(57)【要約】  ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド及びその誘導体からなる群から選択される１種以上の化合物からなる、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤、及び、被検物質の存在下及び非存在下で、ＨＭＧＢタンパクと標識核酸とを混合する混合ステップと、標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクを定量する定量ステップと、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも少ない場合に、当該被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定し、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも多い場合に、当該被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する、判定ステップと、を含む、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法を提供する。
2012036215.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド及びその誘導体からなる群から選択される１種以上の化合物からなる、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤。
【請求項２】
前記化合物は、非メチル化ＣＧ配列を含まず、長さが５〜１００塩基のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の抑制剤。
【請求項３】
前記化合物は、
配列番号４０に記載の塩基配列、又は、
配列番号４０に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、ＨＭＧＢタンパクに対する結合能を有する塩基配列、
からなるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載の抑制剤。
【請求項４】
前記化合物は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの誘導体であり、当該誘導体は、塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマーである、請求項１に記載の抑制剤。
【請求項５】
細胞内において、免疫応答を活性化する核酸とＨＭＧＢタンパクとの結合を阻害する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抑制剤。
【請求項６】
ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化が、抗原特異的な適応免疫系、多発性硬化症、死細胞による過剰な免疫応答、移植臓器拒絶反応、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、アレルギー、敗血症、炎症による腫瘍の増殖、及び核酸含有病原体により引き起こされる炎症性疾患からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抑制剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抑制剤及び薬学的に許容される担体を含有する、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制用組成物。
【請求項８】
被検物質の存在下及び非存在下で、ＨＭＧＢタンパクと標識核酸とを混合する混合ステップと、
標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクを定量する定量ステップと、
被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも少ない場合に、当該被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定し、
被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも多い場合に、当該被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する、
判定ステップと、
を含む、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
被検物質の存在下及び非存在下で、固相化されたＨＭＧＢタンパクを放置する放置ステップと、
放置ステップ後の固相化されたＨＭＧＢタンパクに、標識核酸を接触させる、標識核酸接触ステップと、
固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸を定量する定量ステップと、
被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量よりも少ない場合に、当該被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定し、
被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量よりも多い場合に、当該被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する、
判定ステップと、
を含む、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
被検物質の存在下及び非存在下で、固相化された核酸とＨＭＧＢタンパクとを接触させる、接触ステップと、
固相化された核酸に結合したＨＭＧＢタンパクを定量する定量ステップと、
被検物質の存在下で固相化された核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で固相化された核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも少ない場合に、当該被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定し、
被検物質の存在下で固相化された核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で固相化された核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも多い場合に、当該被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する、
判定ステップと、
を含む、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤、及び、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫応答とその制御において、自己と非自己の識別はその根幹を担っている。自然免疫系及び適応免疫系は、それぞれに特有の機構によってこの識別を担うとともに、自己に応答しない仕組み、いわゆる免疫寛容を確立・維持している。自然免疫応答の活性化は適応免疫応答の誘導にも関与していることが知られていることから、自然免疫応答の抑制は適応免疫応答の抑制にも有効であることが知られている。【０００３】
適応免疫系においては、ランダムな抗原受容体を発現するリンパ球レパートリーを構築後、ほとんどの自己反応性リンパ球が中枢性寛容機構によって排除され、末梢になお残存する自己反応性リンパ球は、末梢性寛容機構によって抑制されることが明らかにされてきた。【０００４】
適応免疫系による抗原の認識はリンパ球の抗原受容体による特異的な分子構造認識を特徴とするが、自然免疫系では、病原体等が持つ分子のパターンを認識するとされており、Ｔｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＬＲ）をはじめとして、多くの自然免疫活性化受容体が知られている。特に、核酸による自然免疫活性化はウイルス等の病原体の排除に重要であるとともに、一方で種々の免疫病態の発症や増悪に関与すするとされていることから大きな関心が寄せられている。しかしながら、自然免疫系における核酸の識別機構には未だ不明な点が多く、核酸により活性化される免疫応答を担う分子群として、Ｔｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＬＲ）３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＩＧ−Ｉ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＤＡＩ、ＡＩＭ２等の受容体分子群が同定されてきたが、未だにその全貌は不明である（例えば非特許文献１〜３を参照）。【０００５】
ＨＭＧＢ（ｈｉｇｈ−ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｂｏｘ）タンパクには、ＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ２及びＨＭＧＢ３が存在することが知られている。これらのＨＭＧＢタンパクは、核内に多く存在し、クロマチン構造や転写の制御に関わっていると考えられている。また、細胞質や細胞外にも存在することが知られている。【０００６】
特許文献１には、細胞外に分泌されたＨＭＧＢ１タンパクと、細胞表面の最終糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）との結合を阻害する、合成二本鎖核酸又は核酸アナログ分子が記載されている。【０００７】
特許文献２には、細胞外に分泌されたＨＭＧＢ１タンパクとＲＡＧＥの相互作用を阻害する、ＨＭＧＢ１アンタゴニストが記載されている。【０００８】
非特許文献４には、塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマーがＴＬＲ９及びＴＬＲ７に高い親和性を有し、これらのＴＬＲのアンタゴニストとして作用することが記載されている。【０００９】
非特許文献５には、５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ−３’（配列番号３７）の塩基配列を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのマウスへの投与がＩＦＮ（インターフェロン）−γ応答を誘導するのに対し、５’−ＴＣＣＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ−３’（配列番号３８）の塩基配列を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはこのような応答を起こさないことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２００８−５０４３３５号広報
【特許文献２】特表２００９−５１７４０４号広報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｋａｗａｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：１３１−１３７，２００６．
【非特許文献２】Ｙｏｎｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２８２：１５３１５−１５３１８，２００７．
【非特許文献３】Ｂｕｒｃｋｓｔｕｍｍｅｒ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２６６−２７２，２００９．
【非特許文献４】Ｈａａｓ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２８：３１５−３２３，２００８．
【非特許文献５】Ｃｏｗｄｅｒｙ  ＪＳ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４５７０−４５７５，１９９６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤及び、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド及びその誘導体からなる群から選択される１種以上の化合物からなり、ＨＭＧＢタンパクに結合することによって、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化を抑制する、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤を提供する。【００１４】
本発明はまた、生体にホスホロチオエートオリゴヌクレオチド及びその誘導体からなる群から選択される１種以上の化合物を投与する工程を含む、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制方法を提供する。【００１５】
本発明はまた、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤としての使用のための、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド及びその誘導体からなる群から選択される１種以上の化合物を提供する。【００１６】
本発明はまた、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド及びその誘導体からなる群から選択される１種以上の化合物の、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤への応用を提供する。【００１７】
発明者らは、核酸によって仲介される免疫応答の活性化には、ＨＭＧＢタンパクが必須であることを明らかにした。すなわち、発明者らは、核酸によって仲介される免疫応答の活性化は、ＨＭＧＢタンパクによって仲介されることを明らかにした。発明者らは、さらに、上記の化合物が、ＨＭＧＢタンパクに強く結合することによって、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化を強力に抑制することを明らかにした。したがって、上記の化合物は、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤として利用することができる。上記の抑制剤は、核酸によって仲介される免疫応答に限らず、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化を抑制する。【００１８】
上記の化合物は、非メチル化ＣＧ配列を含まず、長さが５〜４０塩基のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであることが好ましく、（１）配列番号４０に記載の塩基配列又は（２）配列番号４０に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、ＨＭＧＢタンパクに対する結合能を有する塩基配列、からなるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであることがより好ましい。【００１９】
これらのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤として利用することができる。【００２０】
上記の化合物は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの誘導体であり、当該誘導体は、塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマー（以下、「ＰＳ」という場合がある。）であってもよい。ＰＳは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドから塩基部分を除いた構造を有する化合物である。【００２１】
実施例で示すように、ＰＳは、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤として利用することができる。【００２２】
本発明の抑制剤は、細胞内において、免疫応答を活性化する核酸とＨＭＧＢタンパクとの結合を阻害することにより、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化を強力に抑制する。すなわち、本発明の抑制剤は、発明者らが今回初めて明らかにした機構に基づいて、細胞内のＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化を抑制するものである。【００２３】
ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化としては、抗原特異的な適応免疫系、多発性硬化症、死細胞による過剰な免疫応答、移植臓器拒絶反応、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、アレルギー、敗血症、炎症による腫瘍の増殖、核酸含有病原体により引き起こされる炎症性疾患等が例示される。本発明の抑制剤を投与することにより、ヒト及び動物の生体において、これらの症状を予防又は治療（改善）することができる。【００２４】
本発明はまた、上記の抑制剤及び薬学的に許容される担体を含有する、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制用組成物を提供する。【００２５】
本発明はまた、被検物質の存在下及び非存在下で、ＨＭＧＢタンパクと標識核酸とを混合する混合ステップと、標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクを定量する定量ステップと、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも少ない場合に、当該被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定し、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも多い場合に、当該被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する、判定ステップと、を含む、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法を提供する。【００２６】
本発明はまた、被検物質の存在下及び非存在下で、固相化されたＨＭＧＢタンパクを放置する放置（インキュベーション）ステップと、放置ステップ後の固相化されたＨＭＧＢタンパクに、標識核酸を接触させる、標識核酸接触ステップと、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸を定量する定量ステップと、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量よりも少ない場合に、当該被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定し、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量よりも多い場合に、当該被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する、判定ステップと、を含む、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法を提供する。【００２７】
本発明はまた、被検物質の存在下及び非存在下で、固相化された核酸とＨＭＧＢタンパクとを接触させる、接触ステップと、固相化された核酸に結合したＨＭＧＢタンパクを定量する定量ステップと、被検物質の存在下で固相化された核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で固相化された核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも少ない場合に、当該被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定し、被検物質の存在下で固相化された核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で固相化された核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも多い場合に、当該被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する、判定ステップと、を含む、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法を提供する。【００２８】
上記本発明のスクリーニング方法によれば、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニングを可能にすることができる。これらのスクリーニング方法は、発明者らが今回初めて明らかにした、免疫応答の活性化がＨＭＧＢタンパクによって仲介されるという新たな機構に基づくものである。これらのスクリーニング方法により、簡便に効率よくスクリーニングを行うことができる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明により、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化、すなわち、死細胞による過剰な免疫応答、移植臓器拒絶反応、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、アレルギー、敗血症、炎症による腫瘍の増殖、核酸含有病原体により引き起こされる炎症性疾患等の新たな原理に基づいた抑制剤が提供される。また、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】実施例１の結果を示すグラフである。
【図２】実施例２の結果を示すグラフである。
【図３】実施例３の結果を示すグラフである。
【図４】実施例４の結果を示すグラフである。
【図５】実施例５の結果を示す写真である。
【図６】実施例６の結果を示す写真である。
【図７】実施例７の結果を示すグラフである。
【図８】実施例８の結果を示すグラフである。
【図９】実施例９の結果を示すグラフである。
【図１０】実施例１０の結果を示すグラフである。
【図１１】実施例１１の結果を示すグラフである。
【図１２】実施例１２の結果を示す写真である。
【図１３】実施例１３の結果を示す写真である。
【図１４】実施例１４の結果を示す写真である。
【図１５】実施例１５の結果を示す写真である。
【図１６】実施例１６の結果を示すグラフである。
【図１７】実施例１７の結果を示すグラフである。
【図１８】実施例１８の結果を示すグラフである。
【図１９】実施例１９の結果を示すグラフである。
【図２０】実施例２０の結果を示すグラフである。
【図２１】実施例２１の結果を示す写真である。
【図２２】実施例２２の結果を示すグラフである。
【図２３】実施例２３の結果を示す写真である。
【図２４】実施例２４の結果を示すグラフである。
【図２５】実施例２５の結果を示すグラフである。
【図２６】実施例２６の結果を示すグラフである。
【図２７】実施例２７の結果を示すグラフである。
【図２８】実施例２８の結果を示す写真である。
【図２９】実施例２９の結果を示すグラフである。
【図３０】実施例３０の結果を示すグラフである。
【図３１】実施例３１の結果を示すグラフである。
【図３２】実施例３２の結果を示すグラフである。
【図３３】実施例３３の結果を示すグラフである。
【図３４】実施例３４の結果を示すグラフである。
【図３５】実施例３５の結果を示すグラフである。
【図３６】実施例３６の結果を示すグラフである。
【図３７】実施例３７の結果を示すグラフである。
【図３８】実施例３８の結果を示すグラフである。
【図３９】実施例３９の結果を示すグラフである。
【図４０】実施例４０の結果を示すグラフである。
【図４１】実施例４１の結果を示す写真である。
【図４２】実施例４２の結果を示す写真である。
【図４３】ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の概略図である。
【図４４】ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤のスクリーニング方法の１つの態様を示す図である。
