(57)【要約】  感度及び特異性高く、肝細胞癌のリスクを評価することができる方法を提供することを目的とし、正常肝臓組織サンプルと、肝細胞癌患者由来の非癌肝臓組織サンプルとの間で有意にＤＮＡメチル化レベルの異なるＣｐＧサイト４５箇所を含む、３０領域を抽出した。抽出した３０領域において、正常肝臓組織サンプルと、ＨＣＣ患者由来の非癌肝臓組織サンプルとを判別するためのカットオフ値を設定することで、ＨＣＣ癌患者由来の非癌肝臓組織サンプルにおける肝細胞癌のリスクを評価することができることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、肝細胞癌のリスクを評価する方法
（ａ）被験体の肝臓組織由来のゲノムＤＮＡを調製する工程、
（ｂ）工程（ａ）で調製したゲノムＤＮＡについて、下記ＣｐＧサイト群から選択される少なくとも１つのサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で検出したＤＮＡメチル化レベルから、前記被験体が癌高リスク群に分類されるか否かを決定する工程、
ＣｐＧサイト群：基準ヒトゲノム配列であるＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３６．１アセンブリ上の位置が、１番染色体  ３１，０５２，８２９、１番染色体  ３１，０９３，１３０、１番染色体  ３１，０９３，１４０、１番染色体  ３１，０９３，１４５、１番染色体  ３１，１５３，４８６、１番染色体  ３１，１５３，４９７、１番染色体  ３１，１７５，４４３、１番染色体  ４７，６７７，６５４、１番染色体  ４７，６７７，６６０、１番染色体  ４７，６７７，６６３、１番染色体  １２０，０７１，０９３、２番染色体  ２３５，２８９，８８６、５番染色体  １５１，７０９，９４６、７番染色体  ４４，３１５，８０６、７番染色体  ４４，３１５，８１０、１１番染色体  ３，６１７，３６３、１１番染色体  ３，７２４，６３３、１１番染色体  ３，７２４，６５０、１１番染色体  １１８，７１６，２２１、１１番染色体  １１８，７９８，００５、１１番染色体  １３２，０９４，２５０、１１番染色体  １３２，０９４，２５４、１１番染色体  １３２，０９４，２５６、１１番染色体  １３２，０９４，２５９、１１番染色体  １３２，１４３，８９７、１１番染色体  １３２，１８６，６０２、１２番染色体  ５，１９０，２３７、１２番染色体  ５，２３９，７７０、１２番染色体  ５，２３９，７７８、１２番染色体  ５０，６０１，２１７、１２番染色体  ５０，６８７，０１０、１２番染色体  ５０，６８７，０１３、１２番染色体  ５５，６８１，３９３、１２番染色体  ５５，７３２，３８１、１２番染色体  ５５，７３２，３９１、１６番染色体  ４，５３８，４３５、１６番染色体  ４，５６４，８４６、１６番染色体  ４，６４２，７２６、１６番染色体  ４，６５５，１８１、１６番染色体  ４，６７２，９６１、１９番染色体  ４，９９９，４５８、１９番染色体  ４，９９９，４６８、１９番染色体  ４，９９８，７４４、１９番染色体  ５，０９９，１６６、又は１９番染色体  ５，０９９，１７１であるＣｐＧサイト。
【請求項２】
工程（ｂ）が、工程（ａ）で調製したゲノムＤＮＡについて、前記ＣｐＧサイト群全てのサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出する工程である、請求項１に記載の方法
【請求項３】
前記ＤＮＡメチル化レベルをパイロシークエンシング法によって検出する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法に用いるための、少なくとも１５塩基の鎖長を有する、下記（ａ）〜（ｂ）に記載のいずれかであるオリゴヌクレオチド
（ａ）前記ＣｐＧサイト群から選択される少なくとも１つのサイトを挟み込むように設計された一対のプライマーであるオリゴヌクレオチド
（ｂ）前記ＣｐＧサイト群から選択される少なくとも１つのサイトを含む塩基配列にハイブリダイズするプライマー又はプローブであるオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡメチル化レベルを検出することを含む、肝細胞癌のリスクを評価する方法に関する。また、本発明は、前記評価方法に用いられるプライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞癌（ＨＣＣ）は世界的に知られている悪性腫瘍であり、その主要な発生要因は肝炎ウィルスの感染であることが明らかになっている。そのため、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）に対しては集団予防接種が行われているが、主にアジア及びアフリカにおいて、ＨＢＶ発症年齢は５０歳以上であるため、ＨＢＶが関連する肝癌発症は今後も長年に渡り撲滅できないことが危惧されている（非特許文献１）。また、１９５０年代及び１９６０年代に生じた日本におけるＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）の拡大は、１９８０年代からのＨＣＣ羅患率の急激な増加をもたらし（非特許文献２）、さらに近年、アメリカを含む他の国々においてもＨＣＶの感染は急速に広まっている。【０００３】
また前述の通り、ＨＣＣは肝炎ウィルス感染に関連した慢性肝炎又は肝硬変を患っている患者において通常発症する。しかも、その患者の殆どにおいて、ＨＣＣが発症した段階では既に肝機能が低下しているため、早期に癌と診断されない限り良好な治療成績は期待できない。そのため、慢性肝炎や肝硬変といった前癌状態のサーベイランス（経過観察）は優先して行われるべきであると考えられており、臨床診療において、たとえ自覚症状がなくとも、高いＨＣＣ発生リスクのある患者には特に密なサーベイランスをして早期にＨＣＣを発見し、手術療法等を行うべきであるとされている。しかし、逆にＨＣＣ発生リスクのない患者にとっては密なサーベイランスは過度な負担になるため、ＨＣＣ発生のリスク評価は、慢性肝炎や肝硬変といった慢性肝障害の患者の管理に不可欠であるとして、その評価の開発が望まれている。【０００４】
一方、ヒト多段階発癌において観察される、最も一貫しているエピジェネティックな変化の中にＤＮＡメチル化の変化がある（非特許文献３〜４）。累積している過去の研究成果等から、ＤＮＡメチル化の変化は初期及び前癌段階においても関与していることが示唆されている（非特許文献５〜６）。ＨＣＣ発生に関しても、ＤＮＡメチル化転移酵素のスプライシング及び／又は発現の異常に関連したＤＮＡメチル化の変化は、ＨＣＣ患者から得られた慢性肝炎又は肝硬変が見られる肝臓組織において既に存在していることが明らかになっている（非特許文献７〜１１）。【０００５】
また、癌細胞又は前駆細胞の微小環境に影響を受け易いｍＲＮＡ及びタンパク質の発現とは異なり、ＤＮＡメチル化の変化は、共有結合によってＤＮＡ二重鎖上に安定的に保存されているため、前癌状態におけるわずかな変化でさえ高感度に検出することができるという特性を有している。それゆえ、ＤＮＡメチル化の変化は発癌リスクの評価の最適な指標になることが期待されている（非特許文献１２〜１３）。実際、本発明者らは、全染色体における広範な領域の個々のＤＮＡメチル化傾向の概要を提供することができる、ＢＡＣアレイを基盤とするメチル化ＣｐＧアイランド増幅法（ＢＡＭＣＡ法、非特許文献１３及び１９）を用いて、ＨＣＣ以外の患者から得た正常な肝臓組織と、学習コホートのＨＣＣ患者から得た非癌肝臓組織とを判別することができるＤＮＡメチル化状態を示す２５ＢＡＣクローンを同定した（非特許文献１８）。そして、本発明者らは、これらのＢＡＣクローン上でのＤＮＡメチル化の有無を、ＨＣＣ発生のリスクを評価するための指標として用いることを提案した（特許文献１、非特許文献１４〜１９）。【０００６】
しかしながら、前記指標に関しては、ＢＡＣクローンに挿入されているＤＮＡの平均サイズが１７０ｋｂｐであり、診断能力の高いメチル化ＣｐＧサイトが同定されていなかったため、発癌リスクの評価に多量のゲノムＤＮＡが必要となってしまう。また、かかる分析にＢＡＭＣＡ法を用いるとなると高いコストを要するため、実際の診断に前記指標を適用することは困難であった。さらに、実際の診断への適用を考慮した場合、発癌リスクの評価に用いられる指標としては、前記ＢＡＣクローンを用いた指標よりも高い感度や特異性（望ましくは、１００％）を有していることが好ましいと考えられる。【０００７】
このように、極めて感度及び特異性高くＨＣＣのリスクを予測することのできる方法、さらにはごく少量の患者由来のゲノムＤＮＡを用いて、コストを抑えながら、極めて感度及び特異性高くＨＣＣのリスクを予測することのできる方法が希求されてはいるものの、実用化されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−１４８４２６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃｈａｎｇ  ＭＨら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、１９９７年、３３６巻、１８５５〜９ページ
【非特許文献２】Ｔａｎａｋａ  Ｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００２年、９９巻、１５５８４〜９ページ
【非特許文献３】Ｊｏｎｅｓ  ＰＡら、Ｃｅｌｌ、２００７年、１２８巻、６８３〜９２ページ
【非特許文献４】Ｓｈａｒｍａ  Ｓら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、２００９年、３１巻、２７〜３６ページ
【非特許文献５】Ｋａｎａｉ  Ｙら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、２００７年、２８巻、２４３４〜４２ページ
【非特許文献６】Ｋａｎａｉ  Ｙら、Ｐａｔｈｏｌ  Ｉｎｔ、２００８年、５８巻、５４４〜５８ページ
【非特許文献７】Ｋａｎａｉ  Ｙら、Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１９９６年、８７巻、１２１０〜７ページ
【非特許文献８】Ｋｏｎｄｏ  Ｙら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２０００年、３２巻、９７０〜９ページ
【非特許文献９】Ｋａｎｅｔｏ  Ｈら、Ｇｕｔ、２００１年、４８巻、３７２〜７ページ
【非特許文献１０】Ｓａｉｔｏ  Ｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００２年、９９巻、１００６０〜５ページ
【非特許文献１１】Ｓａｉｔｏ  Ｙら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、２００３年、１０５巻、５２７〜３２ページ
【非特許文献１２】Ｋａｎａｉ  Ｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ、２００９年、１０１巻、３６〜４５ページ
【非特許文献１３】Ａｒａｉ  Ｅら、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ、２０１０年、２巻、４６７〜８１ページ
【非特許文献１４】Ｍｉｓａｗａ  Ａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００５年、６５巻、１０２３３〜４２ページ
【非特許文献１５】Ｓｕｇｉｎｏ  Ｙら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００７年、２６巻、７４０１〜１３ページ
【非特許文献１６】Ｔａｎａｋａ  Ｋら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００７年、２６巻、６４５６〜６８ページ
