(57)【要約】共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡による光計測を用いた走査分子計数法を用いて、発光粒子の拡散特性値（例えば、拡散係数）を測定する方法が提供される。本発明の発光粒子の拡散特性値を測定する方法は、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於いて光学系の光検出領域の位置を所定の経路に沿って周期的に移動させながら光の強度を測定して光強度データを生成し、その光強度データ上に於ける同一の発光粒子に対応する複数の信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間に基づいて発光粒子の拡散特性値を算出することを特徴とする。
2012050011.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子の拡散特性値を測定する方法であって、
前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を所定の経路に沿って周期的に移動する過程と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光の強度を測定して光強度データを生成する過程と、
前記光強度データ上に於いて発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程と、
前記検出された発光粒子の光を表す信号のうち、同一の発光粒子に対応する複数の信号を抽出する過程と、
前記抽出された信号の発生時間の間隔に於ける前記光検出領域の移動周期からのずれ時間に基づいて前記抽出された信号に対応する発光粒子の拡散特性値を算出する過程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、前記拡散特性値を算出する過程に於いて、前記抽出された信号の発生時間の間隔に於ける前記光検出領域の移動周期からのずれ時間と前記光検出領域の移動速度とから算出される前記抽出された信号に対応する発光粒子の変位に基づいて前記拡散特性値が算出されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１の方法であって、前記抽出された信号の発生時間の間隔が複数の連続した前記抽出された信号のうちのいずれか二つの信号の発生時間の時間差であることを特徴する方法。
【請求項４】
請求項１の方法であって、前記同一の発光粒子に対応する複数の信号を抽出する過程に於いて、前記検出された発光粒子の光を表す信号のうちの１つの信号の発生時間に前記光検出領域の周期を加算した時間を中心とする前記光検出領域の寸法と移動速度とに基づいて決定される時間幅内に発生した信号が前記１つの信号に対応する発光粒子と同一の発光粒子の信号であると判定されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１の方法であって、前記光強度データ上に於いて複数の発光粒子からの光を表す信号が存在している場合には、前記複数の発光粒子の各々について別々に前記拡散特性値が算出されることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかの方法であって、前記拡散特性値が拡散係数であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置が前記試料溶液中の発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子からの光を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な光分析方法に係り、より詳細には、上記の如き光学系を用いて単一の発光する粒子からの光を個別に検出して種々の光分析を可能にする方法に係る。なお、本明細書に於いて、光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）は、それ自身が光を発する粒子、又は、任意の発光標識若しくは発光プローブが付加された粒子のいずれであってもよく、発光粒子から発せられる光は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光等であってよい。
【背景技術】
【０００２】
近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence  Correlation  Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１−３、非特許文献１−３参照）に於いては、レーザー共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザー光が集光された焦点領域−コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度の測定が為され、その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報の取得、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象の検出が為される。また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity  Distribution  Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献４、非特許文献４)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon  Counting  Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献５）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成され、そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定され、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定されることとなる。またその他に、特許文献６、７に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献８は、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光をフォトンカウンティング技術を用いて計測してフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術を提案している。【０００３】
特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−０９８８７６
【特許文献２】特開２００８−２９２３７１
【特許文献３】特開２００９−２８１８３１
【特許文献４】特許第４０２３５２３号
【特許文献５】国際公開２００８−０８０４１７
【特許文献６】特開２００７−２０５６５
【特許文献７】特開２００８−１１６４４０
【特許文献８】特開平４−３３７４４６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】金城政孝、蛋白質  核酸  酵素  Vol.４４、No.９、１４３１−１４３８頁  １９９９年
【非特許文献２】エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence  Correlation  Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、２０４−２２４頁
【非特許文献３】加藤則子外４名、遺伝子医学、Vol.６、No.２、２７１−２７７頁
【非特許文献４】カスク他３名、米国科学アカデミー紀要  １９９９年、９６巻、13756‐13761頁（P.  Kask,  K.  Palo,  D.  Ullmann,  K.  Gall  PNAS  96,  13756-13761  (1999)）
【非特許文献５】永井健治他１名、生物物理49（4），181-186頁  ２００９年
