(57)【要約】  本実施の形態は、複数の検体にそれぞれ含まれる検体核酸上の部分核酸配列について解析する方法に関する。当該方法は（ａ）〜（ｅ）を含む。（ａ）第１のプライマーと第２のプライマーを含む複数のプライマーセットを準備する。第１のプライマーは複数準備され、複数の検体に対応し互いに異なるタグ配列を含む。第２のプライマーは第１のプライマーと対である。タグ配列は第１プライマーの３’末端側から６塩基目から１２塩基目の何れかの部位に挿入され、３塩基〜７塩基長である。第１のプライマーが鋳型にハイブリダイズしたときにタグ配列はループアウトする。（ｂ）互いに独立した反応場で複数の検体を対応するプライマーセットで増幅する。（ｃ）（ｂ）で得られた増幅産物を混合する。（ｄ）基体上に固定化された核酸プローブに対して（ｃ）の増幅産物の混合物を反応させる。（ｅ）（ｄ）で生じたハイブリダイゼーション結果から、複数の検体核酸上の前記部分核酸配列について解析する。
2012036111.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の検体にそれぞれ含まれる検体核酸上の部分核酸配列について解析する方法であって、
（ａ）前記複数の検体のそれぞれに対応して互いに異なる配列を有するタグ配列をそれぞれ含む複数の第１のプライマーと、前記第１のプライマーと対で使用される第２のプライマーとをそれぞれに含む複数のプライマーセットを準備することと、
ここで、
前記複数のプライマーセットにそれぞれに含まれる前記第１のプライマーは互いに異なるタグ配列を有し、
前記タグ配列は第１プライマーの３’末端側から６塩基目から１２塩基目の何れかの部位に挿入されており、且つタグ塩基長は３塩基〜７塩基であり、前記第１のプライマーが鋳型にハイブリダイズしたときに、前記タグ配列がループアウトするように設計されている；
（ｂ）互いに独立した反応場において、前記複数の検体を前記対応するプライマーセットを用いてそれぞれ増幅して、前記タグ配列をそれぞれに含む増幅産物を得ることと；
（ｃ）（ｂ）で得られた複数の検体からのそれぞれの増幅産物を混合することと；
（ｄ）基体上に固定化された複数種類の核酸プローブに対して、（ｃ）で得られた前記増幅産物の混合物を反応させることと
ここで、前記複数種類の核酸プローブのそれぞれは、前記タグ配列と、前記部分核酸配列を含む鋳型配列に由来する配列とからなる標的配列またはその相補配列を含む；
（ｅ）（ｄ）で生じたハイブリダイゼーションの有無および/または量を決定して、得られた結果から、前記複数の検体核酸上の前記部分核酸配列について解析することと；
を具備する方法。
【請求項２】
検体中の１または複数の検体核酸上に含まれる複数の部分核酸配列について解析する方法であって、
（ａ）前記複数の部分核酸配列のそれぞれに対応して互いに異なる配列を有するタグ配列をそれぞれ含む第１のプライマーと、前記第１のプライマーと対で使用される第２のプライマーとをそれぞれに含む複数のプライマーセットを準備することと、
ここで、
前記複数のプライマーセットにそれぞれに含まれる前記第１のプライマーは互いに異なるタグ配列を有し、
前記タグ配列は第１プライマーの３’末端側から６塩基目から１２塩基目の何れかの部位に挿入されており、且つタグ塩基長は３塩基〜７塩基であり、前記第１のプライマーが鋳型にハイブリダイズしたときに、前記タグ配列がループアウトするように設計されている；
（ｂ）１つの反応場において、前記検体中の前記１または複数の検体核酸を前記複数のプライマーセットを用いてマルチ増幅して、前記タグ配列をそれぞれに含む増幅産物を得ることと；
（ｃ）基体上に固定化された複数種類の核酸プローブに対して、（ｂ）で得られた前記増幅産物を反応させることと、
ここで、前記前記複数種類の核酸プローブのそれぞれは、前記タグ配列と、前記複数の部分核酸配列から選択された１種類の配列を含む鋳型配列に由来する配列とからなる標的配列またはその相補配列を含む；
（ｄ）（ｃ）において生じたハイブリダイゼーションの有無および/または量を決定して、得られた結果から、前記複数の部分核酸配列について解析することと；
を具備する方法。
【請求項３】
請求項１または２の何れか１項に記載の方法であって、
ここで、前記鋳型配列の５’末端側よりＦ３領域、Ｆ２領域、ＬＦ領域、Ｆ１領域、３’末端側よりＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域、ＬＢｃ領域、Ｂ１ｃ領域を設定したときに、（ａ）の前記プライマーセットが、以下の（１）〜（９）からなる群より少なくとも１選択され；
（１）５’末端側にＦ１と相補的な配列を有し、３’末端側にＦ２と同じ配列を有し、前記Ｆ２と同じ配列内に前記複数の検体または前記複数の部分核酸配列のそれぞれの検体に対応して互いに異なるタグ配列が挿入されたＦＩＰプライマー、および
５’末端側にＢ１ｃと同じ配列を有し、３’末端側にＢ２ｃと相補的な配列を有するＢＩＰプライマー；
（２）５’末端側にＦ１と相補的な配列を有し、且つ３’末端側にＦ２と同じ配列を有するＦＩＰプライマー、および
５’末端側にＢ１ｃと同じ配列を有し、且つ３’末端側にＢ２ｃと相補的な配列を有し、前記Ｂ２ｃと相補的な配列内に前記複数の検体または前記複数の部分核酸配列のそれぞれの検体に対応して互いに異なるタグ配列が挿入されたＢＩＰプライマー；
（３）５’末端側にＦ１と相補的な配列を有し、３’末端側にＦ２と同じ配列を有し、且つ前記Ｆ２と同じ配列を有する配列内に前記複数の検体または前記複数の部分核酸配列のそれぞれの検体に対応して互いに異なるタグ配列が挿入されたＦＩＰプライマー、および
５’末端側にＢ１ｃと同じ配列を有し、３’末端側にＢ２ｃと相補的な配列を有し、且つ前記Ｂ２ｃと相補的な配列内に前記複数の検体または前記複数の部分核酸配列のそれぞれの検体に対応して互いに異なるタグ配列が挿入されたＢＩＰプライマー；
（４）５’末端側にＦ１と相補的な配列を有し３’末端側にＦ２と同じ配列を有し、且つ前記Ｆ２と同じ配列内に前記複数の検体または前記複数の部分核酸配列のそれぞれの検体に対応して互いに異なるタグ配列が挿入されたＦＩＰプライマー、および
５’末端側にＢ１ｃと同じ配列を有し、３’末端側にＢ２ｃと相補的な配列を有するＢＩＰプライマー、
Ｆ３領域と同じ配列を有するＦ３プライマー、および
Ｂ３ｃ領域と相補的な配列を有するＢ３プライマー；
（５）５’末端側にＦ１と相補的な配列を有し、３’末端側にＦ２と同じ配列を有するＦＩＰプライマー、
５’末端側にＢ１ｃと同じ配列を有し、３’末端側にＢ２ｃと相補的な配列を有し、且つ前記Ｂ２ｃと相補的な配列内に前記複数の検体または前記複数の部分核酸配列のそれぞれの検体に対応して互いに異なるタグ配列が挿入されたＢＩＰプライマー、
Ｆ３領域と同じ配列を有するＦ３プライマー、および
Ｂ３ｃ領域と相補的な配列を有するＢ３プライマー；
（６）５’末端側にＦ１と相補的な配列を有し、３’末端側にＦ２と同じ配列を有し、且つ前記Ｆ２と同じ配列内に前記複数の検体または前記複数の部分核酸配列のそれぞれの検体に対応して互いに異なるタグ配列が挿入されたＦＩＰプライマー、
５’末端側にＢ１ｃと同じ配列を有し、３’末端側にＢ２ｃと相補的な配列を有し、且つ前記Ｂ２ｃと相補的な配列内に前記複数の検体または前記複数の部分核酸配列のそれぞれの検体に対応して互いに異なるタグ配列が挿入されたＢＩＰプライマー、
Ｆ３領域と同じ配列を有するＦ３プライマー、および
Ｂ３ｃ領域と相補的な配列を有するＢ３プライマー；
（７）５’末端側にＦ１と相補的な配列を有し、３’末端側にＦ２と同じ配列を有し、且つ前記Ｆ２と同じ配列内に前記複数の検体または前記複数の部分核酸配列のそれぞれの検体に対応して互いに異なるタグ配列が挿入されたＦＩＰプライマー、
５’末端側にＢ１ｃと同じ配列を有し、３’末端側にＢ２ｃと相補的な配列を有するＢＩＰプライマー、
Ｆ３領域と同じ配列を有するＦ３プライマー、および
Ｂ３ｃ領域と相補的な配列を有するＢ３プライマー、並びに
ＬＦ領域と相補的な配列を有するＬＦｃプライマー、および／またはＬＢｃ領域と同じ配列を有するＬＢｃプライマー；
（８）５’末端側にＦ１と相補的な配列を有し、３’末端側にＦ２と同じ配列を有するＦＩＰプライマー、
５’末端側にＢ１ｃと同じ配列を有し、３’末端側にＢ２ｃと相補的な配列を有し、且つ前記Ｂ２ｃと相補的な配列内に前記複数の検体または前記複数の部分核酸配列のそれぞれの検体に対応して互いに異なるタグ配列が挿入されたＢＩＰプライマー、
Ｆ３領域と同じ配列を有するＦ３プライマー、および
Ｂ３ｃ領域と相補的な配列を有するＢ３プライマー、並びに
ＬＦ領域と相補的な配列を有するＬＦｃプライマー、および／またはＬＢｃ領域と同じ配列を有するＬＢｃプライマー；
（９）５’末端側にＦ１と相補的な配列を有し、３’末端側にＦ２と同じ配列を有し、且つ前記Ｆ２と同じ配列内に前記複数の検体または前記複数の部分核酸配列のそれぞれの検体に対応して互いに異なるタグ配列を挿入したＦＩＰプライマー、
５’末端側にＢ１ｃと同じ配列を有し、３’末端側にＢ２ｃと相補的な配列を有し、且つ前記Ｂ２ｃと相補的な配列内に前記複数の検体または前記複数の部分核酸配列のそれぞれの検体に対応して互いに異なるタグ配列を挿入したＢＩＰプライマー、
Ｆ３領域と同じ配列を有するＦ３プライマー、および
Ｂ３ｃ領域と相補的な配列を有するＢ３プライマー、並びに
ＬＦ領域と相補的な配列を有するＬＦｃプライマー、および／またはＬＢｃ領域と同じ配列を有するＬＢｃプライマー；
並びに、ここで、（ｂ）の増幅がＬＡＭＰ法またはＲＴ−ＬＡＭＰ法である方法。
【請求項４】
前記タグ配列がＣＴＧ、ＧＧＡ、ＣＣＴ、ＴＣＣ、ＡＴＣ、ＧＣＧ、ＣＧＣ、ＣＣＴＣＴ、ＧＴＧＣＡ、ＧＡＣＧＴ、ＡＣＧＴＣおよびこれらの相補配列からなる群より２以上で選択される請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記部分核酸配列または前記複数の部分核酸配列の１つが、イヌジステンバーウイルスに由来する配列であり、前記プライマーセットにおいてＦＩＰプライマーがＣＡＧＡＧＴＴＧＡＴＧＣＴＴＧＧＧＡＴＴＡＣ−ＴＧＡＴＣＣＡＧＡＧＧＡＴＣＡＴＡＧＡＣＧＡＣであり、ＢＩＰプライマーがＡＣＡＴＴＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡＧＧＡＧＣＡＡＧ−ＧＡＧＣＴＴＴＣＧＡＣＣＣＴＴＣＧＴＣＴＡＣであり、Ｆ３プライマーがＧＴＧＧＡＡＴＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧであり、Ｂ３プライマーがＣＡＡＴＡＴＣＣＴＴＡＴＴＣＴＣＣＡＡＣＣＡであり、ＬＢｃプライマーがＴＧＧＡＴＴＣＴＧＡＧＧＣＡＧＡＴＧＡＧＴである請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記タグ配列がＣＴＧ、ＧＧＡ、ＣＣＴ、ＣＧＣおよびＧＴＧＣＡであり、前記核酸プローブの配列が、
