(57)【要約】  モルホリノ核酸オリゴマーの製造に有用なモルホリノ核酸誘導体を提供する。本発明としては、次の一般式（１）で表される化合物又はその塩を挙げることができる。  【化１】                      2012043730.tif 000039  式中、Ｒ１は、水素又はトリチル等を表す。  Ｒ２は、アミド又はイミンを表す。  Ｒ３はトリアルキルシリル等で保護されていてもよい水酸基、又は次の一般式（５）で表される基を表す。  【化２】                                                  2012043730.tif 000040［式中、ＸはＯ又はＳを表す。Ｙはジアルキルアミノ、又はアルコキシを表す。Ｚは塩素を表す。］【選択図】  なし
2012043730.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（１）で表される化合物又はその塩。
【化１】
2012043730.tif 000035
式中、Ｒ１は、水素又は次の一般式（２）で表される基を表す。
【化２】
2012043730.tif 000036
［式中、＊は、結合位置を表す。Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は、同一又は異なって、水素、アルキル又はアルコキシを表す。］
Ｒ２は、次の一般式（３）又は（４）で表される基を表す。
【化３】
2012043730.tif 000037
［式中、＊は、前記と同義である。Ｒ４は、アルキル、アリールメチル、又はアリールオキシメチルを表す。
Ｒ５、Ｒ６は、同一又は異なって、アルキルを表す。］
Ｒ３は、トリアルキルシリル若しくはジフェニルアルキルシリルで保護されていてもよい水酸基、又は次の一般式（５）で表される基を表す。
【化４】
2012043730.tif 000038
［式中、＊は、前記と同義である。ＸはＯ又はＳを表す。
Ｙはジアルキルアミノ、又はアルコキシを表す。
Ｚはハロゲンを表す。］
【請求項２】
ＸがＯ、Ｙがジアルキルアミノ、Ｚが塩素である、請求項１記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
Ｒ３がｔ−ブチルジメチルシリル又はｔ−ブチルジフェニルシリルで保護されていてもよい水酸基である、請求項１記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
Ｒ４がフェノキシメチルである、請求項１記載の化合物又はその塩。
【請求項５】
Ｒ１が、トリチル、４−メトキシトリチル、４−メチルトリチル、４，４’−ジメチルトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル、又は４，４’，４’’−トリメチルトリチルである、請求項１記載の化合物又はその塩。
【請求項６】
次の化合物（１）〜（３）のいずれかである、請求項１記載の化合物又はその塩。
（１）Ｎ９−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−｛（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）メチル｝−４−トリチルモルホリン−２−イル］−Ｎ２−（フェノキシアセチル）−Ｏ６−（２−シアノエチル）グアニン、
（２）Ｎ９−｛（２Ｒ，６Ｓ）−６−ヒドロキシメチル−４−トリチルモルホリン−２−イル｝−Ｎ２−（フェノキシアセチル）−Ｏ６−（２−シアノエチル）グアニン、
（３）［（２Ｓ，６Ｒ）−６−｛Ｎ２−（フェノキシアセチル）−Ｏ６−（２−シアノエチル）グアニン−９−イル｝−４−トリチルモルホリン−２−イル］メチル  ジメチルホスホロアミドクロリデート
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なモルホリノ核酸誘導体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
塩基部分がグアニンであるモルホリノ核酸モノマー（以下、「Ｇモノマー」という。）は、グアニンの６位の炭素原子に酸素原子が結合している。そのため、グアニンの６位水酸基が保護されていないＧモノマーを使用してモルホリノ核酸オリゴマーを合成した場合、副反応が生じ得る。例えば、縮合工程において、グアニンの６位水酸基が他のモルホリノ核酸モノマーの活性部位と反応してホスホリル体を形成し、これが脱保護工程で用いられるアンモニアと反応して、グアニンがジアミノプリンに変換されることがある。このような副反応は、目的物の合成収率を低下させる大きな要因となる。
上記副反応を抑えるべく、ＡＶＩ  ＢＩＯＰＨＡＲＭＡ社は、グアニンの６位水酸基がピバロイルオキシベンジル（ＰＯＢ基）で保護されたＧモノマーを報告している（例えば、特許文献１参照。）。しかしながら、ＰＯＢ基は、脱保護工程において４−メチレンシクロヘキサ−２，５−ジエノンに変換され、これがモルホリノ核酸オリゴマーのモルホリンのＮＨ部分に付加して副生成物を形成する。
その他に、特許文献１はグアニンの６位水酸基の他の保護基についても報告している。かかる他の保護基として、特許文献１では、例えば、４−ニトロフェネチル、フェニルスルホニルエチル、メチルスルホニルエチルが開示されている。しかし、これらの保護基は、脱保護工程において、例えば、４−ニトロスチレンのような反応活性種に変換され、これがモルホリノ核酸オリゴマーのモルホリンのＮＨ部分に付加して副生成物を形成する。また、ｔ−ブチルジメチルシリル等のシリル系保護基が知られているが、これは、モルホリノ核酸オリゴマーの合成条件下では不安定であり脱離し易いため、グアニンの６位水酸基が保護されていないＧモノマーと同様の副反応が報告されている。更に、フェニルエーテル系保護基やカーバメート系保護基が知られているが、これらは脱保護工程において当該保護基の脱離が不完全であったり、縮合工程における縮合効率の悪化することが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２００９／０６４４７１  Ａ１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、主として、効率的にモルホリノ核酸オリゴマーを合成するための新規なモルホリノ核酸誘導体、及び、その誘導体の原料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、次の一般式（１）で表される化合物（以下、「本発明化合物」という。）又はその塩が、モルホリノ核酸オリゴマーの合成原料、又は、その合成原料を得るための原料として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
【化１】
2012043730.tif 000003
式中、Ｒ１は、水素又は次の一般式（２）で表される基を表す。【０００７】
【化２】
2012043730.tif 000004
［式中、＊は、結合位置を表す。Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は、同一又は異なって、水素、アルキル又はアルコキシを表す。］
Ｒ２は、次の一般式（３）又は（４）で表される基を表す。【０００８】
【化３】
2012043730.tif 000005
［式中、＊は、前記と同義である。Ｒ４は、アルキル、アリールメチル、又は、アリールオキシメチルを表す。
Ｒ５、Ｒ６は、同一又は異なって、アルキルを表す。］
Ｒ３は、トリアルキルシリル若しくはジフェニルアルキルシリルで保護されていてもよい水酸基、又は次の一般式（５）で表される基を表す。【０００９】
【化４】
2012043730.tif 000006
［式中、＊は、前記と同義である。ＸはＯ又はＳを表す。
Ｙはジアルキルアミノ、又はアルコキシを表す。
Ｚはハロゲンを表す。］
本発明として、上記本発明化合物又はその塩を挙げることができる。
【００１０】
以下に、本明細書で記載している用語について詳述する。
「アルキル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜８のアルキル、具体的には、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、イソヘプチル、ｎ−オクチルを挙げることができる。なかでも、炭素数１〜６のアルキルが好ましく、炭素数１〜３のアルキルがより好ましい。
「トリアルキルシリル」、「ジフェニルアルキルシリル」、「ジアルキルアミノ」の「アルキル」部分としては、上記「アルキル」と同じものを挙げることができる。【００１１】
「アリールメチル」、「アリールオキシメチル」、「アリールスルホニル」の「アリール」部分としては、炭素数６〜１０のもの、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチルを挙げることができる。なかでもフェニルが好ましい。【００１２】
