(57)【要約】より効果的なRas機能阻害物質をスクリーニングする方法を提供する。さらに、Rasポリペプチドについて、Ras機能阻害物質との相互作用に重要な部位のアミノ酸残基を提供する。RasポリペプチドのNMRによる立体構造情報と、Rasポリペプチドとシード化合物との複合体のNMRによる立体構造情報との差異を確認することで、当該シード化合物よりもさらに効果的なリード化合物を選別しうる。RasポリペプチドのNMRによる立体構造情報に基づき解析した結果、本発明のRas機能阻害候補物質（ａ）と相互作用しうるアミノ酸残基は、配列番号１に示すアミノ酸配列を基準とした場合に、K5, E37, D38, S39, L56, E63, Y64, A66, M67, Q70, Y71, R73, T74である。
2012108297.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、Ras機能阻害物質（Ａ）のスクリーニング方法：
１）配列番号１に示すアミノ酸配列、又は配列番号１に示すアミノ酸配列から１〜３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるRas部分ポリペプチドのNMRシグナルを得る工程；
２）Ras機能阻害候補物質（ａ）を、上記１）に記載のRas部分ポリペプチドと接触させ、得られた複合体についてのNMRシグナルを得る工程；
３）上記１）の工程で得られたNMRシグナルと、２）の工程で得られたNMRシグナルとの違いを解析し、Ras機能阻害候補物質（ａ）の誘導体であるRas機能阻害物質（Ａ）を選別する工程。
【請求項２】
配列番号１に示すアミノ酸配列、又は配列番号１に示すアミノ酸配列から１〜３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるRas部分ポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列を基準とした場合に、第５番目のリジン(K)、第３７番目のグルタミン酸(E)、第３８番目のアスパラギン酸(D)、第３９番目のセリン(S)、第５６番目のロイシン(L)、第６３番目のグルタミン酸(E)、第６４番目のチロシン(Y)、第６６番目のアラニン(A)、第６７番目のメチオニン(M)、第７０番目のグルタミン(Q)、第７１番目のチロシン(Y)、第７３番目のアルギニン(R)、及び第７４番目のトレオニン(T)から選択される少なくとも３個以上のアミノ酸残基と相互作用しうる物質を選別することを特徴とする、Ras機能阻害候補物質（ａ）のスクリーニング方法。
【請求項３】
以下の工程を含む、請求項２に記載のRas機能阻害候補物質（ａ）のスクリーニング方法：
１）請求項２に記載の部分ポリペプチドのうち、第５番目のリジン(K)、第３７番目のグルタミン酸(E)、第３８番目のアスパラギン酸(D)、第３９番目のセリン(S)、第５６番目のロイシン(L)、第６３番目のグルタミン酸(E)、第６４番目のチロシン(Y)、第６６番目のアラニン(A)、第６７番目のメチオニン(M)、第７０番目のグルタミン(Q)、第７１番目のチロシン(Y)、第７３番目のアルギニン(R)、及び第７４番目のトレオニン(T)から選択される少なくとも３個以上のアミノ酸残基をNMR測定可能な同位体で標識したポリペプチドを作製し、当該標識ポリペプチドについてのNMRシグナルを得る工程；
２）候補物質を、１）の工程で作製した標識ポリペプチドと接触させて、候補物質と標識ポリペプチドとの複合体についてのNMRシグナルを得る工程；
３）上記１）の工程で得られたNMRシグナルと２）の工程で得られたNMRシグナルとの違いに基づいて、標識ポリペプチドと相互作用しうる物質を、Ras機能阻害候補物質（ａ）として選別する工程。
【請求項４】
Ras部分ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、３５番目のトレオニンがセリンに置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載のRas機能阻害物質（Ａ）又は請求項２〜３のいずれか１に記載のRas機能阻害候補物質（ａ）のスクリーニング方法。
【請求項５】
Ras機能阻害候補物質（ａ）が、以下の一般式(I)で表される、請求項１に記載のRas機能阻害物質（Ａ）のスクリーニング方法。
【化１】
2012108297.tif 000077
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は独立して水素原子、ハロゲン基、低級アルキル基、ニトロ基、又はトリフルオロメチル基からなる群から選択される。）
【請求項６】
以下の一般式(I)で表されるRas機能阻害候補物質（ａ）を有効成分とするRas機能阻害剤。
【化１】
2012108297.tif 000078
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は独立して水素原子、ハロゲン基、低級アルキル基、ニトロ基、又はトリフルオロメチル基からなる群から選択される。）
【請求項７】
配列番号１に示すアミノ酸配列、又は配列番号１に示すアミノ酸配列から１〜３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるRas部分ポリペプチドと、以下の一般式(I)で表されるRas機能阻害候補物質（ａ）との複合体。
【化１】
2012108297.tif 000079
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は独立して水素原子、ハロゲン基、低級アルキル基、ニトロ基、又はトリフルオロメチル基からなる群から選択される。）
【請求項８】
Ras部分ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、３５番目のトレオニンがセリンに置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
NMRシグナルにより特定される請求項７又は８に記載の複合体。
【請求項１０】
配列番号１に示すアミノ酸配列、又は配列番号１に示すアミノ酸配列から１〜３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるRas部分ポリペプチドを含む水溶液であって、
当該Ras部分ポリペプチドの立体構造が、以下の１）及び２）であること特徴とするRas部分ポリペプチド含有水溶液：
１）当該Ras部分ポリペプチドの立体構造が、特定の物質と結合しうるポケットを有する立体構造からなり；
２）当該特定の物質が、当該Ras部分ポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列を基準とした場合に、第５番目のリジン(K)、第３７番目のグルタミン酸(E)、第３８番目のアスパラギン酸(D)、第３９番目のセリン(S)、第５６番目のロイシン(L)、第６３番目のグルタミン酸(E)、第６４番目のチロシン(Y)、第６６番目のアラニン(A)、第６７番目のメチオニン(M)、第７０番目のグルタミン(Q)、第７１番目のチロシン(Y)、第７３番目のアルギニン(R)、及び第７４番目のトレオニン(T)から選択される少なくとも３個以上のアミノ酸残基と相互作用しうる物質である。
【請求項１１】
Ras部分ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、３５番目のトレオニンがセリンに置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１０に記載のRas部分ポリペプチド含有水溶液。
【請求項１２】
特定の物質が、一般式(I)に示されるＲａｓ機能阻害剤(a)であることを特徴とする、請求項１０又は１１に記載のRas部分ポリペプチド含有水溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核磁気共鳴法（NMR）情報を用いることを特徴とする、より効果的なRas機能阻害物質を選別するためのスクリーニング方法に関する。より詳しくは、Rasにおいて分子表面にポケットを有する立体構造をとるRasポリペプチドのNMRによる立体構造情報を利用してRas機能阻害物質をスクリーニングする方法に関する。【０００２】
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願２０１１−２３６９５号優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】
ras癌遺伝子産物であるRasは低分子量Ｇタンパク質であり、哺乳動物では、H-Ras、N-Ras、K-Rasという３つのRasのアイソフォームが存在する。またRasには、アミノ酸配列の類似したM-RasやRapなどのホモログが存在し、これらを含めてRasファミリーが形成されている。ヒトの癌においては、H-Ras、N-Ras、K-Rasのいずれかの突然変異によるRas機能の恒常的活性化が高頻度に認められるため、Rasは抗癌剤の開発における格好の分子標的であると考えられている。【０００４】
