(57)【要約】ARIA遺伝子のプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を組み込んでなるインスリン感受性の低下に起因する疾患の予防または治療剤あるいは肥満抑制物質の探索のための、あるいは肥満誘導物質の探索のための細胞。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ARIA遺伝子のプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を組み込んでなるインスリン感受性の低下に起因する疾患の予防または治療剤あるいは肥満抑制物質の探索のための、あるいは肥満誘導物質の探索のための細胞。
【請求項２】
ARIA遺伝子を導入することによりARIAを過剰発現することを特徴とする、細胞。
【請求項３】
ARIAの過剰発現により、ARIAとPTENの結合が増大することを特徴とする、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
ARIAタンパク質とPTENタンパク質の結合を検出することができる、インスリン感受性の低下に起因する疾患の予防または治療剤あるいは肥満抑制物質の探索のための、あるいは肥満誘導物質の探索のための細胞。
【請求項５】
ARIAタンパク質とPTENタンパク質の両方に、両者が相互作用すると蛍光を発する若しくは消光するタンパク質を各々融合したことを特徴とする請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
ARIA遺伝子が過剰発現することを特徴とするインスリン感受性の低下に起因する疾患のモデル動物。
【請求項７】
前記モデル動物がトランスジェニックマウスである、請求項６に記載のモデル動物。
【請求項８】
ARIA遺伝子の発現量の増減を指標とする、インスリン感受性の低下に起因する疾患の予防または治療剤、あるいは肥満抑制物質、肥満誘導物質、肥満しやすい非ヒト動物のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載の細胞に候補物質を作用させ、ARIA遺伝子の発現量が低下した場合にインスリン感受性の低下に起因する疾患の予防または治療剤若しくは肥満抑制物質であると評価する、請求項８に記載のインスリン感受性の低下に起因する疾患の予防または治療剤若しくは肥満抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれかに記載の細胞に候補物質を作用させ、ARIA遺伝子の発現量が上昇した場合に肥満誘導物質であると評価する、請求項８に記載の肥満誘導物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項６〜７のいずれかに記載のモデル動物に候補物質を作用させ、インスリン感受性の変化を評価することを特徴とするインスリン感受性の低下に起因する疾患の予防または治療剤、あるいは肥満抑制物質、肥満誘導物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
非ヒト動物のARIA遺伝子の発現量を測定する工程、ARIA遺伝子の発現量が高い場合に肥満しやすいと評価することを特徴とする、肥満しやすい非ヒト動物のスクリーニング方法。
【請求項１３】
ARIA遺伝子をノックアウトした、肥満誘導物質の探索のためのモデル動物。
【請求項１４】
被験体のサンプル中のARIAタンパク質の発現量を検出する工程、該発現量を指標としてインスリン感受性を評価する工程を有することを特徴とする、インスリン感受性の低下に起因する疾患の検出方法。
【請求項１５】
前記サンプルが血液、血清、血漿、尿、涙液、唾液からなる群から選ばれるいずれか、好ましくは血漿または血清である、請求項14に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2011年1月20日に出願した特願2011-9375の優先権を主張し、その明細書全体は、本明細書に参考として援用する。【０００２】
本発明は、肥満、メタボリック症候群の予防・治療薬あるいは肥満誘導物質、肥満しやすい非ヒト動物のスクリーニング方法に関し、詳しくはARIA遺伝子の発現量に基づくスクリーニング方法に関する。【０００３】
また本発明は、ARIA遺伝子のインスリン抵抗性疾患の予防または治療剤、肥満誘導物質の探索のための使用、モデル動物に関する。
【背景技術】
【０００４】
インスリン抵抗性疾患とは、インスリン抵抗性の上昇によって引き起こされる疾患のことをいい、２型糖尿病、高脂血症・脂肪肝、肥満、高血圧症、動脈硬化症等の成人病は、インスリン抵抗性疾患と深い関連性を持つことが知られている。【０００５】
