(57)【要約】  組織の線維化や癌の治療薬として有用な新規の抗ヒトＣＣＲ７抗体と、当該抗ヒトＣＣＲ７抗体を含む医薬組成物等を提供することを課題とする。  ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体であって、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、又は７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する抗ヒトＣＣＲ７抗体が提供される。配列番号５〜１０、１５〜２０、２５〜３０、３５〜４０、４５〜５０、５５〜６０、６５〜７０、又は７５〜８０に示すアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１〜３と軽鎖ＣＤＲ１〜３を有する抗ヒトＣＣＲ７抗体も提供される。ＣＣＲ７リガンド刺激によるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断する活性を有するものであることが好ましい。本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体は、組織の線維化や癌の治療薬の有効成分として使用できる。
2012043533.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体であって、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、又は配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（重鎖ＣＤＲ３）を有することを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体。
【請求項２】
ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体であって、その相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列について、下記（Ａ１）〜（Ａ８）のいずれかを満たすことを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体。
（Ａ１）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ２）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ３）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ４）配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ５）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ６）配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ７）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ８）配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する。
【請求項３】
ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体であって、その相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列について、下記（Ｂ１）〜（Ｂ８）のいずれかを満たすことを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体。
（Ｂ１）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ２）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ３）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ４）配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ５）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ６）配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ７）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号６８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ８）配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号８０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
【請求項４】
ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体であって、その重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列について、下記（Ｃ１）〜（Ｃ８）のいずれかを満たすことを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体。
（Ｃ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ２）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ３）配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ４）配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ５）配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ６）配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ７）配列番号６２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ８）配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号７４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
【請求項５】
ＣＣＲ７リガンド刺激によるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断する活性を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体。
【請求項６】
ヒト化抗体又はキメラ抗体であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体。
【請求項７】
抗体断片、一本鎖抗体、又はダイアボディであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体。
【請求項８】
ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体であって、Ｒ７−０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３６９）、Ｒ７−０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０４）、Ｒ７−０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７１）、Ｒ７−０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７２）、Ｒ７−１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７３）、Ｒ７−１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７４）、Ｒ７−２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７５）、又はＲ７−４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７６）により産生されることを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体と同一のエピトープに結合することを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体。
【請求項１０】
Ｒ７−０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３６９）、Ｒ７−０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０４）、Ｒ７−０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７１）、Ｒ７−０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７２）、Ｒ７−１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７３）、Ｒ７−１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７４）、Ｒ７−２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７５）、又はＲ７−４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７６）であることを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする核酸。
【請求項１２】
配列番号１、配列番号３、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５３、配列番号６１、配列番号６３、配列番号７１、又は配列番号７３で表される塩基配列を有する請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターが導入された細胞。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体と、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１６】
ＣＣＲ７リガンドによるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断するものであることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
組織の線維化を治療するために用いられることを特徴とする請求項１５又は１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記組織の線維化が、肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、消化管線維症及び他の線維性疾患からなる群から選択される線維症であることを特徴とする請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記肝線維症が、肝硬変、虚血再灌流、肝移植後傷害、壊死性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、原発性胆汁性肝硬変、及び原発性硬化性胆管炎からなる群から選択されることを特徴とする請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記肝硬変が、アルコールによる誘発、薬物による誘発、及び化学的な誘発からなる群から選択された少なくとも１つによるものであることを特徴とする請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記腎線維症が、増殖性糸球体腎炎、硬化性糸球体腎炎、腎性線維化性皮膚症、糖尿病性腎症、腎尿細管間質性線維症、及び巣状分節性糸球体硬化症からなる群から選択されることを特徴とする請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記肺線維症が、肺間質性線維症、薬物誘発サルコイドーシス、肺線維症、特発性肺線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、びまん性肺胞損傷疾患、肺高血圧症、及び新生児気管支肺形成異常からなる群から選択されることを特徴とする請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記皮膚線維症が、強皮症、ケロイド瘢痕化、乾癬、肥厚性瘢痕化、及び偽性強皮症からなる群から選択されることを特徴とする請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記心血管線維症が、アテローム性動脈硬化、冠動脈再狭窄、うっ血性心筋症、心不全、心移植、及び心筋線維症からなる群から選択されることを特徴とする請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記消化管線維症が、コラーゲン蓄積大腸炎、絨毛萎縮、陰窩過形成、ポリープ形成、クローン病の線維症、胃潰瘍治癒、及び腹部癒着術後瘢痕からなる群から選択されることを特徴とする請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記線維症が、骨に関連する線維化性疾患から生じる状態を有し、リウマチ様パンヌス形成であることを特徴とする請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
癌の転移を治療するために用いられることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記癌が、咽頭癌、軟骨肉腫、大腸癌、膵臓癌、白血病、乳癌からなる群から選択されることを特徴とする請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
請求項１〜９のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体が担体に固定化されてなる抗体固定化担体。
【請求項３０】
ＣＣＲ７発現細胞を含む血液を接触させて、前記体液からＣＣＲ７発現細胞を除去するために用いられることを特徴とする請求項２９に記載の抗体固定化担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ヒトＣＣＲ７抗体、ハイブリドーマ、核酸、ベクター、細胞、医薬組成物、並びに、抗体固定化担体に関し、さらに詳細には、ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体、当該抗体を生産するハイブリドーマ、当該抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする核酸、当該核酸を有するベクター、当該ベクターを有する細胞、当該抗体を含む医薬組成物、並びに、当該抗体が固定化された抗体固定化担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインは様々な細胞の遊走や細胞機能を調節するサイトカインである。ケモカインならびにその受容体の機能異常は、自己免疫疾患、急性ならびに慢性炎症、癌といった様々な病気の原因となっている。これまで、ケモカインならびにその受容体の活性を制御する薬剤の開発がなされ、臨床応用されているが、問題を充分に解決しているとはいい難い。【０００３】
特定のケモカインが細胞の遊走や細胞機能の調節といった活性を発現するためには、ケモカイン選択的な細胞膜受容体と結合することが必要である。ケモカイン受容体はすでに約２０種類発見されており、いずれのケモカイン受容体も３量体Ｇタンパク質と結合する７回膜貫通型タンパク質（ＧＰＣＲ）である。ケモカインが受容体に結合すると、３量体Ｇタンパク質のＧαユニットを遊離させる。その結果、細胞内のＣａ濃度を上昇させたり、phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)やsmall Rho GTPases経路やその他の経路を活性化させて機能を発現させる。いずれのケモカイン受容体も、比較的選択的なケモカインで活性化するものの、タンパク質の１次構造や細胞内の活性化機構は非常に類似している。したがって、特定のケモカイン受容体の機能を選択的に遮断することは容易ではない。生理的ならびに病態における各ケモカインとケモカイン受容体の機能発現は、それぞれのタンパク質が特定の細胞や組織に特定の時期（炎症時）に発現することで制御されている（非特許文献１）。【０００４】
ヒトＣＣモチーフレセプター７（CC MOTIF, RECEPTOR 7；別名：ＥＢＩ１、ＣＭＫＢＲ７；以下、「ＣＣＲ７」と称する。）は、当初、エプスタイン・バー（EPSTEIN-BARR）ウイルス感染によりリンパ球選択的に発現するＧＰＣＲとして発見された（非特許文献２）。その後、ＣＣＲ７は、ＣＣＬ１９（別名：ＥＬＣ）ならびにＣＣＬ２１（別名：ＳＬＣ、ＥＸＯＤＵＳ  ２）の選択的ケモカイン受容体であることがわかった。ＣＣＲ７は生理的条件下では、ＣＤ４陽性Ｔ細胞（Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｒｅｇ細胞）、成熟樹状細胞、Ｂ細胞といった細胞に比較的選択的に発現している。ＣＣＲ７を介して炎症部位などの病巣にこうした細胞が導引され、炎症反応や免疫反応が亢進することが知られている。またＣＣＲ７異常活性化が自己免疫疾患、急性ならびに慢性炎症後の線維症、癌転移といった様々な病気の原因となっている。
ヒトＣＣＲ７のアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は、すでに知られている（例えば、GenBank: EAW60669.1）。【０００５】
炎症は、組織の損傷や感染に対する防御反応である。様々な炎症刺激に応答して炎症性分子（ケモカインやサイトカイン）の発現亢進に引き続き、好中球及び単球の浸潤を促進する。さらに炎症反応が亢進すると、ＴならびにＢリンパ球の流入し病態が慢性化する。一方、炎症の収束段階においては、過剰な白血球のアポトーシスや組織マクロファージによる貪食が起こり、間質細胞（例えば線維芽細胞）による損傷組織の修復が見られる。【０００６】
過剰な間質細胞の分化増殖は、種々の線維症（肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、消化管線維症及び他の線維性疾患）の増悪と深く関連している。慢性肺線維症は、肺全体にわたる瘢痕形成に起因し、予後不良の疾患である。抗線維化作用を有するピルフェニドン、コルチコステロイド類（例えばプレドニゾン）及び／又は体内の免疫系を抑制するその他の薬物が、線維症につながる過程を抑えるため処方される。しかしながら、今のところ充分な治療成績をあげているとはいい難い。【０００７】
一方、近年、炎症反応後の修復過程における線維化の分子機構が明らかにされつつある。そのような修復機構では、局所的な休止線維芽細胞が、損傷領域に移動し、細胞外マトリックスタンパク質を生成し、傷の収縮と線維形成（瘢痕）を促進する。また、循環する線維芽前駆細胞、線維芽細胞（これらは血液中に存在する）が、傷や線維形成の部位に移動し、そこでそれらが分化して組織の修復やその他の線維化反応を仲介することが示唆されてきた。【０００８】
血液中線維芽前駆細胞は、ＣＤ１４＋末梢血単球前駆細胞群が炎症部位に浸潤し、局所で間質細胞様（コラーゲンＩ型及びＩＩＩ型並びにフィブロネクチン）に分化する（非特許文献３）。これらの細胞は、炎症性サイトカインを分泌するとともに、細胞外マトリックスタンパク質、他のサイトカイン類、を分泌し、それらが線維形成をもたらし得る。血液中線維芽前駆細胞の炎症部位への過剰な浸潤を選択的に抑制することができれば、線維化を最小限に食い止めることが期待できるが、まだ臨床応用には至っていない。【０００９】
近年、線維芽前駆細胞に発現するケモカイン受容体として、前記したＣＣＲ７が注目されている（特許文献１）。ＣＣＲ７を欠損させた遺伝子変換動物に肺線維症や腎線維症を発症させるような刺激を付加しても、線維症を発症しないことが示されている（非特許文献４）。そこで、ＣＣＲ７の機能を低分子化合物、モノクローナル抗体、ＲＮＡｉ等で阻害することができれば、種々の線維化を抑制することが期待できる。しかし、ケモカイン受容体のタンパク質の１次構造や細胞内の活性化機構は非常に類似しているため、よりＣＣＲ７を選択的に阻害しうる物質が望まれる。これまでＣＣＲ７の機能を阻害する物質（モノクローナル抗体あるいはＲＮＡｉ）の研究が行われているが、臨床応用まで到達した事例はない。【００１０】
また一方、癌治療においては原発癌の増殖抑制と遠隔転移を伴う再発予防が重要である。従来の外科療法や化学療法に加え、分子標的薬（例えばキナーゼ阻害剤）や抗体医薬療法により治療成績は向上している。しかしながら、遠隔転移を伴う再発癌は予後不良であり、新たな治療薬の開発が望まれている。遠隔転移の機構としては、原発癌より血管を経由する場合とリンパ組織を経由する場合がある。これまで、細胞外マトリックスタンパク質分解酵素阻害剤（ＭＭＰ阻害剤）などが、転移予防薬として開発されたものの、臨床応用まで到達した事例はない。【００１１】
様々な研究により、ＣＣＲ７が、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、乳癌細胞、悪性乳房腫瘍などの様々な腫瘍細胞で発現されることが示されている。更に、ＣＣＲ７は、胃癌、黒色腫、非小細胞肺癌、Ｔ細胞白血病細胞などの様々な癌のリンパ節転移において役割を果たしていることが明らかになってきた（非特許文献１）。ＣＣＲ７のリガンドであるＣＣＬ１９ならびにＣＣＬ２１がリンパ節で高発現していることから、選択的なＣＣＲ７機能阻害が、癌細胞のリンパ性転移を抑制することが期待できる。【００１２】
膜タンパク質（受容体）に対する抗体医薬の主要な作用機序は、当該タンパク質を発現する細胞を抗体が認識した後、補体依存性細胞溶解作用（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）に基づき除去するものが一般的であった。しかしながら、ＣＤＣやＡＤＣＣはマクロファージ等の炎症細胞の活性化を伴い、線維症治療としては必ずしも適切とはいえない。したがって、ＣＣＲ７を選択的に阻害しうるモノクローナル抗体を線維症治療に応用する場合には、ＣＤＣやＡＤＣＣによらない機能性抗体が望ましい。すなわち、ＣＣＲ７のＣＣＬ１９あるいはＣＣＬ２１依存的細胞内情報伝達を選択的に遮断する抗体が望ましい。しかし、一般的に、ＧＰＣＲに対する機能性抗体を効率的に取得することは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特表２００９−５２８９７７号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Viola A, Luster AD "Chemokines and their receptors: drug targets in immunity and inflammation", Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2008;48:171-97
【非特許文献２】Birkenbach, M., Josefsen, K., Yalamanchili, R., Lenoir, G., Kieff, E., "Epstein-Barr virus-induced genes: first lymphocyte-specific G protein-coupled peptide receptors", J. Virol. 67: 2209-2220, 1993.
【非特許文献３】Pilling D, Fan T, Huang D, Kaul B, Gomer RH. "Identification of markers that distinguish monocyte-derived fibrocytes from monocytes, macrophages, and fibroblasts", PLoS One. 2009 Oct 16;4(10):e7475
【非特許文献４】Wada T, Sakai N, Matsushima K, Kaneko S．"Fibrocytes: a new insight into kidney fibrosis"，Kidney Int. 2007 Aug;72(3):269-73.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、線維症や癌の治療薬として有用な新規の抗ヒトＣＣＲ７抗体と、当該抗ヒトＣＣＲ７抗体を含む医薬組成物等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記した課題を解決するための本発明の１つの様相は、ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体であって、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、又は配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（重鎖ＣＤＲ３）を有することを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体である。【００１７】
同様の課題を解決するための本発明の他の様相は、ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体であって、その相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列について、下記（Ａ１）〜（Ａ８）のいずれかを満たすことを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体である。
（Ａ１）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ２）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ３）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ４）配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ５）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ６）配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ７）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ８）配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する。【００１８】
同様の課題を解決するための本発明の他の様相は、ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体であって、その相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列について、下記（Ｂ１）〜（Ｂ８）のいずれかを満たすことを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体である。
（Ｂ１）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ２）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ３）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ４）配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ５）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ６）配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ７）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号６８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ８）配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号８０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。【００１９】
同様の課題を解決するための本発明の他の様相は、ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体であって、その重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列について、下記（Ｃ１）〜（Ｃ８）のいずれかを満たすことを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体である。
（Ｃ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ２）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ３）配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ４）配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ５）配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ６）配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ７）配列番号６２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ８）配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号７４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。【００２０】
好ましくは、ＣＣＲ７リガンド刺激によるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断する活性を有する。【００２１】
好ましくは、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。【００２２】
好ましくは、抗体断片、一本鎖抗体、又はダイアボディである。【００２３】
本発明の他の様相は、ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体であって、Ｒ７−０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３６９）、Ｒ７−０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０４）、Ｒ７−０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７１）、Ｒ７−０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７２）、Ｒ７−１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７３）、Ｒ７−１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７４）、Ｒ７−２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７５）、又はＲ７−４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７６）により産生されることを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体である。【００２４】
本発明の他の様相は、上記の抗ヒトＣＣＲ７抗体と同一のエピトープに結合することを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体である。【００２５】
本発明のさらに他の様相は、Ｒ７−０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３６９）、Ｒ７−０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０４）、Ｒ７−０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７１）、Ｒ７−０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７２）、Ｒ７−１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７３）、Ｒ７−１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７４）、Ｒ７−２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７５）、又はＲ７−４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７６）であることを特徴とするハイブリドーマである。【００２６】
本発明のさらに他の様相は、本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする核酸である。【００２７】
好ましくは、配列番号１、配列番号３、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５３、配列番号６１、配列番号６３、配列番号７１、又は配列番号７３で表される塩基配列を有する。【００２８】
本発明のさらに他の様相は、上記核酸を含むベクターである。【００２９】
本発明のさらに他の様相は、上記ベクターが導入された細胞である。【００３０】
本発明のさらに他の様相は、上記した本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体と、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする医薬組成物である。【００３１】
好ましくは、ＣＣＲ７リガンドによるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断するものである。【００３２】
好ましくは、組織の線維化を治療するために用いられる。【００３３】
好ましくは、前記組織の線維化が、肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、消化管線維症及び他の線維性疾患からなる群から選択される線維症である。【００３４】
好ましくは、前記肝線維症が、肝硬変、虚血再灌流、肝移植後傷害、壊死性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、原発性胆汁性肝硬変、及び原発性硬化性胆管炎からなる群から選択される。【００３５】
好ましくは、前記肝硬変が、アルコールによる誘発、薬物による誘発、及び化学的な誘発からなる群から選択された少なくとも１つによるものである。【００３６】
好ましくは、前記腎線維症が、増殖性糸球体腎炎、硬化性糸球体腎炎、腎性線維化性皮膚症、糖尿病性腎症、腎尿細管間質性線維症、及び巣状分節性糸球体硬化症からなる群から選択されるものである。【００３７】
好ましくは、前記肺線維症が、肺間質性線維症、薬物誘発サルコイドーシス、肺線維症、特発性肺線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、びまん性肺胞損傷疾患、肺高血圧症、及び新生児気管支肺形成異常からなる群から選択されるものである。【００３８】
好ましくは、前記皮膚線維症が、強皮症、ケロイド瘢痕化、乾癬、肥厚性瘢痕化、及び偽性強皮症からなる群から選択されるものである。【００３９】
好ましくは、前記心血管線維症が、アテローム性動脈硬化、冠動脈再狭窄、うっ血性心筋症、心不全、心移植、及び心筋線維症からなる群から選択されるものである。【００４０】
好ましくは、前記消化管線維症が、コラーゲン蓄積大腸炎、絨毛萎縮、陰窩過形成、ポリープ形成、クローン病の線維症、胃潰瘍治癒、及び腹部癒着術後瘢痕からなる群から選択されるものである。【００４１】
好ましくは、前記線維症が、骨に関連する線維化性疾患から生じる状態を有し、リウマチ様パンヌス形成である。【００４２】
好ましくは、癌の転移を治療するために用いられる。【００４３】
好ましくは、前記癌が、咽頭癌、軟骨肉腫、大腸癌、膵臓癌、白血病、乳癌からなる群から選択されるものである。【００４４】
本発明のさらに他の様相は、上記した本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体が担体に固定化されてなる抗体固定化担体である。【００４５】
好ましくは、ＣＣＲ７発現細胞を含む血液を接触させて、前記体液からＣＣＲ７発現細胞を除去するために用いられる。
【発明の効果】
【００４６】
本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体によれば、治療困難な線維症やリンパ性癌転移等に対する新規医薬品を提供することができる。【００４７】
本発明のハイブリドーマについても同様であり、治療困難な線維症やリンパ性癌転移等に対する新規医薬品の有効成分となる抗ヒトＣＣＲ７抗体を製造することができる。【００４８】
本発明の核酸によれば、本発明の抗体を組換え技術をもって生産することができる。また、遺伝子治療への応用も可能である。【００４９】
本発明のベクターについても同様であり、本発明の抗体を組換え技術をもって生産することができる。また、遺伝子治療への応用も可能である。【００５０】
本発明の細胞についても同様であり、本発明の抗体を組換え技術をもって生産することができる。【００５１】
本発明の医薬組成物によれば、治療困難な線維症やリンパ性癌転移等に対する新規医薬品を提供することができる。【００５２】
本発明の抗体固定化担体によれば、線維症や癌などを罹患している患者の血液から、ＣＣＲ７発現細胞を選択的に除去することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】Ｒ７−０１の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。
【図２】Ｒ７−０２の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。
【図３】Ｒ７−０５の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。
【図４】Ｒ７−０９の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。
【図５】Ｒ７−１１の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。
【図６】Ｒ７−１８の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。
【図７】Ｒ７−２５の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。
【図８】Ｒ７−４７の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。
【図９】ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞とマウスコントロールＩｇＧとの相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。
【図１０】ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞と抗ヒトＣＣＲ７抗体Ｒ７−４７との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。
【図１１】細胞内Ｃａ2+濃度と各添加物の濃度との関係を表すグラフである。
【図１２】（ａ）はアイソタイプコントロール抗体とＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体で染色した結果を表すヒストグラム、（ｂ）はＲ７−４７とＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体で染色した結果を表すヒストグラムである。
【図１３】肺線維症を惹起させたマウスに抗ヒトＣＣＲ７抗体Ｒ７−１１、Ｒ７−１８、又はＲ７−４７を投与した実験の結果を表すグラフである。
【図１４】（ａ）はＣＨＯ−Ｋ１細胞とハイブリドーマＲ７−０２由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用の解析結果を表す２次元ドット表示図とヒストグラム、（ｂ）はヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞とハイブリドーマＲ７−０２由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用の解析結果を表す２次元ドット表示図とヒストグラムである。
【図１５】（ａ）はＣＨＯ−Ｋ１細胞とハイブリドーマＲ７−１１由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用の解析結果を表す２次元ドット表示図とヒストグラム、（ｂ）はヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞とハイブリドーマＲ７−１１由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用の解析結果を表す２次元ドット表示図とヒストグラムである。
【図１６】（ａ）はＣＨＯ−Ｋ１細胞とハイブリドーマＲ７−１８由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用の解析結果を表す２次元ドット表示図とヒストグラム、（ｂ）はヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞とハイブリドーマＲ７−１８由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用の解析結果を表す２次元ドット表示図とヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
まず、本発明の抗体が特異的に認識するヒトＣＣＲ７について、その構造を中心に説明する。前述したように、ＣＣＲ７はＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の一種であり、細胞膜を７回貫通し、そのＮ末端を細胞外に、Ｃ末端を細胞内に向けて存在している。ヒトＣＣＲ７をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）はすでに単離されており、ヒトＣＣＲ７のアミノ酸配列も知られている。当該配列情報は、例えば、GenBank等のデータベースから得ることができる（例えば、GenBank:EAW60669.1）。その一例として、配列番号８１にヒトＣＣＲ７遺伝子の塩基配列と該塩基配列に対応するアミノ酸配列を、配列番号８２にアミノ酸配列のみを示す。
【００５５】
ヒトＣＣＲ７の各ドメインは、配列番号８２に示すアミノ酸配列における以下の部分に相当すると考えられている。左側がアミノ酸番号、右側が各ドメインである。なお各ドメイン間の境界については、多少の前後が生じ得る。
【００５６】
１〜  ２４：膜移行シグナルペプチド配列（発現後に切断・除去される）
２５〜  ５９：Ｎ末端ドメイン
８７〜  ９５：細胞内第１ループドメイン
１１７〜１３０：細胞外第１ループドメイン
１５３〜１７０：細胞内第２ループドメイン
１９２〜２１９：細胞外第２ループドメイン
２４８〜２６３：細胞内第３ループドメイン
２９０〜３１３：細胞外第３ループドメイン
３３２〜３７８：Ｃ末端ドメイン
【００５７】
ヒトＣＣＲ７には、配列番号８２に示すもの以外にアミノ酸置換体等の各種のバリアントが知られている。本発明における「ヒトＣＣＲ７」には、細胞外ドメインを有し且つＣＣＲ７としての機能を有する限り、前記バリアントが含まれる。
【００５８】
本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体（以下、単に「本発明の抗体」と略記することがある。）は、ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合するものである。１つの様相（第一の様相）において、本発明の抗体は、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、又は配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（重鎖ＣＤＲ３）を有する。
【００５９】
また他の様相（第二の様相）において、本発明の抗体は、その相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列について、下記（Ａ１）〜（Ａ８）のいずれかを満たす。
（Ａ１）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ２）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ３）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ４）配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ５）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ６）配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ７）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ８）配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する。
【００６０】
また他の様相（第三の様相）において、本発明の抗体は、その相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列について、下記（Ｂ１）〜（Ｂ８）のいずれかを満たす。
（Ｂ１）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ２）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ３）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ４）配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ５）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ６）配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ７）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号６８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ８）配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号８０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
【００６１】
また他の様相（第四の様相）において、本発明の抗体は、その重鎖可変領域（以下、「ＶＨ」と略記することがある。）と軽鎖可変領域（以下、「ＶＬ」と略記することがある。）のアミノ酸配列が以下（Ｃ１）〜（Ｃ８）のいずれかを満たす。