ＣＡＴＣＡＧＧＧＴＣＧＴＣＴＡＴＣＡＧＧＡＴ、
ＣＡＴＣＡＧＧＧＴＣＧＴＣＴＡＴＴＣＣＧＡＴ、
ＣＡＴＣＡＧＧＧＴＣＧＴＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣ、
ＴＣＡＧＧＧＴＣＧＴＣＴＡＴＧＣＧＧおよび
ＣＡＴＣＡＧＧＧＴＣＧＴＣＴＡＴＴＧＣＡＣＧ
である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記部分核酸配列または前記複数の部分核酸配列の１つが、イヌパルボウイルスに由来する配列であり、前記プライマーセットにおいて、ＦＩＰプライマーがＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡ−ＡＣＣＡＴＣＴＣＡＴＡＣＴＧＧＡＡＣＴＡＧＴＧＧＣであり、ＢＩＰプライマーがＣＴＧＴＧＣＣＡＧＴＡＣＡＣＴＴＡＣＴＡＡＧＡ−ＧＴＧＴＴＡＧＴＣＴＡＣＡＴＧＧＴＴＴＡＣＡＡＴＣであり、Ｆ３プライマーがＧＡＧＡＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＡＣであり、Ｂ３プライマーがＣＡＡＴＧＣＴＣＴＡＴＴＴＧＴＴＴＧＣＣＡＴＧであり、およびＬＢｃプライマーがＡＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＴＴＴＧＣＴＡＣＡＧＧである請求項３または４に記載の方法。
【請求項８】
前記タグ配列がＣＴＧ、ＧＧＡ、ＣＣＴ、ＴＣＣおよびＧＴＧＣＡであり、前記核酸プローブが、
ＧＧＴＧＴＧＣＣＡＣＴＡＧＴＣＡＧＴＣＣ、
ＧＧＴＧＴＧＣＣＡＣＴＡＧＴＴＣＣＴＣＣ、
ＧＧＴＧＴＧＣＣＡＣＴＡＧＴＡＧＧＴＣＣ、
ＧＧＴＧＴＧＣＣＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣ、および
ＧＧＴＧＴＧＣＣＡＣＴＡＧＴＴＧＣＡＣＴＣＣ
である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の部分核酸配列の１つが、イヌジステンバーウイルスに由来する配列であり、前記プライマーセットにおいてＦＩＰプライマーがＣＡＧＡＧＴＴＧＡＴＧＣＴＴＧＧＧＡＴＴＡＣ−ＴＧＡＴＣＣＡＧＡＧＧＡＴＣＡＴＡＧＡＣＧＡＣであり、ＢＩＰプライマーがＡＣＡＴＴＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡＧＧＡＧＣＡＡＧ−ＧＡＧＣＴＴＴＣＧＡＣＣＣＴＴＣＧＴＣＴＡＣであり、Ｆ３プライマーがＧＴＧＧＡＡＴＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧであり、Ｂ３プライマーがＣＡＡＴＡＴＣＣＴＴＡＴＴＣＴＣＣＡＡＣＣＡであり、およびＬＢｃプライマーがＴＧＧＡＴＴＣＴＧＡＧＧＣＡＧＡＴＧＡＧＴであり、
前記複数の部分核酸配列のさらなる１つが、イヌパルボウイルスに由来する配列であり、前記プライマーセットにおいて、ＦＩＰプライマーがＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡ−ＡＣＣＡＴＣＴＣＡＴＡＣＴＧＧＡＡＣＴＡＧＴＧＧＣであり、ＢＩＰプライマーがＣＴＧＴＧＣＣＡＧＴＡＣＡＣＴＴＡＣＴＡＡＧＡ−ＧＴＧＴＴＡＧＴＣＴＡＣＡＴＧＧＴＴＴＡＣＡＡＴＣであり、Ｆ３プライマーがＧＡＧＡＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＡＣであり、Ｂ３プライマーがＣＡＡＴＧＣＴＣＴＡＴＴＴＧＴＴＴＧＣＣＡＴＧであり、ＬＢｃプライマーがＡＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＴＴＴＧＣＴＡＣＡＧＧであり、
前記イヌジステンバーウイルスのためのプライマーセットと、前記イヌパルボウイルスのためのプライマーセットが同一のチューブで混合され、前記両方のウイルスに由来する核酸が同時に増幅される請求項２〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
イヌジステンバーウイルスを特異的に増幅するためのプライマーセットであり、前記プライマーセットがＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーとＦ３プライマーとＢ３プライマーとを含み、当該ＦＩＰプライマーがＣＡＧＡＧＴＴＧＡＴＧＣＴＴＧＧＧＡＴＴＡＣ−ＴＧＡＴＣＣＡＧＡＧＧＡＴＣＡＴＡＧＡＣＧＡＣを含み、当該ＢＩＰプライマーがＡＣＡＴＴＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡＧＧＡＧＣＡＡＧ−ＧＡＧＣＴＴＴＣＧＡＣＣＣＴＴＣＧＴＣＴＡＣを含み、当該Ｆ３プライマーがＧＴＧＧＡＡＴＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧを含み、当該Ｂ３プライマーがＣＡＡＴＡＴＣＣＴＴＡＴＴＣＴＣＣＡＡＣＣＡを含むプライマーセット。
【請求項１１】
更に、ループプライマーとしてＴＧＧＡＴＴＣＴＧＡＧＧＣＡＧＡＴＧＡＧＴを含むＬＢｃプライマーを含む請求項１０に記載のプライマーセット。
【請求項１２】
イヌパルボウイルスを特異的に増幅するためのプライマーセットであり、前記プライマーセットがＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーとＦ３プライマーとＢ３プライマーとを含み、当該ＦＩＰプライマーがＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡ−ＡＣＣＡＴＣＴＣＡＴＡＣＴＧＧＡＡＣＴＡＧＴＧＧＣを含み、当該ＢＩＰプライマーがＣＴＧＴＧＣＣＡＧＴＡＣＡＣＴＴＡＣＴＡＡＧＡ−ＧＴＧＴＴＡＧＴＣＴＡＣＡＴＧＧＴＴＴＡＣＡＡＴＣを含み、当該Ｆ３プライマーがＧＡＧＡＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＡＣを含み、当該Ｂ３プライマーがＣＡＡＴＧＣＴＣＴＡＴＴＴＧＴＴＴＧＣＣＡＴＧを含むプライマーセット。
【請求項１３】
更に、ループプライマーとしてＡＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＴＴＴＧＣＴＡＣＡＧＧを含むＬＢｃプライマーを含む請求項１２に記載のプライマーセット。
【請求項１４】
イヌジステンバーを特異的に増幅するためのプライマーセットであり、前記プライマーセットがＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーとＦ３プライマーとＢ３プライマーとを含み、当該ＦＩＰプライマーがＣＡＧＡＧＴＴＧＡＴＧＣＴＴＧＧＧＡＴＴＡＣ−ＴＧＡＴＣＣＡＧＡＧＧＡＴＣＡＴＡＧＡＣＧＡＣを含み、当該ＢＩＰプライマーがＡＣＡＴＴＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡＧＧＡＧＣＡＡＧ−ＧＡＧＣＴＴＴＣＧＡＣＣＣＴＴＣＧＴＣＴＡＣを含み、当該Ｆ３プライマーがＧＴＧＧＡＡＴＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧを含み、当該Ｂ３プライマーがＣＡＡＴＡＴＣＣＴＴＡＴＴＣＴＣＣＡＡＣＣＡを含み、前記ＦＩＰプライマーの３’末端側から６塩基目から１２塩基目にＣＴＧ、ＧＧＡ、ＣＣＴ、ＴＣＣ、ＡＴＣ、ＧＣＧ、ＣＧＣ、ＣＣＴＣＴ、ＧＴＧＣＡ、ＧＡＣＧＴ、ＡＣＧＴＣおよびこれらの相補配列からなる群より選択されるタグ配列を含む第１のプライマーセットと、
イヌパルボウイルスを特異的に増幅するためのプライマーセットであり、前記プライマーセットがＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーとＦ３プライマーとＢ３プライマーとを含み、当該ＦＩＰプライマーがＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡ−ＡＣＣＡＴＣＴＣＡＴＡＣＴＧＧＡＡＣＴＡＧＴＧＧＣを含み、当該ＢＩＰプライマーがＣＴＧＴＧＣＣＡＧＴＡＣＡＣＴＴＡＣＴＡＡＧＡ−ＧＴＧＴＴＡＧＴＣＴＡＣＡＴＧＧＴＴＴＡＣＡＡＴＣを含み、当該Ｆ３プライマーがＧＡＧＡＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＡＣを含み、当該Ｂ３プライマーがＣＡＡＴＧＣＴＣＴＡＴＴＴＧＴＴＴＧＣＣＡＴＧを含み、前記ＦＩＰプライマーの３’末端側から６塩基目から１２塩基目にＣＴＧ、ＧＧＡ、ＣＣＴ、ＴＣＣ、ＡＴＣ、ＧＣＧ、ＣＧＣ、ＣＣＴＣＴ、ＧＴＧＣＡ、ＧＡＣＧＴ、ＡＣＧＴＣおよびこれらの相補配列からなる群より選択されるタグ配列を含む第２のプライマーセットと、
を含むイヌジステンバーとイヌパルボウイルスとを同時に検出するためのアッセイキット。
【請求項１５】
前記第１のプライマーセットが、更にイヌジステンバーのためのループプライマーとしてＴＧＧＡＴＴＣＴＧＡＧＧＣＡＧＡＴＧＡＧＴを含むＬＢｃプライマーを含み、第２のプライマーセットが、更にイヌパルボウイルスのためのループプライマーとしてＡＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＴＴＴＧＣＴＡＣＡＧＧを含むＬＢｃプライマーとを含む請求項１４に記載のアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、核酸を解析するためのプライマー、プローブおよび解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペット産業において、取引される動物の健康が良好であることが重要である。例えば、消費者が購入した動物が、購入から短時間で疾患を発症する、また不幸にして死に至ることは、消費者に不必要な経済的損失や精神的ダメージを与える。それと共に、その動物を提供した販売元やブリーダーは、営業停止となることも少なくはなく、信用を失墜する原因になる。【０００３】
イヌ、特に、未成犬において、ジステンバーウイルスまたはパルボウイルスへの感染は致死率が約１００％といわれている。現在、このようなウイルスの検出は抗原抗体反応を利用した方法が用いられている。抗原抗体反応により正確な判定を行うためには、感染から一定時間経る必要がある上に検出感度が低い。感染の早期に、且つ迅速に診断するためにはそれらの方法は十分ではない。更に、抗原抗体反応の場合、ウイルスの種類毎に検出操作を行う必要がある。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】タグ配列導入プライマーと核酸プローブを示す図。
