(57)【要約】簡便かつ正確にＬＤＬコレステロールを測定可能な新たな測定方法の提供。ＨＤＬ消去処理を施した試料を含む反応液に、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２を存在させ、ＬＤＬ中のコレステロールを酵素反応させる工程を含む試料中のＬＤＬコレステロールの測定方法である。界面活性剤Ａ１はＨＬＢが１２．５以下のポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルであり、界面活性剤Ｂ１はＨＬＢが１２．６以上のポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ＨＬＢが１２．７以上１４．５以下のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル及びＨＬＢが１２．０以上１４．５以下のポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルからなる群から選択され、界面活性剤Ｂ２はＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル及びポリオキシエチレン（３５−４０）オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される。
2012057333.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高密度リポタンパク質消去処理を施した試料を含む反応液に、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２を存在させ、低密度リポタンパク質中のコレステロールを酵素反応させる工程（Ｉ）を含み、
前記界面活性剤Ａ１は、ＨＬＢが１２．５以下のポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルであり、
前記界面活性剤Ｂ１は、ＨＬＢが１２．６以上のポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ＨＬＢが１２．７以上１４．５以下のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル及びＨＬＢが１２．０以上１４．５以下のポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つであり、
前記界面活性剤Ｂ２は、ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル及びポリオキシエチレン（３５−４０）オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである、試料中の低密度リポタンパク質中のコレステロールの測定方法。
【請求項２】
前記高密度リポタンパク質消去処理は、前記界面活性剤Ａ１と界面活性剤Ａ２と試料とを混合して前記試料中の高密度リポタンパク質中のコレステロールを酵素反応させることを含み、
前記界面活性剤Ａ２は、ＨＬＢが１８．０以上のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテル及びポリオキシエチレンミリスチルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
前記工程（Ｉ）は、前記高密度リポタンパク質消去処理を施した試料を含む反応液に、界面活性剤Ｂ３を添加することにより、前記反応液に前記界面活性剤Ａ１、前記界面活性剤Ｂ１、前記界面活性剤Ｂ２及び前記界面活性剤Ｂ３を存在させ、低密度リポタンパク質中のコレステロールを酵素反応させることを含み、
前記界面活性剤Ｂ３は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩及びアルキルベンゼンスルホン酸塩の少なくとも一つである、請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項４】
前記ポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルは、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン多環フェニルエーテルである、請求項１から３のいずれかに記載の測定方法。
【請求項５】
前記工程（Ｉ）における酵素反応は、試料中の低密度リポタンパク質と、コレステロールデヒドロゲナーゼ及びコレステロールエステラーゼとを酵素反応させることを含む、請求項１から５のいずれかに記載の測定方法。
【請求項６】
ＨＬＢが１２．５以下のポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルである界面活性剤Ａ１と、
ＨＬＢが１２．６以上のポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ＨＬＢが１２．７以上１４．５以下のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル及びＨＬＢが１２．０以上１４．５以下のポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである界面活性剤Ｂ１と、
ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル及びポリオキシエチレン（３５−４０）オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである界面活性剤Ｂ２とを含む、低密度リポタンパク質中のコレステロール測定用キット。
【請求項７】
ＨＬＢが１８．０以上のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、及びポリオキシエチレンミリスチルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである界面活性剤Ａ２をさらに含む、請求項６記載のキット。
【請求項８】
ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩及びアルキルベンゼンスルホン酸塩の少なくとも一つである界面活性剤Ｂ３をさらに含む、請求項６又は７に記載のキット。
【請求項９】
コレステロール測定用試薬をさらに含む、請求項６から８のいずれかに記載のキット。
【請求項１０】
前記コレステロール測定用試薬は、コレステロールデヒドロゲナーゼ及びコレステロールエステラーゼを含む、請求項９記載のキット。
【請求項１１】
前記コレステロールデヒドロゲナーゼを含む第１試薬と、
前記コレステロールエステラーゼ、前記界面活性剤Ａ１及び前記界面活性剤Ａ２を含む第２試薬と、
前記界面活性剤Ｂ１を含む第３試薬とを有する、請求項１０記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低密度リポタンパク質（以下、「ＬＤＬ」という）中のコレステロールの測定方法及び測定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＬＤＬは、肝臓で合成されたコレステロールを末梢組織へ運搬する役割を担うリポタンパク質である。ＬＤＬ中のコレステロール（以下、「ＬＤＬコレステロール」ともいう）は、動脈硬化の原因物質の一つであることが知られている。このため、労働安全衛生法に基く健康診断の検査項目として、ＬＤＬコレステロール量は２００８年４月から追加されている。【０００３】
ＬＤＬコレステロールの測定方法としては、例えば、超遠心分離によりＬＤＬを他のリポタンパク質（例えば、高密度リポタンパク質（以下、「ＨＤＬ」ともいう）、超低密度リポタンパク質（以下、「ＶＬＤＬ」ともいう）等と分離した後、酵素を用いてＬＤＬコレステロールのみを測定する方法や、電気泳動によってＬＤＬを分離した後、脂質の染色を行い、その発色強度を測定する方法等がある。しかしながら、これらの方法は操作が煩雑であり、多数の検体を処理することが困難であるため、臨床検査等において使用することは困難である。【０００４】
そこで、酵素を用いたＬＤＬコレステロールの測定方法が種々開発されている。酵素を用いた測定方法としては、ＬＤＬコレステロールそのものを直接測定する直接法や、第一反応でＬＤＬ以外のリポタンパク質由来のコレステロールを反応させてこれらを消去し、第二反応で残ったＬＤＬコレステロールを反応させることによってＬＤＬコレステロール量を測定する消去法等がある。【０００５】
