(57)【要約】  本発明は、S体選択的高活性型の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素であって、アリールマロン酸からほぼ100％e.e.の光学純度のS体のα-アリールプロピオン酸を生成する酵素の提供を目的とする以下の発明である。アリールマロン酸からS体のα-アリールプロピオン酸を生成し得る、配列番号２に示される野生型のアリールマロン酸脱炭酸酵素のアミノ酸配列において以下の(i)の変異、(i)及び(ii)の変異、(i)及び(iii)の変異、又は(i)、(ii)及び(iii)の変異を有する、S体選択的高活性型の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素：(i)  第74番目のグリシンのシステインへの置換、及び第188番目のシステインのグリシンへの置換；(ii)  第48番目のチロシンの他のアミノ酸への置換；(iii)  第159番目のメチオニンの他のアミノ酸への置換。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アリールマロン酸からS体のα-アリールプロピオン酸を生成し得る、配列番号２に示される野生型のアリールマロン酸脱炭酸酵素のアミノ酸配列において以下の(i)の変異、(i)及び(ii)の変異、(i)及び(iii)の変異、又は(i)、(ii)及び(iii)の変異を有する、S体選択的高活性型の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素：
(i)  第74番目のグリシンのシステインへの置換、及び第188番目のシステインのグリシンへの置換；
(ii)  第48番目のチロシンの他のアミノ酸への置換；
(iii)  第159番目のメチオニンの他のアミノ酸への置換。
【請求項２】
配列番号２に示される野生型のアリールマロン酸脱炭酸酵素のアミノ酸配列の第74番目のグリシンがシステインに置換され、かつ第188番目のシステインがグリシンに置換されているG74C/C188G変異型である、請求項１記載の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素。
【請求項３】
配列番号２に示される野生型のアリールマロン酸脱炭酸酵素のアミノ酸配列の第74番目のグリシンがシステインに置換され、第159番目のメチオニンがロイシンに置換され、かつ第188番目のシステインがグリシンに置換されているG74C/M159L/C188G変異型である、請求項１記載の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素。
【請求項４】
配列番号２に示される野生型のアリールマロン酸脱炭酸酵素のアミノ酸配列の第48番目のチロシンがフェニルアラニンに置換され、第74番目のグリシンがシステインに置換され、第159番目のメチオニンがロイシンに置換され、かつ第188番目のシステインがグリシンに置換されているY48F/G74C/M159L/C188G変異型である、請求項１記載の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素。
【請求項５】
配列番号２に示される野生型のアリールマロン酸脱炭酸酵素のアミノ酸配列の第74番目のグリシンがシステインに置換され、かつ第188番目のシステインがセリンに置換されているG74C/C188S変異型酵素に比較して、酵素活性が向上している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素をアリールマロン酸誘導体と接触させることを含む、S体のα-アリールプロピオン酸の製造方法。
【請求項７】
S体のα-アリールプロピオン酸がプロフェン類である、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
S体のα-アリールプロピオン酸がイブプロフェン、ナプロキセン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェン及びインドプロフェンからなる群から選択される、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
アリールマロン酸からS体のα-アリールプロピオン酸を生成し得る、配列番号２に示される野生型のアリールマロン酸脱炭酸酵素のアミノ酸配列において以下の(i)及び(ii)の変異を有する、S体選択的高活性型の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素：
(i)  第74番目のグリシンのシステインへの置換、第159番目のメチオニンのシステインへの置換、及び第188番目のシステインのグリシンへの置換；
(iii)  第156番目のメチオニンのイソロイシン又はロイシンへの置換。
【請求項１０】
請求項９記載の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素をアリールマロン酸誘導体と接触させることを含む、S体のα-アリールプロピオン酸の製造方法。
【請求項１１】
S体のα-アリールプロピオン酸がプロフェン類である、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
S体のα-アリールプロピオン酸がイブプロフェン、ナプロキセン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェン及びインドプロフェンからなる群から選択される、請求項１１記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、S体選択的な高活性型変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素に関し、該酵素はアリールマロン酸からS体のα-アリールプロピオン酸を生成する。
【背景技術】
【０００２】
アリールマロン酸脱炭酸酵素（AMDase、EC 4.1.1.76）は、アリールマロン酸の脱炭酸反応を触媒しR体のカルボン酸誘導体（α-アリールプロピオン酸誘導体：プロフェン類）を生成する酵素であり、Alcaligenes bronchisepticus KU1201株より単離された240アミノ酸(推定分子量24,734 Da)のモノマー酵素である（非特許文献１）。【０００３】
野生型のアリールマロン酸が、R体のα-アリールプロピオン酸のみを生成するが、S体のα-アリールプロピオン酸及びその誘導体は、非ステロイド系抗炎症薬、液晶素材、殺虫剤、除草剤やその中間体として重要な化合物群である。【０００４】
アリールマロン酸脱炭酸酵素のアミノ酸配列において、74番目のグリシンをシステインに置換し、かつ188番目のシステインをセリンに置換した２重変異を導入した変異体（G74C/C188S)は、S体のα-アリールプロピオン酸を生成するようになることが報告されている。しかしながら、その変異体の活性は、野生型酵素の１万分の１程度と非常に低く、実用的ではなかった（非特許文献２及び３）。【０００５】
さらに、上記２重変異体（G74C/C188S)に対してランダム変異導入を行い得られた３重変異体（S36N/G74C/C188S)は、上記２重変異体に対して約１０倍高い活性を有していた。しかしながら、それでも野生型酵素に比較すると１％以下の活性を有しているに過ぎず、依然として実用的ではなかった（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Miyamoto et al., Eur.J.Biochem., 1992, 10, 475-481
【非特許文献２】Terao et al., J Mol Catat B: Enzym, 2007, 15-20
【非特許文献３】Iijima et al., Chemical Communications (Cambridge, United Kingdom), 2005, 7, 877-879.
