(57)【要約】  核酸サンプルにおいて、野生型核酸群に微量に混在する変異型核酸を検出するにあたり、迅速且つ簡便に、高い特異性と感度を両立させた方法を提供する。  本発明方法では、標的部位を有する核酸と、標的部位に対して相補的な配列を有する光連結性核酸類を含むクランププローブとを共存させ、光照射することによって該標的部位を有する核酸と該クランププローブを光連結させ、核酸増幅法による標的部位を含む検出領域の増幅を抑制する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的部位を有する核酸と、標的部位に対して相補的な配列を有する光連結性核酸類を含むクランププローブとを共存させ、光照射することによって該標的部位を有する核酸と該クランププローブを光連結させ、核酸増幅法による標的部位を含む検出領域の増幅を抑制する方法。
【請求項２】
（ａ）野生型核酸の配列を有する標的部位に対して相補的な配列を有する光連結性核酸類を含むクランププローブと、核酸サンプルとを共存させ、クランププローブと標的部位を有する野生型核酸分子とを、特異的にハイブリッド形成させる工程、
（ｂ）ハイブリッド形成したクランププローブと標的核酸分子に、光照射を行って、光連結させる工程、
（ｃ）前記工程（ａ）、（ｂ）の反応産物を核酸増幅反応に供する工程、
（ｄ）前記増幅産物を解析する工程
を含む、変異型核酸の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異型核酸の有無を検出する変異型核酸検出方法。
【請求項３】
（ａ）野生型核酸の配列を有する標的部位に対して相補的な配列を有する光連結性核酸類を含むクランププローブと、核酸サンプルとを共存させ、クランププローブと標的部位を有する野生型核酸分子とを、特異的にハイブリッド形成させる工程、
（ｂ）ハイブリッド形成したクランププローブと標的核酸分子に、光照射を行って、光連結させる工程、
（ｃ）前記工程（ａ）、（ｂ）を核酸増幅反応中に行う工程、
（ｄ）前記増幅産物を解析する工程を
含む、変異型核酸の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異型核酸の有無を検出する変異型核酸検出方法。
【請求項４】
前記核酸増幅法がＰＣＲ法である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸増幅法がリアルタイムＰＣＲ法である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記クランププローブが、標的核酸分子のセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖に相補的な配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記クランププローブの鎖長が７〜３０である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記光照射が、３５０〜３８０ｎｍの範囲の波長によって行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記光照射が、通常の相補鎖同士が結合および解離する温度サイクルにおいて相補鎖同士が結合できる温度において１回以上行われる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記光照射が、３５０〜３８０ｎｍの範囲の波長の光照射機能を付与した核酸増幅装置によって行われる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
標的部位に対して相補的な配列を有する光連結性核酸類を含むクランププローブと、標的部位を含む検出領域を増幅するプライマーとを含む、遺伝子増幅法による標的部位を含む検出領域の増幅を抑制するキット。
【請求項１２】
野生型核酸の配列を有する標的部位に対して相補的な配列を有する光連結性核酸類を含むクランププローブと、標的部位を含む検出領域を増幅するプライマーとを含む、変異型核酸の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異型核酸の有無を検出する変異型核酸検出キット。
【請求項１３】
３５０〜３８０ｎｍの範囲の波長の光照射機能を有する核酸増幅装置。
【請求項１４】
（ａ）標的部位に対して相補的な配列を有する光連結性核酸類を含むクランププローブと、核酸サンプルとを共存させ、クランププローブと標的部位を有する核酸分子とを、特異的にハイブリッド形成させる工程、
（ｂ）ハイブリッド形成したクランププローブと標的核酸分子に、光照射を行って、光連結させる工程、
（ｃ）前記工程（ａ）、（ｂ）の反応産物を核酸増幅反応に供する工程、
を含む、３５０〜３８０ｎｍの範囲の波長の光照射機能を有する核酸増幅装置。
【請求項１５】
（ａ）標的部位に対して相補的な配列を有する光連結性核酸類を含むクランププローブと、核酸サンプルとを共存させ、クランププローブと標的部位を有する核酸分子とを、特異的にハイブリッド形成させる工程、
（ｂ）ハイブリッド形成したクランププローブと標的核酸分子に、光照射を行って、光連結させる工程、
（ｃ）前記工程（ａ）、（ｂ）を核酸増幅反応中に行う工程、
を含む、３５０〜３８０ｎｍの範囲の波長の光照射機能を有する核酸増幅装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光連結性核酸類からなるクランププローブを用いて、例えば、野生型核酸に混在する変異型核酸を選択的に検出する方法、及びキット、更には、３５０〜３８０ｎｍの範囲の波長の光照射機能を有する核酸増幅装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム配列の解読完了後、解読した遺伝子情報を診断などの医療分野に活用しようとする動きが活発化している。ゲノム配列解読に続いて注目されているのは、遺伝子発現プロフィール解析や遺伝子中の一塩基置換（ＳＮＰｓ）の分析などである。様々な条件下で発現している遺伝子の発現量や遺伝子変異が調べられており、それによって遺伝子の機能や遺伝子と疾患あるいは医薬品感受性との関連が明らかにされつつあるため、蓄積された遺伝子に関する情報は、病気の診断だけでなく治療法の選択にも利用されている。【０００３】
中でも一塩基多型や変異は疾患の診断やリスク判定など、遺伝子検査における重要なターゲットとなっており、糖尿病、リウマチ、悪性腫瘍、精神疾患、心臓病と多岐に渡る分野で用いられている。この一塩基置換の検出方法として、これまでに様々な方法が開発されている。具体的にはInvader 法、Sniper 法、TaqMan PCR 法、Hybridization Probe 法、SNPIT法、Pyrominisequencing 法、Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC) 法、MALDI-TOF/MS 法、NanoChip 法などが迅速且つハイスループットで解析する方法として挙げられる。【０００４】
悪性腫瘍の分野では、体内の特定の分子を狙い撃ちしてその機能を抑える分子標的治療薬の開発が盛んに行われており、治療法の選択に際して分子標的治療薬の適用を決定する上で、一塩基置換の検出が重要な検査として位置づけられている。例えば、抗癌剤の使用前にＥＧＦＲ遺伝子やＫＲＡＳ遺伝子の変異解析検査を実施することが推奨されている。それは、変異の有無により薬剤効果に相違があるため、変異を考慮して投与することが指導されているためである。また、このような変異の有無を事前に調べることで、薬剤の有効性よりも重篤な副作用を起こす危険性が大きく、投薬効果の低い患者を選別する狙いもある。このような理由により悪性腫瘍の分野では、特に一塩基置換の検出が重要な検査とされている。【０００５】
しかし悪性腫瘍のような後発変異の検出においては、検体材料の多くを占める正常細胞に由来する野生型の核酸分子がバックグランドとなることから、上記のような解析手法では一塩基置換等の変異を検出できない場合が多い。この問題を解決する為に、Scorpion-ARMS 法やPNA-LNA PCR Clamping 法（特許文献１）が開発されている。【０００６】
Scorpion-ARMS 法とは、変異点がプライマーの３’末端近傍に位置するように変異型の配列に合わせて調製した当該プライマーと、他方のプライマーの組合せにより変異型分子を選択的に増幅した産物を、Scorpion法という蛍光検出法によって解析する方法である。PNA-LNA PCR Clamping 法とは、変異点上に設計した野生型配列と相補的なクランププライマーにより野生型分子を選択的にブロックし、変異型ＬＮＡを蛍光検出プローブとし変異型分子を選択的に増幅検出する方法である。【０００７】
