(57)【要約】【課題】癌幹細胞を標識及び傷害することができる新規でかつ効率的な癌幹細胞を標的とした癌の治療方法、予防方法、及び転移抑制方法、並びに癌幹細胞の傷害方法、識別方法を提供する。【解決手段】  本発明は、癌幹細胞において特異的に発現し、かつ治療や診断に利用可能なプロモーターを備えるウイルスベクターを提供する。また、本発明は該ウイルスベクターを利用した癌の治療方法、予防方法、及び転移抑制方法、並びに癌幹細胞の傷害方法、識別方法を提供する。また、本発明は、該ベクターを有効成分として含有する癌幹細胞の標識剤及び殺傷剤、並びに癌の診断薬、治療薬及び転移抑制剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の遺伝子に作動可能に連結させたＣＤ１３３プロモーターを有する、癌幹細胞特異的に当該所望の遺伝子を発現可能なウイルスベクター。
【請求項２】
前記所望の遺伝子がウイルスの増殖に必須のタンパク質をコードする遺伝子であって、癌幹細胞特異的に増殖可能である、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項３】
腫瘍溶解性である、請求項２に記載のウイルスベクター。
【請求項４】
アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ミキソーマウイルス、レオウイルス、ベジキュラー・ストマタイティスウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、ＲＳウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、又はセネカ・ヴァレイ・ウイルスである、請求項２又は請求項３に記載のウイルスベクター。
【請求項５】
アデノウイルスである、請求項２又は請求項３に記載のウイルスベクター。
【請求項６】
前記所望の遺伝子がアデノウイルスのＥ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子である、請求項５に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項７】
Ｅ１Ａが、Ｒｂ結合領域が欠損したＥ１Ａ（Ｅ１ＡΔ２４）である、又は、Ｅ１Ｂが、ｐ５３結合領域が欠損したＥ１Ｂ（Ｅ１ＢΔ５５Ｋ）である、請求項６に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項８】
更に、標識遺伝子、又は細胞毒性遺伝子を備える、請求項２〜請求項７のいずれか１項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項９】
更に、外来性の癌特異的プロモーターを備える、請求項２〜請求項８のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｃ）から選択される１のアデノウイルスベクターである、請求項６又は請求項７に記載のアデノウイルスベクター：
（ａ）以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター：
（ａ１）ＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ａ遺伝子又はＥ１ＡΔ２４遺伝子からなるＣＤ１３３転写ユニット
（ａ２）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ｂ遺伝子又はＥ１ＢΔ５５Ｋ遺伝子からなる転写ユニット、あるいは、癌特異的プロモーターの下流に作動可能に連結されたＥ１ＢΔ１９Ｋ遺伝子からなる転写ユニット
（ａ３）任意に、真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなる追加転写ユニット；
（ｂ）以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター：
（ｂ１）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ａ遺伝子又はＥ１ＡΔ２４遺伝子からなる転写ユニット、
（ｂ２）ＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ｂ遺伝子又はＥ１ＢΔ５５Ｋ遺伝子からなるＣＤ１３３転写ユニット、
（ｂ３）任意に、真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなる追加転写ユニット；
（ｃ）以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター：
（ｃ１）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ａ遺伝子又はＥ１ＡΔ２４遺伝子からなる転写ユニット、
（ｃ２）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ｂ遺伝子又はＥ１ＢΔ５５Ｋ遺伝子からなる転写ユニット、
（ｃ３）ＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなるＣＤ１３３転写ユニット。
【請求項１１】
前記所望の遺伝子が標識遺伝子である、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項１２】
更に、外来性の癌特異的プロモーターを備える、請求項１１に記載のウイルスベクター。
【請求項１３】
更に、細胞毒性遺伝子を備える、請求項１１又は請求項１２に記載のウイルスベクター。
【請求項１４】
前記所望の遺伝子が、細胞毒性遺伝子である請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項１５】
更に、外来性の癌特異的プロモーターを備える、請求項１４に記載のウイルスベクター。
【請求項１６】
更に、標識遺伝子を備える、請求項１４又は請求項１５のいずれか１項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１７】
腫瘍溶解性ウイルスである、請求項１１〜請求項１６のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
【請求項１８】
アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ミキソーマウイルス、レオウイルス、ベジキュラー・ストマタイティスウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、ＲＳウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、又はセネカ・ヴァレイ・ウイルスである、請求項１１〜請求項１７のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
【請求項１９】
ＣＤ１３３プロモーターが、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）から選択されるいずれか１項に記載の核酸分子である、請求項１〜請求項１８のいずれか１項に記載のウイルスベクター：
（ｉ）配列番号１〜５のいずれか１つの配列番号に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子、
（ｉｉ）配列番号１〜５のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列と８５％の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子、
（ｉｉｉ）配列番号１〜５のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子又はそれと相補的な配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、
（ｉｖ）配列番号１〜５のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列の一部の核酸が置換、欠失し、又は、配列番号１〜５のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列に追加の核酸が付加、挿入された核酸分子。
【請求項２０】
ＣＤ１３３プロモーターが、ＣＤ１３３のプロモータ５である、請求項１〜請求項１９のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
【請求項２１】
請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載のウイルスベクターを含有する癌の治療薬、転移抑制剤、若しくは予防薬又は診断薬。
【請求項２２】
請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載のウイルスベクターを含有する癌幹細胞の標識剤。
【請求項２３】
更に、同時に、連続的に又は時間をおいて別々に投与される以下の（ｉ）〜（ｉｉ）から選択される１以上の薬剤を含有する、請求項２１に記載の治療薬若しくは予防薬又は診断薬：
（ｉ）抗ウイルス作用を低下させる薬剤、
（ｉｉ）抗癌剤。
【請求項２４】
請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載のウイルスベクターをそれを必要とする患者に投与するステップを備える癌幹細胞の標識方法。
【請求項２５】
請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載のウイルスベクターをそれを必要とする患者に投与するステップを備える癌の診断方法。
【請求項２６】
請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載のウイルスベクターをそれを必要とする患者に投与するステップを備える癌の予防方法、転移抑制方法、又は治療方法。
【請求項２７】
更に、前記ウイルスベクターを患者の癌幹細胞に感染させるステップを備える、請求項２６に記載の予防方法、転移抑制方法、又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌幹細胞特異的プロモーターを備える組換アデノウイルスベクターに関する。特に、本発明は癌幹細胞で特異的に複製可能なアデノウイルスベクターに関する。また、本発明は、該ベクターを利用した癌幹細胞の同定方法、癌の診断方法及び治療方法に関する。本発明は、アデノウイルスベクターを有効成分として含有する癌の診断薬及び治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、癌幹細胞の存在が脳腫瘍（非特許文献１〜４参照）、大腸癌（非特許文献５〜９）など幾つかの癌で報告されている。癌幹細胞は、癌を構成する癌細胞のうち、幹細胞の性質を持ち、腫瘍を形成する能力がある少数の細胞と定義されている。癌幹細胞は以下の特徴を持っている：１）低分裂、低増殖率、２）高自己複製修復能、３）がん組織中で自己複製により癌幹細胞を維持しながら、分化によって周辺の大多数のがん細胞を生み出すもととなる、４）抗癌剤耐性と放射線療法耐性（非特許文献４、１０及び１１参照）。但し、幹細胞様（Ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ）の性質を持っていれば１）〜４）の全ての特性を兼ね備えることは必ずしも必須ではなく、癌の悪性化の主原因という点が重要な点であり、よってＴｕｍｏｒ−Ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ又はＣａｎｃｅｒ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ（癌始原細胞あるいは腫瘍又は癌の創始細胞）と呼称されることもある（非特許文献１２参照）。【０００３】
癌治療の重要な標的として、癌幹細胞を治療ターゲットとすることが注目されている。癌幹細胞仮説は既に１９７０年代に提唱されており、近年、癌幹細胞の存在が癌の各治療法への耐性、再発、及び悪化と関連することも明らかにされている。しかし、癌幹細胞の本体はまた不明であり、癌幹細胞を標的とした生物学的解析、及び治療（特に癌幹細胞特異的な治療）についての研究はほとんど進んでいないのが現状である。【０００４】
固形癌、特に脳腫瘍においては、細胞表面に発現する癌幹細胞マーカーとしてＣＤ１３３が報告されている（非特許文献１〜４参照）。ヒトＣＤ１３３は、１９９７年にＣＤ３４＋造血幹細胞に発現したエピトープとして確認された（非特許文献１３参照）。ＣＤ１３３はプロミニン１（ＰＲＯＭ１）とも呼ばれる５回膜貫通型の膜糖タンパク質で、多くのｓｐｌｉｃｅｄ  ｉｓｏｆｏｒｍが存在し、その発現は組織に依存する。ＣＤ１３３のリガンド及び下流のシグナルについてはまだ報告されておらず、機能に関しては未知であった。ＣＤ１３３は造血前駆細胞、血管内皮前駆細胞のマーカーであると同時に、神経系腫瘍（非特許文献１〜４参照）、前立腺癌（非特許文献１４参照）、大腸癌（非特許文献５〜９参照）、肺癌（非特許文献１５参照）、及び肝癌（非特許文献１６〜１８参照）の癌幹細胞マーカーの一つであることが報告されている。【０００５】
ＣＤ１３３は少なくとも５種類のプロモーターにより組織依存的に発現することが報告されているが、ヒト結腸癌由来細胞株であるＣａｃｏ−２細胞、奇形癌細胞株であるＮＴ−２細胞を用いたレポータアッセイの結果ではプロモーター１及び２は活性があるものの、プロモーター３〜５は特に活性は高くなかったことが示されている（非特許文献１９参照）。一方で、ヒト結腸癌由来細胞株であるＣａｃｏ−２細胞、及びヒト滑膜肉腫細胞株であるＦｕｊｉにおけるＣＤ１３３のプロモーター活性を解析した結果ではプロモーター１〜４にはほとんど活性が無く、プロモーター５に活性があることが報告されている（非特許文献２０）。これらの報告で採用した方法ではいずれもｐＧＬ３エンハンサーベクターを用いていることから、ＣＤ１３３プロモーターの活性をエンハンサーにより増強しているがそれほど高いプロモーター活性は認められていない。特に、Ｃａｃｏ−２細胞はＣＤ１３３を強く発現することが知られているが、当該細胞とｐＧＬ３エンハンサーベクターを用いた場合でもＣＤ１３３のプロモーター活性（特にプロモーター１〜４）はそれほど高くないことが知られていた。また、癌幹細胞におけるＣＤ１３３のプロモーター活性についてはこれまで知られていなかった。【０００６】
一般的に組織や幹細胞などの細胞に特異的なプロモーターは、ＲＳＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡプロモーター等の強制発現に利用されるプロモーターと比較するとその活性が非常に弱いことが知られている。このような組織・細胞特異的なプロモーターを利用して治療したり診断したりする場合、目的細胞でのプロモーター活性が低いことが原因でそのままでは治療や診断には用いることができないことが多く、プロモーター活性を高める工夫が必要であることが知られていた（特許文献１、非特許文献２１参照）。【０００７】
癌特異的に増殖可能なウイルスベクター（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ：ＣＲＡ）が知られている。このようなウイルスベクターとしては、アデノウイルスのＥ１領域内のＲｂ結合領域を欠損（Ｅ１ＡΔ２４）させ、又はｐ５３結合領域を欠損（Ｅ１ＢΔ５５）させたものや、Ｅ１遺伝子の内因性プロモーターを癌特異的に高発現するプロモーターと置換したものが知られている。例えば、後者の例としてウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性化受容体プロモーターを用いたアデノウイルスベクター（特許文献２参照）、ＰＥＧ３プロモーターを用いたアデノウイルスベクター（特許文献３参照）、サバイビンプロモーターを用いたアデノウイルスベクター（特許文献４参照）が報告されている。癌特異的に増殖可能なアデノウイルスベクターは、腫瘍溶解性を有する（非特許文献２２参照）ため、癌の治療に有効であると考えられている。また投与時に感染・遺伝子導入された癌細胞で増幅したウイルスが、周囲の癌細胞を壊してさらに周囲や遠隔部の癌細胞に感染して遺伝子導入していくため、ＣＲＡに遺伝子を搭載することにより遺伝子デリバリーのツールとしても有用であると考えている。更に、癌幹細胞を標的としたウイルスベクターによる治療も報告されている（非特許文献２３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２０１０／０９７４１９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００６／０７６４０８号パンフレット
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２００５／１１５４７６号パンフレット
【特許文献４】特許第４６２４１００号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｉｎｇｈ  ＳＫ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００４；４３２：３９６−４０１
【非特許文献２】Ｓｉｎｇｈ  ＳＫ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００３；６３：５８２１−８
【非特許文献３】Ｙｕａｎ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００４；２３：９３９２−４００
【非特許文献４】Ｌｉｕ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００６；５：６７
【非特許文献５】Ｄａｌｅｒｂａ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００７；１０４：１０１５８−６３
【非特許文献６】Ｒｉｃｃｉ−Ｖｉｔｉａｎｉ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００７；４４５：１１１−５
