(57)【要約】  従来よりもボトムピーク波長が算出しやすく、かつボトムピーク波長の変化量が大きい、分子間相互作用の検出方法及びこれに用いるキット、すなわち、前記リガンドとアナライトとの複合体が形成されていない状態における分光反射率のボトムピーク波長（λ0）を算出する工程、および、前記リガンドと、前記ボトムピーク波長（λ0）よりも短波長側に最大蛍光波長（λf）を有する蛍光色素と、アナライトとの複合体が形成された状態における分光反射率のボトムピーク波長（λ1）を算出する工程とを含むことを特徴とする、分子間相互作用の検出方法及びこれに用いるキットを提供する。
2012096037.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学薄膜上にリガンドを有する検出部材と、所定の波長域にわたって分布する光を発光する光源と、受光する光の分光強度を検出する分光器と、前記光源から前記検出部材に光を伝達する第一の光伝達経路と前記検出部材から前記分光器に前記光源からの光を伝達する第二の光伝達経路を有する光伝達部とを備える検出装置を用い、
前記第一及び第二の光伝達経路により、前記光源からの光を前記検出部材に伝達し前記検出部材を介して光を受光してその分光強度を前記分光器で測定し、算出される分光強度分布のボトムピーク波長の変化によって、前記リガンドとアナライトとの分子間相互作用を検出する方法であって、
前記リガンドとアナライトとの複合体が形成されていない状態における分光強度分布のボトムピーク波長（λ0）を算出する工程、および
前記リガンドと、前記ボトムピーク波長（λ0）前後の波長域における分光強度分布の谷部に重なるように最大蛍光波長（λf）を有する蛍光色素と、アナライトとの複合体が形成された状態における分光強度分布のボトムピーク波長（λ1）を算出する工程
を含むことを特徴とする、分子間相互作用の検出方法。
【請求項２】
前記複合体が、前記リガンドに、前記蛍光色素で標識されたアナライトが結合することにより形成される、請求項１に記載の分子間相互作用の検出方法。
【請求項３】
前記複合体が、前記リガンドに前記アナライトが結合した後、さらに前記アナライトに前記蛍光色素で標識されたリガンドが結合することにより形成される、請求項１に記載の分子間相互作用の検出方法。
【請求項４】
前記蛍光色素は、前記ボトムピーク波長（λ0）よりも短波長側に最大蛍光波長（λf）を有するものである請求項１〜３のいずれか一項に記載の分子間相互作用の検出方法。
【請求項５】
前記蛍光色素の最大蛍光波長（λf）と前記ボトムピーク波長（λ0）の差Δλf（＝λ0−λf）が０ｎｍ＜Δλf≦１００ｎｍの関係を満たす、請求項４に記載の分子間相互作用の検出方法。
【請求項６】
少なくとも、前記リガンドを有する検出部材を作製するための構成部材と、前記蛍光色素とを含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに一項に記載の分子間相互作用の検出方法のために使用されるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分子間相互作用、特に生体分子や有機高分子などの分子間相互作用を検出するための検出方法及びこれに使用されるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、抗原抗体反応などの生体分子同士の分子間相互作用や、有機高分子同士の分子間相互作用などの結合の測定は、一般的に、放射性物質や蛍光体などの標識を用いることで行われてきた。この標識には手間がかかり、特にタンパク質への標識は方法が煩雑な場合や標識によりタンパク質の性質が変化する場合があった。そこで、近年、生体分子や有機高分子間の結合を、簡便に標識を用いることなく直接的に検出する手段として、光学薄膜の干渉色変化を利用したＲＩｆＳ方式（Reflectometric Interference Spectroscopy：反射型干渉分光法）が提案され、実用化もされている。ＲＩｆＳ方式の基本原理は特許文献１や非特許文献１などに言及されている。【０００３】
従来のＲＩｆＳ方式について簡単に説明すると、この方式では、図３に示すように、光学薄膜１０４が設けられた基板１０２が用いられる。図３（Ａ）に示すように、基板１０２上の光学薄膜１０４に対し白色光を照射した場合、図４の典型的な一例に示すとおり、白色光そのもの（基準光）の分光強度は実線１０６で表され、その反射光の分光強度は実線１０８で表される。このとき、ｎ0ｄ＝（２ｋ−１）λ／４［式中、ｎ0およびｄはそれぞれ光学薄膜１０４の屈折率および厚さであり、ｋは自然数であり、λは波長である。］の関係式を満たす波長λにおいて、干渉による反射光の減衰が最も大きくなる。照射した白色光とその反射光との各分光強度から反射率を求めると、図５に示すとおり、実線で表されたボトムピーク（スペクトル曲線における極小部）を有する反射スペクトル１１０が得られる。【０００４】
分子間相互作用を検出するにあたっては、図３（Ｂ）に示すとおり、光学薄膜１０４上にリガンド１２０（分析対象物質と分子間相互作用により特異的に結合しうる物質）が設けられる。光学薄膜１０４上にリガンド１２０を設けると、リガンド１２０が設けられた部位における光学的厚さ１１２が変化して光路長が変化し、反射干渉効果により干渉波長（分光器による検出強度が最も小さくなる波長）も変化する。すなわち、反射光の分光強度分布のボトムピークの位置がシフトし、その結果図５に示すとおり、反射スペクトル１１０が反射スペクトル１２２（点線部参照）にシフトする。この状態において、光学薄膜１０４上にサンプル溶液を流すと、図３（Ｃ）に示すとおり、リガンド１２０とサンプル溶液中のアナライト（分析対象物質）１３０とが結合する。リガンド１２０とアナライト１３０とが結合すると、アナライト１３０が結合した部位における光学的厚さ１１２がさらに変化する。リガンド１２０に対してアナライト１３０が部分的に付着することによって不均質な層が生成されるが、この不均質層は巨視的にみればアナライト１３０の付着量に応じた所定の光学的厚さを有する均質層に置き換えられる。従って、入射光の通過する均質層の光学的厚さがアナライト１３０の付着量に応じて変化することとなる。これによって、図５に示すとおり、反射スペクトル１２２が反射スペクトル１３２（１点鎖線部参照）にシフトする。そして、反射スペクトル１２２のボトムピーク波長（反射率が極小値となる波長）λ0と反射スペクトル１３２のボトムピーク波長λ1'との変化量Δλ1'を検出することにより、リガンド１２０とアナライト１３０との分子間相互作用、すなわちサンプル中のリガンド１２０の存在を検出したり、分子間相互作用の進捗度を検出したりすることができるようになっている。【０００５】
