(57)【要約】  【課題】  糖鎖の非還元末端にシアル酸がα２，３結合またはα２，６結合した糖鎖の重要性が知られており、これらの糖鎖化合物についての工業的生産が求められている。特に、糖タンパク質医薬品の製造等に際しては、シアル酸の結合様式（α２，６結合またはα２，３結合）を制御して均一構造の糖鎖を量産することが不可欠である。特に、３分岐型または４分岐型のＮ−型複合型糖鎖について、一般的に化学的にすべての非還元末端にシアル酸を有する糖鎖を合成することは難しいと考えられ、同糖鎖を化学的に合成したという報告はない。さらに酵素学的にもこれらの糖鎖を効率よく調製することは困難であった。  【解決手段】  本発明では、シアル酸転移酵素が、ＣＭＰ存在下において、反応生成物上のシアル酸を分解する活性を新たに見いだし、生成するＣＭＰを酵素的に分解することによって、シアル酸含有糖鎖を効率的に製造可能であることを見出した。さらに、従来合成の困難であった、α２，６結合でシアル酸が４分子付加した４分岐Ｎ−型糖鎖についても、２分岐型糖鎖を原料として、糖鎖伸長反応を行い、各酵素反応後の精製を行なうことなしに、ワンポット合成で高収率で調製できることを見いだした。
2012121041.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアル酸転移酵素、及び、ホスファターゼの存在下において、
第一の糖鎖またはその誘導体に対し、ＣＭＰ−シアル酸を反応させ、
前記第一の糖鎖またはその誘導体の非還元末端にシアル酸を転移させることにより、
シアル酸を有する第二の糖鎖またはその誘導体を製造する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の前記第一の糖鎖またはその誘導体が、３分岐型または４分岐型のＮ−結合型複合型糖鎖またはその誘導体である、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の前記第一の糖鎖またはその誘導体が、
下記式により表わされる化合物
【化１】
2012121041.tif 000026
またはその誘導体である、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の前記シアル酸を有する第二の糖鎖またはその誘導体が、３分岐型または４分岐型のＮ−結合型複合型糖鎖であり、糖鎖の各非還元末端のすべてにシアル酸を有する化合物またはその誘導体である、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の前記シアル酸を有する第二の糖鎖またはその誘導体が、
下記式により表わされる化合物
【化２】
2012121041.tif 000027
【化３】
2012121041.tif 000028
またはその誘導体である、方法。
【請求項６】
以下の工程；
（ａ）糖転移酵素の存在下において、
下記式により表わされる糖鎖
【化４】
2012121041.tif 000029
またはその誘導体に対し、前記糖転移酵素の基質となるＵＤＰ糖を反応させる工程を１回以上行う工程；及び、
（ｂ）シアル酸転移酵素、及び、ホスファターゼの存在下において、
前記工程（ａ）の生成物に対し、ＣＭＰ−シアル酸を反応させる工程；
を含む、シアル酸を有する糖鎖またはその誘導体を製造する方法。
【請求項７】
以下の工程；
（ａ）ＭＧＡＴ４及びＭＧＡＴ５の存在下において、
アガラクト２分岐複合型糖鎖またはその誘導体に対し、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを反応させる工程；
（ｂ）β４ＧａｌＴ１の存在下において、前記工程（ａ）の生成物に対し、ＵＤＰ−Ｇａｌを反応させる工程；及び
（ｃ）シアル酸転移酵素及びホスファターゼの存在下において、前記工程（ｂ）の生成物に対し、ＣＭＰ−シアル酸を反応させる工程；
を含む、非還元末端にシアル酸を有する糖鎖またはその誘導体を製造する方法。
【請求項８】
請求項１〜７に記載の方法であって、前記シアル酸転移酵素が、α２，６シアル酸転移酵素である方法。
【請求項９】
請求項１〜７に記載の方法であって、前記シアル酸転移酵素が、ヒト由来のシアル酸転移酵素である方法。
【請求項１０】
請求項１〜７に記載の方法であって、前記シアル酸転移酵素が、ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉである方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、前記ＣＭＰ−シアル酸が、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃである方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、前記ホスファターゼが、アルカリホスファターゼである方法。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、前記ホスファターゼが、大腸菌由来アルカリホスファターゼである方法。
【請求項１４】
４分岐型のＮ−結合型複合型糖鎖またはその誘導体の各非還元末端のすべてにシアル酸を有する化合物。
【請求項１５】
４分岐のＮ−結合型複合型糖鎖またはその誘導体の各非還元末端のすべてにα２，６結合型のシアル酸を有する化合物。
【請求項１６】
下記式により表わされる化合物。
【化５】
2012121041.tif 000030
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖タンパク質などの医薬品、分析機器のための標準品、学術用試薬、糖鎖アレイなどに応用しうる糖鎖の合成法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質に結合した糖鎖構造は、そのタンパク質の生物活性における機能に重要な役割を果たしていることがこれまでの数多くの研究から明らかになっている。また糖鎖は「細胞の顔」とも呼ばれ、細胞表面上で発現した糖鎖が細胞間相互作用やシグナル伝達、発生・分化、受精、ガン転移などに関与することが知られている。哺乳類の糖鎖修飾は主にＡｓｎ結合型、ムチン型、プロテオグリカン型などがよく知られており、それぞれに異なった生合成経路を経て固有の糖鎖構造を形成している。この糖鎖構造の非還元末端側にはフコースやシアル酸などの糖が付加することが知られている。【０００３】
シアル酸は、アミノ基やカルボキシ基が結合した特殊な９炭糖であるノイラミン酸に対し、アミノ基やヒドロキシ基が置換された化合物の総称であり、５位のアミノ基がアセチル化されたＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）が天然には最も多いと考えられている。また５位のアミノ基がグリコリル基で修飾されたＮ−グリコリルノイラミン酸やデアミノ体であるＫＤＮなど様々な構造が知られている。【０００４】
シアル酸含有糖鎖は、ヒトやマウスなどの哺乳類だけでなく、脊椎動物や棘皮動物、さらには原生生物やグラム陰性の病原性を持つ一部のバクテリアでも存在することが報告されている。このシアル酸含有糖鎖の生産は、シアル酸転移酵素によって行なわれている。シアル酸転移酵素は、シチジン１リン酸（ＣＭＰ）に付加したシアル酸を基質供与体とし、シアル酸の２位に存在するアルデヒド基を介して、ガラクトースの３位や６位、Ｎ−アセチルガラクトサミンの６位、またシアル酸の８位等にシアル酸を転移する。例えば、ガラクトースの３位にシアル酸を転移する酵素はα−２，３シアル酸転移酵素、ガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミンの６位にシアル酸を転移する酵素はα−２，６シアル酸転移酵素、シアル酸の８位にさらにシアル酸を転移する酵素はα−２，８ポリシアル酸転移酵素と呼ばれている。このうちα−２，６シアル酸転移酵素については、ヒトではガラクトースの６位に転移する酵素としてＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ及びＳＴ６Ｇａｌ−ＩＩが、またＮ−アセチルガラクトサミンの６位に転移する酵素としてＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−ＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−ＩＩＩ及びＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−ＩＶが知られている。【０００５】
ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉについては、基質受容体として、Ｎ−アセチルグルコサミンの４位にガラクトースが結合したＮ−アセチルラクトサミン構造（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）を認識するため、一部の糖脂質やＮ−結合型糖鎖の非還元末端構造を修飾する。基質受容体の特異性については、主に２分岐や３分岐のＮ−結合型糖鎖によって解析されており、シアル酸は、α１，３結合のマンノース上に伸びたラクトサミンに転移しやすいことが報告されている（非特許文献１参照。）。２分岐や３分岐のＮ−結合型糖鎖の調製に関しても、糖転移酵素の基質を天然物から抽出することが難しいことや、酵素の大量調製法が確立していなかったことなどから、これらの糖鎖も効率よく量産することは困難であった。
一方、４分岐のＮ−結合型糖鎖に対するα２，６シアル酸転移反応については、ウシ由来のＳＴ６Ｇａｌ−Ｉで検討されており、４カ所のＮ−アセチルラクトサミン構造のうち、まずα１，３結合のマンノース上にβ１，２結合で付加したＮ−アセチルラクトサミン構造に転移しやすく、次にα１，３結合のマンノース上にβ１，４結合で付加したＮ−アセチルラクトサミン構造に、さらにα１，６結合のマンノース上に付加した２つのＮ−アセチルラクトサミン構造のどちらかにシアル酸が転移されるが、４分子シアル酸が入った産物は見いだされなかった（非特許文献２参照。）。またヒトのＳＴ６Ｇａｌ−Ｉについては、ＳＴ６Ｇａｌ−ＩＩとともに基質特異性が報告されている（非特許文献３、４参照。）が、４分岐のＮ−結合型糖鎖を受容体基質としたシアル酸付加については検討されていない。
ＳＴ６Ｇａｌ−ＩのＣＭＰによるプロダクト阻害は０．２５ｍＭのＣＭＰで４９％阻害される（非特許文献５参照。）、または７１％阻害される（非特許文献６参照。）という報告がある。
一方、バクテリア由来のα２，６−シアル酸転移酵素については、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａ  ＪＴ０１６０（非特許文献７参照。）、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ  ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５（非特許文献８参照。）などが報告されているが、いずれも４分岐のＮ−結合型糖鎖を受容体基質としたシアル酸付加については検討されていない。【０００６】
また、４分岐のＮ−結合型糖鎖に対するα２，３シアル酸転移反応に関し、４分子のシアル酸がα２，３結合で付加した４分岐のＮ−結合型糖鎖については、エリスロポエチン（ＥＰＯ）などの糖タンパク質に付加しており（非特許文献９参照。）、シアル酸の付加が血中での安定性に貢献していることが報告されている（非特許文献１０参照。）。これらは天然にも存在する構造であるが、実際に４分子のシアル酸がα２，３結合で付加した４分岐のＮ−結合型糖鎖を大量調製した報告例は見いだされない。これは原料となるＥＰＯなどを多量に調製することがコスト面でも困難であり、また酵素合成を行なうにしても、他の天然物から受容体となるアシアロ４分岐型Ｎ−結合型糖鎖を安価に調製することが難しいためである。またＥＰＯではα２，３結合とα２，６結合が混在した４分岐のＮ−結合型糖鎖なども糖タンパク質に付加していることが知られている（非特許文献１１参照）。
