(57)【要約】  本発明は、不死化細胞株や腫瘍組織において特異的に発現している１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体、又は前記モノクローナル抗体を含む医薬、ハイブリドーマ株、及び腫瘍の診断薬、予防薬又は治療薬を提供する。
2012063839.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｎｔｉ  ＮＫ−Ａｎｔｉｇｅｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＃１４１（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３００）のハイブリドーマ株により産生され、１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドに特異的に結合することを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２】
Ｈ鎖が配列番号５〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含み、Ｌ鎖が配列番号８〜１０のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含む請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
Ｈ鎖が配列番号１１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含み、Ｌ鎖が配列番号１４〜１６のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含む請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
ＧＩＧＩＰＧＬＲＧ（配列番号４１）で表されるアミノ酸配列を含むエピトープを認識する請求項１から３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項１に記載のモノクローナル抗体が有する相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項２に記載のモノクローナル抗体が有する、Ｈ鎖が配列番号５〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含み、Ｌ鎖が配列番号８〜１０のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項７】
請求項３に記載のモノクローナル抗体が有する、Ｈ鎖が配列番号１１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含み、Ｌ鎖が配列番号１４〜１６のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項８】
請求項４に記載のモノクローナル抗体が認識する、ＧＩＧＩＰＧＬＲＧ（配列番号４１）で表されるアミノ酸配列を含むエピトープを認識することを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項９】
ヒト型化されてなる請求項５から８のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
請求項１に記載のモノクローナル抗体が有する相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体へ移植してなることを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１１】
Ｈ鎖が配列番号５〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含み、Ｌ鎖が配列番号８〜１０のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１２】
Ｈ鎖が配列番号１１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含み、Ｌ鎖が配列番号１４〜１６のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１３】
ＧＩＧＩＰＧＬＲＧ（配列番号４１）で表されるアミノ酸配列を含むエピトープを認識することを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１４】
ヒト型化されてなる請求項１１から１３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項１５】
Ａｎｔｉ  ＮＫ−Ａｎｔｉｇｅｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＃１４１（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３００）であることを特徴とするハイブリドーマ株。
【請求項１６】
請求項１から１４のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含むことを特徴とする医薬。
【請求項１７】
請求項１から１４のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含むことを特徴とする腫瘍の診断薬、予防薬又は治療薬。
【請求項１８】
腫瘍が、１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを発現している癌細胞を含む腫瘍である請求項１７に記載の腫瘍の診断薬、予防薬又は治療薬。
【請求項１９】
請求項１、２、４から６、８から１１、１３、及び１４のいずれかに記載のモノクローナル抗体の部分構造であって、
前記モノクローナル抗体が有する相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を含み、前記ＣＤＲが、配列番号５〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含み、且つ配列番号８〜１０のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とするモノクローナル抗体の部分構造。
【請求項２０】
請求項１、３から５、７から１０、及び１２から１４のいずれかに記載のモノクローナル抗体の部分構造であって、
前記モノクローナル抗体が有する相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を含み、前記ＣＤＲが、配列番号１１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含み、且つ配列番号１４〜１６のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とするモノクローナル抗体の部分構造。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＶ型コラーゲン遺伝子産物で１本鎖として分泌される、１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドに結合し、かつ前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを発現する腫瘍組織の増殖を抑制するモノクローナル抗体に関する。また、本発明は、前記モノクローナル抗体を含む医薬、及び腫瘍の診断薬、予防薬、又は治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体組織は、生命の単位である細胞とその細胞周囲や細胞間に存在する細胞外マトリックスとで構成されている。前記細胞外マトリックスは、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、プロテオグリカン等の糖鎖修飾を受けた蛋白質などを主成分とした巨大な蛋白質複合体である。コラーゲンは、生体タンパク質の約３０％を占め、結合組織に多く存在している。またコラーゲンは、上皮と結合組織との境界や、内皮と結合組織との境界では、基底膜を構成している。前記細胞外マトリックスの機能として細胞の増殖及び／又は分化の制御に関わることが知られており、正常組織の発生、修復、再生などにおいて、前記細胞外マトリックスと細胞との相互作用が重要であることが明らかとなっている。【０００３】
この細胞外マトリックスと細胞との相互作用は、腫瘍形成における腫瘍細胞増殖及び血管新生に対しても重要な役割を果たすことが明らかとなっている。腫瘍細胞は、前記細胞外マトリックスの分解と合成を繰り返して細胞外微小環境を再構築し、腫瘍細胞の増殖や新たな血管の形成を促進して腫瘍組織は成長する。更に、腫瘍細胞の浸潤及び／又は転移は、この再構築された細胞外マトリックスの分解によって起こることが知られている。【０００４】
前記コラーゲンは、２０種類以上の遺伝子型が異なるものが知られており、例えば、線維芽細胞や間質細胞等で構成される結合組織ではＩ型コラーゲンが、基底膜ではＩＶ型コラーゲンが主に存在する。【０００５】
前記ＩＶ型コラーゲンは、線維芽細胞あるいは間質細胞以外に、上皮細胞、内皮細胞等の様々な細胞から分泌される。この分泌されたＩＶ型コラーゲンは、互いに会合してメッシュ構造を有する基底膜骨格を構築すると考えられている。正常組織の基底膜は、上皮組織と間質組織との境界若しくは内皮組織と間質組織との境界などに存在し、組織の形態及び機能を調節する。【０００６】
コラーゲン分子は、３本の左巻きのポリペプチド鎖が互いに合わさり、緩い右巻きの３重らせん構造を有してなる。前記ＩＶ型コラーゲンには、６種類の遺伝型が存在し、これらの遺伝子に由来するα１〜α６のポリペプチド鎖が知られており、前記ポリペプチド鎖の組み合わせの違いにより３種類以上の分子種があると考えられている。最も広範に存在する基底膜は、２本のα１ポリペプチド鎖と１本のα２ポリペプチド鎖とが分子間ジスルフィド結合によって架橋されたＩＶ型コラーゲン分子の会合体で構築され、α３〜α６のポリペプチド鎖が構成するＩＶ型コラーゲン分子は、限られた組織の基底膜にしか存在しない。【０００７】
このように前記ＩＶ型コラーゲンとは、分子間ジスルフィド結合で架橋された３本のαポリペプチド鎖が３重らせん構造を形成している３量体分子又はこれらの会合体を指す。一般的にＩＶ型コラーゲンは、３量体分子として細胞外に分泌され、細胞外で会合体を形成することが知られている。ところが本発明者らは、ヒト培養細胞が、前記ＩＶ型コラーゲンの他に、分子間ジスルフィド結合を有さず、またらせん構造を取らない単独のポリペプチド鎖（以下、「１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド」と称することがある）として分泌することを見出した（非特許文献１参照）。特に培地にビタミンＣを含まない場合には、培養細胞は、前記ＩＶ型コラーゲンに比べて前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを圧倒的に多く産生する（非特許文献２参照）。また、前記ＩＶ型コラーゲンは、タンパク質分解酵素（ゼラチナーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ−２など）による分解を受けることが知られているが、前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドは、らせん構造を取らないために、３重らせん構造を有する前記ＩＶ型コラーゲンに比べて分解酵素による分解を受け易く、生体内で完全長の１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを検出することは難しいと想定されたが、本発明者らは、ヒト胎盤において１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを見出した（非特許文献３参照）。【０００８】
本発明者らは、更に、細胞から分泌される１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドが、ＩＶ型コラーゲンとは異なる翻訳後修飾を受けていることを明らかにした。ＩＶ型コラーゲンにおいてプロリン水酸化及びリジン水酸化が３重らせん構造の形成及び／又は安定化に関与することが知られているが、１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドは、ＩＶ型コラーゲンに比べてプロリン水酸化及びリジン水酸化の程度が低い。また、１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドは、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ糖鎖を認識するＡｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ凝集素（ＡＢＡ）レクチンと反応するが、ＩＶ型コラーゲンはＡＢＡレクチンと反応しない。【０００９】
このように１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドは、ＩＶ型コラーゲンあるいはその変性によって生じるポリペプチドとは異なる化学的構造を有しており、１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドはＩＶ型コラーゲンと異なる生物学的機能を有すると推測されている。【００１０】
固形腫瘍は、増殖のために新しい血管を必要とする。このため血管新生を阻害することは、腫瘍増殖の阻害方法の一つである。前記ＩＶ型コラーゲンは、コラーゲン領域と非コラーゲン領域とからなり、Ｃ末端の非コラーゲン領域のポリペプチドであるＡｒｒｅｓｔｅｎが、管腔形成を阻害し、血管新生を阻害する結果、腫瘍の増殖を抑制することが報告されている（非特許文献４参照）。【００１１】
前記ＩＶ型コラーゲンに対するモノクローナル抗体としては、ＪＫ１９９（特許文献１参照）及び血清中のＩＶ型コラーゲンの測定キットに含まれる抗体（非特許文献５、非特許文献６、及び特許文献２参照）が報告されている。【００１２】
また、変性したＩＶ型コラーゲンに対するモノクローナル抗体としては、「隠れたコラーゲン部位（ｃｒｙｐｔｉｃ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｓｉｔｅ）」に作用する抗体（特許文献３参照）が報告されている。しかしながら、これらの抗体が、細胞外に分泌され、安定に存在する１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを認識することは開示も示唆もされていない。【００１３】
一方、１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを認識する抗体としては、ＪＫ１３２（非特許文献１、及び非特許文献７参照）が１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを認識することが報告されている。しかしながら、これらの報告では１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドの生物学的役割及び癌との関連性は明らかにされておらず、１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドに対する抗体を含む医薬が腫瘍の診断薬及び治療薬として有用であることについては開示も示唆もされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開昭６３−７８０６７号公報
【特許文献２】特開平２−１５５３号公報
【特許文献３】特開２００９−２４０３２４号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ（１９９９）ｖｏｌ．３１；ｐ．１６１−１６８
【非特許文献２】Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００１）ｖｏｌ．１２９；ｐ．９２９−９３６
【非特許文献３】Ｋａｊｉｍｕｒａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｉｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ（２００４）ｖｏｌ．３１４；ｐ．１１−１６
【非特許文献４】Ｔｈｏｍａｓ  Ｍ．Ｍｕｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００７）ｖｏｌ．７４；ｐ．８５−８９
【非特許文献５】ＩＶ型コラーゲン測定キット「パナッセイＩＶ・Ｃ（ラテックス）」取扱説明書；第一化学薬品（２００６年改訂版）
【非特許文献６】Ｏｂａｔａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ１８１、ｐ２９３−３０４、１９８９
