(57)【要約】  チロシン フェノール-リアーゼ（tyrosine phenol-lyase）活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に導入された、フェノール生産能を有する形質転換体は、糖類を原料として効率よくフェノールを製造できる。具体的には、この形質転換体を、還元条件下、糖類を含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のフェノールを回収する工程とを含む方法が好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシン フェノール-リアーゼ（tyrosine phenol-lyase）活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、フェノール生産能を有する形質転換体。
【請求項２】
チロシン フェノール-リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、パントエア アグロメランス（Pantoea agglomerans）由来の遺伝子、シトロバクター ブラッキー（Citrobacter braakii）由来の遺伝子、デスルフィトバクテリューム ハフニエンス（Desulfitobacterium hafniense） 由来の遺伝子、クロロフレクサス オウランティアカス（Chloroflexus aurantiacus） 由来の遺伝子、ノストック パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)由来の遺伝子、又はトレポネマ デンティコラ（Treponema denticola）由来の遺伝子である請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
チロシン フェノール-リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が下記の(a)又は(b)のDNAである請求項１に記載の形質転換体。
(a)  配列番号36の塩基配列からなるDNA、配列番号39の塩基配列からなるDNA、配列番号42の塩基配列からなるDNA、配列番号45の塩基配列からなるDNA、配列番号48の塩基配列からなるDNA、又は配列番号51の塩基配列からなるDNA
(b)  (a)の何れかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつチロシン フェノール-リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
【請求項４】
宿主のコリネ型細菌が、その染色体上に存在する下記(c)及び／又は(d)の遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、請求項１〜３の何れかに記載の形質転換体。
(c)  プレフェン酸デヒドラターゼ(prephenate dehydratase)活性を有する酵素をコードする遺伝子
(d)  フェノール2-モノオキシゲナーゼ（phenol 2-monooxygenase）活性を有する酵素をコードする遺伝子
【請求項５】
宿主のコリネ型細菌の以下の(e)及び／又は(f)の代謝遺伝子が、宿主で高発現している請求項１〜４の何れかに記載の形質転換体。
(e)  DAHPシンテターゼ（3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate (DAHP) synthase）活性を有する酵素をコードする遺伝子
(f)  コリスミン酸ムターゼ（chorismate mutase）活性を有する酵素をコードする遺伝子
【請求項６】
宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである請求項１〜５の何れかに記載の形質転換体。
【請求項７】
宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルミカムR（FERM  P−18976）、ATCC13032、又はATCC13869である請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルミカムR（FERM  P−18976）、ATCC13032、又はATCC13869の染色体上に存在する下記(c)及び／又は(d)の遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、請求項６に記載の形質転換体。
(c)  プレフェン酸デヒドラターゼ(prephenate dehydratase)活性を有する酵素をコードする遺伝子
(d)  フェノール2-モノオキシゲナーゼ（phenol 2-monooxygenase）活性を有する酵素をコードする遺伝子
【請求項９】
宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルミカムR（FERM  P−18976）、ATCC13032、又はATCC13869において、以下の(e)及び／又は(f)の代謝遺伝子が高発現しているものである、請求項６又は８に記載の形質転換体。
(e)  DAHPシンテターゼ（3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate (DAHP) synthase）活性を有する酵素をコードする遺伝子
(f)  コリスミン酸ムターゼ（chorismate mutase）活性を有する酵素をコードする遺伝子
【請求項１０】
コリネバクテリウム グルタミカム PHE7（受託番号：NITE  BP−976）形質転換体。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れかに記載の形質転換体を、還元条件下、糖類を含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のフェノールを回収する工程とを含むフェノールの製造方法。
【請求項１２】
反応工程において、形質転換体が実質的に増殖しない請求項１１記載のフェノールの製造方法。
【請求項１３】
還元条件下の反応液の酸化還元電位が−２００〜−５００ミリボルトである請求項１１又は１２に記載のフェノールの製造方法。
【請求項１４】
糖類がグルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、トレハロース、及びマンニトールからなる群より選ばれるものである請求項１１〜１３の何れかに記載のフェノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フェノール生産技術に関する。さらに詳しくは、フェノール生産機能を付与するために特定の遺伝子操作が施されたコリネ型細菌の形質転換体、及びこの形質転換体を用いた効率的なフェノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球温暖化、及び化石資源枯渇問題を背景に、再生可能資源を原料とした化学品の製造は、バイオ燃料製造と並び、新産業バイオリファイナリーとして低炭素社会実現の重要な方策であることが認識され、大きな注目が集まっている。
しかし、再生可能資源を原料としたバイオフェノール生産は、乳酸やエタノールの生産と比較して、原料となる糖類から代謝反応段数が大変多いために生産性が低く、また生産物であるフェノールにより菌の増殖が阻害されたり、フェノールによる細胞毒性がある等の理由により、これまで工業的生産が不可能とされていた。【０００３】
フェノールの重要な用途として、フェノール樹脂が挙げられる。フェノール樹脂は、フェノールとアルデヒド類との付加縮合反応により生成し、プラスチックの中でも最も古い歴史のある樹脂であり、その優れた耐熱性、耐久性等の特長から、現在でも自動車用金属代替材料、半導体封止材料、回路基板など様々な用途に用いられている。また、これまでフェノール樹脂は、原料のフェノールとアルデヒド類の反応性が極めて高く、得られる高分子が複雑な三次元網目構造になるため、ポリマーの精密構造設計やナノマテリアルへの展開が困難であり、高付加価値の用途への利用が難しいとされてきた。しかしながら、近年、高分子の物性理論やシミュレーションの急速な発展により、ネットワーク構造を精密化すればフェノール樹脂から高機能性材料の創製が可能となってきた。このような背景から日本におけるフェノール樹脂生産量も年々増加している。【０００４】
フェノールの現在の工業的生産法（クメン法）は、石油由来のベンゼンとプロピレンを原料とし、多量の溶剤類及び多量の熱エネルギーを必要とする、典型的な化学工業の高エネルギー消費型プロセスである。従って、地球環境保全や温室効果ガス削減の観点から、二酸化炭素排出が少ない省エネルギー型で、再生可能資源から製造でき、低廃棄物排出の環境調和型プロセスの開発、即ちバイオフェノール製造技術確立が急務となっている。
これまで自然界においてフェノール生産菌は報告されていない。【０００５】
遺伝子組換え菌によるフェノール生産技術としては、非特許文献１が挙げられる。非特許文献１の方法では、溶媒耐性菌シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）S12株にパントエア アグロメランス（Pantoea agglomerans）由来のチロシン フェノール-リアーゼをコードするtpl遺伝子を導入した株、及びシュードモナス プチダS12株にシュードモナス プチダS12株由来のDAHPシンテターゼ（3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate (DAHP) synthase）をコードするaroF-1遺伝子を導入した株を作製して使用している。また、シュードモナス プチダS12株にシュードモナス プチダS12株由来のDAHPシンテターゼをコードするaroF-1遺伝子を導入した株の中からフェニールアラニン及びタイロシンのアナログ（代謝拮抗物質）であるm-フルオロ-DL-フェニルアラニン（m-fluoro-DL-phenylalanine）に耐性な株を取得して使用している。さらに、この株の中からm-フルオロ-L-タイロシン（m-fluoro-L-tyrosine）に耐性な株を取得して使用している。そして、これらの株を、グルコースを唯一の炭素源とした好気的条件でのfed-batch cultureに供してフェノールを生産する技術を開示している。
しかし、非特許文献１の方法は、フェノールの生産性が実用上十分とはいない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Applied and Environmental Microbiolology, Vol.71, 2005, 8221-8227.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、糖類を原料として効率よくフェノールを製造できる微生物、及びこの微生物を用いて糖類を原料として効率よくフェノールを製造できる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、以下の知見を得た。
(i)  コリネ型細菌はフェノールに対して高い耐性を有する。
(ii)  コリネ型細菌にチロシン フェノール-リアーゼ遺伝子を導入した形質転換体は、効率よくフェノールを生産する。
(iii)  この形質転換体において、宿主のコリネ型細菌の染色体上に存在するプレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子及び／又はフェノール2-モノオキシゲナーゼ遺伝子が破壊又は欠損しているときは、一層効率よくフェノールを生産できる。
(iv)   この形質転換体において、DAHPシンテターゼ遺伝子、及び／又はコリスミン酸ムターゼ遺伝子が、形質転換前の宿主の遺伝子発現レベルに比べて高発現しているときは、一層効率よくフェノールを生産できる。
(v)  この形質転換体は、還元条件下の反応液中で実質的に増殖しない状態で反応させる場合、好気性の反応液中で増殖させつつ反応させる場合に比べて、フェノール生産効率が高い。【０００９】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の形質転換体及びフェノールの製造方法を提供する。
項１．  チロシン フェノール-リアーゼ（tyrosine phenol-lyase）活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、フェノール生産能を有する形質転換体。
項２．  チロシン フェノール-リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、パントエア アグロメランス（Pantoea agglomerans）由来の遺伝子、シトロバクター ブラッキー（Citrobacter braakii）由来の遺伝子、デスルフィトバクテリューム ハフニエンス（Desulfitobacterium hafniense） 由来の遺伝子、クロロフレクサス オウランティアカス（Chloroflexus aurantiacus） 由来の遺伝子、ノストック パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)由来の遺伝子、又はトレポネマ デンティコラ（Treponema denticola）由来の遺伝子である項１に記載の形質転換体。
項３．  チロシン フェノール-リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が下記の(a)又は(b)のDNAである項１に記載の形質転換体。
(a)  配列番号36の塩基配列からなるDNA、配列番号39の塩基配列からなるDNA、配列番号42の塩基配列からなるDNA、配列番号45の塩基配列からなるDNA、配列番号48の塩基配列からなるDNA、又は配列番号51の塩基配列からなるDNA
(b)  (a)の何れかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつチロシン フェノール-リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
項４．  宿主のコリネ型細菌が、その染色体上に存在する下記(c)及び／又は(d)の遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、項１〜３の何れかに記載の形質転換体。
(c)  プレフェン酸デヒドラターゼ(prephenate dehydratase)活性を有する酵素をコードする遺伝子
(d)  フェノール2-モノオキシゲナーゼ（phenol 2-monooxygenase）活性を有する酵素をコードする遺伝子
項５．  宿主のコリネ型細菌の以下の(e)及び／又は(f)の代謝遺伝子が、宿主で高発現している項１〜４の何れかに記載の形質転換体。
(e)  DAHPシンテターゼ（3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate (DAHP) synthase）活性を有する酵素をコードする遺伝子
(f)  コリスミン酸ムターゼ（chorismate mutase）活性を有する酵素をコードする遺伝子
項６．  宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである項１〜５の何れかに記載の形質転換体。
項７．  宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルミカムR（FERM  P−18976）、ATCC13032、又はATCC13869である項６に記載の形質転換体。
項８．  宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルミカムR（FERM  P−18976）、ATCC13032、又はATCC13869の染色体上に存在する下記(c)及び／又は(d)の遺伝子が破壊され、又は欠損したものである、項６に記載の形質転換体。
(c)  プレフェン酸デヒドラターゼ(prephenate dehydratase)活性を有する酵素をコードする遺伝子
(d)  フェノール2-モノオキシゲナーゼ（phenol 2-monooxygenase）活性を有する酵素をコードする遺伝子
項９．  宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルミカムR（FERM  P−18976）、ATCC13032、又はATCC13869において、以下の(e)及び／又は(f)の代謝遺伝子が高発現しているものである、項６又は８に記載の形質転換体。
(e)  DAHPシンテターゼ（3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate (DAHP) synthase）活性を有する酵素をコードする遺伝子
(f)  コリスミン酸ムターゼ（chorismate mutase）活性を有する酵素をコードする遺伝子
項１０．  コリネバクテリウム グルタミカム PHE7（受託番号：NITE  BP−976）形質転換体。
項１１．  項１〜１０の何れかに記載の形質転換体を、還元条件下、糖類を含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のフェノールを回収する工程とを含むフェノールの製造方法。
項１２．  反応工程において、形質転換体が実質的に増殖しない項１１記載のフェノールの製造方法。
項１３．  還元条件下の反応液の酸化還元電位が−２００〜−５００ミリボルトである項１１又は１２に記載のフェノールの製造方法。
項１４．  糖類がグルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、トレハロース、及びマンニトールからなる群より選ばれるものである項１１〜１３の何れかに記載のフェノールの製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の形質転換体を用いることにより、従来公知の形質転換体に比べて、糖類からフェノールを高効率で製造することができる。
