(57)【要約】  中枢神経系疾患に対する新規な治療手段を提供することを課題とする。ADAMTS-4タンパク質又はADAMTS-4遺伝子を保持する発現ベクターを有効成分として含む中枢神経疾患用治療剤が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）又は（２）を有効成分として含む、中枢神経疾患用治療剤：
（１）ADAMTS-4タンパク質；
（２）ADAMTS-4遺伝子を保持する発現ベクター。
【請求項２】
ADAMTS-4タンパク質が、配列番号１に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に等価なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の中枢神経疾患用治療剤。
【請求項３】
ADAMTS-4遺伝子が、配列番号２に示す塩基配列又は該塩基配列に等価な塩基配列を含む、請求項１に記載の中枢神経疾患用治療剤。
【請求項４】
中枢神経疾患が脊髄損傷、脊髄炎、脳損傷、脳虚血や脳内出血に伴う脳梗塞による神経細胞の変性・脱落、及び神経細胞の障害を伴う網膜疾患からなる群より選択される疾患ないし病態である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の中枢神経疾患用治療剤。
【請求項５】
中枢神経疾患が脊髄損傷である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の中枢神経疾患用治療剤。
【請求項６】
中枢神経疾患の患者に対して、以下の（１）又は（２）を有効成分として含む中枢神経疾患用治療剤を投与するステップを含む、中枢神経疾患の治療法：
（１）ADAMTS-4タンパク質；
（２）ADAMTS-4遺伝子を保持する発現ベクター。
【請求項７】
中枢神経疾患が脊髄損傷、脊髄炎、脳損傷、脳虚血や脳内出血に伴う脳梗塞による神経細胞の変性・脱落、及び神経細胞の障害を伴う網膜疾患からなる群より選択される疾患である、請求項６に記載の治療法。
【請求項８】
中枢神経疾患が脊髄損傷である、請求項６に記載の治療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は中枢神経疾患用の治療剤及びその用途に関する。本出願は、２０１０年１２月２１日に出願された日本国特許出願第２０１０−２８３９１０号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
従来、一度損傷を受けた中枢神経が再生することはないと言われてきた。実際、脳や脊髄といった中枢神経が一度外傷や出血により障害を受け、神経障害が出現すれば、通常治癒はしない。その理由として、再生を促す因子に比べ、それを抑制する因子が強いと考えられている。なかでも、ミエリン関連蛋白であるNogo、MAG、OMgpやコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（以下、「CSPG」）などは神経再生阻害因子として有名である。2002年にBradburryらはCSPGのCS鎖を分解するコンドロイチナーゼABC(以下、「C-ABC」)をラット損傷脊髄に投与することにより後肢運動機能が回復したことを報告した（非特許文献１）。同様に脊髄損傷後に損傷周囲に集積し、神経再生を抑制するとされるケラタン硫酸プロテオグリカン（以下、「KSPG」）がある。我々のグループでは、KSPGのノックアウトされたマウスに脊髄損傷が起きると、野生型マウスに比較して、損傷後の後肢運動機能が回復したことを報告した（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Bradbury EJ et al., Nature 416, 636-640 (2002)
【非特許文献２】Z. Ito et al. Journal of Neuroscience, 2010, 30(17):5937-5947
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、中枢神経系疾患に対する新規な治療手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
以上の課題の下、本発明者らは研究を進めた。まず、C-ABCと同様に脊髄損傷後にケラタン硫酸を分解する酵素であるケラタナーゼII（以下、「K-II」）を、脊髄損傷モデル（ラット）のくも膜下腔に投与したところ、C-ABCと同様の回復が得られた。しかし、C-ABCとK-IIの同時投与を行ったが、その際の効果はC-ABC単独およびK-II単独投与と同等であった。付加的な効果が得られなかった理由として、CSPGのCS鎖及びKSPGのKS鎖が切れることによるプロテオグリカンの構造変化が神経軸索の伸長効果に影響を及ぼしていることが示唆された。そこで、同様のプロテオグリカンの構造変化をもたらす酵素として、コアプロテインを分解するADAMTS-4（A disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motif 4）に注目した。つまり、ADAMTS-4によるコアプロテインの分解により起きるプロテオグリカンの構造変化が脊髄損傷後の神経軸索伸長効果をもたらすことを仮定して実験を進めた。その結果、ADAMTS-4が高い神経軸索伸長効果を示し、脊髄損傷後の機能改善に極めて有効であることが判明した。また、脊髄損傷後、ADMATS4の発現量はmRNAレベルでは変化は認められないものの、タンパク質レベルでは増加が見られることや、ニューロンよりもアストロサイトやミクログリアでADAMTS-4の高発現が認められること、更にはブレビカンやニューロカン或いはフォスファカンなどの脳内プロテオグリカンの分解がADMATS4特異的に生じること等、中枢神経系の再生におけるADAMTS-4の作用機序に関する重要且つ有益な知見が得られた。【０００６】
