(57)【要約】  ＴＲＡＩＬ抵抗性を有する悪性腫瘍におけるＴＲＡＩＬ抵抗性の克服。  グリクラジド、グリベンクラミドまたはＵ３７８８３Ａ等のＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤を有効成分とするＴＲＡＩＬ感受性増強剤を使用することにより、ＴＲＡＩＬ抵抗性を有する悪性腫瘍におけるＴＲＡＩＬ抵抗性を克服した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤を有効成分とするＴＲＡＩＬ感受性増強剤。
【請求項２】
ＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤が５−ｃｈｌｏｒｏ−Ｎ−（４−［Ｎ−（ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）ｓｕｌｆａｍｏｙｌ］ｐｈｅｎｅｔｈｙｌ）−２−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚａｍｉｄｅ、Ｎ−（ｈｅｘａｈｙｄｒｏｃｙｃｌｏｐｅｎｔａ［ｃ］ｐｙｒｒｏｌ−２（１Ｈ）−ｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）−４−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅまたは４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｉｍｉｄｉｎｅ−Ｎ−ａｄａｍａｎｔｙｌ−Ｎ’−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅのいずれか一種以上である請求項１に記載のＴＲＡＩＬ感受性増強剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＴＲＡＩＬ感受性増強剤を有効成分とし、ＴＲＡＩＬと組み合わせて使用される悪性腫瘍治療薬。
【請求項４】
悪性腫瘍が慢性リンパ性白血病、星状細胞腫、髄膜腫またはメラノーマである請求項３に記載の悪性腫瘍治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤を有効成分とするＴＲＡＩＬ（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ；ＴＲＡＩＬ、以下、ＴＲＡＩＬと示す）感受性増強剤に関する。また、ＴＲＡＩＬ感受性増強剤を用いる悪性腫瘍治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＲＡＩＬはＴＮＦ（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦ、以下、ＴＮＦと示す）スーパーファミリーに属するサイトカインであり、腫瘍細胞の細胞表面受容体（ＤＲ４、ＤＲ５）と結合して腫瘍選択的殺細胞作用（アポトーシス誘導作用）を示すことが知られている。この作用が着目され、現在、悪性腫瘍の新たな治療剤として期待され、前臨床試験が進んでいる。
しかし、慢性リンパ性白血病、星状細胞腫、髄膜腫およびメラノーマ等の一部の悪性腫瘍においては、細胞表面受容体（ＤＲ４、ＤＲ５）を発現しているにも関わらず、ＴＲＡＩＬによる腫瘍選択的殺細胞作用（アポトーシス誘導作用）に対し、抵抗性を示すことが明らかにされた。そこで、これらの悪性腫瘍におけるＴＲＡＩＬ抵抗性を克服することがＴＲＡＩＬ臨床応用に向けての最重要課題のひとつとなっている。【０００３】
本発明者らが、本発明において着目したＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤は、細胞膜に存在するカリウムチャネルを阻害する物質である。カリウムチャネルには、電位差依存性カリウムチャネル、カルシウム依存性カリウムチャネルやＡＴＰ感受性カリウムチャネル等がある。このうちＡＴＰ感受性カリウムチャネルは、細胞膜においてカリウムイオンを選択的に通過させることで、インスリン分泌など様々な細胞機能の制御に関わる。
このようなＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤として、５−ｃｈｌｏｒｏ−Ｎ−（４−［Ｎ−（ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）ｓｕｌｆａｍｏｙｌ］ｐｈｅｎｅｔｈｙｌ）−２−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚａｍｉｄｅ（以下、グリベンクラミドまたはＧｌｉｂｅｎｃｌａｍｉｄｅと示す）、Ｎ−（ｈｅｘａｈｙｄｒｏｃｙｃｌｏｐｅｎｔａ［ｃ］ｐｙｒｒｏｌ−２（１Ｈ）−ｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）−４−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ（以下、グリクラジドまたはＧｌｉｃｌａｄｚｉｄｅと示す）、または４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｉｍｉｄｉｎｅ−Ｎ−ａｄａｍａｎｔｙｌ−Ｎ’−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（以下、Ｕ３７８８３Ａと示す）等が知られ、２型糖尿病の治療薬として広く利用されている。【０００４】
グリクラジド、グリベンクラミド等は、１型スルホニル尿素受容体のアンタゴニストとしても知られており、虚血による脳浮腫の治療に使用できることが開示されている（例えば、特許文献１参照）。これは、グリクラジド、グリベンクラミド等によってＮＣｃａ−ＡＴＰチャネルによる細胞内へのＮａ＋の流入を阻害し、細胞の脱分極化を防止することにより、細胞障害性浮腫を予防するというものである。
この特許文献１においては、ＮＣｃａ−ＡＴＰチャネルがＡＴＰ感受性カリウムチャネルと同様に、１型スルホニル尿素受容の調節サブユニット等からなるヘテロ多量体構造体であることから、細胞障害性浮腫の予防のために、グリクラジド、グリベンクラミド等の利用を試みたことが記載されている。【０００５】
また、グリベンクラミドはＵＶＢ等の紫外線被爆に起因するメラニン合成や真皮色素沈着を濃度依存的に抑制することが確認されている。そして、グリベンクラミドは、細胞毒性を有さず、安全に、メラニン生成抑制剤等の有効成分として使用し得ることも開示されている（例えば、特許文献２参照）。
さらに、グリベンクラミドが容積感受性Ｃｌ−チャネルブロッカーのひとつとして、アポトーシス抑制剤の有効成分となり得ることも開示されている（たとえば、特許文献３参照）。これは、細胞の容積が変化したときに、細胞を元の大きさに戻す調節性容積収縮に関わるＣｌ−チャネルの働きを容積感受性Ｃｌ−チャネルブロッカーにより抑制することで、アポトーシスの際にみられる細胞収縮を抑制するというものである。
この特許文献３においては、ＨｅＬａ細胞、Ｕ９３７細胞等の株化された癌細胞を用い、アポトーシス性早期細胞収縮やアポトーシスによる細胞死自体が抑制されていることを確認しており、グリベンクラミドも有効であったことが記載されている。
しかし、これらの公知技術において、グリクラジド、グリベンクラミドまたはＵ３７８８３Ａ等のＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤を、ＴＲＡＩＬ抵抗性を有する悪性腫瘍において、ＴＲＡＩＬ感受性を増強するために使用することは検討されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００８−５１３４４７号公報
【特許文献２】特開２０１０−１０５９４７号公報
【特許文献３】特許第３９３１０２２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＴＲＡＩＬ抵抗性を有する悪性腫瘍において、ＴＲＡＩＬ抵抗性を克服することを課題とする。具体的には、ＴＲＡＩＬ抵抗性を有する悪性腫瘍において、ＴＲＡＩＬ感受性を増強し得る剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、グリクラジド、グリベンクラミドまたはＵ３７８８３Ａ等のＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤が、ＴＲＡＩＬ抵抗性を有する悪性腫瘍において、ＴＲＡＩＬ感受性を増強できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明のグリクラジド、グリベンクラミドまたはＵ３７８８３Ａ等のＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤を有効成分とするＴＲＡＩＬ感受性増強剤を使用することにより、ＴＲＡＩＬ抵抗性を有する悪性腫瘍においても、ＴＲＡＩＬによる腫瘍選択的殺細胞作用（アポトーシス誘導作用）を示すことが可能となる。【０００９】