抗体医薬やサイトカインなどの糖タンパク質医薬品のＮ−型糖鎖に付加するシアル酸の結合様式に関し、α２，６結合シアル酸を付加したタンパク質は、α２，３結合シアル酸を付加したタンパク質に比べ血中からの消失が早いことが報告されている。糖タンパク質の血中からのクリアランスについては、体内のレクチン分子と結合して細胞内へ取り込まれ、最終的に代謝される。従ってα２，６結合のシアル酸を有する糖タンパク質は特異的なレクチンに結合することで臓器特異的に取り込まれることが期待でき、ドラッグデリバリーへの活用が期待できる。また糖タンパク質は、分子サイズに依存し腎臓において尿中に排出されることが知られている。エリスロポエチンでは、糖鎖の分岐数が多いと見かけの分子サイズが増加し、血中からのクリアランスが遅れると報告されている。従ってα２，３結合及び／又はα２，６結合のシアル酸を有する糖鎖、とりわけ、α２，３結合及び／又はα２，６結合のシアル酸を４分子有する４分岐のＮ−型糖鎖を合成することが可能となれば、臓器への取り込み効率が異なる糖タンパク質医薬品の生産へ応用できることが期待される。【０００７】
またヒトインフルエンザウイルスは、細胞表面に発現した糖鎖のα２，６結合のシアル酸を認識して感染するが、トリ由来のインフルエンザウイルスはα２，３結合のシアル酸を認識して感染する。インフルエンザウイルスに限らず、多くのウイルスは感染細胞の糖鎖構造を認識して感染を始めるため、様々な糖鎖を用いてウイルスとの結合特異性を調べることが必要となってきている。従ってα２，３またはα２，６結合のシアル酸を有する糖鎖は、ウイルスの結合特異性を検討するための材料となり、またウイルスの検出などに応用できると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎ  ＤＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．，９２（３），８３９−４５（１９８０）
【非特許文献２】Ｊｏｚｉａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ，２６２，２０２５−２０３３（１９８７）
【非特許文献３】Ｔａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ，２７７，４５７１９−４５７２８（２００２）
【非特許文献４】Ｋｒｚｅｗｉｎｓｋｉ−Ｒｅｃｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＪＢ，２７０，９５０−９６１（２００３）
【非特許文献５】Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１８，１８７−１９４（２００８）
【非特許文献６】Ｋｌｅｉｎｅｉｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．，１４，５７−６６（１９９７）
【非特許文献７】Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＢＢ，６２，２１０−２１４（１９９８）
【非特許文献８】Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１７，１１６７−１１７４（２００７）
【非特許文献９】Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３（８），３６５７−６３（１９８８）
【非特許文献１０】Ｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，，１８８（２），４０５−１１（１９９０）
【非特許文献１１】Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２６３（８），３６５７−６３（１９８８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
糖鎖の非還元末端にシアル酸がα２，３結合またはα２，６結合した糖鎖の重要性が知られており、これらの糖鎖化合物について、天然に存在するものもあるが、天然物から抽出するには、天然物としての希少性、入手困難性、安全性等の問題があり、工業的生産が求められている。特に、抗体医薬やサイトカインなどの糖タンパク質医薬品の製造やウイルスの結合特異性の検討等に際しては、シアル酸の結合様式（α２，６結合またはα２，３結合）を制御して均一構造の糖鎖を量産することが不可欠である。特に、３分岐型または４分岐型のＮ−型複合型糖鎖について、一般的に化学的にすべての非還元末端にシアル酸を有する糖鎖を合成することは難しいと考えられ、例えば、すべての非還元末端にα２，６結合のシアル酸を有する４分岐型のＮ−型複合型糖鎖について、化学的に合成したという報告はない。さらに酵素学的にもこれらのシアル酸を有する３分岐型または４分岐型の糖鎖を効率よく調製することは困難であった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明では、シアル酸転移酵素がＣＭＰ存在下において、反応生成物上のシアル酸を分解する活性を新たに見いだし、生成するＣＭＰを酵素的に分解することによって、シアル酸含有糖鎖を効率的に製造可能であることを見出した。さらに、従来合成の困難であった、α２，６結合でシアル酸が４分子付加した４分岐Ｎ−型糖鎖についても、２分岐型糖鎖を原料として、糖鎖伸長反応を行い、各酵素反応後の精製を行なうことなしに、ワンポット合成により高収率で調製できることを見いだした。
即ち、本発明は、シアル酸転移酵素、及び、ホスファターゼの存在下において、
第一の糖鎖またはその誘導体に対し、ＣＭＰ−シアル酸を反応させ、
前記第一の糖鎖またはその誘導体の非還元末端にシアル酸を転移させることにより、
シアル酸を有する第二の糖鎖またはその誘導体を製造する方法に関する。【００１１】
ここで、本発明のシアル酸を有する第二の糖鎖またはその誘導体を製造する方法の一実施態様においては、前記第一の糖鎖またはその誘導体が、３分岐型または４分岐型のＮ−結合型複合型糖鎖またはその誘導体であることを特徴とする。
また、本発明のシアル酸を有する第二の糖鎖またはその誘導体を製造する方法の一実施態様においては、前記第一の糖鎖またはその誘導体が、
下記式により表わされる化合物
【化１】
2012121041.tif 000003
（図中、ＧｎはＮ-アセチルグルコサミンを、Ｍａｎはマンノースを、Ｇａｌはガラクトースを示す。以下、本明細書において同じ意味である。なお、本明細書中において、Ｎ-アセチルグルコサミンは、ＧｌｃＮＡｃと表記される場合もある。）
またはその誘導体であることを特徴とする。
また、本発明のシアル酸を有する第二の糖鎖またはその誘導体を製造する方法の一実施態様においては、前記シアル酸を有する第二の糖鎖またはその誘導体が、３分岐型または４分岐型のＮ−結合型複合型糖鎖であり、糖鎖の各非還元末端のすべてにシアル酸を有する化合物またはその誘導体であることを特徴とする。
また、本発明のシアル酸を有する第二の糖鎖またはその誘導体を製造する方法の一実施態様においては、前記シアル酸を有する第二の糖鎖またはその誘導体が、
下記式により表わされる化合物
【化２】
2012121041.tif 000004
【化３】
2012121041.tif 000005
（図中、ＧｎはＮ-アセチルグルコサミンを、Ｍａｎはマンノースを、Ｇａｌはガラクトースを、Ｓｉａはシアル酸を示す。以下、本明細書において同じ意味である。なお、本明細書中において、Ｎ-アセチルグルコサミンは、ＧｌｃＮＡｃと表記される場合もある。）
またはその誘導体であることを特徴とする。【００１２】
また、本発明の別の態様は、以下の工程；
（ａ）糖転移酵素の存在下において、
下記式により表わされる糖鎖
【化４】
2012121041.tif 000006
またはその誘導体に対し、前記糖転移酵素の基質となるＵＤＰ糖を反応させる工程を１回以上行う工程；及び、
（ｂ）シアル酸転移酵素、及び、ホスファターゼの存在下において、
前記工程（ａ）の生成物に対し、ＣＭＰ−シアル酸を反応させる工程；
を含む、シアル酸を有する糖鎖またはその誘導体を製造する方法に関する。【００１３】
また、本発明の別の態様は、以下の工程；
（ａ）ＭＧＡＴ４及びＭＧＡＴ５の存在下において、
アガラクト２分岐複合型糖鎖またはその誘導体に対し、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを反応させる工程；
（ｂ）β４ＧａｌＴ１の存在下において、前記工程（ａ）の生成物に対し、ＵＤＰ−Ｇａｌを反応させる工程；及び
（ｃ）シアル酸転移酵素及びホスファターゼの存在下において、前記工程（ｂ）の生成物に対し、ＣＭＰ−シアル酸を反応させる工程；
を含む、非還元末端にシアル酸を有する糖鎖またはその誘導体を製造する方法に関する。【００１４】
また、本発明のシアル酸を有する糖鎖またはその誘導体を製造する方法の一実施態様においては、前記シアル酸転移酵素が、α２，６シアル酸転移酵素であることを特徴とする。
また、本発明のシアル酸を有する糖鎖またはその誘導体を製造する方法の一実施態様においては、前記シアル酸転移酵素が、ヒト由来のシアル酸転移酵素であることを特徴とする。
また、本発明のシアル酸を有する糖鎖またはその誘導体を製造する方法の一実施態様においては、前記シアル酸転移酵素が、ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉであることを特徴とする。
また、本発明のシアル酸を有する糖鎖またはその誘導体を製造する方法の一実施態様においては、前記ＣＭＰ−シアル酸が、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃであることを特徴とする。
また、本発明のシアル酸を有する糖鎖またはその誘導体を製造する方法の一実施態様においては、前記ホスファターゼが、アルカリホスファターゼであることを特徴とする。
また、本発明のシアル酸を有する糖鎖またはその誘導体を製造する方法の一実施態様においては、前記ホスファターゼが、大腸菌由来アルカリホスファターゼであることを特徴とする。【００１５】
また、本発明の別の態様は、４分岐型のＮ−結合型複合型糖鎖またはその誘導体の各非還元末端のすべてにシアル酸を有する化合物に関する。【００１６】
また、本発明の別の態様は、４分岐のＮ−結合型複合型糖鎖またはその誘導体の各非還元末端のすべてにα２，６結合型のシアル酸を有する化合物に関する。【００１７】
また、本発明の別の態様は、下記式
【化５】
2012121041.tif 000007
