(57)【要約】【課題】多能性幹細胞を用いて褐色脂肪細胞を製造する方法と、その中間産物である細胞凝集物を製造する方法、並びに、その方法によって製造される多能性幹細胞由来細胞凝集物及び多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞、また、多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞を用いた細胞療法と提供すること。【解決手段】多能性幹細胞を用いて褐色脂肪細胞を製造する方法であって、工程(A)を含む方法により、多能性幹細胞から細胞凝集物を形成し、工程(B)を含む方法により、細胞凝集物から褐色脂肪細胞を得ることを特徴とする。(A)多能性幹細胞を、無血清環境において、造血性サイトカインの存在下で非接着培養を行い、細胞凝集物を作製する工程(B)細胞凝集物を、造血性サイトカインの存在下で接着培養して、褐色脂肪細胞を作製する工程【選択図】図8
2012147853.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を用いて褐色脂肪細胞を製造する方法であって、
工程(A)を含む方法により、多能性幹細胞から細胞凝集物を形成し、工程(B)を含む方法により、細胞凝集物から褐色脂肪細胞を得る
ことを特徴とする多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞の製造方法。
(A)多能性幹細胞を、無血清環境において、造血性サイトカインの存在下で非接着培養を行い、細胞凝集物を作製する工程
(B)細胞凝集物を、造血性サイトカインの存在下で接着培養して、褐色脂肪細胞を作製する工程
【請求項２】
多能性幹細胞を用いて細胞凝集物を製造する方法であって、
工程(A)を含む方法により、多能性幹細胞から細胞凝集物を得る
ことを特徴とする多能性幹細胞由来細胞凝集物の製造方法。
(A)多能性幹細胞を、無血清環境において、造血性サイトカインの存在下で非接着培養を行い、細胞凝集物を作製する工程
【請求項３】
多能性幹細胞由来細胞凝集物を用いて褐色脂肪細胞を製造する方法であって、
工程(B)を含む方法により、多能性幹細胞由来細胞凝集物から褐色脂肪細胞を得る
ことを特徴とする多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞の製造方法。
(B)細胞凝集物を、造血性サイトカインの存在下で接着培養して、褐色脂肪細胞を作製する工程
【請求項４】
工程(A)で用いる造血性サイトカインが、
BMP4、VEGF、SCF、Flt3L、IL6、IGF2のいずれかである
請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
工程(B)で用いる造血性サイトカインが、
BMP7、VEGF、SCF、Flt3L、IL6、IGF2のいずれかである
請求項１または３に記載の方法。
【請求項６】
多能性幹細胞にES細胞またはiPS細胞を用いる
請求項１ないし５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
iPS細胞にセンダイウイルスベクターにより樹立されたiPS細胞を用いる
請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
多能性幹細胞にヒト多能性幹細胞を用いる
請求項１ないし７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
多能性幹細胞を用いて製造される褐色脂肪細胞であって、
工程(A)、(B)を含む方法により得られる
ことを特徴とする多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞。
(A)多能性幹細胞を、無血清環境において、造血性サイトカインの存在下で非接着培養を行い、細胞凝集物を作製する工程
(B)細胞凝集物を、造血性サイトカインの存在下で接着培養して、褐色脂肪細胞を作製する工程
【請求項１０】
多能性幹細胞を用いて製造される細胞凝集物であって、
工程(A)を含む方法により、多能性幹細胞から得られる
ことを特徴とする多能性幹細胞由来細胞凝集物。
(A)多能性幹細胞を、無血清環境において、造血性サイトカインの存在下で非接着培養を行い、細胞凝集物を作製する工程
【請求項１１】
多能性幹細胞由来細胞凝集物を用いて製造される褐色脂肪細胞であって、
工程(B)を含む方法により、細胞凝集物から得られる
ことを特徴とする多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞。
(B)細胞凝集物を、造血性サイトカインの存在下で接着培養して、褐色脂肪細胞を作製する工程
【請求項１２】
多能性幹細胞を用いて製造される褐色脂肪細胞であって、
少なくとも遺伝子UCP1、PRDM16、PGC1α、Cyt-c、CIDE-A、ELOVL3、PPARα、EVA1、NTRK3の遺伝子発現が誘導されていると共に、多胞性脂肪滴を有する
ことを特徴とする多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞。
【請求項１３】
多能性幹細胞がES細胞またはiPS細胞である
請求項９ないし１２のいずれかに記載の多能性幹細胞由来細胞凝集物または多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞。
【請求項１４】
多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である
請求項９ないし１３のいずれかに記載の多能性幹細胞由来細胞凝集物または多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞。
【請求項１５】
肥満の予防または治療のための細胞療法であって、
請求項９、１１ないし１４のいずれかに記載の多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞を移植することを特徴とする細胞療法。
【請求項１６】
インスリン抵抗性の改善、または、糖尿病の予防または治療のための細胞療法であって、
請求項９、１１ないし１４のいずれかに記載の多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞を移植することを特徴とする細胞療法。
【請求項１７】
高脂血症の予防または治療のための細胞療法であって、
請求項９、１１ないし１４のいずれかに記載の多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞を移植することを特徴とする細胞療法。
【請求項１８】
冠動脈のバイパス血行路を作製する手術のための細胞療法であって、
請求項９、１１ないし１４のいずれかに記載の多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞を移植することを特徴とする細胞療法。
【請求項１９】
造血を促進させるための細胞療法であって、
請求項９、１１ないし１４のいずれかに記載の多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞を移植することを特徴とする細胞療法。
【請求項２０】
肥満の予防または治療、インスリン抵抗性の改善、糖尿病の予防または治療、高脂血症の予防または治療、造血を促進させるための治療、冠動脈のバイパス血行路を作製する手術のいずれかと併用する内科療法であって、
請求項９、１１ないし１４のいずれかに記載の多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞が分泌する物質を投与することを特徴とする内科療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞を用いて褐色脂肪細胞を製造する方法と、その中間産物である細胞凝集物を製造する方法、並びに、その方法によって製造される多能性幹細胞由来細胞凝集物及び多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞、また、多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞を用いた細胞療法、内科療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、肥満者の数は世界的に増加の一途をたどっている。「肥満」はあらゆる生活習慣病の根源と言っても過言ではなく、肥満が関係する諸疾患（糖尿病、高脂血症や高血圧に基づく動脈硬化症、及びそれに起因する虚血性心疾患や脳血管障害等）は、日本を含む先進諸国における死因の上位を占める。特に日本人に関しては、欧米人に比べると肥満の程度が低くても糖尿病を発症しやすいことから、肥満対策はより緊急性を帯びている。また中国、ブラジル、インド、ロシアなどの新興国では、肥満者の増加率は更に著しいため大きな社会問題となっている。【０００３】
肥満治療の基本は、食餌療法及び運動療法に基づく生活習慣の改善にあるのは言うまでもないが、肥満者がやせるのは容易なことではない。食餌療法を遵守できない肥満患者は決して稀ではない。また肥満に伴う諸疾患（変形性関節症、糖尿病性壊疽、心不全等）により運動療法の実施が困難な症例も少なくない。
一方で、「やせの大食い」の言葉にあるように、肥満の原因としては摂食過剰や運動不足以外の「重要な因子」があることは古くから指摘されてきた。【０００４】
従来の肥満研究においては、白色脂肪組織（WAT）が主たる研究対象であった。
しかし最近になって、核医学的検査（PET/CT）のデータを解析した際に、偶然にも、それまで齧歯類にしかないと思われていた褐色脂肪組織（BAT）がヒトにも存在することが明らかとなった（非特許文献１）。同様の報告は相次いで提示され、BAT量と肥満・メタボリックシンドロームの発症と逆相関があることも報告されている。そして現在では、肥満の病態を考える上でBATは極めて重要な組織と認識されるに至っている。【０００５】
BATとWATは発生的にも非常に異なっている。BATは胎児期に既に形成されているが、WATは主として出生後に発達する。また、ヒトを含む大型ほ乳類では、生後2日以内にBATの大半が消失（生理的消失）することが知られているが、この機序は全く不明である。また、残存するBATも加齢により漸減するが、この機序も不明である。
このように、BATを正しく理解するためには、生後に見られる生理的消失や、加齢に伴う消失の機序をも解明することが重要となる。特に生理的消失の機序解明にあたっては、マウスなどの小型ほ乳類は役立たないことも明記されるべき点である。【０００６】
WATが脂肪を蓄えるエネルギー貯蔵組織であるのに対し、BATは脂肪を積極的に燃焼させるエネルギー産生組織である。両者は、細胞形態並びに遺伝子発現においても全く異なる特性を呈する。
形態学的には、白色脂肪細胞では単胞性の大きな脂肪滴を含有し、ミトコンドリアは乏しく（少量のミトコンドリアが核周囲に存在するのみ）、その形態は、酸化的リン酸化の低活性状態を反映して分断化している。一方、褐色脂肪細胞は多胞性の小さい脂肪滴を含有し、ミトコンドリアは豊富であり（脂肪滴周囲に局在する）、その形態は、酸化的リン酸化の高活性化状態を反映して縦に長くひも状に融合し、内部には多数の発達した梯子状クリステを有する。【０００７】
