(57)【要約】  ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を特異的に認識する抗体又はその断片、該抗体又はその断片を用いてｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を免疫学的に測定し、高い検出性能を有する消化器癌の検出及び検査法を実現することを目的とする。  ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を構成するアミノ酸配列の異なるペプチド領域を特異的に認識する２種類以上の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体又はその断片を使用して、試料中のｃｏｆｉｌｉｎ１又はその断片を測定することを特徴とする、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の免疫学的測定方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のいずれかのペプチド領域に存在するエピトープを特異的に認識する抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体又はその断片。
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むペプチド領域
ｂ）前記ａ）のペプチド領域のアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたペプチド領域
ｃ）前記ａ）のペプチド領域のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するペプチド領域
【請求項２】
軽鎖において、
ＣＤＲ１が配列番号８で示される配列を含み、
ＣＤＲ２が配列番号９で示される配列を含み、及び
ＣＤＲ３が配列番号１０で示される配列を含み、ならびに
重鎖において、
ＣＤＲ１が配列番号１１で示される配列を含み、
ＣＤＲ２が配列番号１２で示される配列を含み、及び
ＣＤＲ３が配列番号１３で示される配列を含む、
請求項１に記載の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体又はその断片。
【請求項３】
軽鎖において、
ＣＤＲ１が配列番号１４で示される配列を含み、
ＣＤＲ２が配列番号１５で示される配列を含み、及び
ＣＤＲ３が配列番号１６で示される配列を含み、ならびに
重鎖において、
ＣＤＲ１が配列番号１７で示される配列を含み、
ＣＤＲ２が配列番号１８で示される配列を含み、及び
ＣＤＲ３が配列番号１９で示される配列を含む、
請求項１に記載の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体又はその断片。
【請求項４】
以下のいずれかのペプチド領域に存在するエピトープを特異的に認識する抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体又はその断片。
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むペプチド領域
ｂ）前記ａ）のペプチド領域のアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたペプチド領域
ｃ）前記ａ）のペプチド領域のアミノ酸配列と90％以上の相同性を有するペプチド領域
【請求項５】
軽鎖において、
ＣＤＲ１が配列番号２０で示される配列を含み、
ＣＤＲ２が配列番号２１で示される配列を含み、及び
ＣＤＲ３が配列番号２２で示される配列を含み、ならびに
重鎖において、
ＣＤＲ１が配列番号２３で示される配列を含み、
ＣＤＲ２が配列番号２４で示される配列を含み、及び
ＣＤＲ３が配列番号２５で示される配列を含む、
請求項４に記載の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体又はその断片。
【請求項６】
以下のいずれかのペプチド領域に存在するエピトープを特異的に認識する抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体又はその断片。
ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むペプチド領域
ｂ）前記ａ）のペプチド領域のアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたペプチド領域
ｃ）前記ａ）のペプチド領域のアミノ酸配列と90％以上の相同性を有するペプチド領域
【請求項７】
軽鎖において、
ＣＤＲ１が配列番号２６で示される配列を含み、
ＣＤＲ２が配列番号２７で示される配列を含み、及び
ＣＤＲ３が配列番号２８で示される配列を含み、ならびに
重鎖において、
ＣＤＲ１が配列番号２９で示される配列を含み、
ＣＤＲ２が配列番号３０で示される配列を含み、及び
ＣＤＲ３が配列番号３１で示される配列を含む、
請求項６に記載の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体又はその断片。
【請求項８】
ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質のアミノ酸配列上の異なるエピトープをそれぞれ特異的に認識する２種以上の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片を使用して、試料中のｃｏｆｉｌｉｎ１及び／又はその断片を測定する、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の免疫学的測定方法。
【請求項９】
前記異なるエピトープが配列番号１及び／又は２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域に存在する、請求項８に記載の測定方法。
【請求項１０】
前記異なるエピトープが
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域のうち、少なくとも配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むペプチド領域、及び／又は
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域のうち、少なくとも配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むペプチド領域
に存在する、請求項９に記載の測定方法。
【請求項１１】
前記異なるエピトープが
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域のうち、少なくとも配列番号５及び／又は６で示されるアミノ酸配列を含むペプチド領域、及び／又は
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域のうち、少なくとも配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むペプチド領域
に存在する、請求項９に記載の測定方法。
【請求項１２】
前記異なるエピトープが配列番号５〜７で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域から選択される２つのペプチド領域にそれぞれ存在する、請求項８に記載の測定方法。
【請求項１３】
前記異なるエピトープが配列番号１及び／又は２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域における連続する６個以上２１個以下のアミノ酸からなるペプチド領域に存在する、請求項９に記載の測定方法。
【請求項１４】
前記２種以上の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片が請求項２、３、５及び７に記載の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体又はその断片から選択される、請求項８に記載の測定方法。
【請求項１５】
２種の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片が、以下のいずれかの抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片の組合せである、請求項１４に記載の測定方法。
ａ）請求項２及び５のそれぞれに記載の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片の組合せ
ｂ）請求項２及び７のそれぞれに記載の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片の組合せ
ｃ）請求項３及び５のそれぞれに記載の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片の組合せ
ｄ）請求項５及び７のそれぞれに記載の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片の組合せ
【請求項１６】
前記試料が血液、尿、細胞上清、細胞抽出液、組織抽出液、胃液、唾液、リンパ液、涙液又は精液である、請求項８〜１５のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項１７】
請求項８〜１６のいずれか一項に記載の測定方法を用いて被検体及び健常体由来の試料中のｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質及び／又はその断片の量を測定するステップ、
前記測定ステップで測定されたｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質及び／又はその断片の量を比較して、被検体のｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質及び／又はその断片の量が健常者のそれよりも統計学的に有意に多い場合には被検体が消化器癌に罹患していると判定する判定ステップ
を含む、消化器癌罹患判定方法。
【請求項１８】
前記消化器癌が早期消化器癌である、請求項１７に記載の判定方法。
【請求項１９】
前記消化器癌が胃癌である、請求項１７又は１８に記載の判定方法。
【請求項２０】
ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の異なるエピトープをそれぞれ特異的に認識する２種以上の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片を含む、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の測定用キット。
【請求項２１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体又はその断片を２種以上含む、請求項２０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を免疫学的に測定する方法、抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体、消化器癌罹患判定方法及びｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質測定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ｃｏｆｉｌｉｎ１（ｃｏｆｉｌｉｎ、ｎｏｎ−ｍｕｓｃｌｅ ｉｓｏｆｏｒｍ １８ ｋＤａ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質は、ＡＤＦ／ＣＯＦＩＬＩＮファミリーに属する細胞骨格結合性タンパク質である。哺乳類で高度に保存されたタンパク質の一つで、ヒトやマウス、ラット、チンパンジー、ウシ、イヌ等においてアミノ酸配列が決定されており、これら種間では９８％以上の同一性を示すことが知られている。ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質は、細胞の形態や運動性の調節(非特許文献１)、細胞質分裂(非特許文献２)、エンドサイトーシス(非特許文献３)等様々な生命現象に関与することが明らかとなっている。さらに、このタンパク質は、肺癌（非特許文献４）、膵臓癌（非特許文献５）、乳癌（非特許文献６）、卵巣癌（非特許文献７）や肝癌（非特許文献８）由来の癌組織や癌細胞においても発現が高く、癌の進展に深く関与することも報告されている（非特許文献９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｂｕｇｙｉ Ｂ．ら、２０１０年、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、第３９巻、p.４４９-４７０
【非特許文献２】ｋａｊｉ Ｎ.ら、２００８年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２８３巻、p. ４９８３-４９９２
【非特許文献３】Ｏｋｒｅｇｌａｋ Ｖ．ら、２００７年、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 第１７８巻、p. １２５１−１２６４
【非特許文献４】Ｋｅｓｈａｍｏｕｎｉ ＶＧ．ら、２００６年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第５巻、p.１１４３−１１５４
【非特許文献５】Ｓｉｎｈａ Ｐ．ら、１９９９年、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、第２０巻、p.２９５２−２９６０
【非特許文献６】Ｚｈａｎｇ Ｙ．ら、２０１０年、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第３８巻、p.１０４２−１０４８
【非特許文献７】Ｍａｒｔｏｇｌｉｏ Ａ．ら、２０００年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第６巻、p.７５０−７６５
【非特許文献８】Ｄｉｎｇ Ｓ．ら、２００４年、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、第４巻、p.９８２−９９４
【非特許文献９】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｈ．ら、２００７年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、第１７７３巻、p. ６４２-６５２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、近年、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質が早期胃癌患者の血液中で上昇していることを見出し、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質、その変異体及び／又はそれらの断片を胃癌の早期発見に有用な診断マーカーとして、胃癌の罹患を早期に判定することのできる胃癌検出方法を開発した。ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の定量的な測定が可能になれば、胃癌をはじめとする消化器癌の早期発見と効果的な臨床治療につながることが期待できる。【０００５】
しかし、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の既存の検出法は、ウェスタンブロット法等を用いた低感度かつ非定量的な免疫学的測定法に限られており、臨床応用へ向けては新たな測定方法の開発が課題として残されていた。【０００６】
そこで、本発明では、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を高感度かつ定量的に検出する免疫学的測定方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、本発明者らは、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を構成するアミノ酸配列上の異なる特定のペプチド領域上に存在するエピトープをそれぞれ特異的に認識して結合する２種以上のモノクローナル抗体を組み合わせて、ｃｏｆｉｌｉｎ１及び／又はその断片を免疫学的に測定することにより、高感度かつ定量的に検出できることを見出した。本発明は、上記知見に基づいて成されたものであり、すなわち以下を提供することである。【０００８】
（１）以下のいずれかのペプチド領域に存在するエピトープを特異的に認識する抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体又はその断片。【０００９】
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むペプチド領域
ｂ）前記ａ）のペプチド領域のアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたペプチド領域
ｃ）前記ａ）のペプチド領域のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するペプチド領域
（２）軽鎖において、ＣＤＲ１が配列番号８で示される配列を含み、ＣＤＲ２が配列番号９で示される配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号１０で示される配列を含み、ならびに重鎖において、ＣＤＲ１が配列番号１１で示される配列を含み、ＣＤＲ２が配列番号１２で示される配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号１３で示される配列を含む、（１）に記載の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体又はその断片。【００１０】
（３）軽鎖において、ＣＤＲ１が配列番号１４で示される配列を含み、ＣＤＲ２が配列番号１５で示される配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号１６で示される配列を含み、ならびに重鎖において、ＣＤＲ１が配列番号１７で示される配列を含み、ＣＤＲ２が配列番号１８で示される配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号１９で示される配列を含む、（１）に記載の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体又はその断片。【００１１】
（４）以下のいずれかのペプチド領域に存在するエピトープを特異的に認識する抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体又はその断片。【００１２】
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むペプチド領域
ｂ）前記ａ）のペプチド領域のアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたペプチド領域
ｃ）前記ａ）のペプチド領域のアミノ酸配列と90％以上の相同性を有するペプチド領域
（５）軽鎖において、ＣＤＲ１が配列番号２０で示される配列を含み、ＣＤＲ２が配列番号２１で示される配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号２２で示される配列を含み、ならびに重鎖において、ＣＤＲ１が配列番号２３で示される配列を含み、ＣＤＲ２が配列番号２４で示される配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号２５で示される配列を含む、（４）に記載の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体又はその断片。【００１３】
（６）以下のいずれかのペプチド領域に存在するエピトープを特異的に認識する抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体又はその断片。【００１４】
ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列のうちの、少なくとも配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むペプチド領域
ｂ）前記ａ）のペプチド領域のアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたペプチド領域
ｃ）前記ａ）のペプチド領域のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するペプチド領域
（７）軽鎖において、ＣＤＲ１が配列番号２６で示される配列を含み、ＣＤＲ２が配列番号２７で示される配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号２８で示される配列を含み、ならびに重鎖において、ＣＤＲ１が配列番号２９で示される配列を含み、ＣＤＲ２が配列番号３０で示される配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号３１で示される配列を含む、（６）に記載の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体又はその断片。【００１５】