【非特許文献１７】Ａｒａｉ  Ｅら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、２００９年、３０巻、２１４〜２１ページ
【非特許文献１８】Ａｒａｉ  Ｅら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、２００９年、１２５巻、２８５４〜６２ページ
【非特許文献１９】Ｎｉｓｈｉｙａｍａ  Ｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ、２０１０年、１０１巻、２３１〜４０ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、感度及び特異性高く、肝細胞癌のリスクを評価することができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＢＡＭＣＡ法によって既に同定した、肝細胞癌（ＨＣＣ）の発生リスクを反映するＤＮＡメチル化の変化を示す２５のＢＡＣクローン領域上のＸｍａＩ／ＳｍａＩ制限酵素認識部位２０３箇所におけるＤＮＡメチル化状態を、パイロシークエンシング法により再評価した。正常肝臓組織サンプルと、ＨＣＣ患者由来の非癌肝臓組織サンプルとの間で有意にＤＮＡメチル化レベルの異なるＣｐＧサイト４５箇所を含む、３０領域を抽出した。抽出した３０領域において、正常肝臓組織サンプルと、ＨＣＣ患者由来の非癌肝臓組織サンプルとを判別するためのカットオフ値を設定することで、ＨＣＣ癌患者由来の非癌肝臓組織サンプルを、感度及び特異性高く、発癌高リスク状態にあると評価することができた。【００１２】
また、病理組織診断に際して、生検用に採取された組織は、通常ホルマリン固定及びパラフィン包埋が施され、該組織中のＤＮＡは剪断化されるため、ＰＣＲ法・パイロシークエンシング法における反応が阻害される場合がある。そこで、本発明者らは、前記３０領域の中から、前記反応阻害を受けにくく、ホルマリン固定及びパラフィン包埋が施された組織においても、感度及び特異性高く、肝細胞癌の発生リスクを評価することができる１５領域を見出した。【００１３】
さらに、ＨＣＣ患者由来の非癌肝臓組織において、前記カットオフ値に基づく指標をみたす領域数と、ＨＣＣ患者の予後（無再発生存率（ｃａｎｃｅｒ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｒａｔｅ）及び全生存率（ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｒａｔｅ））との間に相関があることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１４】
本発明は、より詳しくは、以下のものである。
（１）  下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、肝細胞癌のリスクを評価する方法
（ａ）被験体の肝臓組織由来のゲノムＤＮＡを調製する工程、
（ｂ）工程（ａ）で調製したゲノムＤＮＡについて、下記ＣｐＧサイト群から選択される少なくとも１つのサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で検出したＤＮＡメチル化レベルから、前記被験体が癌高リスク群に分類されるか否かを決定する工程、
ＣｐＧサイト群：基準ヒトゲノム配列であるＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３６．１アセンブリ上の位置が、１番染色体  ３１，０５２，８２９、１番染色体  ３１，０９３，１３０、１番染色体  ３１，０９３，１４０、１番染色体  ３１，０９３，１４５、１番染色体  ３１，１５３，４８６、１番染色体  ３１，１５３，４９７、１番染色体  ３１，１７５，４４３、１番染色体  ４７，６７７，６５４、１番染色体  ４７，６７７，６６０、１番染色体  ４７，６７７，６６３、１番染色体  １２０，０７１，０９３、２番染色体  ２３５，２８９，８８６、５番染色体  １５１，７０９，９４６、７番染色体  ４４，３１５，８０６、７番染色体  ４４，３１５，８１０、１１番染色体  ３，６１７，３６３、１１番染色体  ３，７２４，６３３、１１番染色体  ３，７２４，６５０、１１番染色体  １１８，７１６，２２１、１１番染色体  １１８，７９８，００５、１１番染色体  １３２，０９４，２５０、１１番染色体  １３２，０９４，２５４、１１番染色体  １３２，０９４，２５６、１１番染色体  １３２，０９４，２５９、１１番染色体  １３２，１４３，８９７、１１番染色体  １３２，１８６，６０２、１２番染色体  ５，１９０，２３７、１２番染色体  ５，２３９，７７０、１２番染色体  ５，２３９，７７８、１２番染色体  ５０，６０１，２１７、１２番染色体  ５０，６８７，０１０、１２番染色体  ５０，６８７，０１３、１２番染色体  ５５，６８１，３９３、１２番染色体  ５５，７３２，３８１、１２番染色体  ５５，７３２，３９１、１６番染色体  ４，５３８，４３５、１６番染色体  ４，５６４，８４６、１６番染色体  ４，６４２，７２６、１６番染色体  ４，６５５，１８１、１６番染色体  ４，６７２，９６１、１９番染色体  ４，９９９，４５８、１９番染色体  ４，９９９，４６８、１９番染色体  ４，９９８，７４４、１９番染色体  ５，０９９，１６６、又は１９番染色体  ５，０９９，１７１であるＣｐＧサイト。
（２）  工程（ｂ）が、工程（ａ）で調製したゲノムＤＮＡについて、前記ＣｐＧサイト群全てのサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出する工程である、（１）に記載の方法。
（３）  前記ＤＮＡメチル化レベルをパイロシークエンシング法によって検出する、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）  （１）〜（３）のいずれかに記載の方法に用いるための、少なくとも１５塩基の鎖長を有する、下記（ａ）〜（ｂ）に記載のいずれかであるオリゴヌクレオチド
（ａ）前記ＣｐＧサイト群から選択される少なくとも１つのサイトを挟み込むように設計された一対のプライマーであるオリゴヌクレオチド
（ｂ）前記ＣｐＧサイト群から選択される少なくとも１つのサイトを含む塩基配列にハイブリダイズするプライマー又はプローブであるオリゴヌクレオチド。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、感度及び特異性高く、肝細胞癌のリスクを評価することができる方法を提供することが可能となる。さらに、本発明においては、ＢＡＭＣＡ法により肝細胞癌の発生リスク等を評価する際と比して、該評価に必要な肝臓組織由来のゲノムＤＮＡの量は通常５００分の１〜１７分の１であり、コストも通常２００分の１〜７分の１であるので、本発明によれば、比較的少量の患者由来のゲノムＤＮＡを用いて、コストを抑えながら、極めて感度及び特異性高くＨＣＣのリスクを予測することのできる方法を提供することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】パイロシークエンシング法によるＤＮＡメチル化分析の結果の例を示す、パイログラムである。なお図中、「Ｃ６」はＨＣＣ以外の患者由来の正常肝臓組織サンプルのＦＯＸＤ２遺伝子エクソン１（３番染色体  ４７，６７７，６５４，−６０，−６３、表４に示す領域５  参照）についてのＤＮＡメチル化分析の結果を示し、「Ｎ９」はＨＣＣ患者由来の非癌肝臓組織サンプルのＦＯＸＤ２遺伝子エクソン１についてのＤＮＡメチル化分析の結果を示す。また、灰色のカラムが付されている領域は、バイサルファイト修飾後に多型となっていることを示す。さらに、横軸はｄｉｓｐｅｎｓａｔｉｏｎ  ｏｒｄｅｒ（ｄＮＴＰを添加する順序）を示す。また図中の数値（％）は各々のサイトにおけるＤＮＡメチル化レベル（率）を示す。
【図２】パイロシークエンシング法により、ＢＡＭＣＡ法による分析結果を再度検証した結果の例を示す、ＢＡＣクローンの概略図及び散布図である。なお図中、ＢＡＣクローンの概略図において、ｉ〜ＸはＲＰ１１−１７Ｍ１７  ＢＡＣクローン上の、ＢＡＭＣＡ法で有効に評価される２０００ｂｐ以下のＰＣＲ産物を生ずる、ＸｍａＩ／ＳｍａＩサイト１０箇所の各々の位置を示す。また、散布図は前記ＸｍａＩ／ＳｍａＩサイト１０箇所におけるＤＮＡメチル化レベルをパイロシークエンシング法により評価した結果を示す。すなわち、「Ｃ」は正常な肝臓組織サンプル（Ｃ１１〜Ｃ３５）における結果を示し、「Ｎ」は非癌肝臓組織の２２サンプル（Ｎ１３〜Ｎ３４）における結果を示し、「Ｔ」は、Ｎ１〜Ｎ３４サンプルを提供された患者から手術で摘出した標本から得た、原発性ＨＣＣサンプル（Ｔ１〜Ｔ３４）における結果を示す。
【図３】Ｃサンプル（Ｃ１〜Ｃ１０）及びＮサンプル（Ｎ１〜Ｎ１２）における、各ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを示す円グラフである。なお図中、ｉ’、ｉｉｉ’、ｉｖ’、ｖｉｉ’、及びｉｘ’は各々、同一のシークエンシングプライマーを用いて定量的にシークエンスした、ＸｍａＩ／ＳｍａＩサイト（ｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖｉｉ、及びｉｘ）近傍のＣｐＧサイトであることを示す。また円グラフ中黒で表わされているのはメチル化されたシトシンの割合を示し、白で表わされているのはメチル化されていないシトシンの割合を示す。
【図４】パイロシークエンシング法により分析したＤＮＡメチル化レベルについての代表的な結果を示す散布図である。なお図中、「Ｃ」は正常な肝臓組織サンプル（Ｃ１〜Ｃ１０）における結果を示し、「Ｎ」は非癌肝臓組織の２２サンプル（Ｎ１〜Ｎ１２）における結果を示す。また「領域３」、「領域１４」、及び「領域２５」は、表４に示す各々の領域に対応する。さらに「ＣＶ」は各領域におけるＤＮＡメチル化レベルに基づきＮサンプルとＣサンプルを判別することのできるカットオフ値を示す。
【図５】Ｃサンプル（Ｃ１〜Ｃ１０）及びＮサンプル（Ｎ１〜Ｎ１２）と、各サンプルの発癌リスク評価指標（表４に示す指標）を満たす領域数との関係を示す、ヒストグラムである。なお図中、白いカラムはＣサンプルを示し、黒いカラムはＮサンプルを示す。
【図６】Ｃサンプル（Ｃ１１〜Ｃ３５）及びＮサンプル（Ｎ１３〜Ｎ３４）と、各サンプルの発癌リスク評価指標（表４に示す指標）を満たす領域数との関係を示す、ヒストグラムである。なお図中、白いカラムはＣサンプルを示し、黒いカラムはＮサンプルを示す。
【図７】Ｃサンプル（Ｃ１１〜Ｃ３５、Ｃ４４〜Ｃ６３）及びＮサンプル（Ｎ１３〜Ｎ３４、Ｎ４７〜Ｎ６９）と、各サンプルの発癌リスク評価指標（表４に記載の指標）を満たす領域数との関係を示す、ヒストグラムである。なお図中、白いカラムはＣサンプルを示し、黒いカラムはＮサンプルを示す。
【図８】ＨＣＣ患者群（Ｎ１〜Ｎ３４）の生存曲線をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法によって算出し、前癌状態におけるＤＮＡメチル化状態と、ＨＣＣ患者の予後（無再発生存率）との相関を示すグラフである。なお図中、実線は表４に示す指標を満たす領域数が２３以上であるＨＣＣ患者（ｎ＝１７）を示し、点線は表４に示す指標を満たす領域数が２３未満であるＨＣＣ患者（ｎ＝１７）を示す。また、横軸はＨＣＣ患者に肝切除を施してからの術後日数を示す。
【図９】ＨＣＣ患者群（Ｎ１〜Ｎ３４）の生存曲線をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法によって算出し、前癌状態におけるＤＮＡメチル化状態と、ＨＣＣ患者の予後（全生存率）との相関を示すグラフである。なお図中、実線は表４に示す指標を満たす領域数が２３以上であるＨＣＣ患者（ｎ＝１７）を示し、点線は表４に示す指標を満たす領域数が２３未満であるＨＣＣ患者（ｎ＝１７）を示す。また、横軸はＨＣＣ患者に肝切除を施してからの術後日数を示す。
