｚ軸方向の観察においては、図１３Ｂ（Ｚ＝１０μｍ）から図１３Ｄ（Ｚ＝３０μｍ）ではっきり見えるが、図１３Ａ（Ｚ＝０μｍ）及び図１３Ｅ（Ｚ＝４０μｍ）でぼやけている。
図１３Ｄ（Ｚ＝３０μｍ）の矢印で示した細胞も、細胞質が一つの脂肪滴で占められており、Ｘ−Ｙ平面での直径は３０μｍと認められる。これに対し、Ｚ軸方向の観察においては、図１３Ｃ（Ｚ＝２０μｍ）から図１３Ｅ（Ｚ＝４０μｍ）ではっきり見えるが、図１３Ａ（Ｚ＝０μｍ）及び図１３Ｆ（Ｚ＝５０μｍ）でぼやけている。
いずれの細胞もＺ軸方向の直径は２０〜４０μｍと推察できる。直径は上述したように２０〜３０μｍであるので、実施例２の細胞凝集体を形成している細胞の脂肪滴、細胞の形態は球状である。【００６４】
この出願は、２０１１年３月１６日に出願された日本出願特願２０１１−０５７７７０を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【符号の説明】
【００６５】
７  シャーレもしくはウェルプレート
８  培地
９  細胞
１０  培養容器
１１  区画化された領域
１２  壁
１３  開口部
１４  培養底面
２３  スポット
２４  スポットの側壁
【図１】
2012124353.tif 000003
【図２】
2012124353.tif 000004
【図３Ａ】
2012124353.tif 000005
【図３Ｂ】
2012124353.tif 000006
【図３Ｃ】
2012124353.tif 000007
【図４】
2012124353.tif 000008
【図５】
2012124353.tif 000009
【図６Ａ】
2012124353.tif 000010
【図６Ｂ】
2012124353.tif 000011
【図６Ｃ】
2012124353.tif 000012
【図７Ａ】
2012124353.tif 000013
【図７Ｂ】
2012124353.tif 000014
【図８】
2012124353.tif 000015
【図９】
2012124353.tif 000016
【図１０】
2012124353.tif 000017
【図１１】
2012124353.tif 000018
【図１２】
2012124353.tif 000019
【図１３Ａ】
2012124353.tif 000020
【図１３Ｂ】
2012124353.tif 000021
【図１３Ｃ】
2012124353.tif 000022
【図１３Ｄ】
2012124353.tif 000023
【図１３Ｅ】
2012124353.tif 000024
【図１３Ｆ】
2012124353.tif 000025
【図１３Ｇ】
2012124353.tif 000026
【国際調査報告】
2012124353.tif 000027
2012124353.tif 000028
2012124353.tif 000029
2012124353.tif 000030