(57)【要約】  本発明は、メタノール資化性酵母における異種タンパク質の分泌生産性を向上させることを課題とする。  本発明は、VPS遺伝子が破壊されているメタノール資化性酵母を異種タンパク質の分泌生産用宿主として用いることを特徴とする、異種タンパク質の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
VPS遺伝子が破壊されているメタノール資化性酵母を異種タンパク質の分泌生産用宿主として用いることを特徴とする、異種タンパク質の製造方法。
【請求項２】
PRB1遺伝子がさらに破壊されているメタノール資化性酵母を異種タンパク質の分泌生産用宿主として用いることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
メタノール資化性酵母が、ピキア属酵母である、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
ピキア属酵母が、ピキア・アングスタ、ピキア・メタノリカ、ピキア・ミニュータ、およびピキア・パストリスからなる群より選ばれる、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
VPS遺伝子が、VPS5、VPS6、VPS8、VPS10、VPS15、VPS17、VPS21、VPS26、VPS29、VPS34、VPS35、およびVPS45からなる群より選ばれる少なくとも１種類であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
異種タンパク質が、ヒトまたは動物治療用タンパク質であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
異種タンパク質が、抗体または部分抗体であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、VPS遺伝子の破壊により異種タンパク質の分泌生産性が向上した酵母を宿主として用いた異種タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子組換え技術を用いてタンパク質を生産するための宿主として、ＣＨＯ等の動物細胞や、カイコ等の昆虫及び昆虫細胞、ニワトリや牛などの動物、大腸菌、酵母などの微生物などが用いられている。中でも、酵母は安価な培地で大規模な高密度培養が可能であり、タンパク質を低コストで生産することができる。また、分泌シグナルペプチド等を利用すれば培養液中への分泌生産も可能なため、タンパク質の精製も容易となる。【０００３】
しかし、酵母を宿主に用いた場合、異種タンパク質の生産性は常に高いものではないため、強力なプロモーターの使用、シャペロン遺伝子の導入によるシャペロン機能の強化、宿主酵母が有するプロテアーゼ遺伝子の破壊、などの育種改良により生産性を向上させている。【０００４】
一方、培養液中への異種タンパク質分泌生産においては、上述の育種改良の他に、VPS遺伝子（Vacuolar Protein Sorting）の破壊による生産性向上が報告されている。【０００５】
VPS遺伝子は、出芽酵母サッカロマイセス・セレビシアエにVPS1〜75で表記される61遺伝子の存在が知られているが、全てのVPS遺伝子に効果があるわけではなく、特定のVPS遺伝子の破壊によって異種タンパク質の分泌生産性が向上することが報告されている（非特許文献１、特許文献１、２、３）。【０００６】
また、異種タンパク質の分泌生産性向上に効果のある遺伝子は、酵母の種類によって異なり、例えば、VPS10遺伝子の破壊は、分裂酵母シゾサッカロマイセス・ポンベでは有効である（非特許文献１）が、出芽酵母サッカロマイセス・セレビシアエでは効果を示さない（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2009-60797号公報
【特許文献２】特開2009-240185号公報
【特許文献３】特開2010-193869号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Alimjan I. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010 vol85 667-677
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
出芽酵母サッカロマイセス・セレビシアエや分裂酵母シゾサッカロマイセス・ポンベとは性質が大きく異なるメタノール資化性酵母において、VPS遺伝子の破壊が異種タンパク質の分泌生産に及ぼす効果は不明であった。そこで、本発明者らは、メタノール資化性酵母において有効なVPS遺伝子破壊を見出し、異種タンパク質の分泌生産性を向上させることを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下の発明を包含する。
(1) VPS遺伝子が破壊されているメタノール資化性酵母を異種タンパク質の分泌生産用宿主として用いることを特徴とする、異種タンパク質の製造方法。
(2) PRB1遺伝子がさらに破壊されているメタノール資化性酵母を分泌生産用宿主として用いることを特徴とする、(1)に記載の製造方法。
(3) メタノール資化性酵母が、ピキア属酵母の形質転換体である、(1)または(2)のいずれかに記載の製造方法。
(4) ピキア属酵母が、ピキア・アングスタ、ピキア・メタノリカ、ピキア・ミニュータ、およびピキア・パストリスからなる群より選ばれる、(3)に記載の製造方法。
(5) VPS遺伝子が、VPS5、VPS6、VPS8、VPS10、VPS15、VPS17、VPS21、VPS26、VPS29、VPS34、VPS35、およびVPS45からなる群より選ばれる少なくとも１種類であることを特徴とする、(1)〜(4)のいずれかに記載の製造方法。
