(57)【要約】【課題】  アスコルビン酸２−グルコシドの生成率が３５質量％に満たない場合であっても、有意に固結し難い粉末を製造することを可能にするアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】  液化澱粉若しくはデキストリンのいずれかとＬ−アスコルビン酸とを含む溶液に、ＣＧＴａｓｅを作用させ、次いでグルコアミラーゼを作用させてアスコルビン酸２−グルコシドの生成率が２７質量％以上である溶液を得る工程；得られた溶液を精製して、アスコルビン酸２−グルコシド含量を８６質量％超とする工程；制御冷却法又は擬似制御冷却法によってアスコルビン酸２−グルコシドの無水結晶を析出させる工程；析出したアスコルビン酸２−グルコシドの無水結晶を採取し、熟成、乾燥する工程を含むアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造方法を提供することによって解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ア）乃至（オ）の工程を含む、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸無水結晶含有粉末の製造方法：
（ア）原料として液化澱粉若しくはデキストリンのいずれかとＬ−アスコルビン酸とを含む溶液に、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを作用させ、次いでグルコアミラーゼを作用させて２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸の生成率が２７質量％以上である２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸含有溶液を得る工程；
（イ）得られた２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸含有溶液を精製して、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸含量を無水物換算で８６質量％超とする工程；
（ウ）２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸を無水物換算で８６質量％超含有する溶液から制御冷却法又は擬似制御冷却法によって２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸の無水結晶を析出させる工程；
（エ）析出した２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸の無水結晶を採取する工程；
（オ）採取された２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸の無水結晶を、溶解、再結晶化することなく、熟成、乾燥し、必要に応じて粉砕することにより、無水物換算で２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸を９８．０質量％を超え９９．９質量％未満含有し、粉末Ｘ線回折プロフィルに基づき算出される２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸無水結晶についての結晶化度が９０％以上である２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸無水結晶含有粉末を得る工程。
【請求項２】
前記（ア）の工程において、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼとともに澱粉枝切り酵素を作用させることを特徴とする、請求項１記載の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸無水結晶含有粉末の製造方法。
【請求項３】
前記（イ）の工程が、アニオン交換樹脂を充填剤として用いるカラムクロマトグラフィーと、強酸性カチオン交換樹脂を充填剤として用いる擬似移動床式のカラムクロマトグラフィーを行う工程を含んでいる、請求項１又は２記載の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸無水結晶含有粉末の製造方法。
【請求項４】
前記シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼが、下記（ａ）乃至（ｄ）に示す部分アミノ酸配列を有するシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼである請求項１乃至３のいずれかに記載の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸無水結晶含有粉末の製造方法；
（ａ）Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｘ１−Ａｓｎ−Ａｓｎ；
（ｂ）Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｘ２−Ｔｈｒ−Ａｌａ；
（ｃ）Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ；
（ｄ）Ｖａｌ−Ｘ３−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ。
（但し、Ｘ１はＰｒｏ又はＡｌａを、Ｘ２はＳｅｒ又はＡｓｐを、Ｘ３はＳｅｒ又はＧｌｙをそれぞれ意味する。）
【請求項５】
前記シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼが、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス又はサーモアナエロバクター・サーモスルフリゲネス由来の天然型若しくは組換え型酵素である請求項１乃至４のいずれかに記載の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸無水結晶含有粉末の製造方法。
【請求項６】
前記シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼが、配列表における配列番号１、３、４又は５のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼである請求項１乃至５のいずれかに記載の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸無水結晶含有粉末の製造方法。
【請求項７】
得られる２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸無水結晶含有粉末が、原料由来のＬ−アスコルビン酸及び／又はＤ−グルコースを含有し、Ｌ−アスコルビン酸量が無水物換算で０．１質量％以下で、粉末全体の還元力が１質量％未満であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸無水結晶含有粉末の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸無水結晶含有粉末の製造方法に関し、詳細には、従来品に比べて有意に固結し難い２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸無水結晶含有粉末の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アスコルビン酸は、その優れた生理活性や抗酸化作用の故に、従来から飲食品、化粧品などを含め種々の用途に使用されている。反面、Ｌ−アスコルビン酸は、直接還元性故に不安定であり、酸化分解を受け易く、生理活性を失い易いという大きな欠点を有している。このＬ−アスコルビン酸の欠点を解消すべく、本出願人は、特許文献１において、共同出願人の一人として、Ｌ−アスコルビン酸の２位の水酸基に１分子のＤ−グルコースが結合した２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸（以下、本明細書では「アスコルビン酸２−グルコシド」と略称する。）を開示した。このアスコルビン酸２−グルコシドは、直接還元性を示さず、安定であり、かつ、生体内では、生体内にもともと存在する酵素によってＬ−アスコルビン酸とＤ−グルコースとに分解されてＬ−アスコルビン酸本来の生理活性を発揮するという画期的な特性を有している。特許文献１に開示された製造方法によれば、アスコルビン酸２−グルコシドは、Ｌ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物とを含有する溶液にシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（以下、「ＣＧＴａｓｅ」と略称する。）又はα−グルコシダーゼなどの糖転移酵素を作用させることによって生成される。【０００３】
本出願人は、さらに、特許文献２において、アスコルビン酸２−グルコシドの過飽和溶液からアスコルビン酸２−グルコシドを晶析させることに成功し、結晶アスコルビン酸２−グルコシドと、それを含むアスコルビン酸２−グルコシド結晶含有粉末を開示した。また、本出願人は、非特許文献１において、大量スケールのアスコルビン酸２−グルコシド高含有物の製造方法を開示している。なお、アスコルビン酸２−グルコシド結晶としては、現在のところ、無水結晶しか知られていない。因みに、非特許文献２及び３には、アスコルビン酸２−グルコシド結晶について、Ｘ線による構造解析の結果が報告されている。【０００４】
本出願人は、さらに、特許文献３及び４において、酵素反応によって生成したアスコルビン酸２−グルコシドを含有する溶液を、強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーに供してアスコルビン酸２−グルコシドの高含有画分を採取するアスコルビン酸２−グルコシド高含有物の製造方法を開示した。また、本出願人は、特許文献５において、酵素反応によって生成したアスコルビン酸２−グルコシドを含有する溶液からアニオン交換膜を用いる電気透析によってＬ−アスコルビン酸や糖類などの夾雑物を除去するアスコルビン酸２−グルコシド高含有物の製造方法を開示し、特許文献６においては、アスコルビン酸２−グルコシドを含有する溶液をアニオンイオン交換樹脂と接触させて、アニオンイオン交換樹脂に吸着された成分を選択的に脱着させてアスコルビン酸２−グルコシドの高含有画分を得るアスコルビン酸２−グルコシド高含有物の製造方法を開示した。【０００５】
因みに、特許文献７乃至１１には、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｏｍｏｐｈｉｌｕｓ、現在ではジオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に分類される）由来のＣＧＴａｓｅとそのＣＧＴａｓｅ蛋白をコードする遺伝子の塩基配列、塩基配列から決定されたアミノ酸配列、さらには、人為的に変異を導入して作製した変異体ＣＧＴａｓｅとそれを用いた糖質の製造方法が開示されている。また、非特許文献４及び５には、澱粉質とＬ−アスコルビン酸とを含む溶液にバチルス・ステアロサーモフィルス由来ＣＧＴａｓｅを作用させ、次いでグルコアミラーゼを作用させることによりアスコルビン酸２−グルコシドを生成させたことが開示されている。【０００６】
さらに、本出願人は、特許文献１２において、Ｌ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物とを含有する溶液にα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、又は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とＣＧＴａｓｅを作用させてアスコルビン酸２−グルコシドを生成させるアスコルビン酸２−グルコシドの製造方法を開示した。また、本出願人による特許文献１３及び１４には、それぞれ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及びα−イソマルトシル転移酵素が、Ｌ−アスコルビン酸への糖転移を触媒してアスコルビン酸２−グルコシドを生成することが開示されている。【０００７】
また、アスコルビン酸２−グルコシドの用途に関しては、例えば特許文献１５乃至３４に示すとおり、多数の提案が為されている。アスコルビン酸２−グルコシドは、その優れた特性のために、食品素材、食品添加物素材、化粧品素材、医薬部外品素材、或いは医薬品素材として、従来からのＬ−アスコルビン酸の用途はもとより、Ｌ−アスコルビン酸が不安定であるために従来はＬ−アスコルビン酸を用いることができなかったその他の用途にも広く使用されるに至っている。【０００８】
上述したとおり、アスコルビン酸２−グルコシドは、現在では、Ｌ−アスコルビン酸と澱粉質とを原料にして、種々の糖転移酵素を用いて製造できることが知られている。しかし、本出願人がこれまでに得た知見によれば、液化澱粉若しくはデキストリンのいずれかとＬ−アスコルビン酸とを含有する溶液に糖転移酵素としてＣＧＴａｓｅを作用させる方法が、アスコルビン酸２−グルコシドの生成率が最も高く、工業的に優れた方法である。この知見に基づき、本出願人は、液化澱粉若しくはデキストリンのいずれかとＬ−アスコルビン酸とを含有する溶液にＣＧＴａｓｅを作用させる方法によってアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を製造し、これを化粧品・医薬部外品素材及び食品素材、食品添加物素材として、それぞれ、商品名『ＡＡ２Ｇ』（株式会社林原生物化学研究所販売）及び商品名『アスコフレッシュ』（株式会社林原商事販売）として販売している（以下、これら化粧品・医薬部外品素材、食品素材及び食品添加物素材として販売されている従来のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を「医薬部外品級の粉末」と略称する。）。【０００９】
しかし、医薬部外品級の粉末は、製品規格上のアスコルビン酸２−グルコシドの純度が９８．０質量％以上と比較的高純度であり、製造直後は粉末としての良好な流動性を備えているにもかかわらず、高温、高湿の環境下に長期間置くと、自重や吸湿により固結するという欠点を有している。斯かる欠点に鑑み、医薬部外品級の粉末は、その１０ｋｇずつをポリエチレン製の袋に詰め、乾燥剤と共に蓋付きスチール缶に入れた商品形態で販売されているが、本発明者らが得たその後の知見によれば、このような商品形態であっても医薬部外品級の粉末は、保存期間が長期に及ぶと、往々にして固結し、粉末としての有用性が損なわれてしまうという問題点を有している。化粧品素材や医薬部外品素材、或いは食品素材、食品添加物素材として用いられるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末が固結すると、本来、原料素材が流動性を有する粉末であることを前提に製造プラントが設計されている場合には、原料素材の輸送や篩い分け、混合などの工程に支障をきたす恐れがある。【００１０】
一方、本出願人が分析用の標準試薬として販売しているアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末（商品名『アスコルビン酸２−グルコシド  ９９９』、コード番号：ＡＧ１２４、株式会社林原生物化学研究所販売。）（以下、「試薬級の粉末」と略称する。）（非特許文献６参照）は、医薬部外品級の粉末が固結する条件下でも固結せず、粉末としての性状を保っている。この試薬級の粉末は、医薬部外品級の粉末と同じく、Ｌ−アスコルビン酸と澱粉質とを含有する溶液にＣＧＴａｓｅを作用させる工程を経て、得られるアスコルビン酸２−グルコシド含有溶液を精製、濃縮して、アスコルビン酸２−グルコシドの無水結晶を析出させ、これを採取することによって製造される粉末であるが、通常の工程に加えて、一旦得られた結晶を溶解して再び晶析させる再結晶工程や、再結晶工程で得られた結晶を、純水等を用いて繰り返し洗浄する洗浄工程を追加することによって、アスコルビン酸２−グルコシドの純度を９９．９質量％以上という極めて高純度のレベルにまで高めている点で、医薬部外品級の粉末とは異なっている。したがって、医薬部外品級の粉末においても、アスコルビン酸２−グルコシドの純度を９９．９質量％以上にまで高めれば固結し難いアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末が得られるのではないかと推測される。【００１１】
しかしながら、アスコルビン酸２−グルコシドの純度を９９．９質量％以上という高純度にするには、上述したとおり、通常の製造工程に加えて、再結晶工程や、純水等を用いた繰り返しの洗浄工程を追加する必要があり、製造に要する時間と労力が増すばかりでなく、再結晶工程や洗浄工程におけるアスコルビン酸２−グルコシドのロスが避けられず、製品の歩留まりが低下し、製造コストが大幅に上昇するという不都合がある。このため、医薬部外品級の粉末よりも固結し難いアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を得ることを目的として単純にアスコルビン酸２−グルコシドの純度を９９．９質量％以上にまで高めるという選択肢は現実的なものではない。また、本発明者らの知見によれば、試薬級の粉末には、１，３−ブチレングリコール水溶液などの化粧品及び医薬部外品に汎用される親水性溶媒と混合した場合に溶解性に劣るという欠点がある。【００１２】
このような状況下、本出願人は、種々試行錯誤を重ねた結果、液化澱粉若しくはデキストリンのいずれかとＬ−アスコルビン酸とを含有する溶液にＣＧＴａｓｅを作用させ、次いでグルコアミラーゼを作用させる製造方法において、酵素反応によって得られる反応溶液中のアスコルビン酸２−グルコシドの生成率を３５質量％以上に高める場合には、一旦採取したアスコルビン酸２−グルコシドの無水結晶を溶解、再結晶することなく、従来の医薬部外品級の粉末を製造するのとほぼ同じ工程によって、従来の医薬部外品級の粉末よりも有意に固結し難い粉末を製造することができることを見出し、特許文献３５に開示した。しかしながら、上記の製造方法において、酵素反応によって得られる反応溶液中のアスコルビン酸２−グルコシドの生成率を３５質量％以上にまで高めるには、限られた特定のＣＧＴａｓｅを単独で、或いはイソアミラーゼ等の澱粉枝切り酵素と併用して用いる必要があり、製造方法としての汎用性に欠けるという不都合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開平３−１３９２８８号公報
【特許文献２】特開平３−１３５９９２号公報
【特許文献３】特開平３−１８３４９２号公報
【特許文献４】特開平５−１１７２９０号公報
【特許文献５】特開平５−２０８９９１号公報
【特許文献６】特開２００２−０８８０９５号公報
【特許文献７】特開昭５０−６３１８９号公報
【特許文献８】特開昭６３−３９５９７号公報
【特許文献９】特開平５−２４４９４５号公報
【特許文献１０】国際公開ＷＯ９６０３３２６７号パンフレット
【特許文献１１】国際公開ＷＯ９９０１５６３３号パンフレット
【特許文献１２】特開２００４−０６５０９８号公報
【特許文献１３】国際公開ＷＯ０２０１０３６１号パンフレット
【特許文献１４】国際公開ＷＯ０１０９０３３８号パンフレット
【特許文献１５】国際公開ＷＯ０５０８７１８２号パンフレット
【特許文献１６】特開平４−０４６１１２号公報
【特許文献１７】特開平４−１８２４１２号公報
【特許文献１８】特開平４−１８２４１３号公報
【特許文献１９】特開平４−１８２４１９号公報
【特許文献２０】特開平４−１８２４１５号公報
【特許文献２１】特開平４−１８２４１４号公報
【特許文献２２】特開平８−３３３２６０号公報
【特許文献２３】特開２００５−２３９６５３号公報
【特許文献２４】国際公開ＷＯ０６０３３４１２号パンフレット
【特許文献２５】特開２００２−３２６９２４号公報
【特許文献２６】特開２００３−１７１２９０号公報
【特許文献２７】特開２００４−２１７５９７号公報
【特許文献２８】国際公開ＷＯ０５０３４９３８号パンフレット
【特許文献２９】特開２００６−２２５３２７号公報
【特許文献３０】国際公開ＷＯ０６１３７１２９号パンフレット
【特許文献３１】国際公開ＷＯ０６０２２１７４号パンフレット
【特許文献３２】特開２００７−０６３１７７号公報
【特許文献３３】国際公開ＷＯ０６１３２３１０号パンフレット
【特許文献３４】国際公開ＷＯ０７０８６３２７号パンフレット
【特許文献３５】国際公開ＷＯ２０１１／０２７７９０号パンフレット
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】『山陽技術雑誌』、第４５巻、１号、６３〜６９頁（１９９７年）
【非特許文献２】マンダイ・タカヒコら、『カーボハイドレート・リサーチ』（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２３２巻、１９７〜２０５頁（１９９２年）
【非特許文献３】イノウエ・ユタカら、『インターナショナル・ジャーナル・オブ・ファーマシューティクス』（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ）、第３３１巻、３８〜４５頁（２００７年）
【非特許文献４】『アプライド  バイオケミストリー  アンド  マイクロバイオロジー』（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第ｌ４３巻、１号、３６−４０頁（２００７年）
【非特許文献５】『アグリカルチュラル  アンド  バイオロジカル  ケミストリー』（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第７巻、１７５１−１７５６頁（１９９１年）
【非特許文献６】『ワコー  アナリティカル  サークル』（Ｗａｋｏ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｉｒｃｌｅ）、２９号、６頁（２００３年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、上記の不都合を解決するために為されたもので、酵素反応によって得られる反応溶液中のアスコルビン酸２−グルコシドの生成率が３５質量％に満たない場合であっても、医薬部外品級の粉末に比べて有意に固結し難いアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を製造することを可能にするアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造方法を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記の課題を解決するために、本発明者らはアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造方法について更に研究を重ね、種々試行錯誤を繰り返した結果、アスコルビン酸２−グルコシド含有溶液からアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を析出させるに際して後述する制御冷却法又は擬似制御冷却法を適用することによって、酵素反応によって得られる反応溶液中のアスコルビン酸２−グルコシドの生成率が３５質量％に満たないレベルであっても、医薬部外品級の粉末に比べて有意に固結し難いアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を、従来から行われている医薬部外品級の粉末の製造方法とほぼ変わらぬ工程で製造することができることを見出した。【００１７】
すなわち、本発明は、下記（ア）乃至（オ）の工程を含む、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造方法を提供することによって上記の課題を解決するものである：
（ア）原料として液化澱粉若しくはデキストリンのいずれかとＬ−アスコルビン酸とを含む溶液に、ＣＧＴａｓｅを作用させ、次いでグルコアミラーゼを作用させてアスコルビン酸２−グルコシドの生成率が２７質量％以上であるアスコルビン酸２−グルコシド含有溶液を得る工程；
（イ）得られたアスコルビン酸２−グルコシド含有溶液を精製して、アスコルビン酸２−グルコシド含量を無水物換算で８６質量％超とする工程；
（ウ）アスコルビン酸２−グルコシドを無水物換算で８６質量％超含有する溶液から制御冷却法又は擬似制御冷却法によってアスコルビン酸２−グルコシドの無水結晶を析出させる工程；
（エ）析出したアスコルビン酸２−グルコシドの無水結晶を採取する工程；及び、
（オ）採取されたアスコルビン酸２−グルコシドの無水結晶を、溶解、再結晶化することなく、熟成、乾燥し、必要に応じて粉砕することにより、無水物換算でアスコルビン酸２−グルコシドを９８．０質量％を超え９９．９質量％未満含有し、粉末Ｘ線回折プロフィルに基づき算出されるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての結晶化度が９０％以上であるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を得る工程。【００１８】
このように本発明の製造方法によれば、酵素反応によって得られる反応溶液中のアスコルビン酸２−グルコシドの生成率が、３５質量％に達しないレベルであっても、少なくとも２７質量％以上であれば、前記反応溶液を適宜精製して得られるアスコルビン酸２−グルコシド溶液から後述する制御冷却法又は擬似制御冷却法によってアスコルビン酸の無水結晶を析出させることにより、無水物換算でアスコルビン酸２−グルコシドを９８．０質量％を超え９９．９質量％未満含有し、粉末Ｘ線回折プロフィルに基づき算出されるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての結晶化度が９０％以上であるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を得ることができる。【００１９】