以上の通り、本発明者らの鋭意検討の結果、ADAMTS-4が中枢神経系の再生・治癒に極めて有効であるとの知見がもたらされた。以下に示す本発明は、主として当該知見に基づく。
［１］以下の（１）又は（２）を有効成分として含む、中枢神経疾患用治療剤：
（１）ADAMTS-4タンパク質；
（２）ADAMTS-4遺伝子を保持する発現ベクター。
［２］ADAMTS-4タンパク質が、配列番号１に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に等価なアミノ酸配列を含む、［１］に記載の中枢神経疾患用治療剤。
［３］ADAMTS-4遺伝子が、配列番号２に示す塩基配列又は該塩基配列に等価な塩基配列を含む、［１］に記載の中枢神経疾患用治療剤。
［４］中枢神経疾患が脊髄損傷、脊髄炎、脳損傷、脳虚血や脳内出血に伴う脳梗塞による神経細胞の変性・脱落、及び神経細胞の障害を伴う網膜疾患からなる群より選択される疾患ないし病態である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の中枢神経疾患用治療剤。
［５］中枢神経疾患が脊髄損傷である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の中枢神経疾患用治療剤。
［６］中枢神経疾患の患者に対して、以下の（１）又は（２）を有効成分として含む中枢神経疾患用治療剤を投与するステップを含む、中枢神経疾患の治療法：
（１）ADAMTS-4タンパク質；
（２）ADAMTS-4遺伝子を保持する発現ベクター。
［７］中枢神経疾患が脊髄損傷、脊髄炎、脳損傷、脳虚血や脳内出血に伴う脳梗塞による神経細胞の変性・脱落、及び神経細胞の障害を伴う網膜疾患からなる群より選択される疾患である、［６］に記載の治療法。
［８］中枢神経疾患が脊髄損傷である、［６］に記載の治療法。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】損傷脊髄組織から抽出したmRNAを用いたRT-PCRの結果。脊髄損傷手術３日後、１週後、２週後のADAMTS-4 mRNA発現量を調べた。
【図２】損傷脊髄組織から抽出したmRNAを用いたリアルタイムRT-PCRの結果。脊髄損傷手術３日後、１週後、２週後のADAMTS-4 mRNA発現量を定量した。NS：有意差なし。
【図３】損傷脊髄組織のホモジネートを用いたウエスタンブロットの結果。手術１週後に脊髄損傷術群とsham群（第１０胸椎椎弓切除のみ）のADAMTS-4タンパク質発現量を比較した。
【図４】蛍光アッセイの結果。損傷脊髄中のADAMTS-4活性を蛍光アッセイ（n=9）で測定した。＊：<0.001
【図５】神経系細胞から抽出したmRNAを用いたRT-PCRの結果。ニューロン、アストロサイト及びミクログリアのADAMTS-4発現レベルを比較した。
【図６】ラット脳より採取したプロテオグリカン（PG）を用いた分解アッセイの結果。ADAMTS-4及びADAMTS-13によるブレビカンの分解活性をウエスタンブロットで比較評価した。左から順に、第１レーン：コントロール（PGのみ）、第２レーン：ADAMTS-4（1μM）を添加、第３レーン：95℃でボイルしたADAMTS-4を添加、第４レーン：ADAMTS-13（1μM）を添加、第５レーン：95℃でボイルしたADAMTS-13を添加。
【図７】ラット脳より採取したプロテオグリカン（PG）を用いた分解アッセイの結果。ADAMTS-4及びADAMTS-13によるニューロカンの分解活性をウエスタンブロットで比較評価した。左から順に、第１レーン：コントロール（PGのみ）、第２レーン：ADAMTS-4（1μM）を添加、第３レーン：95℃でボイルしたADAMTS-4を添加、第４レーン：ADAMTS-13（1μM）を添加、第５レーン：95℃でボイルしたADAMTS-13を添加。
【図８】ラット脳より採取したプロテオグリカン（PG）を用いた分解アッセイの結果。ADAMTS-4及びADAMTS-13によるフォスファカンの分解活性をウエスタンブロットで比較評価した。左から順に、第１レーン：コントロール（PGのみ）、第２レーン：ADAMTS-4（1μM）を添加、第３レーン：95℃でボイルしたADAMTS-4を添加、第４レーン：ADAMTS-13（1μM）を添加、第５レーン：95℃でボイルしたADAMTS-13を添加。
【図９】軸索伸長アッセイの結果。PGの存在下及び非存在下でADAMTS-4の軸索伸長効果を調べた。PLL：ポリ-L-リジンコートしたスライド使用（酵素添加なし）、ADAMTS-4＋PLL：ポリ-L-リジンコートしたスライド使用且つADAMTS-4添加、ADAMTS-13＋PLL：ポリ-L-リジンコートしたスライド使用且つADAMTS-13添加、PG：プロテオグリカンコートしたスライド使用（酵素添加なし）、ADAMTS-4＋PG：プロテオグリカンコートしたスライド使用且つADAMTS-4添加、ADAMTS-13＋PG：プロテオグリカンコートしたスライド使用且つADAMTS-13添加、C-ABC+PG：プロテオグリカンコートしたスライド使用且つC-ABC添加。NS：有意差なし。＊：<0.01。
【図１０】軸索伸長アッセイの結果。接着細胞数を各条件で比較した。PG：プロテオグリカンコートしたスライド使用（酵素添加なし）、ADAMTS-13：プロテオグリカンコートしたスライド使用且つADAMTS-13添加、ADAMTS-4：プロテオグリカンコートしたスライド使用且つADAMTS-4添加、C-ABC：プロテオグリカンコートしたスライド使用且つC-ABC添加。＊：<0.001。
【図１１】BBBスケールを用いた後肢運動機能評価の結果。脊髄損傷手術を施したラットにADAMTS-4、c-ABC又は溶媒のみ（Vehicle）を含む薬液をくも膜下腔に投与し、後肢運動機能を経時的に比較評価した（n=6）。＊：<0.05。
