(57)【要約】【課題】薬剤の代謝及び毒性試験に使用可能な機能的肝細胞を多能性幹細胞から作製すること。【解決手段】多能性幹細胞を用いて高機能肝細胞を製造する方法であって、工程(A)、(B)を含む方法により、多能性幹細胞から多能性幹細胞由来原始内胚葉を得て、工程(C)を含む方法により、多能性幹細胞由来原始内胚葉から肝前駆細胞を得て、工程(D)を含む方法により、肝前駆細胞から高機能肝細胞を得ることを特徴とする多能性幹細胞由来高機能肝細胞の製造方法。(A)無血清かつ無フィーダー環境下で培養する工程(B)アルブミンと少なくとも一種のサイトカインの存在下で培養する工程(C)SHHまたはSHHアゴニストと、少なくとも一種のサイトカインとの存在下で培養する工程(D)少なくとも一種のサイトカインの存在下で培養して成熟させる工程【選択図】図１４Ａ
2012105505.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を用いて高機能肝細胞を製造する方法であって、
工程(A)、(B)を含む方法により、多能性幹細胞から多能性幹細胞由来原始内胚葉を得て、工程(C)を含む方法により、多能性幹細胞由来原始内胚葉から肝前駆細胞を得て、工程(D)を含む方法により、肝前駆細胞から高機能肝細胞を得る
ことを特徴とする多能性幹細胞由来高機能肝細胞の製造方法。
(A)無血清かつ無フィーダー環境下で培養する工程
(B)アルブミンと少なくとも一種のサイトカインの存在下で培養する工程
(C)SHHまたはSHHアゴニストと、少なくとも一種のサイトカインとの存在下で培養する工程
(D)少なくとも一種のサイトカインの存在下で培養して成熟させる工程
【請求項２】
多能性幹細胞を用いて多能性幹細胞由来原始内胚葉を製造する方法であって、
工程(A)、(B)を含む方法により、多能性幹細胞から多能性幹細胞由来原始内胚葉を得る
ことを特徴とする多能性幹細胞由来原始内胚葉の製造方法。
(A)無血清かつ無フィーダー環境下で培養する工程
(B)アルブミンと少なくとも一種のサイトカインの存在下で培養する工程
【請求項３】
工程(A)において、
多能性幹細胞をその各集塊が互いに接する密度に播種する
請求項１または２に記載の多能性幹細胞由来原始内胚葉の製造方法。
【請求項４】
工程(A)において、
沈降速度差による分離によってフィーダー細胞を除去する
請求項１ないし３のいずれかに記載の多能性幹細胞由来原始内胚葉の製造方法。
【請求項５】
工程(B)において、
アルブミンにヒトリコンビナント・アルブミンを用いる
請求項１ないし４のいずれかに記載の多能性幹細胞由来原始内胚葉の製造方法。
【請求項６】
原始内胚葉を用いて肝前駆細胞を製造する方法であって、
工程(C)を含む方法により、原始内胚葉から肝前駆細胞を得る
ことを特徴とする肝前駆細胞の製造方法。
(C) SHHまたはSHHアゴニストと、少なくとも一種のサイトカインとの存在下で培養する工程
【請求項７】
工程(C)において、
原始内胚葉に多能性幹細胞由来原始内胚葉を用いる
請求項６に記載の肝前駆細胞の製造方法。
【請求項８】
肝前駆細胞を用いて高機能肝細胞を製造する方法であって、
工程(D)を含む方法により、肝前駆細胞から高機能肝細胞を得る
ことを特徴とする高機能肝細胞の製造方法。
(D)少なくとも一種のサイトカインの存在下で培養して成熟させる工程
【請求項９】
多能性幹細胞にES細胞またはiPS細胞を用いる
請求項１ないし８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
iPS細胞にセンダイウイルスベクターにより樹立されたiPS細胞を用いる
請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
多能性幹細胞にヒト多能性幹細胞を用いる
請求項１ないし１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
多能性幹細胞を用いて製造される高機能肝細胞であって、
工程(A)、(B)を含む方法により、多能性幹細胞から多能性幹細胞由来原始内胚葉を得て、工程(C)を含む方法により、多能性幹細胞由来原始内胚葉から肝前駆細胞を得て、工程(D)を含む方法により、肝前駆細胞から得られる
ことを特徴とする多能性幹細胞由来高機能肝細胞。
(A)無血清かつ無フィーダー環境下で培養する工程
(B)アルブミンと少なくとも一種のサイトカインの存在下で培養する工程
(C)SHHまたはSHHアゴニストと、少なくとも一種のサイトカインとの存在下で培養する工程
(D)少なくとも一種のサイトカインの存在下で培養して成熟させる工程
【請求項１３】
多能性幹細胞を用いて製造される高機能肝細胞であって、
Dexamethazone添加時のチトクロームP450酵素活性値がHepaRG細胞の２倍以上であり、ICG取込及び放出活性を有し、PAS染色陽性であり、A1ATを発現し、胆管上皮細胞にも分化可能である
ことを特徴とする多能性幹細胞由来高機能肝細胞。
【請求項１４】
多能性幹細胞を用いて製造される多能性幹細胞由来原始内胚葉であって、
工程(A)、(B)を含む方法により、多能性幹細胞から得られる
ことを特徴とする多能性幹細胞由来原始内胚葉。
(A)無血清かつ無フィーダー環境下で培養する工程
(B)アルブミンと少なくとも一種のサイトカインの存在下で培養する工程
【請求項１５】
原始内胚葉を用いて製造される肝前駆細胞であって、
工程(C)を含む方法により、原始内胚葉から得られる
ことを特徴とする肝前駆細胞。
(C)SHHまたはSHHアゴニストと、少なくとも一種のサイトカインとの存在下で培養する工程
【請求項１６】
肝前駆細胞を用いて製造される高機能肝細胞であって、
工程(D)を含む方法により、肝前駆細胞から得られる
ことを特徴とする高機能肝細胞。
(D)少なくとも一種のサイトカインの存在下で培養して成熟させる工程
【請求項１７】
多能性幹細胞がES細胞またはiPS細胞である
請求項１２ないし１４のいずれかに記載の多能性幹細胞由来高機能肝細胞または多能性幹細胞由来原始内胚葉。
【請求項１８】
多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である
請求項１２ないし１７のいずれかに記載の多能性幹細胞由来高機能肝細胞または多能性幹細胞由来原始内胚葉。
【請求項１９】
薬剤の代謝を試験する方法であって、
請求項１２ないし１８のいずれかに記載の多能性幹細胞由来高機能肝細胞を用いて薬剤の代謝を定量する
ことを特徴とする薬剤代謝の試験方法。
【請求項２０】
薬剤の毒性を試験する方法であって、
請求項１２ないし１８のいずれかに記載の多能性幹細胞由来高機能肝細胞を用いて薬剤による細胞死を定量する
ことを特徴とする薬剤毒性の試験方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞を用いて高機能肝細胞を製造する方法と、その中間産物である多能性幹細胞由来原始内胚葉及び肝前駆細胞を製造する方法、並びに、その方法によって製造される多能性幹細胞由来原始内胚葉、肝前駆細胞、高機能肝細胞、また、高機能肝細胞を用いた薬剤の代謝及び毒性の試験方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、生体での主たる解毒臓器であり、様々な薬剤の代謝を担っている。あらゆる薬剤が、ヒト生体へ投与した際に、多かれ少なかれ肝臓へ負担を与えることが知られている。その程度は、軽度の肝機能変化から、高度の肝機能不全までと広範囲に渡るが、事前にそれを適切に予測するための手段はない。【０００３】
新規に開発された薬剤の安全性の検証は、現在、薬事法上の承認を得るために行われる臨床試験（治験）により行われている。しかし治験の実施には、莫大な予算及び年月が要される。さらに近年は、研究開発中の薬剤が、その肝毒性により開発中止となるケースの割合が増えていることが問題となっている。また、治験を終了して市場に出た薬剤の中にも、重篤な肝障害の発症例が報告されて発売中止となるケースもあり、賠償金支払いという負担も製薬企業にのしかかることとなる。例えば、世界的なメガファーマであるPfizer社が開発した抗糖尿病薬Rezulinは肝毒性にために発売中止となったが、これによりPfizer社が受けた損失は数億ドルにのぼると報告されている（非特許文献１）。【０００４】
また、薬剤の肝毒性は個人差も大きく、治験において毒性が十分に把握されないこともある。このため、市場に現れた薬剤が不幸な事故をもたらして販売中止になる例も稀ではない。【０００５】
そのため、治験実施前に、あらかじめインビトロの試験により、薬剤の代謝及び毒性を評価できるシステムを構築することは、創薬事業における急務となっている。このようなシステムの提供は、世界レベルでの創薬研究の向上と、創薬事業の促進に大きく貢献する。【０００６】
現在、インビトロでの薬剤代謝・毒性試験ための技術として、１）ヒト肝切片と用いたもの、２）ヒト初代培養肝細胞を用いたもの、３）ヒト肝細胞株を用いたもの、４）ヒト肝細胞ミクロソームを用いたもの、が適用されている。【０００７】
このうち、ヒト肝切片及びヒト初代培養肝細胞は、ロット間や個人間の活性のばらつきが大きく、またインビトロの実験における活性が極めて不安定でもあることから、使用に際しての問題は大きい。【０００８】
ヒト肝細胞株に関しては、その多くが薬剤代謝・毒性試験への使用は不適当であることが知られる。唯一、HapaRG（非特許文献２）は薬剤代謝・毒性試験への使用が可能とされているが、これは特定の一個人に由来する細胞株であることから、薬剤代謝・毒性における個人差を評価することは不可能である。【０００９】
ヒト肝細胞ミクロソームは、薬剤代謝に関する評価は可能であるが、これは肝細胞そのものではなく、あくまでもミクロソーム分画を精製したものに過ぎず、肝細胞そのものに対する毒性評価は不可能である。さらにヒト肝細胞ミクロソームの調製には莫大なコストを要することも問題となっている。【００１０】
このような観点からは、無限増殖能と多能性分化能とを併せもつヒト多能性幹細胞から、機能的肝細胞を作製する技術を開発することは、上記の問題点を全て解決するものとなる。すなわち、この技術により、薬剤代謝・毒性に関する評価の質と効率が飛躍的に向上する。【００１１】