一般に微生物はフェノールのような溶剤の細胞毒性により生育が阻害されるため、微生物を用いてフェノールを製造することは困難であったが、本発明方法によれば、微生物を用いて、実用上十分に効率良くフェノールを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】各種の微生物の好気条件下における増殖に及ぼすフェノールの影響を示す図である。
【図２】コリネバクテリウムの還元条件下における糖消費に及ぼすフェノールの影響を示す図である。
【図３】実施例で用いた各種プラスミドの構築図である。
【図４】実施例で用いた各種プラスミドの構築図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）フェノール生産能を有する形質転換体
本発明のフェノール生産能を有する形質転換体は、チロシン フェノール-リアーゼ（tyrosine phenol-lyase）活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された形質転換体である。
【００１３】
宿主
コリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bargeys Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）〕に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、マイクロコッカス属菌等が挙げられる。コリネ型細菌の中ではコリネバクテリウム属菌が好ましい。
【００１４】
コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム  グルタミカム、コリネバクテリウム  エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム  アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム  ハロトレランス（Corynebacterium halotolerance）、コリネバクテリウム  アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）等が挙げられる。中でも、安全でかつフェノール生産性が高い点で、コリネバクテリウム  グルタミカムが好ましい。好適な菌株として、コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R株（FERM P-18976）、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233（FERM BP-1497）、MJ-233AB-41（FERM BP-1498）等が挙げられる。中でも、R株（FERM P-18976）、ATCC13032株、ATCC13869株が好ましい。
【００１５】
なお、分子生物学的分類により、ブレビバクテリウム フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）、コリネバクテリウム リリウム（Corynebacterium lilium）等のコリネ型細菌もコリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に菌名が統一されている〔Liebl, W. et al., Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum" DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns. Int J Syst Bacteriol. 41:255-260. (1991)、駒形和男ら, コリネフォルム細菌の分類, 発酵と工業, 45:944-963 (1987)〕。
旧分類のブレビバクテリウム  ラクトファーメンタムATCC13869株、ブレビバクテリウム フラバムのMJ-233株（FERM BP-1497）、MJ-233AB-41株（FERM BP-1498）なども好適なコリネバクテリウム グルタミカムである。
ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）（例えばATCC6872株）等が挙げられる。
【００１６】
アースロバクター属菌としては、アースロバクター  グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）（例えばATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株）等が挙げられる。
マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム ボビス（Mycobacterium bovis）（例えばATCC19210株、ATCC27289株）等が挙げられる。
マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス  フロイデンライヒ（Micrococcus freudenreichii）（例えばNo. 239株（FERM P-13221））、マイクロコッカス  ルテウス（Micrococcus leuteus）(例えばNo. 240株（FERM P-13222）)、マイクロコッカス ウレアエ（Micrococcus ureae）（例えばIAM1010株）、マイクロコッカス  ロゼウス（Micrococcus roseus）（例えばIFO3764株）等が挙げられる。
【００１７】
また、コリネ型細菌は、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。例えば、ラクテート（乳酸）デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase：LDH）、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ（phosphoenolpyrvate carboxylase）、マレートデヒドロゲナーゼ（malate dehydrogenase）などの遺伝子の破壊株が挙げられる。このような遺伝子破壊株を宿主として用いることにより、フェノールの生産性を向上させたり、副生成物の生成を抑制したりすることができる。
中でも、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。この遺伝子破壊株は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されていることにより、ピルビン酸から乳酸への代謝経路が遮断されている。中でも、コリネバクテリウム グルタミカムの、特にR（FERM P-18976）株のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。
このような遺伝子破壊株は、遺伝子工学的手法により常法に従い作製できる。例えば、ＷＯ２００５／０１０１８２Ａ１に、乳酸デヒドロゲナーゼ破壊株、及びその作製方法が記載されている。
【００１８】
チロシン フェノール-リアーゼ酵素遺伝子(tpl)
チロシン フェノール-リアーゼ酵素は、下記の２反応を触媒する酵素である。
【化１】
2012033112.tif 000002
チロシン フェノール-リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の由来は特に限定されないが、パントエア アグロメランス（Pantoea agglomerans）由来の遺伝子、シトロバクター ブラッキー（Citrobacter braakii）由来の遺伝子、デスルフィトバクテリューム ハフニエンス（Desulfitobacterium hafniense） 由来の遺伝子、クロロフレクサス オウランティアカス（Chloroflexus aurantiacus） 由来の遺伝子、ノストック パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)由来の遺伝子、トレポネマ デンティコラ（Treponema denticola）由来の遺伝子が好ましい。中でも、パントエア アグロメランス、シトロバクター ブラッキー、又はデスルフィトバクテリューム ハフニエンス由来の遺伝子が好ましく、シトロバクター ブラッキー由来の遺伝子がより好ましい。
【００１９】
パントエア アグロメランス由来のチロシン フェノール-リアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号36の塩基配列からなるDNAが挙げられ、シトロバクター ブラッキー由来のチロシン フェノール-リアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号39の塩基配列からなるDNAが挙げられ、デスルフィトバクテリューム ハフニエンス由来のチロシン フェノール-リアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号42の塩基配列からなるDNAが挙げられ、クロロフレクサス オウランティアカス由来のチロシン フェノール-リアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号45の塩基配列からなるDNAが挙げられ、ノストック パンクチフォルメ由来のチロシン フェノール-リアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号48の塩基配列からなるDNAが挙げられ、トレポネマ デンティコラ由来のチロシン フェノール-リアーゼ酵素遺伝子としては、配列番号51の塩基配列からなるDNAが挙げられる。
【００２０】
また、本発明では、配列番号36、39、42、45、48、又は51の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつチロシン フェノール-リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
【００２１】
本発明において「ストリンジェントな条件」は、一般的な条件、例えば、Molecular  Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition,1989,Vol2,p11.45に記載された条件を指す。具体的には、完全ハイブリッドの融解温度(Ｔｍ)より5〜10℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合を指す。
チロシン フェノール-リアーゼ活性は、後述する実施例３に記載の方法で測定できる。
また、本発明では、配列番号36、39、42、45、48、又は51の塩基配列と同一性が90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上の塩基配列からなり、かつチロシン フェノール-リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
塩基配列の同一性は、GENETYX ver.8（GENETYX 株式会社ゼネティックス製）により算出した値である。
【００２２】
配列番号36、39、42、45、48、又は51の塩基配列からなるDNAのホモログは、例えば、これらの塩基配列に基づき常法に従い設計したプライマー又はプローブを用いたPCR又はハイブリダイゼーションにより、他生物種のDNAライブラリーから選択することができ、これにより高確率でチロシン フェノール-リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAが得られる。
【００２３】
形質転換のためのベクターの構築
PCRで増幅したチロシン フェノール-リアーゼ酵素をコードするDNAは、宿主で増幅できる適切なベクターにクローニングすればよい。
プラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内で自律複製機能を司る遺伝子を含むものであれば良い。その具体例としては、ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）2256由来のpAM330〔特開昭58-67699〕、〔Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903（1984）〕 及び 〔Yamaguchi, R. et al., Determination of the complete nucleotide sequence of the Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330 and the analysis of its genetic information. Nucleic Acids Symp. Ser. 16:265-267（1985）〕、コリネバクテリウム グルタミカム ATCC13058由来のpHM1519 〔Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903（1984）〕及びpCRY30 〔Kurusu, Y. et al., Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57:759-764 （1991）〕、コリネバクテリウム グルタミカム T250由来のpCG4〔特開昭57-183799〕、〔Katsumata, R. et al., Protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA. J. Bacteriol.、159:306-311 （1984）〕、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50〔特開昭62-166890〕、pEK0、pEC5、pEKEx1 〔Eikmanns, B.J. et al., A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and promoter probing. Gene, 102:93-98 （1991）〕などが挙げられる。
【００２４】
好ましいプロモーターとしては、コリネバクテリウム  グルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3-フォスフェートデヒドロゲナーゼA遺伝子(gapA)のプロモーターPgapA、マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（mdh）のプロモーターPmdh、ラクテートデヒドロゲナーゼA遺伝子（ldhA）のプロモーターPldhAなどが挙げられ、中でも、PgapAが好ましい。
好ましいターミネーターとしては、大腸菌rRNAオペロンのrrnB T1T2 ターミネーター、大腸菌のtrpA ターミネーター、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）のtrp ターミネーターなどが挙げられ、中でも、rrnB T1T2 ターミネーターが好ましい。
【００２５】
形質転換
形質転換方法は、公知の方法を制限無く使用できる。このような公知の方法として、例えば塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、電気穿孔法などが挙げられる。中でも、コリネ型細菌には、電気パルス法が好適であり、電気パルス法は、公知の方法 〔Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric. Biol. Chem. 54:443-447 （1990）〕 及び 〔Vertes A.A. et al., Presence of mrr- and mcr-like restriction systems in Coryneform bacteria. Res. Microbiol. 144:181-185 （1993）〕により行うことができる。
【００２６】
形質転換体は、微生物の培養に通常使用される培地を用いて培養すればよい。この培地としては、通常、炭素源、窒素源、無機塩類及びその他の栄養物質等を含有する天然培地又は合成培地等を用いることができる。
炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、アラビノース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、ソルビトール、グリセリン等の糖質又は糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸又はグルコン酸等の有機酸；エタノール、プロパノール等のアルコール等が挙げられる。また、所望によりノルマルパラフィン等の炭化水素等も用いることができる。炭素源は、１種を単独で使用でき、又は２種以上を混合して使用してもよい。培地中のこれら炭素源の濃度は、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等が挙げられる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ベプトン、NZ−アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、１種を単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。培地中の窒素源濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト又は炭酸カルシウム等が挙げられる。これら無機塩は、１種を単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。培地中の無機塩類濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（ｗ／ｖ％）とすればよい。
栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、又は動植物若しくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、例えば、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
培地のｐＨは約５〜８が好ましい。
【００２７】
好ましい微生物培養培地としては、A培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。
培養温度は約１５〜４５℃とすればよく、培養時間は約１〜７日間とすればよい。
【００２８】
宿主染色体遺伝子の破壊又は欠失
宿主のコリネ型細菌は、その染色体上に存在するプレフェン酸デヒドラターゼ(prephenate dehydratase)活性を有する酵素をコードする遺伝子(pheA)、及び／又はフェノール2-モノオキシゲナーゼ（phenol 2-monooxygenase）活性を有する酵素をコードする遺伝子(poxF)が、破壊され、または欠失していることが好ましく、これにより一層効率良くフェノールを製造することができる。pheA及びpoxFが共に破壊され、または欠失していることがより好ましい。
遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能する酵素タンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型又は破壊型の遺伝子に置換することができる。欠失型又は破壊型の遺伝子によってコードされる酵素タンパク質は、生成したとしても、野生型酵素タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失している。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子欠失又は破壊は既に確立しており、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
具体的には、実施例２の項目に記載の方法により、プレフェン酸デヒドラターゼ酵素遺伝子や、フェノール2-モノオキシゲナーゼ酵素遺伝子が破壊又は欠失したコリネ型細菌を得ることができる。
【００２９】
代謝遺伝子の高発現
宿主のコリネ型細菌は、DAHPシンテターゼ（3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate (DAHP) synthase）遺伝子（aroG）、及び／又はコリスミン酸ムターゼ（chorismate mutase）遺伝子（csm）が、宿主の本来のレベル、即ち野生型宿主のレベルより高発現していることが好ましい。この高発現は、形質転換による遺伝子導入、又は宿主染色体上の遺伝子のコピー数を高めることにより達成される。aroG及びcsmが共に高発現していることがより好ましい。
形質転換について述べれば、導入するDAHPシンテターゼ遺伝子及びコリスミン酸ムターゼ遺伝子は、宿主の遺伝子と同じ又は実質的に同じDAHPシンテターゼ遺伝子及びコリスミン酸ムターゼ遺伝子でもよく、その他のDAHPシンテターゼ遺伝子及びコリスミン酸ムターゼ遺伝子であってもよい。宿主の遺伝子と同じ又は実質的に同じ、DAHPシンテターゼ遺伝子及び／又はコリスミン酸ムターゼ遺伝子を導入する方が好ましい。
例えば、コリネバクテリウム グルタミカム由来のDAHPシンテターゼ遺伝子としては、配列番号30の塩基配列からなるDNAが挙げられ、コリネバクテリウム グルタミカム由来のコリスミン酸ムターゼ遺伝子としては、配列番号31の塩基配列からなるDNAが挙げられる。
その他のコリネ型細菌のDHAPシンターゼ遺伝子としては、コリネバクテリウム  エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）由来の遺伝子（配列番号62、日本DNAデータバンク：CE2073）、マイコバクテリウム  スメグマティス（Mycobacterium smegmatis）由来の遺伝子（配列番号63、日本DNAデータバンク：MSMEG_4244）、ロドコッカス  オパカス（Rhodococcus opacus）由来の遺伝子（配列番号64、日本DNAデータバンク：ROP_08400）などがあり、コリスミン酸ムターゼ遺伝子としては、コリネバクテリウム  エフィシェンス由来の遺伝子（配列番号65、日本DNAデータバンク：CE0929）、マイコバクテリウム  スメグマティス由来の遺伝子（配列番号66、日本DNAデータバンク：MSMEG_5536）、ロドコッカス  オパカス由来の遺伝子（配列番号67、日本DNAデータバンク：ROP_56380）などがある。
また、DAHPシンテターゼ遺伝子又はコリスミン酸ムターゼ遺伝子について「実質的に同じ遺伝子」としては、当該遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するポリペプチドであって、DAHPシンテターゼ活性又はコリスミン酸ムターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAが挙げられる。また、DAHPシンテターゼ遺伝子又はコリスミン酸ムターゼ遺伝子について「実質的に同じ遺伝子」としては、当該遺伝子と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するDNAであって、DAHPシンテターゼ活性又はコリスミン酸ムターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAが挙げられる。
DAHPシンテターゼ活性の有無は、ホスホエノールピルビン酸とエリトロース-4-リン酸を基質として反応させ、生じた3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate (DAHP)を、チオバルビツール酸を用いた発色法により定量（Appl. Environ. Microbiol., 74: 5497-5503 (2008).）することにより検出することができる。
また、コリスミン酸ムターゼ活性の有無は、コリスミ酸を基質として反応後、生じたプレフェン酸（prephenate）を終濃度0.67N 塩酸によりフェニルピルビン酸（phenylpyruvate）に変換(約10分インキュベート）し、その後320 nmの吸光度増加（フェニルピルビン酸の生成）に基づき検出することができる（Microbiology., 155, 3382-3391 (2009).）。
【００３０】
宿主染色体上のDAHPシンテターゼ遺伝子又はコリスミン酸ムターゼ遺伝子のコピー数を高める方法について述べれば、これらの遺伝子をコリネ型細菌の染色体DNA上に多コピー導入すればよい。微生物の染色体DNA上に遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して、相同組換え法（Experimentsin Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)）により行うことができる。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。また、特開平2-109985号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンと共に転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。さらに、Muファージを用いる方法（特開平2-109985号）で宿主染色体に目的遺伝子を組み込むこともできる。
【００３１】
また、コリネ型細菌の染色体上のDAHPシンテターゼ遺伝子及び／又はコリスミン酸ムターゼ遺伝子のプロモーター等の発現調節配列をより強力なものに置換することによっても、これらの遺伝子の発現を高めることができる。例えば、tacプロモーター、lacプロモーター、trcプロモーター、trpプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、国際公開WO00/18935に開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）等に記載されている。発現調節配列の置換は、例えば、温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。
【００３２】
さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによって、翻訳量を向上させることもできる。
【００３３】
上記のような遺伝子置換を行う方法としては、例えば、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号明細書、または特開平05-007491号公報）。
【００３４】
（ＩＩ）フェノールの製造方法
上記説明した本発明の形質転換体を、還元条件下、糖類を含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のフェノールを回収する工程とを含む方法によりフェノールを製造することができる。
【００３５】
微生物の増殖
反応に先立ち、形質転換体を好気条件下で、温度約２５〜３８℃で、約１２〜４８時間培養して増殖させることが好ましい。
【００３６】
培養用培地
反応に先立つ形質転換体の好気的培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地を用いることができる。
炭素源として、糖類（グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖；スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖；澱粉のような多糖；糖蜜等）、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。
炭素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。
【００３７】
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ−アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。窒素源の培地中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、１種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（ｗ／ｖ％）とすればよい。
【００３８】
栄養物質としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、動植物又は微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地中の濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
培地のｐＨは約６〜８が好ましい。
【００３９】
具体的な好ましいコリネ型細菌用培地としては、A培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。
反応液
反応液としては、炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地を用いることができる。
炭素源としては糖類を用いる。糖類としては、グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖；スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖；澱粉のような多糖；糖蜜等が挙げられる。中でも、単糖が好ましく、グルコースがより好ましい。
炭素源として、糖類の他に、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。
炭素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。
反応液中の糖類の濃度は、約1〜20（ｗ／ｖ％）が好ましく、約2〜10（ｗ／ｖ％）がより好ましく、約2〜5（ｗ／ｖ％）がさらにより好ましい。
また、糖類を含む全炭素源の反応液中の濃度は、通常、約2〜5（ｗ／ｖ％）とすればよい。
【００４０】
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ−アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。窒素源の反応液中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、１種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の反応液中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（ｗ／ｖ％）とすればよい。
【００４１】
栄養物質としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、動植物又は微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の反応液中の濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
反応液のｐＨは約６〜８が好ましい。
【００４２】
具体的な好ましいコリネ型細菌用培地としては、前述したA培地、BT培地等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。
【００４３】
反応条件
反応温度、即ち形質転換体の生存温度は、約２０〜５０℃が好ましく、約２５〜４７℃がより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良くフェノールを製造できる。
また、反応時間は、約１〜７日間が好ましく、約１〜３日間がより好ましい。
培養は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、バッチ式が好ましい。
反応は、好気的条件で行ってもよく、還元条件で行ってもよい。
【００４４】
＜還元条件＞
還元条件では、コリネ型細菌は実質的に増殖せず、一層効率的にフェノールを生産させることができる。
還元条件は、反応液の酸化還元電位で規定される。反応液の酸化還元電位は、約−２００ｍＶ〜−５００ｍＶが好ましく、約−２５０ｍＶ〜−５００ｍＶがより好ましい。
反応液の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬（還元状態であれば、青色から無色への脱色）で推定できるが、正確には酸化還元電位差計（例えば、ＢＲＯＡＤＬＥＹ  ＪＡＭＥＳ社製、ＯＲＰ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ）を用いて測定できる。
【００４５】
還元条件にある反応液の調整方法は、公知の方法を制限なく使用できる。例えば、反応液の液体媒体として、蒸留水などの代わりに反応液用水溶液を使用してもよく、反応液用水溶液の調整方法は、例えば硫酸還元微生物などの絶対嫌気性微生物用の培養液調整方法（Ｐｆｅｎｎｉｇ，  Ｎ  ｅｔ．  ａｌ．（１９８１）：Ｔｈｅ  ｄｉｓｓｉｍｉｌａｔｏｒｙ  ｓｕｌｆａｔｅ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ，  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｈａｂｉｔａｔｓ，  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｅｄ．  ｂｙ  Ｓｔａｒｒ，  Ｍ．  Ｐ．  ｅｔ．  ａｌ．  ｐ．９２６−９４０，  Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ．）や「農芸化学実験書  第三巻、京都大学農学部  農芸化学教室編、１９９０年第２６刷、産業図書株式会社出版」などが参考となり、所望する還元条件下の水溶液を得ることができる。
具体的には、蒸留水などを加熱処理や減圧処理して溶解ガスを除去することにより、還元条件の反応液用水溶液を得ることができる。この場合、約１０ｍｍＨｇ以下、好ましくは約５ｍｍＨｇ以下、より好ましくは約３ｍｍＨｇ以下の減圧下で、約１〜６０分程度、好ましくは約５〜４０分程度、蒸留水などを処理することにより、溶解ガス、特に溶解酸素を除去して還元条件下の反応液用水溶液を作成することができる。
また、適当な還元剤（例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオン、硫化ソーダ等）を添加して還元条件の反応液用水溶液を調整することもできる。
これらの方法を適宜組み合わせることも有効な還元条件の反応液用水溶液の調整方法である。
【００４６】
反応中も反応液を還元条件に維持することが好ましい。反応途中での還元条件を維持するために、反応系外からの酸素の混入を可能な限り防止することが望ましく、具体的には、反応系を窒素ガス等の不活性ガスや炭酸ガス等で封入する方法が挙げられる。酸素混入をより効果的に防止する方法としては、反応途中において本発明の好気性細菌の菌体内の代謝機能を効率よく機能させるために、反応系のｐＨ維持調整液の添加や各種栄養素溶解液を適宜添加する必要が生じる場合もあるが、このような場合には添加溶液から酸素を予め除去しておくことが有効である。
【００４７】
フェノールの回収
