(57)【要約】  アルカリ耐性に優れたアフィニティークロマトグラフィー用担体およびイムノグロブリンを単離する方法の提供。下記一般式（１）で表されるタンパク質リガンドが固定化された、アフィニティークロマトグラフィー用担体：    Ｒ−Ｒ２          （１）（式中、Ｒは、ＡＴＫまたはＡＳＫで示されるアミノ酸配列を含む４〜３０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドを示し、Ｒ2は、配列番号１若しくは配列番号２で示されるアミノ酸配列、その部分配列、またはそれらの配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインを含む、５０〜５００個のアミノ酸残基からなるポリペプチドを示す（ここで、Ｒ2がＲに結合する末端は、該イムノグロブリン結合ドメインのＣ末端またはＮ末端である。）。）。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表されるタンパク質リガンドが固定化された、アフィニティークロマトグラフィー用担体。
Ｒ−Ｒ２          （１）
（式中、
Ｒは、ＡＴＫまたはＡＳＫで示されるアミノ酸配列を含む４〜３０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドを示し、
Ｒ2は、配列番号１若しくは配列番号２で示されるアミノ酸配列、その部分配列、またはそれらの配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインを含む、５０〜５００個のアミノ酸残基からなるポリペプチドを示す（ここで、Ｒ2がＲに結合する末端は、該イムノグロブリン結合ドメインのＣ末端またはＮ末端である。）。）
【請求項２】
前記配列番号１若しくは配列番号２で示されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列が、配列番号３で示されるアミノ酸配列である、請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
【請求項３】
前記一般式（１）で表されるタンパク質リガンドは、該リガンド中のアミノ基またはチオール基がエポキシ基を有する担体とエポキシ基開環反応することにより、該担体に固定化されている、請求項１又は２に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体にイムノグロブリンを含有する試料を通液し、該担体にイムノグロブリンを吸着させる工程、および、
該担体から該イムノグロブリンを溶出させる工程、
を含む、イムノグロブリンを単離する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アフィニティークロマトグラフィー用担体およびイムノグロブリンを単離する方法に関する。特に、イムノグロブリン精製に有用な特定のリガンドを結合したアフィニティークロマトグラフィー用担体およびイムノグロブリンを単離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アフィニティークロマトグラフィーは、不溶性担体に、分離・精製を目的とする物質と特異的に結合する物質（リガンド）を固定化し、得られたリガンド固定化担体を充填したカラムを用いるクロマトグラフィーであり、例えばタンパク質、核酸などの生体関連物質の分離・精製に用いられている（特開平６−２８１６３８号公報）。【０００３】
アフィニティークロマトグラフィー用担体としては、例えば、アガロースゲルに代表される糖鎖の架橋粒子や、合成ポリマーを主成分とする粒子が用いられている。【０００４】
ところで、バイオセパレーションにおける用途では、通常、担体は繰り返し使用される。しかし、精製操作後にも微量な夾雑物が担体内に残るため、夾雑物を除去して担体を元の状態に戻すための洗浄工程が繰り返し使用の間に行われる。この洗浄工程では、通常、クリーニング・イン・プレイス（ＣＩＰ）として知られる操作法を行い、担体から夾雑物を溶出することができる試薬（ＣＩＰ剤）が用いられる。かかる試薬としては例えば、水酸化ナトリウム等のアルカリ性液が挙げられる。水酸化ナトリウムを用いる場合、微生物、タンパク質、脂質および核酸のような夾雑物を効果的に除去することができる。【０００５】
しかしながら、アルカリ性液を用いて夾雑物を担体から除去する場合、担体がアルカリ性条件下に曝される。リガンドとしてタンパク質を用いたアフィニティークロマトグラフィー用担体にとって、このようなアルカリ性条件は過酷であり、リガンドの不安定性による容量低下を生じることがある。特に、リガンドがプロテインＡ等のポリペプチドである多くのアフィニティークロマトグラフィー用担体は、過酷なアルカリ条件に対して不安定である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平６−２８１６３８号公報
【発明の概要】
【０００７】
本発明の一態様に係るアフィニティークロマトグラフィー用担体は、下記一般式（１）で表されるタンパク質リガンドが固定化されている担体である。
【０００８】
Ｒ−Ｒ２          （１）
（式中、
Ｒは、ＡＴＫまたはＡＳＫで示されるアミノ酸配列を含む４〜３０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドを示し、
Ｒ2は、配列番号１若しくは配列番号２で示されるアミノ酸配列、その部分配列、またはそれらの配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインを含む、５０〜５００個のアミノ酸残基からなるポリペプチドを示す（ここで、Ｒ2がＲに結合する末端は、該イムノグロブリン結合ドメインのＣ末端またはＮ末端である。）。）
【０００９】
上記アフィニティークロマトグラフィー用担体の一実施形態において、上記一般式（１）で表されるタンパク質リガンドは、該リガンド中のアミノ基またはチオール基がエポキシ基を有する担体とエポキシ基開環反応することにより、該担体に固定化され得る。
【００１０】
本発明の別の一態様に係るイムノグロブリンを単離する方法は、以下：
上記アフィニティークロマトグラフィー用担体にイムノグロブリンを含有する試料を通液し、該担体にイムノグロブリンを吸着させる工程、及び
該担体から該イムノグロブリンを溶出させる工程、
を含む。
【００１１】
上記本発明の方法の一実施形態において、上記イムノグロブリンを溶出させる工程に使用された上記アフィニティークロマトグラフィー用担体は、アルカリ性液で洗浄された後、再び上記の方法によるイムノグロブリンの単離に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＪＸ０５−ｐＥＴ２４−ａ−ｄ（＋）構築手順。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において、「タンパク質」とは、ペプチド構造単位を有するあらゆる分子をいい、例えば、天然型タンパク質の部分的断片や天然型タンパク質のアミノ酸配列を人為的に改変した変異体を含む概念である。また、「イムノグロブリン結合ドメイン」とは、単独でイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドの機能単位を表し、「イムノグロブリン結合タンパク質」とは、イムノグロブリンに特異的な親和性を有し、かつ、「イムノグロブリン結合ドメイン」を含むタンパク質を表す。「イムノグロブリン結合」とはイムノグロブリン分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の領域、特にＦｃフラグメントに結合することを表す。
【００１４】
本明細書において、プロテインＡとは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁成分であるプロテインＡである。
【００１５】
本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の配列同一性は、リップマン−パーソン法（Lipman-Pearson法；Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（Ｖｅｒ.５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行なうことにより算出される。
【００１６】
本発明は、アルカリ耐性に優れたアフィニティークロマトグラフィー用担体およびイムノグロブリンを単離する方法を提供することを目的とする。
【００１７】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体によれば、アルカリ耐性に優れているため、アルカリ性条件下での洗浄に対して高い耐性を有する。また、上記アフィニティークロマトグラフィー用担体を、例えばイムノグロブリンの精製に用いた場合、繰り返し使用してもイムノグロブリンの動的結合容量が低下しにくいため、安価なイムノグロブリン精製が可能となる。