(6) 異種タンパク質が、ヒトまたは動物治療用タンパク質であることを特徴とする、(1)〜(5)のいずれかに記載の製造方法。
(7) 異種タンパク質が、抗体または部分抗体であることを特徴とする、(1)〜(6)のいずれかに記載の製造方法。【００１１】
本願は、２０１１年３月１１日に出願された日本国特許出願２０１１−０５４６３７の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、異種タンパク質の分泌生産性が向上したメタノール資化性酵母を宿主として用いる異種タンパク質の製造方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の「メタノール資化性酵母」とは、メタノールを単一炭素源として生育できる酵母を意味する。好ましくは、ピキア属やキャンディダ属に属する酵母であり、さらに好ましくは、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・アングスタ（Pichia angsta）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピキア・ミニュータ（Pichia minuta）、キャンディダ・ボイディニィ（Candida boidinii）に属する酵母である。
【００１４】
ピキア・アングスタとしては、好ましくはNCYC495（ATCC14754）、8V（ATCC34438）、DL-1（ATCC26012）などの株が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。これらの菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション等から入手することができる。また、これらの菌株からの誘導株等も使用でき、例えば、ロイシン要求性株であれば、NCYC495由来のBY4329、8V由来のBY5242、DL-1由来のBY5243などが挙げられ、これらはNational BioResource Projectから分譲可能である。
【００１５】
ピキア・パストリスとしては、好ましくはY-11430、X-33などの株が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。これらの菌株は、Northern Regional Research Laboratory等から入手することができる。また、これらの菌株からの誘導株等も使用できる。
【００１６】
ピキア・ミニュータとしては、好ましくはNBRC1473、NBRC0975、NBRC10402、NBRC10746などの株が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００１７】
ピキア・メタノリカとしては、好ましくはNBRC1909、NBRC10704、NBRC101503などの株が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００１８】
キャンディダ・ボイディニィとしては、NBRC1967、NBRC10035、NBRC10240、NBRC10329、NBRC10574、NBRC10871、NBRC101490、NBRC101491などの株が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。これらの菌株は、NITE Biological Resource Center等から入手することができる。また、これらの菌株からの誘導株も使用できる。
【００１９】
本発明の「異種タンパク質」とは、特に限定されるものではないが、微生物由来の酵素類、多細胞生物である動物や植物が産生するタンパク質等である。例えば、フィターゼ、プロテインA、プロテインG、プロテインL、アミラーゼ、グルコシダーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、グルタミナーゼ、ペプチダーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、ラクターゼ、キシラナーゼ 、トリプシン 、ペクチナーゼ、イソメラーゼ、蛍光タンパク質などが挙げられる。好ましい例としては、ヒトまたは動物治療用タンパク質が挙げられる。
【００２０】
ヒトまたは動物治療用タンパク質として、具体的には、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、ヒルジン、抗体、部分抗体、血清アルブミン、上皮成長因子、インシュリン、成長ホルモン、エリスロポエチン、インターフェロン、血液凝固第VIII因子、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、トロンボポエチン、IL-1、IL-6、組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)、ウロキナーゼ、レプチン、幹細胞成長因子(SCF)などが挙げられる。これらの治療用タンパク質のなかでも抗体や部分抗体が好ましい。
【００２１】
「抗体」とは、L鎖とH鎖の各2本のポリペプチド鎖がジスルフィド結合して構成されるヘテロテトラマータンパク質のことを指し、特定の抗原に結合する能力を有していれば、特に限定されない。
【００２２】
「部分抗体」とは、Fab型抗体、（Fab)2型抗体、scFv型抗体、diabody型抗体や、これらの誘導体等のことを指し、特定の抗原に結合する能力を有していれば、特に限定されない。Fab型抗体とは、抗体のL鎖とFd鎖がS-S結合で結合したヘテロマータンパク質、または抗体のL鎖とFd鎖がS-S結合を含まず会合したヘテロマータンパク質のことを指し、特定の抗原に結合する能力を有していれば、特に限定されない。
