(57)【要約】  要約  課題  実際の作物生産現場において安定的な根頭がんしゅ病防除効果や植物種子発芽率向上効果を発揮し、生物農薬等として使用可能な非病原性菌を提供する。  解決手段  本発明は、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ−１菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２６）、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ−２菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２７）、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ−３菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２８）である。また、これら３菌株よりなる群より選ばれる１又は２以上の菌体および／または菌体の培養物を有効成分として含有することを特徴とする根頭がんしゅ病防除剤、及び／又は、植物種子発芽率向上剤である。さらには、本剤を植物あるいは植物種子に接触させるステップを含んでなる、根頭がんしゅ病防除方法及び／又は植物種子発芽率向上方法である。  選択図  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ−１菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２６）。
【請求項２】
リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ−２菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２７）。
【請求項３】
リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ−３菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２８）。
【請求項４】
請求項１に記載のＡＲＫ−１菌株、請求項２に記載のＡＲＫ−２菌株及び請求項３に記載のＡＲＫ−３菌株よりなる群より選ばれる１又は２以上の菌体および／または菌体の培養物を有効成分として含有することを特徴とする根頭がんしゅ病防除剤。
【請求項５】
請求項４に記載の根頭がんしゅ病防除剤を植物に接触させるステップを含んでなる、根頭がんしゅ病防除方法。
【請求項６】
請求項１に記載のＡＲＫ−１菌株、請求項２に記載のＡＲＫ−２菌株及び請求項３に記載のＡＲＫ−３菌株よりなる群より選ばれる１又は２以上の菌体および／または菌体の培養物を有効成分として含有することを特徴とする植物種子発芽率向上剤。
【請求項７】
請求項６に記載の植物種子発芽率向上剤を植物種子に接触させるステップを含んでなる、植物種子発芽率向上方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新菌株、該新菌株を有効成分とする根頭がんしゅ病防除剤及び／又は植物種子発芽率向上剤、該新菌株を用いた根頭がんしゅ病防除方法及び／又は植物種子発芽率向上方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
根頭がんしゅ病は、主に土壌中に生息する細菌である病原性リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）（異名：アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））、リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）（異名：アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ））、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）（異名：アグロバクテリウム・ヴィティス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ））（以下、これらリゾビウム・ラジオバクター、リゾビウム・リゾゲネス及びリゾビウム・ヴィティスを総称して、根頭がんしゅ病菌という。）が、木本・草本の双子葉植物に感染し、「根頭がんしゅ」と呼ばれるがんしゅ（癌腫）を形成することにより、植物体を衰弱・枯死させる植物病の一種である。この根頭がんしゅ病は、日本国内においては、主に果樹や花卉に発生していることから、特に、果樹および花卉の農業生産現場や公園等の桜管理にとって、深刻な被害をもたらす植物病である。【０００３】
根頭がんしゅ病では、病原性リゾビウム・ラジオバクター、リゾビウム・リゾゲネス及びリゾビウム・ヴィティスのいずれもがＴｉ（ｔｕｍｏｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ）プラスミドを保有しており、かかる保有するＴｉ（ｔｕｍｏｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ）プラスミドの一部（Ｔ−ＤＮＡ領域）が、植物細胞核ＤＮＡに形質転換されることにより腫瘍化が誘導される。一度腫瘍が形成されると、根頭がんしゅ病菌を除去しても腫瘍は増殖を続け、植物の衰弱・枯死を引き起こす。従って、現状の技術では、植物が根頭がんしゅ病を一度発病してしまうと、治療することは困難である。そのため、根頭がんしゅ病に関しては、植物が根頭がんしゅ病菌に感染しないように予防措置をとることが重要である。【０００４】
このような根頭がんしゅ病菌の感染に対する予防措置としては、従来、根頭がんしゅ病菌に汚染された土壌に対して、土壌全体を加熱滅菌したり、クロルピクリン剤や臭化メチル剤等の土壌殺菌剤を用いて土壌を薫蒸消毒したり、根頭がんしゅ病菌がグラム陰性であるため、グラム陰性細菌用抗生物質で当該土壌を処理したりすることがなされてきた。しかし、このような方法では、当該土壌に含まれる、根頭がんしゅ病菌以外の有用土壌細菌も殺菌・除去されてしまうので、当該土壌の土質が改悪される。このように改悪された土壌を、本来の植物栽培に適した土壌に回復させるには、有機肥料の投与等が必要である。そのため、多大な経費・労力と、多時間とを要するという問題が生じる。さらに、土壌殺菌剤を用いた土壌の薫蒸消毒では土壌殺菌剤の毒性がきわめて高く、作業者および周辺住民の健康を害する危険性がある。【０００５】
