(57)【要約】  疼痛を治療、改善、または予防するための組成物を提供することを目的とし、メタロチオネインタンパク質は、健常な末梢神経においては発現しているが、疼痛が生じている末梢神経においては発現が認められないことを見出した。また、神経障害性疼痛を惹起したラットにメタロチオネインを投与することによって、該ラットにおける疼痛が抑制されることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタロチオネインタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、または該遺伝子が挿入されたべクターを含有する、疼痛を治療、改善、または予防するための組成物。
【請求項２】
メタロチオネインタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、または該遺伝子が挿入されたべクターを投与する、疼痛を治療、改善、または予防するための方法。
【請求項３】
被験者における疼痛の治療、改善、または予防に対する請求項１に記載の組成物の有効性を判定するための方法であって、
被験者から単離した試料におけるメタロチオネインタンパク質の発現を検出し、
該発現が、健常者におけるメタロチオネインタンパク質の発現よりも有意に低い場合に、前記被験者における疼痛の治療、改善、または予防に対して、請求項１に記載の組成物が有効性が高いと判定する方法。
【請求項４】
メタロチオネインタンパク質の発現を検出する分子を含有する、疼痛を診断するための組成物。
【請求項５】
疼痛を診断するための方法であって、
被験者から単離した試料におけるメタロチオネインタンパク質の発現を検出し、
該発現が、健常者におけるメタロチオネインタンパク質の発現よりも有意に低い場合に、前記被験者は疼痛を羅患している、または疼痛を羅患する危険性を有していると判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疼痛を治療、改善、または予防するための組成物および方法に関する。また、本発明は、疼痛の治療、改善、または予防に対する該組成物の有効性を判定する方法に関する。さらに、本発明は、疼痛を診断するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
複合性局所疼痛症候群（Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｐａｉｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＣＲＰＳ）とは、骨折などの外傷や神経損傷の後に続発する疼痛が、外傷の程度とは不釣合いに激しくかつ持続性に遷延する症候群である。これまで様々な呼称で呼ばれてきており、１８６７年にＭｉｔｃｈｅｌｌが南北戦争で銃創などにより受傷した神経損傷後の灼熱痛をカウザルギー（Ｃａｕｓａｌｇｉａ）と記載したのがはじまりとされている。その後も、有痛性骨萎縮症（ａｌｇｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、慢性外傷性浮腫（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｅｄｅｍａ）、疼痛性外傷後骨粗鬆症（ｐａｉｎｆｕｌ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）など様々な名称で呼ばれてきた。その後、外傷後の頑固な灼熱痛や異常な血管の収縮および拡張は交感神経系に原因があると提唱され、１９４６年にＥｖａｎｓにより反射性交感神経性ジストロフィー（Ｒｅｆｌｅｘ  Ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ、ＲＳＤ）という概念が導入された。その後、カウザルギーやＲＳＤという呼称が疼痛関連領域で一般的に使用されてきたが、１９８６年の国際疼痛学会で、明らかな神経損傷を伴わないものをＲＳＤ、逆に神経損傷に伴うものをカウザルギーと明確に定義された。しかしながら、ＲＳＤの中には交感神経ブロックなどに反応しないものも存在し、病態の首座が不明瞭であるなどの様々な物議を呼び、１９９４年に国際疼痛学会の用語委員会により、ＲＳＤはＣＲＰＳタイプIに、カウザルギーはＣＲＰＳタイプIIに統一されて定義され、現在にいたる。【０００３】
ＣＲＰＳの特徴としては、アロディニア、痛覚過敏、感覚低下、触覚異常、皮膚色の変化、発汗異常、皮膚の萎縮や色素沈着、皺の消失と光沢化、爪の形態変形や菲薄化、関節の可動域制限、骨萎縮、筋力低下、不随運動など様々な症状を呈する。ＣＲＰＳの最大の特徴として、その疼痛の強さが挙げられる。外傷の程度に不釣合いに強度かつ持続的な疼痛は、患者のＱＯＬを著しく低下させる。しかしながら、ＣＲＰＳの治療の現場は非常に混乱している。その最大の理由は病態の解明がなされていないためである。これまで保存的な治療法としては薬物療法（ＮＳＡＩＤＳ、ステロイド、強弱オピオイド、抗不安剤、抗痙攣剤など）、運動療法（関節可動域訓練、筋力訓練など）、ブロック療法（交感神経ブロック、背髄電気刺激療法など）、外科的治療法としては神経剥離、神経切除、神経移植など様々な治療法が試みられてきたが、未だ有効な治療法、特に有効な医薬組成物がないというのが現状である。【０００４】
一方、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ、ＭＴ）は近年中枢神経系で注目されているタンパク質である。アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳなど様々な神経変性疾患や脳損傷後でその上昇が確認されており、さらにＭＴは神経再生に寄与するタンパク質であることが知られている（非特許文献１〜７）。【０００５】
しかしながら、ＭＴについて、末梢神経系においてはほとんど研究されておらず、ＭＴとＣＲＰＳ等における疼痛との関係については、これまで何ら報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｈｕｎｇ，Ｒ．Ｓ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００８年、２８３巻、２２号、１５３４９〜５８ページ
【非特許文献２】Ｃｈｕｎｇ，Ｒ．Ｓ．ら、「Ｔｈｅ  ｎａｔｉｖｅ  ｃｏｐｐｅｒ−  ａｎｄ  ｚｉｎｃ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ  ｂｌｏｃｋｓ  ｃｏｐｐｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｂｅｔａ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ．」、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２０１０年８月１１日、５巻、８号、ｅ１２０３０
【非特許文献３】Ｎａｇａｎｏ，Ｓ．ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２００１年、１３巻、７号、１３６３〜７０ページ
【非特許文献４】Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｍ．Ｏ．ら、Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ、２００９年、３５巻、４号、３１５〜２５ページ
【非特許文献５】Ｅｂａｄｉ，Ｍ．ら、Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ（Ｍａｙｗｏｏｄ）、２００６年、２３１巻、９号、１５７６〜８３ページ
【非特許文献６】Ｃｈｕｎｇ，Ｒ．Ｓ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２００３年、２３巻、８号、３３３６〜４２ページ
【非特許文献７】Ｓｔａｎｋｏｖｉｃ，Ｒ．Ｋら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ、２００６年、４０２巻、１−２号、１〜６ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、疼痛の発症機序に関与する分子を同定し、当該分子を利用した疼痛の治療、改善、または予防のための組成物および方法を提供することにある。また、本発明の目的は、疼痛の治療、改善、または予防に対する該組成物の有効性を、当該分子を標的として判定する方法を提供することにある。さらなる本発明の目的は、当該分子を標的とした疼痛の診断のための組成物および方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ、ＭＴ）タンパク質は、健常な末梢神経においては発現しているが、疼痛が生じている末梢神経においては発現が認められないことを見出した。さらに、神経障害性疼痛（神経因性疼痛）を惹起したラットにメタロチオネインタンパク質を投与することによって、該ラットにおける疼痛が抑制されることを見出した。これらの事実から、本発明者らは、メタロチオネインタンパク質を利用して疼痛の治療などが可能であること、メタロチオネインタンパク質の発現を指標として該治療などの有効性を判定することが可能であること、さらには、メタロチオネインタンパク質の発現を指標として疼痛の診断が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）メタロチオネインタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、または該遺伝子が挿入されたべクターを含有する、疼痛を治療、改善、または予防するための組成物。
（２）メタロチオネインタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、または該遺伝子が挿入されたべクターを投与する、疼痛を治療、改善、または予防するための方法。
（３）被験者における疼痛の治療、改善、または予防に対する（１）に記載の組成物の有効性を判定するための方法であって、被験者から単離した試料におけるメタロチオネインタンパク質の発現を検出し、該発現が、健常者におけるメタロチオネインタンパク質の発現よりも有意に低い場合に、前記被験者における疼痛の治療、改善、または予防に対して、（１）に記載の組成物が有効性が高いと判定する方法。
（４）メタロチオネインタンパク質の発現を検出する分子を含有する、疼痛を診断するための組成物。
