(57)【要約】[課題]センサ構造体の大型化を防止してセンサ構造体の低コスト化および取扱性の向上を可能にしつつ、ＳＰＦＳ装置の設置時やメンテナンス時に光源の取り付け誤差等に対して光学的補正を行うことができ、蛍光検出精度を高精度に維持することのできる表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこれに用いられるセンサ構造体、ならびにこのセンサ構造体に配設される補助誘電体部材を提供すること。[解決手段]誘電体部材の上面に形成された金属薄膜に、誘電体部材側から全反射条件となる入射角（θａ）で励起光を照射し、前記金属薄膜上の電場を増強させることにより、前記金属薄膜上に形成されたリガンド含有層の蛍光物質を励起させ、これにより増強された蛍光を光検出手段にて検出するようにした表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体であって、前記センサ構造体は、主誘電体部材と、前記主誘電体部材の上面に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜の上面に形成されたリガンド含有層と、から少なくとも構成され、前記主誘電体部材が、その下面に補助誘電体部材を光学的に接合可能とする接合面を有する。
2012067013.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘電体部材の上面に形成された金属薄膜に、誘電体部材側から全反射条件となる入射角（θａ）で励起光を照射し、前記金属薄膜上の電場を増強させることにより、前記金属薄膜上に形成されたリガンド含有層の蛍光物質を励起させ、これにより増強された蛍光を光検出手段にて検出するようにした表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体であって、
前記センサ構造体は、
主誘電体部材と、
前記主誘電体部材の上面に形成された金属薄膜と、
前記金属薄膜の上面に形成されたリガンド含有層と、
から少なくとも構成され、
前記主誘電体部材が、
その下面に補助誘電体部材を光学的に接合可能とする接合面を有することを特徴とするセンサ構造体。
【請求項２】
前記主誘電体部材は、全反射条件となる入射角（θａ）で励起光を照射するための励起光の入射面を備える一方、全反射点を検出するための励起光の入射面を備えないことを特徴とする請求項１に記載のセンサ構造体。
【請求項３】
前記補助誘電体部材は、全反射点を検出するための励起光の入射面を備えることを特徴とする請求項１または２に記載のセンサ構造体。
【請求項４】
前記主誘電体部材と前記補助誘電体部材との光学的接合が、
マッチングオイル，マッチングシートおよび光学接着剤から選択されたいずれかを用いて行われることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のセンサ構造体。
【請求項５】
前記主誘電体部材が、ガラスまたは樹脂から成ることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載のセンサ構造体。
【請求項６】
前記補助誘電体部材が、ガラスまたは樹脂から成ることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載のセンサ構造体。
【請求項７】
前記主誘電体部材と前記補助誘電体部材との光学的に接合されるそれぞれの接合面のいずれか一方側面に、他方側面に向かって膨出した膨出部を有することを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載のセンサ構造体。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載のセンサ構造体の主誘電体部材の下面に光学的に接合されるよう構成された補助誘電体部材であって、
全反射点を検出するための励起光の入射面を備えたことを特徴とする補助誘電体部材。
【請求項９】
請求項１から７のいずれかに記載のセンサ構造体を装填可能であるとともに、
請求項８に記載の補助誘電体部材を光学的に接合した請求項１から７のいずれかに記載のセンサ構造体を装填可能であることを特徴とする表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）の原理に基づいた表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこの表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体、さらにはこのセンサ構造体に配設される補助誘電体部材に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、ナノメートルレベルなどの微細領域中で電子と光とが共鳴することにより、高い光出力を得る現象（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Surface Plasmon Resonance）現象）を応用した表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）の原理に基づき、高精度に所望のアナライト検出を行えるようにした表面プラズモン励起増強蛍光測定装置（以下、ＳＰＦＳ装置ともいう）が開発され、例えばバイオテクノロジーなどの分野で利用されている（例えば特許文献１，２）。【０００３】
