(57)【要約】  皮膚におけるケラチノサイト増殖及び分化促進作用並びにコラーゲン産生増強作用を併せ持ち、表皮及び真皮の組織構造や生理機能の維持、改善を助けて、優れた皮膚改善効果をもたらす、持続性の抗シワ作用を有する皮膚外用剤を提供することを課題とし、α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３´）−アデノシン及び／又はα−Ｄ−グルコピラノシル−（１→５´）−アデノシンを有効成分として含有する皮膚外用剤を提供することにより解決する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→５´）−アデノシン及び／又はα−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３´）−アデノシンを有効成分として含有する持続性の抗シワ作用を有する皮膚外用剤。
【請求項２】
α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→５´）−アデノシン及び／又はα−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３´）−アデノシンとともに、抗菌剤として１，３ブチレングリコール又は１，２−アルカンジオールから選ばれる成分を含有することを特徴とする請求項１記載の皮膚外用剤。
【請求項３】
さらに、美白剤、抗酸化剤、抗炎症剤及び保湿剤から選ばれる成分を含有することを特徴とする請求項１又は２記載の皮膚外用剤。
【請求項４】
美白剤、抗酸化剤、抗炎症剤及び保湿剤から選ばれる成分が植物の抽出物である請求項３記載の皮膚外用剤。
【請求項５】
澱粉質とアデノシンとを含む溶液に、α−グルコシル転移酵素又はシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを作用させる工程と、生成したα−Ｄ−グルコピラノシル−（１→５´）−アデノシン又はα−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３´）−アデノシンを採取する工程とを含んでなる、α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→５´）−アデノシン及び／又はα−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３´）−アデノシンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はα−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３´）−アデノシン及び／又はα−Ｄ−グルコピラノシル−（１→５´）−アデノシン（以下、各々「３´−グルコシルアデノシン」及び「５´−グルコシルアデノシン」といい、また、それらを総称して「グルコシルアデノシン」という場合がある）を有効成分としてなる持続性の抗シワ用皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、体の最外層を形成し、外界から生体を保護すると共に体内の水分や栄養分が外界に漏れ出るのを防ぐ役割を果たす外側の薄い表皮（上皮組織）と、主に線維芽細胞、膠原（コラーゲン）線維、弾性線維、プロテオグリカン等が複合的に三次元状に広がった構造を有し、皮膚に強度、伸展性及び弾力性等をもたらす厚みのある真皮（結合組織）から構成される。皮膚の状態は、表皮と真皮がそれぞれの健全な組織構造及び生理機能を共に維持することによって保たれている。【０００３】
皮膚の表皮は、真皮側から「基底層」、「有棘層」、「顆粒層」及び「角質層（角層）」に分けられ、主にケラチノサイト（角化細胞）と呼ばれる細胞で構成されている。ケラチノサイトは、最下層の基底層では分裂能力を有する未熟な細胞として単層を形成し、分裂増殖し上層に押し上げられながらその過程で分化（「角化」）し、最終的に核のない死細胞である角質細胞となって角質層を形成し、その表層部分から垢となって脱落する。皮膚表皮では、このケラチノサイトの増殖、移動、分化、そして脱落の過程が一定の周期で円滑にターンオーバーすることによってその恒常性が保たれている。【０００４】
しかしながら、皮膚は、加齢、乾燥、酸化、太陽光（紫外線）等の様々な要因によって劣化して水分を失ない、シワの発生をはじめ、たるみの発生、張りや弾力性の低下等様々な現象を呈する。そのような皮膚の劣化は、真皮における線維芽細胞によるコラーゲン合成が低下して真皮中のコラーゲン量が減少することが１つの大きな原因であると考えられており、コラーゲン量の減少を改善するためにコラーゲンやコラーゲン産生増強剤を配合した多数の皮膚外用剤や飲食品等が開発されている（例えば、特許第３４９５２１７号公報及び特開２００７−１８６４７１号公報を参照）。【０００５】
一方、体の最外層を形成している表皮においてもシワの発生などの要因となる望ましくない状態が生じる。すなわち、表皮を構成するケラチノサイトの増殖及び分化が抑制されて、下層からの角質細胞の供給及び上層における角質層の形成が減り、角質層のターンオーバーが滞ることにより、角質層の肥厚化及び水分量の減少等が生じ、さらには角質層による保湿機能及びバリア機能が低下する。また、低湿度環境や、過剰な皮膚洗浄、加齢、体質などによって皮膚の乾燥が進行すると、角質層の多重剥離が起き易くなり、皮膚のつやは低下し、化粧のりが悪くなるなどの弊害が発生し、ひいては、シワの発生や肌荒れ等のトラブルが発生する。このトラブルを改善するため、ケラチノサイトの増殖や分化を促進する試みがなされており、ケラチノサイト分化促進活性を有する物質を配合した皮膚に用いる組成物が提案されている（例えば、特表２００１−５１０７７７号公報や特表平８−５０７２８９号公報参照）。【０００６】
上述したように、シワの発生をはじめとする皮膚状態の劣化、すなわち、真皮におけるコラーゲン産生能の低下及び表皮における角質層のターンオーバーの劣化を改善する様々な物質及び皮膚に用いる組成物が多数提案されている。しかしながら、それらは何れも表皮又は真皮の何れか一方の症状の改善のみに着目したものであるため、その抗シワ作用は十分満足できるものではなく、表皮と真皮の両方の症状を改善し、総合的に皮膚の恒常性を保つことのできる、高い抗シワ作用をもたらす皮膚外用剤の開発が望まれている。斯かる機能を有する物質としては、特開２００９−１４９５５７号公報にはプロラクチンが開示されていが、プロラクチンはペプチドであることから、製剤化したときや皮膚に外用剤として用いた場合の安定性、基底層への浸透性等の点で問題がある。これらの問題を解決するために、表皮と真皮の両方に作用して優れた抗シワ作用を有すると共に、その効果の持続性にも優れた新規な成分及びそれを用いた皮膚外用剤がなお強く望まれている。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、上記のような事情に鑑み、表皮と真皮両方の組織構造及び生理機能の改善を助け、皮膚改善効果をもたらし、皮膚の正常な状態を維持する作用を有し、且つ、皮膚に適用しても安定で生体に対して悪影響を及ぼすことがなく安全な、新規の持続性の抗シワ用の皮膚外用剤を提供することを課題とする。
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために核酸関連の物質に着目し、鋭意研究を重ね、種々試行錯誤を繰り返す中で、生体に対する安全性の点から、生体内にもともと存在する成分であるアデノシンを選択し研究を行った。アデノシン自体については、真皮におけるコラーゲン産生増強作用や毛乳頭細胞のケラチノサイト増殖を増強する作用を有することが知られているが（例えば、国際公開ＷＯ０５／０３４９０２号パンフレットや国際公開ＷＯ０５／０４４２０５号パンフレット）、本発明者らの研究により、アデノシンは生体内にもともと存在する酵素により速やかに代謝され、その効果が持続しにくい場合があること、さらに、アデノシンは親水性溶媒に対する溶解度が低く、皮膚外用剤に配合する場合、取扱いに困難を伴うことが判明した。本発明者は、斯かる問題点を解決するため、さらに研究を重ねたところ、アデノシンの３´位又は５´位（アデノシン分子中のリボースの３位又は５位）の水酸基にＤ−グルコースが１分子α結合した３´−グルコシルアデノシン及び／又は５´−グルコシルアデノシンが、表皮ケラチノサイトに作用し、アデノシンよりも有意に優れたケラチノサイト増殖及び分化促進作用を有することを見出した。
【０００９】
さらに、本発明者は、上記グルコシルアデノシンが真皮の線維芽細胞にも作用し、アデノシンよりも有意に優れたコラーゲン産生増強作用を有することを見出した。
【００１０】
さらに、本発明者は、上記グルコシルアデノシンが、アスコルビン酸２−グルコシドなどの配糖体とは異なり、意外にも、生体内に存在する分解酵素等の作用を受けにくく、生体内環境においてアデノシンよりも安定でその効果の持続性にも優れることを見出した。
【００１１】
さらに、本発明者は、上記グルコシルアデノシンはアデノシンよりも親水性溶媒への溶解性に優れることを見出した。
【００１２】
さらに、本発明者は、上記グルコシルアデノシンは、アデノシンよりも細胞障害を起こしにくく、また、上記のように生体内においてアデノシンよりも安定であるものの、徐々に分解され、生成したアデノシンは速やかに代謝されることから、ヒトに適用しても安全な物質であることを見出し、抗シワ作用を有する皮膚外用剤の成分として、効果の強さ、持続性及び安全性のいずれにおいてもアデノシンよりも有用であることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は３´−グルコシルアデノシン及び／又は５´−グルコシルアデノシンを有効成分として含有する持続性の抗シワ作用を有する皮膚外用剤を提供することにより上記課題を解決するものである。
【００１４】
ちなみに、３´−グルコシルアデノシン及び５´−グルコシルアデノシン自体は、例えば、鈴木幸雄、内田  絅、『科学と工業』、６５巻、６号、２６５〜２７４頁（１９９１年）や、タカハシ  シュウジ等、『ザ・ジャーナル・オブ・アンチビオティクス（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）』、４７巻、１号、９５〜１００頁（１９９４年）に開示されるように公知の物質ではあるものの、その表皮ケラチノサイトの増殖及び分化を促進する効果や、真皮の線維芽細胞に対するコラーゲン産生を増強する効果を有し、抗シワ作用を有すること、それらの効果が配糖化前のアデノシンよりも増強されることや生体内にもともと存在する酵素による分解をアデノシンよりも受けにくく、安定で上記効果の持続性が高いことは全く知られていなかった。
【００１５】
本発明のグルコシルアデノシンを有効成分とする本発明の皮膚外用剤は、表皮ケラチノサイトの増殖及び分化促進作用と真皮の線維芽細胞のコラーゲン産生増強作用を併せ持つので、種々の要因により低下した表皮の角質層のターンオーバーを促進させ角質層の肥厚化、水分量の減少等を改善し、保湿機能及びバリア機能を改善するとともに、真皮中のコラーゲン量を増加させ皮膚の張りや弾力性を高めることがでることから、優れた抗シワ作用を発揮し、また、肌荒れ、くすみ、張りや弾力性の低下、乾皮症などの様々な皮膚症状をより効果的に改善し、皮膚を正常な状態に維持することができる。
【００１６】
さらに、本発明のグルコシルアデノシンはアデノシンよりも親水性溶媒への溶解性に優れ、皮膚外用剤に配合する場合アデノシンよりも取扱が容易である。
【００１７】
さらに、本発明のグルコシルアデノシンはアデノシンよりも安定であり、また、アスコルビン酸２−グルコシドなどの他の配糖体よりも酵素により分解されにくいものの、生体内に存在する分解酵素の作用により徐々にＤ−グルコースとアデノシンに分解され、生成したアデノシンが速やかに代謝されることから、ヒトに適用しても安全な物質である上に、アデノシンよりも効果の持続性においても優れている。
【００１８】
また、本発明のグルコシルアデノシンは効果の持続性に優れた抗シワ作用を有することから、特に比較的長時間皮膚に適用する皮膚外用剤に用いるのが好適であり、そのような皮膚外用剤に用いる防腐又は静菌作用を有する抗菌剤としては、連続して用いても肌への刺激の少なく、かつ、本発明のグルコシルアデノシンの効果を損なうことのないものが望ましく、それらと併用することにより本発明の効果を大いに発揮することができる。
【００１９】
また、本発明のグルコシルアデノシンは酵素等に対して安定であることから、皮膚外用剤に用いられる他の成分と併用してもその影響を受けにくく、とりわけ植物の抽出物など天然の成分と併用した場合、それらに含まれる酵素等により分解される恐れが少ないので、それら他の成分の有する活性とともにグルコシルアデノシンの有する抗シワ作用も安定に発揮できる、優れた皮膚外用剤を製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
上記のとおり、本発明は３´−グルコシルアデノシン及び／又は５´−グルコシルアデノシンを有効成分として含有してなる持続性の抗シワ作用を有する皮膚外用剤に関するものである。
【００２１】
本発明でいう皮膚外用剤は、上記グルコシルアデノシンを含有することから、表皮ケラチノサイトの増殖及び分化促進作用とコラーゲン産生増強作用の両方の作用を有し、その効果の持続性にも優れることから、シワの発生をはじめとする皮膚の劣化を抑制し、肌荒れ、くすみ、張りや弾力性の低下、乾皮症などの様々な皮膚症状の改善に用いることができる。
【００２２】
本発明の皮膚外用剤の有効成分として用いるグルコシルアデノシンは、３´−グルコシルアデノシンと５´−グルコシルアデノシンの何れか一方或いはその両方を含有するものの何れであってもよい。なお、後述のように、５´−グルコシルアデノシンは、生体内に存在する酵素などの生体成分に対する安定性に優れ、水などの親水性溶媒に対する溶解性が高いこと、また、３´−グルコシルアデノシンは比較的低濃度で効果を発揮しやすいことから、皮膚外用剤の剤形や目的に応じてそれらを適宜組み合わせて用いるのが望ましい。また、本発明の皮膚外用剤は、上記グルコシルアデノシンのグルコースにさらにＤ−グルコースが１分子以上α−１，４、α−１，６及び／又はα−１，３結合したα−グリコシルアデノシンを含有していてもよい。
【００２３】
本発明の皮膚外用剤に用いるグルコシルアデノシンは、酵素法で調製することができる。また、必要に応じ、発酵法や合成法により調製することもできる。経済性を問題にするのであれば、糖転移酵素を用いる酵素法が有利である。
【００２４】
本発明で用いるグルコシルアデノシンは必ずしも高度に精製されている必要はなく、皮膚に悪影響を及ぼすような不純物を含有するなどの安全性に問題がなく、所期の効果が妨げられない限り、その純度については特に制限はない。本発明の皮膚外用剤の投与形態や剤形に応じ、製造原料として用いるアデノシンを含有する酵素反応後の反応液そのものであっても、その製造方法に特有の他の物質との未分離組成物の形態であってもよく、部分精製したもの、或いは、高度に精製したものでもよい。また、高度に精製した３´−グルコシルアデノシンと５´−グルコシルアデノシンとを、目的に応じ適宜混合して用いることもできる。
【００２５】
本発明でいう表皮ケラチノサイトの増殖及び分化促進作用とは、表皮の基底層に存在するケラチノサイトの分裂増殖、及び、斯かる細胞が上層に押し上げられながら有棘層、顆粒層及び角質層を形成する細胞へと分化し、最終的に核のない死細胞である角質細胞に至る過程の何れか、或いは、その全過程を促進し、健常な表皮を維持する作用をいう。また、本発明でいうコラーゲン産生増強作用とは、真皮に存在する線維芽細胞のコラーゲン産生を亢進する作用をいう。
【００２６】
本発明の皮膚外用剤の投与量は、本発明の所期の効果が得られるのであれば、特に制限はなく、通常、１日に１回乃至複数回に分け、１日当たりの所定量を投与すればよい。１日当たりの投与量は、通常、有効成分であるグルコシルアデノシンとして、皮膚１ｃｍ２当たり０．００１乃至１００ｍｇを塗布すればよく、０．０５乃至１０ｍｇが望ましく、０．０１乃至１ｍｇがより望ましい。経皮による投与量が、皮膚１ｃｍ２当たり０．００１ｍｇよりも少ないと所期の効果が得られない場合があり、１００ｍｇを超えて投与しても投与量に見合う効果が得られない場合がある。
【００２７】
本発明のグルコシルアデノシンは、単独で皮膚外用剤の有効成分として用いることもできるが、本発明の効果を妨げない限り、他の皮膚改善作用、コラーゲン産生増強作用やケラチノサイトの増殖及び分化促進作用を有する他の薬剤、さらには美白剤、抗酸化剤、抗炎症剤、保湿剤など、任意の薬効成分を適宜配合した形態で用いることも随意であり、それらの作用とともに、上記のグルコシルアデノシンの効果も奏する皮膚外用剤とすることもできる。また、本発明の効果を妨げない限り、その形態や剤形に応じ、通常、化粧品、医薬品、医薬部外品などに用いることのできる適切な担体、賦形剤、安定剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、溶媒等、任意の助剤等を添加し、粉末状、顆粒状、溶液等、任意の形態で用いることができる。
