(57)【要約】本発明に係るハンマーヘッド型リボザイムは、編集を受けた標的ＲＮＡと塩基対合することによりハンマーヘッド型リボザイム−標的ＲＮＡ構築物を生成するとともに、ハンマーヘッド型リボザイムの編集認識部位が、標的ＲＮＡの修飾部位と塩基対を形成することにより、修飾部位を開裂させる。この修飾部位の開裂により、編集標的ＲＮＡに起因する疾患の予防または治療に利用できる新規な薬剤の研究・開発に供することができることが期待される。
2012161144.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式 [ I ] ：
【化２１】
2012161144.tif 000046
（式中、Aはアデニン(A)を意味し;
Cはシトシン(C)を意味し;
Gはグアニン(G)を意味し;
Uはウラシル(U)を意味し;
Dは、アデニン(A)、 シトシン(C)、グアニン(G) またはウラシル (U) を意味し; 
Xは、標的RNAの修飾部位を認識する修飾認識塩基であって、アデニン(A)、 シトシン(C)、グアニン(G) またはウラシル (U) から選ばれるいずれかの塩基を意味し；
Nは、いずれも同一であってもまたは異なっていてもよく、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基を意味し；
N’は、同一であっても、または異なっていてもよく、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基であって、対応する塩基Nと塩基対を形成する塩基を意味し；
ａは、１〜１０の整数、好ましくは２〜６の整数、より好ましくは２〜４の整数を意味し；
ｂは、１〜６の整数、好ましくは２〜４の整数を意味し；
ｃは、１〜４の整数、好ましくは１〜２の整数を意味し；
ｍは、２〜５０の整数、好ましくは５〜３０の整数、さらに好ましくは５〜２０の整数を意味し；および
ｎは、２〜５０の整数、好ましくは５〜３０の整数、さらに好ましくは５〜２０の整数を意味する）
で表されるハンマーヘッド型リボザイム。
【請求項２】
請求項１に記載のハンマーヘッド型リボザイムであって、 一般式 [Ia] ：
【化２２】
2012161144.tif 000047
（式中、（式中、N’は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基であって、上記ハンマーヘッド型リボザイム（HHR）[I] において対応する塩基Nと塩基対を形成する塩基を意味し；  
Hは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基であって、上記HHR [I] において対応する塩基Dと塩基対を形成する塩基を意味し；
H’は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基を意味し；
Eは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）またはイノシン（Ｉ）から選ばれるいずれかの塩基であり、かつ、上記HHR [I] において対応する塩基Xと塩基対を形成する塩基であって、塩基Xと塩基対を形成したときに、5’側に隣接する塩基H’との結合を切断する塩基を意味し；
A、C、G、U、D、X、N、N’、ａ、ｂ、ｃ、ｍおよびｎはいずれも前記と同じ意味を有する）
はいずれも前記と同じ意味を有する。）
で表されるハンマーヘッド型リボザイム−標的RNA分子構築物。
【請求項３】
請求項１または２に記載のハンマーヘッド型リボザイムであって、一般式 [Ia] において、塩基Xがアデニン（A）またはシトシン（C）であるハンマーヘッド型リボザイム。
【請求項４】
一般式 [III] ：
【化２３】
2012161144.tif 000048
（式中、A、C、G、U、D、X、N、N’、E、H、H’、ａ、ｂ、ｃ、ｍおよびｎはいずれも前記と同じ意味を有し、矢印は切断部位を示している。）
で表されるハンマーヘッド型リボザイム−標的RNA構築物。
【請求項５】
請求項４に記載のハンマーヘッド型リボザイム−標的RNA構築物であって、一般式 [IIIa] ：
【化２４】
2012161144.tif 000049
（式中、A、C、G、U、D、X、N、N’、E、H、H’、ａ、ｂ、ｃ、ｍおよびｎはいずれも前記と同じ意味を有する。）
で表されるハンマーヘッド型リボザイム−標的RNA構築物。
【請求項６】
請求項４または５に記載のハンマーヘッド型リボザイム−標的RNA構築物であって、構造式 [IIIb] ：
【化２５】
2012161144.tif 000050
で表されるハンマーヘッド型リボザイム−標的RNA構築物。
【請求項７】
請求項４または５に記載のハンマーヘッド型リボザイム−標的RNA構築物であって、構造式 [IIIc] ：
【化２６】
2012161144.tif 000051
で表されるハンマーヘッド型リボザイム−標的RNA構築物。
【請求項８】
請求項４または５に記載のハンマーヘッド型リボザイム−標的RNA構築物であって、構造式 [IIId] ：
【化２７】
2012161144.tif 000052
で表されるハンマーヘッド型リボザイム−標的RNA構築物。
【請求項９】
一般式 [ I ] ：
【化２８】
2012161144.tif 000053
（式中、A、C、G、U、D、X、N、N’、ａ、ｂおよびｃはいずれも前記と同じ意味を有する。）
で表されるハンマーヘッド型リボザイムと、一般式 [ II ] ：
【化２９】
2012161144.tif 000054
（式中、）
で表される標的RNAとを反応させて、一般式 [ III ] ：
【化３０】
2012161144.tif 000055
で表されるハンマーヘッド型リボザイム−標的RNA構築物を得ることにより標的RNAを開裂するRNA開裂方法。
【請求項１０】
請求項９に記載のRNA開裂方法であって、前記ハンマーヘッド型リボザイムが、一般式 [ Ia ] ：
【化３１】
2012161144.tif 000056
で表され、また前記ハンマーヘッド型リボザイム−標的RNA構築物が、一般式 [ IIIa ] ：
【化３２】
2012161144.tif 000057
で表されるRNA開裂方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本件出願は、２０１１年５月２０日に出願された米国仮出願第６１／４８８，３４５号に基づく優先権を主張している。本発明は、RNA配列上の修飾を識別するリボザイムおよびそれを用いたRNA開裂方法に関するものである。更に詳細には、本発明は、RNA配列上のRNA編集などによる修飾を識別するハンマーヘッド型リボザイムおよびそれを用いたRNA開裂方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体内のRNAは化学修飾を受けることが知られており、rRNAやtRNAのようなnoncoding RNAは、修飾を受けることにより機能化する。一方、mRNAも修飾を受け、例えば、mRNAのヌクレオチドがアデノシン（A）からイノシン（I）に置換されるA-to-I編集や、シトシン(C)からウラシル(U)に置換されるC-to-U編集などのRNA編集などの修飾などが知られている。【０００３】
このうち、RNA編集は、転写後の遺伝情報を変換する機構であり、遺伝子からの転写により生じたmRNA前駆体の塩基配列のうち、特定部位の塩基が酵素の作用により他の塩基に改変される現象であり、塩基挿入、欠失、置換などのような様々な形で現れる（非特許文献１）。この現象は、一般に、生理学的条件や環境の変化に応じて遺伝子産物を変化させるために、生体にプログラムされた機構である。高等真核生物においては、アデノシンデアミナーゼ (ADAR) の作用によるmRNA前駆体の特定部位のアデノシン（A）塩基からイノシン（I）塩基への塩基置換が起こるA-to-I編集が生理学的に重要な意義を持つとされている（非特許文献２）。タンパク質をコードするmRNA配列においてA-to-I塩基置換が起これば、そのイノシン（I）は、翻訳中にリボソームによってグアノシンに解読されることから、コドンが変化し、それにより遺伝情報が変換され、本来とは異なる機能を持つタンパク質を生じることになる。【０００４】
コーディングRNAにおけるA-to-I編集について最も研究されているRNA前駆体としては、セロトニン2C型受容体（HTR2CR）とグルタミン酸受容体Bサブユニット (GRIA2) があげられる（非特許文献３）。【０００５】
セロトニン2C型受容体（HTR2CR）は、セロトニンによる脳内神経情報伝達を仲介する7回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体であって、情動制御に深く関与していると考えられており、二本鎖RNA特異的アデノシンデアミナーゼ（ADAR）により、HTR2C mRNA前駆体上のAからE部位の5か所のアデノシン（A）が、イノシン（I）に置換されるRNA編集（A-to-I編集）を受けることが知られている（非特許文献４、図１）。【０００６】
健常人においても、HTR2CR mRNAのA部位からE部位のアデノシン（A）塩基が、A -to -I編集により、酵素ADAR1およびADAR2の触媒作用により、イノシン（I）塩基にそれぞれ適当な頻度で改変されている。その結果、健常人においては、正常な情動制御がなされているのに対し、うつ病患者や自殺者では、その調節が破綻しているとの報告がなされている。うつ病、統合失調症、自閉症などの機能性精神疾患にセロトニン2C型受容体（HTR2CR）におけるRNA編集の異常が関与していると考えられるが、その正常な調節を支配する機構は未だ明らかになっていない。【０００７】
セロトニン2C型受容体（HTR2CR）は、セロトニンがHTR2CRの細胞外ループに結合すると、その刺激を共役したＧタンパク質に伝達し、次いで、細胞内シグナル伝達経路を介して神経細胞の性状変化を引き起こし、最終的に記憶・学習・情動などの脳機能を制御している。セロトニン2C型受容体（HTR2CR）がRNA編集を受けると、受容体タンパク質のＧタンパク質結合領域のアミノ酸配列が変化し、受容体のシグナル伝達能力が変化することになる。HTR2CRにおいては、図２に示すように、HTR2CRの塩基配列およびコードされるアミノ酸のうち、RNA編集を受けた部位（図中では白抜きで示している）を組み合わせると、単一の遺伝子からアミノ酸配列および伝達機能が異なる最大２４種（主に８種）の受容体タンパク質が生じる（非特許文献４、５、図２）。【０００８】
また、グルタミン酸受容体Bサブユニット (GRIA2) のmRNA前駆体においては、RNA編集によって受容体の脱感作動態とイオンチャンネルのCa2++透過能が制御されている（非特許文献６）。【０００９】
RNA置換修飾の別の形式としては、シトシン（C）がウラシル（U）へ塩基置換され、脱アミノ化によりシトシンがウリジンに変換されるC-to-U編集が知られている（非特許文献７）。腸アポリポタンパクB (ApoB) をコードする核転写体は、C-to-U RNA編集を受けて、CAAコドンがUAAストップコドンに変換し、編集前よりも短いタンパク質を生成するとの報告がある（非特許文献８）。【００１０】
上述したように、A-to-I編集およびC-to-U編集などのRNA編集は、非編集の場合に生成するタンパク質とは異なるタンパク質が生成することにより、遺伝適応性を制御するための重要な機構に関係している。コーディング領域中でのRNA置換修飾は、生物学的プロセスの制御において決定的な役割を果たしているので、異常な修飾が発生すると由々しい疾病の原因になり（非特許文献９）、特にRNA置換修飾の統合失調症、双極性障害、大うつ病などの精神疾患への関わりが注目されている。【００１１】
最近、セロトニン2C型受容体（HTR2C）とグルタミン酸受容体Bサブユニット (GRIA2) のRNA前駆体の他に、特に、γ−アミノ酪酸（GABA）受容体や、カリウムチャンネルなどの中枢神経系の精神神経機能に深く関与している受容体、イオンチャンネルや別のタンパク質のタンパク質をコードする配列中に、別のRNA編集の標的が同定された（非特許文献１０）。高スループットシークエンスデータは、RNA置換編集が、アミノ酸配列を変換してタンパク質の機能を制御していることを示唆しているけれども、このRNA編集の詳細な生物学的機能は未だ明らかではない。【００１２】
このようにRNA編集の詳細な生物学的機能が未だ明らかではないとしても、部位特異的RNA置換編集を制御する技術は、RNA編集に関連する生物学的プロセスを分析・制御するための魅力的なツールであることには変わりはない。【００１３】
一方、RNA配列上の修飾を受けた特定部位を特異的に認識し、反応する機能性分子として、リボザイムが知られている。かかるリボザイムのうち、触媒作用を有する最小のRNAモチーフであるハンマーヘッド型リボザイム (HHR) は、特定部位のRNAホスホジエステル結合を切断でき、トランス型を切断する最小のハンマーヘッド型リボザイム (HHR) が、天然のHHRを修飾して作成され（非特許文献１１）、RNAを媒介した遺伝子制御によりin vivoでの標的遺伝子発現を抑制するために利用された（非特許文献１２）。HHRは、中央部の保存された触媒活性を有するコア配列からなる活性領域 (Helix II) と、その活性領域の3’側および5’側に存在する標的配列を認識する２個のハイブリッド形成アーム配列からなる認識領域 (それぞれHelix IIIおよびHelix I) からなっている。【００１４】
標的特異的ハンマーヘッド型リボザイム (HHR) は、標的RNAに対する上記ハイブリッド形成アーム配列を単純なワトソン−クリック塩基対合ルールに従って変換させることによって作製することができる。また、標的RNAに対して様々に異なるコア配列を有するHHRが設計でき、標的RNAの特定のトリプレットを挟むハイブリッド形成配列と相補関係にある配列を使用することによって、標的RNAに結合でき、該トリプレットの3’側に存在するホスホジエステル結合を切断することができる（非特許文献１３）。【００１５】
かかるハンマーヘッド型リボザイム (HHR) は、in vitroならびに in vivoで変異特異的にmRNAを切断することができる（非特許文献１４）。HHRのこれらの変異特異的な性質は、優先的に切断されるトリプレットに基づいて発生する。このように標的RNAを変異特異的に切断できるHHRがいくつか作成されているが、RNA置換修飾を特異的に認識できるHHRは報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Maas, S. and Rich, A.2000. Changing genetic information through RNA editing. Bioessays 22(9): 790-802；Bass, B.L. 2002. RNAediting by adenosine deaminases that act on RNA. Annu RevBiochem 71: 817-846；Farajollahi, S. and Maas, S. 2010. Molecular diversity through RNAediting: a balancing act. Trends Genet 26(5): 221-230；Nishikura, K. 2010. Functionsand regulation of RNA editing by ADAR deaminases. Annu Rev Biochem 79: 321-349.