（５）疼痛を診断するための方法であって、被験者から単離した試料におけるメタロチオネインタンパク質の発現を検出し、該発現が、健常者におけるメタロチオネインタンパク質の発現よりも有意に低い場合に、前記被験者は疼痛を羅患している、または疼痛を羅患する危険性を有していると判定する方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明において、ＭＴタンパク質の発現低下が疼痛の発症に関与しており、ＭＴタンパク質の投与が疼痛の予防、改善、または治療において顕著な効果を示すことが明らかとなった。本発明により、新たな作用機序に基づく疼痛の治療、改善、または予防を行うことが可能となり、新たな指標により客観的に疼痛の診断を行うことが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ウェスタンブロッティングによって、ＣＲＰＳ患者の末梢神経におけるメタロチオネインタンパク質の発現を調べた結果を示す、写真である。
【図２】免疫染色によって、ＣＲＰＳ患者の末梢神経におけるメタロチオネインタンパク質の発現部位を調べた結果を示す、顕微鏡写真である。なお図中「ＭＴ」は抗メタロチオネイン抗体を用いて、「Ｓ１００」はシュワン細胞特異的なマーカーであるＳ１００に対する抗体を用いて、「ＮＦＭ」は軸索特異的なマーカーであるＮＦＭに対する抗体を用いて、各々免疫染色した結果を示す。
【図３】Ｓｅｌｔｚｅｒモデルの疼痛に対するＭＴ局所投与の効果を、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｔｅｓｔ（刺激：１．２６ｇ）にて調べた結果を示すグラフである。なお横軸は、Ｓｅｌｔｚｅｒモデル作製のための手術を施した日後１日目、３日目、５日目、及び７日目（Ｄａｙ１、Ｄａｙ３、Ｄａｙ５、及びＤａｙ７）、並びに該手術前（術前）における結果を示し、縦軸は、Ｓｅｌｔｚｅｒモデルにおいて、右（患側）足底への刺激に対する疼痛逃避行動（Ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の総回数から、左（健側）足底への刺激に対する疼痛逃避行動の総回数を引いた値を示す。
【図４】Ｓｅｌｔｚｅｒモデルの疼痛に対するＭＴ局所投与の効果を、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｔｅｓｔ（刺激：４．３５ｇ）にて調べた結果を示すグラフである。なお横軸は、Ｓｅｌｔｚｅｒモデル作製のための手術を施した日後１日目、３日目、５日目、及び７日目（Ｄａｙ１、Ｄａｙ３、Ｄａｙ５、及びＤａｙ７）、並びに該手術前（術前）における結果を示し、縦軸は、Ｓｅｌｔｚｅｒモデルにおいて、右（患側）足底への刺激に対する疼痛逃避行動（Ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の総回数から、左（健側）足底におけるその総回数を引いた値を示す。
【図５】Ｓｅｌｔｚｅｒモデルの疼痛に対するＭＴ局所投与の効果を、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｔｅｓｔ（刺激：８．７５ｇ）にて調べた結果を示すグラフである。なお横軸は、Ｓｅｌｔｚｅｒモデル作製のための手術を施した日後１日目、３日目、５日目、及び７日目（Ｄａｙ１、Ｄａｙ３、Ｄａｙ５、及びＤａｙ７）、並びに該手術前（術前）における結果を示し、縦軸は、Ｓｅｌｔｚｅｒモデルにおいて、右（患側）足底への刺激に対する疼痛逃避行動（Ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の総回数から、左（健側）足底におけるその総回数を引いた値を示す。
【図６】Ｓｅｌｔｚｅｒモデルの疼痛に対するＭＴ局所投与の効果を、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ  ｔｅｓｔにて調べた結果を示すグラフである。なお横軸は、Ｓｅｌｔｚｅｒモデル作製のための手術を施した日後１日目、３日目、５日目、及び７日目（Ｄａｙ１、Ｄａｙ３、Ｄａｙ５、及びＤａｙ７）、並びに該手術前（術前）における結果を示し、縦軸は、Ｓｅｌｔｚｅｒモデルにおいて、左（健側）足底に熱刺激を放射してから疼痛逃避行動をとるまでの平均時間から、右（患側）足底におけるその平均時間を引いた値を示す。
【図７】Ｓｅｌｔｚｅｒモデルの疼痛に対するＧＳＴ融合ＭＴタンパク質（ＧＳＴ−ＭＴ）の腹腔内投与の効果を、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｔｅｓｔ（刺激：１．２６ｇ）にて調べた結果を示すグラフである。なお横軸は、Ｓｅｌｔｚｅｒモデル作製のための手術を施した日後３日目、５日目、及び７日目（Ｄａｙ３、Ｄａｙ５、及びＤａｙ７）、並びに該手術前（術前）における結果を示す。縦軸は、図３におけるそれと同義である。
【図８】Ｓｅｌｔｚｅｒモデルの疼痛に対するＧＳＴ−ＭＴの腹腔内投与の効果を、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｔｅｓｔ（刺激：４．３５ｇ）にて調べた結果を示すグラフである。なお横軸は、Ｓｅｌｔｚｅｒモデル作製のための手術を施した日後３日目、５日目、及び７日目（Ｄａｙ３、Ｄａｙ５、及びＤａｙ７）、並びに該手術前（術前）における結果を示す。縦軸は、図４におけるそれと同義である。
【図９】Ｓｅｌｔｚｅｒモデルの疼痛に対するＧＳＴ−ＭＴの腹腔内投与の効果を、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｔｅｓｔ（刺激：８．７５ｇ）にて調べた結果を示すグラフである。なお横軸は、Ｓｅｌｔｚｅｒモデル作製のための手術を施した日後３日目、５日目、及び７日目（Ｄａｙ３、Ｄａｙ５、及びＤａｙ７）、並びに該手術前（術前）における結果を示す。縦軸は、図５におけるそれと同義である。
【図１０】Ｓｅｌｔｚｅｒモデルの疼痛に対するＧＳＴ−ＭＴの腹腔内投与の効果を、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ  ｔｅｓｔにて調べた結果を示すグラフである。なお横軸は、Ｓｅｌｔｚｅｒモデル作製のための手術を施した日後３日目、５日目、及び７日目（Ｄａｙ３、Ｄａｙ５、及びＤａｙ７）、並びに該手術前（術前）における結果を示す。縦軸は、図６におけるそれと同義である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜疼痛を治療、改善、または予防するための組成物、並びに方法＞
本発明は、メタロチオネインタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、または該遺伝子が挿入されたべクターを含有する、疼痛を治療、改善、または予防するための組成物を提供する。また、本発明は、メタロチオネインタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、または該遺伝子が挿入されたべクターを投与する、疼痛を治療、改善、または予防するための方法を提供する。
【００１３】
本発明において「メタロチオネインタンパク質」とは、重金属に対する親和性が高い、システイン残基が豊富なタンパク質である（以下、メタロチオネインのことを「ＭＴ」とも称する）。メタロチオネインタンパク質が由来する生物としては、特に制限はなく、例えば、ヒト、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒル、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、マウス、ラット、サルなどが挙げられるが、ヒトの疼痛を治療または予防するために用いる場合には、ヒト由来であることが好ましい。ヒト由来のＭＴタンパク質としては例えば、ＭＴ−１Ａ、ＭＴ−１Ｂ、ＭＴ−１Ｅ、ＭＴ−１Ｆ、ＭＴ−１Ｇ、ＭＴ−１Ｈ、ＭＴ−１Ｍ、ＭＴ−１Ｘ、ＭＴ−２Ａ、ＭＴ−３、及びＭＴ−４が挙げられる。典型的には、ヒトＭＴ−１ＡとしてＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＮＰ＿００５９３７（ＮＭ＿００５９４６）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられ、ヒトＭＴ−１ＢとしてＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＮＰ＿００５９３８（ＮＭ＿００５９４７）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられ、ヒトＭＴ−１ＥとしてＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＮＰ＿７８３３１６（ＮＭ＿１７５６１７）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられ、ヒトＭＴ−１ＦとしてＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＮＰ＿００５９４０（ＮＭ＿００５９４９）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられ、ヒトＭＴ−１ＧとしてＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＮＰ＿００５９４１（ＮＭ＿００５９５０）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられ、ヒトＭＴ−１ＨとしてＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＮＰ＿００５９４２（ＮＭ＿００５９５１）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられ、ヒトＭＴ−１ＭとしてＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＮＰ＿７８９８４６（ＮＭ＿１７６８７０）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられ、ヒトＭＴ−１ＸとしてＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＮＰ＿００５９４３（ＮＭ＿００５９５２）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられ、ヒトＭＴ−２ＡとしてＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＮＰ＿００５９４４（ＮＭ＿００５９５３）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられ、ヒトＭＴ−３としてＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＮＰ＿００５９４５（ＮＭ＿００５９５４）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられ、ヒトＭＴ−４としてＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＮＰ＿１１６３２４（ＮＭ＿０３２９３５）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。
