(57)【要約】  本発明は、ＡＴＦ６を介した経路の活性化を評価する系を提供することを目的とする。すなわち、本発明は、ＡＴＦ６を介した経路を活性化する小胞体ストレッサーのスクリーニング方法を提供することを目的とし、さらにはＡＴＦ６を介した経路の活性化によって引き起こされる小胞体ストレスを抑制する物質のスクリーニング方法、及び抗糖尿病薬候補物質のスクリーニング方法をも提供することをも目的とする。  本発明者等は、鋭意研究を重ねた結果、蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン、及びＡＴＦ６タンパク質ドメインをコードするポリヌクレオチドを用いることにより、ＡＴＦ６を介した経路の活性化を、生細胞の状態でリアルタイムに且つ高感度に評価できることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非蛍光ペプチドドメイン１と非蛍光ペプチドドメイン２とからなる蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン１、及びＡＴＦ６タンパク質ドメインを有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
５’末端側に蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン１をコードする領域を有し、３’末端側にＡＴＦ６タンパク質ドメインをコードする領域を有する、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン１と、ＡＴＦ６タンパク質ドメインとがスペーサーを介して連結してなるアミノ酸配列をコードする、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
【請求項６】
更に、非蛍光ペプチドドメイン１と非蛍光ペプチドドメイン２とからなる蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン２、及び核移行シグナルペプチドドメインを有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、該アミノ酸配列からなるタンパク質が発現可能な状態で含有する、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項４に記載のベクター、並びに非蛍光ペプチドドメイン１と非蛍光ペプチドドメイン２とからなる蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン２、及び核移行シグナルペプチドドメインを有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、該アミノ酸配列からなるタンパク質が発現可能な状態で含有する膵臓β細胞である、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
下記の工程（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を含む、小胞体ストレッサーのスクリーニング方法：
（ａ）小胞体ストレッサー候補物質と、請求項６に記載の形質転換体とを接触させる工程、
（ｂ）小胞体ストレッサー候補物質を接触させた形質転換体の蛍光強度を測定し、該蛍光強度を、小胞体ストレッサー候補物質を接触させない対照形質転換体の蛍光強度と比較する工程、
（ｃ）小胞体ストレッサー候補物質を接触させた形質転換体の蛍光強度が、該対照形質転換体の蛍光強度よりも高い場合に、該小胞体ストレッサー候補物質を小胞体ストレッサーとして選択する工程。
【請求項９】
小胞体ストレッサーが、
ＡＴＦ６経路を活性化し、且つＩＲＥ１α経路及びＰＥＲＫ経路を活性化しない小胞体ストレッサー、又は
ＡＴＦ６経路を活性化し、且つＩＲＥ１α経路及び／若しくはＰＥＲＫ経路を活性化する小胞体ストレッサー
である、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
下記の工程（ｄ）、（ｅ）、及び（ｆ）を含む、小胞体ストレス抑制剤のスクリーニング方法：
（ｄ）小胞体ストレッサー及び被検物質と、請求項６に記載の形質転換体とを接触させる工程、
（ｅ）小胞体ストレッサー及び被検物質を接触させた形質転換体の蛍光強度を測定し、該蛍光強度を、被検物質を接触させずに小胞体ストレッサーを接触させた対照形質転換体の蛍光強度と比較する工程、
（ｆ）小胞体ストレッサー及び被検物質を接触させた形質転換体の蛍光強度が、該対照形質転換体の蛍光強度よりも低い場合に、該被検物質を小胞体ストレス抑制剤として選択する工程。
【請求項１１】
下記の工程（ｇ）、（ｈ）、及び（ｉ）を含む、抗糖尿病薬候補物質のスクリーニング方法：
（ｇ）小胞体ストレッサー及び被検物質と、請求項７に記載の形質転換体とを接触させる工程、
（ｈ）小胞体ストレッサー及び被検物質を接触させた形質転換体の蛍光強度を測定し、該蛍光強度を、被検物質を接触させずに小胞体ストレッサーを接触させた対照形質転換体の蛍光強度と比較する工程、
（ｉ）小胞体ストレッサー及び被検物質を接触させた形質転換体の蛍光強度が、対照形質転換体の蛍光強度よりも低い場合に、該被検物質を抗糖尿病薬候補物質として選択する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小胞体ストレッサー、小胞体ストレス抑制剤、又は抗糖尿病薬候補物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病発症に関わる生体ストレスとしては酸化ストレスが知られており、最近になり、新たなストレスとして小胞体ストレスが見出され、酸化ストレスと同様に、糖尿病への関与が次第に明らかにされている。【０００３】
小胞体ストレスとは、小胞体内において生合成途中の不安定なタンパク質が物理・化学的刺激によって正常な折り畳み構造の構築に失敗し、異常タンパク質となって小胞体に蓄積する状態を言う。小胞体内では、生合成途中の不安定なタンパク質は物理・化学的刺激を受けやすく、その刺激によって異常な折り畳み構造を持つ異常タンパク質へと変化する。小胞体で正しく折り畳まれたタンパク質はゴルジ体へと運ばれるが、折り畳みに失敗した前記異常タンパク質は小胞体内に貯留されることになる。【０００４】
細胞は、このような小胞体ストレスに対して、通常少なくとも下記の３種類の方法で対抗していると考えられている。（１）小胞体内の分子シャペロンなどを増やして、小胞体に蓄積した蛋白を保護する（UPR：unfolded protein response）；（２）小胞体に流入する蛋白を減らして、負荷を軽減する；（３）小胞体で蓄積した蛋白を細胞質で分解する（ERAD：ER associated protein degradation)。【０００５】
しかし、これらの防御機構に対し、ストレスが遙かに大きい場合、あるいは防御機構のどこかに問題があってうまく働かない場合、ある種の細胞死が起こると考えられている。こうした小胞体ストレス由来の細胞死の特徴は、形態的にアポトーシスの特徴を示し、またCHOP、JNK、caspaseと呼ばれる分子の発現誘導、あるいは活性化を伴うことである。【０００６】
近年、小胞体ストレス由来細胞死は、糖尿病、パーキンソン病やアルツハイマー病、ポリグルタミン病、プリオン病、筋萎縮生側索硬化症（ＡＬＳ）等に代表される神経変性疾患、虚血性疾患など様々な病的状態に深く関わっていることが明らかにされてきた。従って、小胞体ストレス由来細胞死を克服することは、様々な疾患に対し、新たな治療法を提供することになると考えられる。【０００７】
そこで、以上の状況から、例えば小胞体ストレスの測定方法や小胞体ストレスに影響を及ぼす物質の探索についての研究が各方面で進められている（例えば、特許文献１〜特許文献４等を参照）が、現在でもなお小胞体ストレスのメカニズムついて、どのような物質がどのように関与しているかについては、あまり分かっているとは言えなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−１３１８９９号公報
【特許文献２】特開２００５−２０４５１６号公報
【特許文献３】特開２００５−０６５６９２号公報
【特許文献４】特開２００４−０８１１４３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
小胞体内で起こる小胞体ストレスは、図１に示されるように、３種類の小胞体膜貫通タンパク質（ＩＲＥ１α、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ６）を介して、小胞体膜を超えて細胞質に伝達される。そして、小胞体ストレスに対する細胞内の応答は、上記３種類の小胞体膜貫通タンパク質を介した経路の内の、どの経路が活性化するのか否か、又は全ての経路が活性化するか否かによって影響を受ける。従って、ある物質、又はある生理的・病理的環境が、上記３種の小胞体膜貫通タンパク質を介した経路のうちのいずれを活性化するのか、又は全てを活性化するのかを評価する系を構築することは、小胞体ストレスに対する細胞内の応答メカニズムの理解、さらには小胞体ストレスに起因する糖尿病、及び神経変性疾患等の治療方法の確立にとって非常に重要である。【００１０】
しかしながら、現在までのところ、上記３種類の小胞体膜貫通タンパク質を介した経路の内、ＩＲＥ１α及びＰＥＲＫを介した経路の活性化を評価する系しか知られておらず、ＡＴＦ６を介した経路の活性化を評価する系はいまだ確立されていない。また、該経路の活性化を評価する系は、小胞体ストレッサー、小胞体ストレス抑制剤、又は抗糖尿病薬候補物質のスクリーニング方法に利用する場合には、スクリーニングを迅速に且つ高精度に行う等の観点から、生細胞の状態でリアルタイムに且つ高感度に行うことができるものであることが求められている。【００１１】
本発明は、ＡＴＦ６を介した経路の活性化を評価する系を提供することを目的とする。すなわち、本発明は、ＡＴＦ６を介した経路を活性化する小胞体ストレッサーのスクリーニング方法を提供することを目的とし、さらにはＡＴＦ６を介した経路の活性化によって引き起こされる小胞体ストレスを抑制する物質のスクリーニング方法、及び抗糖尿病薬候補物質のスクリーニング方法をも提供することをも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は、鋭意研究を重ねた結果、蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン、及びＡＴＦ６タンパク質ドメインをコードするポリヌクレオチドを用いることにより、ＡＴＦ６を介した経路の活性化を、生細胞の状態でリアルタイムに且つ高感度に評価できることを見出した。【００１３】
即ち、本発明は、下記の構成を有するものである。【００１４】
項１．  非蛍光ペプチドドメイン１と非蛍光ペプチドドメイン２とからなる蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン１、及びＡＴＦ６タンパク質ドメインを有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。【００１５】
