(57)【要約】  細胞塊をハンドリングするハンドリング手段と、  前記ハンドリング手段から供給される細胞塊を貯溜し、培養液が外部と流通できる微細孔を有する第１容器と、  前記第１容器を収容し、前記第１容器内の培養液よりも過剰量の培養液を前記第１容器の周囲に満たす第２容器と、  前記細胞塊を第１容器に供給した後、前記ハンドリング手段に残留した水滴又は泡沫を除去する除液手段とを有することを特徴とする細胞塊の培養システム。
2012111684.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞塊をハンドリングするハンドリング手段と、
前記ハンドリング手段から供給される細胞塊を貯溜し、培養液が外部と流通できる微細孔を有する第１容器と、
前記第１容器を収容し、前記第１容器内の培養液よりも過剰量の培養液を前記第１容器の周囲に満たす第２容器と、
前記細胞塊を第１容器に供給した後、前記ハンドリング手段に残留した水滴又は泡沫を除去する除液手段と、を有することを特徴とする細胞塊の培養システム。
【請求項２】
前記ハンドリング手段は前記細胞塊を含む培養液の吸引及び吐出が可能なノズルを備え、前記ノズルを介して細胞塊をハンドリングすることを特徴とする請求項１に記載の培養システム。
【請求項３】
前記除液手段は、前記ノズルの先端が近接して前記吸引又は吐出の際生じた水滴又は泡沫をノズルの先端から除去する水切り部材を備えることを特徴とする請求項２に記載の培養システム。
【請求項４】
前記第１容器は、貯溜された細胞塊を培養して細胞の立体構造体を成形するためのモールドであり、前記モールドの底部に、微細孔を有する部材を設けたことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の培養システム。
【請求項５】
前記第１容器の開口部に、外側に開いた漏斗を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の培養システム。
【請求項６】
培養液の吸引及び吐出が可能なハンドリング手段に備えられたノズルの先端付近に前記吸引又は吐出の際生じた水滴又は泡沫を除去する水切り部材であって、前記ノズルが上下に通過できる大きさの孔が設けられた前記部材。
【請求項７】
前記部材は、前記水滴又は泡沫が前記孔付近の部材に接触することによりノズルの先端から前記水滴又は泡沫を除去するものである請求項６に記載の部材。
【請求項８】
培養容器の開口部に設置されるものである、請求項６又は７に記載の部材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の培養システムに関するものであり、さらに詳しくは水滴又は泡沫除去部材を用いて立体的な構造を有する細胞塊を培養する自動細胞ハンドリングロボットにおける泡沫除去デバイスに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオ分野における装置化の技術が発展しつつある。従来はマニュアルで行われていた作業が装置化されることにより作業の高精度化や高効率化、汚染リスクの低減などの効果が期待できるため研究が重ねられている。例えば、特許文献１にはＤＮＡマイクロアレイに代表される生体サンプルの処理システムが記載され、生体サンプルを効率的に処理するシステムが示されている。また、特許文献２では、ラボ・オン・チップなどで用いられるマイクロプレート、マイクロチューブ、ピペットチップなどで発生する非特異的な吸着を低減するための処理方法が記載され、従来の装置で発生していた問題の解決がなされている。さらに特許文献３には、所定量の採血を可能にしつつ気泡が混入しない採血器とこの採血器に装着して使用されるピペットとが記載されている。【０００３】
一方、再生医療分野の研究も急速に進みつつある。再生医療では、例えば損壊した細胞の代わりに、人工的に培養された細胞を患部に用いて患部を再生治療する。この細胞の培養方法としてはシャーレやペトリ皿上で細胞を培養する２次元培養が従来からよく知られている。
ところで、培養された細胞を患部に適用する場合、細胞を有用な形態で患部に留置しておくことが難しくこのために目的とする治療効果が得られないことがあった。これに対し、より確実に治療効果を獲得するために、治療に必要十分な量の細胞を患部に与えることが考えられたが、治療に必要十分な量の細胞を培養するためには、数週間など長時間にわたり培養を行う必要があった。また、このような長時間の細胞培養では培養された細胞の特性が培養途中で変わることがあり、このために移植に必要とされる量の細胞を取得できない場合があった。そこで、細胞を立体的に培養して患部の治療に必要十分な量の細胞の立体構造体を取得することが考えられたが（特許文献４）、手作業で細胞の立体構造体を形成する場合、効率に関する課題が多く、また、コンタミなど人為的な作業ミスが発生する可能性があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−１６３４０８号公報
【特許文献２】特開２０１０−２０２８２３号公報
【特許文献３】特開２００５−０１７２８１号公報
【特許文献４】特開２００４−３５７６９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものであり、利便性がよく、コンタミの発生を防止しつつ安価かつ安全に細胞塊を培養して細胞の立体構造体を作製できる培養システムの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の目的を達成するため、本発明の培養システムは、
細胞塊をハンドリングするハンドリング手段と、
前記ハンドリング手段から供給される細胞塊を貯溜し、培養液が外部と流通できる微細孔を有する第１容器と、
前記第１容器を収容し、前記第１容器内の培養液よりも過剰量の培養液を前記第１容器の周囲に満たす第２容器と、
前記細胞塊を第１容器に供給した後、前記ハンドリング手段に残留した水滴又は泡沫を除去する除液手段と、を有することを特徴とする。