【非特許文献２】Nishikura, K. 2010.Functions and regulation of RNA editing by ADAR deaminases. Annu RevBiochem 79: 321-349；Pullirsch, D. and Jantsch, M.F. 2010. Proteomediversification by adenosine to inosine RNA editing. RNA Biol 7(2): 205-212.
【非特許文献３】Burns, C.M., Chu, H.,Rueter, S.M., Hutchinson, L.K., Canton, H., Sanders-Bush, E., andEmeson, R.B. 1997. Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling byRNA editing. Nature 387(6630): 303-308；Sommer, B., Kohler,M., Sprengel, R., andSeeburg, P.H. 1991. RNA editing in brain controls a determinant of ion flow inglutamate-gated channels. Cell 67(1): 11-19
【非特許文献４】Werry, T.D.,Loiacono, R., Sexton, P.M., and Christopoulos, A. 2008. RNA editing of theserotonin 5HT2C receptor and its effects on cell signalling, pharmacology andbrain function. Pharmacol Ther 119(1): 7-23.
【非特許文献５】寺田成之他、福岡大学理学集報  40（1）１１６−１２３ (2010)
【非特許文献６】Higuchi, M., Single, F.N., Kohler, M., Sommer, B., Sprengel,R., and Seeburg, P.H. 1993.RNA editing of AMPA receptor subunit GluR-B: a base-paired intron-exon structuredetermines position and efficiency. Cell 75(7): 1361-1370.
【非特許文献７】Blanc, V. and Davidson,N.O. 2003. C-to-U RNA editing: mechanisms leading to geneticdiversity. J Biol Chem 278(3): 1395-1398.
【非特許文献８】Wang, A.B., Liu,D.P., and Liang, C.C. 2003. Regulation of humanapolipoprotein B geneexpression at multiple levels. Exp Cell Res 290(1): 1-12.
【非特許文献９】Maas, S., Kawahara,Y., Tamburro, K.M., and Nishikura, K. 2006. A-    to-I RNA editing and human disease. RNA Biol 3(1): 1-9.
【非特許文献１０】Levanon, E.Y., Hallegger, M., Kinar, Y., Shemesh, R.,Djinovic-Carugo, K., Rechavi, G., Jantsch, M.F., and Eisenberg, E. 2005.Evolutionarily conserved human targets of adenosineto inosine RNA editing. Nucleic Acids Res 33(4): 1162-1168；Gommans, W.M.,Tatalias, N.E., Sie, C.P., Dupuis, D., Vendetti, N., Smith, L., Kaushal, R., and Maas, S.2008. Screening of human SNP database identifies recoding sites of A-to-I RNA editing.RNA 14(10): 2074-2085；Li, J.B., Levanon, E.Y., Yoon, J.K., Aach, J., Xie, B., Leproust,E., Zhang, K., Gao, Y., and Church, G.M. 2009. Genome-wide identification ofhuman RNA editing sites by parallel DNA capturing and sequencing. Science 324(5931):1210-1213；Pullirsch, D. and Jantsch, M.F. 2010. Proteome diversification byadenosine to inosine RNA editing. RNA Biol 7(2): 205-212.
【非特許文献１１】Uhlenbeck, O.C. 1987.A small catalytic oligoribonucleotide. Nature 328(6131): 596-600；Haseloff, J. andGerlach, W.L. 1988. Simple RNA enzymes with new and highly specificendoribonuclease activities. Nature 334(6183): 585-591.
【非特許文献１２】Goodchild, J. 2002. Hammerhead ribozymes for targetvalidation. Expert Opin TherTargets 6(2): 235-247；Citti, L. and Rainaldi, G. 2005. Synthetic hammerhead ribozymesas therapeutic tools to control disease genes. Curr Gene Ther 5(1): 11-24；Tedeschi, L., Lande,C., Cecchettini, A., and Citti, L. 2009. Hammerhead ribozymes intherapeutic target discovery and validation. Drug Discov Today 14(15-16): 776-783.
【非特許文献１３】Kore, A.R., Vaish,N.K., Kutzke, U., and Eckstein, F. 1998. Sequence specificity of thehammerhead ribozyme revisited; the NHH rule. Nucleic Acids Res 26(18): 4116-4120
【非特許文献１４】Scherr, M., Grez, M., Ganser, A., and Engels, J.W. 1997.Specific hammerheadribozyme-mediated cleavage of mutant N-ras mRNA in vitro and ex vivo. Oligoribonucleotidesas therapeutic agents. J Biol Chem 272(22): 14304-14313；Lewin, A.S., Drenser, K.A.,Hauswirth, W.W., Nishikawa, S., Yasumura, D., Flannery, J.G., and LaVail, M.M. 1998.Ribozyme rescue of photoreceptor cells in a transgenic rat model of autosomal dominantretinitis pigmentosa. Nat Med 4(8): 967-971；Dawson, P.A. and Marini, J.C. 2000.Hammerhead ribozymes selectively suppress mutant type I collagen mRNA in osteogenesisimperfecta fibroblasts. Nucleic Acids Res 28(20): 4013-4020.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
そこで、本発明者らは、RNAの特定部位のホスホジエステル結合を切断する触媒作用を有するRNA分子であるハンマーヘッド型リボザイム（HHR）に着目して、そのRNA配列上の修飾を特異的に認識し、反応する機能性について鋭意研究した結果、ハンマーヘッド型リボザイム（HHR）が、標的RNAの修飾部位を特異的に認識し、反応する機能性分子として作用することを見いだして、本発明を完成した。【００１８】
つまり、本発明に係るハンマーヘッド型リボザイム (HHR) は、RNA編集等の修飾部位を特異的に切断できるように、優先的に切断される標的RNAの３塩基（トリプレット）に対するHHRの標的特異性に基づいて設計した。【００１９】
本発明のハンマーヘッド型リボザイム (HHR) の作成に当たっては、トランス型に作用するHHRを変異特異的標的切断のツールとして利用した。しかし、HHRの切断活性は、優先的に切断される上記トリプレットばかりではなく、触媒活性を持つHHRのコア配列に近接する塩基対合によっても、有意に影響されることから、このHHR塩基を修飾認識塩基として利用することによって、RNA修飾に対する特異的リボザイムをHHR塩基の塩基対合に基づいて設計した。【００２０】
上記理論に基づいて設計したハンマーヘッド型リボザイム (HHR) は、図３中の構造式で表すことができる。なお、図３中の構造式において、黒色の太い実線で表した上段の分子は、ハンマーヘッド型リボザイムを表している。このハンマーヘッド型リボザイム (HHR) は、３個の領域、つまり、中央部に触媒活性を有するコア配列からなる活性領域（Helix II）と、その活性領域の5’側に位置して標的RNA（基質RNA）とハイブリダイズするアーム配列からなる5’側認識領域（Helix I）ならびに3’側に位置して標的RNA（基質RNA）とハイブリダイズするアーム配列からなる3’側認識領域（Helix III）とから構成されている。アーム配列からなる5’側認識領域（Helix I）ならびに3’側認識領域（Helix III）は、標的RNA（基質RNA）とハイブリダイズするように設計する。【００２１】
さらに、このハンマーヘッド型リボザイム (HHR) では、 3’側認識領域（Helix III）と活性領域（Helix II）とに挟まれた位置に塩基（D）を、また活性領域（Helix II）と5’側認識領域（Helix I）に挟まれた位置に塩基（X）を介在するように設計する。この塩基（D）は、標的RNA塩基と塩基対を形成して、標的RNA中の3’-NHH’-5’（ 図３中の構造式）で表されるトリプレットの塩基Hと対合することによって切断活性が出現する。一方、塩基（X）は、標的RNAの修飾部位（editing site）とだけ塩基対を形成するように設計されている。したがって、A-to-I編集特異的切断の場合には、シトシンが認識塩基として使用される。同様に、C-to-U編集特異的切断の場合には、グアノシンはアデノシンに変換されるので、認識塩基としてはアデノシンが使用される。当然のことながら、A-to-I編集やC-to-U編集以外のその他の修飾により標的RNAの塩基が別の塩基に変換された場合には、その変換された塩基に対応するようにHHRの認識塩基を設計することができることは言うまでもない。【００２２】
一方、図３中の構造式 において、黒色の実線で表した下段の分子は、標的RNA（基質RNA）を表している。この標的RNAは、HHRの5’側認識領域（Helix I）ならびに3’側認識領域（Helix III）にハイブリダイズしてそれぞれ塩基対を形成する。標的RNA（基質RNA）に修飾部位（ここでは、「edit」と表している）が存在すると、この修飾部位が、HHRの認識塩基とハイブリダイズして塩基対を形成するとともに、この修飾部位と、その修飾部位の3’側に隣接する塩基との結合が切断される。ここで、図３中の構造式 中、3’-NHH’-5’で表されるトリプレットは、切断活性が特に高い部位を示していて、HHRの触媒作用により優先的に切断される部位（Cleavage Site）である。なお、上記構造式においては、Nはいずれのヌクレオチドであってよく、またHはアデノシン（A）、シトシン（C）またはウラシル（U）を表している（Kore et al. 1998）。【００２３】
