(57)【要約】  本発明は、ジクロロフルオレセインを用いた、ＯＡＴＰ１Ｂ１の輸送活性を促進又は阻害する化合物をスクリーニングするための方法を提供する。本発明はまたジクロロフルオレセインの、ＯＡＴＰ１Ｂ１の発現量の測定における使用を提供する。本発明はさらに、ジクロロフルオレセインを用いた、被検細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ１の発現量を測定するための方法を提供する。本発明はさらに、ジクロロフルオレセインと、ＯＡＴＰ１Ｂ１を発現する陽性細胞とを含むキットの、被検細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ１の発現量の測定における使用を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジクロロフルオレセインを用いた、ＯＡＴＰ１Ｂ１の輸送活性を促進又は阻害する化合物をスクリーニングするための方法。
【請求項２】
ＯＡＴＰ１Ｂ１を発現する細胞を用意する工程と、
ジクロロフルオレセイン及び被検化合物を前記細胞と接触させる工程と、
細胞内に取り込まれたジクロロフルオレセインの蛍光強度を測定する工程と、
前記測定された蛍光強度が、被検化合物が存在しない場合の蛍光強度よりも高い場合、前記被検化合物をＯＡＴＰ１Ｂ１の輸送活性を促進する化合物と判定し、被検化合物が存在しない場合の蛍光強度よりも低い場合、前記被検化合物をＯＡＴＰ１Ｂ１の輸送活性を阻害する化合物と判定する工程と
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＯＡＴＰ１Ｂ１を発現する細胞が、ＯＡＴＰ１Ｂ１強制発現細胞、不死化ヒト肝細胞、ヒト初代培養肝細胞、ヒト遊離肝細胞、ヒト凍結肝細胞、及びサンドイッチ培養ヒト肝細胞からなる群より選択される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ＯＡＴＰ１Ｂ１を発現する細胞が、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を細胞膜に過剰発現している細胞である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
前記ＯＡＴＰ１Ｂ１を発現する細胞が、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡによって形質転換された細胞である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
ジクロロフルオレセインの、ＯＡＴＰ１Ｂ１の発現量の測定における使用。
【請求項７】
被検細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ１の発現量を測定するための方法であって、
ジクロロフルオレセインを前記被検細胞と接触させる工程と、
前記被検細胞内に取り込まれたジクロロフルオレセインの蛍光強度を測定する工程と、
前記測定された蛍光強度に基づいて、前記被検細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ１発現量を評価する工程と
を含む、方法。
【請求項８】
対照としてＯＡＴＰ１Ｂ１を発現する陽性細胞を用いて、被検細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ１発現量を相対的に評価する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記陽性細胞が、ＯＡＴＰ１Ｂ１強制発現細胞、不死化ヒト肝細胞、ヒト初代培養肝細胞、ヒト遊離肝細胞、ヒト凍結肝細胞、及びサンドイッチ培養ヒト肝細胞からなる群より選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記陽性細胞が、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を細胞膜に過剰発現している細胞である、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記陽性細胞が、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡによって形質転換された細胞である、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
ジクロロフルオレセインと、ＯＡＴＰ１Ｂ１を発現する陽性細胞とを含むキットの、被検細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ１の発現量の測定における使用。
【請求項１３】
前記陽性細胞が、ＯＡＴＰ１Ｂ１強制発現細胞、不死化ヒト肝細胞、ヒト初代培養肝細胞、ヒト遊離肝細胞、ヒト凍結肝細胞、及びサンドイッチ培養ヒト肝細胞からなる群より選択される、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
前記陽性細胞が、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を細胞膜に過剰発現している細胞である、請求項１２記載の使用。
【請求項１５】
前記陽性細胞が、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡによって形質転換された細胞である、請求項１２記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光化合物であるジクロロフルオレセインを用いた、ＯＡＴＰ１Ｂ１の輸送活性を促進又は阻害する化合物をスクリーニングする方法、及びＯＡＴＰ１Ｂ１発現量を測定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、創薬における肝細胞の役割がますます重要になってきた。肝細胞は、薬物の生体内でのクリアランスの予測や、薬物間相互作用の検討など、薬物の生体内動態の研究において不可欠な存在となっている。肝細胞に存在する、薬物動態（吸収・分布・代謝・排泄）を左右する様々な代謝酵素やトランスポーターの分子メカニズムが解明されつつある。そのうち特に、有機アニオン系薬物の薬物動態に対する、有機アニオントランスポーター（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｎｉｏｎ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ；ＯＡＴＰ）の役割が注目されている（非特許文献１）。【０００３】