遺伝子発現に関しては、WATに特徴的なものとして、resistin、phosphoserine aminotransferase 1(PSAT1)等が挙げられる。BATに特徴的なものとしては、uncoupling  protein  1(UCP1)、PR  domain  containing  16(PRDM16)に加えて、elongation  of  very  long  chain  fatty  acids-like3(ELOVL3)、cell  death-inducing  DFFA-like  effector  A(CIDE-A)、peroxisome  proliferator-activated  receptorα(PPARα)、coactivator  1α(PGC1α)、cytochrome C(Cyt-c)、epithelial  V-like  antigen(EVA1)、neurotrophic  tyrosine  kinase  receptor  type  3(NTRK3)などが挙げられる。
このうちUCP1は、ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化とATP産生を脱共役する作用を持つため、酸化的リン酸化に不可避的に伴うとされる活性酸素の産生を阻止する効果を持つ。即ち、BATはUCP1の発現により、生命活動に付随する酸化ストレスを解消する、という特筆すべき効果を発揮する。【０００８】
またWATとBATは、生体において相反する生理効果をもたらすことが知られている。WATは、脂肪蓄積が過剰となって細胞が肥大化すると酸化ストレスを誘発する。その結果、脂肪組織で炎症が惹起され、炎症性サイトカイン等の影響により個体レベルでのインスリン抵抗性が誘発される。一方、BATは、UCP1が高発現しているために酸化ストレスが誘発されることはなく、個体レベルでのインスリン感受性を高める。
このように、BATは抗肥満作用のみならず、インスリン抵抗性の改善作用があることから、2型糖尿病の予防効果及び治療効果が期待されている。【０００９】
またBATは、血中から積極的に脂質を取り込み、これを燃焼して積極的に消費するために、高脂血症の治療効果があることが最近報告されている（非特許文献２）。【００１０】
また、冠動脈バイパス手術においては、患者本人のWATを手術部に移植することで、少なくとも短期的には成績が向上するが、冠動脈バイパス手術を要する患者は既にメタボリックシンドロームを発症していることが多いため、移植した脂肪細胞における炎症反応の惹起、酸化ストレスの誘発により、長期的には術後の血管再狭窄が懸念されている。実際、冠動脈狭窄症例では、冠動脈周囲にWATが多いことも知られている。
ここで、酸化ストレスを惹起しないBATを冠動脈バイパス手術部に移植することができれば、長期的な成績の向上が期待される。【００１１】
このように、肥満・インスリン抵抗性・2型糖尿病・高脂血症に対する治療効果、並びに冠動脈バイパス手術の成績向上効果が期待されるBATは、メタボリックシンドロームが関係する諸疾患の根治に向けて、極めて重要かつ貴重な組織である。
しかしながら、ヒトにおけるBATの発生、増殖機構、機能制御などについては不明の点が多い。さらに、脂肪組織由来ホルモンとして代謝調節に関与することが知られているアディポカインはいずれもWATから同定されたものであり、既存のアディポカインよりも優れた抗肥満及び代謝改善作用を発揮することが期待されている「BAT特異的アディポカイン」はいまだ同定されていない。
このようにBATに関する重要な知見が欠如している理由は、正常人ボランティアからBAT標本を得ることが、以下の理由によりほぼ不可能であるからである。即ち、１）BATの箇所を同定するには被爆量の多いPET/CT検査が必要である、２）全ての被験者においてPET/CT検査で BATが可視化されるわけではない、３）ヒト成体内ではBATは複数箇所（後頸部、各胸椎の脇等）に分散して存在し、その量は決して多くない（総重量でも300g以下）、４）このように微小組織であるBATを除去した際に生じるデメリット（メタボリックシンドローム発症リスクの増大等）については十分な評価資料がない、の4点が挙げられる。【００１２】
このような問題を克服し、研究目的及び臨床応用（細胞療法等）に向けた使用のために十分量の褐色脂肪細胞を供給するためには、無限自己増幅能と多能性分化能とを併せ持つ多能性幹細胞から褐色脂肪細胞を作製することが極めて有効である。【００１３】
ヒト多能性幹細胞としては、ヒト胚性幹細胞（ES細胞）やヒト人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem  (iPS)細胞）が、最も汎用性が高い細胞として挙げられるが、これらのヒト多能性幹細胞を用いて褐色脂肪細胞作製に成功した例はまだない。【００１４】
一方、マウスの骨髄・皮膚・脂肪組織の存在する体性幹細胞からの褐色脂肪細胞作製と、マウスES細胞からの褐色脂肪細胞作製については報告があるが（特許文献１）、in vitro 試験による褐色脂肪細胞作製の確認はUCP1遺伝子のメッセージ発現のみで行われており、褐色脂肪細胞機能発現に重要な他の遺伝子群（PRDM16, ELOVL3, CIDE-A, PPARα等）の発現は調べられていない。また、細胞形態学的見地からの評価は一切なされていない。このため、作製された褐色脂肪細胞の質については疑問が残る。
また、この方法が、ヒト多能性幹細胞にも適用可能であるかは全く不明である。マウスはBATが多い動物であり、慢性寒冷刺激により頻繁にWATのBAT化が観察されることを鑑みると、マウスでの結果がそのままヒトにも適用されることは極めて考えにくい。
更に、前述のように、この方法で作製されたマウス幹細胞由来褐色脂肪細胞を用いても、ヒトを含む大型ほ乳類で観察される生理的消失の機構解明はなされ得ない。【００１５】
また、マウスのBATから回収された脂肪前駆細胞や、マウス胎児由来10T1/2細胞株からは、BMP7を含む培地で培養することで褐色脂肪細胞が作製される報告がある（非特許文献３）。しかし、この方法は、マウス多能性幹細胞のみならず、ヒト多能性幹細胞にも適用可能であるかは全く不明である。【００１６】
また、ヒト新生児線維芽細胞に、2つの遺伝子（CCAAT/enhancer binding protein β；C/EBPβ、及びPRDM16）を導入して褐色脂肪細胞を作製したという報告はある（非特許文献４）。しかし、ヒト線維芽細胞の寿命を鑑みると、研究材料及び細胞療法ツールの提供を目的とした褐色脂肪細胞の大量調製は困難である。また、遺伝子導入により強制的に褐色脂肪細胞を作製しているため、前述の生理的消失の機序解明への使用も適さない。【００１７】
以上より、ヒトES細胞やヒトiPS細胞を含むヒト多能性幹細胞にも適用可能であり、遺伝子導入による強制的分化誘導を行わずに、多能性幹細胞からの褐色脂肪細胞を作製するための技術開発が、先進諸国及び新興国で大きな社会問題となっているメタボリックシンドロームが関係する諸疾患に対する基礎研究の推進、並びに、予防法及び治療法の開発にむけて急務となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】特開２０１０−１３０９６８
【特許文献２】ＷＯ２００８／０５６７７９
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Cypessら、New England Journal of Medicine、第360巻、第1509-1517頁、2009年
【非特許文献２】Barteltら、Nature Medicine、第17巻、第200-205頁、2011年
【非特許文献３】Tsengら、Nature、第454巻、第1000-1004頁、2008年
【非特許文献４】Kajimuraら、Nature、第460巻、第1154-1158頁、2009年
【非特許文献５】実験医学、Vol.26,No.5（増刊）、第35-40頁、2008年
【非特許文献６】Journalof Cell Physiology、第9巻、第335-344頁、1977年
【非特許文献７】Krings, A. ら、Bone、journal homepage:www.elsevier.com/locate/bone、BON-09309、第7頁 4C、1stEdition、2011年
【非特許文献８】Kushida Tら、Blood97、第3292-9329頁、2001年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は、多能性幹細胞から、遺伝子導入操作を行わずに、褐色脂肪細胞を安定に作製する技術を提供することを主な課題とする。特に、ヒト多能性幹細胞から、高品質な褐色脂肪細胞を作製することを課題とする。【００２１】
本発明は、また、ヒト多能性幹細胞から、メタボリックシンドロームが関係する諸疾患への細胞療法的使用が可能である褐色脂肪細胞を、無血清の環境下で、ヒト多能性幹細胞の株間差なく、安定に作製する技術を提供することを課題とする。【００２２】
本発明は、また、ヒト多能性幹細胞から、褐色脂肪細胞の発生と消失（大型ほ乳類で見られる生後の生理的消失と、加齢に伴う消失）の適切なモデルとなり得る褐色脂肪細胞を、無血清の環境下で、ヒト多能性幹細胞の株間差なく、安定に作製する技術を提供することを課題とする。【００２３】
本発明は、また、テイラーメイド医療も鑑み、任意の個人の体細胞から外来遺伝子のゲノム挿入を来たすことなく樹立されたヒト多能性幹細胞を用い、メタボリックシンドロームが関係する諸疾患への細胞療法的使用が可能であり、また褐色脂肪細胞の発生と消失の適切なモデルとなり得る褐色脂肪細胞を、無血清の環境下で株間差なく安定に作製するための技術の提供を通して、ヒト褐色脂肪細胞に関する基礎研究の推進と、メタボリックシンドロームが関係する諸疾患の予防または治療のためのツールを提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明者らは、以前に同グループが確立したヒト多能性幹細胞の血球分化誘導に関する技術（特許文献２）に関して、さらなる改良（無血清培養化、添加するサイトカインカクテルの価格低下を目指した組成変更等）を講じていた際に、培地中に浮遊する造血細胞以外の、培養皿に接着している細胞集団において、その過半数が褐色脂肪細胞に酷似した細胞形態（多胞性脂肪滴、豊富なミトコンドリア等）を呈することに気づいた。そして遺伝子発現を解析したところ、褐色脂肪細胞に特徴的な遺伝子であるUCP1及びPRDM16の発現が誘導されていることを確認した。【００２５】
このような造血細胞と褐色脂肪細胞との意外な関係については、造血幹前駆細胞の長期培養法の確立者であるDexterらが、骨髄造血ストロマ（造血を支持する機能を持つ細胞）の形態学的特徴を報告した論文（非特許文献６）において、それを示唆する記載がある。形態学的に骨髄由来接着細胞を、上皮様細胞、貪食細胞、giant  fat  cellsの3つの分類し、この中で造血ストロマ活性を示す細胞はgiant  fat  cellsであることが証明されている。また、このgiant  fat  cellsの形態学的特徴として、豊富な多胞性脂肪滴を有すること、ミトコンドリアが脂肪滴上に載っていることが記載されている。
このような重要な知見が発表されていたにも関わらず、これまで造血細胞と褐色脂肪細胞との関係について研究がなされることはなかった。
それに対し、本発明者らは前述の実験事実から、造血細胞分化と褐色脂肪細胞分化に密接な関連性があることに気づき、造血細胞分化誘導系に改変を加えることで、優れた褐色脂肪細胞分化誘導系が確立できることを見いだした。【００２６】
本発明者らは、前述の造血細胞分化誘導培養技術に関して、以下の変更を加えることで褐色脂肪細胞分化誘導法の最適化を達成した。