項２．  ５’末端側に蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン１をコードする領域を有し、３’末端側にＡＴＦ６タンパク質ドメインをコードする領域を有する、項1に記載のポリヌクレオチド。【００１６】
項３．  蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン１と、ＡＴＦ６タンパク質ドメインとがスペーサーを介して連結してなるアミノ酸配列をコードする、項１又は２に記載のポリヌクレオチド。【００１７】
項４．  項１〜３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。【００１８】
項５．  項４に記載の組換えベクターを含有する形質転換体。【００１９】
項６．  更に、非蛍光ペプチドドメイン１と非蛍光ペプチドドメイン２とからなる蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン２、及び核移行シグナルペプチドドメインを有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、該アミノ酸配列からなるタンパク質が発現可能な状態で含有する、項５に記載の形質転換体。【００２０】
項７．  項４に記載のベクター、並びに非蛍光ペプチドドメイン１と非蛍光ペプチドドメイン２とからなる蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン２、及び核移行シグナルペプチドドメインを有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、該アミノ酸配列からなるタンパク質が発現可能な状態で含有する膵臓β細胞である、項６に記載の形質転換体。【００２１】
項８−１．  下記の工程（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を含む、小胞体ストレッサーのスクリーニング方法：
（ａ）小胞体ストレッサー候補物質と、項６に記載の形質転換体とを接触させる工程、
（ｂ）小胞体ストレッサー候補物質を接触させた形質転換体の蛍光強度を測定し、該蛍光強度を、小胞体ストレッサー候補物質を接触させない対照形質転換体の蛍光強度と比較する工程、
（ｃ）小胞体ストレッサー候補物質を接触させた形質転換体の蛍光強度が、該対照形質転換体の蛍光強度よりも高い場合に、該小胞体ストレッサー候補物質を小胞体ストレッサーとして選択する工程。【００２２】
項８−２．  下記の工程（ａ’）、（ｂ’）、及び（ｃ’）を含む、臓器特異的小胞体ストレッサーのスクリーニング方法：
（ａ’）臓器特異的小胞体ストレッサー候補物質と、項６に記載の形質転換体とを接触させる工程、
（ｂ’）臓器特異的小胞体ストレッサー候補物質を接触させた形質転換体の蛍光強度を測定し、該蛍光強度を、臓器特異的小胞体ストレッサー候補物質を接触させない対照形質転換体の蛍光強度と比較する工程、
（ｃ’）臓器特異的小胞体ストレッサー候補物質を接触させた形質転換体の蛍光強度が、該対照形質転換体の蛍光強度よりも高い場合に、該臓器特異的小胞体ストレッサー候補物質を臓器特異的小胞体ストレッサーとして選択する工程。【００２３】
項９−１．  小胞体ストレッサーが、
ＡＴＦ６経路を活性化し、且つＩＲＥ１α経路及びＰＥＲＫ経路を活性化しない小胞体ストレッサー、又は
ＡＴＦ６経路を活性化し、且つＩＲＥ１α経路及び／若しくはＰＥＲＫ経路を活性化する小胞体ストレッサー
である、項８−１又は項８−２に記載のスクリーニング方法。【００２４】
項９−２．  小胞体ストレッサーが、
ＡＴＦ６経路を活性化し、且つＩＲＥ１α経路及びＰＥＲＫ経路を活性化しない小胞体ストレッサー、
ＡＴＦ６経路を活性化し、且つＩＲＥ１α経路及び／若しくはＰＥＲＫ経路を活性化する小胞体ストレッサー、又は
ＡＴＦ６経路を活性化せず、且つＩＲＥ１α経路及び／若しくはＰＥＲＫ経路を活性化する小胞体ストレッサー
である、項８−１又は項８−２に記載のスクリーニング方法。【００２５】
項１０−１．  下記の工程（ｄ）、（ｅ）、及び（ｆ）を含む、小胞体ストレス抑制剤のスクリーニング方法：
（ｄ）小胞体ストレッサー及び被検物質と、項６に記載の形質転換体とを接触させる工程、
（ｅ）小胞体ストレッサー及び被検物質を接触させた形質転換体の蛍光強度を測定し、該蛍光強度を、被検物質を接触させずに小胞体ストレッサーを接触させた対照形質転換体の蛍光強度と比較する工程、
（ｆ）小胞体ストレッサー及び被検物質を接触させた形質転換体の蛍光強度が、該対照形質転換体の蛍光強度よりも低い場合に、該被検物質を小胞体ストレス抑制剤として選択する工程。【００２６】
項１０−２．  下記の工程（ｄ’）、（ｅ’）、及び（ｆ’）を含む、臓器特異的に小胞体ストレスを抑制する物質を、スクリーニングする方法：
（ｄ’）小胞体ストレッサー及び被検物質と、項６に記載の形質転換体とを接触させる工程、
（ｅ’）小胞体ストレッサー及び被検物質を接触させた形質転換体の蛍光強度を測定し、該蛍光強度を、被検物質を接触させずに小胞体ストレッサーを接触させた対照形質転換体の蛍光強度と比較する工程、
（ｆ’）小胞体ストレッサー及び被検物質を接触させた形質転換体の蛍光強度が、該対照形質転換体の蛍光強度よりも低い場合に、該被検物質を、臓器特異的に小胞体ストレスを抑制する物質として選択する工程。【００２７】
項１１．  下記の工程（ｇ）、（ｈ）、及び（ｉ）を含む、抗糖尿病薬候補物質のスクリーニング方法：
（ｇ）小胞体ストレッサー及び被検物質と、項７に記載の形質転換体とを接触させる工程、
（ｈ）小胞体ストレッサー及び被検物質を接触させた形質転換体の蛍光強度を測定し、該蛍光強度を、被検物質を接触させずに小胞体ストレッサーを接触させた対照形質転換体の蛍光強度と比較する工程、
（ｉ）小胞体ストレッサー及び被検物質を接触させた形質転換体の蛍光強度が、対照形質転換体の蛍光強度よりも低い場合に、該被検物質を抗糖尿病薬候補物質として選択する工程。
【発明の効果】
【００２８】
非蛍光ペプチドドメイン１と非蛍光ペプチドドメイン２とからなる蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン１、及びＡＴＦ６タンパク質ドメインをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする本発明によれば、ＡＴＦ６を介した経路の活性化を、生細胞の状態でリアルタイムに且つ高感度に評価することができる。具体的には、本発明のスクリーニング方法によれば、ある物質、又はある生理的・病理的環境が、ＡＴＦ６を介した経路を活性化する小胞体ストレッサーであるか否かをスクリーニングすることができる。さらに、本発明のスクリーニング方法によれば、被検物質が、ＡＴＦ６を介した経路の活性化によって引き起こされる小胞体ストレスを抑制する、小胞体ストレス抑制剤であるか否かをスクリーニングすることができる。またさらに、本発明のスクリーニング方法によれば、抗糖尿病薬候補物質をスクリーニングすることができる。【００２９】
さらに、本発明のスクリーニング方法によって初めて、小胞体ストレス応答に関わる３つの経路（ＩＲＥ１α、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ６それぞれを介する経路）を介する小胞体ストレスを、同一細胞において同時に評価することが可能となる。本発明により、この評価が可能となったことで、小胞体ストレスに対する応答の程度は、３つの経路それぞれについて、由来する臓器が異なる細胞間において異なることが見出された。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】小胞体ストレスによって活性化される３つの経路、及び該経路の活性化によって引き起こされる小胞体ストレス応答の例を示す。
【図２】ＡＴＦ６タンパク質の細胞内における機能を示す。
【図３】本発明のスクリーニング方法の原理を示す。
【図４】EGFP-ATF6d発現ベクターの挿入DNA配列を示す。１）：緑色蛍光タンパク質cDNA断片、２）：スペーサー、３）：3×FLAGタグ、４）：核移行シグナル、５）：PEST配列、６）：マウスATF6αの部分的cDNA断片。
【図５】EGFPL発現ベクターの挿入DNA配列を示す。７）：核移行シグナル、８）：緑色蛍光タンパク質のcDNA断片。
【図６】ATF6活性レポーターシステムが機能することを確認した結果を示す。
【図７】ATF6活性レポーターシステムの小胞体ストレス特異性を確認した結果を示す。
【図８】ATF6活性レポーターシステムの小胞体ストレス応答経路の特異性を確認した結果を示す。
【図９】スペーサー部分をGGGS又はGGGSGGGSGGGSに変更したEGFP-ATF6d発現ベクターの作成に使用したDNA配列を示す。
【図１０】EGFP-ATF6d発現ベクターでのスペーサーの重要性を確認した結果を示す。
【図１１】EGFP-ATF6d発現ベクターでのPEST配列の重要性を確認した結果を示す。
【図１２】XBPスプライシングによりIre1経路を測定するIre1活性化レポーターベクター、及びATF4の翻訳によりPERK経路を測定するPERK活性化レポーター発現ベクターのベクターマップを示す。
【図１３】小胞体ストレス応答シグナルの臓器間における違いを示す（蛍光顕微鏡写真）。
【図１４】小胞体ストレス応答シグナルの臓器間における違いを示す（蛍光強度測定結果）。
【図１５】小胞体ストレッサーにより膵臓β細胞のインスリン分泌が阻害されることを示す。
【図１６】ATF6活性レポーターシステムの方が、従来法（ウェスタンブロット）に比べて、ATF6経路の活性化の検出感度において優れていることを示す。
【図１７】ＥＲＡＩシステムにおける遺伝子構築ならびにＥＲＡＩシステムの機構を示す。
【図１８】ＵＭＡＩシステムにおける遺伝子構築ならびにＵＭＡＩシステムの機構を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（１）本発明の原理
本発明の原理を、図２、及び図３を参照しながら以下に説明する。
【００３２】
本発明において、蛍光タンパク質は、非蛍光ペプチドドメイン１と非蛍光ペプチドドメイン２とからなる。非蛍光ペプチドドメイン１及び非蛍光ペプチドドメイン２は、同一蛍光タンパク質に由来するものであり、蛍光タンパク質を分子内で分割することにより生じる２つの断片の関係にある。従って、非蛍光ペプチドドメイン１が該２つの断片の内のＮ末端側断片である場合は、非蛍光ペプチドドメイン２は該２つの断片の内のＣ末端側断片である。一方、非蛍光ペプチドドメイン１が該２つの断片の内のＣ末端側断片である場合は、非蛍光ペプチドドメイン２は該２つの断片の内のＮ末端側断片である。非蛍光ペプチドドメイン１及び非蛍光ペプチドドメイン２は、それぞれ単独では蛍光活性を有しないが、細胞内で会合することにより蛍光活性を発揮する。
【００３３】