ＯＡＴＰファミリーは、小腸や腎臓、肝臓など生体内の各所に発現しているが、このうち特に肝細胞に発現するものとして、ＯＡＴＰ１Ｂ１（別名：ＯＡＴＰ−Ｃ、ＯＡＴＰ２又はＬＳＴ−１）、ＯＡＴＰ１Ｂ３（別名：ＯＡＴＰ−８）及びＯＡＴＰ２Ｂ１（別名：ＯＡＴＰ−Ｂ）が知られている（非特許文献２及び３）。ＯＡＴＰ１Ｂ１によって肝細胞に取り込まれる基質薬物として、スタチン系薬物やアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬などが知られており、また、ＯＡＴＰ１Ｂ１の取り込み活性を阻害する阻害剤として、シクロスポリンやリファンピシンなどが知られている（非特許文献２）。【０００４】
ＯＡＴＰ１Ｂ１の基質薬物とＯＡＴＰ１Ｂ１阻害剤とを併用すると、基質薬物の肝臓への取り込みが少なくなり、血中濃度が上昇してしまうことが知られている。このため、ＯＡＴＰ１Ｂ１の取り込み活性に対する阻害作用の有無は、薬物間相互作用を評価する上で非常に重要である。従来、トランスポーターを介した薬物間相互作用を定量的に評価するために、放射線同位体によってラベルした既知の基質を用いた評価方法（ＲＩ法）が知られている（特許文献１）。【０００５】
ＲＩ法は高い感度が得られるが、取り扱いが煩雑で費用も高い。一方、放射線同位体を使わず、蛍光化合物を使用する検出法（蛍光法）もある。例えば、ＯＡＴ１（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｎｉｏｎ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  １）の良好な基質である６−カルボキシフルオレセイン（６−ＣＦＬ）を利用した評価方法が報告されている（非特許文献４）。【０００６】
蛍光法は操作が簡単で費用もＲＩ法より低く、スループット性に優れているといえる。しかしながら、一般的にある化合物があるトランスポーターの基質になり得るか否かは容易に予測し得ないため、アニオントランスポーターの基質と成り得る蛍光化合物はあまり知られていなかった。また、従来の蛍光基質の中には基質自体が発する蛍光強度が弱く、被検化合物の自家蛍光や蛍光基質の褪色によって検出感度が必ずしもよくないなどの問題点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−３４０６１０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍａｔｔｈｅｗ  Ｇ．Ｓｏａｒｓら、Ｃｈｅｍｉｃｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ、１６８、（２００７）ｐ２−１５
【非特許文献２】Ｋａｔｈｌｅｅｎ  Ｍ．  Ｇｉａｃｏｍｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｖｏｌ．９、ｐ２１５−２３６，２０１０
【非特許文献３】Ｂｏｎｎｉｅ  Ｈｓｉａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、Ｖｏｌ．２７４、ｐ３７１６１−３７１６８、１９９９
【非特許文献４】Ｔｏｍａｓ  Ｃｉｈｌａｒら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８３，ｐ４９−５５，２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明は従来のＲＩ法の問題点を鑑みて、安全で安価で操作が簡単であり、かつ、ＲＩ法と同程度な感度で検出できる、蛍光化合物を利用した、ＯＡＴＰ１Ｂ１の輸送活性を促進又は阻害する化合物のスクリーニング方法、及びＯＡＴＰ１Ｂ１発現量を測定するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するため、複数の蛍光化合物を用いて、ＯＡＴＰの基質としての適合性を検討した。その結果、ジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）は、ＯＡＴＰ１Ｂ１の優れた基質であることを判明し、また、驚くことにＤＣＦを用いてＯＡＴＰ１Ｂ１の輸送活性を評価する場合、従来のＲＩ法と同等な結果が得られることを見出し、本発明の完成に至った。【００１１】
すなわち、本発明は、ジクロロフルオレセインを用いた、ＯＡＴＰ１Ｂ１の輸送活性を促進又は阻害する化合物をスクリーニングするための方法を提供する。【００１２】
上記方法は好ましくは、ＯＡＴＰ１Ｂ１を発現する細胞を用意する工程と、ジクロロフルオレセイン及び被検化合物を細胞と接触させる工程と、細胞内に取り込まれたジクロロフルオレセインの蛍光強度を測定する工程と、測定された蛍光強度が、被検化合物が存在しない場合の蛍光強度よりも高い場合、被検化合物をＯＡＴＰ１Ｂ１の輸送活性を促進する化合物と判定し、被検化合物が存在しない場合の蛍光強度よりも低い場合、被検化合物をＯＡＴＰ１Ｂ１の輸送活性を阻害する化合物と判定する工程とを含む。【００１３】
本発明のスクリーニング方法におけるＯＡＴＰ１Ｂ１を発現する細胞は、ＯＡＴＰ１Ｂ１強制発現細胞、不死化ヒト肝細胞、ヒト初代培養肝細胞、ヒト遊離肝細胞、ヒト凍結肝細胞、及びサンドイッチ培養ヒト肝細胞からなる群より選択されることが好ましく、また、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を細胞膜に過剰発現している細胞であるか、或いは、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡによって形質転換された細胞であることが好ましい。【００１４】