【非特許文献６】金城政孝他１名、日本バイオレオロジー学会誌  第９巻  第２号  １９９５年  １７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いた光分析技術では、計測される光は、蛍光一分子又は数分子から発せられた光であるが、その光の解析に於いて、時系列に測定された蛍光強度データの自己相関関数の演算又はヒストグラムに対するフィッティングといった蛍光強度のゆらぎの算出等の統計的処理が実行され、個々の蛍光分子等からの光の信号を個別に参照又は分析するわけではない。即ち、これらの光分析技術に於いては、複数の蛍光分子等からの光の信号が統計的に処理され、蛍光分子等について統計平均的な特性が検出されることとなる。従って、これらの光分析技術に於いて統計的に有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するレベル、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているレベルである必要がある。実際、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、上記の光分析技術に於いて使用される試料溶液中の蛍光分子等の濃度は、典型的には、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であり、１ｎＭを大幅に下回るときには、蛍光分子等がコンフォーカル・ボリューム内に存在しない時間が生じて統計的に有意な分析結果が得られないこととなる。一方、特許文献６〜８に記載の蛍光分子等の検出方法では、蛍光強度のゆらぎの統計的演算処理が含まれておらず、試料溶液中の蛍光分子等が１ｎＭ未満であっても蛍光分子等の検出が可能であるが、溶液中でランダムに運動している蛍光分子等の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。【０００７】
そこで、本願出願人は、特願２０１０−０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、観測対象となる発光粒子の濃度又は数密度が、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の統計的処理を含む光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の発光粒子の状態又は特性を定量的に観測することを可能にする新規な原理に基づく光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術に於いては、端的に述べれば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等と同様に共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いるところ、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。）の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。この新規な光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）によれば、測定に必要な試料がＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術と同様に微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く、しかも、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子の存在を検出し、その濃度、数密度又はその他の特性を定量的に検出することが可能となる。【０００８】
ところで、上記の走査分子計数法に於いて光検出領域で試料溶液内を走査する際、光検出領域は、典型的には、例えば、円形、楕円形の所定の経路を循環するよう移動させられる。その際、光検出領域の移動周期が比較的短いとき或いは発光粒子の拡散並進運動の速度が比較的遅いときには、光検出領域が所定の経路を一周する間に所定の経路上の発光粒子が殆ど移動せず、同一の発光粒子が再度検出されることとなる。実際、動きの遅い分子についての走査分子計数法による測定に於いて、光検出領域の移動周期に略等しい時間間隔にて、周期的な発光粒子の光を表す信号が発生することが観察されている（図８（Ａ）参照）。しかしながら、かかる周期的な信号の間隔の長さは、詳細に検査してみると、完全に光検出領域の移動周期には一致せず、また、互いに少しずつずれが生じていることが明らかになった。かかる周期的な信号の間隔の長さのずれは、発光粒子がブラウン運動によりその位置を移動したためであると考えられる。本発明の発明者は、かかる周期的な信号の間隔の長さに於ける“ずれ”を解析することによって、粒子のブラウン運動による移動のし易さ、或いは、粒子の拡散係数を見積もることが可能であることを見出した。【０００９】
かくして、本発明の主な課題は、走査分子計数法の発光粒子の検出手法を用いて、発光粒子のブラウン運動による移動のし易さを表す指標値、典型的には、発光粒子の拡散係数を測定する新規な方法を提供することである。【００１０】
また、本発明のもう一つの課題は、ＦＣＳ等の光分析技術により良好な精度にて計測可能な発光粒子濃度よりも低い濃度の試料溶液中に於ける発光粒子のブラウン運動による移動のし易さを表す指標値又は発光粒子の拡散係数を測定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子の拡散特性値を測定する方法であって、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於いて光学系の光検出領域の位置を所定の経路に沿って周期的に移動する過程と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光の強度を測定して光強度データを生成する過程と、光強度データ上に於いて発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程と、検出された発光粒子の光を表す信号のうち、同一の発光粒子に対応する複数の信号を抽出する過程と、抽出された信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間に基づいて抽出された信号に対応する発光粒子の拡散特性値を算出する過程とを含むことを特徴とする方法によって達成される。かかる構成に於いて、「試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。かかる発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。）。更に、「拡散特性値」とは、粒子のブラウン運動による移動のし易さを表す任意の指標値であってよく、典型的には、粒子の拡散係数であるが、その他の物理量、例えば、並進拡散時間、任意の拡散係数の関数であってもよい。なお、本明細書に於いて、「信号」という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。【００１２】
上記の本発明の方法に於いては、走査分子計数法と同様に、まず、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が検出され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出される。かかる構成に於いて、光検出領域を所定の経路に沿って周期的に移動する場合、光検出領域が或る位置で或る発光粒子を包含した後に所定の経路を周回して前記の発光粒子を包含した位置の付近に到達する間に、その発光粒子が光検出領域の所定の経路から逸脱しないときには、その発光粒子は、再び光検出領域に包含され、その光が検出されることとなる。しかしながら、発光粒子は、光検出領域が所定の経路を一周する間にブラウン運動により、その位置が移動しているので、発光粒子が最初に検出された時間と次に検出された時間との間隔、即ち、発光粒子の信号の発生時間の間隔は、光検出領域の移動周期に完全に一致せず、光検出領域の移動周期からずれることとなり、かかる光検出領域の移動周期からのずれ時間には、発光粒子のブラウン運動による移動のし易さが反映されていることが期待される。そこで、本発明では、上記の如く、光強度データ上に於いて検出された発光粒子の光を表す信号のうちで同一の発光粒子に対応する複数の信号が抽出され、それらの抽出された信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間に基づいて抽出された信号に対応する発光粒子の拡散特性値が算出される。かかる構成によれば、光検出領域の所定の経路に発光粒子が進入すれば、その拡散特性値を個別に測定できるので、ＦＣＳ等の光分析技術に於ける蛍光強度のゆらぎの算出のための統計的処理は必要なく、試料溶液中の発光粒子濃度がＦＣＳ等で良好な測定結果を得るに必要なレベルよりも低い場合でも、発光粒子の拡散特性値が得られる点で有利である。また、本発明の方法によれば、光強度データ（一次元のデータ）上に於ける信号の発生時間に基づいて拡散特性値が算出されることから、演算負荷が然程に大きくならない点でも有利である。【００１３】
なお、上記の方法により検出される発光粒子の変位は、光強度データ上で同一の発光粒子の信号として抽出された信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の周期からのずれ時間と光検出領域の移動速度とから算出される。従って、上記の拡散特性値の算出に於いては、かかる発光粒子の変位がまず算出され、その発光粒子の変位に基づいて、発光粒子の拡散特性値が算出されるようになっていてよい。特に、拡散係数Ｄは、或る時間ｔに於ける粒子の変位ｘから
＜ｘ（ｔ）＞２＝２Ｄｔ      …（１）
（ここで、＜ｘ（ｔ）＞は、変位の平均）
により定義されるので、かかる式（１）の関係を用いて、発光粒子の変位に基づいて算定されてよい。【００１４】
