(57)【要約】  心臓型アデニル酸シクラーゼを阻害できる新規化合物を提供する。下記の式(I)で表される化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物。【化１】2012056976.tif 000012（式中、R1、R2及びR3は、それぞれ、独立に、水素原子又は酸性若しくは塩基性置換基を有するアシル基であるが、但し、R1、R2及びR3のすべてが水素原子であることはない）上記化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物を含むアデニル酸シクラーゼ活性調節剤、医薬組成物及び食品組成物も提供される。
2012056976.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式(I)で表される化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物。
【化１】
2012056976.tif 000010
（式中、R1、R2及びR3は、それぞれ、独立に、水素原子又は酸性若しくは塩基性置換基を有するアシル基であるが、但し、R1、R2及びR3のすべてが水素原子であることはない）
【請求項２】
酸性若しくは塩基性置換基を有するアシル基が、
次式：Ｂ−（ＣＨ2）n−ＣＯ−
（式中、ｎは１〜４の整数であり、Bは酸性若しくは塩基性置換基である。）
で表される基である請求項１記載の化合物。
【請求項３】
酸性若しくは塩基性置換基が、アルキル基で置換されていてもよいアミノ基、カルボキシル基又はヒドロキシカルバモイル基である請求項１又は２記載の化合物。
【請求項４】
下記のいずれかの式で表される請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【化２】
2012056976.tif 000011
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物を含むアデニル酸シクラーゼ活性調節剤。
【請求項６】
アデニル酸シクラーゼが心臓型アデニル酸シクラーゼである請求項５記載の薬剤。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物を含む医薬組成物。
【請求項８】
ベータ遮断剤の適応症の予防及び/又は治療に用いられる請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
ベータ遮断剤の適応症が、心不全、心筋梗塞、不整脈、狭心症、高血圧症及びそれらに関連する病態および疾患から成る群より選択される請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物を含む食品組成物。
【請求項１１】
アンチエイジングおよび長寿、それに関連する疾患および病態の予防又は健康維持のために用いられる請求項１０記載の食品組成物。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物の医薬的に有効な量を被験者に投与することを含む、ベータ遮断剤の適応症を予防及び/又は治療する方法。
【請求項１３】
ベータ遮断剤の適応症の予防及び/又は治療のための請求項１〜４のいずれかに記載の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物の使用。
【請求項１４】
ベータ遮断剤の適応症を予防及び/又は治療する方法に使用するための請求項１〜４のいずれかに記載の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物の有効量を被験者に投与することを含む、アンチエイジングおよび長寿、それに関連する疾患および病態の予防又は健康維持方法。
【請求項１６】
アンチエイジングおよび長寿、それに関連する疾患および病態の予防又は健康維持のための請求項１〜４のいずれかに記載の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物の使用。
【請求項１７】
アンチエイジングおよび長寿、それに関連する疾患および病態の予防又は健康維持方法に使用するための請求項１〜４のいずれかに記載の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アデニル酸シクラーゼの活性調節剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
心不全は世界的に主要な死亡原因であり、わが国でも3大死因の一つに挙げられる。心不全患者において慢性的に亢進した交感神経系を抑制することが、心不全治療の世界標準指針であり、レニンアンジオテンシン系阻害剤およびベータアドレナリン受容体遮断薬（ベータ遮断薬）が主たる治療薬として使用されている。しかしながらベータ遮断剤による一過性の心機能抑制は、特に高齢者にとって、治療の導入に当たっての大きな妨げとなる。一方、ベータ遮断薬には呼吸器の抑制作用もあり、肺気腫などの合併症の多い高齢者では大きな問題となっている。ベータアドレナリン受容体は、細胞膜に存在するアデニル酸シクラーゼ酵素を活性化して細胞内サイクリックAMP（cAMP）濃度を上昇させることで心機能を調節している。すなわち、上記のベータ遮断薬は、アデニル酸シクラーゼ酵素の活性およびその下流のcAMPシグナルを抑制することでその薬理効果を発揮する。一方、肺気管支にもベータアドレナリン受容体が発現しているため、ベータ遮断薬によって気管支筋の収縮がおこり呼吸機能の異常を誘発する。【０００３】
このようなベータ遮断薬による呼吸器系への副作用は、ベータアドレナリン受容体には3種類のサブタイプしかなく、発現の臓器特異性が比較的低いことがその原因として挙げられる。一方、アデニル酸シクラーゼは9つのサブタイプが知られており、心臓型と呼ばれるサブタイプは心臓特異的に発現し、肺にはほとんど発現が認められない。またベータ遮断薬はVaughan Williams分類II群薬として分類され抗不整脈作用が存在することも古くから知られている。したがって、心臓型のアデニル酸シクラーゼを選択的に抑制することで、呼吸器への副作用なくベータ遮断薬と同様の心不全ならびに不整脈への治療効果が期待できる。【０００４】
心臓型アデニル酸シクラーゼを標的にした薬剤はすでに臨床応用されているものがある（非特許文献１）。心臓型アデニル酸シクラーゼの阻害薬としていくつかの化合物がすでに報告されているが（非特許文献２及び３）、臨床応用は始まっておらず、新規化合物も報告されていない。同阻害剤は心不全薬として有用である可能性がこれまでの動物実験から強く示唆されている（非特許文献４〜７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Toya et al., J. Mol. Cell. Cardiol. 1998 Jan;30(1):97-108
【非特許文献２】J. Biol. Chem. 276; 47785-47793, 2001
【非特許文献３】J. Biol. Chem.  279; 40938-40945, 2004
【非特許文献４】Circ. Res.  93: 364-371, 2003
【非特許文献５】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100:9986-90,2003
【非特許文献６】Cell  130:247-58, 2007
【非特許文献７】Circulation  116:1776-83, 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、これまでに公表されていない新規化合物で、心臓型アデニル酸シクラーゼを阻害できるものを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、既知の心臓型アデニル酸シクラーゼ阻害剤であるビダラビン(vidarabine)から複数の誘導体を合成し、心臓型に対する抑制作用と、心不全予防効果を検討した。心不全予防効果に関しては、マウスモデルで実際に心不全を作製し、それに心臓型アデニル酸シクラーゼ阻害剤を投与した群における治療効果を比較検討した。その結果、心臓型アデニル酸シクラーゼを阻害する効果がある新規化合物を見出し、本発明を完成させるに至った。【０００８】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）下記の式(I)で表される化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物。【０００９】
【化１】
2012056976.tif 000003
（式中、R1、R2及びR3は、それぞれ、独立に、水素原子又は酸性若しくは塩基性置換基を有するアシル基であるが、但し、R1、R2及びR3のすべてが水素原子であることはない）
（２）酸性若しくは塩基性置換基を有するアシル基が、
次式：Ｂ−（ＣＨ2）n−ＣＯ−
（式中、ｎは１〜４の整数であり、Bは酸性若しくは塩基性置換基である。）
で表される基である（１）記載の化合物。
（３）酸性若しくは塩基性置換基が、アルキル基で置換されていてもよいアミノ基、カルボキシル基又はヒドロキシカルバモイル基である（１）又は（２）記載の化合物。
（４）下記のいずれかの式で表される（１）〜（３）のいずれかに記載の化合物。【００１０】
【化２】