【００１４】
また、本発明における「メタロチオネインタンパク質」には、前記天然型のＭＴタンパク質と同等の機能を有する限り、アミノ酸の置換、欠失、付加、挿入などにより前記天然型のＭＴタンパク質に対してアミノ酸配列が変異した変異体が含まれる。変異は、自然界において（すなわち、非人工的に）生じたものであっても、人為的に導入されたものであってもよい。人為的な変異の導入は、例えば、部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．＆Ｆｒｉｔｚ，ＨＪ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９８７，１５４，３５０．）により行うことができる。このような変異体におけるアミノ酸の変異数は、その機能が保持される限り、特に制限はないが、通常、１０アミノ酸以内、好ましくは５アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。
【００１５】
また、本発明における「メタロチオネインタンパク質」には、前記天然型のＭＴタンパク質と同等の機能を有する限り、前記天然型のＭＴタンパク質をコードするＤＮＡと高い相同性を有するＤＮＡによりコードされるタンパク質が含まれる。ここで「高い相同性」とは、塩基レベルで少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、ＡｌｔｓｃｈｕｌらによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０）；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１７，３３８９−３４０２（１９９７））によって決定することができる。パラメータは例えば、Ｅ  ｖａｌｕｅ＝０．０１とし、その他はデフォルト値を用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
【００１６】
このようなタンパク質をコードするＤＮＡは、当業者に公知のハイブリダイゼーション技術（例えば、Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９８３年、１００巻、３３３〜３４２ページに記載の方法、Ｂｅｎｔｏｎ，Ｗ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９７７年、１８０〜１８２ページに記載の方法）を利用して調製することができる。すなわち、当業者であれば、前記天然型のＭＴタンパク質をコードするＤＮＡ、またはその一部を利用してハイブリダイゼーションを行い、種々の他の生物からこれと相同性の高いＤＮＡを単離し、さらに単離したＤＮＡから前記天然型のＭＴタンパク質と同等の機能を有するタンパク質を得ることができる。前記天然型のＭＴタンパク質をコードするＤＮＡと相同性の高いＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーションを「６×ＳＳＣ、４０％ホルムアミド、２５℃」、洗浄を「１×ＳＳＣ、５５℃」で行う条件を用いることができる。より好ましい条件としては、ハイブリダイゼーションを「６×ＳＳＣ、４０％ホルムアミド、３７℃」、洗浄を「０．２×ＳＳＣ、５５℃」で行う条件、さらに好ましい条件としては、ハイブリダイゼーションを「６×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、３７℃」、洗浄を「０．１×ＳＳＣ、６２℃」で行う条件を用いることができる。なお、当業者であれば、ＳＳＣの希釈率、ホルムアミド濃度、温度などの諸条件を適宜選択することで、上記の条件と同様のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を実現することができる。
【００１７】
また、前記天然型のＭＴタンパク質をコードするＤＮＡと高い相同性を有するＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの遺伝子増幅技術を利用して調製することも可能である。
【００１８】
さらに、本発明にかかる「メタロチオネインタンパク質」には、前記天然型のＭＴタンパク質と同等の機能を有する限り、その部分ペプチドをも包含する。かかる部分ポリペプチドは、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸、さらに好ましくは２０アミノ酸以上の鎖長を有するポリペプチドである。
【００１９】
調製したタンパク質（変異体を含む）や部分ペプチドが、前記天然型のＭＴタンパク質と「同等の機能を有する」とは、これらが疼痛の予防または治療の効果を有することを意味する。当該効果を有するか否かは、後述の実施例に示すようなＳｅｌｔｚｅｒモデル等を用いた、疼痛に関する行動評価によって判定することができる。
【００２０】
本発明にかかるＭＴタンパク質は公知の手法を適宜選択して調製することができる。天然のタンパク質は、例えば、前記天然型のＭＴタンパク質の発現量が高い腎臓や肝臓組織の抽出液に対し、抗ＭＴタンパク質抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行う方法により調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、例えば、本発明にかかるＭＴタンパク質をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入して得た形質転換体を培養し、発現させたタンパク質を精製することにより調製することが可能である。
【００２１】
より具体的には、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の場合、プラスミドベクターｐＥＴ−３（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ５６，１２５−３５（１９８７））、ｐＧＥＸ−１（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｇｅｎｅ  ６７，３１−４０（１９８８））などが用いられる。大腸菌の形質転換は、熱ショック法（例えば、塩化カルシウム法、Ｈａｎａｈａｎ法、Ｉｎｏｕｅ法、塩化ルビジウム法）、電気穿孔法などで行うことができる。宿主が分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）の場合には、プラスミドベクターｐＥＳＰ−１（Ｌｕ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２００，１３５−１４４（１９９７））などが用いられる。酵母の形質転換は、例えば、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、電気穿孔法などにより行われる。宿主が昆虫細胞の場合には、バキュロウイルスベクターｐＢａｃＰＡＫ８／９（ＢＤクロンテック社）などが用いられる。昆虫細胞の形質転換は、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７−５５（１９８０））などに記載の方法に従って行うことができる。また、宿主が哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞などの場合、ｐＭＳＧ（ＢＤクロンテック社）などのベクターが用いられる。ほ乳動物細胞への組換えＤＮＡの導入は、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒＥｂ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２，４５６−４６７（１９７３））、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｉｌｍａｎ，Ｇ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，１６４１−１６４３（１９８４））、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，７４１３−７４１７（１９８７））、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１，８４１−８４５（１９８２））などで行われる。また、宿主細胞において発現させた組換えタンパク質は、公知の方法により精製することができる。例えば、Ｎ末端にヒスチジン残基のタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などを結合した融合タンパク質の形で合成し、金属キレート樹脂、ＧＳＴ親和性レジンに結合させることにより精製することができる（Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，７２１１−７２１５（１９８８））。また、ベクターとしてｐＥＳＰ−１を用いた場合、目的のタンパク質は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として合成されるため、ＧＳＴ親和性レジンに結合させることより組換えタンパク質を精製できる。融合タンパク質から目的タンパク質を分離するには、例えば、トロンビン、血液凝固因子Ｘａなどで切断する。しかしながら、後述の実施例において示す通り、ＭＴタンパク質は融合タンパク質が付加されていても、疼痛の予防または治療の効果を有している。そのため、本発明にかかるＭＴタンパク質においては、前記切断の処理等が不要であり、簡便かつ比較的低コストにて得られる融合タンパク質が付加されているＭＴタンパク質も好適に用いることができる。
【００２２】
本発明にかかる「メタロチオネインタンパク質をコードする遺伝子」は、典型的なものとしては、例えば、前述のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．で特定される遺伝子が挙げられる。また、本発明にかかる「メタロチオネインタンパク質をコードする遺伝子が挿入されたべクター」としては、動物細胞内にて挿入された前記「メタロチオネインタンパク質をコードする遺伝子」を発現させることが可能なものであればよい。前記「メタロチオネインタンパク質をコードする遺伝子」を発現させることが可能なベクターとしては、例えば、ｐＭＳＧ（ＢＤクロンテック社）等のプラスミドＤＮＡ、レトロウイルスベクター（Ｄａｎｏｓ，Ｏ．ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８５，６４６０−６４６４（１９８８）；Ｄｒａｎｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，３５３９−３５４３（１９９３））、アデノウイルスベクター（Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ
ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７３，３０９−３１９（１９９３））等のウィルスベクター）等が挙げられるが、これらに制限されない。
【００２３】
本発明において「疼痛」とは、物理的刺激、あるいは疼痛物質（セロトニンやブラジキニンなど）による化学的な刺激を疼痛神経終末端が感知し、電気的なシグナルに変換し温痛覚求心経路である外側脊髄視床路を通過し、大脳の中心後回が痛みとして認識した結果を意味する。本発明における疼痛としては、特に制限されることなく、例えば、絞扼性神経障害、難治性疼痛、脊椎疾患において生ずる疼痛が挙げられる。
【００２４】
絞扼性神経障害としては、例えば、手根管症候群、肘部管症候群、Ｇｕｙｏｎ管症候群、胸郭出口症候群、足根管症候群、Ｍｏｒｔｏｎ病が挙げられる。難治性疼痛としては、例えば、ＣＲＰＳ、糖尿病性ニューロパチー、腕神経損傷、肋間神経痛（帯状疱疹後神経痛）、癌性ニューロパチー、有痛性神経腫、幻肢痛、術後疼痛症候群などのいわゆる神経障害性疼痛（神経因性疼痛）が挙げられる。なお「神経障害性疼痛」とは、神経系の一次的な損傷、あるいはその機能異常が原因となって生じた疼痛であり、神経毒性物質や化学療法等による神経障害や、外傷による末梢神経損傷、四肢切断による幻肢痛、椎間板ヘルニアによる神経根症、代謝性疾患、感染症、腫瘍浸潤、脊髄損傷、脳卒中、多発性硬化症など様々な原因によって生じる疼痛を意味する。また、脊椎疾患としては、頚椎／腰椎椎間板ヘルニア、脊髄損傷、脊柱管狭窄症が挙げられる。
【００２５】
これら全ての疾患は、末梢神経に物理的もしくは化学的な傷害が加わることによって起こる疼痛を伴う。従って、後述の表４において示すように、有痛性神経腫（１人は切断の結果できたアンプテーションニューローマ（断端神経腫）、もう１人はリストカット後に生じた神経腫）においてもＭＴタンパク質が消失していたことから明らかなように、かかる末梢神経障害（傷害）においてはＭＴタンパク質は消失または減少しており、また後述の実施例３及び４において示すように、それら傷害を受けている末梢神経にＭＴタンパク質を投与することで、かかる疼痛は緩和されるため、本発明の組成物はこれら疾患における疼痛の治療、改善、または予防に好適に用いることができ、神経障害性疼痛における疼痛の治療、改善、または予防により好適に用いることができ、ＣＲＰＳにおける疼痛の治療、改善、または予防に特に好適に用いることができる。
【００２６】
本発明の組成物は、医薬組成物、飲食品（動物用飼料を含む）、あるいは研究目的（例えば、インビトロやインビボの実験）に用いられる試薬の形態であり得る。
【００２７】
本発明の組成物は、疼痛を緩和する作用を有するため、疼痛、例えば、前記絞扼性神経障害、難治性疼痛、脊椎疾患において生ずる疼痛などの治療または予防のために投与される医薬組成物として、また、疼痛の改善または予防のために日常的に摂取される飲食品として好適に用いることができる。
【００２８】
本発明の組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤などとして、経口的または非経口的に使用することができる。
【００２９】
これら製剤化においては、薬理学上許容される担体または媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。また本発明の組成物を医薬組成物として用いる場合には、絞扼性神経障害、難治性疼痛、脊椎疾患などの前記疾患の治療または予防に用いられる公知の医薬組成物と併用してもよい。
【００３０】
本発明の医薬組成物の投与方法としては特に制限はなく、例えば、経口投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、神経内投与、気道内投与、直腸投与、筋肉内投与、輸液による投与が挙げられる。また、本発明の医薬組成物の好ましい投与方法としては、疼痛が生じている末梢神経への直接注射、疼痛が生じている末梢神経付近の皮膚への注射、経皮吸収型製剤等による経皮投与、腹腔内投与が挙げられ、より好ましい投与方法としては、腹腔内投与が挙げられる。
【００３１】
本発明の組成物を飲食品として用いる場合、当該飲食品は、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、病者用食品、食品添加物、あるいは動物用飼料であり得る。本発明の飲食品は、上記のような組成物として摂取することができる他、種々の飲食品として摂取することもできる。飲食品の具体例としては、食用油、ドレッシング、マヨネーズ、マーガリンなどの油分を含む製品；スープ類、乳飲料、清涼飲料水、茶飲料、アルコール飲料、ドリンク剤、ゼリー状飲料、機能性飲料等の液状食品；飯類、麺類、パン類等の炭水化物含有食品；ハム、ソーセージ等の畜産加工食品；かまぼこ、干物、塩辛等の水産加工食品；漬物等の野菜加工食品；ゼリー、ヨーグルト等の半固形状食品；みそ、発酵飲料等の発酵食品；洋菓子類、和菓子類、キャンディー類、ガム類、グミ、冷菓、氷菓等の各種菓子類；カレー、あんかけ、中華スープ等のレトルト製品；インスタントスープ，インスタントみそ汁等のインスタント食品や電子レンジ対応食品等が挙げられる。さらには、粉末、穎粒、錠剤、カプセル剤、液状、ペースト状またはゼリー状に調製された健康飲食品も挙げられる。本発明の組成物は、ヒトを含む動物を対象として使用することができるが、ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物などを対象とすることができる。具体的には、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒル、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、マウス、ラット、サルなどが挙げられるが、これらに制限されない。
【００３２】
本発明における飲食品の製造は、当該技術分野に公知の製造技術により実施することができる。当該飲食品においては、絞扼性神経障害、難治性疼痛、脊椎疾患などの前記疾患の改善または予防に有効な１種もしくは２種以上の成分を添加してもよい。また、疼痛の緩和以外の機能を発揮する他の成分あるいは他の機能性食品と組み合わせることによって、多機能性の飲食品としてもよい。
【００３３】
本発明の組成物を投与または摂取する場合、その投与量または摂取量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品など）などに応じて、適宜選択される。例えば、１回当たりの本発明の医薬組成物の投与量は、有効成分であるタンパク質量として、８００ｎｇ／ｋｇ体重〜８ｍｇ／ｋｇ体重が好ましい。遺伝子として投与する場合には、発現するタンパク質が上記投与量の範囲となるように投与することが好ましい。
【００３４】
このように本発明は、本発明の組成物を対象に投与もしくは摂取させること等によって、疼痛を治療、改善、または予防することができる。従って、本発明は、メタロチオネインタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、または該遺伝子が挿入されたべクターを投与する、疼痛を治療、改善、または予防するための方法をも提供するものである。
【００３５】
本発明の組成物の製品（医薬品、飲食品、試薬）またはその説明書は、疼痛を治療、改善、または予防するために用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。
【００３６】
なお、本発明においては、メタロチオネインタンパク質の発現を促進する分子を投与して、疼痛を治療、改善、または予防する態様も考えられる。従って、本発明は、メタロチオネインタンパク質の発現を促進する分子を含有する、疼痛を治療、改善、または予防するための組成物を提供することができる。さらに、本発明は、メタロチオネインタンパク質の発現を促進する、疼痛を治療、改善、または予防するための方法も提供することができる。
【００３７】
本態様における「メタロチオネインタンパク質の発現の促進」は、最終的にメタロチオネインタンパク質の発現が促進される限り、転写段階における促進および翻訳段階における促進のいずれによるものであってもよい。「メタロチオネインタンパク質の発現を促進する分子」としては、例えば、メタロチオネインタンパク質の合成を誘導することが知られている、カドミウム、ビスマス、および銅などの金属、並びにこれらの金属塩が挙げられる（閔ら、治療、２００６年７月、８８巻、７号、１８５３〜１８５８ページ  参照）。また、パーキンソン病モデルのラットに対して、ペルゴリドメシル酸塩（ｐｅｒｇｏｌｉｄｅ  ｍｅｓｉｌａｔｅ）を投与することによって、線状体でのメタロチオネイン  ｍＲＮＡの濃度を上昇させるといった報告があることから、ペルゴリドメシル酸塩も挙げられる（Ｏｎｏら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、２００９年、３２巻、１８１３〜１８１７ページ  参照）。さらに、本発明にかかる「メタロチオネインタンパク質の発現を促進する」方法としては、例えば、ＡＬＳ患者脳内のメタロチオネインｍＲＮＡの濃度が、運動療法によって上昇することが知られていることから、運動療法が挙げられる。
【００３８】
＜疼痛の治療、改善、または予防に対する本発明の組成物の有効性を判定する方法＞
本発明は、被験者における疼痛の治療、改善、または予防に対する前述の組成物の有効性を判定するための方法であって、被験者から単離した試料におけるメタロチオネインタンパク質の発現を検出し、該発現が、健常者におけるメタロチオネインタンパク質の発現よりも有意に低い場合に、前記被験者における疼痛の治療、改善、または予防に対して、本発明の組成物の有効性が高いと判定する方法を提供する。
【００３９】
本発明において、「被験者」とは特に制限はなく、例えば、ヒト、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒル、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、マウス、ラット、サルなどが挙げられる。また、疼痛（例えば、前記、絞扼性神経障害、難治性疼痛、脊椎疾患において生ずる疼痛）を患っていてもいなくともよい。
【００４０】
本発明において、「被験者から単離した試料」とは、健常者においてメタロチオネインタンパク質の発現が確認されている細胞、組織、体液等であればよく、例えば、血液、末梢神経、皮膚、粘膜が挙げられる。また、試料の単離の方法は特に限定されることなく、対象の細胞、組織、体液等に適した公知の手法を適宜採用することができる。なお、本発明において「健常者」とは、疼痛（例えば、前記、絞扼性神経障害、難治性疼痛、脊椎疾患において生ずる疼痛）を患っていない者のことを意味する。
