(57)【要約】  本発明は、複数のリソソーム酵素の欠損に起因するリソソーム病の治療に有効な、複数のリソソーム酵素を含む医薬組成物を簡単に、しかも安価に提供することを目的とし、リソソーム病に罹患していない対象由来の細胞から得られたリソソーム酵素群を有効成分として含むリソソーム病治療用医薬組成物を提供する。
2012147933.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を培養して得られたリソソーム酵素群を有効成分として含むリソソーム病治療用医薬組成物。
【請求項２】
細胞がリソソーム酵素にマンノース６リン酸残基を付加する機能を有する細胞である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
細胞がリソソーム病に罹患していない対象由来の細胞である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
リソソーム酵素群が下記工程：
細胞に、両親媒性アミン、リソソーム指向性アミン、イオノフォア、およびＶ−ＡＴＰａｓｅ阻害薬からなる群より選択される１または複数の試薬を添加して培養し、
培養上清を回収し、
得られた培養上清を精製および／または濃縮する、
ことを含む方法により得られたものである、請求項１〜３のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項５】
試薬が、塩化アンモニウム、クロロキン、モネンシン、ニゲリシン、およびバフィロマイシンＡ１からなる群より選択される、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
細胞が正常皮膚線維芽細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞およびＣＨＯ細胞からなる群より選択されるものである、請求項１〜５のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項７】
リソソーム酵素が組み換え酵素ではない、請求項１〜６のいずれか１記載の医薬組成物。
【請求項８】
リソソーム酵素群がマンノース６リン酸残基を有するリソソーム酵素を含むものである、請求項１〜７のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項９】
ムコリピドーシスＩＩ型またはＩＩＩ型の治療用である、請求項１〜８のいずれか１項記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リソソーム病治療用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
リソソームは、細胞内小器官の１つであり、リソソーム内に存在するリソソーム酵素の働きにより細胞内の様々な物質（異物や不要物等）を分解している。リソソーム酵素は、５０種類以上あると言われ、酸性環境に最適ｐＨを有する。遺伝的欠陥によりリソソーム酵素が欠損すると、細胞内に基質が蓄積し、一連のリソソーム病を引き起こす。このような先天性のリソソーム病は、現在４０種類以上知られているが、根本的な治療法は見出されていない。【０００３】
リソソーム病は、欠損した酵素を補うことによって治療され、酵素補充療法、骨髄移植および遺伝子治療が試みられている。今までに多くのリソソーム酵素が同定され、リソソーム病と関連付けられている。【０００４】
酵素補充療法のために、特定の一種類のリソソーム酵素を強発現する細胞株を用いて生産した組み換え酵素が開発されており、現在までに、このような単一の組み換えリソソーム酵素を用いた７種類の酵素製剤、すなわち、ゴーシェ病治療剤セレザイム（登録商標）（イミグルセラーゼ組み換え酵素製剤）、ファブリー病治療剤ファブラザイム（登録商標）（アガルシダーゼベータ組み換え酵素製剤）、ファブリー病治療剤リプレガル（登録商標）（アガルシダーゼアルファ組み換え酵素製剤）、ムコ多糖症Ｉ型治療剤アウドラザイム（登録商標）（ラロニダーゼ組み換え酵素製剤）、ムコ多糖症ＩＩ型治療剤マイオザイム（登録商標）（アルグルコシダーゼアルファ組み換え酵素製剤）、ムコ多糖症ＩＩ型治療剤エラプレース（登録商標）（イデュルスルファーゼ組み換え酵素製剤）、およびムコ多糖症ＶＩ型治療剤ナグラザイム（登録商標）（ガルスルファーゼ組み換え酵素製剤）が販売されている。
しかしながら、いずれも、単一のリソソーム酵素の欠損が原因のリソソーム病の治療を目的としており、複数のリソソーム酵素が欠損しているリソソーム病に対して有効ではない。さらに、現在販売されている上記治療剤は非常に高価であり、安価な治療剤の開発が求められる。【０００５】
細胞内で合成されたリソソーム酵素は、マンノース６リン酸残基を付加されることにより、マンノース６リン酸受容体を介してリソソームに輸送されることが知られている。
この事実に基づき、リソソーム病の酵素補充療法において欠損酵素を効果的にリソソーム中に送達させるために、高リン酸化されたリソソーム酵素を得る研究が進められている。例えば、単離したリソソーム酵素をマンノース６リン酸残基で修飾する方法や（特許文献１参照）、特殊な細胞系を用いて高リン酸化された組み換えリソソーム酵素を作製する方法（特許文献２参照）が報告されている。しかしながら、これらの技術では、多種類のリソソーム酵素を一度に且つ安価に製造することは難しい。【０００６】
複数のリソソーム酵素が欠損しているリソソーム病の例として、ムコリピドーシスＩＩ型（以下、「ＭＬ−ＩＩ」という）およびその軽症型であるムコリピドーシスＩＩＩ型（以下、「ＭＬ−ＩＩＩ」という）が挙げられる。これらのリソソーム病は、細胞内で合成されたリソソーム酵素にマンノース６リン酸残基を付加する酵素ＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼの異常が原因の疾患である。ＭＬ−ＩＩおよびＭＬ−ＩＩＩでは、ＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼの異常により、細胞内で合成されたリソソーム酵素にマンノース６リン酸残基が付加されないため、リソソーム酵素がマンノース６リン酸受容体に認識されず、リソソームへ運搬されない。そのため、ＭＬ−ＩＩおよびＭＬ−ＩＩＩ患者は、リソソーム中においてリソソーム酵素のほとんど全てが欠損している。
したがって、ＭＬ−ＩＩおよびＭＬ−ＩＩＩの治療には、上記したような単一酵素製剤の投与では効果がなく、理論上、欠損したリソソーム酵素の全てを補充する必要があると考えられる。しかしながら、ＭＬ−ＩＩおよびＭＬ−ＩＩＩにおいて欠損した５０種類以上もの酵素の全てを個々に単離・精製することは非常に困難である。また、上記したような組み換えリソソーム酵素製剤は非常に高価なので、このような高価な酵素製剤を数十種類用いることは、経済的にも困難である。