Rasは、活性型であるGTP結合型Ras（Ras-GTP）と、不活性型であるGDP結合型Ras（Ras-GDP）を行き来しながら、シグナル伝達を制御する。細胞膜にある受容体に細胞増殖因子のようなリガンド（細胞外シグナル）が結合したのに応じ、Ras-GDPにおけるGDPがGTPに変換されて活性化され、Ras-GTPが標的分子と結合して細胞増殖シグナルを伝達する。その後、Rasに内在するGTP加水分解（GTPase）活性を促進する因子（GTPase-activating protein: GAP）の働きによって、Ras-GTPはRas-GDPに戻り、次のシグナルがくるまで不活性化の状態となって存在する。ヒトの癌においては、Rasの突然変異（活性型変異）によりRasの内在性GTP加水分解能が低下することと、GAPによるGTP加水分解促進作用を受けなくなることにより、細胞内でのGTP結合型Rasの占有比率が増加することにより、持続的に細胞増殖のシグナルを発信し続けるため、癌になると推定されている。【０００５】
さらに、GTP結合型であるRas-GTPには、相互変換可能な２種類の立体構造（state 1、state 2）が存在することが、31P-核磁気共鳴法（NMR）によって従来より指摘されていた。state 2は、標的タンパク質と結合してシグナル伝達を行うことのできる真の活性型であり、state 1は、標的タンパク質と結合できない不活性型である。Ｘ線結晶構造解析及びNMR解析によって、state 2の立体構造が解明されている。【０００６】
H-Ras-GTPのstate 1の立体構造については解明が試みられているものの、いまだ完全な解明には至っていない。変異型H-RasであるH-Ras T35S（1-189アミノ酸残基）についてＸ線結晶構造解析が行われている（非特許文献１）。しかしながら、非特許文献１に開示されたstate 1の立体構造は、複数のアミノ酸残基の主鎖の電子密度が欠損しており完全な立体構造とはいえない。またかかる欠損部位は、Rasが標的タンパク質を認識・活性化する上で重要である２つのswitch領域（switch I, II）に含まれる部位である。【０００７】
Rasファミリーの一員であるM-Rasに着目し、野生型M-Ras-GTPのstate 1についてのＸ線結晶構造解析が行われている（PDB ID: 1X1S）（非特許文献２）。その結果、M-Ras-GTPのstate 1の分子表面に、Ras-GDPや、Ras-GTPのstate 2には全く認められないポケットが存在すること、かかるポケットは、switch I領域及びswitch II領域によって囲まれていることが判明した。しかしながら、非特許文献２に示されたM-Ras-GTP state 1の立体構造は、ポケット周辺の電子密度が一部欠失した不完全なものであった。【０００８】
変異型H-RasであるH-Ras T35S（1-166アミノ酸残基）について、非特許文献１とは異なる条件でＸ線結晶構造解析が行われた結果（非特許文献３）、2種類のstate 1の立体構造（form 1, 2）が決定された。Form 2はswitch IIの複数のアミノ酸残基の主鎖の電子密度が欠損しており完全な立体構造とはいえなかったが、form 1についてはペプチド全体の電子密度が明瞭な完全なstate 1構造であった。しかしながらform 1についても、薬剤の結合領域に係る具体的なアミノ酸残基情報については依然として不明であった。【０００９】
Ras機能阻害物質は抗癌剤の有力な候補であるため、Ras機能阻害物質を開発するためのコンピュータドッキングシミュレーションに用いられ得るような、Ras-GTPのstate 1構造上の薬剤結合領域に係るアミノ酸残基情報が熱望されている。また、Ras機能阻害作用を有するシード化合物を基にして、最も好適なリード化合物を構築するための立体構造情報についても、熱望されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Spoerner, M., et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr24;98(9):4944-9.
【非特許文献２】Ye M., et al., J Biol Chem. 2005 Sep 2;280(35):31267-75.
【非特許文献３】Shima F., et al., J Biol Chem. 2010 May 17;285(29):22696-705.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、Ras機能阻害物質をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。さらに、Rasポリペプチドについて、Ras機能阻害物質との相互作用に重要な部位のアミノ酸残基を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行い、RasポリペプチドのNMRによる立体構造情報と、Ras機能阻害物質として有効なシード化合物とRasポリペプチドとの複合体についてのNMRによる立体構造情報に基づき解析した結果、RasポリペプチドとRas機能阻害物質との相互作用に重要な部位を確認することができ、本発明を完成した。さらには、当該RasポリペプチドのNMRによる立体構造情報と、Rasポリペプチドとシード化合物との複合体のNMRによる立体構造情報との差異を確認することで、当該シード化合物よりもさらに効果的なリード化合物を選別しうることを見出し、Ras機能阻害物質をスクリーニングする方法に係る本発明を完成した。【００１３】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．以下の工程を含む、Ras機能阻害物質（Ａ）のスクリーニング方法：
１）配列番号１に示すアミノ酸配列、又は配列番号１に示すアミノ酸配列から１〜３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるRas部分ポリペプチドのNMRシグナルを得る工程；
２）Ras機能阻害候補物質（ａ）を、上記１）に記載のRas部分ポリペプチドと接触させ、得られた複合体についてのNMRシグナルを得る工程；
３）上記１）の工程で得られたNMRシグナルと、２）の工程で得られたNMRシグナルとの違いを解析し、Ras機能阻害候補物質（ａ）の誘導体であるRas機能阻害物質（Ａ）を選別する工程。
２．配列番号１に示すアミノ酸配列、又は配列番号１に示すアミノ酸配列から１〜３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるRas部分ポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列を基準とした場合に、第５番目のリジン(K)、第３７番目のグルタミン酸(E)、第３８番目のアスパラギン酸(D)、第３９番目のセリン(S)、第５６番目のロイシン(L)、第６３番目のグルタミン酸(E)、第６４番目のチロシン(Y)、第６６番目のアラニン(A)、第６７番目のメチオニン(M)、第７０番目のグルタミン(Q)、第７１番目のチロシン(Y)、第７３番目のアルギニン(R)、及び第７４番目のトレオニン(T)から選択される少なくとも３個以上のアミノ酸残基と相互作用しうる物質を選別することを特徴とする、Ras機能阻害候補物質（ａ）のスクリーニング方法。
３．以下の工程を含む、前項２に記載のRas機能阻害候補物質（ａ）のスクリーニング方法：
１）前項２に記載の部分ポリペプチドのうち、第５番目のリジン(K)、第３７番目のグルタミン酸(E)、第３８番目のアスパラギン酸(D)、第３９番目のセリン(S)、第５６番目のロイシン(L)、第６３番目のグルタミン酸(E)、第６４番目のチロシン(Y)、第６６番目のアラニン(A)、第６７番目のメチオニン(M)、第７０番目のグルタミン(Q)、第７１番目のチロシン(Y)、第７３番目のアルギニン(R)、及び第７４番目のトレオニン(T)から選択される少なくとも３個以上のアミノ酸残基をNMR測定可能な同位体で標識したポリペプチドを作製し、当該標識ポリペプチドについてのNMRシグナルを得る工程；
２）候補物質を、１）の工程で作製した標識ポリペプチドと接触させて、候補物質と標識ポリペプチドとの複合体についてのNMRシグナルを得る工程；
３）上記１）の工程で得られたNMRシグナルと２）の工程で得られたNMRシグナルとの違いに基づいて、標識ポリペプチドと相互作用しうる物質を、Ras機能阻害候補物質（ａ）として選別する工程。
４．Ras部分ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、３５番目のトレオニンがセリンに置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチドである、前項１に記載のRas機能阻害物質（Ａ）又は前項２〜３のいずれか１に記載のRas機能阻害候補物質（ａ）のスクリーニング方法。
５．Ras機能阻害候補物質（ａ）が、以下の一般式(I)で表される、前項１に記載のRas機能阻害物質（Ａ）のスクリーニング方法。
【化１】
2012108297.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は独立して水素原子、ハロゲン基、低級アルキル基、ニトロ基、又はトリフルオロメチル基からなる群から選択される。）
６．以下の一般式(I)で表されるRas機能阻害候補物質（ａ）を有効成分とするRas機能阻害剤。
【化１】
2012108297.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は独立して水素原子、ハロゲン基、低級アルキル基、ニトロ基、又はトリフルオロメチル基からなる群から選択される。）
