(57)【要約】本発明は、滑脳症患者を治療する薬剤及び方法を提供することを課題とする。本発明は、一般式（Ｉ）2012074120.tif 000100〔式中、Ｒ１は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、複素環基で置換された低級アルキル基、複素環基、又は式（ＩＩａ）2012074120.tif 000101（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）で示される基を示す。Ｒ２はフェニル基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。Ｒ３は低級アルキル基（ハロゲン、低級アルコキシ基又はフェニル基で置換されていてもよい）、縮合多環式炭化水素基、又は水素原子を示す。〕で表される化合物を含有する、滑脳症治療又は予防剤を提供する。
2012074120.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
2012074120.tif 000087
〔式中、Ｒ１は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、複素環基で置換された低級アルキル基、複素環基、又は式（ＩＩａ）
【化２】
2012074120.tif 000088
（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）で示される基を示す。Ｒ２はフェニル基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。Ｒ３は低級アルキル基（ハロゲン、低級アルコキシ基又はフェニル基で置換されていてもよい）、縮合多環式炭化水素基、又は水素原子を示す。〕で表される化合物を含有する、滑脳症治療又は予防剤。
【請求項２】
Ｒ１が、式（ＩＩａ）
【化３】
2012074120.tif 000089
（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）
で示される基である、請求項１に記載の滑脳症治療又は予防剤。
【請求項３】
Ｒ１が、式（ＩＩｂ）
【化４】
2012074120.tif 000090
（式中、ｎは１〜６の整数を示す。）で示される基である、請求項１に記載の滑脳症治療又は予防剤。
【請求項４】
Ｒ１で示される低級アルキル基上に置換した複素環基が、低級アルキル基を有していてもよいピリジルである、請求項１に記載の滑脳症治療又は予防剤。
【請求項５】
Ｒ１で示される複素環基のヘテロ原子が酸素原子である、請求項１に記載の滑脳症治療又は予防剤。
【請求項６】
Ｒ３で示される低級アルキル基がシクロプロピル基である、請求項１〜５のいずれかに記載の滑脳症治療又は予防剤。
【請求項７】
一般式（Ｉ）で表される化合物が、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルエステル、又は
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（ピリジン−２−イル）エチルエステルである、
請求項１に記載の滑脳症治療又は予防剤。
【請求項８】
経口剤、注射剤、又は点滴剤である、請求項１〜７のいずれかに記載の滑脳症治療又は予防剤。
【請求項９】
一般式（Ｉ）で表される化合物５０〜１２００ｍｇが、滑脳症患者に対して２〜５日あたり１回投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の滑脳症治療又は予防剤。
【請求項１０】
一般式（Ｉ）
【化５】
2012074120.tif 000091
〔式中、Ｒ１は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、複素環基で置換された低級アルキル基、複素環基、又は式（ＩＩａ）
【化６】
2012074120.tif 000092
（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）で示される基を示す。Ｒ２はフェニル基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。Ｒ３は低級アルキル基（ハロゲン、低級アルコキシ基又はフェニル基で置換されていてもよい）、縮合多環式炭化水素基、又は水素原子を示す。〕で表される化合物を、滑脳症患者又は滑脳症胎児を妊娠した妊婦へ投与する工程を含む滑脳症治療方法、あるいは、妊婦へ投与する工程を含む滑脳症予防方法。
【請求項１１】
Ｒ１が、式（ＩＩｂ）
【化７】
2012074120.tif 000093
（式中、ｎは１〜６の整数を示す。）で示される基である請求項１０に記載の滑脳症治療方法又は予防方法。
【請求項１２】
滑脳症の治療又は予防における使用のための、一般式（Ｉ）
【化８】
2012074120.tif 000094
〔式中、Ｒ１は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、複素環基で置換された低級アルキル基、複素環基、又は式（ＩＩａ）
【化９】
2012074120.tif 000095
（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）で示される基を示す。Ｒ２はフェニル基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。Ｒ３は低級アルキル基（ハロゲン、低級アルコキシ基又はフェニル基で置換されていてもよい）、縮合多環式炭化水素基、又は水素原子を示す。〕で表される化合物、又は該化合物を含む医薬組成物。
【請求項１３】
Ｒ１が、式（ＩＩｂ）
【化１０】
2012074120.tif 000096
（式中、ｎは１〜６の整数を示す。）で示される基である請求項１２に記載の化合物、又は医薬組成物。
【請求項１４】
滑脳症の治療又は予防のための医薬の製造における、一般式（Ｉ）
【化１１】
2012074120.tif 000097
〔式中、Ｒ１は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、複素環基で置換された低級アルキル基、複素環基、又は式（ＩＩａ）
【化１２】
2012074120.tif 000098
（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）で示される基を示す。Ｒ２はフェニル基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。Ｒ３は低級アルキル基（ハロゲン、低級アルコキシ基又はフェニル基で置換されていてもよい）、縮合多環式炭化水素基、又は水素原子を示す。〕で表される化合物の使用。
【請求項１５】
Ｒ１が、式（ＩＩｂ）
【化１３】
2012074120.tif 000099
（式中、ｎは１〜６の整数を示す。）で示される基である請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、滑脳症治療剤に関する。より詳細には、一般式（Ｉ）
【化１】
2012074120.tif 000003
〔式中、Ｒ１は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、複素環基で置換された低級アルキル基、複素環基、又は式（ＩＩａ）
【化２】
2012074120.tif 000004
（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）で示される基を示す。Ｒ２はフェニル基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。
Ｒ３は低級アルキル基（ハロゲン、低級アルコキシ基又はフェニル基で置換されていてもよい）、縮合多環式炭化水素基、又は水素原子を示す。〕で表される化合物を含有する、滑脳症治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
滑脳症（ｌｉｓｓｅｎｃｅｐｈａｌｙ）は、脳の表面に脳回がなく平滑であり、神経細胞の層構造の異常を示すことを特徴とする形成不全である。滑脳症患者は、重度の精神遅滞やてんかん発作等を示し、生命予後は不良である。新生児〜幼児期に死亡することが多いが５歳を超えて生存する場合も見られる。発生頻度は１万５千人に１人程度とされている。臨床的な診断はＭＲＩ又はＣＴによる画像診断により行われる。専門医が画像から脳回の形態の異常を読み取り、診断を行う。
滑脳症の約６０％は、Ｐａｆａｈ１ｂ１（ＬＩＳ１）遺伝子のヘテロ変異に伴う神経細胞の遊走異常が原因と考えられている。具体的には、ＬＩＳ１タンパク質の発現量低下により、順行性の細胞質ダイニンの移動が阻害され、細胞質ダイニンが中心体に偏在することにより、神経細胞の遊走障害が引き起こされる結果、中枢神経系の層構造に異常が生じる（すなわち、滑脳症を発症する）と考えられている。
滑脳症は、治療法が存在しない難病であったが、近年、治療法の糸口となり得ると期待される画期的な報告がなされた（非特許文献１）。当該報告には、ＬＩＳ１遺伝子ヘテロ変異（Ｌｉｓ１＋／−）の細胞を用いた実験において、カルパイン阻害剤であるＡＬＬＮ（ＣＡＬＰＡＩＮ  ＩＮＨＩＢＩＴＯＲ  Ｉ：構造はＮ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＨＯ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ：２０８７１９−２５ＭＧ））で細胞を処理したところ、ＬＩＳ１タンパク質発現が増加し、神経細胞の遊走も回復したことが記載されている。さらに、Ｌｉｓ１＋／−胎児マウスを妊娠したマウスに対しＡＬＬＮを腹腔内投与することにより、当該胎児マウスの脳の滑脳症の症状が改善され得る可能性が示唆されている。
しかしながら、当該報告は細胞レベル又は胎児レベルで滑脳症を改善し得る可能性を示しているだけであって、実際の臨床現場において活用するのは依然困難であった。というのも、ヒトにおいては、滑脳症は突然変異による散発例が多く、次子に遺伝する可能性がほとんどないことから、出生後に初めて滑脳症と診断されることがほとんどであり、出生後に治療を行う必要があるからである。
また、そもそもＡＬＬＮは毒性が強い化合物であり、この点でも治療目的で用いることは困難であった。
このため、Ｌｉｓ１＋／−の滑脳症新生児〜幼児をも治療可能（つまり、出生後も治療可能）な薬剤及び方法が依然として切望されていた。
なお、上記一般式（Ｉ）で表される化合物及びその製法は、特許文献１に記載されており、当該化合物をカルパイン阻害剤として用い得ることも記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００６−７６９８９号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍａｓａｍｉ  Ｙａｍａｄａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １５，１２０２−１２０７（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、滑脳症患者（特に出生後の滑脳症患者）を予防又は治療する薬剤及び方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、驚くべき事に、上記一般式（Ｉ）で表される化合物を投与することにより、胎児期のみならず出生後であっても滑脳症を治療し得ること、及び当該化合物は毒性も小さいこと、を見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、例えば、以下の項に記載の滑脳症治療又は予防剤等を包含する。
項Ａ−１．
一般式（Ｉ）
【化３】
2012074120.tif 000005
〔式中、Ｒ１は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、複素環基で置換された低級アルキル基、複素環基、又は式（ＩＩａ）
【化４】
2012074120.tif 000006
（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）で示される基を示す。Ｒ２はフェニル基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。Ｒ３は低級アルキル基（ハロゲン、低級アルコキシ基又はフェニル基で置換されていてもよい）、縮合多環式炭化水素基、又は水素原子を示す。〕で表される化合物を含有する、滑脳症治療又は予防剤。
項Ａ−２．
Ｒ１が、式（ＩＩａ）
【化５】
2012074120.tif 000007
（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）で示される基である、項Ａ−１に記載の滑脳症治療又は予防剤。
項Ａ−３．
Ｒ１が、式（ＩＩｂ）
【化６】
2012074120.tif 000008
（式中、ｎは１〜６の整数を示す。）で示される基である項Ａ−１に記載の滑脳症治療又は予防剤。
項Ａ−４．
Ｒ１で示される低級アルキル基上に置換した複素環基が、低級アルキル基を有していてもよいピリジルである項Ａ−１に記載の滑脳症治療又は予防剤。
項Ａ−５．
Ｒ１で示される複素環基のヘテロ原子が酸素原子である項Ａ−１に記載の滑脳症治療又は予防剤。
項Ａ−６．
Ｒ３で示される低級アルキル基がシクロプロピル基である項Ａ−１〜Ａ−５のいずれかに記載の滑脳症治療又は予防剤。
項Ａ−７．
一般式（Ｉ）で表される化合物が、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルエステル、又は
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（ピリジン−２−イル）エチルエステルである、
項Ａ−１に記載の滑脳症治療又は予防剤。
項Ａ−８．
経口剤、注射剤、又は点滴剤である、項Ａ−１〜Ａ−７のいずれかに記載の滑脳症治療又は予防剤。
項Ａ−９．
一般式（Ｉ）で表される化合物約５０〜約１２００ｍｇが、滑脳症患者又は妊婦に対して２〜５日あたり１回投与されるように用いられることを特徴とする、項Ａ−１〜Ａ−８のいずれかに記載の滑脳症治療又は予防剤。
項Ｂ−１．
一般式（Ｉ）
【化７】
2012074120.tif 000009
〔式中、Ｒ１は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、複素環基で置換された低級アルキル基、複素環基、又は式（ＩＩａ）
【化８】
2012074120.tif 000010
（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）で示される基を示す。Ｒ２はフェニル基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。Ｒ３は低級アルキル基（ハロゲン、低級アルコキシ基又はフェニル基で置換されていてもよい）、縮合多環式炭化水素基、又は水素原子を示す。〕で表される化合物（又は当該化合物を含む医薬組成物）を、滑脳症患者又は滑脳症胎児を妊娠した妊婦へ投与する工程を含む滑脳症治療方法、あるいは、妊婦へ投与する工程を含む滑脳症予防方法。
項Ｂ−２．
Ｒ１が、式（ＩＩａ）
【化９】
2012074120.tif 000011
（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）で示される基である、項Ｂ−１に記載の滑脳症治療方法又は予防方法。
項Ｂ−３．
Ｒ１が、式（ＩＩｂ）
【化１０】
2012074120.tif 000012
（式中、ｎは１〜６の整数を示す。）で示される基である項Ｂ−１に記載の滑脳症治療方法又は予防方法。
項Ｂ−４．
Ｒ１で示される低級アルキル基上に置換した複素環基が、低級アルキル基を有していてもよいピリジルである項Ｂ−１に記載の滑脳症治療方法又は予防方法。
項Ｂ−５．
Ｒ１で示される複素環基のヘテロ原子が酸素原子である項Ｂ−１に記載の滑脳症治療方法又は予防方法。
項Ｂ−６．
Ｒ３で示される低級アルキル基がシクロプロピル基である項Ｂ−１〜Ｂ−５のいずれかに記載の滑脳症治療方法又は予防方法。
項Ｂ−７．
一般式（Ｉ）で表される化合物が、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルエステル、又は
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（ピリジン−２−イル）エチルエステルである、
項Ｂ−１に記載の滑脳症治療方法又は予防方法。
項Ｂ−８．
投与が、経口投与又は経血管投与（好ましくは経静脈投与）である、項Ｂ−１〜Ｂ−７のいずれかに記載の滑悩症治療方法又は予防方法。
項Ｂ−９．
一般式（Ｉ）で表される化合物約５０〜約１２００ｍｇが、滑脳症患者に対して２〜５日あたり１回投与されるように用いられることを特徴とする、項Ｂ−１〜Ｂ−８のいずれかに記載の滑脳症治療方法又は予防方法。
項Ｃ−１．
滑脳症の治療又は予防における使用のための、一般式（Ｉ）
【化１１】
2012074120.tif 000013
〔式中、Ｒ１は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、複素環基で置換された低級アルキル基、複素環基、又は式（ＩＩａ）
【化１２】
2012074120.tif 000014
（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）で示される基を示す。Ｒ２はフェニル基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。Ｒ３は低級アルキル基（ハロゲン、低級アルコキシ基又はフェニル基で置換されていてもよい）、縮合多環式炭化水素基、又は水素原子を示す。〕で表される化合物、又は該化合物を含む医薬組成物。
項Ｃ−２．
Ｒ１が、式（ＩＩａ）
【化１３】
2012074120.tif 000015
（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）で示される基である、項Ｃ−１に記載の化合物、又は医薬組成物。
項Ｃ−３．
Ｒ１が、式（ＩＩｂ）
【化１４】
2012074120.tif 000016
（式中、ｎは１〜６の整数を示す。）で示される基である項Ｃ−１に記載の化合物、又は医薬組成物。
項Ｃ−４．
Ｒ１で示される低級アルキル基上に置換した複素環基が、低級アルキル基を有していてもよいピリジルである項Ｃ−１に記載の化合物、又は医薬組成物。
項Ｃ−５．
Ｒ１で示される複素環基のヘテロ原子が酸素原子である項Ｃ−１に記載の化合物、又は医薬組成物。
項Ｃ−６．
Ｒ３で示される低級アルキル基がシクロプロピル基である項Ｃ−１〜Ｃ−５のいずれかに記載の化合物、又は医薬組成物。
項Ｃ−７．
一般式（Ｉ）で表される化合物が、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルエステル、又は
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（ピリジン−２−イル）エチルエステルである、
項Ｃ−１に記載の化合物、又は医薬組成物。
項Ｃ−８．
経口投与又は経血管投与（好ましくは経静脈投与）により投与される、項Ｃ−１〜Ｃ−７のいずれかに記載の化合物、又は医薬組成物。
項Ｃ−９．
一般式（Ｉ）で表される化合物約５０〜約１２００ｍｇが、滑脳症患者又は妊婦に対して２〜５日あたり１回投与されるように用いられることを特徴とする、項Ｃ−１〜Ｃ−８のいずれかに記載の化合物、又は医薬組成物。
項Ｄ−１．
滑脳症の治療又は予防のための医薬の製造における、一般式（Ｉ）
【化１５】
2012074120.tif 000017
〔式中、Ｒ１は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、複素環基で置換された低級アルキル基、複素環基、又は式（ＩＩａ）
【化１６】
2012074120.tif 000018
（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）で示される基を示す。Ｒ２はフェニル基で置換されていてもよい低級アルキル基を示す。Ｒ３は低級アルキル基（ハロゲン、低級アルコキシ基又はフェニル基で置換されていてもよい）、縮合多環式炭化水素基、又は水素原子を示す。〕で表される化合物の使用。
項Ｄ−２．
Ｒ１が、式（ＩＩａ）
【化１７】
2012074120.tif 000019
（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）で示される基である、項Ｄ−１に記載の使用。
項Ｄ−３．
Ｒ１が、式（ＩＩｂ）
【化１８】
2012074120.tif 000020
（式中、ｎは１〜６の整数を示す。）で示される基である項Ｄ−１に記載の使用。
項Ｄ−４．
Ｒ１で示される低級アルキル基上に置換した複素環基が、低級アルキル基を有していてもよいピリジルである項Ｄ−１に記載の使用。
項Ｄ−５．
Ｒ１で示される複素環基のヘテロ原子が酸素原子である項Ｄ−１に記載の使用。
項Ｄ−６．
Ｒ３で示される低級アルキル基がシクロプロピル基である項Ｄ−１〜Ｄ−５のいずれかに記載の使用。
項Ｄ−７．
一般式（Ｉ）で表される化合物が、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルエステル、又は
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（ピリジン−２−イル）エチルエステルである、
項Ｄ−１に記載の使用。
項Ｄ−８．
医薬が、経口剤、注射剤、又は点滴剤である、項Ｄ−１〜Ｄ−７のいずれかに記載の使用。
項Ｄ−９．
医薬が、一般式（Ｉ）で表される化合物約５０〜約１２００ｍｇが、滑脳症患者又は妊婦に対して２〜５日あたり１回投与されるように用いられることを特徴とする医薬である、項Ｄ−１〜Ｄ−８のいずれかに記載の使用。
なお、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステルは、ＳＮＪ−１９４５とも呼ばれる。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の滑脳症治療剤を用いることにより、これまで治療が困難であった滑脳症を、母胎中の胎児のみならず、出生後であっても治療することが可能となる。具体的には、本発明の滑脳症治療剤は、母体のみならず、出生後の滑脳症患者に対して投与した場合であっても、滑脳症患者のＬＩＳ１タンパク質の減少を抑制させることができ、このために神経細胞の遊走が回復して滑脳症の症状を改善させることができる。
また、出生前遺伝子診断等により、ＬＩＳ１遺伝子のヘテロ変異が確認され、胎児が滑脳症を発症し得る可能性が高いことが判明した場合は、母体に上記一般式（Ｉ）で表される化合物を投与することで滑脳症の発症を予防又は治療することもできる。さらに、出生前に胎児のＬＩＳ１遺伝子のヘテロ変異が確認されていてもいなくても、また、その他滑脳症発症に関する因子の存在が確認されていてもいなくても、子供が滑脳症を発症するのを予防するために、母体に上記一般式（Ｉ）で表される化合物を投与することもできる。つまり、上記一般式（Ｉ）で表される化合物は、胎児が滑脳症を患う可能性に関係なく、滑脳症の予防のために母胎に投与して用いることもできる。
またさらに、本発明の滑脳症治療又は予防剤は、一回の投与により少なくとも３日間又はそれ以上効果が持続し得るため、投与対象（母体又は滑脳症患者）の負担を軽減することができる。このため、服薬コンプライアンスの向上も期待できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
図１はＳＮＪ−１９４５が細胞内のＬＩＳタンパク質量に与える影響を検討した結果を示す。ａはウエスタンブロットにより各タンパク質を検出した図を示し、ｂはａで検出されたバンドのｉｎｔｅｎｓｉｔｙをグラフ化した図を示す。ＳＮＪ−１９４５によりＬＩＳタンパク質量が回復したことがわかる。
図２はＳＮＪ−１９４５が細胞のＬＩＳタンパク質の局在に与える影響を検討した結果を示す。ＳＮＪ−１９４５によりＬＩＳタンパク質の局在が回復したことがわかる。
図３はＳＮＪ−１９４５が細胞の細胞質ダイニンの局在に与える影響を検討した結果を示す。ＳＮＪ−１９４５により細胞質ダイニンの局在が回復したことがわかる。
図４はＳＮＪ−１９４５が細胞の細胞質β−ＣＯＰの局在に与える影響を検討した結果を示す。ＳＮＪ−１９４５により細胞質β−ＣＯＰの局在が回復したことがわかる。
図５はＳＮＪ−１９４５が神経細胞（小脳顆粒神経細胞）の遊走能に与える影響を検討した結果を示す。ａは神経細胞の凝集塊をインキュベーションしたときの細胞の遊走を蛍光顕微鏡で観察した図である。また、ｂは遊走した神経細胞を移動距離ごとに集計し、グラフ化した図である。ＳＮＪ−１９４５により神経細胞の遊走能が回復したことがわかる。
図６はＳＮＪ−１９４５が胎児マウス脳のＬＩＳタンパク質量に与える影響を検討した結果を示す（１００μｇ／ｇ：ＩＰ、胎児期Ｅ１２、ｎ＝６）。ａはウエスタンブロットによりＬＩＳタンパク質を検出した図を示し、ｂはａで検出されたバンドのｉｎｔｅｎｓｉｔｙをグラフ化した図を示す。
図７はＳＮＪ−１９４５が新生児マウス脳のＬＩＳタンパク質量に与える影響を検討した結果を示す（２００μｇ／ｇ：ＰＯ、新生児Ｐ１、ｎ＝６）。ａはウエスタンブロットによりＬＩＳタンパク質を検出した図を示し、ｂはａで検出されたバンドのｉｎｔｅｎｓｉｔｙをグラフ化した図を示す。
図８はＳＮＪ−１９４５が成体マウス脳のＬＩＳタンパク質量に与える影響を検討した結果を示す（１００μｇ／ｇ：ＩＰ、生後３週間、ｎ＝６）。ａはウエスタンブロットによりＬＩＳタンパク質を検出した図を示し、ｂはａで検出されたバンドのｉｎｔｅｎｓｉｔｙをグラフ化した図を示す。
図９はＳＮＪ−１９４５が胎児マウス脳のアポトーシスに与える影響を検討した結果を示す。ａはＴＵＮＮＥＬ法による脳の染色結果図を示す。ｂはａにおいて染色された細胞数を集計し、染色された細胞の割合を算出してグラフ化した図を示す。
図１０はＳＮＪ−１９４５投与により滑脳症モデルマウスの運動学習能力が改善するかを、ローターロッドテストにより検討した結果を示す。具体的には、各群のマウスがローターロッドテストの試行を繰り返すにつれ、滞在時間がどのように変化したかを示すグラフを示す。
図１１はＳＮＪ−１９４５投与により滑脳症モデルマウスの運動学習能力が改善するかを、ローターロッドテストにより検討した結果を示す。具体的には、各群のマウスの合計滞在時間を比較したグラフを示す。
図１２はＳＮＪ−１９４５投与により滑脳症モデルマウスの運動機能が改善するかを、Ｇａｉｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓにより検討し、％Ｓｗｉｎｇについて評価した結果を示す。
図１３はＳＮＪ−１９４５投与により滑脳症モデルマウスの運動機能が改善するかを、Ｇａｉｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓにより検討し、Ｓｗｉｎｇ−ｔｏ−ｓｔａｎｃｅ−ｒａｔｉｏについて評価した結果を示す。
図１４はヒト滑脳症患者の遺伝子診断結果（塩基配列の変化）を示す。
図１５は正常ヒト線維芽細胞及びヒト滑脳症患者由来線維芽細胞におけるＬＩＳ１を、蛍光免疫染色により検出した結果を示す。
図１６は、図１５の結果を基に、核辺縁部から細胞の辺縁部まで等間隔で直線状に１０点の蛍光強度を測定し、ＬＩＳ１の細胞内局在を解析した結果を示す。
図１７は正常ヒト線維芽細胞及びヒト滑脳症患者由来線維芽細胞における細胞質ダイニンを、蛍光免疫染色により検出した結果を示す。
図１８は、図１７の結果を基に、核辺縁部から細胞の辺縁部まで等間隔で直線状に１０点の蛍光強度を測定し、細胞質ダイニンの細胞内局在を解析した結果を示す。
図１９は正常ヒト線維芽細胞及びヒト滑脳症患者由来線維芽細胞におけるβ−ＣＯＰ小胞を、蛍光免疫染色により検出した結果を示す。
図２０は、図１９の結果を基に、核辺縁部から細胞の辺縁部まで等間隔で直線状に１０点の蛍光強度を測定し、β−ＣＯＰ小胞の細胞内局在を解析した結果を示す。
図２１は正常ヒト線維芽細胞及びヒト滑脳症患者由来線維芽細胞内のＬＩＳ１、細胞質ダイニン、及びβ−ａｃｔｉｎを、ウエスタンブロットにより検出した図を示す。
図２２は図２１で検出したバンドのｉｎｔｅｎｓｉｔｙをグラフ化した図を示す。
図２３はＳＮＪ−１９４５以外のカルパイン阻害剤を滑脳症モデルマウスに投与した際に、ＬＩＳ１タンパク質発現量が回復するかを検討した結果を示す。（ａ）ウエスタンブロットの結果を示す。（ｂ）ウエスタンブロットにより検出したバンドのｉｎｔｅｎｓｉｔｙをグラフ化した図を示す。
図２４はＳＮＪ−１９４５、Ｅ６４ｄ、及びＡＬＬＮの各カルパイン阻害剤の細胞毒性を検討した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。
上記一般式（Ｉ）中、Ｒ１は、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基、又は複素環基で置換された低級アルキル基であり得る。つまり、Ｒ１は、低級アルキル基を示し得、ここで当該低級アルキル基は低級アルコキシ基又は複素環基で置換されている。当該低級アルキル基としては、炭素数１〜６（１、２、３、４、５又は６）の直鎖状又は分枝状アルキル基が好ましく、具体的にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、１，２−ジメチルプロピル、ヘキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１−エチル−２−メチルプロピル又は１，１，２−トリメチルプロピル等が例示できる。より好ましくは炭素数２又は３の直鎖状又は分枝状アルキル基である。とりわけエチルが好ましい。
Ｒ１で示される低級アルキル基上に置換する低級アルコキシ基としては、炭素数１〜６（１、２、３、４、５又は６）の低級アルコキシ基が好ましい。すなわち、Ｒ１で示される、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基としては、炭素数１〜６の低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基が好ましい。当該炭素数１〜６の低級アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、１−メチルブトキシ、２−メチルブトキシ、１，２−ジメチルプロポキシ、ヘキシルオキシ、１−メチルペンチルオキシ、２−メチルペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、４−メチルペンチルオキシ、１，１−ジメチルブトキシ、１，２−ジメチルブトキシ、１，３−ジメチルブトキシ、２，２−ジメチルブトキシ、２，３−ジメチルブトキシ、３，３−ジメチルブトキシ、１−エチルブトキシ、２−エチルブトキシ、１−エチル−２−メチルプロポキシ又は１，１，２−トリメチルプロポキシ等が例示でき、なかでもメトキシ、エトキシが好ましい。
アルコキシ基は、更にアルコキシ基を構成する炭素原子上に低級アルコキシ基が置換されていてもよく、さらに後者の低級アルコキシ基に低級アルコキシ基が置換されていてもよい。当該置換は、数回繰り返されていてもよい。すなわち、Ｒ１は、式（ＩＩａ）
【化１９】
2012074120.tif 000021
（式中、Ｒ４は低級アルキル基、Ｒ５は低級アルキレン基、ｍは１〜６の整数を示す。）で示される基でもあり得る。
また、さらに好ましい基として、式（ＩＩｂ）
【化２０】
2012074120.tif 000022
（ｎは１〜６の整数を示す。）で示される基が挙げられる。
上記式（ＩＩａ）のＲ４で示される低級アルキル基は、炭素数１〜６（１、２、３、４、５又は６）の直鎖状又は分枝状アルキル基が好ましく、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル又はｔｅｒｔ−ブチル等が例示できる。好ましくはメチル、イソプロピル又はｔｅｒｔ−ブチルであり、より好ましくはメチルである。
上記式（ＩＩａ）のＲ５で示される低級アルキレン基としては、炭素数１〜４（１、２、３又は４）のアルキレン基が好ましく、具体的にはメチレン、エチレン、トリメチレン又はテトラメチレンが例示できる。より好ましくはエチレンである。Ｒ５で示される低級アルキレン基は置換基を有していてもよい。該置換基としては、低級アルキル基（特に炭素数１〜６の直鎖状又は分枝状アルキル基）が挙げられ、例えばメチル又はエチル等が例示できる。
上記式（ＩＩａ）のｍは、１〜６の整数（１、２、３、４、５又は６）であり、好ましくは２〜５の整数である。上記式（ＩＩｂ）のｎは、１〜６の整数（１、２、３、４、５又は６）であり、好ましくは１〜５の整数であり、より好ましくは２〜５の整数である。
上記Ｒ１で示される低級アルキル基上に置換する複素環基としては、低級アルキル基を有していてもよい（すなわち、低級アルキル基で置換されていてもよい）ピリジルが好ましい。すなわち、上記Ｒ１で示される、複素環基で置換された低級アルキル基としては、低級アルキル基を有していてもよいピリジルで置換された低級アルキル基が好ましい。ピリジルとしては、例えば２−ピリジル、３−ピリジル又は４−ピリジルが挙げられる。該ピリジルが有していてもよい低級アルキル基としては、炭素数１〜３の低級アルキル基が好ましく、メチル、エチル、プロピル又はイソプロピルが挙げられる。特に制限されないが、該ピリジルが該低級アルキル基を有する場合、該ピリジルの５位又は６位に該低級アルキル基を有する（即ち、該ピリジルの５位又は６位の水素原子が該低級アルキル基で置換されている）のが好ましい。