【図１２】5-HT線維の免疫組織染色結果。左上、左下及び右上は染色像。右下は5HT陽性エリアの計測結果。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
１．中枢神経疾患用治療剤
本発明の第１の局面は中枢神経疾患用治療剤（以下、説明の便宜上「本発明の治療剤」ともいう）に関する。神経系は中枢神経系と末梢神経系に大別されるが、本発明は中枢神経系の疾患に対して適用される治療剤を提供する。本明細書において「中枢神経疾患用治療剤」とは中枢神経系疾患の治療に用いられる薬剤のことをいう。
【０００９】
本発明の治療剤は有効成分として（１）ADAMTS-4タンパク質又は（２）ADAMTS-4遺伝子を保持する発現ベクターを含む。尚、本発明の治療剤は通常（１）と（２）のいずれかを含むが、これら両者を含むことを妨げるものではない。
【００１０】
（１）ADAMTS-4タンパク質
ADAMTS-4（A disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motif 4）は、ADAMTSファミリーに属する分子であり、アグリカネーゼとも呼ばれる。公共のデータベースに登録されている、ADAMTS-4タンパク質のアミノ酸配列（GenPept(NCBI), ACCESSION：NP_005090, DEFINITION: A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4 preproprotein [Homo sapiens]）を配列表の配列番号１に示す。本発明が意図する作用効果、即ち、中枢神経系疾患に対する有効性が維持される限りにおいて、ADAMTS-4タンパク質の一部（部分タンパク質）を用いてもよい。このような部分タンパク質の一例として、そのアミノ酸配列を配列番号３（52番アミノ酸残基〜685番アミノ酸残基に相当する配列）に示す。尚、本明細書では、このような部分タンパク質も包含する用語として、「ADAMTS-4タンパク質」を使用する。
【００１１】
配列番号１のアミノ酸又は配列番号３のアミノ酸に等価なアミノ酸配列を含むポリペプチドをADAMTS-4タンパク質として用いることもできる。ここでの「等価なアミノ酸配列」とは、基準となるアミノ酸配列（配列番号１又は配列番号３）と一部で相違するが、当該相違がタンパク質の機能（中枢神経疾患に対して有効な作用）に実質的な影響を与えていないアミノ酸配列のことをいう。従って、基準となるアミノ酸配列（配列番号１又は配列番号３）と、それに等価なアミノ酸配列との間には実質的な同一性が認められる。実質的な同一性の有無を判定するためには、例えば、後述の実施例に記載した実験系（動物モデルによる評価）を用い、中枢神経疾患に対する作用・効果の点において二つのアミノ酸配列の間に実質的な差がないことを確認すればよい。尚、ADAMTS-4の保存性は高く、様々な動物種においてADAMTS-4が同定されている。
【００１２】
「アミノ酸配列の一部で相違する」とは、典型的には、アミノ酸配列を構成する１〜数個（上限は例えば３個、５個、７個、１０個）のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１〜数個（上限は例えば３個、５個、７個、１０個）のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変異（変化）が生じていることをいう。ここでのアミノ酸配列の相違は上記機能の大幅な低下がない限り許容される。この条件を満たす限りアミノ酸配列が相違する位置は特に限定されず、また複数の位置で相違が生じていてもよい。ここでの複数とは例えば全アミノ酸の約30％未満に相当する数であり、好ましくは約20％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約10％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約5％未満に相当する数であり、最も好ましくは約1％未満に相当する数である。即ち等価アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列（又は配列番号３のアミノ酸配列）と例えば約70%以上、好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90％以上、より一層好ましくは約95%以上、最も好ましくは約99%以上の配列同一性を有する。
【００１３】
基準となるアミノ酸配列（配列番号１、配列番号３）と等価アミノ酸配列との間の相違が保存的アミノ酸置換基によって生じていることが好ましい。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は、好ましくは同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
【００１４】
ところで、二つのアミノ酸配列又は二つの核酸配列（以下、これらを含む用語として「二つの配列」を使用する）の配列同一性（％）は例えば以下の手順で決定することができる。まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる（例えば、第一の配列にギャップを導入して第二の配列とのアライメントを最適化してもよい）。第一の配列の特定位置の分子（アミノ酸残基又はヌクレオチド）が、第二の配列における対応する位置の分子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるといえる。配列同一性は、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり（すなわち、配列同一性（％）＝同一位置の数／位置の総数 × 100）、好ましくは、アライメントの最適化に要したギャップの数およびサイズも考慮に入れる。
【００１５】
