(57)【要約】下記（１）または（２）のポリヌクレオチド構築物を用いてリボゾームディスプレイ、CISディスプレイ及び／又はmRNAディスプレイを行うことにより目的抗原に対するFabをスクリーニングする。（１）リボゾーム結合配列、Fab 第１鎖コード配列、リンカーペプチドコード配列、Fab 第２鎖コード配列、および足場コード配列をこの順にモノシストロニックに含み、３’末端に自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造を有するポリヌクレオチド構築物。（２）リボゾーム結合配列、Fab 第１鎖コード配列またはFab 第２鎖コード配列、および足場コード配列をこの順に含む、Fab 第１鎖発現シストロンおよびFab 第２鎖発現シストロンを含み、Fab 第１発現シストロンはその３’末端にリボゾームストール配列を有し、Fab 第２鎖発現シストロンはその３’末端に自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造を有するポリヌクレオチド構築物。
2012074029.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Fab第１鎖コード配列とFab第２鎖コード配列を含み、リボゾームを含む無細胞翻訳系に導入されたときに自身がコードするFabを解離させることなく発現し、該Fabとの複合体を維持しうるポリヌクレオチド構築物。
【請求項２】
リボゾーム結合配列、Fab 第１鎖コード配列、リンカーペプチドコード配列、Fab 第２鎖コード配列、および足場コード配列をこの順にモノシストロニックに含む請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物であって、その３’末端に自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造を有するポリヌクレオチド構築物。
【請求項３】
リボゾーム結合配列、Fab 第１鎖コード配列またはFab 第２鎖コード配列、および足場コード配列をこの順に含む、Fab 第１鎖発現シストロンおよびFab 第２鎖発現シストロンを含む請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物であって、Fab 第１発現シストロンはその３’末端にリボゾームストール配列を有し、Fab 第２鎖発現シストロンはその３’末端に自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造を有するポリヌクレオチド構築物。
【請求項４】
自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造は、リボゾームストール配列、ピューロマイシンもしくはその誘導体、またはDNA結合蛋白質コード配列と該DNA結合蛋白質の結合配列である、請求項２または３に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項５】
自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造が、リボゾームストール配列である、請求項４に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項６】
リボゾームストール配列がSecM配列、ジプロリン配列、またはこれらの両方である、請求項５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項７】
リボゾームストール配列がSecM配列の２〜４個の繰り返しである、請求項５または６に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項８】
リボゾームストール配列の３’側に終止コドンが存在する、請求項４〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項９】
自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造が、ピューロマイシンもしくはその誘導体である、請求項４に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項１０】
自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造が、DNA結合蛋白質コード配列と該DNA結合蛋白質の結合配列である、請求項４に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項１１】
DNA結合蛋白質が、転写翻訳時に鋳型となったDNA分子と、転写翻訳反応中に一度も解離することなく、同一DNA分子上に存在する該DNA結合蛋白質の結合配列と結合するシス型結合蛋白質である、請求項１０に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項１２】
DNA結合蛋白質が大腸菌R1 Plasmid にコードされるRepAであり、該DNA結合蛋白質の結合配列が同ポリヌクレオチド上でRepAコード配列の下流に存在するCIS-ori配列である、請求項１０に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項１３】
Fab 第１鎖コード配列およびFab 第２鎖コード配列がランダム配列を含むライブラリーである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項１４】
ランダム配列を含むライブラリーが、(i)ナイーブライブラリーまたは(ii) フォーカスドライブラリーである、請求項１３に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項１５】
ランダム配列を含むライブラリーが、Fab 第１鎖および／またはFab 第２鎖の相補性決定領域（CDR）内に１アミノ酸置換を含むライブラリーである、請求項１３または１４に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項１６】
（i）請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物を無細胞翻訳系に導入してFabを合成し、合成されたFabをそれをコードするポリヌクレオチド上に提示する工程、
（ii）ポリヌクレオチド上に提示されたFabを抗原と接触させる工程、
（iii）抗原と反応する目的Fabを選択する工程、および
（iv）目的Fabをコードするポリヌクレオチドを増幅する工程を含む、Fabのスクリーニング方法。
【請求項１７】
（I）Fab 第１鎖コード配列またはFab 第２鎖コード配列が、親抗体のFab 第１鎖またはFab 第２鎖のアミノ酸配列においてCDR内の１つの位置に対して1アミノ酸置換を含むアミノ酸配列をコードする、請求項１５に記載のポリヌクレオチド構築物を、Fab 第１鎖およびFab 第２鎖のCDR内の複数の位置に対して1アミノ酸置換が含まれるように複数種類用意する工程、
（II）該複数種類のポリヌクレオチド構築物を用いて前記工程（i）〜（iv）を繰り返して高親和性Fabを複数スクリーニングする一次スクリーニング工程、
（III）一次スクリーニング工程で選択された複数のFabにおけるFab 第１鎖およびFab 第２鎖のCDR内の各位置での1アミノ酸置換を解析する工程、
（IV）Fab 第１鎖コード配列およびFab 第２鎖コード配列が、親抗体のFab 第１鎖およびFab 第２鎖の配列においてCDR内の各位置に一次スクリーニングで同定された1アミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列をコードする、請求項１５に記載のポリヌクレオチド構築物を用意する工程、
（V）該ポリヌクレオチド構築物を用いて前記工程（i）〜（iv）を繰り返して高親和性Fabをスクリーニングする二次スクリーニング工程
を含む、請求項１６に記載のFabのスクリーニングを行う方法。
【請求項１８】
インビトロ翻訳系が、独立に精製された因子からなる、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
インビトロ翻訳系が、開始因子、伸長因子、アミノアシルtRNA合成酵素、およびメチオニルtRNAトランスフォルミラーゼからなる群から選択される少なくとも１つの成分を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
インビトロ翻訳系が解離因子を含まない、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
インビトロ翻訳系が、リボゾームを含む細胞抽出液である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物をインビトロ翻訳系に導入してFabを生成させる工程を含む、Fabの製造方法。
【請求項２３】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物を含む、Fabを製造またはスクリーニングするためのキット。
【請求項２４】
（I）標的物質結合蛋白質における標的物質結合部位を構成する全アミノ酸ポジションについて、1アミノ酸ポジションごとに天然アミノ酸全20種類にランダム化する１ポジションライブラリーを、アミノ酸ポジションの数だけ構築する工程、
（II）これらの1ポジションライブラリーを全てあるいは適当な単位で統合して1次ライブラリーを構築する工程、
（III）蛋白質ディスプレイ系を用いて１次ライブラリーを標的親和性で濃縮する工程、
（IV）1次ライブラリー濃縮サンプルのポリヌクレオチド配列情報を決定する工程、
（V）塩基配列情報から高頻度に観察される1アミノ酸置換を抽出する工程、
（VI）高頻度に観察される1アミノ酸置換の組み合わせを含む2次ライブラリーを構築する工程、および
（VII）蛋白質ディスプレイ系を用いて２次ライブラリーを標的親和性で濃縮する工程、
を含む、標的物質結合蛋白質の標的物質親和性を最大化する方法。
【請求項２５】
1次ライブラリー濃縮サンプルのポリヌクレオチド配列情報を決定する工程が次世代シークエンサーを用いて行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
標的物質結合蛋白質が完全長抗体あるいは抗体断片であり、標的物質結合部位がCDR領域である、請求項２４または２５に記載の方法。  
【請求項２７】
蛋白質ディスプレイ系が、リボゾームディスプレイ、CISディスプレイ、mRNAディスプレイ、ファージディスプレイ、バクテリア表面ディスプレイ、酵母細胞表面ディスプレイ、または高等真核生物の細胞表面ディスプレイである、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞翻訳系でFabを提示しうるポリヌクレオチド構築物、ならびにそれを含むキット、それを用いたFabの製造方法およびスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、B細胞が産生する糖蛋白質で、タンパク質などの分子（抗原）を認識して結合する働きをもつ。抗体は種々の内部および外部刺激（抗原）に応答して産生され、他の免疫担当細胞群と協調して体内に侵入してきた細菌・ウイルスなどを排除することで、脊椎動物の生体防御機構において重要な役割を担っている。一種類のB細胞は一種類の抗体しか作れず、また一種類の抗体は一種類の抗原しか認識できない。ヒト体内では数百万〜数億種類といった単位のB細胞がそれぞれ異なる抗体を作り出し、あらゆる抗原に対処しようとしている。これらはまとめて免疫グロブリンと呼ばれ、血液中の最も多量な蛋白質成分の１つであり、総血漿蛋白質の20重量％を構成する。抗体はその抗原特異性から分子標的薬や診断薬等として利用されている。【０００３】
天然に存在する抗体分子は、L鎖（軽鎖）とH鎖（重鎖）の2種類のポリペプチド鎖が2本ずつ会合することで、Y字型の基本構造を形成する。Y字の下半分はFc領域、Y字の上半分の V字の部分は同一のFab領域２つから成る。Fabの先端側半分は可変領域（V領域）と呼ばれ、多様な抗原に結合できるように、アミノ酸配列に多様性がある。L鎖とH鎖の可変領域はそれぞれVL、 VHと呼ばれる。一方、FabのFc側半分は定常領域（C領域）と呼ばれ、アミノ酸配列の変化は少ない。L鎖とH鎖の定常領域はそれぞれCL、CH1と呼ばれる。VLとVHの中で直接抗原と接触する領域は特にアミノ酸配列の多様性が高く相補性決定領域（CDR：complementarity-determining region） と呼ばれ、それ以外の部分はフレームワーク領域（FR：framework region）と呼ばれる。VLとVHに、それぞれ3つのCDR (CDR1〜CDR3) と、これらを取り囲む4つのFR (FR1〜FR4) が存在する。抗原刺激をうけていないナイーブB細胞におけるCDR1とCDR2の配列多様性はゲノムDNAの配列（ジャームライン配列）に由来する。一方でCDR3の配列はB細胞の分化過程で起こるゲノムDNAの組換反応によって新たに形成されるため、他のCDRと比べて多様性が大きい。またL鎖CDR3は1度の組換反応（V-J組換）で形成されるのに対し、H鎖のCDR3は2回の組換反応（V-D組換、D-J組換）を経て形成されるため、同じCDR3でもH鎖の多様性が高い。6つのCDRはFabの先端側で抗原結合に関わる１つの連続した表面を形成する。天然抗体において抗原結合に関与する機能的・構造的なユニットはFabである。Fab を構成するVL、VH、CL、CH1はそれぞれが立体構造として独立したドメインを形成する一方で、4つのドメイン間の相互作用によってより高い安定性を獲得している。Fc領域は抗原への抗体の結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能（例えば抗体依存性細胞障害機能）に関与している。【０００４】
抗体を発現する遺伝子ライブラリーを作製して、標的抗原に対して特異的に結合する抗体をコードする遺伝子をスクリーニングする試みが行われている。標的抗原に対して特異的に結合する抗体を得るために、抗体ライブラリーをコードするDNAから抗体ライブラリーを発現させ、それを標的抗原と接触させ、標的抗原と特異的に結合するものを選択し、それをコードするDNAを増幅するというサイクルを繰り返して抗体をスクリーニングする方法である。このようなディスプレイ技術を利用したスクリーニング法によって選択された抗体はそのアミノ酸配列をコードする遺伝情報を伴っているので、選択された抗体はそれをコードする遺伝情報に基づいて、直ちに遺伝子工学的に大量に調製することができる。またアミノ酸配列についても、遺伝情報を解析することによって、容易に明らかにすることができる。【０００５】
ディスプレイ技術を利用した抗体スクリーニング方法として、1985年にG. Smithらが報告したファージディスプレイ（非特許文献1）がある。ファージディスプレイは、主として繊維状ファージのコート蛋白質に外来蛋白質を融合蛋白質として発現させ、目的の外来蛋白質をコードしているポリヌクレオチドを選択する技術である。この方法は、抗原分子に特異的に結合する抗体の選択等に広く用いられている（非特許文献2、3）。しかしながら、ファージライブラリーを構築する際に大腸菌の形質転換を行うステップが必要であり、この過程で、ライブラリーの大きさが制限される。すなわち、大腸菌の形質転換効率の限界により、例えば1010を超える多様性を持ったライブラリーを構築するために、数十回から数千回のエレクトロポレーションによる大腸菌の形質転換が必要となり、現実的にこれ以上の規模のライブラリーを構築することは困難と考えられている。また、蛋白質への翻訳が大腸菌に依存するので、宿主である大腸菌に有害な蛋白質の発現効率は著しく低下する。【０００６】
一方で、リボゾームディスプレイに代表される無細胞ディスプレイ系は、無細胞翻訳系で合成した蛋白質とそれをコードするポリヌクレオチドとを対応付ける技術であるが、この系を使用した抗体のスクリーニングも報告されている（特許文献1）。しかし、ここで実際に作製されているのは重鎖可変領域（VH）と軽鎖可変領域（VL）をリンカーペプチドでつないだ単鎖抗体（scFv）の作製であり、Fabについての具体的作製方法は開示されていなかった。すなわち、リボゾームディスプレイは一般的にRNAの３’末端を利用して1分子のRNAと1分子の蛋白質を対応付ける技術であること、また合成対象となる蛋白質の分子量が大きくなるにしたがって完全長のペプチド鎖を合成することが困難になる等の理由で、2本のペプチド鎖で構成され、scFvと比べて分子量も大きいFabをリボゾームディスプレイで扱うことは困難と考えられていた（非特許文献4）。また、Fabは2本鎖であるため、同一のRNA上でディスプレイされたH鎖とL鎖のシス会合だけでなく、異なるRNA上のH鎖とL鎖のトランス会合が生じることで、スクリーニング効率が低下するおそれもあった。【０００７】
無細胞ディスプレイ系でFabを扱う試みとして、柳川らは油中水エマルジョン中でFabを構成するH鎖とL鎖をバイシストロニック（bicistronic）に発現させ、ストレプトアビジンとビオチンの相互作用を利用してFabとそれをコードするDNAの対応付けを行うことを報告している（非特許文献4）。しかしながら、この方法では油中水エマルジョン系を採用したため、扱えるライブラリー規模が制限される、一つのコンパートメント中で合成されたFabは一旦DNAおよびmRNAから離れ、その中から1分子のみがDNAとリンクされ、残された多数のFabが競合してしまう、濃縮倍率は100倍程度とそれほど高くない、実験操作に高度の熟練を要する、等の課題が残った。【０００８】
また、標的物質結合蛋白質の標的物質への親和性を高めるために、標的物質結合蛋白質の標的物質結合部位に1アミノ酸置換を導入したライブラリーを使用して1次スクリーニングを行い、得られた1アミノ酸置換を組み合わせて2次スクリーニングを行って、標的物質親和性の向上した変異蛋白質をスクリーニングするルックスルー突然変異誘発という手法が知られていたが（特許文献２）、この方法では、1次スクリーニングの後に得られた配列をクローン化し、これらのクローンから変異蛋白質を発現させ、標的物質との親和性を確かめてから2次スクリーニングを行っており、非常に手間がかかるものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開2008-271903号公報
【特許文献２】特開2011-182794号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】G. P. Smith et al. (1985) Science, vol.228, p.1315-1317
【非特許文献２】J. McCafferty et al., Nature (1990) vol.348, p.552-554
