(57)【要約】  酸素化体の安定性が高く、生体適合性が高く、且つ、調製（合成）が容易である新規なヘモグロビン−アルブミン複合体、並びに該複合体を含む人工血漿増量剤及び人工酸素運搬体を提供する。本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体は、コアとしてのヘモグロビンと、前記ヘモグロビンに架橋剤を介して結合されたシェルとしてのアルブミンと、を有することを特徴とする。また、本発明の人工酸素運搬体は、本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体を含むことを特徴とする。
2012117688.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コアとしてのヘモグロビンと、前記ヘモグロビンに架橋剤を介して結合されたシェルとしてのアルブミンと、を有することを特徴とするヘモグロビン−アルブミン複合体。
【請求項２】
前記ヘモグロビンにおける前記架橋剤との結合部位がリシンであることを特徴とする請求項１に記載のヘモグロビン−アルブミン複合体。
【請求項３】
前記アルブミンにおける前記架橋剤との結合部位がシステイン３４であることを特徴とする請求項１又は２に記載のヘモグロビン−アルブミン複合体。
【請求項４】
前記ヘモグロビンと前記架橋剤との結合がアミド結合であり、前記アルブミンと前記架橋剤との結合がジスルフィド結合及びスルフィド結合のいずれかであることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のヘモグロビン−アルブミン複合体。
【請求項５】
前記アルブミンの数が１個〜７個であることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載のヘモグロビン−アルブミン複合体。
【請求項６】
前記ヘモグロビンが、ヒトヘモグロビン、ウシヘモグロビン、組換えヒトヘモグロビン、及び分子内架橋ヘモグロビンからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載のヘモグロビン−アルブミン複合体。
【請求項７】
前記アルブミンが、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、及び組換えヒト血清アルブミンからなる群から選択される少なくとも１種である請求項１から６のいずれかに記載のヘモグロビン−アルブミン複合体。
【請求項８】
前記架橋剤が、下記一般式（１）〜（３）及び化学式（１）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載のヘモグロビン−アルブミン複合体。【化１】
2012117688.tif 000023
一般式（１）中、Ｒ1は、水素原子及びＳＯ3-Ｎａ+のいずれかを表し、ｎは、１〜１０の整数を表す。
【化２】
2012117688.tif 000024
【化３】
2012117688.tif 000025
一般式（２）中、ｎは、１〜１０の整数を表す。
【化４】
2012117688.tif 000026
一般式（３）中、Ｒ2は、水素原子及びＳＯ3-Ｎａ+のいずれかを表し、ｎは、１〜１０の整数を表す。
【請求項９】
前記架橋剤が、下記一般式（４）で表されることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載のヘモグロビン−アルブミン複合体。【化５】
2012117688.tif 000027
一般式（４）中、Ｒ3は、水素原子及びＳＯ3-Ｎａ+のいずれかを表し、Ｒ4は、下記一般式（５）〜（６）及び下記化学式（２）〜（４）のいずれかを表す。
【化６】
2012117688.tif 000028
一般式（５）中、ｎは、１〜１０の整数を表す。
【化７】
2012117688.tif 000029
【化８】
2012117688.tif 000030
【化９】
2012117688.tif 000031
一般式（６）中、ｎは、２、４、６、８、１０又は１２の整数を表す。
【化１０】
2012117688.tif 000032
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載のヘモグロビン−アルブミン複合体を含むことを特徴とする人工血漿増量剤。
【請求項１１】
請求項１から９のいずれかに記載のヘモグロビン−アルブミン複合体を含むことを特徴とする人工酸素運搬体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ヘモグロビン−アルブミン複合体、並びに該複合体を含む人工血漿増量剤及び人工酸素運搬体に関し、特に、ヘモグロビンとアルブミンとが架橋剤を介して結合されたヘモグロビン−アルブミン複合体（ヘテロクラスター）、並びに該複合体を含む人工血漿増量剤及び人工酸素運搬体に関する。
【背景技術】
【０００２】  血液の重要な役割の１つとして酸素の輸送がある。血液に含まれる赤血球中のヘモグロビン（ヘムを活性中心とする分子量が約６４,５００のヘムタンパク質）が、肺で酸素を結合し、末梢組織で酸素を解離することにより、体組織細胞に絶え間なく酸素が供給されている。【０００３】  ところで、災害や事故などによって人体から大量の出血が生じた場合、輸血により体内の酸素輸送を回復／維持する必要がある。多くの医療先進国においては、献血／輸血体制が整備されており、輸血に伴うウイルス感染などのリスクはかなり低い。  しかしながら、赤血球を投与する際には、事前に血液型の確認（クロスマッチング）を行う必要がある。また、未知ウイルスに感染するリスクを完全に排除することはできない。また、赤血球の保存期間は４℃で３週間と短いため、大規模な災害が発生した場合、充分な量の輸血液を確保することができないという懸念がある。さらに、今後、少子高齢化が進むにつれ、血液提供者（ドナー）層の人口が減少して、輸血液の安定供給が困難になることが予想される。  また、現在、赤血球以外の血液の成分(例えば、血漿タンパク質)の代替物については開発が進んでいるものの、赤血球の代替物としての人工赤血球（酸素運搬体）の開発が遅れている状態である。よって、赤血球の代替物としての人工赤血球（酸素運搬体）が開発されれば、人工血液の開発も大幅に進むことになる。【０００４】  斯かる状況の下、血液型が存在せず（あらゆる血液型の人間に対して投与可能であり）、ウイルス感染などのリスクがなく、長期保存可能で、必要な時にいつでも使用可能である人工酸素運搬体（人工赤血球）の開発が国際的に展開されている。  例えば、米国では、人工酸素運搬体として、ヘモグロビンを分子内架橋した分子内架橋ヘモグロビン（例えば、特許文献１参照）、ヒトヘモグロビンを架橋剤で結合したヘモグロビン重合体（例えば、特許文献２参照）、ウシヘモグロビンを架橋剤で結合したヘモグロビン重合体（例えば、特許文献３参照）、ヒトヘモグロビンの分子表面に水溶性高分子であるポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を結合させたＰＥＧヘモグロビン（例えば、特許文献４参照）、などが開発され、臨床試験が進んでいる。これらの人工酸素運搬体は、サブユニット間を架橋したり、分子サイズ（分子量）を大きくしたりして、ヘモグロビンのサブユニットへの解離等による腎排泄を回避するという分子設計であるが、臨床試験において、血管収縮による血圧亢進等の副作用が生じたり、人工酸素運搬体投与群と生理食塩水投与群との間に効果の差が認められない、などの理由から、食品医薬品局（ＦＤＡ）に認可されて、臨床使用されている製剤は、未だ存在しない。  一方、日本でも、リン脂質分子が水中で自己組織化されて形成される二分子膜小胞体（リポソーム）の内水相にヘモグロビンを封入した細胞型人工酸素運搬体の開発が進んでいる（例えば、特許文献５参照）。この細胞型人工酸素運搬体には、問題となる副作用もなく、実用化が待望されるが、高度な調製技術及び初期コストが必要となるという課題があり、臨床試験まで至っていない。【０００５】  また、本発明者らは、タンパク質のうちヘモグロビンの次に多く血液中に含まれる��清アルブミンの多分子結合能に着目し、その疎水ポケットに酸素結合部位となる鉄ポルフィリン（ヘム）を包接させたアルブミン−ヘム複合体を開発した（例えば、特許文献６参照）。このアルブミン−ヘム複合体は、酸素結合能及び生体内酸素輸送能を有することが明らかであるが、ヘム誘導体が特殊構造であるために合成が煩雑であること、ヘム誘導体の酸素化体の安定性がヘモグロビンの酸素化体の安定性に比べると低いこと、などの課題がある。【０００６】  以上のような背景から、酸素化体の安定性が高く、生体適合性が高く（例えば、腎排泄がなく、血圧亢進等の副作用がなく）、且つ、調製（合成）が容易である新規な人工酸素運搬体の開発が強く望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１０−３０６０３６号公報
【特許文献２】特表平１１−５０２８２１号公報
【特許文献３】特表２００６−５１６９９４号公報