【非特許文献７】Ｐｕｇｌｉｓｉ  ＭＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  ２００９；１３  Ｓｕｐｐｌ  １：５５−６２
【非特許文献８】Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ＣＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００７；４４５：１０６−１０
【非特許文献９】Ｉｅｔａ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  ２００８；１５：６３８−４８
【非特許文献１０】Ｂａｏ  ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００６；４４４：７５６−６０
【非特許文献１１】Ｌｉ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ２００８；１００：６７２−９
【非特許文献１２】Ｎｅｕｚｉｌ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ．  ３５５：  ８５５−８５９，２００７
【非特許文献１３】Ｂｏｎｎｅｔ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９７；３：７３０−７
【非特許文献１４】Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＡＴ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５；６５：１０９４６−５１
【非特許文献１５】Ａ  Ｅｒａｍｏ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２００８）；１５：５０４−５１４
【非特許文献１６】Ｗ  Ｓｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２００８）６２（８）：１２１２−１２１８
【非特許文献１７】Ａｔｓｕｓｈｉ  Ｓｕｅｔｓｕｇｕ，ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２００６）３５１：８２０−８２４
【非特許文献１８】Ｓｈｅｎｇｙｏｎｇ  Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ（２００７）１２０：１４４４−１４５０
【非特許文献１９】Ｓｈｍｅｌｋｏｖ  ＳＶ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００４；１０３：２０５５−６１
【非特許文献２０】Ｋｏｕｉｃｈｉ  Ｔａｂｕ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１０；９：３９
【非特許文献２１】Ｔｏｍｏｋｏｙｕｋｉ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００６；１４（５）：６７３−６８３
【非特許文献２２】Ｔｏｔｈ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００３；１０：１５−２３
【非特許文献２３】Ｔｉｍｏｔｈｙ  Ｐ  Ｃｒｉｐｅら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（１０）：１６７７−１６８２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
癌幹細胞を標的とした効率的な治療方法等は未だ報告されていない。また、抗体等を用いた癌幹細胞を特異的に同定する方法においては、細胞表面への抗体の接触が求められることから、癌組織内部に存在する癌幹細胞を標識することができず、癌組織内部についても同定可能なより効果的な標識方法が求められていた。【００１１】
よって、本発明は、新規でかつ効率的な癌幹細胞を標的とした癌の治療方法及び癌幹細胞の標識方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、癌幹細胞で特異的に活性が高く、治療目的や診断目的で利用可能なプロモーターについて鋭意検討を行った。その結果、驚くべきことにＣａＣｏ−２細胞と比較してＣＤ１３３の発現が同程度か低いにもかかわらず、癌幹細胞ではＣＤ１３３のプロモーター活性が非常に強くそのままで十分治療及び診断目的に利用できることを見出した。また、本発明者らはＣＤ１３３プロモーターを増殖型アデノウイルスベクター（以下、「ＣＲＡ」という）に応用することにより、癌幹細胞特異的に増殖するベクターの作製及び検討を行った。その結果、ＣＤ１３３プロモーターをウイルスゲノムにおけるウイルスの増殖に必須のタンパク質（例えば、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）をコードする核酸に作動可能に連結させたＣＲＡ（以下、「ＣＤ１３３−ＣＲＡ」という。）が、癌幹細胞特異的に増殖することを見出した。また、本発明者らは、癌幹細胞特異的に増殖するベクターが当該癌幹細胞に感染し、当該癌幹細胞の内部で増殖することを見出した。【００１３】
本発明のベクターは、癌組織内に存在する癌幹細胞において特異的に増殖することから、同一ベクターに標識となる外来遺伝子を挿入することにより癌組織内における癌幹細胞を同定することに利用できる。更に、本発明のベクターは、癌幹細胞特異的に増殖するのみならず、最終的には癌幹細胞を破壊する能力を維持することから、癌幹細胞を標的とした治療に有用である。【００１４】
よって、本発明は、癌幹細胞において特異的に活性化するプロモーター及び当該プロモーターを有するウイルスベクターに関する。また、本発明は癌幹細胞において特異的に増殖可能なウイルスベクターに関する。更に本発明は、当該ベクターを利用した癌幹細胞の標識方法、及び癌の診断方法及び治療方法を提供するものである。また、本発明は、癌幹細胞において特異的に増殖可能なベクターを有効成分として含有する癌幹細胞の標識剤、並びに癌の診断薬、転移抑制薬、及び治療薬を提供する。具体的には、本発明は、癌幹細胞において特異的に増殖可能なベクターとしてＣＤ１３３−ＣＲＡを提供する。本発明において癌の予防方法、転移抑制方法及び治療方法は、癌発生の元となる癌幹細胞の増殖の抑制又は殺傷に基づくものである。【００１５】
具体的には、本発明は、以下の発明に関する：
（１）  所望の遺伝子に作動可能に連結させたＣＤ１３３プロモーターを有する、癌幹細胞特異的に当該所望の遺伝子を発現可能なウイルスベクター。
（２）  前記所望の遺伝子がウイルスの増殖に必須のタンパク質をコードする遺伝子であって、癌幹細胞特異的に増殖可能である（１）に記載のウイルスベクター。
（３）  腫瘍溶解性である（２）に記載のウイルスベクター。
（４）  アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ミキソーマウイルス、レオウイルス、ベジキュラー・ストマタイティスウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、ＲＳウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、又はセネカ・ヴァレイ・ウイルスである（２）又は（３）に記載のウイルスベクター。
（５）  アデノウイルスである（２）又は（３）に記載のウイルスベクター。
（６）  前記所望の遺伝子がアデノウイルスのＥ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子である、（５）に記載のアデノウイルスベクター。
（７）  Ｅ１Ａが、Ｒｂ結合領域が欠損したＥ１Ａ（Ｅ１ＡΔ２４）である、又は、Ｅ１Ｂが、ｐ５３結合領域が欠損したＥ１Ｂ（Ｅ１ＢΔ５５）である、（６）に記載のアデノウイルスベクター。
（８）  更に、標識遺伝子、又は細胞毒性遺伝子を備える（２）〜（７）のいずれか１項に記載のアデノウイルスベクター。
（９）  更に、外来性の癌特異的プロモーターを備える（２）〜（８）のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
（１０）  以下の（ａ）〜（ｃ）から選択される１のアデノウイルスベクターである、（６）又は（７）に記載のアデノウイルスベクター：
（ａ）以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター：
（ａ１）ＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ａ遺伝子又はＥ１ＡΔ２４遺伝子からなるＣＤ１３３転写ユニット
（ａ２）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ｂ遺伝子又はＥ１ＢΔ５５Ｋ遺伝子からなる転写ユニット、あるいは、癌特異的プロモーターの下流に作動可能に連結されたＥ１ＢΔ１９Ｋ遺伝子からなる転写ユニット
（ａ３）任意に、真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなる追加転写ユニット；
（ｂ）以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター：
（ｂ１）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ａ遺伝子又はＥ１ＡΔ２４遺伝子からなる転写ユニット、
（ｂ２）ＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ｂ遺伝子又はＥ１ＢΔ５５Ｋ遺伝子からなるＣＤ１３３転写ユニット、
（ｂ３）任意に、真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなる追加転写ユニット；
（ｃ）以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター：
（ｃ１）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ａ遺伝子又はＥ１ＡΔ２４遺伝子からなる転写ユニット、
（ｃ２）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ｂ遺伝子又はＥ１ＢΔ５５Ｋ遺伝子からなる転写ユニット、
（ｃ３）ＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなるＣＤ１３３転写ユニット。
（１１）  前記所望の遺伝子が標識遺伝子である（１）に記載のウイルスベクター。
（１２）  更に、外来性の癌特異的プロモーターを備える（１１）に記載のウイルスベクター。
（１３）  更に、細胞毒性遺伝子を備える（１１）又は（１２）に記載のウイルスベクター。
（１４）  前記所望の遺伝子が、細胞毒性遺伝子である請求項１に記載のウイルスベクター。
（１５）  更に、外来性の癌特異的プロモーターを備える（１４）に記載のウイルスベクター。
（１６）  更に、標識遺伝子を備える（１４）又は（１５）のいずれか１項に記載のアデノウイルスベクター。
（１７）  腫瘍溶解性ウイルスである（１１）〜（１６）のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
（１８）  アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ミキソーマウイルス、レオウイルス、ベジキュラー・ストマタイティスウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、ＲＳウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、又はセネカ・ヴァレイ・ウイルスである（１１）〜（１７）のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
（１９）  ＣＤ１３３プロモーターが、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）から選択されるいずれか１項に記載の核酸分子である、（１）〜（１８）のいずれか１項に記載のウイルスベクター：
（ｉ）配列番号１〜５のいずれか１つの配列番号に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子、
（ｉｉ）配列番号１〜５のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列と８５％の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子、
（ｉｉｉ）配列番号１〜５のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子又はそれと相補的な配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、
（ｉｖ）配列番号１〜５のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列の一部の核酸が置換、欠失し、又は、配列番号１〜５のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列に追加の核酸が付加、挿入された核酸分子。
（２０）  （１）〜（１９）のいずれか１項に記載のウイルスベクターを含有する癌の治療薬、転移抑制剤、若しくは予防薬又は診断薬。
（２１）  （１）〜（１９）のいずれか１項に記載のウイルスベクターを含有する癌幹細胞の標識剤。
（２２）  更に、同時に、連続的に又は時間をおいて別々に投与される以下の（ｉ）〜（ｉｉ）から選択される１以上の薬剤を含有する（２０）に記載の治療薬若しくは予防薬又は診断薬：
（ｉ）抗ウイルス作用を低下させる薬剤、
（ｉｉ）抗癌剤。
（２３）  （１）〜（１９）のいずれか１項に記載のウイルスベクターをそれを必要とする患者に投与するステップを備える癌幹細胞の標識方法。
（２４）  （１）〜（１９）のいずれか１項に記載のウイルスベクターをそれを必要とする患者に投与するステップを備える癌の診断方法。
（２５）  ウイルスベクターが標識遺伝子を有する、（２３）又は（２４）に記載の方法。
（２６）  （１）〜（２０）のいずれか１項に記載のウイルスベクターをそれを必要とする患者に投与するステップを備える癌の予防方法、転移抑制方法、又は治療方法。
（２７）  更に、前記ウイルスベクターを患者の癌幹細胞に感染させるステップを備える（２６）に記載の予防方法、転移抑制方法、又は治療方法。
（２８）  ウイルスベクターが細胞毒性遺伝子を有する、（２６）又は（２７）に記載の方法。
（２９）  前記所望の遺伝子がウイルスの増殖に必須のタンパク質をコードする遺伝子であって、前記ウイルスベクターが癌幹細胞特異的に増殖可能である（２３）〜（２８）のいずれか１項に記載の方法。【００１６】
本発明で使用できるＣＤ１３３プロモーターとしては、ＣＤ１３３（ＡＣ１３３、ＰＲＯＭ１と呼ばれることもある）のプロモーターとして報告された配列を有する核酸分子であれば特に制限されない。例えば、マウス、ラット、及びヒトのＣＤ１３３が報告されている。限定されない例として、Ｓｈｍｅｌｋｏｖ  ＳＶ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００４；１０３：２０５５−６１、並びにＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＡＹ２７５５２４、ＡＹ４３８６４１及びＡＹ４３８６４０に開示されたヒトＣＤ１３３プロモーター１〜５を挙げることができる。本発明のプロモーターとしては、具体的には、ヒトＣＤ１３３プロモーター１（ｐｒ１；配列番号１）、プロモーター２（ｐｒ２；配列番号２）、プロモーター３（ｐｒ３；配列番号３）、プロモーター４（ｐｒ４；配列番号４）、及びプロモーター５（ｐｒ５；配列番号５）を用いることができる。また、他の動物種のＣＤ１３３プロモーター（例えばマウスのＰｒｏｍｉｎｉｎ−１のプロモーター１（配列番号６）、プロモーター２（配列番号７）、又はプロモーター３（配列番号８））（Ｋｅｍｐｅｒ  Ｋ，Ｔｏｌ  ＭＪＰＭ，Ｍｅｄｅｍａ  ＪＰ（２０１０）Ｍｏｕｓｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｐｌｉｃｅ  Ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｍｉｎｉｎ−１．ＰｌｏＳ  ＯＮＥ  ５（８）：ｅ１２３２５）を用いてもよい。【００１７】
