(57)【要約】  本発明の目的は、様々な物質の吸着体として利用可能な多孔質のセルロース粒子を、チオシアン酸カルシウム溶液など毒性が高い溶媒を使わず安全かつ簡便に製造する方法を提供することである。また、本発明は、当該方法で製造された多孔質粒子、当該多孔質粒子を含み、純度の高いタンパク質を安全かつ効率的に精製できる吸着体と、当該吸着体を用いたタンパク質の精製方法を提供することも目的とする。本発明に係る多孔質粒子の製造方法は、セルロースおよびイオン液体を含む溶液を調製する工程；当該セルロース溶液をイオン液体と相溶しない液体に分散させて分散液を調製する工程；および、当該分散液を、アルコールまたはアルコール水溶液と接触させることにより凝固させて多孔質粒子を得る工程を含むことを特徴とする。
2012033223.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質粒子を製造するための方法であって、
セルロースおよびイオン液体を含む溶液を調製する工程；
当該セルロース溶液をイオン液体と相溶しない液体に分散させて分散液を調製する工程；および
当該分散液を、アルコールまたはアルコール水溶液と接触させることにより凝固させて多孔質粒子を得る工程を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項２】
セルロース溶液の調製工程において、水および／またはアルコールを添加し、且つ当該水および／またはアルコールの添加量を、イオン液体との合計量に対して２重量％以上、２０重量％以下にする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
セルロース溶液の温度を０℃以上、７０℃以下に調整する請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
分散液とアルコールまたはアルコール水溶液とを１０℃以上で接触させる請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法で製造されたものであることを特徴とする多孔質粒子。
【請求項６】
カラムに充填し、目的吸着物質以上の分子量を有する複数のタンパク質の分配係数を測定し、縦軸にＫav、横軸に分子量の対数をプロットし、式（Ｉ）が成り立つ部分においてｋ≦−０．１である請求項５に記載の多孔質粒子。
Ｋav＝ｋ・ｌｎ（ＭＷ）＋ｂ      （Ｉ）
［式中、Ｋavは分配係数を示し、ＭＷはタンパク質の分子量を示し、ｂは定数を示す］
【請求項７】
カラムに充填して測定した目的吸着物質のＫavが０．３以上である請求項６に記載の多孔質粒子。
【請求項８】
カラムに充填して測定したＩｇＧのＫavが０．３以上である請求項６に記載の多孔質粒子。
【請求項９】
排除限界分子量が１０3以上、１０9以下である請求項５〜８のいずれかに記載の多孔質粒子。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法で製造された多孔質粒子または請求項５〜９のいずれかに記載の多孔質粒子とアフィニティーリガンドとを含み、アフィニティーリガンドが多孔質粒子に固定化されていることを特徴とする吸着体。
【請求項１１】
アフィニティーリガンドの導入量が、多孔質粒子１ｍＬ当たり１ｍｇ以上、１０００ｍｇ以下である請求項１０に記載の吸着体。
【請求項１２】
セルロース含量が２重量％以上、５０重量％以下である請求項１０または１１に記載の吸着体。
【請求項１３】
多孔質粒子が架橋されているものである請求項１０〜１２のいずれかに記載の吸着体。
【請求項１４】
１０％圧縮時の圧縮応力が０．０１ＭＰａ以上、３ＭＰａ以下である請求項１０〜１３のいずれかに記載の吸着体。
【請求項１５】
体積平均粒径が１μｍ以上２０００μｍ以下である請求項１０〜１４のいずれかに記載の吸着体。
【請求項１６】
アフィニティーリガンドがプロテインＡである請求項１０〜１５のいずれかに記載の吸着体。
【請求項１７】
請求項１０〜１６のいずれかに記載の吸着体をカラムに充填する工程；
当該カラムに粗タンパク質を含む溶液をカラムに充填された吸着体に通液する工程；および
溶離液をカラムに通液する工程を含むことを特徴とするタンパク質の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質粒子を製造するための方法、当該方法で製造された多孔質粒子、当該多孔質粒子を含む吸着体、および当該吸着体を用いてタンパク質を精製するための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
多孔質粒子は、例えば各種クロマトグラフィー用吸着体やアフィニティー吸着体などの担体として広く用いられている。なかでもアフィニティー吸着体は、効率よく目的物を精製でき、不要物濃度を低減できることから、医療用吸着体や抗体医薬品精製用吸着体として利用されてきている。【０００３】
特に、リウマチ、血友病、拡張型心筋症の治療用吸着体として、プロテインＡをアフィニティーリガンドとして多孔質担体に固定化した吸着体が注目されている（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。また、プロテインＡが多孔質担体に固定化された吸着体は、免疫グロブリン（ＩｇＧ）を特異的に吸着できる抗体医薬品精製用吸着体としても注目されている。【０００４】
多糖類は産業的に容易に得ることが可能であり、また生体に対する安全性も高いことから、医療用の多孔質担体の材料として広く用いられている。例えば、多孔質セルロース担体は、機械的強度が比較的高く、リガンドの結合に利用しうるヒドロキシル基を多数有し、非特異吸着も少なく、合成高分子系の担体などに比べて安全性が高いなどの優れた点を有していることが知られている（特許文献１〜２）。例えば、多孔質セルロース担体にプロテインＡを固定化した吸着体が特許文献３に開示されている。【０００５】
しかし、セルロースを溶解できる溶媒はほとんどなく、セルロース多孔質粒子は、一般的に、チオシアン酸カルシウム溶液など毒性が高い溶媒にセルロースを溶解して製造されているが、このような溶媒は腐食性や安全性の面で取扱いが困難である。【０００６】
一方で、近年、不揮発性かつ広い温度域で液体となる特徴を持つイオン液体が注目されている。イオン液体は、主に機能性溶媒やイオニクスデバイスの溶媒として、また、ポリペプチドなど生体由来材料の溶媒として適用されている。近年、このイオン液体は、セルロースも溶解することがわかり、繊維の製造などに適用されている（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１−２７８５３４号公報
【特許文献２】特開平１１−１５８２０２号公報
【特許文献３】ＷＯ２００８／１４６９０６
【特許文献４】特開２００８−２４８４６６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Annals of the  New  York  Academy of Sciences, 2005, Vol.1051, pp.635-646
【非特許文献２】American Heart  Journal, Vol.152, No.4, 2006
【非特許文献３】「アフィニティークロマトグラフィー」笠井献一ら著，東京化学同人，１９９１年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、様々な物質の吸着体として利用可能な多孔質のセルロース粒子を、チオシアン酸カルシウム溶液など毒性が高い溶媒を使わず安全かつ簡便に製造する方法を提供することである。また、本発明は、当該方法で製造された多孔質粒子、当該多孔質粒子を含み、純度の高いタンパク質を安全かつ効率的に精製できる吸着体と、当該吸着体を用いたタンパク質の精製方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。その結果、イオン液体にセルロースを溶解させた上で特定の溶媒と接触させることにより、タンパク質吸着体の材料として適度な大きさと適度な孔を有するアモルファス状の多孔質粒子を安全かつ効率的に製造できることを見出して、本発明を完成した。【００１１】
本発明に係る多孔質粒子の製造方法は、セルロースおよびイオン液体を含む溶液を調製する工程；当該セルロース溶液をイオン液体と相溶しない液体に分散させて分散液を調製する工程；および、当該分散液を、アルコールまたはアルコール水溶液と接触させることにより凝固させて多孔質粒子を得る工程を含むことを特徴とする。【００１２】
本発明方法のセルロース溶液の調製工程においては、水および／またはアルコールを添加し、且つ当該水および／またはアルコールの添加量を、イオン液体との合計量に対して２重量％以上、２０重量％以下にすることが好ましい。かかる態様により、多孔質粒子の内部構造を制御することが可能になる。より具体的には、当該溶液にセルロースの貧溶媒を加えることにより、多孔質粒子の孔径をより均一化することが可能になる。【００１３】
本発明方法では、セルロース溶液の温度を０℃以上、７０℃以下に調整することが好ましい。当該温度が０℃以上であれば、イオン液体に対するセルロースの溶解度が高くなり、また、セルロース溶液の粘度が低くなって分散液が調製し易くなる。また、当該温度が７０℃以下であれば、セルロース溶液や分散液の調製時においてイオン液体以外の溶媒が揮発し難くなる。【００１４】
また、分散液とアルコールまたはアルコール水溶液とを１０℃以上で接触させることが好ましい。理由は明らかではないが、本発明者らは、分散液とアルコールまたはアルコール水溶液とを接触させる際の温度を高くすればするほど得られる多孔質粒子の細孔径が大きくなることを見出した。従って、当該温度としては１０℃以上が好ましい。【００１５】
本発明に係る多孔質粒子は、上記本発明方法で製造されたものであることを特徴とする。【００１６】
また、本発明に係る吸着体は、上記本発明に係る多孔質粒子とアフィニティーリガンドとを含み、アフィニティーリガンドが多孔質粒子に固定化されていることを特徴とする。【００１７】
本発明に係る多孔質粒子および吸着体としては、カラムに充填し、目的吸着物質以上の分子量を有する複数のタンパク質の分配係数を測定し、縦軸にＫav、横軸に分子量の対数をプロットし、式（Ｉ）が成り立つ部分においてｋ≦−０．１であるものが好適である。【００１８】
Ｋav＝ｋ・ｌｎ（ＭＷ）＋ｂ      （Ｉ）
［式中、Ｋavは分配係数を示し、ＭＷはタンパク質の分子量を示し、ｂは定数を示す］
式（Ｉ）におけるｋの値が−０．１以下であれば、吸着物質の分子量における比表面積
は大きくなるので、より優れた吸着能が発揮される。【００１９】
また、カラムに充填して測定した目的吸着物質、特にＩｇＧのＫavが０．３以上である多孔質粒子が好適である。Ｋavが０．３以上であれば、吸着物質の分子量における比表面積は大きくなり、効率よく吸着することが可能である。【００２０】
本発明に係る多孔質粒子および吸着体において、排除限界分子量としては１０3以上、１０9以下が好ましい。排除限界分子量がこの範囲にあれば、本発明に係る多孔質粒子および吸着体を用いて、多くの有用タンパク質の精製が可能になる。【００２１】
