(57)【要約】本発明は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を有効成分として含有する、骨格筋の変性を伴う疾患の治療剤を提供する。本発明の治療剤は特に筋ジストロフィーの治療剤として有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を有効成分として含有する、骨格筋の変性を伴う疾患の治療剤。
【請求項２】
骨格筋の変性を伴う疾患が筋ジストロフィーである、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
骨格筋の変性を伴う疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項２に記載の治療剤
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は骨格筋の変性を伴う疾患の治療剤に関し、特に筋ジストロフィー治療剤に関する。本発明の骨格筋の変性を伴う疾患の治療剤は顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を有効成分として含む。
【背景技術】
【０００２】
筋ジストロフィーとは、筋線維の変性および壊死による進行性の筋力低下、筋萎縮を主症状とする遺伝性疾患の総称であり、その遺伝形式や臨床的特徴から、デュシェンヌ（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ）型、ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）型、肢帯型、先天性、遠位型、顔面肩甲上腕型、筋緊張性など、現在では１０以上の型に分類されている。これらのうち、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型の患者数が最も多く、従来、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型を中心に研究が進められてきた。【０００３】
Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ、ＤＭＤ）は伴性劣性遺伝で、患者の大部分は男性である。新生男児の３，５００人に１人の割合で発症すると言われている。患者は、幼児期に筋力低下症状を現し、一旦発症するとその後筋萎縮が止まることなく進行する。筋組織は次第に脂肪と線維組織で置き換えられていき、１０歳前後で歩行不能となり、平均２０歳程度で進行性衰弱、呼吸不全または心不全で死に至る。【０００４】
ＤＭＤは、Ｘ染色体短腕（Ｘｐ２１）に存在するジストロフィン（Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）遺伝子の異常（欠損あるいは変異など）により発症することが明らかとなっている（非特許文献１）。ジストロフィン遺伝子の遺伝子産物であるジストロフィン蛋白質（分子量４２７ｋＤ）は、筋細胞の形質膜直下に局在し、細胞内で筋原線維の構成蛋白質であるアクチンに結合すると同時に、形質膜のジストロフィン結合糖蛋白質を通じて細胞外マトリックスであるラミニンとも結合することにより、筋細胞の骨格を保つ働きをしている（非特許文献２）。ＤＭＤ患者ではジストロフィン遺伝子の異常により、正常なジストロフィンが産生されず、筋細胞膜にジストロフィンが全く存在しない。そのため、筋細胞がその形を保つことができず、収縮の間の損傷などにより容易に壊死しやすくなっていると考えられている。【０００５】
現在、ＤＭＤに対する有効な治療方法は未だ見出されておらず、症状の進行を遅らせるためのリハビリテーションや人工呼吸器による呼吸管理等が重要な意味をもつのが現状である。薬物治療として副腎皮質ホルモン（ステロイド）があるが、副作用が強く、十分な治療効果も得られていない。試験的な治療方法としては、再生治療（幹細胞や筋芽細胞の移植）（非特許文献３）、遺伝子治療（機能的ジストロフィン遺伝子の導入、アンチセンスモルフォリノによる変異エクソンのスキップ）（非特許文献４）、新たな薬物治療（ナンセンス変異のリードスルー）（非特許文献５）などが試みられているが、実用には至っていない。また、免疫抑制剤も、グルココルチコイド以外には確実な効果が見られない状況であって、そのグルココルチコイドも、筋の強さを増強させるメカニズムが解明されてはおらず、その効果の検証には更なる研究が必要な状況にある。【０００６】
従って、筋ジストロフィーにおける筋線維の崩壊に対して抑制的に働く薬物があれば、筋ジストロフィーの治療ないし進行の抑制に効果があるものと期待される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｏｅｎｉｇ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ＤＭＤ）ｃＤＮＡ  ａｎｄ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＭＤ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．Ｃｅｌｌ  ５０，５０９−５１７（１９８７）．
【非特許文献２】Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｋ．＆  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｋ．Ｐ．Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ．Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ  １７，２−１５（１９９４）．
【非特許文献３】Ｍｅｒｅｇａｌｌｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｔｏ  ｔｒｅａｔ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏ  ｄａｔｅ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２４，２３７−２４７（２０１０）．
【非特許文献４】Ｋｉｎａｌｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｃａｌ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ＡＶＩ−４６５８  ｉｎ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ，ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｃｏｎｃｅｐｔ  ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．８，９１８−９２８（２００９）．
【非特許文献５】Ｆｉｎｋｅｌ，Ｒ．Ｓ．Ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ／Ｂｅｃｋｅｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  ａｔａｌｕｒｅｎ（ＰＴＣ１２４）．Ｊ．Ｃｈｉｌｄ  Ｎｅｕｒｏｌ．２５，１１５８−１１６４（２０１０）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、Ｇ−ＣＳＦを含有する骨格筋の変性を伴う疾患の治療剤、特に筋ジストロフィー治療剤を提供することを目的とする。特に、Ｇ−ＣＳＦが損傷した筋肉に及ぼす効果、メカニズムを解明し、さらにＧ−ＣＳＦを筋ジストロフィー治療剤として用いるにあたっての適切な投与方法、回数、投与量を求めて実用に供しうる筋ジストロフィー治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、Ｇ−ＣＳＦが、変性した筋肉に及ぼす効果とメカニズムについて検討した。その結果、ＤＭＤモデルマウスの一種であるｍｄｘマウスでは、生後３−５週齢で筋肉に変性が生じること、この時期に再生筋において特異的にＧ−ＣＳＦ受容体（Ｇ−ＣＳＦＲ）が発現すること、Ｇ−ＣＳＦを投与すると有意に筋の再生が観察されたことなどを見いだした。更に、ヒトのＤＭＤと似た重篤な症状を示すＤＭＤモデルマウスであるｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスにおいて、Ｇ−ＣＳＦを投与することにより、有意な筋の再生が観察されたのみならず、２００日に亘る長期間の致死回避が観察された。本発明はこの知見に基づき完成したものである。【００１０】