【００１８】
本発明の一実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用担体は、下記一般式（１）で表されるタンパク質リガンドが担体に固定化されている。
【００１９】
Ｒ−Ｒ2          （１）
（式中、
Ｒは、ＡＴＫまたはＡＳＫを含む４〜３０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるポリペプチドを示し、
Ｒ2は、配列番号１若しくは配列番号２で示されるアミノ酸配列、その部分配列、またはそれらの配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインを含む、５０〜５００個のアミノ酸残基からなるポリペプチドを示す（ここで、Ｒ2がＲに結合する末端は、該イムノグロブリン結合ドメインのＣ末端またはＮ末端である。）。）
【００２０】
１．アフィニティークロマトグラフィー用担体
１．１．担体
１．１．１．構成
担体の形状としては、粒子の形態であることができ、かかる粒子は多孔性でも非多孔性でもよい。粒子状の担体は充填ベッドとして使用することもできるし、懸濁形態で使用することもできる。懸濁形態には流動層（ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｂｅｄ）および純然たる懸濁物として知られるものが包含され、粒子が自由に運動できる。モノリス、充填床及び流動層の場合、分離手順は一般に濃度勾配による従来のクロマトグラフィー法に従う。純然たる懸濁物の場合は、回分法が用いられる。好ましくは、当該担体は充填剤である。あるいは、担体は、チップ、キャピラリーまたはフィルターのような形態であってもよい。
【００２１】
本実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用担体は、好ましくは、２０〜２００μｍ、担体が合成ポリマーの場合、より好ましくは２０〜８０μｍ、更に好ましくは３０〜６０μｍ、担体が多糖の場合、より好ましくは５０〜２００μｍ、更に好ましくは６０〜１５０μｍの粒径（体積平均粒子径）を有する。粒径が２０μｍ未満であると、高流速下でカラム圧力が高くなり、実用に耐えない。粒径が２００μｍを超えると、イムノグロブリンがアフィニティークロマトグラフィー用担体に結合する量（結合容量）に劣る場合がある。なお、本発明における「粒径」とは、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置により得られる体積平均粒径である。
【００２２】
本実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用担体は、好ましくは、多孔質であり、５０〜１５０ｍ2／ｇ、より好ましくは、８０〜１３０ｍ2／ｇの比表面積を有する。ここで、比表面積が５０ｍ2／ｇ未満であると、結合容量が劣る場合があり、一方、１５０ｍ2／ｇを超えると、担体の強度が劣るために高流速下で担体が破壊されて、カラム圧力が上昇する場合がある。本発明における「比表面積」とは、水銀ポロシメーターにより得られる細孔径１０〜５０００ｎｍの細孔の有する表面積を粒子の乾燥重量で除した値である。
【００２３】
本実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用担体は好ましくは、１００〜１４００ｎｍ、担体が合成ポリマーの場合、より好ましくは１００〜４００ｎｍ、更に好ましくは２００〜３００ｎｍ、担体が多糖の場合、より好ましくは５００〜１４００ｎｍ、更に好ましくは８００〜１２００ｎｍの体積平均細孔径を有する。ここで、体積平均細孔径が１００ｎｍ未満であると、高流速下の結合容量低下が顕著になる場合があり、一方、１４００ｎｍを超えると、流速にかかわらず結合容量が低下する場合がある。本発明における「体積平均細孔径」とは、水銀ポロシメーターにより得られる細孔径１０〜５０００ｎｍの細孔の体積平均細孔径である。
【００２４】
上記範囲の粒径、比表面積、および細孔径分布を満たす場合、精製対象溶液の流路となる粒子間の隙間および粒子内の比較的大きな細孔径と、精製対象分子の結合表面積のバランスが最適化され、高流速下の結合容量が高いレベルに維持される。
【００２５】
担体の材質としては、例えば、親水性表面を有するポリマーであり、例えば、外表面に（および存在する場合には内表面にも）ヒドロキシ基（−ＯＨ）、カルボキシ基（−ＣＯＯＨ）、アミノカルボニル基（−ＣＯＮＨ2、或いはＮ置換型）、アミノ基（−ＮＨ2、或いは置換型）、オリゴまたはポリエチレンオキシ基を有するポリマーである。ポリマーは一実施形態では、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体のような合成ポリマーである。かかる合成ポリマーは公知の方法により容易に製造される（例えば、Ｊ．ＭＡＴＥＲ．ＣＨＥＭ１９９１，１（３），３７１−３７４に記載の方法を参照されたい）。或いは、トヨパール（東ソー社）のような市販品も使用される。他の実施形態におけるポリマーはデキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、アガロース等の多糖類である。かかる多糖類は公知の方法により容易に製造される（例えば特許第４０８１１４３号に記載の方法を参照されたい）。或いは、セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のような市販品も使用される。その他の実施形態ではシリカ、酸化ジルコニウムなどの無機担体であってもよい。
【００２６】
本実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用担体において担体として使用される多孔性粒子の一具体例としては、例えば、２０〜５０質量％の架橋性ビニル単量体と３〜８０質量％のエポキシ基含有ビニル単量体、２０〜８０質量％のジオール基含有ビニル単量体との共重合体を含有し、粒径が２０〜８０μｍであり、比表面積が５０〜１５０ｍ2／ｇであり、体積平均細孔径が１００〜４００ｎｍである多孔性有機重合体粒子が挙げられる。
【００２７】
なお、本実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用担体を水銀ポロシメーターで測定した場合の細孔径１０〜５０００ｎｍの細孔の浸入体積（細孔体積）は、好ましくは、１．３〜７．０ｍＬ／ｇ、担体が合成ポリマーの場合、より好ましくは１．３〜２．５ｍＬ／ｇ、担体が多糖の場合、より好ましくは３．０〜６．０ｍＬ／ｇである。
【００２８】
１．１．２．リガンドとの結合
リガンドの結合方法としては、タンパク質を担体に固定化する一般的方法を用いて行うことができる。例えば、カルボキシ基を有する担体を用い、このカルボキシ基をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドにより活性化させリガンドのアミノ基と反応させる方法、アミノ基またはカルボキシ基を有する担体を用い、水溶性カルボジイミドなどの脱水縮合剤存在下でリガンドのカルボキシ基またはアミノ基と反応させアミド結合を形成する方法、水酸基を有する担体を用い、臭化シアンなどのハロゲン化シアンで活性化させてリガンドのアミノ基と反応させる方法、または担体の水酸基をトシル化もしくはトレシル化しリガンドのアミノ基と反応させる方法、およびビスエポキシド、エピクロロヒドリンなどによりエポキシ基を担体に導入し、リガンドのアミノ基または水酸基またはチオール基と反応させる方法、エポキシ基を有する担体を用い、リガンドのアミノ基または水酸基またはチオール基と反応させる方法などが挙げられる。
【００２９】
エポキシ基が開環して生成する開環エポキシ基であるアルコール性水酸基は、担体表面を親水化し、タンパク質などの非特異吸着を防止すると共に、水中で担体の靱性を向上させ、高流速下の担体の破壊を防止する役割を果たす。したがって、リガンドを固定化させた後の担体中にリガンドと結合していない残余のエポキシ基が存在している場合、当該残余のエポキシ基を開環させることが好ましい。担体中のエポキシ基の開環方法としては、例えば、水溶媒中で、酸またはアルカリにより、加熱または室温で該担体を攪拌する方法を挙げることができる。また、メルカプトエタノール、チオグリセロールなどのメルカプト基を有するブロッキング剤やモノエタノールアミンなどのアミノ基を有するブロッキング剤で、エポキシ基を開環させても良い。最も好ましい開環エポキシ基は、担体に含まれるエポキシ基をチオグリセロールにより開環させて得られる開環エポキシ基である。チオグリセロールは、原料としてメルカプトエタノールなどよりも毒性が低く、チオグリセロールが付加したエポキシ開環基は、アミノ基を有するブロッキング剤による開環基よりも非特異吸着が低い上に、動的結合量が高くなるといった利点を有する。