二つの配列の比較及び同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68に記載され、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77において改変されたアルゴリズムがあるが、これに限定されることはない。このようなアルゴリズムは、Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に記載のNBLASTプログラムおよびXBLASTプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。本発明における核酸分子に等価なヌクレオチド配列を得るには例えば、NBLASTプログラムでscore = 100、wordlength = 12としてBLASTヌクレオチド検索を行えばよい。基準となるアミノ酸配列に等価なアミノ酸配列を得るには例えば、XBLASTプログラムでscore = 50、wordlength = 3としてBLASTポリペプチド検索を行えばよい。比較のためのギャップアライメントを得るためには、Altschulら (1997) Amino Acids Research 25(17):3389-3402に記載のGapped BLASTが利用可能である。BLASTおよびGapped BLASTを利用する場合は、対応するプログラム（例えばXBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータを使用することができる。詳しくは例えばNCBIのウェブページを参照されたい。配列の比較に利用可能な他の数学的アルゴリズムの例としては、MyersおよびMiller (1988) Comput Appl Biosci. 4:11-17に記載のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、例えばGENESTREAMネットワークサーバー（IGH Montpellier、フランス）またはISRECサーバーで利用可能なALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを利用する場合は例えば、PAM120残基質量表を使用し、ギャップ長ペナルティ＝12、ギャップペナルティ＝4とすることができる。
【００１６】
二つのアミノ酸配列の同一性を、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを用いて、Blossom 62マトリックスまたはPAM250マトリックスを使用し、ギャップ加重＝12、10、8、6、又は4、ギャップ長加重＝2、3、又は4として決定することができる。また、二つの核酸配列の同一性を、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを用いて、ギャップ加重＝50、ギャップ長加重＝3として決定することができる。
【００１７】
ADAMTS-4タンパク質は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にして、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって容易に調製することができる。例えば、ADAMTS-4タンパク質をコードするDNAで適当な宿主細胞（例えば大腸菌、酵母）を形質転換し、形質転換体内で発現されたタンパク質を回収することにより調製することができる。回収されたタンパク質は目的に応じて適宜精製される。このように組換えタンパク質としてADAMTS-4タンパク質を得ることにすれば種々の修飾が可能である。例えば、ADAMTS-4タンパク質をコードするDNAと他の適当なDNAとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなるADAMTS-4タンパク質を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはＮ末端若しくはＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。尚、ADAMTS-4タンパク質は市販もされており（例えば、R&D Systems, Incが提供する組換えヒトADAMTS-4（配列番号３のアミノ酸配列を有する）、カタログ番号4307-AD）、容易に入手可能である。
【００１８】
質的均一性及び純度の面などから、ADAMTS-4タンパク質を遺伝子工学的手法によって調製することが好ましい。しかしながら、ADAMTS-4タンパク質の調製法は遺伝子工学的手法によるものに限られない。例えば、天然材料から標準的な手法（破砕、抽出、精製など）によってADAMTS-4タンパク質を調製することもできる。
【００１９】
（２）ADAMTS-4遺伝子を保持する発現ベクター
本発明の一態様では、ADAMTS-4遺伝子（以下、「ADAMTS-4遺伝子」と呼ぶ）を保持する発現ベクターを有効成分とする。「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞（宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。本発明に係る発現ベクターでは、ADAMTS-4遺伝子が発現可能に保持されることになる。ADAMTS-4遺伝子を標的細胞に導入し、標的細胞内で発現させることが可能である限り、ベクターの種類は特に限定されない。ここでの「ベクター」にはウイルスベクター及び非ウイルスベクターが含まれる。ウイルスベクターを用いた遺伝子導入法は、ウイルスが細胞へと感染する現象を巧みに利用するものであり、高い遺伝子導入効率が得られる。ウイルスベクターとしてアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が開発されている。
【００２０】