本発明はまた、ジクロロフルオレセインの、ＯＡＴＰ１Ｂ１の発現量の測定における使用を提供する。【００１５】
本発明はまた、被検細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ１の発現量を測定するための方法を提供し、該方法はジクロロフルオレセインを被検細胞と接触させる工程と、被検細胞内に取り込まれたジクロロフルオレセインの蛍光強度を測定する工程と、測定された蛍光強度に基づいて、被検細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ１発現量を評価する工程とを含む。【００１６】
本発明の測定方法において、対照としてＯＡＴＰ１Ｂ１を発現する陽性細胞を用いて、被検細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ１発現量を相対的に評価することが好ましい。上記ＯＡＴＰ１Ｂ１を発現する陽性細胞が、ＯＡＴＰ１Ｂ１強制発現細胞、不死化ヒト肝細胞、ヒト初代培養肝細胞、ヒト遊離肝細胞、ヒト凍結肝細胞、及びサンドイッチ培養ヒト肝細胞からなる群より選択されることが好ましく、また、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を細胞膜に過剰発現している細胞であるか、或いは、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡによって形質転換された細胞であることが好ましい。【００１７】
本発明はさらに、ジクロロフルオレセインと、ＯＡＴＰ１Ｂ１を発現する陽性細胞とを含むキットの、被検細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ１の発現量の測定における使用を提供する。該キットにおけるＯＡＴＰ１Ｂ１を発現する陽性細胞が、ＯＡＴＰ１Ｂ１強制発現細胞、不死化ヒト肝細胞、ヒト初代培養肝細胞、ヒト遊離肝細胞、ヒト凍結肝細胞、及びサンドイッチ培養ヒト肝細胞からなる群より選択されることが好ましく、また、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を細胞膜に過剰発現している細胞であるか、或いは、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡによって形質転換された細胞であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
ＯＡＴＰ１Ｂ１の優れた基質と証明されたジクロロフルオレセインを用いることで、安全で安価で操作が簡単であり、かつ、ＲＩ法と同程度な感度で、ＯＡＴＰ１Ｂ１の輸送活性を促進又は阻害する化合物を検出することができる。本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物は、ＯＡＴＰ１Ｂ１の基質である薬物の血中濃度などの体内動態をコントロールすることができると期待されている。また、本発明のスクリーニング方法によって薬物の相互作用を予測することもできる。【００１９】
本発明はまた、安全で安価で操作が簡単であり、かつ、ＲＩ法と同程度な感度で、ＯＡＴＰ１Ｂ１の発現量を測定するための方法を提供することができる。ＯＡＴＰ１Ｂ１の発現量の測定は、例えば、肝細胞などのＯＡＴＰ１Ｂ１を発現する細胞の活性の評価や、異なるロットの肝細胞の活性の比較において有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】各種フルオレセイン誘導体の基質性を示す図である。
【図２】ＯＡＴＰ１Ｂ１によるジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）の経時的取り込みを示す図である。
【図３】ＯＡＴＰ１Ｂ１によるＤＣＦの取り込みの速度論的解析を示す図である。
【図４】既知のＯＡＴＰ阻害剤によるＤＣＦの取り込みへの影響を示す図である。
【図５】ＤＣＦ法と従来のＲＩ法とのＫｉ値の比較を示す図である。
【図６】ヒト肝細胞による時間・温度依存的なＤＣＦの取り込みを示す図である。
【図７】ヒト肝細胞によるＤＣＦの取り込みの速度論的解析を示す図である。
【図８】ヒト肝細胞へのＤＣＦの取り込みに対するＯＡＴＰ阻害剤の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明におけるＯＡＴＰ１Ｂ１は、主にヒト肝細胞の細胞膜に発現し、アニオン化合物を細胞内に取り込む活性（輸送活性）を有する有機アニオントランスポータータンパク質（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｎｉｏｎ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ；ＯＡＴＰ）の１種であり、ＯＡＴＰ−Ｃ、ＯＡＴＰ２又はＬＳＴ−１とも呼ばれている。ＯＡＴＰ１Ｂ１タンパク質として、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるものが挙げられるが、上記アミノ酸配列において、１又は２以上で９以下のアミノ酸残基の置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を含み、ＯＡＴＰ１Ｂ１の機能を有するタンパク質をも本発明に含まれる。ＯＡＴＰ１Ｂ１タンパク質をコードするＤＮＡとして、配列番号２に記載の核酸配列からなるものが挙げられるが、上記核酸配列において、１又は２以上で５０以下の塩基の置換、欠失、又は付加された核酸配列を含み、ＯＡＴＰ１Ｂ１の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡをも本発明に含まれる。