【図２】増幅工程を示すスキーム図。
【図３】検出工程を示す図。
【図４】増幅工程を示すスキーム図。
【図５】ＬＡＭＰプライマーを示す図。
【図６】ＬＡＭＰ増幅の中間産物を示す図。
【図７】増幅工程を示すスキーム図。
【図８】検出工程を示す図。
【図９】ＬＡＭＰ法におけるタグ配列導入プライマーと核酸プローブを示す図。
【図１０】増幅工程を示すスキーム図。
【図１１】ＤＮＡチップの平面図。
【図１２】ＤＮＡチップの平面図。
【図１３】プライマーのスクリーニング結果を示すグラフ。
【図１４】プライマーのスクリーニング結果を示すグラフ。
【図１５】タグ挿入位置とタグ塩基数について示す概要図。
【図１６】タグの増幅への影響を示すグラフ。
【図１７】タグの増幅への影響を示すグラフ。
【図１８Ａ】タグの検出への影響を示すグラフ。
【図１８Ｂ】タグの検出への影響を示すグラフ。
【図１８Ｃ】タグの検出への影響を示すグラフ。
【図１９】タグの検出への影響を示すグラフ。
【図２０】未反応の残存プライマーの影響を示すグラフ。
【図２１】未反応の残存プライマーの影響について示す概要図。
【図２２Ａ】タグの検出への影響を示すグラフ。
【図２２Ｂ】タグの検出への影響を示すグラフ。
【図２３】タグの検出への影響を示すグラフ。
【図２４】複数対象を同時に検出したときの結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
１つの実施形態に従うと、検体核酸中の核酸配列を複数検体について解析する方法が提供される。当該方法においては、検体毎に異なる種類のプライマーセットが使用されて、鋳型配列が増幅される。プライマーセットは、第１のプライマーと第２のプライマーを含む。第１のプライマーは、検体毎に互いに異なる配列を有するタグ配列を含む。第２のプライマーは、第１のプライマーと対で使用される。それにより目的の配列の増幅が達成される。タグ配列は、第１プライマーの３’末端側から６塩基目から１２塩基目に挿入され、タグ配列の塩基数は３塩基〜７塩基である。タグ配列は、第１のプライマーが、部分核酸配列の鋳型配列にハイブリダイズしたときにループアウトするように設計される。次いで、検体毎に得られた増幅産物を混合して、得られた増幅産物混合物を核酸プローブと反応させる。核酸プローブは、基体上に固定化されている。核酸プローブとのハイブリダイズを指標に検出される配列は標的配列である。標的配列は、タグ配列と鋳型配列の部分核酸配列毎の鋳型配列に由来する配列とを含む。次に、ハイブリダイゼーションの量を検出することにより、標的核酸の有無および/または量が検出および/または測定される。
【０００６】
このような実施形態により、迅速且つ簡便に複数の検出対象を解析する方法が提供される。
【０００７】
［定義］
本明細書で使用される「核酸」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、Ｓ−オリゴ、メチルホスホネートオリゴなど、その一部の構造を塩基配列によって表すことが可能な物質を総括的に示すものである。
【０００８】
「検体」とは、本実施形態に従い解析方法を行なうべき対象であり、核酸を含む可能性のある試料であればよい。検体は、増幅反応および／またはハイブリダイゼーション反応を妨害しない状態であることが好ましい。例えば、生体などから得られた材料を、本実施形態に従う検体として使用するために、それ自身公知の何れかの手段により前処理を行ってもよい。例えば、検体は液体であってもよく、その場合、「被検液」と称してもよい。従って、「被検液」は、核酸または鋳型核酸が存在する可能性のある溶液と解されてよい。
【０００９】
「多検体（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓａｍｐｌｅｓ）」および「複数検体（ｐｌｕｒａｌ  ｓａｍｐｌｅｓ）」の語は、２または２以上の検体を示し、交換可能に使用することが可能である。
【００１０】
検体に含まれる核酸を「検体核酸」と称する。検体核酸のうち、本実施形態のプライマーにより増幅されるべき配列を「鋳型配列」と称す。鋳型配列を含む核酸を「鋳型核酸」または「鋳型」と称す。鋳型核酸に含まれる一部分の配列を「部分核酸配列」と称する。部分核酸配列は、解析されるべき配列または塩基である。本実施形態に従うプライマーは、部分核酸配列を含む領域を増幅するように設計される。部分核酸配列は、鋳型配列に等しくてもよく、鋳型配列に含まれてもよい。
【００１１】
本実施形態により、例えば、特定のウイルスを検出する場合には、当該ウイルス由来の核酸が鋳型核酸となればよい。その場合、部分核酸配列を、例えば、当該ウイルスに特異的な配列としてよい。
【００１２】
「標的核酸」とは、鋳型核酸または鋳型配列を、本実施形態に従うフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて増幅して得られた増幅産物をいう。標的核酸は、その一部に標的配列を含む。
【００１３】
「標的配列」とは、タグ配列と鋳型配列の一部の配列とからなる。当該標的配列は、核酸プローブを用いて標的核酸を検出するために利用される。
【００１４】
「核酸プローブ」とは、標的配列と相補的な配列を含む核酸である。核酸プローブは基体などの固相上に固定化されて使用され、鋳型配列に由来の領域を含む増幅産物とハイブリッドを形成する。
【００１５】
「鋳型配列由来の領域」とは、プライマーによって増幅される領域のうち、プライマーが結合する領域以外の領域であり、その配列が増幅産物の配列に反映される領域を意味する。例えば、遺伝子多型または遺伝子変異を検出する場合には、その領域が解析されるべき部分核酸配列である。そして部分核酸配列が、鋳型配列由来の領域内に収まるように設計される。
【００１６】
「ＤＮＡチップ」とは、検出しようとする核酸に相補的な配列を有する核酸プローブと、検出対象の核酸との間のハイブリダイゼーション反応を利用して、核酸を解析する装置である。ＤＮＡチップの語は、一般的に使用される「核酸チップ」、「マイクロアレイ」および「ＤＮＡアレイ」などの用語と同義であり、互いに交換可能に使用される。
【００１７】
「多検体を解析する」とは、複数の検体を同時に解析することをいう。「検体中の複数の核酸配列を解析する」とは、１検体中に含まれる複数の部分核酸配列を同時に解析することを言う。同時に解析される複数の部分核酸配列は、１本の鋳型核酸に含まれていてもよく、検体に含まれる異なる種類の検体核酸にそれぞれ含まれてもよい。
【００１８】
また、解析される項目は、例えば、ウイルスおよび／または細菌などに由来する遺伝子などの特定の核酸の検出、遺伝子発現量の測定、多型についての遺伝子型の同定および／または変異の有無の検出などであってよい。これに限定するものではない。
【００１９】
「増幅」とは、プライマーセットを用いて目的とする核酸を増幅することをいい、例えば、ＰＣＲ法およびＬＡＭＰ法を含む。「ＬＡＭＰ法」は、ＬＡＭＰ法およびＲＴ−ＬＡＭＰ法を含む。「ＲＴ−ＬＡＭＰ法」は、等温遺伝子増幅法であるＬＡＭＰ法の１種である。ＲＴ−ＬＡＭＰ法は、逆転写反応とＬＡＭＰ反応を同時に行うことによりＲＮＡを鋳型として、ＬＡＭＰ増幅を行う方法である。ここおいて単に「ＬＡＭＰ法」と記載した場合、特に記載のない限り「ＬＡＭＰ法」と「ＲＴ−ＬＡＭＰ法」の両方について言及すると解されてよい。ＬＡＭＰ法とＲＴ−ＬＡＭＰ法のプライマーは互いに同じプライマーを用いることが可能である。
【００２０】
「反応場」とは、そこにおいて反応が行われる場をいう。反応場は、例えば、チューブ、ウェル、チャンバー、流路、カップおよびディッシュ並びにそれらを複数個備えたプレート、例えば、マルチウェルプレートに具備されるウェルの内部に形成されてよい。
【００２１】
［実施形態］
以下、本実施形態について説明する。
【００２２】
図１は、タグ配列導入プライマーと核酸プローブを示す図である。
【００２３】
＜プライマー＞
図１のタグ導入Fプライマーに例示されるように、プライマーは、鋳型核酸のプライマー結合部位に結合する第１のプライミング配列および第２のプライミング配列と、第１のプライミング配列と第２のプライミング配列との間に導入されたタグ配列とを含む。タグ配列は、多検体を解析するために利用される。
【００２４】
タグ配列は、複数の検体のそれぞれに対応させるように互いに異なる配列を有する。タグ配列の塩基長は3塩基〜7塩基である。タグ配列を含むプライマーが鋳型核酸に結合したとき、一方、第１のプライミング配列と第２のプライミング配列が鋳型核酸に結合し、他方、タグ配列の部分は鋳型核酸には結合せず、ループアウトする。
【００２５】
複数の検体を解析するために、同じ反応場に持ち込まれる複数のプライマーにそれぞれに対して導入されるタグ配列の組み合わせの例は、「ＣＴＧ」、「ＧＧＡ」、「ＣＣＴ」、「ＴＣＣ」、「ＡＴＣ」、「ＧＣＧ」、「ＣＧＣ」、「ＣＣＴＣＴ」、「ＧＴＧＣＡ」、「ＧＡＣＧＴ」および「ＡＣＧＴＣ」である。２以上の検体について検出を行う場合、それぞれの検体のために「ＣＴＧ」、「ＧＧＡ」、「ＣＣＴ」、「ＴＣＣ」、「ＡＴＣ」、「ＧＣＧ」、「ＣＧＣ」、「ＣＣＴＣＴ」、「ＧＴＧＣＡ」、「ＧＡＣＧＴ」および「ＡＣＧＴＣ」からなる群より少なくとも１選択されるタグ配列が使用されてよい。同じ反応場に持ち込まれるタグ配列の好ましい組み合わせの例は、「ＣＴＧ」、「ＧＧＡ」、「ＣＣＴ」、「ＴＣＣ」、「ＣＧＣ」および「ＧＴＧＣＡ」である。また２以上の検体について検出を行う場合、「ＣＴＧ」、「ＧＧＡ」、「ＣＣＴ」、「ＴＣＣ」、「ＣＧＣ」および「ＧＴＧＣＡ」からなる群より少なくとも１選択されるタグ配列をそれぞれの検体のために用いてもよい。
【００２６】
プライマーの長さは、１３〜４０塩基、例えば、１５〜３０塩基であってよい。タグを含むプライマー（ここでは「タグ含有プライマー」とも称する）の場合では、長さは１６〜４７塩基、例えば、１８〜３７塩基であってよい。
【００２７】
前記タグ配列のプライマーへの挿入場所については、次のことが重要である。即ち、プライマーが鋳型に結合した場合、タグ配列部分は鋳型に結合せずにループアウトする必要がある。更に、図１にあるように変異や一塩基多型などの多型を検出する場合、核酸プローブは、タグ配列と鋳型配列由来の配列との両方を含む必要がある。従って、タグ配列は、ＰＣＲ増幅の場合、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（Ｆプライマー）および／またはＲｅｖｅｒｓｅプライマー（Ｒプライマー)の３’末端側から６塩基目から１２塩基目の何れかの部位に挿入されればよい。ＬＡＭＰ増幅の場合、Ｆ２領域および／またはＢ２領域の３’末端から６塩基目から１２塩基目の何れかの部位に挿入されればよい。具体的には、ＦＩＰプライマーのＦ２配列の３’末端から６塩基目から１２塩基目、および／またはＢＩＰプライマーのＢ２配列の６塩基目から１２塩基目の何れかの部位に挿入されればよい。これにより良好な増幅と検出特性が得られる。
