(57)【要約】  Ｆ遺伝子欠損ウイルスを感染させる宿主細胞として、Ｆ蛋白を常時安定して発現しうる細胞系、およびそのような細胞を利用してＦ遺伝子欠損ウイルスを製造する方法が開示される。非増殖型ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスベクターは、Ｆ遺伝子を欠損したヒトパラインフルエンザ２型ウイルスを、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのＦ遺伝子を非誘導的に発現する様式で有するＶｅｒｏ細胞と共培養し、そして培養上清からウイルス粒子を単離することにより製造される。
2012108195.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非増殖型ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスベクターの製造方法であって、
Ｆ遺伝子を欠損したヒトパラインフルエンザ２型ウイルスを、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのＦ遺伝子を非誘導的に発現する様式で有するＶｅｒｏ細胞と共培養し、そして培養上清からウイルス粒子を単離する、
の各工程を含む方法。
【請求項２】
Ｆ遺伝子を欠損したヒトパラインフルエンザ２型ウイルスの遺伝子中にワクチン用または治療用遺伝子が組み込まれている、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのＦ遺伝子を非誘導的に発現する様式で有するＶｅｒｏ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願
本出願は，日本特許出願２０１１−０２５２３４（２０１１年２月８日出願）に基づく優先権を主張しており，この内容は本明細書に参照として取り込まれる。【０００２】
技術分野
本発明は、遺伝子導入用ウイルスベクターの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトパラインフルエンザ２型ウイルス（ｈＰＩＶ２）は、ヒト気道粘膜に感染し、粘膜免疫誘導が可能であることから、ワクチン用ベクターとしての応用が期待されている。このベクターを医薬品として実用化するためには、ウイルスベクターがヒト細胞に感染する能力をもち、かつ、感染後にヒト体内で伝播性ウイルスを生じないこと（非増殖性ベクターと表記）が必要である。つまり、細胞・組織には単回では感染するが、感染細胞・組織で伝播性ウイルスを産生せず、複数回の感染を引き起こさないシステムが必要である。当該システム系を構築するためには、ウイルスゲノム上の遺伝子を一部欠損させ、当該欠損遺伝子産物を発現する細胞を造成し、当該細胞中で欠損型ウイルスにトランスに欠損遺伝子産物を供給し、非増殖型ベクターを作製するシステムが通常採用されている。DNAウイルスではアデノウイルス（例えばWO94/28152）、RNAウイルスではレトロウイルス（例えばWO2006/084746）に当該システムが導入されている。また、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスの属するパラミクソウイルス科ウイルスでは、Ｆ遺伝子等を欠損したセンダイウイルスベクターが提案されている（WO2000/070070）。また、定型抗酸菌のMycobacterium  kansasiiまたはMycobacterium  bovis  BCG由来のα抗原（Ａｇ８５Ｂ）遺伝子を組み込んだヒトパラインフエンザ２型ウイルスの非増殖性遺伝子組換え型ベクターを用いた結核発症予防ワクチンが、結核菌の強い増殖抑制効果が認められたことが報告されている（PCT/JP2010/069435）。【０００４】
Ｆ遺伝子欠損ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、単独で、宿主細胞侵入後における当該ウイルスの複製・転写工程で、ウイルスエンベロープと細胞膜を融合させウイルスヌクレオカプシドを宿主内に導入する際に必要とされるヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのFusion  protein（以下「F蛋白」と記載）が存在しないため、自立増殖能をもつウイルス粒子を構成することができない。