斯かる製造方法によって得られるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末は、粉末中のアスコルビン酸２−グルコシドの純度は９８．０質量％を超え９９．９質量％未満と従来の医薬部外品級の粉末と同程度かそれに満たないレベルではあるものの、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての結晶化度（以下、本明細書では単に「結晶化度」と略記する。）が９０％以上と高く、医薬部外品級の粉末に比べて有意に固結し難い粉末であるとともに、アスコルビン酸２−グルコシドの純度が９９．９質量％に満たない分、試薬級の粉末よりも化粧品及び医薬部外品に汎用される親水性溶媒への溶解性に優れる粉末である。斯かる粉末は、食品素材、食品添加物素材、化粧品素材、医薬部外品素材、及び医薬品素材として取り扱いが容易であり、好適に使用することができる。【００２０】
因みに、本発明の製造方法においては、酵素反応によって得られる反応溶液中のアスコルビン酸２−グルコシドの生成率は２７質量％以上であれば良く、場合によっては３５質量％以上であっても良い。本発明の製造方法は、上記生成率が３５質量％に満たない２７質量％以上３５質量％未満のレベルにあっても、制御冷却法又は擬似制御冷却法を適用する点を除けば従来から行われている医薬部外品級の粉末の製造方法とほぼ変わらぬ工程で、医薬部外品級の粉末に比べて有意に固結し難い粉末を製造することができる点において特に優れている。また、本発明の製造方法は、上記生成率が３５質量％以上である場合には、制御冷却法又は擬似制御冷却法を適用する点を除けば従来から行われている医薬部外品級の粉末の製造方法とほぼ変わらぬ工程で、自然冷却法によるよりも、より結晶化度が高く、医薬部外品級の粉末に比べて有意に固結し難い粉末を製造することができるという利点を有している。なお、本発明の製造方法においては、アスコルビン酸２−グルコシドの生成率が２７質量％以上であるアスコルビン酸２−グルコシド含有溶液を得る上記（ア）の工程において、必要であれば、イソアミラーゼ、プルラナーゼ等の澱粉枝切り酵素をＣＧＴａｓｅと併用し、反応液中のアスコルビン酸２−グルコシドの生成率をさらに高めるようにしても良い。【００２１】
さらに、本発明の製造方法においては、アスコルビン酸２−グルコシド含有溶液を精製して、アスコルビン酸２−グルコシド含量を無水物換算で８６質量％超とする前記（イ）の工程において、アニオン交換樹脂を充填剤として用いるカラムクロマトグラフィーと、強酸性カチオン交換樹脂を充填剤として用いる擬似移動床式のカラムクロマトグラフィーを行うようにしても良い。前記（イ）の工程において、上記アニオン交換樹脂を充填剤として用いるカラムクロマトグラフィーと、強酸性カチオン交換樹脂を充填剤として用いる擬似移動床式のカラムクロマトグラフィーとを組み合わせて行う場合には、アスコルビン酸２−グルコシド含量が無水物換算で８６質量％超であるアスコルビン酸２−グルコシド含有溶液をより効率良く得ることができるという利点が得られる。【００２２】
さらに、本発明者らが研究を重ねた結果、前記（ア）の工程において、酵素反応によって得られる反応溶液中のアスコルビン酸２−グルコシドの生成率が２７質量％以上となるＣＧＴａｓｅには、アミノ酸レベルで共通する特徴があることが判明した。【００２３】
すなわち、本発明は、前記ＣＧＴａｓｅとして、下記（ａ）乃至（ｄ）に示す部分アミノ酸配列を有するＣＧＴａｓｅを用いるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造方法を提供することによっても、上記の課題を解決するものである；
（ａ）Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｘ１−Ａｓｎ−Ａｓｎ；
（ｂ）Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｘ２−Ｔｈｒ−Ａｌａ；
（ｃ）Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ；
（ｄ）Ｖａｌ−Ｘ３−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ。
（但し、Ｘ１はＰｒｏ又はＡｌａを、Ｘ２はＳｅｒ又はＡｓｐを、Ｘ３はＳｅｒ又はＧｌｙをそれぞれ意味する。）【００２４】
上記（ａ）乃至（ｄ）に示す部分アミノ酸配列を有するＣＧＴａｓｅとしては、例えば、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス又はサーモアナエロバクター・サーモスルフリゲネス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓ）由来の天然型若しくは組換え型の酵素が挙げられ、より具体的には、例えば、配列表における配列番号１、３、４及び５のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するＣＧＴａｓｅが挙げられ、これらＣＧＴａｓｅは本発明において好適に用いることができる。【００２５】
本発明の製造方法によって得られるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末は、好適には、無水物換算でアスコルビン酸２−グルコシドを９８．０質量％を超え９９．９質量％未満含有し、粉末Ｘ線回折プロフィルに基づき算出されるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての結晶化度が９０％以上であることに加えて、原料由来のＬ−アスコルビン酸及び／又はＤ−グルコースを含有し、Ｌ−アスコルビン酸量が無水物換算で０．１質量％以下で、粉末全体の還元力が１質量％未満であるという特性を備えている。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の製造方法によれば、酵素反応によって得られる反応溶液中のアスコルビン酸２−グルコシドの生成率が３５質量％に満たない場合であっても、医薬部外品級の粉末に比べて有意に固結し難いアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を製造することができるので、酵素反応に用いる酵素、特にＣＧＴａｓｅに関して選択の幅が大きく広がるという大きな利点が得られる。また、本発明の製造方法によれば、酵素反応において２７質量％以上という生成率を実現することができるＣＧＴａｓｅが共通して有している部分アミノ酸配列についての情報が提供されるので、この部分アミノ酸配列に基づいて、本発明の製造方法において使用することができるＣＧＴａｓｅを検索することが可能となるという利点が得られる。さらに、本発明の製造方法によれば、酵素反応によって得られる反応溶液からアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を析出させる晶析工程において制御冷却法又は擬似制御冷却法を用いる点を除けば、液化澱粉若しくはデキストリンのいずれかとＬ−アスコルビン酸とを原料として、従来の医薬部外品級の粉末の製造方法と工程的に変わるところのない製造方法によって、医薬部外品級の粉末よりも有意に固結し難いアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を製造することができるので、医薬部外品級の粉末の製造に従来から必要とされていたのと大差ない時間、労力、製造設備、及びコストで、医薬部外品級の粉末に比べて有意に固結し難いアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を製造することができるという優れた利点が得られる。【００２７】
因みに、本発明の製造方法によって製造されるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末は、これを粉末状の食品素材、食品添加物素材、化粧品素材、医薬部外品素材、及び医薬品素材などとして用いる場合には、粉末状素材を構成するアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末が有意に固結し難いので、保存、保管はもとより、取り扱いが容易であるとともに、原料が流動性のある粉末であることを前提に作られている製造プラントに使用しても、原料の輸送や、篩い分け、混合などのプロセスに支障をきたす恐れがないという利点が得られる。【００２８】
また、本発明の製造方法によって製造されるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末は、食品素材などに求められる粒度分布、すなわち、粒径１５０μｍ未満の粒子を粉末全体の７０質量％以上、かつ、粒径５３μｍ以上１５０μｍ未満の粒子を粉末全体の４０乃至６０質量％含有する粒度分布に容易に調整することができるので、これを食品素材、食品添加物素材、化粧品素材、医薬部外品素材、又は医薬品素材として用いても、従前からの製造工程や原料規格を変えることなく、従前どおりに使用できるという利点が得られる。さらに、本発明の製造方法によって製造されるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末は、Ｌ−アスコルビン酸及び／又はＤ−グルコースを含有し、且つ、粉末全体の還元力が０質量％を超え１質量％未満であるので、液化澱粉若しくはデキストリンのいずれかとＬ−アスコルビン酸とを原料にして製造された粉末であるにもかかわらず、アミノ酸や蛋白質などの分子内にアミノ基を有する他成分と混合しても変色などの品質低下を惹起する恐れがないという利点が得られる。さらに、本発明の製造方法によって製造されるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末は、Ｌ−アスコルビン酸含量が無水物換算で０質量％を超え０．１質量％以下であるので、粉末単独で長期間保存した場合でも、粉末自体が淡褐色に着色する恐れがなく、実質的に無着色で白色の粉末として、食品素材、食品添加物素材、化粧品素材、医薬部外品素材、及び医薬品素材として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】実質的にアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶からなるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の特性Ｘ線による粉末Ｘ線回折パターンの一例である。
【図２】実質的に無定形部分からなるアスコルビン酸２−グルコシド含有粉末の特性Ｘ線による粉末Ｘ線回折パターンの一例である。
【図３】実質的にアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶からなるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末のシンクロトロン放射光による粉末Ｘ線回折パターンの一例である。
【図４】実質的に無定形部分からなるアスコルビン酸２−グルコシド含有粉末のシンクロトロン放射光による粉末Ｘ線回折パターンの一例である。
【図５】本発明で用いたジオバチルス・ステアロサーモフィルス  Ｔｃ−９１由来のＣＧＴａｓｅ遺伝子を含む組換えＤＮＡ「ｐＲＳＥＴ−ｉＢＴＣ１２」の構造及び制限酵素認識部位を表す図である。
【図６】各種冷却パターンを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
１．用語の定義
本明細書において以下の用語は以下の意味を有している。
【００３１】
＜結晶化度＞
本明細書でいう「アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての結晶化度」とは、下記式［１］によって定義される数値を意味する。
【００３２】
式［１］：
【数１】
2012121297.tif 000002
【００３３】
式［１］において、解析値Ｈ１００、Ｈ０、Ｈｓを求める基礎となる粉末Ｘ線回折プロフィル（ｐｒｏｆｉｌｅ）は、通常、反射式又は透過式の光学系を備えた粉末Ｘ線回折装置により測定することができる。粉末Ｘ線回折プロフィルは被験試料又は標準試料に含まれるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての回折角及び回折強度を含み、斯かる粉末Ｘ線回折プロフィルから結晶化度についての解析値を決定する方法としては、例えば、ハーマンス法、フォンク法などが挙げられる。これら解析方法のうち、ハーマンス法を用いるのが簡便さと精度の点で好適である。今日、これらの解析方法は、いずれもコンピューターソフトウェア化されていることから、斯かるコンピューターソフトウェアのいずれかが搭載された解析装置を備えた粉末Ｘ線回折装置を用いるのが好都合である。
【００３４】
また、解析値Ｈ１００を求める「実質的にアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶からなるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末標準試料」としては、アスコルビン酸２−グルコシドについての純度が９９．９質量％以上（以下、特にことわらない限り、本明細書では質量％を「％」と略記する。ただし、本明細書でいう結晶化度に付された％はこの限りではない。）である粉末又は単結晶であって、粉末Ｘ線回折パターンにおいて、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶に特有な回折ピークを示し、実質的にアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶からなるものを用いる。斯かる粉末又は単結晶としては、上述した試薬級の粉末、又はこれを再結晶化して得られるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末又はアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶の単結晶が挙げられる。因みに、実質的にアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶からなる上記アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末標準試料の粉末Ｘ線回折プロフィルを、ハーマンス法によるコンピューターソフトウェアにて解析した場合の解析値Ｈ１００は、通常、７０．２乃至７０．５％程度となる。
【００３５】
一方、解析値Ｈ０を求める「実質的に無定形部分からなるアスコルビン酸２−グルコシド含有粉末標準試料」としては、アスコルビン酸２−グルコシドについての純度が９９．１％以上である粉末であって、その粉末Ｘ線回折パターンが無定形部分に由来するハローだけからなり、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶に特有な回折ピークを実質的に示さないものを用いる。斯かる粉末としては、例えば、上記した解析値Ｈ１００を求める標準試料を適量の精製水に溶解し、濃縮した後、凍結乾燥し、さらに、カールフィッシャー法により決定される水分含量が２．０％以下となるまで真空乾燥することにより得られた粉末が挙げられる。斯かる処理を施した場合に、実質的に無定形部分からなる粉末が得られることは、経験上知られている。因みに、実質的に無定形部分からなる上記アスコルビン酸２−グルコシド含有粉末標準試料の粉末Ｘ線回折プロフィルを、ハーマンス法によるコンピューターソフトウェアにて解析した場合の解析値Ｈ０は、通常、７．３乃至７．６％程度となる。
【００３６】
なお、解析値Ｈ０を求める標準試料としては、アスコルビン酸２−グルコシドについての純度が高いものの方が好ましいことはいうまでもないが、解析値Ｈ１００を求める標準試料から上述のようにして調製される解析値Ｈ０を求める標準試料におけるアスコルビン酸２−グルコシドの純度は、後述する実験１−１に示すとおり、解析値Ｈ１００を求める標準試料のアスコルビン酸２−グルコシド純度が９９．９％以上と極めて高いにもかかわらず、９９．１％にとどまる。よって、「実質的に無定形部分からなるアスコルビン酸２−グルコシド含有粉末標準試料」のアスコルビン酸２−グルコシド純度は、上記のとおり、９９．１％以上とした。
【００３７】
＜平均結晶子径＞
一般に、結晶含有粉末における１個の粉末粒子は複数の単結晶、すなわち、複数の結晶子により構成されると考えられている。結晶粉末における結晶子の大きさ（結晶子径）は結晶粉末の特性に反映されると考えられる。本明細書でいう「アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての平均結晶子径」とは、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を粉末Ｘ線回折分析に供し、得られた粉末Ｘ線回折パターンにおいて検出される回折ピークの内、５個の回折ピーク、すなわち、結晶子の不均一歪に起因する回折ピーク幅への影響が少ないとされる比較的低角の領域で、他の回折ピークとよく分離した、回折角（２θ）１０．４°（ミラー指数（ｈｋｌ）：１２０）、１３．２°（ミラー指数：１３０）、１８．３°（ミラー指数：２３０）、２１．９°（ミラー指数：０６０）及び２２．６°（ミラー指数：１３１）の回折ピーク（図１の符号ａ乃至ｅを参照）を選択し、それぞれの半値幅（半価幅）と回折角とを用い、標準品としてケイ素（米国国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ）供給、Ｘ線回折用標準試料（『Ｓｉ６４０Ｃ』）を用いた場合の測定値に基づき補正した後、下記式［２］に示す「シェラー（Ｓｃｈｅｒｒｅｒ）の式」によりそれぞれ算出された結晶子径の平均値を意味する。
【００３８】
式［２］：
【数２】
2012121297.tif 000003
【００３９】
一般的な粉末Ｘ線回折装置には、係る結晶子径算出用のコンピューターソフトウェアが搭載されていることから、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末さえ入手できれば、当該結晶粉末におけるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶の平均結晶子径は比較的容易に測定することができる。なお、被験試料は、粉末Ｘ線回折の測定に先立ち、被験試料を乳鉢によりすり潰した後、５３μｍの篩によりふるい分け、篩を通過した粉末を用いる。
【００４０】
＜還元力＞
本明細書でいう「粉末全体の還元力」とは、Ｄ−グルコースを標準物質として用い、斯界において汎用されるソモジ−ネルソン法及びアンスロン硫酸法によりそれぞれＤ−グルコース換算に基づく還元糖量及び全糖量を求め、下記式［３］を用いて求めることができる、含まれる全糖量に対する還元糖量の百分率（％）を意味する。
【００４１】
式［３］：
【数３】
2012121297.tif 000004
【００４２】
＜粒度分布＞
本明細書において、粉末の粒度分布は以下のようにして決定する。すなわち、日本工業規格（ＪＩＳ  Ｚ  ８８０１−１）に準拠する、目開きが４２５、３００、２１２、１５０、１０６、７５及び５３μｍの金属製網ふるい（株式会社飯田製作所製）を正確に秤量した後、この順序で重ね合わせてロータップふるい振盪機（株式会社田中化学機械製造所製、商品名『Ｒ−１』）へ装着し、次いで、秤取した一定量の試料を最上段のふるい（目開き４２５μｍ）上に載置し、ふるいを重ね合わせた状態で１５分間振盪した後、各ふるいを再度正確に秤量し、その質量から試料を載置する前の質量を減じることによって、各ふるいによって捕集された粉末の質量を求める。その後、ふるい上に載置した試料の質量に対する、各ふるいによって捕集された各粒度を有する粉末の質量の百分率（％）を計算し、粒度分布として表す。
【００４３】
＜アスコルビン酸２−グルコシドの生成率＞
本明細書でいう「アスコルビン酸２−グルコシドの生成率」とは、液化澱粉若しくはデキストリンのいずれかとＬ−アスコルビン酸とを含有する溶液にＣＧＴａｓｅなどの酵素を作用させて得られる酵素反応液中における、無水物換算したアスコルビン酸２−グルコシドの含量（％）を意味する。
【００４４】
＜アスコルビン酸２−グルコシドの無水物換算での含量＞
アスコルビン酸２−グルコシドの無水物換算での含量とは、水分を含めないで計算した場合の全質量に占めるアスコルビン酸２−グルコシドの質量百分率（％）を意味する。例えば、溶液中のアスコルビン酸２−グルコシドの無水物換算での含量とは、溶液に含まれる水分を含めないで、残りの全固形分に対するアスコルビン酸２−グルコシドの質量百分率を意味する。また、粉末中におけるアスコルビン酸２−グルコシドの無水物換算での含量とは、粉末中の水分を含めないで残部を粉末全質量として計算した場合の粉末全質量に対するアスコルビン酸２−グルコシドの質量百分率を意味する。
【００４５】
＜ＣＧＴａｓｅの活性＞
本明細書において「ＣＧＴａｓｅの活性」は以下のように定義される。すなわち、０．３％（ｗ／ｖ）可溶性澱粉、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、１ｍＭ塩化カルシウムを含む基質水溶液５ｍｌに対し、適宜希釈した酵素液０．２ｍｌを加え、基質溶液を４０℃に保ちつつ、反応０分目及び反応１０分目に基質溶液を０．５ｍｌずつサンプリングし、直ちに０．０２Ｎ硫酸溶液１５ｍｌに加えて反応を停止させた後、各硫酸溶液に０．１Ｎヨウ素溶液を０．２ｍｌずつ加えて呈色させ、１０分後、吸光光度計により波長６６０ｎｍにおける吸光度をそれぞれ測定し、下記式［４］により澱粉分解活性として算出する。ＣＧＴａｓｅの活性１単位とは、斯かる測定条件で、溶液中の澱粉１５ｍｇのヨウ素呈色を完全に消失させる酵素の量と定義する。
【００４６】
式［４］：
【数４】
2012121297.tif 000005
【００４７】
＜イソアミラーゼの活性＞
本明細書において「イソアミラーゼの活性」は以下のように定義される。すなわち、０．８３％（ｗ／ｖ）リントナー（Ｌｉｎｔｎｅｒ）可溶化ワキシーコーンスターチ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）を含む基質水溶液３ｍｌに対し、適宜希釈した酵素液０．５ｍｌを加え、基質溶液を４０℃に保ちつつ、反応３０秒目と３０分３０秒目に基質溶液、を０．５ｍｌずつサンプリングし、直ちに０．０２Ｎ硫酸溶液を１５ｍｌずつ加えて反応を停止させ、各硫酸溶液に０．０１Ｎヨウ素溶液を０．５ｍｌずつ加え、２５℃で１５分間呈色させた後、吸光光度計により波長６１０ｎｍにおける吸光度をそれぞれ測定し、下記式［５］により澱粉分解活性として算出する。イソアミラーゼの活性１単位とは、斯かる測定条件で、波長６１０ｎｍの吸光度を０．００４増加させる酵素の量と定義する。
【００４８】
式［５］：
【数５】
2012121297.tif 000006
【００４９】
＜プルラナーゼの活性＞
本明細書において「プルラナーゼの活性」は以下のように定義される。すなわち、１．２５％（ｗ／ｖ）プルラン（株式会社林原生物化学研究所製、プルラナーゼ活性測定用）水溶液を基質溶液とする。この基質溶液４ｍｌと０．０５Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．８）０．５ｍｌとを試験管に取り、３０℃に予熱しておく。０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用い、適宜希釈した酵素液０．５ｍｌを加え、基質溶液を３０℃に保ちつつ、反応３０秒目（対照液）と３０分３０秒目（反応液）に基質溶液、を０．５ｍｌずつサンプリングし、直ちにソモギ−銅液２ｍｌに注入し反応を停止させ、ソモギ−ネルソン法に供し、吸光光度計により波長５２０ｎｍにおける吸光度をそれぞれ測定することにより生成した還元力を測定し、下記式［６］によりプルラン分解活性として算出する。プルラナーゼの活性１単位とは、斯かる測定条件で、１分間に１マイクロモルのマルトトリオースに相当する還元力を遊離させる酵素の量と定義する。
【００５０】
式［６］：
【数６】
2012121297.tif 000007
【００５１】
＜制御冷却法＞
本明細書でいう「制御冷却法」とは、「制御された冷却」によって結晶を晶析させる方法をいい、晶析工程として設定した作業時間を「τ」、晶析開始時の液温を「Ｔ０」、晶析終了時の目標とする液温を「Ｔｆ」、時間「ｔ」における液温を「Ｔ」とすると、時間ｔにおける液温Ｔが原則として下記式［７］で表される冷却方法をいう。
【００５２】
式［７］：
【数７】
2012121297.tif 000008
【００５３】
制御冷却法を、晶析工程として設定する作業時間を横軸、晶析時の液温を縦軸としたグラフを用いてより具体的に（模式的に）表すならば、図６の符号ａに示すごとくである。図６の符号ａに示すとおり、制御冷却法によれば、液温が高い晶析の初期においては液温が緩やかに低下し、液温がある程度低下した晶析の後期においては液温が急速に低下することになり、ｔ＝τ／２の時点、つまり、晶析工程の中間点における液温「Ｔｍ」は、少なくとも  Ｔｍ＞［（Ｔ０−Ｔｆ）／２＋Ｔｆ］  の関係（つまり、晶析工程の中間点における温度変化が総温度変化の５０％未満となる）が維持される。この液温の時間に対する変化パターンにおいて、制御冷却法は、液温がＴ０からＴｆまで時間τをかけて直線的に低下する直線冷却（図６における符号ｂ）や、液温が高い晶析の初期においては液温が指数関数的に急速に低下し、液温が低下した晶析の後期になるほど液温が緩やかに低下してゆく通常の自然冷却法（図６における符号ｃ）とは明らかに区別される。なお、液温Ｔを上記式［７］で表される時間ｔの関数として変化させるには、例えば、市販されている汎用の晶析システム用プログラム恒温循環装置などを用いれば良い。
【００５４】
晶析工程において斯かる制御冷却法を適用する場合には、アスコルビン酸２−グルコシドの種晶を添加した後、晶析の初期においては、液温の冷却が緩やかに行われるので、冷却による急激な過飽和度の上昇と二次的な結晶核の形成が抑制され、添加した種晶を結晶核とする結晶を優先的に成長させることができる。一方、添加した種晶を結晶核とする結晶が出揃った晶析の後期においては、液温を急速に冷却することにより、出揃った結晶を一斉に成長させることになるので、制御冷却法によれば、微結晶が少ない粒径が揃った結晶を含むマスキットが得られるという利点が得られる。なお、「制御冷却法」については、例えば、「久保田徳昭著、『分かり易いバッチ晶析』、分離技術会、平成２２年４月３０日発行、３２〜４７頁」に詳述されている。
【００５５】
＜擬似制御冷却法＞