また、光強度データ上で同一の発光粒子の信号として抽出された信号の発生時間の間隔は、必ずしも時間的に隣接する信号の発生時間の差ではなく、複数の連続した前記の抽出された信号のうちのいずれか二つの信号の発生時間の時間差であってよいことは理解されるべきである。例えば、ｎ個の信号が同一の発光粒子の信号として抽出された場合、ｎ個の信号のうちの二つの信号の組合せの全てについて、二つの信号の発生時間の間隔が、拡散特性値又は拡散係数の算出に用いられてよい。即ち、ｎ個の信号が抽出された場合には、ｎ（ｎ−１）／２個の信号の発生時間の間隔の値が得られ、それらの発生時間間隔の値を用いて拡散特性値又は拡散係数が算出されてよい。かかる手法によれば、隣接する信号の発生時間の差から粒子の変位を逐次計測する場合よりも、少ない測定時間で多くの変位値が得られ、信頼性の高い算出結果が得られる点で有利である。【００１５】
更に、上記の光強度データ上の信号から、同一の発光粒子に対応する複数の信号を抽出する過程に於いては、検出された発光粒子の光を表す信号のうち１つの信号の発生時間に光検出領域の周期を加算した時間から光検出領域の寸法と移動速度とに基づいて決定される時間幅内に発生した信号が前記の１つの信号に対応する発光粒子と同一の発光粒子の信号であると判定されてよい。上記の如く、本発明の方法に於いては、（一つの発光粒子を連続的に追跡するのではなく、）光検出領域が所定の経路を周回する毎に同一の発光粒子を周期的に検出し、その信号の発生時間の間隔又は変位から拡散特性値又は拡散係数を算出する。従って、光検出領域が周回する時間（周期）に於いて、発光粒子の（平均的な）変位が光検出領域の大きさを超えるほど拡散特性値又は拡散係数が大きい場合には、同一の発光粒子の信号を周期的に検出できない可能性がある。即ち、逆に言えば、光検出領域が周回する時間に於ける発光粒子の変位が光検出領域の大きさよりも小さい場合には、その発光粒子の信号の間隔は、光検出領域の周期に、光検出領域の寸法を光検出領域が移動するのに要する時間幅の半分を加算又は減算した値の範囲内となる。そして、光検出領域の寸法を光検出領域が移動するのに要する時間幅は、光検出領域の寸法と移動速度とに基づいて決定されるので、結局、或る信号と、その信号が発生した後、光検出領域の周期に光検出領域の寸法と移動速度とに基づいて決定される時間幅の半分を加算又は減算した値の範囲内に発生した信号とは、同一の発光粒子の信号であると考えられる。かくして、上記の如く、１つの信号の発生時間に光検出領域の周期を加算した時間を中心とする光検出領域の寸法と移動速度とに基づいて決定される時間幅内に発生した信号を前記の１つの信号に対応する発光粒子と同一の発光粒子の信号であると判定する態様により、同一の発光粒子の信号を抽出することが可能となる。光検出領域の寸法と移動速度とに基づいて決定される時間幅ΔＴは、具体的には、光検出領域の直径ｄと移動速度ｖから
ΔＴ＝ｄ／ｖ      …（２）
により与えられてよい。【００１６】
更にまた、本発明の方法に於いて、光強度データ上に於いて複数の発光粒子からの光を表す信号が存在している場合には、それらの複数の発光粒子の各々について別々に拡散特性値又は拡散係数が算出されてよい。本発明の方法によれば、光検出領域が所定の経路を周回する間に、経路上に複数の発光粒子が存在していれば、それらは、別々に検出される。従って、それらの発光粒子の信号を、発光粒子毎に抽出すれば、それぞれについて拡散特性値又は拡散係数が算出可能である。かかる構成によれば、一つの光強度データ上で、複数の発光粒子の拡散特性値又は拡散係数を得ることができ、少ない測定時間で多くの結果が得られる点で有利である。【００１７】
上記の本発明の構成に於ける光検出領域の位置を移動する過程に関して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更されてよい。当業者に於いて理解される如く、発光粒子から検出される光の態様は、その特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、１つの発光粒子から得られる光量は低減することとなるので、１つの発光粒子からの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更されることが好ましい。【００１８】
更に、上記の光検出領域の位置を移動する過程に関して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、発光粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明の方法では、光検出領域が包含した１つの発光粒子から発せられる光を検出して、発光粒子を個別に検出する。しかしながら、発光粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光粒子から複数回、（その存在を表す）信号が検出されてしまう可能性があり、検出された信号と１つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、（光検出領域が所定の経路を一周する間に於いて）１つの発光粒子を、１つの信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、発光粒子によって変わるので、上記の如く、発光粒子の特性（特に、拡散特性値又は拡散係数）に応じて、光検出領域の移動速度は適宜変更されることが好ましい。【００１９】
光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動経路は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。なお、本発明に於いては、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されていることにより、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液に於いて機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、試料溶液中の発光粒子が力学的な作用の影響を受けることなく（アーティファクトの無い状態で）安定した状態にて、光の計測が可能である（例えば、試料に流れを発生させる場合には常に一様な流速を与えることは困難であると共に、装置構成が複雑となり、また、必要な試料量が大幅に増大すると共に、流れによる流体力学的作用によって溶液中の発光粒子又はその他の物質が変質又は変性してしまう可能性がある。また、流れのある液体中の粒子の変位からのその拡散係数の算出は複雑である。）。そして、試料溶液を流通させるといった構成が必要ではないので、ＦＣＳ等の場合と同様に微量（１〜数十μＬ程度）の試料溶液にて計測及び分析が可能である。【００２０】
本発明の方法は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。
【発明の効果】
【００２１】
総じて、本発明の方法によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡に於いて、その光検出領域により試料溶液中を走査することにより、発光粒子の存在を個別に検出すると共に、その発光粒子の拡散特性値又は拡散係数が測定できることとなる。そして、拡散特性値又は拡散係数は、粒子の大きさ及び形状を反映した値であるので、本発明の方法による測定によって、粒子の同定、粒子の大きさ及び形状、それらの変化の検出、或いは、粒子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象の検出及び分析が可能となる。【００２２】
上記の本発明の方法に於ける拡散特性値又は拡散係数の測定は、新規な原理によるものであり、従前の拡散係数の測定又は推定方法とは異なるいくつかの特徴を有している。例えば、ＦＣＳによれば、試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子の並進拡散時間が算出され、その並進拡散時間から発光粒子の拡散係数を見積もることが可能であるが、ＦＣＳの並進拡散時間は、測定時間中の蛍光強度の自己相関関数を先ず演算し、かかる自己相関関数から得られる値であり、そこから算定される拡散係数は、試料溶液中の多数の発光粒子の平均の値である。従って、試料溶液中に種類の異なる発光粒子が存在している場合、演算処理が複雑となるので、例えば、観測対象となる粒子に発光プローブを付加して、かかる粒子について、ＦＣＳによる測定をする場合には、観測対象粒子に結合していない発光プローブを除去するための精製処理が必要となり得る。また、既に述べた如く、ＦＣＳで良好な精度にて蛍光強度の自己相関関数を演算するには、試料溶液中の発光粒子濃度が、測定時間中、常に１つ以上の発光粒子が存在するレベルである必要がある。これに対し、本発明の方法によれば、発光粒子の存在及びその位置を個別に検出して、各粒子の個別の拡散特性値又は拡散係数を算出することが可能である。従って、測定を良好な精度にて実行可能な試料溶液中の発光粒子濃度は、ＦＣＳの場合よりも大幅に低くてもよく、また、信号の特性等によって発光粒子の種類が見分けられる場合には、試料溶液中に種類の異なる発光粒子が存在しているか否かは、拡散特性値又は拡散係数の算出の難易度にあまり影響しないので、発光プローブが付加された粒子について測定する場合にも、発光プローブの除去は必須ではなくなるといった利点が得られる。【００２３】
