(57)【要約】【課題】生体内における生体分子（タンパク質）を蛍光で標識するにも使用できる、タンパク質を蛍光標識する方法を提供する。【解決手段】タンパク質を蛍光標識する方法であって、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質を細胞内で得ること、下記式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を、細胞内のエステラーゼにより下記式（ＩＩ）で表される化合物またはその塩へ変換すること、および前記融合タンパク質と下記式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識する方法。2012105596.tif 000028
2012105596.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内タンパク質を蛍光標識する方法であって、
標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質を細胞内で得ること、
下記式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を、細胞内のエステラーゼにより下記式（ＩＩ）で表される化合物またはその塩へ変換すること、
および前記融合タンパク質と下記式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含み、
前記変異型βラクタマーゼは、前記式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のβ−ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なタンパク質である、タンパク質の蛍光標識方法。
【化２１】
2012105596.tif 000024
前記式（Ｉ）および式（ＩＩ）中、
Ｘは、蛍光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ1は、低級アルキルオキシカルボニルオキシで置換された低級アルキル基または、３−オキシ−１，３−ジヒドロイソベンゾフラン−１−イルである。
【請求項２】
前記融合タンパク質における前記変異型βラクタマーゼのアミノ酸配列が、
配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列、
配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式（ＩＩ）で表わされる化合物のβ−ラクタム環を開環させ、かつ、前記化合物またはその塩のβ−ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列、及び、
配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、かつ、前記化合物またはその塩のβ−ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列である、請求項１記載の細胞内タンパク質の蛍光標識方法。
【請求項３】
前記融合タンパク質を得ることが、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、前記融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で前記融合タンパク質を発現させること、又は、発現した前記融合タンパク質を単離することを含む、請求項１又は２に記載の細胞内タンパク質の蛍光標識方法。
【請求項４】
前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩を含む請求項１〜３のいずれかの方法に用いるための組成物。
【化２２】
2012105596.tif 000025
Ｘは、蛍光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ1は、低級アルキルオキシカルボニルオキシで置換された低級アルキル基または、３−オキシ−１，３−ジヒドロイソベンゾフラン−１−イルである。
【請求項５】
請求項４に記載の組成物と、
請求項１〜３のいずれかの方法に用いるためのプラスミドまたはベクターを含むタンパク質の蛍光標識方法用キット。
前記プラスミドまたはベクターは、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
前記プラスミド又はベクターは、
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列の１〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質において式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のβ−ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び、
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、前記融合タンパク質において式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のβ−ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、からなる群から選択される塩基配列を含むプラスミドまたはベクター。
【化２３】
2012105596.tif 000026
Ｘは、蛍光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ1は、低級アルキルオキシカルボニルオキシで置換された低級アルキル基または、３−オキシ−１，３−ジヒドロイソベンゾフラン−１−イルである。
【請求項６】
一般式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩。
【化２４】
2012105596.tif 000027
Ｘは、蛍光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ1は、低級アルキルオキシカルボニルオキシで置換された低級アルキル基または、３−オキシ−１，３−ジヒドロイソベンゾフラン−１−イルである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を蛍光標識する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生物が生きた状態において、生物内のタンパク質などの生体分子の機能を観察するバイオイメージングが注目されている。この生体分子機能の観察は、生体分子を蛍光で標識し、生物内におけるその生体分子の局在や動きを可視化することにより汎用的に行われている。生体分子を蛍光で標識する方法としては、遺伝子工学的手法を用いて、蛍光タンパク質を目的とする生体分子（タンパク質）の末端に共発現させる方法が一般的である。この蛍光タンパク質は、分子サイズが大きく、また、組織透過性の高い近赤外光蛍光の観測が困難であるなどの不都合がある。そのため、蛍光タンパク質より分子サイズが小さく、かつ、蛍光特性に優れた有機小分子に注目が集まっている。有機小分子を目的タンパク質にラベルする技術として、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）（プロメガ株式会社）（例えば非特許文献１参照）およびＳＮＡＰ−ｔａｇ（登録商標）（例えば非特許文献２参照）を用いたラベル化キットが商品化されている。これらのラベル化法は、酵素反応を利用して目的とする生体分子を蛍光で標識する。そのため、有機小分子を目的とする生体分子にラベル化する際の特異性は非常に高いが、生体分子に結合していない有機小分子由来の蛍光が、バックグラウンドシグナルとして観測されてしまう。このバックグラウンドシグナルを小さくするため、目的とする生体分子を有機小分子で蛍光標識した後、洗浄して、未反応の有機小分子を除去する必要がある。しかしながら、細胞内や生体内に存在する生体分子を洗浄するのは、一般的に困難であり、洗浄できない場合も多い。従って、細胞内や生体内での生体分子の機能を観察するには、上述のラベル化法は汎用的とはいえない。また、有機小分子と目的とする生体分子とを結びつける特定配列のペプチドを用いて、生体分子を蛍光で標識する方法も開発されているが、この方法は、ペプチドと有機小分子との特異性が低いという問題がある。【０００３】
前記問題を解決するため、本発明者らは、既に、下記式（Ａ）を有する化合物を用いた、細胞内や生体内における生体分子（タンパク質）を蛍光で標識するために使用できる、タンパク質を蛍光標識する方法を提供している（特許文献１）。この方法では、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質を得ること、および前記融合タンパク質と下記式（Ａ）で表わされる化合物またはその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含み、前記変異型βラクタマーゼは、前記式（Ａ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、かつ、前記化合物またはその塩のβ−ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なタンパク質である、タンパク質の蛍光標識方法を提供している。【０００４】
【化１】
2012105596.tif 000003
【０００５】
前記式（Ａ）中、Ｘ’は、蛍光性基であり、Ｌ1’は、Ｘ’のためのリンカーであり、Ｒ1’は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基である。【０００６】
しかしながら、前記化合物（Ａ）を用いる方法によって細胞膜透過性が低い場合があり、その結果、細胞内における生体分子（タンパク質）を蛍光で標識するのは効率が悪い場合があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−１１９３８２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Qureshi,M.H., ら、J. Biol. Chem., 2001, 276, p.46422-8
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, p.9955-9959
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明は、細胞内や生体内における生体分子（タンパク質）を蛍光で標識するために使用できる、効率よくタンパク質を蛍光標識する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、細胞内タンパク質を蛍光標識する方法であって、
標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質を細胞内で得ること、
下記式（Ｉ）で表される化合物またはその塩を、細胞内のエステラーゼにより下記式（ＩＩ）で表される化合物またはその塩へ変換すること、
および前記融合タンパク質と下記式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含み、
