(57)【要約】  本発明は、非侵襲的で簡便なアルツハイマー病の診断剤、当該測定によるアルツハイマー病の診断方法、及びそのための測定キットを提供する。  本発明は、ヒト体液中の可溶型ＧＰＶＩ（ｓＧＰＶＩ）の測定用試薬、及び当該ヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化の測定用試薬を含有してなるアルツハイマー病の特異的な診断剤、及び、採取したヒト体液中のｓＧＰＶＩの濃度を測定する工程、及び当該ヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化を測定する工程を含有してなるアルツハイマー病を特異的に診断する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト体液中の可溶型ＧＰＶＩ（ｓＧＰＶＩ）の測定用試薬、及び当該ヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化の測定用試薬を含有してなるアルツハイマー病又はそのリスクの診断剤又はスクリーニング剤。
【請求項２】
ｓＧＰＶＩの測定用試薬が、少なくとも抗ＧＰＶＩ抗体の１種を含有するものである請求項１に記載の診断剤又はスクリーニング剤。
【請求項３】
血小板又は凝固・線溶系の活性化の測定用試薬が、血小板活性化マーカー及び／又は凝固線溶系活性化マーカーの測定用試薬である請求項１又は２に記載の診断剤又はスクリーニング剤。
【請求項４】
血小板活性化マーカーが可溶型Ｐ−セレクチンである、請求項１ないし３のいずれかに記載の診断剤又はスクリーニング剤。
【請求項５】
凝固線溶系活性化マーカーが血清中フィブリノーゲン分解産物（ＦＤＰ）又はＤ−ダイマー (D-dimer)である、請求項１ないし４のいずれかに記載の診断剤またはスクリーニング剤。
【請求項６】
採取したヒト体液中のｓＧＰＶＩの濃度を測定する工程、及び当該ヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化を測定する工程を含有してなるアルツハイマー病又はそのリスクをスクリーニング、判定又は診断する方法。
【請求項７】
ｓＧＰＶＩの濃度を測定する工程が、少なくとも抗ＧＰＶＩ抗体の１種を含有するものである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
血小板又は凝固・線溶系の活性化を測定する工程が、血小板活性化マーカー及び／又は凝固線溶系活性化マーカーを測定する方法である、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
血小板活性化マーカーが、ｓＰ−セレクチンである、請求項６ないし８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
凝固線溶系活性化マーカーが、血清中フィブリノーゲン分解産物（ＦＤＰ）又はＤ−ダイマー(D-dimer)である、請求項６ないし９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血中の可溶型ＧＰＶＩの濃度測定用試薬、及び血小板活性化マーカー又は凝固線溶系活性化マーカーなどによる血小板又は凝固・線溶系の活性化の測定用試薬を含有してなる非侵襲的かつ簡便なアルツハイマー病の診断剤、当該測定によるアルツハイマー病の診断方法、及びそのための測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会に伴って認知症患者の増加が大きな社会問題となっている。２００５年の認知症患者推計によれば、認知症患者は世界全体で２，４３０万人とされていて、毎年４６０万人の新たな患者が発生するとされている。そのうちの約７割がアルツハイマー型認知症と考えられている。アルツハイマー型認知症の症状としては、記憶や会話、日常生活動作が失われていく『中核症状』をはじめ、徘徊や妄想、暴力行為などが生じる『周辺症状』が見られる。他の疾患と比べると患者本人はもちろん、患者の家族のＱＯＬまでも著しく低下させてしまう深刻な疾患である。したがって、アルツハイマーの診断をできるだけ早くしかも正確に行うこと、有効な予防法や治療法を開発することが急務となっている。【０００３】
米国では２００４年にアルツハイマー病の効率的な治療法確立を目指し、患者の血液、脳脊髄液といった生体試料や画像診断を使ってアルツハイマー病の進行を客観的に計測しようと国際的な臨床研究ＡＤＮＩ（Alzheimer Disease Neuroimaging Initiative）が発足した。日本においても２００７年にＪ−ＡＤＮＩを立ち上げ、脳画像と血液や脳脊髄液などについて２〜３年間にわたる追跡調査を行うことが計画されている。【０００４】
アルツハイマー病の診断方法の一つとして、ＤＳＭ−ＩＶやＮＩＮＣＤ−ＡＲＤＡ、ＩＣＤ−１０などの神経心理学的検査がある。これらの検査方法は簡便でかつ特殊な機器を必要としないが、観察期間が長く、患者の気分に左右され再現性に乏しいといった欠点がある。また施設間差などの問題が指摘されており、アルツハイマー病を診断するための標準化は達成されておらず、客観的に評価できる生化学的なバイオマーカーが望まれている。【０００５】
近年の画像診断の進歩に伴い、画像診断を使ったアルツハイマー病の多数の診断方法も報告されている。例えば、ＣＴ・ＭＲＩは脳の形態異常を検出する診断方法であり、ＳＰＥＣＴは脳血流量を測定することで脳の機能的異常を観察する診断方法である。また、ＰＥＴを用いた診断方法も多く開発されている。さらに、ＦＤＧ−ＰＥＴは脳内のブドウ糖代謝異常を測定することで、アミロイドＰＥＴは生体におけるアミロイドベータの脳内の蓄積を画像化することで、アルツハイマー病の診断に利用できるようになった。これらの画像診断方法の進歩は、近年のアルツハイマー病の臨床研究におけるブレークスルーのひとつと言われている。
しかし、これら画像診断方法は特殊な機械及び施設を必要とするため簡便でない。さらにＰＥＴ、ＳＰＥＣＴに関しては、微量ではあるが放射性同位元素を体内に投与するため侵襲性が高い診断方法である。【０００６】
アルツハイマー病の診断の生化学的バイオマーカーとして、脳内のリン酸化タウ、及びアミロイドベータの測定が有力視されている（非特許文献１参照）。特に脳内のリン酸化タウはアルツハイマー病の病理像の本質的な側面を反映しており、感度・特異度も高い診断方法であると報告されている。しかし、これらのバイオマーカーの測定は患者の脳脊髄液を必要とするため、これも侵襲性の高い診断方法である。【０００７】
アルツハイマー病の診断薬のプロファイルとしては、信頼性・再現性・非侵襲性・簡便性・低価格性であることが望まれているが、今のところこれらすべての条件を満たすような診断薬はない。最近、２０１０年アルツハイマー協会アルツハイマー病国際会議（AAICAD2010）において、アルツハイマー病診断基準の改正草案が報告された。この中で、１）アルツハイマー病とアルツハイマー病でない認知症の区別、重複についての理解が深まり始めたこと、２）アルツハイマー病と脳血管性疾患の共存が一般的であること、３）レビ小体病から起こる認知症やピック病などの前頭側頭型認知症等の非アルツハイマー病性の認知症についても多くのことが知られていること、４）現在存在していると一般に考えられているアルツハイマー病の３段階（臨床前アルツハイマー病、アルツハイマー病による軽度の認識障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病性認知症）において、バイオマーカーの役割は３段階のそれぞれで異なるものの、バイオマーカーなどの臨床評価ツールの必要性が改めて指摘されている。【０００８】
血小板膜上に存在する糖蛋白質ＶＩ（Glycoprotein VI（ＧＰＶＩ））は、血小板のコラーゲン受容体であり、コラーゲン刺激による血小板の活性化に中心的役割を担っていることが明らかにされている。そして、抗マウスＧＰＶＩ抗体は、コラーゲン刺激特異的に血小板凝集を抑制し、出血時間の著明な延長を来すことなく、抗血栓作用を発揮することが報告されている。さらに、抗ヒトＧＰＶＩ抗体も出血時間の著明な延長を来すことなく、抗血小板作用を発揮することが報告されている（特許文献１参照）。一方、血液などの体液中には可溶型ＧＰＶＩ（以下ｓＧＰＶＩと記載することがある)として存在することも知られている。【０００９】
本発明者らは、ヒト体液中のｓＧＰＶＩの特異的かつ高感度な測定方法を報告してきた（特許文献２参照）。そして、狭心症、急性心筋梗塞、心臓病、脳梗塞、及び認知症の患者において血漿中のｓＧＰＶＩの濃度が高くなっており、血小板活性化マーカーとして有用であることが確認されている。また、他のグループからもヒト体液中のｓＧＰＶＩの測定系及び健常人の測定結果が報告された（特許文献３参照）。
