(57)【要約】  容易にかつ大量に産生することが可能であり、低濃度でも抗菌力が高く、その上抗菌スペクトルが広く、さらには耐性菌の生じる可能性が低いバクテリオシンを提供する。当該バクテリオシンは、配列表の配列番号１もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列、または、配列表の配列番号１もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／もしくは付加され抗菌活性をもたらすアミノ酸配列を有し、かつ等電点が１２以上であることを特徴とする。
2012108518.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列、または、配列表の配列番号１もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／もしくは付加され抗菌活性をもたらすアミノ酸配列を有し、かつ等電点が１２以上であることを特徴とする、バクテリオシン。
【請求項２】
前記バクテリオシンは、う蝕菌、歯周病菌およびカンジダ菌の全てに対して抗菌性を有することを特徴とする、請求項１に記載のバクテリオシン。
【請求項３】
請求項１または２に記載のバクテリオシン、または、前記バクテリオシンにおいて薬学的に許容される誘導体もしくは薬学的に許容される塩類を有効成分とすることを特徴とする、口腔内疾患の予防、改善および／または治療用組成物。
【請求項４】
前記口腔内疾患の予防、改善および／または治療用組成物は、う蝕菌、歯周病菌および／またはカンジダ菌の増殖抑制剤であることを特徴とする、請求項３に記載の口腔内疾患の予防、改善および／または治療用組成物。
【請求項５】
請求項１または２に記載のバクテリオシンをコードすることを特徴とする、遺伝子。
【請求項６】
請求項５に記載の遺伝子を組み込んで得られることを特徴とする、組み換え発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の組み換え発現ベクターを保有することを特徴とする、宿主細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組み換え発現ベクターにより形質転換されたことを特徴とする、形質転換体。
【請求項９】
前記形質転換体は、細菌であることを特徴とする、請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１０】
ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）を培養する培養工程と、
前記培養工程によって得られた菌体培養物から、請求項１または２に記載のバクテリオシンを抽出する抽出工程と、
を含むことを特徴とする、バクテリオシンの生産方法。
【請求項１１】
前記ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）は、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）ＫＯ１株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１１年１月２４日に寄託申請し受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０６５として受託）、および／または、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）ＫＯ３株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２００９年６月１０日に寄託申請し受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７１として受託）であることを特徴とする、請求項１０に記載のバクテリオシンの生産方法。
【請求項１２】
前記培養工程において、カンジダ菌の死菌を添加することを特徴とする、請求項１０または１１に記載のバクテリオシンの生産方法。
【請求項１３】
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１１年１月２４日に寄託申請し受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０６５として受託されたことを特徴とする、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）ＫＯ１株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口腔内の病気の原因菌に対して抗菌力を発揮するバクテリオシン、該バクテリオシンを有効成分とする口腔内疾患の予防、改善および／または治療用組成物、該バクテリオシンをコードする遺伝子、該遺伝子を組み込んで得られる組み換え発現ベクター、該組み換え発現ベクターを保有する宿主細胞、該組み換え発現ベクターにより形質転換された形質転換体、該バクテリオシンの生産方法、ならびに、該バクテリオシンを産生する新規乳酸菌株のラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、う蝕症および歯周疾患等の口腔内疾患と全身の健康との関連性が重視されている。そこで、う蝕症および歯周疾患等の口腔内疾患の治療方法として、これらの原因菌に対して抗菌力を発揮するペプチドが多く開発されている。例えば、非特許文献１には、ラクトバチルス・ラムノーサスstrain６８株によって産生される、低分子量バクテリオシンのラムノシンＡ（rhamnosin Ａ）について記載されている。【０００３】
また、う蝕菌および歯周病菌等の口腔内疾患の原因菌に対して抗菌力を発揮する、新規な乳酸菌の分離同定についても近年よく行われている。例えば、本発明者は以前、口腔内疾患の原因菌に対して抗菌スペクトルが広く、風味が良く、かつ嗜好性に優れた発酵物を製造可能である、新規乳酸菌株ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ３株（Ｌ８０２０菌）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）ＹＵ３株およびラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）ＹＵ４株を提案した（特許文献１参照）。さらに、口腔内疾患の治療方法のうち、抗菌ペプチドおよび乳酸菌分離株以外の技術では、抗生物質による治療方法も提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１１／００７５８４号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｒ. Dimitrijevic, Ｍ. Stojanovic, Ｉ. Petersen, Ｒ. Ｍ. Jankov, Ｌ. Dimitrijevic, Ｍ. Gavrovic-Jankulovic、２００９、Journal of Applied Microbiology（１０７）、２１０８−２１１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、前述したような種々の抗菌ペプチドの大部分は、ヒト等の哺乳類由来のペプチドであったり、人工的に合成されたペプチドである為、容易にかつ大量にこれらのペプチドを産生することができない。その上、低濃度では抗菌力が弱い為、これらを使用する際には高濃度、すなわち大量の抗菌ペプチドが必要となる。【０００７】
また、抗生物質による治療方法においても、抗生物質の濫用による多剤耐性菌の出現により、その治療効果を得ることができなくなる場合がある。その為、容易にかつ大量に産生でき、低濃度でも抗菌力が高く、さらに耐性菌の生じる可能性が低い、新規なバクテリオシンが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、容易にかつ大量に産生することが可能であり、低濃度でも抗菌力が高く、その上抗菌スペクトルが広く、さらには耐性菌の生じる可能性が低いバクテリオシンの提供を目的とする。また、該バクテリオシン（薬学的に許容される誘導体等を含む）を有効成分とする口腔内疾患の予防、改善および／または治療用組成物、該バクテリオシンをコードする遺伝子、該遺伝子を組み込んで得られる組み換え発現ベクター、該組み換え発現ベクターを保有する宿主細胞、該組み換え発現ベクターにより形質転換された形質転換体、該バクテリオシンの生産方法、ならびに、該バクテリオシンを産生する新規乳酸菌株のラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株の提供も目的とする。【０００９】
