(57)【要約】  本発明により、水溶性薬剤の内包率が向上した単胞リポソームおよびその製造方法が提供される。本発明に係る単胞リポソームの製造方法は、ＣｌｏｇＰの値が１１より小さい脂質からなる水溶性脂質成分（Ｆｗ）が溶解した水性溶媒（Ｗ１）を内水相とすることを特徴とする単胞リポソーム、ならびに、（１）水性溶媒（Ｗ１）に水溶性脂質成分（Ｆｗ）を溶解し、有機溶媒（Ｏ）に当該水溶性脂質（Ｆｗ）以外の混合脂質成分（Ｆ１）を溶解し、これらを混合乳化することによりＷ１／Ｏエマルションを調製する一次乳化工程；（２）上記工程（１）を経て得られたＷ１／Ｏエマルションと水性溶媒（Ｗ２）とを混合乳化することによりＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する二次乳化工程；および（３）上記工程（２）を経て得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションに含まれる有機溶媒を除去することによりリポソームの水性懸濁液を調製する溶媒除去工程を含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣｌｏｇＰの値が１１より小さい脂質からなる水溶性脂質成分（Ｆｗ）が溶解した水性溶媒（Ｗ１）を内水相とすることを特徴とする単胞リポソーム。
【請求項２】
前記水溶性脂質成分（Ｆｗ）が、リゾ脂質、短鎖リン脂質、ＰＥＧ脂質および親水性基を有する化学合成脂質からなる群より選ばれる少なくとも１種を含有するものである、請求項１に記載の単胞リポソーム。
【請求項３】
前記水性溶媒（Ｗ１）にさらに水溶性薬剤が溶解している、請求項１または２に記載の単胞リポソーム。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の単胞リポソームの乾燥粉末。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の単胞リポソームを含有する、または請求項４に記載の乾燥粉末を水性溶媒に添加して得られる、水性懸濁液。
【請求項６】
下記工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする、単胞リポソームの製造方法：
（１）水性溶媒（Ｗ１）に水溶性脂質成分（Ｆｗ）を溶解し、有機溶媒（Ｏ）に当該水溶性脂質（Ｆｗ）以外の混合脂質成分（Ｆ１）を溶解し、これらを混合乳化することによりＷ１／Ｏエマルションを調製する一次乳化工程；
（２）上記工程（１）を経て得られたＷ１／Ｏエマルションと水性溶媒（Ｗ２）とを混合乳化することによりＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する二次乳化工程；
（３）上記工程（２）を経て得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションに含まれる有機溶媒を除去することによりリポソームの水性懸濁液を調製する溶媒除去工程。
【請求項７】
前記水溶性脂質成分（Ｆｗ）が、リゾ脂質、短鎖リン脂質、ＰＥＧ脂質および親水性基を有する化学合成脂質からなる群より選ばれる少なくとも１種を含有するものである、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記一次乳化工程（１）がさらに水溶性薬剤を添加して行われるものである、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記溶媒除去工程（３）がＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの撹拌下に行われるものである、請求項７または８に記載の製造方法。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれかに記載の製造方法により製造された単胞リポソームあるいはその水性懸濁液またはその乾燥粉末。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬、食品、化粧品のドラッグキャリアとして利用可能な単胞リポソームの二段階乳化法を用いた製造方法、およびその製造方法により得られる単胞リポソームに関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、リン脂質を主成分とする脂質二重膜からなる閉鎖小胞体である。細胞膜と類似の構造および機能を有するため免疫系を刺激しにくく、素材としての安全性が高い。また、水溶性の薬剤を脂質二重膜で囲まれる内部の水相に、脂溶性の薬剤を二重膜の中に保持することができ、本来不安定で失活しやすい薬効成分を安定的に内包させることが可能である。【０００３】
このような、医薬品や化粧品などの分野に利用可能なリポソームおよびその製造方法について、特にリポソームに内包させる水溶性の物質（薬剤）の内包率を向上させる手段に関して、たとえば、次のような文献が公開されている。【０００４】
非特許文献１には、Ｗ／Ｏエマルションを分散相、トリス塩酸緩衝液を外水相としてマイクロチャネル乳化法によりＷ／Ｏ／Ｗエマルションを作製する際に、その外水相にカゼインナトリウムを乳化剤として配合すること、これによりリポソーム（脂質カプセル）へのカルセインの内包率を８０％程度に高めることができたことが記載されている。しかしながら、この非特許文献１では、内水相への添加剤については何ら注目されていない。また、内包物質としてはカルセインが例示されているのみで、薬剤についての汎用性は示されておらず、製造スケールを考慮した実用的な検証がなされていない。【０００５】
また、特許文献１には、「１種または２種以上の機能性脂質を含む脂質で構成されている内膜と、１種または２種以上の機能性脂質を含むまたは含まない脂質で構成されている外膜とからなる脂質二重膜層を有し、少なくとも、当該内膜に含まれるいずれか１つの種類の機能性脂質については、その内膜における量が、その外膜における量を上回るとの条件を満たすことを特徴とする、リポソーム」が開示されている。また、上記機能性脂質の一つとして、「たとえば、コレステロールにポリオキシアルキレン基（−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)nＨ）を導入した化合物」のような「水溶性脂質」が挙げられており、「膜構成脂質にポリオキシアルキレン基を導入することにより、リポソームの表面が親水性になり、リポソームの安定性が向上（崩壊性・凝集性などが改善）し、また、体内で異物として認識されなくなる」といった効果が得られると記載されている。さらに、当該発明のリポソームの製造方法としては、マイクロカプセル化法、膜乳化法、超臨界二酸化炭素法などが適用できることが記載されている。【０００６】
しかしながら、上記特許文献１に係る発明における「水溶性脂質」として具体的に挙げられているものは、ポリオキシアルキレン基を導入したコレステロールのような、内膜に入り込んでそれを構成する一部となる化合物である。また、当該発明については、「薬剤などの化合物と化学的に相互作用する機能性脂質を外膜よりも内膜に多く含むなど、内外膜の構成成分（機能性脂質の量）が相違するリポソームは、そのような機能性脂質を内外膜に同量含むリポソームよりも、薬剤の内包率や分散安定性、コントロールリリースに優れる」という作用効果に基づくものであることが説明されているが、そのような発明のより具体的な態様としては、「薬剤の保持に寄与する荷電脂質を内膜だけに含有させ、一方でリポソームの安定性や体内動向に関与する水溶性脂質を外膜だけに含有させ、当該荷電脂質の量が当該水溶性脂質の量を上回るもの」が挙げられているのみである。つまり、必ずしも内膜に一部をなさない水溶性脂質を内水相に添加する製造方法や、それにより得られるリポソームは、上記特許文献１によっては何ら具体的に開示されていない。【０００７】
なお、体内に投与されたリポソームを免疫系に認識されにくくし（ステルス化）特定の臓器に集めやすくしたり、親水性を高め血中安定性を向上させたりする目的で、リポソームの外表面にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を導入する手法も知られている（たとえば非特許文献２）。しかしならが、そのような手法のためには、たとえばＰＥＧ化したコレステロールのような化合物がリポソームの外膜の構成脂質成分として用いられるが、リポソームの内水相ないし内膜の構成脂質成分にそのような化合物を添加することは、そのような手法によって記載ないし示唆されるものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００８／１４００８１号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】黒岩崇，中嶋光敏，市川創作「多相エマルションを基材とした脂質カプセル作製における水相組成の影響」化学工学会  第７４回年会（２００９年３月）要旨集
【非特許文献２】Biochim. Biophys. Acta., 1066, 29-36(1991)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、水溶性薬剤のリポソームへの高内包率を実現させることができるとともに、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションの経時安定性を向上させ、そのプロセスにおいて内包率を維持させることができる単胞リポソームの製造方法、ならびにそのような製造方法により得られる、水溶性薬剤の高内包率の実現した単胞リポソームを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、二段階乳化法によりリポソームを製造する際に内水相に「水溶性脂質」を添加することにより、上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１２】
すなわち、本発明は、ＣｌｏｇＰの値が１１より小さい脂質からなる水溶性脂質成分（Ｆｗ）が溶解した水性溶媒（Ｗ１）を内水相とすることを特徴とする単胞リポソームを提供する。【００１３】
前記水溶性脂質成分（Ｆｗ）は、リゾ脂質、短鎖リン脂質、ＰＥＧ脂質および親水性基を有する化学合成脂質からなる群より選ばれる少なくとも１種を含有するものであることが好ましい。【００１４】
前記水性溶媒（Ｗ１）にはさらに水溶性薬剤が溶解していることが好ましい。【００１５】
また、本発明は、上記の単胞リポソームの乾燥粉末や、上記の単胞リポソームを含有する、または上記の乾燥粉末を水性溶媒に添加して得られる、水性懸濁液を提供する。【００１６】
あわせて、本発明は、下記工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする、単胞リポソームの製造方法を提供する：
（１）水性溶媒（Ｗ１）に水溶性脂質成分（Ｆｗ）を溶解し、有機溶媒（Ｏ）に当該水溶性脂質（Ｆｗ）以外の混合脂質成分（Ｆ１）を溶解し、これらを混合乳化することによりＷ１／Ｏエマルションを調製する一次乳化工程；
（２）上記工程（１）を経て得られたＷ１／Ｏエマルションと水性溶媒（Ｗ２）とを混合乳化することによりＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する二次乳化工程；
（３）上記工程（２）を経て得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションに含まれる有機溶媒を除去することによりリポソームの水性懸濁液を調製する溶媒除去工程。【００１７】
前記水溶性脂質成分（Ｆｗ）は、リゾ脂質、短鎖リン脂質、ＰＥＧ脂質および親水性基を有する化学合成脂質からなる群より選ばれる少なくとも１種を含有するものであることが好ましい。【００１８】
前記一次乳化工程（１）は、さらに水溶性薬剤を添加して行われることが好ましい。【００１９】
前記溶媒除去工程（３）は、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの撹拌下に行われることが好ましい。【００２０】
本発明は、上記いずれかの製造方法により製造された単胞リポソームあるいはその水性懸濁液またはその乾燥粉末も提供する。【００２１】
なお、本発明において、「単胞リポソーム」（ULV、単核リポソームと同義である）は、単一の内水相を有するリポソーム構造物を指し、通常は体積平均粒径の範囲が約２０〜５００ｎｍである。これに対して、「多胞リポソーム」（MVL: multivesicular liposomes）は、複数の非同心円状の内水相を包囲する脂質膜を含んでなるリポソーム構造物を指し、また「多重膜リポソーム」（MLV）は、複数の「タマネギの皮」のような同心円状の膜を有し、その間に殻様の同心円状の水系コンパートメントがあるリポソーム構造物を指す。多胞リポソームおよび多重膜リポソームの特徴は、体積平均粒径がマイクロメーターの範囲であり、通常は０．５〜２５μｍである。
【発明の効果】
【００２２】