非ウイルスベクターとしてリポソーム、正電荷型リポソーム（Felgner, P.L., Gadek, T.R., Holm, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84:7413-7417, 1987）、HVJ(Hemagglutinating virus of Japan)-リポソーム（Dzau, V.J., Mann, M., Morishita, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93:11421-11425, 1996、Kaneda, Y., Saeki, Y. & Morishita, R., Molecular Med. Today, 5:298-303, 1999）等が開発されている。本発明におけるベクターをこのような非ウイルス性ベクターとして構築してもよい。また、YACベクター、BACベクター等を利用することにしてもよい。
【００２１】
アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターではベクターに組み込んだ外来遺伝子が宿主染色体へと組み込まれ、安定かつ長期的な発現が期待できる。レトロウイルスベクターの場合はウイルスゲノムの宿主染色体への組み込みには細胞の分裂が必要であることから非分裂細胞への遺伝子導入には適さない。一方、レンチウイルスベクターやアデノ随伴ウイルスベクターは非分裂細胞においても感染後に外来遺伝子の宿主染色体への組み込みが生ずる。従って、これらのベクターは非分裂細胞において安定かつ長期的に外来遺伝子を発現させるために有効である。
【００２２】
各ウイルスベクターは既報の方法に従い又は市販される専用のキットを用いて作製することができる。例えば、アデノウイルスベクターの作製はCOS-TPC法や完全長DNA導入法などで行うことができる。COS-TPC法は、目的のcDNA又は発現カセットを組み込んだ組換えコスミドと、親ウイルスDNA-末端タンパク質複合体（DNA-TPC）を293細胞に同時トランスフェクションし、293細胞内でおこる相同組換えを利用して組換えアデノウイルスを作製する方法である（Miyake,S., Makimura,M., Kanegae,Y., Harada,S., Takamori,K., Tokuda,C., and Saito,I. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1320.）。一方、完全長DNA導入法は、目的の遺伝子を挿入した組換えコスミドを制限消化処理した後、293細胞にトランスフェクションすることによって組換えアデノウイルスを作製する方法である（寺島美保、近藤小貴、鐘ヶ江裕美、斎藤泉（2003）実験医学 21（7）931.）。COS-TPC法はAdenovirus Expression Vector Kit (Dual Version)（タカラバイオ株式会社）、Adenovirus genome DNA-TPC（タカラバイオ株式会社）を利用して行うことができる。また、完全長DNA導入法は、Adenovirus Expression Vector Kit (Dual Version)（タカラバイオ株式会社）を利用して行うことができる。
【００２３】
一方、レトロウイルスベクターは以下の手順で作製することができる。まず、ウイルスゲノムの両端に存在するLTR（Long Terminal Repeat）の間のパッケージングシグナル配列以外のウイルスゲノム（gag、pol、env遺伝子）を取り除き、そこへ目的の遺伝子を挿入する。このようにして構築したウイルスDNAを、gag、pol、env遺伝子を構成的に発現するパッケージング細胞に導入する。これによって、パッケージングシグナル配列をもつベクターRNAのみがウイルス粒子に組み込まれ、レトロウイルスベクターが産生される。
【００２４】
アデノベクターを応用ないし改良したベクターとして、ファイバータンパク質の改変により特異性を向上させたもの（特異的感染ベクター）や目的遺伝子の発現効率向上が期待できるguttedベクター（ヘルパー依存性型ベクター）などが開発されている。本発明の発現ベクターをこのようなウイルスベクターとして構築してもよい。
【００２５】
ベクターに挿入されるADAMTS-4遺伝子（以下「ADAMTS-4遺伝子」と呼ぶ）は例えば配列番号２（GenBank(NCBI), ACCESSION: NM_005099, DEFINITION: Homo sapiens ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 4 (ADAMTS-4), mRNA.）の塩基配列又は配列番号４（配列番号１のアミノ酸配列の53番アミノ酸残基〜685番アミノ酸残基をコードする配列）からなる。但し、当該塩基配列に等価な塩基配列かならなるDNA（以下、「等価DNA」と呼ぶ）をADAMTS-4遺伝子として用いることもできる。ここでの「等価な塩基配列」とは、基準の塩基配列と一部で相違するが、当該相違によってそれがコードするタンパク質の機能（中枢神経疾患対して有効な作用）が実質的な影響を受けていない塩基配列のことをいう。等価DNAの具体例は、基準の塩基配列（例えば配列番号２又は配列番号４の塩基配列）に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAである。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)やCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアミド、10×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約42℃〜約50℃でインキュベーションし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて約65℃〜約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液として50％ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を挙げることができる。
