(57)【要約】  本発明の課題は、操作性が良好であり、かつ徐放性を有するような、薬物およびコラーゲンを含む医薬組成物を提供することである。かかる課題は、薬物、コラーゲン、ならびに、単糖類、二糖類、三糖類および四糖類から選択される１種以上の糖を含む、徐放性医薬組成物により解決される。本発明者らは糖を含むコラーゲンが生体内に投与されると、コラーゲンがゲル化することを見出し、この知見に基づいて、薬物、コラーゲンおよび糖を含む組成物により薬物の放出速度を制御し得、当該組成物を徐放性医薬組成物として使用し得ることを見出した。
2012050184.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物、コラーゲン、ならびに、単糖類、二糖類、三糖類および四糖類から選択される１種以上の糖を含む、徐放性医薬組成物。
【請求項２】
体内への投与前における糖の濃度が、コラーゲンのゲル化を阻害し得るものである、請求項１に記載の徐放性医薬組成物。
【請求項３】
糖が、二糖類および三糖類から選択される１種以上の糖である、請求項１または２に記載の徐放性医薬組成物。
【請求項４】
コラーゲンの濃度が０．０１〜３０重量%であり、糖の濃度が０．０１M〜３Mである、請求項１〜３に記載の徐放性医薬組成物。
【請求項５】
コラーゲンが、分子量1kDa〜2000kDaのコラーゲンである、請求項１〜４のいずれか１に記載の徐放性医薬組成物。
【請求項６】
コラーゲンが、アテロコラーゲンである、請求項１〜５のいずれか１に記載の徐放性医薬組成物。
【請求項７】
徐放性医薬組成物が、体内への投与前は液状であり、投与後はゲル化する性質を有する、請求項１〜６のいずれか１に記載の徐放性医薬組成物。
【請求項８】
徐放性医薬組成物が、薬物の放出速度を制御しうる、請求項１〜７のいずれか１に記載の徐放性医薬組成物。
【請求項９】
薬物がタンパク質である、請求項１〜８のいずれか１に記載の徐放性医薬組成物。
【請求項１０】
徐放性医薬組成物が、血管新生調節剤である、請求項１〜９のいずれか１に記載の徐放性医薬組成物。
【請求項１１】
薬物がbFGFである、請求項１〜１０のいずれか１に記載の徐放性医薬組成物。
【請求項１２】
徐放性医薬組成物が、液剤の形態である、請求項１〜１１のいずれか１に記載の徐放性医薬組成物。
【請求項１３】
徐放性医薬組成物が、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、体腔内投与、臓器への直接投与、および組織への直接投与からなる群から選ばれる投与経路で投与される、請求項１〜１２のいずれか１に記載の徐放性医薬組成物。
【請求項１４】
徐放性医薬組成物が、血管閉塞性疾患および／または虚血性疾患の治療に用いられる、請求項１〜１３のいずれか１に記載の徐放性医薬組成物。
【請求項１５】
薬物、コラーゲン、ならびに、単糖類、二糖類、三糖類および四糖類から選択される１種以上の糖を混合することを含む、徐放性医薬組成物を製造する方法。
【請求項１６】
糖の濃度が、コラーゲンのゲル化を阻害し得るものである、請求項１５に記載の徐放性医薬組成物を製造する方法。
【請求項１７】
コラーゲン、ならびに、単糖類、二糖類、三糖類および四糖類から選択される１種以上の糖を含む、徐放性基剤。
【請求項１８】
徐放性基剤が、液状である、請求項１７に記載の徐放性基剤。
【請求項１９】
徐放性基剤が、徐放性医薬組成物の製造のために用いられる、請求項１７または１８に記載の徐放性基剤。
【請求項２０】
徐放性医薬組成物において、単糖類、二糖類、三糖類および四糖類から選択される１種以上の糖をコラーゲンと配合することを特徴とする、徐放性医薬組成物からの薬物放出速度を制御する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、徐放性医薬組成物および徐放性医薬組成物の製造方法に関するものである。【０００２】
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願、特願2010-232113号優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】
従来より高分子材料は、組織内の薬物濃度を長期間にわたって有効に保持できることから、徐放性医薬組成物に広く利用されている。高分子材料は薬物を物理的・化学的に結合でき、生体内における分解の進行に伴い、薬物を遊離させる特性を持つ。かかる高分子材料としてはセルロース誘導体、デンプン誘導体、デキストラン誘導体、多糖類、タンパク質、ポリペプチド類、アクリル酸誘導体またはビニル誘導体等が挙げられる。【０００４】
タンパク質であるコラーゲンの薬物徐放特性として、コラーゲン濃度を調節することにより薬物の徐放期間を数日間程度の短期間から数ヶ月に亘る長期間まで制御できることが知られている。たとえば、特許文献１には、コラーゲン濃度を低くすれば、薬物を包含したゲル化コラーゲンの分解は速くなり、薬物の徐放も速く、薬効期間は短期間に終了すること、反対にコラーゲン濃度を高くすれば、ゲル化コラーゲンの分解は遅くなり、薬物の徐放が遅く、長期間薬効を示すことができることが開示されている。しかしながら、コラーゲン濃度が高い場合、製剤化は難しく高い技術が求められる。また、反対にコラーゲン濃度が低い場合、組織内への注入や薬物の添加・混合等の操作性は容易となるが、組織内注入後、薬物が徐放される速度が速くなり、薬効が短時間に限定され、長期間の徐放が示されないために薬効が十分に得られないなどの問題を有する。【０００５】
特許文献２にはコラーゲンを必須構成要素とする担体に、創傷治癒促進活性を有する生理活性物質を混合してなる創傷治癒促進用局所用徐放製剤が開示されている。特許文献２に記載の担体は、コラーゲン、アルブミン等のタンパク質、キチン等の糖質、および合成高分子からなる群から選ばれる成分で構成されている。特許文献２においては、薬物の徐放特性は、粉末、フィルムなどの剤形に依存することが示されているが、これら剤形への成形には時間を要するため、簡便性に欠ける。また、特許文献３にはコラーゲン、多糖類であるグリコサミノグリカン、および薬物を含有する徐放性製剤が開示されている。特許文献３では、グリコサミノグリカンがコラーゲンの線維形成を制御し、薬物の放出制御因子として機能することが示されている。特許文献３の徐放性製剤は、固形製剤であり、針状、棒状などの剤形に成形されるため、特許文献２に記載の製剤と同様に簡便性に欠ける。【０００６】
コラーゲン溶液はin vitroにおいて体温付近に加温するとゲル化することが知られているが、予めコラーゲン溶液に単糖類や二糖類等の糖を加えることによってゲル化が阻害されることが知られている（非特許文献１、非特許文献２）。ゲル化が阻害された状態では、コラーゲンによる薬物の徐放特性が十分に発揮されないと考えられるため、徐放性医薬のための担体としてコラーゲンを応用する際、単糖類等の糖を組み合わせてゲル化を阻害する技術は用いられ得なかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭５６−１２２３１７号公報
【特許文献２】特開平０５−０４３４５３号公報
【特許文献３】特開平１０−１６７９８７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Hayashiら、Factors Affecting the Interaction of Collagen Molecules as Observed by in Vitro Fibril Formation, J.Biochem.,(1972)72, 749
【非特許文献２】Kuznetsovaら、Sugars and Polyols Inhibit Fibrillogenesis of Type I Collagen by Disrupting Hydrogen-Bonded Water Bridges between the Helices、Biochemistry、(1998)37、11888
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、操作性が良好であり、かつ徐放性を有するような、薬物およびコラーゲン含む医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