したがって、本発明は、標的 mRNA上におけるRNAの修飾、例えば、RNA編集（A-to-I編集やC-to-U編集等）などの修飾を識別するハンマーヘッド型リボザイム（HHR）を提供することを目的としている。【００２４】
また、本発明の別の目的は、ハンマーヘッド型リボザイム（HHR）と標的RNA との塩基対合物であるハンマーヘッド型リボザイム−標的RNA構築物を提供することである。【００２５】
さらに、本発明の別の目的は、ハンマーヘッド型リボザイム（HHR）と標的RNA とを塩基対合させることにより、標的RNAの修飾を受けた特定の部位を切断することからなる標的RNAの開裂方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
上記目的を達成するために、本発明は、上記のような修飾を受けた標的RNAを認識できるハンマーヘッド型リボザイムであって、一般式 [ I ] ：【００２７】
【化１】
2012161144.tif 000003
【００２８】
（式中、Aはアデニン(A)を意味し;
Cはシトシン(C)を意味し;
Gはグアニン(G)を意味し;
Uはウラシル(U)を意味し;
Dは、アデニン(A)、 シトシン(C)、グアニン(G) またはウラシル (U) を意味し; 
Xは、標的RNAの修飾部位を認識する修飾認識塩基であって、アデニン(A)、 シトシン(C)、グアニン(G) またはウラシル (U) を意味し；
Nは、いずれも同一であってもまたは異なっていてもよく、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基を意味し；
N’は、同一であってもまたは異なっていてもよく、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基であって、対応する塩基Nと塩基対を形成する塩基を意味し；
ａは、１〜１０の整数、好ましくは２〜６の整数、より好ましくは２〜４の整数を意味し；
ｂは、１〜６の整数、好ましくは２〜４の整数を意味し；
ｃは、１〜４の整数、好ましくは１〜２の整数を意味し；
ｍは、２〜５０の整数、好ましくは５〜３０の整数、さらに好ましくは５〜２０の整数を意味し；および
ｎは、２〜５０の整数、好ましくは５〜３０の整数、さらに好ましくは５〜２０の整数を意味する）
で表されるハンマーヘッド型リボザイムを提供する。【００２９】
本発明の好ましい１つの形態としては、一般式 [Ia] ：【００３０】
【化２】
2012161144.tif 000004
【００３１】
（式中、A、C、G、U、D、X、NおよびN’はいずれも前記と同じ意味を有する。）
で表されるハンマーヘッド型リボザイムが提供される。【００３２】
本発明のさらに好ましい形態としては、一般式 [Ia] において、塩基Xがアデニン（A）またはシトシン（C）であるハンマーヘッド型リボザイムが提供される。【００３３】
一方、本発明のハンマーヘッド型リボザイム（HHR）が認識することができる標的RNAは、一般式 [II] ：【００３４】
【化３】
2012161144.tif 000005
【００３５】
（式中、N’は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基であって、上記ハンマーヘッド型リボザイム（HHR）において対応する塩基Nと塩基対を形成する塩基を意味し；  
Hは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基であって、上記HHRにおいて対応する塩基Dと塩基対を形成する塩基を意味し；
H’は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基を意味し；
Eは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）またはイノシン（Ｉ）から選ばれるいずれかの塩基であるとともに、上記HHR [I] において対応する塩基Xと塩基対を形成する塩基であって、塩基Xと塩基対を形成したときに、5’側に隣接する塩基H’との結合を切断する塩基を意味し；
ｍおよびｎはいずれも前記と同じ意味を有する）
で表わすことができる。【００３６】
したがって、本発明は、上記ハンマーヘッド型リボザイム と、上記標的RNA とが塩基対を形成して構築される一般式 [III] ：【００３７】
【化４】
2012161144.tif 000006
【００３８】
（式中、A、C、G、U、D、X、N、N’、E、H、H’、ａ、ｂ、ｃ、ｍおよびｎはいずれも前記と同じ意味を有し、矢印は切断部位を示している。）
で表されるハンマーヘッド型リボザイム−標的RNA構築物を提供する。【００３９】
本発明は、その好ましい１つの別の形態として、ハンマーヘッド型リボザイム [Ia] と標的RNA [II] とが塩基対合して構築される一般式 [IIIa] ：【００４０】
【化５】
2012161144.tif 000007
【００４１】
（式中、A、C、G、U、D、X、N、N’、E、H、H’、ａ、ｂ、ｃ、ｍおよびｎはいずれも前記と同じ意味を有する。）
で表されるハンマーヘッド型リボザイム−標的RNA構築物を提供する。【００４２】
本発明は、さらに好ましい形態として、一般式 [IIIa] において、前記塩基Ｅが塩基Iの場合、前記塩基Xは塩基Cであり、また前記塩基Ｅが塩基Uの場合、前記塩基Xは塩基Aであるハンマーヘッド型リボザイム−標的RNA構築物を提供する。【００４３】
本発明は、さらに好ましい別の形態としては、一般式 [IIIa] において、前記塩基Eが塩基Iの場合、前記塩基Xは塩基Cであり、また前記塩基Eが塩基Uの場合、前記塩基Xは塩基Aであるハンマーヘッド型リボザイム−標的RNA構築物を提供する。【００４４】
さらに、本発明は、上記HHRを用いて、上記構築物の上記標的RNA部分の切断部位を切断することからなるRNA修飾開裂方法を提供する。更に詳細には、本発明は、上記HHR を用いて、標的RNA 上に存在する修飾部位を、そのRNA修飾部位の5’側上流に隣接する結合部位を開裂することからなるRNA開裂方法を提供する。【００４５】
本発明に係るハンマーヘッド型リボザイム（HHR）は、標的RNAの切断部位の周辺配列であるトリプレット配列5’-N’HH’-3’ (式中、塩基N’がアデニン（A ）、ウラシル（U）、グアニン（G）またはシトシン（C）であり、塩基Hおよび塩基H’がA 、C またはUであるのがよい) に対して高い切断活性を示す。なお、塩基Hおよび塩基H’はいずれもグアニン（G）を表していないが、塩基Hおよび塩基H’がグアニン（G）である場合は、ほとんど切断活性がないと考えられるが、切断活性が生じる場合は、グアニン（G）であってもよい。また、上記トリプレット配列がNUCである場合も高い切断活性を有するとの報告もあるので、このトリプレット配列も当然本発明の範囲に包含されるものと言わざるを得ない。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】セロトニン2C型受容体（HTR2C）上のRNA編集（A-to-I編集）を受ける部位を示す図。
【図２】セロトニン2C受容体の生理機能（Ａ）とそのRNA編集（Ｂ）を説明する図。
【図３】本発明のハンマーヘッド型リボザイム (HHR) の構造を示す概念図。
【図４】各リボザイムと基質RNA (S) の合成後の電気泳動図。
【図５Ａ】各リボザイム（HRz1C、HRz2C、HRz1EおよびHRz2E）と基質RNA (S) のPAGE精製後の電気泳動図。
【図５Ｂ】基質RNA (S5) のPAGE精製後の電気泳動図。
【図６Ａ】各リボザイム（H1: HRz1およびH2: HRz2）と標的RNA配列 (S) の活性評価（EtBr染色）を示す電気泳動図。
【図６Ｂ】各リボザイム（H1: HRz1CおよびH2: HRz2C）と標的RNA配列 (S) の活性評価（EtBr染色）を示す電気泳動図。
【図７】Image Jによる切断バンドの解析結果を示す図。
【図８】各リボザイムの切断活性（RIラベル）の経時変化を示す図。
【図９】図８における各リボザイムの切断活性（RIラベル）の経時毎の切断割合を算出した結果を示す棒グラフである。
【図１０】ライブラリーH1およびH2の作成を確認した電気泳動図。
【図１１Ａ】ラウンド１のサイクルチェックの結果を示す電気泳動図。
【図１１Ｂ】ラウンド１のサイクルチェックの結果を示す別の電気泳動図。
【図１２】ラウンド８のサイクルチェックの結果を示す電気泳動図。
【図１３】ライブラリーH1の配列解析結果を示す図。
【図１４】ライブラリーH2の配列解析結果を示す図。
【図１５】ライブラリーH2の再配列解析結果を示す図。
【図１６】リボザイムHRzC-inoの合成後の確認電気泳動図。
【図１７】リボザイムHRzC-inoの切断割合の算出結果を示す図。
【図１８】HTR2C RNAフラグメントに対するリボザイムのA-to-I編集特異的切断を示す図。（Ａ）は、リボザイムと、HTR2C RNAフラグメントの塩基配列を示す図。（Ｂ）変性PAGE (15%)  を用いたリボザイムによるA-to-I編集特異的切断の分析結果を示す図。（Ｃ）HTR2C-adeおよび HTR2C-inoに対するHR-HTR2Cおよび HR-HTR2C-editに対する実験によって得られた切断率をまとめた図。
【図１９】単独ターンオーバー条件下での編集ならびに非編集HTR2C RNAフラグメントに対するHR-HTR2Cおよび HR-HTR2C-editについての経時切断反応および動態分析結果を示す図。
【図２０】APOB mRNAフラグメントに対するリボザイムのC-to-U編集特異的切断を示す図。（Ａ）は、リボザイムと、APOB mRNAフラグメントの塩基配列を示す図。（Ｂ）変性PAGE (15%)を用いたリボザイムによるHR-APOB-editのC-to-U編集特異的切断の分析結果を示す図。（Ｃ）非編集および編集APOB RNAフラグメントに対するHR-APOB-editについての経時切断反応および動態分析結果を示す図。
【図２１】図２０において、単独ターンオーバー条件下での編集ならびに非編集APOB mRNAフラグメントに対するHR-APOBについての経時切断反応および動態分析結果を示す図。HR-APOB-ade（上段）およびHR-APOB-ino（下段）に対するHR-APOB-editの経時切断を示す変性PAGE (15%)を示す図。
【図２２】FLNAmRNAに対するA-to-I編集特異的切断を示す図。（Ａ）は、リボザイムと、合成FLNA mRNAフラグメントの塩基配列を示す図。（Ｂ）は、変性PAGE (15%)  を用いたリボザイムによるA-to-I編集特異的切断の分析結果を示す図。（Ｃ）FLNA -adeおよび FLNA -inoに対するHR- FLNA および HR- FLNA -editに対する実験（Ｂ）によって得られた切断率をまとめた図。
【図２３Ａ】細胞抽出FLNAmRNAに対するインビトロでのリボザイムのA-to-I編集特異的切断を示す図（Q/R部位での編集率を測定することによる細胞抽出FLNA mRNAに対するHR-FLNA-editの編集特異的切断分析のための実験手法を示した図）。
【図２３Ｂ】細胞抽出FLNAmRNAに対するインビトロでのリボザイムのA-to-I編集特異的切断を示す図（HR-FLNA-editの切断反応の有無による生成物のシークエンスクロマトグラフ図）。
【図２４】リボザイムとの反応後のHR-FLNAフラグメントの編集率の定量結果を示す図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本発明に係るハンマーヘッド型リボザイムは、一般式 [ I ] ：【００４８】
【化６】
2012161144.tif 000008
【００４９】
（式中、Aはアデニン(A)を意味し;
Cはシトシン(C)を意味し;
Gはグアニン(G)を意味し;
Uはウラシル(U)を意味し;
Dは、アデニン(A)、 シトシン(C)、グアニン(G) またはウラシル (U) を意味し; 
Xは、標的RNAの修飾部位を認識する修飾認識塩基であって、アデニン(A)、 シトシン(C)、グアニン(G) またはウラシル (U) から選ばれるいずれかの塩基を意味し；
Nは、いずれも同一であってもまたは異なっていてもよく、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基を意味し；
N’は、同一であっても、または異なっていてもよく、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基であって、対応する塩基Nと塩基対を形成する塩基を意味し；
ａは、１〜１０の整数、好ましくは２〜６の整数、より好ましくは２〜４の整数を意味し；
ｂは、１〜６の整数、好ましくは２〜４の整数を意味し；
ｃは、１〜４の整数、好ましくは１〜２の整数を意味し；
ｍは、２〜５０の整数、好ましくは５〜３０の整数、さらに好ましくは５〜２０の整数を意味し；および