７．配列番号１に示すアミノ酸配列、又は配列番号１に示すアミノ酸配列から１〜３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるRas部分ポリペプチドと、以下の一般式(I)で表されるRas機能阻害候補物質（ａ）との複合体。
【化１】
2012108297.tif 000005
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は独立して水素原子、ハロゲン基、低級アルキル基、ニトロ基、又はトリフルオロメチル基からなる群から選択される。）
８．Ras部分ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、３５番目のトレオニンがセリンに置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチドである、前項７に記載の複合体。
９．NMRシグナルにより特定される前項７又は８に記載の複合体。
１０．配列番号１に示すアミノ酸配列、又は配列番号１に示すアミノ酸配列から１〜３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるRas部分ポリペプチドを含む水溶液であって、
当該Ras部分ポリペプチドの立体構造が、以下の１）及び２）であること特徴とするRas部分ポリペプチド含有水溶液：
１）当該Ras部分ポリペプチドの立体構造が、特定の物質と結合しうるポケットを有する立体構造からなり；
２）当該特定の物質が、当該Ras部分ポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列を基準とした場合に、第５番目のリジン(K)、第３７番目のグルタミン酸(E)、第３８番目のアスパラギン酸(D)、第３９番目のセリン(S)、第５６番目のロイシン(L)、第６３番目のグルタミン酸(E)、第６４番目のチロシン(Y)、第６６番目のアラニン(A)、第６７番目のメチオニン(M)、第７０番目のグルタミン(Q)、第７１番目のチロシン(Y)、第７３番目のアルギニン(R)、及び第７４番目のトレオニン(T)から選択される少なくとも３個以上のアミノ酸残基と相互作用しうる物質である。
１１．Ras部分ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、３５番目のトレオニンがセリンに置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチドである、前項１０に記載のRas部分ポリペプチド含有水溶液。
１２．特定の物質が、一般式(I)に示されるＲａｓ機能阻害剤(a)であることを特徴とする、前項１０又は１１に記載のRas部分ポリペプチド含有水溶液。
【発明の効果】
【００１４】
本発明において、Rasポリペプチドについて、Ras機能阻害物質との相互作用に重要な部位のアミノ酸残基を提供することができた。さらに当該RasポリペプチドのNMRによる立体構造情報と、Rasポリペプチドとシード化合物との複合体のNMRによる立体構造情報との差異を確認することで、毒性発現の可能性が高い置換基や代謝的に不安定な化学構造を、生物学的等価体と置換する形で新規誘導体をデザイン・合成することができ、当該シード化合物よりもさらに効果的なリード化合物を選別しうる。このようなスクリーニング方法により、ある特定のシード化合物に基づいて、さらに効果的な置換基を有するリード化合物をRas機能阻害物質として、構築することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】NMRシグナルを基に構築して得られたRas部分ポリペプチドについての立体構造モデルを示す図である。タンパク質機能に関係した構造揺らぎをも含む概念図である。
【図２】NMRシグナルを基に構築して得られた立体構造モデルから推定されるポケットの部位を模式的に示す図である。タンパク質機能に関係した構造揺らぎをも含む概念図である。
【図３】NMRシグナルを基に構築して得られたRas機能阻害候補物質（ａ）とRas部分ポリペプチドの複合体についての立体構造モデルを示す図である。タンパク質機能に関係した構造揺らぎをも含む概念図である。
【図４】化合物(II)、化合物(III)、化合物(IV)についての生化学活性検証試験結果を示す図である。（実験例１）
【図５】化合物(II)、化合物(III)、化合物(IV)についての細胞生物学的活性検証試験を示す図である。（実験例２）
【図６】Ras部分ポリペプチドと化合物(III)との複合体のNMRの実測データを示す図である。（実施例２）
【図７】Ras部分ポリペプチドにおける化合物(III)と相互作用しうるアミノ酸残基を示す図である。（実施例４）
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、NMR情報を用いることを特徴とする、シード化合物から、さらにより効果的なRas機能阻害物質を選別するためのスクリーニング方法に関する。より詳しくは、Rasにおいて分子表面にポケットを有する立体構造をとるRasポリペプチドのNMRによる立体構造情報を利用してRas機能阻害物質をスクリーニングする方法に関する。
【００１７】
本発明において「候補物質」は、公知又は新規いずれであっても差し支えなく、その構造、由来、物性等にも特に制限はなく、天然化合物、合成化合物、高分子化合物、低分子化合物、ペプチド、核酸類似物のいずれでもよい。候補物質の立体構造の座標化は公知のプログラムを用いればよいが、例えば、低分子化合物の立体構造を座標化するプログラムとして、CORINA(http://www2.chemie.uni-erlangen.de/software/corina/index.html)、Concord(http://www.tripos.com/sciTech/inSilicoDisc/chemInfo/concord.html)、Converter、あるいはCOFIMA(http://www.bpc.uni-frankfurt.de/guentert/wiki/index.php/Software)等を利用することができる。ペプチド、核酸に対しては、CYANA(http://www.las.jp/products/s08_cyana/index.html)、あるいはCNS(http://cns.csb.yale.edu/v1.1/)を利用することができる。
【００１８】
本発明において、「Ras機能阻害候補物質（ａ）」とは、上述の候補物質から一次スクリーニングによって選別されたRas機能阻害作用を有する物質、即ちRas機能阻害作用を有するシード化合物をいう。また、「Ras機能阻害物質（Ａ）」という場合は、Ras機能阻害候補物質（ａ）の情報を基に選別される誘導体、即ち、Ras機能阻害候補物質（ａ）からより最適化されたリード化合物を意味する。
【００１９】
（Ras機能阻害物質（Ａ）のスクリーニング方法）
本発明のRas機能阻害物質（Ａ）のスクリーニング方法の一態様として、以下の工程を含むスクリーニング方法が挙げられる。
１）Ras部分ポリペプチドのNMRシグナルを得る工程；
２）Ras機能阻害候補物質（ａ）を、上記１）に記載のRas部分ポリペプチドと接触させ、得られた複合体についてのNMRシグナルを得る工程；
３）上記１）の工程で得られたNMRシグナルと、２）の工程で得られたNMRシグナルとの違いを解析し、Ras機能阻害候補物質（ａ）の誘導体を選別する工程。
【００２０】
本発明のRas部分ポリペプチドは、Rasタンパク質の部分ポリペプチドに、分子表面にポケットを有する立体構造を形成するような変異を導入した変異型Ras部分ポリペプチドが好適である。ここで、Ras部分ポリペプチドが分子表面にポケットを有する立体構造を形成するためには、GTP若しくはGTPアナログが結合したRas部分ポリペプチド、即ちGTP結合型Ras部分ポリペプチドであることが必要である。GTPアナログは、GTP様の骨格構造を持ち、化学修飾が施されたものや塩を形成させたものが含まれ、GTP結合部位に結合しうるものである。従って、本発明において、Ras部分ポリペプチドについて得られる、結晶、Ｘ線結晶構造解析結果及びNMRシグナルは、すべてGTP結合型Ras部分ポリペプチド（以下、「Ras-GTP」ともいう。）、あるいはRas機能阻害候補物質（ａ）とRas-GTPの複合体より得られるものであることを意味する。Rasにおける分子表面上のポケットは、GDP結合型Ras部分ポリペプチド（以下、「Ras-GDP」ともいう。）の分子表面には存在しないものであり、Ras-GTPに存在することが知られている。当該ポケットは、Rasのアミノ酸配列における、switch領域（switch I領域及びswitch II領域を含む）と呼ばれる領域によって囲まれている。switch領域は、GDP結合型Ras部分ポリペプチドとGTP結合型Ras部分ポリペプチドで大きく立体構造が変化する二つの領域と定義され、Rasが標的分子を認識・活性化する上で重要な領域であり、この近傍にGTPが結合する。
【００２１】
Ras-GTPを構成する本発明のRas部分ポリペプチドは、具体的には、以下の配列番号１（H-Rasの１〜１６６番目）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列から１〜３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異型H-Ras部分ポリペプチドをいう。
【００２２】
配列番号１：H-Ras (1-166アミノ酸残基):
MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHQYREQIKRVKDSDDVPMVLVGNKCDLAARTVESRQAQDLARSYGIPYIETSAKTRQGVEDAFYTLVREIRQH
