(57)【要約】  ＭＨＣクラスＩＩを発現する悪性腫瘍に対して特異的な新たな治療薬を提供する。  重鎖ＣＤＲ１（配列番号５４の４９〜５４位で表わされるアミノ酸配列）、重鎖ＣＤＲ２（配列番号５４の６９〜８４位で表わされるアミノ酸配列）、重鎖ＣＤＲ３（配列番号５４の１１７〜１２８位で表わされるアミノ酸配列）、軽鎖ＣＤＲ１（配列番号５６の４６〜５５位で表わされるアミノ酸配列）、軽鎖ＣＤＲ２（配列番号５６の７１〜７７位で表わされるアミノ酸配列）、及び軽鎖ＣＤＲ３（配列番号５６の１００〜１０８位で表わされるアミノ酸配列）から選ばれる少なくとも一つを含む、悪性腫瘍に発現するＭＨＣクラスＩＩを構成するタンパク質を認識する抗体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖ＣＤＲ１（配列番号５４の４９〜５４位で表わされるアミノ酸配列）、重鎖ＣＤＲ２（配列番号５４の６９〜８４位で表わされるアミノ酸配列）、重鎖ＣＤＲ３（配列番号５４の１１７〜１２８位で表わされるアミノ酸配列）、軽鎖ＣＤＲ１（配列番号５６の４６〜５５位で表わされるアミノ酸配列）、軽鎖ＣＤＲ２（配列番号５６の７１〜７７位で表わされるアミノ酸配列）、及び軽鎖ＣＤＲ３（配列番号５６の１００〜１０８位で表わされるアミノ酸配列）から選ばれる少なくとも一つを含む、悪性腫瘍に発現しているＭＨＣクラスＩＩを構成するタンパク質を認識する抗体。
【請求項２】
重鎖が、以下の（ａ）又は（ｂ）である請求項１記載の抗体。
（ａ）配列番号５４の１９〜１４３位で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する重鎖。
（ｂ）配列番号５４の１９〜１４３位で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加された重鎖可変領域を有する重鎖。
【請求項３】
軽鎖が、以下の（ｃ）又は（ｄ）である請求項１又は２記載の抗体。
（ｃ）配列番号５６の２３〜１３２位で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖。
（ｄ）配列番号５６の２３〜１３２位で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加された重鎖可変領域を有する軽鎖。
【請求項４】
少なくともアミノ酸配列ＣＲＨＮＹＧＶＧＥＳＦＴ（配列番号：１）を含むエピトープと結合する抗原認識部位を有し、且つ悪性腫瘍に発現しているＭＨＣクラスＩＩを構成するタンパク質を認識することを特徴とする抗体。
【請求項５】
抗原認識部位が、更にアミノ酸配列ＲＮＱＫＧＨＳＧＬＱＰＲＧＦＬＳ（配列番号：２８）、アミノ酸配列ＦＦＮＧＴＥＲＶＲＬＬＥＲＨＦ（配列番号：８）、及びアミノ酸配列ＲＨＮＹＧＡＶＥＳＦＴＶＱＲＲ（配列番号：１５）から選ばれる少なくとも一つを認識する請求項４記載の抗体。
【請求項６】
悪性腫瘍に対して特異的に傷害活性を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項記載の抗体。
【請求項７】
ＭＨＣクラスＩＩを発現する悪性腫瘍が、悪性リンパ腫である請求項１〜６のいずれか１項記載の抗体。
【請求項８】
ＭＨＣクラスＩＩを構成するタンパク質が、ＨＬＡ−ＤＰβ、ＨＬＡ−ＤＱβおよびＨＬＡ−ＤＲβのうち少なくとも一つである請求項１〜６のいずれか１項記載の抗体。
【請求項９】
ＭＨＣクラスＩＩを構成するタンパク質がＨＬＡ−ＤＲβである請求項８記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項記載の抗体を含有する医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項記載の抗体を有効成分とするＭＨＣクラスＩＩを発現する悪性腫瘍治療薬。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項記載の抗体を含有するＭＨＣクラスＩＩを発現する悪性腫瘍検出薬。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項記載の抗体の有効量を投与することを特徴とするＭＨＣクラスＩＩを発現する悪性腫瘍の治療方法。
【請求項１４】
悪性リンパ腫細胞に対する傷害活性を有するモノクローナル抗体の作製方法であって、非ヒト動物に２種類の悪性リンパ腫細胞株で交互に少なくとも２回以上免疫する工程、当該免疫した非ヒト動物由来の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する工程、及び得られたハイブリドーマを培養する工程、を含んでなる悪性リンパ腫細胞に対する傷害活性を有するモノクローナル抗体の作製方法。
【請求項１５】
ハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体が、前記２種類の悪性リンパ腫細胞株とは異なる悪性リンパ腫と結合する抗体である、請求項１４記載の悪性リンパ腫細胞に対する傷害活性を有するモノクローナル抗体の作製方法。
【請求項１６】
前記免疫に用いる２種類の悪性リンパ腫細胞株及び前記２種類の悪性リンパ腫細胞株とは相違する悪性リンパ腫細胞株が、同一のＨＬＡを有する悪性リンパ腫細胞株である請求項１５記載の悪性リンパ腫細胞に対する傷害活性を有するモノクローナル抗体の作製方法。
【請求項１７】
前記免疫に用いる２種類の悪性リンパ腫細胞株がＬ４２８及びＫＭＨ−２である請求項１４〜１６のいずれか１項記載の悪性リンパ腫細胞に対する傷害活性を有するモノクローナル抗体の作製方法。
【請求項１８】
前記２種類の悪性リンパ腫細胞株とは相違する悪性リンパ腫細胞株がＬ５４０である請求項１５又は１６記載の悪性リンパ腫細胞に対する傷害活性を有するモノクローナル抗体の作製方法。
【請求項１９】
受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４１８であるハイブリドーマ。
【請求項２０】
請求項１９記載のハイブリドーマが産生する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣクラスＩＩ）を発現する悪性腫瘍、特に悪性リンパ腫に対して特異的に細胞傷害性活性を有する抗体に関する。本発明はさらに、該抗体を含んでなる医薬組成物、悪性リンパ腫の検出薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性リンパ腫は、リンパ系の組織から発生する腫瘍であり、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫に分類される。悪性リンパ腫の治療は主に放射線療法と抗がん剤による化学療法が行なわれる。悪性リンパ腫は、全身に発生するため、完治が困難であり、再発することもある。
近年では、抗ＣＤ２０を標的としたキメラ抗体（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）が作製され、非ホジキンリンパ腫の一種であるＢ細胞リンパ腫において有意な抗腫瘍効果を発揮しており、副作用も限定されている（非特許文献１）。しかしながらＲｉｔｕｘｉｍａｂ単独では効果が低い癌もあり、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾロンによる治療との併用療法が採用されているが、さらに有効な治療薬の開発が望まれている（非特許文献２、非特許文献３）。よって、新たな抗原をターゲットとした抗腫瘍抗体が必要とされており、ＭＨＣクラスＩＩに対するモノクローナル抗体には、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと異なる抗原を認識する抗体として臨床における抗悪性リンパ腫活性が期待される。しかし、これまでも抗ＭＨＣクラスＩＩに対する抗体、例えばＨＬＡ−ＤＲに対する抗体は開発されているものの、治療薬として使用されるまでにはいたっていない（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２００３／０３３５３８