前記変異型βラクタマーゼは、前記式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のβ−ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なタンパク質である。なお、前記「細胞内のエステラーゼ」とは、細胞に本来的に存在するエステラーゼおよび、外部から細胞内へ導入したエステラーゼの少なくとも一方を意味する。【００１１】
【化２】
2012105596.tif 000004
【００１２】
前記式（Ｉ）および式（ＩＩ）中、
Ｘは、蛍光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ1は、低級アルキルオキシカルボニルオキシで置換された低級アルキル基または、３−オキシ−１，３−ジヒドロイソベンゾフラン−１−イルである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のタンパク質を蛍光標識する方法は、細胞内や生体内における生体分子（タンパク質）を効率よく蛍光で標識するために使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１（１）】図１（１）は、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中化合物ＲＢの吸収および蛍光スペクトルを示す。
【図１（２）】図１（２）は、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中化合物ＦＢの吸収および蛍光スペクトルを示す。
【図１（３）】図１（３）は、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中化合物ＦＢ−ＤＡの吸収および蛍光スペクトルを示す。
【図１（４）】図１（４）は、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中化合物ＣＢの吸収および蛍光スペクトルを示す。
【図１（５）】図１（５）は、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中化合物ＣＢ−ＭＡの吸収および蛍光スペクトルを示す。
【図２】図２は、エステラーゼ添加による、化合物ＲＢの加水分解を示すＨＰＬＣチャートである。
【図３】図３は、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中化合物ＲＢの安定性を示すＨＰＬＣチャートである。
【図４】図４は、化合物ＲＢと化合物ＲＡの細胞透過性の蛍光画像を示す。
【図５】図５は、化合物ＲＢによる細胞質ＢＬ−ｔａｇ融合タンパク質の蛍光ラベル化を示す蛍光画像である。
【図６】図６は、ＢＬ−ＮＬＳおよび細胞質ＢＬのタンパク質発現を示すウエスタンブロット分析である。
【図７】図７は、化合物ＲＢによる細胞内ＢＬ−ｔａｇ融合タンパク質の蛍光ラベル化を示す蛍光画像である。
【図８】図８は、化合物ＲＢによる細胞内ＢＬ−ｔａｇ融合タンパク質の蛍光ラベル化を示す蛍光画像である。
【図９】図９は、化合物ＲＢによる細胞内ＢＬ−ｔａｇ融合タンパク質の蛍光ラベル化を示す蛍光画像である。
【図１０】図１０は、化合物ＲＡ、ＦＡおよびＲＢによる細胞内ＢＬ−ｔａｇ融合タンパク質の蛍光ラベル化を示す蛍光画像である。
【図１１】図１１は、化合物ＲＢによる細胞内ＢＬ−ＮＬＳのラベル化反応の時間経過を示す蛍光画像である。
【図１２】図１２は、化合物ＲＢによる分子内ＢＬ−ｔａｇ融合タンパク質を、化合物ＦＡによる分子外ＢＬ−ｔａｇ融合タンパク質と同時にラベル化したことを示す蛍光画像である。
【図１３】図１３は、化合物ＦＢ−ＤＡによる細胞内ＢＬ−ｔａｇ融合タンパク質の蛍光ラベル化を示す蛍光画像である。
【図１４】図１４は、化合物ＦＢ−ＤＡによる細胞内ＢＬ−ｔａｇ融合タンパク質の蛍光ラベル化を示す蛍光画像である。
【図１５】図１５は、化合物ＣＢによる細胞内ＢＬ−ｔａｇ融合タンパク質の蛍光ラベル化を示す蛍光画像である。
【図１６】図１６は、化合物ＣＢ−ＭＡによる細胞内ＢＬ−ｔａｇ融合タンパク質の蛍光ラベル化を示す蛍光画像である。
【図１７】図１７は、化合物ＦＢ−ＤＡによる核局在ＢＬ−ｔａｇ融合タンパク質および市販試薬であるＳＮＡＰ−Ｃｅｌｌ  ＴＭＲ−Ｓｔａｒによるミトコンドリア局在ＳＮＡＰ−ｔａｇの同時蛍光ラベル化を示す蛍光画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
βラクタマーゼのひとつ、ＴＥＭ−１は、下記スキーム１に示すような反応を経て、ペニシリンなどのβ−ラクタム系抗生物質を加水分解することが知られている。
【００１６】
【化３】
2012105596.tif 000005
【００１７】
前記スキーム１に示すように、ＴＥＭ−１は、その７０位Ｓｅｒがラクタム環へ求核攻撃してアシル−酵素複合体を形成する。次いで、その複合体が加水分解され、β−ラクタム環の加水分解が生じる。加水分解においては、ＴＥＭ−１の１６６位Ｇｌｕにより促進されることが知られている。そして、この１６６位Ｇｌｕを他のアミノ酸に変更した変異型βラクタマーゼは、アシル−酵素複合体の加水分解速度が大きく低下することが知られていた。例えば、１６６位ＧｌｕをＡｓｎに変更した変異型βラクタマーゼの場合、下記スキーム２に示すように、アシル−酵素中間体の加水分解が起こらない。そのため、このような変異型βラクタマーゼは、基質であるβ−ラクタム環に不可逆的に結合する。
【００１８】
【化４】
2012105596.tif 000006
【００１９】
本発明は、変異型βラクタマーゼとして例えば、この１６６位Ｇｌｕを他のアミノ酸に変更した変異型βラクタマーゼと、式（Ｉ）で表わされる化合物（以下、「式（Ｉ）の化合物」と呼ぶ）またはその塩を用いることを特徴の一つとする。変異型βラクタマーゼとしては、天然型βラクタマーゼのアミノ酸の変異部位は限定されず、前記式（Ｉ）で表わされる化合物のＲ１が水素に置き換えられた下記式（ＩＩ）の化合物のβ−ラクタム環を開環させ、かつ、前記化合物のβ−ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なタンパク質であればよい。
【００２０】
式（ＩＩ）の化合物として下記に示す化合物ＲＡを用い、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質としてＢＬ−ｔａｇを用いた場合、式（ＩＩ）の化合物と変異型βラクタマーゼの反応を以下のスキーム３に示す。
【００２１】
【化５】
2012105596.tif 000007
【００２２】
スキーム３中、「ＢＬ−ｔａｇ」は、「変異型βラクタマーゼ」を意味する。
【００２３】
本発明の化合物（Ｉ）は、細胞膜透過性が高い。従って、本発明の化合物（Ｉ）を用いることにより、効率よく細胞内のタンパク質を蛍光ラベル化することが可能になった。
【００２４】
また本発明の式（Ｉ）の化合物と、細胞膜透過性が低い式（ＦＡ）の化合物とを併用すると、同一タグタンパク質を用いた場合であっても、細胞膜表面と細胞膜内のタンパク質とを異なる蛍光色素でラベルすることが可能である。この同時ラベル化について、以下のスキーム４を用いて説明する。
【００２５】
【化６】
2012105596.tif 000008
【００２６】
化合物ＲＢは細胞膜透過性が高く、細胞内へ移動することが可能である。その細胞内に存在する化合物ＲＢは、細胞内に存在するエステラーゼにより加水分解を受け、化合物ＲＡへ変換される。この化合物ＲＡは、遊離カルボキシ基を分子内に有するため細胞膜透過性が低い。そのため、細胞内の化合物ＲＡは、細胞外への排出が抑制されて、細胞内に効率的に蓄積される。その細胞内の化合物ＲＡは、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質としてＢＬ−ｔａｇとの間で、スキーム３に示すような反応が進行し、その結果、標識対象タンパク質のラベル化が可能になる。ここで、細胞内の化合物ＲＢは細胞外への排出が抑制されているため、低濃度の化合物ＲＢを用いて、効率よく細胞内の標識対象タンパク質をラベル化することが可能である。
【００２７】
このことは、以下のように説明できる。従来の標識対象タンパク質のラベル化においては、プローブの細胞膜透過性が、プローブに含まれる蛍光性基の性質に大きく依存していた。そのため、細胞膜透過性を有するプローブは、細胞外に存在する標識対象タンパク質にも認識されうる。したがって、細胞膜の内外に標識対象タンパク質が存在する場合、あらかじめ細胞外に存在する標識対象タンパク質を他のプローブでブロックし、その後に、細胞内に存在する標識対象タンパク質をラベル化する必要があった。しかし、本発明によれば、プローブである式（Ｉ）の化合物の細胞膜透過性は、蛍光性基Ｘだけではなく、酵素認識部位であるアンピシリンにも強く依存している。すなわち、式（Ｉ）の化合物は、アンピシリンのカルボキシ基が保護されているため、酵素認識が大きく抑制され、その結果、式（Ｉ）の化合物による細胞外に存在する標識対象タンパク質のラベル化は非常に抑制される。その結果、細胞膜透過性が低い式（Ａ）の化合物と、細胞膜透過性が高い式（Ｉ）の化合物とを併用することで、細胞内外に存在する標識対象タンパク質を同時にラベル化することが可能なのである。このことは、従来技術で知られているラベル化技術によっては、いまだ達成されていない。
【００２８】
本発明は、前記のように、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩を含む本発明の方法に用いるための組成物である。
【００２９】
【化７】
2012105596.tif 000009
【００３０】
前記式（Ｉ）中、
Ｘは、蛍光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ1は、低級アルキルオキシカルボニルオキシで置換された低級アルキル基または、３−オキシ−１，３−ジヒドロイソベンゾフラン−１−イルである。
【００３１】
本発明は、または、本発明の蛍光標識する方法に用いるためのプラスミドまたはベクターであって、
前記プラスミドまたはベクターは、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
前記プラスミド又はベクターは、
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列、
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列の１〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質において式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のβ−ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び、
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、前記融合タンパク質において式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のβ−ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、からなる群から選択される塩基配列を含む。
【００３２】