また、「ＣＤ１３３プロモーター」は、上述のプロモーターに加え、配列番号１〜７のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列と８５％、９０％、９５％、又は９８％の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子であってもよい。配列の相同性は、例えばＢＬＡＳＴを用いることにより決定することができる。更に、「ＣＤ１３３プロモーター」は、上述のプロモーターに加え、配列番号１〜７のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子又はそれと相補的な配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子であってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら，「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（２０１１）に記載された方法によってハイブリダイズすることを言う。より具体的には、ニトロセルロース膜上に固定したＤＮＡと、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡの溶液中、６５℃で反応させ、その後、０．１〜０．５×ＳＳＣ（１５〜３０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５〜３ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１％  ＳＤＳで６５〜６８℃で数回洗浄することによりハイブリダイズすることを言う。「ＣＤ１３３プロモーター」は、配列番号１〜７のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列の一部の核酸が置換、欠失し、又は、配列番号１〜７のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列に追加の核酸が付加、挿入された核酸分子を含む。核酸が欠失、付加、挿入される場合には、その後に続く遺伝子の読み枠が変化しない数が欠失、付加又は挿入される。このような置換、欠失、付加、挿入の数としては、１〜５０ヌクレオチド、１〜２０ヌクレオチド、１〜１０ヌクレオチド、１〜３ヌクレオチドである。また、置換、欠失、付加、挿入のうち、２種類以上の変異が含まれていてもよい。好ましくは、転写因子結合領域以外の位置において置換、欠失、付加、挿入される。転写因子結合領域は、例えば、ＴＦＳＥＡＲＣＨ及びＡｌｉｂａｂａ等の転写因子の結合部位予測プログラムを用いて調べることもできるし、Ｓｈｍｅｌｋｏｖ  ＳＶ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００４；１０３：２０５５−６１の記載（図３等）から知ることができる。【００１８】
配列番号１〜７のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列と８５％、９０％、９５％、又は９８％の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子、配列番号１〜７のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子又はそれと相補的な配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、及び、配列番号１〜７のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列の一部の核酸が置換、欠失し、又は、配列番号１〜７のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列に追加の核酸が付加、挿入された核酸分子は、ＣＤ１３３と同等のプロモーター活性を有することが望ましい。本明細書において、「ＣＤ１３３と同等のプロモーター活性」とは、野生型のＣＤ１３３プロモーターの活性が高い条件下でプロモーター活性が高く、野生型のＣＤ１３３プロモーターの活性が低い条件下で同様にプロモーター活性が低いことを意味する。ＣＤ１３３と同等のプロモーター活性とは、主には質的にＣＤ１３３と同等のプロモーター活性を有することを意味するが、ＣＤ１３３と同等のプロモーター活性は、量的に野生型のＣＤ１３３と同程度かそれよりも強いことであってもよい。【００１９】
更に、本明細書において、「ＣＤ１３３プロモーター」の語は、ＣＤ１３３と同等のプロモーター活性を維持する限り、前記ＣＤ１３３のプロモーターの断片も含む。ＣＤ１３３のプロモーターの断片はＣＤ１３３プロモーターの転写因子の結合部位の少なくとも１つを有し、好ましくは、ＣＤ１３３プロモーターの転写因子結合部位の全てを有する。転写因子結合領域は、上述の方法により決定することができる。例えば、本発明のＣＤ１３３プロモーターの断片は、ヒトＣＤ１３３プロモーター１（ｐｒ１；配列番号１）、プロモーター２（ｐｒ２；配列番号２）、プロモーター３（ｐｒ３；配列番号３）、プロモーター４（ｐｒ４；配列番号４）、及びプロモーター５（ｐｒ５；配列番号５）、並びにマウスＣＤ１３３プロモーター１（配列番号６）、プロモーター２（配列番号７）、プロモーター３（配列番号８）の断片であってもよい。【００２０】
本明細書において、ＣＤ１３３プロモーターがウイルスゲノムにおける所望の遺伝子に「作動可能に連結する」とは、ＣＤ１３３プロモーターが前記所望の遺伝子の上流に当該遺伝子の転写を調整することができるように位置することを意味する。【００２１】
本明細書において、「ウイルスベクター」は、外来性のＤＮＡ又はＲＮＡを遺伝子に組み込むことができるウイルスであって、対象動物（例えば、ヒト）に投与されても安全なウイルスであれば特に制限されない。本発明のウイルスベクターは、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスのいずれであってもよい。好ましくは、本発明のウイルスベクターは癌細胞（好ましくは、癌幹細胞）以外の細胞には感染しないか、当該細胞内では自己複製できないウイルスである。また、好ましくは、ウイルスベクターは、腫瘍溶解性を有するか遺伝子組み換えにより腫瘍溶解性を獲得可能なウイルスである。本発明のウイルスベクターを治療目的で使用する場合、好ましくは本発明のウイルスベクターは細胞溶解性を備える。ここで、「細胞溶解性」とは、ウイルスベクターが複製する条件を備える細胞（例えば、癌細胞、癌幹細胞）に感染した場合に、当該細胞を溶解して細胞外にウイルスを放出する能力を意味する。本発明のウイルスとして好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスである。【００２２】
本明細書において、「腫瘍溶解性ウイルス」は、腫瘍細胞を溶解する能力を有するウイルスのことである。好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスは、ヒト癌細胞には毒性を示すが正常なヒト細胞には毒性を示さない。ウイルスの腫瘍特異性は、ウイルスの感染特性、増幅特性、細胞溶解特性のいずれの特性に基づいていてもよい。例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、ヒト癌細胞には感染し毒性を示すが正常なヒト細胞には感染せず毒性を示さない動物ウイルス；ウイルス遺伝子のプロモーターが癌細胞のみで活性化する腫瘍特異的プロモーターに置換されているため、癌細胞内ではウイルスは複製するが正常細胞では複製しない変異型ウイルス；ウイルス複製に必須の細胞周期が回転しているという環境をもたらすために、細胞周期を抑制する遺伝子（Ｐ５３やＲｂなど）を不活化するウイルス遺伝子が欠損しているか変異が入っているため、細胞周期が異常更新して回転している癌細胞内ではこれら変異に関係なくウイルスは複製するが、正常細胞では細胞周期回転を誘導できないためウイルスは複製しない変異型動物ウイルス；細胞溶解に重要な遺伝子に変異が入っているため、癌細胞は溶解するが正常細胞は溶解しない変異型動物ウイルス；及び、ウイルスワクチンのように連続継代培養により弱毒化した動物ウイルスを含む。【００２３】
例えば、本発明のウイルスベクターとしては、ヘルペス単純ウイルス、ミキソーマウイルス、レオウイルス、ベジキュラー・ストマタイティス・ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ＲＳウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、セネカ・ヴァレイ・ウイルスを挙げることができる（Ｔｉｍｏｔｈｙ  Ｐ  Ｃｒｉｐｅら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（１０）：１６７７−１６８２）。例えば、ミキソーマウイルスは癌細胞では複製し細胞溶解を起こすが、ヒトの正常細胞には感染しない。また、レオウイルスは自然から単離された状態で腫瘍溶解性があり、癌細胞及び癌幹細胞の両方に感染する。ベジキュラー・ストマタイティス・ウイルスは、通常の細胞では急性期の抗ウイルスインターフェロン応答により感染しないが、インターフェロン応答が解除されている癌細胞には感染する。ベジキュラー・ストマタイティス・ウイルスの腫瘍溶解性が高い変異株や組換株が得られている（Ｌｉｃｈｔｙ，ＢＤら，（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０：２１０−２１６）。【００２４】
本明細書において、「アデノウイルス」又は「アデノウイルスベクター」とは、アデノウイルス科マストアデノウイルス属に属する、哺乳動物に感染するウイルスを意味する。好ましくは、ヒトアデノウイルスである。ヒトアデノウイルスはＡ〜Ｆの亜属とセロタイプが存在するが、本発明におけるアデノウイルスは特定の亜属及びセロタイプに限定されるものではない。例えば、アデノウイルスは、Ｅ１Ａ及び／又はＥ１Ｂに変異が入ったアデノウイルスでもよい。Ｅ１Ａタンパク質の変異としては、Ｒｂ結合領域の欠損（Ｅ１ＡΔ２４）を挙げることができる。また、Ｅ１Ｂタンパク質の変異としては、ｐ５３結合領域の欠損（Ｅ１ＢΔ５５Ｋ）を挙げることができる。【００２５】
本明細書において「所望の遺伝子」とは、癌幹細胞において特異的に発現させることにより利用可能な遺伝子であれば特に限定されない。例えば、本発明のウイルスベクターを治療目的で使用する場合、所望の遺伝子は、ウイルスの増殖に必須のタンパク質をコードする遺伝子、又は細胞毒性遺伝子とすることができる。また、本発明のウイルスベクターを診断又は同定目的で使用する場合、所望の遺伝子は標識遺伝子とすることができる。【００２６】
本明細書において、「ウイルスの増殖に必須のタンパク質」とは、ウイルスの増殖において役割を果たすタンパク質であれば特に限定されない。例えば、本発明のウイルスベクターとして、アデノウイルスを用いる場合、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５を挙げることができ、好ましくはＥ１Ａ及びＥ１Ｂである。ここで、ウイルスの増殖に必須のタンパク質は、野生型であってもよいし、変異型であってもよい。例えば、変異型のＥ１Ａタンパク質としては、Ｒｂ結合領域が欠損したＥ１Ａ（Ｅ１ＡΔ２４）を挙げることができる。また、変異型Ｅ１Ｂタンパク質としては、ｐ５３結合領域が欠損したＥ１Ｂ（Ｅ１ＢΔ５５Ｋ）を挙げることができる。特に、本発明のベクターは、ＣＤ１３３プロモーターが活性化されている細胞内においてアデノウイルスの増殖が亢進されることから、本発明のアデノウイルスベクターは、ＣＤ１３３プロモーターと作動可能に連結したＥ１ＡΔ２４及び／又はＥ１ＢΔ５５Ｋを有することよりアデノウイルスの癌幹細胞内での増殖の特異性を高めることができる。【００２７】
また、例えば、本発明のウイルスベクターとしてヘルペス単純ウイルスを用いる場合、ウイルスの増殖に必須のタンパク質は、ＩＣＰ３４．５（ＨＳＶ−１  ＲＬ１遺伝子）、及びＩＣＰ６（ＵＬ３１遺伝子）を挙げることができる。【００２８】
「細胞毒性遺伝子」とは、細胞内で発現することにより当該細胞にアポトーシス若しくはネクローシスを誘導する物質をコードする遺伝子、発現することにより免疫細胞により貪食される遺伝子、又は細胞内で発現することにより細胞増殖を停止させる物質をコードする遺伝子のことである。細胞毒性遺伝子は、タンパク質をコードしていてもよいし、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ等のノンコーディングＲＮＡをコードしていてもよい。また、細胞毒性遺伝子は、コードする物質そのものが細胞の生存又は増殖を直接阻害するものであってもよいし、コードする物質が例えばプロドラッグと共に用いられて該プロドラッグを毒性化して細胞に障害を与えてもよい。あるいは、細胞毒性遺伝子は、細胞表面に提示されて細胞傷害性Ｔ細胞などの免疫細胞や抗体の標的となって間接的に細胞を殺傷し又は増殖を阻害するものであってもよい。細胞毒性遺伝子としては、これに限定されるものではないが、ｍｄａ−５、ｍｄａ−７、ＢＡＸ、ＰＴＥＮ、可溶性ＦＧＦＲ、ｒａｓに対するｓｉＲＮＡ又はアンチセンス、ｍｄａ−９に対するｓｉＲＮＡ又はアンチセンス；ＨＳＶ−ｔｋ（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ；ガンシクロビルを毒性化）、大腸菌シトシンデアミナーゼ（ＣＤ；５−フルオロシトシンを毒性化）等のプロドラッグを毒性化する遺伝子；ｐ５３、アデノウイルスＥ３−１１．６Ｋ（Ａｄ２及びＡｄ５由来）、アデノウイルスＥ３−１０．５Ｋ、アデノウイルスＥ４遺伝子、カスパーゼ等のアポトーシス促進遺伝子；ｐ２１、網膜芽腫遺伝子、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（ｐ１６、ｐ１５、ｐ１８及びｐ１９等）をコードする遺伝子、増殖停止特異的ホメオボックス（ＧＡＸ）遺伝子等の細胞増殖抑制性遺伝子；シュードモナス外毒素等の細胞毒性遺伝子；ＴＮＦ−α、ｐ５３、ＡＰＣ、ＤＰＣ−４、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、ＷＴ−１、ＭＭＡＣ−１等の腫瘍抑制性遺伝子；ＣＥＡ、ｐ５３等の免疫システムに認識される抗原を細胞表面に提示させる抗原遺伝子；ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０等のサイトカイン遺伝子；アンジオスタチン、ＶＥＧＦに対するｓｉＲＮＡ又はアンチセンス等の血管新生抑制遺伝子を挙げることができる。また、細胞毒性遺伝子は、放射線療法、化学療法又は免疫療法の反応性を高める遺伝子であってもよく、例えば、ＥＧＦ受容体（ゲフィチニブ等のＥＧＦＲ特異的チロシンキナーゼ阻害剤による治療効果を高める）、Ｈｅｒ−２受容体（乳癌患者におけるハーセプチンによる治療効果を高める）であってもよい。毒性遺伝子がプロドラッグを毒性化する物質の場合、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子（ガンシクロビル又はアシクロビルと組み合わせて使用）、シトシンデアミナーゼ遺伝子（５−フルオロシトシンと組み合わせて使用）、大腸菌由来ｕｐｐ遺伝子及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のｆｕｒ遺伝子（５−フルオロウラシルと組み合わせて使用）、及びチミジンキナーゼ遺伝子又はチミジンキナーゼとチミジル酸キナーゼの融合遺伝子（アジドチミジンと組み合わせて使用）を挙げ���ことができる。【００２９】
本明細書において、「標識遺伝子」とは、当該遺伝子が導入された細胞を標識可能な物質をコードする遺伝子のことであり、癌幹細胞を標識可能な標識遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＧＦＰ）等の蛍光タンパク質、β−グルクロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子を挙げることができる。また、例えば、フェチリン遺伝子など、画像診断を可能とする標識遺伝子であってもよい。本明細書において、癌幹細胞を「標識する」とは、その利用目的に応じて、一時的に又は長期間、癌幹細胞又は癌幹細胞を含む組織の存在又はその位置を同定し、あるいは癌幹細胞を他の細胞や組織から識別することを意味する。また、本明細書において癌幹細胞の「同定する」とは、一時的又は長期的に癌幹細胞又は癌幹細胞を含む組織の存在又はその位置を特定することを意味し、「識別する」とは、一時的又は長期的に癌幹細胞又は癌幹細胞を含む組織を他の細胞や組織から区別することを意味する。よって、本明細書における標識は、癌幹細胞又は癌幹細胞を含む組織の存在又はその位置を特定し、あるいは、癌幹細胞又は癌幹細胞を含む組織を他の細胞や組織から区別することができれば特に制限されず、癌幹細胞以外の細胞が全く染色等されないことを要するものではない。例えば、癌組織内における癌幹細胞の存在を、本発明のベクターの癌組織への直接注入して染色することにより識別する場合、癌組織内の癌幹細胞でない癌細胞と比較して癌幹細胞が区別可能な程度に染色されていればよく、癌細胞又は他の細胞が（弱く）染色されていてもよい。【００３０】
本発明のウイルスベクターは、ＣＤ１３３プロモーターの下流に所望の遺伝子を作動可能に連結した転写ユニット（以下、「ＣＤ１３３転写ユニット」という）に加えて、癌細胞において特異的に活性が高められているプロモーター（以下、「癌特異的プロモーター」という）の下流に異なる又は同一の所望の遺伝子を作動可能に連結した転写ユニット（以下、「癌特異的転写ユニット」という）を有していてもよい。ＣＤ１３３プロモーター転写ユニットと癌特異的転写ユニットを組み合わせて備えることにより、ウイルスベクターの癌幹細胞に対する毒性の特異性高め、及び／又は一つのウイルスベクターに癌幹細胞に対する毒性と癌幹細胞を識別又は同定する機能の両方を持たせることができる。癌特異的プロモーターとしては、多くの癌に共通して活性が高められているプロモーターを用いてもよいし、標的の癌の種類に応じて当該癌において特異的に発現が高められているプロモーターを用いてもよい。また、癌特異的プロモーターは、癌幹細胞において活性が高められているプロモーターであってもよい。これに限定されるものではないが、癌特異的プロモーターとしては、ネスチンプロモーター、シクロオキシゲナーゼ−２（Ｃｏｘ−２）プロモーター、複数医薬耐性（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ｍｄｒ）タンパク質プロモーター、テロメラーゼプロモーター、前立腺特異的抗原遺伝子プロモーター、カリクレイン２遺伝子プロモーター、ヒトαフェトタンパク質遺伝子プロモーター、メラノーマ分化マーカーチロシナーゼプロモーター、チロシナーゼプロモーター、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子プロモーター、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）遺伝子プロモーター、ガストリン放出ペプチド遺伝子プロモーター、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子プロモーター、ヘキソキナーゼＩＩ遺伝子プロモーター、Ｌ−プラスチン遺伝子プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモーター、ミッドカイン遺伝子プロモーター、ヒトムチン遺伝子ＭＵＣ１プロモーター、サバイビンプロモーター、オーロラキナーゼプロモーター、及びヒトムチン遺伝子ＭＵＣ４プロモーター等を挙げることができる。【００３１】