（８）ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質のアミノ酸配列上の異なるエピトープをそれぞれ特異的に認識する２種以上の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片を使用して、試料中のｃｏｆｉｌｉｎ１及び／又はその断片を測定する、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の免疫学的測定方法。【００１６】
（９）前記異なるエピトープが配列番号１及び／又は２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域に存在する、（８）に記載の測定方法。【００１７】
（１０）前記異なるエピトープが配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域のうち、少なくとも配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むペプチド領域、及び／又は配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域のうち、少なくとも配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むペプチド領域に存在する、（９）に記載の測定方法。【００１８】
（１１）前記異なるエピトープが配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域のうち、少なくとも配列番号５及び／又は６で示されるアミノ酸配列を含むペプチド領域、及び／又は配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域のうち、少なくとも配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むペプチド領域に存在する、（９）に記載の測定方法。【００１９】
（１２）前記異なるエピトープが配列番号５〜７で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域から選択される２つのペプチド領域にそれぞれ存在する、（８）に記載の測定方法。【００２０】
（１３）前記異なるエピトープが配列番号１及び／又は２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域における連続する６個以上２１個以下のアミノ酸からなるペプチド領域に存在する、（９）に記載の測定方法。【００２１】
（１４）前記２種以上の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片が（２）、（３）、（５）及び（７）に記載の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体又はその断片から選択される、（８）に記載の測定方法。【００２２】
（１５）２種の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片が、以下のいずれかの抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片の組合せである、（１４）に記載の測定方法。【００２３】
ａ）（２）及び（５）のそれぞれに記載の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片の組合せ
ｂ）（２）及び（７）のそれぞれに記載の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片の組合せ
ｃ）（３）及び（５）のそれぞれに記載の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片の組合せ
ｄ）（５）及び（７）のそれぞれに記載の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片の組合せ
（１６）前記試料が血液、尿、細胞上清、細胞抽出液、組織抽出液、胃液、唾液、リンパ液、涙液又は精液である、（８）〜（１５）のいずれかに記載の測定方法。【００２４】
（１７）（８）〜（１６）のいずれかに記載の測定方法を用いて被検体及び健常体由来の試料中のｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質及び／又はその断片の量を測定するステップ、前記測定ステップで測定されたｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質及び／又はその断片の量を比較して、被検体のｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質及び／又はその断片の量が健常者のそれよりも統計学的に有意に多い場合には被検体が消化器癌に罹患していると判定する判定ステップを含む、消化器癌罹患判定方法。【００２５】
（１８）前記消化器癌が早期消化器癌である、（１７）に記載の判定方法。【００２６】
（１９）前記消化器癌が胃癌である、（１７）又は（１８）に記載の判定方法。【００２７】
（２０）ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の異なるエピトープをそれぞれ特異的に認識する２種以上の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片を含む、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の測定用キット。【００２８】
（２１）（１）〜（７）のいずれかに記載の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体又はその断片を２種以上含む、（２０）に記載のキット。【００２９】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010-274879号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の免疫学的測定方法によれば、既存の方法と比較して、試料中のｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を、定量的かつ高感度に検出することができる。また、簡易な実験操作で簡便に測定を完了できる。【００３１】
さらに、本発明の消化器癌罹患判定方法によれば、血液等の被検体試料中に含まれるｃｏｆｉｌｉｎ１の量を測定することにより、消化器癌に罹患しているか否かを早期に判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】エピトープ解析に用いた欠失変異体の一次構造及び各ペプチド領域とそのアミノ酸配列番号を示す。
【図２】ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を発現した細胞株試料におけるウェスタンブロッティング図を示す。＋はｐＣＭＶ−Ｍｙｃ＿ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１を、−はｐＣＭＶ−Ｍｙｃベクターのみを、それぞれ導入したＨＥＫ２９３細胞である。
【図３】Ａ〜Ｅ：異なる２種の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによるｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の検出感度を示す。
【図４】ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質測定用サンドイッチＥＬＩＳＡの検出感度の評価。Ｂは、Ａにおける破線円部分を拡大したグラフである。Ｂにおいて、矢印で示す値がＥＬＩＳＡ法の最小検出限界値となる。
【図５】胃癌患者及び健常者の血漿中のｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を、サンドイッチＥＬＩＳＡにより検出したグラフである。
【図６】胃癌患者及び健常者の血清中のｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を、サンドイッチＥＬＩＳＡにより検出したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
１．抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及びその断片
本発明の第１の実施形態は、抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及びその断片である。
【００３４】
１−１．抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体
「ｃｏｆｉｌｉｎ１」とは、ＧｅｎＢａｎｋ アクセッションＮＰ＿００５４９８．１に記載のアミノ酸配列からなるヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質又はその天然変異体、あるいは同アクセッションＮＰ＿０５８８４３に記載のアミノ酸配列からなるラットｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質、同アクセッションＮＰ＿０３１７１３．１に記載のアミノ酸配列からなるマウスｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質、同アクセッションＮＰ＿００１１７０１８３．１に記載のアミノ酸配列からなるチンパンジーｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質、同アクセッションＮＰ＿００１０１５６５５に記載のアミノ酸配列からなるウシｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質、又は同アクセッションＮＰ＿５３３２３１．１に記載のアミノ酸配列からなるイヌｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質のようにヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質と９５％以上の相同性を示す哺乳動物におけるオーソログ又はそれらの天然変異体も含む。
【００３５】
ここでいう「天然変異体」とは、自然界に存在する変異体であって、例えば、前記アミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたもの、前記アミノ酸配列と９０％以上、９２％以上又は９４％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは約９７％以上、一層好ましく約９９％以上の同一性を有するものをいう。「同一性」とは、二つのアミノ酸配列が、最大の一致度とならないようにギャップを導入して、又は導入しないで整列（アラインメント）させたときに、一方のアミノ酸配列の全アミノ酸残基数（ギャップ数も含む）に対する他方のアミノ酸配列の同一アミノ酸残基数の割合（％）をいう。「数個」とは、２〜１０の整数、例えば、２〜７、２〜５、２〜４、２〜３の整数をいう。天然変異体の具体例としては、ＳＮＰ（一塩基多型）等の多型に基づく変異体やスプライス変異体等が挙げられる。前記置換は、保存的アミノ酸置換であることが好ましい。保存的アミノ酸置換であれば、前記アミノ酸配列を有するｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質と実質的に同等な構造又は性質を有し得るからである。保存的アミノ酸とは、互いに、非極性アミノ酸（グリシン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、トリプトファン）及び極性アミノ酸（非極性アミノ酸以外のアミノ酸）、荷電アミノ酸（酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）及び塩基性アミノ酸（アルギニン、ヒスチジン、リジン））及び非荷電アミノ酸（荷電アミノ酸以外のアミノ酸）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、分岐状アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン）、ならびに脂肪族アミノ酸（グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン）等が知られている。
【００３６】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」とは、単一の免疫グロブリン、又はそのフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅ ｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ：以下、「ＦＲ」とする）及び相補鎖決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：以下、「ＣＤＲ」とする）を含み、特定の抗原を特異的に認識し、かつ結合することのできるポリペプチドをいう。したがって、本発明の「抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体」とは、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を特異的に認識し、かつ結合することができるポリペプチドをいう。「特異的に認識し、かつ結合する」とは、交差反応性が無いか又は極めて弱く、標的抗原以外の抗原は認識も結合もしないか、又はほとんどしないことを意味する。
【００３７】
典型的な免疫グロブリン分子は、重鎖及び軽鎖と呼ばれる２本のポリペプチド鎖の組がジスルフィド結合によって２組相互接続された四量体として構成される。重鎖は、Ｎ末側の重鎖可変領域（Ｈ鎖Ｖ領域：以下、「ＶＨ」とする）とＣ末側の重鎖定常領域（Ｈ鎖Ｃ領域：以下、「ＣＨ」とする）からなり、軽鎖は、Ｎ末側の軽鎖可変領域（Ｌ鎖Ｖ領域：以下、「ＶＬ」とする）とＣ末側の軽鎖定常領域（Ｌ鎖Ｃ領域：以下、「ＣＬ」とする）からなる。このうち、ＶＨ及びＶＬは、抗体の結合特異性に関与する点で特に重要である。このＶＨ及びＶＬは、いずれも約１１０個のアミノ酸残基からなり、その内部に抗原との結合特異性に直接関与する３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）と、可変領域の骨格構造として機能する４つのＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）を有している。ＣＤＲは、抗原分子と相補的な立体構造を形成し、抗体の特異性を決定することで知られている（Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｖｏｌ．１、ｅｄｓ．５、ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）。定常領域のアミノ酸配列が種内抗体間ではほとんど一定なのに対して、ＣＤＲのアミノ酸配列は各抗体間において変異性が高く、それ故、超可変領域（Ｈｙｐｅｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）とも呼ばれている。可変領域において、前記ＣＤＲとＦＲは、アミノ酸末端からカルボキシ末端方向にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配列されている。免疫グロブリン分子内においてＶＬ及びＶＨは、相対して二量体を形成することによって抗原結合部位を形成している。免疫グロブリンには、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＤの各クラスが知られているが、本発明の抗体は、いずれのクラスであっても良い。好ましくはＩｇＧである。
【００３８】
本発明の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体は、（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも配列番号５又は６で示されるアミノ酸配列を含むペプチド領域、（２）配列番号２で示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むペプチド領域、（３）前記（１）又は（２）のペプチド領域のアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたペプチド領域、又は（４）前記（１）又は（２）のペプチド領域のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するペプチド領域、に存在するエピトープを特異的に認識することを特徴とする。
【００３９】
配列番号１で示されるアミノ酸配列は、ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質のＣ末端側ペプチド領域（図１ではＭ領域のＣ末端側５アミノ酸とＣ１〜Ｃ３領域）のアミノ酸配列であって、開始メチオニンを１位としたときに１２２位〜１６６位に相当する。配列番号５で示されるアミノ酸配列は、図１におけるＣ１領域のアミノ酸配列であって、ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の１５８位〜１６６位に相当する。配列番号６で示されるアミノ酸配列は、図１におけるＣ３領域のアミノ酸配列であって、ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の１２７位〜１４６位に相当する。配列番号５又は６で示されるアミノ酸配列のペプチド領域には、高感度な抗ｃｏｆｉｌｉｎ１抗体を作製する上で有効なエピトープが存在する。
【００４０】
配列番号５で示されるＣ１領域に存在するエピトープを認識する抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体の具体的な例としては、例えば、後述する実施例３に記載の表１において、抗体クローン名１Ｅ２及び２Ｃ４で表される抗体クローン等が挙げられる。１Ｅ２クローンは、軽鎖におけるＣＤＲ１が配列番号８で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号９で示される配列、そしてＣＤＲ３が配列番号１０で示される配列からなり、かつ重鎖におけるＣＤＲ１が配列番号１１で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号１２で示される配列、そしてＣＤＲ３が配列番号１３で示される配列からなる。また、２Ｃ４クローンは、軽鎖におけるＣＤＲ１が配列番号１４で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号１５で示される配列、そしてＣＤＲ３が配列番号１６で示される配列からなり、かつ重鎖におけるＣＤＲ１が配列番号１７で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号１８で示される配列、そしてＣＤＲ３が配列番号１９で示される配列からなる。
【００４１】
配列番号６で示されるＣ３領域に存在するエピトープを認識する抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体の具体的な例としては、例えば、表１において抗体クローン名４Ｅ１２で表される抗体クローンが挙げられる。４Ｅ１２クローンは、軽鎖におけるＣＤＲ１が配列番号２０で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号２１で示される配列、そしてＣＤＲ３が配列番号２２で示される配列からなり、かつ重鎖におけるＣＤＲ１が配列番号２３で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号２４で示される配列、そしてＣＤＲ３が配列番号２５で示される配列からなる。なお、Ｃ３領域は、僅か９アミノ酸で構成されることから、Ｃ３領域はエピトープそのものを構成している可能性が高い。  また、配列番号２で示されるアミノ酸配列は、ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質のＮ末端側ペプチド領域（図１ではＮ１及びＮ２領域とＭ領域のＮ末端側５アミノ酸）のアミノ酸配列であって、開始メチオニンを１位としたときに１位〜５４位に相当する。配列番号７で示されるアミノ酸配列は、図１におけるＮ２領域のアミノ酸配列であって、ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の２９位〜４９位の配列に相当する。配列番号７で示されるアミノ酸配列のペプチド領域には、高感度な抗ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１抗体を作製する上で有効なエピトープが存在する。
【００４２】
配列番号７で示されるＮ２領域のエピトープを認識する抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体の具体的な例としては、例えば、表１において抗体クローン名４Ｆ１２で表される抗体クローンが挙げられる。４Ｆ１２クローンは、軽鎖におけるＣＤＲ１が配列番号２６で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号２７で示される配列、そしてＣＤＲ３が配列番号２８で示される配列からなり、かつ重鎖におけるＣＤＲ１が配列番号２９で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号３０で示される配列、そしてＣＤＲ３が配列番号３１で示される配列からなる。