すなわち、本発明は以下のものを提供する。
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を有効成分として含有する、骨格筋の変性を伴う疾患の治療剤。
骨格筋の変性を伴う疾患が筋ジストロフィーである、［１］に記載の治療剤。
骨格筋の変性を伴う疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、［２］に記載の治療剤
【発明の効果】
【００１１】
本発明の骨格筋の変性を伴う疾患の治療剤は、特に筋ジストロフィーの治療薬として有効であり、筋ジストロフィーにおける筋線維の崩壊に対して抑制的に働くことが明らかになった。これまで積極的な治療剤のなかった難病の筋ジストロフィーの治療に用いることが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
［図１］
ａ．野生型マウス（ＷＴ）と筋ジストロフィーモデルマウスであるｍｄｘマウス（ｍｄｘ）の外観の比較を示す。ヒトＤＭＤと異なりｍｄｘマウスの体躯に異常は認められない。
ｂ．２−２０週齢のｍｄｘマウスにおける前脛骨（ｔｉｂｉａｌｉｓ  ａｎｔｅｒｉｏｒ：ＴＡ）筋切片をＨ＆Ｅ染色した画像を示す。中心に核のある細胞（再生筋）が４‐５週齢において増加しており、その時期に筋の障害と再生が繰り返し起きていることが観察される。
ｃ．ｍｄｘマウスにおけるＴＡ筋の切片の全筋細胞数を示す。２−４週齢で全細胞数は減少し、その後回復していることが観察される。
ｄ．ｍｄｘマウスにおける全筋細胞に対する中心核筋細胞の割合を示す。
ｅ．ｍｄｘマウスにおけるＴＡ筋切片を、抗Ｇ−ＣＳＦＲ抗体／抗ラミニン−２α抗体／ＤＡＰＩでそれぞれ蛍光染色した画像、およびそれらを合成した画像（ＭＥＲＧＥ）を示す。ＤＡＰＩにより核が染色された細胞（再生筋）において特異的にＧ−ＣＳＦＲが発現していることが観察される。
［図２］
ａ．ｍｄｘマウスへのＧ−ＣＳＦの投与スケジュールを示す。筋の損傷と再生が活発に起きる時期（３週齢〜５週齢）にＧ−ＣＳＦの投与を行う。
ｂ．５週齢におけるｍｄｘマウスのＴＡ筋切片を抗ラミニン−２α抗体で蛍光染色した画像を示す（下は上の拡大画像を示す）。ラミニン−２αは筋線維の基底膜に存在するタンパク質で、抗ラミニン−２α抗体で染色することにより各筋線維の大きさを観察することができる。
ｃ．５週齢におけるｍｄｘマウスのＴＡ筋において中心核を有する筋線維（再生筋線維）の割合を示す（左；Ｃｏｎｔｒｏｌ群、右；Ｇ−ＣＳＦ投与群）。Ｇ−ＣＳＦ投与群において有意に筋の再生が促進された。
ｄ．４週齢におけるＲＮＭｙ２／９Ｄ２、ラミニンおよびＤＡＰＩによる免疫染色を示す（上；Ｃｏｎｔｒｏｌ群、下；Ｇ−ＣＳＦ投与群）。
ｅ．４週齢におけるＴＡ筋中のＲＮＭｙ２／９Ｄ２陽性細胞の割合を再生筋細胞として示す（左；Ｃｏｎｔｒｏｌ群、右；Ｇ−ＣＳＦ投与群）。
ｆ．５週齢におけるｍｄｘマウスのＴＡ筋における筋線維の断面積の分布を示す（左；Ｃｏｎｔｒｏｌ群、右；Ｇ−ＣＳＦ投与群）。Ｇ−ＣＳＦ投与群において小さい筋線維（再生筋線維）の割合が有意に増加していた。
ｇ．５週齢におけるｍｄｘマウスのＴＡ筋における筋周囲径を示す（左；Ｃｏｎｔｒｏｌ群、右；Ｇ−ＣＳＦ投与群）。Ｇ−ＣＳＦ投与群において有意な増加が認められた。
ｈ．５週齢におけるｍｄｘマウスの運動耐久性試験の結果（耐久時間とその個体数の分布）を示す（左；Ｃｏｎｔｒｏｌ群、右；Ｇ−ＣＳＦ投与群）。Ｇ−ＣＳＦ投与群において耐久力の向上が観察された。
ｉ．，ｊ．５週齢におけるｍｄｘマウスの長指伸筋（ｅｘｔｅｎｓｏｒ  ｄｉｇｉｔｏｒｕｍ  ｌｏｎｇｕｓ）におけるｔｅｔａｎｉｃ  ｆｏｒｃｅ（ｉ）およびｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒｃｅ（ｊ）の測定結果を示す（左；Ｃｏｎｔｒｏｌ群、右；Ｇ−ＣＳＦ投与群）。
［図３］
ａ．ｃｓｆ３ｒ＋／−マウス、ｍｄｘマウス、およびｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスの生存曲線を示す。ｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスにおいて、出生直後と生後３〜５週（筋の変性・再生が激しい時期）の二層性に死亡が観察された。
ｂ．，ｃ．出生２日後のｃｓｆ３ｒ＋／−マウス、ｍｄｘマウス、およびｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスの写真（ｂ）ならびに体重（ｃ）を示す。ｍｄｘマウスと比較してｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスは有意に低体重であった。
ｄ．出生２日後のｃｓｆ３ｒ＋／−マウス、ｍｄｘマウス、およびｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスの横隔膜をエバンスブルーで染色した画像を示す。ｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスにおいて横隔膜の壊死、変性が観察された。
ｅ．出生２日後のｃｓｆ３ｒ＋／−マウス、ｍｄｘマウス、およびｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスの横隔膜をヘマトキシリン・エオシン染色（Ｈ＆Ｅ染色）した画像を示す。ｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスにおいて横隔膜の壊死、変性が観察された。
ｆ．ｃｓｆ３ｒ＋／−マウス、ｍｄｘマウス、およびｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスの横隔膜の厚さを示す。
ｇ．ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスおよびｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスの体重曲線を示す。
［図４］
ａ．ｍｄｘマウス、ｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスおよびｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ−／−マウスの出生７日後における外観、ならびにｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスおよびｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ−／−マウスの出生１３日後における外観を示す。
ｂ．２−８週齢のｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスのＴＡ筋のＨ＆Ｅ染色を示す（下段パネルは低倍率、上段パネルは高倍率）。
ｃ．５週齢のｍｄｘマウスとｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスの、ＴＡ筋における中心に核のある筋細胞の数を再生筋細胞数として示す。