【非特許文献７】Ｉｗａｔａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９５）ｖｏｌ．１１７（６）；ｐ．１２９８−１３０４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、腫瘍組織への選択性に優れたモノクローナル抗体、並びに、該モノクローナル抗体を含む医薬、及び腫瘍の治療、診断に有用な腫瘍の診断薬、予防薬又は治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは前記目的を達成するために鋭意研究を行った結果、１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドが、ヒト癌細胞株、担癌動物の癌組織及びヒト臨床腫瘍において高発現していること、また前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体が前記担癌動物の癌組織の増殖を抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１８】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  Ａｎｔｉ  ＮＫ−Ａｎｔｉｇｅｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＃１４１（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３００）のハイブリドーマ株により産生され、１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドに特異的に結合することを特徴とするモノクローナル抗体である。
＜２＞  Ｈ鎖が配列番号５〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含み、Ｌ鎖が配列番号８〜１０のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含む前記＜１＞に記載のモノクローナル抗体である。
＜３＞  Ｈ鎖が配列番号１１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含み、Ｌ鎖が配列番号１４〜１６のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含む前記＜１＞に記載のモノクローナル抗体である。
＜４＞  ＧＩＧＩＰＧＬＲＧ（配列番号４１）で表されるアミノ酸配列を含むエピトープを認識する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のモノクローナル抗体である。
＜５＞  前記＜１＞に記載のモノクローナル抗体が有する相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を含むことを特徴とするモノクローナル抗体である。
＜６＞  前記＜２＞に記載のモノクローナル抗体が有する、Ｈ鎖が配列番号５〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含み、Ｌ鎖が配列番号８〜１０のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とするモノクローナル抗体である。
＜７＞  前記＜３＞に記載のモノクローナル抗体が有する、Ｈ鎖が配列番号１１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含み、Ｌ鎖が配列番号１４〜１６のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とするモノクローナル抗体である。
＜８＞  前記＜４＞に記載のモノクローナル抗体が認識する、ＧＩＧＩＰＧＬＲＧ（配列番号４１）で表されるアミノ酸配列を含むエピトープを認識することを特徴とするモノクローナル抗体である。
＜９＞  ヒト型化されてなる前記＜５＞から＜８＞のいずれかに記載のモノクローナル抗体である。
＜１０＞  前記＜１＞に記載のモノクローナル抗体が有する相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体へ移植してなることを特徴とするモノクローナル抗体である。
＜１１＞  Ｈ鎖が配列番号５〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含み、Ｌ鎖が配列番号８〜１０のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とするモノクローナル抗体である。
＜１２＞  Ｈ鎖が配列番号１１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含み、Ｌ鎖が配列番号１４〜１６のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とするモノクローナル抗体である。
＜１３＞  ＧＩＧＩＰＧＬＲＧ（配列番号４１）で表されるアミノ酸配列を含むエピトープを認識することを特徴とするモノクローナル抗体である。
＜１４＞  ヒト型化されてなる前記＜１１＞から＜１３＞のいずれかに記載のモノクローナル抗体である。
＜１５＞  Ａｎｔｉ  ＮＫ−Ａｎｔｉｇｅｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＃１４１（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３００）であることを特徴とするハイブリドーマ株である。
＜１６＞  前記＜１＞から＜１４＞のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含むことを特徴とする医薬である。
＜１７＞  前記＜１＞から＜１４＞のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含むことを特徴とする腫瘍の診断薬、予防薬又は治療薬である。
＜１８＞  腫瘍が、１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを発現している癌細胞を含む腫瘍である前記＜１７＞に記載の腫瘍の診断薬、予防薬又は治療薬である。
＜１９＞  前記＜１＞、＜２＞、＜４＞から＜６＞、＜８＞から＜１１＞、＜１３＞、及び＜１４＞のいずれかに記載のモノクローナル抗体の部分構造であって、
前記モノクローナル抗体が有する相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を含み、前記ＣＤＲが、配列番号５〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含み、且つ配列番号８〜１０のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とするモノクローナル抗体の部分構造である。
＜２０＞  前記＜１＞、＜３＞から＜５＞、＜７＞から＜１０＞、及び＜１２＞から＜１４＞のいずれかに記載のモノクローナル抗体の部分構造であって、
前記モノクローナル抗体が有する相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を含み、前記ＣＤＲが、配列番号１１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含み、且つ配列番号１４〜１６のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とするモノクローナル抗体の部分構造である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、腫瘍組織への選択性に優れたモノクローナル抗体、並びに、該モノクローナル抗体を含む医薬、及び腫瘍の治療、診断に有用な腫瘍の診断薬、予防薬又は治療薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、腫瘍細胞株（ヒト肝癌細胞株ＨＬＦ又はヒト腎臓癌細胞株ＵＯ３１）における１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドの発現の一例を示す図である。ＪＫ１３２とＡｂ６５８６（Ａｂｃａｍ社製）は、いずれもウエスタンブロッティングで１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを認識する抗体である。「３本鎖ＣＯＬ４」は、３本鎖分子間にジスルフィド結合を保ちＳＤＳ化により変性したＩＶ型コラーゲンを示し、「１本鎖ＣＯＬ４」は、１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを示し、還元処理の「−」は、泳動サンプル用緩衝液中に２−メルカプトエタノールを含まないことを示し、還元処理の「＋」は、泳動サンプル用緩衝液中に２−メルカプトエタノールを含むことを示す。
【図２】図２は、担癌（ヒト肺癌Ｌｕ６５Ａ）ヌードラットの癌組織における１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドの発現の一例を示す図である。「３本鎖ＣＯＬ４」は、３本鎖分子間にジスルフィド結合を保ちＳＤＳ化により変性したＩＶ型コラーゲンを示し、「１本鎖ＣＯＬ４」は、１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを示し、還元処理の「−」は、泳動サンプル用緩衝液中に２−メルカプトエタノールを含まないことを示し、還元処理の「＋」は、泳動サンプル用緩衝液中に２−メルカプトエタノールを含むことを示す。
【図３】図３は、ヒト臨床肺癌組織及び肺癌患者より得られたヒト臨床正常肺組織における１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドの発現量を比較した図である。「３本鎖ＣＯＬ４」は、３本鎖分子間にジスルフィド結合を保ちＳＤＳ化により変性したＩＶ型コラーゲンを示し、「１本鎖ＣＯＬ４」は、１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを示す。
【図４】図４は、ヒト肝癌細胞株ＨＬＦが産生した１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドの精製品の一例を示す図である。「ＭＷ」は、分子量マーカーを示す。
【図５】図５は、抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体（ＮＫ４６１４１）が１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを特異的に認識することの一例を示す図である。「Ｓｕｐ．」は、ヒト肝癌細胞ＨＬＦの培養上清を示し、「ＣＮＴ」は、免疫沈降用の１次抗体を含まないＰＢＳのみの陰性対照を示し、「ＩｇＧ２ｂ」は、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照をそれぞれ示す。
【図６】図６は、ヒト肺癌Ｌｕ６５Ａ皮下移植ヌードマウスモデルにおいて、抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体（ＮＫ４６１４１）が腫瘍の増殖を抑制することの一例を示す図である。−△−は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群を示し、−○−は、本発明の抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体（ＮＫ４６１４１）投与群を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、野生型ＩＶ型コラーゲンα１遺伝子（ＣＯＬ４Ａ１）の全長（ＦＬ）及び変異型ＣＯＬ４Ａ１の発現ベクターを用いて発現させた野生型組換えタンパク質（ＦＬ）及び変異型組換えタンパク質（Δ２９〜４８８、Δ２９〜９８９、Δ２９〜１，０６６）を示す概略説明図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体（ＮＫ４６１４１）が認識するエピトープ絞込みのためのウエスタンブロッティングの結果を示す図である。「Ｍｏｃｋ」は、陰性対照を示し、ＪＫ１３２は、遺伝子発現確認用の対照を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクターを示すを用いて発現させた変異型組換えタンパク質（９９０〜１，０６６ｍｙｃ、９９０〜１，０１９ｍｙｃ、１，０２０〜１，０６６ｍｙｃ）を示す概略説明図である。「ｍｙｃ」は、付加した遺伝子発現確認用マーカーであり、抗ｍｙｃ抗体で認識される。
【図８Ｂ】図８Ｂは、抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体（ＮＫ４６１４１）が認識するエピトープの絞込みのためのウエスタンブロッティングの結果を示す図である。「Ｍｏｃｋ」は、陰性対照を示し、抗ｍｙｃ抗体は、遺伝子発現確認用の対照を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、野生型ＣＯＬ４Ａ１の全長及び変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクターを用いて発現させた野生型組換えタンパク質（ＦＬ）及び変異型組換えタンパク質（Δ１，０２０〜１，０６６、Δ１，０２０〜１，０４９、Δ１，０５０〜１，０６６）を示す概略説明図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＮＫ４６１４１が認識するエピトープの絞込みのためのウエスタンブロッティングの結果を示す図である。「Ｍｏｃｋ」は、陰性対照を示し、ＪＫ１３２は、遺伝子発現確認用の対照を示す。
【図１０】図１０は、ＮＫ４６１４１が認識するエピトープの絞込みのためのｄｏｔ  ｂｌｏｔの結果を示す図である。＃１：配列番号３７で表されるペプチド配列、＃２：配列番号３８で表されるペプチド配列、＃３：配列番号３９で表されるペプチド配列、＃４：配列番号４０で表されるペプチド配列、＃５：配列番号４１で表されるペプチド配列、＃６：配列番号４２で表されるペプチド配列。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（モノクローナル抗体）
本発明のモノクローナル抗体（以下、「抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体」、「ＮＫ４６１４１」などと称することがある）は、以下の第１〜第３の形態を含む。
前記第１の形態としての前記モノクローナル抗体は、Ａｎｔｉ  ＮＫ−Ａｎｔｉｇｅｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＃１４１（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３００）のハイブリドーマ株により産生され、１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドに特異的に結合する抗体である。前記Ａｎｔｉ  ＮＫ−Ａｎｔｉｇｅｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＃１４１は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに国際寄託されているハイブリドーマ株である（受領日２０１０年１０月５日）。
前記第２の形態としての前記モノクローナル抗体は、Ｈ鎖が、配列番号５〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含み、Ｌ鎖が配列番号８〜１０のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含むモノクローナル抗体、又は、Ｈ鎖が配列番号１１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含み、Ｌ鎖が配列番号１４〜１６のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含むモノクローナル抗体である。
前記第３の形態としての前記モノクローナル抗体は、ＧＩＧＩＰＧＬＲＧ（配列番号４１）で表されるアミノ酸配列を含むエピトープを認識するモノクローナル抗体である。
なお、前記第１〜第３の形態のモノクローナル抗体は、いずれも１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドに特異的に結合する抗体である。また、前記第１〜第３の形態に係るモノクローナル抗体は、前記特徴を有する限り、それぞれ同一のものであってもよく、異なるものであってもよい。
【００２２】
本発明において「１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド」とは、ＩＶ型コラーゲン遺伝子産物として１本鎖の状態で細胞から分泌されたタンパク質を指す。通常、「ＩＶ型コラーゲン」とは、３本のＩＶ型コラーゲン遺伝子産物が分子間ジスルフィド結合により架橋され、３重らせん構造を有するタンパク質を指すが、「１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド」は、分子間ジスルフィド結合を有さない。
【００２３】
前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド（分子量約１８０ｋＤａ）は、ＩＶ型コラーゲン（分子量約５００ｋＤａ）を還元して得られた単量体あるいはその変性によって生じるポリペプチドとは異なる化学構造を有している。前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドは、前記ＩＶ型コラーゲンに比べ、水酸化プロリン残基や水酸化リジン残基の割合が低い。また、前記ＩＶ型コラーゲンとは異なり、前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドは、Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ凝集素（ＡＢＡ）レクチンで認識されるＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ糖鎖を有する。また、１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドは、その遺伝子多型体、遺伝子変異体、スプライシングバリアント、翻訳後修飾バリアントをも含む。
【００２４】