所定の水溶性脂質を内水相に添加することによりリポソームの内膜側の安定性が改善され、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションを撹拌または放置してＯ相（油相）を除去する工程を含むような方法でリポソームを製造する場合であっても、水溶性の薬剤の内包率の低下を抑制することができる。従来、このようなリポソームの製造方法においてＷ／Ｏ／Ｗエマルションの作製が容易に進行するのは、Ｏ相がオリーブ油やデカン、ヘキサデカンといった沸点の高い油の場合であることが知られており、一方で、水より沸点の低い有機溶媒をＯ相に用いる場合はＷ／Ｏ／Ｗエマルションの作製は容易ではなく、これは有機溶媒の表面張力が低いために粒子の球形を維持する力が足りないため、と解釈されていた。本発明により、水より沸点の低い有機溶媒をＯ相に用いる場合もＷ／Ｏ／Ｗエマルションの作製が容易になり、水溶性薬剤の内包率が比較的高いリポソームが得られやすくなる。【００２３】
なお、上記の効果が生み出される原理は必ずしも明確にはなっていないが、たとえば、水溶性脂質がリポソーム膜の内壁近傍に集積することにより当該膜が強化されていること、あるいは、薬剤の種類によっては一部がリポソーム膜中に混入して膜を乱し、それにより膜の強度が低下する場合があったところ、そのような混入を防止できていることなどが考えられる。また、水溶性脂質が乳化剤のような機能を有し、乳化挙動をよくしているあるいは水溶性脂質が逆ミセルを形成して薬剤に作用し、その溶解度をコントロールしているということも考えられる。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
− 製造原料 −
・水溶性脂質成分（Ｆｗ）
本発明において、「水溶性脂質成分」とは、ＣｌｏｇＰの値が１１より小さい脂質からなる成分をさす。「ＣｌｏｇＰ」は、有機化合物の水と１−オクタノールに対する親和性を示す係数であり、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｏｆｔ社の分子構造解析、物性計算ツールであるＣｈｅｍＢｉｏＤｒａｗ Ｕｌｔｒａ等により計算することができる。これは、実験によって水と１−オクタノールに対する溶解量を測定し、その比で表わされる「分配係数」を計算によって算出した値である。ＣｌｏｇＰが大きければ相対的に１−オクタノールに溶けやすいことを表し、ＣｌｏｇＰが小さければ相対的に水に溶けやすいことを表している。
【００２５】
本発明に用いることのできる水溶性脂質としては、この「ＣｌｏｇＰ」が１１より小さい値を示すものであればよく、その中でもリゾ脂質、短鎖リン脂質、ＰＥＧ脂質および親水性基を有する化学合成脂質が好ましい。これらの水溶性脂質は、いずれか１種を単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。水溶性脂質成分（Ｆｗ）の水性溶媒（Ｗ１）への添加量は、発明の作用効果および用いる水溶性脂質成分（Ｆｗ）の水への溶解量を考慮しながら適切な範囲で調整することができる。
【００２６】
リゾ脂質は、グリセロリン脂質の一種で、グリセロールの１位または２位に結合した脂肪酸のいずれか一方が除かれたモノアシルグリセロリン脂質であり、たとえば、リゾレシチン（リゾホスファチジルコリン）、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルグリセロールが挙げられる。
【００２７】
短鎖リン脂質は、グリセロリン脂質またはスフィンゴリン脂質のうち、結合した脂肪酸の炭素数が少ない（たとえば２〜１０の）ものであり、たとえば、ジデカノイルホスファチジルコリンが挙げられる。
【００２８】
ＰＥＧ脂質は、脂質にＰＥＧ（ポリエチレングリコール）鎖を導入した誘導体であり、一方、親水性基を有する化学合成脂質は、脂質にＰＥＧ鎖以外の親水性基を導入した誘導体である。上記脂質としてはリン脂質やコレステロールなどが挙げられる。また、ＰＥＧ鎖以外の親水性基としては、糖鎖、アルコール基、アミノ基、チオール基およびカルボン酸基、ならびにこれらを組み合わせたアミノ酸の鎖が挙げられる。特に親水性基として糖鎖を有する化学合成脂質（合成ステロール）の詳細は、たとえば国際公開ＷＯ２００８／０８１６８６に開示されている。
【００２９】
・混合脂質成分（Ｆ１）・（Ｆ２）
一次乳化工程で有機溶媒（Ｏ）に溶解する混合脂質成分（Ｆ１）は主としてリポソームの脂質二重膜の内膜を構成し、場合によっては外膜の構成にも寄与する。一方、必要に応じて二次乳化工程で添加する混合脂質成分（Ｆ２）は主としてリポソームの外膜を構成する。混合脂質成分（Ｆ１）および（Ｆ２）は、同一の組成であっても、異なる組成であってもよい。
【００３０】
これらの混合脂質成分の配合組成は特に限定されるものではなく、公知のリポソームの配合組成に準じたものとすることができる。一般的には、リン脂質（動植物由来のレシチン；ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸またはそれらの脂肪酸エステルであるグリセロリン脂質；スフィンゴリン脂質；これらの誘導体等）と、脂質膜の安定化に寄与するステロール類（コレステロール、フィトステロール、エルゴステロール、これらの誘導体等）とを中心に構成され、さらに糖脂質、グリコール、脂肪族アミン、長鎖脂肪酸（オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸等）、その他各種の機能性を賦与する化合物が配合されていてもよい。また、Ｆ２には、たとえばＰＥＧ化リン脂質のような、リポソーム表面を修飾して各種の機能性を賦与するための脂質を配合することも可能である。これらの化合物の混合脂質成分中の配合比も、脂質膜の安定性やリポソームの生体内での挙動などの性状を考慮しながら、用途に応じて適切に調整すればよい。
【００３１】
・水性溶媒（Ｗ１）・（Ｗ２）、有機溶媒（Ｏ）
水性溶媒（Ｗ１）および（Ｗ２）ならびに有機溶媒（Ｏ）は、公知のリポソームの製造方法でも用いられているような、一般的なものを用いることができる。一次乳化工程で用いられる水性溶媒（Ｗ１）および有機溶媒（Ｏ）は、それぞれＷ１／Ｏエマルションの水相および油相をなし、二次乳化工程で用いられる水性溶媒（Ｗ２）は、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの外水相をなす。水性溶媒としては、たとえば純水に必要に応じて水と混合する他の溶媒、浸透圧調整のための塩類・糖類、ｐＨ調整のための緩衝液などを配合したものが挙げられる。有機溶媒としては、たとえばヘキサン（ｎ−ヘキサン）やクロロホルム、シクロヘキサン、１，２‐ジクロロエテン、ジクロロメタン、１，２‐ジメトキシエタン、１，１，２‐トリクロロエテン、t‐ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ギ酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、メチルエチルケトン、ペンタンなどの非水溶性有機溶媒が挙げられる。また、アセトニトリル、メタノール、アセトン、エタノール、２‐プロパノールなどの水溶性有機溶媒や、上記以外のエーテル、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、ハロゲン化エーテル、エステル類が挙げられる。なかでもクロロホルム、シクロヘキサン、ジクロロメタン、ヘキサン、t‐ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ギ酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、メチルエチルケトン、ペンタン、アセトニトリル、メタノール、アセトン、エタノール、２‐プロパノールなどが好ましい。溶媒除去工程を考慮すると有機溶媒は揮発性の化合物が好ましく、水よりも沸点の低い化合物が好ましい。これらの化合物は、いずれか１種単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。たとえば、得られるナノサイズのＷ１／Ｏエマルションの単分散性が良好なものとなることから、ヘキサンを主成分（５０体積％以上）とする有機溶媒、好ましくはヘキサンが６０体積％以上である有機溶媒を有機溶媒（Ｏ）とすることも好ましい。
【００３２】
・水溶性薬剤（リポソームに内包させる水溶性物質）
本発明における、リポソームに内包させる水溶性の物質（「水溶性薬剤」と称する。）は特に限定されるものではなく、リポソームの用途に応じて医薬品、化粧品、食品などの分野で知られている各種の物質を用いることができる。ただし、そのような水溶性薬剤には、前述した水溶性脂質成分は包含されない。
【００３３】
水溶性薬剤のうち、医療用のリポソームなどに用いられるものとしては、たとえば、造影剤（Ｘ線造影用の非イオン性ヨード化合物、ＭＲＩ造影用のガドリニウムとキレート化剤とからなる錯体等）、抗がん剤（アドリアマイシン、ビラルビシン、ビンクリスチン、タキソール、シスプラチン、マイトマイシン、５−フルオロウラシル、イリノテカン、エストラサイト、エピルビシン、カルボプラチン、イントロン、ジェムザール、メソトレキセート、シタラビンアイソボリン、テガフール、シスプラチン、エトポシド、トポテシン、ビラルビシン、ネダプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、イホスファミド、テスパミン、ニムスチン、ラニムスチン、ダカルバチン、エノシタビン、フルダラビン、ペントスタチン、クラドリビン、ダウノマイシン、アクラルビシン、イビルビシン、アムルビシン、アクチノマイシン、タキソテール、トラスツブマブ、リツキシマブ、ゲムツズマブ、レンチナン、シゾフィラン、インターフェロン、インターロイキン、アスパラギナーゼ、ホスフェストロール、ブスルファン、ボルテゾミブ、アリムタ、ベバシズマブ、ネララビン、セツキシマブ等）、抗菌剤（マクロライド系抗生物質、ケトライド系抗生物質、セファロスポリン系抗生物質、オキサセフェム系抗生物質、ペニシリン系抗生物質、ベータラクタマーゼ配合剤、アミノグリコシド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、ホスホマイシン系抗生物質、カルバペネム系抗生物質、ペネム系抗生物質）、MRSA・VRE・PRSP感染症治療剤、ポリエン系抗真菌剤、ピリミジン系抗真菌剤、アゾール系抗真菌剤、キャンディン系抗真菌剤、ニューキノロン系合成抗菌剤、抗酸化性剤、抗炎症剤、血行促進剤、美白剤、肌荒れ防止剤、老化防止剤、発毛促進性剤、保湿剤、ホルモン剤、ビタミン類、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡのセンス鎖もしくはアンチセンス鎖、プラスミド、ベクター、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等）、タンパク質（酵素、抗体、ペプチド等）、ワクチン製剤（破傷風などのトキソイドを抗原とするもの；ジフテリア、日本脳炎、ポリオ、風疹、おたふくかぜ、肝炎などのウイルスを抗原とするもの；DNAまたはRNAワクチン等）などの薬理的作用を有する物質や、色素・蛍光色素、キレート化剤、安定化剤、保存剤などの製薬助剤が挙げられる。
【００３４】
水溶性薬剤を内包させる目的は、水溶性薬剤を内水相(W1)に溶解することによって達成される。したがって水溶性の高い薬剤は、内水相(W1)に高濃度で溶解すれば、内包される絶対量は増やすことができる。一方、内水相(W1)の量は適宜変えることができ、所定の粒径の粒子(W1/O)を作成しようとすれば、それに必要な脂質の量(個数)は計算できる。たとえば、100 nm のW1/Oエマルション(粒子体積0.0005 μm3)を形成する場合、W1相(内水相) 1.0 mLで製造すれば2.0 x1015個のW1/O粒子が生成する計算である。一方、100 nm のW1/Oナノエマルション(粒子表面積2500 nm2)はリン脂質分子(レシチン表面積0.7 nm2) 0.4 x105個で構成されている、と計算される。したがって、薬液 1.0 mL の1次乳化に必要な脂質量は、2.0 x1015個ｘ0.4 x105個＝0.8 x1020個、すなわち0.132 mmolである。レシチン以外の脂質分子も、その表面積はおおよそ0.7 nm2として差し支えないため、脂質の総量として0.132 mmolが100 nm のW1/Oナノエマルションを作成するのに必要最少量と考えられる。リポソームを作成するには、その倍の0.264 mmolが必要であり、代表的なリン脂質のDPPCで分子量換算すると193 mgが必要である。
【００３５】
そこで、薬剤を1.0 mLに溶解し、100 nmのリポソームを作成する場合を考えると、薬局法記載の通りシタラビンは0.1〜1.0 g溶解するので、薬剤重量比0.1 g/0.193 g〜1.0 g/0.193 g、イオヘキソール(造影剤)は1.0 g以上溶解するので、薬剤重量比1.0 g/0.193 g以上である。これは、脂質量を低減して効率的に薬剤を内包できることを意味し、脂質の投与量を減らすことができる点、臨床上有意義であり、本手法により薬剤重量比0.5〜5が達成できる。さらに、より多くの薬剤を溶解すると、一般的に飽和状態に近づき粘度が上昇する。本手法により、内水相の粘度として１０mPa・sまで内包可能である。
【００３６】
また、100 nmより大きい粒子を製造する場合には、脂質の必要量はそれより少なくて済むので、より効率的ということになる。
【００３７】
・リポソームおよびその水性懸濁液
