(57)【要約】  【課題】  Ｂｏｃ固相合成法により糖ペプチドを合成する際に、糖鎖の非還元末端に位置するシアル酸が分解せずに、高い収率で目的とするシアリル糖鎖を有する糖ペプチドを得ることのできる製造方法を提供する。  【解決手段】  Ｂｏｃ固相合成法において使用するＢｏｃ−シアリル糖鎖付加アミノ酸誘導体を、糖鎖の非還元末端のシアル酸のカルボキシル基がフェナシル基で保護されたものとすることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアリル糖鎖を有する糖ペプチドの製造方法であって、
以下の工程：
（１）水酸基を有する樹脂（レジン）とアミノ基窒素がＢｏｃ基で保護されたアミノ酸とを結合させる工程；
ここで、当該結合させる工程は、前記樹脂の水酸基と前記アミノ酸のカルボキシル基をエステル化反応により結合させる工程であり、
（２）前記Ｂｏｃ基を脱離させることにより遊離アミノ基を形成させる工程；
（３）以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を、少なくとも１回繰り返す工程：
（ｉ）Ｂｏｃ基でアミノ基窒素が保護された別のアミノ酸をさらに結合させることにより樹脂に結合したアミノ酸を伸長させる工程、
ここで、当該伸長させる工程は、前記別のアミノ酸のカルボキシル基と前記樹脂に結合したアミノ酸の前記遊離アミノ基とを結合させる工程であり、
（ｉｉ）（ｉ）における前記Ｂｏｃ基を脱離させることにより遊離アミノ基を形成させる工程；
（４）酸で樹脂を切断する工程；
を含み、
ここで、工程（１）における前記アミノ酸、および／または、工程（３）の少なくとも１回の（ｉ）における前記別のアミノ酸が、糖鎖付加アミノ酸であって、かつ、当該糖鎖付加アミノ酸は、糖鎖非還元末端の少なくとも１つにシアル酸を有し、かつ、当該シアル酸のカルボキシル基はフェナシル基で保護されたものである、
ことを特徴とする製造方法。
【請求項２】
前記糖鎖付加アミノ酸が、アスパラギン結合型糖鎖、またはムチン結合型糖鎖である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記工程（４）において、前記酸がトリフルオロ酢酸／トリフルオロメタンスルホン酸／ジメチルスルフィド／ｍ−クレゾールの混合酸である請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記工程（１）における前記アミノ酸、および／または、前記工程（３）の少なくとも１回の（ｉ）における前記別のアミノ酸が、塩基に弱い非天然アミノ酸である請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記糖鎖付加アミノ酸の少なくとも１つがシアリル糖鎖アスパラギンであって、前記シアリル糖鎖アスパラギンが、６以上の糖残基を有するものである請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記糖鎖付加アミノ酸の少なくとも１つがシアリル糖鎖アスパラギンであって、前記シアリル糖鎖アスパラギンが、９〜１１の糖残基を有するものである請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記糖鎖付加アミノ酸の少なくとも１つがシアリル糖鎖アスパラギンであって、前記糖鎖アスパラギンが、６以上の糖残基を有し、２分岐型糖鎖を結合したものである請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記糖鎖付加アミノ酸が下記式（１）で表されるものである請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【化１】
2012121206.tif 000023
〔式中、Ｒ３およびＲ４は、一方が下記式（２）であり、他方が、水素原子及び下記式（２）〜（６）で示される基からなる群より選択される基である。〕
【化２】
2012121206.tif 000024
【化３】
2012121206.tif 000025
【化４】
2012121206.tif 000026
【化５】
2012121206.tif 000027
【化６】
2012121206.tif 000028
【請求項９】
前記工程（１）の前に、樹脂にチオール化合物を結合させる工程をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記工程（４）の後に、（５）シアリル糖鎖を有する糖ペプチドのチオエステル体と、ペプチドフラグメント又は糖ペプチドフラグメントとを連結する工程をさらに含む、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記工程（４）の酸で樹脂を切断する前に、標識剤を反応させる工程をさらに含む請求項１〜１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
標識剤がダンシルハライドである請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記工程（１）〜（３）のうちの少なくとも１つの工程において、前記アミノ酸の縮合反応及び／又はＢｏｃ基の脱離反応の際、マイクロウェーブを照射する、請求項１〜１０に記載の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３に記載のシアリル糖鎖を有する糖ペプチドの製造方法であって、前記工程（４）の後に、前記シアル酸のカルボキシル基を保護しているフェナシル基を脱保護する工程をさらに含む、製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４に記載の製造方法により作製される、シアリル糖鎖を有する糖ペプチド。
【請求項１６】
シアリル糖鎖アスパラギンのアミノ基がＢｏｃ基で保護され、かつ、糖鎖の非還元末端のシアル酸のカルボキシル基がフェナシル基で保護されたシアリル糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法であって、
アスパラギンのアミノ基が脂溶性保護基により保護されたシアリル糖鎖アスパラギン誘導体にフェナシル基を導入する工程と、
フェナシル基が導入されたシアリル糖鎖アスパラギンの脂溶性保護基を脱離する工程と、
脂溶性保護基を脱離したシアリル糖鎖アスパラギンへＢｏｃ基を導入する工程と、
を含む、製造方法。
【請求項１７】
前記脂溶性保護基がＦｍｏｃである請求項１６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品や分析機器のための標準品、学術用試薬などに応用し得る、シアリル糖鎖を有する糖ペプチドの合成方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、核酸（ＤＮＡ）、タンパク質に続く第三の鎖状生命分子として、糖鎖分子が注目されてきている。ヒトの体は、約６０兆個の細胞から成っている一大細胞社会であり、全ての細胞表面は糖鎖分子によって覆われている。例えば、ＡＢＯ式血液型は細胞表面の糖鎖の違いにより決定されている。
糖鎖は、細胞間の認識や相互作用に関わる働きをもち、細胞社会を成り立たせる要となっている。細胞社会の乱れは、癌、慢性疾患、感染症、老化などにつながり、例えば、細胞が癌化すると細胞表面上の糖鎖の構造変化が起こることが知られている。
また、コレラ菌やインフルエンザウイルスなどは、ある特定の糖鎖を認識し結合することにより、細胞に侵入し感染することが知られている。【０００３】
このような糖鎖の機能の解明は、新しい原理に基づく医薬品や食品の開発などをもたらし、病気の予防、治療に貢献するなど、幅広い応用が期待されている。
糖鎖は単糖の配列、結合様式・部位、鎖の長さ・分岐様式、全体の高次構造などの多様性から、核酸やタンパク質の構造と比べると非常に複雑な構造である。従って、その構造に由来する生物学的な情報は核酸やタンパク質に比べて多種多様である。糖鎖は、研究の重要性を認識されながらも、その構造の複雑さや多様性により、核酸やタンパク質に比べて研究の推進が遅れている状況にある。【０００４】
細胞膜表面や血清などに存在するタンパク質の多くは糖鎖が結合している。糖鎖がタンパク質に共有結合した分子は糖タンパク質とよばれ、糖とタンパク質との結合様式の違いから２つのグループに分けることができる。一つはアスパラギン（Ａｓｎ）の側鎖のアミノ基と糖鎖が結合したアスパラギン結合型糖鎖（Ｎ−グリコシド結合型）である。もう一方はセリン（Ｓｅｒ）やスレオニン（Ｔｈｒ）のアルコールに糖鎖が結合したムチン結合型糖鎖（Ｏ−グリコシド結合型）である。すべてのアスパラギン結合型糖鎖は５つの糖残基からなる基本骨格をもち、結合する糖鎖の非還元末端の糖残基の種類によって高マンノース型、複合型、混成型のサブグループに分類される。一方ムチン結合型糖鎖は基本骨格（コア）の違いから４グループに分類される。【０００５】
糖鎖を有するタンパク質は糖タンパク質製剤としてすでに世界中で利用されているが、この糖タンパク質は主にバイオテクノロジーを利用した方法でのみしか得ることができず、また、これにより作製された糖タンパク質純度が低いという問題を有していた。よって、純度が高く、効率的に目的の糖タンパク質を得られる化学的な合成方法が望まれていた。特に、非天然アミノ酸を有する糖ペプチドを合成する際には、生物学的手法では直接的に生産することができない。【０００６】
ペプチド合成法として現在広く用いられているのは、１９６３年にＲ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄによって開発された固相合成法である。固相合成法は樹脂（レジン）とよばれる固相上にビルディングブロックであるアミノ酸をつなげ、ペプチド鎖を伸長していく方法である。ペプチド鎖の伸長が終了したら、固相からペプチド鎖を切り出し、目的物を得る。
この応用としてペプチド鎖伸長の際、糖鎖を結合させたアミノ酸を組み込むことで糖ペプチド鎖の合成を可能とすることができる。【０００７】
固相合成法において、ビルディングブロックとなるアミノ酸のアミノ基は、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基や、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジルオキシカルボニル（ＣｂｚまたはＺ）基等により保護される。
ここで、Ｂｏｃ基を用いた固相合成法においては、ペプチドの側鎖の保護基の脱保護とペプチド自体を樹脂より切りだす際にフッ化水素等の超強酸を用いるが、このフッ化水素による処理により目的物の一部に糖鎖が含まれていると、その糖鎖の部分、特に糖鎖の非還元末端に存在するシアル酸が容易に分解してしまうという問題を有していた。このように、Ｂｏｃ固相合成法において、シアリル糖鎖を有する目的の糖タンパク質を直接製造することは困難であった。
なお、Ｆｍｏｃ基を用いる固相合成法においては、塩基性条件下において、アミノ酸のアミノ基よりＦｍｏｃ基を脱離することができる。これに対して、Ｂｏｃ基は、酸性の条件下において、アミノ酸のアミノ基より脱保護できるため、塩基に弱い非天然アミノ酸を用いたペプチドまたは糖ペプチドを固相合成法により合成する際には、Ｂｏｃ固相合成法の必要が生じる。【０００８】
非天然アミノ酸は、タンパク質構成アミノ酸ではないが、天然に存在するものもあり、また、化学合成によって得ることができる。非天然アミノ酸は、構造の多様性や置換基選択の自由度が極めて高く、このような非天然アミノ酸を利用してペプチドを合成することにより、生体内における安定性の改善や、力価の向上、吸収効率の向上、組織内の分布の改善や、ペプチドの３次元構造の変化等を望むことができ、新規ペプチド医薬や機能材料の候補物質を設計することができるとして注目されている。【０００９】
また、固相合成法の一つとして、樹脂からペプチドを切り離した際に、作製されたペプチドをチオエステル体とする方法が報告されている（例えば、非特許文献１）。ペプチドチオエステル体を得ることで、例えば、天然型化学的ライゲーション（Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ、ＮＣＬ法）やＫＣＬ法（Ｋｉｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ）を利用して他のペプチド鎖と結合させることができ、より大きい目的のタンパク質を製造することができる（特許文献１および非特許文献２）。【００１０】
ＮＣＬ法とは、Ｎ末端アミノ酸がＣｙｓであるペプチドフラグメントと、Ｃ末端にチオエステルをもつペプチドフラグメントを連結して、より大きなペプチド鎖を得る方法である。このとき、糖鎖を付加したペプチドフラグメントを用いれば、糖タンパク質を合成することができる。各フラグメントは、例えば、上記の固相合成法で合成することができ、合成の途中で、アミノ酸に代えて均一な糖鎖を有する糖鎖付加アスパラギンを結合させることにより、アミノ酸配列及び糖鎖構造が均一な糖鎖付加フラグメントが得られる（特許文献２）。また、ＫＣＬ法とは、連結する両ペプチドフラグメントがＣ末端にチオエステルを有している場合に、反応速度の違いを利用して目的とする糖タンパク質を比較的に多く得る方法である。
このように、糖鎖付加フラグメントを用いてＮＣＬ法やＫＣＬ法を行えば、製造ロット等によるばらつきがなく、医薬品としても利用可能な均一な糖タンパク質を得ることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開公報第９６／３４８７８号パンフレット
【特許文献２】国際公開公報第２０１１／００７７４７号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｘｉａｎｚｈａｎｇ  Ｂｕ．  ｅｔ  ａｌ．：Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００２）４３：２４１９−２４２２
【非特許文献２】Ｈｕｔｌｏｆｆ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ（１９９９）３９７：２６３−２６６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上述のように、Ｂｏｃ固相合成方法において、シアル酸が糖鎖より分解せずに保持可能な合成方法が望まれている。本発明者らは、固相合成法において、糖鎖上のシアル酸のカルボキシル基を特定の化合物により保護することにより、シアリル糖鎖を有する糖ペプチドの合成法を見出している。しかしながら、Ｂｏｃ固相合成法における超強酸条件下では、これらの保護基を使用しても、糖鎖非還元末端のシアル酸を十分に保持することができず、望んだ収率でシアリル糖鎖を有する糖ペプチドを得ることができなかった。
よって、本発明は、Ｂｏｃ基を用いた糖ペプチドの固相合成法において、糖鎖の非還元末端のシアル酸が分解されずに、高い収率で目的のシアリル糖鎖を有する糖ペプチドの合成方法を提供することにある。
さらに、本発明は、Ｂｏｃ基を用いたシアリル糖鎖を有する糖ペプチドの固相合成法において、チオエステル体の糖ペプチドを製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するために本発明者らが鋭意検討した結果、糖鎖非還元末端のシアル酸のカルボキシル基の保護基として、フェナシル基を使用することで、Ｂｏｃ固相合成法においてもシアリル糖鎖を有する糖ペプチドの収量を大幅に改善させることが可能となった。
すなわち、本発明は、シアリル糖鎖を有する糖ペプチドの製造方法であって、以下の工程：
（１）水酸基を有する樹脂（レジン）とアミノ基窒素がＢｏｃ基で保護されたアミノ酸とを結合させる工程；
ここで、当該結合させる工程は、前記樹脂の水酸基と前記アミノ酸のカルボキシル基をエステル化反応により結合させる工程であり、
（２）前記Ｂｏｃ基を脱離させることにより遊離アミノ基を形成させる工程；
（３）以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を、少なくとも１回繰り返す工程：
（ｉ）Ｂｏｃ基でアミノ基窒素が保護された別のアミノ酸をさらに結合させることにより樹脂に結合したアミノ酸を伸長させる工程、
ここで、当該伸長させる工程は、前記別のアミノ酸のカルボキシル基と前記樹脂に結合したアミノ酸の前記遊離アミノ基とを結合させる工程であり、
（ｉｉ）（ｉ）における前記Ｂｏｃ基を脱離させることにより遊離アミノ基を形成させる工程；
（４）酸で樹脂を切断する工程；を含み、
ここで、工程（１）における前記アミノ酸、および／または、工程（３）の少なくとも１回の（ｉ）における前記別のアミノ酸が、糖鎖付加アミノ酸であって、かつ、当該糖鎖付加アミノ酸は、糖鎖非還元末端の少なくとも１つにシアル酸を有し、かつ、当該シアル酸のカルボキシル基はフェナシル基で保護されたものであることを特徴とする製造方法に関する。【００１５】
ここで、本発明のシアリル糖鎖を有する糖ペプチドの製造方法の一実施態様においては、前記糖鎖付加アミノ酸が、アスパラギン結合型糖鎖、またはムチン結合型糖鎖であることを特徴とする。
また、本発明のシアリル糖鎖を有する糖ペプチドの製造方法の一実施態様においては、前記工程（４）において、前記酸がトリフルオロ酢酸／トリフルオロメタンスルホン酸／ジメチルスルフィド／ｍ−クレゾールの混合酸であることを特徴とする。
また、本発明のシアリル糖鎖を有する糖ペプチドの製造方法の一実施態様においては、前記工程（１）における前記アミノ酸、および／または、前記工程（３）の少なくとも１回の（ｉ）における前記別のアミノ酸が、塩基に弱い非天然アミノ酸であることを特徴とする。
また、本発明のシアリル糖鎖を有する糖ペプチドの製造方法の一実施態様においては、前記糖鎖付加アミノ酸の少なくとも１つがシアリル糖鎖アスパラギンであって、前記シアリル糖鎖アスパラギンが、６以上の糖残基を有するものであることを特徴とする。
また、本発明のシアリル糖鎖を有する糖ペプチドの製造方法の一実施態様においては、前記糖鎖付加アミノ酸の少なくとも１つがシアリル糖鎖アスパラギンであって、前記シアリル糖鎖アスパラギンが、９〜１１の糖残基を有するものであることを特徴とする。
また、本発明のシアリル糖鎖を有する糖ペプチドの製造方法の一実施態様においては、  前記糖鎖付加アミノ酸の少なくとも１つがシアリル糖鎖アスパラギンであって、前記糖鎖アスパラギンが、６以上の糖残基を有し、２分岐型糖鎖を結合したものであることを特徴とする。
また、本発明のシアリル糖鎖を有する糖ペプチドの製造方法の一実施態様においては、前記糖鎖付加アミノ酸が式（１）で表されるものであることを特徴とする。
【化１】
2012121206.tif 000002
〔式中、Ｒ３およびＲ４は、一方が（２）であり、他方が、水素原子及び式（２）〜（６）で示される基からなる群より選択される基である。〕
【化２】
2012121206.tif 000003
【化３】
2012121206.tif 000004
【化４】
2012121206.tif 000005
【化５】
2012121206.tif 000006
【化６】
2012121206.tif 000007
また、本発明のシアリル糖鎖を有する糖ペプチドの製造方法の一実施態様においては、前記工程（１）の前に、樹脂にチオール化合物を結合させる工程をさらに含むことを特徴とする。