従って、ゲノム上にＦ遺伝子は欠損するがベクターエンベロープ上にはF蛋白を含有する非増殖型ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスベクターを調製するには、当該ウイルスのＦ蛋白を発現する細胞を造成し、当該細胞で当該欠損ウイルスを培養することにより、当該細胞からトランスに供給されるＦ蛋白の存在下で、ウイルスエンベロープ上にF蛋白を保持させることにより、感染能を有するウイルス粒子が構築される。当該増殖システムにより調製された培養上清から回収されるヒトパラインフルエンザ２型ウイルス粒子のゲノムは、Ｆ遺伝子を欠失している。当該Ｆ遺伝子欠損ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスベクターに予め治療用遺伝子や、ワクチン抗原をコードする遺伝子を組み込んでおけば、医薬品として有用なウイルス粒子を得ることができる。【０００５】
一般にウイルスの膜蛋白質は細胞毒性を有するため、従来は、ウイルスＦ遺伝子等が誘導型プロモーターの制御下に発現されるように設計されたベクター導入による細胞株を樹立し、平常時はＦ遺伝子等の発現を抑制しておき、ウイルスがＦ遺伝子等を発現するヘルパー細胞に感染して再構成されるときにのみＦ遺伝子等を誘導発現させる必要があった。例えば、上記のセンダイウイルスベクターに係る従来技術文献（WO2000/070070）では、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ誘導系を用いて、宿主細胞を増殖させるときにはセンダイウイルスのＦ遺伝子が発現されず、ウイルスを細胞に感染させる際にアデノウイルスを添加することにより、発現を誘導させる系が用いられている。【０００６】
しかしながら、ウイルスベクターの商業的製造においては、アデノウイルスを用意して添加する工程が必要となるため操作が煩雑となり、また、アデノウイルスによる遺伝子導入効率が一定ではないため、医薬品製造管理工程が複雑になるという問題点があった。さらに、実際に膜蛋白質の発現誘導システムを用いてウイルスベクターを製造する工程においては、細胞を培養してウイルス粒子を増殖させる場合、発現膜蛋白質の毒性のため宿主細胞を継代するにつれてウイルスの増殖能が低下し、約５代の継代でウイルスの産生能がほとんどなくなるという問題点があった。【０００７】
このため、ウイルスで欠損している膜蛋白質等をコードする遺伝子を発現し、欠損型ウイルスベクター増殖させることのできる細胞として、当該蛋白を常時安定して発現しうる細胞系が求められている。さらに、継代したときに性質が変わらない堅牢性をもつ宿主細胞系が求められている。【０００８】
本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書に参照として取り込まれる。これらの文献のいずれかが、本明細書に対する先行技術であると認めるものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】WO94/28152
【特許文献２】WO2006/084746
【特許文献３】WO2000/070070
【特許文献４】PCT/JP2010/069435
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ヒトパラインフエンザ2型ウイルスのＦ遺伝子を欠損したウイルスを増殖させる細胞として、ヒトパラインフエンザ２型ウイルスのF蛋白を常時安定して発現しうる細胞系を提供すること、ならびにそのような細胞を利用してＦ遺伝子欠損ヒトパラインフエンザ２型ウイルスベクターを製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ヒトパラインフエンザ２型ウイルスＦ遺伝子欠損ウイルスに感染しウイルス粒子を産生することができるパッケージング細胞として、Ｖｅｒｏ細胞が優れた性質を有していることを見いだした。驚くべきことに、Ｖｅｒｏ細胞は、ヒトパラインフエンザ2型ウイルスＦ蛋白に対する許容性がとりわけ高く、またインターフェロンの発現がなく、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのＦ遺伝子を常時発現させた場合でも安定して増殖することができ、かつウイルス粒子を効率よく産生することができることが判明した。  【００１２】