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  Ｐ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．（１９９８），１６，２８２５−２８３３
【非特許文献２】Ｃｏｉｆｆｉｅｒ  Ｂ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００２），３４６，２３５−２４２
【非特許文献３】がんサポート  ２００５年１０月号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、ＭＨＣクラスＩＩを発現する悪性腫瘍、特に悪性リンパ腫に対して特異的な新たな治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ＭＨＣクラスＩＩを発現する悪性腫瘍、特に悪性リンパ腫に対して特異的に作用する医薬を開発すべく種々検討し、１種の悪性リンパ腫で免疫するのではなく、２種の悪性リンパ腫で免疫した非ヒト動物の抗体産生細胞を用いて融合細胞を作製し、当該融合細胞の中から、さらに別種の悪性リンパ腫と反応し、かつ該悪性リンパ腫に対する傷害活性を有するモノクローナル抗体を産生するクローンを選択した。得られたモノクローナル抗体は、多くの種類の悪性リンパ腫に対して傷害活性を有し、かつ他の細胞に対する傷害活性が弱く、選択的な悪性リンパ腫治療薬として有用であることを見出した。また、本発明者らは悪性リンパ腫の抽出液を用い、得られたモノクローナル抗体が特異的に悪性リンパ腫表面に発現しているＭＨＣクラスＩＩを構成する分子の一つであるＨＬＡ−ＤＲβ鎖と結合していることを見出し、さらに該モノクローナル抗体の可変領域の配列を特定し、該モノクローナル抗体が結合するエピトープを決定し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
［１］重鎖ＣＤＲ１（配列番号５４の４９〜５４位で表わされるアミノ酸配列）、重鎖ＣＤＲ２（配列番号５４の６９〜８４位で表わされるアミノ酸配列）、重鎖ＣＤＲ３（配列番号５４の１１７〜１２８位で表わされるアミノ酸配列）、軽鎖ＣＤＲ１（配列番号５６の４６〜５５位で表わされるアミノ酸配列）、軽鎖ＣＤＲ２（配列番号５６の７１〜７７位で表わされるアミノ酸配列）、及び軽鎖ＣＤＲ３（配列番号５６の１００〜１０８位で表わされるアミノ酸配列）から選ばれる少なくとも一つを含む、悪性腫瘍に発現しているＭＨＣクラスＩＩを構成するタンパク質を認識する抗体。
［２］重鎖が、以下の（ａ）又は（ｂ）である、［１］記載の悪性腫瘍に発現しているＭＨＣクラスＩＩを構成するタンパク質を認識する抗体。
（ａ）配列番号５４の１９〜１４３位で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する重鎖。
（ｂ）配列番号５４の１９〜１４３位で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加された重鎖可変領域を有する重鎖。
［３］軽鎖が、以下の（ｃ）又は（ｄ）である［１］又は［２］記載の抗体。
（ｃ）配列番号５６の２３〜１３２位で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖。
（ｄ）配列番号５６の２３〜１３２位で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加された重鎖可変領域を有する軽鎖。
［４］少なくともアミノ酸配列ＣＲＨＮＹＧＶＧＥＳＦＴ（配列番号：１）を含むエピトープと結合する抗原認識部位を有し、且つ悪性腫瘍に発現しているＭＨＣクラスＩＩを構成するタンパク質を認識することを特徴とする抗体。
［５］抗原認識部位が、更にアミノ酸配列ＲＮＱＫＧＨＳＧＬＱＰＲＧＦＬＳ（配列番号：２８）、アミノ酸配列ＦＦＮＧＴＥＲＶＲＬＬＥＲＨＦ（配列番号：８）及びアミノ酸配列ＲＨＮＹＧＡＶＥＳＦＴＶＱＲＲ（配列番号：１５）から選ばれる少なくとも一つを認識する［４］記載の抗体。
［６］悪性腫瘍に対して特異的に傷害活性を有することを特徴とする［１］〜［５］のいずれか記載の抗体。
［７］悪性腫瘍が、悪性リンパ腫である［１］〜［６］のいずれか記載の抗体。
［８］ＭＨＣクラスＩＩを構成するタンパク質がＨＬＡ−ＤＰβ、ＨＬＡ−ＤＱβおよびＨＬＡ−ＤＲβのうち少なくとも一つである［１］〜［６］のいずれか記載の抗体。
［９］ＭＨＣクラスＩＩを構成するタンパク質がＨＬＡ−ＤＲβである［８］記載の抗体。
［１０］［１］〜［９］のいずれか記載の抗体を含有する医薬組成物。
［１１］［１］〜［９］のいずれか記載の抗体を有効成分とするＭＨＣクラスＩＩを発現する悪性腫瘍治療薬。
［１２］［１］〜［９］のいずれか記載の抗体を含有するＭＨＣクラスＩＩを発現する悪性腫瘍の検出薬。
［１３］［１］〜［９］のいずれか記載の抗体の有効量を投与することを特徴とするＭＨＣクラスＩＩを発現する悪性腫瘍の治療方法。
［１４］悪性リンパ腫細胞に対する傷害活性を有するモノクローナル抗体の作製方法であって、非ヒト動物に２種類の悪性リンパ腫細胞株で交互に少なくとも２回以上免疫する工程、当該免疫した非ヒト動物由来の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する工程、及び得られたハイブリドーマを培養する工程、を含んでなる悪性リンパ腫細胞に対する傷害活性を有するモノクローナル抗体の作製方法。
［１５］ハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体が、前記２種類の悪性リンパ腫細胞株とは異なる悪性リンパ腫と結合することを特徴とする、［１３］記載の悪性リンパ腫細胞に対する傷害活性を有するモノクローナル抗体の作製方法。
［１６］前記免疫に用いる２種類の悪性リンパ腫細胞株及び前記２種類の悪性リンパ腫細胞株とは相違する悪性リンパ腫細胞株が、同一のＨＬＡを有する悪性リンパ腫細胞株である［１５］記載の悪性リンパ腫細胞に対する傷害活性を有するモノクローナル抗体の作製方法。
［１７］前記免疫に用いる２種類の悪性リンパ腫細胞株がＬ４２８及びＫＭＨ−２である［１４］〜［１６］のいずれか記載の悪性リンパ腫細胞に対する傷害活性を有するモノクローナル抗体の作製方法。
［１８］前記２種類の悪性リンパ腫細胞株とは相違する悪性リンパ腫細胞株がＬ５４０である［１５］又は［１６］記載の悪性リンパ腫細胞に対する傷害活性を有するモノクローナル抗体の作製方法。
［１９］受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４１８であるハイブリドーマ。
［２０］［１９］記載のハイブリドーマが産生する抗体。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の抗体は、悪性リンパ腫に発現するＭＨＣクラスＩＩを特異的に認識し、かつ悪性リンパ腫に対する傷害活性が強いため、ＭＨＣクラスＩＩを発現する悪性腫瘍、特に悪性リンパ腫の選択的治療薬として有用である。また、本発明の方法を用いれば、悪性リンパ腫特異的な抗原を認識する抗体を効率的に作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明モノクローナル抗体の悪性リンパ腫に対する作用を示す図である（５分後）。