【００２３】
配列番号１に示すアミノ酸配列から１〜３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるRas部分ポリペプチドとは、配列番号１に示すアミノ酸配列において、２７〜４３番目のアミノ酸からなる領域、好ましくは３０〜４１番目のアミノ酸からなる領域における、１〜３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたポリペプチをいう。好ましくは当該変異は、３１及び／又は３５番目のアミノ酸の置換であり、特に３５番目のトレオニンの置換であることが好ましい。当該３５番目のトレオニンはセリンに置換されていることが好ましい。以下、当該３５番目のトレオニンはセリンに置換されている変異型H-Rasポリペプチドを「H-Ras T35S」と称する。本発明のRas部分ポリペプチドは、H-Ras T35Sも包含する意味で用いられる。
【００２４】
ポリペプチドにおけるアミノ酸の変異は、当業者に周知の部位特異的突然変異誘発法により導入することができ、キットを使用して導入してもよい（例えばQuikChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社）など）。また、当業者に周知の遺伝子工学的手法を用いて、アミノ酸変異をコードするDNA断片を導入・置換することができる。例えば、PCR反応や制限酵素反応、ライゲーション反応等を組み合わせることで変異型Rasポリペプチドを作製することができる。具体的には、例えばベクターpBR322にサブクローニングしたH-Ras T35S（pBR322H-Ras T35S（1-189アミノ酸残基））を鋳型に使用して、通常のPCRで1-166アミノ酸残基に対応するDNAフラグメントを増幅し、pGEX-6p-1にクローニングして、H-Ras T35Sを作製することができる。
【００２５】
本発明のRas機能阻害物質（Ａ）のスクリーニング方法に用いられるRas機能阻害候補物質（ａ）は、以下の方法により候補物質から選別することができる。
本発明のRas部分ポリペプチドのうち、配列番号１に示すアミノ酸配列を基準とした場合に、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、第５番目のリジン(K)、第３７番目のグルタミン酸(E)、第３８番目のアスパラギン酸(D)、第３９番目のセリン(S)、第５６番目のロイシン(L)、第６３番目のグルタミン酸(E)、第６４番目のチロシン(Y)、第６６番目のアラニン(A)、第６７番目のメチオニン(M)、第７０番目のグルタミン(Q)、第７１番目のチロシン(Y)、第７３番目のアルギニン(R)、及び第７４番目のトレオニン(T)のいずれかから選択される少なくとも３個以上のアミノ酸残基と相互作用しうる物質を、候補物質から選別することによる。好ましくは、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、第５番目のリジン、第５６番目のロイシン、第６７番目のメチオニン、第７０番目のグルタミン、第７１番目のチロシン、及び第７４番目のトレオニンから選択される少なくとも３個以上のアミノ酸残基と相互作用しうる物質を、候補物質から選別することによる。
【００２６】
本発明は、上述の特定のアミノ酸残基と相互作用しうる物質を選別することによる、当該Ras機能阻害候補物質（ａ）のスクリーニング方法にも及ぶ。上記において、相互作用とは、Rasタンパク質と特定の物質、例えばRas機能阻害候補物質（ａ）との間に力が働きあうことをいう。相互作用としては、親水性の相互作用（例えば、水素結合、塩橋）、疎水性の相互作用（例えば、疎水結合）、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用など、好ましくは水素結合が挙げられる。
【００２７】
より具体的には、以下の工程を含む方法により、Ras機能阻害候補物質（ａ）をスクリーニングすることができる。
１）本発明のRas部分ポリペプチドのうち配列番号１に示すアミノ酸配列を基準とした場合に、第５番目のリジン(K)、第３７番目のグルタミン酸(E)、第３８番目のアスパラギン酸(D)、第３９番目のセリン(S)、第５６番目のロイシン(L)、第６３番目のグルタミン酸(E)、第６４番目のチロシン(Y)、第６６番目のアラニン(A)、第６７番目のメチオニン(M)、第７０番目のグルタミン(Q)、第７１番目のチロシン(Y)、第７３番目のアルギニン(R)、及び第７４番目のトレオニン(T)から選択される少なくとも３個以上、好ましくは、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、第５番目のリジン、第５６番目のロイシン、第６７番目のメチオニン、第７０番目のグルタミン、第７１番目のチロシン、及び第７４番目のトレオニンから選択される少なくとも３個以上のアミノ酸残基をNMR測定可能な同位体で標識したポリペプチドを作製し、当該標識ポリペプチドについてのNMRシグナルを得る工程；
２）候補物質を、１）の工程で作製した標識ポリペプチドと接触させて、候補物質と標識ポリペプチドとの複合体についてのNMRシグナルを得る工程；
３）上記１）の工程で得られたNMRシグナルと２）の工程で得られたNMRシグナルとの違いに基づいて、標識ポリペプチドと相互作用しうるRas機能阻害候補物質（ａ）を選別する工程。
上記において、NMR測定可能な同位体で標識するアミノ酸残基数は４個以上、より好ましくは６個以上である。
【００２８】
上記において、Ras機能阻害候補物質（ａ）は、配列番号１に示すアミノ酸配列を基準とした場合に、配列番号１に示すアミノ酸配列を基準とした場合に、第５番目のリジン(K)、第３７番目のグルタミン酸(E)、第３８番目のアスパラギン酸(D)、第３９番目のセリン(S)、第５６番目のロイシン(L)、第６３番目のグルタミン酸(E)、第６４番目のチロシン(Y)、第６６番目のアラニン(A)、第６７番目のメチオニン(M)、第７０番目のグルタミン(Q)、第７１番目のチロシン(Y)、第７３番目のアルギニン(R)、及び第７４番目のトレオニン(T)から選択される少なくとも３個以上、好ましくは４個以上、最も好ましくは６個のアミノ酸残基と相互作用しうる物質を選別することにより、スクリーニングされる。好ましくは、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、第５番目のリジン、第５６番目のロイシン、第６７番目のメチオニン、第７０番目のグルタミン、第７１番目のチロシン、及び第７４番目のトレオニンから選択される少なくとも３個以上、好ましくは４個以上、最も好ましくは６個のアミノ酸残基と相互作用しうる物質を選別することにより、スクリーニングされる。
【００２９】
Ras部分ポリペプチドの分子表面に存在するポケットを構成するアミノ酸の一部が、上述のアミノ酸残基であると考えられるからである。具体的には、Ras部分ポリペプチドの分子表面に存在するポケットを構成するアミノ酸残基としては、上記配列番号１に示すアミノ酸配列を基準とした場合に、少なくとも第５番目のリジン、第５６番目のロイシン、第６７番目のメチオニン、第７０番目のグルタミン、第７１番目のチロシン、及び第７４番目のトレオニンを含むと考えられる。さらに第３７番目のグルタミン酸、第３８番目のアスパラギン酸、第３９番目のセリン、第６３番目のグルタミン酸、第６４番目のチロシン、第６６番目のアラニン、第７３番目のアルギニンを含むと考えられる。Ras機能阻害候補物質（ａ）は、Ras部分ポリペプチドの分子表面に存在するポケット部位に存在するアミノ酸残基と相互作用することによって、Ras機能阻害作用を発揮する。
【００３０】
本発明において、本発明のRas機能阻害物質（Ａ）のスクリーニング方法に用いられるRas機能阻害候補物質（ａ）は、上記の方法によらず、自体公知の方法、又は今後開発されるあらゆる方法により選別することができる。
【００３１】
Ras機能阻害候補物質（ａ）の選別方法の例として、例えばRas部分ポリペプチドのＸ線結晶構造解析を用いる方法が挙げられる。具体的には、Ｘ線結晶構造解析により、Ras部分ポリペプチドのポケットを含む立体構造情報を得、当該立体構造情報に基づいて、Ras機能阻害候補物質（ａ）を設計し、又は選択することができる。Ras部分ポリペプチドのＸ線結晶構造解析を行うためには、上記説明したようにRas部分ポリペプチドとGTP若しくはGTPアナログとの共結晶、即ちRas-GTPの共結晶を得ることが必要である。Ras-GTPの共結晶から得られた立体構造情報を用いて、Ras部分ポリペプチドのポケットに結合するRas機能阻害候補物質（ａ）を設計又は選択することができる。得られたRas機能阻害候補物質（ａ）によるRasの機能阻害活性を調べるために、前記Ras機能阻害候補物質（ａ）とRas又はRas部分ポリペプチドとを接触させてもよい。
【００３２】
Ras-GTPの共結晶化のためのRas部分ポリペプチドは、Rasファミリーに含まれるものであればよく、H-Ras、N-Ras、K-Rasという３つのRasのアイソフォーム、及び、M-RasやRapなどのホモログであってもよい。Rasタンパク質は、哺乳動物由来であれば特に限定されず、例えばヒト、ウシ、ブタ由来のものなどが含まれる。好ましくはRasは、H-Ras、M-Rasが挙げられる。Rasのポケットを含む立体構造情報を取得するために最も好適なRas部分ポリペプチドとして、変異型Rasポリペプチド、即ちH-Ras T35Sが挙げられる。
