(57)【要約】  医薬品や農薬等の中間体として有用な光学活性アミノ化合物を、ケトン化合物から効率よく製造するための方法を提供する。  シュードモナス・フルオレッセンス由来のアミノ基転移酵素を改変することにより、野生型の酵素に比べて立体選択性、耐熱性、アミン化合物に対する耐性が向上したアミノ基転移酵素活性を有するポリペプチド、これをコードする遺伝子、その遺伝子を高発現する形質転換体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（i）から（iii）；
（i）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と配列同一性が８５％以上であり、
（ii）アミノ基供与体の存在下、７−メトキシ−２−テトラロンに作用して（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンを生成する反応を行うことができ、
（iii）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるアミノ基転移酵素と比較してその反応性が高い、
の性質を示すポリペプチド。
【請求項２】
以下の(A)から(C)のいずれかに示すポリぺプチド。
(A)配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１６１、４２０、１７、８４、１７１、１７６、２６２、３０２、４２１、４３５、２９、４２、１１６、１５３、１９０、２８４、２０９、２３５、２３６、４０８、４１８、４３４、４４２、３、１１、および１５１番目、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１６１、４２０、１７、８４、１７１、１７６、２６２、３０２、４２１、４３５、２９、４２、１１６、１５３、１９０、２８４、２０９、２３５、２３６、４０８、４１８、４３４、４４２、３、１１、および１５１番目、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸部位以外のアミノ酸の１個もしくは複数個が置換、付加、挿入もしくは欠失されてなり、かつ、アミノ基供与体の存在下、７−メトキシ−２−テトラロンに作用して（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンを生成する反応を行うことができ、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるアミノ基転移酵素と比較してその反応性が高いポリペプチド、
(C)配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１６１、４２０、１７、８４、１７１、１７６、２６２、３０２、４２１、４３５、２９、４２、１１６、１５３、１９０、２８４、２０９、２３５、２３６、４０８、４１８、４３４、４４２、３、１１、および１５１番目、から選択される１つもしくは複数個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列において、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸部位を除いた配列同一性が８５％以上であり、かつ、アミノ基供与体の存在下、７−メトキシ−２−テトラロンに作用して（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンを生成する反応を行うことができ、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるアミノ基転移酵素と比較してその反応性が高いポリペプチド。
【請求項３】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、次のアミノ酸置換の群； 
１６１番目が、非電荷アミノ酸または非極性アミノ酸に置換、
４２０番目が、プロリン、グリシン、システイン、およびスレオニン以外のアミノ酸に置換、
１７番目が非極性アミノ酸に置換、
８４番目が非電荷アミノ酸に置換、
１７１番目が塩基性アミノ酸に置換、
１７６番目が非電荷アミノ酸に置換、
２６２番目が、非極性アミノ酸に置換、
３０２番目が、非極性アミノ酸に置換、
４２１番目が、非電荷アミノ酸に置換、
４３５番目が、非極性アミノ酸に置換、
２９番目が、塩基性アミノ酸に置換、
４２番目が、非電荷アミノ酸に置換、
１１６番目が、非極性アミノ酸に置換、
１５３番目が、非極性アミノ酸に置換、
１９０番目が、非極性アミノ酸に置換、
２８４番目が、非電荷アミノ酸に置換、
２０９番目が、非極性アミノ酸に置換、
２３５番目が、非極性アミノ酸に置換、
２３６番目が、非極性アミノ酸に置換、
４０８番目が、非電荷アミノ酸に置換、
４１８番目が、非電荷アミノ酸に置換、
４３４番目が、非極性アミノ酸に置換、
４４２番目が、非極性アミノ酸に置換。
３番目が、塩基性アミノ酸に置換、
１１番目が、非電荷アミノ酸に置換、および
１５１番目が、塩基性アミノ酸に置換、
から選択される１つもしくは複数のアミノ酸置換が導入されている、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、次のアミノ酸置換の群；
１６１番目が、スレオニン、またはバリンに置換、
４２０番目が、ヒスチジン、セリン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、グルタミン、アスパラギン、リジン、バリン、またはトリプトファンに置換、
１７番目が、イソロイシン、またはロイシンに置換、
８４番目が、システインに置換、
１７１番目が、アルギニンに置換、
１７６番目が、セリンに置換、
２６２番目が、バリンに置換、
３０２番目が、イソロイシンに置換、
４２１番目が、スレオニンに置換、
４３５番目が、アラニンに置換、
２９番目が、リジンに置換、
４２番目がチロシンに置換、
１１６番目が、ロイシンに置換、
１５３番目が、フェニルアラニンに置換、
１９０番目が、チロシンに置換、
２８４番目がイソロイシン、
２０９番目が、アラニンに置換、
２３５番目が、バリンに置換、
２３６番目が、イソロイシンに置換、
４０８番目が、スレオニンに置換、
４１８番目が、ロイシンに置換、
４３４番目が、アラニンに置換、
４４２番目が、バリンに置換、
３番目が、アルギニンに置換、
１１番目が、グリシンに置換、および
１５１番目が、ヒスチジンに置換、
から選択される１つもしくは複数のアミノ酸置換が導入されている、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、下記の（１）〜（１５）；
(１)１６１番目が、非電荷アミノ酸に置換；１７番目が、非極性アミノ酸に置換；かつ４２０番目が、ヒスチジン、セリン、アラニン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸に置換、
(２)１６１番目が、非電荷アミノ酸に置換；かつ４１８番目が、非電荷アミノ酸に置換、
(３)１６１番目が、非電荷アミノ酸に置換；２３６番目が、非極性アミノ酸に置換；かつ４４２番目が、非極性アミノ酸に置換、
(４)１６１番目が、非電荷アミノ酸に置換；かつ４３４番目が、非極性アミノ酸に置換、
(５)１１番目が、非電荷アミノ酸に置換；１５１番目が、塩基性アミノ酸に置換；１６１番目が、非電荷アミノ酸に置換；かつ２６２番目が、非極性アミノ酸、好ましくはバリンに置換、
(６)１６１番目が、非電荷アミノ酸に置換；２０９番目が、非極性アミノ酸に置換；かつ２３５番目が、非極性アミノ酸に置換、
(７)４２番目が、非電荷アミノ酸に置換；かつ４０８番目が、非電荷アミノ酸に置換、
(８)１７番目が、非極性アミノ酸に置換；かつ１５３番目が、非極性アミノ酸に置換、
(９)２９番目が、塩基性アミノ酸に置換；かつ２６２番目が、非極性アミノ酸に置換、
(１０)１６１番目が、非電荷アミノ酸に置換；かつ２８４番目が、非電荷アミノ酸に置換、
(１１)３番目が塩基性アミノ酸に置換；１７番目が、非極性アミノ酸に置換；１１６番目が、非極性アミノ酸に置換；かつ１９０番目が、非極性アミノ酸に置換、
(１２)８４番目が、非電荷アミノ酸に置換；かつ４２０番目が、スレオニン以外の非電荷アミノ酸に置換、
(１３)１６１番目が、非電荷アミノ酸に置換；かつ１７番目が、非極性アミノ酸に置換、
(１４)１６１番目が、非電荷アミノ酸に置換；かつ４２０番目が、塩基性アミノ酸に置換、および
(１５)１７番目が、非極性アミノ酸に置換；かつ４２０番目が、塩基性アミノ酸に置換、
から選択されるいずれかのアミノ酸置換が導入されている、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、下記の（１６）〜（３０）；
（１６）１７番目がイソロイシンに置換；１６１番目がスレオニンに置換；かつ４２０番目がヒスチジンに置換、
（１７）１６１番目がスレオニンに置換；かつ４１８番目がロイシンに置換、
（１８）１６１番目がスレオニンに置換；かつ２３６番目がイソロイシンに置換；かつ４４２番目がバリンに置換、
（１９）１６１番目がスレオニン置換；かつ４３４番目がアラニンに置換、
（２０）１１番目がグリシンに置換；１５１番目がヒスチジンに置換；１６１番目がスレオニンに置換；かつ２６２番目がバリンに置換、
（２１）１６１番目がスレオニンに置換；２０９番目がアラニンに置換；かつ２３５番目がバリンに置換、
（２２）４２番目がチロシンに置換；かつ４０８番目がスレオニンに置換、
（２３）１７番目がロイシンに置換；かつ１５３番目がフェニルアラニンに置換、
（２４）２９番目がリジンに置換；かつ２６２番目がバリンに置換、
（２５）１６１番目がスレオニンに置換；かつ２８４番目がイソロイシンに置換、
（２６）３番目がアルギニンに置換；１７番目がロイシンに置換；１１６番目がロイシンに置換；かつ１９０番目がチロシンに置換、
（２７）８４番目がシステインに置換；かつ４２０番目がセリンに置換、
（２８）１７番目がイソロイシンに置換；かつ１６１番目がスレオニンに置換、
（２９）１６１番目がスレオニンに置換；かつ４２０番目がヒスチジンに置換、および
（３０）１７番目がイソロイシンに置換；かつ４２０番目がヒスチジンに置換、
から選択されるいずれかのアミノ酸置換が導入されている、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド、または、請求項７に記載の形質転換体および／またはその処理物を、アミノ基供与体の存在下、ケトン化合物に作用させることを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法。
【請求項１１】
前記ケトン化合物が、下記式（１）：
【化１】
2012124639.tif 000025
（式中、Ｒ１およびＲ２は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアラルキル基もしくは置換されていてもよいアリール基を示し、Ｒ１とＲ２の両者が互いに結合して環を形成していてもよい。但し、Ｒ１とＲ２は構造が異なる。）で表される非対称ケトンであり、その生成物が下記式（２）：
【化２】
2012124639.tif 000026
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（１）と同じ。＊は不斉炭素原子を示す。）で表される光学活性アミノ化合物である、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド、または、請求項７に記載の形質転換体および／またはその処理物を、アミノ基受容体の存在下、アミノ化合物のエナンチオマー混合物に作用させることを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法。
【請求項１３】
前記アミノ化合物のエナンチオマーが、下記式（３）：
【化３】
2012124639.tif 000027
（式中、Ｒ１およびＲ２は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアラルキル基もしくは置換されていてもよいアリール基を示し、Ｒ１とＲ２の両者が互いに結合して環を形成していてもよい。但し、Ｒ１とＲ２は構造が異なる。）で表わされるエナンチオマー混合物であり、その生成物が下記式（４）：
【化４】
2012124639.tif 000028
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（３）と同じ。＊は不斉炭素原子を示す）で表わされる光学活性アミノ化合物である、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記式（１）で表されるケトン化合物が、１−テトラロン、２−テトラロン、５−メトキシ−２−テトラロン、６−メトキシ−２−テトラロン、７−メトキシ−２−テトラロン、８−メトキシ−２−テトラロン、１−ベンジル−３−ピロリジノン、１−Ｂｏｃー３−ピロリジノン、１−Ｃｂｚー３−ピロリジノン、１−ベンジルー３−ピペリジノン、１−Ｂｏｃー３−ピペリジノン、１−Ｃｂｚー３−ピペリジノン、アセトフェノン、３，４−ジメトキシフェニルアセトン、からなる群から選ばれる１以上のケトン化合物である、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記式（３）で表されるアミノ化合物が、１−アミノテトラリン、２−アミノテトラリン、５−メトキシ−２−アミノテトラリン、６−メトキシ−２−アミノテトラリン、７−メトキシ−２−アミノテトラリン、８−メトキシ−２−アミノテトラリン、１−ベンジルー３−アミノピロリジン、１−Ｂｏｃー３−アミノピロリジン、１−Ｃｂｚー３−アミノピロリジン、１−ベンジルー３−アミノピペリジン、１−Ｂｏｃー３−アミノピペリジン、１−Ｃｂｚー３−アミノピペリジン、１−フェネチルアミン、３，４−ジメトキシアンフェタミン、からなる群から選ばれる１以上のアミノ化合物である、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１６】
アミノ基供与体が、１−フェネチルアミン、２−ブチルアミン、２−ペンチルアミン、２−ヘプチルアミン、３−ヘプチルアミン、ｎ−エチルアミン、ｎ−プロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｎ−アミルアミン、イソプロピルアミン、イソブチルアミン、グリシン、アラニン、グルタミン酸、３−アミノ−１−フェニルブタン、ベンジルアミン、β−フェネチルアミン、シクロヘキシルアミンおよびそれらの光学活性体からなる群より選ばれる１以上の化合物である、請求項１０または１１に記載の製造方法。
【請求項１７】
アミノ基受容体が、ピルビン酸またはグリオキシル酸である請求項１２または１３に記載の製造方法。
【請求項１８】
請求項１０〜１７のいずれかに記載の製造方法であって、反応温度を３５℃以上に保つことを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ基転移反応により、ケトン化合物を効率よく光学活性アミノ化合物に変換し得る酵素および該酵素を用いた光学活性アミノ化合物の製造方法に関する。得られる光学活性アミノ化合物は、医薬品や農薬等の中間体として利用し得る。
【背景技術】
【０００２】
アミノ基転移酵素はこれまでに多くの種類が知られているが、α―アミノ酸以外の光学活性アミノ化合物を生成する酵素の報告例は少ない（非特許文献１）。
そのため、現有の酵素では目的の化合物に対する立体選択性が充分でない事や、基質の物性に適した温度条件やｐＨ条件での反応において酵素の安定性が低いなど、工業的な利用に課題を有することも多い。
このように目的の化合物に対する反応において、立体選択性が高く、安定性の高いアミノ基転移酵素を提供することができれば、光学活性アミノ化合物を工業的に生産する上で有用である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Trends in Biotechnology, 28, 324-332 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる野生型酵素より反応性の向上した改変型アミノ基転移酵素を提供することにある。また、該酵素、または該酵素を生産する形質転換体を用いて、ケトン化合物から光学活性アミノ化合物を効率よく製造するための方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記目的を達成するために種々検討を重ねた結果、シュードモナス・フルオレッセンスKNK08-18由来のアミノ基転移酵素（配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド）に変異を導入することにより、野生型の酵素に比べて活性、立体選択性、安定性、生成物による阻害、が改善されたアミノ基転移酵素が得られることを見出し、本発明に至った。即ち、本発明は以下を提供する。【０００６】
項１．以下の（i）から（iii）；
（i）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と配列同一性が８５％以上であり、
（ii）アミノ基供与体の存在下、７−メトキシ−２−テトラロンに作用して（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンを生成する反応を行うことができ、
（iii）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるアミノ基転移酵素と比較してその反応性が高い、
の性質を示すポリペプチド。
項２．以下の(A)から(C)のいずれかに示すポリぺプチド。
(A)配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１６１、４２０、１７、８４、１７１、１７６、２６２、３０２、４２１、４３５、２９、４２、１１６、１５３、１９０、２８４、２０９、２３５、２３６、４０８、４１８、４３４、４４２、３、１１、および１５１番目、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１６１、４２０、１７、８４、１７１、１７６、２６２、３０２、４２１、４３５、２９、４２、１１６、１５３、１９０、２８４、２０９、２３５、２３６、４０８、４１８、４３４、４４２、３、１１、および１５１番目、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸部位以外のアミノ酸の１個もしくは複数個が置換、付加、挿入もしくは欠失されてなり、かつ、アミノ基供与体の存在下、７−メトキシ−２−テトラロンに作用して（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンを生成する反応を行うことができ、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるアミノ基転移酵素と比較してその反応性が高いポリペプチド、
(C)配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１６１、４２０、１７、８４、１７１、１７６、２６２、３０２、４２１、４３５、２９、４２、１１６、１５３、１９０、２８４、２０９、２３５、２３６、４０８、４１８、４３４、４４２、３、１１、および１５１番目、から選択される１つもしくは複数個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列において、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸部位を除いた配列同一性が８５％以上であり、かつ、アミノ基供与体の存在下、７−メトキシ−２−テトラロンに作用して（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンを生成する反応を行うことができ、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるアミノ基転移酵素と比較してその反応性が高いポリペプチド。