ヒト多能性幹細胞であるヒト胚性幹（ES）細胞及びヒト人工多能性幹（iPS）細胞から、機能的肝細胞を作製する技術として、これまでにいくつかのものが報告され、関連技術も報告されている（特許文献１〜３）。
肝臓での薬剤代謝に主に関与するチトクロームP450酵素の活性を検出できる技術も報告されている。しかし、従来技術はいずれも、作製された肝細胞において、薬剤非添加時よりチトクロームP450酵素活性が十分に顕在化していて、薬剤添加に伴うチトクロームP450酵素活性上昇は全く検出できていない、という致命的な問題点がある（非特許文献３〜８）。【００１２】
さらに従来の技術においては、１）培養系にウシ胎児血清が添加されている、２）培養系にマウスに由来するフィーダー細胞が共存する、３）ヒト多能性幹細胞からの分化指向性に関しては株間でのばらつきが非常に大きい（非特許文献９）、という重要な課題が解決されていない。 【００１３】
ウシ胎児血清が存在すると、評価系に添加された薬剤が血清成分に吸着するため、薬剤本来の代謝・毒性を正しく評価することが不可能となる。同様に、マウス由来細胞が共存する場合も、薬剤代謝・毒性測定系が撹乱される危険性がある。また肝細胞作製効率に関する株間差が大きいことは、薬剤代謝・毒性の測定系を不安定にさせるために、株が由来するところの個人差を検証することは不可能となる。【００１４】
従って、薬剤代謝・毒性試験を適切かつ有効に実施するためには、株間差のない安定した培養技術により、ヒト多能性幹細胞から、無血清・無フィーダー環境下で、薬剤添加に依存したチトクロームP450酵素活性変化の検出を可能とする機能的肝細胞の開発が急務である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開２０１０−７５１９９「ヒト胚幹細胞を迅速に拡大するための培養系」
【特許文献２】特開２００８−２１２１５０「ヒト胚幹細胞由来の膵島細胞」
【特許文献３】特表２０１０−５２９８５１「多重分化能性／多能性細胞及び方法」
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Nicholls H、Drug Discovery Today誌、第8巻、第1055頁
【非特許文献２】Gripon Pら、米国科学アカデミー紀要、第99巻、第15655〜15660頁
【非特許文献３】Inamura Mら、Molecular Therapy誌 (first edition) 2010年
【非特許文献４】Liu Hら、Hepatology誌、第51巻、第1810〜1819頁
【非特許文献５】Sullivan GJら、Hepatology誌、第51巻、第329〜335頁
【非特許文献６】Touboul Tら、Hepatology誌、第51巻、第1754〜1765頁
【非特許文献７】Duan Yら、Stem Cells誌、第28巻、第674〜686頁
【非特許文献８】Hay DCら、et al. 米国科学アカデミー紀要、第105巻、第12301〜12306頁
【非特許文献９】Osafune Kら、ネイチャー・バイオテクノロジー誌、第26巻、第313〜315頁
【非特許文献１０】実験医学 Vol.26、No.5 (増刊)、第35〜40頁、2008年
【非特許文献１１】Mitaka Tら、Biochemicaland Biophysical Research Communications誌、第214巻、第310〜317頁、1995年
【非特許文献１２】Chen Qら、NatureProtcol誌、第2巻、第1197〜1205頁、2007年
【非特許文献１３】Zhao Dら、PLoSOne誌、第4巻、e6468、2009年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、多能性幹細胞から高品質な機能的肝細胞を安定に作製する技術を提供することを主な課題とする。特に、ヒト多能性幹細胞から、薬剤の代謝及び毒性試験に使用される高品質な機能的肝細胞を作製することを課題とする。【００１８】
本発明は、また、ヒト多能性幹細胞から、薬剤添加に依存したチトクロームP450酵素活性変化を検出可能とする機能的肝細胞を、無血清かつ無フィーダーの環境下で、ヒト多能性幹細胞の株間差なく、安定に作製する技術を提供することを課題とする。【００１９】
本発明は、また、テイラーメイド医療も鑑み、任意の個人の体細胞から、センダイウイルスベクターにより外来遺伝子のゲノム挿入を来たすことなく樹立されたヒトiPS細胞から、薬剤添加に依存したチトクロームP450酵素活性変化を検出可能とする機能肝細胞を、無血清かつ無フィーダーの環境下で株間差なく安定に作製するための技術の提供を通して、薬剤の肝毒性に関する個人差をインビトロで評価するためのシステムを提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、ヒト多能性幹細胞からの肝細胞分化誘導培養において、あらかじめ適切な密度に播種されたヒト多能性幹細胞を調製しておくことが鍵となることを見いだした。
具体的には、ヒト多能性幹細胞の各集塊が、互いに丁度接する密度が最適であることを見いだした。これにより、従来は作製が非常に困難であり、株間によりばらつきも大きかったヒト多能性幹細胞からの肝細胞分化が、高効率かつ株間差なく安定に実施可能となった。【００２１】
本発明者らは、また、ヒト多能性幹細胞からの肝細胞分化誘導培養において、従来行われてきた血清または血清代替物の添加が、分化誘導効率を著しく阻害することを見いだした。
血清及び血清代替物の欠如は、一方で、ヒト多能性幹細胞の生存性を顕著に低下させる。そのため、ヒト多能性幹細胞からの肝細胞分化誘導培養においては、血清または血清代替物が存在しても欠損しても、分化誘導効率は著しく低くかつ不安定になるというジレンマがあることを見いだした。
この問題を解決するために、本発明者らは、ヒト多能性幹細胞からの肝細胞分化誘導効率を低下させることなく、かつ生存性を高めるためには、分化誘導初期ステップにおいて、培養系にヒトリコンビナント・アルブミンを添加することが、極めて有効であることを見いだした。【００２２】
本発明者らは、また、マウス発生において、肝臓と膵臓の共通祖先からの肝臓分化の促進因子として知られていたソニックヘッジホッグ（SHH）蛋白を、ヒト多能性幹細胞からの肝細胞化誘導培養系に添加することが、分化誘導の効率化と安定化に有効であることを見いだした。【００２３】
本発明者らは、また、分化誘導開始前に、あらかじめ未分化状態にあるヒト多能性幹細胞から、効率よく、かつ細胞にダメージを与えることなく、フィーダー細胞（マウス胎児線維芽細胞）を除去する方法として、沈降速度差を利用した分離が有効であることを見いだした。これにより、ヒト多能性幹細胞から、速やかに無フィーダー環境下で、効率よく肝細胞分化誘導を実施することが可能となった。【００２４】
これらの知見を基に、本発明は、次の構成を備える。
すなわち、本発明の多能性幹細胞由来高機能肝細胞の製造方法は、多能性幹細胞を用いて高機能肝細胞を製造する方法であって、工程(A)、(B)を含む方法により、多能性幹細胞から多能性幹細胞由来原始内胚葉を得て、工程(C)を含む方法により、多能性幹細胞由来原始内胚葉から肝前駆細胞を得て、工程(D)を含む方法により、肝前駆細胞から高機能肝細胞を得ることを特徴とする。
(A)無血清かつ無フィーダー環境下で培養する工程
(B)アルブミンと少なくとも一種のサイトカインの存在下で培養する工程
(C)SHHまたはSHHアゴニストと、少なくとも一種のサイトカインとの存在下で培養する工程
(D)少なくとも一種のサイトカインの存在下で培養して成熟させる工程【００２５】
また、本発明の多能性幹細胞由来原始内胚葉の製造方法は、多能性幹細胞を用いて多能性幹細胞由来原始内胚葉を製造する方法であって、工程(A)、(B)を含む方法により、多能性幹細胞から多能性幹細胞由来原始内胚葉を得ることを特徴とする。
(A)無血清かつ無フィーダー環境下で培養する工程
(B)アルブミンと少なくとも一種のサイトカインの存在下で培養する工程【００２６】
ここで、工程(A)において、多能性幹細胞をその各集塊が互いに接する密度に播種してもよい。【００２７】
工程(A)において、沈降速度差による分離によってフィーダー細胞を除去してもよい。【００２８】
工程(B)において、アルブミンにヒトリコンビナント・アルブミンを用いてもよい。【００２９】
また、本発明の肝前駆細胞の製造方法は、原始内胚葉を用いて肝前駆細胞を製造する方法であって、工程(C)を含む方法により、原始内胚葉から肝前駆細胞を得ることを特徴とする。
(C)SHHまたはSHHアゴニストと、少なくとも一種のサイトカインとの存在下で培養する工程【００３０】
ここで、工程(C)において、原始内胚葉に多能性幹細胞由来原始内胚葉を用いてもよい。【００３１】
また、本発明の高機能肝細胞の製造方法は、肝前駆細胞を用いて高機能肝細胞を製造する方法であって、工程(D)を含む方法により、肝前駆細胞から高機能肝細胞を得ることを特徴とする。
(D)少なくとも一種のサイトカインの存在下で培養して成熟させる工程【００３２】
以上において、iPS細胞にセンダイウイルスベクターにより樹立されたiPS細胞を用いてもよい。【００３３】
多能性幹細胞にヒト多能性幹細胞を用いてもよい。【００３４】
また、本発明の多能性幹細胞由来高機能肝細胞は、多能性幹細胞を用いて製造される高機能肝細胞であって、工程(A)、(B)を含む方法により、多能性幹細胞から多能性幹細胞由来原始内胚葉を得て、工程(C)を含む方法により、多能性幹細胞由来原始内胚葉から肝前駆細胞を得て、工程(D)を含む方法により、肝前駆細胞から得られることを特徴とする。
(A)無血清かつ無フィーダー環境下で培養する工程
(B)アルブミンと少なくとも一種のサイトカインの存在下で培養する工程
(C)SHHまたはSHHアゴニストと、少なくとも一種のサイトカインとの存在下で培養する工程
(D)少なくとも一種のサイトカインの存在下で培養して成熟させる工程【００３５】