【図４５】実施例４３の結果を示す写真（ａ）及びグラフ（ｂ）である。
【図４６】ＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）、ＣｐＧ−Ｒｅｖ（Ｓ）、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）及びＰＳの構造を示す図である。
【図４７】実施例４４の結果を示す写真である。
【図４８】実施例４５の結果を示すグラフである。
【図４９】実施例４６の結果を示すグラフである。
【図５０】実施例４７の結果を示すグラフである。
【図５１】実施例４８の結果を示すグラフである。
【図５２】実施例４９の結果を示すグラフである。
【図５３】実施例５０の結果を示すグラフである。
【図５４】実施例５１の結果を示すグラフである。
【図５５】実施例５２の結果を示す写真である。
【図５６】実施例５３の結果を示す写真である。
【図５７】実施例５４の結果を示すグラフである。
【図５８】実施例５５の結果を示すグラフである。
【図５９】実施例５６の結果を示すグラフである。
【図６０】実施例５７の結果を示すグラフである。
【図６１】実施例５８の結果を示すグラフである。
【図６２】実施例５９の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
発明者らが新たに解明した機構に基づいた、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤が提供される。この抑制剤は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド及びその誘導体からなる群から選択される１種以上の化合物からなる。
【００３２】
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとは、オリゴデオキシリボヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体である。
【００３３】
抑制剤は、非メチル化ＣＧ配列を含まず、長さが５〜１００塩基であるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドからなることが好ましい。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの長さは、１０〜４０塩基であることがより好ましく、１５〜３０塩基であることが更に好ましく、１５〜２０塩基であることが特に好ましい。このようなホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ＨＭＧＢタンパクと結合して、ＨＭＧＢタンパクをマスクすることにより、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化を抑制することができる。非メチル化シトシン・グアニン（ＣＧ）配列とは、５’−ＣＧ−３’の塩基配列であって、メチル化されていない配列を意味する。非メチル化ＣＧ配列を含まない５〜１００塩基のオリゴヌクレオチドは、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答を活性化しない。一方、１００塩基を超える長さのオリゴヌクレオチドは、免疫応答を活性化する場合がある。
【００３４】
上記のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、配列番号４０に記載の塩基配列又は配列番号４０に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、ＨＭＧＢタンパクに対する結合能を有する塩基配列からなるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであることがより好ましい。配列番号４０の塩基配列は、５’−ＴＣＣＡＴＧＡＧＳＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ−３’であり、ここでＳはＧ又はＣを表す。また、ＳがＣである場合の塩基配列からなるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは後述するＣｐＧ−Ｒｅｖ（Ｓ）（配列番号３８）に対応し、ＳがＧである場合の塩基配列からなるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは後述するＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）（配列番号３９）に対応する。また、１若しくは数個とは、１〜１０個、より好ましくは１〜５個、更により好ましくは１〜３個、特に好ましくは１又は２個を意味する。
【００３５】
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、配列番号４０に記載の塩基配列からなることが更に好ましい。このような塩基配列からなるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化を強力に抑制することができる。
【００３６】
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの誘導体としては、ＨＭＧＢタンパクに対する結合能を有するものであれば特に制限されず、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの骨格の少なくとも一部をリン酸ジエステル結合に変換したもの、少なくとも一部のデオキシリボースをリボースに変換したもの、少なくとも一部の塩基を除いたもの、少なくとも一部をＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）に変換したもの、少なくとも一部をＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）に変換したもの、少なくとも一部の塩基を塩基アナログに変換したもの等を例示できる。これらの誘導体の中でも、塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマー（ＰＳ）が好ましい。
【００３７】
ＰＳとは、化学式（Ｃ５Ｈ８Ｏ４ＰＳ）ｎで表される化合物であり、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドから塩基部分を全て除いた構造を持つ。ｎは１０〜１００であることが好ましく、１５〜２５であることがより好ましい。
【００３８】
上記のホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ＰＳ又はこれらの誘導体は、核酸合成装置等を用いて合成したものでもよく、北海道システムサイエンスやファスマック等のメーカーから購入したものでもよい。
【００３９】
実施例に示すように、ＰＳは、インビトロにおいて、０．１〜５０μＭ、より好ましくは１〜１０μＭ、特に好ましくは５μＭの濃度で投与することにより、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化を抑制することができる。この結果は、そのままインビボにも適用することができる。
【００４０】
ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、実施例に示すように、ＴＬＲ９（Ｔｏｌｌ様受容体９）を欠失した細胞、又は、ＴＬＲ９の発現量が少ないＭＥＦ等の細胞を用いたインビトロ実験において、０．１〜１０μＭ、より好ましくは０．３〜３μＭ、特に好ましくは１μＭの濃度で投与することにより、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化を抑制することができる。この結果は、そのままインビボにも適用することができる。
【００４１】
ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤を臨床で使用する際には、抑制剤に、賦形剤、安定化剤、保存剤、緩衝剤、溶解補助剤、乳化剤、希釈剤、等張化剤等の添加剤が適宜混合された、組成物の形態であってもよい。ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制用組成物は、必須成分である上記の抑制剤の他に、薬学的に許容される担体を含む。薬学的に許容される担体としては、医薬品等に通常使用される各種の成分、すなわち、水、低級アルコール、多価アルコール、油剤、界面活性剤、保湿剤、水溶性高分子化合物、増粘剤、皮膜剤、粉体、キレート剤、ｐＨ調整剤、動植物・微生物由来の抽出物、糖類、アミノ酸類、有機アミン類、合成樹脂エマルジョン、皮膚栄養剤、ビタミン類、酸化防止剤、酸化防止助剤、香料、各種薬効剤等が挙げられ、上記の抑制剤の効果を損なわない範囲で適宜加えることができる。投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口剤、注射剤、坐剤、液剤等による非経口剤、あるいは軟膏剤、クリーム剤、貼付剤等による局所投与等を挙げることができる。抑制剤の使用量は症状、年齢、体重、投与方法等に応じて適宜選択される。
【００４２】
１実施形態において、上記の抑制剤が抑制する、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化は、核酸によって仲介される免疫応答の活性化である。免疫応答を活性化する核酸とは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ）、５’三リン酸化ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ウイルスＤＮＡ、微生物ＤＮＡ（微生物由来のＤＮＡ）、真核生物ＤＮＡ、Ｂ−ＤＮＡ（通常のＤＮＡの立体構造をとった合成ＤＮＡ、Ｂ型ＤＮＡ）ＩＳＤ（ＩＦＮ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ＤＮＡ）、非メチル化オリゴヌクレオチド等を意味する。ＩＳＤとは、４５塩基の合成ＤＮＡ（配列番号３６）であり、ＩＳＤを細胞内に導入するとＩ型ＩＦＮ誘導が起こるが、これはＴＬＲ非依存性に、ＩＲＦ−３の活性化を介して行われることが知られている。本明細書において、これらの免疫応答を活性化する核酸を総称して「全ての免疫原性核酸」と呼ぶ場合がある。また、本明細書において、用語「免疫応答」は「自然免疫応答」及び「適応免疫応答」の双方を含む。
【００４３】
１実施形態において、上記の抑制剤が抑制する、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化は、核酸によって仲介される免疫応答の活性化ではなく、ＨＭＧＢタンパクのサイトカインとしての機能に基づく免疫応答の活性化である。上記の抑制剤がＨＭＧＢタンパクに結合することによって、ＨＭＧＢタンパクのサイトカインとしての機能に基づく免疫応答の活性化が抑制される。
【００４４】
ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化としては、抗原特異的な適応免疫系、多発性硬化症、死細胞による過剰な免疫応答、移植臓器拒絶反応、関節リウマチ等の自己免疫疾患、炎症性腸疾患、アレルギー、敗血症、炎症による腫瘍の増殖、核酸含有病原体により引き起こされる炎症性疾患が例示される。これらの免疫応答は不利益をもたらす例である。ここで、過剰な免疫応答とは、例えば肝臓の壊死性炎症のように、ウイルス感染、循環異常や代謝異常、単純炎症反応等の外的要因で壊死した細胞が炎症を誘発し、さらにこの炎症が新たな細胞の壊死を引き起こすという負の連鎖反応を意味する。また、死細胞は、壊死細胞であることが好ましい。また、核酸含有病原体とは、ウイルス、微生物、寄生虫等を意味する。
【００４５】
上記の免疫応答を活性化する核酸をリポフェクトアミン（商品名、インビトロジェン社）やＤＯＴＡＰ（商品名、ロシュ社）等の陽イオン性脂質を用いてヒト細胞を含む動物細胞の細胞質内に投与すると、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α１、ＩＦＮ−α４等のＩ型ＩＦＮ（インターフェロン）やケモカイン、炎症性サイトカインの遺伝子発現を誘導し、免疫応答が惹起されることが知られている。
【００４６】
非メチル化オリゴヌクレオチドとしてＣｐＧ  オリゴデオキシリボヌクレオチド（以下、ＣｐＧ  ＯＤＮという場合がある。）が、ｄｓＲＮＡとしてｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）が、ｓｓＲＮＡとしてｐｏｌｙ（Ｕ）が、Ｂ−ＤＮＡとしてｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）・（ｄＴ：ｄＡ）等が用いられる場合がある。
【００４７】
ＣｐＧ  ＯＤＮとは、細菌ＤＮＡに出現頻度の高い、非メチル化ＣＧ配列（５’−ＣＧ−３’）を含む合成オリゴヌクレオチドである。ＣｐＧ  ＯＤＮにはポリＧテールを有するＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ（Ｄ型とも言われる。）や、Ｂ細胞を強力に活性化し、Ｔｈ１型サイトカインの産生を誘導するＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮ（Ｋ型とも言われる。）等が存在する。ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮとしては、例えば、５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ−３’（配列番号１）等の配列を有するものが使用可能である。また、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮとしては、例えば、５’−ＧＧＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＧＧＧＧＧ−３’（配列番号２）等の配列を有するものが使用可能である。これらのＣｐＧ  ＯＤＮは、部分的にリン酸ジエステル結合をホスホロチオエート結合等に変換した構造を持つものであってもよい。
【００４８】
ＣｐＧ  ＯＤＮは１０〜３０ｍｅｒのものが好ましく、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は１０〜１００００ｍｅｒのものが好ましく、ｐｏｌｙ（Ｕ）は１０〜１００００ｍｅｒのものが好ましく、ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）・（ｄＴ：ｄＡ）は１０〜１００００ｍｅｒのものが好ましい。
【００４９】
本発明は、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法を提供する。このスクリーニング方法の第１の実施形態は、被検物質の存在下及び非存在下で、ＨＭＧＢタンパクと、標識核酸とを混合する混合ステップと、標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクを定量する定量ステップと、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量と、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量とを比較し、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下における標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも少ない場合に、被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定し、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも多い場合に、被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する、判定ステップと、を含むものである。
【００５０】
混合ステップにおいて、ＨＭＧＢタンパクとしては、ＨＭＧＢ１、２又は３の組換え体をいずれも好適に使用できる。発明者らは、ＨＭＧＢタンパクが、全ての免疫原性核酸に結合することを初めて明らかにした。
【００５１】
標識核酸としては特に制限はないが、ＣｐＧ  ＯＤＮ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ｐｏｌｙ（Ｕ）、Ｂ−ＤＮＡ、５’三リン酸化ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ等の合成核酸、ＨＳＶ−１やワクシニアウイルスＤＮＡ等のウイルスＤＮＡ、微生物ＤＮＡ、ウシ胸腺ＤＮＡ等が例示できる。しかしながら、より均質であることから合成核酸であることがより好ましい。上記の合成核酸は１０〜１００ｍｅｒであることが好ましく、１５〜２５ｍｅｒであることがより好ましい。標識には特に制限はなく、ビオチン、ＦＩＴＣ等の蛍光色素、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）、放射性同位元素等で行われてよい。
【００５２】
被検物質としては、被検物質単体でヒト細胞を含む動物細胞を刺激した場合に、免疫応答を活性化しないものであれば特に制限はなく、核酸、核酸類似体、タンパク、低分子化合物等を使用できる。
【００５３】
被検物質で動物細胞を刺激した場合に免疫応答が活性化されるか否かは、被検物質による刺激によって、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α１、ＩＦＮ−α４等のＩ型ＩＦＮ（インターフェロン）やケモカイン、炎症性サイトカインなどの発現が増加するか否かを測定することにより調べることができる。こららの遺伝子又はタンパクの発現が増加した場合には、免疫応答が活性化したと判断することができる。
【００５４】
混合ステップにおいて、被検物質の濃度は、０．１〜１００μＭであることが好ましい。また、ＨＭＧＢタンパクの濃度は１〜２００μｇ／ｍｌであることが好ましい。また、標識核酸の濃度は０．１〜１００μＭであることが好ましい。これらを適切なプロテアーゼ阻害剤を含むバッファー等の溶媒中で混合し、０．５〜２４時間反応させることが好ましい。
【００５５】
定量ステップは、ストレプトアビジン結合磁性ビーズや、抗ＦＩＴＣ抗体結合磁性ビーズ等を用いたプルダウンアッセイによって行ってもよいし、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｓｈｉｆｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＭＳＡ）等によって行ってもよい。
【００５６】
例えば、標識核酸にビオチン標識核酸を用い、ストレプトアビジン結合磁性ビーズを用いたプルダウンアッセイを行う場合、混合ステップにより得られたサンプルにストレプトアビジン結合磁性ビーズを添加し、サンプル中のビオチン標識核酸をストレプトアビジン結合磁性ビーズに結合させる。続いて、磁性ビーズの磁気を利用して、標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクを回収する。回収したサンプルを、例えばＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した後、ゲル上のＨＭＢＧタンパクを、例えばＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＨＭＧＢ抗体を用いて染色した後、デンシトメトリー解析等により定量することができる。
【００５７】
判定ステップにおいて、被検物質の存在下及び非存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量を比較し、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下における標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも少ない場合に、被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定する。また、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下における標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも多い場合に、被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する。
【００５８】
第１実施形態のスクリーニング方法において、次のような変形が可能である。標識核酸として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド及びその誘導体からなる群から選択される化合物、例えば、配列番号４０に記載の塩基配列からなるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いる。
【００５９】
ここで、上記の標識核酸と、ＨＭＧＢタンパクのそれぞれを、互いにＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、蛍光共鳴エネルギー移動）を起こす関係にある蛍光物質で標識しておく。このような関係にある蛍光物質の対としては、例えば、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）と５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）とＦＡＭ、ＢＨＱ−１と２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）等が挙げられる。これにより、上記の化合物とＨＭＧＢタンパクが結合するとＦＲＥＴが起こり、励起波長に対して生じる蛍光波長が変化する。したがって、試料の蛍光を観察することにより、上記の化合物とＨＭＧＢタンパクとが結合したか否かを容易に検出することが可能となる。
【００６０】
混合ステップにおいて、被検物質の存在下及び非存在下で、標識した標識核酸と、標識したＨＭＧＢタンパクとを混合する。そして、定量ステップにおいて、蛍光観察によりＦＲＥＴが起きたか否かを測定することにより、標識核酸とＨＭＧＢタンパクとの結合の程度を定量的に評価することにより、標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクを定量する。
【００６１】
続いて、判定ステップにおいて、被検物質の存在下及び非存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量を比較し、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下における標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも少ない場合に、被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定する。また、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下における標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも多い場合に、被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する。
【００６２】
このような変形により、更に簡便に、効率よく、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニングを行うことができる。
【００６３】
ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法の第２実施形態は、被検物質の存在下及び非存在下で、固相化されたＨＭＧＢタンパクを放置する放置（インキュベーション）ステップと、放置ステップ後の固相化されたＨＭＧＢタンパクに、標識核酸を接触させる、標識核酸接触ステップと、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸を定量する定量ステップと、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量よりも少ない場合に、被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定し、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量よりも多い場合に、被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する、判定ステップと、を含むものである。
