(57)【要約】  本発明は核酸と安定な複合体を形成しつつも細胞内では該核酸を放出し得る薬物キャリアに適用できるブロックコポリマーを提供する。該ブロックコポリマーは式（１）または式（２）で表わされる。【化１】2012096399.tif 000011式中、Ｒ１およびＲ２は、相互に独立して、水素原子また置換されていてもよい炭素数１〜１２の直鎖もしくは分岐状のアルキル基であり、Ａは親水性ポリマー鎖、Ｌ１およびＬ３は連結基であり、Ｂはカチオン含有基であり、Ｒ３は任意のアミノ酸の側鎖を表し、ｚは５〜５００の整数を表し、ｘはｚの４０％以上の整数を表し、ｙは整数を表し０であってもよく、ｚ−ｘ−ｙは整数を表し０でもよく、ｐは１〜１０の整数を表し、ｑは１〜１０の整数を表す。
2012096399.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブロックコポリマーにより構成される粒子組成物であって、該ブロックコポリマーとして式（１）または式（２）で表わされる薬物キャリアを含む、粒子組成物：
【化１】
2012096399.tif 000010
式中、Ｒ１およびＲ２は、相互に独立して、水素原子また置換されていてもよい炭素数１〜１２の直鎖もしくは分岐状のアルキル基であり、Ａは親水性ポリマー鎖、Ｌ１およびＬ３は連結基であり、Ｂはカチオン含有基であり、Ｒ３は任意のアミノ酸の側鎖を表し、ｚは５〜５００の整数を表し、ｘはｚの４０％以上の整数を表し、ｙは整数を表し０であってもよく、ｚ−ｘ−ｙは整数を表し０でもよく、ｐは１〜１０の整数を表し、ｑは１〜１０の整数を表す。
【請求項２】
前記式（１）および（２）において、前記ｘと前記ｙの合計が前記ｚの９５％以上の整数である、請求項１に記載の粒子組成物。
【請求項３】
ｉ）前記薬物キャリアの親水性ポリマー鎖側末端に標的結合部位が結合している、または、ｉｉ）前記ブロックコポリマーとして、親水性ポリマー鎖、疎水性ポリマー鎖および該親水性ポリマー鎖に結合した標的結合部位を有する標的結合キャリアをさらに含む、請求項１または２に記載の粒子組成物。
【請求項４】
前記標的結合部位が環状ＲＧＤである、請求項３に記載の粒子組成物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の粒子組成物と該粒子組成物に内包された薬物とを有する、医薬組成物。
【請求項６】
前記薬物が生体高分子である、請求項５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子組成物および該粒子組成物を用いた医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを特異的かつ効果的にノックダウンできることから、その医療応用に対する期待が高まっているが、ｓｉＲＮＡを医療に応用するには効果的なデリバリーシステムの開発が必要不可欠である。近年、臨床治験中であるｎａｋｅｄ  ｓｉＲＮＡの眼球内投与による加齢黄斑変性（ＣＮＶ）の治療効果が、ｓｉＲＮＡによる配列特異的な遺伝子ノックダウン効果によるものではなく、細胞表面のＴｏｌｌ様受容体−３（ＴＬＲ−３）による認識を介した配列非特異的な効果によることが明らかにされ、いかなるｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ応用においても、細胞外では安定であるが細胞内に的確にｓｉＲＮＡを送達できるキャリアの開発が重要であると考えられている。【０００３】
これまでに、ＤＮＡとポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）を形成して真核細胞に該核酸を導入し、発現させるキャリアとして、種々のカチオン性ポリマーが提供されている。例えば、ポリ（Ｌ−リシン）のε−アミノ基を介して親水性基（例えば、ポリエチレングリコール）と疎水性基（例えば、パルミトイル）が導入されたポリ（Ｌ−リシン）誘導体は、水性媒体中においてコレステロールの存在下でベシクルを形成し、該ベシクルは遺伝子の組み込まれたプラスミドＤＮＡを凝集し、安定な複合体を形成することが知られている（特許文献１）。また、ポリ（Ｌ−リシン）−ポリ（エチレングリコール）のコポリマーであって、ポリ（Ｌ−リシン）のε−アミノ基をチオレート化することによりカチオン荷電とジスルフィド架橋密度を調節したコポリマー誘導体とプラスミドＤＮＡとのＰＩＣは細胞外媒体中での高い安定性と細胞内コンパートメント内での効果的な該ＤＮＡの放出を示すことが知られている（非特許文献１）。また、側鎖にエチレンジアミン構造を有するポリ（Ｎ−［Ｎ−（２−アミノエチル）−２−アミノエチル］アスパルタミド（ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）））および該ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）をブロックコポリマーの一ブロック成分として含むコポリマーを製造したところ、このようなポリマーは、低い細胞毒性を示し、しかも、プラスミドＤＮＡを高効率で細胞内に導入し、該ＤＮＡ中に組み込まれた遺伝子を効率よく発現することが確認されている（非特許文献２、特許文献２、特許文献３参照）。【０００４】
上記のとおり、ＤＮＡのような高分子核酸に対する有効なキャリアは開発されているが、ｓｉＲＮＡのような小分子核酸とも生理的条件下で安定なＰＩＣのような複合体を形成しつつも、細胞内で好適に該小分子核酸を放出し得るキャリアは未だ提供されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９９／６１５１２号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００６／０８５６６４号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００７／０９９６６０号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋ．Ｍｉｙａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  ２００４，１２６，２３５５−２３６１
【非特許文献２】Ｋ．Ｍｉｙａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  ２００８，１３０，１６２８７−１６２９４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の主目的は、核酸と生理的条件下で安定な複合体を形成しつつも細胞内では該核酸を放出し得る核酸キャリアとして適用可能である薬物キャリアの提供にある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の粒子組成物は、ブロックコポリマーにより構成され、該ブロックコポリマーとして式（１）または式（２）で表わされる薬物キャリアを含む。
【化１】
2012096399.tif 000003
式中、Ｒ１およびＲ２は、相互に独立して、水素原子また置換されていてもよい炭素数１〜１２の直鎖もしくは分岐状のアルキル基であり、Ａは親水性ポリマー鎖、Ｌ１およびＬ３は連結基であり、Ｂはカチオン含有基であり、Ｒ３は任意のアミノ酸の側鎖を表し、ｚは５〜５００の整数を表し、ｘはｚの４０％以上の整数を表し、ｙは整数を表し０であってもよく、ｚ−ｘ−ｙは整数を表し０でもよく、ｐは１〜１０の整数を表し、ｑは１〜１０の整数を表す。
本発明のさらに別の局面によれば、医薬組成物が提供される。該医薬組成物は、上記粒子組成物と該粒子組成物に内包された薬物とを含む。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、核酸と安定な複合体（医薬組成物）を形成しつつも細胞内では該核酸を放出し得るキャリアが提供される。当該キャリアは、核酸やタンパク質といった生体高分子を対象にした薬物キャリアとして適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明による複合体の粒子径分布のヒストグラムである。
【図２】本発明による複合体の各イオン濃度に対する散乱光強度を示すグラフである。
【図３】本発明による複合体と共に培養した細胞のｓｉＲＮＡ取り込み量を示すグラフである。
【図４】本発明による複合体のＲＮＡｉ活性を示すグラフである。
【図５】本発明による複合体の血中動態を示すｉｎ  ｖｉｖｏ共焦点イメージングシステム画像である。
【図６】本発明による複合体の抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図７】本発明による複合体の腫瘍集積性を示すｉｎ  ｖｉｖｏ共焦点イメージングシステム画像である。
【図８】本発明による複合体を投与したマウスにおける腫瘍のＩＶＩＳイメージングシステム画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の好ましい実施形態について説明するが、本発明はこれらの実施形態には限定されない。なお、ブロックコポリマーにより構成される粒子組成物と、該粒子組成物および該粒子組成物に内包された薬物（例えば、生体高分子）により構成される医薬組成物とは、形状的に相違する場合があるが、本明細書においては、これらを共に粒子として取り扱う。