【００２２】
本発明におけるジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）は、蛍光化合物フルオレセインの誘導体であり、市販で入手することができる。ＤＣＦが有機アニオントランスポーターの基質となり得ることはこれまで知られていない。
【００２３】
本発明のスクリーニング方法は、ジクロロフルオレセインを用いた、ＯＡＴＰ１Ｂ１の輸送活性を促進又は阻害する化合物をスクリーニングするための方法であって、好ましくは以下の工程を含むものである。
【００２４】
本発明のスクリーニング方法の第１の工程は、ＯＡＴＰ１Ｂ１を発現する細胞を用意する工程である。ＯＡＴＰ１Ｂ１を発現する細胞とは、細胞膜にＯＡＴＰ１Ｂ１を機能的に発現している細胞をいう。機能的に発現していることとは、ＯＡＴＰ１Ｂ１がアニオン化合物の輸送活性を有する態様で細胞膜に発現されていることを意味する。ＯＡＴＰ１Ｂ１を発現する細胞として、特に限定されないが、例えば不死化された細胞株でＯＡＴＰ１Ｂ１を発現しているものや、人為的に改変された細胞株でＯＡＴＰ１Ｂ１を発現しているもの、ウイルスなどによって不死化された細胞株でＯＡＴＰ１Ｂ１を発現しているものなどが挙げられる。また、ヒト由来の細胞株でＯＡＴＰ１Ｂ１を発現しているものや、ＯＡＴＰ１Ｂ１を高発現するように遺伝子導入された細胞株も好ましく用いられる。
【００２５】
本発明のスクリーニング方法に使用されるＯＡＴＰ１Ｂ１を発現する細胞として、特に、ＯＡＴＰ１Ｂ１強制発現細胞、不死化ヒト肝細胞、ヒト初代培養肝細胞、ヒト遊離肝細胞、ヒト凍結肝細胞、及びサンドイッチ培養ヒト肝細胞などのＯＡＴＰ１Ｂ１を発現する初代及び株化・非株化細胞が好ましい。ここで、ＯＡＴＰ１Ｂ１強制発現細胞とは、遺伝子工学手法によって、ＯＡＴＰ１Ｂ１タンパク質又はペプチドをコードする遺伝子又はヌクレオチドが導入され、ＯＡＴＰ１Ｂ１タンパク質又はペプチドを機能的に発現する細胞をいう。このような強制発現細胞は、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を細胞膜に過剰発現している細胞、或いは、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡによって形質転換された細胞であることが好ましい。ＯＡＴＰ１Ｂ１の過剰発現は、一過性発現又は安定発現のいずれでもよく、再現性を考慮し、安定発現する細胞のほうが好ましく用いられる。形質転換された細胞も同様に一過性に又は安定に形質転換された細胞のいずれでもよく、再現性を考慮し、安定に形質転換された細胞のほうが好ましく用いられる。
【００２６】
強制発現の宿主細胞は特に限定されないが、ＨＥＫ−２９３細胞などの哺乳類細胞やアフリカツメガエル卵母細胞が取り扱いの簡便さから好適に用いられる。遺伝子導入の手法は、一般的に知られている。例えば、ヒト肝臓ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号２の塩基配列の全長をクローニングできるように適宜なプライマーを用いて、ＰＣＲなどによって目的ＤＮＡを増幅し、これを適宜な発現プロモータを有するベクターに挿入し、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、又はマイクロインジェクション法などの方法によって細胞に導入する。形質転換された細胞は適宜な選択培地によって選択することができる。
【００２７】
本発明のスクリーニング方法の第２の工程は、ジクロロフルオレセイン及び被検化合物を細胞と接触させる工程である。ジクロロフルオレセイン及び被検化合物を細胞と接触させることとは、細胞の培養液又は緩衝液に両者を同時に又は前後に添加し細胞と接触させることをいう。ジクロロフルオレセインの添加濃度は、０．１μＭ以上あれば十分な検出感度が得られるが、例えば０．１μＭ〜１０００μＭの範囲内において適宜に調節すればよい。一方、被検化合物の添加量はその化合物によって異なるが、一般的に１ｎＭ〜１ｍＭの範囲内において適宜に調節すればよい。細胞との接触時間は、１分〜３０分であればよく、ジクロロフルオレセインの取り込みが直線的に増加する時間範囲であることが好ましい。
【００２８】
ジクロロフルオレセイン及び被検化合物を細胞と接触させた後に、細胞内に取り込まれていない蛍光化合物を取り除くために、細胞を洗浄することが好ましい。洗浄は、一般的に、１℃〜１０℃の温度で、ＰＢＳやＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ（ＫＨ）などの緩衝液によって、１回〜３回洗浄すればよい。
【００２９】
本発明のスクリーニング方法の第３の工程は、細胞内に取り込まれたジクロロフルオレセインの蛍光強度を測定する工程である。細胞内に取り込まれたジクロロフルオレセインは、細胞を可溶化することによって溶液中に回収することができる。細胞の可溶化は例えばＮａＯＨ水溶液を用いて処理することが挙げられる。回収したジクロロフルオレセインを含む溶液を、蛍光光度計を用いて、励起波長４５０ｎｍ〜５５０ｎｍ、蛍光波長５００ｎｍ〜６００ｎｍにて蛍光強度を測定する。測定した蛍光強度を蛍光化合物の量（モル数など）に換算するために、予め検量線を作成することが好ましい。また、取り込まれた蛍光化合物を基準化するために、細胞当たり又は単位タンパク質当たりの蛍光化合物の量に換算することが好ましい。
【００３０】
本発明のスクリーニング方法の第４の工程は、測定された蛍光強度が、被検化合物が存在しない場合の蛍光強度よりも高い場合、被検化合物をＯＡＴＰ１Ｂ１の輸送活性を促進する化合物と判定し、被検化合物が存在しない場合の蛍光強度よりも低い場合、被検化合物をＯＡＴＰ１Ｂ１の輸送活性を阻害する化合物と判定する工程である。測定された蛍光強度が、被検化合物が存在しない場合の蛍光強度よりも高い場合、被検化合物の存在によってジクロロフルオレセインがより多く細胞内に取り込まれたことを意味するため、被検化合物がＯＡＴＰ１Ｂ１の輸送活性を促進すると考えられる。一方、測定された蛍光強度が、被検化合物が存在しない場合の蛍光強度よりも低い場合、被検化合物の存在によってジクロロフルオレセインがより少なく細胞内に取り込まれたことを意味するため、被検化合物がＯＡＴＰ１Ｂ１の輸送活性を阻害すると考えられる。