このような情況から、ＭＬ−ＩＩおよびＭＬ−ＩＩＩのようなリソソーム病には、従来の単一組み換えリソソーム酵素を用いた酵素製剤は適用できず、新たな有用な治療剤が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００３−５０９０４３号
【特許文献２】特表２００７−５２３６４８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、複数のリソソーム酵素の欠損に起因するリソソーム病の治療に有効な、複数のリソソーム酵素を含む医薬組成物を簡単に、しかも安価に提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、リソソーム病に罹患していない対象由来の細胞に塩化アンモニウム等の特定の試薬を添加して培養し、培養上清を回収し、精製することにより、多種類のリソソーム酵素をマンノース６リン酸残基で修飾された状態で、一度に得ることができることを見出した。また、得られた多種類のリソソーム酵素がリソソーム病の治療剤として利用できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本願発明は、
（１）細胞を培養して得られたリソソーム酵素群を有効成分として含むリソソーム病治療用医薬組成物、
（２）細胞がリソソーム酵素にマンノース６リン酸残基を付加する機能を有する細胞である、上記（１）記載の医薬組成物、
（３）細胞がリソソーム病に罹患していない対象由来の細胞である、上記（１）記載の医薬組成物、
（４）リソソーム酵素群が下記工程：
細胞に、両親媒性アミン、リソソーム指向性アミン、イオノフォア、およびＶ−ＡＴＰａｓｅ阻害薬からなる群より選択される１または複数の試薬を添加して培養し、
培養上清を回収し、
得られた培養上清を精製および／または濃縮する、
ことを含む方法により得られたものである、上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の医薬組成物、
（５）試薬が、塩化アンモニウム、クロロキン、モネンシン、ニゲリシン、およびバフィロマイシンＡ１からなる群より選択される、上記（４）記載の医薬組成物、
（６）細胞が正常皮膚線維芽細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞およびＣＨＯ細胞からなる群より選択されるものである、上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の医薬組成物、
（７）リソソーム酵素が組み換え酵素ではない、上記（１）〜（６）のいずれか１つに記載の医薬組成物、
（８）リソソーム酵素群がマンノース６リン酸残基を有するリソソーム酵素を含むものである、上記（１）〜（７）のいずれか１つに記載の医薬組成物、および
（９）ムコリピドーシスＩＩ型またはＩＩＩ型の治療用である、上記（１）〜（８）のいずれか１つに記載の医薬組成物
を提供する。【００１１】
さらなる態様として、本発明は、細胞に、両親媒性アミン、リソソーム指向性アミン、イオノフォア、およびＶ−ＡＴＰａｓｅ阻害薬からなる群より選択される試薬を添加して培養し、培養上清を回収することを含む、リソソーム酵素群の調製方法を提供する。
また別の態様として、本発明は、リソソーム病の治療のための、細胞を培養して得られたリソソーム酵素群の使用を提供する。
また別の態様として、本発明は、細胞を培養して得られたリソソーム酵素群を患者に投与することを含む、リソソーム病の治療方法を提供する。
また別の態様として、本発明は、リソソーム病治療用医薬組成物の製造のための、細胞を培養して得られたリソソーム酵素群の使用を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本願発明によれば、複数のリソソーム酵素の欠損または活性低下に起因するリソソーム病の治療に有効な、複数のリソソーム酵素を含む医薬組成物を簡単に、しかも安価に提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】細胞培養上清中の各リソソーム酵素の活性を示すグラフである。各酵素活性は、正常細胞の培養上清中の酵素活性に対する比率（倍）で表す。「Ｎｏｒｍａｌ」は正常細胞培養上清、「Ｎｏｒｍａｌ＋ＮＨ４Ｃｌ」は塩化アンモニウムを添加した正常細胞培養上清、「ＭＬ−ＩＩ」はＭＬ−ＩＩ患者由来細胞の培養上清を示す。
【図２】細胞内のリソソーム酵素活性を示すグラフである。「Ｎｏｒｍａｌ」は正常細胞、「ＭＬ−ＩＩ」はＭＬ−ＩＩ患者由来細胞、「ＭＬ−ＩＩ＋ｔＥＲＴ」は全酵素補充療法（ｔｏｔａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ）（以下、ｔＥＲＴという）で処理したＭＬ−ＩＩ患者由来細胞を示す。酵素活性の単位は、「ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ」である。
【図３】リソソーム酵素の経時的な細胞内取り込みを示すグラフである。酵素活性の単位は、「ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ」である。横軸は、リソソーム酵素添加前および添加後の日数を示す。左縦軸は、α−マンノシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、およびガラクトセレブロシダーゼの酵素活性を示す。右縦軸は、総β−へキソサミニダーゼ、およびβ−ヘキソサミニダーゼＡの酵素活性を示す。
【図４−１】リソソーム酵素とマンノース６リン酸との競合阻害試験の結果を示すグラフである。酵素活性の単位は、「ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ」である。
【図４−２】リソソーム酵素とマンノース６リン酸との競合阻害試験の結果を示すグラフである。酵素活性の単位は、「ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ」である。
【図５】リソソーム酵素の細胞内分布を示す蛍光顕微鏡写真である。「Ｌａｍｐ−２」はリソソームマーカーを示す。「Ｍｅｒｇｅ」は、カテプシンＢとＬａｍｐ−２の画像を重ねた画像である。「ＭＬ−ＩＩ＋ｔＥＲＴ」は、ｔＥＲＴ処理したＭＬ−ＩＩ患者由来細胞を示す。
【図６】リソソーム酵素の細胞内分布を示す蛍光顕微鏡写真である。「Ｌａｍｐ−２」はリソソームマーカーを示す。「Ｍｅｒｇｅ」は、カテプシンＤとＬａｍｐ−２の画像を重ねた画像である。「ＭＬ−ＩＩ＋ｔＥＲＴ」は、ｔＥＲＴ処理したＭＬ−ＩＩ患者由来細胞を示す。
【図７】細胞中に蓄積したリン脂質（図７ａ）およびコレステロール量（図７ｂ）を示す。「Ｎｏｒｍａｌ」は正常細胞、「ＭＬ−ＩＩ」はＭＬ−ＩＩ患者由来細胞、「ＭＬ−ＩＩ＋ｔＥＲＴ」はｔＥＲＴ処理したＭＬ−ＩＩ患者由来細胞を示す。
【図８】ＬＣ３のウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。「Ｎｏｒｍａｌ」は正常細胞、「Ｎｏｎ」はｔＥＲＴ処理していないＭＬ−ＩＩ患者由来細胞、「ｔＥＲＴ」はｔＥＲＴ処理したＭＬ−ＩＩ患者由来細胞を示す。