また、本発明は、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩を含む本発明の方法に用いるための組成物と、本発明の方法に用いるためのプラスミドまたはベクターとを含むタンパク質の蛍光標識方法用キットである。
【００３３】
本発明のタンパク質の蛍光標識方法用キットは、さらに、前記プラスミド又はベクターを導入するための宿主細胞、キットの取り扱い説明書を含むのが好ましい。
【００３４】
本発明の化合物において、蛍光性基とは、可視光線、紫外線、Ｘ線等が照射され、そのエネルギーを吸収することにより電子が励起し、それが基底状態に戻る際に余分なエネルギーを電磁波として放出する性質を有する基を意味する。具体的には、蛍光性基とは、クマリン色素、キサンテン色素、シアニン色素、アクリジン、イソインドール、ダンシル色素、アミノフタル酸ヒドラジド、アミノフタルイミド、アミノナフタルイミド、アミノベンゾフラン、アミノキノリン、ジシアノヒドロキノン等から誘導される基あるいは発光性希土類錯体が挙げられ、クマリン色素、キサンテン色素から誘導される基および発光性希土類錯体が好ましい。
【００３５】
本発明の化合物において、ＸのためのリンカーＬ１とは、式（Ｉ）および式（ＩＩ）の化合物のペニシリン骨格とＸとを結び付けるための基である。具体的には、Ｌ１は、−（ＣＨ２）ｎ１ＣＯＮＲ２（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１ＮＲ２ＣＯ（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１ＮＲ３ＣＯＮＲ２（ＣＨ２）ｎ２−、−(ＣＨ２)ｎ１ＮＲ３ＣＳＮＲ２（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１ＣＯＮＲ３（ＣＨ２）ｎ３ＣＯＮＲ２（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１ＣＯＮＲ３（ＣＨ２）ｎ３（ＣＨＲ４）ｎ４ＣＯＮＲ２（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１−、−（ＣＨ２）ｎ１Ｓ（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１Ｏ（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１ＮＲ２（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１ＣＯ２（ＣＨ２）ｎ２−等が挙げられ、−（ＣＨ２）ｎ１ＣＯＮＲ３（ＣＨ２）ｎ３ＣＯＮＲ２（ＣＨ２）ｎ２−および−（ＣＨ２）ｎ１ＣＯＮＲ３（ＣＨ２）ｎ３（ＣＨＲ４）ｎ４ＣＯＮＲ２（ＣＨ２）ｎ２−が好ましい。前記式中、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４はそれぞれ、０または１〜５の整数であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ、水素原子、低級アルキル基、アミノもしくはグアニジンで置換された低級アルキル基またはフェニル基である。このＸのためのリンカーとは、本発明のタンパク質を蛍光標識する方法における条件下で、切断されないリンカーであれば、その構造は限定されない。前記式−（ＣＨ２）ｎ１ＣＯＮＲ３（ＣＨ２）ｎ３ＣＯＮＲ２（ＣＨ２）ｎ２−で表される基としては、ｎ１＝ｎ３＝０、ｎ２＝２または３、Ｒ３＝Ｒ２＝Ｈである基が好ましく、式−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）２−ＣＯＮＨ−または−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）３−ＣＯＮＨ−で表される基がより好ましい。また、前記式−（ＣＨ２）ｎ１ＣＯＮＲ３（ＣＨ２）ｎ３（ＣＨＲ４）ｎ４ＣＯＮＲ２（ＣＨ２）ｎ２−で表される基としては、ｎ１＝ｎ２＝ｎ３＝０、ｎ４＝１、Ｒ３＝Ｒ２＝Ｈ、Ｒ４＝水素原子、低級アルキル基、アミノもしくはグアニジンで置換された低級アルキル基またはフェニル基である基が好ましく、式−ＣＯＮＨ−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨ−ＣＨ（Ｐｈ）−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨ−（ＣＨ（ＣＨ２）４ＮＨ２）−ＣＯＮＨ−および−ＣＯＮＨ−（ＣＨ（ＣＨ２）３−ＮＨ−Ｃ＝ＮＨ（ＮＨ２））−ＣＯＮＨ−で表される基がより好ましい。
【００３６】
本発明の化合物において、ペニシリン骨格、Ｘ、Ｒ１およびＬ１は、１か所以上の不斉中心を有することもあり、それゆえ、式（Ｉ）の化合物および式（ＩＩ）の化合物はラセミ体または純粋な立体異性体として存在してもよい。
【００３７】
本発明の化合物において、低級アルキル基とは、炭素数１〜６のものが挙げられる。具体的には、低級アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｉ−ペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ｔ−ペンチル基、２−メチルブチル基、ｎ−ヘキシル基、１−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、４−メチルペンチル基、１−エチルブチル基、２−エチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、３，３−ジメチルブチル基、および１−エチル−１−メチルプロピル基などの直鎖状または分岐状のアルキル基を挙げることができ、好適には炭素数１〜３のものが挙げられる。
【００３８】
本発明の化合物において、低級アルキルオキシカルボニルオキシで置換された低級アルキル基とは、例えば、エトキシカルボニルオキシ（メチル）メチル等が挙げられ、中でもエトキシカルボニルオキシ（メチル）メチルが好ましい。
【００３９】
本発明において、式（Ｉ）の化合物の塩は、式（Ｉ）の化合物と、酸または塩基との塩であってもよい。また、式（ＩＩ）の化合物の塩は、式（ＩＩ）の化合物と、酸または塩基との塩であってもよい。そのような塩としては、例えばナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などの無機塩基との塩、及びトリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンアミンなどの有機アミン塩、及び塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸塩、及びギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、酒石酸などの有機カルボン酸塩、及びメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などのスルホン酸付加塩、及びアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの塩基性又は酸性アミノ酸といった塩基との塩又は酸付加塩が挙げられる。
【００４０】
本発明において、式（Ｉ）の化合物は、溶媒和物の形をとることもありうるが、これも本発明の範囲に含まれる。溶媒和物としては、好ましくは、水和物及びエタノール和物が挙げられる。
【００４１】
本発明の蛍光標識する方法において用いられる式（Ｉ）の化合物は、従来技術における公知文献を参考に自家製造してもよいし、市販で入手してもよい。
【００４２】
本発明の蛍光標識する方法において用いられる、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質を得ることは、例えば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で融合タンパク質を発現させること、又は、発現した融合タンパク質を単離することを含んでもよい。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、標識対象タンパク質をコードするポリヌクレオチド、変異型βラクタマーゼをコードするポリヌクレオチド等を用い、通常の方法に従い、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを調製することができる。
【００４３】
本発明の蛍光標識する方法において、前記融合タンパク質と、式（ＩＩ）の化合物とを反応させる工程は、融合タンパク質を発現する細胞内や生体内で行ってもよく、単離した融合タンパク質を用いてin vitroで行ってもよい。標識をin vitroで行う場合、例えば、緩衝液中（ｐＨ６．８〜７．４）で２０〜３７℃の温度で行ってもよい。
【００４４】
本発明のタンパク質を蛍光標識する方法において、融合タンパク質における変異型βラクタマーゼのアミノ酸配列は、
（ｉ）配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式（ＩＩ）で表わされる記化合物のβ−ラクタム環を開環させ、かつ、前記化合物のβ−ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列、及び、
（ｉｉｉ）配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、かつ、前記化合物のβ−ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列であるのが好ましい。
【００４５】
本発明の蛍光標識する方法は、変異型β−ラクタマーゼを利用する。β−ラクタマーゼは細菌酵素であり、哺乳類細胞中には存在しないため、内在性タンパク質をラベル化することは無い。従って、本発明のタンパク質を蛍光標識する方法は、内在性タンパク質ではなく対象タンパク質を選択的にラベル化することができる。
【００４６】
本発明の蛍光標識する方法において用いられる、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質を得ることは、例えば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で融合タンパク質を発現させること、又は、発現した融合タンパク質を単離することを含んでもよい。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、標識対象タンパク質をコードするポリヌクレオチド、変異型βラクタマーゼをコードするポリヌクレオチド等を用い、通常の方法に従い、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを調製することができる。
【００４７】
本発明は、また、前記式（Ｉ）で表わされる化合物を含む本発明の方法に用いるための組成物である。
【００４８】
【化８】
2012105596.tif 000010
【００４９】
Ｘは、蛍光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ1は、低級アルキルオキシカルボニルオキシで置換された低級アルキル基または、３−オキシ−１，３−ジヒドロイソベンゾフラン−１−イルである。
【００５０】
本発明は、または、本発明の蛍光標識する方法に用いるためのプラスミドまたはベクターであって、
