(57)【要約】本発明は、投薬治療を受けている患者における悪性新生物の進行度を定量的に評価する方法を提供することを課題とする。悪性新生物を治療するための薬剤が投与されている被験者において、当該悪性新生物の病性の進行を評価する方法であって、（１）前記被験者由来の血中ＤＮＡにおいて、正常なマーカー遺伝子を有するＤＮＡ分子に対する前記薬剤の活性化マーカーとなる活性化変異を有するＤＮＡ分子の割合を決定する工程と、（２）前記被験者由来の血中ＤＮＡにおいて、正常なマーカー遺伝子を有するＤＮＡ分子に対する前記薬剤の耐性マーカーとなる耐性変異を有するＤＮＡ分子の割合を決定する工程と、（３）前記（２）の工程で得た値と、前記（１）の工程で得た値とを比較することによって、前記被験者における悪性新生物が前記薬剤での治療に対して耐性を得ているか否かを評価する工程と、を有することを特徴とする、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性新生物を治療するための薬剤が投与されている被験者において、当該悪性新生物の病勢の進行を評価する方法であって、
（１）前記被験者由来の血中ＤＮＡにおいて、正常なマーカー遺伝子を有するＤＮＡ分子に対する前記薬剤の活性化マーカーとなる活性化変異を有するＤＮＡ分子の割合を決定する工程と、
（２）前記被験者由来の血中ＤＮＡにおいて、正常なマーカー遺伝子を有するＤＮＡ分子に対する前記薬剤の耐性マーカーとなる耐性変異を有するＤＮＡ分子の割合を決定する工程と、
（３）前記（２）の工程で得た値と、前記（１）の工程で得た値とを比較する工程と、
を有することを特徴とする、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、
前記被験者は非小細胞肺癌患者であり、
前記薬剤はＥＧＦＲ阻害剤であり、
前記正常なマーカー遺伝子は正常ＥＧＦＲ遺伝子である
ことを特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法において、
前記耐性変異は、ＥＧＦＲ遺伝子におけるＴ７９０Ｍである
ことを特徴とする、方法。
【請求項４】
請求項２記載の方法において、
前記活性化変異は、ＥＧＦＲ遺伝子におけるΔＥ７４６−Ａ７５０、Ｌ８５８Ｒ、Ｇ７１９Ｃ、Ｇ７１９Ｓ、及びＧ７１９Ａから選択される１若しくはそれ以上の変異である
ことを特徴とする、方法。
【請求項５】
請求項２記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ阻害剤は、ゲフィチニブ又はエルロチニブである
ことを特徴とする、方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、
前記被験者は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者であり、
前記薬剤はイマチニブである
ことを特徴とする、方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法において、
前記耐性変異は、Ｔ３１５Ｉである
ことを特徴とする、方法。
【請求項８】
請求項６記載の方法において、
前記活性化変異は、ｂｃｒ−ａｂｌである
ことを特徴とする、方法。
【請求項９】
請求項１記載の方法において、
前記被験者は肺癌または肺腺癌患者であり、
前記薬剤はＡＬＫ阻害剤である
ことを特徴とする、方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法において、
前記耐性変異は、Ｌ１１９５Ｍ又はＣ１１５６Ｙである
ことを特徴とする、方法。
【請求項１１】
請求項９記載の方法において、
前記活性化変異は、ＥＭＬ４−ＡＬＫである
ことを特徴とする、方法。
【請求項１２】
請求項９記載の方法において、
前記ＡＬＫ阻害剤は、ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂである
ことを特徴とする、方法。
【請求項１３】
請求項１記載の方法において、
前記（１）及び（２）の工程は、エマルジョンＰＣＲを用いて行われるものである
ことを特徴とする、方法。
【請求項１４】
請求項１記載の方法に使用されるキットであって、
前記活性化変異を検出するために用いられるプライマーセットと、
前記耐性変異を検出するために用いられるプライマーセットと
を有することを特徴とする、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性新生物を治療するための薬剤が投与されている被験者において、当該悪性新生物の病勢の進行を評価する方法、並びにこの評価方法に利用するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、癌や脳腫瘍、および白血病やリンパ腫等の造血細胞悪性腫瘍等の悪性新生物（悪性腫瘍）を病因とする疾患に対しては、その腫瘍が存在する部位や進行度等の病状に応じて、外科療法・化学療法・放射線療法等の治療法が施されている。【０００３】
この複数の治療法において、外科療法と放射線療法は局所的な治療に有効であり、一方で、例えば癌の化学療法は、抗癌剤を静脈注射または経口投与することにより血液中に投薬し、全身に存在する癌細胞の分裂を抑え、且つ破壊することができるため、全身のどこに癌細胞があっても治療効果が期待でき、全身的な治療に効果がある。【０００４】
また、化学療法においては、特定の癌や白血病に対する治療薬が数多く開発されているため、外科療法や放射線療法と組み合わせることにより、全身転移した病巣や進行癌等の治療に利用されている。【０００５】
ところで、この化学療法による治療において、特定の癌や白血病に対する治療薬は、治療初期においては非常に有効であるが、継続して治療を続けることにより悪性新生物が当該治療薬に対して耐性（抵抗性）を備えてしまい、それ以上の治療効果を望めなくなることがある。例えば、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ＥＧＦＲ  ＴＫＩｓ）であるゲフィチニブ（イレッサ）は、一部の非小細胞肺癌患者に対しては７０〜８０％と高い奏功率で抗腫瘍効果を示すことが知られている（非特許文献１）。しかし、ゲフィチニブは最終的には投与した全ての患者において耐性を生じてしまい、その多くは投与開始後約１年以内に現れ、耐性獲得後は再び腫瘍が増大する（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｒｉｅｌｙ，Ｇ．Ｊ．，Ｐｏｌｉｔｉ，Ｋ．Ａ．，ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｖ．Ａ．，ｅｔａｌ．（２００６）．Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１２，７２３２−７２４１．
【非特許文献２】Ｓｅｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｖ．，Ｂｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．，Ｌｙｎｃｈ，Ｔ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ，Ｄ．Ａ．（２００７）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５，５８７−５９５．
【０００７】
こうした治療薬に対する耐性獲得は、現在においては、患者の生体組織や臓器の一部を採取してバイオプシーによる検査を行うことにより確認しているが、バイオプシー検査は侵襲性であり、患者の身体への負担が大きいため好ましくはない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、投薬治療を受けている患者における悪性新生物の特定薬剤に対する耐性の有無を非侵襲的に観測することにより、当該患者における悪性新生物の進行度を定量的に評価する方法を提供することを目的とする。【０００９】
本発明はまた、上記評価方法において利用可能なキットを提供することを目的とする。  
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、非小細胞肺癌の一部の症例において、薬剤耐性の原因となる耐性変異が抗癌剤投与前に微量に存在しているという知見を得、病期が進んだ患者群においてその検出頻度が高いことから原発巣において微量に存在している可能性を得た。また、本発明者らは、薬剤投与直前の生体組織検査から耐性変異が検出された症例ではその奏功期間が有意に減少したという報告から、原発巣に存在する微量の耐性変異が薬剤の耐性予測因子となる可能性に着目した。【００１１】
そして、本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、高感度微少変異検出法であるＢＥＡＭｉｎｇを用いて、原発巣における耐性変異を検出し、薬剤の奏功期間との関係を明らかにすることを通して、患者における悪性新生物の進行度を定量的に評価することができることを見出した。【００１２】
具体的には、本発明の第一の主要な観点によれば、悪性新生物を治療するための薬剤が投与されている被験者において、当該悪性新生物の病勢の進行を評価する方法であって、（１）前記被験者由来の血中ＤＮＡにおいて、正常なマーカー遺伝子を有するＤＮＡ分子に対する前記薬剤の活性化マーカーとなる活性化変異を有するＤＮＡ分子の割合を決定する工程と、（２）前記被験者由来の血中ＤＮＡにおいて、正常なマーカー遺伝子を有するＤＮＡ分子に対する前記薬剤の耐性マーカーとなる耐性変異を有するＤＮＡ分子の割合を決定する工程と、（３）前記（２）の工程で得た値と、前記（１）の工程で得た値とを比較する工程と、を有することを特徴とする、方法が提供される。【００１３】
このような構成によれば、活性化変異の割合と耐性変異の割合とを比較するだけで、被験者が有する悪性新生物がその投与された薬剤での治療に対して耐性を得ているか否かを評価することができるため、被験者に特別な負荷を与えることなく、採血するだけで、当該被験者が有する悪性新生物の病勢の進行を評価することが可能となる。また、このような構成によれば、非侵襲的且つ簡便に被験者が有する悪性新生物の病勢の進行を評価することができ、これを通して、被験者に適した治療法を選択するための材料として資することができる。【００１４】