また、本発明の多能性幹細胞由来高機能肝細胞は、多能性幹細胞を用いて製造される高機能肝細胞であって、Dexamethazone添加時のチトクロームP450酵素活性値がHepaRG細胞の２倍以上であり、ICG取込及び放出活性を有し、PAS染色陽性であり、A1ATを発現し、胆管上皮細胞にも分化可能であることを特徴とする。【００３６】
また、本発明の多能性幹細胞由来原始内胚葉は、多能性幹細胞を用いて製造される多能性幹細胞由来原始内胚葉であって、工程(A)、(B)を含む方法により、多能性幹細胞から得られることを特徴とする。
(A)無血清かつ無フィーダー環境下で培養する工程
(B)アルブミンと少なくとも一種のサイトカインの存在下で培養する工程【００３７】
また、本発明の肝前駆細胞は、原始内胚葉を用いて製造される肝前駆細胞であって、工程(C)を含む方法により、原始内胚葉から得られることを特徴とする。
(C)SHHまたはSHHアゴニストと、少なくとも一種のサイトカインとの存在下で培養する工程【００３８】
また、本発明の高機能肝細胞は、肝前駆細胞を用いて製造される高機能肝細胞であって、工程(D)を含む方法により、肝前駆細胞から得られることを特徴とする。
(D)少なくとも一種のサイトカインの存在下で培養して成熟させる工程【００３９】
以上において、多能性幹細胞がES細胞またはiPS細胞であってもよい。【００４０】
多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞であってもよい。【００４１】
また、本発明の薬剤代謝の試験方法は、上述のいずれかに記載の多能性幹細胞由来高機能肝細胞を用いて薬剤の代謝を定量することを特徴とする。【００４２】
また、本発明の薬剤毒性の試験方法は、上述のいずれかに記載の多能性幹細胞由来高機能肝細胞を用いて薬剤による細胞死を定量することを特徴とする。
【発明の効果】
【００４３】
本発明により、多能性幹細胞から高品質な機能的肝細胞を安定に作製する技術を提供することができた。【００４４】
また本発明により、ヒト多能性幹細胞から、薬剤添加に依存したチトクロームP450酵素活性変化を検出可能とする機能的肝細胞を、無血清かつ無フィーダーの環境下で、ヒト多能性幹細胞の株間差なく、安定に作製することができた。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】SeV-iPS細胞における形態変化を示す顕微鏡写真
【図２】SeV-iPS細胞におけるSSEA4,OCT4の各未分化マーカーの発現を示すFACSスキャン結果のグラフ
【図３】SeV-iPS細胞におけるSSEA4,OCT3/4, Nanogの各未分化マーカーの発現を示す免疫染色写真
【図４Ａ】SeV-iPS細胞におけるSeVベクター由来外来遺伝子除去を示す電気泳動写真
【図４Ｂ】SeV-iPS細胞におけるSeVベクター由来外来遺伝子除去を示す顕微鏡写真
【図５】ヒトiPS細胞（#40株）由来肝細胞の位相差顕微鏡写真
【図６】肝細胞マーカー検出用のRT-PCR用プライマーの表
【図７】多能性幹細胞より分化誘導した肝細胞のRT-PCRの電気泳動写真
【図８】多能性幹細胞より分化誘導した肝細胞の定量RT-PCRのグラフ
【図９】多能性幹細胞より分化誘導した肝細胞の免疫染色による写真
【図１０】多能性幹細胞より分化誘導した肝細胞のWestern Blottingによる写真
【図１１】多能性幹細胞より分化誘導した肝細胞のPAS染色による顕微鏡写真
【図１２】多能性幹細胞より分化誘導した肝細胞のICG取り込みと放出を示す顕微鏡写真
【図１３】多能性幹細胞より分化誘導した肝細胞のチトクロームP450活性を示すグラフ
【図１４Ａ】多能性幹細胞より分化誘導した肝細胞の顕微鏡写真
【図１４Ｂ】多能性幹細胞より分化誘導した肝細胞の顕微鏡写真
【図１４Ｃ】多能性幹細胞より分化誘導した肝細胞の顕微鏡写真
【図１５】（Ａ）（Ｂ）ヒト胚性幹細胞由来肝細胞、未分化ヒト胚性幹細胞を用いた薬剤毒性試験を示すグラフ、（Ｃ）（Ｄ）ヒトiPS細胞由来肝細胞、未分化ヒトiPS細胞を用いた薬剤毒性試験を示すグラフ、（Ｅ）（Ｆ）ヒトSeV-iPS細胞由来肝細胞、未分化ヒトSeV-iPS細胞を用いた薬剤毒性試験を示すグラフ、（Ｇ）（Ｈ）HepaRG細胞、HepG2細胞を用いた薬剤毒性試験を示すグラフ
【図１６】D-GalNの肝細胞毒性に関する特異性を示すグラフ
【図１７】（Ａ）ヒトiPS細胞由来肝細胞（#40）の形態を示す顕微鏡写真、（Ｂ）ヒト胚性幹細胞由来肝細胞（KhES-1）の形態を示す顕微鏡写真
【図１８】（Ａ）ヒト人工多能性幹細胞由来肝細胞におけるEpCAM及びα-FPの免疫染色による写真、（Ｂ）ヒト人工多能性幹細胞由来肝細胞におけるBrdU及びKi67の免疫染色による写真、（Ｃ）ヒト人工多能性幹細胞由来肝細胞におけるAlbの免疫染色による写真、（Ｄ）ヒト人工多能性幹細胞由来肝細胞におけるAATの免疫染色による写真、（Ｅ）ヒト人工多能性幹細胞におけるEpCAM及びα-FPの免疫染色による写真、（Ｆ）ヒト人工多能性幹細胞におけるBrdU及びKi67の免疫染色による写真
【図１９】（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）（Ｄ）ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞より誘導した肝細胞中の肝幹/前駆細胞集団の継代培養後の顕微鏡写真、（Ｅ）α-FP、TDO2、AATの発現を示すRT-PCRの電気泳動写真
【発明を実施するための形態】
【００４６】
以下に、本発明の実施形態を、図面に示す実施例を基に説明する。なお、実施形態は下記の例示に限らず、本発明の趣旨から逸脱しない範囲で、前記文献など従来公知の技術を用いて適宜設計変更可能である。
【００４７】
本発明による高機能肝細胞は、多能性幹細胞を用いて製造される高機能肝細胞であって、工程(A)、(B)を含む方法により、多能性幹細胞から多能性幹細胞由来原始内胚葉を得て、工程(C)を含む方法により、多能性幹細胞由来原始内胚葉から肝前駆細胞を得て、工程(D)を含む方法により、肝前駆細胞から得られる。
(A)無血清かつ無フィーダー環境下で培養する工程
(B)アルブミンと少なくとも一種のサイトカインの存在下で培養する工程
(C)SHHまたはSHHアゴニストと、少なくとも一種のサイトカインとの存在下で培養する工程
(D)少なくとも一種のサイトカインの存在下で培養して成熟させる工程
【００４８】
多能性幹細胞から多能性幹細胞由来高機能肝細胞を得るには、典型的には、多能性幹細胞をマウス胎児線維芽細胞等のフィーダー細胞から分離した後、Matrigel（登録商標）（BD社製）等でコートした培養皿の上に、多能性幹細胞の各細胞集塊が互いに丁度接する密度で播種したうえで、未分化維持用培地で３日程度培養してから、中内胚葉分化培地、胚体内胚葉分化培地、肝前駆細胞分化誘導培地、肝細胞成熟促進培地、を用いて順次培養することで行う。
多能性幹細胞からの多能性幹細胞由来高機能肝細胞の作製期間は、20〜30日程度である。
【００４９】
各分化培地及び成熟促進培地は、汎用の基礎培地や無血清培養用培地に、少なくとも一種のサイトカインを10ng/ml〜200ng/ml程度、または少なくとも一種のホルモンを0.1μM程度添加した培地である。培地は、所望により、細胞の維持及び分化に悪影響を及ぼさない限り、適切な他の添加物を含有していてよい。汎用の基礎培地としてはDMEM、DMEM/F12、RPMI、IMDM等が上げられる。無血清培養用培地としてはエスクロンSF-B（三光純薬社製）、エスクロンSF-03（三光純薬社製）、ASF-104（味の素社製）、ASF-104N（味の素社製）、X-VIVO 10（Lonza社製）、X-VIVO 15（Lonza社製）等が上げられる。
【００５０】
分化培地及び成熟促進培地の基本培養成分としては、ヒト多能性幹細胞から肝細胞への分化を誘導するのに適した培地であればよく、例えば、Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640等が挙げられる。
分化誘導における培養条件は、用いられるヒト多能性幹細胞の種類により適宜設定することができるが、例えば、37℃、5%体積炭酸ガス培養装置（5%CO2インキュベータ）の条件等が挙げられる。
【００５１】
以下、詳細に本発明を説明する。
本発明で用いる多能性幹細胞由来胚体内胚葉とは、多能性幹細胞由来の胚体内胚葉である。胚体内胚葉とは初期発生において原腸貫入後に形成される中内胚葉に由来する内胚葉成分であり、胎児の消化管組織の形成に寄与し、SOX17やFOXA2等の転写因子を発現する。胚体内胚葉は、工程(A)、(B)を含む方法で得ることができる。
(A)無血清かつ無フィーダー環境下で培養する工程
(B)アルブミンと少なくとも一種のサイトカインの存在下で培養する工程
【００５２】
以下、各工程について説明する。
(A)無血清かつ無フィーダー環境下で培養する工程：
多能性幹細胞とは多能性を有する幹細胞を指し、例えばES細胞、iPS細胞、精巣幹細胞、成体幹細胞、Muse細胞などが挙げられる。
なお、出発原料の多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞であってよい。この場合、多能性幹細胞は、ヒトに由来し、多能性分化能を保持する細胞群である。これには、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞、ヒト精巣幹細胞、ヒト成体幹細胞、ヒトMuse細胞等が含まれる。
【００５３】
出発原料である多能性幹細胞の入手方法及び樹立方法は公知である。例えば、ヒトES細胞の場合、文部科学省から許可を得た上で、国内樹立機関（京都大学、国立成育医療研究センター）からの分与や、国外施設（私企業、大学等）からの分与または購入が可能である。またヒトiPS細胞については、センダイウイルス（SeV）ベクターを用いる方法が好ましく、例えば市販のヒト線維芽細胞等を、リプログラム因子発現ユニットを搭載したセンダイウイルスベクターが添加された培地で培養することで樹立される。リプログラム因子発現ユニットを搭載したセンダイウイルスベクターとしては、例えばCytoTune-iPS（ディナベック株式会社製）等が挙げられる。レトロウイルスベクターを用いて作製したヒトiPS細胞は、理化学研究所バイオリソースセンターからの購入や、京都大学や国立成育医療研究センターからの分与が可能である。