【００２８】
タグ配列を構成する核酸の種類は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、Ｓ−オリゴ、メチルホスホネートオリゴなど、その一部の構造を塩基配列によって表すことが可能な物質であれば特に限定されない。
【００２９】
＜核酸プローブ＞
１つの反応場に含まれる核酸プローブ群は、複数の検体についてそれぞれに含まれる検体核酸についての配列情報を同時に得るために使用できる。また、１つの検体に含まれる複数種類の検体核酸についてそれぞれの配列情報を同時に得るためにも使用できる。更に、複数の検体および複数種類の検体核酸についてそれぞれの配列情報を同時に得るためにも使用できる。
【００３０】
核酸プローブは、標的核酸を検出し、且つ標的核酸が何れの検体核酸に由来するものであるかを識別し得る。従って、核酸プローブは、タグ配列に相補的な配列を含むように設計される。タグ配列に相補的な配列は、タグ配列検出用の配列である。更に、核酸プローブは、図１に示すように所望に応じて鋳型配列由来の領域と相補的な配列を含むように設計される。
【００３１】
たとえば検体中の核酸の遺伝子変異および／または多型を検出する場合には、遺伝子変異および／または遺伝子多型部位が、増幅産物上のプライマー結合部位近傍の鋳型配列由来の領域に含まれるように、プライマーを準備する。また核酸プローブは、遺伝子変異および／または遺伝子多型部位に対応する配列を含むように設計される。それにより、検体核酸上の変異および／または多型部位の塩基情報は、核酸プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションの有無および／または量を指標にして得られる。例えば、検体核酸が、野生型であるか、変異型であるかを検出ためには、それぞれに対応する核酸プローブを使用し、標的核酸とのハイブリダイゼーション量を比較することにより、検体の遺伝子型を判定することができる。その場合、核酸プローブは、野生型検出用の核酸プローブと、変異型検出用の核酸プローブとが使用される。これらの核酸プローブは、タグ配列検出用の配列と、遺伝子変異および／または多型検出用の配列とを含む。検体核酸が野生型であるか、変異型であるかの判定は、野生型検出用の核酸プローブと変異型検出用の核酸プローブと、標的核酸とのハイブリダイゼーション量を比較することにより遺伝子型を決定して行われてもよい。
【００３２】
また、１つまたは複数の検体中の核酸について、細菌の同じ属に分類されている複数の種を同定するために使用されてもよい。この場合には、例えば同じ属が共通して増幅される前記タグ導入プライマーを検体毎にそれぞれ準備して増幅を行う。このとき、各々の種に特徴的であり、他の種と区別可能な特異性の出せる領域が、増幅産物上のプライマー結合部位近傍の鋳型配列由来の領域に含まれるように、プライマーが設計される。また、核酸プローブは、そのような種を同定するための部位に対応する配列を含むように設計される。それにより、同じ属に分類されている複数の種についての塩基情報は、核酸プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションの有無および／または量を指標にして得られる。そのような核酸プローブは、タグ配列検出用の配列と、各々の種に特徴的な配列を有する種同定用の核酸プローブと含む。更に、種と無関係であることを示す配列を含むネガティブコントロール核酸プローブを用意し、種同定用の核酸プローブと共に使用してもよい。例えば、このような種同定用の核酸プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション、種と無関係な配列を含むネガティブコントロール用核酸プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション量を比較することにより、種の同定を行うこともできる。
【００３３】
解析のための指標として、検体中の核酸の増幅の有無を検出する場合には必ずしも鋳型配列由来の領域と相補的な配列を含む必要はない。
【００３４】
本実施形態に従う核酸プローブの鎖長は、特に限定されるものではないが、５〜５０塩基の範囲が好ましく、１０〜４０塩基の範囲がより好ましく、１５〜３５塩基の範囲がさらに好ましい。
【００３５】
また、核酸プローブは、基体に固定化させるためにアミノ基、カルボキシル基、ヒドロシル基、チオール基、スルホン基などの反応性官能基、アビジン、ビオチン等の物質で修飾されてもよい。また、そのような官能基とヌクレオチドとの間にスペーサーを導入してもよい。スペーサーには、例えばアルカン骨格、エチレングリコール骨格などを用いてよい。核酸プローブの官能基による修飾は、これに限定するものではないが、核酸プローブの末端であることが好ましい。
【００３６】
核酸プローブを固定化するための固相は、一般的にＤＮＡチップのための固相として使用される何れかの基体であればよい。そのような基体は、ガラス、シリコン、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、マイクロタイタープレート、電極、磁石、ビーズ、プラスチック、ラテックス、合成樹脂、天然樹脂、または光ファイバーなどによって構成されてよいが、これらに限定されない。これらの基体上に複数種の核酸プローブを固定化し、DNAチップが構成される。
【００３７】
＜方法＞
次にタグ配列を導入したプライマーとＤＮＡチップを用いた多検体の解析方法について説明する。
【００３８】
図2に示すように、まず、複数の検体、即ち、検体１、検体２、検体３のそれぞれに対応するように、互いに異なる配列の複数のタグ配列、即ち、タグ配列１、タグ配列２、タグ配列３を設計する。これらのタグ配列１、タグ配列２、タグ配列３が導入された複数のタグ導入プライマー、即ち、検体１用タグ導入プライマー、検体２用タグ導入プライマー、検体３用タグ導入プライマーを準備する。これらのタグ導入プライマーを用いて複数の検体を増幅する。この増幅は、複数の検体の種類毎に互いに独立した反応場において行われる。検体の種類毎に互いに独立した反応場とは、異なる検体同士が混じり合わない反応場であればよい。例えば、検体毎に別々のチューブ内、ウェル内または流路内などで増幅が行われてよい。
【００３９】
増幅後には、検体毎に一部配列が異なる増幅産物が得られる。鋳型核酸が存在しない場合、即ち、検体２の場合には増幅は起こらず、増幅産物は得られない。検体１、検体３の場合、それぞれの反応場において得られた増幅産物は、検体毎に互いに異なるタグ配列と、更に鋳型核酸由来の領域を含む。従って、増幅産物に含まれるタグ配列を同定することによって、何れの検体に由来する増幅産物であるかを判定することが可能である。
【００４０】
この増幅産物を混合し、図３に示すように基体上に固定化した核酸プローブと反応させて、ハイブリダイゼーションさせる。核酸プローブは、それぞれのタグ配列に相補的な配列を含む。その後、反応により生じたハイブリダイゼーションの有無および／または量をそれ自身公知の何れかの検出法を利用して検出する。
【００４１】
図２および図３では３検体での例を示したが、検体数については、これに限定されないことは明らかである。また、図１で示すように、上述したような増幅産物の鋳型配列由来の領域に変異や多型部位が含まれるようにプライマーを設計すれば、タグ配列による検体の識別と、検体に含まれる変異および／または多型の検出または同定を同時に解析することが可能である。この場合、核酸プローブは、タグ配列と鋳型配列に由来する配列とを含むか、それらに相補的な配列を含めばよい。鋳型配列に由来する配列またはその相補鎖は、変異および／または多型を検出または同定するための配列を有する。このように、複数の検体を同時に解析する場合には、検体毎に、即ち、検体に対応させて互いに異なる配列のタグ配列を使用すればよい。
【００４２】
さらに、図４に示すように、１つの反応場内で配列の異なる複数の鋳型配列をマルチ増幅して、配列情報を解析することも可能である。この場合、鋳型配列は、検体に含まれる１本の鋳型核酸に含まれる異なる領域に存在する複数の鋳型配列であってもよく、検体に含まれる複数の鋳型核酸にそれぞれ含まれる複数の配列を鋳型配列であってもよい。また、タグ配列は、複数で選択される、増幅されるべき鋳型配列または解析されるべき部分核酸配列のそれぞれに対応して、即ち、鋳型配列毎または部分核酸配列毎に互いに異なる配列を有するように設計されればよい。
【００４３】
上記の増幅後、検体の増幅産物に対しＤＮＡチップ検出を行えば、複数の鋳型配列について、複数検体を解析することが可能となる。検出は、基体上に固定化した核酸プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションを指標に行われる。この核酸プローブは、それぞれのタグ配列に相補的な配列を含む。増幅反応を行って増幅産物を得た後に、その増幅産物と核酸プローブとのハイブリダイゼーションをそれ自身公知の何れかの検出法を利用して検出すればよい。図４では３つの鋳型配列の例を示したが、鋳型核酸の数は、これに限定されないことは明らかである。
【００４４】
また、増幅産物の鋳型配列由来の領域に変異検出用配列および／または種同定用配列を含ませるようにプライマーを設計してもよい。変異検出用配列は、検出または同定しようとする変異および／または多型の部位に対応する配列であればよい。種同定用配列は、同定したい生物種に特徴的で他の生物種に対する特異性が出せる部位に対応する配列であればよい。この場合、変異検出用配列および／または種同定用配列が、解析されるべき配列であり、部分核酸配列と解される。複数の部分核酸配列を同時に解析する場合には、複数の部分核酸配列のそれぞれに対応して、即ち、部分核酸配列毎に互いに異なるタグ配列が使用される。このときに、更に核酸プローブは、タグ配列と変異検出用配列および／または種同定用配列とを含むように設計されてよい。このような互いに異なる複数の鋳型核酸がマルチ増幅された上に、更にそのような核酸プローブを使用することにより、変異、多型、生物種などの解析を行うことが可能である。
【００４５】
また、複数の検体について、複数の部分核酸配列を解析することを行うことも可能である。その場合、上述したような図２に記載する１〜３の検体についての増幅と、それぞれ図４に記載するようなマルチ増幅とを並行して行ってもよく、その場合、得られたマルチ増幅産物と検体毎に増幅された複数の増幅産物とを混合して、その混合物を核酸プローブで検出してもよい。図２に示す増幅と図４に示すマルチ増幅とを、並行して３種類の検体と３種類の部分核酸配列について行う場合、計９種類の互いに異なるタグが使用されてもよい。