また本発明に係る方法は、患者個々人の健康又は病状を管理する上で、客観的かつ簡便な情報提供をするための方法として利用できる。【００１５】
また、本発明の一実施形態によれば、このような方法において、前記被験者は非小細胞肺癌患者であり、前記薬剤はＥＧＦＲ阻害剤であり、前記正常なマーカー遺伝子は正常ＥＧＦＲ遺伝子である。【００１６】
この場合、前記耐性変異は、ＥＧＦＲ遺伝子におけるＴ７９０Ｍであることが好ましい。また、かかる場合の前記活性化変異は、ＥＧＦＲ遺伝子におけるΔＥ７４６−Ａ７５０、Ｌ８５８Ｒ、Ｇ７１９Ｃ、Ｇ７１９Ｓ、及びＧ７１９Ａから選択される１若しくはそれ以上の変異であることが好ましい。【００１７】
本発明の一実施形態において、前記ＥＧＦＲ阻害剤は、ゲフィチニブ又はエルロチニブであることが好ましい。【００１８】
また、本発明の他の一実施形態によれば、上述の本発明の第一の主要な観点のような方法において、前記被験者は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者であり、前記薬剤はイマチニブである。【００１９】
この場合、前記耐性変異は、Ｔ３１５Ｉであることが好ましい。また、かかる場合の前記活性化変異は、ｂｃｒ−ａｂｌであることが好ましい。【００２０】
さらに、本発明の別の一実施形態によれば、上述の本発明の第一の主要な観点のような方法において、前記被験者は肺癌または肺腺癌患者であり、前記薬剤はＡＬＫ阻害剤である。【００２１】
この場合、前記耐性変異は、Ｌ１１９５Ｍ又はＣ１１５６Ｙであることが好ましい。また、かかる場合の前記活性化変異は、ＥＭＬ４−ＡＬＫであることが好ましい。【００２２】
本発明の一実施形態において、前記ＡＬＫ阻害剤は、ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂであることが好ましい。【００２３】
また、本発明のさらに他の一実施形態によれば、上述の本発明の第一の主要な観点のような方法において、前記（１）及び（２）の工程は、エマルジョンＰＣＲを用いて行われるものである。【００２４】
また、本発明の第二の主要な観点によれば、上述の本発明の第一の主要な観点のような方法に使用されるキットであって、前記活性化変異を検出するために用いられるプライマーセットと、前記耐性変異を検出するために用いられるプライマーセットとを有することを特徴とする、キットが提供される。【００２５】
なお、上記した以外の本発明の特徴及び顕著な作用・効果は、次の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係るＢＥＡＭｉｎｇの概要を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の一実施形態に係る蛍光分析による配列ディファレンシエイションの概要を示す模式図である。
【図３】図３は、本発明の一実施形態において、フローサイトメトリーによる分析結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の一実施形態において、一塩基伸長法を用いたＢＥＡＭｉｎｇによって生成されたビーズの定量化を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の一実施形態において、融解温度の測定を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の一実施形態において、ＢＥＡＭｉｎｇによる定量化を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の一実施形態において、ＢＥＡＭｉｎｇによって定量化された変異断片の分画を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の一実施形態において、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の一実施形態に係る、悪性新生物の病勢の進行の評価を示す表である。
【図１０】図１０は、本発明の一実施形態に係る、ＢＥＡＭｉｎｇを用いた場合のプライマーセットを示す表である。
【図１１】図１１は、本発明の一実施形態に係る、悪性新生物の病勢の進行の評価を示す表である。
【図１２】図１２は、本発明の一実施形態に係る、次世代シーケンサーを用いた場合のプライマーセットを示す表である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下に、本願発明に係る一実施形態および実施例を、図面を参照して説明する。  
本実施形態に係る悪性新生物を治療するための薬剤が投与されている被験者において、当該悪性新生物の病勢の進行を評価する方法は、上述したように、（１）前記被験者由来の血中ＤＮＡにおいて、正常なマーカー遺伝子を有するＤＮＡ分子に対する前記薬剤の活性化マーカーとなる活性化変異を有するＤＮＡ分子の割合を決定する工程と、（２）前記被験者由来の血中ＤＮＡにおいて、正常なマーカー遺伝子を有するＤＮＡ分子に対する前記薬剤の耐性マーカーとなる耐性変異を有するＤＮＡ分子の割合を決定する工程と、（３）前記（２）の工程で得た値と、前記（１）の工程で得た値とを比較することによって、前記被験者における悪性新生物が前記薬剤での治療に対して耐性を得ているか否かを評価する工程と、を有することを特徴とするものである。【００２８】
ここで、本発明の一実施形態において、「悪性新生物」又は「悪性腫瘍」とは、他組織に浸潤したり転移することにより、全身において増大可能な腫瘍等を指す。一般には、癌や白血病等のことを意味するものであるが、上皮内新生物、異形成上皮、腺腫、肉腫、悪性リンパ腫、骨肉腫、筋肉腫等、細胞が異常増殖するものであればこれらに限定されない。【００２９】
また、「悪性新生物の病勢の進行」の評価とは、各種疾患に応じて基準や程度は異なるものであるが、例えば、癌であれば、癌の大きさ、周辺リンパ節への転移、遠隔臓器への転移等の基準によってステージ分類されること等を指す。また、各種疾患において、病勢の進行を評価する基準は１種類に限定されるものではなく、本願発明においては、「悪性新生物の病勢の進行」の評価を１の進行度基準を用いて表すこともでき、又は複数の進行度基準を組み合わせて病勢の進行度を評価しても良い。また、本発明の一実施形態においては、「悪性新生物の病勢の進行」の評価として、特定の薬剤の投与可否、特定の治療の実施の可否等の判断をすることも含まれる。【００３０】
また、本発明の一実施形態において、「被験者由来の血中ＤＮＡ」とは、血中に浮遊しているＤＮＡを指し、本発明に係る「血中ＤＮＡ」には、血中浮遊腫瘍ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ：ＣｔＤＮＡ）も含まれる。なお、一般的に、血中に存在するＤＮＡのうち、血中浮遊腫瘍ＤＮＡは、正常細胞ＤＮＡに比べて非常に微量でしか存在しないことが知られている。【００３１】
また、本発明の一実施形態において、「マーカー遺伝子」とは分子標的薬の標的遺伝子を指し、詳細には、特定の疾患においてその原因遺伝子およびその原因遺伝子に作用する標的遺伝子が判明している場合、分子標的薬の標的となる原因遺伝子を指す。また、本発明の一実施形態において、「正常なマーカー遺伝子」とは、特定の疾患における原因遺伝子が、ある１種類の遺伝子の突然変異によるものである場合、正常な細胞が有する当該遺伝子（正常な遺伝子）を指す。また、特定の疾患における原因遺伝子が、１又は複数の遺伝子に突然変異が生じることにより、正常細胞では存在しない異常タンパク質が生じる等の１又は複数のタンパク質に異常が生じる場合であるときには、当該突然変異が生じた１又は複数の遺伝子に対応する、正常な細胞が有する１又は複数の遺伝子（正常な遺伝子群）を指す。【００３２】
また、本発明の一実施形態において、「薬剤の活性化マーカーとなる活性化変異」とは、分子標的薬が作用する標的遺伝子又は標的タンパク質に存在する疾患の原因となる変異、あるいは正常細胞では存在しない異常タンパク質そのものを指す。また、本発明の一実施形態において、「薬剤の耐性マーカーとなる耐性変異」とは、特定の疾患において薬剤耐性の原因となる突然変異を指す。【００３３】
また、本発明に係る方法では、患者が有する疾患関連遺伝子のうち、ある特定の薬剤への活性化変異と耐性変異とを定量的に分析することによって、当該患者の病勢の進行度を評価することが可能となる。【００３４】
（非小細胞肺癌）
例えば、以下においては非小細胞肺癌患者を例として説明する。非小細胞肺癌は肺癌の一種であり、上皮成長因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲ）が関与していることが明らかになっている。ＥＧＦＲとは、分子量約１７万の膜貫通型糖タンパクであり、癌の増殖、維持に関与していることが明らかとなっており、非小細胞肺癌をはじめとして様々な癌でその発現が確認されている。ＥＧＦＲは非活性化状態では一量体として存在するが、ＥＧＦなどの増殖因子が受容体に結合すると二量体を形成し、細胞内領域にあるチロシンキナーゼ部位においてＡＴＰを利用することで受容体細胞内領域のチロシン残基をリン酸化させる。その結果、シグナル伝達経路の下流に位置するタンパク質のチロシンリン酸化を連鎖的に引き起こし、増殖シグナルが核まで伝達することで細胞周期をＧ１期からＳ期へと進行させ細胞の増殖をもたらす。さらにＥＧＦＲチロシンキナーゼの活性化は、細胞内のＴＧＦ−α、ｂＦＧＦなどの増殖因子の産生を亢進させ、自己分泌あるいは傍分泌経路により細胞の増殖を刺激するとともに、血管内皮細胞成長因子ＶＥＧＦの産生を亢進して癌の血管新生を促進する。これら一連の変化により癌の悪性度が増し病勢の進行がもたらされると考えられている。【００３５】
本発明に係る方法において、悪性新生物の病勢の進行を評価可能な被験者として非小細胞肺癌患者が挙げられる。この場合、治療のために投与される薬剤はＥＧＦＲ阻害剤であり、ゲフィチニブ又はエルロチニブ等が挙げられるが、本発明に係る方法において好ましくはゲフィチニブ及びエルロチニブである。【００３６】
このゲフィチニブはｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅを基本骨格としておりＡＴＰのアデニンとの構造上の類似性から、ＥＧＦＲの細胞内チロシンキナーゼ部位のＡＴＰ結合部位に可逆的に結合することでＡＴＰの結合を阻害し、活性化を抑制するというメカニズムを持つ。【００３７】
一部の非小細胞肺癌患者において、このゲフィチニブが抗腫瘍効果を示すことが知られており、その患者の大半はＥＧＦＲチロシンキナーゼ部位に対応する遺伝子に変異を有していることが明らかになっている。これらの変異はＥＧＦＲを恒常的に活性化状態に保つ一方でゲフィチニブが容易に結合する構造へと変化させるためその効果が表れると考えられている（活性化変異）。この活性化変異の例としては、正常ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９位の欠失変異（ΔＥ７４６−Ａ７５０、ΔＥ７４６−Ｔ７５１、ΔＥ７４６−Ａ７５０（ｉｎｓ  ＲＰ）、ΔＥ７４６−Ｔ７５１（ｉｎｓ  Ａ／Ｉ）、ΔＥ７４６−Ｔ７５１（ｉｎｓ  ＶＡ）、ΔＥ７４６−Ｓ７５２（ｉｎｓ  Ａ／Ｖ）、ΔＬ７４７−Ｅ７４９（Ａ７５０Ｐ）、ΔＬ７４７−Ａ７５０（ｉｎｓ  Ｐ）、ΔＬ７４７−Ｔ７５１、ΔＬ７４７−Ｔ７５１（ｉｎｓ  Ｐ／Ｓ）、ΔＬ７４７−Ｓ７５２（）、ΔＬ７４７−７５２（Ｅ７４６Ｖ）、ΔＬ７４７−７５２（Ｅ７５３Ｓ）、ΔＬ７４７−Ｓ７５２（ｉｎｓ  Ｑ）、ΔＬ７４７−Ｐ７５３、ΔＬ７４７−Ｐ７５３（ｉｎｓ  Ｓ）、ΔＳ７５２−Ｉ７５９等）、Ｌ８５８Ｒ点変異、Ｇ７１９Ｃ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ａ、Ｖ６８９Ｍ、Ｎ７００Ｄ、Ｅ７０９Ｋ／Ｑ、Ｓ７２０Ｐ、Ｖ７６５Ａ、Ｔ７８３Ａ、Ｎ８２６Ｓ、Ａ８３９Ｔ、Ｋ８４６Ｒ、Ｌ８６１Ｑ、Ｇ８６３Ｄなどが挙げられるが、ＥＧＦＲを恒常的に活性化状態に保つことができる変異であればそのすべてが含まれる。本発明の一実施形態においては、非小細胞肺癌の正常なマーカー遺伝子としてＥＧＦＲ遺伝子を利用している。【００３８】
また、ゲフィチニブは、投与した患者において耐性を生じることも知られている。その多くは投与開始後約１年以内に現れ、耐性獲得後は再び腫瘍が増大する。その原因は、約半数において、ＥＧＦＲ遺伝子の７９０番目のアミノ酸であるｔｈｒｅｏｎｉｎｅがｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅへと置換されていることによる（耐性変異、Ｔ７９０Ｍ点変異）。結晶構造解析によると、このアミノ酸変化でより分子量の大きいｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅに置換されることで立体障害が起こりゲフィチニブのＥＧＦＲチロシンキナーゼに対する親和性を低下させている可能性が示されている。また、本発明の一実施形態において、このような耐性変異としては、Ｔ７９０Ｍ以外に、Ｄ７６１Ｙ、Ｄ７７０＿Ｎ７７１（ｉｎｓ  ＮＰＧ）、Ｄ７７０＿Ｎ７７１（ｉｎｓ  ＳＶＱ）、Ｄ７７０＿Ｎ７７１（ｉｎｓ  Ｇ）、Ｎ７７１Ｔ、Ｖ７６９Ｌ、Ｓ７６８Ｉ等が挙げられるが、ゲフィチニブへの耐性獲得への原因となる変異であればそのすべてが含まれる。【００３９】
本発明の一実施形態においては、非小細胞肺癌患者における、上記のようなＥＧＦＲ遺伝子の活性化変異と耐性変異との関係を利用することにより、病勢の進行度を評価している。【００４０】
また、本発明の一実施形態において、正常なマーカー遺伝子に対する活性化変異又は耐性変異の割合の測定は、ＢＥＡＭｉｎｇ法などの定量性のある手法によって行われる。ここで、ＢＥＡＭｉｎｇとはオイルエマルジョン中でＰＣＲ反応を行い１個のナノ粒子に１分子由来のＰＣＲ産物を固定した後、当該部位の正常及び変異塩基を異なった蛍光色素で標識・検出する方法である。また、このＢＥＡＭｉｎｇや次世代シーケンサーにおいてはエマルジョンＰＣＲを用いて１分子毎のＤＮＡの増幅を行うこととしているが、本発明に係る方法においては、１分子毎のＤＮＡを定量的に測定できるものであれば任意の定量的解析を用いることができる。例えば、ＤＮＡチップ、マイクロアレイ法、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロット法、ドットブロット法、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法等の種々の分子生物学的手法を用いることもできる。なお、ＢＥＡＭｉｎｇにおいては、エマルジョンＰＣＲを用いて１分子毎のＤＮＡの増幅を行った後にフローサイトメトリーを用いることによって各分子を回収している。また、次世代シーケンサーとしては、ＤＮＡ１分子を鋳型としてＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ合成を行い、１塩基ごとの反応を蛍光・発光等で検出することにより、リアルタイムで塩基配列を決定するものであれば、いかなる種類の次世代シーケンサーであってもよく、次世代シーケンサーにおいて行われる塩基認識方法やリード長、試薬等は任意のものでも良い。【００４１】
また、本発明の一実施形態において、病勢の進行度の評価としては、上述したように、多様な進行度基準を用いて表すこともでき、また特定の薬剤の投与可否、特定の治療の実施の可否等の判断をすることもできるが、これらの評価は、例えば、正常なマーカー遺伝子を有するＤＮＡ分子に対する耐性変異を有するＤＮＡ分子の割合（値）を、正常なマーカー遺伝子を有するＤＮＡ分子に対する活性化変異を有するＤＮＡ分子の割合（値）で除算することによって行われることができる。その他、このような評価は、病勢の進行を反映し得るものであれば、任意の比較法を採用することができる。【００４２】
なお、このような病勢の進行の評価は、患者における正常なマーカー遺伝子を有するＤＮＡ分子に対する耐性変異または活性化変異を有するＤＮＡ分子の割合についての蓄積サンプル数が多ければ多いほど好ましく、本発明に係る評価方法の精度も高くなる。また、本願発明においては、このような蓄積サンプルに係るデータを、任意のデータベースに格納できる構成を取り得る。すなわち、本願発明は、このようなデータを格納するデータベースと、当該データ及び比較解析に必要なプログラム等を読み出して実行する解析装置をも提供することができる。このような解析装置によれば、対象となる被験者毎に、正常なマーカー遺伝子を有するＤＮＡ分子に対する耐性変異または活性化変異を有するＤＮＡ分子の割合に関するデータを蓄積し、必要に応じて蓄積データを取り出し、比較することにより、被験者の病勢の進行をいつでも簡便に評価することができる。【００４３】
（その他の疾患）
上述の通り、本発明の一実施形態において、非小細胞肺癌患者が有するＥＧＦＲにおけるゲフィチニブへの活性化変異と耐性変異とを定量的に分析することによって、当該患者の病勢の進行度を評価することが可能となる。また、本発明に係る方法の対象となる疾患は非小細胞肺癌に限られるものではなく、慢性骨髄性白血病／イマチニブ、肺癌（肺腺癌）／ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ等のように、特定の疾患に作用する薬剤が知られており、その疾患の原因遺伝子（又は活性化変異）と耐性変異が存在する任意の疾患において適用可能である。【００４４】
例えば、慢性骨髄性白血病（Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＣＭＬ）は、骨髄における造血幹細胞の異常分裂を引き起こす慢性白血病の一種であり、骨髄の造血幹細胞で第９染色体（ＡＢＬ遺伝子）と第２２染色体（ＢＣＲ遺伝子）の相互転座が起こり、それによって生じたキメラ遺伝子（ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子）がＢｃｒ−Ａｂｌタンパク質を産生することで発症する（活性化変異）。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質は、そのチロシンキナーゼ活性により細胞増殖シグナルを亢進させ、白血球細胞を無秩序に増殖させる。【００４５】
この慢性骨髄性白血病の化学療法剤として、多くの患者において、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質に作用するイマチニブ（グリベック）が利用されているが、一部の患者においてはイマチニブ耐性を示すことが知られている。この一部は、イマチニブが結合するＢｃｒ−Ａｂｌタンパク質が遺伝子変異により形を変えており、結合できなくなっていることが明らかとなっている（耐性変異）。この耐性変異としては、Ｔ３１５Ｉが挙げられるが、これに限定されるものではなく、イマチニブへの耐性獲得への原因となる変異であればそのすべてが含まれる。【００４６】
また、肺癌、特に肺腺癌（Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）は、肺腺細胞（気管支の線毛円柱上皮、肺胞上皮、気管支の外分泌腺など）から発生する癌であり、一部の肺癌（肺腺癌）患者においては、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子とが融合した異常タンパク質によって誘発される。具体的には、ヒト２番染色体上に存在するＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子とについて、両遺伝子を挟む領域が逆位を形成することによりＥＭＬ４遺伝子の５’側がＡＬＫ遺伝子の酵素活性領域をコードする部分と融合した遺伝子が形成されることによる。この結果産生されるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合型チロシンキナーゼがＥＭＬ４内の二量体化領域を利用して恒常的に二量体化され、キナーゼ活性が上昇して癌を誘導することが明らかになっている（活性化変異）。【００４７】