また、本発明のシアリル糖鎖を有する糖ペプチドの製造方法の一実施態様においては、（５）シアリル糖鎖を有する糖ペプチドのチオエステル体と、ペプチドフラグメント又は糖ペプチドフラグメントとを連結する工程をさらに含むことを特徴とする。
また、本発明のシアリル糖鎖を有する糖ペプチドの製造方法の一実施態様においては、前記工程（４）の酸で樹脂を切断する前に、標識剤を反応させる工程をさらに含むことを特徴とする。
また、本発明のシアリル糖鎖を有する糖ペプチドの製造方法の一実施態様においては、標識剤がダンシルハライドであることを特徴とする。
また、本発明のシアリル糖鎖を有する糖ペプチドの製造方法の一実施態様においては、前記工程（１）〜（３）のうちの少なくとも１つの工程において、前記アミノ酸の縮合反応及び／又はＢｏｃ基の脱離反応の際、マイクロウェーブを照射することを特徴とする。
また、本発明のシアリル糖鎖を有する糖ペプチドの製造方法の一実施態様においては、前記工程（４）の後に、前記シアル酸のカルボキシル基を保護しているフェナシル基を脱保護する工程をさらに含むことを特徴とする。【００１６】
また、本発明の別の態様は、上記製造方法により作製される、シアリル糖鎖を有する糖ペプチドに関する。【００１７】
また、本発明の別の態様は、シアリル糖鎖アスパラギンのアミノ基がＢｏｃ基で保護され、かつ、糖鎖の非還元末端のシアル酸のカルボキシル基がフェナシル基で保護されたシアリル糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法であって、アスパラギンのアミノ基が脂溶性保護基により保護されたシアリル糖鎖アスパラギン誘導体にフェナシル基を導入する工程と、フェナシル基が導入されたシアリル糖鎖アスパラギンの脂溶性保護基を脱離する工程と、脂溶性保護基を脱離したシアリル糖鎖アスパラギンへＢｏｃ基を導入する工程とを含む、製造方法に関する。
また、本発明のシアリル糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法の一実施態様においては、前記脂溶性保護基がＦｍｏｃであることを特徴とする。
また、本発明の一実施態様において、本発明のシアリル糖鎖を有する糖ペプチドの製造方法により製造される糖ペプチドは、エリスロポエチンのアミノ酸配列と同等のアミノ酸配列を有し、かつ、少なくとも１つ以上のシアリル糖鎖を任意の位置に有する糖ペプチドである。また、本発明の一実施態様において、本発明のシアリル糖鎖を有する糖ペプチドの製造方法により製造される糖ペプチドは、エリスロポエチンのアミノ酸配列と同等のアミノ酸配列を有する糖ペプチドの一部であって、少なくとも１つ以上のシアリル糖鎖を任意の位置に有する糖ペプチドフラグメントである。
なお、エリスロポエチンのアミノ酸配列と同等のアミノ酸配列とは、フォールディング後にエリスロポエチンの機能を有するアミノ酸配列であって、エリスロポエチンのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をいう。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のシアリル糖鎖を有する糖ペプチドの製造方法によれば、Ｂｏｃ固相合成法において、糖鎖非還元末端にシアル酸を有する糖ペプチドを直接提供することができる。また、アミノ酸のアミノ基の保護基としてＢｏｃ基を用いるため、塩基に弱い非天然のアミノ酸を使用して、糖ペプチドを作製することも可能である。【００１９】
Ｂｏｃ固相合成のような化学合成により作製される糖ペプチドは、糖鎖の構造が実質的に均一の糖ペプチドを大量に合成することができる。このような糖鎖の構造が均一である糖ペプチドは、品質が一定であり、特に医薬品の製造や、アッセイなどの分野において好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、本発明の一実施の態様である、インターフェロンガンマ（ＩＮＦγ）をモデルペプチドとした、二分岐ジシアロ糖鎖アスパラギンを有するアミノ酸配列（ＴＮ（ジフェナシル−ジシアロ糖鎖）ＹＳＶＴＤＬＮＹ）を、Ｂｏｃ固相合成法により作製する方法のフローを示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の一実施の態様である、インターフェロンガンマ（ＩＮＦγ）をモデルペプチドとした、二分岐ジシアロ糖鎖アスパラギンを有するアミノ酸配列（ＴＮ（ジフェナシル−ジシアロ糖鎖）ＹＳＶＴＤＬＮＹ）を、Ｂｏｃ固相合成法により作製した際のＨＰＬＣプロファイルのグラフを示す。
【図３】図３は、本発明の一実施の態様である、インターロイキン３（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ３：ＩＬ−３）をモデルペプチドとした、二分岐ジシアロ糖鎖アスパラギンを有するアミノ酸配列（ＳＬＱＮ（ジフェナシル−ジシアロ糖鎖）ＡＳＡＩＥＳ）を、Ｂｏｃ固相合成法により作製する方法のフローを示す模式図である。
【図４】図４は、本発明の一実施の態様である、インターロイキン３（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ３：ＩＬ−３）をモデルペプチドとした、二分岐ジシアロ糖鎖アスパラギンを有するアミノ酸配列（ＳＬＱＮ（ジフェナシル−ジシアロ糖鎖）ＡＳＡＩＥＳ）を、Ｂｏｃ固相合成法により作製した際のＨＰＬＣプロファイルのグラフを示す。
【図５】図５は、本発明の一実施の形態である、エリスロポエチンをモデルペプチドとした、二分岐ジシアロ糖鎖アスパラギンを有するアミノ酸配列の製造方法の工程の一部を示す模式図である。具体的には、エリスロポエチンのアミノ酸配列１−２１番目のアミノ酸配列を有するフラグメントＡと、エリスロポエチンのアミノ酸配列２２−４９番目のアミノ酸配列を有するフラグメントＢとを連結させ、フラグメント（Ａ＋Ｂ）を作製する工程を示す模式図である。
【図６】図６は、本発明の一実施の形態である、エリスロポエチンをモデルペプチドとした、二分岐ジシアロ糖鎖アスパラギンを有するアミノ酸配列の製造方法の工程の一部を示す模式図である。具体的には、エリスロポエチンのアミノ酸配列９８−１２７番目のアミノ酸配列を有するフラグメントＥと、エリスロポエチンのアミノ酸配列１２８−１６６番目のアミノ酸配列を有するフラグメントＦとを連結させ、フラグメント（Ｅ＋Ｆ）を作製する工程、および、フラグメント（Ｅ＋Ｆ）のＮ末端のチアゾリジン型システインをシステインへ変換する工程を示す模式図である。
【図７】図７は、本発明の一実施の形態である、エリスロポエチンをモデルペプチドとした、二分岐ジシアロ糖鎖アスパラギンを有するアミノ酸配列の製造方法の工程の一部を示す模式図である。具体的には、エリスロポエチンのアミノ酸配列９８−１６６番目のアミノ酸配列を有するフラグメント（Ｅ＋Ｆ）と、エリスロポエチンのアミノ酸配列７９−９７番目のアミノ酸配列を有するフラグメントＤとを連結させ、フラグメント（Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）を作製する工程、フラグメント（Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）のＮ末端のチアゾリジン型システインをシステインへ変換する工程、および、糖鎖シアル酸上のフェナシル基およびＴｒｐの保護基であるホルミル基（ＣＨＯ）を除去する工程を示す模式図である。
【図８】図８は、本発明の一実施の形態である、エリスロポエチンをモデルペプチドとした、二分岐ジシアロ糖鎖アスパラギンを有するアミノ酸配列の製造方法の工程の一部を示す模式図である。具体的には、エリスロポエチンのアミノ酸配列７９−１６６番目のアミノ酸配列を有するフラグメント（Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）と、エリスロポエチンのアミノ酸配列５０−７８番目のアミノ酸配列を有するフラグメントＣとを連結させ、フラグメント（Ｃ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）を作製する工程、ライゲーションに用いたシステインをアラニンへ還元する工程、および、フラグメント（Ｃ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）のＮ末端のチアゾリジン型システインをシステインへ変換する工程を示す模式図である。
【図９】図９は、本発明の一実施の形態である、エリスロポエチンをモデルペプチドとした、二分岐ジシアロ糖鎖アスパラギンを有するアミノ酸配列の製造方法の工程の一部を示す模式図である。具体的には、エリスロポエチンのアミノ酸配列５０−１６６番目のアミノ酸配列を有するフラグメント（Ｃ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）と、エリスロポエチンのアミノ酸配列１−４９番目のアミノ酸配列を有するフラグメント（Ａ＋Ｂ）とを連結させ、フラグメント（Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）を作製する工程を示す模式図である。
【図１０】図１０は、本発明の一実施の形態である、エリスロポエチンをモデルペプチドとした、二分岐ジシアロ糖鎖アスパラギンを有するアミノ酸配列の製造方法の工程の一部を示す模式図である。具体的には、エリスロポエチンのアミノ酸配列１−１６６番目のアミノ酸配列を有するフラグメント（Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）において、ライゲーションに用いたシステインをアラニンへ変換する工程を示す摸式図である。
【図１１】図１１は、本発明の一実施の形態である、エリスロポエチンをモデルペプチドとした、二分岐ジシアロ糖鎖アスパラギンを有するアミノ酸配列の製造方法の工程の一部を示す模式図である。具体的には、エリスロポエチンのアミノ酸配列１−１６６番目のアミノ酸配列を有するフラグメント（Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）において、システインの保護基を脱保護する工程を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書において、「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸のみならずアミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えば、天然タンパク原性Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β−アラニン、オルニチンなどの天然非タンパク原性アミノ酸；及びアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられることを理解するであろう。非天然アミノ酸の例として、α−メチルアミノ酸（α−メチルアラニンなど）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン及びα−メチル−ヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。好ましい態様において、本発明の化合物に含まれるアミノ酸は、非天然アミノ酸を含む。
【００２２】
本明細書において、「糖鎖」とは、単位糖（単糖及び／又はその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される単糖類及び多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸並びにそれらの複合体及び誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解又は誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。糖鎖は直鎖型であっても分岐鎖型であってもよい。
【００２３】
また、本明細書において、「糖鎖」には糖鎖の誘導体も含まれ、糖鎖の誘導体としては、例えば、糖鎖を構成する糖が、カルボキシル基を有する糖（例えば、Ｃ−１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルクロン酸））、アミノ基又はアミノ基の誘導体（例えば、アセチル化されたアミノ基）を有する糖（例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなど）、アミノ基及びカルボキシル基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ−アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２−デオキシ−Ｄ−リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などである糖鎖が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２４】
また、本明細書において、糖鎖の誘導体には、糖鎖の還元末端に他の化合物が脱水縮合等により結合した化合物も含む。例えば、アスパラギン結合型糖鎖において、糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにさらに化合物が結合した構造を挙げることができる。その他の糖鎖に対する誘導体の場合にも、同様に還元末端に化合物を付加することができる。
糖鎖の誘導体としては、糖鎖の還元末端に、アミノ酸が付加されたもの（糖鎖付加アミノ酸）や、ペプチド、タンパク質、リンカー、蛍光基、脂質、低分子化合物、放射性化合物などが付加されたものも含む。アミノ酸は、天然のアミノ酸のみならずアミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。アミノ酸、ペプチド、タンパク質等は、これらに含まれる水酸基、アミノ基、カルボキシル基のような官能基の一部ないし全部を保護基で保護したものであってもよい。水酸基の保護基としては、例えば、メチル基、ベンジル基、ベンゾイル基、アセチル基、トリメチルシリル（ＴＭＳ）基、トリエチルシリル（ＴＥＳ）基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳまたはＴＢＤＭＳ）基などを挙げることができる。アミノ保護基としては、例えば、脂溶性保護基として、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基などの、カーボネート系またはアミド系の保護基等を挙げることができる。
【００２５】
本明細書中において、好ましい糖鎖は、医薬品となる糖タンパク質の製造という観点からは、生体内で複合糖質（糖ペプチド（又は糖タンパク質）、プロテオグリカン、糖脂質等）として存在する糖鎖であり、好ましくは、生体内で糖ペプチド（又は糖タンパク質）としてペプチド（又はタンパク質）に結合している糖鎖であるＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖等である。Ｎ−結合型糖鎖は、糖鎖がタンパク質に結合する際の結合形式として、糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにおけるアノマー性水酸基が、アスパラギン側鎖のアミノ基（−ＮＨ２）との間で脱水縮合をして結合する糖鎖の総称であり、Ｏ−結合型糖鎖は、糖鎖がタンパク質に結合する際の結合形式として、糖鎖の還元末端のアノマー性水酸基が、セリンまたはスレオニン側鎖の水酸基（−ＯＨ）との間で脱水縮合をして結合する糖鎖の総称である。
Ｎ−結合型糖鎖は、アスパラギン結合型糖鎖、糖アスパラギン、Ｎ−型糖鎖等と呼ばれることもある。Ｎ−結合型糖鎖は、Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮａｃ（β１−４）ＧｌｃＮａｃを基本骨格の母核とする糖鎖群である。また、糖鎖の分岐構造としても、２分岐型、３分岐型、４分岐型などの多分岐型構造が知られており、そのような分岐構造を有する糖鎖も含まれる。これらの糖鎖の構造は、例えば、生化学辞典（第３版、株式会社東京化学同人発行）等にも記載されている。
【００２６】
なお、Ｎ−結合型複合型糖鎖としては、上記糖鎖にＦｕｃ（フコース）やＧｎ（Ｎ−アセチルグルコサミン）が結合した化合物も存在することが知られており、そのような化合物も含まれる。より具体的には、還元末端のＧｎに対して、Ｆｕｃがα１，６結合することや、還元末端のＧｎに結合したＭａｎの４位にＧｎがβ１，４結合すること、分岐部分のＧｎにＦｕｃがα１，３またはα１，４結合することが知られている。また、上記糖鎖の分岐部分における結合様式が、Ｇｎ（β１，６）Ｍａｎに代えて、Ｇｎ（β１，４）ＭａｎまたはＧｎ（β１，２）Ｍａｎである化合物、Ｇｎ（β１，４）Ｍａｎに代えて、Ｇｎ（β１，２）Ｍａｎである化合物や、シアル酸が結合する部分における、Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌの一部がＳｉａ（α２，６）Ｇａｌに代えてＳｉａ（α２，３）Ｇａｌである化合物や、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌの一部がＳｉａ（α２，３）Ｇａｌに代えてＳｉａ（α２，６）Ｇａｌである化合物などのグリコシド結合の結合様式が異なる糖鎖も含まれる。
なお、本明細書中において、ＧｎまたはＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを、Ｍａｎはマンノースを、Ｇａｌはガラクトースを示す。
【００２７】
本明細書において「糖鎖付加アミノ酸」とは、糖鎖が結合したアミノ酸をいい、例えば上述のような、Ｎ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖等を挙げることができる。糖鎖とアミノ酸はリンカーを介して結合していてもよい。糖鎖とアミノ酸との結合部位に特に制限はないが、糖鎖の還元末端にアミノ酸が結合していることが好ましい。
糖鎖が結合するアミノ酸の種類は特に限定されないが、好ましくはＡｓｎ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ等が挙げられ、より好ましくはＡｓｎである。
【００２８】
糖鎖とアミノ酸がリンカーを介して結合する場合、リンカーの種類は特に限定されないが、例えば、−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ａ−ＣＨ２−（式中、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０〜４の整数を示す。）、Ｃ１−１０ポリメチレン、−ＣＨ２−Ｒ−（式中、Ｒは、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、炭素環基、置換された炭素環基、複素環基及び置換された複素環基からなる群より選択される基から水素原子が１つ脱離して生ずる基である）等を挙げることができる。
【００２９】
本明細書において、「シアリル糖鎖」とは、上記の糖鎖の非還元末端の少なくとも１つにシアル酸を有する糖鎖をいう。よって、例えば、４分岐のアスパラギン結合型糖鎖であれば、非還元末端に１以上のシアル酸を有するテトラシアロ体、トリシアロ体、ジシアロ体、モノシアロ体を含み、３分岐のアスパラギン結合型糖鎖であれば、非還元末端に１以上のシアル酸を有するトリシアロ体、ジシアロ体、モノシアロ体を含み、２分岐のアスパラギン結合型糖鎖であれば、非還元末端に１以上のシアル酸を有するジシアロ体、モノシアロ体を含む。また、シアル酸が存在する非還元末端の位置は限定されない。
