(57)【要約】サッカロマイセス・セレビシエ又はキャンディダ・ユティリス等の酵母をＡｂｕ（Ｌ−２−アミノ酪酸）及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ（Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−２−アミノ酪酸）から選ばれる化合物を含む培地で培養し、得られた菌体から酵母エキスを調製することにより、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを乾燥重量あたり０．２％以上含有する酵母エキスを製造する。
2012046731.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ-Glu-Abuを乾燥重量あたり0.2%以上含有する酵母エキス。
【請求項２】
γ-Glu-Abuを乾燥重量あたり0.5%以上含有する酵母エキス。
【請求項３】
γ-Glu-Abuを乾燥重量あたり1.0%以上含有する酵母エキス。
【請求項４】
前記酵母がサッカロマイセス属又はキャンディダ属に属する酵母である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵母エキス。
【請求項５】
前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵母エキス。
【請求項６】
前記酵母がキャンディダ・ユティリスである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵母エキス。
【請求項７】
酵母をAbu及びγ-Glu-Abuから選ばれる化合物を添加した培地で培養し、得られた菌体から酵母エキスを調製することを特徴とする、γ-Glu-Abuを含む酵母エキスの製造方法。
【請求項８】
前記培地は前記化合物を、Abuの場合は10ppm以上、γ-Glu-Abuの場合は1ppm以上添加され、前記酵母エキスはγ-Glu-Abuを乾燥重量当り0.2%以上含有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記酵母がサッカロマイセス属又はキャンディダ属に属する酵母である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエである、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵母がキャンディダ・ユティリスである、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵母が、下記の性質のいずれか又は両方を有することを特徴とする、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法：
（ａ）γ−グルタミルシステイン合成酵素活性が増強されている、
（ｂ）グルタチオン合成酵素活性が弱化されている。
【請求項１３】
アミノ基転移酵素活性又は／及びα−ケト酪酸合成酵素活性が増強するように改変され、かつ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性が増強し、又は／及びグルタチオン合成酵素活性が弱化するように改変された、γ-Glu-Abu含量が高められた酵母。
【請求項１４】
アミノ基転移酵素が、BAT1遺伝子によってコードされる酵素であることを特徴とする請求項１３に記載の酵母。
【請求項１５】
アミノ基転移酵素が、UGA1遺伝子によってコードされる酵素であることを特徴とする請求項１３に記載の酵母。
【請求項１６】
α−ケト酪酸合成酵素が、CHA1遺伝子によってコードされる酵素であることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の酵母。
【請求項１７】
さらに、ペプチド分解酵素の活性が弱化されている、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の酵母。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の酵母から製造された酵母エキス。
【請求項１９】
Abuを添加した酵母エキス原料に、γ−グルタミル基転移酵素を作用させることを特徴とする、γ-Glu-Abuを含む酵母エキスの製造方法。
【請求項２０】
Abuの添加量は、酵母エキス原料の乾燥重量当り0.1％以上であり、前記酵母エキスはAbuを、乾燥重量当り0.2%以上含有する、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ-Glu-Abu（L-γ-グルタミル-L-2-アミノ酪酸）を含有する酵母及び酵母エキス、並びにそれらの製造方法に関するものである。本発明の酵母エキスは、調味料や健康食品といった食品分野で特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
酵母エキスは、食品にあつみ、うま味等を付与する機能を有し、調味料として幅広く食品分野で利用されてきた。中でも、グルタミン酸、システイン、グリシンからなるトリペプチドであるグルタチオン（以下、「GSH」と記載することがある）は、食品にコク味（kokumi）を付与すること（非特許文献１、２）が知られており、GSHを含有する調味料が開発されてきた。【０００３】
ところで、クラスCに分類されるGタンパク質であるカルシウムセンシングレセプター（CaSR）は、GSHに応答することが報告されていた（非特許文献３）が、その生理的な意味は明らかとなっていなかった。また、このCaSRは舌細胞にも存在しており何らかの呈味応答を示すと考えられていた(非特許文献４)が、最近、このCaSRが人のコク味認識に関与していることが明らかとなった（非特許文献５）。同文献では、これまでコク味物質として認識されてきたGSHだけでなく、いくつかのγ−グルタミル化合物が同様にCaSRに応答することが報告されている。さらには、一般式γ-Glu-X又はγ-Glu-X-Gly（XはCysを除くアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）で表されるペプチド、例えばγ-Glu-Met、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Val-Glyなどがコク味付与効果を有していることが報告されている（特許文献１）。また、S-またはO-カルボキシアルキル化ガンマグルタミルまたはベータアスパラギルペプチドのエステルの群（the group of esters of S- or O-carboxyalkylated gamma-glutamyl and beta-asparagyl peptides）などもコク味物質として報告されている（特許文献２）。これらペプチドはGSHと同じく食品にコク味を付与するが、GSHと異なり還元型-SH基を有していない。一般に、GSHのように還元型-SH基を有する物質は不安定であり、ジスルフィド結合の形成とともにその力価が低下することが知られているが（特許文献２）、還元型-SH基を有していないコク味付与ペプチドは安定である点で、γ-Glu-X又はγ-Glu-X-Gly等は有用であると考えられる。【０００４】
ところで、味覚は、喫食後の時間経過とともに変化するが、喫食直後から順に、先味（initial taste）、中味（middle taste）及び後味（aftertaste）という。このような時間経過による呈味変化には様々なパターンが存在するが、特にコク味については、呈味パターンが先味型であるコク味付与剤へのニーズが高い。γ−グルタミル化合物であるγ-Glu-Abu-Glyが、先中味（initial-middle taste）を中心としたコク味付与作用を有していることが知られている（特許文献３、４）。【０００５】
γ−グルタミル化合物の一つであるグルタチオンの合成と分解は、γ−グルタミルサイクルと呼ばれる複数の酵素によって触媒されることが知られている。中でも、γ−グルタミルトランスペプチダーゼは、GSHのγ位のグルタミン酸を他のアミノ基を有する化合物に転移させることによりGSHをシステニルグリシンへと分解することが知られている（非特許文献６）。この転移反応に際し、アミノ基を有する化合物がアミノ酸である場合は、γ-Glu-Xというジペプチドが副生物として生成しうると考えられる。しかし、副生物ということもあり、これを有効に微生物に作らせるという研究はこれまで積極的に行われてこなかった。【０００６】
また、γ-Glu-Xというジペプチドに関する知見として、ミクロコッカス・グルタミカス（Micrococcus glutamicus）の発酵ブロス解析の例を挙げることができる（非特許文献７）。同文献では発酵ブロスを各種カラムにかけペプチド等を分離し、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Val、γ-Glu-Leuを単離したと報告されているが、各種カラム分離の結果見出されたものであり、どの程度の量ブロス中に含まれていたかは不明である。なお、何れの例でもγ-Glu-Abuが含まれていたとの報告はない。【０００７】
GSHは、GluとCysを結合させγ-Glu-Cysを生成するγ−グルタミルシステイン合成酵素と、生じたγ-Glu-CysとGlyを結合させGSHを生成するグルタチオン合成酵素という２つの酵素により生合成される。in vitroの酵素反応で各々の酵素の基質特異性が調べられたことがあり、GluとAbuを基質としてγ-Glu-Abuが生成したとの報告がある（非特許文献８）。しかし、Proteus mirabilisというバクテリアを用いた例であり、酵母を用いた検討ではない。更に、in vitroの酵素反応では基質としてAbuを用いることができるが、酵母でのAbu生成経路は知られていない。【０００８】
酵母菌体を原料にして調製できる酵母エキスは幅広く食品分野で用いられてきた調味料であり、消費者の受容性も高い。その為、呈味性物質のキャリアーとしては酵母エキスの形態がより好ましい。このような酵母を用いた検討として、ミネラル含有酵母を例示することができる。酵母は、培地に金属を添加するとその金属を菌体中に取り込むことが知られている（非特許文献９）。特に、亜鉛、鉄、銅、マンガン、セレン、モリブデン、クロム等の微量元素を培地中に添加すれば、食品に強化したい元素の供給源として酵母が利用できることになる（特許文献５）。この点に着目し、ミネラル含有酵母の製造方法が開発された（特許文献６〜８）。【０００９】
更に、酵母にこれらミネラルを取り込ませることによって、呈味上の有益性を得られる場合がある。例えば、特許文献９で開示されたマグネシウム高含有酵母の例を挙げることができる。無機化合物であるマグネシウム塩を添加したマグネシウム強化食品も市販されているが、無機塩であるために、苦味、渋味が強く、天然素材のマグネシウム配合食品に比べ、日常の摂取は極めて困難であったと記載されている。それに対し、特許文献９に開示された技術は、酵母にマグネシウムを取り込ませることにより、天然素材を製造するというものである。また、酵母にミネラルを取り込ませた場合の栄養面のメリットとして、特許文献１０に開示されている技術を例示することができる。同文献によると、亜鉛は味覚障害の改善や生殖機能の向上などに寄与するが、現在、十分な量が摂取しているとは言えない状況にあるようである。酵母の培養工程に亜鉛を添加すると、酵母が亜鉛を菌体内に取り込むが、水溶性亜鉛がそのまま酵母に蓄積されるわけではなく、タンパク質やアミノ酸と結合して非結晶性の亜鉛として高濃度に蓄積される。このような非結晶性の亜鉛は結晶性の亜鉛と比較して、摂取したときに体内に効率よく吸収されるようである。その結果、単純に亜鉛をそのまま摂取する場合に比べて、一旦酵母に取り込ませることにより、吸収性を良くするといったメリットがある。【００１０】
上記のように、目的物質を単純に食品に添加する場合に比較して、一旦酵母に取り込ませてから、酵母或いは酵母エキスの形態で食品に添加することにより様々なメリットを享受することができる。しかし、必須栄養素であるミネラルと異なり、酵母がアミノ酸やペプチドを取込む能力は複雑に制御されており、単純な適用は困難であると考えられた。【００１１】
上記のようにコク味付与剤であるγ-Glu-Xのようなγ−グルタミル化合物のキャリアーとしては、酵母菌体や酵母エキスの形態が好ましいものの、そのようなγ−グルタミル化合物を含む酵母菌体、及び同菌体から調製されるエキスを製造する方法に関する知見はほとんどない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＷＯ２００７／０５５３９３号
【特許文献２】ＷＯ２００７／０４２２８８号
【特許文献３】ＷＯ２００８／１３９９４５号
【特許文献４】ＷＯ２００８／１３９９４６号
【特許文献５】特開２００４−２９８０１４号
【特許文献６】特開昭５４−１５７８９０号公報
【特許文献７】特開昭６０−７５２７９号公報
【特許文献８】特公平６−１６７０２号公報
【特許文献９】特開平８−３３２０８１号公報
【特許文献１０】特開２００８−０９９５７８号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ueda et al(1990)；Agric.Biol.Chem. 54,163-169
【非特許文献２】Ueda et al(1997)； Biosci. Biotechnolo. Biochem. 61, 1977-1980
【非特許文献３】Wang et al(2006)；Journal of Biological Chemistry 281, 8864-8870
【非特許文献４】Gabriel et al(2009)；Biochemical and Biophysical Research Communications 378, 414-418
【非特許文献５】Ohsu et al(2010)；Journal of Biological Chemistry 285, 1016-1022
【非特許文献６】蛋白質核酸酵素 1988-7 VOL.33 NO.9 ISSN 003909450臨時増刊  「グルタチオン研究のエポックｐ１４３２−１４３３
【非特許文献７】Ronald et al(1965)；Journal of Biological Chemistry 240, p2508-2511
【非特許文献８】Nakayama et al(1981)；Agric. Biol. Chem. 45(12),2839-2845
【非特許文献９】B.Volesky,H.A. (1995) Appl Microbiol Biotechnol 42; 797-806