【００４６】
本実施形態における検出対象は、例えば個体のゲノムＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡなどが含まれる。個体は、これらに限定されるものでないが、ヒト、ヒト以外の動物、植物、並びにウイルス、細菌、バクテリア、酵母およびマイコプラズマなどの微生物が含まれる。
【００４７】
これらの核酸は、個体から採取した試料、例えば、血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、バイオプシー、口腔内粘膜、培養細胞、喀痰等から抽出される。或いは、微生物から直接抽出される。核酸の抽出は、これらに限定されないが、市販の核酸抽出キットであるＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、スマイテスト（住友金属社製）等を利用して実行することができる。個体試料や微生物から抽出された核酸を含む溶液を被検液とする。
【００４８】
検体は、本実施形態の方法に係る増幅法により増幅される。検出対象がRNAの場合には、増幅前に例えば逆転写酵素によって相補鎖DNAに変換することができる。逆転写酵素とDNAポリメラーゼの両方を同一チューブ内に添加し、逆転写とDNA増幅を同時に行ってもよい。
【００４９】
増幅法については、例えば、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ法（ＰＣＲ法）、Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法（ＬＡＭＰ法）、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  （ＩＣＡＮ法）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法（ＮＡＳＢＡ法）、Ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （ＳＤＡ法）、Ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ法）、Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法（ＲＣＡ法）などの方法を用いることができる。得られた増幅産物は、必要に応じて断片化されるか、１本鎖化される。１本鎖化する手段としては、例えば、熱変性、ビーズや酵素等を用いる方法、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写反応を行う方法がある。ＬＡＭＰ法やＩＣＡＮ法などによって増幅され、産物中に１本鎖領域が存在し、この１本鎖領域を標的配列とする場合には、そのままハイブリダイゼーション工程に供することができる。
【００５０】
この１本鎖化工程が不要となるため、増幅により得られた標的核酸はステム・ループ構造を有することも好ましい。ステム・ループ構造を有する増幅産物は、１本鎖であるループ部分の配列をプローブとの反応に都合よく用いることができる。
【００５１】
標的核酸の増幅には、ＬＡＭＰ法（例えば、特許第３３１３３５８号を参照されたい）が好適に用いられる。ＬＡＭＰ法は、迅速かつ簡便な遺伝子増幅法であり、増幅産物中にステム・ループ構造を有している。
【００５２】
図５はＬＡＭＰ法で使用される基本的なプライマーの設計例を示す図である。図５の模式図を用いて、ＬＡＭＰ法の原理を簡単に説明する。ＬＡＭＰ法では、鋳型核酸の最大８つの領域を認識する６種類のプライマーと鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を用いる。鋳型核酸は、等温（６０〜６５℃）条件下で増幅される。上記８つの領域は、鋳型核酸の５’末端側から順にＦ３領域、Ｆ２領域、ＬＦ領域、Ｆ１領域、３’末端側から順にＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域、ＬＢｃ領域、及びＢ１ｃ領域と定義される。なお、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３領域はそれぞれ、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、及びＢ３ｃ領域の相補鎖における領域を示している。図５に示す８種のプライマーは、５’末端側にＦ１と相補的な配列をもち３’末端側にＦ２と同じ配列を有するＦＩＰインナープライマー、５’末端側にＢ１ｃと同じ配列をもち３’末端側にＢ２ｃと相補的な配列を有するＢＩＰインナープライマー、Ｆ３領域と同じ配列を有するＦ３プライマー、Ｂ３ｃ領域と相補的な配列を有するＢ３プライマー、ＬＦ領域と相補的な配列を有するＬＦｃプライマー、ＬＢｃ領域と同じ配列を有するＬＢｃプライマーである。増幅反応に必須なのはＦＩＰインナープライマー、ＢＩＰインナープライマーであり、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＬＦプライマーおよびＬＢプライマーは、増幅効率を高めるために添加される。
【００５３】
ＬＡＭＰ法による増幅産物中には図６に示すようなループ構造が形成され、Ｆ２領域からＦ１領域の間、Ｆ２ｃ領域からＦ１ｃ領域の間、Ｂ２領域からＢ１領域間、およびＢ２ｃ領域からＢ１ｃ領域間が１本鎖の領域となる。このため、この領域に標的配列を設計すれば、簡便かつ高感度に標的核酸を検出できる（例えば、特開２００５−１４３４９２号公報を参照されたい）。ＬＦプライマーおよび／またはＬＢプライマーと標的配列が重なる場合には、ＬＦプライマーおよび／またはＬＢプライマーは添加しない方が好ましい。
【００５４】
図７を用いてＬＡＭＰ法を用いた場合のタグ配列導入プライマーとＤＮＡチップを用いた多検体の解析方法について説明する。
【００５５】
まず、Ｆ２領域および／またはＢ２領域に前記タグ配列を導入したプライマーを検体毎に準備する。
【００５６】
次に、該プライマーを用いて検体ごとに検体毎に独立した反応場において増幅を行なう。例えば、検体毎に別チューブで増幅を行えばよい。増幅後、１本鎖ループ部分に検体によって一部配列が異なる増幅産物が得られる。鋳型核酸が存在しない場合には増幅は起こらず、増幅産物は得られない。この増幅産物を混合し、図８に示すように基体上に固定化した各タグ配列に相補的な配列を含む核酸プローブとハイブリダイゼーションさせる。その後、増幅産物と核酸プローブのハイブリダイゼーションを適宜の検出法により検出する。
【００５７】
図７および図８では３検体での例を示したが、検体数については、これに限定されないことは明らかである。
【００５８】
また、図９で示すように核酸プローブで検出される鋳型配列由来の領域、即ちＦ２領域からＦ１領域の間、Ｆ２ｃ領域からＦ１ｃ領域の間、Ｂ２領域からＢ１領域間、およびＢ２ｃ領域からＢ１ｃ領域間に変異や多型部位を位置させるようにプライマーを設計すれば、これらの変異や多型を検出する核酸プローブを用いることにより検出することができる。
【００５９】
さらに、図１０に示すように、１つの反応場内で異なる配列からなる複数種類の鋳型配列をマルチ増幅することも可能である。増幅後、検体の増幅産物に対し、ＤＮＡチップ検出を行えば、複数の標的配列について、複数検体を解析することが可能となる。検出は、基体上に固定化した各タグ配列に相補的な配列を含む核酸プローブとハイブリダイゼーションさせる。その後、増幅産物と核酸プローブのハイブリダイゼーションを適宜の検出法により検出する。図１０では３つの鋳型核酸の例を示したが、鋳型核酸数は、これに限定されないことは明らかである。また、増幅産物の鋳型配列由来の領域に変異や多型部位、および／または同定したい生物種に特徴的であり、他の生物種に対して特異性が出せる部位が位置するようプライマーを設計すれば、これらの部位の塩基にそれぞれ相補的な配列、即ち、変異検出用配列および／または種同定用配列と、更にタグ配列とを含む核酸プローブ使用し、変異、多型および／または生物種などについて、検体核酸、即ち、検体を解析することができる。
【００６０】
＜ＤＮＡチップ＞
本実施形態において使用されるＤＮＡチップは、基体と基体上に固定化された核酸プローブとを具備すればよい。ＤＮＡチップの基体は、電流検出型を代表とする電気化学的検出型、蛍光検出型、化学発色型および放射能検出型など、従来公知の何れの種類のマイクロアレイ用の基体であってよい。
【００６１】
何れの種類のマイクロアレイも、それ自身公知の方法により製造することが可能である。例えば、電流検出型マイクロアレイの場合、ネガティブコントロールプローブ固定化領域および検出用プローブ固定化領域は、それぞれ異なる電極上に配置されればよい。
【００６２】
ＤＮＡチップの例を模式図として図１１に示すが、これに限定するものではない。ＤＮＡチップは、基体１に固定化領域２を具備する。核酸プローブは該固定化領域２に固定化される。このようなＤＮＡチップは、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体１に配置される固定化領域２の数及びその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。このようなＤＮＡチップは、蛍光を用いた検出方法のために好適に用いられてよい。
【００６３】
ＤＮＡチップの他の例を図１２に示す。図１２のＤＮＡチップは、基体１１に電極１２を具備する。核酸プローブは該電極１２に固定化される。電極１２は、パット１３に接続される。電極１２からの電気的情報はパット１３を介して取得される。このようなＤＮＡチップは、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体１１に配置される電極１２の数及びその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。さらに、本例のＤＮＡチップは、必要に応じて、参照電極及び対極を具備してもよい。
【００６４】
電極は、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウムまたはタングステンのような金属単体およびそれらの合金、或いは、グラファイト、グラシーカーボンのような炭素またはそれらの酸化物または化合物を用いることができるが、これらに限定されない。
【００６５】
本例のようなＤＮＡチップは、電気化学的な検出方法のために好適に用いられてよい。
【００６６】
＜ハイブリダイゼーション条件＞