より具体的には、直接法としては、例えば、シクロデキストリン及び界面活性剤によってＬＤＬコレステロールに対する酵素の特異性を高めてＬＤＬコレステロールを測定する方法がある（特許文献１）。消去法としては、ポリアニオンと２価金属イオンによってＬＤＬ以外のリポタンパク質由来のコレステロールを優先的に酵素反応させた後、ＬＤＬコレステロールを測定する方法（特許文献２）、硫酸カリクスアレンやポリアニリン等をＬＤＬコレステロールに結合させて可溶性複合体を形成させた状態でＬＤＬ以外のリポタンパク質由来のコレステロールを酵素反応させた後、ＬＤＬコレステロールを測定する方法（特許文献３）等がある。アミンを含む緩衝液中でＬＤＬ以外のリポタンパク質由来のコレステロールを酵素反応させた後、ＬＤＬコレステロールを測定する方法（特許文献４）等がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３０９１２３０号公報
【特許文献２】特許第３１９３６３４号公報
【特許文献３】特許第３８２２３４０号公報
【特許文献４】特許第３０５８６０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＬＤＬコレステロールを測定可能な新たな方法及び測定に用いるキットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、高密度リポタンパク質消去処理を施した試料を含む反応液に、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２を存在させ、低密度リポタンパク質中のコレステロールを酵素反応させる工程（Ｉ）を含む、試料中の低密度リポタンパク質中のコレステロールを測定する方法であって、前記界面活性剤Ａ１は、ＨＬＢが１２．５以下のポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルであり、前記界面活性剤Ｂ１は、ＨＬＢが１２．６以上のポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ＨＬＢが１２．７以上１４．５以下のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル及びＨＬＢが１２．０以上１４．５以下のポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つであり、前記界面活性剤Ｂ２は、ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル及びポリオキシエチレン（３５−４０）オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである低密度リポタンパク質中のコレステロールの測定方法に関する。【０００９】
本発明は、その他の態様として、低密度リポタンパク質中のコレステロールの測定に用いるキットであって、ＨＬＢが１２．５以下のポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルである界面活性剤Ａ１と、ＨＬＢが１２．６以上のポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ＨＬＢが１２．７以上１４．５以下のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル及びＨＬＢが１２．０以上１４．５以下のポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである界面活性剤Ｂ１と、ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル及びポリオキシエチレン（３５−４０）オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである界面活性剤Ｂ２とを含む低密度リポタンパク質中のコレステロール測定用キットに関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＬＤＬコレステロールの新たな測定方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、参考例１の結果の一例を示すグラフである。
【図２】図２Ａ及びＢは、参考例３の結果の一例を示すグラフである。
【図３】図３Ａ及びＢは、参考例４の結果の一例を示すグラフである。
【図４】図４Ａ及びＢは、実施例１の結果の一例を示すグラフである。
【図５】図５Ａ〜Ｃは、実施例２の結果の一例を示すグラフである。
【図６】図６Ａ及びＢは、実施例３の測定値と従来法の測定値との相関関係の一例を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、上記の界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２の存在下で、少なくともＬＤＬ及びＶＬＤＬを含む試料、好ましくはＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びカイロミクロン（以下、「ＣＭ」ともいう）を含む試料、より好ましくはＨＤＬ消去処理を施した生体試料を酵素処理することによって、ＬＤＬコレステロールを選択的に酵素反応させることができるため、ＬＤＬコレステロールを測定することができるという知見に基づく。
【００１３】
本発明のＬＤＬコレステロール測定方法によって、ＬＤＬコレステロールを測定できるメカニズムの詳細は明らかではないが、下記のように推測される。すなわち、界面活性剤Ａ１の存在下で界面活性剤Ｂ１がＬＤＬを選択的に可溶化し、界面活性剤Ａ１及び界面活性剤Ｂ１の存在下で界面活性剤Ｂ２がＶＬＤＬ及びＣＭといったＬＤＬ以外のリポタンパク質の可溶化を阻害するため、ＬＤＬコレステロールを選択的に酵素反応させることができる。但し、本発明はこのメカニズムに限定されない。
【００１４】
すなわち、本発明は、
[１] ＨＤＬ消去処理を施した試料を含む反応液に、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２を存在させ、ＬＤＬ中のコレステロールを酵素反応させる工程（Ｉ）を含む、試料中の低密度リポタンパク質中のコレステロールを測定する方法であって、前記界面活性剤Ａ１は、ＨＬＢが１２．５以下のポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルであり、前記界面活性剤Ｂ１は、ＨＬＢが１２．６以上のポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ＨＬＢが１２．７以上１４．５以下のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル及びＨＬＢが１２．０以上１４．５以下のポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つであり、前記界面活性剤Ｂ２は、ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル及びポリオキシエチレン（３５−４０）オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである低密度リポタンパク質中のコレステロールの測定方法；
[２] 前記ＨＤＬ消去処理は、前記界面活性剤Ａ１と界面活性剤Ａ２と試料とを混合して前記試料中のＨＤＬ中のコレステロールを酵素反応させることを含み、前記界面活性剤Ａ２は、ＨＬＢが１８．０以上のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテル及びポリオキシエチレンミリスチルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである[１]記載の低密度リポタンパク質中のコレステロールの測定方法；
[３] 前記工程（Ｉ）は、前記ＨＤＬ消去処理を施した試料を含む反応液に、界面活性剤Ｂ３を添加することにより、前記反応液に前記界面活性剤Ａ１、前記界面活性剤Ｂ１、前記界面活性剤Ｂ２及び前記界面活性剤Ｂ３を存在させ、ＬＤＬ中のコレステロールを酵素反応させることを含み、前記界面活性剤Ｂ３は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩及びアルキルベンゼンスルホン酸塩の少なくとも一つである[１]又は[２]に記載の低密度リポタンパク質中のコレステロールの測定方法；
[４] 前記ポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルは、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン多環フェニルエーテルである[１]から[３]のいずれかに記載の低密度リポタンパク質中のコレステロールの測定方法；
[５] 前記工程（Ｉ）における酵素反応は、試料中の低密度リポタンパク質と、コレステロールデヒドロゲナーゼ及びコレステロールエステラーゼとを酵素反応させることを含む[１]から[４]のいずれかに記載の低密度リポタンパク質中のコレステロールの測定方法；