【００５４】
工程(A)で使用する未分化維持培地は、汎用の未分化維持培地を用いてもよいが、より好ましくは線維芽細胞増殖因子２（FGF2）等のサイトカインが添加されていない未分化維持培地である。
無血清かつ無フィーダー環境下で培養するとは、動物血清及びヒト血清を含まない培地を用いて、当該の多能性幹細胞以外の細胞種（例えばマウス胎児線維芽細胞）が共存しない環境下で培養することである。このとき、多能性幹細胞の培養密度は、多能性幹細胞の各細胞集塊が互いに丁度接する密度であることが最も好ましい。
これよりも低密度の場合は、分化誘導初期に顕著な細胞死が惹起されるか、生存細胞が残る場合でも、その殆どは樹状突起の多い非内胚葉系細胞に分化することとなる。またこれよりも高密度の場合は、分化後期に形成される内胚葉由来組織に特徴的な三次元的構築を示す領域から顕著な細胞死が誘導されることとなる。
【００５５】
(B)アルブミンと少なくとも一種のサイトカインの存在下で培養する工程：
アルブミンはヒトのリコンビナントアルブミンが好ましく、アルブミンの量は0.1〜1%程度、好ましくは0.3 %程度である。
工程(B)で用いるサイトカインの例は、Wnt3AやActivinA等である。サイトカインの量は、例えば、Wnt3Aは10〜50ng/mL程度、好ましくは25ng/ml程度、ActivinAは10〜100ng/ml程度、好ましくは100ng/ml程度である。
工程(A)により調製された未分化多能性幹細胞を、ヒトリコンビナントアルブミン、Wnt3A、Activin Aを含む培地を用いて、37℃、5% CO2インキュベータにて１日程度培養することで多能性幹細胞由来中内胚葉を得ることができる。これをさらにActivin Aと血清代替品を含む培地を用いて、37℃、5% CO2インキュベータにて１日程度培養することで、多能性幹細胞由来胚体内胚葉を得ることができる。また血清代替品としては、KnockOut(登録商標）Serum Replacement(Life  Technologies社製)等が挙げられる。
【００５６】
多能性幹細胞由来胚体内胚葉が出来たことは、SOX17やFOXA2等の胚体内胚葉形成の鍵となる転写因子の発現誘導をRT-PCR等によって確認できる。
【００５７】
本発明で用いる肝前駆細胞とは、原始腸管から肝細胞へのコミットメントが起きた細胞であり、工程(C)を含む方法で得ることができる。
【００５８】
(C)SHHまたはSHHアゴニストと、少なくとも一種のサイトカインとの存在下で培養する工程：
SHHまたはSHHアゴニストとは、それぞれ、ソニックヘッジホッグ・パスウェイを活性化するリコンビナントペプチドまたは薬剤である。SHHとしては、ヒトのソニックヘッジホッグ蛋白のN末ペプチド断片（Cys24-Gly197）、SHHアゴニストとしてはchlorobenzothiophene含有ヘッジホッグアゴニスト（SAG）が挙げられる。ソニックヘッジホッグN末ペプチド断片の濃度は、例えば、100 〜400 ng/ml、SAGの濃度は、例えば、1nM 〜500nMであり、好ましくは、ソニックヘッジホッグN末ペプチド断片の濃度は200 ng/ml程度、SAGの濃度は100 nM程度である。
【００５９】
工程(C)で用いるサイトカインの例は、線維芽細胞増殖因子2（FGF2）、骨形成因子4（BMP4）、肝細胞増殖因子（HGF）等である。サイトカインの量は、例えば、FGF2は5〜50ng/ml、BMP4は5〜50ng/ml、HGFは5〜50ng/mlであり、好ましくはFGF2は10ng/ml程度、BMP4は20ng/ml程度、HGFは20ng/ml程度である。具体的には、工程(B)で得られた多能性幹細胞由来胚体内胚葉を、例えば、2%の血清代替品を含むRPMI1640等の基礎培地にFGF2、BMP4、SHHを添加した培養液で5日間程度培養した後、例えば、2%の血清代替品を含むRPMI1640等の基礎培地にFGF2、BMP4、HGFを添加した培養液で4日間程度培養することで多能性幹細胞由来肝前駆細胞を得ることができる。ここで、前半ではSHHを添加した培養液を用い、後半ではSHHを添加しない培養液を用いているが、後半でもSHHを添加した培養液を用いてもよい。また、各培養期間において、最低１回の培地交換を行うことが好ましい。
【００６０】
多能性幹細胞由来肝前駆細胞が作製されたことは、HNF4a等の肝原基形成の鍵となる転写因子や、αフェトプロテインなどの肝原基マーカー遺伝子の発現誘導をRT-PCRやWestern blotting等によって確認できる。
【００６１】
本発明の多能性幹細胞由来高機能肝細胞は、工程(D) を含む方法で得ることができる。
【００６２】
(D)少なくとも一種のサイトカインの存在下で培養して成熟させる工程：
ここで用いるサイトカイン及びホルモンの例は、オンコスタチンM（OSM）やDexamethazone等である。用いる量は、例えば、OSMは10〜50ng/ml、Dexamethazoneは0.05〜0.5μMであり、好ましくはOSMは25ng/ml程度、Dexamethazoneは0.1μM程度である。
工程(C)で得られた多能性幹細胞由来肝前駆細胞を、例えば、2%の血清代替品を含むRPMI1640等の基礎培地にOSMとDexamethazoneを添加した培養液で、２週間程度培養することで多能性幹細胞由来高機能肝細胞を得ることができる。なお、この培養期間において、３日に１回程度の頻度で培地交換を行うことが好ましい。
【００６３】
このようにして得られた多能性幹細胞由来高機能肝細胞は、高濃度（10μM程度）のDexamethazoneを添加した際のチトクロームP450酵素活性値がHepaRG細胞のそれの２倍以上であり、インドシアニングリーン（ICG）取込及び放出活性を有し、Periodic Acid Schiff (PAS)染色陽性であり、α1- antitrypsin（A1AT）を発現し、胆管上皮細胞にも分化可能である多能性幹細胞由来高機能肝細胞である。
【００６４】
高濃度Dexamethazone添加時のチトクロームP450酵素活性値がHepaRG細胞の２倍以上であるということは、汎用のチトクロームP450酵素活性検出キット等を用いた試験により提示することができる。例えば、プロメガ社のp450-GloTM  CYP  Assay  kitのキットを用いれば、チトクロームP450酵素活性はルミノメータによる光量として実測されるため、多能性幹細胞由来高機能肝細胞とHepaRG細胞のチトクロームP450酵素活性値の比を光量比として計算することができる。
【００６５】
ICG取込活性を有することは、多能性幹細胞由来高機能肝細胞に、例えば、1 mg/mlのICGを添加し、37℃、5% CO2インキュベータにて30分培養した後、PBS等の無色のICG不含バッファーで洗浄したうえで、光学顕微鏡で観察すると、多能性幹細胞由来高機能肝細胞がICG色素により緑色に染色されていることにより確認できる。
【００６６】
ICG放出活性を有することは、上記のICG染色細胞を、肝細胞成熟促進培地を用いて、例えば、37℃、5% CO2インキュベータにて6時間培養した後に光学顕微鏡で観察すると、細胞がICG色素を放出して無色になっていることで確認できる。
【００６７】
PAS染色陽性であることは、多能性幹細胞由来高機能肝細胞を10%程度のホルマリンで固定した後に、汎用の方法でPAS染色を施し、光学顕微鏡による観察で細胞質内の紫紅色顆粒を検出することで、多能性幹細胞由来高機能肝細胞内のグリコーゲン顆粒の存在が確認できる。
【００６８】
A1ATを発現していることは、細胞からRNAを調製して、A1AT特異的プライマーを用いたRT-PCRを行う、細胞溶解液を調製してA1AT特異的抗体を用いてWestern blottingを行う、細胞を固定してA1AT特異的抗体を用いて免疫染色を行う、の３つの試験がいずれもが陽性になることで確認できる。
【００６９】
胆管上皮細胞にも分化可能であることは、工程(D)で作製された細胞の中に、高機能肝細胞とともに、オーバル細胞マーカーであるEpCAMが陽性の細胞集団、及び胆管上皮細胞マーカー（γ-GTP、ALP1, LAP等）が陽性の細胞集団が存在することで判断される。
【００７０】
胆管上皮細胞による胆管構造の形成は、電子顕微鏡による観察において、繊毛上皮細胞からなる管状構造物がヘリング管に連結して検出されることで確認できる。
【００７１】
こうして得られた肝細胞は多能性幹細胞由来高機能肝細胞であり、実質上、異種動物細胞の混入や異種動物由来ウイルスの感染がないという優れた性質を有する。このようにして得られる多能性幹細胞由来高機能肝細胞は、機能的肝細胞であり、高濃度Dexamethazone添加時のチトクロームP450酵素活性値がHepaRG細胞のそれの２倍以上であり、高濃度Dexamethazone添加に伴うチトクロームP450酵素活性値の上昇が統計的有意差をもって検出され、ICG取込及び放出活性を有し、PAS染色陽性であり、A1ATを発現し、胆管上皮細胞にも分化可能である、という特徴を具備する。
また本発明で作製された多能性幹細胞由来高機能肝細胞は、多能性幹細胞の株に依存せず、常に安定した品質を保証するものであることが大きな特長となっている。その点で、ドナーから採取された肝生検材料及びその培養品（初代培養肝細胞）におけるロット間差の問題は完全に克服されたものとなっている。また肝生検材料及び初代培養肝細胞は、長期的な培養により顕著な機能低下を来たすため需要に合わせた調達は極めて困難であるが、多能性幹細胞由来高機能肝細胞は需要に合わせた調達が容易である。
【００７２】
得られた多能性幹細胞由来高機能肝細胞は、薬剤の代謝や毒性の試験に用いることができる。