【００３０】
必要に応じて担体とリガンドの間に任意の長さの分子（スペーサー）を導入してもよい。スペーサーの例としてはポリメチレン鎖、ポリエチレングリコール鎖、糖類などが挙げられる。
【００３１】
１．２．リガンド
１．２．１．アンカーペプチド
リガンドであるイムノグロブリン結合タンパク質は下記一般式（１）で表される。
Ｒ−Ｒ２          （１）
このイムノグロブリン結合タンパク質（以下、「タンパク質１」ともいう。）を、上述のように、例えば担体上のエポキシ基と反応させることにより、担体に結合させることができる。
【００３２】
上記一般式（１）において、Ｒはアンカーペプチドであり得る。該アンカーペプチドは、リガンド分子を担体に連結するために使用され得る。該アンカーペプチドは、少なくとも１つの中性極性残基と少なくとも１つの塩基性極性残基とを有するアミノ酸モチーフを含み得る。一実施形態において、該アンカーペプチドは、少なくとも１つの中性非極性残基をさらに含み得る。当該中性極性残基は、トレオニン残基（Ｔ）又はセリン残基（Ｓ）残基であり得、当該塩基性極性残基は、リジン残基（Ｋ）であり得、当該中性非極性残基は、アラニン残基（Ａ）であり得る。
【００３３】
上記アンカーペプチドは、リガンド分子Ｒ２を担体上に固定化する一方で、該リガンド分子の機能を実質的に保持するのに適している。すなわち、リガンド分子が担体に固定された状態で、該リガンド分子の機能、例えば免疫グロブリン結合性、を少なくとも約５０％保持することができる。本発明の一実施形態において、上記アンカーペプチド（又はリンカーとも称され得る）は、少なくとも２アミノ酸残基を有するモチーフを含み得る。該アンカーペプチドのアミノ酸モチーフは、中性非極性残基、中性極性残基、塩基性極性残基の３つのグループを同等に含み得る。アンカー配列はまた、中性極性残基と塩基性非極性残基のみを、種々の組み合わせ又は配置で含み得る。
【００３４】
上記一般式（１）において、Ｒで表されるポリペプチドのアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基の数は４〜３０個であることが好ましく、４〜２０個がより好ましい。Ｒのアミノ酸配列は、少なくともＡＴＫまたはＡＳＫで示されるアミノ酸配列を含む。ＡＴＫまたはＡＳＫで示されるアミノ酸配列を複数含むこともでき、ＡＴＫとＡＳＫとの組み合わせ（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（例えば、ＡＴＫＡＳＫまたはＡＳＫＡＴＫ）で示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００３５】
一実施形態において、上記Ｒは、式ＸＸ−ＵＵ−ＸＸで示されるアミノ酸配列（ここで、各ＸはＫ、Ｓ若しくはＴであり得、Ｕは任意のアミノ酸であり得る）、又は式ＸＸＸ−ＧＡ−ＸＸで示されるアミノ酸配列（ここで、各ＸはＡ、Ｋ、Ｓ若しくはＴであり得る）で表されるポリペプチドを含んでいてもよい。
当該ポリペプチドは、アミノ酸配列ＡＴＫＡＳＫ、又は少なくとも５０％配列同一で且つ機能的に等価なその誘導体であり得る。
あるいは当該ポリペプチドは、アミノ酸配列ＡＴＫＧＡＴＫ、又は少なくとも５０％配列同一で且つ機能的に等価なその誘導体であり得る。
【００３６】
また、上記Ｒのアミノ酸配列中には、ＴＥＶ認識配列が含まれていてもよい。本発明において、「ＴＥＶ認識配列」とは、ＴＥＶ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ）プロテアーゼによって特異的切断部位として認識され得るアミノ酸配列をいうが、必ずしも実際にＴＥＶプロテアーゼによって切断され得ることは要しない。「ＴＥＶ認識配列」としては、アミノ酸配列ＥＮＬＹＦＱＧ（例えば、配列番号２２の１０〜１６番アミノ酸残基）、及び当該アミノ配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の配列同一性を有し、ＴＥＶプロテアーゼによって認識される（必ずしもＴＥＶプロテアーゼによって切断されることは要しない）アミノ酸配列が挙げられる。
【００３７】
上記アンカーペプチドは、該アンカーペプチドとリガンド分子とを含む融合生成物として提供され得る。該アンカーペプチドは、リガンドタンパク質のＮ−又はＣ末端伸長部であり得る。
【００３８】
上記アンカーペプチド、又は該アンカーペプチドとリガンドタンパク質とを含む融合生成物は、ペプチド合成分野で公知の任意の方法で合成され得る。該方法としては、固相合成法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ａｓｓｏｃ．６５：２１４９；Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９，１９６３；ａｎｄ  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３５：１６１−２１４，１９９０）、及び均質溶液（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中でのペプチド合成（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｅ．Ｗａｎｓｃｈ（Ｅｄ．）Ｖｏｌ．１５，ｐｔｓ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，Ｔｈｉｅｍｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９８７）が挙げられる。
【００３９】
あるいは、上記アンカーペプチド、又は該アンカーペプチドとリガンドタンパク質とを含む融合生成物は、当該分野で公知のリコンビナント法により生成され得る。この場合、該アンカーペプチドは、通常、リガンドタンパク質の末端に、該タンパク質の機能が実質的に保持されるように結合若しくは融合され得る。従って、リガンドタンパク質によって、アンカーはそのＮ末端又はＣ末端に結合され得る。ある場合には、該アンカーペプチドは、両端に結合されてもよく、又は末端残基ではないアミノ酸残基に結合されてもよい。
【００４０】
上記リガンド分子を上記本発明のアンカーペプチドに結合又は融合した後、この融合生成物を担体に固定化することができる。あるいは、該アンカーペプチドは、タンパク質リガンドとの結合より前に、化学的手段により、リコンビナント法により、又は酵素を使用して担体に結合されていてもよい。適切な担体としては、上記１．１．１で述べたとおりである。
【００４１】
上記アンカーペプチドは、当業者に理解されているように、アッセイにおける検出力を高めるために標識され得る。標識としては、限定されないが、放射性標識、蛍光標識、細胞毒性標識等が挙げられ得る。該アンカーペプチドはまた、キャリアタンパク質とともに、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はキーホールリンペットヘモシアニンに結合されて、提供され得る。該アンカーペプチドは、Ｎ末端にビオチン−ＧＧＹＧ配列を有していてもよい。該配列により、チロシン（Ｙ）のＯＤ２８０によるペプチド濃度測定ができるようになる。該Ｎ末端ビオチン部分は、アビジン−ＨＲＰを用いたＥＬＩＳＡアッセイのリガンドとなり得る。
【００４２】
１．２．２．イムノグロブリン結合タンパク質
上記一般式（１）において、Ｒ2は、配列番号１若しくは配列番号２で示されるアミノ酸配列、その部分配列、またはそれらの配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインを含む、５０〜５００個のアミノ酸残基からなるポリペプチドを示す。
例えば、Ｒ2としては、上記配列番号１若しくは配列番号２で示されるアミノ酸配列、それらの部分配列、または当該配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含むポリペプチドが挙げられる。当該イムノグロブリン結合ドメインを２〜１２個含むものが好ましく、３〜８個含むものが更に好ましい。
【００４３】
配列番号１で示されるアミノ酸配列は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に由来するプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインであるＣドメインのアミノ酸配列を表す。
従って、配列番号２で示されるアミノ酸配列とは、当該Ｃドメインのアミノ酸配列における２９番アミノ酸残基がＧｌｙからＡｌａに置換された変異体（ＣドメインＧ２９Ａ変異体）のアミノ酸配列を表す。このＣドメインＧ２９Ａ変異体は、イムノグロブリンに対する結合能を有し、且つ配列番号１で示される親Ｃドメインと比較してアルカリ耐性が改良されている。
【００４４】