【非特許文献３】M. Hust et al., BMC Biotechnology, 2007, 7: 14
【非特許文献４】T． Sumida et al., Nucleic Acid Research, 2009, 37: 22, 147
【発明の概要】
【００１１】
上記のようにディスプレイ技術を利用して抗体をスクリーニングすることは行われていたが、リボゾームディスプレイなどの無細胞ディスプレイ系では分子量が大きく、二本のペプチド鎖からなるFabを効率的にスクリーニングすることは困難であると考えられていた。そこで、本発明は、リボゾームディスプレイなどの無細胞翻訳系においてFabを効率よく発現させ、それをコードするポリヌクレオチドと対応付け、スクリーニングを行う方法を提供すること、およびそのためのポリヌクレオチド構築物を提供することを課題とする。
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、Fab H鎖とFab L鎖をバイシストロニック（bicistronic）にそれぞれ塩基配列情報と対応付けて発現させるためのポリヌクレオチド構築物、およびFab H鎖とFab L鎖をモノシストロニック（monocistronic）に塩基配列情報と対応付けて発現させるポリヌクレオチド構築物を作製し、これを用いてリボゾームディスプレイ及び／又はCISディスプレイを行うことによりFabのスクリーニングが無細胞翻訳系で効率よく行うことができることを見出し、さらにこの無細胞Fabディスプレイ系を用いて抗体の親和性を飛躍的に向上させるYmacs法を見出すことで、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は以下を提供する。
（Fab無細胞系ディスプレイ法に供するポリヌクレオチド構築物）
［１］Fab 第１鎖コード配列とFab 第２鎖コード配列を含み、リボゾームを含む無細胞翻訳系に導入されたときに自身がコードするFabを解離させることなく発現し、該Fabとの複合体を維持しうるポリヌクレオチド構築物。
（ポリヌクレオチド構築物（モノシストロニック））
［２］リボゾーム結合配列、Fab 第１鎖コード配列、リンカーペプチドをコードする配列、Fab 第２鎖コード配列、および足場コード配列をこの順にモノシストロニックに含む［１］に記載のポリヌクレオチド構築物であって、その３’末端に自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造を有するポリヌクレオチド構築物。
（ポリヌクレオチド構築物（バイシストロニック））
［３］リボゾーム結合配列、Fab 第１鎖コード配列またはFab 第２鎖コード配列、および足場コード配列をこの順に含む、Fab 第１鎖発現シストロンおよびFab 第２鎖発現シストロンを含む［１］に記載のポリヌクレオチド構築物であって、Fab 第１鎖発現シストロンはその３’末端にリボゾームストール配列を有し、Fab 第２鎖発現シストロンはその３’末端に自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造を有するポリヌクレオチド構築物。
（リボゾーム／mRNA／CISディスプレイ法に供するポリヌクレオチド構築物）
［４］自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造が、リボゾームストール配列、ピューロマイシンもしくはその誘導体、またはDNA結合蛋白質コード配列と該DNA結合蛋白質の結合配列である、［２］または［３］に記載のポリヌクレオチド構築物。
(リボゾームディスプレイ法に供するポリヌクレオチド構築物)
［５］自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造が、リボゾームストール配列である、［４］に記載のポリヌクレオチド構築物。
［６］リボゾームストール配列がSecM配列、ジプロリン配列、またはこれらの両方である、［５］に記載のポリヌクレオチド構築物。
［７] リボゾームストール配列がSecM配列の２〜４個の繰り返しである、［５］〜［６］のいずれかに記載のポリヌクレオチド構築物。
［８］リボゾームストール配列の３’側に終止コドンが存在する、［４］〜［７］のいずれかに記載のポリヌクレオチド構築物。
（mRNAディスプレイ法に供するポリヌクレオチド構築物）
［９］自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造が、ピューロマイシンもしくはその誘導体である［４］に記載のポリヌクレオチド構築物。
（CISディスプレイ法に供するポリヌクレオチド構築物）
［１０］自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造が、DNA結合蛋白質コード配列と該DNA結合蛋白質の結合配列である、［４］に記載のポリヌクレオチド構築物。
［１１］DNA結合蛋白質が、転写翻訳時に鋳型となったDNA分子と、転写翻訳反応中に一度も解離することなく、同一DNA分子上に存在する該DNA結合蛋白質の結合配列と結合するシス型結合蛋白質である、［１０］に記載のポリヌクレオチド構築物。
［１２］DNA結合蛋白質が大腸菌R1 Plasmid にコードされるRepAであり、該DNA結合蛋白質の結合配列が同ポリヌクレオチド上でRepAコード配列の下流に存在するCIS-ori配列である、［１０］に記載のポリヌクレオチド構築物。
［１３］Fab 第１鎖コード配列およびFab 第２鎖コード配列がランダム配列を含むライブラリーである、［１］〜［１２］のいずれかに記載のポリヌクレオチド構築物。
［１４］ランダム配列を含むライブラリーが、(i)ナイーブライブラリーまたは(ii) フォーカスドライブラリーである［１３］に記載のポリヌクレオチド構築物。
［１５］ランダム配列を含むライブラリーが、Fab 第１鎖および／またはFab 第２鎖の相補性決定領域（CDR）内に１アミノ酸置換を含むライブラリーである、［１３］または［１４］に記載のポリヌクレオチド構築物。
［１６］（i）［１］〜［１５］のいずれかに記載のポリヌクレオチド構築物を無細胞翻訳系に導入してFabを合成し、合成されたFabをそれをコードするポリヌクレオチド上に提示する工程、
（ii）ポリヌクレオチド上に提示されたFabと抗原を接触させる工程、
（iii）抗原と反応する目的Fabを選択する工程、および
（iv）目的Fabをコードするポリヌクレオチドを増幅する工程を含む、Fabのスクリーニング方法。
[１７]（I）Fab 第１鎖コード配列またはFab 第２鎖コード配列が、親抗体のFab 第１鎖またはFab 第２鎖のアミノ酸配列においてCDR内の１つの位置に対して1アミノ酸置換を含むアミノ酸配列をコードする、［１５］に記載のポリヌクレオチド構築物を、Fab 第１鎖およびFab 第２鎖のCDR内の複数の位置に対して1アミノ酸置換が含まれるように複数種類用意する工程、
（II）該複数種類のポリヌクレオチド構築物を用いて前記［１６］に記載の工程（i）〜（iv）を繰り返して高親和性Fabを複数スクリーニングする一次スクリーニング工程、
（III）一次スクリーニング工程で選択された複数のFabにおけるFab 第１鎖およびFab 第２鎖のCDR内の各位置での1アミノ酸置換の頻度を解析する工程、
（IV）Fab 第１鎖コード配列およびFab 第２鎖コード配列が、親抗体のFab 第１鎖およびFab 第２鎖の配列においてCDR内の各位置に一次スクリーニングで同定された1アミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列をコードする、［１５］に記載のポリヌクレオチド構築物を用意する工程、
（V）該ポリヌクレオチド構築物を用いて前記［１６］に記載の工程（i）〜（iv）を繰り返して高親和性Fabをスクリーニングする二次スクリーニング工程
を含む、［１６］に記載のFabのスクリーニングを行う方法。
［１８］インビトロ翻訳系が、独立に精製された因子からなる、［１６］または［１７］に記載の方法。
［１９］インビトロ翻訳系が、開始因子、伸長因子、アミノアシルtRNA合成酵素、およびメチオニルtRNAトランスフォルミラーゼからなる群から選択される少なくとも１つの成分を含む、［１８］に記載の方法。
［２０］インビトロ翻訳系が解離因子を含まない、［１８］または［１９］に記載の方法。
［２１］インビトロ翻訳系が、リボゾームを含む細胞抽出液である、［１６］または［１７］に記載の方法。
［２２］［１］〜［１５］のいずれかに記載のポリヌクレオチド構築物をインビトロ翻訳系に導入してFabを生成させる工程を含む、Fabの製造方法。
［２３］［１］〜［１５］のいずれかに記載のポリヌクレオチド構築物を含む、Fabを製造またはスクリーニングするためのキット。
［２４］（I）標的物質結合蛋白質における標的物質結合部位を構成する全アミノ酸ポジションについて、1アミノ酸ポジションごとに天然アミノ酸全20種類にランダム化する１ポジションライブラリーを、アミノ酸ポジションの数だけ構築する工程、
（II）これらの1ポジションライブラリーを全てあるいは適当な単位で統合して1次ライブラリーを構築する工程、
（III）蛋白質ディスプレイ系を用いて１次ライブラリーを標的親和性で濃縮する工程、
（IV）工程（III）で得られた1次ライブラリー濃縮サンプルのポリヌクレオチド配列情報を決定する工程、
（V）塩基配列情報から高頻度に観察される1アミノ酸置換を抽出する工程、
（VI）高頻度に観察される1アミノ酸置換の組み合わせを含む2次ライブラリーを構築する工程、および
（VII）蛋白質ディスプレイ系を用いて２次ライブラリーを標的親和性で濃縮する工程、
を含む、標的物質結合蛋白質の標的物質親和性を最大化する方法。
［２５］1次ライブラリー濃縮サンプルのポリヌクレオチド配列情報を決定する工程が次世代シークエンサーを用いて行われる、［２４］の方法。
［２６］標的物質結合蛋白質が完全長抗体あるいはscFv、Fab、scFab等の抗体断片であり、標的物質結合部位が天然の抗体で多様性に富む配列が認められる、いわゆるCDR領域である［２４］または［２５］の方法。  
［２７］蛋白質ディスプレイ系が、リボゾームディスプレイ、CISディスプレイ、mRNAディスプレイ、ファージディスプレイ、バクテリア表面ディスプレイ、酵母細胞表面ディスプレイ、高等真核生物の細胞表面ディスプレイ、である［２４］〜［２６］のいずれかの方法。  
【００１４】
本発明によれば、無細胞ディスプレイ系でFabをポリヌクレオチドから解離させることなく効率よく発現させて目的のFabをスクリーニングすることができる。本発明の方法は無細胞翻訳系で行うことができるため、操作が簡便であり、スクリーニングを短期間で行うことができる。また、１０12レベル以上の大規模ライブラリーの構築が容易であり、これにより高効率のスクリーニングが可能である。また、本発明のYmacs法によれば、エラープローンPCRやCDRシャッフリングなどと比べて、抗原に対する親和性が数百倍から千倍以上向上した多数のFabを効率的に取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
図中、mRNA若しくはDNA上の各記号は以下を意味する。
「VL」：FabのL鎖可変領域のコード配列；
「CL」：FabのL鎖定常領域のコード配列；
「VH」：FabのH鎖可変領域のコード配列；
「CH1」：FabのH鎖定常領域のコード配列；
「Linker」：リンカーペプチドのコード配列;
「RBS（○）」：リボゾーム結合部位；
「Pu」：ピューロマイシン、若しくはその誘導体；
「Pro △」：プロモーター；
「RNAP」：RNAポリメラ−ゼ
「RSS（S）」：リボゾームストール配列
「LP（P）」：分泌発現用リーダーペプチド配列
【図１】モノシストロニックポリヌクレオチド構築物上にFabが提示されている模式図（リボゾームディスプレイを利用する態様）（ＲＢＳ（○）はリボゾーム結合部位を示す；以下、同じ）。
【図２】モノシストロニックポリヌクレオチド構築物上にFabが提示されている模式図（mRNAディスプレイを利用する態様）。
【図３】モノシストロニックポリヌクレオチド構築物上にFabが提示されている模式図（CISディスプレイを利用する態様）の模式図（△はプロモーターを示す；以下、同じ）。
【図４】バイシストロニックポリヌクレオチド構築物上にFabが提示されている模式図（５’側シストロンおよび３’側シストロンともにリボゾームディスプレイを利用する態様）。
【図５】バイシストロニックポリヌクレオチド構築物上にFabが提示されている模式図（５’側シストロンはリボゾームディスプレイを、３’側シストロンはmRNAディスプレイを利用する態様）。
【図６】バイシストロニックポリヌクレオチド構築物上にFabが提示されている模式図（５’側シストロンはリボゾームディスプレイを、３’側シストロンはCISディスプレイを利用する態様）。
【図７】Fabのスクリーニング方法（リボゾームディスプレイ）の模式図。
【図８】Fabのスクリーニング方法（CISディスプレイ）の模式図。
【図９】pTrc-Fab Bicistoronic Fab分泌発現ユニットの模式図。
【図１０】モデルFabのCBB染色の写真。左の２レーンはマーカー。
【図１１】モデルFabのELISA(低濃度、Her2抗原)の結果を示すグラフ。
【図１２】モデルFabのELISA(高濃度) の結果を示すグラフ。
【図１３】Bicistoronic型Fab-PRD用のDNA断片（ポリヌクレオチド構築物）の模式図。ＲＳＳはリボゾームストール配列を示す（図１４についても同じ）。
【図１４】Monocistoronic型Fab-PRD用のDNA断片（ポリヌクレオチド構築物）の模式図。
【図１５】ビオチン化抗原のサンドイッチELISAによる評価の結果を示すグラフ。BSAはウシ血清アルブミン（コントロール）を、stAvはストレプトアビジンを示す。
【図１６】Bicistoronic型Fab-PRDでのFab-HHxho濃縮（中央部のみ）の結果を示す電気泳動写真。WBは洗浄バッファーを示す。
【図１７】Bicistoronic型Fab-PRDでのFab-HHxho濃縮（全長）の結果を示す電気泳動写真。
【図１８】Monocistoronic型Fab-PRDでのFab-HHxho濃縮（全長）の結果を示す電気泳動写真。
【図１９】Monocistronic型Fab-PRDのin vitro翻訳産物の検出の結果を示す電気泳動写真（ウエスタンブロット）。
【図２０】Monocistronic型Fab-PRD におけるSecMのコピー数と回収率の関係を示す図。
【図２１】Monocistronic型Fab-PRDにおけるリンカー長と濃縮倍率の関係を示す図。
【図２２】Monocistronic型Fab-PRD における、Fab-TT  400分子、Fab-HH  1x1012分子の集団からのFab-TTの回収を示す電気泳動写真。
【図２３】1ポジション１アミノ酸置換ライブラリーの合成の概要を示す図。
【図２４】Ymacs-1次ライブラリーのCDRの配列を示す図。表中のNNKは1アミノ酸置換を導入するポジションを示す。
【図２５】１次スクリーニングで選択された変異のまとめ。表中のPAは親アミノ酸を示す。
【図２６】Ymacs-２次ライブラリーで採用した変異とそれに対応するコドンを示す図。
【図２７】Ymacs-２次ライブラリーの構築方法を示す図。
【図２８】Monocistronic 型分泌Fab発現ベクターからBicistronic型Fab分泌発現ベクターへの変換の模式図。
【図２９】Ymacs-２次ライブラリーのスクリーニングで選択されたFabのCDRの配列を示す図。
【図３０】Ymacs-２次ライブラリーのスクリーニングで選択されたFabのSPR解析によるkoff測定の結果を示す図。
【図３１】親抗体であるFab-TTとその親和性向上変異体Ymacs #10のSPR解析によるKD測定の結果を示す図。
【図３２】親和性向上変異体Ymacs #10およびYmacs #19についてのKinExA解析によるKD測定の結果を示す図。
【図３３】CISディスプレイでのFab-HHxho濃縮（全長）の結果を示す電気泳動写真。
【図３４】CISディスプレイでのFab-HHxho濃縮（全長）における転写翻訳反応時間の影響を検討した結果を示す電気泳動写真。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
＜ポリヌクレオチド構築物＞
本発明のポリヌクレオチド構築物は、Fab 第１鎖コード配列とFab 第２鎖コード配列を含み、リボゾームを含む無細胞翻訳系に導入されたときに自身がコードするFabを解離させることなく発現し、該Fabとの複合体を維持しうるポリヌクレオチド構築物である。ここで、Fab 第１鎖およびFab 第２鎖とは、Fabを構成する２つの鎖を意味し、通常は一方がFab H鎖であり、他方がFab L鎖であるが、それぞれH鎖とL鎖のキメラ鎖であってもよい。なお、Fab H鎖とはH鎖可変領域（VH）およびH鎖定常領域１（CH1）を含む蛋白質を意味し、Fab L鎖とはL鎖可変領域（VL）およびL鎖定常領域（CL）を含む蛋白質を意味する。
また、「Fabとの複合体を維持する」とは、Fabがポリヌクレオチド構築物とリンクした状態で発現され、その複合体が維持されることを意味する。なお、「ポリヌクレオチド上にFabが提示される」ともいう。
【００１７】
ポリヌクレオチド構築物（モノシストロニック）
本発明の第１の態様にかかるポリヌクレオチド構築物は、リボゾーム結合配列、Fab 第１鎖コード配列、リンカーペプチド配列、Fab 第２鎖コード配列、および足場コード配列をこの順にモノシストロニックに含む。そして、該ポリヌクレオチド構築物はコード領域（シストロン）の３’末端に、自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造を有する。
【００１８】
リボゾーム結合配列とは翻訳を開始するためにリボゾームが結合する開始コドン上流の配列を意味するが、無細胞翻訳系として大腸菌由来のリボゾームを利用する場合には、リボゾーム結合配列としてShine-Dalgarno（SD）配列を用いることが好ましい。SD配列としてはAGGAGGTが一般に知られているが、リボゾームが結合できる限り、改変した配列でもよい。なお、リボゾーム結合配列は宿主に応じて適宜選択することができ、SD配列には限定されない。
【００１９】