このハンドリング手段は液体（前記細胞塊を含む培養液）の吸引および吐出が可能なノズルを備えることが好ましい。また、このノズルには使い捨てチップを装着することもできる。【０００７】
また、除液手段は、前記ノズルの先端が近接して前記吸引又は吐出の際生じた水滴又は泡沫をノズルの先端から除去する水切り部材を備えることを特徴とする。
さらに、本発明の培養システムにおいて、前記第１容器は、貯溜された細胞塊を培養して細胞の立体構造体を成形するためのモールドであり、前記モールドの底部に、微細孔を有する部材（フィルタ）を設けたことを特徴とする。
さらに、本発明の培養システムでは、前記第１容器の開口部に、外側に開いた漏斗を有することを特徴とする。
さらに、本発明は、培養液の吸引及び吐出が可能なハンドリング手段に備えられたノズルの先端付近に前記吸引又は吐出の際生じた水滴又は泡沫を除去する水切り部材であって、前記ノズルが上下に通過できる大きさの孔が設けられた前記部材である。
前記部材は、前記水滴又は泡沫が前記孔付近の部材に接触することによりノズルの先端から前記水滴又は泡沫を除去するものである。上記部材は、培養容器の開口部に設置されることが好ましい。
【発明の効果】
【０００８】
細胞培養装置を用いて細胞をハンドリングする際、培養液と接触する用具は装置のノズル、又はさらにその先端に装着したチップである。本発明において、これらのノズル又はチップに生じた水滴又は泡沫を除去することにより、細胞塊作製の障害となる気泡の発生を防ぐことができる。従って、本発明によれば、利便性がよく、コンタミの発生を防止しつつ細胞塊を培養して細胞の立体構造体を作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の培養システムの構成を概略的に示した斜視図である。
【図２】ノズル先端から水滴を除去して泡の発生を防止する防泡器を斜めから観察した斜視図である。
【図３】防泡器に備えられた水切り部材を、除液孔の配列方向に沿って上部側から底部側に向けて切断した断面図である。
【図４】グリルを有する水切り部材を斜めから観察した斜視図である。
【図５】除液孔の下側にドレーナを設けた水切り部材を除液孔の配列方向に沿って上側から下側に切断した断面図である。
【図６】培養システムに搭載されたハンドリング機構のノズルユニットを部分的に拡大して示した斜視図である。
【図７】第２容器の隔壁を一部切断して、第２容器内部に配置されたモールド（第１容器）を示した斜視図である。
【図８】漏斗、モールド、および第２容器をモールド上部から底部に向かって切断した断面図である。
【図９】上部から底部に向けて切断されたモールド、およびモールド内に配置されたフィルタを拡大した断面図である。
【図１０】培養システムのカバーの一部を切断して内部構成を概略的に示した部分分解斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明者は、培養液が通過できる微細孔を有するチャンバー内に細胞塊を入れ、細胞塊の一部が気相に接する程度の培養液がチャンバー内に含まれるようにして、このチャンバー内の培養液よりも過剰量の培養液中で細胞塊を培養することにより、細胞のみからなる立体構造体を製造する方法を開発した（第4122280号特許）。しかし、従来はこの方法を手作業により実施していたため、コンタミネーション（バクテリアやカビの汚染）や検体取り違えのリスクがあった。他方、設備投資のコストを抑えるためには、装置化及び自動化が必要とされていた。そこで、本発明者は、上記特許発明を実現させるべく、立体構造体を製造するロボットを開発した。
このロボットは、使い捨てチップを用いて、空気圧による溶液の吸引及び吐出を行うことで、溶液中の細胞構造体をハンドリングするものである。
【００１１】
しかしながら、空気圧による溶液の吸引及び吐出を行うとチップ中に空気が出入りするため、チップの先端に水滴や泡沫が残留する。このため、細胞の移送が終わって次の細胞を処理するときのストローク時に気泡が発生する。この気泡が細胞の立体構造体を作製するための容器に入ると、この気泡に細胞塊がトラップされてしまい、細胞塊同士が会合しなくなり、立体構造体を製造することが困難となる。気泡を物理的に破裂させると、培養液が想定範囲外に飛散してコンタミネーションの原因となる。また、気泡除去剤などの界面活性剤の使用は、医療応用を考えると適切ではない。さらに、加熱により気泡を破裂させる場合は、細胞に熱ダメージを与えることとなり、また飛沫のリスクも生じる。
【００１２】
そこで本発明においては、チップに生じた水滴や泡沫を簡易に除去する水切り器具、より具体的には、自動細胞ハンドリングロボットにおける泡沫除去デバイス、及び当該デバイスを用いた培養システムを開発した。すなわち、培養液の吸引及び吐出が可能なハンドリング手段に備えられたノズル又はその先に装着したチップ（特に断らない限り「ノズル」という）を用いて細胞を一の容器から他の容器に移す場合、吸引又は吐出の際に、ノズルの先端付近に水滴又は泡沫が生じる。本発明はこの水滴又は泡沫をノズルから除去するための除液手段に関するものであり、水切り部材として機能する。本発明の除液手段は、細胞のハンドリングを行う装置（ロボット）に使用されるものであり、一態様として、ノズルが上下に通過できる大きさの孔が設けられた板状のものであることを特徴とする。この孔を設けることにより、ノズルは水切り部材を上下に通過することができ、通過の際に孔付近の部材に水滴又は泡沫が接触することで、水滴又は泡沫はノズルから水切り部材を伝わってノズル外に排出し、ノズルに生じた水滴又は泡沫を除去することが可能となる。
但し、本発明の水切り部材は、上記装置に使用する態様に限定されるものではなく、ピペットやチップを用いて細胞の吸引及び吐出を行うハンドリングの際にピペットやチップに付着した水滴又は泡沫を除去する状況が生じた場合であれば適用することができる。この場合、水切り部材は、例えば培養容器の開口部に設置することができる。
【００１３】
さらに、本発明は上記除液手段を利用した培養システムに関する。
すなわち、本発明の培養システムは、
細胞塊をハンドリングするハンドリング手段と、
