(57)【要約】  スフェロイド培養を効率的に行う。  培養基材は、細胞を培養して三次元的に凝集させてなるスフェロイドを作製する培養容器である。培養基材は、合成樹脂材からなる。培養基材の表面には、細胞が培養される隔室となる複数の窪み部２０が形成されている。複数の窪み部２０は、培養基材表面にレーザ照射することにより形成される。窪み部２０の開口周辺には、合成樹脂材が溶解して盛り上がった土手部２２が形成されている。互いに近接する２個の窪み部２０の間の培養基材表面は、非平坦面となっている。
2012036011.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被培養物が培養される隔室を形成する窪み部が培養基材表面に複数形成されており、互いに近接する前記窪み部の間の培養基材表面が非平坦面であることを特徴とする培養基材。
【請求項２】
互いに近接する前記窪み部の間に介在する前記非平坦面が土手部を有することを特徴とする請求項１に記載の培養基材。
【請求項３】
少なくとも前記窪み部の内面が細胞接着抑制剤により被膜されていることを特徴とする請求項１または２に記載の培養基材。
【請求項４】
前記窪み部の開口の直径が２０μｍ以上１５００μｍ以下であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか一項に記載の培養基材。
【請求項５】
前記窪み部の深さが１０μｍ以上１５００μｍ以下であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか一項に記載の培養基材。
【請求項６】
前記複数の窪み部が前記培養基材表面に稠密に配置されていることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか一項に記載の培養基材。
【請求項７】
前記窪み部が前記培養基材表面のウェル形成領域の表面に複数形成されていることを特徴とする請求項１ないし６のいずれか一項に記載の培養基材。
【請求項８】
前記複数の窪み部が、前記培養基材表面のウェル形成領域の表面に、１０個／ｃｍ２〜１００００個／ｃｍ２、形成されていることを特徴とする請求項１ないし７のいずれか一項に記載の培養基材。
【請求項９】
前記窪み部が前記培養基材表面へのレーザ照射により形成されていることを特徴とする請求項１ないし８のいずれか一項に記載の培養基材。
【請求項１０】
前記培養基材の材質が合成樹脂からなることを特徴とする請求項１ないし９のいずれか一項に記載の培養基材。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の培養基材を備えた培養容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞や組織片などの被培養物を培養してスフェロイドを作製する培養基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞を二次元的に培養する単層培養に代わって、細胞を培養して三次元的に凝集させるスフェロイド培養が注目されている。スフェロイド培養は、単層培養に比べて、生体内の細胞に近い状態を構築することができ、細胞が生体内で有する特異的な機能を引き出すことができる。【０００３】
スフェロイド培養を行う従来の培養基材１０１の一例として、例えば、図１１に示した容器が挙げられる。この容器の底面１１４には、図１２に示したように、互いに間隔を空けて複数の窪み部１２０が形成されている。容器の底面１１４は、細胞接着抑制剤（図示省略）で被膜されている（特許文献１参照）。【０００４】
スフェロイド培養は、スフェロイド前駆体としての細胞が撹拌された培養液５０を培養容器内に流し込み、窪み部１２０内で細胞を培養する。そうすると、窪み部１２０内の細胞は、図１２に示したように、窪み部１２０の形状・大きさに対応して培養されて、三次元的に凝集して、スフェロイド６０を形成する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００７／０５５０５６号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところが、上述した従来の培養基材１０１を用いてスフェロイド培養を行うと、スフェロイド６０の他に、単層培養された細胞６２や、不均一な大きさのスフェロイドも多く形成されるという問題点が見い出された。この原因は、従来の培養基材１０１には、図１２に示したように、互いに近接する窪み部１２０間の基板表面に平坦面１３０が形成されているからと考えられた。