そこで、上記の方法に代わる方法として、近年、非病原性菌を生物農薬として用いる拮抗的防除方法が提案されている。特許文献１には、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）Ａ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８７９）、シュードモナス属細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）Ｂ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８８０）、シュードモナス属細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）Ｃ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８８１）、シュードモナス属細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）Ｄ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８８２）、シュードモナス・アルカリジーナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）Ｅ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８８３）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌Ｈ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８８６）、フラボバクテリア（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌Ｆ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８８４）、およびステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属細菌Ｇ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８８５）を根頭がんしゅ病に対する拮抗細菌として用いる方法が開示されている。【０００６】
非特許文献１において、ラネルア・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）ＨＸ２株を拮抗細菌として用いる方法が記載されている。
特許文献２において、非病原性アグロバクテリウム・ヴィティス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）Ｆ２／５（ｐＴ２ＴＦＸＫ）株を拮抗細菌として用いる方法が記載されている。
そして、非特許文献２において、非病原性リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）ＶＡＲ０３−１株を拮抗細菌として用いる方法が記載されている。
また、非特許文献３には、非病原性アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）Ｋ８４株を生物農薬として用いる拮抗的防除方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−３００９０３号公報
【特許文献２】米国特許第７１４１３９５号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｈｅｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｒａｐｅ  ｃｒｏｗｎ  ｇａｌｌ  ｂｙ  Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ  ＨＸ２．Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ９１：９５７−９６３（２００７）
【非特許文献２】Ｋａｗａｇｕｃｈｉ，Ａ．，Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｒａｐｅｖｉｎｅ  ｃｒｏｗｎ  ｇａｌｌ  ａｎｄ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ７５：４６２−４６３（２００９）
【非特許文献３】Ｎｉｃｈｏｌａｓ  Ｃ．ＭｃＣｌｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｒａｎｇｅ  ｏｆ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｔｒａｉｎ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ  Ｋ８４：ａ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｃｒｏｗｎ  Ｇａｌｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：３９７７−３９８２（１９９８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
拮抗微生物による根頭がんしゅ病防除手段として、上記の生物的手段が種々提案されているが、そのほとんどは研究段階に留まり、実用化されていない。
これは、これら拮抗微生物による防除手段の多くが、根頭がんしゅ病防除効果が実験室内での実験において確認されたに留まり、農業生産上最も重要な自然環境下における実際の作物生産現場での安定的な防除効果を認めた事例がほとんどないことによると考えられる。【００１０】
例えば、特許文献１において、個々の拮抗細菌株の拮抗能力には非常にばらつきがあり、これら拮抗細菌の混合培養物を用いる方法は、実用段階で培養物の性質および品質を安定的に保つ生産方法について課題がある。また、実施例において、実験室内で防除効果を確認した植物が根頭がんしゅ病による被害が農業上全く問題となっていないタバコのみであることもまた、本技術を適用できる植物の範囲について大きな問題を残している。【００１１】
非特許文献３において、非病原性アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）Ｋ８４株は既に実用化されているが、ブドウで発生する根頭がんしゅ病には全く防除効果がないという大きな問題がある。それは、ブドウに感染する根頭がんしゅ病菌であるリゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）に対して、Ｋ８４株はまったく抗菌活性を持たないためである。ブドウは醸造用、生食用として世界的に非常に重要な果樹であり、根頭がんしゅ病はブドウに対し、深刻な被害をもたらすため、現在なお大きな農業生産上の問題を抱えている。さらにＫ８４株の抗菌活性に感受性を示さない菌株が自然界に多く存在しており、防除効果が低下する事例が既に存在している。【００１２】
非特許文献１において、ラネルア・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）ＨＸ２株はブドウ根頭がんしゅ病に対して発病を抑制する効果を示すが、ブドウ以外の植物に対する防除効果が未知であり、本技術を適用できる植物の範囲について大きな問題を残している。
これに対し、非特許文献２において、非病原性リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）ＶＡＲ０３−１株はブドウ根頭がんしゅ病だけでなく、他の植物の根頭がんしゅ病に対しても防除効果を示す事例があるが、実際の生産現場で防除効果が認められたのはブドウのみであることから、現在においてなお、実用性について課題を残している。【００１３】
特許文献２において、Ｔｒｉｆｏｌｉｔｏｘｉｎ（ＴＦＸ）という抗菌物質を合成する外来遺伝子を遺伝子組み換え技術により人工的に導入した遺伝子組み換え生物アグロバクテリウム・ヴィティスＦ２／５（ｐＴ２ＴＦＸＫ）株を作出し、根頭がんしゅ病に対する拮抗細菌として用いる方法が開示されている。しかし、実施例において、実際に多く発病する部分である根や地際の主幹部位に対する防除効果を示しておらず、また、ブドウ以外の植物についても防除効果は未知であり、実用性に乏しい。さらに、遺伝子組み換え生物を自然界で使用することには、生態系に著しい混乱を招くことが懸念される。【００１４】