このようなＳＰＦＳ装置１００の基本的な構造は、図１０に示したように、まず誘電体部材１０２と、誘電体部材１０２の主面上に形成された金属薄膜１０４と、金属薄膜１０４の上面に形成され、流路１０８上の所定位置にリガンドが固定化されたＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）を備えたリガンド含有層１０６と、を有するセンサ構造体１１０を備えている。【０００４】
そして、センサ構造体１１０の誘電体部材１０２側には、誘電体部材１０２内に入射され、金属薄膜１０４に向かって全反射条件となる入射角（θａ）で励起光１１２を照射する光源１１４を備え、さらに光源１１４から照射され金属薄膜１０４で反射した反射光１１６を受光する受光手段１１８が備えられている。【０００５】
なお光源１１４および受光手段１１８には、ＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）の略中央を中心として円弧状に移動可能な移動調整手段１３０，１３２がそれぞれ設けられ、これにより光源１１４より照射される励起光１１２の照射角度および受光手段１１８による反射光１１６の受光位置が調整されるようになっている。【０００６】
一方、センサ構造体１１０のリガンド含有層１０６側には、ＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）で固定化されたアナライトを標識した蛍光物質が発する蛍光１２０を受光する光検出手段１２２が設けられている。【０００７】
なお、リガンド含有層１０６のＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）と光検出手段１２２との間には、蛍光１２０を効率良く集光するための集光部材１２４と、蛍光１２０以外に含まれる光を除去し、必要な蛍光１２０のみを選択する波長選択機能部材１２６が設けられている。【０００８】
そして、ＳＰＦＳ装置１００の使用においては、リガンド含有層１０６のＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）内に流路１０８を介してアナライトを有する試料溶液を流入させ、その後、このアナライトを標識する蛍光物質を、同様に流路１０８を介して流入させることで、ＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）に蛍光物質で標識されたアナライトが固定化された状態とする。【０００９】
そして、この状態で光源１１４より誘電体部材１０２を介して金属薄膜１０４に全反射条件となる入射角（θａ）で励起光１１２を照射することで、金属薄膜１０４の表面からエバネッセント波が放出され、金属薄膜１０４上の電場が増強されることとなる。【００１０】
なお、金属薄膜１０４上に表面プラズモンが生ずる際には、励起光１１２と金属薄膜１０４中の電子振動とがカップリングし、反射光１１６の光量減少という現象が生ずる。
このため、受光手段１１８で受光される反射光１１６の光量が減少する地点を見つければ、表面プラズモンが生ずる入射角（θａ）を得ることができる。【００１１】
そして、このエバネッセント波によりＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）の全面に固定化された蛍光物質による蛍光１２０を励起させる。
ここで、全反射条件となる入射角（θａ）は、金属薄膜１０４の材質や膜厚，誘電体部材１０２の材質や励起光１１２の入射面１２８における傾斜角度（θｂ）などの様々な条件によって変化するため、これらの情報を予めデータベース化しておくことで、所定条件に合わせた入射角（θａ）が得られるようになっている。【００１２】
なお、金属薄膜１０４の電場増強具合は、電場増強具合に比例して多くなる金属薄膜１０４上面側の散乱光（図示せず）の光量を光検出手段１２２などで検出することで確認でき、この散乱光の光量が一番多くなるときの励起光１１２の照射角度が、高い電場増強効果の得られる入射角（θａ）である。【００１３】
実際には、金属薄膜１０４に全反射条件となる入射角（θａ）で照射される励起光１１２は、光源１１４から誘電体部材１０２を介して金属薄膜１０４に照射されるため、誘電体部材１０２の入射面１２８が持つ傾斜角度（θｂ）を考慮して、光源１１４から金属薄膜１０４へ照射される励起光１１２の照射角度が決められている。【００１４】
そして、エバネッセント波によって励起されたＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）全面の蛍光１２０を集光部材１２４および波長選択機能部材１２６を介して光検出手段１２２で検出することで、極微量および／または極低濃度のアナライトが検出できるようになっている。【００１５】
ところで全反射条件となる入射角（θａ）を得る場合に、例えば金属薄膜１０４の膜厚などの条件値に誤りが有ると電場増強具合が悪くなって蛍光１２０が充分に励起されず、蛍光検出精度が低下してしまうこととなる。【００１６】
このため金属薄膜１０４へ照射される励起光１１２の入射角（θａ）の正誤の確認を、ＳＰＦＳ装置１００の起動時やメンテナンス時など一定期間毎に行うようにしており、この確認は、例えば金属薄膜１０４へ照射された励起光１１２の反射率を受光手段１１８で検出し、この反射率が最も高くなる励起光１１２の入射角（θｃ）を求め、この値を元にして行われている。なお、金属薄膜１０４へ照射された励起光１１２の反射率の値が最も高くなるポイントは、全反射点と呼ばれる。【００１７】
上記した全反射条件となる入射角（θａ）と同様、この全反射点についても、金属薄膜１０４や誘電体部材１０２の条件によってそのポイントが移動することから、例えば求めた全反射点から金属薄膜１０４の膜厚を逆算し、この膜厚の逆算値と、入射角（θａ）を求める際に使用した条件値との整合性が取れているか否かを確認し、整合性が取れていない場合には光学的補正を加えることで、ＳＰＦＳ装置１００の蛍光検出における精度を高精度に維持している。【００１８】