即ち、本発明は次の（１）〜（１１）のＴＲＡＩＬ感受性増強剤および悪性腫瘍治療薬等に関する。
（１）ＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤を有効成分とするＴＲＡＩＬ感受性増強剤。
（２）ＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤が５−ｃｈｌｏｒｏ−Ｎ−（４−［Ｎ−（ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）ｓｕｌｆａｍｏｙｌ］ｐｈｅｎｅｔｈｙｌ）−２−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚａｍｉｄｅ、Ｎ−（ｈｅｘａｈｙｄｒｏｃｙｃｌｏｐｅｎｔａ［ｃ］ｐｙｒｒｏｌ−２（１Ｈ）−ｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）−４−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅまたは４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｉｍｉｄｉｎｅ−Ｎ−ａｄａｍａｎｔｙｌ−Ｎ’−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅのいずれか一種以上である上記（１）に記載のＴＲＡＩＬ感受性増強剤。
（３）上記（１）または（２）に記載のＴＲＡＩＬ感受性増強剤を有効成分とし、ＴＲＡＩＬと組み合わせて使用される悪性腫瘍治療薬。
（４）悪性腫瘍が慢性リンパ性白血病、星状細胞腫、髄膜腫またはメラノーマである上記（３）に記載の悪性腫瘍治療薬。
（５）ＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤を有効成分とする悪性腫瘍のＴＲＡＩＬ感受性増強剤。
（６）ＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤が５−ｃｈｌｏｒｏ−Ｎ−（４−［Ｎ−（ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）ｓｕｌｆａｍｏｙｌ］ｐｈｅｎｅｔｈｙｌ）−２−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚａｍｉｄｅ、Ｎ−（ｈｅｘａｈｙｄｒｏｃｙｃｌｏｐｅｎｔａ［ｃ］ｐｙｒｒｏｌ−２（１Ｈ）−ｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）−４−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅまたは４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｉｍｉｄｉｎｅ−Ｎ−ａｄａｍａｎｔｙｌ−Ｎ’−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅのいずれか一種以上である上記（５）に記載のＴＲＡＩＬ感受性増強剤。
（７）上記（５）または（６）に記載のＴＲＡＩＬ感受性増強剤を有効成分とし、ＴＲＡＩＬと共に投与されるための悪性腫瘍を処置するための医薬。
（８）悪性腫瘍が慢性リンパ性白血病、星状細胞腫、髄膜腫またはメラノーマである上記（７）に記載の医薬。
（９）上記（５）または（６）に記載のＴＲＡＩＬ感受性増強剤およびＴＲＡＩＬを含む悪性腫瘍治療薬。
（１０）ＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤を投与する工程を含むＴＲＡＩＬ感受性の増強方法。
（１１）ＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤とＴＲＡＩＬを投与する工程を含む悪性腫瘍の治療方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によって、慢性リンパ性白血病、メラノーマ等のＴＲＡＩＬ抵抗性の悪性腫瘍においてもＴＲＡＩＬによる治療が可能となる。グリクラジド、グリベンクラミドまたはＵ３７８８３Ａ等のＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤は２型糖尿病の治療剤としてすでに使用されている剤であることから、これらを有効成分とすることにより、安全性の高い悪性腫瘍治療薬の提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＴＲＡＩＬ感受性増強剤の効果を示した図である（試験例１）。