【００３０】
本明細書において、「シアル酸」とは、ノイラミン酸（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）のアミノ基やヒドロキシ基が置換された物質を総称するファミリー名である。なお、「ノイラミン酸」とは、分子内にアミノ基及びカルボキシル基を有する特殊な９炭糖であり、下記式で表される。
【化７】
2012121206.tif 000008
シアル酸の構造として、上記ノイラミン酸に対する、アミノ基の置換としては、アミノ基のアセチル化、グライコリル化などが知られている他、アミノ基が脱離したデアミノ化などが知られており、ヒドロキシ基の置換としては、アセチル化、メチル化、リン酸化、ラクチル化などが知られているが、これらに限定されない。
本明細書において、天然に存在する糖鎖を付加するという観点からは、糖鎖非還元末端に存在するシアル酸として、天然に最も多く存在するＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、次に多く存在するＮ−グライコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）が好ましい。特に、ヒトの糖タンパク質として天然に存在する糖鎖を付加するという観点からは、Ｎ−アセチルノイラミン酸がより好ましい。
【００３１】
本明細書において「シアリル糖鎖付加アミノ酸」とは、上記の糖鎖付加アミノ酸であって、糖鎖の非還元末端の少なくとも１つにシアル酸を有するシアリル糖鎖が結合したアミノ酸をいう。
本発明に使用されるシアリル糖鎖付加アミノ酸は、天然物から精製し加工したものや、発現系において合成させた糖タンパク質を精製したもの、または、化学的または酵素的に合成したもの等を用いることができ、また、これらに対してさらに糖鎖伸長反応を行ったもの等を用いることができる。糖鎖伸長反応は、希望する糖鎖構造のグリコシド結合様式に合わせて、当該グリコシド結合の形成を触媒する酵素を選択し、糖鎖を構成する糖の結合順序に応じて、これらを順次行うことにより、製造することができる。
【００３２】
天然物からシアリル糖鎖付加アミノ酸を単離する方法としては、例えば、特開第２００３−１２８７０３号に開示の方法が挙げることができ、その開示は、全体として本明細書に組み込まれる。本発明者らが開発したこの方法によれば、種々の単離された糖鎖アスパラギン誘導体を従来に比べて非常に容易かつ大量に得ることができる。
この方法は例えば
（ａ）１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程、
ならびに
（ｂ）該糖鎖アスパラギン誘導体混合物または該糖鎖アスパラギン誘導体混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、
を含む、糖鎖アスパラギン由来の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法である。
この糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法は、たとえば、天然の糖タンパク質に由来する糖鎖アスパラギン、好ましくはアスパラギン結合型糖鎖から得られる糖鎖アスパラギンの混合物に含まれる当該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入（結合）して糖鎖アスパラギン誘導体の混合物を得た後に当該混合物を各糖鎖アスパラギン誘導体に分離することを１つの大きな特徴とする。
【００３３】
また、本発明に使用するシアリル糖鎖付加アミノ酸を取得するために、天然物から単離した、または、化学的・酵素的に合成された糖鎖付加アミノ酸に対して、当業者に周知の方法により糖鎖非還元末端にシアル酸を付加させることもできる。例えば、ＣＭＰ−シアル酸とシアル酸転移酵素を用いることで、シアル酸を糖鎖の非還元末端に転位させて、シアリル糖鎖付加アミノ酸を作製できる。
【００３４】
本明細書において、「シアル酸転移酵素」とは、糖転移酵素の一種であり、糖供与体（ドナー基質ともいう。）であるＣＭＰ−シアル酸から、糖受容体（受容体基質ともいう。）である糖鎖構造にシアル酸残基を転移する反応（以下、「シアル酸転移反応」という。）を触媒する酵素をいう。シアル酸転移酵素は、糖鎖の非還元末端にシアル酸を転移させることが知られている。シアル酸転移反応は、以下の反応式により示すことができる。糖鎖の代わりに糖鎖の誘導体を用いる場合には、式中の糖鎖を糖鎖の誘導体に置き換えることができる。
【数１】
2012121206.tif 000009
［式中、シアル酸−糖鎖は、糖鎖の非還元末端にシアル酸がグリコシド結合した化合物を示す。］
【００３５】
シアル酸転移酵素としては、例えば、糖鎖の非還元末端に存在する、ガラクトースの３位や６位、Ｎ−アセチルガラクトサミンの６位、また、シアル酸の８位に転移することが知られている。例えば、ガラクトースの３位にシアル酸を転移する酵素はα−２，３シアル酸転移酵素、ガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミンの６位にシアル酸を転移する酵素はα−２，６シアル酸転移酵素、シアル酸の８位にさらにシアル酸を転移する酵素はα−２，８ポリシアル酸転移酵素と呼ばれている。
シアル酸転移酵素は、細菌由来のもののほか、ニジマス由来、哺乳類由来のものなどが知られており、また植物からはシアル酸転移酵素様の活性を有するタンパク質が見いだされている。特に、天然に存在する糖鎖を付加するという観点からは、哺乳類由来のものが好ましく、ヒトの糖タンパク質として天然に存在する糖タンパク質またはその糖鎖を製造するという観点から、ヒト由来のものがより好ましい。
α−２，６シアル酸転移酵素については、ヒト由来のものとして、例えば、ガラクトースの６位に転移する酵素としてＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ（ＳＴ６Ｇａｌ１と表記することもある、以下同様。）及びＳＴ６Ｇａｌ−ＩＩが、またＮ−アセチルガラクトサミンの６位に転移する酵素としてＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−ＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−ＩＩＩ及びＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−ＩＶが知られている。
α−２，３シアル酸転移酵素については、ヒト由来のものとして、例えば、ガラクトースの３位に転移する酵素としてＳＴ３Ｇａｌ−Ｉ〜ＳＴ３Ｇａｌ−ＶＩが知られている。
【００３６】
本明細書において、「ＣＭＰ−シアル酸」とは、シチジン５’−モノホスフォシアル酸を意味し、シアル酸の２位のヒドロキシ基とＣｙｔｉｄｉｎｅ  Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＣＭＰ）のリン酸基とが脱水縮合した構造を有するものをいう。ＣＭＰ−シアル酸において、シアル酸をより具体的に特定したものとして、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ）、ＣＭＰ−Ｎ−グライコリルノイラミン酸（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ｇｃ）等が挙げられる。本明細書において、天然に存在する糖タンパク質またはその糖鎖を製造するという観点から、本発明に用いるＣＭＰ−シアル酸としては、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ）、ＣＭＰ−Ｎ−グライコリルノイラミン酸（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ｇｃ）が好ましく、特に、ヒトの糖タンパク質として天然に存在する糖タンパク質またはその糖鎖を製造するという観点から、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ）がより好ましい。
また、本発明において、シアル酸とは、シアル酸の誘導体も含み、シアル酸の誘導体が糖鎖の非還元末端に結合したものも使用することができる。シアル酸誘導体としては、シアル酸の７位、８位或いは９位の炭素に結合している水酸基を水素原子或いはハロゲン原子で置換したものを挙げることができる。ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素等を挙げることができるが、好ましくはフッ素がよい。
また、シアル酸誘導体は、「ＣＭＰ−シアル酸誘導体」を作製することで、上記の転位酵素を用いて糖鎖の非還元末端に転位させることができる。シアル酸誘導体の糖鎖の非還元末端への転移は、例えば、国際公開公報第２００４／０５８９８４号パンフレットに記載されており、その開示は、全体として本明細書に組み込まれる。
【００３７】
本発明の一態様において、シアル酸を有する糖鎖付加アミノ酸がアスパラギン結合型糖鎖である場合には、非還元末端の少なくとも１つにシアル酸を有していれば、分岐構造を有していても、有していなくてもよい。また、分岐構造は、特に限定されず、二分岐、三分岐、四分岐から選択される。また、アスパラギン結合型糖鎖が分岐構造を有している場合には、少なくとも非還元末端の１つにシアル酸を有していればよく、非還元末端の数に応じて、１つ、２つ、３つ、または全てにシアル酸を有していてもよい。
【００３８】
本発明の一態様において、シアル酸を有する糖鎖付加アミノ酸がアスパラギン結合型糖鎖である場合には、一つの糖鎖に、４個以上、例えば５個以上、７個以上、特に９個以上の糖を有する糖鎖であることが好ましい。
【００３９】
本発明の好ましい一態様において、シアル酸を有する糖鎖付加アミノ酸がアスパラギン結合型糖鎖である場合には、一つの糖鎖に、５〜１１個、９〜１１個又は９個の糖を有する糖鎖である。
【００４０】
本発明の好ましい一態様において、シアル酸を有する糖鎖付加アミノ酸がアスパラギン結合型糖鎖である場合は、下記式（７）により表わされる糖鎖である。
【化８】
2012121206.tif 000010
〔式中、Ｒ３およびＲ４は、一方が式（３）であり、他方が、水素原子、式（３）〜（６）で示される基である。〕
【化９】
2012121206.tif 000011
【化１０】
2012121206.tif 000012
【化１１】
2012121206.tif 000013
【化１２】
2012121206.tif 000014
【００４１】
上記のような方法で得られたシアリル糖鎖付加アミノ酸は、本発明の固相合成法に用いる前に、アミノ酸のアミノ基がＢｏｃ基により保護され、かつ、糖鎖上の非還元末端に位置するシアル酸のカルボキシル基がフェナシル基により保護されるように調製される。
【００４２】
本明細書において、「フェナシル」とは、下記式で表される（但し、ここで、Ｘは水素原子である。）。
【化１３】
2012121206.tif 000015
また、本発明に適したフェナシルの誘導体としては、上記式において、Ｘ＝Ｃｌ，Ｂｒであるものなどが挙げられる。
本明細書において、「フェナシル基」とは、下記式で表わされる。
【化１４】
2012121206.tif 000016
シアリル糖鎖付加アミノ酸のアミノ基へのＢｏｃ基の導入は、従来周知の方法により導入することができる。例えば、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｂｏｃ−ＯＳｕ）あるいはジ−ｔｅｒｔ−ブチル  ジカルボネート［（Ｂｏｃ）２Ｏ］をＤＭＳＯ中、塩基（例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等）存在下にて加えることにより導入することができる。反応条件は特に限定されず、例えば、室温で、数時間（１〜５時間）程度で導入することができる。
なお、天然物にＢｏｃを導入することで、Ｂｏｃ−シアリル糖鎖付加アミノ酸誘導体を単離した場合には、直接Ｂｏｃ−シアリル糖鎖付加アミノ酸誘導体へフェナシル基を導入することで、本発明の固相合成法に使用することができる。
シアリル糖鎖付加アミノ酸誘導体へのフェナシル基の導入は、例えば、糖鎖付加アミノ酸誘導体を予め５ｍＭの炭酸セシウムにて溶解したのち凍結乾燥を行い、得られた凍結乾燥粉末に対してＤＭＦ、次いでフェナシルブロミドを添加、室温で６時間以上攪拌することで導入できる。炭酸セシウムで溶解した際のｐＨとしては、３〜８の範囲内とすることが好ましく、３〜４．５の範囲とすることがより好ましく、３．６とすることが最も好ましい。
【００４３】
また、例えば、糖鎖を含む天然の糖鎖混合物へＦｍｏｃを導入し、単離されたＦｍｏｃ−シアリル糖鎖付加アミノ酸誘導体を原料とする場合には、
（ａ）Ｆｍｏｃ−シアリル糖鎖付加アミノ酸誘導体のシアル酸のカルボキシル基をフェナシル基で保護する工程と、
（ｂ）前記Ｆｍｏｃ−シアリル糖鎖付加アミノ酸誘導体のＦｍｏｃを脱離する工程と、
（ｃ）前記工程により得られたシアリル糖鎖付加アミノ酸にＢｏｃ基を導入する工程とを含む方法により、アミノ酸のアミノ基がＢｏｃ基により保護され、かつ、シアル酸のカルボキシル基がフェナシル基により保護された、シアリル糖鎖付加アミノ酸誘導体を製造することができる。
なお、上記（ａ）〜（ｃ）の工程は、本明細書に記載の方法、または従来周知の方法により、行うことができる。
【００４４】
上記のようにして得られたシアル酸がフェナシル基で保護されたＢｏｃ−シアリル糖鎖付加アミノ酸誘導体をＢｏｃ固相合成に用いることで、糖鎖非還元末端にシアル酸を有する糖ペプチドを直接提供することができる。
【００４５】
（固相合成法）
本発明の固相合成は、公知の方法またはそれに準ずる方法に従って行うことができる。
例えば、糖鎖付加されていないフラグメントは、以下の（１）〜（４）の工程によって任意のアミノ酸配列に合成することができる。
（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、Ｂｏｃ基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシル基をエステル化反応させる。この場合アミノ酸のアミノ基窒素をＢｏｃ基で保護しているので、アミノ酸同士の自己縮合は防止され、レジンの水酸基とアミノ酸のカルボキシル基が反応してエステル化が起こる。
（２）上記で得られたエステルのＢｏｃ基を脱離して遊離アミノ基を形成させる。
（３）以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を１回以上行う。これにより、任意の数の任意のアミノ酸が連結し、Ｃ末端にレジンが結合し、Ｎ末端に遊離アミノ基を有するペプチドが得られる。
（ｉ）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させる。
（ｉｉ）上記Ｂｏｃ基を脱離して遊離アミノ基を形成させる。
（４）酸でレジンを切断する。
【００４６】
また、糖鎖が付加されたフラグメントの場合は、例えば、国際公開第２００４／００５３３０号パンフレット（ＵＳ２００５２２２３８２（Ａ１））に記載された方法を用いることができ、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。
具体的には、上記（１）〜（３）の工程により、Ｃ末端側から糖鎖付加されるアミノ酸の手前まで合成した後、Ｂｏｃ基でアミノ基窒素が保護され、かつ、シアル酸のカルボキシル基がフェナシル基で保護されたシアリル糖鎖付加アミノ酸誘導体のカルボキシル基と（３）の遊離アミノ基をアミド化反応させ、次に、シアリル糖鎖付加アミノ酸誘導体のＢｏｃ基を脱離して遊離アミノ基を形成させる。
その後、上記（３）を必要な回数繰り返し、最後に酸で樹脂を切断することにより、任意の位置に糖鎖が付加された任意のアミノ酸配列を有するシアリル糖鎖付加ペプチドを得ることができる。
【００４７】
なお、上記（１）において、水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、Ｂｏｃ基でアミノ基窒素が保護され、かつシアル酸のカルボキシル基がフェナシル基で保護されたたシアリル糖鎖付加アミノ酸誘導体のカルボキシル基をエステル化反応させれば、Ｃ末端アミノ酸に糖鎖が付加されたシアリル糖鎖付加ペプチドを得ることができる。
また、Ｂｏｃ基でアミノ基窒素が保護されたシアリル糖鎖付加アミノ酸誘導体を結合した直後に合成を終了し、酸で樹脂を切断すれば、Ｎ末端アミノ酸に糖鎖が付加されたシアリル糖鎖付加ペプチドを得ることができる。
なお、シアリル糖鎖付加アミノ酸を連結させる工程は、少なくとも１回以上の任意の回数含むことができる。また、複数回含む場合には、シアリル糖鎖付加アミノ酸を連結させる工程を連続させてもよいし、連続していなくてもよく、目的とする糖ペプチドのアミノ酸配列において、任意の箇所に付加できるよう適宜設定することができる。
なお、本発明の一態様においては、目的とする糖タンパク質をいくつかのフラグメントに分けて、各フラグメントをそれぞれ合成し、ライゲーション法によって連結させて作製することもできる。
【００４８】
本発明の好ましい一態様において、製造されるシアリル糖鎖の構造は、実質的に均一とすることができる。本明細書において、糖鎖の構造が実質的に均一であるとは、シアリル糖鎖を有する糖ペプチド間で比較した場合に、糖鎖付加部位、糖鎖を構成する各糖の種類、結合順序、及び糖間の結合様式が同一であることをいい、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の糖鎖の構造が均一であることを言う。糖鎖が均一である糖ペプチドは、品質が一定であり、特に医薬品の製造や、アッセイなどの分野において好ましい。均一な糖鎖の割合は、例えば、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動、ＮＭＲ、質量分析等を用いた方法によって測定することが可能である。糖鎖構造が均一な糖鎖の製造に関しては、国際公開番号第０３／００８４３１号パンフレット（ＵＳ２００４１８１０５４（Ａ１））、国際公開第２００４／０５８９８４号パンフレット（ＵＳ２００６２２８７８４（Ａ１））、国際公開第２００４／０５８８２４号パンフレット（ＵＳ２００６００９４２１（Ａ１））、国際公開第２００４／０７００４６号パンフレット（ＵＳ２００６２０５０３９（Ａ１））、国際公開第２００７／０１１０５５号パンフレットに記載されており、その開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
【００４９】
水酸基を有する樹脂（レジン）としては、通常、固相合成で使用する水酸基を有する樹脂（レジン）であればよく、例えば、Ａｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ樹脂（メルク社製）、Ｗａｎｇ樹脂（メルク社製）、ＨＭＰＡ−ＰＥＧＡ樹脂（メルク社製）、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ樹脂（メルク社製）等を用いることができる。固相合成の後にチオエステル化するという観点からは、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ樹脂が好ましい。
