(57)【要約】【課題】本発明は、DC免疫療法を効率良く実現するためにDCの分化・培養を効率良く確実に短期間で実施する方法を提供するものであり、採取したPBMCから短期間に必要量の成熟DCを得る技術を提供してDC免疫療法を更に普及させ、癌、AIDS等のウイルス感染症等の予防治療に大きく貢献するものである。【解決手段】ヒト末梢血単核球を成熟樹状細胞へ分化・培養する方法に関する。  ヒトより採取した末梢血より分離したヒト末梢血単核球をサイトカインの存在下で培養し、次いで、成熟刺激物質により刺激を行うことにより成熟させて免疫刺激活性を有する成熟樹状細胞を生成する。  使用するサイトカインは、IL-4、GM-CSF、IFN-βであると好適であるとともに、成熟刺激物質が、TNF-α及びPGE2であると好適である。
2012160702.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト末梢血単核球を成熟樹状細胞へ分化・培養する方法であって、
ヒトより採取した末梢血より分離したヒト末梢血単核球をサイトカインの存在下で培養し、次いで、成熟刺激物質により刺激を行うことにより成熟させて免疫刺激活性を有する成熟樹状細胞を生成することを特徴とする樹状細胞の分化・培養方法。
【請求項２】
前記サイトカインが、IL-4、GM-CSF、IFN-βであることを特徴とする請求項１に記載の樹状細胞の分化・培養方法。
【請求項３】
前記サイトカインが、IL-4、GM-CSF、IFN-βであるとともに、前記成熟刺激物質が、TNF-α及びPGE2であることを特徴とする請求項１に記載の樹状細胞の分化・培養方法。
【請求項４】
前記サイトカインが、IL-4、GM-CSF、IFN-βであり、
前記サイトカインの存在下での培養期間が１日間であるとともに、後続する前記成熟刺激物質による成熟期間が１日間であることを特徴とする請求項１に記載の樹状細胞の分化・培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原提示細胞の一種である樹状細胞の分化・培養方法に関し、特に、体外において樹状細胞を効率良く短期間で分化・培養を行うことが可能な方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、研究者達は、生命にかかわる重篤な疾患に対抗するために、様々な努力を重ねてきた。その中で、薬剤を使用するのではなく、生物が本来具備している免疫機能を利用することにより疾病に対処する方法が研究開発されている。【０００３】
そのような研究開発の中で、樹状細胞（Dendritic Cells:以下、単に「DC」と記す）を利用した疾病治療法が注目されている。DCとは、その名の通り分岐した突起を有する免疫細胞の一種であり、抗原提示能力を有する細胞である。
このDCは、抗原たんぱく質をプロセスしてＴ細胞に提示することにより、体内の適応系統に抗原を覚えさせる。つまり、DCは、補足した外来抗原のたんぱく質を限定的に分解して、産出されたペプチドをMHCとの複合体として細胞表面に提示する。そして、血流中のナイーブＴ細胞がこれを認識して活性化することにより抗原特異的免疫応答が発揮される。【０００４】
このように、免疫応答の中心的な役割を果たすDCを利用して、疾病を治療する方法が各種検討されている。例えば、生命にかかわる重篤な疾患である癌治療において、DCを利用した「養子免疫療法（DC免疫療法）」が開発されている。これは、樹状細胞ワクチン療法とも称されるが、Ｔ細胞を刺激する細胞であるDCに腫瘍抗原等を付加して患者へ投与する方法である。【０００５】
そして、この癌治療に利用が期待されるDC免疫療法を、ウイルス感染症の一種である後天性免疫不全症候群（エイズ；AIDS）の予防治療にもまた利用することが期待されている。AIDSは、ヒト免疫不全ウイルス（以下、「HIVウイルス」と記す）の感染によるものである。これは、ヘルパーＴ細胞が破壊された結果、免疫能力が極端に低下することにより、他の病原体に日和見感染することが原因で罹患する疾病である。AIDS感染者においては、発症前よりDCの減少と、この減少に伴う機能異常が認められる。このため、DCを用いたDC免疫療法が、AIDSの予防治療に寄与することが期待されている。【０００６】