ここで金属薄膜１０４に照射される全反射条件の励起光１１２の入射角（θａ）と、全反射点の入射角（θｃ）とは、図１０に示したように照射角度が異なる。
これは、図１１に示した散乱光量と励起光１１２の入射角（θａ）との関係を表した点線のグラフ、および反射率と励起光１１２の入射角（θｃ）との関係を表した実線のグラフから、散乱光量が最大となるときの角度すなわち電場増強効果が最大となる入射角（θａ）と、反射率が最大となる入射角（θｃ）とで異なっており、このことからも明らかである。【００１９】
全反射点を求める際には、光源１１４を移動調整手段１３０で誘電体部材１０２の入射面１２８に沿って円弧状に移動させることで、光源１１４からの励起光１１２を入射角（θｃ）で金属薄膜１０４へ照射するようにすれば良い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】特許第３２９４６０５号公報
【特許文献２】特開２００６−２０８０６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
ところで、上記したような従来のセンサ構造体１１０における誘電体部材１０２は、通常、四角錐形状等であるため、高さ方向の厚みがどうしても厚くなる。
しかもセンサ構造体１１０には、リガンド含有層１０６の流路１０８に送液するためのポンプ（図示せず）やチューブ（図示せず）が取り付けられる場合があり、その場合には更にセンサ構造体１１０全体がかなりの大きさとなる。【００２２】
このように誘電体部材１０２が厚く大型であり、センサ構造体１１０が大型になると、その製造コストを抑えることが難しいことに加えて、センサ構造体１１０の取り扱いが困難となる。【００２３】
本発明はこのような現状に鑑みなされたものであって、センサ構造体の大型化を防止してセンサ構造体の低コスト化および取扱性の向上を可能にしつつ、ＳＰＦＳ装置の設置時やメンテナンス時に光源の取り付け誤差等に対して光学的補正を行うことができ、蛍光検出精度を高精度に維持することのできる表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこれに用いられるセンサ構造体、ならびにこのセンサ構造体に配設される補助誘電体部材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、前述したような従来技術における問題点を解決するために発明されたものであって、
本発明のセンサ構造体は、
誘電体部材の上面に形成された金属薄膜に、誘電体部材側から全反射条件となる入射角（θａ）で励起光を照射し、前記金属薄膜上の電場を増強させることにより、前記金属薄膜上に形成されたリガンド含有層の蛍光物質を励起させ、これにより増強された蛍光を光検出手段にて検出するようにした表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体であって、
前記センサ構造体は、
主誘電体部材と、
前記主誘電体部材の上面に形成された金属薄膜と、
前記金属薄膜の上面に形成されたリガンド含有層と、
から少なくとも構成され、
前記主誘電体部材が、
その下面に補助誘電体部材を光学的に接合可能とする接合面を有することを特徴とする。【００２５】
このように主誘電体部材が、下面に補助誘電体部材を光学的に接合可能とする接合面を有していれば、従来の四角錐形状等の誘電体部材と比べて高さを低くすることができるので、センサ構造体を小型化でき、これにより表面プラズモン励起増強蛍光測定装置を小型化させることができる。【００２６】
また、光学的補正が必要な時にのみ、主誘電体部材の接合面に補助誘電体部材を光学的に接合すれば、主誘電体部材だけの時よりも、励起光の入射面範囲が光源の移動方向に対して広くなるため、全反射条件となる入射角（θａ）の他に、全反射点の入射角（θｃ）も得ることができる。
したがって光学的補正を行うことができ、蛍光検出精度を高精度に維持することができる。【００２７】
また、本発明のセンサ構造体は、
前記主誘電体部材は、全反射条件となる入射角（θａ）で励起光を照射するための励起光の入射面を備える一方、全反射点を検出するための励起光の入射面を備えないことを特徴とする。【００２８】
さらに、本発明のセンサ構造体は、
前記補助誘電体部材は、全反射点を検出するための励起光の入射面を備えることを特徴とする。【００２９】
このように主誘電体部材の入射面と、補助誘電体部材の入射面とを設定しておけば、主誘電体部材から補助誘電体部材を着脱することにより、全反射点を見つけることができるようにしたり、できなくしたりすることが簡単にできる。【００３０】
したがって、全反射点の入射角（θｃ）を得る際にのみ、主誘電体部材に補助誘電体部材を光学的に接合し、通常は主誘電体部材だけで全反射条件となる入射角（θａ）を得るようにすれば良い。したがって、全反射点の入射角（θｃ）を求めるための補助誘電体部材は、センサ構造体と同じ個数用意する必要はない。【００３１】
これにより通常使用時は、センサ構造体の高さを低くして使用し、センサ構造体の低コスト化および取扱性を向上させることができるとともに、光学的補正時には、主誘電体部材に補助誘電体部材を光学的に接合することで、ＳＰＦＳ装置の設置時やメンテナンス時に光源の取り付け精度や、この取り付け精度に基づく励起光の入射角度のずれ等の角度補正を容易に行うことができる。【００３２】
また、本発明のセンサ構造体は、
前記主誘電体部材と前記補助誘電体部材との光学的接合が、
マッチングオイル，マッチングシートおよび光学接着剤から選択されたいずれかを用いて行われることを特徴とする。【００３３】