【００４１】
本発明において、「メタロチオネインタンパク質の発現」とは、メタロチオネインタンパク質をコードする遺伝子の転写および翻訳の双方を含む意である。従って、本発明における「タンパク質の発現の検出」には、メタロチオネインタンパク質の検出のみならず、メタロチオネインｍＲＮＡの検出も含まれる。なお、メタロチオネインタンパク質又はメタロチオネインｍＲＮＡの前記試料からの単離の方法は特に限定されることなく、対象の細胞、組織、体液等に適した公知の手法を適宜採用することができる。
【００４２】
本発明における「メタロチオネインタンパク質の発現の検出」には、公知の手法を用いることができる。メタロチオネインタンパク質を検出する方法としては、例えば、免疫組織化学的染色法、イメージングサイトメトリー、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、イムノブロッティング、抗体アレイ、等のメタロチオネインタンパク質に結合する抗体を用いて検出する方法（免疫学的手法）が挙げられる。またメタロチオネインタンパク質をコードするｍＲＮＡを検出する方法としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ解析法、ノーザンブロッティング、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション、ドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法が挙げられる。
【００４３】
被験者から単離した試料におけるメタロチオネインタンパク質の発現の検出の結果、該発現が、健常者におけるメタロチオネインタンパク質の発現よりも有意に低い場合、前記被験者における疼痛の治療、改善、または予防に対して、本発明の組成物が有効性が高いと判定される。逆に、該発現が、健常者におけるメタロチオネインタンパク質の発現と同等である場合、前記被験者における疼痛の治療、改善、または予防に対して、本発明の組成物が有効性は高くないと判定される。
【００４４】
＜疼痛を診断するための組成物および方法＞
本発明は、メタロチオネインタンパク質の発現を検出する分子を含有する、疼痛を診断するための組成物を提供する。また、本発明は、疼痛を診断するための方法であって、被験者から単離した試料におけるメタロチオネインタンパク質の発現を検出し、該発現が、健常者におけるメタロチオネインタンパク質の発現よりも有意に低い場合に、前記被験者は疼痛を羅患している、または疼痛を羅患する危険性を有していると判定する方法を提供する。
【００４５】
本発明において「メタロチオネインタンパク質の発現を検出する分子」とは、当該検出が可能である限り特に制限はなく、例えば前述の「メタロチオネインタンパク質の発現の検出」において列挙した方法に用いられる分子が挙げられる。具体的には、メタロチオネインタンパク質に結合する抗体、メタロチオネインタンパク質をコードするｍＲＮＡに対して特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドプライマー、ポリヌクレオチドプローブ等）が挙げられる。当該ポリヌクレオチドは、通常、メタロチオネインタンパク質をコードするｍＲＮＡの塩基配列と相補的な少なくとも１５塩基の鎖長を有する。ここで「相補的」とは、検出が可能である限り、すべての塩基配列が（すなわち、完全に）相補的でなくともよい。これら抗体やポリヌクレオチドは、必要に応じて標識されていてもよい。これら抗体やポリヌクレオチドの作成方法や標識方法は、当業者に公知である。
【００４６】
組成物には、メタロチオネインタンパク質の発現を検出する上記分子以外に、他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩、標識化合物、二次抗体などが挙げられる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ−マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
【００４７】
当該組成物は、診断に必要な他の標品と組み合わせてキットとすることもできる。他の標品としては、標識の検出に必要な基質、陽性対照や陰性対照、あるいは試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等が挙げられる。また、標識されていない抗体を標品とした場合には、当該抗体に結合する物質（例えば、二次抗体、プロテインＧ、プロテインＡなど）を標識化したものを、キットに含めることができる。さらに、キットには、その使用説明書を含めることができる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４９】
（実施例１）
＜ＣＲＰＳ患者の末梢神経についてのプロテオミクス解析＞
ＣＲＰＳ患者の末梢神経３検体（表１に記載の「ＣＲＰＳ１〜３」）、コントロール（健常神経）として新鮮遺体から摘出した腓腹神経２検体（表１に記載の「コントロール１〜２」いずれも摘出後は−８０℃で保存しておいた）から、タンパク質抽出を行った（用いた神経の詳細については表１  参照）。すなわち、各神経検体５ｍｍを、抽出バッファー（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓベース、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％  グリセロール、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ）２００μＬ内にてホモゲナイズを行い、その後４℃にて３０分間振動させ、さらに４℃、１０万Ｇにて３０分超遠心処理を施し、可溶性画分と不溶性画分とに分離した。得られた不溶性画分に、さらに１％ＳＤＳを１００μＬ加えて、７０℃で３０分間加温後、２２℃、４００００ｇにて３０分間超遠心を行い、上清を抽出した。可溶性画分はＴＣＡにて処理し、沈殿させた後ＳＤＳ−Ｕ（０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４％  ＳＤＳ、８Ｍ  ウレア、０．１％  ＤＴＴ、０．０１％  ブロモフェノールブルー）に溶解した。また、不溶性画分の上清もＳＤＳ−Ｕに溶解した。なお、ＣＲＰＳ患者の末梢神経は治療として神経切除術を行った際に患者の同意を得たものであり、健常神経は札幌医科大学に献体として提供されたものである。【００５０】
得られたタンパク質抽出液について、プロテオミクスの手法を用いて、質量分析装置にて、ペプチド解析を行った。すなわち先ず、８〜２０％ポリアクリルアミドゲルに、前記可溶性画分及び前記不溶性画分のタンパク質をそれぞれ２００μｇセットして、約１０ｃｍ進むまで（１０Ｖにて一晩）泳動して分画した。次いで、このポリアクリルアミドゲルを、Ｅｚ  Ｓｔａｉｎ  Ｓｉｌｖｅｒ  キット（Ａｔｔｏ社製）を用いて銀染色した後、固定液（メタノール１００ｍＬ、超純水（例えば、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、以下同じ）８０ｍＬ、酢酸２０ｍＬ、Ｓ−１液２ｍＬ）に浸し１０分振とうした。そして、この固定液を排液した後、超純水に浸し１０分振とうし、ポリアクリルアミドゲルを洗浄し、さらにこの超純水を排液した。この洗浄操作を３回繰り返した後、ポリアクリルアミドゲルを染色液（超純水２００ｍＬ、Ｓ−２液２ｍＬ）に浸し、５分振とうした後、この染色液を排液した。次いで、ポリアクリルアミドゲルを超純水に浸し、正確に３０秒振とうした後、排液した。そして、発色液（超純水４００ｍL、Ｓ−３液２ｍL、Ｓ−４液２ｍL）の半分にポリアクリルアミドゲルを浸し、正確に３０秒振とうした後、排液し、さらに発色液の残りの半分に浸し適度な色がつくまで振とうし、排液した。次いで、ポリアクリルアミドゲルを停止液（超純水５００ｍＬ、酢酸５ｍＬ）に浸し１０分振とうした後、ＯＨＰスキャニングでバンド（分画された前記可溶性画分及び前記不溶性画分のタンパク質）の確認を行った。【００５１】
次に、ＯＨＰスキャニングにて確認されたバンドの同定を行うために、前述の通りに銀染色を施したポリアクリルアミドゲルを、還元・アルキル化処理し、さらにトリプシン処理を施した。すなわち、前記ポリアクリルアミドゲルを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．８）に浸して１分振とうした後、排液し、さらに１０ｍＭ  ＤＴＴ液（ＤＴＴ粉末０．５ｇを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．８）５０ｍｌに溶解した液）に浸して１５分振とうした後、排液した。次いで、ポリアクリルアミドゲルをＩＡＡ溶液（Ｉｏｄｏａｃｅｔｏａｍｉｄｅ）粉末１ｇを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．８）５０ｍｌに溶解した液）に浸して１５分振とうした後、排液した。そして、ポリアクリルアミドゲルを停止液（１％酢酸）に浸して１０分振とうした。次いで、このように処理したポリアクリルアミドゲルに切れ目を入れて、１ｍｍ区画のサイコロ状にした。そして、得られたサイコロ状のゲルにＡＣＮを加えて１０分振動した後、このＡＣＮを除去した。次いで、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃにて１５分間処理し、これらのゲルを乾燥させた。そして、かかる乾燥したゲルに１００ｍＭ  Ａｍｂｉｃを加え、１０分振動した後、このＡｍｂｉｃを除去した。次いで、ＡＣＮを加えて１０分振動した後、このＡＣＮを除去した。そして、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃにて１５分間処理し、これらのゲルを乾燥させた。さらに、かかる乾燥したゲルに１００ｍＭ  Ａｍｂｉｃを加え、３０分振動した後、このＡｍｂｉｃを除去した。次いで、ＡＣＮ（７５０μｌ）を加えて１０分振動した後、このＡＣＮを除去した。そして、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃにて３０分間処理し、これらのゲルを乾燥させた。このようにして得られた、乾燥したゲルにトリプシン溶液（１２．５ｎｇ／μＬ  ｉｎ  ５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３、５ｍＭ  ＣａＣｌ２）を加えて、３７℃にて一晩インキュベーションした。【００５２】