そこで、本発明は、実際の作物生産現場において安定的な根頭がんしゅ病防除効果を発揮し、生物農薬として使用可能な非病原性菌を提供することを目的とする。さらには、安定的な根頭がんしゅ病防除効果を発揮するだけでなく、他の植物育種に有用な機能も併せ持った、実用性の高い高機能非病原性菌を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の本発明者らは、根頭がんしゅ病防除効果を発揮する生物農薬としての新規な非病原性菌を見いだすべく、根頭がんしゅ病の防除に有効な微生物を鋭意探索した結果、ブドウ中から分離された非病原性リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）に属する新規の菌株が、根頭がんしゅ病の防除に顕著な効果を示すことを見いだし、また実際の作物生産現場の試験でも高い防除効果を発揮すること、及び、植物種子発芽率向上効果も示すことを確認して、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明の第１の新規菌株は、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ−１菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２６）である。
そして、本発明の第２の新規菌株は、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ−２菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２７）である。
さらに、本発明の第３の新規菌株は、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ−３菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２８）である。【００１６】
本発明は、根頭がんしゅ病防除剤及び／又は植物種子発芽率向上剤も提供する。
本発明の根頭がんしゅ病防除剤及び／又は植物種子発芽率向上剤（以下、「本剤」ということもある。）は、ＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株及びＡＲＫ−３菌株よりなる群より選ばれる１又は２以上の菌体および／または菌体の培養物を有効成分として含有することを特徴とする。【００１７】
本発明は、根頭がんしゅ病防除方法及び／又は植物種子発芽率向上方法も提供する。
本発明の根頭がんしゅ病防除方法及び／又は植物種子発芽率向上方法（以下、「本方法」ということもある。）は、本剤を植物あるいは植物種子に接触させるステップを含んでなることを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＡＲＫ−１菌株による根頭がんしゅ病の発病抑制効果を示す図（図面代用写真）である。図１のＡは、病原性リゾビウム・ヴィティスＧ−Ａｇ−２７株のみをブドウ苗木に接種した結果を示し、矢印で示すようにがんしゅ形成が認められた。図１のＢは、ＡＲＫ−１菌株の菌液と病原性リゾビウム・ヴィティスＧ−Ａｇ−２７の菌液との混合物をブドウ苗木に接種した結果を示し、がんしゅの形成は認められなかった。
【図２】ＡＲＫ−１菌株による根頭がんしゅ病の発病抑制効果を示す図（図面代用写真）である。図２のＡは、汚染土壌にブドウ苗木をそのまま定植したものを６か月後に掘り起こしたブドウ苗木の写真であり、矢印で示すようにがんしゅ形成が認められた。図２のＢは、ブドウ苗木の根をあらかじめＡＲＫ−１の菌液に浸漬した後に汚染土壌に定植したものを６か月後に掘り起こしたブドウ苗木の写真であり、がんしゅ形成が認められなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の新規な菌株は、非病原性リゾビウム・ヴィティスＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株及びＡＲＫ−３菌株である（以下、これらの菌株をそれぞれ「ＡＲＫ−１菌株」、「ＡＲＫ−２菌株」及び「ＡＲＫ−３菌株」ともいう。）。
そして、本剤は、上記ＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株及びＡＲＫ−３菌株よりなる群より選ばれる１又は２以上の菌体および／または菌体の培養物を有効成分として含有することを特徴とする根頭がんしゅ病防除剤及び／又は植物種子発芽率向上剤である。
さらに、本方法は、本剤を植物あるいは植物種子に接触させるステップを含んでなる、根頭がんしゅ病防除方法及び／又は植物種子発芽率向上方法である。
【００２０】
本発明のＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株及びＡＲＫ−３菌株のいずれも、岡山県内で栽培されているブドウ（品種：ピオーネ）から分離されたものである。
【００２１】
ＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株及びＡＲＫ−３菌株のいずれも、以下に示す細菌学的性質を有する。
（ａ）形態
（１）細菌の形：桿状
（２）細菌の大きさ：０．７〜０．９×１．２〜１．７μｍ
（３）多形性：なし
（４）運動性：あり
（５）胞子の有無：なし
（６）グラム染色性：陰性
（ｂ）生育状況
ＰＳＡ平板培地（後述）での培養：コロニーは円形で大きさは直径１〜２ｍｍ、周縁形は全縁、粘性あり、光沢はあるが、培養後７日以上経過すると光沢は消失する。
（ｃ）生理学的性質
（１）３―ケトラクトースの生成：陽性
（２）リトマスミルクでの培養：リトマスを還元してアルカリ性を示す
（３）オキシダーゼ活性：陽性
（４）生長素要求性：陽性
（５）Ｄ−１培地：生育
（６）Ｒｏｙ−Ｓａｓｓｅｒ培地：生育
（７）２％ＮａＣｌ培地：生育
（８）エリトリトールの利用：陰性
（９）メレジトースの利用：陰性
（１０）エタノールの利用：陰性
（１１）酒石酸の利用：陽性
（１２）マロン酸の利用：陽性
（１３）クエン酸の利用：陽性
（１４）アルブチンの分解：陰性
（１５）アルギニンの分解：陽性
（１６）最適生育ｐＨおよび温度の範囲：ｐＨ６〜８、温度２５〜３０℃
【００２２】
以上の特徴をバージェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）およびジャーナル・オブ・システマティック・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）２００１年５１号を参照して近縁菌種を検索した結果、本菌株はリゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）の特徴と一致した。
【００２３】
遺伝学的性質は以下の如くである。ＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株、ＡＲＫ−３菌株の各菌株について１６ＳｒＲＮＡの塩基配列１４７３ベースペア（ｂｐ）を解読し、国立遺伝学研究所（ＤＤＢＪ）のホームページ上の検索サイト「ブラスト（ＢＬＡＳＴ）」で近縁菌種の相同性検索を行った結果、登録されているリゾビウム・ヴィティスの１６ＳｒＲＮＡの塩基配列と１００％一致した。
【００２４】
植物に対する病原性については以下の如くである。
ＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株、ＡＲＫ−３菌株、病原性既知のリゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）それぞれをＰＳＡ平板培地（後述）で２７℃、４８時間培養し、生じたコロニーに爪楊枝の先端を刺し入れて菌を付着させた。そして、その先端をトマト、バラ、ブドウ、リンゴ、ナシ、モモの茎に突き刺して接種し、２５℃〜３５℃のビニルハウス内で静置し、発病の有無を確認した。