[６] ＬＤＬ中のコレステロールの測定に用いるキットであって、ＨＬＢが１２．５以下のポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルである界面活性剤Ａ１と、ＨＬＢが１２．６以上のポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ＨＬＢが１２．７以上１４．５以下のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル及びＨＬＢが１２．０以上１４．５以下のポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである界面活性剤Ｂ１と、ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル及びポリオキシエチレン（３５−４０）オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである界面活性剤Ｂ２とを含む低密度リポタンパク質中のコレステロール測定用キット；
[７] ＨＬＢが１８．０以上のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、及びポリオキシエチレンミリスチルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである界面活性剤Ａ２をさらに含む[６]記載の低密度リポタンパク質中のコレステロール測定用キット；
[８] ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩及びアルキルベンゼンスルホン酸塩の少なくとも一つである界面活性剤Ｂ３をさらに含む[６]又は[７]に記載の低密度リポタンパク質中のコレステロール測定用キット；
[９] コレステロール測定用試薬をさらに含む[６]から[８]のいずれかに記載の低密度リポタンパク質中のコレステロール測定用キット；
[１０] 前記コレステロール測定用試薬は、コレステロールデヒドロゲナーゼ及びコレステロールエステラーゼを含む[９]記載の低密度リポタンパク質中のコレステロール測定用キット；
[１１] 前記コレステロールデヒドロゲナーゼを含む第１試薬と、前記コレステロールエステラーゼ、前記界面活性剤Ａ１及び前記界面活性剤Ａ２を含む第２試薬と、前記界面活性剤Ｂ１を含む第３試薬とを有する[１０]記載の低密度リポタンパク質中のコレステロール測定用キット；
に関する。
【００１５】
本明細書において「低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）」は、比重が１．００６〜１．０６３である広義のＬＤＬ、及び、比重が１．０１９〜１．０６３である狭義のＬＤＬの何れも含む。本明細書において「高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）」は、比重が１．０６３〜１．２１であるリポタンパク質のことをいう。
【００１６】
本明細書において試料としては、例えば、生体試料が挙げられ、具体的にはヒト及びヒトを除く哺乳動物の体液及び体成分が挙げられる。体液及び体成分としては、これらに限定されないが、例えば、全血、血漿、血清、髄液、唾液、尿、汗、羊水、膵液、涙液、粘膜等が挙げられ、中でも全血、血漿、血清が好ましい。また、試料は、そのまま使用してもよいし希釈して使用してもよく、また、遠心分離等によって分離されたものであってもよい。
【００１７】
本明細書において「高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）消去処理を施した試料」とは、ＨＤＬ及び又はＨＤＬ由来のコレステロール（以下、「ＨＤＬコレステロール」ともいう）が消去された試料のことをいい、特に限定されないが、例えば、ＨＤＬ及び又はＨＤＬコレステロールが除去又は分解された試料を含みうる。除去には、特に限定されないが、酵素反応による除去等を含み、例えば、酵素反応により、ＨＤＬからコレステロールを遊離させ、遊離したコレステロールを酸化／還元してコレステノンを生じさせることを含む。ＨＤＬ消去処理を施した試料は、界面活性剤Ａ１及び界面活性剤Ａ２と試料とを混合して試料中のＨＤＬを溶解し、ＨＤＬコレステロールを酵素反応させた試料が好ましい。このため、ＨＤＬ消去処理を施した試料は、界面活性剤Ａ１、及び界面活性剤Ａ２を含むことが好ましく、より好ましくは界面活性剤Ａ１、及び界面活性剤Ａ２、並びにＬＤＬ及び又はＬＤＬコレステロールを含む。また、ＨＤＬ消去処理を施した試料は、ＨＤＬ及び又はＨＤＬコレステロールを実質的に含まないことがより好ましい。ＨＤＬ及び又はＨＤＬコレステロールを実質的に含まないとは、ＨＤＬ消去処理を施した試料に含まれるＨＤＬ及び又はＨＤＬコレステロールの量が、本発明の測定方法によるＬＤＬ中のコレステロールの測定に影響を及ぼさない範囲であることをいう。
【００１８】
本明細書において「ＬＤＬコレステロールを酵素反応させる」とは、例えば、コレステロールとコレステロール測定用酵素とを接触させることを含み、好ましくはコレステロールにコレステロール測定用酵素及び発色剤を接触させることを含む。
【００１９】
本明細書において「ＨＬＢ」は、ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｂａｌａｎｃｅの略であって、例えば、グリフィン式を用いて算出することができる。また、ＨＬＢとしては、界面活性剤の製造メーカのカタログ等に記載されている値を使用することもできる。
【００２０】
［界面活性剤Ａ１］
界面活性剤Ａ１は、ＨＬＢが１２．５以下のポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルである。ポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルのＨＬＢは、ヒト血中に存在するリポタンパク質のうちＨＤＬをより選択的に可溶化させる点から、１２．５以下であり、限定されないが、１２．３以上１２．５以下であることが好ましく、より好ましくは略１２．５である。
【００２１】
ポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルにおける多環フェニルとしては、これらに限定されないが、例えば、１つの芳香環を有する置換基によって２箇所以上置換されているフェニル基、２つ以上の芳香環を有する置換基によって１又は複数箇所置換されているフェニル基等が挙げられる。１つの芳香環を有する置換基としては、これらに限定されないが、例えば、ベンジル、１−（フェニル）エチル等が挙げられる。２つ以上の芳香環を有する置換基としては、これに限定されないが、例えば、ナフチル等が挙げられる。ポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルにおけるポリオキシアルキレンとしては、これらに限定されないが、例えば、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン及びポリオキシブチレン等が挙げられ、中でも異なるポリオキシアルキレンが重合されているものが好ましく、より好ましくはポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとが重合されたものである。このため、ポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルとしては、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン多環フェニルエーテルが好ましい。ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンの重合形式は特に制限されず、例えば、ブロック重合、ランダム重合の何れであってもよい。
【００２２】
ＨＬＢが１２．５以下のポリオキシエチレンポリオキシプロピレン多環フェニルエーテルの具体例としては、これらに限定されないが、ニューコール２６０８Ｆ（商品名、ＨＬＢ：１２．５、日本乳化剤株式会社製）、ニューコール７０７Ｆ（商品名、ＨＬＢ：１２．５、日本乳化剤株式会社製）等が挙げられる。
【００２３】
［界面活性剤Ｂ１］
界面活性剤Ｂ１は、ＨＬＢが１２．６以上のポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ＨＬＢが１２．７以上１４．５以下のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル及びＨＬＢが１２．０以上１４．５以下のポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルからなる群から選択される。これらは１種類で使用してもよいし、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２４】
界面活性剤Ｂ１において、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルのＨＬＢは１２．６以上であり、界面活性剤Ａ１の存在下でＶＬＤＬ及びＣＭと比較してＬＤＬの可溶化能が高く、より選択的にＬＤＬを可溶化させる点から、好ましくは１２．６〜１３．６であり、より好ましくは１２．６〜１３．３、さらに好ましくは１２．６〜１３．２、さらにより好ましくは略１２．６である。