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、先味型のコク味付与効果のある酵母エキス、及びそれを製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、γ-Glu-Abu（L-γ-グルタミル-L-2-アミノ酪酸）が高いCaSRアゴニスト活性と極めて優れたコク味付与効果を有し、特にその呈味パターンが先味型であることを見出している。そして、酵母がAbu（α−アミノ酪酸）又はγ-Glu-Abuを細胞内に取込むこと、及び、Abu又はγ-Glu-Abuを含む培地で培養した酵母から酵母エキスを調製することによって、γ-Glu-Abuを含む酵母エキスを製造することができることを見出した。また、アミノ基転移酵素又は／及びα−ケト酪酸合成酵素の活性を上昇させることにより細胞内でのAbu生成が進行することも見出した。さらに、Abuを添加した酵母エキス原料に、γ−グルタミル基転移酵素を作用させることにより、γ-Glu-Abuを含む酵母エキスを製造することができることを見出した。これらの知見に基づいて、本発明は完成されるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。【００１６】
（１）γ-Glu-Abuを乾燥重量あたり0.2%以上含有する酵母エキス。
（２）γ-Glu-Abuを乾燥重量あたり0.5%以上含有する酵母エキス。
（３）γ-Glu-Abuを乾燥重量あたり1.0%以上含有する酵母エキス。
（４）前記酵母がサッカロマイセス属又はキャンディダ属に属する酵母である、前記酵母エキス。
（５）前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエである、前記酵母エキス。
（６）前記酵母がキャンディダ・ユティリスである、前記酵母エキス。
（７）酵母をAbu及びγ-Glu-Abuから選ばれる化合物を添加した培地で培養し、得られた菌体から酵母エキスを調製することを特徴とする、γ-Glu-Abuを含む酵母エキスの製造方法。
（８）前記培地は前記化合物を、Abuの場合は10ppm以上、γ-Glu-Abuの場合は1ppm以上添加され、前記酵母エキスはγ-Glu-Abuを乾燥重量当り0.2%以上含有する、前記方法。
（９）前記酵母がサッカロマイセス属又はキャンディダ属に属する酵母である、前記方法。
（１０）前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエである、前記方法。
（１１）前記酵母がキャンディダ・ユティリスである、前記方法。
（１２）前記酵母が、下記の性質のいずれか又は両方を有することを特徴とする、前記方法：
（ａ）γ−グルタミルシステイン合成酵素活性が増強されている、
（ｂ）グルタチオン合成酵素活性が弱化されている。
（１３）アミノ基転移酵素活性又は／及びα−ケト酪酸合成酵素活性が増強するように改変され、かつ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性が増強し、又は／及びグルタチオン合成酵素活性が弱化するように改変された、γ-Glu-Abu含量が高められた酵母。
（１４）アミノ基転移酵素が、BAT1遺伝子によってコードされる酵素であることを特徴とする前記酵母。
（１５）アミノ基転移酵素が、UGA1遺伝子によってコードされる酵素であることを特徴とする前記酵母。
（１６）α−ケト酪酸合成酵素が、CHA1遺伝子によってコードされる酵素であることを特徴とする前記酵母。
（１７）さらに、ペプチド分解酵素の活性が弱化されている、前記酵母。
（１８）前記酵母から製造された酵母エキス。
（１９）Abuを添加した酵母エキス原料に、γ−グルタミル基転移酵素を作用させることを特徴とする、γ-Glu-Abuを含む酵母エキスの製造方法。
（２０）Abuの添加量は、酵母エキス原料の乾燥重量当り0.1％以上であり、前記酵母エキスはAbuを、乾燥重量当り0.2%以上含有する、前記方法。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Abu、γ-Glu-Abu、およびγ-Glu-Abu-Gly標品のマスクロマトグラム。
【図２】内部標準物質（3-methyl-His-d2、Gly-d2）のマスクロマトグラム。図中、3MeHis-d2は、3-methyl-His-d2を示す。
【図３】Candida utilisのGSH1領域を含むプラスミドpCGSH1の構築手順を示す図。
【図４】URA3遺伝子を有するGSH1の発現ベクターpCGSH1-URA3の構築手順を示す図。
【図５】γ−グルタミル基転移酵素を作用させた酵母エキス中のAbu添加濃度と、γ-Glu-Abu生成量との関係を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の酵母エキスは、γ-Glu-Abuを乾燥重量あたり0.2%以上含有する酵母エキスである。
本発明の酵母エキスは、γ-Glu-Abuを、乾燥重量当り0.2%以上、好ましくは0.5%以上、より好ましくは1.0%以上、特に好ましくは2.0%以上含有する。
【００１９】
本発明の酵母エキスの原料となる酵母は、後述する本発明の方法に用いられる酵母と同様である。
【００２０】
本発明の酵母エキスは、性状は特に制限されず、粉体状でもよく、溶液であってもよい。また、本発明の酵母エキスは、従来の酵母エキスと同様の用途、例えば、調味料、食品添加物、又は健康食品等として利用することができる。本発明の酵母エキスは、コク味付与効果に優れている。コク味付与効果は、うま味や塩味の共存下でより発揮されるため、酵母エキスにＬ−グルタミン酸ナトリウムや呈味性ヌクレオチド等のうま味物質、及び／又は食塩等の塩味物質を添加してもよい。また、本発明の酵母エキスは、特に先味のコク味に優れている為、プロファイルの異なるコク味物質、例えば、GSHやγ-Glu-Val-Glyなど、又はこれらを含む酵母エキスを添加しても良い。また、調味料、食品添加物又は健康食品に、本発明の酵母エキスと共に、うま味物質及び／又は塩味物質を加えてもよい。尚、呈味パターンは、先味（initial taste）、中味（middle taste）及び後味（aftertaste）に分けることができる。これらは相対的な概念であるが、通常、それぞれ喫食後０から２秒まで、２秒から５秒まで、及び５秒以降に感じる呈味である。また、前記「先中味」（initial-middle taste）は０〜５秒までに感じる呈味であり、後述の「中後味」（middle-after taste）は、２秒以降約３０秒前後までに感じる呈味である。
【００２１】
本発明の酵母エキスは、例えば、下記に示す本発明の方法により製造することができる。
【００２２】
本発明の第一の方法は、酵母をAbu及びγ-Glu-Abuから選ばれる化合物を含む培地で培養し、得られた菌体から酵母エキスを調製することにより、γ-Glu-Abuを含有する酵母エキスを製造する方法である。
【００２３】
酵母は、Abu及び／又はγ-Glu-Abuを細胞内に取込み、細胞内にγ-Glu-Abuを蓄積し得る限り、野生株であっても、各種変異株又は組換え株であってもよい。変異株又は組換え株としては、γ−グルタミルシステイン合成酵素（GSH1）の活性を増強させた株、グルタチオン合成酵素（GSH2）の活性を弱化させた株、或いはこの２つの性質を併せ持った株が挙げられる。また、変異株又は組換え株として、細胞内のペプチドを分解するペプチド分解酵素、例えば、DUG1遺伝子、DUG2遺伝子、DUG3遺伝子、ECM38遺伝子にコードされる酵素の活性が弱化された株が挙げられる。さらに、酵母は、GSH1の活性の増強、及び／又は、GSH2の活性の弱化に加えて、ペプチド分解酵素活性が弱化されていてもよい。上記各遺伝子の塩基配列は、Saccharomyces Genome Database（http://www.yeastgenome.org/）に開示されている。
酵母は、細胞内にγ-Glu-Abuを蓄積することができる限り、特に制限されず、サッカロミセス・セレビシエ等のサッカロミセス属、キャンディダ・ユティリス等のキャンディダ属、ピヒア・パストリス等のピヒア属、シゾサッカロミセス・ポンベ等のシゾサッカロミセス属等に属する酵母を例示することができる。中でも、酵母エキスの生産によく用いられているサッカロミセス・セレビシエやキャンディダ・ユティリスが好ましい。本発明の酵母は、１倍体でもよいし、２倍性またはそれ以上の倍数性を有するものであってもよい。
【００２４】
GSH1等の酵素又はタンパク質の活性を増強させる方法としては、これらをコードする遺伝子の発現を増強させる方法が挙げられる。遺伝子の発現増強は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なものに変更する方法、染色体上に目的の遺伝子を挿入することにより多コピー化を促す方法、目的遺伝子を含むプラスミドを酵母に保持させる方法、又は、目的の酵素をコードする遺伝子の転写因子を活性化させる方法等が挙げられる。
【００２５】
プロモーターは、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよいし、或いは公知の高発現プロモーター、例えば、ADH1、PGK1、PDC1、TDH3、TEF1、HXT7などを用いてもよい。目的遺伝子の多コピー化は、例えば、CEN4の複製開始点を持つプラスミドや2μm DNAの複製開始点を持つ多コピー型プラスミドに目的遺伝子を挿入することにより、行うことができる。或いは、染色体上の任意の領域に目的遺伝子を導入する為に、トランスポゾンを用いても良いし、150コピーあるrDNA配列を標的に目的遺伝子を導入しても良い。
【００２６】
一方、GSH2やペプチド分解酵素等の酵素又はタンパク質の活性を弱化させるには、これらをコードする染色体上の遺伝子のプロモーターをより弱化したものに変更することによって発現を弱化させる方法、目的の酵素に変異を導入することにより活性を低下させる方法、目的の酵素遺伝子の一部又は全体を染色体上から欠失させる方法、又は、目的の酵素遺伝子に他の配列を挿入することによって同遺伝子を不活化する方法等が挙げられる。
尚、酵素活性の弱化には、酵素活性が野生株よりも低い場合、及び、酵素活性を完全に欠損した場合の両方が含まれる。
【００２７】
γ−グルタミルシステイン合成酵素の活性の増強は、例えば米国特許第7553638号、大竹康之ら（バイオサイエンスとインダストリー、第50巻第10号、第989〜994頁、1992年等に開示されている。また、米国特許第7553638号にはグルタチオン合成酵素遺伝子の破壊について開示されている。或いは、γ−グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子の転写因子であるYAP1を不活性化させることによってもグルタチオン合成酵素活性を低下することができる。
【００２８】
サッカロマイセス・セレビシエのGSH1、GSH2、及びYAP1をコードする遺伝子の塩基配列は、それぞれSaccharomyces Genome Database（http://www.yeastgenome.org/）に開示されている。また、キャンディダ・ユティリスのGSH1及びGSH2をコードする遺伝子の塩基配列は、米国特許第7553638号に開示されている。また、キャンディダ・ユティリスのYAP1をコードする遺伝子の塩基配列は、特開2006-75122に開示されている。
【００２９】
上記のような酵母は、自然界からのスクリーニング、各種変異処理、或いは遺伝子工学により育種したものであってもよい。各種変異処理には、ＥＭＳ、ＤＡＰＡ、ＮＴＧなどの各種薬剤を用いることができ、変異処理した酵母を最適な培地にスプレッドし、生育した株から、GSH1活性が増強した株、又はGSH2活性が弱化した株を選択することにより、目的の変異株を取得することができる。
【００３０】
遺伝子工学による育種方法は、特に制限されず、通常使用している方法を用いることができる。特に、サッカロマイセス・セレビシエの遺伝子工学の具体的手法は、多くの書籍に記されている。また、キャンディダ・ユティリスについても、近年各種の方法が報告されており、それらを用いても良い。例えば、ケミカルエンジニアリング1999年6月号（23p-28p、三沢典彦）、FEMS Microbiology Letters 165(1998)335-340（Luis Rodriguez et al）、WO98/07873、特開平8-173170、WO95/32289、Journal of Bacteriology (Dec 1995, p7171-7177 Vol177 No24、KEIJI KONDO et al)、WO98/14600、特開2006-75122、特開2006-75123、特開2007-089441、特開2006-101867などの先行文献にその具体的な手法が記されているので適宜参考にすることができる。
【００３１】
次に、酵母エキスを製造する方法を説明する。
まず、酵母を培地で培養する。培地は、酵母が増殖し得るものであれば特に制限されないが、実施例に記載したSD培地に限定されることなく通常工業的に用いられる培地を利用することができる。例えば、炭素源としてグルコース、蔗糖、糖蜜、エタノール、酢酸、亜硫酸パルプ廃液等を、窒素源として尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム硝酸塩等を、或いはコーンスチープリカー、カゼイン、酵母エキス、ペプトン、大豆蛋白分解物等を、燐酸、カリウム、マグネシウム源として、燐酸、燐酸カリウム、燐酸アンモニウム、過燐酸石灰、塩化カリウム、水酸化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等を、その他微量金属として、銅、マンガン、亜鉛、鉄イオン等の無機塩等を適宜組み合わせて含む培地などを例示することができる。
【００３２】
酵母の培養に際して、上記培地にAbu、もしくはγ-Glu-Abu、又はこれらの両方を添加する。Abuはα−アミノ酪酸を、Gluはグルタミン酸を表す。Abu及びGluは、Ｌ−体である。これらの化合物は、培養開始時から培地に含まれていてもよく、培養途中の任意の時点で培地に添加されてもよい。培養途中での前記化合物の培地への添加は、好ましくは、培養終了時の0〜50時間前（なお、ここでは0時間前とは添加と同時に培養を終了することを意味する）、より好ましくは0.1〜24時間前、特に好ましくは0.5〜6時間前である。また、培養途中での添加は、連続的に添加される形式でもよい。
培地に添加するAbu及び／又はγ-Glu-Abuは、精製品（純品）であってもよいし、必要量のAbu及び／又はγ-Glu-Abuを含有する限り、これらの化合物を含む組成物であってもよい。
【００３３】
前記化合物を含む培地での培養に先立って、前培養を行ってもよい。前培養に用いる培地は、前記化合物を含んでいてもよく、含んでいなくもよい。