ｎは、２〜５０の整数、好ましくは５〜３０の整数、さらに好ましくは５〜２０の整数を意味する）
で表すことができる。【００５０】
なお、本発明のハンマーヘッド型リボザイム のコア配列を有する活性領域 (Helix II) は、修飾を受けた標的RNAの修飾部位の切断活性を触媒する作用を有する領域であって、一般式 [IV]  :
3’-AAGNaNbN’aAGNcAGUC-5’   [IV]
で表すこともできる。上記一般式 [IV] において、下線を施した塩基（A、C、GおよびU）は、標的RNA の修飾部位の切断に必要な切断触媒活性作用を及ぼす塩基配列（共通配列：consensus sequence）を表している。【００５１】
本発明の好ましい１つの形態としてのハンマーヘッド型リボザイムは、一般式 [Ia] ：【００５２】
【化７】
2012161144.tif 000009
【００５３】
（式中、A、C、G、U、D、X、NおよびN’はいずれも前記と同じ意味を有する。）
で表わすことができる。【００５４】
一方、本発明のハンマーヘッド型リボザイムによって認識される標的RNAとしては、例えば、セロトニン2C型受容体（HTR2C）、グルタミン酸受容体、γ−アミノ酪酸（GABA）受容体、FLNA（filamin A, alpha [actin
binding protein 280]：アクチン結合タンパク質２８０)、アポリポタンパクB (ApoB) や、カリウムチャンネル等の中枢神経系の精神神経機能に深く関与している受容体やイオンチャンネル等のRNA前駆体などが挙げられる。【００５５】
これらの標的RNA は、一般式 [II] ：【００５６】
【化８】
2012161144.tif 000010
【００５７】
（式中、N’は、いずれも同一であってもまたは異なっていてもよく、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基であって、上記ハンマーヘッド型リボザイム（HHR）において対応する塩基Nと塩基対を形成する塩基を意味し；  
Hは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基であって、上記HHR [I] において対応する塩基Dと塩基対を形成する塩基を意味し；
H’は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基を意味し；
Eは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）またはイノシン（Ｉ）から選ばれるいずれかの塩基であって、上記HHRにおいて対応する塩基Xと塩基対を形成する塩基であって、塩基Xと塩基対を形成したときに、5’側上流に隣接する塩基H’との結合を切断する塩基を意味し；
ｍおよびｎはいずれも前記と同じ意味を有する）
で表わすことができる。【００５８】
標的RNAにおいて、塩基Eは、RNA編集や変異などの修飾を受けた塩基を意味し、例えば、A-to-I編集を受けた場合には、イノシン (I) を意味し、またC-to-U編集の場合には、ウラシル (U) を意味する。したがって、標的RNA [II] と塩基対を形成するハンマーヘッド型リボザイムの修飾認識塩基 (X) は、標的RNA [II] の塩基Eがイノシン (I) の場合には、シトシン(C) 、標的RNA [II] の塩基Eがウラシル (U) の場合には、アデニン(A) であるのがよい。【００５９】
さらに、上記一般式5’-N’HH’-3’で表される３塩基配列（トリプレット配列）は、標的RNAの切断部位の周辺配列であり、かつ、標的RNAの3’-側領域と5’-側領域に挟まれた塩基配列であって、標的RNAの切断部位に対して高い切断活性を示している。つまり、本発明のハンマーヘッド型リボザイム（HHR）は、このトリプレット配列5’-N’HH’-3’ (式中、塩基N’がアデニン（A ）、ウラシル（U）、グアニン（G）またはシトシン（C）であり、塩基Hおよび塩基H’がA 、C またはUであるのがよい) に対して高い切断活性を示す。なお、塩基Hおよび塩基H’はいずれもグアニン（G）を表していないが、塩基Hおよび塩基H’がグアニン（G）である場合は、切断活性がないか、またはほとんど切断活性がないと考えられる。しかし、グアニン（G）が切断活性が生じる場合があれば、塩基Hおよび塩基H’がーはいずれもグアニン（G）であってもよい。また、上記トリプレット配列がNUCである場合も高い切断活性を有するとの報告もあるので、このトリプレット配列も当然本発明の範囲に包含されるものである。【００６０】
つまり、標的RNA [II] は、RNA編集や変異などの修飾を受けると、その部位の塩基が本来の塩基とは異なる塩基に変換される。その結果、その修飾塩基は、リボザイムの修飾認識塩基とが塩基対を形成し、その結果、修飾塩基と、その5’-側上流に隣接する塩基との結合部位が切断される。【００６１】
したがって、本発明は、上記ハンマーヘッド型リボザイム と、標的RNA とを反応させて塩基対を形成して得られる一般式 [III] ：【００６２】
【化９】
2012161144.tif 000011
【００６３】
（式中、A、C、G、U、D、X、N、N’、E、H、H’、ａ、ｂ、ｃ、ｍおよびｎはいずれも前記と同じ意味を有し、矢印は切断部位を示している。）
で表されるハンマーヘッド型リボザイム−標的RNA構築物を提供する。【００６４】
このハンマーヘッド型リボザイム−標的RNA 構築物において、HHRの修飾認識塩基（X）は、標的RNAの修飾部位（E）と塩基対を形成することにより、該修飾部位（E）の5’側上流に隣接する塩基（H’）との結合を切断する。つまり、標的RNAの塩基（E）は、例えば、A-to-I編集の場合には、イノシン（Ｉ）を意味し、またC-to-U編集の場合には、ウラシル（Ｕ）を意味する。したがって、A-to-I編集の場合には、修飾塩基（E）に対応するハンマーヘッド型リボザイムの修飾認識塩基（X）は、シトシン（Ｃ）になり、またC-to-U編集の場合には、アデニン（Ａ）となる。【００６５】
また、本発明は、その好ましい１つの形態として、一般式 [IIIa] ：【００６６】
【化１０】
2012161144.tif 000012
【００６７】
（式中、A、C、G、U、D、X、N、N’、E、H、H’、ａ、ｂ、ｃ、ｍおよびｎはいずれも前記と同じ意味を有する。）
で表されるハンマーヘッド型リボザイム−標的RNA構築物を提供する。【００６８】
上述したように、本発明のハンマーヘッド型リボザイムは、例えばRNA編集等の修飾を受けた標的RNA の修飾部位を認識して、ハンマーヘッド型リボザイムの修飾認識塩基（X）と、標的RNAの修飾塩基（E）とが塩基対を形成してハンマーヘッド型リボザイム−標的RNA 構築物を構築すると、標的RNAの修飾塩基（E）の5’−側上流に隣接する塩基（H’）とのホスホジエステル結合を切断することになる。【００６９】
その結果、RNA編集などの修飾を受けた標的mRNAは、かかる修飾を受けなかった標的mRNAから誘導される本来のタンパク質とは異なる機能や作用を有するタンパク質を生成することになる。その結果、本発明のハンマーヘッド型リボザイムは、標的mRNAが修飾を受けたことにより生体機能に悪影響を及ぼし兼ねなかった修飾標的mRNA の機能や作用を抑制することが可能になる。したがって、本発明のハンマーヘッド型リボザイムは、例えば、セロトニン2C型受容体（HTR2C）、グルタミン酸受容体、γ−アミノ酪酸（GABA）受容体、FLNA（アクチン結合タンパク質２８０)、アポリポタンパクB (ApoB) や、カリウムチャンネルなどの中枢神経系の精神神経機能に深く関与している受容体やイオンチャンネルなどが関連している統合失調症、双極性障害、大うつ病などの精神疾患などの疾患の予防や治療の改善に役立つものと期待できる。【００７０】
例えば、図１に示すように、生体内のセロトニン2C型受容体（HTR2C）RNAには、Ａ〜Ｅ部位の５つの部位において、下記のような部位にRNA編集が発生していることが知られていて、かかるRNA編集が関与していると考える疾病としては、下表１に示すような疾病が挙げられる。したがって、本発明に係るハンマーヘッド型リボザイムは、上記疾病に加えて、下表１に示すような疾病に対しても作用効果を及ぼすことが期待できる。【００７１】
【表１】
2012161144.tif 000013
【００７２】
これらの他に、タンパク質コード領域内のRNA編集も知られていて、それらの遺伝子と関連する疾病に対しても、本発明に係るハンマーヘッド型リボザイム [I] は、下表２に示すような疾病に対しても作用効果を及ぼすことが期待できる。【００７３】
【表２】
2012161144.tif 000014
【００７４】
以下、ハンマーヘッド型リボザイムとセロトニン２Ｃ受容体（HTR2C）mRNA(HTR2C RNA) との構築物を例に挙げて具体的に説明するが、本発明は、HHR−HTR2C RNA構築物に一切限定されるものではない。本発明で使用するHHR−HTR2C RNA構築物の構造は次のように記載することができる。【００７５】
【化１１】
2012161144.tif 000015
【００７６】
（なお、下線を付した塩基は、触媒活性に必要なコンセンサス配列を意味する。）【００７７】
なお、上記構造式 [IIIb] においては、HTR2C RNAの修飾部位（E）は、アデノシン（Ａ）、つまり未修飾部位として表しているので、ハンマーヘッド型リボザイムの修飾認識塩基 (X) のシトシン（Ｃ）とは塩基対を形成できない。したがって、上記構造式で表される構築物においては、HTR2C RNAの切断部位では切断が起こらないことになる。一方、HTR2C RNAの修飾部位（E）が、A-to-I編集によりイノシン (I) に塩基編集されると、編集認識部位（Ｃ）と塩基対を形成して、矢印で示した切断部位において切断が起こる。【００７８】
上記HTR2C RNAの他に、ハンマーヘッド型リボザイム (HHR) - RNA構築物としては、例えば、HHRとFLNA（アクチン結合タンパク質２８０) との構築物や、HHRとApoB （Apolipoprotein B：アポリポタンパク質B）との構築物などが挙げられる。【００７９】
ここで、上記HHRとFLNAとの構築物（HHRz FLNA01）の構造式は下記に示す通りである。【００８０】
【化１２】
2012161144.tif 000016
【００８１】
また、上記HHRとApoBとの構築物（HHRz ApoB01）の構造式 [IIId]は、下記に示すとおりである。【００８２】
【化１３】
2012161144.tif 000017
【００８３】
本発明に係るハンマーヘッド型リボザイム (HHR) は、直接添加するか、または陽イオン脂質とコンプレックスを形成するか、リポソーム内に包み込むか、あるいはその他の態様で標的細胞に送達することができる。本発明のハンマーヘッド型リボザイムまたはそのコンプレックスは、バイオポリマー内に組み込んでまたは組み込まなくて、エクスビボ（ex vivo）で、または注射、注入ポンプもしくはステントによってインビボ（in vivo）で関連組織に局所的に投与することができる。あるいは、本発明のHHRは、細胞に送達されるDNAベクターやRNAベクターから発現することができるので、誘導性または内在性プロモーターのどちらかからも細胞内で発現できる。これら組換えベクターとしては、DNAプラスミド、アデノウイルス、レトロウイルスまたはアデノ関連ウイルスベクターであるのが好ましい。RNAの発現を指令する他の哺乳動物細胞ベクターもこの目的のために使用することができる。かかる組換えベクターは、上述したようにして局所的に送達でき、送達されたHHRは発現すると直ちに標的mRNAを開裂する。【００８４】
上記リポソームの組成は、通常、ステロイド、特にコレステロールと組み合わせたリン脂質との組み合わせ物、特に、高い相遷移温度リン脂質の組合せ物であるのがよい。リポソームの物理的特性はｐＨ、イオン強度及び二価陽イオンの存在に依存している。本発明の構築物はまた、ネーキッド遺伝子発現ベクターとして送達することもできる。これは、本発明の構築物が送達媒体（例えば、リポソームまたはコロイド粒子）と結合していないことを意味する。ネーキッドベクターで予想される主要な利点の１つはベクター自体によって刺激される免疫応答が無いことである。【００８５】
本発明は、疾病を治療するための遺伝子治療に適用可能である。このような治療法は、上記疾患を有している対象の細胞にmRNAを特異的に開裂する適当なリボザイムを導入することによって治療効果を発揮することが可能である。なお、リボザイムは、キメラウイルスまたはコロイド分散系のような組換え発現ベクターを使用して送達することができる。【００８６】