により表わされる化合物に関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の方法により、シアル酸転移酵素を用いたシアル酸含有糖鎖を従来よりも効率よく製造することができる。特に、従来製造の困難であった、３分岐型または４分岐型の複合型糖鎖に対し、分岐鎖の各非還元末端のすべてにシアル酸が結合したシアル酸含有糖鎖（糖アミノ酸、糖ペプチドを含む）をも効率よく製造することができる。また、ワンポットの合成反応で簡便に収率よく製造することができ、従来困難であったこれらの糖鎖の量産をも可能とするものである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、４分岐複合型糖鎖としてのＮＡ４−Ｆｍｏｃ及びＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを含む溶液にＳＴ６Ｇａｌ−１を添加し、３７℃において、下から順に、０時間後、１時間後、６時間後、２４時間後、及び、２４時間後にＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ及びＳＴ６Ｇａｌ−１を追加しさらに２４時間反応後の反応生成物のＨＰＬＣチャートを示す。図中、上部の「ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ」、「ｔｒｉｓｉａｌｏ」、「ｄｉｓｉａｌｏ」、「ｍｏｎｏｓｉａｌｏ」はそれぞれ、ＨＰＬＣチャートにおける（α２，６）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃ、（α２，６）ｔｒｉｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃ、（α２，６）ｄｉｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃ、（α２，６）ｍｏｎｏｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃの保持時間（分）を示す。
【図２】図２は、（α２，６）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃに対して、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃの存在下または非存在下において、シアル酸転移酵素の存在下または非存在下において３７℃で１５時間反応させた場合の、（α２，６）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃ及び（α２，６）ｔｒｉｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃの存在比率を示す。図中、「＋Ｄｏｎｏｒ」は、２ｍＭ  ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡＣ存在下、「−Ｄｏｎｏｒ」は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡＣ非存在下、「＋Ｂｏｉｌｅｄ  Ｄｏｎｏｒ」は、１００℃で５分間加熱後の２ｍＭ  ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡＣ存在下における反応結果を示す。また、「−Ｅｎｚｙｍｅ」はシアル酸転移酵素非存在下における反応結果を示す。
【図３】図３左側は、ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃに対して、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡＣまたはＣＭＰの存在下または非存在下において、シアル酸転移酵素ＳＴ６Ｇａｌ１を３７℃で１５時間反応させた場合の、（α２，６）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃ及び（α２，６）ｔｒｉｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃの存在比率を示す。また、図３右側は、（α２，３）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏＮＡ４−Ｆｍｏｃに対して、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡＣの存在下または非存在下において、シアル酸転移酵素（ＳＴ６Ｇａｌ−ＩまたはＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩＩ）を３７℃で１５時間反応させた場合の、（α２，３）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃ及び（α２，３）ｔｒｉｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃの存在比率を示す。
【図４】図４は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡＣを３７℃、３３℃、３０℃または２５℃において２時間、８時間または２４時間保温した場合の、ＣＭＰの存在比率を示す。
【図５】図５は、ＮＡ４−Ｆｍｏｃに対し、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡＣ存在下において、シアル酸転移酵素ＳＴ６Ｇａｌ１を、３７℃、３０℃、２５℃、２０℃または１０℃において、２時間、８時間または２４時間反応させた場合の、（α２，６）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃ、（α２，６）ｔｒｉｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃ、（α２，６）ｄｉｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃ、及び、（α２，６）ｍｏｎｏｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃの存在比率を示す。
【図６】図６は、（α２，６）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃに対し、コントロール（ＣＭＰ、ＢＡＰの非存在下）、ＣＭＰの存在下、または、ＣＭＰ及びＢＡＰの存在下において、シアル酸転移酵素ＳＴ６Ｇａｌ１を、３７℃で、３時間、６時間、または２４時間反応させた場合の、（α２，６）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃ及び（α２，６）ｔｒｉｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃの存在比率を示す。
【図７】図７は、実施例の（７）に記載の（α２，６）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃのワンポット合成反応をフローチャートとして示す。
【図８】図８は、実施例の（７）に記載の（α２，６）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃのワンポット合成反応における糖鎖付加反応を、構造式を用いて模式的に示す。
【図９】図９は、実施例の（７）に記載の（α２，６）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃのワンポット合成方法に関し、図中、「＋ＳＴ６Ｇａｌ１」で示された上側のＨＰＬＣチャートは、反応生成物のＨＰＬＣチャート、「ＮＧＡ２−Ｆｍｏｃ」で示された下側のＨＰＬＣチャートは、反応原料のＨＰＬＣチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書において、「シアル酸」とは、ノイラミン酸（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）のアミノ基やヒドロキシ基が置換された物質を総称するファミリー名である。なお、「ノイラミン酸」とは、分子内にアミノ基及びカルボキシル基を有する特殊な９炭糖であり、下記式で表される。
【化６】
2012121041.tif 000008
シアル酸の構造として、上記ノイラミン酸に対する、アミノ基の置換としては、アミノ基のアセチル化、グライコリル化などが知られている他、アミノ基が脱離したデアミノ化などが知られており、ヒドロキシ基の置換としては、アセチル化、メチル化、リン酸化、ラクチル化などが知られているが、これらに限定されない。
本明細書において、天然に存在する糖タンパク質またはその糖鎖を製造するという観点から、転移させるシアル酸としては、天然に最も多く存在するＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、次に多く存在するＮ−グライコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）が好ましい。特に、ヒトの糖タンパク質として天然に存在する糖タンパク質またはその糖鎖を製造するという観点から、Ｎ−アセチルノイラミン酸がより好ましい。
【００２１】
本明細書において、「ＣＭＰ−シアル酸」とは、シチジン５’−モノホスフォシアル酸を意味し、シアル酸の２位のヒドロキシ基とＣｙｔｉｄｉｎｅ  Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＣＭＰ）のリン酸基とが脱水縮合した構造を有するものをいう。ＣＭＰ−シアル酸において、シアル酸をより具体的に特定したものとして、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ）、ＣＭＰ−Ｎ−グライコリルノイラミン酸（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ｇｃ）等が挙げられる。本明細書において、天然に存在する糖タンパク質またはその糖鎖を製造するという観点から、本発明に用いるＣＭＰ−シアル酸としては、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ）、ＣＭＰ−Ｎ−グライコリルノイラミン酸（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ｇｃ）が好ましく、特に、ヒトの糖タンパク質として天然に存在する糖タンパク質またはその糖鎖を製造するという観点から、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ）がより好ましい。
【００２２】
本明細書において、「シアル酸転移酵素」とは、糖転移酵素の一種であり、糖供与体（ドナー基質ともいう。）であるＣＭＰ−シアル酸から、糖受容体（受容体基質ともいう。）である糖鎖構造にシアル酸残基を転移する反応（以下、「シアル酸転移反応」という。）を触媒する酵素をいう。シアル酸転移酵素は、糖鎖の非還元末端にシアル酸を転移させることが知られている。シアル酸転移反応は、以下の反応式により示すことができる。糖鎖の代わりに糖鎖の誘導体を用いる場合には、式中の糖鎖を糖鎖の誘導体に置き換えることができる。
【数１】
2012121041.tif 000009
［式中、シアル酸−糖鎖は、糖鎖の非還元末端にシアル酸がグリコシド結合した化合物を示す。］
シアル酸転移酵素としては、例えば、糖鎖の非還元末端に存在する、ガラクトースの３位や６位、Ｎ−アセチルガラクトサミンの６位、また、シアル酸の８位に転移することが知られている。例えば、ガラクトースの３位にシアル酸を転移する酵素はα−２，３シアル酸転移酵素、ガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミンの６位にシアル酸を転移する酵素はα−２，６シアル酸転移酵素、シアル酸の８位にさらにシアル酸を転移する酵素はα−２，８ポリシアル酸転移酵素と呼ばれている。
シアル酸転移酵素は、細菌由来のもののほか、ニジマス由来、哺乳類由来のものなどが知られており、また植物からはシアル酸転移酵素様の活性を有するタンパク質が見いだされている。特に、哺乳類の糖タンパク質として天然に存在する糖タンパク質またはその糖鎖を製造するという観点から、哺乳類由来のものが好ましく、ヒトの糖タンパク質として天然に存在する糖タンパク質またはその糖鎖を製造するという観点から、ヒト由来のものがより好ましい。