これらの病態の作用機序の解析、治療薬の開発等を目的として、疾患モデルマウスが数多く開発されている。例えば、糖尿病モデルマウスは、糖尿病に関連があると考えられる遺伝子を欠損させることにより作製し、該遺伝子の機能解析や糖尿病治療薬のスクリーニング等に用いられている（非特許文献１）には、主な糖尿病モデルマウスが列記されている。【０００６】
本発明者はシグナルシークエンストラップ法により血管内皮細胞に高い発現を示す遺伝子を発見し、ARIAと名付けて論文発表した（非特許文献２）。【０００７】
ブタ、ウシ、ニワトリなどの家畜は、同じカロリーの食餌により早く太ることが望ましく、肥満しやすい家畜や肥満誘導物質およびその探索方法が望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】「別冊・医学の歩み」、医歯薬出版株式会社、113-117頁  (2004)
【非特許文献２】Proc Natl Acad Sci USA 106(20), 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、肥満、インスリン感受性に関連する遺伝子を明らかにし、これら疾患の予防または治療薬、あるいは肥満を誘導する物質、太りやすい家畜、魚などの非ヒト動物を探索するためのスクリーニング系を確立することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者はシグナルシークエンストラップ法により血管内皮細胞に高い発現を示す遺伝子を発見し、ARIAと名付けて論文発表した（非特許文献２）。【００１１】
本発明者は、ARIA遺伝子の発表後、ARIAは白色脂肪・褐色脂肪といった脂肪組織にも高い発現を示すことを見出した。そして、ARIA遺伝子のノックアウトマウスを作製したところ、高脂肪食で野生型マウスに比べて体重増加が明らかに少なく、また内臓脂肪量の減少が認められ、通常食でも高いインスリン感受性を示すことを見出し、本発明を完成した。【００１２】
本発明は、以下の肥満、メタボリック症候群などのインスリン感受性の低下に起因する疾患の予防・治療薬のスクリーニング方法、ARIA遺伝子のインスリン感受性の低下に起因する疾患の予防または治療剤、肥満抑制物質、肥満誘導物質もしくは肥満しやすい非ヒト動物の探索のための使用、モデル動物、細胞に関する。
項１．  ARIA遺伝子のプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を組み込んでなるインスリン感受性の低下に起因する疾患の予防または治療剤あるいは肥満抑制物質の探索のための、あるいは肥満誘導物質の探索のための細胞。
項２．  ARIA遺伝子を導入することによりARIAを過剰発現することを特徴とする、細胞。
項３．  ARIAの過剰発現により、ARIAとPTENの結合が増大することを特徴とする、項２に記載の細胞。
項４．  ARIAタンパク質とPTENタンパク質の結合を検出することができる、インスリン感受性の低下に起因する疾患の予防または治療剤あるいは肥満抑制物質の探索のための、あるいは肥満誘導物質の探索のための細胞。
項５．  ARIAタンパク質とPTENタンパク質の両方に、両者が相互作用すると蛍光を発する若しくは消光するタンパク質を各々融合したことを特徴とする項４に記載の細胞。
項６．  ARIA遺伝子が過剰発現することを特徴とするインスリン感受性の低下に起因する疾患のモデル動物。
項７．  前記モデル動物がトランスジェニックマウスである、項６に記載のモデル動物。
項８．  ARIA遺伝子の発現量の増減を指標とする、インスリン感受性の低下に起因する疾患の予防または治療剤、あるいは肥満抑制物質、肥満誘導物質、肥満しやすい非ヒト動物のスクリーニング方法。
項９．  項１〜５のいずれかに記載の細胞に候補物質を作用させ、ARIA遺伝子の発現量が低下した場合にインスリン感受性の低下に起因する疾患の予防または治療剤若しくは肥満抑制物質であると評価する、項８に記載のインスリン感受性の低下に起因する疾患の予防または治療剤若しくは肥満抑制物質のスクリーニング方法。
項１０．  項１〜５のいずれかに記載の細胞に候補物質を作用させ、ARIA遺伝子の発現量が上昇した場合に肥満誘導物質であると評価する、項８に記載の肥満誘導物質のスクリーニング方法。
項１１．  項６〜７のいずれかに記載のモデル動物に候補物質を作用させ、インスリン感受性の変化を評価することを特徴とするインスリン感受性の低下に起因する疾患の予防または治療剤、あるいは肥満抑制物質、肥満誘導物質のスクリーニング方法。
項１２．  非ヒト動物のARIA遺伝子の発現量を測定する工程、ARIA遺伝子の発現量が高い場合に肥満しやすいと評価することを特徴とする、肥満しやすい非ヒト動物のスクリーニング方法。
項１３．  ARIA遺伝子をノックアウトした、肥満誘導物質の探索のためのモデル動物。
