(57)【要約】  食経験があり長期間摂取における安全性が明確なLactobacillus gasseriの菌体画分が、遅延型過敏性反応を抑制することが明らかとなった。したがって本発明は、Lactobacillus gasseriの菌体画分を含有する遅延型過敏症の軽減剤を提供する。また、当該Lactobacillus gasseriの菌体画分を含有する遅延型過敏症軽減用の食品組成物を提供する。なお本発明では、当該菌体画分のうちRNA画分が、特に高い遅延型過敏性反応の抑制効果を示すことが明らかとなった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Lactobacillus gasseriの菌体画分を有効成分とする遅延型過敏症を軽減するための薬剤。
【請求項２】
前記菌体画分がRNA画分であることを特徴とする請求項１記載の薬剤。
【請求項３】
前記Lactobacillus gasseriが、Lactobacillus gasseri  OLL2809菌株（受託番号：FERM BP-10542）であることを特徴とする請求項１または２記載の薬剤。
【請求項４】
遅延型過敏症の軽減作用がCD4+ T細胞増殖の抑制作用を介するものである請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の薬剤の有効量を含有せしめた遅延型過敏症を軽減するための食品組成物。
【請求項６】
乳児用調製粉乳、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品、保健機能食品、病者用食品、または乳製品である請求項５記載の食品組成物。
【請求項７】
遅延型過敏症を軽減するための組成物の製造におけるLactobacillus gasseriの菌体画分の使用。
【請求項８】
組成物が、乳児用調製粉乳、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品、保健機能食品、病者用食品、または乳製品に配合されたものである請求項７記載の使用。
【請求項９】
Lactobacillus gasseriの菌体画分の有効量を対象に投与する工程を含む、遅延型過敏症を軽減するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遅延型過敏症を軽減するための薬剤、およびこれを含有する遅延型過敏症軽減用の食品組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
過敏性反応、即ちアレルギー疾患にはI型からIV型までの分類があり、それぞれでその発症メカニズムと症状は異なっている。I型アレルギーでは、抗原感作によって抗原特異的IgEの産生が誘導され、産生されたIgEが肥満細胞の表面に結合する。そこに体内に侵入してきた抗原がその特異的IgEによって捕捉されると、肥満細胞からヒスタミンなどのケミカルメディエーターが分泌される。これにより血管透過性の亢進や気管支収縮が起こり、くしゃみや鼻水などの即時型過敏性反応を呈する。
一方でIV型アレルギーは遅延型過敏性反応による疾患であり、抗原特異的なT細胞がマクロファージなどを活性化して炎症を引き起こし、皮膚などに腫脹を誘発する疾患である。【０００３】
これまでに、乳酸菌などの微生物による即時型過敏性反応への効果が記載された先行技術は多く存在している（特許文献１〜３）。例えば、特許文献３には、Lactobacillus属乳酸菌がアレルギー疾患に効果があることが記載されている。当該文献では、ヒト糞便から分離した、Lactobacillus gasseri OLL2809菌株が、即時型アレルギーに有用であることが記載されている。しかしながら、乳酸菌などの微生物と遅延型過敏性反応の関連を示唆する先行技術は少ない。例えば、特許文献４は、Lactobacillus plantarumのアトピー性皮膚炎緩和剤に関する発明である。当該文献には、アトピー性皮膚炎のアレルギー型は、即時型（I型）アレルギーと遅延型（IV型）アレルギーの側面を併せ持つことが背景技術に記載されている。しかし実施例は、即時型アレルギーモデル及びアトピー性動物モデルでの検証のみで、遅延型過敏性反応に対する効果は何ら実証されていない。さらに、特許文献５は、テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属もしくはロイコノストック属に属する乳酸菌のインターロイキン12産生促進剤に関する発明である。当該文献では、これら乳酸菌がインターロイキン12の産生を促進し、遅延型（IV型）過敏性反応を増強させ、細胞性免疫が増強したことが記載されている。同様に、非特許文献１にはLactobacillus casei Shirota株の生菌を経口投与することで、免疫記憶を亢進し、遅延型過敏性反応が増強したことが示されている。
この様に、乳酸菌などの微生物と遅延型過敏性反応との関連性については、インターロイキン12の産生促進などによる細胞性免疫の増強によって、遅延型過敏性反応が増強することついては報告されている。一方、乳酸菌などの微生物によって遅延型過敏症が軽減したり、遅延型過敏性反応を抑制するといった報告はなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2004-18469号公報
【特許文献２】特許第3585487号公報
【特許文献３】WO2006/093022
【特許文献４】特開2010-47504
【特許文献５】特開2006-28047
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】de Waard R, Claassen E, Bokken GC, Buiting B, Garssen J, Vos JG."Enhanced immunological memory responses to Listeria monocytogenes in rodents, as measured by delayed-type hypersensitivity (DTH), adoptive transfer of DTH, and protective immunity, following Lactobacillus casei Shirota ingestion."Clin Diagn Lab Immunol. 2003 10(1):59-65.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、食経験があり長期間摂取における安全性が明確な、Lactobacillus gasseriの菌体画分を含む、遅延型過敏症の軽減用の薬剤を提供することを課題とする。また本発明は、これを含有する遅延型過敏症を軽減するための食品組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を行った。その結果、本発明者らは、乳酸菌の一種であるLactobacillus gasseriの菌体画分にCD4+T細胞に対する増殖抑制効果があることを明らかにした。また本発明者らは、Lactobacillus gasseri OLL2809菌株のRNA画分が、MyD88依存性シグナル伝達経路を介し、用量依存的にCD4+T細胞の増殖を抑制することを明らかにした。さらに本発明者らは、in vivoにおいてもLactobacillus gasseri OLL2809菌株が遅延型過敏性反応を抑制することを明らかにした。微生物の菌体画分がCD4+T細胞の増殖抑制に関与し、遅延型過敏性反応を抑制することを明らかにしたのは、本発明が初めてである。本発明はこのような知見に基づくものであり、以下の遅延型過敏症の軽減剤、および遅延型過敏症を軽減するための食品組成物などに関する。