次に、前述の通りにトリプシン処理を施したゲルからペプチドを抽出し、質量分析を行った。すなわち、前記トリプシン処理を施したゲルに２０ｍＭ  Ａｍｂｉｃを加え、２０分間超音波処理を施し、軽く遠心を加えた後、液を回収した。次いで、回収した液に、５％ＦＡ／５０％ＡＣＮを加え、２０分間超音波処理を施し、軽く遠心を加えた後、液を回収し、この回収操作を３回繰り返した。そして、回収した液を２２℃、２０ＫＧにて２０分間遠心した。そして、得られた上清を上清を新たなエッペンドルフチューブに移し、液量が約５０μＬになるまで蒸発させた。次いで、１５分間超音波処理を施した後、超遠心用のチューブにうつし、２２℃、４０ＫＧにて３０分間超遠心した。このようにして得られたサンプルを４８００  ｐｌｕｓ  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で解析し、５検体（ＣＲＰＳ３検体、Ｆｒｅｓｈ  ｃａｄａｖｅｒ２検体）から得られたＭＳ、ＭＳ／ＭＳのデータを質量分析装置専用のソフトウェア（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｉｌｏｔ  ｖｅｒ３．）を用いて、データベース解析を行い、タンパク質の同定を行った。得られた結果のうち、ＣＲＰＳ患者の末梢神経においてタンパク質の発現が認められなかったものについて、表２に示す。なお、表２中、「ｕｎｕｓｅｄ（Ｐｒｏｔ  Ｓｃｏｒｅ）」は、タンパク質の同定に使用したペプチドの信頼度から計算されるスコアを示す。【００５３】
【表１】
2012115185.tif 000002
【００５４】
【表２】
2012115185.tif 000003
【００５５】
上記解析の結果、ＣＲＰＳ患者の末梢神経においてに特異的に上昇しているタンパク質はなかったが、ＣＲＰＳ患者の末梢神経において特異的に発現していないものとしてメタロチオネイン（ＭＴ）が見出された（表２  参照）。【００５６】
（実施例２）
＜ＣＲＰＳ患者の末梢神経におけるＭＴの発現分析＞
次に、前記ＣＲＰＳ患者の末梢神経についてのプロテオミクス解析の結果を受けて、ＣＲＰＳ患者の末梢神経におけるＭＴタンパク質の発現並びにその局在をウェスタンブロッティング及び免疫染色にて分析した。得られた結果を図１、図２、表３、及び表４に示す。なお、表３は各サンプル（ＣＲＰＳ患者の末梢神経（ＣＲＰＳ１〜３）及び健常神経（コントロール１〜３））における各タンパク質（ＭＴ、Ｓ１００、ＮＦＭ）に対する染色強度を示す。表４は、ＣＲＰＳ検体５検体、有痛性神経腫２検体、および整形外科疾患で広範囲切除を行った病理ブロックに含まれている末梢神経５７検体の免疫染色をさらに行った結果、すなわち各サンプル（ＣＲＰＳ患者、有痛性神経腫患者、新鮮屍体、良性腫瘍、及び悪性腫瘍の患者の末梢神経）におけるＭＴタンパク質の発現を免疫染色の陽性又は陰性にて示す。また、ウェスタンブロッティング及び免疫染色の方法は下記に示す通りである。【００５７】
＜ウェスタンブロッティング＞
各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分画した。すなわち、先ず、５ｍｍの末梢神経サンプルを、１００μＬ  Ｔ−ＰＥＲ（登録商標）  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、１μＬ  ＨａｌｔＴ（登録商標）  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、及び１μＬ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）内でホモゲナイズした。次いで、４℃にて３０分間振動を加えた後、４℃、４０ＫＧにて超遠心を行い、上清を取り分けた。得られた上清のタンパク質の濃度測定をＢＣＡ法にて行い、タンパク質量１０μｇに対して泳動バッファー（０．６１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、１０％ＳＤＳ、５０％  グリセロール、０．０２％  ブロモフェノールブルー）と終濃度５０ｍＭのＤＴＴとを加え、６５℃にて２０分間加温した。そして、このように調製したサンプルを１０〜２０％ポリアクリルアミドミニゲルにロードし、３０ｍＡ  Ｃ．Ｃ．（定電流）にて泳動した。【００５８】
前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したゲルを、転写バッファー（２ｍＭ  ＣａＣｌ２含有  １０ｍＭ  ＣＡＰＳ／１０％メタノール）にて、電圧４０Ｖを１時間かけ、ＰＶＤＦ膜に各サンプル由来のタンパク質を転写した。次いで、タンパク質が転写された膜を２．５％グルタルアルデヒド溶液に１時間浸した後、ＰＢＳにて５分間洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した（ただし、３回目は５０ｍＭとなるようモノエタノールアミンを加えたＰＢＳにて洗浄を行った）後、５％スキムミルク溶液にて１時間ブロッキング処理を行った。そして、膜をＰＢＳにて軽くリンスした後、室温下、湿箱にて各一次抗体と２時間反応させた。なお、用いた一次抗体は下記の通りである。
抗メタロチオネイン抗体（Ｄａｋｏ社製、製品番号：Ｍ０６３９、マウス由来モノクローナル抗体）は、メタロチオネインタンパク質のＮ末端から５〜７個のアミノ残基を認識する抗体であり、ＭＴ−１及びＭＴ−２の全てのアイソフォームに結合する。また、本ウェスタンブロッティングに使用の際には、０．１％  ＢＳＡ／ＰＢＳにて１００分の１に希釈して使用した。抗アクチン抗体（ＳＩＧＭＡ社製、製品番号：Ａ２１０３、ウサギ由来ポリクローナル抗体）は、各サンプルにおける内部標準としてアクチンを検出するために用いた抗体であり、本ウェスタンブロッティングに使用の際には、０．１％  ＢＳＡ／ＰＢＳにて５００分の１に希釈して使用した。【００５９】
このようにして各一次抗体と反応させた膜を、１％スキムミルク及び０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ溶液にて５分間洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した後、さらにＰＢＳにて膜を軽くリンスした。そして、膜を、室温下、湿箱にて各一次抗体に対応する二次抗体と３０分間反応させた。なお、用いた二次抗体は下記の通りである。
ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ社製、＃３１４３２）を、抗メタロチオネイン抗体の検出のために、０．１％  ＢＳＡ／ＰＢＳにて１００００分の１に希釈して使用した。
ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体（ＩＢＬ社製、＃１７５０２）を、抗アクチン抗体の検出のために、０．１％  ＢＳＡ／ＰＢＳにて２０００分の１に希釈して使用した。【００６０】
このようにして各二次抗体と反応させた膜を、１％スキムミルク及び０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ溶液にて５分間洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した後、さらにＰＢＳにて膜を軽くリンスした。そして、膜をＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）と室温にて１分間反応させた。次いで、暗室にて露光および現像処理を行い、メタロチオネインタンパク質及びアクチンタンパク質を検出した。【００６１】
＜免疫染色＞
先ず、各末梢神経検体を１０％ホルマリンにて固定した後、パラフィンにて包埋した。次いで、各末梢神経検体を薄切りに切片にした後、脱パラフィン処理を行い、３％Ｈ２Ｏ２メタノールに１０分間浸した後、ＰＢＳにて３分間洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した後、抗原賦活化溶液（ｐＨ９、ニチレイ社製）を加えて１０５℃にて１５分間オートクレーブ処理を施した。次いで、粗熱をとった後、ＰＢＳにて３分間洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した後、ブロッキング試薬（ブロックエース、雪印社製）を各切片（スライド）上に２滴（約１００μＬ）載せた。そして、各１次抗体を１００μＬ載せて、１時間各切片と反応させた。なお、用いた一次抗体は下記の通りである。
抗メタロチオネイン抗体（Ｄａｋｏ社製、製品番号：Ｍ０６３９、マウス由来モノクローナル抗体）は、メタロチオネインタンパク質のＮ末端から５〜７個のアミノ残基を認識する抗体であり、ＭＴ−１及びＭＴ−２の全てのアイソフォームに結合する。また、本免疫染色に使用の際には、５０分の１に希釈して使用した。
抗Ｓ１００抗体（ＤＡＫＯ社製、Ｎ１５７３、ウサギ由来ポリクロ―ナル抗体）は、シュワン細胞特異的なマーカーであるＳ−１００Ａ１及びＢを認識する抗体である。また、本免疫染色に使用の際には、製造会社提供の濃度そのままにて使用した。
抗ＮＦＭ抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、１３−０７００、マウス由来モノクロ―ナル抗体）は、軸索特異的なマーカーであるＮＦＭのＣ末端を認識する抗体である。また、本免疫染色に使用の際には、１００分の１に希釈して使用した。【００６２】
このようにして各一次抗体と反応させた切片を、ＰＢＳにて３分間洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した後、各一次抗体に対応する二次抗体を１００μＬ載せて、３０分間各切片と反応させた。なお、二次抗体は、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（ＤＡＫＯ  ＣｈｅｍＭａｔｅ社製）ユニバーサルキットに含まれている抗体を用いた。【００６３】
このようにして各二次抗体と反応させた切片を、ＰＢＳにて３分間洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した後、ＤＡＢ発色液１００μＬ載せて、１０分間各切片と反応させた。また、ヘマトキシリンにて核染色を施した後、脱水、封入処理を行い、顕微鏡下にて観察を行った。【００６４】
【表３】
2012115185.tif 000004
【００６５】
【表４】
2012115185.tif 000005
【００６６】
図１に示した結果から明らかなように、前記プロテオミクス解析の結果と一致して、健常な神経においてはＭＴタンパク質が発現しているのに対し、ＣＲＰＳ患者の末梢神経においてはその発現が認められなかった。【００６７】
また図２及び表３に示した結果から明らかなように、免疫染色にてＭＴの局在を評価した結果、ＭＴタンパク質は軸索においては、その発現が認められないものの、シュワン細胞においては発現していた。また図には示していないが、表４に示した結果から明らかなように、全ての有痛性末梢神経（ＣＲＰＳ５検体及び有痛性神経腫２検体）においてＭＴタンパク質の発現は認められず、それ以外の末梢神経５７検体では、組織標本に脱灰操作が加えられていた９検体を除いた全てにおいてＭＴタンパク質の発現が認められた。【００６８】
（実施例３）