本発明のウイルスベクターは、更に所望の遺伝子を発現させるための追加の転写ユニット（以下、「追加転写ユニット」という）を有していてもよい。本発明のウイルスベクターが追加転写ユニットを有する場合、当該追加転写ユニットを制御するプロモーターは、真核細胞で活性のあるプロモーター（以下、「真核細胞プロモーター」という）であれば特に制限されない。追加転写ユニットにおけるプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルスプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス前初期プロモーター）、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列プロモーター、ヒトエロンゲーションファクター１αプロモーター、ヒトユビキチンｃプロモーター、ＰＥＧ−３プロモーターを用いることができる。また、マウス乳癌ウイルスプロモーター（デキサメタゾンにより誘導可能）、テトラサイクリン反応性又はエクジソン誘導性プロモーター等の誘導可能なプロモーターを用いてもよい。また、前述の癌細胞特異的に活性のあるプロモーターを用いることもできる。また、追加転写ユニットを制御するプロモーターとして、ＣＤ１３３プロモーターを用いてもよい。【００３２】
本発明のベクターが癌特異的転写ユニット及び／又は追加転写ユニットを有する場合、癌特異的転写ユニット及び／又は追加転写ユニットは、ＣＤ１３３プロモーターがウイルスゲノムにおけるウイルスの増殖に必須のタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結した転写ユニットと共にアデノウイルスＥ１領域に挿入されていてもよいし、アデノウイルスの他の領域（例えば、Ｅ３領域）に挿入されてもよい。【００３３】
本発明のベクターが癌特異的転写ユニット及び／又は追加転写ユニットを有する場合、所望の遺伝子としては、ウイルスの増殖に必須のタンパク質をコードする遺伝子、標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子を用いることができる。【００３４】
また、本発明のベクターは、多因子がん特異的増殖制御型組換えアデノウイルス系（ｍ−ＣＲＡ；特開２００５−０４６１０１号及び国際公開第ＷＯ２００５／０１２５３６号）であってもよい。【００３５】
例えば、本発明のアデノウイルスベクターの例として以下のアデノウイルスベクターを挙げることができる：
（ａ）以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター：
（ａ１）ＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ａ遺伝子又はＥ１ＡΔ２４遺伝子からなるＣＤ１３３転写ユニット
（ａ２）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ｂ遺伝子又はＥ１ＢΔ５５Ｋ遺伝子からなる転写ユニット、あるいは、癌特異的プロモーターの下流に作動可能に連結されたＥ１ＢΔ１９Ｋ遺伝子からなる転写ユニット
（ａ３）任意に、真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなる追加転写ユニット；
（ｂ）以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター：
（ｂ１）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ａ遺伝子又はＥ１ＡΔ２４遺伝子からなる転写ユニット、
（ｂ２）ＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ｂ遺伝子又はＥ１ＢΔ５５Ｋ遺伝子からなるＣＤ１３３転写ユニット、
（ｂ３）任意に、真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなる追加転写ユニット；
（ｃ）以下の転写ユニットを有するアデノウイルスべクター：
（ｃ１）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ａ遺伝子又はＥ１ＡΔ２４遺伝子からなる転写ユニット、
（ｃ２）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ｂ遺伝子又はＥ１ＢΔ５５Ｋ遺伝子からなる転写ユニット、
（ｃ３）ＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなるＣＤ１３３転写ユニット。【００３６】
ＣＤ１３３−ＣＲＡとは、ＣＤ１３３プロモーターをウイルスゲノムにおけるウイルスの増殖に必須のタンパク質（例えば、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）をコードする核酸に作動可能に連結させた増殖型アデノウイルスベクター（ＣＲＡ）のことであり、上述の（ａ）又は（ｂ）に記載のアデノウイルスベクターと同義である。【００３７】
また、本発明のウイルスベクターは、ウイルスのファイバーやヘキソンが修飾又は置換されることにより、癌幹細胞への感染特異性が高められていてもよい。例えば、癌幹細胞の表面タンパク質に対するリガンドを、ウイルスファイバーのＨＩループやヘキソンタンパク質等のキャプシド内に含んでいてもよい。【００３８】
本発明のベクターは、癌幹細胞特異的に標識し、又は傷害を与えることができるので、癌の診断、予防、治療及び癌の転移を阻害するための医薬組成物、あるいは癌幹細胞を標識、傷害及び殺傷するための医薬組成物として使用することができる。本発明のベクター又は該ベクターを含有する医薬組成物によって、診断、予防、治療又は転移の抑制が可能な癌としては、脳腫瘍、グリア芽腫、頭頚部癌、胃癌、肺癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、肝癌、気管支癌、上咽頭癌、咽頭癌、食道癌、膀胱がん、膵臓癌、前立腺癌、大腸癌、骨肉腫、皮膚癌、メラノーマ、甲状腺癌、副甲状腺癌、尿管癌、子宮頸癌と、造血器や血液の悪性腫瘍（例えば、白血病、悪性リンパ腫等）を挙げることができる。好ましくは、癌幹細胞の存在が確認されている癌であり、例えば、脳腫瘍、グリア芽腫、頭頚部癌、胃癌、肺癌、乳癌、肝癌、膀胱癌、大腸癌、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌（Ｓ．Ｂｏｍｋｅｎら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ（２０１０）１０３：４３９−４４５；Ｎａｔａｓｈａ  Ｙ．Ｆｒａｎｋら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（２０１０）１２０：４１−５０）を挙げることができる。特に好ましくは、癌幹細胞においてＣＤ１３３の発現が確認されている癌であり、例えば、脳腫瘍、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、肝癌、大腸癌、メラノーマ、前立腺癌を挙げることができる（Ｔａｂｕら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ（２０１０）９：３９；阿部ら、細胞工学（２００８）２７（１０）１０３６−１０４１）。本発明のベクター又は該ベクターを含有する医薬組成物は、前記癌における癌幹細胞の同定剤、識別剤、標識剤、傷害剤又は殺傷剤としてもよい。【００３９】
本明細書において、癌幹細胞に「傷害を与える」とは、癌幹細胞がその機能を発揮できない状態にすることを意味し、具体的には、癌幹細胞が自己増殖及び／又は癌細胞への分化ができない状態にすることを指す。「癌幹細胞特異的に傷害を与える」とは、正常な細胞との比較において癌幹細胞に対してそのような傷害をより強く与えることを意味し、正常な細胞又は癌幹細胞以外の癌細胞への毒性が全くないことを意味するものではない。また、「傷害を与える」とは、癌幹細胞（転移性癌幹細胞を含む）をアポトーシス又はネクローシスにより破壊することの他、癌幹細胞が対象内の免疫システムによって破壊されること、並びに、癌幹細胞の増殖を阻害し、及び／又は分化を阻害することを含む。また、癌幹細胞への傷害は、癌幹細胞特異的に複製可能で細胞溶解性（又は腫瘍溶解性）を有する本発明のウイルスベクターが細胞内で複製後に細胞（特には癌幹細胞）を溶解することにより与えられてもよい。あるいは、癌幹細胞への障害は、細胞毒性遺伝子が細胞内で発現することにより当該細胞にアポトーシス若しくはネクローシスを誘導し、共に用いられるプロドラッグを毒性化し、又は細胞表面に提示されて免疫細胞又は抗体の標的となって与えられるものであってもよい。また、本明細書において、「傷害剤」とは、癌幹細胞にこのような傷害を与える薬剤を意味する。本発明は、本発明のウイルスベクターを有効成分として含有する癌幹細胞の傷害剤を含む。【００４０】
本明細書において、「癌幹細胞」とは、がん組織中で自己複製により癌幹細胞を維持しながら、分化によって周辺の大多数のがん細胞を生み出すもととなる細胞を意味する。少数の癌幹細胞が、分化により癌組織を形成する多数の癌細胞となることから、癌始原細胞あるいは腫瘍又は癌の創始細胞と呼ばれることもある。
本明細書において「癌幹細胞」とは、腫瘍内の細胞であって自己複製能力及び腫瘍を含む癌細胞の異種系列をもたらす能力を有する細胞（Ｃｌａｒｋｅ  ＭＦら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００６）６６：９３３９−９３４４）を意味する。即ち、癌幹細胞は、自己と同一の性質を有する娘細胞を産生する能力と癌組織を形成する細胞（特に悪性腫瘍）への分化能の両方を有する。但し、これは幹細胞様（Ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ）の性質をある程度持っているという意味であり、正常の幹細胞のような厳密な幹細胞の性格を持つ必要はなく（その条件に限定されるものではなく）、むしろ癌の悪性化の主原因という点が重要である。少数の癌幹細胞が、分化により癌組織を形成する多数の癌細胞となることから、Ｔｕｍｏｒ−Ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ又はＣａｎｃｅｒ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ（癌始原細胞あるいは腫瘍又は癌の創始細胞）と呼ばれることもある。本発明における癌幹細胞は、これらの癌始原細胞あるいは腫瘍又は癌の創始細胞をも含むものである（Ｎｅｕｚｉｌ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ．３５５；８５５−８５９，２００７）。例えば、癌幹細胞は、数個〜数万個（好ましくは数十個〜数千個）の細胞を免疫不全マウスに移植した場合に癌を形成することができる細胞であってもよい。また、本明細書における癌幹細胞がこれに限定されるものではないが、固形癌における癌幹細胞は、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＡＢＣＢ５等のマーカーを発現することが知られている。例えば、本発明の癌幹細胞は、脳腫瘍、グリア芽腫、頭頚部癌、胃癌、肺癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、肝癌、気管支癌、上咽頭癌、咽頭癌、食道癌、膀胱がん、膵臓癌、前立腺癌、大腸癌、骨肉腫、皮膚癌、メラノーマ、甲状腺癌、副甲状腺癌、尿管癌、子宮頸癌等の固形癌及び肉腫、並びに造血器や血液の悪性腫瘍（例えば、急性リンパ性白血病等の白血病、悪性リンパ腫）の癌幹細胞を含む。好ましくは、癌幹細胞は脳腫瘍幹細胞又はグリア芽腫幹細胞である。
【発明の効果】
【００４１】
本発明のウイルスベクターは癌幹細胞に特異的に、所望の遺伝子を発現することができる。また、本発明のウイルスベクターを癌幹細胞特異的なウイルス増殖を誘導する増殖型ウイルスとすることによって、腫瘍（癌幹細胞）溶解性の治療効果を獲得できる。更に、本発明のウイルスベクターに標識遺伝子あるいは治療遺伝子を搭載することによって、ウイルス感染後に癌幹細胞を可視化あるいは治療効果を誘導あるいは増強することができる。よって、本発明の腫瘍溶解性ウイルスベクターに標識遺伝子あるいは治療遺伝子を搭載することによって、治療抵抗性の原因となる癌幹細胞を標的としてウイルスの腫瘍溶解性効果あるいはまた治療遺伝子にて傷害を与えると同時に、癌幹細胞の存在を可視化することができる。このことから、癌幹細胞の存在を指標とした癌治療効果の評価に利用できる他、癌幹細胞を外科的に切除する際の指標とすることができる。また本発明のウイルスベクター自身によって癌幹細胞を標的して治療することができる。これまで、癌幹細胞を特異的に同定したり、あるいは癌幹細胞を特異的に治療する技術は、ウイルスベクターに限らず存在しない。よって癌幹細胞を選択的に同定することができる本発明のウイルスベクターによって、癌幹細胞に対する効果的な治療薬、治療技術を、効率よく開発することができる。また本発明のウイルスベクターによって、癌患者の診断時あるいは治療前に、浸潤・転移能が高い悪性化原因の癌幹細胞を癌患者の体内で描出・可視化・同定でき、癌幹細胞の割合や存在場所がわかれば、画期的な癌患者の予後判定法、治療部位や治療法に関する画期的な選択法などができることになる。また癌幹細胞は、抗癌剤や放射線という既存の治療法には抵抗性であり、治療後の癌幹細胞の残存が癌の再発に繋がり、患者さんの予後不良と致死性を決定する主要原因と考えられている。よって本発明のウイルスベクターを用い、治療後に癌患者さんの体内の癌幹細胞を体内で同定・可視化・検出することによって、癌の患者さんの治療法の有効性に関する画期的な評価技術、また治療後の癌再発へ対応できる画期的な診断・治療法の確立、また治療後の癌幹細胞の残存のモニターができることになる。よって癌幹細胞を選択的に診断・治療できる本発明のウイルスベクターは癌の悪性化の診断と悪性化の原因細胞を治療可能とすることで、上記のような癌患者への全く新しい診断、治療技術が多数産出し、癌の診断、治療が大きく向上することになる。よって、本発明のウイルスベクターは、様々な癌幹細胞を標的とした診断と治療に利用することができ、臨床における治療難治性の癌の根治と、再発予防を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ヒト神経癌幹細胞（ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：以下同じ）Ｘ０１ＧＢＳにおけるネスチン、ビメンチン、ＣＤ１３３、及びβＩＩＩチューブリン（Ｔｕｊ１）の発現を細胞免疫染色により確認した結果を示す。図中の各写真において、左上はＤＡＰＩを示す青色色素を示し、右上はそれぞれネスチン、ビメンチン、ＣＤ１３３、及びβＩＩＩチューブリンの存在を示す緑色色素を示す。また、左下は顕微鏡観察写真を示し、右下は他の３枚の写真の全てを合成した写真を示す。
【図２】ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ、大腸癌細胞（Ｃａｃｏ−２）及びヒトｉＰＳ細胞におけるＣＤ１３３の発現をウエスタンブロッティングにより確認した結果を示す。「１２０ｋＤａ  ＣＤ１３３」はＣＤ１３３を示し、「４２ｋＤａ  β−ａｃｔｉｎ」はコントロールとしてのβ−アクチンを示す。
【図３】ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳにおけるＣＤ１３３（＋）細胞含量をフローサイトメトリにより測定した結果を示す。左図はフローサイトメトリに流す全細胞集団を示し、同図において、横軸（ＦＳ  Ｌｉｎ）は、前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｓｃａｔｔｅｒ：ＦＳ）で細胞の大きさを反映し、縦軸（ＳＳ  Ｌｉｎ）は側方散乱光（Ｓｉｄｅ  Ｓｃａｔｔｅｒ：ＳＳ）で細胞の形態や核、顆粒などの細胞内部構造を反映する。また、左図中の数値（％）は、Ｒ１で示す楕円中細胞集団に含まれる細胞数の全細胞数に対する割合を示す。また、右図はＲ１細胞集団にＣＤ１３３（＋）細胞含量を示す。同図において、横軸（ＰＥ  Ｌｏｇ）はＣＤ１３３（＋）細胞含量を示し、縦軸（ＦＩＴＣ  Ｌｏｇ）は、特に意味なし。右図中の数値（ＣＤ１３３（＋）  ２０．１８％）は、Ｒ１細胞集団にＣＤ１３３（＋）細胞の割合を示す。
【図４】ＣＤ１３３陰性の細胞である正常細胞のＷＩ−３８（線維芽細胞）、ＣＤ１３３発現の陽性細胞株であるＣａｃｏ−２（大腸がん）、Ｘ０１ＧＢＳ、Ｘ０１ＧＢＤにおけるＣＤ１３３の発現をフローサイトメトリで測定した結果を示す。上段は、陰性コントロールとしてＩｇＧ抗体を用いた結果を示し、下段は抗ＣＤ１３３抗体を用いた結果を示す。縦軸（Ｓｉｄｅ  Ｓｃａｔｔｅｒ）は、側方散乱光によるデータを示し、細胞の形態や核、顆粒などの細胞内部構造を反映するものである。図中の数値（％）は、四角で囲まれた細胞集団に含まれる細胞数の全細胞数に対する割合を示す。
【図５】ＣＤ１３３陰性の細胞である正常細胞のＷＩ−３８（線維芽細胞）、ＣＤ１３３発現の陽性細胞株であるＣａｃｏ−２（大腸がん）、Ｘ０１ＧＢＳ、Ｘ０１ＧＢＤにおけるＣＤ１３３のｍＲＮＡの発現レベルを示す。写真は、ＲＴ−ＰＣＲ法を行った後に電気泳動の結果を示し、グラフは定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。「ＨＰＲＴ」は、コントロール遺伝子として用いたハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴを示す。グラフの縦軸は、ＨＰＲＴのｍＲＮＡの発現量に対するＣＤ１３３のｍＲＮＡの発現量の比を示す。