〔１〕Lactobacillus gasseriの菌体画分を有効成分とする遅延型過敏症を軽減するための薬剤。
〔２〕前記菌体画分がRNA画分であることを特徴とする〔１〕記載の薬剤。
〔３〕前記Lactobacillus gasseriが、Lactobacillus gasseri  OLL2809菌株（受託番号：FERM BP-10542）であることを特徴とする〔１〕または〔２〕記載の薬剤。
〔４〕遅延型過敏症の軽減作用がCD4+ T細胞増殖の抑制作用を介するものである〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の薬剤。
〔５〕〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の薬剤の有効量を含有せしめた遅延型過敏症を軽減するための食品組成物または飲食品。
〔６〕乳児用調製粉乳、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品、保健機能食品、病者用食品、または乳製品である〔５〕記載の食品組成物または飲食品。
〔７〕遅延型過敏症を軽減するための組成物の製造におけるLactobacillus gasseriの菌体画分の使用。
〔８〕前記菌体画分がRNA画分であることを特徴とする〔７〕記載の使用。
〔９〕前記Lactobacillus gasseriが、Lactobacillus gasseri  OLL2809菌株（受託番号：FERM BP-10542）であることを特徴とする〔７〕または〔８〕記載の使用。
〔１０〕遅延型過敏症の軽減作用がCD4+ T細胞増殖の抑制作用を介するものである〔７〕〜〔９〕のいずれかに記載の使用。
〔１１〕組成物が飲食品に配合されたものである、〔７〕〜〔１０〕のいずれかに記載の使用。
〔１２〕飲食品が、乳児用調製粉乳、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品、保健機能食品、病者用食品、または乳製品である〔１１〕に記載の使用。
〔１３〕Lactobacillus gasseriの菌体画分の有効量を対象に投与する工程を含む、遅延型過敏症を軽減するための方法。
〔１４〕前記菌体画分がRNA画分であることを特徴とする〔１３〕記載の方法。
〔１５〕前記Lactobacillus gasseriが、Lactobacillus gasseri  OLL2809菌株（受託番号：FERM BP-10542）であることを特徴とする〔１３〕または〔１４〕記載の方法。
〔１６〕遅延型過敏症の軽減作用がCD4+ T細胞増殖の抑制作用を介するものである〔１３〕〜〔１５〕のいずれかに記載の方法。
〔１７〕遅延型過敏症の軽減に使用するためのLactobacillus gasseriの菌体画分。
〔１８〕前記菌体画分がRNA画分であることを特徴とする〔１７〕記載の菌体画分。
〔１９〕前記Lactobacillus gasseriが、Lactobacillus gasseri  OLL2809菌株（受託番号：FERM BP-10542）であることを特徴とする〔１７〕または〔１８〕記載の菌体画分。
〔２０〕遅延型過敏症の軽減作用がCD4+ T細胞増殖の抑制作用を介するものである〔１７〕〜〔１９〕のいずれかに記載の菌体画分。
〔２１〕飲食品に配合されたものである、〔１７〕〜〔２０〕のいずれかに記載の菌体画分。
〔２２〕飲食品が、乳児用調製粉乳、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品、保健機能食品、病者用食品、または乳製品である〔２１〕に記載の菌体画分。
【発明の効果】
【０００８】
本発明者らは後述する実施例において確認されたとおり、Lactobacillus gasseriの菌体画分が遅延型過敏症反応を抑制することを見出した。また、特に、Lactobacillus gasseri OLL2809菌株のRNA画分にその効果が高いことを見出した。Lactobacillus gasseriは食経験のある、安全性の高い乳酸菌である。従って、本発明の遅延型過敏症軽減剤、およびこれを含有する遅延型過敏症軽減用の食品組成物によって、遅延型過敏症を安全に軽減することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Lactobacillus gasseri OLL 2809菌株（図中ではLG2809）によるDO11.10由来脾臓CD4+ T細胞の増殖応答の抑制効果を示す図およびグラフである。BALB/cマウス脾臓細胞からからT細胞を除去した細胞(抗原提示細胞；APC)に、(B)加熱処理をしたLactobacillus属乳酸菌(LG2809、MEP225101、MEP225102(10μg dry weight/ml) あるいは、(C)LG2809を濃度依存的に添加して、4時間培養した。DO11.10マウス由来脾臓CD4+ T細胞とOVAペプチド (1μM)を添加して96時間培養後の増殖応答を、[3H]-チミジン取り込み量を測定することで検討した（A）。グラフは平均値+標準偏差を示す。群間の有意差はTukey法を用いて多重検定した（a-c:異符号間で有意差あり、P<0.05）。
【図２】Lactobacillus gasseri OLL 2809菌株（図中ではLG2809）によるCD4+ T細胞増殖応答抑制に関与する菌体成分の探索結果を示すグラフである。試験は図1Aと同様に行った。(A) 加熱処理をしたLG2809 (heat-killed)、LG2809の破砕液 (homogenate),破砕液の上清 (sup)、破砕液の沈殿 (ppt) (0.1, 1, 10 および100μg dry weight LG2809/ml)をAPC に添加した。(B) LG2809の破砕上清 (100μg dry weight LG2809/ml)を、5パターンで処理をした。破砕上清は、DNase I (iii)、Proteinase K (iv)、そして RNase A (v)で処理した。DNase I およびProteinase K は96℃で10分間加熱することで不活化し、RNase A はProteinase K 処理で不活化した。破砕上清は37℃ で4時間放置 (i)、または 37℃で4 時間放置し、その後96℃ で10分間加熱処理(ii)をすることで対照とした (C) LG2809 RNA (0.1、1および10μg/ml)、 または (D) マウス脾臓からのRNA (1、10μg/ml) を培養系に添加した。グラフは平均値+標準偏差を示す。群間の有意差は、Tukey法を用いて多重検定した（a-c:異符号間で有意差あり、P<0.05）。
【図３】Lactobacillus gasseri OLL 2809菌株（図中ではLG2809）およびそのRNA画分による、CD4+ T細胞の直接的な増殖応答を示す図およびグラフである。あらかじめ、抗CD3εモノクローナル抗体（10μg/ml）をコーティングしたプレートに、BALB/cマウスから調製したCD4+ T細胞（1×105cells／ウェル）と、 抗CD28モノクローナル抗体（2μg/ml）、(B)加熱処理をしたLG2809、(C)またはそのRNA、（D）またはマウス脾臓由来のRNAを、終濃度0.1〜10μg/mlになるように添加して96時間培養した。96時間培養の24時間前に、[3H]-チミジンをプレートに添加し、その取り込み量を測定することで検討した（A）。グラフは平均値+標準偏差を示す。群間の有意差は、Tukey法を用いて多重検定した（a-c:異符号間で有意差あり、P<0.05）。