【００３４】
培地に添加する化合物の量は、培養開始時に添加する場合は、添加時の培養液中の最終濃度で、Abuでは通常10ppm以上、好ましくは25ppm以上、より好ましくは50ppm以上、更に好ましくは100ppmであり、γ-Glu-Abuでは通常1ppm以上、好ましくは5ppm以上、より好ましくは10ppm以上である。Abu及びγ-Glu-Abuの両方を添加する場合は、上記範囲に準じて濃度を設定することができる。化合物の量の上限は特に制限されないが、例えば費用の観点から100,000ppm以下と設定することもでき、通常10,000ppm以下、好ましくは1,000ppm以下、より好ましくは500ppm以下である。一方、化合物が、培養途中の任意の時点で、又は、連続的に添加される場合は、添加量の累計が、培養開始時に添加する場合の最終濃度と同等な条件であればよい。
【００３５】
培養条件は、通常の酵母エキスの製造と同様の条件を採用することができ、用いる酵母に応じて適宜変更することができる。バッチ培養、フェドバッチ培養、連続培養など任意の方法を使用することができる。サッカロマイセス・セレビシエ、又はキャンディダ・ユティリスの場合は、25〜35℃で、より好ましくは、27〜33℃で、更に好ましくは28〜32℃で振とう培養等により好気的に培養することが好ましい。
【００３６】
上記のようにして酵母を培養すると、酵母の細胞中に、γ-Glu-Abuが蓄積する。培地にAbuを添加した場合、細胞内にAbuが蓄積するが、γ-Glu-Abuも蓄積する。これは、後述の実施例に記載したように、細胞内に取込まれたAbuが、細胞内のγ−グルタミルシステイン合成酵素の働きにより、γ-Glu-Abuに変換されることによるものである。尚、実施例に示すように、酵母中のγ-Glu-Abu又はγ-Glu-Abu-Glyの含有量と、細胞中のGSHの含有量とは相関しないことから、従来の方法で製造された酵母エキスは、GSHを高濃度で含有する酵母から製造されたものであっても、γ-Glu-Abuを高濃度に含有しないと考えられる。これは、後述の実施例に記載するように、細胞内ではAbuの生成が制限されているためと推定される。好適な形態では、上記のようにして培養された酵母は、乾燥菌体重量あたり、通常0.04%以上、好ましくは0.1%以上、より好ましくは0.15%以上、より好ましくは0.2%以上、特に好ましくは0.4%以上含有する。
【００３７】
得られた酵母からの酵母エキスの調製は、通常の酵母エキスの調製と同様にして行えばよい。酵母エキスは、酵母菌体を熱水抽出したものを処理したものでもよいし、酵母菌体を自己消化や酵素添加により消化したものを処理したものでもよい。また、必要に応じて得られた酵母エキスを濃縮してもよいし、ペースト状でも、乾燥し粉末の形態にしてもよい。
【００３８】
上記のようにして、γ-Glu-Abuの含有量が高められた酵母エキスが得られる。好適な形態では、酵母エキスは、γ-Glu-Abuを、乾燥重量当り0.2%以上、より好ましくは0.5%以上、さらに好ましくは1.0%以上、特に好ましくは2.0%以上含有する。
【００３９】
本発明の第二の方法について説明する。第二の方法は、酵母細胞内にてAbu合成能を強化した酵母に関するものである。従来、酵母細胞内でのAbu合成経路は知られていなかったが、実施例に示すように、酵母内のアミノ基転移酵素により、α-ケト酪酸から生成することが明らかとなった。その為、酵母細胞内でAbu合成能が強化されると、γ-Glu-Abuの蓄積能が向上する。Abu合成能は、アミノ基転移酵素活性、又は、α−ケト酪酸合成酵素活性の増強によって、強化することができる。アミノ基転移酵素やα−ケト酪酸合成酵素の活性の増強は、前記GSH1等と同様にして行うことができる。
本発明の酵母の一形態は、アミノ基転移酵素の活性が増強された酵母である。本発明の酵母の他の形態は、α-ケト酪酸合成酵素活性が増強された酵母である。本発明の酵母の他の形態は、アミノ基転移酵素の活性及びα-ケト酪酸合成酵素活性の両方が増強された酵母である。また、アミノ基転移酵素又は／及びα−ケト酪酸合成酵素の活性が増強された酵母は、第一の発明と同様に、γ−グルタミルシステイン合成酵素（GSH1）の活性が増強されていてもよいし、グルタチオン合成酵素（GSH2）の活性が弱化されていてもよい。或いはこの２つの性質を併せ持っていてもよい。更に、細胞内のペプチドを分解するペプチド分解酵素、例えば、DUG1遺伝子、DUG2遺伝子、DUG3遺伝子、ECM38遺伝子にコードされる酵素が弱化されていても良い。
【００４０】
Abu合成能が強化された酵母、例えば、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性、及びアミノ基転移酵素活性又は／及びα-ケト酪酸合成酵素活性が増強するように改変された酵母は、Abu及びγ-Glu-Abuを添加しない培地で培養したときでも、γ-Glu-Abuを著量蓄積する。このような酵母は、好適な態様、例えば後述のBAT1によりコードされるアミノ基転移酵素活性、及びGSH1活性が増強され、かつ、GSH2活性が弱化された酵母では、γ-Glu-Abuを、乾燥菌体重量あたり、好ましくは0.04%以上、より好ましくは0.1%以上、より好ましくは0.15%以上、更に好ましくは0.2%以上、特に好ましくは0.4%以上含有する。また、同酵母から調製された酵母エキスは、乾燥重量あたりγ-Glu-Abuを0.2%以上含有する。
また、他の態様、例えば上記酵母において更にCHA1によりコードされるセリン（スレオニン）デアミナーゼ活性が増強された酵母は、γ-Glu-Abuを、乾燥菌体重量あたり、好ましくは0.1%以上、より好ましくは0.15%以上、より好ましくは0.2%以上、更に好ましくは0.4%以上、特に好ましくは0.5%以上含有する。尚、Abu合成能が強化された酵母を培養する際に、培地にAbu及び／又はγ-Glu-Abuを添加してもよい。
【００４１】
酵母は、細胞内にγ-Glu-Abuを蓄積することができる限り、特に制限されず、サッカロミセス・セレビシエ等のサッカロミセス属、キャンディダ・ユティリス等のキャンディダ属、ピヒア・パストリス等のピヒア属、シゾサッカロミセス・ポンベ等のシゾサッカロミセス属等に属する酵母を例示することができる。中でも、酵母エキスの生産によく用いられているサッカロミセス・セレビシエやキャンディダ・ユティリスが好ましい。本発明の酵母は、１倍体でもよいし、２倍性またはそれ以上の倍数性を有するものであってもよい。
【００４２】
酵母のアミノ基転移酵素として、アラニン：グリオキシル酸アミノトランフェラーゼ（Alanine:Glyoxylate aminotransferase）、分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼ（Branched-chain Amino acid transaminase）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（Aspartate amino transferase）、γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ（Gamma-aminobutyrate transaminase）などを例示することができる。サッカロマイセス・セレビシエでは既にこれらの酵素をコードする遺伝子が特定されており、各々AGX1（システマティックネーム：YFL030W）、BAT1（システマティックネーム：YHR208W）、BAT2（システマティックネーム：YJR148W）、AAT1（システマティックネーム：YKL106W）、AAT2（システマティックネーム：YLR027C）、UGA1（システマティックネーム：YGR019W）にコードされている。また、キャンディダ・ユティリスの場合も、近年各種遺伝子が報告されているし、近年のシークエンサーの進歩を利用して、全ゲノム配列を特定することにより、容易にそれらのホモログ遺伝子を特定することができるので、それらを利用すればよい。中でも、BAT1及びUGA1が好ましくは、特に、後述の実施例に記すように、BAT1はその効果が顕著であるので好ましい。活性が増強されるアミノ基転移酵素は１種でもよいが、任意の２種以上であってもよい。
【００４３】
酵母のα-ケト酪酸合成酵素としては、CHA1遺伝子（システマティックネーム：YCL064C）によってコードされるセリン（スレオニン）デアミナーゼ、及び、ILV1遺伝子（システマティックネーム：YER086W）によってコードされるスレオニンデアミナーゼが挙げられる。活性が増強されるα-ケト酪酸合成酵素は１種でもよいが、任意の２種以上であってもよい。
【００４４】
アミノ基転移酵素、及び、α-ケト酪酸合成酵素の活性は、GSH1の活性増強と同様に、各々の酵素をコードする遺伝子の発現を増強させることによって増強することができる。
【００４５】
アミノ基転移酵素又は／及びα-ケト酪酸合成酵素の活性が増強され、γ-Glu-Abuを含有する酵母を用いた酵母エキスの製造は、第一の方法と同様にして行うことができる。
【００４６】
本発明の第三の方法は、Abuを添加した酵母エキス原料に、γ−グルタミル基転移酵素を作用させることにより、γ-Glu-Abuを含む酵母エキスを製造する方法である。
Abuにγ−グルタミル基転移酵素を作用させると、γ-Glu-Abuが生成する。したがって、Abuを含む酵母エキスに、γ−グルタミル基転移酵素を作用させることによっても、γ-Glu-Abuを含む酵母エキスが得られる。Abuを含む酵母エキスは、Abuを含む培地で培養した酵母から調製したものであってもよく、酵母エキス原料にAbuを加えたものであってもよい。
【００４７】
酵母エキス原料としては、通常の方法で得られる酵母エキスを使用することができる。  
【００４８】
酵母エキスへのAbuの添加量は、酵母エキス原料の乾燥重量当り、通常0.1%以上、好ましくは1％以上、より好ましくは5%以上、さらに好ましくは10%以上である。
【００４９】
γ−グルタミル基転移酵素による反応は、水又は緩衝液等の水性溶媒中で行う。具体的には、例えば、酵母エキス原料を水性溶媒に溶解し、γ−グルタミル基転移酵素を添加する。反応条件は、用いるγ−グルタミル基転移酵素に応じて適宜設定することができる。通常、pH 3〜9、15〜70℃で、1〜300分間、好ましくはpH 5〜8、30〜70℃、5〜150分間反応させる。
【００５０】
酵母エキス原料の水性溶媒中の濃度は、操作性の見地から定めればよい。通常、酵母エキス原料の乾燥重量として、0.1%〜50%であり、0.5%〜20%が好ましい。
【００５１】
γ−グルタミル基転移酵素としては、グルタミナーゼ、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ-GTP）等が挙げられる。酵素量は、γ-GTPについては、pH8.5、25℃の溶液中で1分間あたりにγ-glutamyl-p-nitroanilideより1.0μmoleのp-nitroanilineを遊離する活性を1ユニットと定義した場合（シグマ総合カタログ2008-2009年版の917ページに記載の定義）、通常0.001〜1000 units/ml、好ましくは0.005〜100units/ml、より好ましくは0.01〜25units/ml、最も好ましくは0.05〜10 units/mlである。グルタミナーゼについても、γ-GTPに準じて酵素量を適宜設定することができる。
【００５２】
酵素反応後、γ−グルタミル基転移酵素を失活させるたための処理、例えば80〜100℃での熱処理を行ってもよく、そのような処理を行わなくてもよい。
【００５３】
γ−グルタミル基転移酵素の基質として、γ−グルタミル化合物、例えばGSHを反応液に加えてもよい。また、酵母エキスに含まれるGSHを基質としてもよい。この場合、GSHの含有量を高めた酵母、例えばGSH1及び／又はGSH2の活性を増強した酵母から調製した酵母エキスを用いることができる。酵母エキス中のGSHの含有量は、多ければ多いほうが良いが、通常乾燥重量あたり1〜50%、好ましくは1％〜30%、より好ましくは5%〜20%である。或いは、グルタミンをGSHと同様に利用することもできる。
【００５４】
上記のようにして、γ-Glu-Abuの含有量が高められた酵母エキスが得られる。好適な形態では、酵母エキスは、γ-Glu-Abuを、乾燥重量当り0.2%以上、より好ましくは0.5%以上、さらに好ましくは1.0%以上、特に好ましくは2.0%以上含有する。
【００５５】
得られた酵母エキスは、必要に応じて濃縮してもよいし、ペースト状でも、乾燥し粉末の形態にしてもよい。
【００５６】
上記、第一〜第三の発明で得られる酵母エキスに、その他のコク味物質を混合しても良い。このようなコク味物質としては、例えば、γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly（Xはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す。）のようなペプチド、具体的にはGSHやγ-Glu-Val-Gly、及び、これらを含有する酵母エキスが挙げられる。このようにして、先味から後味まで幅広い範囲でコク味を有する酵母エキスを製造することもできる。特に、先味と後味のコク味のバランスから、GSHの場合は、γ-Glu-Abuに対するGSHの存在比率は、0.3以上、好ましくは0.5以上、より好ましくは1.0以上、最も好ましくは3.0以上が好ましい。
【実施例】
【００５７】
以下、本発明を実施例に基づいて更に具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例になんら限定されるものではない。尚、特記しない限り、以下に記載するアミノ酸及びアミノ酸誘導体は、Ｌ−体である。【００５８】
〔参考例１〕γ-Glu-Abuのコク味付与活性の評価
γ-Glu-Abuについて、定量的な官能評価試験によりコク味付与活性の強度を調べた。
定量的官能評価試験は以下のように実施した。グルタミン酸ナトリウム（0.05g/dl）、イノシン酸一リン酸（0.05g/dl）、及び、塩化ナトリウム（0.5g/dl）を含有する蒸留水に、被験化合物を0.001〜0.5g/dlにて混合した場合の、コク味付与活性の強度を測定した。前記グルタミン酸ナトリウム、イノシン酸一リン酸、塩化ナトリウムを含有する蒸留水に被検化合物を添加しないサンプルを無添加コントロールとした。被検化合物を溶解後に、無添加コントロールに対し酸性を呈したサンプルについては、NaOHで無添加コントロールに対しpHが±0.2の範囲内となるように合わせて使用した。【００５９】