項１４．  被験体のサンプル中のARIAタンパク質の発現量を検出する工程、該発現量を指標としてインスリン感受性を評価する工程を有することを特徴とする、インスリン感受性の低下に起因する疾患の検出方法。
項１５．  前記サンプルが血液、血清、血漿、尿、涙液、唾液からなる群から選ばれるいずれか、好ましくは血漿または血清である、項17に記載の方法。
項１６．  ARIA遺伝子の発現産物のインスリン感受性の低下に起因する疾患の予防または治療剤、肥満抑制物質あるいは肥満誘導物質もしくは肥満しやすい非ヒト動物の探索のための使用。
項１７．  ARIA遺伝子の発現産物がmRNAまたはARIAタンパク質である、項16に記載の使用。
項１８．  前記インスリン感受性の低下に起因する疾患が、肥満、２型糖尿病またはメタボリック症候群である、項１〜５のいずれかに記載の細胞、項６又は７に記載のモデル動物、項８〜１１のいずれかに記載のスクリーニング方法、項16又は17に記載の使用。
【発明の効果】
【００１３】
本発明では、ARIA遺伝子が肥満、インスリン感受性と関連することを初めて明らかにした。したがって、ARIA遺伝子の発現を抑制する物質を探索することで、肥満、インスリン感受性の低下（インスリン抵抗性の上昇）に起因する疾患の予防ないし治療薬、肥満抑制物質をスクリーニングすることができる。また、ARIA遺伝子の発現を促進する物質を探索することで、肥満誘導物質、肥満しやすい非ヒト動物をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（A）ARIAは白色脂肪、褐色脂肪に高い発現を示す。縦軸はPy4.1のARIA mRNAの発現量を1としたときのARIA mRNAの相対発現量を示し、横軸は各臓器を示す。（B）脂肪細胞に分化誘導した3T3L1におけるARIA mRNAの発現量の推移を示す。縦軸は分化誘導前(day0)のARIA mRNAの発現量を1としたときのARIA mRNAの相対発現量を示し、横軸は分化誘導の日数を示す。グラフの下にARIA mRNAの発現量に対応する電気泳動の図を合わせて示す。
【図２Ａ】ARIAノックアウトマウスの高脂肪食負荷による肥満の程度を示す。通常食では、野生型マウス（WT）とARIAノックアウトマウス(KO)において、体重・脂肪重量に明らかな差はない。
【図２Ｂ】ARIAノックアウトマウスの高脂肪食負荷による肥満の程度を示す。高脂肪食負荷の条件では、ARIAノックアウトマウス(KO)は野生型マウス(WT)よりも有意に体重増加率が小さく、皮下脂肪重量も有意に少ない。
【図３】ARIAノックアウトマウスと野生型マウスのグルコース負荷試験(OGTT)（A）、インスリン負荷試験（ITT）（B）の結果を示す。ARIAノックアウトマウスは通常食下でも野生型マウスに比べてインスリン感受性が高いことが示された。
【図４Ａ】ARIAノックアウトマウスは野生型に比べて、肝臓（A）、骨格筋及び白色脂肪（B）において、インスリンシグナル伝達が亢進していることを示す。
【図４Ｂ】ARIAノックアウトマウスは野生型に比べて、肝臓（A）、骨格筋及び白色脂肪（B）において、インスリンシグナル伝達が亢進していることを示す。
【図５】ARIAはPTENと結合することを示す。
【図６】ARIAがインスリン感受性の増大と関与するメカニズムを説明するための模式図である。ARIAはインスリンシグナルの内因性阻害分子であるPTENと結合して細胞膜直下に局在させることでPTENを活性化し、インスリン受容体の下流シグナル(PI3K-Akt)を抑制している。ARIAを欠失したARIAノックアウトマウスではPI3K-Aktシグナルの抑制が外れる結果、インスリン感受性が亢進すると考えられる。
【図７】ARIAとPTENの結合を蛍光シグナルとして検出できる細胞株を示す。緑色に光っている細胞は、ARIAとPTENが結合したことを示す。
【図８】ARIAを発現していないCHO細胞を用いてARIAを安定的に発現する細胞株を樹立し、ARIAにより膜分画中のPTENが増加することを確認した。
【図９】ARIAを発現しているCHO細胞の培養上清中に可溶性のARIA細胞外ドメインが遊離していることを確認した(A)。さらに遺伝子導入に用いるプラスミドの量によりARIAの発現量を変化させると、ARIAの発現レベルが高い程、培養上清中の可溶性ARIA細胞外ドメインの量も増加するため(B)、可溶性ARIA細胞外ドメインの発現量測定により細胞中のARIA発現レベルが推測できると考えられた。
【図１０】ARIA安定発現細胞株のウェスタンブロット法の結果を示す。最もARIAを多く発現するstable line #6を以後の実験に使用した。
【図１１】高脂肪食を負荷したARIA-KOマウスでは野生型と比べて活動性に差がないにも関わらず、酸素消費量が増大し、呼吸商が低下する。
【図１２】高脂肪食を負荷したARIA-KOマウスでは野生型と比べて熱産生能が亢進している。
【図１３】血管内皮特異的ARIA過剰発現マウスでは虚血誘導性の血管新生形成が有意に減弱していた。