【非特許文献４】Terao et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2006, 73, 647-653
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素であって、アリールマロン酸からほぼ100％e.e.の光学純度のS体のα-アリールプロピオン酸を高活性で生成する酵素、及び該酵素を用いたS体のα-アリールプロピオン酸を製造する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らはすでに、野生型のアリールマロン酸脱炭酸酵素（AMDase）にG74C/C188Sの変異を導入することにより、エナンチオ選択性の逆転に成功し基質であるアリールマロン酸誘導体よりS体のα-アリールプロピオン酸を生成させることに成功していた。しかしながら、その活性は野生型と比較して激減しており、工業利用するために充分な活性を有していなかった。【０００９】
本発明者らは、Directed evolution(進化分子工学的手法)により、G74C/C188S変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素の活性を向上させようと考えた。ここでいうDirected evolutionとは、（１）目的タンパク質の遺伝子に変異を導入したライブラリーを作成し、（２）このライブラリーから目的の性質を持つ変異体を選抜し、（３）選抜された変異体の遺伝子をシーケンシングし、さらに（４）選抜された変異体の遺伝子から再びライブラリーを作成する、というサイクルを繰り返すことで、あたかも生物の「進化」のように目的タンパク質に変異を繰り返し、最終的に望ましい性質を持ったタンパク質を得る、というタンパク質工学の手法のことである。【００１０】
本発明者らは、最初に野生型アリールマロン酸脱炭酸酵素及びS体選択的なG74C/C188S変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素の立体構造をX線結晶構造解析により分析し、触媒活性に関与するアミノ酸残基を特定した。それらのアミノ酸を他のアミノ酸に置換した変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素のライブラリーを構築し、Saturation Mutagenesisを行い、変異型酵素の活性を測定した。【００１１】
その結果、G74C/M159L/C188G変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素及びY48F/G74C/M159L/C188G変異型脱炭酸酵素が、S体選択的なエナンチオ選択性を有しつつ、G74C/C188S変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素に比べ酵素活性が向上していることを見出し、本発明の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素を得た。【００１２】
すなわち、本発明は以下の通りである。【００１３】
[１]  アリールマロン酸からS体のα-アリールプロピオン酸を生成し得る、配列番号２に示される野生型のアリールマロン酸脱炭酸酵素のアミノ酸配列において以下の(i)の変異、(i)及び(ii)の変異、(i)及び(iii)の変異、又は(i)、(ii)及び(iii)の変異を有する、S体選択的高活性型の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素：
(i)  第74番目のグリシンのシステインへの置換、及び第188番目のシステインのグリシンへの置換；
(ii)  第48番目のチロシンの他のアミノ酸への置換；
(iii)  第159番目のメチオニンの他のアミノ酸への置換。【００１４】
[２]  配列番号２に示される野生型のアリールマロン酸脱炭酸酵素のアミノ酸配列の第74番目のグリシンがシステインに置換され、かつ第188番目のシステインがグリシンに置換されているG74C/C188G変異型である、[１]の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素。【００１５】
[３]  配列番号２に示される野生型のアリールマロン酸脱炭酸酵素のアミノ酸配列の第74番目のグリシンがシステインに置換され、第159番目のメチオニンがロイシンに置換され、かつ第188番目のシステインがグリシンに置換されているG74C/M159L/C188G変異型である、[１]の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素。【００１６】
[４]  配列番号２に示される野生型のアリールマロン酸脱炭酸酵素のアミノ酸配列の第48番目のチロシンがフェニルアラニンに置換され、第74番目のグリシンがシステインに置換され、第159番目のメチオニンがロイシンに置換され、かつ第188番目のシステインがグリシンに置換されているY48F/G74C/M159L/C188G変異型である、[１]の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素。【００１７】
[５]  配列番号２に示される野生型のアリールマロン酸脱炭酸酵素のアミノ酸配列の第74番目のグリシンがシステインに置換され、かつ第188番目のシステインがセリンに置換されているG74C/C188S変異型酵素に比較して、酵素活性が向上している、[１]〜[３]のいずれかの変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素。【００１８】
[６]  [１]〜[５]のいずれかの変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素をアリールマロン酸誘導体と接触させることを含む、S体のα-アリールプロピオン酸の製造方法。【００１９】
[７]  S体のα-アリールプロピオン酸がプロフェン類である、[６]の製造方法。【００２０】
[８]  S体のα-アリールプロピオン酸がイブプロフェン、ナプロキセン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェン及びインドプロフェンからなる群から選択される、[７]の製造方法。【００２１】
[９]  アリールマロン酸からS体のα-アリールプロピオン酸を生成し得る、配列番号２に示される野生型のアリールマロン酸脱炭酸酵素のアミノ酸配列において以下の(i)及び(ii)の変異を有する、S体選択的高活性型の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素：
(i)  第74番目のグリシンのシステインへの置換、第159番目のメチオニンのシステインへの置換、及び第188番目のシステインのグリシンへの置換；
(iii)  第156番目のメチオニンのイソロイシン又はロイシンへの置換。【００２２】
[１０]  [９]の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素をアリールマロン酸誘導体と接触させることを含む、S体のα-アリールプロピオン酸の製造方法。【００２３】
[１１]  S体のα-アリールプロピオン酸がプロフェン類である、[１０]の製造方法。【００２４】
[１２]  S体のα-アリールプロピオン酸がイブプロフェン、ナプロキセン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェン及びインドプロフェンからなる群から選択される、[１１]の製造方法。【００２５】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2011-043085号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のS体選択的高活性型の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素により、アリールマロン酸誘導体の脱炭酸によりS体のα-アリールプロピオン酸をほぼ100％e.e.の高い光学純度で得ることができる。S体のα-アリールプロピオン酸（S型プロフェン）は非ステロイド系抗炎症剤（NSAID）等として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】イブプロフェン、ナプロキセン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、インドプロフェンの構造式を示す図である。
【図２】進化分子工学的手法(direct evolution)により、G74C/C188S変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素の活性を向上させるためのスキームを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２９】
本発明のS体選択的高活性型の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素は、配列番号２に示される野生型のアリールマロン酸脱炭酸酵素のアミノ酸配列において以下の(i)の変異、(i)及び(ii)の変異、(i)及び(iii)の変異、又は(i)、(ii)及び(iii)の変異を有する：
(i)  第74番目のグリシンのシステインへの置換、及び第188番目のシステインのグリシンへの置換；
(ii)  第48番目のチロシンの他のアミノ酸への置換；
(iii)  第159番目のメチオニンの他のアミノ酸への置換。
【００３０】
（i）の変異により野生型のアリールマロン酸脱炭酸酵素の立体選択性が逆転し、アリールマロン酸誘導体から、S体のα-アリールプロピオン酸を生成するようになる。しかしながら、（i）の変異により、酵素活性は野生型酵素に比べて低下する。（ii）又は（iii）の変異により、低下した活性が向上する。
【００３１】
他のアミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、リジン及びバリンから野生型酵素のアミノ酸を除いた１９種類のアミノ酸から選択される。
【００３２】
上記変異中、第48番目のチロシンは好ましくはフェニルアラニンに置換され、第159番目のメチオニンは好ましくはロイシンに置換されている。
【００３３】
本発明の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素は、好ましくは配列番号２に示される野生型のアリールマロン酸脱炭酸酵素のアミノ酸配列の第74番目のグリシンがシステインに置換され、第159番目のメチオニンがロイシンに置換され、かつ第188番目のシステインがグリシンに置換されている変異体である。さらに、本発明の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素は、好ましくは配列番号２に示される野生型のアリールマロン酸のアミノ酸配列の第48番目のチロシンがフェニルアラニンに置換され、第74番目のグリシンがシステインに置換され、第159番目のメチオニンがロイシンに置換され、かつ第188番目のシステインがグリシンに置換されている変異体である。本発明において、例えば、第74番目のグリシンのシステインへの変異をG74Cと表し、酵素の変異体を示すときは、G74C変異型酵素という。この表し方によると、上記の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素は、それぞれG74C/M159L/C188G変異型酵素、及びY48F/G74C/M159L/C188G変異型酵素という。
【００３４】
さらに、本発明の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素は、好ましくは配列番号２に示される野生型のアリールマロン酸脱炭酸酵素のアミノ酸配列の第74番目のグリシンがシステインに置換され、第159番目のメチオニンがロイシンに置換され、第188番目のシステインがグリシンに置換され、かつ第156番目のバリンがイソロイシンに置換されている変異体（G74C/M159L/C188G/V156I)である。さらに、本発明の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素は、好ましくは配列番号２に示される野生型のアリールマロン酸脱炭酸酵素のアミノ酸配列の第74番目のグリシンがシステインに置換され、第159番目のメチオニンがロイシンに置換され、第188番目のシステインがグリシンに置換され、かつ第156番目のバリンがロイシンに置換されている変異体（G74C/M159L/C188G/V156L)である。
【００３５】
本発明の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素は、アリールマロン酸に作用し、α位の立体配置がSであるS体のα-アリールプロピオン酸（プロフェン）を生成する。すなわち、野生型アリールマロン酸脱炭酸酵素の有する立体選択性とは逆の立体選択性を有し、エナンチオ選択性がS体である。アリールマロン酸に作用し、S体のα-アリールプロピオン酸（プロフェン）を生成する変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素として、従来より、第74番目のグリシンがシステインに置換され、第188番目のシステインがセリンに置換されたG74C/C188S変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素が知られていた（Terao et al., J Mol Catat B: Enzym, 2007, 15-20）。本発明の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素は、G74C/C188S変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素よりも向上した酵素活性を有する。以下に記載の酵素活性測定法で測定したときの発明の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素活性は、G74C/C188S変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素の５倍以上、好ましくは10倍以上、さらに好ましくは50倍以上、さらに好ましくは100倍以上、特に好ましくは150倍以上である。好ましくは、本発明のG74C/C188G変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素の酵素活性はG74C/C188G変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素の約５倍以上高く、本発明のG74C/M159L/C188G変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素の酵素活性はG74C/C188G変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素の約200倍以上高く、本発明のY48F/G74C/M159L/C188G変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素の酵素活性はG74C/C188G変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素の約920倍高い。
【００３６】
また、本発明のG74C/M159L/C188G/V156I変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素の基質としてα-メチル-α-フェニルマロン酸を用いた場合の酵素活性はG74C/M159L/C188G変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素の約２倍以上高く、本発明のG74C/M159L/C188G/V156L変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素の基質としてα-メチル-α-フェニルマロン酸を用いた場合の酵素活性はG74C/M159L/C188G変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素の約３倍以上高い。
【００３７】
アリールマロン酸脱炭酸酵素の比活性は、例えば以下の方法で測定することができる。すなわち、pH7〜8、数十から数百mMのフェニルマロン酸誘導体水溶液を50μL、1M Tris-HCl pH緩衝液を50μL、超純水350μLを混ぜ、30℃で10分以上インキュベートする。これにアリールマロン酸脱炭酸酵素溶液50μLを加え、混合する。反応時間は、基質の変換率が10％以内になるように調節する。これは、酵素反応速度は基質の濃度によって変化するからである。反応終了後逆相HPLC分析する。同様に同じ条件で、酵素溶液の代わりに10mM Tris緩衝液を添加した系において、逆相HPLC分析し、この測定結果をブランクとして、酵素溶液のデータから差し引いた値から、比活性を計算すればよい。
【００３８】
また、アリールマロン酸脱炭酸酵素のKcat・Kmは、例えば以下の方法で測定することができる。すなわち、基質の終濃度を40、20、10、5、2.5、1.25、0.625mMとした反応系で比活性を測定する。比活性の測定結果をプロットとして、「1/[S]-1/v plot」（Lineweaver-Burk plot）を引き、kcatとKmを決定することができる。
【００３９】
本発明の変異型酵素が基質とする化合物はアリールマロン酸誘導体であり、好ましくはα位にメチル基を有するα-アリール-α-メチル-マロン酸誘導体である。例えば、α-メチル-α-フェニルマロニン酸が挙げられる。変異型酵素はこれらのアリールマロン酸誘導体に作用してS体のα-アリールプロピオン酸を生成する。
【００４０】
アリールマロン酸は下記の一般式（I）で表わされ、本発明の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素により下記の一般式（II）で表わされるα-アリールプロピオン酸が生成する。
【化１】
2012117999.tif 000002
【化２】
2012117999.tif 000003
【００４１】
式中、Rは、H、CH3、F、OH、NH2からなる群から選択され、Arは、無置換又は任意の置換基で置換されているアリール基を示す。置換基として、C１〜C6のアルキル基、C1〜C6のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、C1〜C6のアルコキシカルボニル基、フェニル気、ヒドロキシ基等が挙げられ、アリール基として、フェニル基、α-ナフチル基、β-ナフチル基、2-フリル基、3-フリル基、2-チエニル基、3-チエニル基等が挙げられる。
【００４２】
本発明の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素を用いて製造されるS体のα-アリールプロピオン酸の光学純度は（鏡像体過剰率）は、99％e.e.以上、好ましくは99.5％e.e.以上、さらに好ましくは99.7％e.e.以上である。
【００４３】
鏡像体過剰率は、例えば以下の方法で測定することができる。すなわち、約50μmolの基質を1.5mLチューブに移し、500μLの超純水に溶解し、2M NaOH超純水と2M HCl超純水を用いてpH8に合わせた。これを1mLにメスアップした後、1M Tris-HCl pH緩衝液を250μL加えてvortexした。この溶液を125μLずつ分注し、0〜100μLの超純水と25〜125μLの酵素液を加えて、30℃で1週間程度反応させることで、基質を全て反応させる。この反応液に2M HClを125μL加えて反応を停止し、これにジエチルエーテルを300μL加えてvortexし、遠心分離(13,000rpm, 2min)した後上清を採取した。この操作を3回繰り返すことで、生成物を抽出する。得られる生成物を、TMSジアゾメタンを少量加えることでメチル化し、ジエチルエーテルを揮発させて、500μLのジエチルエーテル：イソプロパノール＝1：1溶液に溶解し、順層HPLC分析を行う。生成物の鏡像異性体のピーク面積から、鏡像体過剰率を測定すればよい。