コラーゲン溶液に糖を添加することによりゲル化が阻害されることが知られているが、本発明者らは驚くべきことに、糖を含むコラーゲン溶液が生体内に投与されると、コラーゲンがゲル化することを見出した。この知見に基づいて、薬物、コラーゲンおよび糖を含む組成物により薬物の放出速度を制御し得、当該組成物を徐放性医薬組成物として使用し得ることに着目し、本発明を達成した。【００１１】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．  薬物、コラーゲン、ならびに、単糖類、二糖類、三糖類および四糖類から選択される１種以上の糖を含む、徐放性医薬組成物。
２．  体内への投与前における糖の濃度が、コラーゲンのゲル化を阻害し得るものである、前項１に記載の徐放性医薬組成物。
３．  糖が、二糖類および三糖類から選択される１種以上の糖である、前項１または２に記載の徐放性医薬組成物。
４．  コラーゲンの濃度が０．０１〜３０重量%であり、糖の濃度が０．０１M〜３Mである、前項１〜３に記載の徐放性医薬組成物。
５．  コラーゲンが、分子量1kDa〜2000kDaのコラーゲンである、前項１〜４のいずれか１に記載の徐放性医薬組成物。
６．  コラーゲンが、アテロコラーゲンである、前項１〜５のいずれか１に記載の徐放性医薬組成物。
７．  徐放性医薬組成物が、体内への投与前は液状であり、投与後はゲル化する性質を有する、前項１〜６のいずれか１に記載の徐放性医薬組成物。
８．  徐放性医薬組成物が、薬物の放出速度を制御しうる、前項１〜７のいずれか１に記載の徐放性医薬組成物。
９．  薬物がタンパク質である、前項１〜８のいずれか１に記載の徐放性医薬組成物。
１０．  徐放性医薬組成物が、血管新生調節剤である、前項１〜９のいずれか１に記載の徐放性医薬組成物。
１１．  薬物がbFGFである、前項１〜１０のいずれか１に記載の徐放性医薬組成物。
１２．  徐放性医薬組成物が、液剤の形態である、前項１〜１１のいずれか１に記載の徐放性医薬組成物。
１３．  徐放性医薬組成物が、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、体腔内投与、臓器への直接投与、および組織への直接投与からなる群から選ばれる投与経路で投与される、前項１〜１２のいずれか１に記載の徐放性医薬組成物。
１４．  徐放性医薬組成物が、血管閉塞性疾患および／または虚血性疾患の治療に用いられる、前項１〜１３のいずれか１に記載の徐放性医薬組成物。
１５．  薬物、コラーゲン、ならびに、単糖類、二糖類、三糖類および四糖類から選択される１種以上の糖を混合することを含む、徐放性医薬組成物を製造する方法。
１６．  糖の濃度が、コラーゲンのゲル化を阻害し得るものである、前項１５に記載の徐放性医薬組成物を製造する方法。
１７．  コラーゲン、ならびに、単糖類、二糖類、三糖類および四糖類から選択される１種以上の糖を含む、徐放性基剤。
１８．  徐放性基剤が、液状である、前項１７に記載の徐放性基剤。
１９．  徐放性基剤が、徐放性医薬組成物の製造のために用いられる、前項１７または１８に記載の徐放性基剤。
２０．  徐放性医薬組成物において、単糖類、二糖類、三糖類および四糖類から選択される１種以上の糖をコラーゲンと配合することを特徴とする、徐放性医薬組成物からの薬物放出速度を制御する方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の徐放性医薬組成物によれば、生体内において、有効成分である薬物を、即効性のある放出と緩徐な徐放が組み合わされた態様で放出制御することが可能となる。本発明の徐放性医薬組成物によれば、投与後初期においては糖の添加によりコラーゲンのゲル化が阻害されるため即効性のある薬物放出が可能となり、かつ、投与後時間の経過に伴って生体内でコラーゲンがゲル化されるため、薬物の放出速度が遅延し、緩徐な徐放が可能となる。
また一般的にコラーゲンが添加された医薬組成物を調剤する際、コラーゲンがゲル化しないように温度を管理する必要があるが、本発明の徐放性医薬組成物においては、糖がコラーゲンに添加されているためゲル化が阻害され、室温での調剤操作を容易にすることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】糖添加によるコラーゲンのゲル化阻害作用を示す図である。図中、ａはコラーゲンのみの場合、ｂはコラーゲンと0.01Mスクロースを配合した場合、ｃはコラーゲンと0.25Mスクロースを配合した場合の結果を示す。（参考例１）
【図２】in  vitroにおいて、各成分を糖添加の薬物放出速度に対する影響を確認した結果を示す図である。図中、黒丸はスクロースが存在する場合、白丸はスクロースが存在しない場合の結果を示す。（実施例１）
【図３】in  vivoにおいて、各成分を配合する順番のコラーゲンゲル化への影響を確認した結果を示す写真である。図中、ａ〜ｃは実施例２に記載の各々の製剤の結果を示し、ｄは対照となる製剤の結果を示す。Pはリゾチームを意味し、Sはスクロースを意味し、ACはアテロコラーゲンを意味する。（実施例２）
【図４】in  vivoにおいて、配合する順番の薬物放出速度に対する影響を確認した結果を示す図である。（実施例３）
【図５】in  vivoにおいて、薬物の種類のコラーゲンゲル化への影響を確認した結果を示す図である。図中、ａは薬物がTransferrin、ｂはPhosphorylase  b、ｃはMyosin  heavy  chain、ｄはFerritin  type  I、ｅはThyrogloblinの結果を示す。（実施例４）
【図６】薬物がbFGFである徐放性医薬組成物による、in  vivo血管新生促進作用を確認した結果を示す写真である。図中、ａは2mg/mL  bFGF、0.25Mスクロース、3%[w/v]コラーゲンを含有する製剤、ｂは2mg/mL  bFGF、3%[w/v]コラーゲンを含有し、スクロースを含有しない製剤、ｃはbFGFおよびスクロースを含有せず、3%[w/v]コラーゲンのみを含有する製剤の結果を示す。（実施例５）
【図７】薬物がbFGFである徐放性医薬組成物の、下肢虚血モデルマウスに対する薬効を確認した結果を示す図である。（実施例６）
【図８】薬物がbFGFである徐放性医薬組成物について、第I - II相臨床試験を行った結果を示す図である。（実施例７）
【図９】in  vitroにおいて、糖添加の各種コラーゲンのゲル化への影響を確認した結果を示す図である。図中、ａはリゾチーム、スクロースを含有せず、0.1%[w/v]コラーゲンのみの製剤、ｂはリゾチームを含有せず、0.25Mスクロース、0.1%[w/v]コラーゲンを含有する製剤、ｃは10mg/mLリゾチーム、0.25Mスクロース、0.1%[w/v]コラーゲンを含有する製剤の結果を示す。（参考例２）
【図１０】in  vitroにおいて、各種糖添加のコラーゲンゲル化への影響を確認した結果を示す図である。グルコースおよびフルクトースのグラフにおいて、ａは糖を含有しない製剤、ｂは糖を0.05Mの濃度で含有する製剤、ｃは糖を0.125Mの濃度で含有する製剤、ｄは糖を0.25Mの濃度で含有する製剤、ｅは糖を0.5Mの濃度で含有する製剤の結果を示す。スクロースおよびマルトースのグラフにおいては、ａは糖を含有しない製剤、ｂは糖を0.05Mの濃度で含有する製剤、ｃは糖を0.125Mの濃度で含有する製剤、ｄは糖を0.25Mの濃度で含有する製剤の結果を示す。ラフィノースのグラフにおいては、ａは糖を含有しない製剤、ｂは糖を0.05Mの濃度で含有する製剤の結果を示す。スタオキオースのグラフにおいては、ａは糖を含有しない製剤、ｂは糖を0.05Mの濃度で含有する製剤、ｃは糖を0.125Mの濃度で含有する製剤の結果を示す。0.05Mの糖の比較を示すグラフにおいては、ａはを含有しない製剤、ｂはグルコースを含有する製剤、ｃはマルトースを含有する製剤、ｄはラフィノースを含有する製剤、ｅはスタキオースを含有する製剤の結果を示す。（参考例３）
【図１１】in  vitroにおいて、スタキオース（四糖）添加のコラーゲンのゲル化への影響を確認した結果を示す図である。図中、ａはスタキオースを含有しない製剤、ｂはスタキオースを含有する製剤の結果を示す。（参考例３）
【図１２】in  vitroにおいて、マルトテトラオース（四糖）またはマルトペンタノース（五糖）を添加した場合のコラーゲンのゲル化への影響を確認した結果を示す図である。図中、ａは糖を含有しない製剤、ｂは0.05Mの糖を含有する製剤、ｃは0.125Mの糖を含有する製剤の結果を示す。（参考例４）
【図１３】in  vitroにおいて、糖添加の各種濃度のコラーゲンのゲル化への影響を確認した結果を示す図である。図中、ａは3%[w/v]のコラーゲンを含有する製剤、ｂは0.4%[w/v]のコラーゲンを含有する製剤の結果を示す。（参考例５）
【図１４】in  vitroにおいて、各種糖を添加した場合のコラーゲンのゲル化への影響を確認した結果を示す図である。（参考例６）