本発明者が鋭意研究を行った結果、特許文献１において提案されているラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ３株（Ｌ８０２０菌）（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に２００９年６月１０日に寄託申請し、その後ブダペスト条約に基づく寄託への移管請求を行い受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７１として受託）において産生される、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド（hypothetical protein  ＨＭＰＲＥＦ０５３９＿２９６９、アクセッション番号ＺＰ＿０４４４２４３７．１、以下Ｋｏｇ１）および配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド（hypothetical protein  ＨＭＰＲＥＦ０５３９＿１１６９、アクセッション番号ＺＰ＿０４４４０６３８．１、以下Ｋｏｇ２）が、抗菌スペクトルが広く、低濃度において抗菌力が高く、その上耐性菌の生じる可能性が低い等電点が１２以上のバクテリオシンとして機能することを発見した。【００１０】
また、本発明者が鋭意研究を行った結果、同様にＫｏｇ１およびＫｏｇ２を産生する新規乳酸菌株である、ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１１年１月２４日に寄託申請し受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０６５として受託）の分離同定にも成功した。すなわち、ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ３株およびラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株を用いることにより、抗菌スペクトルが広く、低濃度において抗菌力が高く、その上耐性菌の生じる可能性が低いバクテリオシンＫｏｇ１およびＫｏｇ２を、容易にかつ大量に産生することが可能であることを見出した。【００１１】
さらに、本発明者が鋭意研究を行った結果、バクテリオシンＫｏｇ１およびＫｏｇ２の、抗菌スペクトルが広く、低濃度において抗菌力が高く、耐性菌の生じる可能性が低い理由について解明した。後の実施例７において詳細に述べるが、これは、バクテリオシンＫｏｇ１およびＫｏｇ２が、歯周病菌等のグラム陰性菌が持つ内毒素（ＬＰＳ、Lipopolysaccharide）の不活性化作用を有するためであった。【００１２】
そこで、本発明の第１の態様に係るバクテリオシンは、配列表の配列番号１もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列、または、配列表の配列番号１もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／もしくは付加され抗菌活性をもたらすアミノ酸配列を有し、かつ等電点が１２以上であることを特徴とする。【００１３】
好ましくは、前記バクテリオシンは、う蝕菌、歯周病菌およびカンジダ菌の全てに対して抗菌性を有することを特徴とする。【００１４】
本発明の第２の態様に係る口腔内疾患の予防、改善および／または治療用組成物は、第１の態様に係るバクテリオシン、または、前記バクテリオシンにおいて薬学的に許容される誘導体もしくは薬学的に許容される塩類を有効成分とすることを特徴とする。【００１５】
好ましくは、前記口腔内疾患の予防、改善および／または治療用組成物は、う蝕菌、歯周病菌および／またはカンジダ菌の増殖抑制剤であることを特徴とする。【００１６】
本発明の第３の態様に係る遺伝子は、第１の態様に係るバクテリオシンをコードすることを特徴とする。【００１７】
本発明の第４の態様に係る組み換え発現ベクターは、第３の態様に係る遺伝子を組み込んで得られることを特徴とする。【００１８】
本発明の第５の態様に係る宿主細胞は、第４の態様に係る組み換え発現ベクターを保有することを特徴とする。【００１９】
本発明の第６の態様に係る形質転換体は、第４の態様に係る組み換え発現ベクターにより形質転換されたことを特徴とする。【００２０】
好ましくは、前記形質転換体は、細菌であることを特徴とする。【００２１】
本発明の第７の態様に係るバクテリオシンの生産方法は、
ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）を培養する培養工程と、
前記培養工程によって得られた菌体培養物から、第１の態様に係るバクテリオシンを抽出する抽出工程と、
を含むことを特徴とする。【００２２】
好ましくは、前記ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）は、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）ＫＯ１株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１１年１月２４日に寄託申請し受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０６５として受託）、および／または、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）ＫＯ３株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２００９年６月１０日に寄託申請し受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７１として受託）であることを特徴とする。【００２３】
さらに好ましくは、前記培養工程において、カンジダ菌の死菌を添加することを特徴とする。【００２４】
本発明の第８の態様に係るラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）ＫＯ１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１１年１月２４日に寄託申請し受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０６５として受託されたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、容易にかつ大量に産生することが可能であり、抗菌スペクトルが広く、その上耐性菌の生じる可能性が低いバクテリオシン、該バクテリオシン（薬学的に許容される誘導体等を含む）を有効成分とする口腔内疾患の予防、改善および／または治療用組成物、該バクテリオシンをコードする遺伝子、該遺伝子を組み込んで得られる組み換え発現ベクター、該組み換え発現ベクターを保有する宿主細胞、該組み換え発現ベクターにより形質転換された形質転換体、該バクテリオシンの生産方法、ならびに、該バクテリオシンを産生する新規乳酸菌株ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株を提供することができる。更に、本発明に係るバクテリオシンは耐熱性が高く、例えば煮沸条件下でも抗菌性能は維持されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施例２に係る０．３９から２５μＭにおけるＫｏｇ１のカンジダ・アルビカンスＧＤＨ１８株に対する抗菌力を示す図である。
【図２】実施例２に係る０．３９から１２μＭにおけるＫｏｇ２のカンジダ・アルビカンスＧＤＨ１８株に対する抗菌力を示す図である。
【図３】実施例３に係るＫｏｇ１、Ｋｏｇ２および他の抗菌ペプチドのストレプトコッカス・ソブリナスＢ−１３株に対する抗菌力を示す図である。
【図４】実施例４に係るＫｏｇ１、Ｋｏｇ２および他の抗菌ペプチドのストレプトコッカス・ミュータンスＮＣＴＣ１０４４９株に対する抗菌力を示す図である。
【図５】実施例４に係るＫｏｇ１、Ｋｏｇ２および他の抗菌ペプチドのストレプトコッカス・ミュータンスIngbritt株に対する抗菌力を示す図である。
【図６】実施例５に係るＫｏｇ１、Ｋｏｇ２および他の抗菌ペプチドのアグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンスHudoe００１株に対する抗菌力を示す図である。
【図７】実施例６に係るカンジダの死菌を添加したラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株における、ＤＮＡマイクロアレイでのＫｏｇ１の発現量を示す図である。
【図８】実施例６に係るカンジダの死菌を添加したラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株における、ＤＮＡマイクロアレイでのＫｏｇ２の発現量を示す図である。
【図９】実施例７に係るＬＰＳとＫｏｇ１の量との関係によるｃｃｌ２の分泌量を示す図である。
【図１０】実施例７に係るＬＰＳとＫｏｇ１の量との関係によるＴＮＦ−αの分泌量を示す図である。
【図１１】実施例８に係るＬＰＳとＫｏｇ２の量との関係によるｃｃｌ２の分泌量を示す図である。
【図１２】実施例８に係るＬＰＳとＫｏｇ２の量との関係によるＴＮＦ−αの分泌量を示す図である。
【図１３】ＬＰＳが原因となる種々の疾患等との関係を示す図である。