ボトムピーク波長の変化の推移を経時的に観測すると、図６に示すとおり、曲線上の第１のショルダー部である時点１４０において、リガンド１２０によるボトムピーク波長の変化を確認することができ、曲線上の第２のショルダー部である時点１４２において、リガンド１２０とアナライト１３０との結合によるボトムピーク波長の変化を確認することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３７８６０７３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Sandstrom et al, APPL.OPT., 24, 472, 1985
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来の方法は、アナライト１３０の存在により生じるボトムピーク波長の変化量Δλ1'が微少であり、検出感度には限界があるため、サンプル溶液中の濃度が低いアナライト１３０の測定には適さない。また、反射光の分光強度を検出する検出装置によって実際に出力されるデータは、図７（Ａ）に示すように、微小な変動を繰り返しており、ボトムピーク位置を定めるには、この反射率データに近似曲線をフィッティングし（図７（Ｂ）参照）、その近似曲線の極小値を上述のボトムピーク位置として求めるなどの演算が必要となる。しかも、ボトムピーク付近は反射率の変化が小さいため、上述のような近似曲線を用いてボトムピーク位置を決定する方法では、原理上、ボトムピークの位置が不正確になりやすく、結果として、ボトムピーク波長の変化量Δλは、分子間相互作用の進捗度とは異なった変化をすることがあり、このような場合は、ボトムピーク波長の変化量Δλは、分子間相互作用の進捗度を正確に判断するための値として適当ではなくなってしまうという問題があった。【０００９】
本発明は、上記のような課題を解決した分子間相互作用の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、光学薄膜にリガンドが形成された状態（図３（Ｂ）に示す状態）における反射光の分光強度分布と特定の関係を満たす分光強度分布を有する蛍光を発する蛍光色素、典型的には、ボトムピーク波長λ0よりも短波長側に最大蛍光波長λfを有する蛍光色素を用いてアナライト１３０を標識し、当該蛍光と反射光との両方を含む測定光のスペクトルを測定するようにすると、蛍光色素が加わることによって、蛍光色素のスペクトルがボトムピーク波長の変化を誇張するように作用する結果、そのスペクトルのボトムピーク波長λ1の前記ボトムピーク波長λ0からの変化量Δλ1が従来の変化量Δλ1'よりも観測しやすくなり、前記のような課題を解決した分子間相互作用の検出方法を実現できることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１１】
すなわち、本発明は以下の実施形態を包含する。
［１］
光学薄膜上にリガンドを有する検出部材と、所定の波長域にわたって分布する光を発光する光源と、受光する光の分光強度を検出する分光器と、前記光源から前記検出部材に光を伝達する第一の光伝達経路と前記検出部材から前記分光器に前記光源からの光を伝達する第二の光伝達経路を有する光伝達部とを備える検出装置を用い、
前記第一及び第二の光伝達経路により、前記光源からの光を前記検出部材に伝達し前記検出部材を介して光を受光してその分光強度を前記分光器で測定し、算出される分光強度分布のボトムピーク波長の変化によって、前記リガンドとアナライトとの分子間相互作用を検出する方法であって、
前記リガンドとアナライトとの複合体が形成されていない状態における分光強度分布のボトムピーク波長（λ0）を算出する工程、および
前記リガンドと、前記ボトムピーク波長（λ0）前後の波長域における分光強度分布の谷部に重なるように最大蛍光波長（λf）を有する蛍光色素と、アナライトとの複合体が形成された状態における分光強度分布のボトムピーク波長（λ1）を算出する工程
を含むことを特徴とする、分子間相互作用の検出方法。【００１２】
［２］
前記複合体が、前記リガンドに、前記蛍光色素で標識されたアナライトが結合することにより形成される、上記項１に記載の分子間相互作用の検出方法。【００１３】
［３］
前記複合体が、前記リガンドに前記アナライトが結合した後、さらに前記アナライトに前記蛍光色素で標識されたリガンドが結合することにより形成される、上記項１に記載の分子間相互作用の検出方法。【００１４】
［４］
前記蛍光色素は、前記ボトムピーク波長（λ0）よりも短波長側に最大蛍光波長（λf）を有するものである上記項１〜３のいずれか一項に記載の分子間相互作用の検出方法。【００１５】
［５］
前記蛍光色素の最大蛍光波長（λf）と前記ボトムピーク波長（λ0）の差Δλf（＝λ0−λf）が０ｎｍ＜Δλf≦１００ｎｍの関係を満たす、上記項４に記載の分子間相互作用の検出方法。【００１６】
［６］