本明細書でいう「擬似制御冷却法」とは、文字どおり上記した制御冷却法に擬似した冷却法であり、液温Ｔを時間ｔに対して厳密に上記式［７］にしたがって変化させるのではなく、晶析に用いるアスコルビン酸２−グルコシド含有溶液におけるアスコルビン酸２−グルコシド純度、濃度、過飽和度、種晶の量などにもよるけれども、作業時間ｔ＝τ／２の時点（晶析工程の中間点）で結晶核がおおむね出揃うことが望ましいことから、ｔ＝τ／２の時点における液温Ｔの変化量（Ｔ０−Ｔｍ）が、総温度変化量（Ｔ０−Ｔｆ）の５％以上５０％未満、望ましくは、１０％以上３０％未満の範囲を維持するように液温Ｔを時間ｔに対して連続的又は段階的に低下させる冷却法を意味する。ｔ＝τ／２の時点における液温Ｔの変化量（Ｔ０−Ｔｍ）が、総温度変化量（Ｔ０−Ｔｆ）の５％以上５０％未満であるように液温Ｔを時間ｔに対して連続的又は段階的に低下させる場合には、液温が高い晶析の初期においては液温Ｔが時間ｔに対して緩やかに低下し、液温がある程度低下した晶析の後期においては液温Ｔが時間ｔに対して急速に低下することになり、結果として、上述した制御冷却法には及ばない場合があるものの、微結晶が少ない粒径が揃った結晶を含むマスキットが得られるという、制御冷却法とほぼ同様の利点が得られる。
【００５６】
具体的には、例えば、作業時間τを、少なくとも２つ、好ましくは３つ以上の区間に分け、晶析工程の初期の区間においては、冷却における温度勾配を緩やかに（冷却速度を遅く）し、初期乃至は中期から後期に向かうにしたがい、温度勾配を大きく（冷却速度を速く）して、ｔ＝τ／２の時点における液温Ｔの変化量（Ｔ０−Ｔｍ）が総温度変化量（Ｔ０−Ｔｆ）の５％以上５０％未満、望ましくは、１０％以上３０％未満となるように液温Ｔを時間ｔに対して連続的又は段階的に低下させれば良い。ｔ＝τ／２の時点における液温Ｔの変化量（Ｔ０−Ｔｍ）が総温度変化量（Ｔ０−Ｔｆ）の５０％以上である場合には、晶析の初期における冷却速度が早すぎて、冷却による急激な過飽和度の上昇によって二次的な結晶核が形成される恐れがあり、５％未満である場合には、晶析の初期における冷却速度が遅すぎて、添加した種晶を結晶核とする結晶が十分に出揃わないままに、急速な冷却が始まる晶析後期を迎えることになり、いずれにしても、微結晶が少ない粒径が揃った結晶を含むマスキットを得ることが困難になる。
【００５７】
上述した制御冷却法を行うには、液温Ｔを式［７］で表される時間ｔの関数として変化させる必要があり、設定したプログラムで液温を制御することのできる装置や晶析缶が必須であるが、擬似制御冷却法によれば、ｔ＝τ／２の時点における液温Ｔの変化量（Ｔ０−Ｔｍ）が総温度変化量（Ｔ０−Ｔｆ）の５％以上５０％未満、望ましくは、１０％以上３０％未満となるように液温Ｔを時間ｔに対して連続的又は段階的に低下させれば良いので、擬似制御冷却法には、液温を精密に制御する設備がない場合であっても、比較的容易に実行することができるという利点がある。
【００５８】
２．本発明の製造方法によって得られるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末
以下、本発明の製造方法によって得られるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末について説明する。
【００５９】
＜アスコルビン酸２−グルコシド含量及びその他の夾雑物含量＞
本発明の製造方法によって得られるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末は、上述したとおり、無水物換算で、アスコルビン酸２−グルコシドを９８．０％を超え９９．９％未満であるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末であり、好適な場合において、上記粉末は、原料由来のＬ−アスコルビン酸及び／又はＤ−グルコースを含有し、粉末全体の還元力が０％を超え１％未満である。良く知られているとおり、Ｌ−アスコルビン酸やＤ−グルコースは直接還元性を有し、アミノ酸や蛋白質などの分子内にアミノ基を有する化合物の共存下で加熱すると褐色の着色を引き起こすので、これらの物質が製品としてのアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末に含まれることは好ましくない。しかし、例えば、液化澱粉若しくはデキストリンのいずれかとＬ−アスコルビン酸とを含有する溶液にＣＧＴａｓｅなどの酵素を作用させる工程を経てアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を製造する場合には、量の多寡はともかく、未反応のＬ−アスコルビン酸や、原料である液化澱粉若しくはデキストリンのいずれかに由来するＤ−グルコースなどが、反応夾雑物として製品であるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末に混入することは避けられない。例えば、従来の医薬部外品級の粉末においては、含まれるＬ−アスコルビン酸とＤ−グルコースの量が、無水物換算した両者の合計で約１％にも達することがあり、食品素材などとして用いた場合に予期せぬ褐色の着色を引き起こすことがあった。
【００６０】
そこで、本発明の製造方法においては、不可避的に避けられないＬ−アスコルビン酸及び／又はＤ−グルコースの混入を許容するとともに、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末における粉末全体の還元力を１％未満、詳細には０％を超え１％未満に規制することとした。後述する実験に示すとおり、本発明の製造方法によって本発明のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を製造する場合には、粉末全体の還元力を、０％を超え１％未満とすることは容易である。Ｌ−アスコルビン酸及び／又はＤ−グルコースを含有していても、粉末全体の還元力が０％を超え１％未満であれば、アミノ酸や蛋白質などの分子内にアミノ基を有する化合物の共存下で加熱しても褐色の着色を引き起こすことが実質的にない。したがって、Ｌ−アスコルビン酸及び／又はＤ−グルコースを含有し、かつ、粉末全体の還元力が０％を超え１％未満であるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末は、着色や変色を懸念することなく、食品、化粧品、医薬部外品、医薬品一般へ配合使用することができるという利点を有している。因みに、粉末全体の還元力が１％未満である場合、含まれるＬ−アスコルビン酸の量は、無水物換算で０．１％以下である。
【００６１】
また、本発明の製造方法によって得られるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末は、Ｌ−アスコルビン酸含量が無水物換算で０．１％以下、詳細には０％を超え０．１％以下である。Ｌ−アスコルビン酸は、酸化防止剤や脱酸素剤として飲食品などに用いられているとおり、酸素との反応性が高い。このため、Ｌ−アスコルビン酸は、分子内にアミノ基を有する化合物の共存下で加熱すると褐色の着色を引き起こすだけでなく、Ｌ−アスコルビン酸を含有する粉末自体の着色にも深く関与していると考えられる。現に、後述する実験に示すとおり、医薬部外品級の粉末にはＬ−アスコルビン酸が０．２％程度含まれているが、本発明者らが得た知見によれば、医薬部外品級の粉末は、これを前述した商品形態で比較的長期間保存すると、往々にして、粉末自体が淡褐色に着色する現象が見られる。これに対し、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末におけるＬ−アスコルビン酸含量が０％を超え０．１％以下である場合には、この粉末を医薬部外品級の粉末と同様の商品形態で比較的長期間保存しても、粉末自体が淡褐色に着色する懸念がない。因みに、本発明の製造方法によれば、精製工程に、Ｄ−グルコースなどの糖類を除去するためのアニオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーに続き、カチオン交換樹脂又は多孔性樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行うことによって、特に、カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーとして擬似移動床式を用いる場合には、製造コストを上昇させることなく比較的容易に、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末におけるＬ−アスコルビン酸含量を、０％を超え０．１％以下にすることができる。
【００６２】
＜結晶化度及び平均結晶子径＞
本発明の製造方法によって得られるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末は、粉末Ｘ線回折プロフィルに基づき算出されるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての結晶化度が９０％以上であり、且つ、平均結晶子径が１，４００Å以上１，７１０Å未満である。以下の実験によって示すとおり、結晶化度及び平均結晶子径が上記レベルにある本発明のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末は、アスコルビン酸２−グルコシドの純度、すなわち、無水物換算でのアスコルビン酸２−グルコシドの含量が、医薬部外品級の粉末とほぼ同じレベルか、試薬級の粉末におけるアスコルビン酸２−グルコシドの純度に満たないにもかかわらず、医薬部外品級の粉末に比べて有意に固結し難く、また、試薬級の粉末に比べて化粧品及び医薬部外品に汎用される親水性媒体への溶解性に優れるという特性を備えている。
【００６３】
＜粒度分布＞
本発明の製造方法によって得られるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末は、その好適な一態様において、粒径１５０μｍ未満の粒子を粉末全体の７０％以上、かつ、粒径５３μｍ以上１５０μｍ未満の粒子を粉末全体の４０乃至６０％含有する。本発明の製造方法によって得られるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末は、例えば、食品素材などに求められる上記の粒度分布に容易に調整することができるので、食品素材、食品添加物素材、化粧品素材、医薬部外品素材、又は医薬品素材として、製造工程や原料規格を変えることなく、従前どおりに使用できるという利点を有している。
【００６４】
３．本発明のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造方法
以下、本発明のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造方法について説明する。
【００６５】
本発明のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造方法は、基本的に、以下の（ア）乃至（オ）の工程を含んでいる：
（ア）液化澱粉若しくはデキストリンのいずれかとＬ−アスコルビン酸とを含む溶液にＣＧＴａｓｅを作用させ、次いで、グルコアミラーゼを作用させてアスコルビン酸２−グルコシドを生成させることにより、グルコアミラーゼ処理後の反応液のアスコルビン酸２−グルコシド生成率が２７％以上であるアスコルビン酸２−グルコシド含有溶液を得る工程；
（イ）得られたアスコルビン酸２−グルコシド含有溶液を精製して、アスコルビン酸２−グルコシド含量を無水物換算で８６％超とする工程；
（ウ）アスコルビン酸２−グルコシドを無水物換算で８６％超含有する溶液から制御冷却法又は擬似制御冷却法によってアスコルビン酸２−グルコシドの無水結晶を析出させる工程；
（エ）析出したアスコルビン酸２−グルコシドの無水結晶を採取する工程；及び、
（オ）採取されたアスコルビン酸２−グルコシドの無水結晶を、溶解、再結晶化することなく、熟成、乾燥し、必要に応じて粉砕することにより、無水物換算でアスコルビン酸２−グルコシドを９８．０％を超え９９．９％未満含有し、粉末Ｘ線回折プロフィルに基づき算出されるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての結晶化度が９０％以上であるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を得る工程。
以下、各工程について説明する。
【００６６】
＜（ア）の工程＞
（ア）の工程は、液化澱粉若しくはデキストリンのいずれかとＬ−アスコルビン酸とを含む溶液にＣＧＴａｓｅを作用させ、次いでグルコアミラーゼを作用させることにより、グルコアミラーゼ処理後の反応液のアスコルビン酸２−グルコシド生成率を２７％以上とする工程である。まず、使用する原料及び酵素について説明し、次に、行われる酵素反応について説明する。
【００６７】
Ａ．使用原料及び酵素
（Ｌ−アスコルビン酸）
用いるＬ−アスコルビン酸としては、ヒドロキシ酸の形態のものであっても、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩などの金属塩の形態のものであっても、さらには、それらの混合物であっても差し支えない。
【００６８】
（液化澱粉若しくはデキストリン）
また、用いる液化澱粉若しくはデキストリンとしては、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、タピオカ澱粉、コーンスターチ、小麦澱粉などを耐熱性α−アミラーゼで液化して得られる液化澱粉又はデキストリンが挙げられる。反応に際しては、ＣＧＴａｓｅとともに、例えば、イソアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６８）、プルラナーゼ（ＥＣ  ３．３．１．４１）などの澱粉枝切り酵素を併用して、澱粉の枝分かれ部分を切断するのが好ましい。液化澱粉若しくはデキストリンは、シクロデキストリンやアミロースに比べ、工業的規模での大量製造に適した原料である。
【００６９】
（ＣＧＴａｓｅ）
用いるＣＧＴａｓｅ（ＥＣ２．４．１．１９）としては、液化澱粉若しくはデキストリンのいずれかとＬ−アスコルビン酸とを含有する溶液にＣＧＴａｓｅを単独で、若しくは澱粉枝切り酵素と共に作用させ、次いで、グルコアミラーゼを作用させたときに、２７％以上の生成率でアスコルビン酸２−グルコシドを生成させることができる限り、その起源や由来に特段の制限はなく、天然の酵素であっても、遺伝子組換えによって得られる酵素であっても良く、さらには天然若しくは組換え型酵素にアミノ酸の置換、付加、欠失を導入した変異体酵素であっても良い。
【００７０】
なお、本発明者らが得た知見によれば、液化澱粉若しくはデキストリンのいずれかとＬ−アスコルビン酸とを含有する溶液にＣＧＴａｓｅを単独で、若しくは澱粉枝切り酵素と共に作用させ、次いで、グルコアミラーゼを作用させたときに、２７％以上の生成率でアスコルビン酸２−グルコシドを生成させることができるＣＧＴａｓｅは、通常、共通する部分アミノ酸配列として、下記（ａ）乃至（ｄ）に示す部分アミノ酸配列を有している：
（ａ）Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｘ１−Ａｓｎ−Ａｓｎ；
（ｂ）Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｘ２−Ｔｈｒ−Ａｌａ；
（ｃ）Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ；
（ｄ）Ｖａｌ−Ｘ３−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ。
（但し、Ｘ１はＰｒｏ又はＡｌａを、Ｘ２はＳｅｒ又はＡｓｐを、Ｘ３はＳｅｒ又はＧｌｙをそれぞれ意味する。）
【００７１】
斯かるＣＧＴａｓｅとしては、例えば、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス又はサーモアナエロバクター・サーモスルフリゲネス由来の天然型若しくは組換え型酵素が挙げられ、具体的には、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス  Ｔｃ−９１株由来ＣＧＴａｓｅ、すなわち配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＣＧＴａｓｅや、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列に、遺伝子工学的手法によりアミノ酸残基の置換、欠失、付加を導入することにより作製したＣＧＴａｓｅ変異体、具体的には、配列表における配列番号４又は５で示されるアミノ酸配列を有するＣＧＴａｓｅ変異体、さらには、配列表における配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するサーモアナエロバクター・サーモスルフリゲネスに由来するＣＧＴａｓｅや当該ＣＧＴａｓｅの変異体などを好適な例として挙げることができる。
【００７２】
なお、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス  Ｔｃ−９１株は、同じ出願人による特開昭５０−６３１８９号公報（特公昭５３−２７７９１号公報）に開示された微生物であり、当初、ＦＥＲＭ−Ｐ  ２２２５として１９７３年７月３０日付で国内寄託され、現在は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２７３として茨城県つくば市東１−１−１中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに国際寄託されている。因みに、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス  Ｔｃ−９１株由来のＣＧＴａｓｅは、約６８，０００ダルトンの分子量を有する酵素であり、他の微生物由来のＣＧＴａｓｅに比べ糖転移作用が強いことが知られている。また、当該ＣＧＴａｓｅはその遺伝子がクローニングされ、遺伝子の塩基配列（配列表における配列番号２で示される塩基配列）から成熟型ＣＧＴａｓｅのアミノ酸配列（配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列）が決定されており、当該ＣＧＴａｓｅのアミノ酸配列上にはα−アミラーゼファミリーに分類される酵素群に共通して存在するとされる４つの保存領域が存在することが知られている。また、当該ＣＧＴａｓｅ蛋白の立体構造はＸ線結晶構造解析によって既に明らかにされている。さらに、当該ＣＧＴａｓｅの３つの触媒残基、すなわち、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列における２２５番目のアスパラギン酸（Ｄ２２５）、２５３番目のグルタミン酸（Ｅ２５３）、３２４番目のアスパラギン酸（Ｄ３２４）も判明している（『工業用糖質酵素ハンドブック』、講談社サイエンティフィク社編集、講談社発行、５６乃至６３頁（１９９９年）参照）。
【００７３】
また、サーモアナエロバクター・サーモスルフリゲネス由来のＣＧＴａｓｅとしては、具体的には、当該微生物由来のＣＧＴａｓｅが組換え型酵素として製造された酵素剤（商品名『トルザイム（Ｔｏｒｕｚｙｍｅ）３．０Ｌ』、ノボザイム・ジャパン社製）が市販されている。サーモアナエロバクター・サーモスルフリゲネス由来のＣＧＴａｓｅについても、その理化学的性質やアミノ酸配列などが既に明らかにされている。
【００７４】
（澱粉枝切り酵素）
液化澱粉若しくはデキストリンのいずれかとＬ−アスコルビン酸とを含む溶液にＣＧＴａｓｅを作用させる際に、澱粉枝切り酵素を併用して、アスコルビン酸２−グルコシドの生成率を高めることができる。澱粉枝切り酵素としては、イソアミラーゼが、酵素活性及び基質特異性などの面で取り扱い易いので特に好ましい。イソアミラーゼとしては、例えば、シュードモナス・アミノデラモサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａ）、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、フラボバクテリウム・エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）由来のものや、同微生物における遺伝子を組み換えて得られた変異イソアミラーゼを挙げることができる。なお、フラボバクテリウム・オドラタム由来のイソアミラーゼとしては、合同酒精株式会社製造のイソアミラーゼ酵素剤（商品名『ＧＯＤＯ−ＦＩＡ』）を使用することができる。
【００７５】
また、プルラナーゼとしては、例えば、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、バチルス・アシドプルリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃａｓ）、クレブシエラ・ニュウモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・アエロジェネス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、フラボバクテリウム・ペニボランス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｎｎｉｖｏｒａｎｓ）、エンテロバクター・アエロジェネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）由来のものを挙げることができる。
【００７６】
（グルコアミラーゼ）
用いるグルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）にも特に制限はなく、液化澱粉若しくはデキストリンのいずれかとＬ−アスコルビン酸とを含有する溶液に、ＣＧＴａｓｅを作用させ、次いで、グルコアミラーゼを作用させたときに、アスコルビン酸２−グルコシドを生成させることができる限り、その起源や由来に特段の制限はなく、天然の酵素であっても遺伝子組換えによって得られる酵素であっても良い。
【００７７】
グルコアミラーゼは、通常、酵素反応液を加熱してＣＧＴａｓｅによる糖転移反応を停止させてから添加されるので、加熱後の酵素反応液の冷却に要するエネルギーと時間を節約することができるように、比較的高い温度、例えば４０乃至６０℃程度の温度で実用に足る酵素活性を発揮し得るものが望ましい。また、使用するグルコアミラーゼがα−グルコシダーゼを含んでいた場合、生成されたアスコルビン酸２−グルコシドが加水分解されてしまうので、グルコアミラーゼとしてはα−グルコシダーゼを実質的に含まないものを使用するのが望ましい。このような条件を満たすものであれば、使用するグルコアミラーゼの給源、純度には特段の制限はなく、例えば、グルコアミラーゼ剤として市販されているリゾプス属に属する微生物に由来する酵素剤（商品名『グルコチーム＃２００００』  ナガセケムテックス株式会社販売）や、アスペルギルス属の微生物に由来する酵素剤（商品名『グルクザイムＡＦ６』  天野エンザイム株式会社販売）を好適に使用することができる。
【００７８】
Ｂ．酵素反応
次に、Ｌ−アスコルビン酸への糖転移反応について説明する。まず、液化澱粉若しくはデキストリンのいずれかとＬ−アスコルビン酸とを含有する溶液（通常は水溶液）にＣＧＴａｓｅを作用させる。液化澱粉若しくはデキストリンのいずれかとＬ−アスコルビン酸とを含む水溶液にＣＧＴａｓｅを作用させると、ＣＧＴａｓｅの酵素作用によって、Ｌ−アスコルビン酸の２位の水酸基に１個又は２個以上のＤ−グルコースが転移し、前記２位の水酸基に１個のＤ−グルコースが結合したアスコルビン酸２−グルコシドが生成するとともに、前記２位の水酸基に２個以上のＤ−グルコースが結合した２−Ｏ−α−マルトシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−マルトトリオシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−マルトテトラオシル−Ｌ−アスコルビン酸などのα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸が生成する。
【００７９】
ＣＧＴａｓｅは、通常、基質濃度が１乃至４０％になるように液化澱粉若しくはデキストリンのいずれかとＬ−アスコルビン酸とを溶解した水溶液に対し、基質１ｇ当り１乃至５００単位の割合で添加され、当該溶液をｐＨ約３乃至１０、温度３０乃至７０℃に保ちつつ、６時間以上、好ましくは約１２乃至９６時間反応させる。Ｌ−アスコルビン酸は酸化により分解しやすいので、反応中、溶液を嫌気又は還元状態に保つ一方、光を遮断するのが望ましく、必要に応じ、反応溶液に、例えば、チオ尿素、硫化水素などの還元剤を共存させる。
【００８０】
溶液中の液化澱粉若しくはデキストリンのいずれかとＬ−アスコルビン酸との質量比は、無水物換算で８：２乃至３：７の範囲に設定するのが望ましい。液化澱粉若しくはデキストリンのいずれかとの割合がこの範囲より大きくなると、Ｌ−アスコルビン酸への糖転移は効率よく進行するものの、アスコルビン酸２−グルコシドの生成率がＬ−アスコルビン酸の始発濃度による制約を受け、低レベルに止まることとなる。逆に、Ｌ−アスコルビン酸の割合が上記した範囲より大きくなると、未反応のＬ−アスコルビン酸が著量残存することとなり、工業的生産には好ましくない。よって、上記した比率の範囲をもって最良とした。
【００８１】
なお、ＣＧＴａｓｅに加えて、澱粉枝切り酵素としてイソアミラーゼを併用する場合、イソアミラーゼは、液化澱粉若しくはデキストリンのいずれかとＬ−アスコルビン酸とを含有する溶液中でＣＧＴａｓｅと共存させた状態で液化澱粉若しくはデキストリンのいずれかに作用させるのが望ましく、添加量としては、イソアミラーゼの種類、至適温度、至適ｐＨなどにもよるけれども、通常、基質１ｇ当り２００乃至２，５００単位とし、５５℃以下で反応させる。また、澱粉枝切り酵素としてプルラナーゼを用いる場合も、通常、基質１ｇ当り１乃至５００単位とし、イソアミラーゼに準じて用いれば良い。
【００８２】
ＣＧＴａｓｅ、又はＣＧＴａｓｅと澱粉枝切り酵素による酵素反応が一通り完了した後、酵素反応液を直ちに加熱してＣＧＴａｓｅ、又はＣＧＴａｓｅと澱粉枝切り酵素とを失活させて酵素反応を停止させ、次いで、この酵素反応液にグルコアミラーゼを作用させる。グルコアミラーゼを作用させると、Ｌ−アスコルビン酸の２位の水酸基に結合している２個以上のＤ−グルコース鎖は切断されて、２−Ｏ−α−マルトシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−マルトトリオシル−Ｌ−アスコルビン酸などのα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸はアスコルビン酸２−グルコシドに変換されることになる。
【００８３】
＜（イ）の工程＞