【図２】本発明モノクローナル抗体の悪性リンパ腫に対する作用を示す図である（１５分後）。
【図３】本発明モノクローナル抗体の悪性リンパ腫に対する作用を示す図である（３０分後）。
【図４】本発明モノクローナル抗体の悪性リンパ腫に対する作用を示す図である（６０分後）。
【図５】本発明モノクローナル抗体のウェスタンブロット結果を示す。
【図６】細胞傷害を確認した各リンフォーマ細胞の本発明抗体の染色性（本発明抗体の細胞表面上の抗原発現量）および細胞傷害感受性をフローサイトメトリーを用いて解析した結果を示す。
【図７】細胞傷害を確認した各リンフォーマ細胞の本発明抗体の染色性（本発明抗体の細胞表面上の抗原発現量）および細胞傷害感受性をフローサイトメトリーを用いて解析した結果を示す。
【図８】ヒト末梢血に対する本発明抗体の作用を示すフローサイトメトリー解析結果を示す。
【図９】本発明抗体のＴＲＡＩＬ  Ｄｅａｔｈ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＤＲ４、ＤＲ５に対する反応性を示す。
【図１０】本発明モノクローナル抗体のＬ４２８、ＨＡＮＫＳ及びＴＬ−１に対する結合性を示すフローサイトメトリー解析結果を示す。
【図１１】本発明モノクローナル抗体とＬ４２８、ＨＡＮＫＳ及びＴＬ−１の分解物との反応性を示す図である。
【図１２】本発明モノクローナル抗体のＬ４２８細胞由来の溶出画分に対するＰＭＦ解析結果を示す。
【図１３】本発明モノクローナル抗体とＬ４２８、ＨＡＮＫＳ及びＴＬ−１の分解物との反応性を示す図である。
【図１４】本発明モノクローナル抗体と市販の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体のＬ４２８細胞への結合性を示す。
【図１５】本発明モノクローナル抗体の重鎖可変領域の遺伝子を示す。
【図１６】本発明モノクローナル抗体の軽鎖可変領域の遺伝子を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、タンパク質は下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略語を用いて表される。また、特に断りがない限り、ペプチド及びタンパク質のアミノ酸残基の配列は、左端から右端に向かってＮ末端からＣ末端となるように記載される。
Ａｌａ又はＡ：アラニン
Ｖａｌ又はＶ：バリン
Ｌｅｕ又はＬ：ロイシン
Ｉｌｅ又はＩ：イソロイシン
Ｐｒｏ又はＰ：プロリン
Ｐｈｅ又はＦ：フェニルアラニン
Ｔｒｐ又はＷ：トリプトファン
Ｍｅｔ又はＭ：メチオニン
Ｇｌｙ又はＧ：グリシン
Ｓｅｒ又はＳ：セリン
Ｔｈｒ又はＴ：トレオニン
Ｃｙｓ又はＣ：システイン
Ｇｌｎ又はＱ：グルタミン
Ａｓｎ又はＮ：アスパラギン
Ｔｙｒ又はＹ：チロシン
Ｌｙｓ又はＫ：リシン
Ａｒｇ又はＲ：アルギニン
Ｈｉｓ又はＨ：ヒスチジン
Ａｓｐ又はＤ：アスパラギン酸
Ｇｌｕ又はＥ：グルタミン酸
【００１１】
本発明は、悪性リンパ腫に発現するＭＨＣクラスＩＩを特異的に認識し、かつ悪性リンパ腫に対する傷害活性が強い抗体を提供する。また、悪性リンパ腫特異的な抗原を認識する抗体を効率的に作製する方法を提供する。
【００１２】
ＭＨＣクラスＩＩ抗体
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）は細胞表面に存在する細胞膜貫通型糖タンパク分子であり、細胞内のさまざまなタンパク質の断片（ペプチド）を細胞表面に提示する働きをもつ。ＭＨＣにはクラスＩとクラスＩＩの２つの種類があり、クラスＩは細胞内の内因性抗原を、クラスＩＩはエンドサイトーシスで細胞内に取り込まれて分解された外来性抗原を結合して提示する。このうちクラスＩＩは、マクロファージや樹状細胞、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞などの抗原提示細胞等に発現しており、ヒトではＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰの三種類がある。また、これらは各々α鎖およびβ鎖からなる２つのタンパク質の複合体として機能している。
【００１３】
本発明の抗体は、悪性腫瘍に発現しているＭＨＣクラスＩＩを構成するタンパク質を認識し、悪性腫瘍に対して傷害活性を有するものであれば特に制限はなく、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であっても良い。また、天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、ヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒト抗体、Ｆａｂ発現ライブラリーによって作製された抗体断片、及びこれらの結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。
【００１４】
本発明の抗体は少なくともＨＬＡ−ＤＲ５２の配列ＣＲＨＮＹＧＶＧＥＳＦＴ（配列番号：１）に結合する能力を有し、この領域内を認識すると考えられる。
【００１５】
更に、本発明の抗体はアミノ酸配列ＲＮＱＫＧＨＳＧＬＱＰＲＧＦＬＳ（配列番号：２８）、アミノ酸配列ＦＦＮＧＴＥＲＶＲＬＬＥＲＨＦ（配列番号：８）、及びアミノ酸配列ＲＨＮＹＧＡＶＥＳＦＴＶＱＲＲ（配列番号：１５）から選ばれる少なくとも一つに結合する能力を有する。
【００１６】
また、本発明の抗体は、悪性腫瘍に発現しているＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰまたはＨＬＡ−ＤＱを認識し、悪性腫瘍に対して傷害活性を有するものであれば特に制限はない。本発明の抗体は、例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）として重鎖ＣＤＲ１（配列番号５４の４９〜５４位で表わされるアミノ酸配列）、重鎖ＣＤＲ２（配列番号５４の６９〜８４位で表わされるアミノ酸配列）、重鎖ＣＤＲ３（配列番号５４の１１７〜１２８位で表わされるアミノ酸配列）、軽鎖ＣＤＲ１（配列番号５６の４６〜５５位で表わされるアミノ酸配列）、軽鎖ＣＤＲ２（配列番号５６の７１〜７７位で表わされるアミノ酸配列）、及び軽鎖ＣＤＲ３（配列番号５６の１００〜１０８位で表わされるアミノ酸配列）から選ばれる少なくとも一つを含む、悪性リンパ腫に発現するＨＬＡ−ＤＲを認識するモノクローナル抗体であってもよい。または、配列番号５４の１９〜１４３位で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号５６の２３〜１３２位で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、悪性腫瘍に発現するＭＨＣクラスＩＩを認識し、悪性腫瘍に対して傷害活性を有する抗体であってもよい。なお、細胞傷害活性には、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）と抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を含む。
【００１７】