【図１０】サーベイランス期間中に採取される肝生検の模擬標本（肝部分切除術標本から採取した模擬肝生検標本（疑似針生検標本））を対象とする、パイロシークエンシングによるＤＮＡメチル化分析方法の概略を示す図である。
【図１１】正常な肝臓組織由来の疑似針生検標本（Ｃ３６〜Ｃ４３及びＣ６４〜Ｃ７４）並びに非癌肝臓組織由来の疑似針生検標本（Ｎ３５〜Ｎ４６、Ｎ７０及びＮ７１）と、表４に記載の１５領域（領域１〜５、１４、１６、１８、１９、２１、２３、２５〜２８）のうち、各疑似針生検標本の発癌リスク評価指標（表４に記載の指標）を満たす領域数との関係を示す、ヒストグラムである。なお図中、白いカラムはＣサンプルを示し、黒いカラムはＮサンプルを示す。
【図１２】ＨＣＣ患者（Ｎ３５〜Ｎ３８）から採取して調製した非癌肝臓組織（疑似針生検標本又はバルク組織）における、表４に記載の領域２のＤＮＡメチル化レベル（率）と、採取した非癌肝臓組織の腫瘍（肝細胞癌の病巣）からの距離との関係を示すグラフである。
【図１３】ＨＣＣ患者（Ｎ３５〜Ｎ３８）から採取して調製した非癌肝臓組織（疑似針生検標本又はバルク組織）における、表４に記載の領域４のＤＮＡメチル化レベル（率）と、採取した非癌肝臓組織の腫瘍（肝細胞癌の病巣）からの距離との関係を示すグラフである。
【図１４】ＨＣＣ患者（Ｎ３９及びＮ４０）から採取して調製した非癌肝臓組織（疑似針生検標本又はバルク組織）における、表４に記載の領域：１〜５、１４、１６、１８、１９、２１、２３、２５〜２８のＤＮＡメチル化レベル（率）を示すグラフである。
【図１５】正常な肝臓組織由来のバルク組織（Ｃ１〜Ｃ３５及びＣ４４〜Ｃ６３）並びに非癌肝臓組織由来のバルク組織（Ｎ１〜Ｎ３４、Ｎ４４〜Ｎ６６）と、表４に記載の１５領域（領域１〜５、１４、１６、１８、１９、２１、２３、２５〜２８）のうち、各バルク組織の発癌リスク評価指標（表４に記載の指標）を満たす領域数との関係を示す、ヒストグラムである。なお図中、白いカラムはＣサンプルを示し、黒いカラムはＮサンプルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、肝細胞癌のリスクを評価する方法を提供する。
（ａ）被験体の肝臓組織由来のゲノムＤＮＡを調製する工程、
（ｂ）工程（ａ）で調製したゲノムＤＮＡについて、下記ＣｐＧサイト群から選択される少なくとも１つのサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で検出したＤＮＡメチル化レベルから、前記被験体が癌高リスク群に分類されるか否かを決定する工程。
【００１８】
本発明において「肝細胞癌」とは、肝臓の実質である肝細胞から発生する原発性肝癌を意味し、Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＨＣＣ）とも称する。
【００１９】
本発明において「被験体」とは特に制限されることなく、例えば、健常人、Ｂ型肝炎感染者、Ｃ型肝炎感染者、慢性肝炎の患者、肝硬変の患者、肝細胞癌患者が挙げられる。また、本発明において「肝細胞癌のリスク」とは、肝細胞癌の発生リスク及び肝細胞癌の予後不良リスクを意味する。さらに、本発明において「ＣｐＧサイト」とは、シトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との間がホスホジエステル結合（ｐ）している部位のことを意味し、「ＤＮＡメチル化」とは前記ＣｐＧサイトにおいて、シトシンの５位の炭素がメチル化されている状態のことを意味する。
【００２０】
本発明において「肝臓組織由来のゲノムＤＮＡを調製」する方法としては特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。ゲノムＤＮＡを調製する公知の手法としては、例えば、フェノールクロロホルム法（肝臓組織を、タンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ）、界面活性剤（ＳＤＳ)、及びフェノールで該組織のタンパク質を変性させ、クロロホルム、エタノール等で該組織からＤＮＡを沈殿させ抽出する方法）、Ｃｌｅａｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（登録商標、ＮｅｘＴｅｃ社製）、ＡｑｕａＰｕｒｅ（登録商標、Ｂｉｏ-Ｒａｄ社製）、ＺＲ  Ｐｌａｎｔ/Ｓｅｅｄ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、ＡｑｕａＧｅｎｏｍｉｃＳｏｌｕｔｉｏｎ（登録商標、Ｍｏ  Ｂｉ  Ｔｅｃ社製）、ｐｒｅｐＧＥＭ（登録商標、ＺｙＧＥＭ社製）、ＢｕｃｃａｌＱｕｉｃｋ（登録商標、ＴｒｉｍＧｅｎ社製）を用いるＤＮＡ抽出方法が挙げられる。
【００２１】
かかる方法によりゲノムＤＮＡが調製される肝臓組織としては、後述の実施例において示す通り、本発明によれば、肝臓組織の状態（慢性肝炎及び肝硬変の段階における、肝炎ウィルス感染、炎症若しくは線維化等）又は肝細胞癌の病巣からの距離に依存せず、肝細胞癌のリスクを評価することができるため、特に制限はない。このような肝臓組織としては、生検等に際して採取したそのままの肝臓組織、生検等に際して採取した後凍結した肝臓組織、生検等に際して採取した後ホルマリン固定及びパラフィン包埋を施した肝臓組織が挙げられる。これらの肝臓組織においては、本発明の評価方法に供するまで、肝臓組織中のゲノムＤＮＡの分解等を抑制し、また後述のＤＮＡメチル化レベルを検出する工程において、より効率良くバイサルファイト処理、ＰＣＲを行えるという観点から、生検等に際して採取した後凍結した肝臓組織を用いることが望ましい。
【００２２】
また、後述の実施例において示す通り、本発明者らは、ＢＡＭＣＡ法によって既に同定した、肝細胞癌（ＨＣＣ）の発生リスクを反映するＤＮＡメチル化の変化を示す２５のＢＡＣクローン領域上のＸｍａＩ／ＳｍａＩ制限酵素認識部位２０３箇所におけるＤＮＡメチル化状態を、パイロシークエンシング法により再評価し、正常肝臓組織サンプルと、ＨＣＣ患者由来の非癌肝臓組織サンプルとの間で有意にＤＮＡメチル化レベルの異なるＣｐＧサイト４５箇所を含む、３０領域を抽出した。さらに、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを検出することにより、ＨＣＣのリスクが評価できることを示した。すなわち、本発明にかかる「ＣｐＧサイト」とは、前記４５箇所のＣｐＧサイトからなる群：基準ヒトゲノム配列であるＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３６．１アセンブリ上の位置が、１番染色体  ３１，０５２，８２９、１番染色体  ３１，０９３，１３０、１番染色体  ３１，０９３，１４０、１番染色体  ３１，０９３，１４５、１番染色体  ３１，１５３，４８６、１番染色体  ３１，１５３，４９７、１番染色体  ３１，１７５，４４３、１番染色体  ４７，６７７，６５４、１番染色体  ４７，６７７，６６０、１番染色体  ４７，６７７，６６３、１番染色体  １２０，０７１，０９３、２番染色体  ２３５，２８９，８８６、５番染色体  １５１，７０９，９４６、７番染色体  ４４，３１５，８０６、７番染色体  ４４，３１５，８１０、１１番染色体  ３，６１７，３６３、１１番染色体  ３，７２４，６３３、１１番染色体  ３，７２４，６５０、１１番染色体  １１８，７１６，２２１、１１番染色体  １１８，７９８，００５、１１番染色体  １３２，０９４，２５０、１１番染色体  １３２，０９４，２５４、１１番染色体  １３２，０９４，２５６、１１番染色体  １３２，０９４，２５９、１１番染色体  １３２，１４３，８９７、１１番染色体  １３２，１８６，６０２、１２番染色体  ５，１９０，２３７、１２番染色体  ５，２３９，７７０、１２番染色体  ５，２３９，７７８、１２番染色体  ５０，６０１，２１７、１２番染色体  ５０，６８７，０１０、１２番染色体  ５０，６８７，０１３、１２番染色体  ５５，６８１，３９３、１２番染色体  ５５，７３２，３８１、１２番染色体  ５５，７３２，３９１、１６番染色体  ４，５３８，４３５、１６番染色体  ４，５６４，８４６、１６番染色体  ４，６４２，７２６、１６番染色体  ４，６５５，１８１、１６番染色体  ４，６７２，９６１、１９番染色体  ４，９９９，４５８、１９番染色体  ４，９９９，４６８、１９番染色体  ４，９９８，７４４、１９番染色体  ５，０９９，１６６、及び１９番染色体  ５，０９９，１７１であるＣｐＧサイトからなる群から選択される少なくとも一のサイトのことである。
【００２３】
また、前記「１番染色体  ３１，０５２，８２９」等の数字は、基準ヒトゲノム配列であるＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３６．１アセンブリ上の位置を示す。表１〜３に示す通り、これらの４５箇所のＣｐＧサイトは、３０領域に分類することができる。このような３０領域の典型的な塩基配列としては、ＣｐＧサイト：１番染色体  ３１，０５２，８２９を含む領域１としては配列番号：９１に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１番染色体  ３１，０９３，１３０、１番染色体  ３１，０９３，１４０、１番染色体  ３１，０９３，１４５を含む領域２としては配列番号：９２に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１番染色体  ３１,１５３，４８６、１番染色体  ３１，１５３，４９７を含む領域３としては、配列番号：９３に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１番染色体  ３１，１７５，４４３を含む領域４としては、配列番号：９４に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１番染色体  ４７，６７７，６５４、１番染色体  ４７，６７７，６６０、１番染色体  ４７，６７７，６６３を含む領域５としては、配列番号：９５に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１番染色体  １２０，０７１，０９３を含む領域６としては、配列番号：９６に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：２番染色体  ２３５，２８９，８８６を含む領域７としては、配列番号：９７に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：５番染色体  １５１，７０９，９４６を含む領域８としては、配列番号：９８に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：７番染色体  ４４，３１５，８０６、７番染色体  ４４，３１５，８１０を含む領域９としては、配列番号：９９に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１１番染色体  ３，６１７，３６３を含む領域１０としては、配列番号：１００に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１１番染色体  ３，７２４，６３３、１１番染色体  ３，７２４，６５０を含む領域１１としては、配列番号：１０１に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１１番染色体  １１８，７１６，２２１を含む領域１２としては、配列番号：１０２に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１１番染色体  １１８，７９８，００５を含む領域１３としては、配列番号：１０３に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１１番染色体  １３２，０９４，２５０、１１番染色体  １３２，０９４，２５４、１１番染色体  １３２，０９４，２５６、１１番染色体  １３２，０９４，２５９を含む領域１４としては、配列番号：１０４に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１１番染色体  １３２，１４３，８９７を含む領域１５としては、配列番号：１０５に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１1番染色体  １３２，１８６，６０２を含む領域１６としては、配列番号：１０６に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１2番染色体  ５，１９０，２３７を含む領域１７としては、配列番号：１０７に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１２番染色体  ５，２３９，７７０、１２番染色体  ５，２３９，７７８を含む領域１８としては、配列番号：１０８に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１２番染色体  ５０，６０１，２１７を含む領域１９としては、配列番号：１０９に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１２番染色体  ５０，６８７，０１０、１２番染色体  ５０，６８７，０１３を含む領域２０としては、配列番号：１１０に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１２番染色体  ５５，６８１，３９３を含む領域２１としては、配列番号：１１１に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１２番染色体  ５５，７３２，３８１、１２番染色体  ５５，７３２，３９１を含む領域２２としては、配列番号：１１２に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１６番染色体  ４，５３８，４３５を含む領域２３としては、配列番号：１１３に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１６番染色体  ４，５６４，８４６を含む領域２４としては、配列番号：１１４に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１６番染色体  ４，６４２，７２６を含む領域２５としては、配列番号：１１５に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１６番染色体  ４，６５５，１８１を含む領域２６としては、配列番号：１１６に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１６番染色体  ４，６７２，９６１を含む領域２７としては、配列番号：１１７に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１９番染色体  ４，９９９，４５８、１９番染色体  ４，９９９，４６８を含む領域２８としては、配列番号：１１８に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１９番染色体  ４，９９８，７４４を含む領域２９としては、配列番号：１１９に記載の塩基配列が挙げられ、ＣｐＧサイト：１９番染色体  ５，０９９，１６６、１９番染色体  ５，０９９，１７１を含む領域３０としては、配列番号：１２０に記載の塩基配列が挙げられる。
【００２４】
本発明においては前記４５箇所のＣｐＧサイトのうち少なくとも一のサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを検出すれば良いが、発癌リスクの評価における、感度又は特異性をより向上させることができるという観点から、感度及び特異性が１００％であるＣｐＧサイト：１６番染色体  ４，６４２，７２６、１６番染色体  ４，６７２，９６１、１９番染色体  ４，９９９，４５８、及び１９番染色体  ４，９９９，４６８におけるＤＮＡメチル化レベルを検出することが好ましく、感度及び／又は特異性が１００％であるＣｐＧサイト：１番染色体  ３１，１７５，４４３、１番染色体  １２０，０７１，０９３、１１番染色体  ３，６１７，３６３、１１番染色体  ３，７２４，６３３、１１番染色体  ３，７２４，６５０、１１番染色体  １１８，７１６，２２１、１１番染色体  １３２，０９４，２５０、１１番染色体  １３２，０９４，２５４、１１番染色体  １３２，０９４，２５６、１１番染色体  １３２，０９４，２５９、１１番染色体  １３２，１４３，８９７、１２番染色体  ５，２３９，７７０、１２番染色体  ５，２３９，７７８、１２番染色体  ５５，６８１，３９３、１２番染色体  ５５，７３２，３８１、１２番染色体  ５５，７３２，３９１、１６番染色体  ４，５３８，４３５、１６番染色体  ４，５６４，８４６、１６番染色体  ４，６４２，７２６、１６番染色体  ４，６５５，１８１、１６番染色体  ４，６７２，９６１、１９番染色体  ４，９９８，７４４、１９番染色体  ４，９９９，４５８、及び１９番染色体  ４，９９９，４６８におけるＤＮＡメチル化レベルを検出することがより好ましく、前記４５箇所全てのＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを検出することが特に好ましい。
【００２５】
また、後述の実施例において示すように、前記４５箇所（前記３０領域）全てのＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルの検出同様に、感度及び特異性高く、肝細胞癌のリスクの評価でき、該評価に要する時間及びコストをさらに低減することができるという観点からは、前記領域１〜５、１４、１６、１８、１９、２１、２３、及び２５〜２８に含まれる全てのＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを検出することも特に好ましい。
【００２６】
ホルマリン固定やパラフィン包埋処理した肝臓組織由来のゲノムＤＮＡを用いる場合においては、後述の実施例において示すように、前記領域１〜５、１４、１６、１８、１９、２１、２３、及び２５〜２８に含まれるＣｐＧサイトのうち少なくとも一のサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを検出することが好ましく、発癌リスクの評価における、感度又は特異性をより向上させることができるという観点から、前記領域１〜５、１４、１６、１８、１９、２１、２３、及び２５〜２８に含まれる全てのＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを検出することがより好ましい。
【００２７】
本発明における、「ＤＮＡメチル化レベルを検出する方法」としては、特定のＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを定量できる方法であればよく、公知の方法を適宜選択して行うことができる。
【００２８】
第一の方法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡに重亜硫酸塩（バイサルファイト）処理を施す。なお、このバイサルファイト処理によって、非メチル化シトシン残基はウラシルに変換されるが、メチル化シトシン残基は変換されない（Ｃｌａｒｋ  ＳＪら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１９９４年、２２巻、２９９０〜７ページ  参照）。また、下記伸長反応（シークエンス反応）においてはウラシルはチミンとして示される。次いで、このようにバイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを鋳型として、前記ＣｐＧサイトを少なくとも一つ含むＤＮＡを増幅する。そして、増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡのうち、片鎖のみを分離する。そして、前記ＣｐＧサイトの塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する。このようにして得られたメチル化シトシン残基由来の発光の強度（シトシンの発光強度）と、非メチル化シトシン残基由来の発光の強度（チミンの発光強度）とを比較し、例えば、下記式によって前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベル（％）を算出する。
ＤＮＡメチル化レベル（％）＝シトシンの発光強度×１００／（シトシンの発光強度＋チミンの発光強度）。
【００２９】
第一の方法としては、例えば、パイロシークエンシング法（登録商標、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （２０００）１０：１０３−１１０  参照）等が挙げられる。
【００３０】
なお、かかる第一の方法において、増幅に用いられるプライマー（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー（フォワードプライマー及びリバースプライマー））、並びに伸長反応に用いられるプライマー（シークエンシングプライマー）は、前記ＣｐＧサイトの塩基の近傍のバイサルファイト変換した配列に基づき、公知の手法により、例えば、後述の実施例に示すような、パイロシークエンシングアッセイデザインソフトウェアｖｅｒ．１．０（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて設計される。また前記増幅においては、ＤＮＡメチル化分析におけるＰＣＲのバイアスを解消するという観点から、Ｓｈｅｎ  Ｌら、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２００７年、４２巻、４８〜５８ページ、及びＧａｏ  Ｗら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、２００８年、２９巻、１９０１〜１０ページに記載の通り、アニーリング温度等が最適化されていることが望ましい。さらに「増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させ、さらに片鎖のみを分離する方法」としては特に制限はなく、例えば、後述の実施例に示すような、ビオチン標識したプライマーによって増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させ、ストレプトアビジンを用いて片鎖のみを分離する方法が挙げられる。
【００３１】
第二の方法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次いで、バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを鋳型とし、前記ＣｐＧサイトを少なくとも一つ含むＤＮＡを、Ｔ７プロモーターを付加したプライマーで増幅する。次いで、ＲＮＡに転写し、ＲＮＡａｓｅにより塩基特異的な切断反応を行う。そして、かかる切断反応産物を質量分析機にかけ、質量測定を行う。
【００３２】
そして、質量測定によって得られたメチル化シトシン残基由来の質量（シトシンの質量）と、非メチル化シトシン残基由来の質量（チミンの質量）とを比較し、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを算出する。