【００２５】
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルにおける多環フェニルとしては、これらに限定されないが、例えば、１つの芳香環を有する置換基によって２箇所以上置換されているフェニル基、２つ以上の芳香環を有する置換基によって１又は複数箇所置換されているフェニル基等が挙げられる。１つの芳香環を有する置換基としては、これらに限定されないが、例えば、ベンジル、１−（フェニル）エチル等が挙げられる。２つ以上の芳香環を有する置換基としては、これに限定されないが、例えば、ナフチル等が挙げられる。ポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルにおけるポリオキシアルキレンとしては、これらに限定されないが、例えば、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン及びポリオキシブチレン等が挙げられ、中でも異なるポリオキシアルキレンが重合されているものが好ましく、より好ましくはポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとが重合されたものである。このため、ポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルとしては、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン多環フェニルエーテルが好ましい。ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンの重合形式は特に制限されず、例えば、ブロック重合、ランダム重合の何れであってもよい。
【００２６】
ＨＬＢが１２．６以上のポリオキシエチレン多環フェニルエーテルとしては、これらに限定されないが、例えば、ニューコール２６０９（商品名、ＨＬＢ：１２．６、日本乳化剤株式会社製）、ニューコール２６１４（商品名、ＨＬＢ：１４．７、日本乳化剤株式会社製）、ニューコール６１０（商品名、ＨＬＢ：１３．８、日本乳化剤株式会社製）等が挙げられる。
【００２７】
界面活性剤Ｂ１において、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルのＨＬＢは１２．７以上１４．５以下であり、界面活性剤Ａ１の存在下でＶＬＤＬ及びＣＭと比較してＬＤＬの可溶化能が高く、より選択的なＬＤＬの可溶化を行う点から、好ましくは略１２．８である。
【００２８】
ＨＬＢが１２．７以上１４．５以下のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルの具体例としては、これらに限定されないが、エマルゲンＡ６０（製品名、ＨＬＢ：１２．８、花王株式会社製）、エマルゲンＡ９０（製品名、ＨＫＢ：１４．５、花王株式会社製）等が挙げられる。
【００２９】
界面活性剤Ｂ１において、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルのＨＬＢは１２．０以上１４．５以下であり、界面活性剤Ａ１の存在下でＶＬＤＬ及びＣＭと比較してＬＤＬの可溶化能が高く、より選択的なＬＤＬの可溶化を行う点から、好ましくは略１２．７である。
【００３０】
ＨＬＢが１２．０以上１４．５以下のポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルの具体例としては、ブラウノンＴＳＰ１６（商品名、ＨＬＢ：１２．７、青木油脂株式会社製）等が挙げられる。
【００３１】
［界面活性剤Ｂ２］
界面活性剤Ｂ２は、ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチルエーテル及びポリオキシエチレン（３５−４０）オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される。これらは１種類で使用してもよいし、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
【００３２】
界面活性剤Ｂ２において、ポリオキシエチレンラウリルエーテルポリオキシエチレンのＨＬＢは１６．９以上であり、界面活性剤Ａ１及び界面活性剤Ｂ１の存在下でＶＬＤＬ及びＣＭの可溶化を阻害し、より選択的にＬＤＬを可溶化させる点から、好ましくは１６．９〜１８．４であり、より好ましくは１６．９〜１８．１、さらに好ましくは１６．９〜１７．９、さらにより好ましくは略１６．９である。ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテルポリオキシエチレンの重合度としては、特に限定されないが、例えば、２３〜５０であり、好ましくは２３〜３０である。ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテルポリオキシエチレンの具体例としては、これらに限定されないが、エマルゲン１２３Ｐ（製品名、ＨＬＢ：１６．９、花王株式会社製）、エマルゲン１３０Ｋ（製品名、ＨＬＢ：１８．１、花王株式会社製）、エマルゲン１５０（製品名、ＨＬＢ：１８．４、花王株式会社製）等が挙げられる。
【００３３】
ポリオキシエチレンミリスチルエーテルとしては、例えば、ＨＬＢが１８．９のポリエチレンミリスチルエーテルが使用できる。ポリオキシエチレンミリスチルエーテルの具体例としては、これに限定されないが、エマルゲン４０８５（商品名、ＨＬＢ１８．９、花王株式会社製）等が挙げられる。
【００３４】
ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルのうちポリオキシエチレンの平均重合度は、界面活性剤Ａ１及び界面活性剤Ｂ１の存在下でＶＬＤＬ及びＣＭの可溶化を阻害し、より選択的にＬＤＬを可溶化させる点から、３５〜４０であり、好ましくは略４０である。ポリオキシエチレン（３５−４０）オクチルフェニルエーテルの具体例としては、これに限定されないが、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−４０５（商品名、重合度：４０、ナカライテスク株式会社製）等が挙げられる。
【００３５】
［界面活性剤Ｂ３］
界面活性剤Ｂ３は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩及びアルキルベンゼンスルホン酸塩の少なくとも一方である。これらは１種類で使用してもよいし、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。塩としては、これらに限定されないが、例えば、アンモニウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等が挙げられる。
【００３６】
ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩におけるポリオキシエチレンの重合度としては、界面活性剤Ａ１及び界面活性剤Ｂ１の存在下において、界面活性剤Ｂ１によるＬＤＬの可溶化速度を促進させる点から、例えば、１〜１０である。ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩としては、これに限定されないが、例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩としては、これらに限定されないが、例えば、エマール２０Ｃ（商品名、花王株式会社製）、ニューコール２３０８ＳＦ（商品名、日本乳化剤株式会社製）、ニューコール２３２０ＳＮ（商品名、日本乳化剤株式会社製）等が挙げられる。
【００３７】
アルキルベンゼンスルホン酸塩としては、これらに限定されないが、ドデシル（ラウリル）ベンゼン硫酸ナトリウム（ナカライ株式会社製他）等が挙げられる。
【００３８】
［界面活性剤Ａ２］
界面活性剤Ａ２は、ＨＬＢが１８．０以上のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテル及びポリオキシエチレンミリスチルエーテルからなる群から選択される。これらは１種類で使用してもよいし、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
【００３９】
界面活性剤Ａ２において、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルのＨＬＢは１８．０以上であり、界面活性剤Ａ１による試料中に含まれるＨＤＬ以外のリポタンパク質の可溶化を阻害する点から、好ましくは１８．０〜１９．０、より好ましくは略１８．０である。ＨＬＢが１８．０以上のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルの具体例としては、これに限定されないが、エマルゲンＡ５００（製品名、ＨＬＢ：１８．０、花王株式会社製）等が挙げられる。
【００４０】