【００３３】
GTPアナログとしては、グアノシン5'-(γ-チオ)-トリホスフェート（GTPγS）や（グアノシン 5'-[β, γ-イミド]トリホスフェート（Gpp(NH)p）が例示されるが、Gpp(NH)pであることが好ましい。Gpp(NH)pは、例えばCALBIOCHEM社のものを購入して用いることができる。
【００３４】
本発明の共結晶は、以下の方法により作製することができる。まずRas-GTP溶液を作製する。この場合において、Ras-GTPのうち、Ras部分ポリペプチドは、変異型H-Rasポリペプチド、即ちH-Ras T35Sであるのが好適である。Ras-GTPを、緩衝液、塩、還元剤などからなる溶液中に存在させる。緩衝液、塩、還元剤は、Rasポリペプチドの立体構造に影響を与えないものであればいかなるものであってもよいが、例えば、緩衝液は、1〜500 mMのNa-HEPES、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、Tris-HClなど、塩は、1 mM〜1 Mの塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化マグネシウムなど、還元剤は、0.1〜10 mMのβ-メルカプトエタノール、ジチオスレイトール(DTT)などが例示される。またRas部分ポリペプチド溶液には、ジメチルスルホキシド(DMSO)が含まれていてもよい。Ras部分ポリペプチドを含む溶液は、pH 4〜11、好ましくはpH 6〜9である。かかるポリペプチド溶液は、そのまま結晶化に用いてもよいし、必要に応じて更に、保存剤や安定化剤、界面活性剤等を添加して、結晶化に用いてもよい。
【００３５】
タンパク質（ポリペプチド）を結晶化する方法としては、蒸気拡散法、バッチ法、透析法などの一般的なタンパク質結晶化手法を用いることができる。また、タンパク質の結晶化においては、タンパク質の濃度、塩濃度、pH、沈殿剤の種類、温度等の物理的及び化学的因子の決定が重要である。
【００３６】
蒸気拡散法とは、沈殿剤を含むタンパク質溶液の液滴を、より高濃度の沈殿剤を含む緩衝液（外液）の入った容器中に置き、密封後静置する方法である。液滴の置き方によって、ハンギングドロップ法及びシッティングドロップ法があるが、本発明ではいずれの方法も採用することが可能である。ハンギングドロップ法は、タンパク質溶液の小さな液滴をカバーグラス上に配置し、カバーグラスをリザーバー内で反転させ、密封する方法である。一方、シッティングドロップ法は、リザーバー内部に適切な液滴台を設置し、タンパク質溶液の小滴を液滴台上に配置し、カバーグラス等でリザーバーを密封する方法である。いずれの方法においても、リザーバー中の溶液（リザーバー溶液）には沈殿剤を含有させる。適宜、沈殿剤をタンパク質小滴中に少量含有させてもよい。
【００３７】
蒸気拡散法で使用するリザーバー溶液は、緩衝液、沈殿剤、塩などからなる溶液である。緩衝液、沈殿剤、塩は、効率よく結晶を作製可能なものであればいかなるものであってもよいが、例えば緩衝液は、pH 4〜9、 1〜500 mMのNa-HEPES、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、Tris-HCl、酢酸ナトリウム、クエン酸など、沈殿剤は、分子量400〜10000、1〜50容量％のポリエチレングリコール（PEG）又は0.2〜3 Mの硫酸アンモニウムや、1〜20容量％のMPD（メチルペンタンジオール）、5〜10容量％のイソプロパノールなど、塩は0.05〜0.3 Mの塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化マグネシウムなどが例示される。リザーバー溶液の成分は上記に限られるわけではない。
【００３８】
結晶を用いたＸ線回折による結晶構造解析の手法により電子密度のデータが得られる。電子密度のデータから、電子密度図を作成することができる。電子密度を得て、特定の結晶について特定のＸ線回折装置を用いることにより、立体構造情報が得られる。
【００３９】
Ras部分ポリペプチドの分子表面にあるポケットに影響を与え得る化合物や、ポケットを埋めることの可能な構造を有する化合物を計算により選択することで、多数の候補物質からRasに特異的なRas機能阻害候補物質（ａ）を効率的に選択することが可能となる。
【００４０】
上記一次スクリーニング方法では、Ras部分ポリペプチドの立体構造情報を用いて、まずポケットを有する立体構造を表す原子座標と、任意の候補物質の立体構造を表す原子座標とをコンピュータ上で適合させる。次に、その適合状態を、例えば経験的スコアリング関数を指標とすることで数値化して、該候補物質のRas部分ポリペプチドのポケットに対する結合能を評価する。Ras部分ポリペプチドのポケットを有する原子座標としては、Ras部分ポリペプチドの原子座標の全体、ポケットを含むその派生物、及びこれらの一部を利用することができる。またスクリーニングに適するように、ポケット部分の原子座標をコンピュータ上で適宜改変したものを利用してもよい。
【００４１】
Ras部分ポリペプチドの立体構造情報のうち原子座標を、分子の原子座標を表現するコンピュータプログラムが動作するコンピュータ又はそのコンピュータの記憶媒体に入力することで、Ras-GTPの三次元的な化学的相互作用の様式を詳細に表現することが可能になる。分子の原子座標を表現するコンピュータプログラムは多数市販されているが、これらプログラムは、一般に、分子の原子座標の入力手段、該座標をコンピュータ画面に視覚的に表現する手段、表現された分子内における各原子間の距離や結合角などを測定する手段、該座標の追加修正を行う手段などを備える。さらに、分子の座標を元に分子の構造エネルギーを計算する手段、水分子などの溶媒分子を考慮して自由エネルギーを計算する手段を備えたプログラムを用いることも可能である。アクセルリス社から市販されているコンピュータプログラムであるInsightIIやQUANTAは、本発明のスクリーニング方法に用いるのに好適であるが、本発明に用いられるものはこれらのプログラムに限定されるものではない。
【００４２】
候補物質の原子座標及びRas部分ポリペプチドのポケットを有する原子座標を同一座標系上で重ね合わせて、両者の適合状態を評価する段階は、上述のような市販パッケージソフトウェアと、該ソフトウェアを作動可能なコンピュータシステムを用いることにより実施可能である。当該コンピュータシステムは、例えば、化合物の構造式を格納する記憶手段、化合物の立体構造を座標化する手段、化合物の原子座標を格納する記憶手段、Rasの原子座標を格納する記憶手段、評価結果を格納する記憶手段、各記憶手段の内容を表示させる手段、キーボード等の入力手段、ディスプレイ等の表示手段、中央処理装置等の、目的のソフトウェアを作動させるのに必要な各種手段を適宜含むものである。
【００４３】
解析用ソフトウェアとしては、コンピュータ上でタンパク質にリガンドをドッキングさせる操作が可能なソフトウェアであれば何を用いても良く、例えばDOCK、FlexX（トライポス社）、LigandFit（アクセルリス社）、Ludi（アクセルリス社）等を用いてもよい。その他、InsightII等の分子表示ソフトウェアを用いて対話的に行うことも可能である。その際、これらのプログラムを用いて適合状態を評価する際の指標としては、複合体全体の自由エネルギー計算値、経験的スコアリング関数、形の相補性の評価などを任意に選んで使用することができる。この指標により、結合の良否を客観的に評価することが可能となる
【００４４】
Ras部分ポリペプチドを含むRas-GTPについての原子座標を用いたRas機能阻害候補物質（ａ）の設計又は選択は、コンピュータ上での迅速なスクリーニングを可能とする。
【００４５】
（Ras機能阻害候補物質（ａ））
本発明のRas機能阻害候補物質（ａ）として、以下の一般式(I)に示す化合物が挙げられる。
【００４６】
【化１】
2012108297.tif 000006
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は独立して水素原子、ハロゲン基、低級アルキル基（炭素数１〜６）、ニトロ基、又はトリフルオロメチル基からなる群から選択される。）
【００４７】
上記、一般式(I)に示される化合物としては、具体的には、以下の式(II)〜(IV)に示す化合物（化合物(II)〜(IV)）が挙げられる。
【００４８】
【化２】
2012108297.tif 000007
【化３】
2012108297.tif 000008
【化４】
2012108297.tif 000009
【００４９】
（NMR解析）
本発明のRas機能阻害物質のスクリーニング方法を行うに際し、Ras部分ポリペプチドについてのNMRシグナル、並びに、Ras機能阻害候補物質（ａ）とRas部分ポリペプチドと接触させ、得られた複合体についてのNMRシグナルとの違いは、以下のようにして解析することができる。
【００５０】
水溶液中のRas部分ポリペプチドについてNMR測定を行い、Ras部分ポリペプチドより得られたNMRシグナル（１）と、Ras機能阻害候補物質（ａ）とRas部分ポリペプチドと接触させて得られた複合体について同様にNMR測定を行い、当該複合体より得られたNMRシグナル（２）、の各NMRシグナルを比較することにより行うことができる。Ras機能阻害候補物質（ａ）とRas部分ポリペプチドとの複合体についてのシグナル（２）が、Ras部分ポリペプチド単独でのシグナル（１）と異なる場合には、該Ras機能阻害候補物質（ａ）がRas部分ポリペプチドと何らかの相互作用をすると判断することができる。前記水溶液は、有機溶剤を含んでいてもよい。