【特許文献４】特表２００５−５１５２２５号公報
【特許文献５】特開２００４−３０７４０４号公報
【特許文献６】特開平８−３０１８７３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  本発明は、酸素化体の安定性が高く、生体適合性が高く、且つ、調製（合成）が容易である新規なヘモグロビン−アルブミン複合体、並びに該複合体を含む人工血漿増量剤及び人工酸素運搬体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  本発明者は、酸素結合能を有するヘモグロビンからなるコアに、負の表面電荷を有する血清アルブミンを、架橋剤を介して、クラスター状に結合させることにより、その目的を達成し得ることを見出した。【００１０】  すなわち、本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体は、コアとしてのヘモグロビンと、前記ヘモグロビンに架橋剤を介して結合されたシェルとしてのアルブミンと、を有することを特徴とする。【００１１】  本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体は、前記ヘモグロビンにおける前記架橋剤との結合部位がリシンであることが望ましい。【００１２】  本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体は、前記アルブミンにおける前記架橋剤との結合部位がシステイン３４であることが望ましい。【００１３】  本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体は、前記ヘモグロビンと前記架橋剤との結合がアミド結合であり、前記アルブミンと前記架橋剤との結合がジスルフィド結合及びスルフィド結合のいずれかであることが望ましい。【００１４】  本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体は、前記アルブミンの数が１個〜７個であることが望ましい。【００１５】  本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体は、前記ヘモグロビンが、ヒトヘモグロビン、ウシヘモグロビン、組換えヒトヘモグロビン、及び分子内架橋ヘモグロビンからなる群から選択される少なくとも１種であることが望ましい。【００１６】  本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体は、前記アルブミンが、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、及び組換えヒト血清アルブミンからなる群から選択される少なくとも１種であることが望ましい。【００１７】  本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体は、前記架橋剤が、下記一般式（１）〜（３）及び化学式（１）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも１種であることが望ましい。【化１】
2012117688.tif 000003
一般式（１）中、Ｒ1は、水素原子及びＳＯ3-Ｎａ+のいずれかを表し、ｎは、１〜１０の整数を表す。
【化２】
2012117688.tif 000004
【化３】
2012117688.tif 000005
一般式（２）中、ｎは、１〜１０の整数を表す。
【化４】
2012117688.tif 000006
一般式（３）中、Ｒ2は、水素原子及びＳＯ3-Ｎａ+のいずれかを表し、ｎは、１〜１０の整数を表す。
【００１８】  本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体は、前記架橋剤が、下記一般式（４）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも１種であることが望ましい。【化５】
2012117688.tif 000007
一般式（４）中、Ｒ3は、水素原子及びＳＯ3-Ｎａ+のいずれかを表し、Ｒ4は、下記一般式（５）〜（６）及び下記化学式（２）〜（４）のいずれかを表す。
【化６】
2012117688.tif 000008
一般式（５）中、ｎは、１〜１０の整数を表す。
【化７】
2012117688.tif 000009
【化８】
2012117688.tif 000010
【化９】
2012117688.tif 000011
一般式（６）中、ｎは、２、４、６、８、１０又は１２の整数を表す。
【化１０】
2012117688.tif 000012
【００１９】  本発明の人工血漿増量剤は、本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体を含むことを特徴とする。  本発明の人工酸素運搬体は、本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】  本発明によれば、酸素化体の安定性が高く、生体適合性が高く、且つ、調製（合成）が容易である新規なヘモグロビン−アルブミン複合体、並びに該複合体を含む人工血漿増量剤及び人工酸素運搬体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】  以下、本発明について必要に応じて図面を参照して具体的に説明する。
【００２３】（ヘモグロビン−アルブミン複合体）  本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体は、少なくとも、コアとしてのヘモグロビンと、シェルとしてのアルブミンとを有し、さらに必要に応じて、その他の部位を有する。  前記ヘモグロビンと前記アルブミンとは、架橋剤を介して結合されている。  例えば、図１に示すように、本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体（星型へテロクラスター）１００は、コアとしてのヘモグロビン１０と、シェルとしての４個のアルブミン２０とを有する。図１において、ヘモグロビン１０とアルブミン２０とは、架橋剤（不図示）を介して結合されている。
【００２４】＜ヘモグロビン＞  前記ヘモグロビンは、分子量が約６４５００である。  前記ヘモグロビン分子は、４つのサブユニットから構成され、各サブユニットは、それぞれ１つのプロトヘムを有する。該プロトヘム内の鉄原子に酸素が結合する。即ち、１つのヘモグロビン分子には、４つの酸素分子が結合する。  前記ヘモグロビンとしては、ヒトを含む脊椎動物のものである限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒトヘモグロビン、ウシヘモグロビン、組換えヒトヘモグロビン、分子内架橋ヘモグロビン、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。  これらの中でも、ヒトヘモグロビンが、生体適合性が高い点で好ましい。  また、前記ヘモグロビンは、タンパク質合成（培養）により容易に製造することができる。
【００２５】−ヒトヘモグロビン−  前記ヒトヘモグロビンとしては、ヒト由来の赤血球から精製したものである限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２６】−ウシヘモグロビン−  前記ウシヘモグロビンとしては、ウシ由来の赤血球から精製したものである限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２７】−組換えヒトヘモグロビン−  前記組換えヒトヘモグロビンとしては、通常の遺伝子組換え操作、培養操作により産生したものである限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２８】−分子内架橋ヘモグロビン−  前記分子内架橋ヘモグロビンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヘモグロビンにおけるサブユニットが架橋剤を介して互いに結合されたヘモグロビン、などが挙げられる。  前記分子内架橋ヘモグロビンの具体例としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｄｉａｓｐｉｒｉｎ架橋ヘモグロビン（物質名：ＤＣＬＨｂ、バクスターヘルスケア社）、などが挙げられる。
【００２９】＜アルブミン＞  前記アルブミンは、血液中ではコロイド浸透圧調整を主な役割とする単純タンパク質であるが、栄養物質やその代謝産物（例えば、脂肪酸）あるいは薬物等の輸送タンパク質としても機能し、その他、ｐＨ緩衝作用、エステラーゼ活性、などを有する。また、前記アルブミンは、血漿タンパク質であるから、生体への適用、特に、赤血球代替物としての利用に関して格段に有利である。  前記アルブミンの等電点は、７よりも低く、生理条件では、分子表面が強く負に帯電しているため、血管内皮細胞の外側にある基底膜（負に帯電）との静電反発により、血管外に漏れ出しにくい。  また、前記アルブミンは、タンパク質合成（培養）により容易に製造することができる。