その結果、病原性既知のリゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）は約９割（８９．７％）発病が確認されたが、ＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株、ＡＲＫ−３菌株のいずれも発病は見られず、ＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株、ＡＲＫ−３菌株のいずれも病原性は認められなかった。
【００２５】
以上の細菌学的性質、遺伝学的性質、植物に対する病原性の結果から、これらＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株及びＡＲＫ−３菌株を、それぞれリゾビウム・ヴィティスに属する非病原性の菌株と同定し、リゾビウム・ヴィティスＡＲＫ−１菌株（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ  ＡＲＫ−１）（発明者が付した識別のための表示：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ  ＡＲＫ−１）、リゾビウム・ヴィティスＡＲＫ−２菌株（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ  ＡＲＫ−２）（発明者が付した識別のための表示：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ  ＡＲＫ−２）、リゾビウム・ヴィティスＡＲＫ−３菌株（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ  ＡＲＫ−３）（発明者が付した識別のための表示：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ  ＡＲＫ−３）と命名した。これらＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株及びＡＲＫ−３菌株は、茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター中央第６に住所を有する独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２０１０年（平成２２年）１０月１４日付で上記名称で寄託された後、２０１１年（平成２３年）１０月３１日付けで国際寄託に移管されており、その受託番号は、ＡＲＫ−１菌株はＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２６であり、ＡＲＫ−２菌株はＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２７であり、そしてＡＲＫ−３菌株はＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２８である。
【００２６】
ＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株及びＡＲＫ−３菌株のいずれも、分離菌株の保存は、グルタミン酸ナトリウム１ｇ／Ｌ（Ｌは単位リットルを示す。以下同様。）、スキムミルク１０ｇ／Ｌ、蒸留水１０００ｍＬの分散媒に懸濁後、−８０℃で凍結し凍結物（以下、「凍結保存物」ということもある）とすることで保存できる。そして、使用にあたっては、菌株を含む凍結保存物を解凍後、ＰＳＡ（Ｐｏｔａｔｏ  ｓｕｃｒｏｓｅ  ａｇａｒ）培地（以下、ＰＳＡともいう）に植え、２５℃〜３０℃で静置培養することができる。なお、ＰＳＡは、じゃがいも３００ｇの煎汁、Ｃａ（ＣＯ３）２・４Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ２．０ｇ、ペプトン５．０ｇ、サッカロース２０ｇ及び寒天２０ｇを蒸留水１０００ｍＬに溶解させ調製できる。また、ＰＳＡはＰＳＡ試験管斜面培地又はＰＳＡ平板培地のいずれとされてもよい。
【００２７】
ＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株及びＡＲＫ−３菌株のいずれも、培養に使用することのできる培地としては、上述のＰＳＡ以外にも本菌株が増殖し得るものであれば任意のものでよい。例えば、培地に用いる炭素源としては、グルコース、サッカロース、デンプン、デンプン糖化液、糖蜜等の糖類、クエン酸等の有機酸など、窒素源としては、アンモニア、硫安、燐安、塩安、硝安等のアンモニウム塩や硝酸塩が適宜使用される。無機塩としては、リン酸、カリウム、マグネシウム、マンガン等の塩類、例えばリン酸二水素カリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄などがあげられる。また微量有機栄養素としてビタミン、アミノ酸、核酸関連物質等は菌の生育上特に必要ではないが、これらを添加したり、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粕等の有機物を添加してもよい。さらに、必要に応じて消泡剤等の種々の添加剤を添加することもできる。
【００２８】
ＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株及びＡＲＫ−３菌株のいずれも、培養は好気的条件下に、例えば通気撹拌や振盪培養法又は固体培養法等によって培養することができる。培養条件は特に限定はないが、温度は２５〜３０℃、ｐＨは６〜８、培養時間は２４〜７２時間の範囲とされてもよい。
【００２９】
以上のように培養した非病原性リゾビウム・ヴィティスＡＲＫ−１菌株、非病原性リゾビウム・ヴィティスＡＲＫ−２菌株、及び非病原性リゾビウム・ヴィティスＡＲＫ−３菌株は、それぞれ培養物から分離することなく培養物の状態で本剤の有効成分として利用することができる。また、上記培養物から、通常の方法、例えば膜分離又は遠心分離等の処理によって上記各菌体を分離し、菌体の状態で本剤の有効成分として利用することもできる。更には、上記培養物又は分離した菌体を凍結乾燥、スプレードライ等の方法によって乾燥した乾燥物の状態で本剤の有効成分として利用することもできる。又、本剤は、上記培養物または菌体そのものからなるものであってもよいが、通常、農薬製剤の慣用的な方法等に従って各種の添加物と共に各種の剤型に製剤化した状態で用いることもできる。かかる剤型としては、例えば粒剤、乳剤、水和剤、フロアブル剤等が挙げられる。
本剤は、ＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株又はＡＲＫ−３菌株をそれぞれ単独で含有するものであってもよいし、また２種以上の菌株を任意に組み合わせて含有するものであってもよい。本剤に含まれるＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株又はＡＲＫ−３菌株の割合（菌濃度）は、本剤が植物を根頭がんしゅ病から防除する効果を発揮する限り、特に制限されないが、例えば、本剤１００ｇあたり上記菌株の菌（総数）を１×１０９〜１×１０１１個の範囲で含有するものを例示することができる。
【００３０】