ｄ．５週齢のｍｄｘマウスと、ｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスの、ＴＡ筋の周囲径を示す。
ｅ．５週齢のｍｄｘマウスと、ｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスの、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＴＡ筋のｔｅｔａｎｉｃ  ｆｏｒｃｅを示す。
ｆ．５週齢のｍｄｘマウスと、ｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスのｅｘ  ｖｉｖｏ  ＴＡ筋のｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒｃｅを示す。
［図５］
ａ．ｍｄｘマウス（ｍｄｘ）とｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−ｕｔｒｏｐｈｉｎダブルノックアウトマウス（ｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−）の外観を示す。ｍｄｘマウスに比べてｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスでは有意に体躯が小さく、著しい脊椎の湾曲が認められる。
ｂ．３−１２週齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスにおけるＴＡ筋切片をＨ＆Ｅ染色した画像を示す。ｍｄｘマウス（図１ｂ）と比較して、筋の障害と再生がより激しく起きていることが観察される。
ｃ．ｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスのＴＡ筋の切片の全筋細胞数を示す。
ｄ．ｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスのＴＡ筋の中心に核のある細胞の割合を示す。
ｅ．ｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスにおけるＴＡ筋切片を、抗Ｇ−ＣＳＦＲ抗体／抗ラミニン−２α抗体／ＤＡＰＩでそれぞれ蛍光染色した画像、およびそれらを合成した画像（ＭＥＲＧＥ）、さらにそれを拡大した画像を示す。ｍｄｘマウス（図１ｃ）と比較して、再生筋におけるＧ−ＣＳＦＲの発現がより顕著であることが観察される。
［図６］
ａ．ｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスへのＧ−ＣＳＦの投与スケジュールを示す。筋の損傷と再生が活発に起きる時期（３週齢〜５週齢）にＧ−ＣＳＦの投与を行う。
ｂ．ｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスのＴＡ筋切片のＨ＆Ｅ染色を示す（左；Ｃｏｎｔｒｏｌ群、右；Ｇ−ＣＳＦ投与群）。
ｃ．ｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスのＴＡ筋の周囲径を示す（左；Ｃｏｎｔｒｏｌ群、右；Ｇ−ＣＳＦ投与群）。
ｄ．ｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスの体重に占める筋湿重量の割合を示す（ＴＡ；前脛骨筋、Ｇａｓ；腓腹筋、Ｑｕａｄ；大腿四頭筋）（左；Ｃｏｎｔｒｏｌ群、右；Ｇ−ＣＳＦ投与群）。Ｇ−ＣＳＦ投与群において腓腹筋、大腿四頭筋の有意な増加が見られた。
ｅ．ｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスのＴＡ筋における中心核を有する筋細胞の数を再生筋細胞数として示す（左；Ｃｏｎｔｒｏｌ群、右；Ｇ−ＣＳＦ投与群）。
ｆ．ｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスのＴＡ筋中の筋線維の数を示す（左；Ｃｏｎｔｒｏｌ群、右；Ｇ−ＣＳＦ投与群）。
ｇ．ｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスのＴＡ筋における筋線維の断面積の分布を示す（左；Ｃｏｎｔｒｏｌ群、右；Ｇ−ＣＳＦ投与群）。
ｈ．ｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスのｅｘ  ｖｉｖｏ  ＴＡ筋のｔｅｔａｎｉｃ  ｆｏｒｃｅを示す（左；Ｃｏｎｔｒｏｌ群、右；Ｇ−ＣＳＦ投与群）。
ｉ．ｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスのＴＡ筋のｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒｃｅを示す（左；Ｃｏｎｔｒｏｌ群、右；Ｇ−ＣＳＦ投与群）。
ｊ．Ｇ−ＣＳＦを投与したときと、しないときのｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスのＫａｐｌｅｎ−Ｍｅｙｅｒ生存曲線を示す。
ｋ．８週齢での一回換気量を体重で割った値を示す（左；Ｃｏｎｔｒｏｌ群、右；Ｇ−ＣＳＦ投与群）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
骨格筋は、細長い筋線維とその細胞間を埋めて束ねる結合組織からなる。筋線維はそれぞれが１個の細胞で、筋細胞と呼ばれる。筋細胞は多くの核をもっている多核細胞である。筋線維の集まりが筋束を構成し、筋束の集まりが骨格筋を構成する。
【００１４】
本発明において、骨格筋の変性を伴う疾患の治療とは、筋肉の変性を抑制し、再生を促進すること、筋力低下の進行を抑制すること、筋線維の崩壊を抑制すること、再生筋線維の割合を増加すること、筋肉を増大させること、筋肉の運動能力を高めることのいずれかを意味する。
【００１５】
骨格筋の変性を伴う疾患は特に限定されないが、典型的には筋ジストロフィーであり、筋ジストロフィーには、デュシェンヌ（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ）型、ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）型、肢帯型、先天性、遠位型、顔面肩甲上腕型、筋緊張性が含まれる。本願発明の治療剤は特にデュシェンヌ（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ）型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）に有用である。
【００１６】
本発明の骨格筋の変性を伴う疾患の治療剤は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を有効成分とする。
【００１７】