（Ｃ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ２）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ３）配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ４）配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ５）配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ６）配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ７）配列番号６２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ８）配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号７４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
【００６２】
配列番号５（重鎖ＣＤＲ１），配列番号６（重鎖ＣＤＲ２），配列番号７（重鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号２（ＶＨ）のアミノ酸番号２７〜３５，５０〜６６，９７〜１１２の部分に相当する（図１（ａ））。
配列番号８（軽鎖ＣＤＲ１），配列番号９（軽鎖ＣＤＲ２），配列番号１０（軽鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号４（ＶＬ）のアミノ酸番号２４〜３９，５５〜６８，９４〜１０２の部分に相当する（図１（ｂ））。
【００６３】
配列番号１５（重鎖ＣＤＲ１），配列番号１６（重鎖ＣＤＲ２），配列番号１７（重鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号１２（ＶＨ）のアミノ酸番号４３〜５１，６６〜８２，１１３〜１２４の部分に相当する（図２（ａ））。
配列番号１８（軽鎖ＣＤＲ１），配列番号１９（軽鎖ＣＤＲ２），配列番号２０（軽鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号１４（ＶＬ）のアミノ酸番号２４〜３７，５３〜５９，８７〜９９の部分に相当する（図２（ｂ））。
【００６４】
配列番号２５（重鎖ＣＤＲ１），配列番号２６（重鎖ＣＤＲ２），配列番号２７（重鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号２２（ＶＨ）のアミノ酸番号３０〜３８，５３〜６８，１００〜１１１の部分に相当する（図３（ａ））。
配列番号２８（軽鎖ＣＤＲ１），配列番号２９（軽鎖ＣＤＲ２），配列番号３０（軽鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号２４（ＶＬ）のアミノ酸番号２３〜３６，５２〜５８，９１〜９９の部分に相当する（図３（ｂ））。
【００６５】
配列番号３５（重鎖ＣＤＲ１），配列番号３６（重鎖ＣＤＲ２），配列番号３７（重鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号３２（ＶＨ）のアミノ酸番号２８〜３６，５１〜６７，９８〜１０９の部分に相当する（図４（ａ））。
配列番号３８（軽鎖ＣＤＲ１），配列番号３９（軽鎖ＣＤＲ２），配列番号４０（軽鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号３４（ＶＬ）のアミノ酸番号２３〜３６，５２〜５８，９１〜９９の部分に相当する（図４（ｂ））。
【００６６】
配列番号４５（重鎖ＣＤＲ１），配列番号４６（重鎖ＣＤＲ２），配列番号４７（重鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号４２（ＶＨ）のアミノ酸番号２９〜３７，５２〜６８，９８〜１１０の部分に相当する（図５（ａ））。
配列番号４８（軽鎖ＣＤＲ１），配列番号４９（軽鎖ＣＤＲ２），配列番号５０（軽鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号４４（ＶＬ）のアミノ酸番号２４〜３９，５５〜６１，９４〜１０２の部分に相当する（図５（ｂ））。
【００６７】
配列番号５５（重鎖ＣＤＲ１），配列番号５６（重鎖ＣＤＲ２），配列番号５７（重鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号５２（ＶＨ）のアミノ酸番号３０〜３７，５３〜６９，９９〜１１１の部分に相当する（図６（ａ））。
配列番号５８（軽鎖ＣＤＲ１），配列番号５９（軽鎖ＣＤＲ２），配列番号６０（軽鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号５４（ＶＬ）のアミノ酸番号２４〜３９，５５〜６１，９４〜１０２の部分に相当する（図６（ｂ））。
【００６８】
配列番号６５（重鎖ＣＤＲ１），配列番号６６（重鎖ＣＤＲ２），配列番号６７（重鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号６２（ＶＨ）のアミノ酸番号３０〜４１，５４〜６９，１００〜１１１の部分に相当する（図７（ａ））。
配列番号６８（軽鎖ＣＤＲ１），配列番号６９（軽鎖ＣＤＲ２），配列番号７０（軽鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号６４（ＶＬ）のアミノ酸番号２４〜３９，５６〜６２，９５〜１０２の部分に相当する（図７（ｂ））。
【００６９】
配列番号７５（重鎖ＣＤＲ１），配列番号７６（重鎖ＣＤＲ２），配列番号７７（重鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号７２（ＶＨ）のアミノ酸番号２７〜３５，５０〜６６，９６〜１０９の部分に相当する（図８（ａ））。
配列番号７８（軽鎖ＣＤＲ１），配列番号７９（軽鎖ＣＤＲ２），配列番号８０（軽鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号７４（ＶＬ）のアミノ酸番号２４〜３９，５５〜６１，９４〜１０２の部分に相当する（図８（ｂ））。
【００７０】
本発明において「抗体」という文言は、「免疫グロブリン」と置き換えることができる。
【００７１】
本発明における抗体には、その機能的断片が含まれる。ここで「抗体の機能的断片」とは、抗体（すなわち免疫グロブリン）の部分断片であって、抗原に対する作用を少なくとも１つ保持するものを指す。前記部分断片の例としては、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ、ＶＨ−ＶＬ）、ＶＨ、及びこれらの重合体、並びに、これらと重鎖ＣＨ３領域との融合体が挙げられる。また、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３等の各ＣＤＲ、及びこれらＣＤＲの連結体、並びに、これらＣＤＲ又はＣＤＲ連結体と重鎖ＣＨ３領域との融合体が挙げられる。すなわち本発明の抗体には、ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合するものである限り、前記したような抗体の部分断片も含まれる。抗体の部分断片を「抗体断片」と称することもある。
【００７２】
さらに本発明の抗体は、多重特異性抗体であってもよい。例としては、二重特異性抗体の一種であるダイアボディ（Diabody）（国際公開第９３／１１１６１号パンフレット等）が挙げられる。
【００７３】
本発明の抗体が機能的断片である場合には、例えば、以下のような効果がある。すなわち、本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体を後述するような医薬に応用する際に、ＩｇＧ型等の全長の抗体を使用すると、標的受容体のシグナル阻害に加えて、標的組織に障害が起き、これが副作用につながる場合がある。このような場合に、可変領域だけを用いた「抗体の機能的断片」を採用すると、前記したような副作用を回避しやすくなる。
【００７４】
本発明の抗体のクラス（アイソタイプ）は特に限定されない。例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等、いずれのクラスであってもよい。さらに、本発明の抗体のサブクラスについても特に限定はなく、例えば、ＩｇＧであれば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３等のいずれのサブクラスであってもよい。
【００７５】
好ましい実施形態では、ＣＣＲ７リガンド刺激によるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断する活性を有する。
【００７６】
本発明の抗体におけるさらに他の様相（第五の様相）は、Ｒ７−０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３６９）、Ｒ７−０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０４）、Ｒ７−０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７１）、Ｒ７−０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７２）、Ｒ７−１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７３）、Ｒ７−１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７４）、Ｒ７−２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７５）、又はＲ７−４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７６）により産生される抗ヒトＣＣＲ７抗体である。これらの８種のハイブリドーマが産生する抗体は、ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合するものである。
後述の実施例で詳細に説明されるとおり、これらのハイブリドーマによって産生される８種の抗体は、それぞれ、上記した特定のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び各ＣＤＲを有する。表１に、ＶＨ、ＶＬ、各ＣＤＲのアミノ酸配列の配列番号と、対応するクローンの関係をまとめる。
【００７７】
【表１】
2012043533.tif 000003
【００７８】
本発明の抗体を産生する上記８種のハイブリドーマは、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ，あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。寄託の詳細は以下のとおりである。
【００７９】
表示：Ｒ７−０１
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３６９
受託日：平成２２年（２０１０年）７月２８日
（２０１０年７月２８日に寄託されたＦＥＲＭ−２１９８８より移管）
【００８０】
表示：Ｒ７−０２
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０４
受託日：平成２２年（２０１０年）７月２８日
（２０１０年７月２８日に寄託されたＦＥＲＭ−２１９８９より移管）
【００８１】
表示：Ｒ７−０５
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７１
受託日：平成２２年（２０１０年）７月２８日
（２０１０年７月２８日に寄託されたＦＥＲＭ−２１９９０より移管）
【００８２】
表示：Ｒ７−０９
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７２
受託日：平成２２年（２０１０年）７月２８日
（２０１０年７月２８日に寄託されたＦＥＲＭ−２１９９１より移管）
【００８３】
表示：Ｒ７−１１
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７３
受託日：平成２２年（２０１０年）７月２８日
（２０１０年７月２８日に寄託されたＦＥＲＭ−２１９９２より移管）
【００８４】
表示：Ｒ７−１８
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７４
受託日：平成２２年（２０１０年）７月２８日
（２０１０年７月２８日に寄託されたＦＥＲＭ−２１９９３より移管）
【００８５】
表示：Ｒ７−２５
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７５
受託日：平成２２年（２０１０年）７月２８日
（２０１０年７月２８日に寄託されたＦＥＲＭ−２１９９４より移管）
【００８６】
表示：Ｒ７−４７
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７６
受託日：平成２２年（２０１０年）７月２８日
（２０１０年７月２８日に寄託されたＦＥＲＭ−２１９９５より移管）
【００８７】
本発明の抗体が特異的に結合するヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインは、Ｎ末端ドメイン、細胞外第１ループドメイン、細胞外第２ループドメイン、細胞外第３ループドメインのいずれでもよい。また本発明の抗体は、これらの細胞外ドメインのいずれか１つのみに結合するものでもよいし、２つ以上に結合するものでもよい。
【００８８】
本発明の抗体には、上記した第一から第五の様相に係る抗ヒトＣＣＲ７抗体と同一のエピトープに結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体も含まれる。換言すれば、上記した第一から第五の様相に係る抗ヒトＣＣＲ７抗体のＣＤＲと「機能的に同等」のＣＤＲを有する抗ヒトＣＣＲ７抗体も含まれる。例えば、後述の実施例で具体的に示す８種の抗ヒトＣＣＲ７抗体のエピトープを、ヒトＣＣＲ７の部分ペプチド等を用いたエピトープマッピング法により解析する。そして、同定されたエピトープを含む合成ペプチドを抗原として用い、上記８種の抗ヒトＣＣＲ７抗体と同一のエピトープに結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体を得ることができる。さらに、得られた抗ヒトＣＣＲ７抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列を決定し、重鎖ＣＤＲ１〜３と軽鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を特定することができる。
なお、当該抗ヒトＣＣＲ７抗体における「機能的に同等」のＣＤＲのアミノ酸配列の例としては、元のアミノ酸配列（配列番号５〜１０、１５〜２０、２５〜３０、３５〜４０、４５〜５０、５５〜６０、６５〜７０、７５〜８０）において１若しくは数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列で且つＣＤＲとして同等の機能を有するものが挙げられる。別の例としては、前記元のアミノ酸配列との相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上のアミノ酸配列で且つＣＤＲとして同等の機能を有するものが挙げられる。
２つの抗体についてエピトープが同一か否かを調べる方法としては、競合実験による方法が挙げられる。例えば、第一抗体たる前記８種の抗ヒトＣＣＲ７抗体と受容体との結合が、試験対象である第二抗体によって競合阻害を受ける場合には、当該第二抗体は、前記第一抗体と同じエピトープに結合するものであるといえる。
【００８９】
本発明の核酸は、本発明の抗体における重鎖可変領域（ＶＨ）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするものである。すなわち、第一の様相に係る、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、又は配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する抗ヒトＣＣＲ７抗体のＶＨまたはＶＬをコードする核酸は、本発明の核酸に含まれる。また、第二の様相に係る、上記（Ａ１）〜（Ａ８）のいずれかを満たすＶＨ又はＶＬをコードする核酸は、本発明の核酸に含まれる。また、第三の様相に係る、上記（Ｂ１）〜（Ｂ８）のいずれかを満たすＶＨ又はＶＬをコードする核酸は、本発明の核酸に含まれる。また、第四の様相に係る、上記（Ｃ１）〜（Ｃ８）のいずれかを満たすＶＨ又はＶＬをコードする核酸は、本発明の核酸に含まれる。これらの核酸の具体例としては、配列番号１、配列番号３、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５３、配列番号６１、配列番号６３、配列番号７１、又は配列番号７３で表される塩基配列を有する核酸が挙げられる。
本発明の核酸は、上記８種のハイブリドーマからＰＣＲ等を用いて取得することもできる。
【００９０】
本発明のベクターは、本発明の核酸を含むものである。ベクターの種類としては特に限定はなく、その後に導入される宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。また、本発明のベクターには、遺伝子治療用ベクターが含まれる。この場合には、ベクターそのものを生体内に直接投与可能である。
【００９１】
本発明の細胞は、本発明のベクターが導入されたものである。細胞の種類としては、導入されたベクターが機能するものであれば特に限定はない。例としては、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、酵母、細菌（大腸菌等）、植物細胞、昆虫細胞、などが挙げられる。
【００９２】
本発明の抗体は、例えば以下のようにして製造することができる。
【００９３】
（ハイブリドーマによる生産）
上記８種のいずれかのハイブリドーマを培養し、該培養物から本発明の抗体を生産することができる。培養の方法としては、ハイブリドーマの培養方法として一般に採用されている方法をそのまま適用することができる。例えば、ＤＭＥＭやＲＰＭＩ１６４０のような動物細胞用の培地を用いてハイブリドーマを培養し、その培養上清から本発明の抗体を得ることができる。動物の腹腔内でハイブリドーマを培養する場合には、腹水を採取し、その腹水から本発明の抗体を得ることができる。
【００９４】
（遺伝子組換え技術による生産）
本発明の抗体は、遺伝子組換えの手法を用いて生産することもできる。特に、キメラ型抗体、ヒト化抗体、抗体の機能的断片などを生産する場合には、遺伝子組換えの手法により生産することが一般的である。
【００９５】
まず、第四の様相に係る、上記（Ｃ１）〜（Ｃ８）のいずれかを満たす重鎖可変領域と軽鎖可変領域を有する抗体を生産する方法について、キメラ型抗体の生産を例に説明する。ここで「キメラ型抗体」とは、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）がヒト以外の動物由来のもので、重鎖定常領域（ＣＨ）や軽鎖定常領域（ＣＬ）などの他の領域がヒト由来のものである抗体を指す。
まず、配列番号２、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、又は配列番号７２に示すアミノ酸配列（ＶＨ）をコードするＤＮＡを調製する。同様に、配列番号４、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３４、配列番号４４、配列番号５４、配列番号６４、又は配列番号７４に示すアミノ酸配列（ＶＬ）をコードするＤＮＡを調製する。これらのＤＮＡとしては、配列番号１、配列番号３、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５３、配列番号６１、配列番号６３、配列番号７１、又は配列番号７３に示すものが例示されるが、他の塩基配列のものでもよい。ＤＮＡの調製は、ＰＣＲ等の公知の方法を用いて行うことができる。化学合成により当該ＤＮＡを調製することもできる。
得られたＶＨ又はＶＬをコードするＤＮＡを、ヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードする配列を有するベクターにそれぞれ挿入し、キメラ型抗体発現ベクターを構築する。なお、ヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードする配列を有するベクターは、市場から入手できる。構築した発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、キメラ型抗体を発現する組換え細胞を得る。そして、この組換え細胞を培養し、該培養物から所望のキメラ型抗体を取得する。
【００９６】
前記宿主細胞としては、発現ベクターが機能できるものであれば特に限定はない。上述したような、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、酵母、細菌（大腸菌等）、植物細胞、昆虫細胞、などを適宜採用することができる。
【００９７】
次に、第三の様相に係る、上記（Ｂ１）〜（Ｂ８）のいずれかを満たす特定のＣＤＲを有する抗体を生産する方法について、ヒト化抗体の生産を例に説明する。ここでヒト化抗体とは、ＣＤＲがヒト以外の動物由来のもので、その他の領域（フレームワーク領域や定常領域など）がヒト由来のものである抗体を指す。
【００９８】
まず、重鎖ＣＤＲ１〜３および軽鎖ＣＤＲ１〜３をコードするＤＮＡとして、配列番号５〜１０、配列番号１５〜２０、配列番号２５〜３０、配列番号３５〜４０、配列番号４５〜５０、配列番号５５〜６０、配列番号６５〜７０、又は配列番号７５〜８０に示すアミノ酸配列をコードする各ＤＮＡを調製する。当該ＤＮＡとしては、配列番号１、配列番号３、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５３、配列番号６１、配列番号６３、配列番号７１、又は配列番号７３に示す塩基配列における各ＣＤＲ相当部分の配列が例示されるが、他の塩基配列のものでもよい。ＤＮＡの調製は、ＰＣＲ等の公知の方法を用いて行うことができる。化学合成により当該ＤＮＡを調製することもできる。
次に、これらのＤＮＡを用いて、任意のヒト抗体におけるＶＨのフレームワーク領域（ＦＲ）に重鎖ＣＤＲ１〜３が移植された可変領域をコードするＤＮＡを作製する。同様に、任意のヒト抗体におけるＶＬのＦＲに軽鎖ＣＤＲ１〜３が移植された可変領域をコードするＤＮＡを作製する。作製した各ＤＮＡを、ヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードする配列を有するベクターに挿入し、ヒト化抗体発現ベクターを構築する。構築した発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、ヒト化抗体を発現する組換え細胞を得る。そして、この組換え細胞を培養し、該培養物から所望のヒト化抗体を取得する。
第二の様相に係る、上記（Ａ１）〜（Ａ８）のいずれかを満たす特定のＣＤＲを有する抗体についても、同様の手順で生産することができる。
第一の様相に係る、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、又は配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する抗ヒトＣＣＲ７抗体についても、同様の手順で生産することができる。
【００９９】
本発明の抗体の精製方法としては特に限定はなく、公知の手法を採用することができる。例えば、前記ハイブリドーマ又は前記組換え細胞の培養上清を回収し、各種クロマトグラフィー、塩析、透析、膜分離等の公知の手法を組み合わせて、本発明の抗体を精製することができる。抗体のアイソタイプがＩｇＧである場合には、プロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって簡便に精製することもできる。
【０１００】
なお、本発明のハイブリドーマは、後述の実施例にて詳述するように、公知のハイブリドーマ作製技術を用いて選抜及び取得されたものである。ここで、動物（例えばマウス）に抗原を免疫する際には、精製されたヒトＣＣＲ７を抗原として用いることもできるが、遺伝子免疫の手法を用いてもよい。特に、大腸菌シャペロニンであるＧｒｏＥＬの遺伝子にＣＣＲ７遺伝子を連結させた融合遺伝子を免疫原として用いることにより、抗体作製が容易に行えることがある。当該遺伝子免疫手法の詳細は、国際公開第２００６／０４１１５７号パンフレットに記載されている。
【０１０１】
本発明の抗体は医薬組成物（治療剤）の有効成分として有用である。本発明の医薬組成物は、本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体と、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とするものである。好ましくは、ＣＣＲ７リガンドによるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断するものである。
【０１０２】
好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は、組織の線維化を治療するために用いられる。組織の線維化の例としては、肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、消化管線維症及び他の線維性疾患からなる群から選択される線維症が挙げられる。
前記肝線維症の例としては、肝硬変、虚血再灌流、肝移植後傷害、壊死性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、原発性胆汁性肝硬変、及び原発性硬化性胆管炎からなる群から選択される肝線維症が挙げられる。肝硬変については、アルコールによる誘発、薬物による誘発、及び化学的な誘発からなる群から選択された少なくとも１つによるものが挙げられる。前記腎線維症の例としては、増殖性糸球体腎炎、硬化性糸球体腎炎、腎性線維化性皮膚症、糖尿病性腎症、腎尿細管間質性線維症、及び巣状分節性糸球体硬化症からなる群から選択される腎線維症が挙げられる。前記肺線維症の例としては、肺間質性線維症、薬物誘発サルコイドーシス、肺線維症、特発性肺線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、びまん性肺胞損傷疾患、肺高血圧症、及び新生児気管支肺形成異常からなる群から選択される肺線維症が挙げられる。
【０１０３】
前記皮膚線維症の例としては、強皮症、ケロイド瘢痕化、乾癬、肥厚性瘢痕化、及び偽性強皮症からなる群から選択される皮膚線維症が挙げられる。前記心血管線維症の例としては、アテローム性動脈硬化、冠動脈再狭窄、うっ血性心筋症、心不全、心移植、及び心筋線維症からなる群から選択される心血管線維症が挙げられる。前記消化管線維症の例としては、コラーゲン蓄積大腸炎、絨毛萎縮、陰窩過形成、ポリープ形成、クローン病の線維症、胃潰瘍治癒、及び腹部癒着術後瘢痕からなる群から選択される消化管線維症が挙げられる。
【０１０４】
また前記線維症が、骨に関連する線維化性疾患から生じる状態を有し、リウマチ様パンヌス形成であってもよい。
【０１０５】
また本発明の医薬組成物は、癌の転移を治療するためにも用いることができる。前記癌の例としては、咽頭癌、軟骨肉腫、大腸癌、膵臓癌、白血病、乳癌からなる群から選択される癌が挙げられる。
【０１０６】
本発明の医薬組成物は、経口あるいは非経口的に、全身あるいは局部的に投与することができる。投与の形態としては、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の場合には、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより、全身または局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状により、適宜、投与方法を選択することができる。本発明の抗体の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことができる。あるいは、例えば、患者あたり抗体０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の抗体の投与量は、これらの範囲に限定されるものではない。
【０１０７】
本発明の抗体を含む医薬組成物は、常法に従って製剤化することができる（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体や添加物を含む。前記担体あるいは前記添加物の例としては、界面活性剤（ＰＥＧ、Ｔｗｅｅｎ等）、賦形剤、酸化防止剤（アスコルビン酸等）、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤（リン酸、クエン酸、他の有機酸等）、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに限定されず、その他常用の担体等を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等のタンパク質、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン及びリシン等のアミノ酸を含んでいてもよい。
【０１０８】
注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０）等と併用してもよい。また、必要に応じ本発明の抗体をマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ［メチルメタクリル酸］等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる（"Remingto's Pharmaceutical Science 16th edition",Oslo Ed. (1980)等参照）。
【０１０９】
さらに、薬剤を徐放させる技術が知られており、本発明の医薬組成物に適用し得る（Langer et al., J. Biomed. Master. Res. 15:167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)；米国特許第３，７７３，９１９号；欧州特許出願公開第５８，４８１号；Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983)；欧州特許出願公開第１３３，９８８号）。
【０１１０】
さらに、抗体に他の薬剤（抗線維化作用剤、低分子抗癌剤、サイトカインなど）を直接融合させ治療効果を高める技術が知られており、本発明の医薬組成物に適用し得る。
【０１１１】
また、本発明の抗体をコードする遺伝子を遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療薬とすることも考えられる。当該遺伝子治療薬（組換えベクター）の投与方法としては、ｎａｋｅｄプラスミドによる直接投与の他、リポソーム等にパッケージングして投与する方法、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ＨＶＪベクター等の各種ウイルスベクターに組み込んで投与する方法（Ａｄｏｌｐｈ『ウイルスゲノム法』，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｆｌｏｒｉｄ（１９９６）参照）、コロイド金粒子等のビーズ担体に被覆（国際公開第９３／１７７０６号パンフレット等）して投与する方法、等が挙げられる。すなわち、前記遺伝子治療薬は、生体内において本発明の抗体が発現され、その作用を発揮できる限り、いかなる方法により投与してもよい。好ましくは、適当な非経口経路（静脈内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪組織内、乳腺組織内、吸入または筋肉内の経路を介して注射、注入、またはガス誘導性粒子衝撃法（電子銃等による）、添鼻薬等粘膜経路を介する方法等）により十分な量が投与される。さらに、前記遺伝子治療薬は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいてリポソームトランスフェクション、粒子衝撃法（米国特許第４，９４５，０５０号）、またはウイルス感染を利用して細胞に投与し、該細胞を動物に再導入することにより投与してもよい。
【０１１２】
さらに、本発明には、ＣＣＲ７シグナルの異常亢進によって発症する疾患又は疾病に罹患した哺乳動物の該疾患に関する治療方法と治療薬も含まれる。
ここで「治療」とは、疾患に罹患するおそれがあるか又は罹患した哺乳動物において、該疾患の病態の進行及び悪化を阻止又は緩和することを意味し、これによって該疾患の諸症状等の進行及び悪化を阻止又は緩和することを目的とする治療的処置の意味として使用される。
【０１１３】
また、「疾患」とは、ＣＣＲ７シグナルの異常亢進に起因して発症する疾患全般のことを意味し、特に限定されるものではなく、例えば、肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、消化管線維症及び他の線維性疾患を含む概念である。また、咽頭癌、軟骨肉腫、大腸癌、膵臓癌、白血病、乳癌を原発とする癌転移を含む概念である。治療の対象となる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウサギなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。
【０１１４】
本発明の抗体固定化担体は、本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体が担体に固定化されてなるものである。好ましい実施形態では、本発明の抗体固定化担体は、ＣＣＲ７発現細胞を含む血液を接触させて、前記体液からＣＣＲ７発現細胞を除去するために用いられる。担体に固定化される抗ヒトＣＣＲ７抗体は、１種類のみでもよいし、２種以上でもよい。
【０１１５】
本発明の抗体固定化担体の具体的形態としては、例えば、本発明の抗体が水不溶性担体に固定され、容器に充填されたものが挙げられる。ここで、水不溶性担体としてはいかなる材質も使用可能であるが、成型性、滅菌性や細胞毒性が低いという点で好ましいものを列記すると、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン等の金属材料が挙げられる。
【０１１６】
担体の形状としては、粒状、綿状、織布、不織布、スポンジ状多孔質体、平板状、などが挙げられるが、体積当たりの表面積が大きいという点で粒状、綿状、織布、不織布、スポンジ状多孔質体が好ましい。例えば、抗体が固定された水不溶性担体を予め容器に充填した多孔質体フィルターに末梢血液を通過させ、疾患に関わるＣＣＲ７発現細胞を効率よく除去することができる。
【０１１７】
本発明の抗体固定化担体と他の構成要素とを組み合わせて、ＣＣＲ７発現細胞除去用キットを作製することができる。当該他の構成要素としては、抗凝固剤、体外循環回路などが挙げられる。
【０１１８】
本発明は、下記（１）〜（５）の抗ヒトＣＣＲ７抗体を包含する。
【０１１９】
（１）ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体であって、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、又は配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（重鎖ＣＤＲ３）を有することを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体。
【０１２０】
（２）その相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列について、下記（Ａ１）〜（Ａ８）のいずれかを満たすことを特徴とする上記（１）に記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体。
（Ａ１）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ２）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ３）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ４）配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ５）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ６）配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ７）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ８）配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する。
【０１２１】
（３）その相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列について、下記（Ｂ１）〜（Ｂ８）のいずれかを満たすことを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体。
（Ｂ１）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ２）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ３）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ４）配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ５）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ６）配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ７）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号６８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ８）配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号８０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
【０１２２】
（４）その重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列について、下記（Ｃ１）〜（Ｃ８）のいずれかを満たすことを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体。
（Ｃ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ２）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ３）配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ４）配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ５）配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ６）配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ７）配列番号６２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ８）配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号７４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
【０１２３】
（５）Ｒ７−０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３６９）、Ｒ７−０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０４）、Ｒ７−０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７１）、Ｒ７−０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７２）、Ｒ７−１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７３）、Ｒ７−１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７４）、Ｒ７−２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７５）、又はＲ７−４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７６）により産生されることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体。
【０１２４】
本発明は、有効量の前記抗ヒトＣＣＲ７抗体を投与する組織の繊維化又は癌の転移の治療方法、を包含する。組織の繊維化と癌の具体例は、前述したとおりである。
【０１２５】
本発明は、組織の繊維化又は癌の転移の治療剤製造のための前記抗ヒトＣＣＲ７抗体の使用、を包含する。また本発明は、組織の繊維化又は癌の転移の治療用の前記抗ヒトＣＣＲ７抗体、を包含する。組織の繊維化と癌の具体例は、前述したとおりである。
【実施例】
【０１２６】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【０１２７】
（１）ヒトＣＣＲ７（ｈＣＣＲ７）遺伝子の調製
ジーンバンク登録済みのヒトＣＣＲ７遺伝子配列（ＮＭ＿００１８３８、配列番号８１）の５'末端にＧＣＴＡＧＣ配列、３'末端にＧＴＣＧＡＣＴＡＧＧＡＡＴＴＣ配列（配列番号８３）を付加した人工合成遺伝子をＤＮＡ合成装置により作製した。その後、この遺伝子をｐＵＣ５７クローニングベクターに導入し、ヒトＣＣＲ７遺伝子クローンを調製した。以下、得られたベクターをＮｈｅＩとＳａｌＩサイトで切断して調製される遺伝子断片を「ＤＮＡ断片Ａ」と称し、ＮｈｅＩとＥｃｏＲＩサイトで切断して調製される遺伝子断片を「ＤＮＡ断片Ｂ」と称する。【０１２８】
（２）ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子の単離
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株（ノバジェン社）からゲノムＤＮＡを抽出・精製した。次に、精製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号８４及び８５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、配列番号８６に示す塩基配列を有するＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、「ＤＮＡ断片Ｃ」と称する。）を増幅した。ＤＮＡ断片Ｃには、プライマーに由来して、５'末端にＳａｌＩサイト、３'末端に２個の停止コドン（ＴＡＡＴＡＧ）をコードする配列及びＮｏｔＩサイトが導入された。【０１２９】
（３）ヒトＣＣＲ７とＧｒｏＥＬサブユニットとの融合タンパク質を発現する遺伝子免疫用ベクターの構築
哺乳動物発現ベクターpCI Mammalian Expression Vector（プロメガ社）を制限酵素ＮｈｅＩとＳａｌＩで消化し、バクテリア由来アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）にて末端を脱リン酸化処理した後、上記（１）で調製したＤＮＡ断片Ａを挿入した。さらに、この発現ベクターをＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＢＡＰにて末端を脱リン酸化処理した後、上記（２）で調製したＤＮＡ断片Ｃを挿入し、ベクターｐＣＩ−ｈＣＣＲ７・ＧｒｏＥＬを構築した。すなわち、ベクターｐＣＩ−ｈＣＣＲ７・ＧｒｏＥＬは、ヒトＣＣＲ７をコードする遺伝子とＧｒｏＥＬサブユニットをコードする遺伝子との融合遺伝子を有している。【０１３０】
（４）ヒトＣＣＲ７遺伝子導入安定発現細胞の作製
上記（１）で調製したＤＮＡ断片ＢをｐＣＩｎｅｏ（プロメガ社）のＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩサイトに導入し、ｐＣＩｎｅｏ−ｈＣＣＲ７を構築した。【０１３１】
リポフェクタミン（Lipofectamin）溶液３７．５μＬと、ＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ培地６２５μＬと、２０μｇのｐＣＩｎｅｏ−ｈＣＣＲ７を含むＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ培地６２５μＬとを混和した。この混和液を用いて、ｐＣＩｎｅｏ−ｈＣＣＲ７を２×１０5個のＣＨＯ−Ｋ１細胞（大日本製薬社）に導入した。対照として、ｐＣＩｎｅｏのみをＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入した。遺伝子が導入された各ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、Ｈａｍ'ｓＦ１２Ｋ＋１０％ＦＢＳ培地（ＩＣＮ社）にて３０時間培養した。さらに、各細胞を剥離、懸濁し、１００ｍｍディッシュに５×１０5個を播き、抗生物質Ｇ４１８（プロメガ社）を０．８ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するＨａｍ'ｓＦ１２Ｋ＋１０％ＦＢＳ培地で２週間薬剤処理を行なった。薬剤処理後、限界希釈法により、Ｇ４１８耐性細胞をクローニングした。さらに、Ｃａシグナル応答を増大させるために、クローニングした細胞にｐＣＥＰ−Ｇα１６（Molecular Devices社）を遺伝子導入し、抗生物質ハイグロマイシンを０．２ｍｇ／ｍＬの濃度下で、同様に薬剤処理を行ない、その後、さらにハイグロマイシン耐性細胞のクローニングを行なった。以上の操作により、ヒトＣＣＲ７遺伝子導入安定発現細胞を作製した。次に、この細胞上のＣＣＲ７機能活性を確認するため、以下の評価を行なった。細胞は２×１０4個／１００μＬの初期細胞濃度にて、９６穴マイクロタイタープレートを用いて一昼夜培養し、培養終了後、１０-6〜１０-12Ｍの濃度範囲内のＣＣＬ２１（R&D systems社）によって各細胞を刺激したところ、細胞内のＣａ2+濃度が一過的に上昇した。Ｃａ2+濃度は、Ｃａ2+シグナル解析装置（ＦＬＩＰＲ；Molecular Devices社）及び細胞内Ｃａ2+染色キット（Ｃａ３ｋｉｔ；Molecular Devices社）を用いて測定した。このことから、活性型ヒトＣＣＲ７が、ＣＨＯ−Ｋ１細胞膜上に正常に安定発現していることがわかった。【０１３２】
（５）遺伝子免疫
生理食塩水にベクターｐＣＩ−ｈＣＣＲ７・ＧｒｏＥＬを２５０μｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解し、免疫用組成物を調製した。この免疫用組成物を、８週齢のマウスＢＡＬＢ／ｃ（雌）の両足大腿筋に各０．１２ｍＬずつ注射を行い、免疫した（０日目）。これにより、ｐＣＩ−ｈＣＣＲ７・ＧｒｏＥＬを両足に各３０μｇずつ、すなわち、１匹につき１回あたり６０μｇ投与した。その後、７日目、２１日目、及び２８日目にも同様して繰り返し免疫した。そして、０、７、１４、２１、２８、３５、４２日目に採血を行い、血清を調製した。対照として、ｈＣＣＲ７を単独で発現するベクターｐＣＩ−ｈＣＣＲ７を用いてマウスを免疫した。【０１３３】
（６）フローサイトメトリーによる活性型ヒトＣＣＲ７に対する血清中抗体結合性評価
ｐＣＩｎｅｏ−ｈＣＣＲ７が導入され安定発現を確認したＣＨＯ−Ｋ１細胞（以下、「ｈＣＣＲ７遺伝子導入細胞」と称する。）及び、ｐＣＩｎｅｏが導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞（対照の細胞）をＰＢＳで洗浄した。免疫後５６日目の血清を５００倍希釈し、各細胞と一緒にインキュベートした。さらに、各細胞をＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社）を添加した後、フローサイトメーターＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社）を用いて、各細胞と血清中の抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用を解析した。【０１３４】