【００２３】
上述の異種タンパク質の由来となる動物は、特に限定されず、ヒト、マウス、ラット、ニワトリ、ラクダなどが挙げられ、また異種タンパク質は、これらの複数の動物由来のタンパク質のキメラタンパク質であっても良い。
【００２４】
上述の異種タンパク質を分泌生産する分泌生産用宿主は、遺伝子組換え技術により異種タンパク質の分泌発現ベクターを形質転換することで作製できる。
【００２５】
本発明の「分泌生産」とは、メタノール資化酵母を液体培養して、菌体内部でなく培養上清に異種タンパク質を蓄積させることを指す。分泌生産は、異種タンパク質に、分泌シグナルを融合したタンパク質として発現させることにより行い、融合は、例えば、異種タンパク質をコードする塩基配列の5’末端にシグナル配列をコードする塩基配列を導入することにより行う。
【００２６】
シグナル配列をコードする塩基配列は、メタノール資化性酵母が異種タンパク質を分泌発現できるシグナル配列であれば特に限定されないが、サッカロマイセス・セレビシアエのMating Factor α（MFα）や、ピキア・アングスタやピキア・パストリスの酸ホスファターゼ（PHO1）、サッカロマイセス・セレビシアエのインベルターゼ（SUC2）、サッカロマイセス・セレビシアエのPLB1、牛血清アルブミン（BSA）、ヒト血清アルブミン(HSA)、免疫グロブリンのシグナル配列をコードする塩基配列などが挙げられる。
【００２７】
本発明の「分泌生産用宿主」とは、異種タンパク質を分泌生産するための発現ベクターを導入することにより、異種タンパク質を高生産できる宿主を意味し、VPS遺伝子が破壊されていることを特徴とする。
【００２８】
「異種タンパク質を分泌生産するための発現ベクター」とは、形質転換後の宿主細胞において目的遺伝子が発現する機能を持った核酸分子のことを指し、発現カセットと、組み込み相同領域、栄養要求性相補遺伝子または薬剤耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子、自律複製配列などを有している。
【００２９】
形質転換後のベクターは、染色体に組み込まれている状態でも良いし、自律複製型として存在している状態でも良い。自律複製型ベクターの例としては、YEpベクター、YRpベクター、YCpベクターなどが挙げられる。ピキア属の場合はpPICHOLI、pHIP、pHRP、pHARSなどが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００３０】
「発現カセット」とは、プロモーターおよび異種タンパク質遺伝子より構成され、ターミネーター遺伝子を含んでも良い。また、分泌するための分泌シグナルは、異種タンパク質のシグナルを用いても良いし、別途宿主で機能しうる分泌シグナルを融合させた状態でも良い。本発現カセットは、例えば、pUC19等のプラスミド上に構築することもできるし、PCR法によっても作成することができる。
【００３１】
酵母の形質転換法は公知の方法、例えば、エレクトロポレーション法や酢酸リチウム法、スフェロプラスト法などが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００３２】
例えば、ピキア・アングスタの形質転換法としては、Highly-efficient electrotransformation of the yeast Hansenula polymorpha.（Curr Genet 25: 305.310.）に記載されているエレクトロポレーション法が一般的である。
【００３３】
本発明の「VPS遺伝子」とは、メタノール資化性酵母において液胞へのタンパク質輸送機構に関わるタンパク質をコードする遺伝子をいい、具体的には、サッカロマイセス・セレビシアエにおいてVPS1〜75と命名されている61個のVPS（vacuolar protein sorting）遺伝子に対応するメタノール資化性酵母のオーソログ遺伝子を指す。さらに、サッカロマイセス・セレビシアエに存在しないが、メタノール資化性酵母で液胞へのタンパク質輸送機構に関わるタンパク質をコードする遺伝子として定義されている遺伝子も、本発明のVPS遺伝子に含まれる。
【００３４】
「オーソログ遺伝子」とは、共通の祖先の遺伝子から進化した、同じ機能を有する、異なる種の遺伝子群をいう。よって、オーソログ遺伝子は、機能的および進化的に等価な関係を有する限り、オーソログ遺伝子間の配列同一性の程度は特に限定はされないが、例えば、アミノ酸配列レベルで３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上をいう。
【００３５】
本発明のVPS遺伝子の破壊は、異種タンパク質の分泌生産性が向上していれば、1種類のVPS遺伝子の単独破壊であっても、複数のVPS遺伝子の多重破壊であっても良い。さらに、VPS遺伝子を他の遺伝子と同時に破壊することで分泌生産性が向上する場合、それらの組合せも含まれる。
【００３６】
VPS遺伝子と同時に破壊させる「他の遺伝子」としては、例えば、VPS遺伝子の破壊によって細胞外に異常分泌されるカルボキシペプチダーゼYなどの液胞プロテアーゼをコードする遺伝子が挙げられる。液胞プロテアーゼ遺伝子を破壊することにより、分泌生産された異種タンパク質の分解を抑制することができる。
【００３７】
液胞プロテアーゼ遺伝子の例としては、サッカロマイセス・セレビシアエにおいてPRB1と命名されている遺伝子に対応するメタノール資化性酵母のオーソログ遺伝子などが挙げられる。
【００３８】