【００３３】
第二の方法としては、例えば、質量分析計を用いたＤＮＡメチル化解析法（例えば、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）、Ｊｕｒｉｎｋｅ  Ｃら、Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ、２００５年、５７３巻、８３〜９５ページ  参照）が挙げられる。
【００３４】
第三の方法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次に、ＤＮＡ二重鎖間に挿入されると蛍光を発するインターカレーターを含む反応系において、前記バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを鋳型として、前記ＣｐＧサイトを少なくとも１つ含む塩基配列を増幅する。次いで、前記反応系の温度を変化させ、前記インターカレーターが発する蛍光の強度の変動を検出する。前記ＣｐＧサイトを少なくとも１つ含む塩基配列の融解曲線を、メチル化・非メチル化対照検体を鋳型とする増幅産物の融解曲線と比較し、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを算出する。
【００３５】
第三の方法としては、例えば、メチル化感受性高解像能融解曲線分析（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ：ＭＳ−ＨＲＭ、Ｗｏｊｄａｃｚ  ＴＫら、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．、２００８年、３巻、１９０３〜８ページ  参照）が挙げられる。
【００３６】
第四の方法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次に、前記ＣｐＧサイトがメチル化されている場合に増幅可能なプライマーセット、及び前記ＣｐＧサイトがメチル化されていない場合に増幅可能なプライマーセットを調製する。そして、前記バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを鋳型とし、前記ＣｐＧサイトを少なくとも１つ含む塩基配列を、これらのプライマーセットを用いて各々増幅する。そして、得られた増幅産物の量、すなわちメチル化ＣｐＧサイト特異的な増幅産物の量、及び非メチル化ＣｐＧサイト特異的な増幅産物の量を比較することにより、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを算出する。
【００３７】
さらに、かかる第四の方法においては別の態様として、先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次に、前記ＣｐＧサイトがメチル化されている場合にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を有し、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを調製する。また、前記ＣｐＧサイトがメチル化されていない場合にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を有し、前記レポーター蛍光色素とは異なるレポーター蛍光色、及びクエンチャー蛍光色素が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを調製する。そして、バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡに前記オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、さらに前記オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズしたゲノムＤＮＡを鋳型として前記ＣｐＧサイトを含む塩基配列を増幅する。そして、前記増幅に伴うオリゴヌクレオチドプローブの分解により、前記レポーター蛍光色素が発する蛍光を検出する。このようにして検出されたメチル化シトシンＣｐＧサイト特異的なレポーター蛍光色素が発する蛍光の強度と、非メチル化シトシンＣｐＧサイト特異的なレポーター蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較することによって、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを算出する。
【００３８】
第四の方法としては、例えば、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）を用いたＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ法等のメチル化特異的定量ＰＣＲ法（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＭＳ−ＰＣＲ）  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ）が挙げられる。
【００３９】
第五の方法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次いで、バイサルファイト変換された前記ＣｐＧサイトを含む塩基配列を鋳型として、直接シークエンシング反応を行う。そして、決定された塩基配列に基づく蛍光強度、すなわちメチル化シトシン残基由来の蛍光強度（シトシンの蛍光強度）と、非メチル化シトシン残基由来の蛍光強度（チミンの蛍光強度）とを比較することによって、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを算出する。
【００４０】
さらに、かかる第五の方法においては別の態様として、先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次いで、バイサルファイト変換された前記ＣｐＧサイトを含む塩基配列をＰＣＲ反応等によってクローンニングする。そして、得られた複数のクローンニング産物の塩基配列を各々決定し、メチル化シトシンＣｐＧサイト特異的な塩基配列を有するクローニング産物の個数と、非メチル化シトシンＣｐＧサイト特異的な塩基配列を有するクローニング産物の個数とを比較することによって、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを算出する。
【００４１】
第五の方法としては、例えば、バイサルファイト直接シークエンシング（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、バイサルファイトクローニングシークエンシング（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）が挙げられる（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ＬＳら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、２００９年、５５巻、１４７１〜８３ページ  参照）。
【００４２】
以上、本発明の「ＤＮＡメチル化レベルを検出する方法」として好適に用いることのできる方法を例示したが、本発明はこれに限定されるものではない。また、これらの方法においては、定量性に最も優れているとの観点から、パイロシークエンシング法を用いることが好ましい。
【００４３】
本発明において、工程（ｂ）で検出したＤＮＡメチル化レベルから、前記被験体が癌高リスク群に分類されるか否かを決定するための指標は、表４に示す通り、各々の前記ＣｐＧサイト、又は前記領域におけるカットオフ値である。すなわち、本発明にかかる工程（Ｃ）においては、例えば領域１におけるＤＮＡメチル化レベルを検出した場合においては、検出されたＤＮＡメチル化レベルが２５．５％より低値である際にその被験体はが癌高リスク群に分類される。また、例えば領域１１におけるＤＮＡメチル化レベルを検出した場合においては、検出されたＤＮＡメチル化レベルが９５．７％より高値である際にその被験体は癌高リスク群に分類される。
【００４４】
また、本発明においては、肝細胞癌リスクの評価における、感度又は特異性をより向上させることができるという観点から、後述の実施例において示すように、前記３０領域において、表４に示す指標を満たす領域が１０以上である場合にその被験体を発癌リスク群に分類することが好ましく、表４に示す指標を満たす領域が１５以上である場合にその被験体を発癌高リスク群に分類することがより好ましい。
【００４５】
また、発癌リスクの評価における、感度又は特異性をより向上させることができ、該評価にかかる時間及びコストをより低減できるという観点からは、領域１〜５、１４、１６、１８、１９、２１、２３、及び２５〜２８において、表４に示す指標を満たす領域が８以上である場合にその被験体を発癌リスク群に分類することがより好ましい。
【００４６】
さらに、ホルマリン固定やパラフィン包埋処理した肝臓組織由来のゲノムＤＮＡを用いる場合においては、発癌リスクの評価における、感度又は特異性をより向上させることができるという観点から、後述の実施例において示すように、領域１〜５、１４、１６、１８、１９、２１、２３、及び２５〜２８において、表４に示す指標を満たす領域が８以上である場合にその被験体を発癌リスク群に分類することが好ましい。
【００４７】
また、本発明は、前記肝細胞癌のリスクを評価する方法に用いるための、少なくとも１５塩基の鎖長を有する、下記（ａ）〜（ｂ）に記載のいずれかであるオリゴヌクレオチドを提供する
（ａ）前記ＣｐＧサイト群から選択される少なくとも１つのサイトを挟み込むように設計された一対のプライマーであるオリゴヌクレオチド
（ｂ）前記ＣｐＧサイト群から選択される少なくとも１つのサイトを含む塩基配列にハイブリダイズするプライマー又はプローブであるオリゴヌクレオチド。
【００４８】
かかる（ａ）前記ＣｐＧサイト群から選択される少なくとも１つのサイトを挟み込むように設計された一対のプライマーとしては、例えば、バイサルファイト変換された前記ＣｐＧサイト群から選択される少なくとも１つのサイトを含むＤＮＡを増幅することができるプライマー（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー（フォワードプライマー及びリバースプライマー））が挙げられる。当該プライマーは、前記ＣｐＧサイト群から選択される少なくとも１つのサイトの両側のバイサルファイト変換された各塩基配列にハイブリダイズするプライマーである。また、（ｂ）前記ＣｐＧサイト群から選択される少なくとも１つのサイトを含む塩基配列にハイブリダイズするプライマーとしては、例えばバイサルファイト変換された前記ＣｐＧサイトの塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行うことができるプライマー（シークエンシングプライマー）が挙げられる。さらに、（ｂ）前記ＣｐＧサイト群から選択される少なくとも１つのサイトを含む塩基配列にハイブリダイズするプローブとしては、例えばバイサルファイト変換された前記ＣｐＧサイトを含む塩基配列にハイブリダイズするプローブ（いわゆるＴａｑＭａｎプローブ（登録商標））が挙げられる。特定の塩基配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、当該特定の塩基配列に相補的な塩基配列を有するが、ハイブリダイズする限り完全に相補的でなくともよい。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、バイサルファイト変換された又はされていない前記ＣｐＧサイトを含む塩基配列に基づき、当業者であれば公知の手法により、例えば、後述の実施例に示すように、パイロシークエンシングアッセイデザインソフトウェアｖｅｒ．１．０（ＱＩＡＧＥＮ社製）等を用いて、適宜設計することができる。