本発明の骨格筋の変性を伴う疾患の治療剤の有効成分であるＧ−ＣＳＦは、どのようなＧ−ＣＳＦでも用いることができるが、好ましくは高度に精製されたＧ−ＣＳＦであり、より具体的には、哺乳動物Ｇ−ＣＳＦ、特にヒトＧ−ＣＳＦと実質的に同じ生物学的活性を有するものである。Ｇ−ＣＳＦの由来は特に限定されず、天然由来のＧ−ＣＳＦ、遺伝子組換え法により得られたＧ−ＣＳＦなどを用いることができるが、好ましくは遺伝子組換え法により得られたＧ−ＣＳＦである。遺伝子組換え法により得られるＧ−ＣＳＦには、天然由来のＧ−ＣＳＦとアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列中の１または複数のアミノ酸を欠失、置換、付加等したもので、天然由来のＧ−ＣＳＦと同様の生物学的活性を有するもの等であってもよい。アミノ酸の欠失、置換、付加などは当業者に公知の方法により行うことが可能である。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ，Ｈ．Ｊ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２，４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）などを用いて、Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸に適宜変異を導入することにより、Ｇ−ＣＳＦと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。一般的に、置換されるアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換されることが好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００；Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，１４３１−１４３３；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａ���ｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
【００１８】
又、Ｇ−ＣＳＦと他のタンパク質との融合タンパク質を用いることも可能である。融合ポリペプチドを作製するには、例えば、Ｇ−ＣＳＦをコードするＤＮＡと他のタンパク質をコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよい。本発明のＧ−ＣＳＦとの融合に付される他のタンパク質としては、特に限定されない。
【００１９】
又、化学修飾したＧ−ＣＳＦを用いることも可能である。化学修飾したＧ−ＣＳＦの例としては、例えば、糖鎖の構造変換・付加・欠失操作を行ったＧ−ＣＳＦや、ポリエチレングリコール・ビタミンＢ１２等、無機あるいは有機化合物等の化合物を結合させたＧ−ＣＳＦなどを挙げることができる。
【００２０】
本発明で用いるＧ−ＣＳＦは、いかなる方法で製造されたものでもよく、例えば、ヒト腫瘍細胞やヒトＧ−ＣＳＦ産生ハイブリドーマの細胞株を培養し、これから種々の方法で抽出し分離精製したＧ−ＣＳＦ、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞、昆虫細胞、などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したＧ−ＣＳＦなどを用いることができる。本発明において用いられるＧ−ＣＳＦは、遺伝子工学的手法により製造されたＧ−ＣＳＦが好ましく、哺乳動物細胞（特にＣＨＯ細胞）を用いて製造されたＧ−ＣＳＦが好ましい（例えば、特公平１−４４２００号公報、特公平２−５３９５号公報、特開昭６２−１２９２９８号公報、特開昭６２−１３２８９９号公報、特開昭６２−２３６４８８号公報、特開昭６４−８５０９８号公報）。
【００２１】
本発明の骨格筋の変性を伴う疾患の治療剤には、その投与方法や剤型に応じて必要により、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を適宜添加することができる。
【００２２】
懸濁剤の例としては、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０，ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等を挙げることができる。
【００２３】
溶液補助剤としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０，ニコチン酸アミド、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができる。
【００２４】
安定化剤としては、デキストラン４０、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム等を挙げることができる。
【００２５】
等張化剤としては例えば、Ｄ−マンニトール、ソルビート等を挙げることができる。
【００２６】
保存剤としては例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を挙げることができる。
【００２７】
吸着防止剤としては例えば、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。
【００２８】
界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレングリセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチエレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等のＨＬＢ６〜１８を有するもの；陰イオン界面活性剤、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数１０〜１８のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンオキシドの平均付加モル数が２〜４でアルキル基の炭素原子数が１０〜１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が８〜１８のアルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数１２〜１８の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。本発明の製剤には、これらの界面活性剤の１種または２種以上を組み合わせて添加することができる。好ましい界面活性剤は、ポリソルベート２０，４０，６０又は８０などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリソルベート２０及び８０が特に好ましい。また、ポロキサマー（プルロニックＦ−６８（登録商標）など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好ましい。
【００２９】
含硫還元剤としては例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。
【００３０】
酸化防止剤としては例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。
【００３１】
さらには、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩；クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩などの通常添加される成分を含んでいてもよい。
【００３２】
本発明の治療剤は、局所投与用注射剤（皮下、皮内、筋肉内など）に適した剤形として投与することが可能である。局所投与が筋肉内投与であることが特に好ましい。
【００３３】
注射剤とする場合には、上記の成分をリン酸緩衝液（好ましくはリン酸一水素ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム系）及び／又はクエン酸緩衝液（好ましくはクエン酸ナトリウムの緩衝液）及び／又は酢酸緩衝液などの溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製する。緩衝液の濃度は一般には１〜５００ｍＭであり、好ましくは５〜１００ｍＭであり、さらに好ましくは１０〜２０ｍＭである。また、注射剤は溶液製剤であっても凍結乾燥製剤であってもよい。
【００３４】
本発明のＧ−ＣＳＦを有効成分とする骨格筋の変性を伴う疾患の治療剤の投与量、投与時期、投与回数は対象の疾患患者の病状を配慮して当業者が適宜決定することができる。
【００３５】