前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを産生する細胞としては、天然由来のものでも、該１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドをコードする遺伝子を導入した遺伝子組換え体のいずれでもよく、該１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを産生する細胞であれば何ら制限はない。前記遺伝子組換え体は公知の手法により得ることができる。
【００２５】
本発明において「１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドに特異的に結合する抗体」（抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体）とは、前記ＩＶ型コラーゲンを認識せず、前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを特異的に認識する抗体であれば、その由来、種類、形状などに制限はない。モノクローナル抗体に限らず、ポリクローナル抗体も、本発明の範囲内として含まれる。
【００２６】
前記ポリクローナル抗体は、前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを感作した動物の血清免疫グロブリン画分から公知の手法によって得ることができる。なお、この際、被感作動物は、ポリクローナル抗体を得られる動物であれば種を問わない。
【００２７】
＜第１の形態＞
前記第１の形態に係る抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体は、前記Ａｎｔｉ  ＮＫ−Ａｎｔｉｇｅｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＃１４１（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３００）のハイブリドーマ株により産生される抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体そのものの他、例えば、該抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体の部分構造を含むキメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト抗体、マウス抗体なども、本発明の範囲内として含まれる。これらの中でも、ヒト型化抗体、ヒト抗体が特に好ましい。
【００２８】
前記部分構造としては、前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを特異的に認識する前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体の一部であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抗原（１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド）と結合する、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域（Ｖ領域）、相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）、ｓｃＦｖ（一本鎖抗体）等を含む部分構造などが挙げられる。
【００２９】
前記「キメラ抗体」とは、２つ以上の異なる抗体由来の領域を含む抗体を意味する。一形態では、前記キメラ抗体は、抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体のＶ領域に由来する領域を含む。他の形態では、前記キメラ抗体は、複数の抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体由来のＶ領域がキメラ抗体中に含まれている。
【００３０】
前記「ヒト抗体」は、ヒトのイムノグロブリン配列に由来するＶ領域を有する抗体を指す。ヒト抗体を作製する技術も公知であり、遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。
【００３１】
前記「ヒト型化抗体」は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の１つ又は複数のＣＤＲをヒト抗体のＣＤＲへ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州出願公開ＥＰ１２５０２３号公報、国際公開第９６／０２５７６号パンフレット参照）。
【００３２】
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲ及びＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法によりヒト型化抗体を合成する方法が知られている（国際公開第９８／１３３８８号パンフレットに記載の方法を参照）。
前記ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、抗体の抗原への結合親和性が高い抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じて、抗体の抗原への結合親和性が高い抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるＦＲのアミノ酸を置換してもよい。
【００３３】
前記ＣＤＲは、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内で見出される非連続な抗原結合部位を意味する。これらの特定の領域は、当技術分野で公知であり、Ｋａｂａｔら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９〜６６１６（１９７７））、Ｋａｂａｔら（米国保健社会福祉省、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９９１））、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７））、及びＭａｃＣａｌｌｕｍら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２〜７４５（１９９６））によって記載されている。
【００３４】
また、ＩＭＧＴ／ＬＩＧＭ−ＤＢデータベース〔Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ、２００６、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３４（Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ）：Ｄ７８１−Ｄ７８４及びＬｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ、１９９５、ＬＩＧＭ−ＤＢ／ＩＭＧＴ：Ａｎ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｉｇ  ａｎｄ  ＴｃＲ、Ｐａｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ．  Ａｎｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７６４（１）、４７−４７ｄｏｉ；１０．１１１１／ｊ．１７４９−６６３２．１９９５．ｔｂ５５８０５．ｘに記載（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｌｅｃｔ／）〕、ＩＭＧＴ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ／）、ＩＭＧＴ／ＧＥＮＥ−ＤＢデータベース〔Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ、２００５、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００５  Ｊａｎ  １；３３（Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２５６−６１に記載（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ＧＥＮＥ−ＤＢ／ＧＥＮＥｌｅｃｔ）〕、Ｋａｂａｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｂａｔｄａｔａｂａｓｅ．ｃｏｍ）のようないくつかのデータベースからも入手可能である。これらのデータベースに登録されているＣＤＲ配列情報と比較することにより、前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体に含まれるＣＤＲの同定も可能である。
【００３５】
前記第１の形態に係る抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体のＣＤＲとしては、Ｈ鎖が、配列番号５〜７及び１１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含み、Ｌ鎖が、配列番号８〜１０及び１４〜１６のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含むことが好ましく、配列番号５〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含むＨ鎖と、配列番号８〜１０のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含むＬ鎖との組合せ、又は、配列番号１１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含むＨ鎖と、配列番号１４〜１６のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含むＬ鎖との組合せがより好ましい。
なお、前記第１の形態に係る抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体の前記ＣＤＲにおける配列番号５〜１６で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかは、１個若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００３６】
また、前記第１の形態に係る抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体は、ＧＩＧＩＰＧＬＲＧ（配列番号４１）で表されるアミノ酸配列を含むエピトープを認識する抗体であることが好ましい。なお、前記エピトープにおいて、前記配列番号４１で表されるアミノ酸配列は、１個若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００３７】
また、前記第１の形態に係る抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体そのものの他、例えば、該抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体の部分構造も、本発明の範囲内として含まれる。
前記部分構造としては、前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを特異的に認識する前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体の一部であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抗原（１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド）と結合する、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｖ領域、相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）、ｓｃＦｖ（一本鎖抗体）等を含む部分構造などが挙げられる。
【００３８】
＜第２の形態＞
前記第２の形態に係る抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体は、Ｈ鎖が配列番号５〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含み、Ｌ鎖が配列番号８〜１０のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含むモノクローナル抗体、又は、Ｈ鎖が配列番号１１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含み、Ｌ鎖が配列番号１４〜１６のいずれかで表されるアミノ酸配列から選択される少なくとも１種を含むモノクローナル抗体である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記第２の形態に係る抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体には、前記Ｈ鎖及び前記Ｌ鎖を含む、キメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト抗体、マウス抗体なども、本発明の範囲内として含まれる。これらの中でも、ヒト型化抗体、ヒト抗体が特に好ましい。
なお、前記第２の形態に係る抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体において、前記配列番号５〜１６で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかは、１個若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００３９】
また、前記第２の形態に係る抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体そのものの他、例えば、該抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体の部分構造も、本発明の範囲内として含まれる。
前記部分構造としては、前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを特異的に認識する前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体の一部であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抗原（１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド）と結合する、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｖ領域、ＣＤＲ、ｓｃＦｖ（一本鎖抗体）等を含む部分構造などが挙げられる。
【００４０】
＜第３の形態＞
前記第３の形態に係る抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体は、ＧＩＧＩＰＧＬＲＧ（配列番号４１）で表されるアミノ酸配列を含むエピトープを認識する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記第３の形態に係る抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体には、前記配列番号４１で表されるアミノ酸配列を認識する、キメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト抗体、マウス抗体なども、本発明の範囲内として含まれる。これらの中でも、ヒト型化抗体、ヒト抗体が特に好ましい。
なお、前記エピトープにおいて、前記配列番号４１で表されるアミノ酸配列は、１個若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００４１】
また、前記第３の形態に係る抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体そのものの他、例えば、該抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体の部分構造も、本発明の範囲内として含まれる。
前記部分構造としては、前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを特異的に認識する前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体の一部であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抗原（１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド）と結合する、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｖ領域、ＣＤＲ、ｓｃＦｖ（一本鎖抗体）等を含む部分構造などが挙げられる。
【００４２】
本発明において、「エピトープ」とは、抗体が結合するタンパク質（抗原）中の特定部位を指し、この特定部位は、直鎖及び非直鎖のエピトープの両方を含む。
【００４３】
前記エピトープの同定方法は、公知の分子生物学的手法や細胞工学的手法や生化学的手法を用いることができる。
【００４４】
例として、以下にエピトープの同定方法を次に示す。