【図１５】in  vivoにおいて、各種濃度のコラーゲンのゲル化への糖添加の影響を確認した結果を示す図である。図中、各写真の左に記載する数値は、製剤中におけるコラーゲンの濃度を表す。（実施例８）
【図１６】in  vivoにおいて、糖の種類を変えた場合のコラーゲンのゲル化への影響を確認した結果を示す図である。図中、ａ〜ｊは表３において示される糖を含有する製剤の結果を示す。（実施例９）
【図１７】in  vivoにおいて、各種濃度のコラーゲンのゲル化への糖添加の影響を確認した結果を示す図である。図中、ａは1%[w/v]のコラーゲンを含有する製剤、ｂは0.5%[w/v]のコラーゲンを含有する製剤の結果を示す。（実施例１０）
【図１８】in  vitroにおいて、各種糖を添加した場合のコラーゲンのゲル化への影響を確認した結果を示す図である。図中、ａは糖を含有しない場合、ｂはスクロースを含有する場合、ｃはグルコースを含有する場合、ｄはグルクロン酸を含有する場合の結果を示す。（参考例７）
【図１９】薬物がThyroglobulinである徐放性医薬組成物のin  vivoでの薬物徐放能を確認した結果を示す図である。（実施例１１）
【図２０】薬物がThyroglobulinである徐放性医薬組成物のin  vivoでのゲル化を確認した結果を示す図である。（実施例１１）
【図２１】薬物がThyroglobulinである徐放性医薬組成物のin  vivoでの薬物放出量の経時的変化を確認した結果を示す図である。（実施例１１）
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、薬物、コラーゲン、ならびに、単糖類、二糖類、三糖類および四糖類から選択される１種以上の糖を含む、徐放性医薬組成物に関する。
【００１５】
本発明の徐放性医薬組成物は、前記１種以上の糖を含むことにより、生体内に投与される前は液状を呈しているが、生体内に投与された後にゲル化することを特徴とする。本発明の徐放性医薬組成物は、生体内に投与された直後は、糖が存在しているためゲル化が阻害されているが、徐々に生体内に糖が拡散することにより、糖によるコラーゲンのゲル化阻害が解除され、コラーゲンが本来の性質を取り戻してゲル化するようになると考えられる。すなわち本発明の徐放性医薬組成物は、生体内に投与された後、ゆっくりとゲル化が進行し、最終的に薬物の徐放作用を発揮することができるものである。本発明の徐放性医薬組成物は、生体内に投与された直後は即放性を有するものと考えられる。このように本発明の徐放性医薬組成物は、即放性と徐放性を有し、薬物の放出速度が制御されたものである。
【００１６】
本発明において「即放性を有する」とは、医薬組成物が投与直後から一定時間まで（初期）に有効量の薬物を放出することを意味する。本発明の医薬組成物は初期において、コラーゲンを含まない組成物と同程度もしくは若干遅く、かつコラーゲンのみを含み糖を含まない組成物よりは速く、薬物を放出する。例えば本発明の医薬組成物は、5時間またはそれ未満、2時間またはそれ未満、1時間またはそれ未満、あるいは約30分またはそれ未満の時間内に、被験体に薬物の初回添加用量を提供するのに十分な量で薬物を放出し得る。
【００１７】
また本発明において「徐放性を有する」とは、医薬組成物が、コラーゲンを含まない組成物と比較して長時間持続的に薬物を放出し、生体内での薬物を適当な濃度に維持することを意味する。例えば本発明の医薬組成物は、投与後12時間以上経過後、16時間以上経過後、1日以上経過後、かつ投与後約3日間まで、約1週間まで、約1ヶ月間まで、あるいは、投与後1ヶ月以上経過後かつ約6ヶ月間までの時間、薬物の連続維持用量を被験体の生体内に提供するのに十分な量で薬物を放出し得る。
【００１８】
さらに本発明の徐放性医薬組成物において、薬物、コラーゲン、ならびに、糖の各成分の濃度、配合比、配合する順番等を適宜調整することにより、薬物放出速度をより自在に制御することが可能になると考えられる。本発明の徐放性医薬組成物では、従来のコラーゲンのみを含み糖を含まない組成物と比較して、初期の薬物放出量を増加させることができ、即放性を付与することが可能となる。例えば、後述する実施例１に記載の条件で試験を行った場合に、溶出開始0〜6時間後の薬物の溶出量（薬物の累積放出量）を従来のコラーゲンのみを含み糖を含まない組成物に比べて約5〜30%増加させ、また溶出開始6〜48時間後の薬物の溶出量（薬物の累積放出量）を30〜50%増加させる範囲で、薬物の放出速度を調節することが可能である。 なおこれらの数値は、本発明の徐放性医薬組成物における初期の薬物放出速度（即放性を発揮する時間範囲および当該時間範囲における薬物の累積放出量）の一例であり、本発明における初期の薬物放出速度はこれらに限定されず、薬物・糖・コラーゲンの種類や濃度によって制御することができる。
【００１９】
本発明の医薬組成物は、体内に投与される前は液状であり、投与後はゲル化する性質を有する。本発明の医薬組成物のゲル化は、コラーゲンに起因するものと考えられる。コラーゲンのゲル化は、一般的に生理的条件下にて生じると知られている。生理的条件とは、温度が2〜45℃、pHが4.0〜10.0、塩濃度が0.01〜3.0Mである条件を意味する。本発明の医薬組成物は、体内に投与される前に生理的条件下におかれたとしても、液状のままであり、ゲル化しないものである。また、本発明において液状とゲル化された状態は、濁度を測定することにより、区別することが可能である。例えば濁度は、400nmにおける吸光度を測定することにより確認することができる。ゲル化する性質とは、コラーゲンを含む組成物を生理的条件下においた際に、400nmにおける吸光度が上昇する性質、例えば吸光度が1.0程度まで上昇する性質を有することを意味する。
【００２０】
本発明の徐放性医薬組成物に含まれる糖は、単糖類、二糖類、三糖類および四糖類から選択される１種以上の糖である。単糖類としては、キシロース、アラビノース、リボース等の五炭糖、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、フコース等の六炭糖、イノシトール、エリスリトール等の糖アルコール、グルコサミン等のアミノ糖、グルクロン酸等のウロン酸が例示され、二糖類としてはスクロース、マルトース、ラクトース、トレハロース、イソマルトースが例示され、三糖類としてはラフィノース、四糖類としてはスタキオースが例示される。本発明の徐放性医薬組成物に含まれる糖は、二糖類および三糖類から選択される１種以上の糖であることが好ましく、二糖類であることがより好ましい。二糖類や三糖類は、医薬組成物を調製する際の操作性の観点からも好ましい。本発明において、単糖類、二糖類、三糖類、および四糖類から選択される１種以上の糖の代わりに、五糖類以上の多糖類をコラーゲンと共存させて徐放性医薬組成物を作製した場合は、コラーゲンによる薬物の徐放性にほとんど影響を与えることができず、薬物徐放速度を調節することができないものと考えられる。
【００２１】
本発明の徐放性医薬組成物における糖の濃度は、医薬組成物における終濃度で、コラーゲンによるゲル化を阻害し得るものであり、本発明の医薬組成物が生理的条件下におかれたとしても、ゲル化しない濃度である。さらに本発明の医薬組成物における糖濃度は、医薬組成物の他の成分の添加に応じて、増減させることが可能であるが、全体として生体内の浸透圧と等張となる濃度に調整されることが好ましい。例えば、糖濃度は0.01〜3.0M、好ましくは0.05〜1.0M、さらに好ましくは0.1〜0.5Mである。糖濃度が、0.01Mより低い場合はゲル化の阻害効果が得られないといった問題点があり、3.0Mより高い場合はコラーゲンのゲル化が完全に阻害され、組成物が薬物徐放性を示さないといった問題点がある。
【００２２】
なお、本発明の徐放性医薬組成物においては、糖の種類や濃度を変更することにより、薬物放出速度を調節すること、生体内に投与された直後の即放性と、コラーゲンのゲル化に起因する徐放性のバランスを調節することが可能である。即放性と徐放性のバランスは、薬物の種類などに応じて調節することが可能である。例えば、二糖類や三糖類が本発明の徐放性医薬組成物に含有されている場合は、比較的コラーゲンのゲル化抑制能が高いため、投与後初期の薬物放出により、より高い局所濃度を実現することができ、より即効性のある薬物放出が可能となる。一方、単糖類や四糖類が本発明の徐放性医薬組成物に含有されている場合は、比較的コラーゲンのゲル化抑制能が低く、二糖類や三糖類含有製剤に比べ薬物の放出速度を遅くすることが可能となる。本発明の徐放性医薬組成物における糖の濃度については前記の通りであるが、二糖類の場合は好ましくは0.05M〜0.3M、三糖類の場合は好ましくは0.01M〜0.3M、単糖類の場合は好ましくは0.05M〜0.5M、四糖類の場合は好ましくは0.05M〜0.3Mの濃度が例示される。