本発明吸着体としてはアフィニティーリガンドの導入量が、多孔質粒子１ｍＬ当たり１ｍｇ以上、１０００ｍｇ以下であるものが好ましい。当該導入量が１ｍＬ以上であれば、十分な吸着能をより確実に確保することができる。一方、過剰量のアフィニティーリガンドを担体へ導入することは難しい場合があり、生産性が落ちるおそれがあり得るので、当該導入量としては１０００ｍｇ以下が好適である。【００２２】
本発明に係る多孔質粒子および吸着体におけるセルロース含量としては、２重量％以上、５０重量％以下が好ましい。セルロース含量が２重量％以上であれば、大スケール、高線速で精製を行っても圧密化を生じない吸着体が得られる。また、セルロース含量が５０重量％以下であると、精製目的物を通すことができる十分な孔を確保することができる。【００２３】
本発明吸着体の担体である多孔質粒子としては、架橋されているものが好適である。架橋されている多孔質粒子は強度に優れているため、高線速下や高圧力下の使用にも耐えることができる。【００２４】
本発明に係る多孔質粒子および吸着体の１０％圧縮時の圧縮応力としては、０．０１ＭＰａ以上、３ＭＰａ以下が好ましい。当該圧縮応力が０．０１ＭＰａ以上であれば、高線速下で通液しても、圧密化し難くなる。また、当該圧縮応力が３ＭＰａ以下であれば、脆性が改善され、微粒子発生がより確実に抑制される。【００２５】
本発明に係る多孔質粒子および吸着体の体積平均粒径としては、１μｍ以上、２０００μｍ以下が好ましい。体積平均粒径が２０μｍ以上であれば、圧密化がより起こり難くなり、１０００μｍ以下であれば、目的物の吸着量がより大きくなり得る。【００２６】
本発明吸着体のアフィニティーリガンドとしては、プロテインＡが好ましい。【００２７】
本発明に係るタンパク質の精製方法は、上記本発明吸着体をカラムに充填する工程；当該カラムに粗タンパク質を含む溶液をカラムに充填された吸着体に通液する工程；および、溶離液をカラムに通液する工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２８】
本発明方法によれば、従来使用されていたチオシアン酸カルシウム溶液などを用いる必要が無く、より安全且つ低コストでセルロース多孔質粒子を製造することができる。また、本発明方法においてチオシアン酸カルシウム溶液の代わりに用いられるイオン液体、および当該イオン液体と相溶しない液体は、使用後に分離回収が可能であり、再利用できるので、本発明方法は工業的な大量生産にも適する。【００２９】
また、本発明方法によれば、セルロース多孔質粒子の硬度や内部構造などを変化させることも可能であり、特に、アモルファス状のセルロース多孔質粒子が得られる。よって、本発明方法により、様々な物質の吸着体の担体として利用可能なセルロース多孔質粒子を提供することが可能となる。【００３０】
さらに本発明方法では、セルロース溶液の分散液の粘度は、イオン液体と相溶しない液体に依存するため、高濃度のセルロース溶液の操作時の見かけ粘度を低く抑えることができ、取扱性を大きく改善することができる。【００３１】
また、本発明方法で得られるセルロース多孔質粒子は、タンパク質などの吸着体の担体として非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】比較例１により得られた本発明のセルロース粒子表面のＳＥＭ写真である。
【図２】図１の高倍率ＳＥＭ写真である。
【図３】比較例１により得られた本発明のセルロース粒子を割断したＳＥＭ写真である。
【図４】図３の高倍率ＳＥＭ写真である。
【図５】比較例１〜３より得られたセルロース粒子のＸＲＤパターンである。
【図６】実施例１により得られた本発明のセルロース粒子表面のＳＥＭ写真である。
【図７】図６の高倍率ＳＥＭ写真である。
【図８】実施例１により得られた本発明のセルロース粒子を割断したＳＥＭ写真である。
【図９】図８の高倍率ＳＥＭ写真である。
【図１０】実施例２により得られた本発明のセルロース粒子表面のＳＥＭ写真である。
【図１１】図１０の高倍率ＳＥＭ写真である。
【図１２】実施例２により得られた本発明のセルロース粒子を割断したＳＥＭ写真である。
【図１３】図１２の高倍率ＳＥＭ写真である。
【図１４】実施例３により得られた本発明のセルロース粒子表面のＳＥＭ写真である。
【図１５】図１４の高倍率ＳＥＭ写真である。
【図１６】実施例３により得られた本発明のセルロース粒子を割断したＳＥＭ写真である。
【図１７】図１６の高倍率ＳＥＭ写真である。
【図１８】比較例１および実施例１〜３より得られたセルロース粒子のＸＲＤパターンである。
【図１９】実施例３〜５より得られたセルロース粒子のＸＲＤパターンである。
【図２０】実施例７により得られた本発明のセルロース粒子を割断したＳＥＭ写真である。
【図２１】図２０の高倍率ＳＥＭ写真である。
【図２２】実施例８により得られた本発明のセルロース粒子表面のＳＥＭ写真である。
【図２３】実施例９により得られた本発明のセルロース粒子表面のＳＥＭ写真である。
【図２４】実施例１０により得られた本発明のセルロース粒子表面のＳＥＭ写真である。
【図２５】実施例８〜１０より得られたセルロース粒子のＸＲＤパターンである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明方法を実施の順番に従って説明する。
【００３４】
（１）  溶液調製工程
本発明に係る製造方法では、まず、セルロースおよびイオン液体を含む溶液を調製する。
【００３５】
イオン液体とは、一般に、常圧１００℃未満で液体であるイオン化合物である。イオン液体のカチオン部分の例は、ピリジニウム、イミダゾリウムおよびイミダゾール等が挙げられ、非環状カチオンとしては、アルキル第４級アンモニウムおよびアルキル第４級リンカチオン等が挙げられる。カチオン部分の対アニオンは、ハロゲンイオン、擬ハロゲンイオン、ハロゲンを含む有機化合物である有機ハロゲン化物イオンおよびカルボキシレート等からなる群より選択される。カルボキシレートとしては、アセテート、シトレート、マレート、マレエート、ホルメートおよびオキシレートが挙げられ、ハロゲンイオンとしては、クロリド、ブロミド、亜鉛クロリド／コリンクロリドが挙げられ、有機ハロゲン化物イオンとしては、テトラフルオロホウ酸イオン、ヘキサフルオロリン酸イオン、ＣＦ3ＳＯ2-、（ＣＦ3ＳＯ2）2Ｎ-、ＣＦ3ＣＯ2-、３−メチル−Ｎ−ブチル−ピリジニウムクロリドおよびベンジルジメチル（テトラデシ）アンモニウムクロリドが挙げられる。
【００３６】
本発明に使用可能なセルロースとしては、イオン液体に溶解するものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、再生セルロース、結晶性セルロース（microcrystalline cellulose）、酢酸セルロースから選択される１種以上を用いることができる。特に、平均重合度が１００以上、７００以下程度の結晶性セルロースが好ましい。平均重合度が１００以上であれば、得られる多孔質粒子の強度を十分なものとすることができる。一方、平均重合度が高過ぎると、セルロース溶液の粘度が過剰に高くなり得るため、平均重合度としては７００以下が好ましい。より好ましい平均重合度は１００以上、５００以下、さらに好ましくは１５０以上、３５０以下、特に好ましくは２００以上、３００以下であり、中でも３００程度の結晶性セルロースが良好である。なお、平均重合度の高いものを用いる場合には、貧溶媒の添加や、高温での操作がセルロース溶液の粘度を下げるために有効である。
【００３７】
セルロースの使用量は特に制限されず、適宜調整すればよい。例えば、セルロース溶液１００重量％に対して２重量％以上、５０重量％以下が好ましい。当該濃度が２重量％以上であれば、本発明方法により、大スケールや高線速で精製を行っても圧密化を生じない吸着体が得られる。また、当該濃度が５０重量％以下であると、精製目的物を通すことができる十分な孔を確保することができる。また、当該濃度が高過ぎると溶液の粘度が過剰に高くなって操作性が悪くなるおそれがあり得るので、当該濃度としては５０重量％以下が好適である。当該濃度としては、３重量％以上がより好ましく、４重量％以上がさらに好ましく、５重量％以上が特に好ましく、また、３０重量％以下がより好ましく、２０重量％以下がさらに好ましく、１５重量％以下が特に好ましい。
【００３８】
溶液の調製方法は特に制限されず、常法を用いればよい。例えば、単にセルロースとイオン液体を混合し、セルロースが十分に溶解されるまで加温したり攪拌したりすればよい。
【００３９】
セルロースおよびイオン液体を含む溶液は、セルロースが析出しない程度でさらに水および／またはアルコールより選択される１種以上を添加することにより、多孔質粒子の内部構造を制御することが可能になる。より具体的には、当該溶液にセルロースの貧溶媒を加えることにより、多孔質粒子の孔径をより均一化することが可能になる。
【００４０】
なお、アルコール水溶液を添加する場合、アルコール濃度は適宜調整すればよいが、例えば、水：アルコール類＝８０：２０〜５：９５（体積比）とすることができる。
【００４１】
水および／またはアルコールの添加量は、常温でセルロースが析出しない範囲で適宜調整すればよいが、例えば、添加すべき水および／またはアルコールとイオン液体との合計量に対して２重量％以上、２０重量％以下とすることができる。当該添加量が２重量％以上であれば、多孔質粒子の孔径の均一化効果をより確実に発揮することができる。一方、当該添加量が多過ぎるとセルロースが析出する可能性があり得るので、当該添加量は２０重量％以下とすることが好ましく、１５重量％以下がより好ましい。
【００４２】
セルロースをイオン液体に溶解するに当たっては、加温してもよい。ただし、一般的なイオン液体は１００℃未満で液体であるため、温度は１００℃未満とすることが好ましい。より好ましくは、５０℃以上、９０℃以下とする。また、溶解を容易にするために、セルロースを事前に微細化しておいてもよい。
【００４３】
（２）  分散化工程
次に、得られたセルロース溶液をイオン液体と相溶しない液体に分散させ、分散液を調製する。
【００４４】
上記セルロース溶液は、イオン液体と相溶しない液体に分散させる前または分散中に、その温度を０℃以上、７０℃以下に調整することが好ましい。当該温度が０℃以上であれば、イオン液体に対するセルロースの溶解度が高くなり、また、セルロース溶液の粘度が低くなって分散液が調製し易くなる。また、当該温度が７０℃以下であれば、セルロース溶液や分散液の調製時においてイオン液体以外の溶媒が揮発し難くなる。
【００４５】