本発明のリポソーム、典型的には以下に説明するような本発明の製造方法により得られるリポソームは、水溶性脂質成分（Ｆｗ）が溶解した水性溶媒（Ｗ１）を内水相とするものであり、水溶性脂質成分が溶解していない水性溶媒を内水相とするものに比べて高い薬剤の内包率を達成することができる。
【００３８】
本発明のリポソームは、典型的には以下に説明するような本発明の製造方法により、水性溶媒（Ｗ２：外水相）に懸濁した状態で得られる。このようなリポソームの水性懸濁液が各種の用途に供されるが、使用されるまでの間、たとえば凍結乾燥法などにより粉末状態のリポソームとして保存することもできる。使用の際には、粉末状態のリポソームを水性溶媒に添加し、再度懸濁させればよい。
【００３９】
本発明のリポソームのサイズは特に限定されるものではないが、たとえば、体積平均粒子径が５０〜１，０００ｎｍとなるよう調整することができる。特に体積平均粒子径が５０〜２００ｎｍのリポソームは、毛細血管を閉塞するおそれがほとんどなく、またがん組織近辺の血管にできる間隙を通過することもできるため、医薬品等として人体に投与して使用する上で好都合である。
【００４０】
なお、本発明における、リポソームおよびエマルションの体積平均粒子径は、動的光散乱法により測定されるものであり、たとえば、動的光散乱式ナノトラック粒度分析計（ＵＰＡ−ＥＸ１５０、日機装株式会社）を用いて算出することができる。リポソームの場合には、リポソームの水性懸濁液をたとえば等張ＰＢＳ溶液で１０倍に希釈し、動的光散乱式ナノトラック粒度分析計を用いて粒度分布や体積平均粒子径を算出することができ、エマルションの場合には、エマルション（たとえば、Ｗ１／Ｏエマルション）をたとえばクロロホルム／ヘキサン混合溶媒で１０倍に希釈し、動的光散乱式ナノトラック粒度分析計を用いて粒度分布や体積平均粒子径を算出することができる。
【００４１】
− リポソームの製造方法 −
本発明のリポソームの製造方法は、少なくとも下記工程（１）〜（３）を含み、必要に応じてその他の工程をさらに含むことができるものである。
【００４２】
（１）一次乳化工程
一次乳化工程は、水性溶媒（Ｗ１）に水溶性脂質成分（Ｆｗ）を溶解し、有機溶媒（Ｏ）に当該水溶性脂質（Ｆｗ）以外の混合脂質成分（Ｆ１）を溶解し、これらを混合乳化することにより、Ｗ１／Ｏエマルションを調製する工程である。
【００４３】
Ｗ１／Ｏエマルションを調製するための方法は特に限定されるものではなく、従来のリポソームの製造方法でも用いられているような方法を採用することができる。たとえば、超音波乳化機、撹拌乳化機、膜乳化機、高圧ホモジナイザーなどの装置を用いた乳化方法が挙げられるが、平均粒径を広い範囲で制御でき、かつ得られるＷ１／Ｏエマルションが単分散性となるような方法が好ましい。
【００４４】
水性溶媒（Ｗ１）のｐＨは、通常３〜１０の範囲で調節され、たとえば、混合脂質成分にオレイン酸を用いる場合、ｐＨは６〜８．５とすることが好ましい。ｐＨを調整するためには適切な緩衝液を用いればよい。
【００４５】
一次乳化工程におけるその他の条件、たとえば、混合脂質成分（Ｆ１）の量（有機溶媒（Ｏ）に対する割合）、有機溶媒（Ｏ）と水性溶媒（Ｗ１）の体積比、Ｗ１／Ｏエマルションの平均粒径などは、公知のリポソームの製造方法（一次乳化工程）に準じて、続く二次乳化工程の条件や最終的に調製するリポソームの態様などを考慮しながら、適宜調節することができる。通常、混合脂質成分（Ｆ１）の量は有機溶媒（Ｏ）に対して１〜５０質量％の割合であり、有機溶媒（Ｏ）と水性溶媒（Ｗ１）の体積比は１００：１〜１：２である。Ｗ１／Ｏエマルションの体積平均粒径は、好ましくは５０〜１，０００ｎｍであり、より好ましくは５０〜２００ｎｍである。
【００４６】
本発明では、リポソームに水溶性薬剤を内包させるために、（ｉ）一次乳化工程の際に水溶性薬剤を添加し、水性溶媒（Ｗ１）に水溶性薬剤を溶解させ、二次乳化工程終了時点でそれを内包するリポソームが得られるようにする方法、（ｉｉ）水溶性薬剤を内包しない（空の）リポソームを得た後に、そのリポソームが分散している水性溶媒またはそのリポソームの凍結乾燥物を再分散させた水性溶媒に水溶性薬剤を添加し、撹拌するなどして、リポソームにそれを取り込ませる方法、いずれを用いることもできる。本発明の製造方法では、上記（ｉ）の方法を用いた場合であっても内包率が比較的高く、効率的にリポソームに水溶性薬剤を内包させることができる。
【００４７】
なお、必要であれば、脂溶性の物質（脂溶性薬剤）を、本発明のリポソームの脂質膜内に内包させることも可能である。その場合は、脂溶性薬剤を、上記（ｉ）のように一次乳化工程の際に添加して有機溶媒（Ｏ）に溶解させておくか、上記（ｉｉ）のように空のリポソームを得た後に添加するようにすればよい。
【００４８】
（２）二次次乳化工程
二次乳化工程は、上記工程（１）により得られたＷ１／Ｏエマルションと水性溶媒（Ｗ２）とを混合乳化することによりＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する工程である。
【００４９】
Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製するための方法は特に限定されるものではなく、従来のＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造方法でも用いられているような方法を採用することができる。
【００５０】
たとえば、乳化操作時の液滴の崩壊および液滴からの内包物質の漏出を抑えるため、乳化処理に大きな機械的剪断力を必要としないマイクロチャネル乳化法を用いることが好適である。マイクロチャネル乳化法では、たとえば、シリコン製マイクロチャンネル基板およびこの基板上部を覆うガラス板から構成される、マイクロチャネル乳化装置モジュールを使用する。上記基板およびガラス板により形成される溝型マイクロチャネルの出口側、あるいは上記基板上に加工された貫通型マイクロチャネルの出口側には、外水相をなす水性溶媒（Ｗ２）を満たしておき、マイクロチャネルの入口側からＷ１／Ｏエマルションを圧入することで、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを形成できる。上記基板としては、デッドエンド型、クロスフロー型、貫通孔型など、種々の形態のものを用いることができる。
【００５１】
また、Ｗ１／Ｏエマルションを乳化膜を通過させて水性溶媒（Ｗ２）中に液滴として分散させることによりＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する、膜乳化法を用いることもできる。特に、直径０．１〜５．０μｍ程度の微細な細孔を有するＳＰＧ（Shirasu Porous Glass：シラス多孔質ガラス）で形成された乳化膜を用いる膜乳化法が好適であり、コストが安く処理量が多い、工業的に有利な方法とすることができる。
【００５２】
なお、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの平均粒径の単分散性を向上させるために、上記のような方法または他の方法による膜乳化でＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを得た後、さらに１回ないし複数回、当該膜乳化で用いた膜と同じ膜またはそれとは異なる膜にＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションによる膜処理を行ってもよい。特に、膜乳化に用いる膜よりも小さな細孔径を有する膜を用いて膜処理を行うようにした場合、膜処理を行うことなく１回の膜乳化でＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する場合に較べて、膜乳化および膜処理それぞれの膜への負荷（エマルションを膜に通過させるために必要な圧力）を小さくすることができ、それにより膜の長寿命化や二次乳化工程に要する処理時間の短縮を図ることができ、リポソームの生産性の向上および低コスト化にも有利である。
【００５３】
さらに、機械的剪断力の生じる可能性のある撹拌乳化においても、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを得ることができる。本発明においても、公知の撹拌乳化法において二液以上の流体を混合するために用いられる各種の方法・装置を用いることができる。たとえば撹拌装置にはいろいろな形状の物が存在し、単に棒・板・プロペラ状の撹拌子を槽内で一定速度・一方向に回転させるものが多いが、撹拌子を間欠回転させたり逆回転させる場合もある。特殊な状況では複数の撹拌子を並べ交互に逆回転させたり、槽側に撹拌子と組合された突起あるいは板を取り付けて撹拌子が発生するせん断応力を増強させるなどの様々な工夫がなされる。撹拌子への動力伝達方法も様々であり、回転軸を介して撹拌子を回転させるものが殆どであるが、磁石を封入しテフロン（登録商標）等でコーティングした撹拌子を容器の外部から回転する磁界で動力を伝達するマグネチックスターラーも存在する。撹拌子のサイズ（半径）や毎分回転数などの条件は、本発明の作用効果や公知の撹拌乳化法における条件を考慮しながら、適切な範囲で調整すればよい。
【００５４】
二次乳化工程におけるその他の条件、たとえば、Ｗ１／Ｏエマルションと水性溶媒（Ｗ２）の体積比、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの平均粒径などは、公知のリポソームの製造方法（二次乳化工程）に準じて、最終的に調製するリポソームの用途などを考慮しながら適宜調節することができる。
【００５５】
さらに、二次乳化工程では、水性溶媒（Ｗ２）およびＷ１／Ｏエマルションに、必要応じて混合脂質成分（Ｆ２）や、混合脂質成分（Ｆ２）の一部として或いはこれに代えて、混合脂質成分（Ｆ１）を添加してもよく、またそれらリポソーム脂質膜を破壊しない水溶性乳化剤を添加してもよい。界面化学の分野では多くの乳化剤が知られており、代表的には、タンパク質、多糖類、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤などが、水溶性乳化剤として乳化・分散プロセスに用いられている。
【００５６】
上記タンパク質としては、ゼラチン（コラーゲンを加熱により変性させた可溶性のタンパク質）、アルブミンやトリプシンなどが挙げられる。ゼラチンは通常、数千〜数百万の分子量分布を有するが、たとえば重量平均分子量が１,０００〜１００,０００であるものが好ましい。医療用ないし食品用として市販されているゼラチンを用いることができる。アルブミンには、卵アルブミン（分子量約４５,０００）、血清アルブミン（分子量約６６,０００…ウシ血清アルブミン）、乳アルブミン（分子量約１４,０００…α−ラクトアルブミン）などが含まれ、たとえば卵アルブミンである乾燥脱糖卵白が好ましい。
【００５７】
上記多糖類としては、デキストラン、デンプン、グリコーゲン、アガロース、ペクチン、キトサン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、グァーガム、マルトトリオース、アミロース、プルラン、ヘパリン、デキストリンなどが挙げられ、たとえば重量平均分子量が１,０００〜１００,０００のデキストランが好ましい。
【００５８】
上記イオン性界面活性剤としては、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００５９】
上記非イオン性界面活性剤としては、オクチルグルコシド等のアルキルグリコシド、ポリアルキレンオキサイド化合物、たとえば「Tween 80」（東京化成工業株式会社，ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート，分子量1309.68）や「プルロニック F-68」（BASF、ポリオキシエチレン（160)ポリオキシプロピレン(30)グリコール、数平均分子量9600）の製品や、重量平均分子量が1000〜100000のポリエチレングリコールなどが挙げられる。ポリエチレングリコール(PEG)は、製品として「ユニルーブ」（日油株式会社）、GL4-400NP、GL4-800NP（日油株式会社）、PEG200,000(和光純薬)、マクロゴール（三洋化成工業株式会社）などが挙げられる。
【００６０】
分子量は、小さすぎると脂質膜中に混入しやすくなってリポソームの形成を阻害するおそれがあり、逆に大きすぎるとＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの外水相中への分散や界面への配向の速度が遅れてリポソームの合一や多胞リポソームの形成につながるおそれがある。そのため、水溶性乳化剤の重量平均分子量は１，０００〜１００，０００の範囲内にあることが好ましい。また、この範囲の重量平均分子量であると、リポソームの薬剤の内包率が良い。
【００６１】
上記のようにして混合脂質成分（Ｆ２）および／または水溶性乳化剤を用いる場合の各種の条件、たとえば、それらの量や、水性溶媒（Ｗ２）およびＷ１／Ｏエマルションとの混合態様（添加順序等）は特に限定されるものではなく、公知のリポソームの製造方法に準じて、適切なものとすればよい。たとえばＦ２が主として水溶性脂質からなる場合、あらかじめそのようなＦ２および／または水溶性乳化剤をＷ２に添加しておき、それにＷ１／Ｏエマルションを添加して乳化処理を行うことができる。一方、Ｆ２が主として脂溶性脂質からなる場合、あらかじめ（Ｗ１／Ｏエマルション調製後）そのようなＦ２をＷ１／Ｏエマルションの油相に添加しておき、それを、必要に応じて水溶性乳化剤が添加されているＷ２に添加して乳化処理を行うことができる。