【００１２】
Ａ．粒子組成物
本発明の粒子組成物は、ブロックコポリマーにより構成され、当該ブロックコポリマーとして、薬物キャリアを含む。
【００１３】
Ａ−１．薬物キャリア
本発明の粒子組成物を構成する薬物キャリアは、親水性ポリマー鎖セグメントおよびポリアミノ酸に由来するセグメントを含むブロックコポリマーであって、下記式（１）または（２）で表わされる。
【化２】
2012096399.tif 000004
式中、Ｒ１およびＲ２は、相互に独立して、水素原子また置換されていてもよい炭素数１〜１２の直鎖もしくは分岐状のアルキル基であり、Ａは親水性ポリマー鎖、Ｌ１およびＬ３は連結基であり、Ｂはカチオン含有基であり、Ｒ３は任意のアミノ酸の側鎖を表し、ｚは５〜５００の整数を表し、ｘはｚの４０％以上の整数を表し、ｙは整数を表し０であってもよく、ｚ−ｘ−ｙは整数を表し０でもよく、ｐは１〜１０の整数を表し、ｑは１〜１０の整数を表す。
【００１４】
Ａは薬物キャリアの親水性ポリマー鎖セグメントを構成する親水性ポリマー鎖を表す。親水性ポリマー鎖を構成する親水性ポリマーとしては、任意の適切な親水性ポリマーが採用され得る。該親水性ポリマーとしては、例えば、ポリ（エチレングリコール）、ポリサッカライド、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸エステル）、ポリ（アクリル酸エステル）、ポリアミノ酸、ポリ（リンゴ酸）、またはこれらの誘導体が挙げられる。ポリサッカライドの具体例としては、デンプン、デキストラン、フルクタン、ガラクタンが挙げられる。これらのなかでも、ポリ（エチレングリコール）は、末端に種々の官能基を有する末端反応性ポリエチレングリコールが市販されており、また、種々の分子量のものが市販されており、容易に入手できることから、好ましく用いられ得る。
【００１５】
上記親水性ポリマー鎖における親水性ポリマーの繰り返し数は、好ましくは３０〜２０，０００の整数、より好ましくは４０〜２，０００の整数、さらに好ましくは５０〜１，０００の整数である。
【００１６】
式（１）および（２）において［  ］で表示された構造が、ポリアミノ酸に由来するセグメント（以下、ポリアミノ酸セグメントという）に対応する構造である。当該ポリアミノ酸セグメントは、特定の環状構造を有するアミノ酸残基（以下、環状構造を有するアミノ酸セグメントという）と、カチオン含有基を有するアミノ酸残基（以下、カチオン含有基を有するアミノ酸セグメントという）とを含む。これらの構造を含むことにより、安定な複合体を形成することができる。ポリアミノ酸セグメントは、環状構造を有するアミノ酸セグメントおよびカチオン含有基を有するアミノ酸セグメント以外のアミノ酸残基を含んでいてもよい。ポリアミノ酸セグメントにおける各アミノ酸残基の結合順は任意であり、ランダム構造であってもよく、ブロック構造であってもよい。
【００１７】
ｚは薬物キャリアのポリアミノ酸セグメントの繰り返し数を表す。ｚは、５〜５００の範囲にある整数であり、当該範囲の下限は１０、さらには２０であってよく、当該範囲の上限は２００、さらには１００であってよい。
【００１８】
ポリアミノ酸セグメントは、任意のアミノ酸がペプチド結合したポリペプチドである。このポリペプチドを構成するアミノ酸としては、任意のアミノ酸を用いることができ、具体的には、リシン、オルニチン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸が好適に用いられる。例えば、該アミノ酸として、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸を用いることにより、所定の環状構造をより確実に導入し得る。
【００１９】
ｘは環状構造を有するアミノ酸セグメントの繰り返し数を表す。環状構造を有するアミノ酸セグメントの割合（後述する実施例における環状構造含有率に相当する）は、薬物キャリアが有するポリアミノ酸セグメントの４０％以上である。つまり、ｘはｚの４０％以上の整数である。このように環状構造を有するアミノ酸セグメントの割合をポリアミノ酸セグメントの４０％以上に制御すると、ブロックコポリマーの疎水性が高まることに起因して安定性の高いミセルが得られ易くなると共に、後述するとおり、細胞内でのエンドソームエスケープが生じ易くなる。環状構造を有するアミノ酸セグメントの割合は、ポリアミノ酸セグメントの５０％以上であり、より好ましくはポリアミノ酸セグメントの６０％以上であり、さらに好ましくは７０％以上であり、特に好ましくは８５％以上である。環状構造を有するアミノ酸セグメントの割合は、１００％であってもよいが、後述するカチオン含有基を有するアミノ酸セグメントによる作用を利用して薬物（例えば、生体高分子）との複合体を比較的容易に（例えば、生理条件下にて）形成させる観点からは、１００％未満が好ましく、例えば９５％以下であってよい。環状構造を有するアミノ酸セグメントは、エンドソーム内のような低いｐＨ環境下（例えば、エンドソーム内はｐＨ５．５）では、プラスチャージを発生させる性質を有しているものと考えられる。このプラスチャージがエンドソーム膜に作用することにより、エンドソームエスケープが引き起こされると考えられる。該エンドソームエスケープにより、複合体は完全に細胞内マトリックスに取り込まれ、内包する薬物を核に放出することができる。そして、こうした環状構造を有するアミノ酸セグメントは、生理条件下である中性のｐＨ環境において、プラスチャージが発生しない性質を有しているため、毒性のない状態で血中に存在し得る。
【００２０】
Ｂは、カチオン含有基を有するアミノ酸セグメントのカチオン含有基を表す。該カチオン含有基はカチオンを含む任意の適切な基であり、例えば、アンモニウムカチオンを含有する基が挙げられる。カチオン含有基を有するアミノ酸セグメントを含むことにより、上記薬物キャリアは、生理的条件下で、薬物として用いられる生体高分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）と複合体（例えば、ＰＩＣ）を形成し得る。具体的には、アミジン基と、ジエチレントリアミンに由来する、下記（ｉ）〜（ｉｖ）よりなる群から選ばれる基が挙げられる。
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ３−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｑ３−〕ｒ１ＮＨ２      （ｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ４−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ４−ＮＨ２〕２      （ｉｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ５−Ｎ｛〔−（ＣＨ２）ｑ５−ＮＨ２〕〔−（ＣＨ２）ｑ６−ＮＨ−〕ｒ２Ｈ｝      （ｉｉｉ）；および
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ６−Ｎ｛−（ＣＨ２）ｑ７−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ８−ＮＨ２〕２｝２      （ｉｖ）
好ましくは（ｉ）で表わされる基が用いられる。ｐ３〜ｐ６およびｑ３〜８は、それぞれ相互に独立して２または３であることが好ましく、より好ましくは２である。一方、ｒ１およびｒ２は、それぞれ相互に独立して、１〜３の整数であることが好ましい。
【００２１】
上記カチオン含有基を有するアミノ酸セグメントは、側鎖の末端、すなわち、上記カチオン含有基の末端にチオール基（−ＳＨ基）を有していてもよい。チオール基は互いに反応することにより、ジスルフィド結合による架橋反応を形成し得る。これにより、ブロックコポリマー同士の会合性が高くなり、安定性の高いミセルを形成可能なブロックコポリマーが得られる。また、ジスルフィド結合は、還元環境下において、容易に開裂する結合である。したがって、非還元的環境下である細胞外では、安定したミセルを維持することができ、還元的環境下である細胞内では内包物を効率よく放出することができる。
【００２２】
したがって、１つの実施形態においては、Ｂは−ＮＨ＋＝Ｃ（＝ＮＨ）−（ＣＨ２）ｑ−ＳＨであり、ｑは１〜１０の整数であり、好ましくは２〜４の整数である。
【００２３】
ｙはカチオン含有基を有するアミノ酸セグメントの繰り返し数を表す。ｙは整数であり、０であってもよい。ｙは、例えば、１以上の整数、２以上の整数、さらには５以上の整数であってよい。また、ｙは、例えば、２００以下の整数、１００以下の整数、８０以下の整数、４０以下の整数、さらには２０以下の整数であってよい。
【００２４】
好ましくは、ポリアミノ酸セグメントにおいて、環状構造を有するアミノ酸セグメントとカチオン含有基を有するアミノ酸セグメントの占める割合は、ポリアミノ酸セグメントの９５％以上である。すなわち、ｘ＋ｙがｚの９５％以上の整数であることが好ましい。なお、上記ブロックコポリマーのポリアミノ酸セグメントは、環状構造を有するアミノ酸セグメントとカチオン含有基を有するアミノ酸セグメントのみで構成されていてもよい。