α−２，６シアル酸転移酵素については、ヒト由来のものとして、例えば、ガラクトースの６位に転移する酵素としてＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ（ＳＴ６Ｇａｌ１と表記することもある、以下同様。）及びＳＴ６Ｇａｌ−ＩＩが、またＮ−アセチルガラクトサミンの６位に転移する酵素としてＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−ＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−ＩＩＩ及びＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−ＩＶが知られている。
α−２，３シアル酸転移酵素については、ヒト由来のものとして、例えば、ガラクトースの３位に転移する酵素としてＳＴ３Ｇａｌ−Ｉ〜ＳＴ３Ｇａｌ−ＶＩが知られている。
シアル酸転移酵素は、特に、糖タンパク質として天然に存在する糖タンパク質またはその糖鎖を製造するという観点からは、ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ、ＳＴ６Ｇａｌ−ＩＩ、ＳＴ３Ｇａｌ−Ｉ、ＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩ、ＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩＩ、ＳＴ３Ｇａｌ−ＩＶ、ＳＴ３Ｇａｌ−ＶＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−ＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−ＩＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−ＩＶ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＶが好ましい。また、Ｎ−結合型糖鎖を製造するという観点からは、ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ、ＳＴ６Ｇａｌ−ＩＩ、ＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩＩ、ＳＴ３Ｇａｌ−ＩＶ、ＳＴ３Ｇａｌ−ＶＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＶが好ましい。
【００２３】
本明細書において、「糖鎖」とは、単位糖（単糖及び／又はその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される単糖類及び多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸並びにそれらの複合体及び誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解又は誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。糖鎖は直鎖型であっても分岐鎖型であってもよい。
【００２４】
また、本明細書中において、「糖鎖」には、糖鎖の置換基が修飾された化合物も含まれ、例えば、糖鎖を構成する糖が、カルボキシル基を有する糖（例えば、Ｃ−１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルクロン酸））、アミノ基又はアミノ基の誘導体（例えば、アセチル化されたアミノ基）を有する糖（例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなど）、アミノ基及びカルボキシル基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ−アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２−デオキシ−Ｄ−リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などである糖鎖が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２５】
本明細書中において、好ましい糖鎖は、医薬品となる糖タンパク質の製造という観点からは、生体内で複合糖質（糖ペプチド（又は糖タンパク質）、プロテオグリカン、糖脂質等）として存在する糖鎖であり、好ましくは、生体内で糖ペプチド（又は糖タンパク質）としてペプチド（又はタンパク質）に結合している糖鎖であるＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖等である。Ｎ−結合型糖鎖は、糖鎖がタンパク質に結合する際の結合形式として、糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにおけるアノマー性水酸基が、アスパラギン側鎖のアミノ基（−ＮＨ２）との間で脱水縮合をして結合する糖鎖の総称であり、Ｏ−結合型糖鎖は、糖鎖がタンパク質に結合する際の結合形式として、糖鎖の還元末端のアノマー性水酸基が、セリンまたはスレオニン側鎖の水酸基（−ＯＨ）との間で脱水縮合をして結合する糖鎖の総称である。
Ｎ−結合型糖鎖は、アスパラギン結合型糖鎖、Ｎ−型糖鎖等と呼ばれることもある。Ｎ−結合型糖鎖は、Ｍａｎ３−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃを母核とする糖鎖群である。母核のＭａｎに結合する糖鎖の構造により、高マンノース（ハイマンノース）型、複合（コンプレックス）型、混成（ハイブリッド）型と呼ばれる特定の糖鎖構造を有することが知られている。また、糖鎖の分岐構造としても、２分岐型、３分岐型、４分岐型などの多分岐型構造が知られている。これらの糖鎖の構造は、例えば、生化学辞典（第３版、株式会社東京化学同人発行）等にも記載されている。
【００２６】
本明細書において、第一の糖鎖または誘導体、すなわち、シアル酸転移酵素及びホスファターゼの存在下において、糖受容体となる糖鎖またはその誘導体は、非還元末端にシアル酸転移酵素の基質となる糖鎖構造を有するものである限り、特に限定されない。天然に存在する糖タンパク質としては、Ｎ−結合型糖鎖の複合（コンプレックス）型、混成（ハイブリッド）型において、非還元末端にシアル酸が結合した構造の分岐型糖鎖が多く知られており、これらの糖鎖を製造する観点からは、Ｎ−結合型複合型糖鎖、Ｎ−結合型混成型糖鎖が好ましく、非還元末端のすべてにシアル酸を有しうるＮ−結合型複合型糖鎖がより好ましい。また、分岐構造については、従来製造の困難であった、Ｎ−結合型の３分岐型または４分岐型糖鎖が好ましく、Ｎ−結合型の３分岐型または４分岐型の複合型糖鎖がより好ましい。
【００２７】
本明細書において、「第一の糖鎖またはその誘導体」とは、シアル酸転移反応において原料化合物（出発化合物ともいう）となる糖鎖またはその誘導体をいい、非還元末端の少なくとも１つに、シアル酸転移酵素の基質となる糖鎖構造を有する糖鎖をいう。シアル酸転移反応において、「第一の糖鎖またはその誘導体」を「糖受容体」または「受容体基質」といい、「ＣＭＰ−シアル酸」を「糖供与体」または「供与体基質」ということもある。「第一の糖鎖またはその誘導体」としては、例えば、分岐型の糖鎖において、各非還元末端がシアル酸転移酵素の基質となる構造を有する化合物、言い換えれば、目的化合物としての「シアル酸を有する第二の糖鎖またはその誘導体」からすべてのシアル酸が欠如した構造を有する化合物を用いることが好ましい。本明細書において、このような糖を「アシアロ糖鎖」、「アシアロ体」、または「アシアロ」と呼ぶことがある。
本明細書において、アシアロ糖鎖としては、例えば、下記式で表される４分岐型の糖鎖またはその誘導体が好ましい。
本明細書において、アシアロ４分岐型Ｎ−結合型複合型糖鎖またはその誘導体としては、例えば、下記式で表される糖鎖
【化７】
2012121041.tif 000010
またはその誘導体が好ましい。
本明細書において、アシアロ３分岐型Ｎ−結合型複合型糖鎖またはその誘導体としては、例えば、下記式で表される糖鎖
【化８】
2012121041.tif 000011
またはその誘導体が好ましい。
本明細書において、アシアロ２分岐型Ｎ−結合型複合型糖鎖またはその誘導体としては、例えば、下記式で表される糖鎖
【化９】
2012121041.tif 000012
またはその誘導体が好ましい。
また、上記糖鎖に対し、各糖鎖の非還元末端のうちの１つないし複数の箇所にシアル酸がグリコシド結合した糖鎖またはその誘導体を、本発明のシアル酸転移反応における糖受容体として用いることもできる。従来の方法では、多分岐型の糖鎖の場合にすべての非還元末端にシアル酸を有する糖鎖を製造することが困難であったところ、これらの従来方法により得られる糖鎖も本発明のシアル酸転移反応によって、すべての非還元末端にシアル酸を有する糖鎖にすることができる。例えば、従来方法により得られる糖鎖としては、下記式で表される化合物
【化１０】
2012121041.tif 000013
などが挙げられる。
上記化合物は、従来方法により得られる他、本発明の方法において、反応時間を調節することにより製造することもできる。
第一の糖鎖またはその誘導体として、糖鎖の非還元末端のうちの１つないし複数の箇所にシアル酸がグリコシド結合した糖鎖またはその誘導体を用い、当該化合物中のシアル酸のグリコシド結合とは異なるグリコシド結合を生じさせるシアル酸転移酵素を用いることにより、シアル酸のグリコシド結合様式が同一ではない化合物を製造することもできる。
【００２８】
本明細書において、「糖鎖の誘導体」には、糖鎖の還元末端に他の化合物が脱水縮合等により結合した化合物も含む。「糖鎖の誘導体」としては、例えば、下記式のように、
【化１１】
2012121041.tif 000014
糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにさらにＲが結合した化合物として表すことができる。上記の糖鎖誘導体は例示であって、他の糖鎖に対する誘導体の場合にも、同様に還元末端に−Ｒを付加する形で表すことができる。
糖鎖の誘導体としては、糖鎖の還元末端に、Ｒとして、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、リンカー、蛍光基、脂質、低分子化合物、放射性化合物などが付加されたものも含む。アミノ酸は、天然のアミノ酸のみならずアミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。アミノ酸、ペプチド、タンパク質等は、これらに含まれる水酸基、アミノ基、カルボキシル基のような官能基の一部ないし全部を保護基で保護したものであってもよい。水酸基の保護基としては、例えば、メチル基、ベンジル基、ベンゾイル基、アセチル基、トリメチルシリル（ＴＭＳ）基、トリエチルシリル（ＴＥＳ）基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳまたはＴＢＤＭＳ）基などを挙げることができる。アミノ保護基としては、例えば、脂溶性保護基として、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基などの、カーボネート系またはアミド系の保護基等を挙げることができる。脂溶性保護基を導入する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ基を導入する場合には、９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミジルカーボネートと炭酸ナトリウムを加えて反応を行うことにより導入できる。