【図１４】実施例８に係るreal-time quantitative ＲＴ−ＰＣＲのType I collagen／β−アクチンの値を示す図である。
【図１５】実施例９に係る煮沸実験による耐熱データの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本明細書において「有する」、「含む」または「含有する」といった表現は、「からなる」または「から構成される」という意も含むものとする。
【００２８】
（バクテリオシン）
本発明の実施の形態１に係るバクテリオシンは、特定のアミノ酸配列を有し、特定の効果をもたらし、特定の特徴を有する塩基性抗菌ペプチドに関する。より具体的には、本明細書における「バクテリオシン」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する塩基性抗菌ペプチド（Ｋｏｇ１）、または、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する塩基性抗菌ペプチド（Ｋｏｇ２）を挙げることができる。さらに、配列番号１および配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する塩基性抗菌ペプチドにおいて、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されており、抗菌活性をもたらし、かつ等電点が１２以上である塩基性抗菌ペプチドも含まれる。「数個」とは、２ないし８個、好ましくは２ないし６個、より好ましくは２ないし５個、さらに好ましくは２ないし４個である。
【００２９】
このようなＫｏｇ１またはＫｏｇ２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されているアミノ酸配列を有し、かつ抗菌活性をもたらすバクテリオシンの場合、好ましくは、Ｋｏｇ１またはＫｏｇ２と同等の抗菌力および近似した塩基性（等電点）を有する。さらに好ましくは、う蝕菌、歯周病菌およびカンジダ菌の全てに対して抗菌性を有する。
【００３０】
本実施の形態１に係るバクテリオシンは、後の実施の形態４において詳細に述べるラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株またはＫＯ３株等を用いる方法により産生しても構わない。しかし、ペプチド合成法または遺伝子工学的方法等の当該技術分野における人工的な常法によって産生してもよい。遺伝子工学的方法については、後の実施の形態３において詳細に述べる。
【００３１】
ペプチド合成法の場合、液相法または固相法を挙げることができる。液相法は、反応を溶液状態で行い、反応混合物から生成物を単離精製し、この生成物を中間体として次のペプチド伸長反応に用いる方法である。一方、固相法は、反応溶媒に対して不溶の固相担体にアミノ酸を結合させ、このアミノ酸に順次縮合反応を行い、ペプチド鎖を伸長させていく方法である。
【００３２】
具体的に、ペプチド合成は、まず、カルボキシル基を保護したアミノ酸にアミノ基を保護したアミノ酸を脱水縮合させ、ペプチド結合を形成させる。次に、アミノ保護基を除去後、遊離したアミノ基に次のアミノ基保護アミノ酸をＣ末端からＮ末端に向かって一つずつ順次延長させていく。脱水縮合反応では、カルボキシル基を活性化し、結合させようとするアミノ基と反応させる。活性化にはジシクロへキシカルボジイミド（ＤＣＣ）法、活性エステル法、酸無水物法またはアジド法等が挙げられるが、その反応性の高さ、ラセミ化およびその他の副反応を考慮し、適宜選択すればよい。縮合反応時の副反応を防止する為、アミノ酸のアミノ基、カルボキシル基および／または側鎖の官能基には保護基が導入される。これらの保護基は、縮合反応での条件において安定であり、必要な時には速やかに除去可能であるものが好ましい。また、アミノ基の保護基とカルボキシル基の保護基とは、互いに選択的に除去可能であることが好ましい。
【００３３】
アミノ基の保護基としては、例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｂｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｐ−ビフェニルイソプロピロオキシカルボニルまたは９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等を挙げることができる。カルボキシ基の保護基としては、例えば、アルキルエステルまたはベンジルエステル等を形成し得る基を挙げることができる。
【００３４】
ただし、固相法の場合、Ｃ末端のカルボキシル基はクロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂またはｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している為、縮合反応はカルボジイミド等の縮合剤の存在下、またはＮ保護アミノ酸活性エステルもしくはペプチド活性エステルを用いて実施すると好ましい。縮合反応終了後、保護基は除去される。固相法の場合、ペプチドのＣ末端と樹脂との結合も切断される。その後、化学合成されたペプチドは、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、エドマン分解法またはガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）等により精製、解析をすることができる。
【００３５】
このようなペプチド合成法等、または後述の遺伝子工学的方法およびラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株またはＫＯ３株を用いる方法によって産生した本実施の形態１に係るバクテリオシンは、薬学的に許容される該バクテリオシンの誘導体等も含め、次に述べる実施の形態２に係る口腔内疾患の予防、改善および／または治療用組成物の有効成分として利用することが可能となる。
【００３６】
（口腔内疾患の予防、改善および／または治療用組成物）
本発明の実施の形態２は、前述の実施の形態１に係るバクテリオシンおよびその薬学的に許容される誘導体等を有効成分とする、口腔内疾患の予防、改善および／または治療用組成物に関する。本実施の形態２に係る口腔内疾患の予防、改善および／または治療用組成物は、前述の実施の形態１に係るバクテリオシンおよびその薬学的に許容される誘導体等を有効成分としている為、同様の特性を有する。
【００３７】
ここで、実施の形態１において述べたバクテリオシンＫｏｇ１およびＫｏｇ２のアミノ酸配列およびその特徴について簡単に説明すると、塩基性アミノ酸および疎水性アミノ酸の割合が多いという特徴を有する。この特徴は、哺乳類由来の抗菌ペプチドと近似している為、耐性菌が生じる可能性が低い。また、等電点が１２以上であり、高い塩基性の抗菌ペプチドとなることから、細胞毒性が小さくなる。さらに、後述の実施例に示すように、優れた抗菌力を有する。これらのＫｏｇ１またはＫｏｇ２における効果についての詳細は、後述の実施例を参照されたい。
【００３８】
なお、本明細書において、「口腔内疾患」とは、例えば、う蝕菌、歯周病菌および／またはカンジダ菌等によって引き起こされる、口腔内における疾患を意味する。具体的には、例えば、う蝕症（虫歯）、歯肉炎、歯周炎、舌炎、鵞口瘡または口角炎等を挙げることができる。
【００３９】
う蝕菌としては、例えば、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）またはストレプトコッカス・ソブリナス（Streptococcus sobrinus）等を挙げることができる。歯周病菌としては、例えば、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンスHudoe００１（Aggregatibacter actinomycetemcomitans Hudoe００１）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、プレボテラ・インターメディア（Prevotella intermedia）、トレポネーマ・デンティコーラ（Treponema denticola）、タンネレラ・フォーサイセンシス（Tannerella forsythensis）、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Actinobacillus actinomycetemcomitans）またはフソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）等を挙げることができる。カンジダ菌としては、例えば、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・グラブレータ（Candida glabrata）またはカンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）等を挙げることができる。
【００４０】