前記プラスミドまたはベクターは、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
前記プラスミド又はベクターは、
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列、
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列の１〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質において式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のβ−ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び、
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、前記融合タンパク質において式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のβ−ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、からなる群から選択される塩基配列を含む。
【００５１】
また、本発明は、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩を含む本発明の方法に用いるための組成物と、本発明の方法に用いるためのプラスミドまたはベクターとを含むタンパク質の蛍光標識方法用キットである。
【００５２】
本発明のタンパク質の蛍光標識方法用キットは、さらに、前記プラスミド又はベクターを導入するための宿主細胞、キットの取り扱い説明書を含むのが好ましい。
【００５３】
本発明の蛍光標識する方法、組成物、およびキットにおいて、一般式（Ｉ）で表わされる化合物としては、Ｘが下記式（ｉ）に示す基、式（ｉｉ）に示す基または式（ｉｉｉ）に示す基:
【００５４】
【化９】
2012105596.tif 000011
【００５５】
であり、Ｌ１が−（ＣＨ２）ｎ１ＣＯＮＲ３（ＣＨ２）ｎ３ＣＯＮＲ２（ＣＨ２）ｎ２−または−（ＣＨ２）ｎ１ＣＯＮＲ３（ＣＨ２）ｎ３（ＣＨＲ４）ｎ４ＣＯＮＲ２（ＣＨ２）ｎ２−（前記式中、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４はそれぞれ、０または１〜５の整数であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ、水素原子、低級アルキル基、アミノもしくはグアニジンで置換された低級アルキル基またはフェニル基である。）
であり、Ｒ１は低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキル基である化合物が好ましく、下記化合物ＲＢ、化合物ＦＢ−ＤＡ、ＣＢおよび化合物ＣＢ−ＭＡがより好ましい。
【００５６】
【化１０】
2012105596.tif 000012
【００５７】
また、本発明の蛍光標識する方法、組成物、およびキットにおいて、一般式（ＩＩ）で表わされる化合物としては、Ｘが下記式（ｉ）に示す基：
【００５８】
【化１１】
2012105596.tif 000013
【００５９】
であり、Ｌ１が−（ＣＨ２）ｎ１ＣＯＮＲ３（ＣＨ２）ｎ３ＣＯＮＲ２（ＣＨ２）ｎ２−または−（ＣＨ２）ｎ１ＣＯＮＲ３（ＣＨ２）ｎ３（ＣＨＲ４）ｎ４ＣＯＮＲ２（ＣＨ２）ｎ２−（前記式中、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４はそれぞれ、０または１〜５の整数であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ、水素原子、低級アルキル基、アミノもしくはグアニジンで置換された低級アルキル基またはフェニル基である。）
であり、Ｒ１は低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキル基である化合物が好ましく、下記化合物ＲＡがより好ましい。
【００６０】
【化１２】
2012105596.tif 000014
【００６１】
また、本発明は、一般式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩である。
【００６２】
【化１３】
2012105596.tif 000015
【００６３】
前記式（Ｉ）中、
Ｘは、蛍光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ1は、低級アルキルオキシカルボニルオキシで置換された低級アルキル基または、３−オキシ−１，３−ジヒドロイソベンゾフラン−１−イルである。
【００６４】
前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物としては、Ｘが前記式（ｉ）に示す基、式（ｉｉ）に示す基または式（ｉｉｉ）に示す基であり、Ｌ１が−（ＣＨ２）ｎ１ＣＯＮＲ３（ＣＨ２）ｎ３ＣＯＮＲ２（ＣＨ２）ｎ２−または−（ＣＨ２）ｎ１ＣＯＮＲ３（ＣＨ２）ｎ３（ＣＨＲ４）ｎ４ＣＯＮＲ２（ＣＨ２）ｎ２−（前記式中、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４はそれぞれ、０または１〜５の整数であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ、水素原子、低級アルキル基、アミノもしくはグアニジンで置換された低級アルキル基またはフェニル基である。）であり、Ｒ１は低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキル基である化合物が好ましく、前記化合物ＲＢ、化合物ＦＢ−ＤＡ、ＣＢおよび化合物ＣＢ−ＭＡがより好ましい。
【００６５】
なお、前記化合物ＦＢ−ＤＡは、細胞内へ移動した後、細胞内エステラーゼにより以下の部分（式中、矢印で示した）が加水分解されると考えられる。
【００６６】
【化１４】
2012105596.tif 000016
【００６７】
化合物ＦＢ−ＤＡにおける蛍光性基は、アニオン性水酸基がアセチル基で保護されているため、蛍光は抑制されている。しかし、この加水分解により脱保護されると、化合物ＦＡが生成し、蛍光は回復する。その結果、細胞内エステラーゼにより加水分解された化合物ＦＡは、細胞内で蛍光を生じることができる。
【００６８】
式（Ｉ）の化合物は、下記式で表わされるバカンピシリンを出発原料とし、従来技術における公知文献ならびに化合物ＲＢおよび化合物ＣＢ−ＭＡの製造方法を参考にすることにより、製造することができる。
【００６９】
【化１５】
2012105596.tif 000017
【００７０】
［実施例］
本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＷＳＣＤ・ＨＣｌ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＨＥＰＥＳ：４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
ＤＭＥＭ：ダルベッコ変法イーグル培地
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
ＨＢＳＳ：ハンクス平衡塩
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＴＢＳＴ：トリス緩衝塩水トゥィーン２０（Tris-Buffered Saline Tween 20）
ＤＩＣ：Differential Interference Contrast Microscopic Image（微分干渉顕微鏡像）。
【００７１】
［化合物および機器］
化合物は、入手できる最も高いグレードのものであり、東京化成工業株式会社、和光純薬工業株式会社、およびシグマ−アルドリッチジャパン株式会社から購入して、さらなる精製を行わずに用いた。抗βラクタマーゼ抗体は、ミリポア（Millipore）から購入し、抗βアクチンはシグマから購入した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合２次抗体は、GEヘルスケアから購入した（抗ウサギＮＡ９３４、抗マウスＮＡ９３１）。ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬は、ＧＥヘルスケアから購入した（ＲＰＮ２１０９）。ｌｅｉｂｏｖｉｔｚの培地とｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターはインビトロジェンから購入した（２１０８３−０２７）。エステラーゼはシグマから購入した（Ｅ２８８４）。制限エンドヌクレアーゼおよびＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳＤＮＡポリメラーゼはタカラバイオ株式会社から購入した。プラスミドDNAは、QIAprep Spin Miniprep kit（商品名）(株式会社キアゲン)を用いて単離した。５（６）−カルボキシテトラメチルローダミン−スクシンイミジルエステルは、インビトロジェンから購入した（Ｃ１１７１）。
【００７２】
ＮＭＲスペクトルは、１Ｈ用には４００ＭＨｚで、１３ＮＭＲ用には１００．４ＭＨｚで、テトラメチルシランを内部標準として用い、ＪＥＯＬ  ＪＮＭ−ＡＬ４００装置で測定した。質量スペクトルは、Waters LCT-Premier XE（日本ウォーターズ株式会社）で測定した。蛍光スペクトルは、日立分光蛍光光度計Ｆ−４５００を用いて測定した。ＵＶ−可視吸収スペクトルは、紫外可視分光光度計ＵＶ１６５０ＰＣスペクトロメーター（株式会社島津製作所）を用いて測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの蛍光イメージは、ローダミン誘導体については、ＢＳＰＥＢＶ００１ＥｔＢｒビューワー（Biospeed）を用いて可視化した。
【００７３】
［ＨＰＬＣ分析］
ＨＰＬＣ分析を、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  （４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）カラム（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）、ポンプ（ＰＵ−２０８０，  ＪＡＳＣＯ）および検出器（ＭＤ−２０１０またはＦＰ−２０２０，  ＪＡＳＣＯ）からなるＨＰＬＣシステムを用いて、行った。分離ＨＰＬＣは、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（１０．０ｍｍ×２５０ｍｍ）カラム（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）、ポンプ（ＰＵ−２０８７，  ＪＡＳＣＯ）および検出器（ＵＶ−２０７５，  ＪＡＳＣＯ）からなるＨＰＬＣシステムを用いて行った。
【００７４】
［蛍光顕微鏡検査］