少なくとも、前記リガンドを有する検出部材を作製するための構成部材と、前記蛍光色素とを含むことを特徴とする、上記項１〜５のいずれかに一項に記載の分子間相互作用の検出方法のために使用されるキット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明においては、ボトムピーク波長（λ0）前後の波長域における分光強度分布の谷部に重なるように最大蛍光波長（λf）を有する蛍光色素を用いることにより、アナライトが存在する場合に観測される分光強度分布のボトムピーク波長が従来よりも長波長側にシフトする、つまりボトムピーク波長の変化量が従来よりも大きくなる。また、アナライトが存在する場合に観測される分光強度分布グラフの谷部が急峻になり、ボトムピーク波長を特定しやすくなる。その結果、アナライトが低濃度であっても従来よりも高感度で検出することができ、また定量的な分析も行いやすくなる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】分子間相互作用の検出装置の概略構成を示す図面である。
【図２】検出部材の概略構成を示す図面である。
【図３】ＲＩｆＳ方式の概略を順番に説明した図面である。特に、（Ｃ）は従来の態様に見られる状態、（Ｄ）および（Ｅ）はそれぞれ本実施形態の第１および第２の態様で見られる状態を示す。
【図４】波長と分光強度との概略的な関係を示すスペクトル例である。
【図５】従来の方法による波長と反射率との概略的な関係を示すスペクトル例である。
【図６】ボトムピーク波長の変化の概略的な推移を示すグラフである。
【図７】（Ａ）は検出により得られた反射スペクトルの線図であり、（Ｂ）は反射スペクトルを近似した高次関数の線図である。
【図８】本実施形態の方法による波長と反射率との概略的な関係を示すスペクトル例である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、図面を参照しながら本発明の好ましい実施形態について説明する。
（分子間相互作用の検出装置の構成）
図１は本発明の一実施形態である分子間相互作用の検出方法が適用され得る分子間相互作用の検出装置１の構成を簡略的に図示した模式図である。
【００２０】
図１に示すように、検出装置１は、主に、検出部材１０，白色光源２０，分光器３０，光伝達部４０，制御装置５０などから構成されている。
検出部材１０は基本的にはセンサーチップ１２，フローセル１４から構成されている。
【００２１】
図２に示すとおり、センサーチップ１２は矩形状を呈したシリコン基板１２ａを有している。シリコン基板１２ａ上にはＳｉＮ（窒化シリコン）膜１２ｂが蒸着されている。ＳｉＮ膜１２ｂは光学薄膜１０４の一例である。
【００２２】
フローセル１４はシリコーンゴム製の透明な部材である。フローセル１４には溝１４ａが形成されている。フローセル１４をセンサーチップ１２に密着させると、密閉流路１４ｂが形成される（図１参照）。溝１４ａの両端部はフローセル１４の表面から露出しており、一方の端部が送液部に接続されてサンプル溶液等の各種溶液６０が供給される流入口１４ｃとして機能し、他方の端部は廃液部に接続されてサンプル溶液等の各種溶液６０の流出口１４ｄとして機能するようになっている。また、フローセル１４の溝１４ａの底部、すなわちセンサーチップ１２の表面には、アナライト６２と結合するリガンド１６が結合されている（図１参照）。
【００２３】
検出部材１０では、センサーチップ１２に対しフローセル１４を貼り替え可能となっており、フローセル１４はディスポーザブル（使い捨て）使用が可能となっている。センサーチップ１２の表面には、シランカップリング剤などにより、表面修飾をおこなってもよく、この場合フローセル１４の貼り替えが容易となる。
【００２４】
光伝達部４０は、白色光源２０からの白色光をフローセル１４の密閉流路１４ｂに導くための第一の光伝達経路としての第一の光ファイバ４１と、第一の光ファイバ４１からの白色光の照射による反射光をフローセル１の密閉流路１４ｂから分光器３０に導くための第二の光伝達経路としての第二の光ファイバ４２とを備えている。図１に示すとおり、フローセル１４の上面であって密閉流路１４ｂの上方に、上記第一及び第二の光ファイバ４１，４２の端部端面が密着して設置されている。
【００２５】
白色光源２０は、ハロゲンランプと、これを格納する筐体とから構成されている。筐体には、第一の光ファイバ４１を接続するための接続ポートが設けられている。この白色光源２０から発せられる白色光には、後述する蛍光色素の励起光が含まれている。なお、本実施形態では白色光源を用いているが、これに限るものではなく、後述するボトムピーク波長の変化が検出でき得る波長域にわたって分布する光を発光する光源であればよい。
【００２６】
第一の光ファイバ４１は、白色光源２０から発せられた白色光をフローセル１４まで導くためのものであり、白色光源２０が点灯すると、その白色光が第一の光ファイバ４１を介して密閉流路１４ｂを照射する。上記第一の光ファイバ４１の白色光源２０側の端部は、当該白色光源２０の接続ポートに接続されている。接続ポートに接続された光ファイバ４１は光入射端面がハロゲンランプ２１に対向するように配置されている。
【００２７】
第二の光ファイバ４２は、フローセル１４から分光器３０に光を導くためのものであり、白色光源２０の白色光が密閉流路１４ｂを照射した時の測定光を分光器３０に導いて検出することを可能としている。上記第二の光ファイバ４２の分光器３０側の端部は、当該分光器３０の受光を行う接続ポートに接続されている。この分光器３０は、受光部で受光する光に含まれる一定の波長間隔ごとの光について光強度を検出し、分光強度として制御装置５０に出力する。なお、本実施形態においては、検出部材１０からの反射光を分光器３０で受光するようにしているが、検出部材１０として光透過性のものを用いて、白色光源２０からの光を検出部材１０に照射し、検出部材１０を透過してきた光を受光するように分光器３０を配置し、透過光の分光強度を検出するようにしても構わない。
【００２８】
上記各光ファイバ４１，４２は、いずれも微細ファイバを束ねた構造となっている。そして、第一の光ファイバ４１と第二の光ファイバ４２のフローセル１４側の端部は、各々の微細ファイバが一つの束となるように複合的に寄り合わされている。即ち、第一の光ファイバ４１を構成する微細ファイバは、フローセル１４側の端面において中央に分布し、第二の光ファイバ４２を構成する微細ファイバは第一の光ファイバ４１の微細ファイバの束を取り囲むようにその周囲に分布している。