Ｒ１は、また、複素環基であり得る。Ｒ１で示される複素環基は、例えば、硫黄原子、酸素原子及び窒素原子からなる群より選択される原子を１〜３個含む５〜７員芳香族、又は部分若しくは完全還元型の飽和複素環基を示し、例えば、フリル、チエニル、ピロリル、アゼピニル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアジアゾリル、ピラニル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、チアゾリジニル、ピラゾリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル又はテトラヒドロチオフェニル等であり、好ましくは、飽和複素環基であり、更に好ましくは、酸素原子を含む５乃至６員飽和複素環基であり、更により好ましくは１，２若しくは３−テトラヒドロフラニル又は１，２，３若しくは４−テトラヒドロピラニルであり、特に好ましくは３−テトラヒドロフラニル又は４−テトラヒドロピラニルである。
Ｒ２で示される低級アルキル基としては、上記したＲ１で示される低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基又は複素環基で置換された低級アルキル基における、低級アルキル基と同様のものが例示されるが、好ましくは、メチル、エチル又はイソブチルである。Ｒ２で示される低級アルキル基は、フェニル基で置換されていることが好ましい。Ｒ２で示されるフェニル基で置換された低級アルキル基の好ましい例は、ベンジル又はフェニルエチルである。
Ｒ３で示される低級アルキル基としては、炭素数１〜６（１、２、３、４、５又は６）の直鎖状又は分枝状アルキル基が好ましく、具体的にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、１，２−ジメチルプロピル、ヘキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１−エチル−２−メチルプロピル又は１，１，２−トリメチルプロピル等が例示できる。より好ましくは炭素数２又は３の直鎖状又は分枝状アルキル基である。また、Ｒ３で示される低級アルキル基は、シクロアルキル基であってもよい。シクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル又はシクロヘキシル等が例示でき、好ましくはシクロプロピル又はシクロブチルである。
該低級アルキル基が置換されてもよいハロゲンとしては、フッ素、塩素又は臭素等が挙げられ、好ましくはフッ素である。該低級アルキル基がハロゲンにより置換されている場合、Ｒ３は好ましくはトリフルオロメチル又は２，２，２−トリフルオロエチルである。
Ｒ３で示される、低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基は、Ｒ１で述べた低級アルコキシ基で置換された低級アルキル基と同様である。なかでもメトキシ基又はエトキシ基で置換された炭素数１〜６（１、２、３、４、５又は６）の低級アルコキシ基が好ましい。また、Ｒ３で示される、フェニル基で置換された低級アルキル基は、Ｒ２で述べたフェニル基で置換された低級アルキル基と同様である。
Ｒ３で示される縮合多環式炭化水素基としては、例えばインダニル、インデニル、ナフチル、アントラニル、ペンタレニル又はアズレニル等が挙げられるが、インダニルが好ましい。
さらに、本発明の滑脳症治療又は予防剤が含有する化合物は、上記化合物の各種の溶媒和や結晶多形の物質ならびにプロドラッグであってもよい。
上記化合物は、例えば以下の方法で合成できる。また、上記化合物のうちいくつかの化合物は公知である（上記特許文献１参照）。
【化２１】
2012074120.tif 000023
（式中Ｒは保護基を、その他の基は前記と同意義を示す。）
工程ａは、式（ＩＩＩ）で示されるアミノ酸のアミノ基に保護基を付加し、これを混合酸無水物とした後、還元剤で還元し、式（Ｖ）で示される化合物〔以下、化合物（Ｖ）という。〕を得る工程である。上記保護基の付加、除去は公知の手段により行うことができる。上記保護基としては、例えば、ホルミル又はそれぞれ置換基を有していてもよいＣ１−６アルキルカルボニル（例えば、アセチル、プロピオニル等）、フェニルカルボニル、Ｃ１−６アルキル−オキシカルボニル（例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル等）、フェニルオキシカルボニル又はＣ７−１０アラルキルオキシカルボニル（例えば、ベンジルオキシカルボニル等のフェニル−Ｃ１−４アルキルオキシカルボニル等）などが用いられる。これらの置換基としては、ハロゲン原子（例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等）又はニトロ基等が用いられ、置換基の数は１〜３個程度である。当該保護基として最も好ましくは、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）である。
上記反応で用いられる還元剤としては例えば水素化リチウムアルミニウム、水素化ホウ素ナトリウム又は水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウム等が挙げられる。好ましくは水素化ホウ素ナトリウムである。反応温度は−４０℃から３０℃、好ましくは−２０℃から０℃である。
化合物（Ｖ）は、式（ＩＶ）で示されるアミノアルコールに、上記アミノ基の保護基を同様に付加することによって得ることもできる（工程ａ’）。
工程ｂは、化合物（Ｖ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の活性化剤存在下、ＤＭＳＯ酸化することにより、式（ＶＩ）で示される化合物〔以下、化合物（ＶＩ）という。〕を得る工程である。ＤＭＳＯ酸化は、公知の方法により行うことができ、例えばＤＭＳＯ単独、あるいはＤＭＳＯと酸化反応を阻害しない溶媒（例えばテトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、ベンゼン、エーテル等）の混合溶媒に溶解し、化合物（Ｖ）１モルに対し通常約１〜約１０倍モルのジイソプロピルエチルアミンを添加する。上記におけるＤＭＳＯの使用量は、化合物（Ｖ）１ｇに対し約１〜約２０ｍＬである。上記ＤＭＳＯの活性化剤としては、例えば三酸化硫黄ピリジン錯体、オキサリルクロリド、ジシクロヘキシルカルボジイミド又は無水酢酸等が有利に使用でき、特に三酸化硫黄ピリジン錯体が好適である。
工程ｃは、化合物（ＶＩ）を亜硫酸水素ナトリウムで処理した後、シアン化ナトリウムと反応させてシアノヒドリン体とし、このものを精製することなく酸又はアルカリ触媒存在下で加水分解し、α−ヒドロキシ−β−アミノ酸をジアステレオマーの混合物とし、次いで、このα−ヒドロキシ−β−アミノ酸のアミノ基に上記したアミノ基の保護基を再度同様に付加し、式（ＶＩＩ）で示される化合物〔以下、化合物（ＶＩＩ）という。〕をジアステレオマーの混合物として得る工程である。
この加水分解は、酸（塩酸、硫酸、酢酸、ギ酸等）又はアルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化バリウム等）と共に加熱又は、加熱還流下で行う。加熱温度は、約５０〜約１００℃程度である。溶媒は、有機溶媒（例えばジオキサン、テトラヒドロフラン等）と水の混合溶媒を好ましく用いることができる。
工程ｄは、化合物（ＶＩＩ）を様々なアミンと縮合させて式（ＶＩＩＩ）で示される化合物〔以下、化合物（ＶＩＩＩ）という。〕を得る工程である。
アミンとしては、目的とする化合物に即して適宜好ましいアミンを選択すればよく、例えばエチルアミン、プロピルアミン、シクロプロピルアミン、ブチルアミン、シクロブチルアミン、メトキシエチルアミン、２−フェノキシエチルアミン、２−アミノインダン又は２，２，２−トリフルオロエチルアミン等が挙げられる。
上記縮合は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及びＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド等の脱水縮合剤の存在下で行うことが好ましい。縮合反応に使用される有機溶媒としてはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、ベンゼン、トルエン、酢酸エチル又はこれらの混合溶媒等が挙げられるが、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドである。反応温度は、氷冷下から室温の範囲である。
工程ｅは、化合物（ＶＩＩＩ）を塩酸酸性下でアミノ保護基の脱離反応により式（ＩＸ）で示されるアミン塩酸塩〔以下、化合物（ＩＸ）という。〕を得る工程である。アミノ保護基の脱離反応は、公知の方法により行い得る。例えば、通常使用される有機溶媒に溶解し、酸の存在下攪拌するという方法によりアミノ保護基を脱離することができる。酸としては塩酸、トリフルオロ酢酸又はｐ−トルエンスルホン酸等が挙げられる。また、市販されている塩酸の酢酸エチル溶液もしくはジオキサン溶液等を用いて脱離することもできる。反応温度は、氷冷下から室温の範囲である。
工程ｆは、化合物（ＩＸ）と式（Ｘ）で示される化合物〔以下、化合物（Ｘ）という。〕をトリエチルアミン存在下に縮合することにより式（ＸＩ）で示される化合物〔以下、化合物（ＸＩ）という。〕を得る工程である。
上記化合物（Ｘ）は、例えば、下記の一般的な反応ルートに従い製造することができる。
【化２２】
2012074120.tif 000024
（式中、各記号は前記と同意義である。）
式（ＸＩＩＩ）で示されるアルコール〔以下、化合物（ＸＩＩＩ）という。〕と炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）とを反応させることにより式（ＸＩＶ）で示される混合炭酸エステル体とし、これをトリエチルアミン存在下、Ｌ−ロイシンエチルエステル塩酸塩と縮合すると、式（ＸＶ）で示される化合物が得られる。この化合物をアルカリでケン化することによって式（ＸＶＩ）で示される化合物〔以下、化合物（ＸＶＩ）という。〕が得られる。また、化合物（ＸＶＩ）は、Ｌ−ロイシンとクロロギ酸エステルを直接反応させることによって得ることもできる。得られた化合物（ＸＶＩ）はヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）と反応させ式（Ｘ）で示されるスクシンイミドエステル体〔以下、化合物（Ｘ）という。〕が製造できる。
工程ｇは、化合物（ＸＩ）を酸化することによって式（ＸＩＩ）で示される化合物〔以下、化合物（ＸＩＩ）という。〕を得る工程である。該酸化方法としては、例えばクロム酸酸化に分類される二クロム酸ピリジニウム（ＰＤＣ）酸化、クロロクロム酸ピリジニウム（ＰＣＣ）酸化、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）酸化、コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）酸化、又はＤＭＳＯ酸化に分類されるスワン（Ｓｗｅｒｎ）酸化、ＤＭＳＯ−三酸化硫黄ピリジン錯体による酸化、ＤＭＳＯ−ジシクロヘキシルカルボジイミドによる酸化、ＤＭＳＯ−塩化オキサリルによる酸化、又はデス−マーチン試薬（Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎｐｅｒｉｏｄｉｎａｎｅ）を用いるデス−マーチン酸化、次亜ハロゲン酸による酸化、Ｎ−ハロゲノカルボン酸アミドによる酸化等、公知の方法を使用することができるが、とりわけデス−マーチン酸化が好ましい。デス−マーチン酸化を用いて酸化する場合は、化合物（ＸＩ）を通常使用される有機溶媒に溶解し、デス−マーチン試薬を加えることで行うことができる。通常使用される有機溶媒としては、例えばジクロロメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノール、ベンゼン、トルエン又は酢酸エチル等のような反応に悪影響をおよぼさない慣用の溶媒又はそれらの混合溶媒が挙げられるが、好ましくはジクロロメタンである。デス−マーチン試薬の使用量は化合物（ＸＩ）に対して約１〜約２０倍モル当量で、好ましくは約１〜約３倍モル当量である。反応温度は、特に限定されず、氷冷下から室温付近である。このようにして得られる化合物（ＸＩＩ）は、例えば濃縮、減圧濃縮、溶媒抽出、晶出、再結晶、転溶又はクロマトグラフィー等により公知の手段により単離精製することができる。化合物（ＸＩＩ）は、一般式（Ｉ）で表される化合物である。
上記、各工程は、通常使用される反応に悪影響を与えない慣用の溶媒又はそれらの混合溶媒の存在下で行われる。反応に悪影響を与えない溶媒としては、例えばジクロロメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノール、ベンゼン、トルエン又は酢酸エチルが挙げられる。
上記方法によって製造される一般式（Ｉ）で表される化合物のなかで、本発明の滑脳症治療又は予防剤に含まれる好ましい化合物としては、例えば（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（エチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物１）、（構造式を下に示す）、
【化２３】
2012074120.tif 000025
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（エチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルエステル（化合物２）、（構造式を下に示す）、
【化２４】
2012074120.tif 000026
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（エチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸テトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルエステル（化合物３）、（構造式を下に示す）、
【化２５】
2012074120.tif 000027
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物４）、（構造式を下に示す）、
【化２６】
2012074120.tif 000028
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルエステル（化合物５）、（構造式を下に示す）、
【化２７】
2012074120.tif 000029
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロプロピルアミノ−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸テトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルエステル（化合物６）、（構造式を下に示す）、
【化２８】
2012074120.tif 000030
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（プロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物７）、（構造式を下に示す）、
【化２９】
2012074120.tif 000031
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロブチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物８）、（構造式を下に示す）、
【化３０】
2012074120.tif 000032
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−ブチルアミノ−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物９）、（構造式を下に示す）、
【化３１】
2012074120.tif 000033
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物１０）、（構造式を下に示す）、
【化３２】
2012074120.tif 000034
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（２−インダニルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物１１）、（構造式を下に示す）、
【化３３】
2012074120.tif 000035
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（２−メトキシエチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物１２）、（構造式を下に示す）、
【化３４】
2012074120.tif 000036
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２，３−ジオキソ−３−エチルアミノ−１−（フェニルエチル）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物１３）、（構造式を下に示す）、
【化３５】
2012074120.tif 000037
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２，３−ジオキソ−３−エチルアミノ−１−（フェニルエチル）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルエステル（化合物１４）、（構造式を下に示す）、
【化３６】
2012074120.tif 000038
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２，３−ジオキソ−３−シクロプロピルアミノ−１−（フェニルエチル）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物１５）、（構造式を下に示す）、
【化３７】
2012074120.tif 000039
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２，３−ジオキソ−３−シクロプロピルアミノ−１−（フェニルエチル）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルエステル（化合物１６）、（構造式を下に示す）、
【化３８】
2012074120.tif 000040
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステル（化合物１７）、（構造式を下に示す）、
【化３９】
2012074120.tif 000041
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルエステル（化合物１８）、（構造式を下に示す）、
【化４０】
2012074120.tif 000042
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルエステル（化合物１９）、（構造式を下に示す）、
【化４１】
2012074120.tif 000043
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸１４−メトキシ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカニルエステル（化合物２０）、（構造式を下に示す）、
【化４２】
2012074120.tif 000044
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２，３−ジオキソ−１−（２−メチルプロピル）−３−（２−フェノキシエチル）アミノプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物２１）、（構造式を下に示す）、
【化４３】
2012074120.tif 000045
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２，３−ジオキソ−１−（２−メチルプロピル）−３−（２−フェノキシエチル）アミノプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステル（化合物２２）、（構造式を下に示す）、
【化４４】
2012074120.tif 000046
（（１Ｓ）−１−（（（（１ＲＳ）−３−アミノ−１−ベンジル−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステル（化合物２３）、（構造式を下に示す）、
【化４５】
2012074120.tif 000047
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（ピリジン−２−イル）エチルエステル（化合物２４）、（構造式を下に示す）、
【化４６】
2012074120.tif 000048
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（６−メチルピリジン−２−イル）エチルエステル（化合物２５）、（構造式を下に示す）、
【化４７】
2012074120.tif 000049
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（５−エチルピリジン−２−イル）エチルエステル（化合物２６）、（構造式を下に示す）、
【化４８】
2012074120.tif 000050
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−ｔｅｒｔ−ブトキシエチルエステル（化合物２７）、（構造式を下に示す）、及び
【化４９】
2012074120.tif 000051
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−イソプロポキシエチルエステル（化合物２８）、（構造式を下に示す）
【化５０】
2012074120.tif 000052
等が挙げられる。より好ましくは、化合物４、化合物１７、化合物１８、化合物１９、化合物２４であり、さらに好ましくは化合物１７である。
なお、上記化合物１〜２８については、上記特許文献１（特開２００６−７６９８９号）に具体的な製造方法及び物性値が記載されている。
これらの化合物は特許文献１に示されるように、優れたカルパイン阻害活性を有しており、本発明の滑脳症治療又は予防剤の有効成分として好ましく用いることができる。
本発明の滑脳症治療又は予防剤を用いることにより、これまで治療が困難であった滑脳症を、母胎中の胎児のみならず、出生後であっても治療することが可能となる。具体的には、本発明の滑脳症治療剤は、母体のみならず、出生後の滑脳症患者に対して投与した場合であっても、滑脳症患者のＬＩＳ１タンパク質の減少を抑制させることができ、このために神経細胞の遊走が回復して滑脳症の症状を改善させることができる。
また、出生前遺伝子診断等により、ＬＩＳ１遺伝子のヘテロ変異が確認され、胎児が滑脳症を発症し得る可能性が高いことが判明した場合は、母体に上記一般式（Ｉ）で表される化合物を投与することで滑脳症の発症を予防又は治療することもできる（胎児が滑脳症を発症していることが診断できている場合は「治療」であり、診断できていない場合は「予防」である。但し、胎児が滑脳症を発症しているか診断することは困難であるため、通常、母体に上記一般式（Ｉ）で表される化合物を投与することは「予防」である。）。さらに、出生前に胎児のＬＩＳ１遺伝子のヘテロ変異が確認されていてもいなくても、また、その他滑脳症発症に関する因子の存在が確認されていてもいなくても、子供が滑脳症を発症するのを予防するために、母体に上記一般式（Ｉ）で表される化合物を投与することもできる。つまり、上記一般式（Ｉ）で表される化合物は、胎児が滑脳症を患う可能性に関係なく、滑脳症の予防のために母胎に投与して用いることもできる。
本発明の滑脳症治療又は予防剤は、ヒトのみならず、ヒト以外の哺乳動物（例えばラット、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等）に対しても用いることができる。
また、上記化合物は組織移行性及び吸収性に優れ、血液脳関門も通過し得、かつ毒性も非常に低く安全性にも優れているので、滑脳症の治療又は予防にとって有利であり、よって当該化合物を含有する本発明の滑脳症治療又は予防剤は有利である。本発明の滑脳症治療又は予防剤は全身的又は局所的に投与され得る。全身的には経口投与の他、静脈内注射、皮下注射又は筋肉内注射等非経口的にも投与され得る。局所的には、皮膚、粘膜、鼻又は眼等に投与され得る。
本発明の滑脳症治療又は予防剤は、上記化合物のみからなるものであってもよいし、当該化合物と薬学上許容される担体又は添加剤等とが配合された医薬組成物であってもよい。つまり、本発明は、上記化合物及び薬学上許容される担体又は添加剤等を含む医薬組成物も包含する。当該医薬組成物には、本発明の効果が損なわれない程度において、他の薬理活性物質や薬学上許容される任意成分が配合されていてもよい。このような担体、添加剤、任意成分、他の薬理活性物質等は、当業者が目的に応じて適宜選択することができ、また、添加量等の条件も適宜設定することができる。
本発明の滑脳症治療又は予防剤が医薬組成物の場合、その製剤形態は、特に制限されないが、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又は坐剤等の固形剤、及びシロップ剤、注射剤、点滴剤、点眼剤又は点鼻剤等の液剤等が例示できる。これらのなかでも、経口投与できる剤（経口剤）、注射剤、点滴剤があることが好ましい。これらは、公知の方法により製造することができる。
例えば、顆粒剤及び錠剤として製造する場合には、薬学上許容される添加剤、例えば、賦形剤（乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム等）、崩壊剤（デンプン、カルメロースナトリウム、炭酸カルシウム等）又は結合剤（デンプン糊液、ヒドロキシプロピルセルロース液、カルメロース液、アラビアゴム液、ゼラチン液、アルギン酸ナトリウム液等）などを用いることにより任意の剤形を製造することができる。また、顆粒剤及び錠剤には、適当なコーティング剤（ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナバロウ等）又は腸溶性コーティング剤（例えば、酢酸フタル酸セルロース、メタアクリル酸コポリマー、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース等）などで剤皮を施してもよい。
カプセル剤として製造する場合には、公知の賦形剤、例えば、流動性及び滑沢性を向上させるためのステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク又は軽質無水ケイ酸、加圧流動性のための結晶セルロースもしくは乳糖、或いは上記崩壊剤等を適宜選択し、本発明化合物と均等に混和又は粒状、もしくは粒状としたものに適当なコーティング剤で剤皮を施したものをカプセルに充填するか、適当なカプセル基剤（ゼラチン等）に必要に応じてグリセリン又はソルビトール等を加えて塑性を増したカプセル基剤で被包成形してもよい。これらカプセル剤には必要に応じて、着色剤、保存剤［例えば、二酸化イオウ、パラベン類（パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等）］等を加えることができる。カプセル剤は、通常のカプセル剤の他、腸溶性コーティングカプセル剤、胃内抵抗性カプセル剤又は放出制御カプセル剤とすることもできる。腸溶性カプセル剤とする場合、腸溶性コーティング剤でコーティングした本発明化合物又は本発明化合物に上記の適当な賦形剤を添加したものを通常のカプセルに充填することができる。あるいは、腸溶性コーティング剤でコーティングしたカプセル、もしくは腸溶性高分子を基剤として成形したカプセルに本発明化合物又は本発明化合物に上記の適当な賦形剤を添加したものを充填することができる。
坐剤として製造する場合には、坐剤基剤（例えば、カカオ脂、マクロゴール等）を適宜選択して使用することができる。
シロップ剤として製造する場合には、例えば、安定剤（エデト酸ナトリウム等）、懸濁化剤（アラビアゴム、カルメロース等）、矯味剤（単シロップ、ブドウ糖等）又は芳香剤等を適宜選択して使用することができる。このような任意成分は、当業者が目的に応じて適宜選択することができ、また、添加量等の条件も適宜設定することができる。
注射剤、点滴剤、点眼剤又は点鼻剤として製造する場合、薬学上許容される添加剤、例えば等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等）、緩衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等）、保存剤（パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等）、増粘剤（ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等）、安定化剤（亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等）又はｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等）などを適宜添加した溶液に、上記化合物を溶解又は分散することによって製造することができる。このような薬学上許容される添加剤は、当業者が目的に応じて適宜選択することができ、また、添加量等の条件も適宜設定することができる。
上記注射剤、点眼剤又は点鼻剤における添加剤の添加量は、添加する添加剤の種類、用途等によって異なるが、添加剤の目的を達成し得る濃度を添加すればよい。
本発明の滑脳症治療又は予防剤の投与量は、対象となる滑脳症患者の疾患進行度合、年齢、投与方法等により異なるが、当該治療剤に含まれる有効成分である上記化合物量が、１日あたり約０．１〜約２０００ｍｇ、好ましくは約１〜約１５００ｍｇを例示できる。特に経口投与又は経血管（好ましくは経静脈）投与する場合は、１日あたり約１０〜約１５００ｍｇ、好ましくは約２０〜約１５００ｍｇ、より好ましくは約５０〜約１２００ｍｇ、さらに好ましくは約１００〜約１０００ｍｇを例示できる。投与は、例えば１日数回（好ましくは１、２、又は３回）に分けて行うことができる。なお、本発明の滑脳症治療剤は、出生後に投与する場合（すなわち、出生後滑脳症治療剤として用いる場合）、出生直後〜死亡のいずれの時期においても投与可能であるが、治療効果の面を考慮して、できるだけ早期に（可能であれば滑脳症と診断された直後から）投与を開始することが好ましい。また、母体に投与して胎児を治療（又は胎児の発症を予防）する場合も同様に、胎児が滑脳症と（又は滑脳症となる可能性が大きいと）診断された時点から、できるだけ早期に投与を開始することが望ましい。胎児が滑脳症であるか否か検査を行うことなく予防目的で投与する場合は、妊娠確認後に投与を開始すればよい。母体への投与量については、例えば上記の投与量と同様であり得、また、当業者は上述の範囲内で、患者又は母体の条件に合わせて適宜選択することができる。
また、本発明の滑脳症治療又は予防剤は、一度投薬すると比較的長時間効果が持続するという特徴も有している。例えば、上記化合物が、約５０〜約１２００ｍｇ、好ましくは約１００〜約１０００ｍｇ含まれる剤を、２日〜５日（好ましくは３日）に１回投与するだけで効果が得られると考えられる。
また、本発明の滑脳症治療又は予防剤に含まれる有効成分である上記化合物量は、特に制限されない。例えば、当該治療又は予防剤全体に対して、０．０１〜１００重量％、好ましくは０．１〜９９重量％、上記化合物が含まれ得る。
本発明は、上記の通り、滑脳症患者又は母体に、本発明の滑脳症治療剤を投与することを特徴とする滑脳症治療又は予防方法も提供する。当該方法は、具体的には、前述の本発明の滑脳症治療又は予防剤を投与することで実施される。なお、当該方法における、投与対象、投与方法、投与時期、有効成分である上記化合物の投与量等の各条件は前述の通りである。
なお、本発明の滑脳症治療又は予防剤に含有される上記化合物は、他のカルパイン阻害剤に比べ毒性が特に低く、副作用が比較的低減されている点でも有利である。また、他のカルパイン阻害剤は、出生後に投与しても血液脳関門を通過できないため滑脳症治療効果がほとんど得られず、この点でも本発明の滑脳症治療剤は優れている。
【実施例】
【００１０】
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。また、以下の検討では、基本的な操作等については、当該分野で著名な教科書（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），、共焦点顕微鏡活用プロトコール（羊土社）、タンパク質実験ハンドブック（羊土社）、脳・神経研究の進めかた（羊土社）等を適宜参考にすることができる。