また、配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列としては、上記Ｃドメインのアミノ酸配列の少なくとも一部を有するＣドメインのフラグメント（Ｃフラグメント）であり、例えば、上記Ｃドメインのアミノ酸配列の９０％以上を有するものであることが好ましく、９５％以上を有するものであることがより好ましい。当該部分配列からなるポリペプチドは、イムノグロブリンに対する結合能を有する。
【００４５】
また、配列番号２で示されるアミノ酸配列の部分配列としては、上記ＣドメインＧ２９Ａ変異体のアミノ酸配列の少なくとも一部を有するＣドメインＧ２９Ａ変異体のフラグメント（ＣＧ２９Ａフラグメント）であり、例えば、上記ＣドメインＧ２９Ａ変異体のアミノ酸配列の９０％以上を有するものであることが好ましく、９５％以上を有するものであることがより好ましい。当該部分配列からなるポリペプチドは、イムノグロブリンに対する結合能を有する。
【００４６】
また、配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列とは、上記Ｃドメインの変異体であり、例えば、Ｃドメインのアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有する。
上記Ｃドメインの変異体は、イムノグロブリンに対する結合能を有するものであり、且つ配列番号１で示されるＣドメインと比較してアルカリ耐性が改良されたものであることが好ましい。この場合、Ｃドメインの変異体が配列番号１で示されるＣドメインと比較してアルカリ耐性が改良されているかどうかは、後述する実施例（３．試験例）記載の方法にて確認することができる。
【００４７】
また、配列番号２で示されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列とは、上記ＣドメインＧ２９Ａ変異体の変異体であり、例えば、ＣドメインＧ２９Ａ変異体のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有し、且つＣドメインアミノ酸配列（配列番号１）の２９位に対応する位置にＡｌａを有するものである。
上記ＣドメインＧ２９Ａ変異体の変異体は、イムノグロブリンに対する結合能を有するものであり、且つＣドメインＧ２９Ａ変異体と比較してアルカリ耐性が改良されたものであることが好ましい。この場合、ＣドメインＧ２９Ａ変異体の変異体がＣドメインＧ２９Ａ変異体と比較してアルカリ耐性が改良されているかどうかは、後述する実施例（３．試験例）記載の方法にて確認することができる。
【００４８】
また、上記部分配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列とは、上記ＣフラグメントまたはＣＧ２９Ａフラグメントの変異体であり、例えば、ＣフラグメントまたはＣＧ２９Ａフラグメントのアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有する。
上記ＣフラグメントまたはＣＧ２９Ａフラグメントの変異体は、イムノグロブリンに対する結合能を有するものであり、且つ当該フラグメントと比較してアルカリ耐性が改良されたものであることが好ましい。この場合、フラグメントの変異体が親フラグメントと比較してアルカリ耐性が改良されているかどうかは、後述する実施例（３．試験例）記載の方法にて確認することができる。
【００４９】
上記配列番号１若しくは配列番号２で示されるアミノ酸配列、またはそれらの部分配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインは、好ましくは、Ｃドメインアミノ酸配列（配列番号１）の１位に対応する位置にＶａｌを有する。このようなイムノグロブリン結合ドメインの例としては、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるものが挙げられる。
なお、本明細書におけるアミノ酸配列上の特定の位置に「対応する位置」は、公知のアルゴリズムに基づくシーケンスアラインメントによる配列比較によって決定することができる。
【００５０】
上記変異体は、天然プロテインＡのＣドメイン等のイムノグロブリン結合タンパク質を、部位特異的突然変異（Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｉｏｎ）等の公知の手段に従って、アミノ酸残基の付加、削除、置換、アミノ酸残基の化学的修飾等により改変することによって作製することができる。
【００５１】
Ｒ2は、さらに上記以外のその他のイムノグロブリン結合ドメインを含むことができる。当該その他のイムノグロブリン結合ドメインとしては、例えば、天然プロテインＡのＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅドメインやその変異体が挙げられる。
Ｒ2において、各イムノグロブリン結合ドメイン間の結合については、１つのドメインのＣ末端と別のドメインのＮ末端とを直接繋げてもよいし、１〜１０個のアミノ酸残基を有するペプチドを介して繋げてもよい。このペプチドとしては、たとえば、ＥＦで表されるペプチドが好ましい例として挙げられる。
Ｒ2がＲに結合する末端は、Ｒ2に含まれるイムノグロブリン結合ドメインのＣ末端またはＮ末端のどちらでもよい。
【００５２】
タンパク質１を構成するアミノ酸残基の総個数は好ましくは７０〜１，０００個であり、アフィニティークロマトグラフィー用担体粒子に結合させる用途に使用する場合、８０〜６００個であるのがより好ましい。
【００５３】
１．２．２．２．タンパク質１の製造
タンパク質１を製造するための標準技術としては、例えば、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．  ＡｕｓｂｅｌらによるＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏｌｏｇｙやＳａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ３rd  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００１）などに記載されている公知の遺伝子組換え技術を利用することができる。すなわち、目的の改変タンパク質（タンパク質１）をコードする核酸配列を含有させた発現ベクターを大腸菌などの宿主に形質転換し、当該細胞を適切な液体培地で培養することにより、培養後の細胞から、タンパク質１を大量かつ経済的に取得することができる。好ましい発現ベクターとしては、細菌内で複製可能な既知のベクターのいずれをも用いることができ、例えば、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されているプラスミドや、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ３rd  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００１）などに記載されているプラスミドが挙げられる。また、宿主としては、特に限定されないが、大腸菌などのバクテリア、真菌類、昆虫細胞、ほ乳類細胞等の組換え蛋白質を発現させるために用いられる公知の宿主を用いることができる。宿主中に核酸を導入することにより宿主を形質転換させるためには、各宿主に応じて当該技術分野において知られるいずれの方法を用いてもよく、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００１）などに記載されている公知の方法を利用することができる。形質転換した細菌を培養して、発現されたタンパク質を回収する方法は、当業者によく知られており、本発明の実施例にも例示されている。なお、上述の手順の間にタンパク質のＮ末端のメチオニン残基がメチオニンアミノペプチダーゼにより切断されることがある（Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５．１２，ｐ２３３６−２３４９，２００６年）。このようなタンパク質もまた、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質として使用できる。例えば、本発明において、配列番号２２のＮ末端のメチオニン残基が切断された配列のタンパク質は、配列番号２２のものと同一のイムノグロブリン結合タンパク質として扱うものとし、他の配列においても同様とする。
【００５４】
本発明の他の一実施形態にかかる核酸は、イムノグロブリン結合タンパク質（タンパク質１）あるいはその等機能変異体をコードする。本発明において、イムノグロブリン結合タンパク質の「等機能変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔ）」とは、部分的なアミノ酸残基の付加、削除、置換、アミノ酸残基の化学的修飾等により改変されたイムノグロブリン結合タンパク質であって、改変前のイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０%以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の相同性を保持し、かつ、イムノグロブリン結合活性において、改変前のイムノグロブリン結合タンパク質と同等のものとして扱うことができるものを意味する。