本発明による遺伝子治療法は、インビボ（in vivo）またはエクスビボ（ex vivo）で常法に従って実施することができる。使用できるウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、レトロウイルスのようなＲＮＡウイルスが挙げられる。上記レトロウイルスベクターとしては、例えば、マウスまたはトリレトロウイルス由来のものである。単一の外来遺伝子を挿入できるレトロウイルスベクターの例としては、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMuLV）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（HaMuSV）、マウス乳癌ウイルス（MuMTV）及びルイス肉腫ウイルス（RSV）が含まれる。【００８７】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、下記実施例は、本発明をより具体的に説明するための目的だけで記載するものであって、本発明を制限する意図は一切ないものと理解すべきである。したがって、下記実施例から想到されるあらゆる変形は本発明の範囲に包含されるものと理解すべきである。
【実施例１】
【００８８】
本実施例においては、設計したリボザイムの編集特異的切断の有効性を評価するために、HTR2C mRNA上のA-to-I編集部位、つまりＣ部位を、標的修飾部位として選択した。また、A-to-I編集特異的切断活性を持つリボザイムを構築するために、HHR (HR-HTR2C) を、触媒活性を持つコア配列および、5’位のＣを切断するためのHTR2C RNAに相補的な１６塩基を含むように共通の方法に従って設計した（図１８Ａ）。【００８９】
本実施例で使用した触媒活性を有するコア配列 (Helix II) は下記に示すとおりである。
5′-CUGANcGAGGCC GAAAGGCCGAA-3′
この配列は、コンセンサス配列 (5′-CUGANGA----GAA-3′)
および４塩基対 (bp) GCGCデュプレックス (duplex) とGAAAテトラループ (tetraloop) を含むステム・ループ構造から構成されている (Scott,
W.G., et al. 1995. Cell 81(7): 991-1002)。この構造における標的切断部位（GUAトリプレット）の配列の前後関係は上記トリプレットルールに基づいて選択されているので、HHRは、HTR2C RNAに対して切断活性を示すことが期待される。そこで、得られたHHR構築物において、その修飾認識塩基は、C部位でU-A 塩基対（Aは修飾部位）を形成する。編集特異的リボザイムは、C部位のAがA-to-I RNA編集によってIで置換されたときだけ切断活性が出るように、認識塩基のUをCに変換することによって構築される（図１８Ａ）。イノシンは、G-C 塩基対と同一であるシトシンと塩基対を形成する。その結果、得られるリボザイムは、塩基対認識による標的RNA修飾部位を識別する能力を取得する。したがって、このリボザイムの編集HTR2C(HR-HTR2C-edit) に対する切断能力は、非編集HTR2Cよりも高いことが期待される。【００９０】
下記実施例で得られるオリゴヌクレオチドの配列は下表３に示すとおりである。【００９１】
【表３】
2012161144.tif 000018
【００９２】
本実施例において使用する材料、試薬等は下記に示すとおりである。
（in vitro 転写試薬）
RNase-Free water、10× AmpliScribe T7 Reaction Buffer, 25mM NTP、100 mM DTT、RiboGuard RNase Inhitor、AmpliScribe T7または Enzyme Solution : AmpliScribe【００９３】
（PCR試薬）
Taq DNA Polymerase、10×Thermo Pol Reaction Buffer：NEB
2.5mM dNTP, 2mM dNTP：
（逆転写試薬）
AMV Reverse Transcriptase 10U/μl、AMV RT 5×BUFFER、10mM dNTP：Promega【００９４】
（脱リン酸化試薬）
Antarctic Phasshatase 5000U/ml、10×Antarctic Phasphatase buffer：NEB
（リン酸化試薬）
T4 Polynucleotide Kinase、10×T4 Polynucleotide Kinase Buffer, ：TAKARA
NEG 502Z 〔gamma-32P〕 222TBq/mmol( 6000Ci/mmol ) 370MBq/ml：PerkinElmer【００９５】
（制限酵素）
BamHＩ 10U/μl：TOYOBO   
EcoRＩ 70U/μl：Promega  10×H buffer：TAKARA
（その他）
2×Ligation mix【００９６】
オリゴDNAは、ジーンネットから常法に従って取得した。
HRz1C （53nt）
5’-GCAATACGTATTCGAAAACTCATCAGTCCTATTGCTATAGTGAGTCGTATTAG-3’
HRz 2C （59nt）
5’-GCAATACGTATTCGGCCTTTCGGCCTCATCAGTCCTATTGCTATAGTGAGTCGTATTAG-3’
HRzC 1E （53nt）
5’-AGCAATACGTTTCGAAAACTCATCAGATCCTATTCTATAGTGAGTCGTATTAG-3’
HRzC 2E （59nt）
5’-AGCAATACGTTTCGGCCTTTCGGCCTCATCAGATCCTATTCTATAGTGAGTCGTATTAG-3’【００９７】
S （40nt）
5’-CAATAGGATTACGTATTGCTACTATAGTGAGTCGTATTAG-3’
S5 （59nt）
5’-GGCTATGCTCAATAGGATTACGTATTGCTACATACCGATCCTATAGTGAGTCGTATTAG-3’
T7proG cap
5’-CTAATACGACTCACTATAG-3’【００９８】
(Library H(+)) （29 mer）
5’-CTAATACGACTCACTATAGGCTATGCTCA-3’            
(Library H1(-)) （59mer）
5’-GGTATGTAGCAATACGTA(N24)TCCTATTGAGCATAGCC-3’    
(Library H2(-)) （63mer）
5’-GGTATGTAGCAATACGTA(N24)TCCTAT(N4)TGAGCATAGCC-3’           【００９９】
HRzC-ino （59nt）
5’-AGCAATACGTTTCGGCCTTTCGGCCTCATCAGGTCCTATTCTATAGTGAGTCGTATTAG-3’【０１００】
プライマー
(Library H(+)) （29 mer）
5’-CTAATACGACTCACTATAGGCTATGCTCA-3’
Selection H RT  16nt
5’-GGTATGTAGCAATACG-3’【０１０１】
HHSeq_F_EcoRI （26mer）
5’-CGGAATTCTAATACGACTCACTATAG-3’
HHSeq_R_BamHI （25mer）
5’-GCGGGATCCGGTATGTAGCAATACG-3’【０１０２】
修飾RNAは、北海道システムサイエンスから取得した。
5’末端biotin S （27nt）
5’-CAUUACGUAAUCCUAUUGAGCAUAGCC-3’
S C-ino （41nt）
5’-GGAUCGGUAUGUAGCAAUACGUAIUCCUAUUGAGCAUAGCC-3’
【実施例２】
【０１０３】
HTR2C mRNA上のE部位を切断するリボザイム (HRz1EおよびHRz2E) の設計（コントロール）は、切断部位周辺の配列が5’-Nn’HH’-3’ ルール（トリプレットルール）に適うように、HRz1CおよびHRz2Cの切断部位を5’側に1塩基シフトさせたE部位切断型リボザイム（HRz1EおよびHRz2E）を設計した。【０１０４】
E部位切断型リボザイム（HRz1EおよびHRz2E）の具体的な配列は、下記式(1)ないし(2)に示すとおりである。【０１０５】
HRz1E  (35nt)：【０１０６】
【化１４】
2012161144.tif 000019
【０１０７】
HRz2E  (41nt)：【０１０８】
【化１５】
2012161144.tif 000020
【０１０９】
次に、リボザイム（HRz1C、HRz2C、HRz1EおよびHRz2E）と基質RNA（S1、S2、S3、S4および S5）（標的配列）の合成を次のように行った。
なお、リボザイム(HRz1CおよびHRz2C) の設計は、HTR2C mRNA上C部位が切断部位となるように、標的認識領域をHTR2C mRNAの配列と相補的な配列に変換した。活性領域に存在するステムの数が切断活性に影響を与えることが既に報告されているため、ステム数が1つのリボザイム（HRz1C：35nt）および、ステム数が4つのリボザイム（HRz2C：41nt）を設計した。しかし、この２種のリボザイムは、切断部位周辺の配列が（5’-UAA-3’）となり、5’-N’HH’-3’ルール（トリプレットルール）には当てはまらない為に活性が低いと予測された。【０１１０】
上記リボザイム (HRz1CおよびHRz2C) の具体的な配列は下記式(3)ないし(4)に示すとおりである。【０１１１】
HRz1C  (35nt）：【０１１２】
【化１６】
2012161144.tif 000021
【０１１３】
HRz2C （41nt）：【０１１４】
【化１７】
2012161144.tif 000022
【０１１５】
上記配列において、左側枠内の塩基群はHelix I（5’−認識領域）、下線を施した塩基群はステム領域、および右側枠内の塩基群Helix III（3’−認識領域）を示す。以下も同じである。【０１１６】
リボザイム(HRz1EおよびHRz2E) についても、リボザイム(HRz1CおよびHRz2C)と実質的には同様に設計、合成することができる。【０１１７】
まず、各リボザイムの配列の上流にT7プロモーターを付加するために、下記組成を用いて、９８ ℃で５分間加熱後、２５ ℃まで１時間かけて除冷してアニーリングを行った。【０１１８】
【表４】
2012161144.tif 000023
【０１１９】
【表５】
2012161144.tif 000024
【０１２０】
【表６】
2012161144.tif 000025
【０１２１】
【表７】
2012161144.tif 000026
【０１２２】
【表８】
2012161144.tif 000027
【０１２３】
アニーリング後のサンプルを鋳型にし、下記組成の溶液中でin vitro 転写反応（３７℃：３時間）によりRNA（リボザイム）を合成した。【０１２４】
【表９】
2012161144.tif 000028
【０１２５】
上記で得られたサンプルに2μlのDNase を加え、３７℃で１５分間インキュベートし、DNase 処理を行った。その後、フェーノール／クロロホルムを加え、15,000 rpmで５分間遠心を行い、上清をフェノール／クロロホルム抽出した。この上清の２.５倍量のエタノールと１０分の１量の3 M 酢酸ナトリウムを加え、15,000 rpmで１５分間遠心を行い、エタノール沈殿により精製を行った。【０１２６】
次に、変性ゲル（6M Urea 15％ ポリアクリルアミドゲル）を用いて、RNAサンプルのPAGE精製を行った。エタノール沈殿により精製を行ったRNAサンプルを90％ホルムアミド( 60μl )で溶解し、変性ゲル(6M Urea 15％ ポリアクリルアミドゲル)を用いて電気泳動を行った。目的バンドを切り出し、ゲルをピペットチップの先端で細かく砕いた後、TEバッファーを400μl加えてローテーターを用い1時間攪拌を行った。15,000 rpmで５分間遠心を行い、ゲルからRNAを抽出した。その後、フェーノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製を行った。精製したRNAサンプルは変性ゲルで純度解析を行った。その結果、HRz1Cは38.8μM、HRz2Cは35.8μM、HRz1Eは17.0μM、ならびにHRz2Eは8.91μMであった。【０１２７】
図４は、各リボザイム（HRz1C、HRz2C、HRz1E、HRz2Eならびに基質RNA (S) のT7プロモーター反応後の電気泳動図である。図５(A) および (B) は、各リボザイムおよび基質RNA (S)ならびにS5 のPAGE精製後のそれぞれの電気泳動図である。【０１２８】
各リボザイム（HRz1C、HRz2CおよびHRz2E）は、PAGE精製にメインバンドを切り出すことに成功した。しかし、HRz1Eはバンドが2本確認できた。一方、基質Sにおいては、転写反応が効率よく起こっていないようなので、配列を長くしたS2、S3、S4、S5の合成を行った結果、S5が最も効率よく転写されることが分かった。【０１２９】