このように、この平坦面１３０が形成されている場合、培養容器内に、細胞が攪拌された培養液５０を流し込むと、平坦面１３０上にも細胞が沈殿する。このような細胞が培養容器内に存在すると、窪み部の大きさに対応したスフェロイド６０の他に、二次元的に培養されたり、窪みの大きさの影響を受けないランダムな大きさのスフェロイドが形成されたりするからである。このように、従来の培養基材１０１では、所望の大きさのスフェロイドを均一に形成させる培養を効率的に行うことができない。これら、単層培養された細胞や、ランダムな大きさのスフェロイドは、窪みの大きさに対応した均一なスフェロイドと比較して、生理機能が異なったり、幹細胞培養の場合には、分化のステージが異なったりなど、培養容器内の細胞群の均一性が低くなり、実験データの評価等に支障をきたす。【０００７】
そこで、本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであり、所望の大きさのスフェロイドを均一に形成でき、培養を効率的に行える培養基材の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の目的を達成するために、本発明に係る培養基材は、被培養物が培養される隔室を形成する窪み部が培養基材表面に複数形成されており、互いに近接する前記窪み部の間の培養基材表面が非平坦面であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、スフェロイド培養を効率的に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る培養基材の斜視図である。
【図２】本発明の第１の実施形態に係る培養基材の縦断面図である。
【図３】本発明の第１の実施形態に係る培養基材のウェル形成領域の一部斜視図である。
【図４】図３のIV−IV矢視断面図である。
【図５】図３のV−V矢視断面図である。
【図６】本発明の第１の実施形態に係る培養基材の表面上にレーザ光の照射スポットを模式的に示した平面図である。
【図７】本発明の第２の実施形態に係る培養基材のウェル形成領域の一部断面図である。
【図８】本発明の第３の実施形態に係る培養基材がシャーレ内に設置された状態の縦断面図である。
【図９】本発明の第４の実施形態に係る培養基材の平面図である。
【図１０】本発明の第４の実施形態に係る培養基材の縦断面図である。
【図１１】従来の培養基材の縦断面図である。
【図１２】従来の培養基材の表面上に被培養物を模式的に示した断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［第１の実施形態］
本発明の第１の実施形態に係る培養基材について、図１ないし図６を用いて説明する。
図１は、本発明の培養基材を有する培養容器の斜視図である。図２は、培養容器の縦断面図である。図３は、培養基材のウェル形成領域の一部斜視図である。図４は、図３のIV−IV矢視断面図である。図５は、図３のV−V矢視断面図である。図６は、培養基材の表面上に照射するレーザ光の照射スポットを示した平面図である。
【００１２】
本実施形態に係る培養基材１は、細胞を培養して三次元的に凝集させてなるスフェロイド（細胞凝集塊）を作製する培養容器の主要部である。
【００１３】
まず、本実施形態に係る培養基材１の構成について説明する。
培養容器は、図１および図２に示したように、容器本体１０および蓋１２を備えている。この例において、容器本体１０の内側の底板部１４が、培養基材１に相当する部分となる。かかる容器本体１０の内側の底板部１４、すなわち培養基材１は、例えばポリスチレンなどの合成樹脂材から構成されている。本実施形態では、培養基材１は、合成樹脂材料を用いた射出成形により得られる。
【００１４】
容器本体１０は、円板状の底板部１４、および、環状の側壁部１６を有している。側壁部１６は、底板部１４の外周縁から起立している。本実施形態では、底板部１４の直径は、８５ｍｍ、底板部１４の厚さは、１ｍｍに設計されている。また、側壁部１６の高さは、２０ｍｍに設計されている。
【００１５】
蓋１２は、容器本体１０に上方の開口部に対応した形状に形成されている。蓋１２は、細胞の培養環境を維持するために、容器本体１０に被せられて使用される。
【００１６】
底板部１４の上面（すなわち、容器本体１０の内側の面に相当する培養基材の上面）のウェル形成領域２４（すなわち、被培養物が培養される隔室が形成される領域）には、図２ないし図５に示したように、複数の窪み部２０が形成されている。窪み部２０の内面は、滑らかな凹面になっている。窪み部２０は、被培養物が培養される隔室（ウェル：ｗｅｌｌ）を形成する。本実施形態では、直径８５ｍｍの円形のウェル形成領域２４に１４２００個程度（約２５０個／ｃｍ２）の窪み部２０が形成されている。