項３．配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、次のアミノ酸置換の群； 
１６１番目が、非電荷アミノ酸または非極性アミノ酸に置換、
４２０番目が、プロリン、グリシン、システイン、およびスレオニン以外のアミノ酸に置換、
１７番目が非極性アミノ酸に置換、
８４番目が非電荷アミノ酸に置換、
１７１番目が塩基性アミノ酸に置換、
１７６番目が非電荷アミノ酸に置換、
２６２番目が、非極性アミノ酸に置換、
３０２番目が、非極性アミノ酸に置換、
４２１番目が、非電荷アミノ酸に置換、
４３５番目が、非極性アミノ酸に置換、
２９番目が、塩基性アミノ酸に置換、
４２番目が、非電荷アミノ酸に置換、
１１６番目が、非極性アミノ酸に置換、
１５３番目が、非極性アミノ酸に置換、
１９０番目が、非極性アミノ酸に置換、
２８４番目が、非電荷アミノ酸に置換、
２０９番目が、非極性アミノ酸に置換、
２３５番目が、非極性アミノ酸に置換、
２３６番目が、非極性アミノ酸に置換、
４０８番目が、非電荷アミノ酸に置換、
４１８番目が、非電荷アミノ酸に置換、
４３４番目が、非極性アミノ酸に置換、
４４２番目が、非極性アミノ酸に置換。
３番目が、塩基性アミノ酸に置換、
１１番目が、非電荷アミノ酸に置換、および
１５１番目が、塩基性アミノ酸に置換、
から選択される１つもしくは複数のアミノ酸置換が導入されている、項１または２に記載のポリペプチド。
項４．配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、次のアミノ酸置換の群；
１６１番目が、スレオニン、またはバリンに置換、
４２０番目が、ヒスチジン、セリン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、グルタミン、アスパラギン、リジン、バリン、またはトリプトファンに置換、
１７番目が、イソロイシン、またはロイシンに置換、
８４番目が、システインに置換、
１７１番目が、アルギニンに置換、
１７６番目が、セリンに置換、
２６２番目が、バリンに置換、
３０２番目が、イソロイシンに置換、
４２１番目が、スレオニンに置換、
４３５番目が、アラニンに置換、
２９番目が、リジンに置換、
４２番目がチロシンに置換、
１１６番目が、ロイシンに置換、
１５３番目が、フェニルアラニンに置換、
１９０番目が、チロシンに置換、
２８４番目がイソロイシン、
２０９番目が、アラニンに置換、
２３５番目が、バリンに置換、
２３６番目が、イソロイシンに置換、
４０８番目が、スレオニンに置換、
４１８番目が、ロイシンに置換、
４３４番目が、アラニンに置換、
４４２番目が、バリンに置換、
３番目が、アルギニンに置換、
１１番目が、グリシンに置換、および
１５１番目が、ヒスチジンに置換、
から選択される１つもしくは複数のアミノ酸置換が導入されている、項１または２に記載のポリペプチド。
項５．配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、下記の（１）〜（１５）；
(１)１６１番目が、非電荷アミノ酸に置換；１７番目が、非極性アミノ酸に置換；かつ４２０番目が、ヒスチジン、セリン、アラニン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸に置換、
(２)１６１番目が、非電荷アミノ酸に置換；かつ４１８番目が、非電荷アミノ酸に置換、
(３)１６１番目が、非電荷アミノ酸に置換；２３６番目が、非極性アミノ酸に置換；かつ４４２番目が、非極性アミノ酸に置換、
(４)１６１番目が、非電荷アミノ酸に置換；かつ４３４番目が、非極性アミノ酸に置換、
(５)１１番目が、非電荷アミノ酸に置換；１５１番目が、塩基性アミノ酸に置換；１６１番目が、非電荷アミノ酸に置換；かつ２６２番目が、非極性アミノ酸、好ましくはバリンに置換、
(６)１６１番目が、非電荷アミノ酸に置換；２０９番目が、非極性アミノ酸に置換；かつ２３５番目が、非極性アミノ酸に置換、
(７)４２番目が、非電荷アミノ酸に置換；かつ４０８番目が、非電荷アミノ酸に置換、
(８)１７番目が、非極性アミノ酸に置換；かつ１５３番目が、非極性アミノ酸に置換、
(９)２９番目が、塩基性アミノ酸に置換；かつ２６２番目が、非極性アミノ酸に置換、
(１０)１６１番目が、非電荷アミノ酸に置換；かつ２８４番目が、非電荷アミノ酸に置換、
(１１)３番目が塩基性アミノ酸に置換；１７番目が、非極性アミノ酸に置換；１１６番目が、非極性アミノ酸に置換；かつ１９０番目が、非極性アミノ酸に置換、
(１２)８４番目が、非電荷アミノ酸に置換；かつ４２０番目が、スレオニン以外の非電荷アミノ酸に置換、
(１３)１６１番目が、非電荷アミノ酸に置換；かつ１７番目が、非極性アミノ酸に置換、
(１４)１６１番目が、非電荷アミノ酸に置換；かつ４２０番目が、塩基性アミノ酸に置換、および
(１５)１７番目が、非極性アミノ酸に置換；かつ４２０番目が、塩基性アミノ酸に置換、
から選択されるいずれかのアミノ酸置換が導入されている、項１または２に記載のポリペプチド。
項６．配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、下記の（１６）〜（３０）；
（１６）１７番目がイソロイシンに置換；１６１番目がスレオニンに置換；かつ４２０番目がヒスチジンに置換、
（１７）１６１番目がスレオニンに置換；かつ４１８番目がロイシンに置換、
（１８）１６１番目がスレオニンに置換；かつ２３６番目がイソロイシンに置換；かつ４４２番目がバリンに置換、
（１９）１６１番目がスレオニン置換；かつ４３４番目がアラニンに置換、
（２０）１１番目がグリシンに置換；１５１番目がヒスチジンに置換；１６１番目がスレオニンに置換；かつ２６２番目がバリンに置換、
（２１）１６１番目がスレオニンに置換；２０９番目がアラニンに置換；かつ２３５番目がバリンに置換、
（２２）４２番目がチロシンに置換；かつ４０８番目がスレオニンに置換、
（２３）１７番目がロイシンに置換；かつ１５３番目がフェニルアラニンに置換、
（２４）２９番目がリジンに置換；かつ２６２番目がバリンに置換、
（２５）１６１番目がスレオニンに置換；かつ２８４番目がイソロイシンに置換、
（２６）３番目がアルギニンに置換；１７番目がロイシンに置換；１１６番目がロイシンに置換；かつ１９０番目がチロシンに置換、
（２７）８４番目がシステインに置換；かつ４２０番目がセリンに置換、
（２８）１７番目がイソロイシンに置換；かつ１６１番目がスレオニンに置換、
（２９）１６１番目がスレオニンに置換；かつ４２０番目がヒスチジンに置換、および
（３０）１７番目がイソロイシンに置換；かつ４２０番目がヒスチジンに置換、
から選択されるいずれかのアミノ酸置換が導入されている、項１または２に記載のポリペプチド。
項７．項１〜６のいずれかに記載のポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ。
項８．項７に記載のＤＮＡを含むベクター。
項９．項８に記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
項１０．項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド、または、項７に記載の形質転換体および／またはその処理物を、アミノ基供与体の存在下、ケトン化合物に作用させることを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法。
項１１．前記ケトン化合物が、下記式（１）：
【化１】
2012124639.tif 000002
（式中、Ｒ１およびＲ２は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアラルキル基もしくは置換されていてもよいアリール基を示し、Ｒ１とＲ２の両者が互いに結合して環を形成していてもよい。但し、Ｒ１とＲ２は構造が異なる。）で表される非対称ケトンであり、その生成物が下記式（２）：
【化２】
2012124639.tif 000003
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（１）と同じ。＊は不斉炭素原子を示す。）で表される光学活性アミノ化合物である、項８に記載の製造方法。
項１２．項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド、または、項７に記載の形質転換体および／またはその処理物を、アミノ基受容体の存在下、アミノ化合物のエナンチオマー混合物に作用させることを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法。
項１３．前記アミノ化合物のエナンチオマーが、下記式（３）：
【化３】
2012124639.tif 000004
（式中、Ｒ１およびＲ２は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアラルキル基もしくは置換されていてもよいアリール基を示し、Ｒ１とＲ２の両者が互いに結合して環を形成していてもよい。但し、Ｒ１とＲ２は構造が異なる。）で表わされるエナンチオマー混合物であり、その生成物が下記式（４）：
【化４】
2012124639.tif 000005
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（３）と同じ。＊は不斉炭素原子を示す）で表わされる光学活性アミノ化合物である、項１０に記載の製造方法。
項１４．前記式（１）で表されるケトン化合物が、１−テトラロン、２−テトラロン、５−メトキシ−２−テトラロン、６−メトキシ−２−テトラロン、７−メトキシ−２−テトラロン、８−メトキシ−２−テトラロン、１−ベンジル−３−ピロリジノン、１−Ｂｏｃー３−ピロリジノン、１−Ｃｂｚー３−ピロリジノン、１−ベンジルー３−ピペリジノン、１−Ｂｏｃー３−ピペリジノン、１−Ｃｂｚー３−ピペリジノン、アセトフェノン、３，４−ジメトキシフェニルアセトン、からなる群から選ばれる１以上のケトン化合物である、項１１に記載の製造方法。
項１５．前記式（３）で表されるアミノ化合物が、１−アミノテトラリン、２−アミノテトラリン、５−メトキシ−２−アミノテトラリン、６−メトキシ−２−アミノテトラリン、７−メトキシ−２−アミノテトラリン、８−メトキシ−２−アミノテトラリン、１−ベンジルー３−アミノピロリジン、１−Ｂｏｃー３−アミノピロリジン、１−Ｃｂｚー３−アミノピロリジン、１−ベンジルー３−アミノピペリジン、１−Ｂｏｃー３−アミノピペリジン、１−Ｃｂｚー３−アミノピペリジン、１−フェネチルアミン、３，４−ジメトキシアンフェタミン、からなる群から選ばれる１以上のアミノ化合物である、項１３に記載の製造方法。
項１６．アミノ基供与体が、１−フェネチルアミン、２−ブチルアミン、２−ペンチルアミン、２−ヘプチルアミン、３−ヘプチルアミン、ｎ−エチルアミン、ｎ−プロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｎ−アミルアミン、イソプロピルアミン、イソブチルアミン、グリシン、アラニン、グルタミン酸、３−アミノ−１−フェニルブタン、ベンジルアミン、β−フェネチルアミン、シクロヘキシルアミンおよびそれらの光学活性体からなる群より選ばれる１以上の化合物である、項１０または１１に記載の製造方法。
項１７．アミノ基受容体が、ピルビン酸またはグリオキシル酸である項１２または１３に記載の製造方法。
項１８．項１０〜１７のいずれかに記載の製造方法であって、反応温度を３５℃以上に保つことを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
シュードモナス・フルオレッセンスＫＮＫ０８−１８株由来のアミノ基転移酵素のアミノ酸配列を改変することにより、活性、立体選択性、安定性、生成物による阻害等が改善された改変型アミノ基転移酵素が得られる。これを用いることで、効率的に光学活性アミノ化合物を生成することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書において記述されているＤＮＡの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）、Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）等の成書に記載されている方法により行なうことができる。
【０００９】
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、タンパク質は、下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略号を用いて表される。また、特に明示しない限り、ペプチドおよびタンパク質のアミノ酸残基の配列は、左端から右端にかけてＮ末端からＣ末端となるように表される。また、参照を容易にするため、一般的に用いられている下記の命名法を適用する。１つは、“もとのアミノ酸；位置；置換したアミノ酸”と記述する方法であり、例えば、位置６４におけるチロシンのアスパラギン酸への置換はＴｙｒ６４Ａｓｐ、またはＹ８４Ｄと表される。多重変異については、スラッシュ記号“／”により分けることで表記する。例えば、Ｓ４１Ａ／Ｙ６４Ｄとは、位置４１のセリンをアラニンへ、かつ、位置６４のチロシンをアスパラギン酸へ置換することを示す。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン、Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン、 
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸、 
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン、 
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン、Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン、 
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン、Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン、 
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン、 
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン、Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン、 
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン、Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン、 
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン、Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン、 
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン、Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン、
【００１０】
また、本明細書において、「非極性アミノ酸」には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプチファンが含まれ、「非電荷アミノ酸」には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ、「酸性アミノ酸」にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、「塩基性アミノ酸」には、リジン、アルギニン、およびヒスチジンが含まれる。
【００１１】
また、酵素活性の単位は特に明記しない限り、１分間に１μｍｏｌの生成物を与える酵素量を１Ｕとする。
【００１２】
1.野生型酵素およびその遺伝子
本発明において、変異を導入する前の野生型酵素は、配列表の配列番号１で表される４５４個のアミノ酸残基からなり、アミノ基供与体の存在下でケトン化合物から光学活性アミノ化合物（例えば７−メトキシ−２−テトラロンから（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン）を生成する活性を有するポリペプチドである。当該ポリペプチドは野生型酵素と記載されるものである。
【００１３】
ポリペプチドの起源は限定されるものではないが、好ましくは、シュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物、より好ましくはシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、さらに好ましくは、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）  ＫＮＫ０８−１８株由来のアミノ基転移酵素である。本菌株は、平成１６年１０月５日付けで、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０２３９として、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託されている。
【００１４】
本発明の野生型酵素遺伝子とは、配列表の配列番号２に示されるポリヌクレオチドであり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））等に記載される通常の遺伝子工学的手法に準じてシュードモナス（Pseudomonas）属、好ましくはシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）  ＫＮＫ０８−１８株から取得することができる。
【００１５】
即ち、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＫＮＫ０８−１８株のゲノムＤＮＡからからＷＯ２００６／１２６４９８Ａ１に記載された方法に準じてＰＣＲを行うことにより、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ又は配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して野生型遺伝子を調製することができる。
【００１６】
また、有機合成化学的手法により、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ又は配列表の配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ等の野生型遺伝子を入手することができる。
【００１７】
２．改変型アミノ基転移酵素
本発明のポリペプチドの一態様として、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と配列同一性が８５％以上であり、かつ、アミノ基供与体の存在下で７−メトキシ−２−テトラロンから（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンを生成する反応を行うことができ、さらに、野生型酵素よりその反応性が高いポリペプチドが挙げられる。