【００２９】
制御装置５０は、例えばＰＣ（Personal Computer）から構成され、オペレータから検出動作の実行の入力を受け付けて、検出装置１０への検出動作制御の実行指令を出力する。これにより、制御装置５０は、制御部として機能する。
【００３０】
また、制御装置５０は、分光器３０から基準となる白色光の分光強度や測定に基づく反射光の分光強度の検出データを受信し、これらに基づいて各波長帯域ごとの反射率を算出し、反射スペクトルを算出する。これにより、制御装置５０は、算出部として機能する。
【００３１】
マイコン（図示せず）は、制御装置５０の制御指令に応じて白色光源２０の点灯と消灯を切り換える制御を行ったり、制御装置５０の設定温度指令に応じて温度制御部の温度制御を行ったりする。
【００３２】
温度制御部（図示せず）は、例えば、ペルチェ素子のような加温と冷却を行う温度調節素子と温度検出素子とからなり、これらは検出部材１０に併設される。そして、制御装置５０が、マイコンを通じて温度検出素子により検出部材１０の温度を検出し、温度調節素子による加温又は冷却によって、設定温度となるように温度制御を実行する。
【００３３】
検出を行う際には予め検出部材１０の暖気が行われる。即ち、制御装置５０は、予め定めた設定温度となるようマイコンに指令を送り、マイコンは温度制御部の温度制御を実行する。暖気により検出部材１０の温度が安定してから、試料溶液等の送液を始める。
【００３４】
分光強度を測定する際、第一の光ファイバ４１が白色光源２０の白色光をフローセル１４の密閉流路１４ｂに導いて照射する。そして、第二の光ファイバ４２を通じて測定光が分光器３０に受光され、分光強度が検出される。この分光強度は制御装置５０に送信される。
【００３５】
次に、制御装置５０において、測定を継続するか判定を行い、継続しない場合には処理を終了する。かかる判定は、例えば、予め測定時間が設定され、当該測定時間が経過したか否かを判定しても良いし、測定の終了の入力を受けるまで測定を継続する設定として、測定終了の入力の有無を判定しても良い。測定を継続する場合には、再び、測定光に対する分光強度の測定が実行される。
【００３６】
制御装置５０は、測定光の分光強度データを取得する。制御装置５０は、白色光（基準光）の分光強度と測定光の分光強度とにより、同一の波長帯域ごとに測定光の光強度を基準光の測定強度で除算することで各波長ごとに反射率を求めて反射スペクトルを算出することができる。基準光の分光強度データは、あらかじめ装置組み立て調整時に測定して保有していたものでもよいし、その他の手段により取得したものでもよい。制御装置５０は、繰り返される計測により、周期的に測定光の分光強度データを取得する。そして、これにより、周期的に反射スペクトルを算出し、さらに、そのボトムピーク波長を算出して、時系列的な変化を記録する。
【００３７】
なお、本実施形態によれば、後述するように、反射スペクトルからボトムピーク波長を決定することが比較的容易になるため、ボトムピーク波長の決定のための演算を簡略化し得るが、より精度を高めるために、以下に述べるような補正演算を用いてもよい。
【００３８】
すなわち、基準光の分光強度データと測定光の分光強度データから反射スペクトル７２を算出すると、その波形は微小な凹凸が繰り返されるような不規則な形状を呈しており、ボトムピーク波長を算出・特定するのが困難な状態となっている場合がある（図７（Ａ））。このとき、たとえば、反射スペクトル７２を高次関数で近似すると、図７（Ｂ）に示すように、反射スペクトル７２の波形を滑らかにすることができる。当該近似は公知のいずれの手法によるものであってもよい。そして、かかる高次多項式からその解（最小値）を求めて、これをボトムピーク波長の値として特定することができる。
【００３９】
（分子間相互作用の検出方法）
本実施形態の分子間相互作用の検出方法には、
工程１：前記リガンドとアナライトとの複合体が形成されていない状態における分光反射率のボトムピーク波長（λ0）を算出する工程と、
工程２：前記リガンドと、前記ボトムピーク波長（λ0）よりも短波長側に最大蛍光波長（λf）を有する蛍光色素と、アナライトとの複合体が形成された状態における分光反射率のボトムピーク波長（λ1）を算出する工程とが含まれる。
【００４０】
上記工程２には、蛍光色素を結合させる対象の異なる２つの態様が含まれる。第１の態様（工程２Ａ）では、図３（Ｄ）に示すように、前記複合体が、前記リガンド１２０に、前記蛍光色素２００で標識されたアナライト１３０（蛍光標識アナライト２３０）が結合することにより形成されるようにする。第２の態様（工程２Ｂ）では、図３（Ｅ）に示すように、前記複合体が、前記リガンド１２０に前記アナライト１３０が結合した後、さらに前記アナライト１３０に前記蛍光色素２００で標識されたリガンド１２０（蛍光標識リガンド２４０）が結合することにより形成されるようにする。
【００４１】
より具体的には、上述した周期的に行われる反射スペクトルの測定およびボトムピーク波長の算出が、下記のようにしてλ0を取得する工程１と、第１態様においてはλ1として下記のようなλ1Aを取得する工程Ａ、第２態様においてはλ1として下記のようなλ1Bを取得する工程Ｂとを含むように行われる。
【００４２】
（工程１：λ0取得工程）
光学薄膜１０４の表面にリガンド１２０が結合されている状態において、送液部からフローセル１４の密閉流路１４ｂに、蛍光標識アナライト２３０や蛍光標識リガンド２４０などを含まない水溶液（たとえば適切な緩衝液）が供給され、流入口１４ｃから密閉流路１４ｂを経て流出口１４ｄに流通される。このように密閉流路１４ｂが水溶液で満たされた状態において、前述したような手段により測定光の分光強度データを取得する。算出されるボトムピーク波長がλ0となる。
【００４３】
（工程２Ａ：λ1A取得工程）