【００１７】
本実施形態では、窪み部２０は、培養基材表面のウェル形成領域２４に対してレーザ光を照射することにより形成される。レーザ照射は、図６に示したように、ｘ−ｙ面上に設置された底板部１４の上面に対して、レーザ光をｚ軸方向に照射して行う。
【００１８】
まず、レーザ照射装置の照射部をｘ軸の正方向に走査させつつ、一定の間隔（例えば８００μｍ）ごとにレーザ光を照射して、ｘ軸方向に並んだ複数の窪み部２０を形成する。続けて、照射部をｙ軸方向に一定の距離（例えば４００μｍ）だけ走査させた後、照射部をｘ軸の負方向に走査させつつ、一定の間隔（例えば８００μｍ）ごとにレーザ光を照射して、ｘ軸方向に並んだ複数の窪み部２０を形成する。同様に、照射部をｙ軸方向に一定の距離（例えば４００μｍ）だけ走査させる。これを繰り返して、底板部１４の上面に規則的に配列された複数の窪み部２０を形成する。
【００１９】
本実施形態では、図６に示したように、照射スポットＡの中心座標（ｘ，ｙ）を原点（０，０）とすると、照射スポットＡに近接した照射スポットＢの中心は、（０．８，０）、照射スポットＣの中心は、（０．４，０．４）、照射スポットＤの中心は、（−０．４，０．４）に位置する。このように、照射スポットＡ，Ｂのｘ座標と照射スポットＣ，Ｄのｘ座標とをずらすことにより、ウェル形成領域２４に複数の窪み部２０を稠密に形成することができる。窪み部２０は、培養基材１のウェル形成領域２４の単位面積あたり、１０個／ｃｍ２〜１００００個／ｃｍ２、形成するのが好ましい。さらに好ましくは、２０個／ｃｍ２〜８０００個／ｃｍ２、さらに好ましくは、２０個／ｃｍ２〜３０００個／ｃｍ２である
上記した数値範囲を示す「〜」とは、特段の定めがない限り、その前後に記載された数値を下限値及び上限値として含む意味で使用され、以下本明細書において「〜」は、同様の意味をもって使用される。
【００２０】
本実施形態では、レーザ光源には、ＣＯ２レーザを用い、レーザ光は、出力１０Ｗ、照射速度６１００ｍｍ／ｍｉｎでパルス照射される。照射スポットの形状は、円形であり、その直径は、約４００μｍである。スフェロイドは、小さすぎると所望の生理機能が生じず、また、大きすぎるとスフェロイドの中心部が壊死してしまう。これを考慮すると、照射スポットの直径は、２０〜１５００μｍが適当である。
【００２１】
なお、照射スポットの形状は、円形であるのに対して、窪み部２０の開口形状は、略楕円形に偏平している。この開口形状の偏平は、容器本体１０の成形時において金型に合成樹脂材を流し込む方向に起因するものと考えられる。
【００２２】
培養基材表面（底板部１４の上面）にレーザ光が照射されると、底板部１４を構成する合成樹脂材が溶解して、窪み部２０が形成される。さらに、窪み部２０の開口周辺には、図３ないし図５に示したように、溶解した合成樹脂材が盛り上がって、土手部２２が形成される。
【００２３】
本実施形態では、互いに隣り合った２個の窪み部２０は、１個または２個の土手部２２を介して形成されており、互いに近接する窪み部２０間の培養基材表面には、平坦面が残らない。すなわち、互いに近接する窪み部２０間の培養基材表面が非平坦面３０になっている。なお、図４に示した図３のIV−IV矢視断面において、隣り合った２個の窪み部２０の間に介在する２個の土手部２２は、互いに連結していて、非平坦面３０を形成している。
【００２４】
レーザ光の照射位置や出力量などの照射条件を調節することにより、近接する窪み部２０間の距離、窪み部２０の径・深さ、土手部２２の幅・高さなどを調節できる。本実施形態では、互いに近接する窪み部２０間の培養基材表面に平坦面が残らないように、すなわち、互いに近接する窪み部２０間の培養基材表面が非平坦面３０になるように、レーザ光の照射条件が設定されて、レーザ照射が行われる。
【００２５】
なお、窪み部２０の深さ（すなわち、図４、５に示したように、レーザ照射前の底板部１４（すなわち、培養基材））の上面を基準とした深さ）ｄは、１０〜１５００μｍに設計されることが望ましく、本実施形態では、２００±２０μｍに設計されている。なお、底板部１４の厚さは、深さｄに応じて貫通しないよう適宜設計される。また、略楕円形の窪み部２０の開口の長径（レーザ照射前の底板部１４の上面での長径）Ｄは、１０〜１５００μｍに設計されることが望ましく、本実施形態では、５００±２０μｍに設計されている。さらに、土手部２２の高さ（すなわち、図４、５に示したように、レーザ照射前の底板部１４の上面を基準とした高さ）ｈは、１０〜５０μｍに設計されることが望ましく、本実施形態では、２５±５μｍに設計されている。