このようなものを用いて光学的接合を行えば、主誘電体部材と補助誘電体部材との光学的接合を確かなものとし、所望の光学特性を得ることができる。したがって蛍光検出を高精度に行うことができる。【００３４】
また、本発明のセンサ構造体は、
前記主誘電体部材が、ガラスまたは樹脂から成ることを特徴とする。
このような材質から成れば、高透明性であるため、主誘電体部材の材質として好適である。特に樹脂製であれば、射出成形により複雑な形状を成形でき好適である。【００３５】
また、本発明のセンサ構造体は、
前記補助誘電体部材が、ガラスまたは樹脂から成ることを特徴とする。
このような材質から成れば、高透明性であるため、補助誘電体部材の材質として好適である。特に樹脂製であれば、射出成形により複雑な形状を成形でき好適である。【００３６】
また、本発明のセンサ構造体は、
前記主誘電体部材と前記補助誘電体部材との光学的に接合されるそれぞれの接合面のいずれか一方側面に、他方側面に向かって膨出した膨出部を有することを特徴とする。【００３７】
このように接合面のいずれか一方側面が、他方側面に向かって膨出した膨出部を有していれば、光学的接合の際に主誘電体部材と補助誘電体部材との間にエアーが入ってしまうことを確実に防止することができる。【００３８】
したがって所望の光学特性を得ることができ、蛍光検出を精度良く行うことができる。
なお、補助誘電体部材を樹脂製とした場合には、特に成形性の観点から補助誘電体部材側に主誘電体部材側に向かって膨出した膨出部備えることが好ましい。【００３９】
また、本発明の補助誘電体部材は、
上記のいずれかに記載のセンサ構造体の主誘電体部材の下面に光学的に接合されるよう構成された補助誘電体部材であって、
全反射点を検出するための励起光の入射面を備えたことを特徴とする。【００４０】
このように構成された補助誘電体部材であれば、例えば光学的補正が必要な時にだけ主誘電体部材に接合して使用するようにすることができる。
また主誘電体部材と補助誘電体部材との光学的接合を、マッチングオイルまたはマッチングシートを用いて行えば、両者が着脱自在であるため、繰り返し使用することができ、例えば装置のメンテナンス時にサービスマンが補助誘電体部材を所持して、その都度、主誘電体部材に光学的に接合して使用するようにすることができる。【００４１】
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
上記のいずれかに記載のセンサ構造体を装填可能であるとともに、
上記に記載の補助誘電体部材を光学的に接合した上記のいずれかに記載のセンサ構造体を装填可能であることを特徴とする。【００４２】
このように下面に補助誘電体部材を光学的に接合できるよう構成された主誘電体部材を備えたセンサ構造体を用いて蛍光検出を行えば、光学的補正などの際に必要となる全反射点を求める機能を追加したり制限したりすることが容易である。【００４３】
また、通常の使用時には主誘電体部材のみとした高さの低いセンサ構造体を使用でき、センサ構造体の低コスト化および取扱性の向上ができるとともに、光学的補正を行う際に、通常の使用時と同じセンサ構造体の、主誘電体部材に補助誘電体部材を光学的に接合して使用するので、表面プラズモン励起増強蛍光測定装置自体で発生した光源の取り付け精度やこの取り付け精度に基づく励起光の入射角度のずれ等の角度補正を簡易に行うことができる。
【発明の効果】
【００４４】
本発明によれば、主誘電体部材の下面に補助誘電体部材を光学的に接合できるよう構成しているので、通常使用時、すなわち全反射条件となる入射角（θａ）を得る際には主誘電体部材のみとし、光学的補正を行う時、すなわち全反射点の入射角（θｃ）を得る際には、主誘電体部材に補助誘電体部材を接合して使用するようにすることができる。【００４５】
したがって、通常使用時にはセンサ構造体の大型化を防止してセンサ構造体の低コスト化および取扱性の向上を可能にしつつ、装置設置時やメンテナンス時などでの必要の際に、主誘電体部材の下面に補助誘電体部材を接合したセンサ構造体を使用することで光学的補正が可能であり、蛍光検出を高精度に行うことのできる表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこれに用いられるセンサ構造体、ならびにこのセンサ構造体に配設される補助誘電体部材を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置の概略図である。
【図２】図２は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置において、主誘電体部材の下面に補助誘電体部材を光学的に接合した状態を示した概略図である。
【図３】図３は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体の実施形態における概略図である。
【図４】図４は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体の他の実施形態における概略図である。
【図５】図５は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体の他の実施形態における概略図である。
【図６】図６は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体の他の実施形態における概略図である。
【図７】図７は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体の他の実施形態における概略図である。
【図８】図８は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体の他の実施形態における概略図である。