「アルコキシ」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜８のアルコキシ、具体的には、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、ｎ−ヘプチルオキシ、ｎ−オクチルオキシを挙げることができる。【００１３】
「ハロゲン」としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。なかでも塩素が好ましい。【００１４】
「アシル」としては、直鎖状若しくは分枝鎖状のアルカノイル、又はアロイルを挙げることができる。アルカノイルとしては、例えば、ホルミル、アセチル、２−メチルアセチル、２，２−ジメチルアセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ペンタノイル、２，２−ジメチルプロピオニル、ヘキサノイルが挙げられる。アロイルとしては、例えば、ベンゾイル、トルオイル、ナフトイルを挙げることができる。かかるアロイルは置換可能な位置において置換されていてもよく、アルキルで置換されていてもよい。【００１５】
「核酸塩基」としては、例えば、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、シトシン、チミン、ウラシル又はそれらの修飾塩基を挙げることができる。かかる修飾塩基としては、例えば、シュードウラシル、３−メチルウラシル，ジヒドロウラシル、５−アルキルシトシン（例えば、５−メチルシトシン）、５−アルキルウラシル（例えば、５−エチルウラシル）、５−ハロウラシル（５−ブロモウラシル）、６−アザピリミジン、６−アルキルピリミジン（６−メチルウラシル）、２−チオウラシル、４−チオウラシル、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）  ウラシル、５’−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、１−メチルアデニン、１−メチルヒポキサンチン、２，２−ジメチルグアニン、３−メチルシトシン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メチルカルボニルメチルウラシル、５−メチルオキシウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、２−チオシトシン、プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、イソグアニン、インドール、イミダゾール、キサンチンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
本発明化合物の中で、次の化合物（ａ）〜（ｃ）、又は、その塩が好ましい。
（ａ）  Ｎ９−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−｛（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）メチル｝−４−トリチルモルホリン−２−イル］−Ｎ２−（フェノキシアセチル）−Ｏ６−（２−シアノエチル）グアニン、
（ｂ）  Ｎ９−｛（２Ｒ，６Ｓ）−６−ヒドロキシメチル−４−トリチルモルホリン−２−イル｝−Ｎ２−（フェノキシアセチル）−Ｏ６−（２−シアノエチル）グアニン、
（ｃ）  ［（２Ｓ，６Ｒ）−６−｛Ｎ２−（フェノキシアセチル）−Ｏ６−（２−シアノエチル）グアニン−９−イル｝−４−トリチルモルホリン−２−イル］メチル  ジメチルホスホロアミドクロリデート。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＣＥ−Ｇモノマー（定義は、表１を参照）を用いて合成された未精製のモルホリノ核酸オリゴマーのＨＰＬＣクロマトグラムのチャートを表す。縦軸は強度（ｍＡＵ）、横軸は保持時間（分）をそれぞれ表す。
【図２】ＰＯＢ−Ｇモノマー（定義は、表１を参照）を用いて合成された未精製のモルホリノ核酸オリゴマーのＨＰＬＣクロマトグラムのチャートを表す。縦軸は強度（ｍＡＵ）、横軸は保持時間（分）をそれぞれ表す。
【図３】ＣＥ−Ｇモノマーを用いて合成された未精製のモルホリノ核酸オリゴマーのＭＳスペクトルチャートを表す。縦軸はイオン強度（ａ．ｕ．）を、横軸は質量電荷比（ｍ／ｚ）をそれぞれを表す。
【図４】ＰＯＢ−Ｇモノマーを用いて合成された未精製のモルホリノ核酸オリゴマーのＭＳスペクトルチャートを表す。縦軸はイオン強度（ａ．ｕ．）を、横軸は質量電荷比（ｍ／ｚ）をそれぞれ表す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の実施の形態について説明する。
以下に示す製造方法において、原料が反応に影響を及ぼす置換基（例えば、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ）を有する場合は、原料をあらかじめ公知の方法に従い、適当な保護基で保護した後に反応を行う。保護基は、最終的に、接触還元、アルカリ処理、酸処理などの公知の方法に従い脱離することができる。
【００１９】
本発明化合物の製法
本発明化合物は、公知化合物又は容易に製造可能な中間体から、例えば、以下の製法１〜製法３を実施することにより製造することができる。
【００２０】
製法１  Ｒ３がトリアルキルシリルオキシ、又はジフェニルアルキルシリルオキシである場合
【００２１】
【化５】
2012043730.tif 000007
式中、Ｒ２は、前記と同義である。Ｒ７は、トリアルキルシリル、又はジフェニルアルキルシリルを表す。Ｒ８は、１個〜３個のアルキルで置換されていてもよいアリールスルホニルを表す。Ｒ１４は、前記の一般式（２）で表される基を表す。
本反応は、化合物（６）と２−シアノエタノールとの縮合反応であって、それ自体公知の方法によって行われる。
２−シアノエタノールの使用量は、化合物（６）に対して、モル比で１倍量〜２０倍量の範囲内が適当であり、好ましくは１．２倍量〜１０倍量の範囲内である。使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン、及び、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、並びに、これら任意の混合溶媒を挙げることができる。特に、ジクロロメタンが好ましい。本工程で使用しうる「塩基」としては、例えば、Ｎ−メチルピロリジン、及び、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン、並びに、これらの混合物を挙げることができる。かかる塩基の使用量は、化合物（６）に対して、モル比で１倍量〜２０倍量の範囲内が適当であり、好ましくは１倍量〜１０倍量の範囲内である。反応温度は０℃〜５０℃の範囲内が適当である。また、反応時間は、使用する原料の種類、反応温度などによって異なるが、通常１時間〜３０時間の範囲内が適当である。
原料化合物である化合物（６）は、例えば、ＷＯ２００９／０６４４７１の実施例１  化合物４の調製の項に記載の方法に準じて製造することができる。
【００２２】
製法２  Ｒ３がヒドロキシルである場合
【００２３】
【化６】
2012043730.tif 000008
式中、Ｒ２、Ｒ７、Ｒ１４は、前記と同義である。
本反応は、化合物（１Ａ）のＲ７を脱離するための反応であって、それ自体公知の方法によって行われる。
本工程で使用しうる「Ｒ７を脱離するための試薬」としては、例えば、テトラブチルアンモニウムフロリド、アミンとフッ化水素酸との塩又は適当な溶媒中においてアミンとフッ化水素酸とを任意の比で混合したものを挙げることができる。
使用する溶媒としては、例えば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリル、ジクロロメタン、トルエン、ジメチルスルホキシド、及び、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、並びに、これら任意の混合溶媒を挙げることができる。特に、ＴＨＦ、ジクロロメタンが好ましい。
化合物（１Ａ）の種類、用いるＲ７を脱離するための試薬、使用する溶媒等によって異なるが、本工程で使用しうるＲ７を脱離するための試薬の使用量としては、化合物（１Ａ）に対して、モル比で１倍量〜１０倍量の範囲内が適当であり、好ましくは１．２倍量〜５倍量の範囲内である。反応温度は０℃〜５０℃の範囲内が適当である。また、反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常１時間〜３０時間の範囲内が適当である。