【００２６】
底板部１４の上面、すなわち培養基材相当部分の表面は、細胞接着抑制剤（図示省略）により被膜されているのが好ましい。培養基材細胞接着抑制剤は、細胞が底板部１４の上面、特に、窪み部２０の内面に接着するのを抑制する役割を果たす。細胞接着抑制剤としては、例えば、リン脂質ポリマー、ポリヒドロキシエチルメタアクリレート、あるいは、ポリエチレングリコールなどが用いられる。
【００２７】
次に、本実施形態に係る培養基材１を用いた被培養物の培養方法について説明する。
【００２８】
被培養物であるスフェロイド前駆体としての細胞を培養液５０に入れて、撹拌する。撹拌後、培養液５０を容器本体１０内に流し入れる（図２参照）。そうすると、培養液５０中の細胞は、沈殿して、窪み部２０内に収まる。
【００２９】
その後、容器本体１０に蓋１２を被せて、数日〜数十日間放置する。窪み部２０内の細胞は、培養され、増殖する。このとき、窪み部２０の内面が細胞接着抑制剤により被膜されているため、細胞は、窪み部２０の形状・大きさに対応して、三次元的に凝集する。こうして、スフェロイドが得られる。
【００３０】
次に、本実施形態に係る培養基材１の効果について説明する。
本実施形態によれば、互いに近接する窪み部２０間の培養基材表面が非平坦面３０になっている。そのため、沈殿する被培養物が窪み部２０に収まりやすい。
【００３１】
従来の培養基材１０１では、隣接する窪み部１２０間の培養基材表面に平坦面１３０が形成されている。そのため、平坦面１３０において、細胞が単層培養されたり、窪み部１２０の大きさの影響を受けないランダムな大きさのスフェロイドが形成してしまう。一方、本実施形態に係る培養基材１では、隣接する窪み部２０間の培養基材表面は、非平坦面３０になっている。そのため、単層培養されたり、不均一なスフェロイドが形成されにくく、均一なスフェロイドが形成される確率が高く、スフェロイド培養を効率良く行うことができる。
【００３２】
スフェロイドの用途や培養する細胞の種類などに応じて、作製すべきスフェロイドの大きさはそれぞれ異なる。そのため、スフェロイドの作製にあたっては、所望するスフェロイドの大きさに対応した窪み部２０を備えた培養基材１を用意する必要がある。ここで、本実施形態では、レーザ照射により窪み部２０および土手部２２を形成する。したがって、照射位置や出力量などの照射条件を調節することによって、培養基材１に任意の大きさの窪み部２０および土手部２２を容易に形成することができる。
【００３３】
また、培養基材として、ポリスチレンなどの透明な合成樹脂材を使用し、この合成樹脂材に対して、レーザ光照射加工により窪み部を形成した場合、窪み部２０の断面形状は上開きとなり、かつ、レーザ光の熱により窪み部２０の内面が滑らかになって、透過光が乱反射するのを低減することができ、窪み部２０内で培養されるスフェロイドの顕微鏡による観察を、容易に行うことができる。
【００３４】
［第２の実施形態］
本発明の第１の実施形態に係る培養基材について、図７を用いて説明する。図７は、培養基材のウェル形成領域の一部断面図である。なお、本実施形態は、第１の実施形態の変形例であって、第１の実施形態と同一部分または類似部分には、同一符号を付して、重複説明を省略する。
【００３５】
第１の実施形態では、複数の窪み部２０および土手部２２は、培養基材表面にレーザ光を照射することにより形成された。一方、本実施形態では、培養基材１は、複数の窪み部２０を形成する凸部および土手部２２を形成する凹部を備えた金型を用いて、合成樹脂材料を射出成形して得られる。複数の窪み部２０および土手部２２は、培養基材１の成形と同時に形成される。
【００３６】
本実施形態では、図７に示したように、培養基材１の培養基材表面には、半球状の窪み部２０および断面半円状の土手部２２が形成されている。金型を用いて射出成型により培養基材１を製造することにより、より均一性の高い窪み部２０を形成することができ、形成されるスフェロイドの均一性を高くすることができる。
【００３７】
［第３の実施形態］
本発明の第１の実施形態に係る培養基材について、図８を用いて説明する。図８は、培養基材がシャーレ内に設置された状態の縦断面図である。なお、本実施形態は、第１の実施形態の変形例であって、第１の実施形態と同一部分または類似部分には、同一符号を付して、重複説明を省略する。
【００３８】