近年において、血漿中のｓＧＰＶＩの濃度は年齢と共に上昇するが、アルツハイマー病の患者においては上昇しないという報告もなされた（非特許文献４参照）。しかし、ヒト体液中のｓＧＰＶＩの濃度とアルツハイマー病との関係についての詳細は十分に検討されておらず、アルツハイマー病でｓＧＰＶＩが上昇するとする報告はない。そして、これまで多くのアルツハイマー病の診断方法が報告されているが、（１）再現性・信頼性に乏しい、（２）特殊な機器を必要とする、（３）侵襲性が高い、など満足できるレベルに達しておらず、血液等を用いて簡便に診断ができるバイオマーカーの開発が切望されている。
また、認知機能障害を呈するアルツハイマー病モデル動物として、アミロイド前駆体タンパク質（Amyloid precurser protein）トランスジェニックマウス（以下、ＡＰＰ−Ｔｇマウスと記載する）が作製されている（非特許文献５）が、このマウスの血中においてｓＧＰＶＩが上昇しているか否かについては知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ２００５／１１１０８３号公報
【特許文献２】ＷＯ２００７／１１６７７９号公報
【特許文献３】特開２００８−２４９５５２号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Geert De Meyer, et al., Arch. Neurol., 67, 949-956 (2010)
【非特許文献２】荒井啓行ほか、日薬理誌（Folia Pharmacol. Jpn) 135,3〜7（2010）
【非特許文献３】Tsuji M., et al., J. Biol. Chem., 272, 23528-23531 (1997)
【非特許文献４】Christoph Laske, et al., J. Psychiatric Res., 42 (2008) 746-751
【非特許文献５】Marcus A. Westerman, et al., J. Neurosci. 2002, 22, 1858-1867
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、非侵襲的で簡便なアルツハイマー病の診断剤、当該測定によるアルツハイマー病の診断方法、及びそのための測定キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、網羅的な疾患スクリーニングを実施し、アルツハイマー病の患者の血中にはｓＧＰＶＩが高濃度で存在していることを、年齢を合わせた臨床検体を用いたスクリーニングにより確認した。さらに、本発明者らは、アルツハイマー病の患者では、血栓性疾患又は血栓症とは異なり、過度な血小板や凝固・線溶系の活性化を伴うことなくｓＧＰＶＩが多量に産生されていることを初めて見出した。
即ち、本発明者らは、アルツハイマー病の患者及び血栓性疾患の患者に対して、血清中や血漿中のｓＧＰＶＩの濃度、並びに血小板活性化マーカー及び凝固・線溶系活性化マーカーを測定したところ、血栓性疾患の患者ではｓＧＰＶＩの濃度、及び血小板活性化マーカーあるいは凝固・線溶系活性化マーカーが上昇していたが、アルツハイマー病の患者では、血小板活性化マーカー及び凝固・線溶系活性化マーカーの上昇を伴うことなくｓＧＰＶＩの濃度のみが上昇することを見出した。そして、本発明者らは、血清や血漿などの体液を用いた非侵襲的で簡便で、かつ特異的なアルツハイマー病の診断方法を見出し、本発明を完成した。【００１４】
即ち、本発明は、ヒト体液中のｓＧＰＶＩの測定用試薬、好ましくは当該試薬及び当該ヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化の測定用試薬を含有してなるアルツハイマー病の特異的な診断剤若しくはスクリーニング剤、又はアルツハイマー病の診断若しくはスクリーニングに使用するためのキット、すなわち、診断用若しくはスクリーニング用キットに関する。
また、本発明は、採取したヒト体液中のｓＧＰＶＩの濃度を測定する工程、好ましくは当該工程及び当該ヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化を測定する工程を含有してなるアルツハイマー病を特異的に判定若しくは診断する方法、又はアルツハイマー病患者若しくはアルツハイマー病を発症する可能性、すなわちリスクのある患者をスクリーニングする方法に関する。【００１５】
本発明をより詳細に説明すれば、次のとおりとなる。
（１）ヒト体液中の可溶型ＧＰＶＩ（ｓＧＰＶＩ）の測定用試薬を含有してなるアルツハイマー病の診断剤、又はアルツハイマー病の診断用キット。
（２）ヒト体液中のｓＧＰＶＩの測定用試薬、及び当該ヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化の測定用試薬を含有してなるアルツハイマー病の診断剤、又はアルツハイマー病の診断用キット。
（３）ｓＧＰＶＩの測定用試薬が、ＧＰＶＩ特異的結合物質を含有してなる前記（１）又は（２）に記載の診断剤、又は診断用キット。
（４）ＧＰＶＩ特異的結合物質が、抗ＧＰＶＩ抗体である前記（３）に記載の診断剤、又は診断用キット。
（５）抗ＧＰＶＩ抗体が、ＧＰＶＩのドメイン１、好ましくは、ループ２又はループ５、より好ましくはループ２に特異的に結合する抗体及び／又はＧＰＶＩのドメイン２、好ましくは、ループ９又はループ１１、より好ましくはループ９に特異的に結合する抗体である前記（４）に記載の診断剤、又は診断用キット。【００１６】
（６）ヒト体液中のｓＧＰＶＩの測定用試薬が、ＧＰＶＩのループ２に特異的に結合する抗体を非固相化抗体として、及び、ＧＰＶＩのループ９に特異的に結合する抗ＧＰＶＩ抗体を固相化抗体として含有してなる前記（１）から（５）のいずれかに記載の診断剤、又は診断用キット。
（７）ヒト体液中のｓＧＰＶＩの測定用試薬が、サンドイッチ免疫測定法による測定のためのものである前記（１）から（６）のいずれかに記載の診断剤、又は診断用キット。
（８）サンドイッチ免疫測定法が、ビオチン化非固相化抗体及びｐｏｌｙ−ＨＲＰ標識化ストレプトアビジンで検出する系である前記（７）に記載の診断剤、又は診断用キット。
（９）血小板又は凝固・線溶系の活性化の測定用試薬が、血小板活性化マーカー及び／又は凝固線溶系活性化マーカーの測定用試薬である前記（１）から（８）のいずれかに記載の診断剤、又は診断用キット。
（１０）血小板活性化マーカーが、可溶型Ｐ−セレクチン（ｓＰ−セレクチン、sP-selectin）である前記（９）に記載の診断剤、又は診断用キット。
（１１）凝固線溶系活性化マーカーが、血清中フィブリノーゲン分解産物（Fibrinogen Degradation Product（ＦＤＰ））又はＤ−ダイマー (D-dimer)である前記（９）に記載の診断剤、又は診断用キット。
（１２）ヒト体液が、ヒト血液、好ましくは血清又は血漿である前記（１）から（１１）のいずれかに記載の診断剤、又は診断用キット。【００１７】
（１３）採取したヒト体液中の可溶型ＧＰＶＩ（ｓＧＰＶＩ）の濃度を測定する工程を含有してなるアルツハイマー病を判定若しくは診断する方法、又はアルツハイマー病患者若しくはアルツハイマー病を発症する可能性のある患者をスクリーニングする方法。
（１４）採取したヒト体液中の可溶型ＧＰＶＩ（ｓＧＰＶＩ）の濃度を測定する工程、及び当該ヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化を測定する工程を含有してなるアルツハイマー病を判定若しくは診断する方法、又はアルツハイマー病患者若しくはアルツハイマー病を発症する可能性のある患者をスクリーニングする方法。
（１５）対照の値と比較して、ヒト体液中のｓＧＰＶＩの濃度が高値であることを確認する工程をさらに含む、前記（１３）又は（１４）に記載の方法。
（１６）対照の値と比較して、ヒト体液中のｓＧＰＶＩの濃度が高値であること、及び、血小板又は凝固・線溶系の活性化の値が高値でないことを確認する工程をさらに含む、前記（１３）又は（１４）に記載の方法。
（１７）ｓＧＰＶＩの濃度を測定する工程が、抗ＧＰＶＩ抗体による方法である前記（１３）から（１５）のいずれかに記載の方法。
（１８）抗ＧＰＶＩ抗体が、ＧＰＶＩのドメイン１、好ましくは、ループ２又はループ５、より好ましくはループ２に特異的に結合する抗体及び／又はＧＰＶＩのドメイン２、好ましくは、ループ９又はループ１１、より好ましくはループ９に特異的に結合する抗体である前記（１７）に記載の方法。【００１８】
（１９）血小板又は凝固・線溶系の活性化を測定する工程が、血小板活性化マーカー及び／又は凝固線溶系活性化マーカーを測定する方法である前記（１３）から（１８）のいずれかに記載の方法。
（２０）血小板活性化マーカーが、ｓＰ−セレクチンを測定するものである前記（１９）に記載の方法。
（２１）凝固線溶系活性化マーカーが、血清中フィブリノーゲン分解産物（Fibrinogen Degradation Product（ＦＤＰ））又はＤ−ダイマー(D-dimer)を測定するものである前記（１９）に記載の方法。
（２２）ヒト体液が、ヒト血液、好ましくは血清又は血漿である前記（１３）から（２１）のいずれかに記載の方法。【００１９】
（２３）可溶型ＧＰＶＩに特異的に結合する抗体を含有する、前記（１３）〜（２２）に記載の方法を行うためのキット。