【図２】Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＴＲＡＩＬ感受性増強剤の効果を示した図である（試験例１）。
【図３】メラノーマ細胞におけるＴＲＡＩＬ感受性増強剤の効果を示した図である（試験例１）。
【図４】メラノーマ細胞におけるＴＲＡＩＬ感受性増強剤の効果を示した図である（試験例１）。
【図５】正常メラニン合成細胞におけるＴＲＡＩＬ感受性増強剤の毒性の有無を確認した図である（試験例２）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の「ＴＲＡＩＬ感受性増強剤」とは、ＴＲＡＩＬ抵抗性を有する悪性腫瘍や、ＴＲＡＩＬ抵抗性は示さないもののＴＲＡＩＬによる効果が弱い悪性腫瘍等において、ＴＲＡＩＬに対する感受性を増強し、ＴＲＡＩＬによる腫瘍選択的殺細胞作用（アポトーシス誘導作用）を示すことを可能とする剤のことをいう。
本発明の「ＴＲＡＩＬ感受性増強剤」は、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤を有効成分とする剤であり、ＴＲＡＩＬ抵抗性を有する悪性腫瘍や、ＴＲＡＩＬ抵抗性は示さないものの、ＴＲＡＩＬによる効果が弱い悪性腫瘍等において、ＴＲＡＩＬに対する感受性を増強できる剤であればいずれのものも含まれる。
本発明の「ＴＲＡＩＬ感受性増強剤」は、有効成分となるＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤のみからなる剤であってもよく、有効成分となるＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤の作用を維持できる成分であれば、薬学的に許容されるその他の成分を含有するものであっても良い。本発明の「ＴＲＡＩＬ感受性増強剤」は、溶液状、固体状、ゲル状やゾル状等が挙げられるが、形態は特に問わない。【００１３】
「ＴＲＡＩＬ感受性増強剤」の有効成分となるＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤は、「ＴＲＡＩＬ感受性増強剤」として働き得るＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤であればいずれのものも含まれる。例えば、グリクラジド、グリベンクラミドまたはＵ３７８８３Ａ等が挙げられ、これらのＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤を一種または複数組み合わせて本発明の「ＴＲＡＩＬ感受性増強剤」の有効成分とすることもできる。
グリクラジド、グリベンクラミドまたはＵ３７８８３Ａ等は、市販されているものであっても良く、ヒト等の生物において安全に使用できるものであれば、従来知られているいずれの方法によって合成されたものであっても良く、独自に合成したものを用いても良い。
本発明の「ＴＲＡＩＬ感受性増強剤」に含まれるＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤は、グリクラジドの場合は１〜９８０μｇ／ｍｌ、２〜６５０μｇ／ｍｌ、３〜４４０μｇ／ｍｌ、５〜２９０μｇ／ｍｌ、８〜１９０μｇ／ｍｌ、１１〜１３０μｇ／ｍｌ、１７〜９０μｇ／ｍｌ、または２５〜６０μｇ／ｍｌで含まれていることが好ましく、９．５〜３８．２μｇ／ｍｌで含まれていることがより好ましく、３８．２μｇ／ｍｌとなるように含まれていることが特に好ましい。また、Ｕ３７８８３Ａの場合もグリクラジドと同様である。
グリベンクラミドの場合は１〜１９００μｇ／ｍｌ、２〜１２７０μｇ／ｍｌ、３〜８５０μｇ／ｍｌ、４〜５６０μｇ／ｍｌ、７〜３８０μｇ／ｍｌ、１０〜２５０μｇ／ｍｌ、１５〜１７０μｇ／ｍｌ、２２〜１１０μｇ／ｍｌ、または３３〜７０μｇ／ｍｌで含まれていることが好ましく、１２．４〜４９．４μｇ／ｍｌで含まれていることがより好ましく、４９．４μｇ／ｍｌとなるように含まれていることが特に好ましい。