各化合物の合成
上記引用文献１に記載の方法に従って、上記化合物１〜２８を合成し、結晶を得た。
具体的には、次のようにして合成した。なお、以下の化合物の分析値において、融点はＹａｎａｃｏ社製ＭＰ−５００Ｖ型（補正なし）を用いて測定した。核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）はＶａｒｉａｎ製Ｇｅｍｉｎｉ２０００型（３００ＭＨｚ）を用いて測定した。マトリックス支援イオン化−飛行時間型マススペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）は、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社製Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ質量分析装置を用いて測定し、質量数は標準物質（α―シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸）で補正した。比は容積比を示す。
〔参考例１〕
Ｎ−（（２−メトキシエトキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１）Ｌ−ロイシン（２５ｇ，０．１９ｍｏｌ）を２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（０．１２Ｌ）に溶解し、この溶液にクロロギ酸２−メトキシエチルエステル（３０ｇ，０．２２ｍｏｌ）と１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を氷冷条件下で同時にゆっくりと加えた。この溶液を室温で１８時間攪拌した後、水（６００ｍＬ）を加え希釈し、ジエチルエーテル（２×２００ｍＬ）で洗浄した。水層をアイスバスで冷却し、６Ｍ塩酸を加えることでｐＨ３に調整した。この溶液を酢酸エチル（５×１５０ｍＬ）で抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮しＮ−（（２−メトキシエトキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシン（４１ｇ，９２％）を無色オイル状物として得た。
（２）Ｎ−（（２−メトキシエトキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシン（２０ｇ，８６ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（１３ｇ，０．１１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２００ｍＬ）に溶解し、そこへ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（２１ｇ，０．１１ｍｏｌ）のジクロロメタン（２００ｍＬ）懸濁液を加えた。この溶液を室温で１８時間攪拌後、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル（３００ｍＬ）で溶解し、この溶液を１Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮し表題化合物（２７ｇ，９５％）を無色オイル状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６），０．９３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６），１．５７−１．８４（ｍ，３Ｈ），２．８１（ｓ，４Ｈ），３．２６（ｓ，３Ｈ），３．５１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．７），４．１０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．７），４．４０（ｍ，１Ｈ），８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１）．
〔参考例２〕
Ｎ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１）（Ｓ）−３−ヒドロキシテトラヒドロフラン（１．０ｇ，１１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（５０ｍＬ）溶液を攪拌しながら、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボナート（４．３ｇ，１７ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（４．４ｇ，１７ｍｍｏｌ，４．８ｍＬ）を室温で加えた。この溶液を室温で１８時間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２００ｍＬ）で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮しＮ−スクシンイミジル（３Ｓ）−３−テトラヒドロフラニルカルボナート（２．６ｇ）を定量的に褐色オイル状物として得た。
（２）Ｌ−ロイシンエチルエステル塩酸塩（２．７ｇ，１４ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２．９ｇ，２８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５０ｍＬ）にＮ−スクシンイミジル（３Ｓ）−３−テトラヒドロフラニルカルボナート（２．６ｇ，１１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２０ｍＬ）溶液を加えた。この反応液を室温で１８時間攪拌し、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル（２００ｍＬ）で溶解し、この溶液を１Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。残渣をヘキサンで洗浄しＮ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステル（３．１ｇ，９８％）を白色固体として得た。
（３）Ｎ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステル（２．９ｇ，１１ｍｍｏｌ）のエタノール（１００ｍＬ）溶液に１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（３３ｍＬ）を加えた。この溶液を氷冷下で３時間攪拌した後、塩酸を加えることでｐＨ３に調整した。エタノールを減圧留去し、酢酸エチルで抽出した。有機層を１Ｍ塩酸及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル／ヘキサン混液で結晶化しＮ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシン（２．６ｇ，８５％）を無色結晶として得た。
融点：９４．９−９６．０°Ｃ．
（４）Ｎ−（（２−メトキシエトキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンの代わりにＮ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを用いて参考例１（２）と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．０），０．９２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．３），１．５５−１．８２（ｍ，３Ｈ），１．８８（ｍ，１Ｈ），２．１２（ｍ，１Ｈ），２．８１（ｓ，４Ｈ），３．６４−３．８４（ｍ，４Ｈ），４．３９（ｍ，１Ｈ），５．１５（ｍ，１Ｈ），８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８）．
〔参考例３〕
Ｎ−（（テトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１）（Ｓ）−３−ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりに４−ヒドロキシテトラヒドロ−４Ｈ−ピランを用いて参考例２（１）と同様の反応を行い、Ｎ−スクシンイミジルテトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルカルボナートを褐色オイル状物として得た。
（２）Ｎ−スクシンイミジル（３Ｓ）−３−テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりにＮ−スクシンイミジルテトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルカルボナートを用いて参考例２（２）と同様の反応を行い、Ｎ−（（テトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを無色固体として得た。
（３）Ｎ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルの代わりにＮ−（（テトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを用いて参考例２（３）と同様の反応を行い、Ｎ−（（テトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを無色固体として得た。
（４）Ｎ−（（２−メトキシエトキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンの代わりにＮ−（（テトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを用いて参考例１（２）と同様の反応を行い、表題化合物を無色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．０），０．９２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．３），１．４３−１．９３（ｍ，７Ｈ），２．８０（ｓ，４Ｈ），３．４２（ｍ，２Ｈ），３．７８−３．８２（ｍ，２Ｈ），４．３９（ｍ，１Ｈ），４．７２（ｍ，１Ｈ），７．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８）．
〔参考例４〕
Ｎ−（（５−メトキシ−３−オキサペンチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１）（Ｓ）−３−ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりにジエチレングリコールモノメチルエーテルを用いて参考例２（１）と同様の反応を行い、５−メトキシ−３−オキサペンチルＮ−スクシンイミジルカルボナートを無色オイル状物として得た。
（２）Ｎ−スクシンイミジル（３Ｓ）−３−テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりに５−メトキシ−３−オキサペンチルＮ−スクシンイミジルカルボナートを用いて参考例２（２）と同様の反応を行い、Ｎ−（（５−メトキシ−３−オキサペンチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。
（３）Ｎ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルの代わりにＮ−（（５−メトキシ−３−オキサペンチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを用いて参考例２（３）と同様の反応を行い、Ｎ−（（５−メトキシ−３−オキサペンチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを無色オイル状物として得た。
（４）Ｎ−（（２−メトキシエトキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンの代わりにＮ−（（５−メトキシ−３−オキサペンチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを用いて参考例１（２）と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．９０（ｄｄ，６Ｈ，Ｊ＝９．５，６．５），１．５６−１．８０（ｍ，３Ｈ），２．８０（ｓ，４Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．４１−３．４６（ｍ，２Ｈ），３．５０−３．５４（ｍ，２Ｈ），３．５６−３．６０（ｍ，２Ｈ），４．０８−４．１１（ｍ，２Ｈ），４．３９（ｍ，１Ｈ），８．０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８）．
〔参考例５〕
Ｎ−（（８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１）（Ｓ）−３−ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりにトリエチレングリコールモノメチルエーテルを用いて参考例２（１）と同様の反応を行い、８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルＮ−スクシンイミジルカルボナートを無色オイル状物として得た。
（２）Ｎ−スクシンイミジル（３Ｓ）−３−テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりに８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルＮ−スクシンイミジルカルボナートを用いて参考例２（２）と同様の反応を行い、Ｎ−（（８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。
（３）Ｎ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルの代わりにＮ−（（８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを用いて参考例２（３）と同様の反応を行い、Ｎ−（（８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを無色オイル状物として得た。
（４）Ｎ−（（２−メトキシエトキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンの代わりにＮ−（（８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを用いて参考例１（２）と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．３），０．９２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．３），１．５６−１．８２（ｍ，３Ｈ），２．８１（ｓ，４Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．４３（ｍ，２Ｈ），３．５２（ｍ，６Ｈ），３．５９（ｍ，２Ｈ），４．１０（ｍ，２Ｈ），４．４０（ｍ，１Ｈ），８．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８）．
〔参考例６〕
Ｎ−（（１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１）（Ｓ）−３−ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりにテトラエチレングリコールモノメチルエーテルを用いて参考例２（１）と同様の反応を行い、１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルＮ−スクシンイミジルカルボナートを無色オイル状物として得た。
（２）Ｎ−スクシンイミジル（３Ｓ）−３−テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりに１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルＮ−スクシンイミジルカルボナートを用いて参考例２（２）と同様の反応を行い、Ｎ−（（１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。
（３）Ｎ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルの代わりにＮ−（（１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを用いて参考例２（３）と同様の反応を行い、Ｎ−（（１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを無色オイル状物として得た。
（４）Ｎ−（（２−メトキシエトキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンの代わりにＮ−（（１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを用いて参考例１（２）と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．９１（ｄｄ，６Ｈ，Ｊ＝９．３，６．３），１．５６−１．７７（ｍ，３Ｈ），２．８１（ｓ，４Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．４１−３．４４（ｍ，２Ｈ），３．４９−３．５２（ｍ，１０Ｈ），３．５９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．７），４．０８−４．１１（ｍ，２Ｈ），４．３８（ｍ，１Ｈ），８．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８）．
〔参考例７〕
Ｎ−（（１４−メトキシ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカニルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１）（Ｓ）−３−ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりにペンタエチレングリコールモノメチルエーテルを用いて参考例２（１）と同様の反応を行い、１４−メトキシ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカニルＮ−スクシンイミジルカルボナートを無色オイル状物として得た。
（２）Ｎ−スクシンイミジル（３Ｓ）−３−テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりに１４−メトキシ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカニルＮ−スクシンイミジルカルボナートを用いて参考例２（２）と同様の反応を行い、Ｎ−（（１４−メトキシ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカニルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。
（３）Ｎ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルの代わりにＮ−（（１４−メトキシ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカニルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを用いて参考例２（３）と同様の反応を行い、Ｎ−（（１４−メトキシ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカニルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを無色オイル状物として得た。
（４）Ｎ−（（２−メトキシエトキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンの代わりにＮ−（（１４−メトキシ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカニルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを用いて参考例１（２）と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６），０．９２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．３），１．５７−１．８２（ｍ，３Ｈ），２．８１（ｓ，４Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．４３（ｍ，２Ｈ），３．５１（ｍ，１４Ｈ），３．５９（ｍ，２Ｈ），４．１０（ｍ，２Ｈ），４．４０（ｍ，１Ｈ），８．０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８）．
〔参考例８〕
（３Ｓ）−３−アミノ−Ｎ−エチル−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタナミド塩酸塩
（１）Ｌ−フェニルアラニノール（５０ｇ，６６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１．３Ｌ）と水（６３０ｍＬ）の溶液にジ−ｔ−ブチルジカルボナート（１４０ｇ，０．６７ｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（５００ｍＬ）溶液と１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（６６０ｍＬ）を氷冷条件下で同時にゆっくりと加えた。この溶液を室温で１８時間攪拌し、有機溶媒を減圧留去した後、酢酸エチル（１Ｌ）を加えた。この溶液を１Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。得られた白色固体を酢酸エチル／ヘキサン（１：１０）混液から再結晶しＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニノール（７０ｇ，８４％）を無色結晶として得た。
（２）Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニノール（６９ｇ，０．２８ｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２８０ｍＬ）とジクロロメタン（１４０ｍＬ）に溶解し、この溶液をアイスバスで冷却した。そこへ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１０ｇ，０．８２ｍｏｌ）と精製した三酸化イオウピリジン錯体の（１３０ｇ，０．８２ｍｏｌ）のＤＭＳＯ（１００ｍＬ）懸濁液を加えた。この溶液を氷冷下で１時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで（１．５Ｌ）で希釈し、１Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル／ヘキサン混液から結晶化しＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニナール（５３ｇ，７７％）を無色結晶として得た。
（３）Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニナール（１７ｇ，６７ｍｍｏｌ）をメタノール（１００ｍＬ）に溶解し、この溶液を５°Ｃに冷却した。亜硫酸水素ナトリウム（７．０ｇ，６７ｍｍｏｌ）を水（１５０ｍＬ）に溶解し、５°Ｃに冷却した。この溶液をアルデヒド溶液に加え５°Ｃで１８時間撹拌した。青酸ナトリウム（４．０ｇ，８１ｍｍｏｌ）を水（１００ｍＬ）に溶かし、酢酸エチル（３００ｍＬ）とともに上記の反応液へ加えた。この反応液を室温で５時間撹拌した。有機層を分離し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮し、シアノヒドリン体を無色オイル状物として得た。このシアノヒドリン体をジオキサン（２５０ｍＬ）と濃塩酸（２５０ｍＬ）に溶解し、これにアニソール（１０ｍＬ）を加えた。この溶液を１８時間緩やかに還流した。この反応液を室温に冷却後、減圧濃縮し褐色半固状物質を得た。これを水（１００ｍＬ）に溶解し、ジエチルエーテル（３×５０ｍＬ）で洗浄した。水層をＤｏｗｅｘ  ５０Ｘ８カラム（１００−２００ｍｅｓｈ，Ｈ＋型；２５×１．８ｃｍ）に付し、ｐＨ５．５になるまで水で洗浄し、２Ｍアンモニウム水（約１．５Ｌ）で溶出した。溶出したアンモニウム水を減圧濃縮して（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸（１２ｇ，８８％）を白色固体として得た。
（４）（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸（１１ｇ，５６．３４ｍｍｏｌ）を１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（７０ｍＬ）に溶解し、この溶液にジ−ｔ−ブチルジカルボナート（１２ｇ，５７ｍｍｏｌ）のジオキサン（７０ｍＬ）溶液を加えた。この溶液を、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を適宜加えることでｐＨ１０〜１１に保持しながら、室温で１８時間攪拌した。そこへ、水（６００ｍＬ）を加え希釈し、ジエチルエーテル（２×２００ｍＬ）で洗浄した。この水層をアイスバスで冷却しながら、１Ｍ塩酸を加えることによりｐＨ２に調整し、ジエチルエーテル（３×２５０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水後、濃縮し（３Ｓ）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸（１２ｇ，７２％）を無色固体のジアステレオマーの混合物として得た。
（５）（３Ｓ）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸（６．３ｇ，２１ｍｍｏｌ）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３．０ｇ，２２．４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（４５ｍＬ）に溶解し、アイスバスで冷却した。そこへ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（４．６ｇ，２４ｍｍｏｌ）を加えた後、さらにエチルアミン水溶液（３．０ｍＬ）を加えた。この溶液を１８時間攪拌した。この溶液を酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈した後、１Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮し（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステル（５．８ｇ，８４％）を白色固体として得た。
（６）（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステル（５．５ｇ，１７ｍｍｏｌ）を４Ｎ塩酸／ジオキサン溶液（６５ｍＬ）に溶解し、この溶液を室温で３時間攪拌した。この溶液を減圧濃縮して表題化合物（４．４ｇ）を定量的に白色固体として得た。
融点：１６２．８−１６３．３°Ｃ．（Ｍａｊｏｒ），１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．０２（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２），２．９３（ｍ，２Ｈ），３．０５−３．２０（ｍ，２Ｈ），３．６０（ｍ，１Ｈ），３．８８（ｍ，１Ｈ），６．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０），７．１９−７．３７（ｍ，５Ｈ），８．０８（ｍ，１Ｈ），８．１７（ｂｒ  ｓ，３Ｈ）．（Ｍｉｎｏｒ），１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．９７（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．４），２．８０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．９），３．００（ｍ，２Ｈ），３．６９（ｍ，１Ｈ），４．２６（ｍ，１Ｈ），６．５３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．４），７．１９−７．３７（ｍ，５Ｈ），８．０３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７），８．１７（ｂｒ  ｓ，３Ｈ）．
〔参考例９〕
（３Ｓ）−３−アミノ−Ｎ−シクロプロピル−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタナミド塩酸塩
エチルアミン水溶液の代わりにシクロプロピルアミンを用いて参考例８（５）と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。
（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルの代わりに（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを用いて参考例８（６）と同様の反応を行い、表題化合物を白色固体として得た。
融点：１６２．９−１６３．３℃．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．４４（ｍ，２Ｈ），０．５７（ｍ，２Ｈ），２．５０（ｍ，０．５Ｈ），２．６５（ｍ，０．５Ｈ），２．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），２．９４（ｍ，１Ｈ），３．６０（ｍ，０．５Ｈ），３．７０（ｍ，０．５Ｈ），３．８７（ｍ，０．５Ｈ），４．２６（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝２．４），６．４５（ｂｒ  ｓ，０．５Ｈ），６．６９（ｂｒ  ｓ，０．５Ｈ），７．２３−７．３５（ｍ，５Ｈ），７．９９（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝４．２），８．０８（ｂｒ  ｓ，１．５Ｈ），８．０９（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝４．５），８．２３（ｂｒ  ｓ，１．５Ｈ）．
〔参考例１０〕
（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニル−Ｎ−プロピルブタナミト塩酸塩
エチルアミン水溶液の代わりにプロピルアミンを用いて参考例８（５）と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−ベンジル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−３−（プロピルアミノ）プロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。
（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルの代わりに（（１Ｓ）−１−ベンジル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−３−（プロピルアミノ）プロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを用いて参考例８（６）と同様の反応を行い、表題化合物を白色固体として得た。
融点：１２７．８−１２９．５℃．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８２（ｍ，３Ｈ），１．３５−１．４７（ｍ，２Ｈ），２．８２（ｍ，０．５Ｈ），２．９５（ｍ，３Ｈ），３．０９（ｍ，０．５Ｈ），３．５８（ｍ，０．５Ｈ），３．７０（ｍ，０．５Ｈ），３．９２（ｍ，０．５Ｈ），４．３１（ｍ，０．５Ｈ），６．５５（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝４．８），６．７７（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝６．６），７．２１−７．３６（ｍ，５Ｈ），７．９８−８．１５（ｍ，２．５Ｈ），８．２４（ｂｒ  ｓ，１．５Ｈ）．