【００２４】
製法３  Ｒ３が次の一般式（５）で表される基である場合
【００２５】
【化７】
2012043730.tif 000009
［式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ、＊は、前記と同義である。］
【００２６】
【化８】
2012043730.tif 000010
式中、Ｒ２、Ｒ１４、Ｘ、Ｙ、Ｚは、前記と同義である。
本反応は、化合物（１Ｂ）をホスホロアミド化するための反応であって、それ自体公知の方法によって行われる。
使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン、ＴＨＦを挙げることができる。
本工程で使用しうる化合物（９）の使用量は、化合物（１Ｂ）に対して、モル比で１倍量〜１０倍量の範囲内が適当であり、好ましくは１．２倍量〜５倍量の範囲内である。
本工程で使用しうる「活性化剤」としては、例えば、１Ｈ−テトラゾール、５−エチルチオテトラゾール、４，５−ジクロロイミダゾール、４，５−ジシアノイミダゾール、Ｎ−メチルイミダゾール、４−ジメチルアミノピリジンを挙げることができる。特にＮ−メチルイミダゾールが好ましい。かかる「活性化剤」の使用量は、化合物（９）に対して、モル比で０．２倍量〜３倍量の範囲内が適当であり、好ましくは０．５倍量〜２倍量の範囲内である。
本工程で使用しうる「塩基」としては、例えば、Ｎ−エチルモルホリンを挙げることができる。かかる塩基の使用量は、化合物（９）に対して、モル比で０．８倍量〜５倍量の範囲内が適当であり、好ましくは１倍量〜３倍量の範囲内である。反応温度は０℃〜８０℃の範囲内が適当である。また、反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常１時間〜３０時間の範囲内が適当である。
【００２７】
製法４  Ｒ１が水素である場合
【００２８】
【化９】
2012043730.tif 000011
式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ１４は、前記と同義である。
本反応は、化合物（１Ｄ）のＲ１４を脱保護するための反応であって、それ自体公知の方法によって行われる。
本工程で使用しうる「酸」、即ち「Ｒ１４を脱離するための試薬」としては、例えば、酢酸、塩酸又は燐酸を挙げることができる。かかる酸の使用量は、化合物（１Ｄ）に対して、モル比で１倍量〜１０００倍量の範囲内が適当であり、好ましくは１０倍量〜１００倍量の範囲内である。
使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、メタノール、水を挙げることができる。
また、反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、通常０．５時間〜５時間の範囲内が適当である。
【００２９】
モルホリノ核酸オリゴマーの製法
好ましいモルホリノ核酸オリゴマーは、以下の式で表わされる基を構成単位とするオリゴマーである。
【化１０】
2012043730.tif 000012
（式中、Ｂａｓｅは、核酸塩基を表す。Ｘ、Ｙは、前記と同義である。）
【００３０】
モルホリノ核酸オリゴマーは、例えば、ＷＯ１９９１／００９０３３、又はＷＯ２００９／０６４４７１に従って製造することができる。特に、モルホリノ核酸オリゴマーは、ＷＯ２００９／０６４４７１に記載の方法に従って製造するか、又は以下に示す方法に従って製造することができる。
【００３１】
モルホリノ核酸オリゴマーの１つの態様として、例えば、次の一般式（Ｉ）で表される化合物（以下、モルホリノ核酸オリゴマー（Ｉ）という。）を挙げることができる。 
【化１１】
2012043730.tif 000013
［式中、Ｂａｓｅ、Ｘ、Ｙは、前記と同義であり；
ｎは、１〜９９の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、１８〜２８の範囲内にある任意の整数である。］
【００３２】
モルホリノ核酸オリゴマー（Ｉ）は、公知の方法に従い製造することができるが、例えば、下記工程の操作を実施することにより製造することができる。
下記工程に使用されている化合物及び試薬は、モルホリノ核酸オリゴマーの製造に一般的に使用されているものであれば特に限定されない。
【００３３】
また、下記のすべての工程は、液相法又は固相法（マニュアル又は市販の固相自動合成機を用いる）で実施することができる。固相法でモルホリノ核酸オリゴマーを製造する場合、操作手順の簡便化及び合成の正確性の点から自動合成機を用いる方法が望ましい。
【００３４】
（１）工程Ａ：
次の一般式（ＩＩ）で表される化合物（以下、化合物（ＩＩ）という。）に酸を作用させることによって、次の一般式（ＩＩＩ）で表される化合物（以下、化合物（ＩＩＩ）という。）を製造する工程。
【化１２】
2012043730.tif 000014
［式中、ｎ、Ｘ、Ｙは、前記と同義であり；
ＢＰは，独立して、保護されていてもよい核酸塩基を表し；
Ｒ１は、トリチル基、モノメトキシトリチル基、又はジメトキシトリチル基を表し；
Ｌは、水素、アシル、又は次の一般式（ＩＶ）で表される基（以下、「基（ＩＶ）」という。）を表す。］
【化１３】
2012043730.tif 000015
ＢＰに係る「核酸塩基」としては、Ｂａｓｅと同じ「核酸塩基」を挙げることができる。但し、ＢＰに係る核酸塩基のアミノ基又は水酸基は保護されていてもよい。
かかるアミノ基の保護基としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチル、（ジメチルアミノ）メチレンを挙げることができる。水酸基の保護基としては、例えば、２−シアノエチル 、４−ニトロフェネチル、フェニルスルホニルエチル、メチルスルホニルエチル、トリメチルシリルエチル、置換可能な任意の位置で１〜５個の電子吸引性基で置換されていてもよいフェニル、ジフェニルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、メチルフェニルカルバモイル、１−ピロリジニルカルバモイル、モルホリノカルバモイル、４−（ｔｅｒｔ−ブチルカルボキシ）ベンジル、４−［（ジメチルアミノ）カルボキシ］ベンジル、４−（フェニルカルボキシ）ベンジルを挙げることができる（例えば、ＷＯ２００９／０６４４７１参照）。なかでも、グアニンの６位水酸基の保護基は、２−シアノエチル が好ましい。
「固相担体」としては、核酸の固相反応に使用しうる担体であれば特に制限されないが、例えば、（ｉ）モルホリノ核酸誘導体の合成に使用しうる試薬（例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、テトラゾール、Ｎ−メチルイミダゾール、ピリジン、無水酢酸、ルチジン、トリフルオロ酢酸）にほとんど溶解せず、（ｉｉ）モルホリノ核酸誘導体の合成に使用しうる試薬に対して化学的に安定であり、（ｉｉｉ）化学修飾ができ、（ｉｖ）望ましいモルホリノ核酸誘導体の装填ができ、（ｖ）処理中にかかる高圧に耐える十分な強度をもち、（ｖｉ）一定の粒径範囲と分布であるものが望ましい。具体的には、膨潤性ポリスチレン（例えば、アミノメチルポリスチレン樹脂  １％ジベンジルベンゼン架橋（２００〜４００メッシュ）（２．４〜３．０ｍｍｏｌ／ｇ）（東京化成社製）、Ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  Ｒｅｓｉｎ・ＨＣｌ［ジベンジルベンゼン１％，１００〜２００メッシュ］（ペプチド研究所社製））、非膨潤性ポリスチレン（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｕｐｐｏｒｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製））、ＰＥＧ鎖結合型ポリスチレン（例えば、ＮＨ２−ＰＥＧ  ｒｅｓｉｎ（渡辺化学社製）、ＴｅｎｔａＧｅｌ  ｒｅｓｉｎ）、定孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ；ＣＰＧ）（例えば、ＣＰＧ社製）、オキサリル化−定孔ガラス（例えば、Ａｌｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１９，１５２７（１９９１）を参照）、ＴｅｎｔａＧｅｌ支持体−アミノポリエチレングリコール誘導体化支持体（例えば、Ｗｒｉｇｈｔら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．３４，３３７３（１９９３）を参照）、Ｐｏｒｏｓ−ポリスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマーを挙げることができる。