【００１８】
また、本発明で「その反応性が高い」とは、野生型酵素と比較した際に、以下の（ａ）〜（e）の少なくとも１つ以上の性質を示すことを意味する。
（ａ）７−メトキシ−２−テトラロンに対する立体選択性が高い
（ｂ）熱安定性が高い
（ｃ）（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン存在下での安定性が高い
（ｄ）７−メトキシ−２−テトラロンに対する活性が高い
（ｅ）（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンによる拮抗阻害が緩和されている
【００１９】
なお、野生型酵素とは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるアミノ基転移酵素を意味する。
【００２０】
本発明のポリペプチドは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に改変を加えて得られるものであってもよい。また、「改変型アミノ基転移酵素」とは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸が１個、または複数個もしくは数個のアミノ酸が置換、付加、挿入もしくは欠失されたアミノ酸配列を有し、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ基転移酵素と配列同一性が８５％以上のポリペプチドであることが好ましい。また、これらのポリペプチドのN末端およびC末端のいずれかあるいは両方にアミノ酸が１つまたは複数個もしくは数個付加されても良い。
【００２１】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に加える改変としては、置換、付加、挿入もしくは欠失が挙げられ、１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。上記の「複数個のアミノ酸」とは、例えば７０個、好ましくは５０個、より好ましくは２０個、さらに好ましくは１０個、８個、５個、４個、３個、または２個のアミノ酸を意味する。
【００２２】
また、改変を加えた後のアミノ酸配列と、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列の配列同一性は８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
【００２３】
N末端およびC末端のいずれかあるいは両方にアミノ酸が１つもしくは複数個付加されている改変型アミノ基転移酵素においては、付加したアミノ酸を除いて配列同一性を評価することとする。
【００２４】
本明細書におけるポリペプチドやポリヌクレオチドの「配列同一性」とは、対比される２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを最適に整列させ、アミノ酸または核酸塩基(例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列で一致した位置の数を比較アミノ酸総数または比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。
【００２５】
アミノ基転移酵素に他の酵素やタンパク、ペプチドを付加して発現させる場合はこれらを除いて配列同一性を決定する。
【００２６】
具体的には、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列同一性は、「ＧＥＮＥＴＹＸ Ver.10」（ゼネティックス社）のMaximum matchingプログラムをデフォルトのパラメーターで用いることで決定し得る。
【００２７】
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列においてアミノ酸が置換、挿入、欠失、付加される場所は特に制限されないが、反応性向上の観点から、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、好ましくは３、１１、１７、２９、４２、８４、１１６、１５１、１５３、１６１、１７１、１７６、１９０、２８４、２０９、２３５、２３６、２６２、３０２、４０８、４１８、４２０、４２１、４３４、４３５、および４４２番目、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているポリペプチド、またはこれらのN末端、C末端のいずれかもしくは両方に、１つもしくは複数のアミノ酸が付加されているポリペプチドが好ましい。
【００２８】
また、本発明のポリペプチドの好適な一態様として、下記(A)〜(C)のいずれかのポリぺプチドが挙げられる。
(A)配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、３、１１、１７、２９、４２、８４、１１６、１５１、１５３、１６１、１７１、１７６、１９０、２８４、２０９、２３５、２３６、２６２、３０２、４０８、４１８、４２０、４２１、４３４、４３５、および４４２番目、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、３、１１、１７、２９、４２、８４、１１６、１５１、１５３、１６１、１７１、１７６、１９０、２８４、２０９、２３５、２３６、２６２、３０２、４０８、４１８、４２０、４２１、４３４、４３５、および４４２番目、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸部位以外のアミノ酸の１個もしくは複数個が置換、付加、挿入もしくは欠失されてなり、かつ、アミノ基供与体の存在下、７−メトキシ−２−テトラロンに作用して（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンを生成する反応を行うことができ、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるアミノ基転移酵素と比較してその反応性が高いポリペプチド、
(C)配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、３、１１、１７、２９、４２、８４、１１６、１５１、１５３、１６１、１７１、１７６、１９０、２８４、２０９、２３５、２３６、２６２、３０２、４０８、４１８、４２０、４２１、４３４、４３５、および４４２番目、から選択される１つもしくは複数個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列において、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸部位を除いた配列同一性が８５％以上であり、かつ、アミノ基供与体の存在下、７−メトキシ−２−テトラロンに作用して（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンを生成する反応を行うことができ、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるアミノ基転移酵素と比較してその反応性が高いポリペプチド。
【００２９】
以下、前記(B)及び（C）のポリペプチドにおいて、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、３、１１、１７、２９、４２、８４、１１６、１５１、１５３、１６１、１７１、１７６、１９０、２８４、２０９、２３５、２３６、２６２、３０２、４０８、４１８、４２０、４２１、４３４、４３５、および４４２番目以外のアミノ酸部位を「任意改変部位」と表記することもある。
【００３０】
前記(B)及び(C)のポリペプチドにおいて、「その反応性が高い」とは、前記の（ａ）〜（e）の少なくとも１つ以上の性質を示すことを意味するが、好ましくは、任意改変部位を置換、付加、挿入もしくは欠失する前のポリペプチドと比較した際に、以下の（ｆ）〜（e）の少なくとも１つ以上の性質を示すことを意味する。
（ｆ）７−メトキシ−２−テトラロンに対する立体選択性が同等又は高い
（ｇ）熱安定性が同等又は高い
（ｈ）（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン存在下での安定性が同等又は高い
（ｉ）７−メトキシ−２−テトラロンに対する活性が同等又は高い
（ｊ）（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンによる拮抗阻害の緩和作用が同等又は高い
【００３１】
前記(B)のポリペプチドの任意改変部位に導入されるアミノ酸の改変は、置換、付加、挿入、および欠失の中から１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。前記(B)のポリペプチドにおいて、任意改変部位に置換、付加、挿入もしくは欠失されるアミノ酸は、１個または複数個もしくは数個であればよく、例えば１〜７０個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、１〜８個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、あるいは１または２個が挙げられる。
【００３２】
また、前記(C)のポリペプチドにおいて「配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸部位を除いた配列同一性」とは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から前記任意改変部位のみを抜き出して、当該任意改変部位のみを比較して算出される配列同一性である。当該配列同一性の決定方法は、前記の通りである。
【００３３】
前記(C)のポリペプチドにおける「配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸部位を除いた配列同一性」は、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
【００３４】
また、一般にポリペプチドの機能の維持のためには、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれている。前記(B)及び(C)のポリペプチドの任意改変部位に導入されるアミノ酸置換は、保存的置換であることが好ましい。即ち、前記任意改変部位における置換としては、例えば、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が非荷電性アミノ酸であれば他の非荷電性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸への置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。
【００３５】
また、前記(B)及び(C)のポリペプチドの任意改変部位において、アミノ酸が置換、挿入もしくは欠失される部位は、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列からなるアミノ基転移酵素の高度保存領域を避けることが好ましい。高度保存領域とは、由来の異なる複数の酵素について、アミノ酸配列を最適に整列させて比較した場合に、複数の配列間でアミノ酸残基が一致している位置を表す。高度保存領域は、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列と、公知の微生物由来のアミノ基転移酵素遺伝子の塩基配列とをＧＥＮＥＴＹＸ等のツールを用いて比較することで確認することができる。高度保存領域として、例えば、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において、３８、１３９、１６２、２１２、２２１、２２６、２３０、２３１、２３２、２３７、２４１、２５９、２６０、２６１、２６４、２６６、２６７、２６９、２７３、２８１、２８２、２８８、２９６、２９９、３２５、３２８、３２９、３３０、３３１、３３４、３４６、３７８、３８０、および３８８番目のアミノ酸が挙げられる。とりわけ、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において、２８８、２５９、１２１、２６１、および３２５番目のアミノ酸は、アミノ基転移酵素の活性中心を構成していると考えられており（FEBS journal (doi:10.1111/j.1742-4658.2011.08468.x)；Biotechnology and Bioengineering 99(2),275-284, 2008）、アミノ酸が置換、挿入もしくは欠失されずに維持されることが好ましい。
【００３６】
（反応性の向上）
本発明のペプチドにおいて、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、３、１１、１７、２９、４２、８４、１１６、１５１、１５３、１６１、１７１、１７６、１９０、２８４、２０９、２３５、２３６、２６２、３０２、４０８、４１８、４２０、４２１、４３４、４３５、および４４２番目において置換するアミノ酸の種類については、特に制限されないが、反応性の向上の観点から、下記の(1a)〜(26a)に示すアミノ酸置換の内、１つまたは複数が導入されていることが好ましい。
(1a)３番目が、好ましくは塩基性アミノ酸、更に好ましくはアルギニンに置換、
(2a)１１番目が、好ましくは非電荷アミノ酸、更に好ましくはグリシンに置換、
(3a)１７番目が、好ましくは非極性アミノ酸、更に好ましくはイソロイシンまたはロイシン、特に好ましくはイソロイシンに置換、
(4a)２９番目が、好ましくは塩基性アミノ酸、更に好ましくはリジンに置換、
(5a)４２番目が、好ましくは非電荷アミノ酸、更に好ましくはチロシンに置換、
(6a)８４番目が、好ましくは非電荷アミノ酸、更に好ましくはシステインに置換、
(7a)１１６番目が、好ましくは非極性アミノ酸、更に好ましくはロイシンに置換、
(8a)１５１番目が、好ましくは塩基性アミノ酸、更に好ましくはヒスチジンに置換、
(9a)１５３番目が、好ましくは非極性アミノ酸、更に好ましくはフェニルアラニンに置換、
(10a)１６１番目が、好ましくは非電荷アミノ酸または非極性アミノ酸、更に好ましくは非電荷アミノ酸、特に好ましくはスレオニンまたはバリンに置換、
(11a)１７１番目が、好ましくは塩基性アミノ酸、更に好ましくはアルギニンに置換、
(12a)１７６番目が、好ましくは非電荷アミノ酸、更に好ましくはセリンに置換、
(13a)２８４番目が、好ましくは非電荷アミノ酸、更に好ましくはイソロイシンに置換、
(14a)１９０番目が、好ましくは非極性アミノ酸、更に好ましくはチロシンに置換、
(15a)２０９番目が、好ましくは非極性アミノ酸、更に好ましくはアラニンに置換、
(16a)２３５番目が、好ましくは非極性アミノ酸、更に好ましくはバリンに置換、
(17a)２３６番目が、好ましくは非極性アミノ酸、更に好ましくはイソロイシンに置換、
(18a)２６２番目が、好ましくは非極性アミノ酸、更に好ましくはバリンに置換、
(19a)３０２番目が、好ましくは非極性アミノ酸、更に好ましくはイソロイシンに置換、
(20a)４０８番目が、好ましくは非電荷アミノ酸、更に好ましくはスレオニンに置換、
(21a)４１８番目が、好ましくは非電荷アミノ酸、更に好ましくはロイシンに置換、
(22a)４２０番目が、好ましくはプロリン、グリシン、システイン、およびスレオニン以外のアミノ酸、更に好ましくはアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リジン、アラニン、バリン、トリプトファン、セリン、より好ましくはアラニン、セリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、特に好ましくはアラニン、セリン、ヒスチジン、最も好ましくはヒスチジンに置換、
(23a)４２１番目が、好ましくは非電荷アミノ酸、更に好ましくはスレオニンに置換、
(24a)４３４番目が、好ましくは非極性アミノ酸、更に好ましくはアラニンに置換、
(25a)４３５番目が、好ましくは非極性アミノ酸、更に好ましくはアラニンに置換、
(26a)４４２番目が、好ましくは非極性アミノ酸、更に好ましくはバリンに置換。
【００３７】
（a）７−メトキシ−２−テトラロンに対する立体選択性
立体選択性向上の観点から、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列のうち、好ましくは１１、１７、２９、４２、８４、１５１、１６１、１７６、２８４、２０９、２３５、２３６、２６２、４０８、４１８、４２０、４２１、４３４、４４２番目、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているポリペプチド、またはこれらのN末端、C末端のいずれかもしくは両方に、１つもしくは複数のアミノ酸が付加されているポリペプチドが好ましい。
【００３８】
より好ましくは、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列のうち、次の(1b)〜(19b)よりなる群；
(1b)１１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはグリシンに置換、
(2b)１７番目が、非極性アミノ酸、好ましくはイソロイシンまたはロイシン、特に好ましくはイソロイシンに置換、
(3b)２９番目が、塩基性アミノ酸、好ましくはリジンに置換、
(4b)４２番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはチロシンに置換、
(5b)８４番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはシステインに置換、
(6b)１５１番目が、塩基性アミノ酸、好ましくはヒスチジンに置換、
(7b)１６１番目が、非電荷アミノ酸または非極性アミノ酸、好ましくはスレオニンまたはバリンに置換、
(8b)１７６番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはセリンに置換、
(9b)２８４番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはイソロイシンに置換、
(10b)２０９番目が、非極性アミノ酸、好ましくはアラニンに置換、
(11b)２３５番目が、非極性アミノ酸、好ましくはバリンに置換、
(12b)２３６番目が、非極性アミノ酸、好ましくはイソロイシンに置換、
(13b)２６２番目が、非極性アミノ酸、好ましくはバリンに置換、
(14b)４０８番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンに置換、
(15b)４１８番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはロイシンに置換、
(16b)４２０番目が、プロリン、グリシン、システイン、およびスレオニン以外のアミノ酸、好ましくはアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リジン、アラニン、バリン、トリプトファン、セリン、更に好ましくはアラニン、セリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、特に好ましくはアラニン、セリン、ヒスチジン、最も好ましくはヒスチジンに置換、
(17b)４２１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンに置換、
