(57)【要約】  本発明は、ＡＧＥ結合アプタマーを有効成分として含む、糖尿病性腎症の治療または予防用組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＧＥ結合アプタマーを含む、糖尿病性腎症の治療用または予防用組成物。
【請求項２】
糖尿病性腎症の進展抑制用組成物である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
腎機能悪化抑制用組成物である、請求項１記載の組成物
【請求項４】
脂質異常症の治療用または予防用組成物である、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
血圧低下用組成物である、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
ＡＧＥ結合アプタマーが、ＡＧＥ−２に結合するアプタマーである、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
ＡＧＥ結合アプタマーが、配列番号１〜４１のいずれかの塩基配列からなる、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
ＡＧＥ結合アプタマーが、配列番号１〜４１のいずれかの塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、ＡＧＥ−２に結合する一本鎖ＤＮＡである、請求項６記載の組成物。
【請求項９】
ＡＧＥ結合アプタマーが、配列番号１〜４１のいずれかの塩基配列において１、２、または３個の塩基が欠失、置換、または付加された塩基配列からなり、ＡＧＥ−２に結合する一本鎖ＤＮＡである、請求項６記載の組成物。
【請求項１０】
ＡＧＥ結合アプタマーを含む、糖尿病患者における脂質異常症の治療用または予防用組成物。
【請求項１１】
ＡＧＥ結合アプタマーを含む、糖尿病患者における血圧低下用組成物。
【請求項１２】
ＡＧＥ結合アプタマーが以下からなる群から選択される、請求項１０または１１記載の組成物。
（ａ）配列番号１〜４１のいずれかの塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１〜４１のいずれかの塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、ＡＧＥ−２に結合する一本鎖ＤＮＡ；および
（ｃ）配列番号１〜４１のいずれかの塩基配列において１、２、または３個の塩基が欠失、置換、または付加された塩基配列からなり、ＡＧＥ−２に結合する一本鎖ＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、終末糖化産物（ＡＧＥ）結合アプタマーを含む糖尿病性腎症の治療用または予防用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
終末糖化産物（Advanced Glycation End-products；ＡＧＥ）は、グルコースなどの還元糖のカルボニル基と、タンパク質のアミノ基との非酵素的な反応（メイラード反応）により生じる高分子物質である。糖尿病などで慢性的に高血糖が続くと、循環血液中や組織でＡＧＥの生成が促進される。糖尿病の合併症の発症および進展に、ＡＧＥの関与が示唆されている（非特許文献１および非特許文献２）。【０００３】
一方、近年、一本鎖ＤＮＡや一本鎖ＲＮＡが種々の立体構造をとり、低分子からタンパク質までの種々の化合物を認識して結合して、抗体のような機能を有し得ることが明らかになっている（非特許文献３および非特許文献４）。このような分子をアプタマーと称する。アプタマーは、ランダム配列の中からＳＥＬＥＸという選別方法によって調製することができる（非特許文献４）。【０００４】
アプタマーは、試験管内で大量に合成できること、抗体よりも結合力が強いものが得られる可能性があること、安定化できることなどの利点を有する。そのため、抗体と同様に、研究、検出、医療などに応用され得る。医療などへの応用が検討されている例としては、ＨＩＶ−１逆転写酵素に対するＲＮＡアプタマー（非特許文献５）等が報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Yamagishi S.ら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002年, 290巻, 973-978頁
【非特許文献２】Okamoto T.ら, FASEB J., 2002年, 16巻, 1928-1930頁
【非特許文献３】Ellington A.D.およびSzostak J.W.，Nature，1990年，346巻，818-822頁
【非特許文献４】Tuerk C.およびGold L.，Science，1990年，249巻，505-510頁
【非特許文献５】Kensch O.ら，J. Biol. Chem.，2000年，275巻，18271-18278頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、糖尿病性腎症の治療または予防に有用な医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、これまでに、ＡＧＥに結合するアプタマーを作成し、これらが網膜周皮細胞のアポトーシスを抑制することを報告している（国際公開２００６／０８０２６２号公報；Microvascular Research 74 (2007) 65-69）。この度、本発明者らは、ＡＧＥ結合アプタマーが２型糖尿病モデル動物において腎保護効果を発揮すること等を見出し、本発明を完成させた。【０００８】