また、本発明の骨格筋の変性を伴う疾患の治療剤は、ヒトに投与する場合、本発明の筋変性抑制効果を得るには、一回の投与で０．１〜５００μｇ／ｋｇ／ｄａｙ投与することが好ましく、１〜５０μｇ／ｋｇ／ｄａｙ投与することがより好ましい。
【００３６】
しかし、本発明はヒトＧ−ＣＳＦの用量によって限定されるものではない。
【００３７】
また、本発明の骨格筋の変性を伴う疾患の治療剤は、他の薬剤と併用してもよい。
【００３８】
以下の実施例に示すように、まず、Ｇ−ＣＳＦがジストロフィン変異を持つＤＭＤモデルマウスでの筋再生と機能回復に明らかに有効であることが示された。また、ジストロフィン変異に加えてＧ−ＣＳＦＲがハプロ不全（片方の遺伝子の発現異常）のマウスの場合には早死傾向があり、これは、Ｇ−ＣＳＦＲのリガンドであるＧ−ＣＳＦがＤＭＤの進行の抑制に極めて重要である、ということを示している。さらに、ジストロフィン／ウトロフィンのダブルノックアウトマウスは、ヒトのＤＭＤと似た重篤な症状を示すもう一つのＤＭＤモデルマウスであって、早死に至るが、Ｇ−ＣＳＦ投与は当該マウスの筋再生、機能回復、生存を劇的に改善した。これらの結果は、ＤＭＤモデルマウスにおいて、Ｇ−ＣＳＦが骨格筋再生と生存に重要な役割を果たしていることを強く示唆すると共に、将来の臨床での使用に道を拓くものである。
【００３９】
これまで筋ジストロフィーには有効な治療手段が存在しなかったが、本願発明は筋ジストロフィーの治療剤として産業上の利用性が期待できる。
【００４０】
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
【実施例】
【００４１】
実施例で用いた実験方法は以下の通りである。
動物【００４２】
ｍｄｘ（Ｃ５７／Ｂ６）マウスおよびウトロフィンヘテロ接合（ｕｔｒｏｐｈｉｎ＋／−）マウスは、武田伸一博士（国立精神・神経センター）から恵与された。ｃｓｆ３ｒ−／−マウスは、Ｄａｎｉｅｌ  Ｃ．Ｌｉｎｋ博士（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）から恵与された（Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｍ．Ｋ．，Ｌｉｕ，Ｆ．，Ｉｗａｓａｋｉ，Ｈ．，Ａｋａｓｈｉ，Ｋ．＆  Ｌｉｎｋ，Ｄ．Ｃ．Ｐｉｖｏｔａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｂｌｏｏｄ  １０２，３５６２−３５６８，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２００３−０２−０５９３（２００３））。全ての実験手法とプロトコルは慶応大学動物のケアと使用委員会で承認され、ＮＩＨの実験動物のケアと使用ガイドラインに従うものである。  ジストロフィンとｃｓｆ３ｒの両方を欠失したノックアウトマウスは以下の交配プログラムで得た：雄ｃｓｆ３ｒノックアウトマウスを雌Ｃ５７／Ｂ６  ｍｄｘマウス（ジストロフィン欠失）と交配して、ｃｓｆ３ｒについてのヘテロ接合体（雌雄）、およびｍｄｘ変異についてのヘテロ接合体（雌）またはｍｄｘ変異についてのヘミ接合体（雄）のいずれかである全てのＦ１世代を得、それらを交配した。  ジストロフィンとウトロフィンの両方を欠失したノックアウトマウスは以下の交配プログラムで得た：雄ウトロフィンヘテロ接合マウスと雌Ｃ５７／Ｂ６ｍｄｘマウスを交配して、ウトロフィンについてのヘテロ接合体（雌雄）、およびｍｄｘ変異についてのヘテロ接合体（雌）またはｍｄｘ変異についてのヘミ接合体（雄）のいずれかであるＦ１世代を得、それらを交配した。（Ｄｅｃｏｎｉｎｃｋ，Ａ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｕｔｒｏｐｈｉｎ−Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｍｉｃｅ  ａｓ  ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｃｅｌｌ  ９０，７１７−７２７，ｄｏｉ：Ｄｏｉ：  １０．１０１６／  ｓ００９２−８６７４（００）８０５３２−２（１９９７））
遺伝子型（Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）【００４３】
ＤＮＡは、Ｅａｓｙ−ＤＮＡＴＭ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用いてマウス尾部から単離した。突然変異ジストロフィン対立遺伝子を決定するためのＰＣＲ分析には、マウスジストロフィンに相補的なフォワード・プライマー
（５′  ＣＡＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＧＣＡＴＡＧＡＴＡＴＴＣＡＧ  ３′）と、野生型対立遺伝子に相補的なリバーズ・プライマー（５′  ＧＴＣＡＣＴＣＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＡＧＣＣＡＴＴＴＡＧ３′）またはマウス突然変異ジストロフィン対立遺伝子に相補的なリバーズ・プライマー
（５′  ＧＴＣＡＣＴＣＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＡＧＣＣＡＴＴＴＡＡ３′）を用いた。どちらのＰＣＲ反応も９５℃、４分；次いで９５℃、１分；５５℃、１分；７２℃、１分の条件で３４サイクル、７２℃１０分の条件下で行った。各反応により２７５ｂｐの産物が得られた。全てのＰＣＲ反応はＧｏＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて行った。ウトロフィンノックアウト状態を決定するためのＰＣＲ分析には、マウスウトロフィンのエクソン７に相補的なフォワード・プライマー
（５‘  ＧＴＧＡＡＧＧＡＴＧＴＣＡＴＧＡＡＡＧ  ３’）と、イントロン７に相補的なリバース・プロモーター（５‘  ＴＧＡＡＧＴＣＣＧＡＡＡＧＡＧＡＴＡＣＣ  ３’）またはＮｅｏノックアウトカセット内に位置するＰＧＫプロモーターに相補的なリバース・プロモーター
（５‘  ＡＣＧＡＧＡＣＴＡＧＴＧＡＧＡＣＧＴＧＣ  ３’）を用いた。ＰＣＲ反応は９４℃、３０秒；５７℃、３０秒；７２℃、２５秒の条件で３５サイクル行った。突然変異ｃｓｆ３ｒ対立遺伝子を決定するためのＰＣＲ分析には、マウスｃｓｆ３ｒに相補的なフォワード・プライマー（５′  ＡＧＴＴＣＡＣＣＡＧＧＣＡＧＧＴＧＡＧＴ  ３′）と、野生型対立遺伝子に相補的なリバーズ・プライマー（５′  ＧＴＡＧＧＣＣＴＡＧＴＴＣＡＴＡＣＣＴＧ  ３′）またはマウス突然変異ｃｓｆ３ｒ対立遺伝子に相補的なリバーズ・プライマー（５′
ＴＣＣＡＧＡＣＴＧＣＣＴＴＧＧＧＡＡＡＡ  ３′）を用いた。どちらのＰＣＲ反応も９５℃、４分；次いで９５℃、３０秒；６０℃、３０秒；７２℃、４５秒の条件で３０サイクル行った。各反応により２７５ｂｐの産物が得られた。全てのＰＣＲ反応はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼキット（ＴａＫａＲａ，Ｊａｐａｎ）を用いて行った。
Ｇ−ＣＳＦ処理【００４４】
Ｇ−ＣＳＦ（ノイトロジンＴＭ，１００μｇ；中外製薬）を生理的食塩水１ｍｌに希釈した。Ｇ−ＣＳＦは５μｇ／日の用量で３週齢雄マウスに２７ゲージの注射針を使って２週間、腹腔内投与した。Ｇ−ＣＳＦ処理マウス群およびコントロール群のマウスは５週齢で屠殺した。
組織学的分析【００４５】
前脛骨（ＴＡ）筋の凍結切片（１０μｍ）をＨ＆Ｅ染色した。Ｈ＆Ｅ染色は、再生筋肉の比率を測定するために切片上で実施した。前脛骨のラミニン−２α免疫蛍光染色切片（７μｍ）からＦｉｂｅｒ  ｃｒｏｓｓ  ａｒｅａ（ＦＳＡ）をソフトウェア（ＢＺ−ＨＩＣ：ＫＥＹＥＮＥ）で測定した。デジタルカメラ（ＢＩＯＲＥＶＯ：ＫＥＹＥＮＣＥ）で各切片から２０倍のデジタル写真を撮った．シグマ社から購入したエバンスブルーをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）に溶解した。１％エバンスブルー０．０５ｍＬを２７ゲージの針を用いて出生後２日目に腹腔内投与した。３時間後にマウスを屠殺した。