2012056976.tif 000004
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物を含むアデニル酸シクラーゼ活性調節剤。
（６）アデニル酸シクラーゼが心臓型アデニル酸シクラーゼである（５）記載の薬剤。
（７）（１）〜（４）のいずれかに記載の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物を含む医薬組成物。
（８）ベータ遮断剤の適応症の予防及び/又は治療に用いられる（７）記載の医薬組成物。
（９）ベータ遮断剤の適応症が、心不全、心筋梗塞、不整脈、狭心症、高血圧症及びそれらに関連する病態および疾患から成る群より選択される（８）記載の医薬組成物。
（１０）（１）〜（４）のいずれかに記載の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物を含む食品組成物。
（１１）アンチエイジングおよび長寿、それに関連する疾患および病態の予防又は健康維持のために用いられる（１０）記載の食品組成物。
（１２）（１）〜（４）のいずれかに記載の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物の医薬的に有効な量を被験者に投与することを含む、ベータ遮断剤の適応症を予防及び/又は治療する方法。
（１３）ベータ遮断剤の適応症の予防及び/又は治療のための（１）〜（４）のいずれかに記載の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物の使用。
（１４）ベータ遮断剤の適応症を予防及び/又は治療する方法に使用するための（１）〜（４）のいずれかに記載の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物。
（１５）（１）〜（４）のいずれかに記載の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物の有効量を被験者に投与することを含む、アンチエイジングおよび長寿、それに関連する疾患および病態の予防又は健康維持方法。
（１６）アンチエイジングおよび長寿、それに関連する疾患および病態の予防又は健康維持のための（１）〜（４）のいずれかに記載の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物の使用。
（１７）アンチエイジングおよび長寿、それに関連する疾患および病態の予防又は健康維持方法に使用するための（１）〜（４）のいずれかに記載の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物。【００１１】
ビダラビンは心臓型アデニル酸シクラーゼに対する阻害効果を持つが、水溶性が少ないため、体内分布として中枢組織への移行が多い。そのため中枢に対する副作用をしめす。本発明の新規化合物は水溶性がきわめて高いため、中枢への移行が極めて少なく、心臓に対する治療効果が高く得られると考えられる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の新規化合物は、心臓型アデニル酸シクラーゼの活性阻害剤として有効である。本発明の新規化合物は、例えば、心不全、心筋梗塞、不整脈の治療薬として利用することができる。【００１３】
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2010‐240301の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】新規化合物、ビダラビン誘導体の化学構造式。
【図２】マウス線条体のアデニル酸シクラーゼ活性に対する各種化合物の抑制効果。線条体は脳の一部であり、5型アデニル酸シクラーゼが酵素活性のほぼすべてを占めることがしられている。このため5型アデニル酸シクラーゼ活性を試験するには心臓以上に選択性が高いとされている。50 μMのフォルスコリン存在下かつ阻害剤非存在下でのアデニル酸シクラーゼ活性を100とした相対値を示す（n=4、means±S.E.）。
【図３】線条体、心臓、および肺のアデニル酸シクラーゼ活性に対する各種ビダラビン誘導体の抑制効果。50 μMのフォルスコリン存在下かつ阻害剤非存在下でのアデニル酸シクラーゼ活性を100とし、各種阻害剤を図の横軸に示す濃度で処理した際に減少したアデニル酸シクラーゼ活性を示した。（n=4、means±S.E.）。
【図４】野生型（ＷＴ）および５型アデニル酸シクラーゼノックアウト（AC5KO）マウスの各組織におけるアデニル酸シクラーゼ活性に対するビダラビン誘導体の抑制効果。50 μMのフォルスコリン存在下かつ阻害剤非存在下でのアデニル酸シクラーゼ活性を100とした相対値を示す（n=4、means±S.E.）。
【図５】各種ビダラビン誘導体のアデニル酸シクラーゼ活性抑制効果の組織選択性。各濃度における、線条体アデニル酸シクラーゼ活性に対する抑制効果を1とした時の相対値で示した（n=4,means±S.E.）。
【図６】ＡＣ５ＫＯマウスとＷＴマウスの心筋組織膜タンパク内のアデニル酸シクラーゼ活性に対する各種化合物の抑制効果。50 μMイソプロテレノール存在下かつ阻害剤非存在下でのアデニル酸シクラーゼ活性を100とした相対値を示す（n=8、means±S.E.）
【図７】フォルスコリン刺激による H9c2 細胞中での cAMP 蓄積に与える各ビダラビン誘導体の効果。100 μMのフォルスコリン存在下かつ阻害剤非存在下におけるH9c2細胞内cAMPレベルを100としたときの相対値を示す（n=1）。
【図８】フォルスコリン刺激 (5μM)による 成体ラット培養心筋細胞中での cAMP 蓄積に与える各ビダラビン誘導体の効果。 5μMのフォルスコリン存在下かつ阻害剤非存在下における成体ラット培養心筋細胞内cAMPレベルを100としたときの相対値を示す（n=4,  means±S.E.）
【図９】心不全の予防効果。野生型マウス(C57BL/6N)にオスモティックミニポンプ(Alzet2001)をもちいてイソプロテレノール(60mg/kg/day  ７日間)のみを１週間投与したマウス(ISO)、イソプロテレノールと同時にビダラビン、V2E、V3E、V5Eをそれぞれ投与した(15mg/kg/day ７日間)。その結果イソプロテレノールのみを投与したマウスでは、投与前に比較して心機能(LVEF:心拍出量)の低下がみられたが、ビダラビンを同時に併用投与したマウスでは心機能低下が有意に抑制された。またビダラビンと同等の心機能抑制効果がV2E、V3E、V5Eを併用投与したマウスでも確認された(n=3-8, means+SE, *P<0.05)。
【図１０】心筋細胞のTUNEL。ラット胎児培養心筋細胞の培養液にイソプロテレノール(10-5M)、イソプロテレノールと同時にビダラビン、V2E、V3E、V5Eをそれぞれ併用刺激（48時間）した後細胞のアポトーシス陽性細胞をTUNEL染色で評価した。V2E, V3E, V5Eはビダラビンと同等のイソプロテレノール刺激によるアポトーシス抑制効果を示した(n=4-7, means+SE, *P<0.05)。
【図１１】毒性試験。ビダラビン、V2E、V3E，V5Eをオスモティックミニポンプを用いて投与(15mg/kg/day  ７日間)後に採血を行い、BUN, Creatinine, GPT,GOTを測定してコントロール群と比較した。コントロール群に比較して有意なBUN, Creatinine, GPT,GOT の上昇は見られなかった(n=4-8, means+SE)。
【図１２】心筋組織のTUNEL。慢性カテコラミン負荷マウス（図9）で用いたマウスの心臓のアポトーシス陽性心筋細胞をTUNEL染色で評価した(n=4-6, means+SE)。
【図１３】中枢神経系に及ぼす影響。ストレキニーネ痙攣に対して抑制作用を示すことが報告されている薬剤の作用部位は中枢であり、ビダラビンも中枢移行性を示しストレキニーネ痙攣に対して抑制作用を示す(医薬品研究 18, 561-576, 1982)。そこでビダラビン、V2E、V3E、およびV5Eの中枢移行性を、ストリキニーネ投与によりマウス(C57BL6/N)に惹起される強直伸展性痙攣および死亡に対する拮抗作用により評価した。生理食塩水に溶解したストリキニーネ硝酸塩をマウス（C57BL/6N：日本エスエルシー，雄，10-12週齢）の頚背部皮下に1.5 mg/kgとなるように投与し、強直伸展性痙攣を起こし死亡に至るまでの時間を計測し、中枢移行に対する影響を間接的に評価した。ビダラビン、V2E、V3E、およびV5Eは生理食塩水に溶解または懸濁させ、ストリキニーネ投与の15分前に腹腔内に投与した (n=4-10, means+SE）（図13）。なお死亡は胸郭呼吸運動の停止で判断した。
【図１４】抗不整脈（心房細動抑制）作用。オスモティックミニポンプ(Alzet 2001)を用いて正常野生型マウス(C57BL/6N)にDMSOに溶解したビダラビン（15mg/kg/day)、V2E、V3E、およびV5E（19.8 mg/kg/day）、またはDMSOのみを投与し、2.5 mAの電圧刺激を経食道カテーテルを用いて、30 msec間隔で60秒間加える（心房頻回刺激：Circ Res 97, 62-69, 2005)）ことで誘発される一過性心房細動が正常洞リズムに戻るまでの心房細動持続時間を測定した (n=4-8，means±SE)。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