〔参考例１１〕
（３Ｓ）−３−アミノ−Ｎ−シクロブチル−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタナミド塩酸塩
エチルアミン水溶液の代わりにシクロブチルアミンを用いて参考例８（５）と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロブチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。
（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルの代わりに（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロブチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを用いて参考例８（６）と同様の反応を行い、表題化合物を白色固体として得た。
融点：１６２．５−１６３．７℃．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．５９（ｍ，２Ｈ），１．８８−２．１８（ｍ，４Ｈ），２．８０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６），２．９１（ｍ，１Ｈ），３．５８（ｍ，０．５Ｈ），３．６９（ｍ，０．５Ｈ），３．８７（ｍ，０．５Ｈ），４．０８（ｍ，０．５Ｈ），４．１６−４．２４（ｍ，１Ｈ），６．５０（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．４），６．７２（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝６．０），７．２１−７．３３（ｍ，５Ｈ），８．０５（ｂｒ  ｓ，１．５Ｈ），８．１９（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．８），８．２０（ｂｒ  ｓ，１．５Ｈ），８．２９（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝８．１）．
〔参考例１２〕
（３Ｓ）−３−アミノ−Ｎ−ブチル−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタナミド塩酸塩
エチルアミン水溶液の代わりにブチルアミンを用いて参考例８（５）と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−ブチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。
（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルの代わりに（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−ブチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを用いて参考例８（６）と同様の反応を行い、表題化合物を白色固体として得た。
融点：１４１．０−１４１．４℃．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８６（ｍ，３Ｈ），１．１６−１．４７（ｍ，４Ｈ），２．８０（ｍ，０．５Ｈ），２．９９（ｍ，３Ｈ），３．１３（ｍ，０．５Ｈ），３．５７（ｍ，０．５Ｈ），３．７０（ｍ，０．５Ｈ），３．９２（ｍ，０．５Ｈ），４．３０（ｍ，０．５Ｈ），６．５３（ｂｒ  ｓ，０．５Ｈ），６．７７（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝６．６），７．１９−７．３９（ｍ，５Ｈ），７．９７−８．１５（ｍ，２．５Ｈ），８．２２（ｓ，１．５Ｈ）．
〔参考例１３〕
（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニル−Ｎ−（２，２，２−トリフルオロエチル）ブタナミド塩酸塩
エチルアミン水溶液の代わりに２，２，２−トリフルオロエチルアミンを用いて参考例８（５）と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−ベンジル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−３−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）プロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。
（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルの代わりに（（１Ｓ）−１−ベンジル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−３−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）プロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを用いて参考例８（６）と同様の反応を行い、（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニル−Ｎ−（２，２，２−トリフルオロエチル）ブタナミド塩酸塩を白色固体として得た。
融点：１０３．０−１０８．５℃．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ２．７１−２．８５（ｍ，１Ｈ），２．８８−２．９７（ｍ，１Ｈ），３．６０−３．８２（ｍ，２．５Ｈ），３．９１−４．０５（ｍ，１Ｈ），４．４５（ｍ，０．５Ｈ），６．７５（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．７），６．９８（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝６．３），７．２０−７．３５（ｍ，５Ｈ），８．１２（ｂｒ  ｓ，１．５Ｈ），８．２５（ｂｒ  ｓ，１．５Ｈ），８．７０（ｍ，１Ｈ）．
〔参考例１４〕
（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−インダニル）−４−フェニルブタナミド塩酸塩
エチルアミン水溶液の代わりに２−アミノインダンを用いて参考例８（５）と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（２−インダニルアミノ）−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。
（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルの代わりに（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（２−インダニルアミノ）−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを用いて参考例８（６）と同様の反応を行い、（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−インダニル）−４−フェニルブタナミド塩酸塩を白色固体として得た。
融点：１８３．０−１８４．８℃．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ２．７６−２．９６（ｍ，４Ｈ），３．０１−３．１８（ｍ，２Ｈ），３．６２（ｍ，０．５Ｈ），３．７４（ｍ，０．５Ｈ），３．９２（ｍ，０．５Ｈ），４．２５−４．３９（ｍ，１Ｈ），４．４９（ｍ，０．５Ｈ），６．４８（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．７），６．７２（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．７），７．１３−７．３５（ｍ，９Ｈ），８．１５（ｍ，３．５Ｈ），８．２６（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．２）．
〔参考例１５〕
（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−メトキシエチル）−４−フェニルブタナミド塩酸塩
エチルアミン水溶液の代わりにメトキシエチルアミンを用いて参考例８（５）と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−ベンジル−２−ヒドロキシ−３−（２−メトキシエチル）−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。
（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルの代わりに（（１Ｓ）−１−ベンジル−２−ヒドロキシ−３−（２−メトキシエチル）−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを用いて参考例８（６）と同様の反応を行い、（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−メトキシエチル）−４−フェニルブタナミド塩酸塩を白色固体として得た。
融点：１１３．９−１１７．７℃．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ２．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６），２．９５（ｍ，１Ｈ），３．１０−３．１９（ｍ，２Ｈ），３．２２（ｓ，１．５Ｈ），３．２３（ｓ，１．５Ｈ），３．２８−３．３４（ｍ，２Ｈ），３．５７（ｍ，０．５Ｈ），３．７０（ｍ，０．５Ｈ），３．９２（ｍ，０．５Ｈ），４．３２（ｍ，０．５Ｈ），６．５９（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝４．５），６．８７（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝６．０），７．２２−７．３６（ｍ，５Ｈ），７．９２（ｔ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．７），７．９８（ｔ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．１），８．０９（ｂｒ  ｓ，１．５Ｈ），８．２４（ｂｒ  ｓ，１．５Ｈ）．
〔参考例１６〕
（３Ｓ）−３−アミノ−Ｎ−エチル−２−ヒドロキシ−５−フェニルペンタナミド塩酸塩
（１）Ｂｏｃ−Ｌ−ホモフェニルアラニン（２０ｇ，７２ｍｍｏｌ）のジメトキシエタン（１００ｍＬ）溶液にＮ−メチルモルホリン（７．２ｇ，７２ｍｍｏｌ）とクロロギ酸イソブチル（９．８ｇ，７２ｍｍｏｌ）を氷冷条件下で加えた。攪拌１時間後、反応液をろ過し、ろ液をアイスバスで冷却し、水素化ホウ素ナトリウム（４．１ｇ，１０７ｍｍｏｌ）の水溶液（１０ｍＬ）を加え、さらに水（３００ｍＬ）を加えた。生じた沈殿物をろ取して、これを水及びメタノールで洗浄しＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ホモフェニルアラニノール（１５ｇ，７９％）を無色結晶として得た。
（２）Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニノールの代わりにＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ホモフェニルアラニノールを用いて参考例８（２）と同様の反応を行い、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ホモフェニルアラニナールを無色オイル状物として得た。
（３）Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニナールの代わりにＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ホモフェニルアラニナールを用いて参考例８（３）と同様の反応を行い、（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸を白色固体として得た。
（４）（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の代わりに（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸を用いて参考例８（４）と同様の反応を行い、（３Ｓ）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸を無色オイル状物として得た。
（５）（３Ｓ）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の代わりに（３Ｓ）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸を用いて参考例８（５）と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソ−１−（フェニルエチル）プロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。
（６）（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルの代わりに（（１Ｓ）−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソ−１−（フェニルエチル）プロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを用いて参考例８（６）と同様の反応を行い、（３Ｓ）−３−アミノ−Ｎ−エチル−２−ヒドロキシ−５−フェニルペンタナミド塩酸塩を白色固体として得た。
融点：１３４．４−１３４．９℃．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．９９−１．０６（ｍ，３Ｈ），１．６５−１．９６（ｍ，２Ｈ），２．５４−２．７６（ｍ，２Ｈ），３．０７−３．２３（ｍ，２Ｈ），４．１５（ｂｒ  ｓ，０．５Ｈ），４．２５（ｂｒ  ｓ，０．５Ｈ），６．４４（ｂｒ  ｓ，０．５Ｈ），６．５５（ｂｒ  ｓ，０．５Ｈ），７．１７−７．３３（ｍ，５Ｈ），７．９９（ｂｒ  ｓ，１．５Ｈ），８．１５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．２），８．２３（ｂｒ  ｓ，１．５Ｈ）．
〔参考例１７〕
（３Ｓ）−３−アミノ−Ｎ−シクロプロピル−２−ヒドロキシ−５−フェニルペンタナミド塩酸塩
エチルアミン水溶液の代わりにシクロプロピルアミンを用いて参考例１６（５）と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソ−１−（フェニルエチル）プロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。
（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルの代わりに（（１Ｓ）−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソ−１−（フェニルエチル）プロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを用いて参考例１６（６）と同様の反応を行い、（３Ｓ）−３−アミノ−Ｎ−シクロプロピル−２−ヒドロキシ−５−フェニルペンタナミド塩酸塩を白色固体として得た。
融点：１４０．２−１４１．３℃．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．４６−０．６４（ｍ，４Ｈ），１．６４−１．９９（ｍ，２Ｈ），２．５４−２．７８（ｍ，３Ｈ），３．３５（ｍ，１Ｈ），４．１３（ｂｒ  ｓ，０．５Ｈ），４．２６（ｂｒ  ｓ，０．５Ｈ），６．３７（ｂｒ  ｓ，０．５Ｈ），６．５１（ｂｒ  ｓ，０．５Ｈ），７．１７−７．３３（ｍ，５Ｈ），８．０５（ｂｒ  ｓ，１．５Ｈ），８．１５（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝４．５），８．２０（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝４．８），８．２７（ｂｒ  ｓ，１．５Ｈ）．
〔参考例１８〕
（３Ｓ）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−５−メチル−Ｎ−（２−フェノキシエチル）ヘキサナミド塩酸塩
（１）Ｌ−フェニルアラニノールの代わりにＬ−ロイシノールを用いて、参考例８（１）と同様の反応を行い、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ロイシノール（７０ｇ，８４％）を無色オイル状物として得た。
（２）Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニノールの代わりにＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ロイシノールを用いて参考例８（２）と同様の反応を行い、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ロイシナールを無色オイル状物として得た。
（３）Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニナールの代わりにＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ロイシナールを用いて参考例８（３），（４）と同様の反応を行い、（３Ｓ）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸を無色オイル状物として得た。
（４）（３Ｓ）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の代わりに（３Ｓ）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸を用い、エチルアミン水溶液の代わりに２−フェノキシエチルアミンを用いて参考例８（５）と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−（２−メチルプロピル）−３−オキソ−３−（２−フェノキシエチル）アミノプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを無色オイル状物として得た。
（５）（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルの代わりに（（１Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−（２−メチルプロピル）−３−オキソ−３−（２−フェノキシエチル）アミノプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを用いて参考例８（６）と同様の反応を行い、表題化合物を白色固体として得た。
融点：９３．６−９６．２℃．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．７１−０．８９（ｍ，６Ｈ），１．３５−１．４７（ｍ，２Ｈ），１．７２（ｍ，１Ｈ），３．４８−３．５４（ｍ，４Ｈ），４．００−４．０７（ｍ，２Ｈ），４．１２（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝３．６），４．３３（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝１．８），６．９１−６．９６（ｍ，３Ｈ），７．２７−７．３２（ｍ，２Ｈ），７．９５（ｂｒ  ｓ，１．５Ｈ），８．１９−８．２９（ｍ，２．５Ｈ）．
〔参考例１９〕
３−アミノ−２−ヒドロキシ−５−フェニルペンタナミド塩酸塩
エチルアミン水溶液の代わりにアンモニアガスを用いて参考例８（５）と同様の反応を行い、（１−ベンジル−３−アミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを白色固体として得た。
（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルの代わりに（１−ベンジル−３−アミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）カルバミン酸１，１−ジメチルエチルエステルを用いて参考例８（６）と同様の反応を行い、表題化合物を白色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ２．８２（ｍ，１Ｈ），２．９３（ｍ，１Ｈ），３．６１（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｍ，０．５Ｈ），４．２６（ｍ，０．５Ｈ），６．４８（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝４．８），６．７５（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．７），７．２４−７．３５（ｍ，５Ｈ），７．５２（ｍ，２Ｈ），８．０４（ｂｒｓ，１．５Ｈ），８．１７（ｂｒｓ，１．５Ｈ）．
〔参考例２０〕
Ｎ−（（２−（ピリジン−２−イル）エチル）カルボニル）−Ｌ−ロイシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１）（Ｓ）−３−ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりに（２−ピリジル）エタノールを用いて参考例２（１）と同様の反応を行い、Ｎ−スクシンイミジル２−（ピリジン−２−イル）エチルカルボナートを褐色オイル状物として得た。
（２）Ｎ−スクシンイミジル（３Ｓ）−３−テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりにＮ−スクシンイミジル２−（ピリジン−２−イル）エチルカルボナートを用いて参考例２（２）と同様の反応を行い、Ｎ−（（２−（ピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。
（３）Ｎ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルの代わりにＮ−（（２−（ピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを用いて参考例２（３）と同様の反応を行い、Ｎ−（（２−（ピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを白色固体として得た。
（４）Ｎ−（（２−メトキシエトキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンの代わりにＮ−（（２−（ピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを用いて参考例１（２）と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８２−０．９１（ｍ，６Ｈ），１．４２−１．７６（ｍ，３Ｈ），２．７６−２．８１（ｍ，４Ｈ），３．００−３．０６（ｍ，２Ｈ），４．３０−４．４０（ｍ，３Ｈ），７．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．１，５．３），７．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８），７．７１（ｍ，１Ｈ），７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１），８．５０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５）．
〔参考例２１〕
Ｎ−（（２−（６−メチルピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１）（Ｓ）−３−ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりに２−（６−メチル−２−ピリジル）エタノールを用いて参考例２（１）と同様の反応を行い、Ｎ−スクシンイミジル２−（６−メチルピリジン−２−イル）エチルカルボナートを褐色オイル状物として得た。
（２）Ｎ−スクシンイミジル（３Ｓ）−３−テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりにＮ−スクシンイミジル２−（６−メチルピリジン−２−イル）エチルカルボナートを用いて参考例２（２）と同様の反応を行い、Ｎ−（（２−（６−メチルピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。
（３）Ｎ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルの代わりにＮ−（（２−（６−メチルピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを用いて参考例２（３）と同様の反応を行い、Ｎ−（（２−（６−メチルピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを無色オイル状物として得た。
（４）Ｎ−（（２−メトキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンの代わりにＮ−（（２−（６−メチルピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを用いて参考例１（２）と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８３−０．９２（ｍ，６Ｈ），１．４９−１．７７（ｍ，３Ｈ），２．４３（ｓ，３Ｈ），２．８１（ｓ，４Ｈ），２．９９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．５），４．２９−４．４２（ｍ，３Ｈ），７．０７−７．０９（ｍ，２Ｈ），７．５８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．７），７．９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４）．
〔参考例２２〕
Ｎ−（（２−（５−エチルピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１）（Ｓ）−３−ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりに（５−エチルピリジン−２−イル）エタノールを用いて参考例２（１）と同様の反応を行い、Ｎ−スクシンイミジル２−（５−エチルピリジン−２−イル）エチルカルボナートを褐色オイル状物として得た。
（２）Ｎ−スクシンイミジル（３Ｓ）−３−テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりにＮ−スクシンイミジル２−（５−エチルピリジン−２−イル）エチルカルボナートを用いて参考例２（２）と同様の反応を行い、Ｎ−（（２−（５−エチルピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。
（３）Ｎ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルの代わりにＮ−（（２−（５−エチルピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを用いて参考例２（３）と同様の反応を行い、Ｎ−（（２−（５−エチルピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを無色オイル状物として得た。
（４）Ｎ−（（２−メトキシエトキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンの代わりにＮ−（（２−（５−エチルピリジン−２−イル）エチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを用いて参考例１（２）と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．７５−０．９２（ｍ，６Ｈ），１．１２−１．２５（ｍ，３Ｈ），１．３６−１．７２（ｍ，３Ｈ），２．５４−２．６３（ｍ，２Ｈ），２．８１−２．８３（ｍ，４Ｈ），２．９６−３．０２（ｍ，２Ｈ），４．０４（ｍ，１Ｈ），４．２９−４．３７（ｍ，２Ｈ），７．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８），７．５３（ｍ，１Ｈ），７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８），８．３４（ｍ，１Ｈ）．
〔参考例２３〕
Ｎ−（（２−ｔｅｒｔ−ブトキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１）（Ｓ）−３−ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりにエチレングリコールｔｅｒｔ−ブチルエーテルを用いて参考例２（１）と同様の反応を行い、Ｎ−スクシンイミジル２−ｔｅｒｔ−ブトキシエチルカルボナートを無色オイル状物として得た。
（２）Ｎ−スクシンイミジル（３Ｓ）−３−テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりにＮ−スクシンイミジル２−ｔｅｒｔ−ブトキシエチルカルボナートを用いて参考例２（２）と同様の反応を行い、Ｎ−（（２−ｔｅｒｔ−ブトキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。
（３）Ｎ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルの代わりにＮ−（（２−ｔｅｒｔ−ブトキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを用いて参考例２（３）と同様の反応を行い、Ｎ−（（２−ｔｅｒｔ−ブトキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを無色オイル状物として得た。
（４）Ｎ−（（２−メトキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンの代わりにＮ−（（２−ｔｅｒｔ−ブトキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを用いて参考例１（２）と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．３），０．９２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．３），１．１３（ｓ，９Ｈ），１．６１（ｍ，１Ｈ），１．７４（ｍ，２Ｈ），２．８１（ｓ，４Ｈ），３．４８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．７），４．０４（ｍ，２Ｈ），４．４０（ｍ，１Ｈ），８．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８）．
〔参考例２４〕
Ｎ−（（２−イソプロポキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１）（Ｓ）−３−ヒドロキシテトラヒドロフランの代わりにエチレングリコールイソプロピルエーテルを用いて参考例２（１）と同様の反応を行い、Ｎ−スクシンイミジル２−イソプロポキシエチルカルボナートを無色オイル状物として得た。
（２）Ｎ−スクシンイミジル（３Ｓ）−３−テトラヒドロフラニルカルボナートの代わりにＮ−スクシンイミジル２−イソプロポキシエチルカルボナートを用いて参考例２（２）と同様の反応を行い、Ｎ−（（２−イソプロポキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを無色オイル状物として得た。
（３）Ｎ−（（（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルの代わりにＮ−（（２−イソプロポキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンエチルエステルを用いて参考例２（３）と同様の反応を行い、Ｎ−（（２−イソプロポキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを無色オイル状物として得た。