（イ）の工程は、上記（ア）の工程で得られたアスコルビン酸２−グルコシド含有溶液を精製して、アスコルビン酸２−グルコシド含量を無水物換算で８６％超とする工程である。すなわち、（ア）の工程で得られたアスコルビン酸２−グルコシド含有溶液を、活性炭などにより脱色濾過し、濾液をカチオン交換樹脂により脱塩し、さらに、カラムクロマトグラフィーを適用することにより、溶液中のアスコルビン酸２−グルコシド含量を無水物換算で８６％超、好ましくは８８％以上にまで精製する。精製に用いるカラムクロマトグラフィーとしては、溶液中のアスコルビン酸２−グルコシド含量を無水物換算で８６％超にまで高めることができる限り、原則的にどのようなカラムクロマトグラフィーを用いても良いが、好適な例としては、Ｄ−グルコースなどの糖類を除去するためのアニオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーに続き、カチオン交換樹脂又は多孔性樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行うのがよい。Ｄ−グルコースなどの糖類を除去するための望ましいアニオン交換樹脂としては、『アンバーライトＩＲＡ４１１Ｓ』、『アンバーライトＩＲＡ４７８ＲＦ』（以上、ローム・アンド・ハース社製）、『ダイヤイオンＷＡ３０』（三菱化学株式会社製）等が挙げられる。アスコルビン酸２−グルコシドとＬ−アスコルビン酸とを分離するための望ましいカチオン交換樹脂としては、『ダウエックス  ５０ＷＸ８』（ダウケミカル社製）、『アンバーライト  ＣＧ１２０』（ローム・アンド・ハース社製）、『ＸＴ−１０２２Ｅ』（東京有機化学工業株式会社製）、『ダイヤイオンＳＫ１０４』、『ダイヤイオン  ＵＢＫ  ５５０』（以上、三菱化学株式会社製）等が挙げられる。多孔性樹脂としては、『トヨパールＨＷ−４０』（東ソー株式会社製）、『セルファインＧＨ−２５』（チッソ株式会社製）等を挙げることができる。カチオン交換樹脂又は多孔性樹脂を用いてカラムクロマトグラフィーを行う場合、カラムに負荷する原料液の濃度は固形分約１０乃至５０％、樹脂への負荷量は湿潤樹脂容積の約１／１０００乃至１／２０、湿潤樹脂容積とほぼ等量の精製水を線速度０．５乃至５ｍ／時間で通液するのが望ましい。中でも、カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーとして擬似移動床式を用いる場合には、精製して得られるアスコルビン酸２−グルコシドの純度が高まり、Ｌ−アスコルビン酸やＤ−グルコースなどの夾雑物、特に、Ｌ−アスコルビン酸含量が低減され、Ｌ−アスコルビン酸含量が無水物換算で０．１％以下と少ないアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末が得られるので好ましい。因みに、カチオン交換樹脂を充填剤として用いる擬似移動床式のカラムクロマトグラフィーにおける溶離条件としては、操作温度、設定流速などにもよるが、擬似移動床式のカラムクロマトグラフィーに供されるアスコルビン酸２−グルコシド含有溶液の濃度は無水物換算で６０％以下、アスコルビン酸２−グルコシド含有溶液の負荷量は湿潤樹脂容積に対し容積比で１／２０以下、溶離液として用いる精製水量は容積比で前記負荷量の３０倍まで、通常、３〜２０倍程度とするのが好ましい。
【００８４】
溶液中のアスコルビン酸２−グルコシドの含量が無水物換算で８６％以下である場合には、後続する（ウ）乃至（オ）の工程を経ても、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての結晶化度が９０％以上であるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を得ることは困難である。その理由は、溶液中のアスコルビン酸２−グルコシドの含量が無水物換算で８６％以下である場合には、その後の工程を経て得られるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末中のアスコルビン酸２−グルコシドの純度が低く、結晶化がスムースに進行しないためであると考えられる。
【００８５】
アスコルビン酸２−グルコシド含量を無水物換算で８６％超、好ましくは８８％以上にまで精製した溶液は、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を析出させる工程に先立ち、所定の濃度、通常は、アスコルビン酸２−グルコシド濃度約６５乃至８５％まで濃縮される。濃縮液の温度は、通常、約３０乃至４５℃に調節される。この濃度及び温度は、アスコルビン酸２−グルコシドについての過飽和度としては１．０５乃至１．５０に相当する。
【００８６】
＜（ウ）の工程＞
（ウ）の工程は、アスコルビン酸２−グルコシドを無水物換算で８６％超、好ましくは８８％以上含有する溶液から制御冷却法又は擬似制御冷却法によってアスコルビン酸２−グルコシドの無水結晶を析出させる工程である。すなわち、上記（イ）の工程で所定の純度及び濃度にまで精製、濃縮し、所定の温度に調整したアスコルビン酸２−グルコシド含有溶液を、助晶缶に移し、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶の種晶を０．１乃至５％（ｗ／ｖ）、好適には０．５乃至２％（ｗ／ｖ）含有せしめ、緩やかに撹拌しつつ、制御冷却法又は擬似制御冷却法によって晶析工程の初期は液温をゆるやかに低下させ、晶析工程の後期において液温を急速に低下させ助晶する。晶析に要する時間はアスコルビン酸２−グルコシドの種晶の添加量によっても異なるものの、例えば、擬似制御冷却法による場合には、全晶析時間を少なくとも２つ、好ましくは３つ以上の区間に分け、各区間内では時間に対して温度を概ね直線的に低下させ、作業時間ｔ＝τ／２の時点（晶析工程の中間点）における液温Ｔの変化量（Ｔ０−Ｔｍ）が、総温度変化量（Ｔ０−Ｔｆ）の５％以上５０％未満、望ましくは、１０％以上３０％未満の範囲を維持するように液温Ｔを時間ｔに対して連続的又は段階的に低下させるのが良い。例えば、４８時間かけて液温を４０℃から１５℃まで冷却して結晶を晶析させる場合には、冷却時間を３６時間と１２時間の２つの区間に分け、液温を４０℃から３０℃まで３６時間かけて冷却し、次いで、３０℃から１５℃まで１２時間かけて冷却するか、又は、液温を４０℃から３５℃まで３０時間かけて冷却し、次いで、３５℃から１５℃まで１８時間かけて冷却するのが好ましく、さらに好ましくは、冷却時間を２４時間、１２時間、１２時間の３つの区間に分け、最初の区間では２４時間かけて液温を４０℃から３５℃まで冷却し、次の区間では１２時間かけて３５℃から２７．５℃まで冷却し、さらに、最後の区間では１２時間かけて液温を２７．５℃から１５℃まで冷却するのが好ましい。
【００８７】
このように、制御冷却法又は擬似制御冷却法による場合には、温度制御を行うことなく自然冷却する晶析法に比べ、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶の微結晶が生じ難く、粒径の揃った結晶を含むマスキットを得ることができる。また、後述するとおり、得られるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶粉末は、自然冷却法で得られる粉末に比べ、アスコルビン酸２−グルコシド純度、及び固結性の重要な指標となるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての結晶化度の点でも高いという特徴を備えている。また、制御冷却法又は擬似制御冷却法による場合には、自然冷却する晶析法によって得られる粉末に比べて、より粒度分布の揃った粉末が得られるという利点がある。
【００８８】
＜（エ）の工程＞
この工程は、（ウ）の晶析工程で得られたマスキットから、常法の分蜜方式に従い、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を遠心分離により採取する工程である。採取されたアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶は、表面に付着している非晶質の蜜を除去するため、少量の精製水をスプレー（シャワー）して洗浄される。なお、結晶の洗浄に用いる精製水の量は、通常、遠心分離前のマスキットの重量に対して、３％以上、１０％までとするのが好ましい。すなわち、洗浄に用いられる精製水の量が３％未満では、洗浄が十分に行われず、非晶質の蜜が残り、所期のアスコルビン酸２−グルコシド純度が得られない恐れがある。一方、洗浄に用いられる精製水の量が１０％を超えると、洗浄によって溶解、除去されるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶の量が増し、結晶の収率が低下する恐れがある。
【００８９】
＜（オ）の工程＞
（オ）の工程は、採取されたアスコルビン酸２−グルコシドの無水結晶を、溶解、再結晶化することなく、熟成、乾燥し、必要に応じて粉砕する工程である。すなわち、遠心分離によって採取したアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を少量の脱イオン水や蒸留水などの精製水などで洗浄し、結晶表面に付着した不純物を洗い流す。洗浄に用いる水の量には特段の制限はないが、多すぎると表面の不純物だけでなく結晶自体も溶解するので歩留まりが低下し、加えて、洗浄水のコストも嵩むので、通常は、結晶質量の３０％まで、好ましくは１５〜２５％の量の洗浄水を用いて結晶表面を洗浄するのが望ましい。洗浄された結晶は、所定の温度及び湿度雰囲気中に一定時間保持することにより、熟成、乾燥し、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末とされる。熟成、乾燥工程における結晶含有粉末の品温や雰囲気の相対湿度、並びに、熟成、乾燥時間は、所期の結晶化度を示す粉末が得られる限り、特段の制限はないものの、熟成、乾燥工程において、結晶含有粉末の品温は２０乃至５５℃、雰囲気の相対湿度は６０乃至９０％に保たれるのが好ましい。また、熟成、乾燥時間は、両者の合計で、約５乃至２４時間とするのが好ましい。熟成、乾燥工程を経た結晶含有粉末は、次いで、室温まで自然放冷される。また、室温程度の清浄な空気を吹き付けて室温程度の品温にまで強制的に冷却することも有利に実施できる。得られた結晶粉末はそのまま、若しくは、必要に応じて粉砕して製品とされる。
【００９０】
上記（ア）乃至（オ）の工程は、上記（エ）の制御冷却法又は擬似制御冷却法による晶析工程を除いて、医薬部外品級の粉末の製造工程と基本的に同じであり、試薬級の粉末の製造工程では必須とされる、再結晶工程や、結晶を繰り返し洗浄する工程は含まれていない。
【００９１】
斯くして得られる粉末は、無水物換算でアスコルビン酸２−グルコシドを９８．０％を超え９９．９％未満含有し、粉末Ｘ線回折プロフィルに基づき算出されるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての結晶化度が９０％以上であるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末であり、より好ましくは、無水物換算でアスコルビン酸２−グルコシドを９８．０％を超え９９．９％未満含有し、粉末Ｘ線回折プロフィルに基づき算出されるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての結晶化度が９０％以上であり、且つ、原料由来のＬ−アスコルビン酸及び／又はＤ−グルコースを含有し、Ｌ−アスコルビン酸量が無水物換算で０．１％以下で、粉末全体の還元力が１％未満であるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末である。斯かる粉末は、従来の医薬部外品級の粉末が固結する条件下でも固結せず、医薬部外品級の粉末に比べて有意に固結し難いアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末である。さらに、当該粉末は、試薬級の粉末に比べ化粧品及び医薬部外品に汎用される親水性溶媒への溶解性に優れるという利点も有している。
【００９２】
本発明の製造方法によって製造されるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末は、従来の医薬部外品級の粉末に比べて有意に固結し難いので、粉末原料を取り扱うことを前提に設計された製造プラントを用いる飲料を含めた食品製造、化粧品製造、医薬部外品製造、さらには医薬品製造の各分野において、他の単独若しくは複数の粉末状の食品素材、食品添加物素材、化粧品素材、医薬部外品素材、医薬品素材などに安心して含有せしめることができるという優れた利点を備えている。
【００９３】
以下、本発明について、実験により具体的に説明する。
【００９４】
＜実験１：アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の固結性におよぼす結晶化度の影響＞
結晶化度が０乃至１００％の範囲にある複数のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を調製し、それらの固結性を試験することにより、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末における結晶化度と固結性との関連性を調べた。詳細は以下のとおり。
【００９５】
＜実験１−１：被験試料の調製＞
＜被験試料１＞
実質的にアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶からなる標準試料として、試薬級のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末（商品名『アスコルビン酸２−グルコシド  ９９９』、コード番号：ＡＧ１２４、純度９９．９％以上）を使用し、これを被験試料１とした。
【００９６】
＜被験試料２＞
実質的に無定形部分からなる標準試料としては、被験試料１を適量の精製水に溶解し、３日間かけて凍結乾燥した後、４０℃以下で１晩真空乾燥して得られた、実質的に無定形部分からなる粉末を使用し、これを被験試料２とした。なお、被験試料２の水分含量をカールフィッシャー法により測定したところ、２．０％であった。
【００９７】
＜被験試料３、４＞
被験試料３、４として、結晶化度が、被験試料１と被験試料２の間に入るものを以下の手順で調製した。すなわち、被験試料２と同様にして調製した無定形部分からなる粉末を金属製トレイ内に延展し、温度２５℃、相対湿度９０％に調整された恒温、恒湿のチャンバー内に２４時間又は７２時間収容することにより結晶化を促し、粉末を部分的に結晶化させた。その後、金属製トレイをチャンバーから取り出し、３８℃で一晩真空乾燥することにより２種類の粉末を調製した。恒温、恒湿のチャンバー内の収容時間が２４時間のものを被験試料３、７２時間のものを被験試料４とした。なお、被験試料３及び４は、分析試験に供する直前まで蓋つきバイアル瓶内に密封し、乾燥剤とともにデシケーター内に密封保存した。
【００９８】
＜実験１−２：被験試料１乃至４のアスコルビン酸２−グルコシド純度と結晶化度＞
＜アスコルビン酸２−グルコシド純度＞
被験試料１乃至４のアスコルビン酸２−グルコシド純度を以下のようにして求めた。すなわち、被験試料１乃至４のいずれかを精製水により２％溶液とし、０．４５μｍメンブランフィルターにより濾過した後、下記条件による液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に供し、示差屈折計によるクロマトグラムに出現したピークの面積から計算し、無水物換算した。結果は表１に示した。
・分析条件
ＨＰＬＣ装置：『ＬＣ−１０ＡＤ』（株式会社島津製作所製）
デガッサー：『ＤＧＵ−１２ＡＭ』（株式会社島津製作所製）
カラム：『Ｗａｋｏｐａｋ  Ｗａｋｏｂｅａｄｓ  Ｔ−３３０』（和光純薬工業株式会社販売  Ｈ＋型）
サンプル注入量：１０μｌ
溶離液：０．０１％（容積／容積）硝酸水溶液
流  速：０．５ｍｌ／分
温  度：２５℃
示差屈折計：『ＲＩＤ−１０Ａ』（株式会社島津製作所製）
データ処理装置：『クロマトパックＣ−Ｒ７Ａ』（株式会社島津製作所製）
【００９９】
＜結晶化度＞
被験試料１乃至４における結晶化度を以下のようにして求めた。すなわち、市販の反射光方式による粉末Ｘ線回折装置（スペクトリス株式会社製、商品名『Ｘ’Ｐｅｒｔ  ＰＲＯ  ＭＰＤ』）を用い、Ｃｕ対陰極から放射される特性Ｘ線であるＣｕＫα線（Ｘ線管電流４０ｍＡ、Ｘ線管電圧４５ｋＶ、波長１．５４０５Å）による粉末Ｘ線回折プロフィルに基づき、同粉末Ｘ線回折装置に搭載された専用の解析コンピューターソフトウェアを用い、被験試料１乃至４の各々についてハーマンス法による結晶化度の解析値を求めた。ハーマンス法による結晶化度の解析に先立ち、各粉末Ｘ線回折パターンにおけるピーク同士の重なり、回折強度、散乱強度などを勘案しながら、最適と判断されるベースラインが得られるように、ソフトウェアに設定された粒状度及びベンディングファクターをそれぞれ適切なレベルに合わせた。なお、ハーマンス法については、ピー・エイチ・ハーマンス（Ｐ．Ｈ．Ｈａｒｍａｎｓ）とエー・ワイジンガー（Ａ．  Ｗｅｉｄｉｎｇｅｒ）、「ジャーナル・オブ・アプライド・フィジクス」（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ）、第１９巻、４９１〜５０６頁（１９４８年）、及び、ピー・エイチ・ハーマンス（Ｐ．Ｈ．Ｈａｒｍａｎｓ）とエー・ワイジンガー（Ａ．  Ｗｅｉｄｉｎｇｅｒ）、「ジャーナル・オブ・ポリマー・サイエンス」（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第４巻、１３５〜１４４頁（１９４９年）に詳述されている。
【０１００】
被験試料１についての結晶化度の解析値を解析値Ｈ１００、被験試料２についての結晶化度の解析値を解析値Ｈ０とし、各被験試料についての結晶化度の解析値をＨｓとして前記した式［１］に代入することにより結晶化度を求めた。因みに被験試料１についてのハーマンス法による結晶化度の解析値（解析値Ｈ１００）及び被験試料２についての同解析値（解析値Ｈ０）は、それぞれ、７０．２３％及び７．５７％であった。結果は表１に併せて示した。なお、標準試料である被験試料１及び２については、粉末Ｘ線回折パターンをそれぞれ図１及び図２に示した。
【０１０１】
図１に見られるとおり、被験試料１の粉末Ｘ線回折パターンにおいては、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶に特有な回折ピークが回折角（２θ）４乃至６５°の範囲に明瞭かつシャープに出現し、無定形部分に特有なハローは一切認められなかった。一方、図２に見られるとおり、被験試料２の粉末Ｘ線回折パターンにおいては、図１の粉末Ｘ線回折パターンとは異なり、無定形部分に特有なハローがベースラインの膨らみとして著明に出現したものの、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶に特有な回折ピークは一切認められなかった。
【０１０２】
＜実験１−３：被験試料１及び２のシンクロトロン放射光による粉末Ｘ線回折＞
本実験では、被験試料１及び２がそれぞれ、解析値Ｈ１００及びＨ０を決定するための標準試料として適切なものであることをさらに裏付ける目的で、これら被験試料をシンクロトロン放射光（以下、「放射光」と言う。）をＸ線源に用い、微弱な回折や散乱のシグナルを検出することができる透過光方式の粉末Ｘ線回折に供した。なお、測定条件は次のとおりであった。
【０１０３】
＜測定条件＞
粉末Ｘ線回折装置：高速粉末Ｘ線回折装置（神津精機社販売、
型番『ＰＤＳ−１６』）、デバイシェラモード、
カメラ長：４９７．２ｍｍ
Ｘ線源  ：偏向電磁石からの放射光（兵庫県ビームライン（ＢＬ０８Ｂ２））
測定波長：０．７７１７Å（１６．０６６ｋｅＶ）
測定強度：１０９フォトン／秒
測定角  ：２乃至４０°
露光時間：６００秒間
画像撮影：イメージングプレート（富士フイルム社製、商品名『イメー
ジングプレート  ＢＡＳ−２０４０』）
画像読取装置：イメージアナライザー（富士フイルム社製、『バイオイ
メージアナライザーＢＡＳ−２５００』）
【０１０４】
測定は、大型放射光施設「ＳＰｒｉｎｇ−８」（兵庫県佐用郡佐用町光都１−１−１）内に設けられた「兵庫県ビームライン（ＢＬ０８Ｂ２）」を利用して実施した。
【０１０５】
粉末Ｘ線回折の測定に先立ち、被験試料１及び２を乳鉢によりすり潰した後、５３μｍの篩によりふるい分け、篩を通過した粉末をＸ線結晶回折用のキャピラリー（株式会社トーホー販売、商品名『マークチューブ』、Ｎｏ．１４（直径０．６ｍｍ、リンデマンガラス製））内に充填長が略３０ｍｍとなるように均一に充填した。次いで、キャピラリーを試料の充填終端で切断し、開口部を接着剤により封じた後、試料マウントへキャピラリーを粘土により固定し、キャピラリーの長手方向が粉末Ｘ線回折装置の光軸に対して垂直になるように、試料マウントを粉末Ｘ線回折装置に取り付けた。
【０１０６】
アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶の配向による粉末Ｘ線回折プロフィルへの影響を除くため、測定中、キャピラリーの長手方向に、１回／６０秒の周期で、試料マウントを±１．５ｍｍの幅で等速往復振動させながら、キャピラリーの長手方向を回転軸として、試料マウントを２回／秒の周期で等速回転させた。
【０１０７】
被験試料１及び２について得られた粉末Ｘ線回折プロフィルを解析し、粉末Ｘ線回折パターンを作成する過程においては、測定精度を上げるため、常法にしたがい、各粉末Ｘ線回折プロフィルから粉末Ｘ線回折装置に由来するバックグラウンドシグナルを除去した。斯くして得られた被験試料１及び２についての粉末Ｘ線回折パターンをそれぞれ図３及び図４に示す。
【０１０８】
図３に見られるとおり、放射光を用いた粉末Ｘ線回折による被験試料１についての粉末Ｘ線回折パターンにおいてはアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶に特有な回折ピークが回折角（２θ）２乃至４０°の範囲に明瞭かつシャープに出現した。図３と図１とを比較すると、放射光の波長（０．７７１７Å）、と特性Ｘ線の波長（１．５４０５Å）とが異なるため、図３においては、図１におけるほぼ２分の１の回折角（２θ）で各回折ピークが出現するという違いはあるものの、図１及び図３における回折パターンは極めてよく一致していた。また、図３における各回折ピークの強度は、図１における回折ピークの強度より１００倍近く強いにもかかわらず、各回折ピークの半値幅は図１におけるよりも明らかに狭く、分離度も高かった。また、図３の粉末Ｘ線回折パターンにおいては、後述する図４におけるがごとき、無定形部分に特有なハローは一切認められなかった。このことは、被験試料１中のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶の結晶性が極めて高く、被験試料１が実質的にアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶からなることを示している。
【０１０９】
一方、図４に示すとおり、放射光を用いた粉末Ｘ線回折による被験試料２についての粉末Ｘ線回折パターンにおいては、無定形部分に特有なハローがベースラインの膨らみとして著明に出現し、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶に特有な回折ピークは一切認められなかった。このことは、被験試料２が実質的に無定形部分からなることを示している。
【０１１０】
放射光をＸ線源として用いて得られた上記の結果は、被験試料１及び被験試料２が、式［１］における解析値Ｈ１００及び解析値Ｈ０を決定するための標準試料として適切なものであることを裏付けている。
【０１１１】
＜実験１−４：固結性試験＞
被験試料１乃至４の各々について、その固結性を調べる目的で、以下の実験を行った。すなわち、実験１−１で調製した被験試料１乃至４を１ｇずつ秤取し、それぞれ別個に内底部が半球状の１４ｍｌ容蓋つきポリプロピレン製円筒チューブ（ベクトン・ディッキンソン社販売、商品名『ファルコンチューブ２０５９』、直径１．７ｃｍ、高さ１０ｃｍ）の内部に充填し、チューブを試験管立てに直立させた状態で５０℃のインキュベーター（アドバンテック東洋株式会社販売、商品名『ＣＩ−４１０』）の内部に収容し、２４時間にわたって静置した後、チューブをインキュベーター外に取り出し、チューブから蓋を外し、チューブを緩慢に転倒させることにより、被験試料を黒色プラスチック製平板上に取り出し、取り出された被験試料の状態を肉眼観察した。
【０１１２】
固結の有無は、被験試料が平板上でもなおチューブ内底部の半球状を明らかに保っている場合を「固結あり」（＋）、被験試料がチューブ内底部の形状をわずかではあるが識別できる場合を「やや固結あり」（±）、被験試料が崩壊し、チューブ内底部の形状を保っていない場合を「固結なし」（−）と判定した。結果は、表１における「固結性」の欄に示すとおりであった。
【０１１３】
【表１】
2012121297.tif 000009
【０１１４】
表１に示されるとおり、解析値Ｈ１００を決定するための標準試料とした被験試料１（結晶化度１００．０％）は、平板上に取り出すと崩壊し、チューブ内底部の形状を保っておらず、「固結なし」（−）と判断された。これに対し、解析値Ｈ０を決定するための標準試料とした被験試料２（結晶化度０．０％）は、チューブから平板上に取り出しても、なおチューブ内底部の半球状を明確に保っており、明らかに「固結あり」（＋）と判断された。平板上に取り出された被験試料２が保っているチューブ内底部の半球状の形態は、平板に軽く振動を与えた程度では崩壊しないほどであった。
【０１１５】
結晶化度が８８．３％である被験試料３は、被験試料２と同様に、チューブから平板上に取り出しても、なおチューブ内底部の半球状を明確に保っており、明らかに「固結あり」（＋）と判断されたが、結晶化度が９３．１％である被験試料４は、被験試料１と同様に、平板上に取り出した途端に崩壊し、「固結なし」（−）と判断された。
【０１１６】
なお、被験試料２乃至４は、上述したとおり、アスコルビン酸２−グルコシド純度が９９．９％の被験試料１を基に調製したものであるが、上述したＨＰＬＣ分析によれば、それらのアスコルビン酸２−グルコシド純度はいずれも９９．１％にとどまった。この理由は定かではないが、調製途中に何らかの理由でアスコルビン酸２−グルコシドが、ごく微量ではあるが、分解などして失われたものと推測される。
【０１１７】
上記の結果は、無水物換算でアスコルビン酸２−グルコシドを９９．１％以上含有する粉末の場合、結晶化度が高いほど固結性が低い傾向にあることを示しており、結晶化度が８８．３％の被験試料３が「固結あり」（＋）と判断され、結晶化度が９３．１％の被験試料４が「固結なし」（−）と判断されたという事実は、上記固結性試験において、「固結あり」（＋）から「固結なし」（−）に変わる臨界点が、結晶化度８８．３％と９３．１％の間にあることを示している。