カルボキシル基の保護基としては、例えば、ベンジル基、アリル基、ジフェニルメチル基などを挙げることができる。上記は例示であって、これらに限定されない。シアル酸転移酵素は、糖鎖の非還元末端に作用するものであるから、糖鎖の還元末端に対する付加物は、糖転移反応に大きな影響を及ぼすものでない限り、いかなるものでも用いることができる。リンカーは、糖鎖製造後に、アミノ酸やタンパク質等に結合させる際に有用であり、例えば、−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ａ−ＣＨ２−
（式中、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０〜４の整数を示す。）、
Ｃ１−１０ポリメチレン、−ＣＨ２−Ｒ１−（ここで、Ｒ１は、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、炭素環基、置換された炭素環基、複素環基及び置換された複素環基からなる群より選択される基から水素原子が１つ脱離して生ずる基である）等を挙げることができるが、これらに限定されない。また、蛍光基は、糖鎖製造後の精製や、糖鎖を検査等に用いる際に有用であり、例えば、ダンシル化、ピリジルアミノ（ＰＡ）化、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）、２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）、９−アミノピレン−１，４，６−トリスルホン酸（ＡＰＴＳ）化等を挙げることができる。また、糖鎖アミノ酸にさらにリンカーを付加する、あるいは、糖とアミノ酸がリンカーを介して結合するなど、２つ以上の付加物を任意の順序で付加したものであってもよい。
本明細書において、糖鎖の誘導体は、好ましくは、糖鎖アミノ酸、糖鎖付加ペプチド、糖鎖付加タンパク質であり、天然の糖タンパク質の糖鎖を製造する観点からは、糖鎖アスパラギン（糖鎖−Ａｓｎと表記することもある）がより好ましい。また、製造した糖鎖アスパラギンを固相合成に用いる観点からは、糖鎖アスパラギンに保護基が結合した化合物（糖鎖−Ａｓｎ−Ｒ２と表記することもある。ここで、Ｒ２は保護基を示す。）が好ましい。保護基としては、脂溶性保護基として、上記に例示したものの他、当業者に公知のものを用いることができる。例えば、脂溶性保護基である、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ等が付加した、糖鎖アスパラギンＦｍｏｃ（糖鎖−Ａｓｎ−Ｆｍｏｃ）、糖鎖アスパラギンＢｏｃ（糖鎖−Ａｓｎ−Ｂｏｃ）等が好ましい。
【００２９】
本明細書において、「シアル酸を有する第二の糖鎖またはその誘導体」とは、シアル酸転移反応において生成物となる糖鎖またはその誘導体をいい、非還元末端の少なくとも１つに、シアル酸を有する糖鎖またはその誘導体をいう。「シアル酸を有する第二の糖鎖またはその誘導体」として、非還元末端のうち、シアル酸転移酵素の基質となる構造を有する全ての非還元末端にシアル酸を有する糖鎖またはその誘導体が好ましい。また、「シアル酸を有する第二の糖鎖またはその誘導体」として、全ての非還元末端にシアル酸を有する糖鎖またはその誘導体がより好ましい。
本明細書において、シアル酸を有する糖鎖またはその誘導体について、糖鎖１分子に対して結合したシアル酸の数を特定する場合、糖鎖１分子に対してシアル酸４分子が結合した場合を「テトラシアロ」と呼び、糖鎖１分子に対してシアル酸３分子が結合した場合を「トリシアロ」と呼び、糖鎖１分子に対してシアル酸２分子が結合した場合を「ジシアロ」と呼び、糖鎖１分子に対してシアル酸１分子が結合した場合を「モノシアロ」と呼ぶ。また、「テトラシアロ糖鎖」や「テトラシアロ体」等の呼び方をすることもある。例えば、４分岐型の糖鎖１分子に対して、シアル酸が４分子結合した化合物であれば、「テトラシアロ」「４分岐型」の糖鎖であり、４分岐型の糖鎖１分子に対して、シアル酸が３分子結合した化合物であれば、「トリシアロ」「４分岐型」の糖鎖であり、３分岐型の糖鎖１分子に対して、シアル酸が３分子結合した化合物であれば、「トリシアロ」「３分岐型」の糖鎖ということができる。
本明細書において、「テトラシアロ」という場合には、糖鎖１分子に対してシアル酸４分子が結合していれば、シアル酸と糖鎖の間のグリコシド結合の種類を問わず、例えば、全て（α２，６）結合である化合物、全て（α２，３）結合である化合物、一部が（α２，６）結合であり、その他が（α２，３）結合である化合物等を含む。ただし、本明細書において、単に「（α２，６）テトラシアロ」と記載した場合には、４分子のシアル酸がすべて（α２，６）結合により糖鎖に結合した化合物をいい、単に「（α２，３）テトラシアロ」と記載した場合には、４分子のシアル酸がすべて（α２，３）結合により糖鎖に結合した化合物をいう。  シアル酸転移酵素により、「第一の糖鎖またはその誘導体」の非還元末端とシアル酸との間に形成されるグリコシド結合の結合様式は特に限定されないが、好ましくは、α２，６結合、α２，３結合、または、α２，８結合である。「シアル酸を有する第二の糖鎖またはその誘導体」が、糖鎖の非還元末端に複数のシアル酸を有する場合には、「第一の糖鎖またはその誘導体」の非還元末端とシアル酸との間に形成されるグリコシド結合の結合様式は同一であっても異なってもよい。
本明細書において、シアル酸転移反応の生成物としての、「シアル酸を有する第二の糖鎖またはその誘導体」は、例えば、下記式により表される糖鎖またはその誘導体が好ましい。
「シアル酸を有する第二の糖鎖またはその誘導体」として、第二の糖鎖の全ての非還元末端にシアル酸を有する４分岐型のＮ−結合型複合型糖鎖（本明細書において、テトラシアロ４分岐型Ｎ−結合型複合型糖鎖ともいう）としては、例えば、下記式により表わされる糖鎖
【化１２】
2012121041.tif 000015
またはその誘導体が好ましい。
また、「シアル酸を有する第二の糖鎖またはその誘導体」として、第二の糖鎖の全ての非還元末端にシアル酸を有する３分岐型のＮ−結合型複合型糖鎖（本明細書において、トリシアロ３分岐型Ｎ−結合型複合型糖鎖ともいう）としては、例えば、下記式により表わされる糖鎖
【化１３】
2012121041.tif 000016
またはその誘導体が好ましい。
また、「シアル酸を有する第二の糖鎖またはその誘導体」として、第二の糖鎖の全ての非還元末端にシアル酸を有する２分岐型のＮ−結合型複合型糖鎖（本明細書において、ジシアロ２分岐型Ｎ−結合型複合型糖鎖ともいう）としては、例えば、下記式により表わされる糖鎖
【化１４】
2012121041.tif 000017
またはその誘導体が好ましい。
なお、Ｎ−結合型複合型糖鎖としては、上記糖鎖にＦｕｃやＧｎが結合した化合物も存在することが知られており、そのような化合物も含まれる。より具体的には、還元末端のＧｎに対して、Ｆｕｃがα１，６結合することや、還元末端のＧｎに結合したＭａｎの４位にＧｎがβ１，４結合すること、分岐部分のＧｎにＦｕｃがα１，３またはα１，４結合することが知られている。また、上記糖鎖の分岐部分における結合様式が、Ｇｎ（β１，６）Ｍａｎに代えて、Ｇｎ（β１，４）ＭａｎまたはＧｎ（β１，２）Ｍａｎである化合物、Ｇｎ（β１，４）Ｍａｎに代えて、Ｇｎ（β１，２）Ｍａｎである化合物や、シアル酸が結合する部分における、Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌの一部がＳｉａ（α２，６）Ｇａｌに代えてＳｉａ（α２，３）Ｇａｌである化合物や、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌの一部がＳｉａ（α２，３）Ｇａｌに代えてＳｉａ（α２，６）Ｇａｌである化合物などのグリコシド結合の結合様式が異なる糖鎖も含まれる。
【００３０】
本明細書において、「ホスファターゼ」とは、リン酸エステルを加水分解する反応を触媒する酵素であり、糖転移酵素の反応条件下においてＣＭＰに対してリン酸エステルの加水分解活性を有するものであれば、特に制限されない。ホスファターゼとしては、アルカリ性条件下で活性を有するアルカリホスファターゼや酸性条件下で活性を有する酸性ホスファターゼ等が知られている。アルカリホスファターゼは、肝臓、腎臓、骨芽細胞、胎盤、小腸をはじめ広く全身に分布することが知られている。酸性ホスファターゼは、リソソームに貯蔵され、様々な臓器や血漿中にも存在することが知られている。ホスファターゼは、細菌由来、大腸菌由来、エビ由来、哺乳類由来のものなどが知られている。例えば、大腸菌由来アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）、牛由来アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ、ＣＡＰ、ＣＩＡＰ）、エビ由来アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）、等が知られている。
【００３１】
本明細書における、シアル酸転移反応について説明する。
シアル酸転移酵素は、市販のもの（α２，３−（Ｎ）−Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，  Ｒａｔ，  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，  Ｓ．  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、α２，３−（Ｏ）−Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，  Ｒａｔ，  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，  Ｓ．  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、α２，６−（Ｎ）−Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，  Ｈｕｍａｎ，  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｓ．  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ−ａｌｐｈａ−２，３−ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ−ａｌｐｈａ−２，６−ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅなど）を用いる他、公知の遺伝子配列やアミノ酸配列に基づいて、ＰＣＲ増幅や化学的に遺伝子合成を行い遺伝子を取得することが出来、この得られた遺伝子をプラスミド等の発現ベクターに挿入し、大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞などの発現系を用いて組換え体として酵素を得ることができる。またウシ小腸などの組織や培養した動物細胞などの生体試料からシアル酸転移酵素を精製し利用することが出来る。本明細書に記載した方法の他、当業者であれば、適宜変更等を加えて、製造することが可能である。
ホスファターゼも市販のもの、例えばＢａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＣＩＰ）、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｈｒｉｍｐ（ＳＡＰ）を用いる他、適宜製造することが可能である。
ＣＭＰ−シアル酸も市販のものとして、シチヂン−５'−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（二ナトリウム）等を用いる他、適宜製造することが可能である。
シアル酸転移酵素反応時の反応溶媒としては、シアル酸転移酵素の活性が保たれる条件であれば特に限定されず、ウシ血清アルブミン等の安定化剤や界面活性剤などを入れてもよい。例えば、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ  ＭｎＣｌ２，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む水溶液を用いることができる。当業者であれば、適宜変更等を加えて用いることができる。