本発明は、下記の式(I)で表される化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物を提供する。
【００１６】
【化３】
2012056976.tif 000005
（式中、R1、R2及びR3は、それぞれ、独立に、水素原子又は酸性若しくは塩基性置換基を有するアシル基であるが、但し、R1、R2及びR3のすべてが水素原子であることはない）
本発明の化合物には立体異性体が存在しうるが、本発明はこれらの異性体すべてを包含する。例えば、光学活性体、ジアステレオマー、ラセミ体などはすべて本発明に含まれる。
【００１７】
本発明の化合物において、酸性若しくは塩基性置換基を有するアシル基は、
次式：Ｂ−（ＣＨ2）n−ＣＯ−
（式中、ｎは１〜４の整数であり、Bは酸性若しくは塩基性置換基である。）
で表される基であるとよい。
【００１８】
Ｂの酸性若しくは塩基性置換基は、アルキル基で置換されていてもよいアミノ基、カルボキシル基又はヒドロキシカルバモイル基であるとよい。アミノ基に置換されるアルキル基は、炭素数１から４個の直鎖状または分枝状のアルキル基、より好ましくは、メチル基、エチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基、ノルマルブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、tert−ブチル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００１９】
本発明の化合物としては、下記のいずれかの式で表される化合物を例示することができる。
【００２０】
【化４】
2012056976.tif 000006
本発明の化合物は、以下の反応スキームに従って、製造することができる。
【００２１】
文献（O'Mahony, G.; Sundgren, A.; Svensson, S.; Grotli, M. Tetrahedron 2007, 63, 6901-6908.）に記載の方法に従いビダラビン（II）からジシロキサニリデン保護した化合物（III）を合成した。化合物（III）とＮ，Ｎ−ジメチルグリシンに脱水縮合剤（ＤＣＣ）を作用させることにより良好な収率でエステル化体（V）が得られる。最後にテトラブチルアンモニウムフルオリドを作用させて、ジシロキサニリデン基を脱保護することにより目的の２位置換体（Ia）が得られる。また、化合物（III）と無水コハク酸を作用させることによりエステル化体（V）が得られる。このエステル化体（V）を１−プロピルりん酸環状無水物で活性化し、ヒドロキシルアミン塩酸塩を作用させることによりヒドロキサム酸（VI）が合成できる。最後にそれぞれにテトラブチルアンモニウムフルオリドを作用させて、ジシロキサニリデン基を脱保護することにより目的の２位置換体（Ib）、（Ic）がそれぞれ得られる。Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンの代わりに他の酸性又は塩基性基を有するカルボン酸を、無水コハク酸の代わりに他の無水カルボン酸を用いてもよい。
【００２２】
【化５】
2012056976.tif 000007
文献（Shen, W.; Kim, J.-S.; Kish, P. E.; Zhang, J.; Mitchell, S.; Gentry, B. G.; Breitenbach, J. M.; Drach, J. C.; Hilfinger, J. Bio. Med. Chem. Lett. 2009, 19, 792-796.）に記載の方法を参考にビダラビン（II）からシリル保護した化合物（VII）を合成した。化合物（VII）とＮ，Ｎ−ジメチルグリシンに脱水縮合剤（ＤＣＣ）を作用させることにより良好な収率でエステル化体（VIII）が得られる。最後にテトラブチルアンモニウムフルオリドを作用させて、シリル基を脱保護することにより目的の３位置換体（Id）が得られる。また、化合物（VII）と無水コハク酸を作用させることにより良好な収率でエステル化体（IX）が得られる。このエステル化体（IX）を１−プロピルりん酸環状無水物で活性化し、ヒドロキシルアミン塩酸塩を作用させることによりヒドロキサム酸（X）が合成できる。最後にそれぞれにテトラブチルアンモニウムフルオリドを作用させて、シリル基を脱保護することにより目的の３位置換体（Ie）、（If）がそれぞれ得られる。Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンの代わりに他の酸性又は塩基性基を有するカルボン酸を、無水コハク酸の代わりに他の無水カルボン酸を用いてもよい。
【００２３】
【化６】
2012056976.tif 000008
文献（Shen, W.; Kim, J.-S.; Kish, P. E.; Zhang, J.; Mitchell, S.; Gentry, B. G.; Breitenbach, J. M.; Drach, J. C.; Hilfinger, J. Bio. Med. Chem. Lett. 2009, 19, 792-796.）に記載の方法を参考にビダラビン（II）からジエステル化合物（XIII）を合成した。化合物（XIII）とＮ，Ｎ−ジメチルグリシンに脱水縮合剤（ＤＣＣ）を作用させることにより良好な収率でトリエステル化体（XIV）が得られる。最後にヒドラジン水和物を作用させて、脱保護することにより目的の５位置換体（Ig）が得られる。また、化合物（XIII）と無水コハク酸を作用させることにより良好な収率でエステル化体（XV）が得られる。このエステル化体（XV）を１−プロピルりん酸環状無水物で活性化し、ヒドロキシルアミン塩酸塩を作用させることによりヒドロキサム酸（XVI）が合成できる。最後にそれぞれにヒドラジン水和物を作用させて、脱保護することにより目的の５位置換体（Ih）、（Ii）がそれぞれ得られる。Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンの代わりに他の酸性又は塩基性基を有するカルボン酸を、無水コハク酸の代わりに他の無水カルボン酸を用いてもよい。
【００２４】
【化７】
2012056976.tif 000009
【００２５】
本発明の化合物の医薬的に許容される塩としては、ナトリウムリン酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩、硫酸塩などの塩を例示することができるが、これらに限定されない。  本発明の化合物の医薬的に許容されるエステルとしては、エチレングリコールエステル、ジエチレングリコールエステル、トリエチレングリコールエステル、ポリエチレングリコールエステル、リン酸エステルなどのエステルを例示することができるが、これらに限定されない。
【００２６】
本発明の化合物の医薬的に許容される溶媒和物としては、水、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、酢酸エチルなどとの溶媒和物を例示することができるが、これらに限定されない。
【００２７】
本発明の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル及び溶媒和物は、アデニル酸シクラーゼ活性調節剤として利用することができる。
【００２８】
また、本発明の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル及び溶媒和物は、ベータ遮断剤の適応症（例えば、心不全、心筋梗塞、不整脈、狭心症、高血圧症、それらに関連する病態および疾患（例えば、振戦、乗り物酔い、時差ボケ、睡眠障害、バセドウ病、食道胃静脈瘤、偏頭痛、パーキンソン病など）の予防及び/または治療に用いることができる(Cardiac Practice 20, 69-73, 2009)。
【００２９】
心不全及び/又は心筋梗塞に関連する病態および疾患としては、不整脈、浮腫、息切れ、狭心症などを例示することができるが、これらに限定されない。
【００３０】
従って、本発明は、上記の式(I)で表される化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物を含むアデニル酸シクラーゼ活性調節剤を提供する。本発明の薬剤は、心臓型アデニル酸シクラーゼに対して特に効果的である。
【００３１】
また、本発明は、上記の式(I)で表される化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物を含む医薬組成物を提供する。
【００３２】