イオン液体と相溶しない液体としては、使用したイオン液体１ｇまたは１ｍＬを２５℃で溶解するのに１０００ｍＬ以上を要する液体が好ましい。かかる液体としては、使用するイオン液体の種類などにもよるが、例えば、ヘキサン、酢酸エチル、炭素数６〜１２の直鎖状飽和脂肪酸、炭素数１６〜２４の不飽和脂肪酸、融点が１００℃以下の動植物油脂類、水素添加動植物油、動植物油脂類やその水素添加物の高融点画分を分別精製した分別油、飽和脂肪酸トリグリセリド類、食用ワックス類、微細藻類由来油脂類、微生物油脂類、中鎖脂肪酸トリグリセリド類、不飽和脂肪酸トリグリセリド類などを挙げることができる。本発明で用いられる油脂は、融点が１００℃以下であれば特に限定されない。例えば、パーム油、シア脂、サル脂、イリッペ脂、豚脂、牛脂、ナタネ油、米油、落花生油、オリーブ油、コーン油、大豆油、シソ油、綿実油、ヒマワリ油、月見草油、ゴマ油、サフラワー油、ヤシ油、カカオ脂、パーム核油、魚油等の動植物油脂類；パーム硬化油、パーム極度硬化油、ナタネ硬化油、ナタネ極度硬化油、大豆硬化油、豚脂硬化油、魚油硬化油等の水素添加動植物油；動植物油脂類やその水素添加物の高融点画分を分別精製した、ヤシ分別油、パーム核油分別油、パーム分別油、カカオ脂分別油、シア脂分別油、豚脂分別油、大豆硬化油分別油、魚油硬化油分別油等の分別油；トリステアリン、トリパルミチン、トリラウリン等の飽和脂肪酸トリグリセリド類；これらのモノグリセリド、ジグリセリド、脂肪酸等の部分グリセリド類；ミツロウ、キャンデリラロウ、米ぬかロウ等の食用ワックス類；ワカメ油やコンブ油等の海藻由来油脂類；スピルリナ抽出油等の微細藻類由来油脂類；酵母抽出油やモルティエラ属抽出油等の微生物油脂類；これらの低融点画分を分別精製したパーム低融点画分、魚油低融点画分、シア脂低融点画分等の分別油；トリカプリリン、トリカプリン等の中鎖脂肪酸トリグリセリド類；トリオレイン、トリリノール等の不飽和脂肪酸トリグリセリド類；これらのモノグリセリド、ジグリセリド等の部分グリセリド類；オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、イコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等の脂肪酸類を挙げることができる。
【００４６】
イオン液体と相溶しない液体は、１種のみ単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。２種以上を混合する場合の例としては、炭素数の異なる飽和脂肪酸の混合溶媒、炭素数の異なる不飽和脂肪酸の混合溶媒、飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の混合溶媒を挙げることができる。
【００４７】
イオン液体と相溶しない液体中にイオン液体を分散させるために、界面活性剤を用いてもよい。界面活性剤としては、例えば、Ｎ−アシル−Ｌ−グルタミン酸トリエタノールアミン、Ｎ−アシル−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、塩酸アルキルジアミノエチルグリシン液、ジメチコンコポリオール、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸プロピレングリコール、モノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリン、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノウリン酸ポリエチレングリコールなどを挙げることができる。セルロースへの着色抑制や溶液粘性などの観点から、界面活性剤としては中鎖脂肪酸トリグリセリド類が好ましい。
【００４８】
セルロース溶液を上記液体に分散させることにより、セルロース溶液の液滴を形成させる。イオン液体と相溶しない液体とセルロース溶液の使用量は特に制限されず適宜調整すればよいが、例えば、上記液体：セルロース溶液＝９８：２〜５０：５０（体積比）とすることができる。当該体積比としては、９７：３〜７０：３０が好ましく、９７：３〜８０：２０がより好ましい。
【００４９】
セルロース溶液の分散方法は特に限定しないが、例えば攪拌翼を用いた攪拌やホモジナイザーを用いた攪拌により、イオン液体と相溶しない液体中にセルロース溶液を均一に分散させることが可能である。さらに静止型ミキサーも用いることができる。
【００５０】
（３）  凝固工程
次に、上記分散液を、アルコールまたはアルコール水溶液と接触させることにより凝固させて、多孔質粒子とする。当該工程により、液滴中のイオン液体を抽出し、セルロースを不溶化して凝縮させることにより、セルロースからなる多孔質粒子を得ることができる。
【００５１】
当該工程で用いるアルコールとしては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、２−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、２−メチル−２−プロパノール（ｔｅｒｔ−ブタノール）、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル‐２‐ブタノール、３‐メチル‐２‐ブタノール、１−ヘキサノール、２−ヘキサノール、３−ヘキサノールなどのＣ1-6アルコール類を挙げることができる。
【００５２】
アルコール水溶液の濃度も特に制限されず、適宜調整すればよいが、例えば、水：アルコール類＝８０：２０〜５：９５（体積比）とすることができる。また、本発明者らは、驚くべきことに、アルコール水溶液における水の体積比が大きいほど多孔質粒子の細孔が大きくなり、アルコール類の体積比が大きいほど多孔質粒子の真球度が大きく且つアモルファス状になることを見出した。これらの観点から、当該割合としては、７０：３０〜１０：９０がより好ましく、５０：５０〜１０：９０がさらに好ましく、４０：６０〜２０：８０が特に好ましい。
【００５３】
上記分散液とアルコールまたはアルコール水溶液との接触方法は特に制限されず、分散液はアルコールまたはアルコール水溶液を全量または一部ずつ添加してもよいし、アルコールまたはアルコール水溶液へ全量または一部ずつ分散液を添加してもよい。好適には、アルコールまたはアルコール水溶液を攪拌しておき、ここへ分散液を徐々に添加する。
【００５４】
アルコールまたはアルコール水溶液の使用量は特に制限されず、イオン液体を抽出するに十分量を用いればよいが、例えば、分散液に対する体積比で１以上、５以下とすることができる。
【００５５】
接触時の温度も特に制限されず、イオン液体の融点以上、使用するアルコールの沸点以下とすることが好ましい。当該温度をイオン液体の融点以下にすると、セルロース粒子中からイオン液体が放出されにくくなるおそれがあり得る。一方、アルコールの沸点以上にすると、還流装置が必要となるなどコストが上がってしまう。当該温度としては、１０℃以上、６０℃以下が好ましく、２５℃以上、６０℃以下がより好ましく、４０℃以上、５５℃以下が特に好ましい。なお、凝固したセルロース粒子の多孔性は、驚くべきことにセルロース溶液とアルコールまたはアルコール水溶液の温度に影響を受け、溶液温度が高いほどセルロース粒子の細孔径は大きくなる。この点でも、当該温度を上記好適範囲にすることが好ましい。
【００５６】
なお、セルロース多孔質粒子の細孔径としては、例えば、最大径で２００Å以上、１５００Å以下、平均径で１００Å以上、４００Å以下が好ましい。平均径としては、１４０Å以上、４００Å以下がより好ましく、２００Å以上、４００Å以下がさらに好ましい。
【００５７】
以上で得られるセルロース粒子は多孔質であり、その孔の大きさや硬度などは、セルロース濃度、分散液温度、セルロース非溶解性の液体を変えることで制御することが可能である。
【００５８】
（４）  回収工程
次に、得られた多孔質粒子を回収すればよい。回収手段は特に制限されず、濾過や遠心分離など一般的な固液分離手段を用いることができる。
【００５９】
得られた多孔質粒子は、必要であれば、孔内に残留しているイオン液体やセルロース非溶解性液体を除去するために、水やアルコール類で洗浄した後、減圧下、乾燥してもよい。
【００６０】
また、使用したイオン液体は、固液分離後の液体からセルロース非溶解性液体を蒸発させることで回収可能である。
【００６１】
（５）  架橋工程
上記本発明方法で得られた多孔質粒子は、架橋剤にて強度をさらに増すことが可能である。架橋剤や架橋反応条件に特に限定は無く、公知の技術を用いて行うことができる。例えば架橋剤としては、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジクロロヒドリンなどのハロヒドリン；２官能性ビスエポキシド（ビスオキシラン）；多官能性ポリエポキシド（ポリオキシラン）を挙げることができる。
【００６２】
多孔質粒子の大きさは特に限定されるものではないが、一般的に１μｍ以上、２ｍｍ以下程度が好ましい。例えば、精製用吸着体の担体として場合、体積平均粒径は２０μｍ以上、１０００μｍ以下が好ましい。多孔質粒子の体積平均粒径が２０μｍ以上であれば、圧密化が起こり難いため好ましく、１０００μｍ以下であれば精製用吸着体の担体に用いた場合の精製目的物の吸着量が大きくなるため好ましい。多孔質粒子の体積平均粒径としては、２０μｍ以上がより好ましく、３０μｍ以上がさらに好ましく、５０μｍ以上が特に好ましく、６０μｍ以上が最も好ましく、また、５００μｍ以下がより好ましく、２５０μｍ以下がさらに好ましく、１２５μｍ以下が特に好ましく、９５μｍ以下が最も好ましい。体積平均粒径は、ランダムに選んだ１００個の多孔質粒子の粒径を測定して求めることができる。個々の多孔質粒子の粒径は、個々の多孔質粒子の顕微鏡写真を撮影して電子データとして保存し、メディアサイバネティックス社製のイメージプロプラスなどの粒径測定ソフトウェアを用いて測定することができる。或いは、レーザ回折／散乱式粒子径分布測定装置を用いて測定することもできる。なお、多孔質粒子の大きさは、例えば、分散時や、分散液とアルコールまたはアルコール水溶液との接触時における攪拌強度や界面活性剤の種類などによって調節することが可能である。
【００６３】
次に、上記で得られたセルロース多孔質粒子を担体として用い、吸着体を製造する方法について説明する。
【００６４】
（６）  アフィニティーリガンドの固定化工程
タンパク質の吸着体を製造するには、目的吸着物質に対して親和性の高いアフィニティーリガンドを、上記セルロース多孔質粒子に固定化する。
【００６５】
アフィニティーリガンドとは、特定の目的物質と相互作用し、特異的に親和力を有し得る分子または化合物を意味する。例えば、抗体が目的吸着物質である場合、特異的に相互作用する抗原やタンパク質、抗体結合活性を有するペプチド等を挙げることができる。
【００６６】
本発明の吸着体のために用いることができるアフィニティーリガンドに特に限定は無く、所望のアフィニティーリガンドを固定化するために活性化された多孔質担体を用いて、様々なアフィニティーリガンドを固定化することができる。固定化方法としては、例えば非特許文献３の表８・１、表８・２、図８・１５に示されるような、臭化シアン法、トリクロロトリアジン法、エポキシ法、トレシルクロリド法、過ヨウ素酸酸化法、ジビニルスルホン酸法、ベンゾキノン法、カルボニルジイミダゾール法、アシルアジド法等を用いてアミノ基含有リガンドを固定化する方法；エポキシ法、ジアゾカップリング法等を用いて水酸基含有リガンドを固定化する方法；エポキシ法、トレシルクロリド法、ジビニルスルホン酸法等を用いて、チオール基含有リガンドを固定化する方法；アミノ化担体にカルボン酸含有リガンドやホルミル基含有リガンドを固定化する方法等の様々な固定化方法を挙げることができる。
【００６７】