また、従来技術の粒子の拡散係数を算出可能な別の例として、ＳＭＴ（Single  Molecule  tracking）やＲＩＣＳ（Raster  Imaging  Correlation  Spectroscopy）（非特許文献５）によれば、光学顕微鏡下で撮影された画像に於いて、溶液中の発光粒子のブラウン運動を追跡し、その二次元の粒子の運動から拡散係数を見積もることが可能であるが、これらの場合、二次元データ（画像データ）の解析を要し、また、発光粒子の速い動きを捉えることが困難である（粒子の変位の時間分解能は、例えば、ビデオレートにより制約を受ける。）。これに対し、本発明の方法に於いては、拡散特性値又は拡散係数は、一次元データ（時系列の光強度データ）を用いて算出されるため、画像データの解析演算に比して、演算負荷が軽く、また、光検出領域の移動速度及び／又は経路の長さを適宜調節することによって、（ＳＭＴ、ＲＩＣＳの場合に比して）動きの速い粒子の拡散係数を発光粒子毎に個別に測定可能である。【００２４】
かくして、本発明の方法に従って、発光粒子を個別に検出し、その拡散特性値又は拡散係数を個別に算出する手法によれば、上記の如く、従前の拡散特性値又は拡散係数の測定又は推定方法にはない幾つかの利点が得られる。特に、本発明では、発光粒子を個別に検出するようになっていることから、試料溶液中で相対的に濃度が低い発光粒子であって、その光が従前の方法ではその他の発光粒子からの光に埋没してしまう発光粒子であっても、検出可能であり、その拡散特性値又は拡散係数が測定可能となる。【００２５】
本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１（Ａ）は、本発明の方法を実行する光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。
【図２】図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明の方法の一部を構成する走査分子計数法に於ける光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。
【図３】図３は、本発明の方法による発光粒子の拡散係数の測定の原理を説明する図である。（Ａ）は、顕微鏡の光検出領域ＣＶの試料溶液内に於ける所定の経路に沿った移動により包含される空間領域の模式的な斜視図である。（Ｂ）は、光検出領域が所定の経路を循環する際に発光粒子が殆ど移動しない場合に検出される発光粒子からの光の強度を時間に対して模式的に表したグラフ図である。（Ｃ）は、所定の経路を循環する光検出領域ＣＶの通過空間領域の一部の模式的な斜視図であり、発光粒子の移動距離と発光粒子の検出される時刻との関係を表している。（Ｄ）は、光検出領域の寸法と本発明の方法により測定される発光粒子のブラウン運動による（光検出領域の一周期当たりの）変位との関係を説明する光検出領域の模式図である。
【図４】図４は、本発明の方法に従って実行される拡散係数測定の処理手順をフローチャートの形式で表した図である。
【図５】図５（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、発光粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより発光粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。
【図６】図６（Ａ）は、走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から発光粒子の存在を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。図６（Ｂ）は、計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、パルス存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。
【図７】図７（Ａ）は、時系列の光強度データ上で検出された発光粒子の信号のうち同一の発光粒子（α又はβ）の信号を抽出する処理の一つの例を説明する図である。図７（Ｂ）は、抽出された同一の発光粒子の信号（（ｉ）〜（ｖ））に於いて参照される信号の発生時間間隔を説明する図である。図７（Ｃ）は、信号の発生時間間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間に基づいて決定される発光粒子の平均二乗変位の（変位の発生した）時間に対するプロットとプロットに対するフィッティング直線とを示した模式的なグラフ図である。（フィッティング直線の傾きが発光粒子の拡散係数Ｄの関数（＝２Ｄ）である。）
【図８】図８（Ａ）は、実施例１に於いて、周期的な強いパルス状の信号が観測された時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）の一部の実測例であり、図８（Ｂ）は、信号４の時間軸について拡大したフォトンカウントデータとそのフィッティング曲線を示している。図８（Ｃ）は、（Ａ）に於ける信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間に基づいて算出された発光粒子の平均二乗変位の、時間（周期数×移動周期）に対するプロットとフィッティング直線とを示すグラフ図である。
【図９】図９は、実施例１に於いて測定された時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）の全体（２秒間）を示している。
【図１０】図１０は、従来の蛍光強度のゆらぎを算出する光分析技術に於いて得られるフォトンカウント（光強度）の時間変化の例であり、（Ａ）は、試料内の粒子の濃度が、十分な計測精度が与えられる程度である場合であり、（Ｂ）は、（Ａ）の場合よりも大幅に試料内の粒子の濃度が低い場合である。
【符号の説明】
【００２７】
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
【００２９】
光分析装置の構成
本発明による方法は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。図１（Ａ）を参照して、光分析装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されており、発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過する。なお、当業者に於いて知られている如く、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、焦点面以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり、コンフォーカル・ボリュームと称される。コンフォーカル・ボリュームに於いては、典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となり、その実効体積は、光強度が１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。かくして、ピンホール１３を通過した光は、ダイクロイックミラー１４ａを経て、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、対応する光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられ、これにより、１つの発光粒子からの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出可能となる。
【００３０】
また、上記の光分析装置の光学系に於いて、更に、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域（即ち、光検出領域）の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。また、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７は、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動経路は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８を上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。上記の如く、試料溶液を移動するのではなく、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動する構成によれば、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することがなくなり、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な計測が達成される。
【００３１】
なお、追加的な構成として、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。