本発明の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物が医薬として用いられる場合には、常法により製剤化した医薬製剤（例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤など）として、ヒト又は動物などの被験者に投与することができる。例えば、有効成分の量に換算して、１日あたり約10〜50 mg/kg（体重）、好ましくは１日あたり約10〜15 mg/kg（体重）の投与量で、１回または数回に分けて経口又は非経口投与するとよいが、その投与量や投与回数は、症状、年齢、投与方法などにより適宜変更しうる。注射剤に製剤化する場合には、蒸留水、生理食塩水などの担体を用いるとよく、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤に製剤化する場合には、デンプン、乳糖、白糖、炭酸カルシウムなどの賦形剤、デンプンのり液、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの結合剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤など、デンプン、寒天、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤などを用いるとよい。製剤中の有効成分の含有率は、１〜９９重量％の間で変動させることができる。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などの形態をとる場合には、有効成分を５〜８０重量％含有させるのが好ましく、注射剤の場合には、有効成分を１〜１０重量％含有させるのが好ましい。
【００３３】
本発明の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル及び溶媒和物は、アンチエイジングおよび長寿、それに関連する疾患および病態（例えば、骨粗しょう症、皮膚のシワなどの老化現象、酸化ストレス過多、臓器機能低下など）の予防又は健康維持のために用いることもできる。その場合、本発明の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル及び溶媒和物は、清涼飲料などの飲料、飴、ガム、パンなどの食品、粉末スープ、ふりかけなどの粉末製品等の飲食品に添加したり、適宜、賦形剤、香料、色素などとともに丸剤、顆粒、錠剤、カプセル剤などに成型して、健康食品あるいは栄養補助食品として供給することができる。従って、本発明は、本発明の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物を含む食品組成物を提供する。
【００３４】
食品組成物における本発明の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物の配合量は、有効成分を０．１〜５０重量％含有させるのが好ましい。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００３６】
〔実施例１〕
当教室の先行研究において、心臓型サブタイプの5型アデニル酸シクラーゼを欠損させた動物モデルが作製された（Circ. Res.  93: 364-371, 2003; Proc. Natl. Acad. Sci. USA.   100:9986-90,2003; Cell   130:247-58, 2007; Circulation  116:1776-83, 2007）。本動物モデルを解析したところ、カテコラミン刺激に対する応答は低下するが定常状態の心機能は低下しないこと、慢性圧負荷やカテコラミンストレスによる心機能低下を予防することが明らかとなった（Circ. Res.  93: 364-371, 2003; Proc. Natl. Acad. Sci. USA.   100:9986-90,2003; Circulation  116:1776-83, 2007）。これらのことは、5型サブタイプの選択的抑制は心機能を低下させずに心不全時に心臓保護的に働くことを示す。一方、長年抗ヘルペス剤として臨床で用いられてきた薬剤（ビダラビン）が5型サブタイプ選択的な抑制効果を示すことが明らかになり、心不全モデル実験でも当該薬剤による心筋保護的な作用が示された（J. Biol. Chem.  279; 40938-40945, 2004）。また、85万種類の薬剤を独自に開発したコンピュータモデルにて解析した結果、5型サブタイプ選択的な抑制剤が複数同定された。一方、5型サブタイプ欠損マウスの脳線条体組織では野生型マウスに比べてアデニル酸シクラーゼ活性が2割程度まで低下していた（J. Biol. Chem. 278:16936-16940, 2003）。すなわち、野生型線条体組織のアデニル酸シクラーゼ活性はその大部分が5型サブタイプによるものであることから、当該組織が5型サブタイプの活性を選択的に抑制する薬剤のスクリーニングに適していると考えられた。【００３７】
本研究では、アデニル酸シクラーゼ5型サブタイプ選択的な心不全治療薬を新たに開発することを最終的な目標としている。今回、ビダラビンをベースに高い親水性を付与した3種類の化合物を新規に合成し、以下に示す実験によりそれら化合物の5型サブタイプへの抑制効果を検討した。親水性をたかめることにより、中枢の一部（線条体）に発現する5型サブタイプに対する刺激性を抑えることができると考えられる。【００３８】
方法
＜ビダラビン誘導体＞
ビダラビンの２位、３位、５位にそれぞれジメチルアミノ酢酸基を導入した新規化合物を合成した(図1)。【００３９】
＜２−Ｏ−(N,N-ジメチルグリシル)ビダラビンの合成＞
東京化成工業製ビダラビンを文献（O'Mahony, G.; Sundgren, A.; Svensson, S.; Grotli, M.  Tetrahedron 2007, 63, 6901-6908.）の方法に従って、ヒドロキシ基をジシロキサニリデン保護し、化合物（III）を調製した。【００４０】
化合物（III）510 mg とＮ，Ｎ−ジメチルグリシン 113 mg をジクロロメタン 5 mL に溶解し、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）248 mg を加え、室温で６時間撹拌した。反応液に水を加え、ジクロロメタンを使って３回抽出操作を行い、抽出した有機層に硫酸ナトリウムを加えて乾燥した。ろ過をして、ろ液を濃縮し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール  19:1）にて精製し、化合物（IV）488 mg (８２％収率)を得た。この様にして得た化合物（IV）をテトラヒドロフラン 5 mL に溶解させ、テトラブチルアンモニウムフルオリド 1.8 mL (1 M テトラヒドロフラン溶液)を加え、１２時間室温で撹拌を行った。反応液を濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール  15:1）にて精製し、白色粉末として目的物（Ia）を 260 mg (９０％収率)で得た。【００４１】
１Ｈ ＮＭＲ (300 MHz, DMSO-d6)
δ8.24 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.29 (s, 2H), 6.45 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 5.84 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 5.32 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 5.12 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.46 (q, J = 5.8 Hz, 1H), 3.87-3.61 (m, 3H), 3.05 (d, J = 17.0 Hz, 1H), 2.53 (d, J = 17.2 Hz, 1H), 1.91 (s, 6H).【００４２】
＜３−Ｏ−(N,N-ジメチルグリシル)ビダラビンの合成＞
東京化成工業製ビダラビンを文献（Shen, W.; Kim, J.-S.; Kish, P. E.; Zhang, J.; Mitchell, S.; Gentry, B. G.; Breitenbach, J. M.; Drach, J. C.; Hilfinger, J. Bio. Med. Chem.   Lett. 2009, 19, 792-796.）の方法を参考に、二つのヒドロキシ基をシリル保護した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド 20 mL にビダラビン（II）2.0 g を撹拌懸濁させ、そこへＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン 0.114 g とトリエチルアミン 3.10 mL 加え、最後にtert−ブチルジメチルクロロシラン 2.26 g を加えた。室温で２４時間反応させた後、溶媒を減圧下留去し、残渣に酢酸エチルを加え、飽和塩化アンモニウム水溶液で洗浄し、続いて水と飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒を留去することにより化合物（VII）を得た。【００４３】
化合物（VII）496 mg とＮ，Ｎ−ジメチルグリシン 113 mg をジクロロメタン 5 mL に溶解し、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）248 mg を加え、室温で６時間撹拌した。反応液に水を加え、ジクロロメタンを使って３回抽出操作を行い、抽出した有機層に硫酸ナトリウムを加えて乾燥した。ろ過をして、ろ液を濃縮し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール  19:1）にて精製し、化合物（VIII）465 mg (８０％収率)を得た。この様にして得た化合物をテトラヒドロフラン 5 mL に溶解させ、テトラブチルアンモニウムフルオリド 1.8 mL (1 M テトラヒドロフラン溶液)を加え、１２時間室温で撹拌を行った。反応液を濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール  15:1）にて精製し、目的物（Id）を 259 mg(９２％収率)で得た。【００４４】