即ち、本発明は、ＡＧＥ結合アプタマーを含む、糖尿病性腎症の治療用または予防用組成物を提供する。【０００９】
また、本発明は、ＡＧＥ結合アプタマーを含む、糖尿病患者における脂質異常症の治療用または予防用組成物を提供する。【００１０】
また、本発明は、ＡＧＥ結合アプタマーを含む、糖尿病患者における血圧低下用組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＡＧＥ結合アプタマーを含む組成物は、糖尿病または糖尿病性腎症に対する医薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】グリセルアルデヒド由来のＡＧＥであるＡＧＥ−２の生成経路を示す図である。
【図２】ＳＥＬＥＸ法の概要を示す工程図である。
【図３】種々の濃度のＡＧＥ−２（Ａ）、ならびに１００μｇ／ｍＬのＡＧＥ−２に種々の濃度のＡＧＥ−２アプタマーを添加した場合（ＢおよびＣ）の蛍光スペクトル図である。消光波長を４７０ｎｍで固定し、励起波長を３００〜４５０ｎｍまでスキャンした。いずれも１ｍｌ中の質量またはモル数を示す。
【図４】アポトーシス阻害率の算出方法を説明する図である。
【図５】ＡＧＥ−２アプタマーの糖尿病モデルマウスへの投与方法を説明する図である。
【図６】ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。図中、各レーンの表示は以下のとおりである。Ｍ：マーカー；Ｉ：無投与C57BL/6jマウス血液由来のＰＣＲ産物；ＩＩ：０．０３μＭ＊  ＡＧＥ−２アプタマー投与３週間後のマウスの血液由来のＰＣＲ産物；ＩＩＩ：０．３μＭ＊  ＡＧＥ−２アプタマー投与３週間後のマウスの血液由来のＰＣＲ産物；３μＭ＊  ＡＧＥ−２アプタマー投与２週間後のマウスの血液由来のＰＣＲ産物（＊ＡＧＥ−２アプタマーの濃度はアプタマーが血中に順調に移行した場合の予想濃度である）。
【図７】尿中のアルブミン排泄量の経時変化を示す図（Ａ）および尿中アルブミン／クレアチニン比率の経時変化を示す図（Ｂ）である。
【図８】ＰＡＳ染色した糸球体の顕微鏡写真を示す。C+BL6jは、コントロールアプタマーを投与したC57BL/6jマウスの糸球体の写真を、A+BL6jは、ＡＧＥ−２アプタマーを投与したC57BL/6jマウスの糸球体の写真を、C+KK/Ayは、コントロールアプタマーを投与したKK-Ay/Taマウスの糸球体の写真を、A+KK/Ayは、ＡＧＥ−２アプタマーを投与したKK-Ay/Taマウスの糸球体の写真を示す。コントロールアプタマーを投与したKK-Ay/Taマウスでは糸球体基底膜の肥厚（硬化）が認められる（図中矢印）。
【図９】Masson-Trichrome染色した糸球体の顕微鏡写真を示す。C+BL6jは、コントロールアプタマーを投与したC57BL/6jマウスの糸球体の写真を、A+BL6jは、ＡＧＥ−２アプタマーを投与したC57BL/6jマウスの糸球体の写真を、C+KK/Ayは、コントロールアプタマーを投与したKK-Ay/Taマウスの糸球体の写真を、A+KK/Ayは、ＡＧＥ−２アプタマーを投与したKK-Ay/Taマウスの糸球体の写真を示す。コントロールアプタマーを投与したKK-Ay/Taマウスでは糸球体の線維化が認められる（図中矢印）。
【図１０】糸球体の線維化の程度を示す図である。Masson-Trichrome染色した糸球体の顕微鏡写真を画像解析することにより、線維化の程度を定量した。
【図１１】糸球体におけるＡＧＥ−２沈着を示す図である。Ctrl-aptamer+KK/Ay (diabetes) は、コントロールアプタマーを投与したKK-Ay/Taマウスの糸球体の写真を、AGEs-aptamer+KK/Ay (diabetes)は、ＡＧＥ−２アプタマーを投与したKK-Ay/Taマウスの糸球体の写真を示す。ＡＧＥ−２アプタマーの投与により糸球体におけるＡＧＥ−２沈着が完全に抑制された。
【図１２】尿中の８ＯＨｄＧの量を示す図である。ＡＧＥ−２アプタマーの投与により糖尿病モデルマウスにおける８ＯＨｄＧ産生が抑制された。
【図１３】配列番号９で表される塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡの推定される２次構造を示す図である。＊は、ＡＣＣ（Ｃ）または（Ｃ）ＣＣＡモチーフの存在を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、ＡＧＥ結合アプタマーを含む糖尿病性腎症の治療用または予防用組成物を提供する。
【００１４】
終末糖化産物（ＡＧＥ）とは、グルコースなどの還元糖のカルボニル基と、タンパク質のアミノ基との非酵素的な反応（メイラード反応）により生じる高分子物質の総称である。本発明における「ＡＧＥ結合アプタマー」は、ＡＧＥに結合するアプタマーを意味し、如何なるＡＧＥに結合するアプタマーも包含する。本発明における好ましいＡＧＥは、グリセルアルデヒドに由来する終末糖化産物であるＡＧＥ−２である。すなわち、本発明において、ＡＧＥ結合アプタマーは、ＡＧＥ−２に結合するアプタマー（以下、ＡＧＥ−２アプタマーとも称す）であることが好ましい。
【００１５】
本発明のアプタマーは、一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡのいずれであってもよいが、好ましくは一本鎖ＤＮＡである。本発明のＡＧＥ結合アプタマーは、少なくとも３５塩基からなり、好ましくは３５塩基〜１２０塩基、より好ましくは５０塩基〜７０塩基である。ＡＧＥ−２アプタマーは、当該アプタマーを構成する塩基中に、シトシンまたはグアニンのいずれか一方を多く含むことが好ましい。シトシンを多く含む場合、シトシン含有率は、３５％〜６０％、４０％〜６０％、または５０％〜６０％であってよい。グアニンを多く含む場合、グアニン含有率は、３２％〜５０％、３５％〜５０％、または４０％〜５０％であってよい。