【００５５】
また、上述したように、タンパク質１は、イムノグロブリン結合ドメインを１個以上（好ましくは２〜１２個、より好ましくは３〜８個）を含むタンパク質であってもよい。このようなタンパク質をコードする適切な発現プラスミドを、例えば本発明の実施例で示すような、公知の方法で作製でき、イムノグロブリン結合ドメインを１個以上含むタンパク質を容易に製造することができる。
【００５６】
１．２．２．３．作用効果
本実施形態に係る担体によれば、初期のＩｇＧ動的結合容量（ＤＢＣ）が高く、アルカリ性条件下での洗浄（例えば０．０１〜０．８Ｍ水酸化ナトリウム等のアルカリ性液を用いた洗浄）に対して高い耐性を有する。
【００５７】
１．３．イムノグロブリンを単離する方法
本発明の一実施形態に係るイムノグロブリンを単離する方法を説明する。本実施形態に係るイムノグロブリンを単離する方法は、上記アフィニティークロマトグラフィー用担体にイムノグロブリンを含有する試料を通液し、該担体にイムノグロブリンを吸着させる工程（第一の工程）、および、該担体から該イムノグロブリンを溶出させる工程（第二の工程）を含み、好ましくは該第二の工程の後に、該担体をアルカリ性液で洗浄する工程（第三の工程）をさらに含む。
【００５８】
第一の工程では、上記アフィニティークロマトグラフィー用担体を充填したカラム等にイムノグロブリンを含有する試料を、リガンドにイムノグロブリンが吸着する条件にて流す。この第一の工程では、試料中のイムノグロブリン以外の物質のほとんどは、リガンドに吸着されずカラムを通過する。この後、必要に応じて、リガンドに弱く保持された一部の物質を除去するため、担体をＮａＣｌなどの塩を含む中性の緩衝液で洗浄してもよい。
第二の工程では、ｐＨ２〜５の適切な緩衝液を流し、リガンドに吸着されたイムノグロブリンを溶出させる。この溶出液を回収することで、試料からイムノグロブリンを単離することができる。
【００５９】
本実施形態に係るイムノグロブリンを単離する方法において、好ましくは、上記第二の工程に続いて第三の工程が行われる。第三の工程では、アルカリ性液で担体を洗浄（ＣＩＰ洗浄）する。第三の工程に使用されるアルカリ性液としては、例えば、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、トリエチルアミン、水酸化テトラブチルアンモニウム等が挙げられる。
【００６０】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、タンパク質リガンドの高いアルカリ耐性により上記第三の工程での洗浄後もイムノグロブリン結合能を安定に保持しているため、本発明のイムノグロブリン単離方法に繰り返し使用することができる。
【実施例】
【００６１】
２．実施例
以下、本実施形態にかかるアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。また、以下の記載は本発明の態様を概括的に示すものであり、特に理由なく、かかる記載により本発明は限定されるものではない。【００６２】
２．１．製造例１（多孔質粒子の合成）
グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）８．２ｇ、トリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）６５．９ｇおよびグリセリンモノメタクリレート（日油社製）９０．６ｇを２−オクタノン（東洋合成工業社製）２４５．８ｇおよびアセトフェノン（和光純薬工業社製）６２ｇに溶解させ、２，２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）２ｇを添加し、有機モノマー溶液を調製した。【００６３】
次に、４２４０ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製  ＰＶＡ−２１７）８．５ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム（花王社製  エマール１０Ｇ）０．４３ｇおよび硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製）２１．３ｇを添加し、一晩撹拌して水溶液を調製した。【００６４】
次いで、得られた水溶液を７Ｌセパラブルフラスコ内に投入し、温度計、攪拌翼、および冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下、６００ｒｐｍで撹拌を開始した。続いて、セパラブルフラスコを温水バスにより加温し、水溶液の温度が８５℃になったところで、この水溶液に滴下ロートを用いて上記有機モノマー溶液を添加し、５時間攪拌を行った。【００６５】
次いで、反応液を冷却したのち、かかる反応液を５Ｌのポリプロピレン製ビンに移し、粒子が浮遊するまで静置し、下方から余分な水を吸い出して廃棄した。さらに、この反応液にアセトンを加えて粒子を沈降させた。次に、反応液を３分間静置して、デカンテーションによりアセトンを除去した。この操作を２回繰り返したのち水を加えて、粒子を沈降させた。さらに、３分間静置してデカンテーションを行った。この操作を２回繰り返して粒子を洗浄した。さらに、粒子の分散液をアセトンで再び置換して、一晩風乾したのち、真空乾燥機にて乾燥を行い、多孔質粒子（以下、ＰＢと記す。）９０ｇを得た。ＰＢの平均粒径は４３μｍ、比表面積は８３ｍ2／ｇであった。【００６６】
２．２．製造例２（組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質（ＪＸ０１）の作製）
本製造例及び以下の製造例において、ＤＮＡの精製にはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの（ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を使用した。制限酵素はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。ＰＣＲ用の酵素はＦｅｒｍｅｎｔａｓから購入した。ＰＣＲ用のプライマーはＳｉｇｍａから購入した。ライゲーションはＴ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で行った。ＤＨ５ａｌｐｈａ  ｃｅｌｌはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ＢＬ２１  ｃｅｌｌはＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥから購入した。ｐＥＴ２４ａ−ｄ（＋）はＮｏｖａｇｅｎから購入した。特別の記載はない限り、すべての実験をＳｕｐｐｌｉｅｒの推薦条件で行った。【００６７】
２．２．１．ＪＸ０１プラスミド（ＪＸ０１−ｐＥＴＭ１１）の構築
プロテインＡのＣドメインのＡ１Ｖ  Ｇ２９Ａ変異体であるＣ＊ドメインをコードするＤＮＡ（配列番号３）を含むプラスミドＪＸ０１−ｐＥＴＭ１１を下記手順にて構築した。
（１）ＳＰ１Ｂ＊−ｐＥＴＭ１１の構築
プロテインＡのＤＮＡ配列（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ，１０８３２）のｃＤＮＡ）を鋳型に、以下のプライマー１（配列番号４）とプライマー２（配列番号５）を用いてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡをｐＥＴＭ１１に導入し、Ｂ＊ドメイン（ＢドメインのＡ１Ｖ変異体）をコードするプラスミドＳＰ１Ｂ＊−ｐＥＴＭ１１を構築した。ＳＰ１Ｂ＊−ｐＥＴＭ１１には、Ｎ末端側にＴＥＶ認識配列が付加され、ＮｃｏＩサイトとＳａｃＩサイトに囲まれたＢ＊ドメインをコードする塩基配列ＳＰ１Ｂ＊配列（配列番号６）が含まれていた。【００６８】
【表１】
2012086660.tif 000002
【００６９】
ＰＣＲ条件は以下のとおり：Ｓｔｅｐ１：９４ｏＣ１分（１サイクル）、Ｓｔｅｐ２：９４℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃２．５分（２５サイクル）、Ｓｔｅｐ３：７２℃１０分（１サイクル）の後、４℃でホールド。
ＰＣＲ産物はＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、１％アガロースＴＡＥゲルを用いて１００℃で４５分間泳動した。【００７０】
（２）ＳＰ１Ｂ＊＊−ｐＥＴＭ１１の構築