このように調製した非病原性リゾビウム・ヴィティスＡＲＫ−１菌株、非病原性リゾビウム・ヴィティスＡＲＫ−２菌株、非病原性リゾビウム・ヴィティスＡＲＫ−３菌株の培養物又は分離した菌体を有効成分とする本剤によれば、これを植物体（種子を含む）又は土壌に適用することにより農園芸作物を根頭がんしゅ病から防除することができ、種子発芽率向上も図ることができる。なお、本発明において「防除」とは、対象とする植物が根頭がんしゅ病菌に感染することを防止することにより、当該植物が根頭がんしゅ病に罹患しがんしゅが形成されることを回避することを意味する。
本剤は、植物にがんしゅ形成を促す病原性を有するリゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）（異名：アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））、リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）（異名：アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ））、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）（異名：アグロバクテリウム・ヴィティス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ））等の根頭がんしゅ病菌により植物に引き起こされる根頭がんしゅ病の防除に顕著な効果を示す。対象とする植物の種類は特に制限されないが、具体的にはリンゴ、バラ、スモモ、オウトウなどのバラ科植物；キクなどのキク科植物；ブドウなどのブドウ科植物；トマトなどのナス科を例示することができる。本剤のうち、ＡＲＫ−１菌株を有効成分とする本剤は上記植物のいずれに対しても高い根頭がんしゅ病防除効果を発揮する。ＡＲＫ−３菌株を有効成分とする本剤もまた、上記植物のいずれに対しても根頭がんしゅ病防除効果を発揮する。ＡＲＫ−２菌株を有効成分とする本剤は、上記植物のうち、特にバラ、ブドウ及びトマトに対して根頭がんしゅ病防除効果を発揮する。
【００３１】
本剤の施用法は、前述の使用形態（製剤の剤型等）に応じて、作物によって適宜選択されてよいが、例えば地上液剤散布、植物を菌液に浸漬する処理、土壌灌注処理などがある。
本剤を液剤として調製して使用する場合、それに含まれるＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株又はＡＲＫ−３菌株の菌濃度は、所望の防除結果が得られるものであればよく、何ら限定されるものではないが、あまり菌濃度が少ないと十分な結果が得られず、逆にあまり菌濃度を多くしても菌が無駄になることがあるので、例えば、１．０×１０７個／ｍＬ〜１．０×１０９個／ｍＬの範囲で適宜調整することができる。
本剤の施用量は適用作物、剤型等によって異なるため、一概には規定できないが、例えば、本剤を土壌に灌注する場合には、ブドウやリンゴなどの果樹類であれば樹木１本あたり５０Ｌ〜１００Ｌとしてもよく、処理は定植前の定植を予定している位置または定植後の株元が好ましい。また、植物を本剤に浸漬する処理では、特に限定されるものではないが、例えば、定植前の樹木の根を、根が十分に浸かる量の本剤に１時間〜２４時間漬け込むようにしてもよく、それよりも小さい草本植物の苗の根であれば、１０分間〜１時間漬け込むようにしてもよい。種子の場合は、本剤に１０分間〜２時間種子を漬け込むか、種子を土壌に播種した後に種子表面に本剤を散布（土壌灌注処理）する方法でもよい。
【００３２】
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではなく、本発明の技術的思想内においてこれらの様々な変形が可能である。
【実施例】
【００３３】
下記実験例及び実施例において使用する「ＡＲＫ−１菌株」、「ＡＲＫ−２菌株」及び「ＡＲＫ−３菌株」は、２００２年に岡山県浅口市金光町で栽培したブドウから分離したリゾウム・ヴィティスに属する菌株であり、それぞれ「リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ−１菌株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２６）」、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ−２菌株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２７）及びリゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ−３菌株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２８）」として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託されている。これらの細菌学的性質、遺伝学的性質及び病原性は前述の通りである。【００３４】
実験例１：（根頭がんしゅ病発病抑制効果）
ＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株及びＡＲＫ−３菌株のそれぞれを、ＰＳＡ平板培地で３日間培養した後、各菌体を滅菌蒸留水に懸濁して菌濃度１．０×１０７個／ｍＬの菌液（ａ）を作成した。また、比較例として、非病原性アグロバテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）Ｋ８４株、及び非病原性リゾビウム・ヴィティスＶＡＲ０６−３２株についてもＰＳＡ平板培地で３日間培養した後、各菌体を滅菌蒸留水に懸濁して菌濃度１．０×１０７個／ｍＬの菌液（ａ）を作成した。ブドウ根頭がんしゅ病菌である病原性リゾビウム・ヴィティスＧ−Ａｇ−２７株をＰＳＡ平板培地で３日間培養した後、菌体を滅菌蒸留水に懸濁して菌濃度１．０×１０７個／ｍＬの菌液（ｂ）を調製した。
本発明の菌（ＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株、ＡＲＫ−３菌株）又は比較例の菌（非病原性アグロバテリウム・ラジオバクターＫ８４株、非病原性リゾビウム・ヴィティスＶＡＲ０６−３２株）を含む菌液（ａ）と、リゾビウム・ヴィティスＧ−Ａｇ−２７の菌液（ｂ）と、を体積比にて１対１の割合で混合したもの５種を接種源とした。なお、対照として、リゾビウム・ヴィティスＧ−Ａｇ−２７の菌液（ｂ）も接種源として用いた。その接種源（合計６種）に爪楊枝の先端を浸し、一接種源当たり７〜１０株のブドウ（品種：ネオ・マスカット、１年生苗木）に該先端を突き刺して接種した。１株のブドウあたり茎の７〜１０か所に接種した。接種したブドウ苗木は温室内で３か月静置した後、接種部位のがんしゅ形成の有無を評価した。
評価の結果を、病原性リゾビウム・ヴィティスＧ−Ａｇ−２７株のみを接種した無処理区（対照）、アグロバテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）Ｋ８４株（比較例）、非病原性リゾビウム・ヴィティスＶＡＲ０６−３２株（比較例）の結果とともに、表１に示す。なお、病原性リゾビウム・ヴィティスＧ−Ａｇ−２７株のみを接種した無処理区（対照）のブドウ苗木の写真を図１のＡに示し（矢印で示すようにがんしゅ形成が認められた）、ＡＲＫ−１菌株の菌液を混合したものを接種したブドウ苗木の写真を図１のＢに示した。表１は、上記の試験を３回反復して行い、その平均値を算出したものである。表１の防除価は以下の数式により算出した。
防除価＝１００×（無処理区の発病率−非病原性菌株と混合して接種した区の発病率）／（無処理区の発病率）。【００３５】
【表１】
2012067127.tif 000003
【００３６】