前記ハンドリング手段から供給される細胞塊を貯溜し、培養液が外部と流通できる微細孔を有する第１容器と、
前記第１容器を収容し、前記第１容器内の培養液よりも過剰量の培養液を前記第１容器の周囲に満たす第２容器と、
前記細胞塊を第１容器に供給した後、前記ハンドリング手段に残留した水滴又は泡沫を除去する除液手段と、を有することを特徴とするものである。
細胞塊をハンドリングする手段としては、細胞塊を操作できるものであれば限定されるものではなく、例えば細胞塊を吸排出可能な機構と、この機構を空間移動させる移動制御機構とを備えることができる。上記の細胞塊を吸排出する機構の代替として、例えば細胞塊をすくい上げ及び放出するショベル機構、並びにショベル機構を空間移動させる移動制御機構を備えることができる。
上述の吸排出機構としては、例えばノズルを挙げることができ、移動制御機構としてはＸＹＺの３軸方向で吸排出機構を移動させるポジショニングデバイスを挙げることができる。このような移動制御機構としては、例えば水平多関節ロボットや垂直多関節ロボットなどの産業用ロボットを用いることができる。本発明においては、培養液の吸排出はシステムに備えられたノズルにより直接行なうことができるが、使い捨てのピペットチップをノズルに装着することが好ましい。
【００１４】
第１容器の形状は特に制限されるものではなく、細胞塊を貯め培養液を外部に流通させることができるものであれば特に限定されるものではない。培養液を外部に流通させる手段として、例えば細胞塊のサイズよりも径の小さな孔を容器の底あるいは側面に設けることができる。あるいは、筒状の容器の底部に、多数の微細孔を有する部材を設けることもできる（詳細は後述する）。
第２容器の形状も、第１容器と同様に特に制限されるものではなく、第１容器内の培養液よりも過剰量の培養液を収容できるものであればよい。このような第２容器の典型例としては、第１の容器を囲繞するように形成された器が挙げられる。第１容器と第２容器との間は培養液の流通が可能であり、これにより、第１容器内の細胞塊に第２容器中の培養液に含まれる栄養分などを供給することが可能となる。
【００１５】
除液手段は、前記細胞塊を第１容器に供給した後に前記ハンドリング手段に残留した水滴又は泡沫（以下、特に断らない限り「水滴」という）を除去できるものであればよい。このような除液手段としては、例えば、ハンドリング手段に付着した水滴をブローして水滴を除去する方法、ハンドリング手段に付着した水滴をアスピレーション（吸引）して水滴を除去する方法や、ハンドリング手段に付着した水滴を重力方向に沿って下向きに突出した尖端に集めて滴下させて除去する方法などがある。以下に、上記で説明したハンドリング手段、第１容器、第２容器、および除液手段を備えた培養システムを示すがあくまで一例であり、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１６】
図１は、本発明の培養システムの概要について示した斜視図である。図１に示すように、培養システム２は、ハンドリング装置３、第２容器である培養器７、防泡器８、培地リザーバ１０を備える。
ハンドリング装置３は、後述するノズル２０（図６参照）、このノズル２０を３次元的に移動制御する移動制御機構を備える。ノズル２０の先には、例えば図６に示すようにチップ２２を装着できるようにしてもよい。移動制御機構は、例えば水平方向（XY方向）へのノズル２０の移動および垂直方向（Z方向）へのノズル２０の移動を正確に制御して細胞塊のハンドリングが可能なようにノズル２０の移動をコントロールする。ノズル２０によってハンドリングされる細胞塊は、例えばウェルプレート４上のウェルに収容され、ノズル２０はこのウェル内から細胞塊を吸い上げ、第２容器の中に設置された第１容器であるモールド２７（図７参照）に排出して細胞塊をモールド２７に収容させることができる。
培養器７の隣には防泡器８が配置され、防泡器８は、ハンドリング装置３から水滴を除去してストローク時における気泡の発生を防止し、ひいては第１容器内の気泡の発生を防止する。ハンドリング装置はノズル２０を備えるため、防泡器８はこのノズル２０から水滴を除去する機構を備える。
【００１７】
図２は、ノズル先端から水滴を除去してストローク時における気泡の発生を防止する水切り部材、及びこの水切り部材を備えた防泡器を斜めから観察した斜視図である。
図２に示すように、防泡器８は水切り部材４０を備える。水切り部材４０にはノズル２０のレイアウトに合わせて、例えば４つの除液孔４０ａが形成されており、各除液孔４０ａは、ノズル２０に装着されたチップ２２先端に残留する水滴又は泡沫を除去できるように、開口サイズが定められている。この除液孔４０ａの数はノズル２０の数に合わせて適宜変更することができる。水切り部材４０は、周囲が隔壁４２に囲繞されるように配置され、この隔壁４２によって、水切り部材４０によりチップ２２先端から除去される水滴が周囲へ飛散することを低減している。
【００１８】
水切り部材の態様としては、例えば図３に示すようにノズル先端の外径に対して所定のクリアランスを有する除液孔を有する水切り部材や、図４に示すようにグリルを有する水切り部材としてもよい。これら水切り部材の除液孔４０ａはノズルの全体又は一部が通過できる程度の孔径を有しているため、ノズル先端が水切り部材の除液孔に近づくことによりノズル先端の水滴が水切り部材に伝わりノズル先端から水滴が除去される。ノズル２０の先端から水滴を除去する仕組みについて以下に詳述する。
【００１９】
図３は、防泡器に備えられた水切り部材を、除液孔の配列方向に沿って上部側から底部側に向けて切断した断面図であり、ノズルの先にチップを装着した態様に基づいて説明する。