【００３１】
ＯＡＴＰ１Ｂ１の輸送活性を促進する化合物は、ＯＡＴＰ１Ｂ１機能低下を伴う遺伝子多型の正常化に利用される。また、ＯＡＴＰ１Ｂ１によって輸送される生体内異物の排泄を促進することができる。一方、ＯＡＴＰ１Ｂ１の輸送活性を阻害する化合物は、ＯＡＴＰ１Ｂ１の選択的基質と薬物間相互作用を引き起こすため、ＯＡＴＰ１Ｂ１輸送活性を阻害しない化合物を選択することで、薬物間相互作用の危険性の少ない医薬品の創出につながる。
【００３２】
本発明はまた、ジクロロフルオレセインのＯＡＴＰ１Ｂ１の発現量の測定における使用を提供する。該ジクロロフルオレセインは、ＯＡＴＰ１Ｂ１の発現量の測定に使用される旨、たとえばＯＡＴＰ１Ｂ１の発現量の測定方法などが記載された取扱説明書などと一緒に包装されることが好ましい。
【００３３】
本発明の被検細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ１の発現量を測定するための方法は、ジクロロフルオレセインを被検細胞と接触させる工程と、被検細胞内に取り込まれたジクロロフルオレセインの蛍光強度を測定する工程と、測定された蛍光強度に基づいて、被検細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ１発現量を評価する工程とを含む。これらの工程は上述の各工程に準ずる。測定された蛍光強度は、まず検量線に基づいて蛍光化合物の量に換算され、その後、細胞当たり又は単位タンパク質当たりの化合物量に基準化されることが好ましい。こうして得られる基準化したデータは他の細胞と比較することができるため、ＯＡＴＰ１Ｂ１発現量が相対的に多いもしくは少ない細胞の選択に利用され得る。
【００３４】
本発明の測定方法において、対照としてＯＡＴＰ１Ｂ１を発現する陽性細胞を用いて、被検細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ１発現量を相対的に評価することが好ましい。ＯＡＴＰ１Ｂ１を発現する陽性細胞が、ＯＡＴＰ１Ｂ１強制発現細胞、不死化ヒト肝細胞、ヒト初代培養肝細胞、ヒト遊離肝細胞、ヒト凍結肝細胞、及びサンドイッチ培養ヒト肝細胞からなる群より選択されることが好ましく、また、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を細胞膜に過剰発現している細胞であるか、或いは、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡによって形質転換された細胞であることが好ましい。
【００３５】
本発明はまた、ジクロロフルオレセインと、ＯＡＴＰ１Ｂ１を発現する陽性細胞とを含むキットの、被検細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ１の発現量の測定における使用を提供する。該キットにおけるＯＡＴＰ１Ｂ１を発現する陽性細胞が、ＯＡＴＰ１Ｂ１強制発現細胞、不死化ヒト肝細胞、ヒト初代培養肝細胞、ヒト遊離肝細胞、ヒト凍結肝細胞、及びサンドイッチ培養ヒト肝細胞からなる群より選択されることが好ましく、また、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を細胞膜に過剰発現している細胞であるか、或いは、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡによって形質転換された細胞であることが好ましい。
【００３６】
上記キットは、他に細胞を培養する培地、細胞に添加するあるいは細胞を洗浄する緩衝液、タンパク質の量を測定するための試薬などを含んでもよい。
【実施例】
【００３７】
（実施例１  各種フルオレセイン誘導体の基質性の検討）
下記のフルオレセイン誘導体である各種蛍光色素について、ＯＡＴＰの基質としての適合性を検討した。【００３８】
【化１】
2012121261.tif 000003
【表１】
2012121261.tif 000004
【００３９】
ヒト肝臓ｔｏｔａｌＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を鋳型に、以下のプライマーを使用し、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＯＡＴＰ１Ｂ１、ＯＡＴＰ１Ｂ３、及びＯＡＴＰ２Ｂ１のｃＤＮＡ（それぞれ配列番号２、３及び４に示す）をクローニングした。
ＯＡＴＰ１Ｂ１用プライマー
センスプライマー：ＣＧＴＣＣＧＡＣＴＴＧＴＴＧＣＡＧＴＴＧ（配列番号５）
アンチセンスプライマー：ＡＡＣＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＣ（配列番号６）
ＯＡＴＰ１Ｂ３用プライマー
センスプライマー：ＴＡＡＣＡＴＣＡＧＡＡＡＡＡＧＧＡＴＧＧＡＣＴＴＧ（配列番号７）
アンチセンスプライマー：ＴＧＣＡＡＴＧＴＴＡＧＴＴＧＧＣＡＧＣＡ（配列番号８）
ＯＡＴＰ２Ｂ１用プライマー
センスプライマー：ＣＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＴＧＣＴＴＣＣＴＣ（配列番号９）
アンチセンスプライマー：ＡＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＴＡＣＴＣＴ（配列番号１０）【００４０】
得られた各遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に組み込んだ発現ベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、リポフェクション法によりＨＥＫ−２９３細胞に導入した。Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ含有選択培地にて培養し、ＯＡＴＰ１Ｂ１、ＯＡＴＰ１Ｂ３及びＯＡＴＰ２Ｂ１をそれぞれ強制発現するＨＥＫ−２９３細胞を作製した。【００４１】