（２４）前記（１３）から（２２）に記載の方法により、アルツハイマー病の発症を予測する方法。
【発明の効果】
【００２０】
血液等を検体とする本発明の診断剤又は診断用キットを用いることにより、非侵襲的、かつ特殊な機器を必要とせず簡便にアルツハイマー病を診断することができる。さらに、本発明の診断剤又は診断用キットを用いた方法は、再現性が高く、かつ特異的にアルツハイマー病の診断を行うことができる。また、その判定・診断は測定値に基づく客観性の高いものである。
本発明の方法は、血液などの体液の採取により簡便にアルツハイマー病を診断することができるために、短時間で迅速に大量の被験者を診断すること、すなわち、スクリーニングを可能とする。また、本発明の方法による測定は特異性、再現性及び客観性が高いことから、例えば、本発明の方法を定期的に行うことにより、アルツハイマー病の早期発見、段階（ステージ）又は進行度の判別、発症リスクの評価、及び発症の予測等をすることも可能となる。さらに、必要に応じて適宜他の検査法と組み合わせることで、非アルツハイマー性認知症、例えば、レビ小体病から起こる認知症やピック病など前頭側頭型認知症、特に脳血管性認知症との鑑別、すなわち、認知症の病因の鑑別も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明のｓＧＰＶＩの測定用試薬による、組換ヒトｓＧＰＶＩ−Ｈｉｓを用いたときの吸光度とｓＧＰＶＩの濃度（ｎｇ／ｍＬ）とのスタンダードカーブをグラフ化したものである。
【図２】図２は、健常人をコントロール検体（図２の左側）としたときの、アルツハイマー患者検体（図２の中央）及び血栓性疾患患者検体（図２の右側）における、血漿中のｓＧＰＶＩの濃度（ｎｇ／ｍＬ）を比較したグラフである。図中の長い線は平均値を示し、上下のバーは標準誤差（ＳＥ）を示す。
【図３】図３は、健常人をコントロール検体（図３の左側）としたときの、アルツハイマー患者検体（図３の中央）及び血栓性疾患患者検体（図３の右側）における、血清中のｓＧＰＶＩの濃度（ｎｇ／ｍＬ）を比較したグラフである。図中の長い線は平均値を示し、上下のバーは標準誤差（ＳＥ）を示す。
【図４】図４は、健常人をコントロール検体（図４の左側）としたときの、アルツハイマー患者検体（図４の中央）及び血栓性疾患患者検体（図４の右側）における、血漿中のｓP-selectinの濃度（ｎｇ／ｍＬ）を比較したグラフである。図中の長い線は平均値を示し、上下のバーは標準誤差（ＳＥ）を示す。
【図５】図５は、健常人をコントロール検体（図５の左側）としたときの、アルツハイマー患者検体（図５の中央）及び血栓性疾患患者検体（図５の右側）における、血清中のＦＤＰの濃度（μｇ／ｍＬ）を比較したグラフである。図中の長い線は平均値を示し、上下のバーは標準誤差（ＳＥ）を示す。
【図６】図６は、野生型マウスをコントロール検体（図６の右側）としたときの、ＡＰＰ−Ｔｇマウス検体（図６の左側）における、血漿中のｓＧＰＶＩの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を比較したグラフである。図中の長い線は平均値を示し、上下のバーは標準誤差（ＳＥ）を示す。
【図７】図７は、野生型マウスをコントロール検体（図７の右側）としたときの、ＡＰＰ−Ｔｇマウス検体（図７の左側）における、血漿中のｓP-selectinの濃度（ｎｇ／ｍＬ）を比較したグラフである。図中の長い線は平均値を示し、上下のバーは標準誤差（ＳＥ）を示す。
【図８】図８は、サル洗浄血小板に、コラーゲン（図８の左から２番目）、可溶型アミロイドβ（ｓＡβ）（図８の左から３番目）、又は線維化アミロイドβ（fＡβ）（図８の右端）の各種刺激剤を添加した場合におけるｓＧＰＶIの産生を、刺激剤を添加しない場合をコントロールとして、コントロールを１．０とした場合の比率で表したものである。図中の上下のバーは標準誤差（ＳＥ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、第一に、アルツハイマー病においてヒト体液中のｓＧＰＶＩの量が上昇するという知見に基づくものであり、第二に当該ヒト体液中のｓＧＰＶＩの量の上昇が血栓性疾患又は血栓症に起因するものでないことを確認することにより、アルツハイマー病であると診断できるという知見に基づくものである。
即ち、本発明は、ヒト体液中のｓＧＰＶＩの測定、及びヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化マーカーの測定を組み合わせてなることを特徴とするものである。ヒト体液中のｓＧＰＶＩを測定する方法は、既に多数の文献に開示されており、例えば、ＷＯ２００７／１１６７７９号公報及び特開２００８−２４９５５２号公報には、抗ＧＰＶＩ抗体を用いたｓＧＰＶＩを測定する方法が開示されている。ヒト体液中のｓＧＰＶＩを測定する方法の例として、ＷＯ２００７／１１６７７９号公報に記載されている事項を、本明細書に取り込む。
また、ヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化を測定する方法も既に多数の文献に開示されており、また既に多くの手法が臨床的に使用されてきている。ヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化を測定する方法としては、例えば、セレクチンファミリーの分子であるＰ−セレクチン（P-selectin／CD62P／GMP-140／PADGEM）の可溶型であるｓＰ−セレクチンなどの血小板活性化マーカーを測定する方法や、血清中フィブリノーゲン分解産物（Fibrinogen Degradation Product（ＦＤＰ））やＤ−ダイマー（D-dimer）などの凝固線溶系活性化マーカーを測定する方法が挙げられる。
本発明の方法は、これらの測定方法を組み合わせて行うことにより、アルツハイマー病を診断する方法である。また、本発明は、これらの測定に使用される測定用試薬を組み合わせてなるアルツハイマー病の診断剤を提供するものである。
【００２３】
現在、アルツハイマー病には３段階、すなわち、臨床前アルツハイマー病（preclinical Alzheimer's disease）、アルツハイマー病による軽度の認識障害（mild cognitive impairment、ＭＣＩ）、アルツハイマー病性認知症（Alzheimer's disease dementia）が存在していると一般に考えられている（２０１０年アルツハイマー協会アルツハイマー病国際会議（AAICAD2010））。本発明においては、特に断らない限り、アルツハイマー病には、これらのすべてを包含するものとし、対象患者の年齢も特に限定されず、若年性及び老人性のいずれのアルツハイマー病も含まれるものとする。また、非アルツハイマー性認知症、例えば、レビ小体病から起こる認知症やピック病など前頭側頭型認知症、特に脳血管性認知症を併発している場合も含むものとする。好ましくは、アルツハイマー病性認知症又はＭＣＩ、特に、アルツハイマー病性認知症である。
【００２４】
本発明における「ヒト体液」としては、血液、血漿、血清、尿、リンパ液、唾液などのヒトから採取可能な体液であって、ｓＧＰＶＩ及び血小板又は凝固・線溶系の活性化を測定することができる体液であれば特に制限はない。好ましいヒト体液としては、採取が容易で測定が容易である血液、特に血漿や血清が挙げられる。
【００２５】
本発明の「ヒト体液中のｓＧＰＶＩの測定用試薬」としては、ヒト体液中のｓＧＰＶＩを測定することができる物質若しくは組成物、又はこれらの組み合わせが挙げられる。物質は純粋物であるのが好ましいが、測定に影響がなければ必ずしも純粋物でなくてもよい。組成物としては、２種以上の物質の混合物や複合体などが挙げられる。これらの組み合わせとしては、測定を行うために、又は測定をより正確にするために、２種以上の物質又は組成物が必要な場合に、これらの物質又は組成物の集合体が挙げられる。
【００２６】
本発明の好ましい「ヒト体液中のｓＧＰＶＩの測定用試薬」としては、ＧＰＶＩに特異的に結合する物質が挙げられ、当該ＧＰＶＩに特異的に結合する物質の好ましい例としては抗ＧＰＶＩ抗体が挙げられる。当該抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、感度や特異性の観点からモノクローナル抗体であることが好ましい。
抗ＧＰＶＩ抗体の由来動物種としては、例えば、哺乳類、特にマウス、ラット、ハムスター、ウサギ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