これらの方法は、共に、ハイブリッド形成したプライマーやプローブと鋳型分子の平衡系における熱的安定性の差を利用しているものであって、プライマーやプローブと鋳型分子が完全に相補的である場合のハイブリッド形成も、プライマーやプローブと鋳型分子が１ないし数塩基、相補的でない場合の不完全なハイブリッド形成もその違いは熱的安定性の違いに過ぎない。そのために、両者を区別する適切な条件は目的の塩基配列によって異なり、さらに適切な条件下でもなお、熱的安定性を変化させる条件は両者に均等に作用する。すなわち、平衡系におけるハイブリッド形成の熱的安定性の差のみを、両者の区別の原理として使用する限りは、特異性と感度のバランスで妥協した温度条件を設定せざるを得ず、尚且つ、設定可能な温度条件のレンジ幅は極めて狭い場合が多く、その為、遺伝子配列によってはプローブやプライマーの設計が困難な場合があった。【０００８】
このような検出技術の状況から、現在の悪性腫瘍における変異検出検査では検査材料の採取に厳密な制限が設けられている。具体的には癌組織から病理標本を作製し、染色標本から腫瘍部位を同定し、連続切片の未染色標本から腫瘍部のみを集めることが推奨されている（大腸がん患者におけるＫＲＡＳ遺伝子変異の測定に関するガイダンス）。しかし、腫瘍部位の同定には組織形態学の専門的な知識が必要で操作が煩雑であり、且つコスト面での負担が大きいものとなっていた。【０００９】
このことから、検査の要件として検査材料の採取や標的遺伝子の塩基配列による制限を然程、受けず、特異性と感度を両立した検出方法の確立が求められていた。【００１０】
特異性と感度を両立した検出方法として、光連結性核酸類を利用した変異遺伝子の検出法が開発されている。例えば、特許文献２では、特定の塩基配列の標的核酸を、相補鎖とのハイブリッド形成原理としつつ、高い特異性と感度を両立させて検出する方法が記載されている。これは、標的核酸に相補な光連結性核酸類と、該光連結性核酸類と光連結可能な塩基部分を３’末端又は５’末端に有する被光連結性核酸類からなり、その核酸類のいずれか一方が標識部分を有し、残る一方が基材に固定化された方法による。この方法によって、同鎖上にある光連結性核酸類と被光連結性核酸類が、光連結を利用して、完全なハイブリッド形成を行った場合のみ特異的に光連結させ、標識部分を有する核酸の分子を、基材に共有結合的に固定化することができ、相補的二重鎖の解離する条件での徹底的な洗浄が可能となり、高い特異性と感度（Ｓ／Ｎ比）を両立させることができた。【００１１】
しかし、検出感度には限界があり、この方法は、大量の標的核酸に含まれる変異の有無を検出する目的には使用できるが、大量の野生型核酸に混在する微量の変異型核酸の検出のためには、該微量の変異型核酸の存在量が検出感度以下である場合が多いので、使用できない。また、光連結性核酸類は、同鎖の被連結核酸と共有結合されてしまうため、検出したい標的核酸に含まれる変異を増幅することもできない。【００１２】
一方、特許文献３では、まず、ＰＣＲにより標的核酸を含む試料を増幅し、それに対して、特許文献２の方法を組み合わせたものであり、核酸サンプル中の１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出する方法である。変異型核酸の割合が微量であれば、ＰＣＲで増幅できたとしても、野生型核酸との含有割合は変わらず、試験管内で検出できる範囲の増幅では、変異型核酸が検出可能なまでに増幅することができない。この方法は、大量の標的核酸に含まれる変異の有無を検出する目的には使用できるが、大量の野生型核酸に混在する微量の変異型核酸の検出のためには使用できない。また、ＰＣＲにより標的核酸を含む試料を増幅するため、ある程度、変異型核酸の含有割合が高ければ、変異型核酸を検出できる可能性はあるが、工程数が多く、煩雑であり、迅速な検査結果を求められる臨床現場の要望にこたえることは出来ない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特許第４２１６２６６号明細書
【特許文献２】ＷＯ２００７／０５８３２６号公報
【特許文献３】特開２００９−２１３４４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、核酸サンプルにおいて、野生型核酸群に微量に混在する変異型核酸を検出するにあたり、迅速且つ簡便に、高い特異性と感度を両立させた方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、野生型核酸の配列を有する標的部位に対して相補的な配列を有する光連結性核酸類を含むクランププローブを、標的部位の配列を有する野生型核酸に対して光連結させることによって、選択的に野生型核酸の増幅を阻止できることを見出した。すなわち、光連結性クランププローブを用いることで、完全なハイブリッド形成を行った場合にのみ特異的に光連結させ、核酸増幅反応における温度サイクルのどの工程においても連結を維持する、すなわち、非平衡状態にすることで、標的分子の核酸増幅反応における鋳型としての役割を阻止することができる。このことにより、野生型核酸の高いクランピング（抑制）効果と変異型核酸の選択的（特異的）核酸増幅の両立を可能にした。【００１６】
本発明は、
［１］標的部位を有する核酸と、標的部位に対して相補的な配列を有する光連結性核酸類を含むクランププローブとを共存させ、光照射することによって該標的部位を有する核酸と該クランププローブを光連結させ、核酸増幅法による標的部位を含む検出領域の増幅を抑制する方法、
［２］（ａ）野生型核酸の配列を有する標的部位に対して相補的な配列を有する光連結性核酸類を含むクランププローブと、核酸サンプルとを共存させ、クランププローブと標的部位を有する野生型核酸分子とを、特異的にハイブリッド形成させる工程、
（ｂ）ハイブリッド形成したクランププローブと標的核酸分子に、光照射を行って、光連結させる工程、
（ｃ）前記工程（ａ）、（ｂ）の反応産物を核酸増幅反応に供する工程、
（ｄ）前記増幅産物を解析する工程
を含む、変異型核酸の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異型核酸の有無を検出する変異型核酸検出方法、
［３］（ａ）野生型核酸の配列を有する標的部位に対して相補的な配列を有する光連結性核酸類を含むクランププローブと、核酸サンプルとを共存させ、クランププローブと標的部位を有する野生型核酸分子とを、特異的にハイブリッド形成させる工程、
（ｂ）ハイブリッド形成したクランププローブと標的核酸分子に、光照射を行って、光連結させる工程、
（ｃ）前記工程（ａ）、（ｂ）を核酸増幅反応中に行う工程、
（ｄ）前記増幅産物を解析する工程
を含む、変異型核酸の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異型核酸の有無を検出する変異型核酸検出方法、
［４］前記核酸増幅法がＰＣＲ法である、［１］〜［３］のいずれかの方法、
［５］前記核酸増幅法がリアルタイムＰＣＲ法である、［１］〜［３］のいずれかの方法、
［６］前記クランププローブが、標的核酸分子のセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖に相補的な配列を有する、［１］〜［３］のいずれかの方法、
［７］前記クランププローブの鎖長が７〜３０である、［１］〜［６］のいずれかの方法、
［８］前記光照射が、３５０〜３８０ｎｍの範囲の波長によって行われる、［１］〜［７］のいずれかの方法、
［９］前記光照射が、通常の相補鎖同士が結合および解離する温度サイクルにおいて相補鎖同士が結合できる温度において１回以上行われる、［１］〜［８］のいずれかの方法、
［１０］前記光照射が、３５０〜３８０ｎｍの範囲の波長の光照射機能を付与した核酸増幅装置によって行われる、［１］〜［９］のいずれかの方法、
［１１］標的部位に対して相補的な配列を有する光連結性核酸類を含むクランププローブと、標的部位を含む検出領域を増幅するプライマーとを含む、遺伝子増幅法による標的部位を含む検出領域の増幅を抑制するキット、
［１２］野生型核酸の配列を有する標的部位に対して相補的な配列を有する光連結性核酸類を含むクランププローブと、標的部位を含む検出領域を増幅するプライマーとを含む、変異型核酸の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異型核酸の有無を検出する変異型核酸検出キット、
［１３］３５０〜３８０ｎｍの範囲の波長の光照射機能を有する核酸増幅装置、
［１４］（ａ）標的部位に対して相補的な配列を有する光連結性核酸類を含むクランププローブと、核酸サンプルとを共存させ、クランププローブと標的部位を有する核酸分子とを、特異的にハイブリッド形成させる工程、
（ｂ）ハイブリッド形成したクランププローブと標的核酸分子に、光照射を行って、光連結させる工程、