上記のようにして培養することにより、反応液中にフェノールが生産される。反応液を回収することによりフェノールを回収できるが、さらに、公知の方法でフェノールを反応液から分離することもできる。そのような公知の方法として、蒸留法、膜透過法、有機溶媒抽出法等が挙げられる。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例1  フェノール生産用宿主としての適性試験； フェノールによるコリネバクテリウム グルタミカム及び他種菌体への影響
（1）  フェノールによる好気増殖への影響
コリネバクテリウム グルタミカム、エシェリヒア コリおよびシュードモナス プチダについて、好気培養におけるフェノールの生育阻害試験を行った。尚、本試験に用いたシュードモナス プチダS12は、溶媒耐性菌として報告されており、これまでに唯一フェノール生産の宿主として用いられた技術が開示されている。
コリネバクテリウム グルタミカムRをA寒天培地[(NH2)2CO  2g、(NH4)2SO4  7g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁]に塗布し、33℃、15時間暗所に静置した。
上記のプレートで生育したコリネバクテリウム グルタミカムRを、A液体培地[(NH2)2CO  2g、(NH4)2SO4  7g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 g、glucose 40 gを蒸留水1Lに溶解] 10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて13時間、好気的に振盪培養を行った。
上記条件で生育したコリネバクテリウム グルタミカムRを、A液体培地100mlに初期菌体濃度OD610=0.05となるように植菌し、同時にフェノールが終濃度0、0.16、0.2、0.24、0.32mMとなるように添加し、33℃にて好気的に振盪培養を行った。菌体の生育はOD610の吸光度を測定することにより行った。【００４９】
エシェリヒア コリJM109をLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布し、37℃、15時間暗所に静置した。
上記プレートで生育したエシェリヒア コリJM109を、LB液体培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキスおよび0.5% 塩化ナトリウム〕10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、37℃にて13時間、好気的に振盪培養を行った。
上記条件で生育したエシェリヒア コリJM109をLB液体培地100mlに初期菌体濃度OD610=0.05となるように植菌し、同時にフェノール濃度が終濃度0、0.16、0.20mMとなるように添加し、37℃にて好気的に振盪培養を行った。菌体の生育はOD610の吸光度を測定することにより行った。【００５０】
シュードモナス プチダF1およびS12をLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布し、30℃、15時間暗所に静置した。
上記プレートで生育したシュードモナス プチダF1およびS12を、LB（+グルコース）液体培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウムおよび0.4%グルコース〕10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、30℃にて13時間、好気的に振盪培養を行った。
上記条件で生育したシュードモナス プチダF1およびS12株をLB（+グルコース）液体培地100mlに初期菌体濃度OD610=0.05となるように植菌し、同時にフェノール濃度が終濃度0、0.10、0.20mMとなるように添加し、30℃にて好気的に振盪培養を行った。菌体の生育はOD610の吸光度を測定することにより行った。
培地中へのフェノール添加による好気増殖への影響の解析結果を図１に示す。図１の縦軸はOD610である。【００５１】
エシェリヒア コリは、0.16%フェノール存在下で著しく増殖阻害を受け、0.20％フェノールでは完全に増殖が阻害された。
シュードモナス プチダF1及び溶剤耐性菌として報告されていたシュードモナス プチダS12は、ほぼ同じ傾向を示し、0.10%フェノール存在下で著しく増殖阻害を受け0.20％フェノールでは完全に増殖が阻害された。
これに対して、コリネバクテリウム グルタミカムは、エシェリヒア コリが顕著な増殖阻害を受けた0.16%のフェノール存在下においても増殖への影響はほとんどなく、エシェリヒア コリやシュードモナス プチダでは完全に増殖を阻害された0.20%のフェノール存在下においても良好な生育を示した。さらに0.24%のフェノール存在下において増殖が可能であった。
このように、コリネバクテリウム グルタミカムはエシェリヒア コリおよびシュードモナス プチダと比較して、フェノールに対し高い耐性を有し、フェノール生産の宿主として高い適性を有することが示された。【００５２】
(2）フェノールによる還元条件下での糖代謝への影響
コリネバクテリウム グルタミカムRを、A寒天培地に塗布し、33℃、20時間暗所に静置した。
上記のプレートで生育したコリネバクテリウム グルタミカムRをA液体培地10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて15時間、好気的に振盪培養を行った。
上記条件で生育したコリネバクテリウム グルタミカムRをA液体培地500mlの入った容量2Lの三角フラスコに植菌し、33℃にて15時間、好気的に振盪培養を行った。
このようにして培養増殖した菌体は、遠心分離 (4℃、5,000×g, 15分)により回収した。得られた菌体を、10 w/v%となるようにBT(-尿素)液体培地〔0.7% 硫酸アンモニウム、0.05% リン酸二水素カリウム、0.05% リン酸水素二カリウム、0.05% 硫酸マグネシウム・7水和物、0.0006% 硫酸鉄・7水和物、0.00042% 硫酸マンガン水和物、0.00002% ビオチン、0.00002% チアミン塩酸塩〕に懸濁した。このそれぞれの菌体懸濁液60mlを容量100mlメディウム瓶に入れ、還元条件下（酸化還元電位；-450 mV）、グルコースを8%、フェノール濃度を0、0.24、0.38、0.46mMとなるように添加し、33℃に保った水浴中で攪拌しながら反応させた。この時、反応液のpHが7.0を下回らないように2.5Nのアンモニア水を用いてpHコントローラー (エイブル株式会社製、型式：DT-1023）でコントロールしながら反応した。【００５３】
コリネバクテリウム グルタミカムRの還元条件下における糖代謝に及ぼすフェノールの影響を検討した結果を図２に示す。
還元条件下においては、好気培養において増殖阻害が認められた0.24%フェノール存在下でも、フェノールによる影響は全く見られず、フェノール未添加と同等の糖消費を示した。
さらに、0.38%のフェノール存在下でも糖消費を認められ、0.46%のフェノール存在下においても僅かながら糖消費を示した。
このように、好気培養と比較して、還元条件ではフェノールに対して高い耐性を示し、還元条件下におけるコリネバクテリウム グルタミカムを宿主としたフェノール生産が、好気条件下における生産と比較して優位であることが示された。【００５４】
実施例2  フェノール生産遺伝子のクローニングと発現
(1) 微生物からの染色体DNAの抽出
コリネバクテリウム グルタミカム （Corynebacterium glutamicum） R (FERM P-18976)からの染色体DNA抽出は、A培地 [(NH2)2CO  2 g、(NH4)2SO4  7 g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 gを蒸留水1 Lに溶解] に、炭素源として、最終濃度4%になるように50% (w/v)グルコース溶液を添加し、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで33℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット（商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製）を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００５５】
パントエア アグロメランス（Pantoea agglomerans）NBRC 12686からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.802培地[polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水1 Lに溶解]に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００５６】
シトロバクター ブラッキー（Citrobacter braakii）ATCC 6750からの染色体DNA抽出は、Nutrient Broth（ベクトン・ディッキンソン社製  BD 234000）に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００５７】
デスルフィトバクテリューム  ハフニエンス（Desulfitobacterium hafniense） Y51からの染色体DNA抽出は、MMYP培地[K2HPO4 7.8 g、KH2PO4 1.2 g、sodium citrate 0.5 g、MgSO4・7H2O 0.1 g、yeast extract 2.0 g、sodium pyruvate 5.5 g、resazurin sodium salt 1.0 mgを蒸留水1 Lに溶解及びpH 7.2に調整]に、白金耳を用いて植菌後、嫌気培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００５８】
クロロフレクサス  オウランティアカス（Chloroflexus aurantiacus J-10-fl）ATCC 29366からの染色体DNA抽出は、Chloroflexus培地[Nitrilotriacetic acid 0.1 g、Micronutrient Solution 1.0 ml、FeCl3 Solution 1.0 ml、CaSO4・2H2O 0.06 g、MgSO4・7H2O 0.1 g、NaCL 0.008 g、KNO3 0.103 g、NaNO3 0.689 g、Na2HPO4 0.111 g、NH4Cl 0.2 g、yeast extract 0.5 g、glycyl-glycine 0.5 gを蒸留水1 Lに溶解；Micronutrient Solution ：H2SO4 0.5 ml、MnSO4・7H2O 2.28 g、ZnSO4・7H2O 0.5 g、H3BO3 0.5 g、CuSO4・2H2O 0.025 g、Na2MoO4・2H2O 0.025 g、CoCl2・6H2O 0.045 gを蒸留水1 Lに溶解、FeCl3 Solution：FeCl3 0.2905 gを蒸留水1 Lに溶解）]に、白金耳を用いて植菌後、タングステンランプ照射及び50℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００５９】
デスルフィトバクテリューム  ハフニエンス（Desulfitobacterium hafniense） Y51からの染色体DNA抽出は、MMYP培地[K2HPO4 7.8 g、KH2PO4 1.2 g、sodium citrate 0.5 g、MgSO4・7H2O 0.1 g、yeast extract 2.0 g、sodium pyruvate 5.5 g、resazurin sodium salt 1.0 mgを蒸留水1 Lに溶解及びpH 7.2に調整]に、白金耳を用いて植菌後、嫌気培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００６０】
ノストック  パンクチフォルメ（Nostoc punctiforme）ATCC 29133からの染色体DNA抽出は、Blue-green nitrogen-fixing培地[K2HPO4 0.04 g、MgSO4・7H2O 0.075 g、CaCl2・2H2O 0.036 g、Citric acid 6.0 mg、Ferric ammonium citrate 6.0 mg、EDTA 1.0 mg、Na2CO3 0.02 g、Trace Metal Mix A5 1.0 mlを蒸留水1 Lに溶解及びpH 7.1に調整；Trace Metal Mix A5：H3BO3 2.86 g、MnCl2・4H2O 1.81 g、ZnSO4・7H2O 0.222 g、Na2MoO4・2H2O 0.39 g、CuSO4・5H2O 0.079 g、Co(NO3)2・6H2O 49. 4mgを蒸留水1 Lに溶解]に、白金耳を用いて植菌後、光照射（2000〜3000 lux）及び26℃で培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
トレポネマ  デンティコラ（Treponema denticola）JCM 8153の染色体DNA（Catalog No. RDB 6217）は独立行政法人 理化学研究所より入手した。【００６１】
(2) クローニングベクターの構築
クローニングベクターpCRB22の構築
コリネバクテリウム  カゼイ JCM12072由来のプラスミドpCASE1のDNA複製起点（以降、pCASE1-oriと記す）配列、及びクローニングベクターpHSG298（タカラバイオ株式会社製）をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、pCASE1-ori配列、クローニングベクターpHSG298をそれぞれクローン化するべく、配列番号1（pCASE1-ori配列）、配列番号2（クローニングベクター−pHSG298）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【００６２】
pCASE1-ori配列増幅用プライマー
（a-1）；  5’- AT AGATCT AGAACGTCCGTAGGAGC -3’      （配列番号3）
（b-1）；  5’- AT AGATCT GACTTGGTTACGATGGAC -3’     （配列番号4）
尚、プライマー（a-1）及び（b-1）には、BglII制限酵素部位が付加されている。【００６３】
クローニングベクターpHSG298増幅用プライマー
（a-2）；  5’- AT AGATCT AGGTTTCCCGACTGGAAAG -3’    （配列番号5）
（b-2）；  5’- AT AGATCT CGTGCCAGCTGCATTAATGA -3’   （配列番号6）
尚、プライマー（a-2）及び（b-2）には、BglII制限酵素部位が付加されている。【００６４】
鋳型DNAは、Japan. Collection of Microorganisms (JCM)より入手したコリネバクテリウム  カゼイ JCM12072から抽出したトータルDNA及びクローニングベクターpHSG298（タカラバイオ株式会社製）を用いた。
実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。【００６５】
2012033112.tif 000003
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
*) pCASE1-ori配列を増幅する場合はプライマー（a-1）と（b-1）の組み合わせ、クローニングベクターpHSG298を増幅する場合はプライマー（a-2）と（b-2）の組み合わせで行った。【００６６】
2012033112.tif 000004
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【００６７】
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、pCASE1-ori配列の場合約1.4-kb、クローニングベクターpHSG298の場合、約2.7-kbのDNA断片が検出できた。
上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウム  カゼイ株由来のプラスミドpCASE1-ori配列含む約1.4-kb DNA断片10μl及びクローニングベクターpHSG298を含む約2.7-kb DNA断片10μlを各々制限酵素BglIIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製）1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションA液とした。
得られたライゲーションA液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素BglIIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpHSG298約2.7-kbのDNA断片に加え、pCASE-ori配列の約1.4-kb DNA断片が認められた。
pCASE1-ori配列を含むクローニングベクターをpCRB22と命名した。【００６８】
クローニングベクターpCRB11の構築
コリネバクテリウム グルタミカム内で複製可能なプラスミドpCG1 [(特開昭57−134500)] 由来のDNA複製起点（以降、pCG1-oriと記す）配列、及びクローニングベクターpHSG398（タカラバイオ株式会社製）をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、pCG1-ori配列、クローニングベクターpHSG398をそれぞれクローン化するべく、配列番号7（pCG1-ori配列）、配列番号8（クローニングベクターpHSG398）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【００６９】
pCG1-ori配列増幅用プライマー
（a-3）；  5’- AT AGATCT AGCATGGTCGTCACAGAG -3’      （配列番号9）