前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを産生するヒト細胞株より調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて、ＩＶ型コラーゲンα１遺伝子（ＣＯＬ４Ａ１、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１２８２）の全長をクローニングし、ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター（野生型）を作製する。次に、クローニングしたＣＯＬ４Ａ１のｃＤＮＡをテンプレートとして、様々なＣＯＬ４Ａ１の変異体の発現ベクター（変異型）も併せて作製する。前記作製した野生型又は変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクターを適当な培養細胞株（例えば、ヒト細胞株）に導入し、野生型又は変異型１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを一過性に過剰発現させる。野生型又は変異型１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを一過性に発現させた培養細胞の上清あるいは細胞抽出液を用いて、１次抗体として前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体を用いたウエスタンブロッティングを実施することにより、抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体が認識する１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドのエピトープの同定が可能である。
【００４５】
また、上記の方法以外にも、ＩＶ型コラーゲンポリペプチドの部分配列ペプチドを化学合成し、ｄｏｔ  ｂｌｏｔ法やＥＬＩＳＡ法などを用いて、前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体が認識する１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドのエピトープを同定することも可能である。
【００４６】
更に、上記２種類の方法を組み合わせることによる前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体が認識する１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドのエピトープの同定も可能である。
【００４７】
＜＜抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体の作製方法＞＞
前記第１〜第３の形態の抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体の作製方法としては、特に制限はなく、公知の手法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などが挙げられる。これらの中でも、免疫学的手法が好ましい。
例として、免疫学的手法による抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体の作製を次に示す。
【００４８】
前記免疫学的手法に用いられる抗原としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成した抗原、組換え抗原、生体試料から精製した抗原などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記抗原としては、前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドの全長のアミノ酸配列からなるタンパク質を用いることが好ましい。前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体の調製の際、抗原が低分子量のために有効な免疫惹起作用を期待できない場合には、キャリアタンパク質を結合させた抗原を用いることが好ましい。
【００４９】
前記キャリアタンパク質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＫＬＭ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）、ＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００５０】
前記キャリアタンパク質の結合方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、ジアゾ縮合法、ＭＢＳ（マレイミドベンゾイルオキシコハク酸イミド）法などが挙げられる。
【００５１】
また、前記抗原としては、１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド（又はその一部）を、ＧＳＴ、βガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク、ヒスチジンタグ等との融合タンパク質として発現させた抗原を用いることもできる。このような融合タンパク質は、汎用的な方法により簡便に精製することができる。
【００５２】
前記免疫学的手法による前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体の調製方法の具体例としては、前記抗原を所望の動物に感作させ、必要に応じて免疫感作を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で採血し、遠心処理などによって血清を得る方法などが挙げられる。十分に抗体価が上昇した時点で免疫動物から抗体産生細胞を摘出する。
次に、得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを融合してハイブリドーマを得る。続いて、このハイブリドーマをモノクローナル化した後、前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドに対して高い特異性を有する抗体を産生するクローンを選択する。選択されたクローンの培養液を精製することによって目的の抗体が得られる。
【００５３】
一方、前記ハイブリドーマを所望数以上に増殖させた後、これを動物（例えば、マウスなど）の腹腔内に移植し、腹水内で増殖させて腹水を精製することにより目的の抗体を取得することもできる。
【００５４】
前記培養液の精製又は腹水の精製には、プロテインＧ、プロテインＡ等を用いたアフィニティークロマトグラフィーが好適に用いられる。また、抗原を固相化したアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。更には、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、硫安分画、及び遠心分離等の方法を用いることもできる。これらの方法は単独乃至任意に組み合わされて用いられる。
【００５５】
前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを特異的に認識する抗体としては、本発明の前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体の他、ＪＫ１３２（非特許文献１及び非特許文献７参照）など公知の抗体が挙げられるが、前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体は、前記公知の抗体と比較して、抗原（１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド）に対する親和性が高い点で有利である。
【００５６】
（ハイブリドーマ株）
本発明のハイブリドーマ株は、Ａｎｔｉ  ＮＫ−Ａｎｔｉｇｅｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＃１４１株と呼ばれ、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３００（受領日２０１０年１０月５日）として独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託されている。
前記ハイブリドーマ株は、前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体を産生することができる。
【００５７】
（医薬）
本発明の医薬は、本発明の前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体及び／又はその部分構造を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の成分を含む。本発明において前記部分構造は、１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドのＣＤＲ又はエピトープを認識する部分、即ち抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体の抗原結合部位を含むことが好ましい。
本発明の医薬は、後述する本発明の腫瘍の診断薬、予防薬又は治療薬（例えば、抗癌剤など）として好適に用いられる。
【００５８】
前記医薬は、抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体及び／又は又はその部分構造を含む医薬組成物も含む。前記医薬組成物には、抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体の他、医薬に用いられる担体を含む。
【００５９】
前記医薬に用いられる担体は、生理的に許容される、ヒト又はヒト以外の哺乳類への投与に適した溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などであれば特段限定ない。
前記医薬に用いられる担体の具体例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノールなどの１種以上、並びにそれらの組み合わせなどが挙げられる。多くの場合、組成物内に等張性の物質、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、又は塩化ナトリウムが含まれることが好ましい。医薬に用いられる担体が、湿潤剤若しくは乳化剤、防腐剤又は緩衝剤などの微量の補助的物質を更に含んでもよく、これらのものは、抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体又は該抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体の部分構造の保存性又は有効性を高める点で有利である。
【００６０】
＜剤形＞
前記医薬の剤形は、特段限定されない。例えば、液体、半固体及び固形の剤形であり、具体的には、溶液（例えば、注射可能な溶液及び不溶性の溶液）、分散液若しくは懸濁液、錠剤、丸薬、粉剤、リポソーム、座薬などが挙げられる。
前記剤形は、投与経路や適応症に応じて適宜選択されるが、好ましくは、注射可能な剤形である。注射可能な剤形の好ましい組成としては、注射可能な溶液又は不溶性の溶液の剤形が挙げられ、筋肉内注射、好ましくは、皮下注射に適したものが挙げられる。
【００６１】
前記医薬は、この他、製造及び保存の条件下で無菌かつ安定であれば、溶液、マイクロエマルション、分散液、リポソーム、又は他の投与に適した態様のいずれにも限られない。抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体及び／又は又はその部分構造を、必要に応じて上記に列挙された成分の１種又は組み合わせたものと共に、必要な量の適切な溶媒内に組み込み、次いでろ過滅菌することによって、注射可能な無菌の溶液を調製することができる。
【００６２】
基本的な分散媒と、上記に列挙されたものから必要な他の成分とを含む無菌の媒体内に、抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体及び／又は又はその部分構造を組み込むことによって分散液を調製するのが一般的である。注射可能な無菌の溶液を調製するための無菌の粉剤の場合において、好ましい調製方法とは、真空乾燥及び凍結乾燥して、有効成分プラス既にろ過滅菌されたその溶液からの任意の所望の追加成分の粉剤を得ることである。例えば、レシチンなどの被覆剤を用いることによって、分散液の場合は必要な粒子径を維持することによって、そして界面活性剤を用いることによって、溶液の適切な流動性を維持することができる。モノステアリン酸塩及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を組成物内に含めることによって、注射可能な組成物の持続的な吸収を成し遂げることができる。
【００６３】
＜投与＞
前記医薬の投与経路は、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内等の非経口が好ましい。好ましくは皮下であるが、注射の他、インプラント、経皮貼布、及びマイクロカプセル化送達システムを含めた制御放出製剤（（Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ジェイ・アール・ロビンソン（Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）編、マルセル・デッカー社（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、１９７８を参照）などの、前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体及び／又は又はその部分構造を急激な放出から保護するような担体を用いて活性化合物を調製してもよい。エチレン酢酸ビニル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。
【００６４】
また、前記医薬は経口投与してもよい。その場合、前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体及び／又は又はその部分構造は不活性化を防止する材料で化合物を被覆する、又は前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体及び／又は又はその部分構造を、不活性化を防止する材料と同時投与することが好ましい。
例えば、前記医薬を、硬質又は軟質のゼラチンカプセル内に封入及び／又は圧縮して錠剤としてもよい。また、不活性な希釈剤又は吸収可能な食用になる担体と共に経口投与してもよい。更には被験体の食物に直接組み込んでもよい。治療のための経口投与に関して、前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体及び／又は又はその部分構造を賦形剤と一緒に組み込んで、そして摂取用の錠剤、舌下錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、カシェ剤などの剤形で用いてもよい。
【００６５】
前記医薬に含まれる前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体及び／又は又はその部分構造の含有量は、特に制限はなく、治療又は予防目的に応じて適宜調整される。
また、実際の投与量は、個体の病状、年齢、性別及び体重等に応じて適宜調整される。なお、本発明においての予防のための投与とは、術後の再発防止、又は疾患の初期段階で増悪を抑制するための投与を指す。
【００６６】
１回の投与あたりの投与量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、通常０．１ｍｇ／ｋｇ〜２５０ｍｇ／ｋｇであり、０．５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇがより好ましく、約５ｍｇ／ｋｇが特に好ましい。前記投与量は、治療する症状に応じて投与の度に調整されうる。また、患者の症状、全身状態等を勘案して、この範囲に収まらない投与量を適用してもよい。
【００６７】
前記医薬の投与スケジュールは、単回、連投のいずれでもよい。また、一定期間の投与の後休薬期間を設け、再び投与を行うことであってもよい。
【００６８】
前記医薬は、他の１種以上の医薬と併用してもよく、併用される医薬は症状や副作用を考慮して適宜選択される。本発明において併用には他の医薬を同時又は相前後して投与する他、他の医薬と共に製剤化することも含まれる。
【００６９】
前記医薬と組み合わせることができる医薬は、症状に応じて適宜選択される。例えば、抗腫瘍活性を有する医薬品である、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン等の白金製剤；シクロフォスファミド、メルファラン等のアルキル化剤；ゲムシタビン、ティーエスワン、５−フルオロウラシル、メトトレキセート等の代謝拮抗剤；ブレオマイシン、ダウノマイシン、アドリアマイシン等の抗腫瘍性抗生物質；イリノテカン、パクリタキセル、エトポシド、ビンクリスチン等のアルカロイド類；ホルモン類等の抗癌剤；エルロチニブ、ゲフィチニブ、ソラフェニブ等の分子標的薬；トラスツズマブ、ベバシズマブ等の抗体医薬；などが挙げられる。
【００７０】
前記医薬を予防用医薬又は医薬組成物として用いる場合の剤形、投与経路、投与量、投与スケジュールは治療に用いられる場合と同一である。
【００７１】
本発明の前記医薬には、治療用キットも含まれる。前記治療用キットは、本発明の前記医薬又は医薬組成物と併用される他の１種以上の医薬を含む。
【００７２】