その結果、ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞を用いた場合は、遺伝子免疫前の血清ではフィコエリスリンがほとんど検出されなかったが、遺伝子免疫後の血清では検出された。これは、免疫後の血清中の抗ヒトＣＣＲ７抗体がヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞に結合することを示していた。一方、対照の細胞を用いた場合も、遺伝子免疫後の血清でもフィコエリスリンが検出されなかった。これは、免疫後の血清中の抗ヒトＣＣＲ７抗体が対照の細胞に結合しないことを示していた。
以上のことから、ベクターｐＣＩ−ｈＣＣＲ７・ＧｒｏＥＬによる遺伝子免疫によって、マウス血清中に活性型ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインを特異的に認識する抗体の産生を誘導することができた。【０１３５】
（７）抗ヒトＣＣＲ７モノクローナル抗体の作製
上記（５）と同様の手順で遺伝子免疫したマウス６匹に対して追加免疫を行った。追加免疫の３日後に脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。ＰＥＧ法により、１×１０8個の脾細胞と、１×１０7個のＢＡＬＢ／Ｃマウス由来のＨＡＴ選択性のミエローマＳＰ２／０細胞とを融合した（細胞融合）。融合した細胞（ハイブリドーマ）の集団をＲＰＭＩ培地に懸濁し、９６穴マイクロプレート１４枚の各穴に播種した。この段階で、約９９０種のハイブリドーマが得られた。【０１３６】
細胞融合の翌日から２週間、３日に１度の頻度で、上記マイクロプレート内の培地をＨＡＴ Ｍｅｄｉａ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×）（シグマ社、品番：Ｈ０２６２）を添加したＲＰＭＩ培地に置き換えた。
上記（６）と同様のフローサイトメトリーによって抗体結合評価を行い、ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞と各穴のハイブリドーマ培養上清中の抗体との結合性を調べた。その結果、８穴において抗体との結合性が確認された。
抗体との結合性が確認された８種のハイブリドーマについて、限界希釈法によるクローニングを行った。すなわち、８種のハイブリドーマについて９６穴マイクロプレートに細胞１個以下／穴になるように播種し、培養した。２週間後、同様のフローサイトメトリーを行い、クローニングされた培養上清中の抗体（抗ヒトＣＣＲ７モノクローナル抗体）の結合性を確認した。その結果、抗ヒトＣＣＲ７モノクローナル抗体を産生する８種のハイブリドーマがクローニングされた。
各ハイブリドーマについてＲＰＭＩ培地１００ｍＬ内でフラスコ培養を２週間行った。各培養上清を、プロテインＧカラム（アマシャムバイオサイエンス社）に供して精製・濃縮し、精製された８種の抗ヒトＣＣＲ７モノクローナル抗体を各々約２０ｍｇ得た。【０１３７】
各ハイブリドーマを、ＩＰＯＤに寄託した。各ハイブリドーマの表示と受託番号は、上述のとおりである。【０１３８】
各々の抗ヒトＣＣＲ７モノクローナル抗体（以下、単に「抗ヒトＣＣＲ７抗体」と称する。）について、以下に示す試験を行った。以下の記載において、ハイブリドーマの表示を抗体名としても用いることとする。【０１３９】
（８）フローサイトメトリーによるヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞に対する結合性評価
１０μｇ／ｍＬ濃度の抗ヒトＣＣＲ７モノクローナル抗体及びマウスコントロールＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ、陰性対照）のＰＢＳ溶液を調製した（以下、「抗体溶液」と称する。）。一方、ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞をＰＢＳで洗浄した後、抗体溶液を細胞と共にインキュベートした。さらに、細胞をＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社）を添加した後、フローサイトメーターＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社）を用いて、細胞と抗ヒトＣＣＲ７抗体及びマウスコントロールＩｇＧとの相互作用を解析した。結果を図９、１０及び表２に示す。図９はヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞と、マウスコントロールＩｇＧとの相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。図１０はヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞と、抗ヒトＣＣＲ７抗体Ｒ７−４７との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。表２は、ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞と、各抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用の解析結果より、算出された特異的結合細胞の割合を示す。図９、１０において、縦軸は細胞数、横軸はフィコエリスリン（ＰＥ）由来の蛍光強度を表す。また、２つのエリア（Ｍ１、Ｍ２）のうち、Ｍ２（右領域）に属する細胞が抗体と結合した細胞を表す。表２において、特異的に結合した細胞の割合は、Ｍ２／（Ｍ１＋Ｍ２）で表される。【０１４０】
その結果、ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞を用いた場合は、Ｍ２のエリアに多くの細胞が検出された（図１０、表２）。これは、各抗ヒトＣＣＲ７抗体がヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞に結合することを示していた。一方、マウスコントロールＩｇＧを用いた場合（図９）は、Ｍ２のエリアにはほとんど細胞が検出されなかった。これは、マウスコントロールＩｇＧがヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞に結合しないことを示していた。以上のことから、得られた抗ヒトＣＣＲ７抗体は、いずれも活性型ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインを特異的に認識するものであることが示された。【０１４１】
【表２】
2012043533.tif 000004
【０１４２】
（９）細胞内Ｃａ2+シグナル伝達阻害活性評価
ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞を、２×１０4個／１００μＬの初期細胞濃度にて、９６穴マイクロタイタープレートを用いて一昼夜培養した。培養終了後、各穴に１０-6〜１０-11Ｍの濃度範囲内の抗ヒトＣＣＲ７抗体を添加した。また対照として、マウスコントロールＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ社、陰性対照）を同様に１０-6〜１０-11Ｍの濃度範囲内で添加したものも調製した。１時間後、１×１０-7ＭのＣＣＬ２１（R&D systems社）によって各細胞を刺激した際の細胞内Ｃａ2+濃度の一過的上昇の抗体濃度依存的減少度を測定した。Ｃａ2+濃度の測定は、Ｃａ2+シグナル解析装置（ＦＬＩＰＲ；Molecular Devices社）及び細胞内Ｃａ染色キット（Ｃａ３ｋｉｔ；Molecular Devices社）を用いて行った。抗ヒトＣＣＲ７抗体Ｒ７−４７を添加した結果を図１１に示す。図１１は細胞内Ｃａ2+濃度と各添加物の濃度との関係を表すグラフである。図１１に示すように、Ｒ７−４７の濃度依存的に、細胞内Ｃａ2+濃度の低下がみられた。これは、Ｒ７−４７がＣＣＬ２１とヒトＣＣＲ７との結合を競合的に阻害した結果、細胞内へのシグナル伝達が阻害されたことを示していた。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出すると、Ｒ７−４７では７．４ｎＭであった。表３は、Ｒ７−４７以外の抗ヒトＣＣＲ７抗体のＩＣ５０を示す。
以上より、得られた抗ヒトＣＣＲ７抗体は、いずれもヒトＣＣＲ７リガンドによるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断できることが示された。【０１４３】
【表３】
2012043533.tif 000005
【０１４４】
（１０）アイソタイプ解析
マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ＧＥヘルスケア社）を用いて、抗ヒトＣＣＲ７抗体のアイソタイプを決定した。検出はホースラディッシュペルオキシダーゼ標識マウスＩｇＧ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによった。結果を表４に示す。【０１４５】
【表４】
2012043533.tif 000006
【０１４６】
（１１）抗体可変領域のｃＤＮＡクローニング、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）の決定
上記８種のハイブリドーマより、各抗体のＬ鎖及びＨ鎖の可変領域をコードするＤＮＡをクローニングし、その塩基配列を決定した。クローニングは以下のように行った。まずハイブリドーマからRNeasyMini Kit（QIAGEN社）を用いてＲＮＡを単離した。次に、「SMARTer-RACE cDNA Amplification Kit」（タカラバイオ社）を用いて、メーカーマニュアルに従い５’−ＲＡＣＥ法によるｃＤＮＡ合成、及びＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲの３'側プライマーとして、γ鎖の場合は、配列番号８７の配列を、κ鎖の場合は配列番号８８〜９０の配列を、λ鎖の場合は配列番号９１の配列をそれぞれ使用した。【０１４７】
得られたＤＮＡ断片をpT７ Blue T Vector（ノバジェン社)にDNA Ligation kit ver.2（タカラバイオ社）に挿入した。このベクターでＸＬ１０Ｇｏｌｄ（ストラタジーン社）をトランスフォームし、Ｘ−ｇａｌ、アンピシリン、ＩＰＴＧ含有プレートに播種後、白いコロニーをピックアップした。正常なサイズのインサートを含むクローン各５種よりプラスミドを調製後、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０型自動シーケンサーを用いてＤＮＡ配列を決定した。決定した配列は一部にＰＣＲエラーによると思われる変異が認められた以外は３クローンとも同じ配列を示したので、その配列をもって目的のＤＮＡ配列とした。得られた塩基配列と対応するアミノ酸配列を、配列番号１（Ｒ７−０１のＶＨ）、配列番号３（Ｒ７−０１のＶＬ）、配列番号１１（Ｒ７−０２のＶＨ）、配列番号１３（Ｒ７−０２のＶＬ）、配列番号２１（Ｒ７−０５のＶＨ）、配列番号２３（Ｒ７−０５のＶＬ）、配列番号３１（Ｒ７−０９のＶＨ）、配列番号３３（Ｒ７−０９のＶＬ）、配列番号４１（Ｒ７−１１のＶＨ）と４３（Ｒ７−１１のＶＬ）、配列番号５１（Ｒ７−１８のＶＨ）、配列番号５３（Ｒ７−１８のＶＬ）、配列番号６１（Ｒ７−２５のＶＨ）、配列番号６３（Ｒ７−２５のＶＬ）、配列番号７１（Ｒ７−４７のＶＨ）、配列番号７３（Ｒ７−４７のＶＬ）に示す。【０１４８】
各塩基配列に対応するアミノ酸配列のみを、配列番号２（Ｒ７−０１のＶＨ）、配列番号４（Ｒ７−０１のＶＬ）、配列番号１２（Ｒ７−０２のＶＨ）、配列番号１４（Ｒ７−０２のＶＬ）、配列番号２２（Ｒ７−０５のＶＨ）、配列番号２４（Ｒ７−０５のＶＬ）、配列番号３２（Ｒ７−０９のＶＨ）、配列番号３４（Ｒ７−０９のＶＬ）、配列番号４２（Ｒ７−１１のＶＨ）と４４（Ｒ７−１１のＶＬ）、配列番号５２（Ｒ７−１８のＶＨ）、配列番号５４（Ｒ７−１８のＶＬ）、配列番号６２（Ｒ７−２５のＶＨ）、配列番号６４（Ｒ７−２５のＶＬ）、配列番号７２（Ｒ７−４７のＶＨ）、配列番号７４（Ｒ７−４７のＶＬ）に示す。【０１４９】
各ＶＨとＶＬについて、ＣＤＲ１〜３を特定した（配列番号５〜１０、１５〜２０、２５〜３０、３５〜４０、４５〜５０、５５〜６０、６５〜７０、７５〜８０）。図１〜９および表１を参照のこと。【０１５０】
（１２）ヒト初代培養細胞を用いた抗ヒトＣＣＲ７抗体の結合確認
健常人の末梢血から、常法に従い Lymphoprep (Axis-Shield社)を用いて単核球細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。単離したＰＢＭＣを、１ｍｇ／ｍＬのヒトガンマグロブリン（Jackson Immuno Research Laboratories社）を含む Phosphate Buffered Saline（ＰＢＳ）溶液に懸濁し、室温で３０分間インキュベートすることでブロッキングした。ブロッキング後のＰＢＭＣ(３×１０5細胞)を、各抗ヒトＣＣＲ７抗体（０．５μｇ）もしくはアイソタイプコントロール抗体（０．５μｇ）と共に４℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＭＣを洗浄バッファー（０．１％ ウシ胎児血清を含むＰＢＳ溶液）で３回洗浄した。次に２次抗体として、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社）を添加し、４℃で１時間インキュベートした。このＰＢＭＣを再度洗浄バッファーで３回洗浄した後、フローサイトメーター（ベックマンコールター社製）を用いて分析した。【０１５１】
Ｒ７−４７を用いたときのフローサイトメトリーの結果を図１２に示す。図１２（ａ）はアイソタイプコントロール抗体とＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体で染色した結果を、図１２（ｂ）はＲ７−４７とＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体で染色した結果を、それぞれ示す。図１２（ａ），（ｂ）の両矢印で示す部分は、それぞれ、アイソタイプコントロール抗体とＲ７−４７が特異的に結合した細胞集団を示している。また図中の数字は、分析したＰＢＭＣの細胞数を１００％としたときの該細胞集団の割合を示す。【０１５２】
ＰＢＭＣ中で各抗ヒトＣＣＲ７抗体が特異的に結合した細胞の割合を表５に示す。
【表５】
2012043533.tif 000007
【０１５３】
これらの結果から、当該抗ヒトＣＣＲ７抗体がヒト天然型ＣＣＲ７を認識し、ヒト天然型ＣＣＲ７に結合できることが示された。【０１５４】
（１３）ヒト初代培養細胞を用いた抗ヒトＣＣＲ７抗体の機能性確認
ＰＢＭＣ（１．６×１０5細胞）を２４ウェルセルカルチャーインサート（ベクトン・ディッキンソン社）のインサートに播種した。さらに、各抗ヒトＣＣＲ７抗体もしくはアイソタイプコントロールＩｇＧ抗体１０μg／ｍＬを添加し、室温にて５分間反応させた。セルカルチャーインサートの各ウェルにはヒトリコンビナントＣＣＬ２１（１５０ｎｇ／ｍＬ）を添加した。インサートをプレート上に設置後、３７℃にて１．５時間反応させた。反応後、インサートを除去し、各ウェル中に遊走した細胞数を測定した。表６と表７に、ＣＣＬ２１依存的細胞遊走に対する当該抗体による機能阻害の結果を示す。【０１５５】
【表６】
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【０１５６】
【表７】
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【０１５７】
まず、ＣＣＬ２１未添加とＣＣＬ２１添加との比較から、ＰＢＭＣの一部の細胞がＣＣＬ２１依存的に細胞遊走することが示された。そして、アイソタイプコントロール（ＩｇＧ１あるいはＩｇＧ２）抗体を添加しても、ＣＣＬ２１依存的な細胞遊走には影響を与えなかった。一方、当該抗体を添加した場合は、８種の抗体全てがＣＣＬ２１依存的な細胞遊走を有意に抑制した。これらの結果から、当該抗ヒトＣＣＲ７抗体のいずれもが、ヒト天然型ＣＣＲ７の機能を抑制することが示された。【０１５８】
（１４）抗ヒトＣＣＲ７抗体の肺線維症モデルにおける組織線維化形成の阻害作用の確認
ヒトＰＢＭＣ中の、ＣＣＲ７を発現するＣＤ１４陽性細胞は、肺線維における線維化形成に重要な細胞である（Abe R, Donnelly SC, Peng T, Bucala R, Metz CN, "Peripheral blood fibrocytes: differentiation pathway and migration to wound sites." J Immunol. 2001 Jun 15;166(12):7556-62；Curnow SJ, Fairclough M, Schmutz C, Kissane S, Denniston AK, Nash K, Buckley CD, Lord JM, Salmon M,"Distinct types of fibrocyte can differentiate from mononuclear cells in the presence and absence of serum." PLoS One. 2010 Mar 18;5(3):e9730）。抗ヒトＣＣＲ７抗体の肺線維症における有効性は、免疫不全マウス（例えばＳＣＩＤマウス）に肺線維症を誘発させる刺激物質（例えばブレオマイシン）を投与後、ヒト由来のＣＣＲ７を発現するＣＤ１４陽性細胞を移入した際の当該細胞の肺組織への移行を調べることで示すことができる。【０１５９】
健常人の末梢血から、常法に従いＰＢＭＣを単離した。単離したＰＢＭＣを、さらにヒトＣＤ１４標識磁気ビーズ（ミルテニーバイオテク社）に接触させ、ＣＤ１４陽性細胞を分離し、マウスへの細胞移入に用いた。Ｔ細胞とＢ細胞が欠如したＳＣＩＤマウスに、生理食塩水に溶解したブレオマイシン（日本化薬社、商品名：ブレオ）を５ｍｇ／ｋｇとなるように経気道投与し、常法に従い肺線維症を惹起させた。ブレオマイシン投与日を０日とし、ブレオマイシン投与４日前、および、投与後から１，４，８，１１日目に、生理食塩水に溶解した抗ヒトＣＣＲ７抗体Ｒ７−１１、Ｒ７−１８、又はＲ７−４７をそれぞれ２０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔投与した。対照として、アイソタイプコントロールＩｇＧを同様のスケジュールで投与した。ブレオマイシン投与後４日目に、上述の方法でＣＣＲ７を発現する細胞を含むヒトＣＤ１４陽性細胞を単離し、ＰＫＨ２６ＰＣＬ赤色蛍光細胞リンカーキット（シグマ社）で蛍光標識した。蛍光標識細胞をマウス一匹当たり１×１０6個、尾静脈より移入した。ブレオマイシン投与から１５日後にマウスを剖検し、常法に従い肺組織を中性ホルマリンで固定し、病理切片を作製した。病理組織を蛍光顕微鏡で観察し、蛍光標識されたヒト細胞由来の細胞数を右肺全視野で計測した。その結果、アイソタイプコントロールＩｇＧを投与したマウスと比較して、抗ヒトＣＣＲ７抗体を投与したマウスでは、いずれも肺において蛍光標識細胞数が減少していた。【０１６０】
また、剖検によって得られた左肺からTRIzol 試薬（Invitrogen社）により組織の全ＲＮＡを抽出し、Nano Drop 1000 (Thermo Fisher Scientific社）により抽出したＲＮＡ量を定量した。各マウス肺から得られたＲＮＡサンプル２μｇに対して、High Capacity cDNA Reverse transcription kit（Applied Biosystems社）を用いて逆転写反応を行い、得られたｃＤＮＡサンプルをリアルタイムＰＣＲ法により肺組織中のヒトＣＣＲ７のｍＲＮＡ量の測定を行った。リアルタイムＰＣＲによる解析は、TaqMan Gene Expression Assaysシステム（Applied Biosystems社）によって行った。内部標準としてTaqMan Ribosomal RNA Control Reagents（Applied Biosystems社）を用い、ヒトＣＣＲ７の検出にはHs01013469_m1のプローブセット（Applied Biosystems社）を用いた。得られたデータはΔΔＣｔ法によって解析を行い、アイソタイプコントロールを投与した群を基準とした相対発現量として評価した。その結果、アイソタイプコントロールＩｇＧを投与したマウスと比較して、抗ヒトＣＣＲ７抗体Ｒ７−１１、Ｒ７−１８、又はＲ７−４７を投与したマウスでは、いずれもヒトＣＣＲ７のｍＲＮＡ量が減少していた（図１３）。この結果は、当該抗ヒトＣＣＲ７抗体が肺線維症において、線維化に重要な細胞の肺組織への浸潤を抑制することを反映している。これらの結果から、当該抗ＣＣＲ７抗体が肺線維化治療に有用であることが示された。【０１６１】
（１５）遺伝子組換え技術による抗ヒトＣＣＲ７抗体の製造
配列番号１１で表されるＤＮＡを含むマウス抗体重鎖全長の遺伝子をクローニングし、分泌発現用ベクターｐＳｅｃＴａｇ２（インビトロジェン社）に導入した。このベクターをｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７０２ＨＣと命名した。同様に、配列番号４１で表されるＤＮＡを含むマウス抗体重鎖全長の遺伝子をクローニングし、分泌発現用ベクターｐＳｅｃＴａｇ２に導入した。このベクターをｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７１１ＨＣと命名した。同様に、配列番号５１で表されるＤＮＡを含むマウス抗体重鎖全長の遺伝子をクローニングし、分泌発現用ベクターｐＳｅｃＴａｇ２に導入した。このベクターをｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７１８ＨＣと命名した。【０１６２】
配列番号１３で表されるＤＮＡを含むマウス抗体軽鎖全長の遺伝子をクローニングし、分泌発現用ベクターｐＳｅｃＴａｇ２に導入した。このベクターをｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７０２ＬＣと命名した。同様に、配列番号４３で表されるＤＮＡを含むマウス抗体軽鎖全長の遺伝子をクローニングし、分泌発現用ベクターｐＳｅｃＴａｇ２に導入した。このベクターをｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７１１ＬＣと命名した。同様に、配列番号５３で表されるＤＮＡを含むマウス抗体軽鎖全長の遺伝子をクローニングし、分泌発現用ベクターｐＳｅｃＴａｇ２に導入した。このベクターをｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７１８ＬＣと命名した。【０１６３】
リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社）を用いて、ｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７０２ＨＣ及びｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７０２ＬＣを、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。この細胞を２日間培養した。培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ−Ｇカラムに供し、ハイブリドーマＲ７−０２由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体を調製した。同様に、リポフェクタミン２０００を用いて、ｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７１１ＨＣ及びｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７１１ＬＣを、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。この細胞を２日間培養した。培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ−Ｇカラムに供し、ハイブリドーマＲ７−１１由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体を調製した。同様に、リポフェクタミン２０００を用いて、ｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７１８ＨＣ及びｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７１８ＬＣを、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。この細胞を２日間培養した。培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ−Ｇカラムに供し、ハイブリドーマＲ７−１８由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体を調製した。【０１６４】
上記（６）と同様にして、ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞（陰性対照）に対し、１０μｇ／ｍＬの各組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体が結合するかどうかを、フローサイトメーターを用いて確認した。蛍光２次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社）を、フローサイトメーターとしてＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社）を用い、各細胞と各組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用を解析した。結果を図１４〜１６に示す。図１４はハイブリドーマＲ７−０２由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体を用いた結果を示す。図１５はハイブリドーマＲ７−１１由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体を用いた結果を示す。図１６はハイブリドーマＲ７−１８由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体を用いた結果を示す。図１４〜１６において、（ａ）はＣＨＯ−Ｋ１細胞を使用した場合の２次元ドット表示図（左）とヒストグラム（右）、（ｂ）はヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞を使用した場合の２次元ドット表示図（左）とヒストグラム（右）である。各２次元ドット表示図において、縦軸はフィコエリスリン（ＰＥ）由来の蛍光強度、横軸はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）由来の蛍光強度を表す。すなわち、いずれの組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体とも、ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞には結合するが、ＣＨＯ−Ｋ１細胞には結合しないことが示された。これらの結果から、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の抗体を、マウス型抗体、キメラ型抗体、ヒト化抗体、抗体の機能的断片、などの形で生産することができることが示された。
【図１】
2012043533.tif 000010
【図２】
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【図３】
2012043533.tif 000012
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年12月3日(2012.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体であって、その相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列について、下記（Ａ１）〜（Ａ８）のいずれかを満たし、補体依存性細胞溶解作用又は抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用を介さずにＣＣＲ７リガンド刺激によるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断する活性を有することを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体。
（Ａ１）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ２）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ３）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ４）配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ５）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ６）配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ７）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ８）配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する。
【請求項２】
下記（Ｂ１）〜（Ｂ８）のいずれかを満たすことを特徴とする請求項１に記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体。
（Ｂ１）配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ２）配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ３）配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ４）配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ５）配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ６）配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ７）配列番号６８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ８）配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号８０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
【請求項３】
下記（Ｃ１）〜（Ｃ８）のいずれかを満たすことを特徴とする請求項２に記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体。
（Ｃ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ２）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ３）配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ４）配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ５）配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ６）配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ７）配列番号６２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ８）配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号７４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
【請求項４】
ヒト化抗体又はキメラ抗体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体。
【請求項５】
抗体断片、一本鎖抗体、又はダイアボディであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体。
【請求項６】
ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体であって、Ｒ７−０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３６９）、Ｒ７−０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０４）、Ｒ７−０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７１）、Ｒ７−０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７２）、Ｒ７−１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７３）、Ｒ７−１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７４）、Ｒ７−２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７５）、又はＲ７−４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７６）により産生され、補体依存性細胞溶解作用又は抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用を介さずにＣＣＲ７リガンド刺激によるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断する活性を有することを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体と同一のエピトープに結合し、補体依存性細胞溶解作用又は抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用を介さずにＣＣＲ７リガンド刺激によるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断する活性を有することを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体。
【請求項８】
Ｒ７−０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３６９）、Ｒ７−０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０４）、Ｒ７−０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７１）、Ｒ７−０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７２）、Ｒ７−１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７３）、Ｒ７−１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７４）、Ｒ７−２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７５）、又はＲ７−４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７６）であることを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする核酸。
【請求項１０】
配列番号１、配列番号３、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５３、配列番号６１、配列番号６３、配列番号７１、又は配列番号７３で表される塩基配列を有する請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターが導入された細胞。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体と、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１４】
組織の線維化を治療するために用いられることを特徴とする請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記組織の線維化が、肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、消化管線維症及び他の線維性疾患からなる群から選択される線維症であることを特徴とする請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記肝線維症が、肝硬変、虚血再灌流、肝移植後傷害、壊死性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、原発性胆汁性肝硬変、及び原発性硬化性胆管炎からなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記肝硬変が、アルコールによる誘発、薬物による誘発、及び化学的な誘発からなる群から選択された少なくとも１つによるものであることを特徴とする請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記腎線維症が、増殖性糸球体腎炎、硬化性糸球体腎炎、腎性線維化性皮膚症、糖尿病性腎症、腎尿細管間質性線維症、及び巣状分節性糸球体硬化症からなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記肺線維症が、肺間質性線維症、薬物誘発サルコイドーシス、肺線維症、特発性肺線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、びまん性肺胞損傷疾患、肺高血圧症、及び新生児気管支肺形成異常からなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記皮膚線維症が、強皮症、ケロイド瘢痕化、乾癬、肥厚性瘢痕化、及び偽性強皮症からなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記心血管線維症が、アテローム性動脈硬化、冠動脈再狭窄、うっ血性心筋症、心不全、心移植、及び心筋線維症からなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記消化管線維症が、コラーゲン蓄積大腸炎、絨毛萎縮、陰窩過形成、ポリープ形成、クローン病の線維症、胃潰瘍治癒、及び腹部癒着術後瘢痕からなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記線維症が、骨に関連する線維化性疾患から生じる状態を有し、リウマチ様パンヌス形成であることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１〜７のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体が担体に固定化されてなる抗体固定化担体。
【請求項２５】
ＣＣＲ７発現細胞を含む血液を接触させて、前記体液からＣＣＲ７発現細胞を除去するために用いられることを特徴とする請求項２４に記載の抗体固定化担体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ヒトＣＣＲ７抗体、ハイブリドーマ、核酸、ベクター、細胞、医薬組成物、並びに、抗体固定化担体に関し、さらに詳細には、ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体、当該抗体を生産するハイブリドーマ、当該抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする核酸、当該核酸を有するベクター、当該ベクターを有する細胞、当該抗体を含む医薬組成物、並びに、当該抗体が固定化された抗体固定化担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインは様々な細胞の遊走や細胞機能を調節するサイトカインである。ケモカインならびにその受容体の機能異常は、自己免疫疾患、急性ならびに慢性炎症、癌といった様々な病気の原因となっている。これまで、ケモカインならびにその受容体の活性を制御する薬剤の開発がなされ、臨床応用されているが、問題を充分に解決しているとはいい難い。
【０００３】
特定のケモカインが細胞の遊走や細胞機能の調節といった活性を発現するためには、ケモカイン選択的な細胞膜受容体と結合することが必要である。ケモカイン受容体はすでに約２０種類発見されており、いずれのケモカイン受容体も３量体Ｇタンパク質と結合する７回膜貫通型タンパク質（ＧＰＣＲ）である。ケモカインが受容体に結合すると、３量体Ｇタンパク質のＧαユニットを遊離させる。その結果、細胞内のＣａ濃度を上昇させたり、phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)やsmall Rho GTPases経路やその他の経路を活性化させて機能を発現させる。いずれのケモカイン受容体も、比較的選択的なケモカインで活性化するものの、タンパク質の１次構造や細胞内の活性化機構は非常に類似している。したがって、特定のケモカイン受容体の機能を選択的に遮断することは容易ではない。生理的ならびに病態における各ケモカインとケモカイン受容体の機能発現は、それぞれのタンパク質が特定の細胞や組織に特定の時期（炎症時）に発現することで制御されている（非特許文献１）。
【０００４】
ヒトＣＣモチーフレセプター７（CC MOTIF, RECEPTOR 7；別名：ＥＢＩ１、ＣＭＫＢＲ７；以下、「ＣＣＲ７」と称する。）は、当初、エプスタイン・バー（EPSTEIN-BARR）ウイルス感染によりリンパ球選択的に発現するＧＰＣＲとして発見された（非特許文献２）。その後、ＣＣＲ７は、ＣＣＬ１９（別名：ＥＬＣ）ならびにＣＣＬ２１（別名：ＳＬＣ、ＥＸＯＤＵＳ  ２）の選択的ケモカイン受容体であることがわかった。ＣＣＲ７は生理的条件下では、ＣＤ４陽性Ｔ細胞（Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｒｅｇ細胞）、成熟樹状細胞、Ｂ細胞といった細胞に比較的選択的に発現している。ＣＣＲ７を介して炎症部位などの病巣にこうした細胞が導引され、炎症反応や免疫反応が亢進することが知られている。またＣＣＲ７異常活性化が自己免疫疾患、急性ならびに慢性炎症後の線維症、癌転移といった様々な病気の原因となっている。
ヒトＣＣＲ７のアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は、すでに知られている（例えば、GenBank: EAW60669.1）。
【０００５】
炎症は、組織の損傷や感染に対する防御反応である。様々な炎症刺激に応答して炎症性分子（ケモカインやサイトカイン）の発現亢進に引き続き、好中球及び単球の浸潤を促進する。さらに炎症反応が亢進すると、ＴならびにＢリンパ球の流入し病態が慢性化する。一方、炎症の収束段階においては、過剰な白血球のアポトーシスや組織マクロファージによる貪食が起こり、間質細胞（例えば線維芽細胞）による損傷組織の修復が見られる。
【０００６】
過剰な間質細胞の分化増殖は、種々の線維症（肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、消化管線維症及び他の線維性疾患）の増悪と深く関連している。慢性肺線維症は、肺全体にわたる瘢痕形成に起因し、予後不良の疾患である。抗線維化作用を有するピルフェニドン、コルチコステロイド類（例えばプレドニゾン）及び／又は体内の免疫系を抑制するその他の薬物が、線維症につながる過程を抑えるため処方される。しかしながら、今のところ充分な治療成績をあげているとはいい難い。
【０００７】
一方、近年、炎症反応後の修復過程における線維化の分子機構が明らかにされつつある。そのような修復機構では、局所的な休止線維芽細胞が、損傷領域に移動し、細胞外マトリックスタンパク質を生成し、傷の収縮と線維形成（瘢痕）を促進する。また、循環する線維芽前駆細胞、線維芽細胞（これらは血液中に存在する）が、傷や線維形成の部位に移動し、そこでそれらが分化して組織の修復やその他の線維化反応を仲介することが示唆されてきた。
【０００８】
血液中線維芽前駆細胞は、ＣＤ１４＋末梢血単球前駆細胞群が炎症部位に浸潤し、局所で間質細胞様（コラーゲンＩ型及びＩＩＩ型並びにフィブロネクチン）に分化する（非特許文献３）。これらの細胞は、炎症性サイトカインを分泌するとともに、細胞外マトリックスタンパク質、他のサイトカイン類、を分泌し、それらが線維形成をもたらし得る。血液中線維芽前駆細胞の炎症部位への過剰な浸潤を選択的に抑制することができれば、線維化を最小限に食い止めることが期待できるが、まだ臨床応用には至っていない。
【０００９】
近年、線維芽前駆細胞に発現するケモカイン受容体として、前記したＣＣＲ７が注目されている（特許文献１）。ＣＣＲ７を欠損させた遺伝子変換動物に肺線維症や腎線維症を発症させるような刺激を付加しても、線維症を発症しないことが示されている（非特許文献４）。そこで、ＣＣＲ７の機能を低分子化合物、モノクローナル抗体、ＲＮＡｉ等で阻害することができれば、種々の線維化を抑制することが期待できる。しかし、ケモカイン受容体のタンパク質の１次構造や細胞内の活性化機構は非常に類似しているため、よりＣＣＲ７を選択的に阻害しうる物質が望まれる。これまでＣＣＲ７の機能を阻害する物質（モノクローナル抗体あるいはＲＮＡｉ）の研究が行われているが、臨床応用まで到達した事例はない。
【００１０】
また一方、癌治療においては原発癌の増殖抑制と遠隔転移を伴う再発予防が重要である。従来の外科療法や化学療法に加え、分子標的薬（例えばキナーゼ阻害剤）や抗体医薬療法により治療成績は向上している。しかしながら、遠隔転移を伴う再発癌は予後不良であり、新たな治療薬の開発が望まれている。遠隔転移の機構としては、原発癌より血管を経由する場合とリンパ組織を経由する場合がある。これまで、細胞外マトリックスタンパク質分解酵素阻害剤（ＭＭＰ阻害剤）などが、転移予防薬として開発されたものの、臨床応用まで到達した事例はない。
【００１１】
様々な研究により、ＣＣＲ７が、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、乳癌細胞、悪性乳房腫瘍などの様々な腫瘍細胞で発現されることが示されている。更に、ＣＣＲ７は、胃癌、黒色腫、非小細胞肺癌、Ｔ細胞白血病細胞などの様々な癌のリンパ節転移において役割を果たしていることが明らかになってきた（非特許文献１）。ＣＣＲ７のリガンドであるＣＣＬ１９ならびにＣＣＬ２１がリンパ節で高発現していることから、選択的なＣＣＲ７機能阻害が、癌細胞のリンパ性転移を抑制することが期待できる。
【００１２】
膜タンパク質（受容体）に対する抗体医薬の主要な作用機序は、当該タンパク質を発現する細胞を抗体が認識した後、補体依存性細胞溶解作用（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）に基づき除去するものが一般的であった。しかしながら、ＣＤＣやＡＤＣＣはマクロファージ等の炎症細胞の活性化を伴い、線維症治療としては必ずしも適切とはいえない。したがって、ＣＣＲ７を選択的に阻害しうるモノクローナル抗体を線維症治療に応用する場合には、ＣＤＣやＡＤＣＣによらない機能性抗体が望ましい。すなわち、ＣＣＲ７のＣＣＬ１９あるいはＣＣＬ２１依存的細胞内情報伝達を選択的に遮断する抗体が望ましい。しかし、一般的に、ＧＰＣＲに対する機能性抗体を効率的に取得することは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特表２００９−５２８９７７号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Viola A, Luster AD "Chemokines and their receptors: drug targets in immunity and inflammation", Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2008;48:171-97
【非特許文献２】Birkenbach, M., Josefsen, K., Yalamanchili, R., Lenoir, G., Kieff, E., "Epstein-Barr virus-induced genes: first lymphocyte-specific G protein-coupled peptide receptors", J. Virol. 67: 2209-2220, 1993.