【００６２】
（３）溶媒除去工程
溶媒除去工程は、前記二次乳化工程により得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションに含まれる有機溶媒相（Ｏ）を除去し、リポソームを形成させる工程である。すなわち、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを回収し、開放容器内に移し静置あるいは撹拌することで、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションに含まれる有機溶媒（Ｏ）を蒸発除去することができる。これにより、混合脂質膜成分（Ｆ１）（および必要に応じて添加される（Ｆ２））からなる脂質膜を内水相の周囲に形成し、リポソームを得ることができる。
【００６３】
上記のような方法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションから溶媒を除去は、定法に従い、必要に応じて加温、減圧、撹拌を用いながら行えばよい。有機溶媒（Ｏ）に含まれる化合物の種類に応じて、それらの有機溶媒が突沸することのない条件範囲が設定される。温度条件は０〜６０℃の範囲が好ましく、０〜２５℃がより好ましい。また、減圧条件は溶媒の飽和蒸気圧〜大気圧の範囲内に設定されることが好ましく、溶媒の飽和蒸気圧の＋１％〜１０％の範囲内に設定されることがより好ましい。異なる溶媒を混合して用いる場合、より飽和蒸気圧の高い溶媒種に合わせた条件が好ましい。これらの除去条件は、溶媒が突沸しない範囲で組み合わせてもよく、例えば、熱に弱い薬剤を使用する際は、より低温側でかつ減圧条件で溶媒を溜去することが好ましい。溶媒除去にはＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの撹拌が無くともよいが、撹拌をしたほうがより均一に溶媒除去が進む。
【００６４】
なお、上記のような製造方法により得られるリポソームには、製法の工程上、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルション由来の多胞リポソームがある程度の割合含まれることがあるが、これを減じるために、撹拌、減圧、またはそれらの組み合わせを行うことが効果的である。たとえば、溶媒の大半が抜ける時間より長く減圧および撹拌を行なうことにより、リポソームを構成する脂質の水和が進み、内包物の漏出を起こさないまま、多胞リポソームが解けて単胞のリポソーム状態にばらけることが可能である。また、本法で副生する、あるいは残存する多胞リポソームはその内部がＷ／Ｏ由来の５０〜２００ｎｍ程度の水滴を多く含む構造であるので、Ｗ／Ｏの粒子径よりもわずかに大きな孔径のフィルターを通過させることで、５０〜２００ｎｍ程度の単胞リポソームへ変換することも可能である。このような操作をしても残った多胞リポソームがある場合には、フィルターにより除去することもできる。
【実施例】
【００６５】
＜カルセイン内包リポソーム＞
［実施例１］
１．一次乳化工程（Ｗ１／Ｏエマルションの調製）
ホスファチジルコリン含量が９５％である卵黄レシチン「COATSOME NC-50」（日油株式会社）０．３ｇ、コレステロール（Chol）０．１５２ｇおよびオレイン酸（OA）０．１０８ｇを含むヘキサン１５ｍＬを有機溶媒相（Ｏ）とし、カルセイン（０．４ｍＭ）およびM-LysoPC（ミリストイル基を有するリゾホスファチジルコリン（リゾレシチン）、日油株式会社、ClogP=6.7）０．０１０ｇを含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）５ｍＬを内水相用の水分散相（Ｗ１）とした。５０ｍＬのビーカーにこれらの混合液を入れ、直径２０ｍｍのプローブをセットした超音波分散装置（ＵＨ−６００Ｓ、株式会社エスエムテー）により、２５℃にて１５分間超音波を照射し（出力５．５）、乳化処理を行った。上記方法に従って測定したところ、この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径約２００ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認され、ＣＶ値は２９％であった。【００６６】
２．二次乳化工程（Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの調製）
続いて、上記一次乳化工程により得られたＷ１／Ｏエマルションを分散相とし、実験用デッドエンド型マイクロチャネル乳化装置モジュールを使用して、マイクロチャネル乳化法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造を行った。【００６７】
上記モジュールのマイクロチャネル基板はシリコン製であり、マイクロチャネル基板のテラス長、チャネル深さおよびチャネル幅はそれぞれ約６０μｍ、約１１μｍおよび約１６μｍであった。上記マイクロチャネル基板にガラス板を圧着させてチャネルを形成し、このチャネルの出口側に外水相溶液（Ｗ２）である３％のアルカリ処理ゼラチン（等電点約５）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を満たしておき、チャネルの入口側から前記Ｗ１／Ｏエマルションを供給して、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。【００６８】
３．溶媒除去工程（リポソームの水性懸濁液の調製）
次に、上記Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20℃で15分静置したのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約２０時間、撹拌子により撹拌し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。カルセインの内包率は７１％であった。【００６９】
［実施例２］
溶媒除去工程において、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20℃で360分静置したのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替えたこと以外は実施例１と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は６８％であった。【００７０】
［実施例３］
溶媒除去工程において、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20℃で360分振とうしたのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替えたこと以外は実施例１と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は６１％であった。【００７１】
［比較例１］
１．一次乳化工程（Ｗ１／Ｏエマルションの調製）
ホスファチジルコリン含量が９５％である卵黄レシチン「COATSOME NC-50」（日油株式会社）０．３ｇ、コレステロール（Chol）０．１５２ｇおよびオレイン酸（OA）０．１０８ｇを含むヘキサン１５ｍＬを有機溶媒相（Ｏ）とし、カルセイン（０．４ｍＭ）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）５ｍＬを内水相用の水分散相（Ｗ１）とした。５０ｍＬのビーカーにこれらの混合液を入れ、直径２０ｍｍのプローブをセットした超音波分散装置（ＵＨ−６００Ｓ、株式会社エスエムテー）により、２５℃にて１５分間超音波を照射し（出力５．５）、乳化処理を行った。上記方法に従って測定したところ、この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径約２００ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認され、ＣＶ値は２９％であった。【００７２】
２．二次乳化工程（Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの調製）
続いて、上記一次乳化工程により得られたＷ１／Ｏエマルションを分散相とし、実験用デッドエンド型マイクロチャネル乳化装置モジュールを使用して、マイクロチャネル乳化法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造を行った。【００７３】
上記モジュールのマイクロチャネル基板はシリコン製であり、マイクロチャネル基板のテラス長、チャネル深さおよびチャネル幅はそれぞれ約６０μｍ、約１１μｍおよび約１６μｍであった。上記マイクロチャネル基板にガラス板を圧着させてチャネルを形成し、このチャネルの出口側に外水相溶液（Ｗ２）である３％のアルカリ処理ゼラチン（等電点約５）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を満たしておき、チャネルの入口側から前記Ｗ１／Ｏエマルションを供給して、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。【００７４】
３．溶媒除去工程（リポソームの水性懸濁液の調製）
次に、上記Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20℃で15分静置したのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約２０時間、撹拌子により撹拌し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。カルセインの内包率は６５％であった。【００７５】
［比較例２］
溶媒除去工程において、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20℃で360分静置したのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替えたこと以外は比較例１と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は４８％であった。【００７６】
［比較例３］
溶媒除去工程において、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20℃で360分振とうしたのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替えたこと以外は比較例１と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は３１％であった。【００７７】
［実施例４］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにS-LysoPC（ステアロイル基を有するリゾホスファチジルコリン、日油株式会社、ClogP=8.7）を内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例１と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は７３％であった。【００７８】
［実施例５］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにS-LysoPCを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は７０％であった。【００７９】
［実施例６］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにS-LysoPCを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例３と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は６５％であった。【００８０】
［実施例７］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDLPG-Na（ジラウロイルホスファチジルグリセロールナトリウム塩、日油株式会社、ClogP=9.02）を内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例１と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は８２％であった。【００８１】
［実施例８］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDLPG-Naを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は７７％であった。【００８２】
［実施例９］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDLPG-Naを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例３と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は７１％であった。【００８３】