＜ＳｅｌｚｅｒモデルへのＭＴタンパク質の局所投与実験＞
前述の結果を受けて、神経障害性疼痛（神経因性疼痛）を惹起するＳｅｌｚｅｒモデルにＭＴタンパク質を局所投与し、該モデルにおける疼痛に対するＭＴタンパク質の効果の有無を調べた。得られた結果を図３〜６に示す。なお、用いたモデルラット、及び該モデルラットに投与したＭＴタンパク質の調製方法、並びに該モデルラットの評価方法等は下記に示す通りである。また、Ｓｅｌｚｅｒモデルは、坐骨神経部分結紮（坐骨神経部分損傷、ｐａｒｔｉａｌ  ｓｃｉａｔｉｃ  ｎｅｒｖｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ，ＰＳＬ）モデルとも称され、神経障害性疼痛のモデルとして解釈されている（佐々木ら、日薬理誌、２００６年、１２７巻、１５１〜１５５ページ  参照）。【００６９】
＜Ｓｅｌｔｚｅｒモデルの調製方法＞
ＳＤラット８匹（雌、体重：２４０〜２６０ｇ）に対して、坐骨神経部分結紮モデル（Ｓｅｌｔｚｅｒモデル）の手術を施行した。すなわち、該ラットにペントバルビタールナトリウム  ５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与し、麻酔した後、腹臥位として右大腿近位部を約２ｃｍ切開して進入し、坐骨神経を露出させた。次いで、大腿骨転子部付近で、坐骨神経がｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｂｉｃｅｐｓ  ｓｅｍｉｔｅｎｄｉｎｏｓｕｓの分枝を出したすぐ遠位において、坐骨神経の背側１／３〜１／２を８−０ナイロンで硬く結紮した。そして、筋膜及び皮膚を４−０ナイロンで縫合した。【００７０】
＜ＭＴタンパク質の調製方法＞
先ず、末梢神経検体より、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標、ＳＩＧＭＡ社製）を用いて抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にてｃＤＮＡの合成を行った。そして、得られた各ｃＤＮＡを鋳型として、下記プライマーを用いて、ヒトＭＴ２Ａの全長をＰＣＲにて増幅した。【００７１】
プライマーの配列
５’−ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＣＡＡＣＴＧＣＴＣＣＴＧ−３’（配列番号：１）
５’−ＧＧＡＡＴＴＣＡＧＧＣＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＴＴＧ−３’（配列番号：２）
次いで、プラスミド（ｐＧＥＸ−６Ｐ−１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）はＢａｍＨ１及びＥｃｏＲ１にて制限酵素処理を行い、増幅して得られたヒトＭＴ２Ａの全長はＢｇｌ２及びＥｃｏＲ１にて制限酵素処理を行った後、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて連結し、ヒトＭＴ２Ａの全長タンパク質を発現することが可能なプラスミドベクターを構築した。そして、得られたプラスミドベクターを大腸菌（ＢＬ２１）に導入した。【００７２】
次いで、この大腸菌を、５０μｇ／ｍｌアンピシリン及び０．２％グルコース含有ＬＢ培地２ｍＬ中、３７℃、２５０ｒ／ｍｉｎにて振とうさせながら、一晩インキュベーションした。そして翌日、該培養液５００μＬを、５０μｇ／ｍｌアンピシリン及び０．２％グルコース含有ＬＢ培地５０ｍｌに加えて、３７℃、２５０ｒ／ｍｉｎにて振とうさせながら、さらに一晩インキュベーションした。次いで翌朝、該培養液のＯＤを計測してスケールアップ後にＯＤ６００が０．１になるように調整し、得られた調整後の培養液１０ｍＬを１ｍＭ  ＺｎＳＯ４含有ＬＢ培地５００ｍＬに加えて、ＯＤ６００が０．８になるまで３７℃、２５０ｒ／ｍｉｎにて振とうさせながらインキュベーションした。そして、かかるインキュベーション後、０．１Ｍ  ＩＰＴＧ溶液を終濃度０．１ｍＭとなるように加えて、さらに３０℃、２５０ｒ／ｍｉｎにて振とうさせながら８時間インキュベーションした。次いで、得られた培養液を４℃、５０００ｇにて、１５分間遠心した後、上清を破棄し、ペレットのみとした。そして、得られたペレットをＰＢＳにて洗浄した後、４℃、４０００ｒｐｍにて、２０分間遠心し、上清を破棄した。次いで、溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．２５Ｍ  スクロース、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（プロテアーゼインヒビタ―、Ｒｏｃｈｅ社製、製品番号：１８７３５８０）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に得られたペレットを懸濁した後、超音波処理を施した。そして、４℃、１００００ｇにて３０分間遠心した後、上清を回収した。次いで、回収して得られた上清にグルタチオン  セファロース  ４Ｂゲル（ＧＳ４Ｂゲル、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を加えて室温にて１時間ローテーション処理を施した。そして、このＧＳ４Ｂゲル混合液を４℃、５００ｇにて５分間遠心した後、上清を破棄し、ＧＳ４Ｂゲルを回収した。回収して得られたＧＳ４ＢゲルをＰＢＳにて洗浄した後、カラムに分注し、さらにＰＢＳおよび切断用バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ）にて洗浄した。そして、１ｍＬの酵素液（切断用バッファー９２０μＬ、及び切断プロテアーゼ（Ｐｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ）８０μＬ）を加えた後、４℃にて４時間静置した。次いで、このカラムに切断用バッファーを加えて、組み換えヒトＭＴ２Ａタンパク質を回収した。【００７３】
＜ＳｅｌｔｚｅｒモデルへのＭＴタンパク質の投与＞
前記手術直後に、治療群には、前記メタロチオネイン２Ａ組み換えタンパク質（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−Ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ２Ａ、ｒＭＴ２Ａ）を、対照群にはＰＢＳを投与した。すなわち、手術当日にｒＭＴ２Ａ  ２０μｇをＰＢＳにて希釈して０．１ｍＬとしたものを前記Ｓｅｌｔｚｅｒモデルの坐骨神経に２７Ｇ針を刺入し、神経内に投与した（対照群はＰＢＳ  ０．１ｍｌを投与した）。そして、その後６日間はｒＭＴ２Ａ  １０μｇをＰＢＳにて希釈して０．４ｍＬとしたものを毎日、経皮的に神経周囲に局所注射した（対照群はＰＢＳ  ０．４ｍＬを局所注射した）。【００７４】
＜Ｓｅｌｔｚｅｒモデルの行動評価＞
前記モデルラットの行動評価は下記の通り、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｔｅｓｔおよびＨａｒｇｒｅａｖｅｓ  ｔｅｓｔにて、術前、術後１、３、５、７日目に行った。【００７５】
‐ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｔｅｓｔ‐
金網状の台の上にプラスチックケースを設置し、前記モデルラットをケース内へ入れて落ち着くまで２０分間待機した。そして、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｆｉｌａｍｅｎｔ（Ｓｅｍｍｅｓ−Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ｍｏｎｏｆｉｌａｍｅｎｔｓ：Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏ．  ＵＳＡ）で１．２６ｇ、４．３５ｇ、及び８．７５ｇの３刺激を左右の足底に１０回ずつ交互に３セット行い、疼痛逃避行動（Ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ、この場合、つつかれた肢を上げる行動）の回数を計測し、右（患側）足底への刺激に対する疼痛逃避行動の総回数から、左（健側）足底への刺激に対する疼痛逃避行動の総回数を引いた値を算出した。【００７６】
なお、かかる１．２６ｇ、４．３５ｇ、及び８．７５ｇは各検査時にキャリブレーションを行って得られた数値である。また、Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  Ｍｏｎｏｆｉｌａｍｅｎｔは、径の太さに応じて２０個用意されており、径の細いものから、１．６５、２．３６、…、６．４５、６．６５とナンバー（ｉｎｄｅｘ  ｎｕｍｂｅｒ）が付されているので、図３〜５中において、前記キャリブレーションした数値に対応したｉｎｄｅｘ  ｎｕｍｂｅｒを各々併記する（キャリブレーションした数値、及びｉｎｄｅｘ  ｎｕｍｂｅｒについては、Ｊｕｄｉｔｈ  Ｂｅｌｌ−Ｋｒｏｔｏｓｋｉら、ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＨＡＮＤ  ＳＵＲＧＥＲＹ、１９８７年１月、１２Ａ巻、１号、１５５〜１６１ページの記載参照）。【００７７】
‐ハーグリーブステスト（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ  ｔｅｓｔ）‐
ガラス台の上にプラスチックケースを設置し、前記モデルラットをケース内へ入れて落ち着くまで２０分間待機した。そして、無拘束下熱刺激装置  ３９０型（米国ＩＩＴＣ社製）を用いて左右の足底に熱刺激を放射し、疼痛逃避行動をとるまでの時間（熱のあてられた肢を上げるまでの時間）を計測した。なお、計測は左右とも５回ずつ行い、その平均時間を算出し、左（健側）足底に熱刺激を放射してから疼痛逃避行動をとるまでの平均時間から、右（患側）足底におけるその平均時間を引いた値を算出した。【００７８】
また、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｔｅｓｔ及びＨａｒｇｒｅａｖｅｓ  ｔｅｓｔにおいては、ともに左右差で比較を行いた。統計学的解析においては、ｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔを用い、Ｐ＜０．０５を有意差ありとした。【００７９】