第１態様では、上記λ0取得工程の後、送液部からフローセル１４の密閉流路１４ｂに、蛍光標識アナライト２３０を含む水溶液が供給され、流入口１４ｃから密閉流路１４ｂを経て流出口１４ｄに流通される。すると、蛍光標識アナライト２３０が固定化リガンド１２０に捕捉され、λ0取得工程のときよりも光学的厚さ１１２が厚くなる。このような状態において、前述したような手段により測定光の分光強度データを取得する、算出されるボトムピーク波長がλ1Aとなり、当該ボトムピーク波長λ1Aと前記ボトムピーク波長λ0との差がボトムピーク波長の変化量Δλ1Aとなる。
【００４４】
（工程２Ｂ：λ1B取得工程）
第２態様では、上記λ0取得工程の後、送液部からフローセル１４の密閉流路１４ｂに、アナライト１３０を含む水溶液が供給され、流入口１４ｃから密閉流路１４ｂを経て流出口１４ｄに流通される。すると、アナライト１３０が固定化リガンド１２０に捕捉される。つづいて、送液部からフローセル１４の密閉流路１４ｂに、蛍光標識リガンド２４０を含む水溶液が供給され、流入口１４ｃから密閉流路１４ｂを経て流出口１４ｄに流通される。すると、蛍光標識リガンド２４０が、固定化リガンド１２０に結合しているアナライト１３０にさらに結合し、λ0取得工程のときよりも（さらにλ1A取得工程のときよりも）光学的厚さ１１２が厚くなる。このような状態において、前述したような手段により測定光の分光強度データを取得する。算出されるボトムピーク波長がλ1Bとなり、当該ボトムピーク波長λ1Bと前記ボトムピーク波長λ0との差がボトムピーク波長の変化量Δλ1Bとなる。
【００４５】
（ボトムピーク波長の典型的な変化）
工程１で得られる分光スペクトル８１と、工程２で得られる分光スペクトル８２の典型例を図８に示す。図８に示すように、工程１で得られる谷部を有する分光スペクトル８１に対して、工程２で得られる分光スペクトル８２は、谷部が長波長側にシフトするとともに、分光スペクトル８２の谷部の短波長側に蛍光色素に由来するショルダー部Ｓが形成される。なお、図８には蛍光色素の分光強度を点線で示しており、蛍光色素の最大蛍光波長は、ボトムピーク波長λ0前後の波長域における分光強度分布における谷部に重なっている。ショルダー部Ｓが形成されることによって、分光スペクトル８２の谷底部は全体的に長波長側へと押しやられた格好になり、分光スペクトル８２のボトムピーク波長λ1は蛍光色素が含まれない場合のアナライト結合後の分光スペクトルにおけるボトムピーク波長λ1'に比べて、ボトムピーク波長が長波長側に移動し、ボトムピーク波長のシフト幅が大きくなる。また、ショルダー部Ｓが形成されることによって、分光スペクトル８２の谷部は分光スペクトル８１の谷部よりも急峻になり、ショルダー部Ｓよりも反射率が低い領域において、ボトムピーク波長における反射率からの反射率の差（図８のｈ１、ｈ２）が同じになるところで比較すると、分光スペクトル８１の谷部の幅ｗ１よりも、分光スペクトル８２の谷部の幅ｗ２の方が狭くなる。従って、アナライト結合後のボトムピーク波長λ1の特定がしやすくなり、ボトムピーク波長の変化量も把握しやすくなる。このため、ボトムピーク波長を特定するための演算も容易になる。
【００４６】
・蛍光色素
本実施形態で用いる蛍光色素としては、所定の励起光（入射光）を照射したときに、図３（Ｂ）の状態における反射光の分光強度分布と特定の関係を満たす分光強度分布を有する蛍光を発する蛍光色素（蛍光分子または蛍光団）が挙げられる。より詳しくは、上述したボトムピーク波長（λ0）前後の波長域における分光強度分布の谷部に重なるように最大蛍光波長（λf）を有する蛍光色素を用いる。
【００４７】
代表的には、ボトムピーク波長（λ0）よりも短波長側に最大蛍光波長（λf）を有する蛍光色素が用いられる。この蛍光色素の最大蛍光波長（λf）とボトムピーク波長（λ0）の差Δλf（＝λ0−λf）は、０ｎｍ＜Δλf（＝λ0−λf）≦１００ｎｍの関係を満たすことが好ましく、０ｎｍ＜Δλf≦５０ｎｍの関係を満たすことがより好ましい。この場合の適切な蛍光色素の最大蛍光波長λfは、あらかじめデータとして取得されているボトムピーク波長λ0、あるいは光学薄膜１０４（たとえばＳｉＮ膜１２ｂ）の厚さと屈折率から予想されるボトムピーク波長λ0を勘案することにより設定することができる。
【００４８】
一方、本発明者らの検討によれば、蛍光色素の最大蛍光波長は必ずしもボトムピーク波長λ0よりも短波長になければならない訳ではなく、ボトムピーク波長λ0と同じかボトムピーク波長λ0よりも所定範囲内で長波長側にあってもよい。この場合もボトムピーク波長λ1を、蛍光色素を用いない場合のボトムピーク波長λ1'よりも長波長側にシフトさせることができる。この場合の蛍光色素の最大蛍光波長（λf）とボトムピーク波長（λ0）の差Δλfの絶対値は８０ｎｍ以内とすることが好ましい。蛍光色素の最大蛍光波長が、ボトムピーク波長λ0と同じかボトムピーク波長λ0よりも所定範囲内で長波長側にあってもボトムピーク波長λ1が長波長側にシフトする詳しい理由は不明であるが、蛍光色素の最大蛍光波長がある程度ボトムピーク波長λ0に近ければ、蛍光色素の短波長成分が寄与することで、上述したのと同様の分光スペクトルの変形を発現させるものと思われる。
【００４９】
上記のような蛍光色素は、各種の測定系（蛍光標識法等）で用いられている一般的な蛍光色素のうち、目的とする特定の条件を満たすものの中から選択することができる。蛍光色素の候補となる蛍光色素としては、たとえば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Integrated DNA Technologies社）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン(株)）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン(株)）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン(株)）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス(株)）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン(株)）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン(株)）などの有機蛍光色素が挙げられる。