【００４３】
本発明において有用な抗体は、鳥及び哺乳動物を含めたあらゆる動物原由来とすることができる。例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ロバ、ヒツジ、ラクダ、ウマ、ニワトリ、又はヒト等が挙げられる。通常は、マウス、ラット、ウサギの抗体が好適に使用される。
【００４４】
さらに、本発明において「抗体」は、多重特異性抗体であってもよい。多重特異性抗体とは、多価抗体、すなわち抗原結合部位を一分子内に複数有する抗体において、それぞれの抗原結合部位が異なるエピトープと結合する抗体をいう。例えば、ＩｇＧのように２つの抗原結合部位を有する抗体で、それぞれの抗原結合部位が異なるエピトープと結合する二重特異性抗体（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ抗体）が挙げられる。本発明においては、この多重特異性抗体は、それぞれの抗原結合部位がｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質上に存在する異なるエピトープと結合できることが好ましい。これらの抗体は、組換えＤＮＡ技術を用いて、公知方法によりＩｇＧ等を人工的に改変することにより得ることができる。
【００４５】
１−２．抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体の断片
本明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体又はその断片」における「その断片」とは、前記モノクローナル抗体の部分断片であって、該抗体が有する抗原特異的結合活性と実質的に同等の活性を有するポリペプチド鎖又はその複合体をいう。例えば、前述の抗原結合部位を少なくとも１つ包含する抗体部分、すなわち、少なくとも１組のＶＬとＶＨを有するポリペプチド鎖又はその複合体が該当する。具体例としては、免疫グロブリンを様々なペプチダーゼで切断することによって生じる多数の十分に特徴付けられた抗体断片等が挙げられる。より具体的な例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’等が挙げられる。Ｆａｂは、パパインによりＩｇＧ分子がヒンジ部のジスルフィド結合よりもＮ末端側で切断されることによって生じる断片であって、ＶＨ及びＣＨを構成する３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）のうちＶＨに隣接するＣＨ１からなるポリペプチドと、軽鎖から構成される。Ｆ（ａｂ’）２は、ペプシンによりＩｇＧ分子がヒンジ部のジスルフィド結合よりもＣ末端側で切断されることによって生じるＦａｂ’の二量体である。Ｆａｂ’は、Ｆａｂよりもヒンジ部を含む分だけＨ鎖が若干長いが実質的にはＦａｂと同等の構造を有する。Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ ｅｄ．、３ｄ ｅｄ．、１９９３。Ｆａｂ’は、Ｆ（ａｂ’）２をマイルドな条件下で還元し、ヒンジ領域のジスルフィド連結を切断することによって得ることができる。これらの抗体断片は、いずれも抗原結合部位を包含しており、抗原（すなわち本発明においてはｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質又はその断片）と特異的に結合する能力を有している。
【００４６】
本発明のモノクローナル抗体の断片は、化学的に、又は組換えＤＮＡ法を用いることによって合成したものであってもよい。例えば、組換えＤＮＡ法を用いて新たに合成された抗体断片が挙げられる。具体的には、限定はしないが、本発明のモノクローナル抗体の一以上のＶＬ及び一以上のＶＨを適当な長さと配列を有するリンカーペプチド等を介して人工的に連結させた一量体ポリペプチド分子、又はその多量体ポリペプチドが該当する。このようなポリペプチドの例としては、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ：ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）（Ｐｉｅｒｃｅ ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９４−１９９５、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ参照）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）又はテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）等の合成抗体等が挙げられる。免疫グロブリン分子において、ＶＬ及びＶＨは、通常別々のポリペプチド鎖（Ｌ鎖とＨ鎖）上に位置する。一本鎖Ｆｖは、これらの可変領域を十分な長さの柔軟性リンカーによって連結し、１本のポリペプチド鎖にＶＬ及びＶＨを包含した構造を有する合成抗体断片である。一本鎖Ｆｖ内において両可変領域は、互いに自己集合して１つの機能的な抗原結合部位を形成することができる。一本鎖Ｆｖは、それをコードする組換えＤＮＡを、公知技術を用いてファージゲノムに組み込み、発現させることで得ることができる。ダイアボディは、一本鎖Ｆｖの二量体構造を基礎とした構造を有する分子である（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、９０：６４４４−６４４８）。例えば、前記リンカーの長さが約１２アミノ酸残基よりも短い場合、一本鎖Ｆｖ内の２つの可変部位は自己集合できないが、ダイアボディを形成させることにより、すなわち、２つの一本鎖Ｆｖを相互作用させることにより、一方のＦｖ鎖のＶＬが他方のＦｖ鎖のＶＨと集合可能となり、２つの機能的な抗原結合部位を形成することができる（Ｍａｒｖｉｎ ｅｔ ａｌ、２００５、Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ．、２６：６４９−６５８）。さらに、一本鎖ＦｖのＣ末端にシステイン残基を付加させることにより、２本のＦｖ鎖同士のジスルフィド結合が可能となり、安定的なダイアボディを形成させることもできる（Ａｌａｆｓｅｎ ｅｔ ａｌ、２００４、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｒ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．、１７：２１−２７）。このようにダイアボディは二価の抗体断片であるが、それぞれの抗原結合部位は、同一エピトープと結合する必要はなく、それぞれが異なるエピトープを認識し、特異的に結合する二重特異性を有していても構わない。トリアボディ、及びテトラボディは、ダイアボディと同様に一本鎖Ｆｖ構造を基本としたその三量体、及び四量体構造を有する。それぞれ、三価、及び四価の抗体断片であり、多重特異性抗体であってもよい。さらに、本発明の抗体断片は、ファージディスプレイライブラリーを用いて同定された抗体断片（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．３４８、５２２−５５４参照）であって、かつ抗原結合能力を有しているものが���まれる。この他、例えば、Ｋｕｂｙ、Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３ｒｄ Ｅｄ．、１９９８、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、も参照されたい。
【００４７】
１−３．抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及びその断片のその他の特徴
本発明の抗体又はその断片は、修飾することができる。ここでいう修飾は、本発明の抗体又はその断片がｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質との特異的結合活性を有する上で必要な機能上の修飾（例えば、グリコシル化）、及び本発明の抗体又はその断片を検出する上で必要な標識のいずれをも含む。前記抗体標識には、例えば、蛍光色素（ＦＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５）、蛍光タンパク質（例えば、ＰＥ、ＡＰＣ、ＧＦＰ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）、又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジン）による標識が挙げられる。また、本発明の抗体のグリコシル化は、標的抗原に対する抗体の親和性を調整するために改変されていてもよい。このような改変は、例えば、抗体配列内の一以上のグリコシル化部位を変更することで達成できる。より具体的に説明すると、例えば、ＦＲ内の一以上のグリコシル化部位を構成するアミノ酸配列に一以上のアミノ酸置換を導入して該グリコシル化部位を除去することにより、その部位のグリコシル化を喪失させることができる。このような脱グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させる上で有効である（米国特許第５７１４３５０号、及び同第６３５０８６１号）。
【００４８】
本発明で使用されるモノクローナル抗体又はその断片は、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質又はその断片に対する特異性を確認するため、使用前に予め他の抗原（タンパク質又はその断片）との交差反応性を検証しておくことが好ましい。本発明の抗体又はその断片において、交差性を確認すべき抗原は、ＡＤＦ／ＣＯＦＩＬＩＮファミリーに属するタンパク質、特に、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質と構造的に類似するｃｏｆｉｌｉｎ２タンパク質が挙げられる。また、前記タンパク質以外にも、部分構造がｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質と共通する他のタンパク質についても本発明で使用される抗体又はその断片の交差反応性を確認しておくことがより好ましい。交差反応の確認には、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を抗原としたＥＬＩＳＡ法を使うことが可能である。反応特異性を試験すべき抗体、すなわち、抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体、及びその断片とｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質との反応の場に、交差性を確認すべき他の抗原タンパク質を共存させれば、両者の競合状態を観察することによって交差性の確認を行うことができる。競合阻害の原理を利用したこのような交差性の確認方法は、すべての抗原について反応系を調製する必要がないのでスクリーニングを迅速に行うことができる。
【００４９】
１−４．抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及びハイブリドーマ作製方法
本発明の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体又はその抗体を産生するハイブリドーマは、以下に記載する方法によって作製することができる。ただし、本方法に限定されるものではなく、当該分野で公知の他のあらゆる方法で作製することもできる。
【００５０】
１−４−１．抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体作製方法
ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列番号１〜７で示されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド領域に存在するエピトープと特異的に結合する抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体を作製するには、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の全長を免疫原としてモノクローナル抗体を作製し、その後、配列番号１〜７で示されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド領域と特異的に結合する抗体をスクリーニングする方法と、予め配列番号１〜７で示されるｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の断片からなるペプチドを免疫原としてモノクローナル抗体を作製する方法がある。
【００５１】
（１）ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の調製
免疫原（抗原）として用いるｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質は、例えば、以下の方法によって調製することができる。
【００５２】
ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質は、天然型、組換え型、又はペプチド合成のようにアミノ酸配列の全部又は一部を化学的に合成した合成ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質のいずれであってもよい。天然型ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質は、血液若しくは尿のような体液をはじめとする試料、又は培養細胞の培養上清から公知のタンパク質分離・精製技術、例えばゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを用いて回収することができる。組換え型ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質は、該タンパク質をコードするＤＮＡを導入した微生物、昆虫細胞、又は動物細胞で発現させた後、当該細胞から公知のタンパク質分離・精製技術を用いて回収することができる。合成ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質は、例えば、公開されたｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質アミノ酸配列情報を利用して、当技術分野で公知の手法、例えば固相ペプチド合成法等により合成することができる。この合成ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質には、ＫＬＨ（スカシ貝ヘモシアニン）、ＯＶＡ（卵白アルブミン）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等のキャリアータンパク質に連結させてもよい。
【００５３】
配列番号１〜７で示されるｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の断片を免疫原とする場合も、天然型ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片、組換え型ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片、又は合成ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片のいずれを使用することもできる。ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片としては、配列番号１〜７で示される配列において、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、又は２３以上の連続したアミノ酸残基を含むオリゴペプチド又はポリペプチドを抗原として使用することができる。
【００５４】
天然型ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の断片を免疫原として用いる場合は、例えば、精製したｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質をトリプシン等の適切なプロテアーゼで処理した後、逆相カラムでピークを分離分取し、各ピークに含まれるペプチドのアミノ酸配列を質量分析器により決定して、配列番号１〜７で示される部分配列又はその一部であるピークを免疫原として用いることができる。
【００５５】
組換え型ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質のアミノ酸部分配列を免疫原として用いる場合は、前述したｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列のうち、配列番号１〜７で示されるアミノ酸部分配列、又はその一部をコードするＤＮＡ配列部分を、全長ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を作製する場合と同様に発現用ベクターに挿入し、各種細胞に導入することで、配列番号１〜７で示されるアミノ酸部分配列、又はその一部の組換え型ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を得ることが出来る。
【００５６】
以下で、配列番号１〜７で示される組み換え型ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片（以下、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片という。）の調製について詳述する。
【００５７】
（ａ）組換え型ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片をコードするポリヌクレオチドの調製
ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片の発現に用いるベクターとしては、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドを使用することができる。例えば、プラスミドとしては、大腸菌由来のプラスミド（ｐＥＴ３０ａ、ｐＧＥＸ６ｐ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）が挙げられる。また、ファージとしては、λファージ（λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターも用いることができる。
【００５８】
上記ベクターにｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片をコードするポリヌクレオチドを挿入するには、例えば、精製した該ポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断し、適当な制限酵素で切断したベクター内部にＤＮＡリガーゼ等を用いて連結する方法がある。
【００５９】
（ｂ）ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片発現ベクターの宿主内への導入
得られたｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片発現ベクターを、その発現ベクターを発現し得る宿主中に導入して、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片発現形質転換体を得る。使用する宿主については、使用したベクターに適する宿主であって、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌（例えば、エシェリヒア・コリ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（例えば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等）、酵母、昆虫細胞、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９８、Ｖｏｌ．１６０、３３９３−３４０２）等が好適に用いられる。細菌への前記ベクターの導入方法は、細菌に該ベクターを導入する公知の方法であれば特に限定されない。例えば、ヒートショック法、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。これらの技術は、いずれも当該分野で公知であり、様々な文献に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ． ｅｔ．ａｌ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。また、動物細胞の形質転換には、リポフェクチン法（ＰＮＡＳ、１９８９、Ｖｏｌ．８６、６０７７）、（ＰＮＡＳ、１９８７、Ｖｏｌ．８４、７４１３）、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９７３、Ｖｏｌ．５２、４５６−４６７）、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法等が好適に用いられる。
【００６０】