表１に示す如く、本発明の菌株であるＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株、及びＡＲＫ−３菌株は、ブドウ根頭がんしゅ病菌である病原性リゾビウム・ヴィティスＧ−Ａｇ−２７株のみを接種した無処理区及び比較例の菌株を接種した区と比較して根頭がんしゅ病の発病率が顕著に低く、根頭がんしゅ病に対して高い防除効果を認めた。なかでも、ＡＲＫ−１菌株は、高い防除効果を認めた。【００３７】
実施例１：（本剤の製造例）
まず、ＰＳ（Ｐｏｔａｔｏ  ｓｕｃｒｏｓｅ）培地を調製した。じゃがいも３００ｇの煎汁、Ｃａ（ＣＯ３）２・４Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ２．０ｇ、ペプトン５．０ｇ及びサッカロース２０ｇを蒸留水１０００ｍＬに溶解させオートクレーブ滅菌しＰＳ培地（以下、「ＰＳ」ともいう。）を調製した。このように調製したＰＳ培地に、ＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株、及びＡＲＫ−３菌株を各々別々に接種し（いずれも、前述の凍結保存物を解凍し、その一白金耳量（２ｍｇ）を接種した。）、３０℃で４８時間、１００ｒｐｍで振とう培養し、各菌株を生きた状態で含有する生菌体含有培養液（本剤）を得た。【００３８】
実験例２：（阻止円形成による評価）
上記実施例１で製造した３種類の生菌体含有培養液（本剤）をそれぞれ浸み込ませた直径８ｍｍのペーパーディスクを、シャーレ内部のＰＳＡ平板培地の上に置いて２７℃で２４時間培養した。２４時間の培養後、そのシャーレのふたの内側に直径９ｃｍの濾紙を敷き、クロロホルムをその濾紙に１ｍＬ滴下してふたを戻して３０分間室温で燻蒸した後、濾紙を外して６０分間静置しクロロホルムをそのシャーレ内部から完全に蒸発除去した。その後、予め表２に記載する各種根頭がんしゅ病菌株をＰＳＡ平板培地で３日間培養した後、滅菌蒸留水に懸濁して作成しておいた菌濃度１．０×１０８個／ｍＬの各菌液を、上記で作製した各培地に、１枚（シャーレ１個）当たり２ｍＬの割合でスプレーで噴霧して接種し、２７℃で４８時間培養後、ペーパーディスク周辺の形成される阻止円の大きさを測定した。その結果、表２に示すとおり、ＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株、ＡＲＫ−３菌株は供試した全ての根頭がんしゅ病菌株に対して、その増殖を抑制した。【００３９】
【表２】
2012067127.tif 000004
【００４０】
実験例３：（ブドウ根頭がんしゅ病の防除例・浸漬処理）
実施例１で製造したＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株、及びＡＲＫ−３菌株の各生菌体含有培養液を用いて、岡山県農林水産総合センター農業研究所の敷地内にある野外の圃場において圃場試験を実施した。なお、上記各生菌体含有培養液は水道水で希釈して菌濃度を１．０×１０９個／ｍＬに調整し、これを本剤として用いた。ブドウ根頭がんしゅ病菌株である病原性リゾビウム・ヴィティスＧ−Ａｇ−２７株、病原性リゾビウム・ヴィティスＭＡＦＦ２１１６７４株、病原性リゾビウム・ヴィティスＭＡＦＦ２１１６７６株、病原性リゾビウム・ヴィティスＧ−Ａｇ−６０株、及び病原性リゾビウム・ヴィティスＶＡＴ０７−１株をそれぞれＰＳＡ平板培地で２７℃、２４時間前培養した。これらの菌体を全て一つのＰＳ培地に入れて２７℃で４８時間、１００ｒｐｍで振とう培養し、各処理区（１．１ｍ２）あたり、上記で得られた培養物２０Ｌを土壌に混和して汚染圃場とした。ブドウ（品種：ピオーネ、２年生苗木）の根を束ねて全長の１／２の位置で切断し、根部を菌濃度１．０×１０９個／ｍＬの本剤に浸漬して１時間静置した後、１処理区あたり４本を定植した。各処理区６反復で試験し、定植６か月後に全株を掘り起こして、がんしゅが形成されている株数の全株数に対する割合を発病株率として、それから防除価を以下の数式で算出した。なお、無処理区とは、本剤で浸漬処理をしないで定植したブドウを意味する。
防除価＝１００×（無処理区の発病株率−処理区の発病株率）／（無処理区の発病株率）。
その結果、表３に示すとおり、本剤（ＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株、ＡＲＫ−３菌株）で浸漬処理することにより、ブドウ根頭がんしゅ病の発病株率が無処理区と比べて著しく減少し、ブドウ根頭がんしゅ病に対して極めて高い防除効果が得られた。
なお、無処理区（対照）の汚染土壌にブドウ苗木をそのまま定植したものを６か月後に掘り起こしたブドウ苗木の写真を図２のＡに示し（矢印で示すようにがんしゅ形成が認められた）、ブドウ苗木の根をあらかじめＡＲＫ−１の菌液に浸漬した後に汚染土壌に定植したものを６か月後に掘り起こしたブドウ苗木の写真を図２のＢに示した（がんしゅ形成が認められない）。【００４１】
【表３】
2012067127.tif 000005
【００４２】
実験例４：（ブドウ根頭がんしゅ病の防除例・土壌灌注処理）
実施例１で製造したＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株、及びＡＲＫ−３菌株の各生菌体含有培養液を用いて、岡山県農林水産総合センター農業研究所の敷地内にある温室において試験を実施した。なお、上記各生菌体含有培養液は水道水で希釈して菌濃度を１．０×１０８個／ｍＬに調整し、これを本剤として用いた。ブドウ根頭がんしゅ病菌株である病原性リゾビウム・ヴィティスＧ−Ａｇ−２７株、病原性リゾビウム・ヴィティスＭＡＦＦ２１１６７４株、病原性リゾビウム・ヴィティスＭＡＦＦ２１１６７６株、病原性リゾビウム・ヴィティスＧ−Ａｇ−６０株、病原性リゾビウム・ヴィティスＧ−Ａｇ−６８株、病原性リゾビウム・ヴィティスＧ−Ａｇ−８０株、病原性リゾビウム・ヴィティスＶＡＴ０７−１株、及び病原性リゾビウム・ヴィティスＡｔ−９０−２３株、をそれぞれＰＳＡ平板培地で２７℃、２４時間前培養した。これらの菌体を全て一つのＰＳ培地に入れて２７℃で４８時間、１００ｒｐｍで振とう培養し、土壌を３００ｇ詰めた直径９ｃｍビニルポット（植木鉢）あたり、上記で調製した培養物１００ｍＬを土壌に混和して汚染土とした。ブドウ（品種：ネオ・マスカット、１年生苗木）を１ポットに１本定植した後、本剤を１ポットあたり５０ｍＬ灌注した。各処理区６０ポットで試験し、定植４か月後に全株を掘り起こして、がんしゅが形成されている株数の全株数に対する割合を発病株率として、それから防除価を以下の数式で算出した。
防除価＝１００×（無処理区の発病株率−処理区の発病株率）／（無処理区の発病株率）。
その結果、表４に示すとおり、本剤（ＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株、ＡＲＫ−３菌株）を土壌に灌注することにより、ブドウ根頭がんしゅ病の発病株率が無処理区と比べて著しく減少し、ブドウ根頭がんしゅ病に対して極めて高い防除効果が得られた。【００４３】
【表４】
2012067127.tif 000006
【００４４】
実験例５：（リンゴ根頭がんしゅ病の防除例・浸漬処理）