これらの濃度のＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤を含む「ＴＲＡＩＬ感受性増強剤」を用いることで、ＴＲＡＩＬ抵抗性を有する悪性腫瘍においてもＴＲＡＩＬによるアポトーシスの誘導を増強することができる。【００１４】
本発明の「悪性腫瘍治療薬」とは、ＴＲＡＩＬ抵抗性を有する悪性腫瘍や、ＴＲＡＩＬ抵抗性は示さないものの効果が弱い悪性腫瘍等において、ＴＲＡＩＬと組み合わせて使用することにより、ＴＲＡＩＬによる腫瘍選択的殺細胞作用（アポトーシス誘導作用）を有効に示すことが可能となる薬のことをいう。
本発明の「悪性腫瘍治療薬」は、本発明の「ＴＲＡＩＬ感受性増強剤」を有効成分とするものであればいずれのものも含まれる。本発明の「ＴＲＡＩＬ感受性増強剤」は、有効成分となるＴＲＡＩＬ感受性増強剤のみを含有するものであってもよく、有効成分となるＴＲＡＩＬ感受性増強剤の作用を維持できる成分であれば、薬学的に許容されるその他の成分を含有するものであっても良い。本発明の「免疫賦活剤」は、溶液状、固体状、ゲル状やゾル状等が挙げられるが、形態は特に問わない。
このような本発明の薬剤の投与は、同時又は順次行うことができる。同時投与は、化合物を単一の組成物として投与するか、同時又はほぼ同時に投与する異なる組成物として投与することによって行うことができる。連続（順次）投与は、必要に応じて任意の順序とすることができる。【００１５】
本発明の「悪性腫瘍治療薬」は、ＴＲＡＩＬ抵抗性を有する悪性腫瘍や、ＴＲＡＩＬ抵抗性は示さないもののＴＲＡＩＬによる効果が弱い悪性腫瘍等を対象として使用することができる。対象となる悪性腫瘍は、これらの悪性腫瘍に該当すればいずれであってもよく、例えば、慢性リンパ性白血病、星状細胞腫、髄膜腫またはメラノーマ等が挙げられる。【００１６】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１７】
＜ＴＲＡＩＬ感受性増強剤＞
１．ＴＲＡＩＬ感受性増強剤（Ａ）
グリクラジド（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）をＴＲＡＩＬ感受性増強剤（Ａ）として用いた。
グリクラジド５ｍｇをＰＢＳ  １．３ｍｌに溶解し、−２０℃で保存した。これを使用時に最終濃度が１００μＭになるように希釈して用いた。
２．ＴＲＡＩＬ感受性増強剤（Ｂ）
グリベンクラミド（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）をＴＲＡＩＬ感受性増強剤（Ｂ）として用いた。
グリベンクラミド５５ｍｇをＤＭＳＯ  ２．２ｍｌに溶解し、−２０℃で保存した。これを使用時に最終濃度が１００μＭになるように希釈して用いた。
３．ＴＲＡＩＬ感受性増強剤（Ｃ）
Ｕ３７８８３Ａ（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）をＴＲＡＩＬ感受性増強剤（Ｃ）として用いた。
Ｕ３７８８３Ａ５ｍｇをＰＢＳ  １．３ｍｌに溶解し、−２０℃で保存した。これを使用時に最終濃度が１００μＭになるように希釈して用いた。【００１８】
［試験例１］
実施例１で製造したＴＲＡＩＬ感受性増強剤と、ポジティブコントロールとして塩化カリウム（ＫＣｌ）、比較として電位差依存性カリウムチャネル阻害剤（Ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ；ＴＥＡ）を用い、ＴＲＡＩＬ抵抗性の悪性腫瘍由来の腫瘍細胞におけるＴＲＡＩＬ感受性増強作用を調べた。【００１９】
＜試料＞
１．試薬
１）ＴＲＡＩＬ感受性増強剤
実施例１で製造したＴＲＡＩＬ感受性増強剤（Ａ）、ＴＲＡＩＬ感受性増強剤（Ｂ）およびＴＲＡＩＬ感受性増強剤（Ｃ）を用いた。
２）塩化カリウム（ＫＣｌ）
ＫＣｌ  １８．６ｍｇをＰＢＳ  １ｍｌに溶解して５倍濃度溶液を作成した。これを使用時に５０ｍＭになるように希釈して用いた。
３）電位差依存性カリウムチャネル阻害剤
電位差依存性カリウムチャネル阻害剤（Ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ；ＴＥＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）２ｇをＰＢＳ  ６０ｍｌに溶解し、−２０℃保存で保存した。これを使用時に最終濃度が２０ｍＭになるように希釈して用いた。【００２０】