【００５０】
また、上記のような有機蛍光色素以外にも、Ｅｕ、Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素（たとえばＡＴＢＴＡ−Ｅｕ3+）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）またはＡｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ；ＬｙｏＦｌｏｇｅｎ（登録商標））などに代表される蛍光タンパク質、ラテックスやシリカなどの蛍光微粒子なども、使用可能な蛍光色素の候補となり得る。
【００５１】
特に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ Ｃｙ３、フルオレセイン・ファミリー、ローダミン・ファミリー、ＧＦＰから選択されるいずれかの蛍光色素を用いることが好ましい。
【００５２】
・アナライトおよびリガンド
アナライト１３０は、それと特異的に結合する物質（すなわちリガンド１２０となる物質）が存在する、分析対象とする物質である。たとえば、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等を含む），核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等を含む），脂質，糖などの生体分子や、薬剤物質，内分泌錯乱化学物質などの生体分子と結合する外来物質などをアナライト１３０とすることができる。一方、リガンド１２０としては、アナライト１３０に応じてそれと特異的に結合する適切な物質が選択される。たとえば、アナライト１３０が抗原となるタンパク質ないしペプチドであればその抗体となるタンパク質が、アナライト１３０が核酸であればそれと相補的な塩基配列を有する核酸が、アナライト１３０が糖であればそれと結合するレクチン（タンパク質）などが、リガンド１２０として使用される。
【００５３】
・蛍光標識アナライトおよび蛍光標識リガンド
第１態様では、蛍光色素２００が連結されたアナライト１３０である「蛍光標識アナライト」２３０を用いる。一方、第２態様では、蛍光色素２００が連結されたリガンド１２０である「蛍光標識リガンド」２４０を用いる。固定化リガンド−アナライト−蛍光標識リガンドの複合体が形成可能であれば、蛍光標識リガンド２４０のリガンドは、固定化リガンド１２０のリガンドと同じものであっても異なるものであってもよい。たとえば、固定化リガンド１２０がポリクローナル抗体である場合、蛍光標識リガンド２４０はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、固定化リガンド１２０がモノクローナル抗体である場合、蛍光標識リガンド２４０はその固定化リガンドが認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。
【００５４】
蛍光標識アナライト２３０および蛍光標識リガンド２４０は公知の手法に従って作製することができる。たとえば、アナライト１３０またはリガンド１２０がタンパク質または核酸である場合、所定の試薬を用いて、選択された蛍光色素２００が有する官能基と当該アナライト１３０またはリガンド１２０が有する官能基とを直接的にまたは間接的に（リンカー等の他の分子を介して）結合させることにより、蛍光標識アナライト２３０または蛍光標識リガンド２４０が得られる。
【００５５】
第１態様において蛍光標識アナライト２３０を用いる場合、前記λ1A取得工程を開始する前に、たとえば、採取した試料を検出装置１の内部または外部で所定の試薬と反応させて調製するなどして、蛍光標識アナライト２３０を含む水溶液を準備しておく。一方、第２態様において蛍光標識リガンド２４０を用いる場合、前記λ1B取得工程を開始する前に、たとえば、別途調製された試薬として検出装置１にセットしておくなどして、蛍光標識リガンド２４０を含む水溶液を準備しておく。
【００５６】
・センサーチップ
センサーチップ１２を構成する光学薄膜１０４は、白色光を用いたときに観測されるボトムピークが適切な範囲となるような屈折率および厚みを有する材質で形成される。たとえば、光学薄膜１０４はＳｉＮ膜１２ｂとすることが好ましい。ＳｉＮの屈折率は可視稿領域の波長約４００から８００ｎｍの範囲において約２．０〜２．５であり、ＳｉＮ膜の膜厚を約４５〜９０ｎｍとすることにより、ボトムピークをおよそ４００ｎｍ〜８００ｎｍの範囲に調節することができる。
【００５７】
また、センサーチップ１２の表面は、前記λ0取得工程の開始に先だって、アナライト１３０に応じたリガンド１２０が結合しているように修飾しておく必要がある。たとえば、無修飾のＳｉＮ膜１２ｂの表面をシランカップリング剤で処理してアミノ基で修飾し、つづいてＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド）−ＰＥＧ４−ビオチンで処理して当該アミノ基にビオチンを結合させ、このビオチンにアビジンを反応させた後に、ビオチン化した抗体もしくは核酸を反応させることにより、表面にリガンド１２０として抗体もしくは核酸を有するセンサーチップ１２を作製することができる。このような修飾は、表面が無修飾のセンサーチップ１２を検出装置１にセットした後、上記のような修飾のための試薬や洗浄液を順次送液することによって行うことができる。
【００５８】
・キット
本実施形態の分子間相互作用の検出装置に用いられる検出用キットとして、リガンド１２０を有する検出部材１０を作製するための構成部材であるセンサーチップ１２と、蛍光色素２００とをセットしたものを準備しておくと、検出を行おうとする者にとって利用しやすくなる。上述した第１の態様においては、蛍光色素２００の代わりに蛍光標識アナライト２３０をセットしていてもよいし、上述した第２の態様においては、蛍光色素２００に代えて蛍光標識リガンド２４０をセットしていてもよい。いずれにしても、蛍光色素２００とセンサーチップ１２との組合せとして適したものがセットされているので、使用者は、蛍光色素２００とセンサーチップ１２との組合せで迷うことがない。