（b-3）；  5’- AT AGATCT GGAACCGTTATCTGCCTATG -3’    （配列番号10）
尚、プライマー（a-3）及び（b-3）には、BglII制限酵素部位が付加されている。【００７０】
クローニングベクターpHSG398増幅用プライマー
（a-4）；  5’- AT AGATCT GTCGAACGGAAGATCACTTC -3’    （配列番号11）
（b-4）；  5’- AT AGATCT AGTTCCACTGAGCGTCAG -3’      （配列番号12）
尚、プライマー（a-4）及び（b-4）には、BglII制限酵素部位が付加されている。
鋳型DNAは、pCG1 [(特開昭57−134500)] 及びクローニングベクターpHSG398（タカラバイオ株式会社製）を用いた。
実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。【００７１】
2012033112.tif 000005
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
*) pCG1-ori配列を増幅する場合はプライマー(a-3)と(b-3)の組み合わせ、クローニングベクターpHSG398を増幅する場合はプライマー(a-4) と (b-4) の組み合わせで行った。【００７２】
2012033112.tif 000006
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【００７３】
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、pCG1-ori配列の場合約1.9-kb、クローニングベクターpHSG398の場合、約2.2-kbのDNA断片が検出できた。【００７４】
上記のPCRにより増幅したプラスミドpCG1由来pCG1-ori遺伝子含む約1.9-kb DNA断片10μl及びクローニングベクターpHSG398を含む約2.2-kb DNA断片10μlを各々制限酵素BglIIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションB液とした。
得られたライゲーションB液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、クロラムフェニコール50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素BglIIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpHSG398約2.2-kbのDNA断片に加え、pCG1-ori配列の約1.9-kb DNA断片が認められた。
pCG1-ori配列を含むクローニングベクターをpCRB11と命名した。【００７５】
クローニングベクターpCRB15の構築
クローニングベクターpCRB11を含むDNA断片及びpSELECT-zeo-mcs（インビトロジェン株式会社製）由来のゼオシン耐性遺伝子をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、クローニングベクターpCRB11及びゼオシン耐性遺伝子をそれぞれクローン化するべく、配列番号13（pCRB11）及び配列番号14（ゼオシン耐性遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【００７６】
クローニングベクターpCRB11配列増幅用プライマー
（a-5）；  5’- AT GATATC CGAAGTGATCTTCCGTTCGA -3’    （配列番号15）
（b-5）；  5’- AT GATATC AAGGCAGTTATTGGTGCCCT -3’    （配列番号16）
尚、プライマー（a-5）及び（b-5）には、EcoRV制限酵素部位が付加されている。【００７７】
ゼオシン耐性遺伝子増幅用プライマー
（a-6）；  5’- AT GATATC TAGCTTATCCTCAGTCCTGC -3’    （配列番号17）
（b-6）；  5’- AT GATATC CCATCCACGCTGTTTTGACA -3’    （配列番号18）
尚、プライマー（a-6）及び（b-6）には、EcoRV制限酵素部位が付加されている。【００７８】
鋳型DNAは、クローニングベクターpCRB11及びpSELECT-zeo-mcs（インビトロジェン株式会社製）を用いた。
実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。【００７９】
2012033112.tif 000007
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
*) クローニングベクターpCRB11配列を増幅する場合はプライマー(a-5)と(b-5)の組み合わせ、ゼオシン耐性遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-6) と (b-6) の組み合わせで行った。【００８０】
2012033112.tif 000008
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【００８１】
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、クローニングベクターpCRB11配列の場合約3.3-kb、ゼオシン耐性遺伝子の場合約0.5-kbのDNA断片が検出できた。
上記のPCRにより増幅したクローニングベクターpCRB11を含む約3.3-kb DNA断片10μl及びpSELECT-zeo-mcsプラスミド由来ゼオシン耐性遺伝子を含む約0.5-kb DNA断片10μlを各々制限酵素EcoRVで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションC液とした。
得られたライゲーションC液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、ゼオシン25μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素EcoRVでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB11由来約3.3-kbのDNA断片に加え、ゼオシン耐性遺伝子の場合、約0.5-kb DNA断片が認められた。
ゼオシン耐性遺伝子を含むクローニングベクターをpCRB15と命名した。【００８２】
クローニングベクターpCRB207の構築
コリネバクテリウム グルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）をコードするgapA遺伝子のプロモーター配列（以降、PgapAと記す）を含むDNA断片、及びクローニングベクターpKK223-3（ファルマシア社製）由来rrnBT1T2双方向ターミネーター配列（以降、ターミネーター配列と記す）を含むDNA断片を以下の方法により増幅した。
PCRに際して、PgapA配列及びターミネーター配列をそれぞれクローン化するべく、配列番号19（PgapA配列）、配列番号20（ターミネーター配列）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【００８３】
PgapA配列増幅用プライマー
（a-7）；5’- CTCT GTCGAC CCGAAGATCTGAAGATTCCTG -3’（配列番号21）
（b-7）；5’- CTCT GTCGAC GGATCC CCATGG TGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG -3’
（配列番号22）
尚、プライマー（a-7）には、SalI制限酵素部位が、プライマー（b-7）には、SalI、BamHI及びNcoI制限酵素部位が付加されている。【００８４】
ターミネーター配列増幅用プライマー
（a-8）；  5’- CTCT GCATGC CCATGG CTGTTTTGGCGGATGAGAGA -3’
（配列番号23）
（b-8）；  5’- CTCT GCATGC TCATGA AAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG -3 
（配列番号24）
尚、プライマー（a-8）には、SphI及びNcoI制限酵素部位が、プライマー（b-8）には、SphI及びBspHI制限酵素部位が付加されている。【００８５】
鋳型DNAは、コリネバクテリウム グルタミカム R (FERM P-18976)から抽出した染色体DNA及びpKK223-3プラスミド（ファルマシア社製）を用いた。
実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。【００８６】
2012033112.tif 000009
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
*) PgapA配列を増幅する場合はプライマー(a-7)と(b-7)の組み合わせ、ターミネーター配列を増幅する場合はプライマー(a-8) と (b-8) の組み合わせで行った。【００８７】
2012033112.tif 000010
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【００８８】
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、PgapA配列の場合約0.6-kb、ターミネーター配列の場合、約0.4-kbのDNA断片が検出できた。
上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウム グルタミカム R由来PgapA配列を含む約0.6-kb DNA断片10μlとクローニングベクターpCRB22約4.1-kbを各々制限酵素SalIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションD液とした。
得られたライゲーションD液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素SalIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB22約4.1-kbのDNA断片に加え、PgapA配列）の約0.6-kb DNA断片が認められた。
PgapA配列を含むクローニングベクターをpCRB206と命名した。【００８９】
上記PCRにより増幅したpKK223-3プラスミド由来ターミネーター配列を含む約0.4-kb DNA断片10μlを制限酵素NcoI及びBspHIで、上述のクローニングベクターpCRB206  2μlを制限酵素NcoIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションE液とした。
得られたライゲーションE液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB206約4.7-kbのDNA断片に加え、ターミネーター配列の約0.4-kb DNA断片が認められた。
rrnBT1T2ターミネーター配列を含むクローニングベクターをpCRB207と命名した。【００９０】
クローニングベクターpCRB209の構築
コリネバクテリウム グルタミカムR由来のgapA（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase A）遺伝子のプロモーター（以降、PgapAと記す）配列を含むDNA断片を以下の方法により増幅した。
PCRに際して、pCRB207配列をクローン化するべく、配列番号25（pCRB207）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【００９１】
pCRB207配列増幅用プライマー
（a-9）； 5’- CTCT CATATG CTGTTTTGGCGGATGAGAG -3’    （配列番号26）
（b-9）； 5’- CTCT CATATG GTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG -3’（配列番号27）
尚、プライマー（a-9）及び（b-9）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【００９２】
鋳型DNAは、gapAプロモーター及びrrnBT1T2ターミネーター配列を含有するクローニングベクターpCRB207を用いた。
実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（宝酒造株式会社製）を用いて下記の条件で行った。【００９３】
2012033112.tif 000011
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
*) pCRB207配列を増幅する場合はプライマー(a-9)と(b-9)の組み合わせで行った。【００９４】
2012033112.tif 000012
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【００９５】
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、クローニングベクターpCRB207配列を含む約5.1-kbのDNA断片が検出できた。【００９６】
上記のPCRにより増幅したpCRB207由来遺伝子を含む約5.1-kb DNA断片10μlを制限酵素NdeIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ  （宝酒造株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションF液とした。
得られたライゲーションF液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素NdeIで切断し、制限酵素サイトの挿入を確認した。
PgapA配列及びrrnBT1T2ターミネーター配列を含むクローニングベクタ−をpCRB209と命名した。【００９７】
クローニングベクターpCRB210の構築
コリネバクテリウム グルタミカムR由来のgapA（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase A）遺伝子のプロモーター（以降、PgapAと記す）配列を含むDNA断片を以下の方法により増幅した。
PCRに際して、pCRB207配列をクローン化するべく、配列番号25（pCRB207）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【００９８】
pCRB207配列増幅用プライマー
（a-10）； 5’- CTCT GATATC CTGTTTTGGCGGATGAGAGA -3’  （配列番号28）
（b-10）； 5’- CTCT GATATC TCTCCTCTAAAGATTGTAGGAAATG -3’
（配列番号29）
尚、プライマー（a-10）及び（b-10）にはEcoRV制限酵素部位が付加されている。
鋳型DNAは、gapAプロモーター及びrrnBT1T2ターミネーター配列を含有するクローニングベクターpCRB207を用いた。
実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（宝酒造株式会社製）を用いて下記の条件で行った。【００９９】
2012033112.tif 000013
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。  *) pCRB207配列を増幅する場合はプライマー(a-10)と(b-10)の組み合わせで行った。【０１００】
2012033112.tif 000014
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、クローニングベクターpCRB207配列を含む約5.1-kbのDNA断片が検出できた。【０１０１】
上記のPCRにより増幅したpCRB207由来遺伝子を含む約5.1-kb DNA断片10μlを制限酵素EcoRVで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ  （宝酒造株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションG液とした。
得られたライゲーションG液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素EcoRVで切断し、制限酵素サイトの挿入を確認した。
PgapA配列及びrrnBT1T2ターミネーター配列を含むクローニングベクターをpCRB210と命名した。【０１０２】
(3) フェノール生産遺伝子のクローニング
コリネバクテリウム グルタミカム由来のフェノール生産遺伝子のクローニング
コリネバクテリウム グルタミカム由来のDAHPシンテターゼをコードするaroG遺伝子、コリスミ酸ムターゼをコードするcsm遺伝子をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、aroG遺伝子及びcsm遺伝子をそれぞれクローン化するべく、配列番号30（コリネバクテリウム グルタミカムaroG遺伝子）及び配列番号31（コリネバクテリウム グルタミカムcsm遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【０１０３】
aroG遺伝子増幅用プライマー
（a-11）； 5’- CTCT CATATG AATAGGGGTGTGAGTTGG -3’    （配列番号32）
（b-11）； 5’- CTCT CATATG TTAATTACGCAGCATTTCTGCAACG -3’
（配列番号33）
尚、プライマー（a-11）及び（b-11）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