反応溶媒のｐＨは、シアル酸転移酵素の活性が保たれる範囲であれば、特に限定されないが、シアル酸転移酵素の至適範囲として、ｐＨ５〜１０程度が好ましく、ｐＨ７〜８程度がより好ましい。また、用いるホスファターゼの活性が保たれる範囲を考慮し、中性よりも少しアルカリ側、又は、酸性側に調製してもよい。
反応温度は、シアル酸転移酵素の活性が保たれる条件であれば特に限定されない。酵素の至適温度としては、３７℃前後が好ましい。好ましくは、１０℃〜４０℃、より好ましくは、２０℃〜３７℃、さらに好ましくは、２５℃〜３７℃である。シアル酸転移酵素によるＣＭＰ−シアル酸の分解を防ぐ観点からは、２５℃〜３０℃が好ましい。
反応時間は、シアル酸転移反応が進行するのに十分な時間であれば特に制限されず、当業者であれば、適宜決定することができる。特に、多分岐型糖鎖の各非還元末端にシアル酸を転移する場合には、好ましくは、８時間〜４８時間、より好ましくは、１６〜２４時間とすることができる。
また、反応に際し、一定時間反応させた後、糖供与体となるＣＭＰ−シアル酸の他、ホスファターゼやシアル酸転移酵素を追加し、さらに反応させてもよい。これらは同時に追加してもよく、また、異なるタイミングで追加してもよい。例えば、２４時間反応させた後、ＣＭＰ−シアル酸及びシアル酸転移酵素を追加し、さらに２４時間反応させることもできる。
【００３２】
本明細書において、第一の糖鎖またはその誘導体は、天然物から精製し加工したものや、発現系において合成させた糖タンパク質を精製したもの、または、化学的または酵素的に合成したもの等を用いることができ、また、これらに対してさらに糖鎖伸長反応を行ったもの等を用いることができる。糖鎖伸長反応は、希望する糖鎖構造のグリコシド結合様式に合わせて、当該グリコシド結合の形成を触媒する酵素を選択し、糖鎖を構成する糖の結合順序に応じて、これらを順次行うことにより、製造することができる。
【００３３】
本発明の一態様においては、シアル酸転移反応において糖受容体となる糖鎖またはその誘導体として用いる多分岐型のＮ−結合型複合型糖鎖を、下記の式で表される糖鎖（以下、アガラクト２分岐型糖鎖という。）またはその誘導体を原料として糖鎖伸長反応を行うことにより、製造する。
【化１５】
2012121041.tif 000018
上記糖鎖の誘導体としては、例えば、下記式により表されるアガラクト２分岐型糖鎖Ａｓｎ−Ｆｍｏｃを用いることができる。
【化１６】
2012121041.tif 000019
【００３４】
本発明の一態様において、第一の糖鎖またはその誘導体が、４分岐型のＮ−結合型複合型糖鎖である場合には、上記式で示されるアガラクト２分岐型糖鎖またはその誘導体に対し、
（ａ）Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の存在下において、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを反応させる工程；
（ｂ）（ａ）の生成物に対し、ガラクトース転移酵素の存在下において、ＵＤＰ−Ｇａｌを反応させる工程；
を行うことによって、製造することができる。
Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素としては、糖鎖と転移する糖との間に生じさせるグリコシド結合に応じて選択すればよく、例えば、目的とするグリコシド結合がβ１−６結合である場合にはβ１−６結合を生じさせる酵素、目的とするグリコシド結合がβ１−４結合である場合にはβ１−４結合を生じさせる酵素を選択すればよい。β１−６結合を生じさせる酵素（β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素）としては、例えば、ヒトＭＧＡＴ５、ウシＧｎＴ−Ｖ等、β１−４結合を生じさせる酵素（β１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素）としては、例えば、ヒトＭＧＡＴ４ａ、ヒトＭＧＡＴ４ｂ、ウシＧｎＴ−ＩＶａなどを挙げることができる。
ガラクトース転移酵素としては、糖鎖と転移する糖との間に生じさせるグリコシド結合に応じて選択し、目的とするグリコシド結合がβ１−４結合である場合には、β１−４結合を生じさせる酵素を選択すればよく、例えば、β４ＧａｌＴ１、β４ＧａｌＴ２、Ｈｅｌｉｃｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ由来β１，４−ガラクトース転移酵素等を挙げることができる。
下記式で表される４分岐型の糖鎖
【化１７】
2012121041.tif 000020
またはその誘導体を製造する場合には、例えば、（ａ）において、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素として、ＭＧＡＴ４ａ及びＭＧＡＴ５、（ｂ）において、ガラクトース転移酵素として、β４ＧａｌＴ１を用いることにより、製造することができる。この酵素の組み合わせ以外にも、上記に例示した酵素等に置き換えて製造することもできる。
【００３５】
本発明の一態様において、第一の糖鎖またはその誘導体が、３分岐型のＮ−結合型複合型糖鎖である場合も、上記の４分岐型糖鎖の場合と同様に行うことができる。
下記式で表される３分岐型の糖鎖
【化１８】
2012121041.tif 000021
またはその誘導体を製造する場合には、例えば、（ａ）において、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素として、ＭＧＡＴ４ａ、（ｂ）において、ガラクトース転移酵素として、β４ＧａｌＴ１を用いることにより、製造することができる。
また、下記式で表される３分岐型の糖鎖
【化１９】
2012121041.tif 000022
またはその誘導体を製造する場合には、例えば、（ａ）において、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素として、ＭＧＡＴ５、（ｂ）において、ガラクトース転移酵素として、β４ＧａｌＴ１を用いることにより、製造することができる。この酵素の組み合わせ以外にも、上記に例示した酵素等に置き換えて製造することもできる。
【００３６】
本発明の一態様において、第一の糖鎖またはその誘導体が、２分岐型のＮ−結合型複合型糖鎖である場合には、上記式で示されるアガラクト２分岐型糖鎖に対し、
（ｂ）ガラクトース転移酵素の存在下において、ＵＤＰ−Ｇａｌを反応させる工程；
を行うことによって、製造することができる。
ガラクトース転移酵素については、４分岐型の場合と同様である。
【００３７】
本発明の一態様において、第一の糖鎖またはその誘導体が、４分岐型のＮ−結合型複合型糖鎖またはその誘導体であって、上記の糖鎖にフコースやＮ−アセチルグルコサミンがさらに結合した化合物である場合には、フコース転移酵素や、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素を用いてこれらの糖を付加することもできる。
【００３８】
本発明の一態様において、第一の糖鎖またはその誘導体を糖鎖伸長反応により製造する場合には、上記アガラクト２分岐型糖鎖を原料とする場合の他、アガラクト２分岐型糖鎖を含む鶏卵卵黄由来の糖ペプチド、ＰＡ化アガラクト２分岐型糖鎖（タカラバイオ社より販売）などを原料として、必要な糖鎖伸長反応を行うことにより製造することもできる。
【００３９】
本発明の一態様において、第一の糖鎖またはその誘導体を糖鎖伸長反応により製造する場合には、各糖鎖伸長反応後に、各糖鎖伸長反応の生成物としての糖鎖またはその誘導体を単離・精製してから次の糖鎖伸長反応に用いることができる。
【００４０】
本発明の一態様において、ワンポットでの合成反応として、上記の糖鎖伸長反応に続いて、シアル酸転移反応を行い、非還元末端にシアル酸を有する糖鎖またはその誘導体を製造する。
本明細書において、ワンポット合成とは、目的化合物の合成に至る過程で、中間生成物の単離・精製を行わずに目的化合物を合成する方法をいう。ワンポット合成反応は、
（ａ）糖転移酵素の存在下において、原料化合物に対し、前記糖転移酵素の基質となるＵＤＰ糖を反応させる工程を１回以上行う工程；
（ｂ）シアル酸転移酵素、及び、ホスファターゼの存在下において、工程（ａ）の生成物に対し、ＣＭＰ−シアル酸を反応させる工程；
を行うことにより製造することができる。
この際に、（ａ）の反応としては、例えば、上記の、２〜４分岐型のＮ−結合型複合型糖鎖の製造工程を行うことができる。
ワンポット合成反応においては、例えば、（ａ）の糖転移反応（（ａ）において糖転移反応を複数回行う場合には、各糖転移反応）、（ｂ）のシアル酸転移反応を開始する際に、（ａ）であれば、糖転移酵素濃縮液、及び、その基質となるＵＤＰ−糖の濃縮液を調製しておき、これらを少量添加することにより、行うことができる。
ワンポット合成反応においては、（ａ）の糖転移反応の後（（ａ）において糖転移反応を複数回行う場合には、各糖転移反応の後、次の糖転移反応開始の前に、）、加熱処理を行うことにより、反応系内の糖転移酵素による糖転移反応を停止させることができる。これにより、さらに、反応生成物の収率を上げることができる。また、（ｂ）工程終了後にも、加熱処理を行うことができる。
加熱処理の条件は、酵素が失活する程度のものであれば、特に限定されないが、例えば、９０℃以上の温度において一定時間保温することにより行うことができる。好ましくは、９０℃から１００℃、５〜１０分程度とすることができる。加熱処理条件は当業者が適宜変更することができる。
【００４１】
本発明の一態様において、製造した糖鎖は、周知の方法（例えば、ＨＰＬＣ等）により精製することができる。ＨＰＬＣ条件は、例えば、本明細書の実施例に記載の条件の他、糖鎖の構造に応じて、当業者が適宜変更することができる。
【００４２】
なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
【００４３】
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【００４４】
（１）ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの発現
ヒトＳＴ６Ｇａｌ−ＩのｍＲＮＡ配列は公共のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ６２８２２として、またアミノ酸配列はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｐ１５９０７として登録されている。このアミノ酸配列を基に、Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａのコドン使用に合わせた形で遺伝子全合成を行なった。なお合成した遺伝子はヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの細胞質ドメインと膜貫通領域を含むＮ−末端側４８アミノ酸を除いて発現させ、その外側には、発現ベクターへの導入を容易にすべく、制限酵素ＢａｍＨＩ部位を導入した。その配列を配列番号１に示す。この配列を含む領域をＢａｍＨＩで切断後、メタノール資化性酵母Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａの発現ベクターｐＯＭＥＡ１−１０Ｈ３ＦのＢａｍＨＩ部位に導入し、ｐＯＭＥＡ１−１０Ｈ３Ｆ−ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを作製した。このプラスミドｐＯＭＥＡ１−１０Ｈ３Ｆ−ＳＴ６Ｇａｌ−ＩをＮｏｔＩで切断後、Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ  ＴＫ−１０−１−２株（Δｏｃｈ１Δｐｅｐ４Δｐｒｂ１Δｕｒａ３Δａｄｅ１、ＷＯ２００３／０９１４３１）を形質転換した。形質転換はエレクトロポレーション法を用いて行なった。形質転換後、ＳＤ−Ａｄｅ（２％グルコース、０．１７％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  （Ｄｉｆｃｏ社製）、アデニンを除く核酸塩基及びアミノ酸混合物（２０−４００ｍｇ／Ｌ））培地にまいて、３０℃にて２日間培養し形質転換体を得た。形質転換体をプレートから掻きとり、ＰＣＲ反応液に懸濁する簡易法ＰＣＲにて染色体上への組み込みを確認し、ＹＴＹ−１株とした。