細菌を宿主とする場合は、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片発現ベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター配列、リボゾーム結合配列、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片をコードするＤＮＡ配列、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する調節因子をコードする遺伝子が含まれていてもよい。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で機能できるものであればいずれを用いてもよい。
【００６１】
酵母、動物細胞、昆虫細胞等の真核細胞を宿主とする場合にも、同様に当技術分野で公知の手法に従ってｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片発現形質転換体を得ることができる。真核細胞において用いられるｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片発現ベクターには、プロモーター配列、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片をコードするＤＮＡ配列のほか、所望によりエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル（ドナー部位、アクセプター部位、ブランチポイント等）、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー配列、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等が連結されていてもよい。
【００６２】
（ｃ）形質転換体の培養及び組換え型ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片の発現
続いて、上記作製した形質転換体を培養する。形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。例えば、細菌を宿主とする場合、培地は、細菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、かつ生育、増殖可能なものであれば、特に限定はしない。天然培地、合成培地のいずれを用いることもできる。より具体的な例としては、ＬＢ培地が挙げられるが、もちろんこれに限定はされない。また、形質転換体の培養を選択的に行うために、必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。培養は、通常、通気攪拌培養等の好気的条件下、３７℃で６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。形質転換体がＣＨＯ細胞等の動物細胞である場合には、Ｇｉｂｃｏ社製ＤＭＥＭ培地に１×１０５細胞／ｍＬとなるように宿主細胞を接種し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにて培養すればよい。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００６３】
前記ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片発現ベクターがタンパク質発現制御システム（例えば、宿主が細菌の場合、リプレッサー遺伝子及びオペレーター等が該当する）を含むタンパク質発現誘導型ベクターである場合には、前記形質転換体に所定の処理を行い、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片の発現を誘導させる必要がある。発現誘導の方法は、ベクターに含まれるタンパク質発現制御システムによって異なるため、そのシステムに適した誘導処理を行えばよい。例えば、細菌を宿主とするタンパク質発現誘導型ベクターにおいて最も一般的に利用されているタンパク質発現制御システムは、ｌａｃリプレッサー遺伝子及びｌａｃオペレーターからなるシステムである。本システムは、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｉｏ−β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）処理により発現を誘導することが可能である。このシステムを含むｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質発現ベクターを有する形質転換体において、目的とするｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を発現させるためには、培地中に適当量（例えば、終濃度１ｍＭ）のＩＰＴＧを添加すればよい。
【００６４】
（ｄ）組換え型ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片の抽出及び／又は回収
培養後、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を回収して破砕することによりタンパク質を抽出することができる。また、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去し、上清を使用すればよい。その後、一般的なタンパク質の精製方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で、又は適宜組合せて用いることにより、前記培養物中からｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を単離精製することができる。ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片が得られたか否かは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認すればよい。
【００６５】
（２）抗ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片抗体の産生細胞の作製
前記（１）で得られた免疫原である組換え型ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片を、緩衝液に溶解して免疫原溶液を調製する。この際、免疫を効果的に行うために、必要であればアジュバントを添加してもよい。アジュバントの例としては、市販の完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）等が挙げられ、これらを単独で又は混合して用いてもよい。
【００６６】
次に、前記調製した免疫原溶液を哺乳動物、例えばラット、マウス（例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）、ウサギ等に投与し、免疫する。免疫原の投与方法としては、例えば、ＦＩＡ又はＦＣＡを用いた皮下注射、ＦＩＡを用いた腹腔内注射、又は０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを用いた静脈注射が挙げられるが、この限りでない。免疫原の１回の投与量は、免疫動物の種類、投与経路等により適宜決定されるものであるが、動物１匹当たり約５０〜２００μｇである。また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは１〜４週間間隔で、２〜６回、好ましくは３〜４回追加免疫を行う。初回免疫より後に、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法等により行い、抗体価がプラトーに達すれば、免疫原を静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。そして、最終免疫の日から２〜５日後、好ましくは３日後に、抗体産生細胞を採取する。
【００６７】
１−４−２．抗ｃｏｆｉｌｉｎ１部分配列モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ作製方法
（１）免疫動物からの抗体産生細胞の回収と細胞融合
免疫動物から得た抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行うことで、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の部分配列を特異的に認識するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを作製することができる。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、一般に入手可能なマウス等由来の株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生育できる性質を有するものが好ましい。また、株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損細胞株である、Ｐ３Ｘ６２−Ａｇ．８株（ＡＴＣＣＴＩＢ９）、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１株（ＪＣＲＢ９０８５）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１株（ＪＣＲＢ０００９）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３株（ＪＣＲＢ００２８）又はＳｐ２／０−Ａｇ１４株（ＪＣＲＢ００２９）等が挙げられる。
【００６８】
上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させるには、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０培地等の動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを約１：１〜２０：１の割合で混合し、細胞融合促進剤の存在下にて融合反応を行う。細胞融合促進剤としては、平均分子量１，５００〜４，０００Ｄａのポリエチレングリコール等を約１０〜８０％の濃度で使用することができる。また、場合によっては、融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を併用してもよい。さらに、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる（Ｎａｔｕｒｅ、１９７７、Ｖｏｌ．２６６、５５０−５５２）。
【００６９】
（２）目的とするハイブリドーマの選抜
細胞融合処理後の細胞から目的とする抗ｃｏｆｉｌｉｎ１断片モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選別する方法としては、細胞懸濁液を、例えば、ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地等で適当に希釈後、９６ウェルマイクロタイタープレート上に２×１０６個／ウェル程度播種し、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。培養温度は２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生細胞とミエローマ細胞のハイブリドーマのみを選択的に生育、増殖させることができるため、選択培地で培養開始後約１０日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして選択することができる。
【００７０】
ＨＡＴ培地で選択されたハイブリドーマは、まず、天然型又は組換え型ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質、又は配列番号１〜７で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域に対する結合活性を指標としてスクリーニングを行う。次いでｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質への結合活性を持つ抗体を産生するハイブリドーマについては、交差性の試験を行う。すなわち、他のＣＸＣファミリー等への結合活性を検証し、許容できるものを選択する。許容できる交差性とは、目的とする抗体の用途において、無視しうる程度の交差性を意味する。たとえば、免疫学的な測定に用いるためのモノクローナル抗体であれば、最終的な測定系において交差反応によるシグナル強度が、バックグラウンドレベルから特異的反応によるシグナル強度の１％未満に抑えられれば、事実上交差反応しないということができる。
【００７１】
ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質への反応性や、他のＡＤＦ／ＣＯＦＩＬＩＮファミリーとの交差反応性を確認するには、例えば、ＥＬＩＳＡ法を利用することができる。ＥＬＩＳＡ法では、抗原となるｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質又はその断片を固相化したマイクロプレートを用意し、これに前記ハイブリドーマの培養上清を適当に希釈した試料を加えて反応させる。十分に反応させた後にウェルを洗浄し、免疫グロブリンに対する２次抗体の標識体を加えて更に反応させる。再度ウェルを洗浄し、最終的にウェルに結合した２次抗体の標識を利用して測定すれば、培養上清中に存在する抗体の、抗原に対する結合活性を定量的に知ることができる。
【００７２】
ハイブリドーマは組換えＤＮＡ技術を用いて選抜することもできる。まず、前述の方法に従って取得したハイブリドーマ群からｍＲＮＡを抽出する。ｍＲＮＡの抽出は、例えば、実施例１に記載のような公知の方法を用いればよい。続いて、Ｏｌｉｇｏ ｄＴプライマーやランダムプライマーを用いて前記ｍＲＮＡのｃＤＮＡを取得する。このｃＤＮＡを鋳型に、可変領域をコードする遺伝子の上流にあるシグナル配列の塩基配列と、定常領域側の塩基配列を含むプライマーセットを利用してＰＣＲを行う。得られた増幅産物を適当なクローニングベクターに挿入してクローン化し、そのハイブリドーマが生産する抗体の可変領域遺伝子のライブラリーを得ることができる。より具体的な例として、限定はしないが、Ｎｏｖａｇｅｎ社の提供するＭｏｕｓｅ Ｉｇ Ｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲを行い、増幅産物（マウス免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の提供するＺＥＲＯ ＢＬＵＮＴ ＰＣＲ ＴＯＰＯ ＶｅｃｔｏｒのＥｃｏＲＩ部位に挿入してクローン化し、得られたベクター群を、可変領域アミノ酸配列をコードする遺伝子ライブラリーとすることができる。次に、前記本発明で開示された可変領域又は各ＣＤＲのアミノ酸配列を元にプローブを設計し、前記ライブラリーからポジティブクローンをスクリーニングすることで、本発明の抗体を生産するハイブリドーマを選抜することができる。
【００７３】
（３）ハイブリドーマを用いた抗体産生
本発明におけるハイブリドーマは、マウスを用いて腹水化することにより抗体生産に用いることが出来る。具体的には、ハイブリドーマを作製する際に用いた融合パートナーに用いた細胞の由来のマウスや、ヌードマウスの腹腔内にハイブリドーマを接種し、腹水を適宜採取することにより、抗体を含む腹水液を回収することができる。より具体的には、ＳＰ／０細胞を融合パートナーとしたハイブリドーマを、プリスタン接種後１０日間を経たＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔中に接種することにより、抗体を含む腹水液を回収できる。
【００７４】
また、本発明におけるハイブリドーマは、適した培地を用いて培養を行うことにより抗体生産に用いることが出来る。具体的には、Ｇｉｂｃｏ社製のハイブリドーマＳＦＭ培地中に１×１０５細胞／ｍＬとなるようにハイブリドーマを接種し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにてハイブリドーマが死滅するまで培養することにより抗体を含む培養液上清を得ることが出来るが、この限りではない。
【００７５】
（４）組換え抗ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片モノクローナル抗体の作製方法
本発明の抗体又はその断片は、本発明で開示されたｃｏｆｉｌｉｎ１断片を特異的に認識するモノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列を利用して、組換えＤＮＡ操作によって得ることもできる。
【００７６】
例えば、上記「１−４−２（２）」の手法で取得した抗ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ由来の該抗体の可変領域をコードするアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を用いて、ＶＨ及びＶＬの塩基配列を任意のＣＬ、及びＣＨをコードする塩基配列にそれぞれ連結し、それぞれのポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入後、完全な免疫グロブリン分子として発現させることもできる。また、ＣＤＲグラフト抗体技術を用いて、上記「１−４−２（２）」の手法で取得した可変領域をコードするアミノ酸配列のうち、ＣＤＲ配列のアミノ酸配列を、任意の免疫グロブリンの各ＣＤＲに組み込んだ可変領域をコードするポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入後、完全な免疫グロブリン分子として発現させてもよい。このとき重鎖と軽鎖とが同一宿主細胞内で発現し、重鎖／軽鎖からなる２量体として産生できるようにすると便利である。具体的には、例えば、軽鎖発現ベクター及び重鎖発現ベクターにより細胞を共形質転換し、この形質転換細胞から本発明による抗体を得ることもできる。又は、上記アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをそのまま適当な発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入後、免疫グロブリン分子の断片として発現させることもできる。あるいは、上述したように、前記アミノ酸配列を含むＶＬ及びＶＨ、又は軽鎖及び重鎖をそれぞれコードするポリヌクレオチドを適当なリンカーで連結してファージに組み込んだ一本鎖Ｆｖとして、又はダイアボディ等の合成抗体断片として発現させてもよい。その他、近年開発された、遺伝子工学技術を活用して組換え抗体をファージ表面に発現させるファージディスプレイ抗体技術（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ、１９９５、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８２、４１−５０、国際公開ＷＯ９７／１３８４４号、同９０−０２８０９号）により、人工的に重鎖、軽鎖をコードする遺伝子をシャッフリングさせ多様化した一本鎖Ｆｖ抗体をファージ融合タンパクとして発現させ、特異抗体を得ることもできる。
【００７７】
組換え抗ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質断片モノクローナル抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドの調製、該ポリヌクレオチドを組み込んだベクター、該ベクターの宿主導入法については、上記「１−４−１．抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体作製方法」に記載したような当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術を用いて行えばよい。目的とする組換え抗ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質抗体又はその断片は、形質転換細胞の培養液中又は当該細胞内から得ることができる。
【００７８】
免疫グロブリン発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター（例えば、ＳＶ４０ ｖｉｒｕ ｂａｓｅｄベクター、ＥＢ ｖｉｒｕｓ ｂａｓｅｄベクター、ＢＰＶ ｂａｓｅｄベクター）等を用いることができるが、これらに限定されない。例えば、ＢＰＶ ｂａｓｅｄベクターの１種であるＢＣＭＧＳ Ｎｅｏベクターは、ＣＯＳ７細胞等に形質転換することによって外来遺伝子を効率良く発現する望ましいベクターである（烏山一「ウシパピローマウイルスベクター」、村松正実及び岡山博人編、実験医学別冊：遺伝子工学ハンドブック、１９９１、羊土社、２９７−２９９）。
【００７９】
前記ベクターは、抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドの他に、前記抗体又はその断片を発現する上で必要な制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリアデニル化部位、スプライシング部位）、又は、必要であれば選択マーカーを含むことができる。
【００８０】
形質転換の宿主としては、上記「１−４−１．抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体作製方法」に記載した宿主の他、ＳＰ２／０（マウスミエローマ）細胞（Ｅｕｒｏｐｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓａｒｃｈ Ｐｒｅｖｉｅｗ（１９９６） Ｖｏｌ．５、５１２−５１９；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓａｒｃｈ（１９９０）Ｖｏｌ．５０、１４９５−１５０２）が好適に用いられる。