図３（Ａ）に示すように、水切り部材４０にはチップ２２先端から水滴を除去するための除液孔４０ａが形成されている。孔径はチップ２２先端の外径に対して所定のクリアランス（水切り部材とチップ先端との距離）を隔てるように形成されており、このクリアランスによりチップ２２先端が水切り部材４０に接触せずにチップ２２先端に溜まった水滴４７のみが水切り部材４０に移される。クリアランスは液体の量及び表面張力にもよるが１０．０ｍｍ以下、９．０ｍｍ以下、８．０ｍｍ以下、７．０ｍｍ以下、６．０ｍｍ以下、５．０ｍｍ以下、４．０ｍｍ以下、３．０ｍｍ以下、２．０ｍｍ以下、又は１．０ｍｍ以下とすることができ、１．０ｍｍ以下が好適であり、０．５ｍｍ以下がより好ましい。このようなクリアランスを隔ててチップ２２先端を除液孔に対して配置することで、図３（Ｂ）に示すように、チップ２２先端から水滴を除去することができる。これにより、次に液体を培養器７の漏斗２８に吐出するときに気泡が発生することを防止することができる。水切り部材４０に移った水滴は防泡器８に貯留される。なお、先端が傷まない程度にチップを除液孔に接触させてチップ先端から水滴を除去してもよいが、この場合、チップのより正確な移動制御が必要となる。
【００２０】
本発明においては、第２容器とは別に水切り専用の防泡器８を設けるほか、第２容器内に水切り部材を設置することにより、第２容器は防泡器を兼用することができる。例えば、図２に示す防泡器の態様と同様に、水切り部材を第２容器の上部（好ましくは培養器の開口部付近）に、第１容器と水切り部材とが垂直方向と同軸（Z方向と同軸）となるように配置すると、細胞塊を中に収めたチップ２２は、水切り部材の除液孔を通過して容器１中の培養用モールドまで下降し、細胞塊を吐出した後に上昇して水切り部材の除液孔を通過する。この通過の際、チップに付着した水滴が除液孔付近の水切り部材と接触して、水滴がチップから除かれる。
ここで、水切りの順序は、細胞塊を第１容器に吐出する前に行なうことも、吐出した後に行なうことも、あるいはその両方とも行なうこともできる。
孔径はチップ全体が通過でき、かつ、チップ２２先端の外径に対して所定のクリアランスを隔てるように形成されており、このクリアランスによりチップ２２先端が水切り部材４０に接触せずにチップ２２先端に溜まった水滴４７のみが水切り部材４０に移される。このようにして、細胞のモールドへの吐出と水滴除去を１ストロークで行なうことができる。この態様の場合は、除去された水滴はそのまま部材を伝わって培養槽に滴下するが、水滴であれば第１容器内の培養液と混合され、泡沫であれば第１容器内の培養液表面に停滞するか消滅するため、続くストロークに影響はない。もちろん、コンタミの問題も生じない。
【００２１】
水切り部材４０によってチップ２２先端から水滴４７を除去することにより、ノズル２０の作動時に泡が発生することを抑えることができる。一旦、泡が発生してしまうと、この泡によって漏斗２８の収斂部２８ａ（図７参照）に泡が停滞したり、あるいは漏斗２８とモールド２７との連通開口などが塞がれ、モールド２７内に細胞塊を収容させることが困難となってしまうが、水切り部材４０を用いることにより、泡の発生を防止して泡に細胞塊がトラップされるのを抑え、細胞塊の効率的な導入を維持することができる。
【００２２】
図４はグリル（網状部）を備えた水切り部材を説明する斜視図である。水切り用のグリルの形状は特に制限されるものではなく、例えばチップの形状やサイズなどに合わせて適宜決定することができる。
図４（Ａ）に例示した水切り部材５０では、チップ２２の降下移動を正確にコントロールすることでチップ２２先端から水滴を除去することができる。水切り部材５０にはグリル（網状部）５２が形成され、チップ２２先端はこのグリル５２に対して所定の間隔を隔てるように下降制御される。チップ２２先端が下降した際のグリル５２との間隔は、前記と同様に、１０．０ｍｍ以下、９．０ｍｍ以下、８．０ｍｍ以下、７．０ｍｍ以下、６．０ｍｍ以下、５．０ｍｍ以下、４．０ｍｍ以下、３．０ｍｍ以下、２．０ｍｍ以下、又は１．０ｍｍ以下とすることができ、１．０ｍｍ以下が好適であり、０．５ｍｍ以下がより好ましい。このような間隔を隔ててチップ２２先端をグリル５２に対向させることにより、水滴がチップ２２先端から水切り部材５０に移り、チップ２２先端から水滴を除去することができる。また、図４（Ｂ）に示すように、より細かな格子状のグリル５６を水切り部材５４に設けてもよい。このような水切り部材５４を用いてもチップ２２先端から水滴を除去することができる。容器１の上部に水切り部材を設ける態様においても、チップ２２が通過できる孔を設け、チップと孔を形成する壁面とのクリアランスを制御することにより、チップ２２先端部の水滴を除去することができる。
【００２３】
また、図３に例示した水切り部材４０ではチップ２２先端の外径に対して所定のクリアランスを有する除液孔４０ａを形成しただけであったが、除液孔の下側にチップ先端に柔軟に接触して水滴を除去するドレーナを設けてもよい。
図５は防泡器に備えられた水切り部材を、除液孔の配列方向に沿って上部側から底部側に向けて切断した断面図である。図５（Ａ）に示すように、水切り部材６０の裏側には、除液孔６０ａに挿入されたチップ２２先端の外周に近接するドレーナ６５が設けられている。ドレーナ６５には内側に向けて窄まった狭窄部６５ａが形成され、狭窄部６５ａがチップ２２先端の外周に近接することができる。
【００２４】
ドレーナ６５は柔軟で弾力性を有する材質で形成されており、例えば、ポリエチレンやポリプロピレンなどの高分子で形成することができる。このような柔軟性に富む弾力的な材質を用いることにより、ドレーナ６５は内向きに付勢力を有し、これにより、チップ２２先端を受け入れつつその外周に接触することができる。
【００２５】
ドレーナ６５の狭窄部６５ａがチップ２２先端の外周に接触することで、チップ２２先端の水滴がドレーナ６５側に移動し、次第にドレーナ６５の下端に溜まってゆく。チップ２２先端が除液孔６０ａに挿入されると、チップ２２先端がドレーナ６５の狭窄部６５ａに当接する。狭窄部６５ａは柔軟であり、さらにチップ２２先端が下方に挿入されると、チップ２２先端の外周によって狭窄部６５ａは外側に押し拡げられる。このようなチップ２２先端とドレーナ６５との一連の動きを通して、チップ２２先端に付着していた水滴は狭窄部６５ａを介してドレーナ６５の先端６５ｂに伝わる。ドレーナ６５を備えたことにより水などに比べて粘度が高い液体についてもチップ２２先端から除去でき、次に液体を培養器７の漏斗２８に吐出するときに泡が発生することを防止することができる。図３や図４で例示した態様では、水切り部材４０、５０にチップ２２先端が接触しないようにチップ２２先端を正確にコントロールする必要があったが、図５に示したような柔軟なドレーナ６５を備えることにより、チップ２２の下降制御を簡便にしつつチップ２２先端から水滴を除去することができる。また、図５に示した水切り部材でも、培養器７の上部に配置することで、前記と同様に水滴を除去することができる。