未成熟DCは、抗原の取込み能力に優れており、炎症性サイトカイン（例えば、TNF、IL-1等）やバクテリアの刺激により成熟DCとなる。この成熟したDCは、T細胞刺激分子の高発現性と、所属リンパ球への移動能を獲得する。そして、所属リンパ節へ移動したDCは、組織の定着し、循環しているT細胞のうち、対応するT細胞受容体を有する特異的T細胞と接触して、この特異的T細胞を刺激する。この刺激された特異的T細胞は速やかに活性化されて増殖・分化する。更に、活性化T細胞上に誘導されたCD40リガンドは、DC上のCD40に結合し、DCを逆に刺激し、この刺激によりケモカインを含めた種々のサイトカイン（細胞の増殖・分化・機能発現を担う）の産生が促され、この結果、免疫応答が更に強化されることとなる。【０００７】
このように、免疫応答が行われるが、HIV-1ウイルスにおいては、未成熟DCのリンパ節への移動及びT細胞刺激能を利用することにより、全身感染を成立させることが知られている。換言すれば、未成熟DCは、感染初期においては、HIV-1の増殖をサポートする。また、DCは分化段階等の条件にもよるが、HIV-1ウイルスに感染しウイルスを産生する。更に、侵入サイトである粘膜においてHIV-1ウイルスに感染しなくとも、HIV-1のエンベロープスパイクであるgp120分子がDC表面上のDC-SIGNという細胞接着に関与するたんぱく質と結合することにより、HIV-1ウイルスがT細胞が豊富なリンパ節へ移動することを可能にする。【０００８】
このような状況を回避するためには、分化段階初期の未成熟DCを移植するのではなく、成熟DCを移植する必要がある。また、未成熟DCには、抗原取込能があるが、成熟DCには、抗原取込能がないため、成熟の最終段階において人為的に抗原をDCに取込ませる必要がある。更に、このように抗原を感作した成熟DCを移植して治療を行うためには、成熟DCを大量に培養調整する必要がある。このように、DC免疫療法を効率良く実現するためには、DCの分化・培養を効率良く確実に実施する必要がある。【０００９】
このような状況下、DCを分化・培養する方法が提案されている。この分化・培養方法は、以下に示すような方法である。簡単なスキームを図７に示す。まず、ヒト末梢血単核球（以下、単に「PBMC」と記す）からヒト末梢血由来単球を精製し、この精製したヒト末梢血由来単球をIL-4及びGM-CSF存在下で５日程度培養する。次いで、TNF等を添加して２日程度で最終的に成熟DCを作成する（例えば、非特許文献１参照）。
また、発明者によって更に、非特許文献２及び非特許文献３に示すように、DCを分化・培養する方法が提案されており、これらによると、例えば、非特許文献３では、IFN-βとIL-4を使用することにより、３日間でDCを分化・培養する方法が提案されている（例えば、非特許文献２及び非特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】J.Virol.,Vol.77,8719-8723(2003);Atsushi Yoshida、Reiko Tanaka、Tsutomu Murakami、Yoshiaki Takahashi、Yoshio Koyanagi、Masataka Nakamura、Mamoru Ito、Naoki Yamamoto、Yuetsu Tanaka
【非特許文献２】日本免疫学会総会・学術集会記録：「IL-4,GM-CSF と IFN-β 存在下ヒト単球の in vitro 短期培養によるユニークな表現型と機能を伴った成熟樹状細胞のジェネレイション」Vol.39,Page.34;2009.11.10、田中勇悦
【非特許文献３】HIV 感染とエイズ発症の阻止および治療に関わる基礎研究平成 19 年度総括・分担研究報告書：Page.15-18;2008  「IFN-βと IL-4 存在下で 3 日間培養の例」、田中勇悦
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
このように、上記非特許文献では、ヒト免疫応答をマウス個体で誘導する系により、培養した成熟DCを用いて、HIV-1抗原に対する感染防御免疫応答を誘導できることが開示されているが、本方法では、DC分化・培養に１週間程度の時間を要する。
また、その他、非特許文献１程ではないが、非特許文献２及び非特許文献３においても、DC分化・培養のために、時間と手間を要する。つまり、上記方法では、必要量の成熟DCを得るために手間と時間がかかるという問題点があった。【００１２】