【００４４】
本発明の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素は、上記の変異を有し、上記第48番目、第74番目、第159番目及び第188番目のアミノ酸以外の位置で、さらに1又は数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個、特に好ましくは１個)のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、アリールマロン酸誘導体の脱炭酸を触媒し、S体のα-アリールプロピオン酸を生成し、G74C/C188G変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素よりも上昇した酵素活性を有する変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素を包含する。さらに、上記の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素のアミノ酸配列に対して、上記の第48番目、第74番目、第159番目及び第188番目のアミノ酸置換を維持し、90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなり、アリールマロン酸誘導体の脱炭酸を触媒し、S体のα-アリールプロピオン酸を生成し、G74C/C188G変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素よりも上昇した酵素活性を有する変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素を包含する。
【００４５】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる酵素は、Alcaligenes bronchisepticus KU1201株（微工研菌寄第11670号）より単離されたアリールマロン酸脱炭酸酵素である。また、配列番号１に該酵素をコードするDNAの塩基配列を示す。上記微生物からアリールマロン酸脱炭酸酵素をコードするDNAを単離し、部位特異的突然変異誘発法等によって上記の変異を導入することによって、本発明の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素をコードするDNAを得ることができる。本発明の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素をコードするDNAを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを宿主に導入し、該DNAを含む形質転換体を作製し、該形質転換体を培養することにより、宿主細胞や培養液等の培養物から本発明の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素を公知の手法で精製すればよい。
【００４６】
この際、ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド(例えばpBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等）、枯草菌由来のプラスミド(例えばpUB110、pTP5等）、酵母由来のプラスミド(例えばYEp13等のYEp系、YCp50等のYCp系等）等を用いることができ、またλファージ等のファージDNAを用いることもできる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルス等の動物ウイルスやバキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００４７】
宿主としては、大腸菌、枯草菌等の細菌、酵母等の真菌類、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞）等の動物細胞、Sf9細胞等の昆虫細胞を用いることができる。
【００４８】
DNAを挿入したベクターの宿主細胞への導入はエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等により行うことができる。
【００４９】
宿主細胞や培養液等の培養物からの本発明の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素の精製は、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知のタンパク質精製法を適宜組み合わせて行うことができる。
【００５０】
本発明は、上記の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素を用いて、アリールマロン酸からＳ体のα-アリールプロピオン酸を製造する方法を包含する。原料となるアリールマロン酸はα-アリール-α−メチルマロン酸誘導体であり、マロン酸から公知の方法によりメチル基とアリール基を付加することにより得ることができる。また、ラセミ体のα-アリールプロピオン酸に炭酸付加することによっても得られる。
【００５１】
アリールマロン酸を本発明の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素と混合し接触させ酵素反応を行わせることにより、Ｓ体のα-アリールプロピオン酸を得ることができる。この際の反応条件は、pH７〜９、４〜50℃で、原料となるアリールマロン酸と変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素の量によるが数分〜数十時間である。原料となるアリールマロン酸と混合する酵素の量は限定されないが、例えば、アリールマロン酸10mMに対して変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素を１〜1000Ｕ混合すればよい。
【００５２】
本発明の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素により、得られるＳ体のα-アリールプロピオン酸は医薬、液晶原料、農薬等、あるいはその中間体として有用である。特に、非ステロイド性抗炎症薬（Nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID)）として有用である。これらのα−アリールプロピオン酸はプロフェン類と呼ばれる。
【００５３】
例えば、以下のアリールマロン酸から以下のα-アリールプロピオン酸が生成する。
【００５４】
α-(p-イソブチルフェニル）-α-メチルマロン酸から、(S)-α-(p-イソブチルフェニル）プロピオン酸（イブプロフェン）が生成し、α-(6-メトキシ-2-ナフチル)-α-メチルマロン酸から(S)-α-(6-メトキシ-2-ナフチル)プロピオン酸（ナプロキセン）が生成し、α-(2-フルオロビフェニル-4-イル）-α-メチルマロン酸から(S)-α-(2-フルオロビフェニル-4-イル）プロピオン酸（フルルビプロフェン）が生成し、α-(3-フェノキシフェニル)-α-メチルマロン酸から(S)-α-(3-フェノキシフェニル)プロピオン酸（フェノプロフェン）が生成し、α-(3-ベンゾイルフェニル)-α-メチルマロン酸から(S)-α-(3-ベンゾイルフェニル)プロピオン酸（ケトプロフェン）が生成し、α-{4-[(2-オキソシクロペンチル)メチル]フェニル}-α-メチルマロン酸から(S)-α-{4-[(2-オキソシクロペンチル)メチル]フェニル}プロピオン酸（ロキソプロフェン）が生成し、α-[4-(1-オキソ-2-イソインドリニル)フェニル]-α-メチルマロン酸から（(S)-α-[4-(1-オキソ-2-イソインドリニル)フェニル]プロピオン酸（インドプロフェン）が生成する。上記のイブプロフェンibuprofen)、ナプロキセン(naproxen)、フルルビプロフェン(flurbiprofen)、フェノプロフェン(fenoprofen)、ケトプロフェン(ketoprofen)、インドプロフェン(indoprofen)の構造式を図１に示す。
【００５５】
さらに、本発明の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素により、オキサプロフェン、ザルトプロフェン、アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ベルモプロフェン、カルプロフェン、シクロプロフェン、フルノキサプロフェン、ミクロプロフェン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、スプロフェン、キシモプロフェン等のS体のプロフェン類を製造することができる。
【００５６】
生成したS体のα-アリールプロピオン酸は、公知のクロマトグラフィー等の手法により精製し、医薬品、農薬、液晶材料あるいはその原料として用いることができる。
【実施例】
【００５７】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００５８】
実施例１  変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素の作製及び活性測定
Directed evolution(進化分子工学的手法)により、既に報告されている、アリールマロン酸変異体（G74C/C188S)の活性を向上させることを試みた。【００５９】