【００２６】
ドレーナの形状は図５（Ａ）に限らず、例えば、図５（Ｂ）のような形状でもよい。図５（Ｂ）に示したドレーナ７０は、断面が内側に向かって緩やかに湾曲するような形状に形成され、柔軟で弾力性を有する材質で形成されている。チップ２２が水切り部材６８の除液孔６８ａに挿入されると、ドレーナ７０の先端７０ａがチップ２２先端の外周に当接し、チップ２２が除液孔６８ａから引抜かれるときに、チップ２２先端の外周に付着した水滴がドレーナ７０の先端７０ａによって拭われ、チップ２２先端から水滴を除去することができる。このような形状のドレーナを用いてチップ２２先端の水滴を除去してもよい。
【００２７】
次に、本発明の除液手段を用いた細胞培養システムにおけるそれぞれの手段について説明する。
ハンドリング機構３（図１参照）は、スカラロボットであり、例えば機構本体３ａと、この機構本体３ａに対して回動可能に一端が軸着された接続アーム３ｂと、接続アーム３ｂの他端に取り付けられた移動体３ｃとを有する。接続アーム３ｂの一端が機構本体３ａに固定され、接続アーム３ｂの他端に移動体３ｃが取り付けられたことにより、移動体３ｃは回転軸Ｐに対して回動することができる。移動体３ｃは昇降移動可なノズルユニット１６を備え、ノズルユニット１６は移動体３ｃによる水平方向の移動と自身の昇降移動とによってＸＹＺ方向に自在に移動して配置されることができる。
図６はハンドリング機構のノズルユニット１６を部分的に拡大して示した斜視図である。図６に示すように、ハンドリング機構３はノズル２０を有し、このノズル２０を介してウェルプレート４上のウェル４ａに収容された細胞塊を取り扱うことができる。ノズル２０は重力方向に沿って下向きに配置され、外周に付着した水滴は先端側に流下するようになっている。
【００２８】
移動体３ｃはノズルユニット１６を備え、ノズルユニット１６が液体を吸引及び吐出するノズル２０を備えたことでウェルプレート４上の任意のウェル４ａについて細胞塊をハンドリングすることができる。ノズルの数は特に限定しないが、ウェル４ａの個数に合わせて１、２、４、６、８、１６個など適宜定めることができる。図６では代表例として、ノズルユニット１６は４つのノズル２２を備え、各ノズル２０にチップ２２を装着することができるシステムを例示する。
【００２９】
ノズル２０は、それ自体で細胞の吸引及び吐出をすることができるが、着脱自在なチップ２２を装着することができ、ノズル２０にチップ２２を装着することにより、チップ２２の外周に付着した水滴は先端側に流下して先端に溜まることとなる。チップ２２は、例えばポリエチレンやポリプロピレンなどのプラスチック材料で形成され、所定のルーチンが終了した後にチップボックス９で脱着される。使用済みのチップ２２の脱着後、移動体３ｃは装着チップボックス６上に移動し、ノズル２０に新しいチップ２２が装着される。
【００３０】
ハンドリング機構３は電動シリンダなどに代表されるポンプ機構と接続されており、これによりノズル２０はポンプ機構から供給される減圧／加圧に応じて細胞塊の吸引／吐出を実行することができる。なお、ここではノズル２０がチップ２２を介することによりノズル自体が汚れることを防止できる態様を示したが、ノズルの洗浄機構を備えてチップを省く装置構成を採用することもできる。
【００３１】
移動体３ｃは、ノズルユニット１６をＸＹＺ方向で駆動制御する並進制御機構と、回転軸Ｑの周りでノズルユニット１６を回転駆動制御する回転制御機構とを備える。これにより、ノズルユニット１６は、回転軸Ｐを中心とした移動体３ｃの回動、この回動とは別の並進移動と回転移動とによって、ベース１３上で自由自在に位置することが可能となっている。
【００３２】
移動体３ｃの移動は、例えばステッピングモータやサーボモータなどの各種モータとそのモータコントローラとによって精密に制御される。
加圧／減圧供給用のポンプ（シリンダ）は、ノズルユニット１６に備えられた個々のノズル２０に接続され、個々のノズル２０はポンプの精密な作動によって、吸引量および吐出量が正確にコントロールされる。
【００３３】
ウェルプレート４には様々な個数のウェル４ａを備えたものが存在するが、ここでは一例として、８行１２列の合計９６個のウェルを図示した。
移動体３ｃはウェルプレート４の表面と平行な方向に移動して位置決めされ、移動体３ｃの位置決め後に、ノズルユニット１６がウェルプレート４の上側から下側に向けて下降する。ノズルユニット１６が下降すると、４つのノズル２０の各先端に装着されたチップ２２の先端がそれぞれウェル４ａに進入し、ノズル２０は直接的に又はチップ２２を介してウェル４ａに内容された細胞塊を含有した細胞懸濁液を吸引することができる。
【００３４】
図７は第２容器である培養器７の隔壁を一部切断して、培養器７内に配置された第１容器（モールド２７）を示した斜視図である。図７に示すように、培養器７は、モールド２７、漏斗２８、支持体２９、隔壁３１を備える。支持体２９にはモールド２７を着脱自在に支持するための固定穴２９ａ（図８参照）が形成され、この固定穴２９ａにモールド２７が嵌め込まれて固定される。
図８は、漏斗、モールド、及び第２容器をモールド上部から底部に向かって切断した断面図である（細胞塊以外の断面）。図８に示すように、漏斗２８の内側には擂鉢状に斜面が形成された収斂部２８ａが形成され、漏斗２８はモールド２７の上部に配置され密嵌されている。このように漏斗２８の収斂部２８ａはモールド２７内部に連通している。
【００３５】
図８、９において、モールド２７の底部には、細胞塊のサイズよりも小さなサイズの径を有する微細孔が多数形成された部材（フィルタ）を設け、この微細孔により細胞塊をモールド２７内に残しながら培養液をモールド外部に流通させることができる。