２．ＴＲＡＩＬ抵抗性の悪性腫瘍由来の腫瘍細胞
１）Ｊｕｒｋａｔ細胞
慢性リンパ性白血病由来の腫瘍細胞として、Ｊｕｒｋａｔ細胞（理研バイオリソースセンターより譲受）を用いた。Ｊｕｒｋａｔ細胞はＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳで培養した。
２）メラノーマ細胞（Ａ３７５）
メラノーマ由来の腫瘍細胞として、メラノーマ細胞（Ａ３７５）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ（以下、ＡＴＣＣと示す）より購入）を用いた。メラノーマ細胞（Ａ３７５）はＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ  Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅで培養した。【００２１】
３．ＴＲＡＩＬ
Ｋｉｌｌｅｒ  ＴＲＡＩＬ（登録商標），Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  （Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、５００μｇ／ｍｌ）を−２０℃で保存した。これを使用時に最終濃度が６．３〜１００ｎｇ／ｍｌになるように希釈して使用した。【００２２】
＜試験＞
上記２．の２４ウエルプレートに接着させ培養した各腫瘍細胞に、２５ｎｇ／ｍｌとなるように調製したＴＲＡＩＬと、の上記１．のＴＲＡＩＬ感受性増強剤（Ａ）（グリクラジド  ３８．２μｇ／ｍｌ）、ＴＲＡＩＬ感受性増強剤（Ｂ）（グリベンクラミド  ４９．４μｇ／ｍｌ）またはＴＲＡＩＬ感受性増強剤（Ｃ）（Ｕ３７８８３Ａ  ３８．２μｇ／ｍｌ）をそれぞれ添加した。添加後２４時間経過した後、アポトーシスがどれくらい誘導されているかをフローサイトメトリー（ＦＩＴＣ−Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉ  ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）によって調べた。
培養液または０．２％  ＤＭＳＯを加えたもの（図１〜４：ｖｅｈｉｃｌｅと示す）、コントロールとしてＴＲＡＩＬのみを添加したもの（図１〜４：ＴＲＡＩＬ  ａｌｏｎｅと示す）およびＴＲＡＩＬ感受性増強剤のみを添加したもの（図１〜４：Ｕ３７８８３Ａ  ａｌｏｎｅまたはＧｌｉｂｅｎｃｌａｍｉｄｅ  ａｌｏｎｅと示す）についても調べた。【００２３】
＜結果＞
図１、２にＪｕｒｋａｔ細胞の結果を、図３，４にメラノーマ細胞（Ａ３７５）の結果を示した。
その結果、図２、図４のグラフから読み取れるように、ｖｅｈｉｃｌｅおよびＴＲＡＩＬ感受性増強剤単独ではいずれもアポトーシスの誘導が増強されていなかったが、本発明のＴＲＡＩＬ感受性増強剤（Ｃ）とＴＲＡＩＬを組み合わせて作用させた場合や、ＴＲＡＩＬ感受性増強剤（Ｂ）とＴＲＡＩＬを組み合わせて作用された場合には、Ｊｕｒｋａｔ細胞およびメラノーマ細胞（Ａ３７５）のいずれにおいても、ＴＲＡＩＬによるアポトーシスの誘導が増強されていることが確認できた。また、ＴＲＡＩＬ感受性増強剤（Ａ）とＴＲＡＩＬを組み合わせて作用させた場合も、ＴＲＡＩＬ感受性増強剤（Ｃ）を用いた場合と同様の結果であった。
従って、これらの結果より、本発明のＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤を有効成分とするＴＲＡＩＬ感受性増強剤によって、ＴＲＡＩＬ抵抗性の悪性腫瘍においても、ＴＲＡＩＬ感受性を増強でき、アポトーシスを誘導することが可能になることが示された。
なお、ＡＴＰ感受性カリウムチャネルや電位差依存性カリウムチャネル等のすべてのカリウムチャネルによる細胞内カリウムの排出を抑制するＫＣｌ（ポジティブコントロール）と組み合わせた場合も同様の結果が得られたが、電位差依存性カリウムチャネル阻害剤と組み合わせた場合では、ＴＲＡＩＬによるアポトーシスの誘導の増強は見られなかった。これは、ＴＲＡＩＬ抵抗性の悪性腫瘍におけるアポトーシスの誘導において、電位差依存性カリウムチャネルではなく、ＡＴＰ感受性カリウムチャネルによって、細胞内カリウムの排出を抑制することが重要であることを示唆するものと考えられた。【００２４】