免疫蛍光【００４６】
全ての免疫蛍光は７μｍの切片で行った。サンプルをＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と共に５分間室温でインキュベートし、次いで洗浄し、以下の一次抗体と共にインキュベートした：抗Ｇ−ＣＳＦＲ抗体（サンタクルーズバイオテクノロジー社（ｓｃ−９１７３）、１：５０希釈）、抗ラミニン−２α抗体（シグマ社（Ｌ０６６３）、１：１０００希釈）、抗ラミニン抗体（Ｌ９３９３、１：１０００希釈、シグマ）およびＲＮＭｙ２／９Ｄ２（ａｂ４９４５７，１：３０希釈、ａｂｃａｍ）。一晩インキュベートした後、結合した抗体を、Ａｌｅｘａ４８８またはＡｌｅｘａ５４６（モレキュラー・プローブ社、東京港区）で標識した二次抗体で可視化した。４’，６−ジアミジン−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ；インビトロジェン社）で核を染色した。
筋力測定試験【００４７】
５週齢マウスから長指伸筋（ｅｘｔｅｎｓｏｒ  ｄｉｇｉｔｏｒｕｍ  ｌｏｎｇｕｓ、ＥＤＬ筋）を単離、除去した。この筋肉をＰＳＳバッファー（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）を満たしたチャンバーに注意深くのせ、３０℃に維持した。筋肉の一つの腱をチャンバー内のスチールフックに固定し、他方をデュアルモードのサーボモータシステム（電気刺激装置、日本光電）のレバーアームに５−０手術用シルクで結びつけた。ｓｉｎｇｌｅ  ｔｗｉｔｃｈおよびｔｅｔａｎｉｃ  ｆｏｒｃｅが最大を示す長さ（最適長：Ｌｏ）まで筋肉を引っ張った。次に、バッファーを替えるための１２０秒の休みをおいて、対応するｔｅｔａｎｉｃ  ｆｏｒｃｅを１５０Ｈｚ、５秒で２０分間測定した。全ての測定の前に筋肉は最適長（Ｌｏ）に適応した。比較のために、全ての測定は、筋肉量を長さと哺乳類骨格筋密度（１．０５６ｍｇ／ｍｍ３）で割って算出した筋断面積ＣＳＡ当たりで表した。Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒｃｅ（Ｎ／ｃｍ２）は筋密度を１．０５６ｍｇ／ｍｍ３と推定して算出した。
運動耐久性試験【００４８】
マウスにトレッドミル運動負荷試験を受けさせた。マウスを１レーン電動トレッドミル（ＭＫ−６８０Ｓ，ラット・マウス用トレッドミル、Ｍｕｒｏｍａｃｈｉ）のベルトにのせた。試験は、５ｍ／分で５分間勾配なしで行い、次に毎分１ｍ／分でスピードを上げた。試験の終点は、マウスが電気刺激付与エリアに２０秒以上とどまったときとした。
全身プレシスモグラフ【００４９】
動物を自由に動けるチャンバにいれた。チャンバを超微差圧トランデューサ（Ｖａｌｙｄｉｎｅ  ＭＰ４５，Ｖａｌｙｄｉｎｅ，Ｎｏｒｔｈ  Ｒｉｄｇｅ，ＣＡ）に連結した。動物が呼吸すると、圧力の変化を一回換気量（ＴＶ）を表すシグナルに変換し、これを増幅し（ＢＭＡ  ８３０；ＣＷＥ，Ａｒｄｍｏｒｅ，ＰＡ）、記録紙レコーダ（Ｄａｓｈ  １０；Ａｓｔｒｏ−Ｍｅｄ，Ｗｅｓｔ  Ｗａｒｗｉｃｋ，ＲＩ）に記録して、呼吸捕捉ソフトウェアを備えたコンピュータに蓄積して分析に用いた。酸素の消費と二酸化炭素の生成をＢｅｃｋｍａｎ  ＯＭ−１４およびＬＢ−２アナライザを用いて開路法で測定した。パラメータＴＶはリアルタイムで分析し、それぞれ連続の３時間にわたって、平均値を２分毎に５回計算した。体重で割ることによりＴＶを正規化した。
統計的分析【００５０】
データはＳｔａｔＶｉｅｗ  Ｊ−４．５ソフトウェアを用いて分析した。値は平均±ＳＤで表す。群間比較は一元配置分散分析によって行った。ＳｃｈｅｆｆｅのＦ検定を用いて有意水準を求めた。有意と認められる確率水準はＰ＜０．０５とした。
実施例１：ｍｄｘマウスの再生筋細胞中におけるＧ−ＣＳＦ受容体の発現【００５１】
ｍｄｘマウスの体サイズ、筋肉サイズ、体躯の外観はおおむね正常であった（図１ａ）。ＤＭＤ患者では進行性の身体的機能障害を示し、２０〜３０歳までに死に至ることが報告されているが、成熟ｍｄｘマウスでは、身体的機能障害はほとんど観察されず、正常な寿命をもつ（Ｅｖａｎｓ，Ｎ．Ｐ．，Ｍｉｓｙａｋ，Ｓ．Ａ．，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｂａｓｓａｇａｎｙａ−Ｒｉｅｒａ，Ｊ．＆  Ｇｒａｎｇｅ，Ｒ．Ｗ．Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｎｓｅｔ  ｉｎ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓ  Ｍｅｄ  Ｒｅｈａｂｉｌ  ８８，５０２−５２２（２００９））。【００５２】
しかしながら、病理学的分析によると、ｍｄｘマウスでは３週齢と５週齢の間で筋の変性と再生が明らかに起きていた（図１ｂ）。２週齢までは、変性と再生がほとんど起きていなかったが、３週齢では、かなりの変性筋肉と白血球の蓄積が観察された。５週齢では、種々の組成の小環状で比較的大きな再生筋細胞が見られた。８週齢で変性は落ち着いた。ＴＡにおける全筋細胞数は２−４週齢で減少し、その後回復した（図１ｃ）。【００５３】
一般に、健康な筋細胞は周辺に核をもち、中心に核のある筋細胞は再生しているあるいは再生された筋細胞である。ｍｄｘマウスで、中心に核のある筋細胞は４週齢後に観察され、１２週齢まで増加した（図１ｄ）。これらのデータは、まず筋線維が変性を起こし、次いで当該変性をほぼ補填するように再生されることを示している。【００５４】
ｍｄｘマウスの筋肉変性にＧ−ＣＳＦシグナル伝達が関与しているかどうかを調べるために、Ｇ−ＣＳＦ受容体（Ｇ−ＣＳＦＲ）に対する免疫蛍光染色を行った。様々な成長段階でのＴＡ（前脛骨）筋切片を観察すると、中心に核のある細胞（再生筋）に小さな環状にＧ−ＣＳＦＲが高度に発現していることがわかった（図１ｅ）。連続的免疫蛍光染色分析によると、Ｇ−ＣＳＦＲ発現細胞は３週齢から５週齢で最も多く出現し、これはｍｄｘマウスの再生時期と一致する。これらの結果から、Ｇ−ＣＳＦがｍｄｘマウスの筋肉再生に関与することが示唆された。
実施例２：ｍｄｘマウスの骨格筋機能における、骨格筋再生によるＧ−ＣＳＦの及ぼす影響【００５５】
ｍｄｘマウスにおいてＧ−ＣＳＦＲ発現細胞は再生筋細胞中で３週齢から５週齢で最も多く出現することから、Ｇ−ＣＳＦを投与することによりｍｄｘマウスの骨格筋再生と骨格筋機能の改善が得られるかどうかを検証した。ｍｄｘマウスに３週間から５週間の間、Ｇ−ＣＳＦを毎日腹腔内投与して（図２ａ）、全体的外観と機能的差異を試験した。各骨格筋細胞の形態を示すために、筋肉基底膜中の主なアイソフォームであるラミニン２αに対する免疫染色を行った（Ｐａｔｔｏｎ，Ｂ．Ｌ．，Ｍｉｎｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｃｈｉｕ，Ａ．Ｙ．＆  Ｓａｎｅｓ，Ｊ．Ｒ．Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｍｉｎｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ，Ａｄｕｌｔ，ａｎｄ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｍｉｃｅ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３９，１５０７−１５２１，ｄｏｉ：１０．１０８３／ｊｃｂ．１３９．６．１５０７（１９９７））。ラミニン２αは筋線維の基底膜に存在するタンパク質で、ラミニン２αで染色することにより各筋線維の大きさを観察することができる。その結果、コントロール群と比較して、Ｇ−ＣＳＦ投与群は中心核を有する筋線維（再生筋線維）の数が５週齢で有意に増加していた（図２ｂ、ｃ）。【００５６】