【００８１】
本発明における、抗体又はその断片を発現するベクターを含有する宿主細胞は、常法にしたがって培養を行うことにより、その培養液上清又は宿主細胞内に抗体を産生させることができる。具体的には、ＣＨＯ細胞を宿主とした場合にはＧｉｂｃｏ社製ＤＭＥＭ培地に１×１０５細胞／ｍＬとなるように宿主細胞を接種し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにて培養することにより抗体を含む培養液上清を得ることが出来る。また、例えば宿主細胞を大腸菌とした場合には、ＬＢ培地等大腸菌の培養に用いられる一般的な培地に接種して培養し、タンパク質の発現を誘導することにより、培養液上清又は宿主細胞内に抗体を産生することができる。
【００８２】
なお、発現産物である抗体又はその断片が定常領域を含む場合には、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム、抗イムノグロブリン抗体アフィニティーカラム等を用いて培養液上清や、細胞破砕液から精製・回収することができる。一方、可変領域のみで構成され、定常領域を含まない状態で発現させた場合には、前記精製方法は適用できないので、他の適当な精製方法を応用する。例えば、そのＣ末端にヒスチジンタグ等の精製に有利なタグ配列を融合させた構造として発現させれば、対応するリガンドを利用したアフィニティークロマトグラフィーによって精製することが可能である。タグとの融合タンパク質ではない場合は、硫安沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーといったタンパク質精製の常法に従って精製することができる。
【００８３】
１−４−３．得られた抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体が認識するｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質上のエピトープの確認
得られた抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体が特異的に認識するｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質上の配列、すなわちエピトープ配列は、該タンパク質の遺伝子をもとにＰＣＲ反応等を用いて各種の欠失変異遺伝子を作製し、該変異型遺伝子から得られる変異型ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質とモノクローナル抗体の結合性を解析することにより決定できる。具体的には、次のような方法により行われる。まずｃｏｆｉｌｉｎ１遺伝子の５’末端側、又は３’末端側、若しくは５’末端と３’末端の両側の１０〜４００塩基が欠失した種々の長さの断片を調製し、これら断片を挿入した発現ベクターを作製する。このような欠失変異を伴う遺伝子断片の調製法は「続生化学実験講座、第１巻、遺伝子研究法ＩＩ、２８９−３０５頁、日本生化学会編」に記載されている。まず、それぞれの欠失変異体の発現ベクター及び完全長ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の発現ベクターを導入した宿主細胞から、前述の方法により各種欠失変異体タンパク質及び完全長ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパクを調製する。続いて、これらタンパク質を抗原としてＥＬＩＳＡ法により、抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体の各種欠失変異体及び完全長タンパク質への結合性の評価を行う。完全長に対して特定のアミノ酸配列の欠失を導入した変異体において、モノクローナル抗体の結合性が失われた場合、該モノクローナル抗体のエピトープ配列のうち、少なくとも一部の領域は欠失させたアミノ酸配列に含まれると判断できる。さらに、欠失変異体の異なる２種、好ましくは３種に対する該モノクローナル抗体の反応性を評価することにより、エピトープ配列をさらに絞り込むことができる。
【００８４】
また、得られた抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体が認識するｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質上のエピトープ配列は、次のような方法によって確認することもできる。
【００８５】
まず、還元アルキル化したｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質と、抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体を反応させて抗原抗体複合体を形成させた後、トリプシン等の適切なプロテアーゼを用いて分解処理を行う。分解処理を受けても、抗体はトリプシン消化されにくいため、ＰｒｏｔｅｉｎＧセファロース等を用いて抗原抗体複合体を回収することができる。この際、抗原はプロテアーゼ処理により、抗体と結合して保護された部分以外は消化されているため、回収された抗原抗体複合体を、ＬＣ−ＭＳにより分析することで、抗体と結合して保護された部分、すなわち抗体が認識するｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質上のエピトープを同定することが出来る。
【００８６】
さらに、抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体が認識するｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質上のエピトープ配列は、例えば、合成ペプチドを用いた競合法によっても確認することが出来る。まず、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を構成するアミノ酸配列のうち６〜２１アミノ酸ずつの合成ペプチドを固相合成法等により調製する。前述のＥＬＩＳＡ法を利用したｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質に対する結合性を確認する実験において、抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体を固相ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質と反応させる際にこの合成ペプチドを作用させ、抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体の結合が阻害されることが確認されれば、当該合成ペプチドのアミノ酸配列が抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体の認識するエピトープ配列であると判断できる。
【００８７】
２．ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の免疫学的測定方法
本発明の第２の実施形態は、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の免疫学的測定方法に関する。本発明の免疫学的測定方法は、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質のアミノ酸配列上の異なるエピトープをそれぞれ特異的に認識する２種以上の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片を使用して、試料中のｃｏｆｉｌｉｎ１及び／又はその断片を測定することを特徴とする。モノクローナル抗体又はその断片を用いることによって、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の定量性と検出感度に優れた測定が実現できる。
【００８８】
本発明の測定方法で使用する「試料」とは、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質及び／又はその断片を含み得る様々な試料をいう。例えば、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質をコードするＤＮＡ又はその断片を含む培養細胞、培養細胞破砕液、培養液上清、又は哺乳動物試料である。「哺乳動物試料」とは、哺乳動物から採取される組織（例えば、術後採取組織）や、血液、リンパ液、尿、髄液、唾液、精液等の体液等のあらゆる哺乳動物由来の生体試料であり、好ましくは血液又は尿である。本発明でいう血液は、血清、血漿又は間質液を包含する。また、哺乳動物の種類に特に制限はないが、好ましくは霊長類、より好ましくはヒトである。
【００８９】
エピトープが存在するペプチド領域の具体例としては、配列番号１及び２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域が挙げられる。配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域のうち、少なくとも配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むペプチド領域、及び配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域のうち、少なくとも配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むペプチド領域は、より好ましい。また、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域のうち、少なくとも配列番号５及び６で示されるアミノ酸配列を含むペプチド領域、及び配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域のうち少なくとも配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むペプチド領域は、さらに好ましい。配列番号５、６及び７で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域は、エピトープが存在するペプチド領域として一層好ましい。これは、前述のように、これらのペプチド領域には、高感度な抗体を作製する上で有効なエピトープが存在するからである。
【００９０】
本発明においてエピトープは、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質又はその断片上に存在するものであれば、特に制限はしない。例えば、異なるエピトープがｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質上で互いに離れた位置に存在していてもよいし、近接した位置に存在していてもよい。また、異なるエピトープのそれぞれが前記配列番号１〜７で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域のいずれかに存在する場合、異なるエピトープは、それぞれ異なるペプチド領域上に存在していてもよいし、又は複数のエピトープを包含し得る十分な長さのアミノ酸からなるペプチド領域であれば、単一のペプチド領域上に存在していてもよい。エピトープが異なるペプチド領域上に存在する場合、ペプチド領域の組合せは特に限定しない。例えば、エピトープがそれぞれ配列番号１及び２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域のそれぞれに存在していてもよいし、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域上の配列番号５及び６で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域のそれぞれに存在していてもよい。あるいは、配列番号５及び６、配列番号５及び７又は配列番号６及び７で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域のそれぞれに存在していてもよい。
【００９１】
本実施形態において使用する２種以上の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片には、前記第１実施形態に記載の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片を使用することができる。例えば、後述する表１に記載の抗体クローン群、好ましくは少なくとも１Ｅ２、２Ｃ４、２Ｄ１２、２Ｆ５、３Ｆ１１、３Ｇ２、４Ｆ１２、４Ｅ１２及び４Ｇ１０を含む抗体クローン群、より好ましくは少なくとも１Ｅ２、２Ｃ４、４Ｆ１２、４Ｅ１２を含む抗体クローン群から選択される２種以上の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片の組合せ、又は、少なくとも、４Ｆ１２と１Ｅ２、４Ｆ１２と４Ｅ１２、１Ｅ２と３Ｆ１１、１Ｅ２と４Ｅ１２、２Ｃ４と４Ｅ１２、３Ｇ２と４Ｅ１２、４Ｇ１０と４Ｅ１２、２Ｄ１２と１Ｅ２、２Ｄ１２と２Ｃ４、又は４Ｅ１２と２Ｆ５の組合せを含む。
【００９２】
本実施形態において使用される、より好ましい２種以上の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片は、（１）少なくとも、軽鎖において、ＣＤＲ１が配列番号８で示される配列を、ＣＤＲ２が配列番号９で示される配列を及びＣＤＲ３が配列番号１０で示される配列を含み、ならびに重鎖において、ＣＤＲ１が配列番号１１で示される配列を、ＣＤＲ２が配列番号１２で示される配列を及びＣＤＲ３が配列番号１３で示される配列を含む抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体又はその断片、（２）軽鎖において、ＣＤＲ１が配列番号１４で示される配列を、ＣＤＲ２が配列番号１５で示される配列を及びＣＤＲ３が配列番号１６で示される配列を含み、ならびに重鎖において、ＣＤＲ１が配列番号１７で示される配列を、ＣＤＲ２が配列番号１８で示される配列を及びＣＤＲ３が配列番号１９で示される配列を含む抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体又はその断片、（３）軽鎖において、ＣＤＲ１が配列番号２０で示される配列を、ＣＤＲ２が配列番号２１で示される配列を、及びＣＤＲ３が配列番号２２で示される配列を含み、ならびに重鎖において、ＣＤＲ１が配列番号２３で示される配列を、ＣＤＲ２が配列番号２４で示される配列を及びＣＤＲ３が配列番号２５で示される配列を含む抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体又はその断片、及び（４）軽鎖において、ＣＤＲ１が配列番号２６で示される配列を、ＣＤＲ２が配列番号２７で示される配列を及びＣＤＲ３が配列番号２８で示される配列を含み、ならびに重鎖において、ＣＤＲ１が配列番号２９で示される配列を、ＣＤＲ２が配列番号３０で示される配列を及びＣＤＲ３が配列番号３１で示される配列を含む抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体又はその断片をからなる群から選択される２種以上の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片の組合せを含む。
【００９３】
本実施形態において使用される、さらに好ましい２種以上の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片は、（１）少なくとも、軽鎖におけるＣＤＲ１が配列番号８で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号９で示される配列及びＣＤＲ３が配列番号１０で示される配列からなり、かつ重鎖におけるＣＤＲ１が配列番号１１で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号１２で示される配列及びＣＤＲ３が配列番号１３で示される配列からなる抗体又はその断片と、軽鎖におけるＣＤＲ１が配列番号２６で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号２７で示される配列及びＣＤＲ３が配列番号２８で示される配列からなり、かつ重鎖におけるＣＤＲ１が配列番号２９で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号３０で示される配列及びＣＤＲ３が配列番号３１で示される配列からなる抗体又はその断片の組合せ、（２）少なくとも、軽鎖におけるＣＤＲ１が配列番号８で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号９で示される配列及びＣＤＲ３が配列番号１０で示される配列からなり、かつ重鎖におけるＣＤＲ１が配列番号１１で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号１２で示される配列及びＣＤＲ３が配列番号１３で示される配列からなる抗体又はその断片と、軽鎖におけるＣＤＲ１が配列番号２０で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号２１で示される配列及びＣＤＲ３が配列番号２２で示される配列からなり、かつ重鎖におけるＣＤＲ１が配列番号２３で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号２４で示される配列及びＣＤＲ３が配列番号２５で示される配列からなる抗体又はその断片の組合せ、（３）少なくとも、軽鎖におけるＣＤＲ１が配列番号１４で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号１５で示される配列及びＣＤＲ３が配列番号１６で示される配列からなり、かつ重鎖におけるＣＤＲ１が配列番号１７で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号１８で示される配列及びＣＤＲ３が配列番号１９で示される配列からなる抗体又はその断片と、軽鎖におけるＣＤＲ１が配列番号２０で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号２１で示される配列、そしてＣＤＲ３が配列番号２２で示される配列からなり、かつ重鎖におけるＣＤＲ１が配列番号２３で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号２４で示される配列及びＣＤＲ３が配列番号２５で示される配列からなる抗体又はその断片の組合せ、及び（４）少なくとも、軽鎖におけるＣＤＲ１が配列番号２０で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号２１で示される配列及びＣＤＲ３が配列番号２２で示される配列からなり、かつ重鎖におけるＣＤＲ１が配列番号２３で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号２４で示される配列及びＣＤＲ３が配列番号２５で示される配列からなる抗体又はその断片と、軽鎖におけるＣＤＲ１が配列番号２６で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号２７で示される配列及びＣＤＲ３が配列番号２８で示される配列からなり、かつ重鎖におけるＣＤＲ１が配列番号２９で示される配列、ＣＤＲ２が配列番号３０で示される配列及びＣＤＲ３が配列番号３１で示される配列からなる抗体又はその断片の組合せが挙げられる。
【００９４】
ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を構成するアミノ酸配列の部分配列である配列番号１〜７で示されるアミノ酸配列は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、イヌ及びチンパンジーにおいて１００％相同性を示す、哺乳動物で高度に保存された領域であり、これら配列を認識する抗体を用いることにより、様々な哺乳動物種由来の試料に対応した、汎用的なｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質測定系の構築が可能となる。
【００９５】
本発明の免疫学的測定は、２種以上の抗体及び／又はその断片を用いる公知の免疫学的測定方法を使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法のような標識抗体を用いた免疫学的測定法、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）、又は水晶振動子マイクロバランス測定法（ＱＣＭ法）により実施することができる。また、本発明の免疫学的測定方法は、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応又は粒子凝集反応等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、目視的に測る測定法により実施することもできる。
【００９６】
ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法は、酵素免疫吸着分析法とも呼ばれ、試料中に含まれる微量の標的抗原を、酵素標識した抗体又は抗原を用いて、当該酵素の作用を利用して抗原抗体反応を発色濃度や蛍光強度として検出し、標的抗原を定量する方法である。すなわち、本発明の抗体若しくはその断片、又はｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質若しくはその断片を固相担体に固定して、当該抗体等及びｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質等との免疫学的反応を酵素的に検出する方法である。直接法、間接法、サンドイッチ法等の方法が知られているが、本発明においては、特にサンドイッチ法が好ましく適用される。サンドイッチ法は、固相担体に固定した第１抗体（固相化抗体）を、抗原と結合させた後、第１抗体とは異なるエピトープを認識する第２抗体（標識抗体／一次抗体）を加えて抗原と結合させ、第２抗体が標識抗体の場合にはその標識を、また第２抗体が一次抗体の場合には第３抗体（二次抗体）によって、検出する方法である。ＥＬＩＳＡ法の測定方法の詳細については、公知の方法（日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」、臨床病理刊行会、１９８３年、石川榮治ら編「酵素免疫測定法」、第３版、医学書院、１９８７年、北川常廣ら編「タンパク質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１酵素免疫測定法」、共立出版、１９８７年、入江實編「ラジオイムノアッセイ」、講談社サイエンティフィク、１９７４年、入江實編「続ラジオイムノアッセイ」、講談社サイエンティフィク、１９７９年）を参照されたい。
【００９７】
前記固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の形状の不溶性担体を用いることができる。本発明の抗体若しくはその断片又はｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質若しくはその断片の固相担体への固定は、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用する方法等、公知の方法に従って結合させることにより達成できる。
【００９８】
前記標識物質としては、ＥＬＩＳＡ法の場合には、例えば、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、アミラーゼ又はビオチン−アビジン複合体等を、蛍光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート、ジクロロトリアジンイソチオシアネート、Ａｌｅｘａ４８０又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８等を、そして放射免疫測定法の場合には、トリチウム（３Ｈ）、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）又はヨウ素１３１（１３１Ｉ）等を用いることができるが、この限りでない。また、発光免疫測定法は、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ２−ルシフェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。標識物質と抗体との結合法は、ＥＬＩＳＡ法の場合にはグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法又は過ヨウ素酸法等の公知の方法を、放射免疫測定法の場合にはクロラミンＴ法、ボルトンハンター法等の公知の方法を用いることができる。
【００９９】
以下で配列番号５及び６で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域に存在するエピトープをそれぞれ特異的に認識する抗ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質モノクローナル抗体を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により本発明の免疫学的測定方法を実施する場合を例に挙げて具体的に説明する。ただし、本発明の実施の態様は、この限りでない。
【０１００】
まず、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域に存在するエピトープを特異的に認識するモノクローナル抗体を、不溶性の担体に固相化する。固相化する抗体（固相化抗体）は、１種類であっても数種類であってもよい。次に、固相化抗体の表面に、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を含む試料を作用させ、固相化抗体とｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質からなる抗原抗体複合体を固相担体の表面に形成させる。その後、洗浄液を用いて十分に洗浄して、固相化抗体と未結合の物質を除去する。続いて、配列番号６で示されるアミノ酸配列で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域に存在するエピトープを特異的に認識するモノクローナル抗体を標識抗体として標識し、該標識抗体を前記固相化抗体とｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の複合体が結合した担体に作用させる。固相化抗体と標識抗体は、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の異なるエピトープを認識することから、固相担体上に固相化抗体／ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質／標識抗体からなる三重複合体が形成される。その後、洗浄液を用いて未結合の標識抗体を十分に洗浄した後、三重複合体における標識抗体の標識を利用して検出することで試料中に存在したｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を検出及び定量することができる。標識抗体は、１種類であっても数種類であってもよいが、２種類以上使用することが好ましく、３種類使用することがより好ましい。また、固相化抗体と標識抗体の由来する動物種が異なる場合には、標識抗体を標識しなくても、一次抗体として固相化抗体／ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質に作用させて、その一次抗体を認識する標識二次抗体を使用して、検出することもできる。なお、固相化に用いた抗体と標識に用いた抗体は、それぞれ逆に用いることも可能である。
【０１０１】
また、標識抗体とｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を含む試料を予め混合して抗原抗体複合体を形成させた後、固相化抗体に作用させることもできる。固相化する抗体をビオチン標識しておけば、ビオチン化固相化抗体、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を含む試料、ビオチン以外の標識を施した抗体を混合して抗原抗体複合体を形成させた後、アビジンを固相化した担体に作用させることで、ビオチン化以外の標識を利用して抗原抗体複合体を検出することができる。
【０１０２】
さらに、本発明の免疫学的測定方法は、免疫クロマト用テストストリップを用いることもできる。免疫クロマト用テストストリップとは、例えば、試料を吸収しやすい材料からなる試料受容部、本発明の診断薬を含有する試薬部、試料と診断薬との反応物が移動する展開部、展開してきた反応物を呈色する標識部、呈色された反応物が展開してくる提示部等から構成される。市販の妊娠診断薬等がこれと同様の形態を有する。本測定方法の原理は、以下の通りである。まず、試料受容部に試料を与えると、試料受容部は、試料を吸収して試料を試薬部にまで到達させる。続いて、試薬部において試料中のｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質と前述の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１部分配列モノクローナル抗体又はその断片が抗原抗体反応し、反応複合体が展開部を移動して標識部に到達する。標識部では、上記反応複合体と標識二次抗体との反応が生じ、その標識二次抗体との反応物が提示部にまで展開すると、呈色が認められることになる。上記免疫クロマト用テストストリップは、侵襲性がきわめて低く、使用者に対し苦痛や試薬使用による危険性を一切与えないものであるため、家庭におけるモニターに使用することができ、その結果を各医療機関レベルで精査・治療（外科的切除等）し、転移・再発予防に結びつけることが可能となる。また現在、このテストストリップは、例えば特開平１０−５４８３０号公報に記載されるような製造方法により安価に大量生産できるものである。
【０１０３】
免疫クロマト用テストストリップを用いた免疫学的測定方法を配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域に存在するエピトープを特異的に認識するモノクローナル抗体（第１抗体とする）と、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域に存在するエピトープを特異的に認識するモノクローナル抗体（第２抗体とする）を用いる場合を例に挙げて具体的に説明する。まず、試料受容部にｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を含む試料を接触させると、試料受容部は、該試料を吸収して該試料を試薬部にまで到達させる。続いて、試薬部において、試料中のｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質と第１抗体との間で抗原抗体反応が起こり、形成された抗原抗体複合体が展開部を移動して標識部に到達する。標識部においては、上記抗原抗体複合体と、標識した第２抗体との反応が起こって、その標識化第２抗体との反応物が提示部にまで展開すると呈色が認められることになる。
【０１０４】
また、本発明の測定方法は、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）を用いることもできる。表面プラズモン共鳴現象とは、金属薄膜に特定の入射角度（共鳴角）でレーザー光を照射すると反射光強度が著しく減衰する現象をいう。ＳＰＲ現象の原理を利用したＳＰＲセンサは、金属薄膜表面上の吸着物を高感度に測定することができる。したがって、該金属薄膜表面上に予め抗体及び／又は標的抗原を固定化しておき、その金属薄膜表面上に試料を通過させることにより、抗原抗体反応の結果生じた試料通過前後の金属表面上の吸着物の差を検出することができる。置換法、間接競合法等が知られるが、いずれを用いてもよい。本技術は、当該分野において周知である。例えば、永田和弘、及び半田宏、生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法、シュプリンガー・フェアラーク東京、東京、２０００を参照されたい。
【０１０５】
さらに、本発明の測定方法は、水晶振動子マイクロバランス測定法（ＱＣＭ法）を用いることもできる。この方法は、晶振動子に取り付けた電極表面に物質が吸着するとその質量に応じて水晶振動子の共振周波数が減少する現象を利用するものである。該方法を用いたＱＣＭセンサは、水共振周波数の変化量によって極微量な吸着物を定量的に捕らえる質量測定センサである。本技術は、当該分野において周知である。例えば、Ｊ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｌｏｖｅ、Ｌ．Ａ．Ｅｓｔｒｏｆｆ、Ｊ．Ｋ．Ｋｒｉｅｂｅｌ、Ｒ．Ｇ．Ｎｕｚｚｏ、Ｇ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ、２００５、Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ ｏｆ ａ Ｆｏｒｍ ｏｆ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ、１０５：１１０３−１１６９；森泉豊榮、中本高道、１９９７、センサ工学、昭晃堂、等を参照されたい。
【０１０６】
３．消化器癌罹患判定方法
本発明の第３の実施形態は、消化器癌罹患判定方法に関する。本実施形態の判定方法は、試料中のｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質及び／又はその断片を消化器癌罹患判定用マーカーとしてその量を測定し、健常体との量比に基づいて被検体における消化器癌の罹患の有無を判定することを特徴とする。本実施形態の方法は、測定ステップ（１）及び判定ステップ（２）を含む。以下、各ステップについて具体的に説明をする。
【０１０７】
（１）測定ステップ  「測定ステップ」とは、前記第２実施形態に記載の測定方法を用いて被検体及び健常体由来の試料中のｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の量を測定するステップである。
【０１０８】
「被検体」とは、本発明の判定方法に供される個体をいう。被検体の種類は、哺乳動物であれば特に限定しない。好ましくはヒトである（以下、本明細書では、ヒトが被検体の場合、「被験者」とする）。
【０１０９】
「健常体」とは、少なくとも消化器癌に罹患していない個体、好ましくは健康な個体をいう。健常体は、被検体と同一の生物種であることを要する。例えば、被検者の場合には、健常体もヒト（本明細書では、この場合、以降「健常者」とする）でなければばらない。健常体の身体的条件は、被検体と同一又は近似することが好ましい。身体的条件とは、例えば、ヒトの場合であれば、人種、性別、年齢、伸長、体重等が該当する。
【０１１０】
本実施形態における試料は、被検体及び健常体由来であることから、哺乳動物試料である。すなわち、哺乳動物から採取される組織（例えば、術後採取組織）や、血液、リンパ液、尿、髄液、唾液、精液等の体液等のあらゆる哺乳動物由来の生体試料が該当する。好ましくは血液、特に好ましくは血清又は血漿である。また、測定値の比較を前提とすることから、原則として、被検体と健常体由来の試料の種類は同一にしておく必要がある。例えば、被検体由来の試料が血清であった場合には、原則として健常体由来の試料も血清であることが望ましい。
【０１１１】
試料中のｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の測定方法は、第２実施形態の測定方法に準じて行えばよいので、ここではその詳細についての説明は省略する。
【０１１２】
（２）判定ステップ
「判定ステップ」とは、前記測定ステップで測定された被検体及び健常体由来の試料におけるｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質及び／又はその断片の量を比較して、被検体のｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質及び／又はその断片の量が健常者のそれよりも統計学的に有意に多い場合には被検体が消化器癌に罹患していると判定するステップである。  「消化器癌」とは、消化器系器官に発生する原発性悪性腫瘍をいう。例えば、食道癌、胃癌、十二指腸癌、小腸癌（空腸癌、回腸癌を含む）、大腸癌（盲腸癌、結腸癌、直腸癌を含む）、及び膵臓癌を含む。本実施形態の判定対象として特に好ましい消化器癌は、胃癌である。ただし、消化器癌に限定されず、乳癌、肝臓癌、肺癌等の他の上皮系腫瘍や、悪性黒色腫等の皮膚癌であってもよい。
【０１１３】
本ステップでは、前記測定ステップにより被検体と健常体由来のそれぞれの試料から得られたｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質及び／又はその断片の量を比較する。比較する量は、濃度のような相対量であってもよいし、又は絶対量であってもよい。絶対量の場合には、測定に供した試料の量を被検体と健常体で予め等量にしておくか、測定に供した試料の量比に基づいて等量となるように換算する必要がある。本ステップでは、被検体由来の試料中のｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質及び／又はその断片の量が健常体由来の試料中のｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質及び／又はその断片の量よりも統計学的に有意に多いか否かに基づいて、有意に多い被検体を消化器癌罹患群に、有意差のない被検体を消化器癌非罹患群に分類する。そして、消化器癌罹患群に分類された被検体は、消化器癌に罹患しているか、その可能性が極めて高いと判定され、また消化器癌非罹患群に分類された被検体は、消化器癌に罹患している可能性を完全排除できないが、その可能性は低いと判定される。
【０１１４】
ここで「統計学的に有意」とは、例えば、得られた値の危険率（有意水準）が５％、１％又は０．１％より小さい場合をいう。それ故、「統計学的に有意に多い」とは、被検体と健常体のそれぞれから得られたｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質及び／又はその断片の量的差異を統計学的に処理したときに両者間に有意差があり、かつ被検体の前記タンパク質量が健常体のそれと比較して多いことをいう。通常、血液試料中のｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の量に関して、被検体が健常体の２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは４倍以上、最も好ましくは５倍以上多い場合が該当する。量的差異が３倍以上であれば信頼度は高く、統計学的にも有意に多いといえる。統計学的処理の検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントｔ検定法、多重比較検定法を用いることができる。
【０１１５】
健常体の血液試料中におけるｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の量は、被検体の血液試料中におけるｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の量を測定する都度、測定することもできるが、予め測定しておいたｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の量を利用することもできる。特に、健常体の様々な身体的条件におけるｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質量を予め測定しておき、その値をコンピューターに入力してデータベース化しておけば、被検体の身体的条件を当該コンピューターに入力することで、その被験体との比較に最適な身体的条件を有する健常体のｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の量を即座に利用できるので便利である。
【０１１６】
本発明において対象となる消化器癌の病期は、特に限定はなく、早期消化器癌から末期消化器癌に及ぶ。特に、本発明の判定方法は、実施形態１の抗体及び／又はその断片の高感度性により、従来の方法では困難であった早期消化器癌であっても、その検出が可能である点において優れている。「早期消化器癌」とは、腫瘍が発生した局所（粘膜内）に限局していて、周囲組織への浸潤の無いもの、又は浸潤があってもその範囲が局所に限局しているものを言う。消化器癌の早期発見は、５年生存率を著しく向上させることから、早期にその罹患を判定できる本発明の実益は高い。
【０１１７】
このように、本発明の消化器癌の検出方法によれば、血液試料中の消化器癌検出用マーカーを、抗体を用いて免疫学的に測定することにより、被検体が消化器癌に罹患しているか否かを簡便かつ迅速に、また早期に判定することができる
本発明の判定方法によれば、被検体の血漿や血清等の試料を用いて、該被検体が消化器癌に罹患しているか否かを早期から判定することができる。
【０１１８】
４．本発明測定法を用いたｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質測定用キット
本発明の第４の実施形態は、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の測定用キットに関する。本実施形態のキットは、必須の構成物として、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を構成するアミノ酸配列上の異なるエピトープをそれぞれ特異的に認識する抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体及び／又はその断片を２種以上含むことを特徴とする。本キットに含まれる前記抗体及び／又はその断片には、例えば、前記実施形態１に記載の抗体及び／又はその断片が挙げられる。また、本キットに含まれる２種以上の抗体及び／又はその断片の組合せには、例えば、前記第２の実施形態に記載の抗体及び／又はその断片の組合せが挙げられる。この他、本キットは、必要に応じて、標識二次抗体、標識の検出に必要な基質、陽性対照や陰性対照、試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液及び／又は使用説明書等を加えることもできる。
【０１１９】
本発明によれば、血液等の適当な試料に含まれるｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を前記第１実施形態に記載の免疫学的測定方法により容易かつ簡便に測定することができる。また、その結果と前記第３実施形態の方法に基づき、試料提供者の消化器癌の罹患の有無を簡便かつ迅速に判定することも可能となる。
【実施例】
【０１２０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。【０１２１】