本発明の目的は、上記課題に鑑み、DC免疫療法を効率良く実現するためにDCの分化・培養を効率良く確実に短期間に実施する方法を提供することにあり、採取したPBMCから短期間に必要量の成熟DCを得る技術を提供してDC免疫療法を更に普及させ、癌やAIDS等のウイルス感染症等の予防治療に大きく貢献することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題は、本発明にかかる樹状細胞の分化・培養方法によれば、ヒト末梢血単核球を成熟樹状細胞へ分化・培養する方法であって、ヒトより採取した末梢血より分離したヒト末梢血単核球をサイトカインの存在下で培養し、次いで、成熟刺激物質により刺激を行うことにより成熟させて免疫刺激活性を有する成熟樹状細胞を生成することにより解決される。【００１４】
そして、具体的には、前記サイトカインは、IL-4、GM-CSF、IFN-βである。
また、更に具体的な組み合わせとしては、前記サイトカインが、IL-4、GM-CSF、IFN-βであるとともに、前記成熟刺激物質が、TNF-α及びPGE2であると好適である。【００１５】
このように、本発明においては、前記サイトカインが、IL-4、GM-CSF、IFN-βであり、前記サイトカインの存在下での培養期間が１日間であるとともに、後続する前記成熟刺激物質による成熟期間が１日間である。
つまり、合計２日間で免疫刺激活性を有する成熟DCを得ることができる。【００１６】
本発明においては、通常、公知の方法であれば、７日間かかる成熟DCの分化・培養を２日間で行うことができる。
更に、特筆すべきは、本発明においては、請求項１に示すように、「ヒトより採取した末梢血より分離したヒト末梢血単核球」をそのまま培養することが可能である。つまり、通常、公知の方法においては、抗体磁石、プラスチック付着等の技術によって、末梢血単核球(PBMC)から単球を精製し、この精製した単級を分化・培養する。しかし、本発明は、精製しない単球つまり、末梢血単核球(PBMC)そのものから免疫刺激活性を有する成熟DCを分化・培養することができる。換言すれば、公知技術のように、末梢血単核球から単球を精製する必要がない。このため、精製のためのステップを削除することができ、免疫刺激活性を有する成熟DCをより短期間で効率良く得ることが可能となる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係る樹状細胞の分化・培養方法によれば、抗原提示細胞の一種である樹状細胞を、体外において効率良く短期間で免疫刺激活性を有する成熟DCに分化・培養することができる。つまり、具体的に言えば、公知の方法であれば、７日間係る成熟DCの分化・培養を２日間で行うことができる。また、公知の方法と異なり、精製しない単球つまり、末梢血単核球(PBMC)そのものから成熟DCを分化・培養することができる。よって、採取したPBMCから、高効率及び短期間に、必要量の免疫刺激活性を有する成熟DCを得る技術を提供することが可能となり、DC免疫療法を更に普及させ、癌、又はAIDS等のウイルス感染症等の予防治療に大きく貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】樹状細胞の有用性を示す模式図である。
【図２】樹状細胞の分化・培養方法を示す模式図である。
【図３】成熟DCの表面マーカー（CD11c,CD83,CD86）発現を示すヒストグラムである。
【図４】アロCD4+T細胞刺激活性能を示すヒストグラムである。
【図５】PBMC-4βG-DCによるCMV抗原特異的CD8＋T細胞の誘導能を示すヒストグラムである。
【図６】PBMC-4bGDCのインフルエンザウイルスFlu-M1(58-66)-特異的CD8+ T 細胞の誘導能を示すヒストグラムである。
【図７】従来の樹状細胞の分化・培養方法を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の一実施形態について説明する。なお、以下に説明する個々の道具等は、本発明を限定するものではなく、本発明の趣旨に沿って各種改変することができることは勿論である。
【００２０】
以下に、実験系及び結果について説明する。図１に、樹状細胞（以下、単に「DC」と記す）の有用性を簡単に示す。DC免疫療法においては、患者より採取したPBMCから精製された単球を、DCへと分化培養する。そして、抗原を感作させて、洗浄・回収した後、患者に投与する。これは、CTL応答を誘導し、HIVや癌等を淘汰することを目的としたのである。