【図１４】血管内皮特異的ARIA過剰発現マウスは野生型と比べて太りやすく、高脂肪食負荷後の耐糖能・インスリン感受性が増悪する。
【図１５】高脂肪食を負荷した血管内皮特異的ARIA過剰発現マウスでは野生型と比べて熱産生能が低下している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ARIAは従来血管内皮細胞に高発現することが知られており、肥満、インスリン抵抗性の上昇またはインスリン感受性の低下、例えば糖尿病との関連は知られていなかった。
【００１６】
ARIAは肥満、インスリン感受性と密接に関連することが明らかにされたので、本発明によれば、肥満を誘導する物質または肥満を抑制する物質、インスリン感受性を上昇させる薬物、肥満しやすい家畜、魚などの非ヒト動物を見出すことができる。
【００１７】
本明細書において、「ARIA」とは、「apoptosis regulator through modulating IAP expression」の略である。ARIA遺伝子は公知であり、各種データベースに登録されている。例えばARIA遺伝子のGenBankのアクセッション番号はEU025066（ヒト）、EU025067（マウス）などであり、使用する動物細胞／動物種に応じて適宜選択できる。外来ARIA遺伝子の由来は導入する細胞と同じであるのが好ましく、ヒトの細胞にはヒトのARIA遺伝子を導入するのが好ましい。ARIA遺伝子のアレル、ARIAの機能を有する改変体を使用することもできる。
【００１８】
ARIAのプロモーター配列も各種データベースに登録されているので、種々の由来細胞のARIAプロモーターもデータベースから取得することができる。
【００１９】
本明細書において「肥満」とは、高カロリー食の摂取による肥満を意味する。
【００２０】
本明細書において「インスリン感受性の低下に起因する疾患」としては、糖尿病(特に２型糖尿病)、耐糖能異常、肥満症、高脂血症、動脈硬化、高血圧症、心疾患、メタボリック症候群などが挙げられる。
【００２１】
「肥満抑制物質」とは、ARIAの発現、機能、活性などを抑制することにより肥満を抑制する物質を意味し、特に高カロリー食の摂取による肥満を抑制できる物質である。肥満抑制物質は、食物と同時に摂取してもよく、食物とは別に摂取してもよい。肥満抑制物質は、医薬の形態であってもよく、食品、サプリメントなどの形態で摂取してもよい。
【００２２】
「肥満抑制物質」とは、ARIAの発現、機能、活性などを活性化することにより肥満を増進する物質を意味し、特に高カロリー食の摂取時の肥満を増進する物質である。ウシ、ブタ、ニワトリ、ヒツジなどの家畜、養殖の魚などを効率よく太らせて早期に出荷できるようにすることができる。
【００２３】
肥満しやすい非ヒト動物は、ARIAのmRNA、ARIAタンパク質などのARIA発現産物の量が多い動物を指し、ARIA発現産物の量が標準よりも多い場合に肥満しやすい非ヒト動物であると判定される。ARIA発現産物の量は、血液、血清、血漿、尿、涙液、唾液などのサンプル、好ましくは血漿または血清中のARIAタンパク質の量をELISA、EIA、イムノクロマトなどの抗体を用いる免疫学的測定法により測定することができる。肥満しやすい非ヒト動物は、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヒツジなどの家畜、養殖の魚介類（ウナギ、タイ、ホタテ、カキ、ブリなど）などにおいて、特に有用である。
【００２４】
１つの実施形態において、本発明のスクリーニングに用いる細胞は、ARIA遺伝子を発現可能に導入し、過剰発現させた細胞である。細胞は、細菌などの原核細胞、酵母、植物細胞、動物細胞などの真核細胞のいずれでもよいが、真核細胞が好ましく、動物細胞がより好ましい。動物細胞としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの哺乳類、ニワトリ、アヒルなどの鳥類、カエルなどの両生類、イモリなどの爬虫類、魚介類、昆虫のいずれの細胞でもよく、哺乳類細胞が好ましく、ヒト細胞が最も好ましい。このARIA過剰発現細胞において、培地に候補化合物を添加し、ARIAの発現量の増加または減少をスクリーニングすることで、肥満促進物質（ARIA発現量が増加した場合）または肥満抑制物質（ARIA発現量が減少した場合）を見出すことができる。ARIAの発現量の測定は、mRNＡまたは蛋白質量をノーザンブロッティング、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡなどの免疫学的手法などにより測定してもよいが、ARIAプロモータの制御下にあるレポーター遺伝子の発現量の測定により行うことが好ましい。ARIAノックアウトモデル動物は、高脂肪食を与えても肥満しにくいモデル動物であるので、この動物に候補化合物を必要に応じて高脂肪食と組み合わせて投与し、肥満の促進の程度を評価することで、肥満促進物質をスクリーニングすることができる。肥満促進物質は、ブタ、ウシ、ヒツジ、ニワトリ、イノシシなどの家畜の餌に加えることで、短期間あるいは少ない餌で体重を増加させることができる。また、ARIAの発現量を評価することで、肥満しやすい系統の家畜を見出すことができ、ヒトの場合には、メタボリック症候群などの肥満に伴う疾患になりやすい体質を評価することができる。