最初に、X線結晶構造解析から得られた構造情報等を用いて酵素の触媒反応について解析したところ、アリールマロン酸脱炭酸酵素の触媒反応について以下のことがわかった。【００６０】
（１）Ser188とCys74側鎖が、生成物のα炭素を挟んで向かい合うように位置している。この構造より、生成物中間体のプロキラル面を挟むように、188番目と74番目の残基が位置している、というエナンチオ選択性が発現される。【００６１】
（２）Cys74とSer188が、直接基質と相互作用することによって、脱炭酸活性に不利な影響を及ぼす。【００６２】
（３）基質が活性部位に結合すると、pro-Sのcarboxylateが側鎖の水酸基や主鎖のアミドとの水素結合によって安定化される一方、pro-Rのcarboxylateが疎水的環境で不安定化される。その結果、pro-Rのcarboxylateが脱離し、エノラート中間体が生成する。最後に中間体に対して188番目又は74番目のシステインがエナンチオ面選択的なプロトン付加を行い、生成物ができる。【００６３】
（４）野生型もG74C/C188S変異型も、1段階目が律速になっている。【００６４】
上記の結果より、G74C/C188S変異が、1段階目のpro-R carboxylateの脱離反応に不利な影響を及ぼし、活性が低下したことが示唆された。【００６５】
そこで、まず、1st screeningとして、188番目に対するsaturation mutagenesisを行うこととした。saturation mutagenesisとは、あるアミノ酸残基に対して19種類全ての天然アミノ酸残基に置換した変異型ライブラリーを構築することをいう。【００６６】
一方、G74Cの変異はエナンチオ選択性の発現に必要不可欠であるため、変異導入はできない。そこで2nd screeningでは、他の残基に変異導入することにより、活性向上を試みることとした。【００６７】
74番目・188番目以外の変異については、hydrophobic pocket(疎水性ポケット)を構成する残基やその近傍に変異を導入することで、「pro-R carboxylateの不安定化」を促進することを試みることとした。【００６８】
PDB-CODE：3DG9(野生型)・3IP8(野生型)・3IXL(G74C/C188S変異型)・3IXM(G74C変異型)の4つの結晶構造を元に、分子モデリングを行い、疎水性ポケットを構成する残基を特定し、Pro14, Leu40, Val43, Tyr48, Leu77, Val156, Met159が、pro-R carboxylateの近傍に位置していることを確認した。【００６９】
以上より、図２に示すDirected evolutionのスキームを計画した。すなわち、G74C/C188Sをテンプレートに、188番目の残基にsaturation mutagenesisを行い、活性の高い変異型を選抜する(1st screening)。ここで得られた変異型をテンプレートに、Leu40, Val43, Tyr48, Met73, Leu77, Val156, Met159の残基にそれぞれsaturation mutagenesisを行い選抜する(2nd screening)。さらに最も活性が高かった変異型をテンプレートに、他の6つの疎水性残基に対する選抜を行う(3rd screening)というスキームである。【００７０】
次に、saturation mutagenesisライブラリーから、脱炭酸活性が高い変異型をスクリーニングする系を確立した。分子進化を行う際は、迅速に酵素精製と活性評価を行う必要があり、そのためには酵素にHis-tagを付加することが有効である。そこで、酵素の発現には、ドイツのBioSpring社から提供された、KU1201株由来AMDaseのORF遺伝子をpBADベクターに組み込んだ発現ベクターを用いることにした(WO/2005/078111）。なお、このベクターで発現したAMDaseのN末端は「MGQ」の3残基伸長しており、C末端側は「GGSHHHHHH」の9残基伸長している。【００７１】
また、基質としてフェニルマロン酸を選択した。その理由は、反応が速い基質であり、微弱なAMDase活性も検出できるためであり、また先行研究で、フェニルマロン酸に対する活性と他の基質に対する活性が相関していたためである。【００７２】
テンプレートプラスミドの特定の残基に対して、NNKコドン（NはA, G, C又はT； KはG又はT)やNHKコドン（NはA, G, C又はT； HはT, C又はA； KはG又はT)を用いたmutagenesis primerを作成し、QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE)のプロトコル(以下、「QuickChange protocol」と表記する)に従って変異導入を行った。作成した複数の変異型プラスミドで大腸菌を形質転換し、プレートにまいた。そして生じたコロニーを96穴マイクロプレートで培養した。この培養液を、剣山を用いて別のマイクロプレートに植菌した後、グリセロールを加えて、マスタープレートとして保存した。植菌後のプレートを37℃で3時間程度培養した後、L-(+)-arabinoseを加えて酵素発現を誘導し、さらに14時間程度培養した。このプレートを遠心し、上清を除き、大腸菌をLysozyme・DNase・PMSFを含む溶液に溶かして凍らせた後、3時間37℃でインキュベートすることにより破砕した。そしてこの無細胞抽出液を、BTBを含むフェニルマロン酸溶液に加え、基質の脱炭酸によるpHの変化をBTBで確認することにより、活性を評価した。【００７３】
活性が高いと判断したウェルの大腸菌を、上記のマスタープレートからピックアップして、プラスミドのシーケンシングを行い、変異型を特定した。この変異型の発現宿主を培養し、菌体を回収して超音波破砕し遠心することによって調製した無細胞抽出液から、Niカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、変異型酵素を精製し、活性を評価した。【００７４】
１．G74C/C188S変異型の活性評価
上記のQuickChange protocolによって、G74C/C188S変異型を作成し、G74C/C188S変異型と野生型の比活性・kcat・Kmを測定した結果を表１に示す。
【表１】
2012117999.tif 000004
【００７５】
G74C/C188S変異型の比活性は先行研究とほぼ一致した。【００７６】
２．1st screening - 188番目に対するsaturation mutagenesis
（１）脱炭酸活性を指標としたスクリーニング
まず、NNNコドンで変異型ライブラリーを作成し、その中から68コロニーについて脱炭酸活性を指標としたスクリーニングを行った。その結果、G74C変異型の活性が最も高く、次いでG74C/C188G変異型の活性が高いという結果が得られた。さらに、NHKコドンを用いて、G74C/C188X(X ≠ C,W,R,G)変異型ライブラリーを構築し、76コロニーをスクリーニングした。その結果、G74C/C188G変異型よりも活性の高い変異型を得ることはできなかった。よって、188番目の残基のスクリーニングにおいて、G74C変異型が最も活性が強く、次にG74C/C188G変異型の活性が強いと判断した。【００７７】
（２）精製と活性測定
G74C/C188G変異型は、約2 gの培養菌体(液体LB培地500 mLより回収)から、Ni Sepharose High Performance(GE Healthcare)を50 mL用いたカラムクロマトグラフィーにより精製した。また、G74C変異型は、約1 gの培養菌体から、COSMOGEL His-Acceptゲルを2mL用いたカラムクロマトグラフィーにより精製した。【００７８】
比活性・kcat・Kmを解析した結果、スクリーニング段階での予測通り、変異型の活性は、G74C変異型 > G74C/C188G変異型 > G74C/C188S変異型の順に高いことが明らかになった（表２）。
【表２】
2012117999.tif 000005
【００７９】
G74C/C188G変異型は、G74C/C188S変異型に比べて、比活性が2．5倍、相対活性が5．6倍の活性向上となった。【００８０】
G74C変異型によって得られる生成物はラセミ体になるので、目的の変異型ではない。そこで、G74C/C188G変異型を2nd screeningのテンプレートとした。【００８１】
３．2nd & 3rd screening - 疎水性ポケットをターゲットとしたDirected evolution
（１）G74C/M159X/C188G変異型ライブラリー
次に、G74C/M159X/C188G変異型ライブラリーをスクリーニングすることにした。159番目の残基は、イギリスのMicklefieldらのグループが、野生型に対してsaturation mutagenesisを試みている。その結果、Kmベースで相対活性を50倍向上させた実績のある残基である。NNKコドンを用いて、G74C/M159X/C188G変異型ライブラリーを構築し、138コロニーをスクリーニングした。その結果、G74C/C188G変異型よりも活性が強いと推定される11株と、G74C/C188G変異型と活性が同等と推定される6株を得た。なお、これらの株は活性が強い順に1〜4群に分類した。【００８２】
シーケンシングをしたところ、G74C/C188G変異型よりも活性が高い株のほとんどはM159L変異であり、他にM159V変異が得られた（表３）。
【表３】
2012117999.tif 000006
【００８３】
精製して比活性・kcat・Kmを解析した結果を表４に示す。 
【表４】
2012117999.tif 000007
【００８４】
G74C/M159L/C188G変異型はG74C/C188S変異型に比べて、比活性が150倍、相対活性が210倍の活性向上となった。(G74C/C188G変異型に比べると、比活性は60倍、相対活性は37倍である。)
（２）G74C/M159X/C188S変異型ライブラリー
次いで、G74C/C188S変異型とG74C/C188G変異型を、実際にG74C/C188S変異型をテンプレートにDirected evolutionを行うことにより比較した。【００８５】