官能評点は、コントロール：０点、強い：３点、非常に強い：５点として、n=4で試験を実施した。また、尺度をより明確にするため、0.001g/dlのγ-Glu-Val-Glyの先味、中後味を各々3.0点とした。尚、「中後味」とは、中味から後味を合わせた時間で感じる呈味である。具体的には、先味、中味及び後味は、それぞれ喫食後０から２秒まで、２秒から５秒まで、及び５秒以降に感じる呈味であり、「中後味」は、２秒以降約３０秒前後までに感じる呈味である。採点については、直線尺度法を用い、−５〜０〜５点の位置を示した直線に対し、該当する評点を位置として記入する方法を用いた。また、食品の調味開発を累積で１年以上経験し、うま味塩味溶液に添加したγ-Glu-Cys-Glyとγ-Glu-Val-Glyの力価の差が１０倍前後と判定できる者（定期的に確認）をパネラーとした。上記添加濃度で幅広くコク味付与活性を示したが、代表的な濃度の結果を表１に示した。【００６０】
又、γ-Glu-Alaについて同様に評価した結果も表２に示した。両者は先味の評点が高い先味タイプであるが、γ-Glu-Abuは極めて力価が強いジペプチドであることが分かった。【００６１】
【表１】
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【００６２】
さらにγ-Glu-Cysやその他ジペプチドについても、上記と同一の定量的な官能評価試験によりコク味付与活性の強度を調べた。その結果を表２に示した。【００６３】
【表２】
2012046731.tif 000004
【００６４】
γ-Glu-Abuが優れたコク味付与活性を有し、更にその呈味パターンにおいて先味の立ち上がりが優れていることが分かった。この先味の立ち上がりは、γ-Glu-Cysに比べて極めて優位な点の一つである。また、γ-Glu-Abuは保存安定性に優れており、この点もγ-Glu-Cysに比べて優位な点である。また、γ-Glu-Abuは、含まれるアミノ酸の残基数が２残基と短いので、含まれるアミノ酸の残基数が３残基であるトリペプチドと比較してより簡便かつ低コストで生産することが可能であり、産業上も非常に有利である。【００６５】
〔実施例１〕各種酵母エキス(酵母抽出物)中のAbu、γ-Glu-Abu、及びγ-Glu-Abu-Glyの検出
各種酵母エキス（酵母抽出物）中のAbu、γ-Glu-Abu、及びγ-Glu-Abu-Gly含量を測定した。測定には以下の方法を用いた。ペプチドを６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（AQC）を用いて蛍光誘導体化し、LC-MS/MSにより検出することより行った。具体的には、適当な濃度に希釈したサンプル2.5μL又は、1μMのAbu、γ-Glu-Abu、及びγ-Glu-Abu-Glyを含む標準液2.5μLに、MillQ水2.5μL、5μM内部標準物質溶液（3-methyl-His-d2、シグマ社、Gly-d2、シグマ社。いずれも安定同位体で標識されている。）5μL、硼酸緩衝液（日本ウォーターズ社製AccQ-Fluor（登録商標）試薬キット付属品）30μLを添加した。この混合物に、AQC試薬溶液（上記試薬キットの試薬粉末をアセトニトリル1mL中に溶解することにより調製）10μLを添加した。得られた混合物を10分間、55℃で加熱後、0.1%のギ酸水溶液100μLを加え、分析サンプルとした。【００６６】
次に前述のように調製した分析サンプルを、下記逆相の液体クロマトグラフィーで分離後に、質量分析装置に導入した。分離条件は下記の通り。【００６７】
（１）HPLC：Agilent 1200シリーズ
（２）分離カラム：Unison UK-Phenyl  内径2.0mm、長さ100mm、粒子径3μm（Imtakt社製）
（３）カラム温度：40℃
（４）移動相Ａ：25mMギ酸水溶液をアンモニア水でpH6.0に調整した水溶液
（５）移動相Ｂ：メタノール
（６）流速：0.25mL／min
（７）溶出条件：溶出は、移動相Ａ及び移動相Ｂの混合液を用いて行った。混合液に対する移動相Ｂの比率は以下の通り。0分（5%）、0分〜17分（5%〜40%）、17分〜17.1分（40%〜80%）、17.1分〜19分（80%）、19分〜19.1分（80%〜5%）、19.1分〜27分（5%）。【００６８】
その後、前述の分離条件によって溶出されたAbu、γ-Glu-Abu、およびγ-Glu-Abu-Glyの誘導体化物を質量分析計に導入してマスクロマトグラムにより定量を行った。分析条件は下記の通り。【００６９】
（１）質量分析装置：AB Sciex API3200 QTRAP
（２）検出モード：Selected Ion Monitoring（ポジティブイオンモード）
（３）選択イオン：表３【００７０】
【表３】
2012046731.tif 000005
【００７１】
Abu、γ-Glu-Abu、およびγ-Glu-Abu-Glyの誘導体化物の定量は、解析ソフトAnalyst ver 1.4.2(AB Sciex)を用いて行った。定量を行うための内部標準物質として、Abuの誘導体化物の場合は3-methyl-His-d2の誘導体化物を、γ-Glu-Abu又はγ-Glu-Abu-Glyの誘導体化物の場合はGly-d2の誘導体化物を、各々用いた。Abu、γ-Glu-Abu、およびγ-Glu-Abu-Gly標品、及び、誘導体化された内部標準アミノ酸の分析結果（マスクロマトグラム）を、それぞれ図１及び図２に示す。この方法を用いることにより、各種サンプル中のAbu、γ-Glu-Abu、及びγ-Glu-Abu-Glyを測定可能なことがわかった。
なお、γ-Glu-Abuの定量の際に、極まれにサンプルによって夾雑ピークが見られた場合は、第二のマスアナライザーでの選択イオンを、145.2、或いは、104.1を用いて定量した。【００７２】
〔実施例２〕各種市販酵母エキス中のγ-Glu-Abu含量測定
実施例１の方法を用いて、各種市販酵母エキス中のγ-Glu-Abu含量（乾燥重量当り）を測定した。また、常法により、GSH含量も測定した。結果を表４に示す。
【表４】
2012046731.tif 000006
【００７３】
表４に示すように各種酵母エキス中のγ-Glu-Abuは15ppm〜920ppmの範囲であった。また、γ-Glu-Abu/GSHの比率も一定ではなく、特にGSH含量が多いブランドほどその比率が低下する傾向が見られた。これは、後述の実施例に示すように、GSH生合成経路を担うGSH1及びGSH2はAbuやγ-Glu-Abuを基質として認識しうるが、そもそも細胞内のAbu生成量は制限されており、GSHの生成経路を強化したとしても、Abuが足りず菌体内にγ-Glu-Abuをあまり多く蓄積できないと考えられる。このことは、公知のGSH高含有酵母のγ-Glu-Abu含量は多くはないことを示唆している。【００７４】
〔実施例３〕サッカロマイセス・セレビシエ標準菌株S288C株へのAbuの添加効果
次に、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の標準菌株であるS288C株に含まれるγ-Glu-Abu含量を測定した。また、同時に前駆体であるAbuの培地への添加効果も検証した。なお、S288C株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（NRBC：NITE Biological Resource Center。〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）にNBRC1136の番号で保存されており、分譲を受けることができる。また、同株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America）にもATCC26108の番号で保存されており、分譲を受けることができる。【００７５】
S288C株をSD培地(500ml容坂口フラスコ中50ml）に１エーゼ分植菌し、30℃で120rpmの速度で24時間振とう培養した。【００７６】
〔SD培地組成〕
グルコース     ２％
Nitrogen Base  １倍濃度
（10倍濃度Nitrogen Baseは、1.7gのBacto Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate (Difco社)と5gの硫酸アンモニウムを混合したものを100mlの滅菌水に溶解し、pHを5.2程度に調整し、フィルター濾過滅菌したもの）【００７７】
得られた培養液の吸光度を測定し、初発OD660が0.01になるように（なお、吸光度は、BECKMAN COULTER社のDU640 SPECTROPHTOMETERを用いて測定した。）、SD培地（2L容バッフルフィン付き三角フラスコ中400ml）、最終濃度で10ppmのAbuを含むSD培地、最終濃度で50ppmのAbuを含むSD培地、又は最終濃度で100ppmのAbuを含むSD培地に植菌し、30℃で120rpmの速度にて回転方式で19時間振とう培養した。得られた培養液から、400 ODunits（OD660が1である培養液1mlに含まれる菌体を1 ODunitと定義する。）分の菌体を遠心分離により採取した。上清は可能な限り取り除き、残った菌体を45mlのmilliQ水に懸濁した。再度遠心分離により菌体を集菌し、45mlのmilliQ水に再懸濁した。この操作を累計3回繰り返すことにより、菌体から培地分を完全に除去した。得られた洗浄菌体は、約1.5mlのmilliQ水に懸濁し、70℃で10分間加熱した。この工程にて菌体内に含まれるエキス分を抽出した。次に、遠心操作によりエキスと菌体残渣を分離した。【００７８】
エキスから10kDaの遠心濾過膜（MILLIPORE社：Amicon Ultra - 0.5mL 10K（カタログ番号UFC501096））を用いて細胞デブリを除去し、得られた画分を実施例１と同様にしてAQC試薬にて誘導体化し、LC-MS/MSによりAbu、γ-Glu-Abu、及びγ-Glu-Abu-Glyを測定した。また、乾燥菌体重量は、洗浄菌体を4時間104℃で乾燥させることにより測定した。このようにして測定した一定量の培養液に含まれるAbu、γ-Glu-Abu、及びγ-Glu-Abu-Gly及び乾燥菌体重量から、乾燥菌体あたりに含まれるAbu、γ-Glu-Abu、及びγ-Glu-Abu-Glyの含量を算出した。結果を表５に示す。【００７９】
【表５】
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【００８０】
表５に示す通り、Abuを培地に添加することにより、菌体内のγ-Glu-Abu含量が増加することがわかった。また、γ-Glu-Abuだけでなくγ-Glu-Abu-Glyも蓄積したことから、酵母細胞内ではγ-Glu-Abuを基質とした何らかの酵素反応によりγ-Glu-Abuの一部がγ-Glu-Abu-Glyに変換されることがわかった。【００８１】
なお、菌体洗浄工程で得られた洗浄液中のAbuを測定した結果、最終洗浄液にはAbuが含まれていなかった。菌体洗浄操作は、更にもう１回行っているため、４段分離により、洗浄工程で培地中のAbuは十分に除去されており、菌体抽出液に持ち越されていないことが確認された。また、後述の実施例記載のγ-Glu-Abu添加実験においても、最終洗浄液からはγ-Glu-Abuは検出されなかった。【００８２】
〔実施例４〕S288C株へのγ-Glu-Abu添加効果（１）
次に、S288C株を培養する際における、培地へのγ-Glu-Abu添加効果を検証した。S288C株をSD培地(500ml容坂口フラスコ中50ml）に１エーゼ分植菌し、30℃で120rpmの速度で24時間振とう培養した。得られた培養液の吸光度を測定し、初発OD660が0.01になるように（なお、吸光度は、BECKMAN COULTER社のDU640 SPECTROPHTOMETERを用いて測定した。）、SD培地（2L容バッフルフィン付き三角フラスコ中400ml）、最終濃度で10ppmのγ-Glu-Abuを含むSD培地、又は最終濃度で100ppmのγ-Glu-Abuを含むSD培地に植菌し、30℃で120rpmの速度にて回転方式で19時間振とう培養した。得られた培養液から、実施例３と同様にしてエキス分を抽出し、各化合物の菌体内含有量を測定した。【００８３】
表６に示す通り、γ-Glu-Abuを含有する培地でS288C株を培養すると、S288C株は培地中のγ-Glu-Abuを菌体内に取込み、蓄積することが判明した。また、実施例３と同様に、γ-Glu-Abuだけでなくγ-Glu-Abu-Glyも蓄積した。【００８４】
【表６】
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【００８５】
〔実施例５〕S288C株へのγ-Glu-Abu添加効果（２）
次に、S288C株を培養する際における、培地へのγ-Glu-Abuの追添効果を検証した。S288C株をSD培地(500ml容坂口フラスコ中50ml）に１エーゼ分植菌し、30℃で120rpmの速度で24時間振とう培養した。得られた培養液の吸光度を測定し、初発OD660が0.01になるように（なお、吸光度は、BECKMAN COULTER社のDU640 SPECTROPHTOMETERを用いて測定した。）SD培地（2L容バッフルフィン付き三角フラスコ中400ml）に植菌し、30℃で120rpmの速度にて回転方式で18時間振とう培養した。培地にγ-Glu-Abuを追添する実験区では、各々最終濃度で10ppm又は100ppmになるようにγ-Glu-Abuを添加し、又、コントロールでは何も添加せずに、更に培養を1時間継続した（トータルの培養時間は19時間）。得られた培養液から、実施例３と同様にしてエキス分を抽出し、各化合物の菌体内含有量を測定した。
表７に示す通り、γ-Glu-Abuの追添した場合でも、実施例４と同様に、培地中のγ-Glu-Abuの菌体内への取込、蓄積が可能なことが判明した。また、実施例３、４と同様に、γ-Glu-Abuだけでなくγ-Glu-Abu-Glyも蓄積した。【００８６】
【表７】
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【００８７】
〔実施例６〕酵母エキス固形分あたりのγ-Glu-Abu含量
実施例３〜５で抽出したエキスの固形分含量を測定し、菌体乾燥重量あたりのγ-Glu-Abu含量から、エキス固形分あたりのγ-Glu-Abu含量を計算した。その結果、市販酵母エキスよりもγ-Glu-Abu含量が大幅に上昇していることがわかった。【００８８】
【表８】
2012046731.tif 000010
【００８９】
〔実施例７〕キャンディダ・ユティリス標準菌株NBRC10707株、NBRC0988株へのAbu添加効果