【図６】ヒト神経癌幹細胞の濃縮分画であるＸ０１ＧＢＳ細胞からセルソーターにてＣＤ１３３発現の陽性細胞と陰性細胞を分取し、それぞれの分画においてＣＤ１３３  ｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲならびに定量的ＲＴ−ＰＣＲ法で調べた結果を示す。左上図は、セルソーターでの分取したそれぞれの分画を示す。「ＣＤ１３３（−）」はＣＤ１３３発現陰性細胞の分画を示し、「ＣＤ１３３（＋）」はＣＤ１３３発現陽性細胞の分画を示す。左下写真は、ＲＴ−ＰＣＲ法を行った後に電気泳動の結果を示す。右下のグラフは定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。「ＨＰＲＴ」は、コントロール遺伝子として用いたハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴを示す。グラフの縦軸は、ＨＰＲＴのｍＲＮＡの発現量に対するＣＤ１３３のｍＲＮＡの発現量の比を示す。
【図７】ＣＤ１３３の各プロモーターの活性を測定するためのレポータアッセイ用アデノウイルスベクターの概略図と名称を示す。ＣＤ１３３の各プロモーターの下流にＬａｃＺを連結し、Ｅ１領域欠損する（ΔＥ１）アデノウイルスベクター（ｐＡｄＨＭ４）に組み込んだ。
【図８】ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳにおける、ＣＤ１３３の各プロモーターの活性を示す。図中の縦軸はβ−ガラクトシダーゼ活性（プロモータ活性）を示し、横軸は、ＬａｃＺの発現に使用した各プロモーターを組み込んだアデノウイルスの種類を示す。横軸において、ｐｒ１、ｐｒ２、ｐｒ３、ｐｒ４及びｐｒ５は、それぞれ順にＣＤ１３３プロモーター１、プロモーター２、プロモーター３、プロモーター４、及びプロモーター５を示す（以下の図において同じ）。
【図９】ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ細胞における、ＣＤ１３３の各プロモーターの活性を示す。図中の縦軸はβ−ガラクトシダーゼ活性（プロモータ活性）を示し、横軸は、ＬａｃＺの発現に使用した各プロモーターを組み込んだアデノウイルスの種類を示す。
【図１０】ヒト神経癌幹細胞から分化した癌細胞を濃縮した分画のＸ０１ＧＢＤ細胞における、ＣＤ１３３の各プロモーターの活性を示す。図中の縦軸はβ−ガラクトシダーゼ活性（プロモータ活性）を示し、横軸は、ＬａｃＺの発現に使用した各プロモーターを組み込んだアデノウイルスの種類を示す。
【図１１】ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳにおけるＣＤ１３３の各プロモーターと対照用非特異的ＲＳＶプロモーターの活性とＣＤ１３３（＋）細胞との相関をフローサイトメトリで確認した結果を示す。図中、横軸はＬａｃＺ活性（ＣＤ１３３各プロモーター活性）を、縦軸はＰＥで標識した抗ＣＤ１３３抗体でＣＤ１３３（＋）細胞を示す。図６に示す数値（％）は、右上の領域Ｒ７内に相関する細胞の割合を示す。
【図１２】ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ細胞におけるＣＤ１３３の各プロモーター活性と対照用非特異的ＲＳＶプロモーターの活性を比較した図を示す。図中、横軸はＬａｃＺ活性（ＣＤ１３３プロモータ活性）を、縦軸は側方散乱光（Ｓｉｄｅ  Ｓｃａｔｔｅｒ：ＳＳ）を示す。図１２に示す数値（％）は、四角で囲った領域に含まれるＬａｃＺ発現細胞の全細胞数に対する割合を示す。
【図１３】ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ細胞、及びヒト神経癌幹細胞から分化した癌細胞を濃縮した分画のＸ０１ＧＢＤ細胞におけるＣＤ１３３の各プロモーター活性を比較した図を示す。図中、横軸はＬａｃＺ活性（ＣＤ１３３プロモータ活性）を、縦軸は側方散乱光（Ｓｉｄｅ  Ｓｃａｔｔｅｒ：ＳＳ）を示す。図１３に示す数値（％）は、四角で囲った領域に含まれるＬａｃＺ発現細胞の全細胞数に対する割合を示す。
【図１４】癌幹細胞に特異的増殖型アデノウイルスベクター（ＣＤ１３３反応性ｍ−ＣＲＡ「Ａｄ．ｈＣＤ１３３ｐｒ５−ｍ−ＣＲＡ」で表記、以下においても同じ）の構造を示す。図中、ＣＤ１３３ｐｒ１〜５は、ＣＤ１３３プロモーター１〜５のいずれかを意味する。
【図１５】ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ細胞におけるアデノウイルスの導入効率を示す。非増殖型アデノウイルスベクター（Ａｄ．ＣＡ−ＥＧＦＰ）をＸ０１ＧＢＳ細胞へ感染してから２４時間後の写真で示す。図中、上から順に「ＥＧＦＰ」はＥＧＦＰの発現を検出した写真を、「Ｐｈａｓｅ」は顕微鏡写真を、「Ｍｅｒｇｅ」は先の２種類の写真を合成した写真でＥＧＦＰの細胞内発現を示す（図１６においても同じ）。また、図の上部の数値は観察した倍率を示す。
【図１６】ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ細胞におけるｈＣＤ１３３ｐｒ５−ｍ−ＣＲＡの細胞殺傷効果を細胞形態で示す。Ａｄ．ｈＣＤ１３３ｐｒ５−ｍ−ＣＲＡをＭＯＩ  １でＸ０１ＧＢＳに感染させ、感染から１，２，３，４及び５日後に２００倍の顕微鏡で観察した結果を示す。図の上部の数値（Ｄａｙ）は感染からの経過日数を示す。図の下部の「ＣＰＥ」は細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を示し、「Ｓｐｈｅｒｅ」は細胞塊形成の程度を意味する。
【図１７】ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ細胞におけるＡｄ．ｈＣＤ１３３ｐｒ５−ｍ−ＣＲＡの細胞殺傷効果を生存細胞数で示すグラフである。Ａｄ．ｈＣＤ１３３ｐｒ５−ｍ−ＣＲＡ、Ａｄ．ＣＡ−ＥＧＦＰ及びＡｄ．ＲＳＶ−ｄＥ１．３をＭＯＩ  １、３、及び１０でヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳに感染後、５日目に生存細胞数を測定した結果を示す。図中縦軸は非処理群と比較した場合の生細胞数の割合（％）を示し、横軸はウイルスの感染条件（ＭＯＩ）を示す。
【図１８】ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ細胞、及びヒト神経癌幹細胞から分化した癌細胞を濃縮した分画のＸ０１ＧＢＤにおけるＡｄ．ｈＣＤ１３３ｐｒ５−ｍ−ＣＲＡの細胞殺傷効果を生存細胞数で示すグラフである。図中縦軸は非処理群と比較した場合の生細胞数の割合（％）を示し、横軸はウイルスの感染条件（ＭＯＩ）を示す。
【図１９】１×１０６と１×１０５のＸ０１ＧＢＳ細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウスの４ヶ所に、１×１０６の分化Ｘ０１ＧＢＤ細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウスの３ヶ所に皮下移植し、１０週間後、肉眼的に認識できる腫瘍結節の形成の割合を評価した結果を示す。グラフの縦軸は腫瘍体積（ｍｍ３）を示し、横軸は移植した細胞の種類及び数を示す。３種類の写真は、いずれも１×１０６細胞（右）と１×１０５細胞（左）のＸ０１ＧＢＳ細胞を移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウスの結果を示す。下の写真は各マウスから採取された腫瘍塊である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
１．ウイルスベクターの製造方法
本発明のウイルスベクターは、当業者に知られたウイルスベクター作製方法を適宜採用して作製することができる。例えば、ウイルスベクターは、ほぼ完全なウイルスゲノムのコピーを有するウイルスバックボーンプラスミドとＣＤ１３３転写ユニットを有するシャトルベクタープラスミドを遺伝子組み換えの技術を利用して組替えることにより作製することができる。遺伝子組み換えは、相同的組換、制限酵素サイト（好ましくは、ｌ−ＣｅｕＩ及びＰｌ−ＳｃｅＩ等の特殊制限酵素サイト）を利用した組換、又は、リコンビネーション反応（例えば、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ）を利用した組換により行うこともできる。
【００４４】
本発明のウイルスベクターがアデノウイルスの場合、例えば、ほぼ完全なアデノウイルスゲノムのコピーを有しＥ１遺伝子が欠損したアデノウイルスバックボーンプラスミドと、ＣＤ１３３転写ユニットを有するシャトルベクタープラスミドを組替えることにより作製することができる。
【００４５】
本発明のウイルスベクターが癌特異的転写ユニット及び／又は追加転写ユニットを有する場合、ウイルスベクターは、ＣＤ１３３転写ユニット、癌特異的転写ユニット及び／又は追加転写ユニットを有する単一のシャトルベクタープラスミドをウイルスバックボーンプラスミドと組み替えて作製してもよいし、ＣＤ１３３転写ユニットを有するシャトルベクタープラスミドと、それとは異なる癌特異的転写ユニット及び／又は追加転写ユニットを有するシャトルベクタープラスミドを用いて、それぞれのプラスミドを個別に又は同時にアデノウイルスバックボーンプラスミドと組み替えて作製してもよい。癌特異的転写ユニット及び／又は追加転写ユニットをアデノウイルスのＥ１領域以外（Ｅ３領域等）に組み込む場合には、ＣＤ１３３転写ユニットを有するシャトルベクタープラスミドとは異なるシャトルベクタープラスミドを用いて、ＣＤ１３３転写ユニットを有するシャトルベクタープラスミドとは別に組換を行うことが望ましい。
【００４６】
本発明のウイルスベクターが、ウイルスのファイバーやヘキソンの修飾又は置換を有する場合、当該修飾及び置換されたベクターは当業者周知の方法により作製することができる。例えば、本発明のウイルスベクターがアデノウイルスの場合、そのようなウイルスベクターは、Ｋｒａｓｎｙｋｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２０００）６０（２４）：６７８４−６７８７、Ｒｕｉｇｏｒｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  （１９９０）２１５：５８９−５９６、Ｋｒａｓｎｙｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：６８３９−６８４６、Ｈｅｎｒｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８（６）：５２３９−６８４６、国際公開公報ＷＯ００／６７５７６号記載の方法に準じて作製ことができる。
【００４７】
２．治療方法
本発明は、本発明のウイルスベクターのうち、ウイルスの増殖に必須のタンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結させたＣＤ１３３プロモーターを有する、癌幹細胞特異的に増殖可能なウイルスベクター及び／又は細胞毒性遺伝子を有するウイルスベクター（以下、総称して「治療用ウイルスベクター」という）を、それを必要とする患者に投与することを含む、癌の治療方法、予防方法、転移抑制方法に関する。本発明の治療用ウイルスベクターは、癌細胞を生み出す元である癌幹細胞に傷害を与えることができるため、そのようなウイルスベクターを癌患者又は癌になることが予想される患者に投与することにより癌を治療し又は予防し、あるいは癌の転移を抑制することができる。よって、本発明の一例は、治療用ウイルスベクターを、それを必要とする患者に投与し、それにより該患者の癌幹細胞内において該ウイルスベクターを増殖させ、又は細胞毒性遺伝子を発現させることを含む、癌の治療方法、予防方法、又は転移抑制方法である。
【００４８】
本発明の治療用ウイルスベクターの投与は、使用するベクター、治療対象疾患、年齢、性別、投与経路、使用する目的等により適宜選択することができ、例えば、１×１０５〜１×１０１２ｐｆｕの力価で投与することができる。投与方法は、腫瘍内点滴、血管内（静脈内、動脈内）注射、髄膜内注射、筋肉内注射、皮内注射、皮下注射、（肺などの）経粘膜投与、経鼻投与等を使用することができる。例えば、本発明のベクターは、１×１０１０ｐｆｕを２日おきに１回、５日間投与することができる
【００４９】
また、本発明の治療用ウイルスベクターは、他の抗癌治療と併用して用いられてもよい。本発明の治療用ウイルスベクターは、癌幹細胞を標的として治療するものであるから、このような抗癌治療は、化学療法、放射線療法、免疫療法、外科的治療等を含む。併用治療する場合の抗癌剤としては、シスプラチン、アドリアマイシン、ドキソルビシン、パクリタキセル等のタキソール誘導体を挙げることができる。また、本発明の治療用ウイルスベクターがプロドラッグを毒性化する細胞毒性遺伝子を有する場合、適切なプロドラッグが併用される。このようなプロドラッグとしては、ガンシクロビル又はアシクロビル（チミジンキナーゼ遺伝子）、５−フルオロシトシン（シトシンデアミナーゼ遺伝子）、５−フルオロウラシル（大腸菌由来ｕｐｐ遺伝子及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のｆｕｒ遺伝子）、及びアジドチミジン（チミジンキナーゼ遺伝子又はチミジンキナーゼとチミジル酸キナーゼの融合遺伝子）を挙げることができる（括弧内は組み合わせる細胞毒性遺伝子を示す）。
【００５０】
また、治療用ウイルスベクターは、癌幹細胞に特異的に傷害を与えることができることから、癌幹細胞の傷害方法に用いることができる。よって、本発明は、治療用ウイルスベクターをそれを必要とする対象に投与するステップを含む、癌幹細胞の傷害方法を含む。本発明の一例は、治療用ウイルスベクターを、それを必要とする患者に投与し、それにより該患者の癌幹細胞内において該ウイルスベクターを増殖させ、又は細胞毒性遺伝子を発現させることを含む、癌幹細胞の傷害方法である。本発明の癌幹細胞の傷害方法は、具体的には前述の本発明の癌の治療方法及び／又は予防方法に準じて行うことができる。
【００５１】
３．診断・標識方法
本発明は、本発明のウイルスベクターのうち、標識遺伝子を有するウイルスベクター（以下、「標識用ウイルスベクター」という）を、対象患者に投与することを含む、癌の診断方法、又は癌幹細胞の標識方法に関する。本発明の標識用ウイルスベクターは、癌幹細胞で特異的に標識遺伝子を発現することができるため、そのようなウイルスベクターを癌患者又は癌になることが予想される患者に投与することにより癌幹細胞を同定又は識別することができる。癌幹細胞は癌細胞内に数〜十数％存在することが知られていることから、癌幹細胞の存在を指標に癌を診断することができる。また、癌の切除等の場面においては癌の増殖の根源である癌幹細胞の除去が重要であると考えられており、癌幹細胞を特異的に標識して可視化することにより、癌幹細胞の確実な切除を助けて手術の成功率を高め、手術後の患者の予後を改善することができる。具体的には、本発明は、標識用ウイルスベクターを対象患者に投与し、標識遺伝子の発現産物を検出することを含む、癌の診断方法、又は癌幹細胞の標識方法に関する。標識遺伝子の発現産物の検出は、使用する標識遺伝子の種類と使用目的により適宜選択することができ、例えば、外科手術中に色素又は蛍光色素を目視で確認してもよいし、画像診断により検出してもよい。また、癌の診断又は癌幹細胞の標識は、癌幹細胞を可視化することにより行ってもよいし、視覚以外の手段で検知可能な手法により行ってもよい。例えば、本発明の癌の診断方法、又は癌幹細胞の標識方法は、標識用ウイルスベクターを、対象患者に投与することを含む、癌幹細胞の可視化方法であってもよい。
【００５２】
本発明の標識用ウイルスベクターの投与、上述の本発明の癌の治療方法又は予防方法に準じて本発明のウイルスベクターを患者に投与することにより行うことができる。
【００５３】
４．医薬組成物
本発明のウイルスベクターを有効成分として包含する医薬組成物（癌の治療薬、予防薬、転移抑制剤及び診断薬、並びに癌幹細胞の標識剤、及び傷害剤を含む）は、有効成分に加えて１以上の薬学的に許容可能な担体を含む組成物であってもよい。医薬組成物が溶液製剤の場合、このような薬学的に許容可能な担体は、滅菌可能でヒトに投与可能な一般的に知られている担体であればよく、限定されない例として、生理食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝生理食塩水、アルブミン注射液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、及びこれらの組み合わせを挙げることができる。また、必要に応じて、医薬組成物は、更に抗酸化剤、緩衝剤及び静菌剤を含有していてもよい。また、医薬組成物は用事調整可能な注射用製剤としてもよい。この場合、医薬組成物（医薬組成物キット）は、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑剤を含んでいてもよい。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。【００５５】
（実施例１）ヒト神経癌幹細胞の癌幹細胞性と癌幹細胞表面マーカーＣＤ１３３発現の細胞免疫染色による確認
（１）細胞
ヒト神経癌幹細胞として、Ｓｏｅｄａ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００８；２８３；１０９５８−６６に記載されたヒト神経癌幹細胞（ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）を使用した。Ｘ０１ＧＢＳ細胞は、Ｘ０１ＧＢ細胞の癌幹細胞分画であり、未分化条件の培地とＳｐｈｅｒｅ培養法で癌幹細胞分画を「濃縮」した細胞群である。よって、以下、特に明記が無い限りにおいて、ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳとはＳｏｅｄａ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００８；２８３；１０９５８−６６に記載されたヒト神経癌幹細胞（ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）（又はＸ０１ＧＢ−ＣＳＣ）を意味するものとする。培養条件：神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳをＢ−２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅ  ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ−２（２０  ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ）とｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＥＧＦ  （２０  ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）添加した１０％ＦＢＳとｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  Ｇ，  ｓｔｒｅｔｏｍｙｃｉｎｓｕｌｆａｔｅを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ／Ｆ−１２（Ｄ６４２１，Ｓｉｇｍａ）培地で５％ＣＯ２、３７℃で培養した。以下の実験に特に説明しなければ同じ条件でＸ０１ＧＢＳ細胞培養を行った。