【００２１】
DCとは、その名のとおり、枝のような樹状突起を有する免疫細胞であり、抗原提示能を発揮する。通常、体内において、DCは認識した異物を捕捉し、リンパ管若しくは血管を経由してリンパ節若しくは脾臓等のリンパ性組織へと移行する。そして、リンパ性組織に移動してきたDCは、補足した異物（外来抗原）中のたんぱく質を限定的に分解して、産生されたペプチドをMHC分子（ヒト：HLA分子）との複合体として細胞表面へ提示する。
ナイーブT細胞は、血流に従って全身を循環しており、リンパ性組織においてDCと接触することとなる。そして、DC上に提示された抗原に対する特異的なレセプターを有するT細胞が、これを認識して活性化され、機動型のエフェクターT細胞となる。このエフェクターT細胞のうちCD4+T細胞はヘルパーT細胞としてB細胞を活性化して抗体産生に関わり、CD8+T細胞は細胞障害性T細胞（キラーT細胞、以下、単に「CTL」と記す）として自己・非自己の識別、生体に危害を与える細胞の殺傷・除去を行う。
一方、HIVに対抗するために、ヒト免疫系は、インターフェロンやナチュラルキラー細胞に続いて、獲得免疫系を誘導する。急性感染期においては、CTL応答とともにウイルス量が減少することが確かめられており、このCTL応答がHIV対策に重要な要素であることが示唆されている。よって、DC免疫療法においては、DCを効率的に分化・培養することを目的とし、この結果成熟DCに抗原を感作させて患者に投与し、獲得免疫系を誘導することによりHIVに対抗することを可能とする。
【００２２】
感作させる抗原は、HIV-1感染症に関しては、不活性HIV-1粒子やHIV-1ペプチドが使用される。なお、疾患が癌の場合には、癌細胞抽出液や、癌関連抗原、癌ウイルス抗原等が使用される。
従来は、このように、患者より採取したPBMCから精製された単球を、DCへと分化・培養していたため、DC分化・培養の時間をかなり要したが、本発明においては、患者より採取したPBMCから直接DCを分化・培養させることができるため、短期間に効率良くDCの分化・培養を行うことが可能となった。
以下、DCの分化・培養方法と効果について示す。
【００２３】
１．分化・培養方法
図２に、本発明に係るDCの分化・培養方法を示す。新鮮末梢血より、比重遠心分離法により分離したPBMCを得た。このPBMCを、IL-4（Interleukin-4：インターロイキン4）20ng/ml、GM-CSF（Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor：顆粒球単球コロニー刺激因子）50ng/ml、IFN-β(interferon-β：インターフェロンβ)1000U/mlを培地に添加して１日間培養した。培地は、RPMI-1640培地を使用した。次いで、１日間培養した培地に、TNF-α（Tumor Necrosis Factor-α：腫瘍壊死因子）20ng/ml、PGE2（Prostaglandin2：プロスタグランジン２）1mMを添加して、更に１日間培養を行った。
つまり、合計で２日間培養を行った。
このようにして得た成熟DCを、以下、単に「PBMC-4βG-DC」と記す。なお、対比となる公知の方法で、分化・成熟させた成熟DC（以下、単に「Mo-G4-LPS DC」と記す）は、PBMCから抗体磁石又はプラスチック付着により精製した単球を、GM-CSF + IL-4を添加した培地で5日間培養した後、LPS, poly I:C , IFN-b やcocktails (TNF-α, IL-1b, IL-6)などを添加して更に2日間、合計で7日間培養して得た。
【００２４】
２．検証及び結果
（１）成熟ミエロイドDCの表現系
フローサイトメトリーにおける結果を図３に示す。図３に示す通り、IL-4、GM-CSF、IFN-βを培地に添加して培養したDCは、ミエロイド系成熟DCの表面マーカーであるCD11cの発現を示した。
また、ミエロイド系成熟DCの表現系であるCD83及びCD86の発現もまた示した。
CD83+及びCD86+の細胞は、TNF-α及びPGE2で刺激した群及び刺激を行わない群両者共に80％を超え、特に刺激をした群は、90%を超える高発現を示した。このように、TNF-α及びPGE2で刺激した群は、刺激を行わない群よりも、これらの表現系のより高い発現を示した。