【００６４】
このスクリーニング方法により、より簡便に、効率よく、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニングを行うことができる。
【００６５】
放置ステップでは、固相化されたＨＭＧＢタンパクを被検物質の存在下及び非存在下で放置する。ＨＭＧＢタンパクとしては、ＨＭＧＢ１、２又は３の組換え体をいずれも好適に使用できる。
【００６６】
ＨＭＧＢタンパクは固相担体にあらかじめ固相化して使用する。固相担体としては、特に制限されないが、例えば、ガラス、セラミックス、金属酸化物等の無機物質、天然高分子、合成高分子等からなり、マイクロプレート、マイクロチップ、ビーズ、フィルム、シート等の形態のものが利用できる。固相担体は、表面がアミノ基（−ＮＨ２）やカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）等の官能基で修飾されていてもよい。
【００６７】
例えば、固相担体として、９６ウェルマイクロプレートを用いる場合、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝液に１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で溶解したＨＭＧＢタンパクの溶液を、マイクロプレートの各ウェルに分注し、４〜３７℃で０．５〜２４時間放置することにより、ＨＭＧＢタンパクを固相化することができる。このマイクロプレートは、使用前にＰＢＳ等の緩衝液で洗浄し、結合しなかったＨＭＧＢタンパクを除去することが好ましい。また、非特異的な吸着を抑制するために、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ（２％ＢＳＡ−ＰＢＳ）等の緩衝液を添加してブロッキングすることが好ましい。
【００６８】
被検物質としては、被検物質単体でヒト細胞を含む動物細胞を刺激した場合に、免疫応答を活性化しないものであれば特に制限はなく、核酸、核酸類似体、タンパク、低分子化合物等を使用できる。被検物質の溶媒としては、ＰＢＳ等の緩衝液を用いることができる。被検物質の非存在下で放置ステップを行う場合には、被検物質を含まない緩衝液のみを用いればよい。放置ステップにおける被検物質の濃度は、０．１〜１００μＭであることが好ましい。また、放置ステップにおいて、対照物質の存在下で放置ステップを行う試験群を設けてもよい。対照物質としては、ＨＭＧＢタンパクに結合することが分かっている核酸や、結合しないことが分かっている化合物等を用いることができ、例えば、ＨＭＧＢタンパクに結合することが分かっているものとしてＢ−ＤＮＡを用いることができる。放置ステップは、４〜３７℃で０．５〜２４時間行うことが好ましい。放置ステップの後にＰＢＳ等の緩衝液で洗浄し、未反応の被検物質や対照物質を除去することが好ましい。
【００６９】
標識核酸接触ステップにおいて、放置ステップ後の固相化されたＨＭＧＢタンパクに、標識核酸を接触させる。標識核酸としては特に制限はないが、ＣｐＧ  ＯＤＮ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ｐｏｌｙ（Ｕ）、Ｂ−ＤＮＡ、５’三リン酸化ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ等の合成核酸、ＨＳＶ−１やワクシニアウイルスＤＮＡ等のウイルスＤＮＡ、微生物ＤＮＡ、ウシ胸腺ＤＮＡ等が例示できる。しかしながら、より均質であることから合成核酸であることがより好ましい。上記の合成核酸は１０〜１００ｍｅｒであることが好ましく、１５〜２５ｍｅｒであることがより好ましい。ＨＭＧＢタンパクがＨＭＧＢ１である場合には、標識核酸はＲＮＡであってもよい。標識には特に制限はなく、ビオチン、ＦＩＴＣ等の蛍光色素、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）、放射性同位元素等で行われてよい。標識核酸接触ステップの後にＰＢＳ等の緩衝液で洗浄し、未反応の標識核酸を除去することが好ましい。ここで、放置ステップで添加した被検物質が、標識核酸のＨＭＧＢタンパクへの結合を阻害する場合があり、このような阻害を行う被検物質は、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤である。
【００７０】
定量ステップにおいて、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸を定量する。標識核酸の定量方法には特に制限はない。例えば、標識核酸がビオチンで標識されていた場合には、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）やアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）等で標識された、抗ビオチン抗体を反応させ、未反応の抗体を洗浄した後、抗体に結合していたＨＲＰやＡＰ等の酵素に対応した基質を反応させて、発光や発色を得る。得られた発光や発色を、プレートリーダー等を用いて定量する。
【００７１】
あるいは、標識核酸がビオチンで標識されていた場合には、抗ビオチン抗体の代わりにＨＲＰやＡＰで標識されたストレプトアビジンを用いてもよい。
【００７２】
例えば、標識核酸がＦＩＴＣで標識されていた場合には、抗ＦＩＴＣ抗体を反応させて標識核酸を定量してもよいし、標識核酸のＦＩＴＣに励起光を照射し、発生する蛍光を、蛍光プレートリーダー等を用いて定量してもよい。
【００７３】
例えば、標識核酸が放射性同位元素で標識されていた場合には、マイクロプレートシンチレーションカウンター等を用いて標識核酸を定量してもよい。
【００７４】
判定ステップにおいて、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量と、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量とを比較し、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量よりも少ない場合に、被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定する。また、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量よりも多い場合に、被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する。
【００７５】
図４４に、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法の１つの態様を示す。放置ステップ（図４４ａ）において、被検物質３の存在下及び非存在下並びに陽性対照物質２の存在下で、固相化されたＨＭＧＢタンパク１を放置する。続いて標識核酸接触ステップ（図４４ｂ）において、ビオチン標識Ｂ−ＤＮＡ  ４を接触させる。続いて定量ステップ（図４４ｃ及び図４４ｄ）において、固相化されたＨＭＧＢタンパク１に結合したビオチン標識Ｂ−ＤＮＡ  ４を定量する。図４４ｃでは、酵素標識された抗ビオチン抗体５を反応させている。続いて酵素の基質６を添加し（図４４ｄ）、発光又は発色をプレートリーダー等を用いて定量する。被検物質３の非存在下（陰性対照）で放置ステップを行ったサンプルにおいては、固相化されたＨＭＧＢタンパク１に標識核酸が結合する。これに対し、陽性対照物質２の存在下で放置ステップを行ったサンプルにおいては、固相化されたＨＭＧＢタンパク１への標識核酸の結合が阻害される。図４４の被検物質３の場合は、被検物質３の存在下で放置ステップを行ったサンプルにおいて、固相化されたＨＭＧＢタンパク１へのビオチン標識Ｂ−ＤＮＡ  ４（標識核酸）の結合が阻害されている。そして、被検物質３の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパク１に結合したビオチン標識Ｂ−ＤＮＡ  ４の量よりも、被検物質３の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパク１に結合したビオチン標識Ｂ−ＤＮＡ  ４の量が少ないため、被検物質３が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定される。
【００７６】
ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法の第３実施形態は、被検物質の存在下及び非存在下で、固相化された核酸とＨＭＧＢタンパクとを接触させる、接触ステップと、固相化された核酸に結合したＨＭＧＢタンパクを定量する定量ステップと、被検物質の存在下で固相化された核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で固相化された核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも少ない場合に、被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定し、被検物質の存在下で固相化された核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で固相化された核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも多い場合に、被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する、判定ステップと、を含むものである。
【００７７】
このスクリーニング方法により、より簡便に、効率よく、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニングを行うことができる。
【００７８】
接触ステップでは、被検物質の存在下及び非存在下で固相化された核酸とＨＭＧＢタンパクとを接触させる。核酸としては、例えば、配列番号４０に記載の塩基配列からなるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いることができる。核酸の固相化方法は特に制限されないが、例えば、ストレプトアビジンをコートしたマルチウェルプレートに、ビオチン標識した上記の核酸を結合させること等によって行うことができる。ＨＭＧＢタンパクとしては、ＨＭＧＢ１、２又は３の組換え体をいずれも好適に使用できる。
【００７９】
被検物質としては、被検物質単体でヒト細胞を含む動物細胞を刺激した場合に、免疫応答を活性化しないものであれば特に制限はなく、核酸、核酸類似体、タンパク、低分子化合物等を使用できる。被検物質の溶媒としては、ＰＢＳ等の緩衝液を用いることができる。接触ステップにおける被検物質の濃度は、０．１〜１００μＭであることが好ましい。接触ステップは、４〜３７℃で０．５〜２４時間行うことが好ましい。接触ステップの後にＰＢＳ等の緩衝液で洗浄し、未反応の被検物質や対照物質を除去することが好ましい。接触ステップで添加した被検物質が、核酸とＨＭＧＢタンパクとの結合を阻害する場合があり、このような阻害を行う被検物質は、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤である。
【００８０】
定量ステップにおいて、固相化された核酸に結合したＨＭＧＢタンパクを定量する。標識核酸の定量方法には特に制限はない。例えば、予めＨＭＧＢタンパクを蛍光物質で標識しておき、この蛍光を定量することができる。あるいは、ＨＭＧＢタンパクに対する抗体を用いてＨＭＧＢタンパクを定量してもよい。
【００８１】
判定ステップにおいて、被検物質の存在下で固相化された核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量と、被検物質の非存在下で固相化された核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量とを比較し、被検物質の存在下で固相化された核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で固相化された核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも少ない場合に、被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤であると判定する。また、被検物質の存在下で固相化された核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で固相化された核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも多い場合に、被検物質が、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤であると判定する。
【００８２】
上記のスクリーニング方法により得られた、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の促進剤は、ウイルス、微生物、寄生虫等による感染症の防御機構の活性化、抗ウイルス活性の増大、免疫細胞の分化のバランスを制御してアレルギーの病状を改善する、抗腫瘍応答を活性化する等の目的で使用することができる。これらの免疫応答は有利な効果をもたらす例である。
【実施例】
【００８３】
（プルダウンアッセイ）
質量分析の前に、マウス胎児繊維芽細胞（ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＭＥＦｓ）をｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）・（ｄＴ：ｄＡ）（Ｂ−ＤＮＡ、１０μｇ／ｍｌ）で４時間刺激した。刺激後、細胞をダウンスホモジナイザー（Ｗｈｅａｔｏｎ  ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いてホモジナイザーションバッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、２０％グリセロール、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌ  アプロチニン、１０μｇ／ｍｌ  ロイペプチン）中でホモジナイズした。細胞質タンパク抽出物は、ホモジナイズしたサンプルを１４５００ｒｐｍで３０分遠心して調製した。細胞質タンパク抽出物を、５’末端をビオチン標識したＢ−ＤＮＡ  １．４μｇ／ｍｌとともにインキュベートした後、ストレプトアビジン結合磁気ビーズ（インビトロジェン社）を添加して４℃で１５分間インキュベートした。プルダウンしたサンプルをＤＮａｓｅ  Ｉ（インビトロジェン社）と反応バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．４、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ）中で反応させ、上清を銀染色（インビトロジェン社）又は質量分析に供した。【００８４】
インビトロプルダウンアッセイは、次のようにして行った。ＨＭＧＢ１、２又は３の組換え体を、まず、競合物質の存在下及び非存在下で室温で３０分処理した。上清をビオチン標識Ｂ−ＤＮＡと４℃で３０分混合した後、ストレプトアビジン結合磁気ビーズ（インビトロジェン社）を添加して結合バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、１００μｇ／ｍｌ  ロイペプチン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４）中でインキュベーションした。続いて混合物を結合バッファーでよく洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、抗ＨＭＧＢ１、２又は３抗体を用いてイムノブロットした。【００８５】
（マウス、細胞、試薬）
Ｂａｌｂ／ｃの遺伝的背景を持つＴｌｒ９−／−マウス以外は、Ｃ５７ＢＬ／６の遺伝的背景を持つマウスを用いた。Ｔｌｒ９−／−、Ｈｍｇｂ１−／−、Ｈｍｇｂ２−／−マウスの作成は常法により行った。ＭＥＦｓ、ＲＡＷ２６４．７、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｔｌｒ９−／−マウスの骨髄由来ｃＤＣｓ（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）及びｐＤＣｓ（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）の維持は常法により行った。Ｈｍｇｂ１−／−マクロファージ、ｃＤＣｓ及びｐＤＣｓは、胎児肝臓造血前駆細胞（分化マーカーのない細胞をミルテニー社のＭＡＣＳ  Ｌｉｎｅａｇｅ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｋｉｔで精製したもの）を、ＳＣＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で２日間培養した後、２０ｎｇ／ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージ）、２０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ（ｃＤＣｓ）、１００ｎｇ／ｍｌヒトＦｌｔ３Ｌ（ｐＤＣｓ）の存在下で６日間培養することにより調製した。ＳＣＦ、ＩＬ−３及びＩＬ−６はペプロテック社から購入した。ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αはＲ＆Ｄシステムズから購入した。ＩＦＮ−βは東レ株式会社から親切にも提供された。Ｂ−ＤＮＡ及びウシ胸腺ＤＮＡはシグマ社から購入した。ビオチン標識ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）・（ｄＴ：ｄＡ）は北海道システムサイエンス社から購入した。ＩＳＤ（ＩＦＮ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ＤＮＡ）、ＣｐＧ  ＯＤＮ、ＦＩＴＣ標識塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマー（ＰＳ、２０ｍｅｒ）及びＦＩＴＣ標識塩基フリーナチュラルデオキシリボースホモポリマー（ＰＤ、２０ｍｅｒ）はファスマック社から購入した。ＰＤとは、ＰＳのホスホロチオエート結合をホスホジエステル結合に変換したものである。精製ワクシニアウイルスＤＮＡ（ＭＯ株）はＡ．Ｋａｔｏ及びＭ．Ｋｉｄｏｋｏｒｏより提供された。ＨＳＶ  ＤＮＡはＹ．Ｋａｗａｇｕｃｈｉから親切にも提供された。５’−三リン酸ＲＮＡはＣ．Ｒｅｉｓ  ｅ  Ｓｏｕｓａ及びＪ．Ｒｅｈｗｉｎｋｅｌから提供された。大腸菌ＤＮＡ（微生物ＤＮＡ）及びＲ８３７はインビボジェン社から購入した。ｐｏｌｙ（Ｕ）及びリポポリサッカライド（ＬＰＳ）はシグマ社から購入した。ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）はＧＥヘルスケアバイオサイエンス社から購入した。Ｂ−ＤＮＡ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及びその他の核酸リガンドは、特記しない限り１０μｇ／ｍｌの濃度で使用した。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮとＤＯＴＡＰ（ロシュ社）の複合体形成は常法により行った。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ  ６３３はインビトロジェン社から購入した。抗ＨＭＧＢ１抗体及び抗ＨＭＧＢ２抗体はアブカム社から購入した。抗ＨＭＧＢ３抗体はトランスジェニック社から購入した。抗ＩＲＦ３抗体（ＺＭ３）はＺｙｍｅｄ社から購入した。抗β−アクチン抗体（ＡＣ−１５）はシグマ社から購入した。抗ＮＦ−κＢ  ｐ６５抗体（Ｃ２０）はサンタクルズバイオテクノロジー社から購入した。抗リン酸化ＳＴＡＴ１抗体（５８Ｄ６）はセルシグナリング社から購入した。【００８６】
（プラスミド構築）
マウスＨＭＧＢ  ｃＤＮＡはＭＥＦｓ由来の全ＲＮＡをもとに、ＲＴ−ＰＣＲにより得て、ｐＧＥＸ４Ｔ３ベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のＳａｌ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉサイトにクローニングした。グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ付きＨＭＧＢタンパクは、グルタチオンセファロースビーズ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて精製した。ＨＭＧＢタンパク及びＧＳＴタンパクはトロンビンプロテアーゼ（ノバジェン社）処理によって分離した。【００８７】
マウスＲＩＧ−Ｉ（配列番号３）、ＨＭＧＢ１（配列番号４）及びＲａｂ５（配列番号５）のｃＤＮＡは、ＭＥＦ由来の全ＲＮＡに対する、逆転写を伴うポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＲＴ−ＰＣＲという場合がある）により得られ、ｐＣＡＧＧＳ−ＣＦＰ、ｐＣＡＧＧＳ−ＹＦＰ及びｐＣＡＧＧＳ−ＲＦＰベクター（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１、１５４１６−１５４２１、２００４を参照）のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ認識部位にそれぞれクローニングし、ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ、ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１及びＲＦＰ−Ｒａｂ５を得た。【００８８】
（イムノブロット解析）
細胞溶解及びイムノブロット解析は常法により行った。ＩＲＦダイマーはネイティブＰＡＧＥ及び後に続く抗マウスＩＲＦ３抗体を使用したイムノブロット解析により行った。ＩＲＦ３ダイマーの定量はＮＩＨ  Ｉｍａｇｅソフトウエアにより行った。３回の独立した実験により同様の結果が得られた。【００８９】
（ＲＮＡ解析）
ＲＮＡ抽出及び逆転写反応は常法により行った。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析（定量的ＲＴ−ＰＣＲ）はライトサイクラー４８０（商品名、ロシュ社）及びＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎシステム（ロシュ社）を用いて行った。全データはグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子について得られた結果を用いて標準化した、相対的発現単位で表示した。データは３重に測定し、平均±標準偏差として表示した。全てのデータについて、２回以上の独立した実験において同様の結果が得られた。【００９０】