ＲＮＭｙ２／９Ｄ２は、骨格筋の発生における胚および新生児の時期、ならびに成体で新しく形成された再生筋細胞に存在するミオシン重鎖（ＭＨＣ）を認識する（Ｂｉｇａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ｍａｔｕｒｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄｕｒａｎｃｅ  ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｉｎ  ｒａｔ．Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ  １６５，１８５−１９２（１９９９））。４週齢でのＲＮＭｙ２／９Ｄ２による免疫染色は、Ｇ−ＣＳＦが再生筋細胞の数を有意に増加させることを示した（図２ｄ，ｅ）。５週齢での筋線維の個々の断面領域には、小さい筋線維（再生筋線維）の割合がかなり増加しており、これは新たに形成された再生骨格筋細胞の有意な増加を意味する（図２ｆ）。これらの結果は、Ｇ−ＣＳＦが再生筋線維の数を増加させることを示唆する。筋肉サイズは筋肉の機能を予測する値であることから、筋周囲径と筋湿潤量を測定した結果、５週齢でのＴＡ筋の周囲径はＧ−ＣＳＦ投与によって有意に増加した（図２ｇ、左：コントロール群、右：Ｇ−ＣＳＦ投与群）。【００５７】
筋肉の弱さは筋ジストロフィーの最も特徴的な症状である（Ｂｕｓｈｂｙ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，ｐａｒｔ  １：ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｓｙｃｈｏｓｏｃｉａｌ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ９，７７−９３，ｄｏｉ：Ｄｏｉ：１０．１０１６／ｓ１４７４−４４２２（０９）７０２７１−６（２０１０））。そこで、ｉｎ  ｖｉｖｏの筋肉機能を評価するために、運動耐久性試験を行った。その結果、Ｇ−ＣＳＦ投与は５週齢での運動耐久性能力を有意に改善することが明らかとなった（図２ｈ、耐久時間とその個体数の分布）（左：コントロール群、右：Ｇ−ＣＳＦ投与群）。【００５８】
また、ｍｄｘマウスの長指伸筋（ｅｘｔｅｎｓｏｒ  ｄｉｇｉｔｏｒｕｍ  ｌｏｎｇｕｓ、ＥＤＬ筋）におけるｔｅｔａｎｉｃ  ｆｏｒｃｅ（図２ｉ）およびｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒｃｅ（図２ｊ）試験から、Ｇ−ＣＳＦ投与は５週齢でのｅｘ  ｖｉｖｏ筋肉特異的機能にも有意の改善を示した（図２ｉ、ｊ）（左：コントロール群、右：Ｇ−ＣＳＦ投与群）。【００５９】
これらのデータは、Ｇ−ＣＳＦがｍｄｘマウスにおける筋肉の機能を、再生によって有意に改善することを示している。
実施例３：筋ジストロフィーモデルマウスの生存における、Ｇ−ＣＳＦシグナル伝達の横隔膜変性を介しての役割【００６０】
筋ジストロフィーにおけるＧ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦＲの役割を明らかにするために、Ｇ−ＣＳＦＲノックアウト（ｃｓｆ３ｒ−／−）マウスを用いた。ｃｓｆ３ｒ−／−マウスは血液学的障害をやや示したが、寿命は正常であった。【００６１】
Ｇ−ＣＳＦＲホモ接合性ノックアウトとｍｄｘ変異を共に持つマウス（ｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ−／−）は深刻な筋肉機能の損傷を受けると推測していたが、驚くべきことに、Ｇ−ＣＳＦヘテロ接合性ｍｄｘ（ｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−）マウスにおいてすら、出生直後と生後３〜５週（筋の変性・再生が激しい時期）の二層性に死亡が観察された（図３ａ）。ｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスに死亡が観察されたとの驚くべき事実は、筋ジストロフィーにおけるＧ−ＣＳＦシグナル伝達の重要性を示すものである。相対的な外観はｍｄｘマウスと比べて、ｃｓｆ３ｒ＋／−もｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスも差がなかった（図３ｂ）。しかし、２日目におけるｃｓｆ３ｒ＋／−マウスとｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスの体重はｍｄｘマウスと比べて有意に減少していた（図３ｃ）。【００６２】
初期の致死の原因を究明するために、横隔膜および病変部位の相対的外観を観察した。出生直後のｃｓｆ３ｒ＋／−マウス、ｍｄｘマウス、およびｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスの横隔膜をエバンスブルーで染色した。ｍｄｘマウスとｃｓｆ３ｒ＋／−マウスではいずれも横隔膜に変性病変はほとんど観察されなかったが、ｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスにおいて横隔膜の壊死、変性が明らかに観察された（図３ｄ、ｅ）。横隔膜の厚さについては、ｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスで横隔膜の厚さが有意に薄かった（図３ｅ、ｆ）。生き残っているマウスの平均体重は、ｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスでは一貫してｃｓｆ３ｒ＋／−マウスよりも体重が減少していた（図３ｇ）。なお、強い表現型をもつｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスは５週齢までに死亡し、比較的健康なｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスが生存していることから、グラフの見掛け上、ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスとｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスとの差は５週齢以降小さくなる。
実施例４：筋ジストロフィーモデルマウスの後期生存における、Ｇ−ＣＳＦの役割【００６３】
ｍｄｘマウスでは約３〜５週で、骨格筋の変性と再生が顕著であった。そこで、ｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウス及びｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ−／−マウスでは筋再生と筋の機能が更に悪化するであろうと考察した。ｍｄｘマウス、ｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスおよびｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ−／−マウスの外観を比較したところ、出生後７日目ではｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスおよびｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ−／−マウスはｍｄｘマウスに比べて体サイズが小さく、また、出生後１３日目ではｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ−／−マウスが明らかに小さかった（図４ａ）。出生直後の致死時期を生き伸びたｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスは約４週で再生筋細胞が減少すると共に変性が著しく進み、８週後においても同様であった（図４ｂ）。ｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスでは、５週で再生筋細胞の数が有意に減少していた（図４ｃ）。また、ｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスでは筋肉のサイズも有意に減少していた（図４ｄ）。ｍｄｘ／ｃｓｆ３ｒ＋／−マウスは、ｅｘ  ｖｉｖｏ筋張力試験でもｔｅｔａｎｉｃ  ｆｏｒｃｅ（図４ｅ）およびｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒｃｅ（図４ｆ）が落ちていた。  これらの結果は、Ｇ−ＣＳＦがｍｄｘマウスの骨格筋再生にとって非常に重要であることを示している。