csm遺伝子増幅用プライマー
（a-12）； 5’- CTCT CATATG ACTAATGCAGGTGACAACTTC -3’（配列番号34）
（b-12）； 5’- CTCT CATATG TTATCCGAGCTTTCCGCG -3’   （配列番号35）
尚、プライマー（a-12）及び（b-12）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。【０１０４】
パントエア アグロメランス由来のフェノール生産遺伝子のクローニング
パントエア アグロメランス由来のチロシン フェノール-リアーゼ活性を有する遺伝子をコードするtpl遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、tpl遺伝子をクローン化するべく、配列番号36（パントエア アグロメランスtpl遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【０１０５】
tpl遺伝子増幅用プライマー
（a-13）；  5’- CTCT CATATG AACTATCCTGCCGAGC -3’  （配列番号37）
（b-13）；  5’- CTCT CATATG TTAAATAAAGTCAAAACGCGCAGTAAAG -3’
（配列番号38）
尚、プライマー（a-13）及び（b-13）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。【０１０６】
シトロバクター  ブラッキー由来のフェノール生産遺伝子のクローニング
シトロバクター ブラッキー由来のチロシン フェノール-リアーゼ活性を有する遺伝子をコードするtpl遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。  PCRに際して、tpl遺伝子をクローン化するべく、配列番号39（シトロバクター ブラッキー tpl遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【０１０７】
tpl遺伝子増幅用プライマー
（a-14）； 5’- CTCT TCATGA ATTATCCGGCAGAACCC -3’    （配列番号40）
（b-14）； 5’- CTCT TCATGA TTAGATATAGTCAAAGCGTGCAG -3’
（配列番号41）
尚、プライマー（a-14）及び（b-14）には、BspHI制限酵素部位が付加されている。【０１０８】
デスルフィトバクテリューム ハフニエンス由来のフェノール生産遺伝子のクローニング
デスルフィトバクテリューム ハフニエンス由来のチロシン フェノール-リアーゼ活性を有する遺伝子をコードするtpl遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、tpl遺伝子をクローン化するべく、配列番号42（デスルフィトバクテリューム ハフニエンス tpl遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【０１０９】
tpl遺伝子増幅用プライマー
（a-15）； 5’- CTCT GATATC ATGAAAACCTATCCTGCAGAACC -3’
（配列番号43）
（b-15）； 5’- CTCT GATATC TCAAATGTGTTCAAATCTGGCGG -3’
（配列番号44）
尚、プライマー（a-15）及び（b-15）には、EcoRV制限酵素部位が付加されている。【０１１０】
クロロフレクサス オウランティアカス由来のフェノール生産遺伝子のクローニング
クロロフレクサス オウランティアカス由来のチロシン フェノール-リアーゼ活性を有する遺伝子をコードするtpl遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、tpl遺伝子をクローン化するべく、配列番号45（クロロフレクサス オウランティアカスtpl遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。
tpl遺伝子増幅用プライマー
（a-16）；  5’- CTCT CATATG CAGGAACAAGACTACCC -3’   （配列番号46）
（b-16）；  5’- CTCT CATATG TCATTCCACCGGTTCAAACC -3’（配列番号47）
尚、プライマー（a-16）及び（b-16）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。【０１１１】
ノストック パンクチフォルメ由来のフェノール生産遺伝子のクローニング
ノストック パンクチフォルメ由来のチロシン フェノール-リアーゼ活性を有する遺伝子をコードするtpl遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、tpl遺伝子をクローン化するべく、配列番号48（ノストック パンクチフォルメtpl遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【０１１２】
tpl遺伝子増幅用プライマー
（a-17）；  5’- CTCT CATATG ACCGATGCCAAGCAAAC -3’  （配列番号49）
（b-17）；  5’- CTCT CATATG TTACTGCAATTCAAATCTTGCTTGAAAG -3’
（配列番号50）
尚、プライマー（a-17）及び（b-17）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。【０１１３】
トレポネマ デンティコラ由来のフェノール生産遺伝子のクローニング
トレポネマ デンティコラ由来のチロシン フェノール-リアーゼ活性を有する遺伝子をコードするtpl遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、tpl遺伝子をクローン化するべく、配列番号51（トレポネマ デンティコラtpl遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【０１１４】
tpl遺伝子増幅用プライマー
（a-18）； 5’- CTCT CATATG GATATTAAAAATTATCCTGCGGAAC -3’
（配列番号52）
（b-18）； 5’- CTCT CATATG TTAGATATGCTCAAAGCGTGCC -3’
（配列番号53）
尚、プライマー（a-18）及び（b-18）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。【０１１５】
鋳型DNAは、コリネバクテリウム グルタミカムは、コリネバクテリウム グルタミカムRから抽出した染色体DNAを用いた。パントエア アグロメランスは、NITE Biological Resource Center（NBRC）より入手したパントエア アグロメランスNBRC 12686から抽出した染色体DNAを用いた。シトロバクター ブラッキーは、American Type Culture Collection (ATCC)より入手したシトロバクター ブラッキーATCC 6750から抽出した染色体DNAを用いた。デスルフィトバクテリューム ハフニエンスは、デスルフィトバクテリューム ハフニエンス Y51から抽出した染色体DNAを用いた。クロロフレクサス オウランティアカスは、American Type Culture Collection (ATCC)より入手したクロロフレクサス オウランティアカス  J-10-f1 ATCC 29366から抽出した染色体DNAを用いた。ノストック パンクチフォルメは、American Type Culture Collection (ATCC)より入手したノストック パンクチフォルメ ATCC 29133から抽出した染色体DNAを用いた。トレポネマ デンティコラは、Japan Collection of Microorganisms (JCM)より入手したトレポネマ デンティコラ染色体DNA（catalog No. RDB 6217）を用いた。【０１１６】
実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
2012033112.tif 000015
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
*) コリネバクテリウム グルタミカムaroG遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-11) と (b-11) の組み合わせ、コリネバクテリウム グルタミカムcsm遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-12) と (b-12) 、パントエア アグロメランス tpl遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-13) と (b-13) の組み合わせ、シトロバクター ブラッキーtpl遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-14) と (b-14) の組み合わせ、デスルフィトバクテリューム ハフニエンスtpl遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-15) と (b-15) の組み合わせ、クロロフレクサス オウランティアカスtpl遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-16) と (b-16) の組み合わせ、ノストック パンクチフォルメ tpl遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-17) と (b-17) の組み合わせ、トレポネマ デンティコラ tpl遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-18) と (b-18) の組み合わせで行った。【０１１７】
2012033112.tif 000016
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【０１１８】
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、コリネバクテリウム グルタミカムaroG遺伝子の場合約1.4-kb、コリネバクテリウム グルタミカムcsm遺伝子の場合約0.3-kb、パントエア アグロメランス tpl遺伝子の場合約1.4-kb、シトロバクター ブラッキーtpl遺伝子の場合約1.4-kb、デスルフィトバクテリューム  ハフニエンスtpl遺伝子の場合約1.4-kb、クロロフレクサス  オウランティアカスtpl遺伝子の場合約1.4-kb、ノストック  パンクチフォルメ tpl遺伝子の場合約1.4-kb、トレポネマ  デンティコラ tpl遺伝子の場合約1.4-kbのDNA断片が検出できた。【０１１９】
(4) フェノール生産遺伝子発現プラスミドの構築
フェノール生産遺伝子のpCRB207へのクローニング
上記項(3)に示したPCRにより増幅したシトロバクター ブラッキー株由来 tpl遺伝子を含む約1.4-kb DNA断片10μlを制限酵素BspHIで、PgapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB207  2μlを制限酵素NcoIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製）  1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションH液とした。
得られたライゲーションH液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
各々培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB207約5.1-kbのDNA断片に加え、シトロバクター ブラッキー株由来tpl遺伝子（ライゲーションH液）の場合、長さ約1.4-kbの挿入断片が認められた。
シトロバクター ブラッキー株由来tpl遺伝子を含むプラスミドをpCRB207-tpl/CBと命名した（図３）。【０１２０】
フェノール生産遺伝子のpCRB209へのクローニング
上記項(3)に示したPCRにより増幅したコリネバクテリウム グルタミカム株由来aroG遺伝子を含む約1.4-kb DNA断片、コリネバクテリウム グルタミカム株由来csm遺伝子を含む約0.3-kb DNA断片、パントエア アグロメランス株由来tpl遺伝子を含む約1.4-kb DNA断片、クロロフレクサス オウランティアカス株由来tpl遺伝子を含む約1.4-kb DNA断片、ノストック パンクチフォルメ株由来tpl遺伝子を含む約1.4-kb DNA断片及びトレポネマ  デンティコラ株由来tpl遺伝子を含む約1.4-kb DNA断片 10μl及びPgapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB209  2μlを各々制限酵素NdeIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ  （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションI液、J液、K液、L液、M液及びN液とした。【０１２１】
得られた6種のライゲーションI液、J液、K液、L液、M液及びN液それぞれを、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
各々培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB209約5.1-kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウム グルタミカム株由来aroG遺伝子（ライゲーションI液）の場合、長さ約1.4-kbの挿入断片が、コリネバクテリウム グルタミカム株由来csm遺伝子（ライゲーションJ液）の場合、長さ約0.3-kbの挿入断片が、パントエア アグロメランス株由来tpl遺伝子（ライゲーションK液）の場合、長さ約1.4-kbの挿入断片が、クロロフレクサス オウランティアカス株由来tpl遺伝子（ライゲーションL液）の場合、長さ約1.4-kbの挿入断片が、ノストック パンクチフォルメ株由来tpl遺伝子（ライゲーションM液）の場合、長さ約1.4-kbの挿入断片が、トレポネマ デンティコラ株由来 tpl遺伝子（ライゲーションN液）の場合、長さ約1.4-kbの挿入断片が認められた。【０１２２】
コリネバクテリウム グルタミカム株由来aroG遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-aroG/CG、コリネバクテリウム グルタミカム株由来csm遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-csm/CG、パントエア アグロメランス株由来tpl遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-tpl/PA、クロロフレクサス オウランティアカス株由来tpl遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-tpl/CA、ノストック パンクチフォルメ株由来tpl遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-tpl/NP、トレポネマ デンティコラ株由来 tpl遺伝子を含むプラスミドをpCRB209-tpl/TDとそれぞれ命名した（図３）。【０１２３】
フェノール生産遺伝子のpCRB210へのクローニング
上記項(3)に示したPCRにより増幅したデスルフィトバクテリューム ハフニエンス株由来tpl遺伝子を含む約1.4-kb DNA断片10μl及びPgapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB210  2μlを各々制限酵素EcoRVで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ  （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションO液とした。
得られたライゲーションO液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
各々培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB210約5.1-kbのDNA断片に加え、デスルフィトバクテリューム ハフニエンス株由来tpl遺伝子（ライゲーションO液）の場合、長さ約1.4-kbの挿入断片が認められた。
デスルフィトバクテリューム ハフニエンス株由来tpl遺伝子を含むプラスミドをpCRB210-tpl/DHと命名した（図３）。【０１２４】
フェノール生産遺伝子のpCRB1へのクローニング
上述のプラスミドpCRB209-aroG/CGを制限酵素BamHIで切断し、アガロース電気泳動後、アガロースゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（株式会社キアゲン社製）によって回収したgapAプロモーターとコリネバクテリウム グルタミカム株由来aroG遺伝子及びターミネーター配列を連結した約2.4-kbのDNA断片とBamHIで切断したクローニングベクターpCRB1 〔Nakata, K. et al., Vectors for the genetics engineering of corynebacteria; in Saha, B.C. (ed.):Fermentation Biotechnology, ACS Symposium Series 862. Washington, American Chemical Society : 175-191 (2003)〕約4.1-kbを70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させたDNA断片を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションP液とした。