【００２３】
本発明の徐放性医薬組成物におけるコラーゲンは、生理的条件下でゲル化し得るものであればいかなるものであってもよい。コラーゲンは、コラーゲンの変性物であるゼラチンとは区別される。コラーゲンは、３本のらせん状ポリペプチド鎖が寄り集まって形成される３重のらせん構造を有するものであるが、ゼラチンはかかる３重らせん構造をとらない。コラーゲンにおける３重らせん構造は、(Gly-X-Y)n （XおよびYは任意のアミノ酸）という繰返し配列を含む分子により形成される。本発明の医薬組成物におけるコラーゲンの分子量は、1〜2000kDa、好ましくは10〜1000kDa、より好ましくは100〜500kDaである。コラーゲンの分子量が、1kDaより小さい場合は生理的条件下におけるコラーゲンのゲル化が生じないといった問題点があり、2000kDaより大きい場合は生理的条件下以外でもゲル化が生じてしまい、製剤の取り扱いが困難になるといった問題点がある。なお本明細書における分子量とは、総分子量を意味し、一般的にGPC法等により測定されるものである。
【００２４】
本発明においては、様々な型の天然型コラーゲンは勿論のこと、ペプシンなどのプロテアーゼで処理したアテロコラーゲン（Stenzelら、Collagen as a biomaterial、 Annual Review of Biophysics and Bioengineering、(1974)3、 231）などをコラーゲンとして用いることができる。アテロコラーゲンは、ニワトリ、ウシ、ブタ、ヒト等の種々の生物由来のものを使用可能である。また、生理学的条件下でゲル化し得るものであれば、化学修飾したコラーゲン、 (Pro-Hyp-Gly)5などのようにGly-X-Y（XおよびYは任意のアミノ酸）の繰返し配列を含む合成ポリペプチドが三重らせんを形成したコラーゲン様分子等を用いることも可能である。例えばゼラチンやコラーゲンペプチドは、生理的条件下でゲル化しないため、本発明の徐放性医薬組成物において用いるコラーゲンとしては好ましくない。
【００２５】
本発明におけるコラーゲンの濃度は、医薬組成物における終濃度で、生理的条件下でゲル化する濃度のものであれば、いかなる濃度であってもよい。例えばコラーゲンの濃度は0.01〜30重量%（%[w/v]）、好ましくは0.05〜20重量%（%[w/v]）、より好ましくは0.1〜10重量%（%[w/v]）である。コラーゲンの濃度が、0.01重量%（%[w/v]）より低い場合はコラーゲンのゲル化が生じないといった問題点があり、30重量%（%[w/v]）より高い場合は本発明の徐放性医薬組成物を溶液として取り扱えないといった問題点がある。
【００２６】
本発明の徐放性医薬組成物におけるコラーゲンと糖の配合比は、コラーゲンのゲル化を糖が阻害し得る配合比であればよい。例えばコラーゲンと糖の配合比は、コラーゲン1重量部（1g）に対して糖の重量（g）が、1:0.005〜1:5000であればよく、好ましくは1:0.01〜1:1000、より好ましくは1:0.02〜1:500、さらに好ましくは1:0.1〜1：100であればよい。コラーゲン1重量部（1g）に対する糖の重量（g）が、0.005より小さい場合はゲル化の阻害効果が得られないといった問題点があり、5000より大きい場合はコラーゲンのゲル化が完全に阻害され、組成物が薬物徐放性を示さないといった問題点がある。またなお、コラーゲン1重量部（1g）に対する糖の重量（g）を増大させることにより、より高度にゲル化を阻害し、より即放性の比重の高い医薬組成物を作製することが可能となる。
【００２７】
本発明の徐放性医薬組成物において、コラーゲンは媒体に溶解されてコラーゲン溶液として存在している。媒体は、生理的条件におけるpH、塩濃度を満たすものであればいかなるものを用いてもよい。例えば、注射用精製水、生理食塩水、緩衝液（例、生理的リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液）などの媒体を用いることができる。
【００２８】
本発明の徐放性医薬組成物は、有効成分として薬物を含有する。薬物は、疾患や病態を予防および／または治療するような作用を有する生理活性物質であればよい。例えば、薬物として、組織再生促進や生理作用の促進・亢進する作用を有する生理活性物質、抗ガン剤、抗生物質等の通常の医薬として使用されているものが挙げられる。薬物としては、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、多糖類、核酸、低分子化合物のいかなるものであってもよいが、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質であることが好ましい。本発明においてペプチドとは２以上のアミノ酸が結合した分子であり、タンパク質とペプチドとは実質的に同義である。糖タンパク質とはタンパク質に糖鎖が結合したものである。本発明における薬物としてのタンパク質はいかなるものであってもよいが、例えば分子量が1〜1000kDaのものを使用することができる。
【００２９】
上記タンパク質、ペプチド、糖タンパク質としては、例えば、FGF（線維芽細胞増殖因子）、EGF（上皮増殖因子）、NGF（神経成長因子）、IGF（インスリン様成長因子）、CSF（コロニー刺激因子）、G-CSF（顆粒球コロニー刺激因子）、TGF（トランスフォーミング増殖因子）、VEGF（血管内皮細胞増殖因子）、GH（成長ホルモン）、EPO（エリスロポエチン）、HGF（肝細胞成長因子）、TNF-α（腫瘍壊死因子）、TNF-β（リンフォトキシン）、インターロイキン、インターフェロン、インスリン、PTH（副甲状腺ホルモン）、PDGF（血小板由来増殖因子）、ワクチン抗原、抗体、リゾチーム（細胞壁溶解酵素）、セラペプターゼ（消炎酵素剤）、プロナーゼ（消炎酵素剤）等が挙げられる。FGFは、bFGF（塩基性線維芽細胞増殖因子）であることが好ましい。
【００３０】
核酸としては、酵素、ホルモン、サイトカイン、コロニー刺激因子、凝固因子、調節タンパク質、転写因子、受容体、もしくは構造タンパク質をコードする遺伝子、またはこれら遺伝子を標的とする、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドなどからなる一本鎖もしくは二本鎖の核酸からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、miRNA、RNA、DNA、アプタマーなどが挙げられる。
【００３１】
本発明の徐放性医薬組成物における薬物の濃度は、本発明の徐放性医薬組成物が投与される被験体（患者）の生体内で疾患や病態を予防および／または治療するような作用を発揮するために十分なものであればよい。薬物の濃度は、通常使用されている医薬の有効性濃度と同程度であればよい。また、薬物単独で有効性が明らかとなっている濃度でもよいが、コラーゲンと混合することにより有効性を示す濃度が薬物単独より低くなるもしくは高くなる場合も想定される。本発明の徐放性医薬組成物は、局所的に使用することが好ましいため、薬物の局所濃度に着目して徐放性医薬組成物における薬物濃度を決定すればよい。
【００３２】
本発明の徐放性医薬組成物は、さらに医薬上許容されうる担体を含有するものであってもよい。医薬上許容されうる担体として、本発明の徐放性医薬組成物が注入可能な注射剤である場合には、必要に応じて、分散剤、界面活性剤、等張化剤、pH調整剤、無痛化剤、安定化剤、保存剤、着色剤などを用いてもよい。
【００３３】
本発明の徐放性医薬組成物は、注射剤として非経口的に使用することが好ましい。例えば、皮内、皮下、筋肉内、体腔内あるいは臓器、組織等に投与することができる。また本発明の徐放性医薬組成物は、被験体として脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、ニワトリなどを含む鳥類、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ヒトなどを含む哺乳類）に投与することが可能である。
【００３４】