本明細書において、「口腔内疾患の予防、改善および／または治療用組成物」とは、好ましくは、前述の、う蝕菌、歯周病菌および／またはカンジダ菌の増殖抑制剤となる組成物を意味する。具体的には、う蝕菌、歯周病菌および／またはカンジダ菌の増殖を抑制することができる、食品、医薬品または口腔用組成物等を挙げることができる。
【００４１】
さらに詳細には、食品の場合、例えば、虫歯、歯周病または口腔内感染症等の予防・改善をコンセプトとした、健康食品、サプリメント、特定保健用食品、乳飲料、ヨーグルトまたはチーズ等を挙げることができる。医薬品の場合、例えば、液剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、粉剤、タブレット、カプセル剤、口腔用スプレーまたはトローチ等を挙げることができ、経口投与の投与形態が好ましい。口腔用組成物の場合、例えば、洗口剤、マウスウォッシュ、練歯磨、粉歯磨、水歯磨、口腔用軟膏剤、ゲル剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、グミゼリー、トローチ、タブレット、カプセル、キャンディーまたはチューインガム等を挙げることができる。
【００４２】
なお、本実施の形態２に係る口腔内疾患の予防、改善および／または治療用組成物において、種々の食品、医薬品または口腔用組成物等を調整する為、薬学的に許容される他の組成物を適宜組み合わせてもよい。さらには、当該バクテリオシンおよび当該組成物を誘導体または塩の形態として使用しても構わない。
【００４３】
誘導体としては、バクテリオシンの一部置換体または付加化合物等のペプチド誘導体を挙げることができる。さらに具体的には、例えば、カルボキシル基をアミド化またはアシル化した誘導体を例示することができる。塩の形態としては、塩酸塩、硝酸塩もしくは臭化水素酸塩等の無機酸塩、または、ｐ−トルエンスルホン酸塩、メタスルホン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩もしくは乳酸塩等の有機酸塩等を挙げることができる。
【００４４】
また、これらの食品、医薬品または口腔用組成物等において、前述の実施の形態１に係るバクテリオシンの有効成分としての含有量および一日における投与量は、当該組成物等の種類によって適宜調節することが可能である。
【００４５】
（遺伝子）
本発明の実施の形態３は、前述の実施の形態１に係るバクテリオシンをコードする遺伝子に関する。具体的には、例えば、配列番号３（Ｋｏｇ１）または配列番号４（Ｋｏｇ２）に記載の塩基配列（および／またはその相補鎖）を有する遺伝子、ポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００４６】
このような配列番号３（Ｋｏｇ１）または配列番号４（Ｋｏｇ２）に記載の塩基配列を有する遺伝子は、当該技術分野の当業者であれば常法を用い、ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株またはＫＯ３株からＤＮＡの分離精製、抽出を行うことが可能である。また、例えば、ＤＮＡ合成キット等を使用し人工的にＤＮＡ合成を行っても構わない。
【００４７】
（組み換え発現ベクター）
分離精製またはキット等を用いＤＮＡ合成した遺伝子配列は、前述の実施の形態１に係るバクテリオシンを遺伝子工学的方法において産生する際に用いる、組み換え発現ベクターに利用することができる。本実施の形態４は、前述の実施の形態３の遺伝子を組み込んで得られる、組み換え発現ベクターに関する。当該組み換え方法は、当業者が利用する任意の方法で構わない。組み換え発現ベクターの構築方法としては、例えば、まず、配列番号３（Ｋｏｇ１）または配列番号４（Ｋｏｇ２）の塩基配列を有する遺伝子の合成を行う。次に、合成した遺伝子と当該遺伝子を宿主細胞内で発現させる為の種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサーおよび／または発現レベルを制御する種々のシスエレメント等）とからなる、発現用遺伝子構築物を有する組み換え発現ベクターを宿主細胞に応じて構築する。
【００４８】
（宿主細胞、形質転換体）
このようにして構築した組み換え発現ベクターは、所定の宿主細胞に発現可能に導入される。当該導入方法は、当業者が利用する任意の方法で構わない。本実施の形態５は、該組み換え発現ベクターを保有する、宿主細胞に関する。好ましくは、宿主細胞は、細菌である。例えば、乳酸菌、大腸菌または酵母等を挙げることができる。さらに、実施の形態６は、該組み換え発現ベクターにより形質転換された形質転換体に関する。すなわち、例えば、前述の実施の形態５の組み換え発現ベクターを保有する宿主細胞において形質転換が起こった形質転換細胞が挙げられる。好ましくは、形質転換体は、細菌である。前述と同様に、例えば、乳酸菌、大腸菌または酵母等を挙げることができる。これらの細菌を所定の条件で培養する。これにより、前述の実施の形態１に係るバクテリオシンの宿主細胞（細菌）内での発現および産生が可能となり、容易にかつ大量に抽出、精製することができる。詳細な生産方法については、後述の実施の形態７での乳酸菌ラクトバチルス・ラムノーサスを培養する場合とほぼ同様であるため、参照されたい。
【００４９】
（バクテリオシンの生産方法）
本発明の実施の形態７は、ラクトバチルス・ラムノーサスを用いる、前述の実施の形態１に係るバクテリオシンの生産方法に関する。
【００５０】
具体的には、ラクトバチルス・ラムノーサスを培養する工程と、培養工程によって得られた菌体培養物から、前述の実施の形態１に係るバクテリオシンを抽出する工程と、を含む。好ましくは、当該ラクトバチルス・ラムノーサスは、ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ３株および／または新規乳酸菌株ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株である。
【００５１】
なお、ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株およびＫＯ３株は、例えば、１２１度で２０分間滅菌したＭＲＳ培地等に接種し、３７度において４８時間大気下で前培養し、蒸留水、超純水または緩衝液等で洗浄後、遠心分離等で集菌し、菌体を得ることができる。
【００５２】
ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株およびＫＯ３株はＫｏｇ１およびＫｏｇ２を産生する為、ラクトバチルス属ラムノーサス種の菌株であれば、Ｋｏｇ１およびＫｏｇ２を産生することが示唆される。従って、ラクトバチルス属ラムノーサス種の菌株を大量に培養し、当該技術分野におけるタンパク質抽出の常法（例えば、細胞破砕法等）を用いることにより、産生されたＫｏｇ１およびＫｏｇ２ペプチドを容易にかつ大量に得ることが可能となる。
【００５３】
培養工程では、果汁培地、野菜汁培地、牛乳培地、脱脂粉乳培地、乳成分を含む培地または乳成分を含まない半合成培地等、種々の培地を使用することが可能である。具体的には、例えば、脱脂乳を還元して加熱滅菌した還元脱脂乳培地、酵母エキスを添加した脱脂粉乳培地、ＭＲＳ培地またはＧＡＭ培地等を挙げることができる。
【００５４】
培養方法は、静地培養、ｐＨを一定にした中和培養、回転培養または連続培養等、当該ラクトバチルス・ラムノーサスが良好に生育する条件であれば特に制限はない。ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ３株の詳細な菌学的性質は、実施の形態８において後述する新規乳酸菌株ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株の詳細な菌学的性質とほぼ同様である。
【００５５】
なお、培養工程においてカンジダ属の菌の死菌を添加すると、より大量にＫｏｇ１およびＫｏｇ２を得ることができる為、好ましい（実施例６参照）。
【００５６】
（ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株）
ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１１年１月２４日に寄託申請し受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０６５として受託）は、本発明者によってヒトの口腔内から新規に分離同定された乳酸菌株である。なお、ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株は、ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ３株と同様、Ｋｏｇ１およびＫｏｇ２を産生するラクトバチルス属ラムノーサス種に分類されるが、種々のタンパク質の発現量およびゲノム情報が異なる新規な乳酸菌株である。
【００５７】
ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株は、１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列がラクトバチルス・ラムノーサスstrainＩＤＣＣ３２０１の塩基配列と１４４３／１４４３の間で１００％の相同性を示し、グラム染色後の顕微鏡下においてグラム陽性桿菌の様相を呈することから、ラクトバチルス属ラムノーサス種であると同定された。当該ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株の菌学的性質は、グラム陽性乳酸桿菌、ホモ型乳酸発酵、カタラーゼ陰性、芽胞形成能無し、好気条件下でも培養可能、菌体外多糖類を形成することを特徴とする。
【００５８】
実施の形態７において前述したとおり、本実施の形態８に係る新規乳酸菌株ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株を培養することにより、培養によって得られた菌体培養物から、前述の実施の形態１に係る塩基性抗菌ペプチドＫｏｇ１およびＫｏｇ２を容易にかつ大量に抽出することが可能となるため効果的である。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。【００６０】
（調製例）
本調製例では、被験菌株の調製・培養方法について説明する。【００６１】
カンジダ菌、う蝕菌および歯周病菌としては、カンジダ・アルビカンスＧＤＨ１８株、ストレプトコッカス・ソブリナスＢ−１３株、ストレプトコッカス・ミュータンスＮＣＴＣ１０４４９株、ストレプトコッカス・ミュータンスIngbritt株、ポルフィロモナス・ジンジバリスHudoi００１株、および、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンスHudoe００１株を使用し、各被験菌株は日本国国立大学法人広島大学歯学部および歯科病院において提供を受けた。【００６２】
カンジダ・アルビカンスＧＤＨ１８株は、ＳＤ培地（Difco社）を用い、３７度で２４時間好気条件下で前培養を行った。ストレプトコッカス・ソブリナスＢ−１３株、ストレプトコッカス・ミュータンスＮＣＴＣ１０４４９株およびストレプトコッカス・ミュータンスIngbritt株は、５％の酵母エキス（Difco社）を添加したＴＳＢ培地（Difco社）を用い、３７度で２４時間好気条件下で前培養を行った。ポルフィロモナス・ジンジバリスHudoi００１株、および、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンスHudoe００１株は、ヘミン（５ｍｇ／Ｌ）およびビタミンＫ３（１ｍｇ／Ｌ）を添加したＢＨＩ培地（Difco社）を用い、３７度で９６時間Anaero Pack System（三菱ガス化学株式会社）を使用した嫌気条件下で前培養を行った。【００６３】
培養後、これらのカンジダ菌、う蝕菌および歯周病菌は、１０００×ｇでの遠心分離において集菌し、１ｍＭ、ｐＨ６．８のリン酸塩緩衝液を用いて二回洗浄し、最終濃度が１×１０８ｃｆｕ／ｍｌまたは１×１０７cells／ｍｌとなるよう懸濁した。ストレプトコッカス属の菌株の懸濁には超音波処理も行った。【００６４】
（実施例１）
本実施例１は、Ｋｏｇ１およびＫｏｇ２の合成に関する。【００６５】
まず、バクテリオシンとしての機能を確認する為、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫｏｇ１、および、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＫｏｇ２を、９−フルオレニルメチルオキシカルボニルを保護基、ｐ−ベンゾイルオキシベンジルアルコールを樹脂として用いたティーバッグ法（Helmerhorstらの方法（１９９９））にて合成した。塩基性抗菌ペプチド完成後、５％チオアニソール、５％フェノール、５％精製水および８５％トリフルオロ酢酸の混合物を用い、樹脂からの切断および側鎖での脱保護基を行った。【００６６】
合成後のＫｏｇ１およびＫｏｇ２の等電点（ｐＩ）および分子量（ＭＷ）を測定すると、Ｋｏｇ１はｐＩ＝１２．９０、ＭＷ＝５４８５．５であり、Ｋｏｇ２はｐＩ＝１２．３８、ＭＷ＝４６８６．６であった。抗菌ペプチドにおいて、ｈＢＤ２（ヒトβ−ディフェンシン−２（Eur Ｊ.、２００２、Oral Sci.（１０９）、１２１−１２４参照））が、塩基性の抗菌ペプチドとして有名であり、等電点は１０程度である。しかし、本実施例２に係るＫｏｇ１およびＫｏｇ２の等電点は、当該ｈＢＤ２の等電点よりも高く、哺乳類由来の抗菌ペプチドにより近似しており、すなわち細胞毒性が小さいということが確認された。【００６７】
なお、合成後のペプチドの精製および純度の分析は、高速液体クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーによって行った。さらに、分子量の確認は質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によって行った。【００６８】
（実施例２）
本実施例２は、カンジダ・アルビカンスＧＤＨ１８株に対するＫｏｇ１およびＫｏｇ２の抗菌力の分析に関する。【００６９】
抗菌活性の評価は、Edgertonらの方法（１９９８）にいくらかの変更を加えた方法において行った。前述の調製例に記載の方法において培養・調製しておいたカンジダ・アルビカンスＧＤＨ１８株の懸濁液２０μｌを、前述の実施例１において合成したＫｏｇ１またはＫｏｇ２を０から２５μＭ含ませた１ｍＭリン酸塩緩衝液２０ｍｌに混合し、振動させながら３７度において９０分間インキュベートした。なお、コントロールとしては、１ｍＭリン酸塩緩衝液２０ｍｌのみのものを用いた。反応を３６０ｍｌのＹＮＢ培地（Difco社）を加える事によって停止させ、形成されるコロニー（colony forming units；ＣＦＵｓ）をコントロールのものと共にカウントすることによって、生存する菌のパーセンテージとした。すなわち、（Ｋｏｇ１またはＫｏｇ２を含む懸濁液のＣＦＵｓ／コントロールの懸濁液のＣＦＵｍｌ−１）×１００の式を用い、パーセンテージを算出した。【００７０】
図１は、実施例２に係る０．３９から２５μＭにおけるＫｏｇ１のカンジダ・アルビカンスＧＤＨ１８株に対する抗菌力を示す図である。図２は、実施例２に係る０．３９から１２μＭにおけるＫｏｇ２のカンジダ・アルビカンスＧＤＨ１８株に対する抗菌力を示す図である。図１および図２に示すように、Ｋｏｇ１およびＫｏｇ２とも、いずれも０．３９μＭのペプチド濃度において、カンジダ・アルビカンスＧＤＨ１８株を１００％死滅させていた。【００７１】
同方法および同条件下において、抗真菌剤であるアンホテリシンＢ、牛乳由来抗菌ペプチドであるラクトフェリシンＢ（配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する）、ヒト唾液由来抗菌ペプチドであるヒスタチン５（配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する）、および、特許第３４７２８２１号の抗菌ペプチドであるＪＨ８１９４（配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する）の抗菌力を測定したところ、それぞれ、５μＭで１００％、５μＭで１００％、１００μＭで１００％、２．５μＭで１００％死滅させていた。なお、いずれも実施例１と同様にティーバッグ法でペプチド合成を行った。【００７２】
この結果から、抗菌ペプチドＫｏｇ１およびＫｏｇ２は、これらいずれの抗真菌剤および抗菌ペプチドよりも低濃度において、すなわち少量でカンジダ菌を死滅させることができるということが証明された。【００７３】
（実施例３）
本実施例３は、ストレプトコッカス・ソブリナスＢ−１３株に対するＫｏｇ１およびＫｏｇ２の抗菌力の分析に関する。具体的には、ｈＢＤ２およびリゾチームタンパク（Lysozyme）と抗菌力を比較した実施例を示す。【００７４】
ストレプトコッカス・ソブリナスＢ−１３株は、調製例にて述べた方法において培養、調製しておいた。抗菌力の評価方法は、前述の実施例２と同様の方法を用いて評価した。なお、各抗菌ペプチドの濃度が０から１００μＭの場合について評価した。【００７５】
図３は、実施例３に係るＫｏｇ１、Ｋｏｇ２および他の抗菌ペプチドのストレプトコッカス・ソブリナスＢ−１３株に対する抗菌力を示す図である。なお、図３の横軸のペプチド濃度（Concentration of peptide）については、対数軸で示されている。図３に示すように、ｈＢＤ２は、濃度が３．１２５μＭでストレプトコッカス・ソブリナスＢ−１３株を１００％死滅させていた。リゾチームタンパクは、完全にストレプトコッカス・ソブリナスＢ−１３株を死滅させることはできなかった。一方、Ｋｏｇ１は濃度が１．５６μＭで、Ｋｏｇ２は濃度が０．３９μＭで、ストレプトコッカス・ソブリナスＢ−１３株を１００％死滅させていた。従って、被験菌株がストレプトコッカス・ソブリナスＢ−１３株の場合でも、低濃度で死滅可能ということが証明された。【００７６】
（実施例４）
本実施例４は、ストレプトコッカス・ミュータンス菌に係るＫｏｇ１およびＫｏｇ２の抗菌力の分析に関する。具体的には、前述の実施例３と同様に、ｈＢＤ２およびリゾチームタンパクと抗菌力を比較した実施例を示す。【００７７】