ＡＴＦ６タンパク質は、小胞体内腔ドメイン（図２中のＡ）、膜貫通ドメイン（図２中のＢ）、及び細胞質ドメイン（図２中のＣ）からなり、細胞内では小胞体膜（図２中のER）を貫通する態様で存在している。ＡＴＦ６タンパク質を介した経路を活性化する小胞体ストレスにより、ＡＴＦ６タンパク質の細胞質ドメイン部分（図２中のＣ）が切り出され、切り出された細胞質ドメイン部分（図２中のＣ）は、該ドメイン部分に内在する核移行シグナルによって核（図２中のNuc）に移行し、転写因子として働き、小胞体ストレス応答に関する遺伝子群の転写を調節する。本発明は、このメカニズムを利用し、ＡＴＦ６を介した経路を活性化する小胞体ストレスを評価する系を構築したものである。具体的には下記の原理によって評価される（図３を参照）。
【００３４】
細胞内で発現した蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン１（図３中のＧＦＰ−Ｓ、以下「非蛍光ペプチドドメイン１」と示す。）及びＡＴＦ６タンパク質ドメイン（図３中のＡ、Ｂ、及びＣ’）の融合タンパク質は、ＡＴＦ６タンパク質ドメイン中の膜貫通ドメイン（図３中のＢ）により、小胞体膜上に配置される。この配置により、ＡＴＦ６タンパク質ドメイン中の小胞体内腔ドメイン（図３中のＡ）は小胞体内腔側に存在し、非蛍光ペプチドドメイン１（図３中のＧＦＰ−Ｓ）、及びＡＴＦ６タンパク質ドメイン中の細胞質ドメイン（図３中のＣ’）は細胞質側に存在することになる。
【００３５】
そして、小胞体ストレス下において、非蛍光ペプチドドメイン１（図３中のＧＦＰ−Ｓ）、及びＡＴＦ６タンパク質ドメイン中の細胞質ドメイン（図３中のＣ’）は小胞体膜から切り出され、ＡＴＦ６タンパク質ドメイン中の核移行シグナルまたは、人工的に融合タンパク質中に挿入した核移行シグナルにより、核内へ移行される。
【００３６】
核内へ移行した該融合タンパク質中の、非蛍光ペプチドドメイン１（図３中のＧＦＰ−Ｓ）は、同じく核内に存在する、蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン２（図３中のＧＦＰ−Ｌ）と会合し、本来の蛍光タンパク質の蛍光活性を回復する。この蛍光活性の回復は、蛍光タンパク質の種類に応じた波長を有する励起光を照射することにより発光する蛍光を検出することにより確認される。
【００３７】
すなわち、ＡＴＦ６を介する小胞体ストレスは、上記蛍光を検出することにより評価することができる。
【００３８】
（２）本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、非蛍光ペプチドドメイン１と非蛍光ペプチドドメイン２とからなる蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン１、及びＡＴＦ６タンパク質ドメインを有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。
【００３９】
（２−１）本発明の蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン１（以下、本発明の非蛍光ペプチドドメイン１と示す。）
蛍光タンパク質は、分子内で分割することにより蛍光活性を失い、且つ該分割断片が再会合することにより蛍光活性を回復することができる限り特に限定されないが、好ましくはＧＦＰ、ＧＦＰ改変体、又はＧＦＰに由来しないＧＦＰ様タンパク質ファミリー、より好ましくはＧＦＰ、又はＧＦＰ改変体が挙げられる。ＧＦＰはオワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質であり、そのアミノ酸配列は配列番号４で表される。
【００４０】
また、蛍光タンパク質は、分子内で分割することにより蛍光活性を失い、且つ該分割断片が再会合することにより蛍光活性を回復することができる限り、１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されていても良い。
【００４１】
例えばアミノ酸の置換の場合には、タンパク質の構造保持の観点から、極性、電荷、可溶性、親水性／疎水性、極性等の点で、置換前のアミノ酸と類似した性質を有するアミノ酸に置換することができる。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンは非極性アミノ酸に分類され；セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンは極性アミノ酸に分類され；フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンは芳香族側鎖を有するアミノ酸に分類され；リジン、アルギニン、ヒスチジンは塩基性アミノ酸に分類され；アスパラギン酸、グルタミン酸は酸性アミノ酸に分類される。従って、同じ群のアミノ酸から選択して置換することができる。
【００４２】
ＧＦＰ改変体は、ＧＦＰ中のアミノ酸を置換することにより、蛍光強度、励起波長、蛍光波長、細胞内での安定性等を改変したものであり、例えばＥＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＲＦＰ等が挙げられる。ＥＧＦＰのアミノ酸配列は配列番号１で表される。
【００４３】
ＧＦＰ様タンパク質ファミリーに属する蛍光タンパク質は、ＧＦＰの構造（11のβシート単位が螺旋状に組織化し発色団(白色部分)を包む形で円筒構造を形成する）と同様の構造を有する蛍光タンパク質であり、例えば甲殻生物由来のＣｏｐＧＦＰ，イソギンチャク由来のＤｓＲｅｄ等が挙げられる。
【００４４】
ＧＦＰ改変体、ＧＦＰ様タンパク質ファミリーに属する蛍光タンパク質については、公知の文献に種々のものが示されており、その様な文献として、例えば、文献１（Appl Microbiol Biotechnol (2007) 77:1-12）が挙げられる。
【００４５】
本発明の非蛍光ペプチドドメイン１は、蛍光タンパク質を分子内で分割することにより生じるＮ末端側断片、又はＣ末端側断片である。分割部位は、分割された断片（Ｎ末端側断片、及びＣ末端側断片）それぞれ単独では蛍光活性を有しないが、両者が会合することにより蛍光活性を回復することができる限り、限定されない。このような分割部位は、公知の文献を参照して適宜設定することができる。このような文献として、例えば、文献２（Nature biotechnology, 2003, vol 21, 539-545 ）が挙げられる。具体例の一つとして、ＥＧＦＰの場合の分割部位は、好ましくは配列番号１中１９５〜２２６番目のアミノ酸のいずれか、より好ましくは配列番号１に示されるアミノ酸配列中の２０５〜２２２番目のアミノ酸のいずれか、特に好ましくは配列番号１中の２１２〜２１８番目のアミノ酸のいずれかである。また、この具体例においては、Ｃ末端断片を、本発明の非蛍光ペプチドドメイン１とすることが好ましい。
【００４６】
（２−２）本発明のＡＴＦ６タンパク質ドメイン
ＡＴＦ６タンパク質が由来する生物種としては、マウス（Mus musculus）のみならず、マウスのＡＴＦ６タンパク質とアミノ酸配列において、好ましくは７０％以上の同一性、より好ましくは８０％以上の同一性、さらに好ましくは８５％以上の同一性、またさらに好ましくは９０％以上の同一性、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するＡＴＦ６タンパク質をコードするゲノム領域を有する生物種が挙げられる。このような生物種としては、ラットに代表されるげっ歯類、ウサギ、サル、及びヒト（Homo sapiens）等の哺乳類が挙げられる。最も好ましい生物種はヒト（Homo sapiens）又はマウス（Mus musculus）である。
【００４７】
ＡＴＦ６タンパク質は、細胞質ドメイン、小胞体膜貫通ドメイン、及び小胞体内腔ドメインからなり、生物種がマウスの場合は、配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、また生物種がヒトの場合は、配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる。生物種がマウスの場合、配列番号２に示されるアミノ酸配列中の１〜３６４番目のアミノ酸領域が細胞質ドメインであり、配列番号２に示されるアミノ酸配列中の３６５〜３８４番目のアミノ酸領域が小胞体膜貫通ドメインであり、配列番号２に示されるアミノ酸配列中の３８５〜６５６番目のアミノ酸領域が小胞体内腔ドメインである。生物種がヒトの場合、配列番号３に示されるアミノ酸配列中の１〜３７７番目のアミノ酸領域が細胞質ドメインであり、配列番号３に示されるアミノ酸配列中の３７８〜３９８番目のアミノ酸領域が小胞体膜貫通ドメインであり、配列番号３に示されるアミノ酸配列中の３９９〜６７０番目のアミノ酸領域が小胞体内腔ドメインである。
【００４８】
本発明のＡＴＦ６タンパク質ドメインは、核移行シグナルペプチド領域（ＡＴＦ６タンパク質中の核移行シグナルペプチド、及び／又は外来性の核移行シグナルペプチド）、小胞体ストレスによる切断に関与する領域、小胞体膜貫通ドメイン、及び小胞体内腔ドメイン中の小胞体ストレスを受容する部分を含むものであって、この限りにおいてＡＴＦ６タンパク質全長であってもよい。
【００４９】
ＡＴＦ６タンパク質中の核移行シグナルは、アミノ酸配列ＲＫＫＫＫＥで示されるものであり、生物種がマウスの場合は、配列番号２に示されるアミノ酸配列中の３１１〜３１６番目のアミノ酸領域であり、生物種がヒトの場合は、配列番号３に示されるアミノ酸配列中の３２４〜３２９番目のアミノ酸領域である。
【００５０】
外来性の核移行シグナルペプチドは、公知のシグナルペプチドを使用することができる。具体的な例としては、ＤＰＫＫＫＲＫＶが挙げられる。核移行シグナルペプチドは、公知のシグナルペプチドの繰り返し配列を使用しても良い。
【００５１】
小胞体内腔ドメイン中の小胞体ストレスを受容する部分は、小胞体ストレスを受容し、ＡＴＦ６の細胞質ドメインの切断を引き起こすのに必要な領域である。
【００５２】
小胞体ストレスによる切断に関与する領域は、生物種がマウスの場合は、配列番号２に示されるアミノ酸配列中の３６５〜４１１番目のアミノ酸領域であり、生物種がヒトの場合は、配列番号３に示されるアミノ酸配列中の３７８〜４２４番目のアミノ酸領域である。
【００５３】
本発明のＡＴＦ６タンパク質ドメインは、核移行シグナルペプチド領域（ＡＴＦ６タンパク質中の核移行シグナルペプチド、又は外来性の核移行シグナルペプチド）、小胞体ストレスによる切断に関与する領域、小胞体膜貫通ドメイン、及び小胞体内腔ドメイン中の小胞体ストレスを受容する部分を含む限り限定されるものではないが、
生物種がマウスの場合には、
好ましくは配列番号２に示されるＡＴＦ６タンパク質のアミノ酸配列中１００〜６５６番目のアミノ酸領域、又は該アミノ酸領域と９０％以上、好適には９５％以上、より好適には９８％以上の同一性を有するアミノ酸領域からなるドメイン、
より好ましくは配列番号２に示されるＡＴＦ６タンパク質のアミノ酸配列中２５０〜６５６番目のアミノ酸領域、又は該アミノ酸領域と９０％以上、好適には９５％以上、より好適には９８％以上の同一性を有するアミノ酸領域からなるドメイン、