ＰＣＲ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓでＳＰ１Ｂ＊−ｐＥＴＭ１１からＢドメインのＡ１Ｖ  Ｇ２９Ａをコードするプラスミドを構築した。詳細には、ＳＰ１Ｂ＊−ｐＥＴＭ１１多段階のＰＣＲ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを経て得られたＤＮＡをｐＥＴＭ１１に導入し、塩基配列ＳＰ１Ｂ＊＊（配列番号７）を含むＳＰ１Ｂ＊＊−ｐＥＴＭ１１を構築した。
ＰＣＲ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓには以下のプライマーを使用した。【００７１】
【表２】
2012086660.tif 000003
【００７２】
ＰＣＲ条件は以下のとおり：Ｓｔｅｐ１：９４ｏＣ１分（１サイクル）、Ｓｔｅｐ２：９４℃３０秒→５５℃１分→６８℃１５分（１８サイクル）、Ｓｔｅｐ３：６８℃１５分（１サイクル）の後、４℃でホールド。【００７３】
（３）ＳＰ１Ｃ＊−ｐＥＴＭ１１の構築
ＰＣＲ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓでＳＰ１Ｂ＊＊ドメインのＡ１Ｖ  Ｇ２９Ａの変異体であるＣ＊ドメインのプラスミドを構築した。詳細には、ＳＰ１Ｂ＊＊−ｐＥＴＭ１１から多段階のＰＣＲ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを経て得られたＤＮＡをｐＥＴＭ１１に導入し、Ｃ＊ドメインをコードする塩基配列ＳＰ１Ｃ＊（配列番号１４）を含むプラスミドＳＰ１Ｃ＊−ｐＥＴＭ１１構築した。
ＰＣＲ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓには以下のプライマーを使用した。【００７４】
【表３】
2012086660.tif 000004
【００７５】
ＰＣＲ条件は以下のとおり：Ｓｔｅｐ１：９４ｏＣ１分（１サイクル）、Ｓｔｅｐ２：９４℃３０秒→５５℃１分→６８℃１５分（１８サイクル）、Ｓｔｅｐ３：６８℃１５分（１サイクル）の後、４℃でホールド。【００７６】
（３）ＪＸ０１−ｐＥＴＭ１１の構築
ＳＰ１Ｃ＊−ｐＥＴＭ１１を鋳型として、下記３組のプライマーペアをそれぞれ利用してＰＣＲを行い、ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ、及びＳａｃＩ−ＸｈｏＩの制限酵素サイトをそれぞれ有する３つのＣ＊ドメインをコードする塩基配列を構築した。この３つの塩基配列をそれぞれに対応する制限酵素で消化した後、ライゲーション反応によりＳＰ１Ｃ＊−ｐＥＴＭ１１に同時に導入してＪＸ０１の塩基配列（配列番号２１）を含むプラスミドＪＸ０１−ｐＥＴＭ１１構築した。このライゲーション反応は、ＳＰ１Ｃ＊−ｐＥＴＭ１１のＥｃｏＲＩとＸｈｏＩの制限酵素サイドを利用した。【００７７】
【表４】
2012086660.tif 000005
【００７８】
ＰＣＲ条件は以下のとおり：Ｓｔｅｐ１：９４ｏＣ１分（１サイクル）、Ｓｔｅｐ２：９４℃３０秒→５５℃３０秒→６８℃１．５分（１８サイクル）、Ｓｔｅｐ３：６８℃１０分（１サイクル）の後、４℃でホールド。
ＤＮＡを増幅するために、ライゲーション反応で得られたＪＸ０１−ｐＥＴＭ１１をＤＨ５ａｌｐｈａ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌに形質転換した。陽性コロニーを選択し、ＤＮＡシークエンシングで正しい配列が挿入されていることを確認した。その後、正しいＤＮＡ配列を持つＪＸ０１−ｐＥＴＭ１１をＢＬ２１  ｃｅｌｌに形質転換した。
【００７９】
２．２．２．ＪＸ０１の発現および精製
得られたＪＸ０１―ｐＥＴＭ１１ベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１株）細胞（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）に導入し培養、１８℃で１ｍＭのＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を添加し、１５時間インキュベートして、組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質を発現させた。誘導に先立って、吸光度（ＯＤ６００）が約０．６に到達するまで上記細胞を３７℃でインキュベートした。タンパク質発現後、細胞を回収し、ｐＨ８．０のトリス緩衝液中で破砕した。【００８０】
得られた組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質を、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ（ニトリロトリ酢酸）粒子、キアゲン社製）によって精製した。精製されたイムノグロブリン結合タンパク質を、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）によって、さらに精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認されたイムノグロブリン結合タンパク質の純度は９６％であった。精製されたイムノグロブリン結合タンパク質をＪＸ０１とした（配列番号２２）。【００８１】
２．３．製造例３（組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質（ＪＸ０２）の作製）
５０ｍＭ トリス塩酸、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、および１ｍＭ ＤＴＴのバッファー（ｐＨ８．０）１５ｍＬに、ＪＸ０１  １５０ｍｇ、ＭｏｂｉＴＥＶプロテアーゼ（ＭｏＢｉＴｅｃ社）９００Ｕを加え３０℃で１２時間攪拌しＪＸ０１のＴＥＶ認識配列を切断した。ＴＥＶプロテアーゼで切断されたＪＸ０１をＮｉ−ＮＴＡカラム（容量：４ｍＬ）に通過させて、ＪＸ０１のヒスタグ部位が切断された粗ＪＸ０２を回収した。得られた粗ＪＸ０２は陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）によって、ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳ緩衝液中でさらに精製された。このＪＸ０２を遠心濃縮器（ビバスピン２０、ザルトリウス社製）にて濃縮した後、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）中で１２時間透析して、ＪＸ０２（配列番号２９）を調製した。【００８２】
２．４．製造例４（組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質（ＪＸ０３）の作製）
２．４．１．ＪＸ０３−ｐＥＴ２４−ａ−ｄ（＋）の構築
ＪＸ０１−ｐＥＴＭ１１を鋳型に下記のプライマー３（配列番号３０）とプライマー４（配列番号３１）を用いたＰＣＲにより、ＪＸ０１のＮ末端にＡＴＫＡＳＫを有するポリペプチド４ＸＣ＊をコードするＤＮＡを構築した。このＤＮＡをｐＥＴ２４−ａ−ｄ（＋）に導入し、ＪＸ０３−ｐＥＴ２４−ａ−ｄ（＋）プラスミドを構築した。導入はｐＥＴ２４−ａ−ｄ（＋）のＮｄｅＩとＸｈｏｌサイトを利用した。ライゲーション反応はＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを使った。ＤＮＡを増幅するために、ライゲーション反応で得られたＪＸ０３−ｐＥＴ２４−ａ−ｄ（＋）をＤＨ５ａｌｐｈａ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ  に形質転換した。陽性コロニーを選択し培養、ＤＮＡシークエンシングで正しい配列が挿入されていることを確認した。その後、正しいＪＸ０３塩基配列（配列番号３２）を持つＪＸ０３−ｐＥＴ２４−ａ−ｄ（＋）をＢＬ２１  ｃｅｌｌに形質転換した。【００８３】
【表５】
2012086660.tif 000006
【００８４】
ＰＣＲ条件は以下のとおり：Ｓｔｅｐ１：９４ｏＣ１分（１サイクル）、Ｓｔｅｐ２：９４℃３０秒→５５℃３０秒→６８℃２．５分（２５サイクル）、Ｓｔｅｐ３：６８℃１０分（１サイクル）の後、４℃でホールド。【００８５】
２．４．２．ＪＸ０３の発現および精製
得られたＪＸ０３−ｐＥＴ２４−ａ−ｄ（＋）をＥ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１株）細胞に導入し培養、１８℃で１ｍＭのＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を添加し、１５時間インキュベートして、組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質を発現させた。誘導に先立って、吸光度（ＯＤ６００）が約０．６に到達するまで上記細胞を３７℃でインキュベートした。タンパク質発現後、細胞を回収し、ｐＨ８．０のトリス緩衝液中で破砕した。【００８６】