「リンカー」としては、通常核酸やモルホリノ核酸誘導体を連結するために使用される公知のものを用いることができるが、例えば、３−アミノプロピル、スクシニル、２，２’−ジエタノールスルホニル、ロングチェーンアルキルアミノ（ＬＣＡＡ）を挙げることができる。
【００３５】
本工程は、化合物（ＩＩ）に酸を作用させることにより実施することができる。
【００３６】
本工程に使用しうる「酸」としては、例えば、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸又はトリクロロ酢酸を挙げることができる。酸の使用量としては、例えば、化合物（ＩＩ）１モルに対して、モル比で０．１倍量〜１０００倍量の範囲内が適当であり、好ましくは１倍量〜１００倍量の範囲内である。
また、前記酸と一緒に、有機アミンを使用することができる。有機アミンとしては、特に限定されるものではないが、例えば、トリエチルアミンを挙げることができる。有機アミンの使用量は、例えば、酸１モルに対して、モル比で０．０１倍量〜１０倍量の範囲内が適当であり、好ましくは、０．１倍量〜２倍量の範囲内である。
本工程において酸と有機アミンとの塩又は混合物を使用する場合には、例えば、トリフルオロ酢酸とトリエチルアミンの塩又は混合物を挙げることができ、より具体的には、トリフルオロ酢酸２当量に対してトリエチルアミン１当量を混合したものを挙げることができる。
本工程に使用しうる酸は、０．１％〜３０％の範囲内の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類（エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど）、水又はこれらの混合物を挙げることができる。
【００３７】
上記反応における反応温度は、例えば、１０℃〜５０℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、２０℃〜４０℃の範囲内であり、さらに好ましくは、２５℃〜３５℃の範囲内である。
反応時間は、使用する酸の種類、反応温度によって異なるが、通常０．１分〜２４時間の範囲内が適当である。好ましくは、１分〜５時間の範囲内である。
【００３８】
また、本工程が終了した後、必要に応じて、系中に存在する酸を中和するために塩基を添加することができる。「塩基」としては、特に限定されないが、例えば、ジイソプロピルアミンが挙げられる。塩基は、０．１％（ｖ／ｖ）〜３０％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。
本工程に用いる溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類（エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど）、水又はこれらの混合物を挙げることができる。反応温度は、例えば、１０℃〜５０℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、２０℃〜４０℃の範囲内であり、さらに好ましくは、２５℃〜３５℃の範囲内である。
反応時間は、使用する塩基の種類、反応温度によって異なるが、通常０．１分〜２４時間の範囲内が適当であり、好ましくは、１分〜５時間の範囲内である。
【００３９】
なお、化合物（ＩＩ）において、ｎ＝１であって、Ｌが基（ＩＶ）である、次の一般式（ＩＩａ）で表される化合物（以下、化合物（ＩＩａ）という。）は、以下の方法に従って製造することができる。
【化１４】
2012043730.tif 000016
［式中、ＢＰ、Ｒ１、リンカー、固相担体は、前記と同義である。］
【００４０】
工程１：
次の一般式（Ｖ）で表される化合物にアシル化剤を作用させることによって、次の一般式（ＶＩ）で表される化合物（以下、化合物（ＶＩ）という。）を製造する工程。
【化１５】
2012043730.tif 000017
［式中、ＢＰ、Ｒ１、リンカーは、前記と同義であり；
Ｒ６は、水酸基、ハロゲン、又は、アミノを表す。］
【００４１】
本工程は、化合物（Ｖ）を出発原料として、公知のリンカーの導入反応により実施することができる。
特に、次の一般式（ＶＩａ）で表される化合物は、化合物（Ｖ）と無水コハク酸とを用いてエステル化反応として知られた方法を実施することにより製造することができる。
【化１６】
2012043730.tif 000018
［式中、ＢＰ、Ｒ１は、前記と同義である。］
【００４２】
工程２：
化合物（ＶＩ）に縮合剤等を作用させることによって、固相担体と反応させ、化合物（ＩＩａ）を製造する工程。
【化１７】
2012043730.tif 000019
［式中、ＢＰ、Ｒ６、Ｒ１、リンカー、固相担体は、前記と同義である。］
本工程は、化合物（ＶＩ）と固相担体とを用いて縮合反応として知られた方法により製造することができる。
【００４３】
化合物（ＩＩ）において、ｎ＝２〜９９の整数であって、Ｌが基（ＩＶ）である、次の一般式（ＩＩａ２）で表される化合物は、化合物（ＩＩａ）を出発原料とし、本明細書に記載のモルホリノ核酸オリゴマーの製法にかかる工程Ａ及び工程Ｂを所望の回数繰り返し実施することにより製造することができる。
【化１８】
2012043730.tif 000020
［式中、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、リンカー、固相担体は、前記と同義であり；
ｎ’は、１〜９８の整数を表す。］
【００４４】
また、化合物（ＩＩ）において、ｎ＝１であって、Ｌが水素である、次の一般式（ＩＩｂ）で表される化合物は、例えば、ＷＯ１９９１／００９０３３に記載の方法により製造することができる。
【化１９】
2012043730.tif 000021
［式中、ＢＰ、Ｒ１は、前記と同義である。］
【００４５】
化合物（ＩＩ）において、ｎ＝２〜９９の整数であって、Ｌが水素である、次の一般式（ＩＩｂ２）で表される化合物は、化合物（ＩＩｂ）を出発原料とし、本明細書に記載のモルホリノ核酸オリゴマーの製法にかかる工程Ａ及び工程Ｂを所望の回数繰り返し実施することにより製造することができる。
【化２０】
2012043730.tif 000022
［式中、ＢＰ、ｎ’、Ｒ１、Ｘ、Ｙは、前記と同義である。］
【００４６】
また、化合物（ＩＩ）において、ｎ＝１であって、Ｌがアシルである、次の一般式（ＩＩｃ）で表される化合物は、化合物（ＩＩｂ）に対してアシル化反応として知られた方法を実施することにより製造することができる。
【化２１】
2012043730.tif 000023
［式中、ＢＰ、Ｒ１は、前記と同義であり；
Ｒ７は、アシルを表す。］
【００４７】
化合物（ＩＩ）において、ｎ＝２〜９９の整数であって、Ｌがアシルである、次の一般式（ＩＩｃ２）で表される化合物は、化合物（ＩＩｃ）を出発原料とし、本明細書に記載のモルホリノ核酸オリゴマーの製法にかかる工程Ａ及び工程Ｂを所望の回数繰り返し実施することにより製造することができる。
【化２２】
2012043730.tif 000024
［式中、ＢＰ、ｎ’、Ｒ１、Ｒ７、Ｘ、Ｙは、前記と同義である。］
【００４８】
（２）工程Ｂ：
化合物（ＩＩＩ）に塩基存在下にモルホリノモノマー化合物を作用させることによって、次の一般式（ＶＩＩ）で表される化合物（以下、化合物（ＶＩＩ）という。）を製造する工程。
【化２３】
2012043730.tif 000025
［式中、ＢＰ、Ｌ、ｎ、Ｒ１、Ｘ、Ｙは、前記と同義である。］
【００４９】
本工程は、化合物（ＩＩＩ）に塩基存在下にモルホリノモノマー化合物を作用させることにより実施することができる。
【００５０】
モルホリノモノマー化合物としては、例えば、次の一般式（ＶＩＩＩ）で表される化合物を挙げることができる。
【化２４】
2012043730.tif 000026
［式中、ＢＰ、Ｒ１、Ｘ、Ｙ、Ｚは前記と同義である。］
本工程に使用しうる「塩基」としては、例えば、ジイソプロピルアミン、トリエチルアミン、又は、Ｎ−エチルモルホリンを挙げることができる。塩基の使用量としては、例えば、化合物（ＩＩＩ）１モルに対して、モル比で１倍量〜１０００倍量の範囲内が適当であり、好ましくは１０倍量〜１００倍量の範囲内である。
本工程に使用しうるモルホリノモノマー化合物および塩基は、０．１％〜３０％の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルイミダゾリドン、Ｎ−メチルピペリドン、ＤＭＦ、ジクロロメタン、アセトニトリル、テロラヒドロフラン 、又はこれらの混合物を挙げることができる。
【００５１】
反応温度は、例えば、０℃〜１００℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、１０℃〜５０℃の範囲内である。
反応時間は、使用する塩基の種類、反応温度によって異なるが、通常１分〜４８時間の範囲内が適当であり、好ましくは、３０分〜２４時間の範囲内である。