例えば、代謝の試験に用いる場合、目的薬剤を多能性幹細胞由来高機能肝細胞に添加して、例えば、37℃、5% CO2インキュベータにて16時間程度培養した後、汎用のチトクロームP450酵素活性検出キットを用いた試験を行うことで実施される。例えば、プロメガ社のp450-GloTM  CYP  Assay  kitのキットを用いる場合、50μlの培養上清を用いればアッセイが可能であるため、多能性幹細胞の分化誘導後に時間経過を追って、チトクロームP450酵素活性を評価することが可能である。
【００７３】
毒性の試験に用いる場合、目的薬剤を多能性幹細胞由来高機能肝細胞に添加して、例えば、37℃、5% CO2インキュベータにて培養し、時間経過を追って、汎用の細胞死測定技術により細胞毒性を評価ができる。汎用の細胞死測定技術としては、電気泳動による染色体DNA分断化の検出、フローサイトメトリーを用いた染色体DNA減少細胞の検出、Annexin Vを用いたアポトーシス細胞の検出、Propidium  iodide(PI)等の死細胞染色剤を用いた死細胞の検出などが挙げられる。
【００７４】
さらに、肝細胞への毒性と、胆管上皮細胞への毒性とを区別するは、目的薬剤を多能性幹細胞由来高機能肝細胞に添加して、例えば、37℃、5% CO2インキュベータにて培養し、時間経過を追って培養上清を回収して、肝細胞に特徴的である酵素群（glutamic oxaloacetic transaminase;GOT，glutamic  pyruvic transaminase;GPT等）、並びに、胆管上皮細胞に特徴的な酵素群（γ-glutamyl  transpeptidase;γ-GTP,leucine aminopeptidase;LAP,1型alkaline  phosphatase(ALP1)等）を汎用の方法で測定することで実施される。
【００７５】
多能性幹細胞由来肝細胞を用いた薬物の毒性試験を行う場合について、より詳しく方法を例示すると、次のような方法で好ましく行うことができる。
まず、多能性幹細胞由来肝細胞の培養上清に、薬物を様々な濃度で添加する（例：アセトアミノフェン 5〜10mM等）。続いて、例えば、37℃、5%CO2インキュベータにて培養し、時間経過を追って細胞生存性及び細胞死の状況を測定することで、薬物の毒性が定量的に評価される。
ここで細胞生存性の定量法としては、テトラゾリウム塩を基質に用いた汎用のミトコンドリア呼吸能測定法（MTTアッセイ、WSTアッセイ等）などが挙げられる。
【００７６】
細胞死の定量法としては、１）用のアポトーシス検出技術（Annexin Vをプローブとするフローサイトメトリーによるアポトーシス細胞の検出法、PIによる細胞DNA含有量の測定（=sub  G1分画の測定）、アガロース電気泳動による染色体由来低分子DNAの定量、TUNELアッセイ等）、２）汎用の死細胞検出技術（フローサイトメトリーによるPI陽性細胞の測定、コメットアッセイによる染色体DNA分解量の測定）、３）汎用法による培養上清中の逸脱酵素（glutamic  oxaloacetic transaminase;GOT，glutamic  pyruvic  transaminase;GPT,γ-glutamyl  transpeptidase;γ-GTP,leucine  aminopeptidase;LAP,alkaline  phosphatase(ALP) 等）の測定が挙げられる。
こられのうち、培養上清中の逸脱酵素測定は、肝細胞毒性と胆管細胞毒性を分けて測定することができる点で特に優れている。すなわち、肝細胞に特徴的な酵素群（GOT,GPT）と，胆管上皮細胞に特徴的な酵素群（γ-GTP,LAP,1型  ALP）のどちらが上昇しているかを調べることで、肝細胞毒性と胆管細胞毒性と区別して評価できる。
【実施例】
【００７７】
[実施例1]センダイウイルスベクターを用いたヒト人工多能性幹細胞の誘導：
まず、ヒト新生児包皮由来線維芽細胞(BJ)(ATCC（http://www.atcc.org）,CRL-2522)5.0x105（個）を10% FBS含有DMEM(Life  Technologies,Inc.,Grand  Island,NY,USA)、37℃、5%CO2インキュベータにて培養した。培養後、MOI=3の濃度の下記（a）〜（d）のベクターを培養した細胞に感染させた。
（a）SeV18+ OCT3/4／TSΔFベクター
（b）SeV18+ SOX2／TSΔFベクター
（c）SeV18+ KLF4／TSΔFベクター
（d）SeVHNL c-MYC／TS15ΔFベクター【００７８】
ベクターを感染後、翌日に10%FBS含有DMEMで培地交換を行った。その後、6日間、37℃、5 % CO2インキュベータにて培養した。その後、ゼラチンコート10cm培養皿に用意したX線照射処理済みのマウス胎児線維芽細胞（MEF）6.0×105（個）の上で、Accutaseで剥がした上記導入細胞の5.0×104（個）から5.0×105（個）を培養した。翌日、10%FBS含有DMEMから霊長類ES細胞用培地（ReproCELL  Inc.,Toyko,Japan）（5ng/mlになるようFGF2を添加した）に培地交換し、3% CO2インキュベータで培養した。培地交換は毎日行った。【００７９】
図１は、BJ細胞由来ヒト人工多能性幹細胞（SeV-iPS細胞）における形態変化を示す顕微鏡写真である。
コロニーは数日後から現れ、20日程度培養することで、ヒト胚性幹細胞様のコロニーが出現した。図１の写真の通り、誘導前のBJ細胞と明らかに異なるヒト胚性幹細胞に見られるのと同様の扁平なコロニーが見られた。このヒト胚性幹細胞様のコロニーは、従来報告されている外観のものと同様であった（非特許文献１０）。これらのコロニーは、マイクロピペットで単離した後、新しいMEF上で培養した。そしてヒト多能性幹細胞用剥離液（0.25% trypsin(Life  Technologies社製),1mg/ml  collagenase  IV(和光純薬工業株式会社製),20%KnockOut（登録商標）Serum  Replacement(Life Technologies社製),1mM CaCl2）を用いた剥離操作を介して、安定した継代・増殖培養が可能であった。【００８０】
上記実験により得られた細胞が、多能性幹細胞に特徴的なマーカーを発現しているか否かを明らかにするために、更に下記実験を行った。【００８１】
[実施例２]センダイウイルスベクターを用いたヒト人工多能性幹細胞の未分化維持の確認：
フローサイトメーター（FACSCalibur（登録商標））（BD Biosciences）を用いて、ヒト多能性幹細胞の未分化マーカーであるSSEA4,OCT3/4の発現を調べた。
具体的には、SSEA4については、実施例１で得られたSeV-iPS細胞を、多能性幹細胞用剥離液（0.25% trypsin(Life  Technologies,Inc.),1mg/ml  collagenase  IV(和光純薬工業株式会社製),20% KnockOut（登録商標）Serum  Replacement(Life Technologies社製),1mM CaCl2）で回収した後、Trypsin/EDTA液（SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO,USA）を用いて分散させたうえで、FACS  buffer(X1 PBS,0.05% NaN3,5% FBS)に浮遊させた。ここに2%Mouse BD Fc Block(BD Biosciences)を添加した後、抗ヒトSSEA4  phycoerythrin conjugated mouse  IgG(R&D,Minneapolis,MN,USA)をX  1/10添加して氷上にて60分静置後、FACS  bufferで洗浄し、フローサイトメーターにてSSEA4発現を解析した。
また、OCT3/4発現については、SeV-iPS細胞を回収後、FIX & PERM CELL PERMEABILIZATION KIT(Caltag  Laboratories,An-Der-Grub,Austria)を用いて細胞の固定・細胞膜透過処理を行ったうえで、2% Mouse BD Fc Block(BD Biosciences)と抗ヒトOCT3/4  phycoerythrin conjugated rat IgG(R&D, Minneapolis, MN)X 1/10を添加し、氷上にて60分静置後、FACS  bufferで洗浄し、フローサイトメーターでOCT3/4発現を解析した。
その結果、図２のFACSスキャン結果に示すように、実施例１で得られたSeV-iPS細胞は、SSEA4, OCT4の各未分化マーカーをいずれも高発現していることが確認された。OCT3についても同様であった。
なお、上段のグラフは、SSEA4, OCT4それぞれ、左がコントロール抗体、右が目的抗体（抗SSEA4抗体、抗OCT4抗体）での染色データである。コントロール抗体に比して目的抗体での染色データがFL2増加方向にシフトしているので、大多数の細胞において目的蛋白の発現が認められた。下段のグラフは、上段のグラフをヒストグラム表示したものであり、コントロール抗体に比して目的抗体での分布曲線がFL2増加方向にシフトしていることが明らかである。【００８２】
また、ヒト多能性幹細胞の未分化マーカーであるSSEA4、OCT3/4、Nanogの発現を免疫染色法でも確認した。
具体的には、実施例１で得られたSeV-iPS細胞をアセトン／メタノール（1:3）で固定し、0.1% Triton-X-100 / PBSにより細胞膜透過処理を施したうえで、抗ヒトSSEA4抗体（ES Cell Marker Sample Kit）（Millipore
Co,Bedford,MA,USA）、抗ヒトOCT3/4抗体（ES  Cell  Marker  Sample  Kit）（MilliporeCo,）、抗ヒトNanog抗体（ReproCELL Inc,Tokyo,Japan）X1/100を用いて一次抗体反応を行った。なお、抗ヒトSSEA4抗体、抗ヒトOCT3/4抗体については、Kitのプロトコールにしたがって行った）。そして、Alexa Fluor 488標識抗ウサギIgG抗体（Life Technologies,Inc）X 1/2000を用いて二次抗体反応を行った後、蛍光顕微鏡による観察を行った。