【００１６】
本発明における好ましいＡＧＥ結合アプタマーは、配列番号１〜４１のいずれかの塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡである。より好ましくは、ＡＧＥ結合アプタマーは、配列番号１〜４１のいずれかの塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡである。配列番号１〜２４のいずれかの塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡは、５４〜５８塩基からなり、塩基中のシトシン含有率は３５％〜６０％である。配列番号２５〜４１のいずれかの塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡは、６１〜６６塩基からなり、塩基中のグアニン含有率は３２％〜５０％である。
【００１７】
本発明のＡＧＥ結合アプタマーは、アプタマーを得るための一般的な方法であるＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment）法によって調製することができる。一本鎖ＤＮＡをライブラリー源とするＳＥＬＥＸ法の概要を以下に説明する。まず、任意の２つのプライマー配列で挟まれた適当な長さのランダム配列を含むテンプレートＤＮＡを合成する。本発明においては、ランダム配列の長さは、３５塩基〜１２０塩基が適切である。このテンプレートＤＮＡをＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）で増幅して、ランダムＤＮＡアプタマープールを得る。次いで、このランダムＤＮＡアプタマープールを標的物質と会合させ、結合しなかったＤＮＡを除去し、そして結合したＤＮＡアプタマーを抽出する。得られたＤＮＡアプタマーを、上記プライマー配列を用いるＰＣＲによって増幅する。このとき、５〜８ｍＭのＭｇ２＋存在下でＰＣＲを行って、複製の正確性を低下させて変異を導入しやすくすることにより、標的物質との会合前のＤＮＡアプタマープールに存在しない新たなＤＮＡアプタマーを含むＤＮＡアプタマープールが得られる。新たなＤＮＡアプタマーは、結合力がより強い可能性があり、すなわち、ＤＮＡアプタマーが進化する可能性が生じる。この進化したＤＮＡアプタマープールについて、上記の一連の操作を５〜１５ラウンド繰り返すことによって、標的物質に結合するＤＮＡアプタマーが得られる。最終ラウンドの後、得られたＤＮＡアプタマープールは、当業者が通常行う操作によってクローニングされ、次いで配列決定される。このＳＥＬＥＸ法における、テンプレートＤＮＡの合成、ＰＣＲなどの操作、ならびにクローニングおよび配列決定は、当業者が通常用いる方法によって行われる。本発明のＡＧＥ結合アプタマーは、このようにして決定された配列に基づいて、当業者が通常用いる方法によって化学合成することができる。
【００１８】
本発明におけるＡＧＥ結合アプタマーは、ＡＧＥ−２を標的物質として調製されたものであることが好ましい。例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のアミノ基とグリセルアルデヒドのアルデヒド基が非酵素的に反応（メイラード反応）して生じた結合体（以下、ＡＧＥ−２−ＨＳＡとも称す）を標的物質とすることができる。ＡＧＥ−２−ＨＳＡは、例えば、培養法、化学合成法などの任意の方法によって調製することができる。培養法で調製する場合、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を、Ｄ−グリセルアルデヒドと数日間インキュベートする。化学合成法によって調製する場合、例えば、Tessierらの方法（Tessier et al., Biochem. J., 2003, 369, 705-719）に従って、アセチル−リジンとグリセルアルデヒドとをリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で混合し、さらにジエチレントリアミンペンタ酢酸および２５％（ｖ／ｖ）メタノールを加えて、３７℃で数日間反応させることによって調製することができる。得られたＡＧＥ−２は、ＳＥＬＥＸ法において用いる場合は、適切な固相（例えば、ビーズなど）に固定化されていることが好ましい。
【００１９】
得られたアプタマーのＡＧＥとの結合親和性は、ＡＧＥが蛍光を発することを利用して、ＡＧＥにアプタマーを添加したときのＡＧＥの蛍光強度の減弱によって測定できる。このようにして、ＳＥＬＥＸ法によって調製したアプタマーのうち、親和性の強いアプタマーを選択することができる。
【００２０】
本発明におけるＡＧＥ結合アプタマーは、その安定性を増加させるため、修飾ヌクレオチドにより構成されていてもよい。例えば、ＡＧＥ結合アプタマーは、ヌクレオチド間の結合部位にあるリン酸基の酸素原子が硫黄原子に置換されたホスホロチオエート（Ｓ化）オリゴヌクレオチドであってよい。
【００２１】