【００５０】
アミノ酸としては全てのアミノ酸を用いることができ、例えば、天然アミノ酸である、セリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）を挙げることができる。また、非天然アミノ酸としては、例えば、Ｄ−アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β−アラニン、オルニチンなどが挙げられる。
【００５１】
本発明の固相合成法は、アミノ酸のアミノ基の保護基として、Ｂｏｃ基で保護し、固相合成後、酸性条件下でＢｏｃ基を脱離するため、塩基性に弱い非天然アミノ酸を使用して糖ペプチドを合成することが可能である。なお、本明細書において、「塩基に弱い非天然アミノ酸」とは、塩基性条件下、特に、Ｆｍｏｃ固相合成法におけるＦｍｏｃの脱離条件下において、化学結合が切れる等により化学構造が崩れてしまう非天然アミノ酸をいう。さらに、Ｂｏｃ固相合成法は、上記のように塩基を利用しないため、塩基に弱いペプチドチオエステルを直接固相合成で作製することができる。
Ｂｏｃ基を導入するには、上記のシアリル糖鎖付加アミノ酸への導入条件と同様の条件により行うことができる。
なお、脂溶性保護基としてＢｏｃ基を用いる固相合成法を、Ｂｏｃ固相合成法と呼ぶ。
【００５２】
Ｂｏｃ基で保護したアミノ酸としては、上記のアミノ酸を上記の方法で製造することができる。また、市販のものも使用することができる。例えば、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ、Ｂｏｃ−Ａｓｎ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ、Ｂｏｃ−Ｉｌｅ、Ｂｏｃ−Ａｌａ、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ、Ｂｏｃ−Ａｓｐ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ、Ｂｏｃ−Ｍｅｔ、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ、Ｂｏｃ−Ｐｒｏを挙げることができる。また、Ｂｏｃ基で保護した非天然アミノ酸としては、アミノ酸の保護と同様の方法で製造することができる。また、市販のものも使用することができる。
また、脂溶性保護基で保護したアミノ酸であって、側鎖に保護基を導入したものとして、例えば、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（ｄｉ−Ｚ）、Ｂｏｃ−Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（Ｂｎ）、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（Ｂｎ）、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（ＤＮＰ）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｎ）、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｎ）、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）等を挙げることができる。
なお、本明細書において、Ｔｈｚは、Ｃｙｓのチアゾリジン型（Ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）を示す。また、（ｄｉ−Ｚ）はジカルボベンゾキシ基（Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ−（ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−）を示し、（Ｘａｎ）はキサンチル基を示し、（Ｂｎ）はベンジル基を示し、（Ａｃｍ）はアセトアミドメチル基を示し、（ｔＢｕ）はｔｅｒｔ−ブチル基を示し、（Ｔｒｔ）はトリチル基を示し、（ＤＮＰ）は２、４−ジニトロフェニル基を示し、（Ｃｌ−Ｚ）は［（２−クロロフェニル）メトキシ］カルボニル基を示し、（ＣＨＯ）はホルミル基を示す。
【００５３】
エステル化触媒として、例えば１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）等の公知の脱水縮合剤を用いることができる。アミノ酸と脱水縮合剤との使用割合は、前者１重量部に対して、後者が、通常１〜１０重量部、好ましくは２〜５重量部である。
【００５４】
エステル化反応は、例えば、固相カラムにレジンを入れ、このレジンを溶剤で洗浄し、その後アミノ酸の溶液を加えることにより行うのが好ましい。洗浄用溶剤としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、塩化メチレン等を挙げることができる。アミノ酸を溶解する溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＭＦ、塩化メチレン等を挙げることができる。エステル化反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０分〜２時間程度、好ましくは５分〜１５分程度行うのが良い。
【００５５】
この時固相上の未反応の水酸基を無水酢酸等を用いてアセチル化してキャッピングすることも好ましい。
【００５６】
Ｂｏｃ基の脱離は、例えば酸で処理することにより行うことができる。酸としては、例えば１０％硫酸／ジオキサン溶液、５０％トリフルオロ酢酸／塩化メチレン、ｐ−トルエンスルホン酸／テトラヒドロフラン−塩化メチレン等を挙げることができる。
【００５７】
遊離アミノ基と、Ｂｏｃ基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させる反応は、活性化剤および溶媒の存在下行うのが好ましい。
活性化剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣ／ＨＣｌ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ジエチルシアノホスホネート（ＤＥＰＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、ヒドロキシフタルイミド（ＨＯＰｈｔ）、ペンタフルオロフェノール（Ｐｆｐ−ＯＨ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスホネート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロジ−４−オキサ−１，２，３−ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ）等を挙げることができる。
【００５８】
活性化剤の使用量は、Ｂｏｃ基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸に対して、０．８〜１０当量、好ましくは０．８〜２当量、さらに好ましくは、０．９５当量とするのが好ましい。
【００５９】
溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、塩化メチレン等を挙げることができる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０分〜２時間程度、好ましくは５分〜１５分程度行うのが良い。
【００６０】
樹脂（レジン）からペプチド鎖を切断するには酸で処理するのが好ましい。酸としては、例えばトリフルオロ酢酸／トリフルオロメタンスルホン酸（ＴｆＯＨ）、弗化水素（ＨＦ）、メタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸／トリフルオロメタンスルホン酸／ジメチルスルフィド／ｍ−クレゾールの混合酸等の超強酸を挙げることができる。
本発明において用いる糖鎖は、その糖鎖上の水酸基を保護してもよい。保護基としては、例えば、アセチル基、トリエチルシリル基等を挙げることができる。好ましくは、合成した糖ペプチドから切断する時に同時に酸で処理できる保護基が好ましい。例えば、トリエチルシリル基を挙げることができる。
【００６１】
また、本発明においては、固相合成法にマイクロウェーブ法を用いることが好ましい場合もある。マイクロウェーブ法とは、例えば、Ｂａｃｓａ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（２００８）７３：７５３２−７５４２に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。
マイクロウェーブ法は、アミノ酸縮合工程や脱保護工程の際にマイクロウェーブを照射して、分子内の凝集や二次構造の形成、保護基による立体的障害等に基づく問題を解消する方法であり、通常の方法では合成しにくいペプチド、特に長鎖ペプチドを合成する際に有用である。マイクロウェーブ照射の条件は、反応時に熱やエネルギーがかかることにより副反応が生じるのを防ぐよう、アミノ酸配列に依存して当業者が適宜決定することができる。
【００６２】
（Ｃ末端のチオエステル化）
また、本発明の一態様においては、目的の糖タンパク質をライゲーションにより連結して製造するための糖ペプチドフラグメントを作製することができる。すなわち、ライゲーションを行うために、製造されたシアリル糖鎖を有する糖ペプチドフラグメントのＣ末端をチオエステル化、すなわちＣ末端にα−カルボキシチオエステル部分を形成させることができる。Ｃ末端に−Ｃ（＝Ｏ）−ＳＲにより表されるα−カルボキシチオエステル部分を有するペプチドフラグメント（又は糖ペプチドフラグメント）の製造方法は、公知の方法又はそれに準ずる方法を用いることができる。かかる方法は、例えば、国際公開第９６／３４８７８号パンフレット（米国特許第６１８４３４４号明細書）に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。
ここで、Ｒはチオール交換反応を阻害せず、カルボニル炭素への求核置換反応において脱離基となる基であれば特に限定されないが、好ましくはベンジルメルカプタン等のベンジル型、チオフェノール、４−（カルボキシメチル）−チオフェノール等のアリール型、２−メルカプトエタンスルホン酸塩、３−メルカプトプロピオン酸アミド等のアルキル型等から選択することができる。
【００６３】
Ｃ末端にα−カルボキシチオエステル部分を有するペプチドフラグメントを製造する方法として、具体的には、例えば固相からペプチドを切り出す際にチオエステル化を行う方法や、固相からペプチドを切り出した後にペプチドのＣ末端カルボキシル基をチオエステル化する方法等が挙げられる。固相からペプチドを切り出す際にチオエステル化する方法としては、例えば固相樹脂にＳａｆｅｔｙ  Ｃａｔｃｈ  Ｌｉｎｋｅｒ（スルファミドリンカー）を用いてペプチドを製造し、チオール化合物を作用させる方法が知られている（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，（１９９９）１２１：１１３６９−１１３７４、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，（２００５）４４：１６５０−１６５４）。
しかしながら、上記の方法は、スルファミドリンカーをアルキル化させる必要があるが、このアルキル化の効率が悪く、また使用する樹脂が高価であるという制限がある。
その他、Ｃ末端にα−カルボキシチオエステル部分を有するペプチドフラグメントを製造する方法としては、固相合成の開始時に、チオエステル体を樹脂に結合させておくことで、樹脂からペプチドを切り出した際にチオエステル体を得る方法がある。この方法は、脂溶性保護基の脱離反応に塩基が必要なＦｍｏｃ固相合成法では適用することができないが、本発明のＢｏｃ固相合成法においては適用可能である。例えば、樹脂にメルカプトプロピオン酸をチオエステル結合させた後に、アミノ酸を連結させていくことで、樹脂から作製されたペプチドを切り離した際に、ペプチドチオエステルを作成することができる。
【００６４】
なお、本発明の一態様においては、糖ペプチドフラグメントを調製する工程と、糖ペプチドフラグメントのＣ末端をチオエステル化する工程が、同時に行われてもよい。
糖ペプチドフラグメントを調製する工程と、糖ペプチドフラグメントのＣ末端をチオエステル化する工程を同時に行う方法としては、例えば各糖ペプチドフラグメントのＣ末端側にインテインのアミノ酸配列を付加した融合タンパク質を調製し、インテイン反応によってインテインを切断するのと同時にフラグメントのＣ末端をチオエステル化することができる。かかる方法は、たとえば、Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒａｎ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００６）Ｖｏｌ．３  Ｎｏ．６  ４２９−４３８）記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【００６５】
また、糖ペプチドフラグメントは、ＫＣＬ法で連結させることもできる。ＫＣＬ法を用いる場合、第一の糖ペプチドフラグメントのＣ末端のチオエステルを、第二の糖ペプチドフラグメントのＣ末端のチオエステルよりも脱離能が高いチオエステルとして用意する必要がある。こうすることで、反応速度の違いによって第一の糖ペプチドフラグメントのＣ末端側に第二の糖ペプチドフラグメントを結合させることができ、逆に連結した副産物等が生成するのを抑制することができる。
一般に、チオール基の反応性は、アリールチオール基>ベンジル型チオール基>アルキル型チオール基の順であるので、この順序に基づいて、一方のペプチドフラグメントのＣ末端に、他方のペプチドフラグメントのＣ末端より反応性の高いチオール基を用意する。
例えば、第一の糖ペプチドフラグメントのＣ末端をチオフェニルエステル、第二の糖ペプチドフラグメントのＣ末端をエチルチオエステルとする組み合わせ；第一の糖ペプチドフラグメントのＣ末端を４−メルカプトフェニルチオエステル（ＭＰＡＡ）、第二の糖ペプチドフラグメントのＣ末端をベンジルチオエステルとする組み合わせ；第一の糖ペプチドフラグメントのＣ末端をチオフェニルエステル、第二の糖ペプチドフラグメントのＣ末端をメルカプトエタンスルホニルエステルとする組み合わせ、等が好ましい。
【００６６】
また、糖ペプチドフラグメントのＮ末端Ｃｙｓの−ＳＨ基は、所望により保護基により保護されていてもよい。例えば、−ＳＨ基をチアゾリジンとして保護してもよい。この保護基はライゲーション反応までの所望の時点で脱保護する。例えばジスルフィド基等、ライゲーションが起こる条件において自然に脱保護される保護基であれば、脱保護せずにそのまま以下のライゲーション反応に用いることもできる。ジスルフィド基は、その後のライゲーション法の反応条件下で容易に脱保護される。
【００６７】
（ライゲーション法による連結工程）
本発明の一態様において、本発明の製造方法により製造された糖ペプチドフラグメントは、他のペプチドフラグメントまたは他の糖ペプチドフラグメントと当業者に周知の方法により連結させることができる。なお、他のペプチドフラグメントおよび他の糖ペプチドフラグメントとしては、Ｂｏｃ固相合成法に限られず、Ｆｍｏｃ固相合成法、その他の化学合成、生合成等、当業者に公知の方法により得られたフラグメントを用いることができる。
例えば、２つの糖ペプチドフラグメントを、必要に応じ、４−メルカプトフェニル酢酸、ベンジルメルカプタン、チオフェノール等の触媒チオールの存在下、１００ｍＭリン酸緩衝溶液等の溶液中で混合する。好ましくは、第一の糖ペプチドフラグメント１当量に対し第二の糖ペプチドフラグメントを０．５〜２当量及び触媒チオールを５当量程度の割合で反応を行う。反応はｐＨ６．５〜７．５程度、２０〜４０℃程度の条件下、約１〜３０時間程度行うのが望ましい。反応の進行は、ＨＰＬＣ、ＭＳ等を組み合わせた公知の手法を用いて確認することができる。
【００６８】
これに、トリス２−カルボキシエチルホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）のような還元剤を加えて副反応を抑制し、所望により精製することで、第一のペプチドフラグメントと第二のペプチドフラグメントとを連結することができる。
【００６９】
また、ＫＣＬ法は、Ｋｅｎｔが報告したもので、反応速度論的制御をしたＮＣＬ法である（Ｋｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００６，４５，３９８５−３９８８）。ＮＣＬ法では、連結する２つのフラグメントのうち、一方のＣ末端をカルボキシル基とし、もう一方のＣ末端をチオエステル化し、チオエステル化したフラグメントのＣ末端側にもう一方のフラグメントが結合させる方法である。これに対し、ＫＣＬ法は、連結するフラグメントの両方がチオエステル化されている場合に用いることができ、より脱離能の高いチオエステルが連結反応に供される。
【００７０】
上述のとおり、チオール基の反応性は、概して、アリールチオール基>ベンジル型チオール基>アルキル型チオール基の順である。従って、Ｃ末端のチオエステル−Ｃ（＝Ｏ）−ＳＲにおいては、Ｒがアリール基であるものがもっとも脱離能が高く、Ｒがベンジル基であるもの、Ｒがアルキル基であるものがこれに次ぐ。これに基づいて各フラグメントのチオエステルを決定すれば、所望の順序で各フラグメントを連結することができる。例えば、一方をチオフェニルエステル、他方をエチルチオエステルとすれば、まずチオフェニルエステルが連結反応に供され、Ｃ末端にエチルチオエステルを有するペプチドが得られる。一方を４−メルカプトフェニルチオエステル（ＭＰＡＡ）、他方をベンジルチオエステルとすれば、ＭＰＡＡが先に反応してＣ末端にベンジルチオエステルを有するペプチドが得られ、一方をチオフェニルエステル、他方をメルカプトエタンスルホニルエステルとすれば、チオフェニルエステルが先に反応してＣ末端にメルカプトエタンスルホニルエステルを有するペプチドが得られる。
このように、ＫＣＬ法によって得られたペプチド鎖はＣ末端にチオエステルを有するので、当該ペプチド鎖を、そのまま別のフラグメントとのライゲーションに用いることができる。
【００７１】
（フォールディング工程）
また、本発明の別の態様では、シアリル糖鎖を有する糖ペプチドを製造した後、フラグメントを連結し、フォールディング工程を行って、適切な高次構造をとるように処理してもよい。
フォールディング工程は、種々の公知の方法を用いることができるが、たとえば、フォールディングバッファー中での透析によって行うことができる。フォールディングバッファーは、たとえば、グアニジン等のグアニジノ基を有する化合物又はその塩を含み、ｐＨは６．０〜９．０であってもよい。透析は、複数回行ってもよく、その場合各透析処理のバッファーの組成やｐＨは同一であっても異なっていてもよい。
ポリペプチドがフォールディングしたことは、ポリペプチドの立体構造を解析する任意の方法で確認することができ、例えば、ジスルフィドマッピング法、立体構造エピトープに特異的な抗体への結合性の評価、Ｘ線解析などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００７２】
なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
【００７３】
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【００７４】
実施例１．Ｂｏｃ−ジフェナシル−ジシアロ糖鎖アスパラギン（Ｂｏｃ−ｄｉｐｈｅｎａｃｙｌ−ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ−ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）の合成
（Ｉ）Ｆｍｏｃ−ジフェナシル−ジシアロ糖鎖アスパラギン（Ｆｍｏｃ−ｄｉｐｈｅｎａｃｙｌ−ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ−ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）の合成
Ｆｍｏｃ−ジシアロ糖鎖アスパラギン（Ｆｍｏｃ−ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ−ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）（２０ｍｇ）を２ｍｌの冷水に溶かし、Ｆｍｏｃ−ジシアロ糖鎖アスパラギンを溶解させた冷水をＤｏｗｅｘ−５０×８（Ｈ＋）の樹脂（１０．５ｃｍ×５ｃｍ）に通し、溶出した溶液を凍結乾燥した。凍結乾燥した溶液を１０ｍｌの水に溶かし、５ｍＭの炭酸セシウム（Ｃｓ２ＣＯ３）水溶液を用いて溶液のｐＨが３．６となるように調製した。その後、溶液を再度凍結乾燥した。凍結乾燥後のＦｍｏｃ−ジシアロ糖鎖アスパラギンを乾燥ＤＭＦ（４ｍｌ）に溶かし、フェナシルブロミド（５．７ｍｇ）を加えた。８時間後、この混合溶液に対して、ジエチルエーテル（２０ｍｌ）を加え、目的物を析出させた。これをろ紙でろ過した。残った沈殿を集め、沈殿に水：アセトニトリル＝７：３の溶液を加えて溶かし、ＨＰＬＣによって精製した。以上の操作により、目的のＦｍｏｃ−ジフェナシル−ジシアロ糖鎖アスパラギンを得ることができた（１６ｍｇ、収率７６％）。
Ｆｍｏｃ−ｄｉｐｈｅｎａｃｙｌ−ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ−ａｓｐａｒａｇｉｎｅ  
ＥＳＩ−ＭＳ：  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１１９Ｈ１６６Ｎ８Ｏ６８  ：  ２７９６．６  ［Ｍ＋Ｈ］＋，  １３９９．３  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋；  ｆｏｕｎｄ：  ２７９８．２  ［Ｍ＋Ｈ］＋，  １３９９．６  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋．【００７５】
（ＩＩ）Ｂｏｃ−ジフェナシル−ジシアロ糖鎖アスパラギン（Ｂｏｃ−ｄｉｐｈｅｎａｃｙｌ−ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ−ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）の合成
Ｆｍｏｃ−ジフェナシル−ジシアロ糖鎖アスパラギン（Ｆｍｏｃ−ｄｉｐｈｅｎａｃｙｌ−ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ−ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）（２０ｍｇ）に対し、１−メチルピロリジン（７５μＬ）、ヘキサメチレンイミン（２μＬ）、および、ＨＯＢｔ（２ｍｇ）を溶かした乾燥ＤＭＦ（１００μＬ）を加え、常温で撹拌し、溶解させた。３０分後、ジエチルエーテルをさらに加え、Ｆｍｏｃが脱離したジフェナシル−ジシアロ糖鎖アスパラギンを析出させた。沈殿物を回収し、ジエチルエーテルをとばした後、沈殿物を蒸留水に溶かした。沈殿物を溶解させた蒸留水をＳｈｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５に通し精製した後、溶出した溶液を凍結乾燥した。得られたジフェナシル−ジシアロ糖鎖アスパラギンをＤＭＦ（１ｍＬ）に溶かし、Ｂｏｃ２Ｏ（４．８μＬ）を加え常温で撹拌することで、Ｂｏｃ基を導入した。４時間後、ジエチルエーテルを加え、沈殿を集めた。沈殿を、５０ｍＭ酢酸アンモニウム：水＝８２：１７に溶解し、ＨＰＬＣによって精製した。以上の操作により、目的のＢｏｃ−ジフェナシル−ジシアロ糖鎖アスパラギンを得ることができた（１３ｍｇ、収率６８％）。
Ｂｏｃ−ｄｉｐｈｅｎａｃｙｌ−ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏ−ａｓｐａｒａｇｉｎｅ  
ＥＳＩ−ＭＳ：  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１０９Ｈ１６４Ｎ８Ｏ６８  ：  ２６７４．５  ［Ｍ＋Ｈ］＋，  １３３８．２  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋；  ｆｏｕｎｄ：  ２６７５．８  ［Ｍ＋Ｈ］＋，  １３３８．４  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋．【００７６】
実施例２．糖ペプチドチオエステル体の合成  （ＴＮ（ジフェナシル−ジシアロ糖鎖）ＹＳＶＴＤＬＮＹ−ＳＲ）
Ｉ）ペプチド鎖の調製
固相合成はプロスチレンカラム（東京理科、  Ｎｏ．１８３  ４７０）を用いて行った。プロスチレンカラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ樹脂（５０μｍｏｌ、１．６７ｇ）を入れ、ＤＭＦ溶媒に十分になじませた。その後、Ａｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ樹脂に対し、Ｓ−トリチル−３−メルカプトプロピオン酸（Ｓ−ｔｒｉｔｙｌ−３−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ）（２００μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１９０μｍｏｌ）、および、ＤＩＰＥＡ（８００μｍｏｌ）をＤＭＦに溶かした溶液を加え、常温で撹拌した。３０分後、ＤＭＦとＤＣＭで樹脂を洗い、９５％ＴＦＡ、５％ＴＩＰＳを加えた。２分後、溶液を濾過し、再度ＴＦＡとＴＩＰＳを加え、２分後、樹脂をＤＭＦで洗浄した。この樹脂に対して、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＢｎ）−ＯＨ（２００ｍＭ）、ＨＢＴＵ（１９０ｍＭ）、ＤＩＰＥＡ（４００ｍＭ）をＤＭＦに溶かした混合溶液を樹脂に加えることで一残基目のアミノ酸のチロシンを縮合させた。２０分後、樹脂をＤＭＦ、ジオキサンで順次洗った。この樹脂に対して、１０％硫酸／ジオキサン溶液を加え、５分後濾過し、さらに同じ溶液を加え３０分撹拌することでＢｏｃ基の脱保護を行った。以降のアミノ酸（Ｂｏｃ−Ａｓｎ（Ｘａｎ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｎ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（ＯＢｎ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＢｎ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＢｎ）−ＯＨ）も同様の方法で縮合した。【００７７】
ＩＩ）シアリル糖鎖付加アミノ酸の縮合、その後のアミノ酸縮合
ペプチドチオエステルを伸長した樹脂（２μｍｏｌ）のＢｏｃ基を上記の方法で脱保護した後、ＤＭＦで洗い、５％ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦを加えた。１分後、ＤＭＦでしっかり洗い、Ｂｏｃ−ジフェナシル−ジシアロ糖鎖アスパラギン（４μｍｏｌ）、ＤＥＰＢＴ（６μｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（４μｍｏｌ）をＤＭＦに溶かした溶液を加え、常温で撹拌した。１４時間後、樹脂をＤＭＦでしっかり洗った。以降のペプチド伸長（Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＢｎ）−ＯＨ）は糖鎖水酸基の副反応を防ぐため、アミノ酸４０ｍＭの濃度で上記と同様の方法で縮合を行った。【００７８】
ＩＩＩ）アミノ酸側鎖の脱保護と樹脂からの切り出し
樹脂をＤＣＭで洗った後、ＴＦＡ（３５０μＬ）、ＤＭＳ（２１０μＬ）、ｍ−クレゾール（７０μＬ）、およびＴｆＯＨ（７０μＬ）を含む、０℃に冷やしたカクテルを加え、０℃で撹拌した。３０分後、溶液を濾過し、樹脂をＴＦＡ、ジエチルエーテル、ＤＭＦ、ＤＣＭ、ＴＦＡの順で洗い、再度、上記のカクテルを同量加え、０℃で撹拌した。２時間後、溶液を濾過し、ＴＦＡ、ジエチルエーテル、ＤＭＦの順番で樹脂をしっかりと洗った。ＭＥＳＮａ（５ｍｇ）を６Ｍのグアニジン塩酸塩が入った２００ｍリン酸緩衝液（９５μＬ）に溶かし、この樹脂に加えた。１２時間後、溶出した溶液に含まれる化合物をＨＰＬＣにより分析、精製を行った。その結果、ジフェナシル−ジシアロ糖鎖アスパラギンを有し、ＴＮ（ジフェナシル−ジシアロ糖鎖）ＹＳＶＴＤＬＮＹ−ＳＲのアミノ酸配列を有する糖ペプチド（１）（配列番号１）を得ることができた。なお、前記のアミノ酸配列中、Ｎ（ジフェナシル−ジシアロ糖鎖）は糖鎖アスパラギンを示し、−ＳＲはスルホン酸エチルチオエステルを示す。【００７９】
実施例３．シアリル糖鎖を有する糖ペプチドチオエステル体の合成  （ＳＬＱＮ（ジフェナシル−ジシアロ糖鎖）ＡＳＡＩＥＳ−ＳＲ）
Ｉ）ペプチドチオエステル体の調製
固相合成はプロスチレンカラム（東京理科、  Ｎｏ．１８３  ４７０）を用いて行った。プロスチレンカラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ樹脂（５０μｍｏｌ、１．６７ｇ）を入れ、ＤＭＦ溶媒に十分になじませた。その後、Ａｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ樹脂に対し、Ｓ−トリチル−３−メルカプトプロピオン酸（Ｓ−ｔｒｉｔｙｌ−３−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ）（２００μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１９０μｍｏｌ）、および、ＤＩＰＥＡ（８００μｍｏｌ）をＤＭＦに溶かした溶液を加え、常温で撹拌した。３０分後、ＤＭＦとＤＣＭで樹脂をしっかり洗い、９５％ＴＦＡ、５％ＴＩＰＳを加えた。２分後、溶液をしっかりと濾過し、再度ＴＦＡとＴＩＰＳを加え、２分後、樹脂をＤＭＦでしっかり洗った。この樹脂に対して、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＢｎ）−ＯＨ（２００ｍＭ）、ＨＢＴＵ（１９０ｍＭ）、ＤＩＰＥＡ（４００ｍＭ）をＤＭＦに溶かした混合溶液を樹脂に加えることで一残基目のアミノ酸のセリンを縮合させた。２０分後、樹脂をＤＭＦ、ジオキサンで順次洗った。この樹脂に対して、１０％硫酸／ジオキサン溶液を加え、５分後濾過し、さらに同じ溶液を加え３０分撹拌することでＢｏｃ基の脱保護を行った。以降のアミノ酸（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｎ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＢｎ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ）も同様の方法で縮合した。【００８０】
ＩＩ）シアリル糖鎖付加アミノ酸の縮合、その後のアミノ酸縮合
ペプチドチオエステルを伸長した樹脂（２μｍｏｌ）のＢｏｃ基を上記の方法で脱保護した後、ＤＭＦで洗い、５％ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦを加えた。１分後、ＤＭＦでしっかり洗い、Ｂｏｃ−ジフェナシル−ジシアロ糖鎖アスパラギン（４μｍｏｌ）、ＤＥＰＢＴ（６μｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（４μｍｏｌ）をＤＭＦに溶かした溶液を加え、常温で撹拌した。１４時間後、樹脂をＤＭＦでしっかり洗った。上記の条件で再度糖鎖の縮合を行った。以降のペプチド伸長（Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＢｎ）−ＯＨ）は糖鎖水酸基の副反応を防ぐため、アミノ酸４０ｍＭの濃度で上記と同様の方法で縮合を行った。【００８１】
ＩＩＩ）アミノ酸側鎖の脱保護と樹脂からの切り出し
樹脂をＤＣＭで洗った後、ＴＦＡ（３５０μＬ）、ＤＭＳ（２１０μＬ）、ｍ−クレゾール（７０μＬ）、およびＴｆＯＨ（７０μＬ）を含む、０℃に冷やしたカクテルを加え、０℃で撹拌した。３０分後、溶液を濾過し、樹脂をＴＦＡ、ジエチルエーテル、ＤＭＦ、ＤＣＭ、ＴＦＡの順で洗い、再度、上記のカクテルを同量加え、０℃で撹拌した。２時間後、溶液を濾過し、ＴＦＡ、ジエチルエーテル、ＤＭＦの順番で樹脂をしっかりと洗った。ＭＥＳＮａ（５ｍｇ）を６Ｍのグアニジン塩酸塩が入った２００ｍリン酸緩衝液（９５μＬ）に溶かし、この樹脂に加えた。１２時間後、溶出した溶液に含まれる化合物をＨＰＬＣにより分析、精製を行った。その結果、ジフェナシル−ジシアロ糖鎖アスパラギンを有するＳＬＱＮ（ジフェナシル−ジシアロ糖鎖）ＡＳＡＩＥＳ−ＳＲのアミノ酸配列を有する糖ペプチド（２）（配列番号２）を得ることができた。なお、前記のアミノ酸配列中、Ｎ（ジフェナシル−ジシアロ糖鎖）は糖鎖アスパラギンを示し、−ＳＲはスルホン酸エチルチオエステルを示す。
Ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ−ｔｈｉｏｅｓｔｅｒ
ＥＳＩ−ＭＳ：  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１４３Ｈ２２２Ｎ１８Ｏ８３Ｓ２  ：  ３５８５．５，  ［Ｍ＋Ｈ］＋，  １７９３．８  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，  １１９６．２  ［Ｍ＋３Ｈ］３＋；  
ｆｏｕｎｄ：  ３５８６．９，  ［Ｍ＋Ｈ］＋，  １７９４．０  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，  １１９６．３  ［Ｍ＋３Ｈ］３＋．
試薬の略号：
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ，ＤＣＭ：ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ，ＨＯＢｔ：１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ，ＴＦＡ：ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ，ＤＥＰＢＴ：３−（Ｄｉｅｔｈｏｘｙ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）−３Ｈ−ｂｅｎｚｏ［ｄ］［１，２，３］ｔｒｉａｚｉｎ−４−ｏｎｅ，ＨＢＴＵ：２−（１Ｈ−Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ）−１，１，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ【００８２】
実施例４．エリスロポエチンの合成
（Ｉ）エリスロポエチンの合成スキームについて
天然のエリスロポエチンは、１６６個のアミノ酸配列を有し、２４位、３８位、および、８３位にアスパラギン（Ｎ）結合型の糖鎖を有し、１２６位にセリンに結合するＯ結合型糖鎖を有する。下記の実施例においては、天然のエリスロポエチンのアミノ酸配列において、２４位および３８位の糖鎖付加アスパラギンを糖鎖が付加していないアスパラギンに変換し、２１位のグルタミン酸をシステインに変換し、７８位のグルタミンをシステインに変換し、１２６位の糖鎖付加セリンを糖鎖が付加していないセリンに変換したアミノ酸配列であって、そのアミノ酸配列中の８３位にシアリル糖鎖アスパラギンを有する糖ペプチドを合成した。なお、２１位のグルタミン酸および７８位のグルタミンの代わりに挿入したシステインはライゲーションの連結部位に使用した。本実施例は、エリスロポエチンのアミノ酸配列における１−１６６個のアミノ酸を、１位−２１位までのアミノ酸を有するペプチドフラグメントＡ、２２位−４９位までのアミノ酸を有するペプチドフラグメントＢ、５０位−７８位までのアミノ酸を有するペプチドフラグメントＣ、７９位−９７位までのアミノ酸を有する糖鎖付加ペプチドフラグメントＤ、９８位−１２７位までのアミノ酸を有するペプチドフラグメントＥ、１２８位−１６６位までのアミノ酸を有するペプチドフラグメントＦの６つのフラグメントに分けて製造する方法を例示する。
より具体的には、下記の工程を含む製造方法を例示する：
（Ａ）下記式（８）で表わされるペプチドフラグメントＡ、下記式（９）で表わされるペプチドフラグメントＢ、下記式（１０）で表わされるペプチドフラグメントＣ、下記式（１１）で表わされる糖鎖付加ペプチドフラグメントＤ、下記式（１２）で表わされるペプチドフラグメントＥ、および、下記式（１３）で表わされるペプチドフラグメントＦを作成する工程。【００８３】
【化１５】
2012121206.tif 000017
（８）
【化１６】
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（９）
【化１７】
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（１０）
【化１８】
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（１１）
【化１９】
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（１２）
【化２０】
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（１３）【００８４】
なお、式中、Ｒ１は、Ａｃｍ基を示す。フラグメントＡ、フラグメントＢ、および、フラグメントＦは、天然のエリスロポエチンのアミノ酸配列における７位、２９位、３３位、１６１位に対応する位置に、それぞれＡｃｍ基を有するシステインを有する。また、Ｒ２は、ホルミル基（ＣＨＯ）を示す。フラグメントＤは、天然のエリスロポエチンのアミノ酸配列における８８位に対応する位置にホルミル基で保護されたトリプトファンを有する。また、Ｒ３は、隣接するＳ（硫黄）とともにスルホン酸エチルチオエステルを示し、Ｒ４は、フェニル基を示し、Ｒ５は、ベンジル基を示す。