【００２８】
本発明の皮膚外用剤におけるグルコシルアデノシンの配合量は、その形態や剤形等に応じて、その効果を達成できる限り限定されないが、通常、製剤全量中０．００１乃至３０質量％となるように配合すればよく、０．０１乃至１０質量％が好ましく、０．１乃至５質量％が特に好ましい。本発明のグルコシルアデノシンは、皮膚外用剤に３０質量％を越えて配合しても配合量に見合う効果が得られない場合があり、また、０．００１質量％よりも少ない場合所期の効果が得られない場合がある。
【００２９】
本発明の皮膚外用剤は、表皮に存在するケラチノサイトの増殖及び分化を促進させ、角質細胞の供給を高め角質層のターンオーバーを促進させることにより、機能低下を来した皮膚の状態を改善し、適正な状態に維持することができる。
【００３０】
さらに、本発明の皮膚外用剤は、表皮ケラチノサイトによるセラミド合成や真皮の線維芽細胞によるコラーゲン合成に関わる遺伝子の発現を増強し、表皮のセラミド量や真皮のコラーゲン量を増加させることによって皮膚の弾力性、張り、バリア機能などを高め、機能低下を来した皮膚の状態を改善し、適正な状態に維持することができる。
【００３１】
したがって、本発明の皮膚外用剤は、皮膚の保湿機能を向上し、肌荒れ、シワ、皮膚の張りや弾力性の低下、皮膚のバリア機能の低下、肌の乾燥、乾皮症、乾癬など、任意の皮膚症状を予防又は改善することができる。また、グルコシルアデノシンは、ケラチノサイト増殖及び分化促進作用、コラーゲン産生増強作用、セラミド合成促進作用に加え、保湿作用をも有しているので、本発明の皮膚外用剤は、ケラチノサイト増殖及び分化促進剤、コラーゲン産生増強剤、セラミド合成促進剤の製造のためのみでなく、保湿剤の製造に用いることも有利に実施できる。さらには、セラミド合成に関与する酵素であるβグルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ）やスフィンゴミエリナーゼ（ＳＭａｓｅ）の遺伝子の発現増強剤の製造に用いることも随意である。
【００３２】
斯かる本発明の皮膚外用剤は、効果の持続性に優れた抗シワ作用を有し、比較的長時間皮膚に適用されるものであるから、防腐又は静菌作用を有する抗菌剤を配合するのが望ましい。抗菌剤としては、安息香酸及びその塩類、サリチル酸及びその塩類、ソルビン酸及びその塩類、デヒドロ酢酸及びその塩、パラオキシ安息香酸アルキルエステルをはじめとするパラオキシ安息香酸エステル、エデト酸、２，４，４´−トリクロロ−２´−ヒドロキシジフェニルエーテル、３，４，４´−トリクロロカルバニリド、ヘキサクロロフェン、塩化ベンザルコニウム、フェノキエタノール、ヒノキチオール、レゾルシン、エタノール、１，３−ブチレングリコール、感光素２０１号、乳酸、１，２−アルカンジオール、クチナシエキス、クララエキス、セージエキス、タイムエキス、ヨモギエキス、オウバクエキス、などの抗菌作用を有する植物の抽出物が挙げられる。
【００３３】
とりわけ、本発明の皮膚外用剤は、連続して用いても肌への刺激の少なく、かつ、本発明のグルコシルアデノシンの効果を損なうことのない抗菌剤を配合することにより、本発明の効果を大いに発揮することができる。上記抗菌剤のうち、１，２−アルカンジオールや１，３−ブチレングリコールなどの非パラオキシ安息香酸エステル系の成分は、皮膚への刺激性の低さ、防腐効果の高さ及び保湿性の点から好ましい。１，２−アルカンジオールとしては、炭素数４乃至１０の１，２−アルカンジオールが好ましく、とりわけ、１，２−ペンタンジオール、１，２−へキサンジオール、１，２−ヘプタンジオール又は１，２−オクタンジオールから選ばれる１種又は２種以上の１，２−アルカンジオールが特に好ましい。なお、本発明のグルコシルアデノシンとこれら抗菌剤を皮膚外用剤において均質に配合するため、本発明の効果を損なわない限り、適宜の界面活性剤を用いることも随意である。
【００３４】
さらに、本発明の皮膚外用剤は、グルコシルアデノシンとともに、通常、化粧品、医薬部外品や医薬品等に用いられる他の任意の成分の１種又は２種以上を必要に応じ適宜配合した形態で利用することができる。本発明の皮膚外用剤において、グルコシルアデノシンとともに用いられる他の任意の成分としては、例えば、美白剤、抗酸化剤、抗炎症剤、保湿剤、紫外線吸収剤、乳化剤、増粘剤をはじめとする下記成分を挙げることができる。
【００３５】
また、本発明のグルコシルアデノシンは酵素等の生体成分に対して比較的安定であることから、他の成分とともに配合してもその影響を受けにくく、とりわけ、上記のような活性を有する植物の抽出物など天然の成分を配合した場合も、その成分に含まれる酵素等により分解される恐れが小さいので、該活性成分による効果とともに本発明のグルコシルアデノシンの抗シワ作用を発揮できる優れた皮膚外用剤とすることができる。
【００３６】
美白剤としては、例えば、Ｌ−アスコルビン酸又はその誘導体、アルブチン、コウジ酸、エラグ酸、胎盤抽出物、ハイドロキノン配糖体、トラネキサム酸又はその誘導体、レゾルシン、４−ｎ−ブチルレゾルシノールなどのアルキルレゾルシノール、及びこれらの塩のようなレゾルシン及びその誘導体、グルタチオン、藍草抽出物、カンゾウエキス、オウゴンエキス、イチョウ葉エキス、エイジツエキス、モクレンエキス、シャクヤクエキス、クチナシエキス、セージエキス、トウキエキス、アイリスエキス、アセンヤクエキス等の植物の抽出物が挙げられる。とりわけ、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシドやトラネキサム酸は、グルコシルアデノシンの持つ生理活性を増強する効果に優れているので望ましい。
【００３７】
抗酸酸化剤としては、例えば、ブチルヒドロキシトルエン、トコフェロール、フィチン、レチノールやその誘導体などのビタミンＡ類、ビタミンＢ６塩酸塩、ビタミンＢ６トリパルミテート、ビタミンＢ６ジオクタノエート、ビタミンＢ２及びその誘導体、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１５及びその誘導体等のビタミンＢ類、アスコルビン酸やその誘導体などのビタミンＣ類、α−トコフェロール、β−トコフェロール、δ−トコフェロール、ビタミンＥアセテート等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、グルタチオン、ルチン、ヘスペリジン、ナリンジンやその誘導体、セイヨウオトギリソウエキス、エイジツエキス、オウゴンエキス、ウーロン茶、紅茶、緑茶などの茶エキス、マツタケエキスなどの抗酸化作用を有する植物の抽出物が挙げられる。
【００３８】
抗炎症剤としては、アラントイン又はその誘導体、グリチルレチン又はその誘導体であるグリチルレチン酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸アラントイン、グリチルレチン酸グリセリン、グリチルレチン酸ステアリル、ステアリン酸グリチルレチニル、３−サクシニルオキシグリチルレチン酸二ナトリウム、グリチルリチン酸ジカリウム、グリチルリチン酸モノアンモニウムなど、パントテン酸及びその誘導体、ビタミンＥ及びその誘導体、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド、アスコルビン酸−トコフェロールリン酸ジエステル、Ｌ−アスコルビン酸硫酸エステル、ジパルミチン酸アスコルビル、パルミチン酸アスコルビル、Ｌ−アスコルビン酸ステアリル、リン酸Ｌ−アスコルビル、Ｌ−アスコルビン酸エチルなどのＬ−アスコルビン酸の誘導体、塩酸ピリドキシン、メントール、ビオチン、カンフル、テレピン油、酸化亜鉛、アズレン、グアイアズレン及びその誘導体、メフェナム酸及びその誘導体、フェニルブタゾン及びその誘導体、インドメタシン及びその誘導体、イブプロフェン及びその誘導体、ケトプロフェン及びその誘導体、ε−アミノカプロン酸、ジクロフェナクナトリウム、ジフェンヒドラミン、トラネキサム酸及びその誘導体、デキサメタゾン、コルチゾン及びそのエステル、ヒドロコルチゾン及びそのエステル、プレドニゾン、プレドニゾロンなどの副腎皮質ホルモン、抗ヒスタミン剤、エイジツ、オトギリソウ、オウバク、カンゾウ、クレソン、コンフリー、サルビア、シコン、シラカバ、チャ、トウキンセンカ、ニワトコ、ホオウ、ムクロジ、ユーカリエキス、ブロッコリー、トウキ、シソ、カミツレ、ヨモギ、アロエ、ニンジン、オウバク末、ヨウバイヒ末、アセンヤク、アマチャ、アルテア、アルニカ、エチナシ、エンメイソウ、オウゴン、オオムギ、オレンジ、カノコソウ、カミツレ、クチナシ、クマザサ、ゲンチアナ、ゲンノショウコウ、ゴボウ、サンショウ、シソ、ボフダイジュ、シャクヤク、セイヨウキズタ、セイヨウネズ、セイヨウノコギリソウ、センキュウ、センブリ、セージ、ソハクヒ、タイソウ、タイム、トウガシ、トウニン、ドクダミ、トルメンチラ、パセリ、ハッカ、イラクサ、ビャクダン、ビワ、ブッチャーブルーム、ブドウ、ベニバナ、ボタン、ボダイジュ、モモ、ヤグルマソウ、ヨモギ、ラベンダー、ローズマリーなどの植物又は植物に由来する成分などを例示することができる。
【００３９】
保湿剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、ヘキシレングリコール、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ムコイチン硫酸、カロニン酸、アテロコラーゲン、コレステリル−１２−ヒドロキシステアレート、乳酸ナトリウム、胆汁酸塩、ｄｌ−ピロリドンカルボン酸塩、短鎖可溶性コラーゲン、ジグリセリン（ＥＯ）ＰＯ付加物、イザヨイバラ抽出物、セイヨウノコギリソウ抽出物、メリロート抽出物、アロエエキス、センブリエキス、クララエキス、ヘチマエキス、マロニエエキス、ユキノシタエキス、タイムエキス、トウキエキス、ユリエキス、クチナシエキス、ウイキョウエキス、オドリコソウエキス、ペパーミントエキスなどの植物の抽出物、トラネキサム酸等が挙げられる。
【００４０】
紫外線吸収剤としては、例えば、パラアミノ安息香酸（以下、「ＰＡＢＡ」と略す）、ＰＡＢＡモノグリセリンエステル、Ｎ，Ｎ−ジプロポキシＰＡＢＡエチルエステル、Ｎ，Ｎ−ジエトキシＰＡＢＡエチルエステル、Ｎ，Ｎ−ジメチルＰＡＢＡエチルエステル、Ｎ，Ｎ−ジメチルＰＡＢＡブチルエステル、Ｎ，Ｎ−ジメチルＰＡＢＡメチルエステル等の安息香酸系紫外線吸収剤、ホモメンチル−Ｎ−アセチルアントラニレート等のアントラニル酸系紫外線吸収剤、アミルサリシレート、メンチルサリシレート、ホモメンチルサリシレート、オクチルサリシレート、フェニルサリシレート、ベンジルサリシレート、ｐ−イソプロパノールフェニルサリシレート等のサリチル酸系紫外線吸収剤、オクチルシンナメート、エチル−４−イソプロピルシンナメート、メチル−２，５−ジイソプロピルシンナメート、エチル−２，４−ジイソプロピルシンナメート、メチル−２，４−ジイソプロピルシンナメート、プロピル−ｐ−メトキシシンナメート、イソプロピル−ｐ−メトキシシンナメート、イソアミル−ｐ−メトキシシンナメート、オクチル−ｐ−メトキシシンナメート（２−エチルヘキシル−ｐ−メトキシシンナメート）、２−エトキシエチル−ｐ−メトキシシンナメート、シクロヘキシル−ｐ−  メトキシシンナメート、エチル−α−シアノ−β−フェニルシンナメート、２−エチルヘキシル−α−シアノ−β−フェニルシンナメート、グリセリルモノ−２−エチルヘキサノイル−ジパラメトキシシンナメート、トリメトキシ桂皮酸メチルビス（トリメチルシロキサン）シリルイソペンチル等の桂皮酸系紫外線吸収剤、３−（４＆ａｐｏｓ；−メチルベンジリデン）−ｄ，１−カンファー、３−ベンジリデン−ｄ，１−カンファー、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチルエステル、２−フェニル−５−メチルベンゾキサゾール、２，２＆ａｐｏｓ，−ヒドロキシ−５−メチルフェニルベンゾトリアゾール、２−（２＆ａｐｏｓ，−ヒドロキシ−５＆ａｐｏｓ；−ｔ−オクチルフェニル）ベンゾトリアゾール、２−（２＆ａｐｏｓ，−ヒドロキシ−５＆ａｐｏｓ；−メチルフェニルベンゾトリアゾール、ジベンザラジン、ジアニソイルメタン、４−メトキシ−４＆ａｐｏｓ；−ｔ−ブチルジベンゾイルメタン、５−（３，３−ジメチル−２−ノルボルニリデン）−３−ペンタン−２−オン、ジモルホリノピリダジノン等が挙げられ、任意の１種又は２種以上を用いることができる。
【００４１】
紫外線散乱剤としては、酸化チタン、微粒子酸化チタン、酸化亜鉛、微粒子酸化亜鉛、酸化鉄、微粒子酸化鉄、酸化セリウムなどの粉末が挙げられる。これら紫外線散乱剤は、通常、針状、紡錘状、球状、粒状の粉末が用いられる。また、粒子径が０１μｍ以下の微粒子粉末が好ましい。メチルハイドロジェンポリシロキサンやシランカップリング剤などのシリコーン処理；金属石鹸処理；パーフルオロアルキルリン酸ジエタノールアミン塩やパーフルオロアルキルシラン等のフッ素処理、デキストリン脂肪酸エステル処理等により、疎水化処理した紫外線散乱剤も好ましい。
【００４２】
液体油脂としては、例えば、アボガド油、ツバキ油、タートル油、マカデミアナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、オリーブ油、ナタネ油、卵黄油、ゴマ油、パーシック油、小麦胚芽油、米胚芽油、サザンカ油、ヒマシ油、アマニ油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生油、茶実油、カヤ油、コメヌカ油、シナギリ油、日本キリ油、ホホバ油、トリグリセリン等が挙げられる。
【００４３】
固体油脂としては、例えば、カカオ脂、ヤシ油、馬脂、硬化ヤシ油、パーム油、牛脂、羊脂、硬化牛脂、パーム核油、豚脂、牛骨脂、モクロウ核油、硬化油、牛脚脂、モクロウ、硬化ヒマシ油等が挙げられる。
【００４４】
ロウ類としては、例えば、ミツロウ、カンデリラロウ、綿ロウ、カルナウバロウ、ベイベリーロウ、イボタロウ、鯨ロウ、モンタンロウ、ヌカロウ、ラノリン、カポックロウ、酢酸ラノリン、液状ラノリン、サトウキビロウ、ラノリン脂肪酸イソプロピル、ラウリン酸ヘキシル、還元ラノリン、ジョジョバロウ、硬質ラノリン、セラックロウ、ＰＯＥラノリンアルコールエーテル、ＰＯＥラノリンアルコールアセテート、ＰＯＥコレステロールエーテル、ラノリン脂肪酸ポリエチレングリコール、ＰＯＥ水素添加ラノリンアルコールエーテル等が挙げられる。
【００４５】
炭化水素油としては、例えば、流動パラフィン、オゾケライト、スクワラン、プリスタン、パラフィン、セレシン、スクワレン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス、ポリエチレンワックス、フィッシャートロプッシュワックス等が挙げられる。
【００４６】
高級脂肪酸としては、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、オレイン酸、ウンデシレン酸、トール酸、リノール酸、リノレイン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）等が挙げられる。
【００４７】
高級アルコールとしては、例えば、直鎖アルコール（例えば、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、ミリスチルアルコール、オレイルアルコール、セトステアリルアルコール等）；分枝鎖アルコール（例えば、モノステアリルグリセリンエーテル（バチルアルコール）、２−デシルテトラデシノール、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロール、ヘキシルドデカノール、オクチルドデカノール等）等が挙げられる。
【００４８】