（４）Ｎ−（（２−メトキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンの代わりにＮ−（（２−イソプロポキシエチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−ロイシンを用いて参考例１（２）と同様の反応を行い、表題化合物を無色オイル状物として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６），０．９２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．３），１．０８（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．３），１．６１（ｍ，１Ｈ），１．７４（ｍ，２Ｈ），２．８１（ｓ，４Ｈ），３．５３（ｍ，２Ｈ），３．５７（ｍ，１Ｈ），４．０７（ｍ２Ｈ），４．４０（ｍ，１Ｈ），８．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８）．
〔製造例１〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（エチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物１）
【化５１】
2012074120.tif 000053
参考例１の化合物（１．２ｇ，３．６ｍｍｏｌ）と参考例８の化合物（１．０ｇ，４．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液にトリエチルアミン（１．１ｇ，１１ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で１８時間攪拌し、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルで溶解し、この溶液を１Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。得られた固体を酢酸エチル／ヘキサン（１：９）混液で洗浄し（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（０．７５ｇ，４７％）を白色固体として得た。
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（０．７ｇ，１．６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（７０ｍＬ）溶液にデス・マーチン試薬（１．０ｇ，２．４ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で１８時間攪拌した。そこへ、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液（３５ｍＬ）と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３５ｍＬ）を加え、この溶液を室温で３０分攪拌した。有機層を分離し、これを１Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル／ヘキサン混液で結晶化し表題化合物（０．６２ｇ，８８％）を無色結晶として得た。
融点：１３８．０−１３８．３°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．５），０．８５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．２），１．０４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．５６（ｍ，１Ｈ），２．８２（ｍ，１Ｈ），３．１４（ｍ，３Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．４７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．５），４．０４（ｍ，３Ｈ），５．１９（ｍ，１Ｈ），７．１６−７．３３（ｍ，６Ｈ），８．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２），８．７０（ｍ，１Ｈ）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２２Ｈ３３Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｎａ）＋，４５８．２２６７，実測値，４５８．２３６１．
〔製造例２〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（エチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルエステル（化合物２）
【化５２】
2012074120.tif 000054
参考例１の化合物の代わりに参考例２の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１５８．９−１６０．７°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６），０．８５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９），１．０４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．５５（ｍ，１Ｈ），１．８３（ｍ，１Ｈ），２．０８（ｍ，１Ｈ），２．８２（ｍ，１Ｈ），３．１４（ｍ，３Ｈ），３．６１−３．７８（ｍ，４Ｈ），４．０１（ｍ，１Ｈ），５．０７（ｍ，１Ｈ），５．１９（ｍ，１Ｈ），７．１７−７．３３（ｍ，６Ｈ），８．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２），８．６９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２３Ｈ３３Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｈ）＋，４４８．２４４７，実測値，４４８．２５０９．
〔製造例３〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（エチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸テトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルエステル（化合物３）
【化５３】
2012074120.tif 000055
参考例１の化合物の代わりに参考例３の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸テトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１４０．０−１４１．８°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８４（ｍ，６Ｈ），１．０４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．４９（ｍ，３Ｈ），１．７９（ｍ，２Ｈ），２．８２（ｍ，１Ｈ），３．１４（ｍ，３Ｈ），３．４１（ｍ，２Ｈ），３．７８（ｍ，２Ｈ），４．０２（ｍ，１Ｈ），４．６６（ｍ，１Ｈ），５．１９（ｍ，１Ｈ），７．１５−７．３３（ｍ，６Ｈ），８．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２），８．６９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２４Ｈ３５Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｎａ）＋，４８４．２４２４，実測値，４８４．２４８６．
〔製造例４〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物４）
【化５４】
2012074120.tif 000056
参考例８の化合物の代わりに参考例９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１１２．４−１１３．５°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５８（ｍ，２Ｈ），０．６５（ｍ，２Ｈ），０．８３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６），０．８５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．５６（ｍ，１Ｈ），２．６８−２．８８（ｍ，２Ｈ），３．１１（ｍ，１Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．４７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．５），４．０４（ｍ，３Ｈ），５．１７（ｍ，１Ｈ），７．１７−７．３４（ｍ，６Ｈ），８．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２），８．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２３Ｈ３３Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｎａ）＋，４７０．２２６７，実測値，４７０．２４４１．［α］Ｄ２５＋６．３°（ｃ０．２０，ＤＭＳＯ）
〔製造例５〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルエステル（化合物５）
【化５５】
2012074120.tif 000057
参考例１の化合物の代わりに参考例２の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１６９．２−１７０．５°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５８（ｍ，２Ｈ），０．６５（ｍ，２Ｈ），０．８３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝８．１），０．８５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９），１．３４（ｍ，２Ｈ），１．５５（ｍ，１Ｈ），１．８３（ｍ，１Ｈ），２．０８（ｍ，１Ｈ），２．７９（ｍ，２Ｈ），３．１２（ｍ，１Ｈ），３．６１−３．８０（ｍ，４Ｈ），４．０２（ｍ，１Ｈ），５．０８（ｍ，１Ｈ），５．１７（ｍ，１Ｈ），７．２２−７．３５（ｍ，６Ｈ），８．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６），８．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２４Ｈ３３Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｎａ）＋，４８２．２２６７，実測値，４８２．２５８６．
〔製造例６〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロプロピルアミノ−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸テトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルエステル（化合物６）
【化５６】
2012074120.tif 000058
参考例１の化合物の代わりに参考例３の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸テトラヒドロ−４Ｈ−ピラン−４−イルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１３７．０−１３８．２°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５８（ｍ，２Ｈ），０．６５（ｍ，２Ｈ），０．８４（ｍ，６Ｈ），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．４８（ｍ，３Ｈ），１．８０（ｍ，２Ｈ），２．７９（ｍ，２Ｈ），３．１１（ｍ，１Ｈ），３．４１（ｍ，２Ｈ），３．７９（ｍ，２Ｈ），４．０３（ｍ，１Ｈ），４．６５（ｍ，１Ｈ），５．１８（ｍ，１Ｈ），７．１５−７．３０（ｍ，６Ｈ），８．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．４）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２５Ｈ３５Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｈ）＋，４７４．２６０４，実測値，４７４．２６４３．
〔製造例７〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（プロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物７）
【化５７】
2012074120.tif 000059
参考例８の化合物の代わりに参考例１０の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−３−（プロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１０８．８−１０９．９°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８３（ｍ，９Ｈ），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．４６（ｍ，２Ｈ），１．５５（ｍ，１Ｈ），２．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．０，９．２），３．０８（ｍ，３Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．４８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．４），４．０４（ｍ，３Ｈ），５．１９（ｍ，１Ｈ），７．２２−７．２８（ｍ，６Ｈ），８．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．６８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２３Ｈ３５Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｈ）＋，４５０．２６０４，実測値，４５０．２８３２．
〔製造例８〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロブチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物８）
【化５８】
2012074120.tif 000060
参考例８の化合物の代わりに参考例１１の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロブチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１１４．２−１１５．３°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８４（ｍ，６Ｈ），１．３４（ｍ，２Ｈ），１．４９−１．７２（ｍ，３Ｈ），２．１０（ｍ，４Ｈ），２．８１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．８，９．３），３．１０（ｍ，１Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．４７（ｍ，２Ｈ），４．０３（ｍ，３Ｈ），４．２２（ｍ，１Ｈ），５．１５（ｍ，１Ｈ），７．２４（ｍ，６Ｈ），８．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２），８．９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２４Ｈ３５Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｎａ）＋，４８４．２４２４，実測値，４８４．２４００．
〔製造例９〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−ブチルアミノ−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物９）
【化５９】
2012074120.tif 000061
参考例８の化合物の代わりに参考例１２の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−ブチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：９４．０−９５．２°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８５（ｍ，９Ｈ），１．２５（ｍ，２Ｈ），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．４２（ｍ，２Ｈ），１．５６（ｍ，１Ｈ），２．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．８，９．０），３．１０（ｍ，３Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．４７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．５），４．０４（ｍ，３Ｈ），５．１８（ｍ，１Ｈ），７．２１−７．２９（ｍ，６Ｈ），８．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６），８．６７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．０）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２４Ｈ３７Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｈ）＋，４６４．２７６０，実測値，４６４．２８７０．
〔製造例１０〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物１０）
【化６０】
2012074120.tif 000062
参考例８の化合物の代わりに参考例１３の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−３−（２，２，２−トリフルオロエチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１５２．５−１５３．９°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８４（ｍ，６Ｈ），１．３４（ｍ，２Ｈ），１．５５（ｍ，１Ｈ），２．８６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．０，８．６），３．１０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．１，４．８），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．４８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．７），３．９０（ｍ，２Ｈ），４．０４（ｍ，３Ｈ），５．１４（ｍ，１Ｈ），７．２１−７．３１（ｍ，６Ｈ），８．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），９．２９（ｍ，１Ｈ）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２２Ｈ３０Ｆ３Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｈ）＋，４９０．２１６５，実測値，４９０．２４３４．
〔製造例１１〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（２−インダニルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物１１）
【化６１】
2012074120.tif 000063
参考例８の化合物の代わりに参考例１４の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２−ヒドロキシ−３−（２−インダニルアミノ）−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１４１．９−１４３．５°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９），０．８６（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９），１．３６（ｍ，２Ｈ），１．５７（ｍ，１Ｈ），２．８０−２．９６（ｍ，３Ｈ），３．１０−３．１８（ｍ，３Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．４７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．７），４．０４（ｍ，３Ｈ），４．５０（ｍ，１Ｈ），５．１９（ｍ，１Ｈ），７．１３−７．３０（ｍ，１０Ｈ），８．２９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２９Ｈ３７Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｈ）＋，５２４．２７６０，実測値，５２４．２８１０．
〔製造例１２〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（２−メトキシエチルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物１２）
【化６２】
2012074120.tif 000064
参考例８の化合物の代わりに参考例１５の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２−ヒドロキシ−３−（２−メトキシエチルアミノ）−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１２７．０−１２７．９°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９），０．８６（ｄ，３，Ｊ＝６．９），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．５６（ｍ，１Ｈ），２．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．８，９．０），３．１１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．０，４．４），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．１６−３．３４（ｍ，２Ｈ），３．３９（ｍ，２Ｈ），３．４８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．５），４．０４（ｍ，３Ｈ），５．２０（ｍ，１Ｈ），７．１８−７．３０（ｍ，６Ｈ），８．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．６６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２３Ｈ３５Ｎ３Ｏ７（Ｍ＋Ｎａ）＋，４８８．２３７３，実測値，４８８．２６８０．
〔製造例１３〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２，３−ジオキソ−３−エチルアミノ−１−（フェニルエチル）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物１３）
【化６３】
2012074120.tif 000065
参考例８の化合物の代わりに参考例１６の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソ−１−（フェニルエチル）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１１９．１−１２０．４°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８９（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝６．３），１．０３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２），１．４３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２），１．６１−１．８５（ｍ，２Ｈ），２．０７（ｍ，１Ｈ），２．５６−２．７４（ｍ，２Ｈ），３．０７−３．１７（ｍ，２Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．４９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．７），４．０５−４．１４（ｍ，３Ｈ），４．８９（ｍ，１Ｈ），７．１６−７．３６（ｍ，５Ｈ），７．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４），８．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．６５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．９）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２３Ｈ３５Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｈ）＋，４５０．２６０４，実測値，４５０．２７０１．
〔製造例１４〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２，３−ジオキソ−３−エチルアミノ−１−（フェニルエチル）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルエステル（化合物１４）
【化６４】
2012074120.tif 000066
参考例１の化合物の代わりに参考例２の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例１６の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−３−エチルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソ−１−（フェニルエチル）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１１１．９−１１４．５°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８９（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝６．３），１．０３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２），１．４３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．４），１．６０−１．９１（ｍ，３Ｈ），２．０９（ｍ，２Ｈ），２．５６−２．７６（ｍ，２Ｈ），３．０７−３．１７（ｍ，２Ｈ），３．６３−３．８２（ｍ，４Ｈ），４．０２−４．１３（ｍ，１Ｈ），４．８８（ｍ，１Ｈ），５．０９−５．１３（ｍ，１Ｈ），７．１６−７．３１（ｍ，５Ｈ），７．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４），８．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．６６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２４Ｈ３５Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｈ）＋，４６２．２６０４，実測値，４６２．２８７０．
〔製造例１５〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２，３−ジオキソ−３−シクロプロピルアミノ−１−（フェニルエチル）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物１５）
【化６５】
2012074120.tif 000067
参考例８の化合物の代わりに参考例１７の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソ−１−（フェニルエチル）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１０９．７−１１１．１°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５３−０．６８（ｍ，４Ｈ），０．８７−０．９１（ｍ，６Ｈ），１．４３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２），１．５９−１．８５（ｍ，２Ｈ），２．０１−２．１３（ｍ，１Ｈ），２．５６−２．７４（ｍ，３Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．４８−３．５１（ｍ，２Ｈ），４．０５−４．１４（ｍ，３Ｈ），４．８７（ｍ，１Ｈ），７．１７−７．３６（ｍ，６Ｈ），８．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６），８．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２４Ｈ３５Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｈ）＋，４６２．２６０４，実測値，４６２．２７４２．
〔製造例１６〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２，３−ジオキソ−３−シクロプロピルアミノ−１−（フェニルエチル）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルエステル（化合物１６）
【化６６】
2012074120.tif 000068
参考例１の化合物の代わりに参考例２の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例１７の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソ−１−（フェニルエチル）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸（３Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１１５．８−１１６．２°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５６−０．５９（ｍ，４Ｈ），０．８８（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝６．３），１．４２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．４），１．６０−１．９１（ｍ，３Ｈ），２．０９（ｍ，２Ｈ），２．５６−２．７６（ｍ，３Ｈ），３．６３−３．８１（ｍ，４Ｈ），４．０５−４．１３（ｍ，１Ｈ），４．８７（ｍ，１Ｈ），５．０９−５．１３（ｍ，１Ｈ），７．２０−７．３５（ｍ，６Ｈ），８．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２５Ｈ３５Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｈ）＋，４７４．２６０４，実測値，４７４．２５９８．
〔製造例１７〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステル（化合物１７）
【化６７】