本発明の診断、予防、又は治療の対象としては、特に制限はなく、肺癌、胃癌、肝臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、胆のう癌、卵巣癌等すべての固形癌、及び造血器腫瘍に適用することができ、１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドの発現が確認された患者に対して診断、予防、又は治療を行うことができる。本発明の診断、予防、又は治療を実施するに際しては、本発明の前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体及び／又は又はその部分構造そのもの、本発明の前記医薬、又は本発明の前記医薬組成物のいずれをも使用することができる。また、本発明の前記医薬又は前記医薬組成物を予防用医薬又は医薬組成物として用いる場合は、固形癌外科手術時の転移予防及び再発予防のための転移予防剤として用いることが有効である。
【００７３】
（腫瘍の診断薬、予防薬又は抗癌剤）
本発明の腫瘍の診断薬、予防薬又は抗癌剤は、前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体を少なくとも含む。前記腫瘍の診断薬は、診断用キットの形態で提供される場合があり、前記キットも本発明に含まれる。
前記腫瘍の診断用キットは、前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体を少なくとも含み、必要に応て、そのほかに、標識物質、あるいは抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体又はその標識物を固定した固相化試薬などを含んでもよい。
【００７４】
前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体の標識物とは、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、又は化学発光化合物によって標識されたものを意味する。前記キットは、前記の構成要素の他、検出を実施するための他の試薬、例えば、標識物が酵素標識物の場合は、酵素基質（発色性基質等）、酵素基質溶解液、酵素反応停止液、あるいは検体用希釈液等を含んでいてもよい。
【００７５】
前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体を用いた腫瘍の検出は、検体として被験者から採取した生体試料、例えば、血液等と前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体又はその構造とを抗原抗体反応によって結合させ、結合した抗体量に基づいて試料中の目的とする抗原（１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド）の量を測定することにより行うことができる。
前記抗原量の検出は、公知の免疫学的測定法に従って行えばよく、例えば、免疫沈降法、免疫凝集法、標識免疫測定法、免疫比懸濁法、ウエスタンブロット法、フローサイトメトリー法などを用いることができる。
【００７６】
前記標識免疫測定法では、前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体のシグナルは、標識抗体を用いて直接検出した標識量で表すほか、既知濃度あるいは既知抗体価の抗体を標準液として相対的に表してもよい。即ち、標準液と検体を測定計により測定し、標準液の値を基準にして試料中の抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体シグナルを相対的に表すことができる。前記標識免疫測定法としては、例えばＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、化学発光免疫測定法（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）などが挙げられる。これらの中でも、ＥＬＩＳＡ法が簡便かつ高感度という点で好ましい。
【００７７】
前記抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド抗体を用いた腫瘍の検出に基づいて、前記検出方法により得られた検出結果を指標として腫瘍の状態を評価又は診断することができる。例えば、検出結果が所定の基準値を超えるものを腫瘍陽性、所定の基準値以下のものを腫瘍陰性とし、陽性の場合には、いずれかの腫瘍を発症している可能性があると判断し、腫瘍の状態を評価することができる。
【００７８】
前記腫瘍の状態とは、腫瘍の罹患の有無又はその進行度を意味し、例えば、腫瘍の発症の有無、進行度、悪性度、転移の有無及び再発の有無等が挙げられる。前記評価に際し、これらの腫瘍の状態は１つを選択してもよく、複数個を適宜組み合わせて選択してもよい。
前記腫瘍の有無を評価するには、前記検出結果に基づき、所定の基準値を境界として腫瘍に罹患しているか否かを判断する。腫瘍の悪性度は、癌がどの程度進行しているのかを示す指標となるものであり、前記検出結果に基づき、病期（Ｓｔａｇｅ）を分類して評価したり、あるいは早期癌、進行癌を分類して評価したりすることも可能である。例えば、上記検査結果を指標として早期癌又は進行癌であると評価することも可能である。前記腫瘍の転移は、前記検出結果を指標として、原発巣の位置から離れた部位に新生物が出現しているか否かにより評価する。前記腫瘍の再発は、間欠期又は寛解の後に検出結果が再び所定の基準値を超えたか否かにより評価する。
【実施例】
【００７９】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これは一例であり、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。【００８０】
（実施例１）
１０容量％胎児牛血清（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社製）を用いて、ヒト肝癌細胞株ＨＬＦ（ＲＩＫＥＮ  ＣＥＬＬ  ＢＡＮＫより入手）及びヒト腎臓癌細胞株ＵＯ３１（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製）を、それぞれ３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。細胞がコンフルエントになった時点で、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地に交換後４８時間培養し、その後培養上清を回収した。この培養上清に４×泳動サンプル用緩衝液〔８（質量／容量）％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、４０（容量）％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２０（容量）％  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、０．００８（質量／容量）％  ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ、０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、（以下の実施例において、泳動サンプル用緩衝液は、同様の組成のものを使用した）〕を１／４量（体積比）を加え、９０℃で５分間加熱してサンプルを作製した〔還元処理（＋）〕。また、前記４×泳動サンプル用緩衝液に２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを含まないこと以外は同様の操作を行ったサンプルも作製した〔還元処理（−）〕。【００８１】
これらのサンプルに対して、ＸＶ  ＰＡＮＴＥＲＡ  ＭＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＲＣ社製）を用いて、４．５（質量／容量）％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及びポリビニリデンジフロライド（ＰＶＤＦ）膜への転写を行った。このＰＶＤＦ膜を２枚用意し、５（質量／容量）％スキムミルクでブロッキングした後、ＪＫ１３２（抗ヒトＩＶ型コラーゲンα１ポリペプチドマウスモノクローナル抗体、工学院大学工学部応用化学科  細胞工学研究室、今村保忠氏より入手、以下同様のものを使用した）若しくはＡｂ６５８６（抗ＩＶ型コラーゲンウサギポリクローナル抗体、Ａｂｃａｍ社製、以下同様のものを使用した）の各抗体溶液で、室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１（容量）％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）による１０分間の洗浄を３回行った後、ＨＲＰ標識された２次抗体として抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）の抗体溶液で、室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０による１０分間の洗浄を３回行った後、ＥＣＬ  ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で化学発光反応をさせ、Ｘ線フィルムに感光させた。【００８２】
結果を図１に示す。Ａｂ６５８６及びＪＫ１３２の各抗体は、１本又は移動度に違いのある２本からなるほぼ同様のバンドパターンを検出した。非還元処理サンプル〔還元処理（−）〕からは、（１）移動度が小さく、分子間ジスルフィド結合を保ったままのＳＤＳ化されたＩＶ型コラーゲン（図１において、「３本鎖ＣＯＬ４」と示す）と、（２）約１８０ｋＤａの、移動度が大きく、最初から分子間ジスルフィド結合を有さない１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド（図１において、「１本鎖ＣＯＬ４」と示す）が検出された。還元処理サンプル〔還元処理（＋）〕からは、前記（２）分子間ジスルフィド結合を有さない１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドと同じ移動度のバンドのみが検出された。還元処理サンプル〔還元処理（＋）〕のバンドは、前記（１）分子間ジスルフィド結合を保ったままのＳＤＳ化されたＩＶ型コラーゲンの分子間ジスルフィド結合が切断されて生じた１本鎖と、前記（２）分子間ジスルフィド結合を有さない１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドとの両者を含む。従ってこれらの癌細胞株は、分子間ジスルフィド結合を有さない１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを発現していることが明らかとなった。【００８３】
（実施例２）
ヌードラット（Ｆ３４４／Ｎ−ｒｎｕ／ｒｎｕ、７週齢、日本クレア社製）皮下で継代したヒト肺癌Ｌｕ６５Ａ（ＪＣＲＢ：Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓより入手）腫瘍塊を約３ｍｍ角のブロックにし、套管針を用いてヌードラットの背側部皮下に移植し、腫瘍体積がおよそ２００ｍｍ３以上になった時点で、癌組織を採取した。組織抽出緩衝液（ｐＨ７．４、０．１Ｍ  ＮａＣｌ／ＰＢＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ社製）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）を湿重量の４倍量を加えてホモジェナイズした。その後、１２，０００回転で５分間遠心し、遠心上清を回収した。この上清に４×泳動サンプル用緩衝液を１／４量（体積比）を加え、９０℃で５分間加熱してサンプルを作製した〔還元処理（＋）〕。また、前記４×泳動サンプル用緩衝液に２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを含まないこと以外は同様の操作を行ったサンプルも作製した〔還元処理（−）〕。【００８４】
これらのサンプルに対して、ＸＶ  ＰＡＮＴＥＲＡ  ＭＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＲＣ社製）を用いて、４．５（質量／容量）％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及びＰＶＤＦ膜への転写を行った。このＰＶＤＦ膜を２枚用意し、５（質量／容量）％スキムミルクでブロッキングした後、ＪＫ１３２若しくはＡｂ６５８６の各抗体溶液で、それぞれ室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０による１０分間の洗浄を３回行った後、ＨＲＰ標識された２次抗体として抗マウスＩｇＧ抗体、抗ウサギＩｇＧ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）をそれぞれ室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０による１０分間の洗浄を３回行った後、ＥＣＬで化学発光反応をさせ、Ｘ線フィルムに感光させた。【００８５】
結果を図２に示す。ＪＫ１３２及びＡｂ６５８６の各抗体は、非還元処理サンプル〔還元処理（−）〕から、分子間ジスルフィド結合を有さない１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチド（図２において、「１本鎖ＣＯＬ４」と示す）のバンドを検出した。従ってヒト肺癌Ｌｕ６５Ａの腫瘍組織では、１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドが発現していることが明らかとなった。また、ＪＫ１３２抗体は、ヒトの１本鎖ＩＶ型コラーゲンα１ポリペプチドとは反応するが、マウスの１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドとは反応しないため、ヒト肺癌Ｌｕ６５Ａの腫瘍組織（ヌードラット皮下移植ヒト腫瘍組織）は、Ｌｕ６５Ａ細胞由来のヒト１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを発現していることが明らかとなった。【００８６】
（実施例３）
実施例１において、ヒト肝癌細胞株ＨＬＦ及びヒト腎臓癌細胞株ＵＯ３１から、ヒト癌細胞株〔Ｌｕ６５Ａ（ＪＣＲＢ：Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓより入手）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製）、ＮＣＩ−Ｈ２２６（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製）、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７（ＡＴＣＣ:Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手）、Ａ４９８（ＡＴＣＣより入手）、Ｐａｎｃ−１（東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センターより入手）、ＯＶＣＡＲ３（東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センターより入手）、又はＨＴ１０８０（大日本製薬株式会社製）〕に変えた以外は、実施例１と同様の方法で各ヒト癌細胞株における１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドの発現を確認した。
また、実施例２において、ヒト肺癌Ｌｕ６５Ａから、ＨＬＦ（ＲＩＫＥＮ  ＣＥＬＬ  ＢＡＮＫより入手）に変えたこと以外は、実施例２と同様の方法で、ヌードラット皮下移植ヒト腫瘍組織における１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドの発現を確認した。
さらにヒト臨床肺癌組織（Ａｓｔｅｒａｎｄ社製、Ｓａｍｐｌｅ  ＩＤ:１１０４４３Ａ１、１１２５２３Ａ１、１０７８１１Ａ１、１１１５４０Ｂ１、１１２２９４Ａ１及び１１１５４１Ａ１）、又は肺癌患者より得られたヒト臨床正常肺組織（Ａｓｔｅｒａｎｄ社製、Ｓａｍｐｌｅ  ＩＤ：９８８５９Ｂ２、１１２２７９Ｂ１及び１１２３０１Ｂ１）は、組織抽出緩衝液（ｐＨ７．４、０．１Ｍ  ＮａＣｌ／ＰＢＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ社製）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）を湿重量の４倍量を加えてホモジェナイズした。その後、１２，０００回転で５分間遠心し、遠心上清を回収した。この上清に前記４×泳動サンプル用緩衝液に２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを含まない前記４×泳動サンプル用緩衝液を１／４量（体積比）を加え、９０℃で５分間加熱してサンプルを作製した〔還元処理（−）〕。
ヒト臨床肺癌組織及び肺癌患者より得られたヒト臨床正常肺組織における１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドの発現では、内部標準としてβ−アクチン量を調べるために、抗β−アクチン抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。
なお、前記ヒト臨床組織において、癌組織及び正常肺組織は、専門医が病理学的に判別したものである。【００８７】