Fab鎖コード配列は、Fab共通領域の配列が開示されており(Sakano et al., Nature (1980) vol.286, p676, Ellison et al., Nucleic Acids Res. (1982) vol.10, p.4071, Huck et al., Nucleic Acids Res. (1986) vol.14, p.1779, Hieter et al., J. Biol. Chem. (1982) vol.257, p.1516, およびMax et al., Cell (1980) vol.22, p.197)、これらの配列に基づいてプライマーを設計し、Fab H鎖コード配列とFab L鎖コード配列を増幅することにより取得することができる。抗体の可変領域および定常領域のクローニング用プライマーは公知である（Marks et al., J. Mol. Biol. (1991) vol.222, p.581, Welschof et al., J. Immunol. Methods (1995) vol.179, p.203, Campbell et al., Mol. Immunol. (1992) vol.29, p.193）。また大量発現の際に利用を予定している宿主のコドンバイアスやRNAプロセッシングを考慮して、Fab鎖コード配列を人工合成することもできる。
なお、特定のFabを発現させる場合は目的の鋳型から配列を増幅して用いればよい。また、目的抗原に対するFabをスクリーニングする場合はランダムなFab鎖コード配列を含むライブラリーを使用すればよい。目的抗原に結合するFabを新規に取得したい場合は、ナイーブライブラリーを使用することができる。また既に取得済みの特定のFabを何らかの目的で最適化したい場合は、フォーカスドライブラリーを使用することができる。
ナイーブライブラリーは目的抗原に結合するFabを新規に取得するために、非常に広範な探索空間を提供することを目的とし、以下に例を示すように様々な形式のものを構築することができる。例えばB細胞から採取したmRNAを出発材料とした逆転写PCRでFabを構成するVH領域および／またはVL領域のcDNA断片を増幅して使用することで、天然B細胞が作り出す抗体多様性を利用した天然ナイーブライブラリー(Clackson et al., Nature (1991) vol.352, p.624-628)を構築できる。また、VH領域および／またはVL領域のうちフレームワーク部分を人工的に合成し、CDR領域に多様な天然のCDR配列を組み込むことで半合成ナイーブライブラリー(Soderlind et al., Nat. Biotechnol. (2000) vol.18, p.852-856)を構築できる。あるいはFabのL鎖（VL-CL）に天然配列、H鎖のCDR1-2に人工配列、CDR3に天然配列を組み込むことで半合成ナイーブライブラリー(Hoet et al., Nat. Biotechnol. (2005) vol.23, p.344-348)を構築することもできる。さらにCDRに多様性を与えつつコード配列の全領域を人工合成する完全人工ナイーブライブラリー(Knappik et al., J. Mol. Biol. (2000) vol.296, p.57-86)を構築することもできる。CDR配列を人工合成する場合は、天然のCDR配列の解析結果に基づき、CDRの長さごとに、各アミノ酸ポジションに出現するアミノ酸の頻度を調整することもできる。
【００２０】
フォーカスドライブラリーは既に取得済みの特定の親Fabの配列を基本とし、これと似て非なる変異体を主な成分として含む様々な形式のものを構築することができる。フォーカスドライブラリーは親Fabの抗原結合特性を維持しながら、親和性の向上、特異性の最適化、動物由来抗体のヒト化、不都合なアミノ酸あるいは配列の除去、安定性向上、物性改善、等の目的で最適化する場合に使用できる。
例えばVH領域および／またはVL領域全体に、ランダムかつ散発的に1個〜数個程度の1アミノ酸置換を導入するためにエラープローンPCR（Error-Prone PCR）を用いることができる(Boder et al., Proc Natl Acad Sci U S A (2000) vol.97, p.10701-10705)。エラープローンPCRは、基質である４種類のデオキシヌクレオチドの濃度や、添加する二価カチオンの種類や濃度を調節することによってエラーが起こり易くなる現象を利用している。人工的に設計した変異導入プライマーを用いて、Fabを構成する特定のアミノ酸だけを狙って、アミノ酸組成に考慮しながら1個〜数個程度の1アミノ酸置換を導入することもできる(Rajpal et al., Proc Natl Acad Sci U S A (2005) vol.102, p.8466-8471)。また人工的に設計した変異導入プライマーを用いて、合計６個のCDRのうち、３〜５個程度のCDR配列を維持したまま、１〜３個程度のCDRの配列を、1アミノ酸単位ではなくCDR配列単位でランダム化することもできる(Lee et al., Blood (2006) vol.108, p.3103-3111)。またL鎖とH鎖のうち片方を固定し、多様な天然配列を利用して他方をランダム化することもできる(Kang et al., Proc Natl Acad Sci U S A (1991) vol.88, p.11120-11123)。
【００２１】
本発明のポリヌクレオチド構築物としては、Fab 第１鎖および／またはFab 第２鎖の相補性決定領域（CDR）内の１またはそれ以上のアミノ酸に1アミノ酸置換を含むライブラリーが好ましい。このようなライブラリーは1アミノ酸置換が導入されるように設計されたプライマーを用いたPCRなどによって作製することができる。
このようなポリヌクレオチド構築物のライブラリーを用いてスクリーニングを行うことにより、目的の抗原に対する抗体を得ることができる。
【００２２】
Fab 第１鎖コード配列とFab 第２鎖コード配列をつなぐリンカーペプチドをコードする配列としては、15〜120残基程度のアミノ酸からなる水溶性ポリペプチドをコードする配列であることが好ましく、ライブラリーのスクリーニング効率の観点から20〜30のアミノ酸からなる水溶性ポリペプチドをコードする配列がより好ましい。例えば、水溶性を高めるためArgを導入したアミノ酸配列を例示することができるが、主にグリシンとセリンを含むいわゆるGSリンカーをコードする配列でもよい。
前記リンカーペプチドをコードする配列はプロテアーゼ認識配列に挟まれていてもよく、それにより、前記ポリヌクレオチド構築物がアミノ酸配列に翻訳された後にプロテアーゼによってリンカーペプチドが切断され、天然型Fabが提示される。プロテアーゼ認識配列としては、エンテロキナーゼ認識配列であるDDDDK（配列番号３１）、ファクターXa認識配列であるIEGR（配列番号３２）などが例示される。
【００２３】
Fab鎖コード配列の３’側に連結される足場コード配列としては、リボゾーム、DNAおよび／またはmRNA上でFabの第１鎖および第２鎖が翻訳されて正確に折り畳まれて複合体を形成し、抗原と反応しうるための足場としての十分な長さを持ったアミノ酸配列をコードする配列が挙げられる。足場コード配列は、少なくとも15アミノ酸をコードする配列であることが好ましく、15〜120のアミノ酸をコードすることがより好ましい。コードされる足場配列は水溶性が高く、特殊な３次元構造をとらない配列であることが好ましく、具体的には、主にグリシンとセリンを含むいわゆるGSリンカーやファージのgeneIIIの部分配列などを用いることができる。
【００２４】
自身がコードするFab鎖との複合体を維持するために必要な構造としては、例えば、シストロンの３’末端に、リボゾームストール配列を有する（この場合はリボゾームディスプレイ）か、DNA結合蛋白質コード配列と該DNA結合蛋白質の結合配列を有するか（この場合はCISディスプレイ）、または３’末端に付加されたピューロマイシンまたはその誘導体を有する（この場合はmRNAディスプレイ）ことができ、それにより発現したFab鎖がポリヌクレオチドと複合体を形成し、第１及び第２のFab鎖コード配列の塩基配列とコードされるアミノ酸配列が物理的に対応付けられる。
【００２５】
リボゾームディスプレイ法に供するポリヌクレオチド構築物（モノシストロニック）
リボゾームストール配列としては、大腸菌のSecMをコードする配列が例示される。SecM配列は、SecM stall配列とも呼ばれ、リボゾーム内部で翻訳アレストを起こすと報告されている配列である（FXXXXWIXXXXGIRAGP：配列番号３０）。この配列を導入することで、mRNA、リボゾーム、融合蛋白質の複合体を効率よく維持できる（Nakatogawa et al., Mol.Cell (2006) vol.22, p.545-552）ので、Fab鎖とそれをコードする塩基配列の対応付けができる。SecM配列は２個以上連結してもよく、２〜４個が好ましく、２個がより好ましい。
また、ジプロリンなどのポリプロリン配列もリボゾームストール配列として使用することができ、単独で用いてもよいし、SecM配列と組み合わせてもよい。
リボゾームストール配列の３’側には終止コドンが読み枠を合わせて配置されることが好ましい。
なお、リボゾームストール配列を採用する代わりに単に終止コドンを欠落させてリボゾームディスプレイを行うことも可能である。
【００２６】
なお、Fab第１鎖コード配列、リンカーコード配列、Fab第２鎖コード配列、足場コード配列およびリボゾームストール配列は、読み枠を合わせて連結される。ここで、「読み枠を合わせて連結される」とは、これらの各要素が融合蛋白質として翻訳されるように連結されることを意味する。なお、Fab第１鎖コード配列、リンカーコード配列、Fab第２鎖コード配列、足場コード配列およびリボゾームストール配列はそれぞれ直接連結されてもよいし、間や前後にタグ配列や任意のポリペプチド配列を介して連結されてもよい。
【００２７】
本発明の第１の態様にかかるポリヌクレオチド構築物において、リボゾームディスプレイを利用する態様の一例を図１に示す。
配列番号１９に、プロモーター配列（塩基番号９〜３１）と、リボゾーム結合配列（SD配列；塩基番号８１〜８７）と、抗Her2 Fab L鎖コード配列、FLAGタグ、リンカー配列（GSリンカー）、FLAGタグ、抗Her2 Fab H鎖コード配列、Hisタグ、足場配列（GSリンカー）およびリボゾームストール配列（secM+ジプロリン）を含む抗Her2 Fab L+H鎖発現シストロン（塩基番号９４〜２２２０；アミノ酸配列は配列番号２０）を含むポリヌクレオチド構築物の塩基配列を示す。
配列番号２１に、プロモーター配列（塩基番号９〜３１）と、リボゾーム結合配列（SD配列；塩基番号８１〜８７）と、抗TNFαR Fab L鎖コード配列、FLAGタグ、リンカー配列（GSリンカー）、FLAGタグ、抗TNFαR Fab H鎖コード配列、Hisタグ、足場配列（GSリンカー）およびリボゾームストール配列（secM+ジプロリン）を含む抗TNFαR Fab L+H鎖発現シストロン（塩基番号９４〜２２２６；アミノ酸配列は配列番号２２）を含むポリヌクレオチド構築物の塩基配列を示す。
ただし、本発明のポリヌクレオチド構築物はこれらに限定されないことは言うまでもない。
【００２８】
mRNAディスプレイ方法に供するポリヌクレオチド構築物（モノシストロニック）
また、リボゾームストール配列の代わりに、ピューロマイシンまたはその誘導体を利用してFabとポリヌクレオチドとの複合体を形成させ、アミノ酸配列とそれをコードする塩基配列の物理的対応付けをしてもよい（mRNAディスプレイ）。すなわち、ポリヌクレオチド構築物の３’末端にスペーサーを介してピューロマイシンまたはその誘導体を結合させ、翻訳産物のＣ末端がピューロマイシンまたはその誘導体に共有結合することによりFabとポリヌクレオチドとの複合体が形成され、Fab鎖のアミノ酸配列とそれをコードする塩基配列の対応付けが可能となる。
ここで、ピューロマイシンまたはその誘導体としては、ピューロマイシン、リボシチジルピューロマイシン、デオキシシチジルピューロマイシン、デオキシウリジルピューロマイシンなどのピューロマイシン誘導体が特に好ましい。
【００２９】
ポリヌクレオチド構築物の３’末端にピューロマイシンまたはその誘導体を結合させるために使用するスペーサーとしては、例えば、WO98/16636号公報に記載されているポリエチレンまたはポリエチレングリコールあるいはその誘導体などの高分子物質、オリゴヌクレオチドやペプチドあるいはその誘導体などの生体高分子物質などが用いられる。これらのうち、ポリエチレングリコールが好ましい。
なお、mRNAディスプレイの別の態様として、ポリヌクレオチド構築物の３’末端側にストレプトアビジンコード配列を連結させ、さらに、３’末端にビオチンを結合させて、翻訳された蛋白質のストレプトアビジン部分がビオチンと結合することにより、Fabとポリヌクレオチドとの複合体を形成させ、アミノ酸配列とそれをコードする塩基配列の物理的対応付けをしてもよい。
【００３０】
本発明の第１の態様にかかるポリヌクレオチド構築物において、mRNAディスプレイを利用する態様の一例を図２に示す。
【００３１】
CISディスプレイ法に供するポリヌクレオチド構築物（モノシストロニック）
また、リボゾームストール配列の代わりに、DNA結合蛋白質コード配列と該DNA結合蛋白質の結合配列を利用してFabとポリヌクレオチドとの複合体を形成させ、アミノ酸配列とそれをコードする塩基配列の物理的対応付けをしてもよい（CISディスプレイ： WO2004/22746）。具体的には、ポリヌクレオチド構築物の足場配列の下流にDNA結合蛋白質コード配列と該DNA結合蛋白質の結合配列を連結させ、Fabと足場配列とDNA結合蛋白質との融合蛋白質として発現させ、DNA結合蛋白質が３’側シストロン下流のDNA結合蛋白質結合配列に結合することによりFabとポリヌクレオチドとの複合体が形成されFab鎖のアミノ酸配列とそれをコードする塩基配列の対応付けが可能となる。ここで、DNA結合蛋白質としては、DNA結合蛋白質が転写翻訳時に鋳型となったDNA分子と転写翻訳反応中に一度も解離することなく同一DNA分子上に存在する該DNA結合蛋白質の結合配列と結合する、シス型の結合様式をもつRepA蛋白質が挙げられ、RepA結合配列としてはCIS配列とそれに続くori配列が挙げられる（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol.101, p.2806-2810, 2004および特表2005-537795）。シス型の結合様式をもつ他のDNA結合蛋白質として、大腸菌Ti plasmid にコードされるRecC蛋白質(Pinto, et al., Mol. Microbiol. (2011) vol.81, p.1593-1606)、φX174ファージのA蛋白質(Francke, et al., Proc Natl Acad Sci U S A (1972) vol.69, p.475-479)、λファージのQ蛋白質(Echols, et al., Genetics (1976) vol.83, p.5-10)等を、該DNA結合蛋白質それぞれに対する結合配列と組み合わせて用いてもよい。また、転写と翻訳がよく共役する無細胞翻訳系を用いる場合は、合成された蛋白質が転写終結部位の近傍でリリースされるため、エストロゲン受容体などの核内受容体のＤＮＡ結合ドメイン、Two-Hybrid Systemに使用されるLexAやGal4のＤＮＡ結合ドメインのように、一般的にトランス型の結合様式を持つDNA蛋白質と考えられているものを、該DNA結合蛋白質それぞれに対する結合配列と組み合わせて用いてもよい。
【００３２】
本発明の第１の態様にかかるポリヌクレオチド構築物において、CISディスプレイを利用する態様の一例を図３に示す。
配列番号７０に、プロモーター配列（塩基番号６１２〜６３９）と、リボゾーム結合配列（SD配列；塩基番号６７２〜６７５）と、抗Her2 Fab L鎖コード配列、FLAGタグ、リンカー配列（GSリンカー）、FLAGタグ、抗Her2 Fab H鎖コード配列、Hisタグ、足場配列（GSリンカー）およびRepAコード配列を含む抗Her2 Fab L+H鎖発現シストロン（塩基番号６８９〜３３２２；アミノ酸配列は配列番号７１）、CIS-ori（塩基番号３３２６〜４１００）を含むポリヌクレオチド構築物の塩基配列を示す。
配列番号７２に、プロモーター配列（塩基番号６１２〜６３９）と、リボゾーム結合配列（SD配列；塩基番号６７２〜６７５）と、抗TNFαR Fab L鎖コード配列、FLAGタグ、リンカー配列（GSリンカー）、FLAGタグ、抗TNFαR Fab H鎖コード配列、Hisタグ、足場配列（GSリンカー）およびRepAコード配列を含む抗TNFαR Fab L+H鎖発現シストロン（塩基番号６８９〜３３２８；アミノ酸配列は配列番号７３）、CIS-ori（塩基番号３３３２〜４１０６）を含むポリヌクレオチド構築物の塩基配列を示す。
ただし、本発明のポリヌクレオチド構築物はこれらに限定されないことは言うまでもない。
【００３３】
ポリヌクレオチド構築物（バイシストロニック）
本発明の第２の態様にかかるポリヌクレオチド構築物は、リボゾーム結合配列、Fab 第１鎖コード配列またはFab 第２鎖コード配列、および足場コード配列をこの順に含むFab 第１鎖発現シストロンおよびFab 第２鎖発現シストロンを含む。そして、Fab 第１鎖発現シストロン（５'側のFab鎖発現シストロン）はその３’末端にリボゾームストール配列を有し、Fab 第２鎖発現シストロン（３'側のFab鎖発現シストロン）はその３’末端側に自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造を有する。ここで、自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造としては、上記のようなリボゾームストール配列、DNA結合蛋白質コード配列と該DNA結合蛋白質の結合配列、またはピューロマイシンもしくはその誘導体が例示される。
【００３４】
すなわち、Fab 第１鎖発現シストロンは、リボゾーム結合配列の３'側にFab 第１鎖コード配列および足場コード配列をこの順で含み、Fab 第２鎖発現シストロンは、リボゾーム結合配列の３'側にFab 第２鎖コード配列および足場コード配列をこの順で含む。Fab 第１鎖とFab 第２鎖は、H鎖、L鎖の順でもよいし、L鎖、H鎖の順でもよいし、それぞれH鎖とL鎖のキメラ鎖であってもよい。
なお、Fab 第１鎖発現シストロンとFab 第２鎖発現シストロンとの間の長さは、Fab 第１鎖発現シストロンで翻訳が一旦終了し、リボゾームがストールされている状態で、Fab 第２鎖発現シストロンのリボゾーム結合配列にリボゾームが結合できる程度の間隔があればよいが、好ましくは50〜200bpである。
【００３５】
リボゾーム結合配列、Fab鎖コード配列については上述したものを用いることができる。
【００３６】
各Fab鎖コード配列の３’側に連結される足場コード配列としては、リボゾーム、DNAおよび／またはmRNA上でFabのH鎖およびL鎖が翻訳されて正確に折り畳まれて複合体を形成し、抗原と反応しうるための足場としての十分な長さを持ったアミノ酸配列をコードする配列が挙げられる。足場コード配列は、少なくとも15アミノ酸をコードする配列であることが好ましく、より好ましくは、15〜120のアミノ酸をコードすることがより好ましい。コードされる足場配列は水溶性が高く、特殊な３次元構造をとらない配列であることが好ましく、具体的には、主にグリシンとセリンを含むいわゆるＧＳリンカーやファージのgeneIIIの部分配列などを用いることができる。