ハイブリダイゼーションは、ハイブリッドが十分に形成される適切な条件下で行えばよい。適切な条件は、標的核酸の種類及び構造、標的配列に含まれる塩基の種類、核酸プローブの種類によって異なる。例えば、イオン強度が０．０１〜５の範囲であり、ｐＨ５〜９の範囲の緩衝液中でハイブリダイゼーションを行えばよい。反応温度は１０℃〜９０℃の範囲であってよい。攪拌や振盪などにより、反応効率を高めても良い。反応溶液中には、硫酸デキストラン、サケ精子ＤＮＡ、及び牛胸腺ＤＮＡのようなハイブリダーゼション促進剤、ＥＤＴＡ、又は界面活性剤などを添加しても良い。
【００６７】
＜洗浄条件＞
ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡチップを洗浄するための洗浄液は、イオン強度が０．０１〜５の範囲であり、ｐＨ５〜９の範囲の緩衝液が好適に用いられる。洗浄液は塩及び界面活性剤などを含むことが好ましい。例えば、塩化ナトリウム又はクエン酸ナトリウムを用いて調製したＳＳＣ溶液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液、Ｔｗｅｅｎ２０溶液、又はＳＤＳ溶液などが好適に用いられる。洗浄温度は、例えば１０℃〜７０℃の範囲で行う。洗浄液は、プローブ固定化基体の表面又は核酸プローブを固定化した領域に通過又は滞留させる。或いは、洗浄液中にＤＮＡチップを浸漬させてもよい。この場合、洗浄液は温度制御可能な容器中に収容されることが好ましい。
【００６８】
＜検出方法＞
ハイブリダイゼーション工程により生じたハイブリッドの検出は、蛍光検出方式及び電気化学的検出方式を利用することができる。
【００６９】
（ａ）蛍光検出方式
蛍光標識物質を用いて検出する。核酸の増幅工程で用いるプライマーをＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、又はローダミンなどの蛍光色素のような、蛍光学的に活性な物質で標識してもよい。或いは、それらの物質で標識したセカンドプローブを用いてもよい。複数の標識物質を同時に使用してもよい。検出装置により、標識された配列または２次プローブ中の標識を検出する。使用する標識に応じて適切な検出装置を用いる。例えば、蛍光物質を標識として用いた場合、蛍光検出器を用いて検出する。
【００７０】
（ｂ）電気化学的検出方式
当該分野で周知の２本鎖認識物質を用いる。２本鎖認識物質は、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター及びポリインターカレーターから選択してよい。更に、これらの２本鎖認識物質を電気化学的に活性な金属錯体、例えばフェロセン、ビオロゲンなどで修飾してもよい。
【００７１】
２本鎖認識物質は、種類によって異なるが、一般的には１ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で使用する。この際には、イオン強度が０．００１〜５の範囲であり、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いることができる。
【００７２】
測定は、例えば２本鎖認識物質が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、２本鎖認識物質に由来する反応電流値を測定する。この際、電位は定速で印加するか、或いは、パルスで印加するか、或いは、定電位を印加してもよい。ポテンショスタット、デジタルマルチメーター、及びファンクションジェネレーターのような装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。電気化学的検出は、当該分野で周知の方法によって実施することができる。例えば、特開平１０−１４６１８３号公報に記載の方法を用いることができる。
【００７３】
＜アッセイキット＞
また本実施形態は、上述した核酸の解析方法において使用するためのアッセイキットも提供する。そのようなアッセイキットは、
検体毎に異なる配列を有するタグ配列を含み、前記タグ配列は、前記検体毎の鋳型核酸中の鋳型配列にハイブリダイズしたときにループアウトするように設計された第１のプライマーと、前記第１のプライマーと対で使用される第２のプライマーとを含むプライマーセット；および増幅反応を行うための基質、酵素、バッファーなどを含み
基体と、前記基体上に固定化された前記タグ配列を含む標的配列に相補的な核酸プローブとを具備するＤＮＡチップ；
を具備すればよい。
【００７４】
このとき核酸プローブは、タグ配列と検体中の鋳型配列に由来する配列の少なくとも一部分とを含む標的配列に相補的な核酸プローブであってよい。
【００７５】
また、アッセイキットは、
プライマーセットと、増幅反応を行うための基質、酵素、バッファーなどのような試薬と、DNAチップを含めばよい。
【００７６】
プライマーセットは、第１のプライマーと、第１のプライマーと対で使用される第２のプライマーとを含んでよい。第１のプライマーは、複数の部分核酸配列に対応して互いに異なる種類の配列を有するタグ配列を含む。タグ配列は、第１のプライマーが鋳型核酸にハイブリダイズしたときにループアウトするように設計されている。
【００７７】
DNAチップは、基体と、基体上に固定化された核酸プローブを具備する。核酸プローブは、標的配列に相補的な配列を含む。標的配列は、タグ配列と、更に鋳型配列に由来する配列の少なくとも一部分とを含む。
【００７８】
具備されるプライマーおよび核酸プローブは、複数の検体を同時に増幅および検出するめに、異なる検体に対応する複数の部分核酸配列に対応するように複数具備されてよい。
【００７９】
また、アッセイキットに含まれる第１のプライマーは、少なくとも１回の解析で使用するのに必要な種類および量のプライマーを含む。ｎ個の検体を同時に解析する場合には、ｎ種類の第１のプライマーが使用される。異なる種類の第１のプライマーを配列について比較すると、タグ配列以外は等しい配列であってよい。
【００８０】
アッセイキットに含まれる第２のプライマーは、少なくとも１回の解析で使用するのに必要な量のプライマーを含む。また、第１のプライマーに加えて、第２のプライマーがタグ配列を含んでもよい。その場合、第２のプライマーは、少なくとも１回の解析で使用するのに必要な種類および量のプライマーを含んでよい。ｎ個の検体を同時に解析する場合には、ｎ種類の第２のプライマーが使用される。異なる種類の第２のプライマーを配列について比較すると、タグ配列以外は等しい配列であってもよい。
【００８１】
アッセイキットが、ＰＣＲ法を利用するものである場合、第１のプライマーは、例えば、少なくとも鋳型核酸を含み得るｎ個の検体に対応づけられたタグ配列と、当該鋳型核酸の一部の配列の相補配列とを含むｎ種類のフォワードプライマーまたはリバースプライマーであればよい（ここで、ｎは２以上の整数である）。第２のプライマーは、少なくとも１回の解析で使用するのに必要な量のプライマーを含む。そのような第２のプライマーは、第１のプライマーと対で使用される少なくとも１種類のリバースプライマーまたはフォワードプライマーであればよい。第１のプライマーがフォワードプライマーであれば、第２のプライマーはリバースプライマーであり、第１のプライマーがリバースプライマーであれば、第２のプライマーはフォワードプライマーであればよい。
【００８２】
ＬＡＭＰ法を利用する解析方法のためのアッセイキットも提供される。鋳型配列の５’末端側よりＦ３領域、Ｆ２領域、ＬＦ領域、Ｆ１領域が設計され、３’末端側よりＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域、ＬＢｃ領域、Ｂ１ｃ領域が設計される場合、以下の１〜９からなる群より少なくとも１選択されるプライマーセットが含まれる；
１．  ５’末端側にＦ１と相補的な配列をもち３’末端側にＦ２と同じ配列をもち、且つ複数の検体に対応して互いに異なるタグ配列をＦ２配列内に挿入されたＦＩＰプライマー（即ち、第１のプライマー）、および５’末端側にＢ１ｃと同じ配列をもち３’末端側にＢ２ｃと相補的な配列を有するＢＩＰプライマー（即ち、第２のプライマー）；
２．  ５’末端側にＦ１と相補的な配列をもち３’末端側にＦ２と同じ配列を有するＦＩＰプライマー（即ち、第２のプライマー）、および５’末端側にＢ１ｃと同じ配列をもち３’末端側にＢ２ｃと相補的な配列をもち、且つ複数の検体に対応して互いに異なるタグ配列をＢ２ｃ配列内に挿入したＢＩＰプライマー（即ち、第１のプライマー）；
３．  ５’末端側にＦ１と相補的な配列をもち３’末端側にＦ２と同じ配列をもち、且つ複数の検体に対応して互いに異なるタグ配列をＦ２配列内に挿入されたＦＩＰプライマー（即ち、第１のプライマー）、および５’末端側にＢ１ｃと同じ配列をもち３’末端側にＢ２ｃと相補的な配列をもち、且つ複数の検体に対応して互いに異なるタグ配列をＢ２ｃ配列内に挿入されたＢＩＰプライマー（即ち、第２のプライマー）；
４．  ５’末端側にＦ１と相補的な配列をもち３’末端側にＦ２と同じ配列をもち、且つ複数の検体に対応して互いに異なるタグ配列をＦ２配列内に挿入されたＦＩＰプライマー（即ち、第１のプライマー）、５’末端側にＢ１ｃと同じ配列をもち３’末端側にＢ２ｃと相補的な配列を有するＢＩＰプライマー（即ち、第２のプライマー）、Ｆ３領域と同じ配列を有するＦ３プライマー（第３のプライマー）、およびＢ３ｃ領域と相補的な配列を有するＢ３プライマー（第４のプライマー）；
５．  ５’末端側にＦ１と相補的な配列をもち３’末端側にＦ２と同じ配列を有するＦＩＰプライマー（即ち、第２のプライマー）、５’末端側にＢ１ｃと同じ配列をもち３’末端側にＢ２ｃと相補的な配列をもち、且つ複数の検体に対応して互いに異なるタグ配列をＢ２ｃ配列内に挿入されたＢＩＰプライマー（即ち、第１のプライマー）、Ｆ３領域と同じ配列を有するＦ３プライマー（即ち、第３のプライマー）、およびＢ３ｃ領域と相補的な配列を有するＢ３プライマー（即ち、第４のプライマー）；
６．  ５’末端側にＦ１と相補的な配列をもち３’末端側にＦ２と同じ配列をもち、且つ複数の検体に対応して互いに異なるタグ配列をＦ２配列内に挿入されたＦＩＰプライマー（即ち、第１のプライマー）、５’末端側にＢ１ｃと同じ配列をもち３’末端側にＢ２ｃと相補的な配列をもち、且つ複数の検体に対応して互いに異なるタグ配列をＢ２ｃ配列内に挿入されたＢＩＰプライマー（即ち、第２のプライマー）、Ｆ３領域と同じ配列を有するＦ３プライマー（即ち、第３のプライマー）、およびＢ３ｃ領域と相補的な配列を有するＢ３プライマー（即ち、第４のプライマー）；
７．  ５’末端側にＦ１と相補的な配列をもち３’末端側にＦ２と同じ配列をもち、且つ複数の検体に対応して互いに異なるタグ配列をＦ２配列内に挿入されたＦＩＰプライマー（即ち、第１のプライマー）、５’末端側にＢ１ｃと同じ配列をもち３’末端側にＢ２ｃと相補的な配列を有するＢＩＰプライマー（即ち、第２のプライマー）、Ｆ３領域と同じ配列を有するＦ３プライマー（即ち、第３のプライマー）、Ｂ３ｃ領域と相補的な配列を有するＢ３プライマー（即ち、第４のプライマー）、ＬＦ領域と相補的な配列を有するＬＦｃプライマー（即ち、第５のプライマー）、および／またはＬＢｃ領域と同じ配列を有するＬＢｃプライマー（即ち、第６のプライマー）；