【図９】ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ／ＤＡＰＩの蛍光強度比率を示すグラフである。
【図１０】ＭＬ−ＩＩ患者由来細胞（「ＭＬ−ＩＩ」）およびｔＥＲＴ処理後のＭＬ−ＩＩ患者由来細胞（「ＭＬ−ＩＩ＋ｔＥＲＴ」）の光学顕微鏡写真である。
【図１１】クラッベ病患者由来細胞およびテイ・サックス病患者由来細胞におけるｔＥＲＴの効果を示すグラフである。「正常」は正常細胞、「Ｋｒａｂｂｅ」はクラッベ病患者由来細胞、「Ｋｒａｂｂｅ＋ｔＥＲＴ」はｔＥＲＴで処理したクラッベ病患者由来細胞、「Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ」はテイ・サックス病患者由来細胞、「Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ＋ｔＥＲＴ」はｔＥＲＴで処理したテイ・サックス病患者由来細胞を示す。酵素活性の単位は、「ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ」である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において、１種類の細胞を培養してリソソーム酵素群を得てもよく、あるいは複数種類の細胞を培養してリソソーム酵素群を得てもよい。特に本発明においては、１種類の細胞を培養した場合にも、多種類のリソソーム酵素を十分に得ることができる。
本発明に用いる細胞として、好ましくは、リソソーム酵素にマンノース６リン酸残基を付加する機能を有する細胞またはリソソーム病に罹患していない対象由来の細胞が用いられる。
【００１５】
本発明において「マンノース６リン酸残基を付加する機能を有する細胞」としては、例えば、ＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼの異常が原因の疾患に罹患していない対象由来の細胞、および正常なＧｌｃＮＡｃ−ホスホトランスフェラーゼを有する細胞が挙げられる。
本発明において「リソソーム病に罹患していない対象由来の細胞」とは、健康な対象由来の正常細胞、およびリソソーム病に罹患していないが他の疾病に罹患している対象由来の細胞を意味する。
該対象は、哺乳動物対象、例えば、ヒト、サル、ウシ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、マーモセット、ヒツジ、ヤギ等であり、好ましくは、ヒトである。
【００１６】
本発明に用いる細胞としては、変異体細胞であってもよく、または変異体ではない細胞であってもよい。本発明において「変異体」には、自然変異体、および人為的な遺伝子組み換え体が包含される。変異体細胞としては、例えば、遺伝子組み換え技術によりＴＦＥＢ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５，４７３−４７７，２００９）を導入してリソソーム酵素の発現量を増加させた細胞が挙げられる。
【００１７】
本発明に用いる細胞は、市販の細胞であってもよく、または、上記対象から直接採取した細胞であってもよい。または、確立された細胞株や寄託株等の公に入手可能な培養細胞であってもよい。
本発明に用いる細胞としては、限定するものではないが、例えば、皮膚、腎臓、胚、卵巣、子宮等に由来する細胞が挙げられ、好ましくは、皮膚線維芽細胞、腎線維芽細胞、胚性線維芽細胞等、さらに好ましくは、正常皮膚線維芽細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞等、またさらに好ましくは、正常ヒト線維芽細胞が挙げられる。
【００１８】
本発明の医薬組成物は、有効成分として、上記培養細胞から得られたリソソーム酵素群（以下、「本発明のリソソーム酵素群」という）を含む。
本発明のリソソーム酵素群は、上記細胞を培養することにより得られる２種類以上のリソソーム酵素からなる酵素混合物であって、マンノース６リン酸残基を有するリソソーム酵素を含む。
本発明のリソソーム酵素群は、例えば、５種類以上、８種類以上、または１２種類以上、好ましくは２０種類以上、さらに好ましくは３０種類以上、またさらに好ましくは４０種類以上、最も好ましくは５０種類以上のリソソーム酵素からなる。
【００１９】
本発明のリソソーム酵素群のリソソーム酵素は、好ましくは、組み換え酵素ではなく、野生型酵素である。本発明において「組み換え酵素」とは、遺伝子組み換え技術によって、酵素をコードする遺伝子を宿主細胞に組み込んで産生させた酵素をいう。本発明において「野生型酵素」とは、その細胞が元来有する酵素をいう。リソソーム酵素が野生型である場合、リソソーム酵素群の人体への投与がより安全となる。
【００２０】
本発明のリソソーム酵素群に含まれるリソソーム酵素の例としては、α−マンノシダーゼ、α−フコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ（例えば、β−ヘキソサミニダーゼＡ、β−ヘキソサミニダーゼＢ、β−ヘキソサミニダーゼＳ）、β−グルクロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、カテプシン（例えば、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ等）、α−Ｌ−イデュロニダーゼ、アリールスルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ、イズロン酸２−スルファターゼ、ヘパラン Ｎ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチルＣｏＡ−α−グルコサミニド Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６―スルファターゼ、ガラクトースー６−スルファターゼ、アリールスルファターゼＡ、ＢおよびＣ、アリールスルファターゼＡセレブロシド、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−ニューラミダーゼ（Ｎｅｕｒａｍｉｄａｓｅ）、アスパルチルグルコサミニダーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、β−マンノシダーゼ、等から選ばれる２種類以上の酵素が挙げられる。
【００２１】
本発明のリソソーム酵素群は、好ましくは、少なくとも、α−マンノシダーゼ、α−フコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼおよびカテプシンを含み、さらに好ましくは、少なくとも、α−マンノシダーゼ、α−フコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＡ、β−ヘキソサミニダーゼＢ、β−グルクロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、カテプシンＢおよびカテプシンＤを含む。最も好ましくは、本発明のリソソーム酵素群は、正常細胞のリソソーム中に含まれる全種類のリソソーム酵素を含む。