【００５２】
さらに本工程の終了後、必要に応じて、アシル化剤を添加することができる。「アシル化剤」としては、例えば、無水酢酸、酢酸クロライド、フェノキシ酢酸無水物を挙げることができる。アシル化剤は、例えば、０．１％〜３０％の範囲内の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類（エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど）、水又はこれらの混合物を挙げることができる。
また、必要であれば、アシル化剤と一緒に、例えば、ピリジン、ルチジン、コリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−エチルモルホリンの塩基を使用することができる。アシル化剤の使用量としては、モル比で０．１倍量〜１００００倍量の範囲内が好ましく、１倍量〜１０００倍量の範囲内がより好ましい。塩基の使用量としては、例えば、アシル化剤１モルに対して、モル比で０．１倍量〜１００倍量の範囲内が適当であり、好ましくは倍量〜１０倍量の範囲内である。
本反応の反応温度は、１０℃〜５０℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、１０℃〜５０℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、２０℃〜４０℃の範囲内であり、さらに好ましくは、２５℃〜３５℃の範囲内である。反応時間は、例えば、使用するアシル化剤の種類、反応温度によって異なるが、通常０．１分〜２４時間の範囲内が適当であり、好ましくは、１分から５時間の範囲内である。
【００５３】
（３）工程Ｃ：
工程Ｂにおいて製造される化合物（ＶＩＩ）において、脱保護剤を用いて保護基を脱離し、一般式（ＩＸ）で表される化合物を製造する工程。
【化２５】
2012043730.tif 000027
［式中、Ｂａｓｅ、ＢＰ、Ｌ、ｎ、Ｒ１、Ｘ、Ｙは、前記と同義である。］
【００５４】
本工程は、化合物（ＶＩＩ）に脱保護剤を作用させることにより実施することができる。
【００５５】
「脱保護剤」としては、例えば、濃アンモニア水、メチルアミンを挙げることができる。本工程に使用しうる「脱保護剤」は、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ＤＭＦ、Ｎ，Ｎ−ジメチルイミダゾリドン、Ｎ−メチルピペリドン又はこれらの混合溶媒で希釈して使用することもできる。なかでも、エタノールが好ましい。脱保護剤の使用量としては、例えば、化合物（ＶＩＩ）１モルに対して、例えば、モル比で１倍量〜１０００００倍量の範囲内が適当であり、好ましくは１０倍量〜１０００倍量の範囲内である。
【００５６】
反応温度は、例えば、１５℃〜７５℃の範囲内が適当であり、好ましくは４０℃〜７０℃の範囲内であり、より好ましくは５０℃〜６０℃の範囲内である。脱保護反応時間は、化合物（ＶＩＩ）の種類、反応温度等によって異なるが、１０分〜３０時間の範囲内が適当であり、好ましくは３０分〜２４時間の範囲内であり、より好ましくは５時間〜２０時間の範囲内である。
【００５７】
（４）工程Ｄ：
工程Ｃに製造される化合物（ＩＸ）に酸を作用させることによって、モルホリノ核酸オリゴマー（Ｉ）を製造する工程。
【化２６】
2012043730.tif 000028
［式中、Ｂａｓｅ、ｎ、Ｒ１、Ｘ、Ｙは、前記と同義である。］
【００５８】
本工程は、化合物（ＩＸ）に酸を加えることによって実施することができる。
【００５９】
本工程に使用しうる「酸」としては、例えば、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、酢酸、リン酸及び塩酸を挙げることができる。酸の使用量としては、例えば、溶液のｐＨが０．１〜４．０の範囲内になるように使用するのが適当であり、より好ましくは１．０〜３．０の範囲内になるように使用する。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、水、又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。
【００６０】
反応温度は、１０℃〜５０℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、２０℃〜４０℃の範囲内であり、さらに好ましくは、２５℃〜３５℃の範囲内である。脱保護反応時間は、化合物（ＩＸ）の種類、反応温度等によって異なるが、０．１分〜５時間の範囲内が適当であり、好ましくは１分〜１時間の範囲内であり、より好ましくは１分〜３０分の範囲内である。
【００６１】
モルホリノ核酸オリゴマー（Ｉ）は、本工程で得られた反応混合物から通常の分離精製手段、例えば、抽出、濃縮、中和、濾過、遠心分離、再結晶、Ｃ８からＣ１８の逆相カラムクロマトグラフィー、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析、限界ろ過などの手段を単独若しくは組み合わせて用いることにより得ることができ、所望のモルホリノ核酸オリゴマー（Ｉ）を単離精製することができる（例えば、ＷＯ１９９１／０９０３３を参照）。
逆相クロマトグラフィーを用いてモルホリノ核酸オリゴマー（Ｉ）を精製する場合には、溶出溶媒として、例えば２０ｍＭのトリエチルアミン／酢酸緩衝液とアセトニトリルの混合溶液を使用することができる。
また、イオン交換クロマトグラフィーを用いてモルホリノ核酸オリゴマー（Ｉ）を精製する場合には、例えば、１Ｍの食塩水と１０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液の混合溶液を使用することができる。
【００６２】
本発明化合物は、そのままモルホリノ核酸オリゴマーの合成原料モノマー、又は、その原料モノマーを合成するための原料として用いることができるが、公知の方法により塩の形にして用いることもできる。このような塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、燐酸などの鉱酸の塩、酢酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、コハク酸、フマル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸などの有機酸の塩などを挙げることができる。
【００６３】
本発明化合物、又はその塩の中には、不斉炭素を有するものも存在するが、各光学異性体及びそれらの混合物のいずれも本発明に含まれる。光学異性体は、例えば、上記のようにして得られたラセミ体から、その塩基性を利用して光学活性な酸（酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、マンデル酸、１０−カンファースルホン酸等）を用いて公知の方法により光学分割するか、予め調製した光学活性な化合物を原料に用いて製造することができる。その他、キラルカラムを用いた光学分割や不斉合成により製造することもできる。
また、本発明化合物、又はその塩に幾何異性体や互変異性体が存在する場合は、いずれか一方の異性体のみならず、それらの混合物も本発明化合物に含まれる。
【００６４】
このようにして、製造される本発明化合物、又はその塩は、それ自体公知の手段、例えば、濃縮、液性変換、転溶、溶媒抽出、結晶化、再結晶、分留、クロマトグラフィーにより分離精製することができる。
【実施例】
【００６５】
以下に参考例、実施例、製造例、試験例を揚げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらのみに限定されない。
【００６６】
参考例１  Ｎ９−｛（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ヒドロキシメチル）モルホリン−２−イル｝−Ｎ２−（フェノキシアセチル）グアニン  ｐ−トルエンスルホン酸塩
工程１  Ｎ２−（フェノキシアセチル）グアノシン
グアノシン（１００ｇ）を８０℃で減圧下、２４時間乾燥した。ピリジン（脱水，５００ｍｌ）、ジクロロメタン（脱水，５００ｍｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、０℃にてクロロトリメチルシラン（４０１ｍＬ）を滴下し室温で３時間撹拌した。再度氷冷し、フェノキシアセチルクロライド（６６．３ｇ）を滴下し、氷冷下、更に３時間撹拌した。反応液にメタノール（５００ｍｌ）を加え、室温で終夜撹拌後、減圧下で溶媒を留去した。残渣にメタノール（５００ｍｌ）を加え、減圧下で濃縮することを３回行った。残渣に水（４Ｌ）を加え氷冷下１時間撹拌し、析出物をろ取した。これを、水、次いで、冷メタノールで洗浄し、乾燥して目的化合物を１５０．２ｇ得た（参考：Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．（２００４），Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１５，２５５５−２５５７）。