【非特許文献３】Pilling D, Fan T, Huang D, Kaul B, Gomer RH. "Identification of markers that distinguish monocyte-derived fibrocytes from monocytes, macrophages, and fibroblasts", PLoS One. 2009 Oct 16;4(10):e7475
【非特許文献４】Wada T, Sakai N, Matsushima K, Kaneko S．"Fibrocytes: a new insight into kidney fibrosis"，Kidney Int. 2007 Aug;72(3):269-73.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、線維症や癌の治療薬として有用な新規の抗ヒトＣＣＲ７抗体と、当該抗ヒトＣＣＲ７抗体を含む医薬組成物等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記した課題を解決するための本発明の１つの様相は、ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体であって、その相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列について、下記（Ａ１）〜（Ａ８）のいずれかを満たし、補体依存性細胞溶解作用又は抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用を介さずにＣＣＲ７リガンド刺激によるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断する活性を有することを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体である。
（Ａ１）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ２）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ３）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ４）配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ５）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ６）配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ７）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ８）配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する。
【００１７】
好ましくは、下記（Ｂ１）〜（Ｂ８）のいずれかを満たす。
（Ｂ１）配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ２）配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ３）配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ４）配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ５）配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ６）配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ７）配列番号６８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ８）配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号８０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
【００１８】
好ましくは、下記（Ｃ１）〜（Ｃ８）のいずれかを満たす。
（Ｃ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ２）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ３）配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ４）配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ５）配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ６）配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ７）配列番号６２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ８）配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号７４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
【００１９】
好ましくは、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。
【００２０】
好ましくは、抗体断片、一本鎖抗体、又はダイアボディである。
【００２１】
本発明の他の様相は、ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体であって、Ｒ７−０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３６９）、Ｒ７−０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０４）、Ｒ７−０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７１）、Ｒ７−０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７２）、Ｒ７−１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７３）、Ｒ７−１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７４）、Ｒ７−２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７５）、又はＲ７−４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７６）により産生され、補体依存性細胞溶解作用又は抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用を介さずにＣＣＲ７リガンド刺激によるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断する活性を有することを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体である。
【００２２】
本発明の他の様相は、上記の抗ヒトＣＣＲ７抗体と同一のエピトープに結合し、補体依存性細胞溶解作用又は抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用を介さずにＣＣＲ７リガンド刺激によるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断する活性を有することを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体である。
【００２３】
本発明のさらに他の様相は、Ｒ７−０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３６９）、Ｒ７−０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０４）、Ｒ７−０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７１）、Ｒ７−０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７２）、Ｒ７−１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７３）、Ｒ７−１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７４）、Ｒ７−２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７５）、又はＲ７−４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７６）であることを特徴とするハイブリドーマである。
【００２４】
本発明のさらに他の様相は、本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする核酸である。
【００２５】
好ましくは、配列番号１、配列番号３、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５３、配列番号６１、配列番号６３、配列番号７１、又は配列番号７３で表される塩基配列を有する。
【００２６】
本発明のさらに他の様相は、上記核酸を含むベクターである。
【００２７】
本発明のさらに他の様相は、上記ベクターが導入された細胞である。
【００２８】
本発明のさらに他の様相は、上記した本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体と、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする医薬組成物である。
【００２９】
好ましくは、組織の線維化を治療するために用いられる。
【００３０】
好ましくは、前記組織の線維化が、肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、消化管線維症及び他の線維性疾患からなる群から選択される線維症である。
【００３１】
好ましくは、前記肝線維症が、肝硬変、虚血再灌流、肝移植後傷害、壊死性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、原発性胆汁性肝硬変、及び原発性硬化性胆管炎からなる群から選択される。
【００３２】
好ましくは、前記肝硬変が、アルコールによる誘発、薬物による誘発、及び化学的な誘発からなる群から選択された少なくとも１つによるものである。
【００３３】
好ましくは、前記腎線維症が、増殖性糸球体腎炎、硬化性糸球体腎炎、腎性線維化性皮膚症、糖尿病性腎症、腎尿細管間質性線維症、及び巣状分節性糸球体硬化症からなる群から選択されるものである。
【００３４】
好ましくは、前記肺線維症が、肺間質性線維症、薬物誘発サルコイドーシス、肺線維症、特発性肺線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、びまん性肺胞損傷疾患、肺高血圧症、及び新生児気管支肺形成異常からなる群から選択されるものである。
【００３５】
好ましくは、前記皮膚線維症が、強皮症、ケロイド瘢痕化、乾癬、肥厚性瘢痕化、及び偽性強皮症からなる群から選択されるものである。
【００３６】
好ましくは、前記心血管線維症が、アテローム性動脈硬化、冠動脈再狭窄、うっ血性心筋症、心不全、心移植、及び心筋線維症からなる群から選択されるものである。
【００３７】
好ましくは、前記消化管線維症が、コラーゲン蓄積大腸炎、絨毛萎縮、陰窩過形成、ポリープ形成、クローン病の線維症、胃潰瘍治癒、及び腹部癒着術後瘢痕からなる群から選択されるものである。
【００３８】
好ましくは、前記線維症が、骨に関連する線維化性疾患から生じる状態を有し、リウマチ様パンヌス形成である。
【００３９】
本発明のさらに他の様相は、上記した本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体が担体に固定化されてなる抗体固定化担体である。
【００４０】
好ましくは、ＣＣＲ７発現細胞を含む血液を接触させて、前記体液からＣＣＲ７発現細胞を除去するために用いられる。
【発明の効果】
【００４１】
本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体によれば、治療困難な線維症やリンパ性癌転移等に対する新規医薬品を提供することができる。
【００４２】
本発明のハイブリドーマについても同様であり、治療困難な線維症やリンパ性癌転移等に対する新規医薬品の有効成分となる抗ヒトＣＣＲ７抗体を製造することができる。
【００４３】
本発明の核酸によれば、本発明の抗体を組換え技術をもって生産することができる。また、遺伝子治療への応用も可能である。
【００４４】
本発明のベクターについても同様であり、本発明の抗体を組換え技術をもって生産することができる。また、遺伝子治療への応用も可能である。
【００４５】
本発明の細胞についても同様であり、本発明の抗体を組換え技術をもって生産することができる。
【００４６】
本発明の医薬組成物によれば、治療困難な線維症やリンパ性癌転移等に対する新規医薬品を提供することができる。
【００４７】
本発明の抗体固定化担体によれば、線維症や癌などを罹患している患者の血液から、ＣＣＲ７発現細胞を選択的に除去することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】Ｒ７−０１の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。
【図２】Ｒ７−０２の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。
【図３】Ｒ７−０５の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。
【図４】Ｒ７−０９の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。
【図５】Ｒ７−１１の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。
【図６】Ｒ７−１８の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。
【図７】Ｒ７−２５の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。
【図８】Ｒ７−４７の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。
【図９】ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞とマウスコントロールＩｇＧとの相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。
【図１０】ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞と抗ヒトＣＣＲ７抗体Ｒ７−４７との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。
【図１１】細胞内Ｃａ2+濃度と各添加物の濃度との関係を表すグラフである。
【図１２】（ａ）はアイソタイプコントロール抗体とＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体で染色した結果を表すヒストグラム、（ｂ）はＲ７−４７とＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体で染色した結果を表すヒストグラムである。
【図１３】肺線維症を惹起させたマウスに抗ヒトＣＣＲ７抗体Ｒ７−１１、Ｒ７−１８、又はＲ７−４７を投与した実験の結果を表すグラフである。
【図１４】（ａ）はＣＨＯ−Ｋ１細胞とハイブリドーマＲ７−０２由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用の解析結果を表す２次元ドット表示図とヒストグラム、（ｂ）はヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞とハイブリドーマＲ７−０２由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用の解析結果を表す２次元ドット表示図とヒストグラムである。
【図１５】（ａ）はＣＨＯ−Ｋ１細胞とハイブリドーマＲ７−１１由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用の解析結果を表す２次元ドット表示図とヒストグラム、（ｂ）はヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞とハイブリドーマＲ７−１１由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用の解析結果を表す２次元ドット表示図とヒストグラムである。
【図１６】（ａ）はＣＨＯ−Ｋ１細胞とハイブリドーマＲ７−１８由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用の解析結果を表す２次元ドット表示図とヒストグラム、（ｂ）はヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞とハイブリドーマＲ７−１８由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用の解析結果を表す２次元ドット表示図とヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
まず、本発明の抗体が特異的に認識するヒトＣＣＲ７について、その構造を中心に説明する。前述したように、ＣＣＲ７はＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の一種であり、細胞膜を７回貫通し、そのＮ末端を細胞外に、Ｃ末端を細胞内に向けて存在している。ヒトＣＣＲ７をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）はすでに単離されており、ヒトＣＣＲ７のアミノ酸配列も知られている。当該配列情報は、例えば、GenBank等のデータベースから得ることができる（例えば、GenBank:EAW60669.1）。その一例として、配列番号８１にヒトＣＣＲ７遺伝子の塩基配列と該塩基配列に対応するアミノ酸配列を、配列番号８２にアミノ酸配列のみを示す。
【００５０】
ヒトＣＣＲ７の各ドメインは、配列番号８２に示すアミノ酸配列における以下の部分に相当すると考えられている。左側がアミノ酸番号、右側が各ドメインである。なお各ドメイン間の境界については、多少の前後が生じ得る。
【００５１】
１〜  ２４：膜移行シグナルペプチド配列（発現後に切断・除去される）
２５〜  ５９：Ｎ末端ドメイン
８７〜  ９５：細胞内第１ループドメイン
１１７〜１３０：細胞外第１ループドメイン
１５３〜１７０：細胞内第２ループドメイン
１９２〜２１９：細胞外第２ループドメイン
２４８〜２６３：細胞内第３ループドメイン
２９０〜３１３：細胞外第３ループドメイン
３３２〜３７８：Ｃ末端ドメイン
【００５２】
ヒトＣＣＲ７には、配列番号８２に示すもの以外にアミノ酸置換体等の各種のバリアントが知られている。本発明における「ヒトＣＣＲ７」には、細胞外ドメインを有し且つＣＣＲ７としての機能を有する限り、前記バリアントが含まれる。
【００５３】
本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体（以下、単に「本発明の抗体」と略記することがある。）は、ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合するものである。１つの様相（第一の様相）において、本発明の抗体は、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、又は配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（重鎖ＣＤＲ３）を有する。
【００５４】
また他の様相（第二の様相）において、本発明の抗体は、その相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列について、下記（Ａ１）〜（Ａ８）のいずれかを満たす。
（Ａ１）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ２）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ３）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ４）配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ５）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ６）配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ７）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ８）配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する。
【００５５】
また他の様相（第三の様相）において、本発明の抗体は、その相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列について、下記（Ｂ１）〜（Ｂ８）のいずれかを満たす。
（Ｂ１）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ２）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ３）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ４）配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ５）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ６）配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ７）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号６８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ８）配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号８０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
【００５６】
また他の様相（第四の様相）において、本発明の抗体は、その重鎖可変領域（以下、「ＶＨ」と略記することがある。）と軽鎖可変領域（以下、「ＶＬ」と略記することがある。）のアミノ酸配列が以下（Ｃ１）〜（Ｃ８）のいずれかを満たす。
（Ｃ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ２）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ３）配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ４）配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ５）配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ６）配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ７）配列番号６２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ８）配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号７４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
【００５７】
配列番号５（重鎖ＣＤＲ１），配列番号６（重鎖ＣＤＲ２），配列番号７（重鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号２（ＶＨ）のアミノ酸番号２７〜３５，５０〜６６，９７〜１１２の部分に相当する（図１（ａ））。
配列番号８（軽鎖ＣＤＲ１），配列番号９（軽鎖ＣＤＲ２），配列番号１０（軽鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号４（ＶＬ）のアミノ酸番号２４〜３９，５５〜６８，９４〜１０２の部分に相当する（図１（ｂ））。
【００５８】
配列番号１５（重鎖ＣＤＲ１），配列番号１６（重鎖ＣＤＲ２），配列番号１７（重鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号１２（ＶＨ）のアミノ酸番号４３〜５１，６６〜８２，１１３〜１２４の部分に相当する（図２（ａ））。
配列番号１８（軽鎖ＣＤＲ１），配列番号１９（軽鎖ＣＤＲ２），配列番号２０（軽鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号１４（ＶＬ）のアミノ酸番号２４〜３７，５３〜５９，８７〜９９の部分に相当する（図２（ｂ））。
【００５９】
配列番号２５（重鎖ＣＤＲ１），配列番号２６（重鎖ＣＤＲ２），配列番号２７（重鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号２２（ＶＨ）のアミノ酸番号３０〜３８，５３〜６８，１００〜１１１の部分に相当する（図３（ａ））。
配列番号２８（軽鎖ＣＤＲ１），配列番号２９（軽鎖ＣＤＲ２），配列番号３０（軽鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号２４（ＶＬ）のアミノ酸番号２３〜３６，５２〜５８，９１〜９９の部分に相当する（図３（ｂ））。
【００６０】
配列番号３５（重鎖ＣＤＲ１），配列番号３６（重鎖ＣＤＲ２），配列番号３７（重鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号３２（ＶＨ）のアミノ酸番号２８〜３６，５１〜６７，９８〜１０９の部分に相当する（図４（ａ））。
配列番号３８（軽鎖ＣＤＲ１），配列番号３９（軽鎖ＣＤＲ２），配列番号４０（軽鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号３４（ＶＬ）のアミノ酸番号２３〜３６，５２〜５８，９１〜９９の部分に相当する（図４（ｂ））。
【００６１】
配列番号４５（重鎖ＣＤＲ１），配列番号４６（重鎖ＣＤＲ２），配列番号４７（重鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号４２（ＶＨ）のアミノ酸番号２９〜３７，５２〜６８，９８〜１１０の部分に相当する（図５（ａ））。
配列番号４８（軽鎖ＣＤＲ１），配列番号４９（軽鎖ＣＤＲ２），配列番号５０（軽鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号４４（ＶＬ）のアミノ酸番号２４〜３９，５５〜６１，９４〜１０２の部分に相当する（図５（ｂ））。
【００６２】
配列番号５５（重鎖ＣＤＲ１），配列番号５６（重鎖ＣＤＲ２），配列番号５７（重鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号５２（ＶＨ）のアミノ酸番号３０〜３７，５３〜６９，９９〜１１１の部分に相当する（図６（ａ））。
配列番号５８（軽鎖ＣＤＲ１），配列番号５９（軽鎖ＣＤＲ２），配列番号６０（軽鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号５４（ＶＬ）のアミノ酸番号２４〜３９，５５〜６１，９４〜１０２の部分に相当する（図６（ｂ））。
【００６３】
配列番号６５（重鎖ＣＤＲ１），配列番号６６（重鎖ＣＤＲ２），配列番号６７（重鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号６２（ＶＨ）のアミノ酸番号３０〜４１，５４〜６９，１００〜１１１の部分に相当する（図７（ａ））。
配列番号６８（軽鎖ＣＤＲ１），配列番号６９（軽鎖ＣＤＲ２），配列番号７０（軽鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号６４（ＶＬ）のアミノ酸番号２４〜３９，５６〜６２，９５〜１０２の部分に相当する（図７（ｂ））。
【００６４】
配列番号７５（重鎖ＣＤＲ１），配列番号７６（重鎖ＣＤＲ２），配列番号７７（重鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号７２（ＶＨ）のアミノ酸番号２７〜３５，５０〜６６，９６〜１０９の部分に相当する（図８（ａ））。
配列番号７８（軽鎖ＣＤＲ１），配列番号７９（軽鎖ＣＤＲ２），配列番号８０（軽鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号７４（ＶＬ）のアミノ酸番号２４〜３９，５５〜６１，９４〜１０２の部分に相当する（図８（ｂ））。
【００６５】
本発明において「抗体」という文言は、「免疫グロブリン」と置き換えることができる。
【００６６】
本発明における抗体には、その機能的断片が含まれる。ここで「抗体の機能的断片」とは、抗体（すなわち免疫グロブリン）の部分断片であって、抗原に対する作用を少なくとも１つ保持するものを指す。前記部分断片の例としては、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ、ＶＨ−ＶＬ）、ＶＨ、及びこれらの重合体、並びに、これらと重鎖ＣＨ３領域との融合体が挙げられる。また、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３等の各ＣＤＲ、及びこれらＣＤＲの連結体、並びに、これらＣＤＲ又はＣＤＲ連結体と重鎖ＣＨ３領域との融合体が挙げられる。すなわち本発明の抗体には、ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合するものである限り、前記したような抗体の部分断片も含まれる。抗体の部分断片を「抗体断片」と称することもある。
【００６７】
さらに本発明の抗体は、多重特異性抗体であってもよい。例としては、二重特異性抗体の一種であるダイアボディ（Diabody）（国際公開第９３／１１１６１号パンフレット等）が挙げられる。
【００６８】
本発明の抗体が機能的断片である場合には、例えば、以下のような効果がある。すなわち、本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体を後述するような医薬に応用する際に、ＩｇＧ型等の全長の抗体を使用すると、標的受容体のシグナル阻害に加えて、標的組織に障害が起き、これが副作用につながる場合がある。このような場合に、可変領域だけを用いた「抗体の機能的断片」を採用すると、前記したような副作用を回避しやすくなる。
【００６９】
本発明の抗体のクラス（アイソタイプ）は特に限定されない。例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等、いずれのクラスであってもよい。さらに、本発明の抗体のサブクラスについても特に限定はなく、例えば、ＩｇＧであれば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３等のいずれのサブクラスであってもよい。
【００７０】
好ましい実施形態では、ＣＣＲ７リガンド刺激によるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断する活性を有する。
【００７１】
本発明の抗体におけるさらに他の様相（第五の様相）は、Ｒ７−０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３６９）、Ｒ７−０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０４）、Ｒ７−０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７１）、Ｒ７−０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７２）、Ｒ７−１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７３）、Ｒ７−１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７４）、Ｒ７−２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７５）、又はＲ７−４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７６）により産生される抗ヒトＣＣＲ７抗体である。これらの８種のハイブリドーマが産生する抗体は、ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合するものである。
後述の実施例で詳細に説明されるとおり、これらのハイブリドーマによって産生される８種の抗体は、それぞれ、上記した特定のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び各ＣＤＲを有する。表１に、ＶＨ、ＶＬ、各ＣＤＲのアミノ酸配列の配列番号と、対応するクローンの関係をまとめる。
【００７２】
【表１】
2012043533.tif 000026
【００７３】
本発明の抗体を産生する上記８種のハイブリドーマは、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ，あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。寄託の詳細は以下のとおりである。
【００７４】
表示：Ｒ７−０１
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３６９
受託日：平成２２年（２０１０年）７月２８日
（２０１０年７月２８日に寄託されたＦＥＲＭ−２１９８８より移管）
【００７５】
表示：Ｒ７−０２
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０４
受託日：平成２２年（２０１０年）７月２８日
（２０１０年７月２８日に寄託されたＦＥＲＭ−２１９８９より移管）
【００７６】
表示：Ｒ７−０５
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７１
受託日：平成２２年（２０１０年）７月２８日
（２０１０年７月２８日に寄託されたＦＥＲＭ−２１９９０より移管）
【００７７】
表示：Ｒ７−０９
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７２
受託日：平成２２年（２０１０年）７月２８日
（２０１０年７月２８日に寄託されたＦＥＲＭ−２１９９１より移管）
【００７８】
表示：Ｒ７−１１
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７３
受託日：平成２２年（２０１０年）７月２８日
（２０１０年７月２８日に寄託されたＦＥＲＭ−２１９９２より移管）
【００７９】
表示：Ｒ７−１８
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７４
受託日：平成２２年（２０１０年）７月２８日
（２０１０年７月２８日に寄託されたＦＥＲＭ−２１９９３より移管）
【００８０】
表示：Ｒ７−２５
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７５
受託日：平成２２年（２０１０年）７月２８日
（２０１０年７月２８日に寄託されたＦＥＲＭ−２１９９４より移管）
【００８１】
表示：Ｒ７−４７
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７６
受託日：平成２２年（２０１０年）７月２８日
（２０１０年７月２８日に寄託されたＦＥＲＭ−２１９９５より移管）
【００８２】
本発明の抗体が特異的に結合するヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインは、Ｎ末端ドメイン、細胞外第１ループドメイン、細胞外第２ループドメイン、細胞外第３ループドメインのいずれでもよい。また本発明の抗体は、これらの細胞外ドメインのいずれか１つのみに結合するものでもよいし、２つ以上に結合するものでもよい。
【００８３】
本発明の抗体には、上記した第一から第五の様相に係る抗ヒトＣＣＲ７抗体と同一のエピトープに結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体も含まれる。換言すれば、上記した第一から第五の様相に係る抗ヒトＣＣＲ７抗体のＣＤＲと「機能的に同等」のＣＤＲを有する抗ヒトＣＣＲ７抗体も含まれる。例えば、後述の実施例で具体的に示す８種の抗ヒトＣＣＲ７抗体のエピトープを、ヒトＣＣＲ７の部分ペプチド等を用いたエピトープマッピング法により解析する。そして、同定されたエピトープを含む合成ペプチドを抗原として用い、上記８種の抗ヒトＣＣＲ７抗体と同一のエピトープに結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体を得ることができる。さらに、得られた抗ヒトＣＣＲ７抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列を決定し、重鎖ＣＤＲ１〜３と軽鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を特定することができる。
なお、当該抗ヒトＣＣＲ７抗体における「機能的に同等」のＣＤＲのアミノ酸配列の例としては、元のアミノ酸配列（配列番号５〜１０、１５〜２０、２５〜３０、３５〜４０、４５〜５０、５５〜６０、６５〜７０、７５〜８０）において１若しくは数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列で且つＣＤＲとして同等の機能を有するものが挙げられる。別の例としては、前記元のアミノ酸配列との相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上のアミノ酸配列で且つＣＤＲとして同等の機能を有するものが挙げられる。
２つの抗体についてエピトープが同一か否かを調べる方法としては、競合実験による方法が挙げられる。例えば、第一抗体たる前記８種の抗ヒトＣＣＲ７抗体と受容体との結合が、試験対象である第二抗体によって競合阻害を受ける場合には、当該第二抗体は、前記第一抗体と同じエピトープに結合するものであるといえる。
【００８４】
本発明の核酸は、本発明の抗体における重鎖可変領域（ＶＨ）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするものである。すなわち、第一の様相に係る、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、又は配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する抗ヒトＣＣＲ７抗体のＶＨまたはＶＬをコードする核酸は、本発明の核酸に含まれる。また、第二の様相に係る、上記（Ａ１）〜（Ａ８）のいずれかを満たすＶＨ又はＶＬをコードする核酸は、本発明の核酸に含まれる。また、第三の様相に係る、上記（Ｂ１）〜（Ｂ８）のいずれかを満たすＶＨ又はＶＬをコードする核酸は、本発明の核酸に含まれる。また、第四の様相に係る、上記（Ｃ１）〜（Ｃ８）のいずれかを満たすＶＨ又はＶＬをコードする核酸は、本発明の核酸に含まれる。これらの核酸の具体例としては、配列番号１、配列番号３、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５３、配列番号６１、配列番号６３、配列番号７１、又は配列番号７３で表される塩基配列を有する核酸が挙げられる。