各フラグメントにおいて、ライゲーションによる連結に使用するＣ末端はチオエステル化されている。また、各フラグメントにおいて、ライゲーションによる連結に使用するＮ末端はシステインを有する。また、上記式で表わされるペプチドフラグメントＣ、糖鎖付加ペプチドフラグメントＤ、およびペプチドフラグメントＥは、それぞれのＣ末端側におけるライゲーション工程において、副反応を避けるために、Ｎ末端側のシステインをチアゾリジン型にしている。【００８５】
上記フラグメントＢ、フラグメントＣ、糖鎖付加フラグメントＤ、フラグメントＥ、および、フラグメントＦのＮ末端のアミノ酸は、天然のエリスロポエチンのアミノ酸配列における２２位、５０位、７９位、９８位、および１２８位のアラニンとなる。しかしながら、本実施例においては、ライゲーション工程において、連結される側のフラグメントＮ末端にシステインを要求する。そのため、各製造例においてフラグメントＢ、フラグメントＣ、糖鎖付加フラグメントＤ、フラグメントＥ、および、フラグメントＦのＮ末端のアミノ酸を、アラニンの代わりにシステインとして合成している。アラニンの代わりに置換されたシステインは、各フラグメント同士のライゲーション後に、アラニンへと還元した。【００８６】
（Ｂ）フラグメントＡとフラグメントＢとをライゲーションにより連結させてフラグメント（Ａ＋Ｂ）を作成する工程（図５参照）。
なお、本明細書において、例えば、フラグメント（Ａ＋Ｂ）とは、フラグメントＡのＣ末端とフラグメントＢのＮ末端とを連結させることにより得られるフラグメントを示す。
（Ｃ）フラグメントＥとフラグメントＦとをライゲーションにより連結させてフラグメント（Ｅ＋Ｆ）を作成する工程および、フラグメント（Ｅ＋Ｆ）のＮ末端のチアゾリジン型のシステインをシステインに変換する工程（図６参照）。
（Ｄ）フラグメントＤとフラグメント（Ｅ＋Ｆ）とをライゲーションにより連結させてフラグメント（Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）を作成する工程、フラグメント（Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）のＮ末端のチアゾリジン型のシステインをシステインに変換する工程、ならびに、トリプトファン上のホルミル（ＣＨＯ）基、および、糖鎖シアル酸上のフェナシル基を除去する工程（図７参照）
（Ｅ）フラグメントＣとフラグメント（Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）とをライゲーションにより連結させてフラグメント（Ｃ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）を作成し、ライゲーションに用いたシステインをアラニンへ還元し、フラグメント（Ｃ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）のＮ末端のチアゾリジン型のシステインをシステインに変換する工程（図８参照）
（Ｆ）フラグメント（Ａ＋Ｂ）とフラグメント（Ｃ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）とをライゲーションにより連結させてフラグメント（Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）を作成する工程（図９参照）
（Ｇ）フラグメント（Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）において、ライゲーションに用いたシステインをアラニンへ還元する工程（図１０参照）。
（Ｈ）システインの保護基を脱保護する工程（図１１参照）【００８７】
（ＩＩ）  各ペプチドフラグメントの合成
（ＩＩ−１．  ペプチドフラグメントＡ−ＳＰｈの合成）
なお、本明細書において、ペプチドフラグメントＡ−ＳＰｈの「−ＳＰｈ」は、チオフェニルを意味する。すなわち、ペプチドフラグメントＡ−ＳＰｈとは、ペプチドフラグメントＡのＣ末端にチオフェニルを有することを意味する。
固相合成用カラムにＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ樹脂（メルク社製）（５０μｍｏｌ）を入れ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（０．２５ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．２７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１．２５ｍｌ）に溶解させた後、固相合成用カラムに入れ、２５℃で２時間攪拌した。【００８８】
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１ｍｌ）に溶解させ、ＨＯＢｔ（０．２５ｍｍｍｏｌ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（０．２５ｍｍｍｏｌ）を加え、５−１０分間活性化した後に、固相合成用カラムに加えた。マイクロウェーブを用いて、３７度で１５分間反応させた後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基およびＢｏｃ基で保護したアミノ酸（０．２５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。ただし、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）のアミノ酸のみマイクロウェーブを用いず、室温で１５分間反応させた。【００８９】
アミノ酸のアミノ基窒素をＦｍｏｃ基で保護したアミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａを順次用いて固相樹脂に連結させた。その結果、固相樹脂にＡｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ２の２１残基ペプチド（３）（配列番号３）を得た。【００９０】
上記で得られたペプチド（３）をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、トリフルオロエタノールと酢酸の混合溶液（１：１）を十分に樹脂が浸る程度加え、１２時間室温で撹拌することで、樹脂とペプチド３とを切り離した。切り離した樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣を濃縮し、アミノ酸の側鎖が保護されたペプチド（３）：Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ２を得た。【００９１】
２１残基のアミノ酸を有しており、かつ、アミノ酸側鎖が保護されたペプチド３を、２５ｍＬ相当ナスフラスコに移し、ＤＭＦ（２．５ｍＬ）に溶解させた。その後、窒素雰囲気下、−１５℃〜−２０℃に冷却した。このものにチオフェノール（１０．２μｌ，０．１ｍｍｏｌ）を加えた後、ＰｙＢＯＰ（５２．０ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）、続いて、ＤＩＰＥＡ（１８．０μｌ，０．１ｍｍｏｌ）を加えた。−２０℃において３時間攪拌した後、ジエチルエーテルを加え、ペプチドを沈殿させた。得られた残渣をトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を加え室温で撹拌した。２時間後、再度、この溶液を別途用意したジエチルエーテルに加え沈殿させた後、遠心分離を行い溶液部分を除くことで目的とするペプチドチオエステル体を含む残渣が得られた。この得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：Ｖｙｄａｃ（Ｃ１８）、φ１０ｘ２５０ｍｍ、流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液  Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ  グラジエント  Ａ：Ｂ＝７５：２５→２５：７５（３０分）ｌｉｎｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、Ｃ末端がチオフェニルエステルであるペプチドフラグメントＡ−ＳＰｈ（４）（配列番号４）：Ｈ２Ｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＳＰｈを得た。ＥＳＩ−ＭＳ：  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ  Ｃ１１６Ｈ１９０Ｎ３２Ｏ３０Ｓ２：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １２８９．５，［Ｍ＋３Ｈ］３＋  ８６０．０，［Ｍ＋４Ｈ］４＋  ６４５．３，ｆｏｕｎｄ  ｆｏｒ  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  １２８９．３，［Ｍ＋３Ｈ］３＋  ８６０．０，［Ｍ＋４Ｈ］４＋  ６４５．３．【００９２】
（ＩＩ−２．  ペプチドフラグメントＢ−ＳＢｎの合成）  
ペプチドフラグメントＢ−ＳＢｎは、上記ＩＩ−１．ペプチドフラグメントＡ−ＳＰｈの合成方法と同様の条件にて、Ｆｍｏｃ固相合成法により合成した。【００９３】
Ｆｍｏｃ基およびＢｏｃ基で保護したアミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）を順次用いて固相樹脂に連結させた。その結果、固相樹脂にＴｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＮＨ２の２８残基ペプチド（５）（配列番号５）を得た。【００９４】
上記で得られたペプチド（５）を上記ＩＩ−１．ペプチドフラグメントＡ−ＳＰｈの合成方法と同様の条件下で操作を行い、樹脂上から切り離し、アミノ酸の側鎖が保護されたペプチド（５）：Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＮＨ２を得た。【００９５】
２８残基ペプチドのアミノ酸を有しており、かつ、アミノ酸の側鎖が保護されたペプチド（５）を、２５ｍＬ相当ナスフラスコに移し、ＤＭＦ（２．５ｍＬ）に溶解させた。その後、窒素雰囲気下、−１５℃〜−２０℃に冷却した。このものにベンジルメルカプタン（１１．７μｌ，０．１ｍｍｏｌ）を加えた後、ＰｙＢＯＰ（５２．０ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）、続いて、ＤＩＰＥＡ（１８．０μｌ，０．１ｍｍｏｌ）を加えた。−２０℃において３時間攪拌した後、ジエチルエーテルを加え、ペプチドを沈殿させた。得られた残渣をトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を加え室温で撹拌した。２時間後、再度、この溶液を別途用意したジエチルエーテルに加え沈殿させた後、遠心分離を行い溶液部分を除くことで目的とするペプチドチオエステル体を含む残渣が得られた。この得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：Ｖｙｄａｃ（Ｃ１８）、φ１０ｘ２５０ｍｍ、流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液  Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ  グラジエント  Ａ：Ｂ＝７０：３０→２０：８０（３０分）ｌｉｎｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、Ｃ末端がチオベンジルエステルであるペプチドフラグメントＢ−ＳＢｎ（６）（配列番号６）：Ｈ２Ｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−ＳＢｎを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ  Ｃ１４４Ｈ２１９Ｎ３７Ｏ４８Ｓ４  ：  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋ １８６３．４，  ［Ｍ＋３Ｈ］３＋  １１２２．６，  ［Ｍ＋４Ｈ］４＋  ８４２．２，  ｆｏｕｎｄ  ｆｏｒ [Ｍ＋２Ｈ]２＋ １８６３．４, [Ｍ＋３Ｈ]３＋ １１２２．６, [Ｍ＋４Ｈ]４＋  ８４２．２．【００９６】
（ＩＩ−３．  ペプチドフラグメントＣ−ＳＲの合成）  
固相合成はプロスチレンカラム（東京理科、  Ｎｏ．１８３  ４７０）を用いて行った。プロスチレンカラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ樹脂（５０μｍｏｌ、１．６７ｇ）を入れ、ＤＭＦ溶媒に十分になじませた。その後、Ａｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ樹脂に対し、Ｓ−トリチル−３−メルカプトプロピオン酸（Ｓ−ｔｒｉｔｙｌ−３−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ）（２００μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１９０μｍｏｌ）、および、ＤＩＰＥＡ（８００μｍｏｌ）をＤＭＦに溶かした溶液を加え、常温で撹拌した。３０分後、ＤＭＦとＤＣＭで樹脂を洗い、９５％ＴＦＡ、５％ＴＩＰＳを加えた。２分後、溶液を濾過し、再度ＴＦＡとＴＩＰＳを加え、２分後、樹脂をＤＭＦで洗った。この樹脂に対して、Ｂｏｃ−Ａｌａ（２００ｍＭ）、ＨＢＴＵ（１９０ｍＭ）、ＤＩＰＥＡ（４００ｍＭ）をＤＭＦに溶かした混合溶液を樹脂に加えることで一残基目のアミノ酸のアラニンを縮合させた。２０分後、樹脂をＤＭＦ、ジオキサンで順次洗った。この樹脂に対して、１０％硫酸／ジオキサン溶液を加え、５分後濾過し、さらに同じ溶液を加え３０分撹拌することでＢｏｃ基の脱保護を行った。以降この操作を繰り返し、Ｂｏｃ基で保護したアミノ酸を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
Ｂｏｃ基で保護したアミノ酸として、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ(ｄｉ−Ｚ)、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ、Ｂｏｃ−Ａｌａ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ(Ｂｎ）、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ(Ｂｎ)、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ、Ｂｏｃ−Ａｌａ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ(ＣＨＯ)、Ｂｏｃ−Ｖａｌ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ(Ｂｎ)、Ｂｏｃ−Ｖａｌ、Ｂｏｃ−Ａｌａ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ(Ｂｎ)、Ｂｏｃ−Ｍｅｔ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ(ｄｉ−Ｚ)、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ(Ｃｌ−Ｚ)、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ(ＣＨＯ)、Ｂｏｃ−Ｔｈｚを順次用いて固相樹脂に連結させた。その結果、固相樹脂にＡｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ(ｄｉ−Ｚ)−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ(Ｂｎ)−Ｓｅｒ(Ｂｎ)−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ(ＣＨＯ)−Ｖａｌ−Ｇｌｕ(Ｂｎ)−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ(Ｂｎ)−Ｍｅｔ−Ａｒｇ(ｄｉ−Ｚ)−Ｌｙｓ(Ｃｌ−Ｚ)−Ｔｒｐ(ＣＨＯ)−Ｔｈｚ−ＮＨの２９残基ペプチド（７）（配列番号７）を得た。【００９７】
上記で得られた樹脂上のペプチド（７）をＤＣＭで洗った後、ＴＦＡ（４００μＬ）、ＴｆＯＨ（４０μＬ）、ＥＤＴ（２０μＬ）、およびＴｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ（４０μＬ）を含む、０℃に冷やしたカクテルを加え、０℃で撹拌した。３０分後、溶液を濾過し、樹脂をＴＦＡ、ジエチルエーテル、ＤＭＦ、ＤＣＭ、ＴＦＡの順で洗い、再度、上記のカクテルを同量加え、０℃で撹拌した。３０分後、溶液を濾過し、ＴＦＡ、ジエチルエーテル、ＤＭＦの順番で樹脂をしっかりと洗った。ＭＥＳＮａ（５ｍｇ）を６Ｍのグアニジン塩酸塩が入った２００ｍＭリン酸緩衝液（９５μＬ）に溶かし、この樹脂に加えた。１２時間後、目的とするペプチドチオエステル体を含む溶出溶液が得られた。この得られた溶液をＨＰＬＣで精製し、Ｃ末端がチオエステルであるペプチドフラグメントＣ−ＳＲ（８）（配列番号８）：ＨＮ−Ｔｈｚ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＳＲを得た。なお、−ＳＲは、スルホン酸エチルチオエステルを示す。
ＥＳＩ−ＭＳ：  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ  Ｃ１４５Ｈ２３５Ｎ４１Ｏ４２Ｓ４  ：  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  １６７７．５，  ［Ｍ＋３Ｈ］３＋  １１１８．６，  ［Ｍ＋４Ｈ］４＋  ８３９．２，  ｆｏｕｎｄ  ｆｏｒ  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  １６７７．５，  ［Ｍ＋３Ｈ］３＋  １１１８．６，  ［Ｍ＋４Ｈ］４＋  ８３９．２.【００９８】
（ＩＩ−４．シアル酸糖鎖を有する糖ペプチドフラグメントＤ−ＳＲの合成）  
上記ＩＩ−３．ペプチドフラグメントＣ−ＳＲの合成方法と同様に、Ｂｏｃ法による固相合成法を用い、アミノ酸セリン残基までＢｏｃ基で保護したアミノ酸を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