工程２  Ｎ９−｛（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ヒドロキシメチル）モルホリン−２−イル｝−Ｎ２−（フェノキシアセチル）グアニン  ｐ−トルエンスルホン酸塩
工程１で得られた化合物（３０ｇ）をメタノール（４８０ｍｌ）に懸濁し、氷冷下、２Ｎ塩酸（１３０ｍｌ）を加えた。次いで、四ほう酸アンモニウム４水和物（５６．８ｇ）、過ヨウ素酸ナトリウム（１６．２ｇ）をこの順で加え、室温で３時間撹拌した。反応液を氷冷し、不溶物をろ過して除き、これをメタノール（１００ｍｌ）で洗浄した。ろ液と洗浄液を合わせて氷冷し、２−ピコリンボラン（１１．５２ｇ）を加えて２０分間撹拌後、ｐ−トルエンスルホン酸・１水和物（５４．６ｇ）をゆっくり加えて、４℃で終夜撹拌した。析出物をろ取し、冷メタノール（５００ｍｌ）で洗浄後、乾燥して目的化合物を１７．７ｇ得た（収率：４３．３％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ９．９−９．２（２Ｈ，ｂｒ），８．３５（１Ｈ，ｓ），７．５５（２Ｈ，ｍ），７．３５（２Ｈ，ｍ），７．１０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８２Ｈｚ），７．００（３Ｈ，ｍ），５．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．６４，２．４２Ｈｚ），４．８５（２Ｈ，ｓ），４．００（１Ｈ，ｍ），３．９０−３．６０（２Ｈ，ｍ），３．５０−３．２０（５Ｈ，ｍ），２．９０（１Ｈ，ｍ），２．２５（３Ｈ，ｓ）
【００６７】
参考例２  アミノメチルポリスチレン樹脂（ＧＥヘルスケア社製、Ｃｕｓｔｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ａｍｉｎｏ  ２００、２８−９２２９−４６）に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（４−ベンズアミド−２−オキソピリミジン−１−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸の製造
アルゴン雰囲気下、Ｎ−｛１−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ヒドロキシメチル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル｝ベンズアミド０．４６ｇと４−ジメチルアミノピリジン（４−ＤＭＡＰ）０．１５ｇをジクロロメタン１０ｍＬに懸濁し、無水コハク酸０．１２ｇを加え、室温で３時間撹拌した。反応液にメタノール１ｍＬを加え、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチルと０．５Ｍのリン酸二水素カリウム水溶液を用いて抽出操作を行った。得られた有機層を０．５Ｍのリン酸二水素カリウム水溶液、水、飽和食塩水の順で洗浄した。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮した。
得られた残渣をピリジン（脱水）５０ｍＬに溶解し、４−ＤＭＡＰ  ０．１ｇ、１−エチル−３‐（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩１．５ｇを加えた。次いで、アミノメチルポリスチレン樹脂（ＧＥヘルスケア社製、Ｃｕｓｔｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ａｍｉｎｏ  ２００、２８−９２２９−４６）５．０ｇ、トリエチルアミン１．７ｍＬを加え、室温で６日間振とうした。反応後、樹脂をろ取した。得られた樹脂をピリジン、メタノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥した。得られた樹脂にテトラヒドロフラン（脱水）４０ｍＬ、無水酢酸３ｍＬ、２，６−ルチジン３ｍＬを加え、室温で１．５時間振とうした。樹脂をろ取し、ピリジン、メタノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥し、５．０ｇの標記化合物を得た。
当該目的物のローディング量は、公知の方法を用いて、樹脂１ｇ当たりのトリチルのモル量を４０９ｎｍにおけるＵＶ吸光度を測定することにより決定した。樹脂のローディング量は、４６．３μｍｏｌ／ｇであった。
ＵＶ測定条件
機器：Ｕ−２９１０（日立製作所）
溶媒：メタンスルホン酸
波長：２６５  ｎｍ
ε値：４５０００
参考例３  アミノメチルポリスチレン樹脂（１％ＤＶＢ架橋、東京化成工業社製、Ａ１５４３）に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（４−ベンズアミド−２−オキソピリミジン−１−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸の製造
アルゴン雰囲気下、Ｎ−｛１−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ヒドロキシメチル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル｝ベンズアミド３０  ｇと４−ジメチルアミノピリジン（４−ＤＭＡＰ）９．６ｇをジメチルホルムアミド６０ｍＬに懸濁し、無水コハク酸７．８６ｇを加え、室温で２時間撹拌した。反応液に１Ｍのリン酸二水素カリウム水溶液を加えて、酢酸エチルで抽出操作を行った。得られた有機層を１Ｍのリン酸二水素カリウム水溶液、水、飽和食塩水の順で洗浄した。得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮して粗結晶３４．０ｇを得た。
得られた粗結晶の２９．５ｇをピリジン（脱水）３００ｍＬに溶解し、４−ＤＭＡＰ  ５．１ｇ、１−エチル−３‐（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩２０．１ｇを加えた。次いで、アミノメチルポリスチレン樹脂（１％ＤＶＢ架橋、東京化成工業社製、Ａ１５４３）２５．０ｇ、トリエチルアミン２４ｍＬを加え、室温で３日間振とうした。反応後、樹脂をろ取した。得られた樹脂をピリジン、メタノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥した。得られた樹脂にテトラヒドロフラン（脱水）３００ｍＬ、無水酢酸３０ｍＬ、２，６−ルチジン３０ｍＬを加え、室温で２．５時間振とうした。樹脂をろ取し、ピリジン、メタノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥し、３３．２ｇの標記化合物を得た。
当該目的物のローディング量は、公知の方法を用いて、樹脂１ｇ当たりのトリチルのモル量を４０９ｎｍにおけるＵＶ吸光度を測定することにより決定した。樹脂のローディング量は、２９２．４μｍｏｌ／ｇであった。
ＵＶ測定条件
機器：Ｕ−２９１０（日立製作所）
溶媒：メタンスルホン酸
波長：２６５  ｎｍ
ε値：４５０００
【００６８】
実施例１  ［（２Ｓ，６Ｒ）−６−｛Ｎ２−（フェノキシアセチル）−Ｏ６−（２−シアノエチル）グアニン−９−イル｝−４−トリチルモルホリン−２−イル］メチル  ジメチルホスホロアミドクロリデート
工程１  Ｎ９−｛（２Ｒ，６Ｓ）−６−ヒドロキシメチル−４−トリチルモルホリン−２−イル｝−Ｎ２−（フェノキシアセチル）グアニンの製造
Ｎ９−｛（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ヒドロキシメチル）モルホリン−２−イル｝−Ｎ２−（フェノキシアセチル）グアニン  ｐ−トルエンスルホン酸塩（２．０ｇ）（参考例１）をジクロロメタン（３０ｍｌ）に懸濁し、氷冷下、トリエチルアミン（１３．９ｇ）、トリチルクロリド（１８．３ｇ）を加えて、室温で１時間撹拌した。反応液を飽和重曹水、次いで水で洗浄後、有機層を回収して硫酸ナトリウムで乾燥し、有機層を減圧濃縮した。残渣に０．２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３）／メタノール（１：４（ｖ／ｖ），４０ｍｌ）を加えて撹拌し、次いで水（４０ｍｌ）を加えて氷冷下１時間撹拌した（懸濁状態）。これをろ取し、冷メタノールで洗浄、乾燥して目的化合物を１．８４ｇ得た（収率：８２．０％）。