すなわち、本発明は、非増殖型ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスベクターの製造方法を提供する。この方法は、Ｆ遺伝子を欠損したヒトパラインフルエンザ２型ウイルスを、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのＦ遺伝子を非誘導的に発現する様式を有するＶｅｒｏ細胞と共培養し、そして、培養上清からウイルス粒子を単離する、の各工程を含む。  【００１３】
本発明の方法の好ましい態様においては、Ｆ遺伝子を欠損したヒトパラインフルエンザ２型ウイルスの遺伝子中にはワクチン用または治療用遺伝子が組み込まれている。【００１４】
別の観点においては、本発明は、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのＦ遺伝子を非誘導的に発現する様式で有するＶｅｒｏ細胞を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法を用いることにより、非増殖型のヒトパラインフルエンザ２型ウイルスベクターを安定して効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１はヒトパラインフルエンザ２型ウイルスの粒子構造およびゲノムを示す。
【図２】図２は、長期培養後（１年程度）のＦ遺伝子発現Ｖｅｒo細胞でのＦ遺伝子の発現をＲＴ―ＰＣＲ法により確認し、Ｆ遺伝子の発現が維持されていることを示す。
【図３】図３は、Ｆ遺伝子導入Ｖｅｒo細胞でＦ蛋白が発現していることを確認するウエスタンブロッティングを示す。
【図４】図４は、Ｆ遺伝子を欠失したヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのアンチセンスゲノムｃＤＮＡおよびＧＦＰ遺伝子を含むプラスミドの構造の一部を示す。
【図５】図５は、Ｍ２遺伝子保持Ｆ遺伝子欠損したｈＰＩＶ２がＭ２蛋白を発現していることを確認するウエスタンブロッティングを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのＦ遺伝子を非誘導的に発現する様式で有するＶｅｒｏ細胞を用いて、Ｆ遺伝子を欠損したヒトパラインフルエンザ２型ウイルスを増殖させる方法を提供する。
【００１８】
ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、パラミクソウイルス科に属するウイルスであり、そのゲノムは約15,000塩基のモノシストロニックな一本鎖マイナスＲＮＡである。図１に、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルス(ｈＰＩＶ２)の基本粒子構造を示す。この核酸にヌクレオカプシド蛋白（ＮＰ）が結合し、らせん対称リボヌクレオシドプロテイン複合体（ヌクレオカプシド、ＲＮＰ）を形成している。ウイルスゲノムがコードする蛋白のうち、ＮＰ蛋白、Ｐ（ホスホ）蛋白およびＬ（ラージ）蛋白がＲＮＰの形成に必要である。Ｆ（フュージョン）蛋白およびＨＮ（ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ）蛋白はエンベロープ蛋白であり、細胞への感染に重要である。Ｍ(マトリクス)蛋白はエンベロープ構造を支える膜蛋白である。
【００１９】
ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスは、感染細胞の細胞質で増殖するＲＮＡウイルスであるため、宿主細胞の染色体中に遺伝子が組み込まれることはない。また、このウイルスは、ヒト気道粘膜に感染し、IｇAの誘導発現による粘膜免疫を誘導することが知られており、さらにこれまでに成人での重篤報告例がないことから、ワクチン用または治療用ウイルスベクターとしてきわめて有用であると考えられる。
【００２０】
ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスを、ＮＰ蛋白、Ｐ蛋白およびＬ蛋白を発現し、Ｆ蛋白を発現しないよう改変すると、ウイルス粒子１回は細胞に感染することができるが、その細胞中で感染能のあるウイルス粒子を産生することができない。したがって、治療・ワクチン用ウイルスベクターとして安全性が高いという利点を有する。
【００２１】
本発明のヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのＦ蛋白発現Ｖｅｒｏ細胞は、このような該ウイルスゲノムのＦ遺伝子欠損ウイルスを増殖させて、Ｆ遺伝子を欠損したウイルス粒子を製造するのに有用な宿主細胞である。
【００２２】