上記細胞を４×１０５細胞／ウェルになるようにポリ−Ｄ−リジンコートディッシュに蒔いた。培地をＫＨバッファーに置換し、ＤＭＳＯに溶解した各種蛍光色素をＫＨバッファー中の最終濃度が１μＭとなるようにそれぞれのＨＥＫ−２９３細胞に添加し、３７℃にて５分間培養した。その後、氷冷したＫＨバッファーを用いて細胞を３回洗浄した後、０．１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液によって細胞を可溶化し、細胞内に取り込まれた蛍光色素の蛍光強度を測定した（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１５ｎｍ）。【００４２】
取り込まれた蛍光化合物の定量のために、予め単位蛍光化合物当たりの蛍光強度を示す検量線を作成した。この検量線に基づき、測定された蛍光強度を各ウェル当たりの蛍光化合物（ｐｍｏｌ／ウェル又はμＬ／ウェル）に変換し、これを、可溶化された細胞の総タンパク質量（ｍｇタンパク質／ウェル）で除する（基準化する）ことにより、単位タンパク質当たりの蛍光化合物量に変換した（ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質又はμＬ／ｍｇタンパク質）。【００４３】
結果は図１（ａ）に示した。図１（ａ）から明らかのように、他の色素とトランスポーターとの組み合わせに比べて、ジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）とＯＡＴＰ１Ｂ１との組み合わせが著しく高い取り込み量を示した。ＤＣＦはＯＡＴＰ１Ｂ１の優れた基質であることを示唆している。参考のため、上記と同様な方法で、各種フルオレセイン誘導体のＯＡＴ１及びＯＡＴ３に対する基質性も検討した。その結果は図１（ｂ）に示した。図１（ｂ）から、非特許文献４記載のとおり、６−ＣＦＬはＯＡＴ１の良好な基質であることが証明されたが、ＤＣＦはＯＡＴ１及びＯＡＴ３のいずれの良好な基質でもないことも明らかになった。この結果からも、ＤＣＦとＯＡＴＰ１Ｂ１との組み合わせは特異的なものであることが証明された。【００４４】
（実施例２  ＯＡＴＰ１Ｂ１によるＤＣＦの経時的取り込み）
実施例１と同じように、ＯＡＴＰ１Ｂ１を強制発現するＨＥＫ−２９３細胞を用意し、４×１０５細胞／ウェルになるようにポリ−Ｄ−リジンコートディッシュに蒔いた。培地をＫＨバッファーに置換し、ＤＭＳＯに溶解したＤＣＦをＫＨバッファー中の最終濃度がそれぞれ０．１μＭ、１μＭ、及び１０μＭとなるように細胞に添加し、３７℃にて０分〜３０分間培養した。１分間、５分間、１０分間及び３０分間の時点においてそれぞれサンプリングし、氷冷したＫＨバッファーを用いて細胞を３回洗浄した後、０．１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液によって細胞を可溶化し、実施例１と同様に細胞内に取り込まれた蛍光色素の蛍光強度を測定した（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１５ｎｍ）。【００４５】
結果は図２に示した。図２からＯＡＴＰ１Ｂ１を強制発現するＨＥＫ−２９３細胞によるＤＣＦの細胞内への取り込み量は、経時的に増大し、かつ、添加された蛍光色素の濃度に依存していることが判った。【００４６】
（実施例３  ＯＡＴＰ１Ｂ１によるＤＣＦの取り込みの速度論的解析）
実施例１と同じように、ＯＡＴＰ１Ｂ１を強制発現するＨＥＫ−２９３細胞を用意し、４×１０５細胞／ウェルになるようにポリ−Ｄ−リジンコートディッシュに蒔いた。培地をＫＨバッファーに置換し、ＤＭＳＯに溶解したＤＣＦをＫＨバッファー中の最終濃度がそれぞれ０．１μＭ〜１００μＭとなるように細胞に添加し、３７℃にて５分間培養した。０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、及び１００μＭの取り込み量をプロットし、取り込み速度をミカエリス・メンテンプロットによって分析した。【００４７】
結果は図３に示した。Ｋｍ及びＶｍａｘは下記のミカエリス・メンテン式（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）によって計算した。その結果、Ｖｍａｘ＝１３１．６（ｐｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質）、Ｋｍ＝７．２２（μＭ）である。なお、いずれの結果も４回の測定の平均値である。ＤＣＦはＯＡＴＰ１Ｂ１の良好な基質であることが判った。
ｖ  ＝  Ｖｍａｘ・Ｓ／（Ｋｍ＋Ｓ）【００４８】
（実施例４  既知のＯＡＴＰ阻害剤によるＤＣＦの取り込みへの影響）
実施例１と同じように、ＯＡＴＰ１Ｂ１を強制発現するＨＥＫ−２９３細胞を用意し、４×１０５細胞／ウェルになるようにポリ−Ｄ−リジンコートディッシュに蒔いた。ＤＣＦ（０．１％ＤＭＳＯ中；最終濃度：３μＭ）及び所定の濃度の既知のＯＡＴＰ１Ｂ１阻害剤を細胞に添加し、３７℃にて５分間培養した。既知のＯＡＴＰ１Ｂ１の阻害剤としては、リファンピシン（Ｒｉｆ；１０μＭ）、ブロモスルフォフタレイン（ＢＳＰ；１０μＭ）、シクロスポリンＡ（Ｃｙｓ  Ａ；１０μＭ）、Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ−１７β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ（ＥＧ；１０μＭ及び３０μＭ）、及びエストロン−３−硫酸（ＥＳ；１０μＭ及び３０μＭ）を使用した。培養後、氷冷したＫＨバッファーを用いて細胞を３回洗浄した後、０．１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液によって細胞を可溶化し、実施例１と同様に細胞内に取り込まれた蛍光色素の蛍光強度を測定した（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１５ｎｍ）。【００４９】