NNKコドンを用いて、G74C/M159X/C188S変異型ライブラリーを構築し、160コロニーをスクリーニングした。その結果、G74C/C188S変異型よりも活性が強いと推定されるM159S変異を1株得た。また、G74C/C188S変異型と活性が同等と推定される7株(内訳は、M159L変異が2株、M159G変異が1株、[テンプレート]が4株)を得た。【００８６】
これらの変異型を精製して、比活性・kcat・Kmを解析した結果を表５に示す。
【表５】
2012117999.tif 000008
【００８７】
さらに、G74C/C188G変異型をテンプレートに、疎水性ポケットのスクリーニングを継続することにした。【００８８】
（３）2nd screeningのまとめ
2nd screeningによって取得した変異型の比活性・kcat・Kmを表６に示す。
【表６】
2012117999.tif 000009
【００８９】
Y48F/G74C/C188G変異型はG74C/C188S変異型に比べて、比活性が20倍、相対活性が23倍の活性向上となった。(G74C/C188G変異型に比べると、比活性は8倍、相対活性は4倍である。)
2nd screeningにより得られた変異型の中で、最も活性が高かったのは、G74C/M159L/C188G変異型であった。そこで、この変異型をテンプレートに3rd screeningを行うこととした。【００９０】
（４）3rd screeningのまとめ
3rd screeningによって取得した変異型の比活性・kcat・Kmを表７に示す。
【表７】
2012117999.tif 000010
【００９１】
得られた変異型の活性は、G74C/M159L/C188G変異型と同等ではあったが、kcatやKmが改善したものが得られた。また、Y48F/G74C/M159L/C188G変異型がG74C/C188S変異型に比べて相対活性が920倍と、最も高い活性を示した。【００９２】
４．基質特異性と光学純度の解析
（１）方法
次に、1st〜3rdスクリーニングにおいて、特に活性が高かった、G74C/Y48F/M159L/C188G変異型・G74C/M159L/C188G変異型・Y48F/G74C/C188G変異型・G74C/C188G変異型・G74C/C188S変異型、および野生型の基質特異性と光学純度を解析することとした。【００９３】
基質は、α-methyl-α-phenylmalonic acid(α-メチル-α-フェニルマロン酸)、α-methyl-α-(2-naphthyl)malonic acid(α-メチル-α-ナフチルマロン酸)及びα-(6-methoxy-2-naphthyl)-α-methylmalonic acid(α-6-(メトキシ-2-ナフチル)-α-メチルマロン酸)を選択した。フェニルマロン酸とα-メチル-α-フェニルマロン酸を比較することでα位のメチル基の影響を、またα-メチル-α-フェニルマロン酸とα-メチル-α-ナフチルマロン酸を比較することでアリール基の影響を解析できると考えた。また医薬品として重要なナプロキセンに対応するα-(6-メトキシ-2-ナフチル)-α-メチルマロン酸を選んだ。【００９４】
活性の指標としては、比活性のみを測定した。フェニルマロン酸と同様、20mMの基質を変異型酵素で変換し、アセトニトリルを加えることで反応を停止した。この反応液を、Cosmosil 5C18-AR-II(ナカライテスク)カラムを用いて逆相HPLCにより分析し、反応生成物を定量した。【００９５】
この実験を行う際に用いた酵素液は、精製してから1〜6ヶ月程度時間がたっており、酵素の失活が懸念された。そこで、フェニルマロン酸を基質として比活性を測定することとし、この測定値を精製直後に測定した比活性で割った値を残存活性と定義した。その結果、残存活性は50〜90%程度であった。【００９６】
さらに、今回の基質に対する比活性の測定値を、残存活性で割る補正を行った。(以降の解析結果は、補正後の値である。)
生成物の光学純度は以下のように測定した。まず、基質の再結晶を行い、基質にわずかに存在した生成物や不純物を除いた。この基質を用いて、後記の比活性を測定する系で酵素反応を行った。反応液に2M HClを加えることで反応を停止し、生成物をジエチルエーテルで抽出し、TMSジアゾメタンを用いてメチルエステル化した。この生成物を、キラルな担体を有するカラムを用いて、順相HPLCにより分析した。【００９７】
（２）解析結果
解析結果を表８に示す。
【表８】
2012117999.tif 000011
【００９８】
まず、α位にメチル基を持つ基質に対して、最も活性が高かったのは、G74C/Y48F/M159L/C188G変異型ではなく、G74C/M159L/C188G変異型であった。この変異型は、野生型の約10〜13分の1と良好な活性を示した。また、生成物の立体配置は野生型を除き全て(S)体であり、鏡像体過剰率は、G74C/C188S変異型を除き全て99% e.e.以上であった。【００９９】
また、α-(6-メトキシ-2-ナフチル)-α-メチルマロン酸の活性は、変異型に関係なくα-メチル-α-ナフチルマロン酸の活性の約半分であった。この結果より、ナフチル基の6位のメトキシ基の電子的効果が活性に影響していると推定できる。【０１００】
５．変異型の活性のまとめ
（１）変異型の活性
今回の1st〜3rdスクリーニングで得られた変異型のフェニルマロン酸に対する活性をまとめたものを表９に示す。
【表９】
2012117999.tif 000012
【０１０１】
G74C/M159L/C188G変異型は、G74C/C188S変異型の210倍の活性向上となった。【０１０２】
Y48F/G74C/M159L/C188G変異型は、G74C/C188S変異型の920倍の活性向上となった。【０１０３】
（２）G74C/C188S変異型とG74C/C188G変異型の比較
G74C/C188G変異型の活性がG74C/C188S変異型に比べて大きい理由は、「グリシンがより立体障害が小さいため」もしくは「セリン水酸基と基質との水素結合が無くなったため」と推定した。【０１０４】
また、Kmは2分の1以下と改善しているのは、セリンを立体障害の小さいグリシンに置換したためと推測した。【０１０５】
またスクリーニングの結果、G74C/C188AよりG74C/C188Gの活性が高かったので、188番目の立体障害も活性に影響することが分かった。【０１０６】
（３）G74C変異の考察
野生型やG74A変異型に比べてG74C変異型の活性は低く、またC188S変異型に比べてG74C/C188S変異型の活性は低い。そしてG74C/C188S変異型の脱炭酸反応には、D2Oの速度論的同位体効果が観測されない。このことから、G74Cの変異が、1段階目のpro-R carbosylate脱離反応の活性を著しく下げたと結論づけることができる。【０１０７】
その理由は、「Cys74がGlyやAlaに比べて立体障害が大きいため」もしくは「Cys74と基質との水素結合」と推定できる。そこで、74番目のCysの影響を、分子モデリングにより解析した。PDB-CODE：3IXM(G74C/C188S変異型)に、基質のフェニルマロン酸をDockingさせ、Minimizationを行った。その結果、74番目のシステインがpro-Sのcarboxylateと水素結合するモデルを得た。【０１０８】
この結果より、Cys74がpro-S carboxylateと水素結合して、基質のbinding modeを乱すことで、pro-R carboxylateの不安定化が弱まり、脱炭酸活性が低下したと推測した。【０１０９】
本実施例において、アリールマロン酸脱炭酸酵素の精製、酵素活性の測定、変異体を作成しての分子進化検討は以下の方法で行った。【０１１０】
（１）アリールマロン酸脱炭酸酵素の精製
変異型の発現プラスミドで形質転換した大腸菌XL1-Blueを、液体LB(amp)培地(10mL)を含む試験管2本にて30℃で一晩培養した。これを液体LB(amp)培地(1L)を含む5L三角フラスコ2本へ植菌し、30℃で2〜5時間程度振盪培養した後、OD660を測定して0.3〜0.4の範囲内であることを確認した。0.1M IPTGを終濃度0.1mMになるように1mLずつ加えることで酵素の発現を誘導し、さらに30℃で18時間振盪培養した。得られた培養液を遠心分離(12,000g, 10min)することにより集菌した。【０１１１】
pH8.0, 0.5mM EDTA, 100mM Tris-HCl buffer(以下、100mM Tris緩衝液と表記する)(35mL)に集菌した大腸菌を懸濁した。培地成分の除去(洗浄)のため、再度遠心分離(12,000g, 20min)し、上清を除いた。得られた培養菌体(約4.5gを2本)を冷凍保存した。【０１１２】
次に、菌体から無細胞抽出液を調製した。2本の菌体をpH8.0, 0.5mM EDTA, 10mM Tris-HCl buffer(以下、10mM Tris緩衝液と表記する)(30mL)にそれぞれ懸濁し、氷浴中で温度を低く保ちながら超音波破砕(OUTPUT 8, DUTY 20, 5min, 2回, 2本, 標準チップ)により破砕した。得られた破砕液を遠心分離(12,000g, 20min)し、沈殿を除くことにより無細胞抽出液を調製した。【０１１３】
これ以降の操作は、氷浴中もしくは4℃の冷蔵庫の中で行った。【０１１４】
次に、硫安分画を行った。無細胞抽出液の液量を測り、硫酸アンモニウム(硫安)を30％飽和になるようにゆっくり添加し、1時間程度撹拌した。この溶液を遠心分離(12,000 , 25min)した上澄みに対し、60％飽和になるように硫酸アンモニウムをゆっくり添加し、2時間以上攪拌した。この溶液をさらに遠心分離(12,000g, 50min)し、AMDaseを含むタンパク質の沈殿を得た。この沈殿を10 mM Tris緩衝液20 mLに溶解し、セルロースチューブに入れ、10mM Tris緩衝液(透析バッファー)2Lに対して透析を行い、硫安や低分子化合物を除去した。透析バッファーは2時間後に一度交換し、さらに6時間以上透析を行った。【０１１５】