【００２５】
ARIAトランスジェニックモデル動物は、特に高脂肪食により肥満しやすいモデル動物であるので、この動物に候補化合物を投与し、肥満の抑制の程度を評価することで、肥満抑制物質をスクリーニングすることができる。
【００２６】
レポーター遺伝子としては、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ(ウミボタル、ホタル、ウミシイタケ、オワンクラゲ、エクオリン)、ＧＦＰ，ＹＦＰ，ＢＦＰ，ＣＦＰ、DsREDまたはＲＦＰなどの蛍光タンパク質、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼなどの遺伝子が挙げられる。
【００２７】
ARIA遺伝子は、通常、機能的に連結した発現制御配列を含む、発現ベクターの形で細胞に導入される。ARIA遺伝子は、例えばイントロンを含む配列を含むことができる。「発現制御配列」は、機能的に連結した、核酸配列の発現を調節する核酸配列を意味する。発現制御配列は、発現制御配列は、核酸配列の転写、および適宜、翻訳を制御および調節する場合、核酸配列に機能的に連結している。したがって、発現制御配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写終結因子、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン（ATG）、イントロンのスプライシングシグナル、mRNAの適切な翻訳を可能とする遺伝子の正しいリーディングフレームの維持、および終止コドンを含むことができる。
【００２８】
本発明は、ARIAとPTENの結合時に蛍光などのシグナルを発するように、ARIAとPTEN の各々の遺伝子に必要に応じて適当なスペーサーを介してFRETなどのエネルギー移動を構成するタンパク質を連結させることができる。このようなタンパク質の組み合わせを以下に例示する：
・ルシフェラーゼと蛍光タンパク質(GFP、YFPなど)
・半分に分割したmKG
・フルオレセイン／ビス-チオバルビツレートトリメチンオキソノール；
・天然蛍光タンパク質／ビス-チオバルビツレートトリメチンオキソノール；
・天然蛍光タンパク質／ビス-チオバルビツレートペンタメチンオキソノール；
・クマリン／ビス-チオバルビツレートトリメチンオキソノール；
・クマリン／ビス-チオバルビツレートペンタメチンオキソノール；
・ビス-チオバルビツレートトリメチンオキソノール／テキサスレッド；
・ビス-チオバルビツレートトリメチンオキソノール；／レソルフィン；
・ビス-チオバルビツレートトリメチンオキソノール／Cys5；
・ビス-チオバルビツレートトリメチンオキソノール／ビス-チオバルビツレートペンタメチンオキソノール；
・テキサスレッド／ビス-チオバルビツレートペンタメチンオキソノール；
・NBD／ビス-チオバルビツレートトリメチンオキソノール；
・NBD／ビス-チオバルビツレートペンタメチンオキソノール。
【００２９】
本発明の１つの実施形態では、細胞内で発現できるエネルギーのドナーとアクセプターの組み合わせがよく、タンパク質若しくはペプチドからなるエネルギーのドナーとアクセプターがよい。また、半分に分割したmKGをARIAとPTENの遺伝子に各々結合させて細胞に導入することにより、これらの結合の程度を評価する細胞株も本発明の好ましい実施形態である。
【００３０】
ARIAとPTENの結合は、特に高脂肪食における肥満に導くので、上記のエネルギーのドナーとアクセプターの組み合わせを発現した細胞の培養液に候補化合物を添加し、それによるARIAとPTENの結合の変化をエネルギー移動の程度により検出することで、候補化合物が肥満を促進するのか（エネルギー移動が増加した場合）、肥満を抑制するのか（エネルギー移動が低下した場合）を評価することができ、肥満促進物質と肥満抑制物質の両方を1つの細胞系でスクリーニングすることができる。
【００３１】
本発明者が作製したARIAのノックアウトモデル動物は、インスリン感受性が向上しているが、その他の不具合はなく、ARIAの発現を抑制する薬物は、重篤な副作用を示さないと考えられる。ARIAのノックアウトモデル動物は、高脂肪食を与えたときには体重増加を抑制し、通常食を与えたときには体重、脂肪重量に大きな影響を与えないため、ARIAを抑制する物質は、適正な体重を保持しながら肥満を防止する理想的な特性を有する。