モールド２７内は流路２９ｃ（図８）を介して培養器７と連通し、培養器７は過剰量の液体を溜められるように形成されている。この培養器７内のボリュームサイズはモールド２７内の容量に合わせて適宜定めることができる。
モールド２７の外部には、例えばこのモールド２７を囲繞するように培養器７が設けられ、この培養器７にはモールド２７内に収容する培養液２４よりも過剰量の培養液２５を収容することができる。この培養器７内の培養液２５がモールド２７の底に形成されたフィルタの微細孔を通して流通することによりモールド内の培養液２４を形成し、第１容器内の細胞塊２３を培養することができる。
【００３６】
培養器７内の培養液は漏斗側あるいはフィルタ側からモールド２７内に流通することができ、この培養液によってモールド２７内の細胞塊が培養される。モールド２７の周囲に過剰に満たされた培養液と、鋳型部２７ｂ内に貯溜された細胞塊とによって、治療に必要十分な量の立体構造体を形成することができる。
培養器７内に供給される培養液の量は、細胞が増殖・分化することができる限り特に限定されるものではないが、例えば、鋳型部２７ｂ内で直径４ｍｍ、厚さ５ｍｍの細胞塊を培養する場合は、培養器７内の培養液の量は例えば１０〜２０ｍｌ必要であり、培養器７に供給する培養液は鋳型部２７ｂの容量の少なくとも５〜１０倍程度必要である。
【００３７】
収斂部２８ａは、例えば、４つのチップ２２の先端から排出された細胞塊を受け入れられるように、外側に開いて形成され、収斂部２８ａに吐出された細胞塊は収斂部２８ａを下方へ流下してモールド２７内に流れ込む。このように、漏斗２８を介して効率的に細胞塊をモールド２７内に導入することができる。
【００３８】
モールド２７、漏斗２８、支持体２９は隔壁３１によって囲繞され、これにより、周囲からの異物の混入および周囲への培養液３３の飛散を低減／防止している。
図９は上部から底部に向けて切断されたモールド、およびモールド内に配置されたフィルタを拡大した断面図である。図９に示すように、モールド２７はモールド本体３５とこのモールド本体３５に組み込まれたフィルタ３７とから構成される。
モールド２７は、漏斗２８を介して流れ込んだスフェロイドなどの細胞塊を基にして細胞の立体構造体（細胞プラグ）を形成する。本発明の好ましい態様において、モールド２７に収容された細胞は、表面張力により培養液と気相との境界に接して浮遊し、次の細胞塊が流れ込むことで、今度は流れ込んだ後の最上部の細胞が培養液と気相との境界部を構成する。これを繰り返すとともに、細胞塊を培養器７内に充たされた過剰な培養液によって培養させることにより、細胞の立体構造体を形成することができる。また、モールド２７内部には開口部２７ａとフィルタ３７とによって囲まれた鋳型部２７ｂが形成され、この鋳型部２７ｂの形状を変えることにより、任意形状の立体構造体を作製することができる。
【００３９】
モールド本体３５の下部には、鋳型部２７ｂから流下した培養液がモールド２７の外部に向かって流通する、あるいは、モールド２７の周囲に満たされる培養液がモールド２７内に向かって流通するためのノッチ３５ａが形成されている。これにより、自在に培養液が流通することができ、モールド２７周囲に満たされた過剰量の培養液によって鋳型部２７ｂ内の細胞塊を培養することができる。培養条件としては、３７℃の温度で５％濃度の二酸化炭素雰囲気下での実行が挙げられる。
【００４０】
モールド２７の素材としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエステル、ポリウレタン、ポリビニルなどの合成樹脂、シリコン樹脂、合成ゴム、天延ゴム、セラミック、ステンレスなどの金属材料、などがある。
【００４１】
フィルタ３７には細胞懸濁液から培養液を濾過するための微細孔３７ａが形成され、この細孔３７ａを通過した培養液はモールド本体３５の下部へさらに流下し、支持体２９に形成された受け部２９ｂに流入する。微細孔３７ａの孔径は、例えば１０〜５００μｍであり、これにより鋳型２７ｂ内の細胞塊はフィルタ３７の下側へ通過せずに培養液のみがフィルタ３７を介して出入することができる。
【００４２】
フィルタの構成材料としては多孔性のものであれば特に制限しないが、例えば、半透膜、高分子材料を発泡または多孔質化させたもの、焼結体、多孔性のガラスやセラミックス、またはキトサン、セルロース、デキストランなど天然由来の高分子物質で多孔質構造を有するものなどが挙げられる。
高分子の発泡または多孔質材料としては、ポリエチレンまたはポリプロピレンなどのポリオレフィン系；ブタジエンまたはイソプレンなどのジエン系；ポリウレタン；ポリ塩化ビニル、アクリルアミド、ポリスチレンまたはポリビニルアルコールなどのビニル系重合体；ポリエーテル、ポリエステル、ポリカーボネートまたはナイロンなどの縮合体；シリコンおよびフッ素樹脂などの材料が適用できる。
【００４３】
本発明の培養システムで培養の対象となる細胞は、例えば、幹細胞（ＥＳ細胞、臍帯血由来細胞、未分化間葉細胞等）、体細胞、腫瘍細胞、などの未分化細胞またはその分化細胞である。
線維芽細胞、幹細胞、血管内皮細胞、表皮細胞、上皮細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞は未分化間葉系幹細胞から容易に分化誘導ができ、関節軟骨細胞や骨細胞などの細胞も使用することができる。
このように本発明は、中胚葉系の組織を中心として、関節軟骨、骨のほか、乳房などの脂肪細胞、靭帯などにも応用することができる。
【００４４】
細胞には、浮遊系細胞と足場依存性細胞とに大きく分類され、前者には血液系や免疫系の細胞が属し、後者には皮膚や骨などの細胞が属する。皮膚や骨などの細胞は、培養液中で浮いている状態では死んでしまい、ガラスなどシャーレに付着することで増殖させる必要がある。このため、ポリテトラフルオロエチレン中に細胞を一カ所に集めるようにすると、細胞は足場を求めて、お互いに接着し合い、細胞凝集塊すなわちスフェロイドが形成される。さらに、スフェロイド同士が接着・融合すると大きな形状のものができる。