本発明の吸着体は、精製用吸着体として用いることが可能であるが、近年注目されている抗体医薬品精製用吸着体としても用いることが可能である。抗体医薬品精製用吸着体などに用いられる場合のアフィニティーリガンドとしては、特に限定は無いが、例えば、抗体に特異性の高い抗原やタンパク質や、プロテインＧ、プロテインＬやそれら変異体、抗体結合活性を有するペプチド等のアミノ基含有リガンドを挙げることができる。
【００６８】
特に、免疫グロブリン（特にＩｇＧ）を特異的に吸着、溶出できる吸着体として、プロテインＡをアフィニティーガンドとして多孔質担体に固定化した吸着体が注目されている。本発明に用いることができるプロテインＡには特に限定は無く、天然物、遺伝子組み換え物等を制限なく使用することができる。また、抗体結合ドメイン及びその変異体を含むもの、融合蛋白質等であってもよい。また、菌体抽出物もしくは培養上清より、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー及び膜分離技術を用いた分子量分画、分画沈殿法等の手法から選択される精製法を組合せ、および／または繰り返すことにより製造された、プロテインＡを用いることもできる。特に、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７や米国特許公報ＵＳ５１５１３５０、ＷＯ２００３／０８０６５５、特開２００６−３０４６３３、特願２００９−０７１７６６に記載されている方法で得られたプロテインＡであることが好ましい。
【００６９】
プロテインＡをアフィニティーリガンドとして多孔質粒子に導入する方法としては、前述の様々な固定化方法から選択することができるが、より好ましいのは多孔質粒子が含有するホルミル基と、プロテインＡのアミノ基との反応を利用して固定化を行う方法である。例えば、特許文献１に記載の方法がある。
【００７０】
本発明の吸着体のアフィニティーリガンドの導入量は、特に制限されないが、例えば、多孔質担体１ｍＬ当り、１ｍｇ以上、１０００ｍｇ以下とすることができる。当該割合が１ｍｇ以上であれば、精製目的物に対する吸着量が大きくなるため好ましく、１０００ｍｇ以下であれば、製造コストを抑制できるため好ましい。アフィニティーリガンドの導入量としては、多孔質担体１ｍＬ当り、２ｍｇ以上がより好ましく、４ｍｇ以上がさらに好ましく、５ｍｇ以上が特に好ましく、また、５００ｍｇ以下がより好ましく、２５０ｍｇ以下がさらに好ましく、２００ｍｇ以下が特に好ましく、１００ｍｇ以下が最も好ましい。
【００７１】
以下に、多孔質粒子を吸着体のための多孔質担体として利用する場合の好ましい物性について説明する。
【００７２】
多孔質粒子を吸着体のために用いる場合、その細孔径が重要な要素の一つとなる。例えば、目的吸着物質よりも細孔径が小さいと、吸着体担体の表面でしか吸着することができず、吸着量が低いおそれがある。また、細孔径が大き過ぎると比表面積が小さくなり、吸着量が低くなるおそれがある。このため、目的吸着物質に適した細孔径を持つ多孔質担体が好ましい。
【００７３】
多孔質粒子の細孔径に関する物性の一つにＫavがある。Ｋavとはゲル相分配係数をいい、所定の大きさの分子に対する溶出または保持容量ＶR（Ｖeとも表される）、空隙容量Ｖoおよびカラムの幾何容量Ｖcから次式で算出される、カラムとは独立した変数である。
【００７４】
Ｋav＝（ＶR−Ｖ0）／（Ｖt−Ｖ0）
（例えば、“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｃａｌｅ−Ｕｐ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ”（１９９７）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ．Ｇａｉｌ  Ｓｏｆｅｒ  ＆  Ｌａｒｓ  Ｈａｇｅｌ  ｅｄｓ．ＩＳＢＮ０−１２−６５４２６６−Ｘ，ｐ．３６８参照）
細孔径の正確な値などではなく、Ｋav値を用いる理由は、カラムクロマトグラフィーのため多孔質粒子を溶媒に分散してゲルのような湿潤状態とした場合、細孔径を正確に測定するのが困難であり、また、乾燥状態で測定された推定細孔径が湿潤状態の細孔径を正確には反映しないためである。
【００７５】
縦軸にＫav、横軸に分子量の対数をプロットした際に、目的吸着物質の分子量以上の分子量領域での直線の傾きが−０．１以下である多孔質担体にアフィニティーリガンドを固定化することで、吸着量の向上が可能である。即ち、目的吸着物質の分子量以上の分子量領域において式（Ｉ）が成り立つとき、ｋ≦−０．１である多孔質担体にアフィニティーリガンドを固定化した吸着体であることが好ましい。
【００７６】
Ｋav＝ｋ・ｌｎ（ＭＷ）＋ｂ        （Ｉ）
［式中、ｋは傾きを示し、ＭＷはＫav測定時のマーカーの分子量を示し、ｂは定数を示す］
式（Ｉ）において、ｋがより小さい方が、吸着物質の分子量における比表面積は大きくなり、吸着量の向上が可能である。そのため、好ましくはｋ≦−０．１５、より好ましくはｋ≦−０．２０、さらに好ましくはｋ≦−０．３０、特に好ましくは−５．０≦ｋ≦−０．３５である。
【００７７】
また、目的吸着物質の分子量におけるＫavが０．３以上であることが好ましい。目的吸着物質の分子量におけるＫavが０．３以上であれば、吸着物質の分子量における比表面積は大きくなり、効率よく吸着することが可能である。Ｋavとしては、０．５５以上がより好ましく、０．６５以上がさらに好ましく、０．７５以上が特に好ましい。また、Ｋavが０．９４以下であることが好ましい。Ｋavが０．９４より大きいと、樹脂含量が少なくなり、吸着体の強度が下がる恐れがある。
【００７８】
多孔質担体の排除限界分子量は、目的吸着物質の分子量よりも大きいことが好ましい。しかし、細孔径が大きく、排除限界分子量が目的吸着物質の分子量より遥かに大きい場合、吸着効率が低下する。例えば、精製用吸着体として用いる場合、目的吸着物質がタンパク質であることが多く、一般的に、タンパク質の分子量は１０3以上、１０8以下程度であるため、排除限界分子量を１０3以上、１０9以下程度に設定することが好ましい。例えば、ＩｇＧを目的吸着物質とするならば排除限界分子量を１０6以上、１０8以下程度に設定するのが好ましい。
【００７９】
排除限界分子量は、従来公知の方法を用いて求めることができる。例えば、排除限界分子量はＫavが０のときの分子量であるので、上記式（Ｉ）のＫavに０を代入した下記式（ＩＩ）により求めることができる。
【００８０】
排除限界分子量＝ｅｘｐ（−ｂ／ｋ）        （ＩＩ）
Ｋavや排除限界分子量など細孔径に関する物性を正確に測定するためには、吸着体に吸着しない化合物を用いて測定するのが好ましく、リガンドを固定化する前の多孔質粒子を用いて測定するのがより好ましい。吸着体を用いて測定する場合、目的吸着物質の分子量と同等の化合物を用いて測定したり、目的吸着物質の分子量前後の化合物を用いてそれぞれ測定し、測定して得られた２点を直線で結んで予測する等の工夫が必要となる。また、測定に用いるマーカー化合物は、目的吸着物質と類似の化合物であることが好ましい。例えば、ポリスチレンのような合成ポリマーとタンパク質とでは、同じ分子量でも測定溶液中での体積が異なる。よって、例えば、目的吸着物質が抗体の場合は、マーカー化合物としてタンパク質を用いることが好ましい。
【００８１】
イオン液体を用いれば、高濃度のセルロース溶液を調製可能であり、上記の本発明方法によれば、従来の方法では得られなかったセルロース含量の高い多孔質粒子が製造可能である。一般に、樹脂含量が高いと圧密化を生じない吸着体が得られる。本発明の吸着体の充填体積あたりのセルロース含量に特に限定は無いが、２重量％以上、５０重量％以下であることが好ましい。充填体積あたりのセルロース含量が２重量％以上であれば、大スケール、高線速で精製を行っても圧密化を生じない吸着体が得られるため好ましい。また、充填体積あたりのセルロース含量が５０重量％以下であると、精製目的物を通すことができる十分な孔を確保することができるため好ましい。また、充填体積あたりのセルロース含量としては、３重量％以上がより好ましく、４重量％以上がさらに好ましく、また、２５重量％以下がより好ましく、１５重量％以下がさらに好ましい。充填体積あたりのセルロース含量は、下記式（ＩＩＩ）に従って、以下のとおり求めることができる。即ち、多孔質粒子体積が減少しなくなるまで沈降させて充填し、多孔質粒子体積が１ｍＬとなるよう多孔質粒子量を調整する。この粒子を１０５℃で１２時間乾燥させ、充填体積当たりの乾燥重量（ｇ）から、ゲル１ｍＬ当たりの乾燥重量パーセント、つまりセルロース含量を求めることができる。
【００８２】
セルロース含量（％）＝［乾燥重量（ｇ）／充填体積（ｍＬ)］×１００  （ＩＩＩ）
本発明の吸着体としては、５％圧縮時の圧縮応力が０．００５ＭＰａ以上、１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０１ＭＰａ以上、３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０３ＭＰａ以上、５ＭＰａ以下のものが好ましい。吸着体の５％圧縮時の圧縮応力が０．００５ＭＰａ以上、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０１ＭＰａ以上、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０３ＭＰａ以上であれば、高線速で通液しても圧密化を生じない吸着体が得られやすいため好ましい。また、吸着体の５％圧縮時の圧縮応力が１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が５ＭＰａ以下であれば、脆性が改善され、微粒子発生が抑制できるため好ましい。ここで、５％圧縮時の圧縮応力とは、吸着体が圧縮されて、初期体積より体積が５％減少した時の応力、１０％圧縮時の圧縮応力とは、吸着体が圧縮されて、初期体積より体積が１０％減少した時の応力、１５％圧縮時の圧縮応力とは、吸着体が圧縮されて、初期体積より体積が１５％減少した時の応力である。初期体積とは、吸着体を含むスラリーに振動を与えながら、吸着体の体積が減少しなくなるまで沈降させて充填した状態の体積である。圧縮時の圧縮応力は、以下の方法で測定しうるものである。
【００８３】
１）  吸着体へ全体積が２倍となるように水を加えてスラリーとし、当該スラリーを内径１５ｍｍのガラス製メスシリンダーに投入する。
【００８４】
２）  ガラス製メスシリンダーに振動を与えながら、吸着体の体積が減少しなくなるまで沈降させて充填し、吸着体の体積が約４ｍＬとなるよう吸着体の量を調整する。この時の体積を初期体積とする。
【００８５】
３）  金属製ピストン（メスシリンダーの内壁と摩擦を生じず、且つ吸着体が漏れないように加工したもの）を、２０Ｎ用ロードセルを装着したオートグラフ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製，ＥＺ−ＴＥＳＴ）に取り付ける。
【００８６】
４）  吸着体の１２０ｖｏｌ％に相当する位置にピストンの底面を合わせる。
【００８７】
５）  気泡が入らないように、試験速度５ｍｍ／ｍｉｎでピストンを下降させ、多孔質担体を圧縮して体積を減少させる。
【００８８】
６）  所定の点の圧縮応力を測定する。
【００８９】