【実施例】
【００５９】
［実施例１］
（工程１：ＳｉＮセンサーチップの表面アミノ基修飾）
シリコンウエハ（１００）の上に、光学薄膜として窒化ケイ素（ＳｉＮ）を６６．５ｎｍの厚さになるようにＣＶＤ蒸着してＳｉＮセンサーチップを作製した。【００６０】
１００μｌの３−ＡＰＴＥＳ（（３−Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ：信越化学工業(株)製）を９．５ｍｌエタノール、０．５ｍｌの超純水との混合溶液中に徐々に滴下し、室温にて１時間撹拌した。そこに上記ＳｉＮセンサーチップを浸漬し、更に室温にて１時間撹拌した。【００６１】
このように処理したＳｉＮセンサーチップを、エタノール、超純水で洗浄した後に、窒素ブローにより水滴を除去した後、乾燥器により８０℃にて１時間乾燥を行った。こうして、ＳｉＮセンサーチップ表面へのアミノ基修飾を行った。【００６２】
（工程２：ＳｉＮセンサーチップの表面ビオチン修飾）
ＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｂｉｏｔｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｋ．Ｋ．製）を２００μｇ／ｍｌになるよう、１０ｍＭホウ酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．５）１０ｍｌにて調製を行い、工程１によりアミノ基修飾を行ったセンサーチップを室温にて１時間浸漬し、表面へのビオチンの導入を行った。【００６３】
（工程３：ＲＩｆＳ測定の準備）
ＲＩｆＳ方式の分子間相互作用測定装置（ＭＩ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ；コニカミノルタオプト(株)製）の電源を入れて光源が安定するまで約２０分間待機した。また、工程２により作製したセンサーチップと、幅２．５ｍｍ×長さ１６ｍｍ×深さ０．１ｍｍの溝及びこの溝の両末端にそれぞれ直径１ｍｍの貫通口を有するフローセル（コニカミノルタオプト(株)製）とをセットし、上記測定装置が備えているチップカバーを通してセンサーチップ上に液体を通過させる事が可能な状態にした。シリンジポンプ（Ｅｃｏｎｏｆｌｏ７０−２２０５；Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ製）により、測定装置外部からＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４；ナカライテスク(株)製）を２０μｌ／ｍｉｎの流量で２０分間送液し、測定基準となる分光反射率が最小となる波長λ0（ベースライン）が約５７０ｎｍ付近で安定するのを確認した。【００６４】
（工程４：ＲＩｆＳ方式による一次抗体と抗原との抗原抗体反応）
工程３により、測定準備を完了したセンサーチップに対して、上記測定装置が備えているインジェクターを通して、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｋ．Ｋ．製）を、上記ＰＢＳバッファーを用いて１００μｇ／ｍｌに調製したサンプルを導入した。続いて、一次抗体としてビオチン化抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）抗体（ｃｌｏｎｅ１Ｄ５；ミクリ免疫研究所(株)製）を、上記ＰＢＳバッファーを用いて１０μｇ／ｍｌに調製したサンプルを導入した。続いて抗原としてＡＦＰ（ＡｃｒｉｓＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＧｍｂＨ製）を、上記ＰＢＳバッファーを用いて１０μｇ／ｍｌに調製したサンプルを導入した。抗原を導入した後のボトムピーク波長をλ1'とした。【００６５】
（工程５：ＲＩｆＳ方式による抗原と二次抗体の抗原抗体反応）
工程４に引き続き、二次抗体として抗ＡＦＰ抗体（ｃｌｏｎｅ６Ｄ２；ミクリ免疫研究所(株)製）をそれぞれＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、最大蛍光波長λf＝５１５ｎｍ）を利用して各種蛍光色素を修飾した抗体４サンプルを調製した。調製した抗体に対して上記ＰＢＳバッファーを用いて１０μｇ／ｍｌに調製した各サンプルを導入した。蛍光色素標識二次抗体を導入した後のボトムピーク波長をλ1とした。λ1とλ0の差をΔλとして二次抗体導入によるボトムピーク波長変化量を測定した。【００６６】
［実施例２］
上記工程５に変えて、下記工程５´を行うように変更した以外は実施例１と同様にＲＩｆＳ方式による抗原抗体反応の検出を行った。
（工程５´：ＲＩｆＳ方式による抗原と二次抗体の抗原抗体反応）
工程４に引き続き、二次抗体として抗ＡＦＰ抗体（ｃｌｏｎｅ６Ｄ２；ミクリ免疫研究所(株)製）をそれぞれＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、最大蛍光波長λf＝５６５ｎｍ）を利用して各種蛍光色素を修飾した抗体４サンプルを調製した。調製した抗体に対して上記ＰＢＳバッファーを用いて１０μｇ／ｍｌに調製した各サンプルを導入した。蛍光色素標識二次抗体を導入した後のボトムピーク波長をλ1とした。λ1とλ0の差をΔλとして二次抗体導入によるボトムピーク波長変化量を測定した。【００６７】
［実施例３］  
上記工程５に変えて、下記工程５´を行うように変更した以外は実施例１と同様にＲＩｆＳ方式による抗原抗体反応の検出を行った。
（工程５´：ＲＩｆＳ方式による抗原と二次抗体の抗原抗体反応）