(18b)４３４番目が、非極性アミノ酸、好ましくはアラニンに置換、および
(19b)４４２番目が、非極性アミノ酸、好ましくはバリンに置換。
から選択される１つもしくは複数のアミノ酸置換が導入されているポリペプチドである。
【００３９】
さらに、立体選択性をより向上させるという観点から、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列のうち、次の(1c)〜(13c)よりなる群；
(1c)１６１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンに置換；かつ４１８番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはロイシンに置換、
(2c)１６１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンに置換；かつ２８４番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはイソロイシンに置換、
(3c)１６１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンに置換；２３６番目が、非極性アミノ酸、好ましくはイソロイシンに置換；かつ４４２番目が、非極性アミノ酸、好ましくはバリンに置換、
(4c)１６１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンに置換；２０９番目が、非極性アミノ酸、更に好ましくはアラニンに置換；かつ２３５番目が、非極性アミノ酸、好ましくはバリンに置換、
(5c)１６１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンに置換；かつ４３４番目が、非極性アミノ酸、好ましくはアラニンに置換、
(6c)４２番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはチロシンに置換；かつ４０８番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンに置換、
(7c)２９番目が、塩基性アミノ酸、好ましくはリジンに置換；かつ２６２番目が、非極性アミノ酸、好ましくはバリンに置換、
(8c)１１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはグリシンに置換；１５１番目が、塩基性アミノ酸、好ましくはヒスチジンに置換；かつ６２番目が、非極性アミノ酸、好ましくはバリンに置換、
(9c)８４番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはシステインに置換；かつ４２０番目が、スレオニン以外の非電荷アミノ酸、好ましくはセリンに置換、
(10c)１６１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンに置換；かつ１７番目が、非極性アミノ酸、好ましくはイソロイシンに置換、
(11c)１６１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンに置換；かつ４２０番目が、塩基性アミノ酸、好ましくはヒスチジンに置換、
(12c)１７番目が、非極性アミノ酸、好ましくはイソロイシンに置換；かつ４２０番目が、塩基性アミノ酸、好ましくはヒスチジンに置換、および
(13c)１６１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンに置換；１７番目が、非極性アミノ酸、好ましくはイソロイシンに置換；かつ、４２０番目が、塩基性アミノ酸、好ましくはヒスチジンに置換、
から選択されるアミノ酸置換が導入されているポリペプチドであることが好ましい。
【００４０】
（ｂ）熱安定性
熱安定性向上の観点から、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、好ましくは３、１７、１１６、１９０番目、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているポリペプチド、またはこれらのN末端、C末端のいずれかもしくは両方に、１つもしくは複数のアミノ酸が付加されているポリペプチドが好ましい。
【００４１】
より好ましくは、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列のうち、次の(1d)〜(4d)よりなる群；
(1d)３番目が塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンに置換、
(2d)１７番目が、非極性アミノ酸、好ましくはロイシンに置換、
(3d)１１６番目が、非極性アミノ酸、好ましくはロイシンに置換、および
(4d)１９０番目が、非極性アミノ酸、好ましくはチロシンに置換、
から選択される１つもしくは複数のアミノ酸置換が導入されているポリペプチドである。
さらに、熱安定性をより向上させるという観点から、３番目が、好ましくは塩基性アミノ酸、更に好ましくはアルギニンに置換；１７番目が、非極性アミノ酸、好ましくはロイシンに置換；かつ１１６番目が、非極性アミノ酸、好ましくはロイシンに置換されたポリペプチドであることが好ましい。
【００４２】
（ｃ）（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン存在下での安定性
（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン存在下での安定性の向上の観点から、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、好ましくは、３、１１、１７、２９、４２、８４、１１６、１５１、１５３、１６１、１７１、１７６、２８４、１９０、２０９、２３５、２３６、２６２、３０２、４０８、４１８、４２０、４３４、４３５、４４２番目、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているポリペプチド、またはこれらのN末端、C末端のいずれかもしくは両方に、１つもしくは複数のアミノ酸が付加されているポリペプチドが好ましい。
【００４３】
より好ましくは、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列のうち、次の(1e)〜(25e)よりなる群；
(1e)３番目が塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンに置換、
(2e)１１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはグリシンに置換、
(3e)１７番目が、非極性アミノ酸、好ましくはイソロイシンまたはロイシンに置換、
(4e)２９番目が、塩基性アミノ酸、好ましくはリジンに置換、
(5e)４２番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはチロシンに置換、
(6e)８４番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはシステインに置換、
(7e)１１６番目が、非極性アミノ酸、好ましくはロイシンに置換、
(8e)１５１番目が、塩基性アミノ酸、好ましくはヒスチジンに置換、
(9e)１５３番目が、非極性アミノ酸、好ましくはフェニルアラニンに置換、
(10e)１６１番目が、非電荷アミノ酸または非極性アミノ酸、好ましくはスレオニンまたはバリンに置換、
(11e)１７１番目が、塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンに置換、
(12e)１７６番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはセリンに置換、
(13e)２８４番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはイソロイシンに置換、
(14e)１９０番目が、非極性アミノ酸、好ましくはチロシンに置換、
(15e)２０９番目が、非極性アミノ酸、好ましくはアラニンに置換、
(16e)２３５番目が、非極性アミノ酸、好ましくはバリンに置換、
(17e)２３６番目が、非極性アミノ酸、好ましくはイソロイシンに置換、
(18e)２６２番目が、非極性アミノ酸、好ましくはバリンに置換、
(19e)３０２番目が、非極性アミノ酸、好ましくはイソロイシンに置換、
(20e)４０８番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンに置換、
(21e)４１８番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはロイシンに置換、
(22e)４２０番目が、非極性アミノ酸、またはスレオニン以外の非電荷アミノ酸、または塩基性アミノ酸、好ましくはアラニン、ヒスチジン、またはセリンに置換、
(23e)４２１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンに置換、
(24e)４３４番目が、非極性アミノ酸、好ましくはアラニンに置換、
(25e)４３５番目が、非極性アミノ酸、好ましくはアラニンに置換、および
(26e)４４２番目が、非極性アミノ酸、好ましくはバリンに置換、
から選択される１つもしくは複数のアミノ酸置換が導入されているポリペプチドである。
【００４４】
さらに、（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン存在下での安定性をより向上させるという観点から、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列のうち、次の(1f)〜(15f)よりなる群；
(1f)１６１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンに置換；かつ４１８番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはロイシンに置換、
(2f)１６１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンに置換；２３６番目が、非極性アミノ酸、好ましくはイソロイシンに置換；かつ４４２番目が、非極性アミノ酸、好ましくはバリンに置換、
(3f)１６１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンに置換；かつ４３４番目が、非極性アミノ酸、好ましくはアラニンに置換、
(4f)１１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはグリシンに置換；１５１番目が、塩基性アミノ酸、好ましくはヒスチジンに置換；１６１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンに置換；かつ２６２番目が、非極性アミノ酸、好ましくはバリンに置換、
(5f)１６１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンに置換；２０９番目が、非極性アミノ酸、好ましくはアラニンに置換；かつ２３５番目が、非極性アミノ酸、好ましくはバリンに置換、
(6f)４２番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはチロシンに置換；かつ４０８番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンに置換、
(7f)１７番目が、非極性アミノ酸、好ましくはロイシンに置換；かつ１５３番目が、非極性アミノ酸、好ましくはフェニルアラニンに置換、
(8f)２９番目が、塩基性アミノ酸、好ましくはリジンに置換；かつ２６２番目が、非極性アミノ酸、好ましくはバリンに置換、
(9f)１６１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンに置換；かつ２８４番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはイソロイシンに置換、
(10f)３番目が塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンに置換；１７番目が、非極性アミノ酸、好ましくはロイシンに置換；１１６番目が、非極性アミノ酸、好ましくはロイシンに置換；かつ１９０番目が、非極性アミノ酸、好ましくはチロシンに置換、
(11f)８４番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはシステインに置換；かつ４２０番目が、スレオニン以外の非電荷アミノ酸、好ましくセリンに置換、
(12f)１６１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンに置換；かつ１７番目が、非極性アミノ酸、好ましくはイソロイシンに置換、
(13f)１６１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンに置換；かつ４２０番目が、塩基性アミノ酸、好ましくはヒスチジンに置換
(14f)１７番目が、非極性アミノ酸、好ましくはロイシンに置換；かつ４２０番目が、塩基性アミノ酸、好ましくはヒスチジンに置換、および
(15f)１６１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンに置換；１７番目が、非極性アミノ酸、好ましくはイソロイシンに置換；かつ４２０番目が、塩基性アミノ酸、好ましくはヒスチジンに置換、
から選択されるアミノ酸置換が導入されているポリペプチドであることが好ましい。
【００４５】
（ｄ）７−メトキシ−２−テトラロンに対する活性
７−メトキシ−２−テトラロンに対する活性向上の観点から、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、好ましくは１７、８４、４２０、４２１番目、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているポリペプチド、またはこれらのN末端、C末端のいずれかもしくは両方に、１つもしくは複数のアミノ酸が付加されているポリペプチドが好ましい。
【００４６】
好ましくは、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列のうち、次の(1g)〜(4g)よりなる群；
(1g)１７番目が、非極性アミノ酸、好ましくはロイシンに置換、
(2g)８４番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはシステインに置換、
(3g)４２０番目が、非極性アミノ酸、またはスレオニン以外の非電荷アミノ酸、好ましくはアラニン、またはセリンに置換、および
(4g)４２１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニンに置換、
から選択されるアミノ酸置換が導入されているポリペプチドである。
【００４７】
さらに、７−メトキシ−２−テトラロンに対する活性をより向上させるという観点から、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列のうち、８４番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはシステインに置換；かつ４２０番目が、スレオニン以外のアミノ酸、好ましくはセリンに置換されたポリペプチドであることが好ましい。
（e）（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンによる拮抗阻害
【００４８】
（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンによる拮抗阻害緩和の観点から、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、好ましくは１１、１７、１５１、１５３、１６１、１７１、１７６、２８４、２０９、２３５、２３６、２６２、３０２、４１８、４３４、４３５、４４２番目、から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているポリペプチド、またはこれらのN末端、C末端のいずれかもしくは両方に、１つもしくは複数のアミノ酸が付加されているポリペプチドが好ましい。
【００４９】
より好ましくは、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列のうち、次の(1h)〜(17h)よりなる群；
(1h)１１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはグリシンに置換、
(2h)１７番目が、非極性アミノ酸、好ましくはイソロイシンまたはロイシンに置換、
(3h)１５１番目が、塩基性アミノ酸、好ましくはヒスチジンに置換、
(4h)１５３番目が、非極性アミノ酸、好ましくはフェニルアラニンに置換、
(5h)１６１番目が、非電荷アミノ酸または非極性アミノ酸、好ましくはスレオニンまたはバリンに置換、
(6h)１７１番目が、塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンに置換、
(7h)１７６番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはセリンに置換、
(8h)２８４番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはイソロイシンに置換、
(9h)２０９番目が、非極性アミノ酸、好ましくはアラニンに置換、
(10h)２３５番目が、非極性アミノ酸、好ましくはバリンに置換、
(11h)２３６番目が、非極性アミノ酸、好ましくはイソロイシンに置換、
(12h)２６２番目が、非極性アミノ酸、好ましくはバリンに置換、
(13h)３０２番目が、非極性アミノ酸、好ましくはイソロイシンに置換、
(14h)４１８番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはロイシンに置換、
(15h)４３４番目が、非極性アミノ酸、好ましくはアラニンに置換、
(16h)４３５番目が、非極性アミノ酸、好ましくはアラニンに置換、および
(17h)４４２番目が、非極性アミノ酸、好ましくはバリンに置換、
から選択される１つもしくは複数のアミノ酸置換が導入されているポリペプチドである。
【００５０】
さらに、（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンによる拮抗阻害の緩和作用をより高めるという観点から、次の群；
(1i)１６１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニン置換；かつ４１８番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはロイシンに置換、
(2i)１６１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニン置換；２３６番目が、非極性アミノ酸、好ましくはイソロイシンに置換；かつ４４２番目が、非極性アミノ酸、好ましくはバリンに置換、
(3i)１６１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニン置換；かつ４３４番目が、非極性アミノ酸、好ましくはアラニンに置換、