ストレプトコッカス・ミュータンスＮＣＴＣ１０４４９株およびストレプトコッカス・ミュータンスIngbritt株は、前述の調製例の方法において培養、調製しておいた。抗菌力の評価方法は、前述の実施例３と同様の方法を用いて評価、比較した。なお、いずれのミュータンス菌についても、抗菌ペプチドの濃度が０から１００μＭの場合について評価、比較した。【００７８】
図４は、実施例４に係るＫｏｇ１、Ｋｏｇ２および他の抗菌ペプチドのストレプトコッカス・ミュータンスＮＣＴＣ１０４４９株に対する抗菌力を示す図である。図５は、実施例４に係るＫｏｇ１、Ｋｏｇ２および他の抗菌ペプチドのストレプトコッカス・ミュータンスIngbritt株に対する抗菌力を示す図である。図４および図５の横軸のペプチド濃度（Concentration of peptide）については、対数軸で示されている。図４および図５に示すように、やはり、ミュータンス菌に関しても、他の抗菌ペプチドと比べると、Ｋｏｇ１およびＫｏｇ２は比較的低濃度において多量のミュータンス菌を死滅させることができると評価される。【００７９】
また、図示していないが、Ｋｏｇ１およびＫｏｇ２はポルフィロモナス・ジンジバリスHudoi００１株に対しても抗菌力を発揮することが評価された。この結果は、本発明者の発見したラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ３株が、ポルフィロモナス・ジンジバリスHudoi００１株についても抗菌力を発揮することが特許文献１の実施例により評価、記載されていることからも示唆されることである。すなわち、特許文献１に記載の実施例を考慮すると、ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ３株がＫｏｇ１およびＫｏｇ２を発現し、該Ｋｏｇ１およびＫｏｇ２がポルフィロモナス・ジンジバリスHudoi００１株に対する抗菌力を発揮していたと推測される。これらを踏まえると、Ｋｏｇ１およびＫｏｇ２は、他のポルフィロモナス属ジンジバリス種の菌株（歯周病菌等）に対しても同様の抗菌力を発揮することが示唆される。【００８０】
（実施例５）
さらに、本発明者はその他の歯周病菌に対する抗菌力についても分析した。本実施例５は、歯周病菌アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンスHudoe００１株に係るバクテリオシンＫｏｇ１およびＫｏｇ２の抗菌力の分析に関する。具体的には、前述と同様のｈＢＤ２およびヒスタチン５、さらにラクトフェリシンＢおよびラクトフェリシンＨ（ヒト由来ラクトフェリシン）と抗菌力を比較した実施例を示す。【００８１】
アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンスHudoe００１株は、前述の調製例の方法において培養、調製しておいた。抗菌力の評価方法は、前述の実施例３と同様の方法を用いて評価、比較した。なお、それぞれの抗菌ペプチドの濃度が０から５０μＭの場合について評価、比較した。【００８２】
図６は、実施例５に係るＫｏｇ１、Ｋｏｇ２および他の抗菌ペプチドのアグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンスHudoe００１株に対する抗菌力を示す図である。なお、図６の横軸のペプチド濃度（Concentration of peptide）については、対数軸で示されている。図６に示すように、Ｋｏｇ１が３．１３μＭ、Ｋｏｇ２が１．５６μＭにおいて、歯周病菌アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンスHudoe００１株を１００％死滅させた。これは、ラクトフェリシンＢまたはｈＢＤ２と同等か、それ以上の抗菌性である。【００８３】
（実施例６）
本実施例６は、カンジダの死菌を添加しながらのラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株の培養に関する。具体的には、カンジダ・アルビカンスＧＤＨ１８株の死菌の非存在下および存在下において、ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株を培養し、Ｋｏｇ１およびＫｏｇ２の発現量をＤＮＡマイクロアレイシステムによって測定した。【００８４】
まず、０、２、４および６μｇのカンジダ・アルビカンスＧＤＨ１８株の死菌を含む５ｍｌのＭＲＳ培地の中に、２０μｌのラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株懸濁液を接種し、３７℃において４８時間インキュベートした。インキュベート後、菌をすぐに１００ｍｌのＲＮＡprotect reagent（Qiagen）および９００ｍｌのリファピン（２５ｍg／ｍｌメタノール）（Sigma-Aldrich）の中へ懸濁した。その後、ボルテックスによって１５分間混合し、室温において１０分間インキュベートした。これらの処理の後、遠心分離により菌を集菌し、上清を廃棄し、−２０℃において保存しておいたペレットからＲＮＡ抽出キットによって精製した。このように前処理を行い、その後、マイクロアレイデータの統計分析をNimbleGenマイクロアレイ解析用ソフトウェアを用い、分析を行った。【００８５】
図７は、実施例６に係るカンジダの死菌を添加したラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株における、ＤＮＡマイクロアレイでのＫｏｇ１の発現量を示す図である。図８は、実施例６に係るカンジダの死菌を添加したラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株における、ＤＮＡマイクロアレイでのＫｏｇ２の発現量を示す図である。図７および図８のいずれにおいても、左端のＫＯ１株のみの培養に比べ、カンジダ（ＣａＧＤＨ１８）の死菌を共存させて培養した場合の方が、その量に依存し（左から２、４および６μｇ）、Ｋｏｇ１およびＫｏｇ２とも発現量が増加していた。【００８６】
これらの実施例の結果から、新規乳酸菌株ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株、ならびに同様にＫｏｇ１およびＫｏｇ２を産生するラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ３株を培養することにより、抗菌スペクトルが広く（う蝕菌、歯周病菌およびカンジダ菌）、その上耐性菌の生じる可能性が低い等電点１２以上のバクテリオシンＫｏｇ１およびＫｏｇ２を、容易にかつ大量に産生することが可能であることが証明された。さらに、ラクトバチルス属ラムノーサス種の他の菌株においても、バクテリオシンＫｏｇ１およびＫｏｇ２を容易にかつ大量に産生することが可能であることが示唆される。また、これらの結果から、当該バクテリオシンＫｏｇ１またはＫｏｇ２をコードする遺伝子を組み込んで得られる組み換え発現ベクターで形質転換させた乳酸菌または大腸菌等の細菌を培養することによっても、優れた抗菌力を有するバクテリオシンＫｏｇ１またはＫｏｇ２を容易にかつ大量に産生することができることは、当該技術分野の当業者にとって当然である。【００８７】
（実施例７）
本実施例７では、実施例１ないし６において証明された、バクテリオシンＫｏｇ１およびＫｏｇ２の抗菌スペクトルの広さ、および塩基性の等電点による耐性菌の生じ難さについて検討した。なお、本発明者は、バクテリシオンＫｏｇ１およびＫｏｇ２が、歯周病菌等のグラム陰性菌の持つＬＰＳを不活性化しているのではないかと予測し、ＬＰＳとバクテリオシンＫｏｇ１およびＫｏｇ２との関係について分析した。【００８８】
まず、培地には、１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）（Biological industries, Haemek, Israel）、１％抗生物質、および１％Ｌ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地を使用した。２４−well plateに、それぞれ前述の培地４００μｌずつを添加し、マウス由来ＲＡＷ２６４．７マクロファージ様細胞を、１００，０００cells／well播種しておいた。【００８９】
なお、バクテリオシンＫｏｇ１またはＫｏｇ２は、実施例１と同様のものを使用し、エッペンチューブにおいて、次の四つの条件で、Porphyromonas gingivalis ＬＰＳ（InvivoGen社製）（以下、Ｐ．ｇ−ＬＰＳ）と、前述と同様の培地と共に、３７度、５％ＣＯ２気相下において２時間インキュベートを行った。（１）１００ｎｇ／ｍｌ  Ｐ．ｇ−ＬＰＳ  positive control、（２）１００ｎｇ／ｍｌ  Ｐ．ｇ−ＬＰＳ＋５μＭＫｏｇ１またはＫｏｇ２、（３）１００ｎｇ／ｍｌ  Ｐ．ｇ−ＬＰＳ＋１０μＭＫｏｇ１またはＫｏｇ２、（４）１００ｎｇ／ｍｌ  Ｐ．ｇ−ＬＰＳ＋２０μＭＫｏｇ１またはＫｏｇ２。【００９０】