【００２６】
等価DNAの他の具体例として、基準の塩基配列（配列番号２、配列番号４）に対して１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、非虚血性心筋障害に対して有効なタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。塩基の置換や欠失などは複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは、当該DNAがコードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが例えば２〜４０塩基、好ましくは２〜２０塩基、より好ましくは２〜１０塩基である。以上のような等価DNAは例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやDNAリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）やランダム突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）による変異の導入などを利用して、塩基の置換、欠失、挿入、付加、及び／又は逆位を含むように基準の塩基配列を有するDNAを改変することによって得ることができる。また、紫外線照射など他の方法によっても等価DNAを得ることができる。
【００２７】
等価DNAの更に他の例として、SNP（一塩基多型）に代表される多型に起因して上記のごとき塩基の相違が認められるDNAを挙げることができる。
【００２８】
ADAMTS-4遺伝子は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって調製することができる。例えば、ADAMTS-4遺伝子に対して特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブ・プライマーを適宜利用することによってヒトcDNAライブラリーよりADAMTS-4遺伝子を単離（及び増幅）することができる。オリゴヌクレオチドプローブ・プライマーとしては、例えば、配列番号２に示す塩基配列又は配列番号４に示す塩基配列に相補的なDNA又はその連続した一部が用いられる。オリゴヌクレオチドプローブ・プライマーは市販の自動化DNA合成装置などを用いて容易に合成することができる。尚、ADAMTS-4遺伝子を調製するために用いるライブラリーの作製方法については、例えばMolecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkが参考になる。
【００２９】
ヒトcDNAライブラリーに代えてヒト以外の哺乳動物細胞（例えば、サル、マウス、ラット、ブタ、ウシ）由来のcDNAライブラリーを用いれば等価DNAを調製可能である。
【００３０】
本発明の治療剤の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。抗生物質、pH調整剤、成長因子（例えば神経成長因子（NGF）、脳由来神経栄養因子（BDNF））等を含有させることにしてもよい。
【００３１】
ADAMTS-4遺伝子を保持する発現ベクターを有効成分とした場合、薬学的に許容可能な媒体を組み合わせて製剤化するとよい。「薬学的に許容可能な媒体」とは、発現ベクターの薬効（即ち中枢神経疾患に対する有効性）に実質的な影響を与えることなく発現ベクターの投与や保存等に関して利点ないし恩恵をもたらす物質をいう。「薬学的に許容可能な媒体」として、脱イオン水、超純水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、5%デキストロース水溶液等を例示できる。
【００３２】
ADAMTS-4遺伝子を保持する発現ベクターがウイルスベクターの形態の場合、生体適合性のポリオル（例えばpoloxamer407など）を併用することが好ましい。ポリオルの使用によってウイルスベクターの形質導入率を１０〜１００倍に上昇させ得る（March et al., Human  Gene Therapy 6:41-53, 1995）。従って、ポリオルを併用することにすればウイルスベクターの投与量を低く抑えることができる。尚、本発明の治療剤の一成分としてポリオルを使用することにしても、本発明の治療剤とは別にポリオル（又はそれを含む組成物）を調製することにしてもよい。後者の場合、本発明の治療剤を投与するときにポリオル（又はそれを含む組成物）を併せて投与することになる。
【００３３】
製剤化する場合の剤形は特に限定されない。剤形の例は錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、及び座剤である。
【００３４】
本発明の治療剤には、期待される治療効果（又は予防効果）を得るために必要な量（即ち治療上有効量）の有効成分が含有される。本発明の治療剤中の有効成分量は一般に剤形によって異なるが、所望の投与量を達成できるように有効成分量を例えば約0.1重量％〜約99重量％の範囲内で設定する。
【００３５】
目的の組織に送達される限りにおいて、本発明の治療剤の投与経路は特に限定されない。例えば、局所投与により適用する。局所投与の例として、目的組織への注入又は塗布を挙げることができる。脊髄損傷に対して適用する場合、例えばくも膜下腔に注入投与するとよい。静脈内注射、動脈内注射、門脈内注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、又は腹腔内注射によって本発明の治療剤を投与することにしてもよい。これらの投与経路は互いに排他的なものではなく、任意に選択される二つ以上を併用することもできる。