【００２２】
本発明のリソソーム酵素群は、培養した上記細胞から公知の手段・方法を用いて得ることができる。好ましくは、本発明のリソソーム酵素群は、上記細胞に塩化アンモニウム等の適当な試薬（以下、「酵素抽出用試薬」という）を添加して培養し、得られた培養上清を公知の手段・方法を用いて精製および／または濃縮することによって得ることができる。
本発明のリソソーム酵素群は、例えば、リソソーム病に罹患していない対象由来の細胞を培養し、得られた細胞から公知の手段・方法を用いて抽出することにより得ることができる。好ましくは、リソソーム病に罹患していない対象由来の細胞に、適当な酵素抽出用試薬を添加して培養し、培養上清を回収し、得られた培養上清を精製および／または濃縮する工程を含む方法によって得られる。
【００２３】
上記細胞培養のための培地組成、培地温度、培養時間等の培養条件は、使用する細胞の種類や量に応じて、適宜選択しうる。
【００２４】
細胞に添加する適当な酵素抽出用試薬としては、細胞のリソソーム中に含まれるリソソーム酵素を培養上清中に排出させることができる試薬であればいずれでもよく、例えば、塩化アンモニウム等の両親媒性アミン、クロロキン等のリソソーム指向性アミン、モネンシン（ｍｏｎｅｎｃｉｎ）またはニゲリシン（ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ）等のイオノフォア、バフィロマイシンＡ１（ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ  Ａ１）等のＶ−ＡＴＰａｓｅ阻害薬が挙げられる。１種または複数の種類の酵素抽出用試薬を細胞に添加してもよい。好ましくは、塩化アンモニウム、クロロキン、モネシン、ニゲリシン、およびバフィロマイシンＡ１からなる群から選択される１または複数の試薬を細胞に添加する。さらに好ましくは、塩化アンモニウム、クロロキン、およびバフィロマイシンＡ１からなる群から選択される１または複数の試薬を細胞に添加する。
細胞に上記のような試薬を添加して培養することにより得られたリソソーム群をリソソーム病の治療に用いる試みは、本発明が初めてである。
【００２５】
該酵素抽出用試薬の量は、リソソーム酵素をリソソーム中から排出させることが可能な量であれば特に限定されない。例えば塩化アンモニウムの場合、例えば、培養培地中において１５ｍＭ以上、例えば、培養培地中において２０ｍＭ程度の濃度で使用してもよい。例えばクロロキンの場合、例えば、培養培地中において１５μＭ以上、例えば、培養培地中において２０μＭ程度の濃度で使用してもよい。例えばバフィロマイシンＡ１の場合、例えば、培養培地中において１５ｎＭ以上、例えば、培養培地中において２０ｎＭ程度の濃度で使用してもよい。
【００２６】
該試薬の添加後、細胞を培養して培養上清を得る。該試薬の添加後の培養期間は、培養上清中に十分な量のリソソーム酵素が排出される期間であれば特に限定されないが、通常、数日間またはそれ以上、例えば、３日間、５日間、７日間、１０日間、１４日間、またはそれ以上の期間細胞を培養する。
【００２７】
培養上清の回収は、常法により行えばよく、例えば、ろ過法および遠心分離法が挙げられる。培養上清を回収後、精製により、酵素抽出用試薬および不純物を培養上清中から除去する。
【００２８】
培養上清の精製は、常法により行えばよく、例えば、溶媒抽出法、有機溶媒による沈澱法、限外ろ過等のろ過法、マンノース６リン酸レセプターカラムやマンノース６リン酸抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー等のアフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー法、塩析法等が挙げられる。
【００２９】
培養上清の濃縮は、常法により行えばよく、例えば、限外ろ過、塩析法等が挙げられる。
培養上清は、適宜所望の程度まで精製・濃縮すればよい。
【００３０】
このようにして得られた本発明のリソソーム酵素群は、培養した細胞のリソソーム中に含まれる多種類の酵素を含み、好ましくは、全種類のリソソーム酵素を含む。
また、該リソソーム酵素群は、リソソーム中にすでに存在する正常なリソソーム酵素を排出させることにより得られるので、マンノース６リン酸残基で修飾された状態のリソソーム酵素を含むことができる。
したがって、本発明によれば、マンノース６リン酸残基を付加する工程を必要とせずに、マンノース６リン酸残基を有する多種類のリソソーム酵素を一度に得ることができ、容易にリソソーム病の治療に用いることができる。
【００３１】
本発明の医薬組成物は、本発明のリソソーム酵素群そのものであってもよく、または常法により、医薬上許容される担体、安定化剤、緩衝剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、嬌味剤、着色剤、香料等の添加剤または賦形剤と共に、注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の適当な剤形にすることができる。医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、動物性油、植物性油等が挙げられ、特に、水、生理食塩水、デキストロース、およびグリセロールは、好ましくは注射剤用の担体として用いられる。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、例えば、経口的に、または非経口的に、例えば、静脈内注射、脳室内注射、髄腔内注射、筋肉内注射等によって、もしくは経皮的に投与することができる。本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与経路等によって適宜決定することができる。
【００３３】
本発明のリソソーム酵素群に含まれるリソソーム酵素は、マンノース６リン酸残基で修飾されているので、対象に投与後、該対象の細胞およびリソソーム中に取り込まれる。
【００３４】
本発明のリソソーム酵素群は、多種類のリソソーム酵素を含むので、本発明の医薬組成物は、単一または複数のリソソーム酵素の欠損または活性低下が原因のリソソーム病の治療に有効である。特に、本発明の医薬組成物は、ムコリピドーシスＩＩ型およびムコリピドーシスＩＩＩ型の治療に有効である。
【００３５】