本発明の核酸は、上記８種のハイブリドーマからＰＣＲ等を用いて取得することもできる。
【００８５】
本発明のベクターは、本発明の核酸を含むものである。ベクターの種類としては特に限定はなく、その後に導入される宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。また、本発明のベクターには、遺伝子治療用ベクターが含まれる。この場合には、ベクターそのものを生体内に直接投与可能である。
【００８６】
本発明の細胞は、本発明のベクターが導入されたものである。細胞の種類としては、導入されたベクターが機能するものであれば特に限定はない。例としては、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、酵母、細菌（大腸菌等）、植物細胞、昆虫細胞、などが挙げられる。
【００８７】
本発明の抗体は、例えば以下のようにして製造することができる。
【００８８】
（ハイブリドーマによる生産）
上記８種のいずれかのハイブリドーマを培養し、該培養物から本発明の抗体を生産することができる。培養の方法としては、ハイブリドーマの培養方法として一般に採用されている方法をそのまま適用することができる。例えば、ＤＭＥＭやＲＰＭＩ１６４０のような動物細胞用の培地を用いてハイブリドーマを培養し、その培養上清から本発明の抗体を得ることができる。動物の腹腔内でハイブリドーマを培養する場合には、腹水を採取し、その腹水から本発明の抗体を得ることができる。
【００８９】
（遺伝子組換え技術による生産）
本発明の抗体は、遺伝子組換えの手法を用いて生産することもできる。特に、キメラ型抗体、ヒト化抗体、抗体の機能的断片などを生産する場合には、遺伝子組換えの手法により生産することが一般的である。
【００９０】
まず、第四の様相に係る、上記（Ｃ１）〜（Ｃ８）のいずれかを満たす重鎖可変領域と軽鎖可変領域を有する抗体を生産する方法について、キメラ型抗体の生産を例に説明する。ここで「キメラ型抗体」とは、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）がヒト以外の動物由来のもので、重鎖定常領域（ＣＨ）や軽鎖定常領域（ＣＬ）などの他の領域がヒト由来のものである抗体を指す。
まず、配列番号２、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、又は配列番号７２に示すアミノ酸配列（ＶＨ）をコードするＤＮＡを調製する。同様に、配列番号４、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３４、配列番号４４、配列番号５４、配列番号６４、又は配列番号７４に示すアミノ酸配列（ＶＬ）をコードするＤＮＡを調製する。これらのＤＮＡとしては、配列番号１、配列番号３、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５３、配列番号６１、配列番号６３、配列番号７１、又は配列番号７３に示すものが例示されるが、他の塩基配列のものでもよい。ＤＮＡの調製は、ＰＣＲ等の公知の方法を用いて行うことができる。化学合成により当該ＤＮＡを調製することもできる。
得られたＶＨ又はＶＬをコードするＤＮＡを、ヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードする配列を有するベクターにそれぞれ挿入し、キメラ型抗体発現ベクターを構築する。なお、ヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードする配列を有するベクターは、市場から入手できる。構築した発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、キメラ型抗体を発現する組換え細胞を得る。そして、この組換え細胞を培養し、該培養物から所望のキメラ型抗体を取得する。
【００９１】
前記宿主細胞としては、発現ベクターが機能できるものであれば特に限定はない。上述したような、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、酵母、細菌（大腸菌等）、植物細胞、昆虫細胞、などを適宜採用することができる。
【００９２】
次に、第三の様相に係る、上記（Ｂ１）〜（Ｂ８）のいずれかを満たす特定のＣＤＲを有する抗体を生産する方法について、ヒト化抗体の生産を例に説明する。ここでヒト化抗体とは、ＣＤＲがヒト以外の動物由来のもので、その他の領域（フレームワーク領域や定常領域など）がヒト由来のものである抗体を指す。
【００９３】
まず、重鎖ＣＤＲ１〜３および軽鎖ＣＤＲ１〜３をコードするＤＮＡとして、配列番号５〜１０、配列番号１５〜２０、配列番号２５〜３０、配列番号３５〜４０、配列番号４５〜５０、配列番号５５〜６０、配列番号６５〜７０、又は配列番号７５〜８０に示すアミノ酸配列をコードする各ＤＮＡを調製する。当該ＤＮＡとしては、配列番号１、配列番号３、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５３、配列番号６１、配列番号６３、配列番号７１、又は配列番号７３に示す塩基配列における各ＣＤＲ相当部分の配列が例示されるが、他の塩基配列のものでもよい。ＤＮＡの調製は、ＰＣＲ等の公知の方法を用いて行うことができる。化学合成により当該ＤＮＡを調製することもできる。
次に、これらのＤＮＡを用いて、任意のヒト抗体におけるＶＨのフレームワーク領域（ＦＲ）に重鎖ＣＤＲ１〜３が移植された可変領域をコードするＤＮＡを作製する。同様に、任意のヒト抗体におけるＶＬのＦＲに軽鎖ＣＤＲ１〜３が移植された可変領域をコードするＤＮＡを作製する。作製した各ＤＮＡを、ヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードする配列を有するベクターに挿入し、ヒト化抗体発現ベクターを構築する。構築した発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、ヒト化抗体を発現する組換え細胞を得る。そして、この組換え細胞を培養し、該培養物から所望のヒト化抗体を取得する。
第二の様相に係る、上記（Ａ１）〜（Ａ８）のいずれかを満たす特定のＣＤＲを有する抗体についても、同様の手順で生産することができる。
第一の様相に係る、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、又は配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する抗ヒトＣＣＲ７抗体についても、同様の手順で生産することができる。
【００９４】
本発明の抗体の精製方法としては特に限定はなく、公知の手法を採用することができる。例えば、前記ハイブリドーマ又は前記組換え細胞の培養上清を回収し、各種クロマトグラフィー、塩析、透析、膜分離等の公知の手法を組み合わせて、本発明の抗体を精製することができる。抗体のアイソタイプがＩｇＧである場合には、プロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって簡便に精製することもできる。
【００９５】
なお、本発明のハイブリドーマは、後述の実施例にて詳述するように、公知のハイブリドーマ作製技術を用いて選抜及び取得されたものである。ここで、動物（例えばマウス）に抗原を免疫する際には、精製されたヒトＣＣＲ７を抗原として用いることもできるが、遺伝子免疫の手法を用いてもよい。特に、大腸菌シャペロニンであるＧｒｏＥＬの遺伝子にＣＣＲ７遺伝子を連結させた融合遺伝子を免疫原として用いることにより、抗体作製が容易に行えることがある。当該遺伝子免疫手法の詳細は、国際公開第２００６／０４１１５７号パンフレットに記載されている。
【００９６】
本発明の抗体は医薬組成物（治療剤）の有効成分として有用である。本発明の医薬組成物は、本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体と、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とするものである。好ましくは、ＣＣＲ７リガンドによるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断するものである。
【００９７】
好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は、組織の線維化を治療するために用いられる。組織の線維化の例としては、肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、消化管線維症及び他の線維性疾患からなる群から選択される線維症が挙げられる。
前記肝線維症の例としては、肝硬変、虚血再灌流、肝移植後傷害、壊死性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、原発性胆汁性肝硬変、及び原発性硬化性胆管炎からなる群から選択される肝線維症が挙げられる。肝硬変については、アルコールによる誘発、薬物による誘発、及び化学的な誘発からなる群から選択された少なくとも１つによるものが挙げられる。前記腎線維症の例としては、増殖性糸球体腎炎、硬化性糸球体腎炎、腎性線維化性皮膚症、糖尿病性腎症、腎尿細管間質性線維症、及び巣状分節性糸球体硬化症からなる群から選択される腎線維症が挙げられる。前記肺線維症の例としては、肺間質性線維症、薬物誘発サルコイドーシス、肺線維症、特発性肺線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、びまん性肺胞損傷疾患、肺高血圧症、及び新生児気管支肺形成異常からなる群から選択される肺線維症が挙げられる。
【００９８】
前記皮膚線維症の例としては、強皮症、ケロイド瘢痕化、乾癬、肥厚性瘢痕化、及び偽性強皮症からなる群から選択される皮膚線維症が挙げられる。前記心血管線維症の例としては、アテローム性動脈硬化、冠動脈再狭窄、うっ血性心筋症、心不全、心移植、及び心筋線維症からなる群から選択される心血管線維症が挙げられる。前記消化管線維症の例としては、コラーゲン蓄積大腸炎、絨毛萎縮、陰窩過形成、ポリープ形成、クローン病の線維症、胃潰瘍治癒、及び腹部癒着術後瘢痕からなる群から選択される消化管線維症が挙げられる。
【００９９】
また前記線維症が、骨に関連する線維化性疾患から生じる状態を有し、リウマチ様パンヌス形成であってもよい。
【０１００】
また本発明の医薬組成物は、癌の転移を治療するためにも用いることができる。前記癌の例としては、咽頭癌、軟骨肉腫、大腸癌、膵臓癌、白血病、乳癌からなる群から選択される癌が挙げられる。
【０１０１】
本発明の医薬組成物は、経口あるいは非経口的に、全身あるいは局部的に投与することができる。投与の形態としては、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の場合には、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより、全身または局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状により、適宜、投与方法を選択することができる。本発明の抗体の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことができる。あるいは、例えば、患者あたり抗体０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の抗体の投与量は、これらの範囲に限定されるものではない。
【０１０２】
本発明の抗体を含む医薬組成物は、常法に従って製剤化することができる（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体や添加物を含む。前記担体あるいは前記添加物の例としては、界面活性剤（ＰＥＧ、Ｔｗｅｅｎ等）、賦形剤、酸化防止剤（アスコルビン酸等）、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤（リン酸、クエン酸、他の有機酸等）、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに限定されず、その他常用の担体等を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等のタンパク質、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン及びリシン等のアミノ酸を含んでいてもよい。
【０１０３】
注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０）等と併用してもよい。また、必要に応じ本発明の抗体をマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ［メチルメタクリル酸］等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる（"Remingto's Pharmaceutical Science 16th edition",Oslo Ed. (1980)等参照）。
【０１０４】
さらに、薬剤を徐放させる技術が知られており、本発明の医薬組成物に適用し得る（Langer et al., J. Biomed. Master. Res. 15:167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)；米国特許第３，７７３，９１９号；欧州特許出願公開第５８，４８１号；Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983)；欧州特許出願公開第１３３，９８８号）。
【０１０５】
さらに、抗体に他の薬剤（抗線維化作用剤、低分子抗癌剤、サイトカインなど）を直接融合させ治療効果を高める技術が知られており、本発明の医薬組成物に適用し得る。
【０１０６】
また、本発明の抗体をコードする遺伝子を遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療薬とすることも考えられる。当該遺伝子治療薬（組換えベクター）の投与方法としては、ｎａｋｅｄプラスミドによる直接投与の他、リポソーム等にパッケージングして投与する方法、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ＨＶＪベクター等の各種ウイルスベクターに組み込んで投与する方法（Ａｄｏｌｐｈ『ウイルスゲノム法』，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｆｌｏｒｉｄ（１９９６）参照）、コロイド金粒子等のビーズ担体に被覆（国際公開第９３／１７７０６号パンフレット等）して投与する方法、等が挙げられる。すなわち、前記遺伝子治療薬は、生体内において本発明の抗体が発現され、その作用を発揮できる限り、いかなる方法により投与してもよい。好ましくは、適当な非経口経路（静脈内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪組織内、乳腺組織内、吸入または筋肉内の経路を介して注射、注入、またはガス誘導性粒子衝撃法（電子銃等による）、添鼻薬等粘膜経路を介する方法等）により十分な量が投与される。さらに、前記遺伝子治療薬は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいてリポソームトランスフェクション、粒子衝撃法（米国特許第４，９４５，０５０号）、またはウイルス感染を利用して細胞に投与し、該細胞を動物に再導入することにより投与してもよい。
【０１０７】
さらに、本発明には、ＣＣＲ７シグナルの異常亢進によって発症する疾患又は疾病に罹患した哺乳動物の該疾患に関する治療方法と治療薬も含まれる。
ここで「治療」とは、疾患に罹患するおそれがあるか又は罹患した哺乳動物において、該疾患の病態の進行及び悪化を阻止又は緩和することを意味し、これによって該疾患の諸症状等の進行及び悪化を阻止又は緩和することを目的とする治療的処置の意味として使用される。
【０１０８】
また、「疾患」とは、ＣＣＲ７シグナルの異常亢進に起因して発症する疾患全般のことを意味し、特に限定されるものではなく、例えば、肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、消化管線維症及び他の線維性疾患を含む概念である。また、咽頭癌、軟骨肉腫、大腸癌、膵臓癌、白血病、乳癌を原発とする癌転移を含む概念である。治療の対象となる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウサギなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。
【０１０９】
本発明の抗体固定化担体は、本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体が担体に固定化されてなるものである。好ましい実施形態では、本発明の抗体固定化担体は、ＣＣＲ７発現細胞を含む血液を接触させて、前記体液からＣＣＲ７発現細胞を除去するために用いられる。担体に固定化される抗ヒトＣＣＲ７抗体は、１種類のみでもよいし、２種以上でもよい。
【０１１０】
本発明の抗体固定化担体の具体的形態としては、例えば、本発明の抗体が水不溶性担体に固定され、容器に充填されたものが挙げられる。ここで、水不溶性担体としてはいかなる材質も使用可能であるが、成型性、滅菌性や細胞毒性が低いという点で好ましいものを列記すると、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン等の金属材料が挙げられる。
【０１１１】
担体の形状としては、粒状、綿状、織布、不織布、スポンジ状多孔質体、平板状、などが挙げられるが、体積当たりの表面積が大きいという点で粒状、綿状、織布、不織布、スポンジ状多孔質体が好ましい。例えば、抗体が固定された水不溶性担体を予め容器に充填した多孔質体フィルターに末梢血液を通過させ、疾患に関わるＣＣＲ７発現細胞を効率よく除去することができる。
【０１１２】
本発明の抗体固定化担体と他の構成要素とを組み合わせて、ＣＣＲ７発現細胞除去用キットを作製することができる。当該他の構成要素としては、抗凝固剤、体外循環回路などが挙げられる。
【０１１３】
本発明は、下記（１）〜（５）の抗ヒトＣＣＲ７抗体を包含する。
【０１１４】
（１）ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体であって、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、又は配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（重鎖ＣＤＲ３）を有することを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体。
【０１１５】
（２）その相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列について、下記（Ａ１）〜（Ａ８）のいずれかを満たすことを特徴とする上記（１）に記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体。
（Ａ１）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ２）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ３）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ４）配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ５）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ６）配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ７）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ８）配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する。
【０１１６】
（３）その相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列について、下記（Ｂ１）〜（Ｂ８）のいずれかを満たすことを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体。
（Ｂ１）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ２）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ３）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ４）配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ５）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ６）配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ７）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号６８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ８）配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号８０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
【０１１７】
（４）その重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列について、下記（Ｃ１）〜（Ｃ８）のいずれかを満たすことを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体。
（Ｃ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ２）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ３）配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ４）配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ５）配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ６）配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ７）配列番号６２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ８）配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号７４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
【０１１８】
（５）Ｒ７−０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３６９）、Ｒ７−０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０４）、Ｒ７−０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７１）、Ｒ７−０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７２）、Ｒ７−１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７３）、Ｒ７−１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７４）、Ｒ７−２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７５）、又はＲ７−４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７６）により産生されることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体。
【０１１９】
本発明は、有効量の前記抗ヒトＣＣＲ７抗体を投与する組織の繊維化又は癌の転移の治療方法、を包含する。組織の繊維化と癌の具体例は、前述したとおりである。
【０１２０】
本発明は、組織の繊維化又は癌の転移の治療剤製造のための前記抗ヒトＣＣＲ７抗体の使用、を包含する。また本発明は、組織の繊維化又は癌の転移の治療用の前記抗ヒトＣＣＲ７抗体、を包含する。組織の繊維化と癌の具体例は、前述したとおりである。
【実施例】
【０１２１】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１２２】
（１）ヒトＣＣＲ７（ｈＣＣＲ７）遺伝子の調製
ジーンバンク登録済みのヒトＣＣＲ７遺伝子配列（ＮＭ＿００１８３８、配列番号８１）の５'末端にＧＣＴＡＧＣ配列、３'末端にＧＴＣＧＡＣＴＡＧＧＡＡＴＴＣ配列（配列番号８３）を付加した人工合成遺伝子をＤＮＡ合成装置により作製した。その後、この遺伝子をｐＵＣ５７クローニングベクターに導入し、ヒトＣＣＲ７遺伝子クローンを調製した。以下、得られたベクターをＮｈｅＩとＳａｌＩサイトで切断して調製される遺伝子断片を「ＤＮＡ断片Ａ」と称し、ＮｈｅＩとＥｃｏＲＩサイトで切断して調製される遺伝子断片を「ＤＮＡ断片Ｂ」と称する。
【０１２３】
（２）ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子の単離
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株（ノバジェン社）からゲノムＤＮＡを抽出・精製した。次に、精製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号８４及び８５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、配列番号８６に示す塩基配列を有するＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、「ＤＮＡ断片Ｃ」と称する。）を増幅した。ＤＮＡ断片Ｃには、プライマーに由来して、５'末端にＳａｌＩサイト、３'末端に２個の停止コドン（ＴＡＡＴＡＧ）をコードする配列及びＮｏｔＩサイトが導入された。
【０１２４】
（３）ヒトＣＣＲ７とＧｒｏＥＬサブユニットとの融合タンパク質を発現する遺伝子免疫用ベクターの構築
哺乳動物発現ベクターpCI Mammalian Expression Vector（プロメガ社）を制限酵素ＮｈｅＩとＳａｌＩで消化し、バクテリア由来アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）にて末端を脱リン酸化処理した後、上記（１）で調製したＤＮＡ断片Ａを挿入した。さらに、この発現ベクターをＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＢＡＰにて末端を脱リン酸化処理した後、上記（２）で調製したＤＮＡ断片Ｃを挿入し、ベクターｐＣＩ−ｈＣＣＲ７・ＧｒｏＥＬを構築した。すなわち、ベクターｐＣＩ−ｈＣＣＲ７・ＧｒｏＥＬは、ヒトＣＣＲ７をコードする遺伝子とＧｒｏＥＬサブユニットをコードする遺伝子との融合遺伝子を有している。
【０１２５】
（４）ヒトＣＣＲ７遺伝子導入安定発現細胞の作製
上記（１）で調製したＤＮＡ断片ＢをｐＣＩｎｅｏ（プロメガ社）のＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩサイトに導入し、ｐＣＩｎｅｏ−ｈＣＣＲ７を構築した。
【０１２６】
リポフェクタミン（Lipofectamin）溶液３７．５μＬと、ＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ培地６２５μＬと、２０μｇのｐＣＩｎｅｏ−ｈＣＣＲ７を含むＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ培地６２５μＬとを混和した。この混和液を用いて、ｐＣＩｎｅｏ−ｈＣＣＲ７を２×１０5個のＣＨＯ−Ｋ１細胞（大日本製薬社）に導入した。対照として、ｐＣＩｎｅｏのみをＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入した。遺伝子が導入された各ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、Ｈａｍ'ｓＦ１２Ｋ＋１０％ＦＢＳ培地（ＩＣＮ社）にて３０時間培養した。さらに、各細胞を剥離、懸濁し、１００ｍｍディッシュに５×１０5個を播き、抗生物質Ｇ４１８（プロメガ社）を０．８ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するＨａｍ'ｓＦ１２Ｋ＋１０％ＦＢＳ培地で２週間薬剤処理を行なった。薬剤処理後、限界希釈法により、Ｇ４１８耐性細胞をクローニングした。さらに、Ｃａシグナル応答を増大させるために、クローニングした細胞にｐＣＥＰ−Ｇα１６（Molecular Devices社）を遺伝子導入し、抗生物質ハイグロマイシンを０．２ｍｇ／ｍＬの濃度下で、同様に薬剤処理を行ない、その後、さらにハイグロマイシン耐性細胞のクローニングを行なった。以上の操作により、ヒトＣＣＲ７遺伝子導入安定発現細胞を作製した。次に、この細胞上のＣＣＲ７機能活性を確認するため、以下の評価を行なった。細胞は２×１０4個／１００μＬの初期細胞濃度にて、９６穴マイクロタイタープレートを用いて一昼夜培養し、培養終了後、１０-6〜１０-12Ｍの濃度範囲内のＣＣＬ２１（R&D systems社）によって各細胞を刺激したところ、細胞内のＣａ2+濃度が一過的に上昇した。Ｃａ2+濃度は、Ｃａ2+シグナル解析装置（ＦＬＩＰＲ；Molecular Devices社）及び細胞内Ｃａ2+染色キット（Ｃａ３ｋｉｔ；Molecular Devices社）を用いて測定した。このことから、活性型ヒトＣＣＲ７が、ＣＨＯ−Ｋ１細胞膜上に正常に安定発現していることがわかった。
【０１２７】
（５）遺伝子免疫
生理食塩水にベクターｐＣＩ−ｈＣＣＲ７・ＧｒｏＥＬを２５０μｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解し、免疫用組成物を調製した。この免疫用組成物を、８週齢のマウスＢＡＬＢ／ｃ（雌）の両足大腿筋に各０．１２ｍＬずつ注射を行い、免疫した（０日目）。これにより、ｐＣＩ−ｈＣＣＲ７・ＧｒｏＥＬを両足に各３０μｇずつ、すなわち、１匹につき１回あたり６０μｇ投与した。その後、７日目、２１日目、及び２８日目にも同様して繰り返し免疫した。そして、０、７、１４、２１、２８、３５、４２日目に採血を行い、血清を調製した。対照として、ｈＣＣＲ７を単独で発現するベクターｐＣＩ−ｈＣＣＲ７を用いてマウスを免疫した。
【０１２８】
（６）フローサイトメトリーによる活性型ヒトＣＣＲ７に対する血清中抗体結合性評価
ｐＣＩｎｅｏ−ｈＣＣＲ７が導入され安定発現を確認したＣＨＯ−Ｋ１細胞（以下、「ｈＣＣＲ７遺伝子導入細胞」と称する。）及び、ｐＣＩｎｅｏが導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞（対照の細胞）をＰＢＳで洗浄した。免疫後５６日目の血清を５００倍希釈し、各細胞と一緒にインキュベートした。さらに、各細胞をＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社）を添加した後、フローサイトメーターＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社）を用いて、各細胞と血清中の抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用を解析した。
【０１２９】
その結果、ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞を用いた場合は、遺伝子免疫前の血清ではフィコエリスリンがほとんど検出されなかったが、遺伝子免疫後の血清では検出された。これは、免疫後の血清中の抗ヒトＣＣＲ７抗体がヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞に結合することを示していた。一方、対照の細胞を用いた場合も、遺伝子免疫後の血清でもフィコエリスリンが検出されなかった。これは、免疫後の血清中の抗ヒトＣＣＲ７抗体が対照の細胞に結合しないことを示していた。
以上のことから、ベクターｐＣＩ−ｈＣＣＲ７・ＧｒｏＥＬによる遺伝子免疫によって、マウス血清中に活性型ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインを特異的に認識する抗体の産生を誘導することができた。
【０１３０】
（７）抗ヒトＣＣＲ７モノクローナル抗体の作製
上記（５）と同様の手順で遺伝子免疫したマウス６匹に対して追加免疫を行った。追加免疫の３日後に脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。ＰＥＧ法により、１×１０8個の脾細胞と、１×１０7個のＢＡＬＢ／Ｃマウス由来のＨＡＴ選択性のミエローマＳＰ２／０細胞とを融合した（細胞融合）。融合した細胞（ハイブリドーマ）の集団をＲＰＭＩ培地に懸濁し、９６穴マイクロプレート１４枚の各穴に播種した。この段階で、約９９０種のハイブリドーマが得られた。
【０１３１】
細胞融合の翌日から２週間、３日に１度の頻度で、上記マイクロプレート内の培地をＨＡＴ Ｍｅｄｉａ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×）（シグマ社、品番：Ｈ０２６２）を添加したＲＰＭＩ培地に置き換えた。
上記（６）と同様のフローサイトメトリーによって抗体結合評価を行い、ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞と各穴のハイブリドーマ培養上清中の抗体との結合性を調べた。その結果、８穴において抗体との結合性が確認された。
抗体との結合性が確認された８種のハイブリドーマについて、限界希釈法によるクローニングを行った。すなわち、８種のハイブリドーマについて９６穴マイクロプレートに細胞１個以下／穴になるように播種し、培養した。２週間後、同様のフローサイトメトリーを行い、クローニングされた培養上清中の抗体（抗ヒトＣＣＲ７モノクローナル抗体）の結合性を確認した。その結果、抗ヒトＣＣＲ７モノクローナル抗体を産生する８種のハイブリドーマがクローニングされた。
各ハイブリドーマについてＲＰＭＩ培地１００ｍＬ内でフラスコ培養を２週間行った。各培養上清を、プロテインＧカラム（アマシャムバイオサイエンス社）に供して精製・濃縮し、精製された８種の抗ヒトＣＣＲ７モノクローナル抗体を各々約２０ｍｇ得た。
【０１３２】
各ハイブリドーマを、ＩＰＯＤに寄託した。各ハイブリドーマの表示と受託番号は、上述のとおりである。
【０１３３】
各々の抗ヒトＣＣＲ７モノクローナル抗体（以下、単に「抗ヒトＣＣＲ７抗体」と称する。）について、以下に示す試験を行った。以下の記載において、ハイブリドーマの表示を抗体名としても用いることとする。
【０１３４】
（８）フローサイトメトリーによるヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞に対する結合性評価
１０μｇ／ｍＬ濃度の抗ヒトＣＣＲ７モノクローナル抗体及びマウスコントロールＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ、陰性対照）のＰＢＳ溶液を調製した（以下、「抗体溶液」と称する。）。一方、ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞をＰＢＳで洗浄した後、抗体溶液を細胞と共にインキュベートした。さらに、細胞をＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社）を添加した後、フローサイトメーターＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社）を用いて、細胞と抗ヒトＣＣＲ７抗体及びマウスコントロールＩｇＧとの相互作用を解析した。結果を図９、１０及び表２に示す。図９はヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞と、マウスコントロールＩｇＧとの相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。図１０はヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞と、抗ヒトＣＣＲ７抗体Ｒ７−４７との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。表２は、ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞と、各抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用の解析結果より、算出された特異的結合細胞の割合を示す。図９、１０において、縦軸は細胞数、横軸はフィコエリスリン（ＰＥ）由来の蛍光強度を表す。また、２つのエリア（Ｍ１、Ｍ２）のうち、Ｍ２（右領域）に属する細胞が抗体と結合した細胞を表す。表２において、特異的に結合した細胞の割合は、Ｍ２／（Ｍ１＋Ｍ２）で表される。
【０１３５】
その結果、ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞を用いた場合は、Ｍ２のエリアに多くの細胞が検出された（図１０、表２）。これは、各抗ヒトＣＣＲ７抗体がヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞に結合することを示していた。一方、マウスコントロールＩｇＧを用いた場合（図９）は、Ｍ２のエリアにはほとんど細胞が検出されなかった。これは、マウスコントロールＩｇＧがヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞に結合しないことを示していた。以上のことから、得られた抗ヒトＣＣＲ７抗体は、いずれも活性型ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインを特異的に認識するものであることが示された。
【０１３６】
【表２】
2012043533.tif 000027
【０１３７】
（９）細胞内Ｃａ2+シグナル伝達阻害活性評価
ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞を、２×１０4個／１００μＬの初期細胞濃度にて、９６穴マイクロタイタープレートを用いて一昼夜培養した。培養終了後、各穴に１０-6〜１０-11Ｍの濃度範囲内の抗ヒトＣＣＲ７抗体を添加した。また対照として、マウスコントロールＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ社、陰性対照）を同様に１０-6〜１０-11Ｍの濃度範囲内で添加したものも調製した。１時間後、１×１０-7ＭのＣＣＬ２１（R&D systems社）によって各細胞を刺激した際の細胞内Ｃａ2+濃度の一過的上昇の抗体濃度依存的減少度を測定した。Ｃａ2+濃度の測定は、Ｃａ2+シグナル解析装置（ＦＬＩＰＲ；Molecular Devices社）及び細胞内Ｃａ染色キット（Ｃａ３ｋｉｔ；Molecular Devices社）を用いて行った。抗ヒトＣＣＲ７抗体Ｒ７−４７を添加した結果を図１１に示す。図１１は細胞内Ｃａ2+濃度と各添加物の濃度との関係を表すグラフである。図１１に示すように、Ｒ７−４７の濃度依存的に、細胞内Ｃａ2+濃度の低下がみられた。これは、Ｒ７−４７がＣＣＬ２１とヒトＣＣＲ７との結合を競合的に阻害した結果、細胞内へのシグナル伝達が阻害されたことを示していた。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出すると、Ｒ７−４７では７．４ｎＭであった。表３は、Ｒ７−４７以外の抗ヒトＣＣＲ７抗体のＩＣ５０を示す。
以上より、得られた抗ヒトＣＣＲ７抗体は、いずれもヒトＣＣＲ７リガンドによるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断できることが示された。