本発明の徐放性医薬組成物は、薬物が血管新生調節作用を発揮する生理活性物質である場合、血管新生調節剤として使用することが可能である。本発明において血管新生調節とは、血管新生を促進するおよび／または阻害する作用を意味する。血管新生調節作用を発揮する生理活性物質としては、FGF（好ましくはbFGF）、PDGF、VEGF、HGF、G-CSF、フマギリン、ベバシズマブ（bevacizumab）、ラニビズマブ（ranibizumab）、血管内皮増殖因子 A（VEGF-A）の活性型を中和する組換えヒトモノクローナル Fab 抗体）、シメチジン、セレコキシブ）、アザスピレン、メガプタニブ（核酸医薬）等が例示されるが、bFGFであることが好ましい。
【００３５】
本発明の血管新生調節剤は、生体内に投与した場合、有効成分である血管新生調節作用を発揮する生理活性物質の局所濃度が早期に上昇し、かつ長期に亘って持続的に放出されて適当な濃度を維持することが可能であることから、血管新生調節作用による様々な治療用途に用いられうる。
【００３６】
血管新生調節作用を発揮する生理活性物質がbFGFである場合、2時間またはそれ未満、1時間またはそれ未満、30分またはそれ未満、あるいは約10分またはそれ未満の時間内に、被験体へbFGFが初回添加用量を提供するのに十分な量で放出される。投与後12時間以上、16時間以上、20時間以上かつ約24時間まで、約28時間まで、または約32時間までの時間、bFGFの連続維持用量を被験体に提供するのに十分な量で放出することを意味する。例えば、bFGFの終濃度が25μg/mLとなるよう血管新生調節剤を調製し、被験者の局所におけるbFGF投与量（用量）を約100〜約500μg、好ましくは約200μgとなるようにすることができる。
【００３７】
本発明の血管新生調節剤は、例えば、血管新生促進、血管新生阻害、組織再生、創傷治癒、骨疾患治療、歯周疾患治療、軟骨疾患治療、癌治療への用途が例示されるが、血管新生促進又は組織再生に用いることが好ましい。本発明の血管新生調節剤により血管新生促進及び／又は組織再生され、症状が改善されることが期待される疾患としては、血管閉塞性疾患及び該血管閉塞に伴う虚血性疾患全般であり、具体的には、慢性動脈閉塞性疾患一般であり、例えば、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、糖尿病性壊疽、心筋梗塞、狭心症などが挙げられる。
【００３８】
本発明の血管新生調節剤の投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、例えばbFGFとして、通常成人患者当たり約0.01〜約500μgの範囲、好ましくは約1〜約300μgの範囲から投与量が選択され、これを患部またはその周辺部位に注入することができる。また１回の投与で効果が不十分であった場合は、該投与を複数回行うことも可能である。
【００３９】
本発明の徐放性医薬組成物は薬物、コラーゲン、ならびに、糖の各成分を所定の濃度、配合比にて混合することにより作製することが可能である。この際、薬物、コラーゲン、および糖の配合順番は、特に限定されるものではなく、例えば以下の順番で配合することにより作製可能である。
（１）薬物と糖を含む混合物に、コラーゲンを添加する。
（２）薬物とコラーゲンを含む混合物に、糖を添加する。
（３）糖とコラーゲンを含む混合物に、薬物を添加する。
また、濃度、配合比、配合の順番を適宜調整することにより、薬物放出速度をより自在に制御することが可能になると考えられる。
【００４０】
さらに本発明は、コラーゲン、ならびに、単糖類、二糖類、三糖類および四糖類から選択される１種以上の糖を含む、徐放性基剤も包含する。徐放性基剤とは、徐放性医薬組成物のための溶剤もしくは基剤を意味する。本発明の徐放性基剤に、有効成分である薬物を添加し混合することにより、徐放性医薬組成物を作製することが可能である。
【００４１】
本発明においては、単糖類、二糖類、三糖類および四糖類から選択される１種以上の糖を、薬物およびコラーゲンを含む医薬組成物に存在させることにより、医薬組成物に即放性と徐放性を付与することが可能となり、薬物放出速度を制御する方法も提供される。
【００４２】
本発明の徐放性医薬組成物の製造方法または、薬物放出速度の制御方法においては、コラーゲンのゲル化を考慮して、糖が存在しない状態では、コラーゲンが変性しない温度、好ましくは2〜10℃の低温で配合操作を行なうことが好ましいが、糖が存在する状態では、0〜50℃、より好ましくは10〜40℃で混合操作を行うことが可能である。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明の内容を参考例および実施例に示して、具体的に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００４４】
（参考例１）糖がコラーゲン溶液のゲル化能に与える影響の分光学的評価
具体的には、コラーゲン溶液（pH7.4、終濃度3%[w/v]）（製品名：コーケンアテロコラーゲンインプラント）に、終濃度が0、0.01または0.25Mとなるようスクロース溶液を加えて混合し、37℃で加温しながら400nmにおける吸光度の経時的変化を分光光度計で測定した。【００４５】
結果を図１に示す。図中、ａはコラーゲンのみの場合、ｂはコラーゲンと0.01Mスクロースを配合した場合、ｃはコラーゲンと0.25Mスクロースを配合した場合の結果を示す。スクロースが添加されていないコラーゲン溶液は約10分でゲル化した。スクロースが添加されたコラーゲン溶液では、スクロース濃度依存的にゲル化が遅延した。【００４６】
（実施例１）コラーゲンからの薬物放出に与える糖の影響の確認
薬物としてリゾチーム（終濃度2mg/mL）（SIGMA社）を用い、コラーゲンからの薬物放出に与える糖の影響を確認した。
リゾチームを、スクロース（終濃度0.05M）を含む生理的緩衝液（PBS、pH7.4）、またはスクロースを含まない生理的緩衝液に溶解した後、アテロコラーゲン溶液（終濃度3%[w/v]）（製品名：コーケンアテロコラーゲンインプラント）と混合し、製剤化した。得られた製剤を、試験管中にてPBSを外液とする溶液に静かに添加して37℃で加温し、経時的に外液中に放出されたリゾチーム量をHPLC（システムインテグレーターC-R7A［島津製作所］、システムコントローラーSCL-6B［島津製作所］、ポンプLC-9A［島津製作所］、デガッサーERC-3522［Elma］、検出器SPC-6AV［島津製作所］、カラム；Cosmosil  C18-AR［ナカライテスク］）にて測定した。
測定条件は以下の通りとした。
溶出開始液：0.1%トリエチルアミン（TEA）を含む30%アセトニトリル溶液
最終溶出液：0.1%  TEAを含む45%アセトニトリル溶液の濃度勾配溶出
速度  1mL/min
溶出時間：30分間
検出波長：220nm【００４７】
その結果を図２に示す。図中、白丸はスクロースが存在しない場合、黒丸はスクロースが存在する場合の結果を示す。スクロースを含まない場合と比較してスクロースを含む場合は、外液へのリゾチーム放出量が多いことがわかった。糖の添加によって、コラーゲン溶液からの薬物の放出が速くなり、薬物の初期放出量が増加することが明らかとなった。【００４８】
（実施例２）製剤化手順のコラーゲンの生体内ゲル化に対する影響の確認
リゾチーム（MW:14kDa）（終濃度2mg/mL）、スクロース（終濃度0.25M）およびアテロコラーゲン（終濃度3%[w/v]）（製品名：コーケンアテロコラーゲンインプラント）の３種類の成分を、下記のａ）〜ｃ）に示すように順番を変えて混合し、製剤化した。
ａ）(P+S)+AC製剤：はじめにリゾチームとスクロースを混合し、次いでアテロコラーゲンを添加して、製剤化した。
ｂ）(P+AC)+S製剤：はじめにリゾチームとアテロコラーゲンを混合し、次いでスクロースを添加して、製剤化した。
ｃ）(S+AC)+P製剤：はじめにスクロースとアテロコラーゲンを混合し、次いでリゾチームを添加して、製剤化した。
アテロコラーゲンのみからなるAC製剤を、対照製剤として用いた。
上記ａ）〜ｃ）の各製剤100μLを、マウス（DDY、雌、20週齢）の背部皮下に投与した。マウス投与24時間後に、アテロコラーゲンが生体内でゲル化されているかを確認した。【００４９】
各製剤の24時間後の生体内での状態を、図３に示す。図中、ａ〜ｃは上記ａ）〜ｃ）の各々の製剤の結果を示し、ｄは対照となる製剤の結果を示す。ａ）〜ｃ）の製剤および対照製剤は、いずれもマウス背部皮下にて、白色のゲルを形成していた。よって、糖を添加・混合する順番は生体内におけるコラーゲンのゲル化には影響せず、いずれの製剤化手順によってもコラーゲンが生体内でゲル化すること、すなわち薬物の放出担体としての形態を形成することがわかった。【００５０】
（実施例３）製剤化手順の薬物放出速度に対する影響の確認