第１の実施形態に係る培養基材１は、培養容器の内側の底面（底板部１４の上面）に複数の窪み部２０が形成されている。一方、本実施形態に係る培養基材１は、円板状に形成された合成樹脂材からなる。培養基材１は、合成樹脂材料を円板状の基板に射出成形された後、その一方の表面に対してレーザ光が照射されて、培養基材１の一方の表面に複数の窪み部２０が形成されている。
【００３９】
本実施形態に係る培養基材１は、図８に示したように、例えばガラス製のシャーレ４０内に設置されて使用される。本実施形態によれば、第１の実施形態に比べて、培養基材１の成形が容易であり、製造コストを抑えることができる。
【００４０】
［第４の実施形態］
本発明の第４の実施形態に係る培養基材について、図９および図１０を用いて説明する。図９は、培養基材の平面図である。図１０は、培養基材を備えた容器本体と蓋を有する培養容器の縦断面図である。なお、本実施形態は、第１の実施形態の変形例であって、第１の実施形態と同一部分または類似部分には、同一符号を付して、重複説明を省略する。
【００４１】
本実施形態に係る培養基材１は、図９に示したように、容器本体１０の底板部１４が相当し、この底板部１４の上面に４つの円形のウェル形成領域２４を有している。４つのウェル形成領域２４は、互いに間隔を空けて配置されている。そして、培養基材１のウェル形成領域２４のそれぞれに被培養物が培養される隔室を形成する窪み部が基材表面に複数形成されており、互いに近接する前記窪み部の間の基材表面が非平坦面とされている。
【００４２】
本実施形態では、ピペットなどを用いて、スフェロイド前駆体としての細胞が入れられ、撹拌された培養液５０や受精卵を含む培養液５０を４つのウェル形成領域２４上に滴下する。続いて、図１０に示したように、容器本体１０内にミネラルオイル５２を流し入れる。このとき、培養液５０とミネラルオイル５２とは、混ざり合わない。この状態で数日〜数十日間放置して、スフェロイドを作製したり、受精卵を培養したりする。
【００４３】
本実施形態によれば、１つの培養基材１で数種類のスフェロイドを作製することができる。
【００４４】
［他の実施形態］
上記の各実施形態は、代表的な例示であって、本発明は、これらに限定されるものではない。例えば、培養基材１の材料は、合成樹脂材ではなく、ガラスであっても良い。また、培養基材１の形状・大きさについては、任意に設計できる。さらに、窪み部２０および土手部２２の形状・大きさについても、培養する細胞や所望するスフェロイドの形状・大きさに応じて、任意に設計できる。
【００４５】
また、上記の実施形態を組み合わせても良い。例えば、第３の実施形態に係る円板状の培養基材１の窪み部２０を、第２の実施形態で説明したように、射出成形により形成しても良い。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明によれば、互いに近接する窪み部間の培養基材表面が非平坦面になっているため、沈殿する被培養物が窪み部に収まりやすく、また非平坦面になっているため、二次元的に単層に培養されたり、不均一なスフェロイドが形成されにくく、三次元的に均一に凝集されたスフェロイドが形成される確率が高く、スフェロイド培養を効率良く行うことができる。
なお、２０１０年９月１４日に出願された日本特許出願２０１０−２０５３０５号の明細書、特許請求の範囲、図面及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の開示として取り入れるものである。
【符号の説明】
【００４７】
１…培養基材、１０…容器本体、１２…蓋、１４…底板部、１６…側壁部、２０…窪み部、２２…土手部、２４…ウェル形成領域、３０…非平坦面、４０…シャーレ、５０…培養液、５２…ミネラルオイル
【図１】
2012036011.tif 000003
【図２】
2012036011.tif 000004
【図３】
2012036011.tif 000005
【図４】
2012036011.tif 000006
【図５】
2012036011.tif 000007
【図６】
2012036011.tif 000008
【図７】
2012036011.tif 000009
【図８】
2012036011.tif 000010
【図９】
2012036011.tif 000011
【図１０】
2012036011.tif 000012
【図１１】
2012036011.tif 000013
【図１２】
2012036011.tif 000014
【国際調査報告】
2012036011.tif 000015
2012036011.tif 000016
2012036011.tif 000017
2012036011.tif 000018