(4i)１１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはグリシンに置換；１５１番目が、塩基性アミノ酸、好ましくはヒスチジンに置換；１６１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニン置換；かつ２６２番目が、非極性アミノ酸、好ましくはバリンに置換、
(5i)１６１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニン置換；２０９番目が、非極性アミノ酸、好ましくはアラニンに置換；かつ１５３番目が、非極性アミノ酸、好ましくはフェニルアラニンに置換、
(6i)１７番目が、非極性アミノ酸、好ましくはロイシンに置換；かつ１５３番目が、非極性アミノ酸、好ましくはフェニルアラニンに置換、および
(7i)１６１番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはスレオニン置換；２８４番目が、非電荷アミノ酸、好ましくはイソロイシンに置換、
から選択されるアミノ酸置換が導入されているポリペプチドであることが好ましい。
【００５１】
本明細書において、７−メトキシ−２−テトラロンからアミノ基供与体の存在下で（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンを生成する反応を行うことができることは、例えば下記のように決定し得る。
【００５２】
すなわち、酵素を含む無細胞抽出液１００μＬを下記組成を有する基質溶液３０５μＬに添加し、３０℃で１時間反応させたのち、６規定の塩酸を５０μＬ添加して反応を停止させる。生成した（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンの光学純度を高速液体クロマトグラフィーで測定する。このとき、酵素1mgあたりの（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン生成活性が好ましくは1mU/mg以上、より好ましくいは１０ｍU/mg以上、さらに好ましくは100mU/mg以上である。生成する（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンの光学純度は好ましくは80%ee以上、より好ましくは90%ee以上、さらに好ましくは95%ee以上である。
［基質溶液組成］
（Ｓ）−１−フェネチルアミン      ２１ｍＭ
リン酸カリウム（ｐＨ７．５）      ０．１Ｍ
７−メトキシ−２−テトラロン      １４ｍＭ
［高速液体クロマトグラフィーによる測定条件］
カラム：Ｃｒｏｗｎｐａｋ  ＣＲ（＋）（ダイセル化学工業社製）
溶離液：過塩素酸水溶液（ｐＨ１．５）／メタノール＝８５／１５（体積比）
流速：１ｍＬ／分
検出：２２０ｎｍ
カラム温度：４７℃
【００５３】
（a）７−メトキシ−２−テトラロンに対する立体選択性が高いとは
本明細書において、立体選択性とは、基質であるケトン化合物から生成するアミノ化合物の光学純度のことである。また、ラセミ体のアミノ化合物をケトン化合物の存在下で一方のエナンチオマーのアミノ基を優先的にケトン化合物に移す際の選択性である。
立体選択性は、例えば、以下のように決定し得る。
【００５４】
（ａ）−１
酵素を含む無細胞抽出液１００μＬを下記組成を有する基質溶液３０５μＬに添加し、３０℃で１時間反応させたのち、６規定の塩酸を５０μＬ添加して反応を停止させる。生成した（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンの光学純度を高速液体クロマトグラフィーで測定する。
［基質溶液組成］
（Ｓ）−１−フェネチルアミン      ２１ｍＭ
リン酸カリウム（ｐＨ７．５）      ０．１Ｍ
７−メトキシ−２−テトラロン      １４ｍＭ
［高速液体クロマトグラフィーによる測定条件］
カラム：Ｃｒｏｗｎｐａｋ  ＣＲ（＋）（ダイセル化学工業社製）
溶離液：過塩素酸水溶液（ｐＨ１．５）／メタノール＝８５／１５（体積比）
流速：１ｍＬ／分
検出：２２０ｎｍ
カラム温度：４７℃
【００５５】
（ａ）−２
また、立体選択性は、以下のように決定しうる。
目的のアミノ基転移酵素、WO2007/139255に記載のペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）ＪＣＭ８７９７株由来Ｌ−乳酸脱水素酵素ＰＡＬＤＨ、および、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素ＧＤＨをその酵素遺伝子をそれぞれ、あるいは、同一のプラスミドベクター等に挿入し、大腸菌等を形質転換させ、大腸菌内で酵素を発現させる。３つの酵素は一つの大腸菌で発現させても良いし、二つ、ないし、三つの大腸菌でそれぞれ発現させても良い。それぞれの菌体を超音波等で破砕し、無細胞抽出液を調製する。三つの酵素のうち、ＰＡＬＤＨおよびＧＤＨはアミノ基転移酵素の活性に対して過剰量となるように混合する。この酵素混合液２５０μＬに下記組成を有する基質溶液２５０μＬを添加し、３５℃で１．５時間反応させたのち、６規定の塩酸を５０μＬ添加して反応を停止させる。生成した（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンの光学純度を前記高速液体クロマトグラフィーで測定する。
［基質溶液組成］
リン酸カリウム（ｐＨ６．８）      ０．２Ｍ
Ｌ−アラニン                      １．１２Ｍ
Ｄ−グルコース                    ３４０ｍＭ
ＮＡＤＨ                          ０．２ｍＭ
ピリドキサルリン酸                ０．８ｍＭ
７−メトキシ−２−テトラロン      ２２８ｍＭ
【００５６】
本明細書中で、立体選択性の高い改変型アミノ基転移酵素とは、上記反応を行なった場合の生成する（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンの光学純度が、（ａ）−１または（ａ）−２の少なくとも１つの反応において野生型に比べて、０．１％ｅ．ｅ．以上高いことを意味し、好ましくは０．５％ｅ．ｅ．以上、さらに好ましくは１．０％ｅ．ｅ．以上高いことを意味する。好ましくは、（ａ）−２の反応において野生型に比べて、０．１％ｅ．ｅ．以上高いことを意味し、好ましくは０．５％ｅ．ｅ．以上、さらに好ましくは１．０％ｅ．ｅ．以上高いことを意味する。
【００５７】
（b）熱安定性が高いとは
酵素の熱安定性は、例えば、以下のように決定し得る。
【００５８】
目的のアミノ基転移酵素を発現する組み換え大腸菌を、２００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５ｍＬの２ｘＹＴ培地に植菌し、３０℃で一晩振とう培養する。得られた培養液１mＬから遠心分離により菌体を得る。この菌体に０．５ｍＭピリドキサルリン酸を含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬを加え、超音波破砕により無細胞抽出液を得る。この無細胞抽出液５００μＬを７５℃で３０分間インキュベートした後、４℃に冷却する。この無細胞抽出液を０．５ｍＭピリドキサルリン酸を含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈する。希釈した無細胞抽出液を１００μＬを下記組成を有する基質溶液３０５μＬに添加し、３０℃で１時間反応させたのち、６規定の塩酸を５０μＬ添加して反応を停止させる。生成した（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンの光学純度を高速液体クロマトグラフィーで測定する。加熱処理を実施しないサンプルと比較することで残存活性を算出する。
［基質溶液組成］
（Ｓ）−１−フェネチルアミン      ２１ｍＭ
リン酸カリウム（ｐＨ７．５）      ０．１Ｍ
７−メトキシ−２−テトラロン      １４ｍＭ
［高速液体クロマトグラフィーによる測定条件］
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ８−ＭＳ（ナカライテスク社製）
溶離液：３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル／メタノール＝４／１／１（体積比）
流速：０．９ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
【００５９】
本明細書中で、熱安定性が高い改変型アミノ基転移酵素とは、上記の評価を行なった場合の残存活性が、野生型に比べて１％以上、好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上、最も好ましくは２０％以上高いことを意味する。
【００６０】
（c）（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン存在下での安定性が高いとは
生成物（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン存在下での酵素の安定性は、例えば、以下のように決定し得る。
【００６１】
（ｃ）−１
酵素を含む無細胞抽出液１００μＬに７−メトキシ−２−アミノテトラリン塩酸塩を１％含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．３）を９００μＬ加えて３５℃、又は４５℃でインキュベートする。反応０時間と２０時間で１００μＬずつサンプリングし、それを０．１Ｍのリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．５）で２００倍に希釈する。それぞれの希釈液２００μＬを下記組成を有する基質溶液８００μＬに添加し、３０℃で１時間反応させたのち、６規定の塩酸を５０μＬ添加して反応を停止させる。生成したアセトフェノンの濃度を下記高速液体クロマトグラフィーで測定する。反応０時間を１００％としたときの反応２０時間の残存活性で決定する。
［基質溶液組成］
（Ｓ）−１−フェネチルアミン    ２５ｍＭ
ピルビン酸ナトリウム            ２５ｍＭ
ピリドキサルリン酸              ２．５ｍＭ
Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）          ０．１Ｍ
［高速液体クロマトグラフィーによる測定条件］
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ８−ＭＳ（ナカライテスク社製）
溶離液：３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル／メタノール＝４／１／１（体積比）
流速：０．９ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
【００６２】
（ｃ）−２
また、（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン存在下での酵素の安定性は例えば、以下のようにも決定し得る。
培養液５ｍＬを遠心分離し、得られた菌体に０．５ｍＭのピリドキサルリン酸を含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.5）を１ｍＬ加え、超音波破砕により無細胞抽出液を得る。
【００６３】
試験管に、この無細胞抽出液５０μＬ、（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン塩酸塩の10％または1.67％水溶液(pH7.5)
600μＬ、0.46M ピルビン酸ナトリウム水溶液(pH
7.5)１００μＬ、１M MOPS緩衝液(pH7.5) 50μＬ、50mM PLP水溶液（pH7.5）
10μＬ、水 190μＬを加え、アルゴンガスを注入後密栓し、３０℃で４時間、スターラーで攪拌する。２００μＬをサンプリングし、0.6規定の塩酸を５０μＬ添加して反応を停止させ、生成した７−メトキシ−２−テトラロンの濃度を以下の方法で高速液体クロマトグラフィーで測定する。1.67％の（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン塩酸塩水溶液を用いた場合の活性を１００％としたときの、１０％水溶液を用いた場合の相対活性を決定する。
［高速液体クロマトグラフィーによる測定条件］
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ８−ＭＳ（ナカライテスク社製）
溶離液：３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル／メタノール＝４／１／１（体積比）
流速：０．９ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
【００６４】
本明細書中で、（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン存在下での安定性が高い改変型アミノ基転移酵素とは、上記の評価を行なった場合の残存活性が、（ｃ）−１又は（ｃ）−２の少なくとも１つの反応において野生型に比べて１％以上高いことを意味し、好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上、最も好ましくは２０％以上高いことを意味する。好ましくは、（ｃ）−１の反応において野生型に比べて、１％以上高いことを意味し、好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上、最も好ましくは２０％以上高いことを意味する。さらに好ましくは、（ｃ）−１の反応において、４５℃でインキュベートした場合に、野生型に比べて、１％以上高いことを意味し、好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上、最も好ましくは２０％以上高いことを意味する。
【００６５】
（d）７−メトキシ−２−テトラロンに対する活性が高いとは
７−メトキシ−２−テトラロンに対する活性は、以下のように決定し得る。
【００６６】
評価するアミノ基転移酵素のDNAを高発現ベクターｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）に組み込み、このプラスミドを用いて大腸菌ＨＢ１０１を形質転換する。形質転換した大腸菌を純化後、２００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５ｍＬの２ｘＹＴ培地に植菌し、３０℃で２８時間振とう培養する。得られた培養液を超音波破砕により無細胞抽出液を得る。試験管に、この無細胞抽出液５０μＬ、１ｍＭのピリドキサルリン酸を含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１５０μＬ、４２ｍＭの（Ｓ）−１−フェネチルアミンを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）２００μＬ、７−メトキシ−２−テトラロンを２０％含むDMSO溶液5μＬを加え、アルゴンガスを注入後密栓し、３０℃で１時間、スターラーで攪拌する。６規定の塩酸を５０μＬ添加して反応を停止させ、生成した（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンの濃度を下記高速液体クロマトグラフィーで測定し、活性を決定する。
［高速液体クロマトグラフィーによる測定条件］
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ８−ＭＳ（ナカライテスク社製）
溶離液：３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル／メタノール＝４／１／１（体積比）
流速：０．９ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
【００６７】
本明細書中で、７−メトキシ−２−テトラロンに対する活性が高い改変型アミノ基転移酵素とは、上記の評価を行なった場合の活性が、野生型を１００％とした相対活性で、１０１％以上、好ましくは１０５％以上、さらに好ましくは１１０％以上、最も好ましくは１２０％以上であることを意味する。
【００６８】
（e）（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンによる拮抗阻害が緩和されているとは
（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンによる拮抗阻害は、以下の様に決定し得る。
【００６９】
培養液５ｍＬを遠心分離し、得られた菌体に０．５ｍＭのピリドキサルリン酸を含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.5）を１ｍＬ加え、超音波破砕により無細胞抽出液を得る。試験管に、この無細胞抽出液１００μＬ、（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン塩酸塩の10％水溶液600μＬ、1.13M （Ｓ）−１−フェネチルアミン水溶液(pH 7.5)100μＬ、１M MOPS緩衝液(pH7.5) 50μＬ、50mM PLP水溶液（pH7.5） 10μＬ、７−メトキシ−２−テトラロン 10mg、水 130μＬを加え、アルゴンガスを注入後密栓し、３０℃で１時間、スターラーで攪拌した。２００μＬをサンプリングし、0.6規定の塩酸を５０μＬ添加して反応を停止させ、生成したアセトフェノンの濃度を下記高速液体クロマトグラフィーで測定することで、活性を決定する。
［高速液体クロマトグラフィーによる測定条件］
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ８−ＭＳ（ナカライテスク社製）
溶離液：３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル／メタノール＝４／１／１（体積比）
流速：０．９ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
【００７０】
本明細書中で、（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンによる拮抗阻害が緩和されている改変型アミノ基転移酵素とは、上記評価を行なった場合の残存活性が、野生型に比べて１％以上、好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上、最も好ましくは２０％以上高いことを意味する。
【００７１】
２. ランダム変異ライブラリーの構築とアッセイ
本発明の改変型アミノ基転移酵素を探索する方法を説明する。
（ライブラリーの作製）
まず、ランダムに変異の導入されたＭＴＡ遺伝子を得る。エラープローンＰＣＲ法（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １，  １１−１５，  １９８９）あるいは同様の原理に基づいたキット、例えばＤｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社性）を用いて、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＫＮＫ０８−１８株由来のＭＴＡ遺伝子全長に（ＷＯ2006/126498）に１つ以上の塩基配列の置換、挿入、欠失、がランダムに導入されたDNA断片を得ることができる。この増幅断片を適当なベクター、例えば高発現ベクターｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）に組み込み、このプラスミドを用いて大腸菌ＨＢ１０１を形質転換する。形質転換した大腸菌を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢプレート培地に塗布し、シングルコロニーの大腸菌を得る。また、野生型遺伝子の代わりに、前記方法で得られた変異型酵素遺伝子を用いて、同様の操作でさらに変異を導入した変異酵素ライブラリーを作製することもできる。上記ライブラリーから、本発明の改変型アミノ基転移酵素を選抜することができる。選抜方法としては特に限定されないが、好ましくは下記の方法である。