界面活性剤Ａ２において、ポリオキシエチレンラウリルエーテルポリオキシエチレンのＨＬＢは１６．９以上であり、界面活性剤Ａ１による試料中に含まれるＨＤＬ以外のリポタンパク質の可溶化を阻害する点から、好ましくは１６．９〜１８．４であり、より好ましくは１６．９〜１８．１、さらに好ましくは１６．９〜１７．９、さらにより好ましくは略１６．９である。ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテルポリオキシエチレンの重合度としては、界面活性剤Ａ１による試料中に含まれるＨＤＬ以外のリポタンパク質の可溶化を阻害する点から、例えば、２３〜５０であり、好ましくは２３〜３０である。ＨＬＢが１６．９以上のポリオキシエチレンラウリルエーテルポリオキシエチレンの具体例としては、これらに限定されないが、エマルゲン１２３Ｐ（製品名、ＨＬＢ：１６．９、花王株式会社製）、エマルゲン１３０Ｋ（製品名、ＨＬＢ：１８．１、花王株式会社製）、エマルゲン１５０（製品名、ＨＬＢ：１８．４、花王株式会社製）等が挙げられる。
【００４１】
ポリオキシエチレンミリスチルエーテルとしては、これらに限定されないが、例えば、ＨＬＢが１８．９のポリエチレンミリスチルエーテルが使用できる。ポリオキシエチレンミリスチルエーテルの具体例としては、これらに限定されないが、エマルゲン４０８５（商品名、ＨＬＢ１８．９、花王株式会社製）等が挙げられる。
【００４２】
［コレステロール測定用試薬］
コレステロール測定用試薬は、コレステロールの測定に用いる試薬であって、コレステロール測定用酵素を含む。コレステロール測定用酵素とは、コレステロールの測定に用いる酵素のことをいい、これらに限定されないが、例えば、コレステロールデヒドロゲナーゼ、コレステロールエステル加水分解酵素及び補酵素等が挙げられる。コレステロール測定用酵素は、公知のものが使用できる。また、コレステロール測定用酵素は、コレステロールデヒドロゲナーゼ、コレステロールエステル加水分解酵素及び補酵素を組み合わせて使用することが好ましい。コレステロールデヒドロゲナーゼ及びコレステロールエステル加水分解酵の由来は特に制限されず、例えば、微生物、動物又は植物由来であってもよく、また、遺伝子操作によって作られたものでもよい。また、化学的に修飾されていてもよい。
【００４３】
コレステロール加水分解酵素としては、コレステロールエステルを加水分解可能な酵素であればよく、これらに限定されないが、例えば、コレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ等が挙げられ、中でもコレステロールエステラーゼが好ましい。コレステロールエステラーゼは、市販品を使用してもよく、特にその由来は制限されない。また、本発明において、２種類以上のコレステロール加水分解酵素を組み合わせて使用してもよい。
【００４４】
酸化型補酵素としては、これらに限定されないが、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、チオＮＡＤ、チオＮＡＤＰ等が挙げられる。
【００４５】
コレステロール測定用試薬は、コレステロール測定用酵素に加えて、例えば、還元型発色剤をさらに含んでいてもよい。還元型発色剤としては、例えば、ジアホラーゼの作用により色素を形成するもの等が使用できる。
【００４６】
還元型発色剤としては、例えば、テトラゾリウム化合物が挙げられる。テトラゾリウム化合物としては、これらに限定されないが、例えば、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムモノナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムモノナトリウム塩（ＷＳＴ−３）等が挙げられる。
【００４７】
［ＬＤＬコレステロール測定方法］
（第１の態様のＬＤＬコレステロール測定方法）
本発明のＬＤＬコレステロール測定方法は、第１の態様として、ＨＤＬ消去処理を施した試料を含む反応液に、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２を存在させ、ＬＤＬ中のコレステロールを酵素反応させる工程（Ｉ）を含む。以下、第１の態様のＬＤＬコレステロール測定方法について説明する。
【００４８】
工程（Ｉ）において、ＨＤＬ消去処理を施した試料を含む反応液に、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２を存在させ、ＬＤＬ中のコレステロールを酵素反応させることにより、試料中のＬＤＬ中のコレステロールを測定する。
【００４９】
試料は、ＨＤＬ消去処理を施した試料を使用する。ＨＤＬ消去処理としては、例えば、界面活性剤Ａ１及び界面活性剤Ａ２と試料とを混合して前記試料中のＨＤＬを溶解し、ＨＤＬ由来のコレステロールを酵素反応させる方法等が挙げられる。
【００５０】
反応液中における界面活性剤Ｂ１の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．４４〜０．９７重量％であり、単独での使用で、界面活性剤Ａ１の存在下でＶＬＤＬ及びＣＭと比較してＬＤＬの可溶化能が高く、より選択的にＬＤＬを可溶化する点から、好ましくは０．６２〜０．７９重量％である。反応液中における界面活性剤Ｂ２の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．０１〜０．０４重量％であり、界面活性剤Ａ１及び界面活性剤Ｂ１の存在下でＶＬＤＬ及びＣＭの可溶化を阻害し、より選択的にＬＤＬを可溶化する点から、好ましくは０．０１８〜０．０３重量％である。反応液中における界面活性剤Ｂ１と界面活性剤Ｂ２との重量％比率（Ｂ１：Ｂ２）は、特に限定されないが、例えば、４４：１〜９７：４であり、好ましくは３１：１〜７９：３である。
【００５１】
工程（Ｉ）では、ＨＤＬを可溶化し、ＨＤＬ由来のコレステロールの消去処理を施した試料を含む反応液に、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２を添加することを含んでいてもよい。ＨＤＬ消去処理を施した試料が界面活性剤Ａ１と同じ界面活性剤を含有している場合は、界面活性剤Ａ１を添加することなく試料に含まれている界面活性剤を界面活性剤Ａ１としてそのまま使用してもよいし、工程（Ｉ）において界面活性剤Ａ１をさらに添加してもよい。ＨＤＬ消去処理を施した試料が界面活性剤Ｂ２と同じ界面活性剤を含有している場合は、界面活性剤Ｂ２を添加することなく試料に含まれている界面活性剤を界面活性剤Ｂ２としてそのまま使用してもよいし、工程（Ｉ）において界面活性剤Ｂ２をさらに添加してもよい。
【００５２】
工程（Ｉ）において、反応液にコレステロール測定用試薬を添加してもよい。コレステロール測定用試薬は、例えば、コレステロールデヒドロゲナーゼ、コレステロール加水分解酵素等のコレステロール測定用酵素、補酵素及び還元型発色剤、ジアホラーゼ等を含み得る。還元型発色剤、ジアホラーゼを含むことにより、還元型補酵素、ジアホラーゼを介した反応により生じた還元型発色剤に由来する色素により、より長波長側の可視光での検出が可能となる。
【００５３】
コレステロールデヒドロゲナーゼの濃度は、特に限定されないが、例えば、１．７４〜４．３５Ｕ／ｍＬであり、反応液中のコレステロール濃度が０．０１２ｍＭの場合において、反応エンドポイントに達する速度が最大となる点から、好ましくは２．９〜４．３５Ｕ／ｍＬである。反応液中におけるコレステロール加水分解酵素の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１９〜０．５８Ｕ／ｍＬであり、反応液中のコレステロールの濃度が０．０１２ｍＭの場合において、反応エンドポイントに達する速度が最大となる点から、好ましくは０．２９〜０．５８Ｕ／ｍＬである。反応液中の補酵素の濃度は、上記コレステロールデヒドロゲナーゼの濃度範囲に付随して、例えば、０．２９〜０．９７ｍＭであり、好ましくは０．７３〜０．９７ｍＭである。
【００５４】
反応液中におけるジアホラーゼの濃度は、特に限定されないが、例えば、１．７４〜４．３５Ｕ／ｍＬであり、好ましくは２．９〜４．３５Ｕ／ｍＬである。還元型発色剤との濃度は、例えば０．１０〜０．２９ ｍＭであり、好ましくは０．１９〜０．２９ ｍＭである。
【００５５】
工程（Ｉ）の反応は、例えば、反応溶液中の緩衝能を保持し、目的となるｐＨを保持するために緩衝液中で行うことが好ましい。緩衝液に使用する緩衝剤としては、例えば、グッドの緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤等が挙げられる。グッドの緩衝剤としては、これらに限定されないが、例えば、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。濃度は、反応溶液中の緩衝能を保持し、目的となるｐＨを保持できる濃度にすればよい。反応液中のｐＨは、使用する酵素のｐＨ安定性や反応至適を考慮し、適宜選択すればよい。本測定方法においては、例えば、６．５〜１０．０であり、好ましくは７．５〜８．０である。