2012074120.tif 000069
参考例１の化合物の代わりに参考例４の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１２７．９−１２８．７°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５４−０．６６（ｍ，４Ｈ），０．８１−０．８６（ｍ，６Ｈ），１．３０−１．４２（ｍ，２Ｈ），１．５７（ｍ，１Ｈ），２．７３（ｍ，１Ｈ），２．８２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．３，９．２），３．１１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．８，４．２），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．４２−３．４４（ｍ，２Ｈ），３．５０−３．５７（ｍ，４Ｈ），３．９９−４．０４（ｍ，３Ｈ），５．１７（ｍ，１Ｈ），７．２２−７．３０（ｍ，６Ｈ），８．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２５Ｈ３７Ｎ３Ｏ７（Ｍ＋Ｎａ）＋，５１４．２５３０，実測値，５１４．２９４４．［α］Ｄ２５＋１３．９°（ｃ０．２０，ＤＭＳＯ）
〔製造例１８〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルエステル（化合物１８）
【化６８】
2012074120.tif 000070
参考例１の化合物の代わりに参考例５の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１１６．０−１１７．２°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５８（ｍ，２Ｈ），０．６５（ｍ，２Ｈ），０．８３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．８），０．８５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．５７（ｍ，１Ｈ），２．７３−２．８６（ｍ，２Ｈ），３．１１（ｍ，１Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．４４（ｍ，２Ｈ），３．５１（ｍ，６Ｈ），３．５６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．７），４．０４（ｍ，３Ｈ），５．１７（ｍ，１Ｈ），７．２２−７．３１（ｍ，６Ｈ），８．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２７Ｈ４１Ｎ３Ｏ８（Ｍ＋Ｎａ）＋，５５８．２７９２，実測値，５５８．２７１７．［α］Ｄ２５＋２．５°（ｃ０．２０，ＤＭＳＯ）
〔製造例１９〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルエステル（化合物１９）
【化６９】
2012074120.tif 000071
参考例１の化合物の代わりに参考例６の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：９７．５−９８．５°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５４−０．６６（ｍ，４Ｈ），０．８１−０．８６（ｍ，６Ｈ），１．３２−１．３７（ｍ，２Ｈ），１．５６（ｍ，１Ｈ），２．７３（ｍ，１Ｈ），２．８２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．０，９．２），３．１１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．１，４．２），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．４１−３．４４（ｍ，２Ｈ），３．５０−３．５１（ｍ，１０Ｈ），３．５４−３．５７（ｍ，２Ｈ），３．９９−４．０８（ｍ，３Ｈ），５．１６（ｍ，１Ｈ），７．２２−７．３１（ｍ，６Ｈ），８．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２），８．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２９Ｈ４５Ｎ３Ｏ９（Ｍ＋Ｎａ）＋，６０２．３０５４，実測値，６０２．３４２７．［α］Ｄ２５＋６．９°（ｃ０．２０，ＤＭＳＯ）
〔製造例２０〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸１４−メトキシ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカニルエステル（化合物２０）
【化７０】
2012074120.tif 000072
参考例１の化合物の代わりに参考例７の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−シクロプロピルアミノ−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸１４−メトキシ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカニルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：９８．５−９９．９°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５８（ｍ，２Ｈ），０．６５（ｍ，２Ｈ），０．８３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９），０．８５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．８），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．５７（ｍ，１Ｈ），２．７３−２．８６（ｍ，２Ｈ），３．１１（ｍ，１Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．４２（ｍ，２Ｈ），３．５１（ｍ，１４Ｈ），３．５６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝３．３），４．０４（ｍ，３Ｈ），５．１７（ｍ，１Ｈ），７．２２−７．３０（ｍ，６Ｈ），８．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．７２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ３１Ｈ４９Ｎ３Ｏ１０（Ｍ＋Ｎａ）＋，６４６．３３１６，実測値，６４６．３４０４．
〔製造例２１〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２，３−ジオキソ−１−（２−メチルプロピル）−３−（２−フェノキシエチル）アミノプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステル（化合物２１）
【化７１】
2012074120.tif 000073
参考例８の化合物の代わりに参考例１８の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−（２−メチルプロピル）−３−オキソ−３−（２−フェノキシエチル）アミノプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−メトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：９９．７−１００．５°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８８（ｄｄ，１２Ｈ，Ｊ＝１２．０，６．３），１．３５−１．５４（ｍ，４Ｈ），１．５８−１．７５（ｍ，２Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．４６−３．５３（ｍ，４Ｈ），４．０３−４．０７（ｍ，５Ｈ），５．０６（ｍ，１Ｈ），６．９１−６．９５（ｍ，３Ｈ），７．２６−７．３１（ｍ，３Ｈ），８．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２），８．８１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．９）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２５Ｈ３９Ｎ３Ｏ７（Ｍ＋Ｈ）＋，４９４．２８６６，実測値，４９４．２９６７．
〔製造例２２〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２，３−ジオキソ−１−（２−メチルプロピル）−３−（２−フェノキシエチル）アミノプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステル（化合物２２）
【化７２】
2012074120.tif 000074
参考例１の化合物の代わりに参考例４の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例１８の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−（２−メチルプロピル）−３−オキソ−３−（２−フェノキシエチル）アミノプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：５３．３−５４．１°Ｃ．１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８７（ｄｄ，１２Ｈ，Ｊ＝１２．２，６．５），１．３５−１．５４（ｍ，４Ｈ），１．５８−１．７５（ｍ，２Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．４１−３．４５（ｍ，２Ｈ），３．４７−３．５７（ｍ，６Ｈ），４．０３−４．０７（ｍ，５Ｈ），５．０６（ｍ，１Ｈ），６．９１−６．９６（ｍ，３Ｈ），７．２６−７．３１（ｍ，３Ｈ），８．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．８３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７）．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：Ｃ２７Ｈ４３Ｎ３Ｏ８（Ｍ＋Ｈ）＋，５３８．３１２８，実測値，５３８．３１４０．
〔製造例２３〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１ＲＳ）−３−アミノ−１−ベンジル−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステル（化合物２３）
【化７３】
2012074120.tif 000075
参考例１の化合物の代わりに参考例４の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例１９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（１Ｓ）−１−（（（（１ＲＳ）−３−アミノ−１−ベンジル−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．７７（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．３），０．８３（ｄ，１．５Ｈ，Ｊ＝６．６），０．８６（ｄ，１．５Ｈ，Ｊ＝６．９），１．０５−１．６３（ｍ，３Ｈ），２．６８−２．８５（ｍ，１Ｈ），３．１２（ｍ，１Ｈ），３．２３（ｓ，３Ｈ），３．４２（ｍ，２Ｈ），３．５１−３．５６（ｍ，４Ｈ），４．０３（ｍ，３Ｈ），５．２２（ｍ，１Ｈ），７．２１−７．３１（ｍ，６Ｈ），７．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４），８．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１８），８．１９（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝６．９），８．２６（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．５）．
〔製造例２４〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（ピリジン−２−イル）エチルエステル（化合物２４）
【化７４】
2012074120.tif 000076
参考例１の化合物の代わりに参考例２０の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（ピリジン−２−イル）エチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５８−０．６６（ｍ，４Ｈ），０．８３（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝７．１），１．３１−１．３５（ｍ，２Ｈ），１．５３（ｍ，１Ｈ），２．７４（ｍ，１Ｈ），２．８１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．１，９．３），３．０２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３），３．１１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．０，４．１），４．０１（ｍ，１Ｈ），４．２８−４．３２（ｍ，２Ｈ），５．１７（ｍ，１Ｈ），７．１４−７．３４（ｍ，８Ｈ），７．７５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．８），８．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２），８．５１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．２），８．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５）．
〔製造例２５〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（６−メチルピリジン−２−イル）エチルエステル（化合物２５）
【化７５】
2012074120.tif 000077
参考例１の化合物の代わりに参考例２１の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（６−メチルピリジン−２−イル）エチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１６２．０−１６３．６℃．
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５４−０．６６（ｍ，４Ｈ），０．７６−０．８６（ｍ，６Ｈ），１．５４（ｍ，１Ｈ），２．４３（ｓ，３Ｈ），２．７３−２．８６（ｍ，２Ｈ），２．９６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．５），３．１１（ｍ，１Ｈ），４．０３（ｍ，１Ｈ），４．２１−４．３４（ｍ，２Ｈ），５．１７（ｍ，１Ｈ），７．０７−７．３０（ｍ，８Ｈ），７．５８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．７），８．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．７２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８）．
〔製造例２６〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（５−エチルピリジン−２−イル）エチルエステル（化合物２６）
【化７６】
2012074120.tif 000078
参考例１の化合物の代わりに参考例２２の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（５−エチルピリジン−２−イル）エチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
融点：１１９．９−１２１．０℃．
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５８−０．６６（ｍ，４Ｈ），０．７５−０．８５（ｍ，６Ｈ），１．１７（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．７），１．３３−１．３６（ｍ，２Ｈ），１．５３（ｍ，１Ｈ），２．５８（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１５．５，８．３），２．７４−２．８５（ｍ，２Ｈ），２．９４−２．９８（ｍ，２Ｈ），３．１２（ｍ，１Ｈ），４．０４（ｍ，１Ｈ），４．２８−４．２９（ｍ，２Ｈ），５．１７（ｍ，１Ｈ），７．１３−７．２６（ｍ，７Ｈ），７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１），８．２２−８．３５（ｍ，２Ｈ），８．７５（ｍ，１Ｈ）．
〔製造例２７〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−ｔｅｒｔ−ブトキシエチルエステル（化合物２７）
【化７７】
2012074120.tif 000079
参考例１の化合物の代わりに参考例２３の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−ｔｅｒｔ−ブトキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５８（ｍ，２Ｈ），０．６５（ｍ，２Ｈ），０．８３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．５），０．８５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９），１．１２（ｓ，９Ｈ），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．５７（ｍ，１Ｈ），２．７４（ｍ，１Ｈ），２．８２（ｍ，１Ｈ），３．１１（ｍ，１Ｈ），３．４５（ｍ，２Ｈ），３．９８（ｍ，３Ｈ），５．１７（ｍ，１Ｈ），７．２４（ｍ，６Ｈ），８．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６），８．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８）．
〔製造例２８〕
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−イソプロポキシエチルエステル（化合物２８）
【化７８】
2012074120.tif 000080
参考例１の化合物の代わりに参考例２４の化合物を、参考例８の化合物の代わりに参考例９の化合物を用いて製造例１と同様の反応を行い、（（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２−ヒドロキシ−３−オキソプロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−イソプロポキシエチルエステルを経て表題化合物を無色結晶として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．５８（ｍ，２Ｈ），０．６５（ｍ，２Ｈ），０．８３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．２），０．８５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９），１．０７（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝５．７），１．３５（ｍ，２Ｈ），１．５７（ｍ，１Ｈ），２．７４（ｍ，１Ｈ），２．８２（ｍ，１Ｈ），３．１２（ｍ，１Ｈ），３．５０（ｍ，２Ｈ），３．５５（ｍ，１Ｈ），４．０１（ｍ，３Ｈ），５．１７（ｍ，１Ｈ），７．２４（ｍ，６Ｈ），８．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９），８．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６）．
μ−カルパイン及びｍ−カルパイン阻害活性の測定
μ−及びｍ−カルパインの阻害活性を文献（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３年、第２０８巻，ｐ．３８７−３９２）に記載された方法に準じて測定した。すなわち、種々の濃度の被験化合物を含むＤＭＳＯ溶液（２．５μＬ）に、０．５ｍｇ／ｍＬのカゼイン、５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、２０ｍＭのジチオスレイトール及び１．０ｎｍｏｌのμ−カルパイン（ヒト赤血球由来、コスモ・バイオ株式会社製）又はｍ−カルパイン（ブタ腎臓由来、コスモ・バイオ株式会社製）を含む反応液（２００μＬ）を９６穴プレート上で加えた。そこへ、２０ｍＭの塩化カルシウム水溶液（５０μＬ）を加え、３０℃で６０分間反応させた。この反応液（１００μＬ）を別の９６穴プレートに移し、精製水（５０μＬ）と５０％のＰｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（バイオラド社製；カタログＮｏ．５００−０００６）水溶液（１００μＬ）を加えて室温で１５分間放置した後、５９５ｎＭで吸光度を測定した。被験化合物を含まず同様に処理したものをコントロール値、２０ｍＭ塩化カルシウム水溶液の代わりに１ｍＭ  ＥＤＴＡ水溶液（５０μＬ）を加え同様に処理したものをブランク値とし、下記の式より算出される阻害率を計算し、５０％阻害に必要な濃度（ＩＣ５０）を求めた。
阻害率（％）＝｛１−（測定値−ブランク値）／（コントロール値−ブランク値）｝×１００
当該濃度（ＩＣ５０）を酵素（カルパイン）阻害活性（μＭ）として、表１に示した。
各化合物はμ−カルパイン及びｍ−カルパインの活性を阻害した。
【表１】
2012074120.tif 000081
これらの化合物のうち、化合物１７を以下の検討に用いた。化合物１７はＳＮＪ−１９４５である。以下、化合物１７をＳＮＪ−１９４５とも表記する。
なお、以下の検討において用いた実験動物や実験細胞は、基本的に上記非特許文献１（Ｍａｓａｍｉ  Ｙａｍａｄａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １５，１２０２−１２０７（２００９））と同様にして調製した。また、実験動物を死亡させる場合には、まず致死量のエーテルを用いて麻酔を施し、安楽死させた。また、以下の実験でＤＡＰＩ染色法を用いる場合があるが、ＤＡＰＩが核を染色する蛍光色素であることはよく知られている。
ＬＩＳ１遺伝子ヘテロ欠損型マウス（ＬＩＳ１ヘテロ変異マウス）の作製
ＬＩＳ１ヘテロ変異マウスは以下の方法で作製した。ＬＩＳ１のコンディショナルノックアウトマウスとして１２９Ｓ−Ｐａｆａｈ１ｂ１ｔｍ２Ａｗｂ／Ｊ（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ）を使用した。このマウスは、イントロンＩＩとイントロンＶの中にｌｏｘＰ配列を挿入し、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムでエクソンＩＩＩ−エクソンＶＩを欠失させＬＩＳ１を不活化するシステムを有するマウスである。この１２９Ｓ−Ｐａｆａｈ１ｂ１ｔｍ２Ａｗｂ／Ｊの雌をホモ型のＥＩＩ−Ｃｒｅ形質転換マウス（ＦＶＢ／Ｎ−Ｔｇ（ＥＩＩａ−ｃｒｅ）Ｃ５３７９Ｌｍｇｄ／Ｊ、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の雄と交配し、Ｃｒｅ蛋白質を部分的に反応させることで１２９Ｓ−Ｐａｆａｈ１ｂ１ｔｍ２Ａｗｂ／Ｊ（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ）が持っているＥＳ細胞のセレクションに用いたｎｅｏ遺伝子を除いた。このｎｅｏ遺伝子を持たない１２９Ｓ−Ｐａｆａｈ１ｂ１ｔｍ２Ａｗｂ／Ｊどうしを交配し、１２９Ｓ−Ｐａｆａｈ１ｂ１ｔｍ２Ａｗｂ／Ｊのホモマウスを作製した。このｎｅｏ（−）１２９Ｓ−Ｐａｆａｈ１ｂ１ｔｍ２Ａｗｂ／Ｊホモマウスの雄をＦＶＢ／Ｎ−Ｔｇ（ＥＩＩａ−ｃｒｅ）Ｃ５３７９Ｌｍｇｄ／Ｊ（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の雌と交配し、ＬＩＳ１ヘテロ変異マウスを作製した。
野生型マウスは、日本クレア株式会社から購入したＦＶＢ／ＮＪｃｌマウスを使用した。
ＳＮＪ−１９４５による細胞内のＬＩＳ１タンパク質量の変化の検討
ＬＩＳ１遺伝子ヘテロ欠損あるいは野生型マウス（１２．５−１４．５日目の胎児）各々５匹から線維芽細胞（ＭＥＦ；ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｌｏｂｌａｓｔ）をそれぞれ樹立した。
線維芽細胞は下記の方法により樹立した。妊娠マウスを頸椎脱臼によって殺し、無菌的に直ちにマウス胎児を単離し、ピンセットで頭部および内臓組織を取り除いた後、ハサミでマウス胎児を細かく裁断した。裁断された組織片にＴｒｉｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ，２５２００）１０ｍｌを加えて５０ｍｌのプラスチックチューブ（ＮＵＮＣ，３７３６８７）に入れて３７℃で３０分インキュベーションした。３０分インキュベーションした後、１０ｍｌのＦｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ−ＢＩＯ，Ｉｎｃ．、ＳＦＢＭ３０−１７９８）を加え、１０ｍｌピペット（ＮＵＮＣ，１５９６３３）でピペッティングし、細胞を単離した。室温で５分間静置した後に上清を回収し、５０ｍｌのプラスチックチューブ（ＮＵＮＣ，３７３６８７）に移し替えた後、５分間１０００ＲＰＭで遠心分離し、上清を捨てた。その後、細胞ペレットをＤ−ＭＥＭ（ＷＡＫＯ，０４１−２９７７５），１０％相当のＦｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ−ＢＩＯ，Ｉｎｃ．、ＳＦＢＭ３０−１７９８）と１％相当のＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＯＣＯ，２５０３０）、ＰｅｎＳｔｒｅｐ（ＧＩＢＯＣＯ，１５１４０）を加えた細胞培養液で１０ｃｍ細胞培養シャーレ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ，６６４１６０）で培養した。細胞は３日ごとに１０ｃｍ細胞培養シャーレ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ，６６４１６０）をＰＢＳで洗浄した。次いでこの細胞培養シャーレに、１ｍｌのＴｒｉｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ，２５２００）１ｍｌを加えて３７℃で５分インキュベーションして細胞を単離し、Ｄ−ＭＥＭ（ＷＡＫＯ，０４１−２９７７５），１０％相当のＦｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ−ＢＩＯ，Ｉｎｃ．、ＳＦＢＭ３０−１７９８）及び１％相当のＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＯＣＯ，２５０３０）、ＰｅｎＳｔｒｅｐ（ＧＩＢＯＣＯ，１５１４０）を加えた細胞培養液（９ｍｌ）を加えて１０ｍｌピペット（ＮＵＮＣ，１５９６３３）でピペッティングし、１０ｃｍ細胞培養シャーレ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ，６６４１６０）５枚に各々２ｍｌずつ加えた。さらに、この細胞培養シャーレに、Ｄ−ＭＥＭ（ＷＡＫＯ，０４１−２９７７５），１０％相当のＦｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ−ＢＩＯ，Ｉｎｃ．、ＳＦＢＭ３０−１７９８）及び１％相当のＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＯＣＯ，２５０３０）、ＰｅｎＳｔｒｅｐ（ＧＩＢＯＣＯ，１５１４０）を加えた細胞培養液（８ｍｌ）を加えて計１０ｍｌの細胞培養液とし、３７℃、５％  ＣＯ２の条件で細胞培養器を用いて培養した。
当該細胞を用いて、以下の手順で各細胞においてＳＮＪ−１９４５が細胞内のＬＩＳタンパク質量にどのように影響するかを検討した。具体的には、次のようにしてウエスタンブロットを行うことにより検討した。すなわち、調製した線維芽細胞を蛋白質抽出バッファーで抽出し（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭＥＤＴＡ，０．１  ％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）、蛋白質を定量し、一レーン当たり１０μｇの蛋白質をのせ、１０％アクリルゲルで分離（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）したのちに、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＩＰＶＨ０００１０）に転写し、ＬＩＳ及びＤＩＣ（ｄｙｎｅｉｎ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｃｈａｉｎ：ダイニン量を反映する）を検出した。なお、βアクチンは蛋白質量のリファレンスとして利用するため検出した。なお、当該ウエスタンブロットに用いた抗体は以下の通りである。抗ＬＩＳ１抗体（Ｎ−１９，ＳＣ−７５７７，ヤギポリクローナル抗体、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：１００希釈）、抗細胞質ダイニン中鎖抗体（７４．１，マウスモノクローナル抗体、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；１：１００希釈）、抗βＣＯＰ抗体（マウスモノクローナル抗体、Ｓｉｇｍａ；１：１００希釈）、抗βアクチン抗体（ＳＣ−７２１０，ウサギポリクローナル抗体、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：１００希釈）。
結果を図１に示す。ａに検出されたバンドを、ｂにバンドのインテンシティーをグラフにしたものを示す。Ｌｉｓ１＋／−の細胞ではＬＩＳタンパク質量が著しく低下しているのに対し、ＳＮＪ−１９４５で処理したＬｉｓ１＋／−の細胞ではＬＩＳタンパク質量の回復がみられた。このことから、ＳＮＪ−１９４５により脳滑症を治療し得ることが示された。
ＳＮＪ−１９４５による細胞内のタンパク質局在の変化の検討
ＬＩＳ１遺伝子ヘテロ欠損あるいは野生型マウス（１２．５−１４．５日目の胎児）各々５匹をまとめて一つのグループとし、上述と同様の方法を用いて、線維芽細胞（ＭＥＦ；ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｌｏｂｌａｓｔ）をそれぞれのグループから樹立した。（すなわち、同じ遺伝子型のマウスをまとめて線維芽細胞を確立した。）当該細胞を用いて、以下の手順で免疫細胞染色を行ない、各細胞においてＳＮＪ−１９４５が細胞内のタンパク質局在にどのように影響するかを検討した。
まず、６穴プレート（Ｎｕｎｃ）にあらかじめ０．１Ｎ塩酸で洗浄したスライドガラス（２４×２４  ｍｍ；松浪硝子）を敷き、ＭＥＦ細胞を１．０×１０５細胞／穴になるようにＤ−ＭＥＭ培養液（１０％ウシ胎児血清を含む，和光純薬）中に蒔いた。次いで、この６穴プレートを３７℃、５％ＣＯ２存在下で一晩培養した後、最終濃度が２００μＭになるようにＳＮＪ−１９４５を添加した。さらに２時間、同条件下でインキュベーションした。