【００５１】
上記において、相互作用とは、Rasタンパク質と特定の物質、例えばRas機能阻害候補物質（ａ）との間に力が働きあうことをいう。相互作用としては、親水性の相互作用（例えば、水素結合、塩橋）、疎水性の相互作用（例えば、疎水結合）、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用などを例示することができる。NMRシグナルから、相互作用を有する部位を確認する方法としては、それ自体既知の通常用いられる方法が用いられる。例えば、空間を通じての核オーバーハウザー効果(nuclear overhauser effect: NOE)に基づく情報や、NMRシグナルを基に構築して得られた立体構造モデルから、例えばCCP4 program suit（Collaborative Computational Project Number 4. (1994) Acta Crystallogr. D 50, 760-763）にあるCONTACTというプログラムを使用して、相互作用するアミノ残基を同定することができ、あるいは目視で得られる情報により、判断することができる。Ras部分ポリペプチドについての立体構造モデルは、図１を参照することができ、Ras機能阻害候補物質（ａ）とRas部分ポリペプチドの複合体についての立体構造モデルは、図２又は３を参照することができる。なお、タンパク質の性質上、タンパク質機能に関係した構造揺らぎが認められるが、Ras部分ポリペプチド並びにRas部分ポリペプチドとRas機能阻害候補物質（ａ）の複合体についても構造揺らぎが認められる。図１〜３各図は、揺らぎによる構造変化も示されている。
【００５２】
Ras部分ポリペプチドとRas機能阻害候補物質（ａ）の複合体の立体構造情報に基づき、複合体モデル上で目視あるいはドッキングシミュレーションソフトを利用して、より安定な複合体を形成させるための当該Ras機能阻害候補物質（ａ）に対する化合物の構造修飾を行うことができる。さらに、Ras機能阻害候補物質（ａ）に対して修飾された構造修飾化合物の構造において、毒性発現の可能性が高い置換基や代謝的に不安定な化学構造を、生物学的等価体と置換する形でより高活性でなおかつ低毒性の新規誘導体をデザイン・合成することができ、リード化合物となり得るRas機能阻害物質（Ａ）を導き出すことができる。かかるシミュレーションを利用して選別されたるRas機能阻害物質（Ａ）は、さらにin vitro又はin vivoによるウェットのアッセイによる活性・毒性検証を行うこともできる。
【００５３】
ここで、上記２つのシグナルのうち、変化したシグナルがどのアミノ酸残基であるかを特定することにより、Ras部分ポリペプチドに対して、Ras機能阻害候補物質（ａ）が相互作用しているアミノ酸残基を特定することもできる。
【００５４】
具体的には、本発明において、上述の一般式(I)に示すRas機能阻害候補物質（ａ）、より具体的には式(II)〜(IV)に示す化合物(II)〜(IV)であるRas機能阻害候補物質（ａ）とRas部分ポリペプチドとの相互作用を有する部位は、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、第５番目のリジン(K)、第３７番目のグルタミン酸(E)、第３８番目のアスパラギン酸(D)、第３９番目のセリン(S)、第５６番目のロイシン(L)、第６３番目のグルタミン酸(E)、第６４番目のチロシン(Y)、第６６番目のアラニン(A)、第６７番目のメチオニン(M)、第７０番目のグルタミン(Q)、第７１番目のチロシン(Y)、第７３番目のアルギニン(R)、及び第７４番目のトレオニン(T)のいずれか１以上であり、少なくとも第５番目のリジン、第５６番目のロイシン、第６７番目のメチオニン、第７０番目のグルタミン、第７１番目のチロシン、及び第７４番目のトレオニンが挙げられる。また、タンパク質の性質上、タンパク質機能に関係した構造揺らぎが認められるが、Ras部分ポリペプチドについても、構造揺らぎが認められる。揺らぎに応じて、Ras部分ポリペプチドとRas機能阻害候補物質（ａ）との相互作用により結合しているアミノ酸残基についても違いが認められる。揺らぎに応じて得た１５種類の構造について解析した結果、第５番目のリジン(K)、第３７番目のグルタミン酸(E)、第３８番目のアスパラギン酸(D)、第３９番目のセリン(S)、第５６番目のロイシン(L)、第６３番目のグルタミン酸(E)、第６４番目のチロシン(Y)、第６６番目のアラニン(A)、第６７番目のメチオニン(M)、第７０番目のグルタミン(Q)、第７１番目のチロシン(Y)、第７３番目のアルギニン(R)、及び第７４番目のトレオニン(T)のいずれか１以上であり、少なくとも第５番目のリジン、第５６番目のロイシン、第６７番目のメチオニン、第７０番目のグルタミン、第７１番目のチロシン、及び第７４番目のトレオニンがRas部分ポリペプチドとRas機能阻害候補物質（ａ）との相互作用に関連するアミノ酸残基であることが認められた。
【００５５】
また、本発明のNMRの測定はRas部分ポリペプチドとRas機能阻害候補物質（ａ）の複合体を、3〜10℃、好ましくは5±1℃でDMSO（10-30％）を含む水溶液中で測定することができる。NMR測定法としては、同種核多次元NMR測定若しくは異種核多次元NMR測定等が好ましく用いられる。例えば、1H-15NHSQCと呼ばれるNMR測定法により行うことができる。かかる測定は当業者に既知の技術である。簡単にいうと、1H-15NHSQCは、タンパク質中のペプチド結合における水素原子と窒素原子との相関スペクトル、すなわち1H-15N相関スペクトルであり、主鎖由来の1H-15Nシグナルから個々の残基の情報を得ることができる。かかるNMR測定方法により、タンパク質等の標的高分子物質の立体構造解析が可能となり、タンパク質の相互作用解析が可能となる。
【００５６】
「Ras部分ポリペプチド」又は「Ras部分ポリペプチドとRas機能阻害候補物質（ａ）の複合体」のNMR測定のための試料としての、Ras部分ポリペプチドを遺伝子組み換えの手法により作製する場合には、発現させたポリペプチドの精製を容易にするために精製用のタグを付加した融合ポリペプチドを作製することができる。特定のリガンドに親和性を持ったタンパク質やペプチド配列（アフィニティー精製用タグ）との融合ポリペプチドとして生産することにより、該融合ポリペプチドを該リガンドを担体に用いたアフィニティークロマトグラフィー等により効率的に精製することができる。例えば精製用タグとして、6Xヒスチジンタグ、FLAGタグ、GST（グルタチオンS-トランスフェラーゼ）タグ、マルトース結合タンパク質やプロテインAなどがある。また、目的とするポリペプチドと精製用タグとの間に特異的プロテアーゼにより認識され、切断を受けるアミノ酸配列を予め挿入しておくことにより、該融合ポリペプチドを開裂させて目的ポリペプチド質のみを回収することが可能である。例えば、PreScissionプロテアーゼ、ファクターXa、トロンビン、エンテロキナーゼやコラゲナーゼ等を特異的プロテアーゼとして用いたものがある。これらのプロテアーゼで切断した後、数個のアミノ酸が目的ポリペプチドの末端に残存することがあるが、活性に影響を及ぼさない限りは目的ポリペプチドとして本発明のNMRシグナルを得るための試料とすることができる。
【００５７】
本発明のスクリーニング方法により得られたRas機能阻害物質（Ａ）は、Rasの機能異常により発生しうる種々の疾患を治療、予防する作用、例えば抗癌作用を有すると考えられる。従って、本発明のRas機能阻害物質（Ａ）を有効成分とする医薬、例えば抗癌剤等の腫瘍の治療薬として使用することができる。本発明のRas機能阻害物質（Ａ）の抗腫瘍効果は、当該Ras機能阻害物質（Ａ）の存在下で、癌細胞を培養し癌化形質が抑制されるかを調べ、あるいは、担癌モデル動物を用いて行うことができる。
【実施例】
【００５８】
以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。【００５９】
（実施例１）Ras機能阻害候補物質（ａ）について
本発明のRas機能阻害候補物質（ａ）として、以下の式(II)〜(IV)に示す化合物（各々、化合物(II)、化合物(III)、化合物(IV)）をＸ線構造解析の立体構造情報から、インシリコ(in silico)スクリーニングにより得た。具体的には、化合物(II)はドッキングシミュレーション（MMPB-SA法）によりスクリーニングして得られ、化合物(III)及び化合物(IV)は、化合物(II)の類縁体探索（Tanimoto係数を指標に）でインシリコスクリーニングし、得られた。これらの化合物は、下記実験例１及び２に示す生化学・細胞学的活性検証試験を通じて同定した。【００６０】
【化２】
2012108297.tif 000010
【化３】
2012108297.tif 000011
【化４】
2012108297.tif 000012
【００６１】
（実験例１）生化学活性検証試験
本実験例では、生化学活性検証試験により、実施例１で得た化合物(II)、化合物(III)及び化合物(IV)について、Ras-Raf結合阻害活性を確認した。本実験例において、RasとしてヒトH-Rasポリペプチド（1-166アミノ酸残基）を用い、GTPとしてGTPアナログ（GTPγ S(Roche Diagnotics)）を用いた。また、Rasの標的蛋白質であるRafとして、ヒトc-Raf-1（51-130アミノ酸残基）を用いた。【００６２】