１Ｈ ＮＭＲ (300 MHz, DMSO-d6)
δ8.22 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.30 (s, 2H), 6.27 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 6.07 (s, 1H), 5.28 (t, J =  3.3 Hz, 1H), 5.22 (s, 1H), 4.31 (s, 1H), 4.00-3.96 (m, 1H), 3.70 (s, 2H), 3.29 (s, 2H), 2.28 (s, 6H).【００４５】
＜５−Ｏ−(N,N-ジメチルグリシル)ビダラビンの合成＞
東京化成工業製ビダラビンを文献（Shen, W.; Kim, J.-S.; Kish, P. E.; Zhang, J.; Mitchell, S.; Gentry, B. G.; Breitenbach, J. M.; Drach, J. C.; Hilfinger, J. Bio. Med. Chem.   Lett. 2009, 19, 792-796.）の方法に従って、ヒドロキシ基をシリル保護し、続いてレブリン酸との縮合によりエステル化し、最後にシリル基を脱保護することにより化合物（XIII）を調整した。【００４６】
化合物（XIII）463 mg とＮ，Ｎ−ジメチルグリシン 113 mg をジクロロメタン 5 mL に溶解し、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）248 mg を加え、室温で６時間撹拌した。反応液に水を加え、ジクロロメタンを使って３回抽出操作を行い、抽出した有機層に硫酸ナトリウムを加えて乾燥した。ろ過をして、ろ液を濃縮し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール  19:1）にて精製し、化合物（XIV）400 mg (７３％収率)を得た。この様にして得た化合物をピリジン−酢酸緩衝液に溶解させ、ヒドラジン一水和物 0.107 mL を加え、１時間室温で撹拌を行った。反応液を濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール  15:1）にて精製し、白色粉末として目的物（Ig）を 167 mg(６５％収率)で得た。【００４７】
１Ｈ ＮＭＲ (300 MHz, DMSO-d6)
δ8.14 (s, 2H), 7.26 (s, 2H), 6.30 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 5.79 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 5.72 (d, J =  4.1 Hz, 1H), 4.41 (dd, J = 7.1, 11.8 Hz, 1H), 4.30 (dd, J = 3.6, 11.8 Hz, 1H), 4.16 (s, 2H), 3.98 (s, 1H), 3.19 (d, J = 2.8 Hz, 2H), 2.23 (s, 6H).
合成された２位置換体（V2E）、３位置換体（V3E）および５位置換体（V5E）は10 mMとなるように純水でストック溶液を調製した。ビダラビンは100％ジメチルスルホキシドに溶解して同様に10 mMのストック溶液を調製した。【００４８】
＜２−Ｏ−(３−カルボキシプロピオニル)ビダラビンと２−Ｏ−(３−（Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）プロピオニル)ビダラビンの合成＞
東京化成工業製ビダラビンを文献（O'Mahony, G.; Sundgren, A.; Svensson, S.; Grotli, M.  Tetrahedron 2007, 63, 6901-6908.）の方法に従って、ヒドロキシ基をジシロキサニリデン保護し、化合物（III）を調製した。【００４９】
化合物（III）510 mg をピリジン 5 mL に溶解し、無水コハク酸 120 mg を加え、室温で６時間撹拌した。反応液に水を加え、ジクロロメタンを使って３回抽出操作を行い、抽出した有機層に硫酸ナトリウムを加えて乾燥した。ろ過をして、ろ液を濃縮し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール  19:1）にて精製し、化合物（V）を580 mg（９５％収率）で得た。【００５０】
１−プロピルりん酸環状無水物（1 M 酢酸エチル溶液, 1 mL）をアセトニトリル 3 mL に加え、上記で得た化合物（V）610 mg とトリエチルアミン 0.50 mL を加えた。３０分室温で撹拌後、ヒドロキシルアミン塩酸塩 208 mg を加え、室温で１２時間撹拌をした。反応液を酢酸エチルで薄めた後、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール  10:1）にて精製し、化合物（VI）386 mg (６２％収率)を得た。【００５１】
上記で得た化合物（V）610 mg あるいは（VI）625 mg をテトラヒドロフラン 5 mL に溶解させ、テトラブチルアンモニウムフルオリド(1 M テトラヒドロフラン溶液、3 mL)を加え、１２時間室温で撹拌を行った。反応液を濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール  10:1）にて精製し、それぞれ目的物（Ib）302 mg (８２％収率)、（Ic）  310 mg (８１％収率)で得た。【００５２】
＜３−Ｏ−(３−カルボキシプロピオニル)ビダラビンと３−Ｏ−(３−（Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）プロピオニル)ビダラビンの合成＞
東京化成工業製ビダラビンを文献（Shen, W.; Kim, J.-S.; Kish, P. E.; Zhang, J.; Mitchell, S.; Gentry, B. G.; Breitenbach, J. M.; Drach, J. C.; Hilfinger, J. Bio. Med. Chem.   Lett. 2009, 19, 792-796.）の方法に従って、ヒドロキシ基をシリル保護し、化合物（VII）を調製した。【００５３】
化合物（VII）496 mg をピリジン 5 mL に溶解し、無水コハク酸 120 mg を加え、室温で６時間撹拌した。反応液に水を加え、ジクロロメタンを使って３回抽出操作を行い、抽出した有機層に硫酸ナトリウムを加えて乾燥した。ろ過をして、ろ液を濃縮し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール  19:1）にて精製し、化合物（IX）を 572 mg （９６％収率）で得た。【００５４】
１−プロピルりん酸環状無水物（1 M 酢酸エチル溶液、1 mL）をアセトニトリル 3 mL に溶解させ、上記で得た化合物（IX）596 mg とトリエチルアミン 0.50 mL を加えた。３０分室温で撹拌後、ヒドロキシルアミン塩酸塩 208 mg を加え、室温で１２時間撹拌をした。反応液を酢酸エチルで薄めた後、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール  15:1）にて精製し、化合物（X）403 mg (６６％収率)を得た。【００５５】
上記で得た化合物（IX）596 mg あるいは（X）611 mg をテトラヒドロフラン 5 mL に溶解させ、テトラブチルアンモニウムフルオリド(1 M テトラヒドロフラン溶液、5 mL)を加え、１２時間室温で撹拌を行った。反応液を濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール  10:1）にて精製し、白色粉末としてそれぞれ目的物（Ie）301 mg（８２％収率）、（If）309 mg（８１％収率）を得た。【００５６】
＜５−Ｏ−(３−カルボキシプロピオニル)ビダラビンと５−Ｏ−(３−（Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）プロピオニル)ビダラビンの合成＞
東京化成工業製ビダラビンを文献（Shen, W.; Kim, J.-S.; Kish, P. E.; Zhang, J.; Mitchell, S.; Gentry, B. G.; Breitenbach, J. M.; Drach, J. C.; Hilfinger, J. Bio. Med. Chem.   Lett. 2009, 19, 792-796.）の方法に従って、ヒドロキシ基をシリル保護し、続いてレブリン酸との縮合によりエステル化し、最後にシリル基を脱保護することにより化合物（XIII）を調製した。【００５７】