【００３０】  前記ヘモグロビンに架橋剤を介して結合するアルブミンの数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１個〜７個が好ましい。７個以上は、立体障害のため結合することが困難と考えられる。  前記アルブミンの数の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、（１）電気泳動法により測定したヘモグロビン−アルブミン複合体全体の分子量と、ヘモグロビンの分子量（６４５００）と、アルブミンの分子量（６６５００）に基づいて算出する方法、（２）シアノメトヘモグロビン法（例えば、アルフレッサファーマ社、ネスコートヘモキットＮ、Ｎｏ．１３８０１６−１４）を用いたタンパク質の定量により算出したタンパク質の濃度、及び、６６０ｎｍ法（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ社、６６０ｎｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｎｏ．２２６６２）を用いたヘムの定量により算出したヘモグロビンの濃度に基づいて算出する方法、（３）電子顕微鏡で観察する方法などが挙げられる。  また、アルブミンの数が異なるヘモグロビン−アルブミン複合体の混合体から、アルブミンの数が所定の個数であるヘモグロビン−アルブミン複合体を単離する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カラムクロマトグラフィーによる単離方法、などが挙げられる。
【００３１】  前記アルブミンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、組換えヒト血清アルブミン、などが挙げられる。
【００３２】−ヒト血清アルブミン−  前記ヒト血清アルブミンとしては、ヒト由来の血漿タンパク質から精製したものである限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。  前記ヒト血清アルブミンは、血漿タンパク質の約６０％を占める単純タンパク質（６６５００Ｄａ）であり、血中では、コロイド浸透圧を維持する役割や、各種内因性／外因性物質を貯蔵乃至運搬する役割を担っている。前記ヒト血清アルブミンの等電点は、４．８と低く、生理条件では、分子表面が強く負に帯電しているため、血管内皮細胞の外側にある基底膜（負に帯電）との静電反発により、血管外に漏れ出しにくい。
【００３３】−ウシ血清アルブミン−  前記ウシ血清アルブミンとしては、ウシ由来の血漿タンパク質から精製したものである限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３４】−組換えヒト血清アルブミン−  前記組換えヒト血清アルブミンとしては、通常の遺伝子組換え操作、培養操作により産生したものである限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。  なお、近年、日本では世界に先駆け、ピキア酵母を宿主とした組換えヒト血清アルブミンの量産体制が確立し、その臨床利用が開始されている。
【００３５】＜架橋剤＞  前記架橋剤としては、ヘモグロビンとアルブミンとを連結可能な２官能性架橋剤である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下記一般式（１）〜（４）及び化学式（１）で表される化合物、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。  これらの中でも、α−（Ｎ−スクシンイミジル）−ω―ピリジルジチオ架橋剤（下記一般式（１）において、Ｒ1が水素原子であり、ｎが５であるもの）、α−（Ｎ−スクシンイミジル）−ω―マレイミド架橋剤（下記一般式（４）において、Ｒ3が水素原子であり、Ｒ4が一般式（５）であるもの、さらには、Ｒ3が水素原子であり、Ｒ4が一般式（５）であり、かつｎ＝５であるもの、さらには、Ｒ3が水素原子であり、Ｒ4が化学式（３）であるもの）が好ましい。【化１１】
2012117688.tif 000013
一般式（１）中、Ｒ1は、水素原子及びＳＯ3-Ｎａ+のいずれかを表し、ｎは、１〜１０の整数を表す。例えば、ｎ＝５のものなどが一般的に挙げられる。
【化１２】
2012117688.tif 000014
【化１３】
2012117688.tif 000015
一般式（２）中、ｎは、１〜１０の整数を表す。例えば、ｎ＝２のものなどが一般的に挙げられる。
【化１４】
2012117688.tif 000016
一般式（３）中、Ｒ2は、水素原子及びＳＯ3-Ｎａ+のいずれかを表し、ｎは、１〜１０の整数を表す。例えば、ｎ＝５のものなどが一般的に挙げられる。
【化１５】
2012117688.tif 000017
一般式（４）中、Ｒ3は、水素原子及びＳＯ3-Ｎａ+のいずれかを表し、Ｒ4は、下記一般式（５）〜（６）及び下記化学式（２）〜（４）のいずれかを表す。
【化１６】
2012117688.tif 000018
一般式（５）中、ｎは、１〜１０の整数を表す。
【化１７】
2012117688.tif 000019
【化１８】
2012117688.tif 000020
【化１９】
2012117688.tif 000021
一般式（６）中、ｎは、２、４、６、８、１０又は１２の整数を表す。
【化２０】
2012117688.tif 000022
【００３６】  前記架橋剤におけるスクシンイミジル基と、ヘモグロビンにおけるリシン残基のアミノ基（−ＮＨ2）とは、アミド結合（共有結合）を形成する。  前記アミド結合を形成するための方法としては、例えば、ヘモグロビン及び架橋剤を５℃〜３０℃で０．２時間〜３時間攪拌すること、などが挙げられる。  前記架橋剤におけるピリジルジチオ基（ＳＳ結合）と、アルブミン分子におけるシステイン３４（還元型システイン）とは、ジスルフィド結合（共有結合）を形成する。なお、該ジスルフィド結合は、切断されやすいという特性を有する。  前記ジスルフィド結合を形成するための方法としては、例えば、アルブミン及び架橋剤を５℃〜３０℃で１時間〜４０時間攪拌すること、などが挙げられる。  前記架橋剤におけるマレイミド基と、アルブミン分子におけるシステイン３４（還元型システイン）とは、スルフィド結合（共有結合）を形成する。  前記スルフィド結合を形成するための方法としては、例えば、アルブミン及び架橋剤を５℃〜３０℃で１時間〜４０時間攪拌すること、などが挙げられる。  アルブミン分子において、システイン３４（還元型システイン）は１つしか存在しないため、本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体は、星型のクラスター構造（例えば、図１）となり、分子構造が明確である。
【００３７】＜その他の部位＞  前記その他の部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アルブミン表面に共有結合により導入されたポリ（エチレングリコール）、アルブミンとともにヘモグロビンに結合された蛋白質、などが挙げられる。
【００３８】  本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体の等電点としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜調整することができるが、４．７〜６．５が好ましく、４．７〜５．５がより好ましい。
【００３９】  以上より、本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体は、酸素結合サイトがヘモグロビンであるため、安定な酸素化体を形成することが可能であり、体組織に効率良く酸素を供給することができる。また、本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体は、コアヘモグロビンの周囲がアルブミンで覆われているので、等電点がアルブミンと同程度に低く、腎排泄、血管内皮細胞からの漏出、血管収縮による血圧亢進も惹起しない。また、ヘモグロビン及びアルブミンは生体物質であるため、代謝が良いと考えられる。さらに、本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体は、調製が比較的容易であるにもかかわらず、三次元構造は明確である。  また、本願発明のヘモグロビン−アルブミン複合体は、ヘモグロビンが酸素結合部位であることにより、酸素結合解離曲線がＳ字曲線となり、特に、末梢細胞の酸素分圧が低下した場合に、酸素運搬能力が向上するという効果を有することが予測される。  以上より、本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体は、安全性（生体適合性）と有効性を併せ持った類例のない人工酸素運搬体といえる。