１）GST-Raf融合蛋白質
Rasの標的蛋白質であるRafとGST（グルタチオンS-トランスフェラーゼ）との融合蛋白質を、GST融合蛋白質発現用ベクター（pGEX-6P-1 vector (GE Healthcare)）を用いて大腸菌で発現させた。発現したGST-Raf融合蛋白質を精製用アフィニティー担体（glutathione Sepharose 4B：レジン (GE Healthcare)）に固定した。
２）Ras放射性ラベル体
GST融合蛋白質切断用プロテアーゼ（PreScission protease (GE Healthcare)）を用いてGSTタグを切断したRasに、GTPアナログの一つであるGTPγ[35S]（Perkin Elmer）を付加し、Ras放射性ラベル体を作製した。
３）Ras-Raf結合阻害活性の測定
上記１）でレジンに固定したGST-Raf融合蛋白質と２）のRas放射性ラベル体を、10% DMSOに可溶化した種々の濃度の化合物（化合物(II)、化合物(III)又は化合物(IV)）存在下でインキュベートし、RasとRafとの結合反応を促した。反応液中のレジンを洗浄後、グルタチオンの添加によりGST-Raf融合蛋白質とRas放射性ラベル体との複合体を溶出した。溶出液の放射活性をシンチレーションカウンティングすることにより、RasとRafとの結合活性を測定し、各種化合物によるRas-Raf結合阻害活性を評価した。その結果、これらの化合物はRasに相互作用することが確認された（図４）。【００６３】
（実験例２）細胞学的活性検証試験
本実験例では、細胞学的活性検証試験により、実施例１で得た化合物(II)、化合物(III)及び化合物(IV)について、足場非依存性細胞増殖阻害活性を確認した。【００６４】
0.6% SeaPlaque(R) agarose (Lonza, Rockland, Inc., ME, USA)を含む細胞培地の上に、H-Ras, N-Ras, K-Rasのいずれかの活性型変異を有する各種培養細胞株を各々懸濁した培地と、化合物（化合物(II)、化合物(III)又は化合物(IV)）を混合した培地を、培養容器に播種し、３７℃で２週間培養し、出現した直径50 μm以上のサイズのコロニー数を測定した。化合物を含まない系で培養細胞株を懸濁した培地について、同様にコロニー数を測定し、コントロール（100%）とした。コントロールに対する化合物投与群でのコロニー形成の阻害率を算出することにより、化合物のコロニー形成阻害活性（足場非依存性細胞増殖阻害活性）を評価した。その結果、これらの化合物は、各細胞についてコロニー形成阻害効果が認められ、上記３種類のRasに相互作用することが確認された（図５）。【００６５】
（実施例２）Rasと化合物(III)との複合体のNMRの実測データ
本実施例では、Rasと化合物(III)との複合体についてNMRの実測データを示す。本実施例では、Rasとして変異型H-RasであるH-Ras T35S（1-166アミノ酸残基）を用い、GTPとしてGTPアナログ（Gpp(NH)p：CALBIOCHEM社）を用いた。以下の実施例でも同様である。【００６６】
１）Ras-GTPと化合物(III)との複合体の作製
NMRによりRasのポケットを含む立体構造情報を取得するために、まず初めにRasを含むRas-GTPを作製することが必要である。Ras 3.6mgとGTP 1.1mgをpH中性の緩衝液1 mLに溶解し、Ras-GTPを作製した。次に、Ras-GTP 3.6mgを重水素化された緩衝溶液（pH6.8）0.16mLに溶解し、Ras-GTP溶液を調製した。化合物(III) 0.3 mgを重水素化されたDMSO（ジメチルスルホキシド）0.04 mLに溶解し、化合物(III)溶液を調製した。前記Ras-GTP溶液と化合物(III)溶液を混合し、20％DMSO、5℃条件でRas-GTPと化合物(III)の複合体を作製した。【００６７】
２）13C-separeted NOESY-HSQCスペクトルによるNMR解析
Ras-GTPと化合物(III)の複合体について、13C-separeted NOESY-HSQCスペクトルによるNMR解析を行った。13C-separated NOESY-HSQCスペクトルでは、化合物(III)及びRas-GTPに由来する特定の水素同士が空間的に接近していると、両者の化学シフトが交差する位置にピークを生じる。スペクトルは炭素の化学シフトによって分離されている為、交差ピークを与える水素がどのアミノ酸あるいは原子団に由来しているかを帰属する事が可能である。従って、本方法によると、Ras-GTPと化合物(III)との間の相互作用を直接的にかつ原子レベルで示す事ができる。図６では化合物(III)に由来する水素と、Ras-GTP中のRas部分のポリペプチドにおける第５番目のリジン、第５６番目のロイシン、第６７番目のメチオニン、及び第７４番目のトレオニンの側鎖に由来する水素との間に出現した交差ピークを示した。なお、図６中KOB316は化合物(III)を意味する。【００６８】
（実施例３）Rasと化合物(III)に近接するアミノ酸の距離情報
実施例２と同手法により作製したRas-GTPと化合物(III)との複合体に関し、Rasと化合物(III)に近接するアミノ酸の距離情報（NOE情報）を確認した。Ras-GTPと化合物(III)との複合体について、実施例２と同様に13C-separated NOESY-HSQCスペクトルによるNMR解析を行った。13C-separated NOESY-HSQCにおける交差ピークの積分強度は水素間の距離に依存するため、化合物(III)とRas-GTPの間の距離情報に変換する事が可能である。各々の交差ピークを基にして得られた、化合物(III)に近接するRasのアミノ酸の距離情報を表１に示した。具体的には、Ras-GTP中のRasにおける第５番目のリジン、第５６番目のロイシン、第６７番目のメチオニン、第７０番目のグルタミン、第７１番目のチロシン、及び第７４番目のトレオニンから選択されるアミノ酸残基の側鎖に由来する水素原子と化合物(III)の特定の水素原子との距離情報を示した。１種のアミノ酸に対して、複数の距離情報が認められるのは、各アミノ酸の中に幾つかの水素核種が存在し、その各々に対して相当する距離情報が存在する事を意味する。【００６９】
【表１】
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【００７０】
（実施例４）Rasと化合物(III)に近接するアミノ酸の距離情報
実施例２と同手法により作製したRas-GTPと、化合物(III)(kobe2601)との複合体に関し、１５種類の複合体のNMR構造に基づき、CCP4 program suit（Collaborative Computational Project Number 4. (1994) Acta Crystallogr. D 50, 760-763）にあるCONTACTというプログラムで計算を行った。その結果、化合物(III)との相互作用が確認できた残基群（１）及びポケットの隙間を埋める形で選んだ残基群（２）を以下に示す。配列番号１に示すアミノ酸配列を基準とした場合、（１）第５番目のリジン(K)、第３７番目のグルタミン酸(E)、第３８番目のアスパラギン酸(D)、第３９番目のセリン(S)、第５６番目のロイシン(L)、第６３番目のグルタミン酸(E)、第６４番目のチロシン(Y)、第６６番目のアラニン(A)、第６７番目のメチオニン(M)、第７０番目のグルタミン(Q)、第７１番目のチロシン(Y)、第７３番目のアルギニン(R)、及び第７４番目のトレオニン(T)であり、（２）は、第６番目のロイシン(L)、第７番目のバリン(V)、第３６番目のイソロイシン(I)、第４１番目のアルギニン(R)、第５４番目のアスパラギン酸(D)、第５５番目のイソロイシン(I)、第５７番目のアスパラギン酸(D)、第５８番目のトレオニン(T)、第５９番目のアラニン(A)、第６５番目のセリン(S)、第７５番目のグリシン(G)である。以下、１５種類の複合体モデルについて、算出されたCONTACT情報を、表２〜表１６に示す。【００７１】
【表２−１】
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【００７２】
【表２−２】
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【００７３】
【表２−３】
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【００７４】
【表２−４】
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【００７５】
【表３−１】
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【００７６】
【表３−２】
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【００７７】
【表３−３】
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【００７８】
【表３−４】
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【００７９】
【表３−５】
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【００８０】
【表４−１】
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【００８１】