【００４９】
また、本発明のオリゴヌクレオチドとしては、後述の実施例に示すように、配列番号：１〜９０に記載の塩基配列からなる群より選択されるプライマーが好ましい（表１及び表２  参照）。
【００５０】
さらに、本発明は、前記オリゴヌクレオチドを含む、前記肝細胞癌のリスクを評価する方法に用いるためのキットも提供することができる。
【００５１】
前記オリゴヌクレオチドの標品において、前記オリゴヌクレオチドは、必要に応じて標識されていてもよい。例えば、パイロシークエンシング法によって検出する場合は、ビオチン標識したプライマーを用いることができ、ＴａｑＭａｎプローブ法によって検出する場合は、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素を標識したプローブを用いることができる。
【００５２】
本発明のキットにおいては、前記オリゴヌクレオチドの標品以外の標品を含むことができる。このような標品としては、バイサルファイト変換に必要な試薬（例えば、亜硫酸水素ナトリウム溶液等）、ＰＣＲ反応に必要な試薬（例えば、デオキシリボヌクレオチドや耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等）、パイロシークエンシングに必要な試薬（例えば、ピロリン酸の検出のためのＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン−５’−ホスホ硫酸、ルシフェラーゼ、及びルシフェリンや、一本鎖ＤＮＡを分離するためのストレプトアビジン等）、ＭＳ−ＨＲＭ法に必要な試薬（例えば、ＤＮＡ二重鎖間に挿入されると蛍光を発するインターカレーター等）が挙げられる。また、前記標識の検出に必要な試薬（例えば、基質や酵素、陽性対照や陰性対照、あるいは試料（被験体の肝臓組織由来のゲノムＤＮＡ等）の希釈や洗浄に用いる緩衝液等）が挙げられる。また、キットには、その使用説明書を含めることができる。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、実施例において用いた試料及び方法は下記に示す通りである。【００５４】
＜患者及び組織サンプル＞
学習コホートとして、顕著な組織学的所見が示されていない正常な肝臓組織サンプル（Ｃ１〜Ｃ１０）を、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓ−Ａｇ）及び抗ＨＣＶ抗体（ａｎｔｉ−ＨＣＶ）が共に陰性であり、ＨＣＣ以外の疾患を患っている患者１０人から手術で摘出した標本から得た。なお、これらの患者は７人の男性と３人の女性からなり、平均年齢（±ＳＤ）は５８．４±９．７才である。また、これらの患者は、国立がん研究センター中央病院にて、原発性結腸癌の肝転移のために肝部分切除術が施された９人の患者と、胃における消化管間質腫瘍の肝転移のために肝部分切除術が施された１人の患者からなる。【００５５】
さらに、非癌肝臓組織の１２サンプル（Ｎ１〜Ｎ１２）を、ＨＣＣのために肝部分切除術が施された１２人の患者から得た。なお、これらの患者は９人の男性と３人の女性からなり、平均年齢は６５．３±６．４才である。また、これらの非癌肝臓組織サンプルについての組織学的検査の結果、４サンプルにおいて慢性肝炎に対応する所見が、８サンプルにおいて肝硬変に対応する所見が確認されている。【００５６】
検証コホートとして、顕著な組織学的所見が示されない正常な肝臓組織サンプル（Ｃ１１〜Ｃ３５）を、ＨＢｓ−Ａｇ及びａｎｔｉ−ＨＣＶが共に陰性である、ＨＣＣ以外の２５人の患者から手術で摘出した標本から得た。なお、これらの患者は２０人の男性と５人の女性からなり、平均年齢は６１．８±７．１才である。また、これらの患者は原発性結腸癌の肝転移のために肝部分切除術が施された２１人の患者と、各々胃における消化管間質腫瘍、胃癌、及び大腸カルチノイド腫瘍の肝転移のために部分的な肝切除が施された残りの患者４人とからなる。【００５７】
さらに、非癌肝臓組織の２２サンプル（Ｎ１３〜Ｎ３４）を、ＨＣＣのために肝部分切除術が施された２２人の患者から得た。なお、これらの患者は２０人の男性と２人の女性からなり、平均年齢は６１．９±８．５才である。また、これらのサンプルのうち、４サンプルはＨＢｓ−Ａｇが陽性であり、１６サンプルはａｎｔｉ−ＨＣＶが陽性であり、２サンプルは共に陰性であった。さらに、これらの非癌肝臓組織サンプルについての組織学的検査の結果、１３サンプルにおいて慢性肝炎に対応する所見が、９サンプルにおいて肝硬変に対応する所見が確認された。【００５８】
また比較のため、原発性ＨＣＣサンプル（Ｔ１〜Ｔ３４）は、Ｎ１〜Ｎ３４サンプルを提供した患者の手術標本から得た。さらに比較のため、ＨＢｓ−Ａｇ又はａｎｔｉ−ＨＣＶが陽性であり、ＨＣＣには進展していない１４人の患者から肝臓組織１４サンプル（Ｖ１〜Ｖ１４）を得た。なお、これらの患者は５人の男性と８人の女性からなり、平均年齢は６５．１±８．２才である。また、これらの患者は、原発性結腸直腸癌の肝転移のために肝部分切除術が施された１２人の患者と、胃癌の肝転移のために肝部分切除術が施された２人の患者とからなる。【００５９】
なお、これらのヒト由来のサンプルを用いた研究は、国立がんセンター倫理委員会によって承認され、全ての上記患者に対し予め説明し同意を得て行われたものである。【００６０】
＜ＤＮＡ抽出及びＤＮＡ重亜硫酸塩（バイサルファイト）修飾＞
採取後直ちに細切して液体窒素中にて急速凍結し液体窒素中に保存した新鮮凍結組織サンプルから、高分子量ＤＮＡをフェノール−クロロホルムにて抽出し、次いで透析処理を施した。また、バイサルファイト変換は、１μｇゲノムＤＮＡ及びＥｐｉＴｅｃｔ  バイサルファイトキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ社製）の試薬を用いて、製造業者のプロコールに従って行った。なお、この変換プロセスによって、非メチル化シトシン残基はウラシルに変換されるが、メチル化シトシン残基は変換されないことが明らかになっている（Ｃｌａｒｋ  ＳＪら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１９９４年、２２巻、２９９０〜７ページ  参照）。【００６１】
＜パイロシークエンシングＤＮＡメチル化分析＞
ＤＮＡメチル化レベル（率）は、パイロシークエンシング（登録商標）技術を用いた高度な定量的手法によって計測した。すなわち先ず、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー（フォワードプライマー及びリバースプライマー）、並びにシークエンシングプライマーを、パイロシークエンシングアッセイデザインソフトウェアｖｅｒ．１．０（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、バイサルファイト変換した配列に基づき設計した。また、ＤＮＡメチル化分析におけるＰＣＲのバイアスを解消するため、Ｓｈｅｎ  Ｌら、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２００７年、４２巻、４８〜５８ページ、及びＧａｏ  Ｗら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、２００８年、２９巻、１９０１〜１０ページに記載の通り、アニーリング温度を最適化した。なお、各々のプライマー配列及びＰＣＲの条件は表１及び表２に示す。また、各ＰＣＲによって調べたＣｐＧサイトを含む塩基配列を表３に示す。【００６２】
【表１】
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【００６３】
【表２】
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【００６４】
【表３】
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【００６５】
そして、バイサルファイト処理ＤＮＡ７．５ｎｇ及びＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）０．６ユニットにてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物は、表１及び表２に示す通り、ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）標識したリバースプライマーを用いて増幅されたものであるので、ストレプトアビジン−コートビーズ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で精製した。【００６６】
次いで、定量的シークエンシングを、Ｐｙｒｏ  Ｇｏｌｄ試薬（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ＰｙｒｏＭａｒｋ  Ｑ２４（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて、製造業者のプロトコールに従って行った。なお、各々のアッセイにおいて、陽性対照としてＥｐｉｔｅｃｔ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を、陰性対照としてＥｐｉｔｅｃｔ  ｕｎｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。また、ＰＣＲ産物を３％アガロースゲルを用いた電気泳動上にて分画し、エチジウムブロマイドで染色することにより、ＰＣＲ産物が適切なサイズの特異的な産物であり、増幅にて非特異的産物が含まれていないことを確認した。さらに、パイロシークエンシングＤＮＡメチル化分析によって得られた、代表的なｐｙｒｏｇｒａｍを図１に示す。なお図１においても示されている、各ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベル（％）は下記式を用いて算出した。
ＤＮＡメチル化レベル（％）＝シトシンの発光強度×１００／（シトシンの発光強度＋チミンの発光強度）。【００６７】
＜統計＞
サンプル群間における各々のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルの有意差は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕテストにて分析した。また、ＨＣＣ患者群の生存曲線をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法によって算出し、その差をｌｏｇ−ｒａｎｋテストにて比較し、ｐ＜０．０５である際に有意とみなした。【００６８】
（実施例１）
＜パイロシークエンシングによるＢＡＭＣＡデータの検証＞
ＢＡＭＣＡ法は、全染色体における広範な領域の個々のＤＮＡメチル化傾向の概要を提供することができるとされている（非特許文献１３及び１９  参照）。また、本発明者らにより、ＢＡＭＣＡ法を用いて、ＨＣＣ以外の患者から得た正常な肝臓組織と、学習コホートのＨＣＣ患者から得た非癌肝臓組織とを判別することができるＤＮＡメチル化状態を示す２５ＢＡＣクローンが同定されている（非特許文献１８  参照）。例えば図２に示すように、ＲＰ１１−１７Ｍ１７上においては、ＸｍａI／ＳｍａIサイト１０箇所がＢＡＭＣＡ法で有効に評価されている。すなわち、本発明者らの先の研究成果にて、ＢＡＭＣＡ法によるこのＢＡＣクローンの平均シグナル比は、正常な肝臓組織サンプルよりもＨＣＣ患者から得た非癌肝臓組織サンプルの方が有意に低く、またＨＣＣ患者から得た非癌肝臓組織サンプルよりもＨＣＣの方が有意に低いことが明らかになっている。【００６９】