次に、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）の標準株であるNBRC10707株、及びNBRC0988へのAbu添加効果を検証した。これらの菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（NRBC：NITE Biological Resource Center。〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）にNBRC10707株、及びNBRC0988の番号で保存されており、分譲を受けることができる。【００９０】
NBRC10707株及びNBRC0988株を、各々SD培地(500ml容坂口フラスコ中50ml)に１エーゼ分植菌し、30℃で120rpmの速度で24時間振とう培養した。得られた培養液の吸光度を測定し、初発OD660が0.01になるように（なお、吸光度は、BECKMAN COULTER社のDU640 SPECTROPHTOMETERを用いて測定した。）SDP培地（2L容バッフルフィン付き三角フラスコ中400ml：実施例３に記載のSD培地において、10倍濃度のYeast Nitrogen Baseの調製時に、5gの硫酸アンモニウムを1gのプロリンで置換えた培地）に植菌し、30℃で120rpmの速度にて回転方式で振とう培養した。各々の菌株が対数増殖期になるように、NBRC10707株は46.5時間培養し、NBRC0988株は22.5時間培養した。更に、Abuを最終濃度で100ppmになるように添加して１時間培養を継続した。対象区として、何も添加せずに１時間培養した。なお、この時の培養液の吸光度は、Abu追添条件で約4.5であり、残糖も検出された。この得られた培養液から、実施例３と同様にしてエキス分を抽出し、各化合物の菌体内含有量を測定した。結果を表９、１０に示す。その結果、Abuを無添加の条件では、菌体内のγ-Glu-Abuは検出されなかったが、Abu追添区では、γ-Glu-Abuが検出された。この結果からも、γ-Glu-Abuの蓄積には、Abuの供給が重要であることがわかった。【００９１】
【表９】
2012046731.tif 000011
【００９２】
【表１０】
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【００９３】
〔実施例８〕酵母GSH1の基質特異性解析
実施例３の結果より、酵母細胞内でAbuを基質とした何らかの酵素反応によりγ-Glu-Abuが生成することがわかったため、γ−グルタミルシステイン合成酵素の副反応の可能性を検証した。【００９４】
１）酵母由来γ-グルタミルシステイン合成酵素遺伝子（GSH1）発現プラスミドpET-GSH1の構築
キャンディダ・ユティリスATCC22023株のγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードするGSH1遺伝子の発現プラスミドpET-GSH1を以下の手順で構築し、エシェリヒア・コリに導入した。前記菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America）にもATCC22023の番号で保存されており、分譲を受けることができる。【００９５】
（１−１）酵母用GSH1発現プラスミドpAUR-GSH1の構築
まず、酵母用GSH1発現プラスミドpAUR-GSH1を、タカラバイオに委託し、以下の手順で構築した。【００９６】
キャンディダ・ユティリスATCC22023株のGSH1遺伝子の塩基配列（配列番号１）を基に作製したプライマーＧ（配列番号３）およびプライマーＨ（配列番号４）、並びに鋳型としてATCC22023株の染色体DNAを用いたPCRにより、GSH1遺伝子を含む配列の増幅を行った。プライマーＧは、ATCC22023株の染色体DNAのGSH1遺伝子の開始コドンを含む領域の5'末端にKpnI認識配列および酵母発現プラスミドpAUR123（タカラバイオ社）の部分配列を付加したものである。プライマーＨは、GSH1遺伝子のＣ末端塩基配列と相補的な塩基配列に、Hisタグをコードする配列と相補的な塩基配列、終止コドン（TAA）と相補的な塩基配列、XbaI認識配列、及びpAUR123の部分配列を付加したものである。PCRは、PrimeSTAR Max DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、マニュアルに従って行った。増幅された断片をIn-Fusion Advantage PCR Cloning Kit（タカラバイオ社製）を用いてpAUR123（タカラバイオ社製）のKpnI-XbaIサイトに導入し、酵母用GSH1発現プラスミドpAUR-GSH1を構築した。【００９７】
（１−２）エシェリヒア・コリ用GSH1発現プラスミドpET-GSH1の構築
続いて、エシェリヒア・コリ用GSH1発現プラスミドpET-GSH1を以下の手順で構築した。【００９８】
日本バイオサービス社より、キャンディダ・ユティリスATCC22023株のGSH1遺伝子の塩基配列（配列番号１）を基に作製したプライマーＩ（配列番号５）およびプライマーＪ（配列番号６）を購入した。プライマーＩは、キャンディダ・ユティリスATCC22023株の染色体ＤＮＡのGSH1遺伝子の開始コドンを含む領域の5'末端にSpeI認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーＪは、上記のpAUR-GSH1のGSH1遺伝子の終止コドンの外側の塩基配列と相補的な塩基配列の5'末端にXhoI認識配列を含む塩基配列を付加したものである。【００９９】
プライマーＩおよびプライマーＪ、並びに鋳型として上記のpAUR-GSH1を用いたPCRにより、GSH1遺伝子を含む配列の増幅を行った。PCRは、プラスミドDNA、0.2μmol/Lの各プライマー、1.25unitのPrimeSTAR HS DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、10μLの5×PrimeSTAR緩衝液（タカラバイオ社製）、各2.5mmol/LのｄNTP（dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP）を含む反応液50μlを調製し、98℃で10秒加温した後、98℃で10秒間、56℃で5秒間、72℃で2分間の工程を30回繰り返し、さらに72℃で1分間加温することにより行った。【０１００】
PCR後の反応液3μlをアガロースゲル電気泳動に供し、GSH1遺伝子断片に相当する約2.0kbのDNA断片が増幅していることを確認した後、残りの反応液からEthachinmate（ニッポンジーン社製）を用いて該DNA断片を精製し、25μlのdH２Oに溶解した。次に、得られたDNA溶液全量を用い、該DNA断片を制限酵素SpeIおよびXhoIで切断した後、MinElute Reaction Cleanup Kit（キアゲン社製）を用いて精製し、15μlのBuffer EB（10 mM Tris-HCl、pH 8.5。キアゲン社製）に溶解した。【０１０１】
1μgの発現プラスミドpET-21a(+)（ノバジェン社製）を制限酵素NheIおよびXhoIで切断後、MinElute Reaction Cleanup Kitを用いて精製し、15μlのBuffer EBに溶解した。次に、得られたDNA溶液全量を用い、DNA断片をアルカリホスファターゼ(Calf intestine)（CIAP）で脱リン酸化した後、MinElute Reaction Cleanup Kitを用いて精製し、10μlのBuffer EBに溶解した。【０１０２】
上記で得られたGSH1遺伝子を含む約2.0kbのDNA断片、および上記で得られた発現プラスミドpET-21a(+)（ノバジェン社製）の約5.4kbのＤＮＡ断片を、TaKaRa Ligation Kit Ver.2.1（タカラバイオ社製）を用いて、16℃で30分間反応させ連結した。該反応液を用いてエシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル（タカラバイオ社製）を、ヒートショック法により形質転換し、該形質転換体を100μg/mlのアンピシリンを含むLB［10g/Lバクトトリプトン（ディフコ社製）、5g/Lイーストエキス（ディフコ社製）、5g/L塩化ナトリウム（Wako社製）］寒天培地に塗布した後、３７℃で一晩培養した。【０１０３】
生育してきた形質転換体のコロニーより、公知の方法によりプラスミドを抽出し、その塩基配列を公知の方法により決定した。得られたプラスミドは、3'末端にHisタグをコードする配列が付加されたキャンディダ・ユティリスATCC22023株由来GSH1遺伝子が、T7プロモーター下流に連結されたプラスミドであり、該プラスミドをpET-GSH1と命名した。なお、キャンディダ・ユティリスATCC22023株由来GSH1遺伝子の塩基配列及びそれによりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および配列番号２に示す。【０１０４】
続いて、pET-GSH1を用いてエシェリヒア・コリRosetta2(DE3)pLysS株コンピテントセル（ノバジェン社製）を、ヒートショック法により形質転換し、該形質転換体を100μg/mlのアンピシリン及び30μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地に塗布した後、37℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、pET-GSH1が保持されていることを確認した。このpET-GSH1を保持するエシェリヒア・コリRosetta2(DE3)pLysS株を、エシェリヒア・コリRosetta2(DE3)pLysS/pET-GSH1と命名した。【０１０５】
２）C末端Hisタグ付加型組換え型Gsh1の精製
上記のようにして得られたエシェリヒア・コリRosetta2(DE3)pLysS/pET-GSH1を100μg/mlのアンピシリン及び30μg/mlのクロラムフェニコールを含む3mLのLB培地の入った試験管に接種し、37℃で16時間振とう培養した。得られた培養液のうち2mlを、100mlのLB培地が入った坂口フラスコに接種した。37℃で２時間振とう培養後、終濃度が0.5mmol/Lになるようにイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加して、さらに30℃で４時間培養した。培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。【０１０６】
前記湿菌体を、300mMの塩化ナトリウムを含むpH8.0の100mmol/Lトリス−塩酸バッファー10mlに懸濁し、超音波処理により破砕した後、遠心分離して得られる上清から、Hisタグ付加タンパク精製キットであるNi Sepharose 6 Fast Flow（GE Healthcare社製）を用い、マニュアルに従いHisタグ付加組換え型Gsh1を精製し、続いて、PD-10カラム（GE Healthcare社製）を用いて、マニュアルに従い脱塩を行った。この精製及び脱塩されたGsh1を、精製Gsh1として以降の実験に用いた。【０１０７】
３）GSH1の基質特異性解析
上記で取得した精製組換え型GSH1 24.6μg、100mmol/LのTris-HCl(pH8.0）、12.5mmol/LのAbu、12.5mmol/Lのグルタミン酸、12.5mmol/Lのアデノシン三リン酸（ATP）、12.5mmol/Lの硫酸マグネシウム、2mmol/Lのジチオスレイトール（DTT）からなる200μlの反応液（pH8.0）をそれぞれ調製し、３７℃で１６時間反応を行った。【０１０８】
反応終了後、反応生成物をHPLCにより分析した。分析条件は、下記の通りである。
（１）HPLC：HITACHI L-2000シリーズ
（２）分離カラム：Synergi 4μHydro-RP 80A、内径4.6mm、長さ250mm、粒子径４μm（Phenomenex社製）
（３）カラム温度：40℃
（４）移動相Ａ：50mMリン酸バッファー（pH2.5）
（５）移動相Ｂ：アセトニトリル
（６）流速：1.0ml/min
（７）溶出条件：溶出は、移動相Ａ及び移動相Ｂの混合液を用いて行った。混合液に対する移動相Ｂの比率は以下の通りである。0分（0%）、0分〜5分（0%〜2.5%）、5分〜15分（2.5%）、15分〜30分（2.5%〜40%）、30分〜30.1分（40%〜0%）、30.1分〜50分（0％）。
（８）検出：ＵＶ２１０ｎｍ【０１０９】
上記測定の結果、それぞれの反応生成物のピークは、γ-Glu-Abuの標品のピークと保持時間が一致し、γ-Glu-Abuであると判断した。定量の結果、γ-Glu-Abu濃度は10.6mMであった。
この結果より、酵母のGSH1はAbuを基質として認識することが判明した。【０１１０】
〔実施例９〕サッカロマイセス・セレビシエGSH1発現強化株へのAbu添加効果
上記実施例８の検討により、GSH1がAbu及びGluを基質とした酵素反応を担うことがin vitroの酵素反応により明らかとなったので、次に、この反応が酵母細胞内で実際に起きているかを検証した。【０１１１】
１）ウラシル要求株（ura3変異株）の取得
ウラシル要求株は、以下に示すように、URA3遺伝子を除いたURA3近傍DNAをサッカロマイセス・セレビシエ野生型株1倍体(Matα型)株に導入し、URA3遺伝子を破壊することによって取得した。【０１１２】
まず、配列番号７(gataaggaga atccatacaa)及び８(gtgagtttag tatacatgca tttacttata atacagtttt gatttatctt cgtttcctgc)に示すプライマーを用い、上記野生型株の染色体DNAを鋳型とするPCRにより、URA3の上流500 bpを増幅した。また、配列番号９(aaaactgtat tataagtaaa)及び１０(cacttatttg cgatacagaa)に示すプライマーを用い、URA3の下流500bpを増幅した。PCRの条件は、熱変性 94℃, 10 sec、アニーリング55℃, 10 sec、伸張 72℃, 1 min、25 cycleであった。次に、エタノール沈殿によって精製したこれら2つのDNA断片を鋳型に、配列番号１１(gataaggaga atccatacaa)及び１２(cacttatttg cgatacagaa)に示すプライマーを用いてオーバーラップPCRを行い、URA3遺伝子の上流500 bp及び、下流 500 bpを結合した1kbのDNA断片を得た。このDNA断片で野生型株を形質転換した後、ウラシルを添加したSD培地で一晩培養し、5-FOA平板培地に菌体を塗布した。得られた形質転換体からura3△0株を取得した。なお、本菌株はプライベート番号AJ14956が付与され、2010年8月18日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号FERM P-22000として寄託され、ブダペスト条約に基く国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-11299が付与されている。【０１１３】