「Ｖｅｒｏ細胞」とは、アフリカミドリザルの腎臓上皮由来の培養細胞であって、インターフェロンを産生しないことを特徴とし、ウイルス感染実験・ワクチン生産に多く用いられるなど世界中で広く用いられている細胞株である。本発明においては、市販のＶｅｒｏ細胞のいずれを用いてもよい。
【００２３】
「Ｆ遺伝子」とは、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのF蛋白をコードする遺伝子であり、本明細書においてこの用語は、ウイルス遺伝子のゲノムＲＮＡのみならず、対応する配列またはその相補配列をもつＤＮＡおよびＲＮＡのいずれをも意味するものとして用いられる。
【００２４】
「非誘導的に発現する」とは、誘導発現系ではなく発現するよう設計され、誘導操作を加えることなく発現することを意味する。ここで、誘導発現系とは、誘導操作を行わないときまたは抑制操作を行ったときには発現せず、誘導操作を行ったときまたは抑制操作を解除したときにのみ発現するよう設計された、宿主／ベクターと培養条件との組み合わせからなる系である。当該技術分野においては多くの誘導発現系が知られている。非誘導的な発現とは、誘導操作または抑制操作の解除を行うことなく発現することを意味する。典型的には、非誘導的な発現は常時発現であるが、細胞分裂や細胞周期の特定のフェーズで発現が抑制されることがある場合や、培養温度、培地組成、細胞密度などの培養条件により発現が抑制されることがある場合も、本発明における「非誘導的」な発現に包含される。  
【００２５】
本発明のＦ蛋白発現Ｖｅｒｏ細胞を製造するためには、まず、Ｆ遺伝子およびマーカー（例えば薬剤耐性）を有する組換えプラスミドベクターを調製し、これをＶｅｒｏ細胞にトランスフェクションする。Ｆ遺伝子の配列は既に知られており、市販の適当なプラスミドベクターにＦ遺伝子を組み込むことにより、組換えプラスミドベクターを容易に製造することができる。トランスフェクションは、種々の市販のトランスフェクション用試薬を用いて、あるいはエレクトロポレーションによって、定法にしたがって行うことができる。次に、マーカーを利用して形質転換体を同定し、単離し、拡大培養する。形質転換Ｖｅｒｏ細胞中のＦ蛋白の発現は、抗体による免疫染色や、後述の実施例に示されるように、ウエスタンブロッティングにより蛋白レベルの発現を調べることによって、あるいはＲＴ−ＰＣＲなどによりＲＮＡレベルの発現を調べることによって、分析することができる。あるいは、感染細胞の細胞融合における多核体形成を観察することにより、Ｆ蛋白の発現を確認してもよい。多核体形成とは、Ｆ蛋白とウイルスの別の膜蛋白質である受容体結合蛋白ＨＮが同一細胞内で共に発現することにより、隣接する細胞が融合し、細胞核が多数集まった巨大細胞を形成することをいう。Ｆ遺伝子を導入できたと想定されるＶｅｒｏ細胞に、ＨＮ遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクションし、多核体形成が認められれば、当該細胞はＦ遺伝子を機能的発現していることが確認できる。このようにして、Ｆ遺伝子を発現する所望の組換えＶｅｒｏ細胞をクローン化することができる。
【００２６】
本発明の別の観点においては、Ｆ遺伝子を欠損した非増殖型ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスベクターの製造方法が提供される。この方法は、Ｆ遺伝子を欠損したヒトパラインフルエンザ２型ウイルスを、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスのＦ遺伝子を非誘導的に発現する様式で有する本発明のＶｅｒｏ細胞と共培養し、そして培養上清からウイルス粒子を単離する、の各工程を含む。
【００２７】
「ウイルスベクター」とは、感染した細胞中で発現させるべき遺伝子がウイルスゲノム遺伝子とともにパッケージングされているウイルス粒子を意味する。
【００２８】
Ｆ遺伝子を欠損したウイルスゲノム遺伝子は、ｈＰＩＶ２の全ゲノム遺伝子に対応するアンチセンスｃＤＮＡを含むプラスミドから、慣用の遺伝子組換え技術を用いて、Ｆ遺伝子の全部または一部の領域を欠失させるか、Ｆ遺伝子の一部にストップコドン変異を導入することにより構築することができる。被験者に投与したウイルスベクターが突然変異によりＦ遺伝子の機能を再び獲得することを回避するため、Ｆ遺伝子の全部を欠失させることが好ましい。また好ましくは、本発明にしたがう非増殖型ウイルスベクターは、各種の治療用遺伝子を組み込むためのクローニングサイトを含むよう設計される。
【００２９】