合成エステル油としては、ミリスチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸デシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、酢酸ラノリン、ステアリン酸イソセチル、イソステアリン酸イソセチル、１２−ヒドロキシステアリン酸コレステリル、ジ−２−エチルヘキサン酸エチレングリコール、ジペンタエリスリトール脂肪酸エステル、モノイソステアリン酸Ｎ−アルキルグリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ−２−エチルヘキサン酸ペンタエリスリトール、トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリン、トリオクタン酸グリセリン、トリイソパルミチン酸グリセリン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、セチル２−エチルヘキサノエート、２−エチルヘキシルパルミテート、トリミリスチン酸グリセリン、トリ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセライド、ヒマシ油脂肪酸メチルエステル、オレイン酸オレイル、アセトグリセライド、パルミチン酸２−ヘプチルウンデシル、アジピン酸ジイソブチル、Ｎ−ラウロイル−Ｌ−グルタミン酸−２−オクチルドデシルエステル、アジピン酸ジ−２−ヘプチルウンデシル、エチルラウレート、セバシン酸ジ−２−エチルヘキシル、ミリスチン酸２−ヘキシルデシル、パルミチン酸２−ヘキシルデシル、アジピン酸２−ヘキシルデシル、コハク酸２−エチルヘキシル、クエン酸トリエチル、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンランダム重合体メチルエーテル等が挙げられる。
【００４９】
シリコーン油としては、例えば、鎖状ポリシロキサン（例えば、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、ジフェニルポリシロキサン等）；環状ポリシロキサン（例えば、オクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、ドデカメチルシクロヘキサシロキサン等）、３次元網目構造を形成しているシリコーン樹脂、シリコーンゴム、各種変性ポリシロキサン（アミノ変性ポリシロキサン、ポリエーテル変性ポリシロキサン、アルキル変性ポリシロキサン、フッ素変性ポリシロキサン等）等が挙げられる。
【００５０】
その他には、エタノール等の低級アルコール；アシルサルコシン酸（例えばラウロイルサルコシンナトリウム）、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸等の有機酸；ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン等のビタミン類；ニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル、γ−オリザノール、アラントイン、グリチルリチン酸（塩）、グリチルレチン酸及びその誘導体、ヒノキチオール、ビサボロール、ユーカルプトーン、チモール、イノシトール、サイコサポニン、ニンジンサポニン、ヘチマサポニン、ムクロジサポニン等のサポニン類、パントテニルエチルエーテル、エチニルエストラジオール、セファランチン、プラセンタエキス等の各種薬剤、ギシギシ、ゼニアオイ、トウヒ、スギナ、ユリ、ヨモギ、サワラ、セイヨウサンザシエキス、イブキジャコウエキス、ウオーターリリーエキス、セイカリュウエキス、トルメンチラエキス、ペパーミントエキスなどの植物由来の抽出物や生薬、ローヤルゼリーエキス、色素、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノステアリン酸ポリオキセチレンソルビタン、ポリエチレングリコールモノオレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリグリコールジエーテル、ラウロイルジエタノールアマイド、脂肪酸イソプロパノールアマイド、マルチトールヒドロキシ脂肪酸エーテル、アルキル化多糖、アルキルグルコシド、シュガーエステル等の非イオン性活性剤、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン性界面活性剤、パルミチン酸ナトリウム、ラウリン酸ナトリウム、ラウリル酸ナトリウム、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル、ロート油、リニアドデシルベンゼン硫酸、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油マレイン酸、アシルメチルタウリン等のアニオン性界面活性剤、両性界面活性剤、中和剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、δ−トコフェロール、ブチルヒドロキシトルエン等の酸化防止剤、フェノキシエタノール、パラベン、アルカンジオール類、感光素２０１号等の防腐剤が挙げられる。またその他、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、エデト酸四ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸及びその誘導体、ルチン、ヘスペリジン、ナリンジンやその誘導体をはじめとするポリフェノール類、カンゾウ抽出物、グラブリジン、火棘の果実の熱水抽出物、カルニチン、コエンザイムＱ１０、各種生薬、酢酸トコフェロール、ヒドロキシデセン酸、グリチルリチン酸及びその誘導体又はその塩等、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、α，α−トレハロース、α，α−トレハロースの糖質誘導体、環状四糖、デキストリン、シクロデキストリン、分岐デキストリン、澱粉、分岐澱粉、プルラン等の糖質、感光素１０１号、感光素３０１号、感光素４０１号などの感光素類、香料、色素なども適宜配合することができる。
【００５１】
本発明の皮膚外用剤は、化粧品、医薬品、医薬部外品を含み、その剤形も水溶液系、可溶化系、乳化系、油液系、ゲル系、ペースト系、軟膏系、エアゾール系、水−油２層系、水−油−粉末３層など、任意のものを含む。また、シート状基剤や粉末状基剤に担持されたものも含む。
【００５２】
本発明でいう皮膚外用剤とは、肌荒、シミやシワ、炎症、老化などの予防、保湿、美容などを目的として、顔や身体の皮膚などの表皮に直接使用されるか、或いは、その使用時に皮膚に接触して、これらに影響を及ぼす可能性のある、化粧石鹸、洗顔料、一般クリーム・乳液、化粧水、オーデコロン、ローション、化粧油、白粉・パウダー、ファンデーション、ほお紅・眉墨、アイクリーム・アイシャドー・マスカラ、香水、日焼け・日焼け止めクリーム、日焼け・日焼け止めローション、日焼け・日焼け止めオイル、アイライナー、口紅、リップクリーム、歯磨き、浴用化粧品、各種疾患治療剤などのスキンケア化粧品、メーキャップ化粧品、ボディケア化粧品、オーラルケア化粧品、フレグランス化粧品などの化粧品、医薬部外品或いは医薬品をいう。また、軟膏、はっぷ剤、フィルム剤などのように、皮膚や粘膜に塗布或いは貼り付けて使用する医薬部外品や、口中清涼剤のように口腔内でその使用時に直接皮膚に接触して使用される医薬品や医薬部外品もこれに含まれる。
【００５３】
ちなみに、本発明の皮膚外用剤の有効成分であるグルコシルアデノシンは、既述したとおり、特定の方法、手段により製造されたものに限定されるべきではないことはいうまでもないけれども、経済性を問題にするのであれば、糖転移酵素を用いる酵素法が有利である。例えば、澱粉質とアデノシンとを含む溶液に、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）、α−グルコシダーゼ、アミラーゼ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素（例えばＷＯ０２／１０３６１号パンフレット参照）、イソマルトシル転移酵素（例えば国際公開ＷＯ０１／９０３３８号パンフレット参照）、α−グルコシル転移酵素（国際公開ＷＯ２００８／１３６３３１号パンフレット）、及び、澱粉を加水分解するとともにグリコシル基の転移を触媒し、シクロデキストリンを生成し、プルランに作用してパノースを生成するα−アミラーゼ（国際公開ＷＯ２００８／１３６３３１号パンフレット）などの糖転移活性を有する酵素を用いる酵素法により、大量、安価に製造することができる。とりわけ、国際公開ＷＯ２００８／１３６３３１号パンフレットにおいて開示したα−グルコシル転移酵素を用いた場合には水溶性の高い５´−グルコシルアデノシンを高収率で得ることができる。また、ＣＧＴａｓｅを用いた場合には、α−グルコシル転移酵素を用いた場合よりも３´−グルコシルアデノシンの構成比率が高いグルコシルアデノシンを高収率で製造することができる。
【００５４】
澱粉質とアデノシンとを含む溶液に、糖転移活性を有するα−グルコシル転移酵素やＣＧＴａｓｅを作用させることにより、アデノシンの３´位又は５´位の水酸基に１分子又は２分子以上のＤ−グルコースが転移し、前記３´位又は５´の水酸基に１分子のＤ−グルコースが結合した３´−グルコシルアデノシン及び５´−グルコシルアデノシンが生成するとともに、前記３´位又は５´位の水酸基に２個以上のＤ−グルコースが結合した、例えば、３´−マルトシルアデノシンや３´−マルトトリオシルアデノシンなどの３´−グリコシルアデノシン、又は、例えば、５´−マルトシルアデノシンや５´−マルトトリオシルアデノシンなどの５´−グリコシルアデノシンが生成する。
【００５５】
α−グルコシル転移酵素やＣＧＴａｓｅは、通常、澱粉質濃度が１乃至４０ｗ／ｖ％になるように澱粉質とアデノシンとを溶解した水溶液に対し、澱粉質１ｇ当たり１乃至２，０００単位、好ましくは１乃至１，０００単位の割合で添加され、当該溶液をｐＨ約３乃至１０、温度３０乃至７０℃に保ちつつ、６時間以上、好ましくは約１２乃至９６時間反応させる。
【００５６】
溶液中の澱粉質とアデノシンとの質量比は、通常、無水物換算で１：２乃至２０：１、望ましくは１：１乃至１０：１の範囲に設定する。澱粉質の割合がこの範囲より大きくなると、アデノシンへの糖転移は効率よく進行するものの、アデノシンの生成率がアデノシンの始発濃度による制約を受け、低レベルに止まることとなる。逆に、アデノシンの割合が上記した範囲より大きくなると、未反応のアデノシンが著量残存することとなり、工業的生産には好ましくない。よって、上記した比率の範囲をもって最良とした。
【００５７】
なお、α−グルコシル転移酵素やＣＧＴａｓｅに加えて、澱粉枝切り酵素としてイソアミラーゼを併用する場合、イソアミラーゼは、アデノシンと澱粉質とを含有する溶液中でα−グルコシル転移酵素やＣＧＴａｓｅと共存させた状態で澱粉質に作用させるのが望ましい。その添加量は、イソアミラーゼの至適温度、至適ｐＨなどにもよるけれども、通常、澱粉質１ｇ当たり２００乃至２，５００単位とし、５５℃以下で反応させることが望ましい。また、澱粉枝切り酵素としてプルラナーゼを用いる場合も、イソアミラーゼに準じて用いればよい。
【００５８】
α−グルコシル転移酵素及び／又はＣＧＴａｓｅと澱粉枝切り酵素による酵素反応が一通り完了すると、酵素反応液を加熱しこれら酵素を失活させて酵素反応を停止させ、次いで、この酵素反応液にグルコアミラーゼを作用させる。グルコアミラーゼを作用させると、アデノシンの３´位及び／又は５´位の水酸基に結合している２分子以上のＤ−グルコース鎖の大部分が切断されて、３´−グルコシルアデノシン及び／又は５´−グルコシルアデノシンに変換され、これらの化合物の生成率が高まることになる。斯かる３´−グルコシルアデノシン及び／又は５´−グルコシルアデノシンの含有率を高めた反応液は、常法により、活性炭などを用いて脱色濾過し、さらに、イオン交換樹脂、合成吸着剤樹脂、多孔性樹脂などを用いるカラムクロマトグラフィーを適用することにより、溶液中のグルコシルアデノシンを精製すればよい。さらに必要であれば、逆相クロマトグラフィーなどを用い、３´−グルコシルアデノシン及び／又は５´−グルコシルアデノシンの純度を高くしてもよく、それぞれの化合物を単離、精製して用いることも随意である。これらグルコシルアデノシンを含有する溶液は、そのままで本発明の皮膚外用剤の原料として用いてもよく、必要に応じて、濃縮して用いてもよく、さらに、減圧乾燥或いは噴霧乾燥などの適宜の方法により乾燥し、必要に応じて粉砕し用いてもよい。
【００５９】
グルコシルアデノシンの製造コストから見た澱粉質へのコスト配分などに照らし、原料は澱粉を用いるのが望ましく、その場合には、液化澱粉におけるグルコース重合度を調整し、枝分かれ部分を切断するために、例えば、イソアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６８）、プルラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４１）などの澱粉枝切酵素を併用することも有利に実施できる。これらの澱粉枝切酵素のうち、イソアミラーゼは酵素活性、基質特異性などの面で取扱やすいので、特に好ましい。澱粉としては、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、タピオカ澱粉、コーンスターチ、小麦澱粉などが挙げられる。また、デキストリンのようなこれら澱粉の部分分解物を用いてもよく、分子内に実質的な枝分かれ構造を有せず、且つ、グルコース重合度が揃った、例えば、シクロマルトデキストリン、シクロアミロース、合成アミロースなどの澱粉質を用いることも随意である。
【００６０】
アデノシンの３´位及び／又は５´位の水酸基に結合している２分子以上のＤ−グルコース鎖の切断に用いるグルコアミラーゼは、その給源、純度を問わず、市販品であってもかまわない。例えば、市販のグルコアミラーゼ剤である、ナガセケムテックス株式会社が商品名『グルコチーム＃２００００』で販売しているリゾプス属に属する微生物に由来する酵素剤や、天野エンザイム株式会社が商品名『グルクザイム』で販売しているアスペルギルスやリゾプス属の微生物に由来する酵素剤を用いることができる。
【００６１】
以下、実験により本願発明をさらに詳しく説明する。
【００６２】
＜実験１：α−グルコシル転移酵素によるグルコシルアデノシンの調製＞
＜実験１−１：α−グルコシル転移酵素の調製＞
国際公開ＷＯ２００８／１３６３３１号パンフレットの実験５の方法により、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学工業株式会社製造）１．５ｗ／ｖ（質量／容積）％、酵母抽出物（商品名『ポリペプトン』、日本製薬株式会社製造）０．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『酵母エキスＳ』、日本製薬株式会社製造）０．１ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・２水和物０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５ｗ／ｖ％、硫酸マンガン・５水和物０．００１ｗ／ｖ％、硫酸第一鉄・７水和物０．００１ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地に、バチルス・サーキュランス  ＰＰ７１０株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７７１として茨城県つくば市東１−１−１中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託されている）を接種し、ファーメンターで約２４時間培養した。培養後、遠心分離して培養液上清を回収し、８０％飽和となるように硫安を添加して４℃、２４時間放置することにより塩析した。塩析物を遠心分離して回収し、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えて溶解した後、同緩衝液に対して透析し、膜濃縮することにより濃縮粗酵素液を調製した。本濃縮粗酵素液のα−グルコシル転移酵素活性は約１３００単位／ｍｌであった。また、本濃縮酵素液には約１４０単位／ｍｌのアミラーゼ活性も認められた。
【００６３】
なお、上記α−グルコシル転移酵素の活性は、次のようにして測定する。マルトースを最終濃度１ｗ／ｖ％となるよう２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解して基質とする。この基質液５ｍｌに、酵素液０．５ｍｌを加え、４０℃で３０分間反応させた後、その反応液０．５ｍｌと５ｍｌの２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ７．０）とを混合し、沸騰水中で１０分間加熱することにより反応停止させた後、反応液中のグルコース量を、常法に従ってグルコース・オキシダーゼ法で測定し、反応によって生成したグルコース量を算出する。α−グルコシル転移酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１マイクロモルのグルコースを生成する酵素量と定義する。また、混在するアミラーゼの活性は、以下のようにして測定した。すなわち、短鎖アミロース（商品名「アミロースＥＸ−Ｉ」、株式会社林原生物化学研究所販売、平均重合度１７）を最終濃度１ｗ／ｖ％となるように１ｍＭの塩化カルシウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて基質液とし、その基質液２ｍｌに、酵素液０．２ｍｌを加え３５℃で３０分間酵素反応させ、その反応液０．２ｍｌを８ｍｌの０．０２Ｎ硫酸溶液に混合し、反応停止させた後、０．２ｍｌの０．１Ｎヨウ素溶液を添加し、２５℃で１５分間保持した後に６６０ｎｍの吸光度を測定する。別途反応０時間の反応液について同様に測定し、反応時間当たりのヨウ素呈色の減少を測定する。アミラーゼの活性１単位は、上記の条件下で２０ｍｇの短鎖アミロースの６６０ｎｍにおける吸光度（ヨウ素呈色）を１０％低下させる酵素量の１０倍量と定義した。