８．  ５’末端側にＦ１と相補的な配列をもち３’末端側にＦ２と同じ配列を有するＦＩＰプライマー（即ち、第２のプライマー）、５’末端側にＢ１ｃと同じ配列をもち３’末端側にＢ２ｃと相補的な配列をもち、且つ複数の検体に対応して互いに異なるタグ配列をＢ２ｃ配列内に挿入されたＢＩＰプライマー（即ち、第１のプライマー）、Ｆ３領域と同じ配列を有するＦ３プライマー（即ち、第３のプライマー）、Ｂ３ｃ領域と相補的な配列を有するＢ３プライマー（即ち、第４のプライマー）、ＬＦ領域と相補的な配列を有するＬＦｃプライマー（即ち、第５のプライマー）、および／またはＬＢｃ領域と同じ配列を有するＬＢｃプライマー（即ち、第６のプライマー）；
９．  ５’末端側にＦ１と相補的な配列をもち３’末端側にＦ２と同じ配列をもち、且つ複数の検体に対応して互いに異なるタグ配列をＦ２配列内に挿入されたＦＩＰプライマー（即ち、第１のプライマー）、５’末端側にＢ１ｃと同じ配列をもち３’末端側にＢ２ｃと相補的な配列をもち、且つ複数の検体に対応して互いに異なるタグ配列をＢ２ｃ配列内に挿入されたＢＩＰプライマー（即ち、第２のプライマー）、Ｆ３領域と同じ配列を有するＦ３プライマー（即ち、第３のプライマー）、Ｂ３ｃ領域と相補的な配列を有するＢ３プライマー（即ち、第４のプライマー）、ＬＦ領域と相補的な配列を有するＬＦｃプライマー（即ち、第５のプライマー）、および／またはＬＢｃ領域と同じ配列を有するＬＢｃプライマー（即ち、第６のプライマー）。
【００８３】
更に、当該アッセイキットは、増幅反応を行なうための酵素および／または容器、洗浄液、緩衝液、緩衝液を調製するための塩類などを含んでもよい。また、ＤＮＡチップは、核酸プローブと基体が一体化されていない状態で含まれてもよい。
【００８４】
このようなアッセイキットによって、より簡便に核酸の解析を行うことが可能になる。
【００８５】
＜ジステンバーウイルスとパルボウイルス＞
当該多検体のための検出方法を用いて、ジステンバーウイルスとパルボウイルスを同時に検出することが可能である。検出のために選択した鋳型核酸をジステンバーウイルスについては表１に、パルボウイルスについては表２に示す。
【表１】
2012036111.tif 000003
【表２】
2012036111.tif 000004
【００８６】
＜プライマーの設計＞
ジステンバーウイルスとパルボウイルスからのそれぞれの鋳型核酸を基にＬＡＭＰ増幅用のプライマーを設計した。ジステンバーウイルスとパルボウイルスについてそれぞれＦ１領域、Ｆ２領域、Ｆ３領域、Ｂ１領域、Ｂ２領域およびＢ３領域を決定した。これらの領域を表３−１、表３−２および表３−３に示す。表中の配列番号１〜１５がジステンバーウイルスのための配列であり、配列番号１６〜４６がパルボウイルスのための配列である。「Ｆ１領域」、「Ｆ２領域」、「Ｆ３領域」、「Ｂ１領域」、「Ｂ２領域」および「Ｂ３領域」の配列は、それぞれ「Ｆ１配列」、「Ｆ２配列」、「Ｆ３配列」、「Ｂ１配列」、「Ｂ２配列」および「Ｂ３配列」と称す。
【表３−１】
2012036111.tif 000005
【表３−２】
2012036111.tif 000006
【表３−３】
2012036111.tif 000007
【００８７】
＜ジステンバーウイルスのためのプライマー配列＞
ジステンバーウイルスのためのＦ１領域、Ｆ２領域、Ｆ３領域、Ｂ１領域、Ｂ２領域およびＢ３領域を基にジステンバーウイルスを特異的にＬＡＭＰ増幅するためのプライマーを設計した。プライマーの例を表４−１および表４−２に示す。
【表４−１】
2012036111.tif 000008
【表４−２】
2012036111.tif 000009
【００８８】
表４−２の最下段には、タグ配列を含むプライマーの例を示した。この配列は、表４−１の配列番号５８のプライマー名Ｄｉ  ＦＩＰ−２−３の３’末端から９塩基目にタグ配列ＣＴＧを挿入した例である。タグ配列に下線を付した。タグ付与プライマーを作製する場合には、同様に所望の位置に所望のタグ配列を含ませればよい。
【００８９】
これらのプライマーをプライマーセットして用いる場合の好ましい組み合わせの例を表５に示す。
【表５】
2012036111.tif 000010
【００９０】
＜パルボウイルスのためのプライマー配列＞
パルボウイルスのためのＦ１領域、Ｆ２領域、Ｆ３領域、Ｂ１領域、Ｂ２領域およびＢ３領域を基にパルボウイルスを特異的にＬＡＭＰ増幅用のプライマーを設計した。決定した。これらの領域を表６−１、表６−２および表６−３に示す。
【表６−１】
2012036111.tif 000011
【表６−２】
2012036111.tif 000012
【表６−３】
2012036111.tif 000013
【００９１】
これらのプライマーをプライマーセットとして用いる場合には、例えば、表７に記載の組み合わせで用いてよい。
【表７】
2012036111.tif 000014
【００９２】
＜プライマー＞
ジステンバーウイルスのためのプライマーの例において、配列番号４７〜配列番号７５で表されるそれぞれのポリヌクレオチドを含む配列であっても、それぞれのポリヌクレオチドからなる配列であってもよい。また、配列番号４７〜配列番号７５の相補配列で表されるそれぞれのポリヌクレオチドを含む配列であっても、それぞれのポリヌクレオチドからなる配列であってもよい。配列番号４７〜配列番号７５またはその相補配列で表されるそれぞれのポリヌクレオチドは、その何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。また、配列番号４７〜配列番号７５またはその相補配列で表されるそれぞれのポリヌクレオチドの何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００９３】
パルボウイルスのためのプライマーの例において、配列番号７７〜配列番号１１５で表されるそれぞれのポリヌクレオチドを含む配列であっても、それぞれのポリヌクレオチドからなる配列であってもよい。また、配列番号７７〜配列番号１１５の相補配列で表されるそれぞれのポリヌクレオチドを含む配列であっても、それぞれのポリヌクレオチドからなる配列であってもよい。配列番号７７〜配列番号１１５またはその相補配列で表されるそれぞれのポリヌクレオチドは、その何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。また、配列番号４７〜配列番号７５またはその相補配列で表されるそれぞれのポリヌクレオチドの何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００９４】
ここで、ユニバーサルなヌクレオチドの例は、これらに限定するものではないが、デオキシイノシン（ｄｅｏｘｙｉｎｏｓｉｎｅ；ｄＩ）や、Ｇｒｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社の３−ニトロピロール（Ｎｉｔｒｏｐｙｒｒｏｌｅ）、５−ニトロインドール（Ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ）、デオキシリボルラノシル（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ；ｄＰ）、デオキシ−５’−ジメトキシトリチル−Ｄ−リボフラノシル（ｄｅｏｘｙ−５’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ−Ｄ−ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ；ｄＫ）が含まれる。
【００９５】
「ミックス塩基」とは、ミックス塩基としたい所望の箇所の塩基を「アデニン」、「チミン」、「シトシン」および「グアニン」に設計したプライマーを２以上または全て混合して使用する核酸プローブセットをいう。また、複数種類の塩基に対して対合可能な修飾塩基で置換するように設計されてもよい。
【００９６】
またここで、プライマーの各配列間またはその末端側には、更なる配列として、１〜１００ヌクレオチド、好ましくは２〜３０ヌクレオチド程度の配列（例えば、スペーサーとして使用される配列）が含まれていてもよい。しかしながら、これらの更なる配列は、タグ配列を含むプライマーの3'末端には含まれないことが望ましい。
【００９７】
＜プライマーセット＞
ジステンバーウイルスのためのプライマーセットの例を表５に示す。好ましい例は、プライマーセット８、９、１１、１２および１４であり、より好ましい例は、プライマーセット９、１２および１４であり、更に好ましい例はプライマーセット９である。
【００９８】
パルボウイルスのためのプライマーセットの例を表７に示す。好ましい例は、プライマーセット１、３、４、６、７、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１９、２０、２５、２６、２７、２８であり、より好ましい例は、プライマーセット１、４、６、７、９、１０、１３、１５、１６、１９、２５、２６、２７、２８であり、更に好ましい例はプライマーセット１９、２５および２６であり、更に好ましい例はプライマーセット１９である。ここで、表５のプライマーセット２および５のＦＩＰプライマー、プライマーセット１４のＬＰｂプライマーはミックス塩基であることを示す。
【００９９】
＜プローブ＞
プローブの配列は、ハイブリダイズして検出を行うためのタグ配列を含む増幅産物由来の配列であればよい。イヌジステンバーウイルスとイヌパルボウイルスを同時に検出するためのプローブセットの１例を表８に示すが、これに限定されるものではない。
【０１００】
［例１］
１．イヌジステンバーウイルス、イヌパルボウイルスのプライマースクリーニング
イヌジステンバーウイルス、イヌパルボウイルスを特異的に増幅するＬＡＭＰプライマーを設計し、ＬＡＭＰ増幅を行った。使用したプライマーについては、表４−１および表４−２にイヌジステンバーウイルスのＬＡＭＰプライマー配列、表５にプライマーセット、表６−１、表６−２および表６−３に、表７にイヌパルボウイルスのＬＡＭＰプライマー配列、プライマーセットを示した。
【０１０１】
鋳型核酸については、表１に示すイヌジステンバーウイルスのＮＰ（Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ）ｇｅｎｅ配列、表２に示すイヌパルボウイルスのＶＰ２  ｇｅｎｅ  配列をそれぞれ人工合成して得たプラスミドを用い、濃度は１０００ｃｏｐｙ／反応液で行った。
【０１０２】