（ｃ）前記工程（ａ）、（ｂ）の反応産物を核酸増幅反応に供する工程、
を含む、３５０〜３８０ｎｍの範囲の波長の光照射機能を有する核酸増幅装置、
［１５］（ａ）標的部位に対して相補的な配列を有する光連結性核酸類を含むクランププローブと、核酸サンプルとを共存させ、クランププローブと標的部位を有する核酸分子とを、特異的にハイブリッド形成させる工程、
（ｂ）ハイブリッド形成したクランププローブと標的核酸分子に、光照射を行って、光連結させる工程、
（ｃ）前記工程（ａ）、（ｂ）を核酸増幅反応中に行う工程、
を含む、３５０〜３８０ｎｍの範囲の波長の光照射機能を有する核酸増幅装置
に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、高い感度と特異性を両立させて、核酸サンプルに混在する変異型核酸の有無を迅速に、また簡便に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】３−シアノビニルカルバゾール−１’−β−デオキシリボシド（ＣＮＶＫ）の構造式である。
【図２】実施例１で実施した、光連結反応による野生型遺伝子のＰＣＲ増幅抑制の有無をライトサイクラーを用いて確認した結果を示すグラフである。
【図３】実施例２で実施した、光連結反応による変異型遺伝子のＰＣＲ増幅抑制の有無をライトサイクラーを用いて確認した結果を示すグラフである。
【図４】実施例４で実施した、ＰＣＲ増幅反応時に光連結反応を行った場合の変異型遺伝子の選択的増幅の有無をアガロースゲル電気泳動により確認した結果を示す図である。レーン１はマーカー（φX174 HaeIII digest）であり、レーン２は野生型であり、レーン３は変異型である。
【図５】実施例５で実施した、対照として、ＰＣＲ増幅反応時に光連結反応を行わなかった場合の変異型遺伝子の検出感度をライトサイクラーを用いて確認した結果を示すグラフである。
【図６】実施例５で実施した、比較例として、（ＰＣＲ増幅反応時に光連結反応を行わず）PNA-LNA clamp PCR反応による変異型遺伝子の検出感度をライトサイクラーを用いて確認した結果を示すグラフである。
【図７】実施例５で実施した、ＰＣＲ増幅反応時に光連結反応を行った場合の変異型遺伝子の検出感度をライトサイクラーを用いて確認した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸、遺伝子、遺伝子発現、コード、相補、鋳型、プロモーター、プローブ、プライマー、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等の用語の定義に関しては、現在、分子生物学、遺伝学、遺伝子工学等で広く一般的に使用されている用語と同じ意味である。
【００２０】
本発明において、核酸とは、ＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいは、後述のヌクレオチドアナログであれば特に限定されるものではなく、天然のものであってもよく、合成されたものであってもよい。天然の核酸として、例えば、生物から回収されたゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ等がある。また、合成された核酸として、β−シアノエチルホスフォロアミダイト法、ＤＮＡ固相合成法等の公知の化学的合成法により合成されたＤＮＡや、ＰＣＲ等の公知の核酸増幅法により合成された核酸、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡ等がある。
【００２１】
本発明において「野生型核酸」とは、変異を生じる前の核酸を意味するものとし、その典型的な例は、変異を生じておらず、本来の正常な機能を有する遺伝情報を含む核酸である。ここで言う遺伝情報とは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ等の情報をコードする転写領域だけでなく、プロモーター等の遺伝子発現上必要な調節領域を含むものとする。
【００２２】
本発明において「変異型核酸」とは、変異を生じた核酸である。「変異」とはＤＮＡやＲＮＡ等の核酸配列の変化であり、遺伝学等で使用される塩基置換、挿入、欠失、逆位、重複、転座等が該当する。当該変異型核酸において、変異の存在する領域は転写領域だけでなく、プロモーター等の遺伝子発現上必要な調節領域を含むものとする。なお、変異により変異型核酸が機能上の変化を有する必要はない。また、「変異」には、先天的なものも後天的なものも含まれる。
【００２３】
本発明において「標的部位」とは、核酸配列において光連結性核酸類からなるクランププローブの標的となる部位であって、当該クランププローブの全部または一部とハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列を有する部位のことである。
【００２４】
通常の実施様態において「標的部位」とは変異型核酸において変異が見られる塩基が存在する部位であり、野生型核酸を含め、本発明において検出の標的とする部位である。例えば、塩基置換があった場合には野生型核酸、変異型核酸共に当該塩基置換した塩基が該当する。また挿入があった場合には変異型核酸においては挿入された塩基が該当し、野生型遺伝子においては変異型核酸で塩基が挿入された部位が該当する。また欠失があった場合には変異型核酸においては欠失によって塩基が失われた部位が該当し、野生型核酸においては変異型核酸で失われた塩基が該当する。当該標的部位の配列は、遺伝情報をコードする配列を有する鎖（以下センス鎖とする）を示すものであってもよいし、センス鎖に対して相補的な配列を有する鎖（以下アンチセンス鎖とする）を示すものであってもよい。
【００２５】
本発明において「核酸増幅反応」とは、公知のポリメラーゼ反応を利用した鋳型核酸の増幅反応を言う。また、「核酸増幅装置」とは、「核酸増幅反応」が行える装置である。
【００２６】
本発明の増幅抑制方法は、標的部位を含む検出領域を増幅可能なプライマーを用いて、通常の核酸増幅法を実施する中で、前記標的部位の変異に基づいて、１種類の核酸（例えば、野生型核酸）の増幅を抑制する一方、それ以外の核酸（例えば、変異型核酸）のみを選択的に増幅させる方法である。
本発明では、野生型核酸または変異型核酸のいずれを増幅抑制の対象とするかは、その目的に応じて適宜選択することができ、特に限定されるものではないが、例えば、核酸サンプル中の存在比に大きな偏りがある場合、大量に存在する核酸（例えば、野生型核酸）の増幅を抑制し、微量に存在する核酸（例えば、変異型核酸）のみを選択的に増幅することにより、微量に存在する核酸の有無を検出することができる。
【００２７】
以下、本発明方法について、本発明の一態様である、変異型核酸の有無を検出する変異型核酸検出方法に基づいて主に説明するが、本発明方法の本質は、前述のとおり、標的部位を含む検出領域を増幅可能なプライマーを用いて、通常の核酸増幅法を実施する中で、前記標的部位の変異に基づいて、１種類の核酸に関してのみ、その増幅を抑制できる点にある。
【００２８】
本発明方法の第１の実施形態としては、
（ａ）野生型核酸の配列を有する標的部位に対して相補的な配列を有する光連結性核酸類を含むクランププローブと、核酸サンプルとを共存させ、クランププローブと標的部位を有する野生型核酸分子とを、特異的にハイブリッド形成させる工程、
（ｂ）ハイブリッド形成したクランププローブと標的核酸分子に、光照射を行って、光連結させる工程、
（ｃ）前記工程（ａ）、（ｂ）の反応産物を核酸増幅反応に供する工程、
（ｄ）前記増幅産物を解析する工程
を含む、変異型核酸の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異型核酸の有無を検出する変異型核酸検出方法にある。
【００２９】
本発明方法の第２の実施形態としては、
（ａ）野生型核酸の配列を有する標的部位に対して相補的な配列を有する光連結性核酸類を含むクランププローブと、核酸サンプルとを共存させ、クランププローブと標的部位を有する野生型核酸分子とを、特異的にハイブリッド形成させる工程、
（ｂ）ハイブリッド形成したクランププローブと標的核酸分子に、光照射を行って、光連結させる工程、
（ｃ）前記工程（ａ）、（ｂ）を核酸増幅反応中に行う工程、
（ｄ）前記増幅産物を解析する工程
を含む、変異型核酸の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異型核酸の有無を検出する変異型核酸検出方法にある。
【００３０】
このような工程によって、野生型核酸の増幅を抑制し、選択的に変異型核酸を増幅することで高感度に変異型核酸を検出することができるものとなっている。