なお、分泌生産性の向上効果は、遺伝子破壊前の株と遺伝子破壊株に異種タンパク質の分泌発現ベクターをそれぞれ導入し、得られた各形質転換体を、液体培養など同一条件で培養を行い、培養上清中に蓄積する異種タンパク質濃度を比較することで評価できる。あるいは、培養液中に含まれる異種タンパク質の総量を、培養した菌体量（ODや乾燥菌体重）で除して求められる、菌体あたりの異種タンパク質の生産量で比較してもよい。
【００３９】
本発明において、「遺伝子が破壊されている」とは、その遺伝子の機能が失われている状態、または著しく機能が減少している状態を指す。例えば、VPS遺伝子が破壊されている状態には、当該遺伝子産物が全く発現されない場合だけでなく、当該遺伝子産物が発現されてもVPSとして正常な機能を有しない場合を含む。このような遺伝子の破壊は、当該遺伝子のORF内の塩基の改変（欠失、置換、付加、または挿入）、および／またはプロモーター領域、エンハンサー領域、ターミネーター領域などの転写開始または停止を制御する領域内の塩基の改変（欠失、置換、付加、または挿入）により行う。なお、前記欠失、置換、付加、または挿入を行う部位や、欠失、置換、付加、または挿入される配列は、当該遺伝子の正常な機能が欠損しうる限り、特に限定されない。
【００４０】
本発明における遺伝子破壊株を得る方法は特に限定されないが、VPS遺伝子の配列の一部または全部と選択マーカーからなる遺伝子破壊ベクターを用いて、目的とするVPS遺伝子周辺に相同組換えによりベクターを導入する方法等が挙げられる。あるいは、非相同組換えや変異剤処理等を用いても構わない。
【００４１】
本発明のVPS遺伝子の破壊株は、メタノール資化性酵母での異種タンパク質の分泌生産量が向上するのであれば、特に限定されないが、分泌生産性向上効果が大きいことから、VPS5、VPS6、VPS8、VPS10、VPS15、VPS17、VPS21、VPS26、VPS29、VPS34、VPS35、VPS45の破壊株が好ましく、VPS8、VPS10、VPS15、VPS17、VPS21、VPS26、VPS45の破壊株がより好ましく、VPS8、VPS10、VPS15の破壊株が最も好ましい。破壊する上記VPS遺伝子は、１種であってもよく、２種以上であってもよい。
【００４２】
本発明の分泌生産用宿主を用いて異種タンパク質を分泌生産する方法としては、上記の分泌生産用宿主を培養し、その培養上清中に蓄積させる方法が挙げられる。
【００４３】
分泌生産用宿主の培養は、通常メタノール資化性酵母が資化しうる栄養源を含む培地であれば何でも使用できる。
【００４４】
例えば、グルコース、シュークロース、マルトース等の糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸類、メタノール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、パラフィン等の炭化水素類、大豆油、菜種油等の油脂類、またはこれらの混合物等の炭素源、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカー等の窒素源、更に、その他の無機塩、ビタミン類等の栄養源を適宜混合・配合した通常の培地を用いることができ、バッチ培養や連続培養のいずれでも培養可能である。
【００４５】
本発明の分泌生産用宿主を用いて生産された異種タンパク質は、培養上清の状態であっても良いし、そこから任意の方法で単離したものでも良い。培養上清からのタンパク質の単離は、公知のタンパク質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。
【００４６】
例えば、まず、当該分泌生産用宿主を適当な培地で培養し、培養液の遠心分離、あるいは、濾過処理により培養上清から菌体を除き、得られた培養上清を、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いることにより、該培養上清から本発明の異種タンパク質を単離する。
【００４７】
単離された異種タンパク質は、そのまま使用することもできるが、その後PEG化等の薬理学的な変化をもたらす修飾、酵素やアイソトープ等の機能を付加する修飾を加えて使用することもできる。また、各種の製剤化処理を使用しても良い。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組み換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：
Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）、Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）、Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）。【００４９】
また、以下の実施例において取得したプラスミドは、大腸菌E. coli DH5αコンピテントセル（タカラバイオ社製）を用いて、これに記載の条件で行うことにより取得した形質転換体を用いて増幅している。【００５０】
PCRにはPrime STAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を用い、反応条件は添付のマニュアルに記載の方法で行った。ゲノムDNAの調製は、各菌株からGenとるくん（タカラバイオ社製）を用いて、これに記載の条件で実施した。【００５１】
抗体発現ベクターおよびVPS遺伝子破壊ベクターの構築において利用した、MOXプロモーター（配列番号1）、MOXターミネーター（配列番号2）、LEU2遺伝子（配列番号3）、GAPプロモーター（配列番号4）は、ピキア・アングスタ 8V株のゲノムDNAをテンプレートにしてPCRで調製した。【００５２】