［実施例１０］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりに短鎖リン脂質DDPC（ジデカノイルホスファチジルコリン、日油株式会社、ClogP=10）を内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例１と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は７０％であった。【００８４】
［実施例１１］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりに短鎖リン脂質DDPCを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は７０％であった。【００８５】
［実施例１２］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりに短鎖リン脂質DDPCを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例３と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は６６％であった。【００８６】
［実施例１３］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにPEGリン脂質「PM020CN」（ジミリストイルホスファチジルエタノールアミンにＰＥＧ鎖（数平均分子量約２０００）を導入したＰＥＧリン脂質、日油株式会社、ClogP=8）を内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例１と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は８１％であった。【００８７】
［実施例１４］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにPEGリン脂質「PM020CN」を内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は７５％であった。【００８８】
［実施例１５］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにPEGリン脂質「PM020CN」を内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例３と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は７７％であった。【００８９】
［実施例１６］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりに、国際公開ＷＯ２００８／０８１６８６に記載の方法（合成例１参照）に従って調製した合成ステロールman-3-chol（コレステロールの３位にマンノースを導入した化合物、ClogP=9.5）を内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例１と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は７４％であった。【００９０】
［実施例１７］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにman-3-cholを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は７０％であった。【００９１】
［実施例１８］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにman-3-cholを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例３と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は７０％であった。【００９２】
［比較例４］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDLPE（ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、日油株式会社、ClogP=11.2）を内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例１と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は７０％であった。【００９３】
［比較例５］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDLPEを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は６０％であった。【００９４】
［比較例６］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDLPEを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例３と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は３３％であった。【００９５】
［比較例７］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDSPE（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、日油株式会社、ClogP=18.9）を内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例１と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は７０％であった。【００９６】
［比較例８］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDSPEを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は５２％であった。【００９７】
［比較例９］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDSPEを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例３と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は４０％であった。【００９８】
［比較例１０］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDEPE（ジエルコイルホスファチジルエタノールアミン、日油株式会社、ClogP=24.5）を内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例１と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は７１％であった。【００９９】
［比較例１１］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDEPEを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は５１％であった。【０１００】
［比較例１２］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDEPEを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例３と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は３９％であった。【０１０１】
［比較例１３］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDSPG-Na（ジステアロイルホスファチジルグリセロールナトリウム塩、日油株式会社、ClogP=16.7）を内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例１と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は６９％であった。【０１０２】
［比較例１４］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDSPG-Naを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は５６％であった。【０１０３】
［比較例１５］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDSPG-Naを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例３と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は３８％であった。【０１０４】
［比較例１６］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDEPG-Na（ジエルコイルホスファチジルエタノールアミンナトリウム塩、日油株式会社、ClogP=22.5）を内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例１と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は７０％であった。【０１０５】
［比較例１７］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDEPE-Naを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は５５％であった。【０１０６】
［比較例１８］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDEPE-Naを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例３と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は４０％であった。【０１０７】
［比較例１９］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDLPC（ジラウロイルホスファチジルコリン、日油株式会社、ClogP=12.2）を内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例１と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は７２％であった。【０１０８】
［比較例２０］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDLPCを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は５２％であった。【０１０９】
［比較例２１］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDLPCを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例３と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は４４％であった。【０１１０】
［比較例２２］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDPPC（ジパルミトイルホスファチジルコリン、日油株式会社、ClogP=17.8）を内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例１と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は７５％であった。【０１１１】
［比較例２３］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDPPCを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は５５％であった。【０１１２】
［比較例２４］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDPPCを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例３と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は４０％であった。【０１１３】