具体的には、１）全ての工程において血清を添加しない、２）2つのステップからなる分化誘導培養法において、第1ステップ（細胞凝集物作製のための浮遊培養工程）での培養期間を長くする（原法では3日であった培養期間を8〜10日に延長する）、３）第1ステップで使用するサイトカインカクテルに関して、SCF及びFlt3Lの濃度を従来の1/10〜1/100程度の低容量にする、４）第2ステップ（細胞凝集物の接着培養工程）において、第1ステップで用いるサイトカインカクテルを構成するサイトカインのうち、bone morphogenetic protein 4(BMP4)をBMP7に変更する、ことで褐色脂肪細胞産生効率が飛躍的に向上することを見いだした。【００２７】
これらの知見を基に、本発明は、次の構成を備える。
すなわち、本発明の多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞の製造方法は、多能性幹細胞を用いて褐色脂肪細胞を製造する方法であって、工程(A)を含む方法により、多能性幹細胞から細胞凝集物を形成し、工程(B)を含む方法により、細胞凝集物から褐色脂肪細胞を得ることを特徴とする。
(A)多能性幹細胞を、無血清環境において、造血性サイトカインの存在下で非接着培養を行い、細胞凝集物を作製する工程
(B)細胞凝集物を、造血性サイトカインの存在下で接着培養して、褐色脂肪細胞を作製する工程【００２８】
また、本発明の多能性幹細胞由来細胞凝集物の製造方法は、多能性幹細胞を用いて細胞凝集物を製造する方法であって、工程(A)を含む方法により、多能性幹細胞から細胞凝集物を得ることを特徴とする。
(A)多能性幹細胞を、無血清環境において、造血性サイトカインの存在下で非接着培養を行い、細胞凝集物を作製する工程【００２９】
また、本発明の多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞の製造方法は、多能性幹細胞由来細胞凝集物を用いて褐色脂肪細胞を製造する方法であって、工程(B)を含む方法により、多能性幹細胞由来細胞凝集物から褐色脂肪細胞を得ることを特徴とする。
(B)細胞凝集物を、造血性サイトカインの存在下で接着培養して、褐色脂肪細胞を作製する工程【００３０】
ここで、工程(A)で用いる造血性サイトカインとしては、BMP4、VEGF、SCF、Flt3L、IL6、IGF2が挙げられ、特には、BMP4が好ましい。
BMP4のみなど、1種のサイトカインを用いてもよいが、3種以上のサイトカインを混合して用いることが好ましく、更には6種の全てのサイトカインを混合して用いることがより好ましい。
用いる濃度としては、例えば、BMP4 (1〜50ng/ml、好ましくは10〜30ng/ml)、VEGF(0.5〜20ng/ml、好ましくは1〜10ng/ml)、SCF(1〜50ng/ml、好ましくは10〜30ng/ml)、Flt3L(0.5〜20ng/ml、好ましくは1〜5ng/ml)、IL6(0.5〜20ng/ml、好ましくは1〜5ng/ml)、IGF2(0.5〜20ng/ml、好ましくは1〜10ng/ml)が挙げられる。【００３１】
工程(B)で用いる造血性サイトカインとしては、BMP7、VEGF、SCF、Flt3L、IL6、IGF2が挙げられ、特には、BMP7が好ましい。
BMP7のみなど、1種のサイトカインを用いてもよいが、3種以上のサイトカインを混合して用いることが好ましく、更には6種の全てのサイトカインを混合して用いることがより好ましい。
用いる濃度としては、例えば、BMP7(1〜50ng/ml、好ましくは5〜20ng/ml)、VEGF(0.5〜20ng/ml、好ましくは1〜10ng/ml)、SCF(1〜50ng/ml、好ましくは10〜30ng/ml)、Flt3L(0.5〜20ng/ml、好ましくは1〜5ng/ml)、IL6(0.5〜20ng/ml、好ましくは1〜5ng/ml)、IGF2(0.5〜20ng/ml、好ましくは1〜10ng/ml)が挙げられる。【００３２】
工程(A)における非接着培養としては、汎用の低吸着培養皿や半固形培地などを用いて、細胞を培養皿底面に接着させることなく、培地中に浮遊した状態を保ちながら、培養装置（例えば、5% CO2インキュベータ内で37℃）で培養することが挙げられる。【００３３】
工程(B)における接着培養としては、汎用の細胞培養用容器を用いて、これに直接かまたはコート（例えば、0.1％のブタ由来ゼラチンなどの蛋白）した上に、播種して、培養する（例えば、5%CO2インキュベータ内で37℃）ことが挙げられる。【００３４】
なお、無血清の環境とは、培地に牛胎仔血清などの血清を添加せずに、インスリン、トランスフェリン、アルブミンなどの蛋白成分や、血清代替品（GIBCO PFHM-II Protein-Free Hybridoma Medium（登録商標）、Life Technologies, Inc.等）を添加して培養することを意味する。【００３５】
細胞凝集物とは、多能性幹細胞等を培地中に浮遊させた状態で培養することで形成される球状（または不定形）の細胞集塊であり、その大きさや組織構造は様々であってよく、また互いに連結されることがあってもよいものを意味する。【００３６】
また、多能性幹細胞にES細胞またはiPS細胞を用いてもよい。【００３７】
iPS細胞にセンダイウイルスベクターにより樹立されたiPS細胞を用いてもよい。【００３８】
多能性幹細胞にヒト多能性幹細胞を用いてもよい。【００３９】
本発明の多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞は、多能性幹細胞を用いて製造される褐色脂肪細胞であって、工程(A)、(B)を含む方法により得られることを特徴とする。
(A)多能性幹細胞を、無血清環境において、造血性サイトカインの存在下で非接着培養を行い、細胞凝集物を作製する工程
(B)細胞凝集物を、造血性サイトカインの存在下で接着培養して、褐色脂肪細胞を作製する工程【００４０】
また、本発明の多能性幹細胞由来細胞凝集物は、多能性幹細胞を用いて製造される細胞凝集物であって、工程(A)を含む方法により、多能性幹細胞から得られることを特徴とする。
(A)多能性幹細胞を、無血清環境において、造血性サイトカインの存在下で非接着培養を行い、細胞凝集物を作製する工程【００４１】
また、本発明の多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞は、多能性幹細胞由来細胞凝集物を用いて製造される褐色脂肪細胞であって、工程(B)を含む方法により、細胞凝集物から得られることを特徴とする。
(B) 細胞凝集物を、造血性サイトカインの存在下で接着培養して、褐色脂肪細胞を作製する工程【００４２】
また更に、本発明の多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞は、多能性幹細胞を用いて製造される褐色脂肪細胞であって、少なくとも遺伝子UCP1、PRDM16、PGC1α、Cyt-c、CIDE-A、ELOVL3、PPARα、EVA1、NTRK3の遺伝子発現が誘導されていると共に、多胞性脂肪滴を有することを特徴とする。【００４３】
なお、遺伝子発現が誘導されていることは、所定のprimerを用いてreverse transcription polymerase  chain  reaction(RT-PCR)を行い、その産物をアガロース電気泳動で可視化した際に、各遺伝子のメッセージに由来するバンドが、未分化多能性幹細胞では全く検出されない一方、分化誘導細胞では検出されることを意味する。【００４４】
多胞性脂肪滴とは、細胞質に存在する多数の小さな球状の脂肪滴を意味し、光学顕微鏡的観察や電子顕微鏡的観察などにより存在が確認される。脂肪滴の数は、電子顕微鏡による観察に際して、核を含む断面における細胞切片の写真において、15個以上検出されることを目安とする。【００４５】
また、本発明の多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞は、多数の梯子状クリステを有する縦に長く融合したひも状のミトコンドリアを、多胞性脂肪滴周囲に有してもよい。
多数の梯子状クリステを含有する縦に長く融合したひも状のミトコンドリアとは、ミトコンドリア同士が互いに長軸方向に融合して長くなり、あたかもひものような形態を呈しつつ、ミトコンドリア内部では長軸方向に対して鉛直に、内膜の端から端まで全周性に広がる円盤状のクリステが、互いに平行に密に並んでいることを意味する。【００４６】
また、多能性幹細胞をES細胞またはiPS細胞としてもよい。【００４７】
多能性幹細胞をヒト多能性幹細胞としてもよい。【００４８】
本発明の細胞療法は、肥満の予防または治療のための細胞療法であって、前述の多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞を移植することを特徴とする。【００４９】
同様に、本発明の細胞療法は、インスリン抵抗性の改善、または、糖尿病の予防または治療のための細胞療法であって、前述の多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞を移植することを特徴とする。【００５０】
同様に、本発明の細胞療法は、高脂血症の予防または治療のための細胞療法であって、前述の多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞を移植することを特徴とする。【００５１】
同様に、本発明の細胞療法は、冠動脈のバイパス血行路を作製する手術のための細胞療法であって、前述の多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞を移植することを特徴とする。【００５２】
同様に、本発明の細胞療法は、造血を促進させるための細胞療法であって、前述の多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞を移植することを特徴とする。【００５３】
本発明の内科療法は、肥満の予防または治療、インスリン抵抗性の改善、糖尿病の予防または治療、高脂血症の予防または治療、造血を促進させるための治療、冠動脈のバイパス血行路を作製する手術のいずれかと併用する内科療法であって、前述の多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞が分泌する物質を投与することを特徴とする。
【発明の効果】
【００５４】
本発明により、多能性幹細胞から無血清かつ無フィーダー環境下で、褐色脂肪細胞を安定に作製する技術を提供することができる。【００５５】
また本発明により、ヒト多能性幹細胞から、遺伝子UCP1、PRDM16、PGC1α、Cyt-c、CIDE-A、ELOVL3、PPARα、EVA1、NTRK3の遺伝子発現が誘導されていると共に、多胞性脂肪滴を有し、更にその周囲に、多数の梯子状クリステを有する縦に長く融合したひも状のミトコンドリアを有する褐色脂肪細胞を提供することができる。【００５６】
本発明で作製される褐色脂肪細胞は、実質的に異種動物由来細胞や外来ウイルス性成分を含まないことから、基礎研究ツールとしても、細胞療法ツールとしても優れている。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】SeV-iPS細胞における形態変化を示す顕微鏡写真
【図２】SeV-iPS細胞におけるSSEA4、OCT3/4の各未分化マーカーの発現を示すFACSスキャン結果のグラフ
【図３】SeV-iPS細胞におけるSSEA4、OCT3/4、Nanogの各未分化マーカーの発現を示す免疫染色写真
【図４】（A）SeV-iPS細胞におけるSeVベクター由来外来遺伝子除去を示す電気泳動写真、（B）同、顕微鏡写真
【図５】（A）ヒトES細胞及びヒトiPS細胞（SeV-iPS）に由来する褐色脂肪細胞の位相差顕微鏡写真、（B）同、oil red O染色像
【図６】褐色脂肪細胞マーカー検出用のRT-PCR用プライマーの表
【図７Ａ】（A）ヒトES細胞より分化誘導した褐色脂肪細胞のRT-PCRの電気泳動写真