得られたライゲーションP液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、クロラムフェニコール50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素BamHIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB1約4.1-kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウム グルタミカム株由来aroG遺伝子（ライゲーションP液）の場合、長さ約2.4-kbの挿入断片が認められた。
コリネバクテリウム グルタミカム株由来aroG遺伝子を含むプラスミドをpCRB1-aroG/CGと命名した（図４）。【０１２５】
フェノール生産遺伝子のpCRB15へのクローニング
上述のプラスミドpCRB209-csm/CGを制限酵素BamHIで切断し、アガロース電気泳動後、アガロースゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（株式会社キアゲン社製）によって回収したgapAプロモーターとコリネバクテリウム グルタミカム株由来csm遺伝子及びターミネーター配列を連結した約1.3-kbのDNA断片とBamHIで切断した上述のプラスミドpCRB15約3.8-kbを70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させたDNA断片を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションQ液とした。
得られたライゲーションQ液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、ゼオシン 25μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素BamHIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB15約3.8-kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウム グルタミカム株由来csm遺伝子（ライゲーションQ液）の場合、長さ約1.3-kbの挿入断片が認められた。
コリネバクテリウム グルタミカム株由来csm遺伝子を含むプラスミドをpCRB15-csm/CGと命名した（図４）。【０１２６】
(5)コリネバクテリウム グルタミカムの染色体遺伝子破壊用プラスミドの構築
コリネバクテリウム グルタミカム株pheA遺伝子破壊用プラスミドの構築
コリネバクテリウム グルタミカム株の染色体上pheA遺伝子のマーカーレス破壊用プラスミドを構築するために必要なDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際してコリネバクテリウム グルタミカム  Rの配列を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【０１２７】
pheA-1領域増幅用プライマー
（a-19）； 5’- CTCT CTGCAG TGAAGTGCGTGTAAACGCAC -3’（配列番号54）
（b-19）； 5’- GCTTAGCTAGTTGGTCGGTTGCAATGATTTGCACGTTGGAG -3’
（配列番号55）
尚、プライマー（a-19）には、PstI制限酵素部位が付加されている。【０１２８】
pheA-2領域増幅用プライマー
（a-20）；  5’- AACCGACCAACTAGCTAAGC -3’            （配列番号56）
（b-20）；  5’- CTCT TCTAGA AATTACTCCTGCCATGGCAG -3’（配列番号57）
尚、プライマー（b-20）には、XbaI制限酵素部位が付加されている。【０１２９】
鋳型DNAは、コリネバクテリウム グルタミカムRから抽出した染色体DNAを用いた。
実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。【０１３０】
2012033112.tif 000017
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
*) pheA-1領域を増幅する場合はプライマー(a-19) と (b-19) の組み合わせ、pheA-2領域を増幅する場合はプライマー(a-20) と (b-20)で行った。【０１３１】
2012033112.tif 000018
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【０１３２】
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、コリネバクテリウム グルタミカムコリpheA-1領域の場合約0.9-kb、pheA-2領域の場合約0.8-kbのDNA断片が検出できた。【０１３３】
次に、上記のPCRにより増幅したpheA-1領域断片とpheA-2領域断片を1μlずつ混合し、PCRにより2種の断片の結合反応を行った。
実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
2012033112.tif 000019
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
*) pheA-1領域断片 と pheA-2領域断片で行った。【０１３４】
2012033112.tif 000020
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【０１３５】
さらに、得られたpheA-1及びpheA -2の結合断片を鋳型とし、PCRによりpheA欠失断片の増幅を行った。
実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
2012033112.tif 000021
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
*) pheA欠失断片を増幅する場合はプライマー(a-19) と (b-20) の組み合わせで行った。【０１３６】
2012033112.tif 000022
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、pheA欠失断片約1.6-kbが検出できた。【０１３７】
上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウム グルタミカム R由来pheA欠失配列約1.6-kb DNA断片10μlと約4.4-kbのマーカーレス染色体遺伝子導入用プラスミドpCRA725 [J. Mol. Microbiol. Biotechnol.、Vol. 8、243-254(2004) 、（特開2006-124440）] 2μlを各々制限酵素PstI及びXbaIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションR液とした。
得られたライゲーションR液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素PstI及びXbaIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRA725約4.4-kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウム グルタミカム株由来pheA欠失遺伝子（ライゲーションR液）の場合、長さ約1.6-kbの挿入断片が認められた。
コリネバクテリウム グルタミカム株由来pheA欠失遺伝子を含むプラスミドをpCRA725-pheA/CGと命名した。【０１３８】
コリネバクテリウム グルタミカム株poxF遺伝子破壊用プラスミドの構築
コリネバクテリウム グルタミカム株の染色体上poxF遺伝子のマーカーレス破壊用プラスミドを構築するために必要なDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際してコリネバクテリウム グルタミカム  Rの配列を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。【０１３９】
poxF-1領域増幅用プライマー
（a-21）； 5’- CTCT TCTAGA TACGTCCTAAACACCCGAC -3’（配列番号58）
（b-21）； 5’- GACCAACCATTGCTGACTTGCGTATCCATAGTCAGGCTTC -3’
（配列番号59）
尚、プライマー（a-21）には、XbaI制限酵素部位が付加されている。【０１４０】
poxF-2領域増幅用プライマー
（a-22）；  5’- CAAGTCAGCAATGGTTGGTC -3              （配列番号60）
（b-22）；  5’- CTCT TCTAGA TGATCAGTACCAAGGGTGAG -3’ (配列番号61）
尚、プライマー（b-22）には、XbaI制限酵素部位が付加されている。【０１４１】
鋳型DNAは、コリネバクテリウム グルタミカムRから抽出した染色体DNAを用いた。
実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。【０１４２】
2012033112.tif 000023
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
*) poxF -1領域を増幅する場合はプライマー(a-21) と (b-21) の組み合わせ、poxF -2領域を増幅する場合はプライマー(a-22) と (b-22)で行った。【０１４３】
2012033112.tif 000024
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【０１４４】
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、コリネバクテリウム  グルタミカムpoxF-1領域の場合約0.8-kb、poxF-2領域の場合約0.8-kbのDNA断片が検出できた。【０１４５】
次に、上記のPCRにより増幅したpoxF-1領域断片とpoxF-2領域断片を1μlずつ混合し、PCRにより2種の断片の結合反応を行った。
実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
2012033112.tif 000025
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
*) poxF-1領域断片 と poxF-2領域断片で行った。【０１４６】
2012033112.tif 000026
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【０１４７】
さらに、得られたpoxF-1及びpoxF-2の結合断片を鋳型とし、PCRによりpoxF欠失断片の増幅を行った。
実際のPCRは、サーマルサイクラー  GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。【０１４８】
2012033112.tif 000027
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
*) poxF欠失断片を増幅する場合はプライマー(a-21) と (b-22) の組み合わせで行った。【０１４９】
2012033112.tif 000028
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、poxF欠失断片約1.6-kbが検出できた。【０１５０】
上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウム グルタミカム R由来poxF欠失配列約1.7-kb DNA断片10μlと約4.4-kbのマーカーレス染色体遺伝子導入用プラスミドpCRA725 [J. Mol. Microbiol. Biotechnol.、Vol. 8、243-254(2004) 、（特開2006-124440）] 2μlを各々制限酵素XbaIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションS液とした。
得られたライゲーションS液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素XbaIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRA725約4.4-kbのDNA断片に加え、コリネバクテリウム グルタミカム株由来pheA欠失遺伝子（ライゲーションS液）の場合、長さ約1.7-kbの挿入断片が認められた。
コリネバクテリウム グルタミカム株由来poxF欠失遺伝子を含むプラスミドをpCRA725- poxF/CGと命名した。【０１５１】
(6)副生経路及びフェノール分解に関わる遺伝子破壊株の構築
マーカーレス染色体遺伝子導入用ベクターpCRA725は、コリネバクテリウム グルタミカムR内で複製不能なプラスミドである。pCRA725-pheA/CGを用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol.、Vol. 144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムRを形質転換し、カナマイシン 50μg/mlを含むA寒天培地〔A液体培地、および1.5% 寒天〕に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10%(W/V)スクロース含有BT寒天培地[(NH2)2CO  2g、(NH4)2SO4  7g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 mlを蒸留水1Lに溶解、および1.5% 寒天]に塗付した。
プラスミドpCRA725-pheA/CGが染色体上の相同領域との一重交叉株の場合、pCRA725-pheA/CG上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、バチラス  サブチリス（Bacillus subtilis）のsacR-sacB遺伝子の発現によるスクロース含有培地での致死性を示すのに対し、二重交叉株の場合、pCRA725-pheA/CG上のカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、sacR-sacB遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での生育性を示す。従って、マーカーレス染色体遺伝子破壊株は、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示す。
そこで、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示した株を選択した。このコリネバクテリウム グルタミカムR株pheA遺伝子マーカーレス破壊株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）PHE1と命名した（表１）。【０１５２】
同様に、上記（5）で構築した、コリネバクテリウム グルタミカムR株においてフェノール2-モノオキシゲナーゼ活性を有する酵素をコードするpoxF遺伝子マーカーレス破壊用プラスミドpCRA725-poxF/CGを用いて電気パルス法[Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol.、Vol. 144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムΔpheA株を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。上記の培地で得られた一重交叉株を、10%(W/V)スクロース含有BT寒天培地に塗付しカナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を選択した。
この得られたpheA遺伝子及びpoxF遺伝子マーカーレス破壊株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）PHE2と命名した（表１）。【０１５３】
【表１】
2012033112.tif 000029
【０１５４】
(7) チロシン フェノール-リアーゼ活性を有するtpl酵素遺伝子導入株の構築
上述のプラスミド6種類pCRB209-tpl/PA、pCRB207-tpl/CB、pCRB210-tpl/DH、pCRB209-tpl/CA、pCRB209-tpl/NP及びpCRB209-tpl/TDを用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol.54、443-447(1990) 及び Res. Microbiol.、Vol.144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカム R 株を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB209-tpl/PA、pCRB207-tpl/CB、pCRB210-tpl/DH、pCRB209-tpl/CA、pCRB209-tpl/NP及びpCRB209-tpl/TDの導入が認められた。