これらの物性を有する多孔質担体にアフィニティーリガンドを固定化した吸着体は、大スケールで且つ高線速で、目的吸着物質を効率良く吸着することが期待される。
【００９０】
本発明の吸着体の、目的物の吸着量は、吸着体１ｍＬあたり１ｍｇ以上であることが好ましい。目的物の吸着量が、吸着体１ｍＬあたり１ｍｇ以上であれば、効率よく精製が行えるため好ましい。また目的物の吸着量が、吸着体１ｍＬあたり１０００ｍｇ以下であれば、吸着した目的物を吸着体から溶出しやすいため好ましい。より好ましい吸着体の、目的物の吸着量は、吸着体１ｍＬあたり、５ｍｇ以上がより好ましく、１０ｍｇ以上がさらに好ましく、２０ｍｇ以上が特に好ましく、３０ｍｇ以上が最も好ましく、また、５００ｍｇ以下がより好ましく、３００ｍｇ以下がさらに好ましく、２５０ｍｇ以下が特に好ましく、２００ｍｇ以下が最も好ましい。
【００９１】
目的物の吸着量は、以下のようにして求めることができる。目的物の吸着量の求め方としては、特に限定は無いが、静的吸着量や動的吸着量によって求めることができる。例えば、静的吸着量を測定する場合は、ｐＨ７．４のリン酸バッファー（シグマ社製）で置換した吸着体０．５ｍＬに対し、７０ｍｇの目的吸着物質を３５ｍＬのｐＨ７．４のリン酸バッファー（シグマ社製）に溶解させた溶液を接触させ、２５℃で２時間攪拌した後、上清中の吸着目的物質の減少量を測定することにより求めることができる。
【００９２】
また、吸着目的物質の動的吸着量と目的物中にリークしたリガンドの濃度を求める方法の一例を以下に述べる。
【００９３】
（１）  溶液作製
Ａ液としてｐＨ７．４リン酸バッファー（シグマ社製）、Ｂ液としてｐＨ３．５の３５ｍＭ酢酸ナトリウム（和光純薬工業社製の酢酸、酢酸ナトリウム、ＲＯ水で調製）、Ｃ液として１Ｍ酢酸（和光純薬工業社製酢酸とＲＯ水で調製）、Ｄ液として１ｍｇ／ｍＬのヒトポリクローナルＩｇＧ溶液（バクスター社製ガンマガードとＡ液で調製）、Ｅ液として６Ｍ尿素、Ｆ液としてＡ液に対して０．２ｖｏｌ％の界面活性剤（和光純薬工業社製ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）を添加した液、中和液として２Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（シグマ社製トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとＲＯ水で調製）を調製し、各溶液を使用前に脱泡する。
【００９４】
（２）  充填と準備
カラムクロマトグラフィー用装置として、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、直径０．５ｃｍ、高さ１５ｃｍのカラムに２２μｍのメッシュを取り付け、本発明の吸着体をそれぞれ３ｍＬ入れ、線速４００ｃｍ／ｈで２０％エタノール水溶液（和光純薬工業社製エタノールとＲＯ水で調製）を１時間通液して充填する。フラクションコレクターに１５ｍｌの採取用チューブをセットし、溶出液の採取用チューブについては、あらかじめ中和液を入れておく。
【００９５】
（３）  洗浄
必要に応じて、Ｆ液、Ｂ液、Ａ液、Ｃ液、Ｅ液の順に、各液を線速３００ｃｍ／ｈで吸着体の３倍量を通液する。この通液サイクルを任意の回数、繰り返す。
【００９６】
（４）  ＩｇＧ精製
Ａ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ通液し、次いでＤ液をＵＶをモニターしながら、ＩｇＧが１０％破過するまで線速３００ｃｍ／ｈで通液する。次いで、Ａ液を線速３００ｃｍ／ｈで３０ｍＬ通液し、Ｂ液を線速３００ｃｍ／ｈで３０ｍＬ通液してＩｇＧを溶出させる。次にＣ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ、Ｅ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ通液する。吸着体の充填終了後からの操作をさらに２回繰り返すことにより、溶出液中のＩｇＧ量とＩｇＧ中にリークしたリガンドの濃度を求めることができる。
【００９７】
本発明の吸着体は、アフィニティークロマトグラフィーを用いたタンパク質などの各種目的物の精製や、非特許文献３に示されるような各種精製方法や、治療用吸着体や医療用着体に利用することができる。精製方法や治療方法には特に限定は無く、非特許文献１、２、３や、その他公知の方法を好適に用いる事ができる。
【００９８】
さらに、本発明の精製用吸着体を用いた精製方法は、直径０．５ｃｍ以上および高さ３ｃｍ以上のカラムを用いることが好ましい。直径が０．５ｃｍ以上および高さ３ｃｍ以上であれば、精製を効率よく行うことができる。また、精製の精度や効率の観点から、カラムの大きさは直径２０００ｃｍ以下および高さ５０００ｃｍ以下であることが好ましい。より好ましいカラムの大きさは直径２ｃｍ以上、４００ｃｍ以下、高さ５ｃｍ以上、４００ｃｍ以下であり、さらに好ましくは直径５ｃｍ以上、３００ｃｍ以下および高さ８ｃｍ以上、２００ｃｍ以下であり、特に好ましくは直径１０ｃｍ以上、２５０ｃｍ以下および高さ１２ｃｍ以上１００ｃｍ以下であり、最も好ましくは直径２０ｃｍ以上、１５０ｃｍ以下および高さ１５ｃｍ以上、５０ｃｍ以下である。
【００９９】
本発明の吸着体を用いた治療や精製は、線速１０ｃｍ／ｈ以上で通液する工程を有することが好ましい。線速１０ｃｍ／ｈ以上で通液する工程を有していれば、治療や精製を効率よく行うことができるため好ましい。また治療や精製の精度や装置の耐久性の観点から、本発明の吸着体を用いた治療や精製は、線速５０００ｃｍ／ｈ以下で行うことが好ましい。精製の線速としては、５０ｃｍ／ｈ以上がより好ましく、１００ｃｍ／ｈ以上がさらに好ましく、２００ｃｍ／ｈ以上が特に好ましく、３００ｃｍ／ｈ以上が最も好ましく、また、３０００ｃｍ／ｈ以下がより好ましく、１５００ｃｍ／ｈ以下がさらに好ましく、１０００ｃｍ／ｈ以下が特に好ましく、７５０ｃｍ／ｈ以下が最も好ましい。
【実施例】
【０１００】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【０１０１】
なお、本発明に係る吸着体を製造する際における反応仕込み時の多孔質粒子の体積は、特に記載が無い限りタッピング体積である。タッピング体積は、多孔質粒子とＲＯ水のスラリーを計量容器に投入し、振動を与えながらこれ以上体積が減少しなくなるまで沈降させた状態の体積である。また、官能基含量における多孔質粒子の体積は、特に記載が無い限り、タッピング体積である。なお、各試験において多孔質粒子が足りなくなった場合は、同じ方法で製造して追加した。【０１０２】
まず各多孔質粒子の物性の測定条件を示す。【０１０３】
試験例１  ホルミル基含量測定
ｐＨ８の０．１Ｍリン酸バッファーで置換した多孔質粒子（４ｍＬ）と、フェニルヒドラジンを溶解したｐＨ８の０．１Ｍリン酸バッファー溶液（２ｍＬ）とを接触させ、４０℃で１時間攪拌した。次いで、ＵＶ測定により反応液の上清の２７８ｎｍ付近の吸収極大の吸光度を測定し、これにより得られたフェニルヒドラジンの多孔質粒子への吸着量として、ホルミル基含量を見積もった。この時、フェニルヒドラジンの投入量は予想ホルミル基含量の３倍モルとし、フェニルヒドラジンの投入量に対して、多孔質粒子への吸着量が１５％以下、または４５％以上であった場合は、フェニルヒドラジンの投入量を見直し、再度測定を行うものとした。【０１０４】
試験例２  分配係数（Ｋav）測定
（１）  カラム充填
多孔質粒子をＲＯ水に分散させ、１時間脱気した。脱気した多孔質粒子を、線速１０５ｃｍ／ｈでカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製，Ｔｒｉｃｏｒｎ  １０／３００）に充填した。その後、ｐＨ７．５の溶出液（１２９ｍＬ）を線速２６ｃｍ／ｈでカラムに通液した。【０１０５】
（２）  マーカー添加
マーカーとして次のものを用いた。【０１０６】
・Ｂｌｕｅ  Ｄｅｘｔｒａｎ  ２０００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＦＩｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製） 
・Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製），ＭＷ３，０００，０００ 
・Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製），ＭＷ６６０，０００
・フェリチン（ＳＩＧＭＡ社製），ＭＷ４４０，０００
・Ａｌｄｏｌａｓｅ（ＳＩＧＭＡ社製），ＭＷ１５８，０００
・ＩｇＧ  ヒト由来（ＳＩＧＭＡ社製），ＭＷ１１５，０００
・Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｗａｋｏ社製），ＭＷ６，７００
・Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ（Ｗａｋｏ社製），ＭＷ１２，４００
・Ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ  （Ｗａｋｏ社製），ＭＷ１，４００
前記溶出液を線速２６ｃｍ／ｈでカラムに通液しながら、上記マーカーをｐＨ７．５のバッファーにて５ｍｇ／ｍＬに薄めたものを、各々１２μＬずつ注入した。なお、マーカーの濃度は都度微調整した。【０１０７】
（３）  測定
測定器として、ＤＧＵ−２０Ａ３、ＳＣＬ−１０Ａ、ＳＰＤ−１０Ａ、ＬＣ−１０ＡＤ、ＳＩＬ−２０ＡＣ、ＣＴＯ−１０ＡＣ（それぞれＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）を用い、測定ソフトウェアとして、ＬＣＳｏｌｕｔｉｏｎを用いた。液量測定には５０ｍＬメスシリンダーを用いた。【０１０８】
マーカー注入と同時にＵＶモニターおよび液量の測定を開始し、
１）ブルーデキストランの最初のピークに対応する液量をＶ0（ｍＬ）とした。【０１０９】
２）各マーカーのピークに対応する液量をＶR（ｍＬ）とした。【０１１０】
３）カラム内の多孔質粒子のトータルボリュームをＶt（ｍＬ）とした。【０１１１】
（４）  算出
各マーカーの分配係数（Ｋav）を次式で算出した。【０１１２】
Ｋav＝（ＶR−Ｖ0）／（Ｖt−Ｖ0）
（５）最大径
各マーカーのＫavと該分子量の対数をプロットし、直線性を示す部分から下記式の傾きと切片を求めた。【０１１３】
Ｋav＝ｋ×Ｌｎ（分子量）＋ｂ
次いで求めた傾きと切片からＫavが０の時の分子量、つまり排除限界分子量を求めた。次に中性緩衝液中の球状タンパク質の直径と分子量の下記相関式に排除限界分子量を代入し、求まった値を試料粒子の孔の最大径とした。【０１１４】
球状タンパク質の中性緩衝液中の直径（Å）＝２．５２３×分子量0.3267
（６）平均孔径
直線性を示す部分の最大Ｋav／２に相当する分子量を前記中性緩衝液中の球状タンパク質の直径と分子量の相関式に代入し、求まった値を試料粒子の孔の平均径とした。【０１１５】
なお、吸着体の目的吸着物質に対するＫavを測定する場合、目的吸着物質が吸着されてしまい、正確な測定ができなくなるおそれがある。よって、吸着体の目的吸着物質に対するＫavは、目的吸着物質と近い分子量を有する２種以上のタンパク質のＫavを測定し、それらのデータから計算で求めるものとする。例えば、目的吸着物質がＩｇＧの場合、フェリチンとアルブミンのデータからＫavを求める。【０１１６】