【図４】Lactobacillus gasseri OLL 2809菌株（図中ではLG2809）とそのRNA画分によるCD4+ T細胞の増殖応答の抑制効果における、MyD88経路の関与を示す図およびグラフである。あらかじめ、抗CD3εモノクローナル抗体（10μg/ml）をコーティングしたプレートに、（B）BALB/cマウス（Wild-type）、または（C）MyD88欠損BALB/cマウス（MyD88-/-）から調製したCD4+ T細胞（1×105cells／ウェル）と、抗CD28モノクローナル抗体（2μg/ml）、加熱処理をしたLG2809とそのRNAを、終濃度10μg/mlになるように添加し、96時間培養した。96時間培養の24時間前に、[3H]-チミジンをプレートに添加し、その取り込み量を測定することで検討した（A）。グラフは平均値+標準偏差を示す。群間の有意差は、Tukey法を用いて多重検定した（a,b:異符号間で有意差あり、P<0.05）。
【図５】Lactobacillus gasseri OLL 2809菌株（図中ではLG2809）による増殖応答の抑制効果における酸化ストレスの関与を示す図およびグラフである。あらかじめ、抗CD3εモノクローナル抗体（10μg/ml）をコーティングしたプレートに、BALB/cマウス（Wild-type）から調製したCD4+ T細胞（1×105cells／ウェル）、N-アセチルシステイン（NAC、25mM）、抗CD28モノクローナル抗体（2μg/ml）、加熱処理をしたLG2809とそのRNA（終濃度10μg/ml)を添加し、96時間培養した。96時間培養の24時間前に、[3H]-チミジンをプレートに添加し、その取り込み量を測定することで検討した（A）。グラフは平均値+標準偏差を示す。群間の有意差は、Studentのt検定を用いた（**：P<0.01）（B）。
【図６】Lactobacillus gasseri OLL 2809菌株（図中ではLG2809）のRNA画分による遅延型過敏（DTH）反応の抑制効果を示す図およびグラフである。DO11.10マウスの尾部に、OVAとフロイント完全アジュバント（CFA）を注射して免疫した。14日後、生理食塩水を右足の足せきに注射し、反対側の足の足せきにOVAのみ、または、OVAとサンプルを混ぜたものを注射した。24時間後、足の腫れを測定した（A）,（B）。グラフは平均値+標準偏差を示す。群間の有意差は、Tukey法を用いて多重検定した（a-c：異符号間で有意差あり、P<0.05）（C）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、Lactobacillus gasseriの菌体画分を含む遅延型過敏症を軽減するための薬剤を提供する。また本発明は、Lactobacillus gasseriの菌体画分を含む遅延型過敏性反応を抑制するための薬剤を提供する。さらに本発明は、Lactobacillus gasseriの菌体画分を含むCD4+T細胞の増殖抑制剤を提供する。本明細書においては特に断りのない限り、これら「軽減剤」、「遅延型過敏性反応の抑制剤」および「CD4+T細胞の増殖抑制剤」を「本発明の薬剤」と総称する。
また本発明は、Lactobacillus gasseriの菌体画分を含む遅延型過敏症軽減用組成物を提供する。また本発明は、Lactobacillus gasseriの菌体画分を含む遅延型過敏性反応の抑制用組成物を提供する。さらに本発明は、Lactobacillus gasseriの菌体画分を含むCD4+T細胞の増殖抑制用組成物を提供する。本明細書においては特に断りのない限り、これら「軽減用組成物」、「遅延型過敏性反応の抑制用組成物」および「CD4+T細胞の増殖抑制用組成物」を「本発明の組成物」と総称する。組成物としては医薬組成物、食品組成物が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１１】
本明細書において「軽減」は、「改善」、「抑制」、「治療」と表現することもできる。従って本発明の「軽減」には、
・軽減
・改善
・抑制
・治療
が含まれる。
【００１２】
本発明の薬剤及び組成物は、その有効成分としてLactobacillus gasseriの菌体画分を含む。本発明の薬剤及び組成物は、医薬品または食品添加剤としても用いることができる。また、本発明の薬剤及び組成物は、Lactobacillus gasseriの菌体画分に加え、Lactobacillus gasseriの菌体画分以外の画分やLactobacillus gasseriそのもの（生菌）、Lactobacillus gasseriの死菌体を含んでもよい。あるいは生菌体を含まないことも可能である。つまり本発明の薬剤及び組成物は死菌体のみからなっていてもよい。
Lactobacillus gasseriの菌体画分は、菌体破砕液上清画分、菌体破砕液上清除タンパク質画分、RNA画分などがあげられるが、遅延型過敏性の軽減作用、遅延型過敏性反応の抑制作用、あるいはCD4+T細胞の増殖抑制作用を有する限りこれらに限定されない。本発明のLactobacillus gasseriの菌体画分として、好ましくは菌体破砕液上清画分、より好ましくはRNA画分が挙げられる。菌体破砕液上清画分、菌体破砕液上清除タンパク質画分、RNA画分は、実施例に記載の方法のほか、当業者に周知のRNA抽出方法や市販のRNA抽出キットを用いることによって調製することができる。
本発明のRNA画分は、RNAを含む限りRNA以外の核酸やタンパク質、細胞成分を含むものであってもよい。あるいはデオキシリボヌクレアーゼやプロテイナーゼなどの酵素処理を受けたものであってもよい。本発明のRNA画分の態様として、リボヌクレアーゼの作用を受けていないRNA抽出物を挙げることができるがこれに限定されない。
【００１３】
本発明の薬剤及び組成物は、その有効成分であるLactobacillus gasseriの菌体画分の他に、Lactobacillus gasseri以外の微生物を含んでいても良い。例えば、Lactobacillus属の乳酸菌であれば、Lactobacillus delbrueckii subsp. burgalicus、Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis、Lactobacillus paracasei subsp. paracasei、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus helveticus subsp. jugurti、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus amylovorus、Lactobacillus gallinarum、Lactobacillus oris、Lactobacillus casei subsp. rhamnosus、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus brevisなどを挙げることができるが、これらに限定されない。本発明の薬剤及び組成物は、このようなLactobacillus属の乳酸菌や他の微生物を１種または２種以上を含んでもよい。本発明のLactobacillus gasseriとして、特に好ましくはLactobacillus gasseri OLL2809 (受託番号：FERM BP-10542)（本菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている）が挙げられるが、これに限定されない。