【００２５】
ポリアミノ酸セグメントにおいて、環状構造を有するアミノ酸セグメントとカチオン含有基を有するアミノ酸セグメントとの比は、本発明の粒子組成物を用いた複合体の用途や内包する薬物に合せて、適宜設定すればよい。環状構造を有するアミノ酸セグメントとカチオン含有基を有するアミノ酸セグメントとの比率は、例えば、ブロックコポリマーの合成過程で用いる溶媒のｐＨの調整および／または任意の触媒の使用により適宜設定することにより調整し得る。具体的には、アルゴン雰囲気下において高純度の触媒（例えば、ジイソプロピルエチルアミン）を使用すること、および／または、精製過程での透析時のｐＨを比較的高く（例えば、ｐＨ６）に設定することにより、上記の環状構造をより確実に導入し得る。
【００２６】
Ｒ３はポリアミノ酸セグメントを構成する任意のアミノ酸の側鎖を表す。このように、ポリアミノ酸セグメントは、環状構造を有するアミノ酸セグメントとカチオン含有基を有するアミノ酸セグメント以外にポリアミノ酸セグメントを構成するアミノ酸由来のセグメント（以下、その他のアミノ酸セグメントともいう）を含み得る。例えば、Ｒ３はリシン、オルニチン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択される１種以上のアミノ酸の側鎖であり得る。その他のアミノ酸セグメントの数は特に制限はなく、環状構造を有するアミノ酸セグメントおよびカチオン含有基を有するアミノ酸セグメントの残りの部分である。例えば、ポリアミノ酸セグメントが塩基性の側鎖を有するアミノ酸から構成される場合、その他のアミノ酸セグメントは、カチオン性基として機能し得る。その他のアミノ酸残基は含まれていなくてもよい。
【００２７】
Ｒ１およびＲ２の基における炭素数１〜１２の直鎖または分枝状のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、デシル基、およびウンデシル基が挙げられる。
【００２８】
上記アルキル基の置換基としては、例えば、アセタールホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、炭素数２〜７のアシルアミド基、シロキシ基、シリルアミノ基、および、トリアルキルシロキシ基（アルキルシロキシ基は相互に独立し、それぞれ炭素数１〜６である）が挙げられる。置換基、特にＲ１における置換基がホルミル基、カルボキシル基、またはアミノ基である場合には、これらの置換基を介して任意のリガンド、例えば、抗体若しくはその断片、またはその他の機能性若しくは標的指向性を有するタンパク質を結合することができる。
【００２９】
Ｌ１およびＬ３は連結基であり、薬物キャリアの親水性ポリマー鎖セグメントと、ポリアミノ酸からなるセグメントとの連結部分を表す。具体的には、Ｌ１で表わされる連結基は、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｏ−Ｌ２−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｌ２−Ｓ−Ｌ２−ＮＨ−（ここで、Ｌ２は独立してＣ１〜Ｃ６アルキレン基である）から選ばれる連結基であり、Ｌ３は−ＯＣＯ−Ｌ４−ＣＯ−、および−ＮＨＣＯ−Ｌ４−ＣＯ−（ただし、Ｌ４はＣ１〜Ｃ６アルキレン基である）から選ばれる連結基である。
【００３０】
ｐおよびｑは、ポリアミノ酸セグメントの側鎖部分のメチレン基の繰り返し単位を表す。ｐは１〜１０の整数であり、好ましくは３〜４である。ｑは１〜１０の整数であり、好ましくは３〜４である。
【００３１】
上記ブロックコポリマーは、例えば、ｉ）親水性ポリマーと所定のモノマーを順次重合し、必要に応じて側鎖が上記環状構造またはカチオン含有基を含むよう置換または変換する、ｉｉ）あらかじめ重合しておいたポリアミノ酸セグメント部分を構成するポリアミノ酸と親水性ポリマーとを結合させ、その後、必要に応じてポリアミノ酸の側鎖に上記環状構造またはカチオン含有基を含むよう置換または変換する、ｉｉｉ）側鎖に上記環状構造およびカチオン含有基を有するポリアミノ酸をあらかじめ調製し、親水性ポリマーと結合させる、ことによって調製できる。
【００３２】
Ｂ．標的結合部位を有する薬物キャリアまたは親水性ポリマー鎖、疎水性ポリマー鎖および該親水性ポリマー鎖に結合した標的結合部位を有する標的結合キャリアをさらに含む粒子組成物
１つの好ましい実施形態においては、本発明の粒子組成物は、薬物キャリアの親水性ポリマー鎖側末端に標的結合部位が結合している。また、他の好ましい実施形態においては、粒子組成物を構成するブロックコポリマーとして、親水性ポリマー鎖、疎水性ポリマー鎖および該親水性ポリマー鎖に結合した標的結合部位を有する標的結合キャリアを、薬物キャリアとは別に含む。これらの実施形態において、該粒子はその粒子表面に標的結合部位を有しており、薬物キャリアは該粒子組成物に内包される薬物（例えば、生体高分子）と結合している。生体高分子と薬物キャリアとの結合は、例えば、生体高分子と上記カチオン含有基とのイオン結合であってもよく、ジスルフィド結合のような化学結合であってもよい。本明細書において、標的結合部位とは、生体およびウイルスに由来する物質に対し特異的に結合して当該物質と生物学的な結合対を形成し得る、生物学的な認識機能を有する部位をいう。
【００３３】
Ｂ−１．標的結合部位を有する薬物キャリア
標的結合部位を有する薬物キャリアは、薬物キャリアの親水性ポリマー鎖セグメント側の末端に、任意の連結基を介して結合した標的結合部位を有する。標的結合部位を有する薬物キャリアを用いることにより、標的となる所望の部位への薬物の到達性を向上できる。該標的結合部位は、例えば、標的結合部位を有する化合物を薬物キャリアの親水性ポリマー鎖側の末端に結合させることにより形成され得る。該標的結合部位を有する化合物としては、標的となる組織や目的に応じて、任意の化合物を結合させればよく、例えば、抗体若しくはその断片、またはその他の機能性若しくは標的指向性を有するタンパク質、ペプチド、アプタマー、ラクトースのような糖、葉酸といった生理活性物質が挙げられる。標的結合部位を有するポリマーユニットとして標的結合部位を有する薬物キャリアを用いる場合、該薬物キャリアが薬物と結合していてもよい。
【００３４】
具体的には、標的結合部位を有する薬物キャリアは、例えば、下記式（３）または（４）で表わされる：
【化３】
2012096399.tif 000005
（式中、Ａ、Ｒ２、Ｌ１、Ｌ３は上記式（１）および（２）と同じであり、Ｚは上記式（１）および（２）のポリアミノ酸セグメントを表し、ｌは１〜５の整数を表し、Ｄは標的結合部位を表す）。
【００３５】
上記薬物キャリアが有する標的結合部位（式（３）および（４）中のＤ）は、好ましくは重量平均分子量が５０〜２０，０００のペプチドであり、より好ましくは重量平均分子量が１００〜１０，０００のペプチドであり、さらに好ましくは重量平均分子量が１５０〜３，０００のペプチドである。
【００３６】
また、Ｄは１〜２００個のアミノ酸残基を有するペプチドであることが好ましく、１〜１００個のアミノ酸残基を有するペプチドであることがより好ましく、１〜３０個のアミノ酸残基を有するペプチドであることがさらに好ましい。
【００３７】
上記ペプチドとしては、例えば、血管新生や内膜肥厚、悪性腫瘍の増殖に関与するインテグリンと特異的に結合することができるペプチドが挙げられ、具体的には、ＲＧＤペプチドが挙げられる。ＲＧＤペプチドを標的結合部位として用いることにより、疾患部分を特異的に認識可能な粒子組成物および該粒子組成物を用いた医薬組成物が得られる。ここで、ＲＧＤペプチドとは、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を含むペプチドをいう。好ましくは、ＲＧＤペプチドは環状ＲＧＤ（ｃＲＧＤ）ペプチドである。式（３）および（４）で表わされるブロックコポリマーに含まれるｃＲＧＤペプチドとしては、具体的には下記式で表わされるペプチドが挙げられる。
【化４】
2012096399.tif 000006
【００３８】
上記標的結合部位と薬物キャリアの親水性ポリマーとの連結基としては、任意の適切な基を用いることができ、例えば、任意のアミノ酸残基が挙げられる。
【００３９】
標的結合部位を有する薬物キャリアの製造方法としては、任意の適切な方法を用いることができる。例えば、式（１）または（２）で表わされる薬物キャリアをあらかじめ調製し、親水性ポリマー側の末端をアセタール化し、システイン末端を有する所望の標的結合部位を有する化合物と酸性溶液中で混合してもよく、側鎖に特定の環状構造およびカチオン含有基を有していないポリアミノ酸と親水性ポリマーとのブロックコポリマーの親水性ポリマー側の末端をアセタール化し、システイン末端を有する所望の標的結合部位を有する化合物と酸性溶液中で混合して、親水性ポリマー末端に標的結合部位を結合させた後、ポリアミノ酸の側鎖に特定の環状構造およびカチオン含有基を置換または変換させてもよい。
【００４０】
Ｂ−２．標的結合キャリア