２）プロモーター置換の為の鋳型プラスミドの作製
まず、配列番号１３(atagcatgct cataaaattg ataaggaga)及び１４(atagaattca ggacgtcatt agtggcgaa)のプライマーを用い、サッカロマイセス・セレビシエ野生株の染色体DNAを鋳型とするPCRによりURA3ローカスを増幅した（熱変性 94℃, 10 sec、アニーリング50℃, 10 sec、伸張 72℃, 1 min、25 cycle）。得られたDNA断片をエタノール沈殿により精製後、SphI及びEcoRIで消化し、プラスミドpUC19のSphI-EcoRI部位に挿入し、pUC19-URA3を得た。次に、配列番号１５(atactgcaga taatcgatta attttttttt ctttc)及び１６(atactgcaga agtagataat tacttcctt)に示すプライマーを用いてサッカロマイセス・セレビシエ野生株の染色体DNAよりADH1プロモーター領域を増幅した。このDNA断片をPstIで消化し、PstIで消化及び、CIAP処理を行ったpUC19-URA3のPstI部位に挿入し、pUC19-ADH1p-URA3を得た。なお、ADH1pが正しくURA3遺伝子と順方向に挿入されていることを当該近傍領域のシークエンスにより確認した。同様に、配列番号１７(atagacgtct aatttttttt tctttc)及び１８(atagacgtct gttttatatt tgttgtaaa)に示すプライマーを用いて増幅したADH1プロモーターをAatIIで消化し、AatIIで消化及び、CIAP処理を行ったpUC19-ADH1p-URAのAatII部位に挿入し、pUC19-ADH1p-URA3-ADH1pを得た。なお、ADH1pが正しくURA3遺伝子と順方向に挿入されていることを当該近傍領域のシークエンスにより確認した。【０１１４】
３）染色体上のGSH1遺伝子へのADH1プロモーターの導入
5’端にGSH1の上流配列をもつ配列番号１９のプライマー（TATTGCCCCAGTGTTCCCTCAACAACCTTGGTAGTTGGAGCGCAATTAGCGTATCCTGTACCATACTAATTCTCTTCTGCTCTTAACCCAACTGCACAGA）、及びGSH1遺伝子の開始コドンから始まる一部のORF内配列を持つ配列番号２０のプライマー（ATACCTTCATCCCTTATGTGTTCATTGTACGTCCTAGACTCAAACCACTGCAAAGGCGTGCCCAAAGCTAAGAGTCCCATTGTATATGAGATAGTTGATT）を用い、pUC19-ADH1p-URA3-ADH1pを鋳型にPCRを行い（熱変性 94℃, 10 sec、アニーリング 60℃, 10 sec、伸張 72℃, 4 min）、ADH1プロモーターに挟まれたURA3を持つDNA断片を調製した。このDNA断片でura3△0株を形質転換し、SD平板培地に塗布し得られる形質転換体から、GSH1プロモーターがADH1プロモーター−URA3−ADH1プロモーターに置換された株を取得した。【０１１５】
４）URA3選択マーカーの除去とGSH1遺伝子のプロモーター置換
GSH1プロモーターがADH1プロモーター−URA3−ADH1プロモーターに置換された株を、ウラシル添加SD培地で一晩培養し、適量を5-FOA平板培地に塗布した。生育するコロニーから、導入されたADH1プロモーター間の相同組換えにより、URA3が除去され、GSH1プロモーターがADH1プロモーターに置換した株AG1-ura3△0を取得した。さらに、野生型ゲノムを鋳型に、配列番号２１（AGTTACAGCAATGAAAGAGCAGAGCGAGAG）及び２２（ATTACTGCTGCTGTTCCAGCCCATATCCAA）のプライマーを用いて増幅したDNAを前記株に導入することにより、URA3が野生型に復元し、GSH1プロモーターがADH1プロモーターに置換している株を取得した。本菌株をAG1株と命名した。一方、同様にura3△0株であるAJ14956に、野生型ゲノムを鋳型に、配列番号２３（AGTTACAGCAATGAAAGAGCAGAGCGAGAG）及び２４（ATTACTGCTGCTGTTCCAGCCCATATCCAA）のプライマーを用いて増幅したDNAを導入することにより、URA3が野生型に復元した株を得た。同株を、Control株と命名した。【０１１６】
５）Control株及びAG1株へのAbu添加効果
次に、Control株及びAG1株をSD培地(500ml容坂口フラスコ中50ml）に１エーゼ分植菌し、30℃で120rpmの速度で24時間振とう培養した。得られた培養液の吸光度を測定し、初発OD660が0.01になるように、各種濃度のAbuを含むSD培地(500ml容坂口フラスコ中50ml）に植菌し、30℃で120rpmの速度で19時間振とう培養した。得られた培養液から、20 ODunits分の菌体を遠心分離により採取した。以後は、実施例３と同様の操作により、エキス分を抽出し、各化合物の菌体内含有量を測定した。
その結果、下記表に示すように、AG1株ではControl株よりもγ-Glu-Abu含量が大幅に上昇していた。このことより、細胞内でもGSH1がAbuを基質として認識し、γ-Glu-Abuを生成することが判明した。なお、AG1株をAbuを含まないSD培地で培養したときは、菌体内のγ-Glu-Abuは定量限界以下であったことから、単に、GSH1の発現を強化しただけでは細胞内のγ-Glu-Abu含量が増加するわけではなく、Abuの供給が重要であることも判明した。【０１１７】
【表１１】
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【０１１８】
【表１２】
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【０１１９】
〔実施例１０〕キャンディダ・ユティリスGSH1発現強化株へのAbu添加効果
Candida utilisのGSH1発現強化株へのAbu添加効果も、実施例７と同様に確認できる。具体的には、Candida utilis NBRC0988を親株に、公知のCre-loxP系を用いて、染色体上のURA3遺伝子を欠失させたウラシル要求性のCUD4F株を取得できる（Shigeru Ikushima et al 2009, Biosci.Biotechnolo.Biochem.,73(4),879-884）。なお、遺伝子操作に必要な遺伝子配列情報は、WO95/32289、U.Gueldenerらの論文（Nucleic Acids Research, 2002, Vol.30, No.6 e23）、Gritz.L and Davis Jの論文（Gene 25, 179-188(1983)）などに記載されている為、これら配列情報をもとに各種ツールを作製してもよい。【０１２０】
Candida utilisのGSH1発現プラスミドを公知の方法により、以下のように構築できる。公知のプラスミドpRI177（Ryo Iwakiri et al 2005, Yeast,22,1079-1087）を制限酵素BamHIで切断し、常法に従い精製することにより、直鎖状のプラスミドを取得できる。なお、プラスミドpR177と同等のプラスミドYRpGAPの調製方法は、特開2006-75122にも開示されている。【０１２１】
一方、実施例９で構築したCandida utilisのGSH1の配列を含むプラスミドpAUR-GSH1を鋳型として、プライマーＳ（配列番号２５：GCAGCCCGGGGGATCATGGGGCTGCTATCATTAGG、5'末端側の15塩基は制限酵素BamHIで切断した直鎖状のプラスミドの末端との相同配列）及びプライマーＴ（配列番号２６：TAGAACTAGTGGATCTTAAGCCCTTTGGGTTGTTTATC、5'末端側の15塩基は制限酵素BamHIで切断した直鎖状のプラスミドの末端との相同配列）を用いたPCRによりGSH1のORF領域を増幅する。この際、プライマーＳ及びプライマーＴの末端には、pRI177を制限酵素BamHIで切断する際に生じる末端配列に相同な配列を付加しておく。PCR産物を常法により精製し、精製するPCR産物と直鎖状のプラスミドをIn-Fusion Advantage PCR Cloning Kit（タカラバイオ）を用いることにより連結することができる。目的通りの配列を有するプラスミドを選択することにより、Candida utilisのGSH1領域を含んだ自律複製型プラスミドpCGSH1を構築できる。pCGSH1の構築手順を図３に示す。【０１２２】
更に、前記pCGSH1に、選択マーカーであるURA3遺伝子もIn-Fusion Advantage PCR Cloning Kitを用いることにより導入できる。具体的には、マニュアルに従い、プライマーＵ(配列番号２７：TTACGCCAAGCGCGCAATTA)及びプライマーＶ（配列番号２８：TCATGGTCATAGCTGTTTCC）を用いたPCRにより、pCGSH1の全長を増幅する。この際、プライマーの設定領域をマニュアルに従い設計することにより、目的の部位で平滑末端化した直鎖状のプラスミドを調製できる。一方、導入するURA3遺伝子は、公知の配列情報（Luis Rodriguez et al 1998, Yeast 14, 1399-1406）をもとに設計できるプライマーＷ（配列番号２９：GCGCGCTTGGCGTAACAAATAGCTCTCTACTTGCT、5'末端側の15塩基は直鎖状のプラスミドの末端との相同配列））、及びプライマーＸ（配列番号３０：CAGCTATGACCATGAGCAATCTACAACTTCGAAA、5'末端側の15塩基は直鎖状のプラスミドの末端との相同配列）を用いて、NBRC0988株のゲノム染色体を鋳型としたPCRにより増幅できる。この際、プライマーの末端には、直鎖状のプラスミドの末端配列を付加することにより、In-Fusion Advantage PCR Cloning Kitによりプラスミドに連結できる。このようにして、自律複製型でかつ選択マーカーとしてURA3遺伝子を有するGSH1の発現ベクターpCGSH1-URA3が構築できる。pCGSH1-URA3の構築手順の概要を図４に示す。【０１２３】
次に、公知のCandida utilisのエレクトロポレーション法（Shigeru Ikushima et al 2009, Biosci.Biotechnolo.Biochem.,73(4),879-884）により、CUD4F株にpCGSH1-URA3を導入する。得られる形質転換体をSD培地にスプレッドし、生育する株の中から目的のプラスミドを有する形質転換体を選択することにより、GSH1発現強化株を取得できる。このGSH1発現強化株を、実施例７と同様に、Abuを含むSDP培地で培養すると菌体内にγ-Glu-Abuを蓄積する。【０１２４】
〔実施例１１〕酵母GSH2の基質特異性解析
実施例３、４、５の結果より、酵母細胞内ではγ-Glu-Abuを基質とした何らかの酵素反応により蓄積したγ-Glu-Abuの一部がγ-Glu-Abu-Glyに代謝されることがわかったため、グルタチオン合成酵素の副反応の可能性を検証した。【０１２５】
１）酵母由来グルタチオン合成酵素遺伝子（GSH2）発現プラスミドpET-GSH2の構築
サッカロマイセス・セレビシエS288C株のグルタチオン合成酵素をコードするGSH2遺伝子の発現プラスミドpET-GSH2を以下の手順で構築し、エシェリヒア・コリに導入した。【０１２６】
（１−１）酵母用GSH2発現プラスミドpAUR-GSH2の構築
まず、酵母用発現プラスミドpAUR-GSH2を、タカラバイオに委託し、以下の手順で構築した。【０１２７】
サッカロマイセス・セレビシエS288C株のGSH2遺伝子の塩基配列（配列番号３１）を基に作製したプライマーＡ（配列番号３３）およびプライマーＢ（配列番号３４）、並びに鋳型としてS288C株の染色体DNAを用いたPCRにより、GSH2遺伝子を含む配列の増幅を行った。プライマーＡは、S288C株の染色体DNAのGSH2遺伝子の開始コドンを含む領域の5’末端にKpnI認識配列および酵母発現プラスミドpAUR123（タカラバイオ社）の部分配列を付加したものである。プライマーＢは、GSH2遺伝子のＣ末端塩基配列と相補的な塩基配列に、Hisタグをコードする配列と相補的な塩基配列、終止コドン（TAA）と相補的な塩基配列、XbaI認識配列、及びpAUR123の部分配列を付加したものである。PCRは、PrimeSTAR Max DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、マニュアルに従って行った。増幅された断片をIn-Fusion Advantage PCR Kit（タカラバイオ社製）を用いて酵母用発現プラスミドpAUR123（タカラバイオ社製）のKpnI-XbaIサイトに導入し、酵母用GSH2発現プラスミドpAUR-GSH2を構築した。【０１２８】
（１−２）エシェリヒア・コリ用GSH2発現プラスミドpET-GSH2の構築
続いて、エシェリヒア・コリ用GSH2発現プラスミドpET-GSH2を以下の手順で構築した。
日本バイオサービス社より、サッカロマイセス・セレビシエS288C株のGSH2遺伝子の塩基配列（配列番号３１）を基に作製したプライマーＣ（配列番号３５）およびプライマーＤ（配列番号３６）を購入した。プライマーＣは、サッカロマイセス・セレビシエS288C株の染色体DNAのGSH2遺伝子の開始コドンを含む領域の5’末端にNdeI認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーＤは、上記のpAUR-GSH2のGSH2遺伝子の終止コドンの外側の塩基配列と相補的な塩基配列の5'末端にXhoI認識配列を含む塩基配列を付加したものである。【０１２９】
プライマーＣおよびプライマーＤ、並びに鋳型として上記のpAUR-GSH2を用いたPCRにより、GSH2遺伝子を含む配列の増幅を行った。PCRは、プラスミドDNA、0.2μmol/Lの各プライマー、1.25unitのPrimeSTAR HS DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、10μLの5×PrimeSTAR緩衝液（タカラバイオ社製）、各2.5mmol/LのdNTP（dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP）を含む反応液50μlを調製し、98℃で10秒加温した後、98℃で10秒間、56℃で5秒間、72℃で2分間の工程を30回繰り返し、さらに72℃で1分間加温することにより行った。【０１３０】