Mating Factorαプレプロシグナル（MFα、配列番号5）は、サッカロマイセス・セレビシアエS288c株のゲノムDNAをテンプレートにしてPCRで調製した。抗体遺伝子は、完全ヒト型化抗TNF-α 抗体（adalimumab；HUMIRA（登録商標））の公開配列情報（特開2009−082033）に基づいて、L鎖（配列番号6）、H鎖（配列番号7）を化学合成したものをテンプレートにしてPCRで調製した。G418耐性遺伝子（配列番号8）は、pMW218（ニッポン・ジーン社製）をテンプレートにしてPCRで調製した。ゼオシン耐性遺伝子（配列番号52）は、pPICZα(Invitrogen社製)をテンプレートにしてPCRで調製した。VPS8遺伝子（配列番号9）、VPS10遺伝子（配列番号10）、VPS15遺伝子（配列番号11）、VPS17遺伝子（配列番号12）、VPS21遺伝子（配列番号13）、VPS26遺伝子（配列番号14）、VPS45遺伝子（配列番号15）、PRB1遺伝子（配列番号53）は、ピキア・アングスタ NCYC495株のゲノムDNAをテンプレートにしてPCRで調製した。
（実施例１）Fab抗体発現ベクターの構築【００５３】
HindIII-NotI-BamHI-SpeI-MunI-BglII-XbaI-EcoRIのサイトを有する遺伝子断片（配列番号16）を全合成し、これをpUC19のHindIII-EcoRIサイトに挿入してpUC-1を調製した。【００５４】
LEU2遺伝子の両側にHindIIIサイトを有する遺伝子断片を、プライマー1および2（配列番号17および18）を用いたPCRにより調製し、HindIII処理後にpUC-1のHindIIIサイトに挿入した(pUC-2)。【００５５】
次に、MOXプロモーターの両側にBamHIサイトを有する遺伝子断片を、プライマー3および4（配列番号19および20）を用いたPCRにより調製し、BamHI処理後にpUC-2のBamHIサイトへ挿入した（pUC-3）。【００５６】
MOXプロモーターの両側にMunIサイトを有する遺伝子断片を、プライマー5および6（配列番号21および22）を用いたPCRにより調製し、MunI処理後にpUC-3のMunIサイトへ挿入した（pUC-4）。【００５７】
MOXターミネーターの両側にXbaIサイトを有する遺伝子断片を、プライマー7および8（配列番号23および24）を用いたPCRにより調製し、XbaI処理後にpUC-4のXbaIサイトに挿入した(pUC-PmPmTm)。【００５８】
MFαの上流にSpeIサイトを有する遺伝子断片を、プライマー9および10（配列番号25および26）を用いたPCRにより調製した。L鎖の上流にMFαの3’末端20bpを有し、下流にSpeIサイトを有する遺伝子断片を、プライマー11および12（配列番号27および28）を用いたPCRにより調製した。これらの遺伝子断片を混合してテンプレートにして、プライマー9および12を用いたPCRにより、MFαとL鎖の融合遺伝子の両側にSpeIサイトを有する遺伝子断片を調製した。本遺伝子断片をSpeI処理後、pUC-PmPmTmのSpeIサイトに挿入し、pUC-PmLPmTmを構築した。【００５９】
MFαの上流にBglIIサイトを有する遺伝子断片をプライマー13（配列番号29）および10を用いたPCRにより調製した。Fd鎖の上流にMFαの3’末端20bpを有し、下流にBglIIサイトを有する遺伝子断片を、プライマー14および15（配列番号30および31）を用いたPCRにより調製した。これらの遺伝子断片を混合してテンプレートにし、プライマー13および15を用いたPCRにより、MFαとFd鎖の融合遺伝子の両側にBglIIサイトを有する遺伝子断片を調製した。本遺伝子断片をBglII処理後、pUC-PmLPmTmのBglIIサイトに挿入し、pUC-PmLPmFTmを構築した。【００６０】
本発現ベクターは、Fab型抗体のL鎖およびFd鎖がそれぞれ別々のMOXプロモーター制御下で発現するように設計されている。
（実施例２）Fab抗体発現株の育種【００６１】
実施例１で構築したFab抗体発現ベクターを、MOXターミネーター内のEcoRVまたはNruIサイトで切断して直鎖状にし、本断片を用いてピキア・アングスタを形質転換した。形質転換方法は以下の通りである。【００６２】
ピキア・アングスタ BY4329（NCYC495由来、leu1-1）を3mlのYPD培地（1% yeast extract bacto（Difco社製），2% tryptone bacto（Difco社製），2% glucose）にそれぞれ接種し、37℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液500μlを50mlのYPD培地に接種し、OD600が1〜1.5になるまで30℃で振盪培養後、集菌（3000×g、10分、20℃）した。【００６３】
菌体を250μlの1M DTT（終濃度25mM）を含む10mlの50mMリン酸カリウムバッファー, pH7.5に懸濁し、懸濁液を37℃で15分インキュベートした。集菌（3000×g、10分、4℃）した後、氷冷した50mlのSTMバッファー（270mMスクロース, 10mM Tris-HCl, 1mM塩化マグネシウム, pH7.5）で菌体を再懸濁した。集菌（3000×g、10分、4℃）後、菌体を25mlの氷冷STMバッファーで再懸濁した。集菌（3000×g、10分、4℃）した後、菌体を250μlの氷冷STMバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。【００６４】
このコンピテントセル溶液60μlと直鎖状のFab抗体発現ベクター溶液3μl（DNA量0.5〜1μg）を混合し、エレクトロポレーション用キュベット（ディスポキュベット電極，電極間隔2mm；ビーエム機器社製）に移し入れ、7.5kV／cm、10μF、900Ωの条件でエレクトロポレーションした。その後、菌体をYPD培地1mlで懸濁し、37℃で1時間静置した。集菌（3000×g、5分、室温）し、1mlのYNB培地（0.67% yeast nitrogen base（Difco社製），1% glucose）で菌体を洗浄し、再度集菌（3000×g、5分、室温）した。菌体を適当量のYNB培地で懸濁後、YNB選択寒天プレートに塗布し、37℃、3日間の静置培養で生育する株を選択し、Fab抗体発現株を取得した。