Ｂｏｃ基で保護したアミノ酸として、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ(Ｃｌ−Ｚ)、Ｂｏｃ−Ａｓｐ(Ｂｎ)、Ｂｏｃ−Ｖａｌ、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ(ＤＮＰ)、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ(Ｂｎ)、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ(ＣＨＯ)、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ(Ｂｎ)、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ(Ｂｎ)を順次用いて固相樹脂に連結させた。その結果、固相樹脂にＬｙｓ(Ｃｌ−Ｚ)−Ａｓｐ(Ｂｎ)−Ｖａｌ−Ｈｉｓ(ＤＮＰ)−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ(Ｂｎ)−Ｔｒｐ（ＣＨＯ)−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ（Ｂｎ）−Ｓｅｒ(Ｂｎ)のペプチドフラグメント（９）（配列番号９）を得た。【００９９】
上記で得たペプチドフラグメント（９）に対して１０％硫酸／ジオキサン溶液を加え、５分後濾過し、さらに同じ溶液を加え３０分撹拌することでＢｏｃ基の脱保護を行った。その後、ＤＭＦで洗い、５％ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦを加えた。１分後、ＤＭＦでしっかり洗い、Ｂｏｃ−ジフェナシル−ジシアロ糖鎖アスパラギン（４μｍｏｌ）、ＤＥＰＢＴ（６μｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（４μｍｏｌ）をＤＭＦに溶かした溶液を加え、常温で撹拌した。１４時間後、樹脂をＤＭＦでしっかり洗った。上記の条件で再度糖鎖の縮合を行った。その際、糖鎖水酸基の副反応を防ぐため、アミノ酸４０ｍＭの濃度で上記と同様の方法で縮合を行った。Ｂｏｃ基で保護したアミノ酸として、Ｂｏｃ−Ｖａｌ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ、Ｂｏｃ−Ｔｈｚを順次用いて固相樹脂に連結させた。その結果、固相樹脂にＬｙｓ(Ｃｌ−Ｚ)−Ａｓｐ(Ｂｎ)−Ｖａｌ−Ｈｉｓ(ＤＮＰ)−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ(Ｂｎ)−Ｔｒｐ(ＣＨＯ)−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ(Ｂｎ)−Ｓｅｒ(Ｂｎ)−Ａｓｎ(ジフェナシル−ジシアロ糖鎖)−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｚ−ＮＨの１９残基糖ペプチド（１０）（配列番号１０）を得た。【０１００】
上記で得られた樹脂上のペプチド（１０）をＤＣＭで洗った後、ＴＦＡ（３５０μＬ）、ＤＭＳ（２１０μＬ）、ｍ−クレゾール（７０μＬ）、およびＴｆＯＨ（７０μＬ）を含む、０℃に冷やしたカクテルを加え、０℃で撹拌した。３０分後、溶液を濾過し、樹脂をＴＦＡ、ジエチルエーテル、ＤＭＦ、ＤＣＭ、ＴＦＡの順で洗い、再度、上記のカクテルを同量加え、０℃で撹拌した。３０分後、溶液を濾過し、樹脂をＴＦＡ、ジエチルエーテル、ＤＭＦ、ＤＣＭ、ＴＦＡの順で洗い、再度、上記のカクテルを同量加え、０℃で撹拌した。２時間後、溶液を濾過し、ＴＦＡ、ジエチルエーテル、ＤＭＦの順番で樹脂をしっかりと洗った。ＭＥＳＮａ（５ｍｇ）を６Ｍのグアニジン塩酸塩が入った２００ｍＭリン酸緩衝液（９５μＬ）に溶かし、この樹脂に加えた。１２時間後、目的とするペプチドチオエステル体を含む溶出溶液が得られた。このものをＨＰＬＣで精製し、Ｃ末端がチオエステルであるペプチドフラグメントＤ−ＳＲ（１１）（配列番号１１）：ＨＮ−Ｔｈｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ(ジフェナシル−ジシアロ糖鎖)−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ(ＣＨＯ)−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−ＳＲを得た。なお、−ＳＲは、スルホン酸エチルチオエステルを示す。
ＥＳＩ−ＭＳ：  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ．ｆｏｒＣ２０３Ｈ３０６Ｎ３２Ｏ９５Ｓ３  ：  ［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １６０４．７，  ［Ｍ＋４Ｈ］４＋  １２０３．７，  ［Ｍ＋５Ｈ］５＋  ９６３．１，  ｆｏｕｎｄ  ｆｏｒ  ［Ｍ＋３Ｈ］３＋  １６０５．４，  ［Ｍ＋４Ｈ］４＋  １２０４．３，  ［Ｍ＋５Ｈ］５＋  ９６３．２．【０１０１】
（ＩＩ−５．  ペプチドフラグメントＥ−ＳＲの合成）
ペプチドフラグメントＥ−ＳＲは、上記ＩＩ−３．ペプチドフラグメントＣ−ＳＲの合成方法と同様の条件にて、Ｂｏｃ固相合成法により合成した。まず、糖鎖付加アミノ酸の連結直前となるセリン残基まで、Ｂｏｃ基で保護したアミノ酸を使用し、Ｃ末端側よりアミノ酸を順次縮合させた。
Ｂｏｃ基で保護したアミノ酸として、Ｂｏｃ−Ａｌａ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ(Ｂｎ)、Ｂｏｃ−Ａｌａ、Ｂｏｃ−Ａｌａ、Ｂｏｃ−Ａｓｐ(Ｂｎ)、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ(Ｂｎ)、Ｂｏｃ−Ｉｌｅ、Ｂｏｃ−Ａｌａ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ(Ｂｎ)、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ(Ｃｌ−Ｚ)、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ(Ｂｎ)、Ｂｏｃ−Ａｌａ、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ、Ｂｏｃ−Ａｌａ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ(ｄｉ−Ｚ)、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ(Ｂｎ)、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ(Ｂｎ)、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ(Ｂｎ)、Ｂｏｃ−Ａｒｇ(ｄｉ−Ｚ)、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ(Ｂｎ)、Ｂｏｃ−Ｖａｌ、Ｂｏｃ−Ｔｈｚを順次用いて固相樹脂に連結させた。その結果、固相樹脂にＡｌａ−Ｓｅｒ(Ｂｎ)−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ(Ｂｎ)−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ(Ｂｎ)−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ(Ｂｎ)−Ｌｙｓ(Ｃｌ−Ｚ)−Ｇｌｕ(Ｂｎ)−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ(ｄｉ−Ｚ)−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ(Ｂｎ)−Ｔｈｒ(Ｂｎ)−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ(Ｂｎ)−Ａｒｇ(ｄｉ−Ｚ)−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ(Ｂｎ)−Ｖａｌ−Ｔｈｚ−ＮＨの３０残基ペプチド（１２）（配列番号１２）を得た。【０１０２】
上記で得られた樹脂上のペプチド（１２）を上記ＩＩ−３．ペプチドフラグメントＣ−ＳＲの合成方法と同様の条件にて操作を行い樹脂上から切り出した。このものをＨＰＬＣで精製し、Ｃ末端がチオエステルであるペプチドフラグメントＥ−ＳＰｈ（１３）（配列番号１３）：ＨＮ−Ｔｈｚ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ＳＰｈを得た。なお、−ＳＲは、スルホン酸エチルチオエステルを示す。
ＥＳＩ−ＭＳ：  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１３１Ｈ２２６Ｎ３８Ｏ４４Ｓ３  ：  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  １５６７．８，  ［Ｍ＋３Ｈ］３＋  １０４５．５，  ｆｏｕｎｄ  ｆｏｒ  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  １５６８．０，  ［Ｍ＋３Ｈ］３＋  １０４５．６．【０１０３】
（ＩＩ−６．  ペプチドフラグメントＦ−ＯＨの合成）
ペプチドフラグメントＦ−ＯＨは、上記ＩＩ−１．ペプチドフラグメントＡ−ＳＰｈの合成方法と同様の条件にて、Ｆｍｏｃ固相合成法により合成した。
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）を順次用いて固相樹脂に連結させた。その結果、固相樹脂にＡｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＮＨ２の３９残基ペプチド（１４）（配列番号１４）を得た。【０１０４】
上記で得られた樹脂上のペプチド（１４）を一般的なＦｍｏｃ法で用いられる手法で樹脂から切り出しＨＰＬＣで精製することで、ペプチドフラグメントＦ（１５）（配列番号１５）：Ｈ２Ｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２０６Ｈ３３４Ｎ６２Ｏ５６Ｓ２  ：  ［Ｍ＋３Ｈ］３＋  １５４７．５，  ［Ｍ＋４Ｈ］４＋  １１６０．８，  ［Ｍ＋５Ｈ］５＋  ９２８．９，  ［Ｍ＋６Ｈ］６＋  ７７４．２，  ［Ｍ＋７Ｈ］７＋  ６６３．８，  ｆｏｕｎｄ  ｆｏｒ    ［Ｍ＋３Ｈ］３＋  １５４７．２，  ［Ｍ＋４Ｈ］４＋  １１６０．８，  ［Ｍ＋５Ｈ］５＋  ９２８．９，  ［Ｍ＋６Ｈ］６＋  ７７４．２，  ［Ｍ＋７Ｈ］７＋  ６６３．８．【０１０５】
（ＩＩＩ）  各フラグメントの連結によるジシアロ糖鎖付加エリスロポエチンの合成
上記で作製した各フラグメントの連結およびジシアロ糖鎖付加エリスロポエチンの合成は、以下に示す全１０工程により行った。
（ＩＩＩ−１．  第１工程  ペプチドフラグメントＥとペプチドフラグメントＦとの連結）
３０残基のＣ末端がチオフェニルエステル体であるペプチドフラグメントＥ（１３）（３．７ｍｇ）と３９残基のペプチドフラグメントＦ（１５）（２．５ｍｇ）の二種類を同じナスフラスコにいれ、ｐＨ６．８のバッファー溶液（０．４０ｍｌ）（６Ｍグアニジン塩酸液、０．２Ｍリン酸溶液、２０ｍＭトリスカルボキシエチルホスフィン溶液（ＴＣＥＰ溶液）にて調製）に溶解させた後、ＭＰＡＡ（２．７ｍｇ）を加え、室温で反応を行った。３時間後、反応をＨＰＬＣで確認した後、反応溶液にメトキシアミン溶液を加え、ｐＨ４．０に調製し、室温で反応を行うことにより、Ｎ末端のチアゾリジン型のシステインをシステインへ変換した。２時間後、ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：Ｖｙｄａｃ（Ｃ１８）、φ１０ｘ２５０ｍｍ、流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液  Ａ液：０．１％ＴＦＡ水  Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、Ａ：Ｂ＝７５：２５→２５：７５（３０分）ｌｉｎｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、目的とするペプチドフラグメント（Ｅ＋Ｆ）（１６）（配列番号１６）を得た（図６）。
ＥＳＩ−ＭＳ：  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３３４Ｈ５５４Ｎ１００Ｏ９７Ｓ３    ：  ［Ｍ＋４Ｈ］４＋  １９０５．７，  ［Ｍ＋５Ｈ］５＋  １５２４．８，  ［Ｍ＋６Ｈ］６＋  １２７０．８，  ［Ｍ＋７Ｈ］７＋  １０８９．４，  ［Ｍ＋８Ｈ］８＋  ９５３．４，  ［Ｍ＋９Ｈ］９＋  ８４７．５，  ［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋  ７６２．９，  ｆｏｕｎｄ  ｆｏｒ  １９０６．０，  １５２５．０，  １２７１．０，  １０８９．７，  ９５３．７，  ８４７．８，  ７６３．２．【０１０６】
（ＩＩＩ−２．  第２工程  ペプチドフラグメントＤとペプチドフラグメント（Ｅ＋Ｆ）との連結）
１９残基のＣ末端がチオエステル体のジシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメントＤ（１１）（３．８ｍｇ）と上記第１工程で得られたペプチドフラグメント（Ｅ＋Ｆ）（１６）（６．０ｍｇ）の二種類を同じナスフラスコにいれ、ｐＨ６．８のバッファー溶液（０．４０ｍｌ）（６Ｍグアニジン塩酸液、０．２Ｍリン酸溶液、４０ｍＭＴＣＥＰ溶液にて調製）に溶解させた。その後、ＭＰＡＡ（２．７ｍｇ）を加え、室温で反応を行った。ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、反応が終了しているのを確認した後、２−メルカプトエタノール（３．０μＬ）（０．２Ｍリン酸溶液、ｐＨ８．０、６０μＬに加え調製）を加え、室温で反応を行うことにより、フェナシル基およびホルミル基の脱保護を行った。２時間後、塩酸を用いて中和した後、反応溶液にメトキシアミン溶液を加え、ｐＨ４．０に調製し、室温で反応を行うことにより、チアゾリジン型のシステインをシステインへ変換した。３時間後、ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：Ｖｙｄａｃ（Ｃ１８）、φ１０ｘ２５０ｍｍ、流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液  Ａ液：０．１％ＴＦＡ水  Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、Ａ：Ｂ＝７５：２５→２５：７５（３０分）ｌｉｎｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、目的とする糖鎖付加ポリペプチドフラグメント（Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）（１７）（配列番号１７）を得た（図７）。
ＥＳＩ−ＭＳ：  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ  Ｃ５１７Ｈ８４２Ｎ１３２Ｏ１８６Ｓ４  ［Ｍ＋７Ｈ］７＋ １７１６．９，  ［Ｍ＋８Ｈ］８＋  １５０２．４，  ［Ｍ＋９Ｈ］９＋  １３３５．６，  ［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋  １２０２．１，  ［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋  １０９２．９，  ［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋  １００１．９，  ［Ｍ＋１３Ｈ］１３＋  ９２４．９，  ［Ｍ＋１４Ｈ］１４＋  ８５９．０，  ｆｏｕｎｄ  １７１７．２， １５０２．８，  １３３５．９，  １２０２．４，  １０９３．３，  １００２．２，  ９２５．１，  ８５８．７．【０１０７】
（ＩＩＩ−３．  第３工程  ペプチドフラグメントＣと糖鎖付加ペプチドフラグメント（Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）との連結）
２９残基のＣ末端がチオエステル体のペプチドフラグメントＣ（８）（１．３４ｍｇ）と上記第２工程で得られた、糖鎖付加ポリペプチドフラグメント（Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）（１７）（４．８ｍｇ）の二種類を同じナスフラスコにいれ、ｐＨ６．８のバッファー溶液（０．４０ｍｌ）（６Ｍグアニジン塩酸液、０．２Ｍリン酸溶液、４０ｍＭＴＣＥＰ溶液にて調製）に溶解させた。その後、ＭＰＡＡ（１．４ｍｇ）を加え、室温で反応を行った。ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した後、反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：Ｖｙｄａｃ（Ｃ１８）、φ１０ｘ２５０ｍｍ、流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液  Ａ液：０．１％ＴＦＡ水  Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、Ａ：Ｂ＝７０：３０→２０：８０（３０分）ｌｉｎｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、目的とする糖鎖付加ポリペプチドフラグメント（Ｃ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）（１８）（配列番号１８）を得た（図８）。
ＥＳＩ−ＭＳ：  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ  Ｃ６６１Ｈ１０７１Ｎ１７３Ｏ２３５Ｓ６    ：  ［Ｍ＋８Ｈ］８＋  １９０５．３，  ［Ｍ＋９Ｈ］９＋  １６９３．７，  ［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋  １５２４．４，  ［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋  １３８５．９，  ［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋  １２７０．５，  ［Ｍ＋１３Ｈ］１３＋  １１７２．９，  ［Ｍ＋１４Ｈ］１４＋  １０８９．１，  ［Ｍ＋１５Ｈ］１５＋  １０１６．６，  ［Ｍ＋１６Ｈ］１６＋  ９５３．１，  ［Ｍ＋１７Ｈ］１７＋  ８９７．１，  ｆｏｕｎｄ  １９０５．１，  １６９３．８，  １５２４．５，  １３８５．９，  １２７０．７，  １１７３．０，  １０８９．２，  １０１６．７，  ９５３．２，  ８９７．２．【０１０８】
（ＩＩＩ−４．第４工程  ＣｙｓのＡｌａへの還元）