また、本発明の抗体は、悪性腫瘍に発現しているＭＨＣクラスＩＩを認識し、悪性腫瘍に対して傷害活性を有する限り、配列番号５４の１９〜１４３位で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号５６の２３〜１３２位で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、悪性腫瘍に発現するＭＨＣクラスＩＩを認識する抗体であってもよく、そのアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。ここで、「アミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により、または天然に生じ得る程度の１又は数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味する。アミノ酸の改変の個数は、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらにより好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜２個である。また、本発明の抗体は、前記アミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、特に好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域又は軽鎖可変領域を含む、悪性腫瘍に対して傷害活性を有する抗体であってもよい。
【００１８】
また、本発明の抗体はヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなるヒト化抗体であっても良く、この様な抗体はマウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。このヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体のＣＤＲをヒト抗体のＣＤＲへ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９９３，５３，８５１−８５６．）。
【００１９】
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９３／１２２２７，ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２，ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
【００２０】
抗体のクラスは特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。精製の容易性等を考慮すると好ましくはＩｇＧであり、より好ましくはＩｇＧ１ａである。
【００２１】
機能的断片としては、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物が挙げられる。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｄｉａｂｏｄｙなどを挙げることができる。このような抗体断片を得るには、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
【００２２】
医薬組成物
本発明のＭＨＣクラスＩＩを発現する悪性腫瘍の治療薬等の医薬組成物は、当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、製剤化することができる。
【００２３】
治療対象となる疾患は、ＭＨＣクラスＩＩを発現する悪性腫瘍であれば特に限定されないが、例えば悪性リンパ腫が挙げられる。この悪性リンパ腫としては、白血病（慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病を含む）、リンパ腫（非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞系リンパ腫、Ｂ細胞系リンパ腫、バーキットリンパ腫、悪性リンパ腫、びまん性リンパ腫、濾胞性リンパ腫を含む）等が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明の抗体を適用する際の腫瘍は１種類に限られず、複数種類の腫瘍が併発したものでもよい。
【００２４】
経口投与用の好適な製剤は、本発明抗体を、水、生理食塩水のような希釈剤に有効量溶解させた液剤、有効量を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、顆粒剤、散剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量を懸濁させた懸濁液剤、有効量を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００２５】
非経口投与用には、本発明抗体を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、坐剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、本発明の抗体を水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、本発明の医薬は、油性又は水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、又は乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、本発明抗体を粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液又は懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、本発明抗体を粉末化し、ラクトース又はデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。坐剤処方は、本発明抗体をカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、本発明の治療剤は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。
【００２６】
また、本発明の抗体に、ヨード、イットリウム、インジウム、テクネチウム等の放射性核種［Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｍｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．，１９９３  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ］、緑膿菌毒素、ジフテリアトキシン、リシンのような細菌毒素、及びメトトレキセート、マイトマイシン、カリキアマイシンなどの化学療法剤［Ｄ．Ｊ．Ｋｉｎｇ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，１９９８  Ｔ．Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ．；Ｍ．Ｌ．Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ＢａｓｅｄＴｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．，１９９８  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ］、さらに、Ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ等のプロドラッグ［Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９２  Ｖｏｌ．５２：１２７；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６  Ｖｏｌ．９３：８６８１］などを結合させることにより悪性リンパ腫に対する治療効果をさらに増強することも可能である。
【００２７】