【００７２】
（生成物に対する安定性が向上した酵素のプレート評価による選抜法）
変異酵素ライブラリーの各組み換え大腸菌を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢプレート培地に塗布し３０℃で一晩インキュベートし、菌体を得る。得られた菌体を７−メトキシー２−アミノテトラリン塩酸塩を４％含むＬＢプレート培地に植菌し、３７℃で一晩インキュベートする。野生型は高濃度の（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンによる酵素の阻害あるいは失活により、変色しないが、活性を保持する変異株は不安定な化合物である７−メトキシー２−アミノテトラロンを生成し、黒色に変色する。着色の見られた株のＤＮＡ配列を調べることで、改変型のアミノ酸配列を決定できる。
【００７３】
（セルフリーアッセイ）
変異酵素ライブラリーの各組み換え大腸菌を、２００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５ｍＬの２ｘＹＴ培地（トリプトン1.6%、イーストエキス1.0%、塩化ナトリウム0.5%、pH7.0））に植菌し、３０℃で２８時間振とう培養する。得られる培養液５００μＬに１ｍＭピリドキサルリン酸を含む０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）５００μＬを加え、超音波破砕により無細胞抽出液を得る。この無細胞抽出液を用いて前述した立体選択性と（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン安定性を調べ、野生型より優れた性質を持つ改変型アミノ基転移酵素を選抜することができる。
【００７４】
３. 多重変異酵素・飽和変異の作製
得られた改変型アミノ基転移酵素の変異部位について、部位特異的変異導入によって、他のアミノ酸に改変することにより、さらに優れた性質を持つ改変酵素を取得できる。また、得られた複数の改変型アミノ基転移酵素の変異を部位特異的変異導入によって、一方のいくつか、あるいは双方を組み合わせることで、一方の性質の強化あるいは双方の性質を併せ持つ改変型アミノ基転移酵素を作製できる。これらの酵素も本発明の酵素に含まれる。
【００７５】
（変異酵素の作製方法（１））
部位特異的変異導入法としては、例えば、Olfert Landtら（Gene 96 125-128 1990）、Smithら（Genetic Engineering 3 1 Setlow,J.and Hollaender,A Plenum:New York）、Vlasukら（Experimental Manipulation of Gene Expression,Inouye,M.:Academic Press,New York）、Hos.N.Huntら（Gene 77 51 1989）の方法やQuikChange II Kit（ストラタジーン社製）の市販キットの利用等があげられる。なお、２個所以上に変異を導入する場合には上記方法に準じた方法を繰り返すことにより、目的とする本発明のポリペプチドをコードするDNAを得ることができる。
【００７６】
４．本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、上記方法で取得したポリペプチドをコードするＤＮＡであり、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で上記ポリペプチドを発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。例えば、配列表１に記載のアミノ酸配列と配列同一性が８５％以上であり、かつ、アミノ基供与体の存在下で７−メトキシ−２−テトラロンから（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンを生成する活性を有し、さらに、野生型酵素より反応性の向上したポリペプチドをコードし、かつ、配列表の配列番号２に示した塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列を含むDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAが好ましい。
【００７７】
ここで、「配列表の配列番号２に示した塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列を含むDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA」とは、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるDNAを意味する。
【００７８】
ハイブリダイゼーションは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）」等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡをあげることができる。好ましくは６５℃で１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、さらに好ましくは０．２倍、０．１倍、０．０５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡである。
【００７９】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列表の配列番号２に示されるＤＮＡとの配列同一性が好ましくは７４％以上、より好ましくは７８％以上、さらに好ましくは８５％、９０％、９４％以上のＤＮＡをあげることができ、コードされるポリペプチドが、上記のアミノ基転移活性を有する限り、上記ＤＮＡに包含される。
【００８０】
また、本発明のＤＮＡは、当業者であれば化学的に合成すること等により容易に入手できる。
【００８１】
５．ベクター
本発明の実施形態のＤＮＡを宿主微生物内に導入して発現させるために用いるベクターＤＮＡとしては、適切な宿主微生物内で該ＤＮＡがコードする遺伝子を発現できるものであればいずれでもよい。このようなベクターＤＮＡとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられる。また、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用され得る。
【００８２】
このようなベクターは、作動可能に連結されたプロモーター（ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含むベクターとして好適に用いられ得る。例えば、ｐＵＣ１８（東洋紡社製）、ｐＵＣ１９（東洋紡社製）、ｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報）などが挙げられる。
【００８３】
制御因子とは、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
【００８４】
また、作動可能に連結とは、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプおよび種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【００８５】
各種生物において利用可能なベクター、プロモーター等に関しては、「微生物学基礎講座８遺伝子工学（共立出版、１９８７）」などに詳細に記述されている。
【００８６】
６．宿主および形質転換体
本発明の実施形態のＤＮＡを発現させるために用いる宿主生物は、各ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターにより形質転換され、ＤＮＡを導入したポリペプチドを発現することができる生物であれば、特に制限はされない。利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発されている細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発されている放線菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、およびキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの宿主ベクター系の開発されている酵母、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの宿主ベクター系の開発されているカビ、などが挙げられる。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Ｎａｔｕｒｅ３１５，５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。これらのうち、導入および発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。
【００８７】
本発明のＤＮＡを含む発現ベクターは、公知の方法により宿主微生物に導入できる。例えば、宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、市販のＥ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入できる。
【００８８】
７．光学活性アミノ化合物の製造方法
次に、本発明の実施形態のポリペプチドまたは当該ポリペプチドの生産能を持つ微生物を用いて光学活性アミノ化合物を製造する方法について説明する。
【００８９】
本発明の実施形態のポリペプチドの生産能を持つ微生物としては、特に限定されないが、例えば、実施形態のＤＮＡを含むベクターを導入された形質転換体が挙げられる。
【００９０】
本発明の光学活性アミノ化合物の製造方法としては、目的とするアミノ化合物と同じ骨格のケトン化合物に、アミノ基供与体からアミノ基を転移させ、生成する光学活性アミノ化合物を採取する方法（以下、製造方法Ｉとする）と、アミノ化合物のエナンチオマー混合物のうち、一方のエナンチオマーのアミノ基を選択的にアミノ基受容体に転移させ、残存するエナンチオマー（光学活性アミノ化合物）を採取する方法（以下、製造方法ＩＩという）が挙げられる。
【００９１】
まず、製造方法Ｉについて説明する。
（製造方法Ｉ）
製造方法Ｉは、ケトン化合物に、アミノ基供与体の存在下、本発明のポリペプチド、あるいは該ポリペプチド生産能を持つ形質転換体の培養物を作用させ、光学活性アミノ化合物を製造する方法である。
【００９２】
本製造方法は、例えば、一般式（１）：
【化５】
2012124639.tif 000006
で表されるケトン化合物に、アミノ基供与体の存在下、本発明のポリペプチドあるいは該ポリペプチド生産能を持つ微生物の培養物を作用させることにより、一般式（２）：
【化６】
2012124639.tif 000007
で表される光学活性アミノ化合物の製造方法である。
【００９３】
前記式（１）および（２）において、Ｒ１およびＲ２は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアラルキル基もしくは置換されていてもよいアリール基を示し、Ｒ１とＲ２の両者が互いに結合して環を形成していてもよい。但し、Ｒ１とＲ２は構造が異なる。
【００９４】
Ｒ１とＲ２は、好ましくは炭素数１から２０の置換されていてもよいアルキル基、炭素数１から２０の置換されていてもよいアラルキル基もしくは炭素数２から（２０の置換されていてもよいアリール基であり、より好ましくは、炭素数１から１０の置換されていてもよいアルキル基、炭素数３から１２の置換されていてもよいアラルキル基もしくは炭素数４から１０の置換されていてもよいアリール基である。
【００９５】
アリール基としては、フェニル基、ナフチル基、ピリジル基、チエニル基、オキサジアゾリル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、フリル基、ピロリル基、フェノキシ基、ナフトキシ基、ピリジルオキシ基、チエニルオキシ基、オキサジアゾリルオキシ基、イミダゾリルオキシ基、チアゾリルオキシ基、フリルオキシ基、ピロリルオキシ基等が挙げられる。
【００９６】
アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、イソプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、メトキシ基、エトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ビニル基、アリル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等が挙げられる。アラルキル基としては、ベンジル基等が挙げられる。
【００９７】
これらの基は、更に置換されていてもよく、その置換基としては、ハロゲン原子、窒素原子、硫黄原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基やメチレンジオキシ等が挙げられる。また、環の形成は置換基を介してもよい。
【００９８】
上記ケトン化合物の具体的な化合物としては、例えば、１−テトラロン、２−テトラロン、５−メトキシ−２−テトラロン、６−メトキシ−２−テトラロン、７−メトキシ−２−テトラロン、８−メトキシ−２−テトラロン、１−ベンジル−３−ピロリジノン、１−Ｂｏｃー３−ピロリジノン、１−Ｃｂｚー３−ピロリジノン、１−ベンジル−３−ピペリジノン、１−Ｂｏｃー３−ピペリジノン、１−Ｃｂｚー３−ピペリジノン、アセトフェノン、３，４−ジメトキシフェニルアセトンなどが挙げられる。
【００９９】
（アミノ基供与体）
アミノ基供与体としては、本発明のポリペプチドが作用するアミノ化合物であればいかなるものでも使用できる。具体例としては、１−フェネチルアミン、２−ブチルアミン、２−ペンチルアミン、２−ヘプチルアミン、３−ヘプチルアミン、ｎ−エチルアミン、ｎ−プロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｎ−アミルアミン、イソプロピルアミン、イソブチルアミン、グリシン、アラニン、３−アミノ−１−フェニルブタン、ベンジルアミン、β−フェネチルアミン、シクロヘキシルアミンおよびそれらの光学活性体が挙げられる。なかでも、１−フェネチルアミン、アラニンが好ましい。
【０１００】
（ポリペプチドの形態）
製造方法Ｉにおいては、前記ケトン化合物に、アミノ基供与体の存在下、前記本発明のポリペプチドまたは当該ポリペプチドの生産能を有する微生物の培養物を作用させる。
【０１０１】
ここで、培養物とは、菌体を含む培養液、培養菌体、またはその処理物を意味する。ここでその処理物とは、例えば、無細胞抽出液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、またはそれら菌体の磨砕物等を意味する。さらに、これらポリペプチドおよび培養物は、固定化酵素あるいは固定化菌体として用いることもできる。なお、固定化は、当業者に周知の方法（例えば架橋法、物理的吸着法、包括法等）で行なうことができる。
【０１０２】
（反応平衡、生成物阻害の解消による反応性の改善）
アミノ基転移反応を用いたアミノ化反応は一般的に可逆反応であるため、一般的に平衡点で見かけ上反応が停止する。これらの反応平衡を解消する公知の方法を組み合わせることで、本発明のポリペプチドを用いた反応を改善することができる。例えば、ＷＯ２００７／１３９０５５公報に記載のように、アミノ基供与体としてアラニンを用いて、副生成するピルビン酸を乳酸脱水素酵素と補酵素再生用のグルコース脱水素酵素を共役させることで乳酸へ変換し、反応平衡を解消する方法が有効である。同様に、アミノ基供与体としてアラニンを用いて、副生成するピルビン酸を、ピルビン酸デカルボキシラーゼで除く方法（ＷＯ２００７／０９３３７２Ａ１公報）、アラニン脱水素酵素を用いる方法（ＵＳ２００９／０１１７６２７Ａ１公報、  Ｅｖｏｎｉｋ  Ｄｅｇｕｓｓａ  ＧｍｂＨ）、過酸化水素で除く方法（ＵＳ２００８／０２１３８４５Ａ１公報）、アセト酪酸合成酵素を用いる方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２（１１），３０３０−３０３３（２００８））なども有効である。
【０１０３】
（基質濃度）
反応に用いる基質の濃度としては、ケトン化合物は、反応液組成中、０．１〜８０重量％、好ましくは１〜５０重量％であり、また、アミノ基供与体は、キラルアミンの場合は、ケトン化合物に対し、８０〜１２００モル％、好ましくは１００〜６００モル％の濃度になるように用いることが好ましい。なお、前記アミノ基供与体としてラセミ体のアミノ化合物の場合は、一方の立体が上記の濃度となるように使用することもできる。
【０１０４】
（反応ｐＨ）
本発明のポリペプチドの至適ｐＨは、下限は、好ましくはｐＨ４．０以上であり、より好ましくはｐＨ５．０以上である。上限は、好ましくはｐＨ１０．０以下であり、より好ましくはｐＨ９．０以下であることが望ましい。
複数のポリペプチドを共役させる場合には、使用する全てのポリペプチドが安定的かつ高活性に作用するｐＨを選択することが好ましい。
【０１０５】
（反応温度）
本発明のポリペプチドの反応温度は、至適温度および熱安定性の観点から、好ましくは２５℃以上、より好ましくは３０℃以上、さらに好ましくは３５℃以上、４０℃以上、４５℃以上であり、また、好ましくは８０℃以下、より好ましくは７０℃以下、さらに好ましくは６０℃以下である。
複数のポリペプチドを共役させる場合には、使用する全てのポリペプチドが安定的かつ高活性に作用する反応温度を選択することが好ましい
【０１０６】
（溶媒）
反応溶媒は、通常、イオン交換水、緩衝液等の水性媒体を使用するが、有機溶媒を含んだ系でも反応を行なうことができる。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２―プロパノール、１−ブタノール等のアルコール系溶媒、ペンタン、ヘキサン等の脂肪族炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒、塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒、その他、アセトニトリル等を適宜使用できる。
【０１０７】
（２相系）
必要に応じて、上記の有機溶媒を水への溶解度以上に加えて２相系で反応を行なうこともできる。有機溶媒を反応系に共存させることで、選択率、変換率、収率などが向上する場合も多い。
【０１０８】
（反応時間）
反応は、通常、１時間〜１週間、好ましくは１〜７２時間であり、そのような時間で反応が終了する反応条件を選択することが好ましい。
【０１０９】
（抽出精製）
上記の反応により、光学活性アミノ化合物が生成する。生成した光学活性アミノ化合物は、反応混合液から抽出、蒸留、再結晶、カラム分離など公知の方法によって単離することができる。
【０１１０】
例えば、ｐＨを酸性に調整後、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類；ヘキサン、オクタン、ベンゼン等の炭化水素類；塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素等一般的な溶媒により、生成した光学活性アミノ化合物を水相に残したまま、未反応の基質およびアミノ基転移反応により生じたアミノ基供与体に対応するケトン化合物を選択的に除くことができる。