（実施例３）VPS8の遺伝子破壊【００６５】
VPS8 ORF（配列番号9）の989〜3395の配列の上下流それぞれにSpeIサイトを有する断片を、プライマー16および17（配列番号32および33）を用いてPCRで調製した。本断片をSpeI処理後、pUC-1のSpeIサイトに挿入し、pUC-VPS8を得た。【００６６】
GAPプロモーターの上流にHindIIIサイト、下流にG418耐性遺伝子の5’末端の配列を付加した断片を、プライマー18および19（配列番号34および35）を用いてPCRで調製した。G418耐性遺伝子の下流にHindIIIサイトを有する断片をプライマー20および21（配列番号36および37）を用いてPCRで調製した。この2断片をテンプレートにして、プライマー18および21を用いたPCRにより、GAPプロモーターで制御されるG418耐性遺伝子の上下流にHindIIIサイトを有する断片を得た。【００６７】
このG418耐性遺伝子を、pUC-VPS8のVPS8遺伝子内のHindIIIサイトに挿入、pUC-Δvps8を得た。pUC-Δvps8をSpeI処理し、VPS8遺伝子の989〜3395の配列のHindIIIサイトにG418耐性遺伝子が挿入されたVPS8遺伝子破壊用ベクターを構築した。【００６８】
上記のVPS8遺伝子破壊用ベクターを用いて、実施例２記載のFab抗体発現株を形質転換し、0.5g/LのG418を含むYNBプレート上でコロニーを選択した。遺伝子破壊ベクターがVPS8遺伝子に挿入されていることをPCRで確認し、VPS8遺伝子が破壊されたFab抗体発現株を取得した。
（実施例４）VPS10の遺伝子破壊【００６９】
VPS10 ORF（配列番号10）の3029〜4484の配列の上下流それぞれにSpeIサイトを有する断片を、プライマー22および23（配列番号38および39）を用いてPCRで調製した。本断片をSpeI処理後、pUC-1のSpeIサイトに挿入し、pUC-VPS10を得た。【００７０】
GAPプロモーターの上流にBsp1407Iサイト、下流にG418耐性遺伝子の5’末端の配列を付加した断片を、プライマー24（配列番号40）および19を用いてPCRで調製した。G418耐性遺伝子の下流にBsp1407Iサイトを有する断片をプライマー20と25（配列番号41）を用いてPCRで調製した。この2断片をテンプレートにして、プライマー24と25を用いたPCRにより、GAPプロモーターで制御されるG418耐性遺伝子の上下流にBsp1407Iサイトを有する断片を得た。【００７１】
このG418耐性遺伝子を、pUC-VPS10のVPS10遺伝子内のBsp1407Iサイトに挿入、pUC-Δvps10を得た。pUC-Δvps10をSpeI処理し、VPS10遺伝子の3029〜4484の配列のBsp1407IサイトにG418耐性遺伝子が挿入されたVPS10遺伝子破壊用ベクターを構築した。【００７２】
上記のVPS10遺伝子破壊用ベクターを用いて、実施例２記載のFab抗体発現株を形質転換し、0.5g/LのG418を含むYNBプレート上でコロニーを選択した。遺伝子破壊ベクターがVPS10遺伝子に挿入されていることをPCRで確認し、VPS10遺伝子が破壊されたFab抗体発現株を取得した。
（実施例５）VPS15の遺伝子破壊【００７３】
VPS15 ORF（配列番号11）の506〜2112の配列の上下流それぞれにSpeIサイトを有する断片を、プライマー26および27（配列番号42および43）を用いてPCRで調製した。本断片をSpeI処理後、pUC-1のSpeIサイトに挿入し、pUC-VPS15を得た。【００７４】
実施例４で調製したG418耐性遺伝子を、pUC-VPS15のVPS15遺伝子内のBsp1407Iサイトに挿入、pUC-Δvps15を得た。pUC-Δvps15をSpeI処理し、VPS15遺伝子の506〜2112の配列のBsp1407IサイトにG418耐性遺伝子が挿入されたVPS15遺伝子破壊用ベクターを構築した。【００７５】
上記のVPS15遺伝子破壊用ベクターを用いて、実施例２記載のFab抗体発現株を形質転換し、0.5g/LのG418を含むYNBプレート上でコロニーを選択した。遺伝子破壊ベクターがVPS15遺伝子に挿入されていることをPCRで確認し、VPS15遺伝子が破壊されたFab抗体発現株を取得した。
（実施例６）VPS17の遺伝子破壊【００７６】
VPS17 ORF（配列番号12）の106〜1512の配列の上下流それぞれにSpeIサイトを有する断片を、プライマー28および29(配列番号44および45)を用いてPCRで調製した。本断片をSpeI処理後、pUC-1のSpeIサイトに挿入し、pUC-VPS17を得た。【００７７】
実施例４で調製したG418耐性遺伝子を、pUC-VPS17のVPS17遺伝子内のBsp1407Iサイトに挿入、pUC-Δvps17を得た。pUC-Δvps17をSpeI処理し、VPS17遺伝子の106〜1512の配列のBsp1407IサイトにG418耐性遺伝子が挿入されたVPS17遺伝子破壊用ベクターを構築した。【００７８】
上記のVPS17遺伝子破壊用ベクターを用いて、実施例２記載のFab抗体発現株を形質転換し、0.5g/LのG418を含むYNBプレート上でコロニーを選択した。遺伝子破壊ベクターがVPS17遺伝子に挿入されていることをPCRで確認し、VPS17遺伝子が破壊されたFab抗体発現株を取得した。
（実施例７）VPS21の遺伝子破壊【００７９】