【００４０】（人工血漿増量剤）  本発明の人工血漿増量剤は、本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体を含むことを特徴とする。なお、前記人工血漿増量剤とは、出血などにより、循環血液量が不足した患者に対して、循環血液量を回復・維持させる目的で投与される輸液剤乃至輸液製剤である。
【００４１】（人工酸素運搬体）  本発明の人工酸素運搬体は、本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体を含むことを特徴とする。なお、前記人工酸素運搬体とは、酸素分子を運搬可能な物質であり、生体に投与した場合には、赤血球の代替物として機能するものである。
【実施例】
【００４２】  以下、本発明について、実施例に基づき具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００４３】（実施例１）−調製例１：メルカプトヒト血清アルブミン（ＨＳＡ−ＳＨ）の調製−  まず、メルカプト分率が約２５％と低いヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）におけるシステイン（Ｃｙｓ−３４）の残基を全てチオール基に還元しておくために、以下の操作を行った。  まず、サンプル瓶（３０ｍＬ容量）にヒト血清アルブミン（９２０μＭ）１．３ｍＬを入れ、リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、１０ｍＭ、ｐＨ７．４）１０．７ｍＬで希釈し、０．１ｍＭ（１２ｍＬ）のヒト血清アルブミン溶液を調製した。  次に、エッペンドルフチューブ（２ｍＬ容量）にジチオスレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）（ＤＴＴ、和光純薬社製）１２．３ｍｇを入れ、軽く脱気した後、別途脱気したリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）１ｍＬを加えて溶解し、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液（８０ｍＭ）１ｍＬを調製した。  ヒト血清アルブミン溶液（１２ｍＬ）にジチオスレイトール（ＤＴＴ）水溶液３０μＬ（ジチオスレイトール／ヒト血清アルブミン（ＤＴＴ／ＨＳＡ）＝２（ｍｏｌ／ｍｏｌ））を加えてよく振とうし、室温で４０分間静置した。  その溶液１２．０ｍＬを数本の遠心濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、ＶＩＶＡ  ＳＰＩＮ  ２０、限外分子量５ｋＤａ）に分け入れ、それぞれをリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、１０ｍＭ、ｐＨ７．４）で希釈後、遠心分離機（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製、Ａｌｌｅｇｒａ  Ｘ−１５Ｒ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて、４０００ｒｐｍ、３０分間、４℃の条件で、約１．０ｍＬまで濃縮した。  さらに、リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）１９ｍＬを添加し、同条件で約１．０ｍＬまで濃縮した。  この希釈／濃縮操作を３回繰り返すことにより余剰のジチオスレイトール（ＤＴＴ）を除去することができた。  最後に数本のチューブ内の試料をサンプル瓶（８ｍＬ容量）にまとめ、リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）で全容量を２．４ｍＬに調整した結果、メルカプトヒト血清アルブミン（ＨＳＡ−ＳＨ）濃度は０．５ｍＭとなった。  チオール基とジスルフィド結合の交換反応を利用して、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のメルカプト分率を定量した。２，２'−ジチオピリジン（２，２'−Ｄｉｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）（２，２'−ＤＴＰ）は遊離チオール（ＳＨ）基と反応し、２−チオピリジノン（２−Ｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｏｎｅ）（２−ＴＰ）を生じるので、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に２，２'−ジチオピリジン（２，２'−ＤＴＰ）を加え、生成した２−チオピリジノン（２−ＴＰ）の量を測ることにより、システイン３４（Ｃｙｓ−３４）におけるチオール（ＳＨ）基の量が定量できた。  エッペンドルフチューブ（２ｍＬ容量）に２，２'−ジチオピリジン（２，２'−ＤＴＰ）２．２ｍｇを入れ、リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）１ｍＬを加えてよく振とうし、２，２'−ジチオピリジン（２，２'−ＤＴＰ）溶液（１０ｍＭ）１ｍＬを調製した。  まず、分光用石製セル（１ｃｍ）にリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）２．７ｍＬを加え、紫外可視吸収（ＵＶ−Ｖｉｓ．）スペクトル（１９０ｎｍ−７００ｎｍ）を紫外可視分光光度計（商品名：紫外可視分光光度計８４５４、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて測定した（ブランク）。  次に、石英セルに、メルカプトヒト血清アルブミン（ＨＳＡ−ＳＨ）（５００μＭ）０．３ｍＬを加えてよく振とうし（１０倍希釈となる。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）濃度＝５０μＭ）、紫外可視吸収スペクトル測定を行った。  続いて、２，２'−ジチオピリジン（２，２'−ＤＴＰ）溶液（１０ｍＭ）０．０７５ｍＬを添加し（ジチオピリジン／ヒト血清アルブミン（ＤＴＰ／ＨＳＡ）＝５（ｍｏｌ／ｍｏｌ））、よく振とうした。  ３０分間静置した後、紫外可視吸収スペクトル測定を行った。３４２ｎｍの吸光度と２−チオピリジノン（２−ＴＰ）のモル吸光係数（ε342＝８．１×１０3Ｍ-1ｃｍ-1）から、ピリジルジチオ基の濃度を算出した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）濃度で割ることにより、ヒト血清アルブミンのメルカプト分率（還元型システイン３４の割合）を算出したところ、約８０％〜１００％であった。【００４４】−調製例２：ヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＰＤＰＨ）の調製−  サンプル瓶（８ｍＬ容量）にＣＯ化ヒトヘモグロビン（Ｈｂ）水溶液（５０９μＭ）０．３９ｍＬを入れ、リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）１．６１ｍＬで希釈し、０．１ｍＭ  ２ｍＬとした。  次に、エッペンドルフチューブ（２ｍＬ容量）にスクシンイミジル−６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６［３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ）（ＳＰＤＰＨ、ＰＩＥＲＣＥ社製）２．１ｍｇを入れ、エタノール(ＥｔＯＨ)０．２５ｍＬを加えて溶解し、２０ｍＭ  スクシンイミジル−６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＰＤＰＨ）のエタノール溶液を調製した。  先のヒトヘモグロビン（Ｈｂ）溶液（２ｍＬ）にスクシンイミジル−６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＰＤＰＨ）溶液０．２ｍＬを撹拌（１００ｒｐｍ）しながら添加し（スクシンイミジル−６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート／ヒトヘモグロビン（ＳＰＤＰＨ／Ｈｂ）（＝１８（ｍｏｌ／ｍｏｌ））、室温で３０分間撹拌した。  得られた反応溶液から、調製例１に記載の方法で未反応のスクシンイミジル−６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＰＤＰＨ）を除去した。  具体的には、ヒトヘモグロビン（Ｈｂ）溶液２．２ｍＬを遠心濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０）に移し、リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）約１８ｍＬで１０倍に希釈後、４０００ｒｐｍ、３０分間、４℃で約１．０ｍＬまで濃縮した。  そこに、リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）１９ｍＬを添加し、同条件で約１．