定量的ＲＴ−ＰＣＲのためのプライマー配列は次のとおりであった。ＨＭＧＢ１  センス  ５’−ＣＣＡＡＡＧＧＧＧＡＧＡＣＣＡＡＡＡＡＧ−３’（配列番号６）、ＨＭＧＢ１  アンチセンス  ５’−ＴＣＡＴＡＧＧＧＣＴＧＣＴＴＧＴＣＡＴＣＴ−３’（配列番号７）、ＨＭＧＢ２  センス  ５’−ＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＧＣＴ−３’（配列番号８）、ＨＭＧＢ２  アンチセンス  ５’−ＧＧＡＣＣＣＴＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＴＴＣ−３’（配列番号９）、ＨＭＧＢ３  センス  ５’−ＧＧＡＧＡＴＧＡＡＡＧＡＴＴＡＴＧＧＡＣＣＡＧ−３’（配列番号１０）、ＨＭＧＢ３  アンチセンス  ５’−ＣＴＴＴＧＣＴＧＣＣＴＴＧＧＴＧ−３’（配列番号１１）、ＧＢＰ１  センス  ５’−ＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＧＣＡＡＡＡＧＧ−３’（配列番号１２）、ＧＢＰ１  アンチセンス  ５’−ＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＣＴＧＴＧ−３’（配列番号１３）、ＩＲＦ７  センス  ５’−ＧＣＡＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＣＡＣＴＡ−３’（配列番号１４）、ＩＲＦ７  アンチセンス  ５’−ＣＡＡＧＣＡＣＡＡＧＣＣＧＡＧＡＣＴ−３’（配列番号１５）、ＩＬ−１２ｐ４０  センス  ５’−ＧＡＣＡＣＧＣＣＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣ−３’（配列番号１６）、ＩＬ−１２ｐ４０  アンチセンス  ５’−ＴＡＧＴＣＣＣＴＴＴＧＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧ−３’（配列番号１７）、ＧＡＰＤＨ  センス  ５’−ＣＴＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣ−３’（配列番号１８）、ＧＡＰＤＨ  アンチセンス  ５’−ＣＡＣＡＴＴＧＧＧＧＧＴＡＧＧＡＡＣＡＣ−３’（配列番号１９）、ＩＬ−６  センス  ５’−ＡＴＧＡＡＧＴＴＣＣＴＣＴＣＴＧＣＡＡＧＡＧＡＣＴ−３’（配列番号２０）、ＩＬ−６  アンチセンス  ５’−ＣＡＣＴＡＧＧＴＴＴＧＣＣＧＡＧＴＡＧＡＴＣＴＣ−３’（配列番号２１）、ＲＡＮＴＥＳ  センス  ５’−ＡＣＧＴＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣ−３’（配列番号２２）、ＲＡＮＴＥＳ  アンチセンス  ５’−ＧＡＴＧＴＡＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＣＡＣＴ−３’（配列番号２３）、ＩκＢ−α  センス  ５’−ＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴ−３’（配列番号２４）、ＩκＢ−α  アンチセンス  ５’−ＴＧＡＣＡＴＣＡＧＣＣＣＣＡＣＡＴＴＴ−３’（配列番号２５）、ＩＦＮ−α１  センス  ５’−ＧＣＣＴＴＧＡＣＡＣＴＣＣＴＧＧＴＡＣＡＡＡＴＧＡＧ−３’（配列番号２６）、ＩＦＮ−α１  アンチセンス  ５’−ＣＡＧＣＡＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＡＣＡＧ−３’（配列番号２７）、ＩＦＮ−α４  センス  ５’−ＧＡＣＧＡＣＡＧＣＣＡＡＡＧＡＡＧＴＧＡ−３’（配列番号２８）、ＩＦＮ−α４  アンチセンス  ５’−ＧＡＧＣＴＡＴＧＴＣＴＴＧＧＣＣＴＴＣＣ−３’（配列番号２９）、ＩＦＮ−β  センス  ５’−ＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣＣＣＴＣＴＣＣＡＴＣＡＡＣＴＡＴ−３’（配列番号３０）、ＩＦＮ−β  アンチセンス  ５’−ＣＡＡＧＴＧＧＡＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＧＧＡＣＡＴＣ−３’（配列番号３１）。【００９１】
但し、実施例５０、５４及び５６における定量的ＲＴ−ＰＣＲで使用したプライマーの塩基配列は次の通りであった。Ｉｆｎａ４  フォワード鎖（Ｆｗ）５’−ＣＡＡＴＧＡＣＣＴＣＡＡＡＧＣＣＴＧＴＧＴＧ−３’（配列番号４７）、Ｉｆｎａ４  リバース鎖（Ｒｖ）５’−ＣＡＣＡＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＧＧＡＡＧＴ−３’（配列番号４８）、Ｉｆｎｂ１（Ｆｗ）５’−ＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣＣＣＴＣＴＣＣＡＴＣＡＡＣＴＡＴ−３’（配列番号４９）、Ｉｆｎｂ１（Ｒｖ）５’−ＣＡＡＧＴＧＧＡＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＧＧＡＣＡＴＣ−３’（配列番号５０）、Ｉｌ６（Ｆｗ）５’−ＡＣＧＡＴＧＡＴＧＣＡＣＴＴＧＣＡＧＡＡ−３’（配列番号５１）、Ｉｌ６（Ｒｖ）５’−ＧＴＡＧＣＴＡＴＧＧＴＡＣＴＣＣＡＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号５２）、Ｔｎｆａ（Ｆｗ）５’−ＴＣＡＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＡＡＣＣＴＣ−３’（配列番号５３）、Ｔｎｆａ（Ｒｖ）５’−ＧＴＡＴＡＴＧＧＧＣＴＣＡＴＡＣＣＡＧＧＧＴＴＴ−３’（配列番号５４）、Ｃｃｌ５（ＲＡＮＴＥＳ）（Ｆｗ）５’−ＡＣＧＴＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣ−３’（配列番号２２）、Ｃｃｌ５（ＲＡＮＴＥＳ）（Ｒｖ）５’−ＧＡＴＧＴＡＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＣＡＣＴ−３’（配列番号２３）、Ｇａｐｄｈ（Ｆｗ）５’−ＣＴＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣ−３’（配列番号１８）、Ｇａｐｄｈ（Ｒｖ）５’−ＣＡＣＡＴＴＧＧＧＧＧＴＡＧＧＡＡＣＡＣ−３’（配列番号１９）。【００９２】
（統計解析）
対照群及び試験群の結果はスチューデントのｔ検定により評価した。【００９３】
（ＥＬＩＳＡ）
マウスＩＦＮ−β、ＩＬ−６及びＩＬ−１βはＥＬＩＳＡにより測定した。ＩＦＮ−β  ＥＬＩＳＡキットはＰＢＬバイオメディカルラボラトリーズ社から購入した。ＩＬ−６及びＩＬ−１β  ＥＬＩＳＡキットはＲ＆Ｄシステムズ社から購入した。全データについて、追加の独立した２回の試験において同様の結果が得られた。【００９４】
（ＲＮＡ干渉）
ｓｉＲＮＡベクターは、オリゴヌクレオチドをｐＳＵＰＥＲ．ｒｅｔｒｏ．ｐｕｒｏ  レトロウイルスベクターのＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入することにより構築した。マウスＨＭＧＢ１、２及び３（ｐａｎ−ＨＭＧＢ−ｓｉＲＮＡ、以下、ＨＭＢＧ−ｓｉという場合がある。）；ＨＭＧＢ２；及びレニラルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）（対照、以下、Ｃｔｒｌ−ｓｉという場合がある。）のｓｉＲＮＡの標的配列は、それぞれ５’−ＧＴＡＴＧＡＧＡＡＧＧＡＴＡＴＴＧＣＴ−３’（配列番号３２）、５’−ＧＣＧＴＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＣＡＧＴＴ−３’（配列番号３３）及び５’−ＧＴＡＧＣＧＣＧＧＴＧＴＡＴＴＡＴＡＣＡ−３’（配列番号３４）であった。遺伝子導入されたＭＥＦｓ細胞はピューロマイシン（シグマ社）２μｇ／ｍｌで、ＲＡＷ２６４．７細胞はピューロマイシン４μｇ／ｍｌで４８時間選択した。【００９５】
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ  （ＥＭＳＡ）
ＥＭＳＡは常法により行った。ＮＦ−κＢのコンセンサス配列（５’−ＴＣＧＡＣＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧ−３’、配列番号３５）を用いた。ＮＦ−κＢ−ＤＮＡ複合体中に存在するｐ６５の存在は、抗ｐ６５抗体を用いたスーパーシフトバンドの検出により確認した。【００９６】
（ウイルス感染）
ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）１．０のＨＳＶ−１又はＶＳＶを１２時間細胞に感染させた。ＨＳＶ−１及びＶＳＶの収率を測定する場合には、常法によりプラーク形成アッセイを行った。全データについて、追加の独立した２回の試験において同様の結果が得られた。ウイルスの調製は常法により行った。【００９７】
（蛍光顕微鏡観察）
ＨｅＬａ細胞（５×１０４個）を、底面がガラス製の３５ｍｍ組織培養ディッシュ（松浪硝子工業株式会社）上で培養した。蛍光顕微鏡観察は、レーザー走査型共焦点顕微鏡ＩＸ８１（オリンパス株式会社）を用いて行った。２重及び３重カラーイメージは連続取得モードにより撮影し、交差励起を防いだ。【００９８】
（オリゴヌクレオチド）
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであるＣｐＧ−Ｂ（配列番号３７、以下「ＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）」と標記する場合がある。）、ＣｐＧ−Ｒｅｖ（配列番号３８、以下「ＣｐＧ−Ｒｅｖ（Ｓ）」と標記する場合がある。）及びＣｐＧ−Ｍ（配列番号３９、以下「ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）」と標記する場合がある。）並びにＰＳを用いた。これらの化合物の塩基配列を図４６に示す。図４６において、下線を付した、ＣＧ（ＣｐＧ−Ｂ（Ｓ））、ＧＣ（ＣｐＧ−Ｒｅｖ（Ｓ））及びＧＧ（ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ））は、各ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドにおける特徴的な塩基配列である。また、上記のほか、次のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドも使用した。ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０１８（Ｓ）５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号５５）、ＯＤＮ  １０１９（Ｓ）５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＧＧＴＴＡＧＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号５６）。また、次のオリゴヌクレオチドも使用した。ＣｐＧ−Ａ  ５’−ｇｇＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡｇｇｇｇｇＧ−３’（配列番号２）。ＣｐＧ−Ａは、小文字表記の塩基はホスホロチオエート骨格をもち、大文字表記の塩基はリン酸ジエステル骨格をもつ。【００９９】
（マウス脾細胞の調製）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脾臓を摘出し、これにＤＮａｓｅ  Ｉ・ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ｄ入りＰＢＳを２５Ｇの注射針（Ｎｉｐｒｏ）で注入し、滲出した細胞浮遊液を回収した。さらに脾臓を新たなＤＮａｓｅ  Ｉ・ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ｄ入りＰＢＳ中で細切し、これを回収して３７℃インキュベーション（３０分）した。両者をセルストレイナー（メッシュサイズ４０μｍ、ＢＤ）に通し、ＰＦＥ（ＰＢＳ  ｐＨ７．２（インビトロジェン）に１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ）及び２％ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）を添加したもの）で洗浄した後１×ＲＢＣ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に懸濁し赤血球を溶血させた。得られた細胞をさらに２度ＰＦＥで洗浄した後、再度セルストレイナー（メッシュサイズ４０μｍ、ＢＤ）に通し、ＲＰＭＩ培地に懸濁した。【０１００】
（ウェスタンブロッティングによるシグナル伝達経路の活性化の解析）
実施例５３において、１次抗体として、次の抗体を使用した。ウサギ抗ＩＲＦ３ポリクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ウサギ抗リン酸化ＩＲＦ３（Ｓｅｒ３９６）（４Ｄ４Ｇ）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、マウス抗ＩκＢα（Ｌ３５Ａ５）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギ抗リン酸化ＩκＢα（Ｓｅｒ３２）（１４Ｄ４）抗体、（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギ抗ＪＮＫ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギ  抗リン酸化ＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５）（８１Ｅ１１）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギ抗ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギ抗リン酸化ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。また、２次抗体として、次の抗体を使用した。抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ結合抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ結合抗体  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。【０１０１】
（細胞質ＤＮＡ又はＲＮＡにより活性化される免疫応答におけるＨＭＧＢの役割）
（実施例１）
Ｈｍｇｂ１＋／＋ＭＥＦ細胞又はＨｍｇｂ１−／−ＭＥＦ細胞を、Ｂ−ＤＮＡ（図１ａ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図１ｂ）で６時間、又はリポポリサッカライド（ＬＰＳ）（２００ｎｇ／ｍｌ）（図１ｃ）で２時間刺激した。ＩＦＮ−β  ｍＲＮＡの誘導レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図１に示す。「＊」はＨｍｇｂ１＋／＋ＭＥＦ細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。
Ｈｍｇｂ１−／−ＭＥＦ細胞では、細胞質へのＤＮＡ又はＲＮＡの送達によるＩＦＮ−β誘導が低下した。【０１０２】
（実施例２）
Ｈｍｇｂ２＋／＋ＭＥＦ細胞又はＨｍｇｂ２−／−ＭＥＦ細胞をＢ−ＤＮＡ（図２ａ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図２ｂ）で６時間、又はＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍｌ）（図２ｃ）で２時間刺激した。ＩＦＮ−β  ｍＲＮＡの誘導レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図２に示す。「＊」はＨｍｇｂ２＋／＋ＭＥＦ細胞と比較した場合にｐ＜０．００１であることを示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。【０１０３】
Ｈｍｇｂ２−／−ＭＥＦ細胞における、ＩＦＮ−β誘導の低下は、細胞質へのＤＮＡの送達により観察されたが、ＲＮＡの送達によっては観察されなかった。【０１０４】
（実施例３）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するレトロウイルスで形質転換したＭＥＦに、Ｂ−ＤＮＡ又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を脂質導入（リポフェクション）した。続いて、ＩＦＮ−β（図３ａ及びｅ）、ＩＦＮ−α４（図３ｂ及びｆ）、ＩＬ−６（図３ｃ及びｇ）、ＲＡＮＴＥＳ（図３ｄ及びｈ）のｍＲＮＡの発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図３に示す。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ−ＭＥＦと比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。【０１０５】
全てのＨＭＧＢを欠失したＭＥＦは、細胞質ＤＮＡ又はＲＮＡに対する免疫応答が欠損していた。【０１０６】
（実施例４）
全てのＨＭＧＢを欠失したＭＥＦに、様々な供給源から調製された核酸、すなわち、ＨＳＶ−１  ＤＮＡ（図４ａ）、ワクシニアウイルスＤＮＡ（図４ｂ）、５’−三リン酸ＲＮＡ（図４ｃ）、微生物ＤＮＡ（図４ｄ）、ウシ胸腺ＤＮＡ（図４ｅ）、ＩＳＤ（図４ｆ）を、脂質導入により、細胞質に送達した。ＩＳＤの塩基配列は５’−ＴＡＣＡＧＡＴＣＴＡＣＴＡＧＴＧＡＴＣＴＡＴＧＡＣＴＧＡＴＣＴＧＴＡＣＡＴＧＡＴＣＴＡＣＡ−３’（配列番号３６）である。対照としてＬＰＳによる刺激も行った（図４ｇ）。脂質導入から６時間後におけるＩＦＮ−β  ｍＲＮＡの発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図４に示す。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ−ＭＥＦと比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。【０１０７】
全てのＨＭＧＢを欠失したＭＥＦを、ＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍｌ）により２時間刺激した結果、ＩＦＮ−βが誘導された（図４ｇ）。これに対し、全てのＨＭＧＢを欠失したＭＥＦは、様々な供給源から調製された核酸の細胞質への送達から６時間後におけるＩＦＮ−β誘導が欠損していた（図４ａ〜ｈ）。【０１０８】
（細胞質核酸受容体に媒介されたシグナル経路の活性化、及び抗ウイルス免疫応答におけるＨＭＧＢの必要性）
（実施例５）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するレトロウイルスで形質転換したＭＥＦに、Ｂ−ＤＮＡ又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を脂質導入（リポフェクション）した。ＩＲＦ３の二量体化をネイティブＰＡＧＥ及びそれに続くイムノブロットにより評価した。結果を図５に示す。【０１０９】
（実施例６）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するレトロウイルスで形質転換したＭＥＦに、Ｂ−ＤＮＡ又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を脂質導入（リポフェクション）した。ＮＦ−κＢの活性化をＥＭＳＡにより評価した。結果を図６に示す。【０１１０】
（実施例７）
ウイルス感染によるＩ型ＩＦＮの誘導を検討した。全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するレトロウイルスで形質転換したＭＥＦに、ＶＳＶ又はＨＳＶ−１を感染させた。Ｉ型ＩＦＮ、すなわち、ＩＦＮ−β（図７ａ及びｂ）、ＩＦＮ−α１（図７ｃ及びｄ）、ＩＦＮ−α４（図７ｅ及びｆ）のｍＲＮＡの発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図７に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ−ＭＥＦと比較した場合にｐ＜０．０１であることを示し、「＊＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ−ＭＥＦと比較した場合にｐ＜０．０５であることを示す。【０１１１】
（実施例８）
樹状細胞（ＤＣｓ）のサブセットの１つである形質細胞様樹状細胞の前駆細胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ、ｐＤＣｓ）においては、ＴＬＲ９を介して大量のＩ型ＩＦＮの産生が誘導されることが知られている。脾臓由来のｐＤＣｓにおいては、ＤＮＡウイルスである１型単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓｔｙｐｅ  １、ＨＳＶ−１）により感染を受けると、ＴＬＲ９を介してＩ型ＩＦＮの発現が誘導されるが、骨髄由来のｐＤＣｓやｃＤＣｓ（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ＤＣｓ）においては、ＨＳＶ−ＩによるＩ型ＩＦＮの発現誘導に、ＴＬＲ９非依存性の経路も存在することが報告されている。【０１１２】
Ｈｍｇｂ１＋／＋又はＨｍｇｂ１−／−ｃＤＣｓを、ＴＬＲリガンド、すなわち、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図８ａ及びｂ）、ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮ（図８ｃ及びｄ）で刺激した。対照としてＬＰＳによる刺激も行った（図８ｅ及びｆ）。続いて、ＩＬ−６（図８ａ、ｃ、ｅ）及びＴＮＦ−α（図８ｂ、ｄ、ｆ）のｍＲＮＡの発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図８に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。「＊」は野生型細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。【０１１３】
（実施例９）
Ｈｍｇｂ１＋／＋又はＨｍｇｂ１−／−ｐＤＣｓを、ＴＬＲリガンド、すなわち、ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮ（図９ａ）及びｐｏｌｙ（Ｕ）（図９ｂ）で刺激した。対照としてＲ８３７（ＴＬＲ７アゴニスト）による刺激も行った（図９ｃ）。続いて、ＩＦＮ−βのｍＲＮＡの発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図９に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。「＊」は野生型細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。【０１１４】
（ＨＭＧＢへの高結合親和性核酸類似体を用いた、核酸により活性化される免疫応答の干渉）
（実施例１０）
ＭＥＦはＴＬＲ９の発現量が少ないことが知られている。ＭＥＦを、１μＭのＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮによる３０分間の前処理の有無の後に、Ｂ−ＤＮＡ（図１０ａ）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図１０ｂ）又はＬＰＳ（図１０ｃ）の細胞質への送達により刺激した。ＩＦＮ−β  ｍＲＮＡの発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図１０に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。「＊」は前処理された細胞の結果が、前処理されなかった細胞の結果に対してｐ＜０．０１であることを示す。【０１１５】
（実施例１１）
骨髄由来のＴｌｒ９−／−ｐＤＣｓを、５μＭ  ＰＳ又は１μＭ  ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮによる３０分間の前処理の有無の後に、１μｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｕ）（図１１ａ）の脂質導入又は２５μｇ／ｍｌのＲ８３７（図１１ｂ）のいずれかにより８時間刺激した。ＩＦＮ−β  ｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図１１に示す。「＊」は前処理された細胞の結果が、前処理されなかった細胞の結果に対してｐ＜０．０１であることを示す。【０１１６】
（ＨＭＧＢの同定とそのＤＮＡ及びＲＮＡへの結合）
（実施例１２）
ＨＭＧＢを同定した。Ｂ−ＤＮＡで４時間刺激したＭＥＦの細胞質抽出物を、ビオチン結合Ｂ−ＤＮＡ及びストレプトアビジン結合磁性ビーズを用いたプルダウンアッセイに供した。Ｂ−ＤＮＡに結合したタンパクをＤＮａｓｅ  Ｉ処理により溶出した。溶出されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びそれに続く銀染色により可視化され（図１２ａ）、続いて質量分析により解析された。図１２ａに銀染色の結果を示す。図１２ｂにＨＭＧＢ１、２及び３に対する抗体を用いたイムノブロット解析の結果を示す。【０１１７】
（実施例１３）