化合物（XIII）463 mg をピリジン 5 mL に溶解し、無水コハク酸 120 mg を加え、室温で６時間撹拌した。反応液に水を加え、ジクロロメタンを使って３回抽出操作を行い、抽出した有機層に硫酸ナトリウムを加えて乾燥した。ろ過をして、ろ液を濃縮し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール  10:1）にて精製し、化合物（XV）539 mg（９６％収率）を得た。【００５８】
１−プロピルりん酸環状無水物（1 M 酢酸エチル溶液、1 mL）をアセトニトリル 3 mL に溶解させ、上記で得た化合物（XV）564 mg とトリエチルアミン 0.50 mL を加えた。３０分室温で撹拌後、ヒドロキシルアミン塩酸塩 208 mg を加え、室温で１２時間撹拌をした。反応液を酢酸エチルで薄めた後、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール  10:1）にて精製し、化合物（XVI）360 mg （６２％収率）を得た。【００５９】
上記で得た化合物（XV）564 mg あるいは（XVI）579 mg をピリジン−酢酸緩衝液に溶解させ、ヒドラジン一水和物 0.107 mL を加え、１時間室温で撹拌した。反応液を濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール  10:1）にて精製し、白色粉末としてそれぞれ目的物（Ih）310 mg（８４％収率）、（Ii）305 mg（８０％収率）を得た。【００６０】
＜膜アデニル酸シクラーゼアッセイ＞
生後12〜15週齢の野生型マウス（C57BL）（日本チャールズリバー株式会社）およびAC5ノックアウト（KO）マウス（Circ. Res.  93: 364-371, 2003）から線条体・心臓・肺組織を摘出し、それぞれの膜タンパク質画分を調製した。得られた膜タンパク質標品を用い、アデニル酸シクラーゼの活性化剤であるフォルスコリン（50 μM、Sigma Cat. No. F6886）および各種化合物の存在下で30℃にて反応液（20 mM HEPES, pH 8、5 mM MgCl2、0.5 mM EDTA, pH 8、0.1 mM ATP、1  mM phospho creatine、8 U/mL creatine phosphor kinase、200 μM IBMX ）をインキュベートしcAMPを産生させた。線条体および肺では1 μg、心臓では2 μgの膜タンパク質をそれぞれ本アッセイに用いた。反応開始から15分（線条体、肺）、または30分（心臓）後にトリクロロ酢酸（TCA）溶液を終濃度5％となるように添加して反応を終了させ、遠心分離（13, 500 x g、10分）によりタンパク質を沈殿させた。【００６１】
＜H9c2培養細胞＞
ラット心臓由来のH9c2細胞（ATCC）は、10％（v/v）のウシ胎児血清（FBS）を含むダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM、Sigma Cat. No. D6429) を用い、95％空気-5％CO2存在下に37℃で培養した。80〜90％コンフルエントのH9c2細胞を10％FBSを含むDMEMに懸濁し、24穴プレートに1ウェルあたり細胞数が4万となるように細胞懸濁液を500 μL添加し、37℃で一晩インキュベートした。その後細胞を無血清DMEM（500 μL/well）中で48時間インキュベートし、cAMP accumulationアッセイに供した。【００６２】
＜ラット成体心筋細胞＞
Sprague-Dawley雄ラット（日本エスエルシー）(240-260g)をペントバルビタール(50mg/kg ip)で麻酔後、へパリンを投与(1000UPS/kg iv)したのち、迅速に心臓を摘出し、すみやかにランゲンドルフ還流装置に摘出した心臓を装着する。0.06%コラゲナーゼと0.02%プロテアーゼを含むCa2+-free Tyrode溶液で還流を行った。KB溶液(KOH 85mM, KCl 30mM, KH2PO4 30, MgSO4 3, EGTA 0.5, HEPES 10, l-Glutamine 50,Taurin 20mM, pH7.4)内で遊離してくる心筋細胞をフィルターろ過したのち10％FBSを含むDMEMに懸濁した。24穴プレートに1ウェルあたり細胞数が4万となるように細胞懸濁液を500 μL添加し、37℃で一晩インキュベートした。その後細胞を無血清DMEM（500 μL/well）中で4時間インキュベートし、cAMP accumulationアッセイに供した(Circulation 98, 1329-1334, 1998)。【００６３】
＜cAMP accumulationアッセイ＞
H9c2細胞を500 μMのIBMX存在下、37℃で20分間インキュベートした後、各種ビダラビン誘導体を50 μMとなるように培養液に添加し、さらに10分間37℃でインキュベートした。その後、フォルスコリンを100 μMとなるように添加しcAMP産生反応を開始させた。反応開始20分後、培養液を吸引し、200 μLの7.5％（v/v）TCA溶液を加えて反応を停止させ、さらに4℃で一晩インキュベートした。また各種ビダラビン誘導体は10μM、フォルスコリンは5μM刺激条件下でラット成体培養心筋細胞をもちいても同様の実験を行った。【００６４】
膜アデニル酸シクラーゼアッセイ、cAMP accumulationアッセイともにTCA溶液中に含まれるcAMPを [125Ｉ]-cAMPを用いたラジオイムノアッセイにより測定した。【００６５】
＜慢性カテコラミン負荷実験＞
イソプロテレノールを満たした浸透圧ミニポンプをマウス皮下に移植し、徐放性にイソプロテレノールを1週間連続投与をおこなった（60mg/kg）。心臓超音波検査にて、心機能（EF, エジェクションフラクション、駆出率）を測定し、イソプロテレノール投与前後で比較した。一般にイソプロテレノールをミニポンプを用いてマウスに投与すると、心機能（EF）が低下する（心不全を発症する）ことがしられている。【００６６】
＜心筋細胞のTUNEL＞
ラット胎児培養心筋細胞（妊娠ラット（ウイスター）を日本エスエルシーより購入）の培養液にイソプロテレノール(10-5M)、イソプロテレノールと同時にビダラビン、V2E、V3E、V5E（10-5M）をそれぞれ併用刺激（48時間）した後細胞のアポトーシス陽性細胞をTUNEL染色で評価した。【００６７】
＜毒性試験＞
野生型マウス(C57BL/6N: 日本エスエルシー)  にビダラビン、V2E、V3E，V5Eをオスモティックミニポンプを用いてに投与後(15mg/kg/day 7日間)採血を行い、BUN, Creatinine, GPT,GOTを測定してコントロール群と比較した。【００６８】
＜心筋組織のTUNEL＞
慢性カテコラミン負荷実験用いたマウスのアポトーシス陽性細胞をTUNEL染色で評価した。【００６９】
結果
新規に合成した3種類のビダラビン誘導体（図1）は、いずれも純水により10 mMのストック溶液を調製した。臨床において、抗ヘルペス治療薬としては約2 mMのビダラビン点滴液を使用することから（アラセナ-A点滴静注用、持田製薬）、それと比較して5倍程度の濃度の溶液を調製することが可能であった。一方、今回ビダラビンは10 mMのストック溶液を100％DMSOを用いて調製した。【００７０】
野生型マウスの線条体膜のアデニル酸シクラーゼ活性は、50 μMのフォルスコリン刺激で約15〜20倍に上昇した。各種化合物を100 μMの濃度で処理したところ、5型サブタイプの選択的抑制剤として既に報告されているビダラビンは、フォルスコリン存在下におけるアデニル酸シクラーゼ活性を約17.3％まで抑制した。一方、フォルスコリンにより刺激されたアデニル酸シクラーゼ活性をV2Eは約24.5％、V3Eは約25.1％、V5Eは約24.9％まで減少させた（図2）。【００７１】
続いて、各種ビダラビン誘導体について野生型マウスの線条体、心臓および肺のアデニル酸シクラーゼ活性に対する抑制効果を3種類の濃度（10、50、100 μM）で解析した。その結果、線条体のアデニル酸シクラーゼ活性に対するIC50値はビダラビンが約6.0 μM、V2Eが約13.1 μM、V3Eが約13.0 μM、およびV5Eが25.1 μMと推定された。同様に、心臓における各種薬剤のIC50値はそれぞれ7.7 μM、17.8 μM、19.9 μM、および42.9 μMであった。これらのことは、線条体の全アデニル酸シクラーゼに占める5型サブタイプの発現比率が心臓のそれよりも圧倒的に高いためであると考えられた（図3）。さらに、AC5KOマウスの線条体のアデニル酸シクラーゼ活性に対するこれらの化合物の抑制効果は、野生型に比べて低いことが明らかになった（図4）。特に、線条体膜のアデニル酸シクラーゼ活性は50 μMの阻害剤存在下でもコントロールの80％程度に保持されていた。このことは、各種ビダラビン誘導体が高い5型アデニル酸シクラーゼ抑制作用を持つことを示す。【００７２】
また、V2Eは10 μMの濃度において野生型心臓アデニル酸シクラーゼ活性を肺の約2.6倍強く抑制し、線条体は肺の約3.0倍強く抑制した。当該濃度におけるビダラビンの抑制効果の組織特異性は、肺と比較して心臓が約2.4倍、線条体が約2.8倍高いことから、V2Eはビダラビンと同等の5型選択的な抑制効果を有する親水性の高い化合物であることが示唆された（図5）。【００７３】