以下、工程ごとに説明する。なお、工程（ｃ）以外は、第１の実施形態と第２の実施形態は同様であるので、以下、主に第１の実施形態に沿って説明を行った後、第２の実施形態について、第１の実施形態との異なる点を挙げて説明する。
【００３１】
工程（ａ）において、野生型核酸の配列を有する標的部位に対して相補的な配列を有する光連結性核酸類を含むクランププローブと、核酸サンプルとを共存させ、クランププ
ローブと野生型核酸配列を有する標的核酸分子とを、特異的にハイブリッド形成させる。この反応はハイブリッド形成に適した通常の条件（温度、ｐＨ、塩濃度、緩衝液等）で行うことができるが、反応液中にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やホルムアミド等を加えることでクランププローブと野生型核酸との特異的なハイブリッド形成を促すこともできる。但し、その後または同時に行われる核酸増幅反応を阻害するような物質の混入を避けることが好ましい。特に核酸増幅反応と同時に行う場合は核酸増幅反応に適した反応組成であることが好ましい。
【００３２】
工程（ａ）に用いる「核酸サンプル」とは、核酸を含有するサンプルであって、標的部位を含む核酸を含有する可能性のあるサンプルであれば、特に限定されるものではないが、好ましくは、標的部位を有する野生型核酸またはその変異型核酸の少なくとも一方を含有する可能性のあるサンプル、更に好ましくは、その両方を含有する可能性のあるサンプルである。例えば、血液や組織等を試料として試料中の全細胞から得られるゲノムＤＮＡやＲＮＡが該当する。この核酸の抽出は、フェノール／クロロホルム法等の公知の手法により行うことができる。このとき、検出の対象である標的核酸における変異型の存在率は問わない。例えば、１００％が野生型であってもよいし、５０％が野生型で残り５０％が変異型であってもよい。また、当該核酸サンプルは、細胞から得られるゲノムＤＮＡであってもよいし、細胞から調製されたｍＲＮＡであってもよいし、ｍＲＮＡを鋳型にして逆転写反応を行って得られるｃＤＮＡであってもよい。さらにはクローン化された多数の遺伝子を人工的に混合したものであってもよいし、核酸増幅反応によって人工的に増幅させた核酸、またはそれらの混合物であってもよい。
【００３３】
本発明に使用できる光連結性核酸類としては、標的部位の核酸あるいは標的部位の近傍の核酸に光連結によりクロスリンク可能であれば良い。例えば、ソラレン誘導体（Chang, E. et al. Biochemistry 1991, 30, 8283）やアミノプリン誘導体（特開2001-206896）や４−チオウラシル等が使用できる。前記ソラレン誘導体は５’−ＡＴ−３’である塩基配列のチミン特異的に反応する性質があり、また、アミノプリン誘導体は配列依存性はないもののシチジン特異的であることから、適用範囲に一定の制約があるため、そのような制限のない下記の光連結性核酸類がより好ましい。
【００３４】
使用が好ましい第１の光連結性核酸類として、塩基部分として、式Ｉ：
【化１】
2012033190.tif 000002
（式中、Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素である）
で表される基を有する核酸類（Org. Lett., Vol. 10, No. 15, 2008、特開2009-254279）を挙げることができる。結合される核酸がＤＮＡの場合、この式Ｉで表される置換カルバゾリル基は、式Ｉ(a)：
【化２】
2012033190.tif 000003
で示すように、２−デオキシリボースの１位の炭素原子（Ｃ）に、β位で結合している。具体的な例としては、３−シアノビニルカルバゾール−１’−β−デオキシリボシド〔3-cyanovinylcarbazole-1’-β-deoxyriboside (ＣＮＶＫ) 〕が挙げられる。
【００３５】
また、使用が好ましい第２の光連結性核酸類として、式II：
【化３】
2012033190.tif 000004
（式中、Ｒは、−ＣＮ、−ＣＯＮＲ１Ｒ２、または−ＣＯＯＲ３であって、かかるＲ１〜Ｒ３は、それぞれ独立して、水素原子またはアルキル基ＣｎＨ２ｎ＋１（ｎ≧１）である。ここでｎの上限は特に限定されるものではないが、例えば、ｎは１〜７、好ましくは１〜５であることができる）
で表される基を有する核酸類（Organic & Biomolecular Chemistry 2007, 5, 2583、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15 (2005) 1299-1301、特開2005-348645）を挙げることができる。結合される核酸がＤＮＡの場合、この式IIで表される置換フェノキシ基は、式II(a)：
【化４】
2012033190.tif 000005
で示すように、２−デオキシリボースの１位の炭素原子（Ｃ）に、α位で結合している。Ｒが−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＭｅであるものが好ましく、特には、−ＣＯＯＨあるいは−ＣＯＯＭｅであるものが好ましい。
【００３６】
これらの式Ｉや式IIで表される基を有することで光連結性を備えた核酸類となる。この光連結性の付与はＤＮＡであってもＲＮＡであっても、さらにはヌクレオチドアナログであっても可能である。これらの光連結性核酸類は通常の核酸の製造方法に準じて製造することができる。
【００３７】
工程（ａ）に用いられる「クランププローブ」とは、標的部位に対して相補的な配列を有し、かつ、前記光連結性核酸類を含む核酸類プローブをいう。当該クランププローブは前記の式ＩおよびIIで表される基を有した光連結性核酸類を含んでいればよいが、式Ｉで表される基を有した光連結性核酸類を含んでいることが好ましい。また、当該クランププローブは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもさらにはヌクレオチドアナログであってもよい。本発明の変異型核酸検出方法においては、当該クランププローブが有する光連結性核酸類が野生型核酸の標的部位に対して相補的な配列であることを特徴とする。当該クランププローブの塩基配列及び光連結性核酸類の位置や数は標的部位の一部、または全部と特異的にハイブリダイゼーションするものであれば、特に限定はされない。クランププローブの長さは、特異的なハイブリダイゼーションが可能であれば特に限定されるものではないが、例えば、７塩基から３０塩基であることが好ましい。
【００３８】
前記「ヌクレオチドアナログ」とは、非天然のヌクレオチドであり、天然のヌクレオチドであるデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）やリボヌクレオチド（ＲＮＡ）と同様の機能を有するものをいう。すなわち、ヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドと同様にリン酸ジエステル結合により鎖を形成することができ、かつ、ヌクレオチドアナログを用いて形成されたプライマーやプローブは、ヌクレオチドのみを用いて形成されたプライマーやプローブと同様に、ＰＣＲやハイブリダイゼーションに用いることができる。このようなヌクレオチドアナログとして、例えば、ＰＮＡ（ポリアミドヌクレオチド誘導体）、ＬＮＡ（ＢＮＡ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、及びこれらの複合体等がある。ここで、ＰＮＡは、ＤＮＡやＲＮＡのリン酸と５炭糖からなる主鎖をポリアミド鎖に置換したものである。また、ＬＮＡ（ＢＮＡ）は、リボヌクレオシドの２’部位の酸素原子と４’部位の炭素原子がメチレンを介して結合している２つの環状構造を持つ化合物である。
【００３９】
工程（ａ）に用いられるクランププローブは、センス鎖に対するもののみならず、アンチセンス鎖に対しても調製して用いることができる。特に工程（ａ）の核酸サンプル中の核酸が二本鎖ＤＮＡである場合、両鎖に対して調製したクランププローブを同時に使用し、両鎖の標的部位に光連結させることによって、後の工程（ｃ）において野生型核酸の核酸増幅抑制効果を増大することができる。センス鎖およびアンチセンス鎖に対するクランププローブは、お互いのクランププローブ同士が光連結を起こさない位置に光連結性核酸類を導入することが好ましい。
【００４０】
工程（ｂ）において、ハイブリッド形成したクランププローブと相補鎖の野生型核酸分子に対して光照射を行うことで光連結させる。この光連結は人工塩基部分の光反応によって光連結性核酸類分子と標的核酸分子との間に、分子間の共有結合が形成されて生じることから、分子間の架橋（クロスリンク）にあたるものである。このようにクロスリンクが形成された分子と分子は単なる熱的な安定性のみで会合しているのではないので、相補的二重鎖が解離する条件におかれた場合でも解離することなく結合している。
【００４１】