試験例３  平均粒子径測定
レーザ回折／散乱式粒子径分布測定装置（堀場社製ＬＡ−９５０）を用いてメジアン径を測定し、平均粒子径とした。【０１１７】
試験例４  静的結合容量測定
ｐＨ７．４のリン酸バッファー（シグマ社製）で置換した吸着体０．５ｍＬに対し、７０ｍｇのヒトポリクローナルＩｇＧ（ニチヤク社製ガンマグロブリンニチヤク１５００ｍｇ／１０ｍＬ，０．４６７ｍＬ）をｐＨ７．４のリン酸バッファー（シグマ社製）に溶解させて全量を３５ｍＬとした溶液を接触させ、２５℃で２時間撹拝した後、上清中のＩｇＧの減少量を測定することにより求めた。【０１１８】
試験例５  動的結合容量測定
（１）溶液作成
以下の溶液を調製した。【０１１９】
Ａ液：ｐＨ７．４リン酸バッファー（シグマ製）
Ｂ液：ｐＨ３．５Ｍの３５ｍＭ酢酸ナトリウム（ナカライテスク社製の酢酸、酢酸ナトリウム、ＲＯ水で調製）
Ｃ液：１Ｍ酢酸（ナカライテスク社製の酢酸とＲＯ水で調製）
Ｄ液：１ｍｇ／ｍＬのヒトポリクローナルＩｇＧ溶液（ニチヤク社製ガンマグロブリンニチヤク１５００ｍｇ／１０ｍＬとＡ液で調製）
Ｅ液：６Ｍ尿素（関東化学社製の尿素とＲＯ水で調製）
各溶液は、使用前に脱泡した。【０１２０】
（２）充填、準備
カラムクロマトグラフィー用装置として、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、直径０．５ｃｍ、高さ１５ｃｍのカラムに２２μｍのメッシュを取り付け、本発明の吸着体をそれぞれ３ｍＬ入れ、線速４５０ｃｍ／ｈで２０％エタノール水溶液（和光純薬工業社製エタノールとＲＯ水で調整）を１時間通液して充填した。フラクションコレクターに１５ｍｌの採取用チューブをセットし、溶出液の採取用チューブについては、あらかじめ中和液を入れておいた。【０１２１】
（３）ＩｇＧ精製
Ａ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ通液し、次いでＤ液を、ＵＶをモニターしながら、ＩｇＧが１０％破過するまで線速３００ｃｍ／ｈで通液した。次いで、Ａ液を線速３００ｃｍ／ｈで３０ｍＬ通液し、Ｂ液を線速３００ｃｍ／ｈで３０ｍＬ通液してＩｇＧを溶出させた。次にＣ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ，Ｅ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ通液した。【０１２２】
試験例６  圧縮応力測定
内径１５ｍｍのガラス製メスシリンダーに多孔質粒子または吸着体の５０ｖｏｌ％のスラリーを投入した。ガラス製メスシリンダーに振動を与えながら、多孔質粒子または吸着体の体積が減少しなくなるまで沈降させて充填し、多孔質粒子または吸着体の体積が４ｍＬとなるよう多孔質粒子または吸着体量を調整した。この時の体積を初期体積とした。金属製ピストン（メスシリンダーの内壁と摩擦を生じず、且つ多孔質粒子または吸着体が溶出しないように加工したもの）を、２０Ｎ用ロードセルを装着したオートグラフ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製，ＥＺ−ＴＥＳＴ）に取り付けた。多孔質粒子または吸着体の１２０ｖｏｌ％に相当する位置にピストンの底面を合わせた。気泡が入らないように、試験速度５ｍｍ／ｍｉｎでピストンを下降させ、多孔質粒子または吸着体を圧縮して体積を減少させ、任意の点の圧縮応力を測定した。【０１２３】
比較例１
１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート（シグマ・アルドリッチ社製，２０ｇ）に結晶性セルロース（２．７３ｇ）を７０℃にて溶解させ、１２．０重量％溶液を調製した。このセルロース溶液から１５ｍＬを量り取り、ホモジナイザー（ＨＳＩＡＮＧＴＡＩ社製，ＨＧ−２００）により４０００ｒｐｍの速度で攪拌されている中鎖脂肪酸トリグリセリド（ＭＣＴ）（理研ビタミン社製，アクターＭ−２，脂肪酸組成：Ｃ８が１００％，８５ｍＬ）に添加した。５分間攪拌してＭＣＴ中にセルロース溶液を分散させた。当該分散液を、３００ｒｐｍの速度で攪拌している２５℃の水へ徐々に添加し、セルロースを固化させた。静置して液相を分離させたところ、上層がＭＣＴ、下層が水と１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテートの二層溶液となった。セルロースは下層に沈降した。【０１２４】
セルロースを回収し、メタノールで洗浄した後、水で洗浄した。マイクロスコープ（キーエンス社製，デジタルマイクロスコープＶＨ−６２００）で観察したところ、粒子状のセルロースが得られていた。【０１２５】
得られた粒子の顕微鏡画像を市販の画像解析処理ソフト（Ｍｏｔｉｃ社製，ｍｏｔｉｃ  ｉｍａｇｅｓ  ｐｌｕｓ）を用いて解析し、平均アスペクト比を測定した。平均アスペクト比は、画像中における粒子の長軸と短軸を測定して各粒子のアスペクト比を算出し、さらにそれらの平均を計算することにより求めた。また、レーザ回折／散乱式粒子径分布測定装置（堀場社製ＬＡ−９５０）を用いてメジアン径を測定し、平均粒子径とした。その結果、平均粒子径は１０４．０μｍ、平均アスペクト比は１．１０と、微細で且つ真球に近いセルロース粒子が得られていることが証明された。【０１２６】
また、圧縮強度試験機（ＳＩＭＡＤＺＵ社製，ＥＺ−ＴＥＳＴ）を用い、圧縮強度を測定することで、セルロース粒子の硬度を評価した。その結果、体積が１０％圧縮されたとき０．０４２Ｍｐａの応力を示し、適度な硬度を有していることが明らかとなった。【０１２７】
さらに、得られたセルロース粒子の孔内を２−メチル−２−プロパノールで置換し、凍結乾燥後、走査型電子顕微鏡（日立製作所社製，Ｓ−８００，以下「ＳＥＭ」と称する）にて解析した。その結果、セルロース粒子は図１〜４に示したような多孔性の粒子であることが確認された。【０１２８】
また、乾燥させたセルロース粒子を粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ，ＲｉｇａｋｕＭｉｎｉＦｌｅｘＩＩ，以下同じ）により解析した。結果を図５に示す。図５のとおり、結晶性があることが確認された。【０１２９】
比較例２
セルロース濃度を１０．０重量％とする以外は比較例１と同様の条件および方法でセルロース粒子を析出させた。その結果、平均粒子径が１２１．４μｍ、平均アスペクト比１．１２のセルロース粒子が得られた。また、セルロース体積が１０％圧縮されたとき０．０１５Ｍｐａの応力を示した。得られた粒子は、比較例１と同様の多孔質粒子だった。【０１３０】
比較例３
セルロース濃度を７．０重量％とする以外は比較例１と同様の条件および方法でセルロース粒子を析出させた。その結果、平均粒子径が１０４．０μｍ、平均アスペクト比１．１０のセルロース粒子が得られた。また、セルロース体積が１０％圧縮されたとき０．００４Ｍｐａの応力を示した。得られた粒子は、比較例１と同様の多孔質粒子だった。図５に比較例１から比較例３のセルロース粒子をＸＲＤで解析した結果を示すが、いずれも結晶性が確認できるので、水より得られたセルロース粒子は結晶性をもつと判断できる。【０１３１】
実施例１
セルロース濃度を１２．０重量％、セルロース非溶解性液体をメタノール：水＝７：３の混合溶媒とした以外は比較例１と同様の条件および方法でセルロース粒子を析出させた。セルロースを析出させた後、静置したところ、下層がＭＣＴ、上層がメタノールと水と１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテートとＭＣＴの二層溶液となった。析出したセルロースは上層に沈んでいた。セルロースを回収したところ、平均粒子径９８．５μｍ、平均アスペクト比１．０７の真球状セルロース粒子であった。また、図６〜９のＳＥＭ写真のとおり、当該粒子は多孔質なものである。【０１３２】
実施例２
セルロース濃度を１２．０重量％、セルロース非溶解性液体をメタノール：水＝９：１の混合溶媒とした以外は比較例１と同様の条件および方法でセルロース粒子を析出させた。セルロースを析出させた後、静置したところ、下層がＭＣＴ、上層がメタノールと水と１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテートとＭＣＴの二層液体となった。析出したセルロースは上層に沈んでいた。セルロースを回収したところ、平均粒子径９７．３μｍ、平均アスペクト比１．０７の真球状セルロース粒子であった。また、図１０〜１３のＳＥＭ写真のとおり、当該粒子は多孔質なものである。【０１３３】
実施例３
セルロース非溶解性液体をメタノールとした以外は比較例１と同様の条件および方法でセルロース粒子を析出させた。メタノールにセルロース液滴分散液を添加し、セルロースを析出させた後、静置したところ、下層がＭＣＴ、上層がメタノールと１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテートとＭＣＴの二層溶液となった。析出したセルロースは上層に沈んでいた。セルロースを回収したところ、平均粒子径６０．４μｍ、平均アスペクト比１．０７の真球状セルロース粒子であった。【０１３４】
セルロース体積が１０％圧縮されたとき０．０５３Ｍｐａの応力を示した。【０１３５】
また、図１４〜１７のＳＥＭ写真のとおり、当該粒子は多孔質なものである。【０１３６】
凍結乾燥後、ＸＲＤで解析したところ、得られたセルロース粒子はアモルファスであった。図１８に比較例１および実施例１から実施例３のセルロース粒子をＸＲＤで解析した結果を示すが、凝固液として水を用いた比較例１のセルロース粒子以外はアモルファスであると判断できる。【０１３７】
使用溶媒を回収し、エバポレーターでメタノールを蒸発させたところ、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテートとＭＣＴが分離した。ＭＣＴを取り除き、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテートの体積と重量を測定した結果、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテートの濃度は９８％と判断できた。このように高純度のイオン液体は、十分に再利用することができる。【０１３８】
実施例４
セルロース濃度を１０．０重量％とする以外は実施例３と同様の条件および方法でセルロースを析出させた。その結果、平均粒子径５４．２３μｍ、平均アスペクト比１．０７の真球状セルロース粒子が得られた。セルロース体積が１０％圧縮されたとき０．０２７Ｍｐａの応力を示した。【０１３９】
実施例５
セルロース濃度を７．０重量％とする以外は実施例３と同様の条件および方法でセルロースを析出させた。その結果、平均粒子径６０．３６μｍ、平均アスペクト比１．０７の真球状セルロース粒子が得られた。図１９に実施例３から実施例５のセルロース粒子をＸＲＤで解析した結果を示すが、いずれもアモルファスのセルロース粒子であった。【０１４０】
実施例６