０ｍＬまで濃縮した。  この希釈／濃縮操作を数回繰り返すことにより未反応のスクシンイミジル−６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＰＤＰＨ）を除去することができる。  最後にチューブ内の試料をサンプル瓶（８ｍＬ容量）に移し、リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）を添加し、全容量を２．０ｍＬに調整した。  ヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＰＤＰＨ）濃度は０．１ｍＭとなる。  ヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＰＤＰＨ）分子表面に導入されたピリジルジチオ基の数は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で末端ジスルフィド結合を還元し、遊離した２−チオピリジノン（２ＴＰ）の量を測ることにより決定できる。  エッペンドルフチューブ（２ｍＬ容量）にジチオスレイトール（ＤＴＴ）１２．３ｍｇを入れ、軽く脱気した後、別途脱気したリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）１ｍＬを加え溶解し、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液（８０ｍＭ）１ｍＬを調製した。  分光用石英セル（１ｃｍ×１ｃｍ）にリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）２．８５ｍＬを加え、紫外可視吸収（ＵＶ−Ｖｉｓ．）スペクトル（１９０ｎｍ−７００ｎｍ）を測定した（ブランク）。  次に、ヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＰＤＰＨ、１００μＭ）０．１５ｍＬを加えてよく振とうし（２０倍に希釈となる。ヒトヘモグロビン（Ｈｂ）濃度＝５μＭ）、紫外可視吸収スペクトルを測定した。  引き続き、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液（８０ｍＭ）１８μＬを添加し（ジチオスレイトール／ヒトヘモグロビン（ＤＴＴ／Ｈｂ）＝９５（ｍｏｌ／ｍｏｌ））、よく振とうした。  ３０分間静置した後、１９０ｎｍ〜７００ｎｍにおいて紫外可視スペクトルを測定した。３４２ｎｍの吸光度と２−チオピリジノン（２−ＴＰ）のモル吸光係数（ε342＝８．１×１０3Ｍ-1ｃｍ-1）値から、ピリジルジチオ基の濃度を算出した。  ヒトヘモグロビン（Ｈｂ）濃度との比率から、ヒトヘモグロビン１分子当たりのピリジルジチオ基の本数を決定したところ、８〜９本であった。【００４５】−調製例３：ヒトヘモグロビン／ヒト血清アルブミン（Ｈｂ／ＨＳＡn）ヘテロクラスターの調製−  調製例１で得たメルカプトヒト血清アルブミン（ＨＳＡ−ＳＨ）（５００μＭ）２ｍＬをサンプル瓶（８ｍＬ容量）に入れ、撹拌子で撹拌（１００ｒｐｍ）しながら、調製例２で得たヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＰＤＰＨ）１ｍＬをゆっくりと滴下し、室温・遮光下で２０時間反応させた。  反応溶液（３ｍＬ）をＤｉｓｍｉｃフィルター（口径０．４５μｍ、Ａｄｖａｎｔｅｃ社製）で濾過し、得られた混合物のうち２ｍＬを低圧クロマトグラフィーシステム（ＧＥヘルスケア、ＡＫＴＡ  ｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓ、カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ２００  １０／３００  ＧＬ、溶出液：リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ））を用いて、４℃にて分離・精製した。溶出液はフラクションコレクターで捕集した。溶出曲線においては、ヒトヘモグロビン（Ｍｗ：６４．５ｋＤａ）やヒト血清アルブミン（Ｍｗ：６６．５ｋＤａ）のピークより早い時間に複数のピークが出現し、高分子量体の生成が示唆された。主要な４つのピークを含む分画について、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ電気泳動測定（和光純薬、ＳｕｐｅｒＳｅｐ  Ａｃｅ  ５−１２％  １３ｗｅｌｌ）を行ったところ、Ｍｗ：１８０ｋＤａ、２６０ｋＤａ、３６０ｋＤａ、４７０ｋＤａ付近に明確なバンドが現れたので、それぞれの各成分のみを含む分画を単離し、回収した。  単離した高分子量体について、シアノメトヘモグロビン法（アルフレッサファーマ社、ネスコートヘモキットＮ、Ｎｏ．１３８０１６−１４）によりヒトヘモグロビン濃度を定量し、６６０ｎｍ法（Ｐｉｅｒｃｅ社、６６０ｎｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｎｏ．２２６６２）によりタンパク質濃度を定量した。  分子量の低い成分から、ヒト血清アルブミン／ヒトヘモグロビン比が１．１、２．２、３．０、３．８となり、ヒトヘモグロビンにヒト血清アルブミンが１、２、３、４つ結合したヘテロクラスター（（Ｈｂ／ＨＳＡ1）ＳＰＤＰＨ、（Ｈｂ／ＨＳＡ2）ＳＰＤＰＨ、（Ｈｂ／ＨＳＡ3）ＳＰＤＰＨ、（Ｈｂ／ＨＳＡ4）ＳＰＤＰＨ）が生成していることが分かった。【００４６】（実施例２）  実施例１における調製例２で、スクシンイミジル−６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６［３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ）（ＳＰＤＰＨ、ＰＩＥＲＣＥ社製）の代わりに、スルホスクシンイミジル−６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６［３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ）（ＳＳＰＤＰＨ、ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いた以外は、実施例１における調製例１及び２と同様な方法に従って、ヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＳＰＤＰＨ）を調製した。ピリジルジチオ基の濃度を算出し、ヒトヘモグロビン（Ｈｂ）濃度との比率からヒトヘモグロビン１分子当たりのピリジルジチオ基の本数を決定したところ、７〜８本であった。  引き続き、実施例１における調製例３でヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＰＤＰＨ）の代わりにヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＳＰＤＰＨ）を用いた以外は、実施例１における調製例３と同様な方法に従って、ヒトヘモグロビンにヒト血清アルブミンが１、２、３、４つ結合したヘテロクラスター（（Ｈｂ／ＨＳＡ1）ＳＳＰＤＰＨ、（Ｈｂ／ＨＳＡ2）ＳＳＰＤＰＨ、（Ｈｂ／ＨＳＡ3）ＳＳＰＤＰＨ、（Ｈｂ／ＨＳＡ4）ＳＳＰＤＰＨ）を合成し、それぞれを単離した。【００４７】（実施例３）  実施例１における調製例２で、スクシンイミジル−６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６［３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ）（ＳＰＤＰＨ、ＰＩＥＲＣＥ社製）の代わりに、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α（２−ピリジルジチオ）トルエン（４−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−ｍｅｔｈｙｌ−α（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｔｏｌｕｅｎｅ）（ＳＭＰＴ、ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いた以外は、実施例１における調製例１及び２と同様な方法に従って、ヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＭＰＴ）を調製した。ピリジルジチオ基の濃度を算出し、ヒトヘモグロビン（Ｈｂ）濃度との比率からヒトヘモグロビン１分子当たりのピリジルジチオ基の本数を決定したところ、７〜９本であった。  引き続き、実施例１における調製例３でヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−��ＰＤＰＨ）の代わりにヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＭＰＴ）を用いた以外は、実施例１における調製例３と同様な方法に従って、ヒトヘモグロビンにヒト血清アルブミンが１、２、３、４つ結合したヘテロクラスター（（Ｈｂ／ＨＳＡ1）ＳＭＰＴ、（Ｈｂ／ＨＳＡ2）ＳＭＰＴ、（Ｈｂ／ＨＳＡ3）ＳＭＰＴ、（Ｈｂ／ＨＳＡ4）ＳＭＰＴ）を合成し、それぞれを単離した。