工程（ｂ）における光連結させる反応は、緩衝作用のある塩を含む反応溶液中で行うことができる。緩衝作用のある塩としてはカコジル酸塩、リン酸塩、トリス塩をあげることができる。緩衝作用のある塩の濃度は、５〜２５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲にあることが好ましい。また、アルカリ金属及び／またはアルカリ土類金属の塩を含むことが好ましい。アルカリ金属及び／またはアルカリ土類金属として塩化ナトリウム、及び塩化マグネシウムをあげることができる。さらに反応液中にＤＭＳＯやホルムアミド等の有機溶剤を加えることでクランププローブと野生型核酸との特異的な光結合反応を促すこともできる。但し、その後または同時に行われる核酸増幅反応を阻害するような物質の混入を避けることが好ましい。特に核酸増幅反応と同時に行う場合は核酸増幅反応に適した反応組成であることが好ましい。
【００４２】
工程（ｂ）における光照射は、一般に３５０〜３８０ｎｍの範囲、好ましくは３６６ｎｍの波長を含む光が好ましく、特に好ましくは３６６ｎｍの単波長のレーザー光である。好適な実施の様態において光照射による光反応は１秒〜数秒以内が好ましい。但し、容器および溶液の光透過性を考慮してさらに時間をかけて行うこともできる。
【００４３】
工程（ｂ）における光連結は、前記のごとく通常のハイブリッド形成において相補的二重鎖が解離する条件においても結合を維持できることから、通常の相補鎖同士が結合および解離する温度サイクルを設け、相補鎖同士が結合できる温度において光照射を繰り返すことによってクランププローブとクロスリンク（連結）した相補鎖の野生型核酸分子を蓄積することができる。
【００４４】
工程（ａ）、（ｂ）に用いられる核酸サンプルがｍＲＮＡ等のＲＮＡの場合、クランププローブと光連結反応を行った後に、ｃＤＮＡ合成をしてＰＣＲ等の増幅反応に供することもできるし、１ステップＰＣＲ等で遺伝子増幅することもできる。また、ｃＤＮＡ合成した後、インビトロトランスクリプション法によりＲＮＡ増幅することもできる。
【００４５】
工程（ａ）、（ｂ）に用いられる核酸サンプルがｃＤＮＡ等の一本鎖ＤＮＡの場合、クランププローブと光連結反応を行った後に、ＰＣＲ等の増幅反応に供することができるしインビトロトランスクリプション法によりＲＮＡ増幅することもできる。
【００４６】
工程（ａ）、（ｂ）に用いられる核酸サンプルが染色体ＤＮＡ等の二本鎖ＤＮＡの場合、該二本鎖ＤＮＡのハイブリダイズを熱変性や酸性条件などの変性条件で処理し、一本鎖ＤＮＡとしてから工程（ａ）を上記の一本鎖ＤＮＡの場合と同様に実施することができる。
【００４７】
工程（ｃ）において、光結合反応を施した核酸サンプルを鋳型とし、増幅プライマーを用いて核酸増幅法（例えば、ＰＣＲ）を行うことにより標的部位を含む検出領域を増幅する。工程（ｃ）で用いる増幅プライマーは、変異型核酸の標的部位を含む検出領域を増幅することのできるプライマーであり、それは同時に、クランクプローブが光連結される前の野生型核酸において、野生型核酸の標的部位を含む検出領域も増幅できるプライマーである。野生型配列を有する分子は光照射によってクランププローブとクロスリンク（連結）している為、架橋された塩基より３’末側への伸長反応が進まず増幅されない。一方、変異型配列を有する分子の大部分はクランププローブとクロスリンク（連結）していない為、伸長反応が起こり、その結果、選択的な核酸増幅が成される。
【００４８】
核酸増幅法がＰＣＲである場合、工程（ｃ）において用いられる増幅プライマーは、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列（増幅用ヌクレオチド配列）をＰＣＲにより増幅し得るプライマーであり、増幅用ヌクレオチド配列を挟む２種類のプライマーである。例えば、増幅用ヌクレオチド配列の上流端領域と相同的なヌクレオチド配列を有するフォワードプライマーと、増幅用ヌクレオチド配列の下流端領域と相補的なヌクレオチド配列を有するリバースプライマーとからなる２種類のプライマーであってもよい。なお、ＰＣＲにおいて用いられる該２種類のプライマーの各濃度は、ＰＣＲ産物として二本鎖核酸を得ることができる濃度比であれば特に限定されるものではないが、等濃度で用いることが好ましい。
【００４９】
ＰＣＲに用いられるこれらのプライマーは標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列の配列情報から常法により設計、合成することができる。
【００５０】
ＰＣＲに用いられるこれらのプライマーは、ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログからなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により連結したものである。プライマーの長さは、プライマーのＴｍ値、増幅ヌクレオチド配列の種類等を考慮して適宜決定することができるが、１０〜１００分子連結したものであることが好ましい。
【００５１】
ＰＣＲは、通常用いられる試薬を通常用いられる量で用いて、通常使用されるプロトコールに基づき、常法により行うことができる。なお、ＰＣＲに用いられるＤＮＡポリメラーゼは、通常ＰＣＲにおいて用いられるＤＮＡポリメラーゼであれば特に限定されるものではないが、耐熱性ポリメラーゼであることが好ましい。
【００５２】
光照射による標的分子とのクロスリンクによってポリメラーゼの伸長反応を阻害することから、クランププローブ自体にヌクレアーゼ活性に対する抵抗性は必要としない。従って、ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの使用も可能である。但し、プライマーとして機能しポリメラーゼの伸長反応が生じ得る核酸類をクランププローブに用いる場合は、ポリメラーゼによる伸長反応が起こる温度で標的分子から解離するようにＴｍ値を考慮するか、クランププローブの３’末端に伸長反応を阻害する物質を修飾することによって増幅プライマーとして機能しないようにすることが好ましい。
【００５３】
工程（ｄ）において、工程（ｃ）の増幅産物を解析する方法として、以下の公知の方法が挙げられる。例えば、工程（ｃ）で得られた増幅産物を使用する方法としては、該増幅産物に含まれる変異型核酸が既知の変異の場合は、マイクロアレイのような基板アッセイを利用して変異型核酸の有無を判定することができる。また、ＲＦＬＰ法を用いれば制限酵素による消化の有無によって変異型核酸の有無を判定することができる場合がある。あるいは、標的部位に未知の変異型核酸があると思われる場合は、検出領域の増幅産物について塩基配列を決定することで変異型核酸の有無を判定することができる。
【００５４】
一方、例えば、判定したい変異型核酸が既知変異である場合には、工程（ｃ）において公知のリアルタイムＰＣＲを行うことにより、変異型核酸の有無の判定もしくは定量も行うことができる。このように、工程（ｃ）と工程（ｄ）を同時に行うことにより、迅速且つ簡便に変異型核酸の有無を判定することができるので好ましい。リアルタイムＰＣＲにより、変異型核酸の増幅と判定を同時に実施する方法としては、特許文献１を参考にすることができる。
【００５５】
次に、第２の実施形態について、第１の実施形態との異なる点を挙げて説明する。
第１の実施形態と異なる点は、工程（ａ）及び工程（ｂ）を工程（ｃ）の核酸増幅反応中に行うことである。具体的には、例えばＰＣＲの際に、標的分子とクランププローブがハイブリッドを形成しうる温度条件時（いわゆる工程（ａ））に光を照射することで、標的核酸とクランププローブが有する光連結核酸類を結合させ（いわゆる工程（ｂ））、直接、選択的に変異型核酸の増幅を実施する。
光の照射は１回以上行なえばよいが、増幅サイクル毎に光照射を繰り返すことによって、より確実に野生型核酸の増幅を抑制することができるため、ＰＣＲのサイクル毎に繰り返し実施することが好ましい。全増幅サイクルで光を照射してもよいし、任意の増幅サイクルから照射を開始または終了してもよい。
【００５６】
工程（ｃ）におけるＰＣＲ反応の際にも、通常のＰＣＲ増幅反応に適した反応組成で実施できる。さらに変異型核酸の選択的増幅反応を促すために反応液中にＤＭＳＯやホルムアミド等、ハイブリダイズ条件に影響を与える物質を加えることも可能である。
【００５７】
本発明のキットとしては、野生型核酸の配列を有する標的部位に対して相補的な配列を有する光連結性核酸類を含むクランププローブと、標的部位を含む検出領域を増幅するプライマーとを含む、変異型核酸の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異型核酸の有無を検出するものである。更に、緩衝液や遺伝子増幅用のポリメラーゼ等を含むこともできる。
【００５８】