【０１３８】
【表３】
2012043533.tif 000028
【０１３９】
（１０）アイソタイプ解析
マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ＧＥヘルスケア社）を用いて、抗ヒトＣＣＲ７抗体のアイソタイプを決定した。検出はホースラディッシュペルオキシダーゼ標識マウスＩｇＧ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによった。結果を表４に示す。
【０１４０】
【表４】
2012043533.tif 000029
【０１４１】
（１１）抗体可変領域のｃＤＮＡクローニング、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）の決定
上記８種のハイブリドーマより、各抗体のＬ鎖及びＨ鎖の可変領域をコードするＤＮＡをクローニングし、その塩基配列を決定した。クローニングは以下のように行った。まずハイブリドーマからRNeasyMini Kit（QIAGEN社）を用いてＲＮＡを単離した。次に、「SMARTer-RACE cDNA Amplification Kit」（タカラバイオ社）を用いて、メーカーマニュアルに従い５’−ＲＡＣＥ法によるｃＤＮＡ合成、及びＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲの３'側プライマーとして、γ鎖の場合は、配列番号８７の配列を、κ鎖の場合は配列番号８８〜９０の配列を、λ鎖の場合は配列番号９１の配列をそれぞれ使用した。
【０１４２】
得られたＤＮＡ断片をpT７ Blue T Vector（ノバジェン社)にDNA Ligation kit ver.2（タカラバイオ社）に挿入した。このベクターでＸＬ１０Ｇｏｌｄ（ストラタジーン社）をトランスフォームし、Ｘ−ｇａｌ、アンピシリン、ＩＰＴＧ含有プレートに播種後、白いコロニーをピックアップした。正常なサイズのインサートを含むクローン各５種よりプラスミドを調製後、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０型自動シーケンサーを用いてＤＮＡ配列を決定した。決定した配列は一部にＰＣＲエラーによると思われる変異が認められた以外は３クローンとも同じ配列を示したので、その配列をもって目的のＤＮＡ配列とした。得られた塩基配列と対応するアミノ酸配列を、配列番号１（Ｒ７−０１のＶＨ）、配列番号３（Ｒ７−０１のＶＬ）、配列番号１１（Ｒ７−０２のＶＨ）、配列番号１３（Ｒ７−０２のＶＬ）、配列番号２１（Ｒ７−０５のＶＨ）、配列番号２３（Ｒ７−０５のＶＬ）、配列番号３１（Ｒ７−０９のＶＨ）、配列番号３３（Ｒ７−０９のＶＬ）、配列番号４１（Ｒ７−１１のＶＨ）と４３（Ｒ７−１１のＶＬ）、配列番号５１（Ｒ７−１８のＶＨ）、配列番号５３（Ｒ７−１８のＶＬ）、配列番号６１（Ｒ７−２５のＶＨ）、配列番号６３（Ｒ７−２５のＶＬ）、配列番号７１（Ｒ７−４７のＶＨ）、配列番号７３（Ｒ７−４７のＶＬ）に示す。
【０１４３】
各塩基配列に対応するアミノ酸配列のみを、配列番号２（Ｒ７−０１のＶＨ）、配列番号４（Ｒ７−０１のＶＬ）、配列番号１２（Ｒ７−０２のＶＨ）、配列番号１４（Ｒ７−０２のＶＬ）、配列番号２２（Ｒ７−０５のＶＨ）、配列番号２４（Ｒ７−０５のＶＬ）、配列番号３２（Ｒ７−０９のＶＨ）、配列番号３４（Ｒ７−０９のＶＬ）、配列番号４２（Ｒ７−１１のＶＨ）と４４（Ｒ７−１１のＶＬ）、配列番号５２（Ｒ７−１８のＶＨ）、配列番号５４（Ｒ７−１８のＶＬ）、配列番号６２（Ｒ７−２５のＶＨ）、配列番号６４（Ｒ７−２５のＶＬ）、配列番号７２（Ｒ７−４７のＶＨ）、配列番号７４（Ｒ７−４７のＶＬ）に示す。
【０１４４】
各ＶＨとＶＬについて、ＣＤＲ１〜３を特定した（配列番号５〜１０、１５〜２０、２５〜３０、３５〜４０、４５〜５０、５５〜６０、６５〜７０、７５〜８０）。図１〜９および表１を参照のこと。
【０１４５】
（１２）ヒト初代培養細胞を用いた抗ヒトＣＣＲ７抗体の結合確認
健常人の末梢血から、常法に従い Lymphoprep (Axis-Shield社)を用いて単核球細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。単離したＰＢＭＣを、１ｍｇ／ｍＬのヒトガンマグロブリン（Jackson Immuno Research Laboratories社）を含む Phosphate Buffered Saline（ＰＢＳ）溶液に懸濁し、室温で３０分間インキュベートすることでブロッキングした。ブロッキング後のＰＢＭＣ(３×１０5細胞)を、各抗ヒトＣＣＲ７抗体（０．５μｇ）もしくはアイソタイプコントロール抗体（０．５μｇ）と共に４℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＭＣを洗浄バッファー（０．１％ ウシ胎児血清を含むＰＢＳ溶液）で３回洗浄した。次に２次抗体として、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社）を添加し、４℃で１時間インキュベートした。このＰＢＭＣを再度洗浄バッファーで３回洗浄した後、フローサイトメーター（ベックマンコールター社製）を用いて分析した。
【０１４６】
Ｒ７−４７を用いたときのフローサイトメトリーの結果を図１２に示す。図１２（ａ）はアイソタイプコントロール抗体とＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体で染色した結果を、図１２（ｂ）はＲ７−４７とＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体で染色した結果を、それぞれ示す。図１２（ａ），（ｂ）の両矢印で示す部分は、それぞれ、アイソタイプコントロール抗体とＲ７−４７が特異的に結合した細胞集団を示している。また図中の数字は、分析したＰＢＭＣの細胞数を１００％としたときの該細胞集団の割合を示す。
【０１４７】
ＰＢＭＣ中で各抗ヒトＣＣＲ７抗体が特異的に結合した細胞の割合を表５に示す。
【表５】
2012043533.tif 000030
【０１４８】
これらの結果から、当該抗ヒトＣＣＲ７抗体がヒト天然型ＣＣＲ７を認識し、ヒト天然型ＣＣＲ７に結合できることが示された。
【０１４９】
（１３）ヒト初代培養細胞を用いた抗ヒトＣＣＲ７抗体の機能性確認
ＰＢＭＣ（１．６×１０5細胞）を２４ウェルセルカルチャーインサート（ベクトン・ディッキンソン社）のインサートに播種した。さらに、各抗ヒトＣＣＲ７抗体もしくはアイソタイプコントロールＩｇＧ抗体１０μg／ｍＬを添加し、室温にて５分間反応させた。セルカルチャーインサートの各ウェルにはヒトリコンビナントＣＣＬ２１（１５０ｎｇ／ｍＬ）を添加した。インサートをプレート上に設置後、３７℃にて１．５時間反応させた。反応後、インサートを除去し、各ウェル中に遊走した細胞数を測定した。表６と表７に、ＣＣＬ２１依存的細胞遊走に対する当該抗体による機能阻害の結果を示す。
【０１５０】
【表６】
2012043533.tif 000031
【０１５１】
【表７】
2012043533.tif 000032
【０１５２】
まず、ＣＣＬ２１未添加とＣＣＬ２１添加との比較から、ＰＢＭＣの一部の細胞がＣＣＬ２１依存的に細胞遊走することが示された。そして、アイソタイプコントロール（ＩｇＧ１あるいはＩｇＧ２）抗体を添加しても、ＣＣＬ２１依存的な細胞遊走には影響を与えなかった。一方、当該抗体を添加した場合は、８種の抗体全てがＣＣＬ２１依存的な細胞遊走を有意に抑制した。これらの結果から、当該抗ヒトＣＣＲ７抗体のいずれもが、ヒト天然型ＣＣＲ７の機能を抑制することが示された。
【０１５３】
（１４）抗ヒトＣＣＲ７抗体の肺線維症モデルにおける組織線維化形成の阻害作用の確認
ヒトＰＢＭＣ中の、ＣＣＲ７を発現するＣＤ１４陽性細胞は、肺線維における線維化形成に重要な細胞である（Abe R, Donnelly SC, Peng T, Bucala R, Metz CN, "Peripheral blood fibrocytes: differentiation pathway and migration to wound sites." J Immunol. 2001 Jun 15;166(12):7556-62；Curnow SJ, Fairclough M, Schmutz C, Kissane S, Denniston AK, Nash K, Buckley CD, Lord JM, Salmon M,"Distinct types of fibrocyte can differentiate from mononuclear cells in the presence and absence of serum." PLoS One. 2010 Mar 18;5(3):e9730）。抗ヒトＣＣＲ７抗体の肺線維症における有効性は、免疫不全マウス（例えばＳＣＩＤマウス）に肺線維症を誘発させる刺激物質（例えばブレオマイシン）を投与後、ヒト由来のＣＣＲ７を発現するＣＤ１４陽性細胞を移入した際の当該細胞の肺組織への移行を調べることで示すことができる。
【０１５４】
健常人の末梢血から、常法に従いＰＢＭＣを単離した。単離したＰＢＭＣを、さらにヒトＣＤ１４標識磁気ビーズ（ミルテニーバイオテク社）に接触させ、ＣＤ１４陽性細胞を分離し、マウスへの細胞移入に用いた。Ｔ細胞とＢ細胞が欠如したＳＣＩＤマウスに、生理食塩水に溶解したブレオマイシン（日本化薬社、商品名：ブレオ）を５ｍｇ／ｋｇとなるように経気道投与し、常法に従い肺線維症を惹起させた。ブレオマイシン投与日を０日とし、ブレオマイシン投与４日前、および、投与後から１，４，８，１１日目に、生理食塩水に溶解した抗ヒトＣＣＲ７抗体Ｒ７−１１、Ｒ７−１８、又はＲ７−４７をそれぞれ２０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔投与した。対照として、アイソタイプコントロールＩｇＧを同様のスケジュールで投与した。ブレオマイシン投与後４日目に、上述の方法でＣＣＲ７を発現する細胞を含むヒトＣＤ１４陽性細胞を単離し、ＰＫＨ２６ＰＣＬ赤色蛍光細胞リンカーキット（シグマ社）で蛍光標識した。蛍光標識細胞をマウス一匹当たり１×１０6個、尾静脈より移入した。ブレオマイシン投与から１５日後にマウスを剖検し、常法に従い肺組織を中性ホルマリンで固定し、病理切片を作製した。病理組織を蛍光顕微鏡で観察し、蛍光標識されたヒト細胞由来の細胞数を右肺全視野で計測した。その結果、アイソタイプコントロールＩｇＧを投与したマウスと比較して、抗ヒトＣＣＲ７抗体を投与したマウスでは、いずれも肺において蛍光標識細胞数が減少していた。
【０１５５】
また、剖検によって得られた左肺からTRIzol 試薬（Invitrogen社）により組織の全ＲＮＡを抽出し、Nano Drop 1000 (Thermo Fisher Scientific社）により抽出したＲＮＡ量を定量した。各マウス肺から得られたＲＮＡサンプル２μｇに対して、High Capacity cDNA Reverse transcription kit（Applied Biosystems社）を用いて逆転写反応を行い、得られたｃＤＮＡサンプルをリアルタイムＰＣＲ法により肺組織中のヒトＣＣＲ７のｍＲＮＡ量の測定を行った。リアルタイムＰＣＲによる解析は、TaqMan Gene Expression Assaysシステム（Applied Biosystems社）によって行った。内部標準としてTaqMan Ribosomal RNA Control Reagents（Applied Biosystems社）を用い、ヒトＣＣＲ７の検出にはHs01013469_m1のプローブセット（Applied Biosystems社）を用いた。得られたデータはΔΔＣｔ法によって解析を行い、アイソタイプコントロールを投与した群を基準とした相対発現量として評価した。その結果、アイソタイプコントロールＩｇＧを投与したマウスと比較して、抗ヒトＣＣＲ７抗体Ｒ７−１１、Ｒ７−１８、又はＲ７−４７を投与したマウスでは、いずれもヒトＣＣＲ７のｍＲＮＡ量が減少していた（図１３）。この結果は、当該抗ヒトＣＣＲ７抗体が肺線維症において、線維化に重要な細胞の肺組織への浸潤を抑制することを反映している。これらの結果から、当該抗ＣＣＲ７抗体が肺線維化治療に有用であることが示された。
【０１５６】
（１５）遺伝子組換え技術による抗ヒトＣＣＲ７抗体の製造
配列番号１１で表されるＤＮＡを含むマウス抗体重鎖全長の遺伝子をクローニングし、分泌発現用ベクターｐＳｅｃＴａｇ２（インビトロジェン社）に導入した。このベクターをｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７０２ＨＣと命名した。同様に、配列番号４１で表されるＤＮＡを含むマウス抗体重鎖全長の遺伝子をクローニングし、分泌発現用ベクターｐＳｅｃＴａｇ２に導入した。このベクターをｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７１１ＨＣと命名した。同様に、配列番号５１で表されるＤＮＡを含むマウス抗体重鎖全長の遺伝子をクローニングし、分泌発現用ベクターｐＳｅｃＴａｇ２に導入した。このベクターをｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７１８ＨＣと命名した。
【０１５７】
配列番号１３で表されるＤＮＡを含むマウス抗体軽鎖全長の遺伝子をクローニングし、分泌発現用ベクターｐＳｅｃＴａｇ２に導入した。このベクターをｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７０２ＬＣと命名した。同様に、配列番号４３で表されるＤＮＡを含むマウス抗体軽鎖全長の遺伝子をクローニングし、分泌発現用ベクターｐＳｅｃＴａｇ２に導入した。このベクターをｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７１１ＬＣと命名した。同様に、配列番号５３で表されるＤＮＡを含むマウス抗体軽鎖全長の遺伝子をクローニングし、分泌発現用ベクターｐＳｅｃＴａｇ２に導入した。このベクターをｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７１８ＬＣと命名した。
【０１５８】
リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社）を用いて、ｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７０２ＨＣ及びｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７０２ＬＣを、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。この細胞を２日間培養した。培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ−Ｇカラムに供し、ハイブリドーマＲ７−０２由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体を調製した。同様に、リポフェクタミン２０００を用いて、ｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７１１ＨＣ及びｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７１１ＬＣを、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。この細胞を２日間培養した。培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ−Ｇカラムに供し、ハイブリドーマＲ７−１１由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体を調製した。同様に、リポフェクタミン２０００を用いて、ｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７１８ＨＣ及びｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７１８ＬＣを、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。この細胞を２日間培養した。培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ−Ｇカラムに供し、ハイブリドーマＲ７−１８由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体を調製した。
【０１５９】
上記（６）と同様にして、ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞（陰性対照）に対し、１０μｇ／ｍＬの各組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体が結合するかどうかを、フローサイトメーターを用いて確認した。蛍光２次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社）を、フローサイトメーターとしてＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社）を用い、各細胞と各組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用を解析した。結果を図１４〜１６に示す。図１４はハイブリドーマＲ７−０２由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体を用いた結果を示す。図１５はハイブリドーマＲ７−１１由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体を用いた結果を示す。図１６はハイブリドーマＲ７−１８由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体を用いた結果を示す。図１４〜１６において、（ａ）はＣＨＯ−Ｋ１細胞を使用した場合の２次元ドット表示図（左）とヒストグラム（右）、（ｂ）はヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞を使用した場合の２次元ドット表示図（左）とヒストグラム（右）である。各２次元ドット表示図において、縦軸はフィコエリスリン（ＰＥ）由来の蛍光強度、横軸はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）由来の蛍光強度を表す。すなわち、いずれの組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体とも、ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞には結合するが、ＣＨＯ−Ｋ１細胞には結合しないことが示された。これらの結果から、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の抗体を、マウス型抗体、キメラ型抗体、ヒト化抗体、抗体の機能的断片、などの形で生産することができることが示された。
【手続補正書】
【提出日】平成25年1月31日(2013.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体であって、その相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列について、下記（Ａ１）〜（Ａ８）のいずれかを満たし、補体依存性細胞溶解作用又は抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用を介さずにＣＣＲ７リガンド刺激によるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断する活性を有することを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体。
（Ａ１）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ２）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ３）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ４）配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ５）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ６）配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ７）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ８）配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する。
【請求項２】
下記（Ｂ１）〜（Ｂ８）のいずれかを満たすことを特徴とする請求項１に記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体。
（Ｂ１）配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ２）配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ３）配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ４）配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ５）配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ６）配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ７）配列番号６８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ８）配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号８０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
【請求項３】
下記（Ｃ１）〜（Ｃ８）のいずれかを満たすことを特徴とする請求項２に記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体。
（Ｃ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ２）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ３）配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ４）配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ５）配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ６）配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ７）配列番号６２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ８）配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号７４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
【請求項４】
ヒト化抗体又はキメラ抗体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体。
【請求項５】
抗体断片、一本鎖抗体、又はダイアボディであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体。
【請求項６】
ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体であって、Ｒ７−０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３６９）、Ｒ７−０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０４）、Ｒ７−０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７１）、Ｒ７−０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７２）、Ｒ７−１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７３）、Ｒ７−１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７４）、Ｒ７−２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７５）、又はＲ７−４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７６）であることを特徴とするハイブリドーマにより産生され、補体依存性細胞溶解作用又は抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用を介さずにＣＣＲ７リガンド刺激によるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断する活性を有することを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体と受容体との結合を競合阻害し、かつ補体依存性細胞溶解作用又は抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用を介さずにＣＣＲ７リガンド刺激によるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断する活性を有することを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体。
【請求項８】
Ｒ７−０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３６９）、Ｒ７−０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０４）、Ｒ７−０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７１）、Ｒ７−０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７２）、Ｒ７−１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７３）、Ｒ７−１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７４）、Ｒ７−２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７５）、又はＲ７−４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７６）であることを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする核酸。
【請求項１０】
配列番号１、配列番号３、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５３、配列番号６１、配列番号６３、配列番号７１、又は配列番号７３で表される塩基配列を有する請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターが導入された細胞。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体と、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１４】
組織の線維化を治療するために用いられることを特徴とする請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記組織の線維化が、肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、消化管線維症及び他の線維性疾患からなる群から選択される線維症であることを特徴とする請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記肝線維症が、肝硬変、虚血再灌流、肝移植後傷害、壊死性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、原発性胆汁性肝硬変、及び原発性硬化性胆管炎からなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記肝硬変が、アルコールによる誘発、薬物による誘発、及び化学的な誘発からなる群から選択された少なくとも１つによるものであることを特徴とする請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記腎線維症が、増殖性糸球体腎炎、硬化性糸球体腎炎、腎性線維化性皮膚症、糖尿病性腎症、腎尿細管間質性線維症、及び巣状分節性糸球体硬化症からなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記肺線維症が、肺間質性線維症、薬物誘発サルコイドーシス、肺線維症、特発性肺線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、びまん性肺胞損傷疾患、肺高血圧症、及び新生児気管支肺形成異常からなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記皮膚線維症が、強皮症、ケロイド瘢痕化、乾癬、肥厚性瘢痕化、及び偽性強皮症からなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記心血管線維症が、アテローム性動脈硬化、冠動脈再狭窄、うっ血性心筋症、心不全、心移植、及び心筋線維症からなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記消化管線維症が、コラーゲン蓄積大腸炎、絨毛萎縮、陰窩過形成、ポリープ形成、クローン病の線維症、胃潰瘍治癒、及び腹部癒着術後瘢痕からなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記線維症が、骨に関連する線維化性疾患から生じる状態を有し、リウマチ様パンヌス形成であることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１〜７のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体が担体に固定化されてなる抗体固定化担体。
【請求項２５】
ＣＣＲ７発現細胞を含む血液を接触させて、前記体液からＣＣＲ７発現細胞を除去するために用いられることを特徴とする請求項２４に記載の抗体固定化担体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ヒトＣＣＲ７抗体、ハイブリドーマ、核酸、ベクター、細胞、医薬組成物、並びに、抗体固定化担体に関し、さらに詳細には、ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体、当該抗体を生産するハイブリドーマ、当該抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする核酸、当該核酸を有するベクター、当該ベクターを有する細胞、当該抗体を含む医薬組成物、並びに、当該抗体が固定化された抗体固定化担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインは様々な細胞の遊走や細胞機能を調節するサイトカインである。ケモカインならびにその受容体の機能異常は、自己免疫疾患、急性ならびに慢性炎症、癌といった様々な病気の原因となっている。これまで、ケモカインならびにその受容体の活性を制御する薬剤の開発がなされ、臨床応用されているが、問題を充分に解決しているとはいい難い。
【０００３】
特定のケモカインが細胞の遊走や細胞機能の調節といった活性を発現するためには、ケモカイン選択的な細胞膜受容体と結合することが必要である。ケモカイン受容体はすでに約２０種類発見されており、いずれのケモカイン受容体も３量体Ｇタンパク質と結合する７回膜貫通型タンパク質（ＧＰＣＲ）である。ケモカインが受容体に結合すると、３量体Ｇタンパク質のＧαユニットを遊離させる。その結果、細胞内のＣａ濃度を上昇させたり、phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)やsmall Rho GTPases経路やその他の経路を活性化させて機能を発現させる。いずれのケモカイン受容体も、比較的選択的なケモカインで活性化するものの、タンパク質の１次構造や細胞内の活性化機構は非常に類似している。したがって、特定のケモカイン受容体の機能を選択的に遮断することは容易ではない。生理的ならびに病態における各ケモカインとケモカイン受容体の機能発現は、それぞれのタンパク質が特定の細胞や組織に特定の時期（炎症時）に発現することで制御されている（非特許文献１）。
【０００４】
ヒトＣＣモチーフレセプター７（CC MOTIF, RECEPTOR 7；別名：ＥＢＩ１、ＣＭＫＢＲ７；以下、「ＣＣＲ７」と称する。）は、当初、エプスタイン・バー（EPSTEIN-BARR）ウイルス感染によりリンパ球選択的に発現するＧＰＣＲとして発見された（非特許文献２）。その後、ＣＣＲ７は、ＣＣＬ１９（別名：ＥＬＣ）ならびにＣＣＬ２１（別名：ＳＬＣ、ＥＸＯＤＵＳ  ２）の選択的ケモカイン受容体であることがわかった。ＣＣＲ７は生理的条件下では、ＣＤ４陽性Ｔ細胞（Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｒｅｇ細胞）、成熟樹状細胞、Ｂ細胞といった細胞に比較的選択的に発現している。ＣＣＲ７を介して炎症部位などの病巣にこうした細胞が導引され、炎症反応や免疫反応が亢進することが知られている。またＣＣＲ７異常活性化が自己免疫疾患、急性ならびに慢性炎症後の線維症、癌転移といった様々な病気の原因となっている。
ヒトＣＣＲ７のアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は、すでに知られている（例えば、GenBank: EAW60669.1）。
【０００５】
炎症は、組織の損傷や感染に対する防御反応である。様々な炎症刺激に応答して炎症性分子（ケモカインやサイトカイン）の発現亢進に引き続き、好中球及び単球の浸潤を促進する。さらに炎症反応が亢進すると、ＴならびにＢリンパ球の流入し病態が慢性化する。一方、炎症の収束段階においては、過剰な白血球のアポトーシスや組織マクロファージによる貪食が起こり、間質細胞（例えば線維芽細胞）による損傷組織の修復が見られる。
【０００６】
過剰な間質細胞の分化増殖は、種々の線維症（肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、消化管線維症及び他の線維性疾患）の増悪と深く関連している。慢性肺線維症は、肺全体にわたる瘢痕形成に起因し、予後不良の疾患である。抗線維化作用を有するピルフェニドン、コルチコステロイド類（例えばプレドニゾン）及び／又は体内の免疫系を抑制するその他の薬物が、線維症につながる過程を抑えるため処方される。しかしながら、今のところ充分な治療成績をあげているとはいい難い。
【０００７】
一方、近年、炎症反応後の修復過程における線維化の分子機構が明らかにされつつある。そのような修復機構では、局所的な休止線維芽細胞が、損傷領域に移動し、細胞外マトリックスタンパク質を生成し、傷の収縮と線維形成（瘢痕）を促進する。また、循環する線維芽前駆細胞、線維芽細胞（これらは血液中に存在する）が、傷や線維形成の部位に移動し、そこでそれらが分化して組織の修復やその他の線維化反応を仲介することが示唆されてきた。
【０００８】
血液中線維芽前駆細胞は、ＣＤ１４＋末梢血単球前駆細胞群が炎症部位に浸潤し、局所で間質細胞様（コラーゲンＩ型及びＩＩＩ型並びにフィブロネクチン）に分化する（非特許文献３）。これらの細胞は、炎症性サイトカインを分泌するとともに、細胞外マトリックスタンパク質、他のサイトカイン類、を分泌し、それらが線維形成をもたらし得る。血液中線維芽前駆細胞の炎症部位への過剰な浸潤を選択的に抑制することができれば、線維化を最小限に食い止めることが期待できるが、まだ臨床応用には至っていない。
【０００９】
近年、線維芽前駆細胞に発現するケモカイン受容体として、前記したＣＣＲ７が注目されている（特許文献１）。ＣＣＲ７を欠損させた遺伝子変換動物に肺線維症や腎線維症を発症させるような刺激を付加しても、線維症を発症しないことが示されている（非特許文献４）。そこで、ＣＣＲ７の機能を低分子化合物、モノクローナル抗体、ＲＮＡｉ等で阻害することができれば、種々の線維化を抑制することが期待できる。しかし、ケモカイン受容体のタンパク質の１次構造や細胞内の活性化機構は非常に類似しているため、よりＣＣＲ７を選択的に阻害しうる物質が望まれる。これまでＣＣＲ７の機能を阻害する物質（モノクローナル抗体あるいはＲＮＡｉ）の研究が行われているが、臨床応用まで到達した事例はない。
【００１０】
また一方、癌治療においては原発癌の増殖抑制と遠隔転移を伴う再発予防が重要である。従来の外科療法や化学療法に加え、分子標的薬（例えばキナーゼ阻害剤）や抗体医薬療法により治療成績は向上している。しかしながら、遠隔転移を伴う再発癌は予後不良であり、新たな治療薬の開発が望まれている。遠隔転移の機構としては、原発癌より血管を経由する場合とリンパ組織を経由する場合がある。これまで、細胞外マトリックスタンパク質分解酵素阻害剤（ＭＭＰ阻害剤）などが、転移予防薬として開発されたものの、臨床応用まで到達した事例はない。
【００１１】
様々な研究により、ＣＣＲ７が、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、乳癌細胞、悪性乳房腫瘍などの様々な腫瘍細胞で発現されることが示されている。更に、ＣＣＲ７は、胃癌、黒色腫、非小細胞肺癌、Ｔ細胞白血病細胞などの様々な癌のリンパ節転移において役割を果たしていることが明らかになってきた（非特許文献１）。ＣＣＲ７のリガンドであるＣＣＬ１９ならびにＣＣＬ２１がリンパ節で高発現していることから、選択的なＣＣＲ７機能阻害が、癌細胞のリンパ性転移を抑制することが期待できる。
【００１２】
膜タンパク質（受容体）に対する抗体医薬の主要な作用機序は、当該タンパク質を発現する細胞を抗体が認識した後、補体依存性細胞溶解作用（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）に基づき除去するものが一般的であった。しかしながら、ＣＤＣやＡＤＣＣはマクロファージ等の炎症細胞の活性化を伴い、線維症治療としては必ずしも適切とはいえない。したがって、ＣＣＲ７を選択的に阻害しうるモノクローナル抗体を線維症治療に応用する場合には、ＣＤＣやＡＤＣＣによらない機能性抗体が望ましい。すなわち、ＣＣＲ７のＣＣＬ１９あるいはＣＣＬ２１依存的細胞内情報伝達を選択的に遮断する抗体が望ましい。しかし、一般的に、ＧＰＣＲに対する機能性抗体を効率的に取得することは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特表２００９−５２８９７７号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Viola A, Luster AD "Chemokines and their receptors: drug targets in immunity and inflammation", Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2008;48:171-97
【非特許文献２】Birkenbach, M., Josefsen, K., Yalamanchili, R., Lenoir, G., Kieff, E., "Epstein-Barr virus-induced genes: first lymphocyte-specific G protein-coupled peptide receptors", J. Virol. 67: 2209-2220, 1993.