最初に述べたそれぞれの２４−well plateの培地をピペットマンを用いて吸った後、前述の四つの条件のそれぞれのエッペンチューブの培地を入れて、well plateの細胞と共に、３７度、５％ＣＯ２気相下において１２時間培養した。その後、培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法で培地中に分泌されたケモカインのｃｃｌ２の量、またはサイトカインのＴＮＦ−αの量を、吸光度４５０ｎｍマイクロプレートリーダーを用いて定量した。これらはいずれも炎症の形成に関与する為、内毒素であるＬＰＳと、バクテリオシンＫｏｇ１およびＫｏｇ２との関係を分析することができる。【００９１】
図９は、実施例７に係るＬＰＳとＫｏｇ１の量との関係によるｃｃｌ２の分泌量を示す図である。すなわち、ＬＰＳとＫｏｇ１とを用いて２時間のインキュベートを行った際の、分泌されたケモカインのｃｃｌ２の量（Ｋｏｇ１が０μＭの場合を１００％とする）を示す（ＬＰＳ＋ｋｏｇ１→cell ｃｃｌ２）。図９では、＊（有意水準）＝ｐ＜０．０５、＊＊（有意水準）＝ｐ＜０．０１であり、ｎ＝３である。図９に示すように、Ｋｏｇ１の添加量が増加するほど、分泌されたケモカインのｃｃｌ２の量が減少していた。すなわち、バクテリオシンＫｏｇ１は、ＬＰＳの不活性化作用を有するということが解った。【００９２】
図１０は、実施例７に係るＬＰＳとＫｏｇ１の量との関係によるＴＮＦ−αの分泌量を示す図である。すなわち、ＬＰＳとＫｏｇ１とを用いて２時間のインキュベートを行った際の、分泌されたサイトカインのＴＮＦ−αの量（Ｋｏｇ１が０μＭの場合を１００％とする）を示す（ＬＰＳ＋ｋｏｇ１→cell ＴＮＦ−α）。図１０では、＊＊（有意水準）＝ｐ＜０．０１であり、ｎ＝３である。図１０に示すように、Ｋｏｇ１の添加量が増加するほど、分泌されたサイトカインのＴＮＦ−αの量が減少していた。すなわち、図９に示す結果と同様に、バクテリオシンＫｏｇ１は、ＬＰＳの不活性化作用を有するということが解った。【００９３】
図１１は、実施例７に係るＬＰＳとＫｏｇ２の量との関係によるｃｃｌ２の分泌量を示す図である。すなわち、ＬＰＳとＫｏｇ２とを用いて２時間のインキュベートを行った際の、分泌されたケモカインのｃｃｌ２の量（Ｋｏｇ２が０μＭの場合を１００％とする）を示す（ＬＰＳ＋ｋｏｇ２→cell ｃｃｌ２）。図１１では、＊（有意水準）＝ｐ＜０．０５、＊＊（有意水準）＝ｐ＜０．０１であり、ｎ＝３である。図１１に示すように、Ｋｏｇ２の添加量が少量の場合（５μＭ）は分泌されたケモカインのｃｃｌ２の量は増加してしまうが、添加量がある一定量を超えると、添加量が増加するほどｃｃｌ２の量が減少していくことが示唆される。すなわち、Ｋｏｇ２も、多量を添加することによって、ＬＰＳの不活性化作用を有するということが解った。【００９４】
図１２は、実施例７に係るＬＰＳとＫｏｇ２の量との関係によるＴＮＦ−αの分泌量を示す図である。すなわち、ＬＰＳとＫｏｇ２とを用いて２時間のインキュベートを行った際の、分泌されたサイトカインのＴＮＦ−αの量（Ｋｏｇ２が０μＭの場合を１００％とする）を示す（ＬＰＳ＋ｋｏｇ２→cell ＴＮＦ−α）。図１２では、＊＊（有意水準）＝ｐ＜０．０１であり、ｎ＝３である。図１２に示すように、Ｋｏｇ２の添加量が少量の場合（５μＭ）は分泌されたサイトカインのＴＮＦ−αの量は増加してしまうが、添加量がある一定量を超えると、添加量が増加するほどＴＮＦ−αの量が減少していくことが示唆される。すなわち、図１１に示す結果と同様に、多量を添加することによって、ＬＰＳの不活性化作用を有するということが解った。【００９５】
このように図９ないし図１２の結果から、バクテリオシンＫｏｇ１およびＫｏｇ２の優れた抗菌力等は、少なくともバクテリオシンＫｏｇ１およびＫｏｇ２が有するＬＰＳの不活性化作用に関連していることが解った。また、バクテリオシンＫｏｇ１およびＫｏｇ２がＬＰＳの不活性化作用を有するということは、これまでに解明されている、内毒素であるＬＰＳが関連するその他の疾患等の予防、または治療法に利用できることが示唆される。このような疾患には、口腔内疾患以外にも、骨吸収、慢性炎症の助長、肝障害、糖尿病および動脈硬化等を挙げることができる。図１３は、ＬＰＳが原因となる種々の疾患等との関係を示す図である。図１３に示すように、内毒素であるＬＰＳは様々な物質を経由し、多くの疾患または治療機構に関与している。【００９６】
（実施例８）
そこで、本発明者は、口腔内疾患以外にも、Ｋｏｇ２が骨芽細胞の分化に影響を与えるか否かをreal-time quantitative ＲＴ（Reverse transcriptase）−ＰＣＲによって調べた。【００９７】
細胞は、マウス由来骨芽細胞様細胞のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を使用した。当該ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、１０％ＦＢＳ（Biological industries, Haemek, Israel）、Ｌ−グルタミン、抗生物質混合物（Invitrogen）、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（Sigma）、および、Ｋｏｇ２を０ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭまたは１０００ｎＭを含有したα変法イーグル培地（α−ＭＥＭ）中において、３７度、５％ＣＯ２の下、プラスチック上またはチタン上において培養した。このように培養したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞から、TRIzol reagent（Invitrogen）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ReverTra Ace reverse transcriptase（東洋紡）を用いてｃＤＮＡを作製した。その後、作製したｃＤＮＡを用い、real-time quantitative ＲＴ−ＰＣＲによって、骨芽細胞の分化マーカーであるType-I collagenと、内在性コントロールであるβ−アクチンの発現を解析した。【００９８】
real-time quantitative ＲＴ−ＰＣＲにおいて、Type-I collagenでは配列番号８に記載のフォワードプライマー、配列番号９に記載のリバースプライマー、配列番号１０に記載のプローブを使用した。β−アクチンでは、配列番号１１に記載のフォワードプライマー、配列番号１２に記載のリバースプライマー、配列番号１３に記載のプローブを使用した。【００９９】
図１４は、実施例８に係るreal-time quantitative ＲＴ−ＰＣＲのType I collagen／β−アクチンの値を示す図である。図１４に示すように、Ｋｏｇ２を２５０ｎＭ添加した場合が、全くＫｏｇ２を添加していない場合（ctrl（０μＭ））と比較して、３倍近くType I collagen／β−アクチンの値が増加していた。今回の実験においては、Ｋｏｇ２を２５０ｎＭ程度添加した場合、骨芽細胞の分化が最も促進されるということが判った。すなわち、バクテリオシンＫｏｇ２は、種々の骨疾患にも利用できることが充分に示唆される。【０１００】
（実施例９）
さらに、本発明者は、バクテリオシンＫｏｇ１およびＫｏｇ２が加熱された場合でも同様の抗菌力を有するか否かを煮沸実験によって調べた。【０１０１】
本実施例９では、カンジダ・アルビカンスＭＹＡ２７４株を対象として抗菌力を調べた。まず、カンジダ・アルビカンスＭＹＡ２７４株をサブロー・ブドウ糖液状培地（Sabouraud Dextrose Broth）（Difco）を用いて３７度で２４時間前培養し、ＭＱ水で２回洗浄後、ＯＤ６００で０．３（１．０×１０７cells／ｍｌ）となるよう調製しておいた。【０１０２】
なお、本実施例９では、バクテリオシンＫｏｇ１もしくはＫｏｇ２、またはラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株もしくはＫＯ３株を直接使用せず、ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ３株が含まれた乳酸菌培地である、８０２０ヨーグルト（ドリンクタイプ）を使用して実験を行った。具体的には、当該８０２０ヨーグルト（ドリンクタイプ）は、１５％脱脂乳＋３％ブドウ糖培地に、ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ３株１％とＹＦ−Ｌ８１１スターター１％とを添加し、３５度で二日間培養したものである。より詳細には、その他の原材料として、果糖ブドウ糖液糖、乳製品、砂糖、安定剤（ペクチン）、酸味料および香料を含み、Brixが１７．４％、乳酸酸度が０．５７％、ｐＨが３．９６、無脂乳固形分が３．０％に調製されているものである。【０１０３】
実験には、このような８０２０ヨーグルト（ドリンクタイプ）を遠沈し、乳酸菌を除去した上清（以下、上清Ｂ）と、当該上清Ｂを１００度２０分間で煮沸したもの（以下、上清Boil）とを使用した。なお、これまでの実施例の結果から、上清Ｂにはラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ３株より抽出されたバクテリオシンＫｏｇ１およびＫｏｇ２が含有されているものと考えられる。【０１０４】