蛍光顕微鏡画像は、ＩＸ７１蛍光顕微鏡（オリンパス）、クール・スナップ・ＨＱ冷却（Ｃｏｏｌ  Ｓｎａｐ  ＨＱ  ｃｏｏｌｅｄ）ＣＣＤカメラ（Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＵＳＨ−１０３ＯＬ水銀ランプ（オリンパス）を用いて記録した。用いたフィルターセットは、化合物ＲＢ用に、オリンパスＢＰ５１０−５５０、ＤＭ５７５およびＢＡ５７５−６２５であった。メタモルフ・イメージング・ソフトウェア（ＭｅｔａＭｏｒｐｈ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、イメージングとデータ解析に用いた。共焦点顕微鏡については、共焦点レーザー蛍光顕微鏡ＦＶ１０ｉを用いた（オリンパス）。励起光はＦＡ，ＦＢの場合は４７３ nm、ＲＢの場合は５５９nmの光をそれぞれ用いた。また、用いた吸収フィルターセットは、ＦＡ、ＦＢについてはオリンパスＢＡ４９０−５４０、化合物ＲＢについてはＢＡ５７０−６２０であった。
【００７５】
［Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−ＢＬプラスミドの構築］
ＢＬのＤＮＡフラグメントは、ＢＬ−ＥＧＦＲプラスミド（特開２０１０−１１９３８２号公報；S. Mizukami, S. Watanabe, Y. Hori, K. Kikuchi, J. Am. Chem. Soc.2009, 131, 5016−5017）からＰＣＲにより、増幅させ、ＮｈｅｌおよびＨｉｎｄｌｌｌを用いて消化させた。ＤＮＡフラグメントは、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）にライゲーションさせ、それを同じ制限酵素を用いて消化させて、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＢＬ（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−ＢＬ）を得た。
【００７６】
［ＢＬ−ＮＬＳプラスミドの構築］
ＮＬＳオリゴＤＮＡを市販のオリゴヌクレオチド（配列番号９および配列番号１０：  Ｇｅｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｉｎｃ．）から増幅させ、ＨｉｎｄｌｌｌおよびＢａｍＨｌを用いて消化させた。その後、Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−ＢＬプラスミドをＨｉｎｄｌｌｌおよびＢａｍＨｌを用いて消化させた。消化されたＮＬＳオリゴＤＮＡは、消化されたＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−ＢＬプラスミドにライゲーションさせ、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＢＬ−ＮＬＳ  （ＢＬ−ＮＬＳ）を得た。
【００７７】
［化合物ＲＢのエステラーゼ活性］
エステラーゼ反応溶液（５ユニット／ｍＬ）を１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で調製した。化合物ＲＢストック溶液（ＤＭＳＯ中１ｍＭ）をエステラーゼ反応溶液へ添加した（最終濃度：１０μＭ）。反応混合物を２５℃で１０分間インキュベートし、その後、反応性生物を逆相ＨＰＬＣで分析した。
【００７８】
［Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−ＢＬおよびＢＬ−ＮＬＳを化合物ＲＢによりラベル化］
３７℃５％ＣＯ２雰囲気下でＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１０％ＦＢＳ中に保持されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−ＢＬまたはＢＬ−ＮＬＳをコードするプラスミドを用いて形質移入した。５〜６時間後、培地をＤＭＥＭ（フェノール・レッド無し）と置き換え、その細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。その細胞を次いで、ＨＢＳＳを用いて一度洗浄し、化合物ＲＢ（５ｎＭ〜１００ｎＭ）と共に３７℃で１５分間インキュベートした。未反応プローブを洗浄した後、細胞の蛍光イメージを適切なフィルターセットを用いて、ＨＢＳＳ中で撮影した。
【００７９】
［ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で発現したＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−ＢＬ、ＢＬ−ＮＬＳおよびＢＬ−ＥＲのウエスタンブロット分析］
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、リポフェクタミン２０００を用いてＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−ＢＬもしくはＢＬ−ＮＬＳを、またはＢＬ−ＥＲ用いて形質移入した。５〜６時間後、培地をＤＭＥＭと置き換え、その細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。その細胞を次いで、ＰＢＳ（−）を用いて洗浄し、２００μＬの１×ＳＤＳゲル・ローディング緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）、１．３％ＳＤＳ、１０％グリセロールおよび５％メルカプトエタノール）を用いて、溶解させた。かき取った後、溶解産物を９５℃で３分間沸騰させた。次いで、サンプルを７．５％または１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、ウェスタンブロット用のＰＶＤＦ膜に移した。膜を５％スキムミルクを含むＴＢＳＴ緩衝液（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、１３８ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．６）を用いて室温で１時間インキュベーションすることにより、ブロックした。その後、抗βラクタマーゼ（１：５０００希釈）または抗βアクチン（１：５０００希釈）抗体を各膜に加えた。１６時間４℃で振とうしながらインキュベーションした後、膜をＴＢＳＴ緩衝液で３回洗浄し、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合２次抗体と共にインキュベートし、ＴＢＳＴ緩衝液で洗浄し、ＥＣＬウェスタンブロット検出試薬を用いて視覚化させた。
【実施例１】
【００８０】
［化合物ＲＢの製造］【００８１】
【化１６】
2012105596.tif 000018
【００８２】
バカンピシリン塩酸塩（７１  ｍｇ，１４０μｍｏｌ）をＤＭＦ（５００μＬ）中に溶解させた。ＴＥＡ（２９ｍｇ，２８０μｍｏｌ）と５（６）−カルボキシテトラメチルローダミン−スクシンイミジルエステル（１５ｍｇ，２８μｍｏｌ）をその後室温で加えた。その混合物を１６時間攪拌し、溶媒を凍結乾燥した。残渣を、０．１％ギ酸を含むＨ２Ｏ／アセトニトリルで溶出して逆相ＨＰＬＣにより精製して、化合物ＲＢ（６ｍｇ，収率２４％）を得た。【００８３】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.23 (t, 3H, J = 7.3 Hz), 1.40−1.48 (m, 9H), 2.95 (s, 12H), 4.14 (q, 2H, J = 7.3 Hz), 4.25 (s, 1H), 5.40 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 5.57 (dd, 1H J = 3.9, 9.3 Hz), 5.63 (d, 1H, J = 6.4 Hz), 6.29−6.53 (m, 7H), 6.68 (q, J = 5.4 Hz, 1H), 7.16 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 7.27−7.41 (m, 5H), 7.59 (d, 1H, J = 5.8 Hz), 8.05 (dd, 1H, J = 1.5, 7.8 Hz), 8.33 (s, 1H); 
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 14.1, 19.5, 26.8, 31.0, 40.2, 57.9, 58.6, 64.8, 67.7, 70.2, 70.3, 92.2, 98.4, 106.3, 108.9, 109.0, 123.5, 124.9, 127.5, 128.6, 128.8 (２つの炭素), 129.0 (２つの炭素), 133.8, 135.2, 136.9, 152.4, 152.9, 153.1, 165.4, 165.7, 168.9, 169.4, 172.9; 
HRMS (ESI+) m/z: 878.3094 ([M+H]+について計算値: 878. 3077)。
【実施例２】
【００８４】
［化合物ＦＢ−ＤＡの製造］【００８５】
【化１７】
2012105596.tif 000019
【００８６】
＜ＦＢの製造＞
バカンピシリン塩酸塩（５６６ｍｇ，１．１３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２．５ｍＬ）中に溶解させた。ＴＥＡ（１１４ｍｇ，１．１３ｍｍｏｌ）と６−カルボキシフルオレセイン−スクシンイミジルエステル（１０７ｍｇ，２２５μｍｏｌ）をその後０℃で加えた。その混合物を２２時間攪拌し、その混合物へ酢酸エチルを加えた。有機相を１０％クエン酸水溶液および水、次いで飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。有機溶媒を有機相から除去した後、残渣を、ジクロロメタンとメタノールの混合溶媒で溶出してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物ＦＢ（６１ｍｇ，収率３２％）を得た。【００８７】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.21(t, 3H, J = 7.2 Hz), 1.34−1.52(m, 9H), 4.15(q, 2H), 4.31(s, 1H), 5.44(d, 1H, J = 4 Hz), 5.54(dd, 1H, J = 4.0, 7.0 Hz), 5.86(d, 1H, J = 7.6 Hz), 6.55−6.58(m, 7H), 7.27−7.43(m, 5H), 7.83(s, 1H), 8.07(d, 1H, J = 8.4 Hz), 8.23(d, 1H, J = 8.4 Hz), 9.11(d, 1H, J = 7.0 Hz), 9.21(d, 1H, J = 7.6 Hz), 10.14(s, 2H) ;
HRMS (FAB+) m/z: 824.2105 ([M+H]+について計算値:824.2047)。【００８８】
＜ＦＢ−ＤＡの製造＞
ＦＢ（３０ｍｇ，３６．４μｍｏｌ）を、アセトニトリル（２ｍＬ）中に溶解させ、その溶液中へ、炭酸セシウム（４９ｍｇ，１５３μｍｏｌ）および無水酢酸のジクロロメタン溶液（１０９μＬ，１０９μｍｏｌ）を、室温で添加した。得られた混合物を２５℃で２時間攪拌し、その混合物へ酢酸エチルを加えた。有機相を１０％クエン酸水溶液および水、次いで飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。有機溶媒を有機相から除去した後、残渣を、ジクロロメタンとメタノールの混合溶媒で溶出してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物ＦＢ−ＤＡ（１５ｍｇ，収率４６％）を得た。【００８９】