引き続いて、リボザイムの活性評価をEtBr染色によって行った。上記で構築したHRz1C（35nt）、HRz2C（41nt）、HRz1E（35nt）、HRz2E（41nt）と標的配列（S（35nt））を、80℃で３分間加熱後、25 ℃まで１５分間かけて除冷してアニーリングした後、以下の組成を持つアニーリングサンプル（36μl）に20mM MgCl2（4μl）を添加して３７℃でインキュベートすることによって切断反応を行った。反応溶液を各時間（０、１、２、２４時間）おきにサンプリング（4μlおよび8μlずつ）して、サンプリングした反応溶液は、エタノール沈殿による精製後、90％ ホルムアミドに溶解し、変性ゲル (6M Urea 15％ ポリアクリルアミドゲル) を用いた電気泳動により、切断バンドの解析を行なった。泳動写真をスキャナで取り込み、画像解析ソフトImage Jを用いて切断割合を算出した。【０１３０】
【表１０】
2012161144.tif 000029
【０１３１】
図６Ａおよび図６Ｂは、各リボザイムと標的RNA配列 (S)の経時活性評価（EtBr染色）を示す電気泳動図である。図６Ａ中、Ｈ１はHRz1を表し、Ｈ２はHRz2を表す。図６Ａ中、Ｈ１はHRz1Cを表し、Ｈ２は HRz2Cを表す。また、数字は時間（ｈ）を表す。
図７は、Image Jによる切断バンドの解析結果を示す棒グラフであり、（Ａ）は、HRz1E vs HRz1Cの切断バンドの割合、（Ｂ）はHRz2E vs HRz2Cの切断バンドの割合を示している。【０１３２】
解析の結果、すべてのサンプルで標的配列の切断バンドを確認したが、HRz1ならびにHRz2よりもコントロールの方がより短時間で標的配列を切断することが明らかになった。これは、分子設計だけでは5’-UAA-3’配列に対しては高活性なリボザイムを構築するのは困難であるという予測通りの結果である。さらに詳しく切断割合を算出するために、RIラベルによる切断活性評価を行った。【０１３３】
引き続いて、上記で得られたリボザイムの切断活性評価を行うために、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)を用いて、用いて基質Sの5’末端をRI (γ-32P) で標識した。
まず、上記で得られたサンプルに、H2O (79μl)、10×Antarctic Phasphatase buffer (10μl)、10μM S (10μl)、Antarctic Phasphatase
(1μl) を加え、37℃にて１時間インキュベートして5’末端の脱リン酸化を行った。その後、フェーノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製を行ったサンプルをH2O 14μlに溶解し、ブロックインキュベーターを用いて65℃で１０分間加熱することによりAntarctic Phasphataseを失活させた。【０１３４】
次に、脱リン酸化後の基質S (14μl)、10×T4 Polynucleotide Kinase Buffer (2 μl)、(γ-32P)ATP (2 μl)、T4 Polynucleotide Kinase(2 μl) を加え、37℃にて３０分間インキュベートし5’末端を同位元素で標識した。その後、スピンカラムを用いてフィルターろ過を行い未反応の (γ32P)ATPを取り除く操作を行い（8,000 rpm 、１分間遠心）、エタノール沈殿により精製した。上記のようにエタノール沈殿により精製したサンプルを80%ホルムアミドで溶解し、変性(8M尿素、15％ ポリアクリルアミドゲル) ゲルを用いて電気泳動を行った。目的バンドを切り出し、ゲルをピペットチップの先端で細かく砕いた後、TEバッファーを300μl加えてローテーターを用い１時間攪拌を行った。15,000 rpmで５分間遠心を行い、ゲルからRNAを抽出した後、エタノール沈殿により精製を行った。精製後のサンプルを20μlのTEで溶解し、5’末端を放射標識した基質Sを準備した。【０１３５】
【表１１】
2012161144.tif 000030
【０１３６】
【表１２】
2012161144.tif 000031
【０１３７】
上記で得たリボザイムの切断活性を以下の方法により評価した。2μM リボザイム (10μl)に、10×cleavage buffer (2μl)、5’末端を同位元素標識した基質S (1μl)、H2O (5μl)を加え、ブロックインキュベーターを用いて80℃にて３分間加熱後、室温で１０分間放冷しアニーリング反応を行い、20mM MgCl2を加えることにより反応を開始した。その後、37℃でインキュベートして切断反応を行った。各時間（１、３、６時間）おきにサンプリングして（3.6μlずつ）、サンプリングした溶液に0.5M EDTAを0.4μl 、ホルムアミドを16μl加えて、80℃で３分間加熱後、氷上にて２分間急冷し、変性ゲル (8M尿素、15％ ポリアクリルアミドゲル) を用いた電気泳動により、切断バンドの解析を行なった。【０１３８】
図８は、各リボザイムの切断活性（RIラベル）の経時変化を示す図である。図９は、図８における各リボザイムの切断活性（RIラベル）の経時毎の切断割を算出した結果を示す棒グラフである。
【実施例３】
【０１３９】
本実施例では、in vitro セレクション法を用いたHTR2C mRNA上C部位を切断するリボザイムを構築した。このin vitro セレクション法は、機能性RNA (核酸) を構築する方法の一つである。
RNAは、逆転写でDNAに変換することができ、DNAはPCRで増幅することも可能である。この性質を利用し、以下のような手順で目的機能を有するRNA分子の選出を行った。(1) RNAライブラリーからの特定条件下（標的分子に結合するや、活性を示すなど）でのRNA分子の選別。(2) (1)で選択した RNA分子を逆転写反応によるDNAへの変換。PCRによるT7プロモーター配列の付加、増幅。(3) T7 RNAポリメラーゼによるRNAへの転写。(1)〜(3)の操作を繰り返し行うことで、HTR2C mRNA上C部位を切断する機能をもつRNA分子を得た。【０１４０】
なお、基本骨格は、Schistosoma mansoni由来のハンマーヘッド型リボザイム（Martick, M.; Scott, W. G. Cell 2006, 126, 309-20）を用いた。セレクション方法は、文献（Persson, T., et. al. Chembiochem 2002, 3, 1066-71）を参考にして設計した。【０１４１】
（ライブラリーH1およびH2の作成）
活性領域に存在する24塩基を全てランダム化したライブラリーH1と、標的認識領域に4塩基のループを導入したライブラリーH2を設計した。【０１４２】
ライブラリーH1の具体的な設計は以下に示すとおりである。【０１４３】
【化１８】
2012161144.tif 000032
【０１４４】
ライブラリーH2の具体的な設計は以下に示すとおりである。【０１４５】
【化１９】
2012161144.tif 000033
【０１４６】
ライブラリー H(+) と、ライブラリーH1(-) またはライブラリーH2(-) をそれぞれアニーリングした後にKlenowを用いて鋳型DNAの調節を行った。作成した二本鎖DNAを鋳型にし、in vitro 転写反応により、ライブラリーH1およびH2をそれぞれ合成した（図１０）。【０１４７】
組成は以下に示すとおりである（H1およびH2のどちらも組成は同じ）。【０１４８】
【表１３】
2012161144.tif 000034
【０１４９】
上記で得られたライブラリーH1およびH2をセレクション処理した。
まず、ライブラリーH1およびH2と、5’末端をbiotin化した標的RNAをそれぞれアニーリングした。続いて、洗浄用バッファー（10mM HEPES、5mM EDTA、50mM NaCl）で洗浄したマグネットビーズ（Dynabeads M-280 streptavidin: DYNAL社）とアニーリングしたサンプルを混合し、室温で２０分間インキュベートすることにより、biotinとstreptavidinの結合反応を行なった（1Round：300μl；2〜8Round：50μl）。【０１５０】
【表１４】
2012161144.tif 000035
【０１５１】
【表１５】
2012161144.tif 000036
【０１５２】
上記で得られたサンプルに、切断用バッファー（50mM Tris/HCl (pH7.5)、50mM NaCl、 20mM MgCl2)を加え、37℃で３０分間インキュベートし、リボザイムを活性化させた。ここで、活性を有する分子は、標的RNAを切断し、マグネットビーズから解離する。マグネットビーズを除去した後、溶液をエタノール沈澱により精製し、6μlのTEに溶解後、逆転写反応によりcDNAに変換した。【０１５３】
逆転写反応は、セレクションサンプル (3μl)と20μセレクションH RT (9.5μl) とを、80℃で１５分間加熱した後、25℃で１分間放置した後、4℃で冷却してアニーリングした。このようにして得られたアニールサンプル (12.5μl) を、5 xバッファー (4l) 10mM dNTP (2l) AMV RTase (1.5) と混合し、42℃で１５分間加熱した後、99℃で５分間加熱した後、４℃に冷却して逆転写反応を行った。【０１５４】
その後、PCRにより鋳型となるDNAを増幅した。PCRは、下記組成を用いて、９５℃で１５秒間加熱後、５５℃で３０秒間、続いて６８℃で３０秒間加熱することを１サイクルとして行った。【０１５５】
【表１６】
2012161144.tif 000037
【０１５６】
その際、最適なPCR条件を決定するために、上記PCRと同一条件でサイクルチェックを行なった。サイクルチェックは、１〜３ラウンドにおいては、１０〜３５サイクルまでは５サイクルごとにサンプリングし、４〜８ラウンドにおいては、８〜２４サイクルまでは４サイクルごとにサンプリングして行った。【０１５７】
図１１Ａおよび図１１Ｂは、ラウンド１のサイクルチェックの結果をそれぞれ示す電気泳動図である。図中、左半分はライブラリーH1、右半分はライブラリーH2を示す。【０１５８】
増幅後のサンプルをフェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製後、10μlのTEに溶解し、10μl中5μlのtemplate DNAを用いて、in vitro転写反応（３７℃で３時間加熱）により次のラウンドに用いるRNAライブラリーを合成した。【０１５９】
【表１７】
2012161144.tif 000038
【０１６０】
上記の操作を８回繰り返し、サイクルチェックの結果から、分子種が収束していると予想されたため、RNA分子の配列解析を行った（図１２：左半分はライブラリーH1を、また右半分はライブラリーH2を示す）。ライブラリーH1の配列解析結果は図１３に、またライブラリーH2の配列解析結果は図１４に示すとおりである。【０１６１】
配列解析の結果、ライブラリーH1は、10/16が基本骨格よりも短い断片がえられていた。また、その他の分子については、切断部位の配列が5’-N’HH’-3’の法則に従うようにC部位から１塩基シフトしたリボザイムが得られた。また、ライブラリーH2に関しては、あまり分子種の収束が見られなかったため、引き続きin vitro セレクションを行い、１２ラウンドで逆転写反応後のPCRサイクル数の減少を確認したので再び配列解析を行った。再配列解析結果を図１５に示す。【０１６２】
再配列解析にて３６分子配列を確認したうち、図１５に示す３分子において収束が見られた。この3分子の活性評価（RIラベル）を行ったが、HTR2C mRNAに対しては全く切断活性を示さなかった。そこで、C部位を切断リボザイムのみを選択できるように、活性領域に存在する切断活性に必須である配列 (5’-CUGA-3’)を固定し、それ以外を多様化したRNAライブラリー（2H1ならびに2H2）を再設計した。【０１６３】
なお、上記で合成したサンプルに1μlのDNaseＩを加え、３７℃で１５分間インキュベートし、DNase 処理を行った。その後、フェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製を行った。また、未反応のNTPを除くため、精製後のサンプルを40μlのTEに溶解し、ゲルろ過を行った。方法は、Micro Bio-Spin 30 Colum in RNase Freeを用い、3,200rpmで４分間遠心した。ナノビューを用いて、ゲルろ過後のサンプルの濃度を決定し、次のラウンドに移った。【０１６４】
（制限酵素サイトふ化）
８ラウンドのPCRにより増幅したDNAライブラリーに制限酵素をふ化するために、HH-FwとHH-Rvの2種類のプライマーを用いてPCRを行った。その際、最適なPCR条件を決定するために、サイクルチェックを行なった。サイクルチェックは、下記組成を用いて、９５℃で１５秒間加熱した後、５５℃で３０秒間、続いて６８℃で３０秒間加熱処理し、２〜１０ラウンドまでは２サイクルごとにサンプリングした。その結果、６ラウンドが最適条件であったので、以下の組成で制限酵素ふ化を行った。【０１６５】