【００１４】
本発明者らは、ヒト成人の糞便より独自に分離したLacgtobacillus gasseriから、マウス由来CD4+ T細胞（ヘルパーT細胞）の増殖を阻害し、さらに、Lactobacillus gasseriの菌体画分が遅延型過敏性反応を抑制することを見出した。またさらに、ヒト成人の糞便より独自に分離したLacgtobacillus gasseriの中でも、Lactobacillus gasseri OLL2809菌株（受託番号：FERM BP-10542）を選抜した。したがって本発明は、Lactobacillus gasseriの菌体画分を有効成分とする遅延型過敏症の軽減剤、またはこれらを含有する遅延型過敏症軽減用の食品組成物又は飲食品を提供する。
【００１５】
本発明者らは、Lactobacillus gasseri OLL2809菌株を独立行政法人産業技術総合研究所に寄託した。以下に、寄託を特定する内容を記載する。
（１）寄託機関名：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
（２）連絡先：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６
郵便番号 305-8566
電話番号 029-861-6029, 6079
（３）識別のための表示：Lactobacillus gasseri OLL2809（受託番号：FERM BP-10542）
（４）寄託日：平成１８年３月１日
【００１６】
Lactobacillus gasseri OLL2809菌株（受託番号：FERM BP-10542）は、グラム陽性桿菌であり、Lactobacilli MRS Agar（Difco）上でのコロニー形態は円形、淡黄色、扁平状である。生理学的特徴としては、ホモ乳酸発酵形式、45℃での発育性、グルコース、マンノース、フルクトース、ガラクトース、シュクロース、セロビオース、ラクトース、トレハロースに対する発酵性を有する。
【００１７】
Lactobacillus gasseri OLL2809菌株（受託番号：FERM BP-10542）を培養するための培地としては、乳酸菌の培地に通常用いられる培地が使用される。すなわち主炭素源のほか窒素源、無機物その他の栄養素を程良く含有する培地ならば、いずれの培地も使用可能である。炭素源としては、ラクトース、グルコース、スクロース、フラクトース、澱粉加水分解物、廃糖蜜などが、使用菌の資化性に応じて使用できる。窒素源としては、カゼインの加水分解物、ホエータンパク質加水分解物、大豆タンパク質加水分解物等の有機窒素含有物が使用できる。ほかに、増殖促進剤として、肉エキス、魚肉エキス、酵母エキス等が用いられる。
【００１８】
培養は嫌気条件下で行うことが望ましいが、通常用いられる液体静置培養などによる微好気条件下でもよい。嫌気培養には炭素ガス気層下で培養する方法などの公知の手法を適用することができるが、他の方法でもかまわない。培養温度は一般に30〜40℃が好ましいが、菌が生育する温度であれば他の温度条件でもよい。培養中の培地のpHは6.0〜7.0に維持することが好ましいが、菌が生育する温度であれば他のpH条件でもよい。また、バッチ培養条件下で培養することもできる。培養時間は通常10〜24時間が好ましいが、菌が生育することができる時間であれば、他の培養時間であってもよい。
【００１９】
本発明に使用可能なLactobacillus gasseriも、グラム陽性桿菌である点や、その他の生理学的特徴について、Lactobacillus gasseri OLL2809と同様の特徴を示す。このようなLactobacillus gasseriは、当業者であればヒト糞便等から生理学的特徴に基づいて分離することができる。培養も、Lactobacillus gasseri OLL2809について上述したのと同様の方法によって可能である。
【００２０】
本発明の薬剤及び組成物は、Lactobacillus gasseriに何らかの処理を施した乳酸菌処理物としてのLactobacillus gasseriの菌体画分を含んでも良い。あるいは、Lactobacillus gasseriの菌体画分とLactobacillus gasseriの菌体画分を内包した乳酸菌そのものや、Lactobacillus gasseriを培養した培地を含んでもよい。例えばLactobacillus gasseriを乳酸菌懸濁液、乳酸菌培養物（菌体、培養上清液（培地成分を含む））、乳酸菌発酵物（乳酸菌飲料、酸乳、ヨーグルト等）等として使用することができる。
【００２１】
本発明に用いられるLactobacillus gasseriに何らかの処理を施した乳酸菌処理物としては、例えばLactobacillus gasseriの菌体画分含有物、Lactobacillus gasseriの菌体画分を含有した発酵乳の濃縮物、Lactobacillus gasseriの菌体画分のペースト化物、Lactobacillus gasseriの菌体画分の乾燥物（噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物から選ばれる少なくともひとつ）、Lactobacillus gasseriの菌体画分の液状物、Lactobacillus gasseriの菌体画分の希釈物、Lactobacillus gasseriの菌体画分の破砕物等が挙げられる。また、Lactobacillus gasseriの菌体画分を調製する際のLactobacillus gasseriとしては生菌体、湿潤菌、乾燥菌等が適宜使用可能である。あるいは、殺菌すなわち加熱殺菌処理、放射線殺菌処理、または破砕処理等を施した死菌体であってもよい。これらの処理工程は単独であっても複数を併用してもかまわない。このような乳酸菌処理物を、粉ミルクなど生物学的規格を有する医薬品および／または飲食品においても添加することも可能であり、医薬品および／または飲食品の形態などによらず様々な医薬品および／または飲食品に応用できる。
【００２２】
本発明の薬剤及び組成物は、単独、または複数の混合物として経口投与したり、他の遅延型過敏症の軽減効果、予防効果、治療効果を有する化合物や微生物等と併用したりすることにより、ヒトおよび動物における遅延型過敏症の軽減に有効である。遅延型過敏症の種類は特に限定されないが、例えば、遅延型アトピー性皮膚炎、ツベルクリン反応、接触性皮膚炎、シェーグレン症候群、ギランバレー症候群、薬剤性肺炎等を挙げることができる。遅延型過敏症とは、これら遅延型過敏性反応を引き起こす疾患を包含し、遅延型過敏性反応に起因するアレルギー疾患と表現することもできる。
【００２３】
遅延型過敏症の軽減効果、遅延型過敏性反応の抑制効果は、遅延型過敏症に特有の、当業者に周知の様々な症状の変化を観察することにより確認することができる。例えば身体の各組織や器官における腫脹や炎症、かゆみ、かぶれ等の変化を観察することにより、遅延型過敏症の改善効果、遅延型過敏性反応の抑制効果を確認することができるがこれらに限定されない。またCD4+T細胞の増殖抑制の効果も、例えば実施例に記載されている[3H]-チミジンの取り込み量を測定する方法、MTTアッセイなど当業者に周知の方法により確認することができる。
【００２４】
本発明の薬剤や組成物を医薬品または飲食品へ配合する配合量は、形態、剤型、症状、体重、用途などによって異なるため、特に限定されないが、あえて挙げるなら、0.001〜100 %(w/w)の含量で配合することができ、好ましくは0.01〜100%(w/w)、さらに好ましくは0.1〜100%(w/w)の含量で配合することができる。