得られた株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRB209-tpl/PA、R/pCRB207-tpl/CB、R/pCRB210-tpl/DH、R/pCRB209-tpl/CA、R/pCRB209-tpl/NP及びR/pCRB209-tpl/TDと命名した。【０１５５】
(8) フェノール生産遺伝子導入株の構築
上述のプラスミドpCRB209-tpl/PAを用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol.、Vol. 144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムR株を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入プラスミドを確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB209-tpl/PAの導入が認められた。
得られた株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）PHE3と命名した。【０１５６】
また、上述のプラスミドpCRB209-tpl/PA及びpCRB1-aroG/CGを用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol.、Vol. 144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムR株を形質転換し、カナマイシン 50μg/ml及びクロラムフェニコール 5μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。尚、これら2種類のプラスミドは、コリネバクテリウム グルタミカム内で共存可能なプラスミドである。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB209-tpl/PA及びpCRB1-aroG/CGの導入が認められた。得られた株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）PHE4と命名した。【０１５７】
上述のプラスミドpCRB209-tpl/PA、pCRB1-aroG/CG及びpCRB15-csm/CGを用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol.、Vol. 144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムR株を形質転換し、カナマイシン 50μg/ml、クロラムフェニコール 5μg/ml及びゼオシン25μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。尚、これら3種類のプラスミドは、コリネバクテリウム グルタミカム内で共存可能なプラスミドである。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB209-tpl/PA、pCRB1-aroG/CG及びpCRB15-csm/CGの導入が認められた。得られた株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）PHE5と命名した。尚、本株の遺伝子組換えの概要は、表２にまとめて示した。【０１５８】
【表２】
2012033112.tif 000030
＊)  表２内の表示の略語は以下の通り
＜遺伝子起源略語＞
PA；  パントエア アグロメランス
CG；  コリネバクテリウム グルタミカム  R【０１５９】
(9) 副生経路及びフェノール分解遺伝子破壊株へのフェノール生産遺伝子の導入
上述のプラスミドpCRB209-tpl/PA、pCRB1-aroG/CG及びpCRB15-csm/CGを用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol.、Vol. 144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムPHE1（ΔpheA）株、及びPHE2（ΔpheAΔpoxF）株を形質転換し、カナマイシン 50μg/ml、クロラムフェニコール 5μg/ml及びゼオシン25μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。尚、これら3種類のプラスミドは、コリネバクテリウム グルタミカム内で共存可能なプラスミドである。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpCRB209-tpl/PA、pCRB1-aroG/CG及びpCRB15-csm/CGの導入が認められた。PHE1（ΔpheA）株に導入した株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）PHE6、PHE2（ΔpheAΔldhA）株に導入した株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）PHE7と命名した。尚、本株の遺伝子組換えの概要は、表6にまとめて示した。コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）PHE7は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818）の独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託した（受託日：2011年8月12日、受託番号：NITE BP-976）（原寄託の受託日：2010年8月31日、受託番号：NITE P-976）。【０１６０】
【表３】
2012033112.tif 000031
＊)  表内の表示の略語は以下の通り
＜遺伝子起源略語＞
PA；  パントエア アグロメランス
CG；  コリネバクテリウム グルタミカム  R【０１６１】
実施例３   tpl遺伝子導入株におけるチロシン フェノール-リアーゼ活性測定
(1) チロシン フェノール-リアーゼの活性測定
実施例2 (7)において構築したチロシン フェノール-リアーゼ遺伝子を導入したコリネバクテリウム グルタミカムR/pCRB209-tpl/PA、R/pCRB207-tpl/CB、R/pCRB210-tpl/DH、R/pCRB209-tpl/CA、R/pCRB209-tpl/NP及びR/pCRB209-tpl/TDを、カナマイシン 50μg/ml含むA寒天培地 [(NH2)2CO  2g、(NH4)2SO4  7g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁] に塗布し、28℃、20時間暗所に静置した。
上記のプレートで生育した各コリネバクテリウム グルタミカム チロシン フェノール-リアーゼ遺伝子導入株を、カナマイシン50μg/mlを含むA液体培地[(NH2)2CO  2g、(NH4)2SO4  7g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 g、glucose 40 gを蒸留水1Lに溶解] 10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて16時間、好気的に振盪培養を行った。【０１６２】
上記条件で生育したチロシン フェノール-リアーゼ遺伝子導入株を、カナマイシン50μg/ml を含有したA液体培地100mlに植菌し、33℃にて16時間、好気的に振盪培養を行った。コリネバクテリウム グルタミカムR は、A培地にカナマイシンを添加しないこと以外は同様の条件にて培養した。
このようにして培養増殖されたそれぞれの菌体を、遠心分離 (4℃、8,000×g, 10分)により回収した。ガラスビーズで菌体細胞を破砕した後、遠心分離(15,000 rpm, 20 min)によって得た細胞破砕上清を粗酵素液として用い、以下の方法によりTpl活性を測定した。
50 mM リン酸カリウムバッファー, pH 8.0, 2.5 mM L-Tyr, 0.1 mM ピリドキサールリン酸, 20% グリセロール、粗酵素液を混合し、30℃、30 分間反応を行った。反応停止は0.6N 塩酸（終濃度）添加により行った。これをフィルターろ過後、生じたフェノールはHPLCで分析、定量した（Cosmosil C18 ARII, 移動相20% MeOH, 0.07% 過塩素酸）。酵素反応により生じたフェノールと、酵素比活性を表４に示した。【０１６３】
この結果、コリネバクテリウム グルタミカムで発現させたパントエア アグロメランス株由来tpl遺伝子、シトロバクター ブラッキー株由来tpl遺伝子及びデスルフィトバクテリューム ハフニエンス株由来tpl遺伝子は特に高い活性を示し、クロロフレクサス オウランティアカス株由来tpl遺伝子、ノストック パンクチフォルメ株由来tpl遺伝子、トレポネマ デンティコラ株由来 tpl遺伝子についても活性が認められた。【０１６４】
【表４】
2012033112.tif 000032
【０１６５】
実施例４  コリネバクテリウム グルタミカム  フェノール生産遺伝子導入株のフェノール生成実験
フェノール生産遺伝子であるチロシン フェノール-リアーゼ酵素活性を有する酵素をコードするパントエア アグロメランスのtpl遺伝子、DAHPシンテターゼをコードするコリネバクテリウム グルタミカムのaroG遺伝子、コリスミン酸ムターゼをコードするコリネバクテリウム  グルタミカムのcsm遺伝子の効果を調べる為に、コリネバクテリウム グルタミカム  R株に各遺伝子を順番に積み重ねて導入し、フェノールの生産比較を行った。
実施例２で構築した（表2参照）PHE3(tpl遺伝子導入)、PHE4（tpl遺伝子及びaroG遺伝子導入）及びPHE5（tpl遺伝子、aroG遺伝子及びcsm遺伝子導入）株を、PHE3株はカナマイシン50μg/ml、PHE4株はカナマイシン50μg/ml及びクロラムフェニコール5μg/ml、PHE5株はカナマイシン 50μg/ml、クロラムフェニコール 5μg/ml及びゼオシン25μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO  2g、(NH4)2SO4  7g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁] に塗布し、28℃、20時間暗所に静置した。【０１６６】
上記のプレートで生育したコリネバクテリウム グルタミカム単一遺伝子導入株を、各抗生物質を含むA液体培地[(NH2)2CO  2g、(NH4)2SO4  7g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 g、glucose 40 gを蒸留水1Lに溶解] 10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、28℃にて15時間、好気的に振盪培養を行った。
上記条件で生育したフェノール生産遺伝子導入株を、各抗生物質を含むA液体培地100mlに植菌し、33℃にて24時間、好気的に振盪培養を行った。
フェノールの定量は、サンプリングした反応液を遠心分離（4℃、15,000×g、10分）し、得られた上清液を液体クロマトグラフィーで分析することにより行った。
結果を以下の表５に示す。コリネバクテリウム グルタミカム  PHE3は、24時間後に0.1 mMのフェノールを、コリネバクテリウム グルタミカム  PHE4は、24時間後に0.4 mMのフェノールを、コリネバクテリウム グルタミカム  PHE5は、24時間後に0.9 mMのフェノールを培養液中に生産していた。すなわち、tpl遺伝子の導入によりグルコースからフェノール生成を可能とし、aroG遺伝子及びcsm遺伝子の導入による代謝改変により、フェノール生成量の増大を達成した。【０１６７】
【表５】
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＊)  表内の表示の略語は以下の通り
＜遺伝子起源略語＞
PA；  パントエア アグロメランス
CG；  コリネバクテリウム グルタミカム  R【０１６８】
実施例５  フェノール生産遺伝子を導入した、副生経路及びフェノール分解遺伝子破壊株のフェノール生成実験
実施例２において構築したフェノール生産遺伝子発現プラスミドpCRB209-tpl/PA、pCRB1-aroG/CG及びpCRB15-csm/CGを導入したコリネバクテリウム グルタミカム染色体遺伝子マーカーレス破壊株PHE6(ΔpheA)、及びPHE7(ΔpheAΔpoxF)株を、カナマイシン 50μg/ml、クロラムフェニコール 5μg/ml及びゼオシン25μg/ml含むA寒天培地 [(NH2)2CO  2g、(NH4)2SO4  7g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁] に塗布し、28℃、20時間暗所に静置した(表６)。【０１６９】
上記のプレートで生育したフェノール生産遺伝子導入株を、カナマイシン 50μg/ml、クロラムフェニコール 5μg/ml及びゼオシン25μg/mlを含むA液体培地[(NH2)2CO  2g、(NH4)2SO4  7g、KH2PO4  0.5 g、K2HPO4  0.5 g、MgSO4.7H2O  0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O  1 ml、0.02% (w/v) biotin solution  1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract  2 g、vitamin assay casamino acid  7 g、glucose 40 gを蒸留水1Lに溶解] 10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて16時間、好気的に振盪培養を行った。
上記条件で生育したフェノール生産遺伝子導入株を、カナマイシン50μg/ml、クロラムフェニコール 5μg/ml及びゼオシン25μg/ml を含有したA液体培地100mlに植菌し、33℃にて24時間、好気的に振盪培養を行った。
フェノールの定量は、サンプリングした反応液を遠心分離（4℃、15,000Xg、10分）し、得られた上清液を液体クロマトグラフィーで分析することにより行った。【０１７０】
この結果、24時間後に、コリネバクテリウム グルタミカム野生株を宿主としたPHE5は、24時間後に0.9 mMのフェノールを生成したのに対して、pheA遺伝子を破壊したコリネバクテリウム グルタミカムを宿主としたPHE6は、5.8 mMのフェノールを、pheA及びpoxF遺伝子を破壊したコリネバクテリウム グルタミカムを宿主としたPHE7は、6.9  mMのフェノールを生成していた。
すなわち、フェニールアラニンへの副生経路を遮断したpheA遺伝子破壊、及びフェノールの分解経路を遮断したpoxF遺伝子破壊による代謝工学的改変により、順次フェノール生産性の向上が達成された。【０１７１】
【表６】
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＊)  表内の表示の略語は以下の通り
＜遺伝子起源略語＞
PA；  パントエア  アグロメランス
CG；  コリネバクテリウム グルタミカム【０１７２】
実施例６  コリネバクテリウム グルタミカムPHE7を用いた還元条件下におけるフェノール生成実験
実施例２で創製したコリネバクテリウム グルタミカムPHE7フェノール生成株を、カナマイシン50μg/ml、クロラムフェニコール 5μg/ml及びゼオシン25μg/ml を含有したA寒天培地に塗布し、28℃、20時間暗所に静置した。
上記のプレートで生育したコリネバクテリウム グルタミカムPHE7フェノール生成株を、カナマイシン50μg/ml、クロラムフェニコール 5μg/ml及びゼオシン25μg/ml を含有したA液体培地10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、28℃にて15時間、好気的に振盪培養を行った。
上記条件で生育したコリネバクテリウム グルタミカムPHE7フェノール生成株を、カナマイシン50μg/ml、クロラムフェニコール 5μg/ml及びゼオシン25μg/ml を含有したA液体培地500mlの入った容量2Lの三角フラスコに植菌し、28℃にて15時間、好気的に振盪培養を行った。【０１７３】
このようにして培養増殖されたそれぞれの菌体は、遠心分離 (4℃、5,000×g, 15分)により菌体を回収した。得られた菌体を、終濃度OD610=35となるようにBT(-尿素)液体培地〔0.7% 硫酸アンモニウム、0.05% リン酸二水素カリウム、0.05% リン酸水素二カリウム、0.05% 硫酸マグネシウム・7水和物、0.0006% 硫酸鉄・7水和物、0.00042% 硫酸マンガン水和物、0.00002% ビオチン、0.00002% チアミン塩酸塩〕に懸濁した。このそれぞれの菌体懸濁液60mlを容量100mlメディウム瓶に入れ、還元条件下（酸化還元電位；-450 mV）、グルコースを8%となるように添加し、33℃に保った水浴中で攪拌しながら反応させた。この時、反応液のpHが7.0を下回らないように2.5Nのアンモニア水を用いてpHコントローラー (エイブル株式会社製、型式：DT-1023）でコントロールしながら反応した。
サンプリングした反応液を遠心分離 (4℃、15,000×g、10分) し、得られた上清液を用いてフェノールの定量を行った。
この結果、コリネバクテリウム グルタミカムPHE7フェノール生成株は、還元条件下における反応において、好気培養と比較して高い生産性を示し、24時間後に11.3 mMのフェノールを生成していた。
【産業上の利用可能性】
【０１７４】
本発明方法によれば、微生物を用いて実用的な効率でフェノールを製造することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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