配列番号１〜１５で表される塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡは、全て、ＡＣＣ（Ｃ）または（Ｃ）ＣＣＡなる配列モチーフ（ここで（Ｃ）は、Ｃが存在しても存在しなくてもよいことを示す）を有する。また、配列番号１〜１５で表される塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡは、全て、その二次構造中にＡＣＣ（Ｃ）または（Ｃ）ＣＣＡなる配列モチーフが１または２個存在するループを有する。例えば、配列番号９で表される塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡは、図１３のような二次構造を有する。よって、さらなるＡＧＥ結合アプタマーの非限定的な例としては、（ａ）二次構造中にＡＣＣ（Ｃ）または（Ｃ）ＣＣＡなる配列モチーフが１または２個存在するループを有し；（ｂ）５４〜５８塩基からなり；（ｃ）塩基中のシトシン含有率が３５％〜６０％であり；かつ（ｄ）ＡＧＥ−２に結合する、一本鎖ＤＮＡ、または、（ａ’）塩基配列中にＡＣＣ（Ｃ）または（Ｃ）ＣＣＡなる配列モチーフが少なくとも１個存在し；（ｂ）５４〜５８塩基からなり；（ｃ）塩基中のシトシン含有率が３５％〜６０％であり；かつ（ｄ）ＡＧＥ−２に結合する、一本鎖ＤＮＡが挙げられる。なお、上記（ａ）および（ａ’）において、ＡＣＣ（Ｃ）と（Ｃ）ＣＣＡのモチーフが重複する場合は、１個と数える。例えば、ＡＣＣＣＡという配列は、ＡＣＣＣとＣＣＣＡの２つのモチーフが連続することにより重複する配列であるが、この場合のモチーフの数は１個と数える。配列番号１〜１５で表される塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡは、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）を満たす例として挙げられる。
【００２２】
また、本発明のＡＧＥ結合アプタマーは、配列番号１〜４１のいずれかで表される塩基配列を改変して得られたものであってもよい。すなわち、ＡＧＥ結合アプタマーは、配列番号１〜４１のいずれかの塩基配列において、１、２、または３個の塩基が欠失、置換、または付加された塩基配列を含み、ＡＧＥに結合する一本鎖ＤＮＡ；配列番号１〜４１のいずれかの塩基配列において、１、２または３個の塩基が欠失、置換、または付加された塩基配列からなり、ＡＧＥに結合する一本鎖ＤＮＡ；配列番号１〜４１のいずれかの塩基配列と９５、９０、８５、８０、７５または７０％の配列同一性を有する塩基配列を含み、ＡＧＥに結合する一本鎖ＤＮＡ；または配列番号１〜４１のいずれかの塩基配列と９５、９０、８５、８０、７５または７０％の配列同一性を有する塩基配列からなり、ＡＧＥに結合する一本鎖ＤＮＡ、であってもよい。
【００２３】
本発明において、塩基配列の「配列同一性」とは、２つのオリゴヌクレオチド間の配列の類似の程度を意味し、比較対象の塩基配列の領域にわたって最適な状態（配列の一致が最大となる状態）にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。配列同一性の数値（％）は両方の配列に存在する同一の塩基を決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内の塩基の総数で割り、得られた数値に１００をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなど）が挙げられる。塩基配列の配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定される。
【００２４】
アプタマーのＡＧＥに対する結合性は、上記の説明にしたがい、または以下の実施例に記載の方法により、調べることができる。
【００２５】
糖尿病性腎症は、糖尿病の合併症の１つであり、糖尿病によって腎臓の糸球体が細小血管障害のため硬化して数を減じていく病気ある。本発明における糖尿病には、１型糖尿病、２型糖尿病、遺伝子の異常、肝臓や膵臓の病気、感染症、免疫の異常などの他の病気および薬剤が原因となって惹起される糖尿病、および妊娠糖尿病が含まれる。
【００２６】
糖尿病性腎症に関する日本糖尿病学会・日本腎臓学会合同委員会の病期分類では、糖尿病性腎症の臨床経過は、１〜５期（ステージ）に分類される（日腎会誌2002;44(1):i）（表１参照）。さらに、第３期は、ＧＦＲ（糸球体濾過量）およびクレアチニン・クリアランスがほぼ正常である前期と、ＧＦＲ（糸球体濾過量）およびクレアチニン・クリアランスの低下が認められる後期に分けられる。
【表１】
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１型糖尿病における腎症は、微量アルブミン尿の出現により発症し、発症早期にＧＦＲの顕著な増加、糸球体過剰濾過を呈する。そして、年間１０〜２０％尿アルブミンが増加し、通常１０〜１５年後に慢性腎症期（第３期に相当）に移行する。慢性腎症期以降（第３〜５期に相当）では、ＧＦＲ（糸球体濾過量）が低下し、半数以上の症例で１０年以内に末期腎不全に至る。生活習慣の欧米化とともに増加しつつある２型糖尿病では、糖尿病発症時期が不明瞭であることや、１型糖尿病に比較して腎症発症前よりすでに高血圧症を合併していることが多い。腎症を発症すれば、その臨床経過は１型糖尿病による腎症に類似するものと考えられる。
【００２７】
本発明において、疾患または症状の「治療」には、当該疾患または症状の病態の改善および寛解、並びに当該疾患または症状の進展の抑制が含まれる。また、疾患または症状の「予防」には、当該疾患または症状の発症の抑制および遅延が含まれる。
【００２８】
本発明の糖尿病性腎症の治療用または予防用組成物は、投与により糖尿病性腎症の進展を抑制しうるものである。よって、本発明の組成物は、糖尿病性腎症の進展抑制用組成物でありうる。
【００２９】
腎症の進展の抑制の非限定的な例としては、第１期から第２期、第３期（第３期前期または後期であり得る）、第４期、または第５期への進展の抑制、第２期から第３期（第３期前期または後期であり得る）、第４期、または第５期への進展の抑制が挙げられる。
【００３０】
本発明の糖尿病性腎症の治療用または予防用組成物は、投与により患者の腎機能の悪化を抑制しうるものである。よって、本発明の組成物は、腎機能悪化抑制用組成物でありうる。
【００３１】