【００２５】
本発明の薬剤や組成物の医薬品または飲食品としての一日当たりの摂取量は年齢、症状、体重、用途などによって異なるため特に限定されないが、あえて挙げるなら0.1〜1000mg/kgを摂取することができ、好ましくは0.1〜100mg/kgを摂取することができる。
また本発明の薬剤は、経口投与又は非経口投与（筋肉内、皮下、静脈内、坐薬等）のいずれでも投与できる。
【００２６】
本発明の薬剤や組成物は、医薬品または飲食品のいずれの形態でも利用することができる。例えば、医薬品として直接投与することにより、または特定保健用食品等の特別用途食品や栄養機能食品として直接摂取することにより、各種の遅延型過敏症を軽減することが期待される。また、各種飲食品（乳製品、牛乳、清涼飲料、発酵乳、ヨーグルト、チーズ、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラスト、調製粉乳（特に乳児用調製粉乳）、流動食、病者用食品、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品、栄養食品、保健機能食品等）に本発明の薬剤や組成物、これらを構成する乳酸菌を添加し、これを摂取してもよい。Lactobacillus gasseriの菌体画分をそのまま使用し、あるいは、Lactobacillus gasseriの菌体画分を含む乳酸菌や、他の食品ないし食品成分と混合するなど、通常の飲食品組成物における常法にしたがって使用できる。また、その性状についても、通常用いられる飲食品の状態、例えば、固体状（粉末、顆粒状その他）、ペースト状、液状ないし懸濁状のいずれでもよい。
本発明の薬剤や組成物を含有する飲食品には、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を主成分として使用することができる。タンパク質としては、例えば全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、ホエー粉、ホエータンパク質、ホエータンパク質濃縮物、ホエータンパク質分離物、α―カゼイン、β―カゼイン、κ−カゼイン、β―ラクトグロブリン、α―ラクトアルブミン、ラクトフェリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、これら加水分解物；バター、乳性ミネラル、クリーム、ホエー、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分などが挙げられる。糖質としては、糖類、加工澱粉（テキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維などが挙げられる。脂質としては、例えば、ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂；パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミンA、カロチン類、ビタミンB群、ビタミンC、ビタミンD群、ビタミンE、ビタミンK群、ビタミンP、ビタミンQ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレンなどが挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。これらの成分は、2種以上を組み合わせて使用することができ、合成品および／またはこれらを多く含む食品を用いてもよい。
【００２７】
本発明の薬剤や組成物を医薬品として使用する場合には、種々の形態で投与することができる。その形態として、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、被覆錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、注射剤、坐剤、浸剤、煎剤、チンキ剤等を挙げることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主剤に対して必要に応じて賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤、充填剤、増量剤、保湿剤、界面活性剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて製剤化することができる。また、この医薬製剤中に着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有させてもよい。
【００２８】
本発明の薬剤または組成物を構成するLactobacillus gasseriの菌体画分の量は、その目的、用途（薬剤、飲食品組成物）に応じて任意に定めることができる。本発明はこれに限定されないがその含量としては、全体量に対して通常、0.001〜100％（w/w）、特に0.01〜100％（w/w）が好ましい。
【００２９】
Lactobacillus gasseriの菌体画分を含む組成物や薬剤を飲食品や医薬品の製造に使用する場合、製造方法は当業者に周知の方法によって行うことができる。当業者であれば、Lactobacillus gasseriの菌体画分を他の成分と混合する工程、成形工程、殺菌工程、発酵工程、焼成工程、乾燥工程、冷却工程、造粒工程、包装工程等を適宜組み合わせ、所望の飲食品や医薬品を作ることが可能である。
【００３０】
またLactobacillus gasseriの菌体画分を各種乳製品の製造に使用する場合も、当業者に周知の方法で所望の乳製品を製造できる。ヨーグルトの場合の一例を示せば、Lactobacillus gasseriを用いてスターターを調製する工程、該スターターを前処理した牛乳に加えて培養する工程、冷却工程、フレーバーリング工程、充填工程等を経てヨーグルトを製造できる。チーズであれば、例えば、殺菌等の前処理をした牛乳に本発明の乳酸菌をスターターとして添加して乳酸発酵させる工程、レンネットを添加してチーズカードを生成する工程、カード切断工程、ホエー排出工程、加塩工程、熟成工程などを経て製造可能である。あるいは、前記各種乳製品の製造において、他の乳酸菌をスターターとして用い、製造工程中にLactobacillus gasseriまたはLactobacillus gasseriの菌体画分を添加してもよい。
【００３１】
また本発明は、Lactobacillus gasseriの菌体画分を動物に経口投与する工程を含む、遅延型過敏症の軽減方法に関する。Lactobacillus gasseriの菌体画分が投与される対象としては哺乳動物が挙げられる。哺乳動物としてはヒト及びヒト以外の哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトやサルが挙げられ、より好ましくはヒトが挙げられる。
また本発明は、遅延型過敏症の軽減に使用するためのLactobacillus gasseriの菌体画分に関する。あるいは本発明は遅延型過敏症の軽減剤や軽減用組成物の製造におけるLactobacillus gasseriの菌体画分の使用に関する。また本発明は、遅延型過敏症の軽減のためのLactobacillus gasseriの菌体画分の使用に関する。また本発明は、Lactobacillus gasseriの菌体画分と薬学的に許容される担体を配合する工程を含む、遅延型過敏症の軽減剤や軽減用組成物の製造方法に関する。
【００３２】