【図９】図９は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体の他の実施形態における概略図である。
【図１０】図１０は、従来の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置の概略図である。
【図１１】図１１は、電場増強効果が最大となる入射角（θａ）と、全反射点の入射角（θｃ）の関係を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
以下、本発明の実施の形態について、図面に基づいてより詳細に説明する。
図１は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置の概略図、図２は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置において、主誘電体部材の下面に補助誘電体部材を光学的に接合した状態を示した概略図、図３は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体の実施形態における概略図である。
【００４８】
本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）およびこれに用いられるセンサ構造体、ならびにこのセンサ構造体に配設される補助誘電体部材は、センサ構造体の大型化を防止してセンサ構造体の低コスト化および取扱性の向上を可能にしつつ、ＳＰＦＳ装置の設置時やメンテナンス時に光源の取り付け誤差等に対して光学的補正を行うことができ、蛍光検出精度を高精度に維持することのできるものである。
また、本明細書中でいう「表面プラズモン」とは、広義の意味で用いられるものであって、「局在プラズモン」についても含まれるものである。
【００４９】
＜表面プラズモン励起増強蛍光測定装置１０＞
本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置（以下、ＳＰＦＳ装置ともいう）１０は、図１に示したように、まず主誘電体部材１２ａと、主誘電体部材１２ａの主面上に形成された金属薄膜１４と、金属薄膜１４の上面に形成され、流路１８上の所定位置にリガンドが固定化されたＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）を備えたリガンド含有層１６と、を有するセンサ構造体２０を備えている。
【００５０】
そして、センサ構造体２０の主誘電体部材１２ａ側には、主誘電体部材１２ａ内に入射され、金属薄膜１４に向かって全反射条件となる入射角（θａ）で励起光２２を照射する光源２４を備え、さらに光源２４から照射され金属薄膜１４で反射した反射光２６を受光する受光手段２８が備えられている。
【００５１】
なお光源２４および受光手段２８には、ＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）の略中央部分を中心として円弧状に移動可能な移動調整手段４０，４２がそれぞれ設けられ、これにより励起光２２の照射角度および受光手段２８による反射光２６の受光位置が調整されるようになっている。
【００５２】
光源２４から照射される励起光２２としてはレーザ光が好ましく、波長２００〜９００ｎｍ、０．００１〜１，０００ｍＷのＬＤレーザ、または波長２３０〜８００ｎｍ、０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザが好適である。
【００５３】
一方、センサ構造体２０のリガンド含有層１６側には、ＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）で固定化されたアナライトを標識した蛍光物質が発する蛍光３０を受光する光検出手段３２が設けられている。
【００５４】
光検出手段３２としては、超高感度の光電子増倍管、または多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサを用いることが好ましい。
なお、リガンド含有層１６のＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）と光検出手段３２との間には、蛍光３０を効率良く集光するための集光部材３４と、蛍光３０以外に含まれる光を除去し、必要な蛍光３０のみを選択する波長選択機能部材３６が設けられている。
【００５５】
集光部材３４としては、光検出手段３２に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであれば、任意の集光系で良い。簡易な集光系としては、顕微鏡などで使用されている市販の対物レンズを転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。
【００５６】
一方、波長選択機能部材３６としては、光学フィルタ，カットフィルタなどを用いることができる。
光学フィルタとしては、減光（ＮＤ）フィルタ，ダイアフラムレンズなどが挙げられる。
【００５７】
さらにカットフィルタとしては、外光（装置外の照明光），励起光（励起光の透過成分），迷光（各所での励起光の散乱成分），プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、センサ構造体の表面上の構造物または付着物などの影響で発生する散乱光），酵素蛍光基質の自家蛍光などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば干渉フィルタ，色フィルタなどが挙げられる。
【００５８】