【００３２】
発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。また、発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２〜５が省略されてよい。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子を励起する光の波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の発光粒子が含まれている場合に、それらからの光を波長によって別々に検出できるようになっていてよい。
【００３３】
本発明の方法の原理
「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の方法によれば、端的に述べれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域の位置を試料溶液内にて所定の経路に沿って周期的に移動しながら、試料溶液中にて分散する発光粒子が光検出領域内に包含される際に放出する光を検出して発光粒子の存在を個別に検知する「走査分子計数法」に於いて、光検出領域が所定の経路を周回する間の発光粒子の位置のずれが反映される発光粒子の信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間に基づいてその発光粒子の移動し易さ、即ち、発光粒子の拡散特性値又は拡散係数が算出される。かかる構成によれば、試料溶液中の発光粒子の各々を個別に検出し、その拡散特性値又は拡散係数が個別に測定されることになるので、試料溶液中の発光粒子濃度がＦＣＳ等の蛍光ゆらぎの大きさの算出のための統計的処理を要する分光分析技術で良好に測定可能な濃度よりも低い場合でも、発光粒子の拡散特性値又は拡散係数の測定が可能となる。以下、走査分子計数法及び本発明による拡散特性値又は拡散係数の測定方法の原理について説明する。
【００３４】
１.走査分子計数法の原理
ＦＣＳ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＣＳ等の分光分析技術では、原理的に、発光粒子の特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度が、図１０（Ａ）に模式的に描かれているように、蛍光強度の計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、同図の右側に示されている如く、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし発光粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、図１０（Ｂ）に描かれているように、発光粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度の信号（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも発光粒子の濃度が大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。
【００３５】
そこで、本願出願人は、特願２０１０−０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、発光粒子の濃度が、上記の如きＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、発光粒子の特性の検出を可能にする新規な原理に基づく「走査分子計数法」を提案した。
【００３６】
走査分子計数法に於いて実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、図２にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、図２（Ａ）の如く、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔｏ〜ｔ２）に於いて１つの発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光粒子から光が放出され、図２（Ｂ）に描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度（Ｅｍ）のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如きパルス状の信号（有意な光強度）を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、発光粒子の特性に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の特性に関する情報が取得可能である。
【００３７】
２．本発明による発光粒子の拡散特性値の測定の原理
上記の走査分子計数法に於いて、図３（Ａ）に模式的に描かれている如く、光検出領域（ＣＶ）は、試料溶液中で、所定の経路（例えば、半径Ｒの円環）を通過するよう循環される。かかる光検出領域の移動の間、発光粒子は、ブラウン運動により、位置が移動するところ、一度検出された発光粒子（一度光検出領域に包含された発光粒子）が、光検出領域が所定の経路を周回する間に、光検出領域の通過する空間領域から逸脱しない場合には、その発光粒子は再び検出されることとなる。特に、発光粒子のブラウン運動の速度が比較的低いときには、一度検出された発光粒子は、しばらくの間、光検出領域の周回毎に光検出領域に包含されることとなるので、光強度データ上に於いて、発光粒子の光を表す信号が、図３（Ｂ）に模式的に例示されている如く、概ね、光検出領域が所定の経路を一周する時間（移動周期）ｔcycle毎に周期的に検出される。しかしながら、かかる周期的に検出される信号の発生時間の間隔は、光検出領域の移動周期に完全には一致しておらず、光検出領域が所定の経路を周回する時間に於ける発光粒子のブラウン運動による位置の移動に依存して光検出領域の移動周期に対して増減する、即ち、移動周期からのずれ時間が生ずることとなる。そこで、本発明に於いては、上記の周期的に検出される信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間に基づいて、発光粒子のブラウン運動による移動のし易さ、即ち、拡散特性値の算出が試みられる。なお、以下、拡散特性値として、拡散係数を算出する例について説明されるが、その他の拡散特性値についても信号の発生時間の間隔に於ける移動周期からのずれ時間に基づいて適宜算出できることは理解されるべきであり、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。
【００３８】
周期的に検出される発光粒子の信号の発生時間と発光粒子の拡散係数は、具体的には、以下の如く関係づけられる。まず、図３（Ｃ）の左に示されている如く、時刻ｔ＝ｔｏに或る発光粒子が光検出領域に包含され、その発光粒子の信号が発生した後、光検出領域が移動周期ｔcycleにて所定の経路を、ｋ回（ｋは、正の整数）、周回して同一の発光粒子を包含してその信号が検出されるとき、図３（Ｃ）の右に示されている如く、発光粒子は位置を移動しているので、信号の発生時間ｔ＝ｔｋは、
ｔ＝ｔｋ＝ｔｏ＋ｋ・ｔcycle＋Δｔ      …（３）
により与えられる。ここで、Δｔは、発光粒子の位置の移動による発光粒子が光検出領域に包含される時刻のずれ、即ち、二つの信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間である（Δｔは、正又は負で有り得る。）。従って、ｋ・ｔcycle（ｋ周期）に於ける光検出領域の移動方向に沿った発光粒子の位置の変位ｘ（ｋ・ｔcycle）は、光検出領域の移動速度ｖを用いて、
ｘ(ｋ・ｔcycle)＝ｖΔｔ      …（４）
により与えられる。ところで、粒子の拡散係数Ｄと時間ｔに於ける粒子の一次元の変位ｘ（ｔ）の関係は、アインシュタイン−スモルコフスキー(Einstein-Smoluchowski)の式より、
＜ｘ（ｔ）＞２＝２Ｄｔ      …（５）
により与えられる。かくして、式（３）、（４）を用いて、周期的に検出される信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間から発光粒子の位置の変位ｘ(ｋ・ｔcycle)を算出し、それらの変位を用いて、式（５）により、拡散係数Ｄを算定することが可能となる。
【００３９】
ところで、或る光検出領域の移動周期ｔcycleに於ける発光粒子の（平均的な）変位が光検出領域の大きさを超えるほど拡散係数が大きい場合には、同一の発光粒子の信号を光検出領域の周回毎に捉えることが困難となる。なぜなら、光検出領域により一度包含された発光粒子は、その移動方向が、偶然、光検出領域の通過領域（所定の経路）に沿っていれば、光検出領域の周回後に再度光検出領域により包含されるが、発光粒子はランダムな方向に運動するので、光検出領域の一周期に於ける発光粒子の（平均的な）変位が光検出領域の大きさを超えるほど大きいときには、発光粒子は、光検出領域により一度包含された後、光検出領域の通過領域から逸脱し、光検出領域の周回後に再度光検出領域により包含されなくなる可能性が高いためである。従って、上記の拡散係数Ｄの算定を確実に達成するべく周期的な信号を捉えるためには、図３（Ｄ）に例示されている如く、光検出領域の移動周期ｔcycleに於ける発光粒子の（３次元の）変位ｌが光検出領域の直径２ｒを超えないように、光検出領域の移動周期ｔcycleが調整されることが好ましい。即ち、本発明の方法により拡散係数の測定をする場合には、好適には、光検出領域の移動周期ｔcycleは、