【０１１１】
生成した光学活性アミノ化合物および未反応のアミノ基供与体は、例えば、ｐＨを塩基性に調節し、同様に一般的な有機溶媒で抽出することができる。生成した光学活性アミノ化合物と未反応のアミノ基供与体は、例えば、蒸留により分離することができる。
【０１１２】
（製造方法ＩＩ）
次に本発明の製造方法ＩＩについて説明する。
本製造方法は、アミノ化合物のエナンチオマー混合物に、アミノ基受容体の存在下、本発明のポリペプチドあるいは該ポリペプチド生産能を持つ形質転換体の培養物を作用させる光学活性アミノ化合物の製造方法である。
【０１１３】
本製造方法は、例えば、一般式（３）：
【化７】
2012124639.tif 000008
で表わされるアミノ化合物のエナンチオマー混合物に、アミノ基受容体の存在下、本発明のポリペプチドあるいは該ポリペプチド生産能を持つ微生物の培養物を作用させることにより、一般式（４）：
【化８】
2012124639.tif 000009
で表わされる光学活性アミノ化合物を得ることができる。
【０１１４】
前記式（３）および（４）におけるＲ１、Ｒ２は、前記式（１）および（２）におけるＲ１、Ｒ２と同じである。
【０１１５】
上記光学活性アミノ化合物の具体的な化合物としては、例えば、１−アミノテトラリン、２−アミノテトラリン、５−メトキシ−２−アミノテトラリン、６−メトキシ−２−アミノテトラリン、７−メトキシ−２−アミノテトラリン、８−メトキシ−２−アミノテトラリン、１−ベンジルー３−アミノピロリジン、１−Ｂｏｃー３−アミノピロリジン、１−Ｃｂｚー３−アミノピロリジン、１−ベンジルー３−アミノピペリジン、１−Ｂｏｃー３−アミノピペリジン、１−Ｃｂｚー３−アミノピペリジン、１−フェネチルアミン、３，４−ジメトキシアンフェタミン、などが挙げられる。
【０１１６】
（アミノ基受容体）
本方法においては、ケトン化合物をアミノ基受容体として用いる。
【０１１７】
ケトン化合物としては、アミノ基受容体としての活性があればいかなるものでもよいが、好ましくは、ピルビン酸あるいはグリオキシル酸である。
【０１１８】
製造方法ＩＩにおいては、アミノ化合物のエナンチオマー混合物に、上記アミノ基受容体の存在下、本発明のポリペプチドあるいは該ポリペプチドの生産能を有する形質転換体の培養物を作用させる。
【０１１９】
ここで、アミノ化合物のエナンチオマー混合物とは、エナンチオマーとその鏡像体の混合物をいう。通常は、ラセミ体が安価で入手しやすいため、ラセミ体を用いることが好ましい。ただし、ラセミ体に限定されず、例えば、エナンチオマーが鏡像体よりも若干過剰に含まれる混合物を用いて、製造方法ＩＩにより、その光学純度を高めることも好ましく行ない得る。
【０１２０】
なお、培養物の意味するところは、前述の製造方法Ｉの場合と同様である。
【０１２１】
また、アミノ化合物の濃度は、反応液組成中、０．１〜８０重量％、好ましくは１〜５０重量％である。アミノ基受容体の濃度は、アミノ化合物に対し、３０〜１００モル％、好ましくは５０〜６０モル％で用いることが好ましい。反応ｐＨ、反応温度、反応溶媒は製造方法Ｉと同様の条件が用いられ得る。
【０１２２】
上記の反応により、光学活性アミノ化合物が生成する。生成した光学活性アミノ化合物は、製造方法Ｉと同様の方法で反応混合液から単離することができる。
【実施例】
【０１２３】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。
【実施例１】
【０１２４】
変異酵素ライブラリーの作製
ＷＯ２００６／１２６４９８Ａ１記載のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＫＮＫ０８−１８株由来のアミノ基転移酵素（ＭＴＡ）遺伝子を含むプラスミドｐＮＴＭＴＡをテンプレートに、プライマー１：5’-TGGAGTGGCCATATGAACAGCAACAACAAAGC-3’ （配列表の配列番号３）およびプライマー２：5’-TGGTCAGCGAATTCTTACCAGGGGTTGGCAACG-3’ （配列表の配列番号４）を用いてエラープローンＰＣＲ法（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １，  １１−１５，  １９８９）を用いて、ＭＴＡ遺伝子にランダムな変異を導入したＤＮＡ増幅断片を得た。【０１２５】
この増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化したのち、同酵素で処理した高発現ベクターｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）に組み込み、複数の変異酵素発現プラスミド混合物を得た。このプラスミド混合物を用いて大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢプレート培地に塗布した。生育したコロニーは変異導入されたＭＴＡ遺伝子を有する組み換え大腸菌であり、この組み換え大腸菌群を変異酵素ライブラリーとした。
【実施例２】
【０１２６】
（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン耐性の向上した改変型アミノ基転移酵素の選抜(1)
実施例１で作製した変異酵素ライブラリーを１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢプレート培地に画線し、生育した大腸菌を、（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン塩酸塩を４％含むＬＢプレート培地に植菌した。アミノ基転移酵素活性を保持する株は不安定な化合物である７−メトキシ−２−テトラロンを生成し、黒色に変色する。プレートに植菌後、３７℃で１晩インキュベートしたところ、野生型酵素は酵素活性を失い変色しなかったが、変異酵素ライブラリーではいくつかの株で着色が見られ、これらの株の持つ改変型酵素は野生型より高い（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン耐性を保持していると考えられた。これらの株は、２００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２ｘＹＴ培地に植菌し、得られた菌体からプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドはＤＮＡ配列を調べることで、改変型のアミノ酸配列を決定した。表１にその結果を示す。【０１２７】
【表１】
2012124639.tif 000010
【実施例３】
【０１２８】
立体選択性の向上した改変型アミノ基転移酵素の選抜(1)：７−メトキシ−２−テトラロンに対する立体選択性(３０℃、ＰＥＡ法)
実施例２で得た組み換え大腸菌を、２００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５ｍＬの２ｘＹＴ培地に植菌し、３０℃で２８時間振とう培養した。得られた培養液５００μＬに１ｍＭピリドキサルリン酸を含む０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）５００μＬを加え、超音波破砕により無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液１００μＬを下記組成を有する基質溶液３０５μＬに添加し、３０℃で１時間反応させたのち、６規定の塩酸を５０μＬ添加して反応を停止させた。生成した（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンの光学純度を下記条件のHPLCで測定した。その結果、表２に示す改変型酵素の立体選択性が野生型より向上していた。
［基質溶液組成］
（Ｓ）−１−フェネチルアミン      ２１ｍＭ
リン酸カリウム（ｐＨ７．５）      ０．１Ｍ
７−メトキシ−２−テトラロン      １４ｍＭ
［高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による測定条件］
カラム：Ｃｒｏｗｎｐａｋ  ＣＲ（＋）（ダイセル化学工業社製）
溶離液：過塩素酸水溶液（ｐＨ１．５）／メタノール＝８５／１５（体積比）
流速：１ｍＬ／分
検出：２２０ｎｍ
カラム温度：４７℃【０１２９】
【表２】
2012124639.tif 000011
【実施例４】
【０１３０】
（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン耐性の向上した改変型アミノ基転移酵素の選抜(2)（６％）
実施例３と同様の方法で各変異株の培養液を得た。培養液５ｍＬを遠心分離し、得られた菌体に０．５ｍＭのピリドキサルリン酸を含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.5）を１ｍＬ加え、超音波破砕により無細胞抽出液を得た。【０１３１】
試験管に、この無細胞抽出液５０μＬ、（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン塩酸塩の10％水溶液600μＬ、0.46M ピルビン酸ナトリウム水溶液(pH 7.5)１００μＬ、１M MOPS緩衝液(pH7.5) 50μＬ、50mM PLP水溶液（pH7.5） 10μＬ、水 190μＬを加え、アルゴンガスを注入後密栓し、３０℃で４時間、スターラーで攪拌した。２００μＬをサンプリングし、0.6規定の塩酸を５０μＬ添加して反応を停止させ、生成した７−メトキシ−２−テトラロンの濃度を下記条件のHPLCで測定し、活性を決定した。その結果、表３に示す改変型酵素は残存活性が野生型酵素より高く、（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンに対する耐性が野生型より向上していた。
［高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による測定条件］
＜定量分析＞
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ８−ＭＳ（ナカライテスク社製）
溶離液：３０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル／メタノール＝４／１／１（体積比）
流速：０．９ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ【０１３２】
【表３】
2012124639.tif 000012
【実施例５】
【０１３３】
（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン耐性の向上した改変型アミノ基転移酵素の選抜(3)（0.9％）
実施例２と同様の方法で各変異株の培養液を得た。培養液８ｍＬを遠心分離し、得られた菌体に０．５ｍＭのピリドキサルリン酸を含む３０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．１）を１ｍＬ加え、超音波破砕により無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液１００μＬに（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン塩酸塩を１％含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．３）を９００μＬ加えて３５℃でインキュベートした。反応０時間と２０時間で１００μＬずつサンプリングし、それを０．１Ｍのリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．５）で２００倍に希釈した。それぞれの希釈液２００μＬを下記組成を有する基質溶液８００μＬに添加し、３０℃で１時間反応させたのち、６規定の塩酸を５０μＬ添加して反応を停止させた。生成したアセトフェノンの濃度を実施例４と同条件のHPLCで測定した。反応０時間を１００％としたときの反応２０時間の残存活性を下表に示す。表４に示す改変型酵素の（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンに対する耐性が野生型より向上していた。
［基質溶液組成］
（Ｓ）−１−フェネチルアミン      ２５ｍＭ
ピルビン酸ナトリウム              ２５ｍＭ
ピリドキサルリン酸                ２．５ｍＭ
Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）            ０．１Ｍ【０１３４】
【表４】
2012124639.tif 000013
【実施例６】
【０１３５】
活性の向上した改変型アミノ基転移酵素の選抜(1)(３０℃、ＰＥＡ法)
実施例２と同様の方法で各変異株の無細胞抽出液を得た。試験管に、この無細胞抽出液５０μＬ、１ｍＭのピリドキサルリン酸を含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１５０μＬ、４２ｍＭの（Ｓ）−１−フェネチルアミンを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）２００μＬ、７−メトキシ−２−テトラロンを２０％含むDMSO溶液5μＬを加え、アルゴンガスを注入後密栓し、３０℃で１時間、スターラーで攪拌した。６規定の塩酸を５０μＬ添加して反応を停止させ、生成した（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンの濃度を実施例４と同様の方法で高速液体クロマトグラフィーで測定し、活性を決定した。その結果、表５に示す改変型酵素の活性が野生型より向上していた。【０１３６】
【表５】
2012124639.tif 000014
【実施例７】
【０１３７】
生成物（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンの拮抗阻害が改善した改変型アミノ基転移酵素の選抜(1)(３０℃、ＰＥＡ法)
実施例２と同様の方法で各変異株の培養液を得た。培養液５ｍＬを遠心分離し、得られた菌体に０．５ｍＭのピリドキサルリン酸を含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.5）を１ｍＬ加え、超音波破砕により無細胞抽出液を得た。試験管に、この無細胞抽出液１００μＬ、（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン塩酸塩の10％水溶液600μＬ、1.13M （Ｓ）−１−フェネチルアミン水溶液(pH 7.5)100μＬ、１M MOPS緩衝液(pH7.5) 50μＬ、50mM PLP水溶液（pH7.5） 10μＬ、７−メトキシ−２−テトラロン 10mg、水 130μＬを加え、アルゴンガスを注入後密栓し、３０℃で１時間、スターラーで攪拌した。２００μＬをサンプリングし、0.6規定の塩酸を５０μＬ添加して反応を停止させ、生成したアセトフェノンの濃度を実施例４と同条件のHPLCで測定し、活性を決定した。その結果、表６に示す改変型酵素が野生型酵素に比べて生成物（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンによる拮抗阻害が緩和されていた。【０１３８】
【表６】
2012124639.tif 000015
【実施例８】
【０１３９】
耐熱性の向上した改変型アミノ基転移酵素の選抜(1)
実施例１で作製したプラスミド混合物を用いて大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢプレート培地に塗布した。生育したコロニーを滅菌したろ紙に吸着させた。このろ紙を７５℃の温水中で５分間加熱した後、室温まで冷却した。このろ紙に下記組成を有する反応溶液に浸し、３７℃で５時間反応させ、着色の見られた株は、元のLBプレートの対応するコロニーから取得した。これらの株をLB培地で培養し、抽出したプラスミドのＤＮＡ配列を調べることで、改変型のアミノ酸配列を決定した。その結果、表７に示す変異を持つ改変型酵素は耐熱性が野生型酵素より向上していた。
［基質溶液組成］
（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン      ５６ｍＭ
ピルビン酸ナトリウム                            ８４ｍＭ
リン酸カリウム（ｐＨ７．５）                    ０．１Ｍ【０１４０】
【表７】
2012124639.tif 000016
【実施例９】
【０１４１】
耐熱性の向上した改変型アミノ基転移酵素の選抜(2)
実施例８で得た組み換え大腸菌を、２００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５ｍＬの２ｘＹＴ培地に植菌し、３０℃で２８時間振とう培養した。得られた培養液１mＬから遠心分離により菌体を得た。この菌体に０．５ｍＭピリドキサルリン酸を含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬを加え、超音波破砕により無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液５００μＬを７５℃で３０分間インキュベートした後、４℃に冷却した。この加熱処理した無細胞抽出液と加熱処理をしていないものの活性を実施例５と同様の方法で測定し、酵素の加熱処理による活性残存率を決定した。その結果、表８に示す改変型酵素の耐熱性が野生型より向上していた。【０１４２】
【表８】
2012124639.tif 000017
【実施例１０】
【０１４３】
多重変異改変型アミノ基転移酵素の作製(1)
実施例２で取得したプラスミドpNTMTAm04を鋳型として、プライマー２：5’-TGGTCAGCGAATTCTTACCAGGGGTTGGCAACG-3’ （配列表の配列番号４）とプライマー３：5’-GAAGAGCTGGCGTACTGTTCGTTGTTTCCCGGC-3’（配列表の配列番号５）、および、プライマー１：5’-TGGAGTGGCCATATGAACAGCAACAACAAAGC-3’ （配列表の配列番号３）とプライマー４：5’-GCCGGGAAACAACGAACAGTACGCCAGCTCTTC-3’（配列表の配列番号６）を用いてそれぞれPCRを行ないDNA増幅断片を得た。得られたDNA増幅断片を混合し、これを鋳型として、プライマー１、プライマー２を用いてＰＣＲを行い、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうちY84CおよびT420Sのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡを得た。この増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化したのち、同酵素で処理したプラスミドベクターｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）に組み込み、Ｅ.  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Y84C/T420Sのアミノ酸置換を有する改変型酵素を発現する組み換え大腸菌を作成した。
【実施例１１】
【０１４４】
活性の向上した改変型アミノ基転移酵素の選抜(2)多重変異
実施例１０で得られた組み換え大腸菌の活性を、実施例６と同様の方法で測定した。その結果、表９に示すように、Y８４CとT420Sの２重変異酵素は単独変異酵素に比べて高い活性を示した。【０１４５】
【表９】
2012124639.tif 000018