そして、このような肺癌（肺腺癌）患者に対する化学療法剤として、ＡＬＫ特異的阻害剤であるｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂが利用されているが、一部の患者においてはｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ耐性を示すことが知られている。この多くは、ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂが作用するＥＭＬ４−ＡＬＫタンパク質が遺伝子変異により形を変えており、作用できなくなっていることが明らかとなっている（耐性変異）。この耐性変異としては、Ｌ１１９５ＭやＣ１１５６Ｙ等が挙げられるが、これに限定されるものではなく、ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂへの耐性獲得への原因となる変異であればそのすべてが含まれる。【００４８】
（キット）
本発明の一実施形態では、悪性新生物を治療するための薬剤が投与されている被験者において、当該悪性新生物の病勢の進行を評価する方法に使用されるキットであって、前記活性化変異を検出するために用いられるプライマーセットと、前記耐性変異を検出するために用いられるプライマーセットとを有することを特徴とする、キットが提供される。【００４９】
ここで、本発明の一実施形態において、前記活性化変異または耐性変異を検出するために用いられるプライマーセットとは、任意のＰＣＲを用いることによって目的のＤＮＡ分子又は遺伝子を増幅可能なフォワード及びリバースのプライマーセットものであれば特に制限されない。また、本発明係るキットに用いられるプライマーとしては、目的遺伝子を特異的に検出することができるものであれば特に制限されるものではないが、１２〜２６塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。その塩基配列は、ヒトの各遺伝子の配列情報に基づいて決定する。そして、決定した配列を有するプライマーを、例えば、ＤＮＡ合成機を用いて作製することができる。また、後述するように、本発明の一実施形態においては、エマルジョンＰＣＲを用いているが対象となるＰＣＲはこれに限られない。また、プライマーの長さ、配列等については当業者が適宜設計可能である。さらに、本発明の一実施形態において、「プライマーセット」とは、選択されるＰＣＲに応じて、必要な場合には、変異部位検出のためのプローブを含んでも良い。
【実施例】
【００５０】
以下に、実施例を用いて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実験手法および材料）
以下に、本発明において用いる実験手法および材料について説明する。なお、本実施形態において、以下の実験手法を用いているが、これら以外の実験手法を用いても、同様の結果を得ることができる。【００５１】
１．ゲノムＤＮＡの単離および定量
１−１．健常提供者及び肺癌患者の血漿からのＤＮＡの抽出および精製
まず、４〜５ｍｌの血液（スピッツ２本、ＥＤＴＡ入り）を、１５ｍｌの遠沈管に入れ、大型遠心機ＬＸ−１２０で８００Ｇ×１０分遠心した。遠心すると、血液が３層（血漿、白血球、赤血球）に分離するため、白血球を吸い込まないように血漿を２ｍｌのエッペンチューブに回収した。次に、残った細胞成分を取り除くため、１６０００Ｇ×１０分遠心した。そして、遠心後の上澄みを血漿サンプルとして回収した（１．２ｍｌ）。続いて、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｇｅｎｆｉｎｄ  Ｖ２を用いて血漿４００ｕｌに対して精製を行った。まず、Ｌｙｓｉｓバッファー液８００μｌにＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ１８μｌと血漿４００μｌとを加え、混合した。そしてこの混合液を３７℃で１０分間インキュベートした。次に、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを６００μｌ加え、十分にピペッティングし、その後、室温で５分間インキュベートした。そして、この溶液をマグネットにセットし、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  １で２回、及びＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２で２回洗浄した。Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒを十分に取り除き、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを２０μｌ加え、ＤＮＡを溶出した。【００５２】
１−２．肺腫瘍サンプルからのＤＮＡの抽出および精製
大阪府立成人病センター研究所に提供された肺癌組織検体を用いた。なお、これらの症例は以前の研究により、ダイレクトシークエンスあるいはＳＮａＰｓｈｏｔ反応を用いて、ＥＧＦＲの代表的な変異（欠失変異、点変異（Ｌ８５８Ｒ、Ｇ７１９Ａ、Ｌ８６１Ｑ、Ｔ７９０Ｍ））を確認している。この肺癌サンプルからゲノムＤＮＡの抽出を行った。まずＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，０．２％ＳＤＳ）１ｍＬ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（２０ｍｇ／ｍＬ，Ｒｏｃｈｅ）１０μＬの溶液に入れられた凍結検体をＭｉｘｅｒ  Ｍｉｌｌ  ＭＭ  ３００（ＱＩＡＧＥＮ）で破砕し、さらにＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２ｍＬ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  ２０μＬを加え、５５℃で３時間撹拌した。次にＰｈｅｎｏｌ：Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ：Ｉｓｏａｍｙｌ  Ａｌｃｏｈｏｌ  ２５：２４：１（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）を３ｍＬ加え、１時間室温で攪拌した後、２，５００ｒｐｍで２０分間遠心した。遠心後上層をとり、９９．５％エタノール（Ｗａｋｏ）７．５ｍＬ，１０ｍｇ／ｍＬ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５μＬを加えて混合し、−２０℃で一晩静置した後、３，５００ｒｐｍで３０分間遠心を行った。遠心後、上清を除いてペレットをＤ．Ｗ．３００μＬで溶出し、Ｐｈｅｎｏｌ：Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ：Ｉｓｏａｍｙｌ  Ａｌｃｏｈｏｌ  ２５：２４：１（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）を等量加えて混合した後、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心を行った。遠心後、上層をとり、Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍを等量加えて混合し、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心を行った。遠心後、上層をとり９９．５％エタノール（Ｗａｋｏ）を２．５当量、３Ｍ  ＮａＯＡｃを１／１０当量加えて混合し、１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心を行った。遠心後、上清を除き７５％エタノールでペレットを洗浄後、上清を除き、１０分間室温で乾燥させた。得られたペレットに１０〜５０μＬのＤ．Ｗ．を加え、Ｏ．Ｄ．（２６０ｎｍ）に基づいてＤＮＡの濃度を測定した。【００５３】
２．定量的分析のためのサンプル調製
ＢＥＡＭｉｎｇの定量性を確認するため、Ｔ７９０Ｍ  ｍｕｔａｎｔ−ｔｙｐｅであった肺癌サンプルを用いて、様々な割合でｍｕｔａｎｔ−ｔｙｐｅを含むテンプレートを作製した。まず凍結検体からＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＡＧＰＣ法（３２）によりｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。このＲＮＡからＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成し、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＰＣＲ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるクローニングを行った。その後シークエンスで各配列を確認することで、１００％ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ、１００％ｍｕｔａｎｔ−ｔｙｐｅのｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡを作製した。このＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、濃度を調整後種々の割合でサンプルを混合することでｍｕｔａｎｔ−ｔｙｐｅ  １００％、１０％、１％、０．１％、０．０１％、０％のｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡを作製した。【００５４】
３．ＢＥＡＭｉｎｇによる変異分析
３−１．標的領域の増幅
ゲノムＤＮＡから目的ａｌｌｅｌｅ部位を含む約１００ｂｐをＰＣＲによって増幅した（図１Ａ）。ＰＣＲに用いるプライマーは遺伝子特異的な配列に加えてその５’側にＢＥＡＭｉｎｇ共通に用いられるＴａｇ（Ｔａｇ  １，５’−ｔｃｃｃｇｃｇａａａｔｔａａｔａｃｇａｃ−３’（配列ＩＤ番号：１）、Ｔａｇ  ２，５’−ｇｃｔｇｇａｇｃｔｃ−ｔｇｃａｇｃｔａ−３’（配列ＩＤ番号：２））を付けた配列で設計した（ｐｒｉｍｅｒ  １；５’−ｔｃｃｃｇｃｇａａａｔｔａａｔａｃｇａｃｇｃａｔ−ｃｔｇｃｃｔｃａｃｃｔｃｃａｃ−３’（配列ＩＤ番号：３），ｐｒｉｍｅｒ  ２；５’−ｇｃｔｇｇａｇｃｔｃｔｇｃａｇｃｔａｔｇｃｃｔｃｃｔｔｃｔｇｃａｔｇｇｔａｔ−３’（配列ＩＤ番号：４））。