本発明抗体の投与量は、患者の症状、投与経路、体重、年令等によっても異なるが、例えば成人１日あたり１μｇ〜５００ｍｇであるのが好ましい。
【００２８】
治療方法
本発明の医薬組成物を用いれば、生物学的活性を示す物質により治療され得る悪性リンパ腫を治療することができる。従って、本発明は、本発明抗体の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、悪性リンパ腫の治療方法を提供する。
【００２９】
ＭＨＣクラスＩＩを発現する悪性腫瘍の検出薬
本発明によれば、ＭＨＣクラスＩＩを発現する悪性腫瘍の存在を検出するための試薬であって、本発明の抗体を含んでなる試薬が提供される。本発明の抗体は、標識したものであってもよい。この検出薬は抗原抗体反応を検出することによりＭＨＣクラスＩＩを発現する悪性腫瘍の存在を検出する。従って本発明の検出薬は、所望により、抗原抗体反応を実施するための種々の試薬、例えばＥＬＩＳＡ法等に用いる２次抗体、発色試薬、緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
【００３０】
悪性リンパ腫を特異的に認識する抗体の作製方法
本発明のモノクローナル抗体は、非ヒト動物に２種類の悪性リンパ腫細胞株で交互に各２回以上免疫する工程、当該免疫した非ヒト動物由来の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する工程、得られたハイブリドーマを培養する工程を含む。
【００３１】
免疫に用いる２種類の悪性リンパ腫細胞株（以下、免疫細胞株ともいう）は、既知の樹立された悪性リンパ腫細胞株の中から選ばれた２種であればよく、ホジキンリンパ腫細胞株でも非ホジキンリンパ腫細胞株でもよい。例えばＫＭＨ−２、Ｌ４２８、Ｌ５４０、ＲＡＪＩ、Ｄａｕｄｉ、ＫＡＲＰＡＳ−２９９、Ｃ１Ｒ及びＨＴから選ばれる２種が挙げられる。このうち、同一のＨＬＡを有する細胞株から選択するのが好ましい。例えばＫＭＨ−２、Ｌ４２８及びＬ５４０はＨＬＡ−ＡがいずれもＡ３であるから、これらの中から２種を選択して使用するのが好ましい。さらに、ＫＭＨ−２とＬ４２８を用いるのが特に好ましい。
【００３２】
これらの２種類の免疫細胞株で交互に２回以上免疫する。すなわち、２種類の免疫細胞株で交互に２回以上、合計で４回以上免疫する。より好ましい免疫回数は各２〜５回であり、さらに好ましくは各３回以上であり、特に好ましくは各３回である。１回の免疫に用いる免疫細胞株の量は、２×１０７〜１０８個、特に３×１０７個が好ましい。
【００３３】
免疫の手段としては、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射、足蹠注射などが挙げられるが、腹腔内注射が好ましい。免疫の間隔は、例えば２週間〜４週間間隔が好ましい。その後、免疫した動物の血清中の抗原に対する抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給原として用いる。最終免疫から３〜５日後の動物由来の抗体産生細胞を用いるのが好ましい。
【００３４】
免疫に用いられる非ヒト動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ブタ等が挙げられるが、マウスが特に好ましい。また、抗体産生細胞としては、脾、リンパ節、骨髄等が挙げられるが、脾細胞が好ましい。
【００３５】
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ等の動物由来のものが挙げられるが、マウス由来の株化ミエローマ細胞が好ましい。具体的には、Ｐ３×６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３−Ｕ１）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）、Ｓｐ２／ｏ−Ａｇ１４（ＳＰ−２）、Ｐ３×６３Ａｇ８．６５３（６５３）、Ｐ３×６３Ａｇ８（×６３）などが挙げられる。
【００３６】
前記の抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、例えば抗体産生細胞とミエローマ細胞とを細胞数で０．５：１〜２：１の割合になるように混合し、５０ｗ／ｖ％ポリエチレングリコール（分子量１０００〜４０００）を添加して行う。その後、ＨＡＴ培地を用いた選択により融合細胞を選択する。
【００３７】
得られたハイブリドーマから、前記２種の免疫細胞株とは相違する悪性リンパ腫細胞株（以下、選択細胞株ともいう）と反応し、かつ該悪性リンパ腫細胞株傷害活性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する。選択細胞株は、前記の２種の免疫細胞株とは相違する細胞株であればよく、前述の悪性リンパ腫細胞株から選ぶことができる。選択細胞株は、ホジキンリンパ腫細胞株でも非ホジキンリンパ腫細胞株でもよい。また、前記の免疫用細胞株と同一のＨＬＡを有する細胞株がより好ましく、ＨＬＡ−ＡがＡ３であるのがより好ましい。特にＬ５４０が好ましい。
【００３８】
本発明ハイブリドーマの選択は、例えば選択細胞株の培養液に、被検ハイブリドーマの上清を添加して、トリパンブルー等の色素を用いるダイエクスクロージョンテストにより、選択細胞株を障害するモノクローナル抗体を産生するクローンを選択する。
【００３９】
かくして得られた本発明のハイブリドーマの例としては、４７１３ｍＡｂ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４１８）が挙げられる。４７１３ｍＡｂは、〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１−１−１つくばセンター中央第６  独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物センターに寄託されている（寄託日：平成２２（２０１０）年９月２８日）。
【００４０】
本発明のハイブリドーマを培養することにより、悪性リンパ腫治療薬として有用なモノクローナル抗体を得ることができる。大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、スピナー培養、あるいはホローファイバーシステムを用いた培養で行われる。この大量培養における上清を、ゲルろ過等、当業者に周知の方法を用いて精製することにより、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。また、同系統のマウスの腹腔内で該ハイブリドーマを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。また、得られたモノクローナル抗体は、前述の方法によりキメラ抗体、ヒト化抗体とすることができる。
【実施例】
【００４１】
実施例１
（１）免疫方法
ＢＡＬＢ／ｃ，８週齢のメスマウスに２週間おきに３×１０７個ずつの２種類のホジキンリンパ腫細胞を交互に３回ずつ計６回免疫した。アジュバンドは用いず、培養細胞を２回生理食塩水で洗浄して生理食塩水２００μＬに再懸濁して腹腔に注射した。
２種類のホジキンリンパ腫はＬ４２８とＫＭ−Ｈ２で、ともにＨＬＡ−Ａ３を発現していることから選んだ。【００４２】
（２）細胞融合
最終免疫から３日後に免疫マウスの脾臓細胞１０８個とミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１１０８個とをＰＥＧ４０００を用いて細胞融合させた。これを９６ｗｅｌｌ  ｆｌａｔのプレート５０枚に蒔いた。【００４３】
（３）スクリーニング方法