【表４−２】
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【００８２】
【表４−３】
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【００８３】
【表４−４】
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【００８４】
【表５−１】
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【００８５】
【表５−２】
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【００８６】
【表５−３】
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【００８７】
【表５−４】
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【００８８】
【表５−５】
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【００８９】
【表６−１】
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【００９０】
【表６−２】
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【００９１】
【表６−３】
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【００９２】
【表６−４】
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【００９３】
【表７−１】
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【００９４】
【表７−２】
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【００９５】
【表７−３】
2012108297.tif 000038
【００９６】
【表７−４】
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【００９７】
【表８−１】
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【００９８】
【表８−２】
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【００９９】
【表８−３】
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【０１００】
【表８−４】
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【０１０１】
【表９−１】
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【０１０２】
【表９−２】
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【０１０３】
【表９−３】
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【０１０４】
【表９−４】
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【０１０５】
【表１０−１】
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【０１０６】
【表１０−２】
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【０１０７】
【表１０−３】
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【０１０８】
【表１１−１】
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【０１０９】
【表１１−２】
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【０１１０】
【表１１−３】
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【０１１１】
【表１１−４】
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【０１１２】
【表１１−５】
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【０１１３】
【表１２−１】
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【０１１４】
【表１２−２】
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【０１１５】
【表１２−３】
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【０１１６】
【表１２−４】
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【０１１７】
【表１３−１】
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【０１１８】
【表１３−２】
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【０１１９】
【表１３−３】
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【０１２０】
【表１３−４】
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【０１２１】
【表１４−１】
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【０１２２】
【表１４−２】
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【０１２３】
【表１４−３】
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【０１２４】
【表１４−４】
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【０１２５】
【表１４−５】
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【０１２６】
【表１５−１】
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【０１２７】
【表１５−２】
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【０１２８】
【表１５−３】
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【０１２９】
【表１５−４】
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【０１３０】
【表１６−１】
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【０１３１】
【表１６−２】
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【０１３２】
【表１６−３】
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【０１３３】
【表１６−４】
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【産業上の利用可能性】
【０１３４】
以上説明したように、RasポリペプチドとRas機能阻害物質との相互作用に重要な部位のアミノ酸残基を確認することができた。当該重要なアミノ酸残基と相互作用しうる物質をスクリーニングすることで、効果的にスクリーニングを行うことができる。さらには、当該RasポリペプチドのNMRによる立体構造情報と、Rasポリペプチドとシード化合物との複合体のNMRによる立体構造情報との差異を確認することで、Ras機能阻害候補物質（ａ）の誘導体であるRas機能阻害物質（Ａ）の構造を効率的に推定することができる。つまり、Ras機能阻害候補物質（ａ）に対して修飾された構造修飾化合物の構造において、毒性発現の可能性が高い置換基や代謝的に不安定な化学構造を、生物学的等価体と置換する形で新規誘導体をデザイン・合成することができ、リード化合物となり得るRas機能阻害物質（Ａ）を導き出すことができる。【０１３５】
得られたRas機能阻害物質（Ａ）は、Rasの機能異常により発生しうる種々の疾患の治療・予防作用、例えば抗癌作用を有すると考えられる。従って、本発明のRas機能阻害物質（Ａ）を有効成分とする医薬、例えば抗癌剤等の腫瘍の治療薬として使用することができる。
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2012108297.tif 000088
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