【００６４】
＜実験１−２：グルコシルアデノシンの調製＞
アデノシン（和光純薬株式会社販売、試薬特級）の濃度が１０質量％となるように０．３Ｎの塩酸で溶解した。このアデノシンの１０質量％溶液４０ｍｌとデキストリン（松谷化学株式会社販売、商品名『パインデックス＃１』、固形分約９２．３質量％）１２ｇとを、２ｍＭのＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）３３６ｍｌに加え撹拌混合し、実験１−１で調製した濃縮粗酵素液を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）でα−グルコシル転移酵素の活性が２０単位／ｍｌとなるように希釈した酵素液９ｍｌを加え、撹拌混合し、５０℃で２４時間反応を行った。反応終了後の反応液に１Ｎ塩酸を加えｐＨ３．５に調整後、グルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業社販売、商品名『ＸＬ−４』、３，８００単位／ｍｌ）を、デキストリンの固形分１ｇ当たり１，０００単位加え５０℃で２４時間反応させ、１００℃で１０分間処理し、酵素反応を停止した。この酵素反応を停止した反応液を、活性炭カラム（１００ｍｍ×φ４１ｍｍ）に、流速ＳＶ＝３（５ｍｌ／分）で通液することによりグルコシルアデノシンをカラムに吸着させた後、脱イオン水（湿潤樹脂容積の５倍量）及び２０容積％エタノール溶液（湿潤樹脂容積の３倍量）でカラムを洗浄し、４０容積％エタノール溶液で溶出した。溶出液を５０ｍｌずつ分画し、紫外吸収（２６０ｎｍ）が０．１５以上の画分を回収した。回収した画分をロータリーエバポレーターで濃縮し、ＯＤＳカラムを用いた分取用高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し、グルコシルアデノシンの溶出画分のメインピークを回収した。ＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣによる分取を２回に分けて実施し、固形物換算でグルコシルアデノシンを９９質量％以上含有する標品を、合計で約０．８ｇ調製した。なお、分取用ＨＰＬＣは以下の条件で行った。
【００６５】
＜分取ＨＰＬＣ条件＞
装置：ＳＨＩＭＡＤＺＵ  Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−１０２（検出器），ＬＣ−１０ＡＤ（ポンプ），ＳＩＬ−１０ＡＤｖｐ（オートサンプラー）、Ｃ−Ｒ７Ａｐｌｕｓ（記録計）
カラム：ＯＤＳカラム（ＹＭＣ社販売、商品名『ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｒ＆Ｄ  ＯＤＳ−Ａ』、φ２０ｍｍ×２５０ｍｍ）
移動相 ： ２０ｍＭ酢酸−酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．５）／メタノール  ８４／１６（容積／容積）
検出： ＲＩ
流速 ：３．０ｍｌ／分
カラム温度 ３５℃
【００６６】
＜実験２：ＣＧＴａｓｅによるグルコシルアデノシンの調製＞
無水物換算で、アデノシン（東京化成工業株式会社販売、試薬特級）の濃度が１ｗ／ｖ％、デキストリン（松谷化学株式会社販売、商品名『パインデックス＃１』）の濃度が１０ｗ／ｖ％となるように、１０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．５）に添加し、５０℃に加温し、撹拌し完全に溶解させた。特開昭５０−６３１８９号公報（特公昭５３−２７７９１号公報）に開示されたジオバチルス・ステアロサーモフィラス（旧分類ではバチルス・ステアロサーモフィラス）  Ｔｃ−９１株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２７３として茨城県つくば市東１−１−１中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託されている；受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２２５を国際寄託に移管したもの）由来のＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所製造）をデキストリン１ｇ当たり１，０００単位添加し、５０℃で２４時間反応後、１００℃で１５分間加熱しＣＧＴａｓｅを失活させた後、グルコアミラーゼ（ナガセケムテックス株式会社販売、商品名『グルコチーム＃２００００』、２０，０００単位／ｇ）をデキストリン１ｇ当たり２，６００単位加え、５０℃で２４時間反応させた。この反応液を１００℃で１０分間加熱した後、遠心（１１，５００ｒｐｍ）し、上清を回収した。この上清を、活性炭カラム１５０ｍｌ（１２０ｍｍ×φ４１ｍｍ）に、流速ＳＶ＝３（５ｍｌ／分）で通液することによりグルコシルアデノシンをカラムに吸着させた後、脱イオン水（湿潤樹脂容積の７倍量）及び２０容積％エタノール溶液（湿潤樹脂容積の６倍量）でカラムを洗浄し、４０容積％エタノール溶液で溶出した（湿潤樹脂容積の１６倍量）。溶出液を５０ｍｌずつ分画し、紫外吸収（２６０ｎｍ）が０．１５以上の画分を回収した。回収した画分を濃縮後、ＯＤＳカラムを用いた分取用ＨＰＬＣに供し、グルコシルアデノシン含有画分のメインピークを回収した。この回収した画分を、活性炭カラムに吸着させて脱塩し、４０容積％エタノールにより溶出し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、グルコシルアデノシンの溶出画分を回収した。分取用ＨＰＬＣは、移動相 に２０ｍＭ酢酸−酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．５）／メタノール８２／１８（容積／容積）を用い、カラム温度を４０℃とした以外は前記実験１−２と同様にグルコシルアデノシンの分取と同じ条件で行い、無水物換算でグルコシルアデノシンを９９質量％以上含有する標品を約１．６ｇ調製した。ちなみに、ＯＤＳカラムを用いた分取用ＨＰＬＣから溶出されたグルコシルアデノシンのメインピークは、実験１−２で溶出されたグルコシルアデノシンのメインピークとは異なるリテンションタイムに溶出された。また、斯かるメインピークにグルコシルアデノシンが含まれていることは、予め、常法によるマススペクトラム（ＭＳ）分析による分子量の測定でも確認した。
【００６７】
実験１−２及び実験２において、ＯＤＳカラムを用いた分取用ＨＰＬＣにより調製した２種のグルコシルアデノシンの構造を、常法によるＮＭＲ分析により決定した。ＮＭＲの分析の結果に基づく、２種のグルコシルアデノシンのカーボン化学シフト値を、アデノシンのカーボン化学シフト値と併せて表１に示す。なお、ＮＭＲ分析は下記条件により行った。また、アデノシンのカーボン化学シフト値は独立行政法人産業総合技術研究所公開の有機化合物のスペクトルデータベース（ＳＤＢＳ；ｈｔｔｐ：／／ｒｉｏｄｂ０１．ｉｂａｓｅ．ａｉｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ｓｄｂｓ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｄｉｒｅｃｔ＿ｆｒａｍｅ＿ｔｏｐ．ｃｇｉ）から入手したものを表１に併せて示す。
＜ＮＭＲ分析条件＞
装置：日本電子株式会社販売、商品名『ＪＮＭ−ＡＬ３００』、１Ｈ：３００．４ＭＨｚ、１３Ｃ：７５．４５ＭＨｚ
溶媒：重水（０．６ｍｌ）
内部標準：３−トリメチルシリル−１−プロパンスルフォン酸ナトリウム塩（ＴＰＳ）
積算回数：１Ｈ−ＮＭＲ  １２８回、１３Ｃ−ＮＭＲ  ４，０００回、ＤＥＰＴ  ４００回、Ｈ−Ｈ  ＣＯＳＹ  ３２回、Ｈ−Ｃ  ＣＯＳＹ  ３６回
試料量：２０ｍｇ
【００６８】
【表１】
2012105542.tif 000002
【００６９】
表１から明らかなように実験１−２で調製したグルコシルアデノシンはリボースの５´位の炭素のδｃ値が、実験２で調製した化合物はリボースの３´位の炭素のδｃ値がシフトしていることから、各々、５´−グルコシルアデノシン及び３´−グルコシルアデノシンであると同定した。
【００７０】
＜実験３：グルコシルアデノシンの水への溶解性＞
本発明のグルコシルアデノシンの基本的な性質として、水に対する溶解性をアデノシンと比較した。実験１−２で調製した５´−グルコシルアデノシン及び実験２で調製した３´−グルコシルアデノシンの水に対する溶解度を以下のようにして求め、アデノシンの溶解度と比較した。すなわち、５００μｌの純水に１００ｍｇの５´−グルコシルアデノシン又は３´−グルコシルアデノシン（以下、両方の化合物を総称し「グルコシルアデノシン」という場合がある。）を、各々室温（２５℃）で溶解させた。また、５００μｌの純水に５ｍｇのアデノシンを室温（２５℃）で溶解させた。２５℃の恒温室に１日静置後、遠心分離により溶け残った沈殿を除去した上清を、限外濾過（日本ミリポア社販売、商品名『ウルトラフリー  ０．５  Ｂｉｏｍａｘ−５  Ｍｅｍｂｒａｎｅ』）後、移動相で希釈し、さらに膜濾過（日本ミリポア社販売、商品名『Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＨ』、ポアサイズ０．４５μｍ）した。これを下記条件のＨＰＬＣに供し、紫外線検出器によるクロマトグラムに出現したピークの面積からグルコシルアデノシン及びアデノシン量をそれぞれ求め、濃度を計算して、これを室温（２５℃）での最大溶解濃度とした。同じサンプルを４℃の冷室に１ヶ月間静置した後、再度遠心分離し、同様に膜濾過処理した上清中のグルコシルアデノシン及びアデノシン量をそれぞれ同様に測定し、これを４℃での最大溶解濃度とした。その結果を表２に示す。
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
装置：ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＵＶ−ＶＩＳ  ＤＥＴＥＣＴＯＲ  ＳＰＤ−１０ＡＶ（検出器），ＬＣ−１０ＡＴ（ポンプ），Ｃ−Ｒ８Ａ（記録計），ＳＩＬ−２０ＡＣ（オートサンプラー）
カラム ：ＯＤＳカラム（ＹＭＣ社販売、商品名『ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ』、φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）
移動相 ： ０．１容積％酢酸水溶液／メタノール＝９６／４（容積／容積）
検出波長 ：２６０ｎｍ
流速 ：１．０ｍｌ／分
注入量： ２０μｌ
カラム温度： ４０℃
【００７１】
【表２】
2012105542.tif 000003
【００７２】
表２から明らかなように、室温（２５℃）の水にはアデノシンが０．８ｗ／ｖ％しか溶解しないのに対し、３´−グルコシルアデノシンは水に２ｗ／ｖ％まで溶解し、アデノシンよりも水への溶解性が上昇した。さらに、５´−グルコシルアデノシンは、室温で水に１６．１ｗ／ｖ％を超えて溶解し、アデノシンよりも水への溶解性が顕著に上昇した。また、４℃の水にはアデノシンが０．４ｗ／ｖ％しか溶解しないのに対し、３´−グルコシルアデノシンは２．０ｗ／ｖ％まで溶解し、アデノシンよりも水への溶解性が上昇した。さらに、５´−グルコシルアデノシンは、４℃の水に１５．７ｗ／ｖ％を超えて溶解し、アデノシンよりも水への溶解性が顕著に上昇した。この結果は、３´−グルコシルアデノシン及び５´−グルコシルアデノシンは、親水性溶媒を用いる皮膚外用剤の製造に用いる場合、例えば、溶液の状態で調合でき、調合時に不溶化して析出する恐れがない等、均質な皮膚外用剤を製造する上での加工適性が向上していることを示している。
【００７３】
＜実験４：グルコシルアデノシンの持続性＞
＜実験４−１：アデノシンデアミナーゼに対する耐性＞
アデノシンは生体内にもともと存在するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）によって速やかにイノシン、ヒポキサンチンへと分解されることが確認されている。そこで、アデノシンの配糖体であるグルコシルアデノシンについて、その効果を持続して発揮できる可能性について調べるため、アデノシン代謝に関与する酵素の給源としてヒト胎児正常線維芽細胞のセルライゼート（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）を用い、５´−グルコシルアデノシン及び３´−グルコシルアデノシンが生体内で分解されるかどうかを確認する試験を実施した。１０容積％ウシ胎児血清（以下、「ＦＣＳ」と略記する）含有ダルベッコのミニマムエッセンシャルメディウム（日水製薬株式会社販売、商品名『ダルベッコ変法イーグル培地「ニッスイ」』、以下、ＤＭＥＭと略記する）で希釈したヒト胎児正常線維芽細胞（クラボウ社販売、以下「ＮＨＤＦ細胞」という）を、１５０ｃｍ２培養フラスコ（コーニング社製）に、１．５×１０６細胞／２０ｍｌ／フラスコで播種し、４日間培養した。培養上清を除去後、０．０５質量％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（ギブコ社販売、商品名『Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ』）で処理し、細胞懸濁液をフラスコから回収した。細胞懸濁液を遠心し、上清を除去後、細胞のペレットに、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ、ｔａｂｌｅｔｓ、ロシュ社製）を溶解した１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液（Ｌｙｓｉｓ緩衝液）を加え、ＮＨＤＦ細胞を４．０×１０６ｃ／ｍｌとなるように懸濁した。懸濁液を、超音波処理（ＢＲＡＮＳＯＮ  ＳＩＮＩＦＩＥＲ  ＣＥＬＬ  ＤＩＳＲＯＰＴＯＲ  １８５）し、細胞を破砕（３回、各３０秒×２回）した後、１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を回収し、セルライゼートを調製した。実験１−２で調製した５´−グルコシルアデノシン又は実験２で調製した３´−グルコシルアデノシンを濃度５ｍＭとなるよう溶解したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）０．１ｍｌと上記セルライゼート０．９ｍｌを混合、撹拌し、３７℃で反応させた。反応開始時（０時間）、反応開始１、７及び２４時間の反応液を回収し、実験３と同じ方法で反応液を処理し、ＨＰＬＣ法によりアデノシン又はグルコシルアデノシン量を定量した。各々の化合物の反応開始時の濃度を１００％とし、各反応時間における化合物の反応液中の濃度の相対値を計算し、アデノシン或いはグルコシルアデノシンの残存率として表３に示す。
【００７４】
【表３】
2012105542.tif 000004
【００７５】
表３から明らかなように、アデノシンは、セルライゼートに含まれる酵素により速やかに分解され、反応７時間で完全に消失した。５´−グルコシルアデノシンは、反応２４時間でも９０％以上が残存していた。３´−グルコシルアデノシンは、反応７時間では８０％以上が残存し、２４時間では１７％が残存していた。この結果は、アデノシンは生体内では短時間で分解されてその機能を消失しやすいのに対し、３´−グルコシルアデノシン及び５´−グルコシルアデノシンは、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）やα−グルコシダーゼ等の生体内にもともと存在する酵素の作用を受け難く、アデノシンよりもその長時間残存してその機能を発揮できることを示している。ちなみに、５´−グルコシルアデノシン及び３´−グルコシルアデノシンをＮＨＤＦ細胞のセルライゼート（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）と反応させた場合、何れも、イノシンやヒポキサンチンが生成したこと、及び、この反応がα−グルコシダーゼ阻害剤で阻害されることから（データには示していない）、アデノシン配糖体は細胞内のα−グルコシダーゼによりアデノシンとグルコースに分解された後、アデノシンと同様ＡＤＡにより分解されてイノシン、ヒポキサンチンへと分解されると判断した。
＜実験４−２：３次元皮膚モデル中での残存性＞