【非特許文献３】Pilling D, Fan T, Huang D, Kaul B, Gomer RH. "Identification of markers that distinguish monocyte-derived fibrocytes from monocytes, macrophages, and fibroblasts", PLoS One. 2009 Oct 16;4(10):e7475
【非特許文献４】Wada T, Sakai N, Matsushima K, Kaneko S．"Fibrocytes: a new insight into kidney fibrosis"，Kidney Int. 2007 Aug;72(3):269-73.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、線維症や癌の治療薬として有用な新規の抗ヒトＣＣＲ７抗体と、当該抗ヒトＣＣＲ７抗体を含む医薬組成物等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記した課題を解決するための本発明の１つの様相は、ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体であって、その相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列について、下記（Ａ１）〜（Ａ８）のいずれかを満たし、補体依存性細胞溶解作用又は抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用を介さずにＣＣＲ７リガンド刺激によるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断する活性を有することを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体である。
（Ａ１）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ２）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ３）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ４）配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ５）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ６）配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ７）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ８）配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する。
【００１７】
好ましくは、下記（Ｂ１）〜（Ｂ８）のいずれかを満たす。
（Ｂ１）配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ２）配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ３）配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ４）配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ５）配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ６）配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ７）配列番号６８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ８）配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号８０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
【００１８】
好ましくは、下記（Ｃ１）〜（Ｃ８）のいずれかを満たす。
（Ｃ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ２）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ３）配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ４）配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ５）配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ６）配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ７）配列番号６２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ８）配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号７４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
【００１９】
好ましくは、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。
【００２０】
好ましくは、抗体断片、一本鎖抗体、又はダイアボディである。
【００２１】
本発明の他の様相は、ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体であって、Ｒ７−０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３６９）、Ｒ７−０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０４）、Ｒ７−０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７１）、Ｒ７−０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７２）、Ｒ７−１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７３）、Ｒ７−１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７４）、Ｒ７−２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７５）、又はＲ７−４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７６）であることを特徴とするハイブリドーマにより産生され、補体依存性細胞溶解作用又は抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用を介さずにＣＣＲ７リガンド刺激によるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断する活性を有することを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体である。
【００２２】
本発明の他の様相は、上記の抗ヒトＣＣＲ７抗体と受容体との結合を競合阻害し、かつ補体依存性細胞溶解作用又は抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用を介さずにＣＣＲ７リガンド刺激によるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断する活性を有することを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体である。
【００２３】
本発明のさらに他の様相は、Ｒ７−０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３６９）、Ｒ７−０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０４）、Ｒ７−０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７１）、Ｒ７−０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７２）、Ｒ７−１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７３）、Ｒ７−１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７４）、Ｒ７−２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７５）、又はＲ７−４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７６）であることを特徴とするハイブリドーマである。
【００２４】
本発明のさらに他の様相は、本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする核酸である。
【００２５】
好ましくは、配列番号１、配列番号３、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５３、配列番号６１、配列番号６３、配列番号７１、又は配列番号７３で表される塩基配列を有する。
【００２６】
本発明のさらに他の様相は、上記核酸を含むベクターである。
【００２７】
本発明のさらに他の様相は、上記ベクターが導入された細胞である。
【００２８】
本発明のさらに他の様相は、上記した本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体と、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする医薬組成物である。
【００２９】
好ましくは、組織の線維化を治療するために用いられる。
【００３０】
好ましくは、前記組織の線維化が、肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、消化管線維症及び他の線維性疾患からなる群から選択される線維症である。
【００３１】
好ましくは、前記肝線維症が、肝硬変、虚血再灌流、肝移植後傷害、壊死性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、原発性胆汁性肝硬変、及び原発性硬化性胆管炎からなる群から選択される。
【００３２】
好ましくは、前記肝硬変が、アルコールによる誘発、薬物による誘発、及び化学的な誘発からなる群から選択された少なくとも１つによるものである。
【００３３】
好ましくは、前記腎線維症が、増殖性糸球体腎炎、硬化性糸球体腎炎、腎性線維化性皮膚症、糖尿病性腎症、腎尿細管間質性線維症、及び巣状分節性糸球体硬化症からなる群から選択されるものである。
【００３４】
好ましくは、前記肺線維症が、肺間質性線維症、薬物誘発サルコイドーシス、肺線維症、特発性肺線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、びまん性肺胞損傷疾患、肺高血圧症、及び新生児気管支肺形成異常からなる群から選択されるものである。
【００３５】
好ましくは、前記皮膚線維症が、強皮症、ケロイド瘢痕化、乾癬、肥厚性瘢痕化、及び偽性強皮症からなる群から選択されるものである。
【００３６】
好ましくは、前記心血管線維症が、アテローム性動脈硬化、冠動脈再狭窄、うっ血性心筋症、心不全、心移植、及び心筋線維症からなる群から選択されるものである。
【００３７】
好ましくは、前記消化管線維症が、コラーゲン蓄積大腸炎、絨毛萎縮、陰窩過形成、ポリープ形成、クローン病の線維症、胃潰瘍治癒、及び腹部癒着術後瘢痕からなる群から選択されるものである。
【００３８】
好ましくは、前記線維症が、骨に関連する線維化性疾患から生じる状態を有し、リウマチ様パンヌス形成である。
【００３９】
本発明のさらに他の様相は、上記した本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体が担体に固定化されてなる抗体固定化担体である。
【００４０】
好ましくは、ＣＣＲ７発現細胞を含む血液を接触させて、前記体液からＣＣＲ７発現細胞を除去するために用いられる。
【発明の効果】
【００４１】
本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体によれば、治療困難な線維症やリンパ性癌転移等に対する新規医薬品を提供することができる。
【００４２】
本発明のハイブリドーマについても同様であり、治療困難な線維症やリンパ性癌転移等に対する新規医薬品の有効成分となる抗ヒトＣＣＲ７抗体を製造することができる。
【００４３】
本発明の核酸によれば、本発明の抗体を組換え技術をもって生産することができる。また、遺伝子治療への応用も可能である。
【００４４】
本発明のベクターについても同様であり、本発明の抗体を組換え技術をもって生産することができる。また、遺伝子治療への応用も可能である。
【００４５】
本発明の細胞についても同様であり、本発明の抗体を組換え技術をもって生産することができる。
【００４６】
本発明の医薬組成物によれば、治療困難な線維症やリンパ性癌転移等に対する新規医薬品を提供することができる。
【００４７】
本発明の抗体固定化担体によれば、線維症や癌などを罹患している患者の血液から、ＣＣＲ７発現細胞を選択的に除去することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】Ｒ７−０１の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。
【図２】Ｒ７−０２の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。
【図３】Ｒ７−０５の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。
【図４】Ｒ７−０９の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。
【図５】Ｒ７−１１の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。
【図６】Ｒ７−１８の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。
【図７】Ｒ７−２５の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。
【図８】Ｒ７−４７の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。
【図９】ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞とマウスコントロールＩｇＧとの相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。
【図１０】ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞と抗ヒトＣＣＲ７抗体Ｒ７−４７との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。
【図１１】細胞内Ｃａ2+濃度と各添加物の濃度との関係を表すグラフである。
【図１２】（ａ）はアイソタイプコントロール抗体とＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体で染色した結果を表すヒストグラム、（ｂ）はＲ７−４７とＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体で染色した結果を表すヒストグラムである。
【図１３】肺線維症を惹起させたマウスに抗ヒトＣＣＲ７抗体Ｒ７−１１、Ｒ７−１８、又はＲ７−４７を投与した実験の結果を表すグラフである。
【図１４】（ａ）はＣＨＯ−Ｋ１細胞とハイブリドーマＲ７−０２由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用の解析結果を表す２次元ドット表示図とヒストグラム、（ｂ）はヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞とハイブリドーマＲ７−０２由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用の解析結果を表す２次元ドット表示図とヒストグラムである。
【図１５】（ａ）はＣＨＯ−Ｋ１細胞とハイブリドーマＲ７−１１由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用の解析結果を表す２次元ドット表示図とヒストグラム、（ｂ）はヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞とハイブリドーマＲ７−１１由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用の解析結果を表す２次元ドット表示図とヒストグラムである。
【図１６】（ａ）はＣＨＯ−Ｋ１細胞とハイブリドーマＲ７−１８由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用の解析結果を表す２次元ドット表示図とヒストグラム、（ｂ）はヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞とハイブリドーマＲ７−１８由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用の解析結果を表す２次元ドット表示図とヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
まず、本発明の抗体が特異的に認識するヒトＣＣＲ７について、その構造を中心に説明する。前述したように、ＣＣＲ７はＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の一種であり、細胞膜を７回貫通し、そのＮ末端を細胞外に、Ｃ末端を細胞内に向けて存在している。ヒトＣＣＲ７をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）はすでに単離されており、ヒトＣＣＲ７のアミノ酸配列も知られている。当該配列情報は、例えば、GenBank等のデータベースから得ることができる（例えば、GenBank:EAW60669.1）。その一例として、配列番号８１にヒトＣＣＲ７遺伝子の塩基配列と該塩基配列に対応するアミノ酸配列を、配列番号８２にアミノ酸配列のみを示す。
【００５０】
ヒトＣＣＲ７の各ドメインは、配列番号８２に示すアミノ酸配列における以下の部分に相当すると考えられている。左側がアミノ酸番号、右側が各ドメインである。なお各ドメイン間の境界については、多少の前後が生じ得る。
【００５１】
１〜  ２４：膜移行シグナルペプチド配列（発現後に切断・除去される）
２５〜  ５９：Ｎ末端ドメイン
８７〜  ９５：細胞内第１ループドメイン
１１７〜１３０：細胞外第１ループドメイン
１５３〜１７０：細胞内第２ループドメイン
１９２〜２１９：細胞外第２ループドメイン
２４８〜２６３：細胞内第３ループドメイン
２９０〜３１３：細胞外第３ループドメイン
３３２〜３７８：Ｃ末端ドメイン
【００５２】
ヒトＣＣＲ７には、配列番号８２に示すもの以外にアミノ酸置換体等の各種のバリアントが知られている。本発明における「ヒトＣＣＲ７」には、細胞外ドメインを有し且つＣＣＲ７としての機能を有する限り、前記バリアントが含まれる。
【００５３】
本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体（以下、単に「本発明の抗体」と略記することがある。）は、ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合するものである。１つの様相（第一の様相）において、本発明の抗体は、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、又は配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（重鎖ＣＤＲ３）を有する。
【００５４】
また他の様相（第二の様相）において、本発明の抗体は、その相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列について、下記（Ａ１）〜（Ａ８）のいずれかを満たす。
（Ａ１）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ２）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ３）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ４）配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ５）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ６）配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ７）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ８）配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する。
【００５５】
また他の様相（第三の様相）において、本発明の抗体は、その相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列について、下記（Ｂ１）〜（Ｂ８）のいずれかを満たす。
（Ｂ１）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ２）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ３）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ４）配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ５）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ６）配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ７）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号６８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ８）配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号８０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
【００５６】
また他の様相（第四の様相）において、本発明の抗体は、その重鎖可変領域（以下、「ＶＨ」と略記することがある。）と軽鎖可変領域（以下、「ＶＬ」と略記することがある。）のアミノ酸配列が以下（Ｃ１）〜（Ｃ８）のいずれかを満たす。
（Ｃ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ２）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ３）配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ４）配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ５）配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ６）配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ７）配列番号６２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ８）配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号７４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
【００５７】
配列番号５（重鎖ＣＤＲ１），配列番号６（重鎖ＣＤＲ２），配列番号７（重鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号２（ＶＨ）のアミノ酸番号２７〜３５，５０〜６６，９７〜１１２の部分に相当する（図１（ａ））。
配列番号８（軽鎖ＣＤＲ１），配列番号９（軽鎖ＣＤＲ２），配列番号１０（軽鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号４（ＶＬ）のアミノ酸番号２４〜３９，５５〜６８，９４〜１０２の部分に相当する（図１（ｂ））。
【００５８】
配列番号１５（重鎖ＣＤＲ１），配列番号１６（重鎖ＣＤＲ２），配列番号１７（重鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号１２（ＶＨ）のアミノ酸番号４３〜５１，６６〜８２，１１３〜１２４の部分に相当する（図２（ａ））。
配列番号１８（軽鎖ＣＤＲ１），配列番号１９（軽鎖ＣＤＲ２），配列番号２０（軽鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号１４（ＶＬ）のアミノ酸番号２４〜３７，５３〜５９，８７〜９９の部分に相当する（図２（ｂ））。
【００５９】
配列番号２５（重鎖ＣＤＲ１），配列番号２６（重鎖ＣＤＲ２），配列番号２７（重鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号２２（ＶＨ）のアミノ酸番号３０〜３８，５３〜６８，１００〜１１１の部分に相当する（図３（ａ））。
配列番号２８（軽鎖ＣＤＲ１），配列番号２９（軽鎖ＣＤＲ２），配列番号３０（軽鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号２４（ＶＬ）のアミノ酸番号２３〜３６，５２〜５８，９１〜９９の部分に相当する（図３（ｂ））。
【００６０】
配列番号３５（重鎖ＣＤＲ１），配列番号３６（重鎖ＣＤＲ２），配列番号３７（重鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号３２（ＶＨ）のアミノ酸番号２８〜３６，５１〜６７，９８〜１０９の部分に相当する（図４（ａ））。
配列番号３８（軽鎖ＣＤＲ１），配列番号３９（軽鎖ＣＤＲ２），配列番号４０（軽鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号３４（ＶＬ）のアミノ酸番号２３〜３６，５２〜５８，９１〜９９の部分に相当する（図４（ｂ））。
【００６１】
配列番号４５（重鎖ＣＤＲ１），配列番号４６（重鎖ＣＤＲ２），配列番号４７（重鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号４２（ＶＨ）のアミノ酸番号２９〜３７，５２〜６８，９８〜１１０の部分に相当する（図５（ａ））。
配列番号４８（軽鎖ＣＤＲ１），配列番号４９（軽鎖ＣＤＲ２），配列番号５０（軽鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号４４（ＶＬ）のアミノ酸番号２４〜３９，５５〜６１，９４〜１０２の部分に相当する（図５（ｂ））。
【００６２】
配列番号５５（重鎖ＣＤＲ１），配列番号５６（重鎖ＣＤＲ２），配列番号５７（重鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号５２（ＶＨ）のアミノ酸番号３０〜３７，５３〜６９，９９〜１１１の部分に相当する（図６（ａ））。
配列番号５８（軽鎖ＣＤＲ１），配列番号５９（軽鎖ＣＤＲ２），配列番号６０（軽鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号５４（ＶＬ）のアミノ酸番号２４〜３９，５５〜６１，９４〜１０２の部分に相当する（図６（ｂ））。
【００６３】
配列番号６５（重鎖ＣＤＲ１），配列番号６６（重鎖ＣＤＲ２），配列番号６７（重鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号６２（ＶＨ）のアミノ酸番号３０〜４１，５４〜６９，１００〜１１１の部分に相当する（図７（ａ））。
配列番号６８（軽鎖ＣＤＲ１），配列番号６９（軽鎖ＣＤＲ２），配列番号７０（軽鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号６４（ＶＬ）のアミノ酸番号２４〜３９，５６〜６２，９５〜１０２の部分に相当する（図７（ｂ））。
【００６４】
配列番号７５（重鎖ＣＤＲ１），配列番号７６（重鎖ＣＤＲ２），配列番号７７（重鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号７２（ＶＨ）のアミノ酸番号２７〜３５，５０〜６６，９６〜１０９の部分に相当する（図８（ａ））。
配列番号７８（軽鎖ＣＤＲ１），配列番号７９（軽鎖ＣＤＲ２），配列番号８０（軽鎖ＣＤＲ３）は、それぞれ、配列番号７４（ＶＬ）のアミノ酸番号２４〜３９，５５〜６１，９４〜１０２の部分に相当する（図８（ｂ））。
【００６５】
本発明において「抗体」という文言は、「免疫グロブリン」と置き換えることができる。
【００６６】
本発明における抗体には、その機能的断片が含まれる。ここで「抗体の機能的断片」とは、抗体（すなわち免疫グロブリン）の部分断片であって、抗原に対する作用を少なくとも１つ保持するものを指す。前記部分断片の例としては、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ、ＶＨ−ＶＬ）、ＶＨ、及びこれらの重合体、並びに、これらと重鎖ＣＨ３領域との融合体が挙げられる。また、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３等の各ＣＤＲ、及びこれらＣＤＲの連結体、並びに、これらＣＤＲ又はＣＤＲ連結体と重鎖ＣＨ３領域との融合体が挙げられる。すなわち本発明の抗体には、ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合するものである限り、前記したような抗体の部分断片も含まれる。抗体の部分断片を「抗体断片」と称することもある。
【００６７】
さらに本発明の抗体は、多重特異性抗体であってもよい。例としては、二重特異性抗体の一種であるダイアボディ（Diabody）（国際公開第９３／１１１６１号パンフレット等）が挙げられる。
【００６８】
本発明の抗体が機能的断片である場合には、例えば、以下のような効果がある。すなわち、本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体を後述するような医薬に応用する際に、ＩｇＧ型等の全長の抗体を使用すると、標的受容体のシグナル阻害に加えて、標的組織に障害が起き、これが副作用につながる場合がある。このような場合に、可変領域だけを用いた「抗体の機能的断片」を採用すると、前記したような副作用を回避しやすくなる。
【００６９】
本発明の抗体のクラス（アイソタイプ）は特に限定されない。例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等、いずれのクラスであってもよい。さらに、本発明の抗体のサブクラスについても特に限定はなく、例えば、ＩｇＧであれば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３等のいずれのサブクラスであってもよい。
【００７０】
好ましい実施形態では、ＣＣＲ７リガンド刺激によるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断する活性を有する。
【００７１】
本発明の抗体におけるさらに他の様相（第五の様相）は、Ｒ７−０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３６９）、Ｒ７−０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０４）、Ｒ７−０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７１）、Ｒ７−０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７２）、Ｒ７−１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７３）、Ｒ７−１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７４）、Ｒ７−２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７５）、又はＲ７−４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７６）により産生される抗ヒトＣＣＲ７抗体である。これらの８種のハイブリドーマが産生する抗体は、ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合するものである。
後述の実施例で詳細に説明されるとおり、これらのハイブリドーマによって産生される８種の抗体は、それぞれ、上記した特定のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び各ＣＤＲを有する。表１に、ＶＨ、ＶＬ、各ＣＤＲのアミノ酸配列の配列番号と、対応するクローンの関係をまとめる。
【００７２】
【表１】
2012043533.tif 000033
【００７３】
本発明の抗体を産生する上記８種のハイブリドーマは、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ，あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。寄託の詳細は以下のとおりである。
【００７４】
表示：Ｒ７−０１
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３６９
受託日：平成２２年（２０１０年）７月２８日
（２０１０年７月２８日に寄託されたＦＥＲＭ−２１９８８より移管）
【００７５】
表示：Ｒ７−０２
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０４
受託日：平成２２年（２０１０年）７月２８日
（２０１０年７月２８日に寄託されたＦＥＲＭ−２１９８９より移管）
【００７６】
表示：Ｒ７−０５
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７１
受託日：平成２２年（２０１０年）７月２８日
（２０１０年７月２８日に寄託されたＦＥＲＭ−２１９９０より移管）
【００７７】
表示：Ｒ７−０９
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７２
受託日：平成２２年（２０１０年）７月２８日
（２０１０年７月２８日に寄託されたＦＥＲＭ−２１９９１より移管）
【００７８】
表示：Ｒ７−１１
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７３
受託日：平成２２年（２０１０年）７月２８日
（２０１０年７月２８日に寄託されたＦＥＲＭ−２１９９２より移管）
【００７９】
表示：Ｒ７−１８
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７４
受託日：平成２２年（２０１０年）７月２８日
（２０１０年７月２８日に寄託されたＦＥＲＭ−２１９９３より移管）
【００８０】
表示：Ｒ７−２５
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７５
受託日：平成２２年（２０１０年）７月２８日
（２０１０年７月２８日に寄託されたＦＥＲＭ−２１９９４より移管）
【００８１】
表示：Ｒ７−４７
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７６
受託日：平成２２年（２０１０年）７月２８日
（２０１０年７月２８日に寄託されたＦＥＲＭ−２１９９５より移管）
【００８２】
本発明の抗体が特異的に結合するヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインは、Ｎ末端ドメイン、細胞外第１ループドメイン、細胞外第２ループドメイン、細胞外第３ループドメインのいずれでもよい。また本発明の抗体は、これらの細胞外ドメインのいずれか１つのみに結合するものでもよいし、２つ以上に結合するものでもよい。
【００８３】
本発明の抗体には、上記した第一から第五の様相に係る抗ヒトＣＣＲ７抗体と同一のエピトープに結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体も含まれる。換言すれば、上記した第一から第五の様相に係る抗ヒトＣＣＲ７抗体のＣＤＲと「機能的に同等」のＣＤＲを有する抗ヒトＣＣＲ７抗体も含まれる。例えば、後述の実施例で具体的に示す８種の抗ヒトＣＣＲ７抗体のエピトープを、ヒトＣＣＲ７の部分ペプチド等を用いたエピトープマッピング法により解析する。そして、同定されたエピトープを含む合成ペプチドを抗原として用い、上記８種の抗ヒトＣＣＲ７抗体と同一のエピトープに結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体を得ることができる。さらに、得られた抗ヒトＣＣＲ７抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列を決定し、重鎖ＣＤＲ１〜３と軽鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を特定することができる。
なお、当該抗ヒトＣＣＲ７抗体における「機能的に同等」のＣＤＲのアミノ酸配列の例としては、元のアミノ酸配列（配列番号５〜１０、１５〜２０、２５〜３０、３５〜４０、４５〜５０、５５〜６０、６５〜７０、７５〜８０）において１若しくは数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列で且つＣＤＲとして同等の機能を有するものが挙げられる。別の例としては、前記元のアミノ酸配列との相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上のアミノ酸配列で且つＣＤＲとして同等の機能を有するものが挙げられる。
２つの抗体についてエピトープが同一か否かを調べる方法としては、競合実験による方法が挙げられる。例えば、第一抗体たる前記８種の抗ヒトＣＣＲ７抗体と受容体との結合が、試験対象である第二抗体によって競合阻害を受ける場合には、当該第二抗体は、前記第一抗体と同じエピトープに結合するものであるといえる。
【００８４】
本発明の核酸は、本発明の抗体における重鎖可変領域（ＶＨ）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするものである。すなわち、第一の様相に係る、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、又は配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する抗ヒトＣＣＲ７抗体のＶＨまたはＶＬをコードする核酸は、本発明の核酸に含まれる。また、第二の様相に係る、上記（Ａ１）〜（Ａ８）のいずれかを満たすＶＨ又はＶＬをコードする核酸は、本発明の核酸に含まれる。また、第三の様相に係る、上記（Ｂ１）〜（Ｂ８）のいずれかを満たすＶＨ又はＶＬをコードする核酸は、本発明の核酸に含まれる。また、第四の様相に係る、上記（Ｃ１）〜（Ｃ８）のいずれかを満たすＶＨ又はＶＬをコードする核酸は、本発明の核酸に含まれる。これらの核酸の具体例としては、配列番号１、配列番号３、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５３、配列番号６１、配列番号６３、配列番号７１、又は配列番号７３で表される塩基配列を有する核酸が挙げられる。
本発明の核酸は、上記８種のハイブリドーマからＰＣＲ等を用いて取得することもできる。
【００８５】
本発明のベクターは、本発明の核酸を含むものである。ベクターの種類としては特に限定はなく、その後に導入される宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。また、本発明のベクターには、遺伝子治療用ベクターが含まれる。この場合には、ベクターそのものを生体内に直接投与可能である。
【００８６】
本発明の細胞は、本発明のベクターが導入されたものである。細胞の種類としては、導入されたベクターが機能するものであれば特に限定はない。例としては、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、酵母、細菌（大腸菌等）、植物細胞、昆虫細胞、などが挙げられる。
【００８７】
本発明の抗体は、例えば以下のようにして製造することができる。
【００８８】
（ハイブリドーマによる生産）
上記８種のいずれかのハイブリドーマを培養し、該培養物から本発明の抗体を生産することができる。培養の方法としては、ハイブリドーマの培養方法として一般に採用されている方法をそのまま適用することができる。例えば、ＤＭＥＭやＲＰＭＩ１６４０のような動物細胞用の培地を用いてハイブリドーマを培養し、その培養上清から本発明の抗体を得ることができる。動物の腹腔内でハイブリドーマを培養する場合には、腹水を採取し、その腹水から本発明の抗体を得ることができる。
【００８９】
（遺伝子組換え技術による生産）
本発明の抗体は、遺伝子組換えの手法を用いて生産することもできる。特に、キメラ型抗体、ヒト化抗体、抗体の機能的断片などを生産する場合には、遺伝子組換えの手法により生産することが一般的である。
【００９０】
まず、第四の様相に係る、上記（Ｃ１）〜（Ｃ８）のいずれかを満たす重鎖可変領域と軽鎖可変領域を有する抗体を生産する方法について、キメラ型抗体の生産を例に説明する。ここで「キメラ型抗体」とは、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）がヒト以外の動物由来のもので、重鎖定常領域（ＣＨ）や軽鎖定常領域（ＣＬ）などの他の領域がヒト由来のものである抗体を指す。
まず、配列番号２、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、又は配列番号７２に示すアミノ酸配列（ＶＨ）をコードするＤＮＡを調製する。同様に、配列番号４、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３４、配列番号４４、配列番号５４、配列番号６４、又は配列番号７４に示すアミノ酸配列（ＶＬ）をコードするＤＮＡを調製する。これらのＤＮＡとしては、配列番号１、配列番号３、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５３、配列番号６１、配列番号６３、配列番号７１、又は配列番号７３に示すものが例示されるが、他の塩基配列のものでもよい。ＤＮＡの調製は、ＰＣＲ等の公知の方法を用いて行うことができる。化学合成により当該ＤＮＡを調製することもできる。
得られたＶＨ又はＶＬをコードするＤＮＡを、ヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードする配列を有するベクターにそれぞれ挿入し、キメラ型抗体発現ベクターを構築する。なお、ヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードする配列を有するベクターは、市場から入手できる。構築した発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、キメラ型抗体を発現する組換え細胞を得る。そして、この組換え細胞を培養し、該培養物から所望のキメラ型抗体を取得する。
【００９１】
前記宿主細胞としては、発現ベクターが機能できるものであれば特に限定はない。上述したような、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、酵母、細菌（大腸菌等）、植物細胞、昆虫細胞、などを適宜採用することができる。
【００９２】
次に、第三の様相に係る、上記（Ｂ１）〜（Ｂ８）のいずれかを満たす特定のＣＤＲを有する抗体を生産する方法について、ヒト化抗体の生産を例に説明する。ここでヒト化抗体とは、ＣＤＲがヒト以外の動物由来のもので、その他の領域（フレームワーク領域や定常領域など）がヒト由来のものである抗体を指す。
【００９３】
まず、重鎖ＣＤＲ１〜３および軽鎖ＣＤＲ１〜３をコードするＤＮＡとして、配列番号５〜１０、配列番号１５〜２０、配列番号２５〜３０、配列番号３５〜４０、配列番号４５〜５０、配列番号５５〜６０、配列番号６５〜７０、又は配列番号７５〜８０に示すアミノ酸配列をコードする各ＤＮＡを調製する。当該ＤＮＡとしては、配列番号１、配列番号３、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５３、配列番号６１、配列番号６３、配列番号７１、又は配列番号７３に示す塩基配列における各ＣＤＲ相当部分の配列が例示されるが、他の塩基配列のものでもよい。ＤＮＡの調製は、ＰＣＲ等の公知の方法を用いて行うことができる。化学合成により当該ＤＮＡを調製することもできる。
次に、これらのＤＮＡを用いて、任意のヒト抗体におけるＶＨのフレームワーク領域（ＦＲ）に重鎖ＣＤＲ１〜３が移植された可変領域をコードするＤＮＡを作製する。同様に、任意のヒト抗体におけるＶＬのＦＲに軽鎖ＣＤＲ１〜３が移植された可変領域をコードするＤＮＡを作製する。作製した各ＤＮＡを、ヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードする配列を有するベクターに挿入し、ヒト化抗体発現ベクターを構築する。構築した発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、ヒト化抗体を発現する組換え細胞を得る。そして、この組換え細胞を培養し、該培養物から所望のヒト化抗体を取得する。
第二の様相に係る、上記（Ａ１）〜（Ａ８）のいずれかを満たす特定のＣＤＲを有する抗体についても、同様の手順で生産することができる。
第一の様相に係る、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、又は配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する抗ヒトＣＣＲ７抗体についても、同様の手順で生産することができる。
【００９４】
本発明の抗体の精製方法としては特に限定はなく、公知の手法を採用することができる。例えば、前記ハイブリドーマ又は前記組換え細胞の培養上清を回収し、各種クロマトグラフィー、塩析、透析、膜分離等の公知の手法を組み合わせて、本発明の抗体を精製することができる。抗体のアイソタイプがＩｇＧである場合には、プロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって簡便に精製することもできる。
【００９５】
なお、本発明のハイブリドーマは、後述の実施例にて詳述するように、公知のハイブリドーマ作製技術を用いて選抜及び取得されたものである。ここで、動物（例えばマウス）に抗原を免疫する際には、精製されたヒトＣＣＲ７を抗原として用いることもできるが、遺伝子免疫の手法を用いてもよい。特に、大腸菌シャペロニンであるＧｒｏＥＬの遺伝子にＣＣＲ７遺伝子を連結させた融合遺伝子を免疫原として用いることにより、抗体作製が容易に行えることがある。当該遺伝子免疫手法の詳細は、国際公開第２００６／０４１１５７号パンフレットに記載されている。
【００９６】
本発明の抗体は医薬組成物（治療剤）の有効成分として有用である。本発明の医薬組成物は、本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体と、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とするものである。好ましくは、ＣＣＲ７リガンドによるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断するものである。
【００９７】
好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は、組織の線維化を治療するために用いられる。組織の線維化の例としては、肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、消化管線維症及び他の線維性疾患からなる群から選択される線維症が挙げられる。
前記肝線維症の例としては、肝硬変、虚血再灌流、肝移植後傷害、壊死性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、原発性胆汁性肝硬変、及び原発性硬化性胆管炎からなる群から選択される肝線維症が挙げられる。肝硬変については、アルコールによる誘発、薬物による誘発、及び化学的な誘発からなる群から選択された少なくとも１つによるものが挙げられる。前記腎線維症の例としては、増殖性糸球体腎炎、硬化性糸球体腎炎、腎性線維化性皮膚症、糖尿病性腎症、腎尿細管間質性線維症、及び巣状分節性糸球体硬化症からなる群から選択される腎線維症が挙げられる。前記肺線維症の例としては、肺間質性線維症、薬物誘発サルコイドーシス、肺線維症、特発性肺線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、びまん性肺胞損傷疾患、肺高血圧症、及び新生児気管支肺形成異常からなる群から選択される肺線維症が挙げられる。