そして、ＳＰＦＳ装置１０の使用においては、リガンド含有層１６のＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）内に流路１８を介してアナライトを有する試料溶液を流入させ、その後、このアナライトを標識する蛍光物質を、同様に流路１８を介して流入させることで、ＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）に蛍光物質で標識されたアナライトが固定化された状態とする。
【００５９】
そして、この状態で光源２４より主誘電体部材１２ａを介して金属薄膜１４に全反射条件となる入射角（θａ）で励起光２２を照射することで、金属薄膜１４の表面からエバネッセント波が放出される。
【００６０】
なお、金属薄膜１４上に表面プラズモンが生ずる際には、励起光２２と金属薄膜１４中の電子振動とがカップリングし、反射光２６の光量減少という現象が生ずる。
このため、受光手段２８で受光される反射光２６の光量が減少する地点を見つければ、表面プラズモンが生ずる入射角（θａ）を得ることができる。
【００６１】
そして、このエバネッセント波によりＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）の全面に固定化された蛍光物質による蛍光３０を励起させる。
ここで、全反射条件となる入射角（θａ）は、金属薄膜１４の材質や膜厚，主誘電体部材１２ａの材質や入射面３８の傾斜角度（θｂ）などの条件によって変化するため、これらの情報を予めデータベース化しておくことで、所定条件に合わせた入射角（θａ）が得られるようになっている。
【００６２】
なお、金属薄膜１４の電場増強具合は、電場増強具合に比例して多くなる金属薄膜１４上面側の散乱光（図示せず）の光量を光検出手段３２などで検出することで確認でき、この散乱光の光量が一番多くなるときの励起光２２の照射角度が、高い電場増強効果の得られる入射角（θａ）である。
【００６３】
実際には、金属薄膜１４に全反射条件となる入射角（θａ）で照射される励起光２２は、光源２４から主誘電体部材１２ａを介して金属薄膜１４に照射されるため、主誘電体部材１２ａの入射面３８が持つ傾斜角度（θｂ）を考慮して、光源２４から金属薄膜１４へ照射される励起光２２の向きが決められている。
【００６４】
そして、エバネッセント波によって励起されたＳＰＦＳアッセイ領域（Ａ）全面の蛍光３０を光検出手段３２で検出することで、極微量および／または極低濃度のアナライトが検出できるようになっている。
【００６５】
なお、センサ構造体２０の金属薄膜１４の材質としては、好ましくは金，銀，アルミニウム，銅，および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは金からなり、さらにこれら金属の合金から成ることである。
【００６６】
このような金属は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから金属薄膜１４に好適である。
また、金属薄膜１４の形成方法としては、例えばスパッタリング法，蒸着法（抵抗加熱蒸着法，電子線蒸着法など），電解メッキ法，無電解メッキ法などが挙げられる。中でもスパッタリング法，蒸着法は、薄膜形成条件の調整が容易であるため好ましい。
【００６７】
さらに金属薄膜１４の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、およびこれら金属の合金：５〜５００ｎｍの範囲内であることが好ましい。
【００６８】
電場増強効果の観点からは、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびこれら金属の合金：１０〜７０ｎｍの範囲内であることがより好ましい。
【００６９】
金属薄膜１４の厚さが上記範囲内であれば、表面プラズモンが発生し易く好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜１４であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されないものである。
【００７０】
さらに、アナライト検出時に用いられる検体としては、血液，血清，血漿，尿，鼻孔液，唾液，便，体腔液（髄液，腹水，胸水等）などが挙げられる。
また、検体中に含有されるアナライトは、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド，ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子），タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等），アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。），糖質（オリゴ糖，多糖類，糖鎖等），脂質，またはこれらの修飾分子，複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー，シグナル伝達物質，ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
【００７１】
さらに蛍光物質としては、所定の励起光２２を照射するか、または電界効果を利用することで励起し、蛍光３０を発する物質であれば特に限定されないものである。なお本明細書でいう蛍光３０とは、燐光など各種の発光も含まれるものである。
【００７２】
また、主誘電体部材１２ａの材質としては、光学的に透明な材質であれば特に限定されるものではないが、例えば樹脂またはガラスであれば、取扱いが容易であるとともに安価であるため好ましい。特に樹脂製であれば、射出成形により複雑な形状を成形可能であり、形状の自由度が増すので好適である。