セルロース濃度を１２．０重量％とし、セルロース非溶解性液体をエタノールとした以外は比較例１と同様の条件および方法でセルロース粒子を析出させた。その結果、平均粒子径８７．４４μｍ、平均アスペクト比１．０７の真球状セルロース粒子が得られた。なお、エタノールを用いた場合は、水やメタノールを用いた場合とは異なり、溶液は二層に分離しなかった。【０１４１】
セルロース体積が１０％圧縮されたとき０．０２６Ｍｐａ  の応力を示した。【０１４２】
凍結乾燥後、ＸＲＤで解析したところ、得られたセルロース粒子はアモルファスであった。図５と図１９より、セルロース粒子の結晶性はセルロース溶液濃度によらず、セルロース非溶解性液体にアルコール類を用いた場合はアモルファスとなり、水を用いた場合は結晶性を示すことが分かった。また、セルロース粒子の結晶性はセルロース非溶解性液体の種類により制御可能であった。【０１４３】
実施例７
１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート（５２．１８ｇ）に結晶性セルロース（５．８０ｇ）を７０℃にて溶解させ、１０．０重量％溶液を調製した。このセルロース溶液から５０ｍＬを量り取り、内径１１３ｍｍの円筒型容器中、翼径７０ｍｍのＨ型翼にて１００ｒｐｍの速度で攪拌されている９５０ｍＬのＭＣＴに添加し、分散させた。分散液の溶液温度を４０℃とし、１Ｌ／ｍｉｎの速度で静止型ミキサー（フジキン社製，分散君１．５Ａ）を通し、セルロース非溶解性液体であるメタノール：水＝９：１の混合溶媒に添加し、セルロースを析出させた。メタノール：水＝９：１の混合溶媒は、内径１４３．５ｍｍの円筒型容器中、翼径６４．２ｍｍのフラットタービン翼にて３００ｒｐｍの速度で攪拌し、溶液量は２０００ｍＬ、溶液温度は２５℃とした。セルロースを回収し、メタノールで洗浄した後、水で洗浄した。比較例１と同様にマイクロスコープで観察したところ、平均粒子径８６．３μｍ、平均アスペクト比１．０７のセルロース粒子が得られていた。また、図２０〜２１のＳＥＭ写真のとおり、当該粒子は多孔質なものである。【０１４４】
実施例８
１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート（シグマ・アルドリッチ社）２０ｇにメタノール：水＝７：３の混合溶液を２．２２ｇ加えた溶液に、結晶性セルロースを２．７３ｇ溶解した。当該溶液のセルロース濃度は、１０．９重量％である。このセルロース溶液から１５ｍＬを量り取り、４００ｒｐｍの速度で攪拌されている５０℃の中鎖脂肪酸トリグリセリド（ＭＣＴ）（製品名：アクターＭ−２、理研ビタミン（株）、脂肪酸組成はＣ８が１００％）８５ｍＬに添加した。３０分間攪拌し、ＭＣＴ中にセルロース溶液を分散させた後、３００ｒｐｍで攪拌している５０℃のメタノール：水＝７：３の混合溶媒４００ｍＬにセルロース液滴分散液を添加し、セルロースを固化させた。【０１４５】
３０分攪拌した後セルロースを回収し、セルロース粒子をエタノールで洗浄した後、水で洗浄した。次いで１２５μｍのメッシュを用いて分級を行い、大きい粒子径のものを除去した。次いで５３μｍのメッシュを用いて分級を行い、小さい粒子径のものを除去した。得られた回収したセルロース粒子の一部を２−メチル−２−プロパノールで置換し、凍結乾燥後、走査型電子顕微鏡（日立製作所Ｓ−４８００、以下ＳＥＭと称する）にて解析した。その結果、セルロース粒子は図２２に示したような多孔質の粒子であることが確認された。【０１４６】
取得したセルロース多孔質粒子の細孔径を上述のＫav測定法にて求めた結果、本セルロース多孔質粒子の最大細孔径は７２５Å、平均径は２７１Åであった。また傾きｋは−０．１５３であった。ＩｇＧを用いて測定したＫavは０．８６であった。また、排除限界分子量は３．５×１０7であった。乾燥させたセルロース粒子を粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ、ＲｉｇａｋｕＭｉｎｉＦｌｅｘＩＩ、以下同じ）により解析したところ、アモルファスのパターンを示した。平均粒子径は９４μｍであった。【０１４７】
実施例９
ＭＣＴ温度を２５℃、メタノール：水＝７：３の混合溶媒の温度を２５℃とする以外は実施例８と同様の条件でセルロース粒子を得た。ＳＥＭにて解析した結果、得られたセルロース粒子は図２３に示したような多孔性の粒子であることが確認された。取得したセルロース多孔質粒子の細孔径を上述のＫav測定法にて求めた結果、本セルロース多孔質粒子の最大細孔径は３５０Å、平均径は１９４Åであった。また傾きｋは−０．２６６であった。ＩｇＧを用いて測定したＫavは０．９３であった。また、排除限界分子量は３．８×１０6であった。平均粒子径は８８μｍであった。【０１４８】
実施例１０
ＭＣＴ温度を１０℃、メタノール：水＝７：３の混合溶媒の温度を１０℃とする以外は実施例８と同様の条件でセルロース粒子を得た。ＳＥＭにて解析した結果、得られたセルロース粒子は図２４に示したような多孔性の粒子であることが確認された。平均粒子径は８３μｍであった。図２５に実施例８〜１０のセルロース粒子をＸＲＤで解析した結果を示すが、いずれもアモルファスのセルロース粒子であった。【０１４９】
実施例１１
１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート（シグマ・アルドリッチ社）２０ｇにメタノール：水＝６：４の混合溶液を２．２２ｇ加えたことと、セルロース液滴分散液をメタノール：水＝６：４のセルロース非溶解性液体４００ｍＬに添加した以外は実施例９と同様の条件でセルロース粒子を得た。ＳＥＭにて解析した結果、得られたセルロース粒子は実施例９と同様の多孔性の粒子であることが確認された。取得したセルロース多孔質粒子の細孔径を上述のＫav測定法にて求めた結果、本セルロース多孔質粒子の最大細孔径は３６２Å、平均径は２０１Åであった。また傾きｋは−０．２２２であった。ＩｇＧを用いて測定したＫavは０．８０であった。また、排除限界分子量は４．２×１０6であった。ＸＲＤで解析したところ、得られたセルロース粒子はアモルファスであった。平均粒子径は９０μｍであった。【０１５０】
実施例１２
１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート（シグマ・アルドリッチ社）２０ｇにメタノール：水＝９：１の混合溶液を２．２２ｇ加えたことと、セルロース液滴分散液をメタノール：水＝９：１のセルロース非溶解性液体４００ｍＬに添加した以外は実施例９と同様の条件でセルロース粒子を得た。ＳＥＭにて解析した結果、得られたセルロース粒子は実施例９と同様の多孔性の粒子であることが確認された。取得したセルロース多孔質粒子の細孔径を上述のＫav測定法にて求めた結果、本セルロース多孔質粒子の最大細孔径は２６１Å、平均径は１８４Åと求められた。また傾きｋは−０．３８０であった。ＩｇＧを用いて測定したＫavは０．８６であった。また、排除限界分子量は１．５×１０6であった。ＸＲＤで解析したところ、得られたセルロース粒子はアモルファスであった。平均粒子径は９０μｍであった。【０１５１】
実施例１３
１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート（シグマ・アルドリッチ社）２０ｇにメタノール：水＝７：３の混合溶液を２．２２ｇ加えた溶液に、結晶性セルロースを１．９３ｇ溶解させ、セルロース濃度を８．０重量％とした以外は実施例９と同様の条件でセルロース粒子を得た。ＳＥＭにて解析した結果、得られたセルロース粒子は実施例８と同様の多孔性の粒子であることが確認された。取得したセルロース多孔質粒子の細孔径を上述のＫav測定法にて求めた結果、本セルロース多孔質粒子の最大細孔径は１０２０Å、平均径は３０６Åと求められた。また傾きｋは−０．１１７であった。ＩｇＧを用いて測定したＫavは０．７９であった。また、排除限界分子量は１．０×１０8であった。ＸＲＤで解析したところ、得られたセルロース粒子はアモルファスであった。平均粒子径は９４μｍであった。【０１５２】
実施例１４
１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート１８．０ｇに結晶性セルロースを２．００ｇ溶解させ、セルロース濃度を１０．０重量％とした。このセルロース溶液から１５ｍＬを量り取り、４００ｒｐｍの速度で攪拌されている２５℃のＭＣＴ８５ｍＬに添加した。３０分間攪拌し、ＭＣＴ中にセルロース溶液を分散させた後、３００ｒｐｍで攪拌している２５℃のメタノール：水＝７：３の混合溶媒４００ｍＬにセルロース液滴分散液を添加し、セルロースを固化させた。【０１５３】
３０分攪拌した後セルロースを回収し、セルロース粒子をエタノールで洗浄した後、水で洗浄した。【０１５４】
取得したセルロース多孔質粒子の細孔径を上述のＫav測定法にて求めた結果、本セルロース多孔質粒子の最大細孔径は１３４０Å、平均径は３５３Åであった。また、傾きｋは−０．１０２であった。ＩｇＧを用いて測定したＫavは０．７８であった。また、排除限界分子量は２．３×１０8であった。【０１５５】
実施例１５  架橋多孔質粒子の製造
実施例８にて得られたセルロース多孔質粒子から、目開き１２５μｍの篩を用いて粗大多孔質粒子を除去し、次いで、目開き５３μｍの篩を用いて過小多孔質粒子を除去した。かかる分級操作後の１１．０ｍＬのセルロース多孔質粒子ＡにＲＯ水を加えて、１６．５ｍＬとし、これを５０ｍＬの遠沈管に移した。ここに４ＮＮａＯＨ（ナカライテスク社製とＲＯ水で調製）を３．８６ｍＬ加え、ハイブリダイゼーションオーブン（東京理化学機器製  ＭＨＳ−２０００）中にて、４０度に昇温させた。ここに架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテルを含有するデナコールＥＸ−３１４（ナガセケムテック社製）を１．７７ｇ投入し、４０℃で４時間攪拌した。反応終了後、グラスフィルター（シバタ製  １１ＧＰ１００）上で吸引濾過しながら、多孔性粒子の２０倍体積量以上のＲＯ水で洗浄し、架橋多孔質粒子を得た。【０１５６】
得られた架橋多孔質粒子にＲＯ水を加えて、全量を架橋多孔質粒子の１０倍体積量とし、アルミ箔２枚で封をして、オートクレーブ（トミー社製、高圧滅菌器ＥＳ−３１５）を用いて、１２０℃で１時間加温した。室温まで放冷した後、グラスフィルター（シバタ製  １１ＧＰ１００）上で多孔質粒子の５倍体積量以上のＲＯ水で洗浄し、エポキシ基がグリセリル基に変化したオートクレーブ済みの多孔質粒子Ｂを得た。【０１５７】
次いで、このオートクレーブ済みの多孔質粒子Ｂ（１０ｍＬ）にＲＯ水を加えて１６．５ｍＬとし、これを５０ｍＬの遠沈管に移した。これに４Ｎ−ＮａＯＨ（ナカライテスク社製とＲＯ水で調製）を３．８６ｍＬ加え、ハイブリダイゼーションオーブン（東京理化学機器製  ＭＨＳ−２０００）中で４０℃に昇温させた。ここにデナコールＥＸ−３１４（ナガセケムテック社製）を１．７７ｇ投入し４０度で４時間攪拌した。反応終了後、グラスフィルター（シバタ製  １１ＧＰ１００）上で吸引濾過しながら、多孔質粒子の２０倍体積量以上のＲＯ水で洗浄し、架橋多孔質粒子を得た。【０１５８】