【００９８】
前記皮膚線維症の例としては、強皮症、ケロイド瘢痕化、乾癬、肥厚性瘢痕化、及び偽性強皮症からなる群から選択される皮膚線維症が挙げられる。前記心血管線維症の例としては、アテローム性動脈硬化、冠動脈再狭窄、うっ血性心筋症、心不全、心移植、及び心筋線維症からなる群から選択される心血管線維症が挙げられる。前記消化管線維症の例としては、コラーゲン蓄積大腸炎、絨毛萎縮、陰窩過形成、ポリープ形成、クローン病の線維症、胃潰瘍治癒、及び腹部癒着術後瘢痕からなる群から選択される消化管線維症が挙げられる。
【００９９】
また前記線維症が、骨に関連する線維化性疾患から生じる状態を有し、リウマチ様パンヌス形成であってもよい。
【０１００】
また本発明の医薬組成物は、癌の転移を治療するためにも用いることができる。前記癌の例としては、咽頭癌、軟骨肉腫、大腸癌、膵臓癌、白血病、乳癌からなる群から選択される癌が挙げられる。
【０１０１】
本発明の医薬組成物は、経口あるいは非経口的に、全身あるいは局部的に投与することができる。投与の形態としては、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の場合には、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより、全身または局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状により、適宜、投与方法を選択することができる。本発明の抗体の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことができる。あるいは、例えば、患者あたり抗体０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の抗体の投与量は、これらの範囲に限定されるものではない。
【０１０２】
本発明の抗体を含む医薬組成物は、常法に従って製剤化することができる（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体や添加物を含む。前記担体あるいは前記添加物の例としては、界面活性剤（ＰＥＧ、Ｔｗｅｅｎ等）、賦形剤、酸化防止剤（アスコルビン酸等）、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤（リン酸、クエン酸、他の有機酸等）、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに限定されず、その他常用の担体等を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等のタンパク質、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン及びリシン等のアミノ酸を含んでいてもよい。
【０１０３】
注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０）等と併用してもよい。また、必要に応じ本発明の抗体をマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ［メチルメタクリル酸］等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる（"Remingto's Pharmaceutical Science 16th edition",Oslo Ed. (1980)等参照）。
【０１０４】
さらに、薬剤を徐放させる技術が知られており、本発明の医薬組成物に適用し得る（Langer et al., J. Biomed. Master. Res. 15:167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)；米国特許第３，７７３，９１９号；欧州特許出願公開第５８，４８１号；Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983)；欧州特許出願公開第１３３，９８８号）。
【０１０５】
さらに、抗体に他の薬剤（抗線維化作用剤、低分子抗癌剤、サイトカインなど）を直接融合させ治療効果を高める技術が知られており、本発明の医薬組成物に適用し得る。
【０１０６】
また、本発明の抗体をコードする遺伝子を遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療薬とすることも考えられる。当該遺伝子治療薬（組換えベクター）の投与方法としては、ｎａｋｅｄプラスミドによる直接投与の他、リポソーム等にパッケージングして投与する方法、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ＨＶＪベクター等の各種ウイルスベクターに組み込んで投与する方法（Ａｄｏｌｐｈ『ウイルスゲノム法』，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｆｌｏｒｉｄ（１９９６）参照）、コロイド金粒子等のビーズ担体に被覆（国際公開第９３／１７７０６号パンフレット等）して投与する方法、等が挙げられる。すなわち、前記遺伝子治療薬は、生体内において本発明の抗体が発現され、その作用を発揮できる限り、いかなる方法により投与してもよい。好ましくは、適当な非経口経路（静脈内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪組織内、乳腺組織内、吸入または筋肉内の経路を介して注射、注入、またはガス誘導性粒子衝撃法（電子銃等による）、添鼻薬等粘膜経路を介する方法等）により十分な量が投与される。さらに、前記遺伝子治療薬は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいてリポソームトランスフェクション、粒子衝撃法（米国特許第４，９４５，０５０号）、またはウイルス感染を利用して細胞に投与し、該細胞を動物に再導入することにより投与してもよい。
【０１０７】
さらに、本発明には、ＣＣＲ７シグナルの異常亢進によって発症する疾患又は疾病に罹患した哺乳動物の該疾患に関する治療方法と治療薬も含まれる。
ここで「治療」とは、疾患に罹患するおそれがあるか又は罹患した哺乳動物において、該疾患の病態の進行及び悪化を阻止又は緩和することを意味し、これによって該疾患の諸症状等の進行及び悪化を阻止又は緩和することを目的とする治療的処置の意味として使用される。
【０１０８】
また、「疾患」とは、ＣＣＲ７シグナルの異常亢進に起因して発症する疾患全般のことを意味し、特に限定されるものではなく、例えば、肝線維症、腎線維症、肺線維症、皮膚線維症、心血管線維症、消化管線維症及び他の線維性疾患を含む概念である。また、咽頭癌、軟骨肉腫、大腸癌、膵臓癌、白血病、乳癌を原発とする癌転移を含む概念である。治療の対象となる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウサギなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。
【０１０９】
本発明の抗体固定化担体は、本発明の抗ヒトＣＣＲ７抗体が担体に固定化されてなるものである。好ましい実施形態では、本発明の抗体固定化担体は、ＣＣＲ７発現細胞を含む血液を接触させて、前記体液からＣＣＲ７発現細胞を除去するために用いられる。担体に固定化される抗ヒトＣＣＲ７抗体は、１種類のみでもよいし、２種以上でもよい。
【０１１０】
本発明の抗体固定化担体の具体的形態としては、例えば、本発明の抗体が水不溶性担体に固定され、容器に充填されたものが挙げられる。ここで、水不溶性担体としてはいかなる材質も使用可能であるが、成型性、滅菌性や細胞毒性が低いという点で好ましいものを列記すると、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン等の金属材料が挙げられる。
【０１１１】
担体の形状としては、粒状、綿状、織布、不織布、スポンジ状多孔質体、平板状、などが挙げられるが、体積当たりの表面積が大きいという点で粒状、綿状、織布、不織布、スポンジ状多孔質体が好ましい。例えば、抗体が固定された水不溶性担体を予め容器に充填した多孔質体フィルターに末梢血液を通過させ、疾患に関わるＣＣＲ７発現細胞を効率よく除去することができる。
【０１１２】
本発明の抗体固定化担体と他の構成要素とを組み合わせて、ＣＣＲ７発現細胞除去用キットを作製することができる。当該他の構成要素としては、抗凝固剤、体外循環回路などが挙げられる。
【０１１３】
本発明は、下記（１）〜（５）の抗ヒトＣＣＲ７抗体を包含する。
【０１１４】
（１）ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ヒトＣＣＲ７抗体であって、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、又は配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（重鎖ＣＤＲ３）を有することを特徴とする抗ヒトＣＣＲ７抗体。
【０１１５】
（２）その相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列について、下記（Ａ１）〜（Ａ８）のいずれかを満たすことを特徴とする上記（１）に記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体。
（Ａ１）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ２）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ３）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ４）配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ５）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ６）配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ７）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ａ８）配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する。
【０１１６】
（３）その相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列について、下記（Ｂ１）〜（Ｂ８）のいずれかを満たすことを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体。
（Ｂ１）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ２）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ３）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ４）配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号４０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ５）配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ６）配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ７）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号６８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する、
（Ｂ８）配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号８０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
【０１１７】
（４）その重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列について、下記（Ｃ１）〜（Ｃ８）のいずれかを満たすことを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体。
（Ｃ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ２）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ３）配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ４）配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ５）配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ６）配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ７）配列番号６２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、
（Ｃ８）配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号７４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
【０１１８】
（５）Ｒ７−０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３６９）、Ｒ７−０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４０４）、Ｒ７−０５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７１）、Ｒ７−０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７２）、Ｒ７−１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７３）、Ｒ７−１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７４）、Ｒ７−２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７５）、又はＲ７−４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３７６）により産生されることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ヒトＣＣＲ７抗体。
【０１１９】
本発明は、有効量の前記抗ヒトＣＣＲ７抗体を投与する組織の繊維化又は癌の転移の治療方法、を包含する。組織の繊維化と癌の具体例は、前述したとおりである。
【０１２０】
本発明は、組織の繊維化又は癌の転移の治療剤製造のための前記抗ヒトＣＣＲ７抗体の使用、を包含する。また本発明は、組織の繊維化又は癌の転移の治療用の前記抗ヒトＣＣＲ７抗体、を包含する。組織の繊維化と癌の具体例は、前述したとおりである。
【実施例】
【０１２１】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１２２】
（１）ヒトＣＣＲ７（ｈＣＣＲ７）遺伝子の調製
ジーンバンク登録済みのヒトＣＣＲ７遺伝子配列（ＮＭ＿００１８３８、配列番号８１）の５'末端にＧＣＴＡＧＣ配列、３'末端にＧＴＣＧＡＣＴＡＧＧＡＡＴＴＣ配列（配列番号８３）を付加した人工合成遺伝子をＤＮＡ合成装置により作製した。その後、この遺伝子をｐＵＣ５７クローニングベクターに導入し、ヒトＣＣＲ７遺伝子クローンを調製した。以下、得られたベクターをＮｈｅＩとＳａｌＩサイトで切断して調製される遺伝子断片を「ＤＮＡ断片Ａ」と称し、ＮｈｅＩとＥｃｏＲＩサイトで切断して調製される遺伝子断片を「ＤＮＡ断片Ｂ」と称する。
【０１２３】
（２）ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子の単離
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株（ノバジェン社）からゲノムＤＮＡを抽出・精製した。次に、精製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号８４及び８５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、配列番号８６に示す塩基配列を有するＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、「ＤＮＡ断片Ｃ」と称する。）を増幅した。ＤＮＡ断片Ｃには、プライマーに由来して、５'末端にＳａｌＩサイト、３'末端に２個の停止コドン（ＴＡＡＴＡＧ）をコードする配列及びＮｏｔＩサイトが導入された。
【０１２４】
（３）ヒトＣＣＲ７とＧｒｏＥＬサブユニットとの融合タンパク質を発現する遺伝子免疫用ベクターの構築
哺乳動物発現ベクターpCI Mammalian Expression Vector（プロメガ社）を制限酵素ＮｈｅＩとＳａｌＩで消化し、バクテリア由来アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）にて末端を脱リン酸化処理した後、上記（１）で調製したＤＮＡ断片Ａを挿入した。さらに、この発現ベクターをＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＢＡＰにて末端を脱リン酸化処理した後、上記（２）で調製したＤＮＡ断片Ｃを挿入し、ベクターｐＣＩ−ｈＣＣＲ７・ＧｒｏＥＬを構築した。すなわち、ベクターｐＣＩ−ｈＣＣＲ７・ＧｒｏＥＬは、ヒトＣＣＲ７をコードする遺伝子とＧｒｏＥＬサブユニットをコードする遺伝子との融合遺伝子を有している。
【０１２５】
（４）ヒトＣＣＲ７遺伝子導入安定発現細胞の作製
上記（１）で調製したＤＮＡ断片ＢをｐＣＩｎｅｏ（プロメガ社）のＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩサイトに導入し、ｐＣＩｎｅｏ−ｈＣＣＲ７を構築した。
【０１２６】
リポフェクタミン（Lipofectamin）溶液３７．５μＬと、ＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ培地６２５μＬと、２０μｇのｐＣＩｎｅｏ−ｈＣＣＲ７を含むＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ培地６２５μＬとを混和した。この混和液を用いて、ｐＣＩｎｅｏ−ｈＣＣＲ７を２×１０5個のＣＨＯ−Ｋ１細胞（大日本製薬社）に導入した。対照として、ｐＣＩｎｅｏのみをＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入した。遺伝子が導入された各ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、Ｈａｍ'ｓＦ１２Ｋ＋１０％ＦＢＳ培地（ＩＣＮ社）にて３０時間培養した。さらに、各細胞を剥離、懸濁し、１００ｍｍディッシュに５×１０5個を播き、抗生物質Ｇ４１８（プロメガ社）を０．８ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するＨａｍ'ｓＦ１２Ｋ＋１０％ＦＢＳ培地で２週間薬剤処理を行なった。薬剤処理後、限界希釈法により、Ｇ４１８耐性細胞をクローニングした。さらに、Ｃａシグナル応答を増大させるために、クローニングした細胞にｐＣＥＰ−Ｇα１６（Molecular Devices社）を遺伝子導入し、抗生物質ハイグロマイシンを０．２ｍｇ／ｍＬの濃度下で、同様に薬剤処理を行ない、その後、さらにハイグロマイシン耐性細胞のクローニングを行なった。以上の操作により、ヒトＣＣＲ７遺伝子導入安定発現細胞を作製した。次に、この細胞上のＣＣＲ７機能活性を確認するため、以下の評価を行なった。細胞は２×１０4個／１００μＬの初期細胞濃度にて、９６穴マイクロタイタープレートを用いて一昼夜培養し、培養終了後、１０-6〜１０-12Ｍの濃度範囲内のＣＣＬ２１（R&D systems社）によって各細胞を刺激したところ、細胞内のＣａ2+濃度が一過的に上昇した。Ｃａ2+濃度は、Ｃａ2+シグナル解析装置（ＦＬＩＰＲ；Molecular Devices社）及び細胞内Ｃａ2+染色キット（Ｃａ３ｋｉｔ；Molecular Devices社）を用いて測定した。このことから、活性型ヒトＣＣＲ７が、ＣＨＯ−Ｋ１細胞膜上に正常に安定発現していることがわかった。
【０１２７】
（５）遺伝子免疫
生理食塩水にベクターｐＣＩ−ｈＣＣＲ７・ＧｒｏＥＬを２５０μｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解し、免疫用組成物を調製した。この免疫用組成物を、８週齢のマウスＢＡＬＢ／ｃ（雌）の両足大腿筋に各０．１２ｍＬずつ注射を行い、免疫した（０日目）。これにより、ｐＣＩ−ｈＣＣＲ７・ＧｒｏＥＬを両足に各３０μｇずつ、すなわち、１匹につき１回あたり６０μｇ投与した。その後、７日目、２１日目、及び２８日目にも同様して繰り返し免疫した。そして、０、７、１４、２１、２８、３５、４２日目に採血を行い、血清を調製した。対照として、ｈＣＣＲ７を単独で発現するベクターｐＣＩ−ｈＣＣＲ７を用いてマウスを免疫した。
【０１２８】
（６）フローサイトメトリーによる活性型ヒトＣＣＲ７に対する血清中抗体結合性評価
ｐＣＩｎｅｏ−ｈＣＣＲ７が導入され安定発現を確認したＣＨＯ−Ｋ１細胞（以下、「ｈＣＣＲ７遺伝子導入細胞」と称する。）及び、ｐＣＩｎｅｏが導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞（対照の細胞）をＰＢＳで洗浄した。免疫後５６日目の血清を５００倍希釈し、各細胞と一緒にインキュベートした。さらに、各細胞をＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社）を添加した後、フローサイトメーターＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社）を用いて、各細胞と血清中の抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用を解析した。
【０１２９】
その結果、ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞を用いた場合は、遺伝子免疫前の血清ではフィコエリスリンがほとんど検出されなかったが、遺伝子免疫後の血清では検出された。これは、免疫後の血清中の抗ヒトＣＣＲ７抗体がヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞に結合することを示していた。一方、対照の細胞を用いた場合も、遺伝子免疫後の血清でもフィコエリスリンが検出されなかった。これは、免疫後の血清中の抗ヒトＣＣＲ７抗体が対照の細胞に結合しないことを示していた。
以上のことから、ベクターｐＣＩ−ｈＣＣＲ７・ＧｒｏＥＬによる遺伝子免疫によって、マウス血清中に活性型ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインを特異的に認識する抗体の産生を誘導することができた。
【０１３０】
（７）抗ヒトＣＣＲ７モノクローナル抗体の作製
上記（５）と同様の手順で遺伝子免疫したマウス６匹に対して追加免疫を行った。追加免疫の３日後に脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。ＰＥＧ法により、１×１０8個の脾細胞と、１×１０7個のＢＡＬＢ／Ｃマウス由来のＨＡＴ選択性のミエローマＳＰ２／０細胞とを融合した（細胞融合）。融合した細胞（ハイブリドーマ）の集団をＲＰＭＩ培地に懸濁し、９６穴マイクロプレート１４枚の各穴に播種した。この段階で、約９９０種のハイブリドーマが得られた。
【０１３１】
細胞融合の翌日から２週間、３日に１度の頻度で、上記マイクロプレート内の培地をＨＡＴ Ｍｅｄｉａ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×）（シグマ社、品番：Ｈ０２６２）を添加したＲＰＭＩ培地に置き換えた。
上記（６）と同様のフローサイトメトリーによって抗体結合評価を行い、ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞と各穴のハイブリドーマ培養上清中の抗体との結合性を調べた。その結果、８穴において抗体との結合性が確認された。
抗体との結合性が確認された８種のハイブリドーマについて、限界希釈法によるクローニングを行った。すなわち、８種のハイブリドーマについて９６穴マイクロプレートに細胞１個以下／穴になるように播種し、培養した。２週間後、同様のフローサイトメトリーを行い、クローニングされた培養上清中の抗体（抗ヒトＣＣＲ７モノクローナル抗体）の結合性を確認した。その結果、抗ヒトＣＣＲ７モノクローナル抗体を産生する８種のハイブリドーマがクローニングされた。
各ハイブリドーマについてＲＰＭＩ培地１００ｍＬ内でフラスコ培養を２週間行った。各培養上清を、プロテインＧカラム（アマシャムバイオサイエンス社）に供して精製・濃縮し、精製された８種の抗ヒトＣＣＲ７モノクローナル抗体を各々約２０ｍｇ得た。
【０１３２】
各ハイブリドーマを、ＩＰＯＤに寄託した。各ハイブリドーマの表示と受託番号は、上述のとおりである。
【０１３３】
各々の抗ヒトＣＣＲ７モノクローナル抗体（以下、単に「抗ヒトＣＣＲ７抗体」と称する。）について、以下に示す試験を行った。以下の記載において、ハイブリドーマの表示を抗体名としても用いることとする。
【０１３４】
（８）フローサイトメトリーによるヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞に対する結合性評価
１０μｇ／ｍＬ濃度の抗ヒトＣＣＲ７モノクローナル抗体及びマウスコントロールＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ、陰性対照）のＰＢＳ溶液を調製した（以下、「抗体溶液」と称する。）。一方、ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞をＰＢＳで洗浄した後、抗体溶液を細胞と共にインキュベートした。さらに、細胞をＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社）を添加した後、フローサイトメーターＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社）を用いて、細胞と抗ヒトＣＣＲ７抗体及びマウスコントロールＩｇＧとの相互作用を解析した。結果を図９、１０及び表２に示す。図９はヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞と、マウスコントロールＩｇＧとの相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。図１０はヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞と、抗ヒトＣＣＲ７抗体Ｒ７−４７との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。表２は、ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞と、各抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用の解析結果より、算出された特異的結合細胞の割合を示す。図９、１０において、縦軸は細胞数、横軸はフィコエリスリン（ＰＥ）由来の蛍光強度を表す。また、２つのエリア（Ｍ１、Ｍ２）のうち、Ｍ２（右領域）に属する細胞が抗体と結合した細胞を表す。表２において、特異的に結合した細胞の割合は、Ｍ２／（Ｍ１＋Ｍ２）で表される。
【０１３５】
その結果、ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞を用いた場合は、Ｍ２のエリアに多くの細胞が検出された（図１０、表２）。これは、各抗ヒトＣＣＲ７抗体がヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞に結合することを示していた。一方、マウスコントロールＩｇＧを用いた場合（図９）は、Ｍ２のエリアにはほとんど細胞が検出されなかった。これは、マウスコントロールＩｇＧがヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞に結合しないことを示していた。以上のことから、得られた抗ヒトＣＣＲ７抗体は、いずれも活性型ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインを特異的に認識するものであることが示された。
【０１３６】
【表２】
2012043533.tif 000034
【０１３７】
（９）細胞内Ｃａ2+シグナル伝達阻害活性評価
ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞を、２×１０4個／１００μＬの初期細胞濃度にて、９６穴マイクロタイタープレートを用いて一昼夜培養した。培養終了後、各穴に１０-6〜１０-11Ｍの濃度範囲内の抗ヒトＣＣＲ７抗体を添加した。また対照として、マウスコントロールＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ社、陰性対照）を同様に１０-6〜１０-11Ｍの濃度範囲内で添加したものも調製した。１時間後、１×１０-7ＭのＣＣＬ２１（R&D systems社）によって各細胞を刺激した際の細胞内Ｃａ2+濃度の一過的上昇の抗体濃度依存的減少度を測定した。Ｃａ2+濃度の測定は、Ｃａ2+シグナル解析装置（ＦＬＩＰＲ；Molecular Devices社）及び細胞内Ｃａ染色キット（Ｃａ３ｋｉｔ；Molecular Devices社）を用いて行った。抗ヒトＣＣＲ７抗体Ｒ７−４７を添加した結果を図１１に示す。図１１は細胞内Ｃａ2+濃度と各添加物の濃度との関係を表すグラフである。図１１に示すように、Ｒ７−４７の濃度依存的に、細胞内Ｃａ2+濃度の低下がみられた。これは、Ｒ７−４７がＣＣＬ２１とヒトＣＣＲ７との結合を競合的に阻害した結果、細胞内へのシグナル伝達が阻害されたことを示していた。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出すると、Ｒ７−４７では７．４ｎＭであった。表３は、Ｒ７−４７以外の抗ヒトＣＣＲ７抗体のＩＣ５０を示す。
以上より、得られた抗ヒトＣＣＲ７抗体は、いずれもヒトＣＣＲ７リガンドによるＣＣＲ７依存的な細胞内情報伝達機構を遮断できることが示された。
【０１３８】
【表３】
2012043533.tif 000035
【０１３９】
（１０）アイソタイプ解析
マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ＧＥヘルスケア社）を用いて、抗ヒトＣＣＲ７抗体のアイソタイプを決定した。検出はホースラディッシュペルオキシダーゼ標識マウスＩｇＧ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによった。結果を表４に示す。
【０１４０】
【表４】
2012043533.tif 000036
【０１４１】
（１１）抗体可変領域のｃＤＮＡクローニング、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）の決定
上記８種のハイブリドーマより、各抗体のＬ鎖及びＨ鎖の可変領域をコードするＤＮＡをクローニングし、その塩基配列を決定した。クローニングは以下のように行った。まずハイブリドーマからRNeasyMini Kit（QIAGEN社）を用いてＲＮＡを単離した。次に、「SMARTer-RACE cDNA Amplification Kit」（タカラバイオ社）を用いて、メーカーマニュアルに従い５’−ＲＡＣＥ法によるｃＤＮＡ合成、及びＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲの３'側プライマーとして、γ鎖の場合は、配列番号８７の配列を、κ鎖の場合は配列番号８８〜９０の配列を、λ鎖の場合は配列番号９１の配列をそれぞれ使用した。
【０１４２】
得られたＤＮＡ断片をpT７ Blue T Vector（ノバジェン社)にDNA Ligation kit ver.2（タカラバイオ社）に挿入した。このベクターでＸＬ１０Ｇｏｌｄ（ストラタジーン社）をトランスフォームし、Ｘ−ｇａｌ、アンピシリン、ＩＰＴＧ含有プレートに播種後、白いコロニーをピックアップした。正常なサイズのインサートを含むクローン各５種よりプラスミドを調製後、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０型自動シーケンサーを用いてＤＮＡ配列を決定した。決定した配列は一部にＰＣＲエラーによると思われる変異が認められた以外は３クローンとも同じ配列を示したので、その配列をもって目的のＤＮＡ配列とした。得られた塩基配列と対応するアミノ酸配列を、配列番号１（Ｒ７−０１のＶＨ）、配列番号３（Ｒ７−０１のＶＬ）、配列番号１１（Ｒ７−０２のＶＨ）、配列番号１３（Ｒ７−０２のＶＬ）、配列番号２１（Ｒ７−０５のＶＨ）、配列番号２３（Ｒ７−０５のＶＬ）、配列番号３１（Ｒ７−０９のＶＨ）、配列番号３３（Ｒ７−０９のＶＬ）、配列番号４１（Ｒ７−１１のＶＨ）と４３（Ｒ７−１１のＶＬ）、配列番号５１（Ｒ７−１８のＶＨ）、配列番号５３（Ｒ７−１８のＶＬ）、配列番号６１（Ｒ７−２５のＶＨ）、配列番号６３（Ｒ７−２５のＶＬ）、配列番号７１（Ｒ７−４７のＶＨ）、配列番号７３（Ｒ７−４７のＶＬ）に示す。
【０１４３】
各塩基配列に対応するアミノ酸配列のみを、配列番号２（Ｒ７−０１のＶＨ）、配列番号４（Ｒ７−０１のＶＬ）、配列番号１２（Ｒ７−０２のＶＨ）、配列番号１４（Ｒ７−０２のＶＬ）、配列番号２２（Ｒ７−０５のＶＨ）、配列番号２４（Ｒ７−０５のＶＬ）、配列番号３２（Ｒ７−０９のＶＨ）、配列番号３４（Ｒ７−０９のＶＬ）、配列番号４２（Ｒ７−１１のＶＨ）と４４（Ｒ７−１１のＶＬ）、配列番号５２（Ｒ７−１８のＶＨ）、配列番号５４（Ｒ７−１８のＶＬ）、配列番号６２（Ｒ７−２５のＶＨ）、配列番号６４（Ｒ７−２５のＶＬ）、配列番号７２（Ｒ７−４７のＶＨ）、配列番号７４（Ｒ７−４７のＶＬ）に示す。
【０１４４】
各ＶＨとＶＬについて、ＣＤＲ１〜３を特定した（配列番号５〜１０、１５〜２０、２５〜３０、３５〜４０、４５〜５０、５５〜６０、６５〜７０、７５〜８０）。図１〜９および表１を参照のこと。
【０１４５】
（１２）ヒト初代培養細胞を用いた抗ヒトＣＣＲ７抗体の結合確認
健常人の末梢血から、常法に従い Lymphoprep (Axis-Shield社)を用いて単核球細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。単離したＰＢＭＣを、１ｍｇ／ｍＬのヒトガンマグロブリン（Jackson Immuno Research Laboratories社）を含む Phosphate Buffered Saline（ＰＢＳ）溶液に懸濁し、室温で３０分間インキュベートすることでブロッキングした。ブロッキング後のＰＢＭＣ(３×１０5細胞)を、各抗ヒトＣＣＲ７抗体（０．５μｇ）もしくはアイソタイプコントロール抗体（０．５μｇ）と共に４℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＭＣを洗浄バッファー（０．１％ ウシ胎児血清を含むＰＢＳ溶液）で３回洗浄した。次に２次抗体として、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社）を添加し、４℃で１時間インキュベートした。このＰＢＭＣを再度洗浄バッファーで３回洗浄した後、フローサイトメーター（ベックマンコールター社製）を用いて分析した。
【０１４６】
Ｒ７−４７を用いたときのフローサイトメトリーの結果を図１２に示す。図１２（ａ）はアイソタイプコントロール抗体とＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体で染色した結果を、図１２（ｂ）はＲ７−４７とＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体で染色した結果を、それぞれ示す。図１２（ａ），（ｂ）の両矢印で示す部分は、それぞれ、アイソタイプコントロール抗体とＲ７−４７が特異的に結合した細胞集団を示している。また図中の数字は、分析したＰＢＭＣの細胞数を１００％としたときの該細胞集団の割合を示す。
【０１４７】
ＰＢＭＣ中で各抗ヒトＣＣＲ７抗体が特異的に結合した細胞の割合を表５に示す。
【表５】
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【０１４８】
これらの結果から、当該抗ヒトＣＣＲ７抗体がヒト天然型ＣＣＲ７を認識し、ヒト天然型ＣＣＲ７に結合できることが示された。
【０１４９】
（１３）ヒト初代培養細胞を用いた抗ヒトＣＣＲ７抗体の機能性確認
ＰＢＭＣ（１．６×１０5細胞）を２４ウェルセルカルチャーインサート（ベクトン・ディッキンソン社）のインサートに播種した。さらに、各抗ヒトＣＣＲ７抗体もしくはアイソタイプコントロールＩｇＧ抗体１０μg／ｍＬを添加し、室温にて５分間反応させた。セルカルチャーインサートの各ウェルにはヒトリコンビナントＣＣＬ２１（１５０ｎｇ／ｍＬ）を添加した。インサートをプレート上に設置後、３７℃にて１．５時間反応させた。反応後、インサートを除去し、各ウェル中に遊走した細胞数を測定した。表６と表７に、ＣＣＬ２１依存的細胞遊走に対する当該抗体による機能阻害の結果を示す。
【０１５０】
【表６】
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【０１５１】
【表７】
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【０１５２】
まず、ＣＣＬ２１未添加とＣＣＬ２１添加との比較から、ＰＢＭＣの一部の細胞がＣＣＬ２１依存的に細胞遊走することが示された。そして、アイソタイプコントロール（ＩｇＧ１あるいはＩｇＧ２）抗体を添加しても、ＣＣＬ２１依存的な細胞遊走には影響を与えなかった。一方、当該抗体を添加した場合は、８種の抗体全てがＣＣＬ２１依存的な細胞遊走を有意に抑制した。これらの結果から、当該抗ヒトＣＣＲ７抗体のいずれもが、ヒト天然型ＣＣＲ７の機能を抑制することが示された。
【０１５３】
（１４）抗ヒトＣＣＲ７抗体の肺線維症モデルにおける組織線維化形成の阻害作用の確認
ヒトＰＢＭＣ中の、ＣＣＲ７を発現するＣＤ１４陽性細胞は、肺線維における線維化形成に重要な細胞である（Abe R, Donnelly SC, Peng T, Bucala R, Metz CN, "Peripheral blood fibrocytes: differentiation pathway and migration to wound sites." J Immunol. 2001 Jun 15;166(12):7556-62；Curnow SJ, Fairclough M, Schmutz C, Kissane S, Denniston AK, Nash K, Buckley CD, Lord JM, Salmon M,"Distinct types of fibrocyte can differentiate from mononuclear cells in the presence and absence of serum." PLoS One. 2010 Mar 18;5(3):e9730）。抗ヒトＣＣＲ７抗体の肺線維症における有効性は、免疫不全マウス（例えばＳＣＩＤマウス）に肺線維症を誘発させる刺激物質（例えばブレオマイシン）を投与後、ヒト由来のＣＣＲ７を発現するＣＤ１４陽性細胞を移入した際の当該細胞の肺組織への移行を調べることで示すことができる。
【０１５４】
健常人の末梢血から、常法に従いＰＢＭＣを単離した。単離したＰＢＭＣを、さらにヒトＣＤ１４標識磁気ビーズ（ミルテニーバイオテク社）に接触させ、ＣＤ１４陽性細胞を分離し、マウスへの細胞移入に用いた。Ｔ細胞とＢ細胞が欠如したＳＣＩＤマウスに、生理食塩水に溶解したブレオマイシン（日本化薬社、商品名：ブレオ）を５ｍｇ／ｋｇとなるように経気道投与し、常法に従い肺線維症を惹起させた。ブレオマイシン投与日を０日とし、ブレオマイシン投与４日前、および、投与後から１，４，８，１１日目に、生理食塩水に溶解した抗ヒトＣＣＲ７抗体Ｒ７−１１、Ｒ７−１８、又はＲ７−４７をそれぞれ２０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔投与した。対照として、アイソタイプコントロールＩｇＧを同様のスケジュールで投与した。ブレオマイシン投与後４日目に、上述の方法でＣＣＲ７を発現する細胞を含むヒトＣＤ１４陽性細胞を単離し、ＰＫＨ２６ＰＣＬ赤色蛍光細胞リンカーキット（シグマ社）で蛍光標識した。蛍光標識細胞をマウス一匹当たり１×１０6個、尾静脈より移入した。ブレオマイシン投与から１５日後にマウスを剖検し、常法に従い肺組織を中性ホルマリンで固定し、病理切片を作製した。病理組織を蛍光顕微鏡で観察し、蛍光標識されたヒト細胞由来の細胞数を右肺全視野で計測した。その結果、アイソタイプコントロールＩｇＧを投与したマウスと比較して、抗ヒトＣＣＲ７抗体を投与したマウスでは、いずれも肺において蛍光標識細胞数が減少していた。
【０１５５】
また、剖検によって得られた左肺からTRIzol 試薬（Invitrogen社）により組織の全ＲＮＡを抽出し、Nano Drop 1000 (Thermo Fisher Scientific社）により抽出したＲＮＡ量を定量した。各マウス肺から得られたＲＮＡサンプル２μｇに対して、High Capacity cDNA Reverse transcription kit（Applied Biosystems社）を用いて逆転写反応を行い、得られたｃＤＮＡサンプルをリアルタイムＰＣＲ法により肺組織中のヒトＣＣＲ７のｍＲＮＡ量の測定を行った。リアルタイムＰＣＲによる解析は、TaqMan Gene Expression Assaysシステム（Applied Biosystems社）によって行った。内部標準としてTaqMan Ribosomal RNA Control Reagents（Applied Biosystems社）を用い、ヒトＣＣＲ７の検出にはHs01013469_m1のプローブセット（Applied Biosystems社）を用いた。得られたデータはΔΔＣｔ法によって解析を行い、アイソタイプコントロールを投与した群を基準とした相対発現量として評価した。その結果、アイソタイプコントロールＩｇＧを投与したマウスと比較して、抗ヒトＣＣＲ７抗体Ｒ７−１１、Ｒ７−１８、又はＲ７−４７を投与したマウスでは、いずれもヒトＣＣＲ７のｍＲＮＡ量が減少していた（図１３）。この結果は、当該抗ヒトＣＣＲ７抗体が肺線維症において、線維化に重要な細胞の肺組織への浸潤を抑制することを反映している。これらの結果から、当該抗ＣＣＲ７抗体が肺線維化治療に有用であることが示された。
【０１５６】
（１５）遺伝子組換え技術による抗ヒトＣＣＲ７抗体の製造
配列番号１１で表されるＤＮＡを含むマウス抗体重鎖全長の遺伝子をクローニングし、分泌発現用ベクターｐＳｅｃＴａｇ２（インビトロジェン社）に導入した。このベクターをｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７０２ＨＣと命名した。同様に、配列番号４１で表されるＤＮＡを含むマウス抗体重鎖全長の遺伝子をクローニングし、分泌発現用ベクターｐＳｅｃＴａｇ２に導入した。このベクターをｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７１１ＨＣと命名した。同様に、配列番号５１で表されるＤＮＡを含むマウス抗体重鎖全長の遺伝子をクローニングし、分泌発現用ベクターｐＳｅｃＴａｇ２に導入した。このベクターをｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７１８ＨＣと命名した。
【０１５７】
配列番号１３で表されるＤＮＡを含むマウス抗体軽鎖全長の遺伝子をクローニングし、分泌発現用ベクターｐＳｅｃＴａｇ２に導入した。このベクターをｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７０２ＬＣと命名した。同様に、配列番号４３で表されるＤＮＡを含むマウス抗体軽鎖全長の遺伝子をクローニングし、分泌発現用ベクターｐＳｅｃＴａｇ２に導入した。このベクターをｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７１１ＬＣと命名した。同様に、配列番号５３で表されるＤＮＡを含むマウス抗体軽鎖全長の遺伝子をクローニングし、分泌発現用ベクターｐＳｅｃＴａｇ２に導入した。このベクターをｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７１８ＬＣと命名した。
【０１５８】
リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社）を用いて、ｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７０２ＨＣ及びｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７０２ＬＣを、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。この細胞を２日間培養した。培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ−Ｇカラムに供し、ハイブリドーマＲ７−０２由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体を調製した。同様に、リポフェクタミン２０００を用いて、ｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７１１ＨＣ及びｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７１１ＬＣを、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。この細胞を２日間培養した。培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ−Ｇカラムに供し、ハイブリドーマＲ７−１１由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体を調製した。同様に、リポフェクタミン２０００を用いて、ｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７１８ＨＣ及びｐＳｅｃＴａｇ２−Ｒ７１８ＬＣを、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。この細胞を２日間培養した。培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ−Ｇカラムに供し、ハイブリドーマＲ７−１８由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体を調製した。
【０１５９】
上記（６）と同様にして、ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞（陰性対照）に対し、１０μｇ／ｍＬの各組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体が結合するかどうかを、フローサイトメーターを用いて確認した。蛍光２次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社）を、フローサイトメーターとしてＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社）を用い、各細胞と各組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体との相互作用を解析した。結果を図１４〜１６に示す。図１４はハイブリドーマＲ７−０２由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体を用いた結果を示す。図１５はハイブリドーマＲ７−１１由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体を用いた結果を示す。図１６はハイブリドーマＲ７−１８由来の組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体を用いた結果を示す。図１４〜１６において、（ａ）はＣＨＯ−Ｋ１細胞を使用した場合の２次元ドット表示図（左）とヒストグラム（右）、（ｂ）はヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞を使用した場合の２次元ドット表示図（左）とヒストグラム（右）である。各２次元ドット表示図において、縦軸はフィコエリスリン（ＰＥ）由来の蛍光強度、横軸はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）由来の蛍光強度を表す。すなわち、いずれの組換え型抗ヒトＣＣＲ７抗体とも、ヒトＣＣＲ７遺伝子導入細胞には結合するが、ＣＨＯ−Ｋ１細胞には結合しないことが示された。これらの結果から、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の抗体を、マウス型抗体、キメラ型抗体、ヒト化抗体、抗体の機能的断片、などの形で生産することができることが示された。
【国際調査報告】
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