本発明のグルコシルアデノシンの効果の持続性を判断するために、３次元皮膚環境における残存性についても調べた。１２ウェルプレート（ベクトンディッキンソン社販売、商品名『１２ウェルマルチウェルプレート』）にＥＰＩ１００アッセイ培地（クラボウ社販売  商品名『ＥＰＩアッセイ培地』）を０．３３ｍｌ／ｗｅｌｌ添加し、３次元皮膚モデルＥＰＩ２００（クラボウ社販売  商品名『ＥＰＩ−２００キット』）の皮膚モデルカップをウェルに移した。５％ＣＯ２、３７℃で３時間培養後、ＤＭＥＭ培地（日水製薬株式会社販売、商品名『ダルベッコ変法イーグル培地「ニッスイ」』）を０．９ｍｌ／ｗｅｌｌ添加した６ウェルプレート（ベクトンディッキンソン社販売、商品名『６ウェルマルチウェルプレート』）に皮膚モデルカップを移した。実験１−２の方法で調製した５´−グルコシルアデノシン、実験２の方法で調製した３´−グルコシルアデノシンまたはアデノシンを終濃度が０．１％となるよう３０％エタノールに溶解し、得られた溶液の０．１ｍｌを皮膚モデルカップ内に添加した。５％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養後、サンプル透過液（ウェル中の培地）を回収し、限外濾過（日本ミリポア社販売、商品名『ウルトラフリー  ０．５  Ｂｉｏｍａｘ−５  Ｍｅｍｂｒａｎｅ』）した後、移動相で希釈した。これを下記条件のＨＰＬＣに供し、別途作成した検量線により５´−グルコシルアデノシン、３´−グルコシルアデノシン及びアデノシンの量を求めた。３次元皮膚中透過後の各化合物の残存量とイノシン及びヒポキサンチンの生成量を表４に示した。
【００７６】
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
装置：ＨＰＬＣポンプ   Ｍｏｄｅｌ  ５１０、ポンプコントローラ   Ｍｏｄｅｌ  ６８０、オートインジェクター   Ｍｏｄｅｌ  ７１２、検出器   Ｍｏｄｅｌ  ２４８７、データ処理（定量計算）   Ｅｍｐｏｗｅｒ  ２  ｓｏｆｔｗａｒｅ  （ミリポア社製）
カラム ：ＯＤＳカラム（ＹＭＣ社販売、商品名『ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ  ＡＱ−３０３』、φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）
移動相 ：２０ｍＭ酢酸−酢酸アンモニウムバッファー（ｐＨ３．５）／メタノール＝９２／８（容積／容積）
検出波長 ：２６０ｎｍ
流速 ：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
注入量 ：１０μｌ
カラム温度 ：４０℃
【００７７】
【表４】
2012105542.tif 000005
【００７８】
表４から明らかなように、アデノシンは３次元皮膚透過の過程で全てイノシン及びヒポキサンチンへと代謝され、消失していた。それに対し、５´−グルコシルアデノシン及び３´−グルコシルアデノシンは、一部がイノシンやヒポキサンチンに代謝されたが、投与２４時間後に３次元皮膚透過後でも残存していた。このことは、アデノシンは皮膚内に浸透後、速やかに分解されて効果を失いやすいのに対し、グルコシルアデノシンは皮膚に浸透後も安定に存在し、真皮にまで達してその効果を発揮することを示している。なお、３次元皮膚における安定性は、５´−グルコシルアデノシンの方が３´−グルコシルアデノシンよりも優れていた。
【００７９】
実験４の結果から、アデノシンは皮膚に投与後比較的速やかに分解されて消失するが、グルコシルアデノシンはアデノシンよりも皮膚において分解されにくいことがわかった。特に、アデノシンは速やかにイノシンやヒポキサンチンに代謝されるのに対し、グルコシルアデノシンにおいてアデノシンが検出されず、アデノシンの代謝産物であるイノシンやヒポキサンチンの生成も少ないことは、α−グルコシダーゼによるグルコシルアデノシンの分解が徐々に進行することを示しており、グルコシルアデノシンは、皮膚において長時間残存し、その機能を持続的に発揮できることを物語っている。
【００８０】
＜実験５：グルコシルアデノシンのケラチノサイトの分化に及ぼす効果＞
グルコシルアデノシンの抗シワ作用に関し、皮膚のケラチノサイトに及ぼす効果を調べるため、ヒトの皮膚のケラチノサイトに対する分化促進剤の評価に汎用されている正常ヒト表皮角化細胞を用い、以下のように実施した。すなわち、正常ヒト表皮角化細胞（クラボウ社販売、新生児由来、以下「ＮＨＥＫ細胞」という）を用い、ケラチノサイトが基底層の細胞から顆粒層の細胞に分化する場合、顆粒層の細胞に分化した際に、顆粒層の細胞に特異的に発現され、その分化マーカーとされているプロフィラグリン（ｐｒｏｆｉｌａｇｇｒｉｎ：顆粒層の細胞のマーカー）を指標とし、このマーカー蛋白に対する特異的抗体を用いるウエスタンブロッティング法によりその発現量を比較し、ケラチノサイトの分化に対するグルコシルアデノシンの効果を評価した。本実験において、プロフィラグリンの増加は、基底層のケラチノサイトの分化が促進され、顆粒層の細胞が増加したことを意味する。
【００８１】
＜ケラチノサイトの分化の評価方法＞
細胞増殖添加剤（ＥＤＧＳ：ＥｐｉＬｉｆｅ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）含有ＥｐｉＬｉｆｅ培地（ Ｃａｓｋａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社販売）（以下、ＥＤＧＳ含有ＥｐｉＬｉｆｅ培地を「ＥｐｉＬｉｆｅ培地」と略記する。）に懸濁したＮＨＥＫ細胞を５×１０５細胞／１．５ｍｌ／ウエルとなるようコラーゲン（新田ゼラチン社販売、商品名『Ｃｅｌｌｍａｔｏｒｉｘ  Ｔｙｐｅ  ＩＶ』）をコートした６ウエルプレート（ベクトンデッキンソン社販売、商品名『ＦＡＬＣＯＮ  ＭＵＬＴＩ−ＷＥＬＬＴＭ  ６ＷＥＬＬ』）に播種し、インキュベータにて、５容積％ＣＯ２存在下、３７℃の条件で２日間培養した。各ウエルの培養上清を吸引除去し、実験１−２で調製した５´−グルコシルアデノシン又は実験２で調製した３´−グルコシルアデノシンを、終濃度が０．１μＭ、１μＭ又は１０μＭとなるように、各々ＥｐｉＬｉｆｅ培地で希釈し１．５ｍｌ／ウエル添加した。対照１として、アデノシンを終濃度が０．１μＭ、１μＭ又は１０μＭとなるようにＥｐｉＬｉｆｅ培地で希釈し１．５ｍｌ／ウエル添加した。さらに、対照２としてＥｐｉＬｉｆｅ培地のみを１．５ｍｌ／ウエル添加した。以降１日おきに、最初に添加したものと同じ成分を含む培地で培地交換しながら培養を８日間行った。各ウエルの培養液を吸引除去し、ＰＢＳを加え洗浄した後、抽出緩衝液（ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）を１００μｌ／ウエル加え、セルスクレイパーを用いて細胞をウエルから剥離し、１．５ｍｌマイクロチューブ（エッペンドルフ社販売、商品名『エッペンドルフチューブ』）に回収した。回収した細胞を、ボルテックスミキサーにより混合、懸濁した後、氷上に３０分放置し、遠心（１５，０００×ｇ、１０分、４℃）し、上清を回収し、分析用サンプルを調製した。なお抽出緩衝液として２質量％ソディウムドデシルサルフェイト（ＳＤＳ）、１ｍＭエデト酸（ＥＤＴＡ）、２０μＭ  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｅ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、２０μＭロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、０．１μＭアプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いた。
【００８２】
＜ウエスタンブロッティング分析＞
５容積％のジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む２．５ｗ／ｖ％ＳＤＳ水溶液８μｌに、上記分析用サンプル１２μｌを加えて混合し、蛋白質量が２０μｇ／レーンとなるようにチャージし、常法により、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した。泳動終了後、ゲルに含まれる蛋白質を、常法により、ニトロセルロース膜に移し、非特異的な反応を抑制するためブロッキング溶液（大日本住友製薬社販売、商品名「ブロックエース」）に浸漬した。このブロッキング処理したニトロセルロース膜を、抗プロフィラグリ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社販売、商品名『Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ（ＡＫＨ１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ』）を１０容積％ブロックエース含む５０ｍＭ  ＴＢＳ（２００ｍＭ  ＮａＣｌ含有５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））緩衝液（以下、「ＴＢＳ緩衝液」という）で１００倍希釈した溶液に、室温で１時間浸漬した後、０．０５容積％ツイーン２０を含む５０ｍＭ  ＴＢＳ緩衝液で洗浄し過剰の抗体を除いた。ニトロセルロース膜を、ＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧウサギポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社販売）溶液に、室温で２時間浸漬した。この膜を０．０５容積％ツイーン２０を含む５０ｍＭ  ＴＢＳ緩衝液で３０分間洗浄後、発色反応は、市販のウエスタンブロッティング検出キット（ジーイー  ヘルスケア  バイオサイエンス社販売、商品名「ＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  ａｎｄ  Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ」）を用いて行った。対照として、抗プロフィラグリ抗体に代えて、抗β−アクチン抗体を用いた以外は同様に処理を行った。発色後のニトロセルロース膜をデンシトメーター（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社販売、商品名『Ｉｍａｇｅ  Ｍａｓｔｅｒ  １Ｄ』）により、各バンドの濃さ（強度）を測定し、β−ａｃｔｉｎを内部標準とし、プロフィラグリのバンド強度をβ−ａｃｔｉｎのバンド強度の値で除しプロフィラグリンの発現量とした。ＥｐｉＬｉｆｅ培地のみで培養した対照２のプロフィラグリンの発現量を１とし、５´−グルコシルアデノシン、３´−グルコシルアデノシン又はアデノシンを添加して培養したときのプロフィラグリンの発現量の相対値を求め表５に示す。
【００８３】
【表５】
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【００８４】
表５から明らかなように、培地にアデノシンを添加し培養した場合には、ＮＨＥＫ細胞におけるプロフィラグリン蛋白の発現量の有意な増強は認められなかった。これに対し、培地に５´−グルコシルアデノシン又は３´−グルコシルアデノシンを添加してＮＨＥＫ細胞を培養した場合、表皮の顆粒層の細胞のマーカーであるプロフィラグリン蛋白の発現量の有意な増加が認められた。この結果は、５´−グルコシルアデノシン及び３´−グルコシルアデノシンは、いずれも表皮基底層のケラチノサイトを顆粒層の細胞に分化させるケラチノサイト分化促進作用を有し、抗シワ作用を有する皮膚外用剤の成分として好適であることを示している。なお、５´−グルコシルアデノシンと３´−グルコシルアデノシンを比較すると、５´−グルコシルアデノシンを添加した場合の方が、強いプロフィラグリン蛋白の発現増強効果を示した。
【００８５】
＜実験６：グルコシルアデノシンのコラーゲン産生に及ぼす効果＞
グルコシルアデノシンの抗シワ作用について、真皮におけるコラーゲン産生に及ぼす効果を調べるため、ヒトの皮膚のコラーゲン産生増強剤の評価に汎用されているヒト胎児正常線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を用い、以下のように実施した。すなわち、ヒト胎児正常線維芽細胞（クラボウ社販売、以下「ＮＨＤＦ細胞」という）を、１０容積％ウシ胎児血清（以下、「ＦＣＳ」と略記する）含有ダルベッコのミニマムエッセンシャルメディウム（以下、ＤＭＥＭと略記する）（日水製薬社販売）に懸濁し、２４ウエルプレート（ベクトンデッキンソン社販売、商品名『ＦＡＬＣＯＮ  ＭＵＬＴＩ−ＷＥＬＬＴＭ  ２４ＷＥＬＬ』）に１．５×１０５細胞／０．５ｍｌ／ウエルで播種し、インキュベータにて、５容積％２存在下、３７℃の条件で１日間培養した。実験１−２で調製した５´−グルコシルアデノシン、実験２で調製した３´−グルコシルアデノシン又はアデノシンの何れかを終濃度が表６に示す濃度となるように、１０容積％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭで希釈し、０．５ｍｌ／ウエル添加し、インキュベータにて、５容積％ＣＯ２存在下、３７℃の条件で３日間培養後、培養上清を吸引除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、１Ｍ酢酸で１ｍｇ／ｍｌに希釈したペプシン（ＳＩＧＭＡ社販売）溶液を２５０μｌ／ウエル添加した。室温で４時間振とうした後、セルスクレイパーでウエルに付着した細胞をウエルから剥離し、ピペッティングして、ペプシン消化後の細胞懸濁液を１．５ｍｌマイクロチューブ（エッペンドルフ社販売、商品名『エッペンドルフチューブ』）に回収した。このチューブにコラーゲン定量用発色試薬（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社販売、商品名『Ｓｉｃｒｏｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ』）を５００μｌ／チューブ添加し、ボルテックスミキサーにて混合後、室温でローテーター（ＴＡＩＴＥＣ社販売、商品名『ＲＴ−５０』）を用いて正確に３０分間転倒混和した後、４℃で１０分間遠心（１５，０００ｒｐｍ）し、上清を除去した沈殿に、１ＮのＮａＯＨを１００μｌ／チューブ添加した後、沈殿をピペッティングにより溶かし、その全量を９６マイクロウエルプレート（ベクトンデッキンソン社販売、商品名『ＦＡＬＣＯＮ  ＭＩＣＲＯＴＥＳＴＴＭ９６』）に移し、吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社販売、商品名『Ｖｍａｘ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ』）により吸光度（Ａ５６０−Ａ６５０）を測定した。同じ方法により、タイプIコラーゲン（ＫＯＫＥＮ社販売）を用いて作成したコラーゲン定量用発色試薬による発色の検量線に基づき、各ウエルのコラーゲン量を求め、表６に併せて示す。
【００８６】
【表６】
2012105542.tif 000007
【００８７】
表６から明らかなように、培地にアデノシンを添加した場合、５μＭの添加では、無添加の場合と差が認められなかったものの、１０μＭの添加では、コラーゲン産生の亢進が認められた。これに対し、５´−グルコシルアデノシン又は３´−グルコシルアデノシンを添加してＮＨＤＦ細胞を培養した場合、何れもその濃度に依存して、有意のコラーゲンの産生の亢進が認められ、このコラーゲン産生増強作用の強さは、アデノシンよりも５´−グルコシルアデノシン及び３´−グルコシルアデノシンの方が強かった。このことは、５´−グルコシルアデノシン及び３´−グルコシルアデノシンは、アデノシンよりも繊維芽細胞におけるコラーゲン産生を増強させる機能に優れ、抗シワ作用を有する皮膚外用剤の成分として好適であることを示している。なお、コラーゲン産生増強作用の強さは、５´−グルコシルアデノシンと３´−グルコシルアデノシンとでほぼ同等であった。
【００８８】
実験５と実験６の結果は、５´−グルコシルアデノシン及び３´−グルコシルアデノシンは、何れも、表皮のケラチノサイト分化促進作用と真皮の線維芽細胞によるコラーゲン産生増強作用を併せ持ち、抗シワ作用を有する皮膚外用剤の有効成分として利用できることを物語っている。また、斯かる効果は、グルコシルアデノシンの方がアデノシンよりも強いと判断された。
【００８９】
＜実験７：グルコシルアデノシンのケラチノサイトの分化に及ぼす効果２＞