リゾチーム（MW:14kDa）、スクロースおよびアテロコラーゲン（製品名：コーケンアテロコラーゲンインプラント）の３種類の成分を、下記のａ）〜ｄ）に示すように順番を変えて混合し、製剤化した。各々の製剤をマウス背部皮下に投与し、1時間後に、放出されたリゾチームの量を測定した。
ａ）(P+S)+AC製剤：はじめにリゾチームとスクロースを混合し、次いでアテロコラーゲンを添加して、製剤化した。
ｂ）(P+AC)+S製剤：はじめにリゾチームとアテロコラーゲンを混合し、次いでスクロースを添加して、製剤化した。
ｃ）(S+AC)+P製剤：はじめにスクロースとアテロコラーゲンを混合し、次いでリゾチームを添加して、製剤化した。
ｄ）AC+P製剤：アテロコラーゲンとリゾチームを混合し、製剤化した。
いずれの製剤も、リゾチーム、スクロースおよびアテロコラーゲンの最終濃度が、それぞれ5mg/mL、0.25Mおよび3%[w/v]となるように調製した。
マウス背部皮下にａ）〜ｄ）の各製剤を100μL投与し、1時間後、体温でゲル化した製剤を取り出し、ゲル内に残ったリゾチーム量をHPLCにて測定し、放出されたリゾチーム量を算出した。【００５１】
結果を図４に示す。リゾチームの放出量は混合手順を変えることにより変動した。従って、コラーゲン、薬物、糖の混合手順を変えることによって生体内において徐放特性が変わることが明らかとなった。なお、マウス背部皮下投与1時間後の製剤は、いずれもゲル化しており、薬物の徐放担体としての形態を維持していた。【００５２】
（実施例４）薬物の分子量のコラーゲンの生体内ゲル化に対する影響の確認
以下の表１に記載の各種タンパク質（終濃度10mg/mL）である薬物、スクロース（終濃度0.25M）およびアテロコラーゲン（終濃度3%[w/v]）（製品名：コーケンアテロコラーゲンインプラント）の３種類の成分を、製剤化した。製剤化は実施例２ｃ）の手法と同様にして、スクロースを生理的緩衝液に溶解した後、アテロコラーゲン溶液と混合し、次いで生理的緩衝液に溶解したタンパク質を添加して行った。
【表１】
2012050184.tif 000003
マウス（ICR、雄、8週齢、体重27-29g）の背部皮下の一箇所につき、表１に記載のタンパク質を含む各製剤100μLを投与し、投与24時間後に、コラーゲンが生体内でゲル化されているかを確認した。【００５３】
各製剤の24時間後の生体内での状態を、図５に示す。図中、ａはTransferrin、ｂはPhosphorylase  b、ｃはMyosin  heavy  chain、ｄはFerritin  type  I、ｅはThyrogloblinの結果を示す。いずれの製剤もマウス背部皮下にて、ゲルを形成していた。よって、薬物特にタンパク質の分子量はコラーゲンのゲル化には影響せず、いずれの製剤であってもコラーゲンが生体内でゲル化することがわかった。【００５４】
（実施例５）本発明の製剤の効果確認１
薬物としてbFGF（MW:17kDa）（終濃度2mg/mL）を用い、スクロース（終濃度0.25M）およびアテロコラーゲン（終濃度3%[w/v]）（製品名：コーケンアテロコラーゲンインプラント）の３種類の成分を順に混合し、混合した製剤20μLをマウス（C57BL/6[SLC]、雌、7週齢）の背部皮下に投与した。3週間後の投与部位における組織の様子を肉眼的に確認した。【００５５】
結果を図６に示す。スクロースを含む製剤（図６ａ）を投与した場合は、投与部位における血管周辺で赤みを帯びているのが確認され（矢印）、毛細血管の新生が示唆された。他方、スクロースを含まない製剤（図６ｂ）を投与した場合は、投与部位周辺の明確な赤みが見られず（矢印）、スクロースを含む製剤に比べ、血管新生が遅延すると考えられた。対照としてコラーゲン溶液のみを投与した場合では、スクロースを含まない製剤と同様に、毛細血管の新生は見られなかった（図６ｃ）。このような皮下における、bFGFの効果の差異（図６ａとｂの間の差異）は、コラーゲンがゲル化する過程での、bFGFが製剤から放出される時間の差によるものと考えられ、スクロースを含む製剤ではbFGFの放出が速く、血管の新生も早まったことが推察された。【００５６】
（実施例６）本発明の製剤の効果確認２
１）製剤の調製
白糖を含むbFGFの溶液（製品名：フィブラストスプレー（科研製薬株式会社））に、コラーゲン溶液（終濃度3%[w/v]）（製品名：コーケンアテロコラーゲンインプラント（株式会社高研））を添加し、bFGF  1.0mg/mLの製剤とした。【００５７】
２）下肢虚血モデル動物の作製
34週齢のマウス（C3H/He、雄、日本SLC株式会社）を２群（n=10）に分け、室温19.5〜26.4℃、湿度34.5〜75.4%、12時間の明暗周期、食餌は自由摂取の環境下で訓化した。
マウスをイソフルラン0.5〜4%麻酔下で、背位に固定し、右下肢大腿部を切開し、大腿動脈の中枢側及び末梢側並びに伏在動脈の末梢側を糸で結さつし、血行を遮断した。ペニシリンＧカリウム溶液を滴下し、切開部を縫合した。【００５８】
３）下肢虚血モデル動物への製剤の投与
下肢虚血モデルマウス作製後、製剤の投与量がbFGF  100μg/動物となるよう、右虚血下肢筋肉内１箇所あたり20μLを５箇所、注射器にて投与した。【００５９】
４）下肢血流量の測定
薬剤投与4週間後に、下肢虚血部位における血流の回復を、レーザードップラ血流画像装置（OZ-1、オメガウェーブ（株））を用いて評価した。
マウスをイソフルラン0.5〜4%麻酔下で、背位に固定し、右後肢（虚血肢）及び左後肢（正常肢）の血流量を測定し、虚血肢／正常肢の血流量を算出した。
結果は平均値±標準偏差（S.E.）で示し、Studentのt検定により有意差（p＜0.05）を評価した。【００６０】
結果を図７に示す。下肢虚血モデルマウスを用いた実験では、スクロースを含む製剤投与群では、対照であるコラーゲン投与群と比較し、有意に血流量が回復した。【００６１】
（実施例７）  本発明の製剤の効果確認３
本発明の製剤の効果確認として、第I - II相臨床試験を以下の通り行った。
１）対象
Fontaine III、IV度に属し、安静時疼痛または虚血性潰瘍・壊死を有する下肢末梢性血管疾患で、あらゆる内科的、外科的治療を施行した後も、臨床症状の改善が得られない患者の内、インフォームドコンセントを得た後に、bFGF含有アテロコラーゲン（AC）に対する皮内反応陰性の症例を対象とした。年齢制限は設けないこととした。
適応除外患者は、下肢血行再建術（外科的バイパス術、PTA）後3ヶ月以内、狭心症・心筋梗塞・うっ血性心不全など重篤な心機能障害を有する患者、膠原病・悪性新生物・感染症・糖尿病性網膜症の患者、妊婦、アテロコラーゲン溶液皮内反応陽性の患者とした。
本実施例の対象とした患者を以下の表２に示す。
【表２】
2012050184.tif 000004
【００６２】
２）方法
腰椎硬膜外麻酔下に、白糖を含むbFGF（製品名：フィブラストスプレー（科研製薬株式会社））200μg含有3%[w/v]アテロコラーゲン（AC）（製品名：コーケンアテロコラーゲンインプラント（株式会社高研））を虚血下肢の腓腹筋に注射した（100μl x 40箇所）。プラセボあるいは無治療群は設定しなかった。【００６３】
３）評価
4週間および6ヶ月目に、bFGF  200μg含有アテロコラーゲン溶液の安全性および治療効果を評価した。
一次エンドポイント：  一次エンドポイントは安全性の確認とした。
二次エンドポイント：  二次エンドポイントは主項目判定と副項目判定の２つの観点から評価した。【００６４】
主項目判定（安静時疼痛、上肢−下肢血圧比[Ankle-brachial blood pressure index, ABI]、6分間歩行距離）
副項目判定（経皮的酸素分圧[transcutaneous oxygen pressure, TcO2]、皮膚灌流圧 [skin perfusion pressure, SPP]）【００６５】
具体的には以下のように評価した。
主項目
（ｉ）安静時疼痛の評価
ビジュアルアナログスケール（Visual analogue scale、VAS）法を用い、最大の痛みを10とし、痛みなしを0として、測定時の痛みを評価した。
（ii）6分間歩行距離
6分間に歩行可能な距離（途中休憩を含む。休憩はいすなどを使わないものとする。）を病棟廊下で測定した。
（iii）ABI: Ankle-brachial blood pressure index; 上肢−下肢血圧比
上腕血圧と足関節血圧の比（上腕血圧／足関節血圧）から算出した。【００６６】
副項目
（ｉ）経皮的酸素分圧測定 (Transcutaneous oxygen pressure: TcO2)
皮膚はあらかじめ43.5度に温め、脛骨粗面より約10cm末梢側前面皮膚にプローブを当て測定した。【００６７】