ＨＬＡ−Ａ３を発現しているホジキンリンパ腫Ｌ５４０細胞２×１０６個／ｍＬ、５０μＬ  ＲＰＭＩ（ｃｏｎｔａｉｎ  ２％ＦＣＳ）をｆｉｓｈｅｒ  ｔｕｂｅもしくは別の９６ｗｅｌｌ  ｆｌａｔのプレートに入れ、これにｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｗｅｌｌのｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｕｐ．５０μＬを加え３７℃で１時間インキュベーションした。
トライパンブルーを加えｄｙｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｔｅｓｔで標的細胞Ｌ５４０細胞を殺す抗体を産生するクローンを調べた。（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ  １８１  Ｊｕｎｅ  １９９５  の２００８ページに従う）
これにより得たクローン（４７１３ｍＡｂと名付けた）を２回リミティング  ダイリューションして得たハイブリドーマの培養上清もしくはヌードマウスにつくらせた腹水を以降の実験に用いた。
抗体のサブクラスはマウスＩｇＧ１であった。【００４４】
実施例２
（方法）Ｌ５４０に対する細胞傷害活性を調べたのと同様の方法でホジキンリンフォーマであり、かつマウスの免疫に用いたＬ４２８およびＫＭ−Ｈ２に対する本発明モノクローナル抗体（４７１３ｍＡｂ）細胞傷害活性を調べた。２×１０６／ｍＬのＬ４２８細胞又はＫＭ−Ｈ２細胞に３μｇ／ｍＬとなるよう４７１３ｍＡｂを添加して細胞の形態の経過を顕微鏡で観察する。ＫＭ−Ｈ２に関しては１時間のインキュベーションでは１０％以下の細胞致死率しか得られなかった。しかし細胞死に至る前にしばしば認められる細胞の凝集が認められたため、さらに１２時間インキュベーションでの細胞傷害活性を同様の方法で調べた。【００４５】
（結果）
結果を図１〜図４に示す。
図１〜図４から明らかなように、数分で細胞が凝集し（図１）、１５分でトライパンブルーを添加すると凝集した細胞塊の一部の細胞が青色に染まり抗体により殺された細胞が出現し始めたことが観察される（図２）、抗体とのインキュベーションが３０分を超えると３０％を超える細胞が傷害されてきているのが観察される（図３）、抗体とのインキュベーションが６０分でほとんどの細胞が細胞死を経て溶解してしまう。死細胞が主体となる凝集塊が残存して観察されることもある（図４）。【００４６】
実施例３
本発明モノクローナル抗体（４７１３ｍＡｂ）のウェスタンブロット結果を図５に示す。【００４７】
実施例４
上記実施例と同様の方法でホジキン以外のリンフォーマ細胞としてバーキットリンフォーマに対する細胞傷害活性を調べた。その結果、ホジキンリンフォーマと同様に調べたバーキットリンフォーマでも１時間で５０％をわずかに超えるリンフォーマ細胞が傷害された。【００４８】
実施例５
その他のリンフォーマ細胞に対する細胞傷害活性も同様な方法で調べた。結果を表１に示す。【００４９】
【表１】
2012046745.tif 000002
【００５０】
表１から明らかなように、４７１３ｍＡｂは、多種の悪性リンパ腫を障害するが、正常リンパ球は傷害しない。【００５１】
実施例６
細胞傷害を確認した各リンフォーマ細胞に対する本発明抗体の染色性および細胞傷害感受性をフローサイトメトリーで解析した。
細胞浮遊液に本発明抗体を添加して３０分後に洗浄後二次抗体としてフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を結合したラット抗マウスイムノグロブリンと反応させ染色性を緑線のヒストグラムで示す（図６、７）。慢性骨髄性白血病由来の細胞株であるＫ５６２以外では黒い実線で示した基線より大きく右にシフトして、よく染色されていることが判る。つまり、抗体がリンフォーマ細胞表面を認識していることが示されている。またこの時、死細胞にのみ取り込まれるプロピディウムイオダイド（ＰＩ）による染色を赤線のヒストグラムで示す。
わずか３０分のインキュベーションでかなりの細胞がすでに死んでいることが判る。Ｋ５６２のように緑線のシフトの少ない、つまり抗体があまり結合しない、表面抗原の少ない細胞でも僅かながら死細胞が認められる。【００５２】
実施例７
健常人の末梢血を採取しトリス塩化アンモニウムで赤血球を溶解除去した後、そのままもしくはＣｏｎ  Ａで２４時間刺激した後に本発明抗体と１時間インキュベーションした。次に第二抗体としてＦＩＴＣラベルした抗マウスイムノグロブリン抗体で染色した後フローサイトメトリーで解析した。このときＰＩも添加して死細胞数も解析した。【００５３】
（結果）
本発明モノクローナル抗体は、図８に示すように、健常人の末梢血の一部を染色するが、少なくとも６０分間は健常人の末梢血細胞を殺すことはなかった。Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ（Ｃｏｎ  Ａ）で１２時間活性化しても結果は同じであった。【００５４】
実施例８
本発明抗体のＴＲＡＩＬ  Ｄｅａｔｈ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＤＲ４、ＤＲ５に対する反応性
（方法）ハムスターの細胞であるＢＨＫ細胞にＤＲ４  ＲｅｃｅｐｔｏｒやＤＲ５Ｒｅｃｅｐｔｏｒを遺伝子導入した細胞と本発明抗体を１時間インキュベーションして実験６と同様にフローサイトメトリーで解析した。【００５５】
（結果）
本発明抗体がＤｅａｔｈ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（細胞死に導く抗原）として知られているＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ）Ｄｅａｔｈ  ＲｅｃｅｐｔｏｒであるＤＲ４  ＲｅｃｅｐｔｏｒやＤＲ５Ｒｅｃｅｐｔｏｒを標的とする抗体であるかどうかを確認するためにハムスターの細胞であるＢＨＫ細胞にＤＲ４  ＲｅｃｅｐｔｏｒやＤＲ５Ｒｅｃｅｐｔｏｒを遺伝子導入した細胞の本発明抗体による染色性を同様の方法で確かめたところ、既知のＤＲ４  ＲｅｃｅｐｔｏｒやＤＲ５Ｒｅｃｅｐｔｏｒに対する抗体では染色された（赤線）が、本発明抗体では染色されなかった（図９）。したがって本抗体はＤＲ４やＤＲ５などのＴＲＡＩＬ  Ｄｅａｔｈ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒを標的とした抗体ではないことが確認された。【００５６】
実施例９（４７１３ｍＡｂと悪性リンパ腫細胞株との結合）
Ｌ４２８、ＨＡＮＫ１、ＴＬ１細胞を、フローサイトメーターで解析し、４７１３ｍＡｂの結合を確認した（図１０）。【００５７】
実施例１０（４７１３ｍＡｂの標的抗原の同定）
ＧＥヘルスケア社プロトコールに従い４７１３ｍＡｂ（５ｍｇ）をＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰ（１ｍＬ容量、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＃１７−０７１６−０１）に結合させた４７１３ｍＡｂカラムを作製した。Ｌ４２８、ＨＡＮＫＳ、ＴＬ細胞（１×１０８個）を１％  Ｎｏｉｎｄｅｔ  Ｐ−４０（和光純薬工業）とタンパク分解酵素阻害剤（ロッシュ社）を含むリン酸緩衝液でけん濁し、４℃で５分間インキュベートした後、卓上遠心機（１５００ｒｐｍ，５分間）で分離した。上澄画分を回収し、リン酸緩衝液で平衡化した４７１３ｍＡｂカラムにアプライした。リン酸緩衝液で洗浄後、０．１％グリシン塩酸水溶液（ｐＨ２．７）で溶出し、１Ｍ  トリス塩酸水溶液（ｐＨ９．０）で中和した。