実施例１及び２の結果と併せて、実施例１と同様の方法で１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドの発現が確認されたヒト癌細胞株（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）及び実施例２と同様の方法で１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドの発現が確認されたヌードラット皮下移植ヒト腫瘍組織（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の結果を表１に示す。また、ヒト臨床肺癌組織及びヒト臨床正常肺組織の結果を図３に示す。
表１に示すように、１０種のヒト癌細胞株及び２種のヌードラット皮下移植ヒト腫瘍組織で１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドの発現が確認された。また、図３に示すように、６例の全てのヒト臨床肺癌組織で１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドの高発現が確認された。一方、肺癌患者より得られたヒト臨床正常肺組織での１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドの発現は僅かであった。【００８８】
【表１】
2012063839.tif 000003
【００８９】
以上の結果より、表１に記載のヒト癌細胞株及びヌードラット皮下移植ヒト腫瘍組織において１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドが発現していることが明らかとなった。また、図３の結果から１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドは、腫瘍組織に特異的に高発現していることが明らかである。【００９０】
（実施例４）
＜１本鎖ＩＶ型コラーゲンα１ポリペプチドの調製＞
−細胞と細胞培養−
ヒト肝癌細胞株ＨＬＦ（ＲＩＫＥＮ  ＣＥＬＬ  ＢＡＮＫ）を１０容量％胎児牛血清（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養し、維持した。【００９１】
−１本鎖ＩＶ型コラーゲンα１ポリペプチドの調製−
Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｓらの方法（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ”（１９９９）ｖｏｌ．３１；ｐ．１６１−１６８）を参考に、１本鎖ＩＶ型コラーゲンα１ポリペプチドを、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社製）中で７日間培養したヒト肝癌ＨＬＦ細胞の培地から、イムノアフィニティー精製した。
簡潔に記載すると、先ずＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に４．２ｍｇのＪＫ１３２抗体を固定化することで、ＪＫ１３２アフィニティーカラムを作製した。ＪＫ１３２アフィニティーカラムは、０．２Ｍ  ｇｌｙｃｉｎ−ＨＣｌ、ｐＨ２．５で洗浄した。【００９２】
培養上清４５０ｍｌを１ｍｌのＪＫ１３２アフィニティーカラムに通して、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、０．２Ｍ  ｇｌｙｃｉｎ−ＨＣｌ、ｐＨ２．５で収集した分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにより分析した。得られた溶出画分を透析し、凍結乾燥したものを−８０℃にて保管した。精製した１本鎖ＩＶ型コラーゲンα１ポリペプチドを４．５（質量／容量）％ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、銀染色（第一化学薬品株式会社製）した結果を図４に示す。分子量マーカー（ＭＷ）は、ＢｉｏＲａｄ社のＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｒを用いた。【００９３】
（実施例５）
＜モノクローナル抗体（ＮＫ４６１４１）のスクリーニング＞
−免疫−
実施例４で調製した１本鎖ＩＶ型コラーゲンα１ポリペプチド（抗原）を用いてメスのＢａｌｂ／ｃマウス（日本エスエルシー株式会社）を腹腔注射により免疫した。初回免疫は、一匹あたりＦｒｅｕｎｄの完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ社製）中の１００μｇ若しくは２０μｇの１本鎖ＩＶ型コラーゲンα１ポリペプチドを投与し、以降は、ＲＩＢＩアジュバント（Ｃｏｒｉｘａ社製）中の２０μｇ〜５０μｇの１本鎖ＩＶ型コラーゲンα１ポリペプチドを投与した。免疫は、それぞれ２週間〜３週間の間隔で行った。最後に免疫の７日間後に２５μｇの１本鎖ＩＶ型コラーゲンα１ポリペプチドを含む食塩加リン酸バッファー（ＰＢＳ）で追加免疫することにより動物の抗体価を高めた。【００９４】
−ハイブリドーマの作製−
追加免疫の３日間後、免疫した高抗体価の動物から脾臓細胞を常法により調製し、該脾臓細胞と、Ｐ３．Ｘ６３−Ａｇ８．６５３マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣより入手、＃ＣＲＬ−１５８０）とを、ポリエチレングリコール４０００（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて融合した。公知のＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの技術を用いて、ハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地〔ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）１０質量％、Ｄ（＋）−Ｇｌｕｃｏｓｅ（和光純薬工業株式会社製）５００μＭ、ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）２質量％、ヒポキサンチンナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１００μＭ、アミノプテリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）０．１μＭ、及びチミジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１６μＭをＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁して作製；以下の実施例においても同様の組成のものを使用した。〕中のマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ社製）で選択した。【００９５】
−抗体価の測定−
前記免疫した動物の抗体価を、下記に示すＥＬＩＳＡ法を用いた血清中の抗体価の測定により選択した。先ず、マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ社製）を１本鎖ＩＶ型コラーゲンα１ポリペプチド（抗原）でコートした。次いで１（質量／容量）％ＢＳＡ／ＴＢＳ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ・ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）−０．０５（容量）％  Ｔｗｅｅｎ２０でブロッキングしたウェルに連続希釈した血清を添加しインキュベートした。１本鎖ＩＶ型コラーゲンα１ポリペプチド（抗原）に結合した抗体をマウス免疫グロブリンに対するパーオキシターゼ結合抗体で検出した。【００９６】
−ハイブリドーマのＥＬＩＳＡ法によるスクリーニング−
１本鎖ＩＶ型コラーゲンα１ポリペプチド（抗原）（５０ｍＭ炭酸バッファー中１μｇ／ｍｌ濃度）を９６ウェルマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ社製）に室温で２時間固定した。次いでプレートをＴＢＳ／０．０５容量）％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、プレート表面のフリーの吸着部分を１（質量／容量）％  ＢＳＡ／ＴＢＳ−０．０５（容量）％  Ｔｗｅｅｎ２０を用いてブロックし（室温で３０分間）、再びＴＢＳ／０．０５（容量）％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。ハイブリドーマ培養上清をそれぞれウェルに加え、室温で１時間反応させた。その後、プレートをＴＢＳ／０．０５（容量）％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、次いで１（質量／容量）％  ＢＳＡ／ＴＢＳ−０．０５（容量）％  Ｔｗｅｅｎ２０中に希釈したパーオキシターゼ結合マウス抗ＩｇＧ抗体（ＢＥＴＨＹＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＃Ｅ９０−１３１）を５０μＬ／ウェル加えた。室温で１時間インキュベートした後、プレートをＴＢＳ／０．０５（容量）％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、基質溶液（クエン酸バッファー（ｐＨ５）、０．０５（質量／容量）％  ｏ−フェニレンジアミン、０．０３容量％  Ｈ２Ｏ２）をウェルに１００μＬ／ウェルで加えた。２０分間〜３０分間後、２Ｎ硫酸で反応を止め、分光光度計で４９０ｎｍの吸光度を測定した。
このようにして得られたハイブリドーマ株は、Ａｎｔｉ  ＮＫ−Ａｎｔｉｇｅｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＃１４１（以下、「＃１４１株」と称することがある）として、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに国際寄託した（受領日２０１０年１０月５日）。【００９７】
−モノクローナル抗体の精製−
前記抗体産生ハイブリドーマ＃１４１株を、ＨＡＴ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した培養上清を調製した。また、前記抗体産生ハイブリドーマ＃１４１株を腹腔内投与し、７日間〜１０日間後に採取したマウス腹水をフィルターでろ過して不溶物を除去した。
前記抗体産生ハイブリドーマ培養上清、若しくは前記マウス腹水を、常法に従ってＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅｌｔｈｅｃａｒｅ）を充填したカラムに通して抗体成分を吸着させた後、非特異吸着分を除去してから酸性条件におくことで、遊離したモノクローナル抗体を回収し精製抗体とした。得られた精製抗体は、１００倍量（体積比）のＰＢＳ緩衝液に透析して置換した。本発明者らは、このモノクローナル抗体を「ＮＫ４６１４１」と名付けた。【００９８】
−モノクローナル抗体ＮＫ４６１４１アイソタイプの測定−
サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて、ＮＫ４６１４１のアイソタイプを測定した。抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製）５０μｌ（固相抗体、５０ｍＭ炭酸バッファーで１，０００倍希釈）を９６ウェルマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ社製）６ウェルに分注し、室温で２時間固定した。次いでウェルをＴＢＳ／０．０５（容量）％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、ウェル表面のフリーの吸着部分を１（質量／容量）％  ＢＳＡ／ＴＢＳ−０．０５（容量）％  Ｔｗｅｅｎ２０を用いてブロックし（室温で３０分間）、再びＴＢＳ／０．０５（容量）％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。
この各ウェルにＮＫ４６１４１産生ハイブリドーマの培養上清を５０μｌ添加し、室温で１時間反応させた。その後、ウェルをＴＢＳ／０．０５（容量）％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、１（質量／容量）％  ＢＳＡ／ＴＢＳ−０．０５（容量）％  Ｔｗｅｅｎ２０で１，０００倍に希釈した６種類の検出用抗体（ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ１ヤギ抗体、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ２ａヤギ抗体、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ２ｂヤギ抗体、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ３ヤギ抗体、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＡヤギ抗体、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧＭヤギ抗体；全てＢＥＴＨＹＬ社製）をウェルごとに１種類ずつ５０μＬ加えた。室温で１時間インキュベートした後、ＴＢＳ／０．０５（容量）％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、基質溶液（クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）、０．０５（質量／容量）％  ｏ−フェニレンジアミン、０．０３容量％Ｈ２Ｏ２）を各ウェルに１００μ加えた。２０分間〜３０分間後、２Ｎ硫酸で反応を止め、分光光度計で４９０ｎｍの吸光度を測定した。
その結果ＮＫ４６１４１のアイソタイプはＩｇＧ２ｂであることが判明した。【００９９】
−免疫沈降分析−
免疫沈降分析は、０．５μｇの精製モノクローナル抗体（ＮＫ４６１４１）と、実施例１と同様の方法で培養した、５００μｌの１本鎖ＩＶ型コラーゲンα１ポリペプチドを発現しているヒト肝癌胞株ＨＬＦの培養上清とを４℃でローテーションしながら３０分間インキュベートした。陽性対照としては、ＮＫ４６１４１に代えてＪＫ１３２を用いたこと以外は、前記同様の操作を行った。アイソタイプ対照としては、ＮＫ４６１４１に代えてＭｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ｂ（Ｉｓｏｔｙｐｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒａｄｅ、ＭＢＬ社製、Ｍ０７７−３Ｍ２）を用いたこと以外は、前記同様の操作を行った。また、陰性対照としては、免疫沈降用の１次抗体を含まないＰＢＳのみを用いたこと以外は、前記同様の操作を行った。
次に、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｓｈｅｅｐ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ二次抗体（ｄｙｎａｂｅａｄｓ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ、ベリタス社製、＃ＤＢ１１２０１）を１０μｌ加え、４℃でローテーションしながら１時間インキュベートした。また、陰性対照として、ヒト肝癌胞株ＨＬＦの培養上清にＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｓｈｅｅｐ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ二次抗体を加え、同様にインキュベートした。
マグネットに２分間静置し、上清を除き、５００μｌのｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ中に０．０５（容量）％  Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）で、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを３回洗浄した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓに５０μｌの２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを含まない１×泳動サンプル用緩衝液を添加し、９０℃で５分間加熱し、サンプルを調製した。このサンプルに対して、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及びＰＶＤＦ膜への転写を行った。そしてＰＶＤＦ膜をＡｂ６５８６でインキュベーションし、実施例１と同様に分析した。【０１００】
図５に結果を示す。図５において「Ｓｕｐ．」は、免疫沈降前のヒト肝癌胞株ＨＬＦの培養上清であり、Ａｂ６５８６によって、複数のバンドが検出された。このサンプルをＮＫ４６１４１やＪＫ１３２で免疫沈降すると、１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドだけが選択的に回収されることが示された。免疫沈降法ではＮＫ４６１４１がＩＶ型コラーゲンを認識せず、１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを特異的に認識することを示した。【０１０１】
以上より、１本鎖ＩＶ型コラーゲンα１ポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体ＮＫ４６１４１が得られた。【０１０２】
（実施例６）
＜モノクローナル抗体ＮＫ４６１４１の結合親和性＞