抗ＧＰＶＩ抗体の形態としては、種々のものが適用可能であり、例えば、本発明の抗体としては、抗体の断片もしくは一部又は誘導体でもよいが、ＧＰＶＩとの結合能を有する限りにおいて、これらに限定されるものではない。好ましい形態の例としては、例えば、断片としては、Ｆａｂ（Fragment of antigen binding）、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２等が挙げられ、誘導体としては、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｓＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃ（Ｆｖ）２（例えば、Orita T、 Blood.2005; 105:562-566参照）、ｎａｎｏｈｏｄｙ（例えば、Cortez-Retamozo v.、Cancer Research 64、 2853-2857、2004参照）及びＣＤＲを含有するペプチド等が挙げられる。これらは公知の方法で作製しうる。
公知の抗ＧＰＶＩ抗体としては、例えば、マウス抗ヒトＧＰＶＩモノクローナル抗体（ＷＯ２００１／８１０号公報、ＷＯ２００２／８０９６８号公報、ＷＯ２００５／１１１０８３号公報等参照）、ラット抗マウスＧＰＶＩモノクローナル抗体（Nieswandt et al.）、ラット抗ヒトＧＰＶＩモノクローナル抗体ｈＧＰ５Ｃ４（ＷＯ２００５／５４２９４号公報等参照）、ヒト一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）（ＷＯ２００１／８１０号公報、ＷＯ２００３／５４０２０号公報等参照）、及びヒト抗ヒトＧＰＶＩモノクローナル抗体（ＷＯ２００５／７８００号公報参照）などが挙げられる。
【００２７】
抗ＧＰＶＩ抗体としては、結合領域や結合部位、又はエピトープが同定されている抗体等が好ましく、特定のＧＰＶＩのドメイン、例えば、ＧＰＶＩのドメイン１又はドメイン２と結合する抗体、又は、特定のループ、例えば、ＧＰＶＩのループ２又はループ９の少なくとも一部を認識する抗体が挙げられる。具体例としては、実施例に示された抗体並びにＷＯ２００７／１１６７７９号公報、ＷＯ２００６／１１７９１０号公報、及びＷＯ２００６／１１８３５０号公報の実施例に記載された抗体等が挙げられる。これらの特許文献に記載の事項は、本明細書に取り込まれる。
本発明のこのような抗体の製造方法及び同定方法は、種々の方法が適用でき、公知の方法を応用することもできるが、好ましくは、ＧＰＶＩの特定部位、例えば特定のドメイン、好ましくは特定のループ領域を他のアミノ酸配列、具体的には、他の動物種のＧＰＶＩの対応するアミノ酸配列で置換した変異体を免疫用抗原又は抗体の同定用抗原として用いる方法が挙げられ、具体的には、ＷＯ２００７／１１６７７９号公報、ＷＯ２００６／１１７９１０号公報、特開２００８−２４９５５２号公報及びＷＯ２００６／１１８３５０号公報の実施例に記載された方法を適用することができる。また、それらの抗体の認識領域等は、当該置換変異体と抗体との統合性及びＧＰＶＩと抗体との統合性を公知の方法に準じて測定することにより推定しうる。これらの結合領域等の同定された抗体を１又は２以上、好ましくは結合領域等の異なる２種類、好ましくはＧＰＶＩとの結合において互いに競合しない抗体の組合せ、例えば、ドメイン１と結合する抗体及びドメイン２と結合する抗体、又は、ループ２の少なくとも一部と結合する抗体及びループ９の少なくとも一部と結合する抗体の組合せを用いることにより、特異性、選択性及び／又は感度の高いｓＧＰＶＩの検出又は定量が可能であり、特に、複数のＧＰＶＩ分子種が混在する場合において、そのうちの特定のＧＰＶＩ分子種、例えば、ｓＧＰＶＩを特異的、選択的及び／又は高感度に検出し、定量する測定が可能となる。
【００２８】
本発明のｓＧＰＶＩの測定における測定感度は必ずしも限定されないが、試料中の濃度で示した場合、１ｎｇ／ｍＬ以下であればよく、３００ｐｇ／ｍＬ以下、さらに１００ｐｇ／ｍＬ以下、３０ｐｇ／ｍＬ以下、１０ｐｇ／ｍＬ以下、３．０ｐｇ／ｍＬ以下、又は１．０ｐｇ／ｍＬ以下のような高感度であっても良い。また、検出限界濃度としては、１ｎｇ／ｍＬ以下であればよく、３００ｐｇ／ｍＬ以下、１００ｐｇ／ｍＬ以下、３０ｐｇ／ｍＬ以下、１０ｐｇ／ｍＬ以下、３．０ｐｇ／ｍＬ以下、１．０ｐｇ／ｍＬ以下のような検出限界濃度であってもよい。
被検体からの試料中の濃度は、例えば図１に示されるような標準曲線を作成することができる標準物質の量として換算しても良い。標準物質としては、例えば、ｓＧＰＶＩと免疫グロブリンＦｃ断片との融合蛋白質（ｓＧＰＶＩ−Ｆｃ）、ヒスチジン−タグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）を結合させたｓＧＰＶＩ（ｓＧＰＶＩ−Ｈｉｓ）等が挙げられる。また、測定前に試料の希釈操作を要する場合は、希釈後の値である。
【００２９】
被検体の試料、特に血漿中のｓＧＰＶＩを測定する場合は、血漿成分の影響を受けずに特異的に血小板より遊離したＧＰＶＩを測定することが好ましい。したがって、一般的には特異性の高い抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法が使用される。本発明の測定法においては、精度よくｓＧＰＶＩを測定するために、できるだけ血漿成分の影響を減らすことが好ましく、その手段として検体の希釈が挙げられる。また、影響を減らす目的で反応液中に界面活性剤等の成分を添加することも可能であるが、それらが測定系に影響を及ぼす可能性がある場合には好ましくない。
抗ＧＰＶＩ抗体は、標識抗体又は非標識抗体のいずれでもよいが、少なくともｌつの標識抗体を用いることが好ましい。この標識において、標識物質及び標識方法は公知の物質及び方法を用いることができ、放射性物質、酵素、蛍光物質及び化学発光物質等が用いられ、いずれも適用可能である。これらのうち、酵素標識抗体を用いる方法が特殊な設備や高価な検出装置を必要とせず取り扱いも簡便である等の点で好ましい。
また、標識には、直接法と間接法があり、いずれも適用可能である。
本発明において、少なくともひとつの抗ＧＰＶＩ抗体を固相化抗体として使用する場合は、種々の抗体を用いることができるが、好ましくはドメイン２、より好ましくはループ９又はループ１１、特にループ９に特異的に結合する抗体が挙げられる。また、非固相化抗体として使用する場合のものとしては、種々の抗体を用いることができるが、好ましくはドメイン１、より好ましくはループ２又はループ５、特にループ２に特異的に結合する抗体が挙げられる。また、これらのうち、固相化抗体としてループ９に特異的に結合する抗体及び非固相化抗体としてループ２に特異的に結合する抗体の組合せが好ましい。
【００３０】
本発明の「ヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化の測定用試薬」としては、ヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化を測定することができる物質若しくは組成物、又はこれらの組み合わせが挙げられる。物質は純粋物であるのが好ましいが、測定に影響がなければ必ずしも純粋物でなくてもよい。組成物としては、２種以上の物質の混合物や複合体などが挙げられる。これらの組み合わせとしては、測定を行うために、又は測定をより正確にするために、２種以上の物質又は組成物が必要な場合に、これらの物質又は組成物の集合体が挙げられる。
本発明の好ましい「ヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化の測定用試薬」としては、例えば、Ｐ−セレクチン、ＣＤ４０Ｌ、トロンボキサンＢ２（ＴＸＢ２）及び８−イソ−プロスタグランジンＦ２α（8-iso-PGF2α）、特に、ｓＰ−セレクチン、βトロンボグロブリン、血小板第４因子、ＣＤ６３（Lysosome-associated membrane glycoprotein 3(LAMP-3)）、ｓＣＤ４０Ｌ、マイクロパーティクル等の血小板活性化マーカーや血清中のＦＤＰ、Ｄ−ダイマー、トロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）、プロトロンビンフラグメントＦ１＋２（Ｆ１＋２）、等の凝固線溶系活性化マーカーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
即ち、本発明における「ヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化の測定用試薬」、及びそれを用いたヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化の測定方法は、ヒト体液中のｓＧＰＶＩの濃度の上昇が、血栓性疾患又は血栓症に起因する上昇でないことを確認できるものであれば十分であり、公知のヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化の測定手段をそのまま適用することができる。
図２及び図３に示されるように、アルツハイマー患者検体（図２及び３の中央）及び血栓性疾患患者検体（図２及び３の右側）のいずれにおいても、体液中のｓＧＰＶＩの量は上昇しており、この状態ではｓＧＰＶＩの量の上昇がアルツハイマー病によるものか、血小板の活性化、例えば、血栓症によるものであるのかを区別することはできない。しかし、公知の血栓性疾患又は血栓症の診断手法を使用することにより、体液中のｓＧＰＶＩの量の上昇が、アルツハイマー病によるものか、血小板の活性化、例えば、血栓性疾患又は血栓症によるものであるのかを区別することが可能となる。