【００３６】
ここでの「対象」は特に限定されず、ヒト及びヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウズラ等である）を含む。好ましい一態様では本発明の治療剤はヒトに対して適用される。好ましくは、本発明の治療剤の効果を最大限活かすように、急性期又は亜急性期の対象に対して本発明の組成物を投与する。
【００３７】
本発明の治療剤の投与量は、期待される治療効果が得られるように設定される。治療上有効な投与量の設定においては一般に患者の症状、年齢、性別、及び体重などが考慮される。尚、当業者であればこれらの事項を考慮して適当な投与量を設定することが可能である。例えば、ADAMTS-4タンパク質を有効成分とした場合、例えば、成人（体重約60kg）を対象として一日当たりの有効成分量が約20μg〜約20mg、好ましくは約2mg〜約10mgとなるよう投与量を設定することができる。投与スケジュールとしては例えば１日１回〜数回、２日に１回、或いは３日に１回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、患者の症状や有効成分の効果持続時間などを考慮することができる。
【００３８】
本発明の治療剤は中枢神経疾患の治療に用いられる。理論に拘泥する訳ではないが、本発明の治療剤によればその有効成分によって、損傷した中枢神経の再生を阻害するプロテオグリカンの構造変化が生じ、治療効果が発揮される。このような機序に基づく治療が有効な疾患ないし病態であれば、その種類や原因等の如何に拘わらず、本発明の対象疾患となり得る。好ましくは、外傷や出血などに起因する中枢神経疾患、具体的には脊髄損傷、脊髄炎、脳損傷、脳虚血や脳内出血に伴う脳梗塞による神経細胞の変性・脱落、及び神経細胞の障害を伴う網膜疾患等に対して、本発明の治療剤は適用される。
【００３９】
脊髄損傷は外部からの衝撃や脊髄腫瘍又はヘルニアなどの内的要因によって脊髄が損傷した状態をいう。損傷の度合によって完全型（脊髄が途中で完全に切断された状態）と不完全型（脊髄が損傷又は圧迫を受けているものの脊髄の機能が部分的に維持されている状態）に分かれる。現在の医療技術では脊髄損傷を完全に回復させることはできず、新たな治療法の確立が切望されている。脊髄損傷は、再生医療の適用が期待される疾病の一つであり、骨髄、神経幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞等の使用が検討されている。しかしながら、様々な問題から、決定的な治療技術の実現には至っていない。本発明の治療剤は、このような状況にあって高い治療効果を期待できる治療法を提供するものであり、その意義・価値は極めて高い。
【実施例】
【００４０】
ADAMTS-4によるコアプロテインの分解により起きるプロテオグリカンの構造変化が脊髄損傷後の神経軸索伸長効果をもたらすことを仮定し、以下の実験を行った。【００４１】
１．方法
（１）脊髄損傷手術
メス成体SD（Sprague-Dawley）ラット（200-230g）を用いた。ケタミン(100mg/kg)及びキシラジン(10mg/kg)をラット腹腔内に投与して、麻酔をかけた。第10胸椎椎弓切除を行い、硬膜を露出した。IH impactor (Infinite Horizon impactor; Precision Systems & Instrumentation, Lexington, KY)を用いて、200kdynの強度で脊髄損傷を作成した。第11胸椎椎弓を部分切除し、事前に薬液を注入したポンプ（Alzet pump）に接続しておいたシリコンチューブを顕微鏡下にくも膜下腔に留置した。1日に2回徒手排尿を行った。食物はケージの底に置き、抗生剤入りの飲水ボトルを設置した。名古屋大学医学部のガイドラインに沿って管理を行った。【００４２】
（２）損傷脊髄におけるADAMTS-4 mRNAの測定（RT-PCR およびリアルタイムPCR）
損傷脊髄組織をRNeasy Lipid Tissue Mini Kit (QIAGEN)を用いて、プロトコールに沿ってmRNAを抽出した。SuperScriptIII First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen)を用いて、mRNAよりcDNAを作成した。PCRには以下のプライマーを用いた。
＜ADAMTS-4用プライマー＞
5’-ctacaaccaccgaaccgac-3’（配列番号５）
5’-tgccagccaccagaactt-3’（配列番号６）
＜ラット特異的GAPDH用プライマー
5’-tatgactctacccacggcaag-3’（配列番号７）
5’-tgcattgctgacaatcttgag-3（配列番号８）【００４３】
脊髄損傷中のADAMTS-4 mRNAを定量するためにリアルタイムPCRを行った。リアルタイムPCRはLight Cycler 480 Real-Time System (Roche Diagnostics Corporation)及びLight Cycler Fast Start DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostics Corporation)を用いて行った。リアルタイムPCRでは以下のプライマーを用いた。
＜ラット特異的ADAMTS-4用プライマー＞
5’-cccggaatggtggaaagtatt-3’（配列番号９）
5’-tcttcacggaaggtcaatgct-3’（配列番号１０）
＜ラット特異的GAPDH用プライマー＞
5’-tgattctacccacggcaagt-3’（配列番号１１）
5’-agcatcaccccatttgatgt-3’（配列番号１２）【００４４】
（３）損傷脊髄におけるADAMTS-4蛋白の発現と活性の測定