各種ビダラビン誘導体の5型アデニル酸シクラーゼノックアウトマウス(AC5KO)に対する抑制効果を野生型マウスと比較したところ、心筋組織膜タンパク内のアデニル酸シクラーゼ活性に対する各種ビダラビン誘導体の抑制効果は野生型マウスのほうがAC5KOに比較して有意に高かった。この結果はビダラビン誘導体が5型サブタイプに選択的な抑制効果があることを示唆している（図6）。【００７４】
一方、膜標本としたアデニル酸シクラーゼではなく、インタクトな細胞内におけるアデニル酸シクラーゼによるcAMP産生に対する抑制作用の有無を確認することを目的に、フォルスコリンで刺激した細胞中に蓄積するcAMPレベルに与えるビダラビン誘導体の効果を調べた。今回は、予備的な実験としてラット心臓由来のH9c2培養細胞を材料として用いた。一般に化合物の中には細胞膜透過性の低いものもあり、そのような化合物は生体内での活性が極めて低くなるためである。その結果、各種阻害剤の存在下ではフォルスコリンにより蓄積したcAMPレベルがコントロールと比べて著明に低い値を示した（ビダラビン；約35.1%、V2E；約57.1％、V3E；約45.7％、V5E；約82.5％）（図7）。同様の実験を成体ラット心筋細胞を用いて行ったが、H9C2細胞を用いた場合と同様の傾向が得られた（図8）。このことから、ビダラビンおよびビダラビン誘導体は、インタクト細胞に対してもアデニル酸シクラーゼ抑制剤としての効果を発揮することが期待された。つまり良好な膜透過性を有することがわかった。【００７５】
野生型マウス(C57BL/6N)にオスモティックミニポンプ(Alzet2001)をもちいてイソプロテレノール(60mg/kg/day  ７日間)のみを１週間投与したマウス(ISO)、イソプロテレノールと同時にビダラビン、V2E、V3E、V5Eをそれぞれ投与した(15mg/kg/day ７日間)。その結果イソプロテレノールのみを投与したマウスでは、投与前に比較して心機能(LVEF:心拍出量)の低下がみられたが、ビダラビンを同時に併用投与したマウスでは心機能低下が有意に抑制された（図9）。またビダラビンと同等の心機能抑制効果がV2E、V3E、V5Eを併用投与したマウスでも確認された(n=3-8, means+SE, *P<0.05) （図9）。【００７６】
以上、本研究では新規に合成した3種類のビダラビン誘導体が高い親水性を有し、かつ5型アデニル酸シクラーゼを強く抑制することが明らかとなった。とりわけ２位置換体はビダラビンと同様の5型サブタイプ選択な抑制効果を持つことが示唆され、心不全の予防効果が示された。【００７７】
心筋細胞のTUNELでは、ラット胎児培養心筋細胞の培養液にイソプロテレノール(10-5M)、イソプロテレノールと同時にビダラビン、V2E、V3E、V5Eをそれぞれ併用刺激（48時間）した後細胞のアポトーシス陽性細胞をTUNEL染色で評価した。V2E, V3E, V5Eはビダラビンと同等のイソプロテレノール刺激によるアポトーシス抑制効果がみられた(n=4-7, means+SE, *P<0.05) （図10）。【００７８】
毒性試験では、ビダラビン、V2E、V3E，V5Eをオスモティックミニポンプを用いて投与(15mg/kg/day  ７日間)を投与後に採血を行い、BUN, Creatinine, GPT,GOTを測定してコントロール群と比較した。コントロール群に比較して有意なBUN, Creatinine, GPT,GOT の上昇は見られなかった(n=4-8, means+SE) （図11）。
イソプロテレノールを用いた慢性カテコラミン負荷マウスの心筋組織のアポトーシス陽性心筋細胞の割合をTUNEL染色で評価した。慢性カテコラミン刺激により誘導される心筋細胞のアポトーシスをビダラビンとV2Eは同等に抑制した(n=4-6, means+SE)（図12）。【００７９】
ビダラビン、V2E、V3E、およびV5Eの中枢移行性を、ストリキニーネ投与によりマウスに惹起される強直伸展性痙攣および死亡に対する拮抗作用により評価した。生理食塩水に溶解したストリキニーネ硝酸塩をマウス（C57BL/6N：日本エスエルシー，雄，10-12週齢）の頚背部皮下に1.5 mg/kgとなるように投与し、強直伸展性痙攣を起こし死亡に至るまでの時間を計測した。ビダラビン、V2E、V3E、およびV5Eは生理食塩水に溶解または懸濁させ、ストリキニーネ投与の15分前に腹腔内に投与した。【００８０】
ビダラビンはヘルペス脳炎治療薬として臨床応用され中枢移行性が確認されているが150 mg/kg（0.525 mmol/kg）、300 mg/kg（1.05 mmol/kg）で容量依存的にストリキニーネによる痙攣死までの時間を有意に延長させた。一方、V2E、V3E、およびV5Eはビダラビンと同様の投与量において、死亡までの時間を延長しなかった。すなわちV2E, V3E, V5Eはいずれの薬剤も、ストリキニーネによる死亡発現率には影響を与えず中枢移行性がきわめて低いことが示唆された。なおいずれの薬剤を用いた実験でも死亡率は100%であった（n=4-10, means+SE）（図13）。【００８１】
イソフルレンを用いてマウスを吸入麻酔後、心内心電図を記録する目的で口腔内から心電図アンプに接続した電極カテーテル（Millar: Model EPR800、サイズ1.1 F、長さ4.5 cm）をゆっくりと食道に挿入し、P波が最も大きく記録される部位で電極カテーテルを固定した。固定した電極カテーテルは位置が動かないよう慎重に電気刺激装置に接続し、以後は体表面心電図をII誘導で記録した。次に2.5 mAの電圧刺激を30 msec間隔で60秒間加えることで、その後心房細動が一過性に誘発される。体表面心電図上、基線からP波が消失するとともに、R-R間隔が一定でなく脈が不整になることを確認できる時間を心房細動持続時間とした。【００８２】
オスモティックミニポンプ(Alzet: 2001)を用いて正常野生型マウス(C57BL/6N)にDMSOに溶解したビダラビン（15mg/kg/day)、V2E、V3E、およびV5E（19.8 mg/kg/day）、またはDMSOのみを投与し、上記の条件で心房細動を誘発して正常洞リズムに戻るまでの心房細動持続時間を測定した（図14）。正常洞リズムが5分間以上持続し、心房細動の再発現がない事を確認して実験終了とした。なお、ヘルペス治療において、ヒトに対して認可されているビダラビンの最大投与量は15mg/kg/dayを10日間である。
ビダラビン、V2E、V3E、ならびにV5Eはペーシングにより誘発された心房細動が正常洞リズムにもどるまでの時間を有意に短縮した (n=4-8，means±SE)。【００８３】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明は、心不全、心筋梗塞、不整脈などの予防及び/又は治療に利用可能である。
【図１】
2012056976.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2012056976.tif 000017
【図６】
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【図７】
2012056976.tif 000019
【図８】
2012056976.tif 000020
【図９】
2012056976.tif 000021
【図１０】
2012056976.tif 000022
【図１１】
2012056976.tif 000023
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年11月9日(2012.11.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（Ｉ’）で表される化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物（但し、５’−Ｏ−（３−カルボキシプロパノイル）−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン及び５’−Ｏ−（４−カルボキシブタノイル）−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを除く）。
【化８】
2012056976.tif 000027
（式中、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ、独立に、水素原子又は式：Ｂ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−（式中、ｎは１〜４の整数であり、Ｂは少なくとも１個の水素原子がアルキル基で置換されたアミノ基、カルボキシル基又はヒドロキシカルバモイル基である。）で表される基であるが、但し、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３のすべてが水素原子であることはない）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
下記のいずれかの式で表される請求項１記載の化合物。
【化２】
2012056976.tif 000028
【請求項５】
下記の式（Ｉ’）で表される化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物を含むアデニル酸シクラーゼ活性調節剤。
【化８】
2012056976.tif 000029