【００３１】
図４は、本発明の「ヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化の測定用試薬」として、血小板活性化マーカーの１種として知られている血漿中可溶型Ｐ−セレクチン（sP-selectin）濃度の測定用試薬を用いて血漿中のsＰ−セレクチンの濃度を測定した結果を示したものである。この結果、アルツハイマー患者検体（図４の中央）では血漿中のｓＰ−セレクチンの濃度は上昇していないが、血栓性疾患患者検体（図４の右側）では血漿中のｓＰ−セレクチンの濃度が上昇しており、両者の疾患を区別することが可能となることを示している。
また、図５では、本発明の「ヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化の測定用試薬」として、凝固線溶系活性化マーカーの１種として知られている血清中ＦＤＰ濃度の測定用試薬を用いて血清中のＦＤＰの濃度を測定した結果を示したものである。この結果、アルツハイマー患者検体（図５の中央）では血清中のＦＤＰの濃度は上昇していないが、血栓性疾患患者検体（図５の右側）では血清中のＦＤＰの濃度が上昇しており、ＦＤＰの測定によっても両者の疾患を区別することが可能となることを示している。
さらに、アミロイド前駆体タンパク質（Amyloid precurser protein）トランスジェニックマウス（以下、ＡＰＰ−Ｔｇマウスと記載する）における検討においても、その野生型と比較することにより、同様な結果が得られた（図６及び７参照）。
ｓＧＰＶＩサンドイッチＥＬＩＳＡ系はヒトのｓＧＰＶＩの他に、サルのｓＧＰＶＩにも交差反応性を示すので、サル血小板を用いてｓＧＰＶＩの産生を検討した。その結果、ｓＧＰＶＩの産生機序の一つとして、アルツハイマー病患者において神経毒性作用を持つとされている線維化Ａβの増加により、ｓＧＰＶＩの産生が誘導される可能性が示唆された（図８参照）。
【００３２】
このように、本発明における、「ヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化の測定用試薬」及びそれを用いたヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化の測定方法は、ヒト体液中のｓＧＰＶＩの濃度の上昇以外の方法により、ヒト体液中のｓＧＰＶＩの濃度の上昇が血栓性疾患に起因する上昇でないことを確認できる測定用試薬及びそれを用いた測定方法であればよく、ヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化の測定手段を全て適用することができる。言い換えれば、本発明の「ヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化の測定用試薬」及びそれを用いたヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化の測定方法は、ヒト体液中のｓＧＰＶＩの濃度の上昇以外の方法により、血栓性疾患であると診断することが可能な診断用の測定用試薬及びそれを用いた測定方法の全てを包含しているということもできる。
【００３３】
本発明のヒト体液中のｓＧＰＶＩの測定用試薬及びそれを用いた測定方法、並びに本発明のヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化の測定用試薬及びそれを用いた測定方法のいずれも、種々の公知の測定原理を適用することができるが、一般的には免疫測定法が好ましい。免疫測定法としては、例えば、酵素抗体法、ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチ免疫測定法、凝集法、固相直接法、固相結合法、溶液反応法、競合法、非競合法、イムノクロマト法、フロースルー法等が挙げられ、これらを単独又は組み合わせて、適用しうる（例えば、「超高感度酵素免疫測定法」石川栄治著、学会出版センター（１９９３年）、「免疫測定法の新しい活用事例と診断試薬・治療薬開発への応用」免疫測定法開発研究会、経営教育出版、酵素免疫測定法（第３版）石川栄治等編、医学書院（１９８７年）等参照）。また、標識の信号を電気化学的に測定するＭＥＤＩＡ法（特開平５−２６４５５２号公報）による測定、マイクロチップを使用したイムノアッセイ法（「バイオサイエンスとインダストリー」第６１巻４４９−４５４頁２００３年）、時間分解蛍光免疫測定法「アナリティカル  バイオケミストリー（Analytical biochemistry）」（米国）、１９８４年、第１３７巻、ｐ．３３５−３４３）及びホモジーニアス免疫測定法も適用できる。これらのうち、サンドイッチ免疫測定法、特に、マイクロウェルプレート等の不溶性担体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法が簡便であり、感度の面でも好ましい。
【００３４】
サンドイッチ免疫測定法は公知の技術を利用することができる。測定法の原理、応用及び改良法については、例えば、「超高感度酵素免疫測定法」石川栄治著、学会出版センター（１９９３年）、「免疫測定法の新しい活用事例と診断試薬・治療薬開発への応用」免疫測定法開発研究会、経営教育出版、酵素免疫測定法（第３版）石川栄治等編、医学書院（１９８７年）に記載されているので、これを参照して本明細書に取り込む。サンドイッチ免疫測定法は、通常測定する蛋白質を認識する部位の異なる２種類以上の抗体を用いて抗体−抗原−抗体複合体を形成させることにより測定する方法である。サンドイッチ免疫測定法においては、通常、不溶性担体を用いるが、その場合、不溶性担体に結合させる第一の抗体を、固相化（用）抗体又はキャプチャー抗体と、そして第二の抗体を、非固相化抗体、液相抗体、若しくは検出用抗体、又は直接的若しくは間接的に標識される場合標識抗体と呼ぶことがある。まず、第一の抗体が結合した不溶性担体を用意し、固相又は反応場所とする。検体を固相の該不溶性担体に添加し、反応させる。一定時間反応させた後、洗浄して固相に特異的に結合しなかった物質を除去する。続いて標識した第二の抗体を添加する。一定時間反応させた後、洗浄して複合体を形成しなかった標識抗体を除去し、標識物に基づいて固相に特異的に結合した複合体の量を特異的に定性又は定量する。サンドイッチ法は上記のように２段階で行う方法（２ステップ法）と、抗原及び標識抗体を同時に加える１段階法（１ステップ法）のいずれかを使用することもできる。
【００３５】
サンドイッチ免疫測定法において、不溶性担体を用いずに、溶液中で行うこともできる。例えば、抗原と標識抗体及び標識した第二の結合物質を液相中で反応させ、該標識と該第二の標識との相互作用を測定する方法である。
また、サンドイッチ免疫測定法において、さらに別法として第二の特異結合を利用して測定することもできる。抗体−抗原−抗体−第二の特異結合物質の複合体又は抗体−抗原−抗体−第二の特異結合物質−第二の特異結合物質の特異結合パートナー（以下、第二の特異結合パートナーと記載することがある。）の複合体を形成させて測定する方法である。第二の特異結合物質−第二の特異結合パートナーの組み合わせとしては、抗原とその抗体、リガンドとそのレセプター、糖鎖含有物質とレクチン、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン等が挙げられる。さらに、抗体に対する抗体、すなわち、抗イムノグロブリン抗体を利用して、抗体−抗原−抗体−抗イムノグロブリン抗体の複合体を形成させて測定する方法、また、抗イムノグロブリン抗体及び第二の特異結合を利用して、抗イムノグロブリン抗体−抗体−抗原−抗体−第二の特異結合物質−第二の特異結合パートナー等を形成させて測定する方法が例示される。
また、免疫測定法等において、別法として競合法により測定することもできる。抗原−抗体複合体を形成させる中で、検体中の抗原と標識した抗原又は標識した抗原類似物質を競合させることにより測定する方法である。
【００３６】
２種類の結合部位の異なる抗体を用いる本発明の好適な例としては、第二の特異結合物質−第二の特異結合パートナーとしてビオチンとアビジン又はストレプトアビジンを用いて、一方、特に、非固相化抗体をビオチン化し、これを標識、特にポリ−ＨＲＰ標識したストレプトアビジンで検出する系が挙げられる。
サンドイッチ免疫測定系で用いる不溶性担体としては、ビーズ、ラテックス粒子、磁性粒子、プレート、チューブ又はメンブレン等が用いられる。ビーズ、プレート又はチューブは、その材料としてポリスチレン、ナイロン、ガラス、シリコンラバー、ステンレス、プラスチック等が挙げられる。メンブレンとしては、セルロース、セルロース誘導体、ニトロセルロース、多孔性合成ポリマー、グラスファイバー、布、不織布、濾紙等が挙げられる。形状としては、ビーズ、ラテックス粒子又は磁性粒子等は球形として用いることができ、保存時のスペースの確保の点で有利である。プレート又はチューブはウエル形として用いることができ、市販の自動化測定器、プレートリーダー等に対応可能な点で有利である。また、メンブレンは、イムノクロマト法、フロースルー法に用いることができる。抗体、第二の結合物質、第二の特異結合物質若しくはそのパートナー、又は抗イムノグロブリン抗体の不溶性担体への結合は、熱吸着法、化学結合法等により行うことができる。