実験５において、グルコシルアデノシンが皮膚改善に有効な表皮ケラチノサイトの分化促進作用を有することが確認されたので、この作用につきさらに詳しく解析するため、リアルタイムＰＣＲ解析法を用い、ケラチノサイトの分化マーカー遺伝子を指標としてその発現量の変化を調べる試験を以下のように行った。さらに、ヒトの皮膚の保湿やバリア機能に重要な役割を有し皮膚改善に有効とされているセラミド合成に及ぼすグルコシルアデノシンの影響を調べる目的で、セラミドの合成に関与する遺伝子の発現量についても併せて検討した。すなわち、解析対象遺伝子として、ケラチノサイトの分化マーカーとしてプロフィラグリン（ＰＦＧ：後期のマーカー）やインボルクリン（ＩＮＶ：初期の分化マーカー）を、セラミドの合成に関与する酵素であるβグルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ）、スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭａｓｅ）を選択し、ＰＣＲ反応の際の内部標準としてサイクロフィリンＢ（ＣｙｐＢ）の遺伝子を用いた（表７参照）。コラーゲンコートした６ウエルプレートにＮＨＥＫ細胞を８×１０４細胞／１．５ｍｌ／ウエルで播種し、ＥｐｉＬｉｆｅ培地を用い、インキュベータにて、５容積％ＣＯ２存在下、３７℃の条件で２日培養し、培地を除去後、５´−グルコシルアデノシン、３´−グルコシルアデノシン又はアデノシンを含有する新しいＥｐｉＬｉｆｅ培地を１．５ｍｌ／ウエル添加し（グルコシルアデノシン又はアデノシンの終濃度は１μＭ）、１日おきにグルコシルアデノシン又はアデノシンを含有する同じ培地を用い培地交換（１．５ｍｌ／ウエル）しながら７日間培養した。培養終了後、各ウエルをＰＢＳ（Ｋ−）で２回洗浄後、０．０２５質量％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を０．２ｍｌ／ウエル添加し、室温で５分放置することにより細胞をプレートから剥離した。さらに、中和液（キレックス処理した０．５容積％ＦＣＳ含有ＰＢＳ）を１ｍｌ／ウエル添加し、ピペッティングしながら細胞懸濁液を１．５ｍｌマイクロチューブ（エッペンドルフ社販売、商品名『エッペンドルフチューブ』）に回収した。このチューブを５，０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を除去することにより得た細胞ペレットを、全ＲＮＡ抽出に供した。対照として、ＥｐｉＬｉｆｅ培地のみを添加し培養した細胞を同様に処理した。試験は、対照、グルコシルアデノシン又はアデノシンにつき各３ウエルを用いた。
【００９０】
これらの細胞ペレットからの全ＲＮＡ抽出は、市販のＲＮＡ抽出キット（何れもキアゲン（ＧＩＡＧＥＮ）社販売、細胞の破砕：商品名『ＱＩＡ  ｓｈｌｅｄｄｅｒ』、ＲＮＡの回収：商品名『ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ』）を用い、操作は、その説明書に従った。途中、ＤＮａｓｅ（キアゲン社販売）処理を加えた。次に、市販の逆転写酵素（ギブコ社販売、商品名『Ｍ−ＭＬＶＲＴ』）を用い、添付の説明書に準じ以下のように、ｃＤＮＡテンプレートを合成した。全ＲＮＡにオリゴｄＴランダムプライマー（ギブコ社販売）及びｄＮＴＰｓ（ＧＥヘルスケア社販売、商品名『ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ』）を混合して７０℃で５分間処理後、氷上にて１分間以上放置した。これに、逆転写酵素及びジチオスレイトールを添加し２５℃で１０分間、４２℃で５０分間、続いて７０℃で１５分間インキュベートした。
【００９１】
内部標準及び解析対象遺伝子のＰＣＲ解析に必要なプライマーの塩基配列（Ｆｏｒｗａｒｄ及びＲｅｖｅｒｓｅ  プライマー）は、ＧＥＮＢＡＮＫのｍＲＮＡ配列から「ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェア」（フリーウエア）を用いて設計するか、或いは、既知の塩基配列を用い、プライマーは、合成の受託会社（シグマアルドリッチ株式会社）に依頼して調製した。本実験の対象とした解析対象遺伝子及び内部標準として用いた遺伝子、及び、これらの遺伝子のＰＣＲ反応のプライマーとして用いた塩基配列を表７に併せて示す。このプライマーを用い、市販のＰＣＲ定量解析システム（ロシュ・ダイアグノスティックス社販売、商品名『Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ４８０』）により各解析対象遺伝子の発現量を定量した。各ｃＤＮＡテンプレートのＰＣＲ反応は、市販のＰＣＲキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社販売、商品名『ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒ  ｋｉｔ』）を用い、その添付の説明書に基づき、最初に反応液を９５℃で５分間熱変性を行った後、ＰＣＲ反応（９５℃で１０秒、６０℃で１０秒、７２℃で１５秒を１サイクルとし、これを４５サイクル繰り返した）を行った。内部標準としてサイクロフィリンＢをコードするＤＮＡを用い、各解析対象遺伝子の相対的な発現量を算出した。対照における各解析対象遺伝子の発現量の３ウエルの平均値を１．００とし、各々の解析対象遺伝子の発現量の相対値の３ウエルの平均値を求め表８に示す。
【００９２】
【表７】
2012105542.tif 000008
【００９３】
【表８】
2012105542.tif 000009
【００９４】
表８から明らかなように、ＮＨＥＫ細胞は、アデノシンを添加して培養した場合には、プロフィラグリン（ＰＦＧ）、インボルクリン（ＩＮＶ）、βグルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ）及びスフィンゴミエリナーゼ（ＳＭａｓｅ）遺伝子の発現量が、それぞれ、１．４１、１．１５、１．３７、１．３５となり、何れの遺伝子も、対照の発現量と比較し、有意な増強は認められなかった。これに対し、３´−グルコシルアデノシンを添加し培養した場合には、プロフィラグリン（ＰＦＧ）、インボルクリン（ＩＮＶ）、βグルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ）及びスフィンゴミエリナーゼ（ＳＭａｓｅ）遺伝子の発現量が、それぞれ、２．０３、１．５２、２．０８、２．０３となり、何れの遺伝子も、対照の発現量と比較し、有意に増強された。また、５´−グルコシルアデノシンを添加し培養した場合、培地のみで培養した場合に比較し、プロフィラグリン（ＰＦＧ）、インボルクリン（ＩＮＶ）、βグルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ）及びスフィンゴミエリナーゼ（ＳＭａｓｅ）遺伝子の発現量が、それぞれ、２．５４、１．６６、２．６８、２．５７となり、何れの遺伝子も、対照の発現量と比較し、有意な増強が認められた。この結果は、３´−グルコシルアデノシン及び５´−グルコシルアデノシンによるケラチノサイト分化促進作用が遺伝子の発現レベルにも及び、その増強作用は、遺伝子レベルにおいても、アデノシンよりグルコシルアデノシンの方が強いことを示している。また、グルコシルアデノシン添加後２４時間以上経過しても上記遺伝子が発現していることから、グルコシルアデノシンの効果は少なくとも２４時間持続していることを示している。３´−グルコシルアデノシンと５´−グルコシルアデノシンとを比較すると、５´−グルコシルアデノシンの方が強いことを示している。さらに、この実験結果は、グルコシルアデノシンがβグルコセレブロシダーゼやスフィンゴミエリナーゼなど、皮膚の保湿やバリア機能に重要な役割を果たしているセラミドの合成にも遺伝子レベルで作用することを示しており、グルコシルアデノシンがβグルコセレブロシダーゼやスフィンゴミエリナーゼの発現増強剤、さらには、セラミドの合成促進剤としても利用できることを示している。
【００９５】
＜実験８：ケラチノサイト増殖因子に及ぼす影響＞
実験５及び７において、グルコシルアデノシンはケラチノサイトの分化を促進する作用が確認されたので、ケラチノサイトの増殖に対する影響も調べた。正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）において、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）発現に対する５´−グルコシルアデノシンと３´−グルコシルアデノシンの影響を比較した。ＮＨＤＦを１０％ＦＢＳ（ＪＲＳ社販売、商品名『Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）  Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｏｒｉｇｉｎ』）含有ＤＭＥＭ培地（日水製薬株式会社販売、商品名『ダルベッコ変法イーグル培地「ニッスイ」』）に懸濁し、１２ウェルプレート（ベクトンデッキンソン社販売、商品名「１２ウェルマルチウェルプレート」）に３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ／ｗｅｌｌで播種し、５％ＣＯ２、３７℃で１日培養した。培養上清を除去後、実験１−２の方法で得た５´−グルコシルアデノシン又は実験２の方法で得た３´−グルコシルアデノシンを終濃度０．１５、１．５ｍＭとなるように、各々を１％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で希釈し、添加した。グルコシルアデノシンを含まない１％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地を添加したものを対照とした。５％ＣＯ２、３７℃で４時間培養後、培養上清を吸引除去し、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、細胞をＲＮＡ抽出に供した。
【００９６】
全ＲＮＡ抽出は市販のＲＮＡ抽出キット（キアゲン社販売、商品名『ＱＩＡ  ｓｈｌｅｄｄｅｒ＋ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ』）を用いて行った。操作は、キットに付属の説明書に従った。ＲＴ反応はＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社販売、商品名『Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ合成キット』）を用い、ＲＮＡ１０．５μｌ、５×ＶＩＬＯ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘ３μｌ、１０×ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘ１．５μｌを混合したもの（合計１５μｌ）を、２５℃で１０分間、４２℃で６０分間、次いで８５℃で５分間処理する条件で行った。
【００９７】
リアルタイムＰＣＲ反応はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、商品名『ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒ』)を用い、水１．８μｌ、ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ６．０μｌ、ｐｒｉｍｅｒ  Ｌ  （１０μＭ）０．６μｌ、ｐｒｉｍｅｒ  Ｒ  （１０μＭ）０．６μｌ、ｔｅｍｐｌａｔｅ３．０μｌを混合し（合計１２．０μｌ）、９５℃で１０秒、６０℃で１０秒、次いで７２℃で１５秒保持する条件で４５サイクル行った。各サンプルのＫＧＦ発現量は標準曲線から算出し、内部標準（１８ｓ  ｒＲＮＡ）の発現量で補正した。対照における発現量を１．０とした場合の相対値を求めて、各サンプルの発現量を評価した。使用したプライマーは表９に示したものを用いた。結果を表１０に示した。
【００９８】
【表９】
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【００９９】
【表１０】
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【０１００】
表１０から明らかなように、３´−グルコシルアデノシンを用いた場合、０．１５ｍＭ以上の濃度でＫＧＦの発現量が２倍以上となり、５´−グルコシルアデノシンを用いた場合、１．５ｍＭ以上の濃度でＫＧＦの発現量が上昇した。このことは、３´−グルコシルアデノシン及び５´−グルコシルアデノシンは、いずれもケラチノサイトの分化のみならず、その増殖をも促進する作用を有することから、抗シワ作用を有する皮膚外用剤の有効成分として好適であることを示している。
【０１０１】
実験５、７及び実験８の結果は、３´−グルコシルアデノシン及び５´−グルコシルアデノシンは、いずれもケラチノサイトの分化及び増殖を促進することから、皮膚のターンオーバーを改善する作用を有し、シワの発生を抑制する作用において優れることを示している。また、実験７により本発明のグルコシルアデノシンの効果は添加後24時間経ても持続していること、実験４により本発明のグルコシルアデノシンは皮膚において長時間残存することが示されたことからから、本発明のグルコシルアデノシンの抗シワ作用は持続性を有することを示している。なお、５´−グルコシルアデノシンはケラチノサイトの分化に対し、３´−グルコシルアデノシンはケラチノサイト増殖に対する促進効果が強かったことから、皮膚外用剤に用いる場合、目的に応じて両グルコシルアデノシンを適宜組み合わせて利用するのが好適である。
【０１０２】
＜実験９：グルコシルアデノシンの細胞障害＞
グルコシルアデノシンに関し、持続性の皮膚外用剤の成分として、皮膚に対して継続的に使用できるかどうかを調べるため、その細胞障害について調べた。グルコシルアデノシン及びアデノシンの３次元皮膚に対する影響として、細胞が障害を受けた際に放出されるラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を指標とし、細胞障害の強さを調べた。２４ウェルプレート（ベクトンディッキンソン社販売、商品名『２４ウェルマルチウェルプレート』）にＥＰＩ１００アッセイ培地（クラボウ社販売  商品名『ＥＰＩアッセイ培地』）を０．１９ｍｌ／ｗｅｌｌ添加し、３次元皮膚モデルＥＰＩ２００（クラボウ社販売  商品名『ＥＰＩ−２００キット』）の皮膚モデルカップを上記ウェルに移した。５％ＣＯ２、３７℃で３時間培養後、新しい６ウェルプレート（ベクトンディッキンソン社販売、商品名『６ウェルマルチウェルプレート』）にＥＰＩ１００アッセイ培地を０．９ｍｌ／ｗｅｌｌ添加し、皮膚モデルカップを移した。実験１−２の方法で得た５´−グルコシルアデノシン、実験２の方法で得た３´−グルコシルアデノシン、またはアデノシンを終濃度５％となるよう３０％エタノールで溶解し、得られた溶液０．１ｍｌを皮膚モデルカップ内に添加し、１８時間後、透過液（ウェル内の培地）を回収した。グルコシルアデノシン及びアデノシンを含まない３０％エタノールを添加したものを対照とした。回収した透過液について、皮膚モデルより放出されたラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を細胞障害検出キット（ロシュ社販売  商品名『細胞障害検出キット（ＬＤＨ）』）を用いて測定し、対照のＬＤＨ活性を１．０として相対ＬＤＨ活性を求め、各試料の細胞障害を評価した。結果を表１１に示した。
【０１０３】
【表１１】
2012105542.tif 000012
【０１０４】
表１１から明らかなように、アデノシンを用いた場合、回収液中のＬＤＨ活性が濃度依存的に上昇し、濃度１％で明らかなＬＤＨの放出が認められた。一方、５´−グルコシルアデノシン及び３´−グルコシルアデノシンを用いた場合は、いずれも濃度５％においてもＬＤＨ活性は上昇せず、ＬＤＨの放出は認められなかった。このことは、アデノシンは濃度依存的に細胞障害を起こす恐れがあるが、本発明のグルコシルアデノシンはアデノシンと比較して極めて皮膚に対する障害を起こしにくいことを示しており、皮膚外用剤の有効成分として、とりわけ、長時間皮膚に適用することができる、持続性の抗シワ作用を有する皮膚外用剤の有効成分として有用であることを示している。なお、上述のように、本発明のグルコシルアデノシンはα−グルコシダーゼにより徐々に分解され、生成したアデノシンは速やかに代謝されるために、α−グルコシダーゼによりグルコースとアデノシンに分解されても、細胞障害を起こすおそれのあるアデノシンとして蓄積しないと考えられる。
【０１０５】
＜実験１０：グルコシルアデノシンの安全性＞
グルコシルアデノシンの安全性を１０名のボランティアによるパッチテストにより評価した。
【０１０６】
＜被験者＞
年齢が２２乃至４５歳の男女合計２０名（男性１０名、女性１０名）を、無作為に１０名ずつ（各群男性５名、女性５名）の２群に分けた。
＜被験試料＞