PCR後の反応液3μlをアガロースゲル電気泳動に供し、GSH2遺伝子断片に相当する約1.5kbのDNA断片が増幅していることを確認した後、残りの反応液からEthachinmate（ニッポンジーン社製）を用いて該DNA断片を精製し、25μlのdH２Oに溶解した。次に、得られたDNA溶液全量を用い、該DNA断片を制限酵素NdeIおよびXhoIで切断した後、MinElute Reaction Cleanup Kit（キアゲン社製）を用いて精製し、15μlのBuffer EB（10 mM Tris-HCl、pH 8.5。キアゲン社製）に溶解した。【０１３１】
1μgの発現プラスミドpET-21a(+)（ノバジェン社製）を制限酵素NdeIおよびXhoIで切断後、MinElute Reaction Cleanup Kitを用いて精製し、15μlのBuffer EBに溶解した。次に、得られたDNA溶液全量を用い、DNA断片をアルカリホスファターゼ(Calf intestine)（CIAP）で脱リン酸化した後、MinElute Reaction Cleanup Kitを用いて精製し、10μlのBuffer EBに溶解した。【０１３２】
上記で得られたGSH2遺伝子を含む約1.5kbのDNA断片、および上記で得られた発現プラスミドpET-21a(+)の約5.4kbのDNA断片を、TaKaRa Ligation Kit Ver.2.1（タカラバイオ社製）を用いて、16℃で30分間反応させ連結した。該反応液を用いてエシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル（タカラバイオ社製）を、ヒートショック法により形質転換し、該形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含むLB［10g/Lバクトトリプトン（ディフコ社製）、5g/Lイーストエキス（ディフコ社製）、5g/L塩化ナトリウム（Wako社製）］寒天培地に塗布した後、37℃で一晩培養した。【０１３３】
生育してきた形質転換体のコロニーより、公知の方法によりプラスミドを抽出し、その塩基配列を公知の方法により決定した。得られたプラスミドは、3'末端にHisタグをコードする配列が付加されたサッカロマイセス・セレビシエS288C株由来GSH2遺伝子が、T7プロモーター下流に連結されたプラスミドであり、該プラスミドをpET-GSH2と命名した。なお、サッカロマイセス・セレビシエS288C株由来GSH2遺伝子の塩基配列及びそれによりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３１および配列番号３２に示す。【０１３４】
続いて、pET-GSH2を用いてエシェリヒア・コリBL21(DE3)株コンピテントセル（ノバジェン社製）を、ヒートショック法により形質転換し、該形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布した後、37℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、pET-GSH2が保持されていることを確認した。このpET-GSH2を保持するエシェリヒア・コリBL21(DE3)株を、エシェリヒア・コリBL21(DE3)/pET-GSH2と命名した。【０１３５】
２）C末端Hisタグ付加組換え型Gsh2の精製
上記で得られたエシェリヒア・コリBL21(DE3)/pET-GSH2を100μg/mlのアンピシリンを含む3mＬのLB培地の入った試験管に接種し、37℃で16時間振とう培養した。得られた培養液のうち2mlを100mlのLB培地が入った試験管に接種した。37℃で2時間振とう培養後、終濃度が0.5mmol/Lになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加して、さらに30℃で4時間培養した。培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。【０１３６】
前記湿菌体を、300mMの塩化ナトリウムを含むpH8.0の100mmol/Lトリス−塩酸バッファー10mlに懸濁し超音波処理により破砕した後、遠心分離して得られる上清から、Hisタグ付加タンパク質精製キットであるNi Sepharose 6 Fast Flow（GE Healthcare社製）を用い、マニュアルに従いHisタグ付加組換え型Gsh2を精製し、続いて、PD-10カラム（GE Healthcare社製）を用いて、マニュアルに従い脱塩を行った。その後、10kDaの遠心濾過膜（MILLIPORE社：Amicon Ultra - 0.5mL 10K（カタログ番号UFC501096））を用いて、マニュアルに従って、このサンプルを濃縮した。この精製、脱塩、及び濃縮されたGsh2を、精製Gsh2として以降の実験に用いた。【０１３７】
３）精製Gsh2を用いたγ-Glu-Abu-Glyの生成
上記で取得した精製Gsh2を用い、γ-Glu-Abuを基質としたγ-Glu-Abu-Glyの生成可能性を検討した。下記組成の反応液を調製し、30℃で22hrの酵素反応を行った。
〔反応液組成〕
精製Gsh2                          300μg/500μl
Tris-HCl(pH8.0）                  100  mmol/L
γ-Glu-Abu                        10mmol/L
グリシン                          10mmol/L
アデノシン三リン酸（ATP）         10mmol/L
MgCl２                             10mmol/L
ジチオスレイトール（DTT）         0.1mmol/L【０１３８】
反応終了後、実施例８と同じ条件で、反応物をHPLCにて測定した。その結果、反応生成物のピークは、γ-Glu-Abu-Glyの標品のピークと保持時間が一致し、γ-Glu-Abu-Glyであると判断した。定量の結果、γ-Glu-Abu-Gly濃度は約10mMであった。【０１３９】
〔実施例１２〕GSH2破壊株へのAbu添加効果
実施例１１の結果から、γ-Glu-Abuは酵母のグルタチオン合成酵素の基質となり、γ-Glu-Abu-Glyを生成することが明らかとなった。一方、実施例４、５の結果から、細胞内に取り込まれたγ-Glu-Abuの一部は、γ-Glu-Abu-Glyに変換されるが、γ-Glu-Abuも蓄積されることが示された。これらの結果より、酵母野生株のGSH2の活性では、菌体内に蓄積したγ-Glu-Abuの全てをγ-Glu-Abu-Glyに代謝することはできないが、その活性を弱めた方が、よりγ-Glu-Abuを蓄積しやすくなると考えられた。そこで、GSH2の破壊株へのAbu添加効果を検証した。【０１４０】
具体的には、以下の手順でサッカロマイセス・セレビシエS288C gsh2△0株を取得した。まず、配列番号３７（CTAGTGAAAAACAAGAAGTA）および３８（GCCACATAGAAAAATCGATG）に示すプライマーを用い、YEAST KNOCK OUT STRAIN COLLECTION (フナコシ、YCS1056)のGSH2破壊株ゲノムを鋳型に、カナマイシン耐性遺伝子カセットKanMXに置換されたGSH2を含む領域を増幅した。PCRの条件は、熱変性 94℃, 10 sec、アニーリング50℃, 10 sec、伸張 72℃, 3 min、25 cycleであった。次に、エタノール沈殿によってDNA断片を精製した後、S288Cを形質転換し、G418を添加したYPD平板培地に菌体を塗布した。得られた形質転換体から、gsh2△0株を取得した。【０１４１】
次に、この菌株を実施例３と同様にしてAbu添加効果を検証した。まず、gsh2△0株をSD培地(500ml容坂口フラスコ中50ml）に１エーゼ分植菌し、30℃で120rpmの速度で48時間振とう培養した。得られた培養液の吸光度を測定し、初発OD660が0.01になるように（なお、吸光度は、BECKMAN COULTER社のDU640 SPECTROPHTOMETERを用いて測定した。）、SD培地（2L容バッフルフィン付き三角フラスコ中400ml）、又は最終濃度で100ppmのAbuを含むSD培地に植菌し、30℃で120rpmの速度にて回転方式で65.75時間振とう培養した。得られた培養液から、実施例３と同様にしてエキス分を抽出し、γ-Glu-Abuの菌体内含有量を測定した。【０１４２】
その結果、SD培地で培養した場合は、菌体内のγ-Glu-Abu含量は128ppmであったが、100ppmのAbuを含む培地で培養した場合は、菌体内のγ-Glu-Abu含量は10333ppmであった。この結果からも、単にGSH2遺伝子を欠損しただけでは菌体内にγ-Glu-Abuは蓄積せず、Abuの供給が重要であることがわかった。【０１４３】
〔実施例１３〕GSH2破壊株へのAbu添加効果（２）
実施例１０で、Candida utilisのURA3破壊に用いたのと同様に、cre-loxp系を用いた手法で、一部プライマー配列を変更することにより、Candida utilis CUDF4株のGSH2を破壊した株を取得できる。【０１４４】
具体的には、Biosci.Biotechnol.Biochem.,73(4),879-884,2009(Shigehito IKUSHIMA et alに記載されているCUDF4株を取得した際に用いられたプライマーIM-59の代わりにプライマーN-59（配列番号３９：AAGTAGCCAATACAACCAGC：Candida utilisのGSH2のORF上流-57番の領域〜-38番の領域の配列）を用い、プライマーIM60の代わりにプライマー N-60 （配列番号４０：CTGCAGCGTACGAAGCTTCAGCTGGCGGGCCACTCACCCACTCAACATCAC、5'末端から31塩基はオーバーラップPCR用の重複配列）を用い、プライマーIM295の代わりにプライマーN-295（配列番号４１：GCTGTTTTAGACTCGTTTGC：Candida utilisのGSH2のORFの244番目の塩基〜263番目の塩基の領域）を用い、プライマーIM296の代わりにプライマーN-296（配列番号４２：CTGCAGCGTACGAAGCTTCAGCTGGCGGCCAGAAGATTCAGACACCGGGA、5'末端から29塩基はオーバーラップPCR用の重複配列）を用い、プライマーIM61の代わりにプライマーN-61（配列番号４３：ATTAGGTGATATCAGATCCACTAGTGGCCTGGTTTCTTAAGATCTATTCC、5'末端から30塩基はオーバーラップPCR用の重複配列）を用い、プライマーIM-62の代わりにプライマー N-62 （配列番号４４：TAAATGCGGCTCCATCTATTG：Candida utilis GSH2のORF下流+18塩基までの領域）を用いることにより、Candida utilisのGSH2を破壊カセットが調製できる。この破壊カセットを論文記載と同様の手法を用いることによりCUDF4株のGSH2を破壊する。なお、各形質転換工程、及び培養工程で1mMのGSH及び必要量のウラシルを培地に添加しておくと、菌株の取得率が向上し得る。このようにして取得できる菌株は、PCRにより、目的のGSH2破壊株であることを確認することができる。更に、このGSH2破壊株を、実施例１０と同様にpCGSH1-URA3で形質転換することにより、GSH1が発現強化され、かつGSH2が破壊された株を取得できる。この株をAbuを含む培地で培養すると、菌体内にγ-Glu-Abuを著量蓄積する。【０１４５】
〔実施例１４〕細胞内のAbu合成酵素の探索
Saccharomyces cerevisiaeの代謝経路は非常によく研究されているが、Abuを生合成する酵素は知られていない。しかし、発明者らは、他の微生物での検討時に、アミノ基転移酵素の基質認識が比較的曖昧であったことに鑑み、その他のアミノ基転移酵素として報告されている酵素が、AKB（α-ケトブチレート（α−ケト酪酸））をAbuに変換する活性を保有しているのではないかと推測した。そこで、BCAA（分岐鎖アミノ酸）のアミノ基転移反応を担うと報告されているBAT1の高発現株及び、GABA（γ-アミノ酪酸）のアミノ基転移反応を担うと報告されているUGA1の高発現株を育種した。【０１４６】
１）BAT1及びUGA1発現ベクターの構築
まず、常法に従い、酵母-大腸菌シャトルベクターであるプラスミドpYES2（インビトロジェン社）に酵母の構成発現プロモーターであるADH1pを導入した。具体的には、酵母野生株より調製したゲノムを鋳型として、配列番号４５（ATAACCGGTGGGTGTACAATATGGACTTC）及び４６（ATAAAGCTTTGTATATGAGATAGTTGATT）のプライマーを用いてPCRによりADH1のプロモーター領域を増幅した（熱変性 94℃, 10 sec、アニーリング50℃, 10 sec、伸張 72℃, 1 min、25 cycle）。得られたDNA断片をエタノール沈殿により精製後、制限酵素HindIII及びAgeIで消化し、プラスミドpYES2のHindIII-AgeI部位に挿入し、pYES2-ADH1pを得た。【０１４７】
次に、このpYES2-ADH1pに各遺伝子のORF領域を挿入する為に、各遺伝子の増幅産物をpT7ベクターにサブクローニングした。具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ野生株より調製したゲノムを鋳型として、配列番号４７（GGATCCATGTTGCAGAGACATTCC)及び４８（TCTAGATTAGTTCAAGTCGGC）のプライマーを用いて、BAT1のORF領域を、配列番号４９（AAGCTTACAGACAAGAAACCGTC）及び５０（TCTAGAGGCCTCGCTAATATAC）のプライマーを用いて、UGA1のORF領域をPCRにより、各々増幅した。得られたBAT1 増幅産物は、制限酵素BamHI及びXbaIで消化し、pT7ベクターのBamHI-XbaI部位に挿入し、pT7-BAT1を得た。また、UGA1 増幅産物は、制限酵素HindIII及びXbaIで消化し、pT7ベクターのHindIII-XbaI部位に挿入し、pT7-UGA1を得た。【０１４８】
このようにして得られたpT7-BAT1を制限酵素BamHI及びXbaIで処理し、電気泳動による分離及び目的遺伝子断片の切り出しにより、BAT1のDNA断片を精製後、プラスミドpYES2-ADH1pのBamHI及びXbaI部位に導入した。また、pT7-UGA1を制限酵素HindIII及びXbaIで処理し、電気泳動による分離及び目的遺伝子断片の切り出しにより、UGA1のDNA断片を精製後、プラスミドpYES2-ADH1pのHindIII及びXbaI部位に導入した。このようにして、BAT1の高発現ベクターpYES2-ADH1p-BAT1、及びUGA1の高発現ベクターpYES2-ADH1p-UGA1を調製した。