次に、より発現量を向上させるため、シャペロン遺伝子の導入を行なった。特願２００９−５３９１６２に記載された、ＯｍＰＤＩ１、ＯｍＥＲＯ１、ＯｍＫＡＲ２を恒常的に発現する遺伝子を含むベクターＯｎａＰ１１００７をＮｏｔＩで切断し、ＹＴＹ−１の形質転換を行なった。形質転換はエレクトロポレーション法を用いて行なった。形質転換後、ＳＤ−Ｕｒａ（２％グルコース、０．１７％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、ウラシルを除く核酸塩基及びアミノ酸混合物（２０−４００ｍｇ／Ｌ））培地にまいて、３０℃にて２日間培養し形質転換体を得た。形質転換体をプレートから掻きとり、ＰＣＲ反応液に懸濁する簡易法ＰＣＲにて染色体上への組み込みを確認し、ＹＴＹ−２株とした。
得られたＹＴＹ−２株を培養し、ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの発現を行なった。５ｍｌのＹＰＡＤ＋ＫＣｌ培地（２％ポリペプトン、１％酵母エキス、２％グルコース、アデニン（４０  ｍｇ／Ｌ）、０．３  Ｍ  ＫＣｌ）に植菌し、３０℃、一晩前培養した。次に１５０ｍｌのＹＰＡＤ＋ＫＣｌ培地に１ｍｌの前培養液を植菌し、３０℃、４８時間培養した。集菌後、１００ｍｌのＢＭＭＹ＋２％カザミノ酸培地（１％酵母エキス，２％ポリペプトン，１．３４％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  （Ｄｉｆｃｏ社製），０．１Ｍ  ＫＰｉ（ｐＨ６．０），２％カザミノ酸，０．５％メタノール）に再懸濁し、２０℃、９６時間培養した。なお、１２時間ごとに０．５％になるようにメタノールを添加した。培養終了後遠心して菌体を除き、粗酵素液とした。
粗酵素液はＳＰバッファー（２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５），０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に透析後、ＳＰバッファーで平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰ（５ｍｌ）に供した。ＳＰバッファーで洗浄後、１ＭのＮａＣｌを含むＳＰバッファーで溶出を行なった。ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ活性を示す画分を回収し、反応バッファー（２５ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．３）に透析し、部分精製標品とした。
酵素活性測定は以下のように行った。反応液（０．１Ｍ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．３），５ｍＭ  ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ，５０μＭ  ＰＡ化Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｅ（ＬＮｎＴ−ＰＡ））１８μｌに対し、粗酵素液を２μｌ加え反応を開始した。３７℃，３０分反応後、煮沸することで反応を停止し、ＨＰＬＣによる解析を行った。カラムはＡｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０（４．６×２５０ｍｍ：Ｓｈｏｄｅｘ社）を使用し、移動相は０．２Ｍトリエチルアミン−酢酸（ｐＨ７．０）（Ａ液）とアセトニトリル（Ｂ液）を用い、Ａ液：Ｂ液＝３０：７０でカラムを平衡化した。試料注入後２０分かけてＡ液：Ｂ液の割合を５０：５０まで直線的に変化させ、グラジェント溶出を行った。検出は蛍光検出器（Ｅｘ：３１５ｎｍ，Ｅｍ：３８０ｎｍ）にて行った。基質であるＬＮｎＴ−ＰＡは９分に、反応産物である６’−Ｓｉａｌｙｌ−ＬＮｎＴ−ＰＡは１８．５分に溶出される。ピーク面積から得られた反応産物を定量し、活性（Ｕ）とした。なお１Ｕは、１分間に１μｍｏｌの反応産物を生成する酵素量と定義した。【００４５】
（２）アシアロ４分岐複合型糖鎖の調製
アシアロ４分岐複合型糖鎖誘導体の１種として、下記式で表わされる化合物（以下、ＮＡ４−Ｆｍｏｃという。）を以下の方法により製造した。
【化２０】
2012121041.tif 000023
下記式で表される化合物（以下、ＮＧＡ２−Ｆｍｏｃという。）、
【化２１】
2012121041.tif 000024
すなわち、アスパラギン残基の側鎖にアガラクト型２分岐複合型糖鎖が結合し、またアスパラギン残基のアミノ基がＦｍｏｃで修飾された化合物を糖転移反応の受容体基質として用いた。反応液Ａ（０．１Ｍ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．３），４０ｍＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ，６．７ｍＭ  ＮＧＡ２−Ｆｍｏｃ，１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２，５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），１ｍＭ  ＰＭＳＦ）0．１５ ｍｌに０．３ｍＵのＭＧＡＴ４ａおよびＭＧＡＴ５を添加し、３７℃、１６時間反応を行なった。反応後、１００℃において５分間の加熱処理を行ない、酵素を失活させた。この溶液に等量の反応液Ｂ（０．１Ｍ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．３），３０ｍＭ  ＵＤＰ−Ｇａｌ，１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２，１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ，８ｍＭ  ＡＭＰ）０．１５ｍｌを添加後、５ｍＵのβ４ＧａｌＴ１を加え、３７℃において１６時間反応を行なった。反応後、１００℃において５分間の加熱処理を行ない、酵素を失活させた。
得られた反応液から目的糖鎖（ＮＡ４−Ｆｍｏｃ）の精製を行なった。カラムはＫｒｏｍａｓｉｌ  １００−５Ｃ１８（４．６×２５０ｍｍ：ＥＫＡ−ＣＨＥＭＩＣＡＬ社）を使用し、移動相は２５ｍＭ酢酸アンモニウム（Ａ液）とアセトニトリル（Ｂ液）を用い、Ａ液：Ｂ液＝８２：１８でカラムを平衡化した。試料注入後２０分で糖鎖を回収した。検出は蛍光検出器（Ｅｘ：２６５ｎｍ，Ｅｍ：３１５ｎｍ）にて行った。基質であるＮＧＡ２−Ｆｍｏｃは１４分に、反応産物であるＮＡ４−Ｆｍｏｃは８分にシングルピークとして溶出された。反応産物の糖鎖を回収し、ＮＡ４−Ｆｍｏｃとして以後の実験に用いた。【００４６】
（３）α２，６シアル酸が付加した４分岐複合型糖鎖の調製
α２，６シアル酸が付加した４分岐複合型糖鎖誘導体の１種として、下記式で表わされる化合物（以下、（α２，６）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃという。）
【化２２】
2012121041.tif 000025
の調製を以下のようにして行った。原料としての５０μＭ  ＮＡ４−Ｆｍｏｃを含む反応液Ｃ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ  ＭｎＣｌ２，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，２ｍＭ  ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ）を調製した。この反応液Ｃ２０μｌに、（１）で調製したＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを１６０μＵ添加し、３７℃で２４時間反応を行なった。反応０時間後、１時間後、６時間後、２４時間後の反応液のＨＰＬＣ解析の結果を図１に示す。２４時間後でも反応は完全には進まず、シアル酸が３分子付加した糖鎖（以下、（α２，６）ｔｒｉｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃという。図１中では、省略して「ｔｒｉｓｉａｌｏ−」で示す。）がメインピークであった。そこでさらに１６０μＵのＳＴ６Ｇａｌ−Ｉと終濃度として２ｍＭとなるようにＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ  ５μｌを反応液に添加し反応を行なったが、目的化合物としての、シアル酸が４分子付加した糖鎖である、（α２，６）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃ（図１中では、省略して「ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−」で示す。）の回収率は４０％程度であった。
シアル酸が４分子付加した糖鎖に対応するピークを回収し、（α２，６）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃとして以後の実験に用いた。【００４７】
（４）ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉのシアル酸分解活性の測定
酵素量の増加に伴う反応産物の増加が見られなかったため、反応産物が分解されている可能性が示唆された。そこで反応産物の分解が起きているかどうかを評価するため以下の実験を行なった。
５０ｐｍｏｌ分の（α２，６）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃ型糖鎖を含む反応液Ｄ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ  ＭｎＣｌ２，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を調製した。反応液Ｄ５μｌに５０μＵのＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ５μｌを添加し、３７℃で１７時間保温した。同様に５０μＵのＳＴ６Ｇａｌ−Ｉと終濃度として２ｍＭとなるようにＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ  ５μｌを加えた反応液を調製した。また同様に、５０μＵのＳＴ６Ｇａｌ−Ｉと１００℃において５分間加熱処理を行なったＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃを終濃度として２ｍＭとなるように加えた反応液を調製した。これらも同様に３７℃で１７時間保温した。反応産物は１００℃において５分間加熱後、（２）に示した方法と同様にＨＰＬＣ解析を行なった。その結果を図２に示す。基質供与体であるＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃを加えなかった場合にはシアル酸の脱離はほとんど見られなかった。一方、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃを加えた場合には、（α２，６）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃのうち約３０％が（α２，６）ｔｒｉｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃとなり、シアル酸の脱離が確認できた。さらに、加熱したＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃを加えた場合では、（α２，６）ｔｒｉｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃが５８％みられた。