【実施例１２】
【０１４６】
４２０番残基改変酵素の作製
ＷＯ２００６／１２６４９８Ａ１記載のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＫＮＫ０８−１８株由来のＭＴＡ遺伝子を含むプラスミドｐＮＴＭＴＡを鋳型に、実施例１０と同様の方法でMTAの４２０番残基を改変した酵素をコードするDNAを含むプラスミドを得た。使用したプライマーのうち、各プラスミド作製時に共通で使用するプライマー１、プライマー２以外のものを以下に示す。
T420F  プライマー5   ５’−CGGAGTGATGATTCGTTTTATCGTCAACAAGCTG−３’
（配列表の配列番号7）
プライマー6    ５’−CAGCTTGTTGACGATAAAACGAATCATCACTCCG−３’ （配列表の配列番号8）   
T420L  プライマー7   ５’−CGGAGTGATGATTCGTCTGATCGTCAACAAGCTG−３’
（配列表の配列番号9）
プライマー8    ５’−CAGCTTGTTGACGATCAGACGAATCATCACTCCG−３’ （配列表の配列番号10）  
T420I  プライマー9   ５’−CGGAGTGATGATTCGTATTATCGTCAACAAGCTG−３’
（配列表の配列番号11）
プライマー10   ５’−CAGCTTGTTGACGATAATACGAATCATCACTCCG−３’ （配列表の配列番号12）
T420M  プライマー11  ５’−CGGAGTGATGATTCGTATGATCGTCAACAAGCTG−３’
（配列表の配列番号13）
プライマー12   ５’−CAGCTTGTTGACGATCATACGAATCATCACTCCG−３’ （配列表の配列番号14）  
T420V  プライマー13  ５’−CGGAGTGATGATTCGTGTGATCGTCAACAAGCTG−３’
（配列表の配列番号15）
プライマー14   ５’−CAGCTTGTTGACGATCACACGAATCATCACTCCG−３’ （配列表の配列番号16）
T420A  プライマー15  ５’−CGGAGTGATGATTCGTGCGATCGTCAACAAGCTG−３’
（配列表の配列番号17）
プライマー16   ５’−CAGCTTGTTGACGATCGCACGAATCATCACTCCG−３’ （配列表の配列番号18）
T420Y  プライマー17  ５’−CGGAGTGATGATTCGTTATATCGTCAACAAGCTG−３’
（配列表の配列番号19）
プライマー18   ５’−CAGCTTGTTGACGATATAACGAATCATCACTCCG−３’ （配列表の配列番号20）
T420H  プライマー19  ５’−CGGAGTGATGATTCGTCATATCGTCAACAAGCTG−３’
（配列表の配列番号21）
プライマー20   ５’−CAGCTTGTTGACGATATGACGAATCATCACTCCG−３’ （配列表の配列番号22）
T420Q  プライマー21  ５’−CGGAGTGATGATTCGTCAGATCGTCAACAAGCTG−３’
（配列表の配列番号23）
プライマー22   ５’−CAGCTTGTTGACGATCTGACGAATCATCACTCCG−３’ （配列表の配列番号24）
T420N  プライマー23  ５’−CGGAGTGATGATTCGTAACATCGTCAACAAGCTG−３’
（配列表の配列番号25）
プライマー24   ５’−CAGCTTGTTGACGATGTTACGAATCATCACTCCG−３’ （配列表の配列番号26）
T420K  プライマー25  ５’−CGGAGTGATGATTCGTAAAATCGTCAACAAGCTG−３’
（配列表の配列番号27）
プライマー26   ５’−CAGCTTGTTGACGATTTTACGAATCATCACTCCG−３’ （配列表の配列番号28）
T420D  プライマー27  ５’−CGGAGTGATGATTCGTGATATCGTCAACAAGCTG−３’
（配列表の配列番号29）
プライマー28   ５’−CAGCTTGTTGACGATATCACGAATCATCACTCCG−３’ （配列表の配列番号30）
T420E  プライマー29  ５’−CGGAGTGATGATTCGTGAAATCGTCAACAAGCTG−３’
（配列表の配列番号31）
プライマー30   ５’−CAGCTTGTTGACGATTTCACGAATCATCACTCCG−３’ （配列表の配列番号32）
T420W  プライマー31  ５’−CGGAGTGATGATTCGTTGGATCGTCAACAAGCTG−３’
（配列表の配列番号33）
プライマー32   ５’−CAGCTTGTTGACGATCCAACGAATCATCACTCCG−３’ （配列表の配列番号34）
T420R  プライマー33  ５’−CGGAGTGATGATTCGTCGCATCGTCAACAAGCTG−３’
（配列表の配列番号35）
プライマー34   ５’−CAGCTTGTTGACGATGCGACGAATCATCACTCCG−３’ （配列表の配列番号36）
T420S  プライマー35  ５’−CGGAGTGATGATTCGTAGCATCGTCAACAAGCTG−３’
（配列表の配列番号37）
プライマー36   ５’−CAGCTTGTTGACGATGCTACGAATCATCACTCCG−３’ （配列表の配列番号38）【０１４７】
WO2007/139255に記載のｐNTTAPAGを制限酵素SacI、およびSphIで消化することにより得られるペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）ＪＣＭ８７９７株由来Ｌ−乳酸脱水素酵素ＰＡＬＤＨ、及び、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素GDHの両構造遺伝子が繋がった二本鎖DNAを、本検討で得られた４２０番残基を改変した酵素を発現する各プラスミドのSacI切断点とSphI切断点の間に挿入し、pNTTAm04-01〜pNTTAm04-17を得た。得られたプラスミドを用いてＥ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、４２０番残基を改変した酵素、PALDH、および、GDHを共発現する各組み換え大腸菌を取得した。
【実施例１３】
【０１４８】
立体選択性の向上した改変型アミノ基転移酵素の選抜(2)：４２０番残基改変酵素の評価(３５℃、アラニン法)
実施例１２で得られた４２０番残基を改変した酵素とPALDH、および、GDHを共発現する各組み換え大腸菌を２００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５ｍＬの２ｘＹＴ培地に植菌し、３０℃で２８時間振とう培養した。培養液２ｍＬを遠心分離し、得られた菌体に０．５ｍＭのピリドキサルリン酸を含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を１ｍＬ加え、超音波破砕により無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液２５０μＬに下記組成を有する基質溶液２５０μＬを添加し、３５℃で１．５時間反応させたのち、６規定の塩酸を５０μＬ添加して反応を停止させた。生成した（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンの光学純度を実施例２と同条件のHPLCで測定した。その結果、表１０に示す改変型酵素の立体選択性が野生型より向上していた。
［基質溶液組成］
リン酸カリウム（ｐＨ６．８）      ０．２Ｍ
Ｌ−アラニン                      １．１２Ｍ
Ｄ−グルコース                    ３４０ｍＭ
ＮＡＤＨ                          ０．２ｍＭ
ピリドキサルリン酸                ０．８ｍＭ
７−メトキシ−２−テトラロン      ２２８ｍＭ【０１４９】
【表１０】
2012124639.tif 000019
【実施例１４】
【０１５０】
多重変異改変型アミノ基転移酵素の作製(2)（３酵素菌）
実施例２で得られた改変酵素を発現するプラスミドｐＮＴＭＴＡm12(M17I)、および、pNTMTAm19（M161T）を鋳型に実施例10と同様の方法で多重変異を導入したプラスミドを構築した。得られたプラスミドに実施例１２と同様の方法でＰＡＬＤＨ遺伝子及びＧＤＨ遺伝子を挿入し、表１１に示すプラスミドを構築した。得られたプラスミドを用いてＥ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、改変酵素、PALDH、および、GDHを共発現する各組み換え大腸菌を取得した。【０１５１】
【表１１】
2012124639.tif 000020
【０１５２】
改変酵素作製に使用したプライマーのうち、各プラスミド作製時に共通で使用するプライマー１、プライマー２以外のものを以下に示す。
T420H  プライマー19  ５’−CGGAGTGATGATTCGTCATATCGTCAACAAGCTG−３’
（配列表の配列番号21）
プライマー20   ５’−CAGCTTGTTGACGATATGACGAATCATCACTCCG−３’ （配列表の配列番号22）
M17I  プライマー37   ５’−GCACAACACGGTGCACATTATGCATCCGATGC−３’ （配列表の配列番号39）
プライマー38   ５’−GCATCGGATGCATAATGTGCACCGTGTTGTGC−３’ （配列表の配列番号40）
M161T  プライマー39  ５’−GAACTTCGGTGGCACGTCCGCCTGTGGCG−３’ （配列表の配列番号41）
プライマー40   ５’−CGCCACAGGCGGACGTGCCACCGAAGTTC−３’ （配列表の配列番号42）
【実施例１５】
【０１５３】
（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン耐性の向上した改変型アミノ基転移酵素の選抜(3)（多重変異0.9％、４５℃）
実施例１４で得られた組み換え大腸菌について、実施例１３と同様の方法で培養液を得た。培養液８ｍＬを遠心分離し、得られた菌体に０．５ｍＭのピリドキサルリン酸を含む３０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．１）を１ｍＬ加え、超音波破砕により無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液１００μＬに（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン塩酸塩を１％含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．３）を９００μＬ加えて４５℃でインキュベートした。反応０時間と２０時間で１００μＬずつサンプリングし、それを０．１Ｍのリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．５）で２００倍に希釈した。それぞれの希釈液２００μＬを下記組成を有する基質溶液８００μＬに添加し、３０℃で１時間反応させたのち、６規定の塩酸を５０μＬ添加して反応を停止させた。生成したアセトフェノンの濃度を実施例４と同条件のHPLCで測定した。反応０時間を１００％としたときの反応２０時間の残存活性を表１２に示す。下表の改変型酵素の（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンに対する耐性が野生型より向上していた。
［基質溶液組成］
（Ｓ）−１−フェネチルアミン      ２５ｍＭ
ピルビン酸ナトリウム              ２５ｍＭ
ピリドキサルリン酸                ２．５ｍＭ
Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）            ０．１Ｍ【０１５４】
【表１２】
2012124639.tif 000021
【実施例１６】
【０１５５】
立体選択性の向上した改変型アミノ基転移酵素の選抜(3)：（多重変異、４５℃、ALA法）
実施例１４で得られた組み換え大腸菌について、実施例１３と同条件で改変型酵素の立体選択性を調べた。その結果、表１３に示す改変型酵素の立体選択性が野生型より向上していた。【０１５６】
【表１３】
2012124639.tif 000022
【実施例１７】
【０１５７】
N-ベンジル−３−ピロリジノンに対する立体選択性(３０℃、アラニン法)
実施例１４で得られた組み換え大腸菌について、N-ベンジル−３−ピロリジノンに対する立体選択性を調べた。実施例１３と同様の方法で得られた無細胞抽出液２５０μＬに下記組成を有する基質溶液２５０μＬを添加し、３０℃で１．５時間反応させたのち、６規定の塩酸を５０μＬ添加して反応を停止させた。生成した（Ｓ）−N-ベンジル−３−アミノピロリジンの光学純度は以下の分析条件で測定した。その結果、表１４に示す変異型酵素が野生型酵素に比べてN-ベンジル−３−ピロリジノンに対する立体選択性が向上していた。
［基質溶液組成］
リン酸カリウム（ｐＨ６．８）      ０．２Ｍ
Ｌ−アラニン                      １．１２Ｍ
Ｄ−グルコース                    ３４０ｍＭ
ＮＡＤＨ                          ０．２ｍＭ
ピリドキサルリン酸                ０．８ｍＭ
N-ベンジル−３−ピロリジノン      ２２８ｍＭ
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による光学純度測定条件］
反応液を適量の炭酸ナトリウムで塩基性にしたのち、ジニトロベンゾイルクロライドで誘導体化した後、以下の条件で分析した。
カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＩＡ（ダイセル化学工業社製）
溶離液：ヘキサン／エタノール／ジエチルアミン／アセトニトリル＝８００／２００／１／５（体積比）
流速：０．８ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：３０℃【０１５８】
【表１４】
2012124639.tif 000023
【実施例１８】
【０１５９】
（Ｓ）−N-ベンジル−３−アミノピロリジンに対する安定性(３０℃、アラニン法)
実施例１４で得られた組み換え大腸菌について、（S）-N-ベンジルー３−アミノピロリジノンに対する耐性について調べた。実施例１３と同様の方法で多重変異株の無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液１００μＬに（S）-N-ベンジルー３−アミノピロリジノンを0.83％含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．３）を９００μＬ加えて３５℃でインキュベートした。反応０時間と2.5時間で１００μＬずつサンプリングし、それを０．１Ｍのリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．５）で２００倍に希釈した。それぞれの希釈液２００μＬを下記組成を有する基質溶液８００μＬに添加し、３０℃で１時間反応させたのち、６規定の塩酸を５０μＬ添加して反応を停止させた。生成したアセトフェノンの濃度を実施例４と同条件のHPLCで測定した。反応０時間を１００％としたときの反応2.5時間の残存活性を表１５に示す。その結果、表１５に示す変異型酵素が野生型酵素に比べて（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンに対する耐性が向上していた。【０１６０】
【表１５】
2012124639.tif 000024
【実施例１９】
【０１６１】
３５℃、ＷＴ（野生型）とＭ１６１Ｔ
あらかじめ基質である７−メトキシ−２−テトラロン１．６ｇと、Ｌ−アラニン４．８５ｇ、Ｄ−グルコース２．４５ｇ、ＮＡＤ６．５ｍｇ、ピリドキサルリン酸６０．２ｍｇを入れた１００ｍＬ容の３つ口フラスコに、実施例１８で得られた野生型酵素あるいはM161Tのブロス４０ｍＬを加えて、３規定のＮａＯＨでｐＨ５．７に調製しながら、アルゴン置換下、３５℃において、４６時間攪拌しながら反応を行なった。反応終了後、反応液中に生成した７−メトキシ−２−テトラリンを以下のHPLCで分析した。その結果、野生型酵素は変換率３５％で反応が停止していたが、Ｍ１６１Ｔでは変換率９０％に達していた。このとき生成した（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンの光学純度は前者が９６．７％ｅｅ、後者が９７．４％ｅ．ｅ．であった。また、残存するアミノ基転移酵素の活性は前者が１１％であったのに対し、後者は３５％であった。
［高速液体クロマトグラフィーによる測定条件］
＜定量分析＞
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ８−ＭＳ（ナカライテスク社製）
溶離液：３０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル／メタノール＝４／１／１（体積比）
流速：０．９ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
＜光学純度分析＞
カラム：Ｃｒｏｗｎｐａｋ  ＣＲ（＋）（ダイセル化学工業社製）
溶離液：過塩素酸水溶液（ｐＨ１．５）／メタノール＝８５／１５（体積比）
流速：０．９ｍＬ／分
検出：２２０ｎｍ
カラム温度：４７℃
【実施例２０】
【０１６２】
４５℃、５％仕込み、ＷＴとＭ１６１Ｔ
あらかじめ基質である７−メトキシ−２−テトラロン２．０ｇと、Ｌ−アラニン６．０７ｇ、Ｄ−グルコース３．０７ｇ、ＮＡＤ８．１４ｍｇ、ピリドキサルリン酸７５．２ｍｇを入れた１００ｍＬ容の３つ口フラスコに実施例１８で得られた野生型酵素あるいはM161Tのブロス４０ｍＬを加えて、３規定のＮａＯＨでｐＨ６．２に調製しながら、アルゴン置換下で、４５℃で、攪拌しながら反応を行なった。反応２４時間後、反応液を以下のHPLCで分析した。その結果、野生型は変換率８５％で反応が停止していたが、Ｍ１６１Ｔでは変換率９６％に達していた。このとき生成した（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンの光学純度は９４．２％ｅ．ｅ．および９６．２％ｅｅであった。また、残存するアミノ基転移酵素の活性は前者が２０％であったのに対し、後者は４０％であった。
［高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による測定条件］
＜定量分析＞
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ８−ＭＳ（ナカライテスク社製）
溶離液：３０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル／メタノール＝４／１／１（体積比）
流速：０．９ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
＜光学純度分析＞
カラム：Ｃｒｏｗｎｐａｋ  ＣＲ（＋）（ダイセル化学工業社製）
溶離液：過塩素酸水溶液（ｐＨ１．５）／メタノール＝８５／１５（体積比）
流速：０．９ｍＬ／分
検出：２２０ｎｍ
カラム温度：４７℃
【配列表】
2012124639000001.app
【国際調査報告】
2012124639.tif 000029
2012124639.tif 000030
2012124639.tif 000031
2012124639.tif 000032
2012124639.tif 000033