本発明の医薬組成物の治療対象となるリソソーム病の例としては、限定するものではないが、例えば、アスパルチルグルコサミン尿症、ファブリー病、乳児型バッテン病（ＣＮＬ１）、古典的遅発乳児型バッテン病（ＣＮＬ２）、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病１型、２型および３型、ＧＭ１−ガングリオシドーシス、ハンター症候群、ハーラー症候群、ハーラー・シャイエ症候群、シャイエ症候群、クラッベ病、α−マンノシドーシス、β−マンノシドーシス、マロトー・ラミー症候群、異染性白質ジストロフィー、モルキオ症候群Ａ型、モルキオ症候群Ｂ型、ムコ脂質症ＩＩ／ＩＩＩ型、ニーマン・ピック病Ａ型およびＢ型、ポンペ病、サンドホフ病、サンフィリッポ症候群Ａ型、サンフィリッポ症候群Ｂ型、サンフィリッポ症候群Ｃ型、サンフィリッポ症候群Ｄ型、シンドラー病、シンドラー神崎病、シアリドーシス、スライ症候群、テイ・サックス病、ウォルマン病、ムコ多糖症ＩＸ型、マルチプルサルファターゼ欠損症、ダノン病、遊離シアル酸蓄積症、セロイドリポフスチノーシス等が挙げられる。本発明の医薬組成物は、好ましくは、ムコリピドーシスＩＩ型、およびムコリピドーシスＩＩＩ型の治療に用いられる。
【００３６】
本発明のリソソーム酵素群は、さらに精製することにより、単一酵素製剤の製造のために利用することもできる。
本発明のリソソーム酵素群は、また、研究用のリソソーム酵素試薬として利用することもできる。
【００３７】
以下、実施例により本発明を説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００３８】
リソソーム酵素群の調製
１０ｃｍ培養皿において、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）および推奨量の抗生剤／抗菌剤（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｍｔｉｍｙｃｏｔｉｃ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＤＭＥＭ培地（以下、「標準培養培地」という）中でコンフルエントな状態まで培養した正常皮膚線維芽細胞に、培地中２０ｍＭ濃度となるように塩化アンモニウムを添加し、培養した。培養７日後、上清を回収し、０．２μｍ滅菌フィルターでろ過して大きい細胞破片および生存細胞を除去した。ろ過後の上清中のリソソーム酵素活性を下記の方法によって測定した。
次いで、培養上清を０℃にて、分画分子量５０００の分子量フィルター（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  １５Ｒ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）のスピンカラムで遠心分離して塩化アンモニウムを除去した。得られたリソソーム酵素群を最終的に、α−マンノシダーゼ活性が６００ｎｍｏｌ／ｈ／μＬとなるように無血清ＤＭＥＭを用いて希釈し、下記の実施例においてサンプルとして用いた。該サンプル中の使用時の酵素活性は、α−マンノシダーゼ ３６４．６ｎｍｏｌ／ｈ／μＬ、α−フコシダーゼ ３８．４ｎｍｏｌ／ｈ／μＬ、α−ガラクトシダーゼ ５．６ｎｍｏｌ／ｈ／μＬ、α−グルコシダーゼ １０．３ｎｍｏｌ／ｈ／μＬ、β−ガラクトシダーゼ ３５．０ｎｍｏｌ／ｈ／μＬ、β−グルコシダーゼ ２５．９ｎｍｏｌ／ｈ／μＬ、総β−ヘキソサミニダーゼ ２６５０．４ｎｍｏｌ／ｈ／μＬ、β−ヘキソサミニダーゼＡ ５２２．９ｎｍｏｌ／ｈ／μＬ、β−グルクロニダーゼ １４．３ｎｍｏｌ／ｈ／μＬ、およびガラクトセレブロシダーゼ ０．５７ｎｍｏｌ／ｈ／μＬであった。なお、酵素活性の測定方法は下記にしたがう。
下記の実施例におけるｔＥＲＴは、該サンプルを培地に添加して細胞を７日間培養して行った。その後、培養液を通常の標準培養培地に置き換えて２４時間以内に各アッセイを行った。【００３９】
リソソーム酵素群中の酵素活性の測定
得られたリソソーム酵素群中にリソソーム酵素が含まれることを確認するために、上記の塩化アンモニウム添加培養後の培養上清を用いて、リソソーム酵素活性を測定した。対照として、塩化アンモニウムを添加していない正常皮膚線維芽細胞の培養上清、および塩化アンモニウムを添加していないＭＬ−ＩＩ患者由来の皮膚線維芽細胞（以下、「ＭＬ−ＩＩ細胞」という）の培養上清中のリソソーム酵素活性を測定した。
リソソーム酵素の活性は、合成４−メチルウンベリフェリル基質を用いる標準的な方法で測定した。簡単に言えば、試料を酸性リン酸またはクエン酸バッファー中において３７℃で１時間、該合成基質と共にインキュベートし、３６５ｎｍの励起波長および４５０ｎｍの発光波長にてマイクロプレートリーダーで蛍光を測定した。ガラクトセレブロシダーゼの場合、６−ヘキサデカノイルアミノ−４−メチルウンベリフェリル  β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｓｌａｔｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｉｔｈ  Ｌｔｄ．）を基質として用い、３８５ｎｍの励起波長および４５０ｎｍの発光波長にて蛍光を測定した。酵素活性は、ｎｍｏｌ／ｈ／μＬとして計算した。
結果を図１に示す。図１において、各酵素活性は、正常細胞の培養上清中の酵素活性に対する比率（倍）で表す。【００４０】
結果
図１から明らかなように、塩化アンモニウムを添加した正常皮膚線維芽細胞の培養上清は、少なくとも１０種類のリソソーム酵素（α−マンノシダーゼ、α−フコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＡ、β−ヘキソサミニダーゼＢ、β−グルクロニダーゼ、およびガラクトセレブロシダーゼ）を含んでいた。また、該培養上清中の酵素活性パターンは、ＭＬ−ＩＩ細胞の培養上清中の酵素活性パターンと類似していた。
ＭＬ−ＩＩでは、リソソーム酵素にマンノース６リン酸残基が付加されていないため、リソソーム酵素がマンノース６リン酸受容体に認識されず、リソソームへ運搬されないので、リソソーム中においてリソソーム酵素が枯渇し、細胞外にマンノース６リン酸残基が付加されていないリソソーム酵素が溢れ出ている。したがって、ＭＬ−ＩＩ細胞の培養上清中には多種類のリソソーム酵素が含まれる。このことは、ＭＬ−ＩＩ細胞の培養上清の酵素活性測定結果と一致する。
【実施例２】
【００４１】
リソソーム酵素群の細胞内取り込の確認
実施例１で得られたリソソーム酵素群をＭＬ−ＩＩ細胞に投与してｔＥＲＴを行い、リソソーム酵素が活性な状態で該細胞内に取り込まれることを確認するために、細胞内リソソーム酵素活性を測定した。
実施例１で得られたリソソーム酵素群サンプルをＭＬ−ＩＩ細胞の培養培地に添加し、所定の期間培養後、細胞を培養培地から単離し、プロテアーゼ阻害剤を含有する水中でソニケーションし、得られた懸濁液のタンパク質濃度を常法により測定した。得られた懸濁液を用いて、実施例１に記載の方法により、リソソーム酵素活性を測定した。酵素活性は、ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎとして計算した。対照として、正常皮膚線維芽細胞、およびｔＥＲＴ処理していないＭＬ−ＩＩ細胞を用いた。
結果を図２に示す。
図２から明らかなように、ｔＥＲＴによって、細胞内のリソソーム酵素活性が上昇したことから、リソソーム酵素が細胞内に取り込まれたことが確認できた。