まず、抽出したゲノムＤＮＡ  １．５μｇ（血漿の場合血漿３００μＬ分）に、１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ）５μＬ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ（ＴＯＹＯＢＯ）５μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４（ＴＯＹＯＢＯ）２μＬ、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ）１μＬ、１０ｐｍｏｌ／μＬ  ｐｒｉｍｅｒ  １，２ｍｉｘ  ２μＬを加え、全量が５０μＬになるようＤ．Ｗ．で調整した。Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて９４℃２分で変性させた後、９４℃１５秒、６２℃１０秒、６８℃１５秒を３０サイクル、７２℃５分のＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＵＩＡＧＥＮ）を用いて精製し、Ｏ．Ｄ．（２６０ｎｍ）に基づいて濃度を測定した。【００５５】
３−２．プライマーの磁性ビーズへの結合
ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎでコートされたビーズにエマルジョンＰＣＲ時にプライマーとなるｄｕａｌ  ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｂｅを結合させた（図１Ｂ）。このオリゴヌクレオチドにはその５’末端にＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）１８  ｓｐａｃｅｒとｔｈｙｍｉｄｉｎｅ塩基を挟んで二重にｂｉｏｔｉｎを修飾した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ｂｉｏｔｉｎとａｖｉｄｉｎの親和力は非常に強く、不可逆的な結合を形成するためビーズ表面上で数多くのプライマーを強固に結合させることが可能である。【００５６】
まずＭｙＯｎｅ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｃｏａｔｅｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄｓ（１０ｍｇ／ｍＬ；７−１２×１０９ｂｅａｄｓ／ｍＬ，ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１００μＬを１．５ｍＬエッペンチューブに入れた後、マグネット（ＤｙｎａＭａｇ，ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に固定させ上清を取り除いた。その後、１００μＬのＴＫ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４），５０ｍＭ  ＫＣｌ）を加えて軽くタッピングを行い、再びマグネットに固定させて上清を取り除くことでｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄｓのｗａｓｈを行った。この操作を再度繰り返した後、１００μＬのＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ７．５），０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１Ｍ  ＮａＣｌ）１００μＬに懸濁させ、１００ｐｍｏｌ／μＬ  ｄｕａｌ  ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｂｅ（５’−ｔｃｃｃｇｃｇａａａｔｔａａｔａｃｇａｃ−３’）（配列ＩＤ番号：５）１０μＬを加えｖｏｒｔｅｘ  ｍｉｘｔｕｒｅで攪拌した後、室温で３０分静置した。この間１０分ごとにｖｏｒｔｅｘ  ｍｉｘｔｕｒｅで攪拌した。次に、再び１００ｐｍｏｌ／μＬ  ｄｕａｌ  ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｂｅを１０μＬ加え攪拌後１０分間静置し１００μＬのＴＫ  ｂｕｆｆｅｒで３回ｗａｓｈした後、１００μＬのＴＫ  ｂｕｆｆｅｒに懸濁させた。【００５７】
３−３．ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ−ｏｉｌの調整
ＷＥ０９（Ｄｅｇｕｓｓａ）４２０μＬ、ｍｉｎｅｒａｌ  ｏｉｌ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）１，２００μＬ、ＤＥＣ（Ｄｅｇｕｓｓａ）４，３８０μＬをｖｏｒｔｅｘ  ｍｉｘｔｕｒｅで攪拌した後、室温で３０分間静置した。【００５８】
３−４．エマルジョンＰＣＲ
ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ−ｏｉｌとＰＣＲ溶液で乳化した溶液中で、その水滴中に２−３−１で調整したＰＣＲ増幅産物一つ、２−３−２で調整したビーズ一個入るよう溶液を調整し、ビーズに結合させたＤＮＡタグをプライマーとしてＰＣＲを行った（図１Ｃ．Ｄ）。【００５９】
精製したｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ（１０ｐｇ／μＬ）１．５μＬ、Ｄ．Ｗ．９３．２５μＬ、１０×ＫＯＤ  ｂｕｆｆｅｒ  １５μＬ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  １５μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ６μＬ、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−９μＬ、１０ｐｍｏｌ／μＬ  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（５’−ｔｃｃｃｇｃｇａａａｔｔａａｔａｃｇａｃ−３’）（配列ＩＤ番号：６）０．２５μＬ、１００ｐｍｏｌ／μＬ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（５’−ｇｃｔｇｇａｇｃｔｃｔ−ｇｃａｇｃｔａ−３’）（配列ＩＤ番号：７）４μＬを混合し、さらに調整したｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄｓを十分に攪拌した後６μＬ加え、全量１５０μＬのＰＣＲ溶液を調整した。次に２ｍＬエッペンチューブに５ｍｍのジルコニアビーズ、ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ−ｏｉｌ６００μＬ、エマルジョンＰＣＲ溶液１５０μＬを加えＭｉｘｅｒ  Ｍｉｌｌ  ＭＭ  ３００（ＱＩＡＧＥＮ）で１５Ｈｚ、１７ｓの条件で攪拌した。調整した溶液を９６ｗｅｌｌ  ＰＣＲ  ｐｌａｔｅに５０μＬずつ分注し、表１の条件でＰＣＲ反応を行った。【００６０】
【表１】
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【００６１】
ＰＣＲ反応溶液を２ｍＬエッペンチューブに回収し１５，０００ｇで５分間遠心を行った後、上層を取り除いた。その後、Ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００，１％ＳＤＳ，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）３００μＬ、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１Ｍ  ＮａＣｌ）３００μＬを加え、ｖｏｒｔｅｘ  ｍｉｘｔｕｒｅで攪拌しエマルションを崩壊させた後（図１Ｅ）、再び１５，０００ｇで５分間遠心を行った。マグネットを用いてこの溶液の上層を取り除いた後、１００μＬのＴＫ  ｂｕｆｆｅｒで懸濁させ、１．５ｍＬチューブに移した。次に再びマグネットを用いて上層を取り除いた後、ビーズ上の二本鎖ＤＮＡを一本鎖とするため（図１Ｆ）、０．１Ｍ  ＮａＯＨ  ５００μＬを加えｖｏｒｔｅｘ  ｍｉｘｔｕｒｅで攪拌後２分間室温で静置させ、その後マグネットを用いて上層を取り除き、ビーズに結合していないＤＮＡ鎖を取り除いた。最後に１００μＬのＴＫ  ｂｕｆｆｅｒで２回ｗａｓｈし３０μＬのＤ．Ｗ．に懸濁させた。【００６２】
３−５．蛍光分析による配列ディファレンシエイション
ビーズに結合したＤＮＡ鎖に対して、文献に従い、二種類の配列特異的な蛍光標識法を検討した。【００６３】
３−５−１．一塩基伸長法
ビーズに結合したＤＮＡのａｌｌｅｌｅ部位に対して一塩基伸長法（ｓｉｎｇｌｅ  ｂａｓｅ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ，ＳＢＥ）で異なる蛍光を標識した。ＳＢＥ法とは、対象とするａｌｌｅｌｅ部位に対して一塩基上流までの配列に相補的なプローブをハイブリダイズさせ、その後蛍光標識したｄｄＮＴＰをＤＮＡポリメラーゼによる酵素反応によって取り込ませるという手法である（図２Ａ）。この手法は配列特異性の高い酵素反応を用いるため、ａｌｌｅｌｅ識別能が高くＳＮＰタイピング技術などとして数多く用いられている。【００６４】
まず、２−３−４で調整したビーズ１４μＬに、１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）２μＬ、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）１μＬ、０．１ｍＭ  Ｃｙｅ５−ｌａｂｅｌｅｄ  ｄｄＧＴＰ（ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）０．５μＬ、０．１ｍＭ  ＦＩＴＣ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｄｄＡＴＰ  （ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）０．５μＬ、１０ｐｍｏｌ／μＬ  ＳＢＥ  ｐｒｉｍｅｒ（５’−ａｇｃｃｇａａｇｇｇｃａｔｇａｇｃｔｇｃ−３’）（配列ＩＤ番号：８）２μＬを加えて全量を２０μＬとした。尚ＳＢＥ  ｐｒｉｍｅｒの５’末端にはｂｉｏｔｉｎを修飾した（Ｇｅｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｃ）。これをＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用いて、９４℃２分、６０℃１分、７０℃１０分の反応を行い、１００μＬのＴＫ  ｂｕｆｆｅｒでｗａｓｈ後、反応ビーズにＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ２０μＬ、１ｍｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μＬを加え軽くタッピングし、１０分間室温で静置した。このビーズを１００μＬのＴＫ  ｂｕｆｆｅｒで１回ｗａｓｈし、１００μＬのＴＫ  ｂｕｆｆｅｒに懸濁させた。【００６５】