【００４８】（実施例４）  実施例１における調製例２で、スクシンイミジル−６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６［３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ）（ＳＰＤＰＨ、ＰＩＥＲＣＥ社製）の代わりに、スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート(Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＳＰＤＰ、ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いた以外は、実施例１における調製例１及び２と同様な方法に従って、ヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＰＤＰ）を調製した。  ピリジルジチオ基の濃度を算出し、Ｈｂ濃度との比率からヒトヘモグロビン１分子当たりのピリジルジチオ基の本数を決定したところ、８〜９本であった。  引き続き、実施例１における調製例３でヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＰＤＰＨ）の代わりにヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＰＤＰ）を用いた以外は、実施例１における調製例３と同様な方法に従って、ヒトヘモグロビンにヒト血清アルブミンが１、２、３、４つ結合したヘテロクラスター（（Ｈｂ／ＨＳＡ1）ＳＰＤＰ、（Ｈｂ／ＨＳＡ2）ＳＰＤＰ、（Ｈｂ／ＨＳＡ3）ＳＰＤＰ、（Ｈｂ／ＨＳＡ4）ＳＰＤＰ）を合成し、それぞれを単離した。【００４９】（実施例５）  実施例１における調製例２で、スクシンイミジル−６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６［３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ）（ＳＰＤＰＨ、ＰＩＥＲＣＥ社製）の代わりに、スルホスクシンイミジル−６［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６［α−ｍｅｔｈｙｌ−α−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｔｏｌｕａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ（ＳＳＭＰＴＨ、ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いた以外は、実施例１における調製例１及び２と同様な方法に従って、ヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＳＭＰＴＨ）を調製した。ピリジルジチオ基の濃度を算出し、Ｈｂ濃度との比率からヒトヘモグロビン１分子当たりのピリジルジチオ基の本数を決定したところ、７〜８本であった。  引き続き、実施例１における調製例３でヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＰＤＰＨ）の代わりにヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＳＭＰＴＨ）を用いた以外は、実施例１における調製例３と同様な方法に従って、ヒトヘモグロビンにヒト血清アルブミンが１、２、３、４つ結合したヘテロクラスター（（Ｈｂ／ＨＳＡ1）ＳＳＭＰＴＨ、（Ｈｂ／ＨＳＡ2）ＳＳＭＰＴＨ、（Ｈｂ／ＨＳＡ3）ＳＳＭＰＴＨ、（Ｈｂ／ＨＳ��4）ＳＳＭＰＴＨ）を合成し、それぞれを単離した。【００５０】（実施例６）−調製例１：ヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＭＰＨ）の調製−  サンプル瓶（８ｍＬ容量）にＣＯ化ヒトヘモグロビン（Ｈｂ）水溶液（５０９μＭ）０．３９ｍＬを入れ、リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）１．６１ｍＬで希釈し、０．１ｍＭ２ｍＬとする。次に、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート(Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６−（β−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ)（ＳＭＰＨ、ＰＩＥＲＣＥ社製）７．６ｍｇをジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ）０．２５ｍＬに溶解し、８０ｍＭスクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）のジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)溶液を調製した。先のヒトヘモグロビン（Ｈｂ）溶液（２ｍＬ）にスクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）溶液０．０４７ｍＬを撹拌（１００ｒｐｍ）しながら添加し（スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート／ヒトヘモグロビン（ＳＭＰＨ／Ｈｂ））＝１８（ｍｏｌ／ｍｏｌ））、室温で３０分間撹拌した。得られた反応溶液から、実施例１における調製例２に記載の方法と同様の方法で未反応のスクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）を除去した。具体的には、ヒトヘモグロビン（Ｈｂ）溶液２．１ｍＬを遠心濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０）に移し、リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）約１８ｍＬで１０倍に希釈後、４０００ｒｐｍ、３０分間、４℃で約１．０ｍＬ（１／１０）まで濃縮した。そこにリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）１９ｍＬを添加し、同条件で約１．０ｍＬまで濃縮した。この希釈／濃縮操作を３回繰り返すことにより未反応のスクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）を除去した。最後にチューブ内の試料をサンプル瓶（８ｍＬ容量）に移し、リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）で全容量を２．０ｍＬに調整した。ヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＭＰＨ）濃度は０．１ｍＭとなった。【００５１】−調製例２：ヒトヘモグロビン／ヒト血清アルブミン（Ｈｂ／ＨＳＡn）ヘテロクラスターの調製−  実施例１の調製例１で得たメルカプトヒト血清アルブミン（ＨＳＡ−ＳＨ）（５００μＭ）２ｍＬをサンプル瓶（８ｍＬ容量）に入れ、撹拌子で撹拌（１００ｒｐｍ）しながら、ヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＭＰＨ）１ｍＬをゆっくりと滴下し、室温・遮光下で２０時間反応させた。  反応溶液（３ｍＬ）をＤｉｓｍｉｃフィルター（口径０．４５μｍ、Ａｄｖａｎｔｅｃ社製）で濾過し、得られた混合物のうち２ｍＬを低圧クロマトグラフィーシステム（ＧＥヘルスケア、ＡＫＴＡ  ｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓ、カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ２００  １０／３００  ＧＬ、溶出液：リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ））を用いて、４℃にて分離・精製した。溶出液はフラクションコレクターで捕集した。溶出曲線においては、ヒトヘモグロビン（Ｍｗ：６４．５ｋＤａ）やヒト血清アルブミン（Ｍｗ：６��．５ｋＤａ）のピークより早い時間に複数のピークが出現し、高分子量体の生成が示唆された。主要な４つのピークを含む分画について、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ電気泳動測定（和光純薬、ＳｕｐｅｒＳｅｐ  Ａｃｅ  ５−１２％  １３ｗｅｌｌ）を行ったところ、Ｍｗ：１８０ｋＤａ、２６０ｋＤａ、３６０ｋＤａ、４７０ｋＤａ付近に明確なバンドが現れたので、それぞれの各成分のみを含む分画を単離し、回収した。  