＜実施例１＞大腸菌による組換え型ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の調製
（ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１遺伝子の調製）
抗体の免疫原として用いる組換え型ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を調製するために、ヒト胎児腎細胞株であるＨＥＫ２９３細胞より、ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１ｍＲＮＡの調製を行った。ｍＲＮＡの調製は、Ｑｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ及びＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用し、詳細は付属のプロトコールに従った。【０１２２】
次に、逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、得られたトータルｍＲＮＡを鋳型にｃＤＮＡを合成し、ヒトｃＤＮＡライブラリーを作製した。逆転写反応は、前記酵素に付属のプロトコールに従った。【０１２３】
続いて、得られたヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型に、配列番号３２及び３５に示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。配列番号３２で示した塩基配列は、ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１遺伝子の５’末端領域の一部とその上流側にＢａｍＨＩ認識配列を含む。配列番号３５で示した塩基配列は、ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１遺伝子の３’末端領域の一部とその下流側にＥｃｏＲＩ認識配列を含む。ＰＣＲの反応液は、ＤＮＡポリメラーゼにＫＯＤ（東洋紡社製）を用いて、ｃＤＮＡライブラリー１０ｎｇと各プライマー１０ｐｍｏｌを含むようにして、ＫＯＤに添付のプロトコールに従い調製した。反応条件は、９４℃の温度で５分間加熱した後、９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で３０秒間保つサイクルを３５回繰り返した後、最後に６８℃で４分間保温する条件で行った。増幅したＤＮＡ断片は、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製した。この反応により全長約５００ｂｐのＰＣＲ産物を得た。【０１２４】
得られたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ切断及びＥｃｏＲＩ切断した後、ＢａｍＨＩ切断、ＥｃｏＲＩ切断及びＢＡＰ処理した開環ｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）内に組み込むためライゲーション反応を行った。ＤＮＡリガーゼにはＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を使用し、反応は付属のプロトコールに従った。続いて、ライゲーション反応後の溶液を用いて、コンピテント細胞の形質転換を行った。コンピテント細胞は、大腸菌株ＤＨ５α（タカラバイオ社製）を用い、詳細は付属のプロトコールに従った。形質転換処理後の菌は、抗生物質カナマイシンを１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢプレート上に塗布し、３７℃で一晩培養した。得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ液体培地で３７℃にて一晩培養し、ミニプレップによって目的とするｐＥＴ３０ａ＿ｃｏｆｉｌｉｎ１を得た。【０１２５】
続いて、得られたｐＥＴ３０ａ＿ｃｏｆｉｌｉｎ１遺伝子(１０nｇ)を鋳型として、配列番号３９及び４０に示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。配列番号３９で示した塩基配列は、ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１遺伝子の５’末端領域の一部とその上流側にＥｃｏＲＩ認識配列を含む。配列番号４０で示した塩基配列は、ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１遺伝子の３’末端領域の一部とその下流側にＢｇｌＩＩ認識配列を含む。ＰＣＲの反応液は、ＤＮＡポリメラーゼにＫＯＤ（東洋紡社製）を用いて、ｃＤＮＡライブラリー１０ｎｇと各プライマー１０ｐｍｏｌを含むようにして、ＫＯＤに添付のプロトコールに従い調製した。反応条件は、９４℃の温度で５分間加熱した後、９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で３０秒間保つサイクルを３５回繰り返した後、最後に６８℃で４分間保温する条件で行った。増幅したＤＮＡ断片は、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製した。この反応により全長約５００ｂｐのＰＣＲ産物を得た。【０１２６】
得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ切断及びＢｇｌＩＩ切断した後、ＥｃｏＲＩ切断、ＢａｍＨＩ切断及びＢＡＰ処理した開環ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）内に組み込むためライゲーション反応を行った。ＤＮＡリガーゼにはＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を使用し、反応は付属のプロトコールに従った。続いて、ライゲーション反応後の溶液を用いて、コンピテント細胞の形質転換を行った。コンピテント細胞は、大腸菌株ＤＨ５α（タカラバイオ社製）を用い、詳細は付属のプロトコールに従った。形質転換処理後の菌は、抗生物質カナマイシンを５０μｇ／ｍＬを含有するＬＢプレート上に塗布し、３７℃で一晩培養した。得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ液体培地で３７℃にて一晩培養し、ミニプレップによって目的とするｐＣＭＶ−Ｍｙｃ＿ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１を得た。【０１２７】
（組換え型ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の調製）
組換え型ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を調製するために、ｐＥＴ３０ａ＿ｃｏｆｉｌｉｎ１を用いて、大腸菌株Ｒｏｓｅｔｔａ−Ｇａｍｉ ２（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）の形質転換を行った。得られた形質転換体を、カナマイシン及びクロラムフェニコールを含むＬＢ培地１０ｍＬで３７℃にて一晩前培養を行った。次に、１Ｌの同培地に前培養を接種し、３７℃にて５時間培養し、終濃度０．２５ｍＭのＩＰＴＧを添加して３２℃にて１２時間培養を行い、目的の組換え型ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の発現を誘導させた後、遠心分離により菌体を回収した。【０１２８】
得られた菌体をＰＢＳにて洗浄した後、Ｂ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて不溶性画分を沈殿として調製した。詳細は付属のプロトコールに従った。次に不溶性画分を６Ｍのウレアにて可溶化した後、ＴＡＬＯＮ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ社製）を用いてヒスチジンタグ融合ヒトｃｏｆｉｌｉｎ1タンパク質を吸着させた。タンパク質の吸着したレジンを、１０ｍＭイミダゾールを含む６Ｍのウレアにて洗浄した後、１Ｍイミダゾールを含む６Ｍのウレア溶液を用いて溶出した。【０１２９】
次に得られた溶出画分から、タンパク質のリフォールディングを行った。まず、６Ｍのウレアを加えたＰＢＳ溶液に一晩透析した後、透析液中のウレアの終濃度が１ＭになるまでＰＢＳを透析液に段階的に添加して、希釈した。最後に新たに調製したＰＢＳ溶液に一晩透析し、得られたリフォールディング溶液についてアクリルアミドゲル電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルー染色により分子量約１６、０００Ｄａのヒスチジンタグ融合ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の精製を確認した。【０１３０】
＜実施例２＞ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体の作製と選抜
（抗ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１抗体産生マウスの作製）
実施例１で得られた５０μＬの１ｍｇ／ｍＬのヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質溶液を５０μＬのＳｉｇｍａ ａｄｊｕｖａｎｔ ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｇｍａ社製）と混合し、全量を６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与した。２週間後、及び４週間後に同様に調製したヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質溶液を同量投与した。続いて、マウス尾部静脈より血液を１００μＬ採取し、一晩清置した後、５０００×ｇで５分間遠心して上清を血清として回収した。【０１３１】
Ｆｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ ９６ｗｅｌｌ プレート（Ｎｕｎｃ社製）のウェルに１００μＬの０．１μｇ／ｍＬヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質溶液を入れ、一晩固相化した。ウェル中のタンパク溶液を廃棄後、４倍に希釈したブロッキング溶液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔ）を４００μＬ注ぎ、１時間室温で静置した。その後、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質固相化プレートとした。前記で得られた血清を１０００倍希釈し、ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質固相化プレートのウェルに１００μＬ入れ、室温で１時間静置した。その後、ウェル中の溶液を廃棄し、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ溶液（ＧＥヘルスケア社製）を１００μＬ入れ、さらに室温で１時間静置した。ウェル中の溶液を廃棄し、ＰＢＳ‐Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを入れて１５分間反応させた。反応によって生じる発色を４５０ｎｍの吸光度で確認し、発色した血液試料を採取したマウスにおいて、ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質に対する抗体が産生されていると判断した。【０１３２】
（抗ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体の作製）
ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質に対する抗体の産生が確認されたマウスについて、上記と同様に調製したヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質溶液を腹腔投与し、３日後に脾臓の摘出を行った。摘出した脾臓にシリンジで穴を開け、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）を注入して脾臓細胞を押し出し、脾臓細胞液を得た。得られた脾臓細胞液を１２００ｒｐｍで７分間遠心した後に上清を除去し、ＲＰＭＩ１６４０培地にて洗浄した。再びＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁して細胞数をカウントし、脾臓細胞数の１／１０量のＳＰ２／０ミエローマ細胞液を調製した。両細胞液を混合し、２２００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を廃棄した。細胞をタッピングしてほぐし、ＰＥＧ（ＲＯＣＨＥ社製）とＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ社製）を５：１で混合した溶液を１ｍＬ添加して攪拌した。以降の作業では、特に断りがない限り、溶液や培地は全て３７℃で保温したものを用いた。【０１３３】
ＰＥＧとＨＢＳＳを加えた細胞溶液に、ＲＰＭＩ１６４０培地９ｍＬを５分間かけて添加し、ゆっくり混合した後、２２００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去した。得られた沈殿細胞を、１５％ＦＣＳとＨＡＴ（ＲＯＣＨＥ社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、９６ウェル細胞培養プレート（グライナー社製）に１ウェルあたり２００μＬ注ぎ、３７℃、５％ＣＯ２下で１週間培養した。【０１３４】
ＨＡＴ添加条件下で生育したコロニーを脾臓細胞とミエローマ細胞が融合したハイブリドーマと判断し、コロニーの生育しているウェルの上清を５倍希釈して、前記ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質固相化プレートのウェルに１００μＬ添加し、前記と同様の方法で抗体産生の有無を確認した。抗体の産生が確認できたウェルを陽性とした。陽性ウェルのコロニーを１５％ＦＣＳとＨＴ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＲＰＭＩ培地に懸濁し、限界希釈法によって陽性クローンのクローニングを行った。クローニングの結果得られたハイブリドーマ３９種類について、ＳＦＭ培地に馴化し、抗体の産生を行った。１００％ＳＦＭ培地６０ｍＬにハイブリドーマを１×１０５細胞／ｍＬになるように接種し、細胞が死滅するまで１０日間培養を行った後、培養液を３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、細胞を除去した。得られた培養上清について、ＰｒｏＳｅｐ−ｖＡ Ｕｌｔｒａ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ミリポア社製）を用いて含まれている抗体を精製した。【０１３５】
＜実施例３＞ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質抗体のエピトープマッピング
（欠失変異体の作製）
取得した３９種類の精製抗体について、次のような手法でエピトープ配列を決定した。まず、実施例１に示す変異体Ａ〜変異体Ｅまでの５種のヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質欠失変異体及び完全長のヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質をＧＳＴ融合タンパク質として調製した（図１）。【０１３６】
ｐＥＴ３０ａ＿ｃｏｆｉｌｉｎ１遺伝子(１０nｇ)を鋳型として、変異体Ａについては配列番号３２及び３７に示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて、変異体Ｂについては配列番号３３及び３５に示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて、変異体Ｃについては配列番号３２及び３８に示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて、変異体Ｄについては配列番号３２及び３６に示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて、変異体Ｅについては配列番号３４及び３８に示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて、完全長のヒトｃｏｆｉｌｉｎ１については配列番号３２及び３５に示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて、それぞれＰＣＲにより遺伝子を取得した。配列番号３２、３３及び３４で示した塩基配列は、ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１遺伝子の５’末端領域の一部とその上流側にＢａｍＨＩ認識配列を含む。配列番号３５〜３８で示した塩基配列は、ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１遺伝子の３’末端領域の一部とその下流側にＥｃｏＲＩ認識配列を含む。【０１３７】
得られた前記６種のＰＣＲ産物を、それぞれＢａｍＨＩ切断及びＥｃｏＲＩ切断した後、ＢａｍＨＩ切断、ＥｃｏＲＩ切断及びＢＡＰ処理した開環ｐＧＥＸ６Ｐ−１（ＧＥヘルスケア）内に組み込むためライゲーション反応を行った。ＤＮＡリガーゼにはＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を使用し、反応は付属のプロトコールに従った。続いて、ライゲーション反応後の溶液を用いて、コンピテント細胞の形質転換を行った。コンピテント細胞は、大腸菌株ＤＨ５α（タカラバイオ社製）を用い、詳細は付属のプロトコールに従った。形質転換処理後の菌は、抗生物質アンピシリンを１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢプレート上に塗布し、３７℃で一晩培養した。得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢ液体培地で３７℃にて一晩培養し、ミニプレップによって目的とする完全長のヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質及び５種の欠失変異体の遺伝子を導入した発現ベクター６種を得た。【０１３８】
前記６種の発現ベクターをそれぞれ大腸菌株Ｒｏｓｅｔｔａ−Ｇａｍｉ２（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）へ形質転換を行い、下記に示す操作により、完全長のヒトｃｏｆｉｌｉｎ１及び５種の欠失変異体の組み換えＧＳＴ融合タンパク質を調製した。まず、形質転換体を、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含むＬＢ培地１０ｍＬで３７℃にて一晩前培養を行った。次に、１Ｌの同培地に前培養を接種し、３７℃にて５時間培養し、終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加して３７℃にて１２時間培養を行い、目的の組換え型ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の発現を誘導させた後、遠心分離により菌体を回収した。【０１３９】
得られた菌体をＰＢＳにて洗浄した後、Ｂ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて可溶性画分を取得した。詳細は付属のプロトコールに従った。次にグルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥヘルスケア）を用いて、可溶性画分の組み換えＧＳＴ融合タンパク質を吸着させた。タンパク質の吸着したレジンを、ＴＢＳ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）にて洗浄した後、１０ｍＭ還元型グルタチオンを含むＴＢＳで溶出した。得られたＧＳＴ融合タンパク質を１ｍｇ/ｍＬに調製し以下の実験に用いた。【０１４０】
（ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１欠失変異体へのモノクローナル抗体の反応性の評価）