【図７Ｂ】（B）ヒトiPS細胞（SeV-iPS）より分化誘導した褐色脂肪細胞のRT-PCRの電気泳動写真
【図８】多能性幹細胞より分化誘導した褐色脂肪細胞の電子顕微鏡写真
【図９ＡＢＣ】（A）ヒトiPS細胞（SeV-iPS）からの褐色脂肪細胞分化誘導における造血性サイトカインの必要性とBMP7の有効性を示すRT-PCRの電気泳動写真、（B）同、位相差顕微鏡写真、（C）ヒトES細胞からの褐色脂肪細胞分化誘導におけるBMP7の有効性を示す位相差顕微鏡写真
【図９ＤＥ】（D）多能性幹細胞からの褐色脂肪細胞分化誘導において造血性サイトカインを除いた条件の褐色脂肪細胞の位相差顕微鏡写真、（E）多能性幹細胞からの褐色脂肪細胞分化誘導において造血性サイトカインを除いた条件のRT-PCRの電気泳動写真
【図１０】多能性幹細胞より分化誘導した褐色脂肪細胞に、アドレナリンβ受容体アゴニストを添加した際のUCP1、PRDM16遺伝子の発現上昇を示すRT-PCRの電気泳動写真
【図１１Ａ】（A）ヒトES細胞より分化誘導した褐色脂肪細胞をマウス背部皮下に移植し、アドレナリンβ受容体アゴニストを添加した際の体表面温度変化を示す写真
【図１１Ｂ】（B）ヒトiPS細胞（SeV-iPS）より分化誘導した褐色脂肪細胞をマウス背部皮下に移植し、アドレナリンβ受容体アゴニストを添加した際の体表面温度変化を示す写真
【図１２】（A）ヒトES細胞より分化誘導した褐色脂肪細胞のミトコンドリア呼吸能評価を示すグラフ、（B）ヒトiPS細胞（SeV-iPS）より分化誘導した褐色脂肪細胞のミトコンドリア呼吸能評価を示すグラフ、（C）ヒトMSC由来白色脂肪細胞のミトコンドリア呼吸能評価を示すグラフ
【図１３Ａ】（A）ヒトES細胞より分化誘導した褐色脂肪細胞をマウス背部皮下に移植し、アドレナリンβ受容体アゴニストを添加した際の血中の中性脂肪変化を示すグラフ
【図１３Ｂ】（B）ヒトiPS細胞（SeV-iPS）より分化誘導した褐色脂肪細胞をマウス背部皮下に移植し、アドレナリンβ受容体アゴニストとオリーブオイルを添加した際の血中の中性脂肪変化を示すグラフ
【図１４Ａ】（A）糖負荷試験のスケジュールの説明図
【図１４Ｂ】（B）ヒトES細胞より分化誘導した褐色脂肪細胞を背部皮下に移植したマウスの空腹時血糖値を示すグラフ
【図１４Ｃ】（C）ヒトES細胞より分化誘導した褐色脂肪細胞を背部皮下に移植したマウスの糖負荷試験結果を示すグラフ
【図１４Ｄ】（D）ヒトES細胞より分化誘導した褐色脂肪細胞を背部皮下に移植したマウスの糖代謝異常の治療効果を示すグラフ
【図１５】ヒトES細胞より分化誘導した褐色脂肪細胞の活性酸素産生抵抗性を示す顕微鏡写真
【図１６Ａ】（A）ヒトES細胞より分化誘導した褐色脂肪細胞の造血ストロマ機能試験方法の説明図
【図１６ＢＣＤ】（B）FACSによるヒトCD45発現細胞の評価を示すグラフ、（C）FACSによるヒトCD33、ヒトCD45発現細胞の評価を示すグラフ、（D）ヒトES細胞より分化誘導した褐色脂肪細胞の造血性サイトカイン発現評価を示す電気泳動写真
【図１６Ｅ】（E）ヒトES細胞より分化誘導した褐色脂肪細胞の造血性サイトカイン発現量の褐色脂肪細胞刺激剤による影響を示す電気泳動写真
【図１６Ｆ】（F）ヒトES細胞より分化誘導した褐色脂肪細胞の刺激剤による骨髄抑制緩和効果を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００５８】
以下に、本発明の実施形態を、図面に示す実施例を基に説明する。なお、実施形態は下記の例示に限らず、本発明の趣旨から逸脱しない範囲で、前記文献など従来公知の技術を用いて適宜設計変更可能である。
【００５９】
本発明による褐色脂肪細胞は、多能性幹細胞を用いて製造される褐色脂肪細胞であって、  工程(A)、(B)を含む方法により得られる。
(A)多能性幹細胞を、無血清環境において、造血性サイトカインの存在下で非接着培養を行い、細胞凝集物を作製する工程
(B)細胞凝集物を、造血性サイトカインの存在下で接着培養して、褐色脂肪細胞を作製する工程
【００６０】
典型的には、多能性幹細胞から多能性幹細胞由来褐色細胞を得るには、多能性幹細胞をマウス胎児線維芽細胞などのフィーダー細胞から分離した後、BMP4を添加した細胞凝集物作製用培地を用いて、汎用の低吸着培養容器内で細胞を浮遊させた状態を保ちながら8〜10日程度培養し、これにより作製された細胞凝集物を、BMP7を添加した褐色脂肪細胞分化培地を用いて、汎用の細胞培養容器またはこれをゼラチン等の蛋白成分でコートした容器内で培養する。これにより、多能性幹細胞から多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞の作製は10〜15日程度で達成される。
【００６１】
以下、各工程について詳細に説明する。
(A)多能性幹細胞を、無血清環境において、造血性サイトカインの存在下で非接着培養を行い、細胞凝集物を作製する工程：
出発原料の多能性幹細胞とは、多能性を有する幹細胞を指し、例えば、ES細胞、iPS細胞、精巣幹細胞、成体幹細胞、Muse細胞などが挙げられる。
多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞であってよい。この場合、多能性幹細胞は、ヒトに由来し、多能性分化能を保持する細胞群である。これには、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞、ヒト精巣幹細胞、ヒト成体幹細胞、ヒトMuse細胞などが含まれる。
【００６２】
多能性幹細胞の入手方法及び樹立方法は公知である。例えば、ヒトES細胞の場合、文部科学省から許可を得た上で、国内樹立機関（京都大学、国立成育医療研究センター）からの分与や、国外施設（私企業、大学等）からの分与または購入が可能である。またヒトiPS細胞については、センダイウイルス（SeV）ベクターを用いる方法が好ましく、例えば、市販のヒト線維芽細胞などを、リプログラム因子発現ユニットを搭載したセンダイウイルスベクターが添加された培地で培養することで樹立される。リプログラム因子発現ユニットを搭載したセンダイウイルスベクターとしては、例えばCytoTune-iPS（DNAVEC Corporation）などが挙げられる。レトロウイルスベクターを用いて作製したヒトiPS細胞は、理化学研究所バイオリソースセンターからの購入や、京都大学や国立成育医療研究センターからの分与が可能である。
【００６３】
一般に、多能性幹細胞は、未分化維持に必要な添加物を用いず、かつ多能性幹細胞の生存性を維持する効果のある添加物を用いて、汎用の低吸着培養容器などにより浮遊培養することで、細胞凝集物を形成できる。しかし、多能性幹細胞由来細胞凝集物の分化指向性は、細胞凝集物を作製する際に用いられた培地の組成により制御される。
褐色脂肪細胞を作製する際には、細胞凝集物作製用培地には、少なくとも一種の造血性サイトカインが含まれていることが必須となる。換言すると、褐色脂肪細胞を作製する際には、中間産物である細胞凝集物の形態や大きさについては特別な制限はないが、細胞凝集物の作製に用いる培地の組成は、所定の条件が伴う。なお、造血性サイトカインを血球分化の際に用いるような高容量（例えば、SCFやFlt3Lを100〜300ng/ml）で使用することは、褐色脂肪細胞の産生を抑制するので好ましくない。
【００６４】
細胞凝集物作製用培地の基礎成分としては、例えば、汎用の基礎培地であるIMDM/F12に、次のものを添加したものなどが用いられる。即ち、5mg/ml牛血清アルブミン（BSA）、1%体積
合成脂質溶液(Life  Technologies,Inc.)、1%体積x100インスリンートランスフェリンーセレン(ITS-A)(Life  Technologies,Inc.)、450μMα-monothioglycerol（MTG）(Sigma-Aldrich,Inc.)、2mM L-Glutamine(Life  Technologies,Inc.)、5%体積  GIBCO  PFHM-II  Protein-Free  Hybridoma  Medium(PFHII)（登録商標）(Life  Technologies,Inc.)、50μg/ml  Ascorbic  acidである。
【００６５】
ここに、造血性サイトカインとして、BMP4(1〜50ng/ml、好ましくは10〜30ng/ml)、VEGF (0.5〜20ng/ml、好ましくは1〜10ng/ml)、SCF(1〜50ng/ml、好ましくは10〜30ng/ml)、Flt3L(0.5〜20ng/ml、好ましくは1〜5ng/ml)、IL6(0.5〜20ng/ml、好ましくは1〜5ng/ml)、IGF2(0.5〜20ng/ml、好ましくは1〜10ng/ml)を添加して使用する。
造血性サイトカインカクテルの一例としては、BMP4(20ng/ml)、VEGF(5ng/ml)、SCF(20ng/ml)、Flt3L(2.5 ng/ml)、IL6(2.5 ng/ml)、IGF2(5 ng/ml)が挙げられる。
【００６６】
細胞凝集物作製用培地を用いて、多能性幹細胞を汎用の低吸着培養容器などに入れ、容器底面に接着させずに培地中に浮遊させた状態を保ちながら、例えば、5%CO2インキュベータ内で37℃で8〜10日間培養する。
その間、例えば、3日毎に培地の半量を新鮮なものと交換する。培地交換の際には、例えば、低吸着培養容器を30度程傾けて1分ほど放置し、細胞凝集物が完全に沈むのを確認した上で、培養上清のみを半量ピペットで静かに吸い出した後、同量の新鮮な細胞凝集物作製用培地を添加し、低吸着培養容器全体を軽く揺すりながら細胞凝集物を均一に分散させるようにする。
【００６７】
浮遊培養に用いる低吸着培養容器としては、多能性幹細胞が容器底面に接着しないものであればよく、例えば、2-methacryloxyethyl  phosphorylcholine(MPC)コート培養皿（Thermo Fisher Scientific Inc.）、Hydro cell（商標登録）(CellSeed Inc.)などが挙げられる。
【００６８】
なお、多能性幹細胞からフィーダー細胞を分離・除去するためには、例えば、剥離液処理により回収された多能性幹細胞のけん濁液を、遠沈管内で30秒程度静置して多能性幹細胞のみを選択的に沈降させた上で、細胞凝集物作製用培地を用いて細胞を再度けん濁させてから、低吸着培養容器内で浮遊培養することが好ましい。
【００６９】
多能性幹細胞由来細胞凝集物の多くは、内部が充満した球状またはそれに近い形態を呈するが、時には不定形を呈したり、互いに融合することもある。また稀に、内部が空洞状となる場合もある。大きさは、光学顕微鏡で確認されるレベル（直径100〜300μm）から、肉眼で容易に確認できるもの（直径300〜1000μm）まで様々である。
【００７０】
(B)細胞凝集物を、造血性サイトカインの存在下で接着培養して、褐色脂肪細胞を作製する工程：
工程(A)で作製された多能性幹細胞由来細胞凝集物を、汎用の細胞培養用容器を用いて行える。細胞培養用容器は、一般に細胞培養に用いられるものであればいずれでもよい。
汎用の基礎培地としては、IMDM、IMDM/F12、DMEM、DMEM/F12、RPMIなどが挙げられる。無血清培養用培地としてはエスクロンSF-B（EIDIA Co.,Ltd.）、エスクロンSF-03（EIDIA Co.,Ltd.）、ASF-104（AJINOMOTO CO.,Inc.）、ASF-104N（AJINOMOTO CO.,Inc.）、X-VIVO 10（Lonza group Ltd.）、X-VIVO 15（Lonza group Ltd.）などが挙げられる。
【００７１】