スフェロイドを介することにより、細胞周期において細胞は静止期に移行し、タンパク質の産生が増加すると考えられる。従って、本発明では、細胞を静止期に誘導するため、一旦スフェロイドにしてから所定の形状に形成することが好ましい。
【００４５】
細胞培養に用いられる培養液は、培養対象の細胞にもよるが、慣用の合成培地または天然培地を用いることができる。
動物由来物質からの細菌ウイルスなどの感染、供給時期や品質の安定性を考慮すると合成培地が好ましい。
合成培地としては、例えば、α−ＭＥＭ（Mnimum Essential Medium）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地)ＲＰＭＩ １６４０培地、ＣＭＲＣ培地、ＨＡＭ培地、ＤＭＥ／Ｆ１２培地、ＭＣＤＢ培地、などを用いることができる。
これらの培地には、増殖因子や成長因子、ホルモンなどの生理活性物質、薬理作用を有するその他の種々の物質を適宜添加してもよい。このような物質を添加することにより、機能を付与したり変化させることができる。
【００４６】
一例として、成長因子または細胞増殖因子としては、骨形成蛋白質(BMP:Bone Morphogenetic Protein）、繊維芽細胞増殖因子(FGF:Fibroblast Growth Factor）、トランスフォーミング増殖因子(TGF-β:Transforming Growth Factor−β）、インスリン様増殖因子(IGF:Insulin-like Growth Factor）、血小板由来増殖因子(PDGF:Platelet Derived Growth Factor）、血管内皮細胞増殖因子(VEGF:Vascular Endothelial Growth Factor）、トランスフェリンなどの既知血清成分（濃度は適宜調整）、各種ビタミンやストレプトマイシンなどの抗生物質などがある。
ホルモンとしては、例えば、インシュリン、トランスフェリン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、チロキシン、３，３'，５−トリヨードチロニン、１−メチル−３−ブチルキサンチン、プロゲステロン、などが挙げられる。
その他の生理活性物質として典型的には、例えば、アスコルビン酸（特に、Ｌ−アスコルビン酸）、ビオチン、パントテン酸カルシウム、アスコルビン酸二リン酸、ビタミンＤ等のビタミン類、血清アルブミン、トランスフェリン等のタンパク質、脂質、脂質酸源、リノール酸、コレステロール、ピルビン酸、ＤＮＡおよびＲＮＡ合成用ヌクレオシド、グルココルチコイド、レチノイン酸、β−グリセロホスフェート、モノチオグリセロールなどが挙げられる。
【００４７】
細胞の培養温度は、典型的には３５〜４０℃であり、好ましくは３７℃前後である。培養期間は目的の細胞塊のサイズに応じて適宜調節するとよい。例えば胚性幹細胞を培養する場合は、３７℃の温度で培養を実行し、さらに５％の二酸化炭素濃度の条件下で培養を実行することが一般的によく知られている。
胚性幹細胞由来のスフェロイドの形成は、上記の培養条件のもとに実行することができる。以下に本発明のより詳細な態様について説明する。
【００４８】
上記で説明した培養システムについてさらに具体的な構成について以下に説明する。図１０は本発明の培養システムを覆うカバーの一部を切断して内部構成を概略的に示した部分分解斜視図である。なお、図１〜９における説明と同様の部分については同じ符号を付して説明を省略する。
図１０に示すように、培養システム１０２は、ハンドリング手段であるハンドリング機構３、ウェルプレート４が載置される載置台１０５、装着チップボックス１０６、培養器７、防泡器８、使用済みチップの脱着チップボックス１０９、培地リザーバ１０、電動シリンダ１１１、図示しない調温器、給排気機構などを備える。ハンドリング機構３、ウェルプレート４、載置台１０５、培養器７、チップボックス１０９、電動シリンダ１１１は、それぞれベース１１３上に固定され、周囲がカバー１１４によって覆われる。システム全体をカバー１１４によって覆うこともでき、これにより、外部から塵や埃が装置内部に侵入することが防止される。
【００４９】
ベース１１３の中央にはハンドリング機構３が配置され、ハンドリング機構３の移動体３ｃは軸Ｐの周りで回動移動することができる。ハンドリング機構３としては、例えば水平多関節ロボットや垂直多関節ロボットなどのロボットを用いることができる。
ハンドリング機構３は、ベース１１３に固定された機構本体３ａと、この機構本体３ａに対して回動可能に一端が軸着された接続アーム３ｂと、接続アーム３ｂの他端に取り付けられた移動体３ｃとを有し、一端が機構本体３ａに固定された接続アーム３ｂの他端に移動体３ｃが取り付けられたことにより、移動体３ｃは回転軸Ｐに対して回動することができる。
ハンドリング機構３の周囲には、装着チップボックス１０６を備えウェルプレート４の載置が自在な載置台１０５、培養器７、防泡器８、培地リザーバ１０、脱着チップボックス１０９が配置されている。ここで、図１０は水切り部材を設置した防泡器８と培養器７とを別々に配置した態様を示すが、培養器７に水切り部材を配置することもできる。
【００５０】
装着チップボックス１０６には、ノズル２０（図６参照）に装着される複数の未使用チップが備えられており、これにより培養作業ごとにチップを交換することが可能となっている。ウェルプレート４には、例えば培養された細胞塊（スフェロイド）が収容されており、このウェルプレート４に収容された細胞塊を用いて立体構造体が形成される。培地リザーバ８は細胞の立体構造体形成時に培養器７内に注入される培地を収容する。脱着チップボックス１０９は、既に使用されノズルから脱着されたチップを収容するためのものである。
【００５１】
次に図１０に例示されたシステムを用いて本発明の作用の一例について説明する。
スフェロイドなどの細胞塊が収容されたウェルプレート４が載置台１０５上に載置され、ハンドリング機構３の移動体３ｃがウェルプレート４上に移動してノズルユニット１６が下降する。ノズルユニット１６が下降すると４つのノズル２０に装着されたそれぞれのチップ２２が対応するウェル４ａに進入し、それぞれのウェル４ａに収容された細胞塊が各チップ２２内に吸引される。