また、Ｘ０１ＧＢＤ細胞は、このヒト神経癌幹細胞（神経膠芽腫由来の癌幹細胞；ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）が濃縮された細胞群であるＸ０１ＧＢＳ細胞から、以下の方法で樹立された、「分化したヒト神経癌細胞」（分化した神経膠芽腫（ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ））が濃縮した細胞群として作製した。Ｘ０１ＧＢＤ細胞は、Ｉｎａｇａｋｉ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００７；３６１；５８６−５９２に記載された樹立法及び分化した状態での維持培養法に従って樹立、維持された。つまり、Ｘ０１ＧＢＳ細胞を１０％のウシ胎児血清Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍを加えてＦＧＦ−２を除いたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ    ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ／Ｆ−１２培地中、通常の接着可能な培養ディッシュで接着単層培養し、これを長期（５０継代以上繰り返し）培養し維持することで、癌幹細胞分画が劇的に減少し、ほとんどが分化した癌細胞分画に置き換わった細胞群であるＸ０１ＧＢＤ細胞を得た。Ｘ０１ＧＢＤ細胞の特性は、Ｉｎａｇａｋｉ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００７；３６１；５８６−５９２に記載された通りであった。
つまり同一患者の同一組織であるヒト脳神経悪性腫瘍から、悪性度の強い未分化性が高い癌幹細胞分画のＸ０１ＧＢＳ細胞群と、分化した悪性度の低いＸ０１ＧＢＤ細胞群が樹立された。【００５６】
（２）第一抗体
第一抗体として、以下の抗体を使用した：
抗ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）ウサギポリクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）
抗ビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）ウサギポリクローナル抗体（Ａｂ４５９３９、Ａｂｃａｍ，ＵＫ）
抗ＣＤ１３３ウサギポリクローナル抗体（Ａｂ１９８９８，Ａｂｃａｍ，ＵＫ）
抗βＩＩＩチューブリン（ｔｕｂｕｌｉｎ）（Ｔｕｊ１）マウスモノクローナル抗体ＴＵ２０（Ａｂ７７５１、Ａｂｃａｍ，ＵＫ）【００５７】
（３）第二抗体
第二抗体として、波長４８８ｎｍの緑色蛍光色素と結合した以下の抗体を使用した：
Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ４８８（ｍｏｕｓｅ／ｒａｂｂｉｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）【００５８】
（４）細胞免疫染色
ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳの細胞塊（ｓｐｈｅｒｅｓ）を、０．１％ゼラチンコートしたカバーガラス上に播種し、Ｂ−２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅ  ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ−２（２０  ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ）とｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＥＧＦ  （２０  ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）添加した１０％ＦＢＳとｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  Ｇ，  ｓｔｒｅｔｏｍｙｃｉｎｓｕｌｆａｔｅを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ／Ｆ−１２（Ｄ６４２１，Ｓｉｇｍａ）培地に５％ＣＯ２、３７℃で４時間培養した。その後、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、４００μＬの４％ＰＦＡ／ＰＢＳで、室温に１５分間固定した。固定後の細胞を１×ＰＢＳで洗浄後、第一抗体を細胞に添加し室温に１時間で反応をさせた。反応後１×ＰＢＳで洗浄し、第二抗体を上述の希釈率となるように添加し、室温で３０分間反応後、ＰＢＳで洗浄した。【００５９】
（５）ＤＡＰＩ染色
室温で細胞免疫染色を行った細胞にＭｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（Ｈ−１５００，  Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  ＵＳＡ）１滴を添加すると、細胞核をすぐ染色された。【００６０】
染色後の細胞蛍光画像は、ＦＩＴＣ又はＤＡＰＩの検出に適したフィルターセットを有する倒立蛍光顕微鏡Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ａ１（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）上で撮影された。観察した結果を図１に示す。図は、右上図は各癌幹細胞と神経細胞マーカー（名前は図上に記載）の蛋白発現をＦＩＴＣで検出している写真であり、左上図は核をＤＡＰＩで検出した写真であり、左下図は位相差像（蛍光なし）の写真であり、右下はこれら三種類の写真を重ね合わせた（ｍｅｒｇｅ）像の写真である。ネスチンはｃｌａｓｓ  ＶＩの中間径フィラメントであり、中脳の神経系幹細胞に強く発現していることが報告されている神経系幹細胞の重要なマーカーの１つである。ビメンチンは発生時のみに発現することが報告されている間葉系細胞のマーカーである。βＩＩＩチューブリン（Ｔｕｊ１）は神経細胞の骨組みを作るタンパク質であることが報告されており、主に神経細胞で遺伝子発現が見られることから、神経細胞のマーカーとして用いられる。また、ＤＡＰＩは、核を青色に染色する蛍光色素である。図１に示す通り、本実験に用いたヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳは、神経幹細胞マーカーであるネスチン、及びビメンチンに対する抗体で染色される一方、成熟した神経細胞マーカーであるβＩＩＩチューブリンに対する抗体では染色されないことから、幹細胞性を有することが示された。また、本実験に用いたヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳは、ＣＤ１３３に対する抗体で染色されることから、ＣＤ１３３を発現していることが確認された。【００６１】
（実施例２）ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳの癌幹細胞表面マーカーＣＤ１３３発現のウエスタンブロッティングによる確認。
（１）細胞
ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ、陽性コントロールとして大腸癌細胞（Ｃａｃｏ−２）及びヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７，理化学研究所より購入）を使用した。
（２）抗体
第一抗体として、抗ＣＤ１３３ウサギポリクローナル抗体（Ａｂ１９８９８，Ａｂｃａｍ，ＵＫ）（希釈率１：１０００）を使用し、第二抗体として、ヤギ抗ウサギポリクローナル抗体ＩｇＧ／ＨＲＰ（Ｄａｋｏ，Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）（希釈率１：２０００）を使用した。
（３）ウエスタンブロッティング
培養した細胞を含む１０ｃｍディッシュの培養液を捨てて、ＰＢＳで洗浄後、たんぱく質保護剤０．５ｍＭ  ＰＭＳＦとＰｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（直前に加える）含む可溶化ＲＩＰＡバッファー（０．５％  ＮＰ４０，０．１％  ＳＤＳ，０．５％  Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌと５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５））を１ｍＬ加え細胞を溶解させた。細胞可溶化溶液と等量の２×サンプルバッファー（４％  ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０６％  β−メルカプトエタノール、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、０．１％  ブロモフェノブルー）を加え、９５℃で５分煮沸した。１０％ポリアクリルアミドゲル（１９６−１２９２１、Ｗａｋｏ）にサンプルを２０μｇアプライして、電気泳動を行った。メンブレンを転写装置から取り除き、ブロッキングバッファー（５％  ｎｏｎ−ｆａｔ  ｄｒｙ  ｍｉｌｋ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）に浸して、室温で１時間振とうしてブロッキングした。ブロッキングバッファーを除去後、ブロッキングバッファーで１：１０００に希釈した一次抗体反応液を加え、メンブレンを室温で１時間振とうで反応させた。その後、一次抗体液を除去し、ウォッシュバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）を加えて、メンブレンを振とうしながら、室温で１５分間、３回洗浄した。ウォッシュバッファーを除去し、２０００倍に希釈した二次抗体反応液を加え、メンブレンを振とうしながら、室温で１時間反応させた。二次抗体反応液を除去して、ウォッシュバッファーを添加し、メンブレンを振とうしながら、室温で１５分間３回洗浄した。ウォッシュバッファーを除去後、０．１２５ｍＬ／ｃｍ２の化学発光反応液Ｃｈｅｍｉ−Ｌｕｍｉ  Ｏｎｅ（０５０２７−２０，Ｗａｋｏ）をメンブレンに加えて１分間反応させてから、露光してタンパク質の発現を検出した。【００６２】
結果を図２に示す。ウエスタンブロッティングにより、陽性コントロールであるＣａｃｏ−２細胞とヒトｉＰＳ細胞においてＣＤ１３３の発現が認められた。また、本実験において用いたＸ０１ＧＢＳ細胞についてもＣＤ１３３の発現がウエスタンブロッティングにより確認された。【００６３】
（実施例３）フローサイトメトリ（ＦＣＭ）による、ＣＤ１３３（＋）細胞数の確認
（１）ＦＣＭ（１回目）
ＦＣＭ解析は使用する抗体の製造者Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社の添付のプロトコールに従って行った。ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳを使用際にＣＤ１３３（＋）細胞含量を確認した。
図中、楕円で囲んだ範囲に含まれる細胞を全細胞として解析を行った。
（２）ＦＣＭ（２回目）
一回目と同様にＦＡＣＳを行った。抗体として、マウス抗ヒトＣＤ１３３／２（２９３Ｃ３）−ＰＥ、及び、マウスＩｇＧ−ＰＥ（共にＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を使用した。ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭ  ＩＩ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いて検出した。【００６４】
複数行った実験のうち代表的な結果を図３に示す。図中、横軸（ＰＥ  Ｌｏｇ）はＣＤ１３３（＋）細胞を対数値で示し、縦軸（ＦＩＴＣ  Ｌｏｇ）は特に意味がない。フローサイトメトリによる解析の結果、ＣＤ１３３（＋）細胞がＸ０１ＧＢＳの全細胞数に対する割合は約１０〜２０．１８％であった。このことから、ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳの約１０〜２０％がＣＤ１３３を細胞表面に発現していることが示された。【００６５】
（実施例４）フローサイトメトリによるＸ０１ＧＢＳ細胞、Ｘ０１ＧＢＤ細胞におけるＣＤ１３３発現解析
ヒト神経癌幹細胞の濃縮分画であるＸ０１ＧＢＳ細胞と、それから分化した癌細胞を濃縮した分画のＸ０１ＧＢＤ細胞において、ＣＤ１３３発現の陽性細胞株であるＣａｃｏ−２細胞（大腸がん）とＣＤ１３３陰性の細胞である正常細胞のＷＩ−３８細胞（線維芽細胞）とともに、同時にフローサイトメトリを行った。【００６６】
複数行った実験のうち代表的な結果を図４に示す。この上段のグラフは、抗体の特性を評価するための実験の陰性コントロールとしてＩｇＧ抗体を用いたものであり、下段のグラフが抗ＣＤ１３３抗体を用いて行ったフローサイトメトリの結果である。４．２％がＣＤ１３３陽性を示すＸ０１ＧＢＳ細胞に比べ、Ｘ０１ＧＢＤ細胞では僅か０．５％がＣＤ１３３陽性に過ぎないことから、Ｘ０１ＧＢＳ細胞でＣＤ１３３細胞陽性細胞が濃縮されていることが明確となった。またＸ０１ＧＢＳ細胞でのＣＤ１３３陽性細胞の割合が図３と若干違うのは、実験の条件（フローサイトメーターでの対象の細胞間での蛍光補正のやり方、縦軸の違い／図４ではｓｉｄｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを設定、等）と細胞状態の実験毎の若干の違い等によるものであると考えられた。【００６７】
（実施例５）Ｘ０１ＧＢＳ細胞、Ｘ０１ＧＢＤ細胞におけるＣＤ１３３  ｍＲＮＡ発現解析
ヒト神経癌幹細胞の濃縮分画であるＸ０１ＧＢＳ細胞、それから分化した癌細胞を濃縮した分画のＸ０１ＧＢＤ細胞、及び正常細胞であるＷＩ−３８細胞におけるＣＤ１３３のｍＲＮＡの発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲ法後の電気泳動、ならびに定量的ＲＴ−ＰＣＲ法で調べた。ハウスキーピング遺伝子であるＨＰＲＴを、ＲＴ−ＰＣＲのコントロール遺伝子として用いた。【００６８】
図５に実験結果を示す。ＲＴ−ＰＣＲによる電気泳動写真で、陽性コントロール細胞のＣａｃｏ−２細胞と同様に、Ｘ０１ＧＢＳ細胞で著明なＣＤ１３３  ｍＲＮＡの発現がみられるのとは対称的に、正常細胞のＷＩ−３８細胞ならびにＸ０１ＧＢＤ細胞では発現は検出できなかった。さらに、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、Ｘ０１ＧＢＳ細胞では高レベルのＣＤ１３３  ｍＲＮＡ発現がみられるのに対し、Ｘ０１ＧＢＤ細胞でのＣＤ１３３  ｍＲＮＡ発現レベルは極めて低いレベルであり、統計的有為差（Ｐ＜０．０００５）が確認できた。【００６９】
（実施例６）Ｘ０１ＧＢＳ細胞、Ｘ０１ＧＢＤ細胞におけるＣＤ１３３  ｍＲＮＡ発現解析
さらにヒト神経癌幹細胞の濃縮分画であるＸ０１ＧＢＳ細胞をセルソーターにてＣＤ１３３発現の陽性細胞と陰性細胞に分けて分取し、それぞれの分画において、同様にＣＤ１３３  ｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲならびに定量的ＲＴ−ＰＣＲ法で調べた。【００７０】
図６に代表的な結果を示す。左上図は、セルソーターでの分取したそれぞれの分画を示している。左下図はＲＴ−ＰＣＲ、右下図は定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果である。分取されたＣＤ１３３陽性細胞を分取した分画で、ＣＤ１３３陰性細胞を分取した分画より、統計的有為差（Ｐ＜０．００５）を持ってＣＤ１３３  ｍＲＮＡが高発現していることが確認できた。【００７１】
（実施例７）ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳにおけるＣＤ１３３プロモーター活性測定（β−ｇａｌアッセイ）
（１）ＣＤ１３３プロモーター活性解析用のアデノウイルスベクターの構築
ヒトＣＤ１３３については、５種類のプロモーターが知られており、それぞれ、プロモーター１（ｐｒ１；配列番号１）、プロモーター２（ｐｒ２；配列番号２）、プロモーター３（ｐｒ３；配列番号３）、プロモーター４（ｐｒ４；配列番号４）、及びプロモーター５（ｐｒ５；配列番号５）と呼ばれている（Ｓｅｒｇｅｙ  Ｖ．Ｓｈｍｅｌｋｏｖら，ＢＬＯＯＤ，１５  ＭＡＲＣＨ  ２００４，Ｖｏｌ．１０３，Ｎｏ．６）。ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳにおける各プロモーター活性を測定するため、図７に示すように、５つのヒトＣＤ１３３プロモーターの下流にＬａｃＺを連結して、Ｅ１領域欠損する非増殖型アデノウイルスベクターに組み込み、レポータアッセイ用アデノウイルスベクターを構築した。以下、ｐｒ１の下流にＬａｃＺを連結したものをアデノウイルスベクターに組み込んだベクターを「Ａｄ．ｈＣＤ１３３ｐｒ１−ＬａｃＺ」といい、同様にｐｒ２〜ｐｒ５の下流にＬａｃＺを連結したものをアデノウイルスベクターのΔＥ１に組み込んだベクターを、それぞれ「Ａｄ．ｈＣＤ１３３ｐｒ２−ＬａｃＺ」、「Ａｄ．ｈＣＤ１３３ｐｒ３−ＬａｃＺ」、「Ａｄ．ｈＣＤ１３３ｐｒ４−ＬａｃＺ」、「Ａｄ．ｈＣＤ１３３ｐｒ５−ＬａｃＺ」という。また、これらのベクターを総称して「Ａｄ．ｈＣＤ１３３ｐｒ１−５−ＬａｃＺ」という。