ＬＡＭＰ増幅は、表９に示す組成で行い、６３℃で９０分、核酸を増幅させた。鋳型ネガティブコントロールでは、鋳型核酸の代わりに滅菌水を用いた。
【０１０３】
増幅の立ち上がり時間はＬｏｏｐａｍｐリアルタイム濁度測定装置を用い、増幅反応に伴い生成されるピロリン酸と溶液中のマグネシウムの白濁を検出することで行った。実験は各２回行った。
【０１０４】
図１３にイヌジステンバーウイルスを増幅した結果を示した。プライマーセット９において、濁度立ち上がり時間が最も早かった。次に濁度立ち上がり時間が早いのは、プライマーセット１２および１４であり、プライマーセット８および１１がそれに続いた。以下の実験には、プライマーセット９を用いた。プライマーセット９は、プライマー領域の変異が少ない点からも好ましいことが考えられた。ネガティブコントロールでは、どのプライマーセットにおいても濁度の立ち上がりは見られなかった。
【０１０５】
図１４にイヌパルボウイルスを増幅した結果を示した。プライマーセット１９において、濁度立ち上がり時間が最も早かった。プライマーセット２５および２６も濁度立ち上がり時間がプライマーセット１９に非常に近いものであった。次に濁度立ち上がり時間が早いのは、プライマーセット１、４、６、７、９、１０、１３、１５、１６、２７、２８であり、プライマーセット３、１２、１４、２０がそれに続いた。以下の実験には、プライマーセット１９を用いた。プライマーセット１９は、プライマー領域の変異が少ない点からも好ましいことが考えられた。ネガティブコントロールでは、どのプライマーセットにおいても濁度の立ち上がりは見られなかった。
【０１０６】
［例２］
タグ挿入位置、タグ塩基数の検討
例１で決定したイヌジステンバーウイルスのプライマーセット９、イヌパルボウイルスのプライマーセット１９を用いてタグの挿入位置、タグの塩基数の検討を行った。図１５に示すようにタグの挿入位置についての検討は、ＦＩＰプライマーの３’末端側から３塩基目、６塩基目、９塩基目、１２塩基目、１５塩基目で行い、タグの塩基数については、３塩基、５塩基、７塩基、９塩基で行い、タグの塩基については２種類設計した。
【０１０７】
各鋳型濃度は１０００ｃｏｐｙ／反応液、１００ｃｏｐｙ／反応液、１０ｃｏｐｙ／反応液であった。増幅の立ち上がり時間は例１と同様にＬｏｏｐａｍｐリアルタイム濁度測定装置で測定した。
【０１０８】
イヌジステンバーウイルスの結果を図１６に示す。３’末端から３塩基目の場合には、タグ塩基数が全ての場合において増幅は見られなかった。３’末端から６塩基目の場合には、タグ塩基数３塩基、５塩基の場合では増幅が見られた。３’末端から９塩基目、１２塩基目、１５塩基目の場合には、タグ塩基数３塩基、５塩基、７塩基の場合で増幅が見られた。一方、９塩基の場合には、増幅立ち上がり時間が遅いか、増幅が見られなかった。
【０１０９】
同様に、イヌパルボウイルスの結果を図１７に示す。３’末端から３塩基目の場合には、タグ塩基数が全ての場合において増幅は見られなかった。３’末端から６塩基目の場合には、タグ塩基数３塩基、５塩基の場合では増幅が見られた。３’末端から９塩基目、１２塩基目、１５塩基目の場合には、タグ塩基数３塩基、５塩基、７塩基の場合で増幅が見られた。一方、９塩基の場合には、増幅立ち上がり時間が遅いか、増幅が見られなかった。
【０１１０】
以上のことから、タグ挿入位置は３’末端から６塩基目より５’末端側、タグ塩基数は３塩基〜７塩基がより優れていることが示唆された。
【０１１１】
［例３］
１２種のタグ導入増幅産物のチップ検出
ＦＩＰプライマーの３’末端側から９塩基目に３塩基のタグを挿入したプライマーを１２種設計し、増幅を行った。１２種類のタグは、１．ＧＡＣ、２．ＣＴＧ、３．ＧＧＡ、４．ＣＣＴ、５．ＡＧＧ、６．ＴＣＣ、７．ＡＴＣ、８．ＴＡＧ、９．ＡＣＡ、１０．ＴＧＴ、１１．ＣＡＡ、１２．ＧＴＴを用い、互いに２塩基以上配列が異なるように設計した。ここにおいてタグ配列の前に付した数字は便宜上のタグの認識番号である。
【０１１２】
１２種類の増幅産物について、各々のタグを検出するプローブを基体上に固定化し、チップ検出を行った。使用したプローブ配列を表８に示す。表８の配列において下線を付した部分がタグ配列である。プローブ配列はプライマーに導入したタグ配列と逆鎖の配列となる。チップ検出は電気化学的な手法により行った。
【表８】
2012036111.tif 000015
【０１１３】
図１８Ａ、図１８Ｂおよび図１８Ｃにジステンバーウイルスをチップ検出した結果を示した。１．ＧＡＣを導入した産物は６．ＴＣＣ検出プローブから非特異的な信号が見られた。２．ＣＴＧを導入した産物は５．ＡＧＧ検出プローブから非特異的な信号が見られた。逆に５．ＡＧＧを導入した産物は２．ＣＴＧ検出プローブから非特異的な信号が見られた。８．ＴＡＧ、９．ＡＣＡ、１０．ＴＧＴ、１１．ＣＡＡ、１２．ＧＴＴについては、各々を特異的に検出するプローブの信号が低かった。このことから、２．ＣＴＧ、３．ＧＧＡ、４．ＣＣＴ、６．ＴＣＣ、７．ＡＴＣの組み合わせがより好ましいと示唆された。図１９にこれら５つのタグ用いて１チップ上で検出した結果を示す。結果、良好な特性を示すことが確認された。
【０１１４】
パルボウイルスについても同様の傾向が見られ、２．ＣＴＧ、３．ＧＧＡ、４．ＣＣＴ、６．ＴＣＣ、７．ＡＴＣの組み合わせにおいて非特異信号は見られず、且つ特異信号も高く良好な結果であった。
【０１１５】
［例４］
陰性増幅産物中に存在する残存プライマーによるハイブリダイゼーションの阻害
３’末端側から１２塩基目、１５塩基目に実施例３で得られた良好なタグの組み合わせ２．ＣＴＧ、３．ＧＧＡ、４．ＣＣＴ、６．ＴＣＣ、７．ＡＴＣを挿入したプライマーを設計し、同様にチップ検出を行った。その結果、図２０に示すように、３’末端側から１５塩基目の場合、各々の陽性増幅産物を単独で検出した場合には十分な信号が得られた。これに対して、１つの陽性増幅産物に４つの陰性増幅産物を混合した場合には特異信号の低下および非特異信号の増大が見られた。図２１に示すように、この特異信号の低下は、陰性増幅産物中に存在する増幅に使われなかった未反応の残存プライマーが２．ＣＴＧ増幅産物と２．ＣＴＧ検出プローブのハイブリを阻害していることが原因であると考えられた。非特異信号の増大は同じく未反応の残存プライマーが各々プローブに反応してしまっていることが原因であると考えられた。
【０１１６】
３’末端側から１２塩基目、９塩基目については、陰性増幅産物を混合しても信号に変化はなかった。このことから、残存プライマーの悪影響を回避するためはタグ挿入位置を３’末端から１２塩基目より３’末端側に設計することが好ましいことが示された。
【０１１７】
例２の増幅特性の結果と合わせると、タグの挿入位置は３’末端から６塩基目から１２塩基目がより良好あると考えられた。
【０１１８】
［例５］
良好なタグの組み合わせについて、追加検討
例３にて、良好なタグの組み合わせが見出されたが、さらに同時検出可能な検体数を増やすため、１３．ＧＣＧ、１４．ＣＧＣ（実施例３で抽出された５タグとは２塩基以上互いに異なる配列）、さらに５塩基のタグとして８種類のタグ配列、１５．  ＣＣＴＣＴ、１６．  ＣＴＣＴＧ、１７．  ＡＧＴＧＧ、１８．ＴＧＡＣＣ、１９．ＧＴＧＣＡ、２０．  ＧＡＣＧＴ、２１．ＧＣＡＡＧ、２２．ＡＣＧＴＣ（互いに４塩基以上異なる）を設計し、チップ検出を行った。これらのタグは例３と同様にＦＩＰプライマーの３’末端側から９塩基目に導入した。
【０１１９】
結果、図２２Ａおよび図２２Ｂに示すように２．ＣＴＧ増幅産物を検出した時の１６．  ＣＴＣＴＧ、１７．  ＡＧＴＧＧ、２１．ＧＣＡＡＧ検出プローブで非特異信号が高いことが示された。また、６．ＴＣＣ増幅産物を検出した時の１８．ＴＧＡＣＣ検出プローブで非特異信号が高いことが示された。その他、新たに検討した１３．ＧＣＧ、１４．ＣＧＣ、１５．ＣＣＴＣＴ、１９．ＧＴＧＣＡ、２０．  ＧＡＣＧＴ、２２．ＡＣＧＴＣについては図２２、図２３に示すように良好な結果を示すことが明らかとなった。これにより、２．ＣＴＧ、３．ＧＧＡ、４．ＣＣＴ、６．ＴＣＣ、７．ＡＴＣ  、１３．ＧＣＧ、１４．ＣＧＣ、１５．ＣＣＴＣＴ、１９．ＧＴＧＣＡ、２０．  ＧＡＣＧＴ、２２．ＡＣＧＴＣの１１種のタグを用いることにより１１検体の同時検出が可能であることが実証された。
【０１２０】
［例６］
イヌジステンバーウイルスおよびイヌパルボウイルスのマルチ増幅させた産物の検出
例３および５で選ばれた１１種のタグの中で特に良好な特性を示した２．ＣＴＧ、３．ＧＧＡ、４．ＣＣＴ、１４．ＣＧＣ、１９．ＧＴＧＣＡについて、ジステンバー検出用とした。パルボについても同様に検討した。その結果、２．ＣＴＧ、３．ＧＧＡ、４．ＣＣＴ、６．ＴＣＣ、１４．ＣＧＣ、１９．ＧＴＧＣＡがより良好であった。
【０１２１】
そこで、チューブ１の増幅試薬にジステンバーの２．ＣＴＧ挿入ＦＩＰプライマー、パルボの２．ＣＴＧ挿入ＦＩＰプライマー、チューブ２の増幅試薬にジステンバーの３．ＧＧＡ挿入ＦＩＰプライマー、パルボの３．ＧＧＡ挿入ＦＩＰプライマー、チューブ３の増幅試薬にジステンバーの４．ＣＣＴ挿入ＦＩＰプライマー、パルボの４．ＣＣＴ挿入ＦＩＰプライマー、チューブ４の増幅試薬にジステンバーの１４．ＣＧＣ挿入ＦＩＰプライマー、パルボの６．ＴＣＣ挿入ＦＩＰプライマー、チューブ５の増幅試薬にジステンバーの２２．ＡＣＧＴＣ挿入ＦＩＰプライマー、パルボの１９．ＧＴＧＣＡ挿入ＦＩＰプライマー  を各々混合した。子犬の糞便検体から抽出した核酸を検体とし、表１０に示す組成の反応液中でＲＴ−ＬＡＭＰをかけた。
【０１２２】
検体１はチューブ１、検体２はチューブ２、検体３はチューブ３、検体４はチューブ４、検体５はチューブ５に入れて、増幅を行った。チップ検出の結果を図２４に示すように、実検体１はジステンバー陰性、パルボ陽性、実検体２、３はジステンバー陰性、パルボ陰性、実検体４はジステンバー陽性、パルボ陰性、実検体５はジステンバー陽性、パルボ陽性であった。これらの結果は、抗原抗体反応の結果と一致した。
【０１２３】
［増幅用反応液の組成］
ＬＡＭＰ増幅は表９に示した組成を用いることが可能である。この組成は、例えば、合成されたプラスミドなどの増幅において使用するための組成の１例である。ウイルスについて増幅を行う場合には、例えば、表１０に示す組成を用いればよい。
【表９】
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【表１０】
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【符号の説明】
【０１２４】
１…基体、２…固定化領域、１１…基体、１２…電極、１３…パット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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