上記標的結合キャリアは、例えば、親水性ポリマー鎖および疎水性ポリマー鎖を有するブロックコポリマーの親水性ポリマー鎖に、標的結合部位を有する化合物を結合させることにより得られる。標的結合キャリアをさらに含む粒子組成物によれば、標的となる所望の部位への薬物の到達性を向上できることに加えて、薬物キャリアの分子量が数万以下となるよう設計することにより、標的部位に到達する前に粒子が崩壊した場合には、代謝により薬物キャリアを体外に排出することが可能となるために、正常細胞（非標的細胞）への無用な遺伝子導入とそれに起因した損傷を回避できる。該親水性ポリマー鎖セグメントおよび疎水性ポリマー鎖セグメントを有するブロックコポリマーとしては、具体的には、以下の式（Ｉ）または（ＩＩ）で表わされるブロックコポリマーが挙げられる。
【化５】
2012096399.tif 000007
一般式（Ｉ）および一般式（ＩＩ）において、Ｒ４及びＲ６は、それぞれ独立して、水素原子又はＲ１１（Ｒ１２）ＣＨ（ＣＨ２）k−で表される基を表し（ただし、Ｒ１１およびＲ１２は、ｉ）それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−６アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールＣ１−３オキシ基、シアノ基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−７アシルアミド基、トリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基、シロキシ基、シリルアミノ基である、ｉｉ）同一であって、Ｃ１−３アルキル基で置換されている若しくは未置換のエチレンジオキシ基又はプロピレンジオキシ基を形成する、またはｉｉｉ）それらが結合しているＣＨ基と一緒になってホルミル基を形成する）、ｋは０〜１０の整数であり、
Ｒ５は水素原子、飽和若しくは不飽和のＣ１〜Ｃ２９脂肪族カルボニル基またはアリールカルボニル基であり、
Ｒ７は水酸基、飽和若しくは不飽和のＣ１〜Ｃ３０脂肪族オキシ基またはアリール−低級アルキルオキシ基であり、
Ｒ８は−Ｏ−または−ＮＨ−であり、
Ｒ９は水素原子、フェニル基、ベンジル基、−（ＣＨ２)４−フェニル基、未置換のまたはアミノ基若しくはカルボニル基で置換されたＣ４〜Ｃ１６アルキル基、または、ステロール誘導体の残基であり、
Ｒ１０はメチレン基であり、
ｎは５５〜４，６００の範囲にある整数であり、
ｈは１０〜２００の範囲にある整数であり、
ｍは０〜２００の範囲にある整数であり（ただし、ｍが１以上である場合、（ＣＯＣＨＮＨ）のユニットと（ＣＯＲ１０ＣＨＮＨ）のユニットとの結合順、および、（ＮＨＣＨＣＯ）のユニットと（ＮＨＣＨＲ１０ＣＯ）の結合順は任意であり、ｍが２以上である場合、Ｒ９は１つのブロックコポリマー内の各アミノ酸ユニットにおいて各々独立に選択され、ランダムに存在するが、Ｒ９が水素原子である場合はＲ９全体の７５％以下である）、
ｉは１又は２であり、
Ｌ５は−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｏ−Ｍ１−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｍ１−Ｓ−Ｍ１−ＮＨ−（ここで、Ｍ１は独立してＣ１〜Ｃ６アルキレン基である）から選ばれる連結基であり、
Ｌ６は−ＯＣＯ−Ｍ２−ＣＯ−、および−ＮＨＣＯ−Ｍ２−ＣＯ−（ただし、Ｍ２はＣ１〜Ｃ６アルキレン基である）から選ばれる連結基である。
【００４１】
ｎは好ましくは１１０以上の整数であり、より好ましくは１８０以上の整数である。また、ｎは好ましくは４６０以下の整数であり、より好ましくは３４０以下の整数である。
【００４２】
ｈは好ましくは２０以上の整数である。また、ｈは好ましくは１００以下の整数であり、より好ましくは６０以下の整数である。
【００４３】
ｍは好ましくは１００以下の整数であり、より好ましくは６０以下の整数である。
【００４４】
標的結合部位を有する化合物としては、標的となる組織や目的に応じて、任意の標的結合部位を有する化合物を結合させればよく、例えば、Ｂ−１項で例示した化合物が挙げられる。上記標的結合キャリアの親水性ポリマー鎖セグメントと標的結合部位を有する化合物とは、直接結合していてもよく、任意の連結基を介して結合していてもよい。例えば、上記式（Ｉ）または（ＩＩ）で表わされるブロックコポリマーのＲ４またはＲ６がＲ１１（Ｒ１２）ＣＨ（ＣＨ２）ｋ−で表される基である場合、この基を介して標的結合部位を有する化合物と結合し得る。
【００４５】
正常細胞への無用な遺伝子導入とそれに起因した損傷を回避する観点から、標的結合キャリアとしては、薬物キャリアに比べて核酸との結合力が弱いブロックコポリマー（例えば、疎水性セグメント部分が電気的に中性またはアニオン性であるブロックコポリマー）であって、標的結合部位を有するキャリアを選択することが好ましい。
【００４６】
Ｃ．医薬組成物
本発明の医薬組成物は、上記粒子組成物および該粒子組成物に内包された薬物を含む。粒子組成物に含まれる薬物キャリアは、内包される薬物としての生体高分子と複合体（例えば、ＰＩＣ）を形成し得る。したがって、本発明の医薬組成物は、該複合体を含む。当該複合体は、カチオン含有基を有するアミノ酸セグメントによる作用を利用することで比較的容易に（例えば、生理条件下にて）形成できる。他方、カチオン含有基を有するアミノ酸セグメントを有しない薬物キャリア（例えば、環状構造を有するアミノ酸セグメントの割合が１００％である態様）であっても、形成環境を酸性条件下（例えば、ｐＨ５以下、また例えばｐＨ４以下）に設定することで、カチオン含有基による作用を利用せずに複合体を形成できる。
【００４７】
上記薬物としては、生理的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）の水性媒体中において正電荷より多くの負電荷を有するアニオン性化合物、および、該水性媒体中において負電荷より多くの正電荷を有するカチオン性化合物が挙げられる。上記薬物は、薬物キャリアと好適に複合体を形成し得るという点から、生体高分子が好ましい。本明細書において、生体高分子とは生体に由来する高分子及びこれと構造が類似する高分子をいい、具体的には、タンパク質、脂質および核酸が挙げられる。上記生体高分子は、好ましくはタンパク質および核酸からなる群より選択される少なくとも１種である。本明細書において、タンパク質はペプチドを含む。
【００４８】
上記核酸としては、プリンまたはピリミジン塩基、ペントース、リン酸からなるヌクレオチドを基本単位とするポリもしくはオリゴヌクレオチドを意味し、オリゴもしくはポリ二本鎖ＲＮＡ、オリゴもしくはポリ二本鎖ＤＮＡ、オリゴもしくはポリ一本鎖ＤＮＡおよびオリゴもしくはポリ一本鎖ＲＮＡを挙げることができる。また、同一の鎖にＲＮＡとＤＮＡが混在したオリゴもしくはポリ２本鎖核酸、オリゴもしくはポリ１本鎖核酸も含まれる。また核酸に含有されるヌクレオチドは天然型であっても、化学修飾された非天然型のものであっても良く、またアミノ基、チオール基、蛍光化合物などの分子が付加されたものであってもよい。限定されるものでないが、該核酸は、４〜２０，０００塩基、好ましくは１０〜１０，０００塩基、さらに好ましくは１８〜３０塩基からなるものであることができる。また、機能もしくは作用を考慮すると、プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸、アプタマーおよびリボザイムを挙げることができる。
【００４９】
上記核酸がｓｉＲＮＡである場合、上記粒子組成物とｓｉＲＮＡとの混合比は、任意の適切な比に設定することができる。例えば、粒子組成物を構成する薬物キャリア中のカチオン性基（実質的には、上記ポリアミノ酸セグメントに含まれる１〜４級アミノ基、アミジン基、イミジン基、上記（ｉ）〜（ｉｖ）で表わされる基）の総数（Ｎ）と核酸中のリン酸基の総数（Ｐ）との比（Ｎ／Ｐ比）が０．５〜１００であることが好ましく、０．５〜１０であることがより好ましく、１〜１０であることがさらに好ましい。Ｎ／Ｐ比が上記の範囲であれば、遊離のポリマーが少ない安定な複合体が調製され、生体内で高い発現率が得られる。なお、上記のカチオン性基（Ｎ）は、内包する核酸中のリン酸基と静電的に相互作用し、イオン結合を形成することができる基をいう。
【００５０】
上記複合体の大きさは、目的に応じて任意の適切な大きさに設定され得る。例えば、動的散乱測定法（ＤＬＳ）による平均粒子径が５ｎｍ〜２００ｎｍであることが好ましく、１０ｎｍ〜１００ｎｍであることがより好ましい。
【００５１】
薬物を内包した粒子組成物は、例えば、薬物キャリアと薬物との混合液を、超音波照射によるエネルギーをかけながら撹拌することにより調製できる。また、上記複合体は、例えば、ｓｉＲＮＡと粒子組成物とを任意のバッファー（例えば、Ｔｒｉｓバッファー）中で混合することにより調製することができる。上記混合工程は、ブロックコポリマーとｓｉＲＮＡとのイオン結合の前に、粒子組成物を構成するブロックコポリマーのみがジスルフィド結合を形成して凝集しないよう、十分な還元状態下で行うことが好ましい。還元条件は、例えば、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）を添加することにより調整することができる。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。なお、実施例における各特性の分析方法は、特に記載がない限り、以下の通りである。【００５３】