結果は図４に示した。図４から、既知のＯＡＴＰ１Ｂ１阻害剤を添加しない対照と比較し、阻害剤を添加した細胞においてＤＣＦの取り込みが減少したことが判った。すなわち、ＨＥＫ−２９３細胞によるＤＣＦの取り込みは既知のＯＡＴＰ１Ｂ１阻害剤によって阻害された。この阻害は、阻害剤であるＥｓｔｒａｄｉｏｌ−１７β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ、及びエストロン−３−硫酸の濃度に依存的であることも判明した。ＤＣＦの取り込みはＨＥＫ−２９３細胞に発現しているＯＡＴＰ１Ｂ１によるものであることが証明された。【００５０】
（実施例５  ＤＣＦ法と従来のＲＩ法とのＫｉ値の比較）
実施例１と同じように、ＯＡＴＰ１Ｂ１を強制発現するＨＥＫ−２９３細胞を用意し、４×１０５細胞／ウェルになるようにポリ−Ｄ−リジンコートディッシュに蒔いた。ＤＣＦ法では、実施例４と同じようにＤＣＦ（０．１％ＤＭＳＯ中；最終濃度：３μＭ）及び所定の濃度の既知のＯＡＴＰ阻害剤を細胞に添加し、３７℃にて５分間培養し、細胞内に取り込まれた蛍光色素の蛍光強度を測定した（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１５ｎｍ）。従来のＲＩ法では、ラベルしたＥｓｔｒａｄｉｏｌ−１７β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ（ＥＧ）を使用した。ＤＣＦと同じようにＥＧ（０．１％ＤＭＳＯ中；最終濃度：０．０１μＭ）及び所定の濃度の既知のＯＡＴＰ阻害剤を細胞に添加し、３７℃にて５分間培養した。その後、氷冷したＫＨバッファーを用いて細胞を３回洗浄した後、０．１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液によって細胞を可溶化し、１Ｎ  ＨＣｌ水溶液にて中和した後、細胞内に取り込まれた放射活性を測定した。阻害剤として下記の表に示した化合物を使用した。ＤＣＦ法及び従来のＲＩ法のそれぞれのＫｉ値を計算し、相関を確認した。【００５１】
【表２】
2012121261.tif 000005
【００５２】
結果は図５に示した。図５から判るように、ＤＣＦ法のＫｉ値と従来のＲＩ法のＫｉ値とは非常に良い相関を有している（Ｒ２＝０．９７９７）。このことから、ＤＣＦを用いたＯＡＴＰ１Ｂ１の阻害活性の評価は可能であり、かつ、従来のＲＩ法と同等な確度で阻害定数を算出できることが証明された。【００５３】
（実施例６  ヒト肝細胞への時間・温度依存的なＤＣＦの取り込み）
ヒト凍結肝細胞及び融解用培地であるＣｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｍｅｄｉｕｍ  （ＣＨＲＭ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入した。３７℃の水浴でヒト凍結肝細胞を融解させた後、あらかじめ３７℃に温めておいたＣＨＲＭに肝細胞を添加した。室温で遠心後、上清を捨て、肝細胞に氷冷したＫＨバッファーを加え、１×１０６細胞／ｍＬとなるように肝細胞懸濁液を調製し、氷上に保存した。また、ＤＣＦをＫＨバッファー中の最終濃度が２０μＭとなるように溶解し、ＤＣＦ溶液を調製した。反応開始前に、肝細胞懸濁液を３７℃の水浴で２分間温め、あらかじめ３７℃に温めておいたＤＣＦ溶液を肝細胞懸濁液と等量添加し反応を開始した。同様に、４℃においても、氷上に保存した肝細胞懸濁液に、あらかじめ氷上に保存したＤＣＦ溶液を肝細胞懸濁液に等量添加し、反応を開始した。３７℃及び４℃にてそれぞれ０分〜５分間肝細胞を培養した。０．５分間、２分間、及び５分間の時点においてそれぞれサンプリングし、オイルスピン法（たとえば、Ｙｏｓｈｉｈｉｓａ  ＳＨＩＴＡＲＡら、ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ、３０４：６１０−６１６、２００３）により肝細胞をＤＣＦ溶液から分離した。具体的には、肝細胞培養液８０μＬを５０μＬオイル（比重１．０１５；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び、オイル層の下にある１００μＬの２Ｎ  ＮａＯＨ水溶液が入った遠心チューブに添加し、１０，０００ｇで２０秒間遠心した。これにより、肝細胞はオイル層を通過し、２Ｎ  ＮａＯＨ水溶液にて可溶化した。続いて、実施例１と同様に細胞内に取り込まれた蛍光色素の蛍光強度を測定した（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１５ｎｍ）。【００５４】
結果は図６に示した。４℃では肝細胞膜表面のトランスポーターが機能しないため、測定された蛍光化合物ＤＣＦの取り込み量は、トランスポーターを介さない取り込み（膜表面への非特異的結合、もしくは受動拡散）と考えられる。３７℃ではトランスポーターが機能するため、３７℃と４℃とのＤＣＦの取り込み量の差は、トランスポーター（ＯＡＴＰ１Ｂ１及びそれ以外のトランスポーター）を介した取り込み量であると考えられる。図６から、３７℃ではトランスポーターを介したヒト肝細胞内へのＤＣＦの取り込み量は、経時的に増大することが判った。【００５５】
（実施例７  ヒト肝細胞によるＤＣＦの取り込みの速度論的解析）