［試験例２］
実施例１で製造したＴＲＡＩＬ感受性増強剤を用い、正常細胞への毒性の有無を調べた。
＜試料＞
１．試薬
１）ＴＲＡＩＬ感受性増強剤
実施例１で製造したＴＲＡＩＬ感受性増強剤（Ｃ）を用いた。【００２５】
２．細胞
１）メラノーマ細胞（Ａ３７５）
ＴＲＡＩＬ抵抗性の悪性腫瘍由来の腫瘍細胞として、試験例１と同様にメラノーマ細胞（Ａ３７５）（ＡＴＣＣ）を用いた。
２）ヒトメラニン産生細胞  正常細胞として、ヒト上皮メラニン産生細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。
ヒトメラニン産生細胞は、ヒトメラニン産生細胞増殖補助因子（ＨＭＧＳ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＭ２５４培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。【００２６】
３．ＴＲＡＩＬ
使用時に最終濃度が１００ｎｇ／ｍｌになるように希釈して、試験例１と同様に調製したものを使用した。【００２７】
＜試験＞  上記２．の各細胞を８−チャンバーカバーガラス（Ａｓａｈｉ  Ｇｌａｓｓ  Ｃｏ．製）に播き、１００ｎｇ／ｍｌとなるように調製したＴＲＡＩＬと、の上記１．のＴＲＡＩＬ感受性増強剤（Ｃ）（Ｕ３７８８３Ａ）を終濃度が１００μＭとなるように、それぞれ添加した。これを３７°Ｃで２４時間、ＣＯ２インキュベーター中で培養した後、培地を除きＰＢＳで洗浄した。
それぞれの細胞に各４μＭのｃａｌｃｅｉｎ−アセトキシメチルエステル（ＡＭ）またはｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒを加え、暗所で室温、３０分間静置して、細胞を染色した。ここで、使用したＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭおよびｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒは、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に含まれるものである。
細胞染色後、倒立蛍光顕微鏡（ＩＸ７１  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（Ｏｌｙｍｐｕｓ製）で細胞を観察し、生細胞および死細胞についてのデータをＬｕｍｉｎａＶｉｓｉｏｎ  ソフトウエア（Ｍｉｔａｎｉ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）で解析した。
【００２８】
＜結果＞
その結果、図５に示したように、ヒトメラニン産生細胞は、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ感受性増強剤（Ｃ）およびこれらを組み合わせて作用させても、いずれもアポトーシスを起こした細胞（死細胞）が確認されず、本発明のｔｒａｉｌ感受性増強剤（Ｃ）は、単独およびＴＲＡＩＬとの組合せであっても、正常細胞には作用しない、毒性の低い剤であることが確認できた。
一方、ヒトメラノーマ細胞に対しては、ＴＲＡＩＬおよびＴＲＡＩＬ感受性増強剤（Ｃ）はいずれも細胞のアポトーシスを誘導し、これらを組み合わせて使用することによって、著しい細胞死を起こすことが確認できた。
【実施例２】
【００２９】
＜悪性腫瘍治療薬＞
実施例１において製造した、グリクラジド、グリベンクラミドまたはＵ３７８８３Ａを有効成分として含むＴＲＡＩＬ感受性増強剤を有効成分として、悪性腫瘍治療薬を製造した。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明のＴＲＡＩＬ感受性増強剤の提供によって、慢性リンパ性白血病、メラノーマ等のＴＲＡＩＬ抵抗性の悪性腫瘍においてもＴＲＡＩＬによる治療が可能となる。グリクラジド、グリベンクラミドまたはＵ３７８８３Ａ等のＡＴＰ感受性カリウムチャネル阻害剤は２型糖尿病の治療剤としてすでに使用されている剤であることから、これらを有効成分とすることにより、安全性の高い悪性腫瘍治療薬が提供できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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