その結果、図３の免疫染色結果に示すように、実施例１で得られたSeV-iPS細胞は、SSEA4, OCT4, Nanogの各未分化マーカーをいずれも高発現していることが確認された。なお、OCT3についても同様であった。【００８３】
[実施例３]SeVベクター由来外来遺伝子の除去：
実施例1で得られたSeV-iPS細胞よりSeVベクター由来外来遺伝子が除去された株を得るためにクローニングを行った。
SeVベクター由来外来遺伝子の除去の目安として、抗SeV抗体（Medical & Biological Laboratories  Co.,Ltd.,Nagoya,Japan）による免疫染色を行った。SeV-iPS細胞を10%マイルドホルム（WAKO Pure Chemical  Industries,Osaka,Japan）で固定し、一次抗体として抗SeV抗体、二次抗体としてAlexa Fluor 488標識抗ウサギIgG抗体（Life Technologies,Inc.）を用いた染色を行った後、蛍光顕微鏡による観察を行った。【００８４】
さらに、transgenes及びSeVゲノムを検出するためにreverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)を行った。RTはSuperscript III First-Strand  Synthesis  System for RT-PCR（Life Technologies,Inc.）を用いて行った。PCRはGeneAmpR PCR System 9700(Life  Technologies,Inc.)を用いて、変性（94oCで5分）、増幅（94oCで30秒、55oCで30秒、72oCで30秒、30〜35サイクル）、後伸張（72oCで10分）の各ステップを行った。プライマーは、
OCT3/4(Fw:CCCGAAAGAGAAAGCGAACCAG,Rv:AATGTATCGAAGGTGCTCAA),SOX2(Fw:ACAAGAGAAAAAACATGTATGG,Rv:ATGCGCTGGTTCACGCCCGCGCCCAGG),KLF4(Fw:ACAAGAGAAAAAACATGTATGG,Rv:CGCGCTGGCAGGGCCGCTGCTCGAC),cMYC(Fw:TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG,Rv:TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG),SeV(Fw:GGATCACTAGGTGATATCGAGC),Rv:ACCAGACAAGAGTTTAAGAGATATGTATC)を用いた。
その結果、図４（Ａ）の電気泳動結果及び図４（Ｂ）の顕微鏡写真に示すように、実施例１で得られたSeV-iPS細胞株は、SeV抗原陰性であり、SeVベクター由来外来遺伝子を保持しないことが確認された。そのため、SeV-iPS細胞株は、レトロウイルスベクターで作製されたiPS細胞に比して、臨床的使用、薬剤評価系、病態モデル系への使用にも適する。【００８５】
[実施例４]ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞の維持培養：
ヒト胚性幹細胞（KhES-1）は京都大学・再生医科学研究所より供与された。レトロウイルスベクターを用いて作製したヒト人工多能性幹細胞は、京都大学・iPS細胞研究所（253G1）及び国立成育医療研究センター（#40）より供与された。KhES-1、253G1、#40、SeV-iPS細胞株は、X線照射処理済みのMEF上で、20% Knockout Serum Replacement（KSR）（Life Technologies,Inc.）、5ng/ml FGF2、1% non-essential amino acids  solution、100μM  2-mercaptethanol、2mM L-glutamine含有DMEM/F12（Life Technologies, Inc.）培地を用いて維持培養を行った。【００８６】
[実施例５]ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞からの肝細胞誘導：
肝細胞への分化誘導前に、KhES-1、253G1、#40、SeV-iPS細胞株からMEFを分離・除去するため、剥離液処理により回収された多能性幹細胞の浮遊液を、遠沈管内で30秒程度静置することで多能性幹細胞のみを選択的に沈降させたうえで、マトリゲル（BDBioscience）でコートされた培養皿上で培養した。この際、マトリゲルコート皿上に細胞非接着面が露出しない程度の高密度で多能性幹細胞を播種することが重要である。【００８７】
肝細胞への分化誘導は次の５段階の工程で行った。
（1）100ng/ml アクチビンA、25ng/ml Wnt3A、ヒトリコンビナントアルブミン含有RPMI培地（インビトロジェン）で24時間培養
（2）100ng/ml アクチビンA、0.2% KSR含有RPMI培地で24時間培養
（3）10ng/ml FGF2、20ng/ml  BMP4、200ng/ml SHH、2%  KSR含有RPMI培地で5日間培養
（4）10ng/ml FGF2、20ng/ml  BMP4、20ng/ml HGF、2%  KSR含有RPMI培地で5日間培養
（5）10ng/ml oncostatin M、0.1μM dexamethasone、2%  KSR含有RPMI培地で6〜16日間培養
この５段階の工程で培養を行うことにより、図５の顕微鏡写真に示すように、KhES-1、253G1、#40、SeV-iPS細胞より、内胚葉由来組織に特徴的な三次元的構築、及び肝細胞培養に特徴的とされる多角形構造体を含む肝細胞集団が得られた。なお、図５では、代表的な例として#40の位相差顕微鏡像を示したが、KhES-1、253G1、SeV-iPS細胞についても同様であった。【００８８】
[実施例６]ヒト人工多能性幹細胞より誘導した肝細胞のRT-PCRによる評価：
未分化状態及び、並びに、肝細胞分化誘導したヒト人工多能性幹細胞（253G1）から、TRIzol（LifeTechnologies,Inc.）を用いてtotal  RNAを抽出した。得られた1μgのtotal RNAを用いてRT-PCRを行った。PCRは、変性（94oCで5分）、増幅（94oCで1分、50〜60oCで1分、72oCで30秒、35サイクル）、後伸張（72oCで10分）の各ステップを行った。用いたプライマーを図６の表に示す。
その結果、図７の電気泳動結果に示すように、ヒト人工多能性幹細胞より誘導した肝細胞において、α-FP,アルブミン,A1AT,HNF4α,TAT,CYP3A4,TDO2の遺伝子発現が、分化誘導後の時間経過とともに誘導されることが確認された。【００８９】
[実施例７]ヒト人工多能性幹細胞より誘導した肝細胞のリアルタイムRT-PCRによる評価：
リアルタイムRT-PCR用のtotal RNAをTRIzol（Life Technologies, Inc.）を用いて、肝細胞分化誘導を施行している培養皿上の全ての細胞からtotal RNAを抽出した。得られた1μg のtotal RNAを用いてRTによりcDNAを合成した。このcDNA、TaqMan標的プローブ／プライマー、GAPDHプローブ／プライマー、QuantiTect Multiplex PCR  Master Mix（Qiagen Science,Maryland,USA）を用いてABI PRISM 7900 HT sequence Detection System（Life  Technologies,Inc.）によりduplexリアルタイムRT-PCRを行った。増幅は、50oCで2分、95oCで10分の反応後に、95oCで15秒と60oCで1分の反応を45サイクル繰り返して行った。得られた結果はGAPDHによる標準化を行った。プローブ／プライマーはTDO2 (Assay  ID:Hs00194611_ml)、 Cyp3A4 (Assay  ID:Hs01546612_ml)、TAT (Assay  ID:Hs00356930_ml)を用いた。
その結果、図８のグラフに示すように、ヒト人工多能性幹細胞（253G1）より誘導した肝細胞においてTDO2、CYP3A4、TATの遺伝子発現が肝細胞の成熟に伴って上昇することが観察された。TDO2, TATについては、未分化細胞に比して分化誘導後16日において約2000倍、2.8倍の発現上昇を認めた。またCyp3A4については、HepG2に比して分化誘導後16日目において約566倍の発現上昇を認めた。【００９０】
[実施例８]ヒト胚性幹細胞より誘導した肝細胞の免疫染色による評価：
細胞をアセトン／メタノール（1:3）で固定し、0.1%Triton-X-100/PBSで細胞膜透過処理を行い、抗ヒトα-fetoprotein(α-FP)抗体（Epitomics Inc.,Burlingame,CA,USA）X  1/500、抗アルブミン抗体（DAKO  A/S,Denmark）、抗ヒトα1-antitrypsin(A1AT)抗体（Lifespan  Bioscience,Inc.,Seattle,WA）X  1/500、抗ヒトcytochrome  P450(Cyp)抗体（Abcam  Plc,Cambridge,UK）X  1/2000を用いた一次抗体反応、Alexa  Fluor 488標識抗ウサギIgG抗体（Life  Technologies,Inc）X  1/2000を用いた二次抗体反応を行った後に、細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
その結果、図９の免疫染色結果に示すように、ヒト胚性幹細胞より誘導した肝細胞においてα-FP、アルブミン、A1ATのシグナルが検出された。