（結果）
結果を図８に示す。表２に示した両患者は4日間の入院期間中、全身症状、血液、尿検査に変化はなく、予定通り退院した。製剤投与による有害事象は認められなかった。安静時疼痛はいずれの患者も治療前に比べ、製剤投与後、経時的に改善した。ABIは、低値を示したバージャー病患者で改善効果が認められた。6分間歩行距離はいずれの患者も治療前に比べ、改善効果が認められた。TcO2、SPPはいずれも製剤の投与により改善効果が認められた。【００６８】
（参考例２）糖が各種コラーゲン溶液のゲル化能に与える影響の分光学的評価
各種コラーゲン溶液のゲル化能（線維形成能）に対する糖の影響を調べた。
まず、各種コラーゲンを1mM HClにて0.2%[w/v]に希釈した。用いた各種コラーゲンは以下のとおりである。
・Type1アテロコラーゲン(3.5％ KAI：ウシ，Lot.I-107，pH 7)
・Type1アテロコラーゲン(3％ KAI：ブタ，研究所在庫，pH 7)
・Type2アテロコラーゲン(CL-22，Lot.622052，pH 3)
・Type3アテロコラーゲン(NIP，0.3％ PSC-3-100-20，Lot.BSP310G001，5 mM 酢酸)
・Type1 Nativeコラーゲン(1％ I-AC，Lot.6002173，pH 3)
・サメアテロコラーゲン(研究所にて作製したもの。粉末。-30℃保存)【００６９】
0.2%[w/v] 各種コラーゲン溶液に蒸留水（大塚蒸留水、Cat.1324，Lot.0J90N）、2.5 M スクロース（和光純薬工業株式会社，Cat.196-00015，Lot.CKM1674）、100 mg/mL リゾチーム（東京化成株式会社，Cat.L072）および10×PBS（DULBECCO'PBS、大日本住友製薬株式会社，Cat.28-103-05 FN，Lot.896458）を加え、終濃度0.2%[w/v]コラーゲン/0.25 M スクロース/10 mg/mL リゾチーム/1×PBS  の溶液を調製した。この時、混合する順番がコラーゲン→蒸留水→スクロース→リゾチーム→PBSとなるように添加した。
調製したサンプルを96wellマイクロプレートに100 μlずつ添加し，37℃で加温しながら400 nmにおける吸光度の経時的変化（測定間隔30秒，測定時間3時間）を吸光マイクロプレートリーダー（TECAN，サンライズサーモRC-R）で測定した。各時間における測定値の平均（n=3）を算出した。【００７０】
結果を図９に示す。図中、ａはリゾチーム、スクロースを含有せず、0.1%[w/v]コラーゲンのみの製剤、ｂはリゾチームを含有せず、0.25Mスクロース、0.1%[w/v]コラーゲンを含有する製剤、ｃは10mg/mLリゾチーム、0.25Mスクロース、0.1%[w/v]コラーゲンを含有する製剤の結果を示す。Type1・2・3アテロコラーゲン，Type1Nativeコラーゲンおよびサメアテロコラーゲンの各種コラーゲン溶液では、糖の添加によりゲル化が抑制されることがわかった。【００７１】
（参考例３）各種糖がコラーゲン溶液のゲル化能に与える影響の分光学的評価
（１）添加する糖の種類および濃度を変え、繊維形成時間を測定することにより、糖によるコラーゲンン溶液のゲル化抑制能を確認した。
コラーゲンは終濃度3%[w/v]となるように調製した。コラーゲンはKAI(pH 7、PB buffer)を使用した。用いた糖の種類および終濃度は以下の通りである。
（ｉ）単糖：グルコース、またはフルクトース
0.05、0.125、0.25、0.5  M
（ii）二糖：スクロース、またはマルトース
0.05、0.125、0.25  M
（iii）三糖：ラフィノース
0.05  M
（iv）四糖：スタキオース
0.05、0.125  M
なお本参考例では、脱気操作を行わずに測定した。【００７２】
結果を図１０に示す。グルコースおよびフルクトースのグラフにおいて、ａは糖を含有しない製剤、ｂは糖を0.05Mの濃度で含有する製剤、ｃは糖を0.125Mの濃度で含有する製剤、ｄは糖を0.25Mの濃度で含有する製剤、ｅは糖を0.5Mの濃度で含有する製剤の結果を示す。スクロースおよびマルトースのグラフにおいては、ａは糖を含有しない製剤、ｂは糖を0.05Mの濃度で含有する製剤、ｃは糖を0.125Mの濃度で含有する製剤、ｄは糖を0.25Mの濃度で含有する製剤の結果を示す。ラフィノースのグラフにおいては、ａは糖を含有しない製剤、ｂは糖を0.05Mの濃度で含有する製剤の結果を示す。スタオキオースのグラフにおいては、ａは糖を含有しない製剤、ｂは糖を0.05Mの濃度で含有する製剤、ｃは糖を0.125Mの濃度で含有する製剤の結果を示す。0.05Mの糖の比較を示すグラフにおいては、ａは糖を含有しない製剤、ｂはグルコースを含有する製剤、ｃはマルトースを含有する製剤、ｄはラフィノースを含有する製剤、ｅはスタキオースを含有する製剤の結果を示す。単糖および二糖を添加した場合は、濃度依存的にコラーゲンのゲル化が抑制された。また、糖の種類を変えた場合でも、濃度依存的にゲル化抑制を確認することができた。三糖を添加した場合も、糖を添加してない場合と比較して、線維形成時間の遅延が確認された。しかし、四糖は、3%[w/v]コラーゲン溶液では線維形成の遅延が確認され難かった。【００７３】
（２）コラーゲン濃度を0.4%[w/v]にしたこと、コラーゲン溶液としてKSコラーゲン(pH 3)を中和液(7%[w/v]Na2HPO4、0.9%[w/v]NaCl)でpH 7に調製したものを使用した以外は、上記（１）の方法と同様にして、四糖によるゲル化能に対する影響を確認した。四糖としては、（１）と同様にスタキオース  0.05Mを用いた。【００７４】
結果を図１１に示す。図中、ａはスタキオースを含有しない製剤、ｂはスタキオースを含有する製剤の結果を示す。四糖を添加した場合に、コラーゲン溶液の線維形成時間が遅延した。よって、四糖でも、コラーゲン溶液の線維形成が抑制されることを確認できた。四糖に関しては、単糖・二糖・三糖に比べ、線維形成抑制効果が低いと考えられる。【００７５】
（参考例４）各種糖がコラーゲン溶液のゲル化能に与える影響の分光学的評価
添加する糖の種類および濃度を変え、繊維形成時間を測定することにより、糖によるコラーゲンン溶液のゲル化抑制能を確認した。
コラーゲンは終濃度3%[w/v]となるように調製した。コラーゲンはKAI(pH 7、PB buffer)を使用した。用いた糖の種類および終濃度は以下の通りである。
（ｉ）四糖：マルトテトラオース
0.05、0.125  M
（ii）五糖：マルトペンタノース
0.05、0.125  M【００７６】
結果を図１２に示す。図中、ａは糖を含有しない製剤、ｂは0.05Mの糖を含有する製剤、ｃは0.125Mの糖を含有する製剤の結果を示す。マルトテトラオースは、単糖と同レベルの線維形成抑制効果を示した。マルトペンタノースを添加した場合、3%[w/v]コラーゲン溶液では線維形成時間の遅延が殆ど確認できなかった。【００７７】
（参考例５）糖が各種濃度のコラーゲン溶液のゲル化能に与える影響の分光学的評価
コラーゲンと糖の濃度比による影響を確認した。コラーゲンの終濃度が3%[w/v]もしくは0.4%[w/v]となるように調製した。調製方法は終濃度3%[w/v]の場合は参考例３（１）、終濃度0.4%[w/v]の場合は参考例３（２）と同様の方法で作製した。用いた糖の種類はグルコース、スクロース、ラフィノース、スタキオース（参考例２〜３と同様のもの）であり、終濃度0.05Mである。調製した各溶液を37℃で加温しながら400nmにおける吸光度の経時的変化を分光光度計で測定した。【００７８】
結果を図１３に示す。図中、ａは3%[w/v]のコラーゲンを含有する製剤、ｂは0.4%[w/v]のコラーゲンを含有する製剤の結果を示す。等濃度の糖を添加した場合、コラーゲン濃度が低いほど糖による抑制効果が大きくなることがわかった。【００７９】
（参考例６）各種糖がコラーゲン溶液のゲル化能に与える影響の分光学的評価
添加する糖として、グルコースのみから構成される単糖〜五糖までの糖を使用し、線維形成時間を測定することにより、糖によるコラーゲン溶液のゲル化抑制能を確認した。
コラーゲンは終濃度2%[w/v]となるように調製した。コラーゲンはコーケンアテロコラーゲンインプラント[株式会社高研]を使用した。用いた糖は、グルコース[東京化成株式会社]、マルトース[和光純薬工業株式会社]、マルトトリオース[和光純薬工業株式会社]、マルトテトラオース[東京化成株式会社]、マルトペンタノース[和光純薬工業株式会社]である。各種糖を生理食塩水[大塚製薬株式会社]に溶解し、1.25 M糖溶液を調製した。