【００５６】
工程（Ｉ）において、界面活性剤Ｂ３を添加し、酵素反応を界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ｂ１、界面活性剤Ｂ２及び界面活性剤Ｂ３の存在下で行うことが好ましい。これにより、例えば、ＬＤＬの選択的な可溶化を促進させることができ、より好ましくはＶＬＤＬの影響をより抑制することができる。反応液中における界面活性剤Ｂ３の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．０３〜０．０７重量％であり、ＬＤＬの可溶化をより促進させる点から、好ましくは０．０４〜０．０６重量％である。
【００５７】
工程（Ｉ）の反応温度は、特に限定されないが、ヒト血液中成分、特に生化学項目を測定する際の反応温度は、通常３７℃程度である。反応時間は、特に限定されないが、例えば、１８０〜３００秒であり、本反応系において、ヒト血中のＬＤＬコレステロールが５００ｍｇ／ｄＬ付近の濃度でも十分に定量可能である点から、好ましくは２４０〜２７０秒である。
【００５８】
ＬＤＬコレステロールの測定は、例えば、反応液の吸光度を測定することにより行うことができる。吸光度の測定は、例えば、過酸化水素測定用試薬により生じた色素の吸光度を測定してもよい。
【００５９】
（第２の態様のＬＤＬコレステロール測定方法）
本発明のＬＤＬコレステロール測定方法は、第２の態様として、試料、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ａ２及びコレステロール測定用試薬を混合して試料中のＨＤＬ中のコレステロールを酵素反応させる工程（ｉ）と、工程（ｉ）後の反応液に界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２を存在させ、ＬＤＬ中のコレステロールを酵素反応させることにより、前記試料中のＬＤＬ中のコレステロールを測定する工程（ｉｉ）とを含む。
【００６０】
本態様のＬＤＬコレステロール測定方法によって、ＨＤＬコレステロール及びＬＤＬコレステロールをこれらの順で選択的に酵素反応させ、ＬＤＬコレステロールを測定できるメカニズムの詳細は明らかではないが、下記のように推測される。すなわち、上記界面活性剤Ａ１がＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭといったＨＤＬ以外のリポタンパク質と比較してＨＤＬを選択的に可溶化するとともに、上記界面活性剤Ａ２が上記界面活性剤Ａ１の存在下で上記ＨＤＬ以外のリポタンパク質の可溶化を阻害するため、ＨＤＬコレステロールを選択的に酵素反応させることができる。さらに、上記反応後、上記界面活性剤Ｂ１が上記反応後の反応液においてＶＬＤＬ及びＣＭといったＬＤＬ以外のリポタンパク質と比較してＬＤＬを選択的に可溶化するとともに、上記界面活性剤Ｂ２が界面活性剤Ｂ１の存在下でＬＤＬ以外のリポタンパク質の可溶化を阻害するため、ＬＤＬコレステロールを選択的に酵素反応させることができる。なお、界面活性剤Ｂ２として界面活性剤Ａ２と同じものを使用する場合、工程（ｉｉ）において界面活性剤Ｂ２を新たに加える必要はない。但し、本発明はこのメカニズムに限定されない。
【００６１】
以下、第２の態様のＬＤＬコレステロール測定方法について説明する。
【００６２】
［工程（ｉ）］
まず、工程（ｉ）において、試料、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ａ２及びコレステロール測定用試薬を混合して試料中のＨＤＬ中のコレステロールを酵素反応させる。
【００６３】
試料、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ａ２及びコレステロール測定用試薬を混合する順番は特に限定されず、予め試料とコレステロール測定用試薬の一部とを混合した後、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ａ２及びコレステロール測定用試薬の残部を添加してもよいし、試料、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ａ２及びコレステロール測定用試薬を同時に混合してもよい。
【００６４】
工程（ｉ）（ＨＤＬ消去工程）の反応液中における界面活性剤Ａ１の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．２２〜０．３０重量％であり、ＨＤＬをより選択的に可溶化させる点で、好ましくは０．２２〜０．２８重量％である。反応液中における界面活性剤Ａ２の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．０２重量％以上であり、界面活性剤Ａ１によるＨＤＬの可溶化への影響を抑制しつつ、ＨＤＬ以外のリポタンパク質の可溶化を阻害する点で、好ましくは０．０４〜０．１０重量％、より好ましくは０．０６〜０．０９重量％である。反応液中における界面活性剤Ａ１と界面活性剤Ａ２との重量比（Ａ１：Ａ２）は、特に限定されないが、例えば、１１：１〜１５：１であり、界面活性剤Ａ１によるＨＤＬの可溶化への影響を抑制しつつ、ＨＤＬ以外のリポタンパク質の可溶化を阻害し、ＨＤＬをより選択的に可溶化させる点で、好ましくは１０：２．４〜１０：３.７である。
【００６５】
コレステロール測定用試薬の組成、各成分の濃度は、第１の態様の工程と同様である。また、工程（ｉ）の反応は、反応溶液中の緩衝能を保持し、目的となるｐＨを保持するために緩衝液中で行うことが好ましく、緩衝剤及びｐＨは、第１の態様と同様である。
【００６６】
工程（ｉ）の反応温度は、特に限定されないが、ヒト血液中成分、特に生化学項目を測定する際の反応温度は、通常３７℃程度である。反応時間は、特に限定されないが、例えば、２００〜２７０秒であり、本反応系において、ヒト血中のＨＤＬコレステロールが１５０ｍｇ／ｄＬ付近の濃度でも十分に消去可能である点から、好ましくは２４０〜２７０秒である。
【００６７】
［工程（ｉｉ）］
つぎに、工程（ｉｉ）において、工程（ｉ）後の反応液に界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２を存在させ、ＬＤＬ中のコレステロールを酵素反応させることにより、試料中のＬＤＬ中のコレステロールを測定する。
【００６８】
工程（ｉｉ）では、工程（ｉ）後の反応液に界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２を添加することを含んでいてもよい。また、工程（ｉｉ）の界面活性剤Ｂ２として界面活性剤Ａ２と同じ界面活性剤を使用する場合は、工程（ｉｉ）において界面活性剤Ｂ２をさらに添加してもよいし、さらに添加することなく工程（ｉ）で使用した界面活性剤Ａ２を界面活性剤Ｂ２としてそのまま使用してもよい。
【００６９】
反応液中における界面活性剤Ｂ１及びＢ２の濃度、界面活性剤Ｂ１と界面活性剤Ｂ２との重量％比率は、第１の態様の工程（Ｉ）と同様である。反応液中における界面活性剤Ａ１と界面活性剤Ｂ１と界面活性剤Ｂ２との重量％比率（Ａ１：Ｂ１：Ｂ２）は、特に限定されないが、例えば、１９：４４：１〜２５：９７：４であり、好ましくは１９：６２：２〜２３：７９：３である。
【００７０】
工程（ｉｉ）において、コレステロール測定用試薬をさらに添加してもよいし、さらに添加することなく工程（ｉ）で使用したコレステロール測定用試薬をそのまま使用してもよい。
【００７１】
工程（ｉｉ）において、工程（ｉ）後の反応液にさらに界面活性剤Ｂ３を添加し、酵素反応を界面活性剤Ｂ１、界面活性剤Ｂ２及び界面活性剤Ｂ３の存在下で行うことが好ましい。これにより、例えば、ＬＤＬの選択的な可溶化を促進させることができ、より好ましくはＶＬＤＬの影響をより抑制することができる。反応液中における界面活性剤Ｂ３の濃度は、第１の態様の工程（Ｉ）と同様である。
【００７２】
工程（ｉｉ）における反応温度及び反応時間は、第１の態様の工程（Ｉ）と同様である。
【００７３】
ＬＤＬコレステロールの測定は、例えば、反応液の吸光度を測定することにより行うことができる。吸光度の測定は、例えば、過酸化水素測定用試薬により生じた色素の吸光度を測定してもよい。
【００７４】
［ＬＤＬコレステロール測定用キット］
本発明のＬＤＬコレステロール測定用キットは、一つの態様において、ＬＤＬ中のコレステロールの測定に用いるキットであって、界面活性剤Ａ１と界面活性剤Ｂ１と界面活性剤Ｂ２とを含む（以下、「本発明のキット」ともいう）。本発明のキットは、本発明のＬＤＬコレステロールの測定方法に用いることができる。界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２は、本発明のＬＤＬコレステロール測定方法と同様である。
【００７５】
本発明のキットは、コレステロール測定用試薬を含んでいてもよい。コレステロール測定用試薬は、本発明のＬＤＬコレステロール測定方法と同様である。
【００７６】
本発明のキットは、界面活性剤Ｂ３を含んでいてもよい。界面活性剤Ｂ３は、本発明のＬＤＬコレステロール測定方法と同様である。