Ｆ遺伝子を欠損したウイルスゲノム遺伝子からＦ遺伝子欠損ウイルス粒子を製造するためには、Ｆ遺伝子を欠損したウイルスゲノム遺伝子をＴ７プロモーターの制御下に発現するよう構築したプラスミドを、ｈＰＩＶ２のＦ蛋白およびポリメラーゼユニット（ＮＰ蛋白、Ｐ蛋白およびＬ蛋白）を発現する４種類のベクターとともにＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞、またはＴ７ポリメラーゼを発現するプラスミド共にｈＰＩＶ２のポリメラーゼユニット（ＮＰ蛋白、Ｐ蛋白およびＬ蛋白）をＦ遺伝子を発現するＶｅｒoにトランスフェクションする。感染した細胞を３〜６日間培養した後、培養上清からＦ遺伝子欠損ウイルス粒子を回収することができる。
【００３０】
このようにして得られたＦ遺伝子欠損ウイルス粒子を、本発明のＦ遺伝子を発現するＶｅｒｏ細胞に感染させると、ウイルス粒子は細胞内で増殖して、Ｆ遺伝子欠損ウイルス粒子ではあるが、それ自体はウイルスエンヴベロープ上にF蛋白を有する感染性のウイルス粒子が産生される。
【００３１】
本発明の１つの好ましい態様においては、Ｆ遺伝子を欠損したヒトパラインフルエンザ２型ウイルスに基づくウイルスベクター中には治療用・ワクチン用遺伝子が組み込まれており、本発明の方法により得られる非増殖型ウイルスベクターを標的細胞に感染させることにより、標的細胞に治療用遺伝子を導入することができる。治療用遺伝子とは、感染した細胞中で発現させるべき遺伝子であり、例としては、ヒトを含む哺乳動物由来の蛋白またはその一部をコードする遺伝子、癌抗原またはその一部をコードする遺伝子、細菌やウイルス由来の遺伝子、治療用抗体またはその一部をコードする遺伝子、およびこれらの遺伝子のフラグメント、ならびにこれらの遺伝子に変異が導入されている遺伝子が挙げられる。細菌やウイルス由来の遺伝子またはそのフラグメントを含むウイルスベクターはワクチンとして有用である。ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスの遺伝子中への治療用遺伝子の組み込みは、慣用の組換えＤＮＡ技術及びリバースジェネティクス技術を用いて定法により行うことができる。
【００３２】
本発明にしたがって製造されるウイルスベクターは、典型的には、噴霧剤としてヒトを含む哺乳動物細胞に投与することができる。噴霧剤は定法により調製することができる。例えば、ウイルスベクターを含む培養上清を、必要により濃縮し、適当な担体または賦形剤とともに、ＰＢＳ等の緩衝液または生理食塩水に懸濁した後、必要に応じてフィルターなどで濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。噴霧剤には、必要に応じて安定化剤、保存剤などを加えてもよい。こうして得られた発現ベクターを被験者に吸入投与することができる。
【００３３】
本明細書において用いる場合、「・・・を含む（comprising）」との表現により表される態様は、「本質的に・・・からなる（essentially  consisting  of）」との表現により表される態様、ならびに「・・・からなる（consisting  of）」との表現により表される態様を包含する。
【００３４】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書に参照として取り込まれる。
【実施例】
【００３５】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【００３６】
実施例１  Ｆ遺伝子発現Ｖｅｒｏ細胞の作製
ネオマイシン耐性遺伝子（Neo）を保持し、トリβアクチンプロモーター配列およびウサギβグロビンpolyA配列を保持するプラスミドに、ｈＰＩＶ２のゲノム遺伝子から切り出したＦ遺伝子を導入して、プラスミドｐＣＸＮ２−Ｆを構築した。対照としては、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ誘導系によりＦ遺伝子を発現しうるよう構築したプラスミドｐＣＡＬ−Ｆを用いた。これらのプラスミドをａｍａｘａ社のヌクレオフェクターを用いてＶｅｒｏ細胞にトランスフェクションした。【００３７】
トランスフェクションした細胞をネオマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）を含む培地中で培養して、ネオマイシンによる薬剤耐性によりスクリーニングを行った。ｐＣＸＮ２−Ｆを導入した細胞から２０株、ｐＣＡＬ−Ｆを導入した細胞から２７株の薬剤耐性コロニーを単離して、Ｆ遺伝子の発現について調べた。その際、プラスミドとしてｐＣＡＬ−Ｆを用いた場合には、Ｃｒｅ遺伝子保持アデノウイルスを感染させて、ｌｏｘＰ配列で不要遺伝子断片を除去することによりＦ遺伝子発現を誘導させた。【００３８】