一方、図３に示す通り、（α２，３）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃに対してＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを添加しても分解活性は全く見られなかった。また、（α２，３）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃに対し、α２，３シアル酸転移酵素であるＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩＩを添加しても分解は見られなかった。このことからＳＴ６Ｇａｌ−Ｉによるシアル酸の脱離はα２，６結合のシアル酸に特異的であることが示唆された。【００４８】
（５）ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃの安定性
基質供与体であるＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃの分解によってＣＭＰが生成しているかどうかを確認するため、５ｍＭのＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ／０．１Ｍ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．３）を２５℃、３０℃、３３℃、３７℃で保温し、ＣＭＰの生成量を測定した。測定はＨＰＬＣで行ない、カラムはＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ（７．５×７５ｍｍ：東ソー社）を用い、溶媒は５０ｍＭ  ＫＰｉ（ｐＨ８．０）を用いた。検出はＵＶ検出器（検出波長２５４ｎｍ）にて行なった。ＣＭＰの生成度は［ＣＭＰのピーク面積］／［ＣＭＰのピーク面積＋ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃのピーク面積］×１００（％）として表わした。その結果を図４に示す。２４時間後では、３７℃で４５％のＣＭＰが生成しているのに対し、３０℃では２１％であり、３７℃の場合の約半分であった。従って温度を下げてＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの反応を行なうことにより、ＣＭＰ依存的なシアル酸分解活性を抑制できることが示唆された。
次に、α２，６シアル酸が付加した４分岐複合型糖鎖の生成率を評価するため、５０μＭ  ＮＡ４−Ｆｍｏｃを含む反応液Ｅ（０．１Ｍ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．３），５ｍＭ  ＭｎＣｌ２，５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン，５ｍＭ  ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ）を調製した。反応液Ｅ１０μｌに、（１）で調製したＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを１００μＵ添加し、１０℃、２０℃、２５℃、３０℃、３７℃で２４時間反応を行なった。図５に示すように、反応２４時間後において、２５℃と３０℃で反応させた場合に、目的の糖鎖である（α２，６）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃの収率が高かった。従って、（α２，６）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃの収率を上げるためには、シアル酸転移酵素の至適温度から外れた２５℃〜３０℃で反応させた方がよいことが示唆された。【００４９】
（６）α２，６シアル酸が付加した４分岐複合型糖鎖（（α２，６）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃ）の分解抑制法の確立
基質供与体であるＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃの分解の他にも、合成反応の副産物としてＣＭＰが生成するため、これらのＣＭＰを分解することによりシアル酸転移酵素によるシアル酸脱離反応を抑制することを試みた。２５ｐｍｏｌ分の（α２，６）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃと２．５ｎｍｏｌのＣＭＰを含む反応液Ｅ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ  ＭｎＣｌ２，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を調製した。この反応液Ｅ１０μｌに２５μＵのＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを添加し、３７℃で１７時間保温した。同様に２５μＵのＳＴ６Ｇａｌ−Ｉと５０μＵの大腸菌由来アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）（タカラバイオ社）を加えた反応液を調製し、同様に保温した。反応産物は１００℃において５分間加熱後、（３）に示した方法で分析を行なった。その結果を図６に示す。ＣＭＰを加えた場合には、２４時間後には（α２，６）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃのうち約７０％が（α２，６）ｔｒｉｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃとなり、シアル酸の脱離が確認された。一方、大腸菌由来アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）を添加した場合には、（α２，６）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃの分解はほとんど見られなかった。このことから、ＣＭＰをホスファターゼで分解し５’−シチジン酸とすることにより、ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉのテトラシアロ糖鎖に対するシアル酸脱離活性を抑制できることを確認した。【００５０】
（７）α２，６シアル酸が付加した４分岐複合型糖鎖のワンポット合成法の確立
１５０μｌの反応液Ｆ（０．１Ｍ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．３），４０ｍＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（６μｍｏｌ），６．７ｍＭ  ＮＧＡ２−Ｆｍｏｃ（１μｍｏｌ），０．３ｍＵ  ＭＧＡＴ４ａ，０．３ｍＵ  ＭＧＡＴ５，５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ）を調製し、３７℃において１６時間反応を行なった。１００℃において５分間保温し反応を停止後、反応液Ｆに対して２５０μｌの反応液Ｇ（０．１Ｍ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．３），２４ｍＭ  ＵＤＰ−Ｇａｌ（６μｍｏｌ），４．８ｍＵ  β４ＧａｌＴ１，８ｍＭ  ＭｎＣｌ２，５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ，４ｍＭ  ＡＭＰ）を添加し、３７℃、１６時間反応を行なった。１００℃において５分間保温し反応を停止後、減圧乾固を行なった。このチューブに２５０μｌの反応液Ｈ（４０ｍＭ  ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ（１０μｍｏｌ），３ｍＵ  ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ，１５ｍＵ  ＢＡＰ）を添加し、３０℃において１６時間反応を行なった。さらにＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ（２０ｍＭ  ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ）５μｌを添加し、３０℃において１６時間反応を行なった。反応後、１００℃において５分間の加熱処理を行ない、反応を停止させた。上記の一連のワンポット合成反応をフローチャートとして、図７に示す。また、上記の一連のワンポット合成反応における糖鎖付加反応を、構造式を用いて模式的に図８に示す。
反応原料及び反応生成物について、ＨＰＬＣ解析を行ない、（α２，６）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃの定量を行なった。ＨＰＬＣ解析条件として、カラムはＡｍｉｄｏ−８０（３μｍ、４．６×１５０ｍｍ：ＴＯＳＯＨ社）を使用し、移動相はアセトニトリル（Ａ液）と０．２Ｍ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）（Ｂ液）を用い、Ａ液：Ｂ液＝７５：２５でカラムを平衡化した。試料注入後３５分で糖鎖を回収した。検出は蛍光検出器（Ｅｘ：２６５ｎｍ，Ｅｍ：３１５ｎｍ）にて行った。その結果を図９に示す。反応原料であるＮＧＡ２−Ｆｍｏｃは約１６分に、反応生成物である（α２，６）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃは約３０分にシングルピークとして溶出された。反応原料のＮＧＡ２−Ｆｍｏｃのピーク面積に対し、得られた（α２，６）ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ−ＮＡ４−Ｆｍｏｃのピーク面積は９０％であり、ワンポット合成で非常に収率よく目的糖鎖の合成が出来ることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の方法により、シアル酸転移酵素を用いたシアル酸含有糖鎖を従来よりも効率よく製造することができる。特に、従来製造の困難であった、３分岐型または４分岐型の複合型糖鎖に対し、分岐鎖の各非還元末端のすべてにシアル酸が結合したシアル酸含有糖鎖またはその誘導体を効率よく製造することができる。また、その製造方法としても、ワンポットの合成反応で簡便に収率よく製造することができ、従来困難であったこれらの糖鎖（特に（α２，６）テトラシアロ４分岐複合型糖鎖など）の量産をも可能とするものである。これらの糖鎖は、新規の機能を有する糖鎖、糖タンパク質などの医薬品や、分析機器のための標準品、学術用試薬、糖鎖アレイの一糖鎖として利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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