対照実験として、１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加し同様の実験を行なった。ＭＥＦ細胞は、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄後、４％パラホルムアルデヒド（ＷＡＫＯ：１６２−１６０６５）で固定した（室温、１５分間）。このＭＥＦ細胞を、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で処理後（室温、１０分間）、５％ウシ血清アルブミン（和光純薬）／ブロックエース（雪印乳業）で室温、１時間ブロッキングした。一次抗体として、抗ＬＩＳ１抗体（Ｎ−１９，ＳＣ−７５７７，ヤギポリクローナル抗体、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：１００希釈）、抗細胞質ダイニン中鎖抗体（７４．１，マウスモノクローナル抗体、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；１：１００希釈）、抗βＣＯＰ抗体（マウスモノクローナル抗体、Ｓｉｇｍａ；１：１００希釈）、をそれぞれブロッキング溶液で希釈し、室温で１時間反応させた。反応後、このＭＥＦ細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、二次抗体としてＡｌｅｘａ５４６抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）あるいはＡｌｅｘａ５４６抗ヤギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１：２０００希釈したものと室温で１時間反応させた。核染色のために、最終濃度が０．２μＭ  になるようにＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｄ１３０６）を添加し、さらに室温で１５分間インキュベーションした。インキュベーション後、この細胞をＰＢＳでよく洗浄し、蛍光顕微鏡観察用グリセロール（Ｍｅｒｃｋ）を用いて包埋した。
また、微小管のマイナス端が集積している部位の位置情報を得るため、中心体のマーカーであるγチューブリンについても同様に免疫染色を行った。抗ガンマチューブリン抗体としては（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  マウスマウスモノクローナル抗体、１：１００希釈）、二次抗体としては蛍光標識された（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｌｅｘａ  ４８８  抗マウスＩｇＧ，１：１０００希釈）を用いた。
共焦点レーザー顕微鏡（ＴＣＳ−ＳＰ５，Ｌｅｉｃａ）にて丁寧に観察を行った後、各々の因子のそれぞれの条件下でのＭＥＦ細胞における細胞内局在を「核周辺に集積している細胞」と「細胞質全体に分布している細胞」に２大別して、それぞれの細胞群に対して１０標本ずつ、１標本当たり１０個の細胞を任意に抽出し、計１００個の細胞について評価し、平均値±標準偏差を算出し、スチューデントｔ−テスト（ｕｎｐａｉｒｅｄ）により有意差検定を行った。結果を図２〜図４に示す。図４中の記号は次の意味を表す；Ｎ．Ｓ．：有意差なし，＊：Ｐ＜０．０５，＊＊：Ｐ＜０．０１，＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
なお、図２ｂ、図３ｂ、図４ｂは、細胞を核辺縁部から細胞の辺縁部まで放射状に十分割し、各々の領域での蛍光強度を測定して（つまり、核辺縁部から細胞の辺縁部まで等間隔で直線状に１０点の蛍光強度を測定して）定量化した結果をグラフ化したものである。蛍光強度は所定の蛋白質の量を反映しており、各々の領域にどれだけの蛋白質が存在しているかを示す。ＬＩＳ１は中心体周辺に多く存在するべきところ、ＬＩＳ１ヘテロ変異マウスから確立した線維芽細胞は中心体周辺であってもＬＩＳ１量が低下している。しかし、ＳＮＪ−１９４５により、ＬＩＳ１量は正常に戻ることがわかる（図２）。
また、細胞質ダイニンは中心体周辺をピークになだらかなスロープを形成しているのに対して、ＬＩＳ１ヘテロ変異マウスから確立した線維芽細胞は中心体周辺をピークに急激に低下しており、細胞周辺では正常に比較して枯渇している。しかし、ＳＮＪ−１９４５により、細胞質ダイニン量も正常に戻ることがわかる（図３）。
また、β−ＣＯＰはゴルジ体（線維芽細胞では中心体周辺に局在している）のマーカーの一つであり、細胞質ダイニンの機能をみる指標として一般的に用いられており、正常では中心体に高い密度をもちつつ、細胞周辺に一定の分散を示す。ＬＩＳ１のヘテロ変異マウスから確立した線維芽細胞では、細胞質ダイニンと同様に細胞の中心に偏在した分布を示す（図４）。この分布異常は細胞質ダイニンの偏在を反映したものであり、ＳＮＪ−１９４５の投与によって細胞質ダイニンの局在が正常化することに伴って分布が正常化しているのがわかる（図４）。
ＳＮＪ−１９４５による小脳顆粒神経細胞の遊走能の変化の検討
ＬＩＳ１遺伝子ヘテロ欠損あるいは野生型マウス（生後３−７日後）の小脳（それぞれ１０匹分）を軽くピペッティングにより組織片を破砕した後、０．０２５％トリプシン（ＧＩＢＣＯ：２５２００）／０．００１３％  ＤＮａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ：ＤＮ−２５）で３７℃、２０分間処理した。遠心後、１０％ウマ血清を含むＢＭＥ培養液（Ｇｉｂｃｏ：２１０１０）を加えて洗浄し、反応を停止した。その後、０．００５２％  ＤＮａｓｅＩ／１０％ウマ血清を含むＢＭＥ培養液を加えてピペッティングし、細胞用メッシュ（Ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒ，径７０μｍ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を通した後、未処理の２４穴プレートに細胞を蒔き、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間プレインキュベーションした。さらに、ＤＮａｓｅＩを含まない１０％ウマ血清を含むＢＭＥ培養液中で、８−１２時間同様にインキュベーションして、小脳顆粒細胞の凝集塊を形成させた。その後、６穴プレート（Ｎｕｎｃ）中に、ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ：Ｐ４７０７）及びラミニン（Ｓｉｇｍａ：Ｌ４５４４）で処理したカバーガラス（２４×２４ｍｍ；松浪硝子）を敷き、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｎ−２  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；Ｇｉｂｃｏ：１７５０２０４８）を含むＢＭＥ培養液中に小脳顆粒神経細胞の凝集塊を移し、最終濃度が２００μＭになるようにＳＮＪ−１９４５を添加した。この凝集塊を１８−２４時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。
対照実験として、１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ，Ｓｉｇｍａ：Ｄ８７７９）を添加し同様の実験を行った。
インキュベーション後、凝集塊をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄後、４％パラホルムアルデヒド（ＷＡＫＯ：１６２−１６０６５）で固定した（室温、１５分間）。次いで、０．２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で処理後（室温、１０分間）、核染色の為に、最終濃度が０．２μＭになるようにＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｄ１３０６）を添加し、さらに室温で１５分間インキュベーションした。その後、ＰＢＳで繰り返しよく洗浄し、凝集塊が壊れないように丁寧に蛍光顕微鏡観察用グリセロール（Ｍｅｒｃｋ）を用いて包埋した。
共焦点レーザー顕微鏡（ＴＣＳ−ＳＰ５，Ｌｅｉｃａ）にて丁寧に観察を行った後、それぞれの細胞群について、小脳顆粒細胞凝集塊の辺縁からの神経細胞の移動した距離（μｍ）を測定し、１０−２１０（μｍ）を２０（μｍ）ずつに分けて、それぞれの移動距離の範囲内に分布する細胞数を全体の細胞数に対するパーセントで表した。また、平均移動距離（μｍ）を算出し、平均移動距離（μｍ）±標準偏差で表した。有意差検定は、スチューデントｔ−テスト（ｕｎｐａｉｒｅｄ）により行った。結果を図５に示す。
図５に示されるように、Ｌｉｓ１＋／−の神経細胞はほとんど遊走しないのに対し、ＳＮＪ−１９４５で処理したＬｉｓ１＋／−の神経細胞では遊走能の回復がみられた。
このことから、ＳＮＪ−１９４５により脳滑症を治療し得ることが示された。
ＳＮＪ−１９４５腹腔内投与によるマウス胎児脳でのＬＩＳ１蛋白質の変化の検討
ホモ型のＥＩＩ−Ｃｒｅ形質転換マウス（ＦＶＢ／Ｎ−Ｔｇ（ＥＩＩａ−ｃｒｅ）Ｃ５３７９Ｌｍｇｄ／Ｊ、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の雌５匹に対して、ｎｅｏ遺伝子を持たないｎｅｏ（−）１２９Ｓ−Ｐａｆａｈ１ｂ１ｔｍ２Ａｗｂ／Ｊホモマウスの雄１匹を同一のマウスケージで飼育することで交配させ、このマウスケージを計６セット用意して交配実験を開始した。なお、ｎｅｏ（−）１２９Ｓ−Ｐａｆａｈ１ｂ１ｔｍ２Ａｗｂ／Ｊホモマウスは、上述の方法と同様にして作製した。毎朝７−１０時の間にプラーク確認（交尾の確認）を行い、妊娠周期を決定した。ＳＮＪ−１９４５を１００ｍｇ／ｍｌの濃度でｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ，Ｓｉｇｍａ：Ｄ８７７９））に溶かし、胎生１２日（Ｅ１２）の時点で妊娠母体の腹腔内に投与量が１００μｇ／体重ｇになるように注入（腹腔内投与）した。
ＳＮＪ−１９４５の投与による効果を判定するために、正常マウス胎児、及びＬＩＳ１ヘテロ変異マウス胎児（ＳＮＪ−１９４５投与）のＬＩＳ１の蛋白質を測定した。
ＳＮＪ−１９４５投与群においては、時間経過に伴うＳＮＪ−１９４５の効果を判定するために、投与後０時間（投与直後）、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、及び７２時間の各時間後に脳組織を取り出してＬＩＳ１の蛋白質を測定した。なお、ＬＩＳ１蛋白質の各測定には、マウスを６匹ずつ用いた（ｎ＝６）。
母体を頸椎脱臼によって死亡させた後、直ちに胎児を分離し脳組織を単離した。ＬＩＳ１の蛋白質量の測定はマウス脳を取り出した後、直ちに重量を測定し、マウス脳の重量に対して２倍量の蛋白質溶解液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ．６．８，１．５％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ），０．３％  ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ（ＢＰＢ，Ｓｉｇｍａ：Ｂ５５２５−１０Ｇ）），０．３％  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏ−ｅｔｈａｎｏｌ（２−ＭＥ，ＷＡＫＯ：１３５−０７５２２），１５％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を加え、さらに超音波処理によって完全に可溶化させた。９５℃、５分間の熱処理の後、脳組織に由来する蛋白質溶解液１μｌを１２．５％のＳＤＳ−アクリルアミド電気泳動によって分離し、抗ＬＩＳ１抗体（Ｎ−１９，ＳＣ−７５７７，ヤギポリクローナル抗体、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：１００希釈））を用いたウエスタンブロティングによって検出した。
結果を図６に示す。ＬＩＳ１ヘテロ変異マウス胎児のＬＩＳ１タンパク質量は正常マウス胎児の半分程度であるが、ＳＮＪ−１９４５投与により正常程度にまで回復した。また、一回の投与により、その効果は少なくとも３日間持続することが解った。
このことから、ＳＮＪ−１９４５により脳滑症を治療し得ることが示された。
ＳＮＪ−１９４５経口投与によるマウス新生児脳でのＬＩＳ１蛋白質の変化の検討
ホモ型のＥＩＩ−Ｃｒｅ形質転換マウス（ＦＶＢ／Ｎ−Ｔｇ（ＥＩＩａ−ｃｒｅ）Ｃ５３７９Ｌｍｇｄ／Ｊ、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の雌５匹に対して、ｎｅｏ遺伝子を持たないｎｅｏ（−）１２９Ｓ−Ｐａｆａｈ１ｂ１ｔｍ２Ａｗｂ／Ｊホモマウスの雄１匹を同一のマウスケージで飼育することで交配させ、このマウスケージを計６セット用意して交配実験を開始した。毎朝出産を確認し、出産確認時を新生児と定義した。ＳＮＪ−１９４５を１００ｍｇ／ｍｌの濃度でｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）に溶かし、投与量が２００μｇ／体重ｇになるようにピペットを用いて経口で投与した。
ＳＮＪ−１９４５の投与による効果の判定のために、正常マウス新生児、及びＬＩＳ１ヘテロ変異マウス新生児（ＳＮＪ−１９４５投与）のＬＩＳ１の蛋白質を測定した。ＳＮＪ−１９４５投与群においては、時間経過に伴うＳＮＪ−１９４５の効果を判定するために、投与後０時間（投与直後）、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間の各時間後に脳組織を取り出してＬＩＳ１の蛋白質を測定した。なお、ＬＩＳ１蛋白質の各測定には、それぞれマウスを６匹ずつ用いた（ｎ＝６）。
新生児マウスを断頭して死亡させた後、直ちに脳組織を単離した。ＬＩＳ１の蛋白質量の測定は、マウス脳を取り出した後、直ちに重量を測定しマウス脳の重量に対して２倍量の蛋白質溶解液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ．６．８，１．５％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ），０．３％  ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ（ＢＰＢ），０．３％  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏ−ｅｔｈａｎｏｌ（２−ＭＥ），１５％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を加え、さらに超音波処理によって完全に可溶化させた。９５℃、５分間の熱処理の後、脳組織に由来する蛋白質溶解液１μｌを１２．５％のＳＤＳ−アクリルアミド電気泳動によって分離し、抗ＬＩＳ１抗体（Ｎ−１９，ＳＣ−７５７７，ヤギポリクローナル抗体、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：１００希釈）を用いたウエスタンブロティングによって検出した。
結果を図７に示す。ＬＩＳ１ヘテロ変異マウス新生児のＬＩＳ１タンパク質量は正常マウス新生児の半分程度であるが、ＳＮＪ−１９４５投与により正常程度にまで回復した。また、一回の投与により、その効果は少なくとも３日間持続することが解った。
このことから、出生後であっても、ＳＮＪ−１９４５の経口投与により脳滑症を治療し得ることが示された。
ＳＮＪ−１９４５腹腔内投与によるマウス成体脳でのＬＩＳ１蛋白質の変化の検討
ＬＩＳ１−テロ変異マウスに対してＳＮＪ−１９４５を１００ｍｇ／ｍｌの濃度でｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）に溶かし、生後３週間の時点で投与量が１００μｇ／体重ｇになるように腹腔内に注入した。
ＳＮＪ−１９４５の投与による効果の判定のために、正常マウス成体、及びＬＩＳ１ヘテロ変異マウス成体（ＳＮＪ１９４５投与）のＬＩＳ１の蛋白質を測定した。ＳＮＪ−１９４５投与群においては、時間経過に伴うＳＮＪ−１９４５の効果を判定するために、投与後０時間（投与直後）、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間の各時間後に脳組織を取り出してＬＩＳ１の蛋白質を測定した。なお、ＬＩＳ１蛋白質の各測定には、それぞれマウスを６匹ずつ用いた（ｎ＝６）。
生体マウスを頸椎脱臼によって死亡させた後、脳組織を直ちに単離した。ＬＩＳ１の蛋白質量の測定は、マウス脳を取り出した後、直ちに重量を測定しマウス脳の重量に対して２倍量の蛋白質溶解液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ．６．８，１．５％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ），０．３％  ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ（ＢＰＢ），０．３％  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏ−ｅｔｈａｎｏｌ（２−ＭＥ），１５％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を加え、さらに超音波処理によって完全に可溶化させた。９５℃、５分間の熱処理の後、脳組織に由来する蛋白質溶解液１μｌを１２．５％のＳＤＳ−アクリルアミド電気泳動によって分離し、抗ＬＩＳ１抗体（Ｎ−１９，ＳＣ−７５７７，ヤギポリクローナル抗体、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：１００希釈）を用いたウエスタンブロティングによって検出した。
結果を図８に示す。ＬＩＳ１ヘテロ変異マウス成体のＬＩＳ１タンパク質量は正常マウス成体の半分程度であるが、ＳＮＪ−１９４５投与により正常程度にまで回復した。また、一回の投与により、その効果は少なくとも３日間持続することが解った。
このことから、出生後であっても、ＳＮＪ−１９４５の投与により脳滑症を治療し得ることが示された。
ＳＮＪ−１９４５腹腔内投与によるマウス胎児脳のアポトーシスに与える影響の検討
ホモ型のＥＩＩ−Ｃｒｅ形質転換マウス（ＦＶＢ／Ｎ−Ｔｇ（ＥＩＩａ−ｃｒｅ）Ｃ５３７９Ｌｍｇｄ／Ｊ、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の雌５匹に対して、ｎｅｏ遺伝子を持たないｎｅｏ（−）１２９Ｓ−Ｐａｆａｈ１ｂ１ｔｍ２Ａｗｂ／Ｊホモマウスの雄１匹を同一のマウスケージで飼育することで交配させ、このマウスケージを計６セット用意して交配実験を開始した。毎朝７−１０時の間にプラーク確認（交尾の確認）を行い、妊娠周期を決定した。ＳＮＪ−１９４５を１００ｍｇ／ｍｌの濃度でｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）に溶かし、隔日でＥ９．５日（妊娠９．５日）より１００μｇ／体重ｇを、ＬＩＳ１変異マウス（Ｌｉｓ１＋／−）およびコントロールマウス（正常胎児マウス）の妊娠マウス母体の腹腔内に投与した。Ｅ１５．５（妊娠１５．５日）において、マウス母体を頸椎脱臼によって死亡させた後、マウス胎児を取り出し４％パラホルムアルデヒド（ＷＡＫＯ：１６２−１６０６５）で２４時間固定し、ＰＢＳに置換後、乗法に従ってパラフィン包埋を行った。組織ブロックを５μｍ厚の切片にし、ＡＰＳコートのスライドグラスの上に接着させた。
脱パラフィン操作の後、２０μｇ／ｍｌのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ／ＰＢＳ処理を室温で１５分行い３％のＨ２Ｏ２／ＰＢＳ処理を室温で１０分行った。ＡｐｏｐＴａｇ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：Ｓ７１００）を用いてＴＵＮＮＥＬ（ＴｄＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄＵＴＰ  ｎｉｃｋ  ｅｎｄｌａｂｅｌｉｎｇ）ｓｔａｉｎを行いアポトーシスを検出した。なお、ＴＵＮＮＥＬ  ｓｔａｉｎは断片化ＤＮＡを検出することによりアポトーシスを検出することができる方法として知られている。
結果を図９に示す。正常マウスではほとんどアポトーシスは見られないが、ＬＩＳ１変異マウスでは高頻度にアポトーシスが見られた。さらに、ＳＮＪ−１９４５の投与により、ＬＩＳ１変異マウスに見られるアポトーシスは有意に軽減することがわかった。このことから、ＳＮＪ−１９４５の投与により滑脳症の症状が軽減され得ると考えられた。
滑脳症モデルマウス（ＬＩＳ１遺伝子ヘテロ欠損マウス）の行動解析
滑脳症患者は、運動機能が著しく低下している。そこで、滑脳症の治療効果を確認するため、滑脳症モデルマウスの運動機能を指標とした検討を行った。
＜行動解析実験用マウスの準備＞
行動解析実験に当たり、野生型マウスとＬｉｓ１（＋／−）のヘテロ変異体マウスを５つの群（Ｃ群、Ｍ１群、Ｍ２群、Ｍ３群、及びＭ４群）へと群分けした。各群に属するマウスの詳細は、次の通りである。なお、餌としては（ＣＥ−２、日本クレア）を用いた。使用した野生型マウス及びヘテロマウスの作製方法は、上述の「ＬＩＳ１遺伝子ヘテロ欠損型マウス（ＬＩＳ１ヘテロ変異マウス）の作製」と同様である。
Ｃ群：コントロール群の野生型マウス
Ｍ１群：ＳＮＪ−１９４５の非投与のＬｉｓ１ヘテロマウス
Ｍ２群：ＳＮＪ−１９４５を１００ｍｇ／ｍｌの濃度でｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ  Ｄ−５８７９）に溶かし、胎生９．５日（Ｅ９．５）の時点で、投与量が２００μｇ／母体体重ｇ／日になるよう、妊娠母体の餌にＳＮＪ−１９４５を加えて投与し、さらに出生後は下記Ｍ３群と同様の投与を行った、Ｌｉｓ１ヘテロマウス
Ｍ３群：生後当日より０．５％ＣＭＣ（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ：和光０３９−０１３３５）にＳＮＪ−１９４５を５０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解したものを２００μｇ／体重ｇ／日になるように強制経口投与を行い、さらに生後２１日目からは投与量が２００μｇ／体重ｇ／日になるように餌にＳＮＪ−１９４５を加えたものを投与した、Ｌｉｓ１ヘテロマウス
Ｍ４群：生後１０日目より０．５％ＣＭＣ（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）にＳＮＪ−１９４５を５０  ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解したものを２００μｇ／体重ｇ／日になるように強制経口投与を行い、さらに生後２１日目からは投与量が２００μｇ／体重ｇ／日になるように餌にＳＮＪ−１９４５を加えたものを投与した、Ｌｉｓ１ヘテロマウス
食餌（ＣＥ−２、日本クレア）にＳＮＪ−１９４５を混ぜ、ＳＮＪ−１９４５投与量が２００μｇ／体重ｇ／日になるように継続的に各マウスに経口投与した。行動解析実験は、各群１２〜１６匹のマウスを用意し、行動実験施設で１〜２週間予備飼育した後、約９週齢から１２週齢の期間に行った。行動解析実験終了後は、遺伝子型の判定を行い、全てのマウスについて遺伝子型を確認した。
なお、行動解析の結果が各群の違いに起因することを保証するため、行動解析開始前に、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の点において、異常を示すマウスがいないことを確認した。
（ｉ）健康状態
直腸温測定、体重測定を行い、直腸温や体重において各群に異常、有意差がないことを確認した。また、ひげの状態（ひげが短くなっていないか、なくなっていないか）、体毛の状態（体毛がはげていないか、毛並みがきちんと整えられているか）の確認を行った。問題のある個体はいなかった。
（ｉｉ）神経学的な異常神経学的な異常がないか、以下の項目について確認した。
Ｒｉｇｈｔｉｎｇ  Ｒｅｆｌｅｘ（ひっくり返して元に戻るか）
Ｗｈｉｓｋｅｒ−Ｔｗｉｔｃｈ（ひげを触ったときに、振り返る等の反応があるか）
Ｅａｒ−Ｔｗｉｔｃｈ（耳を触ったときに、振り返る等の反応があるか）
Ｒｅａｃｈｉｎｇ（宙づりしたときに前の机に手を伸ばすか、視覚の確認）
Ｋｅｙ  Ｊａｎｇｌｉｎｇ（鍵束を振る音への反応があるか、聴覚、痙攣感受性の確認）。
これらの項目について、反応に異常があるマウスはいなかった。
（ｉｉｉ）握力と筋力
握力測定と筋力測定を行い、握力、筋力に問題がないか、以下の項目について確認した。
Ｗｉｒｅ  ｈａｎｇ  ｔｅｓｔ（マウスを金網にしがみつかせてから、金網をひっくり返すテスト）
Ｇｒｉｐ  Ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｔｅｓｔ（マウスを金網にしがみつかせて引っ張り、マウスの筋力を測定するテスト）
これらの試験の結果、各群には有意な差はなく、握力や筋力に問題がないことがわかった。
（ｉｖ）不安様行動
不安様行動のテストとして、明暗選択テストを行った。明るい箱と暗い箱が、一か所で接続されている装置を用意し、マウスを暗箱の中に置く。マウスは一般的に暗い場所を好むが、探索行動を行うために明るい箱にも侵入する。１０分間に明箱と暗箱にそれぞれ滞在していた時間、明箱と暗箱を行き来した回数、最初に明箱に入るまでの潜時、移動距離を測定した。明箱の滞在時間が短い、行き来した回数が少ない、最初に明箱に入るまでの潜時が長いなどのときは、不安様行動が亢進していると考えられる。実験の結果、各群に有意差がなく、また、明箱、暗箱それぞれの滞在時間に差がなかった。不安様行動は亢進していないと考えられ、実験環境、実験者等に訓化していることが確認できた。
＜統計処理＞
マウスの行動解析実験データの統計処理は、統計ソフトＳｔａｔ  Ｖｉｅｗ（ＳＡＳ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いて行った。前記５群全体についてＡＮＯＶＡ解析（多群の分散分析）を行い、危険率（ｐ値）が５％以下（ｐ＜０．０５）のものについて有意差ありと判定した。ＡＮＯＶＡ解析で比較対象決定後の多重比較（事後比較）には、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ＰＬＳＤ法を用いた。
＜行動解析実験１：ローターロッドテスト＞
協調運動・運動学習のテストとして、ローターロッドテストを行った。当該テストの概要は次の通りである。円柱状の棒（ロッド）が一定の速度で回転する装置を用意し、マウスを回転するロッドにのせると、マウスは落ちないようにロッドの上を歩く。ロッドの回転スピードを５分間の間で、５ｒｐｍから４０ｒｐｍまで加速していった。１試行は、マウスがロッドから落ちるか、５分が経過するまで行った。実験は１日３試行で２日間（合計６試行）行った。試行を繰り返すにつれ、マウスはロッドからなかなか落ちなくなるため、ロッドの上での滞在時間が長くなる。運動学習能力が減少している（劣る）マウスは、ロッドから落ちないような運動の上達が悪くなり、ロッドの上での滞在時間が長くならない。実験の結果、Ｃ群が、もっとも運動の上達が早く、滞在時間が長かった（図１０、１１）。Ｍ１群はＣ群と比べて、運動の上達が遅く、滞在時間が有意に減少しており、よって運動学習能力が減少していることがわかった（図１０、１１）。ＳＮＪ−１９４５投与を行ったＭ２、Ｍ３群は、運動の上達曲線がＭ１群とＣ群の中間にあり（図１０）、総合滞在時間は、Ｃ群と有意差がないレベルまで長くなっており、ＳＮＪ−１９４５の経口投与による運動学習能力の改善が確認できた（図１１）。
＜行動解析実験２：Ｇａｉｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ＞
運動機能の異常や小脳失調などを調べるため、歩行（足跡）を解析するテスト（Ｇａｉｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。具体的には、２４ｃｍ／秒で回転する透明なトレッドミル上にマウスを乗せて、歩行させ、下から高速カメラ（１５０  ｆｌａｍｅ／秒）で撮影して足跡を専用ソフト（ＤｉｇｉＧａｉｔ，ＭＯＵＳＥ  ＳＰＥＣＩＦＩＣＳ，Ｉｎｃ．）で解析した。このテストで、歩幅や足の角度の他、足の付き方や離れ方など多種の指標を評価した。
〔Ｇａｉｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓの主な解析項目〕
・Ｓｗｉｎｇ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ：足が空中に浮いている時間
・％Ｓｗｉｎｇ：一歩踏み出す動作において、足が空中に浮いている時間の割合
・Ｂｒａｋｉｎｇ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ：ベルトに足がついてから、完全に足がベルトに密着するまでの時間
・％Ｂｒａｋｉｎｇ：一歩踏み出す動作において、ベルトに足がついてから、完全に足がベルトに密着するまでの時間の割合
・％Ｂｒａｋｅ  ｏｆ  Ｓｔａｎｃｅ：足がベルトに接している動作において、ベルトに足がついてから、完全に足がベルトに密着するまでの時間の割合
・Ｐｒｏｐｕｌｓｉｏｎ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ：完全に足がベルトに密着してから、足がベルトから離れる直前までの時間
・％Ｐｒｏｐｕｌｓｉｏｎ：一歩踏み出す動作において、完全に足がベルトに密着してから、足がベルトから離れる直前までの時間の割合
・％Ｐｒｏｐｅｌ  ｏｆ  Ｓｔａｎｃｅ：足がベルトに接している動作において、完全に足がベルトに密着してから、足がベルトから離れる直前までの時間の割合
・Ｓｔａｎｃｅ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ：足がベルトに接している時間
・％Ｓｔａｎｃｅ：一歩踏み出す動作において、足がベルトに接している時間の割合
・Ｓｔｒｉｄｅ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ：一歩踏み出すのにかかる時間
・Ｓｗｉｎｇ−ｔｏ−ｓｔａｎｃｅ  ｒａｔｉｏｎ：足が空中に浮いている時間と足がベルトに接している時間の比
有意差があったのは、％Ｓｗｉｎｇ（一歩踏み出す動作において、足が空中に浮いている時間の割合）とＳｗｉｎｇ−ｔｏ−ｓｔａｎｃｅ  ｒａｔｉｏ（足が空中に浮いている時間と足がベルトに接している時間の比）であった。そこで、これらを指標とした検討を行うこととした。なお、％Ｓｗｉｎｇは、関節炎などがある動物の場合、値が上昇することが知られている。これは、空中で足を踏み出す場合に、関節がスムーズに動かないためと考えられている。
Ｃ群に比べて、Ｍ１群は有意に％Ｓｗｉｎｇが上昇しており、足を踏み出す運動機能に異常があると考えられた（図１２）。ＳＮＪ−１９４５投与を行ったＭ２，Ｍ３，Ｍ４群は、Ｃ群と有意差がなく、運動機能の改善が確認できた。Ｓｗｉｎｇ−ｔｏ−ｓｔａｎｃｅ−ｒａｔｉｏは、歩き方が変わる時に変化する値で、走っている状態に近づくほど１に近くなる。Ｃ群に比べて、Ｍ１群は有意にＳｗｉｎｇ−ｔｏ−ｓｔａｎｃｅ−ｒａｔｉｏが減少し、１に近づいているが、ＳＮＪ−１９４５を投与したＭ２群は、Ｃ群と有意差がないレベルに戻り、Ｍ３及びＭ４群でもＭ１群に比べ１に近づいていた（図１３）。これらの結果から、胎児期、および生後のＳＮＪ−１９４５の経口投与による運動機能の改善が確認できた。
ヒト滑脳症患者由来細胞の解析
＜ヒト滑脳症患者の遺伝子診断＞
滑脳症患者および両親より血液１ｍｌを採取し、１．５ｍｌ用のサンプルカップ（Ｂｉｏ−ＢＩＫ：ＳＣ−０１５）用いて４℃、３０００回転／分で遠心分離を行った。白血球を含む沈殿表層を５０μｌ採取し、ＤＮＡ抽出ｂｕｆｆｅｒ  ２５０μｌ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．５％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ，１０ｍＭ  ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ，Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  １０μｇ／ｍｌ（Ｒｏｃｈｅ  ０３−１１５−８５２−００１））に溶解し、３７℃で１時間反応させた。その後、Ｐｈｅｎｏｌ  １００μｌ、Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ  １００μｌを加え、激しく混和したのち４℃、１５，０００回転／分で５分間遠心分離を行った。上清２５０μｌを新たな１．５ｍｌ用のサンプルカップ（Ｂｉｏ−ＢＩＫ：ＳＣ−０１５）に移し、３Ｍ酢酸ナトリウム３０μｌ、エタノール７００μｌを加え、混和したのち４℃、１５，０００回転／分で５分間遠心分離を行った。上清を捨て、沈殿したＤＮＡを溶解バッファー１００μｌ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）に溶かし、遺伝子診断に用いた。
遺伝子診断は、ｔｃｔａａａａｔａｇ  ｔｔａｔｃｃｔｔｔｇ  ｔｔａｃとａｇｇｔｇａａｔａａａｇｇａａｃａｃｔｇｔａｃａをプライマーとしてＰＣＲで遺伝子を増幅して行った。患者のＤＮＡ  １μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  １μｌ，１００μＭ  プライマー１μｌ，ＢＩＯＴＡＧ（Ｂｉｏｌｉｎｅ  Ｂｉｏ２１０４０）０．５μｌを計５０μｌの反応液に加え、９４℃：２０秒、５５℃：３０秒、７２℃：６０秒を３５サイクル回すＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ９７００）で増幅し、ＤＮＡの塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定はｔｃｔａａａａｔａｇ  ｔｔａｔｃｃｔｔｔｇ  ｔｔａｃとａｇｇｔｇａａｔａａａｇｇａａｃａｃｔｇｔａｃａをプライマーとしてＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＃４３３６９１７）を用いて行った。サイクルシーケンスは、９４℃：２０秒、５５℃：３０秒、６０℃：４分を３５サイクル（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ９７００）で行い、反応物をＡＢＩ  ３５００ｘＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で判読した。その結果、タンパク質翻訳領域の４６０番目のｃｙｔｏｓｉｎｅがｔｈｙｍｉｎｅに置き換わっており、これによりストップコドンが生じ、タンパク質の翻訳がそこで終了することによって機能的に不活性なＬＩＳ１ができることが分かった（図１４）。