３−５−２．配列特異的ハイブリダイゼーション
ビーズに結合したＤＮＡのａｌｌｅｌｅ部位に対して配列特異的ハイブリダイゼーション（ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＡＳＨ）で異なる蛍光を標識した。ＡＳＨ法はａｌｌｅｌｅ部位を中央に置いたオリゴヌクレオチドに対してそれぞれ異なった蛍光を５’末端に標識したプローブを作製し、ハイブリダイゼーションによって配列特異的に標的部位にプローブを結合させる手法である（図２Ｂ）。本研究ではｍｕｔａｎｔ−ｔｙｐｅ  ＤＮＡ配列に相補的なプローブ（ｍｕｔａｎｔ−ｔｙｐｅ  ＡＳＨ  ｐｒｏｂｅ；５’−ａｔｇａｇｃｔｇｃａｔｇａｔｇ−ａｇ−３）（配列ＩＤ番号：９）にはＡｌｅｘａ６４７による蛍光修飾を、ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ＤＮＡ配列に相補的なプローブ（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ＡＳＨ  ｐｒｏｂｅ；５’−ｔｇａｇｃｔｇｃｇｔｇａｔｇａｇ−３’）（配列ＩＤ番号：１０）にはＡｌｅｘａ４８８による蛍光修飾を５’末端に行った（Ｇｅｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｃ．）。尚、プローブの塩基数は融解温度（Ｔｍ値）に基づいてそれぞれ１７ｂｐ、１６ｂｐとした。ＡＳＨ法は非酵素反応であるため、反応毎のばらつきが少なくその標識率も高いと考えられるが、ＳＢＥ法に比べａｌｌｅｌｅ識別能が低くミスマッチでのハイブリダイゼーションも数多く反応すると考えられる。そこでプローブのａｌｌｅｌｅ部位に相補鎖認識能を向上させるｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＬＮＡ）を用いることとした。この２種の蛍光プローブに加えて、ｍｕｔａｎｔ−ｔｙｐｅ、ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅの共通配列に相補的なプローブ（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｂｅ；５’−ｃｇｇａｃａｔａｇｔｃｃａｇｇａｇ−３’）（配列ＩＤ番号：１１）を作製し、その５’末端にｂｉｏｔｉｎを修飾した（Ｇｅｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｃ）。【００６６】
まず、３−４で調整したビーズ３０μＬに１．５×ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（４．５Ｍ  ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ，７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，６ｍＭ  ＥＤＴＡ）６４μＬ、５ｐｍｏｌ／μＬの上記３種の標識プローブ（ｍｕｔａｎｔ−ｔｙｐｅ  ＡＳＨ  ｐｒｏｂｅ、ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ＡＳＨ  ｐｒｏｂｅ、ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｂｅ）各２μＬを加えピペッティングにより攪拌した後、５０μＬずつ八連チューブに分注しＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用いて７０℃１０秒でプローブを解離させ、次に３５℃までゆっくりと冷やし（０．１℃／ｓ）２分間インキュベートした後、ゆっくり（０．１℃／ｓ）室温に戻した。反応液を１．５ｍＬエッペンチューブに回収後、マグネットを用いてこの反応液の上層を取り除き、１×ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ５０μＬに懸濁させ、４８℃で５分間インキュベートした。反応液を室温に戻した後、マグネットを用いて上層を取り除き、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ２０μＬ、１ｍｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２μＬを加え軽くタッピングし、１０分間室温で静置した。このビーズを１００μＬのＴＫ  ｂｕｆｆｅｒで一回ｗａｓｈし、１００μＬのＴＫ  ｂｕｆｆｅｒに懸濁させた。【００６７】
３−６．フローサイトメトリー分析
ビーズ懸濁液を５ｍＬ  Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  Ｒｏｕｎｄ−Ｂｏｔｔｏｍ  Ｔｕｂｅ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ（登録商標））に移し、ＴＫ  ｂｕｆｆｅｒで希釈して全量を１ｍＬとした。このビーズをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって解析した。ビーズの流速は概ね５，０００ｅｖｅｎｔｓ／ｓに設定し、個々のビーズを４８８ｎｍアルゴンレーザーと６３５ｎｍ半導体レーザーのデュアルレーザーを用いた３カラーによる測定を行った。まずｆｏｒｗａｒｄ−ｓｃａｔｔｅｒ（ＦＳＣ）とｓｉｄｅ−ｓｃａｔｔｅｒ（ＳＳＣ）のシグナル（図３Ａ）の値を基にｓｉｎｇｌｅ  ｂｅａｄｓのみを選択し、その中でＰＥのシグナルが検出されたビーズ（図３Ｂ）を解析に用いた。得られたデータはＣＥＬＬＱＵＥＳＴ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって解析した。サンプルにおけるｍｕｔａｎｔ−ｔｙｐｅの割合は、ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅのシグナルを検出したビーズとｍｕｔａｎｔ−ｔｙｐｅのシグナルを検出したビーズの個数から算出した。またビーズのソーティング操作に関しては  ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ  ＳＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行った。【００６８】
なお、上述した「３．ＢＥＡＭｉｎｇによる変異分析」に係る実験プロトコルは、いずれもＥＧＦＲにおけるＴ７９０Ｍ変異の検出を例として説明しているが、この実験プロトコルは、目的の変異に適したプライマー設計や最適ハイブリ条件等の当業者が必要と認める範囲において適宜変形することにより、任意の疾患における任意の耐性変異および活性化変異の定量的な検出を可能にするものである。例えば、本願明細書において説明した非小細胞肺癌であれば、Ｄ７６１ＹやＮ７７１Ｔ等のＴ７９０Ｍ以外のＥＧＦＲにおける耐性変異およびΔＥ７４６−Ａ７５０やＬ８５８Ｒ等のＥＧＦＲにおける活性化変異も定量的に検出可能である。また、慢性骨髄性白血病や肺癌（肺腺癌）等の疾患においても、当該実験プロトコルを用いることにより、疾患原因遺伝子（又は活性化変異）および耐性変異を定量的に検出することができ、かかる検出が可能な疾患はこれらに限られるものではない。【００６９】
４．融解温度の決定
ＤＮＡとＬＮＡの相補差認識能の比較を行うため、それぞれｆｕｌｌｍａｔｃｈ配列とｍｉｓｍａｔｃｈ配列での融解温度（Ｔｍ値）を測定した。ＨＰＬＣ精製した互いに相補的な配列のオリゴヌクレオチド（一方に蛍光基修飾）を脱塩後、凍結乾燥し、それぞれを１００μＭになるように１×Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒで溶解し、等量を混合してアニーリングした。アニーリングは、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動および低温（２０℃）でのＨＰＬＣ分析により確認した。その後、ＵＶ１６５０ＰＣ／ＴＭＳＰＣ−８（島津）を用いて５℃から毎分１℃の割合で９９℃まで昇温し、吸光度を測定した。Ｔｍ値は微分法により算出した。それぞれの配列は表２に示す。【００７０】
【表２】
2012157684.tif 000003
【００７１】
５．配列分析
シークエンス反応にはＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖｅｒ．３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、その精製にはＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＣｌｅａｎＳＥＱ（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）を用いた。各塩基配列はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出し、ＢｉｏＥｄｉｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｅｄｉｔｏｒにより解析した。【００７２】
（結果）
以下に、上述した実験手法および材料を用いた本願発明に係る方法による悪性新生物の病勢の進行の評価を、図面を参照して説明する。【００７３】