VPS21 ORF（配列番号13）の31〜605の配列の上下流それぞれにSpeIサイトを有する断片を、プライマー30および31（配列番号46および47）を用いてPCRで調製した。本断片をSpeI処理後、pUC-1のSpeIサイトに挿入し、pUC-VPS21を得た。【００８０】
実施例３で調製したG418耐性遺伝子を、pUC-VPS21のVPS21遺伝子内のHindIIIサイトに挿入、pUC-Δvps21を得た。pUC-Δvps21をSpeI処理し、VPS21遺伝子の31〜605の配列のHindIIサイトにG418耐性遺伝子が挿入されたVPS21遺伝子破壊用ベクターを構築した。【００８１】
上記のVPS21遺伝子破壊用ベクターを用いて、実施例２記載のFab抗体発現株を形質転換し、0.5g/LのG418を含むYNBプレート上でコロニーを選択した。遺伝子破壊ベクターがVPS21遺伝子に挿入されていることをPCRで確認し、VPS21遺伝子が破壊されたFab抗体発現株を取得した。
（実施例８）VPS26の遺伝子破壊【００８２】
VPS26 ORF（配列番号14）の31〜882の配列の上下流それぞれにSpeIサイトを有する断片を、プライマー32および33（配列番号48および49）を用いてPCRで調製した。本断片をSpeI処理後、pUC-1のSpeIサイトに挿入し、pUC-VPS26を得た。【００８３】
実施例４で調製したGAPプロモーター制御のG418耐性遺伝子を、pUC-VPS26のVPS26遺伝子内のBsp1407Iサイトに挿入、pUC-Δvps26を得た。pUC-Δvps26をSpeI処理し、VPS26遺伝子の31〜882の配列のBsp1407IサイトにG418耐性遺伝子が挿入されたVPS26遺伝子破壊用ベクターを構築した。【００８４】
上記のVPS26遺伝子破壊用ベクターを用いて、実施例２記載のFab抗体発現株を形質転換し、0.5g/LのG418を含むYNBプレート上でコロニーを選択した。遺伝子破壊ベクターがVPS26遺伝子に挿入されていることをPCRで確認し、VPS26遺伝子が破壊されたFab抗体発現株を取得した。
（実施例９）VPS45の遺伝子破壊【００８５】
VPS45 ORF（配列番号15）の647〜1697の配列の上下流それぞれにSpeIサイトを有する断片を、プライマー34および35（配列番号50および51）を用いてPCRで調製した。本断片をSpeI処理後、pUC-1のSpeIサイトに挿入し、pUC-VPS45を得た。【００８６】
実施例４で調製したGAPプロモーター制御のG418耐性遺伝子を、pUC-VPS45のVPS45遺伝子内のBsp1407Iサイトに挿入、pUC-Δvps45を得た。pUC-Δvps45をSpeI処理し、VPS45遺伝子の647〜1697の配列のBsp1407IサイトにG418耐性遺伝子が挿入されたVPS45遺伝子破壊用ベクターを構築した。【００８７】
上記のVPS45遺伝子破壊用ベクターを用いて、実施例２記載のFab抗体発現株を形質転換し、0.5g/LのG418を含むYNBプレート上でコロニーを選択した。遺伝子破壊ベクターがVPS45遺伝子に挿入されていることをPCRで確認し、VPS45遺伝子が破壊されFab抗体発現株を取得した。
（実施例１０）PRB1の遺伝子破壊【００８８】
PRB1 ORF（配列番号53）の51〜1400の配列の上下流それぞれにSpeIサイトを有する断片を、プライマー36および37（配列番号54および55）を用いてPCRで調製した。本断片をSpeI処理後、pUC-1のSpeIサイトに挿入し、pUC-PRB1を得た。【００８９】
ゼオシン耐性遺伝子の断片を、プライマー38（配列番号56）および39(配列番号57)を用いてPCRで調製した。【００９０】
上記で調製したゼオシン耐性遺伝子を、pUC-PRB1のPRB1遺伝子内のEcoRVサイトに挿入、pUC-Δprb1を得た。pUC-Δprb1をSpeI処理し、PRB1遺伝子の51〜1400の配列のEcoRVサイトにゼオシン耐性遺伝子が挿入されたPRB1遺伝子破壊用ベクターを構築した。【００９１】
上記のPRB1遺伝子破壊用ベクターを用いて、実施例２記載のFab抗体発現株、実施例３〜５記載のVPS遺伝子（VPS8、VPS10、またはVPS15遺伝子）が破壊されたFab抗体発現株を形質転換し、0.1g/Lのゼオシンを含むYNBプレート上でコロニーを選択した。遺伝子破壊ベクターがPRB1遺伝子に挿入されていることをPCRで確認し、PRB1遺伝子が破壊されたFab抗体発現株、およびPRB1遺伝子とVPS遺伝子が二重破壊されたFab抗体発現株を取得した。
（比較例１）PEP4の遺伝子破壊【００９２】
PEP4 ORF（配列番号58）の51〜1000の配列の上下流それぞれにSpeIサイトを有する断片を、プライマー40および41（配列番号59および60）を用いて、ピキア・アングスタ NCYC495株のゲノムDNAをテンプレートにしてPCRで調製した。本断片をSpeI処理後、pUC-1のSpeIサイトに挿入し、pUC-PEP4を得た。【００９３】
実施例１０で調製したゼオシン耐性遺伝子の断片をpUC-PEP4のPEP4遺伝子内のScaIサイトに挿入、pUC-Δpep4を得た。pUC-Δpep4をSpeI処理し、PEP4遺伝子の51〜1400の配列のScaIサイトにゼオシン耐性遺伝子が挿入されたPEP4遺伝子破壊用ベクターを構築した。【００９４】
上記のPEP4遺伝子破壊用ベクターを用いて、実施例２記載のFab抗体発現株、実施例３〜５記載のVPS遺伝子（VPS8、VPS10、またはVPS15遺伝子）が破壊されたFab抗体発現株を形質転換し、0.1g/Lのゼオシンを含むYNBプレート上でコロニーを選択した。遺伝子破壊ベクターがPEP4遺伝子に挿入されていることをPCRで確認し、PEP4遺伝子が破壊されたFab抗体発現株、およびPEP4遺伝子とVPS遺伝子が二重破壊されたFab抗体発現株を取得した。