Ｄｊａｖａｄｉ−Ｏｈａｎｉａｎｃｅ  Ｌ．らの方法〔Ｄｊａｖａｄｉ−Ｏｈａｎｉａｎｃｅ  Ｌ．、ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｅｄｓ．：ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．）、Ｃｈａｐｔｅｒ  ４、ｐｐ．７７−９７．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ．〕を参考に、ＥＬＩＳＡ法を用いて、精製モノクローナル抗体ＮＫ４６１４１の解離定数を求めた。
簡潔に記載すると、予め１本鎖ＩＶ型コラーゲンα１ポリペプチド（抗原）を固相化したイムノプレート（Ｎｕｎｃ社製）を準備した。一方、一定濃度（０．１０μｇ／ｍｌ）のＪＫ１３２及びＮＫ４６１４１を様々な濃度の抗原と平衡に達するまでの充分な時間インキュベーションした。このインキュベーション液をＥＬＩＳＡウェルに添加して、Ｆｒｅｅ抗体の量を求めた。抗原抗体反応は、質量作用の法則により、下記式１に実測値を当てはめ、下記式２のＸ及びＹを求めてグラフを描くことにより、その傾き（１／Ｋｄ）から解離定数を求めた。【０１０３】
（式１）
ｘ／［全抗体濃度］×１／［Ｆｒｅｅ抗原］＝（１−ｘ／［全抗体濃度］）×１／Ｋｄ
ここで、
Ｘ＝ｘ／［全抗体濃度］、Ｙ＝ｘ／（［全抗体濃度］×［Ｆｒｅｅ抗原］
とおくと、
（式２）
Ｙ＝（１−Ｘ）×１／Ｋｄ
その結果を表２に示す。【０１０４】
【表２】
2012063839.tif 000004
【０１０５】
ＪＫ１３２及びＮＫ４６１４１の解離定数は、それぞれ１５．３×１０−８Ｍ及び３．４×１０−８Ｍであり、ＮＫ４６１４１は、ＪＫ１３２に比べて１本鎖ＩＶ型コラーゲンα１ポリペプチドに対する親和性が高いことが示された．【０１０６】
（実施例７）
＜モノクローナル抗体ＮＫ４６１４１が認識するエピトープ部位の解析＞
サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて、抗原（１本鎖ＩＶ型コラーゲンα１ポリペプチド）に対する反応性を評価した。実施例５で精製したモノクローナル抗体ＮＫ４６１４１（固相抗体、５０ｍＭ炭酸バッファー中５μｇ／ｍｌ濃度）を９６ウェルマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ社製）に室温で２時間固定した。次いでプレートをＴＢＳ／０．０５（容量）％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、プレート表面のフリーの吸着部分を１（質量／容量）％  ＢＳＡ／ＴＢＳ−０．０５（容量）％  Ｔｗｅｅｎ２０を用いてブロックし（室温で３０分間）、再びＴＢＳ／０．０５（容量）％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。抗原として１本鎖ＩＶ型コラーゲンα１ポリペプチド（１（質量／容量）％  ＢＳＡ／ＴＢＳ−０．０５（容量）％  Ｔｗｅｅｎ  ２０中１μｇ／ｍｌ）をウェルに加え、室温で１時間反応させた。その後、プレートをＴＢＳ／０．０５（容量）％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、次いでＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ（ＷＡＫＯ社製）を用いて検出用にＨＲＰ標識抗体とした単クローン抗体を５０μＬ／ｗｅｌｌで加えた。室温で１時間インキュベートした後、プレートをＴＢＳ／０．０５（容量）％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、基質溶液（クエン酸バッファー（ｐＨ５）、０．０５（質量／容量）％  ｏ−フェニレンジアミン、０．０３容量％Ｈ２Ｏ２）をウェルに１００μＬ／ウェルで加えた。２０分間〜３０分間後、２Ｎ硫酸で反応を止め、分光光度計で４９０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を表３に示す。【０１０７】
【表３】
2012063839.tif 000005
【０１０８】
本試験の結果、固相抗体にＪＫ１３２を用い、かつ、ＨＲＰ標識抗体にＪＫ１３２又はモノクローナル抗体ＮＫ４６１４１を用いたときの吸光度は、それぞれ、０．２７３及び３．３５４であった。また、固相抗体にＮＫ４６１４１を用い、かつ、ＨＲＰ標識抗体にＪＫ１３２又はＮＫ４６１４１を用いたときの吸光度は、それぞれ、３．２８４及び０．２０９であったことから、ＮＫ４６１４１とＪＫ１３２は、１本鎖ＩＶ型コラーゲンα１ペプチドに対する結合について競合しないことが明らかとなった。このことから、ＮＫ４６１４１が認識するエピトープとＪＫ１３２が認識するエピトープとは異なる部位に存在することが示され、ＮＫ４６１４１とＪＫ１３２が認識するエピトープが異なることが明らかとなった。【０１０９】
これらの分析により、モノクローナル抗体ＮＫ４６１４１とＪＫ１３２の結合親和性及び認識するエピトープ部位の違いが明らかとなった結果は、ＮＫ４６１４１はＪＫ１３２と異なる活性を有する抗体であることを示した。【０１１０】
（実施例８）
＜ヌードマウス移植ヒト肺癌細胞株に対する抗腫瘍効果＞
ヒト肺癌細胞株Ｌｕ６５Ａ（ＪＣＲＢより入手）を１０容量％胎児牛血清（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養し、維持した。注射筒を用いて２×１０６個／０．２ｍｌのＬｕ６５Ａ細胞懸濁液をヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ／ｎｕ、９週齢、日本クレア社製）の背側部皮下に移植した。
モノクローナル抗体ＮＫ４６１４１を腫瘍の移植前日、移植後３日目、７日目、１０日目、及び１４日目の計５回、尾静脈に投与した。ＮＫ４６１４１は、生理食塩水（大塚製薬株式会社製）で稀釈して用いた。対照群には生理食塩水を用いた。
Ｌｕ６５Ａ移植後７日目、１０日目、１４日目、１７日目、及び２１日目の腫瘍体積を測定した。なお、腫瘍体積は、腫瘍の長径（Ｌｍｍ）及び短径（Ｗｍｍ）を計測し、（Ｌ×Ｗ２）／２により算出した。
結果を図６に示す。ヒト肺癌細胞Ｌｕ６５Ａ皮下移植マウスモデルにおいて、ＮＫ４６１４１（３０ｍｇ／ｋｇ）投与群は、ＮＫ４６１４１を投与しなかった対照群に比べて有意（ｐ値＜０．０５、ｔ検定）に腫瘍体積が小さかったことから、ＮＫ４６１４１が腫瘍組織の増殖を抑制することが明らかとなった。【０１１１】
（実施例９）
＜ＮＫ４６１４１のＣＤＲ配列の決定＞
ハイブリドーマ＃１４１株より、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを得た。得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡから、５’‐ＲＡＣＥ  ＰＣＲ法により、ＮＫ４６１４１のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域のｃＤＮＡを増幅しクローニングを行った。ＤＮＡシーケンシング及びＮ末端アミノ酸配列分析により、ＮＫ４６１４１のＨ鎖若しくはＬ鎖の可変領域の遺伝子配列（配列番号１及び２）及びアミノ酸配列（配列番号３及び４）を決定した。
ＮＫ４６１４１のＣＤＲは、ＮＫ４６１４１のアミノ酸配列と既知抗体のＣＤＲアミノ酸配列とを比較して決定した。即ち、ＩＭＧＴ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ／）、ＩＭＧＴデータベース（ＩＭＧＴ／ＬＩＧＭ−ＤＢデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｌｅｃｔ／）及びＫａｂａｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｂａｔｄａｔａｂａｓｅ．ｃｏｍ）を用いて、ＮＫ４６１４１と相同性の高い既知抗体遺伝子を検索し、この抗体遺伝子のＣＤＲアミノ酸配列情報からＮＫ４６１４１のＣＤＲを決定した。【０１１２】
前記２種類のＩＭＧＴデータベースによる解析結果では、Ｈ鎖のＣＤＲ１をＧＦＴＦＴＤＹＹ（配列番号５）、ＣＤＲ２をＩＳＥＧＧＳＹＴ（配列番号６）及びＣＤＲ３をＡＳＰＹＹＧＤＧＧＦＡＹ（配列番号７）と決定し、Ｌ鎖のＣＤＲ１をＱＳＩＶＨＳＤＧＮＴＹ（配列番号８）、ＣＤＲ２をＫＶＳ（配列番号９）及びＣＤＲ３をＦＱＧＳＨＶＰＰＴ（配列番号１０）と決定した。【０１１３】
Ｋａｂａｔ  データベースによる解析では、Ｈ鎖のＣＤＲ１をＤＹＹＭＹ（配列番号１１）、ＣＤＲ２をＴＩＳＥＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号１２）及びＣＤＲ３をＰＹＹＧＤＧＧＦＡＹ（配列番号１３）と決定し、Ｌ鎖のＣＤＲ１をＲＳＳＱＳＩＶＨＳＤＧＮＴＹＬＥ（配列番号１４）、ＣＤＲ２をＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１５）及びＣＤＲ３をＦＱＧＳＨＶＰＰＴ（配列番号１６）と決定した。【０１１４】
（実施例１０）
＜ＮＫ４６１４１が認識するエピトープ配列の同定＞
ＮＫ４６１４１が認識するエピトープ部位の絞込みを実施するために、以下に示す方法で、様々な変異型１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチドを作製した。【０１１５】
−野生型ＩＶ型コラーゲンα１遺伝子のクローニング−
１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチドを産生するヒト肝癌細胞ＨＬＦ細胞株より、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを得た。得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡから、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＨＬＦ細胞由来のｃＤＮＡを調製した。ＨＬＦ細胞由来のｃＤＮＡをテンプレートとして、配列番号１７及び１８で表されるプライマー配列を用いて、野生型ＩＶ型コラーゲンα１遺伝子（ＣＯＬ４Ａ１、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１２８２）をＰＣＲにより増幅し、クローニングを行った。クローニングした野生型ＣＯＬ４Ａ１は、ＤＮＡシーケンシングにより、変異がないことを確認した。【０１１６】
−野生型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクターの作製−
前記野生型ＣＯＬ４Ａ１を、ｐＥＮＴＲ１Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）へサブクローニングし、ＬＲ  ｃｌｏｎａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、野生型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクターを作製した。【０１１７】
−変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター１の作製−
１本鎖ＩＶ型コラーゲンα１ポリペプチドの第２９残基〜第４８８残基のアミノ酸を欠失させた変異型ＣＯＬ４Ａ１組換えタンパク質を得るため、以下の方法で変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター１を作製した。
前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチドの第２９残基〜第４８８残基のアミノ酸欠失部位に相当する塩基を欠失させるため、前記野生型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクターをテンプレートとし、配列番号１９及び２０で表されるプライマー配列を用いてＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅させた。次いで、前記野生型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクターの作製において、野生型ＣＯＬ４Ａ１を前記ＰＣＲ産物に変えたこと以外は、前記野生型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクターの作製と同様の方法で変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター１を作製した【０１１８】
−変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター２の作製−
前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター１の作製において、配列番号１９及び２０で表されるプライマー配列を、配列番号２１及び２２で表されるプライマー配列に変えたこと以外は、前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター１の作製と同様の方法で変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター２を作製した。
前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター２は、前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチドの第２９残基〜第９８９残基のアミノ酸欠失部位に相当する塩基を欠失させた発現ベクターである。【０１１９】
−変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター３の作製−
前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター１の作製において、配列番号１９及び２０で表されるプライマー配列を、配列番号２３及び２４で表されるプライマー配列に変えたこと以外は、前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター１の作製と同様の方法で変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター３を作製した。
前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター３は、前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチドの第２９残基〜第１，０６６残基のアミノ酸欠失部位に相当する塩基を欠失させた発現ベクターである。【０１２０】
作製した野生型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター及び変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター１〜３には、ＣＯＬ４Ａ１由来のシグナル配列が存在することから、哺乳類細胞で一過性に過剰発現させた野生型あるいは変異型の１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチドは、培養上清に分泌される。
そこで、作製した野生型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター及び変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター１〜３を、それぞれヒト胎児腎細胞由来２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入して一過性に野生型あるいは変異型の１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチドを発現させた。以下、野生型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクターを用いて発現させた、１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチドのアミノ酸配列の全長を有する野生型組換えタンパク質を「ＦＬ」、変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター１を用いて発現させた変異型組換えタンパク質を「Δ２９〜４８８」、変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター２を用いて発現させた変異型組換えタンパク質を「Δ２９〜９８９」、変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター３を用いて発現させた変異型組換えタンパク質を「Δ２９〜１，０６６」と称することがある。【０１２１】
作製した野生型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター及び変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター１〜３、並びに、これらより発現したＦＬ、Δ２９〜４８８、Δ２９〜９８９、及びΔ２９〜１，０６６について、下記表４及び図７Ａにまとめて示す。
図７Ａは、野生型１本鎖１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチド（ＦＬ）又は３種類の変異型１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチド（Δ２９〜４８８、Δ２９〜９８９、及びΔ２９〜１，０６６）を示す概略説明図である。【０１２２】
【表４】
2012063839.tif 000006
【０１２３】