［比較例２５］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDSPE020（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンにＰＥＧ鎖（数平均分子量約２０００）を導入したＰＥＧリン脂質、日油株式会社、ClogP=13.6）を内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例１と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は８０％であった。【０１１４】
［比較例２６］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDSPE020を内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は６０％であった。【０１１５】
［比較例２７］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDSPE020を内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例３と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は３８％であった。【０１１６】
［比較例２８］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりに、国際公開ＷＯ２００８／０８１６８６に記載の方法（合成例１３参照）従って調製した合成ステロールman-6-chol（コレステロールの６位にマンノースを導入した化合物、ClogP=11.1）を内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例１と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は７４％であった。【０１１７】
［比較例２９］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにman-6-cholを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は５８％であった。【０１１８】
［比較例３０］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにman-6-cholを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例３と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。カルセインの内包率は４５％であった。【０１１９】
【表１】
2012053484.tif 000002
【０１２０】
＜シタラビン内包リポソーム＞
［実施例１９］
１．一次乳化工程（Ｗ１／Ｏエマルションの調製）
ホスファチジルコリン含量が９５％である卵黄レシチン「COATSOME NC-50」（日油株式会社）０．３ｇ、コレステロール（Chol）０．１５２ｇおよびオレイン酸（OA）０．１０８ｇを含むヘキサン１５ｍＬを有機溶媒相（Ｏ）とし、シタラビン（８０ｍＭ）およびM-LysoPC（ミリストイル基を有するリゾホスファチジルコリン（リゾレシチン）、日油株式会社、ClogP=6.7）０．０１０ｇを含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）５ｍＬを内水相用の水分散相（Ｗ１）とした。５０ｍＬのビーカーにこれらの混合液を入れ、直径２０ｍｍのプローブをセットした超音波分散装置（ＵＨ−６００Ｓ、株式会社エスエムテー）により、２５℃にて１５分間超音波を照射し（出力５．５）、乳化処理を行った。上記方法に従って測定したところ、この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径約２００ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認され、ＣＶ値は２９％であった。【０１２１】
２．二次乳化工程（Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの調製）
続いて、上記一次乳化工程により得られたＷ１／Ｏエマルションを分散相とし、実験用デッドエンド型マイクロチャネル乳化装置モジュールを使用して、マイクロチャネル乳化法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造を行った。【０１２２】
上記モジュールのマイクロチャネル基板はシリコン製であり、マイクロチャネル基板のテラス長、チャネル深さおよびチャネル幅はそれぞれ約６０μｍ、約１１μｍおよび約１６μｍであった。上記マイクロチャネル基板にガラス板を圧着させてチャネルを形成し、このチャネルの出口側に外水相溶液（Ｗ２）である３％のアルカリ処理ゼラチン（等電点約５）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を満たしておき、チャネルの入口側から前記Ｗ１／Ｏエマルションを供給して、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。【０１２３】
３．溶媒除去工程（リポソームの水性懸濁液の調製）
次に、上記Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20℃で15分静置したのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約２０時間、撹拌子により撹拌し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。シタラビンの内包率は４７％であった。【０１２４】
［実施例２０］
溶媒除去工程において、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20℃で360分静置したのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替えたこと以外は実施例１９と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は４３％であった。【０１２５】
［実施例２１］
溶媒除去工程において、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20℃で360分振とうしたのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替えたこと以外は実施例１９と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は４０％であった。【０１２６】
［実施例２２］
１．一次乳化工程（Ｗ１／Ｏエマルションの調製）
ホスファチジルコリン含量が９５％である卵黄レシチン「COATSOME NC-50」（日油株式会社）０．３ｇ、コレステロール（Chol）０．１５２ｇおよびオレイン酸（OA）０．１０８ｇを含むヘキサン１５ｍＬを有機溶媒相（Ｏ）とし、シタラビン（８０ｍＭ）およびM-LysoPC（ミリストイル基を有するリゾホスファチジルコリン（リゾレシチン）、日油株式会社、ClogP=6.7）０．０１０ｇを含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）５ｍＬを内水相用の水分散相（Ｗ１）とした。５０ｍＬのビーカーにこれらの混合液を入れ、直径２０ｍｍのプローブをセットした超音波分散装置（ＵＨ−６００Ｓ、株式会社エスエムテー）により、２５℃にて１５分間超音波を照射し（出力５．５）、乳化処理を行った。上記方法に従って測定したところ、この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径約２００ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認され、ＣＶ値は２９％であった。【０１２７】
２．二次乳化工程（Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの調製）
得られたＷ１／Ｏエマルションを分散相として、ＳＰＧ膜乳化法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造を行った。ＳＰＧ膜乳化装置（ＳＰＧテクノ社製、商品名「外圧式マイクロキット」）に直径１０ｍｍ、長さ２０ｍｍ、細孔径１０μｍの円筒形ＳＰＧ膜を用い、装置出口側に外水相溶液（Ｗ２）である３％のアルカリ処理ゼラチン（等電点約５）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、５０ｍＭ）を満たしておき、装置入口側から上記Ｗ１／Ｏエマルションを供給して、Ｗ１：Ｗ２が１：４０となるようにＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。【０１２８】
３．溶媒除去工程（リポソームの水性懸濁液の調製）
次に、上記Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20℃で15分静置したのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約２０時間、撹拌子により撹拌し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。シタラビンの内包率は５０％であった。【０１２９】
［実施例２３］
溶媒除去工程において、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20℃で360分静置したのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替えたこと以外は実施例２２と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は４６％であった。【０１３０】
［実施例２４］
溶媒除去工程において、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20℃で360分振とうしたのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替えたこと以外は実施例２２と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は４０％であった。【０１３１】
［実施例２５］
１．一次乳化工程（Ｗ１／Ｏエマルションの調製）
ホスファチジルコリン含量が９５％である卵黄レシチン「COATSOME NC-50」（日油株式会社）０．３ｇ、コレステロール（Chol）０．１５２ｇおよびオレイン酸（OA）０．１０８ｇを含むヘキサン１５ｍＬを有機溶媒相（Ｏ）とし、シタラビン（８０ｍＭ）およびM-LysoPC（ミリストイル基を有するリゾホスファチジルコリン（リゾレシチン）、日油株式会社、ClogP=6.7）０．０１０ｇを含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）５ｍＬを内水相用の水分散相（Ｗ１）とした。５０ｍＬのビーカーにこれらの混合液を入れ、直径２０ｍｍのプローブをセットした超音波分散装置（ＵＨ−６００Ｓ、株式会社エスエムテー）により、２５℃にて１５分間超音波を照射し（出力５．５）、乳化処理を行った。上記方法に従って測定したところ、この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径約２００ｎｍの単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認され、ＣＶ値は２９％であった。【０１３２】
２．二次乳化工程（Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの調製）
得られたＷ１／Ｏエマルションを分散相とし、３％のアルカリ処理ゼラチン（等電点約５）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、５０ｍＭ）の水分散相（Ｗ２）を外水相として、撹拌乳化法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造を行った。撹拌乳化は、スターラーによりＷ２を強く撹拌しているところに、上記Ｗ１／Ｏエマルションを供給し、Ｗ１：Ｗ２が１：４０となるようにＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。【０１３３】
３．溶媒除去工程（リポソームの水性懸濁液の調製）
次に、上記Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20℃で15分静置したのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替え、室温下で約２０時間、撹拌子により撹拌し、ヘキサンを揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。シタラビンの内包率は５０％であった。【０１３４】
［実施例２６］