本発明の装置としては、３５０〜３８０ｎｍの範囲の波長の光照射機能を有する核酸増幅装置である。前記核酸増幅装置としては、本発明の反応を実施できるものであって、公知の核酸増幅機能を備えているものであれば良く、好ましくは、増幅した核酸を定量することができるリアルタイムＰＣＲ装置などを使用することができる。このような装置に、３５０〜３８０ｎｍの範囲の波長の光照射機能を備えれば良い。
【００５９】
本発明の装置は、好ましくは、本発明の第１の実施形態の工程（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）標的部位に対して相補的な配列を有する光連結性核酸類を含むクランププローブと、核酸サンプルとを共存させ、クランププローブと標的部位を有する核酸分子とを、特異的にハイブリッド形成させる工程、
（ｂ）ハイブリッド形成したクランププローブと標的核酸分子に、光照射を行って、光連結させる工程、
（ｃ）前記工程（ａ）、（ｂ）の反応産物を核酸増幅反応に供する工程、
を実施させることのできるプログラム、及び／又は、本発明の第２の実施形態の工程（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）標的部位に対して相補的な配列を有する光連結性核酸類を含むクランププローブと、核酸サンプルとを共存させ、クランププローブと標的部位を有する核酸分子とを、特異的にハイブリッド形成させる工程、
（ｂ）ハイブリッド形成したクランププローブと標的核酸分子に、光照射を行って、光連結させる工程、
（ｃ）前記工程（ａ）、（ｂ）を核酸増幅反応中に行う工程、
を実施させることのできるプログラムを含むことができる。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００６１】
《実施例１》
野生型遺伝子に対するＰＣＲ増幅抑制の検証
（材料と方法）
１．光連結性クランププローブの調製
ＫＲＡＳ遺伝子上の変異点Ｇｌｙ１２およびＧｌｙ１３を標的部位として、野生型配列を有する標的部位にハイブリダイゼーションするセンス鎖と相補的なクランププローブを設計した。同時にアンチセンス鎖に対するクランププローブも設計し、お互いのクランププローブ同士が光連結を起こさない位置に光応答性核酸である３−シアノビニルカルバゾール−１’−β−デオキシリボシド（ＣＮＶＫ）（特開2009-254279に記載の方法にて調製。北陸先端大科学技術大学院大学、マテリアルサイエンス研究科、藤本研究室より入手。）を導入して調製した。クランププローブの合成はファスマック社に委託した。これらクランププローブの配列を表１に示す。また、ＣＮＶＫの構造式を図１に示す。【００６２】
【表１】
2012033190.tif 000006
【００６３】
２．野生型ＫＲＡＳ遺伝子断片の調製
健常者の末梢血より通常の方法によりヒトゲノムＤＮＡを調製し、これを鋳型としてプライマーＦ１及びＲ１により変異点Ｇｌｙ１２およびＧｌｙ１３を包含するＫＲＡＳエクソン２の領域を通常のＰＣＲ反応条件により増幅した。ＰＣＲ反応に用いたプライマー配列は以下の通りである。
Ｆ１：５’−ＡＡＡＧＧＴＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧ−３’（配列番号１）
Ｒ１：５’−ＴＧＡＡＡＡＴＧＧＴＣＡＧＡＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号２）【００６４】
得られたＰＣＲ増幅産物をpGEMT easy Vector（プロメガ）内に、添付のプロトコルに従って挿入しクローニングした。これを野生型プラスミドとした。次に、このプラスミドを鋳型として、前記プライマーセットＦ１及びＲ１を用いて通常のＰＣＲ反応条件によって増幅を行い、直鎖状のＫＲＡＳ野生型遺伝子断片を得た。PCR Purification Kit（キアゲン）を用いて精製した後、これを以降の実験の鋳型として用いた。【００６５】
３．野生型ＫＲＡＳ遺伝子断片に対するクランププローブの光連結反応
１．５ｍＬチューブに、１ｎｍｏｌ／Ｌの野生型ＫＲＡＳ遺伝子断片を２μＬと、１０μｍｏｌ／Ｌの野生型センス鎖用クランププローブ（ＯＤＮ０９）および野生型アンチセンス鎖用クランププローブ（ＯＤＮ１０）を各２μＬずつ加え、１×ＰＣＲバッファー（10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3), 50 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCl2, 0.001% (W/V) gelatin）の終濃度で総量を２０μＬとした。また、両ＯＤＮを添加せず、その分量を滅菌水に置き換えたものを用意した。９５℃に加温したヒートブロック中で３分間、加熱処理した後、５５℃に加温したヒートブロックで３分間静置し、ＵＶ−ＬＥＤにより、３６６ｎｍ光を５秒間照射した。尚、対照として３６６ｎｍ光の照射を行わないサンプルを同時に用意した。【００６６】
４．ライトサイクラーを用いたＰＣＲ増幅反応の確認
上記の各調製液２０μＬに８０μＬの滅菌水をそれぞれ加えよく混合した後、その内５μＬずつを鋳型としてプライマーＮＦ１およびＮＲ１によりライトサイクラー（LightCycler；ロッシュ）を使用してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応試薬にはLight Cycler Fast Start DNA Master SYBER GreenI（ロッシュ）を使用した。尚、プライマーの配列は以下の通りである。
ＮＦ１：５’−ＡＡＣＣＴＴＡＴＧＴＧＴＧＡＣＡＴＧＴＴＣＴＡＡ−３’（配列番号３）
ＮＲ１：５’−ＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴＧＣ−３’（配列番号４）【００６７】
（結果、考察）
図２にその結果を示す。グラフの縦軸は蛍光強度であり、横軸はＰＣＲのサイクル数を示す。
ＯＤＮを添加して光照射を行った鋳型サンプル（４）とＯＤＮを添加し光照射を行わなかった鋳型サンプル（３）の増幅曲線を比較すると、光照射を行った鋳型サンプルのＣＰ（クロッシング）値が増加した。また、ＯＤＮ未添加の鋳型サンプルの増幅曲線を、光照射の有（２）あるいは無（１）で比較すると、両者のＣＰ値は同程度であり、さらに、光照射を行わなかった鋳型サンプルの増幅曲線をＯＤＮ添加の有（３）あるいは無（１）で比較すると、両者のＣＰ値は同程度であった。このことから、ＯＤＮの添加や３６６ｎｍの光照射を単独で実施しただけではＰＣＲによる遺伝子増幅反応は抑制されず、ＯＤＮの存在下で３６６ｎｍの光照射を行うことによってのみクランプが形成され、その結果、ＫＲＡＳ遺伝子断片の増幅抑制が起きることが明らかとなった。また、ＰＣＲ反応の前に、鋳型分子に対してクランプを形成することで遺伝子増幅を抑制できたことから、通常のハイブリッド形成では解離する温度条件であっても、一度結合したＯＤＮと鋳型分子は解離しない、即ち、非平衡状態にあることが確認された。尚、ＣＰ値の相対比較から光連結反応によって当初の鋳型量の約９７％がＯＤＮと光連結を起こしているものと推量できた。【００６８】
《実施例２》
変異型遺伝子に対するＰＣＲ増幅抑制の検証
（材料と方法）
１．変異型ＫＲＡＳ遺伝子断片の調製
実施例１で調製した野生型プラスミドに、PrimeSTAR（登録商標）Mutagenesis Basal Kit（タカラバイオ）を用いてＧｌｙ１２Ｓｅｒの変異を導入した。すなわち、当該方法により、Ｋｒａｓ遺伝子の３４番塩基「Ｇ」を「Ａ」に変異させた。これを変異型プラスミドとした。次に、このプラスミドを鋳型として、実施例１の２に記載のプライマーセットＦ１及びＲ１を用いて通常のＰＣＲ反応条件によって増幅を行い、直鎖状のＫｒａｓ変異型遺伝子断片を得た。PCR Purification Kit（キアゲン）を用いて精製した後、これを以降の実験の鋳型として用いた。【００６９】
２．変異型ＫＲＡＳ遺伝子断片に対するクランププローブの光連結反応
１．５ｍＬチューブに、１ｎｍｏｌ／Ｌの変異型ＫＲＡＳ遺伝子断片を２μＬと、１０μｍｏｌ／ＬのＯＤＮ０９及びＯＤＮ１０を各２μＬずつ加え、１×ＰＣＲバッファーの終濃度で総量を２０μＬとした。クランププローブの配列は実施例１に記載のものと同一である。また、光連結反応は実施例１の３と同様の条件で行った。尚、対照として３６６ｎｍ光の照射を行わないサンプルを用意した。【００７０】
３．ライトサイクラーを用いたＰＣＲ増幅反応の確認
実施例１の４と同様に実施した。【００７１】
（結果、考察）
図３にその結果を示す。グラフの縦軸は蛍光強度であり、横軸はＰＣＲのサイクル数を示す。
ＯＤＮ共存下で光照射を行ったサンプルと行わなかったサンプルのＣＰ値が同程度であることから、ＰＣＲ増幅抑制は殆ど認められなかった。即ち、野生型配列のＯＤＮが変異型遺伝子断片に対して殆ど光連結していないことから、変異型遺伝子断片を選択的に増幅できることが示唆された。【００７２】