あるいは本発明は、Lactobacillus gasseriの菌体画分を含む遅延型過敏性反応の抑制剤を提供する。また本発明は、Lactobacillus gasseriの菌体画分を動物に投与する工程を含む遅延型過敏性反応の抑制方法を提供する。さらに本発明は、遅延型過敏性反応の抑制に使用するためのLactobacillus gasseriの菌体画分に関する。あるいは本発明は、遅延型過敏性反応の抑制剤や抑制用組成物の製造におけるLactobacillus gasseriの菌体画分の使用に関する。あるいは本発明は、遅延型過敏性反応を抑制するためのLactobacillus gasseriの菌体画分の使用に関する。あるいは本発明は、Lactobacillus gasseriの菌体画分と薬学的に許容される担体を配合する工程を含む、遅延型過敏性反応の抑制剤や抑制用組成物の製造方法に関する。
【００３３】
さらに本発明は、Lactobacillus gasseriの菌体画分を含むCD4+T細胞の増殖抑制剤を提供する。また本発明は、Lactobacillus gasseriの菌体画分を動物に投与する工程を含むCD4+T細胞の増殖を抑制する方法を提供する。さらに本発明は、CD4+T細胞の増殖の抑制に使用するためのLactobacillus gasseriの菌体画分に関する。あるいは本発明は、CD4+T細胞の増殖抑制剤や増殖抑制用組成物の製造におけるLactobacillus gasseriの菌体画分の使用に関する。あるいは本発明は、CD4+T細胞の増殖を抑制するためのLactobacillus gasseriの菌体画分の使用に関する。あるいは本発明は、Lactobacillus gasseriの菌体画分と薬学的に許容される担体を配合する工程を含む、CD4+T細胞の増殖抑制剤や増殖抑制用組成物の製造方法に関する。
本発明の薬剤や組成物は、経口投与に好適な担体を配合することができる。本発明の薬剤や組成物は、遅延型過敏症の軽減を目的として、食品を兼ねて投与することができる。
【００３４】
以下に本発明を実施例に基づいてさらに説明するが、かかる実施例は本発明の例示であり、本発明を限定するものではない。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００３５】
脾臓CD4+ T細胞の増殖応答の抑制効果【００３６】
１．材料と方法
〔動物〕
8〜10週齢の雌性BALB/cマウスは日本クレアから購入した。8〜10週齢の雌性のDO11.10 TCRトランスジェニックマウスは、卵白アルブミン（OVA）の323-339位に特異的な、I-Ad拘束性T細胞受容体(TCR)αβ鎖（BALB/cマウス由来）を発現するものを用いた。【００３７】
〔加熱処理細菌懸濁物およびその画分の調製〕
加熱処理菌体（乾燥菌体重量で3mg）は遠心分離によって集菌し、生理食塩水に5mg/mlの濃度で懸濁した。菌体懸濁液に0.5gのガラスビーズ（直径0.1mm; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を加え、マルチビーズショッカー（安井機械）で破砕し、菌体破砕液を得た。破砕液を4℃、300×gで10分間遠心分離し、上清と沈殿画分に分画した。【００３８】
乳酸菌株のうち、菌株名にMEPと記載された菌株は株式会社明治の保有菌株である。
また、MEP225101は、Lactobacillus gasseri種であり、MEP225102は、Lactobacillus casei種である。また、Lactobacillus gasseri OLL2809をLG2809と略して記載することがある。【００３９】
〔菌体破砕液上清の酵素処理〕
菌体破砕液の上清は以下の様に処理した。(1)37℃で4時間放置、(2)37℃で4時間放置し、その後96℃で10分間加熱処理、(3)100μg/mlのDNase I（Sigma-Aldrich）を加えて37℃で4時間放置し、その後96℃で10分間加熱処理してDNase Iを不活性化、(4)100μg/mlのプロテイナーゼK（Sigma-Aldrich）を加えて37℃で4時間放置し、その後96℃で10分間加熱処理して酵素を不活性化、(5) 100μg/mlのRNase A（Sigma-Aldrich）を加えて37℃で4時間放置し、その後Proteinase K処理で酵素を不活性化した。【００４０】
〔細菌からのRNAの抽出〕
細菌からのRNA抽出はRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden Germany)を用いて行った。培養終了後の菌体（乾燥菌体重量で3mg）を遠心分離し、ペレットを生理食塩水に懸濁した。ペレットに0.5gのガラスビーズ（0.1mm）を加えてマルチビーズショッカーで破砕した。破砕液にBuffer RLTを加え、10秒間激しく混合した。遠心分離後、上清を新しいチューブに移し、等量の70%エタノールを加えてピペッティングした。破砕液をRNeasy spin columに移し、8000×gで15秒間遠心分離した。Buffer RW1をRNeasy spin columに加えて再度遠心分離し、洗浄した。Buffer RPEをRNeasy spin columに添加し、8000×gで2分間遠心分離し、洗浄した。30μlの水をRNeasy spin columに加え、8000×gで1分間遠心分離し、RNAを溶出した。抽出したRNAは使用時まで-80℃で保存した。【００４１】
〔マウス細胞株〕
マウス由来の細胞は10%のFCS（牛胎児血清、Gibco, Grand Island, NY）、2g/LのNaHCO3、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、50μM  2-メルカプトエタノール、300mg/L L-グルタミンを含むRPMI1640培地（日水製薬）で、37℃で5%のCO2インキュベーターで培養した。【００４２】
〔CD4+ T細胞増殖アッセイ〕
BALB/cマウスからの脾細胞の調製は既出の方法で行った。T細胞不含脾細胞は、脾細胞からMACS（磁気細胞分離装置）を用いて、Thy1.2マイクロビーズ（Miltenyi Biotec, Bergish Gladbach, Germany）によるネガティブセレクションを行って調製した。抗原提示細胞として調製したこれらの細胞は1×105cells/ウェルの濃度で、菌体懸濁液（3株）、LG2809菌体破砕液、LG2809由来RNA、マウス脾臓RNA（Ambion, Austin, TX）の存在下で、96ウェル平底プレートで、37℃で4時間、5%濃度のCO2インキュベーターで培養した。DO11.10マウス由来CD4+ T細胞は脾細胞からMACSを用いて、既出の方法によってCD4マイクロビーズ（Miltenyi Biotec）によるポジティブセレクションを行って調製した。分離したCD4+ T細胞（5×104cells/ウェル）およびOVA 323-339 (0.1, 0.3, 1μM)を、抗原提示細胞に各被験物質を加えた培養液に添加した。培養3日後、1ウェルに37kBqの[3H]-チミジンを添加し、さらに24時間培養した。March III harvester (Tomtec, Hamden, CT)を用いて細胞を回収し、細胞に取り込まれなかった[3H]-チミジンをTrilux1450 Microbeta counter (Wallac, Gaithersburg, MD)およびMicrobeta 270.004ソフトウェア(Wallac)を用いて解析した。