野生型１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチド又は３種類の変異型１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチドが分泌された培養上清を回収し、ＮＫ４６１４１をプローブとしたウエスタンブロッティングを行い、ＮＫ４６１４１のエピトープの絞込みを実施した。このとき、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子を含まないベクターのみを前記同様にヒト胎児腎細胞由来２９３ＦＴ細胞導入して得た培養上清を陰性対照とした（Ｍｏｃｋ）。更に、ＮＫ４６１４１とは異なるエピトープを認識する抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチド抗体であるＪＫ１３２を遺伝子発現確認用の対照として用いた。結果を図７Ｂに示す。【０１２４】
この結果、Δ２９〜１，０６６にはバンドが検出されず、ＮＫ４６１４１が認識するエピトープは、１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチドのアミノ酸配列の第９９０残基〜第１，０６６残基に存在することが明らかとなった。なお、ＪＫ１３２が認識するＩＶ型コラーゲンα１ポリペプチドのエピトープは、アミノ酸配列の第１，１６５残基〜第１，１７９残基に存在することが知られている。【０１２５】
更にＮＫ４６１４１が認識するエピトープを絞込む為に、以下の変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター４〜６を作製した。【０１２６】
−変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター４の作製−
前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター１の作製において、テンプレートとしての野生型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクターを、前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター２に変え、配列番号１９及び２０で表されるプライマー配列を、配列番号２５及び２６で表されるプライマー配列に変えたこと以外は、前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター１の作製と同様の方法で変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター４を作製した。次いで、変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター４のＣ末端に、常法によりｍｙｃエピトープを付加した。
前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター４は、前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチドの第２９残基〜第９８９残基及び第１，０６７残基〜第１，６６９残基のアミノ酸欠失部位に相当する塩基を欠失させた発現ベクターである。【０１２７】
−変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター５の作製−
前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター４の作製において、配列番号２５及び２６で表されるプライマー配列を、配列番号２７及び２８で表されるプライマー配列に変えたこと以外は、前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター４の作製と同様の方法で変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター５を作製した。次いで、変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター５のＣ末端に、常法によりｍｙｃエピトープを付加した。
前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター５は、前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチドの第２９残基〜第９８９残基及び第１，０２０残基〜第１，６６９残基のアミノ酸欠失部位に相当する塩基を欠失させた発現ベクターである。【０１２８】
−変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター６の作製−
前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター４の作製において、テンプレートとしての変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター２を、前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター４に変え、配列番号２５及び２６で表されるプライマー配列を、配列番号２９及び３０で表されるプライマー配列に変えたこと以外は、前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター４の作製と同様の方法で変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター６を作製した。次いで、変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター６のＣ末端に、常法によりｍｙｃエピトープを付加した。
前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター６は、前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチドの第２９残基〜第１．０１９残基及び第１，０６７残基〜第１，６６９残基のアミノ酸欠失部位に相当する塩基を欠失させた発現ベクターである。【０１２９】
作製した変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター４〜６を、それぞれヒト胎児腎細胞由来２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入して一過性に野生型あるいは変異型の１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチドを培養上清に発現させた。以下、変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター４を用いて発現させた変異型組換えタンパク質を「９９０〜１，０６６ｍｙｃ」、変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター５を用いて発現させた変異型組換えタンパク質を「９９０〜１，０１９ｍｙｃ」、変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター６を用いて発現させた変異型組換えタンパク質を「１，０２０〜１，０６６ｍｙｃ」と称することがある。【０１３０】
作製した変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター４〜６、並びに、これらより発現した９９０〜１，０６６ｍｙｃ、９９０〜１，０１９ｍｙｃ、及び１，０２０〜１，０６６ｍｙｃについて、下記表５及び図９にまとめて示す。
図９は、３種類の変異型１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチド（９９０〜１，０６６ｍｙｃ、９９０〜１，０１９ｍｙｃ、及び１，０２０〜１，０６６ｍｙｃ）を示す概略説明図である。【０１３１】
【表５】
2012063839.tif 000007
【０１３２】
３種類の変異型１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチドが分泌された培養上清を回収し、ＮＫ４６１４１をプローブとしたウエスタンブロッティングを行い、ＮＫ４６１４１のエピトープの絞込みを実施した。このとき、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子を含まないベクターのみを前記同様にヒト胎児腎細胞由来２９３ＦＴ細胞導入して得た培養上清を陰性対照とした（Ｍｏｃｋ）。また、１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチドの発現を確認するための陽性対照として抗ｍｙｃ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を使用した。結果を図８Ｂに示す。【０１３３】
この結果、９９０〜１，０１９ｍｙｃにはバンドが検出されず、ＮＫ４６１４１が認識するエピトープは、１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチドのアミノ酸配列の第９９０残基〜第１，０１９残基に存在することが明らかとなった。【０１３４】
更にＮＫ４６１４１が認識するエピトープを絞込む為に、以下の変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター７〜９を作製した。【０１３５】
−変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター７の作製−
前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター１の作製において、配列番号１９及び２０で表されるプライマー配列を、配列番号３１及び３２で表されるプライマー配列に変えたこと以外は、前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター１の作製と同様の方法で変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター７を作製した。
前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター７は、前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチドの第１，０２０残基〜第１，０６６残基のアミノ酸欠失部位に相当する塩基を欠失させた発現ベクターである。【０１３６】
−変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター８の作製−
前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター１の作製において、配列番号１９及び２０で表されるプライマー配列を、配列番号３３及び３４で表されるプライマー配列に変えたこと以外は、前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター１の作製と同様の方法で変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター８を作製した。
前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター８は、前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチドの第１，０２０残基〜第１，０４９残基のアミノ酸欠失部位に相当する塩基を欠失させた発現ベクターである。【０１３７】
−変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター９の作製−
前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター１の作製において、配列番号１９及び２０で表されるプライマー配列を、配列番号３５及び３６で表されるプライマー配列に変えたこと以外は、前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター１の作製と同様の方法で変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター９を作製した。
前記変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター９は、前記１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチドの第１，０５０残基〜第１，０６６残基のアミノ酸欠失部位に相当する塩基を欠失させた発現ベクターである。【０１３８】
作製した変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター７〜９を、それぞれヒト胎児腎細胞由来２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入して一過性に野生型あるいは変異型の１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチドを培養上清に発現させた。以下、変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター７を用いて発現させた変異型組換えタンパク質を「Δ１，０２０〜１，０６６」、変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター８を用いて発現させた変異型組換えタンパク質を「Δ１，０２０〜１，０４９」、変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター９を用いて発現させた変異型組換えタンパク質を「Δ１，０５０〜１，０６６」と称することがある。【０１３９】
前記野生型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクターと併せて、作製した変異型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター７〜９、並びに、これらより発現したΔ１，０２０〜１，０６６、Δ１，０２０〜１，０４９、及びΔ１，０５０〜１，０６６について、下記表６及び図９Ａにまとめて示す。
図９Ａは、３種類の変異型１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチド（Δ１，０２０〜１，０６６、Δ１，０２０〜１，０４９、及びΔ１，０５０〜１，０６６）を示す概略説明図である。【０１４０】
【表６】
2012063839.tif 000008
【０１４１】
３種類の変異型１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチドが分泌された培養上清を回収し、ＮＫ４６１４１をプローブとしたウエスタンブロッティングを行い、ＮＫ４６１４１のエピトープの絞込みを実施した。このとき、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子を含まないベクターのみを前記同様にヒト胎児腎細胞由来２９３ＦＴ細胞導入して得た培養上清を陰性対照とした（Ｍｏｃｋ）。更に、ＮＫ４６１４１とは異なるエピトープを認識する抗１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチド抗体であるＪＫ１３２を遺伝子発現確認用の対照として用いた。結果を図９Ｂに示す。【０１４２】
この結果、Δ１，０２０〜１，０６６及びΔ１，０５０〜１，０６６にはバンドが検出されず、ＮＫ４６１４１が認識するエピトープは、１本鎖ＩＶ型コラーゲンペプチドのアミノ酸配列の第１，０５０残基〜第１，０６６残基に存在することが明らかとなった。【０１４３】
実施例１０で、野生型ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター及び変異ＣＯＬ４Ａ１発現ベクター１〜９の作製に使用したプライマー配列を以下にまとめて示す。【０１４４】
【数１】
2012063839.tif 000009
【０１４５】
更に、ＮＫ４６１４１が認識するエピトープを決定する為に、下記に示す配列番号３７〜４２で表されるペプチド配列を化学合成し、ＮＫ４６１４１をプローブとしてｄｏｔ  ｂｌｏｔを行った。図１０において、＃１は、配列番号３７で表されるペプチド配列、＃２は、配列番号３８ので表されるペプチド配列、＃３は、配列番号３９で表されるペプチド配列、＃４は、配列番号４０で表されるペプチド配列、＃５は、配列番号４１で表されるペプチド配列、＃６は、配列番号４２で表されるペプチド配列を表す。
その結果、ＮＫ４６１４１が認識するエピトープは、ＩＶ型コラーゲンα１ポリペプチドのアミノ酸配列の第１，０５６残基〜第１，０６４残基に存在するアミノ酸配列“ＧＩＧＩＰＧＬＲＧ”（配列番号４１）で表されるペプチドであることが明らかとなった（図１０の＃５）。【０１４６】
【数２】
2012063839.tif 000010
【０１４７】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【受託番号】
【０１４８】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３００
【産業上の利用可能性】
【０１４９】
以上のように、腫瘍組織に特異的に発現している１本鎖ＩＶ型コラーゲンポリペプチドを標的とした本発明の抗体は正常組織や正常器官、正常細胞には作用しない医薬ないしは診断薬又は腫瘍の治療用キットないしは診断用キットとして有用である。
【図１】
2012063839.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
2012063839.tif 000023
【配列表】
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【国際調査報告】
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