【００２５】
（２）アロCD4+T細胞刺激活性能
HLAタイプの異なったナイーブT細胞をCSFEラベルし、他のドナーから得られたDCと,DC:T細胞比率を1:20で混合培養した。１週間後、CFSEの希釈の度合いをフローサイトメトリーで解析した。結果を、図４に示す。CSFEは細胞が一回分裂するとその度合いが１/2になるのでCSFEの弱い細胞は増殖細胞である。なお、通常の方法で分化・精製したMo-G4-LPS DCは、精製単球から７日で分化させた。PBMC-4βG-DCは２日で分化させた。
図４に示すように、Mo-G4-LPS DC及びPBMC-4βG-DC双方において、増殖細胞の発生が示され、その割合は、Mo-G4-LPS DC に比してPBMC-4βG-DCの方が高かった。また、細胞の培養上清中のIFN-γは双方とも高く、IL-4とIL-10は検出以下であった。つまり、双方ともTh2誘導型ではなく、Th1誘導型であることが明らかである。
以上より、Mo-G4-LPS DC及びPBMC-4βG-DC双方において、Th1型細胞増殖を誘導することが検証された。
【００２６】
（３）PBMC-4βG-DCによるCMV抗原特異的CD8＋T細胞の誘導能（in vitro）
HLA-A2402のドナーのPBMCと別のドナー（サイトメガロウイルス(CMV)抗体陽性）のPBMCを、CMVのペプチド存在下で2日間培養した自己のPBMC-4βG DCと１週間混合培養した。CD8陽性のCTLの活性化の様子をテトラマー結合試験でテストした。結果を図５に示す。図５に示すように、PBMC-4βG DCは、PBMCからCMV特異的なCD8+CTLを増殖させることがわかる。
【００２７】
（４）PBMC-4bG DCのインフルエンザウイルスFlu-M1(58-66)-特異的CD8+ T 細胞の誘導能
上記（３）の項での検証と同様にインフルエンザ特異的なCLT細胞の誘導能を比較した。結果を図６に示す。図６に示すように、HLA-A2のドナーからは、自己PBMC-4βG DCとの混合培養とインフルエンザペプチドにより特異的なCLT細胞の誘導ができることが明らかである。必要なDCのT細胞との比率は、1：80以下である。
【００２８】
以上のように、本件においては、PBMCから免疫刺激活性を有する成熟DCを短期間に効率良く分化・培養することができる。つまり、精製しない単球、換言すれば末梢血単核球(PBMC)そのものからのDCの分化培養方法を提供することができる。具体的には、培地にGM-CSF、IL-4及びIFN-βを添加して１日間培養し、さらに成熟刺激としてTNF-α(腫瘍壊死因子）とPGE2 （プロスタグランジン２）を添加し、さらに１日間培養させる方法である。この方法によれば、成熟DCの分化・培養が２日間で終了する。
【００２９】
これまで試験管内での機能的なヒトDCの分化方法について種々の培養法が開発されてきた。現在、一般的に用いられているDCの前駆細胞はPBMCの5~10%を占める単球(monocyte)である。単球はPBMCからプラスチック付着法または抗体結合マグネット法で精製される。一般に広く用いられるサイトカインは、GM-CSF及び IL-4の組合せであり、成熟にLPS、TNF-a、CD40L若しくは IFN-bが使用されている。この組み合わせによると、培養と成熟に合計７日間を要する。しかし、本件においては、免疫刺激活性を有する成熟DCの分化・培養が２日間で終了する。
【００３０】
免疫刺激活性を有する成熟DCは、癌や感染症の免疫療法に使用することが可能であり、特に、現在行われている癌に対する治療のみならずAIDS等のウイルス感染症の治療への使用が期待される。本件発明は、このように有用な免疫刺激活性を有する成熟DCを効率良く短期間で分化・培養する方法を提供したものである。
以上のように本発明は、難治性の疾患の治療において、有用な知見を提供するものであり、将来の医療に寄与するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
2012160702.tif 000010
2012160702.tif 000011
2012160702.tif 000012
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