特に好ましくは外来性の核移行シグナルペプチド領域と、配列番号２に示されるＡＴＦ６タンパク質のアミノ酸配列中３６０〜６５６番目のアミノ酸領域、又は該アミノ酸領域と９０％以上、好適には９５％以上、より好適には９８％以上の同一性を有するアミノ酸領域とからなるドメインであり、
生物種がヒトの場合には、
好ましくは配列番号３に示されるＡＴＦ６タンパク質のアミノ酸配列中１００〜６７０番目のアミノ酸領域、又は該アミノ酸領域と９０％以上、好適には９５％以上、より好適には９８％以上の同一性を有するアミノ酸領域からなるドメイン、
より好ましくは配列番号３に示されるＡＴＦ６タンパク質のアミノ酸配列中２５０〜６７０番目のアミノ酸領域、又は該アミノ酸領域と９０％以上、好適には９５％以上、より好適には９８％以上の同一性を有するアミノ酸領域からなるドメイン、
特に好ましくは外来性の核移行シグナルペプチド領域と、配列番号３に示されるＡＴＦ６タンパク質のアミノ酸配列中３７３〜６７０番目のアミノ酸領域、又は該アミノ酸領域と９０％以上、好適には９５％以上、より好適には９８％以上の同一性を有するアミノ酸領域とからなるドメインである。
【００５４】
ＡＴＦ６タンパク質ドメインは、上記例示したドメイン中の１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加したものであっても良い。このような変異は、核移行シグナルペプチド領域、小胞体内腔ドメイン中の小胞体ストレスを受容する部分、小胞体膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメイン中の小胞体ストレスにより切断される部分がその機能を損なわないように、適宜設計することができる。
【００５５】
例えばアミノ酸の置換の場合には、タンパク質の構造保持の観点から、極性、電荷、可溶性、親水性／疎水性、極性等の点で、置換前のアミノ酸と類似した性質を有するアミノ酸に置換することができる。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンは非極性アミノ酸に分類され；セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンは極性アミノ酸に分類され；フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンは芳香族側鎖を有するアミノ酸に分類され；リジン、アルギニン、ヒスチジンは塩基性アミノ酸に分類され；アスパラギン酸、グルタミン酸は酸性アミノ酸に分類される。従って、同じ群のアミノ酸から選択して置換することができる。
【００５６】
（２−３）非蛍光ペプチドドメイン１、及びＡＴＦ６タンパク質ドメインの配置
本発明において、非蛍光ペプチドドメイン１、及びＡＴＦ６タンパク質ドメインをコードするポリヌクレオチドにおける２つのドメインの配置は、特に限定されるものではないが、非蛍光ペプチドドメイン１をコードする領域が５’末端側に配置され、ＡＴＦ６タンパク質ドメインをコードする領域が３’末端側に配置されることが好ましい。
【００５７】
また、蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン１と、ＡＴＦ６タンパク質ドメインとは、スペーサーを介して配置されることが好ましい。
【００５８】
本発明において、スペーサーとは天然タンパク質由来又は人工のアミノ酸配列である。スペーサーのアミノ酸配列は、特に限定されるものではないが、αヘリックス構造やβシート構造などの２次構造を作らず、且つ自由に折り曲がるアミノ酸配列であることが好ましい。スペーサーのアミノ酸配列の例としてはＧＧＧＳの４残基、又は該配列の繰り返し配列が挙げられる。
【００５９】
スペーサーのアミノ酸残基数は、好ましくは３アミノ酸残基以上、より好ましくは４〜５０アミノ酸残基、さらに好ましくは６〜２０アミノ酸残基、特に好ましくは７〜１５アミノ酸残基である。本発明においては、スペーサーのアミノ酸残基数が少な過ぎると、蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン１及び２の会合が、ＡＴＦ６タンパク質ドメインによって妨げられると考えられるため、本発明のポリヌクレオチドを用いた、小胞体ストレッサー、小胞体ストレス抑制剤、又は抗糖尿病薬候補物質のスクリーニング方法において、蛍光検出の感度の観点から好ましくない。
【００６０】
（２−４）その他の配列
本発明のポリヌクレオチドは、その他の配列として、タンパク質タグをコードするポリヌクレオチド、その他のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいても良い。
【００６１】
タンパク質タグとしては、FLAGタグ、Hisタグ、又はGSTタグ等を使用することができる。これらのタンパク質タグはタグ配列の繰り返し配列として使用しても良い。
【００６２】
その他のペプチドとしては、PEST配列が挙げられる。PEST配列を挿入することにより、融合タンパク質の分解が促進される。PEST配列は公知のものを用いることができ、その機能を発揮することができる限り特に限定されるものではないが、例示すると、SHGFPPEVEEQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINVからなるアミノ酸配列が挙げられる。PEST配列の配置は、その機能を発揮することができる限り特に限定されるものではないが、非蛍光ペプチドドメイン１とＡＴＦ６タンパク質ドメインの間に配置されることが好ましい。本発明において、PEST配列は必須ではないが、PEST配列の挿入により、本発明のポリヌクレオチドを用いた、小胞体ストレッサー、小胞体ストレス抑制剤、又は抗糖尿病薬候補物質のスクリーニング方法において、バックグラウンドの蛍光を低減することができ、より高感度に蛍光検出することができる。
【００６３】
（３）本発明のポリヌクレオチドの製造方法
本発明のポリヌクレオチドは、人工遺伝子合成技術、又は市販されているポリヌクレオチド若しくはcDNAライブラリーからの核酸増幅技術（PCR等）により、合成することができる。各ドメインをコードするポリヌクレオチドは、公知の制限酵素配列を両端に付加しておき、公知の遺伝子連結技術によって、連結することもできる。
【００６４】
蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドを有する各種発現ベクターが市販されており（例えばClontech社）、該ポリヌクレオチドの配列情報も公開されている。
【００６５】
ＡＴＦ６タンパク質ドメインをコードするポリヌクレオチドは、例えば、NCBIデータベース等の遺伝子データベース上で公開されているＡＴＦ６遺伝子配列の情報を基に、適切な部位にプライマーを設計して、cDNAライブラリーから該プライマーを用いた遺伝子増幅技術により増幅し、得ることができる。
【００６６】
本発明に係るポリヌクレオチドに含まれ得るその他の配列、例えばタンパク質タグをコードするポリヌクレオチド配列、核移行シグナルをコードするポリヌクレオチド配列、又はPEST配列をコードするポリヌクレオチド配列は、公知となっており、公知の配列情報を基に、例えば人工遺伝子合成技術により得ることができる。
【００６７】
（４）本発明の組換えベクター
本発明の組換えベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターであり、本発明のポリヌクレオチドを適当なベクターに連結することによって得ることができる。
【００６８】
ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含有し得るものであれば、特に限定されないが、好ましくは真核生物細胞、より好ましくは動物細胞、さらに好ましくは哺乳類動物細胞、特に好ましくはげっ歯類（特にマウス）又はヒトの細胞において、本発明のポリヌクレオチドがコードする融合タンパク質を発現し得るものが挙げられる。具体的には、大腸菌ベクターのpBR322、pUC19、pKK233-2、pET21a等、酵母用ベクターYip5、Yrp17、Yep24等、動物細胞用ベクターのpcDNA、pBAC等を例示できる。
【００６９】
上記組換えベクターには、形質転換された細胞の選択を可能とするために、マーカー遺伝子が含まれていることが望ましい。当該マーカー遺伝子としては、例えば、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子、又は薬剤に対する抵抗遺伝子等を挙げることができる。また、上記組換えベクターには、宿主で上記遺伝子の発現を可能にするためのプロモーターやその他の制御配列（例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）が含まれていることが好ましい。当該プロモーターとして、具体的にはSV40、CMV、ie1、T7、lac、trp、tac等のプロモーターを例示できる。
【００７０】
（５）本発明の形質転換体
上記組換えベクターを用いて、宿主を形質転換することによって、該組換えベクターを含む形質転換体を得ることができる。
【００７１】
宿主としては、本発明の組換えベクターによって形質転換されうるものであれば特に限定されない。具体的には、大腸菌等の細菌、酵母、糸状菌、動物細胞等を挙げることができる。これらの中でも好ましくは真核生物細胞、より好ましくは動物細胞、さらに好ましくはげっ歯類（特にマウス）又はヒトの細胞が挙げられる。また、宿主が動物細胞である場合は、宿主として種々の臓器由来の細胞、例えば膵臓細胞、腎臓細胞、肝細胞、脂肪細胞、又は骨格細胞を用いることができる。形質転換体を抗糖尿病薬候補物質のスクリーニング方法に使用する場合は、これらの中でも膵臓細胞が好ましく、膵臓細胞の中でも膵臓β細胞がより好ましい。
【００７２】
形質転換は、宿主の種類に応じて、公知の方法に従って行うことができる。公知の方法としては、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法等が挙げられる。形質転換体からベクターが有する薬剤耐性マーカーなどを指標にして本発明の形質転換体を選択すればよい。
【００７３】
更に、本発明の形質転換体は、非蛍光ペプチドドメイン１と非蛍光ペプチドドメイン２とからなる蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン２（以下、「非蛍光ペプチドドメイン２」と示す）、及び核移行シグナルペプチドドメインを有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、該アミノ酸配列からなるタンパク質が発現可能な状態で含有することが好ましい。この形質転換体（以下、「スクリーニング用形質転換体」と示す）は、後述のスクリーニング方法に用いることができる。さらに、宿主が膵臓β細胞である「スクリーニング用形質転換体」（以下、「抗糖尿病薬候補物質スクリーニング用形質転換体」と示す）は、後述のスクリーニング方法、特に抗糖尿病薬候補物質のスクリーニング方法に好適に用いることができる。
【００７４】