溶出画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、クマーシーブリリアントブルー染色を行った（図１１）。回収率の高かったＬ４２８細胞由来の溶出画分を、分子量の低い方から番号を付け、９つのバンドのペプチド質量フィンガープリント（ＰＭＦ）解析を実施した（図１２）。その結果を表１（島津テクノリサーチ実施）に示す。次に、溶出画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、４７１３ｍＡｂを用いたウエスタンブロット法で解析した。その結果、ＰＭＦ解析で同定されたＭａｔ  Ｉ−２のバンドであるＨＬＡ−ＤＲ  β−ｃｈａｉｎに４７１３ｍＡｂが結合することが認められた（図１３）。【００５８】
【表２】
2012046745.tif 000003
【００５９】
実施例１１（ＨＬＡクラスＩＩ−β鎖のペプチドライブラリーと４７１３ｍＡｂの結合能解析）
ソフトウエアＭａｓｃｏｔ（島津テクノリサーチ）による解析の結果、最も相同性が高かったＨＬＡ−ＤＲ５２β−ｃｈａｉｎのアミノ酸配列を用いて、１アミノ酸移動させた８から１２アミノ酸からなるオーバーラップペプチドをＣ末端からアレイ上で化学合成したペプチドマイクロアレイを作製した（ＬＣ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳ）。まず非特異的な抗体の結合を防ぐブロッキングとして、アレイを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ｐＨ７．０）（ピアス社）溶液に４℃で１昼夜浸した。次に、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０と０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の洗浄液で洗浄した後、５μｇ／ｍＬの４７１３ｍＡｂ溶液内で２５℃、１時間インキュベートした。洗浄液で２０分間洗浄後、１０ｎｇ／ｍＬのＣｙ５標識したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体溶液内で２５℃、１時間インキュベートした。マイクロアレイスキャナー（ＰＭＴ７００ボルト）の６３５ｎｍの波長で、Ｃｙ５を測定した。Ｃ末端にトリプトファン残基を持つペプチド配列に対する非特異的結合が認められたため、それらを削除して特異的結合を示すペプチド配列を解析した。その結果、すべてのＨＬＡクラスＩＩ（ＤＲ，ＤＰ，ＤＱ）のβ−ｃｈａｉｎ分子に保存されている４つのシステイン残基の中で、Ｎ末端側から２番目のシステイン残基から１２アミノ酸残基からなるペプチド（ＣＲＨＮＹＧＶＧＥＳＦＴ：配列番号１）領域内に、唯一４７１３ｍＡｂ特異的な結合シグナルを認めた。ＷＯ２００３／０３３５３８に記載されている抗体が結合するＨＬＡ−ＤＲβ−ｃｈａｉｎ上のペプチド配列（ＷＮＳＱＫＤＩＬＥＱＫＲＧ：配列番号２）は、Ｎ末端から２番目のシステイン残基の６アミノ酸残基前に存在しているが、４７１３ｍＡｂの結合は認められなかった。【００６０】
上記ペプチドマイクロアレイの結果を再確認するため、Ｌ４２８細胞が発現するＨＬＡ−ＤＲを解析した。血清対応型タイピングの結果、Ｌ４２８細胞はＨＬＡ−ＤＲ１２のみを発現していることが明らかとなった（（株）エスアールエル）。次にＨＬＡ−ＤＲ１２アミノ酸配列からオーバーラップペプチドを合成し、カスタムＳＰＯＴｓニトロセルロースメンブレンを作製した（シグマアルドリッチ）。メンブレンをメタノールで５分リンスした後、トリスホウ酸緩衝液（ＴＢＳ）で洗浄し、ブロッキングを２時間室温でインキュベートし行った。次に、ビオチン化４７１３抗体を最終濃度１μｇ／ｍＬで添加し、３時間インキュベートした。メンブレンを洗浄後、パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識したストレプトアビジン（ダコ社製）をＴＢＳで３０００倍希釈した溶液中で２時間インキュベートした。洗浄後、ＥＣＬプライムウエスタンブロッティング検出キット（ＧＥヘルスケア社製）と化学発光検出器（ＬＡＳ−４０００）により陽性スポットを検出した（表３）。その結果、最も強く反応したペプチドはＤＲ１２−２６で、その次に強い反応を示したペプチドはＤＲ１２−６とＤＲ１２−１３であった。ＤＲ１２−１３はペプチドマイクロアレイ解析の結果、唯一特異的な結合能をもったＨＬＡ−ＤＲ５２のペプチド配列、ＣＲＨＮＹＧＶＧＥＳＦＴと同じ領域のＨＬＡ−ＤＲ１２由来のペプチド配列であることから、再現性がある結合能であることが認められた。また、ＷＯ２００３／０３３５３８に記載されている抗体が結合するＨＬＡ−ＤＲ１２由来のペプチドもＤＲ１２−２８に配置したが、結合は認められなかった（表３）。一方、ＨＬＡ−ＤＲの細胞内領域にあるＤＲ１２−２６ペプチドや、別の細胞外領域にあるＤＲ１２−６ペプチドにも強い結合能が認められたから、４７１３抗体がエピトープ配列以外のペプチドにも結合し得る可能性も示唆された。【００６１】
【表３】
2012046745.tif 000004
【００６２】
実施例１２（ＨＬＡ−ＤＲエピトープペプチドライブラリーと４７１３ｍＡｂの結合能解析）
ＷＯ２００３／０３３５３８記載の抗体が結合するＨＬＡ−ＤＲβ鎖内のエピトープ配列群のペプチドライブラリーを、実施例３と同様にカスタムＳＰＯＴｓニトロセルロースメンブレン上に作製し、４７１３抗体との結合能をウエスタンブロッティングで解析した。その結果、ペプチドの＃２５、＃３４、＃３８との結合能が認められた（表４）。また、実施例３で結合能が認められた３つのペプチドＤＲ１２−３、ＤＲ−１３、ＤＲ−２６への結合能の再現性も認められた。以上の結果は、４７１３抗体がエピトープ配列以外のペプチド配列にも結合する能力を示唆しているが、結合するペプチド群の１次配列に相同性が認められないことから、ペプチドの立体構造を認識している可能性が考えられる。【００６３】
【表４】
2012046745.tif 000005
【００６４】
実施例１３（４７１３ｍＡｂと抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体のＬ４２８細胞への結合能と細胞死誘導能の比較）
４７１３ｍＡｂと同様にＨＬＡ−ＤＲに結合することがわかっている市販の抗体（クローン名：ＬＮ３）のＬ４２８細胞への結合能と細胞死誘導能を比較した。Ｌ４２８細胞への各抗体の結合能は、段階希釈した各抗体溶液とのインキューベーションＶ、フローサイトメーターにより解析した。両抗体とも濃度依存的な結合能を示すものの、４７１３ｍＡｂの方が、ＬＮ３に比べて約１０倍低濃度で同様の結合能示すことが認められた（図１４と表５）。細胞死誘導は、ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）の取り込みをフローサイトメーターで解析した。その結果、４７１３ｍＡｂの細胞死誘導能は、細胞表面への結合能にほぼ相関して、ＬＮ３よりも約１０倍低濃度で活性を示した（表５）。【００６５】
【表５】
2012046745.tif 000006
【００６６】
実施例１４（４７１３ｍＡｂ産生ハイブリドーマからの抗体遺伝子のクローニング）
１．マウス抗体（ＩｇＧ）配列特異的ＲＴ反応
４７１３ｍＡｂを産生するハイブリドーマ（受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４１８）から定法に従って調製した全ＲＮＡを鋳型として、マウス抗体（ＩｇＧ）重鎖特異的なプライマー（Ｈ−ＲＴ１：ＴＣＣＡＫＡＧＴＴＣＣＡ（配列番号７））を用いてｃＤＮＡ合成を行った。同様に軽鎖特異的なプライマー（Ｌ−ＲＴ１：ＧＣＴＧＴＣＣＴＧＡＴＣ（配列番号８））を用いてｃＤＮＡを合成した。ＲＴ反応は、ＳＭＡＲＴｅｒＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｃａｔ．Ｎｏ．６３４９２４）の説明書に従い、以下の条件で行なった。【００６７】