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.26−1.56(m, 12H), 2.32(s, 6H), 4.18−4.24(m, 3H), 5.30−5.42(m, 2H), 5.59(d, 1H, J = 6.8 Hz), 6.73−6.87(m, 7H), 7.29−7.37(m, 5H), 7.55(s, 1H), 8.01(d, 1H, J = 8.4 Hz), 8.06(d, 1H, J = 8.4 Hz) ; 
HRMS (FAB+) m/z: 908.2312 ([M+H]+について計算値: 908.2258)。【００９０】
［参考例］
化合物ＦＡ、ＲＡは、Multicolor Protein Labeling in Living Cells Using Mutant β-lactamase-Tag Technology; Watanabe, S.; Mizukami, S.; Hori, Y.; Kikuchi, K. Bioconjug. Chem. 2010, 21, DOI: 10.1021/bc100333k.に従い製造した。【００９１】
【化１８】
2012105596.tif 000020
【実施例３】
【００９２】
［化合物ＣＢ−ＭＡの製造］【００９３】
【化１９】
2012105596.tif 000021
【００９４】
＜化合物２の合成＞
カルボン酸１（１２９ｍｇ，６２６μｍｏｌ）のＤＭＦ（２．６ｍＬ）溶液にＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（１０９ｍｇ，９４７μｍｏｌ）を加え、０℃に冷却した。そこにＷＳＣＤ・ＨＣｌ（１８０ｍｇ，９３９μｍｏｌ）を加え、０℃で１１時間撹拌した。酢酸エチル（１０ｍＬ）で希釈した後、１０％クエン酸水溶液（１０ｍＬ）で洗浄した。次いで、水（１０ｍＬ）で洗浄後、飽和食塩水（１０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去することで、スクシンイミジルエステル２（６３．８ｍｇ，２１０μｍｏｌ，３４％）を得た。なお、カルボン酸１は、Alvim, Jr. J.; Dias, R. L. A.; Castilho, M. S.; Oliva, G.; Correa, A. G. J. Braz. Chem. Soc., 2005, 16, 763-773.に従い製造した。【００９５】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)
δ 11.46 (s, 1H), 9.02 (s, 1H), 7.88 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.90 (dd, J = 8.8, 2.0 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 2.88 (s, 4H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)
δ 170.4, 165.8, 158.8, 158.1, 155.7, 152.8, 133.3, 114.6, 110.5, 106.4, 102.0, 25.6;
HRMS (FAB+) m/z: 304.0457 ([M+H]+について計算値: 304.0451)。【００９６】
＜化合物ＣＢの製造＞
バカンピシリン塩酸塩（７５．４ｍｇ，１５０μｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液を０℃に冷却した後、ＤＩＰＥＡ（３８μＬ，２１８μｍｏｌ）、スクシンイミジルエステル２（２９．６ｍｇ，９７．６μｍｏｌ）を加え、０℃で１６時間撹拌した。１０％クエン酸水溶液（１ｍＬ）を加え、１０分間撹拌した後、酢酸エチル（５×５ｍＬ）で抽出した。次いで１０％クエン酸水溶液（２５ｍＬ）で洗浄後、水（２５ｍＬ）および飽和食塩水（２５ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去することで、化合物ＣＢ（６１．９ｍｇ，９４．７μｍｏｌ，９７％）を得た。なお、この反応は、 Mizukami, S.; Watanabe, S.; Hori, Y.; Kikuchi, K. J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 5016-5017.を参考にして行った。細胞試験には化合物ＣＢ（３０．２ｍｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝９９：１）でさらに精製したもの（２７．６ｍｇ）を供した。【００９７】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)
δ 11.14 (brs, 1H), 9.62 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 9.41 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 8.79 (s, 1H), 7.82 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.45-7.43 (m, 2H), 7.37-7.27 (m, 3H), 6.88 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.72-6.66 (m, 1H), 5.91 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 5.60 (ddd, J = 8.0, 8.0, 4.0 Hz, 1H), 5.45 (dd, J = 4.0, 2.8 Hz,1H), 4.37 (d, J = 21.6 Hz, 1H), 4.19-4.13 (m, 2H), 1.54 (s, 3H), 1.48 (t, J = 5.6 Hz, 3H), 1.38 (s, 3H), 1.23-1.19 (m, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)
δ 173.5, 173.2, 169.7, 165.7, 165.6, 164.0, 161.3, 160.8, 156.5, 152.4, 152.3, 148.6, 138.2, 132.2, 128.5, 127.8, 126.6, 114.5, 113.0, 111.1, 101.9, 92.1, 92.0, 69.8, 69.5, 67.3, 67.1, 64.4, 64.1, 64.0, 58.5, 58.0, 55.6, 30.4, 29.4, 26.3, 19.2, 13.9;
HRMS (FAB+) m/z: 654.1731 ([M+H]+について計算値: 654.1758);【００９８】
＜化合物ＣＢ−ＭＡの製造＞
化合物ＣＢ（２９．２ｍｇ，４４．７μｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（０．２６ｍＬ）溶液にＥｔ３Ｎ（８．７５μＬ，６２．８μｍｏｌ）を加え、０℃に冷却した。そこにＡｃ２Ｏ（５．１μＬ，５４．０μｍｏｌ）を加え、室温で３時間半撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）で希釈し、０℃に冷却後、飽和塩化アンモニウム水溶液（１ｍＬ）を加え、反応を停止した。有機層を回収し、水層については、さらにＣＨ２Ｃｌ２（３×３ｍＬ）で抽出した。次いで飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。この粗精製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３）で精製することで化合物ＣＢ−ＭＡ（２４．７ｍｇ，３５．５μｍｏｌ，７９％）を得た。なお、この反応は、Zhao, Y.; Zheng, Q.; Dakin, K.; Xu, K.; Martinez, M. L.; Li, W-H. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 4653-4663.を参考にして行った。【００９９】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)
δ 9.63 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 9.43 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 8.88 (s, 1H), 8.04 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.47-7.43 (m, 3H), 7.37-7.25 (m, 4H), 6.71-6.61 (m, 1H), 5.92 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 5.60 (ddd, J = 7.6, 7.6, 4.0 Hz, 1H), 5.45 (dd, J = 4.2, 2.6 Hz,1H), 4.38 (d, J = 21.2 Hz, 1H), 4.19-4.13 (m, 2H), 2.33 (s, 3H), 1.54 (s, 3H), 1.48 (t, J = 5.6 Hz, 3H), 1.38 (s, 3H), 1.23-1.19 (m, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)
δ 173.5, 173.1, 169.6, 168.7, 165.7, 165.6, 160.6, 160.3, 154.7, 154.7, 152.4, 152.3, 147.6, 138.1. 131.4, 128.5, 127.9, 126.7, 119.6, 117.6, 116.4, 110.0, 92.1, 92.0, 79.2, 69.8, 69.5, 67.3, 67.1, 64.5, 64.4, 64.1, 64.0, 58.5, 58.1, 55.7, 30.4, 29.4, 26.3, 20.9, 19.2, 13.9;
HRMS (FAB+) m/z: 696.1851 ([M+H]+について計算値: 696.1863);【０１００】
［蛍光分析］
励起光および蛍光の両方について、スリット幅は２．５ｎｍであり、光電子倍増管電圧は７００Ｖであった。化合物ＲＢ、化合物ＲＡ、化合物ＦＡ、化合物ＦＢ、化合物ＣＢおよび化合物ＣＢ−ＭＡをＤＭＳＯ中に溶解して、１０ｍＭストック溶液を調製し、これらの溶液を適切な水性緩衝液を用いて所望の最終濃度まで希釈した。化合物ＲＢおよび化合物ＲＡの相対的蛍光量子収率を、サンプルの蛍光スペクトル下面積を、０．５μＭのローダミンＢ（５４５ｎｍで励起したときに、０．９７の量子効率である）のＥｔＯＨ溶液の蛍光スペクトル下面積と比較することにより得た。化合物ＦＡおよび化合物ＦＢの相対的蛍光量子収率を、サンプルの蛍光スペクトル下面積を、フルオレセイン（４９２ｎｍで励起したときに、０．８５の量子効率である）の１００ｍＭのＮａＯＨ水溶液の蛍光スペクトル下面積と比較することにより得た。また、緩衝液中の化合物ＣＢおよびＥｔＯＨ中の化合物ＣＢ−ＭＡの絶対的蛍光量子収率を得た。得られた結果を表１に示す。【０１０１】