また、非特異的吸着等の反応を低減し、測定系の特異性もしくは感度を高める目的で、不溶性担体に上記物質が結合していない非吸着面に対して、測定系に影響しない物質でブロッキング処理することが好ましい。測定系に影響しない物質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン等の蛋白質及びＴｗｅｅｎ２０、ＮＰ−４０等の界面活性剤等が例示される。
【００３７】
サンドイッチ免疫測定系キットに用いる標識としては、ペルオキシダーゼ、特に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、オキシダーゼ及びウリカーゼ等の酵素、アクリジニウム若しくはその誘導体、又はエクオリン若しくはその改変体等の化学発光物質、ＦＩＴＣ、又はユウロピウム（Ｅｕ）若しくはサマリウム（Ｓｍ）等のランタノイド等の蛍光物質、色素、金コロイド、着色ラテックス、あるいはアイソトープが挙げられる。
例えば酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合は、発色基質として３，３’，５，５’−テトラベンジジン、又は１，２−フェニレンジアミン等が、アルカリフォスファターゼを用いる場合は、発色基質として４−ニトロフェニルフォスフェート等が、β−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合は、発色基質として２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド等が例示される。
抗体、第二の結合物質、第二の特異結合物質若しくはそのパートナー、又は抗イムノグロブリン抗体への酵素標識は、二段階グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリジル・ジスルフィド法等により行うことができる。酵素以外の標識についても熱吸着法、化学結合法等の公知の技術を利用して行うことができる。
酵素標識は、上記に例示される様な発色基質を用いれば、通常の吸光度測定系を用いて測定でき、また感度も比較的高く好ましい。化学発光物質、蛍光物質、着色標識若しくはアイソトープを標識として用いる場合は、その標識に応じた測定機器により測定できる。また、Ｅｕ、例えばクリプテート（Ｅｕ３＋クリプテート）等の蛍光物質を用いる場合は、第二の標識としてＸＬ６６５等のアロフィコシアニン誘導体を用いて、蛍光共鳴エネルギー転移を測定することもできる。また、簡易な測定キット、例えイムノクロマト法、フロースルー法を利用したキットに用いる標識は、色素、金コロイド若しくは着色ラテックスが視覚的にも観察可能であるので好ましい。凝集法で不溶性担体として用いられる粒子としては、ラテックス、赤血球（例えば羊赤血球）、ゼラチン、マイクロビーズ又はカーボン粒子等、一般に用いられている粒子を使用することができる。
【００３８】
本発明の測定用試薬又はキットは、１以上の測定用の活性物質以外に任意の構成成分又は構成要素を含有してもよい。例えば、測定用試薬又はキットの任意の構成成分として、安定化剤、賦形剤又は保存剤等の添加剤、また、キットの任意の構成要素として、標準物質、検体若しくは標識抗体等の緩衝液若しくは希釈剤、標識抗体に酵素が使われる場合の酵素に適した発色基質、ブロッキング剤、反応停止剤又は洗浄剤等が例示される。希釈剤は、特に限定はないが、検体に含まれる物質を含む希釈剤が好ましい。検体が血清であり、その血清を入手するための採血をＥＤＴＡやクエン酸存在下で行われた場合、希釈剤としても同量のＥＤＴＡやクエン酸が存在することが好ましい。例えば、希釈剤中にＥＤＴＡを０．２〜１ｍｇ／ｍＬ含むことが好ましい。標準物質としては、生体試料から調製した標準品や、遺伝子工学的に調製した組換体等が挙げられる。これらは公知の方法で調製できる。
【００３９】
本発明は、被検体試料としてヒトから採取されたヒト体液中のｓＧＰＶＩを測定することができる測定用試薬、及び当該ヒト体液中の血小板又は凝固・線溶系の活性化を測定することができる測定用試薬を用いて、被検体試料としてヒトから採取されたヒト体液中のｓＧＰＶＩ及び血小板又は凝固・線溶系の活性化を測定することによりアルツハイマー病を非侵襲的で、特殊な機器を必要とせず簡便に、かつ特異的に判定若しくは診断することができる診断剤、又はアルツハイマー病の診断に使用するためのキットを提供するものである。
本発明の診断方法は、被検体から体液を採取し、採取された被検体の試料を、必要に応じて測定可能な濃度に希釈し、本発明の測定用試薬を用いて試料中のｓＧＰＶＩの濃度を測定し、同時又は順次に、本発明の血小板又は凝固・線溶系の活性化の測定用試薬を用いて試料中の血小板又は凝固・線溶系の活性化を測定し、これを健常人などの対照、好ましくは年齢を合せた、又は同年代の健常人の値と比較することにより行われる。
健常人の値との比較は、例えば、予め複数の健常人の測定結果を求めておき、その測定結果の平均値又は範囲をとる等により標準化した健常人の値又はその範囲を、対照としての健常人の標準値として、測定した値と比較することにより行われる。この比較は、標準偏差（ＳＤ）又は標準誤差（ＳＥ）を用いて、例えば、健常人の平均値＋２ＳＤ（もしくはＳＥ）又は３ＳＤ（もしくはＳＥ）をカットオフ値として健常人の標準値を求めればよい。また、予め患者の基準値を求めておいて、測定した値と比較してもよい。その他、統計学的有意差を指標とすることもできる。
ある局面においては、対照との比較ではなく、同一人の経時的な変化を観察することが有用である。例えば、１０年、５年、３年、１年、又は６月程度の間隔をおいて検査を実施することで、より早期に、又は、精度よく、診断等すること又は病気の段階若しくは進行度を判定することが可能となる。
【００４０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４１】
・Ｆ１２３２−１０−２  Ｆａｂ’−ＨＲＰの作製
ＷＯ２００７／１１６７７９号公報及びＷＯ２００６／１１８３５０号公報の実施例に記載された抗ＧＰＶＩ抗体Ｆ１２３２−１０−２を、リジルエンドペプチターゼ（Lysylendopeptidase）で処理することによりＦ１２３２−１０−２  Ｆ（ａｂ’）２を作製した。
即ち、リン酸緩衝生理的塩溶液Ｄ−ＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ）にバッファー交換したＦ１２３２−１０−２  ５０ｍｇに、リジルエンドペプチターゼ（Lysylendopeptidase）（Wako社製）１ＡＵを添加した。３７℃で４時間反応した後、セリンプロテアーゼ阻害剤トシルリジンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ、SIGMA社製）を終濃度が３０ｍＭとなるように添加して反応を停止した。次に、Ｆ１２３２−１０−２  Ｆ（ａｂ’）２を精製した。すなわち、切断されたＦｃ部位と未切断のＦ１２３２−１０−２を除く目的で、酵素消化した抗体をプロテインＡカラム（Protein A Column）（Millipore社製）に供した。Ｆ（ａｂ’）２が含まれる非吸着両分を透析し４ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．５）にバッファー交換した。次いでモノＱカラム（Mono Q Column）（GE Healthcare社製）を用いて陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。得られたＦ１２３２−１０−２  Ｆ（ａｂ’）２をＤ−ＰＢＳにバッファー交換した後に、ウシ血清ＩｇＧをスタンダードとしてプロテインアッセイ染料試薬（Protein Assay Dye Reagent）（Bio-Rad社製）を用いてタンパク濃度を測定した。
引き続きＦ１２３２−１０−２  Ｆ（ａｂ’）２を、パーオキシダーゼ標識キットＳＨ（Peroxidase Labeling Kit SH）（同仁化学社製）を用いてＨＲＰ標識した。すなわち、Ｆ１２３２−１０−２  Ｆ（ａｂ’）２を部分還元し、ヒンジ部分に存在するシステイン残基にパーオキシダーゼ（Peroxidase）標識した。
【実施例２】
【００４２】
・ｓＧＰＶＩサンドイッチＥＬＩＳＡ系