非蛍光ペプチドドメイン２は、蛍光タンパク質を分子内で分割することにより生じるＮ末端側断片、又はＣ末端側断片である。非蛍光ペプチドドメイン２は、前述の非蛍光ペプチドドメイン１と、同一蛍光タンパク質に由来するものであり、蛍光タンパク質を分子内で分割することにより生じる２つの断片の関係にある。従って、非蛍光ペプチドドメイン１がＮ末端側断片である場合は、非蛍光ペプチドドメイン２はＣ末端側断片である。非蛍光ペプチドドメイン１及び２は、どちらがＮ末端側断片又はＣ末端側断片であるか特に限定されるものではないが、非蛍光ペプチドドメイン１がＣ末端側断片であり、非蛍光ペプチドドメイン２がＮ末端側断片であることが好ましい。
【００７５】
核移行シグナルペプチドドメインは、公知のシグナルペプチドを使用することができる。具体的な例としては、Asp-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Valが挙げられる。核移行シグナルペプチドは、公知のシグナルペプチドの繰り返し配列を使用しても良い。
【００７６】
「発現可能な状態で含有する」とは、非蛍光ペプチドドメイン２、及び核移行シグナルペプチドドメインを有するアミノ酸配列からなるタンパク質が、細胞内で発現できる限り特に限定されるものではないが、非蛍光ペプチドドメイン２、及び核移行シグナルペプチドドメインを有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの５’末端側にプロモーター配列が存在することが好ましい。
【００７７】
プロモーター配列は、公知の配列を使用することができる。このようなプロモーター配列としては、ＣＭＶプロモーター配列、及びＳＶ４０プロモーター等が挙げられる。
【００７８】
（６）本発明のスクリーニング方法
上記形質転換体を用いて、小胞体ストレッサー、小胞体ストレス抑制剤、又は抗糖尿病薬候補物質をスクリーニングすることができる。
【００７９】
（６−１）小胞体ストレッサーのスクリーニング方法
小胞体ストレッサーのスクリーニング方法は、（ａ）小胞体ストレッサー候補物質と、上記「（５）本発明の形質転換体」で説明した「スクリーニング用形質転換体」とを接触させる工程、（ｂ）小胞体ストレッサー候補物質を接触させた形質転換体の蛍光強度を測定し、該蛍光強度を、小胞体ストレッサー候補物質を接触させない対照形質転換体の蛍光強度と比較する工程、及び（ｃ）小胞体ストレッサー候補物質を接触させた形質転換体の蛍光強度が、該対照形質転換体の蛍光強度よりも高い場合に、該小胞体ストレッサー候補物質を小胞体ストレッサーとして選択する工程を含むものである。
【００８０】
小胞体ストレッサーの候補物質の種類は特に限定されない。例えばタンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物（ヌクレオチド、アミン、糖質、脂質等）、有機低分子化合物、無機低分子化合物、醗酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。
【００８１】
細胞への小胞体ストレッサー候補物質の接触は、細胞が死滅せず、かつ、導入した組換えベクターから、蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン１及びＡＴＦ６タンパク質ドメインの融合タンパク質、並びに蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン２を含むタンパク質が発現できる条件（温度、ｐＨ、培地成分など）で行えばよい。細胞に接触させる小胞体ストレッサーの候補物質の濃度は、物質の種類によっても異なるが、例えば0.001〜100μg/ml程度とすることができる。
【００８２】
蛍光の検出は、蛍光タンパク質に適した波長を有する励起光を照射し、蛍光を生じさせることにより行うことができる。
【００８３】
蛍光強度の測定方法は、小胞体ストレッサーを接触させた形質転換体の蛍光強度と、小胞体ストレッサーを接触させない対照形質転換体との蛍光強度とを比較できる方法であれば特に限定されない。例えば、蛍光を生じた形質転換体の画像イメージをコンピューター上で取り込み、該画像イメージ中で、蛍光に応じた色の濃さ等を測定することにより、蛍光強度を測定することができる。
【００８４】
また、臓器特異的小胞体ストレッサーをスクリーニングする場合は、該臓器に由来する、本発明の形質転換体を用いてスクリーニングすることができる。例えば肝臓特異的小胞体ストレッサーをスクリーニングする場合は、宿主が肝細胞である本発明の形質転換体を用いてスクリーニングすることができる。
【００８５】
更に、本スクリーニング方法に公知のスクリーニング方法を組み合わせることにより、
小胞体ストレッサーが
ＡＴＦ６経路を活性化し、且つＩＲＥ１α経路及びＰＥＲＫ経路を活性化しない小胞体ストレッサー、
ＡＴＦ６経路を活性化し、且つＩＲＥ１α経路及び／若しくはＰＥＲＫ経路を活性化する小胞体ストレッサー、又は
ＡＴＦ６経路を活性化せず、且つＩＲＥ１α経路及び／若しくはＰＥＲＫ経路を活性化する小胞体ストレッサー
であるかを選択することができる。
すなわち小胞体ストレッサーが
（ｏ）ＡＴＦ６経路を活性化し、且つＩＲＥ１α経路及びＰＥＲＫ経路を活性化しない小胞体ストレッサー、
（ｐ）ＡＴＦ６経路及びＩＲＥ１α経路を活性化し、且つＰＥＲＫ経路を活性化しない小胞体ストレッサー、
（ｑ）ＡＴＦ６経路及びＰＥＲＫ経路を活性化し、且つＩＲＥ１α経路を活性化しない小胞体ストレッサー、又は
（ｒ）ＡＴＦ６経路、ＩＲＥ１α経路、及びＰＥＲＫ経路を活性化する小胞体ストレッサー
（ｓ）ＡＴＦ６経路を活性化せず、且つＩＲＥ１α経路及びＰＥＲＫ経路を活性化する小胞体ストレッサー、
（ｔ）ＡＴＦ６経路及びＩＲＥ１α経路を活性化せず、且つＰＥＲＫ経路を活性化する小胞体ストレッサー、又は
（ｕ）ＡＴＦ６経路及びＰＥＲＫ経路を活性化せず、且つＩＲＥ１α経路を活性化する小胞体ストレッサー
であるかを選択することができる。
【００８６】
公知のスクリーニング方法とは、小胞体ストレッサー候補物質が、ＩＲＥ１α経路及び／又はＰＥＲＫ経路を活性化するか選択することができる公知の方法であり、例えば特開2005−204516号公報に記載された方法である。従って、小胞体ストレッサー候補物質の中からＡＴＦ６経路を活性化する小胞体ストレッサーを選択することができる本スクリーニング方法と、公知のスクリーニング方法を組み合わせることにより、ＡＴＦ６経路を活性化する小胞体ストレッサーが上記（ｏ）〜（ｕ）に記載の小胞体ストレッサーのいずれであるかを選択することが可能になる。更に、公知のスクリーニング方法と組合わせて検討することにより、ＡＴＦ６経路を活性化しない小胞体ストレッサーの選択が可能になる。
【００８７】
特開2005−204516号公報に記載された方法について、以下に具体的に説明する。
【００８８】
細胞としては、
（ｖ）ＸＢＰ１遺伝子と第１のレポータータンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子を含む発現ベクターであって、該ＸＢＰ１遺伝子がスプライシングを受けた場合のみ、ＸＢＰ１タンパク質と該第１のレポータータンパク質との融合タンパク質が発現するように配置されている、発現ベクター；および
（ｗ）ＡＴＦ４遺伝子と第２のレポータータンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子を含む発現ベクターであって、該第２のレポータータンパク質をコードする遺伝子が該ＡＴＦ４遺伝子の真の翻訳開始点よりも下流に配置されている、発現ベクター；
が共導入された、トランスジェニック細胞。
を用いる。
【００８９】
前記トランスジェニック細胞を用いて、下記工程（ｘ）、（ｙ）、（ｚ）；
（ｘ）前記トランスジェニック細胞と候補物質とを接触させる工程、
（ｙ）前記トランスジェニック細胞において、第１のリポータータンパク質および第２のリポータータンパク質の活性を測定する工程、並びに
（ｚ）前記トランスジェニック細胞において、
該第１のリポータータンパク質の活性が検出され、該第２のリポータータンパク質の活性が検出されない場合に、前記候補物質を、ＩＲＥ１α経路を活性化し且つＰＥＲＫ経路を活性化しない小胞体ストレッサーとして選択し、
該第１のリポータータンパク質の活性が検出されず、該第２のリポータータンパク質の活性が検出される場合に、前記候補物質を、ＰＥＲＫ経路を活性化し且つＩＲＥ１α経路を活性化しない小胞体ストレッサーとして選択し、
該第１のリポータータンパク質及び該第２のリポータータンパク質の活性が検出される場合に、前記候補物質を、ＩＲＥ１α経路及びＰＥＲＫ経路を活性化する小胞体ストレッサーとして選択する工程
を含む方法により、候補物質が、ＩＲＥ１α経路及び／又はＰＥＲＫ経路を活性化する小胞体ストレッサーであるかを選択することができる。
【００９０】
（ＥＲＡＩシステム用の遺伝子）
発現ベクター（ｖ）は、図１７に示すように、ＥＲＡＩシステムが作動するように構築されている。発現ベクター（ｖ）は、ＸＢＰ１遺伝子と第１のレポータータンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子を含み、該ＸＢＰ１遺伝子がスプライシングを受けた場合のみ、ＸＢＰ１タンパク質と該第１のレポータータンパク質との融合タンパク質が発現するように配置されている。
【００９１】
ＸＢＰ１遺伝子は、刺激応答遺伝子の一種であり、小胞体ストレス下でＩＲＥ１によって２６ヌクレオチドのイントロンがスプライシングされる。例えば、ヒト、ウシ、マウス、アフリカツメガエル、およびゼブラダニオ（ｚｅｂｒａ ｆｉｓｈ）のＸＢＰ１のｃＤＮＡ配列が知られており、ＥＳＴデータベース上に、それぞれＢＥ１７０１１９、ＡＶ６０４６６７、ＢＦ１４３０１９、ＡＦ３５８１３３、およびＡＦ３９９９１８として登録されている。本発明においては、ＸＢＰ１のｃＤＮＡとして、ＮＣＢＩの登録番号ＡＢ０７６３８３のヒトＸＢＰ１のｃＤＮＡ（以下、「配列１」と示す）を例に挙げて説明する。非スプライシング時には、配列１の９位〜７９４位がコード領域となり、２６１アミノ酸残基からなるＸＢＰ１タンパク質（短縮型）に翻訳される（以下、「配列２」と示す）。一方、ｃＤＮＡのイントロンは、配列１の５０２位〜５２７位の塩基配列である。ＩＲＥ１によるＸＢＰ１遺伝子のスプライシングによってフレームシフトが起こり、配列１の９位〜５０１位および５２８位〜１１６５位がコード領域になり、３７６アミノ酸残基からなる活性型ＸＢＰ１タンパク質に翻訳される。
【００９２】
第１のレポータータンパク質をコードする遺伝子は、スプライシングによって発現する活性型ＸＢＰ１タンパク質コード領域の下流側の適切な位置に、読み枠が一致するように融合される。すなわち、発現ベクター（ｖ）は、ＩＲＥ１によってスプライシングされた場合のみ、活性型ＸＢＰ１タンパク質と第１のレポータータンパク質との融合タンパク質が発現するように、構築される。
【００９３】