ＨＭＧＢのＤＮＡ、ＲＮＡ及び塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマー（ＰＳ）への結合を検討した。図１３に結果を示す。組換えＨＭＧＢ１又は２並びにビオチン結合Ｂ−ＤＮＡを用いたインビトロプルダウンアッセイを、１、３、１０、３０、１００μｇ／ｍｌの非標識核酸（Ｂ−ＤＮＡ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ｐｏｌｙ（Ｕ）、ウシ胸腺ＤＮＡ、微生物ＤＮＡ）、Ｒ８３７（１、３、１０、３０、１００μｇ／ｍｌ）（上及び中段パネル）、塩基フリーナチュラルデオキシリボースホモポリマー（ＰＤ；０．０１、０．１、０．３、１、３μｇ／ｍｌ；下段パネル）、及び塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマー（ＰＳ；０．０１、０．１、０．３、１、３μｇ／ｍｌ；下段パネル）の存在下で行った。下段パネルでは、段階的に増加する非標識Ｂ−ＤＮＡ又はＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮ（０．１、０．３、１、３μｇ／ｍｌ）も使用した。ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮ及びＰＳの半数阻害濃度（ＩＣ５０）は非標識Ｂ−ＤＮＡのそれよりも、それぞれ１５０分の１及び１００分の１であった。【０１１８】
（実施例１４）
組換えＨＭＧＢ１及びビオチン結合ｐｏｌｙ（Ｕ）を用いて、段階的に増加する非標識ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮ、ＰＳ又はＲ８３７（０．１、１又は１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、インビトロプルダウンアッセイを行った。結果を図１４に示す。【０１１９】
（実施例１５）
組換えＨＭＧＢ３及びビオチン結合Ｂ−ＤＮＡを用いて、１又は１０μｇ／ｍｌの非標識Ｂ−ＤＮＡ又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の存在下又は非存在下で、インビトロプルダウンアッセイを行った。結果を図１５に示す。【０１２０】
（核酸により活性化される免疫応答におけるＨＭＧＢの必須の役割）
（実施例１６）
Ｈｍｇｂ１＋／＋又はＨｍｇｂ１−／−ＭＥＦにＢ−ＤＮＡ（図１６ａ、ｂ、ｃ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図１６ｄ、ｅ、ｆ）を脂質導入（リポフェクション）した。続いて、ＩＦＮ−α４（図１６ａ及びｄ）、ＩＬ−６（図１６ｂ及びｅ）、ＲＡＮＴＥＳ（図１６ｃ及びｆ）のｍＲＮＡの発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図１６に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。「＊」はＨｍｇｂ１＋／＋ＭＥＦ細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。ＨＭＧＢ１の非存在下では、様々なサイトカイン及びケモカイン遺伝子の誘導が低下した。【０１２１】
（実施例１７）
野生型及び同腹仔由来のＨｍｇｂ１−／−ＭＥＦを段階的に増加するＢ−ＤＮＡ（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図１７ａ及びｂ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図１７ｃ及びｄ）で６時間刺激、又はＬＰＳ（１０、５０、１００、５００ｎｇ／ｍｌ）（図１７ｅ及びｆ）で２時間刺激した。ＩＦＮ−β（図１７ａ、ｃ、ｅ）及びＩＬ−６（図１７ｂ、ｄ、ｆ）のｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図１７に示す。【０１２２】
（実施例１８）
Ｈｍｇｂ１＋／＋又はＨｍｇｂ１−／−ｃＤＣｓ（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）にＢ−ＤＮＡ（図１８ａ、ｂ、ｃ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図１８ｄ、ｅ、ｆ）を脂質導入（リポフェクション）した。続いて、ＩＦＮ−β（図１８ａ及びｄ）、ＩＦＮ−α４（図１８ｂ及びｅ）、ＩＬ−６（図１８ｃ及びｆ）のｍＲＮＡの発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図１８に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。「＊」はＨｍｇｂ１＋／＋ｃＤＣｓ細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。【０１２３】
ＨＭＧＢ１の非存在下では、様々なサイトカイン及びケモカイン遺伝子の誘導が低下した。ｃＤＣｓにおけるｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）に対する応答はＲＬＲ及びＴＬＲ３の双方により媒介されていると考えられる。【０１２４】
（実施例１９）
ＨＭＧＢ２の非存在下でのサイトカイン遺伝子の誘導を検討した。野生型及び同腹仔由来のＨｍｇｂ２−／−ＭＥＦを段階的に増加するＢ−ＤＮＡ（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図１９ａ及びｂ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図１９ｃ及びｄ）で６時間刺激、又はＬＰＳ（１０、５０、１００、５００ｎｇ／ｍｌ）（図１９ｅ及びｆ）で２時間刺激した。ＩＦＮ−β（図１９ａ、ｃ、ｅ）及びＩＬ−６（図１９ｂ、ｄ、ｆ）のｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図１９に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。【０１２５】
（実施例２０）
Ｈｍｇｂ１−／−ＭＥＦにおけるＨＭＧＢ２のノックダウンの影響を検討した。ＨＭＧＢ２を標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ２−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するレトロウイルスで形質転換したＨｍｇｂ１−／−ＭＥＦを、Ｂ−ＤＮＡ（図２０ａ及びｂ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図２０ｃ及びｄ）で刺激し、ＩＦＮ−β（図２０ａ及びｃ）又はＩＦＮ−α４（図２０ｂ及びｄ）のｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＨｍｇｂ１＋／＋についても、比較のために解析した。結果を図２０に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。「＊」は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現する細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。【０１２６】
（実施例２１）
ＨＭＧＢ２を標的としたｓｉＲＮＡの効果を検討した。野生型のＭＥＦを、示されたｓｉＲＮＡレトロウイルスで形質転換し、各ＨＭＧＢタンパクの発現をイムノブロット解析により解析した。結果を図２１に示す。【０１２７】
（実施例２２）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡの効果を検討した。野生型のＭＥＦを、全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するレトロウイルスで形質転換し、ＨＭＧＢ１（図２２ａ）、ＨＭＧＢ２（図２２ｂ）及びＨＭＧＢ３（図２２ｃ）タンパクの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した。結果を図２２に示す。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉを導入したＭＥＦと比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。【０１２８】
（実施例２３）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡの効果を検討した。野生型のＭＥＦを、全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するレトロウイルスで形質転換し、各ＨＭＧＢタンパクの発現をイムノブロット解析により解析した。結果を図２３に示す。【０１２９】
（実施例２４）
ＨＭＧＢ欠失細胞における、様々な核酸による細胞質の刺激に対する、免疫応答の欠損を検討した。全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するレトロウイルスで形質転換したＭＥＦを、ＨＳＶ−１  ＤＮＡ（図２４ａ）、ワクシニアウイルスＤＮＡ（図２４ｂ）、５’−三リン酸ＲＮＡ（図２４ｃ）、微生物ＤＮＡ（図２４ｄ）、ウシ胸腺ＤＮＡ（図２４ｅ）、ＩＳＤ（図２４ｆ）示された核酸で６時間、又はＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍｌ）（図２４ｇ）で２時間刺激した。ＩＬ−６遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図２４に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉを導入したＭＥＦと比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。【０１３０】
（実施例２５）
ＨＭＧＢ欠失細胞における、様々な濃度の核酸リガンドに対する免疫応答の欠損を検討した。全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＭＥＦを、段階的に増加するＢ−ＤＮＡ（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図２５ａ、ｄ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図２５ｂ、ｅ）で６時間刺激、又はＬＰＳ（１０、５０、１００、５００ｎｇ／ｍｌ）（図２５ｃ、ｆ）で２時間刺激した。ＩＦＮ−β（図２５ａ、ｂ、ｃ）又はＩＬ−６（図２５ｄ、ｅ、ｆ）のｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図２５に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。【０１３１】
（実施例２６）
ＨＭＧＢ欠失細胞における、様々な濃度の核酸リガンドに対する免疫応答の欠損を検討した。全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＭＥＦを、段階的に増加するＢ−ＤＮＡ（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図２６ａ、ｃ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図２６ｂ、ｄ）で６時間刺激、又はＬＰＳ（１０、５０、１００、５００ｎｇ／ｍｌ）（図２６ｅ）で２時間刺激した。ＩＦＮ−β（図２６ａ及びｂ）又はＩＬ−６（図２６ｃ、ｄ、ｅ）の発現をＥＬＩＳＡで測定した。結果を図２６に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。【０１３２】
（実施例２７）
ＨＭＧＢ欠失細胞の、様々なサイトカイン刺激への応答を検討した。全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＭＥＦを、Ｂ−ＤＮＡ（１０μｇ／ｍｌ）で６時間（図２７ａ）、ＩＦＮ−β（５００ユニット／ｍｌ）で６時間（図２７ｂ）、ＩＦＮ−γ（１ユニット／ｍｌ）で２時間（図２７ｃ）又はＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）で２時間（図２７ｄ）刺激した。ＩＦＮ−β（図２７ａ）、ＩＲＦ７（図２７ｂ）、ＧＢＰ１（図２７ｃ）及びＩκＢ−α（図２７ｄ）のｍＲＮＡ発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図２７に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。基本的に、これらのリガンドの異なる量においても同じ結果が得られた。【０１３３】
（実施例２８）
ＨＭＧＢ欠失細胞における、ＩＦＮ−γに誘導されたＳＴＡＴ１の活性化を検討した。全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＭＥＦをＩＦＮ−γ（１又は１０ユニット／ｍｌ）で３０分間刺激した。リン酸化されたＳＴＡＴ１及びβ−アクチンを、抗リン酸化ＳＴＡＴ１（ｐ−ＳＴＡＴ１）及び抗β−アクチン抗体でそれぞれ検出した。結果を図２８に示す。【０１３４】
（実施例２９）
ＨＭＧＢ欠失ＲＡＷ２６４．７細胞における、核酸による細胞質刺激に対する免疫応答の欠損を検討した。全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞を、Ｂ−ＤＮＡ（図２９ａ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図２９ｂ）で示された時間刺激した。ＩＦＮ−β遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図２９に示す。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。【０１３５】
（実施例３０）
ＨＭＢＧ−ｓｉ又はＣｔｒｌ−ｓｉを発現するＲＡＷ２６４．７細胞を、段階的に増加するＢ−ＤＮＡ（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図３０ａ及びｄ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図３０ｂ及びｅ）で６時間刺激、又はＬＰＳ（１０、５０、１００、５００ｎｇ／ｍｌ）（図３０ｃ及びｆ）で２時間刺激した。示されたサイトカイン遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図３０に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。【０１３６】
（実施例３１）
ＨＭＧＢ欠失ＮＩＨ３Ｔ３細胞における、核酸による細胞質刺激に対する免疫応答を検討した。全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を、Ｂ−ＤＮＡ（図３１ａ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図３１ｂ）で示された時間刺激した。ＩＦＮ−β遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図３１に示す。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。【０１３７】
（実施例３２）
ＨＭＢＧ−ｓｉ又はＣｔｒｌ−ｓｉを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を、段階的に増加するＢ−ＤＮＡ（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図３２ａ及びｃ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図３２ｂ及びｄ）で９時間刺激、又はＬＰＳ（１０、５０、１００、５００ｎｇ／ｍｌ）（図３２ｅ）で２時間刺激した。ＩＦＮ−β（図３２ａ及びｂ）又はＩＬ−６（図３２ｃ、ｄ、ｅ）のｍＲＮＡ発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図３２に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。【０１３８】
（実施例３３）
Ｂ−ＤＮＡ刺激によるインフラマソーム（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）経路の活性化と細胞死におけるＨＭＧＢの関与を検討した。【０１３９】
Ｈｍｇｂ１＋／＋又はＨｍｇｂ１−／−胎児肝臓造血前駆細胞由来マクロファージ（図３３ａ）、及び全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞（図３３ｂ）にＢ−ＤＮＡを脂質導入し、１２時間後に分泌された成熟ＩＬ−１βの量をＥＬＩＳＡで測定した。ＲＡＷ２６４．７細胞は５０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで１６時間刺激し、インフラマソームを活性化させた。結果を図３３に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。図３３に結果を示す。「＊」は野生型細胞又はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。ＮＤは検出されなかったことを意味する。【０１４０】
ＨＭＢＧ−ｓｉ又はＣｔｒｌ−ｓｉを発現するＲＡＷ２６４．７細胞を、段階的に増加するＢ−ＤＮＡで刺激した。細胞は２４時間の刺激後に回収し、トリパンブルーで染色した。未処理細胞に対する生細胞の百分率を計算した。結果を図３３ｃに示す。ＨＭＧＢ−ｓｉを発現しているＲＡＷ２６４．７細胞は、ＤＮＡに誘導される細胞死に対して、より耐性であった。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。【０１４１】
（実施例３４）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＭＥＦに、ＶＳＶ（図３４ａ）又はＨＳＶ−１（図３４ｂ）を感染させ、２４時間後にウイルスタイターを測定した。結果を図３４に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。【０１４２】
（実施例３５）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞に、ＶＳＶ（図３５ａ、ｂ、ｃ）又はＨＳＶ−１（図３５ｄ、ｅ、ｆ）を感染させた。続いて、ＩＦＮ−β（図３５ａ及びｄ）、ＩＦＮ−α１（図３５ｂ及びｅ）及びＩＦＮ−α４（ｃ及びｆ）のｍＲＮＡ発現量を測定した。結果を図３５に示す。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示し、「＊＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０５であることを示す。ＮＤは検出されなかったことを意味する。【０１４３】
（実施例３６）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞に、ＶＳＶ又はＨＳＶ−１を感染させた。続いて、ウイルスタイターを測定した。結果を図３６に示す。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。【０１４４】
（核酸に媒介されたＴＬＲの活性化にはＨＭＧＢが必要である）
（実施例３７）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞を、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図３７ａ及びｂ）又はＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮ（図３７ｃ及びｄ）で刺激し、ＩＬ−６（図３７ａ及びｃ）及びＴＮＦ−α（図３７ｂ及びｄ）のｍＲＮＡの発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図３７に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。ＮＤは検出されなかったことを意味する。【０１４５】
（実施例３８）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞を、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ、並びにＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ及びＤＯＴＡＰで刺激し、ＩＦＮ−β（図３８ａ）及びＩＦＮ−α４（図３８ｂ）のｍＲＮＡの発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。ＤＯＴＡＰ（商品名、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）はＤＮＡ、ＲＮＡ等の負に帯電した分子を真核細胞中にカチオンリポソームを介して導入するための試薬である。結果を図３８に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。【０１４６】
（実施例３９）
核酸類似体を用いた刺激による、核酸により活性化される免疫応答の阻害を検討した。  ＭＥＦにＢ−ＤＮＡを脂質導入した後、１μＭ  ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮで０、１、２、３時間共刺激し、ＩＦＮ−βの誘導をＥＬＩＳＡで測定した。結果を図３９に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。「＊」はＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮでの刺激を伴わない、Ｂ−ＤＮＡによる刺激と比較した場合に、ｐ＜０．０１であることを示す。【０１４７】
（実施例４０）
骨髄由来Ｔｌｒ９−／−ｃＤＣｓを、５μＭ  ＰＳ又は１μＭ  ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮで３０分の前処理の有無の後に、５０μｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（脂質導入なし）（図４０ａ）、又は２５μｇ／ｍｌのＲ８３７（図４０ｂ）で４時間刺激した。ＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図４０に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。「＊」は、前処理された細胞の結果に対する、前処理されなかった細胞の結果がｐ＜０．０１であることを示す。ＮＤは検出されなかったことを意味する。【０１４８】
（実施例４１）
ＨＭＧＢ１及びＲＩＧ−Ｉの細胞内局在を検討した。ＨｅＬａ細胞に、ＣＦＰタグを付けたＲＩＧ−Ｉ（ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ）及びＹＦＰタグを付けたＨＭＧＢ１（ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１）の発現ベクターを、ＲＦＰタグを付けたＲａｂ５（ＲＦＰ−Ｒａｂ５）と共に又はＲＦＰ−Ｒａｂ５なしで導入した。遺伝子導入から１６時間後、細胞をｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）で２時間刺激し、レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて蛍光顕微鏡観察を行った。【０１４９】
図４１に発現ベクター（ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ、ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１、ＲＦＰ−Ｒａｂ５）を共導入された細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。図４１の上段及び下段は、それぞれ単独（左から右に、ＲＩＧ−Ｉ、ＨＭＧＢ１、Ｒａｂ５）及び重ね合わせ（左から右に、ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ＋ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１、ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ＋ＲＦＰ−Ｒａｂ５、ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１＋ＲＦＰ−Ｒａｂ５、ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ＋ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１＋ＲＦＰ−Ｒａｂ５）の写真を示す。スケールバーは５μｍを示す。多くの細胞で観察された、代表的な結果を示す。ＲＩＧ−Ｉ及びＨＭＧＢ１の双方が部分的にＲａｂ５と重なっており、これは、ＲＩＧ−Ｉ及びＨＭＧＢ１のエンドソーム膜への動員、及びおそらくはＨＭＧＢによるＲＩＧ−Ｉの活性化を示している。【０１５０】