溶媒除去工程において、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20℃で360分静置したのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替えたこと以外は実施例２５と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は４３％であった。【０１３５】
［実施例２７］
溶媒除去工程において、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉したサンプル瓶にいれて20℃で360分振とうしたのち蓋のない開放ガラス製容器に移し替えたこと以外は実施例２５と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は３９％であった。【０１３６】
［実施例２８］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDLPG-Naを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２２と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は４９％であった。【０１３７】
［実施例２９］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDLPG-Naを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２３と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は４８％であった。【０１３８】
［実施例３０］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDLPG-Naを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２４と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は４５％であった。【０１３９】
［実施例３１］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにPM020CNを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２５と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は５３％であった。【０１４０】
［実施例３２］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにPM020CNを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２６と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は５１％であった。【０１４１】
［実施例３３］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにPM020CNを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２７と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は５３％であった。【０１４２】
［実施例３４］
一次乳化工程においてM-LysoPCの代わりにPM020CNを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと、また二次乳化工程において３％のアルカリ処理ゼラチン（等電点約５）の代わりに０．１％のプルロニックF-68（ポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコール、数平均分子量9600、登録商標、非イオン界面活性剤プロノン(#188P, 日油株式会社)）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を用いたこと以外は、実施例１９と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は６０％であった。【０１４３】
［実施例３５］
一次乳化工程においてM-LysoPCの代わりにPM020CNを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと、また二次乳化工程において３％のアルカリ処理ゼラチン（等電点約５）の代わりに０．１％のプルロニックF-68を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を用いたこと以外は、実施例２０と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は６０％であった。【０１４４】
［実施例３６］
一次乳化工程においてM-LysoPCの代わりにPM020CNを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと、また二次乳化工程において３％のアルカリ処理ゼラチン（等電点約５）の代わりに０．１％のプルロニックF-68を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を用いたこと以外は、実施例２１と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は５２％であった。【０１４５】
［比較例３１］
一次乳化工程において、M-LysoPCを内水相（Ｗ１）に溶解させなかったこと以外は実施例１９と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は４０％であった。【０１４６】
［比較例３２］
一次乳化工程において、M-LysoPCを内水相（Ｗ１）に溶解させなかったこと以外は実施例２０と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は３２％であった。【０１４７】
［比較例３３］
一次乳化工程において、M-LysoPCを内水相（Ｗ１）に溶解させなかったこと以外は実施例２１と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は１２％であった。【０１４８】
［比較例３４］
一次乳化工程において、M-LysoPCを内水相（Ｗ１）に溶解させなかったこと以外は実施例２２と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は４３％であった。【０１４９】
［比較例３５］
一次乳化工程において、M-LysoPCを内水相（Ｗ１）に溶解させなかったこと以外は実施例２３と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は３０％であった。【０１５０】
［比較例３６］
一次乳化工程において、M-LysoPCを内水相（Ｗ１）に溶解させなかったこと以外は実施例２４と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は２０％であった。【０１５１】
［比較例３７］
一次乳化工程において、M-LysoPCを内水相（Ｗ１）に溶解させなかったこと以外は実施例２５と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は４３％であった。【０１５２】
［比較例３８］
一次乳化工程において、M-LysoPCを内水相（Ｗ１）に溶解させなかったこと以外は実施例２６と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は３４％であった。【０１５３】
［比較例３９］
一次乳化工程において、M-LysoPCを内水相（Ｗ１）に溶解させなかったこと以外は実施例２７と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は２３％であった。【０１５４】
［比較例４０］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDSPG-Naを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２２と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は４９％であった。【０１５５】
［比較例４１］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDSPG-Naを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２３と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は３９％であった。【０１５６】
［比較例４２］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDSPG-Naを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２４と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は２６％であった。【０１５７】
［比較例４３］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDSPE020を内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２５と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は５１％であった。【０１５８】
［比較例４４］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDSPE020を内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２６と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は４０％であった。【０１５９】
［比較例４５］
一次乳化工程において、M-LysoPCの代わりにDSPE020を内水相（Ｗ１）に溶解させたこと以外は実施例２７と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は３２％であった。【０１６０】
［比較例４６］
一次乳化工程においてM-LysoPCを内水相（Ｗ１）に溶解させなかったこと、また二次乳化工程において３％のアルカリ処理ゼラチン（等電点約５）の代わりに０．１％のプルロニックF-68を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を用いたこと以外は、実施例１９と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は４４％であった。【０１６１】
［比較例４７］
一次乳化工程においてM-LysoPCを内水相（Ｗ１）に溶解させなかったこと、また二次乳化工程において３％のアルカリ処理ゼラチン（等電点約５）の代わりに０．１％のプルロニックF-68を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を用いたこと以外は、実施例２０と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は３０％であった。【０１６２】
［比較例４８］
一次乳化工程においてM-LysoPCを内水相（Ｗ１）に溶解させなかったこと、また二次乳化工程において３％のアルカリ処理ゼラチン（等電点約５）の代わりに０．１％のプルロニックF-68を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を用いたこと以外は、実施例２１と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は２２％であった。【０１６３】
［比較例４９］
一次乳化工程においてM-LysoPCの代わりにDSPE020を内水相（Ｗ１）に溶解させたこと、また二次乳化工程において３％のアルカリ処理ゼラチン（等電点約５）の代わりに０．１％のプルロニックF-68を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を用いたこと以外は、実施例１９と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は５８％であった。【０１６４】
［比較例５０］
一次乳化工程においてM-LysoPCの代わりにDSPE020を内水相（Ｗ１）に溶解させたこと、また二次乳化工程において３％のアルカリ処理ゼラチン（等電点約５）の代わりに０．１％のプルロニックF-68を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を用いたこと以外は、実施例２０と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は４４％であった。【０１６５】
［比較例５１］