実験２の方法で得た３´−グルコシルアデノシン又は実験１−２の方法で得た５´−グルコシルアデノシンを下記濃度となるように精製水に溶解し、被験試料１及び２を調製した。対照として精製水を用いた。
被験試料１：３´−グルコシルアデノシン２ｗ／ｖ％を含有する水溶液
被験試料２：５´−グルコシルアデノシン２ｗ／ｖ％を含有する水溶液
対照：精製水のみ
【０１０７】
＜試験方法＞
１群１０名には被験試料１と対照を塗布した（実験群１）。１０名の被験者の中、無作為に選択した５名の被験者には、左上腕内側に対照を塗布し、右上腕内側に被験試料１を塗布し、残りの５名には左上腕内側に被験試料１を塗布し、右上腕内側に対照を塗布した。被験試料１又は対照の各々１５μｌを、フィンチェンバー（エピテスト（Ｅｐｉｔｅｓｔ  Ｌｔｄ．）社製  フィンランド国）を用い、常法により２４時間の閉塞塗布を実施した。残りの１群１０名の被験者には、被験試料１に代えて被験試料２を１５μｌを用いた以外は、被験試料１と同じ条件で２４時間の閉塞塗布試験を実施した（実験群２）。塗布開始２４時間後にフィンチェンバーを除去し、除去後１時間と２４時間の塗布部位の状態を目視により確認した。試料塗布部位の皮膚の状態を下記判定基準により判定し、その被験者数を表１２に示す。なお、試験期間中、フィンチェンバーを除去するまでは、入浴、シャワー、過激な運動は禁止し、除去後２４時間は過激な運動を禁止するとともに、タオル等による摩擦など、試料塗布部位に対する刺激行為を禁止した。
【０１０８】
＜評価方法＞
日本接触皮膚炎学会の「環境皮膚科学」が示すパッチテスト判定基準のうちの本邦基準（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄａｉｉｃｈｉｃｌｉｎｉｃ．ｊｐ／ｄｅｒｍａ／ｓｅｓｙｏｋｕ／ｃｏｎｔｅｎｔｓ＿０３／ｐａｔｃｈｔｅｓｔ＿ｔａｂｌｅ＿２．ｈｔｍｌ）に基づき、塗布部位につき、目視により判定した。判定は、反応なし（−）、わずかな紅斑（±）、明らかな紅斑（＋）、紅斑＋浮腫、丘疹（＋＋）、紅斑＋浮腫・丘疹＋小水疱（＋＋＋）、大水疱（＋＋＋＋）の６段階で評価した。
【０１０９】
【表１２】
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【０１１０】
表１２から明らかなように、被験試料１（３´−グルコシルアデノシン）及び対照を塗布した実験群１では、フィンチェンバー除去後１時間及び２４時間で、何れも塗布部位に反応は認められなかった。被験試料２（５´−グルコシルアデノシン）及び対照を塗布した実験群２群では、フィンチェンバー除去後１時間及び２４時間で、何れも塗布部位に反応は認められなかった。この結果は、グルコシルアデノシンが皮膚に塗布しても安全な物質であることを示している。
【０１１１】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【０１１２】
＜グルコシルアデノシン含有粉末＞
アデノシン（和光純薬工業株式会社販売、試薬特級）の濃度が１ｗ／ｖ％、デキストリン（松谷化学株式会社販売、商品名『パインデックス＃１』、固形分約９２．３質量％）の濃度が１０ｗ／ｖ％となるように、それぞれを、２ｍＭのＣａＣｌ２溶液６，６００ｍｌに添加し、５０℃に加温し、撹拌することにより完全に溶解した。１Ｎ  ＨＣｌによりｐＨを６．０に調整した後、実験１−１で調製したバチルス・サーキュランス  ＰＰ７１０株（独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター  受託番号ＢＰ−１０７７１）を培養することにより調製したα−グルコシル転移酵素の濃縮粗酵素液を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）でα−グルコシル転移酵素の活性が５００単位／ｍｌとなるように希釈した酵素液３０ｍｌ（α−グルコシル転移酵素をデキストリン１ｇ当たり２０単位添加）を加え、撹拌混合し、５０℃で２４時間反応を行った。反応終了後の反応液に１Ｎ  ＨＣｌを加えｐＨ３．５に調整後、グルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業社販売、商品名『ＸＬ−４』、３，８００単位／ｍｌ）を、デキストリンの固形分１ｇ当たり１，０００単位加え５０℃で２４時間反応させ、１００℃で１０分間処理し、酵素反応を停止した。この酵素反応を停止した反応液を、活性炭カラム（１００ｍｍ×φ４１ｍｍ）に、流速ＳＶ＝３（５ｍｌ／分）で通液することによりグルコシルアデノシンをカラムに吸着させた後、脱イオン水（湿潤樹脂容積の５倍量）及び２０容積％エタノール溶液（湿潤樹脂容積の３倍量）でカラムを洗浄し、４０容積％エタノール溶液で溶出した。溶出液を５０ｍｌずつ分画し、紫外吸収（２６０ｎｍ）が０．１５以上の画分を回収した。回収した画分をロータリーエバポレーターで濃縮し、強酸性カチオン交換樹脂（オルガノ社販売、商品名『ＸＴ−１０３０Ｅ』（Ｎａ型）、φ４．２ｃｍ×１００ｃｍ、２本）に４０ｍｌ／分の流速で通液し、脱イオン水を用いて溶出し、回収した画分を実験３と同様の条件のＨＰＬＣにより分析し、無水物換算で、グルコシルアデノシンを９５質量％以上含有すると計算された画分を回収した。さらにこの回収した画分を減圧乾燥することによりグルコシルアデノシン含有粉末１５ｇを得た。本品は、無水物換算で、５´−グルコシルアデノシンを約８５質量％、３´−グルコシルアデノシンを約１０質量％、ニゲロシルアデノシンを約０．３質量％、アデノシンを約２質量％含有していた。本品は、表皮及び真皮の組織構造や生理機能の維持、改善を助けるための持続性の抗シワ作用を有する皮膚外用剤の有効成分として、そのままで、適宜の担体、賦形剤、安定剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、溶媒等、任意の助剤等を添加した製剤として、或いは、これらを配合した医薬品、医薬部外品、化粧品などの形態で用いることができる。また、本品は、ケラチノサイト分化及び増殖促進剤、コラーゲン産生増強剤、セラミド合成促進剤或いは保湿剤として利用することも随意である。【０１１３】
ちなみに、上記ニゲロシルアデノシンは、本品を下記条件のＨＰＬＣに供したところ、５´−グルコシルアデノシン、３´−グルコシルアデノシン、アデノシンの溶出ピーク以外に、アデノシンと３´−グルコシルアデノシンの溶出ピークの間にマイナーピーク（リテンションタイムが約２２乃至２３分）として確認された。斯かるピーク画分を回収し、常法によるマススペクトラム（ＭＳ）分析に供したところ、分子量が６０７と算出されたので、アデノシンに２分子グルコースが結合した化合物と判断した。さらに、回収した画分を用い、下記条件のＭＮＲ分析によるカーボン及びプロトンの化学シフト値（表１３参照）から、回収した画分に含まれる物質は、アデノシンの５´位の水酸基にニゲロース１分子が結合した５´−ニゲロシルアデノシン（α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→５´）−アデノシン；５´−α−ニゲロシルアデノシン）であると同定した。なお、５´−ニゲロシルアデノシンは重水に６ｗ／ｖ％以上溶解するので、３´−グルコシルアデノシンより水性溶媒に対する溶解性が高い。また、アデノシン及びニゲロースのカーボン化学シフト値は独立行政法人産業総合技術研究所公開の有機化合物のスペクトルデータベース（ＳＤＢＳ；ｈｔｔｐ：／／ｒｉｏｄｂ０１．ｉｂａｓｅ．ａｉｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ｓｄｂｓ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｄｉｒｅｃｔ＿ｆｒａｍｅ＿ｔｏｐ．ｃｇｉ）より入手した。
＜ＨＰＬＣ条件＞
装置：ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＵＶ−ＶＩＳ  ＤＥＴＥＣＴＯＲ  ＳＰＤ−２０Ａ（検出器），ＬＣ−２０ＡＢ（ポンプ），Ｃ−Ｒ７Ａｐｌｕｓ（記録計），ＳＩＬ−２０ＡＣ（オートサンプラー）
カラム：ＯＤＳカラム（ＹＭＣ社販売、商品名『ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱ３０３』、φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）
移動相 ： ２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．５）／メタノール＝９２／８（容積／容積）
検出波長 ：２６０ｎｍ
流速 ：０．５ｍｌ／分
注入量： ２０μｌ
カラム温度： ４０℃
＜ＮＭＲ分析条件＞
装置：日本電子株式会販売、商品名『ＪＮＭ−ＡＬ３００』、１Ｈ：３００．４ＭＨｚ、１３Ｃ：７５．４５ＭＨｚ
溶媒：重水（０．６ｍｌ）
内部標準：３−トリメチルシリル−１−プロパンスルフォン酸ナトリウム塩（ＴＰＳ）
積算回数：１Ｈ−ＮＭＲ  ６４回、１３Ｃ−ＮＭＲ  １２，００回、ＤＥＰＴ  １００回、Ｈ−Ｈ  ＣＯＳＹ  ３６回、Ｈ−Ｃ  ＣＯＳＹ  ７２回、ＨＭＢＣ  ９２０回
試料量：３６．４ｍｇ【０１１４】
【表１３】
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【実施例２】
【０１１５】
実施例１で調製したグルコシルアデノシン含有粉末２．５ｇに精製水１００ｍｌを加え溶解し、実験１−２と同じ条件でＯＤＳカラムを用いた分取用ＨＰＬＣに供し、５´−グルコシルアデノシン含有画分を回収し、減圧乾燥することにより、無水物換算で、５´−グルコシルアデノシンを９９質量％以上含有する粉末標品を合計で約１．６ｇ調製した。本品は、表皮及び真皮の組織構造や生理機能の維持、改善を助けるための持続性の抗シワ作用を有する皮膚外用剤の有効成分として、そのままで、適宜の担体、賦形剤、安定剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、溶媒等、任意の助剤等を添加した製剤として用いることができる。また、本品は、ケラチノサイト分化及び増殖促進剤、コラーゲン産生増強剤、セラミド合成促進剤或いは保湿剤として利用することも随意である。
【実施例３】
【０１１６】
＜グルコシルアデノシン含有粉末＞
アデノシン（東京化成工業株式会社販売、試薬特級）の濃度が１ｗ／ｖ％、デキストリン（松谷化学株式会社販売、商品名『パインデックス＃１』、固形分約９２．３質量％）の濃度が１０ｗ／ｖ％となるように、それぞれを１０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．５）に添加し、５０℃に加温し、撹拌し完全に溶解させた。ジオバチルス・ステアロサーモフィラス  Ｔｃ−９１株（独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２７３）由来のＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所製造）をデキストリン１ｇ当たり１，０００単位添加し、５０℃で２４時間反応後、１００℃で１５分間加熱しＣＧＴａｓｅを失活させた後、グルコアミラーゼ（ナガセケムテックス株式会社販売、商品名『グルコチーム＃２００００』、２０，０００単位／ｇ）をデキストリン１ｇ当たり２，６００単位加え、５０℃で２４時間反応させた。この反応液を１００℃で１０分間加熱した後、遠心（１１，５００ｒｐｍ）し、上清を８００ｍｌ回収した。この上清を、活性炭カラム１５０ｍｌ（１２０ｍｍ×φ４１ｍｍ）に、流速ＳＶ＝３（５ｍｌ／分）で通液することによりグルコシルアデノシン及びアデノシンをカラムに吸着させた後、脱イオン水（湿潤樹脂容積の７倍量）及び２０容積％エタノール溶液（湿潤樹脂容積の６倍量）でカラムを洗浄し、４０容積％エタノール溶液で溶出した（湿潤樹脂容積の１６倍量）。溶出液を５０ｍｌずつ分画し、紫外吸収（２６０ｎｍ）の認められた画分を回収した。回収した画分の約半量を膜濾過（ポワサイズ０．２２μｍ）後、減圧乾燥し、グルコシルアデノシン含有粉末約４ｇを得た。本品は、無水物換算で、５´−グルコシルアデノシンを約２６質量％、３´−グルコシルアデノシンを約５２質量％、アデノシンを約２１質量％含有していた。本品は、表皮及び真皮の組織構造や生理機能の維持、改善を助けるための持続性の抗シワ作用を有する皮膚外用剤の有効成分として、そのままで、適宜の担体、賦形剤、安定剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、溶媒等、任意の助剤等を添加した製剤として、或いは、これらを配合した医薬品、医薬部外品、化粧品などの形態で用いることができる。また、本品は、ケラチノサイト分化及び増殖促進剤、コラーゲン産生増強剤、セラミド合成促進剤或いは保湿剤として利用することも随意である。
【実施例４】
【０１１７】
実施例３で回収した活性炭カラム溶出画分の残りの半量を、実験１−２と同じ条件でＯＤＳカラムを用いた分取用ＨＰＬＣに供し、３´−グルコシルアデノシン画分、及び、５´−グルコシルアデノシン画分を個々に回収し、それぞれ実施例３と同様に、活性炭カラムクロマトグラフィーにより脱塩し、４０容積％エタノールにより溶出し、グルコシルアデノシンの溶出画分を回収した。回収した画分を膜濾過（ポワサイズ０．２２μｍ）後、減圧乾燥することにより、無水物換算で３´−グルコシルアデノシン９９質量％以上含有する標品を約１．６ｇと、５´−グルコシルアデノシンを９９質量％以上含有する標品を約０．６ｇ調製した。本品は何れも、表皮及び真皮の組織構造や生理機能の維持、改善を助けるための持続性の抗シワ作用を有する皮膚外用剤の有効成分として、そのままで、適宜の担体、賦形剤、安定剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、溶媒等、任意の助剤等を添加した製剤として、或いは、これらを配合した医薬品、医薬部外品、化粧品などの形態で用いることができる。また、本品は、ケラチノサイト分化及び増殖促進剤、コラーゲン産生増強剤、セラミド合成促進剤或いは保湿剤として利用することも随意である。
【実施例５】
【０１１８】
＜グルコシルアデノシン含有粉末＞
アデノシン（東京化成工業株式会社販売、試薬特級）の濃度が１ｗ／ｖ％、デキストリン（松谷化学株式会社販売、商品名『パインデックス＃１』、固形分約９２．３質量％）の濃度が１０ｗ／ｖ％となるように、それぞれを１０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．５）に添加し、５０℃に加温し、撹拌し完全に溶解させた。ジオバチルス・ステアロサーモフィラス  Ｔｃ−９１株（独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２７３）由来のＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所製造）をデキストリン１ｇ当たり１，０００単位添加し、５０℃で２４時間反応後、１００℃で１５分間加熱しＣＧＴａｓｅを失活させた後、遠心（１１，５００ｒｐｍ）し、上清を４００ｍｌ回収した。この上清を、活性炭カラム１５０ｍｌ（１２０ｍｍ×φ４１ｍｍ）に、流速ＳＶ＝３（５ｍｌ／分）で通液することによりグルコシルアデノシンを含むグリコシルアデノシン及びアデノシンをカラムに吸着させた後、脱イオン水（湿潤樹脂容積の７倍量）及び２０容積％エタノール溶液（湿潤樹脂容積の６倍量）でカラムを洗浄し、４０容積％エタノール溶液で溶出した（湿潤樹脂容積の１６倍量）。溶出液を５０ｍｌずつ分画し、紫外吸収（２６０ｎｍ）の認められた画分を回収した。回収した画分を膜濾過（ポワサイズ０．２２μｍ）後、減圧乾燥し、グルコシルアデノシンを含むグリコシルアデノシンとアデノシンとを含有する粉末約５ｇを得た。本品は、無水物換算で、３´−グルコシルアデノシン、３´−マルトシルアデノシンや３´−マルトトリオシルアデノシンなどの３´−グリコシルアデノシン、及び、５´−グルコシルアデノシン、５´−マルトシルアデノシンや５´−マルトトリオシルアデノシンなどの５´−グリコシルアデノシンを合計で約５８質量％とアデノシンを約３７質量％含有していた。また、本品中のグリコシルアデノシンの約３０質量％は、その５´位が配糖化されていた。本品は、表皮及び真皮の組織構造や生理機能の維持、改善を助けるための持続性の抗シワ作用を有する皮膚外用剤の有効成分として、そのままで、適宜の担体、賦形剤、安定剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、溶媒等、任意の助剤等を添加した製剤として、或いは、これらを配合した医薬品、医薬部外品、化粧品などの形態で用いることができる。また、本品は、ケラチノサイト分化及び増殖促進剤、コラーゲン産生増強剤、セラミド合成促進剤或いは保湿剤として利用することも随意である。
【実施例６】
【０１１９】
＜グルコシルアデノシン含有組成物＞