腎機能の指標の非限定的な例としては、尿中アルブミン排出量、尿中アルブミン／クレアチニン比、血中のクレアチニン・クリアランス、血中尿素窒素量、血中クレアチニン量が挙げられる。本発明の腎機能悪化抑制用組成物は、上記糖尿病性腎症の進展に伴い悪化する指標のうち、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または５つ全ての指標の悪化を抑制しうる。これにより腎機能の保護効果が認められるので、本発明の組成物は、腎機能保護用組成物でもありうる。
【００３２】
本発明の糖尿病性腎症の治療用または予防用組成物は、投与により患者の腎組織を保護しうるものである。よって、本発明の組成物は、腎組織保護用組成物でありうる。
【００３３】
糖尿病性腎症の進展に伴い、メサンギウム基質の増加、糸球体基底膜の肥厚（硬化）、糸球体の線維化、および／または腎肥大（腎臓／体重比の増加）が認められる。本発明の腎組織保護用組成物は、上記のうち、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つ全てを抑制しうる。
【００３４】
本発明の組成物は、糖尿病性腎症を発症しているヒトにも、発症していないヒトにも投与されうる。糖尿病性腎症を発症していないヒトの非限定的な例としては、糖尿病を発症していないものの発症する危険性が高いヒト、糖尿病を発症しているものの糖尿病性腎症を発症していないヒト、過去に糖尿病腎症を発症したものの治癒または寛解し現在腎症の症状を呈しないヒトが挙げられる。糖尿病を発症していないものの発症する危険性が高いヒトの非限定的な例としては、メタボリックシンドロームを呈するヒトが挙げられる。糖尿病性腎症を発症しているヒトの非限定的な例には、糖尿病性腎症の第１期（腎症前期）、第２期（早期腎症）、第３期（顕性腎症）、または第４期（腎不全期）を呈するヒトが挙げられる。
【００３５】
別の態様において、本発明は、ＡＧＥ結合アプタマーを含む、糖尿病患者における脂質異常症の治療用または予防用組成物を提供する。ＡＧＥ結合アプタマーおよび糖尿病については、上記と同様である。脂質異常症の症状としては、血中の総コレステロール量の増加、血中の中性脂肪量の増加および血中の遊離脂肪酸量の増加が挙げられる。脂質異常症の治療および予防には、糖尿病の進展に伴う血中の総コレステロール量、中性脂肪量および／または遊離脂肪酸量の増加の抑制が含まれる。
【００３６】
本発明の脂質異常症の治療用または予防用組成物は、脂質異常症を呈する糖尿病患者にも、脂質異常症を呈さない糖尿病患者にも投与されうる。また、糖尿病患者には、糖尿病性腎症を発症している患者（すなわち、糖尿病性腎症の患者）も、発症していない患者も含まれる。本発明の脂質異常症の治療用または予防用組成物の投与対象の非限定的な例としては、糖尿病を発症しており脂質異常症を呈するヒト、糖尿病を発症しており脂質異常症を呈する危険性が高いヒト、糖尿病性腎症を発症しており脂質異常症を呈するヒト、糖尿病性腎症を発症しており脂質異常症を呈する危険性が高いヒトが挙げられる。
【００３７】
別の態様において、本発明は、ＡＧＥ結合アプタマーを含む、糖尿病患者における血圧低下用組成物を提供する。ＡＧＥ結合アプタマーおよび糖尿病については、上記と同様である。糖尿病患者には、糖尿病性腎症を発症している患者（すなわち、糖尿病性腎症の患者）も、発症していない患者も含まれる。本発明の血圧低下用組成物の投与対象の非限定的な例としては、糖尿病を発症しており高血圧であるヒト、糖尿病を発症しており高血圧となる危険性が高いヒト、糖尿病性腎症を発症しており高血圧であるヒト、糖尿病性腎症を発症しており高血圧となる危険性が高いヒトが挙げられる。
【００３８】
本発明の組成物は、ＡＧＥ結合アプタマーを医薬として許容される担体と配合し、固形製剤（例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤など）、または液状製剤（例えば、シロップ剤、注射剤など）として製造することができる。医薬として許容される担体としては、例えば、賦形剤（例えば、乳糖、ショ糖、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、崩壊剤（例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム等）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）、溶剤（例えば、水、食塩水、大豆油等）、保存剤（例えば、p-ヒドロキシ安息香酸エステル等）などがあげられるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
本発明の組成物の投与方法は、投与対象の年齢、体重、健康状態等によって適宜選択される。例えば、本発明の組成物は、経口投与、静脈内投与、または皮下投与により投与することができるが、静脈内投与によることが好ましい。本発明の組成物の投与量もまた、投与方法、投与対象の年齢、体重、健康状態等によって適宜選択される。例えば、成人１日当たり、ＡＧＥ結合アプタマーの量として１ｍｇ〜１００ｇを投与することができるが、これに限定されない。
【００４０】
別の態様において、本発明は、ＡＧＥ結合アプタマーを含む組成物を投与することにより、糖尿病性腎症を治療または予防する方法、糖尿病患者における脂質異常症を治療または予防する方法、および糖尿病患者において血圧を低下する方法を提供する。
【００４１】
別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、糖尿病または糖尿病性腎症の治療または予防に有用なＡＧＥ結合アプタマーをスクリーニングする方法を提供する：
（ｉ）ＳＥＬＥＸ法を用いてＡＧＥ結合アプタマーを得る工程；
（ｉｉ）得られたＡＧＥ結合アプタマーを糖尿病モデル動物に投与する工程；および