なお、図中、緑色は目的蛋白に対する抗体での染色像、青色はDAPIによる核染色像である。核が染色されているものはどれも細胞質が緑に染色されているので、全ての細胞が染色されていることがわかり、目的蛋白の細胞内局在と一個一個の細胞の存在が明確化された。図中、K1-derived HepatocyteのK1は、京都大学で樹立されたヒトES細胞株KhES-1を示す。【００９１】
[実施例９]ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞より誘導した肝細胞のWestern blottingによる評価：
分化誘導した細胞の溶解液を等量のSDS-PAGE用サンプルbufferと混和し、98oCで5分間熱変性した。12%のアクリルアミドゲルでSDS-PAGEを行い、セミドライブロッティング法によりPVDF膜へ転写を行った。5%ミルク/TBS-Tでブロッキングを行い、抗α-FP抗体（Epitomics Inc.）X 1/500、抗アルブミン抗体（DAKO A/S）X 1/20000、抗A1AT抗体（Lifespan  Bioscience）X 1/500、抗Cyp抗体（Abcam Plc）X 1/2000を用いた一次抗体反応、HRP標識抗ウサギIgG (Cell Signaling  Technology,Inc.,Beverly,MA,USA)X 1/2000を用いた二次抗体反応の後に、ECLウェスタンブロッティング検出システム（GE  Healthcare,Fairfield,CT,USA）を用いてX線フィルム（FUJIFILM,RX-U）(Fuji Photo Film  Co.,Ltd.,Tokyo,Japan)にシグナルを感光させた。
その結果、ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞より誘導した肝細胞において、肝細胞に特徴的なタンパクの発現を検出した。代表的な例としてKhES-1のWestern Blotting結果を図１０に示す。肝細胞に特徴的なα-FP、アルブミン、A1AT、CYP3A4のタンパク発現が検出された。なお、初代培養肝細胞（HC）については、入手後に実験に必要な量の細胞を得るために最低数の継代培養をしたが、機能蛋白の発現は消失した。図中、253G1は京都大学で樹立されたヒトiPS細胞株、#40は国立成育医療研究センターで樹立されたヒトiPS細胞株を示す。【００９２】
[実施例１０]ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞より誘導した肝細胞のPAS染色による評価：
肝細胞内のグリコーゲンをPeriodic Acid Schiff (PAS)染色キット（Muto Pure  Chemicals Co. Ltd, Tokyo）を用いて検出した。
10.5%ホルムアルデヒドを用いて、ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞より誘導した肝細胞の室温で固定を行い、1% 過ヨウ素酸で10分処理後、37oCで30分Schiff染色を行った。ヘマトキシリンでカウンター染色を行い、顕微鏡による観察を行った。
その結果、ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞より誘導した肝細胞において、高頻度にPAS染色陽性の細胞が観察された。代表的な例としてKhES-1のPAS染色結果を図１１に示す。図中、K1-derived  HepatocyteのK1、Undifferentiated  hES  K1のhES  K1、K1-derived  HepatocyteのK1は、いずれも京都大学で樹立されたヒトES細胞株KhES-1を示す。【００９３】
[実施例１１]ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞より誘導した肝細胞のICG取込み能と放出能の評価：
肝細胞の解毒能力（異物を処理する能力）をICGの取込みと放出により測定した。
ICG取込みは、肝細胞を1mg/mlのICGと37oCで30分間インキュベートし、PBSで洗浄後に光学顕微鏡で観察することで評価した。ICG放出は、ICG不含培地でさらに6時間培養した後に光学顕微鏡で観察することで評価した。
その結果、ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞より誘導した肝細胞において、ICGの取込みと放出を確認した。代表的な例としてKhES-1の顕微鏡観察結果を図１２に示す。図中、緑色はICGを示す。上段の写真では、細胞領域がICGを取り込んで緑色を呈しているが、６時間培養後の下段の写真では、ICGが細胞外に排出されている。【００９４】
[実施例１２]ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞より誘導した肝細胞のCYP3A4活性の評価：
肝細胞のシトクロムP450 3A4（CYP3A4）活性をp450-GloTM
CYP3A4測定キット（Promega Co.,Madison,WI,USA）を用いて測定した。
50μMのデキサメサゾンあるいは100μMのリファンピシリンで16時間刺激を行った肝細胞の培養上清にCYP3A4の合成基質を加え、4時間後に培養上清を回収して微弱発光測定装置（ルミノメーター）により発光強度を測定した。
その結果、図１３のグラフに示すように、ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞より誘導した肝細胞においてCYP3A4活性が観察された。常に未分化細胞に比して数倍以上の活性値が得られた。センダイウイルスベクターを用いて誘導したヒト人工多能性幹細胞由来の肝細胞ではHepaRG細胞（BIOPREDIC  International,Rennes,France）の8倍以上の活性が観察された。
なお、HepaRG細胞の培養はBIOPREDIC  international社のプロトコールに従って行った。HepG2細胞はヒューマンサイエンス研究資源バンクより、ヒト初代培養成人肝細胞株はDS Pharma Biomedical Co., Ltd. (Osaka, Japan)より購入し、Cell Systems社（Kirkland,WA,USA）のCS-C培地キットを用いて培養した。図中、253G1は京都大学で樹立されたヒトiPS細胞株、#40は国立成育医療研究センターで樹立されたヒトiPS細胞株、SeVはSeVベクターを用いて誘導したiPS細胞株、ES-K1は京都大学で樹立されたヒトES細胞株、CTLはControlの略を示す。【００９５】
[実施例１３]ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞より誘導した肝細胞の電子顕微鏡写真による評価：
多能性幹細胞由来肝細胞を、2.5%グルタールアルデヒド液で固定した後、BML  Inc.(Tokyo,Japan)にて、2% 四酸化オスミウム液で後固定、エポン樹脂への包埋、ウルトラミクロトームで70nm厚の切片作製を行った後、電子顕微鏡により観察した。
その結果、図１４（Ａ）（Ｂ）に示すように、肝細胞に特徴的な絨毛に富んだ細胞が検出され、さらにそれらにおいて肝細胞に特異的な構造、即ち、細胞質のグリコーゲンα顆粒（ロゼット形成しているグリコーゲン顆粒）、及び、細胞間境界の微細胆管とそれに続く密着結合とデスモゾームが検出され、成熟肝細胞が作製されていることが確認された。代表的な例としてKhES-1の結果を示す。
また、図１４（Ｃ）に示すように、胆管上皮細胞に特異的な構造、即ち、細胞の一方の面には背の低い絨毛（腎尿細管や小腸・大腸に見られる刷子縁より明らかに短く、胆管上皮細胞に特徴的な絨毛）と、反対側の面には基底膜が検出され、成熟胆管上皮細胞が作製されていることが確認された。代表的な例として#40の結果を示す。
なお、ヒト胚性幹細胞由来の胆管上皮細胞についても、ヒト人工多能性細胞由来の胆管上皮細胞についても、同様の結果であった。【００９６】
[実施例１４]ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞より誘導した肝細胞を用いた薬剤の毒性評価：
多能性幹細胞由来肝細胞に、肝細胞毒性をもつことが知られるD-galactosamine(D-GalN)を終濃度25mMで添加して37℃で培養した。24時間後に1.5mlの培養上清を回収し、4℃で15000rpm回転して細胞成分を完全に除去した上で、上清中に含まれる肝臓由来逸脱酵素である
Glutami  oxaloacetic  transaminase(GOT)、glutamic  pyruvictransaminase(GPT)、γ-glutamyl  transpeptidase(γ-GTP)、leucine  aminopeptidase(LAP)、lactate  ehydrogenase(LDH)、並びにLDHアイソザイム（LDH1〜5）の濃度を測定（株式会社ビー・エム・エル（東京都渋谷区）にて施行）した。
その結果、図１５（Ａ）に示すように、ヒトES細胞（KhES-1株）由来肝細胞(分化誘導２８日め)においては、D-GalN投与に依存して、成熟肝細胞逸脱酵素であるGOTの上昇が認められた。また、微細胆管（肝細胞）及び胆管上皮細胞に由来する逸脱酵素であるγ-GTP、及び、胆管上皮細胞に由来する逸脱酵素であるLAPの上昇も認められた。また、成熟肝細胞逸脱酵素であるLDHの上昇も確認され、かつアイソザイム測定では４型５型優位の「肝障害型」のパターンが認められた。一方、未分化ES細胞にD-GalNを投与した際には、図１５（Ｂ）に示すように、いずれの逸脱酵素も上昇が認められなかった。【００９７】
また、ヒトiPS細胞（#40）由来肝細胞においても、同様の結果が得られた。即ち、図１５（Ｃ）に示すように、D-GalN投与に依存して、成熟肝細胞逸脱酵素であるGOT及びGPT、微細胆管（肝細胞）及び胆管上皮細胞に由来する逸脱酵素であるγ-GTP、及び、胆管上皮細胞に由来する逸脱酵素であるLAPの上昇が認められた。さらに成熟肝細胞逸脱酵素であるLDHの上昇も確認され、かつアイソザイム測定では４型５型優位の「肝障害型」のパターンが認められた。一方、未分化ES細胞にD-GalNを投与した際には、図１５（Ｄ）に示すように、GOT、GPT、γ-GTP、LAP、LDHの上昇は認められなかった。【００９８】