次に、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを行った。20%エタノール中で保存していたDEAE-Toyopearlゲル100mLをカラムに充填し、蒸留水300mLと10mM Tris緩衝液300mLを流すことにより平衡化した。これに、透析後の粗酵素液を1.0mL/minで流し、AMDaseをゲルに吸着させた。続いて10mM Tris緩衝液を300mL流した後、溶出速度1.0mL/minで0mMから200mMの直線的なNaCl濃度勾配600mLで溶出した。1フラクションあたり20mLずつ30本を回収した後、後述のBTBアッセイ法でAMDase活性のある画分を特定した。【０１１６】
次に、疎水性カラムクロマトグラフィーを行った。活性画分を集め、硫安を20％になるようにゆっくり添加した。20％エタノール中で保存していたButyl-Toyopearlゲル60mLをカラムに充填し、蒸留水180mLと20%硫安を含む10mM Tris緩衝液180mLを流すことにより平衡化した。これに、20％硫安を含む活性画分を1.0mL/minで流し、AMDaseをゲルに吸着させた。続いて20％硫安を含む透析バッファー180mL流した後、溶出速度1.0mL/minで20％から0％の直線的な硫安濃度勾配360mLで溶出した。1フラクションあたり12mLずつ30本を回収した。BTBアッセイ法でAMDase活性のある画分を特定した。【０１１７】
活性画分はそれぞれSDS-PAGEで分析した。AMDaseのみが溶解している(バンドが単一である)フラクションがある場合は、その活性画分を集め、透析バッファー2Lで3時間以上2回透析することで、粗酵素溶液から硫安とNaClを除去し、精製を完了した。バンドが単一であるフラクションが無い場合は、AMDaseのバンドが濃い活性画分を集めた後、SuperQ-Toyopearlゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーと、Phenyl-Toyopearlゲルを用いた疎水性カラムクロマトグラフィーを行い、SDS-PAGEでバンドが単一になるまで精製を行った。SuperQ-Toyopearlゲルは60mLを用いて、0mMから200mMの直線的なNaCl濃度勾配360mLで溶出した。Phenyl-Toyopearlゲルは50mLを用いて、25％から0％の直線的な硫安濃度勾配300mLで溶出した。【０１１８】
（２）変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素の活性測定
野生型及び変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素の比活性、Kcat及びKmは以下の方法で測定した。【０１１９】
(A)基質としてフェニルマロン酸を用いた場合
(i)  比活性の測定
pH7.0、200mMフェニルマロン酸水溶液を50μL、1M Tris-HCl pH緩衝液を50μL、超純水350μLを混ぜ、ヒートブロック上で30℃で10分以上保温した。これにAMDase溶液50μLを加え、3回程ピペッティングすることで混ぜた。反応時間は、基質の変換率が10％以内になるように調節した。なぜなら、酵素反応速度は基質の濃度によって変化するからである。反応終了後アセトニトリルを500μL加えてクエンチした。クエンチに用いたアセトニトリルには、あらかじめ内部標準物質として20mM 2-フェニルプロピオン酸を溶かした。この反応液をそのまま逆相HPLC分析した。【０１２０】
これと全く同じ条件で、AMDase溶液の代わりに10mM Tris緩衝液を添加し、同様にクエンチを行い、逆相HPLC分析した。この測定結果をブランクとして、AMDase溶液のデータから差し引いた値から、比活性を計算した。【０１２１】
(ii)  Kcat・Kmの解析
基質の終濃度を40、20、10、5、2.5、1.25、0.625mMとした反応系で比活性を測定した。基質溶液は、200mMのフェニルマロン酸溶液を段階希釈したものを50μL用いた。ブランクは、それぞれの基質濃度ごとに測定した。【０１２２】
反応時間は、20mMの反応系での基質変換率が5%程度になるように調節した。この反応時間であれば、全ての基質濃度で、基質変換率が20%未満になることが多いからである。【０１２３】
比活性の測定結果をプロットとして、「1/[S]-1/v plot」（Lineweaver-Burk plot）を引き、kcatとKmを決定した。【０１２４】
(iii)  逆相HPLC分析
反応液をアセトニトリルでクエンチした溶液をそのまま分析した。フェニル酢酸と2-フェニルプロピオン酸で作成した検量線を用いて、フェニル酢酸を定量した。【０１２５】
分析条件は以下の通りであった。【０１２６】
カラム  Cosmosil 5C18-AR-II（ナカライテスク）
展開溶媒  メタノール/超純水/TFA=60:40:0.05
流速  0.8mL/min
検出  254nm
各物質の保持時間は次の通りであった。【０１２７】
フェニルマロン酸（基質）  約4.6-4.8min
フェニル酢酸（生成物）  約6.6-6.8min
2-フェニルプロピオン酸（内部標準物質）  約8.9-9.5min
（B)  基質としてα-メチル-α-フェニルマロン酸を用いた場合の比活性の測定
基質としてフェニルマロン酸を用いて比活性を測定する系において、約pH8、20mMのα-メチル-α-フェニルマロン酸を基質として酵素反応を行った。そして20mM 2-フェニル酢酸アセトニトリル溶液を用いてクエンチを行い、逆相HPLC分析した。Kcat・Kmの解析は、基質としてフェニルマロン酸を用いた場合と同様の方法で行った。【０１２８】
用いたカラムはCosmosil 5C18-AR-II（ナカライテスク）、展開溶媒は、メタノール/超純水/TFA=60:40:0.05、流速は0.8mL/min、検出は254nmで行った。フェニル酢酸と2-フェニルプロピオン酸で作成した検量線を用いて、2-フェニルプロピオン酸を定量した。【０１２９】
（C)  基質としてα-メチル-α-ナフチルマロン酸又はα-(6-メトキシ-2-ナフチル)-α-メチルマロン酸を用いた場合の比活性の測定
基質としてフェニルマロン酸を用いて比活性を測定する系において、約pH8、20mMのα-メチル-α-ナフチルマロン酸又はα-(6-メトキシ-2-ナフチル)-α-メチルマロン酸を基質として酵素反応を行った。そして20mM 2-ナフチル酢酸アセトニトリル溶液を用いてクエンチを行い、逆相HPLC分析した。Kcat・Kmの解析は、基質としてフェニルマロン酸を用いた場合と同様の方法で行った。【０１３０】
用いたカラムはCosmosil 5C18-AR-II（ナカライテスク）、展開溶媒は、メタノール/超純水/TFA=65:35:0.05、流速は0.8mL/min、検出は254nmで行った。生成物と2-ナフチル酢酸で作成した検量線を用いて、生成物を定量した。【０１３１】
（３）アリールマロン酸脱炭酸酵素の分子進化
(i)  Mutagenesis primerの設計
変異導入のプライマー対は、表１０に示すものを用いた。
【表１０】
2012117999.tif 000013
【０１３２】
(ii)  変異型ライブラリーの作成
変異導入は、「QuickChange protocol」により行った。PCR酵素は、PfuUltraを用いた。PCR条件は、「QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kitのマニュアル」「PfuUltraTM HF DNA polymeraseのマニュアル」及びLei Zheng, Jean-Louis Reymond, Nucleic Acids Research, 2004, 32, No. 14を参考に決定した。【０１３３】
pBADベクターを用いる場合は、L-(+)-arabinoseで酵素の発現を誘導する。そのため、L-(+)-arabinoseを取り込むことができ、かつ代謝分解しない大腸菌を宿主として選ぶ必要がある。そこで、araBADC-とaraEFGH+の遺伝子型を持ち、pBADベクターの宿主として推奨されている大腸菌top10を宿主として用いた。【０１３４】
(iii)  脱炭酸活性のスクリーニング
96穴マイクロプレートの全てのウェルに、液体LB(amp)培地を150μLずつ加えた。これらのウェルに変異型ライブラリーと、コントロールとしてテンプレートの変異型発現宿主をつまようじで植菌し、37℃で一晩培養した。この培養液を、酵素発現用の液体LB(amp)培地100μL(96穴マイクロプレート)に剣山で植菌した。元の培養菌体には、80％グリセロールを50μL加え、-80℃で保存した。これを、マスタープレートとした。【０１３５】
酵素発現用の液体LB(amp)培地100μLを37℃で3時間程度培養した後、0.075% L-(+)-arabinoseを含む液体LB(amp)培地50μLを加えることで酵素の発現を誘導し(L-(+)-arabinoseの終濃度0.025%)、さらに37℃で14時間培養した。培養終了後、プレートリーダーで660nmの吸光度を測定し、各ウェルの大腸菌の生育具合を確認した。次いで遠心分離(860g, 2000rpm, 20min)を行った後、ピペットマンで上清を除いた。【０１３６】
沈殿した菌体に、10mM Tris, 300mM NaCl, 1μg/mL DNase, 10mg/mL Lysozyme, 10μg/mL PMSFを100μL加え、-80℃で30min以上静置することにより凍らせた。これを37℃で3時間インキュベートした後、遠心分離(860g, 2000rpm, 45min)を行った。この上清を無細胞抽出液とした。なお、PMSFは水溶液中で分解するため、メタノール溶液として保存し、菌体に加える直前に調整した。【０１３７】
無細胞抽出液20μLを新しい96穴マイクロプレートに移した。これに、10mM MOPS, 25mM フェニルマロン酸, 11g/L BTBを180μL加えた(反応液)。直後から、プレートリーダーで660 nmの吸光度を測定し続け、また目視で反応液が緑から青に変色するのを確認した。沈殿させた破砕菌体が反応液に入ると、吸光度やBTB変色活性が見にくいので、入れないようにした。【０１３８】