ベクターの構築方法はＣｈｅｎ  ＳＨ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＰＮＡＳ  ９２  （７）：２５７７−２５８１記載の方法に参考して構築した。
（２）ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳにおけるＣＤ１３３プロモーター活性測定
神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ細胞の培養条件が実施例１の（１）と同じ。ウイルスの感染方法は感染する予定の細胞を１．５ｍｌチューブに集めて、一回遠心してから、上清を除いて、ウイルス入りの培養液で細胞ｐｐｔに加え、１時間、３７℃でウイルス感染を行った。感染途中、１５分毎にｔａｐｐｉｎｇかｐｉｐｅｔｔｉｎｇを行って、ウイルスと細胞の接触回数を増やし感染効率を上げるようにした。
上述の通り構築したレポータアッセイ用アデノウイルスベクター（Ａｄ．ｈＣＤ１３３ｐｒ１−５−ＬａｃＺ）を細胞１個に対するウイルスの数ＭＯＩ  （ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｒｃｔｉｏｎ）数で感染を行った。ＭＯＩ  ３０でヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳに感染させた。感染二日後にＢｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を用いて、製造者添付のプロトコールに従って、ヒトＣＤ１３３の各プロモーターの活性を測定した。【００７２】
結果を図８に示す。β−ｇａｌアッセイによりプロモーター活性を解析した結果、ヒトＣＤ１３３の発現を制御する５つのプロモーターのうち、プロモーター１、２、４、５は活性が高く、その中でもプロモーター５がヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳにおいて最も高い転写活性を有することが示された。【００７３】
（実施例８）
さらに、ＣＤ１３３プロモーターの特性をより詳細に調べるため、ヒト神経癌幹細胞の濃縮分画であるＸ０１ＧＢＳ細胞と、それから分化した癌細胞を濃縮した分画のＸ０１ＧＢＤ細胞において、同様のＣＤ１３３プロモーターアッセイの実験を行った。各グループはＮ＝３で行った。陽性コントロールとしてＲＳＶプロモーターを、陰性コントロールとしてはプロモーターの挿入されていないアデノウイルス（ΔＰｒ）、ならびにアデノウイルスを加えていない細胞（ＮＣ）を用いた。活性の感度を上げて詳細に比較できるように、アデノウイルスの感染方法やβ−ｇａｌａ  ａｃｔｉｖｉｔｙの活性測定の感度が上昇できるような各実験ステップでの小さな工夫を除いては、基本的な実験方法は実施例７と同一であった。【００７４】
実験結果の平均値と標準誤差を図９（Ｘ０１ＧＢＳ細胞）と図１０（Ｘ０１ＧＢＤ細胞）に示した。図９に示した様に、ヒト神経癌幹細胞の濃縮分画であるＸ０１ＧＢＳ細胞では、全てのプロモーターで様々な活性がみられたが、図８の傾向と同様に、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ５で最も活性が強く、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  １，  ２，  ４の活性強度がその次であり、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ３の活性は低かった。一方、図１０に示した様に、分化した癌細胞分画のＸ０１ＧＢＤ細胞においてはＰｒｏｍｏｔｅｒ  ５で僅かに活性がみられるものの、その他のＰｒｏｍｏｔｅｒ  １，２，３，４の活性は検出感度（カットオフ値）以下であった。またＰｒｏｍｏｔｅｒ  ５の活性も、図９で示したＸ０１ＧＢＳ細胞での値と比べると桁違いに低くほぼ検出限界であり、またコントロールのＲＳＶプロモーターとの比較においても、ＣＤ１３３プロモーターは癌細胞を濃縮した分画のＸ０１ＧＢＤ細胞で特異的な活性がみられることが明らかとなった。【００７５】
（実施例９）ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳにおけるＣＤ１３３プロモーター活性測定（フローサイトメトリより）
ＣＤ１３３プロモーター活性解析用のアデノウイルスベクターは、実施例４と同様の方法により構築し、ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳに導入した。感染二日後にフローサイトメトリにより、ＦｌｕｏＲｅｐｏｒｔｅｒ  ｌａｃＺ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．）を用いて、製造者添付のプロトコールに従いＬａｃＺの発現を検出することで、ＣＤ１３３プロモーターの活性を測定した。また、抗ＣＤ１３３抗体（マウス抗ヒトＣＤ１３３／２（２９３Ｃ３）−ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社））を用いてＣＤ１３３（＋）細胞を標識して、測定した。【００７６】
ヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳにおけるＣＤ１３３の各プロモーター活性と細胞表面のＣＤ１３３の発現量との相関を図１１に示す。図中、横軸はＬａｃＺ活性（ＣＤ１３３プロモータ活性）を、縦軸はＰＥで標識した抗ＣＤ１３３抗体（細胞表面のＣＤ１３３の発現量）を示す。図１１に示す数値（％）は、右上の領域Ｒ７内に分布する細胞の割合を示す。図１１に示される通り、ＣＤ１３３の各プロモーターの活性は、ＣＤ１３３の発現量と相関性があることが明らかとなった。これに対し、コントロールとして恒常的（ユビキタス）強発現を示すプロモーターとしては代表的なＲＳＶプロモーターを用いて同様の実験をおこなったところ、内因性のＣＤ１３３の発現と相関することなしに、つまりＣＤ１３３非特異的にＲＳＶプロモーターの活性が見られた。よって、ＣＤ１３３プロモーター１−５は、内因性のＣＤ１３３の発現に相関して、つまりＣＤ１３３発現特異的に活性化するということが分かった。また、図１２にＸ０１ＧＢＳ細胞におけるＣＤ１３３の各プロモーター活性を比較した図を示す。図１２において、横軸はＬａｃＺ活性（ＣＤ１３３プロモーター活性）を、縦軸は側方散乱光（Ｓｉｄｅ  Ｓｃａｔｔｅｒ：ＳＳ）を示す。図１２に示す数値（％）は、四角で囲った領域Ｒ６内に分布する細胞の割合を示す。これらの結果から、ＣＤ１３３プロモーターの中でも、特にプロモーター２とプロモーター５が高い活性を示した。【００７７】
（実施例１０）
さらにヒト神経癌幹細胞を濃縮分画のＸ０１ＧＢＳと、分化した癌細胞を濃縮した分画のＸ０１ＧＢＤにおいて、ＣＤ１３３の各プロモーター活性をフローサイトメトリで確認した。【００７８】
結果を図１３に示す。図中、横軸はＬａｃＺ活性（ＣＤ１３３各プロモーター活性）を、縦軸（ＳＳ  Ｌｉｎ）は側方散乱光（Ｓｉｄｅ  Ｓｃａｔｔｅｒ：ＳＳ）で細胞の形態や核、顆粒などの細胞内部構造を反映する。図１３に示す数値（％）は、ＣＤ１３３の各プロモーター活性（ＬａｃＺ陽性の割合）を示している。このように、ＣＤ１３３のＰｒｏｍｏｔｅｒ  １から５のいずれにおいても、ＣＤ１３３プロモーター活性を示す細胞の割合が癌幹細胞濃縮分画のＸ０１ＧＢＳの方がＸ０１ＧＢＤよりも多かった。またＸ０１ＧＢＳでＣＤ１３３の各プロモーターで活性を示す細胞の割合は、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ５が最多で、次にＰｒｏｍｏｔｅｒ  １，２，４がほぼ同程度（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ２がその中でも少し強い）で多く、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ３の活性を示す細胞は一番割合が少なかった。この傾向は、図８、図９に示した各プロモーターの活性の強さとよく相関していた。【００７９】
（実施例１１）癌幹細胞特異的増殖型アデノウイルスベクターの構築
（１）癌幹細胞特異的増殖型アデノウイルスベクターの構築
国際公開第ＷＯ２００５／０１２５３６号パンフレット記載の方法に準じて、図１４に示すように５つのＣＤ１３３プロモーターをアデノウイルスの増殖に必須な初期遺伝子であるＥ１Ａ領域の前に組み込むことにより、ＣＤ１３３発現腫瘍に特異的に殺傷することのできる癌幹細胞特異的な増殖制御型アデノウイルスベクター（ＣＤ１３３反応性ｍ−ＣＲＡ）を構築した。以下、ＣＤ１３３プロモーター１を組み込んだＣＤ１３３反応性ｍ−ＣＲＡを「ｈＣＤ１３３ｐｒ１−ｍ−ＣＲＡ」という。プロモーター２〜５についても同様に命名する。また、５種類のＣＤ１３３プロモーターを組み込んだＣＤ１３３反応性ｍ−ＣＲＡを総称して「ｈＣＤ１３３ｐｒ１−５−ｍ−ＣＲＡ」という。【００８０】
（２）アデノウイルスベクターのヒト神経癌幹細胞への導入効率測定
神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ細胞の培養条件は実施例１の（１）と同じとした。またウイルスの感染方法は実施例４の（２）と同様に行った。
ベクターの構築方法はＣｈｅｎ  ＳＨ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＰＮＡＳ  ９２  （７）：２５７７−２５８１記載の方法に参考して構築した。
上述の通り構築した非増殖型アデノウイルスベクター（Ａｄ．ＣＡ−ＥＧＦＰ）を用いて、ＭＯＩ  ３０でヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳに感染させた。感染から２４時間後にＡｄ．ＣＡ−ＥＧＦＰのヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳへの導入効率を測定した。具体的には、Ａｄ．ＣＡ−ＥＧＦＰは、ＣＡプロモーターの下流にＥＧＦＰ蛍光たんぱく質遺伝子が導入している。ことから、Ａｄ．ＣＡ−ＥＧＦＰの感染によりＥＧＦＰの発現が確認できた。【００８１】
非増殖型アデノウイルスベクターのヒト神経癌幹細胞への導入効率を測定した結果を図１５に示す。感染の２４時間後では、ほとんどのＸ０１ＧＢＳ細胞においてＥＧＦＰの発現が確認されたことから、アデノウイルスベクター（Ａｄ．ＣＡ−ＥＧＦＰ）が効率よく神経癌幹細胞に導入されることが確認された。【００８２】
（３）ｈＣＤ１３３ｐｒ５−ｍ−ＣＲＡによるＸ０１ＧＢＳ細胞殺傷効果の測定
神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ細胞の培養条件が実施例１の（１）と同じとした。ウイルスの感染方法は実施例４の（２）と同様に行った。
上述の通り構築したｈＣＤ１３３ｐｒ５−ｍ−ＣＲＡをＭＯＩ  ３でヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳに感染させた。感染から１，２，３，４及び５日後にｈＣＤ１３３ｐｒ５−ｍ−ＣＲＡを導入したヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳを顕微鏡で観察した。【００８３】
図１６に示す通り、ＣＤ１３３ｐｒ５−ｍ−ＣＲＡは、Ｘ０１ＧＢＳ細胞を殺傷できることが明らかとなった。アデノウイルスＡｄ．ＲＳＶ−ｄＥ１．３、Ａｄ．ＣＡ−ＥＧＦＰを感染させた場合（結果は非図示）と比較して、感染２日後において、ｈＣＤ１３３ｐｒ５−ｍ−ＣＲＡはＸ０１ＧＢＳ細胞によりＣＰＥを引き起こさせ、癌幹細胞の細胞塊（Ｓｐｈｅｒｅ）構造を破壊していることが確認された。また、感染５日後においては、ｈＣＤ１３３ｐｒ５−ｍ−ＣＲＡを感染させた細胞はほとんど死んでいる状態となった。このことから、ＣＤ１３３ｐｒ５−ｍＣＲＡはヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ細胞を殺傷する能力があることが示された。【００８４】
（４）ウイルス感染後Ｘ０１ＧＢＳ細胞の生存細胞数測定（ＷＳＴ  ａｓｓａｙ）
神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳ細胞の培養条件が実施例１の（１）と同じ。ウイルスの感染方法は実施例４の（２）と同じ。
上述の通り構築したｈＣＤ１３３ｐｒ５−ｍ−ＣＲＡ、並びにネガティブコントロールとして、Ａｄ．ＣＡ−ＥＧＦＰ及びＡｄ．ＲＳＶ−ｄＥ１．３をＭＯＩ  １、３、及び１０でヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳに感染させた。非増殖型アデノウイルスベクター（Ａｄ．ＲＳＶ−ｄＥ１．３）はＲＳＶプロモーターをＥ１とＥ３領域欠損する非増殖型アデノウイルスベクターに組み込んだベクターで、アデノウイルスの感染実験にウイルスの感染によるウイルス自身の毒性（治療効果と違い）を評価するため使う。感染から５日後にＷＳＴ−８  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｎａｋａｒａｉ社）を用いて、生存細胞数を測定した。【００８５】
結果を図１７に示す。ｈＣＤ１３３ｐｒ５−ｍ−ＣＲＡは、特にＭＯＩ３及びＭＯＩ５において、Ｘ０１ＧＢＳ細胞を殺傷することが示された。一方、Ａｄ．ＣＡ−ＥＧＦＰ及びＡｄ．ＲＳＶ−ｄＥ１．３にはこのような効果は確認されなかった。【００８６】
（実施例１２）Ｘ０１ＧＢＳ及びＸ０１ＧＢＤに対するｈＣＤ１３３ｐｒ−ｍ−ＣＲＡの細胞障害活性
さらにｈＣＤ１３３ｐｒ−ｍ−ＣＲＡの殺傷治療効果が、癌幹細胞特異的であることを示すため、同様の実験をヒト神経癌幹細胞を濃縮分画のＸ０１ＧＢＳだけでなく、分化した癌細胞を濃縮した分画のＸ０１ＧＢＤでも行い、比較した。【００８７】
結果を図１８に示す。左図はｈＣＤ１３３ｐｒ５−ｍ−ＣＲＡ、Ａｄ．ＣＭＶ−ＥＧＦＰ及びＡｄ．ＲＳＶ−ｄＥ１．３をＭＯＩ３でヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳに感染後、３日目に生存細胞数を測定した結果である。右図はｈＣＤ１３３ｐｒ５−ｍ−ＣＲＡ、Ａｄ．ＣＭＶ−ＥＧＦＰ及びＡｄ．ＲＳＶ−ｄＥ１．３をＭＯＩ１と３で分化したヒト神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＤに感染後、５日目に生存細胞数を測定した結果を示している。図中縦軸は非処理群と比較した場合の生細胞数の割合（％）を示し、横軸はウイルスの感染条件（ＭＯＩ）を示す。図１８のように、ヒト神経癌幹細胞を濃縮分画のＸ０１ＧＢＳではｈＣＤ１３３ｐｒ５−ｍ−ＣＲＡのみが有意な細胞障害効果を示した一方、ｈＣＤ１３３ｐｒ５−ｍ−ＣＲＡは分化した癌細胞を濃縮した分画のＸ０１ＧＢＤに対する効果はほとんどみられなかった。つまりｈＣＤ１３３ｐｒ５−ｍ−ＣＲＡは、癌幹細胞で特異的なウイルス増殖と細胞殺傷効果を示すことがわかった。【００８８】
（実施例１３）Ｘ０１ＧＢＳの腫瘍形成能の確認
またヒト神経癌幹細胞を濃縮分画のＸ０１ＧＢＳと、分化した癌細胞を濃縮した分画のＸ０１ＧＢＤが、その通りの特性を持つことを確証するため、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウスへのそれぞれの分画細胞の移植実験を行い、腫瘍形成能を調べた。１×１０６と１×１０５のＸ０１ＧＢＳ細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウスの４ヶ所に、１×１０６の分化Ｘ０１ＧＢＤ細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウスの３ヶ所に皮下移植した。その１０週間後、肉眼的に認識できる腫瘍結節の形成の割合を評価した。【００８９】
結果を、図１９に示す。Ｘ０１ＧＢＳ細胞を移植したマウスでは、いずれの細胞数を移植した場合でも全てのマウスに腫瘍形成がみられた一方、Ｘ０１ＧＢＤを移植した場合は１０倍多い細胞量（１×１０６）を移植した全マウスでも腫瘍形成が認められなかった。これにより未分化細胞Ｘ０１ＧＢＳの腫瘍形成能が確認された。またマウスは安楽死後に皮膚切開して皮下に形成された腫瘍結節を取り出し観察することで、間違いなく腫瘍が形成されていること（炎症などの反応ではないこと）も確認した。【００９０】
以上の結果から、ｈＣＤ１３３ｐｒ５−ｍ−ＣＲＡは、癌幹細胞で増殖し、ＣＭＶプロモーターの下流に搭載したＥＧＦＰ遺伝子を発現していることから、癌幹細胞を可視化することができることが明らかとなった。これによりｈＣＤ１３３ｐｒ５−ｍ−ＣＲＡは、癌幹細胞の存在位置の確認や存在量を測定することを可能とすることから、例えば治療効果の評価に利用できる。また、ｈＣＤ１３３ｐｒ５−ｍ−ＣＲＡは、癌幹細胞の可視化のみならず癌幹細胞を殺傷する能力を有することから、治療効果をも有することが示された。【００９１】
以上の結果から、新たに開発した癌幹細胞を標的する増殖制御型アデノウイルスベクターＣＤ１３３反応性ｍ−ＣＲＡは神経癌幹細胞Ｘ０１ＧＢＳに感染し、殺傷できることが示された。また、増殖制御型アデノウイルスベクターＣＤ１３３反応性ｍ−ＣＲＡにＥＧＦＰ遺伝子を搭載することによって、ウイルス感染後の治療可視化効果も得た。本発明の癌幹細胞を標的するアデノウイルスベクターは難治性の癌を根治し再発予防（臨床実用化）を現実に進めるものである。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明のウイルスベクターは、癌幹細胞を標的とした癌の治療、予防、転移抑制、及び診断に用いることができることから、治療薬、診断薬の分野で利用可能である。