（１）核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲ）
核磁気共鳴装置（日本電子製、ＪＥＯＬ  ＡＬ３００  （３００ＭＨｚ））を用い、溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ６、測定温度：２５℃で行った。
（２）環状構造を有するアミノ酸セグメントおよびカチオン含有基を有するアミノ酸セグメントの含有率（イミノチオレイン置換率）の測定
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのリシンのβ−，γ−，δ−メチレンプロトン（（ＣＨ２）３、δ＝１．３〜１．９ｐｐｍ）とメルカプトプロピル基のトリメチレンユニット（ＨＳ−（ＣＨ２）３、δ＝２．１〜２．８ｐｐｍ）とのピーク強度比から算出した。
（３）ブロックコポリマーのポリアミノ酸セグメントの構造決定
（３−１）チオール基含有率の測定
実施例１で得られたブロックコポリマー溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１５ｍＭ  ＤＴＴを含有）中で３０分間室温で培養し、還元した。この溶液をナノセップ分離カラム（分画分子量：３０００）を用いて、遠心分離した。遠心分離後の溶液に、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液（５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有）を添加し、再度遠心分離を行った（濃縮／洗浄工程）。濃縮／洗浄工程を３回行い、最後の遠心分離後、濃縮したポリマー溶液を集め、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液（５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有）を添加し、希釈した。通過（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）画分も回収し、同様の処理を行った。これらの画分は氷の上に置き、エルマン試薬を添加するまで、液温が０〜４℃の状態を保持した。
処理後のポリマー画分および通過画分について、エルマン法により、波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定した。遊離チオール含量はグルタチオンの検量線と、ＤＴＴ残量で補正した通過画分中のチオール含有量を減じたポリマー画分中の最終チオール含有量により決定した。
（３−２）１級アミノ基含有率の測定
実施例１で得られたブロックコポリマー溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を０．１Ｍの重曹（ｐＨ  ８．２）で希釈し、リシンユニットモル濃度換算で０．０９ｍＭ（ＰＥＧ−ＰＬＬ）または０．９ｍＭ（実施例１）のポリマー溶液を得た。２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳＡ）溶液（ＭｅＯＨの５ｗｔ／ｖｏｌ％溶液）を０．１Ｍの重曹（ｐＨ  ８．２）で希釈し、０．３４ｍＭ  ＴＮＢＳＡ溶液を調製した。ポリマー溶液とＴＮＢＳＡ溶液を体積比２：１（ポリマー溶液：ＴＮＢＳＡ溶液）で混合し、３７℃で２時間培養した。培養後、サンプルを１５分間静置して室温に戻し、次いで３５４ｎｍでの吸光度を分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００）を用いて測定した。
（３−３）環状構造含有率の測定
得られたブロックコポリマーのユニット数から、（３−１）で得られたチオール基含有率および（３−２）で得られた１級アミノ基含有率を減ずることにより算出した。【００５４】
［合成例１］アセタール−ポリエチレングリコール−ポリ（Ｌ−リシン）ブロック共重合体（アセタール−ＰＥＧ−ＰＬＬ）の合成
平均分子量１２，０００のアセタール−ＰＥＧ−ＮＨ２１．２０ｇとチオ尿素２．９０ｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１８ｍＬに溶解した。次いで、ε−トリフルオロアセチル−Ｌ−リシンのＮ−カルボン酸無水物（Ｌｙｓ（ＴＦＡ）−ＮＣＡ、アセタール−ＰＥＧ−ＮＨ２の５０当量）１．３４ｇをＤＭＦ２０．１ｍＬに溶解した溶液を加え、２０℃で２日間反応させた。反応溶液をジエチルエーテル−メタノール（１５／１）の混合溶媒６００ｍＬに滴下し、白色沈殿を得た。さらに沈殿をメタノールに溶解しジエチルエーテル中に滴下することを２回繰り返した。得られた白色沈殿をろ過して真空乾燥し、アセタール−ＰＥＧ−ＰＬＬ（ＴＦＡ）２．２２ｇを得た。
得られたアセタール−ＰＥＧ−ＰＬＬ（ＴＦＡ）２．００ｇをメタノール２００ｍＬに溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液２０ｍＬを加えて３５℃で１２時間反応させた。反応溶液を透析チューブ（フナコシ（株）製、スペクトラ／ポア、分画分子量６，０００〜８，０００）に入れ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｉｎ  １０ｍＭ  リン酸緩衝溶液  ｐＨ７．４を外液として４回、続いて純水を外液として３回透析を行い、透析膜内液を回収し、凍結乾燥し、アセタール−ＰＥＧ−ＰＬＬ  １．６３ｇを白色固体として得た。得られた化合物が目的物であることを１Ｈ−ＮＭＲにより確認した。得られたアセタール−ＰＥＧ−ＰＬＬのポリリシンセグメントの重合度は４５であった。【００５５】
［合成例２］ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬＬの合成
ｃＲＧＤペプチド  ２６．２ｍｇ（アセタール−ＰＥＧ−ＰＬＬに対し５倍当量）を１０ｍＭリン酸塩  １ｍＬ（ｐＨ７．４）に溶解した。次いで、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）  ５ｍｇ（ｃＲＧＤペプチドに対し１当量）を加えて、２５℃で３０分間撹拌し、ｃＲＧＤペプチドを還元した。別の容器に、合成例１で得られたアセタール−ＰＥＧ-ＰＬＬ  １２５ｍｇ（１当量）を０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解し、還元したｃＲＧＤペプチド溶液を撹拌しながら滴下した。反応は撹拌しながら、２５℃で４日間行った。反応溶液を透析チューブ（フナコシ（株）製、スペクトラ／ポア、分画分子量：６−８Ｋ）に移し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｉｎ  １０ｍＭ  リン酸緩衝溶液  ｐＨ７．４で２日間、次いで、蒸留水で２日間透析した。透析後、フィルター（日本ミリポア社、ＳｔｅｒｉｖｅｘＴＭ  ＧＰ  ０．２２μｍ）で処理した後、凍結乾燥し、ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬＬの白色粉末を得た（収量：１１２ｍｇ、収率８６％）。ＰＥＧ−ＰＬＬに結合したｃＲＧＤペプチドの量は、１Ｈ−ＮＭＲにより測定したｃＲＧＤペプチドのフェニルＣＨタンパクのピークとＰＥＧのＣＨ２主鎖ピークとの積分比から算出した。得られたｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬＬのｃＲＧＤの導入率は６０％であった。【００５６】
［実施例１］ＰＥＧ−ＰＬＬ（Ｎ２ＩＭ／ＩＭ）の合成
反応容器に、合成例１で得られたアセタール−ＰＥＧ−ＰＬＬ  ８９ｍｇおよび５ｗｔ／ｖｏｌ％ＬｉＣｌ含有Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）  ２ｍＬを加えた。反応容器をアルゴンで満たした後、セプタムで栓をした。反応容器を加熱しながら撹拌し、アセタール−ＰＥＧ−ＰＬＬを完全に溶解した。次いで、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）  １７８μＬ（ＰＬＬのリシン中のアミンの５当量）をアルゴン下で、セプタムを通して溶液に加えた。