【００７３】
このようなＳＰＦＳ装置１０は、移動調整手段４０，４２に角度可変部（図示せず）が設けられると良く、角度可変部（図示せず）は、サーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるために受光手段２８と光源２４とを同期し、４５〜８５°の角度変更を可能とし、分解能が０．０１°以上であることが好ましい。
【００７４】
また光検出手段３２に入力された情報を処理するためのコンピュータ（図示せず）などを有しても良いものである。
上記したような構成を有する本発明のＳＰＦＳ装置１０では、特にセンサ構造体２０の主誘電体部材１２ａが特徴的な構造を有している。
【００７５】
具体的には、主誘電体部材１２ａが、その下面に補助誘電体部材１２ｂを光学的に接合可能とする接合面４４を備えた略台形状に構成されており、図１０に示したような従来の四角錐形状の誘電体部材１０２とは形態が全く異なっている。
以下、このような略台形状の主誘電体部材１２ａを有するセンサ構造体２０について説明する。
【００７６】
＜センサ構造体２０＞
本発明のセンサ構造体２０に用いられる主誘電体部材１２ａは、図１に示したように、その形態が略台形状であり、従来の四角錐形状の誘電体部材を途中で分断したような形態となっている。
【００７７】
このため、四角錐形状の誘電体部材よりも高さ方向が小さくなっており、ＳＰＦＳ装置１０の小型化に寄与できる形態である。
なお、主誘電体部材１２ａの高さ方向の最大幅を狭めれば狭めるほど、ＳＰＦＳ装置１０の小型化には好都合である。
【００７８】
しかしながら、ＳＰＦＳ装置１０における主誘電体部材１２ａは、金属薄膜１４に全反射条件となる入射角（θａ）で励起光２２を照射させる際、この主誘電体部材１２ａが、光源２４から照射された励起光２２を金属薄膜１４の所定の位置へ入射させる役割を有するため、入射面３８の広さが矢印で示した光源２４の移動方向に対してあまりにも狭くなってしまうと、金属薄膜１４に全反射条件となる入射角（θａ）で励起光２２を照射させることができない。
【００７９】
したがって、主誘電体部材１２ａは、金属薄膜１４上の電場を最も増強させることのできる傾斜角度（θｂ）、つまり全反射条件となる入射角（θａ）を検出可能な入射面３８の広さを有するだけの高さ方向の最大幅Ｈを確保する必要がある。
【００８０】
この最大幅Ｈについては、全反射条件となる入射角（θａ）が、金属薄膜１４の材質や膜厚，主誘電体部材１２ａの材質や入射面３８の傾斜角度（θｂ）などの条件によって変化するため、例えば使用する金属薄膜１４や主誘電体部材１２ａによりどの程度全反射条件となる入射角（θａ）が変化するかを事前に調べておき、これに合わせて最大幅Ｈを規定するようにすれば良い。
【００８１】
したがって、図１に開示されているような台形状の主誘電体部材１２ａを備えたセンサ構造体２０は、従来よりも高さを狭めることができ、これによりセンサ構造体２０の低コスト化および取扱性を向上することができる。
【００８２】
ところで、主誘電体部材１２ａの高さが狭められると、ＳＰＦＳ装置１０の光学的補正の際に必要となる全反射点を検出できない場合がある。
背景技術の欄でも説明したように、全反射点は、全反射条件となる入射角（θａ）の正誤の確認を、ＳＰＦＳ装置１０の起動時やメンテナンス時などの一定期間毎に行う際に用いられ、金属薄膜１４へ照射された励起光２２の反射率が最も高くなる励起光２２の入射角（θｃ）を示したものである。
【００８３】
この全反射点は、通常、全反射条件となる入射角（θａ）よりも角度が小さくなるため、図１に示したような台形状の主誘電体部材１２ａでは、光源２４を移動調整手段４０で移動させても、全反射点の入射角（θｃ）に励起光２２を金属薄膜１４に照射させることができない。
【００８４】
このため、本発明のＳＰＦＳ装置１０では、図２に示したように、全反射点を求める時にだけ、主誘電体部材１２ａの底面（接合面４４）に補助誘電体部材１２ｂを光学的に接合させるようにしている。
【００８５】
補助誘電体部材１２ｂは、少なくとも励起光２２の入射面４６を有し、金属薄膜１４に照射される励起光２２の反射が最も少なくなる入射角（θｃ）に光源２４からの励起光２２を照射できるよう、入射面４６の傾斜角度（θｄ）が規定されたものである。
【００８６】
また本実施形態では、補助誘電体部材１２ｂの入射面４６の傾斜角度（θｄ）と、主誘電体部材１２ａの入射面３８の傾斜角度（θｂ）とが同じ角度であり、両部材の接合時に主誘電体部材１２ａの入射面３８と補助誘電体部材１２ｂの入射面４６とが一直線状となる形態である。
【００８７】
なお補助誘電体部材１２ｂの材質としては、主誘電体部材１２ａと同様、光学的に透明な材質であれば特に限定されるものではないが、例えば樹脂またはガラスであれば、取扱いが容易であるとともに安価であるため好ましい。特に樹脂製であれば、射出成形により複雑な形状を成形可能であり、形状の自由度が増すので好適である。
【００８８】
ここで、主誘電体部材１２ａと補助誘電体部材１２ｂとの光学的接合は、マッチングオイル，マッチングシートおよび光学接着剤から選択されたいずれかを用いて行われることが好ましく、中でも特にマッチングオイルとマッチングシートは両部材間において着脱が容易であるため好ましい。図３に示したように、本実施形態におけるセンサ構造体２０では、両部材間の光学的接合を、マッチングオイル４８を用いて行っている。
【００８９】
また補助誘電体部材１２ｂは、主誘電体部材１２ａの接合面４４に向かって膨出する膨出部５０を有している。これは、主誘電体部材１２ａと補助誘電体部材１２ｂとの光学的接合の際に、膨出部５０の先端から放射状に接合面４４と当接するようにして、両部材間に空気が入ってしまうことを防止するための構造である。