【００３７】
リボゾームディスプレイ法に供するポリヌクレオチド構築物（バイシストロニック）
本発明の第２の態様にかかるポリヌクレオチド構築物においては、リボゾーム上で、mRNAとポリペプチド（Fabの第１鎖または第２鎖）の複合体を形成させるため、Fab 第１鎖発現シストロンの３’末端に上述したようなリボゾームストール配列を配置する。なお、リボゾームストール配列の３’側には終止コドンが読み枠を合わせて配置されることが好ましい。リボゾームストール配列を採用する代わりに単に終止コドンを欠落させてリボゾームディスプレイを行うことも可能である。
【００３８】
なお、Fab第１鎖コード配列またはFab第２鎖コード配列、足場コード配列およびリボゾームストール配列は、読み枠を合わせて連結される。ここで、「読み枠を合わせて連結される」とは、これらの各要素が融合蛋白質として翻訳されるように連結されることを意味する。なお、Fab第１鎖コード配列またはFab第２鎖コード配列、足場コード配列およびリボゾームストール配列はそれぞれ直接連結されてもよいし、間や前後にタグ配列や任意のポリペプチド配列を介して連結されてもよい。
【００３９】
本発明の第２の態様にかかるポリヌクレオチド構築物において、Fab第１鎖発現シストロンおよびFab第２鎖発現シストロンともにリボゾームディスプレイを利用する態様の一例を図４に示す。
配列番号１３に、プロモーター配列（塩基番号９〜３１）と、リボゾーム結合配列（SD配列；塩基番号８１〜８７）と、抗Her2 Fab L鎖コード配列、FLAGタグ、足場配列（GSリンカー）およびリボゾームストール配列（secM+ジプロリン）を含む抗Her2 Fab L鎖発現シストロン（塩基番号９４〜１１５８；アミノ酸配列は配列番号１４）と、リボゾーム結合配列（SD配列；塩基番号１１９１〜１１９７）と、抗Her2 Fab H鎖コード配列、Hisタグ、足場配列（GSリンカー）およびリボゾームストール配列（secM+ジプロリン）を含む抗Her2 Fab H鎖発現シストロン（塩基番号１２６４〜２３６４；アミノ酸配列は配列番号１５）を含むポリヌクレオチド構築物の塩基配列を示す。
配列番号１６に、プロモーター配列（塩基番号９〜３１）と、リボゾーム結合配列（SD配列；塩基番号８１〜８７）と、抗TNFα受容体（TNFαR） Fab L鎖コード配列、FLAGタグ、足場配列（GSリンカー）およびリボゾームストール配列（secM+ジプロリン）を含む抗TNFαR Fab L鎖発現シストロン（塩基番号９４〜１１５８；アミノ酸配列は配列番号１７）と、リボゾーム結合配列（SD配列；塩基番号１１９１〜１１９７）と、抗TNFαR Fab H鎖コード配列、Hisタグ、足場配列（GSリンカー）およびリボゾームストール配列（secM+ジプロリン）を含む抗TNFαR Fab H鎖発現シストロン（塩基番号１２６４〜２３７０；アミノ酸配列は配列番号１８）を含むポリヌクレオチド構築物の塩基配列を示す。
ただし、本発明のポリヌクレオチド構築物はこれらに限定されないことはいうまでもない。
【００４０】
mRNAディスプレイ法に供するポリヌクレオチド構築物（バイシストロニック）
なお、Fab 第２鎖発現シストロン（３'側のFab鎖発現シストロン）については、ピューロマイシンまたはその誘導体を利用してFab鎖とポリヌクレオチドの複合体を形成させ、アミノ酸配列とそれをコードする塩基配列の物理的対応付けをしてもよい（mRNAディスプレイ）。すなわち、３'側のシストロンの末端、すなわち、ポリヌクレオチド構築物の３’末端にスペーサーを介してピューロマイシンまたはその誘導体を結合させ、３'側のシストロンが翻訳されたときに、翻訳産物のＣ末端がピューロマイシンまたはその誘導体に共有結合することによりFab鎖とポリヌクレオチドの複合体を形成させ、Fab鎖のアミノ酸配列とそれをコードする塩基配列の対応付けが可能となる。
【００４１】
本発明の第２の態様にかかるポリヌクレオチド構築物において、Fab第１鎖発現シストロンがリボゾームディスプレイを利用し、Fab第２鎖発現シストロンがmRNAディスプレイを利用する態様の一例を図５に示す。
【００４２】
CISディスプレイ法に供するポリヌクレオチド構築物（バイシストロニック）
また、Fab 第２鎖発現シストロン（３'側のFab鎖発現シストロン）については、DNA結合蛋白質コード配列と該DNA結合蛋白質の結合配列を利用してFab鎖とポリヌクレオチドの複合体を形成させ、アミノ酸配列とそれをコードする塩基配列の物理的対応付けをしてもよい（CISディスプレイ： WO2004/22746）。具体的には、Fab 第２鎖発現シストロンの３'末端側、すなわち、Fab 第２鎖発現シストロンのFab第２鎖コード配列と足場配列の下流にDNA結合蛋白質コード配列と該DNA結合蛋白質の結合配列を連結させ、Fab 第２鎖発現シストロンをFab第２鎖と足場配列とDNA結合蛋白質との融合蛋白質として発現させ、DNA結合蛋白質がFab 第２鎖発現シストロン下流のDNA結合蛋白質結合配列に結合することによりFab第２鎖とポリヌクレオチドの複合体を形成させ、Fab第２鎖のアミノ酸配列とそれをコードする塩基配列の対応付けが可能となる。ここで、DNA結合蛋白質としては、DNA結合蛋白質が転写翻訳時に鋳型となったDNA分子と転写翻訳反応中に一度も解離することなく同一DNA分子上に存在する該DNA結合蛋白質の結合配列と結合する、いわゆるシス型の結合様式をもつRepA蛋白質などが挙げられ、RepA結合配列としてはCIS配列とそれに続くori配列が挙げられる（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol.101, p.2806-2810, 2004および特表2005-537795）。シス型の結合様式をもつ他のDNA結合蛋白質として、大腸菌Ti plasmid にコードされるRecC蛋白質(Pinto, et al., Mol. Microbiol. (2011) vol.81, p.1593-1606)、φX174ファージのA蛋白質(Francke, et al., Proc Natl Acad Sci U S A (1972) vol.69, p.475-479)、λファージのQ蛋白質(Echols, et al., Genetics (1976) vol.83, p.5-10)等を、該DNA結合蛋白質それぞれに対する結合配列と組み合わせて用いてもよい。また、転写と翻訳がよく共役する無細胞翻訳系を用いる場合は、合成された蛋白質が転写終結部位の近傍でリリースされるため、エストロゲン受容体などの核内受容体のＤＮＡ結合ドメイン、Two-Hybrid Systemに使用されるLexAやGal4のＤＮＡ結合ドメインのように、一般的にトランス型の結合様式を持つDNA蛋白質と考えられているものを、該DNA結合蛋白質それぞれに対する結合配列と組み合わせて用いてもよい。
【００４３】
本発明の第２の態様にかかるポリヌクレオチド構築物において、Fab第１鎖発現シストロンがリボゾームディスプレイを利用し、Fab第２鎖発現シストロンがCISディスプレイを利用する態様の一例を図６に示す。
【００４４】
なお、本発明のポリヌクレオチド構築物はmRNAでもよいし、mRNAを転写するDNAでもよい。ポリヌクレオチド構築物がmRNAの場合、「Fabを発現させる」とはmRNAからFab蛋白質への翻訳を意味し、 ポリヌクレオチド構築物がDNAの場合、「Fabを発現させる」とはDNAからmRNAへの転写およびmRNAからFab蛋白質の翻訳を意味する。なお、ポリヌクレオチド構築物がDNAの場合は、mRNAを転写するためのRNAポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列をさらに含むことが好ましい。プロモーターは、使用する発現系に応じて適宜、選択することができる。例えば、大腸菌細胞や大腸菌由来の無細胞翻訳系を用いる場合、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、あるいは大腸菌ゲノム中の内因性プロモーター等の大腸菌で機能するプロモーターが例示される。
【００４５】
上記ポリヌクレオチド構築物は、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクターなどに組み込まれてもよい。ベクターの種類は、用いる翻訳系やスクリーニング系にしたがって適宜選択することができる。上記ポリヌクレオチド構築物およびそれを含むベクターはMolecular Cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001）などに記載されている公知の遺伝子学的手法によって作製することができる。
【００４６】
なお、上記第１の態様及び第２の態様において、Fab H鎖コード配列とFab L鎖コード配列はどちらが先に配置されてもよい。Fab H鎖コード配列を先（５’側）に配置し、先にH鎖を翻訳させて近くで待たせておき、L鎖の翻訳が完了したら直ちにペアリングさせると、H鎖同士のペアリングよりも起こりやすいと言われているL鎖同士のペアリングのリスクを低減できるという利点がある。一方、Fab L鎖コード配列を先（５’側）に配置し、先にL鎖を翻訳させ近くで待たせておき、H鎖の翻訳が完了したら直ちにペアリングさせると、一般的にL鎖よりも物性が悪くアグリゲーションするリスクが高いと言われているH鎖がアグリゲーションに進むリスクを低減できる。
【００４７】
＜Fabの製造方法＞
本発明のFabの製造方法は上記ポリヌクレオチド構築物をリボゾームを含む無細胞翻訳系に導入してFabを生成させる工程を含む。無細胞翻訳系としては大腸菌、酵母、哺乳動物細胞等の細胞から得られた無細胞翻訳系が例示されるが、大腸菌由来の無細胞翻訳系が好ましい。
【００４８】
そして、無細胞翻訳系は、リボゾームを含む画分を細胞から抽出して得られる細胞抽出液でもよいし、個別に精製された因子から構成された再構成型の無細胞翻訳系でもよい。
【００４９】
細胞抽出液型の無細胞翻訳系は、一般的には細胞を破砕し、30,000g程度の超遠心等で不要物を除いたS30と呼ばれる細胞抽出液に、適切な処理を加えて調製する。S30の出発材料としてこれまで様々な生物の細胞が試されてきたが、現在では、大腸菌(Zubay, Annual Review of Genetics (1973) vol.7, p.267-287)、コムギ胚芽(Roberts, et al., Proc Natl Acad Sci U S A (1973) vol.70, p.2330-2334)、ウサギ網状赤血球(Pelham, et al., Eur. J. Biochem. (1976) vol.67, p.247-256)の3種類が一般的に利用されている。また大腸菌を出発材料とする場合は、目的に応じて様々な変異株を用いてS30を調製することもできる。例えば、鋳型として用いる直鎖状の二本鎖DNAを反応液中で安定化させたい場合は、RecBCD複合体（Exonuclease V）のサブユニットであるRecDの欠損変異株であるSL119株(Lesley, et al., J. Biol. Chem. (1991) vol.266, p.2632-2638)を用いることができる。
【００５０】
個別に精製された因子から構成された再構成型の無細胞翻訳系としては、例えば、特開2003-102495や特開2008-271903に記載のPUREシステムを挙げることができる。この再構成型無細胞翻訳系は、細胞抽出液を使用する無細胞翻訳系よりもヌクレアーゼやプロテアーゼの混入を容易に防ぐことができるので、mRNAからポリペプチドへ翻訳する効率を高めることができる。
上記CISディスプレイの場合は遺伝媒体として細胞抽出液中でも比較的安定な二本鎖DNAを用いるのでリボゾームを含む画分を細胞から抽出して得られる細胞抽出液を用いることも可能である。
リボゾームディスプレイの場合は、細胞抽出液中に大量に存在するRNA分解酵素により遺伝媒体であるRNAが分解される危険性があるため、個別に精製された因子から構成された再構成型の無細胞翻訳系が好ましい。このようなPUREシステムを用いたリボゾームディスプレイは「PURE ribosome display（PRD）」と呼ばれている。
【００５１】
各因子は、種々の細胞の抽出液から精製することによって得ることができる。因子を精製するための細胞は、例えば原核細胞、または真核細胞を挙げることができる。原核細胞としては、大腸菌細胞、高度好熱菌細胞、または枯草菌細胞を挙げることができる。真核細胞としては、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞を挙げることができる。
【００５２】
リボゾームとそれ以外の因子をそれぞれ精製し、再構成型の無細胞翻訳系を調製することがより好ましい。
リボゾームは、リボゾームRNAと種々のリボゾーム蛋白質とで構成される巨大な複合体であり、大小２つのサブユニットからなる。リボゾームやそれを構成するサブユニットは、ショ糖密度勾配などによって相互に分離することができ、その大きさは、沈降係数によって表される。具体的には、原核生物においては、リボゾームとそれを構成するサブユニットは、それぞれ次のような大きさを有する。大腸菌などの原核生物は容易に大量培養することができるので、大腸菌などの原核生物は、リボゾームを大量に調製するうえで、好ましい生物である。
リボゾーム（70S）＝大サブユニット（50S）＋小サブユニット（30S）
分子量： 約2.5x106約1.6x106 約0.9x106
【００５３】
更に細かく見ると、50Sサブユニットと30Sサブユニットは、それぞれ次のような成分で構成されていることが明らかにされている。
50Sサブユニット；L1〜L34の34種類の蛋白質（リボゾーム蛋白質）
23S RNA（約3200ヌクレオチド）
5S RNA（約120ヌクレオチド）
30Sサブユニット；
S1〜S21の21種類の蛋白質（リボゾーム蛋白質）
16S RNA（約1540ヌクレオチド）
つまり各サブユニットは、これらの成分からなる複合体として単離されうる。更にリボゾームは、各サブユニットの複合体として単離されうる。精製されたリボゾームとは、たとえば原核生物由来のリボゾームにおいては、大小のサブユニットからなる70Sリボゾームとして精製された複合体、または、それぞれ精製された50Sサブユニットと30Sサブユニットを混合してできた複合体を指す。
【００５４】
一方、真核細胞においては、リボゾームとそれを構成するサブユニットは、それぞれ次のような大きさを有する。リボゾーム（80S）＝大サブユニット（60S）＋小サブユニット（40S）したがって、無細胞翻訳系を真核細胞由来のリボゾームで構成する場合には、80Sリボゾームとして精製されたリボゾームを利用することができる。
【００５５】
無細胞翻訳系に加えられるリボゾーム以外の因子としては、例えば、以下のような因子が挙げられる。これらの因子は、大腸菌等の原核細胞由来のものに限らず、真核細胞由来のものも使用できる。なお、これらの因子および因子の精製方法は公知である（特開2003-102495）。
開始因子 (Initiation Factor; IF)、
伸長因子 (Elongation Factor; EF)、
アミノアシルtRNA合成酵素、
メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ（MTF）
なお、解離因子も含んでよいが、リボゾーム上で蛋白質とポリヌクレオチドの複合体を安定に維持するためには解離因子を含まないことが好ましい。
【００５６】
開始因子とは、翻訳開始複合体の形成に必須であるか、又は、これを著しく促進する因子であり、大腸菌由来のものとして、IF1、IF2及びIF3が知られている（Claudio O et al. (1990) Biochemistry, vol.29, p.5881-5889）。開始因子IF3は、翻訳の開始に必要な段階である、70Sリボゾームの30Sサブユニットと50Sサブユニットへの解離を促進し、また、翻訳開始複合体の形成の際に、フォルミルメチオニルtRNA以外のtRNAのP部位への挿入を阻害する。開始因子IF2は、フォルミルメチオニルtRNAと結合し、30SリボゾームサブユニットのP部位へフォルミルメチオニルtRNAを運び、翻訳開始複合体を形成する。開始因子IF1は開始因子IF2，IF3の機能を促進する。例えば、大腸菌由来の開始因子を使用した場合、例えば、0.01μM〜300μM、好ましくは、0.04μM〜60μMで使用できる。
【００５７】
伸長因子としては、大腸菌由来のものとして、EF-Tu、EF-Ts及びEF-Gが知られている。伸長因子EF-Tuは、GTP型とGDP型の2種類があり、GTP型はアミノアシルtRNAと結合してこれをリボゾームのA部位へ運ぶ。EF-Tuがリボゾームから離れる際にGTPが加水分解され、GDP型へ転換する。（Pape T et al, (1998) EMBO J, vol.17, p.7490-7497）。伸長因子EF-Tsは、EF-Tu（GDP型）に結合し、GTP型への転換を促進する（Hwang YW et al. (1997) Arch. Biochem. Biophys., vol.348, p.157-162）。伸長因子EF-Gは、ペプチド鎖伸長過程において、ペプチド結合形成反応の後の転位（translocation）反応を促進する（AgrawalRK et al, (1999) Nat. Struct. Biol., vol.6, p.643-647, Rodnina MW. et al, (1999) FEMS Microbiology Reviews, vol.23, p.317-333）。例えば、大腸菌由来の伸長因子を使用した場合、例えば、0.005μM〜200μM、好ましくは、0.02μM〜50μMで使用できる。
【００５８】
アミノアシルtRNA合成酵素（aminoacyl-tRNA synthetases; AARS）は、ATPの存在下でアミノ酸とtRNAを共有結合させ、アミノアシルtRNAを合成する酵素であり、各アミノ酸に対応したアミノアシルtRNA合成酵素が存在している（Francklyn C et al, (1997) RNA, vol.3, p.954-960, 蛋白質核酸酵素, vol.39, p.1215-1225 (1994)）。例えば、大腸菌由来のアミノアシルtRNA合成酵素を使用した場合、例えば、0.01μg/ml〜10,000μg/ml、好ましくは、0.05μg/ml〜5,000μg/mlで使用できる。
【００５９】
メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ（MTF）は、原核生物における蛋白質合成においてメチオニル開始tRNAのアミノ基にフォルミル基がついたN-フォルミルメチオニル(fMet)開始tRNAを合成する酵素である。即ち、メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼは、FDのフォルミル基を、開始コドンに対応するメチオニル開始tRNAのアミノ基に転移させ、fMet-開始tRNAにする（Ramesh V et al, (1999) Proc.Natl.Acad.Sci.USA, vol.96, p.875-880）。付加されたフォルミル基は開始因子IF2により認識され、蛋白質合成の開始シグナルとして作用する。真核生物の細胞質における蛋白質合成系にはMTFが存在していないが、真核生物のミトコンドリア及び葉緑体における蛋白質合成系には存在する。MTFの好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌K12株から得られるものである。大腸菌由来のMTFを使用した場合、例えば、100 U/ml〜1,000,000 U/ml、好ましくは、500 U/ml〜400,000 U/mlで使用できる。ここで、1分間に1 pmolのfMet-開始tRNAを形成する活性を1 Uとする。また、MTFの基質であるフォルミルドナー(FD)は、例えば、0.1μg/ml〜1000μg/ml、好ましくは、1μg/ml〜100μg/mlで使用できる。
【００６０】
更に反応液に添加されるポリヌクレオチドがDNAの場合には、mRNAに転写するためのRNAポリメラーゼを含むことができる。具体的には、次のようなRNAポリメラーゼを利用することができる。これらのRNAポリメラーゼは市販されている。
T7 RNAポリメラーゼ
T3 RNAポリメラーゼ
SP6 RNAポリメラーゼ
T7RNAポリメラーゼを使用した場合、例えば、0.01μg/ml〜5000μg/ml、好ましくは、0.1μg/ml〜1000μg/mlで使用できる。またCISディスプレイにおいて再構築型の無細胞翻訳系を用いることで、FabとDNAの複合体形成の効率を追及する場合には、Nucleic Acid Research 2010, vol. 38, No. 13, e141に記載されているように、精製された大腸菌の内因性RNAポリメラーゼを添加することもできる。また、Nucleic Acid Research 1988, vol. 16, No. 14, 6493に記載されているように、精製された大腸菌の転写終結因子であるrho蛋白質を添加することもできる。
【００６１】
無細胞翻訳系は、転写や翻訳のための因子に加え、更に付加的な成分を含むことができる。付加的な成分として、たとえば、次のような成分を示すことができる。
反応系においてエネルギーを再生するための酵素：
クレアチンキナーゼ；
ミヨキナーゼ；および
ヌクレオシドジフォスフェートキナーゼなど
転写・翻訳で生じる無機ピロリン酸の分解のための酵素：
無機ピロフォスファターゼなど
上記酵素は、例えば、0.01μg/ml〜2000μg/ml、好ましくは、0.05μg/ml〜500μg/mlで使用できる。
【００６２】
無細胞翻訳系は、アミノ酸、ヌクレオシド三リン酸、tRNA、塩類を含むことが好ましい。さらに、大腸菌等の原核細胞由来の反応系である場合は、上記メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼおよび10-フォルミル5,6,7,8-テトラヒドロ葉酸（FD）を含むことが好ましい。
【００６３】
アミノ酸としては、天然型アミノ酸に加え、非天然型アミノ酸も用いることができる。これらのアミノ酸は、無細胞翻訳系を構成するアミノアシルｔRNA合成酵素の作用によってtRNAに保持される。あるいは、予めアミノ酸をtRNAにチャージして無細胞翻訳系に加えることができる。ここで、tRNAへのアミノ酸のチャージとは、tRNAにアミノ酸を保持（carry）させ、リボゾームにおける翻訳反応に利用される状態にすることをいう。非天然アミノ酸を認識する人工アミノアシル合成酵素存在下で非天然アミノ酸を添加したり、非天然アミノ酸でチャージされたtRNAを用いたりすることで、蛋白質の特定のコドンの部位に非天然アミノ酸を導入することが可能となる。天然のアミノ酸を使用した場合、例えば、0.001 mM〜10 mM、好ましくは、0.01 mM〜2 mMで使用できる。
【００６４】
tRNAとしては、大腸菌、酵母等の細胞から精製したtRNAを用いることができる。またアンチコドンやその他の塩基を任意に変更した人工tRNAも用いることができる（Hohsaka, Tet al. (1996) J. Am. Chem. Soc., vol.121, p.34-40, Hirao I et al (2002) Nat. Biotechnol., vol.20, p.177-182）。例えば、CUAをアンチコドンとして持つtRNAに非天然のアミノ酸をチャージすることで、本来終止コドンであるUAGコドンを非天然アミノ酸に翻訳することが可能である。また，4塩基コドンをアンチコドンとして持つtRNAに非天然アミノ酸をチャージした人工アミノアシルtRNAを用いることにより、天然には存在しない4塩基コドンを非天然アミノ酸に翻訳することが可能である（Hohsaka et al. (1999) J.Am.Chem.Soc., vol.121, p.12194-12195）。このような人工tRNAを作製する方法としては，RNAを用いる方法も使用できる（特表2003-514572）。これらの方法により部位特異的に非天然アミノ酸を導入した蛋白質を合成することができる。大腸菌tRNA混合液を使用した場合、例えば、0.1A260/ml〜1000 A260/ml、好ましくは、1 A260/ml〜500 A260/mlで使用できる。
【００６５】
上記再構成型無細胞翻訳系は、各因子を転写や翻訳に好適なpH7-8を維持する緩衝液に加えることによって調製することができる。緩衝液としては、リン酸カリウム緩衝液（pH7.3）、Hepes-KOH（pH 7.6）などを挙げることができる。Hepes-KOH（pH 7.6）を使用した場合、例えば、0.1 mM〜200 mM、好ましくは、1 mM〜100 mMで使用できる。
【００６６】
無細胞翻訳系は、因子の保護や活性の維持を目的として塩類を含むこともできる。具体的には、グルタミン酸カリウム、酢酸カリウム、塩化アンモニウム、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどがあげられる。これらの塩類は、通常、0.01 mM〜1000 mM、好ましくは、0.1 mM〜200 mMで使用される。
【００６７】
無細胞翻訳系は、酵素の基質として、また、活性の向上、維持を目的として、その他の低分子化合物を含むことができる。具体的には、ヌクレオシド三リン酸（ATP, GTP, CTP,UTPなど）などの基質、プトレシン（putrescine）、スペルミジン（spermidine）などのポリアミン類、ジチオトレイトール（DTT）などの還元剤、およびクレアチンリン酸などのエネルギー再生のための基質などを無細胞翻訳系に加えることができる。これらの低分子化合物は、通常、0.01 mM〜1000 mM、好ましくは、0.1 mM〜200 mMで使用できる。
【００６８】
無細胞翻訳系の具体的な組成は、Shimizuら（Shimizu et al., Nat. Biotechnol. (2001) vol.19, p.751-755、Shimizu et al., Methods (2005) vol.36, p.299-304）、あるいはYingら（Ying et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2004) vol.320, p.1359-1364）の記載を元に調製することができる。ただし、各因子の濃度は、精製した因子の比活性や目的などに応じて適宜増減できる。たとえば、エネルギー消費が大きくなる場合はATPを増やすことができる。また、翻訳されるmRNAのコドンの使用頻度に応じて、特定のtRNAを添加することも可能である。
【００６９】
無細胞翻訳系は、高次構造を形成しにくい蛋白質の場合、分子シャペロンと呼ばれる一群の蛋白質を含むこともできる。具体的には、Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40、Hsp10、低分子量Hspおよび、それらのホモログ、さらに大腸菌のトリガーファクターなどを添加した無細胞翻訳系があげられる。分子シャペロンは、細胞内で蛋白質の高次構造形成を助け、蛋白質の凝集を防ぐことが知られている蛋白質である（Bukau and Horwich, Cell (1998) vol.92, p.351-366、Young et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol (2004) vol.5,p.781）。
【００７０】
また、Fabを発現させる場合は、分子内でジスルフィド結合を形成するので、反応液の酸化還元電位が重要である。そのため、反応液から、還元剤であるDTTを除去したり、さらには、グルタチオンを添加した無細胞翻訳系を使用することもできる。さらには、ジスルフィド結合を促進したり、正しい結合に組み替える酵素を添加した無細胞翻訳系を使用することができる。具体的には、このような酵素としては、真核細胞のERに存在するプロテインジスルフィドイソメラーゼ（PDI）や、大腸菌のDsbA、DsbC等があげられる。
【００７１】
上記のような無細胞翻訳系にポリヌクレオチド構築物を導入し、翻訳反応を行うことにより、Fabを得ることができる。なお、得られたFabはアフィニティカラム等を用いて精製することもできる。
【００７２】
＜スクリーニング方法＞
本発明のスクリーニング方法は、（i）Fabのライブラリーをコードするポリヌクレオチド構築物を無細胞翻訳系に導入してFabを合成し、合成されたFabをそれをコードするポリヌクレオチド上に提示する工程、（ii）ポリヌクレオチド上に提示されたFabを抗原と接触させる工程、（iii）抗原と反応する目的Fabを選択する工程、および（iv）目的Fabをコードするポリヌクレオチドを増幅する工程を含む。
【００７３】
上記のような無細胞翻訳系を使用し、与えられた遺伝情報に基づいてFabがリボゾーム及び／又はmRNA上に提示される。リボゾームディスプレイにおいては、Fabを含むポリペプチドは、３’末端のリボゾームストール配列の存在によりmRNA上にリボゾームがストールされて、それをコードする遺伝情報（mRNA）を伴ったまま維持される。すなわち、mRNA−リボゾーム−ポリペプチドの３つの要素の複合体が形成される。一方、ピューロマイシンまたはその誘導体を利用したmRNAディスプレイでは、ポリヌクレオチド構築物（mRNA）の３’末端のピューロマイシンまたはその誘導体の存在により、Fabを含むポリペプチドのＣ末端がピューロマイシンまたはその誘導体に共有結合し、Fabを含むポリペプチドとそれをコードするmRNAのリンクが維持される。またCISディスプレイではFabを含むポリペプチドをDNA結合蛋白質との融合蛋白質として発現させ、DNA結合蛋白質がDNA上の標的配列に結合することにより、Fabを含むポリペプチドとそれをコードするDNAのリンクが維持される。いずれの方法でも抗原に結合したFabを選択し、それに結合したmRNAを回収することによって、その遺伝情報も回収される。標的抗原と結合したFabとmRNAを含む複合体中のmRNAからcDNAを合成し、PCRにより増幅させた後、再び転写・翻訳反応を行なう。これらの工程を繰り返すことにより目的抗原に対する抗体を得ることができる。
【００７４】
以下、より具体的に説明する。
Fab遺伝子ライブラリーの規模は、通常1×108以上、好ましくは1×109以上、より好ましくは1×1010以上、さらに好ましくは1×1012以上である。
標的物質（抗原）に前記Fab遺伝子ライブラリーから発現したFabライブラリーを接触させ、Fabライブラリーから標的物質に結合するFabを選択し、それをコードするポリヌクレオチドを増幅する。
【００７５】
標的物質に結合したFabを選択するには、標的物質と結合したFabを、標的物質と結合していない多数のFabの中からスクリーニングする必要がある。これはパニングとよばれる既知の方法に従って行う（Coomber (2002) Method Mol. Biol., vol.178, p.133-145）。パニングの基本的なプロトコルは以下のとおりである。
（１）標的物質にFabライブラリーを接触させる。ビーズ、プレートやカラム等の担体に標的物質を結合させ、ここにFabとポリヌクレオチドの複合体を含む試料を接触させてもよい（固相選択）。また、標的物質をビオチン化し、これをFabと結合させ、標的物質とFabの複合体をストレプトアビジン磁気ビーズビーズで回収するような、液相での選択も可能である。また、固相選択と液相選択を組み合わせてもよい。スクリーニングを複数ラウンド行い、前半は固相選択、後半は液相選択を行うことで、高親和性抗体を効率よく選択することができる。
（２）標的物質に結合しなかった、ライブラリーに含まれていたその他のFabを除去する。例えば、洗浄により除去することができる。洗浄は通常の抗原抗体反応の洗浄に使用される洗浄液を使用することができるが、後述するような親Fabより親和性の高いFabを得るためのスクリーニングを行う場合には、親Fabと抗原との結合が維持され、それより弱い結合が除かれるような条件で洗浄を行うことが好ましい。
（３）除去されなかったFab、すなわち標的物質に特異的に結合していたFabを回収する。
（４）必要に応じ（１）から（３）の操作を複数回繰り返す。
【００７６】
リボゾームディスプレイやmRNAディスプレイ、CISディスプレイの場合、一連の工程を繰り返す場合には、（１）の工程の前に、回収されたポリペプチド-ポリヌクレオチドを含む複合体中のポリヌクレオチドを増幅する。例えば、mRNAはRT-PCRによって増幅することができる。RT-PCRによって、mRNAを鋳型としてDNAが合成される。DNAを再びmRNAに転写し、複合体の形成のために利用することができる。図７、８に、DNAからmRNAを転写し、翻訳してFabを生成させ、抗原と結合したFabを選択してmRNAそこからを回収して増幅するという一連の操作を示したFabのスクリーニング法の一例に関する模式図を示す。
【００７７】
以上の操作により、目的抗原に特異的に結合するFabをコードするポリヌクレオチドが濃縮される。目的のFabのアミノ酸配列情報は、得られたポリヌクレオチドの配列を解析することにより同定することができる。
【００７８】
また、目的の抗原に対する抗体が既に得られており、その抗体におけるCDRの配列が公知であるときは、本発明のスクリーニング法を利用して、親和性がさらに高まった抗体を得ることもできる。
すなわち、本発明においては、
（I）Fab 第１鎖コード配列またはFab 第２鎖コード配列が、親抗体のFab 第１鎖またはFab 第２鎖のアミノ酸配列においてCDR内の１つの位置に対して1アミノ酸置換を含むアミノ酸配列をコードする、本発明のポリヌクレオチド構築物を、Fab 第１鎖およびFab 第２鎖のCDR内の複数の位置に対して1アミノ酸置換が含まれるように複数種類用意する工程、
（II）該複数種類のポリヌクレオチド構築物を用いて前記工程（i）〜（iv）を繰り返して高親和性Fabを複数スクリーニングする一次スクリーニング工程、
（III）一次スクリーニング工程で選択された複数のFabにおけるFab 第１鎖およびFab 第２鎖のCDR内の各位置での1アミノ酸置換を解析する工程、
（IV）Fab 第１鎖コード配列およびFab 第２鎖コード配列が、親抗体のFab 第１鎖およびFab 第２鎖の配列においてCDR内の各位置に一次スクリーニングで同定された1アミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列をコードする、本発明のポリヌクレオチド構築物を用意する工程、
（V）該ポリヌクレオチド構築物を用いて前記工程（i）〜（iv）を繰り返して高親和性Fabをスクリーニングする二次スクリーニング工程
を含む、Fabのスクリーニングを行う方法が提供される。
なお、工程（I）における複数とは２以上であればよいが、好ましくはCDR内の全てのアミノ酸である。
【００７９】
以下、Fabの親和性を高めるためのスクリーニング方法について具体的に説明する。
ただし、本発明のスクリーニング方法はこの態様に限定されない。
まず、目的の抗原に対する抗体（親抗体）のアミノ酸配列（親配列）を用意する。そして、図２４のように、このアミノ酸配列において、H鎖のCDRのアミノ酸（CDR-H1  ８個、CDR-H2  １１個、CDR-H3  １２個、合計３１個）のうちの１つにおいて1アミノ酸置換（好ましくは親アミノ酸を含めた天然20アミノ酸全てが出現する1アミノ酸置換）を有するようなH鎖コード配列と親抗体のL鎖コード配列を含む本発明のポリヌクレオチド構築物をH鎖のCDRのアミノ酸（合計３１個）の数だけ用意する（H鎖ライブラリー）。
また、親抗体のアミノ酸配列において、L鎖のCDRのアミノ酸（CDR-L1  ７個、CDR-L2  ６個、CDR-L3  ６個、合計１９個）のうちの１つにおいて、1アミノ酸置換（好ましくは親アミノ酸を含めた天然20アミノ酸全てが出現する1アミノ酸置換）を有するようなL鎖コード配列と親抗体のH鎖コード配列を含むポリヌクレオチド構築物をL鎖のCDRのアミノ酸（合計１９個）の数だけ用意する（L鎖ライブラリー）。
上記H鎖ライブラリーとL鎖ライブラリーを一次ライブラリーとし、これを用いて工程（i）〜（iv）を繰り返し、高親和性抗体のスクリーニングを行う（１次スクリーニング）。
１次スクリーニングによって高親和性抗体をコードするポリヌクレオチド配列が濃縮されているので、濃縮された複数の配列を解析し、H鎖およびL鎖のCDRの各位置について高頻度に観察されるアミノ酸置換を、親和性向上のために好ましいアミノ酸置換として選択する。
【００８０】
ポリヌクレオチドの配列解析は通常のシークエンシングによって行うことができるが、スクリーニングによって増幅されたFabコード配列をクローン化することなく、大量に網羅的に配列解析でき、スクリーニング時間が大幅に短縮できるという点で、次世代シークエンサーを用いることが好ましい。
ここで、Sanger シークエンシング法を利用した蛍光キャピラリーシークエンサーに代表される第1世代シークエンサーと対比させて使われている次世代シークエンサーという用語は、実際には多様な機器や技術を含み、今後も様々な形態のものが考案されると考えられる（Mardis, Annu. Rev. Genom. Human Genet. (2008) vol.9, p.387-402およびPersson et al., Chem. Soc. Rev. (2010) vol.39, p.985-999）。
第1世代シークエンサーが一般にベクター宿主システムを用いてクローン化したDNAの配列決定に利用されるのに対し、次世代シークエンサーは多様な配列をもつDNAサンプルを解析対象としながらも、ベクター宿主システムを用いてDNAのクローン化をすることなく、サンプル中に存在するDNA配列を高速に解読できる。