得られた組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質を、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）と陽イオン交換によって、クロマトグラフィー（ＳＰ−セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認されたイムノグロブリン結合タンパク質の純度は９６％以上であった。精製されたイムノグロブリン結合タンパク質をＪＸ０３とした（配列番号３３）。【００８７】
２．５．製造例５（組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質（ＪＸ０４）の作製）  ２．５．１．ＪＸ０４−ｐＥＴ２４−ａ−ｄ（＋）の構築
ＪＸ０３−ｐＥＴ２４−ａ−ｄ（＋）から下記の２段階を経て、ＪＸ０３のＮ末端ＡＴＫＡＳＫが欠失し且つＣ末端にＡＴＫＡＳＫが付加されたポリペプチドＪＸ０４をコードするＤＮＡ（配列番号３４）を含むプラスミドＪＸ０４−ｐＥＴ２４−ａ−ｄ（＋）を構築した。
（１）下記のプライマーを用いたＰＣＲ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓでＪＸ０３−ｐＥＴ２４−ａ−ｄ（＋）からＮ末端ＡＴＫＡＳＫをコードするＤＮＡ配列を削除した。【００８８】
【表６】
2012086660.tif 000007
【００８９】
ＰＣＲ条件は以下のとおり：Ｓｔｅｐ１：９４ｏＣ１分（１サイクル）、Ｓｔｅｐ２：９４℃３０秒→５５℃１分→６８℃１５分（１８サイクル）、Ｓｔｅｐ３：６８℃１５分（１サイクル）の後、４℃でホールド。
得られたプラスミドをＤＨ５ａｌｐｈａ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌに導入して陽性コロニーを培養し、プラスミドＤＮＡを精製し、ＤＮＡシークエンシングでＮ末端ＡＴＫＡＳＫのＤＮＡ配列が削除されたことを確認した。【００９０】
（２）下記のプライマーを用いたＰＣＲ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓにより、（１）で得られたＮ末端ＡＴＫＡＳＫ配列を削除したプラスミドにＣ末端ＡＴＫＡＳＫ配列を付加した。【００９１】
【表７】
2012086660.tif 000008
【００９２】
ＰＣＲ条件は以下のとおり：Ｓｔｅｐ１：９４ｏＣ１分（１サイクル）、Ｓｔｅｐ２：９４℃３０秒→５５℃１分→６８℃１５分（１８サイクル）、Ｓｔｅｐ３：６８℃１５分（１サイクル）の後、４℃でホールド。
得られたプラスミドをＤＨ５ａｌｐｈａ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌに導入して細胞を培養し、プラスミドＤＮＡを精製し、ＤＮＡシークエンシングでＣ末端ＡＴＫＡＳＫのＤＮＡ配列が付加されていることを確認した。正しいＤＮＡ配列を持つプラスミドＪＸ０４−ｐＥＴ２４−ａ−ｄ（＋）をＢＬ２１  ｃｅｌｌに形質転換した。【００９３】
２．５．２．ＪＸ０４の発現および精製
得られたＪＸ０４−ｐＥＴ２４−ａ−ｄ（＋）をＥ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１株）細胞に導入し培養を行い、１８℃で１ｍＭのＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を添加し、１５時間インキュベートして、組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質を発現させた。誘導に先立って、吸光度（ＯＤ６００）が約０．６に到達するまで上記細胞を３７℃でインキュベートした。タンパク質発現後、細胞を回収し、ｐＨ８．０のトリス緩衝液中で破砕した。【００９４】
得られた組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質を、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）と陽イオン交換によって、クロマトグラフィー（ＳＰ−セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認されたイムノグロブリン結合タンパク質の純度は９６％以上であった。精製されたイムノグロブリン結合タンパク質をＪＸ０４とした（配列番号３５）。  【００９５】
２．６．製造例６（組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質（ＪＸ０５）の作製）
２．６．１．ＪＸ０５−ｐＥＴ２４−ａ−ｄ（＋）の構築
ＪＸ０３−ｐＥＴ２４−ａ−ｄ（＋）から下記図１で示される３段階を経て、８個のイムノグロブリン結合ドメインとＮ末端ＡＴＫＡＳＫを有するポリペプチドＪＸ０５をコードするＤＮＡ配列（配列番号４０）を含むプラスミドＪＸ０５−ｐＥＴ２４−ａ−ｄ（＋）を構築した。
（１）ＡｃｃＩ制限酵素でＪＸ０３−ｐＥＴ２４−ａ−ｄ（＋）を消化した。
（２）下記のプライマーを用いたＰＣＲ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓで２つのＡｃｃＩサイトを持つ４ドメンプラスミドｐＵＣ５７／４Ｃ(ｐＵＣ５７はＧｅｎＳｃｒｉｐｔから購入した)を構築した。【００９６】
【表８】
2012086660.tif 000009
【００９７】
ＰＣＲ条件は以下のとおり：Ｓｔｅｐ１：９４ｏＣ１分（１サイクル）、Ｓｔｅｐ２：９４℃３０秒→５５℃１分→６８℃１５分（１８サイクル）、Ｓｔｅｐ３：６８℃１５分（１サイクル）の後、４℃でホールド。
得られたプラスミドをＤＨ５ａｌｐｈａ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌに導入して陽性コロニーを培養し、プラスミドＤＮＡを精製し、ＤＮＡシークエンシングで２つ目のＡｃｃＩサイトが追加されたことを確認した。このプラスミドもＡｃｃＩ制限酵素で消化した。
（３）ＡｃｃＩ制限酵素で消化されたＪＸ０３−ｐＥＴ２４−ａ−ｄ（＋）とｐＵＣ５７／４ＣをＴ４  ＤＮＡ  ＬｉｇａｓｅでライゲーションしてＪＸ０５−ｐＥＴ２４−ａ−ｄ（＋）を構築した。ＤＮＡを増幅するために、ライゲーション反応で得られた新しいＪＸ０５−ｐＥＴ２４−ａ−ｄ（＋）をＤＨ５ａｌｐｈａ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌに形質転換した。陽性コロニーを選択し、ＤＮＡシークエンシングで正しい配列であることを確認した。その後、正しいＤＮＡ配列を持つＪＸ０５−ｐＥＴ２４−ａ−ｄ（＋）をＢＬ２１  ｃｅｌｌに形質転換した。【００９８】
２．６．２．ＪＸ０５の発現および精製
得られたＪＸ０５−ｐＥＴ２４−ａ−ｄ（＋）をＥ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１株）細胞に導入し培養、１８℃で１ｍＭのＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を添加し、１５時間インキュベートして、組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質を発現させた。誘導に先立って、吸光度（ＯＤ６００）が約０．６に到達するまで上記細胞を３７℃でインキュベートした。タンパク質発現後、細胞を回収し、ｐＨ８．０のトリス緩衝液中で破砕した。【００９９】
得られた組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質を、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）と陽イオン交換によって、クロマトグラフィー（ＳＰ−セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認されたイムノグロブリン結合タンパク質の純度は９６％以上であった。精製されたイムノグロブリン結合タンパク質をＪＸ０５とした（配列番号４１）。【０１００】
２．７．製造例７（イムノグロブリン結合タンパク質の粒子への固定化−１）
１．１ｍＬの製造例１で調製したＰＢと、２０ｍｇのＪＸ０２が分散した１０ｍＬの０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．８）との混合液を調製した後、２．１ｇの硫酸ナトリウムを加え、２５℃で２４時間転倒混和し、ＪＸ０２をＰＢに結合させた。生成した粒子を濾過した後、５Ｍチオグリセロール１０ｍＬと混合し３０℃で４時間反応させ、残余のエポキシ基をブロッキングし、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｅｅｅｎ２０で洗浄後、ＰＢＳで洗浄し、１．１ｍＬのＪＸ０２結合多孔質粒子（ＪＸ０２−ＰＢ１）を得た。