工程２  Ｎ９−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−｛（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）メチル｝−４−トリチルモルホリン−２−イル］−Ｎ２−（フェノキシアセチル）グアニンの製造  
工程１で得られた化合物（３８．３ｇ）をジクロロメタン（３００ｍＬ）に溶解し、氷冷下、イミダゾール（４．６４ｇ）、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（９．４７ｇ）をこの順で加え、室温で１時間撹拌した。反応液を０．２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３）、次いで、飽和食塩水で洗浄後、有機層を回収して硫酸マグネシウムで乾燥し、有機層を減圧濃縮して目的化合物を粗生成物として４４．１ｇを得た。
工程３  Ｎ９−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−｛（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）メチル｝−４−トリチルモルホリン−２−イル］−Ｎ２−（フェノキシアセチル）−Ｏ６−トリイソプロピルベンゼンスルホニルグアニンの製造
工程２で得られた化合物（４４．１ｇ）をジクロロメタン（３００ｍＬ）に溶解し、氷冷下、４−ジメチルアミノピリジン（０．６４ｇ）、トリエチルアミン（２９．２ｍＬ）、トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド（１９．０ｇ）を加えて室温で１時間撹拌した。反応液を１Ｍリン酸二水素ナトリウム水溶液で洗浄後、有機層を回収して硫酸ナトリウムで乾燥し、有機層を減圧濃縮して目的化合物を粗生成物として６０．５ｇを得た。
工程４  Ｎ９−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−｛（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）メチル｝−４−トリチルモルホリン−２−イル］−Ｎ２−（フェノキシアセチル）−Ｏ６−（２−シアノエチル）グアニンの製造
工程３で得られた化合物（６０．５ｇ）をジクロロメタン（３００ｍＬ）に溶解し、氷冷下、Ｎ−メチルピロリジン（５４．５ｍＬ）を加えて１時間撹拌した。反応液にエチレンシアノヒドリン（３７．２ｇ）、次いで１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（１１．９６ｇ）を加え、氷冷下、更に２時間撹拌した。反応液を１Ｍリン酸二水素ナトリウム水溶液、次いで水で洗浄後、有機層を回収して硫酸ナトリウムで乾燥し、有機層を減圧濃縮して目的化合物を粗生成物として７２．４ｇを得た。
工程５  Ｎ９−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−ヒドロキシメチル−４−トリチルモルホリン−２−イル］−Ｎ２−（フェノキシアセチル）−Ｏ６−（２−シアノエチル）グアニンの製造
工程４で得られた化合物（７２．４ｇ）をジクロロメタン（３００ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミントリヒドロフルオリド（２１．１ｇ）を加えて室温で１７時間撹拌した。反応液を冷飽和重曹水に注ぎ、中和後ジクロロメタン層を回収して硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＰＳＱ１００Ｂ（冨士シリシア化学株式会社製、以下同じ。））により精製し、目的化合物を１４．３ｇ得た（工程２からの収率：３９．２％）。
工程６  ［（２Ｓ，６Ｒ）−６−｛Ｎ２−（フェノキシアセチル）−Ｏ６−（２−シアノエチル）グアニン−９−イル｝−４−トリチルモルホリン−２−イル］メチル  ジメチルホスホロアミドクロリデートの製造
アルゴン雰囲気下、ＴＨＦ（８６ｍＬ）にジメチルアミノホスホリルジクロリド（４．０３ｍＬ）を加え氷冷し、これにＮ−メチルイミダゾール（３．３７ｍＬ）を加えた。反応液は懸濁状態になった。５分後、工程５で得られた化合物（１１．８６ｇ）を粉末のまま加え、更に５分間撹拌して、Ｎ−エチルモルホリン（２．１６ｍＬ）を加えた後、室温で３時間撹拌した。反応液を氷冷した１Ｍリン酸二水素ナトリウム水溶液に注ぎ、酢酸エチル（３００ｍｌ）で抽出操作を行った。次いで、有機層を飽和食塩水で洗浄し、有機層を回収して硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＰＳＱ１００Ｂ）により精製し、目的化合物を９．９ｇ得た（収率：７０．７％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ８．８５（１Ｈ，ｂｓ），７．８５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４５Ｈｚ），７．６０−７．００（２０Ｈ，ｍ），６．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５１Ｈｚ），４．９０−４．７０（４Ｈ，ｍ），４．６０−４．４０（１Ｈ，ｍ），４．２０−４．００（１Ｈ，ｍ），３．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２８Ｈｚ），３．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．２１Ｈｚ），３．００（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５６Ｈｚ），２．６５（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．８９，４．１Ｈｚ），１．８５−１．５５（２Ｈ，ｍ）
３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ２０．７０９７，２０．３５００
【００６９】
以下の製造例、又は試験例に用いるモルホリノモノマー化合物の構造式と略称を表１に示す。
【表１】
2012043730.tif 000029
【００７０】
製造例１  ＣＥ−Ｇを用いた、塩基配列が５’−ＣＡＧＴＧＣ−３’である、下記構造を有するモルホリノ核酸オリゴマーの合成
【化２７】
2012043730.tif 000030
［工程１］アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（４−ベンズアミド−２−オキソピリミジン−１−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸（参考例２）２１６ｍｇ（１０  μｍｏｌ）を合成用カラムに移し入れ、自動合成機（Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  １０：ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に装填した。その他、必要な試薬類も調製し装填した。固相合成は５０℃で（カラムオーブンを使用）、表２の合成条件で合成を行った。
【表２】
2012043730.tif 000031
※  モノマー溶液とアクティベーター溶液は、６：４の体積比に設定した。
なお、デブロック溶液としては、３％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を含有するジクロロメタン溶液を用いた。アクティベーターとしては、２０％（ｖ／ｖ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、および、１０％（ｖ／ｖ）のテトラヒドロフランを含有するアセトニトリル溶液を用いた。
モルホリノモノマー化合物として、表１に記載のＡＰ、ＣＰ、ＴＰ、及びＣＥ−Ｇを用いた。
モルホリノモノマー溶液としては、上記モルホリノモノマー化合物を０．１３−０．１５Ｍになるように、テトラヒドロフランで溶解したものを用いた  （ＡＰ，ＣＰ：０．１４Ｍ；  ＴＰ：０．１５Ｍ ；  ＣＥ−Ｇ：０．１３Ｍ）。
［工程２］
［工程１］で得られたモルホリノ核酸オリゴマーが担持されたアミノメチルポリスチレン樹脂を反応容器から回収し、２時間以上室温で減圧乾燥した。乾燥したアミノメチルポリスチレン樹脂に担持されたモルホリノ核酸オリゴマーの１０ｍｇを反応容器に入れ、２８％アンモニア水−エタノール（１／３）１．０ｍＬを加え、５５℃で１５時間撹拌した。アミノメチルポリスチレン樹脂をろ別し、エタノール１．０ｍＬで洗浄した。得られたろ液にエチルエーテル１０ｍＬを加えた。遠心後に上澄みを除去し、減圧乾燥することで目的物を白色沈殿として得た。 