実施例６と同様にヒト肝細胞を用意し、１×１０６細胞／ｍＬになるように肝細胞懸濁液を調製した。ＤＣＦをＫＨバッファー中の最終濃度がそれぞれ２μＭ、６μＭ、２０μＭ、６０μＭ、２００μＭ、６００μＭ、及び２０００μＭとなるように溶解した。反応開始前に肝細胞懸濁液を３７℃の水浴で２分間温め、あらかじめ３７℃に温めておいたＤＣＦ溶液を肝細胞懸濁液に等量添加し、反応を開始した。３７℃にてそれぞれ０分〜５分間肝細胞を培養し、０．５分間、２分間、及び５分間の時点においてそれぞれサンプリングし、オイルスピン法により肝細胞をＤＣＦ溶液から分離した。肝細胞は２Ｎ  ＮａＯＨ水溶液にて可溶化し、実施例１と同様に細胞内に取り込まれた蛍光色素の蛍光強度を測定した（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１５ｎｍ）。上記濃度でのそれぞれの取り込み量をプロットし、取り込み速度を受動拡散の定数項を含むミカエリス・メンテンプロットによって分析し、さらに、取り込み速度と取り込まれた蛍光化合物との相関をイーディー・ホフスティープロットによって分析した。【００５６】
結果は図７の（ａ）及び（ｂ）に示した。図７の（ｂ）において、ＤＣＦの高濃度側（取り込み速度の高い側）で取り込みの飽和が認められた。このことから、ヒト肝細胞によるＤＣＦの取り込みはトランスポーターによるものと考えられる。また、速度論的解析においては、下記の受動拡散の定数項を含むミカエリス・メンテン式によってＫｍ、Ｖｍａｘ及びＰｄｉｆを計算した。その結果、Ｋｍ＝３８．５５μＭ、Ｖｍａｘ＝１１７．５２ｐｍｏｌ／分／１０６細胞、Ｐｄｉｆ＝２．２０μＬ／分／１０６細胞であった。ここのＫｍは、実施例３のＯＡＴＰ１Ｂ１を強制発現する細胞を用いた解析結果（Ｋｍ＝７．２２μＭ）と値が近いこと、及び、実施例１に示したように、ＤＣＦはヒト肝細胞に発現するＯＡＴＰトランスポーターのうちＯＡＴＰ１Ｂ１が最も高い輸送活性を示したことから、ヒト肝細胞によるＤＣＦの取り込みは主にＯＡＴＰ１Ｂ１によるものと推測される。
ｖ  ＝  Ｖｍａｘ・Ｓ／（Ｋｍ＋Ｓ）＋Ｐｄｉｆ・Ｓ【００５７】
（実施例８  ヒト肝細胞へのＤＣＦの取り込みに対するＯＡＴＰ阻害剤の効果）
実施例６と同様にヒト肝細胞を用意し、１×１０６細胞／ｍＬになるように肝細胞懸濁液を調製した。ＤＣＦをＫＨバッファー中の最終濃度がそれぞれ２０μＭ、２０００μＭとなるように溶解した。２０μＭのＤＣＦを含むＫＨバッファーに所定の濃度の既知のＯＡＴＰ１Ｂ１阻害剤のＤＭＳＯ溶液を添加し阻害剤溶液とした。既知のＯＡＴＰ１Ｂ１の阻害剤としては、ブロモスルフォフタレイン（ＢＳＰ；最終濃度１０μＭ）、リファンピシン（Ｒｉｆ；最終濃度１０μＭ）、及びシクロスポリンＡ（ＣｙｓＡ；最終濃度１０μＭ）を使用した。また、阻害剤を添加しない陽性対照、ＯＡＴＰ１Ｂ１阻害剤を添加せずに４℃にて検討する陰性対照（４度）、及び、阻害剤の代わりに高濃度（最終濃度１０００μＭ）のＤＣＦを添加したもの（ＤＣＦ（１０００））については、所定の濃度のＤＣＦを含むＫＨバッファーに、ＤＭＳＯを添加した。反応開始前に、肝細胞懸濁液を３７℃の水浴で２分間温め、あらかじめ３７℃に温めておいたＤＣＦを含む溶液を肝細胞懸濁液に等量添加し、反応を開始した。３７℃にてそれぞれ０分〜５分間肝細胞を培養し、０．５分間、２分間、及び５分間の時点においてそれぞれサンプリングし、オイルスピン法により肝細胞をＤＣＦ溶液から分離した。肝細胞を２Ｎ  ＮａＯＨ水溶液にて可溶化し、実施例１と同様に細胞内に取り込まれた蛍光色素の蛍光強度を測定した（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１５ｎｍ）。【００５８】
結果は図８に示した。図８における阻害剤を添加しない陽性対照と４℃での取り込み量との差は、トランスポーターを介したＤＣＦの取り込み量であると考えられる。これに対して、１０００μＭのＤＣＦを添加したものは、４℃での取り込みと同程度の蛍光強度を示しており、トランスポーターを介した取り込みは観察されなかった。これは、１０００μＭのＤＣＦによってトランスポーターが飽和したためと考えられる。また、ＯＡＴＰ１Ｂ１阻害剤であるＢＳＰ、Ｒｉｆ、及びＣｙｓＡによって、ＤＣＦの取り込みが４℃での取り込みと同程度まで減少したことが判った。すなわち、ヒト肝細胞によるＤＣＦの取り込みは既知のＯＡＴＰ１Ｂ１阻害剤によって阻害された。このことから、ヒト肝細胞へのＤＣＦの取り込みは、主にＯＡＴＰ１Ｂ１によるものと確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
ＯＡＴＰ１Ｂ１の優れた基質と証明されたジクロロフルオレセインを用いることで、安全で安価で操作が簡単であり、かつ、ＲＩ法と同程度な感度で、ＯＡＴＰ１Ｂ１の輸送活性を促進又は阻害する化合物を検出することができる。本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物は、ＯＡＴＰ１Ｂ１の基質である薬物の血中濃度などの体内動態をコントロールすることができると期待されている。また、本発明のスクリーニング方法によって薬物の相互作用を予測することもできる。【００６０】
本発明はまた、安全で安価で操作が簡単であり、かつ、ＲＩ法と同程度な感度で、ＯＡＴＰ１Ｂ１の発現量を測定するための方法を提供することができる。ＯＡＴＰ１Ｂ１の発現量の測定は、例えば、肝細胞などのＯＡＴＰ１Ｂ１を発現する細胞の活性の評価や、異なるロットの肝細胞の活性の比較に有用であると考えられる。
【図２】
2012121261.tif 000006
【図３】
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【図４】
2012121261.tif 000008
【図５】
2012121261.tif 000009
【図６】
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【図７】
2012121261.tif 000011
【図８】
2012121261.tif 000012
【図１】
2012121261.tif 000013
【配列表】
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【国際調査報告】
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2012121261.tif 000015
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