＜ヒト滑脳症患者由来線維芽細胞の確立＞
線維芽細胞の確立は次のようにして行った。即ち、無菌的に上記滑脳症患者から表皮の一部（５ｍｍ四角）を提供してもらい、培養液（Ｅ−ＭＥＭ（和光０５１−０７６１５）、１０％  ウシ胎児血清（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ  Ｉｎｃ、ＳＦＢＭ３０−１７９８、１ｘＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ  ２５０３０），１ｘＰｅｎ  Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ  １５１４０）；以下、培養液として当該組成のものを使用した）中に保存して室温で４時間輸送した。輸送後、組織片を１ｍｍ四角に裁断し、培養フラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ３５３００９）に固着させ、培養液６ｍｌ中で３週間培養した。３週間培養の後、組織片からの線維芽細胞が増殖を確認の後、（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ（−）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．４）で洗浄しＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ  ２５２００）を０．５ｍｌ加えて３７℃で５分間反応させ細胞を分離したのち、培養液を１０ｍｌ加え、１０ｃｍシャーレ（Ｇｒｅｉｎｅｒ６６４−１６０）に移して培養した。
＜細胞蛍光免疫染色＞
細胞を顕微鏡で観察するために、カバーガラス上で細胞を培養した。カバーガラス（２４ｘ２４  Ｎｏ．１、マツナミ）を、０．１Ｍ塩酸に２０分浸けて、水洗後、７０％エタノールにいれてクリーンベンチ内で保存した。クリーンベンチ内で６ｗｅｌｌプレート（ＦＡＬＣＯＮ  ３５３０４６）の各ｗｅｌｌ底に当該カバーガラスを一枚ずつ置き、エタノールを乾燥させた後、１ｗｅｌｌあたり０．５ｘ１０５個の線維芽細胞を添加し、１６時間培養して、カバーガラス上に細胞を接着させた。
ＳＮＪ−１９４５含有培養液を用意した。具体的には、ＤＩＭＥＴＨＹＬ  ＳＵＬＦＯＸＩＤＥ（ＳＩＧＭＡ  Ｄ−５８７９）に溶解したＳＮＪ−１９４５を培養液に最終濃度２００μＭとなるように混合し、１時間３７℃に静置し、ＳＮＪ−１９４５を培地に溶解させて、ＳＮＪ−１９４５含有培養液とした。上述の６ｗｅｌｌプレートで培養した細胞に対し、ｗｅｌｌ中の培地を捨てた後ＳＮＪ−１９４５含有培養液を２ｍｌ／ｗｅｌｌで加えて、２時間培養を行った。またコントロールとして、同量のＤＩＭＥＴＨＹＬ  ＳＵＬＦＯＸＩＤＥを添加した培養液を用いて、同様に培養を行った。
２時間培養後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ（−）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．４）で洗浄し、４％  Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（ＰＦＡ）ｉｎ  ＰＢＳ（−）（和光  １６３−２０１４５）を加え、室温で１５分おいて、細胞を固定した。ＰＢＳ（−）で洗浄し、０．２％  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎ（１０）Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ  Ｅｔｈｅｒ，和光  １６８−１１８０５）ｉｎ  ＰＢＳ（−）を加え、室温で１０分おいて、細胞の浸透化を行った。さらに細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ３１５６−５Ｇ）、４％  ブロックエース粉末（雪印乳業株式会社）、ＰＢＳ（−））を添加し、室温で一時間おいて、非特異的結合をブロックできるようにした（ブロッキング処理）。一次抗体は、１５０００ｒｐｍ、４℃、５分遠心したものの上清をＢｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎで１００倍希釈して使用した。
Ｗｅｔ  ｃｈａｍｂｅｒにパラフィルムをひいて、抗体溶液を３００μｌのせ、カバーガラスの細胞面が下になるように当該抗体溶液上において、室温で１時間静置して反応させた。ＰＢＳ（−）を入れた６ｗｅｌｌプレートに細胞の接着したカバーガラスを戻し、５分間振とうする洗浄を４回繰り返した。二次抗体と、核を染色するための色素１０ｍＭ  ＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ，同仁  ２８７１８−９０−３）は、１５０００ｒｐｍ、４℃、５分遠心したものの上清をＰＢＳ（−）で１０００倍（ＤＡＰＩは５００倍）希釈し、１ｗｅｌｌあたり１．５ｍｌ加えて、遮光し、室温で１時間ゆっくり振とうさせながら反応させた。ＰＢＳ（−）を加えて、５分振とうする洗浄を４回繰り返した。スライドガラス（蛍光染色用Ｓ０３１８、マツナミ）に封入液（Ｆｌｕｏｒ  Ｓａｖｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）を一滴ずつ滴下し、細胞面が下になるようにカバーガラスをかぶせて封入した。空気の侵入を防ぐために、カバーガラスの周囲をラッカーで密封した。３０分〜１時間程度固定して、カバーガラス表面を、水を含ませた麺棒で洗浄した後、エタノールを含ませた麺棒でクリーニングを行い、観察試料とした。
なお、蛍光染色用に用いた抗体の一覧を以下の表２に示す。
【表２】
2012074120.tif 000082
＜共焦点顕微鏡観察＞
蛍光免疫染色を行った細胞の観察を共焦点顕微鏡（ＴＣＳ  ＦＰ５Ｓ，Ｌｅｉｃａ）で行った。３種類のレーザー（Ｄｉｏｄｅ  ４０５  ｎｍ，Ａｒｇｏｎ  ４８８ｎｍ  出力３０％，ＨｅＮｅ  ５４３ｎｍ）を用いて、蛍光色素を励起し、油振対物レンズ（ＨＣＸ  ＰＬ  Ａｐｏ  ｌａｍｂｄａ  ｂｌｕｅ  ６３ｘ１．４  Ｏｉｌ）を使用して観察した。画像の撮影には専用ソフトウェア（ＬＡＳ  ＡＦ，Ｌｅｉｃａ）を使い、Ｚｏｏｍｘ２，５１２ｘ５１２  ｐｉｘｅｌ，ｓｃａｎ  ｓｐｅｅｄ  ４００Ｈｚ，ｆｒａｍｅ  ａｖｅｒａｇｅ  ４の条件で撮影した。細胞の境界は、微分干渉像を同時に撮影して得た。撮影画像は、ＬＩＦ（Ｌｅｉｃａ  Ｉｍａｇｅ  Ｆｏｒｍａｔ）ファイルから、ＴＩＦＦ形式のファイルに変換して画像解析を行った。蛍光顕微鏡画像の解析は、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いて行った。
〔ＬＩＳ１の分布：図１５及び図１６〕
抗Ｌｉｓ１抗体を用いて蛍光免疫染色した培養細胞を用いて、ＬＩＳ１の細胞内の分布を観察した。その結果、正常なＬｉｓ１（＋／＋）細胞では、ＬＩＳ１は、核および中心体周辺に局在しており、細胞辺縁部には、ほとんど見られなかった。Ｌｉｓ１（＋／−）細胞では、Ｌｉｓ１（＋／＋）細胞で見られた核周辺へのＬＩＳ１の集積が失われ、核周辺から細胞辺縁部まで、一様に分布していた。特にＬｉｓ１（＋／＋）細胞ではほとんど見られなかった、細胞の縁に沿った分布が顕著に観察された。このＬｉｓ１（＋／−）細胞をＳＮＪ−１９４５で処理すると、再びＬｉｓ１（＋／＋）と同様に、核および中心体周辺へＬＩＳ１が集積することが確認できた。このことから、ＳＮＪ−１９４５処理によって、ヒト滑脳症患者由来細胞のＬＩＳ１の細胞内分布を、正常な細胞と同様の分布へと回復させることができることがわかった。
〔細胞質ダイニンの分布：図１７及び図１８〕
抗ＤＩＣ（細胞質ダイニン中間鎖）抗体を用いて蛍光免疫染色した培養細胞を用いて、細胞質ダイニンの細胞内の分布を観察した。その結果、Ｌｉｓ１（＋／＋）細胞では、細胞質ダイニンは、核および中心体周辺から、細胞辺縁部にかけて、ゆるやかな勾配を持ちながら、全体に分布していた。一方、Ｌｉｓ１（＋／−）細胞では、周辺部への細胞質ダイニンの拡散が失われて、核および中心体周辺に細胞質ダイニンの強い局在が見られた。このＬｉｓ１（＋／−）細胞をＳＮＪ−１９４５で処理すると、再びＬｉｓ１（＋／＋）細胞と同様に、核周辺から細胞辺縁部にかけて、細胞質ダイニンが全体に分布するようになった。このことから、ＳＮＪ−１９４５処理によって、ヒト滑脳症患者由来細胞の細胞質ダイニンの細胞内分布を、正常な細胞と同様の分布へと回復させることができることがわかった。
〔β−ＣＯＰ小胞の分布：図１９及び図２０〕
β−ＣＯＰ小胞の細胞内の分布を、抗β−ＣＯＰ抗体を用いて観察した。その結果、Ｌｉｓ１（＋／＋）細胞では、β−ＣＯＰ小胞は、核および中心体周辺から、細胞辺縁部にかけて、ゆるやかな勾配を持ちながら、全体にほぼ均一に分布していた。Ｌｉｓ１（＋／−）細胞では、核周辺以外へのβ−ＣＯＰ小胞の拡散が失われて、核および中心体周辺に大きくβ−ＣＯＰ小胞が局在していた。このＬｉｓ１（＋／−）細胞をＳＮＪ−１９４５で処理すると、再びＬｉｓ１（＋／＋）細胞と同様に、核周辺から細胞辺縁部にかけて、β−ＣＯＰ小胞がほぼ一様に分布するようになった。このことから、ＳＮＪ−１９４５処理によって、ヒト滑脳症患者由来細胞のβ−ＣＯＰ小胞の細胞内分布を、正常な細胞と同様の分布へと回復させることができることがわかった。
なお、図１６、１８、２０は、図２ｂ、図３ｂ、図４ｂと同様の解析結果を示すグラフである。すなわち、具体的には、次のようにして作成したグラフである。ＬＩＳ１、細胞質ダイニン、β−ＣＯＰ小胞それぞれの細胞内局在を、核辺縁部から細胞の辺縁部まで等間隔で直線状に１０点の蛍光強度を測定した。各条件においてそれぞれ２０個の細胞を計測し、各点の蛍光強度は細胞全体の蛍光強度を１として規格化した値をグラフ化した。誤差線は標準誤差を示す。
ＬＩＳ１の分布は、正常な細胞で核周辺部に集積し、Ｌｉｓ１（＋／−）細胞では、細胞全体に拡散してしまうが、ＳＮＪ−１９４５処理によって、正常な細胞と同レベルまで核周辺部への集積が回復した（図１６）。細胞質ダイニンとβ−ＣＯＰ小胞は、正常な細胞では細胞全体に分布しているが、Ｌｉｓ１（＋／−）細胞では、細胞核周辺部への集積が起こる。ＳＮＪ−１９４５処理によって、正常な細胞と同様の細胞内分布に回復させることができた（図１８、２０）。
＜タンパク質定量＞
〔細胞抽出液の調製〕
クリーンベンチ内で６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり３ｘ１０５個の細胞を添加し、１６時間培養し、プレートの各ｗｅｌｌに細胞を接着させた。Ｗｅｌｌ中の培地を捨て、上記ＳＮＪ−１９４５含有培養液（ＤＩＭＥＴＨＹＬ  ＳＵＬＦＯＸＩＤＥにＳＮＪ−１９４５を溶解させたものを、ＳＮＪ−１９４５終濃度が２００μＭとなるよう加えた培養液）を２ｍｌ／ｗｅｌｌの割合で加え、２時間培養を行った。またコントロールとして、同量のＤＩＭＥＴＨＹＬ  ＳＵＬＦＯＸＩＤＥ（ＳＩＧＭＡ  Ｄ−５８７９）を添加した培地を用いて同様に培養を行った。
ＳＮＪ−１９４５を添加して２時間培養した後、細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ＰＢＳ（−）５００μｌを加えて、セルスクレイパーで細胞を掻き取った。１．５ｍｌチューブに回収し、１５０００ｒｐｍ、５分、４℃で、遠心し、上清を捨て、細胞の沈澱を得た。ＰＢＳ（−）５００μｌを、細胞を掻きとったあとのｗｅｌｌに入れて、再度セルスクレイパーで残った細胞を掻き取り、沈殿に加えた。１５０００ｒｐｍ、５分、４℃で、遠心し、上清を捨て、細胞の沈澱を得た。さらに、ＰＢＳ（−）５００μｌを、細胞を掻きとったあとのｗｅｌｌに入れて、残った細胞を回収し、沈殿に加え、１５０００ｒｐｍ、５分、４℃で、遠心し、上清を捨て、細胞の沈澱を回収した。
細胞を回収したチューブに７０μｌずつＬｙｓａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒを加え、ピペッティングして細胞を溶解し、細胞懸濁液を得た。なお、Ｌｙｓａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒは用時調整とし、組成は次の通りである。
２０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２−Ａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ，ｐＨ７．５，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１％  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１０μｇ／ｍｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ，１０μｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，１０μｇ／ｍｌ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ（Ｂｅｎｚｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  Ｆｌｕｏｒｉｄｅ，ＳＩＧＭＡ  Ｐ７６２６−５Ｇ）
次に、当該細胞懸濁液を液体窒素で凍結させた。そして、凍結させた細胞懸濁液をもう一度溶かした。この細胞懸濁液をさらにピペッティングし、超音波処理を行い、細胞を溶解させた。この液体窒素凍結、ピペッティング、超音波の一連の処理を３回繰り返した。その後、１５０００ｒｐｍ、５分、４℃で、遠心し、上清を回収し、新しいチューブに入れた。これを細胞抽出液として実験に用いた。
〔Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ〕
細胞抽出液の吸光度を測定し、溶液全体のタンパク定量を行った。Ｌｙｓａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒに溶かしたウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ，ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ  Ａ３１５６−５Ｇ）を標準試料として用いた。９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに、ブラッドフォード試薬を２００μｌ入れ、細胞抽出液２μｌを加えて、５９５ｎｍの吸光度を９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ  ＡＲＶＯ  Ｓｘ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で測定し、全体のタンパク量を定量した。
次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。１０％  ポリアクリルアミドミニスラブゲルを用意し、細胞抽出液をサンプルバッファ（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８，４０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ，８％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ），５％  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，５％  Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）と３：１で混合した。ブラッドフォード法で定量したタンパク量をもとに、１０μｇ／ｗｅｌｌをとなるように、ゲルの各ｗｅｌｌにＬｏａｄした。同時に電気泳動用タンパク質マーカー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｒ  １６１−０３７３，ＢＩＯ−ＲＡＤ）を５μｌ  Ｌｏａｄした。泳動ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ  ｔｒｉｓ，１９２ｍＭ  ｇｌｙｃｉｎｅ，０．１％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ））を用いて、ミニスラブゲル１枚当たり２０ｍＡ，８５分の条件で電気泳動を行った。
電気泳動終了後のゲルからＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ  ＩＰＶＨ０００１０，ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）にタンパク質を転写した。１５０ｍＡ，９０分の条件で転写を行った。なお、転写のために用いたＴｒａｎｓｆｅｒ  ｂｕｆｆｅｒの組成は次の通りである。
Ａ液：０．３Ｍ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．６，０．０２％  ＳＤＳ，
Ｂ液：２５ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ１０．２，０．０２％  ＳＤＳ，
Ｃ液：２５ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ１０．２，０．０２％  ＳＤＳ，２ｍＭ  ６−アミノヘキサン酸
タンパク質転写後のメンブレン１枚当たり３０ｍｌのＢｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（５％  ＢＳＡ，４％  ブロックエース、２５ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６，１３７．７ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  ｔｗｅｅｎ−２０）にメンブレンを入れて、室温で１時間振とうして、非特異的結合をブロックした（ブロッキング処理）。一次抗体は、１５０００ｒｐｍ、４℃、５分遠心したものの上清をＢｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎで１００〜３００倍希釈して使用した。一次抗体は、Ｗｅｔ  Ｃｈａｍｂｅｒ内で室温下、１時間メンブレンと反応させた。一次抗体反応後、ＴＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ  ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６，１３７．７ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  ｔｗｅｅｎ−２０）で１０分間振とうし、３回メンブレンの洗浄を行った。二次抗体は、１５０００ｒｐｍ、４℃、５分遠心したものの上清をＴＴＢＳに１０００倍希釈して使用した。二次抗体は、Ｗｅｔ  Ｃｈａｍｂｅｒ内で室温下、１時間メンブレンと反応させた。ＴＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで１０分間振とうし、３回洗浄した。ＭｉｌｌｉＱ水で３分間振とうし、３回洗浄した。ＡＰ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  ｔｒｉｓ  ｐＨ９．５，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）にＮＢＴ／ＢＣＩＰ液（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ  Ｓｔｏｃｋ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｒｏｃｈｅ）を１％加えたものを発色液として、メンブレンを発色液に浸し、１０分から３０分発色させた。ＭｉｌｌｉＱ水で３分間振とうし、３回洗浄した。キムタオルで画面をはさんでメンブレンを乾燥させた。
なお、当該Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇに用いた一次抗体及び二次抗体の一覧を、以下の表３に示す。
【表３】
2012074120.tif 000083
ルミノイメージアナライザーＬＡＳ−３０００（富士フィルム）を用いて、乾燥させたメンブレンを解析し、画像の取り込みを行った。専用ソフトＬＡＳ３０００ＩＲ（富士フィルム）を用いて、Ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｙｐｅ  −  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，Ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｉｍｅ  −  Ａｕｔｏ，Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  −  Ｓｔａｎｄａｒｄ，Ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ  −  ５の条件で、Ｍｅｔｈｏｄ  −  Ｄｉｇｉｔｉｚｅ  ＥＰＩモードで撮影した。撮影した画像ＴＩＦＦ形式で保存し、専用の画像解析ソフトウェアＭｕｌｔｉＧａｕｇｅ  Ｖ３．１（富士フィルム）を用いて、目的のタンパク質のバンドの吸光度を測定した。ヒト線維芽細胞内のＬＩＳ１，細胞質ダイニン、β−ａｃｔｉｎそれぞれのタンパク質の総量をＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇのバンドによって確認した（図２１）。また、実験を４回行った結果の平均をグラフ化した（図２２：誤差線は標準誤差を示し、有意差は危険率５％でｔ検定を行って判定した）。その結果、Ｌｉｓ１（＋／−）の細胞のＬＩＳ１の量は、正常な細胞のＬｉｓ１（＋／＋）と比べて半分以下に減少していたが、薬剤処理を行った後のＬＩＳ１の量は、Ｌｉｓ１（＋／＋）のＬＩＳ１のレベル近くまで回復していた。細胞質ダイニン中間鎖の量も増加がみられた。コントロールタンパク質として観察したβ−ａｃｔｉｎの量の変化は見られなかった。このことから、ＳＮＪ−１９４５によって、タンパク質分解酵素であるカルパインの機能を阻害することで、ＬＩＳ１の分解が抑えられて、細胞内のＬＩＳ１の量が正常細胞に近いレベルにまで増加したことが確認できた。
ＳＮＪ−１９４５以外のカルパイン阻害剤を用いた検討（参考検討例）
正常マウス及びＬｉｓ１（＋／−）のヘテロ変異体マウス（各群８匹）を、通常食餌（ＣＥ−２、日本クレア）で飼育し、生後３週齢で、カルパイン阻害剤であるＡＬＬＮ（Ｍｅｒｃｋ  ２０８７１９）を１０ｍｇ／ｍｌとなるようｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅに溶かし、ＡＬＬＮ  ４０μｇ／ｇ体重相当量をマウス腹腔内に注入した。また他のカルパイン阻害剤であるＥ６４ｄ（Ｒｏｃｈｅ  １５８５６８１）を１０ｍｇ／ｍｌとなるようｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅに溶かし、Ｅ６４ｄ  ２０μｇ／ｇ体重相当量をマウス（８匹）の腹腔内に注入した。注入後、６時間及び２４時間後に投与マウスを麻酔処置後頸椎脱臼によって死亡させ、直ちに脳組織を単離した。ＬＩＳ１の蛋白質量の測定はマウス脳を取り出した後、直ちに重量を測定し、マウス脳の重量に対して２倍量の蛋白質溶解液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ．６．８，１．５％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ），０．３％  ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ，０．３％  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏ−ｅｔｈａｎｏｌ，１５％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を加え、さらに超音波処理によって完全に可溶化させた。９５℃、５分間の熱処理の後、脳組織に由来する蛋白質溶解液１μｌを１２．５％のＳＤＳ−アクリルアミド電気泳動によって分離し、抗ＬＩＳ１抗体を用いたウエスタンブロッティングによってＬＩＳ１を検出した。なお、抗体は上記表３に記載したものを用いた。
なお、以下にＡＬＬＮ及びＥ６４ｄの構造式を示す。
【化７９】
2012074120.tif 000084
【化８０】
2012074120.tif 000085
結果を図２３に示す。Ｌｉｓ１ヘテロ変異マウス胎児のＬＩＳ１タンパク質量は正常マウス胎児の半分程度であるところ、ＡＬＬＮ，Ｅ６４ｄを投与してもＬＩＳ１タンパク質の量の改善は認められず、ＡＬＬＮ，Ｅ６４ｄは滑脳症治療薬として期待できないことが分かった。
各カルパイン阻害剤の毒性の検討
生後４〜５日目のＦＶＢマウス（１５匹）より小脳を切り出し、Ｃａ２＋−ｆｒｅｅ  Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＦ−ＨＢＳＳ；Ｃａ２＋，Ｍｇ２＋−ｆｒｅｅ  Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＭＦ−ＨＢＢＳ，ＳＩＧＭＡ）に５ｍＭ  塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２，Ｗａｋｏ）および４ｍｇ／ｍＬ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｗａｋｏ）を含ませたもの）内で髄膜を取り除き、細かく切断した。小脳片をＣＦ−ＨＢＳＳで洗浄後、０．０２５％  トリプシン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および６．２５μｇ／ｍＬ  Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＤＮａｓｅ，ＳＩＧＭＡ）を含むＣＦ−ＨＢＳＳ内にて３７℃で２０分放置して、遠心した。得られた組織を１０％  ＨＳ／ＢＭＥ（ＤＮａｓｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）（１０％  Ｈｏｒｓｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＨＳ，ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＢａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ，  ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１０％  ＨＳ／ＢＭＥ）に５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および  ２５μｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅを添加したもの）で洗浄・遠心し、細胞にＤＮａｓｅ  Ｍｅｄｉｕｍを加えて２４ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅ（ｎｕｎｃ）に移し、５％  ＣＯ２を含む大気下３７℃で３０分静置し、細胞を浮遊させた。細胞浮遊液を回収後１０％  ＨＳ／ＢＭＥで洗浄し、再び２４ｗｅｌｌ−ｐｌａｔに移し５％  ＣＯ２含む大気下３７℃で１６時間培養した。細胞を１％  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ、ＳＩＧＭＡ）および０．５％  Ｎ２  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＢＭＥ内に回収し、細胞浮遊液を、あらかじめＰｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ）およびＬａｍｉｎｉｎ（ＳＩＧＭＡ）でコートした３５ｍｍ  Ｇｌａｓｓ  Ｂａｓｅ  Ｄｉｓｈ（ＩＷＡＫＩ）に、５×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにまき、５％  ＣＯ２を含む大気下３７℃で８時間培養した。培養された神経細胞を被験神経細胞とした。
ＳＮＪ−１９４５、Ｅ６４ｄ、又はＡＬＬＮを含む培養液（１０％  ＨＳ／ＢＭＥ）を次のようにして調製した。ＤＩＭＥＴＨＹＬ  ＳＵＬＦＯＸＩＤＥ（ＳＩＧＭＡ  Ｄ−５８７９）に溶解したＳＮＪ−１９４５を培養液に最終濃度２００μＭとなるように混合し、１時間３７℃に静置し、ＳＮＪ−１９４５を培地に完全に溶解させた。ＡＬＬＮとＥ６４ｄも同様に培地に溶解させた。但し、ＡＬＬＮとＥ６４ｄはそれぞれ最終濃度が５０μＭと１００μＭになるように、培地に添加した。
用意していた被験神経細胞に、各化合物が溶けた培地を２ｍｌ／ｗｅｌｌで加えて、１６時間培養を行った。またコントロールとして、同量のＤＩＭＥＴＨＹＬ  ＳＵＬＦＯＸＩＤＥ（ＳＩＧＭＡ  Ｄ−５８７９）を添加した培地を用いて同様に培養を行った。培養後、細胞を倒立型顕微鏡（ＴＣＳ  ＦＰ５Ｓ、Ｌｅｉｃａ）で観察した。対物レンズは２０倍のものを使用した。画像の撮影には専用ソフトウェア（ＬＡＳ  ＡＦ、Ｌｅｉｃａ）を使い、５１２ｘ５１２  ｐｉｘｅｌの条件で撮影した。結果を図２４に示す。
図２４に示されるように、ＤＩＭＥＴＨＹＬ  ＳＵＬＦＯＸＩＤＥ（ＤＭＳＯ）のみを添加したコントロールの細胞では、神経突起が正常に伸長し、細胞の遊走が起こって、細胞が周囲に拡散していた。ＳＮＪ１９４５を添加した細胞も、神経突起が伸展し、細胞が遊走しており、コントロールとの差はなかった。一方、ＡＬＬＮを添加した細胞では、細胞が丸く凝集しており、神経突起を伸ばしているものはほとんどなかった。細胞は中央に集積したままで、遊走もほとんど観察できなかった。Ｅ６４ｄを添加した細胞も同様に、中央に凝集しており、突起をのばすことができない細胞が多かった。遊走もコントロールに比較するとほとんど起こらず、周辺部への細胞の移動はわずかだった。このことから、ＳＮＪ−１９４５は、他のカルパイン阻害剤に比べて、高い濃度でも細胞毒性がまったく観察されず、細胞に対する安全性が高いことが確認できた。
［配列表］
2012074120.tif 000086
【図２２】
2012074120.tif 000102
【図１】
2012074120.tif 000103
【図２】
2012074120.tif 000104
【図３】
2012074120.tif 000105
【図４】
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【図５】
2012074120.tif 000107
【図６】
2012074120.tif 000108
【図７】
2012074120.tif 000109
【図８】
2012074120.tif 000110
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2012074120.tif 000114
【図１３】
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【図１４】
2012074120.tif 000116
【図１５】
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【図１６】
2012074120.tif 000118
【図１７】
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【図１８】
2012074120.tif 000120
【図１９】
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【図２０】
2012074120.tif 000122
【図２１】
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【図２３】
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【図２４】
2012074120.tif 000125
【国際調査報告】
2012074120.tif 000126
2012074120.tif 000127
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