【表１８】
2012161144.tif 000039
【０１６６】
【表１９】
2012161144.tif 000040
【０１６７】
増幅後、フェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製を行い、20μlのTEで溶解した。【０１６８】
以下の組成で３７℃で２時間制限酵素処理を行った後、フェノール/クロロホルム抽出をした後、エタノール沈殿により精製を行った。【０１６９】
【表２０】
2012161144.tif 000041
【０１７０】
処理後、ナノビューによる濃度定量の結果は、DNAライブラリーH1は0.020μg /μl、またDNAライブラリーH2は0.020μg /μlであった。【０１７１】
（ベクターの制限酵素処理）
pBluescript（0.245μg /μl）を、BamHＩとEcoRＩを含む組成を用いて、37℃で2時間処理して制限酵素処理を行った。処理後、フェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製を行った。処理後、ナノビューによる濃度定量の結果は、0.041μg /μlであった。【０１７２】
【表２１】
2012161144.tif 000042
【０１７３】
（ライゲーション）
pBluescriptと、DNAライブラリー（H1、H2）とを、１６℃で４時間３１分間ライゲーションを行った。なお、mol比がpBluescript：DNAライブラリー＝1：3であった。その後、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製を行った後、H2O 3μlで溶解した。【０１７４】
【表２２】
2012161144.tif 000043
【０１７５】
（エレクトポレーション）
ライゲーション後のサンプル3μlから1.5μlを氷上にて溶解したJM83に加え、エレクトロキュベットに移し、エレクトロポレーションを行った。その後、直ちにSOCに注ぎ、３７℃にて３０分間培養を行った。培養後のサンプルをLB培地（アンピシリン、X-gal含）に撒き、３７℃にて一夜培養を行った。【０１７６】
（コロニーPCR）
一夜培養を行った後、青コロニーおよび白コロニーのうち、白コロニーのみを爪楊枝を用いて、DNAライブラリーH1およびH2をそれぞれ24個ずつPCRチューブにピックアップした。チューブには、以下の組成のPCRミックスをそれぞれ10μlずつ分注した。【０１７７】
【表２３】
2012161144.tif 000044
【０１７８】
PCRは、９５℃で１５秒間、５５℃で３０秒間ならびに６８℃で３０秒間の加熱処理を１サイクルとして３０サイクル行った後、1%アガロース電気泳動を行い目的の増幅物が得られているかを確認した。DNAライブラリーH1およびH2を１８サンプルずつを選別し、シークエンスPCRを行った。【０１７９】
シークエンスPCR後、エタノール沈殿により精製を行い、ホルムアミド：ブルーデキストラン（5：1）の混合溶液3μlに溶解した。そのサンプルを９５℃にて３分間加熱後、氷上で急冷した。その後ABI377で塩基配列の解析を行った。
【実施例４】
【０１８０】
本実施例では、HTR2C mRNA上C部位のA-to-I編集を識別するリボザイム ( HRzC-ino) の設計を行った。
HRz2Eを基本骨格とし、C部位のアデノシンは、HRzCの標的認識領域に存在するウリジンと塩基対を形成することにより認識される。そこで、イノシンがシトシンと塩基対を形成することを利用し、C部位と塩基対合するウリジンをシトシンに置換することにより、C部位がA to I編集された時にのみ切断活性を示すリボザイムHRzC-inoを設計した。【０１８１】
リボザイムHRzC-ino（41nt）の具体的な配列は下記式(5)に示すとおりである。【０１８２】
【化２０】
2012161144.tif 000045
【０１８３】
上記のようにして設計したリボザイムHRzC-inoに基づいて、HTR2C mRNA上C部位のA-to-I編集を識別するリボザイム ( HRzC-ino) の合成を行ったところ、最終濃度（2.3μM）は低かったけれどHRzC-inoが得られた（図１６）。【０１８４】
上記で得られたリボザイム HRzC-inoの活性評価（RI標識）を行った。標的RNAとしては、基質SとSのC部位がイノシン (I) であるS C-inoを用い、それぞれの標的RNAに対しての切断活性を比較した（図１７）。なお、標的RNAの5’末端標識方法ならびに活性評価方法は、上記に示した方法と同様に行った。  【０１８５】
上記のようにリボザイム HRzC-inoの切断活性を評価した結果、C部位が、塩基Aよりも塩基Iの配列に対してより高い切断活性（約１４倍）を示すことを確認した。以上の結果より、リボザイム HRzC-inoは、HTR2C mRNAのC部位におけるA-to-I編集を特異的に識別できることが示された。
【実施例５】
【０１８６】
本実施例では、HTR2C RNAフラグメントに対するA-to-I編集特異的リボザイムのin vitroトランス切断活性および特異性を調べた。
HR-HTR2C-editの切断活性と編集特異性を評価するために、インビトロアッセイを、Ｃ部位を含む合成HTR2C RNAフラグメントを用いて行った。このアッセイでは、２形式の32P標識 HTR2C mRNAフラグメント（３７個のヌクレオチド）、つまり、１つは、非編集基質（HTR2C-ade）としてのC部位に塩基Aを有するものと、編集基質としてのC部位に塩基Iを有するものとの２形式を使用した（図１８Ａ）。【０１８７】
基質RNAは、インビトロで転写し、ゲル精製した過剰量のHR-HTR2CとHR-HTR2C-editリボザイムの存在下でアニールした。切断反応は、３７℃で20 mM MgCl2を添加して開始した。１時間後、切断バンドは、ゲル電気泳動を用いて分析し、切断率を算出した（図１８Ｂ、１８Ｃ）。HR-HTR2Cの場合、HTR2C-adeとHTR2C-ino (0.69 and 0.59) に対して同様の切断率が観察された。対照的に、HR-HTR2C-editを用いたHTR2C-inoに対する切断率は、HTR2C-ade (0.76 and 0.09) に対する切断率よりも格段に高かった。これらの結果は、HR-HTR2Cの２番目の塩基を変換してHR-HTR2C-editを形成することは、A-to-I編集特異的切断活性を授けることを示している。【０１８８】
次に、リボザイムのための切断動態を分析するために、上述した実験法を用いて、単独ターンオーバー条件下でtrans切断率定数を決定した（図１９）。図１９Ａは、HTR2C-ade（図１９Ａの上図）とHTR2C-ino（図１９Ａの下図）に対するHR-HTR2C-editの反応から得られた切断産物の経時変化を示す。HR-HTR2C-editの動態分析結果は、HTR2C-inoを用いた場合は高kcat値 (0.67 ± 0.011 min-1)、HTR2C-adeを用いた場合は低kcat (0.01 ± 0.001 min-1)値を示した（図１９Ｂ、表３）。対照的に、HR-HTR2Cは、編集ならびに非編集基質の両方の切断をkcat値（0.05 ± 0.001 min-1、0.44 ± 0.022 min-1）で触媒活性を示した。このリボザイムに対するkcat値の相違は、HR-HTR2C-editに対するそれよりも小さかった。反応の最終ポイント（F∞）での産物の分画は、認識塩基と修飾部位との組み合わせが、U-A (0.74)、U-I (0.63)、C-I (0.85）である場合は類似しているが、C-A の場合は有意に低い値（0.23）を示した。【０１８９】
この結果、先行研究（Werner, M., et al. 1995. Nucleic Acids Res 23(12): 2092-2096）の結果と一致しているとともに、HR-HTR2C-editの切断活性が、塩基対が認識塩基で形成されているかどうかに左右されて非常に影響されることを見いだした。HR-HTR2Cについては、U-AならびにU-I 間の切断活性の相違は、塩基対の熱安定性に従った順になるようも思われ、U-I 塩基対はU-A 塩基対よりも安定性が低かった (Serra, M.J., et al. 2004. Nucleic Acids Res 32(5): 1824-1828)。これらの結果は、リボザイムの編集特異的切断活性が、認識塩基と、標的修飾部位の塩基とを組み合わせることによって設計できることを示した。
【実施例６】
【０１９０】
本実施例では、リボザイムを用いたAPOB RNAに対するC-to-U編集特異的切断を調べた。本発明で作製したリボザイムが他の形式のRNA置換編集の特異的切断に応用可能かどうかを決定するために、認識塩基を変化させてC-to-U編集特異的リボザイムを構築した。C-to-U編集特異的リボザイムは、APOB mRNAの6666位の塩基ＣのC-to-U編集が、グルタミンコドン（CAA）をフレーム内（in-frame）ストップコドンに変換することによって、APOB mRNAに対する標的として設計した。A-to-I 編集に使用した同様の方法を用いて、HHRは、同じ触媒活性コア配列を用いて、APOB mRNA上の５’位のC-to-U修飾部位を切断するように構築した。C-to-U編集特異的リボザイム（HR-APOB-edit）は、塩基Aを、APOB RNAのC-to-U編集からの塩基Uと塩基対を形成するように、認識ヌクレオチドに導入することによって生成した。非編集基質（APOB-cyt）と編集基質（APOB-uri）に対するHR-APOB-editの切断活性は、インビトロ切断アッセイ法によって分析した（図２０Ｂ）。図２０Ｂに示すように、過剰量のリボザイムの存在下での１時間での切断反応後では、APOB-uriの切断は、APOB-cytの切断よりもかなり大きかった。HR-APOB-editに対する動的分析では、APOB-cytとAPOB-uriに対するHR-APOB-editの切断率は有意に異なっていた（0.01 ± 0.006 min-1 and 0.17 ± 0.008 min-1）（図２０Ｃ）。その上、最終ポイントでの産物分画においては、APOB-cytとAPOB-uriの間には明確な違いが観察された。これらのデータは、認識塩基とターゲット修飾部位との組み合わせを選択することが、A-to-I変異特異的切断ばかりではなく、C-to-U編集特異的切断のリボザイムの構築に応用できることを示した。
【実施例７】
【０１９１】
本実施例では、細胞抽出ならびに合成FLNA mRNAに対するA-to-I編集特異的切断について調べるために、細胞抽出したmRNAに対するA-to-I編集特異的切断の有効性を評価した。
保存A-to-I修飾部位（Q/R部位）を含むFLNA mRNAを、内在性FLNA mRNAが編集されて、細胞中でRNA 2上で作用するアデノシン・デアミナーゼ(ADAR2)を過剰発現する標的mRNAとして使用した
(Nishimoto, Y., et al. 2008. Neurosci Res 61(2): 201-206)。FLNA mRNA (HR-FLNA-edit) の編集特異的切断のためのリボザイムは、上述した方法を用いて設計し、HR-FLNA-editの切断活性ならびに編集特異性は、合成FLNA RNAフラグメントを使用したインビトロ切断アッセイにより分析した（図２２）。編集FLNA RNAフラグメントに対するHR-FLNA-editの最終ポイントでの産物の切断率定数ならびに分画は、非編集FLNA RNAフラグメントのそれよりもずっと大きかった（図２２、表３）。これらの結果は、HR-HTR2C-editに対して観察された結果と類似していた。【０１９２】
次に、細胞抽出FLNA mRNAに対するHR-FLNA-editのための編集特異的切断の効率を評価するために、ADAR2を過剰発現するHEK293細胞から編集FLNA mRNAを調製した。本発明者は、ドキシサイクリン（Dox）誘発可能な発現システムを含むADAR2発現ベクターで安定的にトランスフェクト可能なTet-ADAR2細胞をすでに確立した。編集FLNA mRNAおよび非編集 FLNA mRNAの混合物を含む全RNAは、任意の濃度のDoxを用いて培養したTet-ADAR2細胞から得ることができた。もしリボザイムが抽出した全RNA中の編集 FLNA mRNAを特異的に切断するならば、編集FLNA mRNAと非編集 FLNA mRNAとの比率は低下するはずである。したがって、編集特異的切断の効率は、Q/R部位での編集率に差異があるリボザイムを含むサンプルと含まないサンプルとの違いを測定することによって評価した。編集率を定量化する実験スキームを図２３Ａに示す。第一に、抽出RNA150ngを過剰量のHR-FLNA-edit (最終濃度： 2.5μM)でアニールし、MgCl2  20mMを含むバッファー中で切断反応を行った。異なる時間（１、３、６、２４時間）切断反応を行った後、RNAサンプルを、FLNA特異的プライマーを用いてRT-PCRを行い、蛍光dideoxyシーケンシング法を用いてPCRフラグメントを直接シーケンシングした（図２３Ａ）。各サンプルのQ/R部位での編集率を定量化するために、TならびにCのピーク高が、リバースプライマーを用いて増幅させた配列のために生成したクロマトグラムで測定した（図２３Ｂ）。編集率はHR-FLNA-edit反応の長さに従って低下した。つまり、１、３、６、２４時間当たり、編集率はそれぞれ0.56、0.52、0.47、0.36であり、これらの値は、リボザイムを含まない反応に比べて低かった。A/G混合ピーク高は、T/C混合ピーク高よりもかなり不一致であったけれども、フォワードプライマーを使用した各反応における編集率を測定して、リボザイム存在下での反応時間における編集率の低下を評価した（図２４）。これらの結果は、HR-FLNA-editが細胞抽出FLNA mRNAを編集特異的に切断することを示していた。【０１９３】