アルゴン存在下で、別の容器に、２−イミノチオレイン塩化物１７２ｍｇを５ｗｔ／ｖｏｌ％ＬｉＣｌおよび２５０ｍＭのＤＩＰＥＡ（２−イミノチオレインに対して１当量）を含むＮＭＰ５ｍＬに溶解し、２５０ｍＭの２−イミノチオレイン溶液を調製した。アルゴン存在下で、アセタール−ＰＥＧ−ＰＬＬ溶液に、得られた２−イミノチオレイン溶液（ＰＬＬのリシン中のアミンに対して２．６当量）２．１５ｍＬを撹拌しながら滴下し、２５℃で１８時間反応させた。反応後、反応溶液の１０倍量超の乾燥ジエチルエーテル中で沈殿させ、反応を終了させた。沈殿物をエーテルで数回洗浄し、真空下で恒量まで乾燥し、粗生成物を得た。得られた粗生成物を１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｉｎ  １０ｍＭ  リン酸緩衝溶液  ｐＨ６．０に溶解した後、透析チューブ（フナコシ（株）製、スペクトラ／ポア７、分画分子量：１０ｋＤａ）に移し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｉｎ  １０ｍＭ  リン酸緩衝溶液  ｐＨ６．０で１日（外液を３回交換）、蒸留水で１日（外液を３回交換）透析した。透析後、フィルター（日本ミリポア社、ＳｔｅｒｉｖｅｘＴＭ  ＧＰ  ０．２２μｍ）で処理した後、凍結乾燥し、アセタール−ＰＥＧ−ＰＬＬ（Ｎ２ＩＭ／ＩＭ）の白色粉末を得た（収量９９ｍｇ、収率８５％）。得られたＰＥＧ−ＰＬＬ（Ｎ２ＩＭ／ＩＭ）のイミノチオレイン置換率は９５％であった。得られたブロックコポリマーのイミノチオレイン置換率および環状構造含有率を表１に示す。【００５７】
［実施例２］ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬＬ（Ｎ２ＩＭ／ＩＭ）の合成
反応容器に、合成例２で得られたｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬＬ  ５５ｍｇ（１当量）および５ｗｔ／ｖｏｌ％ＬｉＣｌ含有ＮＭＰ  ５ｍＬを加えた。反応容器をアルゴンで満たした後、セプタムで栓をした。反応容器を加熱しながら撹拌し、ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬＬを完全に溶解した。次いで、ＤＩＰＥＡ  ２５２μＬ（ＰＬＬに含まれるリシン中のアミンの１１．８当量）をアルゴン下で、セプタムを通して溶液に加えた（溶液１）。アルゴン存在下で、別の容器に、２−イミノチオレイン塩化物  １０６ｍｇを５ｗｔ／ｖｏｌ％ＬｉＣｌ含有ＮＭＰ  ７．８６ｍＬとＤＩＰＥＡ  １３４μＬ（２−イミノチオレインに対して１当量）に溶解し、９６ｍＭの２−イミノチオレイン溶液を調製した（溶液２）。アルゴン存在下で、溶液１（ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬＬ溶液）に、得られた溶液２（２−イミノチオレイン溶液、ＰＬＬのリシン中のアミンに対して２．３５当量）３ｍＬを撹拌しながら滴下し、２５℃で１８時間反応させた。反応後、反応溶液の１０倍量超の乾燥ジエチルエーテル中で沈殿させ、反応を終了させた。沈殿物をエーテルで数回洗浄し、真空下で恒量まで乾燥し、粗生成物を得た。得られた粗生成物を１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｉｎ  １０ｍＭ  リン酸緩衝溶液  ｐＨ６．０に溶解した後、透析チューブ（フナコシ（株）製、スペクトラ／ポア７、分画分子量：１０ｋＤａ）に移し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｉｎ  １０ｍＭ  リン酸緩衝溶液  ｐＨ６．０で１日（外液を３回交換）、蒸留水で１日（外液を３回交換）透析した。透析後、フィルター（日本ミリポア社、ＳｔｅｒｉｖｅｘＴＭ  ＧＰ  ０．２２μｍ）で処理した後、凍結乾燥し、ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬＬ（Ｎ２ＩＭ／ＩＭ）の白色粉末を得た（収量６１ｍｇ、収率８５％）。得られたｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬＬ（Ｎ２ＩＭ／ＩＭ）のイミノチオレイン置換率は９５％であった。得られたブロックコポリマーのイミノチオレイン置換率および環状構造含有率を表１に示す。なお、環状構造置換率は、実施例１のブロックコポリマーにおけるチオール基含有率と環状構造含有率との比（１：９）から、イミノチオレイン置換率を０．９倍した値として算出した。【００５８】
［実施例３］ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬＬ（Ｎ２ＩＭ／ＩＭ）の合成
合成例２で得られたｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬＬ（２６．２ｍｇ）とＤＩＰＥＡ（５８．０μＬ、ＰＬＬに含まれるリシン中のアミンの５．７当量）を５ｗｔ／ｖｏｌ％ＬｉＣｌ含有ＮＭＰ（２．７ｍＬ）に溶解し（溶液１）、また別途に２−イミノチオレイン塩化物量（１８７．６ｍｇ）とＤＩＰＥＡ（２３８μＬ）を５ｗｔ／ｖｏｌ％ＬｉＣｌ含有ＮＭＰ（９．７６ｍＬ）に溶解した後に、溶液の一部を１／３に希釈し、４５．０ｍＭの２−イミノチオレイン溶液を調製し（溶液２）、１ｍＬの溶液２（ＰＬＬのリシン中のアミンに対して０．７８当量）を２．７ｍＬの溶液１に滴下したこと以外は、実施例２と同様にして、白色粉末を得た（収量２７．３ｍｇ、収率＞９５％）。得られたｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬＬ（Ｎ２ＩＭ／ＩＭ）のイミノチオレイン置換率を実施例２と同様にして算出した。得られたｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬＬ（Ｎ２ＩＭ／ＩＭ）のイミノチオレイン置換率は４５％であった。得られたブロックコポリマーのイミノチオレイン置換率および環状構造含有率を表１に示す。【００５９】
（比較例１）ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬＬ（Ｎ２ＩＭ／ＩＭ）の合成
合成例２で得られたｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬＬ（２５．７ｍｇ）とＤＩＰＥＡ（４９．８μＬ、ＰＬＬに含まれるリシン中のアミンの５当量）を５ｗｔ／ｖｏｌ％ＬｉＣｌ含有ＮＭＰ（２．６ｍＬ）に溶解し（溶液１）、また別途に２−イミノチオレイン塩化物量（１８７．６ｍｇ）とＤＩＰＥＡ（２３８μＬ）を５ｗｔ／ｖｏｌ％ＬｉＣｌ含有ＮＭＰ（９．７６ｍＬ）に溶解した後に、溶液の一部を１／１０に希釈し、１３．６ｍＭの２−イミノチオレイン溶液を調製し（溶液２）、１ｍＬの溶液２（ＰＬＬのリシン中のアミンに対して０．２４当量）を２．６ｍＬの溶液１に滴下したこと以外は、実施例２と同様にして、白色粉末を得た（収量２７．３ｍｇ、収率＞９５％）。得られたｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬＬ（Ｎ２ＩＭ／ＩＭ）のイミノチオレイン置換率を実施例２と同様にして算出した。得られたｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬＬ（Ｎ２ＩＭ／ＩＭ）のイミノチオレイン置換率は１５％であった。得られたブロックコポリマーのイミノチオレイン置換率および環状構造含有率を表１に示す。【００６０】
（比較例２）ＰＥＧ−ＰＬＬ（ＤＴＢＰ）の合成
反応容器に、合成例１で得られたアセタール−ＰＥＧ−ＰＬＬ３００ｍｇおよび１００ｍＭのボロン酸緩衝液（ｐＨ９．０）６０ｍＬを加えた。得られたポリマー溶液に、ジメチル３、３’ジチオビスプロピオンイミデート２塩酸塩（ＤＴＢＰ）４３９ｍｇ（リシンユニットに対して２当量）を溶解した。室温で撹拌しながら４５分反応させた後、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット（分画分子量：３．５ｋＤａ）に移し、１５０ｍＭのＮａＣｌ  ｉｎ  １０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に対して１．５時間の透析処理を行った。透析後、ＤＴＴ３００ｍｇを添加した。室温での３０分の反応の後、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット（分画分子量：３．５ｋＤａ）に移し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｉｎ  １０ｍＭ  リン酸緩衝溶液  ｐＨ６．０に対して１．５時間、純水に対して１．５時間の透析処理を行った。透析後、フィルター（日本ミリポア社、ＳｔｅｒｉｖｅｘＴＭ  ＧＰ  ０．２２μｍ）で処理した後、凍結乾燥し、アセタール−ＰＥＧ−ＰＬＬ（ＤＴＢＰ）の白色粉末を得た（収量２９９ｍｇ、収率７３％）。得られたＰＥＧ−ＰＬＬ（ＤＴＢＰ）のＤＴＢＰ置換率は９５％であった。得られたブロックコポリマーのイミノチオレイン置換率および環状構造含有率を表１に示す。【００６１】
【表１】
2012096399.tif 000008
【００６２】
《試験例１：複合体の調製》
後述する複合体の調製に用いたｓｉＲＮＡは、以下のとおりである。Ｃｙ５のような標識は、全てセンス鎖の５’末端に導入した。これらｓｉＲＮＡは、北海道システムサイエンス株式会社を通じて入手できる。
（１）ＧＬ３-ｓｉＲＮＡ（ホタルルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ）：
センス鎖：５’−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ−３’（配列番号１）