第1世代シークエンサーを用いたDNA配列決定では、
(i)プラスミド等のベクターへのDNA断片の組み込みと大腸菌等の宿主の形質転換、
(ii)宿主コロニーの単離によるクローン化、
(iii)解析規模に応じた数のクローンの培養およびプラスミドの抽出、
(iv)プラスミド等を鋳型としたPCR等によるシークエンス反応、
(v)キャピラリー電気泳動等を用いたシークエンス反応産物の分離・検出・解析、
という過程を経て個々のクローンのDNA配列を決定する。多数のクローンのDNA配列を一度に決定する場合は、クローン化以降の(ii)〜(v)の工程で、クローンごとに独立した反応・処理が必要となり、解析クローン数の規模に比例した作業量が必要となる。
一方、次世代シークエンサーを用いたDNA配列決定では、多様な配列を含むDNA断片を、Emulsion PCRやBridge PCR といった単分子PCR法等の増幅技術、あるいは1分子観察等の高感度検出技術、を応用することで解析用基板上に大規模数存在する個々の解析スポット上にクローン化して超並列的に配列解析する。このため、解析クローン数の規模に関わらず単一の反応・処理で、例えば１つの解析用基板上に形成された106〜109のクローンの配列を決定できる。
【００８１】
現時点で最も普及している次世代シークエンサーは、DNAポリメラーゼまたはDNAリガーゼによる逐次的DNA合成法を用いて、蛍光・発光など光検出により超並列的に塩基配列を決定する原理のものである。DNAポリメラーゼを用いる方法として、GS FLX（Roche Diagnostics）、Solexa (Illumina)等が、またDNAリガーゼを用いる方法としてSOLiD（Applied Biosystems）、Polonator （Dover Systems）等が知られている。また、DNA1分子を鋳型としてDNAポリメラーゼによるDNA合成を行い、1塩基ごとの反応を蛍光・発光などの光で検出することにより、１分子リアルタイム観察により塩基配列を決定するHeliScope (Helicos Biosciences)、SMRT (Pacific Biosciences)等が知られている。その他に、Post-light シークエンシングと称される蛍光・発光など光検出以外の検出方法により、超並列的に塩基配列を決定する原理も報告されており、半導体(CMOS)チップを用いて、DNA ポリメラーゼにより各塩基が取り込まれるときに放出される水素イオン(pH変化)を検出することで塩基配列を決定する、Ion Torrent Systems等がこれに該当する。他にもNanopore（Oxford Nanopore Technologies）等が知られている。
【００８２】
1次スクリーニングで得られたH鎖およびL鎖のCDRの各アミノ酸の1アミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を二次ライブラリーとする。例えば、１次スクリーニングにおいて、H鎖の１番目のCDR（H1）の一番目のアミノ酸はAlaまたはThrに置換されていることが好ましく、二番目のアミノ酸はIleまたはLeuに置換されていることが好ましいという結果が得られたら、二次スクリーニングに使用するライブラリーは一番目のアミノ酸がAlaまたはThrであり、二番目のアミノ酸がIleまたはLeuであり、その他のアミノ酸も１次スクリーニングで得られた好ましいアミノ酸の組み合わせになるよう塩基配列を設計して２次ライブラリーを作製する。なお、１次スクリーニングで得られた好ましい変異アミノ酸と親配列のアミノ酸の組み合わせを二次ライブラリーとしてもよい。
【００８３】
このようにして得られた二次ライブラリーを用いて、工程（i）〜（iv）を繰り返し、２次スクリーニングを行うことにより、親抗体よりも抗原に対する親和性が顕著に向上した抗体を多数取得することができる。親抗体よりも抗原に対する親和性が顕著に向上したことは、SPRやELISAなどによって解析することができる。
【００８４】
なお、本発明のポリヌクレオチド構築物は、Fabを製造したり、スクリーニングしたりするためのキットの構成成分とすることができる。
【００８５】
本発明のYmacs法における、1次ライブラリーによるポテンシャルな有用1アミノ酸置換の検索、２次ライブラリーによるこれら有用1アミノ酸置換の最適な組合せ検索、からなる2段階親和性成熟の原理は抗体のFab断片に限らず、scFvや完全長抗体、その他の標的結合性蛋白質における標的親和性の向上のために、幅広い蛋白質ディスプレイ系と組み合わせて応用できる。
【００８６】
すなわち、本発明では、
（I）標的物質結合蛋白質における標的物質結合部位を構成する全アミノ酸ポジションについて、1アミノ酸ポジションごとに天然アミノ酸全20種類にランダム化する１ポジションライブラリーを、アミノ酸ポジションの数だけ構築する工程、
（II）これらの1ポジションライブラリーを全てあるいは適当な単位で統合して1次ライブラリーを構築する工程（１次ライブラリーポリヌクレオチド構築物を用意する工程）、
（III）蛋白質ディスプレイ系を用いて１次ライブラリーを標的親和性で濃縮する工程、
（IV）（III）で得られた1次ライブラリー濃縮サンプルのポリヌクレオチド配列情報を決定する工程、
（V）塩基配列情報から高頻度（好ましくは２以上）に観察される1アミノ酸置換を抽出する工程、
（VI）高頻度に観察される1アミノ酸置換の組み合わせを含む2次ライブラリーを構築する工程（２次ライブラリーポリヌクレオチド構築物を用意する工程）、および
（VII）蛋白質ディスプレイ系を用いて２次ライブラリーを標的親和性で濃縮する工程、
を含む、標的物質結合蛋白質の標的物質親和性を最大化する方法（標的物質親和性が向上した変異型標的物質結合蛋白質を得る方法）が提供される。
なお、工程（II）で適当な単位で統合して1次ライブラリーを構築する場合、工程（I）で構築した１ポジションライブラリーを２群以上に分けて、１次ライブラリーを２種類以上使用してもよい。また（VI）で構築する2次ライブラリーには、高頻度に観察される1アミノ酸置換に加え、親抗体がコードしていた親アミノ酸を追加してもよい。
【００８７】
ここで、標的物質結合蛋白質としては、抗原結合蛋白質やサイトカインなどが挙げられる。
抗原結合蛋白質としては、Fab、scFv、完全長抗体などの抗体が挙げられるが、抗原に特異的に結合するものである限り、抗体に分類されない蛋白質であってもよい。
また、サイトカインに変異を導入し、受容体に対する結合性を高めることもできる。
【００８８】
蛋白質ディスプレイ系としては、蛋白質とそれをコードするポリヌクレオチドが対応付けられるものである限り特に制限されず、上述したようなリボゾームディスプレイ、mRNAディスプレイ、CISディスプレイなどの無細胞系のみならず、ファージディスプレイ（非特許文献１）やバクテリア表面ディスプレイ(Jose, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2006) vol.69, p.607-614)、酵母表面ディスプレイ(Feldhaus et al., Nat. Biotechnol. (2003) vol.21, p.163-70)、または高等真核生物の細胞表面ディスプレイ(Horlick, WO 2008/103475)等、その他の蛋白質ディスプレイ系であってもよい。１ポジションライブラリーポリヌクレオチドの標的物質結合蛋白質コード領域以外の部分は、公知の各蛋白質ディスプレイ用のベクターに準じた構成とすることができる。ライブラリーポリヌクレオチドに含まれる標的物質結合蛋白質コード領域は、標的物質結合蛋白質の全長をコードしてもよいし、標的物質結合蛋白質のうち標的物質結合部位を含む一部をコードしてもよい。
【００８９】
以下、一例を挙げてより具体的に説明する。
例えば、標的物質結合蛋白質（野生型）において、標的物質結合部位が１０アミノ酸からなる領域である場合、１〜１０のうちの１つのポジションに２０アミノ酸が出現する１ポジションライブラリーを合計１０種類用意する。
この１０種類の１ポジションライブラリーを合わせて１次ライブラリーとし、これを用いて、標的物質親和性で濃縮する。具体的には、下記の工程（i'）〜（iv'）を繰り返して標的物質に高親和性の配列を濃縮する。
（i'）ライブラリーを蛋白質ディスプレイ系に導入して標的物質結合蛋白質を発現させ、該標的物質結合蛋白質をコードするポリヌクレオチド上で提示させる工程、
（ii'）標的物質と標的物質結合蛋白質を接触させる工程、
（iii'）標的物質と反応する目的標的物質結合蛋白質を選択する工程、および
（iv'）目的標的物質結合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを増幅する工程、を繰り返す（1次スクリーニング）。
これらの工程は、通常の蛋白質ディスプレイにおける操作と同様にして行うことができる。
工程（ii'）は、ビーズ、プレートやカラム等の担体に標的物質を結合させ、ここに標的物質結合蛋白質とポリヌクレオチドの複合体を含む試料を接触させてもよい（固相選択）。また、標的物質をビオチン化し、これを標的物質結合蛋白質と結合させ、標的物質と標的物質結合蛋白質の複合体をストレプトアビジン磁気ビーズビーズで回収するような、液相での選択も可能である。また、固相選択と液相選択を組み合わせてもよい。スクリーニングを複数ラウンド行い、前半は固相選択、後半は液相選択を行うことで、高親和性蛋白質を効率よく選択することができる。
非特異的結合を除くため、（ii'）と（iii'）の間に洗浄項操作を行うことが好ましい。洗浄は、野生型標的物質結合蛋白質と標的物質との結合が維持され、それより弱い結合が除かれるような条件で行うことが好ましい。
【００９０】
１次スクリーニングによって標的物質高親和性蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列が濃縮されるので、濃縮された複数の標的物質結合部位の配列を解析し、H鎖およびL鎖のCDRの各位置について高頻度に観察されるアミノ酸置換を、親和性向上のために好ましいアミノ酸置換として選択する。
ポリヌクレオチドの配列解析は通常のシークエンシングによって行ってもよいが、スクリーニングによって増幅された標的物質結合蛋白質コード配列をクローン化することなく、大量に網羅的に配列解析でき、スクリーニング時間が大幅に短縮できるという点で、次世代シークエンサーを用いることが好ましい。
ここで、Sanger シークエンシング法を利用した蛍光キャピラリーシークエンサーに代表される第1世代シークエンサーと対比させて使われている次世代シークエンサーという用語は、実際には多様な機器や技術を含み、今後も様々な形態のものが考案されると考えられる（Mardis, Annu. Rev. Genom. Human Genet. (2008) vol.9, p.387-402およびPersson et al., Chem. Soc. Rev. (2010) vol.39, p.985-999）。
第1世代シークエンサーが一般にベクター宿主システムを用いてクローン化したDNAの配列決定に利用されるのに対し、 次世代シークエンサーは、多様な配列をもつDNAサンプルを解析対象としながらも、ベクター宿主システムを用いてDNAのクローン化をすることなく、サンプル中に存在するDNA配列を高速に解読できる。
第1世代シークエンサーを用いたDNA配列決定では、
(i)プラスミド等のベクターへのDNA断片の組み込みと大腸菌等の宿主の形質転換、
(ii)宿主コロニーの単離によるクローン化、
(iii)解析規模に応じた数のクローンの培養およびプラスミドの抽出、
(iv)プラスミド等を鋳型としたPCR等によるシークエンス反応、
(v)キャピラリー電気泳動等を用いたシークエンス反応産物の分離・検出・解析、
という過程を経て個々のクローンのDNA配列を決定する。多数のクローンのDNA配列を一度に決定する場合は、クローン化以降の(ii)〜(v)の工程で、クローンごとに独立した反応・処理が必要となり、解析クローン数の規模に比例した作業量が必要となる。
一方、次世代シークエンサーを用いたDNA配列決定では、多様な配列を含むDNA断片を、Emulsion PCRやBridge PCR といった単分子PCR法等の増幅技術、あるいは1分子観察等の高感度検出技術、を応用することで解析用基板上に大規模数存在する個々の解析スポット上にクローン化して超並列的に配列解析する。このため、解析クローン数の規模に関わらず単一の反応・処理で、例えば１つの解析用基板上に形成された106〜109のクローンの配列を決定できる。
【００９１】
現時点で最も普及している次世代シークエンサーは、DNAポリメラーゼまたはDNAリガーゼによる逐次的DNA合成法を用いて、蛍光・発光など光検出により超並列的に塩基配列を決定する原理のものである。DNAポリメラーゼを用いる方法として、GS FLX（Roche Diagnostics）、Solexa (Illumina)等が、またDNAリガーゼを用いる方法としてSOLiD（Applied Biosystems）、Polonator （Dover Systems）等が知られている。また、DNA1分子を鋳型としてDNAポリメラーゼによるDNA合成を行い、1塩基ごとの反応を蛍光・発光などの光で検出することにより、１分子リアルタイム観察により塩基配列を決定するHeliScope (Helicos Biosciences)、SMRT (Pacific Biosciences)等が知られている。その他に、Post-light シークエンシングと称される蛍光・発光など光検出以外の検出方法により、超並列的に塩基配列を決定する原理も報告されており、半導体(CMOS)チップを用いて、DNA ポリメラーゼにより各塩基が取り込まれるときに放出される水素イオン(pH変化)を検出することで塩基配列を決定する、Ion Torrent Systems等がこれに該当する。他にもNanopore（Oxford Nanopore Technologies）等が知られている。
【００９２】
1次スクリーニングで得られた配列を次世代シークエンサーを用いて網羅的に解析することで、各配列をクローニング（ベクターにクローン化して個々に発現させる）することなく２次スクリーニングに使用することができるので、スクリーニング時間を大幅に短縮できる利点がある。ただし、１次スクリーニングの効率を確かめるなどの目的で一部クローン化し、結合性を調べてもよい。
【００９３】
次に、1次スクリーニングでの配列解析により得られた標的物質結合部位の各アミノ酸における1アミノ酸置換を組み合わせて二次ライブラリーとする。例えば、１次スクリーニングにおいて、標的物質結合部位の一番目のアミノ酸はAlaまたはThrに置換されていることが好ましく、二番目のアミノ酸はIleまたはLeuに置換されていることが好ましいという結果が得られたら、二次スクリーニングに使用するライブラリーは一番目のアミノ酸がAlaまたはThrであり、二番目のアミノ酸がIleまたはLeuであり、その他のアミノ酸も１次スクリーニングで得られた好ましいアミノ酸になるよう塩基配列を設計して２次ライブラリーを作製する。なお、１次スクリーニングで得られた好ましい変異アミノ酸と親配列のアミノ酸の組み合わせを二次ライブラリーとしてもよい。
この二次ライブラリーを用いて、工程（i'）〜（iv'）を繰り返し、２次スクリーニングを行うことにより、親蛋白質よりも標的物質に対する親和性が顕著に向上した蛋白質を多数取得することができる。親蛋白質よりも標的物質に対する親和性が顕著に向上したことは、SPRやELISAなどによって解析することができる。
【実施例】
【００９４】
以下、実施例を参照して本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の態様に限定されない。【００９５】
〔実施例１〕モデルFabの調製：
無細胞Fabディスプレイ系で用いるFabのフレームワークとして、ヒトにおける主要な抗体サブクラスのひとつであり、大腸菌での発現効率に優れ（Kanappik et al., J Mol Biol. (2000) vol.296, p.57-86）、無細胞scFvディスプレイ系での実績が報告された（Shibui et al., Appl Microbiol Biotechnol. (2009) vol.84, p.725-732）、VL k subgroup IおよびVH subgroup IIIの組合せを選択した。無細胞Fabディスプレイ系の動作確認に用いる上記フレームワークをもつモデルFabとして、Carterらが報告したヒトEGFR-2（Her-2）反応性のFab（Carter et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (1992) vol. 89, p.4285-4289）を選択し、Fab-HHとした。
もうひとつのモデルFabとしてFab-HHのL鎖およびH鎖のCDR1-3領域を、渋井らの無細胞scFvディスプレイ系で見出されたTNFαR反応性scFvの配列（Shibui et al., Biotechnol. Lett. (2009) vol.31, p.1103-1110）で置換し、Fab-TTとした。
これら２種類のモデルFabのVLドメインおよびVHドメインをコードするcDNAを人工合成した。またCLドメイン、CH1ドメインをコードするcDNAをヒト癌細胞株のゲノムDNAを鋳型としたPCRで取得した。得られたcDNA断片を、大腸菌発現ベクターpTrc99Aに組み込み、モデルFabをBicistronicに分泌発現するベクターとして、pTrc Fab-HH、pTrc Fab-TTを構築した。また本来のL鎖とH鎖の組合せを意図的に変更してFab-HT（Her-2反応性のL鎖とTNFαR反応性のH鎖の組合せ）およびFab-TH（TNFαR反応性のL鎖とHer-2反応性のH鎖の組合せ）とし、これらを発現するpTrc Fab-HTおよびpTrc Fab-THを合わせて構築した。このとき、L鎖のC末端にmycタグを、H鎖のC末端に2連続FLAGタグおよびHisタグを付加した。pTrc Fabベクター中のBicistronicに Fabを発現するユニットの概略構造を図９に示す。【００９６】
pTrc Fab-HHの塩基配列を配列番号１に、コードされるアミノ酸配列を配列番号２，３に示す。pTrc Fab-TTの塩基配列を配列番号４に、コードされるアミノ酸配列を配列番号５，６に示す。pTrc Fab-HTの塩基配列を配列番号７に、コードされるアミノ酸配列を配列番号８，９に示す。pTrc Fab-THの塩基配列を配列番号１０に、コードされるアミノ酸配列を配列番号１１，１２に示す。【００９７】