実施例１で製造したＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株、及びＡＲＫ−３菌株の各生菌体含有培養液を用いて、岡山県農林水産総合センター農業研究所の敷地内にある野外の圃場において圃場試験を実施した。なお、上記各生菌体含有培養液は水道水で希釈して菌濃度を２．０×１０８個／ｍＬに調整し、これを本剤として用いた。リンゴ根頭がんしゅ病菌株に属する病原性リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＡＲＡＴ００１株、病原性リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ＡＲＡＴ００２株、病原性リゾビウム・リゾゲネスＮＥＡＲ８株、病原性リゾビウム・リゾゲネスＮＥＡＲ１１株、及び病原性リゾビウム・リゾゲネスＮＥＡＲＮｏ．９  ３／２株をそれぞれＰＳＡ平板培地で２７℃、２４時間前培養した。これらの菌体を全て一つのＰＳ培地に入れて２７℃で４８時間、１００ｒｐｍで振とう培養し、各処理区（６．０ｍ２）あたり１００Ｌを土壌に混和して汚染圃場とした。リンゴ（品種：フジ、２年生苗木）の根を束ね、根部を菌濃度２．０×１０８個／ｍＬの本剤に浸漬して１時間静置した後、１処理区あたり１１本を定植した。各処理区３反復で試験し、定植６か月後に全株を掘り起こして、がんしゅが形成されている株数の全株数に対する割合を発病株率として、それから防除価を以下の数式で算出した。
防除価＝１００×（無処理区の発病株率−処理区の発病株率）／（無処理区の発病株率）。
その結果、表５に示すとおり、本剤（ＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株、ＡＲＫ−３菌株）で浸漬処理することにより、リンゴ根頭がんしゅ病の発病株率が無処理区と比べて著しく減少し、リンゴ根頭がんしゅ病に対して極めて高い防除効果が得られた。【００４５】
【表５】
2012067127.tif 000007
【００４６】
実験例６：（バラ根頭がんしゅ病の防除例・浸漬処理）
実施例１で製造したＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株、ＡＲＫ−３菌株の各生菌体含有培養液を用いて、岡山県農林水産総合センター農業研究所の敷地内にある温室において実施した。なお、上記の各生菌体含有培養液は水道水で希釈して菌濃度を５．０×１０８個／ｍＬに調整し、これを本剤として用いた。リンゴ根頭がんしゅ病菌株である病原性リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＡＲＡＴ００１株、病原性リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ＡＲＡＴ００２株、病原性リゾビウム・リゾゲネスＮＥＡＲ８株、病原性リゾビウム・リゾゲネスＮＥＡＲ１１株、及び病原性リゾビウム・リゾゲネスＮＥＡＲＮｏ．９  ３／２株をそれぞれＰＳＡ平板培地で２７℃、２４時間前培養した（なお、リンゴ根頭がんしゅ病菌はバラにも強い病原性を有するため、ここではリンゴ根頭がんしゅ病菌を供試した。）。これらの菌体を全て一つのＰＳ培地に入れて２７℃で４８時間、１００ｒｐｍで振とう培養し、土壌を６００ｇ詰めた直径１５ｃｍビニルポットあたり、上記培養物２００ｍＬを土壌に混和して汚染土とした。バラ（品種：ローテローゼ、１年生苗木）の根を束ねて全長の１／２の位置で切断し、根部を菌濃度５．０×１０８個／ｍＬの本剤に浸漬して２４時間静置した後、１処理区あたり１５本を定植した。なお、１本を１ポットに定植し、１処理区を１５ポットにて形成した。各処理区３反復で試験し、定植６か月後に全株を掘り起こして、がんしゅが形成されている株数の全株数に対する割合を発病株率として、それから防除価を以下の数式で算出した。
防除価＝１００×（無処理区の発病株率−処理区の発病株率）／（無処理区の発病株率）。
その結果、表６に示すとおり、本剤で浸漬処理することにより、バラ根頭がんしゅ病の発病株率が無処理区と比べて著しく減少し、バラ根頭がんしゅ病に対して極めて高い防除効果が得られた。【００４７】
【表６】
2012067127.tif 000008
【００４８】
実験例７：（トマト根頭がんしゅ病の防除例・浸漬処理）
実施例１で製造したＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株、ＡＲＫ−３菌株の各生菌体含有培養液を用いて、岡山県農林水産総合センター農業研究所の敷地内にある温室において試験を実施した。なお、各生菌体含有培養液を水道水で希釈して菌濃度を５．０×１０８個／ｍＬに調整したものを、本剤として用いた。リンゴ根頭がんしゅ病菌株である病原性リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＡＲＡＴ００１株、病原性リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ＡＲＡＴ００２株、病原性リゾビウム・リゾゲネスＮＥＡＲ８株、病原性リゾビウム・リゾゲネスＮＥＡＲ１１株、及び病原性リゾビウム・リゾゲネスＮＥＡＲＮｏ．９  ３／２株をそれぞれＰＳＡ平板培地で２７℃、２４時間前培養した（なお、リンゴ根頭がんしゅ病菌はトマトにも強い病原性を有するため、ここではリンゴ根頭がんしゅ病菌を供試した。）。これらの菌体を全て一つのＰＳ培地に入れて２７℃で４８時間、１００ｒｐｍで振とう培養し、土壌を３００ｇ詰めた直径９ｃｍビニルポットあたり、上記培養物１００ｍＬを土壌に混和して汚染土とした。トマト（品種：桃太郎８、実生、発芽４週間後）の根を束ねて全長の１／２の位置で切断し、根部を菌濃度５．０×１０８個／ｍＬの本剤に浸漬して１０分間静置した後、１処理区あたり４０本を定植した。なお、１本を１ポットに定植し、１処理区を４０ポットにて形成した。各処理区３反復で試験し、定植３か月後に全株を掘り起こして、がんしゅが形成されている株数の全株数に対する割合を発病株率として、それから防除価を以下の数式で算出した。
防除価＝１００×（無処理区の発病株率−処理区の発病株率）／（無処理区の発病株率）。
その結果、表７に示すとおり、本剤で浸漬処理することにより、トマト根頭がんしゅ病の発病株率が無処理区と比べて著しく減少し、トマト根頭がんしゅ病に対して極めて高い防除効果が得られた。【００４９】
【表７】
2012067127.tif 000009
【００５０】
実験例８：（モモ根頭がんしゅ病の防除例・浸漬処理）
実施例１で製造したＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−３菌株の各生菌体含有培養液を用いて、岡山県農林水産総合センター農業研究所の敷地内にある野外の圃場において圃場試験を実施した。なお、上記各生菌体含有培養液は水道水で希釈して菌濃度を２．５×１０８個／ｍＬに調整し、これを本剤として用いた。モモ根頭がんしゅ病菌株に属する病原性リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）Ｐｃｈ−Ａｇ−２株をＰＳＡ平板培地で２７℃、２４時間前培養した。この菌体をＰＳ培地に入れて２７℃で４８時間、１００ｒｐｍで振とう培養し、各処理区（４．２ｍ２）あたり１００Ｌを土壌に混和して汚染圃場とした。モモ（品種：白鳳、２年生苗木）の根を束ね、根部を菌濃度２．５×１０８個／ｍＬの本剤に浸漬して１時間静置した後、１処理区あたり１３本を定植した。各処理区３反復で試験し、定植６か月後に全株を掘り起こして、がんしゅが形成されている株数の全株数に対する割合を発病株率として、それから防除価を以下の数式で算出した。
防除価＝１００×（無処理区の発病株率−処理区の発病株率）／（無処理区の発病株率）。
その結果、表８に示すとおり、ＡＲＫ−１菌株またはＡＲＫ−３菌株を有効成分とする本剤で浸漬処理することにより、モモ根頭がんしゅ病の発病株率が無処理区と比べて著しく減少し、モモ根頭がんしゅ病に対して高い防除効果が得られた。とりわけＡＲＫ−１菌株は極めて高い防除効果を示した。【００５１】
【表８】
2012067127.tif 000010
【００５２】