【０１１８】
＜実験２：アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の固結性と結晶化度の関係＞
本実験では、実験１の結果に基づき、固結性と結晶化度の関係をさらに詳細に調べるために、結晶化度が０乃至１００％の範囲にあり、アスコルビン酸２−グルコシドの純度が９９．１乃至９９．９％である７種類のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を用い、実験１におけると同様に固結性について試験した。
【０１１９】
＜実験２−１：被験試料の調製＞
実験１−１で調製した被験試料１と被験試料２とをそれぞれ適量とり、均一に混合することにより、表２に示す被験試料５乃至９の粉末を調製した。実験１−２に記載した方法によって求めた被験試料５乃至９のアスコルビン酸２−グルコシド純度と、結晶化度は表２に示すとおりであった。なお、表２における被験試料１及び２についての結果は表１から転記した。
【０１２０】
＜実験２−２：固結性試験＞
被験試料５乃至９を実験１−４の固結性試験に供した。結果を表２の「固結性」の欄に示した。なお、表２における被験試料１及び２についての「固結性」は、表１に記載した被験試料１及び２についての固結性試験結果を転記したものである。
【０１２１】
【表２】
2012121297.tif 000010
【０１２２】
表２の結果に見られるとおり、結晶化度が２９．９％である被験試料９は「固結あり」（＋）と判断され、結晶化度が８９．２％である被験試料８は「やや固結あり」（±）と判断された。これに対し、結晶化度が９１．５％である被験試料７、結晶化度が９２．６％である被験試料６、及び結晶化度が９９．８％である被験試料５は、いずれも被験試料１と同様に、「固結なし」（−）と判断された。これらの結果は、無水物換算でアスコルビン酸２−グルコシドを９９．１％以上９９．９％未満含有するアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末において、結晶化度が９０％以上の場合、本実験の条件下では固結しないことを示している。
【０１２３】
＜実験３：アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の結晶化度に及ぼすアスコルビン酸２−グルコシド純度の影響＞
先行する実験によって、アスコルビン酸２−グルコシド純度が９９．１％以上という高純度のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末において、異なる結晶化度のものが存在することが明らかとなったので、本実験では、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の結晶化度とアスコルビン酸２−グルコシド純度との関係について検討した。さらに、アスコルビン酸２−グルコシド純度と固結性との関係について検討した。
【０１２４】
＜実験３−１：被験試料の調製＞
以下のようにして、Ｌ−アスコルビン酸と、デキストリンとを含有する水溶液から、表３に示すアスコルビン酸２−グルコシド純度が互いに異なる被験試料１０乃至１５を調製した。
【０１２５】
すなわち、デキストリン（松谷化学工業株式会社販売、商品名『パインデックス＃１００』）４質量部を水１５質量部に加熱溶解し、Ｌ−アスコルビン酸３質量部を加え、ｐＨ５．５、液温を５５℃に保ちつつ、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス  Ｔｃ−６２株由来のＣＧＴａｓｅをデキストリン１ｇ当り１００単位と、イソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所販売）をデキストリン１ｇ当り２５０単位加え、５０時間反応させ、アスコルビン酸２−グルコシドを生成させた。なお、反応液中には、２−Ｏ−α−マルトシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−マルトトリオシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−マルトテトラオシル−Ｌ−アスコルビン酸などのα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸類も当然に生成していると推測される。
【０１２６】
反応液を加熱することにより酵素を失活させた後、ｐＨ４．５に調整し、グルコアミラーゼ（商品名『グルクザイムＡＦ６』  天野エンザイム株式会社販売）をデキストリン１ｇ当り５０単位加え、２４時間反応させることにより、上記のごときα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸類をアスコルビン酸２−グルコシドにまで、また、混在するオリゴ糖をＤ−グルコースにまで分解した。この時点で、反応液におけるアスコルビン酸２−グルコシドについての生成率は３９％であった。
【０１２７】
反応液を加熱することによりグルコアミラーゼを失活させ、活性炭で脱色濾過した後、濾液をカチオン交換樹脂（Ｈ＋型）のカラムに通液して脱塩した後、アニオン交換樹脂（ＯＨ−型）にＬ−アスコルビン酸及びアスコルビン酸２−グルコシドを吸着させ、水洗してＤ−グルコースを除いた後、０．５Ｎ塩酸溶液で溶出した。さらに、この溶出液を固形分約５０％にまで濃縮し、次いで、強酸性カチオン交換樹脂（ダウケミカル社製造、商品名『ダウエックス５０ＷＸ４』、Ｃａ２＋型）を用いるカラムクロマトグラフィーに供した。カラムに、その湿潤樹脂容積の約１／５０量負荷し、負荷量の５０倍の精製水を線速度１ｍ／時間で通液し、溶出液をカラム容積の０．０５容積量ずつ分画した。その後、各画分の組成を実験１−２で述べたＨＰＬＣ法により測定し、無水物換算でアスコルビン酸２−グルコシド含量が８０％以上であった６画分につき、それらを濃度約７６％まで減圧濃縮し、得られた濃縮液を助晶缶にとり、種晶として、実験１−１における被験試料１を２％ずつ加え、濃縮液を緩慢に撹拌しながら、２日間かけて液温を４０℃から１５℃にまで、約２日間かけて自然冷却し、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を晶析させた。
【０１２８】
その後、常法にしたがい、バスケット型遠心分離機によりマスキットから結晶を採取し、少量の蒸留水で洗浄した後、熟成、乾燥し、２５℃の空気を３０分間吹き付け冷却し、粉砕することにより、表３に示す被験試料１０乃至１５を得た。また、被験試料１６として、従来の医薬部外品級の粉末であるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末（商品名『ＡＡ２Ｇ』  株式会社林原生物化学研究所販売）を用いた。
【０１２９】
【表３】
2012121297.tif 000011
【０１３０】
なお、表３に見られる被験試料１及び２は実験１−１におけると同様のものであり、それらのアスコルビン酸２−グルコシドの純度、結晶化度は先行する実験で得た結果をそのまま転記したものである。被験試料１０乃至１６の固結性を実験１−４におけると同様の方法で試験した。結果を表３に示す。なお、表３に見られる被験試料１及び２についての固結性試験の結果は表１におけるものをそのまま転記したものである。
【０１３１】
＜実験３−２：保存性試験＞
実験１−４等において行われた固結性試験が、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の実際の保存時における固結性を評価する試験として妥当なものであることを確認すべく、実験１−１の方法で得た被験試料１、実験３−１で得た被験試料１０乃至１５、及び被験試料１６について、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末が実際に保存される状態、環境、期間などを想定した保存性試験を行った。
【０１３２】
すなわち、被験試料１及び被験試料１０乃至１６を１０ｋｇずつとり、それぞれを、二重にしたポリエチレン袋（縦８００ｍｍ×横６００ｍｍ）に入れたものを各被験試料につき１袋ずつ作製した。次いで各ポリエチレン袋を、開口部を上向きにし、開口したまま閉口することなくスチール缶に収納し（１８リットル容）、スチール缶の蓋をせずに静置し、高温多湿を避けて、室内で４５日間保存した。４５日間保存後、スチール缶から各被験試料の入ったポリエチレン袋を取り出し、袋から被験試料を黒色プラスチック製平板上に取り出し、その際の被験試料の流動性と固結の状態を肉眼観察した。
【０１３３】
固結の有無は、被験試料中に塊状物が認められ、保存開始時と比べ流動性が低下している場合を「固結あり」（＋）、塊状物が認められず、保存開始時と比べ流動性に変化がない場合を「固結なし」（−）と判定した。なお、本保存試験における各被験試料の保存形態は、開口部をゴムバンドで閉口していない点、乾燥剤を入れていない点、及び、スチール缶の蓋をしていない点を除き、医薬部外品級の粉末の商品形態と同じであり、実際に市場に流通し、保存される際の形態と同じである。なお、上記３つの相違点は、試験結果を早期に得られるように、保存試験での保存環境を実際の保存環境よりもやや過酷にすべく、設定された相違点である。結果を表３に併せて示した。
【０１３４】
表３に示されるとおり、実質的に無定形部分からなる被験試料２、及び医薬部外品級の粉末である被験試料１６を除いて、その余の被験試料１及び被験試料１０乃至１５においては、アスコルビン酸２−グルコシド純度が高まるにつれ、結晶化度が高くなる傾向がある。さらに、固結性試験において、アスコルビン酸２−グルコシド純度がそれぞれ９７．４％及び９８．０％である被験試料１０及び１１が「固結あり」（＋）又は「やや固結あり」（±）と判断されたのに対し、アスコルビン酸２−グルコシド純度が９８．６乃至９９．７％である被験試料１２乃至１５は「固結なし」（−）と判断された。これらの結果は、固結性を左右すると考えられるアスコルビン酸２−グルコシド純度についての閾値が９８．０％付近にあることを示しており、「固結なし」（−）と評価されるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を得るには９８．０％を超えるアスコルビン酸２−グルコシド純度が必要であると結論づけることができる。
【０１３５】
また、被験試料１２乃至１５のアスコルビン酸２−グルコシド純度は９８．６乃至９９．７％であり、医薬部外品級の粉末である被験試料１６のアスコルビン酸２−グルコシド純度９８．９％とほぼ同じレベルであり、試薬級の粉末であって実質的にアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶からなる被験試料１の純度より有意に低いにもかかわらず、被験試料１と同様に全く固結は認められなかった。因みに、被験試料１２乃至１５の結晶化度は９１．６乃至９９．５％と９０％以上であるが、医薬部外品級の粉末である被験試料１６の結晶化度は８８．９％と９０％を下回っていた。これらの結果から、医薬部外品級の粉末である被験試料１６よりも有意に固結し難いアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を得るには、結晶化度を９０％以上とする必要があると判断される。
【０１３６】
なお、表３の最下段に示すとおり、各被験試料を実際の商品形態に倣って、１０ｋｇ入りの袋詰めの状態で４５日間保存した保存性試験においても、アスコルビン酸２−グルコシドの純度がそれぞれ９７．４％及び９８．０％である被験試料１０及び１１が「固結あり」（＋）と判断されたのに対し、アスコルビン酸２−グルコシド純度が９８．６乃至９９．７％である被験試料１２乃至１５は「固結なし」（−）と判断され、固結性試験と同様の結果が得られた。この事実は、実験１−４等における固結性試験が、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の実際の保存環境下での固結性を評価する試験として妥当なものであることを示している。
【０１３７】
＜実験４：アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の還元力と着色との関係＞
先行する実験で用いた被験試料は、いずれも、Ｌ−アスコルビン酸と澱粉質とを含む溶液にＣＧＴａｓｅを作用させる工程を経て得られたアスコルビン酸２−グルコシド含有溶液から調製されるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末である。このような製法による場合、得られる粉末には、量の多寡はともかく、製造方法に特有の夾雑物であるＬ−アスコルビン酸及びＤ−グルコースが含まれることになる。Ｌ−アスコルビン酸やＤ−グルコースは、いずれも還元性を有しており、含まれる量にもよるが、蛋白質やアミノ酸などのアミノ基を有する化合物を含む製品に使用した場合、製品に不都合な変色をもたらす恐れがある。中でも、Ｌ−アスコルビン酸は、酸素との反応性が高く、これを使用した製品に不都合な変色をもたらすだけでなく、従来の医薬部外品級の粉末を長期間保存した場合に往々にして認められた粉末自体の着色の原因ともなると考えられる。
【０１３８】
そこで、本実験では、先行する実験で用いた被験試料１及び被験試料１２乃至１６につき、それらの粉末におけるＬ−アスコルビン酸とＤ−グルコースとの合計量、Ｌ−アスコルビン酸量、さらには、粉末全体の還元力と着色性との関係について、下記の手順にて、加熱処理による加速試験を行うことにより検討した。
【０１３９】
１０ｍｌ容螺子蓋付き試験管内に各被験試料を無水物換算で１５０ｍｇずつ秤取し、試験管の開口部を塞いだ状態でオーブン（増田理化株式会社販売、商品名『ＤＲＹＩＮＧ−ＯＶＥＮ  ＳＡ３１０』）内に収容し、８０℃で３日間加温した。次いで、試験管から螺子蓋を外し、各被験試料に脱イオン水を３ｍｌずつ加え、溶解させた後、分光光度計（株式会社島津製作所販売、商品名『ＵＶ−２４００ＰＣ』）により波長４００ｎｍにおける吸光度を測定した。加温に伴う着色の度合いは、波長４００ｎｍにおける吸光度の数値が０．５０未満である場合：「着色しないか、あるいは、実質的に着色しない」（−）、前記吸光度の数値が０．５０以上である場合：「着色する」（＋）、の２段階で判定した。結果を表４に示す。
【０１４０】
なお、各被験試料中のＬ−アスコルビン酸とＤ−グルコースの合計量は実験１−１で述べたＨＰＬＣ法により決定した。また、粉末全体の還元力については、Ｄ−グルコースを標準物質として用い、斯界で汎用されているソモジ−ネルソン法及びアンスロン硫酸法により、それぞれ、還元糖量及び全糖量を測定し、それらを上述した式［３］に代入し、計算することにより求めた。各被験試料におけるＬ−アスコルビン酸とＤ−グルコースとの合計量、Ｌ−アスコルビン酸量、及び、粉末全体の還元力は表４に示すとおりであった。
【０１４１】
【表４】
2012121297.tif 000012
【０１４２】
表４に示すとおり、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末においては、実質的にアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶からなる試薬級の粉末である被験試料１では、Ｌ−アスコルビン酸及びＤ−グルコース量は、いずれも検出限界以下であった。これに対し、本発明のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末である被験試料１２乃至１５、及び、従来の医薬部外品級の粉末である被験試料１６では、いずれの粉末においてもＬ−アスコルビン酸及び／又はＤ−グルコースが検出された。さらに、斯かる粉末においては、被験試料１２乃至１５のように、Ｌ−アスコルビン酸とＤ−グルコースの合計量が無水物換算で０．２％以下である場合には、「着色しないか、あるいは、実質的に着色しない」（−）と判断されたのに対し、被験試料１６のように、Ｌ−アスコルビン酸とＤ−グルコースの合計量が無水物換算で０．３％に達すると、「着色する」（＋）と判断された。さらに、斯かる粉末の着色性に最も強く関与すると考えられるＬ−アスコルビン酸については、被験試料１２乃至１５のように、その含量が無水物換算で０．１％以下である場合には、「着色しないか、あるいは、実質的に着色しない」（−）と判断されたのに対し、被験試料１６のように、Ｌ−アスコルビン酸量が無水物換算で０．２％に達すると、「着色する」（＋）と判断された。因みに、既述のごとく、Ｌ−アスコルビン酸は酸素との反応性が高く、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の着色に関与していると考えられるので、Ｌ−アスコルビン酸量が０％を超え０．１％以下の場合には、斯かる粉末を従来の医薬部部外品級の粉末の商品形態で長期保存した場合、実質的な着色を懸念しなくてよいと判断された。
【０１４３】
一方、還元力から見ると、被験試料１２乃至１５のように、粉末全体の還元力が０％を超え１％未満である場合、「着色しないか、あるいは、実質的に着色しない」（−）と判断されたのに対し、被験試料１６のように、粉末全体の還元力が１％を超えると、「着色する」（＋）と判断された。この結果は、上記したＬ−アスコルビン酸とＤ−グルコースの合計量を指標にして判定した結果と良く一致していた。
【０１４４】
以上の結果は、製造方法に起因して、不可避的に、Ｌ−アスコルビン酸及び／又はＤ−グルコースを検出できるレベルで含んでいても、粉末全体の還元力を０％を超え１％未満とする場合には、着色の懸念がないアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を得ることができることを示している。また、使用した製品の着色だけでなく、粉末自体の着色という観点を含めれば、Ｌ−アスコルビン酸の含量は、無水物換算で０％を超え０．１％以下が好ましいことを示している。
【０１４５】
＜実験５：晶析時の冷却方法がアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の結晶化度に及ぼす影響＞
晶析時の冷却方法がアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の結晶化度に及ぼす影響を調べるために、下記に示す方法により、表５に示すアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末（被験試料１７乃至２２）を調製した。なお、酵素反応液中のアスコルビン酸２−グルコシドの生成率は、実験１−２の方法で測定した。
【０１４６】
＜被験試料の調製方法＞
（１）被験試料１７
後述の参考例１の方法において、ＣＧＴａｓｅ及びイソアミラーゼの作用時間を参考例１の半分である２５時間目で停止し、アスコルビン酸２−グルコシド含量８６％以上にまで精製した後、アスコルビン酸２−グルコシドを含む溶液を濃度約７６％まで減圧濃縮した点、及び、得られた濃縮液を周囲にジャケットタンクを配した助晶缶に移し、ジャケットタンク内の水温を調整することにより、１．５日間かけて４０℃から３０℃へ緩やかに冷却した後、０．５日間かけて３０℃から１５℃へ急速に冷却する擬似制御冷却法により結晶を晶析させた点以外は、後述する参考例１におけると同様にしてアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末である被験試料１７を調製した。なお、酵素反応液中のアスコルビン酸２−グルコシドの生成率は２５．３％であった。
（２）被験試料１８
後述の実施例１の方法において、原料として用いた液化馬鈴薯澱粉をデキストリン（松谷化学工業株式会社販売、商品名「パインデックス＃１００」）に代えた点、及び、酵素反応後の溶液を精製、減圧濃縮後、４０℃から１５℃まで約２日間かけて自然冷却し結晶を晶出させた点以外は、実施例１におけると同様にしてアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末である被験試料１８を調製した。なお、酵素反応液中のアスコルビン酸２−グルコシドの生成率は２７．０％であった。
（３）被験試料１９
酵素反応後の溶液を精製、減圧濃縮後、周囲にジャケットタンクを配した助晶缶に移し、ジャケットタンク内の水温を調整することにより、１．５日間かけて４０℃から３０℃へ緩やかに冷却後、０．５日間かけて３０℃から１５℃へ急速に冷却する擬似制御冷却法により結晶を晶析させた点以外は被験試料１８と同様にしてアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末である被験試料１９を調製した。なお、酵素反応液中のアスコルビン酸２−グルコシドの生成率は２７．０％であった。
（４）被験試料２０
後述の実施例４の方法において、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を晶析する際、アスコルビン酸２−グルコシドを含む溶液を、濃度約７６％にまで減圧濃縮し、得られた４０℃の溶液を助晶缶に移し、４０℃から１５℃まで約２日間かけて自然冷却し結晶を晶出させた以外は、実施例４におけると同様にしてアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末である被験試料２０を調製した。なお、酵素反応液中のアスコルビン酸２−グルコシドの生成率は３２．５％であった。
（５）被験試料２１
酵素反応後の溶液を精製、減圧濃縮後、周囲にジャケットタンクを配した助晶缶に移し、ジャケットタンク内の水温を調整することにより、１．５日間かけて４０℃から３０℃へ緩やかに冷却後、０．５日間かけて３０℃から１５℃へ急速に冷却する擬似制御冷却法により結晶を晶析させた点以外は被験試料２０と同様にしてアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末である被験試料２１を調製した。なお、酵素反応液中のアスコルビン酸２−グルコシドの生成率は３２．５％であった。
（６）被験試料２２
実験３−１における被験試料の調製方法において、ＣＧＴａｓｅとイソアミラーゼによる酵素反応を反応３０時間で停止し、精製してアスコルビン酸２−グルコシド含量を８６．２％まで高めた溶液を、濃度約７６％にまで減圧濃縮し、得られた４０℃の溶液を助晶缶に移し、４０℃から１５℃まで約２日間かけて冷却する自然冷却法により結晶を晶出させた以外は、実験３−１におけると同様にしてアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末である被験試料２２を調製した。なお、酵素反応液中のアスコルビン酸２−グルコシドの生成率は３５．３％であった。
【０１４７】
＜アスコルビン酸２−グルコシド純度及び結晶化度の測定＞
実験１−２におけると同様の方法によって、被験試料１７乃至２２のアスコルビン酸２−グルコシド純度、及びアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての結晶化度を測定した。
【０１４８】
＜平均結晶子径＞
被験試料１７乃至２２の平均結晶子径を以下の方法により測定した。既述の式［２］による算出のために、各被験試料の結晶化度の測定に用いた粉末Ｘ線回折プロフィルに基づき作成された回折パターンにおいて、図１の符号ａ乃至ｅで示す回折ピークに該当する、回折角（２θ）１０．４°（ミラー指数（ｈｋｌ）：１２０）、１３．２°（ミラー指数：１３０）、１８．３°（ミラー指数：２３０）、２１．９°（ミラー指数：０６０）及び２２．６°（ミラー指数：１３１）に検出される５個の回折ピークについての半値幅と回折角（２θ）につき、粉末Ｘ線回折装置（スペクトリス株式会社製、商品名『Ｘ’Ｐｅｒｔ  ＰＲＯ  ＭＰＤ』）に付属する解析処理用コンピューターソフトウェア（『エクスパート  ハイスコア  プラス（Ｘ’ｐｅｒｔ  Ｈｉｇｈｓｃｏｒｅ  Ｐｌｕｓ）』を用いて処理し、次いで、同ソフトウェア中の「シェラー（Ｓｃｈｅｒｒｅｒ）の式」によるプログラムにて、これら被験試料におけるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶の平均結晶子径を算出した。
【０１４９】
以上の結果を表５に示す。
【０１５０】
【表５】
2012121297.tif 000013
【０１５１】
表５に示すとおり、アスコルビン酸２−グルコシドの生成率が２７．０％又は３２．５％の酵素反応液を、精製、濃縮後、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシド含有溶液から、擬似制御冷却法によりアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を晶析させて調製した被験試料１９及び２１は、結晶化度が９０％を超え、平均結晶子径はそれぞれ１，４５０Å及び１，６５０Åであった。これに対し、アスコルビン酸２−グルコシドの生成率が２５．３％の酵素反応液を、精製、濃縮後、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシド含有溶液から、同じく擬似制御冷却法によりアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を晶析させて調製した被験試料１７は、平均結晶子径は１，４１０Åと比較的大きかったものの、結晶化度は９０％に満たなかった。また、アスコルビン酸２−グルコシドの生成率が被験試料１９及び２１と同じく２７．０％又は３２．５％である酵素反応液を、精製、濃縮後、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシド含有溶液から、自然冷却法によりアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を晶析させて調製した被験試料１８及び２０は、結晶化度が９０％に満たず、平均結晶子径がそれぞれ１，２２０Å及び１，２５０Åといずれも低かった。一方、アスコルビン酸２−グルコシドの生成率が３５．３％の酵素反応液を、精製、濃縮後、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシド含有溶液から、自然冷却法によりアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を晶析させて調製した被験試料２２は、結晶化度が９８．９％と高く、平均結晶子径も１，７０５Åと高かった。
【０１５２】