（実施例４２）
ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ及びＹＦＰ−ＨＭＧＢ１発現ベクターを共導入した細胞を、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激後に、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ  ６３３（ｍｉｔｏＴＲ、インビトロジェン社）で染色し、レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて蛍光顕微鏡観察を行った。図４２に細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。図４２の上段及び下段は、それぞれ単独（左から右に、ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ、ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１、ｍｉｔｏＴＲ）及び重ね合わせ（左から右に、ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ＋ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１、ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ＋ｍｉｔｏＴＲ、ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１＋ｍｉｔｏＴＲ、ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ＋ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１＋ｍｉｔｏＴＲ）の写真をそれぞれ示す。スケールバーは５μｍを示す。【０１５１】
ここで示されるように、ＲＩＧ−ＩはｍｉｔｏＴＲと重なっており、ＨＭＧＢ１及びｍｉｔｏＴＲの間には、重なりは全く見られなかった。実施例４１で示された結果と共に、この結果は、次のように解釈される。ＨＭＧＢ１によるｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）認識の後、ＲＩＧ−Ｉが活性化されてミトコンドリアに局在化し、そこでＩＰＳ−１／ＭＡＶＳと相互作用する。【０１５２】
これらの観察は、核酸認識及び免疫応答の活性化の一連の活動における「スナップショット」であり、この観察においては、ＲＩＧ−Ｉの一部の画分がＨＭＧＢ１と相互作用し、一方で他の画分がＨＭＧＢ１から解離してＩＰＳ−１／ＭＡＶＳと結合している。【０１５３】
図４３に、上記の実施例の結果に基づいて作成した、核酸によって仲介される免疫応答の活性化、すなわちＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の概略図を示す。全ての免疫原性核酸はＨＭＧＢに結合し（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ  ｓｅｎｓｉｎｇ、広範な認識）、これは後に続く免疫応答を活性化するための特異的パターン認識受容体による認識（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｖｅ  ｓｅｎｓｉｎｇ、特異的な認識）に必要である。【０１５４】
（実施例４３）
マイクロプレートを用いて、固相化されたＨＭＧＢタンパクを用いた、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤のスクリーニング方法を評価した。５μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶解した組換えＨＭＧＢ１タンパクを、１００μｌずつ、９６ウェルマイクロプレートに分注し、２５℃で１時間放置して固相化した。各ウェルをＰＢＳ溶液で２回洗浄後、２％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を１００μｌずつ加え、２５℃で１時間放置してブロッキングした。各ウェルをＰＢＳ溶液で２回洗浄後、ＰＢＳ溶液のみ、７５μｇ／ｍｌのＢ−ＤＮＡ、１００μｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ及び２５μｇ／ｍｌのＲ８３７を溶解したＰＢＳ溶液を１００μｌずつ添加し、２５℃で１時間放置した。続いて、各ウェルをＰＢＳ溶液で２回洗浄後、１μＭの５’末端をビオチン標識したＢ−ＤＮＡ又はＰＢＳ溶液のみを１００μｌずつ加え、２５℃で１時間放置した。続いて、各ウェルをＰＢＳ溶液で２回洗浄後、ＰＢＳ溶液で２００倍希釈したＨＲＰ標識抗ビオチン抗体（Ｒ＆Ｄ社）を１００μｌずつ加え、２５℃で１時間放置した。各ウェルをＰＢＳ溶液で２回洗浄後、ＨＲＰの基質溶液（ＢＤ  バイオサイエンス社）を１００μｌずつ加え、２５℃で１５分間発色させた。各ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ  ６８０、バイオラッド社）で定量した。図４５（ａ）に発色後のマイクロプレートの写真を示し、図４５（ｂ）に各サンプルの吸光度のグラフを示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。【０１５５】
（ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化に対する、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド及びＰＳの効果）
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであるＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）、ＣｐＧ−Ｒｅｖ（Ｓ）及びＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）並びにＰＳを用いた実験を行った。これらの化合物の塩基配列を図４６に示す。図４６において、下線を付した、ＣＧ（ＣｐＧ−Ｂ（Ｓ））、ＧＣ（ＣｐＧ−Ｒｅｖ（Ｓ））及びＧＧ（ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ））は、各ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドにおける特徴的な塩基配列である。【０１５６】
（インビトロプルダウンアッセイ）
（実施例４４）
実施例１３と同様にして、０．１、０．５、２．５、１２．５、６２．５μｇ／ｍｌのＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）、ＣｐＧ−Ｒｅｖ（Ｓ）、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）及びＰＳを競合物質として、組換えＨＭＧＢ１及びビオチン結合Ｂ−ＤＮＡを用いたインビトロプルダウンアッセイを行った。結果を図４７に示す。ＣｐＧ−Ｒｅｖ（Ｓ）及びＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）（データ示さず）はＰＳよりも強い競合性を示した。【０１５７】
（ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制）
（実施例４５）
ＭＥＦの培地に０．１、０．２５、０．５、０．７５、１μＭの濃度のＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）、ＣｐＧ−Ｒｅｖ（Ｓ）又はＰＳを添加し、１時間処理した。続いて、これらのＭＥＦに５μｇ／ｍｌのＢ−ＤＮＡ又は５μｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を脂質導入して２４時間刺激し、ＩＦＮ−βの産生をＥＬＩＳＡ法により測定した。結果を図４８に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。（ａ）〜（ｃ）はＢ−ＤＮＡで刺激した結果を示し、（ｄ）〜（ｆ）はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）で刺激した結果を示す。その結果、ＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）（図４８ａ及びｄ）又はＣｐＧ−Ｒｅｖ（Ｓ）（図４８ｂ及びｅ）で処理したＭＥＦにおいて、ＩＦＮ−βの産生が顕著に減弱していた。また、今回実験した濃度においては、ＰＳを用いた場合のＭＥＦによるＩＦＮ−βの産生の抑制は、ＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）又はＣｐＧ−Ｒｅｖ（Ｓ）を用いた場合と比較して弱いことが明らかとなった（図４８ｃ及びｆ）。【０１５８】
以上の結果から、ＭＥＦによるＩＦＮ−βの産生の抑制には、塩基部分の存在が重要であることが明らかとなった。ＴＬＲ９を介した免疫応答の活性化にはＣｐＧ−Ｂ（配列番号１）の第８番目及び第９番目の塩基がＣＧの配列であることが重要であることが知られているが、この配列をＧＣに変え、リン酸ジエステル結合を全てホスホロチオエート結合に置き換えたＣｐＧ−Ｒｅｖ（Ｓ）（配列番号３８）で処理したＭＥＦにおいて、ＩＦＮ−βの産生が顕著に減弱していた。この結果から、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制には、非メチル化ＣＧ配列（５’−ＣＧ−３’）は重要ではなく、（１）ホスホロチオエート結合を有していること、及び（２）塩基を有していること、が重要であると考えられる。【０１５９】
（実施例４６）
野生型マウス由来の骨髄細胞を、上述したようにヒトＦｌｔ３Ｌで分化誘導してｐＤＣｓを得た。このｐＤＣｓ（以下、「Ｆｌｔ３−ＤＣｓ」という場合がある。）を、３μＭのＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の存在下で１時間処理した後、１μＭのＣｐＧ−Ａ（ＴＬＲ９アゴニスト）又は５μｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｕ）（ＴＬＲ７アゴニスト）を脂質導入して２４時間刺激し、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βの産生をＥＬＩＳＡ法により測定した。結果を図４９に示す。（ａ）及び（ｂ）はＩＦＮ−αの産生量の測定結果を示し、（ｃ）及び（ｄ）はＩＦＮ−βの産生量の測定結果を示す。また、（ａ）及び（ｃ）はＣｐＧ−Ａで刺激した結果を示し、（ｂ）及び（ｄ）はｐｏｌｙ（Ｕ）で刺激した結果を示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。その結果、Ｆｌｔ３−ＤＣｓは、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）による処理によって、ＣｐＧ−Ａ又はｐｏｌｙ（Ｕ）で刺激された場合のＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βの産生が顕著に抑制されることが明らかとなった。【０１６０】
（インビボ敗血症モデル）
（実施例４７）
マウスへのＬＰＳ投与は、敗血症のモデルとして用いられる。致死量のＬＰＳをマウスに投与した場合、血中における炎症性サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６の濃度はＬＰＳ投与後間もなく上昇し、２〜３時間後にピークを迎え、その後数時間で基底濃度に戻る。一方、マウスの生存の経過を追うと、多くの個体が死に至るにはＬＰＳ投与から１２〜４８時間の経過を要する。この時期に血中で高濃度に存在するサイトカインとして見出されたのが、ＨＭＧＢ１である。ＨＭＧＢ１の血中濃度は、ＬＰＳ投与後８時間のうちには変化が見られず、その後上昇して、投与から１６〜３６時間後に高濃度を維持する。血中のＨＭＧＢ１濃度と敗血症の重症度が相関していること、ＨＭＧＢ１の中和抗体を投与すると生存率が上昇することから、敗血症の致死性に対するＨＭＧＢ１の寄与の重要性が伺える。【０１６１】
また、敗血症モデルにおいては肝細胞が壊死（ネクローシス）を起こすことが知られており、壊死細胞によって放出される核酸などのＤＡＭＰｓが症状を増悪させている可能性が考えられる。これらのいわゆる炎症メディエーターを阻害することで、症状を改善できる可能性について検討した。【０１６２】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＬＰＳ  １．２５ｍｇ／匹を腹腔内投与した場合に惹起される敗血症モデルにおいて、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の効果を検討した。ＬＰＳの投与の１時間前に、１００μｇ／匹のＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）又は生理食塩水を尾静脈投与し、マウスの生存率を測定した。結果を図５０に示す。ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）を投与したマウスにおいて、生存率の改善が認められた。ＬＰＳの投与により、肝臓等において細胞死が生じ、核酸が放出され、これらの核酸によって、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化が誘導されると考えられる。特定の理論に拘泥する物ではないが、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の投与により、このようなＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化が抑制されていることが考えられる。【０１６３】
図５０に示すように、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の投与を行わなかった対照群（ｎ＝１０）ではＬＰＳ注射後１２〜４８時間後に全個体が死亡したのに対し、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）を投与後にＬＰＳを注射したサンプル群（ｎ＝１０）では７０％が生存した。【０１６４】
（塩基配列の検討）
（実施例４８）
ＭＥＦに５ｍｅｒ、１０ｍｅｒ（配列番号４１）、１５ｍｅｒ（配列番号４２）及び２０ｍｅｒ（配列番号４３）の塩基数のｐｏｌｙ（ｄＡ）（プリン塩基）の塩基配列を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（以下「ｐｏｌｙ（ｄＡ）（Ｓ）」と標記する場合がある。）又は５ｍｅｒ、１０ｍｅｒ（配列番号４４）、１５ｍｅｒ（配列番号４５）及び２０ｍｅｒ（配列番号４６）の塩基数のｐｏｌｙ（ｄＣ）（ピリミジン塩基）の塩基配列を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（以下「ｐｏｌｙ（ｄＣ）（Ｓ）」と標記する場合がある。）を１時間１μＭで前処理した。続いて、５μｇ／ｍｌの濃度のＢ−ＤＮＡを脂質導入することで前処理後のＭＥＦを刺激し、３時間後又は６時間後のＩＦＮ−βのｍＲＮＡの誘導をＲＴ−ＰＣＲにて検討した。【０１６５】
結果を図５１に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。（ａ）はｐｏｌｙ（ｄＡ）（Ｓ）の結果を示し、（ｂ）はｐｏｌｙ（ｄＣ）（Ｓ）の結果を示す。陽性対照としてＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）で前処理したものを用い、陰性対照としてオリゴを添加せずに前処理したものを用いた。ｐｏｌｙ（ｄＡ）（Ｓ）及びｐｏｌｙ（ｄＣ）（Ｓ）のいずれも、Ｂ−ＤＮＡ刺激によるＩＦＮ−β  ｍＲＮＡの誘導を抑制した。特にプリン塩基であるｐｏｌｙ（ｄＡ）（Ｓ）を用いた場合のＩＦＮ−β  ｍＲＮＡの誘導の抑制は顕著であった。また、１５ｍｅｒ以上の長さのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ＩＦＮ−β  ｍＲＮＡの誘導の抑制効果が大きかった。【０１６６】
（核酸認識受容体シグナルを阻害する非免疫原性オリゴデオキシリボヌクレオチドの探索）
（各種オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）のＩ型ＩＦＮ産生抑制能の比較）
（実施例４９）
ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）・（ｄＴ：ｄＡ）（Ｂ型コンフォメーションをとるｄｓＤＮＡ、以下、「Ｂ−ＤＮＡ」という。）、ｄｓＲＮＡであるｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）の細胞内にリポフェクション法によって導入すると、Ｉ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−α／β）及び炎症性サイトカインが産生されることが報告されている。そこでまず、予め培地中にＯＤＮを加えておくこと（以下、「ＯＤＮ前処理」という。）による免疫応答抑制を、核酸刺激によるＩ型ＩＦＮの産生量を指標として検討した。核酸刺激の１時間前に各種ＯＤＮによる前処理を行った場合、行わなかった場合について、ＭＥＦにおけるＩ型ＩＦＮの産生量をＥＬＩＳＡにて定量した。その結果、ＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）、ＣｐＧ−Ｒｅｖ（Ｓ）、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）、ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０１８（Ｓ）、ＯＤＮ  １０１９（Ｓ）を前処理に用いると、培地中のＯＤＮ濃度上昇に依存してＩ型ＩＦＮの産生が抑制された。また、塩基をもたずホスホロチオエート骨格のみからなるＯＤＮ（ＰＳ）は、上記の塩基をもつＯＤＮで前処理を行った場合よりも、Ｉ型ＩＦＮ産生抑制能が低いことが明らかになった。結果を図５２に示す。【０１６７】
より詳細には、ＭＥＦにおいて、各種ＯＤＮ（ＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）、ＣｐＧ−Ｒｅｖ（Ｓ）、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）、ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０１８（Ｓ）、ＯＤＮ  １０１９（Ｓ）、ＰＳ）による前処理の１時間後に、５μｇ／ｍＬ  Ｂ−ＤＮＡ（Ａ−Ｆ）、或いは５μｇ／ｍＬ  ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（Ｇ−Ｌ）で刺激を行い、２４時間後の培養液上清中のＩＦＮ−βをＥＬＩＳＡで定量した。それぞれ独立した２つのサンプルを用いて、平均値と標準偏差を示した。図５２中、「＊」はＰ＜０．０５で、「＊＊」はＰ＜０．０１でＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）（＋）とＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）（−）の値に有意差があることを示す。【０１６８】
（実施例５０）
タンパク質の合成阻害がＯＤＮによる免疫応答抑制の原因である可能性を検討した。ＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）及びＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）について、ＭＥＦにおけるＩ型ＩＦＮ及び炎症性サイトカインのｍＲＮＡの誘導を定量的ＲＴ−ＰＣＲにて検討した。その結果、図５３に示すように、ＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）、又はＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）を前処理に用いると、Ｉ型ＩＦＮ及び炎症性サイトカインのいずれも、ｍＲＮＡの発現誘導が抑制された。よって、これらのＯＤＮはｍＲＮＡ発現誘導より上流を標的として免疫応答抑制を行っていることが示唆された。また、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）と同じ塩基配列をもち且つリン酸ジエステル骨格からなるＯＤＮ（ＣｐＧ−Ｍ）を前処理に用いた場合には、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）で前処理を行った場合のようなＩ型ＩＦＮ及び炎症性サイトカインの発現誘導の抑制が見られなかった。【０１６９】
より詳細には、ＭＥＦにおいて、各種ＯＤＮ（ＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）と同じ配列でリン酸ジエステル骨格をもつＯＤＮ（ＣｐＧ−Ｍ））による前処理の１時間後に、５μｇ／ｍＬ  Ｂ−ＤＮＡ、或いは５μｇ／ｍＬ  ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を細胞内に導入し、刺激を行った。刺激から３、６時間後に全ＲＮＡを回収し、（Ａ）Ｉｆｎａ４、（Ｂ）Ｉｆｎｂ１、（Ｃ）Ｉｌ６、（Ｄ）Ｃｃｌ５のｍＲＮＡの誘導を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより定量した。それぞれ独立した２つのサンプルを用いて、平均値と標準偏差を示した。図５３中、Ｎ．Ｄ．は検出不能を示す。「＊」はＰ＜０．０５で、「＊＊」はＰ＜０．０１でＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）（−）の値との間に有意差があることを示す。【０１７０】
（核酸の取込み効率の解析）
（実施例５１）
実施例５０の解析より、ＭＥＦにＯＤＮ前処理を施すことでＢ−ＤＮＡ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激によるＩＦＮ産生が抑制されることが示された。これについて、ＯＤＮはどのような機構でＩＦＮ産生を抑制しているのかについて検討した。Ｂ−ＤＮＡ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を用いて細胞を刺激する際、リポフェクション法によって核酸を導入する必要がある。したがって、実施例５０においては、ＯＤＮがリポフェクションによるＢ−ＤＮＡ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の細胞内への取込みを阻害することにより、結果としてＩＦＮ産生が抑制されている可能性が考えられた。そこで、５’末端がＦＩＴＣ標識されたＢ−ＤＮＡを細胞内に取り込ませる際、ＴＬＲ９を活性化しないと考えられるＣｐＧ−Ｒｅｖ（Ｓ）、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）、ＯＤＮ  １０１９（Ｓ）の前処理の有無がＢ−ＤＮＡ取込みに与える影響について検討した。結果を図５４に示す。ＦＩＴＣ標識Ｂ−ＤＮＡを導入したＭＥＦにおいて、ＦＩＴＣに由来する蛍光をフローサイトメトリーにて観測した。フローサイトメトリー解析はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）を用いて行った。この条件下において、ＩＦＮ産生を阻害するＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）、ＣｐＧ−Ｒｅｖ（Ｓ）、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）で前処理したサンプル（図５４、Ｃ、Ｄ、Ｅ）では処理無しのコントロール（図５４、Ｂ）と比較し、同程度若しくはより強い蛍光が観測され、Ｂ−ＤＮＡの取り込みを阻害していないことが明らかとなった。一方で、ＯＤＮ  １０１９（Ｓ）による前処理を行ったＭＥＦ（図５４、Ｆ）では、コントロールの細胞群（図５４、Ｂ）と比較し、ＦＩＴＣ由来の蛍光を発する細胞が少なかったことから、ＯＤＮ  １０１９（Ｓ）はリポフェクションによるＢ−ＤＮＡのＭＥＦへの取込みを阻害していることが判明した。【０１７１】