次に、多核体形成を確認した。ＨＮ遺伝子を保持するプラスミドＳＲα−ＨＮを作製し、取得したネオマイシン耐性のＶｅｒｏ細胞に当該プラスミドをヌクレオフェクターを用いてトランスフェクションした。１または2日後に多核体形成を顕微鏡下で観察し、多核体を形成している細胞をＦ遺伝子発現細胞として二次選抜を行った。ｐＣＸＮ２−Ｆを導入した細胞から単離された２０個のクローンのうち、１２クローンが多核形成能を示した。  【００３９】
次に、ＲＴ−ＰＣＲによりＦ遺伝子の発現をＲＮＡレベルで測定した。その結果、ｐＣＸＮ２−Ｆを導入した細胞から単離された２０個のクローンのうち、１２クローンが多核形成能を示し、このうち９クローンがＲＴ−ＰＣＲにおいて陽性であった。また、ｐＣＡＬ−Ｆを導入した細胞から単離された２７個のクローンのうち、９クローンが多核形成能を示し、このうち７クローンがＲＴ−ＰＣＲにおいて陽性であった。また、ｐＣＸＮ２−ＦによりＦ遺伝子を導入し1年間培養した２ｘ１０６個のＶｅｒｏ細胞をＯｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＩＡＧＥＮ）に供した。ＰＣＲは、Ｆ遺伝子欠損ウイルスゲノムが存在する場合には５５０ｂｐ付近にＰＣＲ増幅産物が得られるようにプライマーを設定して行った。その結果、異なる３クローンのそれぞれのＰＣＲで５５０ｂｐ付近にＰＣＲ増幅産物のバンドが確認された。依然としてF遺伝子が発現していることが確認できた（図２)。すなわち、Ｆ遺伝子を常時発現するＶｅｒｏ細胞を、Ｆ遺伝子を誘導発現するＶｅｒｏ細胞と匹敵する効率で得ることができ、しかも長期間安定的に発現し続けることができた。このことは、Ｖｅｒｏ細胞がＦ蛋白に対する許容性が高く、Ｆ遺伝子を常時に長期間発現させた場合でも安定して増殖しうることを示す。【００４０】
次に、F遺伝子発現Ｖｅｒｏ細胞でのF蛋白の発現確認を行った。９．５ｘ１０５個のF遺伝子発現Ｖｅｒｏ細胞に対して、０．０３％Sulfo-NHS-LC-Biotin溶液1mlを用いて細胞膜上にある全ての蛋白にビオチン化を行ない、穏やかな条件で500μlの細胞溶解液を作製した。次に細胞溶解液300μlをF蛋白質特異的抗体80μlで免疫沈降法を用いてF蛋白のみを抗体と結合させ選択的に回収、濃縮を行なった。このサンプル全量をSDS-PAGEを行ないPVDFメンブレンに転写した。この時点で、既にF蛋白はビオチン化された状態となっており、アビジン−ビオチン複合体（avidin-biotin  complex）法によってアビジン-ビオチン複合体を形成させた。アビジンには西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）が標識されているのでECL試薬と反応させHRPの発光によってビオチン化されたF蛋白を検出した（図３)。【００４１】
実施例２  Ｆ遺伝子欠損アンチセンスｈＰＩＶ２ゲノムの構築
Ｔ７プロモーターの下流にｈＰＩＶ２の全ゲノム遺伝子に対応するアンチセンスｃＤＮＡを含むプラスミドから、全Ｆ遺伝子コード領域を含む配列を完全に欠失させ、ＮｏｔＩ制限部位にＧＦＰ（グリーン蛍光蛋白）遺伝子を組み込んだプラスミド（ｈＰＩＶ２−ΔＦ−ＧＦＰ）を構築した（図４）。構築は、Ｆ遺伝子の上流領域と下流領域の配列に基づいて設計したプライマーと、市販のＧＦＰ含有ベクターから切り出したＧＦＰ遺伝子断片とを用いて、ｈＰＩＶ２のゲノム遺伝子を含むプラスミドをテンプレートとして、多段階ＰＣＲにより行った。【００４２】
実施例３  Ｆ発現Ｖｅｒｏ細胞を用いたＦ遺伝子欠損ウイルス粒子の回収
実施例２で作製したプラスミド（ｈＰＩＶ２−ΔＦ−ＧＦＰ）を、トランスフェクション試薬としてリポフェクタミン又はＦＵＧＥＮＥ６を用いて、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞にトランスフェクションした。このとき、ｈＰＩＶ２のＦ蛋白およびポリメラーゼユニット（ＮＰ蛋白、Ｐ蛋白およびＬ蛋白）を発現する計４種類のベクターをともにトランスフェクションした。【００４３】
３日間培養した後、上清を回収して、Ｆ遺伝子発現Ｖｅｒｏ細胞またはＦ遺伝子を発現しない通常のＶｅｒｏ細胞に感染させ、感染６日後に、ＧＦＰ蛍光を観察した。Ｆ遺伝子発現Ｖｅｒｏ細胞では、細胞全体でＧＦＰの蛍光が認められた。一方、通常のＶｅｒｏ細胞では、ＧＦＰの蛍光を呈する細胞の数は、Ｆ遺伝子発現Ｖｅｒｏ細胞と比較して遥かに少なかった。【００４４】