【００３２】
本発明者が作製したARIAのトランスジェニックモデル動物は、インスリン感受性が低下し、褐色脂肪における血管密度の低下および熱産生・脂肪酸酸化に関わる遺伝子群の発現低下が認められる。ARIAは全身で発現させてもよいが、血管内皮細胞や脂肪細胞（白色脂肪細胞または褐色脂肪細胞）などで部位特異的に発現させてもよい。ARIAのトランスジェニックモデル動物は、高脂肪食に起因する肥満モデル動物になる。この肥満モデル動物を用いたスクリーニングにより得られた肥満抑制物質は、通常食を与えたときには体重、脂肪重量に大きな影響を与えないため、適正な体重を保持しながら肥満を防止する理想的な特性を有する。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。【００３４】
実施例１
(1)マウスの各臓器におけるARIAの発現
マウスの各臓器（心臓(Heart)、骨格筋(Muscle)、白色脂肪(White adipose)、褐色脂肪(Brown adipose)、肺(Lung)、腎臓(Kidney)、肝臓(Liver)、Py4.1(mouse EC)）よりtotal RNAを抽出した後に逆転写酵素を用いてcDNAを作成し、これらcDNAを鋳型として定量的PCR法によりARIAの遺伝子発現を定量解析した結果を図1左に示す。ARIAは白色脂肪・褐色脂肪といった脂肪組織にも高い発現を示すことを確認した。【００３５】
(2)脂肪細胞への分化誘導
マウス線維芽細胞の3T3-L1細胞をインスリン、デキサメタゾン、ピオグリタゾンを用いて脂肪細胞へと分化誘導した。誘導開始前(Day0)および開始後２、４、６日目の細胞よりtotal RNAを抽出し、上記(1)と同様の手法にてARIAの遺伝子発現を定量評価した。結果を図１（B）に示す。図1（B）に示すように、脂肪細胞に分化するに従って、ARIAの発現量が増加することが分かる。【００３６】
本発明者はこの結果から、ARIAはインスリン抵抗性と何らかの関与があると予測した。【００３７】
実施例２
(1)ARIAノックアウトマウスの作製
ARIAノックアウトマウスの作製手順は以下の通りである。
(i)ARIAのエクソン１-３をNeoカセットで置換したターゲッティングベクターを作成し、C57BL6由来のES細胞にエレクトロポレーション法にて遺伝子導入を行った。
(ii)ホモロガスリコンビネーションを起こしたES細胞をマウスブラストシストに注入し、仮親マウスの子宮内に移植した。
(iii)生殖系細胞に遺伝子改変ES細胞が分化したキメラマウスよりF0ヘテロノックアウトマウスを得、ヘテロノックアウトマウス同士を交配してホモノックアウトマウスを得た。【００３８】
(2) ARIAノックアウトマウスの評価
このARIAノックアウトマウスに通常食を摂取させたところ、野生型マウスとARIAノックアウトマウスの体重・脂肪重量に有意な差はなかった（図2（A））。一方、高脂肪食（脂肪分60%カロリー比高脂肪飼料；オリエンタル酵母 HFD-60）を負荷したところ、野生型マウスに比べてARIAノックアウトマウスの体重増加が明らかに少なく、また内臓脂肪量の減少が認められた（図２（B））。さらにARIAノックアウトマウスは通常食を与えている状態でも野生型に比べて高いインスリン感受性を示すことをグルコース負荷テスト（OGTT）・インスリン負荷テスト(ITT)により明らかとした（図３）。すなわち、それぞれ2g/kgのブドウ糖を胃管を通じて投与／0.75U/kgのインスリンを皮下注射にて投与し、経時的に眼窩採血を行って血糖を測定した。加えてARIAノックアウトマウスではインスリン標的臓器である、肝臓・白色脂肪・骨格筋において細胞内インスリンシグナル伝達が著明に亢進していることを見出した(図４Ａ，Ｂ)。即ち、皮下注射にてマウスに0.75U/kgのインスリン投与を行い１０分後に肝臓、白色脂肪、骨格筋を摘出した。直ちに氷上にてSDSを含む蛋白溶解液中で組織の溶解を行い、遠心にて不溶性分画を除去した後にSDS-PAGEゲル上で電気泳動を行った。ゲル上の蛋白をニトロセルロース膜に転写した後に特異的抗体を用いて免疫ブロット法を行い、インスリン下流シグナル分子であるAktのリン酸化を定量的に評価した結果、肝臓、白色脂肪、骨格筋の全てにおいて野生型マウスよりもARIAノックアウトマウスにおいて細胞内インスリンシグナル伝達が著明に亢進していた。【００３９】