そこで、パイロシークエンシング法を用いて、ＢＡＭＣＡ法で有効に評価される２０００ｂｐ以下のＰＣＲ産物が生じる、全てのＸｍａI／ＳｍａI制限酵素認識サイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを定量的に再度評価した。得られた結果、すなわちＨＣＣ患者から得た非癌肝臓組織３４サンプルのＲＰ１１−１７Ｍ１７  ＢＡＣクローンにおけるＸｍａI／ＳｍａIサイト１０箇所について、パイロシークエンシング法によって同定された平均ＤＮＡメチル化レベルを図２及び図３に示す。【００７０】
図２及び図３に示した結果から明らかなように、パイロシークエンシング法によって同定された、非癌肝臓組織３４サンプルの平均ＤＮＡメチル化レベルは、正常な肝臓組織３５サンプルのそれと比して、ＸｍａI／ＳｍａIサイト  i、ii、vii、viii、及びixにおいては同程度であった。また、ＸｍａI／ＳｍａIサイト  iii、iv、ｖ、vi、及びxにおいては、非癌肝臓組織３４サンプルの平均ＤＮＡメチル化レベルは、正常な肝臓組織３５サンプルのそれと比して、有意に低かった。さらに、ＨＣＣ（肝細胞癌）３４サンプルのＤＮＡメチル化レベルは、ＸｍａI／ＳｍａIサイト  i〜ｘにおいて、ＨＣＣ患者から得た非癌肝臓組織サンプルのそれよりも有意に低かった（図２  参照）。【００７１】
さらに、例えば  ＣｐＧサイト  ｉｉｉ、ｉｉｉ’、ｉｖ、及びｉｖ’においては、同一のシークエンシングプライマーを用いて定量的にシークエンスした、ＸｍａＩ／ＳｍａＩサイト近傍のＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルは、各々のサンプルにおいて、そのＸｍａＩ／ＳｍａＩサイト自体におけるＤＮＡメチル化レベルと近い傾向にあることが明らかになった（図３  参照）。従って、ＲＰ１１−１７Ｍ１７において協調的に生じるＤＮＡメチル化の変化を、ＢＡＭＣＡ法が検出できることが確認された。【００７２】
また、本発明者らの先の研究成果において発癌リスク評価の指標として同定した、別のＢＡＣクローン  ＲＰ１１−７９９Ｏ６において、ＢＡＭＣＡ法によって得た平均シグナル比は、正常な肝臓組織サンプルよりもＨＣＣ患者から得た非癌肝臓組織サンプルの方が有意に高いことが明らかになっている（非特許文献１８  参照）。そこで、ＲＰ１１−１７Ｍ１７同様に、ＢＡＭＣＡ法で有効に評価される２０００ｂｐ以下のＰＣＲ産物を生ずる、ＸｍａI／ＳｍａIサイト１０箇所の平均ＤＮＡメチル化レベルをパイロシークエンシングによって分析した。その結果、図には示さないが、ＸｍａI／ＳｍａIサイト７箇所における平均ＤＮＡメチル化レベルは、ＨＣＣ患者から得た非癌肝臓組織サンプルと正常な肝臓組織サンプルとでは同程度であった。さらに、ＸｍａI／ＳｍａIサイト３箇所における平均ＤＮＡメチル化レベルは、正常な肝臓組織サンプルよりもＨＣＣ患者から得た非癌肝臓組織サンプルの方が顕著に高かった。【００７３】
従って、ＢＡＭＣＡ法により発癌リスク予測の指標として同定された、ＢＡＣクローンに関するデータは、パイロシークエンシング法によって再度その妥当性が評価された。【００７４】
（実施例２）
＜パイロシークエンシングに基づく、肝臓組織サンプルを用いた発癌リスク評価のための指標の確立＞
診断に最も効果があるＣｐＧサイトを同定し、発癌リスクの評価における感度及び特異性を向上させるため、本発明者らの先のＢＡＭＣＡ法による分析結果から同定された指標 (非特許文献１８  参照）に基づき、２５のＢＡＣクローンにおいてＢＡＭＣＡ法で有効と評価されたＸｍａI／ＳｍａIサイトを網羅するプライマーセットを用いたパイロシークエンシングを行い、該ＢＡＣクローン上のＣｐＧサイト２０３箇所におけるＤＮＡメチル化レベルを測定した。【００７５】
その測定の結果、５９のＣｐＧサイトにおいて、平均ＤＮＡメチル化レベルは、学習コホートの正常な肝臓組織とＨＣＣ患者から得た非癌肝臓組織との間において、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕテスト（ｐ＜０．００１）によって有意に差があることが明らかになった。【００７６】
なお、再現性の高い指標を確立するため、正常な肝臓組織及びＨＣＣ患者から得た非癌肝臓組織における平均ＤＮＡメチル化レベルが１０％以下であるＣｐＧサイト１４箇所は、パイロシークエンシング技術の特性（Ｓｈｅｎ  Ｌら、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２００７年、４２巻、４８〜５８ページ  参照）を考慮し、発癌リスク予測のための指標の候補から除外した。また、１つのシークエンシングプライマーを用いて、いくつかのＣｐＧサイトを測定し得る場合、それらいくつかのＣｐＧサイトの平均ＤＮＡメチル化レベルを用いて、そのシークエンシングプライマーによってカバーされる１領域に対し、１カットオフ値を設定した。得られた結果の代表的な例として、正常な肝臓組織及びＨＣＣ患者から得た非癌肝臓組織のサンプルの散布図を図４に示す。【００７７】
図４に示した結果から明らかなように、各領域において、学習コホートのＨＣＣ患者から得た非癌肝臓組織と正常な肝臓組織とを十分な感度及び特異性をもって判別することができる、カットオフ値を設定することができた。また、図４に示した領域を含む、残りの４５ＣｐＧサイトにおいても同様に、７０％以上の感度及び特異性をもって判別することができる、カットオフ値を設定することができた。【００７８】
このように、ＣｐＧサイト４５箇所を含む３０領域に対して、３０カットオフ値（指標）を設定した。また各領域における感度及び特異性を表４に示す。さらに前記３０領域の染色体座位及び特性（ＣｐＧアイランドであるか否か、特定の遺伝子若しくは非コーディング領域のエクソン又はイントロンであるか等）の概要についても表４に示す。【００７９】
【表４】
2012102377.tif 000005
【００８０】
また、学習コホートのＣ１〜Ｃ１０及びＮ１〜Ｎ１２サンプルについて、表４のリストに記載した指標を満たす領域数を示すヒストグラムを図５に示す。【００８１】
図５に示した結果から明らかなように、表４に記載の指標を１５領域以上で満たす肝臓組織は発癌リスクが高いと判断すると、学習コホートのＨＣＣ患者から得た非癌肝臓組織を、感度及び特異性共に１００％で正常な肝臓組織と区別することができることが明らかになった。そして、これらの指標を確認するため、さらに肝臓組織４７サンプルを検証研究としてパイロシークエンシング法によって分析した。得られた結果を図６に示す。【００８２】
図６に示した結果から明らかなように、表４に記載の指標を１５領域以上で満たした全ての検証用２２サンプルは、ＨＣＣ患者から得た非癌肝臓組織（Ｎ１３〜Ｎ３４）であることが確認された。また、表４に記載の指標を１５領域以上で満たさなかった全ての検証用２５サンプルは、正常な肝臓組織（Ｃ１１〜Ｃ３５）であることが確認された。【００８３】
従って、これらの指標により、検証コホートのＨＣＣ患者から得た非癌肝臓組織を感度及び特異性と共に１００％の確率で発癌リスクが高いと診断することができることが明らかになった。【００８４】
（実施例３）
＜拡大した検証コホートにおける、パイロシークエンシングに基づく、肝臓組織サンプルを用いた発癌リスク評価＞
実施例２において確立した発癌リスク予測のための指標の信頼性について確認すべく、実施例２よりも多い症例数（拡大した検証コホート）にて、当該指標を用いて、発癌リスクの評価を行った。【００８５】
すなわち、先ず、顕著な組織学的所見が示されない正常な肝臓組織サンプル（Ｃ１１〜Ｃ３５，Ｃ４４〜Ｃ６３）を、ＨＢｓ−Ａｇ及びａｎｔｉ−ＨＣＶが共に陰性である、ＨＣＣ以外の４５人の患者から手術で摘出した標本から得た。なお、これらの患者は３４人の男性と１１人の女性からなり、平均年齢は６２．２±７．０才である。また、これらの患者は原発性結腸癌の肝転移のために肝部分切除術が施された３９人の患者と、胃癌の肝転移のために部分的な肝切除が施された患者３人と、各々胃における消化管間質腫瘍、膵癌、及び大腸カルチノイド腫瘍の肝転移のために部分的な肝切除が施された残りの患者３人とからなる。さらに、非癌肝臓組織の４５サンプル（Ｎ１３〜Ｎ３４，Ｎ４７〜Ｎ６９）を、ＨＣＣのために肝部分切除術が施された４５人の患者から得た。なお、これらの患者は３７人の男性と８人の女性からなり、平均年齢は６２．３±９．７才である。また、これらのサンプルのうち、１３サンプルはＨＢｓ−Ａｇが陽性であり、２９サンプルはａｎｔｉ−ＨＣＶが陽性であり、１３サンプルは共に陰性であった。さらに、これらの非癌肝臓組織サンプルについての組織学的検査の結果、２２サンプルにおいて慢性肝炎に対応する所見が、２３サンプルにおいて肝硬変に対応する所見が確認された。なお、これらのヒト由来のサンプルを用いた研究は、国立がんセンター倫理委員会によって承認され、全ての上記患者に対し予め説明し同意を得て行われたものである。【００８６】
そして、これら組織サンプルについて、＜ＤＮＡ抽出及びＤＮＡ重亜硫酸塩（バイサルファイト）修飾＞及び＜パイロシークエンシングＤＮＡメチル化分析＞の項に記載の方法に沿って、表１〜３に示すプライマーと条件にてパイロシークエンシング法を施行した。得られた結果を図７に示す。【００８７】
図７に示した結果から明らかなように、表４に記載の指標を１３領域以上で満たした全ての検証用４５サンプルは、ＨＣＣ患者から得た非癌肝臓組織（Ｎ１３〜Ｎ３４，Ｎ４７〜Ｎ６９）であることが確認された。また、表４に記載の指標を１３領域以上で満たさなかった全ての検証用４５サンプルは、正常な肝臓組織（Ｃ１１〜Ｃ３５，Ｃ４４〜Ｃ６３）であることも確認された。【００８８】
従って、拡大した検証コホートにおいても、ＨＣＣ患者から得た非癌肝臓組織と正常な肝臓組織とでは、ＤＮＡメチル化状態は異なっており、ＤＮＡメチル化状態に基づいてＨＣＣ患者から得た非癌肝臓組織を発癌リスクが高いと診断できることが明らかになった。【００８９】
（実施例４）
＜表４に記載した３０領域におけるＤＮＡメチル化状態の臨床病理学的意義＞
表４に記載した３０領域におけるＤＮＡメチル化状態の臨床病理学的意義を評価するため、学習コホート及び検証コホートのＨＣＣ患者由来の非癌肝臓組織３４サンプル（Ｎ１〜Ｎ３４）を、前記指標を満たす領域数に従って２つのグループに分けた。すなわち、表４に記載の指標を満たす領域数の中央値である２３を基準とし、前記指標を満たす領域数が２３以上であるグループと、該領域数が２３未満であるグループとに、ＨＣＣ患者由来の非癌肝臓組織３４サンプルを分けた。そして、それら患者の予後を１１〜３９３６日間（平均  １４１７日間）調べた。得られた結果を図８及び図９に示す。【００９０】
図８及び図９に示した結果から明らかなように、これらの非癌肝臓組織において、表４に記載の指標を満たす領域数が２３以上であるＨＣＣ患者の無再発生存率（ｃａｎｃｅｒ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｒａｔｅ）及び全生存率（ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｒａｔｅ）は、該領域数が２３未満であるＨＣＣ患者のそれらより有意に低かった（無再発生存率（ｐ＝０．００２３）に関しては図８  参照、全生存率（ｐ＝０．００１５）に関しては図９  参照）。【００９１】
従って、これらのデータから、患者の予後に相関する臨床病理学的意義を有するＤＮＡメチル化の変化は、前癌状態において既に確立していることが明らかになった。【００９２】
また、非癌肝臓組織サンプル（Ｎ１〜Ｎ３４）に関して、表４に記載の指標を満たす領域数において、慢性肝炎が見られる肝臓組織（ｎ＝１７、２０．６±３．１）と肝硬変が見られる肝臓組織（ｎ＝１７、２２．９±３．８）との間で有意な差はないことも明らかになった（ｐ＝０．０５２５）。【００９３】