単離した高分子量体について、シアノメトヘモグロビン法（アルフレッサファーマ社、ネスコートヘモキットＮ、Ｎｏ．１３８０１６−１４）によりヒトヘモグロビン濃度を、６６０ｎｍ法（Ｐｉｅｒｃｅ社、６６０ｎｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｎｏ．２２６６２）によりタンパク質濃度を定量した。分子量の低い成分から、ヒト血清アルブミン／ヒトヘモグロビン比が１．２、２．３、３．３、３．９となり、ヒトヘモグロビンにヒト血清アルブミンが１、２、３、４つ結合したヘテロクラスター（（Ｈｂ／ＨＳＡ1）ＳＭＰＨ、（Ｈｂ／ＨＳＡ2）ＳＭＰＨ、（Ｈｂ／ＨＳＡ3）ＳＭＰＨ、（Ｈｂ／ＨＳＡ4）ＳＭＰＨ）を合成した。【００５２】（実施例７） 実施例６における調製例１で、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエートＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６−（β−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ  （ＳＭＰＨ、ＰＩＥＲＣＥ社製）の代わりに、（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル（（α−ｍａｌｅｉｍｉｄｏａｃｅｔｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）（ＭＡＳ、ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いた以外は、実施例６における調製例１と同様な方法に従って、ヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＭＡＳ）を調製した。  実施例６における調製例２でヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＭＰＨ）の代わりにヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＭＡＳ）を用いた以外は、実施例６における調製例２と同様な方法に従って、ヒトヘモグロビンにヒト血清アルブミンが１、２、３、４つ結合したヘテロクラスター（（Ｈｂ／ＨＳＡ1）ＭＡＳ、（Ｈｂ／ＨＳＡ2）ＭＡＳ、（Ｈｂ／ＨＳＡ3）ＭＡＳ、（Ｈｂ／ＨＳＡ4）ＭＡＳ）を合成し、単離した。【００５３】（実施例８）  実施例６における調製例１で、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６−（β−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ）（ＳＭＰＨ、ＰＩＥＲＣＥ社製）の代わりに、（ε−マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミドエステル（（ε−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）（ＭＣＳ、ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いた以外は、実施例６における調製例１と同様な方法に従って、ヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＭＣＳ）を調製した。  実施例６における調製例２でヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＭＰＨ）の代わりにヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＭＣＳ）を用いた以外は、実施例６における調製例２と同様な方法に従って、ヒトヘモグロビンにヒト血清アルブミンが１、２、３、４つ結合したヘテロクラスター（（Ｈｂ／ＨＳＡ1）ＭＣＳ、（Ｈｂ／ＨＳＡ2）ＭＣＳ、（Ｈｂ／ＨＳＡ3）ＭＣＳ、（Ｈｂ／ＨＳＡ4）ＭＣＳ）を合成し、単離した。【００５４】（実施例９）  実施例６における調製例１で、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６−（β−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ）（ＳＭＰＨ、ＰＩＥＲＣＥ社製）の代わりに、（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（ε−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ  （ＭＣＳＳ、ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いた以外は、実施例６における調製例１と同様な方法に従って、ヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＭＣＳＳ）を調製した。  実施例６における調製例２で、ヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＭＰＨ）の代わりにヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＭＣＳＳ）を用いた以外は、実施例６における調製例２と同様な方法に従って、ヒトヘモグロビンにヒト血清アルブミンが１、２、３、４つ結合したヘテロクラスター（（Ｈｂ／ＨＳＡ1）ＭＣＳＳ、（Ｈｂ／ＨＳＡ2）ＭＣＳＳ、（Ｈｂ／ＨＳＡ3）ＭＣＳＳ、（Ｈｂ／ＨＳＡ4）ＭＣＳＳ）を合成し、単離した。【００５５】（実施例１０）  実施例６における調製例１で、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６−（β−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ）（ＳＭＰＨ、ＰＩＥＲＣＥ社製）の代わりに、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（ＳＭＣＣ、ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いた以外は、実施例６における調製例１と同様な方法に従って、ヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＭＣＣ）を調製した。  実施例６における調製例２で、ヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＭＰＨ）の代わりにヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＭＣＣ）を用いた以外は、実施例６における調製例２と同様な方法に従って、ヒトヘモグロビンにヒト血清アルブミンが１、２、３、４つ結合したヘテロクラスター（（Ｈｂ／ＨＳＡ1）ＳＭＣＣ、（Ｈｂ／ＨＳＡ2）ＳＭＣＣ、（Ｈｂ／ＨＳＡ3）ＳＭＣＣ、（Ｈｂ／ＨＳＡ4）ＳＭＣＣ）を合成し、単離した。【００５６】（実施例１１）  実施例６における調製例１で、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６−（β−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ）（ＳＭＰＨ、ＰＩＥＲＣＥ社製）の代わりに、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−６−エチレングリコールエステル（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−６−ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］  ｅｓｔｅｒ）（ＳＭ（ＰＥＧ）6、ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いた以外は、実施例６における調製例１と同様な方法に従って、ヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＭ���ＰＥＧ）6）を調製した。  実施例６における調製例２で、ヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＭＰＨ）の代わりにヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＭ（ＰＥＧ）6）を用いた以外は、実施例６における調製例２と同様な方法に従って、ヒトヘモグロビンにヒト血清アルブミンが１、２、３、４つ結合したヘテロクラスター（（Ｈｂ／ＨＳＡ1）ＳＭ（ＰＥＧ）6、（Ｈｂ／ＨＳＡ2）ＳＭ（ＰＥＧ）6、（Ｈｂ／ＨＳＡ3）ＳＭ（ＰＥＧ）6、（Ｈｂ／ＨＳＡ4）ＳＭ（ＰＥＧ）6）を合成し、単離した。