【００９０】
なお、両部材の組合せの実施形態については、図３に示したもの以外に、例えば図４から図９に示したような形態であっても良い。
まず、図４に示したセンサ構造体２０は、補助誘電体部材１２ｂの入射面４６の傾斜角度（θｄ）と、主誘電体部材１２ａの入射面３８の傾斜角度（θｂ）とが異なっている。
【００９１】
このような形態であれば、光源の移動範囲が装置構成上、制限されていたとしても、確実に全反射点を得ることができる。
また図５に示したセンサ構造体２０は、接合面４４が斜めに形成されている。このような形態であっても、両者が同光学特性を有していれば、何ら問題を生ずることはないものである。
【００９２】
さらに図６に示したセンサ構造体２０は、主誘電体部材１２ａおよび補助誘電体部材１２ｂとで、半円形状となっている。なお、このような曲面形態の場合、入射面３８，４６の傾斜角度（θｂ，θｄ）は、励起光２２が入射面３８，４６にぶつかったその位置と入射面３８，４６との接線の傾斜角度（θｂ，θｄ）として考えれば良い。
【００９３】
また、図７に示したセンサ構造体２０は、曲面状の入射面３８を有する主誘電体部材１２ａと直線状の入射面４６を有する補助誘電体部材１２ｂとの組合せである。
さらに図８に示したセンサ構造体２０は、補助誘電体部材１２ｂが、主誘電体部材１２ａと同様に台形状である。
【００９４】
このような形態の場合には、全反射点の入射角（θｃ）を得る場合にもセンサ構造体２０の高さを狭めることができるので、装置１０の小型化により寄与することができる。
また、図９に示したセンサ構造体２０は、主誘電体部材１２ａの下面に補助誘電体部材１２ｂが接合され、さらに補助誘電体部材１２ｂの下面に別の補助誘電体部材１２ｃが接合されている。
【００９５】
このような形態の場合には、全反射点を求める際に必要な分だけ、補助誘電体部材を積層して使用することで、所望の入射角（θｃ）で励起光２２を金属薄膜１４へ照射することができる。
【００９６】
以上、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこれに用いられるセンサ構造体、ならびにこのセンサ構造体に配設される補助誘電体部材の好ましい形態について説明したが、本発明は上記の形態に限定されるものではなく、例えばセンサ構造体の主誘電体部材および補助誘電体部材について、光学的接合の際に両者が同材質のものを使用しても、異材質のものを使用しても良いものである。両部材の材質がそれぞれ異なる場合には、材質の違いにおける光学特性の違いを予め数値化しデータベース化しておくことで、同材質の場合への数値換算が可能であり特に不都合が生ずるものではないものである。
【００９７】
また、上記実施形態では全反射条件時の励起光と、全反射点を求める時の励起光とは、同波長のものを照射することを前提としているが、波長の違いに合わせて入射角（θａ，θｃ）の調整を行うなどの光学的補正が可能であれば、波長を変えても良いものである。
【００９８】
このように本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこれに用いられるセンサ構造体、ならびにこのセンサ構造体に配設される補助誘電体部材は、その目的を逸脱しない範囲で種々の変更が可能なものである。
【符号の説明】
【００９９】
１０・・・表面プラズモン励起増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）
１２ａ・・主誘電体部材
１２ｂ・・補助誘電体部材
１２ｃ・・補助誘電体部材
１４・・・金属薄膜
１６・・・リガンド含有層
１８・・・流路
２０・・・センサ構造体
２２・・・励起光
２４・・・光源
２６・・・反射光
２８・・・受光手段
３０・・・蛍光
３２・・・光検出手段
３４・・・集光部材
３６・・・波長選択機能部材
３８・・・入射面
４０・・・移動調整手段
４２・・・移動調整手段
４４・・・接合面
４６・・・入射面
４８・・・マッチングオイル
５０・・・膨出部
Ａ・・・ＳＰＦＳアッセイ領域
Ｈ・・・主誘電体部材の高さ方向の最大幅
θａ・・入射角
θｂ・・傾斜角度
θｃ・・入射角
θｄ・・傾斜角度
１００・・・表面プラズモン励起増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）
１０２・・・誘電体部材
１０４・・・金属薄膜
１０６・・・リガンド含有層
１０８・・・流路
１１０・・・センサ構造体
１１２・・・励起光
１１４・・・光源
１１６・・・反射光
１１８・・・受光手段
１２０・・・蛍光
１２２・・・光検出手段
１２４・・・集光部材
１２６・・・波長選択機能部材
１２８・・・入射面
１３０・・・移動調整手段
１３２・・・移動調整手段
【図１】
2012067013.tif 000003
【図２】
2012067013.tif 000004
【図３】
2012067013.tif 000005
【図４】
2012067013.tif 000006
【図５】
2012067013.tif 000007
【図６】
2012067013.tif 000008
【図７】
2012067013.tif 000009
【図８】
2012067013.tif 000010
【図９】
2012067013.tif 000011
【図１０】
2012067013.tif 000012
【図１１】
2012067013.tif 000013
【国際調査報告】
2012067013.tif 000014
2012067013.tif 000015
2012067013.tif 000016
2012067013.tif 000017
2012067013.tif 000018
2012067013.tif 000019