実施例５：重篤な筋ジストロフィーモデルマウスにおける、再生筋細胞におけるＧ−ＣＳＦＲの発現【００６４】
筋細胞膜にジストロフィンが存在しないことがヒトではＤｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の発症につながり、重篤な筋力低下、筋萎縮をもたらし、若年での致死に至る。しかし、ジストロフィン欠失ｍｄｘマウスは、潜在的な筋肉の変性と再生にも関わらす、身体的には正常に見える。ウトロフィンはジストロフィン関連蛋白質で、ジストロフィンと機能的モチーフを共有している。ジストロフィンもそのホモログであるウトロフィンも発現しないｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスではヒトＤＭＤ患者と似た重篤なジストロフィーを示し、ＤＭＤの動物モデルとなりうる（Ｇｒａｄｙ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  Ｌａｃｋｉｎｇ  Ｕｔｒｏｐｈｉｎ  ａｎｄ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ：Ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｃｅｌｌ  ９０，７２９−７３８，ｄｏｉ：Ｄｏｉ：１０．１０１６／ｓ００９２−８６７４（００）８０５３３−４（１９９７）；      Ｄｅｃｏｎｉｎｃｋ，Ａ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｕｔｒｏｐｈｉｎ−Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｍｉｃｅ  ａｓ  ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｃｅｌｌ  ９０，７１７−７２７，ｄｏｉ：Ｄｏｉ：１０．１０１６／ｓ００９２−８６７４（００）８０５３２−２（１９９７））。ｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスは有意に体躯が小さく、ｍｄｘマウスと比べて著しい脊椎の湾曲が認められる（図５ａ）。【００６５】
２−１２週齢でＴＡ筋切片をＨ＆Ｅ染色したところ、３週齢／４週齢／５週齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスではｍｄｘマウス（図１ｂ）と比較して、筋の障害がより激しく起きていることが観察され、またこの障害はそれ以後も続いた（図５ｂ）。【００６６】
２−５週でＴＡ筋の全筋細胞数は減少し、その後回復した（図５ｃ）。ｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスでは、３週より後に中心に核のある筋細胞が観察された（図５ｄ）。【００６７】
また、ｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスにおけるＴＡ切片を、抗Ｇ−ＣＳＦＲ抗体／抗ラミニン−２α抗体／ＤＡＰＩでそれぞれ蛍光染色した画像、およびそれらを合成した画像（ＭＥＲＧＥ）、さらにそれを拡大した画像を示す（図５ｅ）。ｍｄｘマウス（図１ｅ）と比較して、再生筋におけるＧ−ＣＳＦＲの発現がより顕著であることが観察される。
実施例６：重篤な筋ジストロフィーモデルマウスにおける、骨格筋の再生と機能におけるＧ−ＣＳＦの改善効果【００６８】
ｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスにＧ−ＣＳＦを図６ａに記載の投与スケジュールで投与した。すなわち、筋の損傷と再生が活発に起きる時期（３週齢〜５週齢）に１日１回Ｇ−ＣＳＦの腹腔内投与を行った。【００６９】
ＴＡ筋の切片をＨ＆Ｅ染色した写真（図６ｂ）、およびＴＡ筋の周囲径（図６ｃ）を示す（左；コントロール群、右；Ｇ−ＣＳＦ投与群）。Ｇ−ＣＳＦ投与により筋肉サイズが増加したことを示している。また、体重に対する筋湿潤量の割合は、Ｇ−ＣＳＦ投与によって、前脛骨筋で増加する傾向にあり、腓腹筋（Ｇａｓｔｒｏｎｅｍｉｕｓ）と大腿四頭筋（Ｑｕａｄｒｉｃｅｐｓ）で有意に増加した（図６ｄ）（ＴＡ；前脛骨筋、Ｇａｓ；腓腹筋、Ｑｕａｄ；大腿四頭筋）（左；コントロール群、右；Ｇ−ＣＳＦ投与群）。【００７０】
３〜５週齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスの前脛骨筋において中心核を有する筋線維（再生筋線維）の割合（図６ｅ）および筋線維数（図６ｆ）を示す（左；コントロール群、右；Ｇ−ＣＳＦ投与群）。Ｇ−ＣＳＦ投与は、再生筋線維の割合と筋線維数を増加した。ＴＡ筋における筋線維の断面積の分布を示す（図６ｇ）（左；コントロール群、右；Ｇ−ＣＳＦ投与群）。Ｇ−ＣＳＦ投与群において筋細胞の全てのサイズが有意に増加していた。ｅｘ  ｖｉｖｏ筋張力試験でも、Ｇ−ＣＳＦ投与はｔｅｔａｎｉｃ  ｆｏｒｃｅ（図６ｈ）およびｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒｃｅ（図６ｉ）を有意に改善した。これらの結果は、Ｇ−ＣＳＦがｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスにおいて、骨格筋の再生と筋肉機能を改善することを示している。【００７１】
次に、Ｇ−ＣＳＦの長期投与がｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスの生存に寄与し得るかどうかを試験した。ｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスは３週齢から死亡し始め、１８０日までに全てが死に至った（図６ｊ）。Ｇ−ＣＳＦ投与群には、Ｇ−ＣＳＦを３−５日の間は毎日投与し、その後は１週間に２回投与した。驚くべきことに、Ｇ−ＣＳＦ投与により、全てのｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスの生存が２００日まで確認できた（図６ｊ）。全身プレシスモグラフ試験の結果、Ｇ−ＣＳＦ投与が８週におけるｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスの呼吸機能、一回換気量を有意に増加することを示した（図６ｋ）。さらに、Ｇ−ＣＳＦを投与したｍｄｘ／ｕｔｒｎ−／−マウスは１５０日の時点で身体活動が改善されていた。心筋症はＤＭＤの致死性表現型の１つであるが、Ｇ−ＣＳＦ投与によって、心臓の形態は影響を受けなかった（データ示さず）。これらのデータは、Ｇ−ＣＳＦが骨格筋再生を改善し、マウスにおけるＤＭＤモデルの命を救うことを強く示唆するものである。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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