煮沸による抗菌力の変化を調べるため、２４−well plateを用い、以下に述べる三種類の試料を注入し、３７度２４時間後のＡＴＰの値（ｐｍｏｌ／Ｌ）を測定した。三種類の試料は、１）サブロー液状培地（Sabouraud Broth）１ｍｌ、上清Ｂ１ｍｌおよび前述のカンジダ・アルビカンスＭＹＡ２７４株調製液５０μｌを含むものと、２）サブロー液状培地（Sabouraud Broth）１ｍｌ、上清Boil１ｍｌおよび前述のカンジダ・アルビカンスＭＹＡ２７４株調製液５０μｌを含むものと、３）コントロールとしてのサブロー液状培地（Sabouraud Broth）１ｍｌ、１５％脱脂乳＋３％ブドウ糖培地１ｍｌおよび前述のカンジダ・アルビカンスＭＹＡ２７４株調製液５０μｌを含むものである。【０１０５】
図１５は、実施例９に係る煮沸実験による耐熱データの結果を示す図である。当該耐熱データは、各々の試料を四つずつ作製し、平均値±ＳＤを算出したものである。図１５に示すように、１００度２０分間煮沸した上清Boilでも上清Ｂと同様のＡＴＰの量が測定されているため、煮沸した上清Boilでも上清Ｂと同様の高い抗菌性を有することが確認された。すなわち、バクテリオシンＫｏｇ１およびＫｏｇ２が加熱された場合でも同様の抗菌力を有することが確認された。【０１０６】
本発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。【０１０７】
本明細書の中で明示した論文および公開特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。【０１０８】
本出願は、２０１１年２月１０日に出願された日本国特許出願２０１１−２７８８２号および２０１１年８月２６日に出願された日本国特許出願２０１１−１８４６５５号に基づく。本明細書中に、日本国特許出願２０１１−２７８８２号および日本国特許出願２０１１−１８４６５５号の、明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明者らは、ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ３株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２００９年６月１０日に寄託申請し受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７１として受託）において、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫｏｇ１および配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＫｏｇ２が、抗菌スペクトルが広く、低濃度において抗菌力が高く、その上耐性菌の生じる可能性が低いバクテリオシンとして機能していることを発見した。さらに、同様にＫｏｇ１およびＫｏｇ２を産生する新規乳酸菌株ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１１年１月２４日に寄託申請し受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０６５として受託）の分離同定にも成功した。【０１１０】
そこで、本発明によれば、容易にかつ大量に産生することが可能であり、抗菌スペクトルが広く、その上耐性菌の生じる可能性が低いバクテリオシン、該バクテリオシン（薬学的に許容される誘導体等を含む）を有効成分とする口腔内疾患の予防、改善および／または治療用組成物、該バクテリオシンをコードする遺伝子、該遺伝子を組み込んで得られる組み換え発現ベクター、該組み換え発現ベクターを保有する宿主細胞、該組み換え発現ベクターにより形質転換された形質転換体、ならびに、該バクテリオシンの生産方法を提供することができる。また、該バクテリオシンを産生する新規乳酸菌ラクトバチルス・ラムノーサスＫＯ１株も提供することができる。更に、本発明に係るバクテリオシンは耐熱性が高いため、工業加工が容易となる。特に、グミゼリー、トローチ、タブレット、キャンディーまたはチューインガム等は、成形加工時に熱を伴うため、耐熱性を有する本発明に係るバクテリオシンを用いる際に、抗菌効果を落とすことなく加工することが可能となる。また、例えば、ご飯またはスープ等の調理を行う食品に添加しても当該バクテリオシンの効果を失うことはないため、様々な用途に繋がることが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図７】
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【図８】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年9月4日(2012.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列、または、配列表の配列番号１もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／もしくは付加されているアミノ酸配列を有し、
う蝕菌、歯周病菌およびカンジダ菌に対して抗菌性を持ち、
等電点が１２以上であることを特徴とする、塩基性抗菌ペプチド。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
請求項１に記載の塩基性抗菌ペプチド、または、前記塩基性抗菌ペプチドにおいて薬学的に許容される誘導体もしくは薬学的に許容される塩類を有効成分とすることを特徴とする、口腔内疾患の予防、改善および／または治療用組成物。
【請求項４】
前記口腔内疾患の予防、改善および／または治療用組成物は、う蝕菌、歯周病菌および／またはカンジダ菌の増殖抑制剤であることを特徴とする、請求項３に記載の口腔内疾患の予防、改善および／または治療用組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の塩基性抗菌ペプチドをコードすることを特徴とする、遺伝子。
【請求項６】
請求項５に記載の遺伝子を組み込んで得られることを特徴とする、組み換え発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の組み換え発現ベクターを保有することを特徴とする、宿主細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組み換え発現ベクターにより形質転換されたことを特徴とする、形質転換体。
【請求項９】
前記形質転換体は、細菌であることを特徴とする、請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１０】
ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）を培養する培養工程と、
前記培養工程によって得られた菌体培養物から、請求項１に記載の塩基性抗菌ペプチドを抽出する抽出工程と、
を含むことを特徴とする、塩基性抗菌ペプチドの生産方法。
【請求項１１】
前記ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）は、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＫＯ１株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１１年１月２４日に寄託申請し受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０６５として受託）、および／または、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＫＯ３株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２００９年６月１０日に寄託申請し受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−７７１として受託）であることを特徴とする、請求項１０に記載の塩基性抗菌ペプチドの生産方法。
【請求項１２】
前記培養工程において、カンジダ菌の死菌を添加することを特徴とする、請求項１０または１１に記載の塩基性抗菌ペプチドの生産方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の塩基性抗菌ペプチドを産生し、
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１１年１月２４日に寄託申請し受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０６５として受託されたことを特徴とする、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＫＯ１株。
【国際調査報告】
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