抗原提示細胞非存在下でのT細胞の活性化には、96ウェル平底プレートを10μg/mlの抗CD3εモノクローナル抗体（BD Biosciences, San Jose, CA）で、37℃で2時間コーティングした。BALB/cマウスまたはMyD88欠損マウス（BALB/cマウス由来）の脾細胞から単離したCD4+ T細胞を5×104cells/ウェルの濃度で、抗CD3εモノクローナル抗体でコーティングしたプレートに加え、2μg/mlの抗CD28モノクローナル抗体（BD Biosciences）と共に、LG2809またはRNA（LG2809由来またはマウス脾臓由来）の存在下で72時間培養した。また別の試験では、N-アセチルシステイン（NAC）を25mMの濃度で添加して培養した。細胞の増殖応答測定は上述の方法と同様に行った。【００４３】
〔LG2809によるDO11.10由来脾臓CD4+ T細胞の増殖応答の抑制の検討方法〕
BALB/cマウス脾臓細胞からからT細胞を除去した細胞(抗原提示細胞；APC)に、(図１B)加熱処理をしたLactobacillus属(LG2809、MEP225101、MEP225102(10μg dry weight/ml) あるいは、(図１C)LG2809を濃度依存的に添加して、4時間培養した。DO11.10マウス由来脾臓CD4+ T細胞とOVAペプチド (1μM)を添加して96時間培養後の増殖応答を、[3H]-チミジン取り込み量を測定することで検討した（図１A）。各実験で対照は無添加区とした。グラフは平均値+標準偏差を示す。群間の有意差は、Tukey法を用いて多重検定した（a-c:異符号間で有意差あり、P<0.05）。【００４４】
〔増殖応答抑制に関与する菌体成分の探索方法〕
試験方法は上記のLG2809によるDO11.10由来脾臓CD4+ T細胞の増殖応答の抑制の検討方法（図1A）と同様に行った。加熱処理をしたLG2809 (heat-killed)、LG2809の破砕液 (homogenate),破砕液の上清 (sup)、破砕液の沈殿 (ppt) (0.1, 1, 10 および100μg dry weight LG2809/ml)をAPC に添加した（図2A）。LG2809の破砕上清 (100μg dry weight LG2809/ml)を、5パターンで処理をした。破砕上清は、DNase I (iii)、Proteinase K (iv)、そして RNase A (v)で処理した。DNase I およびProteinase K は96℃で10分間加熱することで不活化し、RNase A はProteinase K 処理で不活化した。破砕上清は37℃ で4時間放置 (i)、または 37℃で4 時間放置し、その後96℃で10分間加熱処理(ii)をすることで対照とした（図2B)。0.1、1および10μg/mlのLG2809 RNAを培養系に添加した（図2C)。1、10μg/mlのマウス脾臓からのRNAを培養系に添加した（図2D)。各実験で対照は無添加区とした。グラフは平均値+標準偏差を示す。群間の有意差は、Tukey法を用いて多重検定した（a-c:異符号間で有意差あり、P<0.05）。【００４５】
〔LG2809およびそのRNAによるCD4+ T細胞直接的な増殖応答の抑制の検討方法〕
あらかじめ、抗CD3εモノクローナル抗体（10μg/ml）をコーティングしたプレートに、BALB/cマウスから調製したCD4+ T細胞（1×105cells／ウェル）と、抗CD28モノクローナル抗体（2μg/ml）、加熱処理をしたLG2809（図3B)、または加熱処理をしたLG2809のRNA（図3C)、またはマウス脾臓由来のRNA（図3D）を、終濃度0.1〜10μg/mlになるように添加して96時間培養した。96時間培養の24時間前に、[3H]-チミジンをプレートに添加し、その取り込み量を測定することで検討した（図3A）。各実験で対照は無添加区とした。グラフは平均値+標準偏差を示す。群間の有意差は、Tukey法を用いて多重検定した（a-c:異符号間で有意差あり、P<0.05）。【００４６】
〔LG2809とそのRNAによる増殖応答の抑制効果におけるMyD88経路の関与の検討方法〕
あらかじめ、抗CD3εモノクローナル抗体（10μg/ml）をコーティングしたプレートに、（図4B）BALB/cマウス（Wild-type）、または（図4C）MyD88欠損BALB/cマウス（MyD88-/-）から調製したCD4+ T細胞（1×105cells／ウェル）と、抗CD28モノクローナル抗体（2μg/ml）、加熱処理をしたLG2809とそのRNAを、終濃度10μg/mlになるように添加し、96時間培養した。96時間培養の24時間前に、[3H]-チミジンをプレートに添加し、その取り込み量を測定することで検討した（図4A）。各実験で対照は無添加区とした。グラフは平均値+標準偏差を示す。群間の有意差は、Tukey法を用いて多重検定した（a,b:異符号間で有意差あり、P<0.05）。【００４７】
〔LG2809による増殖応答の抑制効果における酸化ストレスの関与の検討方法〕
あらかじめ、抗CD3εモノクローナル抗体（10μg/ml）をコーティングしたプレートに、BALB/cマウス（Wild-type）から調製したCD4+ T細胞（1×105cells／ウェル）、N-アセチルシステイン（NAC、25mM）、抗CD28モノクローナル抗体（2μg/ml）、加熱処理をしたLG2809とそのRNA（終濃度10μg/ml)を添加し、96時間培養した。96時間培養の24時間前に、[3H]-チミジンをプレートに添加し、その取り込み量を測定することで検討した（図5A,B）。対照はLG2809またはLG2809由来RNAを加えない無添加区とした。グラフは平均値+標準偏差を示す。群間の有意差は、Studentのt検定を用いた（**：P<0.01）。【００４８】
〔LG2809のRNAによる遅延型過敏性（DTH）反応の測定方法〕
DO11.10マウスにフロイント完全アジュバント（CFA）に懸濁した100μgのOVAを、尾部から静脈注射して感作させた。14日後に、対照として50μlの生理食塩水を右足せきに注射し、5μgのOVAまたはOVAと被験物の混合物を含む50μlの生理食塩水を左足せきに注射した。試験群（各群ともn = 4）は以下の通りである。（1）OVAを含む生理食塩水を注射する群、(2)OVAおよびLG2809由来RNAを含む生理食塩水を注射する群、(3)OVA、LG2809由来RNAおよびNACを注射する群、(4)OVAおよびNACを注射する群。遅延型過敏反応は注射後24時間後に測定し、「左足せきの腫脹（肥厚）−右足せきの腫脹（肥厚）」から算出した（図6A、B、C）。グラフは平均値+標準偏差を示す。群間の有意差は、Tukey法を用いて多重検定した（a-c：異符号間で有意差あり、P<0.05）。【００４９】
〔統計解析〕
試験データは平均値+標準偏差で示した。統計学的有意差はTukey法による多重検定、またはStudentのt検定で解析した。P<0.05で有意と判断した。【００５０】
２．結果
LG2809および2株（MEP225101、MEP225102）のLactobacillus属乳酸菌のCD4+ T細胞の活性化について検討するため、加熱処理をしたこれらの乳酸菌株の存在下で抗原刺激した際のDO11.10マウス由来CD4+ T細胞の増殖応答を測定した（図1A）。試験を行ったLactobacillus属乳酸菌株は全てCD4+ T細胞の増殖を抑制したが、中でもLG2809が最も強い抑制効果を示した（図1B）LG2809についてその抑制効果を検討したところ、用量依存的であることが確認された（図1C）。そこで、以降の試験ではLG2809を使用した。【００５１】