実験５の結果は、アスコルビン酸２−グルコシドの生成率が同じ反応液から調製したアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末であっても、擬似制御冷却法によってアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を晶析させた場合の方が、自然冷却によって晶析させた場合よりも結晶化度が高く、かつ、平均結晶子径も大きくなることを示している。また、自然冷却によってアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を晶析させる場合には、酵素反応液中のアスコルビン酸２−グルコシドの生成率が３５％を超えないと、結晶化度が９０％を超えるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末が得られないのに対し、晶析時に擬似制御冷却法を適用する場合には、酵素反応液中のアスコルビン酸２−グルコシドの生成率が３５％に満たない、３２．５％（被験試料２１）や２７．０％（被験試料１９）であっても、結晶化度が９０％を超えるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末が得られている。これらの結果は、擬似制御冷却法が結晶化度の上昇や、結晶子径の増大に有効であり、酵素反応液中のアスコルビン酸２−グルコシドの生成率が２７．０％以上であれば、精製、濃縮後、擬似制御冷却法又は制御冷却法を用いることによって、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての結晶化度が９０％を超えるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を得ることができることを示している。なお、被験試料１９及び２１は、アスコルビン酸２−グルコシドの純度が９８．０％超９９．９％未満の範囲内にあり、かつ、結晶化度が９０％を超えているので、従来の医薬部外品級の粉末に比べて有意に固結し難いアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末である。
【０１５３】
＜実験６：平均結晶子径が親水性溶媒に対する溶解性に及ぼす影響＞
被験試料として、上記実験で用いた被験試料１７乃至２２、後述の実施例１乃至４の方法で製造したアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末、実験１−１で調製した被験試料１及び実験３−１で用いた被験試料１６（医薬部外品級の粉末）を用い、化粧品や医薬部外品で汎用されている親水性溶媒に対する溶解性を調べた。
【０１５４】
すなわち、上記被験試料或いは実施例１乃至４の粉末のいずれかを、各々０．２５ｇ秤量し、内底部が半球状の１４ｍｌ容蓋付きポリプロピレン製円筒チューブ（ベクトン・ディッキンソン社販売、商品名「ファルコンチューブ２０５９」に入れた。各々の試料を入れたチューブに、１，３−ブチレングリコール（和光純薬工業株式会社製、試薬特級）を脱イオン水で３０％濃度に希釈したものを５ｍｌ加え、５０℃の恒温水槽で、３０分間加温した後、２回転倒させ、さらに５０℃で１５分保持し、目視により、粉末が完全に溶解したと見なされる場合を「溶解性良」（−）、不溶物の残存が確認される場合を「溶解性不良」（＋）と判定した。この不溶物の残存が確認される場合、さらに５０℃で１５分保持し、その時粉末が完全に溶解したと見なされた場合は「溶解性やや不良」（±）と判定した。結果を表６に示す。
【０１５５】
さらに、上記被験試料或いは実施例１乃至４の粉末を用い、実験１−４及び実験３−２の方法により、固結性試験及び保存性試験を実施した。結果を併せて表６に示す。なお、被験試料１及び１６についての平均結晶子径は実験５の方法で測定し、表６に併せて示した。また、被験試料１及び１６についてのアスコルビン酸２−グルコシド純度、結晶化度、固結性及び保存性の結果は、表３に記載した被験試料１及び１６についての結果を転記したものである。
【０１５６】
【表６】
2012121297.tif 000014
【０１５７】
表６に示すように、平均結晶子径が１，６７０Å以下である被験試料１６乃至２１及び後述の実施例１乃至４の粉末は「溶解性良」（−）と判定された。これに対し、平均結晶子径が１，７０５Åの被験試料２２は、「溶解性やや不良」（±）と判定された。平均結晶子径が１，７７０Åの被験試料１（試薬級の粉末）は、「溶解性不良」（＋）と判定された。さらに、被験試料１、１９、２１、２２、及び実施例１乃至４の粉末は、固結性試験及び保存性試験において、「固結しない」（−）と判定されたのに対し、被験試料１６乃至１８及び２０は、「固結する」（＋）と判定された。この結果から、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の親水性溶媒に対する溶解性に影響を及ぼす平均結晶子径の閾値は１，７０５Åよりも小さいと推測され、平均結晶子径が１，７００Å未満、より詳細には１，６７０Å以下のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末は、試薬級の粉末よりも親水性溶媒に対する溶解性が優れていると判断された。さらに、溶解性、固結性、及び保存性のいずれにおいても良い評価が得られた被験試料１９、２１、及び、実施例１乃至４の粉末のうち、最も小さな平均結晶子径は１，４５０Å（被験試料１９）であるので、好ましい平均結晶子径の範囲は１，４００Å以上１，７００Å未満、より好ましくは１，４５０Å以上１，６７０Å以下であると判断された。
【０１５８】
＜実験７：各種微生物由来ＣＧＴａｓｅによるアスコルビン酸２−グルコシドの生成率＞
液化澱粉とＬ−アスコルビン酸を含有する溶液にＣＧＴａｓｅを作用させ、次いで、グルコアミラーゼを作用させる酵素反応によってアスコルビン酸２−グルコシドを生成させる酵素反応系において、ＣＧＴａｓｅの由来の違いが、酵素反応で得られる酵素反応液中のアスコルビン酸２−グルコシド生成率にどのような影響を及ぼすかを調べるべく、以下の実験を行った。
【０１５９】
＜市販ＣＧＴａｓｅ＞
各種微生物由来のＣＧＴａｓｅのうち、市販されているＣＧＴａｓｅとしては、以下のＣＧＴａｓｅを用いた。すなわち、バチルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）由来のＣＧＴａｓｅとしては、市販のＣＧＴａｓｅ（商品名『コンチザイム』、天野エンザイム株式会社販売）を、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のＣＧＴａｓｅとしては、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス  Ｔｃ−９１株由来ＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所製）を、サーモアナエロバクター・サーモスルフリゲネス由来のＣＧＴａｓｅとしては、組換え型酵素として販売されている市販のＣＧＴａｓｅ（商品名『トルザイム（Ｔｏｒｕｚｙｍｅ）  ３．０Ｌ』、ノボザイムズ・ジャパン株式会社販売）を用いた。
【０１６０】
＜実験７−１：各種微生物由来ＣＧＴａｓｅの調製＞
＜実験７−１−１：パエニバチルス・イリノイセンシス  ＮＢＲＣ１５３７９株由来ＣＧＴａｓｅの調製＞
パエニバチルス・イリノイセンシス  ＮＢＲＣ１５３７９株を、デキストリン２％、塩化アンモニウム０．５％、リン酸水素カリウム０．０５％、硫酸マグネシウム０．０２５％及び炭酸カルシウム０．５％を含む液体培地で２７℃、３日間培養し、培養液を遠心分離して得たそれぞれの遠心上清を常法に従い硫安塩析、透析することによりＣＧＴａｓｅの粗酵素液を得た。得られたＣＧＴａｓｅ粗酵素液を、それぞれＤＥＡＥ−トヨパール  ６５０Ｓゲル（東ソー株式会社製）を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー及びブチル−トヨパール  ６５０Ｍゲル（東ソー株式会社製）を用いた疎水カラムクロマトグラフィーに供して精製し、部分精製ＣＧＴａｓｅを調製した。
【０１６１】
＜実験７−１−２：ジオバチルス・ステアロサーモフィラス  Ｔｃ−９１株ＣＧＴａｓｅ変異体の調製＞
ジオバチルス・ステアロサーモフィラス  Ｔｃ−９１株起源のＣＧＴａｓｅは、前記したごとくその遺伝子がクローニングされ、遺伝子の塩基配列（配列表における配列番号２で示される塩基配列）から成熟型ＣＧＴａｓｅのアミノ酸配列（配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列）が決定されている。当該ＣＧＴａｓｅの遺伝子ＤＮＡに下記の手順で変異を導入し、野生型ＣＧＴａｓｅよりもアスコルビン酸２−グルコシドの生成能に優れるＣＧＴａｓｅ変異体を取得した。
【０１６２】
すなわち、本発明者らが保有しているジオバチルス・ステアロサーモフィラス  Ｔｃ−９１株（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２７３）由来のＣＧＴａｓｅ遺伝子を用い、そのコードするアミノ酸配列を変えることなく変異させて制限酵素切断部位などを導入又は欠失させ、それをプラスミドベクターに組換え、野生型ＣＧＴａｓｅをコードする遺伝子を含む組換えＤＮＡを作製した。当該組換えＤＮＡ「ｐＲＳＥＴ−ｉＢＴＣ１２」の構造を図５に示した。次いで、得られた組換えＤＮＡにおける野生型ＣＧＴａｓｅの活性残基を含む領域をコードする遺伝子断片（Ｎｄｅ  Ｉ−ＥｃｏＴ２２Ｉ断片）を切り出し、ＰＣＲ変異キット（商品名『ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＰＣＲ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ』、ストラタジーン社販売）を用いて試験管内でランダムに変異を加え、元の組換えＤＮＡに戻すことにより様々なアミノ酸置換が生じたＣＧＴａｓｅ変異体をコードする遺伝子混合物を作製した。その変異遺伝子を発現プラスミドベクターに組込み、組換えＤＮＡを作製した。当該組換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、ＣＧＴａｓｅ変異体遺伝子ライブラリーを作製した。
【０１６３】
次に、得られた遺伝子ライブラリーから１３，０００株を超える形質転換体を単離し、培養して得られた菌体からＣＧＴａｓｅ変異体を含む溶菌液を粗酵素液として調製した。得られた粗酵素液をＬ−アスコルビン酸と澱粉部分分解物とを含む水溶液に作用させ、生成するα−グリコシルＬ−アスコルビン酸をグルコアミラーゼ処理してアスコルビン酸２−グルコシドを生成させ、その生成量を野生型ＣＧＴａｓｅと比較することによって、アスコルビン酸２−グルコシド高生産型ＣＧＴａｓｅ変異体を産生する形質転換体をスクリーニングした。そのスクリーニングの過程で目的とする変異ＣＧＴａｓｅ遺伝子を保持する形質転換体２株、すなわち、＃１２９株及び＃２６８株を得た。当該形質転換体がそれぞれ保持する変異ＣＧＴａｓｅ遺伝子の塩基配列を解読したところ、形質転換体＃１２９株が産生するＣＧＴａｓｅ変異体は、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列において２箇所のアミノ酸残基が置換しており、第１７６番目のグリシン残基（Ｇ）がアルギニン残基（Ｒ）に、及び、第４５２番目のチロシン残基（Ｙ）がヒスチジン残基（Ｈ）に置換したアミノ酸配列、すなわち配列表における配列番号４で示されるアミノ酸配列を有することが判明した。また、形質転換体＃２６８株が産生するＣＧＴａｓｅ変異体は、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列において１箇所のアミノ酸残基が置換しており、第２２８番目のリジン残基（Ｋ）がイソロイシン残基（Ｉ）に置換したアミノ酸配列、すなわち、配列表における配列番号５で示されるアミノ酸配列を有していることが判明した。これらＣＧＴａｓｅ変異体を、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸残基は置換した箇所とアミノ酸置換に基づき、それぞれＧ１７６Ｒ／Ｙ４５２Ｈ、及び、Ｋ２２８Ｉと名付けた。
【０１６４】
上記ＣＧＴａｓｅ変異体をコードする遺伝子ＤＮＡを保持する形質転換体２株を、それぞれ、アンピシリンＮａ塩１００μｌ／ｍｌを含むＴ培地（培地１Ｌ当り、バクト−トリプトン１２ｇ、バクト−イーストエキストラクト２４ｇ、グリセロール５ｍｌ、１７ｍＭ  リン酸一カリウム、７２ｍＭ  リン酸二カリウムを含有）を用いて３７℃で２４時間好気的に培養した。培養液を遠心分離して得た菌体を超音波破砕器（商品名『Ｕｌｔｒａ  Ｓｏｎｉｃ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ  ＵＨ−６００』、エムエステー株式会社製）を用いて破砕処理し、破砕液上清を６０℃で３０分間熱処理し、宿主由来の非耐熱性蛋白質を変性、失活させた。熱処理液をさらに遠心分離しＣＧＴａｓｅ変異体の部分精製標品をそれぞれ調製した。
【０１６５】
なお、上述した各ＣＧＴａｓｅの酵素活性は、前記した方法に従い測定し、式［４］を用いて算出した。
【０１６６】
＜実験７−２：アスコルビン酸２−グルコシド生成反応＞
デキストリン（商品名『パインデックス  ＃１』、松谷化学工業株式会社販売）５質量部を水２０質量部に加えて加熱溶解し、Ｌ−アスコルビン酸３質量部を加え、ｐＨを５．５に調整し基質溶液とした。これに、上述した市販のＣＧＴａｓｅ、及び、実験７−１で調製したＣＧＴａｓｅのいずれかをデキストリン固形分１ｇ当り１００単位加え、５５℃で４０時間反応させ、反応液を加熱することにより酵素を失活させることにより、アスコルビン酸２−グルコシドとともに、２−Ｏ−α−マルトシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−マルトトリオシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−マルトテトラオシル−Ｌ−アスコルビン酸などのα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成させた。次いで、得られた反応液を加熱し酵素を失活させた後、ｐＨ４．５に調整し、これにグルコアミラーゼ剤（天野エンザイム株式会社販売、商品名『グルクザイムＡＦ６』、６，０００単位／ｇ）をデキストリン固形分１ｇ当り５０単位加え５５℃で２４時間処理し、α−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸をアスコルビン酸２−グルコシドにまで、また、混在する糖質をＤ−グルコースにまで分解した後、反応液を加熱することによりグルコアミラーゼを失活させ酵素反応液１乃至６を得た。
【０１６７】
＜実験７−３：アスコルビン酸２−グルコシド生成率の測定＞
実験７−２で得た酵素反応液１乃至６におけるアスコルビン酸２−グルコシド生成率を以下のようにして求めた。すなわち、酵素反応液１乃至６をそれぞれ精製水により２％溶液とし、０．４５μｍメンブランフィルターにより濾過した後、実験１−２記載のＨＰＬＣ分析に供し、示差屈折計によるクロマトグラムに出現したピークの面積から反応液のアスコルビン酸２−グルコシド含量を計算し、無水物換算した。結果を表７に示す。なお、表７に示す各酵素反応液中のアスコルビン酸２−グルコシド生成率は、各ＣＧＴａｓｅについて同一の条件でアスコルビン酸２−グルコシド生成反応及びグルコアミラーゼ処理を５回繰り返した場合にも、若干のばらつきの範囲内で再現性よく得られる値である。
【０１６８】
【表７】
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【０１６９】
表７に示すとおり、バチルス・マセランス由来のＣＧＴａｓｅを用いた場合（反応液１）には、グルコアミラーゼ処理後のアスコルビン酸２−グルコシド生成率は１６％にとどまり、パエニバチルス・イリノイセンシス由来のＣＧＴａｓｅを用いた場合（反応液２）も、アスコルビン酸２−グルコシド生成率は１８％と低かった。一方、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス  Ｔｃ−９１株由来のＣＧＴａｓｅを用いた場合（反応液３）にはアスコルビン酸２−グルコシド生成率は２８％に達し、サーモアナエロバクター・サーモスルフリゲネス由来のＣＧＴａｓｅを用いた場合（反応液４）には、アスコルビン酸２−グルコシド生成率は３０％に達した。さらに、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス  Ｔｃ−９１株ＣＧＴａｓｅ変異体であるＧ１７６Ｒ／Ｙ４５２Ｈ及びＫ２２８Ｉをそれぞれ用いた場合（反応液５及び６）にはアスコルビン酸２−グルコシド生成率はそれぞれ３２％及び３１％に達した。
【０１７０】
この結果は、バチルス・マゼランス由来、及び、パエニバチルス・イリノイセンシス由来のＣＧＴａｓｅでは、収率よくアスコルビン酸２−グルコシドを製造することができず、これら微生物由来のＣＧＴａｓｅがアスコルビン酸２−グルコシドの製造に適さないことを明瞭に示すものである。
【０１７１】
＜実験８：アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末のアスコルビン酸２−グルコシド純度及び諸物性に及ぼす晶析方法の影響＞
アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を析出させる晶析方法として、従来から用いられている自然冷却法と、擬似制御冷却法とを用い、実験７で得たアスコルビン酸２−グルコシド生成率が異なる酵素反応液３乃至６から、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を調製し、粉末のアスコルビン酸２−グルコシド純度及び諸物性に及ぼす晶析方法の影響を調べた。なお、酵素反応液の段階でアスコルビン酸２−グルコシド生成率が顕著に低い酵素反応液１及び２、すなわちバチルス・マセランス由来ＣＧＴａｓｅ及びパエニバチルス・イリノイセンシス由来ＣＧＴａｓｅを作用させて得た酵素反応液については、効率よいアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造が見込めないと判断し、粉末の調製は行わなかった。
【０１７２】
＜実験８−１：被験試料の調製＞
＜被験試料２３乃至２６＞
実験７で得たアスコルビン酸２−グルコシド生成率が異なる酵素反応液３乃至６のそれぞれを、活性炭で脱色濾過し、濾液をカチオン交換樹脂（Ｈ＋型）にて脱塩し、次いで、アニオン交換樹脂（ＯＨ−型）にＬ−アスコルビン酸及びアスコルビン酸２−グルコシドを吸着させ、水洗してＤ−グルコースを含む糖質を除いた後、０．５Ｎ塩酸水溶液で溶出した。さらに、この溶出液を固形分約５０％にまで濃縮し、強酸性カチオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオン  ＵＢＫ  ５５０』Ｎａ＋型、三菱化学株式会社製）を充填したカラムクロマトグラフィーに供した。アスコルビン酸２−グルコシド含量が８６％以上となるようにアスコルビン酸２−グルコシド高含有画分を採取した。採取した画分を合わせて固形物濃度約７５％まで濃縮し、酵素反応液３乃至６のそれぞれに対応する、アスコルビン酸２−グルコシド含有溶液３乃至６（アスコルビン酸２−グルコシドを無水物換算で８６．３乃至８７．１％含有）を得た。
【０１７３】
上記アスコルビン酸２−グルコシド含有溶液３乃至６をそれぞれ助晶缶にとり、各糖液の容量に対して約２％（ｗ／ｖ）のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を種晶として加えて攪拌しつつ４０℃から１５℃まで約４８時間かけて自然冷却することにより助晶し、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を晶析させたマスキットを調製した。前記マスキットから、常法により、バスケット型遠心分離機によりアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を採取し、採取したアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶をマスキット重量に対し８％の脱イオン水を用いて洗浄し、４０℃で３時間、熟成、乾燥させた後、２５℃の清浄な空気を３０分間吹き付けて強制冷却し、粉砕することにより、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末とした。アスコルビン酸２−グルコシド含有溶液３乃至６のそれぞれから自然冷却法にて得られたアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末をそれぞれ被験試料２３乃至２６とした。
【０１７４】
＜被験試料２３ｃ乃至２６ｃ＞
上記で調製した無水物換算でのアスコルビン酸２−グルコシド含量が異なるアスコルビン酸２−グルコシド含有溶液３乃至６のそれぞれを、減圧下で固形物濃度約７５％にまで濃縮し、助晶缶にとり、溶液の容量に対して約２％（ｗ／ｖ）のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を種晶として加えて攪拌しつつ、４０℃から１５℃まで約４８時間かけて擬似制御冷却法により助晶した以外は、上記と同様にして、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を晶析させたマスキットを調製した。なお、擬似制御冷却法は、全４８時間の晶析時間を２４時間、１２時間、１２時間の３つの区間に分け、最初の区間では２４時間かけて液温を４０℃から３５℃まで冷却し、次の区間では１２時間かけて３５℃から２７．５℃まで冷却し、さらに、最後の区間では１２時間かけて液温を２７．５℃から１５℃まで冷却することによって行った。得られたマスキットから、常法により、バスケット型遠心分離機によりアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を採取し、採取したアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶をマスキット重量に対し８％の脱イオン水を用いて洗浄し、４０℃で３時間、熟成、乾燥させた後、２５℃の清浄な空気を３０分間吹き付けて強制冷却し、粉砕することにより、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末とした。アスコルビン酸２−グルコシド含有溶液３乃至６のそれぞれから擬似制御冷却法によって得られたアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末をそれぞれ被験試料２３ｃ乃至２６ｃとした。
【０１７５】
＜実験８−２：被験試料２３乃至２６、及び、被験試料２３ｃ乃至２６ｃのアスコルビン酸２−グルコシド純度及び諸物性＞
上記で得た被験試料２３乃至２６及び被験試料２３ｃ乃至２６ｃについて、実験６と同様にアスコルビン酸２−グルコシド純度、結晶化度、平均結晶子径、固結性、及び、親水性溶媒である１，３−ブチレングリコールへの溶解性を調べた。結果を表８に示した。なお、比較のため、医薬部外品級の粉末である被験試料１６の結果についても表６から転記し併せて表８に示した。
【０１７６】
【表８】
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【０１７７】
表８に示すとおり、被験試料２３乃至２６、被験試料２３ｃ乃至２６ｃのアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末における無水物換算でのアスコルビン酸２−グルコシド含量、すなわちアスコルビン酸２−グルコシド純度は、いずれも９８％を超え、これら被験試料は、従来の医薬部外品級のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末である被験試料１６と同等の高純度のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末であった。
【０１７８】
一方、結晶化度に関しては、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶の晶析工程において従来の自然冷却法を適用して調製した被験試料２３乃至２６では、従来の医薬部外品級の粉末である被験試料１６と同等の９０％未満に止まったのに対し、晶析工程において擬似制御冷却法を適用して調製した被験試料２３ｃ乃至２６ｃはいずれも９０％以上の値を示し、擬似制御冷却法が、得られるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の結晶化度を高める効果があることがあらためて確認された。また、結晶化度と同様に、粉末の平均結晶子径においても被験試料２３乃至２６では１，２２０乃至１，２８０Åの範囲に止まっていたのに対し、被験試料２３ｃ乃至２６ｃでは１，４８０乃至１，５４０Åと高い値が得られた。
【０１７９】
また、粉末の固結性についても結晶化度が９０％未満、平均結晶子径が１，４００Å未満の被験試料２３乃至２６が、「固結する」（＋）と判定されたのに対し、結晶化度が９０％以上、平均結晶子径が１，４００Å以上の被験試料２３ｃ乃至２６ｃは「固結しない」（−）と判定された。なお、１，３−ブチレングリコールへの溶解性についてはいずれの被験試料も「溶解性良」（−）と判定された。
【０１８０】
上記実験７及び８の結果は、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造において、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のＣＧＴａｓｅ及びその変異体酵素、又は、サーモアナエロバクター・サーモスルフリゲネス由来のＣＧＴａｓｅを用いてアスコルビン酸２−グルコシド生成率２７％以上の酵素反応液を得、アスコルビン酸２−グルコシド含量８６％以上にまで精製し、晶析工程において擬似制御冷却法又は制御冷却法を適用すれば、結晶化度９０％以上の固結し難い粉末が製造できることを示している。
【０１８１】
＜実験９：澱粉枝切り酵素の併用が各種微生物由来ＣＧＴａｓｅによるアスコルビン酸２−グルコシドの生成率に及ぼす影響＞
液化澱粉とＬ−アスコルビン酸を含有する溶液にＣＧＴａｓｅを作用させ、次いで、グルコアミラーゼを作用させる酵素反応によってアスコルビン酸２−グルコシドを生成させる酵素反応系において、澱粉枝切り酵素の併用が、各種微生物由来ＣＧＴａｓｅを用いた酵素反応で得られる反応液中のアスコルビン酸２−グルコシド生成率にどのような影響を及ぼすかを調べるべく、以下の実験を行った。
【０１８２】