ここに、造血性サイトカインとして、BMP7(1〜50ng/ml、好ましくは5〜20ng/ml)、VEGF(0.5〜20ng/ml、好ましくは1〜10ng/ml)、SCF(1〜50ng/ml、好ましくは10〜30ng/ml)、Flt3L(0.5〜20ng/ml、好ましくは1〜5ng/ml)、IL6(0.5〜20ng/ml、好ましくは1〜5ng/ml)、IGF2(0.5〜20ng/ml、好ましくは1〜10ng/ml)を添加して使用する。
造血性サイトカインカクテルの一例としては、BMP7(10ng/ml)、VEGF(5ng/ml)、SCF(20ng/ml)、Flt3L(2.5ng/ml)、IL6(2.5ng/ml)、IGF2(5ng/ml)が挙げられる。
【００７２】
分化誘導における培養条件は、用いられるヒト多能性幹細胞の種類により適宜設定することができ、例えば、37℃、5%CO2インキュベータで1週間程度培養する。
【００７３】
細胞接着性を高めるために、コート処理を施してもよい。コート処理には、例えば、0.1%ブタゼラチン水溶液を培養容器内に入れて室温で10分程度放置する。また、汎用の細胞接着性を高めた培養容器（Corning  CellBIND  Surface（登録商標）、Corning  Inc.等）を使用してもよい。なお、培養中に、3日毎程度で培地を新鮮なものに交換することが好ましい。
【００７４】
多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞が作製されたことは、UCP1、PRDM16、PGC1α、Cyt-c、CIDE-A、ELOVL3、PPARα、EVA1、NTRK3などの褐色脂肪細胞マーカー遺伝子の発現誘導を、RT-PCRなどで調べることで確認できる。
また、位相差顕微鏡での多胞性脂肪滴の観察、電子顕微鏡観察での多胞性脂肪滴の観察、梯子状クリステを有する縦に長く融合したミトコンドリアの細胞質での観察により確認できる。
【００７５】
多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞の機能は、アドレナリンβ受容体アゴニストであるイソプロテレノールなどを添加した際に、PRDM16やUCP1などのミトコンドリア増幅や熱産生に関わる遺伝子の発現が上昇することで確認される。
【００７６】
多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞の機能は、アドレナリンβ受容体アゴニストであるイソプロテレノールなどを添加した際に細胞温度が上昇すること、または、酸素消費量が増大すること、または、多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞をマウスなどに移植して、これにアドレナリンβ受容体アゴニストであるイソプロテレノールなどを投与した際に、移植部の温度が上昇することにより確認できる。
【００７７】
こうして得られた褐色脂肪細胞は多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞であり、実質上、異種動物細胞の混入や異種動物由来ウイルスの感染がないという優れた性質を有する。このようにして得られる多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞は、褐色脂肪細胞の発生や脱分化などに関する基礎研究ツールとして、更には肥満や高脂血症などに対する細胞療法ツールとしての使用が可能である。
【００７８】
本発明で作製される褐色脂肪細胞は、脂肪滴内の中性脂肪に蓄積された化学エネルギーを熱エネルギーに変換するための遺伝子群を発現している。
そのため、本発明で作製される褐色脂肪細胞を生体内に移植した際には、個体の総熱産生量が増加し、それに応じて基礎代謝が亢進するために、長期的には肥満を改善することが期待される。即ち、本発明で作製される褐色脂肪細胞は、肥満に対する細胞療法ツールとして有用である。
【００７９】
本発明で作製される褐色脂肪細胞は、生体内に蓄積されている化学エネルギーを熱エネルギーとして無駄に消費してくれるために、新たに脂肪組織内に余剰エネルギーを貯蓄するためのスペースが確保されることとなる。
そのため、食事から摂取されたエネルギーは脂肪組織に速やかに取り込まれることとなる。つまり、脂肪組織において、容量以上に脂肪が蓄積した結果、食事に由来する余剰エネルギーの貯蓄のための予備容量がなくなったために生じるインスリン抵抗性は、本発明で作製される褐色脂肪細胞を移植することで、新たに余剰エネルギー貯蓄容量が確保され、改善されることとなる。即ち、本発明で作製される褐色脂肪細胞は、インスリン抵抗性に対する細胞療法ツールとして有用である。
【００８０】
また、本発明で作製される褐色脂肪細胞は、外部から取り込まれた脂質成分を、細胞質内で多胞性脂肪滴として蓄えることで、総表面積の大きい状態で保持している。またこれらの脂肪滴の近傍には、電子伝達系による酸化的リン酸化が高活性であるミトコンドリアが、長軸方向に長く融合し、かつ内部に発達した梯子状クリステを持つ形態で多数存在している。更に本発明で作製される褐色脂肪細胞は、酸化的リン酸化で得られるエネルギーを熱エネルギーに変換するための遺伝子群を発現している。
そのため、本発明で作製される褐色脂肪細胞を生体内に移植した際には、血液中の脂質成分を積極的に取り込んで、これを燃焼・消失する効果を発揮する。即ち、本発明で作製される褐色脂肪細胞は、高脂血症に対する細胞療法ツールとして有用である。
なお、高脂血症に対する細胞療法ツールとしての有用性は、高脂肪食などによって予め高脂血症状態を誘発しておいたマウスなどに、本発明で作製される褐色脂肪細胞を移植して、血清中の脂肪値を1週間追跡することなどによって確認される。または、本発明で作製される褐色脂肪細胞を移植したマウスを、一昼夜絶食させた後に経口的にオリーブオイル等の食用油脂を負荷し、以後は経時的に4時間程度、血中の中性脂肪値を追跡することで確認される。
【００８１】
また、本発明で作製される褐色脂肪細胞はUCP1を発現している。UCP1は電子伝達系においてアンカップリングを起こすことで、ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化反応に付随して、不可避的に産生されるべき活性酸素の発生を阻止する作用を発揮する。即ち、本発明で作製される褐色脂肪細胞は、活性酸素を産生することはなく、また炎症反応を惹起することはない。
そのため、本発明で作製される褐色脂肪細胞を生体内に移植した際には、移植部における活性酸素の発生は阻止される。このことにより、例えば、冠動脈バイパス手術における脂肪移植療法のジレンマ（移植された脂肪細胞から活性酸素が産生されることで、血行再建部位に炎症反応が惹起されて、長期的な血行再建術の予後を悪化させる危険性がある）を克服し、血行再建術後の長期予後を向上させることができる。即ち、本発明で作製される褐色脂肪細胞は、冠動脈バイパス手術における脂肪移植療法のため細胞療法ツールとして有用である。
【００８２】
マウスの骨髄に由来する脂肪細胞株の中には、造血支持能を支持する「造血ストロマ細胞」があることはよく知られている。また既に述べたように、マウスの骨髄に存在する造血ストロマ細胞は褐色脂肪細胞としての形態学的特徴を示す。またつい最近、マウスの骨髄中に褐色脂肪細胞が存在することも報告された（非特許文献７）。一方で、ヒト骨髄間葉系幹細胞から作製した白色脂肪細胞には造血支持能がないことも知られている。即ち、白色脂肪細胞が造血を負に制御するのに対して、褐色脂肪細胞は造血を正に制御することが示唆されている。これらのことから、本発明で作製される褐色脂肪細胞は、抗癌剤治療に伴う骨髄抑制や造血障害性疾患に対する細胞療法ツールとして有用であると考えられる。
【００８３】
また、本発明で作製される褐色脂肪細胞が分泌するアディポカイン等を生体内に投与した際には、それが肝臓や骨格筋、白色脂肪細胞等に作用して脂質や糖の代謝を改善したり、骨髄系造血前駆細胞に間接的に作用して造血機能を向上させ得る。即ち、本発明で作製される褐色脂肪細胞が分泌する物質は、肥満の予防または治療、インスリン抵抗性の改善、糖尿病の予防または治療、高脂血症の予防または治療、造血を促進させるための治療、冠動脈のバイパス血行路を作製する手術などと併用する内科療法ツールとして有用である。
【実施例】
【００８４】
[実施例1]センダイウイルスベクターを用いたヒト人工多能性幹細胞の誘導：
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)（Lonza  group  Ltd.）2.5x105個/wellを、0.1%ブタゼラチンでコートした6穴型培養プレートの上に播種し、EGM-2培地（Lonza group  Ltd.）を用いて、37℃、5%CO2インキュベータにて培養した。培養後、MOI=3の濃度の下記（a）〜（d）のベクターを培養した細胞に感染させた。
（a）SeV18+OCT3/4／TSΔFベクター
（b）SeV18+SOX2／TSΔFベクター
（c）SeV18+KLF4／TSΔFベクター
（d）SeV(HNL)c-MYC／TS15ΔFベクター【００８５】
ベクターを感染後、翌日に10%FBS含有DMEMで培地交換を行った。その後、6日間、37℃、5%CO2インキュベータにて培養した。次いで、ゼラチンコート10cm培養皿に用意したX線照射処理済みのマウス胎児線維芽細胞（MEF）6.0×105（個）の上で、Accutase（Innovative  Cell  Technologies,Inc.）で剥がした導入細胞を9.0×105〜1.5×106（個）培養した。翌日、10%FBS含有DMEMから霊長類ES細胞用培地（ReproCELL  Inc.）（5ng/mlになるようFGF2を添加した）に培地交換し、3%CO2インキュベータで培養した。培地交換は毎日行った。【００８６】
図１は、HUVEC由来ヒト人工多能性幹細胞（SeV-iPS細胞）における形態変化を示す顕微鏡写真である。
培養数日後にコロニーが現れ、20日程度培養することで、ヒト胚性幹細胞様のコロニーが出現した。図１の写真の通り、誘導前のHUVECと明らかに異なるヒト胚性幹細胞に見られるのと同様の扁平なコロニーが見られた。このヒト胚性幹細胞様のコロニーは、従来報告されている外観のものと同様であった（非特許文献5）。【００８７】
これらのコロニーを、マイクロピペットで単離した後、新しいMEF上で培養した。そして、ヒト多能性幹細胞用剥離液（0.25% trypsin(Life  Technologies,Inc.)、1mg/ml  collagenase  IV(Wako  Pure  Chemical  Industries,Ltd.)20%  KnockOut（登録商標）Serum  Replacement(Life  Technologies,Inc.)1mM  CaCl2）を用いた剥離操作を介して、安定した継代・増殖培養が可能であった。【００８８】
上記実験により得られた細胞が、多能性幹細胞に特徴的なマーカーを発現しているか否かを明らかにするために、下記の実験を行った。【００８９】
[実施例２]センダイウイルスベクターを用いたヒト人工多能性幹細胞の未分化維持の確認：
フローサイトメーター（FACSCalibur（登録商標））（Becton,Dickinson  and  Company）を用いて、ヒト多能性幹細胞の未分化マーカーであるSSEA4、OCT3/4の発現を調べた。