より詳細には、各種ＯＤＮによる前処理を行わず、ＦＩＴＣ標識Ｂ−ＤＮＡを導入しなかったＭＥＦ（Ａ）、３μｇ／ｍＬ  ＦＩＴＣ標識Ｂ−ＤＮＡのみを導入したＭＥＦ（Ｂ）、及び１μＭ  ＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）（Ｃ）、１μＭ  ＣｐＧ−Ｒｅｖ（Ｓ）（Ｄ）、１μＭ  ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）（Ｅ）、１μＭ  ＯＤＮ  １０１９（Ｓ）（Ｆ）による前処理を１時間行った後、３μｇ／ｍＬ  ＦＩＴＣ標識Ｂ−ＤＮＡを導入したＭＥＦについて、細胞内に取込まれたＦＩＴＣ標識Ｂ−ＤＮＡ由来の蛍光を、フローサイトメトリーにて検出した。ＦＩＴＣ由来蛍光の蛍光強度を横軸とし、細胞数をヒストグラムで示した。図５４中、各パネル中の数値は、ＦＩＴＣ陽性細胞の全体に占める割合を示す。【０１７２】
ＯＤＮ  １０１９（Ｓ）がどのようにリポフェクションによる核酸の細胞質内への導入を阻害しているかその機構は不明であるが、この様式の抑制作用の解析は、ここでは主眼とはしていない。したがって本明細書においては、ＯＤＮ  １０１９（Ｓ）による取り込み阻害機構についてはこれ以上の解析を行わず、以下の実験には、ＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）と同様に核酸の取込みを阻害しない  ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）を用いた。【０１７３】
（ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）とＨＭＧＢタンパク質との結合及び核酸受容体シグナル経路の抑制）
（実施例５２）
上記の結果から、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）によるＩＦＮ産生の抑制は、核酸の取り込み阻害によるものではないことが明らかとなった。そこで、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）による抑制の作用点はどこかについて検討した。核酸認識に関連するシグナル伝達分子に着目し、解析を進めた。Ｂ−ＤＮＡやｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の刺激によってＩ型ＩＦＮの誘導のみならずＮＦ−κＢ経路及びＭＡＰキナーゼ経路が活性化されることが知られているが、Ｂ−ＤＮＡやｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）とＨＭＧＢタンパク質との結合を阻害することで、これらのシグナル伝達経路の活性化が抑制される可能性を検討した。ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）とＨＭＧＢタンパク質との結合についてインビトロプルダウンアッセイにて検討した。ＨＭＧＢ１の組換えタンパク質を精製し、ビオチン標識Ｂ−ＤＮＡと混合すると、図５５Ａに示すように、ＨＭＧＢ１はＢ−ＤＮＡと結合した。この結合はＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）を競合物として加えていくことで完全に阻害された。次に、このＨＭＧＢ１とＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）との強い結合をＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）によって阻害できるかどうかを検討した。図５５Ｂに示すように、ビオチン標識ＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）とＨＭＧＢ１タンパク質を混合し、ここにＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）を添加していくと用量依存的にＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）とＨＭＧＢ１との強い結合を阻害できることが判明した。ビオチン標識していないＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）を添加した場合と同等に結合が阻害されたことから、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）はＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）と同程度に強くＨＭＧＢ１と結合することが示唆された。また同時に、図５５Ｂに示すように、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）は、塩基をもたないホスホロチオエート骨格のみのＯＤＮ（ＰＳ）及びＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）と同じ配列でリン酸ジエステル骨格をもつＯＤＮ（ＣｐＧ−Ｍ）よりも強くＨＭＧＢ１と結合することが示された。【０１７４】
より詳細には、ＨＭＧＢ１の組換えタンパク質２μｇと終濃度２．５μｇ／ｍＬのビオチン標識Ｂ−ＤＮＡに対し、競合物（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）として終濃度０、０．１、０．５、２．５、１２．５、６２．５μｇ／ｍＬのＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）を加え、インキュベーションした（室温、３０分）。ストレプトアビジン結合磁気ビーズを用いてビオチン標識Ｂ−ＤＮＡをプルダウンし、共沈したタンパク質に対し抗ＨＭＧＢ１抗体を用いて、ウェスタンブロッティングによりＨＭＧＢ１を検出した。結果を図５５Ａに示す。また、ＨＭＧＢ１の組換えタンパク質２μｇと終濃度０．２μＭのビオチン標識ＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）に対し、競合物として終濃度０、１、２、４、８、１６、３２μＭのビオチン標識していないＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）、塩基をもたないホスホロチオエート骨格のみのＯＤＮ（ＰＳ）、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）と同じ配列でリン酸ジエステル骨格をもつＯＤＮ（ＣｐＧ−Ｍ）を加えた。ストレプトアビジン結合磁気ビーズを用いてビオチン標識ＣｐＧ−Ｂをプルダウンし、共沈したタンパク質に対し抗ＨＭＧＢ１抗体を用いて、ウェスタンブロッティングによりＨＭＧＢ１を検出した。結果を図５５Ｂに示す。【０１７５】
（実施例５３）
実施例４９の検討において、ＨＭＧＢ１に高い結合親和性を有すると考えられるＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の方が、ホスホロチオエート骨格のみのＰＳよりも核酸刺激によるＩＦＮ誘導の抑制能が強かったこと、実施例５０の検討において、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）がＩ型ＩＦＮ及び炎症性サイトカインのｍＲＮＡ誘導を抑制するのに対しＣｐＧ−Ｍは抑制しなかったことを考慮すると、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）による免疫応答抑制作用は、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）がＨＭＧＢタンパク質と強く結合することによって、免疫原性核酸のＨＭＧＢタンパク質への結合による下流の免疫受容体への結合及びシグナル伝達を阻害することに起因するのではないかと考えられた。この仮説に則れば、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の抑制作用はＩ型ＩＦＮの誘導のみにとどまらず、ＮＦ−κＢやＭＡＰキナーゼの活性化経路にまで及んでいるはずである。そこで次に、核酸刺激によるこれら転写因子やシグナル伝達分子の活性化へのＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の抑制作用について検討した。【０１７６】
Ｂ−ＤＮＡやｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）等の核酸刺激によるＩ型ＩＦＮの誘導には転写因子であるＩＦＮ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ３（ＩＲＦ３）が重要な役割を果たしていることが報告されている。ＩＲＦ３は、無刺激時は単量体として細胞質内に存在するが、リン酸化等によって活性化を受けると、ホモ二量体を形成し核内移行することが知られている。そこでＩＲＦ３の活性化を、リン酸化を指標に検討した。図５６に結果を示す。核酸刺激によるＩＲＦ３のリン酸化は、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の前処理によって顕著に抑制されていることが明らかになった。次に、ＮＦ−κＢ経路の活性化をＩκＢαのリン酸化を指標として、またＭＡＰキナーゼ経路の活性化をｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ（ＪＮＫ）、ｐ３８のリン酸化を指標として検討した。その結果、やはりＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の前処理により、これらの転写因子、シグナル伝達分子の活性化も著明に減弱していることが明らかとなった。以上のことから、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）はＨＭＧＢタンパク質と結合することにより、Ｂ−ＤＮＡやｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）とＨＭＧＢタンパク質との結合を阻害し、それらによる自然免疫受容体刺激によるシグナル経路を抑制していることが示唆された。【０１７７】
より詳細には、１μＭ  ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）による１時間の前処理を行った、或いは行わなかったＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のＭＥＦに対し、１μｇ／ｍＬ  Ｂ−ＤＮＡ（Ａ）或いは１μｇ／ｍＬ  ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（Ｂ）を細胞質内に導入し、刺激を行った。刺激後０．５、１、１．５、２、３、４時間後のタンパク質のサンプルを回収し、ＩＲＦ３、ＩκＢα、ＪＮＫ、ｐ３８のリン酸化（ｐ−ＩＲＦ３、ｐ−ＩκＢα、ｐ−ＪＮＫ、ｐ−ｐ３８）を、ウェスタンブロッティングにより検出した。【０１７８】
（ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の抑制作用におけるＴＬＲ９の関与の検討）
（実施例５４）
上記の結果から、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）はＢ−ＤＮＡの細胞内への取込みには影響を与えず、細胞内核酸認識受容体下流のシグナル伝達経路の活性化を阻害することが明らかになった。ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）はＨＭＧＢタンパク質を標的として免疫応答を抑制していることが強く示唆される。ところで、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）は、ＴＬＲ９アゴニストであるＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）と１塩基のみ異なる配列をもつ。そこで、ＴＬＲ９が発現している細胞種においても、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）は核酸刺激による免疫系の活性化を抑制できるか否かについて検討した。また、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）自体がＴＬＲ９によって認識され、アゴニストとして作用してしまう可能性について検討した。Ｔｌｒ９遺伝子欠損（Ｔｌｒ９−／−）マウス及び対照（Ｔｌｒ９＋／−）マウス由来のｃＤＣを用い、細胞内核酸刺激に対する応答がＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）前処理によって抑制されるか検討した。図５７に示すように、これらのマウス由来のｃＤＣをＢ−ＤＮＡ又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）で刺激すると、両者のｃＤＣにおいてＩ型ＩＦＮ及び炎症性サイトカインの遺伝子の発現が同等に誘導された。このとき、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の前処理によって、Ｔｌｒ９＋／−  ｃＤＣ、Ｔｌｒ９−／−  ｃＤＣのいずれの場合においてもＩ型ＩＦＮ及び炎症性サイトカイン遺伝子の発現誘導が抑制された。以上のことより、ＭＥＦ以外の細胞種においてもＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）は核酸刺激による免疫系活性を抑制することが明らかになった。また、この抑制作用はＴＬＲ９のシグナルには依存せず、ＴＬＲ９より上流の、おそらくＨＭＧＢタンパク質とＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の結合によってもたらされるものと推察された。さらに、Ｂ−ＤＮＡ又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）で刺激せず、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）のみ添加した場合にはＩ型ＩＦＮも炎症性サイトカインも誘導されなかったことから、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）はＴＬＲ９のアゴニストであるＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）とは異なり、免疫原性をもたないことが明らかになった。【０１７９】
より詳細には、Ｔｌｒ９遺伝子欠損マウス（Ｔｌｒ９−／−）及び対照マウス（Ｔｌｒ９＋／−）由来のｃＤＣに１μＭ  ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）により前処理を行い、或いはコントロールとして前処理を行わず、１時間後に５μｇ／ｍＬ  Ｂ−ＤＮＡ、５μｇ／ｍＬ  ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を細胞内に導入し、刺激を行った。刺激から３、６時間後に全ＲＮＡを回収し、（Ａ）Ｉｆｎａ４、（Ｂ）Ｉｆｎｂ１、（Ｃ）Ｉｌ６、（Ｄ）ＴｎｆａのｍＲＮＡの誘導を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより定量した。それぞれ独立した２つのサンプルを用いて、平均値と標準偏差を示した。図５４中、Ｎ．Ｄ．は検出不能を示す。「＊」はＰ＜０．０５で、「＊＊」はＰ＜０．０１でＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）（＋）とＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）（−）の値に有意差があることを示す。【０１８０】
（ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）によるＴＬＲ経路の抑制の検討）
（実施例５５）
実施例５４の結果より、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）がＴＬＲ９のさらに上流を標的として核酸刺激による免疫系活性を抑制すると考えられた。そこで、同じく核酸を認識する膜型受容体であるＴＬＲ７の下流のシグナル経路も、同様にＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）によって抑制され得るかについて検討した。ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）はＴＬＲ９のアゴニストとして免疫原性をもたない。よって、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９を多く発現し、それぞれのリガンドであるｓｓＲＮＡ、ＣｐＧモチーフをもつＤＮＡを認識すると大量のＩ型ＩＦＮを産生する細胞、ｐＤＣを用いて、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９が核酸認識した際のＩ型ＩＦＮの誘導がＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）によって抑制されるか検討した。図５８に示すように、ｐＤＣをＴＬＲ９リガンドであるＣｐＧ−Ａ、又はＴＬＲ７リガンドであるｐｏｌｙ（Ｕ）で刺激すると、ＩＦＮ−αの産生が誘導されたが、この産生はＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）での前処理によって抑制された。【０１８１】
より詳細には、３μＭ  ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）で前処理を行った、或いは行わなかったＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のｐＤＣを、（Ａ）ＴＬＲ９リガンドである１μＭ  ＣｐＧ−Ａ、（Ｂ）ＴＬＲ７リガンドである５μｇ／ｍＬ  ｐｏｌｙ（Ｕ）で刺激し、２４時間後の培養上清中のＩＦＮ−αをＥＬＩＳＡにて定量した。「＊＊」はＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）（−）と（＋）との値にＰ＜０．０１で有意差があることを示す。【０１８２】
（実施例５６）
次に、定量的ＲＴ−ＰＣＲにてＩ型ＩＦＮ遺伝子の発現誘導を解析したところ、図５９に示すように、ＣｐＧ−Ａ、ｐｏｌｙ（Ｕ）のいずれを用いて刺激した場合も、ｍＲＮＡのレベルでＩ型ＩＦＮ遺伝子の発現が抑制された。このことから、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）はＴＬＲ７、ＴＬＲ９による核酸認識に共通した機構を標的として、Ｉ型ＩＦＮの誘導を抑制していることが示唆された。【０１８３】
より詳細には、１０μＭ  ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）で前処理を行った、或いは行わなかったＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のｐＤＣを、１μＭ  ＣｐＧ−Ａで刺激した際の（Ａ）Ｉｆｎａ４、（Ｂ）Ｉｆｎｂ１、及び、５μｇ／ｍＬ  ｐｏｌｙ（Ｕ）で刺激した際の（Ｃ）Ｉｆｎａ４、（Ｄ）Ｉｆｎｂ１のｍＲＮＡ誘導を定量的ＲＴ−ＰＣＲにて定量した。いずれもそれぞれ独立した２つのサンプルを用いて、平均値と標準偏差を示した。Ｎ．Ｄ．は検出不能を示す。「＊」はＰ＜０．０５で、「＊＊」はＰ＜０．０１でＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）（＋）とＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）（−）との値に有意差があることを示す。【０１８４】
（ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の核酸刺激による適応免疫系活性化の抑制及び病態モデルにおける評価）
上記の結果から、インビトロにおけるＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の自然免疫応答抑制能が示された。病原体由来分子パターン（Ｐａｔｈｏｇｅｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎｓ；ＰＡＭＰｓ）や自己の組織に由来するダメージ関連分子パターン（Ｄａｍａｇｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎｓ；ＤＡＭＰｓ）を素早く認識し、応答を行う自然免疫は、生体内の非自己を速やかに排除する点で重要である。しかし同時に、適応免疫系を活性化し、より特異性の高い免疫応答を惹起することもまた自然免疫の重要な役割である。【０１８５】
そこで、まず、インビボにおける自然免疫応答、及びこれにより活性化される適応免疫応答は、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）によって抑制され得るか否かをＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を指標に検討した。さらに、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）による適応免疫系の抑制に加え、上記の結果から示された、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）には免疫原性がないことに着眼し、実験的自己免疫性脳脊髄炎（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ；ＥＡＥ）や敗血症などの病態モデルにおいてＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）が与える影響について検討した。【０１８６】
（ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）による抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化抑制）
（実施例５７）
自然免疫系の活性化は適応免疫系の活性化と密接に関連している。抗原とアジュバントを投与することで抗原に特異的な適応免疫系が活性化されることは良く知られており、アジュバントが自然免疫系を活性化し、樹状細胞等において共刺激分子を発現させ、成熟化を促すことでＴ細胞への抗原提示を促進していると考えられている。核酸と抗原の投与によって抗原特異的な適応免疫系が惹起されることは多数報告されており、ここでは適応免疫系の活性化をＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）が抑制できるか否か、核酸としてＢ−ＤＮＡを用い、抗原として卵白アルブミンタンパク質（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ；ＯＶＡ）を投与した際に誘導されるＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を指標に検討を行った。マウスをＯＶＡとＢ−ＤＮＡで免疫する際、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）を投与する群と投与しない群を用意した。免疫後８日目に脾細胞を調製し、ＯＶＡ特異的ＭＨＣクラスＩテトラマーを用いてＯＶＡに特異的に反応するＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーにて検出した。図６０に示すように、ＯＶＡのみでマウスを感作させた場合（０．９７％）と比較し、Ｂ−ＤＮＡと一緒にＯＶＡで免疫した場合ではＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（１２．６％）は有意に増強していた。このとき、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）を投与したマウスではこの割合（２．４１％）は著明に減弱していた。すなわち、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）は核酸による適応免疫系の活性化を抑制できることが示された。【０１８７】