Ｄ−ＰＢＳを用いて１０μｇ／ｍＬに調製したＷＯ２００７／１１６７７９号公報及びＷＯ２００６／１１８３５０号公報の実施例に記載された抗ＧＰＶＩ抗体Ｆ１２３２−７−１を、５０μＬ／ウエルで免疫プレート（immunoplate）（NuncC8Maxisorb社製）に分注し、４℃で一晩固相した。固相したプレートを氷冷イオン交換水にて５回洗浄した後、５％  スタバイオロガード（stabiolguard）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、３．２％  ショ糖（sucrose）／Ｄ−ＰＢＳを、２００μＬ／ウエルで加えて未反応の部分をブロッキングした。その後、プレートを真空乾燥下で冷蔵保存した。
ヒト血清及びヒト血漿は、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．３Ｍ  ＮａＣｌ／Ｄ−ＰＢＳにて１００倍以上に希釈調製してＦ１２３２−７−１固相プレートに加え、２８℃で２時間インキュベートした。なお、標準物質には、蛋白質発現システムFree Style 293 Expression System（Invitrogen社製）で発現精製した組換ヒトｓＧＰＶＩ−Ｈｉｓを用いた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだ生理食塩水でプレートを洗浄した。二次標識抗体として、実施例１で作製したＦ１２３２−１０−２  Ｆａｂ’−ＨＲＰを、２％ラット血清、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／Ｄ−ＰＢＳにて１００倍希釈して添加し、２８℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、室温に戻したテトラメチルベンチジン（tetramethylbenzidine、以下ＴＭＢと記載）を添加し、１０分間反応させた。０．５Ｍ硫酸を添加して反応を停止した後、マイクロプレートリーダーSepectraMax（Molecular Devices社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定し、６５０ｎｍ吸光度をブランクとして差し引いた。得られた吸光度はマイクロプレートデータ解析用ソフトウェアSoftMax Pro5.2（Molecular Devices社製）を用いて解析した。スタンダードカーブを、図１に示した。なお、データは原則として平均±標準誤差（ＳＥ）で表示した。
【実施例３】
【００４３】
・各疾患患者の血清及び血漿ｓＧＰＶＩ濃度の測定
各疾患患者の血清及び血漿中に含まれるｓＧＰＶＩを、実施例２で作製したサンドイッチＥＬＩＳＡ系を用いて測定した。測定には血栓性疾患患者検体、アルツハイマー患者検体及び健常人コントロール検体を用いた。なお、健常人コントロールはアルツハイマー患者の年齢に合わせて高齢者由来の検体を用いた。血漿をサンプルとして用いた測定結果を、図２に、血清をサンプルとして用いた測定結果を図３に示した。血栓性疾患患者及びアルツハイマー患者の血清及び血漿中ｓＧＰＶＩ濃度は健常人コントロールに比べ高値を示した。
【実施例４】
【００４４】
・各疾患患者の血漿中ｓＰ−セレクチン（sP-selectin）濃度の測定
実施例３で使用した各疾患患者の血漿を用いて、血小板活性化マーカーであるｓＰ−セレクチン濃度を、GMP-140(P-selectin) EIA kit(TAKARA)を用いて測定した。測定結果を図４に示した。血栓性疾患患者のｓＰ−セレクチン濃度は健常人コントロールに比べ高値を示したが、アルツハイマー患者と健常人コントロールとの間に差は認められなかった。
【実施例５】
【００４５】
・各疾患患者の血清中フィブリノーゲン分解産物（Fibrinogen Degradation Product（ＦＤＰ））濃度の測定
実施例３で使用した各疾患患者の血清を用いて、線溶系のマーカーであるＦＤＰを、ＦＤＰ測定キットLATECLE FDP（カイノス社製）を用いて測定した。結果を図５に示した。血栓性疾患患者のＦＤＰ濃度は健常人コントロールに比べ高値を示したが、アルツハイマー患者と健常人コントロールとの間に差は認められなかった。
【実施例６】
【００４６】
・各疾患患者におけるｓＧＰＶＩ濃度と血小板活性化マーカー及び凝固系マーカーの比較
実施例３〜５の結果を統計ソフトＳＡＳ／ＳＴＡＴ９．１を用いて解析を行った。
最初に血漿サンプルに対して解析を行った。すなわち、実施例３で測定した各疾患患者の血漿サンプル中のｓＧＰＶＩ濃度をノンパラメトリック多重比較Dunnett型steelの検定方法を用いて解析した。対照群を健常人コントロール群（年齢８４．５±７．１）として、アルツハイマー患者群（年齢８８．９±４．５）と血栓性疾患患者群（年齢６７．１±１０．９）におけるｓＧＰＶＩ濃度の比較を行った。その結果、アルツハイマー患者群（ｐ＝０．０００４４）と血栓性疾患患者群（ｐ＝０．００２４）は共にｓＧＰＶＩ濃度が有意に上昇していた。さらに、実施例４で測定した各疾患患者の血漿サンプル中のｓＰ−セレクチン濃度を同様な方法で統計解析した。その結果、健常人コントロール群と比較して血栓性疾患患者群はｓＰ−セレクチン濃度が有意に上昇しているのに対して（ｐ＝０．００３３）、アルツハイマー患者群においては健常人コントロール群との差は認められなかった（ｐ＝０．９６）。
次に血清サンプルに対して解析を行った。実施例３で測定した各疾患患者の血清サンプル中のｓＧＰＶＩ濃度をノンパラメトリック多重比較Dunnett型steelの検定方法を用いて解析した。対照群を健常人コントロール群（年齢８４．６±９．１）として、アルツハイマー患者群（年齢８５．１±１１．４）と血栓性疾患患者群（年齢不明）におけるｓＧＰＶＩ濃度の比較を行った。その結果、アルツハイマー患者群（ｐ＝０．０２７）と血栓性疾患患者群（ｐ＝０．０４５）は共にｓＧＰＶＩ濃度が有意に上昇していた。さらに、実施例５で測定した各疾患患者の血清サンプル中のＦＤＰ濃度を同様な方法で統計解析したところ、健常人コントロール群と比較して血栓性疾患患者群ではＦＤＰ濃度が有意に上昇しているのに対して（ｐ＝０．０１８）、アルツハイマー患者群においては健常人コントロール群との差は認められなかった（ｐ＝０．４１）。以上の結果は、ｓＧＰＶＩとｓＰ−セレクチンのような血小板活性化マーカーあるいはＦＤＰのような凝固線溶系活性化マーカーを組み合わせることでアルツハイマーを特異的に検出できることを示している。
【実施例７】
【００４７】
・マウスｓＧＰＶＩサンドイッチＥＬＩＳＡ系の作製
（１）ウサギ抗マウスＧＰＶＩ抗体の作製
組換えマウスｓＧＰＶＩ−Ｈｉｓ８５μｇを５００μＬの生理食塩水に溶解し、５００μＬのフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合し、ニュージーランド白色ウサギ（北山ラベス）メス10週齢の背部皮下に投与した。２週間後、組換えマウスｓＧＰＶＩ−Ｈｉｓ８５μｇを５００μＬの生理食塩水に溶解し、５００μＬのフロインド不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合し、背部皮下に投与した。
２回目の投与から１週間後、ウサギの耳動脈より採血した後、抗血清を分離し、抗体を精製した。すなわち抗血清に最終飽和濃度の５０％となるように硫酸アンモニウムを添加し、室温で１時間攪拌した。析出した沈殿を遠心分離した。沈殿画分をリン酸緩衝液（ＳＩＧＭＡ）（以下、Ｄ−ＰＢＳと記載）で溶解し、さらに透析法を用いてＤ−ＰＢＳにバッファー交換した。透析サンプルを濾過後、プロテインＡカラム（Millipore社）に供し、結合したイムノグロブリン画分を０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）により溶出した。溶出されたイムノグロブリン画分は、１／１０倍量の１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．５）を添加することでｐＨを中和し、透析法によりＤ−ＰＢＳにバッファー置換した。得られたウサギ抗マウスＧＰＶＩ抗体は、ウシ血清ＩｇＧをスタンダードとしてプロテインアッセイ染料試薬（Protein Assay Dye Reagent）（Bio-Rad社製）を用いてタンパク濃度を測定した。【００４８】
（２）ウサギ抗マウスＧＰＶＩ抗体Ｆａｂ’−ＨＲＰの作製
上記（１）で作製したウサギ抗マウスＧＰＶＩ抗体を酢酸緩衝溶液（ｐＨ４．０）にバッファー交換し、ペプシン（Roche社）を重量比３０：１（抗体；ペプシン）で添加した。３７℃で３時間反応させた後、２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．５）を添加してｐＨを中性にすることで反応を停止した。
次に、ペプシン消化した抗体を４ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）中にバッファー交換し、陰イオンカラム（Mono Q Column）（GE Healthcare社製）を用いてクロマトグラフィーを行った。精製されたＦ（ａｂ’）２画分はＤ−ＰＢＳにバッファー交換した後に、上記（１）と同様にタンパク濃度を測定した。