アンチセンス鎖：５’−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｄＴｄＴ−３’（配列番号２）
（２）ｓｃｒａｍｂｌｅ-ｓｉＲＮＡ（非治療用配列ｓｉＲＮＡ）：
センス鎖：５’−ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵｄＴｄＴ−３’（配列番号３）
アンチセンス鎖：５’−ＡＣＧＵＧＡＣＡＣＧＵＵＣＧＧＡＧＡＡｄＴｄＴ−３’（配列番号４）
（３）ｈＶＥＧＦ-ｓｉＲＮＡ（ヒト血管内皮成長因子に対するｓｉＲＮＡ）：
センス鎖：５’−ＧＡＵＣＵＣＡＵＣＡＧＧＧＵＡＣＵＣＣｄＴｄＴ−３’（配列番号５）
アンチセンス鎖：５’−ＧＧＡＧＵＡＣＣＣＵＧＡＵＧＡＧＡＵＣｄＴｄＴ−３’（配列番号６）
（４）ｍＶＥＧＦＲ２−ｓｉＲＮＡ（マウス血管内皮成長因子に対するｓｉＲＮＡ）：
センス鎖：５’−ＡＵＧＣＧＧＣＧＧＵＧＧＵＧＡＣＡＧＵｄＴｄＴ−３’（配列番号７）
アンチセンス鎖：５’−ＡＣＵＧＵＣＡＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＡＵｄＴｄＴ−３’（配列番号８）【００６３】
実施例１で得られたＰＥＧ−ＰＬＬ（Ｎ２ＩＭ／ＩＭ）、実施例２〜３および比較例１で得られたｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬＬ（Ｎ２ＩＭ／ＩＭ）、比較例２で得られたＰＥＧ−ＰＬＬ（ＤＴＢＰ）ならびに比較例３としてＰＬＬ側鎖が未修飾のｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬＬ（合成例２で調製したブロックコポリマー）を濃度が５ｍｇ／ｍＬとなるよう、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。次いで、ＤＴＴ濃度３０．５４ｍｇ／ｍＬの１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）と混合し、Ｎ／Ｐ比が１〜８となるよう濃度を調製し、室温で３０分間静置した。ｓｉＲＮＡを１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、１５μＭのｓｉＲＮＡ溶液を調製した。ｓｉＲＮＡ溶液とＰＥＧ−ＰＬＬ（Ｎ２ＩＭ／ＩＭ）溶液、ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬＬ（Ｎ２ＩＭ／ＩＭ）溶液、ＰＥＧ−ＰＬＬ（ＤＴＢＰ）溶液、または、ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬＬ溶液とをそれぞれ体積比で２：１で混合し、２５℃で２４時間静置した。得られた溶液をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット（分画分子量：３．５ｋＤａ）で５ｖ／ｖ％のＤＭＳＯ含有１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．４）で２日間、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．４）で２日間透析し、ブロックコポリマーとｓｉＲＮＡの複合体であるｓｉＲＮＡ内包ミセルを得た。ここでの「Ｎ／Ｐ比」とは、［ブロックコポリマー中のポリアミノ酸ユニット濃度］／［核酸中のリン酸基濃度］を意味する。作製したｓｉＲＮＡ内包ミセルについて、表２に示す。【００６４】
【表２】
2012096399.tif 000009
【００６５】
≪試験例２：ｓｉＲＮＡ内包ミセルの物性評価≫
ｓｉＲＮＡ内包ミセル１について、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を用いて、動的光散乱法（ＤＬＳ）により、ｓｉＲＮＡ内包ミセルの多分散度（ＰＤＩ）、キュムラント粒径、粒子径分布のヒストグラム測定を行った。粒子径分布のヒストグラムは付属のソフトウェアにより決定した。粒子径分布のヒストグラムを図１に示す。【００６６】
ｓｉＲＮＡ内包ミセル１をＤＬＳ分析した結果、キュムラント粒径は４１ｎｍであった。また、ＰＤＩは０．０９であり、単分散な粒子が得られた。【００６７】
≪試験例３：ｓｉＲＮＡ内包ミセルの安定性評価≫
ｓｉＲＮＡ内包ミセル５と目的とする濃度のＮａＣｌ溶液（ＮａＣｌ濃度：１５０ｍＭ、３００ｍＭ、６００ｍＭ）とを体積比１：１で混合し、３７℃で２４時間培養した。培養後の溶液について、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を用いて、散乱光強度を測定した。ｓｉＲＮＡ内包ミセルＣ−２についても、同様にして、散乱光強度を測定した。各ＮａＣｌ濃度での散乱光強度を図２に示す。【００６８】
通常、ＰＩＣミセルは、イオン強度が高くなるのに伴い解離するため、イオン強度の上昇に伴い、散乱光強度が低下する。ｓｉＲＮＡ内包ミセル５は、高イオン強度下（ＮａＣｌ濃度：６００ｍＭ）においても散乱光強度の低下が少なくｓｉＲＮＡ内包ミセルが安定した構造を有していた。一方、環状構造を有していないブロックコポリマーを用いたｓｉＲＮＡ内包ミセルＣ−２は、イオン強度が上昇するに従い、散乱光強度が低下した。【００６９】
≪試験例４：細胞内ｓｉＲＮＡ取り込み量評価≫
６ｗｅｌｌディッシュに５００００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにＨｅＬａ細胞をまき、１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ培地を用いて、インキュベーターで２４時間培養した。培地を新しい１０％牛胎児血清ＤＭＥＭ培地に交換し、Ｃｙ５−ｓｉＲＮＡが３００ｎＭ／ｗｅｌｌとなるよう、ｓｉＲＮＡ内包ミセル１〜２およびＣ−１を培地に添加した。インキュベーターで３７℃で２時間培養した後、細胞を１ｍＬのＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で細胞をディッシュからはがした。はがした細胞をＣｙ５フィルターをセットしたフローサイトメーター（ＢＤ社製、ＬＳＲＩＩ）を用いてヒストグラム解析を行い、細胞内へのｓｉＲＮＡの取り込み量を評価した。細胞内へのｓｉＲＮＡ取り込み量を示すグラフを図３に示す。【００７０】
いずれのｓｉＲＮＡ内包ミセルも内包するｓｉＲＮＡの細胞内への移行が確認された。ここで、環状構造の含有率が４０％以上であるブロックコポリマーを用いたｓｉＲＮＡ内包ミセルは、顕著に高い強度を示しており、細胞内への移行性が特に優れていた。【００７１】
≪試験例５：ＲＮＡｉ活性評価≫
３５ｍｍシャーレに５００００ｃｅｌｌｓとなるようルシフェラーゼ発現ＨｅＬａ（ＨｅＬａ−Ｌｕｃ）細胞をまき、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いてインキュベーターで２４時間培養した。培地を新しい１０％牛胎児血清ＤＭＥＭ培地に交換し、ｓｉＲＮＡ内包ミセル１〜２、Ｃ−１およびＲ−１（１０μＭ  ｓｉＲＮＡ含有）をｓｉＲＮＡが２００ｎＭとなるよう培地に添加し、次いでルシフェリン基質を１００μＭとなるよう添加した。比較のため、ｎａｋｅｄ  ＧＬ３ｓｉＲＮＡを２００ｎＭとなるよう培地に添加し、次いでルシフェリン基質を１００μＭとなるよう添加した。リアルタイム細胞発光測定装置（Ａｔｔｏ社製、クロノス)を用いて、ルシフェラーゼ発光量を定量し、ＲＮＡｉ活性を評価した。得られた発光量を、ｎａｋｅｄ  ｓｉＲＮＡおよびミセル溶液を投与していないシャーレの発光量を１として相対値で表わした結果を図４に示す。なお、ｓｉＲＮＡ内包ミセルＲ−１は、内包するｓｉＲＮＡが非治療目的のｓｉＲＮＡである以外はｓｉＲＮＡ内包ミセル１と同じである。【００７２】
ｓｉＲＮＡ内包ミセル１〜２は、高いＲＮＡｉ活性を示した。このように環状構造の含有率が４０％以上であるブロックコポリマーを用いたｓｉＲＮＡ内包ミセルは、相対的に高いＲＮＡｉ活性を示した。【００７３】
≪試験例６：ｓｉＲＮＡ内包ミセルの血中動態≫
ｓｉＲＮＡ内包ミセル１〜２、Ｃ−１、Ｃ−３（１０μＭ  ｓｉＲＮＡ）を投与量が２０μｇ  Ｃｙ５−ｓｉＲＮＡとなるようマウス(Ｂａｌｂ／ｃ  ヌードマウス、メス、６週齢）の尾静脈から投与した。比較のため、ｎａｋｅｄ  Ｃｙ５−ＧＬ３ｓｉＲＮＡを投与量が２０μｇとなるよう、マウス(Ｂａｌｂ／ｃ  ヌードマウス、メス、６週齢）の尾静脈から投与した。高速レゾナントスキャナー搭載Ｉｎ  ｖｉｖｏ共焦点イメージングシステム(Ｎｉｋｏｎ  Ａ１Ｒ、ニコン社製)を用いて、マウスの耳血管内でのミセルの血中動態を経時的に観察した。投与１分後、３分後、１０分後のミセルの血中動態を示す写真を図５に示す。【００７４】
投与１分後には、全てのマウスでｓｉＲＮＡが確認された。環状構造の含有率が高いブロックコポリマーを用いたｓｉＲＮＡ内包ミセル１は、投与後１０分であっても血液中にｓｉＲＮＡ内包ミセルが安定して存在していた。【００７５】
≪試験例７：抗腫瘍性評価≫
＜治療群＞