さらに、培養細胞を用いた検討にてARIAはPhosphatase and Tensin Homolog Deleted from Chromosome 10 (PTEN)と結合することを発見した(図５)。即ち、マウス血管内皮細胞のcell lineであるpy4.1細胞にFLAGタグをつけたARIAをトランスフェクション法にて発現させた。細胞を1% Triton-X100を含む細胞溶解液中で溶解し、遠心にて不溶性分画を除去した。抗FLAG抗体とprotein Gを用いてARIA-FLAGの免疫沈降を行った。沈降した蛋白をSDS-PAGEゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写した後に特異的抗体を用いて免疫ブロット法を行った）。PTENはインスリン下流シグナル分子であるphosphoinositide 3-kinase (PI3K)に拮抗する脱リン酸化酵素であり、PI3Kによりリン酸化された膜リン脂質（PIP3）を脱リン酸化してPIP2に戻すことでPI3Kの働きを阻害する。従って、PTENは細胞膜付近に存在しないとその機能を発揮できないことが知られている。ARIAは細胞膜上に存在する膜蛋白であることから、ARIAはインスリンシグナルを負に調節するPTENを細胞膜近傍に局在させて活性化することでインスリンシグナル伝達を抑制していると考えられた（図６、図８）。ARIAの欠損によりインスリン刺激時のインスリンシグナル伝達抑制が外れる結果、ARIAノックアウトマウスは高いインスリン感受性を示すと考えられ、以上の結果よりARIAを抑制する物質は、肥満、インスリン感受性の低下に起因する疾患、及び／又はメタボリック症候群に対する全く新しい薬物になることが期待され、ARIAの発現量、さらにPTENとの結合を測定／検出することにより、これら疾患に対する物質をスクリーニングすることができる。また本発明によりARIAの機能阻害剤が肥満・インスリン抵抗性・メタボリック症候群に対する治療薬として有用である論理的根拠を提供する。ARIAの機能阻害とはすなわちARIAとPTENの結合阻害を意味する。本発明者はARIAとPTENの結合を阻害する化合物をスクリーニングするアッセイ系として、蛍光物質であるKusabira-Green (mKG)を半分に分割した（前半分をmKG-N、後ろ半分をmKG-Cと呼ぶ）レポーター分子をARIAとPTENに結合したリコンビナント蛋白を発現するCHO細胞株を樹立した。ARIAとPTENが結合すると半分に分割したmKG再構成が起こり、緑色の蛍光を発する（図７）。この細胞にARIAとPTENの結合を阻害する化合物を作用させるとARIAとPTENの結合が阻害された結果、mKGの再構成が起こらないために蛍光強度が減少する筈である。蛍光強度はプレートリーダーを用いて簡便かつ短時間に測定できるため、このアッセイ系を用いて大規模な１次スクリーニングを行うことが可能である。さらに本発明者はもともとARIAを発現しないCHO細胞にARIAを恒常的に発現する安定発現株を作成した（CHO/ARIA）。細胞膜分画を超遠心法により抽出して膜に局在するPTENの発現量を免疫ブロット法にて検討したところ対照細胞と比較してCHO/ARIAでは明らかに細胞膜に局在するPTENが増加していた（図８）。この増加分は細胞膜上に存在するARIAに結合したPTENと考えられる。したがってARIAとPTENの結合を阻害する被験薬物を加えるとCHO/ARIAの細胞膜分画中のPTENが減少するはずである。このアッセイ系はより定量的かつリアルタイムでARIAとPTENの結合阻害を評価できるため、１次スクリーニングで陽性であった候補化合物に対する２次スクリーニングとして最適である。つまり本発明者らが樹立した細胞株を利用したアッセイ系でARIAとPTENの���互作用を指標とすることを特徴とする肥満及び／又はメタボリック症候群の予防及び／又は治療薬の１次および２次スクリーニングを行うことができる。多くの膜蛋白は特異的／非特異的反応にて切断され、細胞外ドメインの一部が遊離することが知られている。ARIAも同様に細胞外ドメインの一部が培養上清へ遊離することを確認した（図９）。この結果はARIAの細胞外ドメインの一部が血中に放出されている可能性を強く示唆するものであり、血液中のARIAを測定することで簡便にARIAの発現量変化を評価できる可能性が高い。この結果よりARIAは肥満、インスリン感受性の低下に起因する疾患、及び／又はメタボリック症候群に対する新しい血中バイオマーカーと成り得る。【００４０】
実施例３：細胞株の樹立
上皮系細胞のセルラインであるCHO-K1細胞を10% FBS入りのDMEM/F-12培地で培養した。サブコンフルエントのCHO-K1細胞にARIAまたはARIA-mKG-NおよびPTEN-mKG-CのcDNAを組み込んだベクターをリポフェクション法にて遺伝子導入した。ARIA-mKGとPTEN-mKGの作製は、CoralHue Fluo-chase Kit（Medical & Biological Laboratories (MBL)製）を用いて行った。ベクターにはネオマイシン耐性遺伝子が含まれていた。２４時間後に細胞を２０〜３０倍希釈して播き直し、さらに２４時間後にネオマイシンを培地に加えた。以後２日おきに培地を交換してベクター上の遺伝子を安定的に発現する細胞のみが生存し、かつ単一細胞起源のコロニーが出現するまで培養を続けた。これらコロニー中の細胞をクローニングカップを用いて個々に回収し、モノクローナルな細胞株を単離した。目的とするタンパク質の安定的な発現はウェスタンブロット法にて確認した。ARIAを安定的に発現する細胞株のウェスタンブロット法の結果を図10に示す。最もARIAを多く発現するstable line #6を以後の実験に使用した。【００４１】