（ｉｉｉ）前記ＡＧＥ結合アプタマーを投与された糖尿病モデル動物において、尿中のアルブミン排泄量、腎重量、血中尿素窒素濃度、血中クレアチニン濃度、血中総コレステロール濃度、血中中性脂肪濃度、血中遊離脂肪酸濃度、および血圧からなる群から選択される少なくとも１つを測定する工程。
糖尿病モデル動物は、好ましくは２型糖尿病モデル動物である。２型糖尿病モデル動物の非限定的な例としては、KK-Ay/Taマウスが挙げられる。
【００４２】
前記の治療または予防方法およびスクリーニング方法は、本発明の組成物に関する記載を考慮することで、当業者が適宜実施することができる。
【００４３】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
実施例１  ＡＧＥ結合アプタマーの作成（１）
（１）一本鎖ランダムオリゴＤＮＡの作成
３４、５６、または７２残基のランダム領域およびその両側にプライマー部位（配列番号４２および配列番号４３）を含む一本鎖ランダムオリゴＤＮＡを以下のように合成した。【００４５】
まず、３’末端のヌクレオチドが３’水酸基を介して結合されたＣＰＧ（controlled pore glass）担体をカラムに充填した。次いで、リボースの５’位の保護基であるジメトキシトリチル基をトリクロロ酢酸によって除去して、脱トリチル化を行った。リボースの３’位の水酸基がリン酸シアノエチルアミダイド誘導体である２番目のヌクレオチドを、脱トリチル化された１番目のヌクレオチドの５’水酸基に、塩基触媒（テトラゾール）を用いてカップリングさせ、未反応の５’水酸基を無水酢酸によってアセチル化した。２つのヌクレオチド間の結合を、ヨードを用いて酸化して、３価のリンから５価のリン酸エステルへ変換した。上記の脱トリル化からリン酸エステルへの変換までの操作を目的の鎖長になるまで繰り返した。ランダム部分の配列は、カップリング反応の際に、４種のヌクレオチドアミダイド混合物を使用して行った。反応後、カラムからアンモニア処理によってオリゴＤＮＡを切り出し、逆相カートリッジカラムによって精製した。凍結乾燥後、適量の水に溶解し、ＳＥＬＥＸライブラリーのテンプレートＤＮＡとした。【００４６】
（２）ＡＧＥ−２の合成
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Sigma社製）を無菌状態で、Ｄ−グリセルアルデヒドと３８℃にて７日間インキュベートした。未反応の糖を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の透析によって除去した。使用する前に、Endospecy ES-20Sシステム（生化学工業）を用いて、エンドトキシンがないことを確認した。【００４７】
（３）ＡＧＥ−２のビーズへの結合
上記（２）で得たＡＧＥ−２をPIERCE社のSulfoLink（登録商標）カップリングゲル（カタログ番号20401）を使用して製品の指示書に従って、以下のようにビーズに固定化した。【００４８】
まず、カップリングゲルをカラムにとり、カップリング緩衝液（50mM Tris-HCl, 5mM EDTA, pH8.5）で平衡化した。ＡＧＥ−２をカップリング緩衝液に溶解し、カップリングゲルと混合して、室温で１時間インキュベートした。反応終了後、カップリング緩衝液でカラムを数回洗浄した。Ｌ−システインをカップリング緩衝液に溶解し、カップリングゲルと混合して、室温で３０分間インキュベートした。反応終了後、カップリング緩衝液およびＰＢＳでカラムを数回洗浄した。なお、反応前および反応後の吸光度を測定することによって、ＡＧＥ−２の固定化量を算出した。固定化後のゲル（ビーズ）を小分けし、使用するまで冷暗所に保存した。【００４９】
（４）ＨＳＡのビーズへの結合
ＨＳＡを、PIERCE社のSulfoLink（登録商標）カップリングゲル（カタログ番号20401）およびUltraLink（登録商標）EDC/DADPA固定化キット（カタログ番号53154）を使用して、ビーズに固定化した。【００５０】
（５）ＳＥＬＥＸ法
上記（１）で合成したランダムオリゴＤＮＡを鋳型にして、forwardプライマー（配列番号４２）とrevereseプライマー（配列番号４３）によるＰＣＲ（１サイクル：９４℃、１５秒；５５℃、１５秒；７２℃、１５秒Ｘ１２サイクル）を行った。増幅後、forwardプライマーのみを用いた非対称ＰＣＲによりプラス鎖を増幅した（１サイクル：９４℃、１５秒；５５℃、１５秒；７２℃、１５秒Ｘ４５サイクル）。増幅したプラス鎖をアガロースゲル電気泳動によって精製し、ＳＥＬＥＸ用ＤＮＡライブラリーとした。このＳＥＬＥＸ用ＤＮＡライブラリーをＰＢＳに溶かし、９５℃で５分加熱し、室温に戻した。次いで、ＳＥＬＥＸ用ＤＮＡライブラリーと上記（３）で調製したＡＧＥ−２を固定化させたビーズとを混合し、室温で３０分間インキュベートした。インキュベート後、ＰＢＳでビーズを数回洗浄した。適量の水をビーズに加えて混合し、１００℃で５分間加熱し、ＡＧＥ−２ビーズに結合したＤＮＡを解離させて回収した。回収したＤＮＡと上記（４）で調製したＨＳＡを固定化させたビーズとを混合し、室温で１０分間インキュベートした。素通りした（ＨＳＡに結合しなかった）ＤＮＡを回収して、エタノール沈殿法によって濃縮した。濃縮したＤＮＡを鋳型にして、上記の操作を５〜１５ラウンド繰り返した。この時、５〜８ｍＭのＭｇ＋存在下でＰＣＲを行って、変異を導入させた。【００５１】
（６）クローニング
５〜１５ラウンド後に得られたＤＮＡを、forwardプライマー（配列番号４２）とrevereseプライマー（配列番号４３）を用いるＰＣＲによって増幅し、アガロースゲル電気泳動によって精製し、そしてＡＧＥ−２特異的ＤＮＡを得た。このＤＮＡをクローニングベクター（Invitrogen社: Zero Blunt（登録商標）TOPO（登録商標）PCR Cloning Kit for Sequencing（カタログ番号K2875J10））へ導入し、以下のようにして配列を決定した。【００５２】