１．ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異の検出のための定量分析の開発
ＢＥＡＭｉｎｇの感度について評価するためＴ７９０Ｍ  ｍｕｔａｎｔ−ｔｙｐｅ  １００％、１０％、１％、０．１％、０．０１％、０％のｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡを用いてＢＥＡＭｉｎｇを行った。【００７４】
１−１．一塩基伸長法
本発明者らは、これまでの研究により、ＳＢＥ法によるＢＥＡＭｉｎｇを成功させている。その結果を図４に示す。ＢＥＡＭｉｎｇでは一つのビーズに一つのゲノム由来のＰＣＲ産物が結合している。すなわち、蛍光基によって配列分離されたビーズの個数の割合はサンプルに存在するそれぞれのアレル頻度と一致する。【００７５】
この解析ではｓｉｎｇｌｅ  ｂｅａｄｓ約３００，０００個を測定した。その中でＰＥのシグナルが検出されたビーズ（ＰＥ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂｅａｄｓ）は約２０，０００個であったことから全ビーズの約７％のビーズに対してＰＣＲが反応したと考えられる。反応が進行したビーズに対するＳＢＥ反応による蛍光標識の結果、ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ＤＮＡの配列を含むビーズはＣｙｅ５のシグナルが検出され、ｍｕｔａｎｔ−ｔｙｐｅ  ＤＮＡの配列を含むビーズはＦＩＴＣのシグナルが検出された。この結果ｍｕｔａｎｔ−ｔｙｐｅ  ＤＮＡ  ０．１％の感度までは定量的に測定可能であることが示された。しかしそれ以下の割合で存在するものについては現法での測定では困難である。今回、定量測定に用いられるビーズは約２０，０００個であるため、その解析原理上、１０００分の１以上の感度は望めない。よってさらに感度を上昇させるためにはスクリーニングするビーズ数を大幅に増加させる必要がある。しかし、スクリーニングするビーズ数の増加はバックグラウンドに存在する配列識別困難なビーズ数の増加を伴い、ＳＢＥ法の蛍光強度では正確な定量性が保たれる可能性は低い。そこでより強い蛍光シグナルを求めるべく、ビーズの蛍光標識法に改良を加えた。【００７６】
１−２．配列特異的ハイブリダイゼーション
これまでの研究から、ＳＢＥ法ではビーズ上で蛍光基が取り込まれていないフラグメントが数多く存在することが明らかとなっている（図示せず）。これはＢＥＡＭｉｎｇにおける反応は通常のＤＮＡポリメラーゼの伸長反応と異なり固相上に固定された鋳型に対する反応となるためＳＢＥの反応率が著しく低下することが原因の一つと考えられる。一方、ＡＳＨ法は化学的な反応となるため、プローブを過剰に加えることによってプローブが結合する方向へ反応を傾けることが可能である。しかしハイブリダイゼーション時のプローブの結合力は配列や溶媒の塩濃度に強く依存するため、正確に蛍光を標識するためにはプローブの配列認識能を強くさせる必要がある。今回はプローブのａｌｌｅｌｅ識別部位にＬＮＡを用いた。通常ヌクレオシドの糖部コンフォメーションはＮ型とＳ型の平衡状態で存在する。一般にＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖はＡ型らせん構造をとり、その糖部は主にＮ型である。一方、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖はＢ型らせん構造をとり、糖部は主にＳ型で存在する。安定な二重鎖を形成させるためには、糖部コンフォメーションがＮ型あるいはＳ型で存在することが重要である。ＬＮＡは糖部２’位の酸素原子と４’位の炭素原子をメチレン架橋することにより、糖部コンフォメーションを厳密にＮ型に固定することで二重鎖形成能を大きく向上させた人工核酸アナログである。しかし今回用いるプローブはその５’末端に分子量６００程度の異なる蛍光基が標識されているため、その立体障害から配列認識能が低下する可能性がある。そこで今回用いる蛍光プローブとその相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、それぞれフルマッチ配列とミスマッチ配列での融解温度（Ｔｍ）を測定しその差からＬＮＡ導入によるａｌｌｅｌｅ識別能効果について評価した。Ｔｍ測定とは、温度上昇に伴う紫外部吸収の変化を測定したものでＴｍ  値とは二重鎖ＤＮＡの半分が解離する温度であり二重鎖の安定性の指標となる。よってその差（ΔＴ）をとることで、ハイブリダイズ時の平衡の偏りを評価できる。Ｔｍ値測定の結果ＬＮＡにおけるΔＴ（ΔＴＬＮＡ）とＤＮＡにおけるΔＴ（ΔＴＤＮＡ）では１．０００℃の温度差が確認された。よってＬＮＡが導入されたプローブは蛍光基が修飾された場合でもａｌｌｅｌｅ認識能を向上させることが明らかとなった（図５）。【００７７】
今回の実験によりＬＮＡを用いることでビーズに蛍光標識時の特異度が上昇することが明らかとなった。よってＬＮＡによって配列認識能が向上したプローブを用いて蛍光を付加することで、個々のビーズの蛍光強度が増し、配列特異的なビーズの分離能の向上が期待できる。そこでＬＮＡプローブによるＡＳＨ法を使ったＢＥＡＭｉｎｇを行った。その結果を図６に示す。この解析ではｓｉｎｇｌｅ  ｂｅａｄｓを１％測定時は５００，０００個、０．１％測定時は１，０００，０００個、０．０１％、０％測定時は５，０００，０００個それぞれ解析した。今回の実験でも全ビーズの７〜１０％程度のビーズに対してＰＣＲが反応した。反応が進行したビーズに対するＡＳＨ法による蛍光標識の結果、ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ＤＮＡの配列を含むビーズはＡｌｅｘａ４８８のシグナルが検出され、ｍｕｔａｎｔ−ｔｙｐｅ  ＤＮＡの配列を含むビーズはＡｌｅｘａ６４７のシグナルが検出された。ＬＮＡを導入した蛍光プローブは、ビーズ上で増幅したＰＣＲ産物の多くにハイブリダイゼーションしたと考えられ、その蛍光強度はＳＢＥ法の数十倍から数百倍まで高められた。さらに種々の割合で混合されたサンプルをそれぞれ１０回ずつ測定し、その測定係数から標準偏差を算出することでＢＥＡＭｉｎｇにおける定量性を評価した。その結果、０．０１％と微小な変異を検出する時でも高い定量性を保ち測定が可能であることが明らかとなった（図７）。この結果はＢＥＡＭｉｎｇにより、そのターゲットとなる領域の配列に依存せず、多くのｗｉｌｄ−ｔｙｐｅの配列に含まれる微小なｍｕｔａｎｔ−ｔｙｐｅの配列を正確に認識できることを示唆している。今回、そのビーズの蛍光強度を強くさせることで、スクリーニングを行うビーズの数を大幅に増やし、感度を上昇させることに成功した。【００７８】
２．腫瘍サンプルにおける変異検出
本発明者らは、これまでの研究により肺癌原発巣２６３症例に対してダイレクトシークエンス、あるいはＳＮａＰｓｈｏｔ反応を行いＥＧＦＲ遺伝子の代表的な変異（欠失変異、点変異（Ｌ８５８Ｒ、Ｇ７１９Ａ、Ｌ８６１Ｑ、Ｔ７９０Ｍ））を確認している。Ｔ７９０Ｍ変異はゲフィチニブ耐性変異、その他の変異はＥＧＦＲ活性化変異として知られている。ＳＮａＰｓｈｏｔ反応とは変異検出部位直前までに相補的なプライマーを設計し、蛍光標識したヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応で取り込ませた後、シークエンサーでその解析を行うという技術である。この手法はダイレクトシークエンスより感度良く検出可能であり、多数のサンプルを同時に処理できる。Ｔ７９０Ｍ変異陽性の症例に対して、ＢＥＡＭｉｎｇを用いてＴ７９０Ｍ変異の検出を行った。この解析ではＰＥ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂｅａｄｓ  約５００，０００個を解析した。その実施例を図８に示す。【００７９】
赤点で示されているビーズ（各グラフにおける４分画中左上分画に点在するビーズ）はｗｉｌｄ−ｔｙｐｅビーズ、青点で示されているビーズ（各グラフにおける４分画中右下分画に点在するビーズ）はｍｕｔａｎｔ−ｔｙｐｅビーズである。このビーズの個数をそれぞれ算出し、ｍｕｔａｎｔ−ｔｙｐｅビーズの割合が０．０１５％以上になるものをｐｏｓｉｔｉｖｅとした。緑点で示されているビーズ（各グラフにおける４分画中右上分画に点在するビーズ）は、エマルジョンＰＣＲ時に異なった二つのフラグメントが同時に入ったものと推測されるため、今回の解析からは除外した。図８ではｓａｍｐｌｅ４８とｓａｍｐｌｅ１９２のｍｕｔａｎｔ−ｔｙｐｅの割合がそれぞれ０．００１６％、０．００３７％となりｎｅｇａｔｉｖｅ、ｓａｍｐｌｅ１４１とｓａｍｐｌｅ３０６がそれぞれ０．５２７０％、０．０２７３％となりｐｏｓｉｔｉｖｅである。【００８０】
（病勢の進行の評価）
以上のように、ＢＥＡＭｉｎｇを用いることで血漿中ＤＮＡにおける活性化変異および耐性変異を定量的に検出し得ることがわかった。続いて、定量的に得られた活性化変異および耐性変異を用いた病勢の進行の評価を、図９〜図１１を用いて説明する。【００８１】
図９は、非小細胞肺癌を例として、その一部の患者の血漿中ＤＮＡにおけるＥＧＦＲ変異の検出を示す表である。図９では耐性変異としてＴ７９０Ｍを、活性化変異として第１９エクソン欠損変異（ΔＥ７４６−Ａ７５０等）およびＬ８５８Ｒを用いている。活性化変異については、このいずれかの活性化変異が検出されたものを合わせたものである。また、図９における変異検出に用いた各種プライマーセットを図１０に示す。図１０において、表の上から順に、エマルジョンＰＣＲに用いたプライマー、血漿中ＤＮＡから目的の変異を検出するためのプライマー、蛍光標識のためのハイブリダイゼーション用プライマー、目的配列の増殖確認用プライマーを示す。なお、このようなプライマーセットは適宜設計変更することができることは言うまでもない。【００８２】
さらに、図９においては、病勢の進行は、正常なマーカー遺伝子を有するＤＮＡ分子に対する耐性変異を有するＤＮＡ分子の割合（値）を、正常なマーカー遺伝子を有するＤＮＡ分子に対する活性化変異を有するＤＮＡ分子の割合（値）で除算することによって評価している（図９における「耐性アレルの割合」の欄参照）。この除算結果によって、例えば算出可能な数値が算出された場合に、耐性変異が医学的に考慮されるべき割合で存在し始めていると判断し、ゲフィチニブ（イレッサ）投与を中止するという治療判断をすることができる。また、この判断を得るための数値は、年齢、性別等の患者属性、疾患の状態（初期、末期など）、投薬情報（薬剤の種類、投与期間、投与量など）、によって、５％以上、１０％以上など適宜設定可能である。【００８３】