さらに比較のため、ＨＢＶ又はＨＣＶに感染しているが、ＨＣＣには進展していない患者から得た、追加の肝臓組織１４サンプルの３０領域におけるＤＮＡメチル化レベルをパイロシークエンシングによって分析した。その結果、Ｖ１〜Ｖ１４において、表４に記載の指標を満たす平均領域数（１２．０±５．０）は、Ｎ１〜Ｎ３４（２１．７±３．６）のそれよりも有意に低いことが確認された（ｐ＜０．０００１）。【００９４】
従って、これらの結果から、前記指標は、慢性肝炎及び肝硬変の段階における、肝炎ウィルス感染、炎症、又は線維化を単に反映するものではなく、真に発癌リスクそのものを反映していることが明らかになった。【００９５】
（実施例５）
＜本発明にかかる指標の臨床診断への適用についての検証１＞
ＨＢＶ又はＨＣＶ感染患者に対しては、サーベイランス（経過観察）期間の間、基準肝組織像（ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｌｉｖｅｒ  ｈｉｓｔｏｒｏｇｙ）を明らかにするため、インターフェロン治療に先立って、肝生検標本の顕微鏡検査（病理組織診断）が行われる。サーベイランス期間中に採取される肝生検標本を用いて、前記指標による発癌リスクの評価が行うことができれば、肝生検標本を有効に活用することができ、患者の負担も抑えることが期待できる。【００９６】
しかしながら、かかる病理組織診断に際して、生検用に採取された組織は、通常ホルマリン固定及びパラフィン包埋が施される。そして、該組織中のＤＮＡは剪断化されるため、ＰＣＲ法・パイロシークエンシング法における反応が阻害される場合がある。すなわち、ホルマリン固定等が施された組織をパイロシークエンシング法等によって分析する場合においては、塩基配列特異的に、このような反応阻害を受け易い領域と、受けにくい領域とが存在することになる。【００９７】
従って、サーベイランス期間中に採取される肝生検標本を対象として、本発明の方法を実施する際には、前記反応阻害を受けにくい領域のみを指標として用いた方が、表４に記載の３０領域全てを用いるよりも再現性のある結果が得られ、良好に発癌リスクの評価を行えることが期待できる。【００９８】
そこで、下記に示す組織サンプル及び方法（図１０  参照）にて、ホルマリン固定及びパラフィン包埋後の組織を対象として、ＰＣＲ法・パイロシークエンシング法を行い、表４に記載の３０領域の中から、前記反応阻害を受けにくく、肝生検標本において本発明を実施するのに好適な領域の同定を試みた。【００９９】
＜組織サンプル及び方法＞
サーベイランス期間中に採取される肝生検の模擬標本（肝部分切除術標本から採取した模擬肝生検標本（疑似針生検標本））として、バルク組織に１８Ｇのニードルを刺し、約１ｃｍ長の組織片を採取し、得られた組織片にホルマリン固定及びパラフィン包埋を施して調製した。すなわち、１０％ホルマリンで一昼夜室温で固定し、１００％エタノールで脱水を行い、さらにクロロホルムに置換した。その後、パラフィンを十分に浸透させた後、パラフィンブロックを作製した。【０１００】
また、前記バルク組織としては、正常な肝臓組織１９サンプル（Ｃ３６〜Ｃ４３及びＣ６４〜Ｃ７２）並びに非癌肝臓組織１４サンプル（Ｎ３５〜Ｎ４６、Ｎ７０及びＮ７１）を用いた。これらサンプルの詳細は下記の通りである。【０１０１】
顕著な組織学的所見を示さない正常な肝臓組織サンプル（Ｃ３６〜Ｃ４３）の疑似針生検標本を、ＨＢｓ−Ａｇ及びａｎｔｉ−ＨＣＶが共に陰性であり、ＨＣＣ以外の疾患に罹患している８人の患者から手術で摘出した標本から得た。なお、これらの患者は５人の男性と３人の女性からなり、平均年齢は６２．６±２．６才である。また、これらの患者は、原発性結腸直腸癌の肝転移のために肝部分切除術が施された７人の患者と、胃における消化管間質腫瘍の肝転移のために肝部分切除術が施された１人の患者からなる。【０１０２】
さらに、顕著な組織学的所見を示さない正常な肝臓組織サンプル（Ｃ６４〜Ｃ７４）の疑似針生検標本を、ＨＢｓ−Ａｇ及びａｎｔｉ−ＨＣＶが共に陰性であり、ＨＣＣ以外の疾患に罹患している１１人の患者から手術で摘出した標本から得た。なお、これらの患者は８人の男性と３人の女性からなり、平均年齢は５７．５±１０．７才である。また、これらの患者は、原発性結腸直腸癌の肝転移のために肝部分切除術が施された１０人の患者と、精巣における胚細胞腫瘍の肝転移のために肝部分切除術が施された１人の患者からなる。【０１０３】
また、非癌肝臓組織の１２サンプル（Ｎ３５〜Ｎ４６）の疑似針生検標本は、ＨＣＣのために肝部分切除術が施された１２人の患者から手術で摘出した標本から得た。なお、これらの患者は１０人の男性と２人の女性からなり、平均年齢は６１．３±１２．２才である。また、これらの非癌肝臓組織サンプルについての組織学的検査の結果、４サンプルにおいて慢性肝炎に対応する所見が、５サンプルにおいて肝硬変に対応する所見が確認されている。【０１０４】
また、非癌肝臓組織の２サンプル（Ｎ７０及びＮ７１）の疑似針生検標本は、ＨＣＣのために肝部分切除術が施された２人の患者から手術で摘出した標本から得た。なお、これらの患者は１人の男性と1人の女性からなり、年齢は７３才と６３才である。また、これらの非癌肝臓組織サンプルについての組織学的検査の結果、２サンプルとも慢性肝炎に対応する所見が確認されている。【０１０５】
そして、前記の通り調製した疑似針生検標本のパラフィンブロックより５μｍ厚標本を１０枚程薄切し、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ社製）の試薬を用いて、製造業者のプロコールに従ってＤＮＡを抽出した。さらに、＜ＤＮＡ抽出及びＤＮＡ重亜硫酸塩（バイサルファイト）修飾＞の項に記載の方法にてバイサルファイト修飾を施した。【０１０６】
そして、これらバイサルファイト修飾を施したサンプルを、＜パイロシークエンシングＤＮＡメチル化分析＞の項に記載の方法にて分析した結果、表４に記載の３０領域の中から、前記反応阻害を受けにくく、肝生検標本において本発明を実施するのに好適な領域として、１５領域（表４に記載の領域：１〜５、１４、１６、１８、１９、２１、２３、２５〜２８）を同定した。【０１０７】
また、図１１に示す通り、これら１５領域において、表４に記載の指標を８領域以上で満たす肝臓組織は発癌リスクが高いと判断すると、非癌肝臓組織の疑似針生検標本を、感度９３％、特異度９５％にて、正常な肝臓組織と区別することができることが明らかになった。【０１０８】
（実施例６）
＜本発明にかかる指標の臨床診断への適用についての検証２＞
臨床現場において肝生検標本は、通常は体表等から到達し易く安全に施行できる部位から採取され、必ずしも肝細胞癌の病巣の近傍から採取される訳ではない。肝細胞癌の病巣からの距離に依存せずに本発明が実施できれば、採取部位に制限のある肝生検標本における発癌リスク診断の実現可能性が高まる。【０１０９】
そこで、実施例５に記載の方法と同様の方法にて、肝部分切除術標本の複数の部位から組織を採取し、ホルマリン固定及びパラフィン包埋を施した疑似針生検標本を調製した。また、前記肝部分切除術標本の複数の部位から組織を採取し、＜ＤＮＡ抽出及びＤＮＡ重亜硫酸塩（バイサルファイト）修飾＞の項に記載の方法にて、新鮮凍結バルク組織を調製した。そして、これら疑似針生検標本及び新鮮凍結バルク組織から、前記方法にて、ＤＮＡ抽出、バイサルファイト修飾、パイロシークエンシングＤＮＡメチル化分析を行い、肝細胞癌の病巣からの距離とＤＮＡメチル化状態との関係を調べた。得られた結果の一部（表４に記載の領域２及び４における結果）を図１２及び１３に示す。【０１１０】
図１２及び１３に示した代表的な領域における結果から明らかなように、同一肝部分切除術標本から得られた複数のサンプルにおいては、疑似針生検標本とバルク組織の別を問わず、肝細胞癌の病巣からの距離に依存せず、同等程度のＤＮＡメチル化率を示した。【０１１１】
従って、表４に記載の３０領域におけるＤＮＡメチル化異常は、肝に広汎あるいは一様に蓄積する発癌リスクを反映しているため、実施例５において示す結果と併せ、表４に記載の３０領域（特に前記１５領域）のメチル化を指標とすることにより、臨床現場において、採取部位に制限のある肝生検標本を用いても、肝細胞癌のリスクを評価できることが明らかになった。【０１１２】
（実施例７）
＜本発明にかかる指標の臨床診断への適用についての検証３＞
ホルマリン固定及びパラフィン包埋を伴わない標本、例えばバルク組織等でも、前記１５領域（表４に記載の領域：１〜５、１４、１６、１８、１９、２１、２３、２５〜２８）を用いて、表４に記載の全３０領域を用いた場合と同等程度に肝細胞癌のリスクを評価することができるのであれば、診断に要する時間を短縮し、コストを節減するために好ましく、病院検査部等における普及が容易となることが期待される。そこで、実施例６に記載の方法と同様の方法にて、前記１５領域におけるメチル化状態を、疑似針生検標本及び新鮮凍結バルク組織について分析した。得られた結果の一部（症例Ｎ３９及びＮ４０における結果）を図１４に示す。【０１１３】
図１４に示す通り、前記１５領域のＤＮＡメチル化状態は、疑似針生検標本とバルク組織の別に依存せず、同一症例において相互によく一致することが明らかになり、ホルマリン固定・パラフィン包埋を伴わない組織においても前記１５領域を用いても、表４に記載の全３０領域を用いた場合と同等程度に肝細胞癌のリスクの評価できることが示唆された。【０１１４】
そこで、次に、正常な肝臓組織（Ｃ１〜Ｃ３５，Ｃ４４〜Ｃ６３）全５５サンプル及びＨＣＣのために肝部分切除術標本からとられた非癌肝臓組織（Ｎ１〜Ｎ３４，Ｎ４４〜Ｎ６６）全５７サンプルのバルク組織について、前記１５領域におけるメチル化状態を分析した。得られた結果を図１５に示す。【０１１５】
図１５に示した結果から明らかなように、前記１５領域において、表４に記載の指標を８領域以上で満たす肝臓組織は発癌リスクが高いと判断すると、非癌肝臓組織のバルク組織を、感度９８％、特異度９８％にて、正常な肝臓組織と区別することができることが明らかになった。すなわち、ホルマリン固定及びパラフィン包埋を伴わない組織においても、前記１５領域を用いることにより、有効に発癌リスクの評価を行えることが明らかになり、病理組織診断目的で採取されホルマリン固定及びパラフィン包埋された肝生検標本だけではなく、ホルマリン固定及びパラフィン包埋されていない肝臓組織（例えば、手術で得られたバルク組織）についても、表４に記載の全３０領域に代えて、前記１５領域を用いても、感度及び特異性高く、肝細胞癌のリスクの評価できることが実証された。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
以上説明したように、本発明によれば、本発明にかかる前記４５箇所のＣｐＧサイト、又は該サイトを含む表４に記載の３０領域のＤＮＡメチル化レベルを検出し、該メチル化レベルに基づき、肝細胞癌高リスク群に分類されるか否かを決定することが可能となる。【０１１７】
したがって、本発明の方法は、極めて感度及び特異性高く、肝細胞癌のリスクを評価することができるため、慢性肝炎や肝硬変といった慢性肝障害患者のサーベイランス（経過観察）において有用である。【０１１８】
また、本発明によれば、評価に供する肝臓組織の状態、例えば、ホルマリン固定及びパラフィン包埋の有無、肝細胞癌の病巣からの距離を問わずに、肝細胞癌のリスクを評価することができるため、本発明は臨床の現場において極めて有用である。【０１１９】
さらに、表４に記載の全３０領域に代えて、前記１５領域（表４に記載の領域：１〜５、１４、１６、１８、１９、２１、２３、２５〜２８）を用いても、感度及び特異性高く、肝細胞癌のリスクの評価できるため、評価に要する時間及びコストをさらに低減することができ、ひいては、病院検査部等において広く普及し得るものである。
【配列表フリーテキスト】
【０１２０】
配列番号１〜９０
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列
【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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