実施例１乃至５の方法により調製したグルコシルアデノシン含有粉末の何れか１質量部に対しα，α−トレハロース２質量部を添加し、均質に混合してグルコシルアデノシン含有組成物を調製した。本品は、表皮及び真皮の組織構造や生理機能の維持、改善を助けるための持続性の抗シワ作用を有する皮膚外用剤の有効成分として用いることができる。また、本品は、ケラチノサイト分化及び増殖促進剤、コラーゲン産生増強剤、セラミド合成促進剤或いは保湿剤として利用することも随意である。
【実施例７】
【０１２０】
＜グルコシルアデノシン含有組成物＞
実施例１乃至５の方法により調製したグルコシルアデノシン含有粉末の何れか２質量部に対しα，α−トレハロースの糖質誘導体含有シラップ（株式会社林原生物化学研究所販売、商品名『トルナーレ』）を噴霧乾燥した粉末（株式会社林原生物化学研究所調製）３質量部を添加し、均質に混合してグルコシルアデノシン含有組成物を調製した。本品は、表皮及び真皮の組織構造や生理機能の維持、改善を助けるための持続性の抗シワ作用を有する皮膚外用剤の有効成分として用いることができる。また、本品は、ケラチノサイト分化及び増殖促進剤、コラーゲン産生増強剤、セラミド合成促進剤或いは保湿剤として利用することも随意である。
【実施例８】
【０１２１】
＜グルコシルアデノシン含有組成物＞
実施例１乃至５の方法により調製したグルコシルアデノシン含有粉末の何れか１質量部に対しアスコルビン酸２−グルコシド（株式会社林原生物化学研究所販売、商品名『ＡＡ２Ｇ』）５質量部、エデト酸２ナトリウム０．１質量部を添加し、均質に混合してグルコシルアデノシン含有組成物を調製した。本品は、表皮及び真皮の組織構造や生理機能の維持、改善を助けるための持続性の抗シワ作用を有する皮膚外用剤の有効成分として用いることができる。また、本品は、ケラチノサイト分化及び増殖促進剤、コラーゲン産生増強剤、セラミド合成促進剤或いは保湿剤として利用することも随意である。
【実施例９】
【０１２２】
＜グルコシルアデノシン含有組成物＞
精製水２０質量部に対し、実施例１乃至５の方法により調製したグルコシルアデノシン含有粉末の何れか１質量部、α−グルコシルヘスペリジン又はα−グルコシルルチン２質量部、シクロニゲロシルニゲロース（環状四糖：株式会社林原生物化学研究所製造）１質量部を添加し、撹拌溶解した後、常法により噴霧乾燥することによりグルコシルアデノシン含有組成物を調製した。本品は、表皮及び真皮の組織構造や生理機能の維持、改善を助けるための持続性の抗シワ作用を有する皮膚外用剤の有効成分として用いることができる。また、本品は、ケラチノサイト分化及び増殖促進剤、コラーゲン産生増強剤、セラミド合成促進剤或いは保湿剤として利用することも随意である。【０１２３】
＜配合例１：クリーム形態の皮膚外用剤＞
配合成分                                                （質量％）
（１）プロピレングリコール                                      ５
（２）ミツロウ                                                  ５
（３）セチルアルコール                                          ４
（４）還元ラノリン                                              ５
（５）スクワラン                                              ３５
（６）ステアリン酸グリセライド                                  ２
（７）ポリオキシエチレン（２０モル）
ソルビタンモノラウリン酸エステル                          ２
（８）実施例４で調製した３´−グルコシルアデノシン又は、
５´−グルコシルアデノシン                            １
（９）防腐剤                                                  適量
（１０）香料                                                  適量
精製水を加え全量を１００質量％とする。【０１２４】
＜グルコシルアデノシンを配合した皮膚外用剤の抗シワ作用＞
本発明のグルコシルアデノシンの皮膚外用剤における有効性を確認するため、有効成分として３´−グルコシルアデノシン又は、５´−グルコシルアデノシンを配合した上記配合例１のクリームを用い、ボランティアによる試験を実施した。すなわち、問診により慢性的な肌荒れに悩む３０乃至５０歳代の女性４０名を被験者として選択し、無作為に１０名ずつ４群に分けた。１群１０名には上記クリーム（３´−グルコシルアデノシン配合：クリーム１）を、肌荒れ部分に、１日３回（朝、昼、晩）、１ヶ月間毎日塗布させた。１群１０名には上記クリーム（５´−グルコシルアデノシン配合：クリーム２）を、肌荒れ部分に、１日３回（朝、昼、晩）、１ヶ月間毎日塗布させた。１群１０名には、上記クリームのグルコシルアデノシンに代えてアデノシンを１質量％配合した以外は上記と同じ処方のクリーム（クリーム３）を、肌荒れ部分に、１日３回（朝、昼、晩）、１ヶ月間毎日塗布させた。残りの１群１０名には、グルコシルアデノシン又はアデノシンを含まない以外は上記と同じ配合のクリーム（クリーム４）を、肌荒れ部分に、１日３回（朝、昼、晩）、１ヶ月間毎日塗布させた。下記方法により、皮膚の水分量を測定すると共に、シワの状態をシワスコアとして評価し、肌荒れの状態を判定した。なお、この方法によれば、肌荒れの状態は、被験試料を塗布する前に比べ、塗布後の皮膚の水分量が高くなり、シワスコアが低くなるほど改善したことを意味する。
＜肌の水分量の測定方法＞
クリームの塗前日及び布終了翌日に、クリーム塗布部位の皮膚の水分含量及びシワスコアを測定した。皮膚の水分含量は水分含量測定装置（ＩＢＳ社販売、商品名『ＳＫＩＣＯＮ−２００ＥＸ』）を用いて測定し、各クリームを塗布した被験者１０名の水分含量の平均値を表１５に示す。
＜シワスコアの判定方法＞
シワスコアの判定は、各被験者につき、判定者５名の目視により、化粧品機能評価ガイドライン（『日本香粧品学会誌』、３０巻、４号、３１６乃至３３２頁（２００６年）参照）に基づき、表１４に示す８段階のシワスコア（０乃至７グレード）で評価した。各被験者に対する判定者５名の平均値を、その被験者のシワスコアとし、各クリームを塗布した被験者１０名のシワスコアの平均値を表１５に示す。【０１２５】
【表１４】
2012105542.tif 000015
【０１２６】
【表１５】
2012105542.tif 000016
【０１２７】
表１５から明らかなようにグルコシルアデノシンを配合したクリーム（クリーム１又は２）を塗布した場合には、塗布前と比較し、塗布後の皮膚の水分量及びシワスコアが有意に改善、肌荒れが改善した。これに対し、グルコシルアデノシンに代えてアデノシンを配合したクリーム（クリーム３）、及び、グルコシルアデノシンやアデノシンを配合していないクリーム（クリーム４）では、皮膚の水分量及びシワスコアに塗布の後も、塗布前と比較し有意の改善は認められず、肌荒れ改善しなかった。グルコシルアデノシンを配合したクリーム間で比較すると、５´−グルコシルアデノシンを配合したクリーム（クリーム２）を塗布した場合の方が、３´−グルコシルアデノシンを配合したクリーム（クリーム１）を塗布した場合よりも、皮膚の水分量及びシワスコアの改善効果が高い傾向を示したので、５´−グルコシルアデノシンの方が３´−グルコシルアデノシンよりも肌荒れ改善効果が強いと判断した。また、グルコシルアデノシンを配合したクリーム（クリーム１又は２）を塗布した期間中及び試験終了後に、被験者にクリーム塗布に起因する異常は何ら認められなかったので、グルコシルアデノシンは安全性に優れていると判断した。【０１２８】
＜配合例２：溶液形態の組成物＞
配合成分                                                （質量％）
（１）グリセリン                                                ３
（２）プロピレングリコール                                      ４
（３）エタノール                                                ８
（４）ポリオキシエチレン（２０モル）オレインアルコール      ０．５
（５）実施例１乃至５の方法により調製したグルコシル
アデノシン含有粉末の何れか１種                      ０．５
又は実施例６乃至８の方法で調製したグルコシル
アデノシン含有組成物の何れか１種                        ３
（６）モクレンエキス                                            ２
（７）クエン酸                                            ０．０１
（８）クエン酸ナトリウム                                    ０．１
（９）１，２−ペンタンジオール                              ０．１
（１０）香料                                                ０．０５
精製水を加え全量を１００質量％とする。【０１２９】
＜配合例３：パック形態の皮膚外用剤＞
配合成分                                                （質量％）
（１）ポリビニルアルコール                                    １５
（２）ポリエチレングリコール                                    ３
（３）プロピレングリコール                                      ７
（４）エタノール                                              １０
（５）マツタケエキス                                            １
（６）実施例１乃至５の方法により調製したグルコシル
アデノシン含有粉末の何れか１種                      ０．１
又は実施例６乃至８の方法で調製したグルコシル
アデノシン含有組成物の何れか１種                    ０．５
（７）１，２−ペンタンジオール                              ０．１
（８）香料                                                    適量
精製水を加え全量を１００質量％とする。【０１３０】
＜配合例４：リップクリーム＞
下記の配合により、常法に従ってリップクリームを調製した。
配合成分                                                （質量％）
（１）脂肪酸デキストリンエステル                            ８．０
（２）ミツロウ                                              ４．０
（３）マイクロクリスタリンワックス                          ３．０
（４）カプリン酸トリグリセリド                            １５．０
（５）トリイソステアリン酸ジグリセリル                    ２０．０
（６）リンゴ酸ジイソステアリル                            ３２．０
（７）ポリブテン                                          １０．０
（８）酢酸トコフェロール                                    ２．０
（９）実施例２の方法で調整した５´−グルコシルアデノシン    ２．０
（１０）カンゾウエキス                                      ０．１
（１１）１，２−ペンタンジオール                            ０．１
（１２）香料                                                適量【０１３１】
＜配合例５：ジェル形態の皮膚外用剤＞
配合成分                                                （質量％）
（１）トリオクタレイン                                    ５１．３
（２）α，α−トレハロースの糖質誘導体含有シラップ
（株式会社林原商事販売、商品名「ハローデックス」）        １６．４
（３）モノミリスチン酸ポリグリセリル−１０                  ５．２
（４）モノステアリン酸ポリグリセリル−１０                １．７５
（５）アスコルビン酸２−グルコシド                              １
（６）カンゾウエキス                                        ０．１
（７）ヒアルロン酸                                        ０．２５
（８）実施例１乃至５の方法により調製したグルコシル
アデノシン含有粉末の何れか１種                      ０．２
又は実施例６乃至８にの方法で調製したグルコシル
アデノシン含有組成物の何れか１種                    １．０
（９）１，２−ペンタンジオール                              ０．１
（１０）香料                                                  適量
精製水を加え全量を１００質量％とする。【０１３２】
＜配合例６：軟膏形態の皮膚外用剤＞
配合成分                                                （質量％）
（１）酢酸ナトリウム                                      １．０
（２）リン酸水素カルシウム                                ４．０
（３）グリセリン                                        １０．０
（４）ハッカ油                                            ０．５
（５）緑茶エキス                                          ０．６
（６）Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド                  ２．０
（７）１，２−ヘキサンジオール                            ０．１
（７）ワセリン                                          ４９．０
（８）木ロウ                                            １０．０
（９）ラノリ                                            １０．０
（１０）ゴマ油                                          １０．５【０１３３】
これらの配合例の各種皮膚外用剤は、それぞれの典型的な使用態様において、抗シワ作用を持続的に発揮することができ、皮膚状態を改善することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
以上のように、有効成分としてα−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３´）−アデノシン及び／又はα−Ｄ−グルコピラノシル−（１→５´）−アデノシンを含有する本発明の皮膚外用剤は、表皮ケラチノサイトの増殖及び分化促進作用と真皮線維芽細胞のコラーゲン産生増強作用を併せ持ち、皮膚においてそれらの作用を安定して発揮できるので、表皮及び真皮の組織構造や生理機能の維持、改善を助ける優れた持続性の抗シワ作用を有する皮膚外用剤として、化粧品、医薬品、医薬部外品、雑貨などを製造する業界などにおいて利用することができる。本発明は、斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に多大の貢献をする、誠に意義のある発明である。
【配列表】
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【国際調査報告】
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