具体的には、SSEA4については、実施例１で得られたSeV-iPS細胞を、多能性幹細胞用剥離液（0.25%  trypsin(Life  Technologies,Inc.)1mg/ml  collagenase  IV(Wako  Pure  Chemical  Industries,Ltd.)20%  KnockOut（登録商標）Serum  Replacement(Life  Technologies,Inc.)1mM  CaCl2）で回収した後、Trypsin/EDTA液（Sigma-Aldrich,Inc.）を用いて分散させた上で、FACS  buffer(X1  PBS,0.05%  NaN3,5%  FBS)に浮遊させた。ここに、2%  Mouse  BD  Fc  Block(Becton,Dickinson  and  Company)を添加した後、抗ヒトSSEA4  phycoerythrin  conjugated  mouse  IgG(R&D  Systems  Inc.)をX1/10添加して氷上にて60分静置後、FACS  bufferで洗浄し、フローサイトメーターにてSSEA4発現を解析した。【００９０】
また、OCT3/4の発現については、SeV-iPS細胞を回収後、FIX & PERM CELL PERMEABILIZATION KIT(Life Technologies,Inc.)を用いて細胞の固定・細胞膜透過処理を行った上で、2%Mouse BD Fc Block(Becton, Dickinson and Company)と抗ヒトOCT3/4 phycoerythrin conjugated rat IgG(R&D Systems Inc.)X 1/10を添加し、氷上で60分静置後、FACS bufferで洗浄し、フローサイトメーターでOCT3/4発現を解析した。
その結果、図2のFACSスキャン結果に示すように、実施例１で得られたSeV-iPS細胞は、SSEA4及びOCT3/4の各未分化マーカーをいずれも高発現していることが確認された。【００９１】
なお、上段のグラフは、SSEA4とOCT3/4それぞれ、左がコントロール抗体、右が目的抗体（抗SSEA4抗体、抗OCT3/4抗体）での染色データである。コントロール抗体に比して目的抗体での染色データがFL2増加方向にシフトしているので、大多数の細胞において目的蛋白の発現が認められた。下段のグラフは、上段のグラフをヒストグラム表示したものであり、コントロール抗体に比して目的抗体での分布曲線がFL2増加方向にシフトしていることが明らかである。【００９２】
また、ヒト多能性幹細胞の未分化マーカーであるSSEA4、OCT3/4、Nanogの発現を免疫染色法でも確認した。
具体的には、実施例１で得られたSeV-iPS細胞をアセトン/メタノール（1:3）で固定し、0.1%  Triton-X-100/ PBSにより細胞膜透過処理を施した上で、抗ヒトSSEA4抗体（ES  Cell  Marker  Sample  Kit）（Millipore  Co.）、抗ヒトOCT3/4抗体（ES  Cell  Marker  Sample  Kit）（Millipore  Co.）、抗ヒトNanog抗体（ReproCELL  Inc.）X  1/100を用いて一次抗体反応を行った。なお、抗ヒトSSEA4抗体、抗ヒトOCT3/4抗体については、Kitのプロトコールにしたがって行った。そして、Alexa  Fluor 488標識抗ウサギIgG抗体（Life  Technologies,Inc.）X  1/2000を用いて二次抗体反応を行った後、蛍光顕微鏡による観察を行った。
その結果、図3の免疫染色結果に示すように、実施例１で得られたSeV-iPS細胞は、SSEA4、OCT3/4、Nanogの各未分化マーカーをいずれも高発現していることが確認された。【００９３】
[実施例３]SeVベクター由来外来遺伝子の除去：
実施例1で得られたSeV-iPS細胞よりSeVベクター由来外来遺伝子が除去された株を得るためにクローニングを行った。
SeVベクター由来外来遺伝子の除去の目安として、抗SeV抗体（DNAVEC Corporation）による免疫染色を行った。SeV-iPS細胞を10%マイルドホルム（Wako  Pure  Chemical  Industries,Ltd.）で固定し、一次抗体として抗SeV抗体、二次抗体としてAlexa  Fluor  488標識抗ウサギIgG抗体（Life  Technologies,Inc.）を用いた染色を行った後、蛍光顕微鏡による観察を行った。【００９４】
更に、transgenes及びSeVゲノムを検出するためにRT-PCRを行った。RTはSuperscript  III  First-Strand  Synthesis  System  for  RT-PCR（Life  Technologies,Inc.）を用いて行った。PCRはGeneAmpR  PCR  System  9700(Life  Technologies,Inc.)を用いて、変性（95oCで5分）、増幅（95oCで30秒、55oCで30秒、72oCで30秒、30〜35サイクル）、後伸張（72oCで7分）の各ステップを行った。プライマーは、
OCT3/4(Fw:CCCGAAAGAGAAAGCGAACCAG,Rv:AATGTATCGAAGGTGCTCAA),SOX2(Fw:ACAAGAGAAAAAACATGTATGG,Rv:ATGCGCTGGTTCACGCCCGCGCCCAGG),KLF4(Fw:ACAAGAGAAAAAACATGTATGG,Rv:CGCGCTGGCAGGGCCGCTGCTCGAC),cMYC(Fw:TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG,Rv:TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG),SeV(Fw:GGATCACTAGGTGATATCGAGC,Rv:ACCAGACAAGAGTTTAAGAGATATGTATC)を用いた。【００９５】
その結果、図4Aの電気泳動結果及び図4Bの顕微鏡写真に示すように、実施例１で得られたSeV-iPS細胞株は、SeV抗原陰性であり、SeVベクター由来外来遺伝子を保持しないことが確認された。そのため、SeV-iPS細胞株は、レトロウイルスベクターで作製されたiPS細胞に比して、臨床的使用、薬剤評価系、病態モデル系への使用にも適する。【００９６】
[実施例４]ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞の維持培養：
ヒト胚性幹細胞（KhES-3）は京都大学・再生医科学研究所より供与されたものを用いた。KhES-3、及び実施例１〜３に記載のSeV-iPS細胞株は、X線照射処理済みのMEF上で、20%
Knockout Serum Replacement（KSR）（Life Technologies, Inc.）、5ng/ml FGF2、1% non-essential amino acids  solution、100μM  2-mercaptethanol、2mM  L-glutamine含有DMEM/F12（Life  Technologies,Inc.）培地を用いて維持培養を行った。【００９７】
[実施例５]ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞からの褐色脂肪細胞誘導：
褐色脂肪細胞への分化誘導にあたっては、まずKhES-3及びSeV-iPS細胞株からMEFを分離・除去するため、剥離液処理により回収された多能性幹細胞の浮遊液を、遠沈管内で30秒程度静置することで多能性幹細胞のみを選択的に沈降させた。【００９８】
褐色脂肪細胞への分化誘導は次の2段階の工程で行った。
（1）実施例３における多能性幹細胞からなる沈降物を、4 mlの細胞凝集物作製用培地（5 mg/ml BSA、1%体積 合成脂質溶液 、1%体積 x100
ITS-A、450μM MTG、2mM L-Glutamine、5%体積 PFHII、50μg/ml
ascorbic  acid、20ng/ml  BMP4、5ng/ml  VEGF、20ng/ml  SCF、2.5ng/ml  Flt3L、2.5ng/ml  IL6、5ng/ml  IGF2を含有するIMDM/F12培地）に浮遊させ、これを6穴型のMPCコート培養皿に移し入れて、37°Cで5%  CO2インキュベータ内で培養した。以後、3日ごとに半量の培地を交換しながら8〜10日間培養した。なお培地交換は、MPCコート培養皿全体を30度程傾けて1分ほど放置し、細胞凝集物が完全に沈むのを確認した上で、培養上清のみを半量ピペットで静かに吸い出した後、同量の新鮮な細胞凝集物作製用培地を添加し、MPCコート培養皿全体を軽く揺すりながら細胞凝集物を均一に分散させることで行った。【００９９】
（2）上述で作製された多能性幹細胞由来細胞凝集物を、10 ml程度の遠沈管に移し入れ、30秒〜1分ほど静置して細胞成分を沈降させてから、上清を除去して3mlの褐色脂肪細胞誘導培地（5 mg/ml BSA、1%体積 合成脂質溶液 、1%体積x100  ITS-A、450μM  MTG、2mM  L-Glutamine、5%体積  PFHII、50μg/ml  ascorbic  acid、10ng/ml  BMP7、5ng/ml  VEGF、20ng/ml  SCF、2.5ng/ml  Flt3L、2.5ng/ml  IL6、5ng/ml  IGF2 を含有するIMDM/F12培地）を加えて、1100rpmで5分間遠心をした。これを、あらかじめ0.1%ブタゼラチン水溶液で室温で10分間反応させた細胞培養皿に移し入れ、37°Cで5% CO2インキュベータ内で培養した。以後、3日ごとに培地を交換しながら1週間培養した。【０１００】
その結果、図5Aの位相差顕微鏡写真に示すように、細胞質に多胞性脂肪滴（多数の黄身がかった光沢のある球形物）を持つ細胞が得られた。なお、この球形物が脂肪滴であることは、図5Bに示すように、oil red O染色（中性脂肪を紅色に発色させる試験）により確認された。【０１０１】
また、図6に記載のprimerを用いたRT-PCRにより、褐色脂肪細胞に特徴的な遺伝子群（UCP1、PRDM16、PGC1α、Cyt-c、CIDE-A、ELOVL3、PPARα、EVA1、NTRK3）の発現が誘導されていることが、図7に示す電気泳動の通り確認された。さらに、褐色脂肪細胞と白色脂肪細胞の共通マーカーであるPPARγ及びadiponectinの発現が誘導されていることも確認された。一方、白色脂肪細胞のマーカーであるresistin、ホスホセリントランスアミナーゼ1（PSAT1）、エンドセリン受容体アルファ（EDNRA）の発現は誘導されていないことも確認された。
なお、resistinはインスリン抵抗性を惹起するのみならず、癌化や動脈硬化とも関連する遺伝子である。ヒト多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞においてresistinの発現が誘導されていないことは、ヒト多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞を用いた創薬研究はもちろんのこと、ヒト多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞を用いた細胞療法における安全性を考える上で極めて重要な点である。【０１０２】
また、図8の電子顕微鏡観察像に示すように、褐色脂肪細胞に特徴的な微細構造である多胞性脂肪滴、縦に長く融合したミトコンドリアの存在が確認された。更に、褐色脂肪細胞に特徴的な梯子状に発達したクリステがミトコンドリア内部に確認された。【０１０３】
[実施例６]ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞からの褐色脂肪細胞誘導における造血性サイトカインの必要性とBMP7の有効性の確認：
実施例５に記載の方法に準じて、KhES-3及びSeV-iPS細胞株から褐色脂肪細胞分化を行うに当たり、浮遊培養の工程（A）において、造血性サイトカインを添加せずに、サイトカインとして5 ng/ml IGF2と20 ng/ml BMP4だけが添加された培地を用いて培養を行うと、大量の細胞死が誘発されてしまい、細胞凝集物は全く形成されなかった。即ち、造血性サイトカインカクテルは、ヒト多能性幹細胞の褐色脂肪細胞分化過程の前半部に相当する細胞凝集物の作製工程（A）に必須である。