【００７７】
本発明のキットは、界面活性剤Ａ２を含んでいてもよい。界面活性剤Ａ２は、本発明のＬＤＬコレステロール測定方法と同様である。
【００７８】
本発明のキットは、その他の態様において、ＬＤＬ中のコレステロールの測定に用いるキットであって、界面活性剤Ａ１と界面活性剤Ａ２と界面活性剤Ｂ１とを含む。本態様のＬＤＬコレステロール測定用キットは、界面活性剤Ｂ２を含んでいてもよく、また、界面活性剤Ｂ３及びコレステロール測定用試薬を含んでいてもよい。界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ａ２、界面活性剤Ｂ１、界面活性剤Ｂ２、界面活性剤Ｂ３及びコレステロール測定用試薬は、本発明のＬＤＬコレステロール測定方法と同様である。
【００７９】
本発明のキットとしては、例えば、２試薬系のキット、３試薬系のキット、４試薬系のキット等が挙げられる。
【００８０】
コレステロールデヒドロゲナーゼを含む２試薬系のキットにおいて、コレステロールデヒドロゲナーゼは、第１試薬のみに含まれることが好ましい。コレステロールエステラーゼは、例えば、第１試薬及び第２試薬のうちの少なくとも一つに含まれていてもよく、好ましくは第２試薬のみに含まれることが好ましい。界面活性剤Ａ１及びＡ２は、それぞれ、第１試薬のみに含まれることが好ましい。界面活性剤Ｂ１、Ｂ２及びＢ３は、第２試薬のみに含まれることが好ましい。
【００８１】
３試薬系のキットにおいては、コレステロールデヒドロゲナーゼ、界面活性剤Ａ１及びＡ２は、例えば、第１反応を優先する試薬の組み合わせとして、第１試薬、第２試薬及び第１試薬のみのうちの少なくとも一つに含まれていてもよい。コレステロールエステラーゼは、例えば、第１試薬、第２試薬及び第３試薬並びにこれらのうちの少なくとも一つに含まれていてもよく、好ましくは第２反応を優先する試薬のみに含まれることである。界面活性剤Ｂ１、Ｂ２及びＢ３は、例えば、第２反応を優先する試薬の組み合わせとして、第２試薬、第３試薬及び第３試薬のみのうちの少なくとも一つに含まれていてもよい。
【００８２】
好ましい測定用キットの形態としては、コレステロールデヒドロゲナーゼを含む第１試薬と、コレステロールエステラーゼ、界面活性剤Ａ１及び界面活性剤Ａ２を含む第２試薬と、界面活性剤Ｂ１を含む第３試薬とを有する測定用キットが挙げられる。
【００８３】
本発明のキットは、上記試薬を用いてＬＤＬコレステロールを測定する方法等が記載された取扱い説明書を含むことが好ましい。本発明のキットは、説明書が本発明の測定キットの同梱されることなくウェブ上で提供される場合も含みうる。
【００８４】
本発明のキットとしては、例えば、コレステロール測定用試薬、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ａ２及び界面活性剤Ｂ１等が試薬パックに収納されていてもよい。試薬パックは、例えば、使い捨て可能なカートリッジ形状であることが好ましく、上記試薬を配置可能な槽を２種類以上備えることがより好ましい。本発明のキットとしては、上記第１試薬、第２試薬及び第３試薬が個別の槽に配置された試薬パックが好ましい。試薬パックは、例えば、反応槽、検体槽、分注チップ、反応用光学セル、廃棄槽等をさらに含んでいてもよい。このような試薬パックを用いることにより、例えば、本発明のＬＤＬコレステロール測定方法をより一層簡便に実施することができ、また、自動化装置への適用も極めて容易することができる。
【００８５】
以下に、参考例及び実施例を用いて本発明をさらに説明する。但し、本発明は以下の実施例に限定して解釈されない。
【００８６】
なお、下記の実施例において、以下の略語を使用する。
ＣＨＤＨ：コレステロールデヒドロゲナーゼ（商品名：ＣＨＤＨ“Ａｍａｎｏ”５、天野エンザイム製）
Ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ：ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（商品名：ＤｉａｐｈｏｒａｓｅＩ、ユニチカ製）
ＢＥＳ  ：Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（同仁化学製）
ＣＥ    ：コレステロールエステラーゼ（商品名：ＣＯＥ−３１１、東洋紡製）
ＭＴＴ  ：３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（同仁化学製）
ＢＳＡ  ：ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ製）
ＮＡＤ  ：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリエンタル酵母製）
【実施例】
【００８７】
（参考例１）
下記表１に示す試薬１−１〜１−４及び試薬２を用いて試料中のＬＤＬコレステロールの測定を行った。試料としては、ヒト血清から超遠心分画法により回収したＶＬＤＬ及びＬＤＬを、リポタンパク質を含まないヒト血清に添加し、それを試薬１−３で２０倍希釈したものを使用した（ＬＤＬ濃度：８３ｍｇ／ｄｌ、ＶＬＤＬ濃度：６１ｍｇ／ｄＬ）。【００８８】
試料２０μＬに試薬１−１  ９０μＬ、試薬１−２  ３０μＬ及び試薬１−４  １５μＬを順番に加え、３７℃で２４０秒間反応させた。ついで、下記表２に示す界面活性剤を含む試薬２  １５μＬを加え、汎用自動分析装置（商品名：ＢｉｏＭａｊｅｓｔｙ−８、日本電子社製）を用いて吸光度を測定し、ＬＤＬコレステロール測定値を得た。その結果を下記表２に示す。【００８９】
【表１】
2012057333.tif 000003
【００９０】
【表２】
2012057333.tif 000004
【００９１】
上記表２に示すように、試薬２の界面活性剤としてＨＬＢが１２．６のポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ＨＬＢが１２．８のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル又はＨＬＢが１２．７のポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルを使用した場合、得られたＬＤＬ測定値はいずれも検定値（８３ｍｇ／ｄｌ）からの乖離が小さかった。また、ＬＤＬ濃度が高い試料（ＬＤＬ濃度：１４１ｍｇ／ｄＬ）であっても同様に検定値からの乖離が小さかった(data not shown)。したがって、ＨＬＢが１２．６のポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ＨＬＢが１２．８のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル又はＨＬＢが１２．７のポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルを用いることによって、界面活性剤Ａ１の存在下でＬＤＬを選択的に可溶化できることがわかった。【００９２】
（参考例２）
試薬２の界面活性剤として、ＨＬＢが１２．８のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル（商品名：エマルゲンＡ６０、花王株式会社製、濃度８重量％（終濃度：０.７１重量％））を用い、下記表３に示す組成の試料ａ〜ｆを用いて、参考例１と同様に吸光度の測定を行った。その結果を図１に示す。なお、図１において、縦軸は吸光度を示し、横軸は測定時間を示し、１Ｐｔ．は９秒を意味する。【００９３】
【表３】
2012057333.tif 000005
【００９４】
図１に示すように、ＶＬＤＬ濃度が１００ｍｇ／ｄＬ未満の試料ｃ及びｄでは、界面活性剤Ａ１及び界面活性剤Ｂ１の存在下で酵素反応させることによって、ＬＤＬを選択的に可溶化できることが確認された。一方、ＶＬＤＬ濃度が１００ｍｇ／ｄＬを超える試料ｅ及びｆでは、測定時間の経過とともにＬＤＬのみならずＶＬＤＬが可溶化されることが確認された。【００９５】
（参考例３）
下記表４に示す試薬１−１〜１−４を用いて試料中のＨＤＬコレステロールの消去処理を行った。ヒト血清から超遠心分画法により回収し、適宜濃度に濃縮したＨＤＬ標品を、生理食塩水に添加したもの（ＨＤＬ濃度：１６０ｍｇ／ｄｌ）を試料として使用した。【００９６】
試料に試薬１−１、試薬１−２及び試薬１−４を順番に加え、３７℃で２４０秒間反応させた後、汎用自動分析装置（商品名：ＢｉｏＭａｊｅｓｔｙ−８、日本電子社製）を用いて吸光度を測定し、ＨＤＬコレステロール測定値を得た。その結果を図２Ａに示す。【００９７】
また、ＨＤＬ消去処理の際のＬＤＬの可溶化の有無を確認するために、ヒト血清から超遠心分画法により回収し、適宜濃度に濃縮したＬＤＬ標品を、生理食塩水に添加したもの（ＬＤＬ濃度：３４７ｍｇ／ｄＬ）を試料として使用し、ＬＤＬコレステロール測定を行った以外は、上記と同様の測定を行った。その結果を図２Ｂに示す。【００９８】
【表４】
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【００９９】