【表１】
2012105596.tif 000022
【０１０２】
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中化合物ＲＢの吸収および蛍光スペクトルを図１（１）に示す。吸収スペクトル測定では、化合物ＲＢの濃度は５μＭであり、蛍光スペクトル測定では、化合物ＲＢの濃度は０．５μＭであった。励起波長は５５５ｎｍであった。図１（１）に示すように、化合物ＲＢは、化合物ＲＡと同様のスペクトル特性を示した。従って、アンピシリンのカルボキシ基をエステル化したことにより、蛍光体のスペクトル特性には影響は無かった。【０１０３】
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中化合物ＦＢの吸収および蛍光スペクトルを図１（２）に示す。吸収スペクトル測定では、化合物ＦＢの濃度は５μＭであり、蛍光スペクトル測定では、化合物ＦＢの濃度は０．５μＭであった。励起波長は４９２ｎｍであった。図１（２）に示すように、化合物ＦＢは、化合物ＦＡと同様のスペクトル特性を示した。従って、アンピシリンのカルボキシ基をエステル化したことにより、蛍光体のスペクトル特性には影響は無かった。【０１０４】
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中化合物ＦＢ−ＤＡの吸収および蛍光スペクトルを図１（３）に示す。吸収スペクトル測定では、化合物ＦＢ−ＤＡの濃度は５μＭであり、蛍光スペクトル測定では、化合物ＦＢの濃度は０．５μＭであった。図１（３）に示すように、化合物ＦＢ−ＤＡは、フルオレセインがアセチル化され、ラクトン環を形成しているため、吸収および蛍光はほとんど無かった。【０１０５】
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中化合物ＣＢの吸収および蛍光スペクトルを図１（４）に、エタノール中化合物ＣＢ−ＭＡの吸収および蛍光スペクトルを図１（５）に示す。吸収スペクトル測定では、化合物ＣＢおよび化合物ＣＢ−ＭＡの濃度はそれぞれ１０μＭであり、蛍光スペクトル測定では、化合物ＣＢおよび化合物ＣＢ−ＭＡの濃度はそれぞれ０．１μＭであった。励起波長は４０６ｎｍであった。図１（４）および図１（５）に示すように、化合物ＣＢ−ＭＡは、クマリンのヒドロキシ基をアセチル化したことにより、蛍光体のスペクトル特性に影響は無かった。【０１０６】
＜エステラーゼ添加による、化合物ＲＢのエトキシカルボニルオキシエチルエステルの加水分解＞
化合物ＲＢを細胞内に導入した際、化合物ＲＢは、細胞内エステラーゼにより加水分解され、対応する化合物ＲＡに変換された。化合物ＲＢがエステラーゼにより化合物ＲＡへ変換することを確認するため、化合物ＲＢを試験管内の１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中のエステラーゼで処理し、反応生成物をＨＰＬＣで分析した。エステラーゼの添加により、化合物ＲＢの保持時間は１０分以内にシフトし（図２参照）、対応する生成物の質量スペクトルは化合物ＲＡの質量スペクトル（［Ｍ＋Ｈ］＋：７６２．３）と同様であった。一方、化合物ＲＢは、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中で１２０℃で１２０分間インキュベートした後でさえも、エステラーゼ非存在下で非常に安定であった。図３中、下段のチャートはインキュベート前の化合物ＲＢのチャートであり、上段のチャートはインキュベート後の化合物ＲＢのチャートである。溶離液：（Ａ）０．１％ギ酸／水、（Ｂ）０．１％ギ酸／アセトニトリル。（Ａ）の割合は、０分から２５分で１０％まで減少させた。流速は１ｍＬ／分であり、溶出液は５５０ｎｍで吸収をモニターした。図３中、「Ｉ」は、規格化吸収強度である。【０１０７】
＜化合物ＲＡの細胞透過性と比較した化合物ＲＢの細胞透過性＞
化合物ＲＢの細胞透過性と化合物ＲＡの細胞透過性を比較した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５μＭの化合物ＲＡまたは化合物ＲＢ溶液と共にＣＯインキュベータ中で３０分間インキュベートした。その後、染料を２回洗浄して、細胞からの蛍光を共焦点顕微鏡により測定した。その結果、強い蛍光が、化合物ＲＢと共にインキュベートした細胞に確認され、その蛍光は少なくとも１８０分間持続した。一方、化合物ＲＡと共にインキュベートした細胞には、ほとんど蛍光は確認できなかった。細胞の蛍光分析の結果を図４に示す。蛍光分析画像は、５５９ｎｍにおいて励起したものである。スケールバーは２０μｍを示す。図４中、「ＤＩＣ」は、Differential Interference Contrast Microscopic Image（微分干渉顕微鏡像）を、「Fluorescence」は蛍光分析画像を意味する。この結果により、化合物ＲＢはＣ３位のカルボキシ基のエステル化により十分な細胞透過性を有することが確認できた。細胞内に入ったあと、化合物ＲＢは迅速に加水分解され、生じたカルボキシ基の負の荷電により、細胞内に留まる。【０１０８】
＜化合物ＲＢによる細胞内ＢＬ−ｔａｇ融合タンパク質の蛍光ラベル化＞
まず、ＢＬ−ｔａｇ遺伝子を哺乳類発現ベクターにライゲートした。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、βラクタマーゼの非修飾コード領域は、ペリプラスム中に分泌するためのシグナルペプチド配列を含む（R. P. Ambler, G. K. Scott, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1978, 75, 3732−3736）。ＢＬタンパク質の細胞内形態を生成するため、そのシグナル配列を除去し、イニシエーター・メチオニンと置き換えた。さらに、発現レベルを増強するため、真核生物における最適翻訳効率用のコンセンサス配列を、イニシエーター・コドンに隣接して添加した（M. Kozak, J. Cell Biol., 1991, 115, 887-903.）。修飾したＢＬ−ｔａｇ遺伝子を哺乳類発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１（＋））へ挿入し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＢＬ（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ＢＬ）を生じた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に細胞質ＢＬをコードするプラスミドをトランスフェクトし、化合物ＲＢと共にインキュベートして、トランスフェクトされた細胞の細胞質ゾルを赤色蛍光でラベルした（図５）。図５中、「ＤＩＣ」は、Differential Interference Contrast Microscopic Image（微分干渉顕微鏡像）を、「Fluorescence」は蛍光分析画像を意味する。「ＢＬ−ＣＹＴＯ」は、修飾したＢＬ−ｔａｇ遺伝子を哺乳類発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１（＋））へ挿入したサンプルを、「Empty vector」は、哺乳類発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１（＋））自体のサンプルを意味する。図５に示すように、ＢＬ−ｔａｇ融合タンパク質は、哺乳類細胞中で発現し、化合物ＲＢでラベル化されることが確認できた。【０１０９】
蛍光ラベルを測定するのを容易にするため、ＢＬ−ｔａｇを３つの連続サル・ウィルス４０（ＳＶ４０）大Ｔ抗原核局在化配列（ＮＬＳ）（D. Kalderon, B. L. Roberts, W. D. Richardson, A. E. Smith, Cell, 1984, 39, 499−509.）に融合し、ＢＬ−ＮＬＳプラスミドを得ることにより、哺乳類細胞の核をラベル化した。ＢＬ−ＮＬＳおよび細胞質ＢＬのタンパク質発現は、ウエスタンブロット分析により確認した。図６参照。図６中、「WB：anti-β-lactamase」は抗ベータラクタマーゼ抗体を用いたウエスタンブロットを意味し、「WB:anti-β-actin」は、抗ベータアクチン抗体を用いたウエスタンブロットを意味し、「１．ＢＬ−ＣＹＴＯ」は、修飾したＢＬ−ｔａｇ遺伝子を哺乳類発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１（＋））へ挿入したサンプルを意味し、「２．ＢＬ−ＮＬＳ」は、修飾したＢＬ−ｔａｇ遺伝子を３つの連続サル・ウィルス４０（ＳＶ４０）大Ｔ抗原核局在化配列（ＮＬＳ）へ挿入したサンプルを意味し、「３．Empty vector」は、哺乳類発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１（＋））自体のサンプルを意味する。細胞質ＢＬプラスミドによりトランスフェクトされた細胞の溶解物が、抗βラクタマーゼ抗体により検出された場合、１つの太いバンドが分子量約２５ｋＤａの付近で確認できた。このバンドは、細胞質ＢＬ融合タンパク質に対応する。１つのバンドがＢＬ−ＮＬＳによりトランスフェクトされた細胞からも確認された。このバンドは、細胞質ＢＬのものより僅かに上の位置に観察された。このことは、３つの連続したＮＬＳの融合の結果、分子量が増加したことと合致した。【０１１０】
ベクター発現ＢＬ−ＮＬＳを用いてトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、化合物ＲＢ（１００ｎＭ）と共に核染色剤ヘキスト33342で１５分間インキュベートし、洗浄して、共焦点蛍光顕微鏡でイメージ化した。洗浄の後、ネガティブコントロール細胞と比較して、赤色蛍光がほとんど全てのトランスフェクトされた細胞において確認された。図７および図８参照。図７中、「phase contrast」は、位相差顕微鏡像を、「Fluorescence」は蛍光分析画像を意味する。「ＢＬ−ＮＬＳ」は、修飾したＢＬ−ｔａｇ遺伝子を３つの連続サル・ウィルス４０（ＳＶ４０）大Ｔ抗原核局在化配列（ＮＬＳ）へ挿入したサンプルを意味し、「Empty vector」は、哺乳類発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１（＋））自体のサンプルを意味する。図８中、「ａ」は位相差顕微鏡像を、「ｂ」はヘキスト蛍光画像を、「ｃ」はＲＢ蛍光画像を、「ｄ」は画像ｂと画像ｃを重ね合わせた画像を意味する。ラベル化された細胞の組み合わせ、かつ核染色試薬ヘキスト３３３４２との共染色画像（図８）から、細胞の核のみが強い蛍光シグナルを発していることが確認できた。これらの実験により、核の蛍光ラベルは、ＢＬ−ＮＬＳの共有結合ラベル化によるものであることが確認できた。ＢＬ−ＮＬＳ発現細胞を化合物ＦＡ及びＲＡ（５μＭ）ならびに化合物ＲＢ（２００ｎＭ）と共にインキュベートした場合、化合物ＦＡおよび化合物ＲＡの場合には、核の染色は確認できなかった（図１０参照）。図１０中、「ＤＩＣ」は、Differential Interference Contrast Microscopic Image（微分干渉顕微鏡像）を、「Fluorescence」は蛍光分析画像を意味する。【０１１１】