（２ｒ）２＞２δ・Ｄ・ｔcycle      …（６）
（ここで、δは、次元であり、ここでは、δ＝３である。）
を満たすよう調整される。なお、実際の測定に於いては、検査されるべき発光粒子の予想される拡散係数に於いて、上記の式（６）の条件が成立するよう光検出領域の移動周期ｔcycleが調整されてよい。
【００４０】
処理操作過程
図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いた本発明の方法による発光粒子の拡散係数の測定方法の実施形態に於いては、具体的には、（１）発光粒子を含む試料溶液の調製過程、（２）試料溶液の光強度の測定処理過程、及び（３）測定された光強度の分析処理過程が実行される。図４は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理過程を示している。
【００４１】
（１）試料溶液の調製
本発明の方法に於いて観測対象となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的粒子などであってよい（試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。）。また、観測対象となる粒子は、それ自体が発光する粒子であってもよく、或いは、発光標識（蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子）が任意の態様にて付加された粒子であってよい。
【００４２】
（２）試料溶液の光強度の測定
本実施形態の走査分子計数法による光強度の測定処理過程では、ミラー偏向器１７を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行いながら、光強度の測定が為される（図４−ステップ１００）。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。計測が開始されると、まず、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、光源２から、試料溶液中の発光粒子の励起波長の光が出射されると共に、ミラー偏向器１７がミラー７（ガルバノミラー）を駆動して、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８は、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ  ＴＩＭＥ）に、例えば、１０μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
【００４３】
光検出領域の位置の移動速度に関して、走査分子計数法に於いて、一般的には、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出を、定量的に精度よく実行するために、好適には、光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定される。光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図５（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化（発光粒子からの光を表す信号）を特定することが困難となる。そこで、好適には、図５（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略同様となり（粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。図６（Ａ）上段参照。）、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
【００４４】
具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径ｒの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δτは、平均二乗変位の関係式
（２ｒ）２＝６Ｄ・Δτ      …（７）
から、
Δτ＝（２ｒ）２／６Ｄ      …（８）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２ｒ／Δτ＝３Ｄ／ｒ      …（９）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、発光粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０−１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、ｒが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０−３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その１０倍以上の１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。なお、発光粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
【００４５】
更に、本発明の方法に於いては、既に述べた如く、光検出領域の移動周期ｔcycleは、好適には、検査されるべき発光粒子の拡散係数Ｄに対して、式（６）の条件が成立するよう設定される。例えば、図３（Ａ）に例示されている如く、光検出領域の移動経路が円形であるときには、光検出領域の移動周期ｔcycle、移動速度ｖ及び移動経路の半径Ｒの関係は、
２πＲ＝ｖ・ｔcycle      …（１０）
により与えられるので、式（６）から、光検出領域の移動速度ｖは、
ｖ＞（３πＲ／ｒ２）・Ｄ      …（１１）
も成立するよう設定される。
【００４６】
（３）光強度の分析
上記の処理により試料溶液中の発光粒子の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、光強度データ上に於ける発光粒子からの光に対応する信号の検出、同一の発光粒子の信号の抽出、拡散係数の算出が実行される。
【００４７】
（ｉ）発光粒子に対応する信号の検出
時系列の光強度データに於いて、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図５（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、（光学系により決定される）光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する（図８（Ｂ）参照）。従って、走査分子計数法では、基本的には、適宜設定される閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（−２ｔ２／ａ２）      …（１２）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（１２）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。）
【００４８】
時系列光強度データからの発光粒子の一括的な検出を行う処理方法の一つの例としては、まず、時系列光強度データ（図６（Ａ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図４−ステップ１１０、図６（Ａ）中上段「スムージング」）。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法等により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ  ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
【００４９】
次いで、スムージング処理後の時系列光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光強度データの時間微分値は、図６（Ａ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。
【００５０】