得られた架橋多孔質粒子にＲＯ水を加えて、全量を架橋多孔質粒子の１０倍体積量とし、ガラス製三角フラスコ（３００ｍＬ）に入れ、アルミ箔２枚で封をして、オートクレーブ（トミー社製、高圧滅菌器ＥＳ−３１５）を用いて１２０℃で６０分間加温した。室温まで放冷した後、グラスフィルター（シバタ製  １１ＧＰ１００）上で多孔質粒子の５倍体積量以上のＲＯ水で洗浄し、オートクレーブ済みの多孔質粒子Ｃを得た。【０１５９】
さらに、このオートクレーブ済みの多孔質粒子Ｃ（１０．５ｍＬ）にＲＯ水を加えて１５．８ｍＬとし、これを５０ｍＬの遠沈管に移した。これに４Ｎ−ＮａＯＨ（ナカライテスク社製とＲＯ水で調製）を２．６８ｍＬ加え、ハイブリダイゼーションオーブン（東京理化学機器製  ＭＨＳ−２０００）中で４０℃に昇温させた。ここにデナコールＥＸ−３１４（ナガセケムテック社製）を１．６９ｇ投入し４０℃で４時間攪拌した。反応終了後、グラスフィルター（シバタ製  １１ＧＰ１００）上で吸引濾過しながら、多孔質粒子の２０倍体積量以上のＲＯ水で洗浄し、架橋多孔質粒子を得た。【０１６０】
得られた架橋多孔質粒子にＲＯ水を加えて、全量を架橋多孔質粒子の１０倍体積量とし、ガラス製三角フラスコ（３００ｍＬ）に入れ、アルミ箔２枚で封をして、オートクレーブ（トミー社製、高圧滅菌器ＥＳ−３１５）を用いて１２０℃で６０分間加温した。室温まで放冷した後、グラスフィルター（シバタ製  １１ＧＰ１００）上で多孔質粒子の５倍体積量以上のＲＯ水で洗浄し、架橋多孔質粒子Ｄを得た。【０１６１】
実施例１６  吸着体の製造
実施例１５にて得られた架橋多孔質粒子Ｄ、１１．０ｍＬに、ＲＯ水を加えて全量を１７．０ｍＬとし、５０ｍＬの遠沈管に入れ、これを２５℃にてミックスローター（アズワン社製  ミックスローターＭＲ−３）上に取り付けた後、攪拌した。次に、過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業社製）をＲＯ水に溶解させた、８．６４ｍｇ／ｍＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を６．０ｍＬ作成し、先程多孔質粒子Ｄを入れた遠沈管に加え、２５度で１時間攪拌した。反応後、グラスフィルター（シバタ製  １１ＧＰ１００）上で、濾液の電気伝導度が１μＳ／ｃｍ以下となるまでＲＯ水で洗浄し、ホルミル基架橋多孔質担体Ｅを得た。洗浄濾液の電気伝導度は、導電率計（ＥＵＴＥＣＨ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製、ＥＣＴｅｓｔｅｒ１０  Ｐｕｒｅ＋）で測定した。得られた多孔質粒子Ｅのホルミル基含量を前述の方法で測定した結果、ホルミル基含量は多孔質粒子Ｅ１ｍＬあたり２０．１７μｍｏｌであった。【０１６２】
得られたホルミル基架橋多孔質担体Ｅ（９．０ｍＬ）をグラスフィルター（シバタ製  １１ＧＰ１００）でｐＨ１１の０．５Ｍクエン酸三ナトリウム（関東化学社製）＋０．１５Ｍ食塩（関東化学社製）バッファー３０ｍＬで置換した。ｐＨ８の０．５Ｍクエン酸ナトリウム＋０．１５Ｍ食塩バッファーを用い、置換後のホルミル基含有多孔質担体を、遠沈管に入れ、総体積量１４．０ｍＬとなるように液量を調整した。ここに、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７に記載の方法で作製されたプロテインＡの濃度が、６７．５８ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ含有溶液（カネカ社製ＰＮＸＬ３０）を５．３２７ｇ加えた後、６℃にて、０．０８ＮＮａＯＨ（ナカライテスク社製とＲＯ水で調製）を用いて、ｐＨを１２に調整した後、６度にて２３時間、ミックスローター（アズワン社製  ミックスローターＭＲ−３）を用い、攪拌させながら反応させた。【０１６３】
２３時間反応後、反応液のｐＨが５．０になるように２．４Ｎクエン酸（関東化学社製クエン酸とＲＯ水で調製）を用いてｐＨ調整した後、６℃で４時間、ミックスローター（アズワン社製  ミックスローターＭＲ−３）を用いて、攪拌させた。引き続き、５．５％ジメチルアミンボラン（ＤＭＡＢ）水溶液（キシダ化学社製ジメチルアミンボランとＲＯ水で調整）を０．３９ｍＬ加えて、６℃で１時間攪拌した後、反応温度を２５℃に上昇させ、２５℃で１８時間、ミックスローター（アズワン社製  ミックスローターＭＲ−３）を用いて攪拌しながら反応させた。反応後、反応液の２７８ｎｍ付近の吸収極大のＵＶ吸光度を測定した結果、アフィニティーリガンドであるプロテインＡの導入量が、多孔質担体１ｍＬあたり、２８．９３ｍｇであることがわかった。【０１６４】
反応後の多孔質担体をグラスフィルター（シバタ製  １１ＧＰ１００）上で、多孔質担体の３倍体積量のＲＯ水で洗浄した。次いで、３倍体積量の０．１Ｎクエン酸一水和物（関東化学社製クエン酸一水和物とＲＯ水で調製）を加え、当該多孔質担体に０．１Ｎクエン酸一水和物を加えて全量を３０ｍＬ以上とし、遠沈管に入れ、２５℃で３０分間攪拌しながら、酸洗浄を行った。【０１６５】
酸洗浄後、多孔質担体をグラスフィルター（シバタ製１１ＧＰ１００）上で、多孔質担体の３倍体積量のＲＯ水で洗浄し、次いで、３倍体積量の０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（ナカライテスク製水酸化ナトリウム、関東化学社製硫酸ナトリウム及びＲＯ水で調製）を加えた。次に、当該多孔質担体に、０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液を加えて全量を３０ｍＬ以上とし、遠沈管に入れ、室温で３０分間攪拌しながら、アルカリ洗浄を行った。【０１６６】
アルカリ洗浄後、多孔質担体をグラスフィルター（シバタ製  １１ＧＰ１００）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。次に、多孔質担体の３倍量の０．１Ｎクエン酸一水和物（関東化学社製クエン酸＋ＲＯ水で調製）を加え、濾液が中性になっていることを確認した後、ＲＯ水を用いて、洗浄濾液の電導度が１μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄し、目的とするプロテインＡを固定化した吸着体Ｆを得た。洗浄濾液の電導度は導電率計（ＥＵＴＥＣＨ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製、ＥＣＴｅｓｔｅｒ１０  Ｐｕｒｅ＋）で測定した。【０１６７】
得られた吸着体の目的物としてヒトポリクローナルＩｇＧ（ニチヤク製、ガンマグロブリンニチヤク１５００ｍｇ／１０ｍＬ）を選択し、静的結合容量を測定した結果、８３．９ｍｇ／ｍＬ吸着体であった。また動的結合容量を求めた結果、線速３００ｃｍ／ｈでのＩｇＧ吸着容量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、２９．８ｍｇ／ｍＬ吸着体であった。また線速１５０ｃｍ／ｈでのＩｇＧ吸着容量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、３６．０ｍｇ／ｍＬ吸着体であった。【０１６８】
実施例１７  吸着体の製造
実施例９にて得られたセルロース多孔性粒子を用いた以外は、実施例１５〜１６に記載された方法と同様の方法にて、プロテインＡを固定化した吸着体を得た。得られた吸着体の静的結合容量を測定した結果、８５．９ｍｇ／ｍＬ吸着体であった。また、動的吸着量を求めた結果、線速３００ｃｍ／ｈでのＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、６．９ｍｇ／ｍＬ吸着体であった。【０１６９】
実施例１８
実施例１０にて得られたセルロース多孔性粒子を用いた以外は、実施例１５〜１６に記載された方法と同様の方法にて、プロテインＡを固定化した吸着体を得た。得られた吸着体の静的結合容量を測定した結果、４９．３ｍｇ／ｍＬ吸着体であった。また、動的吸着量を求めた結果、線速３００ｃｍ／ｈでのＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、１．６ｍｇ／ｍＬ吸着体であった。【０１７０】
実施例１９
実施例１１にて得られたセルロース多孔性粒子を用いた以外は、実施例１５〜１６に記載された方法と同様の方法にて、プロテインＡを固定化した吸着体を得た。得られた吸着体の静的結合容量を測定した結果、７９．３ｍｇ／ｍＬ吸着体であった。また、動的吸着量を求めた結果、線速３００ｃｍ／ｈでのＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、９．３ｍｇ／ｍＬ吸着体であった。【０１７１】
実施例２０
実施例１２にて得られたセルロース多孔性粒子を用い、実施例１５〜１６に記載された方法と同様の方法にて、プロテインＡを固定化した吸着体を得た。得られた吸着体の静的結合容量を測定した結果、５８．９ｍｇ／ｍＬ吸着体であった。また、動的吸着量を求めた結果、線速３００ｃｍ／ｈでのＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、１．６ｍｇ／ｍＬ吸着体であった。【０１７２】
実施例２１
実施例１３にて得られたセルロース多孔性粒子を用い、実施例１５〜１６に記載された方法と同様の方法にて、プロテインＡを固定化した吸着体を得た。得られた吸着体の静的結合容量を測定した結果、８３．９ｍｇ／ｍＬ吸着体であった。また、動的吸着量を求めた結果、線速３００ｃｍ／ｈでのＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、１２．８ｍｇ／ｍＬであった。
【図１】
2012033223.tif 000003
【図２】
2012033223.tif 000004
【図３】
2012033223.tif 000005
【図４】
2012033223.tif 000006
【図５】
2012033223.tif 000007
【図６】
2012033223.tif 000008
【図７】
2012033223.tif 000009
【図８】
2012033223.tif 000010
【図９】
2012033223.tif 000011
【図１０】
2012033223.tif 000012
【図１１】
2012033223.tif 000013
【図１２】
2012033223.tif 000014
【図１３】
2012033223.tif 000015
【図１４】
2012033223.tif 000016
【図１５】
2012033223.tif 000017
【図１６】
2012033223.tif 000018
【図１７】
2012033223.tif 000019
【図１８】
2012033223.tif 000020
【図１９】
2012033223.tif 000021
【図２０】
2012033223.tif 000022
【図２１】
2012033223.tif 000023
【図２２】
2012033223.tif 000024
【図２３】
2012033223.tif 000025
【図２４】
2012033223.tif 000026
【図２５】
2012033223.tif 000027
【国際調査報告】
2012033223.tif 000028
2012033223.tif 000029
2012033223.tif 000030
2012033223.tif 000031