第１のレポータータンパク質としては、その発現を確認できるタンパク質であれば特に限定されない。インビボで容易に確認可能な点で、蛍光活性を有するタンパク質であることが好ましい。蛍光活性を有するタンパク質としては、ルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、それらの改変体などが挙げられる。ルシフェラーゼとしては、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼなどが挙げられる。グリーン蛍光タンパク質およびその改変体としては、オワンクラゲグリーン蛍光タンパク質、ＥＧＦＰ（enhanced green fluoro protein）、ＹＦＰ（yellow fluoro protein）、ＢＦＰ（blue fluoro protein）、ＲＦＰ（red fluoro protein）などが挙げられる。これらはいずれも市販されており、容易に入手可能である。
【００９４】
（ＵＭＡＩシステム用の遺伝子）
発現ベクター（ｗ）は、ＡＴＦ４遺伝子と第２のレポータータンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子を含み、該第２のレポータータンパク質をコードする遺伝子が該ＡＴＦ４遺伝子の真の翻訳開始点よりも下流に配置されている。
【００９５】
小胞体ストレス下では、ＰＥＲＫが活性化され、ｅＩＦ−２αがリン酸化されてｅＩＦ−２αの機能が低下して、ＡＴＦ４のｍＲＮＡ中の複数の翻訳開始点のうち最も下流にある真の翻訳開始点からの翻訳が促進される。例えば、ヒト、マウス、アメフラシなどのＡＴＦ４のｃＤＮＡ配列が知られており、ＥＳＴデータベース上に、それぞれＨＳＵ０３７１２、ＮＭ＿００９７１６、およびＡＣＵ４０８５１として登録されている。本発明においては、ＡＴＦ４のｃＤＮＡとして、ＮＣＢＩの登録番号ＢＣ０１１９９４のヒトＡＴＦ４のｃＤＮＡ（以下、「配列３」と示す）を例に挙げて説明する。ＡＴＦ４のｃＤＮＡはｍＲＮＡに転写された後、通常状態時、つまりｅＩＦ−２αが正常に機能しているときには、ＡＴＦ４は偽の複数の上流翻訳開始点から、翻訳される。すなわち、それぞれ配列３の４位〜９位、６７位〜７８位、および１６６位〜３４５位が翻訳される。一方、ＰＥＲＫが活性化されると、ＡＴＦ４のｍＲＮＡの真の翻訳開始点である配列３の２６３位〜１３１８位が翻訳される。
【００９６】
第２のレポータータンパク質をコードする遺伝子は、ＡＴＦ４遺伝子の真の翻訳開始点よりも下流に配置される。例えば、ＮＣＢＩの登録番号ＨＳＵ０３７１２のヒトＡＴＦ４のｃＤＮＡを例に挙げると、配列３の２６３位よりも下流に、より具体的には、真の翻訳開始コドン（配列番号５の２６３〜２６５位）よりも下流に配置される。そのため、ＰＥＲＫが活性化されて真の翻訳開始点から翻訳される場合のみ、第２のレポータータンパク質が発現する。
【００９７】
第２のレポータータンパク質としては、上記の第１のレポータータンパク質と同様に、その発現を確認できるタンパク質であれば特に限定されない。インビボで容易に確認可能な点で、蛍光タンパク質であることが好ましい。また、第１のレポータータンパク質の発現と容易に区別可能なように、第１のレポータータンパク質とは異なるタンパク質とすべきである。第１のレポータータンパク質と第２のレポータータンパク質との組み合わせは、例えば、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼ、ＥＧＦＰとＲＦＰなどの組み合わせが好ましい。
【００９８】
発現ベクター（ｖ）及び（ｗ）を含有するトランスジェニック細胞を用いて、例えば、該細胞を、当業者が通常用いる適切な培地中、適切な条件下で培養した後、スクリーニングすべき薬剤と接触させる。接触の手段としては、例えば、薬剤を培地に添加すること、薬剤を細胞に注入することなどが挙げられる。細胞と薬剤とを一定の期間接触させた後、第１のレポータータンパク質および第２のレポータータンパク質の発現について測定する。各レポータータンパク質の発現の測定は、通常、発現したタンパク質の活性を測定する。例えば、レポータータンパク質が蛍光タンパク質である場合は、細胞の蛍光強度を測定する。
【００９９】
第１のレポータータンパク質の活性のみが上昇している場合は、ＩＲＥ１α経路のみが活性化されることを示す。逆に、第２のレポータータンパク質の活性のみが上昇している場合は、ＰＥＲＫ経路のみが活性化されることを示す。また、第１および第２の両方のレポータータンパク質の活性が上昇している場合は、ＩＲＥ１α経路及びＰＥＲＫ経路が活性化されることを示し、両方の活性がない場合は、ＩＲＥ１α経路及びＰＥＲＫ経路が活性化されないことを示す。
【０１００】
上記公知のスクリーニング方法と、本スクリーニング方法との組み合わせ方としては、特に限定されないが、例えば次のような組み合わせ方が挙げられる。
【０１０１】
使用する形質転換体として、上記「（５）本発明の形質転換体」で説明した「スクリーニング用形質転換体」に代えて、該形質転換体に更に上記発現ベクター（ｖ）及び（ｗ）を含有する形質転換体（以下、「３経路検出用形質転換体」）を用いる。この際、本スクリーニング方法に用いる「蛍光タンパク質」の蛍光強度、上記第１のレポータータンパク質の蛍光強度又は活性、及び上記第２のレポータータンパク質の蛍光強度又は活性がそれぞれ区別できるように、該蛍光タンパク質と該第１又は２のレポータータンパク質の種類を選択する。３経路検出用形質転換体に小胞体ストレッサー候補物質を接触させ、対照細胞と、蛍光タンパク質の蛍光強度やレポータータンパク質の蛍光強度又は活性を比較することにより、小胞体ストレッサー候補物質が上記（ｏ）〜（ｕ）に記載の小胞体ストレッサーのいずれであるかを選択することができる。
【０１０２】
本スクリーニング方法は、どのような物質が小胞体ストレスを引き起こすのかを調べることができ、小胞体ストレスのメカニズムの解明、更には、小胞体ストレスによって引き起こされる糖尿病や神経変性疾患等の疾患治療の研究に有用である。
【０１０３】
（６−２）小胞体ストレス抑制剤のスクリーニング方法
小胞体ストレス抑制剤のスクリーニング方法は、（ｄ）小胞体ストレッサー及び被検物質と、上記「（５）本発明の形質転換体」で説明した「スクリーニング用形質転換体」とを接触させる工程、（ｅ）小胞体ストレッサー及び被検物質を接触させた形質転換体の蛍光強度を測定し、該蛍光強度を、被検物質を接触させずに小胞体ストレッサーを接触させた対照形質転換体の蛍光強度と比較する工程、及び（ｆ）小胞体ストレッサー及び被検物質を接触させた形質転換体の蛍光強度が、該対照形質転換体の蛍光強度よりも低い場合に、該被検物質を小胞体ストレス抑制剤として選択する工程を含むものである。
【０１０４】
小胞体ストレッサーは、小胞体ストレスを起こすことが分かっている物質である限り特に限定されるものではない。このような物質としては、ツニカマイシン、タプシガルギン、及びＤＴＴ（dithiothreitol）等が挙げられる。また、上記小胞体ストレッサーのスクリーニング方法により選択された小胞体ストレッサーも用いることができる。
【０１０５】
被検物質の種類は特に限定されない。例えばタンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物（ヌクレオチド、アミン、糖質、脂質等）、有機低分子化合物、無機低分子化合物、醗酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。
【０１０６】
被検物質の接触は、細胞が死滅せず、かつ、導入した組換えベクターから、蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン１及びＡＴＦ６タンパク質ドメインの融合タンパク質、並びに蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン２を含むタンパク質が発現できる条件（温度、ｐＨ、培地成分など）で行えばよい。細胞に接触させる小胞体ストレッサーの候補物質の濃度は、物質の種類によっても異なるが、例えば0.001〜100μg/ml程度とすることができる。
【０１０７】
また、臓器特異的に小胞体ストレスを抑制する物質をスクリーニングする場合は、該臓器に由来する、本発明の形質転換体を用いてスクリーニングすることができる。例えば、肝臓特異的に小胞体ストレスを抑制する物質をスクリーニングする場合は、肝臓に由来する、本発明の形質転換体を用いてスクリーニングすることができる。
【０１０８】
本スクリーニング方法は、小胞体ストレスを抑制する物質をスクリーニングすることができ、小胞体ストレスによって引き起こされる糖尿病や神経変性疾患等の疾患治療の研究に有用である。
【０１０９】
（６−３）抗糖尿病薬候補物質のスクリーニング方法
抗糖尿病薬候補物質のスクリーニング方法は、（ｇ）小胞体ストレッサー及び被検物質と、上記「（５）本発明の形質転換体」で説明した「抗糖尿病薬候補物質スクリーニング用形質転換体」とを接触させる工程、（ｈ）小胞体ストレッサー及び被検物質を接触させた形質転換体の蛍光強度を測定し、該蛍光強度を、被検物質を接触させずに小胞体ストレッサーを接触させた対照形質転換体の蛍光強度と比較する工程、及び（ｉ）小胞体ストレッサー及び被検物質を接触させた形質転換体の蛍光強度が、対照形質転換体の蛍光強度よりも低い場合に、該被検物質を抗糖尿病薬候補物質として選択する工程を含むものである。
【０１１０】
小胞体ストレッサーは、小胞体ストレスを起こすことが分かっている物質である限り特に限定されるものではない。このような物質としては、ツニカマイシン、タプシガルギン、及びＤＴＴ等が挙げられる。また、上記小胞体ストレッサーのスクリーニング方法により選択された小胞体ストレッサーも用いることができる。
【０１１１】
被検物質の種類は特に限定されない。例えばタンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物（ヌクレオチド、アミン、糖質、脂質等）、有機低分子化合物、無機低分子化合物、醗酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。
【０１１２】
被検物質の接触は、細胞が死滅せず、かつ、導入した組換えベクターから、蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン１及びＡＴＦ６タンパク質ドメインの融合タンパク質、並びに蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン２を含むタンパク質が発現できる条件（温度、ｐＨ、培地成分など）で行えばよい。細胞に接触させる小胞体ストレッサーの候補物質の濃度は、物質の種類によっても異なるが、例えば0.001〜100μg/ml程度とすることができる。
【０１１３】
本スクリーニング方法により選択した抗糖尿病薬候補物質は、更に、病態モデル動物を用いた薬効試験や安全性試験に供することにより、より一層実用的な抗糖尿病薬として取得することができる。
【実施例】
【０１１４】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【０１１５】