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年6月11日(2013.6.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の遺伝子に作動可能に連結させたＣＤ１３３プロモーターを有する、癌幹細胞特異的に当該所望の遺伝子を発現可能なウイルスベクター。
【請求項２】
前記所望の遺伝子がウイルスの増殖に必須のタンパク質をコードする遺伝子であって、癌幹細胞特異的に増殖可能である、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項３】
腫瘍溶解性である、請求項２に記載のウイルスベクター。
【請求項４】
アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ミキソーマウイルス、レオウイルス、ベジキュラー・ストマタイティスウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、ＲＳウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、又はセネカ・ヴァレイ・ウイルスである、請求項２又は請求項３に記載のウイルスベクター。
【請求項５】
アデノウイルスである、請求項２又は請求項３に記載のウイルスベクター。
【請求項６】
前記所望の遺伝子がアデノウイルスのＥ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子である、請求項５に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項７】
Ｅ１Ａが、Ｒｂ結合領域が欠損したＥ１Ａ（Ｅ１ＡΔ２４）である、又は、Ｅ１Ｂが、ｐ５３結合領域が欠損したＥ１Ｂ（Ｅ１ＢΔ５５Ｋ）である、請求項６に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項８】
更に、標識遺伝子、又は細胞毒性遺伝子を備える、請求項２〜請求項７のいずれか１項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項９】
更に、外来性の癌特異的プロモーターを備える、請求項２〜請求項８のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｃ）から選択される１のアデノウイルスベクターである、請求項６又は請求項７に記載のアデノウイルスベクター：
（ａ）以下の転写ユニットを有するアデノウイルスベクター：
（ａ１）ＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ａ遺伝子又はＥ１ＡΔ２４遺伝子からなるＣＤ１３３転写ユニット
（ａ２）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ｂ遺伝子又はＥ１ＢΔ５５Ｋ遺伝子からなる転写ユニット、あるいは、癌特異的プロモーターの下流に作動可能に連結されたＥ１ＢΔ１９Ｋ遺伝子からなる転写ユニット
（ａ３）任意に、真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなる追加転写ユニット；
（ｂ）以下の転写ユニットを有するアデノウイルスベクター：
（ｂ１）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ａ遺伝子又はＥ１ＡΔ２４遺伝子からなる転写ユニット、
（ｂ２）ＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ｂ遺伝子又はＥ１ＢΔ５５Ｋ遺伝子からなるＣＤ１３３転写ユニット、
（ｂ３）任意に、真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなる追加転写ユニット；
（ｃ）以下の転写ユニットを有するアデノウイルスベクター：
（ｃ１）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ａ遺伝子又はＥ１ＡΔ２４遺伝子からなる転写ユニット、
（ｃ２）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ｂ遺伝子又はＥ１ＢΔ５５Ｋ遺伝子からなる転写ユニット、
（ｃ３）ＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなるＣＤ１３３転写ユニット。
【請求項１１】
前記所望の遺伝子が標識遺伝子である、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項１２】
更に、外来性の癌特異的プロモーターを備える、請求項１１に記載のウイルスベクター。
【請求項１３】
更に、細胞毒性遺伝子を備える、請求項１１又は請求項１２に記載のウイルスベクター。
【請求項１４】
前記所望の遺伝子が、細胞毒性遺伝子である請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項１５】
更に、外来性の癌特異的プロモーターを備える、請求項１４に記載のウイルスベクター。
【請求項１６】
更に、標識遺伝子を備える、請求項１４又は請求項１５のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
【請求項１７】
腫瘍溶解性ウイルスである、請求項１１〜請求項１６のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
【請求項１８】
アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ミキソーマウイルス、レオウイルス、ベジキュラー・ストマタイティスウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、ＲＳウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、又はセネカ・ヴァレイ・ウイルスである、請求項１１〜請求項１７のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
【請求項１９】
ＣＤ１３３プロモーターが、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）から選択されるいずれか１項に記載の核酸分子である、請求項１〜請求項１８のいずれか１項に記載のウイルスベクター：
（ｉ）配列番号１〜５のいずれか１つの配列番号に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子、
（ｉｉ）配列番号１〜５のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列と８５％の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子、
（ｉｉｉ）配列番号１〜５のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子又はそれと相補的な配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、
（ｉｖ）配列番号１〜５のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列の一部の核酸が置換、欠失し、又は、配列番号１〜５のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列に追加の核酸が付加、挿入された核酸分子。
【請求項２０】
ＣＤ１３３プロモーターが、ＣＤ１３３のプロモータ５である、請求項１〜請求項１９のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
【請求項２１】
請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載のウイルスベクターを含有する癌幹細胞に特異的に傷害を与える組成物。
【請求項２２】
請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載のウイルスベクターを含有する癌幹細胞を特異的に標識するための標識剤。
【請求項２３】
更に、同時に、連続的に又は時間をおいて別々に投与される以下の（ｉ）〜（ｉｉ）から選択される１以上の薬剤を含有する、請求項２１に記載の治療薬若しくは予防薬又は診断薬：
（ｉ）抗ウイルス作用を低下させる薬剤、
（ｉｉ）抗癌剤。
【請求項２４】
請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載のウイルスベクターをそれを必要とする患者に投与するステップを備える癌幹細胞の標識方法。
【請求項２５】
請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載のウイルスベクターをそれを必要とする患者に投与するステップを備える癌の診断方法。
【請求項２６】
請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載のウイルスベクターをそれを必要とする患者に投与するステップを備える癌の予防方法、転移抑制方法、又は治療方法。
【請求項２７】
更に、前記ウイルスベクターを患者の癌幹細胞に感染させるステップを備える、請求項２６に記載の予防方法、転移抑制方法、又は治療方法。
【請求項２８】
癌幹細胞が、脳腫瘍幹細胞又はグリア芽腫幹細胞である、請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
【請求項２９】
所望の遺伝子に作動可能に連結させたＣＤ１３３プロモーターを有する、癌幹細胞特異的に当該所望の遺伝子を発現可能なウイルスベクターを含む、神経膠腫の癌幹細胞に前記所望の遺伝子を発現させるための組成物。
【請求項３０】
前記所望の遺伝子がウイルスの増殖に必須のタンパク質をコードする遺伝子であって、癌幹細胞特異的に増殖可能である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
ウイルスベクターが腫瘍溶解性である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
ウイルスベクターがアデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ミキソーマウイルス、レオウイルス、ベジキュラー・ストマタイティスウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、ＲＳウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、又はセネカ・ヴァレイ・ウイルスである、請求項３０又は請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
ウイルスベクターがアデノウイルスである、請求項３０又は請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記所望の遺伝子がアデノウイルスのＥ１Ａ又はＥ１Ｂ遺伝子である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
Ｅ１Ａが、Ｒｂ結合領域が欠損したＥ１Ａ（Ｅ１ＡΔ２４）である、又は、Ｅ１Ｂが、ｐ５３結合領域が欠損したＥ１Ｂ（Ｅ１ＢΔ５５Ｋ）である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
更に、標識遺伝子、又は細胞毒性遺伝子を備える、請求項３０〜請求項３５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３７】
更に、外来性の癌特異的プロモーターを備える、請求項３０〜請求項３６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３８】
ウイルスベクターが以下の（ａ）〜（ｃ）から選択される１のアデノウイルスベクターである、請求項３４又は請求項３５に記載の組成物：
（ａ）以下の転写ユニットを有するアデノウイルスベクター：
（ａ１）ＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ａ遺伝子又はＥ１ＡΔ２４遺伝子からなるＣＤ１３３転写ユニット
（ａ２）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ｂ遺伝子又はＥ１ＢΔ５５Ｋ遺伝子からなる転写ユニットあるいは、癌特異的プロモーターの下流に作動可能に連結されたＥ１ＢΔ１９Ｋ遺伝子からなる転写ユニット
（ａ３）任意に、真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなる追加転写ユニット；
（ｂ）以下の転写ユニットを有するアデノウイルスベクター：
（ｂ１）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ａ遺伝子又はＥ１ＡΔ２４遺伝子からなる転写ユニット、
（ｂ２）ＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ｂ遺伝子又はＥ１ＢΔ５５Ｋ遺伝子からなるＣＤ１３３転写ユニット、
（ｂ３）任意に、真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなる追加転写ユニット；
（ｃ）以下の転写ユニットを有するアデノウイルスベクター：
（ｃ１）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ａ遺伝子又はＥ１ＡΔ２４遺伝子からなる転写ユニット、
（ｃ２）真核細胞プロモーター、癌特異的プロモーター又はＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結されたＥ１Ｂ遺伝子又はＥ１ＢΔ５５Ｋ遺伝子からなる転写ユニット、
（ｃ３）ＣＤ１３３プロモーター及びその下流に作動可能に連結された標識遺伝子又は細胞毒性遺伝子からなるＣＤ１３３転写ユニット。
【請求項３９】
前記所望の遺伝子が標識遺伝子である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項４０】
更に、外来性の癌特異的プロモーターを備える、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
更に、細胞毒性遺伝子を備える、請求項３９又は請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記所望の遺伝子が、細胞毒性遺伝子である請求項２９に記載の組成物。
【請求項４３】
更に、外来性の癌特異的プロモーターを備える、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
更に、標識遺伝子を備える、請求項４２又は請求項４３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４５】
腫瘍溶解性ウイルスである、請求項３９〜請求項４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４６】
アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ミキソーマウイルス、レオウイルス、ベジキュラー・ストマタイティスウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、ＲＳウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、又はセネカ・ヴァレイ・ウイルスである、請求項３９〜請求項４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４７】
ＣＤ１３３プロモーターが、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）から選択されるいずれか１項に記載の核酸分子である、請求項２９〜請求項４８のいずれか１項に記載の組成物：
（ｉ）配列番号１〜５のいずれか１つの配列番号に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子、
（ｉｉ）配列番号１〜５のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列と８５％の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子、
（ｉｉｉ）配列番号１〜５のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子又はそれと相補的な配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、
（ｉｖ）配列番号１〜５のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列の一部の核酸が置換、欠失し、又は、配列番号１〜５のいずれかの配列番号に記載のヌクレオチド配列に追加の核酸が付加、挿入された核酸分子。
【請求項４８】
ＣＤ１３３プロモーターが、ＣＤ１３３のプロモータ５である、請求項２９〜請求項４７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４９】
請求項２９〜請求項４８のいずれか１項に記載の組成物を含有する癌の治療薬、転移抑制剤、若しくは予防薬又は診断薬。
【請求項５０】
請求項２９〜請求項４８のいずれか１項に記載の組成物を含有する癌幹細胞の標識剤。
【請求項５１】
更に、同時に、連続的に又は時間をおいて別々に投与される以下の（ｉ）〜（ｉｉ）から選択される１以上の薬剤を含有する、請求項４９に記載の治療薬若しくは予防薬又は診断薬：
（ｉ）抗ウイルス作用を低下させる薬剤、
（ｉｉ）抗癌剤。
【国際調査報告】
2012132369.tif 000021
2012132369.tif 000022
2012132369.tif 000023
2012132369.tif 000024
2012132369.tif 000025
2012132369.tif 000026