さらに、経時的なリソソーム酵素のＭＬ−ＩＩ細胞内取り込みを図３に示す。
リソソーム酵素は少なくとも７日間、持続的に細胞内に取り込まれた。細胞内酵素活性は７日間上昇し続けたので、本実施例の上記の評価は、ｔＥＲＴ処理の７日後に回収した細胞を用いて行った。また、下記の実施例４〜９においても、ｔＥＲＴ処理の７日後の細胞を用いた。
【実施例３】
【００４２】
マンノース６リン酸競合阻害試験
リソソーム酵素群が細胞表面のマンノース６リン酸受容体を介して細胞内に取り込まれていることを確認するために、マンノース６リン酸を同時投与し、細胞内取り込み阻害について試験した。
実施例１で得られたリソソーム酵素群サンプルをＭＬ−ＩＩ細胞の培養培地に添加し、同時に、マンノース６リン酸を添加しない（０ｍＭ）、あるいはマンノース６リン酸を５ｍＭまたは１０ｍＭとなるように添加した。細胞を所定時間培養後、実施例１および実施例２と同様の方法により、細胞内酵素活性を測定した。
結果を図４に示す。
リソソーム酵素の細胞内への取り込みは、マンノース６リン酸により、濃度依存的に競合的に阻害された。
【実施例４】
【００４３】
リソソーム酵素群のリソソーム中への運搬の確認
細胞内に取り込まれたリソソーム酵素がリソソームまで運搬されているか確認するために、細胞の免疫染色を行った。
実施例１に記載のようにＭＬ−ＩＩ細胞をｔＥＲＴ処理し、下記の方法により蛍光染色した。対照として、正常皮膚線維芽細胞およびｔＥＲＴ処理しないＭＬ−ＩＩ細胞を用いた。
細胞を３．７％ホルムアルデヒドで１時間固定し、次いで、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で１５分間透過処理し、室温にて１時間、１％ウシ血清アルブミンでブロッキングした。一次抗体として、モノクローナル抗Ｌａｍｐ−２抗体（Ｈ４Ｂ４）、ポリクローナル抗カテプシンＢ抗体（Ｓ−１２）、ポリクローナル抗カテプシンＤ抗体（Ｈ−７５）、およびポリクローナル抗β−グルコシダーゼ抗体（Ｈ−３００）（全て、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡから入手）を１：１００濃度で用いて、室温で１時間処理した。次いで、二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８または５５５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１：１０００希釈で用いて、室温で１時間処理した。ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＤＮＤ−９９（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．＃７５２８）は０．２μＭ濃度で用いて、３７℃で１時間処理した。全ての蛍光画像は、蛍光顕微鏡（ＢＸ５１，Ｏｌｙｍｐｕｓ）または共焦点レーザー走査顕微鏡システム（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ−２，Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて獲得した。リソソームマーカーとしてＬａｍｐ−２およびＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒを用いた。
結果を図５および図６に示す。
図５および図６に示されるように、ＭＬ−ＩＩ細胞ではカテプシンＢおよびカテプシンＤが確認できなかった。一方、ｔＥＲＴ処理したＭＬ−ＩＩ細胞では、カテプシンＢおよびカテプシンＤの画像がリソソーム（Ｌａｍｐ−２）の画像と重なったことから、細胞に投与されたリソソーム酵素混合物からリソソーム酵素がリソソームに運搬されたことが確認できた。【００４４】
β−グルコシダーゼの場合、正常細胞、ＭＬ−ＩＩ細胞、およびｔＥＲＴ処理したＭＬ−ＩＩ細胞との間で免疫染色結果に差がなかった。さらに、β−グルコシダーゼについて、酵素活性試験（図２参照）において正常であることが確認でき、マンノース６リン酸競合阻害試験（図４参照）においても影響を受けないことが示された。
リソソーム酵素のなかでも、β−グルコシダーゼは、マンノース６リン酸依存性の運搬システムではなく、ＬＩＭＰ−２というタンパク質でリソソームに運搬されていることが証明されている（Ｒｅｃｚｅｋ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２００７；１３１（４）：７７０−８３）。したがって、ＭＬ−ＩＩ細胞は、β−グルコシダーゼを欠損していない。この以前の知見は、上記実験結果と一致する。
【実施例５】
【００４５】
ｔＥＲＴの蓄積物質に対する効果
ＭＬ−ＩＩでは、リン脂質およびコレステロールが蓄積する。したがって、細胞中のリン脂質およびコレステロール量を測定することにより、ＭＬ−ＩＩに対するｔＥＲＴの効果を評価した。
実施例１に記載のようにＭＬ−ＩＩ細胞をｔＥＲＴ処理し、市販の測定キットを用い、製造者の指示書にしたがって、細胞中のリン脂質およびコレステロール量を測定した（リン脂質：Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  Ｃ−ｔｅｓｔ，Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃｏ．、およびコレステロール：Ａｍｐｌｅｓ  Ｒｅｄ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ａ１２２１６），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。対照として、正常皮膚線維芽細胞およびｔＥＲＴ処理しないＭＬ−ＩＩ細胞を用いた。
結果を図７ａおよび図７ｂに示す。
リン脂質およびコレステロールは、正常細胞に比べてＭＬ−ＩＩ細胞において蓄積しているが、ｔＥＲＴによって蓄積量が減少した。
【実施例６】
【００４６】
オートファジー異常およびミトコンドリア異常に対する効果
ＭＬ−ＩＩにおけるオートファジー異常およびミトコンドリア異常に対するｔＥＲＴの効果を評価した。対照として、正常細胞およびｔＥＲＴ処理していないＭＬ−ＩＩ細胞を用いた。
実施例１に記載のようにＭＬ−ＩＩ細胞をｔＥＲＴ処理し、ウェスタンブロッティングによりＬＣ３−ＩＩの量を測定した。一次抗体として、ポリクローナル抗ＬＣ３抗体（ＰＭ０３６）およびポリクローナル抗β−アクチンＨＲＰ  ＤｉｒｅｃＴ抗体（ＰＭ０５３−７）（ＭＢＬ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）を用いた。
結果を図８に示す。ｔＥＲＴにより、ＬＣ３−ＩＩの量が減少した。