しかる後、時系列光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号を検出し、検出された信号が発光粒子に対応する信号であるか否かが判定される。具体的には、まず、時系列光強度データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた時系列光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図６（Ａ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピーク（最大値）の強度Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図６（Ｂ）左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの発光粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの発光粒子が検出されたこととなる。一方、図６（Ｂ）右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。上記のステップ１３０〜１５０の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、時系列光強度データの全域に渡って繰り返し実行されてよい（ステップ１６０）。また、時系列光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。
【００５１】
（ii）同一の発光粒子の信号の抽出（図４−ステップ１７０）
時系列光強度データ上に於ける発光粒子のパルス信号の検出が為されると、それらのパルス信号のうちから、同一の発光粒子の信号の抽出が為される。上記までの説明から理解される如く、同一の発光粒子の信号は、光検出領域の移動周期に（完全に一致しないが）概ね等しい周期にて連続的に出現する。そこで、同一の発光粒子の信号の抽出は、光検出領域の移動周期に概ね等しい周期にて連続的に出現する信号を任意の手法又はアルゴリズムにより選択することにより為されてよい。例えば、最も単純には、実験者が時系列光強度データ上に於いて光検出領域の移動周期に概ね等しい周期にて連続的に出現する信号を目視によって特定することにより、同一の発光粒子の信号が抽出されてよい。
【００５２】
また、既に触れたように、本発明の方法では、有意に発光粒子の拡散係数が算出できるよう周期的な信号を捕捉可能にすべく、好適には、観測対象の発光粒子の光検出領域の周回毎の（平均的な）変位が光検出領域の大きさを超えない程度となるよう光検出領域の移動周期が調整される（式（６）参照）。その場合、一旦検出された発光粒子の光検出領域の周回後に於ける位置は、光検出領域の範囲内にあることが期待される。即ち、或る一つの発光粒子の信号が検出された後、光検出領域の一周期が経過する時間を中心として、光検出領域がその移動方向の大きさ（直径ｄ）を移動する時間に相当する時間幅、
ΔＴ＝ｄ／ｖ      …（２）
の範囲内に発生した信号は、前記の一つの発光粒子と同一の発光粒子の信号であると判断できる。そこで、同一の発光粒子の信号の抽出方法の一つとして、時系列光強度データ上に於いて、１つの発光粒子の信号の発生時間に光検出領域の周期を加算した時間を中心とする時間幅ΔＴの範囲内に発生した信号が、前記の１つの信号に対応する発光粒子と同一の発光粒子の信号であると判定するアルゴリズムが採用されてよい。より具体的には、図７（Ａ）に模式的に例示されている如く、例えば、或る発光粒子の信号α（ｉ）を選択した後、その選択された信号α（ｉ）の発生時刻（ピーク時であってよい。）から光検出領域の一周期が経過する時間を中心として、時間幅ΔＴの範囲内に信号α（ii）が存在する場合には、その信号α（ii）が信号α（ｉ）と同一の発光粒子の信号として選択される。しかる後、更に、選択された信号α（ii）の発生時刻から光検出領域の一周期が経過する時間（ｔcycle）を中心として、時間幅ΔＴの範囲内に信号α（iii）が存在する場合には、その信号α（iii）が既に選択された信号α（ｉ）、α（ii）と同一の発光粒子の信号として選択される。かくして、新たに信号が選択される毎に、その選択された信号の発生時刻から光検出領域の一周期が経過する時間を中心として時間幅ΔＴの範囲内に存在する信号を選択する処理を順に反復して実行することにより、時系列光強度データ上に於いて、同一の発光粒子の一連の信号（信号群）を抽出することが可能となる。（なお、最初に選択された信号の発生時刻を基準として、光検出領域の移動周期（ｔcycle）が経過する毎に、各周期が終了する時間を中心として、時間幅ΔＴの範囲内に存在する信号が最初に選択された信号と同一の発光粒子の信号として選択されるようになっていてもよい。）
【００５３】
また、光検出領域の通過領域に複数の発光粒子が進入する場合には、図７（Ａ）に例示されている如く、或る周期的に出現する信号の群（α）の間に、別の周期的に出現する信号の群（β）が出現することとなる。その場合には、その別の周期的に出現する信号の群についても上記と同様のアルゴリズムに従って、信号が逐次的に抽出されるようになっていてよい。即ち、一つの時系列光強度データ上に於いて、複数の周期的に出現する信号の群が存在する場合には、それらの信号群は、それぞれ、個別に抽出されてよい。実際の抽出処理に於いては、例えば、時系列光強度データに於いて、最初に或る一つの信号（α（ｉ））を選択して、その一つの信号を基準として、上記の如き態様にて一群の周期的な信号が抽出された後、抽出された信号群に選択されなかった一つの信号（β（ｉ））を基準として、上記の如く一つの周期的な信号の群（β（ii），…）が抽出される。かかる処理を繰り返して、一つの時系列光強度データ上にて、複数の信号群が抽出されてよい。上記の信号抽出方法は、特に、時系列光強度データ上に多数の発光粒子の信号が検出されている場合、コンピュータによって自動的に信号を抽出する際に有利に用いられる。
【００５４】
（iii）発光粒子の変位の算出（図４−ステップ１８０）
上記の如く（発光粒子毎に）同一の発光粒子の信号群が抽出されると、各信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間に基づいて発光粒子の変位が見積もられる。既に触れたように、光検出領域が所定の経路をｋ周する時間（ｋ・ｔcycle）の発光粒子の変位は、ｋ回の光検出領域の周回に於ける最初の信号の発生時間ｔｏと最後の信号の発生時間ｔｋとの間に於けるｋ周期に相当する時間ｋ・ｔcycleからのずれ時間
Δｔ＝ｔｋ−ｔｏ−ｋ・ｔcycle      …（１３）
を用いて、式（４）にて算出される。従って、発光粒子の変位の算出に於いては、典型的には、抽出された信号群に於ける信号のうちから二つの信号の組合せの全てについて、式（１３）により、ずれ時間Δｔが算出され、算出されたΔｔに光検出領域の移動速度ｖが乗ぜられて（式（４）により）、各信号の発生時間の間隔に於ける発光粒子の変位ｘが算出されてよい。例えば、図７（Ｂ）の如く、５個の信号が略周期的な信号が検出されているとすると、光検出領域の移動の１周期、２周期、３周期及び４周期に相当する時間に於けるずれ時間（粒子の変位）を与える信号の組合せ数は、それぞれ、４組（１、５、８、１０）、３組（２、６、９）、２組（３、７）及び１組（４）となり、全部で、１０個のずれ時間及び粒子の変位のデータが算出されることとなる。そして、発光粒子の信号群の信号数がｎ個であるときには、１〜ｎ−１周期に相当する時間の各々に対して、ずれ時間及び粒子の変位のデータが得られ、データの総数は、ｎ（ｎ−１）／２個となる。
【００５５】
（iv）拡散係数の算出（図４−ステップ１９０）
かくして、上記のステップ１８０に於ける処理により、一つの発光粒子の、光検出領域の移動時間（周回数×移動周期）の各々に於ける粒子の変位が算出されると、式（５）の関係を用いて、その発光粒子の拡散係数Ｄが算出される。例えば、一つの態様に於いては、図７（Ｃ）に模式的に例示されている如く、時間（周回数×移動周期）に対するステップ１８０で得られた粒子の変位の二乗値ｘ２のプロットに対して、最小二乗法等により直線をフィッティングし、その直線の傾き（＝２Ｄ）から、拡散係数Ｄが算出されてよい（直線のフィッティングに於いては、粒子の変位の二乗値ｘ２（図中、×）に対して直線をフィッティングが為されるか、周期毎の粒子の変位の二乗値ｘ２の平均値（図中、●）に対して直線をフィッティングが為されてよい。）。また、それぞれの粒子の変位ｘについて、
Ｄ＝ｘ２／（２ｋ・ｔcycle）      …（１４）
を算出し、算出されたＤの平均値をその発光粒子の拡散係数としてもよい。
【００５６】
かくして、上記の本発明の方法によれば、光検出領域により試料溶液中にて走査して発光粒子を個別に検出する走査分子計数法に於いて、発光粒子の拡散係数を“測定”することが可能となる。既に述べた如く、拡散係数は、粒子の大きさや形状を反映した物理量であるので、本発明によれば、任意の観測したい粒子に発光標識を付与することによって発光粒子とし、かかる発光粒子の拡散係数を測定することによって、観測したい粒子の大きさ、構造又はそれらの変化、或いは、種々の分子間相互作用に関する情報を得ることが可能となる。特に、本発明に於いては、光検出領域の移動周期を調整することにより、測定可能な拡散係数の大きさが可変となるので、比較的広範囲の種類の粒子の拡散係数を測定可能であることが期待される。実際の測定に於いては、光検出領域の移動周期は、観測対象粒子の周期的な信号が得られるよう予備実験を通じて、適切な値に調整されてよい。
【００５７】
上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
【実施例１】
【００５８】
発光粒子の拡散係数の測定