図３〜６に示した結果から明らかなように、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｔｅｓｔでは４．３５ｇ、８．７５ｇの刺激に対しては、術後３日目から有意に疼痛行動が減少した。さらに、１．２６ｇの刺激に対しても術後７日目で有意な疼痛行動の減少が認められた。通常、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｔｅｓｔにおいて、径の太いＶｏｎ  Ｆｒｅｙ  Ｍｏｎｏｆｉｌａｍｅｎｔを用いて与える刺激（本実施例においては、Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  Ｍｏｎｏｆｉｌａｍｅｎｔ５．０７（８．７５ｇ）を用いて与える刺激）による痛みと、径の細いＶｏｎ  Ｆｒｅｙ  Ｍｏｎｏｆｉｌａｍｅｎｔを用いて与える刺激（本実施例においては、Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  Ｍｏｎｏｆｉｌａｍｅｎｔ４．１７（１．２６ｇ）を用いて与える刺激）による痛みとは量的な点のみならず、質的な点においても異なり、これら異なる刺激に反応する神経回路も異なると考えられている。すなわち、一次知覚神経は主に触圧覚を担うＡβ線維、鋭い痛みを担うＡδ（デルタ）線維、鈍い痛み・温冷覚を担うＣ線維からなるが、神経因性疼痛においては触圧覚が強い疼痛に変化するなど複雑な神経線維応答変調を生じさせると考えられている。従って、ＭＴタンパク質はこれら異なる刺激による異なる疼痛を両方とも抑制できる効果を有していることも明らかになった。【００８０】
また、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ  ｔｅｓｔにおいては、術後３日目及び７日目にて疼痛回避行動までの時間が有意に改善していた。従って、ＭＴタンパク質をラットに投与することにより、該ラットの疼痛を有意に抑制することができ、前記ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｔｅｓｔの結果と併せて、ＭＴタンパク質は機械刺激・熱刺激の双方に対応する除痛効果を有していることが明らかになった。【００８１】
（実施例４）
＜ＳｅｌｚｅｒモデルへのＭＴタンパク質の腹腔内投与実験＞
前記ＳｅｌｚｅｒモデルにＧＳＴ融合ＭＴタンパク質を１００μｇ／回、術日も含め、その後７日連続で腹腔内投与（ＩＰ）した。また、対照群として、ＧＳＴ融合ＭＴタンパク質の代わりに、ＧＳＴタンパク質を投与したＳｅｌｚｅｒモデルも調製した。そして、実施例３の記載と同様にして、これらモデルラットの行動を評価した。得られた結果を図７〜１０に示す。なお、前記Ｓｅｌｚｅｒモデルに投与したＧＳＴ融合ＭＴタンパク質は、＜ＭＴタンパク質の調製方法＞において、切断処理を施さず、ＧＳＴが付加されたままの組み換えヒトＭＴ２Ａタンパク質である。【００８２】
図７〜１０に示した結果から明らかなように、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｔｅｓｔでは、１．２６ｇの刺激に対しては、術後５日目から有意に疼痛行動が減少した。また、４．３５ｇ又は８．７５ｇの刺激に対しては、術後７日目で疼痛行動の有意な減少が確認された。【００８３】
また、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ  ｔｅｓｔでは、統計的な有意差は確認できなかったが、図１０に示す通り、疼痛回避行動までの時間は明らかに改善されていた。【００８４】
従って、ＭＴタンパク質は、実施例３に記載のような局所投与（障害を受けた神経内及び近傍への投与）に限らず、腹腔内投与にても機械刺激・熱刺激の双方に対応する除痛効果を有していることが明らかになった。また、精製用のタグタンパク質（ＧＳＴ）が付加されたままでも、ＭＴタンパク質は疼痛改善効果を有していることも明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明のＭＴタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、または該遺伝子が挿入されたべクターを含有する組成物により、新たな作用機序に基づく疼痛の治療、改善または予防が可能となる。また、本発明のＭＴタンパク質の発現を検出する分子を含有する組成物により、客観的な指標により疼痛の診断が可能となる。従って、本発明は、特に医療分野において大きく貢献しうるものである。
【配列表フリーテキスト】
【００８６】
配列番号１〜２
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列
【図１】
2012115185.tif 000006
【図２】
2012115185.tif 000007
【図３】
2012115185.tif 000008
【図４】
2012115185.tif 000009
【図５】
2012115185.tif 000010
【図６】
2012115185.tif 000011
【図７】
2012115185.tif 000012
【図８】
2012115185.tif 000013
【図９】
2012115185.tif 000014
【図１０】
2012115185.tif 000015
【配列表】
2012115185000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年12月21日(2012.12.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタロチオネインタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、または該遺伝子が挿入されたベクターを含有する、疼痛を治療、改善、または予防するための医薬品組成物（但し、重金属中毒による疼痛を治療、改善、または予防するための医薬品組成物を除く）。
【請求項２】
メタロチオネインタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、または該遺伝子が挿入されたベクターを投与する、疼痛を治療、改善、または予防するための方法（但し、重金属中毒による疼痛を治療、改善、または予防するための方法を除く）。
【請求項３】
被験者における、疼痛の治療、改善、または予防（但し、重金属中毒による疼痛の治療、改善、または予防を除く）に対する請求項１に記載の組成物の有効性を判定するためのデータを得るための方法であって、
被験者から単離した試料におけるメタロチオネインタンパク質の発現を検出する方法。
【請求項４】
メタロチオネインタンパク質の発現を検出する分子を含有する、疼痛を診断するための組成物。
【請求項５】
疼痛を診断するためのデータを得るための方法であって、被験者から単離した試料におけるメタロチオネインタンパク質の発現を検出する方法。
【請求項６】
メタロチオネインタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、または該遺伝子が挿入されたベクターを含有する、手根管症候群、肘部管症候群、Ｇｕｙｏｎ管症候群、胸郭出口症候群、足根管症候群、Ｍｏｒｔｏｎ病、ＣＲＰＳ、糖尿病性ニューロパチー、腕神経損傷、肋間神経痛（帯状疱疹後神経痛）、癌性ニューロパチー、有痛性神経腫、幻肢痛または術後疼痛症候群を治療、改善、または予防するための医薬品組成物。
【請求項７】
メタロチオネインタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、または該遺伝子が挿入されたベクターを投与する、手根管症候群、肘部管症候群、Ｇｕｙｏｎ管症候群、胸郭出口症候群、足根管症候群、Ｍｏｒｔｏｎ病、ＣＲＰＳ、糖尿病性ニューロパチー、腕神経損傷、肋間神経痛（帯状疱疹後神経痛）、癌性ニューロパチー、有痛性神経腫、幻肢痛または術後疼痛症候群を治療、改善、または予防するための方法。
【請求項８】
被験者における、手根管症候群、肘部管症候群、Ｇｕｙｏｎ管症候群、胸郭出口症候群、足根管症候群、Ｍｏｒｔｏｎ病、ＣＲＰＳ、糖尿病性ニューロパチー、腕神経損傷、肋間神経痛（帯状疱疹後神経痛）、癌性ニューロパチー、有痛性神経腫、幻肢痛または術後疼痛症候群の治療、改善、または予防に対する請求項６に記載の組成物の有効性を判定するためのデータを得るための方法であって、
被験者から単離した試料におけるメタロチオネインタンパク質の発現を検出する方法。
【請求項９】
メタロチオネインタンパク質の発現を検出する分子を含有する、手根管症候群、肘部管症候群、Ｇｕｙｏｎ管症候群、胸郭出口症候群、足根管症候群、Ｍｏｒｔｏｎ病、ＣＲＰＳ、糖尿病性ニューロパチー、腕神経損傷、肋間神経痛（帯状疱疹後神経痛）、癌性ニューロパチー、有痛性神経腫、幻肢痛または術後疼痛症候群を診断するための組成物。
【請求項１０】
手根管症候群、肘部管症候群、Ｇｕｙｏｎ管症候群、胸郭出口症候群、足根管症候群、Ｍｏｒｔｏｎ病、ＣＲＰＳ、糖尿病性ニューロパチー、腕神経損傷、肋間神経痛（帯状疱疹後神経痛）、癌性ニューロパチー、有痛性神経腫、幻肢痛または術後疼痛症候群を診断するためのデータを得るための方法であって、
被験者から単離した試料におけるメタロチオネインタンパク質の発現を検出する方法。
【請求項１１】
メタロチオネインタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、または該遺伝子が挿入されたベクターを含有する、外傷による末梢神経損傷、四肢切断による幻肢痛、椎間板ヘルニアによる神経根症、代謝性疾患、感染症、腫瘍浸潤、脊髄損傷、脳卒中又は多発性硬化症によって生じる神経障害性疼痛を治療、改善、または予防するための医薬品組成物。
【請求項１２】
メタロチオネインタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、または該遺伝子が挿入されたベクターを投与する、外傷による末梢神経損傷、四肢切断による幻肢痛、椎間板ヘルニアによる神経根症、代謝性疾患、感染症、腫瘍浸潤、脊髄損傷、脳卒中又は多発性硬化症によって生じる神経障害性疼痛を治療、改善、または予防するための方法。
【請求項１３】
被験者における、外傷による末梢神経損傷、四肢切断による幻肢痛、椎間板ヘルニアによる神経根症、代謝性疾患、感染症、腫瘍浸潤、脊髄損傷、脳卒中又は多発性硬化症によって生じる神経障害性疼痛の治療、改善、または予防に対する請求項１１に記載の組成物の有効性を判定するためのデータを得るための方法であって、
被験者から単離した試料におけるメタロチオネインタンパク質の発現を検出する方法。
【請求項１４】
メタロチオネインタンパク質の発現を検出する分子を含有する、外傷による末梢神経損傷、四肢切断による幻肢痛、椎間板ヘルニアによる神経根症、代謝性疾患、感染症、腫瘍浸潤、脊髄損傷、脳卒中又は多発性硬化症によって生じる神経障害性疼痛を診断するための組成物。
【請求項１５】
外傷による末梢神経損傷、四肢切断による幻肢痛、椎間板ヘルニアによる神経根症、代謝性疾患、感染症、腫瘍浸潤、脊髄損傷、脳卒中又は多発性硬化症によって生じる神経障害性疼痛を診断するためのデータを得るための方法であって、
被験者から単離した試料におけるメタロチオネインタンパク質の発現を検出する方法。
【国際調査報告】
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