また、蛍光免疫染色を実施例４の記載と同様に行った。ミトコンドリアのマーカーとしてＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．＃７５１２）を３７℃で１時間、２００ｎＭ濃度で用いた。オートファジーのマーカーとして、ポリクローナル抗ＬＣ３抗体（ＰＭ０３６）（ＭＢＬ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）を用いた。
蛍光顕微鏡で観察したところ、ｔＥＲＴにより、ＬＣ３の小胞が減少し、ミトコンドリアの形態も明らかに改善を示したことが確認された。
【実施例７】
【００４７】
リソソーム数および形態の測定
ＭＬ−ＩＩは、皮膚線維芽細胞における封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）の存在によって特徴付けられる。封入体は、リソソーム酵素の異常により分解できない基質がリソソームに蓄積することが原因であり、同時に、リソソームの数も顕著に増加する。ｔＥＲＴのこれらの現象に対する効果を下記の方法によって評価した。対照として、正常細胞およびｔＥＲＴ処理していないＭＬ−ＩＩ細胞を用いた。
実施例１に記載のようにＭＬ−ＩＩ細胞をｔＥＲＴ処理し、トリプシンを用いて細胞を標準的な方法で回収し、小型のチューブに入れた。該細胞のペレットを、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＤＮＤ−９９（１μＭ）およびＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ）の両方を含有する標準培養培地中に再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、遠心分離により該細胞を回収し、ＰＢＳで１回リンスした後、該細胞をＰＢＳ中に再懸濁した。該細胞懸濁液の蛍光強度をマイクロプレートリーダー（Ｖｏｒｏｎａ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ＭＴＰ８１０Ｌａｂ）を用いて、励起波長５３０ｎｍ／発光波長５９０ｎｍ（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒの場合）および、励起波長３６５ｎｍ／発光波長４５０ｎｍ（ＤＡＰＩの場合）で測定した。実施例４の記載と同様にして、蛍光画像を得た。該蛍光染色の結果、ｔＥＲＴによりリソソームの染色が減少したことが分かった。
さらに、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ／ＤＡＰＩの蛍光強度比率を算出し、各細胞あたりのリソソーム量（数および大きさ）を評価した。
結果を図９示す。ｔＥＲＴにより、各細胞あたりのリソソーム量が減少した。
さらに、光学顕微鏡写真観察では、ｔＥＲＴにより、封入体の減少が確認された（図１０）。また、電子顕微鏡写真観察では、ｔＥＲＴにより、均質な小胞の蓄積が解消されたことが確認された。
【実施例８】
【００４８】
エンドサイトーシスに対する効果
蛍光標識したセラミド（ＢＯＤＩＰＹ−Ｃｅｒ）を用いて、正常細胞、ＭＬ−ＩＩ細胞およびｔＥＲＴ処理したＭＬ−ＩＩ細胞におけるエンドサイトーシスによって取り込まれた物質の細胞内輸送を評価した。
ガラス底皿中で皮膚線維芽細胞を調整した。ＢＳＡに複合体化したＢＯＤＩＰＹ ＦＬＣ５−セラミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ｂ２２６５０）を入手し、標準培養培地中２．５ｎＭ濃度に希釈した。該培地中で３０分間、細胞を培養した。培養後、該細胞をＰＢＳで１回洗浄し、実施例４に記載の共焦点顕微鏡で直接観察した。実施例４の記載と同様にして、蛍光画像を得た。
蛍光画像を解析したところ、正常細胞ではセラミドはゴルジ体に運ばれたが、ＭＬ−ＩＩでは細胞質内の小胞に閉じこめられていた。一方、ｔＥＲＴ処理したＭＬ−ＩＩ細胞では、セラミドは、細胞質内の小胞に多少残っているものの、ゴルジ体へ運搬されるようになった。
また、氷冷培地中において、原形質膜に対するＢＯＤＩＰＹ−Ｃｅｒの接着について試験した結果、正常細胞、ＭＬ−ＩＩ細胞およびｔＥＲＴ処理したＭＬ−ＩＩ細胞間に違いはなかった。
【実施例９】
【００４９】
マンノース６リン酸受容体取り込み試験
マンノース６リン酸受容体に対する抗体を用いて、細胞表面の該受容体を介して取り込まれた該抗体の細胞内輸送を評価した。
マンノース６リン酸受容体抗体［モノクローナル抗マンノース６リン酸受容体抗体（２Ｇ１１）（Ａｂｃａｍ）］を１：７５濃度で含有する標準培養培地中で細胞をインキュベートした。３０分間の取り込み試験の場合、該抗体含有培地で細胞を３０分間インキュベートした。インキュベーション後、氷冷ＰＢＳで洗浄し、すぐに３．７％ホルムアルデヒド中で固定した。細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で１５分間透過性処理し、室温で１時間、１％ウシ血清アルブミンでブロッキングした後、細胞を二次抗体で処理した。１時間の取り込みおよび２時間のインキュベーション試験の場合、該抗体含有培地で細胞を１時間インキュベートし、洗浄し、次いで、抗体を含有しない標準培養培地中で培養した。その後の工程は、上記の３０分取り込み試験と同様である。二次抗体としてＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ４８８標識抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を用いた。実施例４の記載と同様にして、蛍光画像を得た。
蛍光画像を解析したところ、正常細胞では、小胞に留まっていたが、ＭＬ−ＩＩ細胞ではゴルジ体に留まっていた。一方、ｔＥＲＴ処理したＭＬ−ＩＩ細胞では、正常細胞と同じ小胞のパターンを示した。
【実施例１０】
【００５０】
様々な試薬を用いたリソソーム酵素群の調製
１０ｃｍ培養皿において、標準培養培地中でコンフルエントな状態まで培養した正常皮膚線維芽細胞に、培地中２０ｍＭ濃度となるように塩化アンモニウム、培地中２０μＭ濃度となるようにクロロキン、または培地中２０ｎＭ濃度となるようにバフィロマイシンＡ１を添加し、培養した。培養５日後および７日後に上清を回収し、０．２μｍ滅菌フィルターでろ過して大きい細胞破片および生存細胞を除去した。ろ過後の上清中のリソソーム酵素活性を実施例１の記載と同じ方法で測定した。対照として、いずれの試薬も添加していない標準培養培地中で培養した正常皮膚線維芽細胞の培養上清中のリソソーム酵素活性を測定した。
結果を表１および２に示す。なお、表１および表２中、β−Ｇａｌはβ−ガラクトシダーゼ、ｔｏｔａｌ β−Ｈｅｘは総β−ヘキソサミニダーゼ、β−Ｈｅｘ Ａはβ−ヘキソサミニダーゼＡ、β−Ｇｌｕｃはβ−グルコシダーゼ、α−Ｍａｎはα−マンノシダーゼ、α−Ｆｕｃはα−フコシダーゼ、α−Ｇｌｕｃはα−グルコシダーゼ、α−Ｇａｌはα−ガラクトシダーゼ、β−Ｇｌｕｃｕｒｏはβ−グルクロニダーゼ、α−Ｉｄｕｒｏはα−Ｌ−イデュロニダーゼ、ＧＡＬＣはガラクトセレブロシダーゼを示す。ＳＣＭは、いずれの試薬も添加していない標準培養培地（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）を示す。ＣＱはクロロキンを示し、ＢａｆｉｌｏはバフィロマイシンＡ１を示す。酵素活性は、ｎｍｏｌ／ｈ／μＬで示す。【００５１】