上記第３工程で得られた、エリスロポエチンのアミノ酸配列における７９、９８、１２８位に相当する位置のＣｙｓに遊離チオール基を有し、エリスロポエチンのアミノ酸配列における８３位に相当する位置のＡｓｎにジシアロ糖鎖を有する１１７残基の糖鎖付加ペプチドフラグメント（Ｃ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）（１８）（３．８ｍｇ）をナスフラスコに入れ、ｐＨ７．０のバッファー溶液（１．０ｍｌ）（６Ｍグアニジン塩酸液、０．２Ｍリン酸溶液にて調製）に溶解させた後、ｐＨ７．０のトリスエチルカルボキシホスフィン（ＴＣＥＰ）（１３０ｍｇ）、ＭＥＳＮａ（５０ｍｇ）、ＶＡ−０４４（１．６ｍｇ）を加え、室温にて反応させた。１０時間後、ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：Ｖｙｄａｃ（Ｃ１８）、φ１０ｘ２５０ｍｍ、流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液  Ａ液：０．１％ＴＦＡ水  Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、Ａ：Ｂ＝７０：３０→２０：８０（３０分）ｌｉｎｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、目的とする糖鎖付加ペプチドフラグメント（Ｃ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）（１９）（配列番号１９）を得た（図８）。
ＥＳＩ−ＭＳ：  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ  Ｃ６６１Ｈ１０７１Ｎ１７３Ｏ２２５Ｓ３  ：  ［Ｍ＋９Ｈ］９＋  １６８３．９，  ［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋  １５１４．８，  ［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋  １３７７．２，  ［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋  １２６２．５，  ［Ｍ＋１３Ｈ］１３＋  １１６５．５，  ［Ｍ＋１４Ｈ］１４＋  １０８２．３，  ［Ｍ＋１５Ｈ］１５＋  １０１０．２，  ［Ｍ＋１６Ｈ］１６＋  ９４７．１，  ［Ｍ＋１７Ｈ］１７＋  ８９１．５，    ［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋  ８４２．０，  ｆｏｕｎｄ  １６８３．１，  １５１４．９，  １３７７．２，  １２６２．７，  １１６５．６，  １０８２．３，  １０１０．３，  ９４７．２，  ８９１．６，  ８４２．１．【０１０９】
（ＩＩＩ−５．第５工程  脱Ｔｈｚ反応）
上記第４工程で得られた、エリスロポエチンのアミノ酸配列における８３位に相当する位置のＡｓｎにジシアロ糖鎖を有する１１７残基の糖鎖付加ポリペプチド（Ｃ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）（１９）（２．０ｍｇ）をｐＨ６．８のバッファー溶液（０．０５ｍｌ）（０．２Ｍリン酸溶液にて調製）に溶解させた後、反応溶液に０．２Ｍメトキシアミン溶液を加え、ｐＨ４．０に調製し、室温で反応を行った。３時間後、反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：Ｖｙｄａｃ（Ｃ１８）、φ１０ｘ２５０ｍｍ、流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液  Ａ液：０．１％ＴＦＡ水  Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、Ａ：Ｂ＝７５：２５→３０：７０（３０分）ｌｉｎｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、目的とする糖鎖付加ペプチドフラグメント（Ｃ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）（２０）（配列番号２０）を得た（図８）。
ＥＳＩ−ＭＳ：  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ  Ｃ６６０Ｈ１０７１Ｎ１７３Ｏ２２５Ｓ３  ： ［Ｍ＋９Ｈ］９＋  １６８１．６，  ［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋  １５１３．６， ［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋  １３７６．０，  ［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋  １２６１．５，  ［Ｍ＋１３Ｈ］１３＋  １１６４．５，  ［Ｍ＋１４Ｈ］１４＋  １０８１．４，  ［Ｍ＋１５Ｈ］１５＋  １００９．４，  ［Ｍ＋１６Ｈ］１６＋  ９４６．４，  ［Ｍ＋１７Ｈ］１７＋  ８９０．８，［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋  ８４１．３， ｆｏｕｎｄ  １６８１．６，  １５１３．６，  １３７６．０，  １２６１．４，  １１６４．４，  １０８１．３，  １００９．４，  ９４６．３，  ８９０．７，  ８４１．３．【０１１０】
（ＩＩＩ−６．  第６工程  ペプチドフラグメントＡとペプチドフラグメントＢとの連結）
２１残基のＣ末端がチオフェニルエステル体であるペプチドフラグメントＡ（４）（２．０ｍｇ）と２８残基のペプチドフラグメントＢ（６）（２．７ｍｇ）の二種類を同じナスフラスコにいれ、ｐＨ６．５のバッファー溶液（０．４０ｍｌ）（６Ｍグアニジン塩酸液、０．２Ｍリン酸溶液、３０ｍＭトリスカルボキシエチルホスフィン溶液（ＴＣＥＰ溶液）にて調製）に溶解させ、室温で反応を行った。反応が終了した後、ＭＥＳＮａ（５．２ｍｇ）を加え、室温にて反応させた。２時間後、ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：Ｖｙｄａｃ（Ｃ１８）、φ１０ｘ２５０ｍｍ、流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液  Ａ液：０．１％ＴＦＡ水  Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、Ａ：Ｂ＝６５：３５→１５：８５（３０分）ｌｉｎｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、目的とするペプチドフラグメント（Ａ＋Ｂ）（２１）（配列番号２１）を得た（図５）。
ＥＳＩ−ＭＳ：  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ  Ｃ２４９Ｈ４０１Ｎ６９Ｏ８１Ｓ６  ：  ［Ｍ＋３Ｈ］３＋  １９５０．１，  ［Ｍ＋４Ｈ］４＋  １４６３．４，  ［Ｍ＋５Ｈ］５＋  １１７０．９，  ［Ｍ＋６Ｈ］６＋  ９７５．９，  ［Ｍ＋７Ｈ］７＋  ８３６．７，  ｆｏｕｎｄ  １９５０．７，  １４６３．６，  １１７１．１，  ９７６．１，  ８３６．８．【０１１１】
（ＩＩＩ−７．  第７工程  ペプチドフラグメント（Ａ＋Ｂ）と糖鎖付加ペプチドフラグメント（Ｃ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）との連結）
上記第６工程で得られた、４９残基目のＣ末端がチオエステル体のペプチドフラグメント（Ａ＋Ｂ）（２１）（２．０ｍｇ）と上記第５工程で得られた、糖鎖付加ポリペプチドフラグメント（Ｃ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）（２０）（３．５ｍｇ）の二種類を同じナスフラスコにいれ、ｐＨ７．０のバッファー溶液（０．０７７ｍｌ）（６Ｍグアニジン塩酸液、０．２Ｍリン酸溶液、５０ｍＭＴＣＥＰ溶液にて調製）に溶解させた後、ＭＰＡＡ（ｃａ．０．８ｍｇ）を加え、室温で反応を行った。ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した後、反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：Ｖｙｄａｃ（Ｃ１８）、φ１０ｘ２５０ｍｍ、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液  Ａ液：０．１％ＴＦＡ水  Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、Ａ：Ｂ＝６５：３５→２５：７５（３０分）ｌｉｎｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、目的とする糖鎖付加ペプチドフラグメント（Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）（２２）（配列番号２２）を得た（図９）。
ＥＳＩ−ＭＳ：  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ  Ｃ９０７Ｈ１４６８Ｎ２４２Ｏ３０３Ｓ７  ： ［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋  １８９５．１，  ［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋  １７３７．３，  ［Ｍ＋１３Ｈ］１３＋  １６０３．７，  ［Ｍ＋１４Ｈ］１４＋  １４８９．２，  ［Ｍ＋１５Ｈ］１５＋  １３９０．０，  ［Ｍ＋１６Ｈ］１６＋  １３０３．２，  ［Ｍ＋１７Ｈ］１７＋  １２２６．６，  ［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋  １１５８．５，  ［Ｍ＋１９Ｈ］１９＋  １０９７．６，  ［Ｍ＋２０Ｈ］２０＋  １０４２．８，  ［Ｍ＋２１Ｈ］２１＋  ９９３．２，  ［Ｍ＋２２Ｈ］２２＋  ９４８．１，  ［Ｍ＋２３Ｈ］２３＋  ９０６．９，  ［Ｍ＋２４Ｈ］２４＋  ８６９．１，  ［Ｍ＋２５Ｈ］２５＋  ８３４．４，  ｆｏｕｎｄ  １８９５．０，  １７３７．３，  １６０３．８，  １４８９．１，  １３８９．９，  １３０３．２，  １２２６．６，  １１５８．５，  １０９７．７，  １０４２．７，  ９９３．２，  ９４８．０，  ９０６．９，  ８６９．２，  ８３４．４.【０１１２】
（ＩＩＩ−８．  第８工程  ＣｙｓのＡｌａへの還元）
上記第７工程で得られた、２２、５０位Ｃｙｓに遊離チオール基を持ち、８３位Ａｓｎにジシアロ糖鎖を有する１６６残基の糖鎖付加ポリペプチド（Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）（２２）（１．０ｍｇ）をナスフラスコに入れ、ｐＨ７．０のバッファー溶液（０．２ｍｌ）（６Ｍグアニジン塩酸液、０．２Ｍリン酸溶液にて調製）に溶解させた後、ｐＨ７．０のトリスエチルカルボキシホスフィン（ＴＣＥＰ）（２６ｍｇ）、ＭＥＳＮａ（１０ｍｇ）、ＶＡ−０４４（０．３２ｍｇ）を加え、室温にて反応させた。４時間後、ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：Ｖｙｄａｃ（Ｃ８）、φ１０ｘ２５０ｍｍ、流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液  Ａ液：０．１％ＴＦＡ水  Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、Ａ：Ｂ＝７０：３０→２０：８０（３０分）ｌｉｎｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、目的とする糖鎖付加ポリペプチドフラグメント（Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｆ）（２３）（配列番号２３）を得た（図１０）。
ＥＳＩ−ＭＳ：  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ  Ｃ９０７Ｈ１４６８Ｎ２４２Ｏ３０３Ｓ５  ：  ［Ｍ＋１３Ｈ］１３＋  １５９８．８，  ［Ｍ＋１４Ｈ］１４＋  １４８４．７，  ［Ｍ＋１５Ｈ］１５＋  １３８５．７，  ［Ｍ＋１６Ｈ］１６＋  １２２９．２，  ［Ｍ＋１７Ｈ］１７＋  １２２２．８，  ［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋  １１５５．０，  ［Ｍ＋１９Ｈ］１９＋  １０９４．２，  ［Ｍ＋２０Ｈ］２０＋  １０３９．６，  ［Ｍ＋２１Ｈ］２１＋  ９９０．１，  ［Ｍ＋２２Ｈ］２２＋  ９４５．１，  ［Ｍ＋２３Ｈ］２３＋  ９０４．１，  ［Ｍ＋２４Ｈ］２４＋  ８６６．５，  ［Ｍ＋２５Ｈ］２５＋  ８３１．９，  ［Ｍ＋２６Ｈ］２６＋  ７９９．９，  ［Ｍ＋２７Ｈ］２７＋  ７７０．３，  ｆｏｕｎｄ  １５９８．６，  １４８４．４，  １３８５．５，  １２９９．０，  １２２２．７，  １１５４．９，  １０９４．１，  １０３９．４，  ９９０．０，  ９４５．２，  ９０４．０，  ８６６．４，  ８３１．６，  ７９９．９，  ７７０．３．【０１１３】
（ＩＩＩ−９．  第９工程  Ａｃｍ基の脱保護）
上記第８工程で得られた、８３位Ａｓｎにジシアロ糖鎖を有する１６６残基の糖鎖付加ポリペプチド（２３）（ｃａ．０．７ｍｇ）をエッペンドルフチューブに入れ、９０％酢酸水溶液（０．１７６ｍｌ）に溶解させた後、酢酸銀（ｃａ．０．８ｍｇ）を加え、室温にて遮光させながら反応させた。３．５時間後、ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した。反応溶液にジチオスレイトール（６．０ｍｇ）を加え、室温で５分間撹拌したのち、遠心分離を行い、沈殿物を除く上澄み液を回収した。その回収した上澄み液をメンブレンフィルターで濾過し、目的物を含む濾液部分をＨＰＬＣ［カラム：ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液  Ａ液：０．１％ＴＦＡ水  Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、グラジエント  Ａ：Ｂ＝６５：３５→２５：７５（３０分）ｌｉｎｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、７位、２９位、３３位、１６１位のＡｃｍ基が脱保護された、８３位Ａｓｎにジシアロジベンジル糖鎖を有する１６６残基の糖鎖付加ポリペプチド（２４）（配列番号２４）を得た（図１１）
ＥＳＩ−ＭＳ：  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ  Ｃ８９５Ｈ１４４８Ｎ２３８Ｏ２９９Ｓ５  ：    ［Ｍ＋１３Ｈ］１３＋  １５７６．９，  ［Ｍ＋１４Ｈ］１４＋  １４６４．３，  ［Ｍ＋１５Ｈ］１５＋  １３６６．８，  ［Ｍ＋１６Ｈ］１６＋  １２８１．４，  ［Ｍ＋１７Ｈ］１７＋  １２０６．１，  ［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋  １１３９．２，  ［Ｍ＋１９Ｈ］１９＋  １０７９．３，  ［Ｍ＋２０Ｈ］２０＋  １０２５．３，  ［Ｍ＋２１Ｈ］２１＋  ９７６．６，  ［Ｍ＋２２Ｈ］２２＋  ９３２．２，  ［Ｍ＋２３Ｈ］２３＋  ８９１．７，  ［Ｍ＋２４Ｈ］２４＋  ８５４．６，  ［Ｍ＋２５Ｈ］２５＋  ８２０．５，  ［Ｍ＋２６Ｈ］２６＋  ７８９．０，  ［Ｍ＋２７Ｈ］２７＋ ７５９．８，  ｆｏｕｎｄ  １５７６．７，  １４６４．３，  １３６６．７，  １２８１．４，  １２０６．０，  １１３９．１，  １０７９．２，  １０２５．２，  ９７６．５，  ９３２．２，  ８９１．６，  ８５４．６，  ８２０．４，  ７８８．９，  ７５９．８．【０１１４】
（ＩＩＩ−１０．  第１０工程  フォールディング工程）
上記第９工程により得られた、８３位Ａｓｎにジシアロ糖鎖を有する糖鎖付加ポリペプチド（２４）を遠沈管に入れ、ｐＨ７．５のバッファー溶液（１３ｍｌ）（６Ｍグアニジン塩酸液、０．１ｍＭトリス溶液にて調製）に溶解させた後、室温にて静置させた。この溶液を透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｒｏ、ＭＷＣＯ；８０００）に移し替えた。この透析膜を透析外液Ａ（３Ｍグアニジン塩酸液、０．１ｍＭトリス溶液、４μＭシステイン、０．５μＭシスチン、にて調製。ｐＨ８．５）に入れ、４℃にて透析を行った。１２時間後、この透析膜を透析外液Ｂ（１Ｍグアニジン塩酸液、０．１ｍＭトリス溶液にて調製。ｐＨ８．０）に入れ直し、４℃にて透析を行った。８時間後、この透析膜を透析外液Ｃ（１０ｍＭトリス溶液。ｐＨ７．０）に入れ直し、４℃にて透析を行った。２４時間後、この透析膜を透析外液から取り出し、透析膜内液を遠沈管に移し替えた。透析膜内液をそのままＨＰＬＣ［カラム：ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液  Ａ液：０．１％ＴＦＡ水  Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、グラジエント  Ａ：Ｂ＝６０：４０→２５：７５（３０分）ｌｉｎｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、糖鎖付加ポリペプチド（２５）（配列番号２５）を得た。なお、フォールディング後の糖鎖付加ポリペプチド（２５）は、７位のシステインと１６１位のシステインとの間においてジスルフィド結合を有しており、２９位のシステインと３３位のシステインとの間においてジスルフィド結合を有している。
ＥＳＩ−ＭＳ：  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ  Ｃ８９５Ｈ１４４４Ｎ２３８Ｏ２９９Ｓ５  ［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋  １８６３．１，  ［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋  １７０７．９，  ［Ｍ＋１３Ｈ］１３＋  １５７６．６，  ［Ｍ＋１４Ｈ］１４＋  １４６４．１，  ［Ｍ＋１５Ｈ］１５＋  １３６６．５，  ［Ｍ＋１６Ｈ］１６＋  １２８１．２，  ［Ｍ＋１７Ｈ］１７＋  １２０５．９，  ［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋  １１３８．９，  ｆｏｕｎｄ  １８６３．２，  １７０８．０，  １５７６．６，  １４６４．０，  １３６６．５，  １２８１．２，  １２０５．８，  １１３８．９．
【図１】
2012121206.tif 000029
【図２】
2012121206.tif 000030
【図３】
2012121206.tif 000031
【図４】
2012121206.tif 000032
【図５】
2012121206.tif 000033
【図６】
2012121206.tif 000034
【図７】
2012121206.tif 000035
【図８】
2012121206.tif 000036
【図９】
2012121206.tif 000037
【図１０】
2012121206.tif 000038
【図１１】
2012121206.tif 000039
【配列表】
2012121206000001.app
【国際調査報告】
2012121206.tif 000040
2012121206.tif 000041