一次乳化工程においてM-LysoPCの代わりにPM020CNを内水相（Ｗ１）に溶解させたこと、また二次乳化工程において３％のアルカリ処理ゼラチン（等電点約５）の代わりに０．１％のプルロニックF-68を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を用いたこと以外は、実施例２１と同様にして、リポソームの水性懸濁液を調製した。シタラビンの内包率は３２％であった。【０１６６】
【表２】
2012053484.tif 000003
【０１６７】
＜造影剤内包リポソーム＞
［実施例３７］
１．一次乳化工程（Ｗ１／Ｏエマルションの調製）
オムニパーク350（イオヘキソール含有量７５０ｍｇ／ｍＬ，１０ｍＰａ・ｓ）０．２５ｍＬにM-LysoPC（ミリストイル基を有するリゾホスファチジルコリン（リゾレシチン）、日油株式会社、ClogP=6.7）０．０１０ｇを溶解させて内水相（Ｗ１）とし、DPPC（ジパルミトイルホスファチジルコリン、「MC-6060」、日油株式会社）５０ｍｇ、およびDPPG（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、「COATSOME MG-6060LA」、日油株式会社）１０ｍｇを含む混合溶媒（ヘキサン／ジクロロメタン＝３／１）１．２５ｍＬを有機溶媒相（Ｏ）とした。３．５ｍＬのサンプル瓶にこれらの混合液を入れ、φ７ｍｍのプローブをセットした超音波分散装置（ＵＨ−６００Ｓ、株式会社エスエムテー）により、２０℃にて１５分間超音波を照射し乳化処理を行った。【０１６８】
２．二次乳化工程（Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの調製）
得られたＷ１／Ｏエマルションを、０．１％のプルロニックＦ６８を含むトリス−塩酸緩衝液（Ｗ２、ｐＨ７．４、５０ｍＭ）１５ｍＬ中にスターラー撹拌下で添加し、１５分間撹拌して、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。【０１６９】
３．溶媒除去工程（リポソームの水性懸濁液の調製）
得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉容器に移し替え、２０℃・５００ｍｂａｒの減圧条件下で約８時間撹拌し、次いで２０℃・１８０ｍｂａｒの減圧条件下で約８時間撹拌し、段階的に溶媒を揮発させた。得られたリポソーム懸濁液は半透明の黄色であり、この粒子内には造影剤イオヘキソールが含まれていることが確認された。リポソームのイオヘキソール内包率は４８％であった。【０１７０】
［比較例５２］
一次乳化工程において、M-LysoPCを内水相（Ｗ１）に溶解させなかったこと以外は実施例３７と同様にしてリポソームの水性懸濁液を調製した。イオヘキソールの内包率は３９％であった。【０１７１】
【表３】
2012053484.tif 000004
【０１７２】
＜siRNA内包リポソーム＞
［実施例３８］
内水相（Ｗ１）として、等張ＰＢＳ溶液０．２５ｍＬにｓｉＲＮＡ（ランダム配列）１０ｍｇおよびM-LysoPC（ミリストイル基を有するリゾホスファチジルコリン（リゾレシチン）、日油株式会社、ClogP=6.7）０．０１０ｇを溶解させた溶液を用いたこと、および外水相（Ｗ２）として０．１％のプルロニックＦ６８を含む等張ＰＢＳ溶液を用いたこと以外は実施例３７と同様にしてリポソームの水性懸濁液を調製した。ｓｉＲＮＡの内包率は５７％であった。【０１７３】
［比較例５３］
一次乳化工程において、M-LysoPCを内水相（Ｗ１）に溶解させなかったこと以外は実施例３８と同様にしてリポソームの水性懸濁液を調製した。ｓｉＲＮＡの内包率は４８％であった。【０１７４】
【表４】
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【０１７５】
［実施例３９］（SPG2次乳化で20倍スケールアップ）
（一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造）
ホスファチジルコリン含量が９５％である卵黄レシチン「COATSOME NC-50」（日油株式会社製）６．０ｇ、コレステロール（Chol）３．０４ｇおよびオレイン酸（OA）２．１６ｇを含む混合溶媒（ヘキサン：ジクロロメタン＝８：２）３００ｍＬを有機溶媒相（Ｏ）とし、シタラビン（ＭＷ２４３．２２，２０ｍｇ／ｍＬ，８０ｍＭ）およびM-LysoPC（ミリストイル基を有するリゾホスファチジルコリン（リゾレシチン）、日油株式会社、ClogP=6.7）０．２０ｇを含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）１００ｍＬを内水相用の水分散相（Ｗ１）とした。高圧ホモジナイザー（ナノマイザー、吉田機械興業社製）を用いて１００ＭＰａの圧力条件で一次乳化工程の処理を行った。得られたＷ１／Ｏエマルションの室温下での平均粒径は１３７ｎｍであった。【０１７６】
（二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造）
上記一次乳化工程により得られたＷ１／Ｏエマルションを分散相として、ＳＰＧ乳化法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造を行った。ＳＰＧ膜乳化装置（ＳＰＧテクノ社製、商品名「高速ミニキットKH-125」）に直径１０ｍｍ、長さ１２５ｍｍ、細孔径１．０μｍの円筒形ＳＰＧ膜用い、装置出口側に外水相溶液（Ｗ２）である３％のアルカリ処理ゼラチン（等電点約５）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を満たしておき、装置入口側から上記Ｗ１／Ｏエマルションを供給して、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。膜乳化に必要とした圧力は約１０ｋＰａであった。【０１７７】
（有機溶媒相の除去によるリポソームの製造）
上記二次乳化工程により得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉容器に移し替え、５００ｍｂａｒの減圧室温条件下で約４時間撹拌し、次いで１８０ｍｂａｒの減圧室温条件下で約１８時間撹拌し、溶媒を揮発させた。微細なリポソーム粒子の懸濁液が得られ、この粒子内にはシタラビンが含まれていることが確認された。得られたリポソームのシタラビン内包率は４７％であった。【０１７８】
（考察）処理量の増加に伴い、ＳＰＧ膜乳化に90分かかった。その後20℃で270分静置してから有機溶媒の除去を実施したので、おおよそ実施例２３と同様の静置を実施したことになる。スケールアップ実験においても実施例２３と同様のシタラビン内包率を得ることができた。【０１７９】
［実施例４０］（撹拌2次乳化で20倍スケールアップ）
二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造において、外水相溶液（Ｗ２）である３％のアルカリ処理ゼラチン（等電点約５）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を用いて撹拌乳化法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造を行ったこと以外は実施例３９と同様に実験した。撹拌乳化は、スターラーによりＷ２を強く撹拌しているところに、上記Ｗ１／Ｏエマルションを供給し、Ｗ１：Ｗ２が１：４０となるようにＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。得られたリポソームのシタラビン内包率は４７％であった。【０１８０】
（考察）処理量の増加に伴い、撹拌時間を30分とした。その後20℃で330分静置してから有機溶媒の除去を実施したので、おおよそ実施例２６と同様の静置を実施したことになる。スケールアップ実験においても実施例２６と同様のシタラビン内包率を得ることができた。【０１８１】
（考察2）撹拌2次乳化によるリポソーム製造法は、マイクロカプセル化法（たとえばIshii et al., J. Dispers. Sci. Technol.. vol.9, No.1, pp.1-15, 1988.参照）として知られているが、内包する薬剤によっては高い内包率を実現できない。せん断力によってやわらかいW/O/W粒子が壊れて内包された薬剤が外に出てしまうのが原因と考えられ、内包率数％という結果に終わることもある。大きなスケールで撹拌効率を維持するためには大きなトルクで撹拌する必要があり、撹拌羽の近くの局所的にはせん断力が大きくなってしまうので、この傾向は顕著になる。しかしながら、水溶性脂質添加による膜を強化する効果が表れて大きなスケールでも再現性が得られたものと考えられる。【０１８２】
【表５】
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【０１８３】
（フィルターろ過）
実施例３１，３２，３３および比較例４３，４４，４５で得られたリポソーム懸濁液を顕微鏡で観察したところ多胞リポソームの存在が確認され、粒度分布測定結果もマイクロ粒子が確認できた。得られたリポソーム懸濁液をメンブランフィルタDISMIC（0.2 μm のセルロースアセテート製、アドバンテック東洋製)を２０℃で通過させることで、顕微鏡観察および粒度分布測定から多胞リポソームがなくなったことが確認でき、なおかつメンブランフィルタろ過の前後で内包率に変化がないことを確認できた。なお、他の実施例および比較例においては、多胞リポソームは観察されなかった。【０１８４】
（カルセインの内包率測定方法）
リポソーム水溶液（３ｍＬ）全体の蛍光強度（Ｆtotal）を分光光度計（Ｕ−３３１０、日本分光株式会社）により測定した。次に０．０１Ｍ，ＣｏＣｌ2トリス塩酸緩衝液３０μＬを加えて外水相に漏出したカルセインの蛍光をＣｏ2+により消光することで、ベシクル内の蛍光強度（Ｆin）を測定した。さらに、カルセインを加えないでサンプルと同じ条件でベシクルを作製し、脂質自身が発する蛍光（Ｆl）を測定した。内包率は下記式より算出した；
内包率Ｅ（％）  ＝  (Ｆin−Ｆl)／(Ｆtotal−Ｆl)×１００
（粒度分布の測定方法）
実施例および比較例の一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションの体積平均粒径およびＣＶ値は、下記の方法に従って測定した。【０１８５】
Ｗ１／Ｏエマルションをヘキサン／ジクロロメタン混合溶媒（体積比：１／１）で１０倍に希釈し、動的光散乱式ナノトラック粒度分析計（ＵＰＡ−ＥＸ１５０、日機装株式会社）を用いて粒度分布を測定し、これに基づき体積平均粒径およびＣＶ値（＝（標準偏差／体積平均粒径）×１００［％］）を算出した。また、リポソームの体積平均粒径は、同装置を用いて、作製したリポソーム懸濁液をそのまま測定した。【０１８６】
（シタラビンの内包率測定方法）
リポソーム粒子の懸濁液を超遠心条件のもと超遠心装置を用い成分分離し、固形分(リポソーム)と上澄溶液とに含まれるシタラビンの量をそれぞれＨＰＬＣ（カラム：VarianPolaris C18-A（3μm, 2x40ｍｍ））で定量した。固形分（リポソーム）の定量値、すなわちリポソームに内包されているシタラビンの量と、上澄溶液の定量値、すなわちリポソームに内包されていないシタラビンの量との合計値で、前者のリポソームに内包されているシタラビンの量を除した値に１００を乗じて、シタラビンの内包率（％）を算出した。【０１８７】
（イオヘキソールの内包率測定方法）
造影剤用化合物（イオヘキソール）内包リポソームの分散液５０μＬを採取し１．８％生理食塩水９５０μＬを加えて遠心分離（６，０００ｒｐｍ、２０分）を行った。得られた上清および残渣（リポソーム）を完全に分離した後、各々アルコールを加えて溶解し２０ｍＬに仕上げた。波長約２４５ｎｍにおける吸光度を測定し、内包造影剤用化合物の吸光度と造影剤用化合物の濃度の検量線に基づき、リポソームに内包される造影剤用化合物の質量および系内の全造影剤用化合物の質量を計算して、以下の式で造影剤用化合物の内包率を求めた。ここで、リポソーム内包造影剤用化合物質量は残渣から測定された造影剤用化合物質量、全造影剤用化合物質量は上清と残渣から測定された造影剤用化合物質量の和とする。【０１８８】
造影剤用化合物内包率（％）
＝リポソーム内包造影剤用化合物質量／全造影剤用化合物質量×１００
（siRNAの内包率測定方法）
ｓｉＲＮＡの内包率は、リポソーム液を超遠心分離して外液とリポソームを分離し、各ｓｉＲＮＡ量をＨＰＬＣで測定することで求めた。【０１８９】
（ClogPの算出方法）
分配係数は、実際に測定しなくても定量的構造活性相関アルゴリズムを用いた計算によって求めることができる。フラグメント法では、ある分子の分配係数を、その分子の部分構造ごとの分配係数の総和によって計算する。ソフトウェアChemDrawに搭載された計算プログラムで、フラグメントのClogP値を算出し、BioByte社が開発したフラグメントベースでのClogP値計算に準じ、その値を加算して算出した。たとえばM-LysoPCはその構造式を二つのフラグメントに分けることができ、それぞれのClogPを計算すると5.18、1.42であるので、M-LysoPCのClogP値はそれらを加算して6.7とした。
【国際調査報告】
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