LG2809のCD4+ T細胞増殖抑制効果の有効成分を同定するため、LG2809破砕物の各種画分の効果を検討した。その抑制効果はLG2809の破砕液上清に認められ、沈殿には認められなかった（図2A）。次に、LG2809破砕液上清画分の酵素処理の影響を検討した。その結果図2Bに示すとおり、対照と比較して未処置の菌体破砕液上清画分(i)では有意な抑制効果が認められた。未処置の菌体破砕液上清画分（i）と比較すると、加熱処理(ii)、DNase I処理(iii)、プロテイナーゼK処理(iv)では有意な影響は認められなかったが、RNase A処理（v）によってその抑制効果は消失した。さらに、LG2809から抽出したRNAは用量依存的にDO11.10マウス由来脾細胞CD4+ T細胞の増殖抑制効果を示した（図2C）。マウス脾臓由来のRNAは増殖抑制効果を示さなかった（図2D）。【００５２】
LG2809およびそのRNAは、抗原刺激および抗原提示細胞によって活性化されたCD4+ T細胞の増殖抑制効果を示したので、これらがCD4+ T細胞に直接的に作用を及ぼしているのかを検討した。BALB/cマウスの脾細胞からCD4+ T細胞を単離し、抗CD3モノクローナル抗体および抗CD28モノクローナル抗体の刺激下で、LG2809（図3B)およびそのRNA（図3C)を添加して培養した。その結果、LG2809およびそのRNAは用量依存的にCD4+ T細胞の増殖を抑制したが、マウス由来のRNAでは効果は認められなかった（図3D）。これらの結果はLG2809およびそのRNAが、CD4+ T細胞に直接作用して増殖抑制応答を呈することを示すものであった。【００５３】
本効果にMyD88依存的なシグナル伝達経路が関与しているかを検討した結果を図4に示した。LG2809およびそのRNAはMyD88欠損マウス由来のCD4+ T細胞では増殖抑制効果を示さなかった。この結果は、LG2809およびそのRNAが、MyD88依存性シグナル伝達経路を介してCD4+ T細胞の増殖を抑制したことを示す。【００５４】
LG2809およびそのRNAの抑制効果における活性酸素の関与を検討するために、酸化剤としてNACの作用を検討した。その結果、NACのみを添加した場合は対照と比較して試験に影響を与えなかったが、NACによりLG2809およびそのRNAの抑制効果は解除された（図5）。以上の結果から、LG2809およびそのRNAによるCD4+ T細胞増殖抑制効果は抗酸化剤により減弱した。つまり、酸素シグナルを必要とする事が明らかになった。【００５５】
LG2809由来RNAについて、抗原刺激したCD4+ T細胞の増殖抑制効果をin vivoの遅延型過敏反応で評価した（図6）。生理食塩水を注射したマウスの足せきでは腫脹が認められたが、LG2809由来RNAを投与したマウスでは腫脹の程度が低く、遅延型過敏応答が抑制されていることが確認された。さらに、NAC処置によってLG2809由来RNAによる遅延型過敏反応抑制効果が解除された。つまり、LG2809由来RNAは遅延型過敏反応を抑制した。この結果から、in vivoにおいてもLG2909由来RNAは活性酸素シグナルを介して遅延型過敏反応を抑制することが確認された。【００５６】
３．考察
本発明で、LG2809およびそのRNAがマウスCD4+ T細胞の増殖を直接的に抑制する効果を有することを明らかにした。また、この抑制効果はMyD88依存性シグナル伝達経路を介しており、抗酸化剤処理によって解除された。さらに、in vivoにおいてLG2809由来RNAが遅延型過敏反応を抑制する事も明らかにした。これらの結果は、RNAによるT細胞増殖抑制効果が、プロバイオティクスが炎症性疾患に対して有益な効果をもたらす機序になっていることを示すものである。
本発明で使用した3株のLactobacillus属乳酸菌の中で、LG2809が最も強い抑制効果を示した。本発明では、LG2809は、APC共培養実験モデルによりAPCと抗原の共刺激を誘導した場合だけでなく、抗CD3ε/CD28刺激で誘導した場合にもCD4+ T細胞の増殖を抑制した。また、LG2809およびそのRNAはアポトーシスを誘導しないことを確認している。従って、LG2809は樹状細胞に関与しないメカニズムで、またアポトーシスを誘導せずにCD4+ T細胞の増殖を抑制している。
本発明でLG2809のRNAがその関与成分であることを明らかにした。細菌のRNAがT細胞増殖抑制効果の関与成分であることを明らかにしたのは本発明が初めてである。RNAの増殖阻害活性の特異性を検討するため、ヒトおよびEscherichia coliから調製したRNAについてもその効果を検討した。興味深いことに、E. coli由来RNAはCD4+ T細胞増殖抑制効果を示したが、ヒト由来RNAは影響しなかった。RNAの調製方法による抑制効果の違いを検討するために、細菌からのRNA調製法によって抽出したBALB/cマウスの脾細胞RNAも評価したが、効果は認められなかった。これらの結果は細菌のRNAがCD4+ T細胞増殖抑制効果を有していることを示すものである。
ヒトの細胞には細菌のRNAに対して、TLR3とTLR7の膜結合型受容体および細胞質受容体であるNALP3（NACHT-LRR protein 3）の2種類の受容体がある。TLR3が二本鎖RNAを認識するのに対して、TLR7とNALP3は一本鎖RNAを認識する。これらの受容体の中で、TLR7のみがそのシグナル伝達経路にMyD88を要することが知られている。本発明では、LG2809およびそのRNAは、MyD88欠損マウス由来CD4+ T細胞には抑制効果を示さなかった。TLR7の発現はCD4+ T細胞でも認められ、TLR7のリガンドであるImiquimodもCD4+ T細胞増殖を強く抑制することも確認している。これらの知見はLG2809由来RNAはTLR7を介してその増殖抑制効果を示すものである。
遅延型過敏性反応は、細胞性免疫応答の典型的なin vivoの症状であり、その反応はT細胞の活性化と優先的な集積により特徴づけられる。遅延型過敏性反応はI型ヘルパーT細胞（Th1）細胞を介して起こることは一般的に知られている。LG2809由来RNAは、in vitroで脾細胞CD4+ T細胞の増殖を抑制したのと同様に、Th1細胞の増殖を阻害し、遅延型過敏性反応を抑制したといえる。抑制効果はin vivoでも認められているので、LG2809由来RNAは免疫抑制剤として炎症疾患への治療に有用と考えられる。さらに、LG2809由来RNAの抑制効果はNAC処理により消失したことから、LG2809由来RNAによるT細胞を介したin vivoでの免疫応答において、活性酸素種が影響を及ぼしたことが示される。
結論として、LG2809およびそのRNAはCD4+ T細胞の増殖を、MyD88依存性シグナル伝達経路を介して抑制し、その抑制効果は抗酸化剤により減弱した。これらの結果は、RNAによるT細胞増殖抑制効果は、プロバイオティクスによる炎症性疾患改善効果の機序であることを示すものである。LG2809およびそのRNAはCD4+ T細胞の過敏反応に起因する疾患をもつ患者の治療に有用であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明は食品産業や医薬産業において好ましく利用され得る。本発明の遅延型過敏症軽減剤によれば、食経験があり長期間摂取における安全性が明確なヒト腸内由来乳酸菌であるLactobacillus gasseriの菌体画分を用いて、遅延型過敏症の軽減効果を得ることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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