本発明の方法により発光粒子の拡散係数が測定されることを検証した。【００５９】
試料溶液として、ＳＹＴＯＸ  Ｏｒａｎｇｅ（インビトロジェン社、Cat.No.S-11368）を１０ｎＭにて含むリン酸緩衝液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む）中に、観測対象粒子として、プラスミド（ｐＢＲ３２２、タカラバイオ株式会社、Cat.No.3035）を、その濃度が１ｐＭとなるように溶解した溶液を調製した。なお、ＳＹＴＯＸ  Ｏｒａｎｇｅは、ＤＮＡ（プラスミド）に結合すると、蛍光強度が約５００倍増大する蛍光色素である。光の測定に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の「（２）試料溶液の光強度の測定」にて説明した態様に従って、上記の試料溶液について、時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）を取得した。その際、励起光は、６３３ｎｍのレーザー光を用い、バンドパスフィルターを用いて、６６０−７１０ｎｍの波長帯域の光を測定し、時系列光強度データを生成した。試料溶液中に於ける光検出領域は、１０ｍ秒の移動周期及び１５ｍｍ／秒の移動速度にて、円形（半径約２３．９μｍ）の経路を循環させた。また、ＢＩＮ  ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は、２秒間とした。光強度の測定後、上記の「（３）（ｉ）発光粒子に対応する信号の検出」に記載された処理手順に従って、試料溶液について取得された時系列光強度データにスムージング処理を施し、スムージングされたデータに於いて、パルス信号の始点及び終点を決定した後、各パルス信号にガウス関数を最小二乗法によりフィッティングして、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、パルス幅（半値全幅）、相関係数を決定した。そして、下記の条件:
２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
ピーク強度＞１．０［ｐｃ／１０μｓ］        …（Ａ）
相関係数＞０．９５
を満たすパルス信号のみを発光粒子に対応する信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないパルス信号はノイズとして無視した。【００６０】
図８（Ａ）は、上記の２秒間の測定により得られた光強度データのうちの１．５〜１．６秒に於けるデータに於いて、（光検出領域の移動周期である）約１０ｍ秒にて周期的に出現した発光粒子の光を表す信号１〜５の例を示している。いずれの信号も、時間方向について拡大した図を観察すると、図８（Ｂ）に示されている如く、概ね、釣鐘状のパルス状の信号であった。上記の各信号のピーク時刻は、以下の通りであった（単位は、ｍ秒）。
信号１      １５１０．７４１
信号２      １５２０．７２６
信号３      １５３０．７３８
信号４      １５４０．７６７
信号５      １５５０．８２５
これらの一連の信号の周期は、光検出領域の移動周期に略等しく、同一の発光粒子の信号であると考えられる。そこで、上記の信号のピーク時刻を用いて、「（iii）発光粒子の変位の算出」に記載されている要領にて、５つの信号のうちの二つの信号の組合せの全てについて、式（１３）により、信号の発生時間の間隔に於ける移動周期に相当する時間（周期数×移動周期）からのずれ時間Δｔを算出し、更に、式（４）により発光粒子の変位ｘを算出した。図８（Ｃ）は、かくして算出された変位ｘの二乗値（ｘ２）を時間（周期数×移動周期）に対してプロットした図である（各点は、各時間に於ける変位ｘの二乗値の平均値である。）。図から理解される如く、変位ｘの二乗値ｘ２の平均値は、時間に対して略比例した。このことは、変位ｘの二乗値ｘ２の平均値と時間との間に式（５）にて表される関係が成立しており、上記の信号の発生時間の間隔に於ける移動周期に相当する時間からのずれ時間Δｔに基づいて、ブラウン運動による発光粒子の変位ｘが算定できることを示している。なお、図８（Ｃ）のプロットに対して、最小二乗法により直線をフィッティングして得られた直線の傾き（＝２Ｄ）から得られた拡散係数Ｄは、３．８９×１０−１１［ｍ２／ｓ］であった。【００６１】
更に、上記の２秒間の測定により得られた光強度データの全体（図９）に於ける発光粒子の信号から、同一の発光粒子に対応する信号の組の全てを別々に抽出し、発光粒子毎に拡散係数を算定した。信号の抽出に於いては、「（ii）同一の発光粒子の信号の抽出」に於いて述べた如く、光強度データ上で、最初に一つの発光粒子の信号を選択した後、その選択された信号のピーク発生時刻から光検出領域の移動周期（ｔcycle）が経過する時間を中心として、式（２）で与えられる時間ΔＴの範囲内に存在する信号を最初に選択された信号と同一の発光粒子の信号として選択し、更に、新たに選択された信号のピーク発生時刻から光検出領域の移動周期（ｔcycle）が経過する時間を中心として、式（２）で与えられる時間ΔＴの範囲内に存在する信号を選択する処理を繰り返して、一群の信号を抽出した。次いで、前の信号群に選択されなかった一つの信号を基準として、上記の如く一つの周期的な信号の群を抽出する処理を繰り返して、一つの時系列光強度データ上にて、複数の信号群を抽出した。図９の例では、式（２）で与えられる時間ΔＴは、ΔＴ＝５３μ秒に設定した（ｄ＝０．８μｍ、ｖ＝１５ｍｍ／秒を用いて演算。）。その結果、図９の光強度データ上で発光粒子の信号の総数は、７１８８個であったところ、光検出領域の移動周期毎に２回以上周期的に発生した信号の組の数は、１７０８組であった（周期的に発生した信号の総数は、４１５６個であった。）。かかる信号の組の数は、発光粒子の数に対応するので、本実施例の場合、２秒間の測定による一つの光強度データに於いて、１７０８個の発光粒子の拡散係数の値が得られることとなる。かくして、検出された１７０８組の信号群の各々について、式（１３）に従って、信号の発生時間の間隔に於ける移動周期に相当する時間からのずれ時間Δｔを算出した後、式（４）に従ってΔｔから算出される変位ｘの二乗値ｘ２と光検出領域の移動時間（周回数×移動周期）とから、式（５）の関係を用いて、拡散係数を算出したところ、拡散係数は、平均９．９×１０−１２［ｍ２／ｓ］であった。【００６２】
上記の観測対象粒子（プラスミドｐｂｒ３２２）を１０ｎＭにて含む溶液についてＦＣＳによる測定（１分子蛍光測定装置ＭＦ−２０を使用）を行って得られた観測対象粒子の拡散係数は、４．０×１０−１２［ｍ２／ｓ］であった。また、観測対象粒子の比容を１．０ｃｍ３／ｇとして、観測対象粒子が球状であると仮定した場合に、ストークス・アインシュタインの式（Ｄ＝κＢＴ／６πηｒ）より、理論的に算定される拡散係数は、２．２×１０−１１［ｍ２／ｓ］となり、観測対象粒子が棒状であると仮定した場合（直径４ｎｍ、長さ６８０ｎｍと仮定）の理論的に算定される拡散係数は、４．２×１０−１２［ｍ２／ｓ］となる（非特許文献６の式（８）による補正を用いた。）。かくして、上記の本実施例に於ける拡散係数の結果値は、ＦＣＳによる方法及び理論値とオーダーが略一致しており、このことは、本発明の方法により、粒子の拡散係数の測定が可能であることを示している。【００６３】
かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、上記の本発明の方法によれば、走査分子計数法に於いて発光粒子の拡散係数の測定が可能となる。特に、本発明の方法は、光強度データ上に於ける周期的に発生する発光粒子の信号を個別に検出して、その信号の発生時刻に基づいて拡散係数を算出するよう構成されているので、本発明の方法によれば、試料溶液中の発光粒子濃度が、ＦＣＳ等の光分析技術で要求される濃度域よりも低くても、発光粒子の拡散係数の測定が可能であり、かかる特徴は、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合に有利であろう。また、本発明の方法では、拡散係数が一次元の光強度データ上に於ける周期的に発生する発光粒子の信号の発生時刻に基づいて算出されるので、演算負荷は比較的低く、一つの発光粒子の拡散係数の算出に要する演算量又は時間は、ＳＭＴ等の画像処理を用いる方法に比して軽減されることが期待される。【００６４】
なお、上記に於いては、走査分子計数法を用いて拡散係数を測定する例について詳細に説明されているが、信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間に基づいて拡散係数以外の拡散特性値が算出可能であることは理解されるべきであり、そのような場合も本発明の範囲に属する。例えば、「信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間」に基づいて算出される時間に対する粒子の変位の二乗値のプロットの傾き、並進拡散時間が算出され、粒子の大きさ又は構造変化や分子間相互作用の評価に用いられても良い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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