緑色蛍光タンパク質GFPをレポータータンパク質としたEGFPS-ATF6d発現ベクターとEGFPL発現ベクターを作製し、両ベクターによって構成されるATF6活性レポーターシステムを以下の細胞株に遺伝子導入を行った。EGFPS-ATF6d発現ベクターは、図４に示すように、緑色蛍光タンパク質cDNA断片（配列番号１中のアミノ酸番号２１６〜２３１番目のアミノ酸領域をコードするＤＮＡ断片：図４中の１）部分）に、スペーサー(GGGSGGGSからなるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片：図４中の２)部分)、3XFLAGタグ（DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKからなるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片：図４中の３）部分）、核移行シグナル（DPKKKRKVを3回繰り返したものからなるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片：図４中の４）部分）、PEST配列（SHGFPPEVEEQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINVからなるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片：図３中の５）部分）、マウスATF6αの部分的cDNA断片（配列番号２中のアミノ酸番号３６１〜６５６番目のアミノ酸領域をコードするDNA断片：図４中の６）部分）を、pEGFP-Puroに挿入して作製した。EGFPL発現ベクターは、図５に示すように、核移行シグナル（DPKKKRKVを3回繰り返したものからなるアミノ酸配列をコードするDNA断片：図５中の７）部分）に、緑色蛍光タンパク質cDNA断片（配列番号１中のアミノ酸配列番号１〜２１５番目のアミノ酸領域をコードするDNA断片：図５中の８）部分）を、pEGFP-N1に挿入して作製した。pEGFP-PuroとpEGFP-N1は、サイトメガロウィルスプロモーターおよびエンハンサーの下流に挿入された遺伝子を、哺乳動物細胞に高発現させることができる。【０１１６】
１．EGFPS-ATF6d発現ベクターの作製
実際のEGFPS-ATF6d発現ベクターの作製は、3工程で行った。
工程1  人工遺伝子合成技術により、緑色蛍光タンパク質cDNA断片、スペーサー、3XFLAGタグ、及び核移行シグナルをコードする２本鎖DNA（図４中の１）、２）、３）、及び４）部分）を合成し、pEGFP-Puro発現ベクターに挿入してEGFPS発現ベクターを作製した。
工程2  マウスcDNAよりkpn.mATF6d.SP1（配列：5’-CTAGGGTACCCCAAAGCGAAGAGCTGTCTG -3’）とnot.mATF6d.AP1（配列：5’-TTTTTTCCTTGCGGCCGCCTACTGCAACGACTCAGGGA -3’）のPCRにより生成したマウスATF6αの部分的cDNA断片（図４中の６）部分）を、EGFPS発現ベクターに挿入してEGFPS-ATF6d-PEST(-)発現ベクターを作製した。
工程3  マウスcDNAよりxho.PEST.SP1（配列：5’-CTAGCTCGAGAGCCATGGCTTCCCGCCGGC -3’）とkpn.PEST.AP1（配列：5’-CTAGGGTACCCACATTGATCCTAGCAGAAG -3’）のPCRにより生成したマウスODCのPEST配列（図４中の５）部分）を、EGFPS-ATF6d-PEST(-)発現ベクターに挿入してEGFPS-ATF6d発現ベクターを作製した。【０１１７】
EGFPS発現ベクター、EGFPS-ATF6d-PEST(-)発現ベクター、EGFPS-ATF6d発現ベクターは、pEGFP-Puro由来のピューロマイシン薬剤耐性遺伝子も有する。【０１１８】
２．EGFPL発現ベクターの作製
EGFPL発現ベクターは、人工遺伝子合成技術により、核移行シグナル、及び緑色蛍光タンパク質をコードする２本鎖DNA（図５中の７）及び８）部分）を合成し、pEGFP-N1発現ベクターに挿入してEGFPL発現ベクターを作製した。EGFPL発現ベクターはネオマイシン薬剤耐性遺伝子も有する。【０１１９】
３．細胞培養
HEK293細胞（ATCC番号：CRL-1573）、MIN6細胞（Miyazaki J et al., Endocrinology 127:126-132(1990)において報告された膵臓β細胞）、HepG2細胞（ATCC番号：HB-8065）、3T3-L1細胞（ATCC番号：CL-173）、L6細胞（ATCC番号：CRL-1458）、ATF6活性レポーターシステム導入細胞（後述）は、特に明記しない限り、DMEMに10％牛胎児血清を加えた培地を用いて、37℃、5％CO2環境下で培養した。【０１２０】
４．ATF6活性レポーターシステム導入細胞の取得
HEK293細胞には、ポリエチレンイミン法にて、EGFPS-ATF6d発現ベクターとEGFPL発現ベクターを90％以上の効率で遺伝子導入した。Neon（Invitorogen社）を用いたエレクトロポレーション法で、MIN6細胞、HepG2細胞、3T3-L1細胞、L6細胞に、EGFPS-ATF6d発現ベクターとEGFPL発現ベクターをそれぞれ、80％、60％、90％、70％以上の効率で遺伝子導入した。【０１２１】
５．ATF6活性レポーターシステムの確認
小胞体ストレス依存的にATF6活性レポーターシステムが機能しているかを確かめるために、HEK293細胞に、EGFPS-ATF6d発現ベクターとEGFPL発現ベクターをそれぞれ単独発現または共発現させた。細胞の蛍光シグナルは倒立蛍光顕微鏡DMI6000B（Leica社）で観察し、蛍光シグナルをCCDカメラRolera-XR（Qiaging社）で取得し、画像解析ソフトImage-Pro Plus(Media Cybernetics社)で解析した。【０１２２】
図６に示すように通常培養条件下では、EGFPS-ATF6d発現ベクターとEGFPL発現ベクターをそれぞれ単独で発現させた細胞では緑色蛍光を全く認めず、共発現した細胞では極めてわずかに緑色蛍光を認めた。小胞体ストレス誘導剤であるツニカマイシンを0.2ug/mlで刺激後6時間に観察すると、EGFPS-ATF6d発現ベクターとEGFPL発現ベクターをそれぞれ単独で発現させた細胞では緑色蛍光を全く認めず、共発現した細胞では強い緑色蛍光を認めた。【０１２３】
このことから、分割した緑色蛍光タンパク質は単独では蛍光せず、小胞体ストレスによりATF6活性レポーターシステムが機能することが確認できた。【０１２４】
６．ATF6活性レポーターシステムの小胞体ストレス特異性の確認
ATF6活性レポーターシステムが小胞体ストレス特異的にATF６の活性化を検出できることが重要である。そこで、EGFPS-ATF6d発現ベクターとEGFPL発現ベクターを共発現させたHEK293細胞に、DNA複製阻害剤であるエトポシド、小胞体ストレス誘導剤であるタプシガルギン、小胞体ストレス誘導剤であるDTTを、それぞれ100 uM, 0.2 uM、1 mMで刺激して、蛍光を観察した。いずれの条件も36時間後には細胞死をおこすストレスであることをHoechst33258染色で確認した。【０１２５】
しかしながら、図７に示すように、小胞体ストレスと関係ないエトポシド刺激では緑色蛍光を全く認めず、小胞体ストレス誘導剤であるタプシガルギンとDTT刺激では強い緑色蛍光を認めた。【０１２６】
このことから、ATF6活性レポーターシステムが小胞体ストレス特異的にATF6の活性化を検出できることが確認できた。【０１２７】
７．ATF6活性レポーターシステムの小胞体ストレス応答経路の特異性の確認
小胞体ストレス応答は３つの独立した経路で制御されることが知られているので、ATF6活性レポーターシステムが他の経路であるIre1経路やPERK経路の影響を受けずにATF６の活性化を検出できることが重要である。そこで、Ire1α遺伝子あるいはPERK遺伝子を欠失させたマウス線維芽細胞に、EGFPS-ATF6d発現ベクターとEGFPL発現ベクターを共発現させて、小胞体ストレス誘導剤であるツニカマイシンを0.2ug/mlで刺激後6時間に観察した。【０１２８】
図８に示すように、Ire1α遺伝子欠失線維芽細胞あるいはPERK遺伝子欠失線維芽細胞いずれにおいても、ツニカマイシン刺激により強い緑色蛍光を認めた。【０１２９】
このことから、ATF6活性レポーターシステムがIre1経路やPERK経路の影響を受けずにATF６の活性化を検出できることが確認できた。【０１３０】
８．EGFPS-ATF6d発現ベクターでのスペーサーの重要性の確認
高い蛍光シグナルを得るには、分割した蛍光緑色タンパク質が効率よく再構成する必要があり、分割した蛍光緑色タンパク質の会合を妨げないように適切なスペーサーを入れることが重要である。スペーサーの長さを検討するために、人工遺伝子合成技術により、図９に示すような２本鎖DNAを合成してpEGFPS-ATF6d発現ベクターに挿入し、スペーサーのみGGGSに変更したpEGFPS-ATF6d-SP1発現ベクターとスペーサーのみをGGGSGGGSGGGSに変更したpEGFPS-ATF6d-SP３発現ベクターを作製した。EGFPL発現ベクターにpEGFPS-ATF6d-SP1発現ベクター（スペーサーGGGS）、EGFPS-ATF6d発現ベクター（スペーサーGGGSGGGS）、pEGFPS-ATF6d-SP３発現ベクター（スペーサーGGGSGGGSGGGS）のいずれかを共発現させたHEK293細胞に、小胞体ストレス誘導剤であるツニカマイシンを0.2ug/mlで刺激後6時間に観察した。【０１３１】
図１０に示すように、スペーサーGGGSより長いスペーサーGGGSGGGSとスペーサーGGGSGGGSGGGSを発現させた細胞で、より強い緑色蛍光を認めた。【０１３２】
このことから、本システムにおいてスペーサーの長さの重要性が確認できた。【０１３３】
９．EGFPS-ATF6d発現ベクターでのPEST配列の重要性の確認
小胞体ストレス応答は小胞体の恒常性維持に必須で、病的な状態のみならず生理的な状態においても、小胞体ストレス応答が誘導されている。通常培養条件下の培養細胞においても、弱いながらも小胞体ストレス応答が惹起されている。それによってレポーターである緑色蛍光タンパク質の蓄積が生じて高いバックグランドシグナルとなることが、ATF6活性レポーターシステムを発現している細胞では予想される。そこで、緑色蛍光タンパク質の分解を促進するマウスODCのPEST配列を発現させるEGFPS-ATF6d発現ベクターあるいはマウスODCのPEST配列をもたないEGFPS-ATF6d-PEST(-)発現ベクターとEGFPL発現ベクターを共発現させたHEK293細胞に、刺激をする前と小胞体ストレス誘導剤であるツニカマイシンを0.2ug/mlで刺激後6時間に観察した。【０１３４】
図１１に示すように、PEST配列により通常培養条件下で緑色蛍光が著しい減弱を認めた。ツニカマイシン刺激ではPEST配列により緑色蛍光の誘導がやや低下を認めたが、非刺激時と刺激時での緑色蛍光輝度の増大率はPEST配列により向上した。【０１３５】
このことから、本システムにおいてPEST配列の重要性が確認できた。【０１３６】
１０．ATF6活性レポーターシステムを用いて臓器特異的な小胞体ストレス応答シグナルの違いの検出の確認