次に、ＧＦＰ蛍光を呈するＦ遺伝子発現Ｖｅｒｏ細胞の培養上清を回収し、シャーレ上で別のＦ遺伝子発現Ｖｅｒｏ細胞に感染させ、その培養上清を回収した。この操作を３回繰り返した後、培養上清１．５ｍｌを取り、１０００ｘｇ、１分間遠心し残渣を除去した。上清を２０，０００ｘｇ、３０分間遠心し、上清を除去し沈殿物を２０μｌのＲＮＡａｓｅフリー水に懸濁した。０．５μｌを取り、Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＩＡＧＥＮ）に供した。ＰＣＲの結果は、Ｆ遺伝子欠損ウイルスゲノムが存在する場合には約４００ｂｐ、ＧＦＰ遺伝子が挿入されている場合には約５００ｂｐが存在するようにそれぞれプライマーを設定した。その結果、それぞれのＰＣＲで４００ｂｐ付近と５００ｂｐ付近にＰＣＲ増幅産物のバンドが確認された。このことから、Ｆ遺伝子欠損型のＰＩＶ２ウイルスが回収できたものと考えられた。【００４５】
上述のようにして得られたＧＦＰ発現Ｆ遺伝子発現Ｖｅｒｏ細胞の培養上清を、０．４５μｍ径のフィルターを通して残渣を除去した。当該培養上清液を順次１０倍希釈し、Ｆ遺伝子を発現していないＶｅｒｏ細胞に感染させた。３日後にＧＦＰの蛍光を呈する細胞を確認した。その結果、ＧＦＰの蛍光を呈する細胞が認められ、希釈に比例してＧＦＰの陽性細胞数が減少していた。このことから、Ｆ遺伝子発現Ｖｅｒｏ細胞の培養上清中にＦ遺伝子欠損ｈＰＩＶ２ウイルスが存在し、このウイルスがＦ遺伝子を発現していないＶｅｒｏ細胞に感染したことが確認された。なお、Ｆ遺伝子を発現していないＶｅｒｏ細胞の培養上清からは、感染性のあるウイルス粒子は得られなかった。【００４６】
また、ＧＦＰ遺伝子を保持するＦ遺伝子を欠損したｈＰＩＶ２ウイルスをマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞に感染させたところ、ＧＦＰ陽性ＮＩＨ−３Ｔ３細胞の存在が観察されたが、感染の効率はＶｅｒｏ細胞より低かった。【００４７】
実施例４  インフエンザウイルスのウイルスＭ２蛋白を発現するＦ遺伝子欠損型ＰＩＶ２ウイルスの作製
実施例２と同様にして、Ｆ遺伝子欠損アンチセンスｈＰＩＶ２ゲノムのＮｏｔＩ制限部位にインフルエンザウイルスのウイルスの脂質層の膜上に存在するＭ２蛋白（Ｍ２イオンチャネル）遺伝子を組み込んだプラスミド（ｈＰＩＶ２−ΔＦ−Ｍ２）を構築した。このプラスミド（ｈＰＩＶ２−ΔＦ−Ｍ２）を、実施例３と同様にして、トランスフェクション試薬としてリポフェクタミンまたはＦＵＧＥＮＥ６を用いて、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞にトランスフェクションした。このとき、ｈＰＩＶ２のＦ蛋白およびポリメラーゼユニット（ＮＰ蛋白、Ｐ蛋白およびＬ蛋白）を発現する計４種類のベクターをともにトランスフェクションした。次に、実施例３と同様の方法でウイルス回収を行い、Ｍ２遺伝子保持Ｆ遺伝子欠損したｈＰＩＶ２を、Ｆ遺伝子を発現しているＶｅｒｏ細胞（２ｘ１０６個）に感染させ、２日後に細胞を回収し、Ｍ２抗体を用いたウエスタンブロッティングに供した。その結果、Ｍ２の発現を確認することができた（図５）。すなわち、ＧＦＰ以外の遺伝子についてもＦ遺伝子欠損型のＰＩＶ２ウイルスが回収できたことが確認された。【００４８】
以上の結果から、Ｆ遺伝子発現Ｖｅｒｏ細胞を用いることにより、Ｆ遺伝子を欠損した非増殖型ｈＰＩＶ２ウイルスの回収が可能であること、当該ウイルスがＦ遺伝子発現細胞でのみ増殖が可能であり、Ｆ遺伝子を発現していない細胞で１次感染することができるが、感染性ウイルスを産生しないことが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明は、遺伝子治療用のウイルスベクターの製造に有用である。
【図１】
2012108195.tif 000003
【図２】
2012108195.tif 000004
【図３】
2012108195.tif 000005
【図４】
2012108195.tif 000006
【図５】
2012108195.tif 000007
【国際調査報告】
2012108195.tif 000008
2012108195.tif 000009
2012108195.tif 000010
2012108195.tif 000011