《実施例３》
変異型選択的核酸増幅の確認
（材料と方法）
１．ＫＲＡＳ野生型および変異型混合サンプルの調製
実施例１および２で調製したＫＲＡＳ野生型遺伝子断片と変異型遺伝子断片を９９：１の割合で混合し、１０７コピー／μＬのＫＲＡＳ遺伝子混合サンプルを調製した。【００７３】
２．クランププローブとの光連結反応
調製した混合サンプルを１．５ｍＬチューブに２μＬ分注し、クランププローブとして１０μｍｏｌ／ＬのＯＤＮ０９及びＯＤＮ１０を各２μＬずつ加え、１×ＰＣＲバッファーの終濃度で総量を２０μＬとした。尚、クランププローブの配列は実施例１に記載のものと同一である。また、光連結反応は実施例１の３と同様の条件で行った。【００７４】
３．光連結反応後のＰＣＲおよび、ＰＣＲ産物のクローニング
上記で得られた光連結反応液２０μＬに８０μＬの滅菌水を加え、その内５μＬを鋳型として実施例１の４に記載したプライマーＮＦ１及びＮＲ１により通常の条件で３５サイクルのＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ産物をpGEMT easy Vector（プロメガ）内に、添付のプロトコルに従って挿入しクローニングした。ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ）に形質転換しＬＢアンピシリンプレートで一晩、培養して大腸菌コロニーを形成させた。【００７５】
４．塩基配列決定による野生型／変異型の混在比の確認
１００個のコロニーを鋳型として、ベクター配列を利用したプライマーＭ１３Ｆ及びＭ１３Ｒにより通常の条件でＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ産物を鋳型にして、ダイレクトシークエンス法により各クローンの塩基配列を決定した。尚、シークエンス反応に供したプライマーはＳＰ６及びＴ７であり、シーケンス反応試薬はBigDye Terminator V1.1 cycle sequence Kit（アプライドバイオシステム）を使用した。
各プライマーの塩基配列を以下に示す：
Ｍ１３Ｆ：５’−ＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡ−３’（配列番号５）
Ｍ１３Ｒ：５’−ＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧ−３’（配列番号６）
ＳＰ６  ：５’−ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡ−３’（配列番号７）
Ｔ７    ：５’−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’（配列番号８）【００７６】
（結果、考察）
光照射前の混在比が野生型９９／変異型１であったサンプルが、光照射後に野生型８７／変異型１３に上昇していることが確認された。【００７７】
《実施例４》
ＰＣＲ増幅反応時に光連結を行った場合の変異型遺伝子の選択的増幅の確認
（材料と方法）
１．ＰＣＲ反応溶液の調製
遺伝子増幅用反応液として以下のＰＣＲ用反応液を調製し使用した：
ＰＣＲバッファー（10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3), 50 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCl2, 0.001% (W/V) gelatin）；
２００μｍｏｌ／Ｌ  各ｄＮＴＰ（=dATP, dTTP, dCTP, dGTP）；
０．７５Ｕ／μＬ  AmpliTaq Gold（Applied Biosystems社）。
上記遺伝子増幅用反応液に増幅プライマーとしてＮＦ１及びＮＲ１をそれぞれ０．２μｍｏｌ／Ｌ添加した。さらにクランププローブとしてＯＤＮ０９及びＯＤＮ１０をそれぞれ０．４μｍｏｌ／Ｌ添加した。尚、増幅プライマー及びクランププローブの配列は実施例１に記載のものと同一である。この遺伝子増幅用反応液に１００ｐｍｏｌ／Ｌの野生型ＫＲＡＳ遺伝子断片および変異型ＫＲＡＳ遺伝子断片を鋳型として１μＬずつ、個別のチューブに加えてＰＣＲ反応に使用した。本反応の鋳型として用いた遺伝子断片は１０７コピーに相当する。【００７８】
２．光連結反応を伴うＰＣＲ反応の実施
ＰＣＲ用０．２ｍＬチューブに前記反応溶液及び鋳型遺伝子断片を入れ、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応は９４℃，１０分＋（９４℃，３０秒／５５℃，３０秒／７２℃，３０秒）×３５サイクル＋７２℃，３分の条件で実施した。全３５サイクルにおいて、５５℃，３０秒のアニーリング毎に３６６ｎｍ光をＵＶ−ＬＥＤにより５秒間、照射し、クランプを形成させた。ＰＣＲ後の反応液は、３％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、エチジウムブロマイドによる染色後、トランスイルミネーターによって増幅産物の確認を行った。【００７９】
（結果、考察）
図４にその結果を示す。野生型遺伝子断片由来のＰＣＲ増幅産物は電気泳動後のエチジウムブロマイド染色によってその存在が確認できなかったが、変異型遺伝子断片由来のＰＣＲ増幅産物はその存在が確認できた。このことから、野生型用クランププローブによる光連結反応は一塩基置換という僅かな変異の存在を識別し、野生型および変異型配列に対するＰＣＲによる核酸増幅量に差異を生じさせていることがわかった。この高い特異性を備えたクランププローブを利用することによって、変異型を選択的かつ高感度に検出する方法の確立が可能であると考えられる。【００８０】
《実施例５》
ＰＣＲ増幅反応時に光連結を行った場合の変異型遺伝子の検出感度の確認
（材料と方法）
１．光連結性クランププローブの調製
ＥＧＦＲ遺伝子上の変異点Ｌｅｕ８５８を標的部位として、野生型配列を有する標的部位にハイブリダイゼーションするセンス鎖と相補的なクランププローブを設計した。同時にアンチセンス鎖に対するクランププローブも設計し、お互いのクランププローブ同士が光連結を起こさない位置に実施例１で記載した光応答性核酸であるＣＮＶＫを導入して調製した。クランププローブの合成はファスマック社に委託した。これらクランププローブの配列を表２に示す。
【表２】
2012033190.tif 000007
【００８１】
２．ＥＧＦＲエクソン２１領域における野生型および変異型遺伝子断片の調製
健常者の末梢血より通常の方法によりヒトゲノムＤＮＡを調製し、これを鋳型としてプライマーセットＥＧＦＲエクソン２１Ｆ及びＥＧＦＲエクソン２１Ｒにより変異点Ｌｅｕ８５８を包含するＥＧＦＲエクソン２１の領域を通常のＰＣＲ反応条件により増幅した。ＰＣＲ反応に用いたプライマー配列は以下の通りである。
ＥＧＦＲエクソン２１Ｆ：５’−ＧＣＡＴＧＡＡＣＴＡＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣ−３’（配列番号９）
ＥＧＦＲエクソン２１Ｒ：５’−ＡＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＡＣ−３’（配列番号１０）【００８２】
得られたＰＣＲ増幅産物をpGEMT easy Vector（プロメガ）内に、添付のプロトコルに従って挿入しクローニングした。これを野生型プラスミドとした。次に、この野生型プラスミドに、PrimeSTAR（登録商標） Mutagenesis Basal Kit（タカラバイオ）を用いてＬｅｕ８５８Ａｒｇの変異を導入した。すなわち、当該方法により、ＥＧＦＲ遺伝子の２５７３番塩基「Ｔ」を「Ｇ」に変異させた。これを変異型プラスミドとした。
これらのプラスミドを鋳型として、前記プライマーセットＥＧＦＲエクソン２１Ｆ及びＥＧＦＲエクソン２１Ｒを用いて通常のＰＣＲ反応条件によって増幅を行い、直鎖状のＥＧＦＲエクソン２１の野生型および変異型遺伝子断片を得た。PCR Purification Kit（キアゲン）を用いて精製した。
精製したＥＧＦＲエクソン２１の野生型および変異型遺伝子断片の重量濃度をNanoDrop spectrophtometer（Thermo Scientific）を用いて測定し、増幅断片長を考慮して各遺伝子断片のコピー数を算出した。野生型と変異型の遺伝子断片を表３のように混合し、これを以降の実験の鋳型として用いた。
【表３】
2012033190.tif 000008
【００８３】
３．光連結反応を伴うＰＣＲによる増幅反応
実施例４と同様の組成で遺伝子増幅用反応液を調製し、これに増幅プライマーとしてＥＧＦＲエクソン２１ＮＦ及びＥＧＦＲエクソン２１ＮＲをそれぞれ０．２μｍｏｌ／Ｌ添加した。このプライマー配列は以下の通りである。