【００５２】
各チップ２２内に細胞塊が吸引された後、移動体３ｃが培養器７上に移動し、ノズルユニット１６が漏斗２８に向けて下降する。ノズルユニット１６の下降後、各チップ２２から漏斗２８の収斂部２８ａに細胞塊が吐出され、収斂部２８ａに吐出された細胞塊は溶液よりも重いので、収斂部２８ａを流下してモールド２７の鋳型部２７ｂに収容される。
【００５３】
細胞塊の吐出後、必要に応じてハンドリング機構３の移動体３ｃは培地リザーバ１０上に移動し、ノズルユニット１６が下降してチップ２２内に培地リザーバ１０の培地を吸引することもできる。培地の吸引後、移動体３ｃは培養器７上へ移動してチップ２２内の培地を漏斗２８の脇から培養器７の支持体２９上に吐出し、過剰量の培地がモールド２７の周囲に満たされる。
このときの培養条件は、例えば温度３７℃、５％二酸化炭素雰囲気である。所定の培養時間の経過後、治療に必要十分な量の立体構造体がモールド２７の鋳型部２７ｂに形成される。チップ２２先端の水滴は防泡器８に具備された水切り部材４０によって除去することができる。
立体構造体の形成後、モールド２８上に装着されていた漏斗２８を脱着し、さらに支持体２９からモールド２７を取り外すことで、モールド２７内から細胞の立体構造体を取り出すことができる。
【００５４】
以上のように、本発明の培養システムによれば、さらに、防泡器又は培養器に水切り部材を備えることにより、チップの先端に残留する水滴を除去することができ、気泡の発生を防ぐとともに水滴が周囲へ飛散することを低減している。また、本発明によれば、人の手を介することなく細胞塊をモールド内に流し込み再生治療に用いられる細胞の立体構造体を成形することができ、細菌や微生物による汚染を低減しつつ、利便性を高めることができる。また、ハンドリング機構としてスカラロボットを用いることにより、設置スペースがより小さなコンパクトな培養システムにすることができる。
【符号の説明】
【００５５】
２  培養システム
３  ハンドリング機構（ハンドリング手段）
４  ウェルプレート
４ａ  ウェル
７  培養器（第２容器）
８  防泡器
１６  ノズルユニット
２０  ノズル
２２  チップ
２３  細胞塊
２４  培養液
２５  培養液
２７  モールド（第１容器）
２８  漏斗
２９  支持体
３５  モールド本体
３７  フィルタ
３７ａ  微細孔
４０  水切り部材（除液手段）
４０ａ  挿通開口
４５  ドレーナ
５０  ドレーナ
１０２  培養システム
１０５  載置台
１０９  チップボックス
１１１  電動シリンダ
【図１】
2012111684.tif 000003
【図２】
2012111684.tif 000004
【図３】
2012111684.tif 000005
【図４】
2012111684.tif 000006
【図５】
2012111684.tif 000007
【図６】
2012111684.tif 000008
【図７】
2012111684.tif 000009
【図８】
2012111684.tif 000010
【図９】
2012111684.tif 000011
【図１０】
2012111684.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成24年5月9日(2012.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞塊をハンドリングするハンドリング手段と、
前記ハンドリング手段から供給される細胞塊を貯溜し、培養液が外部と流通できる微細孔を有する第１容器と、
前記第１容器を収容し、前記第１容器内の培養液よりも過剰量の培養液を前記第１容器の周囲に満たす第２容器と、
前記ハンドリングの際前記ハンドリング手段に残留した水滴又は泡沫を除去する除液手段と、を有することを特徴とする細胞塊の培養システム。
【請求項２】
前記ハンドリング手段は前記細胞塊を含む培養液の吸引及び吐出が可能なノズルを備え、前記ノズルを介して細胞塊をハンドリングすることを特徴とする請求項１に記載の培養システム。
【請求項３】
前記除液手段は、前記ノズルの先端が近接して前記吸引又は吐出の際生じた水滴又は泡沫をノズルの先端から除去する水切り部材を備えることを特徴とする請求項２に記載の培養システム。
【請求項４】
前記第１容器は、貯溜された細胞塊を培養して細胞の立体構造体を成形するためのモールドであり、前記モールドの底部に、微細孔を有する部材を設けたことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の培養システム。
【請求項５】
前記第１容器の開口部に、外側に開いた漏斗を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の培養システム。
【請求項６】
培養液の吸引及び吐出が可能なハンドリング手段に備えられたノズルの先端付近に前記吸引又は吐出の際生じた水滴又は泡沫を除去する水切り部材であって、前記ノズルが上下に通過できる大きさの孔が設けられた前記部材。
【請求項７】
前記部材は、前記水滴又は泡沫が前記孔付近の部材に接触することによりノズルの先端から前記水滴又は泡沫を除去するものである請求項６に記載の部材。
【請求項８】
培養容器の開口部に設置されるものである、請求項６又は７に記載の部材。
【請求項９】
前記水切り部材は、前記ノズルが上下に通過できる大きさの除液孔が設けられるとともに前記第１容器の垂直方向と同軸上に配置されるものである、請求項３に記載の培養システム。
【請求項１０】
前記除去された水滴又は泡沫は、前記水切り部材を伝わって前記第１容器内に滴下する、請求項９に記載の培養システム。
【国際調査報告】
2012111684.tif 000013
2012111684.tif 000014
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