そこで、ヒト多能性幹細胞の褐色脂肪細胞分化過程の後半部における造血性サイトカイン並びにBMP7の必要性について評価を行うために、浮遊培養の工程（A）では、20ng/ml  BMP4、5ng/ml  VEGF、20ng/ml  SCF、2.5ng/ml  Flt3L、2.5ng/ml  IL6、5ng/ml  IGF2を含有する、実施例５の記載された培地を用いて細胞凝集物を作製し、それに続く接着培養の工程（B）において、造血性サイトカインカクテル及びBMP7を含有する培地、または含有しない培地、を用いて培養を行い、UCP1並びにPRDM16の遺伝子発現誘導状状況及び細胞形態を調べた。【０１０４】
その結果、ヒト人工多能性幹細胞を用いた実験においては、接着培養の工程（A）で造血性サイトカインカクテルを含有しない培地（図9A, lane 3）を用いて培養した場合には、UCP1、RPDM16ともに遺伝子発現が誘導されなかった。またBMP7を含有せずにBMP4を含有する培地（図9A, lane 2）を用いて培養した場合は、BMP7を含有する培地（図9A, lane 1）を用いて培養した場合に比べて、UCP1、RPDM16ともに遺伝子発現の誘導が減弱した。
また、図9Bに示すように、細胞を位相差顕微鏡で観察したところ、接着培養の工程（B）で造血性サイトカインカクテルを含有しない培地を用いて培養した場合には、細胞質に脂肪滴を含有する細胞は全く検出されなかった。またBMP7を含有せずにBMP4を含有する培地を用いて培養した場合には、細胞質に脂肪滴を含有する細胞は検出されたものの、BMP7添加培地を用いた場合よりも脂肪滴含有細胞の数は少なかった。
このBMP7の作用効果は、ヒト胚性幹細胞を用いた実験においても同様に確認された（図9C）。【０１０５】
さらに、各々の造血性サイトカイン（VEGF、SCF、Flt3L、IL6）の必要性を確認するために、これらを１つずつ、サイトカインカクテルから除いた分化培地を用いて分化誘導を行った。
まず、ヒト多能性幹細胞の褐色脂肪細胞分化過程の前半部に相当する細胞凝集物の作製工程（A）において、上記の4つのサイトカインを１つずつ除去すると、図9Dの上段（Day 8）に示すように、全てのサイトカインを加えた培地（陽性コントロール）に比べて、細胞凝集物の形態は不整形となり、細胞凝集物に取込まれない死細胞が培地に浮遊するなど、細胞生存性が低下していることが確認された。また、ヒト多能性幹細胞の褐色脂肪細胞分化過程の後半部に相当する細胞凝集物の接着培養の工程（B）において、上記の4つのサイトカインを1つずつ除去すると、図9Dの下段（Day 10）に示すように、全てのサイトカインを加えた培地（陽性コントロール）に比べて、多胞性脂肪滴を持つ細胞の割合は低下した。
これを定量的に評価するために、各々の分化誘導条件において作製された産物からtotal RNAを抽出してRT-PCRを試行した。結果は、図9Eに示すように、全てのサイトカインを加えた培地（陽性コントロール）に比べて、VEGFを除去した際には、PRDM16及びUCP1の誘導が著減することが判明した。また、SCF、Flt3-LまたはIL6を除去した際には、PRDM 16の発現は誘導されるものの、UCP1の発現の誘導は著減することが判明した。さらに、SCF、 Flt3-LまたはIL6を除去した際には、白色脂肪細胞のマーカーであるPSAT1の発現が誘導されることが判明し、褐色脂肪細胞としての分化効率が低下するのみならず、作製された褐色脂肪細胞の品質が低下することが明らかとなった。【０１０６】
[実施例７]ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞から作製された褐色脂肪細胞におけるアドレナリンβ受容体アゴニストによる「熱産生能」の上昇の確認：
実施例５に記載の方法に準じて、KhES-3細胞株及びSeV-iPS細胞から褐色脂肪細胞を作製し、アドレナリン受容体アゴニストであるイソプロテレノールを （100 μM）の濃度で4時間反応させた。アドレナリン受容体アゴニストの添加に伴う褐色脂肪細胞の活性化状況を評価するために、PRDM16及びUCP1の遺伝子発現をRT-PCRにより調べた。
その結果、図10に示すように、イソプロテレノールの添加に依存して、PRDM16遺伝子とともに、熱産生に必須であるUCP1遺伝子の発現が上昇することが確認された。【０１０７】
さらに、ヒト多能性幹細胞から作製した褐色脂肪細胞の生体内における熱産生機能を確認するために、以下の実験を行った。KhES-3細胞株及びSeV-iPS細胞から作製した褐色脂肪細胞（1 x 106 個/ 100 μl 生理食塩水（生食））を、あらかじめ3日前に脱毛処理をしておいた6週齢のマウス（ICR系統）の皮下（背部）に移植した。翌日、イソプロテレノール(30 μmol/kg)を投与し、4時間後に麻酔下でThermo GEAR G120（NEC Avio Infrared Technologies Co., Ltd製）を用いてサーモグラフィ撮影を行った。また陰性コントロールとして、生食（100 μl）及び未分化KhES-3細胞（1 x 106 個/ 100 μl 生食）、または生食（100 μl）及び未分化SeV-iPS細胞（1 x 106 個/ 100 μl 生食）を、それぞれ移植した。
結果は、図11（図11A右, 11B右）に示すように、ヒト多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞を移植したマウスでのみ、移植部において、皮膚温の上昇が確認された。【０１０８】
[実施例８]ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞から作製された褐色脂肪細胞における、アドレナリンβ3受容体アゴニストによるミトコンドリア呼吸能亢進の確認：
実施例５に記載の方法に準じて、KhES-3細胞株及びSeV-iPS細胞株から褐色脂肪細胞を分化誘導した。ここで、分化誘導の接着培養の工程（B）は、XF96 Extracellular Flux Analyzer  (Seahorse Bioscience Inc., Billerica,
MA)に専用の96穴プレートを0.1% ゼラチンでコートしたものを用いて行った。また播種する細胞凝集物の量は、1穴あたり30 個とした。96穴プレートに播種した細胞凝集物を、5%CO2インキュベータ内で37℃で2日間培養した後、半分の穴にイソプロテレノール（100 μM）またはCL316,243（100 nM）を添加し、さらに5%CO2インキュベータ内で37℃で4時間培養した後に、XF96 Extracellular Flux Analyzer  (Seahorse Bioscience Inc.,Billerica,MA)を用いて、1分間当りの酸素消費量（OCR）を測定した。
結果は、図12に示すように、未分化ヒトES細胞（図12A左）や未分化ヒトiPS細胞（図12B左）ではCL316,243投与に伴うOCR値の変化は認めなかったが、ヒトES細胞由来褐色脂肪細胞（図12A右）及びヒトiPS細胞由来褐色脂肪細胞（図12B右）では、CL316,243投与に依存してOCR値の有意な上昇が確認された。同様の結果は、イソプロテレノール刺激においても確認された。またヒト間葉系幹細胞（MSC）から作製した白色脂肪細胞では、CL316,243投与に伴うOCR値の変化は認めず（図12C）、イソプロテレノール投与でも同様であった。【０１０９】
[実施例９]ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞から作製された褐色脂肪細胞の血中の中性脂肪（Triglyceride;TG）の除去効果の確認：
まず最初に、空腹時の血中TGの除去効果について検証した。具体的には、実施例５に記載の方法により、ヒトES細胞（hES-3細胞株）から褐色脂肪細胞を作製した。このヒトES細胞由来褐色脂肪細胞（1 x 106 個）を、6週齢のマウス（ICR系統）の皮下（背部）に移植した。16時間の絶食の後にイソプロテレノール(30 μmol/kg)を投与し、さらに2時間後に外側足根静脈より少量の血液サンプル(〜5μl)を採取して、Accutrend Plus(登録商標)(F.Hoffmann-La Roche,Ltd.,Basel,Switzerland)を用いてTG値（mM/L）を測定した。なお陰性コントロールとしては、未分化ヒトES細胞（KhES-3株）を用いた。また陽性コントロールとしては、ヒト間葉系幹細胞(mesenchymal  stem  cells;MSC,Lonza  Group  Ltd.,Basel,Switzerland)より脂肪細胞分化誘導キット（hMSC  Differentiation  BulletKitTM,Adipogenic,Lonza  Group  Ltd）を用いて作製した白色脂肪細胞 (WA)を用いて実験を行った。
結果は、図13Aに示すように、ヒトES細胞由来褐色脂肪細胞の移植により空腹時の血中TG値が有意に低下することが確認された。かつ、ヒトES細胞由来褐色脂肪細胞のTG値低下効果は、ヒトMSC由来白色脂肪細胞のそれよりも顕著であった。【０１１０】
次に、経口脂肪負荷後の血中TGの除去効果について検証した。具体的には、実施例５に記載の方法により、ヒトiPS細胞（SeV-iPS細胞株）から褐色脂肪細胞を作製した。このヒトiPS細胞由来褐色脂肪細胞（1 x 106 個）を、6週齢のマウス（ICR系統）の皮下（背部）に移植した。16時間の絶食の後、イソプロテレノール(15μmol/kg)を投与し、2時間後にオリーブオイル（200μl）をゾンデで経口投与した。イソプロテレノール投与以後は2時間毎に、外側足根静脈より少量の血液サンプル(〜5μl)を採取して、Accutrend
Plus(登録商標)(F. Hoffmann-La Roche, Ltd.)によりTG値（mM/L）を測定した。陰性コントロールとしては、未分化ヒトiPS細胞（SeV-iPS株）（1 x
106 個）を移植して同様の実験を行った。
結果は、図13Bに示すように、ヒトiPS細胞由来褐色脂肪細胞の移植により、オリーブオイル負荷後の血中TG値の上昇は有意に抑制された。
以上より、ヒトES細胞由来褐色脂肪細胞及びヒトiPS細胞由来褐色脂肪細胞には、血中TGを除去する作用があることが示され、これらが生体内で脂質代謝改善効果を発揮することが確認された。
なお、この脂質代謝改善効果の基盤としては、ヒト多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞が血中TGを直接に取込んだ可能性、ヒト多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞が分泌するアディポカインが他臓器（肝臓、骨格筋、白色脂肪細胞等）に作用して脂質代謝を改善した可能性、またはその両方、が考えられる。【０１１１】
[実施例１０]ヒト胚性幹（ES）細胞から作製された褐色脂肪細胞の糖代謝改善効果の確認：
実施例５に記載の方法に準じて、KhES-3細胞株から褐色脂肪細胞を作製した。このヒトES細胞由来褐色脂肪細胞（1 x 106 個）を、6週齢のマウス（ICR系統）の皮下（背部）に移植した。16時間の絶食の後にイソプロテレノール(30 μmol/kg)を投与し、さらに3時間45分後に、ゾンデを用いて経口的にブドウ糖（2 mg/マウス体重(g)）を投与した。ブドウ糖投与前、投与後15分、30分、60分後に採血し、血中ブドウ糖濃度（血糖値）を測定した（図14A）。またコントロールとして、ヒトMSCから作製した白色脂肪細胞を用いても同様の実験を行った。