また、図９では、正常なマーカー遺伝子を有するＤＮＡ分子に対する耐性変異を有するＤＮＡ分子の割合は、ＢＥＡＭｉｎｇによって検出された全ＥＧＦＲ分子に対する、Ｔ７９０Ｍ変異を有するＥＧＦＲ分子を用いて算出している（図９における「耐性変異（Ｔ７９０Ｍ）」の欄参照）。例えば、サンプル番号１の患者においては、全ＥＧＦＲ分子が４１９９７４であり、Ｔ７９０Ｍ変異を有するＥＧＦＲ分子が５７６であり、その割合が０．１３７であることがわかる。同様に、正常なマーカー遺伝子を有するＤＮＡ分子に対する活性化変異を有するＤＮＡ分子の割合は、ＢＥＡＭｉｎｇによって検出された全ＥＧＦＲ分子に対する、いずれか１つの活性化変異を有するＥＧＦＲ分子を用いて算出している（図９における「活性化変異」の欄参照）。例えば、サンプル番号１の患者においては、全ＥＧＦＲ分子が３０１５０８であり、いずれか１つの活性化変異を有するＥＧＦＲ分子が３１４３であり、その割合が１．０３であることがわかる。【００８４】
そして、このようにして求めた正常なマーカー遺伝子を有するＤＮＡ分子に対する耐性変異を有するＤＮＡ分子の割合（値）を、正常なマーカー遺伝子を有するＤＮＡ分子に対する活性化変異を有するＤＮＡ分子の割合（値）で除算することにより（サンプル番号１の患者においては１３．２８と算出される）、病勢の評価をすることができる。【００８５】
また、図１１は、図９の患者を含む患者群について、ＥＧＦＲ−ＴＫＩで治療した進行性疾患（ＰＤ）の患者群をＧｒｏｕｐ  １として、ＥＧＦＲ−ＴＫＩで治療していない患者群をＧｒｏｕｐ  ２としてまとめたものである。本図において、「ａｄｅｎｏ」は「ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ」で腺癌を、「Ｓｑ」は「ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ」で扁平上皮癌を、「ａｄｅｎｏ＋Ｓｑ」は「ａｄｅｎｏｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ」で腺扁平上皮癌をそれぞれ指すものである。本図からもわかるように、Ｇｒｏｕｐ  ２の患者群ではいずれも、活性化変異に対する耐性変異（Ｔ７９０Ｍ）の割合は０．０或いはＮＡであり、これにより病勢の進行度が低い、或いは耐性変異が医学的に考慮されるべき割合で存在していない等の評価をすることができる。一方で、Ｇｒｏｕｐ  １の患者群では、１〜９までの患者の活性化変異に対する耐性変異（Ｔ７９０Ｍ）の割合が高く算出されており、これは病勢が進行していることを意味し、ＰＤの患者であることとも一致する。【００８６】
（次世代シーケンサーを用いた場合の病勢の進行の評価）
以上のように、ＢＥＡＭｉｎｇを用いることで血漿中ＤＮＡにおける活性化変異および耐性変異を定量的に検出することができ、さらに定量的に得られた活性化変異および耐性変異を用いて、患者における病勢の進行の評価ができることがわかった。続いて、ＢＥＡＭｉｎｇに替えて次世代シーケンサーを用いた場合の、活性化変異および耐性変異の定量的な検出、およびその定量的な割合に基づいた患者における病勢の進行の評価について説明する。【００８７】
肺がん患者血漿ＤＮＡからＥＧＦＲエクソン１９〜２１の各エクソンをＰＣＲで増幅した。増幅反応の反応液は以下の通りである。
ｄＨ２Ｏ                                  ６０ｕＬ
１０×ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｂｕｆｆｅｒ      １０ｕＬ
２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                        １０ｕＬ
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４                      ４ｕＬ
ＰｒｉｍｅｒＭｉｘ（５ｕＭ  ｅａｃｈ）    ４ｕＬ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−                        ２ｕＬ
血漿ＤＮＡ（血漿４００ｕｌに相当）        １０ｕＬ【００８８】
ＰｒｉｍｅｒＭｉｘはそれぞれのエクソンの順方向と逆方向のプライマーからなるものである。また、そのＰｒｉｍｅｒＭｉｘの各配列を図１２に示す。ＰＣＲ反応条件は以下の通りである。
９４ｄＣ  ２分
９４ｄＣ  １５秒
６２ｄＣ  ３０秒×４０サイクル
６８ｄＣ  ５０秒
１６ｄＣ  保温【００８９】
反応後のサンプルをＱＩＡ  ｃｕｂｅ（ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）で精製した。ＮａｎｏＤｒｏｐで増幅ＤＮＡ量を測定し、等量になるように各断片増幅物を混合し、次世代シーケンサーＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｃｈｉｎｅ用のライブラリを、装置取扱書のプロトコルに従って作成した。そのライブラリについて、ＰＧＭ３１６チップを使って塩基配列決定反応を行った。それぞれのエクソン分子について１００，０００分子以上塩基配列決定を行い、変異を探索した。その結果を表３に示す。【００９０】
【表３】
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【００９１】
以上のように、次世代シーケンサーを用いた場合でもＢＥＡＭｉｎｇと同様、耐性変異と活性化変異の分子数から耐性変異の存在比を計測できることがわかった。症例１５５は、臨床像は耐性なしであったが、Ｔ７９０Ｍが認められた。その他の症例においては、臨床像とＴ７９０Ｍの状態との間に食い違いは見られなかった。【００９２】
その他、本発明は、さまざまに変形可能であることは言うまでもなく、上述した一実施形態に限定されず、発明の要旨を変更しない範囲で種々変形可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年3月11日(2013.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性新生物を治療するための薬剤が投与されている被験者において、当該悪性新生物の病勢の進行を評価する方法であって、
（１）前記被験者由来の血中ＤＮＡにおいて、正常なマーカー遺伝子を有するＤＮＡ分子に対する前記薬剤の活性化マーカーとなる活性化変異を有するＤＮＡ分子の割合を決定する工程と、
（２）前記被験者由来の血中ＤＮＡにおいて、正常なマーカー遺伝子を有するＤＮＡ分子に対する前記薬剤の耐性マーカーとなる耐性変異を有するＤＮＡ分子の割合を決定する工程と、
（３）前記（２）の工程で得た値を前記（１）の工程で得た値で除算することによって、前記（２）の工程で得た値と、前記（１）の工程で得た値とを比較する工程と、
を有することを特徴とする、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、
前記被験者は非小細胞肺癌患者であり、
前記薬剤はＥＧＦＲ阻害剤であり、
前記正常なマーカー遺伝子は正常ＥＧＦＲ遺伝子である
ことを特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法において、
前記耐性変異は、ＥＧＦＲ遺伝子におけるＴ７９０Ｍである
ことを特徴とする、方法。
【請求項４】
請求項２記載の方法において、
前記活性化変異は、ＥＧＦＲ遺伝子におけるΔＥ７４６−Ａ７５０、Ｌ８５８Ｒ、Ｇ７１９Ｃ、Ｇ７１９Ｓ、及びＧ７１９Ａから選択される１若しくはそれ以上の変異である
ことを特徴とする、方法。
【請求項５】
請求項２記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ阻害剤は、ゲフィチニブ又はエルロチニブである
ことを特徴とする、方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、
前記被験者は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者であり、
前記薬剤はイマチニブである
ことを特徴とする、方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法において、
前記耐性変異は、Ｔ３１５Ｉである
ことを特徴とする、方法。
【請求項８】
請求項６記載の方法において、
前記活性化変異は、ｂｃｒ−ａｂｌである
ことを特徴とする、方法。
【請求項９】
請求項１記載の方法において、
前記被験者は肺癌または肺腺癌患者であり、
前記薬剤はＡＬＫ阻害剤である
ことを特徴とする、方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法において、
前記耐性変異は、Ｌ１１９５Ｍ又はＣ１１５６Ｙである
ことを特徴とする、方法。
【請求項１１】
請求項９記載の方法において、
前記活性化変異は、ＥＭＬ４−ＡＬＫである
ことを特徴とする、方法。
【請求項１２】
請求項９記載の方法において、
前記ＡＬＫ阻害剤は、ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂである
ことを特徴とする、方法。
【請求項１３】
請求項１記載の方法において、
前記（１）及び（２）の工程は、エマルジョンＰＣＲを用いて行われるものである
ことを特徴とする、方法。
【請求項１４】
請求項１記載の方法に使用されるキットであって、
前記活性化変異を検出するために用いられるプライマーセットと、
前記耐性変異を検出するために用いられるプライマーセットと
を有することを特徴とする、キット。
【国際調査報告】
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2012157684.tif 000018
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