さらにSeV-iPS由来肝細胞においても、ほぼ同様の結果が得られた。即ち、図１５（Ｅ）に示すように、SeV-iPS由来肝細胞をD-GalN存在下で培養した際には、培養上清中にGOTの上昇が認められ、一方、図１５（Ｆ）に示すように、未分化SeV-iPS細胞をD-GalN存在下で培養した際には、培養上清中でGOTの上昇は認められなかった。【００９９】
市販の肝細胞株であるHepaRG細胞をD-GalN存在下で培養した際には、図１５（Ｇ）に示すように、培養上清中にGOT、GPT、LAP、及び５型LDHの上昇が認められたが、γ-GTPの上昇は認められなかった。また、図１５（Ｈ）に示すように、HepG2細胞をD-GalN存在下で培養した際には、GOT、GPT及び５型LDHの上昇が認められたが、γ-GTPやLAPの上昇は認められなかった。【０１００】
さらに、図１５（Ａ）〜（Ｈ）の実験で検出された培養上清中での肝臓由来逸脱酵素の上昇が、確かにD-GalNの肝細胞/胆管上皮細胞に対する毒性によるものであることは、Prostaglandin E1(PGE1)を用いた以下の実験により確認された。即ち、#40株由来肝細胞にあらかじめ4 mMのPGE1を添加し、37℃で4時間培養した後に、上記と同様にしてD-GalN投与実験を施行した。その結果は図１６に示すように、培養上清中に検出される全ての肝臓由来逸脱酵素の上昇は、PGE1の前処理により有意に抑制された。結果を記さないが、他のヒトiPS細胞株やヒトES細胞株に由来する肝細胞分化誘導サンプルにおいても同様の傾向が認められた。
なお、PGE1に関しては、肝障害抑制効果や肝再生促進効果等があることが知られていて、臨床においても肝切除や肝移植における虚血再潅流障害の抑制、肝切除後の肝機能の改善、ABO血液型不適合肝移植における単臓器播種性血管内凝固症候群の予防などに有効であることが報告されている。【０１０１】
以上の通り、多能性幹細胞由来肝細胞を肝毒性薬剤の存在下で培養すると、汎用の生化学検査技術で検出できるレベルの肝細胞酵素が培養上清中に逸脱することが実証された。この方法によれば、従来法のような細胞回収等の手間は必要なく、わずか1.5 ml程度の培養上清を採取するだけで、簡便に肝毒性を定量的に幅広く評価することが可能である。また、本発明による多能性幹細胞由来肝細胞を用いた評価システムの最大の特長は、微細胆管に由来する逸脱酵素であるγ-GTP及び胆管上皮細胞に由来する逸脱酵素であるLAPの上昇が検知できる点である。既存のHepaRG細胞やHepG2細胞を用いてアッセイしても、これらの逸脱酵素の上昇を同時に確認することはできなかったことから、肝毒性 [肝細胞の細胞質（GOT, LDH）〜肝細胞の細胞膜（微細胆管）（γ-GTP）〜胆管上皮細胞（LAP）] を網羅的に評価するためには多能性幹細胞由来肝細胞の使用が必須となる。【０１０２】
[実施例１５] ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞より誘導した肝細胞中の肝幹/前駆細胞集団の同定：
多能性幹細胞由来肝細胞は、図５に示したように、多角形の細胞集団が平面的に広がる２次元領域と、細胞同士が重層化して盛り上がっている３次元構築領域とからなる（図１７）。形態学的には、前者は成熟肝細胞の特徴であり、後者は肝幹/前駆細胞の特徴であることから、多能性幹細胞由来肝細胞中には肝幹/前駆細胞が含まれ、それらは３次元構築領域に存在することが強く示唆された。
このことを確認するとともに、形態学的観察により簡便に肝幹/前駆細胞を同定・分離するための手法を確立するために、肝幹/前駆細胞のマーカーであるepithelial cell adhesion molecule (EpCAM)及びα-FPの発現について免疫染色法にて調べた。図１８（Ａ）は、ヒト人工多能性幹細胞（#40）から作製された肝細胞（分化誘導28日め）におけるEpCAM及びα-FPの免疫染色の結果である。ここに示すように、３次元構築領域に一致してEpCAMとα-FPの発現が認められた。なお、３次元構築領域にある細胞が増殖サイクルにあることは、核酸アナログであるbromodeoxyuridine(BrdU)の取込み試験（図１８（Ｂ）左）及び増殖期マーカーであるKi67の免疫染色（図１８（Ｂ）右）により確認された。一方、多角形の細胞集団が平面的に広がる２次元領域では、成熟肝細胞マーカーであるAlb（図１８（Ｃ））及びAAT（図１８（Ｄ））の発現が免疫染色法により確認された。一連の結果は、他のヒト人工多能性幹細胞株でも確認された（図１８（Ｅ）（Ｆ））。
以上より、多能性幹細胞から作製された肝細胞分化誘導産物において、３次元構築領域にある細胞集団は肝幹/前駆細胞であり、一方、２次元領域にある細胞集団は成熟肝細胞であることが明らかとなった。【０１０３】
[実施例１６] ヒト胚性幹細胞及びヒト人工多能性幹細胞より誘導した肝細胞中の肝幹/前駆細胞集団の継代培養：
前実施例で同定した、多能性幹細胞に由来する肝幹/前駆細胞集団（肝細胞分化誘導産物中で３次元的構築を形成する細胞集団）を回収し、継代培養することを試みた。まず細胞を回収するための細胞剥離法について検討した。Trypsinやcollagenaseなどの蛋白分解酵素、または２価イオン等のキレート剤を含む溶液を用いて、３次元構築領域を形成する細胞集団を剥離（分離）すると、細胞の生存性は著しく低下し、継代後にはほぼ全ての細胞が死ぬことが判明した。そこで、マイクロナイフを用いて物理的に３次元構築領域を切り出し、緩やかなピペッティング操作により細胞集団を分散させた後に、マトリゲル（BD社製）でコートしたフレッシュな培養皿に移し入れ、5%体積炭酸ガスインキュベータ内で37℃培養した。
その結果、図１９に示すように、継代した細胞集団は生存性を保持し増殖を開始した。継代培養11日めには培養皿一面に細胞が広がり（図１９（Ａ））、それらの中には再び３次元構築領域を形成する部分も確認された（図１９（Ｂ）、矢印位置）。また別の３次元構築領域には、small hepatocyte colonies（非特許文献１１〜１２）と呼ばれる肝前駆細胞に酷似した形態を示す細胞群も認められた（図１９（Ｃ）（Ｄ）、矢印位置）。【０１０４】
次に、継代培養によって増幅された細胞集団に関して、肝前駆細胞マーカーであるα-FP、成熟肝細胞マーカーであるTDO2及びAATの発現をRT-PCRで調べた。その結果、図１９（Ｅ）に示すように、α-FP及びAATの発現は継代後も維持され、かつTDO2の発現は継代前よりもむしろ上昇していた。これらの結果から、３次元構築領域を形成する細胞集団は、継代培養後にも肝前駆細胞の存在を保持しつつも、肝細胞成熟度を上げながら増幅することが明らかとなった。
以上より、多能性幹細胞由来肝細胞分化誘導産物中で３次元的構築を形成する細胞集団は肝幹/前駆細胞集団であり、これらはマイクロナイフ等により物理的に剥離・分散してからマトリゲルコート皿上で培養することで、容易に継代増幅培養を行うことができることが示された。
ヒト多能性幹細胞由来肝細胞集団からの肝幹/前駆細胞の純化方法に関しては、抗N-Cadherin抗体を用いたcell sorting技術が報告されている（非特許文献１３）。しかし、この方法では、特異的抗体を用いた染色工程と、cell sorter等の高価な機器を用いた細胞分画の工程が必要となるうえ、純化した肝幹/前駆細胞を増幅するためにはマウス由来フィーダー細胞（STO株）上で共培養することが必要である。これに対して本発明による方法では、位相差顕微鏡下でのマイクロナイフ等による３次元構築領域の回収という、簡便な操作のみで肝幹/前駆細胞の純化を可能とするうえに、純化された肝幹/前駆細胞の増幅は無フィーダー環境培養（マトリゲルコート皿等）で達成されるという利点がある。
このように、本発明による多能性幹細胞由来肝幹/前駆細胞の純化及び継代培養のための技術は、汎用性が高いうえに、異種動物に由来する細胞を一切用いない無フィーダー培養系であることから、多能性幹細胞由来肝幹/前駆細胞の製造のために極めてフィージビリティの高い方法である。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明によると、従来の薬剤代謝・毒性評価系が抱えていた数々の問題点、すなわち、データの不安定性、ロット差、株間差、コスト、個人差の検出不能などの問題点が克服されるので、画期的な創薬研究ツールを提供できる。また、現行の医薬開発における前臨床試験段階における肝細胞に関する安全性試験等にも寄与する。
本発明による薬剤代謝・毒性評価システムを構成する肝細胞の出発材料の一つであるヒトES細胞やヒトiPS細胞等は無限増殖能をもつことから、工業的スケールで安定的に生産することが極めて容易である。また、肝細胞は、ヒト多能性幹細胞から１ヶ月以内に作製可能であり、需要に応じた供給も可能である。また、その肝細胞の作製技術は、汎用の細胞培養設備のみを使用することから、世界のあらゆる国と地域において実施が可能であるので、巨大プラント産業に展開し得て、実用的であり産業上利用価値が高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
2012105505.tif 000020
【図１６】
2012105505.tif 000021
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年11月1日(2013.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
ヒト肝細胞株に関しては、その多くが薬剤代謝・毒性試験への使用は不適当であることが知られる。唯一、HepaRG（非特許文献２）は薬剤代謝・毒性試験への使用が可能とされているが、これは特定の一個人に由来する細胞株であることから、薬剤代謝・毒性における個人差を評価することは不可能である。
【国際調査報告】
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