結果は、図14Bに示すように、ヒトES細胞由来褐色脂肪細胞を移植した個体では、ヒトMSC由来白色脂肪細胞を移植した個体と比して、有意に空腹時血糖値が低下することが確認された。また図14Cに示すように、ブドウ糖負荷30分後の血糖値に関しては、ヒトES細胞由来褐色脂肪細胞を移植した個体では、ヒトMSC由来白色脂肪細胞を移植した個体に比して、有意な血糖値の低下が確認された。
さらに、ヒト多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞の、肥満に伴う糖代謝異常の治療効果を検証するために、ヒトMSC由来白色脂肪細胞の移植による耐糖能悪化状態が、ヒトES細胞由来褐色脂肪細胞の共移植により改善されるかどうかを調べた。図14Dに示すように、ヒトMSC由来白色脂肪細胞の移植個体において上昇したブドウ糖負荷30分後の血糖値は、同数（1x106 個）のヒトES細胞由来褐色脂肪細胞を同時に移植しておくことで、有意に低下することが実証された。即ち、ヒトES細胞由来褐色脂肪細胞は、ヒトMSC由来白色脂肪細胞が惹起する耐糖能異常、即ち肥満状態における糖代謝異常に対して、有意な治療効果を発揮することが示された。
以上の通り、ヒトES細胞由来褐色脂肪細胞とヒトMSC由来白色脂肪細胞は、どちらも脂肪代謝改善効果は認めているが、糖代謝に関しては、ヒトES細胞由来褐色脂肪細胞においてのみ改善効果があることが確認された。
なお、この糖代謝改善効果の基盤としては、ヒト多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞が血中ブドウ糖を直接に取込んだ可能性、ヒト多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞が分泌するアディポカインが他臓器（肝臓、骨格筋、白色脂肪細胞、膵β細胞等）に作用して糖代謝を改善した可能性、またはその両方、が考えられる。【０１１２】
[実施例１１]ヒト胚性幹細胞から作製された褐色脂肪細胞における活性酸素非産生性の確認：
実施例５に記載の方法に準じて、KhES-3細胞株から褐色脂肪細胞を分化誘導した。そして、細胞内活性酸素種のプローブとして汎用されている2,7-dichlorodihydroflurescein diacetate （DCFDA）を200 μM添加し、活性酸素種の産生状況を蛍光顕微鏡観察により評価した。なお陽性コントロールとして、活性酸素種の恒常的産生が認められるヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を用いて同様の実験を行った。
結果は、図15に示すように、HUVECにおいては、細胞内活性酸素種により蛍光活性を獲得したDCFDAのシグナルが検出されたが、ヒトES細胞由来褐色脂肪細胞では全くシグナルは検出されなかった。
以上より、ヒト胚性幹細胞由来褐色脂肪細胞は、その高いUCP-1発現により、活性酸素種を産生しないことが確認された。この事実は、冠動脈バイパス手術における脂肪移植療法において、ヒト多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞を用いることの安全性ならびに有効性を強く示唆するものである。【０１１３】
[実施例１２]ヒト胚性幹細胞から作製された褐色脂肪細胞における造血ストロマ機能の確認：
実施例５に記載の方法により、直径6 cmの培養皿を用いて、ヒトES細胞（KhES-3細胞株）から褐色脂肪細胞を作製した。そして図16Aに記載の方法により、ヒトES細胞由来褐色脂肪細胞の造血支持能を評価した。具体的には、ヒトES細胞由来褐色脂肪細胞をγ線照射（40Gy）により増殖を停止させ、さらに培地を10% 牛胎仔血清を含有するRPMI1640培地（リコンビナント・サイトカインは一切添加しない）に交換した上で、6 x 105 個のヒト臍帯血CD34陽性細胞（造血幹/前駆細胞）をヒトES細胞由来褐色脂肪細胞の上で培養した。7日後に浮遊細胞を回収し、生理的食塩水（生食）で1回洗浄した後、2 x 105 cells/10 μL（生食）の細胞混濁液を作製して、6週齢のメスのnon-obese
diabetic/severe combined immunodeficiency (NOD/SCID)/γcnull (NOG) マウス の大腿骨骨髄内に移植した。なお骨髄内細胞移植（intra-bone marrow transplantation）は汎用の方法に従った（詳細は、非特許文献８など）。移植後は、6週、8週、12週後にマウスを安楽死させて骨髄、脾臓、胸腺から造血細胞を回収し、ヒト特異的CD45抗体（汎白血球マーカー）、ヒト特異的CD33抗体（骨髄系細胞マーカー）、ヒト特異的CD19抗体（B細胞マーカー）、ヒト特異的CD3抗体（T細胞マーカー）を用いたフローサイトメトリーによりキメラ率（マウス個体内におけるヒト血球の陽性率）を計算した。なおコントロールとして、ヒト臍帯血CD34陽性細胞を培養せずにそのまま移植する実験（以下、直接移植と記載）も行った。【０１１４】
結果は、１）脾臓におけるヒトCD45陽性細胞の陽性率は、ヒトES細胞由来褐色脂肪細胞との共培養群では、直接移植群に比して有意に増加する（図16B）、２）脾臓におけるヒトCD33陽性細胞の陽性率は、ヒトES細胞由来褐色脂肪細胞との共培養群では、直接移植群に比して有意に増加する（図16C）、ことが確認された。このことは、ヒトES細胞由来褐色脂肪細胞が、骨髄系造血前駆細胞（顆粒球やマクロファージの前駆細胞）の増殖と分化を支持するストロマとして機能することを意味する。
上記の知見は、ヒトES細胞由来褐色脂肪細胞おけるサイトカイン遺伝子の発現を調べた結果からも検証された。図16Dに示すように、ヒトES細胞由来褐色脂肪細胞おいて多種類の造血性サイトカイン（thrombopoietin;TPO,IL6,IL3,granulocyte  colony-stimulating  factor;G-CSF,granulocyte/macrophage  colony-stimulating  factor;GM-CSF,erythropoietin;EPO）が発現するが、ヒトMSC由来白色脂肪細胞ではIL6などの限られたサイトカインしか発現していなかった。さらに、図16Eに示すように、ヒトES細胞由来褐色脂肪細胞におけるこれらのサイトカイン（TPO,IL6,IL3,G-CSF,GM-CSF,EPO）の発現量は、褐色脂肪細胞刺激剤であるイソプロテレノールで処理することにより増加することが確認された。
さらに、抗癌剤投与時の重大な副作用である骨髄抑制に対して、褐色脂肪細胞刺激剤が緩和効果を発揮するかどうかを調べた。具体的には、10週齢のマウス（雄、ICR系統）に、抗癌剤である5-fluorouracil(5-FU)を100 mg/kgの用量で投与し、3〜6日後にかけてイソプロテレノール（30μmol/kg）または生食を投与し、経時的に大腿骨から骨髄細胞を回収して細胞数を計測した。結果は、図16Fに示すように、5-FU投与3日後に骨髄抑制は最大になるが、褐色脂肪細胞刺激剤であるイソプロテレノール（ISO）を投与したマウスでは、5-FU投与7日後の骨髄細胞数は有意に上昇していた（P=0.032）。即ち、褐色脂肪細胞刺激剤は、抗癌剤投与に伴う骨髄抑制を緩和し、骨髄抑制からの回復を早めることが示された。
従来の造血支持細胞に関する研究では、造血幹細胞のニッシェ（細胞周期をG0期にとどめることに寄与する細胞集団で、未熟骨芽細胞や類洞内皮細胞から構成される）のみが対象となっており、「特定系列にコミットした造血前駆細胞」の造血支持に寄与するストロマ細胞に関しては手つかずであった。しかし、本結果により、褐色脂肪細胞が骨髄系造血前駆細胞のストロマとして機能することが示された。このことは、造血障害性疾患や、抗癌剤治療後の骨髄抑制（感染防御機能低下により敗血症などの重症感染症の引き金となる）の期間短縮のための細胞療法に、ヒト多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞が有用であることを示すものである。
なお、この造血機能の向上効果は、ヒト多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞と骨髄系造血前駆細胞との直接の細胞間相互作用を介してもたらされた可能性、ヒト多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞が分泌するアディポカインが骨髄系造血前駆細胞に間接的に作用して造血機能を向上させた可能性、またはその両方、が考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明によると、これまで全く供給手段がなかったヒト褐色脂肪細胞を安定に供給することが可能となり、ヒトにおける褐色脂肪細胞の発生・分化・脱分化などの解析のための研究ツール、並びに、肥満・インスリン抵抗性・高脂血症などに対する細胞療法ツール、冠動脈バイパス手術の成績向上に向けた移植材料、さらには造血障害疾患や抗癌剤投与後骨髄抑制に対する細胞療法ツールの提供が可能となる。また、肥満・インスリン抵抗性・高脂血症、冠動脈バイパス手術の成績向上、造血障害疾患や抗癌剤投与後骨髄抑制に対する新規内科療法の開発に向けた、褐色脂肪細胞特異的アディポカインの探索のための研究ツールの提供が可能となる。
本発明による褐色脂肪細胞の出発材料の一つであるヒトES細胞やヒトiPS細胞などは無限増殖能をもつことから、工業的スケールで安定的に生産することが極めて容易である。また、褐色脂肪細胞は、ヒト多能性幹細胞から2週間程度で作製可能であり、需要に応じた供給も可能である。また、その褐色脂肪細胞の作製技術は、汎用の細胞培養設備のみを使用することから、世界のあらゆる国と地域において実施が可能であるので、巨大プラント産業に展開し得て、実用的であり産業上利用価値が高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９ＡＢＣ】
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【図９ＤＥ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６ＢＣＤ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年12月9日(2013.12.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
その結果、ヒト人工多能性幹細胞を用いた実験においては、接着培養の工程（B）で造血性サイトカインカクテルを含有しない培地（図9A, lane 3）を用いて培養した場合には、UCP1、RPDM16ともに遺伝子発現が誘導されなかった。またBMP7を含有せずにBMP4を含有する培地（図9A, lane 2）を用いて培養した場合は、BMP7を含有する培地（図9A, lane 1）を用いて培養した場合に比べて、UCP1、RPDM16ともに遺伝子発現の誘導が減弱した。
また、図9Bに示すように、細胞を位相差顕微鏡で観察したところ、接着培養の工程（B）で造血性サイトカインカクテルを含有しない培地を用いて培養した場合には、細胞質に脂肪滴を含有する細胞は全く検出されなかった。またBMP7を含有せずにBMP4を含有する培地を用いて培養した場合には、細胞質に脂肪滴を含有する細胞は検出されたものの、BMP7添加培地を用いた場合よりも脂肪滴含有細胞の数は少なかった。
このBMP7の作用効果は、ヒト胚性幹細胞を用いた実験においても同様に確認された（図9C）。
【国際調査報告】
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