（式中、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ、独立に、水素原子又は式：Ｂ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−（式中、ｎは１〜４の整数であり、Ｂは少なくとも１個の水素原子がアルキル基で置換されたアミノ基、カルボキシル基又はヒドロキシカルバモイル基である。）で表される基であるが、但し、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３のすべてが水素原子であることはない）
【請求項６】
アデニル酸シクラーゼが心臓型アデニル酸シクラーゼである請求項５記載の薬剤。
【請求項７】
請求項１又は４に記載の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物を含む医薬組成物。
【請求項８】
ベータ遮断剤の適応症の予防及び／又は治療に用いられる請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
ベータ遮断剤の適応症が、心不全、心筋梗塞、不整脈、狭心症、高血圧症及びそれらに関連する病態および疾患から成る群より選択される請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１又は４に記載の化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物を含む食品組成物。
【請求項１１】
アンチエイジングおよび長寿、それに関連する疾患および病態の予防又は健康維持のために用いられる請求項１０記載の食品組成物。
【請求項１２】
下記の式（Ｉ’）で表される化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物の医薬的に有効な量を被験者に投与することを含む、ベータ遮断剤の適応症を予防及び／又は治療する方法。
【化８】
2012056976.tif 000030
（式中、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ、独立に、水素原子又は式：Ｂ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−（式中、ｎは１〜４の整数であり、Ｂは少なくとも１個の水素原子がアルキル基で置換されたアミノ基、カルボキシル基又はヒドロキシカルバモイル基である。）で表される基であるが、但し、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３のすべてが水素原子であることはない）
【請求項１３】
ベータ遮断剤の適応症の予防及び／又は治療のための下記の式（Ｉ’）で表される化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物の使用。
【化８】
2012056976.tif 000031
（式中、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ、独立に、水素原子又は式：Ｂ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−（式中、ｎは１〜４の整数であり、Ｂは少なくとも１個の水素原子がアルキル基で置換されたアミノ基、カルボキシル基又はヒドロキシカルバモイル基である。）で表される基であるが、但し、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３のすべてが水素原子であることはない）
【請求項１４】
ベータ遮断剤の適応症を予防及び／又は治療する方法に使用するための下記の式（Ｉ’）で表される化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物。
【化８】
2012056976.tif 000032
（式中、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ、独立に、水素原子又は式：Ｂ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−（式中、ｎは１〜４の整数であり、Ｂは少なくとも１個の水素原子がアルキル基で置換されたアミノ基、カルボキシル基又はヒドロキシカルバモイル基である。）で表される基であるが、但し、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３のすべてが水素原子であることはない）
【請求項１５】
下記の式（Ｉ’）で表される化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物の有効量を被験者に投与することを含む、アンチエイジングおよび長寿、それに関連する疾患および病態の予防又は健康維持方法。
【化８】
2012056976.tif 000033
（式中、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ、独立に、水素原子又は式：Ｂ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−（式中、ｎは１〜４の整数であり、Ｂは少なくとも１個の水素原子がアルキル基で置換されたアミノ基、カルボキシル基又はヒドロキシカルバモイル基である。）で表される基であるが、但し、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３のすべてが水素原子であることはない）
【請求項１６】
アンチエイジングおよび長寿、それに関連する疾患および病態の予防又は健康維持のための下記の式（Ｉ’）で表される化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物の使用。
【化８】
2012056976.tif 000034
（式中、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ、独立に、水素原子又は式：Ｂ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−（式中、ｎは１〜４の整数であり、Ｂは少なくとも１個の水素原子がアルキル基で置換されたアミノ基、カルボキシル基又はヒドロキシカルバモイル基である。）で表される基であるが、但し、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３のすべてが水素原子であることはない）
【請求項１７】
アンチエイジングおよび長寿、それに関連する疾患および病態の予防又は健康維持方法に使用するための下記の式（Ｉ’）で表される化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物。
【化８】
2012056976.tif 000035
（式中、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ、独立に、水素原子又は式：Ｂ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−（式中、ｎは１〜４の整数であり、Ｂは少なくとも１個の水素原子がアルキル基で置換されたアミノ基、カルボキシル基又はヒドロキシカルバモイル基である。）で表される基であるが、但し、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３のすべてが水素原子であることはない）
【請求項１８】
下記の式（Ｉ’）で表される化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物を含む、ベータ遮断剤の適応症の予防及び／又は治療に用いられる医薬組成物。
【化８】
2012056976.tif 000036
（式中、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ、独立に、水素原子又は式：Ｂ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−（式中、ｎは１〜４の整数であり、Ｂは少なくとも１個の水素原子がアルキル基で置換されたアミノ基、カルボキシル基又はヒドロキシカルバモイル基である。）で表される基であるが、但し、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３のすべてが水素原子であることはない）
【請求項１９】
下記の式（Ｉ’）で表される化合物、その医薬的に許容される塩、エステル又は溶媒和物を含む、アンチエイジングおよび長寿、それに関連する疾患および病態の予防又は健康維持のために用いられる食品組成物。
【化８】
2012056976.tif 000037
（式中、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ、独立に、水素原子又は式：Ｂ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−（式中、ｎは１〜４の整数であり、Ｂは少なくとも１個の水素原子がアルキル基で置換されたアミノ基、カルボキシル基又はヒドロキシカルバモイル基である。）で表される基であるが、但し、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３のすべてが水素原子であることはない）
【国際調査報告】
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