pTrc Fabベクターを保有する大腸菌DH5α株を100μｇ/mlのアンピシリンを含むLB培地中で培養し、対数増殖期に終濃度0.1mMのIPTGを添加することで培養上清中にモデルFabを発現させた。IPTGを添加してから18時間培養した後に培養上清を回収し、この中に含まれるモデルFabをH鎖のC末端に付加したHisタグを利用してNi-NTAアガロースビーズ（QIAGEN社）に結合させた。ビーズを洗浄後、終濃度250mMのイミダゾールを含むPBSで溶出した。溶出画分をPBSで透析し高純度のモデルFabを調製した。モデルFabの濃度は280nmの吸光度から1 OD=1 mg/mlとして算出した。サンプルを5-20%グラジエントゲルSDS-PAGEで分離後、クマシーブルーで染色した。結果を図１０に示す。調製したモデルFabの純度が十分であることがわかる。【００９８】
〔実施例２〕モデルFabの活性、特異性、L鎖H鎖相互依存性の評価：
モデルFabの抗原蛋白質である、Her-2およびTNFαR（R&D systems社）をPBSで1μｇ/mlに希釈した。これをELISAプレートに添加し4℃で一晩放置することでプレートに固定した。ウェルを洗浄後、モデルFabを添加し抗原に結合させた。ウェルを洗浄後、検出用抗体として1000倍希釈したHRP標識抗FLAG抗体（シグマ社）を添加し、モデルFabに付加したFLAGタグに結合させた。ウェルを洗浄後、HRP用発色基質を添加した。適度な発色が得られたところで停止液を添加し、OD405nmにて吸光度を測定した。抗原蛋白質にHer-2を用いて4種類のモデルFabを広い濃度域でタイトレーションした結果を図１１に示す。Fab-HHがHer-2に強く結合（ED50=2nM）することがわかる。次に2種類の抗原蛋白質に4種類のモデルFabを高濃度（HH、TT、HT、THの順に7.1、1.8、2.9、5.8μM）で接触させた結果を図１２に示す。Fab-HHがHer-2には結合するがTNFαRには結合しないこと、またFab-TTがTNFαRには結合するがHer-2には結合しないことがわかる。さらにハイブリッドFab であるFab-HTおよびFab-THがどちらの抗原にも結合しないことから、Fab-HHのHer-2に対する結合およびFab-TTのTNFαRに対する結合は、L鎖H鎖相互依存的であり、正しいL鎖とH鎖の組み合わせが抗原蛋白質との結合に必要であることがわかる。【００９９】
〔実施例３〕Bicistronic型Fab-PRD用のベクター構築：
上記のFab-HHと酷似したアミノ酸配列をもち、Fellouseら（Fellouse et al., J. Mol.Biol. (2007) vol.373, p.924-940）により大腸菌での発現効率がさらに向上すると報告された配列をFab-SSとした。この配列を無細胞ディスプレイ系で提示するために、大腸菌最適化コドンを用いてBicistronic型Fab-PRD用のDNA断片を人工合成した。これを汎用ファージミドベクターpBluescript SK(+)に組み込むことでpGAv2-SSを構築した。次にpGAv2-SSのL鎖CDR1-3領域およびH鎖CDR1-3領域を、pTrc Fab-HHの対応する領域と置換することでpGAv2-HHを構築した。同様にpGAv2-SSとpTrc Fab-TTを用いてpGAv2-TTを構築した。次にpGAv2-HHのL鎖下流のGSリンカー最下流部位にアミノ酸配列を変えずにXhoI認識部位を導入することでpGAv2-HH xhoIを構築した。Bicistronic型Fab-PRD用のDNA断片の概略構造を図１３に示す。【０１００】
〔実施例４〕Monocistronic型Fab-PRD用のベクター構築：
Bicistronic型Fab-PRD用のpGAv2-HH xhoIとpGAv2-TTの中の、L鎖下流のリボゾームストール配列の先頭アミノ酸からH鎖の最初のメチオニンまでの領域を、FLAGタグをコードする配列に置換し、FLAGタグを介してL鎖下流GSリンカーのC末端をインフレームでH鎖と接続した構造をもつ、Monocistronic型Fab-PRD用のベクター、pGAv6-HH xhoIとpGAv6-TTを構築した。Monocistronic型Fab-PRD用のDNA断片の概略構造を図１４に示す。【０１０１】
〔実施例５〕鋳型DNAの調製：
Bicistronic型Fab-PRD用にpGAv2-HH xhoIおよびpGAv2-TT 、Monocistronic型Fab-PRD用にpGAv6-HH xhoIおよびpGAv6-TTを鋳型として、PCR反応によりin vitro転写用鋳型DNA断片を増幅した。PCR用酵素としてPrimeStarMax（タカラ社）を使用し、プライマーとしてPURE-rt-1FおよびPURE-3Rの組合せ、またはSL-1FおよびSL-2Rの組合せを使用した。増幅したin vitro転写用鋳型DNA断片はフェノール・クロロホルム抽出、イソプロパノール沈殿で精製した。in vitro転写用鋳型DNAの濃度は260nmの吸光度から1 OD=5 0μｇ/mlとして算出した。4種類のベクターからSL-1FおよびSL-2R のプライマーセットで増幅したin vitro転写用鋳型DNA断片の配列は以下のとおりである。
Bicistronic型Fab-PRD用
pGAv2-HH xhoI 配列番号１３（アミノ酸配列は配列番号１４（L），１５（H））
pGAv2-TT 配列番号１６（アミノ酸配列は配列番号１７（L），１８（H））
Monocistronic型Fab-PRD用
pGAv6-HH xhoI 配列番号１９（アミノ酸配列は配列番号２０）
pGAv6-TT  配列番号２１（アミノ酸配列は配列番号２２）【０１０２】
なお、使用したプライマーの配列を以下に示す。
PURE-rt-1F：（caatttcggtaatacgactcactatagggagaatttaggtgacactatagaagtg）（配列番号２３）
PURE-3R：（caggtcagacgattggccttg）（配列番号２４）
SL-1F：（caatttcggtaatacgactcactatagggagaccacaacggtttcccatttaggtgacactatagaagtg）（配列番号２５）
SL-2R：（ccgcacaccagtaaggtgtgcggcaggtcagacgattggccttgatattcacaaacg）（配列番号２６）【０１０３】
〔実施例６〕mRNA合成：
mRNA合成は500ngの鋳型DNA断片と2.7μｇの精製T7 RNA polymeraseを用いて50μlスケールで実施した。37度60分の合成反応の後、RNase free DNase（Promega社）を1μl添加し、37度10分の反応で鋳型DNAを分解した。mRNAはフェノール・クロロホルム抽出、イソプロパノール沈殿で精製した後、30μlのNuclease free water（Promega社）で溶解した。mRNAの濃度は260nmの吸光度から1 OD=40 μｇ/mlとして算出した。【０１０４】
〔実施例７〕再構築型無細胞翻訳系（PUREシステム）によるmRNAの翻訳：
PUREシステムを構成する翻訳因子群およびリボゾームは、清水（Shimizu et al., Nat Biotechnol. (2001) vol.19, p.751-755）や大橋（Ohashi et al., Biochem Biophys Res Commun. (2007) vol.352, p.270-276）らの報告に記載の方法で調製した。翻訳反応は2 p moleのmRNAと20 p moleのリボゾームを用いて20μlスケールとした。酸化還元条件に関しては、酸化型および還元型グルタチオン、蛋白質ジスルフィドイソメラーセを除き、1mMのDTTを添加し還元条件下での翻訳反応とした。37度20分の翻訳反応の後に終濃度2.5mMの酸化型グルタチオンを添加してDTTを中和した。【０１０５】
〔実施例８〕抗原のビオチン化と品質確認：
Her-2およびTNFαR（R&D systems社）をPBSで各々0.5mg/mlに溶解した。ビオチン化試薬としてSulfo-NHS-SS-Biotin（サーモサイエンティフィック社）をPBSで0.6 mg/ml （Her-2用）および4.0 mg/ml（TNFαR用）にて調製し、1.1μl（Her-2用）および3.6μl（TNFαR用）を抗原溶液100μlに添加して室温で1時間反応させた。反応産物をゲル濾過スピンカラムに通して未反応のビオチン化試薬を除去した。アビジン（カルビオケム社）をPBSで2μｇ/mlに希釈した。これをELISAプレートに添加し4℃で一晩放置することでプレートに固定した。ウェルを洗浄後、ビオチン化抗原を添加しアビジンに結合させた。ウェルを洗浄後、実施例１で調製した高純度モデルFabを添加しビオチン化抗原に結合させた。ウェルを洗浄後、検出用抗体として1000倍希釈したHRP標識抗FLAG抗体（シグマ社）を添加し、モデルFabに付加したFLAGタグに結合させた。ウェルを洗浄後、HRP用発色基質を添加した。適度な発色が得られたところで停止液を添加し、OD405nmにて吸光度を測定した。得られた結果を図１５に示す。2種類のビオチン化抗原がアビジンと対応するモデルFabに同時反応性をもつことがわかる。【０１０６】
〔実施例９〕PRDによるFabの選択（Fab-PRD）：
大橋らが報告した方法（Ohashi et al., Biochem Biophys Res Commun. (2007) vol.352, p.270-276）を参考に、PUREシステムによるribsome display法（PRD）によるFabのin vitro選択を実施した。M-280ストレプトアビジン磁気ビーズ（DYNAL社）30μlを洗浄し、実施例８で調製したビオチン化抗原蛋白質を5 p mole加えて室温で30分反応させ、磁気ビーズにベイト蛋白質を固定した。磁気ビーズを洗浄し選択用ビーズとした。同様の操作でベイト蛋白質を固定しないプレクリア用ビーズを調製した。【０１０７】
鋳型DNAあるいはmRNAとしてFab-TTの中に少量のFab-HH xhoを任意の含有率で添加し、選択前サンプルとした。これを用いて実施例７に記載した方法でin vitro翻訳産物を調製した。これをプレクリア用ビーズと混合し、4℃で30分反応させ上清を回収した。上清を選択用ビーズと混合し、4℃で30分反応させ磁気ビーズを回収した。磁気ビーズを洗浄した後、溶出液を100μl加え、室温で10分反応させた。溶出液は（50mM Tris-Cl pH 7.6、150mM NaCl、10 μg/ml出芽酵母RNA）をベースとし、還元溶出の場合は終濃度100mM のDTTを、キレート溶出の場合は終濃度50mM のEDTAを添加した。還元溶出はビオチンリンカー中のSS結合を還元切断することで、またキレート溶出はマグネシウムイオン依存的なディスプレイ分子複合体（mRNA-リボゾーム-ポリペプチド三者複合体）を解離させることで、Fabを介して磁気ビーズに結合したmRNAを溶出するものである。溶出サンプルからフェノール・クロロホルム抽出およびイソプロパノール沈殿、あるいはRNaeasy RNA精製キット（QIAGEN社）でmRNAを精製した。【０１０８】
逆転写酵素としてSuperScriptIII（Invitrogen社）を用いた反応で溶出mRNAをcDNAに変換した。逆転写反応用プライマーとしてPURE-2RまたはPURE-3R を用いた。PrimeStarMax（タカラ社）を用いたPCR反応でcDNAを増幅後、フェノール・クロロホルム抽出およびイソプロパノール沈殿で精製し、選択後DNAサンプルとした。mRNA全長配列を増幅するPCRプライマーとしてPURE-rt-1FおよびPURE-3Rの組合せ、またはSL-1FおよびSL-2Rの組合せを使用した。また、L鎖CDR3からH鎖CDR1までの部分断片を増幅するPCRプライマーとしてL-CDRex-1FおよびH-CDRex-2Rの組合せを使用した。使用したプライマーの配列を以下に示す。
PURE-2R：（gacgattggccttgatattcacaaacg）（配列番号２７）
L-CDRex-1F：（attaaacgtaccgttgcagcaccgagc）（配列番号２８）
H-CDRex-2R：（tgagcctccaggctgaaccagaccac）（配列番号２９）【０１０９】
〔実施例１０〕Fab-PRDによる特異的濃縮の確認：
選択前と選択後のDNAサンプルをXhoIで消化し、１％アガロースゲルで分離後、エチジウムブロマイドで染色した。選択前のDNAサンプルはFab-TT が主成分となるためXhoIでほとんど切断されないが、選択後のDNAサンプルはFab-HH xhoの含有率が上がるため、XhoI感受性が増すと考えられる。このようにDNAサンプルのXhoI感受性の増加によりFab-HHの濃縮を確認した。以下、Her-2をベイト蛋白質としたシングルラウンドのBicistronic型あるいはMonocistronic型Fab-PRDでFab-HHを選択した結果を示す。【０１１０】
TT/HH比=10からBicistronic型Fab-PRDでFab-HHを選択し、L鎖CDR3からH鎖CDR1までの部分断片を増幅して、XhoI感受性を評価した結果を図１６に示す。選択前のDNAサンプルと比較し、ビオチン化Her-2未処理の磁気ビーズで選択を実施した場合、またビオチン化Her-2処理した磁気ビーズで選択を実施した場合でも、DTTやEDTAのような特異的溶出に必要な成分を含まない溶出液（WB）を用いた場合は、XhoI感受性の増加は認められなかった。一方で、ビオチン化Her-2処理した磁気ビーズで選択を実施し、DTTやEDTAを含む溶出液を用いた場合はXhoI感受性の増加が認められた。これらの結果から、Fab-HHが特異的に濃縮されたことがわかる。【０１１１】
同様に、TT/HH比=10および100のDNAサンプルからBicistronic型Fab-PRDでFab-HHを選択し、DTTで溶出後mRNA全長配列を増幅して、XhoI感受性を評価した結果を図１７に示す。TT/HH比=10および100のどちらの場合も、XhoI感受性の増加が認められ、Fab-HHが特異的に濃縮されたことがわかる。【０１１２】
一方でTT/HH比=100〜100000のDNAサンプルからMonocistronic型Fab-PRDでFab-HHを選択した結果を図１８に示す。TT/HH比=100〜1000の場合はXhoI感受性の増加が認められ、Fab-HHが特異的に濃縮されたことがわかる。【０１１３】
〔実施例１１〕Monocistronic Fabのin vitro翻訳産物の確認：
実施例７に記載した方法でMonocistronic型Fab-PRD用のmRNAを用いて無細胞翻訳産物を調製した。翻訳産物を5-20%グラジエントゲルSDS-PAGEで分離後、PVDF膜に転写し、検出用抗体として1000倍希釈したHRP標識抗FLAG抗体（シグマ社）を用いてウエスタンブロッティングを実施した。結果を図１９に示す。scFab-TTの全長翻訳産物が確認できるが、全長翻訳産物の比率が陽性対照に使用したscFv-TTの翻訳量に比べて極端に少ないことがわかる。【０１１４】
〔実施例１２〕SecMのコピー数と回収率の関係：
pGAv6-HH xhoIを鋳型としたPCRでリボゾームストール配列（SecM配列）を2コピーに増やしたDNA断片を合成し、v6.5断片とした。同様のPCRで、SecM配列を3コピーもつv6.5-S3断片、SecM配列を4コピーもつv6.5-S4断片を調製した。調製した鋳型DNA断片(100% Fab-HH)を用いて、Monocistronic型Fab-PRDによるFab-HHの回収率を測定した。Monocistronic型Fab-PRDは実施例９に記載の固相選択にて実施し、回収した逆転写産物の定量は、濃度既知の鋳型DNA断片を検量線用サンプルとした定量PCRにて実施した。定量PCRに用いる検出用プライマーとして上流域プライマーと下流域プライマーの2種類を準備し、CDR-L1付近の上流域とCDR-H3付近の下流域における回収率（1st strand cDNAの分子数/投入したRNAの分子数）をそれぞれ求めた。結果を図２０に示す。SecM配列を2コピーに増やすことでFab-PRDによるFab-HHの回収率が約10倍向上した。本実験ではSecM配列を3コピー以上に増やしても更なる回収率の向上は認められなかったが、翻訳反応時間を長くするなど実験条件を変更した場合は、SecMを 3コピー以上にすることで回収率が更に上昇する可能性もあると考えられる。
定量PCRで使用したプライマーを以下に示す。
FabHH用上流域プライマー
RT-1F：gatattcagatgacccagagcccgagc（配列番号３３）
RT-1R：cagcttcggggcttttcctgg（配列番号３４）
FabHH用下流域プライマー
HH-4F：ccagggaactttggttactgtttc（配列番号３５）
Model-4R：ctttaaccagacaacccagtgc（配列番号３６）
Fab-PRDに使用した、v6.5、v6.5-S3、v6.5-S4、DNA断片のSecM領域以降の配列を、それぞれ配列番号３７、４０、４４に示す。【０１１５】
〔実施例１３〕リンカー長と濃縮倍率の関係：
Monocistronic型Fab-PRDで使用する鋳型DNAにはL鎖-H鎖間とH鎖-SecM間に計２つのリンカー配列が存在し、実施例１２のv6.5断片ではL鎖-H鎖間リンカー長が128アミノ酸、 H鎖-SecM間リンカー長が123アミノ酸となっている。Monocistronic型Fab-PRDの濃縮倍率に与えるリンカー長の影響を検討するために、Fab-HH xhoIとFab-TTについてSecM配列を2コピーもつv6.5断片を基本構造とし、H鎖-SecM間リンカー長を最小化したv7断片と、L鎖-H鎖間リンカー長を最小化したv8.1断片を調製した。
v7断片におけるH鎖-SecM間リンカー長は、H鎖の最終アミノ酸のシステインからSecMの先頭アミノ酸のアラニンの間のアミノ酸数を20とした。v8.1断片におけるL鎖-H鎖間リンカー長はL鎖のC末端のシステインからH鎖のN末端のグルタミン酸の間のアミノ酸数を30とした。それぞれの構造で鋳型DNAをTT/HH比=100で混合し、実施例９に記載の固相選択によるFab-PRDでFab-HH xhoIを選択した。得られた逆転写産物をサンプルとしてFab-HHおよびFab-TTの回収率をそれぞれ定量PCRで測定し、濃縮倍率（Fab-HHの回収率/Fab-TTの回収率）を求めた。定量PCRに用いる検出用プライマーはCDR-H3付近の下流域プライマーを使用した。結果を図２１に示す。H鎖-SecM間リンカーおよびL鎖-H鎖間リンカーのいずれを最小化した場合でも、実用的な濃縮倍率が確認されたことから、リンカー長に関しては状況に応じて幅広い選択が可能と考えられる。
定量PCRで使用したプライマーを以下に示す。
FabHH用下流域プライマー
HH-4F：ccagggaactttggttactgtttc（配列番号３５）
Model-4R：ctttaaccagacaacccagtgc（配列番号３６）
Fab-TT用下流域プライマー
TT-5F：gcaccctggttaccgtgag（配列番号４９）
Model-4R：ctttaaccagacaacccagtgc（配列番号３６）
Fab-PRDに使用した、v7、v8.1、DNA断片のリンカー部分の配列をそれぞれ配列番号５０、５２に示す。【０１１６】
〔実施例１４〕Monocistronic型Fab-PRDにおける必要最低コピー数の検討：