（１）全ＲＮＡ  ０．５μｇ、Ｈ−ＲＴ１又はＬ−ＲＴ１（１２μＭ）１μｌ、ｄＨ２Ｏ  ３．７５μｌまでを混合し、７０℃、３分間、４２℃、２分間の反応を行った。
（２）反応液に、ＳＭＡＲＴｅｒ  ＩＩ  Ａ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（１２μＭ）１μｌ、ＤＴＴ（２０ｍＭ）１μｌ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（各１０ｍＭ）１μｌ、５×Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２μｌ、ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μｌ）０．２５μｌ、ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅＴＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（１００Ｕ／μｌ）１μｌを添加し、４２℃、９０分間、７０℃、１０分間の反応を行った。
（３）５０μｌ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＥＤＴＡバッファーを添加して反応を停止させ、−２０℃にて保存した。【００６８】
２．マウス抗体（ＩｇＧ）配列特異的ＲＡＣＥ  ＰＣＲ反応
ＳＭＡＲＴｅｒＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ解析を行った。
（１）上記１で合成したｃＤＮＡ（重鎖特異的なプライマーにより合成）を鋳型として、マウス抗体（ＩｇＧ）重鎖特異的なプライマーをリバースプライマー、キットに含まれるＵＰＭ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘ）をフォワードプライマーとしてＲＡＣＥ  ＰＣＲ反応を行った。同様にｃＤＮＡ（軽鎖特異的なプライマーにより合成）を鋳型に、軽鎖特異的なプライマーを用いてＲＡＣＥ  ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ酵素にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（タカラバイオ株式会社）を使用した。
ＰＣＲ反応は上記キットに添付されたプロトコルに従って行なった。
（２）想定の大きさのＰＣＲ産物が得られたことを、アガロースゲルで電気泳動することにより確認した。ＰＣＲ産物をＨ鎖ＲＴ−ＰＣＲ（ＳＹＮ３４６０Ｈ）、Ｌ鎖ＲＴ−ＰＣＲ（ＳＹＮ３４６０Ｌ）と命名し、ゲル抜き精製後、解析に用いた。【００６９】
３．クローニング及び塩基配列解析
（１）ゲル抜き精製したＰＣＲ産物（ＳＹＮ３４６０Ｈ、ＳＹＮ３４６０Ｌ）をクローニングプラスミドｐＭＤ２０−Ｔ（タカラバイオ株式会社）にライゲーションした。
（２）常法により形質転換を行い、ＰＣＲ産物ごとに４８クローンを取得した。
（３）取得したクローンに含まれるインサートの配列を定法に従い解析した。シークエンス反応は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ社）を使用し、同社プロトコルに従ってＡＢＩ３７３０  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ社）により行った。
（４）重鎖、軽鎖、それぞれ４８クローンの塩基配列解析結果と、ここからベクター領域及び確度の低い領域を除いた塩基配列を取得した。【００７０】
４．結果評価
次に、３−（４）で得られた塩基配列を用いて以下の解析を行った。
（１）取得配列の分類とコンセンサス配列の取得
重鎖、軽鎖の塩基配列を相同性により分類した。相同性比較はＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅアセンブルソフトウエア、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲＴＭ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ：Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）版）により行った。この結果、重鎖で２つ、軽鎖で３つのコンティグが得れた（コンティグを構成しない配列も見られた。）。得られたコンティグからコンセンサス配列を取得した。
（２）目的遺伝子の候補配列について
コンセンサス配列及び、コンティグを形成しなかった配列から、目的遺伝子の候補と考えられる配列を選別した。ここでは抗体定常域遺伝子のアミノ酸配列上流に、ストップコドンを含まずにメチオニン残基を持つ配列を全て選択した。
（３）アミノ酸配列の推定
候補配列の内、コンティグを形成した配列数及び、取得配列で考えられた遺伝子長から、重鎖、軽鎖それぞれのメジャーコンティグが目的配列の可能性が高いと考えられた。そこで、それぞれのメジャーコンティグのコンセンサス配列にコードされるアミノ酸配列を重鎖及びＬ鎖のアミノ酸配列とした。【００７１】
以上の方法により取得した４７１３ｍＡｂ重鎖及び軽鎖の可変領域の遺伝子配列及びアミノ酸配列をそれぞれ図１５及び１６に示す。重鎖の可変領域の遺伝子配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５３及び５４に示す。軽鎖の可変領域の遺伝子配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５５及び５６に示す。配列番号５４において、Ｋａｂａｔらの番号付け（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，１９９１，Ｂｅｔｈｅｓｄａ：ＵＳ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ．）によれば１〜１８位がリーダー配列、４９〜５４位がＣＤＲ１、６９〜８４位がＣＤＲ２、１１７〜１２８位がＣＤＲ３に相当する。同様に、配列番号５６において、１〜２２位がリーダー配列、４６〜５５位がＣＤＲ１、７１〜７７位がＣＤＲ２、１００〜１０８位がＣＤＲ３に相当する。
【図８】
2012046745.tif 000007
【図９】
2012046745.tif 000008
【図１４】
2012046745.tif 000009
【図１５】
2012046745.tif 000010
【図１６】
2012046745.tif 000011
【図１】
2012046745.tif 000012
【図２】
2012046745.tif 000013
【図３】
2012046745.tif 000014
【図４】
2012046745.tif 000015
【図５】
2012046745.tif 000016
【図６】
2012046745.tif 000017
【図７】
2012046745.tif 000018
【図１０】
2012046745.tif 000019
【図１１】
2012046745.tif 000020
【図１２】
2012046745.tif 000021
【図１３】
2012046745.tif 000022
【配列表】
2012046745000001.app
【国際調査報告】
2012046745.tif 000023
2012046745.tif 000024
2012046745.tif 000025
2012046745.tif 000026
2012046745.tif 000027
2012046745.tif 000028
2012046745.tif 000029
2012046745.tif 000030