完全長のヒトｃｏｆｉｌｉｎ１、５種の欠失変異体の組み換えＧＳＴ融合タンパク質について１μｇ／ｍＬ溶液を調製し、それぞれ１００μＬずつＦｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ ９６ｗｅｌｌ プレート（Ｎｕｎｃ社製）のウェルに入れ、３時間固相化した。それぞれについて、ウェル内のＧＳＴ融合タンパク質溶液を廃棄後、ブロッキング溶液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔ）を４００μＬ注ぎ、１時間、４℃で静置した。その後、溶液を廃棄し、ＰＢＳ‐Ｔで洗浄したものを抗原タンパク質固相化プレートとした。また、ＧＳＴ融合タンパク質の固相化を施さず、ブロッキング反応のみを行ったプレートを作製し、ブランクプレートとした。次に、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔで終濃度１μｇ／ｍＬになるように希釈した前記３９種の抗ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体それぞれを、ブランクプレート及びＧＳＴ融合タンパク質固相化プレートに入れ、１時間、室温で反応させた。ウェル内の溶液を廃棄してＰＢＳ‐Ｔで洗浄後、１００μＬのＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体溶液（ＧＥヘルスケア）を１時間室温で反応させた。続いて、ＰＢＳ−Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを入れて１分発色反応させた。反応の停止は、１００μＬの２Ｎ硫酸溶液の添加によって行った。発色は、４５０ｎｍの吸光度の測定により確認した。ブランクウェルに比べ吸光度が０．５以上高い場合「反応性あり」とみなし、固相化した組み換えＧＳＴ融合タンパク質と添加したモノクローナル抗体とが結合した、と判断した。それぞれのＧＳＴ融合タンパク質に対する３９種の抗ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体の結合性を表１に示す。表１では、「反応性あり」と判断された場合を「○」で、「反応性なし」と判断された場合を「×」で示している。【０１４１】
（エピトープ配列の同定）
３９種それぞれの抗ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体の完全長のヒトｃｏｆｉｌｉｎ１及び５種の欠失変異体に対する反応性の差異を指標にエピトープ配列を決定した。例えば、４Ｅ１２抗体は、完全長のヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質及び変異体Ｂにのみ反応し、その他の欠失変異体には反応しない。故に、４Ｅ１２抗体のエピトープ配列の少なくとも一部の配列は、完全長ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質及び変異体Ｂに存在し、その他の欠失変異体においては欠失した領域である配列番号４で示されるＣ３領域に含まれることが分かる（図１）。【０１４２】
同様の解析をその他クローンに対しても行い、３９種の抗ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体が認識するエピトープが、ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の部分配列からなるペプチド領域であるＮ１、Ｎ２、Ｍ、Ｃ１、Ｃ２又はＣ３のいずれかに存在するかを分類した（表１）。
【表１】
2012077643.tif 000002
【０１４３】
＜実施例４＞ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質測定用ＥＬＩＳＡの構築
（ＨＥＫ２９３細胞でのヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の発現）
ＨＥＫ２９３細胞（２×１０６細胞）を１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）中で細胞培養用ディッシュ（コーニング社製）を用いて一晩培養し、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付のプロトコールに従いｐＣＭＶ−Ｍｙｃ＿ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１又はｐＣＭＶ−Ｍｙｃを導入した。２日間培養の後、培地を取り除き、１０ｍＬのＰＢＳで洗浄の後、１％ＮＰ４０緩衝液（１％ＮＰ４０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０）１．０ｍＬを加え、３０分間、４℃に静置した。細胞を１％ＮＰ４０緩衝液に懸濁し、１ｍＬの遠心チューブに移して、１，５０００×ｇで遠心の後、上澄みを回収した。各サンプル５μＬをＬＤＳサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で変性処理を行い、ＮｕＰａｇｅ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて電気泳動にかけた後、タンパク質をＰＶＤＦ膜へ移した。これをウサギポリクローナル抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ社）、さらにパーオキシダーゼ標識２次抗体と反応させた。免疫反応するタンパク質をＷｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ−ＥＣＬ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いてＸ線フィルムに感光させ可視化した。その結果、ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ＿ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１導入細胞でのみ、ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質のバンドが検出された（図２）。【０１４４】
（抗体の組み合わせの選定）
高感度検出が可能なサンドイッチＥＬＩＳＡ用の２種の抗体の組み合わせを選定するために、取得した３９種の抗体とビオチン標識した同３９種抗体の組み合わせから得られるに１５２１通り（３９×３９通り）について、サンドイッチＥＬＩＳＡの検出感度の優劣を比較した。試料の陽性コントロールとしてｐＣＭＶ−Ｍｙｃ＿ｃｏｆｉｌｉｎ１導入細胞抽出液を、陰性コントロールとしてｐＣＭＶ−Ｍｙｃ導入細胞抽出液を用いてＥＬＩＳＡ測定を行い、陽性コントロールの測定値から陰性コントロールの測定値を差し引いた値を指標に、検出感度の優劣を判定した。【０１４５】
まず、３９種の精製抗体について３μｇ／ｍＬ溶液を調製し、それぞれ１００μＬずつＦｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ ９６ｗｅｌｌ プレート（Ｎｕｎｃ社製）のウェルに入れ、５時間固相化した。ウェル内の精製抗体溶液を廃棄後、ブロッキング溶液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔ）を４００μＬ注ぎ、一晩、4℃で静置した。その後、溶液を廃棄し、ＰＢＳ‐Ｔにて洗浄したものを精製抗体固相化プレートとした。次に、ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ＿ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１導入細胞、又はｐＣＭＶ−Ｍｙｃ導入細胞のタンパク質抽出液を、１％ＮＰ４０緩衝液で１０倍希釈した後、固相化抗体１種につき３９ｗｅｌｌずつ１００μＬ添加し、１時間、室温で反応させた。続いて、ウェル内の溶液を廃棄してＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、取得した３９種抗体のビオチン体を、１％ＢＳＡを含む１％ＮＰ４０緩衝液で０．５μｇ／ｍＬに希釈し、それぞれをｐＣＭＶ−Ｍｙｃ＿ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１導入細胞の抽出液を反応させたウェルとｐＣＭＶ−Ｍｙｃ導入細胞の抽出液を反応させたウェルに入れ、１時間、室温で反応させた。ウェル内の溶液を廃棄してＰＢＳ‐Ｔで洗浄後、１００μＬのａｖｉｄｉｎ‐ＨＲＰ溶液（Ｒ＆Ｄ社製）を１時間室温で反応させた。さらに、ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ溶液を廃棄し、ＰＢＳ−Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを入れて５分反応させた。反応の停止は、１００μＬの２Ｎ硫酸溶液の添加によって行った。発色は、４５０ｎｍの吸光度の測定により確認し、３９種の固相化抗体と３９種のビオチン標識抗体の全ての組み合わせについて、陽性コントロール及び陰性コントロールのヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質濃度を測定し、陽性コントロールから陰性コントロールを差し引いた値にもとに、感度が良い抗体の組み合わせを決定した。その結果、Ｃ１領域、Ｃ３領域、若しくはＮ２領域のいずれか１つの領域を特異的に認識する２種類の抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナルを用いることで、ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を特に高感度に検出できることが明らかになった（図３）。【０１４６】
＜実施例５＞抗ｃｏｆｉｌｉｎ１モノクローナル抗体のアミノ酸配列の解析
（ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖ｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列の決定）
選抜した５種類の抗体の組み合わせに必要な抗体４種について、軽鎖及び重鎖のｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列を決定した。まず、それぞれの抗体を産生するハイブリドーマを、１５％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２下で１×１０６細胞／ｍＬになるまで培養した。その後、培養液を１２００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、細胞を回収した。回収したハイブリドーマよりｍＲＮＡを調製した。調製は、Ｑｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ及びＲＮｅａｚｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製））を使用し、詳細は付属のプロトコールに従った。次に、逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））を用いて、得られたＴｏｔａｌ  ｍＲＮＡを鋳型にＯｌｉｇｏ ｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。【０１４７】
各ハイブリドーマごとに得られたｃＤＮＡライブラリーを鋳型に、Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いてＰＣＲを行い、増幅産物（（マウス免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡ））をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の提供するＺＥＲＯ ＢＬＵＮＴ ＴＯＰＯ ＰＣＲ  ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）を用いてライゲーションを行った。次に、ライゲーション反応液を用いて、コンピテント細胞の形質転換を行った。コンピテント細胞は、ＤＨ５α（タカラバイオ社製）を用い、詳細は付属のプロトコールにしたがって行った。形質転換処理後の菌は、５０μg／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩培養した。各増幅産物由来の形質転換体を４クローンずつ５０μg／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ液体培地に接種し、３７℃で一晩培養した。各培養液からミニプレップによってベクターＤＮＡ溶液を調製した結果、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡを組み込んだベクター溶液を各増幅産物につき４種類ずつ得た。【０１４８】
得られたベクター溶液について、Ｍ１３プライマーを用いて、モノクローナル抗体をコードする領域のＤＮＡ配列解析を行った。解析は、３１３０ｘlジェネティックアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。挿入領域に停止コドンのないクローンを目的のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ配列として判断し、前記４つの抗体（１Ｅ２，２Ｃ４、４Ｅ１２、４Ｆ１２）の軽鎖、重鎖のＤＮＡ配列を決定した。決定されたＤＮＡ配列について、大腸菌のコドン使用頻度にしたがってコードするアミノ酸配列を決定し、配列番号８〜３１に示す配列を得ることができた。【０１４９】
配列番号８〜３１に示されるアミノ酸配列は、１Ｅ２をコードするアミノ酸配列として得られた。より詳細には、配列番号８、９、１０は、それぞれ１Ｅ２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を、また配列番号１１、１２、１３に示されるアミノ酸配列は、それぞれ１Ｅ２の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を、コードする。【０１５０】
配列番号１４〜１９に示されるアミノ酸配列は、２Ｃ４をコードするアミノ酸配列として得られた。より詳細には、配列番号１４〜１６は、それぞれ２Ｃ４の軽鎖ＣＤＲ１〜３を、また配列番号１７〜１９に示されるアミノ酸配列は、それぞれ２Ｃ４の重鎖ＣＤＲ１〜３を、コードする。【０１５１】
配列番号２０〜２５に示されるアミノ酸配列は、４Ｅ１２をコードするアミノ酸配列として得られた。より詳細には、配列番号２０〜２２は、それぞれ４Ｅ１２の軽鎖ＣＤＲ１〜３を、また配列番号２３〜２５に示されるアミノ酸配列は、それぞれ４Ｅ１２の重鎖ＣＤＲ１〜３をコードする。【０１５２】
配列番号２６〜３１に示されるアミノ酸配列は、４Ｆ１２をコードするアミノ酸配列として得られた。より詳細には、配列番号２６〜２８は、それぞれ４Ｆ１２の軽鎖ＣＤＲ１〜３を、また配列番号２９〜３１に示されるアミノ酸配列は、それぞれ４Ｆ１２の重鎖ＣＤＲ１〜３をコードする。【０１５３】
＜実施例６＞モノクローナル抗体１Ｅ２とモノクローナル抗体４Ｅ１２を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の検出
実施例３により、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域に存在するエピトープを特異的に認識するモノクローナル抗体１Ｅ２と、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるペプチド領域に存在するエピトープを特異的に認識するモノクローナル抗体４Ｅ１２のビオチン標識体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法が、最もヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を高感度に検出できることが判明した。そこで、Ｈｉｓ−ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を１％ＢＳＡ及び１％ＮＰ４０を含むＴＢＳ緩衝液で１０００ｎｇ／ｍＬから１０ｐｇ／ｍＬまで段階的に希釈し、これを試料とした測定により本サンドイッチＥＬＩＳＡの検出感度を算出した。その結果、１Ｅ２と４Ｅ１２の組み合わせによるＥＬＩＳＡ法の最小検出限界値（平均値＋２ＳＤと被検体の平均値−２ＳＤが重ならない最小濃度）は、１０ｐｇ／ｍＬであった（図４矢印）。【０１５４】
＜実施例７＞血漿中のヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質測定による胃癌の検出
１Ｅ２と４Ｅ１２のビオチン標識体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、胃癌患者及び健常者の血漿中のヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質を検出した。胃癌患者５１名（ステージＩ：２４名、ステージＩＩ：６名、ステージＩＩＩ：１１名、ステージＩＶ：１０名）及び対照健常者２０名よりベネディクトＩＩ真空採血管（テルモ社製）を用いて採血を行い、血漿を得た。血漿はそれぞれ１％ＢＳＡと１％ＮＰ４０を含むＴＢＳ緩衝液で１０倍希釈した後、１００μＬを試料として用いた。【０１５５】
まず、抗ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１抗体１Ｅ２について３μｇ／ｍＬ溶液を調製し、それぞれ１００μＬずつＦｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ ９６ｗｅｌｌ プレート（Ｎｕｎｃ社製）のウェルに入れ、５時間固相化した。それぞれについて、ウェル内の精製抗体溶液を廃棄後、ブロッキング溶液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔ）を４００μＬ注ぎ、一晩、4℃で静置した。ブロッキング溶を取り除き、４００μＬのＰＢＳ−Ｔで一回洗浄した後、血漿試料１００μＬを添加し、１時間、室温で反応させた。ウェル内の溶液を廃棄し、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、１％ＮＰ４０を含むＴＢＳ緩衝液で０．５μｇ／ｍＬに希釈した４Ｅ１２のビオチン標識体を１００μＬずつウェルに入れ、１時間、室温で反応させた。続いて、ウェル内の溶液を廃棄してＰＢＳ‐Ｔで洗浄後、１００μＬのａｖｉｄｉｎ‐ＨＲＰ溶液（Ｒ＆Ｄ社製）を１時間室温で反応させた。さらに、ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ溶液を廃棄し、ＰＢＳ−Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを入れて５分反応させた。反応の停止は、１００μＬの２Ｎ硫酸溶液の添加によって行った。発色は、４５０ｎｍの吸光度の測定により確認した。その結果、早期及び進行性胃癌患者では、対照健常者と比べて統計学的に有意に高値のヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質が血漿中から検出された（図５）。【０１５６】
＜実施例８＞血清中のヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質測定による胃癌の検出
１Ｅ２と４Ｅ１２のビオチン標識体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、胃癌患者及び健常者の血清中のヒトｃｏｆｉｌｉｎ１を検出した。胃癌患者１５名（ステージＩ：７名、ステージＩＩ：１名、ステージＩＩＩ：４名、ステージＩＶ：３名）及び対照健常者５名よりベネディクトＩＩ真空採血管（テルモ社製）を用いて採血を行い、血清を得た。血清はそれぞれ１％ＢＳＡ及び１％ＮＰ４０を含むＴＢＳ緩衝液で１０倍希釈した後、１００μＬを試料として用いた。【０１５７】
まず、抗ヒトｃｏｆｉｌｉｎ１抗体１Ｅ２について３μｇ／ｍＬ溶液を調製し、それぞれ１００μＬずつＦｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ ９６ｗｅｌｌ プレート（Ｎｕｎｃ社製）のウェルに入れ、５時間固相化した。それぞれについて、ウェル内の精製抗体溶液を廃棄後、ブロッキング溶液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔ）を４００μＬ注ぎ、一晩、４℃で静置した。ブロッキング溶を取り除き、４００μＬのＰＢＳ−Ｔで一回洗浄した後、血清試料１００μＬを添加し、１時間、室温で反応させた。ウェル内の溶液を廃棄し、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、１％ＮＰ４０を含むＴＢＳ緩衝液で０．５μｇ／ｍＬに希釈した４Ｅ１２のビオチン標識体を１００μＬずつウェルに入れ、１時間、室温で反応させた。続いて、ウェル内の溶液を廃棄してＰＢＳ‐Ｔで洗浄後、１００μＬのａｖｉｄｉｎ‐ＨＲＰ溶液（Ｒ＆Ｄ社製）を１時間室温で反応させた。さらに、ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ溶液を廃棄し、ＰＢＳ−Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを入れて５分反応させた。反応の停止は、１００μＬの２Ｎ硫酸溶液の添加によって行った。発色は、４５０ｎｍの吸光度の測定により確認した。その結果、血清中からも、早期及び進行性胃癌患者においては、対照健常者と比べて統計学的に有意に高値のヒトｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質が検出された（図６）。
【産業上の利用可能性】
【０１５８】
本発明により、様々な哺乳類細胞由来の生体試料中に存在するｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質の高感度かつ定量的な検出が可能となる。また、本発明の方法によれば、患者血液を用いて早期消化器癌を高感度に検出できるため、非侵襲的な検査手法による早期癌患者のスクリーニング法としても有用である。さらには、ｃｏｆｉｌｉｎ１タンパク質が関与する細胞骨格制御機構の解明を目的とした基礎研究におけるアッセイ系としても有用である。【０１５９】
なお、本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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