Fab-HH xhoIとFab-TTのv7断片（実施例１３）を鋳型DNAとして調製し、0.125mg/ml yeast RNAと7 x 109分子/μｌのFab-HH鋳型DNAを含むキャリア溶液でFab-TT鋳型DNAの10倍希釈系列を調製した。1 x 106 Fab-TT分子の鋳型DNA /μｌから1 x 10-5Fab-TT分子の鋳型DNA /μlのDNAサンプルをFab-TT特異的プライマーを用いた１分子PCRで増幅し、PCR産物を5-20%グラジエントPAGEで分離した。鋳型DNAとしてFab-TT分子が1分子以上含まれるPCRからはFab-TT特異的なバンドが検出され、Fab-TT分子が0.1分子以下のPCRからはFab-TT特異的なバンドが検出されないことを確認した。
1分子PCRによる品質確認済みFab-TT鋳型DNAの希釈サンプルから400分子相当を分取し、1x1012分子のFab-HH鋳型DNAに加えた。ここからRNAを合成し、選択前RNAとした。選択前RNAをFab-PRDに投入し、400分子相当のFab-TTの回収を試みた。翻訳反応は20μlスケールで30℃40分とし、反応後1μMのビオチン化TNFαRを含むWBTBR buffer（50mM Tris-HCl pH=7.6, 90mM NaCl, 50mM Mg(OAc)2, 5mg/ml BSA, 1.25mg/ml yeast RNA, 0.5% Tween20, 0.04U/μｌ RNase Inhibitor）を等量混合し、4℃で一晩静置した。これに25μｌ分のM-280ストレプトアビジン磁気ビーズビーズペレットを添加しFab-TTを回収した。M-280ビーズからDTTで溶出したRNAを選択後RNAとした。Fab-PRDによる選択前と選択後のRNAを逆転写し、Fab-TT特異的なCDR-H3付近のプライマーでFab-TT断片（図２２のレーン1と2）を、さらにFab-HHとFab-TT双方の共通DNA配列を認識するプライマーで CDR-L1からCDR-H3までの重要な遺伝情報を含むコア断片（図２２のレーン4と5）を、それぞれRT-PCRで増幅した。コアDNA断片のバンドを5-20%グラジエントゲルから回収し2nd PCRで再増幅した（図２２のレーン7と8）。
2nd PCRで得たコアDNA断片を鋳型とし、Fab-TT特異的プライマーを用いたPCRでFab-TT断片を増幅したところ、選択前サンプルのみならず、選択後サンプルからもFab-TT断片が検出されたことから、400分子のFab-TTからコア断片の回収に成功したと考えた。次にこの回収がFab−PRDによる特異的なものであることを確認するために、Fab-TTの濃縮倍率を定量PCRで測定した。Fab-TT断片とコア断片を独立して定量し、濃縮倍率（選択後サンプル中Fab-TT相対量/選択前サンプル中Fab-TT相対量）を算出した結果、選択後コアDNA断片（図２２のレーン7）では選択前コアDNA断片（図２２のレーン8）に対しFab-TTの含量が582倍上昇していた（濃縮倍率=582倍）。これらの結果から、ライブラリー中に存在する標的結合クローンは少なくとも400分子以上あればFab-PRDで特異的に回収できることが示唆された。この回収率はファージディスプレイ系に匹敵すると考えられる。
使用したプライマーを以下に示す。
Fab-TT特異的プライマー
T1P-F：gttttactattgaacgttatgcgatgggt（配列番号５４）
T1P-R：cgtagtacataccgttcgggtagttag（配列番号５５）
Fab-HHとFab-TTに共通のコア領域増幅用プライマー
Core-1F：gcgcaagcgttggtgatc（配列番号５６）
Core-1R：gctcggacctttggtgcttg（配列番号５７）【０１１７】
〔実施例１５〕Ymacs-1次ライブラリーの構築（親和性成熟の第一段階前半）：
Fab-PRDの応用例として、モデルFabの一つであるFab-TTの親和性成熟を試みた。抗原抗体の結合界面は100個以上のファンデルワールス力、数個の水素結合や塩橋が存在する。これらの相互作用ネットワークの全体最適化を実現するために、第一段階で親和性向上に有用と思われるCDR中の変異を検索し、第二段階でこれらの変異の最適な組み合わせを検索する、Ymacsと呼ぶ本来的二段階戦略を採用した。
第一段階前半の作業として、Fab-TTのCDRを構成する全50のアミノ酸の１つ１つを20種類のアミノ酸にランダム化しながら、50アミノ酸分のCDRポジションをマトリクススキャンするためのライブラリー（Ymacs-1次ライブラリー）を構築した。
まずFab-TTのCDRを構成する全50のアミノ酸を１つずつNNKコドンで置換するための1アミノ酸置換導入forwardプライマーを全50種類合成した。これら1アミノ酸置換導入forwardプライマーはNNKコドンの上流に15bp、下流に12bpのアニーリング領域をもつよう設計した。例として50箇所の1アミノ酸置換導入部位の最上流部位と最下流部位に対応するプライマーを以下に示す。
FabTT Ymacs-1 L1-1：tgtcgtgcaagccagNNKattaaaaattat（配列番号５８）（L鎖CDR1の１番目のアミノ酸に1アミノ酸置換を入れるためのプライマー）
FabTT Ymacs-1 H3-12：atgtactacgttatgNNKtattggggtcag（配列番号５９）（H鎖CDR3の１２番目のアミノ酸に1アミノ酸置換を入れるためのプライマー）
pGAv6.5-Fab-TTを鋳型とし上記50種類の1アミノ酸置換導入forwardプライマーをPURE-3Rプライマーと組み合せたPCRで50種類の変異導入下流DNA断片を独立して合成した。PCR産物を1%アガロースゲルで分離後、エチジウムブロマイド染色でバンドを確認した。次に変異導入下流DNA断片のreverse鎖を上流方向に伸長させて全長化する反応で鋳型となる、共通の定常配列上流DNA断片をPCRで合成した。定常配列上流DNA断片は、自身のforward鎖が全長化するのを回避する目的で3末端側にミスアニール領域をもつよう、PURE-rt-1F とH3checkR Not TA6をプライマーとしたPCRで合成し、PCR産物を1%アガロースゲルで分離後、エチジウムブロマイド染色でバンドを確認した。
PURE-rt-1F：caatttcggtaatacgactcactatagggagaatttaggtgacactatagaagtg（配列番号６０）
H3checkR Not TA6：tatatatatatagcggccgcagaactgccggaaaggtatg（配列番号６１）【０１１８】
1ポジション1アミノ酸置換ライブラリーの合成の概要を図２３に示す。1アミノ酸置換導入部位が最上流と最下流の２つを例示した。定常配列上流DNA断片（図中A、B）と変異導入下流DNA断片（図中C、D）を混合し、PURE-rt-1Fプライマー（図中E）の存在下で非対称PCRを行った。これにより変異導入下流DNA断片のreverse鎖であるC鎖が上流方向に伸長して全長化され、全長化されたC鎖はPURE-rt-1Fによって二本鎖化される。個々の変異導入下流DNA断片4μｌを定常配列上流DNA断片0.6μｌと混合し、50μｌのスケールで非対称PCRを行い、50種類の1ポジション1アミノ酸置換ライブラリーを合成した。得られたPCR産物を1%アガロースゲルで分離後、エチジウムブロマイド染色でバンドを確認した。
1ポジション1アミノ酸置換ライブラリーをL鎖とH鎖にグループ化して等量混合し、L鎖Ymacs-1次ライブラリー、H鎖Ymacs-1次ライブラリーとした。図２４に示すように、Ymacs-1次ライブラリーはそれぞれL鎖は19種類、H鎖は31種類の1ポジション1アミノ酸置換ライブラリーから構成される。【０１１９】
〔実施例１６〕Ymacs-1次ライブラリーの濃縮と次世代シークエンス解析（親和性成熟の第一段階後半）：
第一段階後半の作業として、L鎖とH鎖のYmacs-1次ライブラリーを独立してFab-PRDで濃縮し、得られたDNAサンプルの次世代シークエンス解析結果から、CDR中の有用と思われる変異を同定した。
Fab-PRDによるYmacs-1次ライブラリーの濃縮は実施例９で示した固相選択と実施例１４で示した液相選択を併用した。ラウンド１では固相選択を実施し、ラウンド２では固相選択後、長時間（13h）の洗浄を実施した。最終ラウンドのラウンド３ではベイト濃度1nMで液相選択を実施した。全ラウンド1x1012分子のRNAを20μｌスケールで翻訳した。逆転写PCRでは実施例１４で示したコアDNA断片を回収した。コアDNA断片に適当な上流断片、下流断片を加え、PURE-rt-1FとPURE-3Rをプライマーとしたoverlapping extension-PCRで全長DNA断片を合成し、これを精製後に次のラウンドの鋳型DNAとして使用した。
ラウンド３で得られたコアDNA断片のL鎖、H鎖それぞれのCDR1-3領域の塩基配列をRoche GS FLX次世代シークエンサーで解析し、L鎖ライブラリー由来サンプルからL鎖CDR1-3配列1812リード、H鎖ライブラリー由来サンプルからH鎖CDR1-3配列2288リードの塩基配列データを回収した。この中から、CDR1-3領域において連続したORFをもつ、L鎖468リード、H鎖1293リードを有効リードとして選抜し、CDRを構成するL鎖19アミノ酸、H鎖31アミノ酸、合計50アミノ酸分のCDRポジションにおける変異を集計した。各変異のカウント数を、20種類のアミノ酸を縦方向、合計50のCDRポジションを横方向に配したマトリクス表にまとめ図２５に示した。各CDRポジションにおける親アミノ酸は除外し、カウント数が大きい変異をポテンシャルな有用変異とした。【０１２０】
〔実施例１７〕Ymacs-2次ライブラリーの構築（親和性成熟の第二段階前半）：
第二段階前半の作業として、実施例１６で同定した有用変異を組み合わせることで、Ymacs-２次ライブラリーを構築した。有用変異として計12のCDRポジションにおける計21の変異を採用し、各CDRポジションで親アミノ酸と有用変異アミノ酸をコードできる混合塩基コドンを決定した。混合塩基コドンによっては、親アミノ酸と有用変異アミノ酸以外の意図しないアミノ酸が入る。採用した有用変異と混合塩基コドンを図２６にまとめた。Ymacs-２次ライブラリーの理論多様性は核酸レベルで1.9 x 107、蛋白質レベルで4.9 x 106となる。12のCDRポジションは6つのCDR全てに分散したため、１つのCDRごとに計6つの変異導入forwardプライマーを合成した。これらを用いて図２７に示す断片２から断片７の計6本の変異導入DNA断片を合成し、これに断片１を加えた計7本のDNA断片をoverlapping extension反応による連結で全長化し、PCR反応で増幅した。得られたPCR産物を精製後、設計通りの混合塩基で変異導入部位がランダム化されていることを確認し、Ymacs-２次ライブラリーとした。
以下に変異導入forwardプライマーを示した。
FabTT Ymacs-2 L1-Fwd  ：  tgtcgtgcaagccaggatattaaaaattatttgWCTtggtatcaacaacaa（配列番号６２）（L鎖CDR1）
FabTT Ymacs-2 L2-Fwd  ：  gccccgaagccactgatttatGSTggttctaaccgccaatctggagttcct（配列番号６３）（L鎖CDR2）
FabTT Ymacs-2 L3-Fwd  ：  acctattattgccaacaaactKMTRNMtaccctatcacctttggccag（配列番号６４）（L鎖CDR3）
FabTT Ymacs-2 H1-Fwd  ：  agctgtgcagcaagcggttttASAattGRGcgttatgcgatgRSTtgggtgcgtcaggct（配列番号６５）（H鎖CDR1）
FabTT Ymacs-2 H2-Fwd  ：  ggcctggaatgggttggtacgatttatcctKDSRSCgattatRBYgattatgccgatagc（配列番号６６）（H鎖CDR2）
FabTT Ymacs-2 H3-Fwd  ：  tactactgcgctcgctctaactacccgaacggtMTGKRCtacgttatggaatat（配列番号６７）（H鎖CDR3）【０１２１】
〔実施例１８〕Ymacs-2次ライブラリーの濃縮とクローンの親和性解析（親和性成熟の第二段階後半）：
第二段階後半の作業として、Ymacs-2次ライブラリーをFab-PRDで濃縮し、得られたDNAを大腸菌の分泌発現ベクターにクローン化した。ELISAおよびSPR（ProteOn XPR36、BioRad社）で高親和性クローンを絞込み、Fab-TT変異体の代表2クローン（図29〜32中のYmacs#10、 #19）のKDをKinExA（KinExA3200、Sapidyne社）で測定した。
Fab-PRDによるYmacs-2次ライブラリーの濃縮は全5ラウンドを液相選択にて実施した。ラウンド1から5にかけてベイト濃度を、100nM、60nM、20nM、1nM、100pMまたは10pMと徐々に下げることで、選択圧を上げていった。ラウンド5で回収したコアDNA断片を、monocistronicなscFab-HH発現ベクター中のFab-HHのコア領域と置換する形でクローン化した（図２８）。ランダムにピックアップした48クローンの培養上清を用いてTNFαR を抗原としたELISAを実施した。ELISAのヒット率が50%程度であることを確認した後、残りの数百コロニーをポリクローナルな状態で一括して回収しプラスミドを精製した。このプラスミドがコードするscFab-TT変異体のL鎖-H鎖間のGSリンカーの領域を、Bicistronic発現用の非翻訳配列-分泌シグナル断片で置換することで、発現様式をmonocistronic 型からBicistronic型に変換した（図２８）。この操作によりscFabではなく天然型FabとしてFab-TT変異体を発現するベクターを構築し、再度クローン化した。ランダムにピックアップした96クローンの培養上清を用いてTNFαR を抗原としたELISAを実施し、ELISAのヒットクローンについてCDRの配列を決定した（図２９）。ELISAヒットクローンについては結合時間１分、解離時間30分のSPRによるスクリーニングを実施し、Koffを指標に高親和性クローンを絞り込んだ（図３０）。親FabのFab-TTと、親和性向上変異体であるYmacs #10について、SPRによる親和性測定を試みた結果、Fab-TTがKD = 7.28 x 10-9、Ymacs #10がKD < 1.57 x 10-11とそれぞれ算出され、約460倍の親和性向上が観察された（図３１）。次に高度に親和性が向上しているYmacs#10およびYmacs #19の2クローンについてKinExAでの親和性測定を試みた結果、Ymacs #10がKD = 1.87 x 10-11、Ymacs #19がKD = 3.45 x 10-12とそれぞれ算出され、Ymacs #19で約2100倍の親和性向上が観察された（図３２）。
KinExAによるYmacs #19のKD測定実験は、35pMと350pMの２つのFab濃度で実施した。抗原であるTNFαRの濃度は35pMのFabに対し2nMから976fMまでの2倍希釈系列、また350pMのFabに対し5nMから2.44pMまでの2倍希釈系列とした。抗原抗体反応が平衡に達するまでサンプルを室温で48時間インキュベートし、TNFαR 固相化アズラクトンビーズを用いたKinExAで平衡到達後のフリーのFabの存在率を定量した。フリーのFabの存在率（縦軸）を抗原濃度（横軸）に対してプロットし、Fabの濃度ごとに2本の用量-反応曲線を描いた。これをKinExA Pro Softwareでグローバルフィッティング処理しKDを算出した。【０１２２】
〔実施例１９〕CISディスプレイ法によるFabの選択（Fab-CIS）
Odegripらの報告（Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (2004) vol. 101, p. 2806-2810）を参考にCISディスプレイ法によるFabの選択を試みた。図８のように、v7断片中のscFabコード領域の上流および下流にそれぞれ、大腸菌RNAポリメラーゼ用プロモータ配列およびRepA-CIS-ori配列をoverlapping extension-PCRで付加しv10.1断片とした。RepAコード配列はOdegripらが報告した配列とGenBank V00351の配列が異なっていたため、V00351の配列を採用した。Fab-HH xhoI とFab-TTのv10.1断片をTT/HH比=10で混合したものをin vitro転写翻訳反応の鋳型DNAとした。精製済み鋳型DNA（1.2μg）を大腸菌由来S30ベースの転写翻訳系（25μL、大腸菌SL119株由来、直鎖DNA用、L1030、Promega社）に投入し、30℃40分でディスプレイ分子複合体を合成した。翻訳反応後はOdegripらの報告を参考に、実施例１４と同様の液相選択でFab-HHを回収し、溶出したDNAを鋳型とし、Cis-1FとCis-6RをプライマーとしたPCRで全長断片を増幅した。XhoI感受性を指標とした実施例１０と同様の評価系で、CISディスプレイ法によるFab-HH選択系の動作確認を実施した。結果を図３３に示す。選択前のDNAサンプルと比較し、ビオチン化Her-2を添加せずに選択を実施した場合はXhoI感受性の増加が認められなかった。一方で、ビオチン化Her-2を添加して選択を実施した場合、XhoI感受性の増加が認められた。これらの結果から、Fab-HHが特異的に濃縮されたことがわかる。
さらに、Fab-HH xhoIとFab-TTのv10.1断片をTT/HH比=100で混合したものを用いて同様の実験を実施し最適な転写翻訳時間を検討した。結果を図３４に示す。検討した全ての転写翻訳時間においてFab-HHの特異的な濃縮は認められたが、転写翻訳時間10分では不十分であった濃縮倍率が転写翻訳時間20分〜40分にかけて十分高まり、転写翻訳時間80分〜120分にかけて次第に低下する傾向を示した。これらの結果から、転写翻訳時間として20分〜40分が最適と考えられた。
v10.1断片の全長増幅用プライマーの配列を以下に示す。
Cis-1F
cagttgatcggcgcgagatttaatcgccgc（配列番号６８）
Cis-6R
cgtaagccggtactgattgatagatttcaccttacccatc（配列番号６９）
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
本発明は遺伝子工学や蛋白質工学等の分野で有用である。本発明の方法によって得られるFabは診断や医療や研究等の分野で有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図１０】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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