まず、ＡＧＥ−２特異的ＤＮＡ（ＰＣＲ産物）とクローニングベクター（TOPOベクター）とを混合し、室温で５分間インキュベートした。反応終了後、反応液の一部をコンピテントセルに加え、氷冷下で３０分間インキュベートした。４２℃にて３０秒間ヒートショックした後、氷上で２分間冷却した。冷却した反応液に、キット中に含まれているＳＯＣ培地を加えて３７℃にて１時間培養した。適量を寒天プレート（５０μｇ／ｍLアンピシリンを含むLB培地）に播種し、３７℃にて一晩培養した。無作為に数十個のクローンを選び、アルカリ法によってプラスミドＤＮＡを調製した。【００５３】
（７）配列決定
上記（６）で得られたプラスミドＤＮＡ中のＡＧＥ−２特異的ＤＮＡの配列を、Applied Biosystem社のABI377を用いてBigDye Terminator Cycle sequence法によって決定した。その結果、３４塩基の一本鎖ＤＮＡからは、ＡＧＥ−２に結合するものが得られなかった。５６塩基の一本鎖ＤＮＡからは、配列番号１〜２４に示す５４〜５８塩基の一本鎖ＤＮＡ、すなわちＡＧＥ−２アプタマーが得られた（表２）。なお、７２塩基の一本鎖ＤＮＡについてもＡＧＥ−２に結合するものが得られたが、配列決定は行っていない。【００５４】
【表２】
2012070621.tif 000003
【００５５】
表２に示すように、得られたＡＧＥ−２アプタマーはいずれも、当該アプタマーを構成する塩基中のシトシン含有率が３５％以上であった。【００５６】
実施例２  ＡＧＥ結合アプタマーの作成（２）
６４残基のランダム領域およびその両側にプライマー部位（配列番号４２および配列番号４３）を含む一本鎖ランダムオリゴＤＮＡを鋳型に用いたこと以外は、実施例と同様にしてＡＧＥ−２アプタマーを作成した。その結果、配列番号２５〜４１に示す６１〜６６塩基の一本鎖ＤＮＡ、すなわちＡＧＥ−２アプタマーが得られた（表３）。【００５７】
【表３】
2012070621.tif 000004
【００５８】
表３に示すように、得られたＡＧＥ−２アプタマーはいずれも、当該アプタマーを構成する塩基中のグアニジン含有率が３２％以上であった。【００５９】
得られたＡＧＥ−２アプタマーの配列に基づいて、上記実施例１（１）と同様にホスホアミダイド法により、各ＡＧＥ−２アプタマーを化学合成した。【００６０】
実施例３  ＡＧＥ−２アプタマーによるＡＧＥ−２蛍光阻害実験
ＡＧＥ−２の蛍光特性を測定するために、蛍光分光光度計（ＦＰ−７７７；日本分光）を用いて、励起波長および消光波長を決定した。その結果、励起は３８０ｎｍおよび消光は４７０ｎｍで最大蛍光を示した。そこで、２５〜１００μｇ／ｍＬのＡＧＥ−２を用いて、励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度を測定して検量線を作成した（図３Ａ）。
次いで、１００μｇ／ｍＬのＡＧＥ−２に対して、最終濃度２５〜１００ｎＭとなるように各アプタマー（配列番号１〜１５）を添加し、蛍光強度を測定した（図３Ｂおよび図３Ｃ）。アプタマーを２５ｎＭ添加したときのＡＧＥ−２の蛍光強度の減弱に基づいて、アプタマー単位モル数（ｎｍｏｌ）あたりに結合するＡＧＥ−２の質量（ｎｇ）を算出した。結果を表４に示す。【００６１】
【表４】
2012070621.tif 000005
【００６２】
実施例４  ウシ周皮細胞を用いたアポトーシス実験
ウシ周皮細胞を、屠殺後のウシから調製し、ダルベッコ改変イーグル培地（Gibco BRL, Rockville, MD）に２０％ウシ胎児血清（ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH）を添加した培地中で継代培養した。培養したウシ周皮細胞を、２０μｇ／ｍＬのＡＧＥ−２および１００μｇ／ｍＬのアプタマー（配列番号１〜２２）とともに３７℃にて２日間インキュベートした。コントロールではアプタマーの代わりにＨＳＡを添加して、ならびに陽性コントロールではＡＧＥ−２を添加して、上記と同様にインキュベートした。２日後、細胞をトリプシンで剥離し、［３Ｈ］−チミジンの取込実験を行って、生存細胞の数をカウントした。生存細胞数から、図４に示すようにして、アポトーシス阻害率を算出した。結果を表５に示す。【００６３】
【表５】
2012070621.tif 000006
【００６４】
表５に示すように、ＡＧＥ−２のみの添加によって誘発されるアポトーシスが、ＡＧＥ−２アプタマーを加えることによって阻害されたことがわかる。このことから、ＡＧＥ−２アプタマーがＡＧＥ−２に結合して、その機能を阻害し得ることがわかった。【００６５】
実施例４  ＡＧＥ−２アプタマーの投与量の決定
（１）方法
２型糖尿病モデルマウスKK-Ay/Taマウス（日本クレア、雄性、６週齢）の腹腔内に浸透圧ポンプ（ALZET社）を埋め込んだ。投与後の血中濃度が０．０３、０．３、３μＭとなるように薬液を浸透圧ポンプに充填し、ＡＧＥ−２アプタマー（配列番号１）を腹腔内持続投与した（２週間または３週間）。ＡＧＥ−２アプタマー（配列番号１）の合成はOperon社に依頼し、その配列は下記のとおりである。
ＡＧＥ−２アプタマー
2012070621.tif 000007
【００６６】
投与後、マウスより血液を採取し、採取した血液を下記プライマーおよび酵素（KOD FX（登録商標）（東洋紡績社））を含むＰＣＲ反応混合物に添加し（全血の添加量は反応液量２５μＬのうち０．５μＬ）、PerkinElmer社GeneAmp PCR System 2400にてＰＣＲを行った。下記プライマーの合成はGenosys社に依頼した。反応終了後、アガロースゲル電気泳動を行い、増幅断片を検出した。