テンプレートの変異型と比較してBTBの変色が速いと判断したウェルの大腸菌を、上記のマスタープレートから植菌して液体LB(amp)培地3.5mL(Round Bottom tube)で培養した。このうち培養液0.5mLを等量の80％グリセロールと混ぜ、グリセロールストックとして-80℃で保存した。残りの3mLから、プラスミド抽出を行った。続いてプラスミドのシーケンシングを行い、変異型を特定した。【０１３９】
変異型の発現宿主を上記のグリセロールストックから一晩前培養し、100mLの液体LB(amp)培地に1mL植菌した。これを30℃で2〜4時間程度培養して、660nmの吸光度(OD660)が0.5になったときに、10％ L-(+)-arabinoseを250μL加えて(終濃度0.025％)、さらに14時間培養した。得られた培養液を遠心分離(12,000g, 10min)することにより集菌し、冷凍保存した。この菌体から、上記の方法でAMDaseを精製した。酵素の失活を考慮して、精製してから長くても2週間以内に変異型の活性を評価した。【０１４０】
（４）  His-tagを含むAMDaseの精製
(i)  少量系の精製
pH8.0, 25mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 20mM imidazole buffer(以下、10mM imidazole緩衝液と表記する)10mLに培養菌体約0.5gを懸濁した。氷浴中で温度を低く保ちながら超音波破砕(OUTPUT 2〜3, DUTY 20, 5min, 2回, 細長いチップ)により破砕した。以降の操作は、氷浴中もしくは4℃の冷蔵庫の中で行った。得られた破砕液を遠心分離(8000g, 40min)し、沈殿を除くことにより無細胞抽出液を調製した。【０１４１】
20％エタノール中で保存していたCOSMOGEL His-Accept(ナカライテスク)ゲル2mLをスモールカラムに充填し、蒸留水10mLと10mM imidazole緩衝液10 mLを流すことにより平衡化した。これに、無細胞抽出液10mLを流し、AMDaseをゲルに吸着させた。続いて10mM imidazole緩衝液2.5mLを4回流すことで、余分なタンパク質を除去した。続いて、pH8.0, 25mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 60mM imidazole buffer(以下、60mM imidazole緩衝液と表記する)2.5mLを4回流すことで、AMDaseを溶出した。【０１４２】
最後に、Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unitsを用いて酵素液の濃縮と脱塩を行った。この操作は、imidazoleがアリールマロン酸の脱炭酸もしくはラセミ化を触媒する可能性がある(共同研究者のRobertによる指摘)ためと、imidazoleは280nmの吸光を持ち酵素濃度の定量に悪影響があるためである。【０１４３】
(ii)  大量系の精製
G74C/C188S変異型とG74C/C188G変異型はAMDase活性が微弱であったため、以下の方法により精製し、約1mg/mLの酵素液を得た。【０１４４】
10mM imidazole緩衝液35mLに培養菌体約2gを懸濁した。氷浴中で温度を低く保ちながら超音波破砕(OUTPUT 8, DUTY 20, 5 min, 2回, 標準チップ)により破砕した。以降の操作は、氷浴中もしくは4℃の冷蔵庫の中で行った。得られた破砕液を遠心分離(12,000g, 20min)し、沈殿を除くことにより無細胞抽出液を調製した。【０１４５】
20％エタノール中で保存していたNi Sepharose（商標）High Performance(GE Healthcare)ゲル45mLをカラムに充填し、蒸留水150mLと10mM imidazole緩衝液150 mLを流すことにより平衡化した。これに、無細胞抽出液35mLを流し、AMDaseをゲルに吸着させた。続いて10mM imidazole緩衝液を450mL流した後、溶出速度1.0mL/minで10mMから250mMの直線的なimidazole濃度勾配900mLで溶出した。1フラクションあたり22mLずつ41本を回収した後、BTBアッセイ法でAMDase活性のある画分を特定した。なお、AMDaseは概して95〜120mM imidazoleのフラクションに溶出した。活性画分を集め、Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unitsを用いて酵素液の濃縮と脱塩を行った。【０１４６】
（５）  変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素の作製
(i)  変異型の作製
上記のQuickChange protocolにより、変異型発現プラスミドを作成し、組み換え大腸菌top10を形質転換した。なお、形質転換はヒートショック法を用いた。【０１４７】
育成したコロニーを爪楊枝で、別のLB(amp)培地プレートへストリークすることにより単菌化した。この爪楊枝上のコロニーを液体LB(amp)培地3.5mL(Round Bottom tube)に植菌して培養した。培養液0.5mLからグリセロールストックを作成し、残りの3mLから、プラスミド抽出を行った。続いてプラスミドのシーケンシングを行い、目的とする変異型であることを確認した。【０１４８】
(ii)  Mutagenesis primerの設計
上記のQuickChange protocolにより、G74A変異型の発現プラスミドから、野生型・G74C変異型・C188S変異型・G74C/C188S変異型・S36N/G74C/C188S変異型・S36N/G74C/C188G変異型・S36N/G74C/M159L/C188G変異型の発現プラスミドを作成した。【０１４９】
これらの変異導入に使用したプライマーを表１１に示す。なお、overlapping primerになっているのはS36Nの対だけである。
【表１１】
2012117999.tif 000014
【０１５０】
（６）  基質特異性の解析
(i)  基質の再結晶
基質であるα-メチル-α-フェニルマロン酸, α-メチル-α-ナフチルマロン酸, α-(6-メトキシ-2-ナフチル)-α-メチルマロン酸をナスフラスコに移し、ジエチルエーテルに溶解して飽和させ、少量のヘキサンを加えて密閉し、常温放置した。生成した結晶を、桐山ろ紙でろ過して回収し、デシケーターに移して真空ポンプで引いて乾燥させた。【０１５１】
(ii)  生成物の鏡像体過剰率の測定
約50μmolの基質を1.5mLチューブに移し、500μLの超純水に溶解し、2M NaOH超純水と2M HCl超純水を用いてpH 8に合わせた。これを1mLにメスアップした後、1M Tris-HCl pH緩衝液を250μL加えてvortexした。この溶液を125μLずつ分注し、0〜100μLの超純水と25〜125μLの酵素液を加えて、30℃で1週間程度反応させることで、基質を全て反応させた。【０１５２】
反応液に2M HClを125μL加えて反応を停止した。これにジエチルエーテルを300μL加えてvortexし、遠心分離(13,000rpm, 2min)した後上清を採取した。この操作を3回繰り返すことで、生成物を抽出した。【０１５３】
生成物を、TMSジアゾメタンを少量加えることでメチル化した。ジエチルエーテルを揮発させて、500 μLのジエチルエーテル：イソプロパノール＝1：1溶液に溶解し、順層HPLC分析を行った。生成物の鏡像異性体のピーク面積から、鏡像体過剰率を測定した。【０１５４】
実施例２  変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素の基質としてα-メチル-α-フェニルマロン酸を用いた場合の活性測定
実施例１に示すようにα位にメチル基を持つ基質に対して、G74C/M159L/C188G変異型が最も活性が高かったが、さらに高活性の変異型の作製を試みた。【０１５５】
実施例１に記載の方法で、G74C/M159L/C188G、G74C/M159L/C188G/V156I及びG74C/M159L/C188G/V156Lのアミノ酸変異を有する変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素を作製した。基質としてα-メチル-α-フェニルマロン酸を用いて、実施例１の４と同様の方法で酵素活性を測定した。【０１５６】
表１２に活性測定の結果を示す。
【表１２】
2012117999.tif 000015
【０１５７】
G74C/M159L/C188G変異型、G74C/M159L/C188G/V156I変異型、G74C/M159L/C188G/V156L変異型の順で、酵素との親和性を示すKm値が向上した。また、活性も向上した。その結果、G74C/M159L/C188G変異型に対して、相対活性が２〜３倍向上した変異体が得られた。【０１５８】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１５９】
本発明のS体選択的高活性型の変異型アリールマロン酸脱炭酸酵素を用いることにより、医農薬、液晶材料やそれらの中間体として工業的に有用なS体のα-アリールプロピオン酸を製造することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１６０】
配列番号３〜３２  プライマー
【図１】
2012117999.tif 000016
【図２】
2012117999.tif 000017
【配列表】
2012117999000001.app
【国際調査報告】
2012117999.tif 000018
2012117999.tif 000019
2012117999.tif 000020
2012117999.tif 000021