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ  計算値：１９２１．６６
測定値：１９１７．６９
【００７１】
製造例２  ＰＯＢ−Ｇを用いた、塩基配列が５’−ＣＡＧＴＧＣ−３’である、モルホリノ核酸オリゴマーの合成
ＣＥ−Ｇモノマーの代わりに、［（２Ｓ，６Ｒ）−６−｛Ｎ２−（フェノキシアセチル）−Ｏ６−（ピバロイルオキシベンジル）グアニン−９−イル｝−４−トリチルモルホリン−２−イル］メチル  ジメチルホスホロアミドクロリデート（ＷＯ２００９／０６４４７１  Ａ１参照、以下、ＰＯＧ-Ｇという（表１参照）。）を使用して、製造例１の［工程１］、［工程２］と同様の方法で、製造例１と同じ配列のモルホリノ核酸オリゴマーを製造した。
【００７２】
製造例３  塩基配列が、５’−ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴ−３’である、モルホリノ核酸オリゴマーの合成
アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（４−ベンズアミド−２−オキソピリミジン−１−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸（参考例３）６．０２ｇ（１．７５ｍｍｏｌ）を反応槽に移し入れ、ジクロロメタン９０ｍＬを添加し、３０分間静置した。ろ過後、表３の合成サイクルを開始した。標記化合物の塩基配列になるよう、各サイクルにおいて所望のモルホリノモノマー化合物を添加した。
【表３】
2012043730.tif 000032
※１  固相担体が膨潤して撹拌可能になる最少量。
※２  １０ｍｅｒまで９０ｍｉｎ，  
１１−２１ｍｅｒは３００ｍｉｎ。
【００７３】
なお、デブロック溶液としては、トリフルオロ酢酸（２当量）とトリエチルアミン（１当量）の混合物を３％（ｗ／ｖ）になるように、１％（ｖ／ｖ）のエタノールと１０％（ｖ／ｖ）の２，２，２−トリフルオロエタノールを含有するジクロロメタン溶液で溶解したものを用いた。中和溶液としては、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを５％（ｖ／ｖ）になるように、２５％（ｖ／ｖ）の２−プロパノールを含有するジクロロメタン溶液で溶解したものを用いた。
カップリング溶液Ａとしては、モルホリノモノマー化合物（ＡＰ、ＣＰ、ＴＰ、及びＣＥ−Ｇ）を０．１５Ｍになるように、１０％（ｖ／ｖ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを含有する１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノンで溶解したものを用いた。カップリング溶液Ｂとしては、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを１０％（ｖ／ｖ）になるように、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノンで溶解したものを用いた。キャッピング溶液としては、ジクロロメタンに対して２０％（ｖ／ｖ）の無水酢酸と３０％（ｖ／ｖ）の２，６−ルチジンを溶解したものを使用した。【００７４】
上記で合成したモルホリノ核酸オリゴマーが担持されたアミノメチルポリスチレン樹脂を反応容器から回収し、２時間以上室温で減圧乾燥した。乾燥したアミノメチルポリスチレン樹脂に担持されたモルホリノ核酸オリゴマーを反応容器に入れ、２８％アンモニア水−エタノール（１／４）３５０ｍＬを加え、５５℃で１５時間撹拌した。アミノメチルポリスチレン樹脂をろ別し、水−エタノール（１／４）１５０ｍＬで洗浄した。得られたろ液を減圧濃縮した。得られた残渣を２０ｍＭの酢酸−トリエチルアミン緩衝液（ＴＥＡＡ緩衝液）とアセトニトリルの混合溶媒（４／１）４００ｍＬに溶解し、メンブレンフィルターでろ過した。得られたろ液を逆相ＨＰＬＣにて精製した。使用した条件は、表４の通りである。
【表４】
2012043730.tif 000033
【００７５】
各フラクションを分析して目的物を回収し、減圧濃縮して淡黄色固体を得た。得られた固体に１０ｍＭのリン酸水溶液２００ｍＬを加え、懸濁させた。２Ｍのリン酸水溶液１０ｍＬを加え、１５分間攪拌した。さらに、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液１５ｍＬを加えて中和した。さらに、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液２０ｍＬを加えてアルカリ性とし、メンブレンフィルター（０．２２μｍ）でろ過した。１０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液１８０ｍＬで洗いこみ、目的物（５．８ｇ、収率５０％）を含む水溶液（４００ｍＬ）を得た。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ  計算値：６６０９．６２
測定値：６６０９．０９
【００７６】
試験例１  本発明化合物（ＣＥ−Ｇ）を用いて製造されたモルホリノ核酸オリゴマー（製造例１）と、先行技術化合物（ＰＯＢ−Ｇ）を用いて製造されたモルホリノ核酸オリゴマー（製造例２）との比較 
【００７７】
（１）合成されたモルホリノ核酸オリゴマーの純度ないし収量の比較
製造例１の［工程１］、及び製造例２の［工程１］と同じ操作で得られた、モルホリノ核酸オリゴマーが担持されたアミノメチルポリスチレン樹脂を、それぞれ濃アンモニア水／エタノール混合液で処理し、モルホリノ核酸オリゴマーを固相担体から切り出した。担体を濾過にて除去した後、ろ液に大過剰のエーテルを添加して遠心分離に供し、上澄み液を除いて、当該オリゴマーの粗生成物を固形物として回収した。固形物を乾燥後、水（２０ｍｌ）に溶解し、このうち５μｌを採取してＨＰＬＣに供し、当該未精製の混合物中に含まれる標記モルホリノ核酸オリゴマーの含有量を測定した。結果をそれぞれ図１及び図２のＨＰＬＣクロマトグラムに示す。
なお、測定条件は以下の通りである。
測定条件：
ＨＰＬＣ装置  
送液ユニット：ＬＣ−１０ＡＴ  ＶＰ（島津製作所社製）
検出器：ＳＰＤ−１０ＡＶＰ  （島津製作所社製）
逆相ＨＰＬＣカラム
ＸＢｒｉｄｇｅ＜２．５μｍ，φ４．６ｍｍ  ｘ  ５０ｍｍ＞（Ｗａｔｅｒｓ社製）
カラム温度：６０℃
移動相
グラジエント：リニアグラジエント２０分（Ｂ液：０−４０％）
Ａ液：５０ｍＭ  トリエチルアミン−酢酸緩衝液
Ｂ液：アセトニトリル
移動相の流量：０．７５ｍｌ／分
紫外線可視分光器検出波長：２６０ｎｍ
【００７８】
図１及び図２のＨＰＬＣクロマトグラムを解析して得られた、未精製の混合物中に含まれる標記モルホリノ核酸オリゴマーの面積百分率（％）及び、ピーク面積（μＡＵ・ｓｅｃ）を表５に示す。
【００７９】
【表５】
2012043730.tif 000034
表５の結果から、モルホリノ核酸オリゴマーの合成において、ＣＥ−Ｇモノマーを用いた場合は、ＰＯＢ−Ｇモノマーを用いた場合と比較して、面積百分率が高く、ピーク面積が大きいことから、合成されたモルホリノ核酸オリゴマーの純度が高く、収量が多いと言えるので、本発明は先行技術よりも優れていることが明らかである。
【００８０】
（２）合成されたモルホリノ核酸オリゴマーのＭＳスペクトル分析による比較
上記（１）で得られたそれぞれの未精製のモルホリノ核酸オリゴマーについて、ＭＳスペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；Ａｕｔｏｆｌｅｘ／Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）を測定し、それぞれ図３及び図４のＭＳスペクトラムを得た。
その結果、ＰＯＢ−Ｇモノマーを用いた場合（図４）には、ＣＥ−Ｇモノマーを用いた場合（図３）では確認されない副生成物の存在が確認された。当該副生成物の分子量の測定値は、標記モルホリノ核酸オリゴマーの基準ピークよりも１０６大きいものであり、ＷＯ２００９／０６４４７１で報告されているｐ−ヒドロキシベンジル付加体であると推定された。
一方、ＣＥ−Ｇモノマーを用いた場合、ＣＥ基はβ−脱離するにもかかわらず、アクリロニトリルの付加体は検出されなかったので（図３）、ＣＥ−Ｇモノマーはモルホリノ核酸オリゴマーの合成において優れている。
【図１】
2012043730.tif 000041
【図２】
2012043730.tif 000042
【図３】
2012043730.tif 000043
【図４】
2012043730.tif 000044
【国際調査報告】
2012043730.tif 000045
2012043730.tif 000046
2012043730.tif 000047
2012043730.tif 000048