【表１】
2012147933.tif 000003
【００５２】
【表２】
2012147933.tif 000004
【００５３】
表１および表２から明らかなように、クロロキンまたはバフィロマイシンＡ１を用いた場合も、塩化アンモニウムを用いた場合と同様に、これらの試薬を加えない場合と比べて、多くのリソソーム酵素群を培養上清中に排出させることができた。
【実施例１１】
【００５４】
ＣＯＳ−１細胞を用いたリソソーム酵素の調製
１０ｃｍ培養皿において、標準培養培地中でコンフルエントな状態まで培養したＣＯＳ−１細胞に、培地中２０ｍＭ濃度となるように塩化アンモニウムを添加し、培養した。培養３日後に上清を回収し、０．２μｍ滅菌フィルターでろ過して大きい細胞破片および生存細胞を除去した。ろ過後の上清中のリソソーム酵素活性を実施例１の記載と同じ方法で測定した。対照として、塩化アンモニウムを添加していない標準培養培地中で培養したＣＯＳ−１細胞の培養上清中のリソソーム酵素活性を測定した。
結果を表３に示す。なお、表３中、β−Ｇａｌはβ−ガラクトシダーゼ、ｔｏｔａｌ β−Ｈｅｘは総β−ヘキソサミニダーゼ、β−Ｈｅｘ Ａはβ−ヘキソサミニダーゼＡ、β−Ｇｌｕｃはβ−グルコシダーゼ、α−Ｍａｎはα−マンノシダーゼ、α−Ｆｕｃはα−フコシダーゼ、α−Ｇｌｕｃはα−グルコシダーゼ、α−Ｇａｌはα−ガラクトシダーゼ、β−Ｇｌｕｃｕｒｏはβ−グルクロニダーゼ、α−Ｉｄｕｒｏはα−Ｌ−イデュロニダーゼ、ＧＡＬＣはガラクトセレブロシダーゼを示す。ＮＨ４Ｃｌ（−）は、塩化アンモニウムを加えない場合の培養上清を示し、ＮＨ４Ｃｌ（＋）は、塩化アンモニウムを加えた場合の培養上清を示す。酵素活性は、ｎｍｏｌ／ｈ／μＬで示す。【００５５】
【表３】
2012147933.tif 000005
【００５６】
表３から明らかなように、ＣＯＳ−１細胞を用いた場合も、塩化アンモニウムの添加により、塩化アンモニウムを添加しない場合と比べて、多くのリソソーム酵素群を培養上清中に排出させることができた。
【実施例１２】
【００５７】
クラッベ病およびテイ・サックス病に対するｔＥＲＴ試験
実施例１で得られたリソソーム酵素群サンプルを、クラッベ病およびテイ・サックス病の患者由来の皮膚線維芽細胞（以下、各々、「クラッベ病細胞」および「テイ・サックス病細胞」という）の培養培地に添加し、７日間培養した。細胞を培養培地から単離し、プロテアーゼ阻害剤を含有する水中でソニケーションし、得られた懸濁液のタンパク質濃度を常法により測定した。得られた懸濁液を用いて、実施例１に記載の方法により、リソソーム酵素活性を測定した。酵素活性は、ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎとして計算した。対照として、正常皮膚線維芽細胞、およびｔＥＲＴ処理していないクラッベ病細胞またはｔＥＲＴ処理していないテイ・サックス病細胞を用いた。
結果を図１１に示す。
図１１に示されるように、本発明のリソソーム酵素群を用いるｔＥＲＴによって、クラッベ病およびテイ・サックス病でそれぞれ欠損しているリソソーム酵素（クラッベ病についてガラクトセレブロシダーゼ、テイ・サックス病についてβ−ヘキソサミニダーゼＡ）の細胞内酵素活性が上昇した。
【図１】
2012147933.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年3月13日(2013.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を培養して得られた、精製されたリソソーム酵素群を有効成分として含むムコリピドーシスＩＩ型またはＩＩＩ型治療用医薬組成物であって、該リソソーム酵素群が少なくとも、α−マンノシダーゼ、α−フコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼおよびカテプシンを含む、医薬組成物。
【請求項２】
細胞がリソソーム酵素にマンノース６リン酸残基を付加する機能を有する細胞である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
細胞がリソソーム病に罹患していない対象由来の細胞である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
リソソーム酵素群が下記工程：
細胞に、両親媒性アミン、リソソーム指向性アミン、イオノフォア、およびＶ−ＡＴＰａｓｅ阻害薬からなる群より選択される１または複数の試薬を添加して培養し、
培養上清を回収し、
得られた培養上清を精製する、
ことを含む方法により得られたものである、請求項１〜３のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項５】
試薬が、塩化アンモニウム、クロロキン、モネンシン、ニゲリシン、およびバフィロマイシンＡ１からなる群より選択される、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
細胞が正常皮膚線維芽細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞およびＣＨＯ細胞からなる群より選択されるものである、請求項１〜５のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項７】
リソソーム酵素が組み換え酵素ではない、請求項１〜６のいずれか１記載の医薬組成物。
【請求項８】
リソソーム酵素群がマンノース６リン酸残基を有するリソソーム酵素を含むものである、請求項１〜７のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
少なくとも、α−マンノシダーゼ、α−フコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼおよびカテプシンを含む、精製されたリソソーム酵素群を有効成分として含ませることを特徴とする、ムコリピドーシスＩＩ型またはＩＩＩ型治療用医薬組成物の製造方法であって、該リソソーム酵素群を下記工程：
細胞に、両親媒性アミン、リソソーム指向性アミン、イオノフォア、およびＶ−ＡＴＰａｓｅ阻害薬からなる群より選択される１または複数の試薬を添加して培養し、
培養上清を回収し、
得られた培養上清を精製する、
ことを含む方法により得ることを特徴とする方法。
【請求項１１】
試薬がバフィロマイシンＡ１である、請求項１０記載の方法。
【国際調査報告】
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2012147933.tif 000020
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