コラーゲン（終濃度2%[w/v]）と各種糖（終濃度0.3 M）をシリンジに充填し、コネクタを介し直列につなぎ、氷上にて50回往復することにより十分に混合した。1.5  mLサンプリングチューブに移し、遠心脱泡(13000 rpm、4℃)した後、恒温槽(37℃)で加温し、0分、10分、30分、60分、12時間、24時間、3日後でゲル化の様子を観察した。【００８０】
結果を図１４に示す。単糖・二糖・三糖はゲル化抑制効果が大きく，その効果は二糖または三糖が最大となっており、四糖以上の糖の場合、糖鎖が増えるにつれゲル化抑制効果が低くなることが確認された。ゲル化抑制効果が低くなるメカニズムとしては、物理的または電荷的要因による効果の減少が考えられる。【００８１】
（実施例８）  各種濃度のコラーゲン溶液の生体内ゲル化に対する影響の確認
スクロース（終濃度0.25M）[和光純薬工業株式会社]、リゾチーム（終濃度10mg/mL）[東京化成株式会社]およびアテロコラーゲン（終濃度0.05、0.1、0.5、1%[w/v]）（コーケンアテロコラーゲンインプラント[株式会社高研]）の３種類の成分を製剤化した。製剤化は実施例２ｃ）の手法と同様にして、スクロースをアテロコラーゲン溶液と混合し、次いでリゾチームを添加して行った。マウス（ICR、雌、8週齢）の背部皮下の一箇所につき、0.05%[w/v]および0.1%[w/v]コラーゲンを含有する製剤は1 mLずつ、0.5%[w/v]および1%[w/v]コラーゲンを含有する製剤は50 μLずつ投与し、投与24時間後にコラーゲン溶液の状態を観察した。【００８２】
結果を図１５に示す。図中、各写真の左に記載する数値は、製剤中におけるコラーゲンの濃度を表す。0.1%[w/v]および0.05%[w/v]コラーゲン含有製剤および0.5%[w/v]および1%[w/v]コラーゲン含有製剤においてゲル化が確認された。濃度0.05〜1%[w/v]コラーゲン含有製剤(0.25 Mスクロースおよび10 mg/mLリゾチーム含有)は，マウス皮下埋入24時間後にゲル化しうることが確認できた。【００８３】
（実施例９）  各種糖のコラーゲン溶液の生体内ゲル化に対する影響の確認
本発明の製剤において、混合する糖の種類を変えた場合の、マウス皮下24時間後のゲル化状態を観察した。
糖の種類および濃度は以下の表３に記載の通りである。
【表３】
2012050184.tif 000005
表３に記載の各種糖、リゾチーム（終濃度10mg/mL）およびアテロコラーゲン（終濃度3%[w/v]）（コーケンアテロコラーゲンインプラント[株式会社高研]）の３種類の成分を、製剤化した。製剤化は実施例２ｃ）の手法と同様にして、スクロースを生理的食塩水に溶解した後、アテロコラーゲン溶液と混合し、次いで生理的食塩水に溶解したリゾチームを添加して行った。マウス（ICR、雌、9週齢）の背部皮下の一箇所につき、表3に記載の糖を含む各製剤50μLを投与し、投与24時間後に、コラーゲン溶液の状態を確察した。【００８４】
結果を図１６に示す。図１６のａ〜ｊは、各々上記の表３における符号に該当する糖の種類および糖濃度で作製した製剤の場合の結果である。いずれの糖および濃度であっても、全ての製剤においてゲル化を確認することができた。【００８５】
（実施例１０）  各種濃度のコラーゲン溶液の生体内ゲル化に対する影響の確認
本発明の製剤において、コラーゲンの濃度およびマウス皮下埋入時間を変えた場合のゲル化状態を観察した。
スクロース（終濃度0.25M）[和光純薬工業株式会社]、リゾチーム（終濃度10mg/mL）[東京化成株式会社]およびアテロコラーゲン（終濃度0.05,  0.1,  0.5,  1%[w/v]）（コーケンアテロコラーゲンインプラント[株式会社高研]）の３種類の成分を、製剤化した。製剤化は実施例２ｃ）の手法と同様にして、スクロースをアテロコラーゲン溶液と混合し、次いでリゾチームを添加して行った。マウス（ICR、雌、9週齢）の背部皮下の一箇所につき、各製剤100μLを投与し、投与24時間後および48時間後に、コラーゲン溶液の状態を観察した。【００８６】
アテロコラーゲン濃度が1%[w/v]（ａ）、0.5%[w/v]（ｂ）までは24時間後、48時間後でゲル化状態になっていることが観察された（図１７）。0.1%[w/v]、0.05%[w/v]では全くコラーゲンが消失してしまっていた。ゲル化したコラーゲンの濃度や形状も24時間後、48時間後のアテロコラーゲン濃度が1%[w/v]、0.5%[w/v]の間では差が認められなかった。
本発明の製剤は、0.25Mでスクロースを含有するため、浸透圧の関係で体液の水分を吸収した後に糖を放出しながらアテロコラーゲンが線維化を引き起こしゲル化することが予想される。一定濃度以下のサンプルでは長期間の保持性は低いことが予測される。【００８７】
（参考例７）各種糖がコラーゲン溶液のゲル化能に与える影響の分光学的評価
添加する糖として、以下の糖を使用し、繊維形成時間を測定することにより、糖によるコラーゲンン溶液のゲル化抑制能を確認した。
二糖：スクロース
単糖：グルコース、グルクロン酸【００８８】
コラーゲン溶液（pH7.4、終濃度3%[w/v]）（コーケンアテロコラーゲンインプラント[株式会社高研]）に、終濃度が0.01Mとなるよう各種糖溶液を加えて混合し、37℃で加温しながら400nmにおける吸光度の経時的変化を分光光度計で測定した。【００８９】
結果を図１８に示す。図中、ａは糖を含まない製剤、ｂはスクロースを含有する製剤、cはグルコースを含有する製剤、ｄはグルクロン酸を含有する製剤の結果を示す。スクロースおよびグルコースはゲル化の抑制効果が高い。また、単糖類のうち、グルクロン酸はグルコースに比べてゲル化の抑制効果が低い。【００９０】
（実施例１１）本発明の製剤における薬物の徐放能の確認
薬物として高分子のタンパク質（チオグロブリン：Thyroglobulin (669kDa)）を含有する本発明の製剤を作製し、マウス皮下内埋入24時間後のゲル化を観察した。Thyroglobulinの徐放量を経過時間的にHPLC定量測定した。
最終濃度が3%[w/v]アテロコラーゲン、0.25Mショ糖、10mgタンパク質に調整し、本発明の製剤を作製した。3.5%[w/v]アテロコラーゲンLot. I-175、笠井ラック：2.5Mショ糖：100mgタンパク質溶液を（8：1：1）の配合比で混合した。まずは氷上でアテロコラーゲンとショ糖をシリンジ直列につなぎ、50回往復することにより十分に混合した。この混合液にタンパク溶液をマウスの皮下に注入直前にシリンジ往復50回混合を行った。
マウスは日本SLCから購入、ICR種のメスを使用する1週間前に7週令で購入し8週令で使用した。コラーゲン混合液は一箇所につき100μLで3箇所に注入した（n=3）。0、10分、30分、45分、1時間、3時間、6時間、12時間後の各サンプルを摘出し、エッペンチューブ内で80℃に加温してコラーゲンを変性させて溶液状にした。このサンプルをアジレントHPLC、SEC-4ゲルろ過カラムを用いて解析し、ゲル内のタンパク濃度を定量した。HPLCでは、Thyroglobulinは5.927分に溶出される。【００９１】
結果を図１９〜２１に示す。注入後3時間まで急激な放出が観察され、その後、緩やかな徐放速度に代わった。これは体内でのゲル化と密接に関係していると考えられた。混合するタンパク質の分子量に関わらずタンパク質の放出速度は初期の急な放出とゲル化後の緩やかな放出の2層性を示すものであった。混合するショ糖濃度を変えることにより、初期の急な放出速度とゲル化までの時間を変更できる可能性がある。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明の徐放性医薬組成物によれば、生体内において、有効成分である薬物を、即効性のある放出と緩徐な徐放が組み合わされた態様で徐放することが可能となり、薬物の放出速度を制御できるため有用である。本発明によれば薬物の放出速度を制御することが可能となるため、これまで有効性が認められなかった適応症に対しても治療等を行うことができる可能性がある。
また一般的にコラーゲンが添加された医薬組成物を調剤する際、コラーゲンがゲル化しないように温度を管理する必要があるが、本発明の徐放性医薬組成物によれば、糖がコラーゲンに添加されていれば、ゲル化が阻害されるため、室温での調剤可能となり、操作を容易にすることができる。また低温での調剤操作に適用できなかった薬物を使用することが可能となり、有用である。
【図１９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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