皮下にＧＦＰ発現ＨｅＬａ（ＨｅＬａ−ＧＦＰ）を移植した担がんマウス（Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス、メス、８週齢、ｎ＝４）に、１回当たりの投与量が２０μｇ  ｓｉＲＮＡとなるよう、ｓｉＲＮＡ内包ミセルを尾静脈から投与した。投与スケジュールは、ｓｉＲＮＡ内包ミセル３を投与開始日、４日後、８日後に、ｓｉＲＮＡ内包ミセル４を１日後、５日後、９日後にそれぞれ投与した。投与後、経時的に腫瘍の大きさ（Ｖ＝ａ×ｂ２／２、ａ＝長軸長、ｂ＝短軸長）を計測した。投与開始時の腫瘍の大きさに対する相対的な大きさとして表わしたグラフおよび投与開始後１２日経過後の腫瘍の状態を撮影した写真を図６に示す。【００７６】
＜対照群１＞
投与開始日、１日後、４日後、５日後、８日後、９日後にｓｉＲＮＡ内包ミセルＲ−１を投与した以外は、治療群と同様にして、皮下にＨｅＬａ−ＧＦＰを移植した担がんマウス（Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス、メス、８週齢、ｎ＝４）に投与した。投与開始時の腫瘍の大きさに対する相対的な大きさを表わしたグラフおよび投与開始後１２日経過後の腫瘍の状態を撮影した写真を図６に示す。【００７７】
＜対照群２＞
ｎａｋｅｄ  ｍＶＥＧＦ−Ｒ２ｓｉＲＮＡを投与開始日、４日後、８日後に、ｎａｋｅｄ  ｈＶＥＧＦｓｉＲＮＡを１日後、５日後、９日後にそれぞれ、１回当たりの投与量が２０μｇ  ｓｉＲＮＡとなるよう投与した以外は、治療群と同様にして、皮下にＨｅＬａ−ＧＦＰを移植した担がんマウス（Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス、メス、８週齢、ｎ＝４）に投与した。投与開始時の腫瘍の大きさに対する相対的な大きさを表わしたグラフを図６に示す。【００７８】
＜ブランク群＞
投与開始日、１日後、４日後、５日後、８日後、９日後にＨＥＰＥＳ  ２００μＬを投与した以外は、治療群と同様にして、皮下にＨｅＬａ−ＧＦＰを移植した担がんマウス（Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス、メス、８週齢、ｎ＝４）に投与した。投与開始時の腫瘍の大きさに対する相対的な大きさを表わしたグラフおよび投与開始後１２日経過後の腫瘍の状態を撮影した写真を図６に示す。【００７９】
治療群のマウスでは、明らかな抗腫瘍効果が認められた。非治療用ｓｉＲＮＡを内包するｓｉＲＮＡ内包ミセルＲ−１を用いた対照群１およびｎａｋｅｄ  ｓｉＲＮＡを投与した対照群２では、抗腫瘍効果が認められなかった。【００８０】
≪試験例８：腫瘍集積性評価≫
ｓｉＲＮＡ内包ミセル１および５（１０μＭ  ｓｉＲＮＡ含有）を投与量が５０μｇ  Ｃｙ５−ＧＬ３ｓｉＲＮＡとなるよう、皮下にＧＦＰ発現ＨｅＬａ（ＨｅＬａ−ＧＦＰ）を移植した担がんマウス（Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス、メス、８週齢）に尾静脈から投与した。投与２４時間後のがん組織（血管周辺部およびがん細胞）を、高速レゾナントスキャナー搭載Ｉｎ  ｖｉｖｏ共焦点イメージングシステム（Ｎｉｋｏｎ  Ａ１Ｒ、ニコン社製)を用いて、ｓｉＲＮＡ内包ミセルの集積状況を観察した。その後、がん組織を摘出し、Ｃｙ５用フィルターを用いてＩＶＩＳイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ社製）にて、ｓｉＲＮＡ内包ミセルの集積状況を観察した。Ｉｎ  ｖｉｖｏ共焦点イメージングシステム画像を図７に、ＩＶＩＳイメージングシステム画像を図８に示す。【００８１】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ共焦点イメージングシステムで観察したところ、ｃＲＧＤが表面に配置されたｓｉＲＮＡ内包ミセル１は、腫瘍血管およびがん細胞に集積していた。摘出したがん細胞のＩＶＩＳイメージシステムによる観察でも、がん細胞へのｓｉＲＮＡ内包ミセルの集積性が高かった。標的結合部位を有するｓｉＲＮＡ内包ミセルは、標的結合部位を有さないｓｉＲＮＡ内包ミセルよりも腫瘍血管およびがん細胞に集積しやすいことが確認された。【００８２】
≪試験例９：Ｇ−ＣＳＦ内包率≫
ブロックコポリマー（ポリリシンセグメントの重合度４５、イミノチオレイン置換率９１％、環状構造含有率９８％）を、約１０ｍｇスピッツ管に秤量し、ポリマー濃度が５ｍｇ／ｍＬになるよう精製水を加え、室温にて溶解し、ポリマー溶液を得た。該ポリマー溶液をバイオディスラプター（日本精機製作所製、Ｈｉｇｈ  Ｐｏｗｅｒ  Ｕｎｉｔ）を用いて、超音波照射（氷浴中、Ｌｏｗ、１．５秒間欠、１５分）し、次いで、０．２２μｍメンブレンフィルター処理した。これにより、５ｍｇ／ｍＬのポリマー濃度の空ミセル溶液を得た。この空ミセル溶液（０．０９ｍＬ）に、ポリマーに対して５％（ｗ/ｗ）になるよう０．３ｍｇ／ｍＬのＧ−ＣＳＦ溶液（０．０７５ｍＬ）、２００ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５)（０．０３ｍＬ）、５０％スクロース溶液（０．０３ｍＬ）および精製水を加え、最終的に１．５ｍｇ／ｍＬのポリマー濃度、０．０７５ｍｇ／ｍＬのＧ−ＣＳＦ濃度、２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）の組成になるよう、０．１Ｎ  ＨＣｌ（０．０５ｍＬ）で調整した。この溶液を２、３度転倒撹拌した後、４℃にて一晩静置した。このように調製したＧ−ＣＳＦ内包ミセルを用い、以下のような電気泳動にてＧ−ＣＳＦの内包率を測定した。【００８３】
＜Ｇ−ＣＳＦ内包率の測定方法＞
サンプルバッファー（バイオ・ラッドラボラトリーズ社製、Ｎａｔｉｖｅ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃａｔ＃１６１−０７３８、Ｌｏｔ＃３１０００７９９０））とＧ−ＣＳＦ内包ミセルを１：１（ｖ／ｖ）で混合し、泳動ゲル（バイオ・ラッドラボラトリーズ社製、Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）  ＴＧＸＴＭ  Ｐｒｅｃａｓｔ  Ｇｅｌｓ（４−２０％、１２ｗｅｌｌ  ｃｏｍｂ、Ｃａｔ＃４５６−１０９５））のウェルの底に静かに１０μＬアプライした。なお、マーカー（バイオ・ラッドラボラトリーズ社製、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｃａｔ＃１６１０３６３、Ｌｏｔ＃３１０００８９５０)）は５μＬアプライした。次いで、以下の条件で泳動し、シェーカーで緩やかに振とうしながら染色液（バイオ・ラッドラボラトリーズ社製、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ２５０  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃａｔ＃１６１−０４３６、Ｌｏｔ＃２１０００７０３９)）に約１５分浸し、次いで脱色液（１０％酢酸／４０％メタノール）に約１０分間浸した。【００８４】
（電気泳動条件）
泳動装置：Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（バイオ・ラッドラボラトリーズ社製）
泳動バッファー（Ｎａｔｉｖｅ)：１０×Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃａｔ＃１６１−０７３４、バイオ・ラッドラボラトリーズ社製)、１×組成：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）、１９２ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ
電圧：２００Ｖ、泳動時間：３０分【００８５】
次いで、該泳動ゲルを水中へ移動・保存し、白色ライトで照らしながら、泳動ゲルを撮影（カメラ：ＴＶ  ＺＯＯＭＬＥＮＳ  ８．５−５１ｍｍ  Ｆ１．２、絞り１５〜２０（ＶＩＬＢＥＲ  ＬＯＵＲＭＡＴ社製）、撮影機：ＤＰ−００１．ＦＤＣ（ＶＩＬＢＥＲ  ＬＯＵＲＭＡＴ社製））した。画像解析ソフトＩｍａｇｅＪ（Ｖｅｒ．１．４２ｑ）でゲル上のバンド中の濃度を解析し、下式からＧ−ＣＳＦの内包率を求めた。当該内包率は１００％であった。このように、本発明の粒子組成物は、タンパク質のキャリアとしても適用できる。
Ｇ−ＣＳＦ内包率（％）＝（１−検出されたバンドのＧ−ＣＳＦ量／総Ｇ−ＣＳＦ量（泳動ゲルにアプライした理論量））×１００
【図１】
2012096399.tif 000012
【図２】
2012096399.tif 000013
【図３】
2012096399.tif 000014
【図４】
2012096399.tif 000015
【図５】
2012096399.tif 000016
【図６】
2012096399.tif 000017
【図７】
2012096399.tif 000018
【図８】
2012096399.tif 000019
【配列表】
2012096399000001.app
【国際調査報告】
2012096399.tif 000020
2012096399.tif 000021