同様の手順で、ＪＸ０３〜ＪＸ０５のいずれかが結合した多孔質粒子（ＪＸ０３−ＰＢ１、ＪＸ０４−ＰＢ１、ＪＸ０５−ＰＢ１）を得た。【０１０１】
２．８．製造例８（イムノグロブリン結合タンパク質の粒子への固定化−２）
４ｍＬの製造例１で調製したＰＢと、７５ｍｇのＪＸ０２が分散した４０ｍＬの４ｇの硫酸ナトリウムを溶解させた０．１Ｍほう酸バッファー（ｐＨ８．０）との混合液を調製し、２５℃で５時間転倒混和し、ＪＸ０２をＰＢに結合させた。生成した粒子を濾過した後、１Ｍチオグリセロール４０ｍＬと混合し２５℃で４時間反応させ、残余のエポキシ基をブロッキングし、０．５Ｍ  ＮａＯＨで洗浄後、０．１Ｍくえん酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）で洗浄し、４ｍＬのＪＸ０２結合多孔質粒子（ＪＸ０２−ＰＢ２）を得た。
同様の手順で、ＪＸ０３〜ＪＸ０５のいずれかが結合した多孔質粒子（ＪＸ０３−ＰＢ２、ＪＸ０４−ＰＢ２、ＪＸ０５−ＰＢ２）を得た。【０１０２】
３．試験例
３．１．測定例１（イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）動的結合容量の測定）
ＪＸ０２−ＰＢ２を内径０．５ｃｍのカラムにベッド高２０ｃｍまで充填した。カラムを２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で平衡化した後、ヒトポリクローナルＩｇＧ（５ｍｇ／ｍＬ）を含む２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）を、線流速３００ｃｍ／時間で流し、吸光度モニターで溶出液中のヒトポリクローナルＩｇＧ濃度が１０％ブレークスルー（破過）の時のヒトポリクローナルＩｇＧ吸着量と担体体積から動的結合容量（ＤＢＣ）を求めた。ＤＢＣ結果は４５ｍｇ／ｍＬだった。
同様の手順で、ＪＸ０３−ＰＢ２、ＪＸ０４−ＰＢ２、ＪＸ０５−ＰＢ２のＤＢＣを求めた。【０１０３】
３．２．測定例２（耐アルカリ性の測定）
測定例１で用いた担体充填カラムをＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓにセットし、０．５Ｍ水酸化ナトリウム２０ｍｌをカラム内に流した。カラムを装置から外し、密閉した後室温で一定時間（１５、３０、４５時間）放置した後、測定例１と同様に、線流速３００ｃｍ／時間におけるヒトポリクローナルＩｇＧの結合容量を測定した。０．５Ｍ水酸化ナトリウムで処理する前のヒトポリクローナルＩｇＧ結合量（測定例１）を１００％とした時の結合容量維持率を求めた。【０１０４】
３．４．測定例３
Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥヘルスケア製）４ｍｌをカラムに充填し、測定例１〜２と同様にＤＢＣおよび結合容量維持率を測定した。【０１０５】
測定結果を表９に示す。イムノグロブリンタンパク質ＪＸ０２〜ＪＸ０５が結合した担体粒子ＪＸ０２−ＰＢ２〜ＪＸ０５−ＰＢ２は、初期ＤＢＣは高く、強アルカリ接触時間が長くなっても、結合容量の維持率の低下が小さかった。ＪＸ０２−ＰＢ１〜ＪＸ０５−ＰＢ１においても同様の傾向が見られた。
このことから、上記一般式（１）で表されるタンパク質リガンドが固定化された担体は、耐アルカリ性に優れていることが確認された。【０１０６】
【表９】
2012086660.tif 000010
【０１０７】
本実施形態に係る説明は以上である。本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、さらなる種々の変形が可能である。また本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法および結果が同一の構成、あるいは目的および結果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成または同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【図１】
2012086660.tif 000011
【配列表】
2012086660000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年7月10日(2012.7.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表されるタンパク質リガンドが固定化された、アフィニティークロマトグラフィー用担体。
Ｒ−Ｒ２          （１）
（式中、
Ｒは、ＡＴＫまたはＡＳＫで示されるアミノ酸配列を含む４〜３０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドを示し、
Ｒ２は、配列番号１若しくは配列番号２で示されるアミノ酸配列、その部分配列、またはそれらの配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインを含む、５０〜５００個のアミノ酸残基からなるポリペプチドを示す（ここで、Ｒ２がＲに結合する末端は、該イムノグロブリン結合ドメインのＣ末端またはＮ末端である。）。）
【請求項２】
前記配列番号１若しくは配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列が、配列番号３で示されるアミノ酸配列である、請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
【請求項３】
前記Ｒが、ＡＴＫとＡＳＫとの組み合わせで示されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
【請求項４】
前記Ｒが、ＡＴＫＡＳＫまたはＡＳＫＡＴＫで示されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
【請求項５】
前記一般式（１）で表されるタンパク質リガンドは、該リガンド中のアミノ基またはチオール基がエポキシ基を有する担体とエポキシ基開環反応することにより、該担体に固定化されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体にイムノグロブリンを含有する試料を通液し、該担体にイムノグロブリンを吸着させる工程、および、
該担体から該イムノグロブリンを溶出させる工程、
を含む、イムノグロブリンを単離する方法。
【手続補正書】
【提出日】平成25年4月23日(2013.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表されるタンパク質リガンドが固定化された、アフィニティークロマトグラフィー用担体。
Ｒ−Ｒ2          （１）
（式中、
Ｒは、ＡＴＫまたはＡＳＫで示されるアミノ酸配列を含む４〜３０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドを示し、
Ｒ2は、配列番号１若しくは配列番号２で示されるアミノ酸配列、または配列番号１若しくは配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインを含む、５０〜５００個のアミノ酸残基からなるポリペプチドを示す（ここで、Ｒ2がＲに結合する末端は、該イムノグロブリン結合ドメインのＣ末端またはＮ末端である。）。）
【請求項２】
前記配列番号１若しくは配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列が、配列番号３で示されるアミノ酸配列である、請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
【請求項３】
前記Ｒが、ＡＴＫとＡＳＫとの組み合わせで示されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
【請求項４】
前記Ｒが、ＡＴＫＡＳＫまたはＡＳＫＡＴＫで示されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
【請求項５】
前記一般式（１）で表されるタンパク質リガンドは、該リガンド中のアミノ基またはチオール基がエポキシ基を有する担体とエポキシ基開環反応することにより、該担体に固定化されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体にイムノグロブリンを含有する試料を通液し、該担体にイムノグロブリンを吸着させる工程、および、
該担体から該イムノグロブリンを溶出させる工程、
を含む、イムノグロブリンを単離する方法。
【国際調査報告】
2012086660.tif 000012
2012086660.tif 000013
2012086660.tif 000014
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