ＢＬ−ＮＬＳ発現細胞を、5 nMの化合物ＲＢと共に洗浄操作を行う事無く、インキュベートした。その結果、ＢＬ−ＮＬＳ融合タンパク質細胞は時間と共に徐々に核のラベル化が確認できた（図９）。このことにより、化合物ＲＢは加水分解により化合物ＲＡへ変換され、トラップされ、効率的に細胞内に蓄積されることが確認できた。【０１１２】
＜ＢＬ−ＮＬＳのラベル化反応の時間経過＞
洗浄工程の時間経過を確認した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＢＬ−ＮＬＳプラスミドを用いてトランスフェクトし、上記のように化合物ＲＢ（２００ｎＭ）と共にインキュベートした。インキュベートの後、その細胞をＨＢＳＳで２回洗浄し、空気中での微速度画像のため１０％ＦＢＳを含むLeibovitz’s L-15培地中でインキュベートし、その後、蛍光顕微鏡で経時的にイメージ化した（図１１参照）。図１１中、「ＤＩＣ」は、Differential Interference Contrast Microscopic Image（微分干渉顕微鏡像）を意味する。その結果、細胞核からの明確な蛍光が、培地でインキュベートして１０分後から確認できた。細胞の核は、この測定中、安定した強い蛍光を示していた。ラベル化濃度を最適化することにより、細胞内のＢＬ−ｔａｇ融合タンパク質を、より高いシグナル対ノイズ比でラベル化することができ、かつ、余分なラベル化化合物（化合物ＲＢ）を除去する洗浄工程を短くすることが可能である。【０１１３】
＜分子内および分子外ＢＬ−ｔａｇ融合タンパク質を同時にラベル化する＞
まず、２種類のプラスミド、ＢＬ−ＮＬＳとＢＬ−ＥＧＦＲを用いた。ＢＬ−ＥＧＦＲは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）とのＢＬ−ｔａｇの融合タンパク質であり、プラスミド・エンコード化ＢＬ−ＥＧＦＲを用いてトランスフェクトすることにより、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞表面において融合タンパク質ＢＬ−ＥＧＦＲを発現させた。【０１１４】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＢＬ−ＮＬＳプラスミドおよびＢＬ−ＥＧＦＲプラスミドと共にトランスフェクトさせた。その細胞を化合物ＲＢと化合物ＦＡと共にインキュベートした。この化合物ＦＡは、細胞非透過性な蛍光アンピシリン融合体である（S. Mizukami, S. Watanabe, Y. Hori, K. Kikuchi, J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 5016−5017; Watanabe, S.; Mizukami, S.; Hori, Y.; Kikuchi, K.Bioconjugate Chem. 2010, 21, DOI: 10.1021/bc100333k; Sadhu, K. K.; Mizukami, S.; Watanabe, S.; Kikuchi, K. Chem. Commun. 2010, 46, 7403-7405.参照）。その後、共焦点蛍光顕微鏡を用いたイメージングの前に細胞を洗浄し、細胞膜と細胞核において、融合タンパク質が正確に局在化していることを確認した。化合物ＦＡ由来の緑色蛍光が、細胞質膜に沿って確認でき、化合物ＲＢ由来の赤色蛍光が細胞核から確認できた（図１２参照）。図１２中、「phase contarst」は、位相差顕微鏡像を、「Fluorescence」は蛍光分析画像を意味する。【０１１５】
【化２０】
2012105596.tif 000023
【０１１６】
化合物ＲＢは、化合物ＦＡ（１００ｎＭ）と同じ濃度（１００ｎＭ）でラベル化することが可能であった。これは、化合物ＲＢがエステラーゼにより加水分解され、細胞内で効率的にトラップされていることを示す。さらに、化合物ＲＢの細胞透過性はβ−ラクタム部位の特性に拠り、蛍光体には拠らないことも確認できた。化合物ＲＢが他のアンピシリン系化合物と共に細胞外に共存していても、アンピシリン系化合物がＢＬ−ｔａｇ融合タンパク質と優先的に結合した。これはＲＢのtagによる認識がエステル保護によって大きく抑制されているためで、ＲＢは細胞内で加水分解を受けることで初めて機能を発揮するためである。従って、化合物ＲＢと他の細胞非透過性なアンピシリン系化合物を同時に、細胞内および細胞外に局在化する２種類のＢＬ−ｔａｇ融合タンパク質をラベル化することが可能である。【０１１７】
＜化合物ＦＢ−ＤＡによる細胞内ＢＬ−ｔａｇ融合タンパク質の蛍光ラベル化＞
ＢＬ−ＮＬＳを用いてトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、化合物ＦＢ−ＤＡ（１００ｎＭ）と共に１５分間インキュベートし、洗浄して、共焦点顕微鏡でイメージ化した（図１３参照）。図１３中、「phase contrast」は、位相差顕微鏡像を、「Fluorescence」は蛍光分析画像を意味する。その結果、ＦＢ−ＤＡを用いた場合は選択的に核の蛍光染色が見られた。これはＦＢ−ＤＡではそのアニオン性残基がアセチル基によって保護されているため、細胞膜を通過できるためと考えられる。なお、化合物ＦＢ−ＤＡの場合、フルオレセインのアセチル基はラクトン環を形成しているが、アンピシリンのエトキシカルボニルオキシ（メチル）メチルと同様に、細胞内エステラーゼに切断される。その結果、フルオレセインは細胞内でその蛍光を回復する。以上の結果より、プローブ膜透過性はβ−ラクタムのカルボキシル基の状態と蛍光色素の性質の両者に依存することが分かった。【０１１８】
ＢＬ−ＮＬＳ発現細胞を、５ｎＭの化合物ＦＢ−ＤＡと共に洗浄操作を行う事無く、インキュベートした。その結果、ＢＬ−ＮＬＳ融合タンパク質細胞は時間と共に徐々に核のラベル化が確認できた。このことにより、化合物ＦＢ−ＤＡは加水分解により化合物ＦＡへ変換され、トラップされ、効率的に細胞内に蓄積されることが確認できた（図１４参照）。【０１１９】
＜化合物ＣＢおよび化合物ＣＢ−ＭＡによる細胞内ＢＬ−ｔａｇ融合タンパク質の蛍光ラベル化＞
３７℃５％ＣＯ２雰囲気下でＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１０％ＦＢＳ中に保持されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＢＬ−ＮＬＳをコードするプラスミドを用いて形質移入した。その細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。その細胞を次いで、ＨＢＳＳを用いて一度洗浄し、化合物ＣＢまたは化合物ＣＢ−ＭＡ（１００ｎＭ）と共に３７℃で１５分間インキュベートした。未反応プローブを洗浄した後、細胞の蛍光イメージを適切なフィルターセットを用いて、ＨＢＳＳ中で撮影した（図１５および図１６）。【０１２０】
図１５および図１６中、「Confocal microscope」は、共焦点顕微鏡像を、「Fluorescence」は蛍光分析画像を意味する。「ＢＬ−ＮＬＳ」は、修飾したＢＬ−ｔａｇ遺伝子を３つの連続サル・ウィルス４０（ＳＶ４０）大Ｔ抗原核局在化配列（ＮＬＳ）へ挿入したサンプルを意味し、「control」はコントロールを意味する。図１５および図１６に示すように、ＢＬ−ｔａｇ融合タンパク質は、哺乳類細胞中で発現し、化合物ＣＢおよびＣＢ−ＭＡでラベル化されることが確認できた。【０１２１】
＜化合物ＦＢ−ＤＡによる化合物ＦＢ−ＤＡによる核局在ＢＬ−ｔａｇ融合タンパク質および市販試薬であるＳＮＡＰ−Ｃｅｌｌ  ＴＭＲ−Ｓｔａｒによるミトコンドリア局在ＳＮＡＰ−ｔａｇの同時蛍光ラベル化＞
３７℃５％ＣＯ２雰囲気下でＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１０％ＦＢＳ中に保持されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＢＬ−ＮＬＳプラスミドおよびＳＮＡＰ−ＣＯＸ８―２をコードするプラスミド（New England BioLabs Inc.）の両方を同時に用いて形質移入した。その細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。その細胞を次いで、ＨＢＳＳを用いて一度洗浄し、化合物ＦＢ−ＤＡ（１００ｎＭ）とＳＮＡＰ−Ｃｅｌｌ（登録商標）ＴＭＲ−Ｓｔａｒ（New England BioLabs Inc., １μＭ）と共に３７℃で１５分間インキュベートした。未反応プローブを洗浄した後、ＨＢＳＳ中で３０分インキュベーションし、細胞の蛍光イメージを適切なフィルターセットを用いて、ＨＢＳＳ中で撮影した（図１７）。【０１２２】
図１７中、（ａ）は、核局在蛋白質にラベル化されたＦＢ−ＤＡ（実際には細胞内エステラーゼによって加水分解されたもの）の蛍光画像を、（ｂ）は、ミトコンドリア局在蛋白質にラベル化されたＳＮＡＰ−Ｃｅｌｌ  ＴＭＲ−Ｓｔａｒの蛍光画像を、（ｃ）は、細胞の位相差顕微鏡画像を、（ｄ）は、（ａ）と（ｂ）の重ね合わせ蛍光画像を、を意味する。図１７に示すように、本発明技術は市販の細胞内蛋白質ラベル化技術と同時に使用かつ異なる蛍光色で同時に検出が可能であることから、既存技術等見合わせることで複数の細胞内蛋白質の可視化に利用可能であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
本発明のタンパク質を蛍光標識する方法は、細胞イメージング等に適用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１２４】
配列番号１  Ｅ１６６Ｎ  ＴＥＭ−１のアミノ酸配列
配列番号２  Ｅ１６６Ａ  ＴＥＭ−１のアミノ酸配列
配列番号３  Ｅ１６６Ｄ  ＴＥＭ−１のアミノ酸配列
配列番号４  Ｅ１６６Ｑ  ＴＥＭ−１のアミノ酸配列
配列番号５  Ｅ１６６Ｎ  ＴＥＭ−１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号６  Ｅ１６６Ａ  ＴＥＭ−１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号７  Ｅ１６６Ｄ  ＴＥＭ−１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号８  Ｅ１６６Ｑ  ＴＥＭ−１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号９  オリゴヌクレオチド
配列番号１０  オリゴヌクレオチド
【図１（１）】
2012105596.tif 000029
【図１（２）】
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【図１（３）】
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【図１（４）】
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【図１（５）】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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