（比較例２）YPS1の遺伝子破壊【００９５】
YPS1 ORF（配列番号61）の501〜1700の配列の上下流それぞれにSpeIサイトを有する断片を、プライマー42および43（配列番号62および63）を用いて、ピキア・アングスタ NCYC495株のゲノムDNAをテンプレートにしてPCRで調製した。本断片をSpeI処理後、pUC-1のSpeIサイトに挿入し、pUC-YPS1を得た。【００９６】
実施例１０で調製したゼオシン耐性遺伝子の断片をpUC-YPS1のYPS1遺伝子内のEcoRVサイトに挿入、pUC-Δyps1を得た。pUC-Δyps1をSpeI処理し、YPS1遺伝子の501〜1700の配列のEcoRVサイトにゼオシン耐性遺伝子が挿入されたYPS1遺伝子破壊用ベクターを構築した。【００９７】
上記のYPS1遺伝子破壊用ベクターを用いて、実施例２記載のFab抗体発現株、実施例４記載のVPS遺伝子（VPS10遺伝子）が破壊されたFab抗体発現株を形質転換し、0.1g/Lのゼオシンを含むYNBプレート上でコロニーを選択した。遺伝子破壊ベクターがYPS1遺伝子に挿入されていることをPCRで確認し、YPS1遺伝子が破壊されたFab抗体発現株、およびYPS1遺伝子とVPS遺伝子が二重破壊されたFab抗体発現株を取得した。
（実施例１１）Fab抗体の分泌生産量の測定【００９８】
実施例３〜１０で得られたVPS遺伝子破壊株、VPS遺伝子とPRB1遺伝子の二重破壊株、およびこれらの遺伝子破壊株の調製に用いた元株（未破壊株）について、Fab抗体の培養上清への分泌生産量を、サンドイッチELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）法により解析した。【００９９】
培養上清の調製は以下のように実施した。即ち、各種Fab抗体発現株を、2mlのBMGMY培地（1% yeast extract bacto，2% peptone，1.34% yeast nitrogen base，0.4mg/l Biotin，100mMリン酸カリウム(pH6.0)，1% Glycerol, 1% Methanol）に植菌し、30℃で72時間振とう培養後、遠心分離（15,000rpm、1分、4℃）により培養上清を調製した。【０１００】
サンドイッチELISAは、ELISA用プレート（マキシソープ；NUNC社製）に固定化バッファー（0.1N重炭酸ナトリウム溶液，pH9.6）にて5000倍希釈したANTI-HUMAN IgG（Fab SPECIFIC）Affinity Isolated Antigen Specific Antibody（SIGMA社製）を50μl/ウェルで添加し、終夜で4℃インキュベートした。インキュベート後、ウェル中の溶液を除去し、5倍希釈したイムノブロック（大日本住友製薬社製）を250μl/ウェルで加え、室温で１時間静置し、ブロッキングした。【０１０１】
各ウェルをPBST（PBS(タカラバイオ社製)+0.1% Tween20）で3回洗浄後、系列希釈した標準タンパク質（Anti-Human IgG Fab；rockland社製）と培養上清の希釈液を50μl/ウェルで加え、室温で1時間反応した。ウェル中の溶液を除去し、PBSTで2回洗浄後、PBSTIB（PBST+1/50希釈イムノブロック）溶液にて8000倍希釈した二次抗体溶液（二次抗体：Anti-Human IgG（Fab SPECIFIC）PEROXIDASE CONJUGATE Antibody developed in Goat Affinity Isolated Antibody；SIGMA社製）を50μl/ウェルで加え、室温で１時間反応させた。【０１０２】
ウェル中の溶液を除去し、PBSTで4回洗浄後、TMB 1-Component Microwell Peroxidase Substrate，SureBlue（KPL社製）を100μl/ウェルで添加し、室温で20分静置した。TMB Stop Solution（KPL社製）を100μl/ウェルで添加して反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（BenchMark Plus；Bio-Rad社製）で450nmの吸光度を測定した。培養上清中の抗体の定量は、標準タンパク質の検量線を用いて行った。この方法で、培養上清に分泌発現している抗体の蓄積を確認した。
また、比較例１で得られたPEP4遺伝子破壊株、比較例２で得られたYPS1遺伝子破壊株についても上記同様にして培養上清への抗体分泌生産量を調べた。【０１０３】
結果を下記表１および表２に示す。
【表１】
2012124567.tif 000002
【０１０４】
【表２】
2012124567.tif 000003
【０１０５】
表１に示されるように、VPS遺伝子の破壊によりFabの分泌量向上が認められた。また、表２に示されるように、VPS遺伝子とPRB1遺伝子との二重破壊により更なるFabの分泌量向上が認められたが、VPS遺伝子とPEP4遺伝子及びVPS遺伝子とYPS1遺伝子の二重破壊では更なるFabの分泌量向上は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明は、疾患治療用タンパク質、特には抗体の製造分野において利用できる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
【配列表】
2012124567000001.app
【国際調査報告】
2012124567.tif 000004
2012124567.tif 000005
2012124567.tif 000006
2012124567.tif 000007
2012124567.tif 000008
2012124567.tif 000009