より詳細には、（Ａ）ＯＶＡのみ（Ｂ−ＤＮＡ（−））、（Ｂ）ＯＶＡとＢ−ＤＮＡ（Ｂ−ＤＮＡ（＋））、又は（Ｃ）ＯＶＡとＢ−ＤＮＡに更にＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）を加えたもの（Ｂ−ＤＮＡ（＋）・ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）（＋））をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに腹腔内投与した。８日後の脾臓におけるＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を、ＭＨＣクラスＩテトラマーを用いて、フローサイトメトリーにより解析した。図６０に、ＣＤ８＋Ｔ細胞についてゲートをかけた細胞を表示している。また、ＣＤ４４陽性且つＭＨＣテトラマー陽性の分画を赤枠で囲んでいる。表記の数字はＣＤ８＋Ｔ細胞にゲートをかけた細胞集団におけるＣＤ４４陽性且つＭＨＣテトラマー陽性分画の割合を示す。【０１８８】
（ＥＡＥ病態におけるＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の評価）
（実施例５８）
ＥＡＥはヒトの多発性硬化症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＭＳ）の動物モデルのひとつである。ＭＳは中枢神経系における自己免疫性の脱ミエリン炎症疾患であり、マウスのＥＡＥでは、ミエリン由来のペプチド（ＭＯＧペプチド３５−５５、Ｏｐｅｒｏｎ、以下「ＭＯＧペプチド」という。）をフロイント完全アジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ；ＣＦＡ）とともに正常マウスに投与し、免疫することで発症させることができる。ＭＳとＥＡＥに共通する病理的所見は、中枢神経系へのＢ細胞、Ｔ細胞、マクロファージの浸潤とその結果生じる神経障害であり、その病態の増悪には核酸が関与しているという報告もある。【０１８９】
そこで、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）を投与することによってＥＡＥの病態を軽減できるのではないかと考え、実験を行った。ＥＡＥでは、尾や四肢の麻痺といった神経障害の重症度をスコア化することで、自己免疫性炎症の進行を評価できる。ＥＡＥの病態スコアは、表１の基準に基づいて判定した。ＭＯＧペプチドとＣＦＡとをマウス後背部に皮下注射し、免疫した。注射１週間後から２日おきに３回、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）（ｎ＝４）又はコントロールとしてＰＢＳを投与（ｎ＝４）し、その後の病態の評価を行った。結果を図６１に示す。ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）投与群では、対照群と比較しＥＡＥの病態が顕著に軽減されていた。すなわち、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）はＥＡＥの病態を軽減できることが示された。【０１９０】
より詳細には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの後背部へのＭＯＧペプチド及びＣＦＡの投与後１週間後から２日おきに３回、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）（ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）（＋）、ｎ＝４）又は対照としてＰＢＳ（ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）（−）、ｎ＝４）を尾静脈注射により投与した。図６１に、ＭＯＧペプチドの投与からの日数を横軸として、各群の病態スコアの経過を平均値と標準偏差で示した。「＊」はＰ＜０．０５で、「＊＊」はＰ＜０．０１で、「＊＊＊」はＰ＜０．００１でＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）（＋）とＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）（−）との値に有意差があることを示す。【０１９１】
【表１】
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【０１９２】
（壊死細胞による免疫系活性化に対するＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の抑制効果）
（実施例５９）
次に、壊死細胞によって惹起される免疫系の活性化（死細胞による過剰な免疫応答）をＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）が抑制できるかどうかについて検討した。マウスマクロファージ系細胞株であるＪ７７４．１細胞を繰り返し凍結融解することで壊死を誘導し、この壊死細胞をＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の存在下、非存在下で脾細胞と混合して、炎症性サイトカインであるＩＬ−６及びＴＮＦ−αの産生をＥＬＩＳＡにて検討した。図６２に示すように、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）で前処理した脾細胞では、前処理のＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の濃度の上昇に依存してＩＬ−６及びＴＮＦ−αの産生量が減弱する結果が得られた。これらの結果は、ターゲットの脾細胞での応答を抑制しているのか、又は壊死細胞によって放出される炎症性メディエーターを直接阻害しているのか不明ではあるが、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）が壊死細胞によって惹起される免疫系活性化を抑制できることを示しているものと考えられた。【０１９３】
図６２において、Ｊ７７４．１細胞に壊死を誘導させ、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の存在下、非存在下で脾細胞と混合し、２４時間後の培養上清中の（Ａ）ＩＬ−６及び（Ｂ）ＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡにて定量した結果を示す。【０１９４】
（考察）
（免疫応答抑制ＯＤＮの探索とＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の作用点の解析）
ＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）はＣＧモチーフを１箇所もち、このＣＧがＴＬＲ９に認識されることで細胞内の免疫応答が惹起される。よって、ＴＬＲ９の発現が低いＭＥＦにおいてはＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）は免疫応答を惹起しないものの、ＴＬＲ９を発現するｐＤＣやマクロファージも存在する生体内においては、免疫応答抑制効果のみを期待することは困難である。したがって、ＴＬＲ９による認識を免れることを目的として、ＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）の配列中のＣＧをＧＣに置き換えたＣｐＧ−Ｒｅｖ（Ｓ）、ＧＧに置き換えたＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）を合成し、これらがＭＥＦにおいてＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）と同様のＩ型ＩＦＮ産生抑制効果を持つことを確認した。また同じくＣＧモチーフをもつＣｐＧ  ＯＤＮ  １０１８（Ｓ）に対し、ＣＧをＧＧ及びＡＧで置き換えたＯＤＮ  １０１９（Ｓ）を合成し、同様に検討したところ、ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０１８（Ｓ）、ＯＤＮ  １０１９（Ｓ）の両者ともにＭＥＦにおいてＩ型ＩＦＮ産生抑制を示した。【０１９５】
続いて行った各種ＯＤＮによるＢ−ＤＮＡ取込み阻害の検討において、ＣｐＧ−Ｒｅｖ（Ｓ）及びＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）と、ＯＤＮ  １０１９（Ｓ）とでは大きな違いが見られた。ＣｐＧ−Ｒｅｖ（Ｓ）及びＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）ではＢ−ＤＮＡの取り込みに影響を与えなかったものの、ＯＤＮ  １０１９（Ｓ）による前処理を行ったＭＥＦでは細胞内に取込まれたＢ−ＤＮＡが少なかったことから、ＯＤＮ  １０１９（Ｓ）はＢ−ＤＮＡの細胞内への取り込みを阻害していると考えられた。取り込み阻害機構の詳細は不明であるが、ＯＤＮの全体配列やこれに起因するＯＤＮの立体構造が何らかの影響を与えていると考えられる。取り込み阻害による免疫系抑制効果は本研究の焦点とするものではないため、ＯＤＮ  １０１９（Ｓ）を用いたその後の検討は行なわず、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）に焦点をあて、解析を進めた。【０１９６】
ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）はどのようにして核酸刺激に対する応答を阻害しているのか、阻害の作用点はどこかについて検討した。ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）はＨＭＧＢタンパク質と強く結合し、その機能を阻害することで、核酸に対する免疫応答を抑制しているのではないかと考えた。まずインビトロプルダウンアッセイによる解析から、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）はＨＭＧＢ１と強く結合することが示された。さらに、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）がＨＭＧＢタンパク質の機能を阻害することで核酸刺激による応答を抑制しているとする仮説は、本研究で得られた以下の４つの結果によって支持される。【０１９７】
（ｉ）細胞内核酸刺激によって活性化される主要な転写因子、シグナル伝達分子である、ＩＲＦ３、ＮＦ−κＢ及びＭＡＰキナーゼのいずれも、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）での前処理によって活性化が顕著に抑制されていた。このことから、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）がこれらの転写因子やシグナル伝達分子の活性化経路の上流で作用していることが示唆される。また、Ｂ−ＤＮＡ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）のどちらの刺激によるシグナル経路活性化もＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）によって抑制されたことから、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）は細胞内のＤＮＡ及びＲＮＡの両者の認識機構に共通するしくみを標的としていると考えられる。【０１９８】
（ｉｉ）ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）による抑制作用は、Ｔｌｒ９遺伝子欠損ｃＤＣにおいても観察された。すなわち、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）による抑制の作用点はＴＬＲ９のシグナル伝達系よりさらに上流であることが示唆される。ＴＬＲ９のシグナル経路の活性化にもＨＭＧＢ１が必要であるという報告と併せて考えると、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）はＴＬＲ９より上流においてＨＭＧＢ１を阻害しているものと考えられた。【０１９９】
（ｉｉｉ）ｐＤＣにおいて、ＴＬＲ７、９のどちらの刺激によるＩ型ＩＦＮ誘導もＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）によって抑制された。このことから、上述の（ｉ）、（ｉｉ）と併せて、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）は細胞内核酸認識機構のみならずＴＬＲによる核酸認識にも共通するしくみを標的としていると考えられる。これは、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）がＨＭＧＢ１を阻害しているとする仮説を支持するものと考えられる。【０２００】
（ｉｖ）ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）のＨＭＧＢ１に対する結合は、塩基部分をもたずホスホロチオエート骨格のみからなるＰＳのそれと比較し、非常に強いことが明らかとなった。ＰＳもＨＭＧＢ１と結合はするものの結合親和性は低く、また同時に核酸刺激に対する免疫応答の抑制作用も、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）と比較して非常に弱いことが判明した。このことは、ＯＤＮとＨＭＧＢ１との結合の強さがＯＤＮの免疫応答の抑制作用の強さと相関していることを示唆しており、ＯＤＮがＨＭＧＢ１を阻害することによってこの抑制作用がもたらされるという仮説を支持しているものと考えられる。【０２０１】
ＨＭＧＢタンパク質に強く結合するための核酸の要因として、以下の３つの要素が必要であると考えられる。【０２０２】
（ｉ）ホスホロチオエート結合骨格を有するオリゴＤＮＡは、通常のホスホジエステル結合骨格のオリゴＤＮＡよりも、ＨＭＧＢ１との結合が強い。【０２０３】
（ｉｉ）塩基部位が存在するＯＤＮの方が、塩基をもたない骨格のみのものより、ＨＭＧＢ１との結合が強い。このとき、結合親和性は塩基配列には依存しないと考えられる。実際、塩基部位が全てアデニンもしくはチミンであり且つホスホロチオエート骨格をもつＯＤＮを前処理に用いた場合においても、核酸刺激による免疫応答は抑制されるという知見を得ている。ただし、ＣｐＧ−Ｂ（Ｓ）のようにオリゴＤＮＡ内にＣＧモチーフをもつことでＴＬＲ９に認識されてしまい、免疫応答を活性化してしまう可能性も考えられる。なお、ＣＧモチーフを有しないＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）には免疫系活性化能は認められなかった。【０２０４】
（ｉｉｉ）ＯＤＮによる抑制作用には１５ｍｅｒ以上の鎖長が必要である。上記のホスホロチオエート骨格、及びアデニンもしくはチミンのみから成る塩基部位を有する、鎖長５ｍｅｒ、１０ｍｅｒ、１５ｍｅｒ又は２０ｍｅｒのＯＤＮを用いて抑制作用を検討したところ、２０ｍｅｒのものでは抑制効果が見られたが、それ以下の鎖長ではほとんど抑制が認められなかった。これらの知見から、オリゴＤＮＡとＨＭＧＢタンパク質との結合、及び免疫応答の抑制作用には、ホスホロチオエート骨格を有し、２０ｍｅｒ程度の鎖長で且つ塩基部位を有することが重要であると推察される。これらの特徴を明らかにしたことは、ＨＭＧＢタンパク質を標的とした抑制剤を考える上で有用な情報であると期待される。【０２０５】
次に、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）には免疫系活性化能はないことに着眼し、核酸が関与するような病態を軽減する抑制剤として、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）を用いることについて検討した。ＯＶＡを抗原としてＢ−ＤＮＡと一緒にマウスに免疫した際のＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化はＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の投与によって顕著に抑制されていることが明らかとなった。すなわち、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）は自然免疫系の活性化を抑制するのみならず、インビボにおいて適応免疫系をも抑制できることが判明した。抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化に関しては、ＣＤ４０とＴＬＲの刺激が相乗的に働くことが報告されており、このときのＴＬＲの刺激はＩ型ＩＦＮの誘導を行う要因として考えられている。したがって、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）投与によって観察されたＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化の抑制は、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）が樹状細胞等において自然免疫系の活性化を阻害されることで、引き続いて誘導される適応免疫系をも抑制されるものと考えられる。しかし、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）が直接ＣＤ８＋Ｔ細胞に感作する可能性等、その他の影響も厳密には否定できない。【０２０６】
ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）は自然免疫系のみならず適応免疫系をも抑制できるという観点から、自己免疫疾患のモデルの１つであるＥＡＥ病態モデルにおいて、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の評価を行った。その結果、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の投与によってＥＡＥの病態が劇的に改善できることが判明した。今回の解析で用いたプロトコルでは、ＭＯＧペプチドをＣＦＡと混合して正常マウスに投与した。よって、ＭＯＧペプチド特異的ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化が誘導される。しかし、ＥＡＥの病態には、Ｔ細胞応答に留まらず、様々な因子がその増悪に寄与していることが報告されており、ＴＬＲ９を介したシグナルの関与も指摘されている。ＥＡＥの病態の軽減は、こうした核酸認識受容体シグナルをＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）が抑制している可能性も考えられた。【０２０７】
（ＨＭＧＢ１の炎症性サイトカインとしての役割とＣｐＧ−Ｍ（Ｓ））
ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）を抗ＨＭＧＢ１抗体のように個体に投与することによってＨＭＧＢ１の炎症性サイトカイン機能を阻害し、敗血症の病態を抑制できる可能性を検討した。マウスへのＬＰＳ投与による敗血症モデルにおいて評価した結果、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）を予め投与しておくことによって、生存率が顕著に改善することが明らかとなった。ＭＥＦやＲＡＷ２６４．７などの細胞において、ＬＰＳ刺激によるサイトカインの産生自体はＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）は抑制しないという知見が得られており、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）は細胞へのＬＰＳ刺激そのものを抑制しているものではないことが示唆される。【０２０８】
ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の作用点の可能性として、ＬＰＳ投与によって血中に放出されたＨＭＧＢ１とＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）が会合し、ＨＭＧＢ１の炎症性メディエーターとしての機能を阻害していることが考えられる。或いは、ＬＰＳ投与によって肝細胞が壊死を起こすことが知られていることから、壊死などによって放出された核酸が惹起する免疫応答を、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）が抑制していることも考えられる。【０２０９】
そこで、Ｊ７７４．１細胞に壊死を生じさせ、脾細胞と混合したところ、ＯＤＮを投与しない場合には脾細胞において産生されるＩＬ−６やＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインが、ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）の投与によって抑制されていた。調製した壊死細胞溶液には、細胞から流出したＨＭＧＢ１と壊死細胞由来の核酸の両者に加え、それらの複合体も含まれていると考えられることから、この結果は、現段階では上記の２つのいずれの仮説にも矛盾しない。炎症性メディエーターとしてのＨＭＧＢ１をＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）が結合することで阻害しているのか、壊死細胞による免疫系活性化を抑制しているのか、その両者の可能性があるのか、さらには核酸の関与の有無などを明らかすることで、今後ＣｐＧ−Ｍ（Ｓ）を生体に投与することも視野に入れることができると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０２１０】
本発明により、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化、すなわち、抗原特異的な適応免疫系、多発性硬化症、死細胞による過剰な免疫応答、移植臓器拒絶反応、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、アレルギー、敗血症、炎症による腫瘍の増殖、核酸含有病原体により引き起こされる炎症性疾患等の新たな原理に基づいた抑制剤が提供される。また、ＨＭＧＢタンパクによって仲介される免疫応答の活性化の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法が提供される。
【符号の説明】
【０２１１】
１…ＨＭＧＢタンパク、２…陽性対照物質、３…被検物質、４…ビオチン標識Ｂ−ＤＮＡ、５…抗ビオチン抗体、６…基質。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４６】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６１】
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【図６２】
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【図５】
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【図６】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２８】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４５】
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【図４７】
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【図５１】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図６０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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