BAT1及びUGA1の塩基配列を、各々配列番号５１及び５３に示す。また、これらの遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を、各々配列番号５２及び５４に示す。【０１４９】
２）S288Cura3△0株の育種
実施例９と同様の手法により、S288C株のura3遺伝子のORF領域を欠失させたS288Cura3△0株を育種した。【０１５０】
３）各種発現株の育種
１)で構築した各発現ベクターで、各々２）で育種したS288Cura3△0を形質転換することにより、各遺伝子を高発現する菌株を育種した。具体的には、Zymo Research社のFrozen EZ Yeast Transformation IIキットを用いて、S288Cura3△0のコンピテントセルを作製し、各発現ベクターを導入することによりS288C/pYES2-ADH1p株、S288C/pYES2-ADH1p-BAT1株、S288C/pYES2-ADH1p-UGA1株を取得した。【０１５１】
４）取得菌株の評価
上記の各菌株を実施例３と同様にSD培地で培養評価した。結果を表１３に示す。【０１５２】
【表１３】
2012046731.tif 000015
【０１５３】
その結果、BAT1高発現株及びUGA1高発現株にて、細胞内のAbu含量に増加が見られた。また、細胞内で合成されたAbuはγ-Glu-Abuやγ-Glu-Abu-Glyの基質として使用されるため、これら３化合物の合計量をモル比で比較すると、コントロール菌株は2.46μmol/g-DCW、BAT1高発現株は7.06μmol/g-DCW、UGA1高発現株は3.91μmol/g-DCWと算出され、各種アミノ基転移酵素の高発現により細胞内のAbu含有化合物含量が増加すること、即ち、Abu生合成能が高まることが明らかとなった。また、S288Cura3△0株を親株にして、実施例１２でS288Cgsh2△0株を取得したのと同様の方法により、S288Cura3△0gsh2△0株を取得した。この菌株のコンピテントセルを作製し、各発現ベクターを導入することにより、S288Cgsh2△0/pYES2-ADH1p株及びS288Cgsh2△0/pYES2-ADH1p-BAT1株を取得した。後者の菌株を、SD培地で培養評価するとγ-Glu-Abuを蓄積する。【０１５４】
〔実施例１５〕GSH1高発現かつアミノ基転移酵素高発現効果
上記検討により、アミノ基転移酵素の高活性化、特にBAT1の高活性化により細胞内のAbu含有化合物の増加効果が見られた為、GSH1高発現との組合せ効果を検討した。実施例９で取得したウラシル要求性株のAG1-ura3△0を、実施例１４で作製したpYES2-ADH1p-BAT1で形質転換し、BAT1及びGSH1の高発現株である、AG1/pYES2-ADH1p-BAT1株を育種した。この株を実施例３と同様にして、SD培地で培養し、菌体内のγ-Glu-Abu含量及び、抽出エキス固形分あたりのγ-Glu-Abu含量を算出した。その結果、AG1/pYES2-ADH1p-BAT1株は、乾燥菌体重量あたりで1813ppmのγ-Glu-Abuを含有しており、また、同菌体から抽出したエキス分には、乾燥固形分あたりで約4560ppmのγ-Glu-Abuを含有していた。【０１５５】
〔実施例１６〕γ−グルタミル基転移酵素を作用させた、Abuを添加した酵母エキス
固形分あたりにGSHを約8％となるように試薬のGSH（和光純薬工業株式会社）を添加した酵母エキスの1％水溶液を調製し、NaOHを用いてそのpHを7.0に調製した。この溶液に、粉末のAbuを水溶液中の最終濃度で800ppm、1600ppm、又は8000ppmになるように添加し、被検サンプルを作製した。また、Abuを添加しない酵母エキス水溶液をコントロールとした。これらの被検サンプルにγ-GTP（シグマ社 γ-Glutamyltranspeptidase from equine kidney、コードG9270-100UN）を0.05mg/mlになるように添加し、37℃で120分間酵素反応を行った。反応液は、速やかに氷冷し、γ-Glu-Abu含量を測定した。また、反応液の一部を用いて固形分含量を測定し、酵素反応により生成したγ-Glu-Abuの固形分あたりの含量を算出した。【０１５６】
その結果、図５に示す通り、Abu無添加区では、γ-Glu-Abuはほとんど生成しなかったが、Abuの添加量を増やすにつれ、γ-Glu-Abuの生成が見られた。【０１５７】
〔実施例１７〕γ-Glu-Abuを含有する酵母エキスの官能評価（１）
まず、下記の手順にて官能評価用のサンプルを調製した。実施例４と同様にして、S288C株をSD培地(500ml容坂口フラスコ中50ml）に１エーゼ分植菌し、30℃で120rpmの速度で24時間振とう培養した。得られた培養液の吸光度を測定し、初発OD660が0.01になるように（なお、吸光度は、BECKMAN COULTER社のDU640 SPECTROPHTOMETERを用いて測定した。）、SD培地（2L容バッフルフィン付き三角フラスコ中400ml×4本）、又は、γ-Glu-Abuを終濃度で200ppm含有するSD培地（2L容バッフルフィン付き三角フラスコ中400ml×4本）に植菌し、30℃で120rpmの速度にて回転方式で19時間振とう培養した。実施例４と同様にして得られた菌体よりエキス分を抽出し、エキス中のγ-Glu-Abu濃度及び、エキスの固形分含量を求めた。その結果、γ-Glu-Abuを添加区から調製したエキス中のγ-Glu-Abu濃度は約1,000ppmであり、固形分濃度は約0.59%であった（抽出物１）。一方、無添加区から調製したエキスの固形分濃度は約1.00%であった（抽出物２）。【０１５８】
次に、これらサンプルのコク味を下記方法にて、専門のパネラー６名で評価した。【０１５９】
・コントロールサンプル：0.2%のMSG及び0.5%のNaClを含有する水溶液
・サンプル１：コントロールサンプルに、γ-Glu-Abuが約40ppmとなるように抽出物１を添加した水溶液
・サンプル２：コントロールサンプルに、抽出物２を、サンプル１に添加した抽出物１の固形分濃度と同じになるように添加した水溶液【０１６０】
その結果、パネラー全員がサンプル１の方が先味のコク味が強いと評価した。この結果より、γ-Glu-Abuは酵母エキス中においても、その先味という特徴を発揮することが確認された。【０１６１】
〔実施例１８〕γ-Glu-Abuを含有する酵母エキスの官能評価（２）
γ−グルタミルシステイン（γ-GC）を蓄積するサッカロマイセス・セレビシエAJ14892株（特開2008-61525）をSD培地（500ml容坂口フラスコ中50ml×4本）に１エーゼ分植菌し、30℃で120rpmの速度で48時間振とう培養した。得られた培養液の吸光度を測定し、初発OD660が0.1になるようにSD培地（2L容バッフルフィン付き三角フラスコ中400ml×4本）に植菌し、30℃で120rpmの速度にて回転方式で振とう培養した。培養時間は、残糖及び吸光度を経時的に測定し、ほぼS288CをSD培地で19時間培養した時の吸光度1.8前後と同じになるように、約42時間培養した。実施例４と同様にして、菌体よりエキス分を抽出し、エキスの固形分含量を求めたところ約0.71%であった（抽出物３）。またこの時の抽出物３溶液中のγ-GC含量は、約390ppmであった。このようにして、固形分あたりのγ-GC含量が約5.5%の抽出物３を調製した。
次に、これらサンプルのコク味を下記方法にて、専門のパネラー6名で評価した。【０１６２】
・コントロールサンプル：0.2%のMSG及び0.5%のNaClを含有する水溶液
・サンプル３：コントロールサンプルに、抽出物３を、サンプル１に添加した抽出物１の固形分濃度と同じになるように添加した水溶液
・サンプル４：コントロールサンプルに、市販のGSH高含有酵母エキス（興人（株）アロマイルドＵＧ８）を、サンプル１に添加した抽出物１の固形分濃度と同じになるように添加した水溶液【０１６３】
なお、評価に際しコントロールサンプルのコク味力価を0.0と定義し、サンプル４のコク味力価を3.0と定義した。その結果、下記表に示すように、γ-Glu-Abu酵母エキス（サンプル１）は、同じジペプチドであるγ-GC高含有酵母エキス（サンプル３）や、トリペプチドであるGSH高含有酵母エキス（サンプル４）と官能プロファイルが異なり、先味に強いコク味力価を与えることがわかった。【０１６４】
【表１４】
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【０１６５】
〔実施例１９〕α−ケト酪酸生成能の強化効果
次に、α−ケト酪酸生成能の強化効果を検討した。従来、α−ケト酪酸が酵母細胞内でAbuの前駆体となることは知られていなかったが、アミノ基転移酵素を活性化することにより酵母細胞内でのAbu生成能が高まったことから、α−ケト酪酸合成能を強化することにより細胞内でのAbu生成能が高まるか否かを検討した。
まず、実施例１３で作製したpYES2-ADH1pにセリン（スレオニン）デアミナーゼをコードするCHA1のORF領域を挿入する為に、CHA1の増幅産物をpT7ベクターにサブクローニングした。具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ野生株より調製したゲノムを鋳型として、配列番号５５（ATAAAGCTTAACCAGCGAGATGTCG)及び５６（CTCTCTAGAGGGCAAATTGATGCTTC）のプライマーを用いて、CHA1のORF領域をPCRにより増幅した。得られたCHA1増幅産物は、制限酵素HindIII及びXbaIで消化し、pT7ベクターのHindIII-XbaI部位に挿入し、pT7-CHA1を得た。【０１６６】
このようにして得られたpT7-CHA1を制限酵素HindIII及びXbaIで処理し、電気泳動による分離及び目的遺伝子断片の切り出しにより、CHA1のDNA断片を精製後、プラスミドpYES2-ADH1pのHindIII及びXbaI部位に導入した。このようにして、CHA1の高発現ベクターpYES2-ADH1p-CHA1を調製した。
CHA1の塩基配列を、配列番号５７に示す。また、この遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号５８に示す。【０１６７】
次に、実施例９で育種したウラシル要求性株のAG1-ura3△0のBAT1のプロモーター領域を、Sofyanovichらの方法（Olga A. Sofyanovich et al: A New Method for Repeated “Self-Cloning” Promoter Replacement in Saccharomyces cerevisiae, Mol. Biotechnol.,48,218-227 (2011)）にもとづきPGK1のプロモーター領域に置換した。プロモーター置換用のDNAフラグメントは、論文記載のpPUPプラスミドと、BAT1置換用のプライマーとして、配列番号５９（GCCAGGCGGTTGATACTTTGTGCAGATTTCATACCGGCTGTCGCTATTATTACTGATGAATTGGCTCTCTTTTTGTTTAATCTTAACCCAACTGCACAGA）及び６０（TTGGATGCATCTAATGGGGCACCAGTAGCGAGTGTTCTGATGGAGAATTTCCCCAACTTCAAGGAATGTCTCTGCAACATTGTTTTATATTTGTTGTAAA）を用いて、PCRにより増幅することによって調製した。このようにして構築したウラシル要求性のGSH1及びBAT1増強株であるAGB-ura3△0株を、CHA1の高発現ベクターで形質転換することにより、GSH1、BAT1及びCHA1を高発現する菌株を育種した。具体的には、実施例１４と同様にしてZymo Research社のFrozen EZ Yeast Transformation IIキットを用いて、AGB-ura3△0株のコンピテントセルを作製し、pYES2-ADH1p-CHA1を導入することによりAGB-ura3△0/pYES2-ADH1p-CHA1株を取得した。【０１６８】
上記の菌株を実施例１４と同様にSD培地で培養評価した。その結果、同菌株は乾燥菌体重量あたりで2024ppmのγ-Glu-Abuを含有していた。【０１６９】
〔実施例２０〕ペプチド分解酵素の破壊効果
次に、GSH分解に関与すると報告されている酵素遺伝子DUG2の破壊効果を検証した。DUG2の塩基配列を配列番号６１に、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号６２に示す。
まず、DUG2の開始コドンより上流80塩基を付加した配列番号６３のプライマー(TTAAGTGAAAAACTATTTCGAGAAACCGAACAACCCTGTAAGGAAAAGTGAAAAACGAGGGCAGAAGTAATTGTGAAATCGTTCATCATCTCATGGATCT)、及びDUG2の終止コドンより下流80塩基を付加した配列番号６４のプライマー(ACTAATTATCATTAGGTAGAGGCCTACATATGCAAATTGGGTATATATTAAGCACTTTAAAATCAATTGTTTGTAGTTGTAGATTCCCGGGTAATAACTG)を用い、野生型株のURA3遺伝子を増幅した。PCRの条件は、熱変性（94℃、10 sec）、アニーリング（50℃、10 sec）、伸張（72℃、2 min）、25 cycleとした。得られたDNA断片でAG1-ura3△0株を形質転換し、ウラシルを含有しないSD培地に塗布した。生育した形質転換体からAG1-ura3△0のdug2D株（以下、AG1-dug2△0株）を得た。AG1株及びAG1-dug2△0株を実施例９と同様にして100ppmのAbuを含むSD培地で培養した。その結果、AG1-dug2△0株の方が、より多くのγ-Glu-Abuを含有することがわかった。GSHを分解する酵素の破壊は、γ-Glu-Abuの蓄積に有益であることが示唆された。【０１７０】
【表１５】
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【産業上の利用可能性】
【０１７１】
本発明により、γ-Glu-Abuを含む酵母、及びγ-Glu-Abuを含む酵母エキスを製造することができる。これらのペプチドを含む酵母エキスは、コク味、特に先味型のコク味を付与する効果に優れている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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