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【００６７】
（２）結果
投与後の血中濃度が０．０３、０．３、３μＭとなるように設計された薬液の持続投与により、ＡＧＥ−２アプタマー（配列番号１）の血中移行が確認された（図６）。【００６８】
実施例５  ＡＧＥ−２アプタマーの糖尿病モデルマウスを用いた薬効評価（１）
（１）方法
２型糖尿病モデルマウスKK-Ay/Taマウス（日本クレア、雄性、６週齢）およびC57BL/6jマウス（日本クレア、雄性、６週齢）の腹腔内に浸透圧ポンプ（ALZET社）を埋め込んだ。ＡＧＥ−２アプタマー（配列番号１）および下記配列を有するコントロールアプタマー（配列番号４８）を、投与後の血中濃度が３．３３４μＭとなるように薬液を浸透圧ポンプに充填し（０．１ｍｇ／２０ｇ体重）、腹腔内に持続投与した。
コントロールアプタマー
2012070621.tif 000009
コントロールアプタマーは、Operon社に合成を依頼し、入手した。アプタマーの投与は、KK-Ay/Taマウスにおいて糖尿病合併症の発症が認められる８週齢から、腎障害（結節性病変）、尿中アルブミンが認められる１６週齢まで実施した。【００６９】
経時的に体重、血圧を測定した。また、経時的に尿を採取し、尿量、尿中のアルブミン量およびクレアチニン量を測定した。１６週齢において、血糖値、血中のＨｂＡ１ｃ、総コレステロール、中性脂肪、遊離脂肪酸、尿素窒素、およびクレアチニンの量、並びに腎重量を測定した。ＨｂＡ１ｃは、グリコヘモグロビンのうち、ヘモグロビンのβ鎖のＮ末端にグルコースが結合した糖化蛋白質であり、ＡＧＥの１種である。また、腎臓組織からパラフィン切片を作成し、ＰＡＳ（periodic acid Schiff）染色およびMasson-Trichrome染色を行った。糸球体の線維化を定量化するために、Masson-Trichrome染色した組織切片の画像をコンピューターに取込み、染色された面積を測定した。【００７０】
（２）結果
ＡＧＥ−２アプタマー（配列番号１）投与により、KK-Ay/Taマウスにおいて尿中のアルブミン排泄量の増加が顕著に抑制された（図７（Ａ））。尿中のアルブミン／クレアチニン比率は、ＡＧＥ−２アプタマー投与（配列番号１）により１２週齢に比べ１６週齢では改善傾向が認められた（図７（Ｂ））。また、ＡＧＥ−２アプタマー（配列番号１）投与KK-Ay/Taマウスの腎臓組織においては、メサンギウム基質の増加、糸球体基底膜の肥厚（硬化）、および糸球体の線維化は認められず、コントロールマウスと変わらぬ正常な組織構造が認められた（図８、９、および１０）。さらに、ＡＧＥ−２アプタマー（配列番号１）投与により、コントロールアプタマー（配列番号４８）投与に比較し、KK-Ay/Taマウスにおいて、腎肥大の抑制、尿素窒素およびクレアチニンの血中濃度の増加抑制、総コレステロール、中性脂肪、および遊離脂肪酸の血中濃度の増加抑制、および血圧の低下（表６）が認められた。一方、血糖値およびＨｂＡ１ｃについては、ＡＧＥ−２アプタマー（配列番号１）投与による増加抑制は認められなかった（表７）。【００７１】
尿素窒素およびクレアチニンの測定結果から、ＡＧＥ−２アプタマー（配列番号１）を投与したKK-Ay/Taマウスの腎機能は正常であり、ＡＧＥ−２アプタマー（配列番号１）投与により腎機能の悪化が抑制されたことが明らかとなった。また、総コレステロール、中性脂肪、および遊離脂肪酸の測定結果から、ＡＧＥ−２アプタマー（配列番号１）投与により糖尿病モデルマウスにおける脂質異常が抑制されたことが明らかとなった。
【表６】
2012070621.tif 000010
【表７】
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【００７２】
実施例６  ＡＧＥ−２アプタマーの糖尿病モデルマウスを用いた薬効評価（２）
実施例５と同様にして、ＡＧＥ−２アプタマー（配列番号１）の薬効評価を行った。結果を表８に示す。また、糸球体におけるＡＧＥ−２沈着を検討するため、腎臓切片をポリクローナル抗ＡＧＥ−２抗体（Molecular Medicine 6(2): 114-125, 2000に記載の方法により作製）（１：１０００）で染色した。その結果、ＡＧＥ−２アプタマー（配列番号１）を投与したKK-Ay/Taマウスでは、糸球体におけるＡＥＧ−２沈着が観察されなかった（図１１）。さらに、尿中の８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）の量を測定したところ、ＡＧＥ−２アプタマー（配列番号１）の投与により８−ＯＨｄＧ産生の抑制が認められ、酸化ストレスの亢進が抑制されたことが示された（図１２）。
【表８】
2012070621.tif 000012
* vs Ctrl+C-apt p<0.05
# vs DM+C-apt p<0.05
Ctrl+C-apt: コントロールアプタマーを投与したC57BL/6jマウス；Ctrl+A-apt：ＡＧＥ−２アプタマーを投与したC57BL/6jマウス；DM+C-apt：コントロールアプタマーを投与したKK-Ay/Taマウス；DM+A-apt：ＡＧＥ−２アプタマーを投与したKK-Ay/Taマウス。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明で提供されるＡＧＥ結合アプタマーを含む組成物は、糖尿病性腎症治療等に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2012070621.tif 000022
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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