工程４に引き続き、二次抗体として抗ＡＦＰ抗体（ｃｌｏｎｅ６Ｄ２；ミクリ免疫研究所(株)製）をそれぞれＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、最大蛍光波長λf＝６１７ｎｍ）を利用して各種蛍光色素を修飾した抗体４サンプルを調製した。調製した抗体に対して上記ＰＢＳバッファーを用いて１０μｇ／ｍｌに調製した各サンプルを導入した。蛍光色素標識二次抗体を導入した後のボトムピーク波長をλ1とした。λ1とλ0の差をΔλとして二次抗体導入によるボトムピーク波長変化量を測定した。
［実施例４］【００６８】
上記工程５に変えて、下記工程５´を行うように変更した以外は実施例１と同様にＲＩｆＳ方式による抗原抗体反応の検出を行った。
（工程５´：ＲＩｆＳ方式による抗原と二次抗体の抗原抗体反応）
工程４に引き続き、二次抗体として抗ＡＦＰ抗体（ｃｌｏｎｅ６Ｄ２；ミクリ免疫研究所(株)製）をそれぞれＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、最大蛍光波長λf＝６６５ｎｍ）を利用して各種蛍光色素を修飾した抗体４サンプルを調製した。調製した抗体に対して上記ＰＢＳバッファーを用いて１０μｇ／ｍｌに調製した各サンプルを導入した。蛍光色素標識二次抗体を導入した後のボトムピーク波長をλ1とした。λ1とλ0の差をΔλとして二次抗体導入によるボトムピーク波長変化量を測定した。【００６９】
［比較例１］
上記工程４を終えた時点で、従来の抗原抗体反応のみによるボトムピーク波長変化量（λ1'とλ0の差）Δλ'を測定した。【００７０】
［比較例２］
上記工程５に変えて、下記工程５´を行うように変更した以外は実施例１と同様にＲＩｆＳ方式による抗原抗体反応の検出を行った。【００７１】
（工程５´：ＲＩｆＳ方式による抗原と二次抗体の抗原抗体反応）
工程４に引き続き、二次抗体として抗ＡＦＰ抗体（ｃｌｏｎｅ６Ｄ２；ミクリ免疫研究所(株)製）を前記ＰＢＳバッファーを用いて１０μｇ／ｍｌに調製した溶液を導入した。二次抗体を導入した後のボトムピーク波長をλ1とした。λ1とλ0の差をΔλとして二次抗体導入によるボトムピーク波長変化量を測定した。【００７２】
ＲＩｆＳ方式を利用して測定した、実施例１〜４および比較例２におけるΔλ（λ1−λ0）の値および比較例１におけるΔλ'（λ1'−λ0）の値、ならびにボトムピーク波長の検出値の安定性の指標として、前者ではλ1検出時の二次抗体導入後、後者ではλ1'検出時の抗原導入後、それぞれ反応が平衡状態に達した後に継続的に検出を行った際の、連続して検出されるボトムピーク波長の値５０点の標準偏差を算出した結果（ベースラインの安定性）とを表１に示した。【００７３】
【表１】
2012096037.tif 000003
表１の結果から、ＳｉＮにリガンドを何も付けていない状態のＲＩｆＳボトムピーク波長（５７０ｎｍ）に対して、蛍光色素の最大蛍光波長（λf）とボトムピーク波長（λ0）の差が０ｎｍ＜（λ0−λf）≦１００ｎｍの関係式を満たすＡｌｅｘａ４８８，Ａｌｅｘａ５５５による標識を行うことで、ＲＩｆＳシステムが蛍光と反射光との両方を含む測定光のスペクトルを測定するので、蛍光色素のスペクトルが測定対象の反射スペクトルを長波長側に押しやるように作用し、結果的にボトムピーク波長の変化が誇張され、Δλが大きく観察されている（実施例１、実施例２）。特に、ＳｉＮのボトムピーク波長に最も近い５５５ｎｍの蛍光色素は最も効果が高い。また、蛍光色素が反射率のボトムピーク付近のスペクトルが急峻になることで、ボトムピーク波長が安定して検出しやすくなるため、ベースラインの安定性も増すものと思われる。一方、最大蛍光波長（λf）がボトムピーク波長（λ0）よりも長波長側にある蛍光色素を用いた場合は、最大蛍光波長（λf）がボトムピーク波長（λ0）よりも短波長にある蛍光色素を用いた場合ほどではないが、ボトムピーク波長の変化幅Δλが蛍光色素を用いない場合に比べて大きくなっている。もちろん、従来のＲＩｆＳの使用法である、比較例１に示したような固相化した抗体に対する抗原との反応のみを検出するよりも有効であることは明らかである。
【符号の説明】
【００７４】
１    検出装置
１０    検出部材
１２    センサーチップ
１２ａ  シリコン基板
１２ｂ  ＳｉＮ（窒化シリコン）膜
１４    フローセル
１４ａ  溝
１４ｂ  密閉流路
１４ｃ  流入口
１４ｄ  流出口
１６    リガンド
２０    白色光源
３０    分光器
４０    光伝達部
４１    第一の光ファイバ
４２    第二の光ファイバ
５０    制御装置
６０    水溶液
６２    アナライト
１００    検出部材
１０２    基板
１０４    光学薄膜
１１２    光学的厚さ
１２０    リガンド
１３０    アナライト
２００    蛍光色素
２３０    蛍光標識アナライト
２４０    蛍光標識リガンド
１０６    分光強度（基準光）
１０８    分光強度（反射光）
１１０    反射スペクトル（図３（Ａ）の状態）
１２２    反射スペクトル（図３（Ｂ）の状態）
１３２    反射スペクトル（図３（Ｃ）の状態）
１４０    第１のショルダー部
１４２    第２のショルダー部
７２    反射スペクトル
８１    工程１で得られる分光スペクトル
８２    工程２で得られる分光スペクトル
【図１】
2012096037.tif 000004
【図２】
2012096037.tif 000005
【図３】
2012096037.tif 000006
【図４】
2012096037.tif 000007
【図５】
2012096037.tif 000008
【図６】
2012096037.tif 000009
【図７】
2012096037.tif 000010
【図８】
2012096037.tif 000011
【国際調査報告】
2012096037.tif 000012
2012096037.tif 000013
2012096037.tif 000014
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