図２Ａは、各種濃度の界面活性剤Ａ２（終濃度：０、０．０２、０．０４、０．０６、及び０．１１重量％）を用いてＨＤＬの消去処理を行った結果の一例を示すグラフであり、図２Ｂは、各種濃度の界面活性剤Ａ２を用いてＬＤＬの可溶化の有無を行った結果の一例を示すグラフである。図２Ａ及びＢにおいて、縦軸は吸光度を示し、横軸は測定時間を示す。なお、図２Ａ及びＢにおいて１Ｐｔ．は９秒を意味する。図２Ａに示すように、界面活性剤Ａ１及びＡ２の存在下でＨＤＬを含む試料を酵素処理することにより、試料に含まれるＨＤＬのほとんどを酵素と反応させて消去することができた。また、図２Ｂに示すように、界面活性剤Ａ１及びＡ２の存在下ではＬＤＬの可溶化は十分抑制され、特に界面活性剤の添加濃度が０．３重量％（終濃度：０．０６重量％）であれば、より効果的にＬＤＬの可溶化を抑制できた。【０１００】
（参考例４）
試薬１−２の界面活性剤の添加濃度を０．３重量％（終濃度：０．０５３重量％）とし、試料としてヒト血清（ＨＤＬ：６８ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ：９３ｍｇ／ｄＬ）にＴＧ（５０〜１２００ｍｇ／ｄＬ）又はＶＬＤＬ（０〜１２５ｍｇ／ｄＬ）を添加し、それを試薬１−３で希釈したもの（ＨＤＬ：６８ｍｇ／ｄＬ、ＴＧ：５０〜１２００ｍｇ／ｄＬ、ＶＬＤＬ：０〜１２５ｍｇ／ｄＬ）を使用した以外は参考例３と同様にして、ＨＤＬを酵素と反応させてＨＤＬの消去処理を行った。その結果を図３に示す。【０１０１】
図３Ａ及びＢは、界面活性剤Ａ１及びＡ２の存在下でＨＤＬの消去処理を行った結果の一例を示すグラフであり、図３ＡはＨＤＬとＴＧとを含む試料を用いた結果の一例であり、図３ＢはＨＤＬとＶＬＤＬとを含む試料を用いた結果の一例である。図３Ａ及びＢにおいて、縦軸はＴＧ又はＶＬＤＬを含まない試料により得られたＨＤＬ測定値との差を示し、横軸はＴＧ又はＶＬＤＬの濃度を示す。図３Ａ及びＢに示すように、界面活性剤Ａ１及びＡ２の存在下でＨＤＬを酵素反応させる際、ＴＧ及びＶＬＤＬの可溶化は十分抑制されていた。【０１０２】
（実施例１）
上記表１に示す試薬１−１〜１−４と、界面活性剤Ｂ１（ＨＬＢが１２．８のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、商品名：エマルゲンＡ６０、花王株式会社製、濃度８重量％）及び下記表５に示す界面活性剤（いずれか一つ）を含む試薬２（３種類）とを用いてＬＤＬコレステロールの測定を行った。その結果を図４Ａ及びＢに示す。【０１０３】
ＬＤＬコレステロールの測定は、参考例１と同様の方法で行った。ＨＬＢが１２．８のポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルの濃度は、８重量％とした（反応系での終濃度：０．７１重量％）。下記表５に示す界面活性剤の濃度は、０重量％、０．１重量％、０．２重量％又は０．４重量％とした。試料としては、ＬＤＬのみの試料（ＬＤＬ濃度：５０ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬとＶＬＤＬを含む試料（ＬＤＬ濃度：５２ｍｇ／ｄＬ、ＶＬＤＬ：１５６ｍｇ／ｄＬ）の２種類の試料を準備した。【０１０４】
【表５】
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【０１０５】
図４Ａは、ＨＬＢが１６．９のポリオキシエチレンラウリルエーテルを用いた結果の一例を示すグラフであり、図４Ｂは、ＨＬＢが１８．９のポリオキシエチレンミリスチルエーテルを用いた結果の一例を示すグラフである。図４において、縦軸は吸光度を示し、横軸は測定時間を示す。なお、図４において１Ｐｔ．は９秒を意味する。【０１０６】
図４Ａ及びＢに示すように、ＨＬＢが１６．９のポリオキシエチレンラウリルエーテル又はＨＬＢが１８．９のポリオキシエチレンミリスチルエーテルを添加することによって、測定時間の経過に伴う吸光度の上昇が抑制された。ポリオキシエチレン（３５−４０）オクチルフェニルエーテルを用いた場合も、同様の傾向が得られた(data not shown)。このため、界面活性剤Ｂ２であるこれらの界面活性剤を添加することによって、ＶＬＤＬの可溶化を抑制し、ＬＤＬを選択的に可溶化して測定できることが確認できた。したがって、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ｂ１及び界面活性剤Ｂ２の存在下で酵素反応させることによって、ＬＤＬを選択的に可溶化し、ＬＤＬコレステロールを選択的に測定できた。【０１０７】
図４Ａ及びＢに示すように、ＨＬＢが１６．９のポリオキシエチレンラウリルエーテル又はＨＬＢが１８．９のポリオキシエチレンミリスチルエーテルの濃度が０．２重量％（反応液中の終濃度：０．０１８重量％）である場合、ＶＬＤＬを含まない試料（図４Ａ及びＢにおける白四角）と同様の挙動を示した。ポリオキシエチレン（３５−４０）オクチルフェニルエーテルを用いた場合も、同様の傾向が得られた。このため、本条件の場合、これらの界面活性剤の最適濃度は０．２重量％（反応液中の終濃度：０．０１８重量％）であることがわかった。【０１０８】
（実施例２）
上記表１に示す試薬１−１〜１−４と、下記表６に示す組成の試薬（試薬２）を使用し、参考例１と同様にＬＤＬコレステロールの測定を行った。その結果を図５Ａ〜Ｃに示す。なお、界面活性剤Ｂ３の濃度は、０％、０．３０重量％（反応液中の終濃度：０．０２６重量％）又は０．６０重量％（反応液中の終濃度：０．０５３重量％）とした。試料は、ＬＤＬ濃度が５１ｍｇ／ｄＬである試料（ＶＬＤＬ濃度：０ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬ濃度が１３６ｍｇ／ｄＬである試料（ＶＬＤＬ濃度：０ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬ濃度が４９ｍｇ／ｄＬでありＶＬＤＬ濃度が１５６ｍｇ／ｄＬである試料を使用した。【０１０９】
【表６】
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【０１１０】
図５Ａは、ＬＤＬ濃度が１３６ｍｇ／ｄＬである試料を用いた結果の一例を示すグラフであり、図５Ｂは、ＬＤＬ濃度が５１ｍｇ／ｄＬである試料を用いた結果の一例を示すグラフであり、図５Ｃは、ＬＤＬ濃度が４９ｍｇ／ｄＬでありＶＬＤＬ濃度が１５６ｍｇ／ｄＬである試料を用いた結果の一例を示すグラフである。図５Ａ〜Ｃにおいて、縦軸は吸光度を示し、横軸は測定時間を示し、また１Ｐｔ．は９秒を意味する。【０１１１】
図５Ａ〜Ｃに示すように、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム又はラウリルベンゼン硫酸ナトリウムを添加することにより、ＬＤＬの可溶化を促進できることが確認できた。したがって、界面活性剤Ａ１、界面活性剤Ｂ１、界面活性剤Ｂ２及び界面活性剤Ｂ３の存在下で酵素反応させることによって、ＬＤＬコレステロールを選択的かつ効率よく測定できることが確認された。【０１１２】
（実施例３）
下記表７に示す試薬１−１〜１−４及び試薬２を用い、試料としてルーチン検査検体を用いた以外は、参考例１と同様にＬＤＬコレステロールの測定を行い、その測定値を市販のＬＤＬコレステロール測定用試薬の測定値と比較した。その結果を図６Ａ及びＢに示す。市販の測定用試薬としては、デタミナーＬＤＬ（商品名、協和メデックス製）、コレテストＬＤＬ（商品名、積水メディカル製）を使用した。なお、ルーチン検査検体とは、検査センターや院内の検査室で日常的に取り扱われる実検体のことをいう。【０１１３】
【表７】
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【０１１４】
図６Ａは、デタミナーＬＤＬ（商品名、協和メデックス製）との相関関係の一例を示すグラフであり、図６Ｂは、コレテストＬＤＬ（商品名、積水メディカル製）との相関関係の一例を示すグラフである。図６Ａ及びＢにおいて、縦軸が実施例３のＬＤＬコレステロール測定値であり、横軸は市販のコレステロール測定用試薬のＬＤＬコレステロール測定値である。【０１１５】
図６Ａ及びＢに示すように、実施例３の試薬を用いたＬＤＬコレステロールの測定値と市販のコレステロール測定用試薬の測定値とは良好な相関関係を示し、デタミナーＬＤＬの測定値との相関係数は０．９７９９であり、コレテストＬＤＬの測定値との相関係数は０．９７９４であった。したがって、本発明のＬＤＬコレステロール測定方法は、市販のＬＤＬ測定用試薬と同等の精度でＬＤＬコレステロールを測定できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明の試料分析方法は、例えば、医療分野、臨床検査の分野等の様々な分野に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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