【００５７】（実施例１２）  実施例６における調製例１で、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６−（β−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ）（ＳＭＰＨ、ＰＩＥＲＣＥ社製）の代わりに、κ−(マレイミドウンデカノイルオキシ)スルホスクシンイミドエステル（κ−（Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｕｎｄｅｃａｎｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）（ＳＭＵＳ、ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いた以外は、実施例６における調製例１と同様な方法に従って、ヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＭＵＳ）を調製した。  実施例６における調製例２でヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＭＰＨ）の代わりにヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＭＵＳ）を用いた以外は、実施例６における調製例２と同様な方法に従って、ヒトヘモグロビンにヒト血清アルブミンが１、２、３、４つ結合したヘテロクラスター（（Ｈｂ／ＨＳＡ1）ＳＭＵＳ、（Ｈｂ／ＨＳＡ2）ＳＭＵＳ、（Ｈｂ／ＨＳＡ3）ＳＭＵＳ、（Ｈｂ／ＨＳＡ4）ＳＭＵＳ）を合成し、単離した。【００５８】（実施例１３）  実施例１における調製例２で、ヒトヘモグロビンの代わりに、ウシヘモグロビン（ＢＨｂ）を用いた以外は、実施例１における調製例１及び２と同様な方法に従って、ウシヘモグロビン−架橋剤結合体（ＢＨｂ−ＳＰＤＰＨ）を調製した。ピリジルジチオ基の濃度を算出し、ウシヘモグロビン（ＢＨｂ）濃度との比率からヒトヘモグロビン１分子当たりのピリジルジチオ基の本数を決定したところ、７〜９本であった。  引き続き、実施例１における調製例３でヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＰＤＰＨ）の代わりに、ウシヘモグロビン−架橋剤結合体（ＢＨｂ−ＳＰＤＰＨ）を用いたこと以外は、実施例１における調製例３と同様な方法に従って、ウシヘモグロビンにヒト血清アルブミンが１、２、３、４つ結合したヘテロクラスター（（ＢＨｂ／ＨＳＡ1）ＳＰＤＰＨ、（ＢＨｂ／ＨＳＡ2）ＳＰＤＰＨ、（ＢＨｂ／ＨＳＡ3）ＳＰＤＰＨ、（ＢＨｂ／ＨＳＡ4）ＳＰＤＰＨ）を合成し、それぞれを単離した。【００５９】（実施例１４）  実施例８で、ヒトヘモグロビンの代わりに、ウシヘモグロビン（ＢＨｂ）を用いた以外は、同様な方法に従って、ウシヘモグロビン−架橋剤結合体（ＢＨｂ−ＭＣＳ）を調製した。 実施例８で、ヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＭＣＳ）の代わりにウシヘモグロビン−架橋剤結合体（ＢＨｂ−ＭＣＳ）を用いたこと以外は、同様な方法に従って、ウシヘモグロビンにヒト血清アルブミンが１、２、３、４つ結合したヘテロクラスター（（ＢＨｂ／ＨＳＡ1）ＭＣＳ、（ＢＨｂ／ＨＳＡ2）ＭＣＳ、（ＢＨｂ／ＨＳＡ3）ＭＣＳ、（ＢＨｂ／ＨＳＡ4）ＭＣＳ）を合成し、単離した。【００６０】（実施例１５）  実施例１０で、ヒトヘモグロビンの代わりに、ウシヘモグロビン（ＢＨｂ）を用いた以外は、同様な方法に従って、ウシヘモグロビン−架橋剤結合体（ＢＨｂ−ＳＭＣＣ）を調製した。 実施例１０で、ヒトヘモグロビン−架橋剤結合体（Ｈｂ−ＳＭＣＣ）の代わりにウシヘモグロビン−架橋剤結合体（ＢＨｂ−ＳＭＣＣ）を用いたこと以外は、同様な方法に従って、ウシヘモグロビンにヒト血清アルブミンが１、２、３、４つ結合したヘテロクラスター（（ＢＨｂ／ＨＳＡ1）ＳＭＣＣ、（ＢＨｂ／ＨＳＡ2）ＳＭＣＣ、（ＢＨｂ／ＨＳＡ3）ＳＭＣＣ、（ＢＨｂ／ＨＳＡ4）ＳＭＣＣ）を合成し、単離した。【００６１】−等電点電気泳動測定−  実施例１で得た（ヒトヘモグロビン／ヒト血清アルブミン）ヘテロクラスター（Ｈｂ／ＨＳＡ1）ＳＰＤＰＨ、（Ｈｂ／ＨＳＡ2）ＳＰＤＰＨ、（Ｈｂ／ＨＳＡ3）ＳＰＤＰＨ、（Ｈｂ／ＨＳＡ4）ＳＰＤＰＨの等電点電気泳動（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＯＶＥＸ  ＩＥＦゲル）を測定したところ、各ヘテロクラスターの等電点（ｐＩ値）は、５．１、５．１、５．２、５．３であり、ヒトヘモグロビン（ｐＩ＝７．０）に比べ大幅に減少していることがわかった。ヒト血清アルブミンの結合数の増大に伴い、ｐＩ値が減少していることからも、ヒトヘモグロビンの分子表面にヒト血清アルブミンが結合している構造であることが示された。  なお、ヘモグロビンを分子内架橋した分子内架橋ヘモグロビン、ヒトヘモグロビンを架橋剤で結合したヘモグロビン重合体、ウシヘモグロビンを架橋剤で結合したヘモグロビン重合体は、いずれも、等電点が７．０付近であると考えられ、また、アルブミン−ヘム複合体の等電点は４．８である。【００６２】−酸素親和性（Ｐ50）測定−  実施例１で得たヒトヘモグロビン−ヒト血清アルブミン  ヘテロクラスター（（Ｈｂ／ＨＳＡ4）ＳＰＤＰＨ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）を窒素で十分に置換して脱酸素した後、別途窒素雰囲気下で調整した亜ニチオン酸ナトリウム水溶液を添加することにより、ヒトヘモグロビンのヘム鉄を還元した。  このリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）の紫外可視吸収スペクトルは、λmax：４３０ｎｍ、５５７ｎｍを示し、ヒトヘモグロビンの脱酸素化体（デオキシ体）のスペクトルパターンと一致したことから、ヒトヘモグロビン−ヒト血清アルブミン  ヘテロクラスター（（Ｈｂ／ＨＳＡ4）ＳＰＤＰＨ）のヒトへモグロビン部位が酸素を結合していないデオキシ体を形成していることが分かった。  そこへ酸素を通気すると、直ちに酸素化体（オキシ体）のスペクトルが得られ（λmax：４１２ｎｍ、５４０ｎｍ、５７５ｎｍ）、再度窒素を通気すると、デオキシ体のスペクトルパターンとなったことから、ヒトヘモグロビン−ヒト血清アルブミン  ヘテロクラスター（（Ｈｂ／ＨＳＡ4）ＳＰＤＰＨ）が酸素を可逆的に吸脱着していることが示された。  一方、一酸化炭素を通気すると、きわめて安定な一酸化炭素化体（λmax：４１９ｎｍ、５３８ｎｍ、５６９ｎｍ）を形成した。異なる酸素分圧に対する紫外可視吸収スペクトル変化から、Ｈｉ��ｌ式を用いて、酸素親和性（Ｐ50）（酸素結合解離曲線グラフにおいて酸素結合率が５０％の時の酸素分圧）を算出したところ、ヒトヘモグロビン−ヒト血清アルブミン  ヘテロクラスター（（Ｈｂ／ＨＳＡ4）ＳＰＤＰＨ）のＰ50は１３Ｔｏｒｒ（３７℃）であった。  他のヒトヘモグロビン−ヒト血清アルブミン  ヘテロクラスター（（Ｈｂ／ＨＳＡ1）ＳＰＤＰＨ、（Ｈｂ／ＨＳＡ2）ＳＰＤＰＨ、及び（Ｈｂ／ＨＳＡ3）ＳＰＤＰＨ）についても同様の実験を行ったところ、Ｐ50（３７℃）は、それぞれ、１２Ｔｏｒｒ（３７℃）、１２Ｔｏｒｒ（３７℃）、１１Ｔｏｒｒ（３７℃）であった。  さらに、実施例１４で得たウシヘモグロビン−ヒト血清アルブミン  ヘテロクラスター（（ＢＨｂ／ＨＳＡ1）ＭＣＳ、（ＢＨｂ／ＨＳＡ2）ＭＣＳ、（ＢＨｂ／ＨＳＡ3）ＭＣＳ、及び（Ｈｂ／ＨＳＡ4）ＭＣＳについても同様の実験を行ったところ、Ｐ50（３７℃）は、それぞれ、１０Ｔｏｒｒ（３７℃）、１０Ｔｏｒｒ（３７℃）、１１Ｔｏｒｒ（３７℃）、１２Ｔｏｒｒ（３７℃）であった。
【産業上の利用可能性】
【００６３】  本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体を有効成分とする人工酸素運搬体は、生体内に投与する場合も安全度の高い輸血代替物として利用できる。加えて、移植臓器又は組織の保存液、再生組織の培養液、腫瘍の抗癌治療増感剤、術前血液希釈液、人工心肺などの体外循環回路の補填液、移植臓器の灌流液、虚血部位への酸素供給液（心筋梗塞、脳梗塞、呼吸不全、など）慢性貧血治療剤、液体換気の灌流液としても利用できる。また、ガス吸着剤、酸化還元触媒、酸素酸化反応触媒、酸素添加反応触媒として利用した場合、従来の血清アルブミン−ヘム錯体と比較して、酸素化体が安定であるため、精密に酸素供給量を制御できる。  また、本発明のヘモグロビン−アルブミン複合体を有効成分とする人工酸素運搬体を稀少血液型患者、動物の手術、などにも適用することができる。
【符号の説明】
【００６４】  １０  ヘモグロビン  ２０  アルブミン１００  ヘモグロビン−アルブミン複合体（星型へテロクラスター）
【図１】
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【国際調査報告】
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