＜実験９−１：アスコルビン酸２−グルコシド生成反応＞
実験７で用いた各種ＣＧＴａｓｅとともに、澱粉枝切り酵素としてデキストリン固形分１ｇ当たり１，０００単位のイソアミラーゼ酵素剤（シュードモナス・アミロデラモサ由来、株式会社林原製）を作用させた以外は実験７と同様にアスコルビン酸２−グルコシド生成反応を行い、グルコアミラーゼ処理して後述する表９に示す酵素反応液７乃至１２をそれぞれ得た後、実験１−２の方法で酵素反応液７乃至１２におけるアスコルビン酸２−グルコシド生成率を測定した。結果を表９に示した。
【０１８３】
【表９】
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【０１８４】
表９に見られるとおり、澱粉枝切り酵素を併用した場合、バチルス・マセランス由来のＣＧＴａｓｅの場合（反応液７）及び、パエニバチルス・イリノイセンシス由来のＣＧＴａｓｅの場合（反応液８）には、グルコアミラーゼ処理後のアスコルビン酸２−グルコシド生成率はそれぞれ２１％又は２５％であった。一方、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のＣＧＴａｓｅ（反応液９）ではアスコルビン酸２−グルコシド生成率は３７％、サーモアナエロバクター・サーモスルフリゲネス由来のＣＧＴａｓｅ（反応液１０）では、アスコルビン酸２−グルコシド生成率は３３％であった。さらに、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス  Ｔｃ−９１株由来ＣＧＴａｓｅの変異体であるＧ１７６Ｒ／Ｙ４５２Ｈ及びＫ２２８Ｉを用いた場合（反応液１１及び１２）では、それぞれ３７％及び３６％であった。
【０１８５】
ＣＧＴａｓｅの由来によってばらつきはあるものの、ＣＧＴａｓｅによる酵素反応に澱粉枝切り酵素（イソアミラーゼ）を併用することにより、酵素反応液７乃至１２のいずれにおいても、グルコアミラーゼ処理後のアスコルビン酸２−グルコシド生成率は、ＣＧＴａｓｅを単独で用いた場合（表７の反応液１乃至６を参照）よりもそれぞれ３乃至９％有意に増加した。しかしながら、バチルス・マセランス由来のＣＧＴａｓｅの場合（反応液７）及び、パエニバチルス・イリノイセンシス由来のＣＧＴａｓｅの場合（反応液８）には、澱粉枝切り酵素を併用した場合であっても、グルコアミラーゼ処理後のアスコルビン酸２−グルコシド生成率はそれぞれ２１％又は２５％に止まり、それ以外のＣＧＴａｓｅを単独で用いた場合（表７の反応液３乃至６を参照）よりも顕著に低い生成率であった。
【０１８６】
上記結果は、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス  Ｔｃ−９１株由来のＣＧＴａｓｅ、サーモアナエロバクター・サーモスルフリゲネス由来のＣＧＴａｓｅ、及び、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス  Ｔｃ−９１株由来ＣＧＴａｓｅの変異体であるＧ１７６Ｒ／Ｙ４５２Ｈ及びＫ２２８Ｉでは、澱粉枝切り酵素を併用することにより、澱粉枝切り酵素を使用せずＣＧＴａｓｅ単独で作用させた場合に比べ約３乃至９％程度高い生成率が得られることから、より効率よくアスコルビン酸２−グルコシドを製造できることを示している。
【０１８７】
また、上記結果から、バチルス・マゼランス由来及びパエニバチルス・イリノイセンシス由来のＣＧＴａｓｅの場合、澱粉枝切り酵素を併用したとしても、生成率よくアスコルビン酸２−グルコシドを製造することができず、これらのＣＧＴａｓｅはアスコルビン酸２−グルコシドの製造に適さないことがあらためて確認された。
【０１８８】
＜実験１０：ＣＧＴａｓｅと澱粉枝切り酵素を併用して得た反応液からのアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造に及ぼす晶析方法の影響＞
本実験では、ＣＧＴａｓｅと澱粉枝切り酵素を併用して得た反応液からのアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造において、晶析方法が粉末のアスコルビン酸２−グルコシド純度及び諸物性に及ぼす影響を実験８と同様に検討した。なお、アスコルビン酸２−グルコシド生成率が低い酵素反応液７及び８については、実験８と同様の理由により粉末の調製は行わなかった。
【０１８９】
＜実験１０−１：被験試料の調製＞
＜被験試料２７乃至３０＞
実験９で得た酵素反応液９乃至１２をそれぞれ実験８と同様に精製し、アスコルビン酸２−グルコシド含量８６％以上のアスコルビン酸２−グルコシド含有溶液９乃至１２とした後、実験８−１と同様の自然冷却法を適用してアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を晶析し、それぞれ調製したアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を被験試料２７乃至３０とした。
【０１９０】
＜被験試料２７ｃ乃至３０ｃ＞
アスコルビン酸２−グルコシドの晶析工程において、実験８と同じ擬似制御冷却法を適用した以外は被験試料２７乃至３０の場合と同様にしてアスコルビン酸２−グルコシド含量８６％以上のアスコルビン酸２−グルコシド含有溶液９乃至１２からアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を調製し、それぞれ被験試料２７ｃ乃至３０ｃとした。
【０１９１】
＜実験１０−２：被験試料２７乃至３０及び被験試料２７ｃ乃至３０ｃのアスコルビン酸２−グルコシド純度及び諸物性＞
被験試料２７乃至３０、及び、被験試料２７ｃ乃至３０ｃのアスコルビン酸２−グルコシド純度、結晶化度、平均結晶子径、固結性及び親水性溶媒としての１，３−ブチレングリコールへの溶解性を実験８と同様にそれぞれ調べた。結果を表１０に示した。また、比較のため、医薬部外品級の粉末である被験試料１６の結果についても表６から転記し併せて表１０に示した。
【０１９２】
【表１０】
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【０１９３】
表１０から明らかなように、被験試料２８の場合を除けば、被験試料２７、２９、３０、及び、被験試料２７ｃ乃至３０ｃのいずれもアスコルビン酸２−グルコシド純度は９９．２％以上となり、また、結晶化度は９２．６％以上、平均結晶子径は１，４４０Å以上となり、試験した条件下では固結性を示さない粉末であった。酵素反応の段階でのアスコルビン酸２−グルコシド生成率が３３％に止まった酵素反応液から晶析工程において自然冷却法を適用して調製した被験試料２８は、アスコルビン酸２−グルコシド純度は９９．２％であったものの、結晶化度が８８．０％、平均結晶子径が１，２８０Åとなり、また、固結性試験において「固結する」（＋）と判定された。一方、被験試料２８ｃの結果から明らかなように、酵素反応の段階でのアスコルビン酸２−グルコシド生成率が３３％に止まった場合であっても、晶析工程において擬似制御冷却法を適用すれば、結晶化度は９０％以上、平均結晶子径は１，４００Å以上となり、固結性を示さない粉末を得ることができる。
【０１９４】
上記結果は、アスコルビン酸２−グルコシド生成反応において澱粉枝切り酵素を併用し、アスコルビン酸２−グルコシド生成率を３５％以上にまで高めた酵素反応液からは、晶析工程における冷却方法にかかわらず結晶化度が９０％以上の固結し難いアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を製造することができること、及び、アスコルビン酸２−グルコシド生成反応においてアスコルビン酸２−グルコシド生成率が３３％程度と３５％未満に止まった場合であっても、晶析工程において擬似制御冷却法又は制御冷却法を適用すれば、結晶化度が９０％以上と高く、固結し難い優れた物性を有するアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末が製造できることを示している。
【０１９５】
＜実験１１：アスコルビン酸２−グルコシドの製造に好適なＣＧＴａｓｅに共通する部分アミノ酸配列＞
アスコルビン酸２−グルコシドの製造に好適なＣＧＴａｓｅを特徴づける目的で、アスコルビン酸２−グルコシドの製造に好適な前記ジオバチルス・ステアロサーモフィラス  Ｔｃ−９１株由来ＣＧＴａｓｅとその変異体酵素のアミノ酸配列（配列表における配列番号１、４及び５）と、サーモアナエロバクター・サーモスルフリゲネス由来ＣＧＴａｓｅのアミノ酸配列（配列表における配列番号３）、及び、アスコルビン酸２−グルコシドの製造に適さない前記バチルス・マゼランス由来ＣＧＴａｓｅのアミノ酸配列（配列表における配列番号６）とパエニバチルス・イリノイセンシス由来ＣＧＴａｓｅのアミノ酸配列（配列表における配列番号７）を比較した。なお、アミノ酸配列の比較においては、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス  Ｔｃ−９１株由来ＣＧＴａｓｅとバチルス・マゼランス由来ＣＧＴａｓｅのアミノ酸配列としては、出願人が独自に決定し、本願と同じ出願人による特開昭６１−１３５５８１号公報にそれぞれ開示されたものを用いた。また、サーモアナエロバクター・サーモスルフリゲネス由来ＣＧＴａｓｅのアミノ酸配列としては、遺伝子データベース『ＧｅｎＢａｎｋ』にアクセッションＮｏ．３５４８４として登録されているものを用いた。さらに、パエニバチルス・イリノイセンシス由来ＣＧＴａｓｅのアミノ酸配列としては、パエニバチルス・イリノイセンシス  ＮＢＲＣ１５３７９株のＣＧＴａｓｅ遺伝子を出願人が独自にクローニングし決定した塩基配列にコードされるアミノ酸配列を用いた。
【０１９６】
上記したアミノ酸配列の比較において、アスコルビン酸２−グルコシドの製造に好適なＣＧＴａｓｅ、すなわち、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス  Ｔｃ−９１株由来ＣＧＴａｓｅ及びその変異体酵素、及び、サーモアナエロバクター・サーモスルフリゲネス由来ＣＧＴａｓｅに共通して存在し、且つ、アスコルビン酸２−グルコシドの製造に適さないＣＧＴａｓｅ、すなわち、バチルス・マゼランス由来ＣＧＴａｓｅとパエニバチルス・イリノイセンシス由来ＣＧＴａｓｅに存在しない部分アミノ酸配列として、下記（ａ）乃至（ｄ）の部分アミノ酸配列が認められた。
（ａ）Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｘ１−Ａｓｎ−Ａｓｎ；
（ｂ）Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｘ２−Ｔｈｒ−Ａｌａ；
（ｃ）Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ；及び
（ｄ）Ｖａｌ−Ｘ３−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ
（但し、Ｘ１はＰｒｏ又はＡｌａを、Ｘ２はＳｅｒ又はＡｓｐを、Ｘ３はＳｅｒ又はＧｌｙをそれぞれ意味する。）
【０１９７】
以上の結果から、本発明の製造方法によるアスコルビン酸２−グルコシドの製造に好適なＣＧＴａｓｅ、すなわち、アスコルビン酸２−グルコシドの生成率が２７％以上となるＣＧＴａｓｅは、上記（ａ）乃至（ｄ）の部分アミノ酸配列を有すると特徴づけることができることが判明した。
【０１９８】
以下、実施例、比較例及び参考例に基づき本発明をさらに詳しく説明する。しかしながら、本発明はこれらによってなんら限定されるものではない。
【実施例１】
【０１９９】
＜アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造＞
液化馬鈴薯澱粉４質量部を水２０質量部に加えて加熱溶解し、Ｌ−アスコルビン酸３質量部を加え、ｐＨを５．５に調整し基質溶液とした。これに、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス  Ｔｃ−９１株（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２７３）由来のＣＧＴａｓｅの粗酵素液（株式会社林原生物化学研究所製造）を液化馬鈴薯澱粉の固形分１ｇ当り１００単位を加え、５５℃で４０時間反応させ、アスコルビン酸２−グルコシドとともに、２−Ｏ−α−マルトシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−マルトトリオシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−マルトテトラオシル−Ｌ−アスコルビン酸などのα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成させた。【０２００】
本反応液を加熱し酵素を失活させた後、ｐＨ４．５に調整し、これにグルコアミラーゼ剤（天野エンザイム株式会社販売、商品名『グルクザイムＡＦ６』、６，０００単位／ｇ）を液化馬鈴薯澱粉の固形分１ｇ当り５０単位加え５５℃で２４時間処理し、α−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸をアスコルビン酸２−グルコシドにまで、また、混在する糖質をＤ−グルコースにまで分解した。本反応液中のＬ−アスコルビン酸２−グルコシドの生成率は約２８％であった。【０２０１】
本反応液を加熱し酵素を失活させ、活性炭で脱色濾過し、濾液をカチオン交換樹脂（Ｈ＋型）にて脱塩し、次いで、アニオン交換樹脂（ＯＨ−型）にＬ−アスコルビン酸及びアスコルビン酸２−グルコシドを吸着させ、水洗してＤ−グルコースを除いた後、０．５Ｎ塩酸水溶液で溶出した。さらに、この溶出液を固形分約５０％にまで濃縮し、強酸性カチオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオン  ＵＢＫ  ５５０』Ｎａ＋型、三菱化学株式会社製）を充填した１０本のカラムを用いた擬似移動床式のカラムクロマトグラフィーに供した。カラムにその湿潤樹脂容積の約４０分の１量チャージし、チャージ量の約５倍の溶離液を連続的にカラムに供給し、Ｌ−アスコルビン酸含量の少ない、アスコルビン酸２−グルコシド高含有画分を連続的に採取した。採取した画分におけるアスコルビン酸２−グルコシド含量は無水物換算で８７．２％であった。【０２０２】
この画分を減圧濃縮し、濃度を約７６％とした。これを助晶缶にとり、分析用の標準試薬として販売されているＬ−アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末（株式会社林原生物化学研究所販売、商品名『アスコルビン酸２−グルコシド  ９９９』（コード番号：ＡＧ１２４、アスコルビン酸２−グルコシド純度９９．９％以上））を種晶として２％加えて４０℃とし、穏やかに撹拌しつつ４０℃から３０℃へ１．５日間かけて冷却した後、３０℃から１５℃へ０．５日間かけて冷却する擬似制御冷却法により、アスコルビン酸２−グルコシドの無水結晶を析出させた。【０２０３】
析出した結晶をバスケット型遠心分離機で回収し、少量の冷精製水でスプレーし洗浄した後、３８℃で３時間、熟成、乾燥した後、２５℃の空気を４５分間吹き付け冷却し、粉砕してアスコルビン酸２−グルコシド純度９９．３％、Ｌ−アスコルビン酸とＤ−グルコースの合計含量０．１％、Ｌ−アスコルビン酸含量０．１％未満、粉末全体の還元力０．２７％、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての結晶化度９０．３％、その平均結晶子径が１，４６０Åであるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を得た。因みに、上記結晶化度の測定はハーマンス法にて行い、実験１−２で求めた解析値Ｈ１００及びＨ０を用いて行った。本粉末の粒度分布を測定したところ、粒径１５０μｍ未満の粒子が９１．０％、粒径が５３μｍ以上１５０μｍ未満の粒子が５０．７％含まれていた。【０２０４】
本粉末は、医薬部外品向け美白成分などとして市販されている従来の医薬部外品級の粉末と比べ、固結し難く、化粧品及び医薬部外品に汎用される親水性溶媒への溶解性に優れているので取扱い容易である。本粉末は、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末である点では従来の医薬部外品級の粉末と何ら変わりがないので、従来の医薬部外品級の粉末と同様に、それ単独で、或いは他の成分と混合して、粉末状の食品素材、食品添加物素材、化粧品素材、医薬部外品素材、医薬品素材などとして好適に用いることができる。
【実施例２】
【０２０５】
＜アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造＞
液化澱粉とＬ−アスコルビン酸とを含む溶液にＣＧＴａｓｅを作用させる際に、液化澱粉の固形分当たり５単位のプルラナーゼ（株式会社林原生物化学研究所販売、商品コード（ＥＮ２０１）、クレブシエラ・ニューモニア（アエロバクター・アエロジェネス）由来を作用させたこと、及び、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を晶析させる際、溶液の温度を４０℃から３５℃へ１．５日間かけて冷却した後、３５℃から１５℃へ０．５日間かけて冷却する擬似制御冷却法を適用した以外は、実施例１と同様にして、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を製造した。なお、グルコアミラーゼ処理後の反応液におけるアスコルビン酸２−グルコシドの生成率は約２９．５％であった。アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶の晶析に供した溶液のアスコルビン酸２−グルコシド含量は無水物換算で９１．８％であった。【０２０６】
本品は、アスコルビン酸２−グルコシド純度９９．５％、Ｌ−アスコルビン酸とＤ−グルコースの合計含量０．１％、Ｌ−アスコルビン酸含量０．１％未満、粉末全体の還元力０．２１％、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての結晶化度９１．０％、その平均結晶子径が１，５４０Åであるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末であった。因みに、上記結晶化度の測定はハーマンス法にて行い、実験１−２で求めた解析値Ｈ１００及びＨ０を用いて行った。本粉末の粒度分布を測定したところ、粒径１５０μｍ未満の粒子が９３．０％、粒径が５３μｍ以上１５０μｍ未満の粒子が５３．７％含まれていた。【０２０７】
本粉末は、医薬部外品向け美白成分などとして市販されている従来の医薬部外品級の粉末と比べ、固結し難く、化粧品及び医薬部外品に汎用される親水性溶媒への溶解性に優れているので取扱い容易である。本粉末は、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末である点では従来の医薬部外品級の粉末と何ら変わりがないので、従来の医薬部外品級の粉末と同様に、それ単独で、或いは他の成分と混合して、粉末状の食品素材、食品添加物素材、化粧品素材、医薬部外品素材、医薬品素材などとして好適に用いることができる。
【実施例３】
【０２０８】
＜アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造＞
コーンスターチ５質量部を水１５質量部に加え、市販の液化酵素を加え加熱溶解し、Ｌ−アスコルビン酸３質量部を加え、ｐＨを５．５に調整し基質溶液とした。これに、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属由来のＣＧＴａｓｅ遺伝子を組み換えてバチラス属の菌株で発現させた市販のＣＧＴａｓｅ（ノボザイム（ＮＯＶＯＺＹＭＥ）社販売、商品名『トルザイム（Ｔｏｒｕｚｙｍｅ）３．０Ｌ』）（例えば、特許文献３０及び３１参照）を、コーンスターチの固形分１ｇ当り１００単位加えて５５℃で５０時間反応させアスコルビン酸２−グルコシド、及びその他のα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成させた。【０２０９】
この反応液を加熱し酵素を失活させた後、ｐＨを４．５に調整し、これにグルコアミラーゼ剤（ナガセケムテックス株式会社販売、商品名『グルコチーム＃２００００』、２０，０００単位／ｇ）をコーンスターチの固形分１ｇ当り５０単位加え、５５℃で２４時間反応させ、２−Ｏ−α−マルトシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−マルトトリオシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−マルトテトラオシル−Ｌ−アスコルビン酸などのα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸をアスコルビン酸２−グルコシドにまで、また、混在する糖質をＤ−グルコースにまで分解した。本反応液におけるアスコルビン酸２−グルコシドの生成率は約３１％であった。【０２１０】
本反応液を加熱し酵素を失活させた後、活性炭で脱色濾過し、濾液をカチオン交換樹脂（Ｈ＋型）にて脱塩し、次いで、アニオン交換樹脂（ＯＨ−型）にＬ−アスコルビン酸及びアスコルビン酸２−グルコシドを吸着させ、水洗してＤ−グルコースを除いた後、０．５Ｎ塩酸溶液で溶出し、さらに多孔性樹脂（商品名『トヨパールＨＷ−４０』、東ソー株式会社製）を用いたカラムクロマトグラフィーに供して、アスコルビン酸２−グルコシドを高含有し、Ｌ−アスコルビン酸量の少ない画分を採取した。採取した画分におけるアスコルビン酸２−グルコシド含量は無水物換算で８８．６％であった。【０２１１】
この画分を減圧濃縮し、濃度約７６％とし、これを助晶缶にとり、実施例１で製造したアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を種晶として２％加えて４０℃とし、穏やかに撹拌しつつ４０℃から３３℃へ１．５日間かけて冷却した後、３３℃から１５℃へ０．５日間かけて冷却する擬似制御冷却法により、アスコルビン酸２−グルコシドの無水結晶を晶析させた。【０２１２】
バスケット型遠心分離機で結晶を回収し、結晶を少量の蒸留水でスプレーし洗浄した後、３５℃で８時間、熟成、乾燥した後、２５℃の空気を１５分間吹き付け冷却し、粉砕することによりアスコルビン酸２−グルコシド純度９９．２％、Ｌ−アスコルビン酸とＤ−グルコースの合計含量０．１％、Ｌ−アスコルビン酸含量０．１％未満、粉末全体の還元力０．１７％、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての結晶化度９１．５％、その平均結晶子径１，６１０Åであるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を得た。因みに、上記結晶化度の測定はハーマンス法にて行い、実験１−２で求めた解析値Ｈ１００及びＨ０を用いて行った。本粉末の粒度分布を測定したところ、粒径が１５０μｍ未満の粒子が８３．２％、粒径が５３μｍ以上１５０μｍ未満の粒子が５７．１％含まれていた。【０２１３】
本粉末は、医薬部外品向け美白成分などとして市販されている従来の医薬部外品級の粉末と比べ、固結し難く、化粧品及び医薬部外品に汎用される親水性溶媒への溶解性に優れているので取扱い容易である。本粉末は、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末である点では従来の医薬部外品級の粉末と何ら変わりがないので、従来の医薬部外品級の粉末と同様に、それ単独で、或いは他の成分と混合して、粉末状の食品素材、食品添加物素材、化粧品素材、医薬部外品素材、医薬品素材などとして好適に用いることができる。
【実施例４】
【０２１４】
＜アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造＞
コーンスターチ６質量部を水１５質量部に加え、市販の液化酵素を加え加熱溶解し、Ｌ−アスコルビン酸３質量部を加えた溶液に市販のＣＧＴａｓｅ（ノボザイム（ＮＯＶＯＺＹＭＥ）社販売、商品名『トルザイム（Ｔｏｒｕｚｙｍｅ）３．０Ｌ』）を作用させたこと、その際に、コーンスターチの固形分当たり５００単位のイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製造、シュードモナス・アミロデラモサ（ＡＴＣＣ  ２１２６２）由来を作用させたこと、及び、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を晶析させる際、溶液の温度を４０℃から３５℃へ２４時間かけて冷却した後、３５℃から３０℃へ１２時間かけ、さらに、３０℃から１５℃へ１２時間かけて冷却する擬似制御冷却法を適用した以外は、実施例１と同じ方法を用い、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を製造した。なお、グルコアミラーゼ処理後の反応液におけるアスコルビン酸２−グルコシドの生成率は約３２．５％であった。アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶の晶析に供した溶液のアスコルビン酸２−グルコシド含量は無水物換算で８９．６％であった。【０２１５】
本品は、アスコルビン酸２−グルコシド純度９９．７％、Ｌ−アスコルビン酸とＤ−グルコースの合計含量０．１％、Ｌ−アスコルビン酸含量０．１％未満、粉末全体の還元力０．１０％、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての結晶化度９２．４％、その平均結晶子径１，６７０Åであるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を得た。因みに、上記結晶化度の測定はハーマンス法にて行い、実験１−２で求めた解析値Ｈ１００及びＨ０を用いて行った。本粉末の粒度分布を測定したところ、粒径１５０μｍ未満の粒子が９４．５％、粒径が５３μｍ以上１５０μｍ未満の粒子が５５．３％含まれていた。【０２１６】
本粉末は、医薬部外品向け美白成分などとして市販されている従来の医薬部外品級の粉末と比べ、固結し難く、化粧品及び医薬部外品に汎用される親水性溶媒への溶解性に優れているので取扱い容易である。本粉末は、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末である点では従来の医薬部外品級の粉末と何ら変わりがないので、従来の医薬部外品級の粉末と同様に、それ単独で、或いは他の成分と混合して、粉末状の食品素材、食品添加物素材、化粧品素材、医薬部外品素材、医薬品素材などとして好適に用いることができる。