上記の手順により、ARIAを発現する細胞株、ARIA-mKGおよびPTEN-mKGを同時に発現し、ARIAとPTENの一方又は両方の機能の低下を検出可能な細胞株を得た。【００４２】
CHO-K1細胞は本来ARIAを発現していないので、ARIA遺伝子を導入することで、ARIA依存性のPTENの機能変化をより高感度に行うことができる。ARIAを発現するとPTENと結合し、PTENを細胞膜に固定するので、ARIAとPTENの結合に影響する物質を作製したARIA発現細胞株に作用させた後に膜分画を分離し、PTENの発現量を測定することで、ARIAの機能に影響する物質をスクリーニングすることができる。この細胞株は二次スクリーニングに好適に使用できる。【００４３】
また、ARIA-mKG-NとPTEN-mKG-Cを発現する細胞株は、これらの結合体の量を視覚的に検出でき、プレートリーダーなどを用いて簡便に定量評価が可能であるため、ARIAとPTENの結合を増減する物質のスクリーニングに好適に使用でき、特に操作の簡便性から一次スクリーニングに適している。【００４４】
これらの細胞株を用いることで、ARIAの機能を低下または亢進させる物質をスクリーニングすることが可能になった。【００４５】
実施例４
ARIAノックアウトマウスが高脂肪食誘導性の肥満に抵抗性であるメカニズム
本発明者らは、高脂肪食を負荷したARIAノックアウトマウスでは活動性に差がないにも関わらず野生型と比して酸素消費が高く、また呼吸商が低下していることを見出した（図１１）。このことはARIAノックアウトマウスではエネルギー消費が高く、また脂肪をエネルギー源としてより多く使用していることを意味している。また、本発明者らは、高脂肪食を負荷したARIAノックアウトマウスでは野生型に比して体温が有意に高く、またその体温差は寒冷暴露によってより顕著になることを発見した（図１２）。熱産生は多くの脂肪酸とエネルギーを消費して褐色脂肪で行われる。高脂肪食を負荷したARIAノックアウトマウスの褐色脂肪では熱産生や脂肪酸酸化に関わる遺伝子群の発現が有意に上昇していた（図１２）。【００４６】
以上の結果からARIAノックアウトマウスではエネルギー消費が増大する結果、肥満抵抗性を示すと考えられた。このことを確認するために、本発明者らは、血管内皮細胞において特異的にARIAを過剰発現するマウス（TIE2-ARIA-Tg）を作成した。TIE2-ARIA-Tgマウスでは虚血誘導性の血管新生能が有意に減弱していることを確認した（図13）。このマウスに高脂肪食を負荷したところ、ARIAノックアウトマウスとは逆に太りやすく、耐糖能・インスリン感受性が野生型マウス以上に増悪することが判明した（図14）。高脂肪食を負荷したTIE2-ARIA-TgマウスではARIAノックマウスと反対に熱産生能が低下し、褐色脂肪における血管密度の低下および熱産生・脂肪酸酸化に関わる遺伝子群の発現低下が認められた（図15）。これらの結果からARIAの機能阻害は血管増生を促進することでエネルギー消費を増大させ、肥満を抑制する全く新しい創薬ターゲットになると考えられた。
【図１】
2012099243.tif 000002
【図２Ａ】
2012099243.tif 000003
【図２Ｂ】
2012099243.tif 000004
【図３】
2012099243.tif 000005
【図４Ａ】
2012099243.tif 000006
【図４Ｂ】
2012099243.tif 000007
【図５】
2012099243.tif 000008
【図６】
2012099243.tif 000009
【図７】
2012099243.tif 000010
【図８】
2012099243.tif 000011
【図９】
2012099243.tif 000012
【図１０】
2012099243.tif 000013
【図１１】
2012099243.tif 000014
【図１２】
2012099243.tif 000015
【図１３】
2012099243.tif 000016
【図１４】
2012099243.tif 000017
【図１５】
2012099243.tif 000018
【国際調査報告】
2012099243.tif 000019
2012099243.tif 000020
2012099243.tif 000021
2012099243.tif 000022
2012099243.tif 000023
2012099243.tif 000024