実験例９：（ナシ根頭がんしゅ病の防除例・浸漬処理）
実施例１で製造したＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株、ＡＲＫ−３菌株の各生菌体含有培養液を用いて、岡山県農林水産総合センター農業研究所の敷地内にある温室において実施した。なお、上記の各生菌体含有培養液は水道水で希釈して菌濃度を２．５×１０８個／ｍＬに調整し、これを本剤として用いた。ナシ根頭がんしゅ病菌株である病原性リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）Ｐ−Ａｇ−１株およびＰ−Ａｇ−６株をそれぞれＰＳＡ平板培地で２７℃、２４時間前培養した。これらの菌体を全て一つのＰＳ培地に入れて２７℃で４８時間、１００ｒｐｍで振とう培養し、各処理区（４．２ｍ２）あたり１００Ｌを土壌に混和して汚染圃場とした。ナシ（品種：豊水、２年生苗木）の根を束ね、根部を菌濃度２．５×１０８個／ｍＬの本剤に浸漬して１時間静置した後、１処理区あたり１３本を定植した。各処理区３反復で試験し、定植６か月後に全株を掘り起こして、がんしゅが形成されている株数の全株数に対する割合を発病株率として、それから防除価を以下の数式で算出した。
防除価＝１００×（無処理区の発病株率−処理区の発病株率）／（無処理区の発病株率）。
その結果、表９に示すとおり、本剤で浸漬処理することにより、ナシ根頭がんしゅ病の発病株率が無処理区と比べて著しく減少し、ナシ根頭がんしゅ病に対して高い防除効果が得られた。とりわけＡＲＫ−１菌株は極めて高い防除効果を示した。【００５３】
【表９】
2012067127.tif 000011
【００５４】
実験例１０：（種子発芽率向上例）
岡山県内で栽培されていたブドウ（品種：ピオーネ）中から分離したリゾビウム・ヴィティスＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株およびＡＲＫ−３菌株をポテト・デキストロース液体培地で２７℃、２日間培養し、遠心分離機により培養菌体のみを得た。これを蒸留水にて１０８個／ｍＬに調整した。
市販されているミツバ、パセリ、ニガウリの種子を前記の手法で調製した菌液に６０分間浸漬し、浸漬種子を得た。この種子を育苗培土に播種し、温室内で育苗した。播種２週間後に発芽率を調査した。なお、比較例としては、各種種子を水道水に６０分間浸漬したものを用いた（実験例１０−１）。
また、市販されているミツバ、パセリ、ニガウリの種子を育苗培土に播種し、覆土する前に培土および種子表面に実施例１で調製した菌液を５００ｍＬ／ｍ２の割合で土壌灌注処理した。土壌灌注処理後、覆土を行い、温室内で育苗し、播種２週間後に発芽率を調査した。なお、比較例としては、水道水を５００ｍＬ／ｍ２の割合で土壌灌注処理したものを用いた（実験例１０−２）。
何れの試験も、発芽率は子葉が地上部において完全に展開しているものを発芽とみなして、以下の式（１）により算出した。
発芽率（％）＝（発芽数／播種数）×１００。
その結果、表１０に示すとおり、リゾビウム・ヴィティスＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株およびＡＲＫ−３菌株を培養して得られた菌体を未発芽の種子に作用させることは、植物種子の発芽率を向上させることが示された。【００５５】
【表１０】
2012067127.tif 000012
【００５６】
以上述べたように、本発明の新規な微生物ＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株及びＡＲＫ−３菌株のいずれも根頭がんしゅ病に対して極めて優れた防除効果を示した。
また、本発明に係わる微生物ＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株及びＡＲＫ−３菌株のいずれも冷凍保存でき、使用にあたりその一部を取り出して容易に増殖できるので、取り扱いが簡単である。
また、本発明に係わる微生物ＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株及びＡＲＫ−３菌株のいずれも自然界に存在する非病原性リゾビウム・ヴィティスに属するものであり、安全性に優れ、環境への影響が少ない。
以上の通り、本発明に係わる非病原性リゾビウム・ヴィティスＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株及びＡＲＫ−３菌株はいずれも根頭がんしゅ病に対して高い防除効果を示すことから、根頭がんしゅ病の防除剤として、農業分野および園芸分野で広く適用できる。【００５７】
そしてさらに、本発明のリゾビウム・ヴィティスＡＲＫ−１菌株、ＡＲＫ−２菌株およびＡＲＫ−３菌株は、根頭がんしゅ病防除作用だけでなく植物種子発芽率向上作用を併せ持つことから、一度適用するだけで２つの効果を期待することができる。このような効果は農作物生産において、コスト削減と作業簡易化に役立つ。また、本発明の菌株は自然界から分離されたことから、環境や生態系に悪影響を及ぼすことはなく、安全性が高いという利点がある。【００５８】
本発明を要約すれば次のとおりである。【００５９】
すなわち本発明は、実際の作物生産現場において安定的な根頭がんしゅ病防除効果や植物種子発芽率向上効果を発揮し、生物農薬等として使用可能な非病原性菌を提供することを目的とする。【００６０】
そして、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ−１菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２６）、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ−２菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２７）、リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ−３菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２８）よりなる群より選ばれる１又は２以上の菌体および／または菌体の培養物を有効成分とすることで、根頭がんしゅ病防除剤、及び／又は、植物種子発芽率向上剤等を提供できる。さらに、当該剤を植物あるいは植物種子に接触させるステップを含んでなる、根頭がんしゅ病防除方法及び／又は植物種子発芽率向上方法も提供できる。【００６１】
本発明において国際寄託されている微生物の受託番号を下記に示す。
（１）リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ−１菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２６）。
（２）リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ−２菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２７）。
（３）リゾビウム・ヴィティス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ）ＡＲＫ−３菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２８）。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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