上述したように、本発明においては、編集特異的リボザイムを構築するために、リボザイムの認識塩基が、標的RNAの修飾塩基とだけ塩基対を形成するように設計したので、このように設計したリボザイムは、RNA編集特異的切断に非常に有効であることが示された。A-to-I編集特異的切断のために設計したリボザイムは、編集HTR2Cと編集FLNA RNAフラグメントに対する触媒活性が、非編集RNAに対するよりも１０倍以上高かった。同様に、APOB RNAのC-to-U編集のためのリボザイムも、編集APOB RNAフラグメントに対する触媒活性が非常に高いことが判明した。本発明におけるインビトロ切断アッセイによる結果は、本発明に係る編集特異的ハンマーヘッド型リボザイム (HHR) が、編集標的RNAに対して選択的切断活性を有することを示した。編集基質に対する本発明のハンマーヘッド型リボザイム (HHR) の動的分析データを比較すると、HR-HTR2C-editの切断率は、HR-FLNA-editならびにHR-APOB-editのそれよりも非常に高いことが分かった。一方、反応の各最終ポイントでの産物分画は同様であった。これらの切断率の違いは、ハイブリダイズ形成アームとそれらの塩基対の配列によるものと考えられる。HHRの認識塩基に相当する位置での変異分析において示されるように（例えば、Zoumadakis, M., et al. 1994. Nucleic Acids Res 22(24): 5271-5278）、本発明のHHRの標的切断活性は、その認識塩基が標的RNAの修飾塩基と塩基対を形成できるかどうかに基づいて制御される。加えて、U-AならびにU-I塩基対を有するHR-HTR2Cのデータもまた、切断活性が、認識塩基での塩基対の熱安定性によって影響されることを示している。これらの結果は、本発明が、認識塩基と標的塩基との適切な組み合わせを選択することによって、RNA置換編集ばかりではなく、点変異、一塩基多型（SNP）などを含む別の形式の塩基置換の特異的切断にも応用できることを示唆している。【０１９４】
本発明のようにリボザイムの認識塩基を変換することは、その切断活性が、たとえ上記トリプレットルールによって制限されたとしても、編集特異的ならびに変異特異的切断などを設計するのに有用である。本発明においては、例示した全ての標的RNAの切断部位は、リボザイムの切断活性を保持するトリプレットルールに合致するように選択した。HHRはN’HH’切断特異性があるため、本発明は、標的配列の変異部位の5’側1塩基、もしくは２塩基上流のヌクレオチドにＧが存在する場合は適用することができない。同様の理由で、N’HH’特異性を応用したHHRによる変異体認識法を用いても、全ての組み合わせの変異を識別することはできない。しかしながら、本発明で採用した戦略に基づいて、どの塩基が、標的変異部位であるかまたはその周囲の配列の前後関係に存在するかを考慮してリボザイムを設計すれば、ほぼあらゆるヌクレオチドの置換を人工リボザイムによって特異的に認識することが可能である。このように標的変異特異性が広がれば、リボザイムを遺伝子発現を選択的抑制する変異もしくは置換編集に応用できる可能性を増大させることができる。  【０１９５】
さらに、本発明は、リボザイムによる編集特異的切断が、インビトロにおいて、短いRNAフラグメントばかりでなく、生理学的mRNAに対しても応用可能であることを示している。本発明においては、細胞由来標的mRNAの編集特異的切断の有効性は、DNAシーケンシングクロマトグラムに基づく修飾部位のピーク高を利用した編集率の変化として評価した。この方法によって、HR-FLNA-editの編集特異的切断を分析したところ、FLNA mRNAの総量の定量化が必要であるけれども、大雑把に見積もったところ、FLNA mRNAの51％が24時間の反応においてHR-FLNA-editによって切断された。編集特異的切断の量は、反応時間に依存したが、切断効率は、FLNA mRNAフラグメントに対する反応に比べて低く、FLNA mRNAフラグメントに対する１時間の切断反応でほぼ飽和状態になった（図２２、２３）。
【産業上の利用可能性】
【０１９６】
要約すると、本発明においては、最小のハンマーヘッド型リポソーム（HHR）のフレームワークを利用して、A-to-IならびにC-to-U RNA置換編集に基づく標的RNA切断のためのリボザイム設計・作成を発展させてきた。本発明のリボザイム設計の基本フレームワークは、リボザイムの認識塩基を変換し、合成編集RNAフラグメントならびに生理学的mRNAの両方に対して高い特異的切断活性を示すリボザイムを作製することにある。さらに、本発明の戦略は、RNA置換編集ばかりではなく、認識塩基と標的塩基との特異的組み合わせを選択することによって、別の形式の変異、例えば、SNPなどの変異を含む、塩基の置換、欠失、追加等の修飾などにも幅広く応用することができる。したがって、本発明は、RNA編集などに起因する疾患ばかりではなく、その他の形式の変異などの修飾に起因する疾患の予防ならびに治療に寄与する新しい薬剤の研究・開発に役立つものと期待される。
【図１】
2012161144.tif 000058
【図２】
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【図３】
2012161144.tif 000060
【図４】
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【図５Ａ】
2012161144.tif 000062
【図５Ｂ】
2012161144.tif 000063
【図６Ａ】
2012161144.tif 000064
【図６Ｂ】
2012161144.tif 000065
【図７】
2012161144.tif 000066
【図８】
2012161144.tif 000067
【図９】
2012161144.tif 000068
【図１０】
2012161144.tif 000069
【図１１Ａ】
2012161144.tif 000070
【図１１Ｂ】
2012161144.tif 000071
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2012161144.tif 000082
【図２３Ａ】
2012161144.tif 000083
【図２３Ｂ】
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【図２４】
2012161144.tif 000085
【手続補正書】
【提出日】平成25年3月21日(2013.3.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
一般式［ＩＩＩ］：
【化２３】
2012161144.tif 000086
（式中、Ａはアデニン（Ａ）を意味し；
Ｃはシトシン（Ｃ）を意味し；
Ｇはグアニン（Ｇ）を意味し；
Ｕはウラシル（Ｕ）を意味し；
Ｄは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）であって、Ｈと塩基対を形成する塩基を意味し；
Ｘは、標的ＲＮＡの修飾部位を認識する修飾認識塩基であって、アデニン（Ａ）またはシトシン（Ｃ）を意味するが、Ｅがシトシン（Ｃ）である場合には、Ｘはアデニン（Ａ）を意味し、Ｅがアデニン（Ａ）の場合には、Ｘはシトシン（Ｃ）を意味し；
Ｎは、いずれも同一であってもまたは異なっていてもよく、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基であって、Ｎ’と塩基対を形成する塩基を意味し；
Ｅは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）またはイノシン（Ｉ）から選ばれるいずれかの塩基であり、かつ、上記一般式［ＩＩＩ］において対応する塩基Ｘと塩基対を形成する塩基であって、塩基Ｘと塩基対を形成したときに、５’側に隣接する塩基Ｈ’との結合を切断される塩基を意味し；
Ｈ’は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基を意味し；
Ｎ’は、同一であっても、または異なっていてもよく、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基であって、対応する塩基Ｎと塩基対を形成する塩基を意味し；
ａは、１〜１０の整数、好ましくは２〜６の整数、より好ましくは２〜４の整数を意味し；
ｂは、１〜６の整数、好ましくは２〜４の整数を意味し；
ｃは、１〜４の整数、好ましくは１〜２の整数を意味し；
ｍは、２〜５０の整数、好ましくは５〜３０の整数、さらに好ましくは５〜２０の整数を意味し；および
ｎは、２〜５０の整数、好ましくは５〜３０の整数、さらに好ましくは５〜２０の整数を意味し；
矢印は切断部位を意味する）
で表されるハンマーヘッド型リボザイム−標的ＲＮＡ構築物。
【請求項５】
請求項４に記載のハンマーヘッド型リボザイム−標的ＲＮＡ構築物であって、一般式［ＩＩＩａ］：
【化２４】
2012161144.tif 000087
（式中、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ｄ、Ｘ、Ｎ、Ｎ’、Ｅ、Ｈ、Ｈ’、ａ、ｂ、ｃ、ｍおよびｎはいずれも前記と同じ意味を有する。）
で表されるハンマーヘッド型リボザイム−標的ＲＮＡ構築物。
【請求項６】
請求項４または５に記載のハンマーヘッド型リボザイム−標的ＲＮＡ構築物であって、構造式［ＩＩＩｂ］：
【化２５】
2012161144.tif 000088
で表されるハンマーヘッド型リボザイム−標的ＲＮＡ構築物。
【請求項７】
請求項４または５に記載のハンマーヘッド型リボザイム−標的ＲＮＡ構築物であって、構造式［ＩＩＩｃ］：
【化２６】
2012161144.tif 000089
で表されるハンマーヘッド型リボザイム−標的ＲＮＡ構築物。
【請求項８】
請求項４または５に記載のハンマーヘッド型リボザイム−標的ＲＮＡ構築物であって、構造式［ＩＩＩｄ］：
【化２７】
2012161144.tif 000090
で表されるハンマーヘッド型リボザイム−標的ＲＮＡ構築物。
【請求項９】
一般式［Ｉ］：
【化２８】
2012161144.tif 000091
（式中、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ｄ、Ｘ、Ｎ、Ｎ’、ａ、ｂおよびｃはいずれも前記と同じ意味を有する）
で表されるハンマーヘッド型リボザイムと、一般式［ＩＩ］：
【化２９】
2012161144.tif 000092
（式中、Ｅ、Ｎ’、Ｈ、Ｈ’、ｍおよびｎは前記と同じ意味を有する。）
で表される標的ＲＮＡとを反応させて、一般式［ＩＩＩ］：
【化３０】
2012161144.tif 000093
（式中、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｎ’、Ｈ、Ｈ’、Ｘ、ａ、ｂ、ｃ、ｍおよびｎは前記と同じ意味を有する）
で表されるハンマーヘッド型リボザイム−標的ＲＮＡ構築物を得ることにより標的ＲＮＡを開裂するＲＮＡ開裂方法。
【請求項１０】
請求項９に記載のＲＮＡ開裂方法であって、前記ハンマーヘッド型リボザイムが、一般式［Ｉａ］：
【化３１】
2012161144.tif 000094
（式中、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ｄ、Ｎ、Ｘ、ｍおよびｎは前記と同じ意味を有する）
で表され、また前記ハンマーヘッド型リボザイム−標的ＲＮＡ構築物が、一般式［ＩＩＩａ］：
【化３２】
2012161144.tif 000095
で表されるＲＮＡ開裂方法。
【国際調査報告】
2012161144.tif 000096
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2012161144.tif 000098
2012161144.tif 000099
2012161144.tif 000100