小胞体ストレス応答はIre1経路、PERK経路、ATF6経路の３つで制御されるが、小胞体の恒常性以外に、それぞれが独立して臓器特異的な代謝の制御に関連している。３つの小胞体ストレス応答経路を検出することは、副作用が少ない臓器特異的な小胞体ストレス応答を標的とした創薬で重要と予想できる。そこで、図１２に示すように、Nat Med.(2004) 10 98-102に報告されているXBP1のスプライシングによりIre1経路を測定するIre1活性化レポーター発現ベクターとJ Cell Biol.(2004) 167 27-33により報告されているATF4の翻訳によりPERK経路を測定するPERK活性化レポーター発現ベクターを作製した。膵β細胞株MIN6細胞、肝細胞株HepG2細胞、脂肪細胞株3T3-L1細胞、骨格筋細胞株L6細胞に、EGFPS-ATF6d発現ベクターとEGFPL発現ベクター、Ire1活性化レポーター発現ベクター、PERK活性化レポーター発現ベクターをそれぞれ発現させ、小胞体ストレス誘導剤であるツニカマイシンを0.2ug/mlで刺激後6時間に細胞を観察した。細胞の蛍光を倒立蛍光顕微鏡DMI6000B（Leica社）で観察した写真を図１３に示す。また、蛍光顕微鏡で観察した細胞像をＣＣＤカメラRolera-XR（Qiaging社）で取得して、画像解析ソフトImage-Pro Plus(Media Cybernetics社)で細胞が発する蛍光強度を定量した結果を図１４に示す。【０１３７】
図１３に示すように、同じストレス条件下においても、異なる臓器由来の細胞では小胞体ストレス応答シグナルに違いを認めた。【０１３８】
また図１４に示すように、ツニカマイシンに対するIRE1経路の活性化は、肝細胞株HepG2細胞、膵β細胞株MIN6細胞及び骨格筋細胞株L6細胞において比較的強く起こっており、脂肪細胞株3T3-L1細胞において比較的弱いことが示された。また、ツニカマイシンに対するATF6経路の活性化の程度は、程度の強い細胞から順に、肝細胞株HepG2細胞、膵β細胞株MIN6細胞、骨格筋細胞株L6細胞、脂肪細胞株3T3-L1細胞の順であった。さらに、ツニカマイシンに対するPERK経路の活性化の程度は、程度の強い細胞から順に、肝細胞株HepG2細胞、（膵β細胞株MIN6細胞及び骨格筋細胞株L6細胞）、脂肪細胞株3T3-L1細胞の順であった。【０１３９】
このことから、公知の技術に本システムを組み合わせることで、３つの小胞体ストレス応答経路からのシグナル強度の臓器特異的違いを明らかにできることが確認できた。さらに、３つの経路（ＩＲＥ１α、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ６それぞれを介する経路）の内、ＡＴＦ６経路のみを活性化する小胞体ストレッサーや、ＡＴＦ６経路、並びにＩＲＥ１α経路及びＰＥＲＫ経路からなる群から選択される少なくとも１経路を活性化する小胞体ストレッサーをスクリーニングできることが確認できた。【０１４０】
１１．膵臓β細胞におけるインスリン分泌の阻害
膵β細胞MIN6細胞を培養している培養液（10％牛胎児血清含有DMEM）に、コントロール溶液（DMSO）、タプシガルギン溶液（タプシガルギン／DMSO溶液）、又はDTT溶液（DTT／DMSO溶液）を加え、30分後に培養液を通常の培養液（10％牛胎児血清含有DMEM）に交換して、36時間培養した。なお、タプシガルギン溶液は、培養液中のタプシガルギン濃度が0.2 uMになるように加え、DTT溶液は、培養液中のDTT濃度が1 Mになるように加えた。その後、培養液を3 mM又は20 mMのグルコースを含むKREBS緩衝液に交換して1時間培養し、その培養液に分泌されたインスリン濃度をELISA法で測定した。結果を図１５に示す。【０１４１】
図１５に示すように、小胞体ストレス誘導剤であるタプシガルギン又はDTTを加えることによりインスリン分泌の抑制が認められた。【０１４２】
１２．ATF6活性レポーターシステムと従来法（ウェスタンブロット法）との検出感度の比較
小胞体ストレス特異的なATF6経路活性化を検出する感度について、ATF6活性レポーターシステムと従来法（ウェスタンブロット法）との間で比較した。【０１４３】
ATF6活性レポーターシステムの検出感度については次のように測定した。上記「４．ATF6活性レポーターシステム導入細胞の取得」に従って得られた脂肪細胞株3T3-L1細胞を既知の分化誘導刺激（インシュリン、デキサメタゾン、及び3−イソブチル−1−メチルキサンチンへの曝露）で刺激し、該刺激の14日間後に、小胞体ストレッサー候補物質として試験化合物（化合物1〜10の何れか）を加え、6時間後に小胞体ストレスなどの刺激剤（パルミチン酸）を最終濃度400μMになるように加え、更に16時間後に細胞像を倒立蛍光顕微鏡DMI6000B（Leica社）で取得し、画像解析ソフトImage-Pro Plus(Media Cybernetics社)で細胞が発する蛍光強度を定量した。【０１４４】
従来法（ウェスタンブロット法）については次のように測定した。脂肪細胞株3T3-L1細胞を既知の分化誘導刺激（インシュリン、デキサメタゾン、及び3−イソブチル−1−メチルキサンチンへの曝露）14日間後に、試験化合物（化合物1〜10の何れか）を加え、6時間後に小胞体ストレスなどの刺激剤を加え、更に16時間後細胞を回収した。該細胞から細胞抽出液を調製し、ATF6αタンパク質の発現量を、Anti-ATF6 alfa antibody mouse monoclonal （BioAcademia 73-505）を使用したウェスタンブロット法によって検出した。Image-Pro Plus(Media Cybernetics社)で検出シグナル強度を定量した。【０１４５】
結果を図１６に示した。縦軸に示される蛍光強度又はシグナル強度は、テスト化合物を加えない場合（コントロール）を「１」として表した。すなわち、縦軸数値が１以上であれば、テスト化合物によりATF6経路が活性化していることを示す。横軸にテスト化合物番号（１〜１０）を示した。【０１４６】
従来法においては、テスト化合物１〜１０のいずれを加えた場合でも、ATF6経路の活性化は見られなかった。これに対して、本法においては、テスト化合物４〜８及び１０を加えた場合において、ATF6経路の活性化が観察された（コントロールの約１．２倍）。【０１４７】
この結果より、従来法では検出できないようなわずかなATF6経路の活性化も、本法によれば検出できることが示された。すなわち、本法は、従来法に比べて顕著に優れた検出感度を有することが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年8月27日(2012.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非蛍光ペプチドドメイン１と非蛍光ペプチドドメイン２とからなる蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン１、及びＡＴＦ６タンパク質ドメインを有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
５’末端側に蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン１をコードする領域を有し、３’末端側にＡＴＦ６タンパク質ドメインをコードする領域を有し、非蛍光ペプチドドメイン１をコードする領域とＡＴＦ６タンパク質ドメインをコードする領域の間にＰＥＳＴ配列をコードする領域を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン１と、ＡＴＦ６タンパク質ドメインとが６アミノ酸残基以上のスペーサーを介して連結してなるアミノ酸配列をコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
【請求項６】
更に、非蛍光ペプチドドメイン１と非蛍光ペプチドドメイン２とからなる蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン２、及び核移行シグナルペプチドドメインを有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、該アミノ酸配列からなるタンパク質が発現可能な状態で含有する、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項４に記載のベクター、並びに非蛍光ペプチドドメイン１と非蛍光ペプチドドメイン２とからなる蛍光タンパク質に由来する非蛍光ペプチドドメイン２、及び核移行シグナルペプチドドメインを有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、該アミノ酸配列からなるタンパク質が発現可能な状態で含有する膵臓β細胞である、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
下記の工程（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を含む、小胞体ストレッサーのスクリーニング方法：
（ａ）小胞体ストレッサー候補物質と、請求項６に記載の形質転換体とを接触させる工程、
（ｂ）小胞体ストレッサー候補物質を接触させた形質転換体の蛍光強度を測定し、該蛍光強度を、小胞体ストレッサー候補物質を接触させない対照形質転換体の蛍光強度と比較する工程、
（ｃ）小胞体ストレッサー候補物質を接触させた形質転換体の蛍光強度が、該対照形質転換体の蛍光強度よりも高い場合に、該小胞体ストレッサー候補物質を小胞体ストレッサーとして選択する工程。
【請求項９】
小胞体ストレッサーが、
ＡＴＦ６経路を活性化し、且つＩＲＥ１α経路及びＰＥＲＫ経路を活性化しない小胞体ストレッサー、又は
ＡＴＦ６経路を活性化し、且つＩＲＥ１α経路及び／若しくはＰＥＲＫ経路を活性化する小胞体ストレッサー
である、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
下記の工程（ｄ）、（ｅ）、及び（ｆ）を含む、小胞体ストレス抑制剤のスクリーニング方法：
（ｄ）小胞体ストレッサー及び被検物質と、請求項６に記載の形質転換体とを接触させる工程、
（ｅ）小胞体ストレッサー及び被検物質を接触させた形質転換体の蛍光強度を測定し、該蛍光強度を、被検物質を接触させずに小胞体ストレッサーを接触させた対照形質転換体の蛍光強度と比較する工程、
（ｆ）小胞体ストレッサー及び被検物質を接触させた形質転換体の蛍光強度が、該対照形質転換体の蛍光強度よりも低い場合に、該被検物質を小胞体ストレス抑制剤として選択する工程。
【請求項１１】
下記の工程（ｇ）、（ｈ）、及び（ｉ）を含む、抗糖尿病薬候補物質のスクリーニング方法：
（ｇ）小胞体ストレッサー及び被検物質と、請求項７に記載の形質転換体とを接触させる工程、
（ｈ）小胞体ストレッサー及び被検物質を接触させた形質転換体の蛍光強度を測定し、該蛍光強度を、被検物質を接触させずに小胞体ストレッサーを接触させた対照形質転換体の蛍光強度と比較する工程、
（ｉ）小胞体ストレッサー及び被検物質を接触させた形質転換体の蛍光強度が、対照形質転換体の蛍光強度よりも低い場合に、該被検物質を抗糖尿病薬候補物質として選択する工程。
【国際調査報告】
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