【実施例５】
【０２１７】
＜アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造＞
コーンスターチ５質量部を水１５質量部に加え、市販の液化酵素を加え加熱溶解し、Ｌ−アスコルビン酸３質量部を加え、ｐＨを５．５に調整し基質溶液とした。これに、実験７及び９で用いたジオバチルス・ステアロサーモフィルス  Ｔｃ−９１株由来ＣＧＴａｓｅの変異体Ｇ１７６Ｒ／Ｙ４５２Ｈをコーンスターチの固形分１ｇ当り１００単位加えて５５℃で５０時間反応させアスコルビン酸２−グルコシド及びその他のα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成させた。【０２１８】
この反応液を加熱し酵素を失活させた後、ｐＨを４．５に調整し、これにグルコアミラーゼ剤（ナガセケムテックス株式会社販売、商品名『グルコチーム＃２００００』、２０，０００単位／ｇ）をコーンスターチの固形分１ｇ当り５０単位加え、５５℃で２４時間反応させ、２−Ｏ−α−マルトシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−マルトトリオシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−マルトテトラオシル−Ｌ−アスコルビン酸などのα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸をアスコルビン酸２−グルコシドにまで、また、混在する糖質をＤ−グルコースにまで分解した。本反応液におけるアスコルビン酸２−グルコシドの生成率は３１．５％であった。【０２１９】
本反応液を加熱し酵素を失活させた後、活性炭で脱色濾過し、濾液をカチオン交換樹脂（Ｈ＋型）にて脱塩し、次いで、アニオン交換樹脂（ＯＨ−型）にＬ−アスコルビン酸及びアスコルビン酸２−グルコシドを吸着させ、水洗してＤ−グルコースを除いた後、０．５Ｎ塩酸溶液で溶出し、さらに多孔性樹脂（商品名『トヨパールＨＷ−４０』、東ソー株式会社製）を用いたカラムクロマトグラフィーに供して、アスコルビン酸２−グルコシドを高含有し、Ｌ−アスコルビン酸量の少ない画分を採取した。採取した画分におけるアスコルビン酸２−グルコシド含量は無水物換算で８７．６％であった。【０２２０】
これを助晶缶にとり、標準試薬級のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末（商品名『アスコルビン酸２−グルコシド  ９９９』、コード番号：ＡＧ１２４、アスコルビン酸２−グルコシド純度９９．９％以上、株式会社林原生物化学研究所販売）を種晶として２％加えて４０℃とした後、穏やかに撹拌しつつ、溶液の温度を４０℃から３５℃へ２４時間かけて冷却した後、３５℃から３０℃へ１２時間かけ、さらに、３０℃から１５℃へ１２時間かけて冷却する擬似制御冷却法を適用し、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を晶析させた。バスケット型遠心分離機で結晶を回収し、結晶をマスキット重量に対し約５％の精製水でスプレーし洗浄した後、３５℃で８時間、熟成、乾燥し、２０℃の空気を１０分間吹き付けて冷却し、粉砕して、無水物換算でアスコルビン酸２−グルコシドを９９．２％、Ｌ−アスコルビン酸とＤ−グルコースを合計０．４％、Ｌ−アスコルビン酸を０．１％未満含有し、粉末全体の還元力０．５０％のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を得た。【０２２１】
本アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての結晶化度は９０．４％、平均結晶子径は１，４８０Åであった。因みに、上記結晶化度の測定はハーマンス法にて行い、実験１−２で求めた解析値Ｈ１００及びＨ０を用いて行った。本品の粒度分布を測定したところ、粒径１５０μｍ未満の粒子が８５．２％、粒径５３μｍ以上１５０μｍ未満の粒子が６９．３％含まれていた。本品を用い、実験１−４と同じ方法により固結性試験を行ったところ、「固結なし」（−）と判定された。また、実験６と同じ方法により１，３−ブチレングリコールへの溶解性を試験したところ、溶解性「良」と判定された。【０２２２】
本製造方法によって製造されたアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末は、市販されている従来の医薬部外品級のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末（商品名『ＡＡ２Ｇ』、株式会社林原商事販売）と比べて、アスコルビン酸２−グルコシド純度においてそれほどの違いがないにもかかわらず、有意に固結し難い粉末であり、保存や取扱いが容易である。本品は、アスコルビン酸２−グルコシドの無水結晶含有粉末である点では従来の医薬部外品級のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末と同様であり、保存や取り扱いが容易である分、食品素材、食品添加物素材、化粧品素材、医薬部外品素材、及び医薬品素材などとしてより好適に用いることができる。
【実施例６】
【０２２３】
＜アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造＞
液化馬鈴薯澱粉４質量部を水２０質量部に加えて加熱溶解し、Ｌ−アスコルビン酸３質量部を加え、ｐＨを５．５に調整し基質溶液とした。これに、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス  Ｔｃ−９１株由来のＣＧＴを澱粉の固形分１ｇ当り１００単位、フラボバクテリウム・オドラタス由来イソアミラーゼ（製品名『ＧＯＤＯ−ＦＩＡ』、合同酒精株式会社製）を澱粉の固形分１ｇ当たり５００単位加え、５５℃で４０時間反応させ、アスコルビン酸２−グルコシドとともに、２−Ｏ−α−マルトシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−マルトトリオシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−マルトテトラオシル−Ｌ−アスコルビン酸などのα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成させた。【０２２４】
本反応液を加熱し酵素を失活させた後、ｐＨ４．５に調整し、これにグルコアミラーゼ剤（天野エンザイム株式会社販売、商品名『グルクザイムＡＦ６』、６，０００単位／ｇ）を澱粉の固形分１ｇ当り５０単位加え５５℃で２４時間処理し、α−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸をアスコルビン酸２−グルコシドにまで、また、混在する糖質をＤ−グルコースにまで分解した。本反応液中のＬ−アスコルビン酸２−グルコシドの生成率は約３６％であった。【０２２５】
本反応液を加熱し酵素を失活させ、活性炭で脱色濾過し、濾液をカチオン交換樹脂（Ｈ＋型）にて脱塩し、次いで、アニオン交換樹脂（ＯＨ−型）にＬ−アスコルビン酸及びアスコルビン酸２−グルコシドを吸着させ、水洗してＤ−グルコースを除いた後、０．５Ｎ塩酸水溶液で溶出した。さらに、この溶出液を固形分約５０％にまで濃縮し、強酸性カチオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオン  ＵＢＫ  ５５０』Ｎａ＋型、三菱化学株式会社製）を充填した１０本のカラムを用いた擬似移動床式のカラムクロマトグラフィーに供した。溶出液を固形分濃度約５０％にまで濃縮し、カラムにその樹脂容積の約１／４０量チャージし、チャージ量の約１５倍の溶離液をカラムに供給することによりアスコルビン酸２−グルコシドを溶出し、Ｌ−アスコルビン酸含量の少ない、アスコルビン酸２−グルコシド高含有画分を採取した。採取した画分におけるアスコルビン酸２−グルコシド含量は無水物換算で約８６．６％であった。【０２２６】
この画分を減圧濃縮し、濃度を約７６％とした。これを助晶缶にとり、試薬級のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末（商品名『アスコルビン酸２−グルコシド  ９９９』、コード番号：ＡＧ１２４、アスコルビン酸２−グルコシド純度９９．９％以上、株式会社林原生物化学研究所販売）を種晶として２％加えて４０℃とし、穏やかに撹拌しつつ溶液の温度を４０℃から３５℃へ２０時間かけて冷却した後、３５℃から３０℃へ１６時間かけて冷却し、さらに、３０℃から１５℃へ１２時間かけて冷却する擬似制御冷却法を適用することにより４８時間かけて冷却し、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を晶析させた。バスケット型遠心分離機で結晶を回収し、結晶をマスキット重量に対し約５％の精製水でスプレーし洗浄した後、３８℃で３時間、熟成、乾燥し、２０℃の空気を４５分間吹き付けて冷却し、粉砕して、無水物換算でアスコルビン酸２−グルコシドを９９．５％、Ｌ−アスコルビン酸とＤ−グルコースを合計で０．１％、Ｌ−アスコルビン酸を０．１％未満含有し、粉末全体の還元力０．２１％のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を得た。【０２２７】
本製造方法によって製造されたアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての結晶化度は９３．９％、平均結晶子径は１，６３０Åであった。因みに、上記結晶化度の測定はハーマンス法にて行い、実験１−２で求めた解析値Ｈ１００及びＨ０を用いて行った。本品の粒度分布を測定したところ、粒径１５０μｍ未満の粒子が９１．２％、粒径５３μｍ以上１５０ｍ未満の粒子が５７．３％含まれていた。本品を用い、実験１−４と同じ方法により固結性試験を行ったところ、「固結なし」（−）と判定された。また、実験６と同じ方法により１，３−ブチレングリコールへの溶解性を試験したところ、溶解性「良」と判定された。【０２２８】
本品は、従来の医薬部外品級のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末に比べ有意に固結し難い粉末であり、食品素材、食品添加物素材、化粧品素材、医薬部外品素材、及び医薬品素材などとして有利に利用することができる。
【実施例７】
【０２２９】
＜アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造＞
アスコルビン酸２−グルコシド生成反応において、ＣＧＴａｓｅとしてサーモアナエロバクター由来の組換え型ＣＧＴａｓｅ（商品名『トルザイム（Ｔｏｒｕｚｙｍｅ）３．０Ｌ』、ノボザイム（ＮＯＶＯＺＹＭＥ）社販売）を、また、ＣＧＴａｓｅと併用する澱粉枝切り酵素として、バチルス・アシドプルリティカス由来のプルラナーゼ（商品名『プロモザイム』、ノボザイム・ジャパン社販売）を澱粉の固形分１ｇ当り５０単位使用し、また、晶析工程において、５段階で４０℃から１５℃まで計４８時間かけて冷却する擬似制御冷却法、すなわち、４０℃から３８℃へ１２時間、３８℃から３５℃へ１２時間、３５℃から３０℃へ８時間、３０℃から２３℃へ８時間、さらに、２３℃から１５℃へ８時間かけて冷却する擬似制御冷却法を適用した以外は実施例６と同様にして、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を製造し、無水物換算でアスコルビン酸２−グルコシドを９９．３％、Ｌ−アスコルビン酸とＤ−グルコースを合計で０．１％、Ｌ−アスコルビン酸を０．１％未満含有し、粉末全体の還元力が０．２８％のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を得た。なお、本製造において、グルコアミラーゼ処理後の反応液におけるアスコルビン酸２−グルコシドの生成率は３２．９％であった。アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶の晶析に供した溶液のアスコルビン酸２−グルコシド含量は無水物換算で８６．４％であった。【０２３０】
本アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての結晶化度は９６．４％、平均結晶子径は１，５７０Åであった。因みに、上記結晶化度の測定はハーマンス法にて行い、実験１−２で求めた解析値Ｈ１００及びＨ０を用いて行った。本品の粒度分布を測定したところ、粒径１５０μｍ未満の粒子が９２．２％、粒径５３μｍ以上１５０ｍ未満の粒子が５４．８％含まれていた。本品を用い、実験１−４と同じ方法により固結性試験を行ったところ、「固結なし」（−）と判定された。また、実験６と同じ方法により１，３−ブチレングリコールへの溶解性を試験したところ、溶解性「良」と判定された。【０２３１】
本製造方法によって製造されたアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末は、市販されている従来の医薬部外品級のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末（商品名『ＡＡ２Ｇ』、株式会社林原商事販売）と比べて、アスコルビン酸２−グルコシド純度においてそれほどの違いがないにもかかわらず、有意に固結し難い粉末であり、保存や取扱いが容易である。【０２３２】
本品は、アスコルビン酸２−グルコシドの無水結晶含有粉末である点では従来の医薬部外品級のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末と同様であり、保存や取り扱いが容易である分、食品素材、食品添加物素材、化粧品素材、医薬部外品素材、及び医薬品素材などとしてより好適に用いることができる。
【実施例８】
【０２３３】
＜アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造＞
アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶の晶析工程において、汎用の晶析システム用プログラム恒温循環装置を用い、温度制御した熱媒体を助晶缶のジャッケットに流して、温度を４０℃から１５℃へ、前記式［７］に近似させた２０段階の冷却プロファイルにて４８時間かけて冷却する制御冷却法を適用することにより、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶を晶析させた以外は、実施例３と同様の方法によりアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を製造した。得られた粉末は、無水物換算でアスコルビン酸２−グルコシドを９９．６％、Ｌ−アスコルビン酸とＤ−グルコースを合計で０．１％、Ｌ−アスコルビン酸を０．１％未満含有し、粉末全体の還元力が０．１７％のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末であった。なお、本製造において、グルコアミラーゼ処理後の反応液におけるアスコルビン酸２−グルコシドの生成率は約３１％であった。アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶の晶析に供した溶液のアスコルビン酸２−グルコシド含量は無水物換算で８８．７％であった。【０２３４】
本アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての結晶化度は９３．０％、平均結晶子径は１，６５０Åであった。因みに、上記結晶化度の測定はハーマンス法にて行い、実験１−２で求めた解析値Ｈ１００及びＨ０を用いて行った。本品の粒度分布を測定したところ、粒径１５０μｍ未満の粒子が９０．４％、粒径５３μｍ以上１５０ｍ未満の粒子が６５．３％含まれていた。本品を用い、実験１−４と同じ方法により固結性試験を行ったところ、「固結なし」（−）と判定された。また、実験６と同じ方法により１，３−ブチレングリコールへの溶解性を試験したところ、溶解性「良」と判定された。【０２３５】
本製造方法によって製造されたアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末は、市販されている従来の医薬部外品級のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末（商品名『ＡＡ２Ｇ』、株式会社林原商事販売）と比べて、アスコルビン酸２−グルコシド純度においてそれほどの違いがないにもかかわらず、有意に固結し難い粉末であり、保存や取扱いが容易である。【０２３６】
本品は、アスコルビン酸２−グルコシドの無水結晶含有粉末である点では従来の医薬部外品級のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末と同様であり、保存や取り扱いが容易である分、食品素材、食品添加物素材、化粧品素材、医薬部外品素材、及び医薬品素材などとしてより好適に用いることができる。【０２３７】
＜比較例１：アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造＞
アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶の晶析工程において擬似制御冷却法を適用せず、従来の自然冷却法を用いた以外は実施例１におけると同様にしてアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を製造し、無水物換算でアスコルビン酸２−グルコシドを９８．６％、Ｌ−アスコルビン酸とＤ−グルコースを合計で０．５％、Ｌ−アスコルビン酸を０．３％含有し、粉末全体の還元力０．７２％のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を得た。なお、本製造において、グルコアミラーゼ処理後の反応液におけるアスコルビン酸２−グルコシドの生成率は２８．４％、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶の晶析に供した溶液のアスコルビン酸２−グルコシド含量は無水物換算で８６．５％であった。【０２３８】
本アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての結晶化度は８７．５％、平均結晶子径は１，２９０Åであった。因みに、上記結晶化度の測定はハーマンス法にて行い、実験１−２で求めた解析値Ｈ１００及びＨ０を用いて行った。本品の粒度分布を測定したところ、粒径１５０μｍ未満の粒子が７４．８％、粒径５３μｍ以上１５０μｍ未満の粒子が６８．６％含まれていた。本品を用い、実験１−４と同じ方法で固結性試験を行ったところ、「固結あり」（＋）と判定された。また、実験６と同じ方法により１，３−ブチレングリコールへの溶解性を試験したところ、溶解性「良」と判断された。【０２３９】
＜比較例２：アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造＞
アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶の晶析工程において擬似制御冷却法を適用せず従来の自然冷却法を用いた以外は実施例３におけると同様にしてアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を製造し、無水物換算でアスコルビン酸２−グルコシドを９８．３％、Ｌ−アスコルビン酸とＤ−グルコースを合計で０．６％、Ｌ−アスコルビン酸を０．４％含有し、粉末全体の還元力０．８５％のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を得た。なお、本製造において、グルコアミラーゼ処理後の反応液におけるアスコルビン酸２−グルコシドの生成率は３０．５％、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶の晶析に供した溶液のアスコルビン酸２−グルコシド含量は無水物換算で８７．８％であった。【０２４０】
本アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての結晶化度は８６．６％、平均結晶子径は１，３１０Åであった。因みに、上記結晶化度の測定はハーマンス法にて行い、実験１−２で求めた解析値Ｈ１００及びＨ０を用いて行った。本品の粒度分布を測定したところ、粒径１５０μｍ未満の粒子が７６．５％、粒径５３μｍ以上１５０μｍ未満の粒子が６８．４％含まれていた。本品を用い、実験１−４と同じ方法で固結性試験を行ったところ、「固結あり」（＋）と判定された。また、実験６と同じ方法により１，３−ブチレングリコールへの溶解性を試験したところ、溶解性「良」と判断された。【０２４１】
＜参考例１：アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造＞
馬鈴薯澱粉５質量部を水１５質量部に加え、市販の液化酵素を加え加熱溶解し、Ｌ−アスコルビン酸３質量部を加え、ｐＨを５．５に調整し基質溶液とした。これに、ＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所製造、ジオバチルス・ステアロサーモフィルス  Ｔｃ−９１株（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２７３）由来）とイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製造）を、それぞれ馬鈴薯澱粉１ｇ当り１００単位及び１，０００単位加えて５５℃で５０時間反応させアスコルビン酸２−グルコシド及びその他のα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成させた。この反応液を加熱し酵素を失活させた後、ｐＨを４．５に調整し、これにグルコアミラーゼ剤（ナガセケムテックス株式会社販売、商品名『グルコチーム＃２００００』、２０，０００単位／ｇ）を馬鈴薯澱粉１ｇ当り５０単位加え、５５℃で２４時間反応させ、α−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸をアスコルビン酸２−グルコシドにまで、また、混在する糖質をＤ−グルコースにまで分解した。本反応液におけるアスコルビン酸２−グルコシドの生成率は約３８％であった。【０２４２】
本反応液を加熱し酵素を失活させた後、活性炭で脱色濾過し、濾液をカチオン交換樹脂（Ｈ＋型）にて脱塩し、次いで、アニオン交換樹脂（ＯＨ−型）にＬ−アスコルビン酸及びアスコルビン酸２−グルコシドを吸着させ、水洗してＤ−グルコースを除いた後、０．５Ｎ塩酸溶液で溶出し、さらに、多孔性樹脂（商品名『トヨパールＨＷ−４０』、東ソー株式会社製）を用いたカラムクロマトグラフィーに供して、アスコルビン酸２−グルコシドを高含有し、Ｌ−アスコルビン酸量の少ない画分を採取した。採取した画分におけるアスコルビン酸２−グルコシド含量は無水物換算で８７．６％であった。【０２４３】
この画分を減圧濃縮し、濃度約７６％とし、これを助晶缶にとり、実施例１で製造したアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を種晶として２％加えて４０℃とし、穏やかに撹拌しつつ自然冷却法にて２日間で１５℃まで冷却し、アスコルビン酸２−グルコシドの無水結晶を晶析させた。バスケット型遠心分離機で結晶を回収し、結晶を少量の蒸留水でスプレーし洗浄した後、３５℃で８時間、熟成、乾燥し、２０℃の空気を１０分間吹き付け冷却し、粉砕することによりアスコルビン酸２−グルコシド純度９８．５％、Ｌ−アスコルビン酸とＤ−グルコースの合計の含量０．１％未満、Ｌ−アスコルビン酸含量０．１％未満、粉末全体の還元力０．１５％、アスコルビン酸２−グルコシド無水結晶についての結晶化度９１．８％、その平均結晶子径が１，３２０Åであるアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を得た。因みに、上記結晶化度の測定はハーマンス法にて行い、実験１−２で求めた解析値Ｈ１００及びＨ０を用いて行った。本粉末の粒度分布を測定したところ、粒径１５０μｍ未満の粒子が８３．０％、粒径５３μｍ以上１５０μｍ未満の粒子が５７．７％含まれていた。本粉末を用い、実験１−４、実験３−２及び実験６と、それぞれ同じ方法により固結性試験、保存性試験及び溶解性試験を行ったところ、本粉末は固結性試験及び保存性試験において「固結なし」（−）と判定されたものの、溶解性試験において、「溶解性不良」（−）と判定された。
【産業上の利用可能性】
【０２４４】
以上のとおり、本発明のアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末の製造方法によれば、澱粉若しくはデキストリンのいずれかとＬ−アスコルビン酸とを原料として、酵素反応液中のアスコルビン酸２−グルコシドの生成率が３５％に満たない場合であっても、晶析工程において制御冷却法又は擬似制御冷却法を適用することによって、従来の医薬部外品級の粉末よりも有意に固結し難いアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を製造することができる。このように本発明の製造方法は、使用する酵素についてその選択の幅を広げるとともに、限られた資源である澱粉若しくはデキストリンとＬ−アスコルビン酸とを原料として、より効率的にアスコルビン酸２−グルコシド無水結晶含有粉末を工業的規模で製造することを可能にするものであり、その産業上の有用性には格別のものがある。
【符号の説明】
【０２４５】
図１において、
ａ：結晶子径の算出に用いる回折角（２θ）１０．４°（ミラー指数（ｈｋｌ）：１２０）の回折ピーク
ｂ：結晶子径の算出に用いる回折角（２θ）１３．２°（ミラー指数：１３０）の回折ピーク
ｃ：結晶子径の算出に用いる回折角（２θ）１８．３°（ミラー指数：２３０）の回折ピーク
ｄ：結晶子径の算出に用いる回折角（２θ）２１．９°（ミラー指数：０６０）の回折ピーク
ｅ：結晶子径の算出に用いる回折角（２θ）２２．６°（ミラー指数：１３１）の回折ピーク
図５において、
ｐＵＣ  ｏｒｉ：プラスミドｐＵＣの複製開始点
Ｔ７：Ｔ７プロモーター
白矢印（Ａｍｐ）：アンピシリン耐性遺伝子
黒矢印：ＣＧＴａｓｅ遺伝子
図６において、
ａ：制御冷却曲線
ｂ：直線冷却
ｃ：自然冷却曲線
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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