ＥＧＦＲエクソン２１ＮＦ：５’−ＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣＣＧＴＣＧＣＴＴＧ−３’（配列番号１１）
ＥＧＦＲエクソン２１ＮＲ：５’−ＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＡＣＴＴＴＧＣＣＴＣ−３’（配列番号１２）
さらにクランププローブとして前記ＯＤＮ１１及びＯＤＮ１２をそれぞれ０．４μｍｏｌ／Ｌずつ、遺伝子増幅用反応液に添加した。
ＰＣＲ用０．２ｍＬチューブに各混合比の鋳型遺伝子断片を４μＬずつ、個別のチューブに分注し、前記遺伝子増幅用反応液を加えてＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応は９４℃，１０分＋（９４℃，３０秒／５５℃，３０秒／７２℃，３０秒）×３５サイクル＋７２℃，３分の条件で実施した。全３５サイクルにおいて、５５℃，３０秒のアニーリング毎に３６６ｎｍ光をＵＶ−ＬＥＤにより５秒間、照射した。尚、対照として３６６ｎｍ光の照射を行わないサンプルを同時に用意した。【００８４】
４．ライトサイクラーを用いたＰＣＲ反応によるコピー数の確認
３．項で得られた各ＰＣＲ増幅産物の一部を分取し、ここに滅菌水を加えて１００〜１０００００倍希釈したサンプルを調製した。これらのサンプル５μＬずつを鋳型として、プライマーＥＧＦＲエクソン２１ＮＦ及びＥＧＦＲエクソン２１ＮＲにより、ライトサイクラー（LightCycler；ロッシュ）を使用してＰＣＲ反応を行った。その際、野生型遺伝子断片の希釈系列（コピー数＝１０３〜１０８）を用意し、これをスタンダードとして同時にＰＣＲ反応に供した。ＰＣＲ反応試薬にはLight Cycler Fast Start DNA Master SYBER GreenI（ロッシュ）を使用した。
ＰＣＲ反応後、スタンダードの増幅曲線から検量線を作成し、各サンプルのＣＰ値からサンプル原液のコピー数を算出した。その値をもとに、３．項で得られた各ＰＣＲ増幅産物をそれぞれ１０６コピー／４μＬとなるように滅菌水で希釈調製した。【００８５】
５．リアルタイム定量ＰＣＲ用反応液の調製
リアルタイム定量ＰＣＲ用反応液として以下の試薬を混合して調製した。
１２．５μＬの2×Premix Ex Taq（登録商標）（タカラバイオ）に、増幅プライマーとしてＥＧＦＲエクソン２１ＮＦ及びＥＧＦＲエクソン２１ＮＲをそれぞれ５ｐｍｏｌずつ添加した。さらに末端蛍光標識した変異検出プローブを２．５ｐｍｏｌ添加した。この変異検出プローブの配列は以下の通りである。
Ｌ８５８Ｒ検出プローブ：５'−（６−ＦＡＭ）ｔｔｔｇｇｃｃＣｇｃｃｃａａ（ＢＨＱ１）−３'
ここで、配列の小文字はＤＮＡを、大文字ＣはＬＮＡを、６−ＦＡＭは蛍光色素を、ＢＨＱ１は蛍光抑制物質を、それぞれ示す。当該変異検出プローブの合成はＩＤＴ社に委託した。尚、ここに記載した本反応液の容量は１サンプルあたりのものであり、これを必要量分調製した。【００８６】
６．PNA-LNA clamp PCR用反応液の調製
５．項で調製したリアルタイム定量ＰＣＲ用反応液に、Ｌ８５８Ｒ用のクランププローブとしてＰＮＡ（Ｌ８５８ｃ）を１２．５ｐｍｏｌ添加し、PNA-LNA clamp PCR用反応液とした。ＰＮＡ（Ｌ８５８ｃ）の配列は以下の通りである。
ＰＮＡ（Ｌ８５８ｃ）：ＮＨ２−ＴＴＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＡ−ＣＯＮＨ２
ＰＮＡ（Ｌ８５８ｃ）の合成はパナジーン社に委託した。
尚、ここに記載した本反応液の容量は１サンプルあたりのものであり、これを必要量分調製した。【００８７】
７．リアルタイム定量ＰＣＲによる変異型遺伝子検出感度の確認
５．項で調製したリアルタイム定量ＰＣＲ反応液に、３．項で３６６ｎｍ光の照射を行ったＰＣＲ増幅産物を４．項記載の方法で１０６コピー／４μＬに希釈調製し、鋳型として４μＬずつ個別のウェルに添加した。最終液量が２５μＬとなるように滅菌蒸留水で調製した後、ライトサイクラーＬＣ４８０（ロッシュ）を使用してリアルタイム定量ＰＣＲを行った。対照として、３．項で３６６ｎｍ光の照射を行なわなかったＰＣＲ増幅産物を４．項記載の方法で１０６コピー／４μＬに希釈調製したものについても、リアルタイム定量ＰＣＲを行なった。
また、比較例として、６．項で調製したPNA-LNA clamp PCR用反応液に、３．項で３６６ｎｍ光の照射を行わなかったＰＣＲ増幅産物を４．項記載の方法で１０６コピー／４μＬに希釈調製し、鋳型として４μＬずつ個別のウェルに添加した。最終液量が２５μＬとなるように滅菌蒸留水で調製した後、同時にリアルタイム定量ＰＣＲを行った。尚、本反応は９５℃，１０秒＋（９５℃，３秒／５６℃，３０秒）×４５サイクルの条件で実施した。【００８８】
（結果、考察）
図５〜図７にその結果を示す。各グラフの縦軸は蛍光強度であり、また横軸はＰＣＲのサイクル数を示す。図５はＰＣＲ増幅反応時に光連結反応を実施しなかったサンプル（対照）であり、図６はＰＣＲ増幅反応時に光連結反応を実施しなかったものについて、PNA-LNA clamp PCR反応を実施したサンプル（比較例）であり、図７は光連結反応を実施したサンプル（本発明）である。ａからｃは、各ＰＣＲ反応の鋳型に用いた野生型遺伝子と変異型遺伝子の混合比を示す。すなわち、ａは１００：１、ｂは１０００：１、ｃは野生型遺伝子のみ、である。図５に示すように、光連結反応もPNA-LNA clamp PCR反応も実施しなかったサンプルでは、変異型遺伝子の混在量が１／１００量（ａ）であっても野生型遺伝子のみ（ｃ）のシグナル（バックグランド）との区別が殆どつかず、変異型遺伝子の検出は出来なかった。図６のPNA-LNA clamp PCR反応を行ったサンプルでは、変異型遺伝子の混在量が１／１００量（ａ）では検出可能であったが、１／１０００量（ｂ）では野生型遺伝子のみ（ｃ）のシグナルと区別がつかなかった。すなわち、変異遺伝子の検出感度は１％であった。一方、図７の３６６ｎｍ光の照射で光連結反応を行ったサンプルでは、変異型遺伝子の混在量が１／１０００量（ｄ）であっても、十分な検出が可能であり、０．１％の検出感度が確認できた。【００８９】
以上の結果から、光連結反応を用いた本発明によれば、ＥＧＦＲの遺伝子プールに混在する点突然変異遺伝子の検出は、その混在比率が０．１％であっても可能であることが判明した。サザンブロットやダイレクトシークエンス法のような従来の方法では、信用性の高い検出感度の限界が約１０％であったこと、比較例として同時に行ったPNA-LNA clamp PCR法による本変異点の検出感度は１％であったことを考えると、本発明の変異遺伝子検出方法は非常に高い検出感度を有するといえる。
PNA-LNA clamp PCR法は、ＰＮＡ（クランププローブ）とＬＮＡ（変異検出プローブ）の競合効果を利用して変異検出感度を向上している。すなわちクランプ形成と検出反応が同時に進行するのに対し、光連結反応を利用した場合、本実施例のようにクランプ形成と検出反応を独立して行え、競合反応を利用しない通常のリアルタイム定量ＰＣＲなどでも高感度な変異検出が可能である。この事は、先の実施例で示したように光連結性クランププローブと鋳型分子の結合を非平衡状態にできることによって初めて可能になる事象といえ、本発明の優位性を示している。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明によれば、高い特異性と感度を両立させて、野生型遺伝子群に混在する微量な変異遺伝子の検出を行うことができる。癌発症の原因として認識されている既知変異や、薬効との関連が示唆されている既知変異を標的として本発明を実施することで、癌の早期発見や薬効評価による個別化医療が可能となる。さらに本発明によれば、変異型核酸分子が微量にしか存在しない癌患者の血液サンプル等からの検出も可能に成りえる。これまでは外科手術により調達した癌組織やバイオプシーサンプルといった侵襲性の高い検査材料しか扱えなかったことから、現実的に困難であった治療効果の確認やモニタリング検査が行えるようになり産業上有用である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表フリーテキスト】
【００９１】
配列表の配列番号５〜８の各塩基配列はプライマー配列である。
【図１】
2012033190.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図４】
2012033190.tif 000015
【配列表】
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【国際調査報告】
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