次に、得られたウサギ抗マウスＧＰＶＩ抗体Ｆ（ａｂ’）２を部分還元し、パーオキシダーゼ標識キットＳＨ（Peroxidase Labeling Kit SH）（同仁化学社製）を用いて、ヒンジ部分に存在するシステイン残基にパーオキシダーゼ（Peroxidase）を標識し、標識抗体（ウサギ抗マウスＧＰＶＩ抗体Ｆａｂ’−ＨＲＰと表記）を調製した。【００４９】
（３）マウスｓＧＰＶＩサンドイッチＥＬＩＳＡ系の作製
上記（１）で作製されたウサギ抗マウスＧＰＶＩ抗体をＤ−ＰＢＳを用いて１０μｇ／ｍＬに調製した。希釈調製した抗体溶液を５０μＬ／ウエルで免疫プレート（immunoplate）（NuncC8Maxisorb社製）に分注し、４℃で一晩固相した。固相したプレートを氷冷イオン交換水にて５回洗浄した後、２％  スタビリガード（stabilguard）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、３．２％  ショ糖（sucrose）／Ｄ−ＰＢＳを、２００μＬ／ウエルで加えて未反応の部分をブロッキングした。その後、プレートを真空乾燥下で冷蔵保存した。
マウス血漿を、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／Ｄ−ＰＢＳにて１０倍以上に希釈調製してウサギ抗マウスＧＰＶＩ抗体固相プレートに加え、室温で２時間インキュベートした。なお、標準物質には組換マウスｓＧＰＶＩ−Ｈｉｓを用いた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだ生理食塩水でプレートを洗浄した。二次標識抗体として、上記（２）で作製したウサギ抗マウスＧＰＶＩ抗体Ｆａｂ’−ＨＲＰを、２％ウサギ血清、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／Ｄ−ＰＢＳにて１００倍希釈して添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、室温に戻したＴＭＢを添加し、１０分間反応させた。０．５Ｍ硫酸を添加して反応を停止した後、マイクロプレートリーダーSepectraMax（Molecular Devices社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定し、６５０ｎｍ吸光度をブランクとして差し引いた。得られた吸光度はマイクロプレートデータ解析用ソフトウェアSoftMax Pro5.2（Molecular Devices社製）を用いて解析した。前記した実施例２と同様にして、スタンダードカーブを作成した。
【実施例８】
【００５０】
・アミロイド前駆体タンパク質（Ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）トランスジェニックマウス（以下、ＡＰＰ−Ｔｇマウスと記載する）における検討
（１）血漿ｓＧＰＶＩ濃度の測定
約１８〜２４ヶ月齢のＡＰＰ−Ｔｇマウス（B6;SJL-Tg(APPSWE)2576Kha,  Taconic Farms Inc.）及びコントロールマウス血漿中に含まれるｓＧＰＶＩを、実施例７で作製したサンドイッチＥＬＩＳＡ系を用いて測定した。なお、コントロールには同じ遺伝的背景を持つ野生型マウスを用いた。測定結果を図６に示した。
（２）マウスの血漿中ｓＰ−セレクチン（sP-selectin）濃度の測定
実施例８で使用した各マウスの血漿を用いて、血小板活性化マーカーであるｓＰ−セレクチン濃度を測定した。測定にはｓＰ−セレクチン ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ(Ｒ＆Ｄ社)を用いた。測定結果を図７に示した。
（３）各マウスにおけるｓＧＰＶＩ濃度と血小板活性化マーカーの比較
統計ソフトＳＡＳ／ＳＴＡＴ９．１を用いて、上記（１）で測定した各マウスの血漿サンプル中のｓＧＰＶＩ濃度をwilcoxonの順位和検定により解析した。その結果、ＡＰＰ−Ｔｇマウス群ではｓＧＰＶＩ濃度が有意に上昇していた（Ｐ＝０．００１１）。また、上記（２）で測定した各マウスの血漿サンプル中のｓＰ−セレクチン濃度をwilcoxonの順位和検定により解析したところ、両群間に有意な差は見られなかった（Ｐ＝０．０９４１）。
以上の結果は、ヒトのアルツハイマー患者と同様にマウスのアルツハイマーモデルにおいても血小板の活性化を伴わずにｓＧＰＶＩが産生されている事を示している。
【実施例９】
【００５１】
・ｓＧＰＶＩ産生機序の検討
実施例２で示したｓＧＰＶＩサンドイッチＥＬＩＳＡ系はヒトのｓＧＰＶＩの他に、サルのｓＧＰＶＩにも交差反応性を示す。そこでサル血小板を用いてｓＧＰＶＩの産生を検討した。
（１）サル洗浄血小板の調製
抗凝固剤としてクエン酸ナトリウムを用いてサル足静脈より全血を採取した。得られた全血を９００ｒｐｍ×１０ｍｉｎで遠心する事により多血小板血漿（Platelet-rich plasma（以下、ＰＲＰと記す））を分離し、ＰＲＰ画分のみをピペットマンで緩やかに吸い取り、新しいチューブに移した。得られたＰＲＰを室温、２０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎで遠心し、血小板を沈殿させた。沈殿した血小板を常法に従って調製したＡＣＤ（Acid-citrate-dextrose）−Ａ液含有０．０２％ＢＳＡ／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．４）に懸濁し、再度２０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎで遠心し、血小板を沈殿させた。洗浄目的の本操作を２回行った。２回目の洗浄終了後、遠心により血小板を沈殿させた後、０．０２％ＢＳＡ／ＨＥＰＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）に撹拌した。Sysmex F-820（東亜医用電子）を用いて血小板数をカウントし、４０．０×１０７個／ｍＬになるように調製し、洗浄血小板として用いた。
（２）アミロイドβ（以下、Ａβと記す）の調製
洗浄血小板に添加する、可溶型アミロイドβ（以下、sＡβと記す）と、線維化アミロイドβ（以下、fＡβと記す）をCindy M Sondag（Journal of Neuroinflammation. 2009 Jan 5;6:1-13）らの方法により、以下の手順で調製した。
Ａβ１−４２（AnaSpec Inc）を１ｍｇ／ｍＬとなるようにヘキサフルオロイソプロパノール（Hexafluoroisopropanol）（SIGMA）を添加し、1時間室温で静置し完全に溶解した。緩やかに加温することで、Hexafluoro isopropanolを完全に蒸発させた後、Ａβ１−４２が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いて溶解し、さらにＤ−ＰＢＳを用いて４００μｇ／ｍＬに希釈した。Ｄ−ＰＢＳで希釈した直後のＡβをｓＡβとし、希釈した後に室温で１週間静置したものをｆＡβとして使用した。
（３）サル洗浄血小板を用いたｓＧＰＶIの産生の検討
サル洗浄血小板に、コラーゲン、ｓＡβ、又はｆＡβの各種刺激剤を添加する事によりｓＧＰＶＩの産生を検討した。すなわち、上記（１）で調製した洗浄血小板懸濁液１８０μＬに、１００ｍＭ塩化カルシウム溶液を４μＬ添加した。さらに各種刺激剤を２０μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた。反応終了後１５０００ｒｐｍ×２ｍｉｎで遠心し、上清を新しいチューブに移した後、プロテアーゼ阻害剤混合物（Protease Inhibitor Cocktail）(SIGMA)を終濃度５％となるように、またＥＤＴＡを終濃度５ｍＭとなるように添加して反応を停止させた。反応液中のｓＧＰＶＩ濃度は実施例２に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定した。刺激剤を添加しない場合をコントロールとして、各種刺激剤を添加した場合の結果を図８に示す。
図８に示すように、刺激剤を添加していないコントロール群と比較して、ＧＰＶＩのリガンドであるコラーゲンを添加した際にはｓＧＰＶＩの産生が認められた。一方、ｓＡβを添加してもｓＧＰＶIの産生は認められなかったが、アルツハイマー患者において神経毒性作用を持つとされている線維化Ａβを添加した場合にはｓＧＰＶＩの産生が認められた。
この結果、ｓＧＰＶＩの産生機序の一つとして、アルツハイマー病患者において神経毒性作用を持つとされている線維化Ａβの増加により、ｓＧＰＶＩの産生が誘導される可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明は、非侵襲的、かつ特殊な機器を必要とせず簡便にアルツハイマー病を診断することができる診断剤又は診断に使用するためのキットを提供するものであり、診断剤又は診断用キットとして、産業上有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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