脊髄損傷後1週間での脊髄組織をホモゲナイズした後に、10000gで15分間遠心分離を行った。上清を採取して蛋白定量を行い、20μgの蛋白量にてウエスタンブロットを行った。1次抗体には抗ADAMTS-4 (1000倍希釈; Santa Cruz)、抗βアクチン抗体(100,000倍希釈; Sigma)、2次抗体にはホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG抗体(5000倍希釈)及び抗ウサギIgG抗体(5000倍希釈; Invitrogen)を用いた。発色にはECL plus Western blotting detection kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)を用いた。損傷脊髄中のADAMTS-4活性は、SensoLyte（登録商標） 520 Aggrecanase-1 assay kit (AnaSpec, San Jose, USA)を用いた蛍光アッセイにて測定した。【００４５】
（４）細胞培養
(a)ニューロン
p8ラットの小脳より軟膜を除去し、細かくした後に37℃で15分間培養した。その後、溶液に10%FBS、1M MgCl2、DAaseIを投与して、再度37℃で10分間培養した。これをPBSにて洗浄し、これを60%および35%パーコールの入った容器に入れ、遠心操作を行った。これでニューロンとグリアが分けられる。分取したニューロンをシャーレ上で培養した。
(b)アストロサイト
p3ラットの大脳より軟膜を除去し、細かくした後に10%FBS入りDMEMにてフラスコで37℃、5%CO2の条件下で培養を行った。培養液は3-5日ごとに交換し、コンフルエントな状態になるまで培養した。95%がGFAP陽性細胞であることを確認した。最終的にmRNAを採取する際に、振盪することでミクログリアを除去した。
(c)ミクログリア
アストロサイトと同様の方法で、細胞集団（グリア細胞）を21日間培養し、シェイカーにて200回転/分で30分間振盪し、細胞（ミクログリア）を剥がして、これを回収して培養し、使用した。95%以上の細胞がIba-1陽性細胞であることを確認した。【００４６】
（５）ニューロン／アストロサイト／ミクログリアにおけるADAMTS-4 mRNA発現
細胞からRNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用い、添付のプロトコールに沿ってmRNAを抽出した。上述した方法（２）と同様の方法でADAMTS-4 mRNAの発現を確認した。【００４７】
（６）分解アッセイ（Degradation assay）によるADAMTS-4のプロテオグリカン分解作用の確認
ラット脳からMatsuiらの方法（2006, Adv Pharmacol 2006;53:3-20）により、100kDa以上のプロテオグリカン（PG）を採取した。精製したPG（3μg）に酵素（ADAMTS-4（1μM）、ADAMTS-13（1μM）、95℃でボイルしたADAMTS-4、又は95℃でボイルしたADAMTS-13）を添加し、37℃で3時間インキュベートした。その後、さらにC-ABC 10U/mlを投与し、37℃で1時間インキュベートした溶液を試料として、抗ブレビカン（Brevican）抗体、抗ニューロカン（Neurocan）抗体、及び抗フォスファカン（Phosphacan）抗体を用いたウエスタンブロットを行い、各酵素の分解活性を調べた。【００４８】
（７）ADAMTS-4による軸索伸長アッセイ
ニューロンは上述の方法で採取した。4ウェルキャンバースライドに20μg/mlポリ-L-リジン(PLL; Sigma)又は300ng/mlプロテオグリカン(Millipore Bioscience Research Reagents)を滴下して4℃で一晩置いた。このようにして調製したスライドに2.0×105/ウェルの細胞密度でニューロンを播種した。その後、10nM/ml ADAMTS-4、10U/ml C-ABC又は10nM ADAMTS-13を投与し、24時間後に4%パラホルムアルデヒドにて固定し、抗β-チューブリン抗体を用いて神経軸索の伸長と細胞接着数を計測した。【００４９】
（８）後肢運動機能評価
BBBスケール（Basso, Beattie and Bresnahan scale）を用いて、脊髄損傷手術を施したラット（ADAMTS-4（5.3 μg/μl）、C-ABC（0.25U/μl）又は溶媒のみを含む薬液をくも膜下腔に投与）の後肢運動機能を評価した。薬液の注入量は約15μl／日とした。損傷後1週ごとに8週目まで測定を行った。二重盲検法で測定した。【００５０】
（９）免疫組織染色によるセロトニン作動性線維（serotonergic fiber）の評価
後肢運動機能の改善を免疫組織学的に評価するべく、5-HT陽性線維のカウントによりセロトニン作動性線維（serotonergic fiber）の染色を調べた。脊髄損傷後8週にて、ラットを4%パラホルムアルデヒドにて灌流固定し、１日間4%パラホルムアルデヒドにて再度固定した後に、30%スクロースに2日間浸して、20μmの凍結切片を作成した。切片に対して、一次抗体（抗5-HT抗体）及び二次抗体（Alexa 488標識）を反応させて、顕微鏡にて確認した。線維のカウントにはMetaMorph Offline version 6.3 r2（Molecular Devices）を用いた。【００５１】
２．結果
（１）損傷脊髄におけるADAMTS-4 mRNAの発現は、RT-PCR及びリアルタイムRT-PCRのいずれの測定においても、損傷前、損傷後3日、1週、2週で有意差はなかった（図１、２）。
（２）ウエスタンブロットにより蛋白の発現を調べた結果、損傷後1週においてsham群（第１０胸椎椎弓切除のみ）に比べて損傷群ではやや上昇していた（図３）。蛍光ペプチドアッセイによるADAMTS-4の蛋白活性ではsham群と比べて損傷群では1.4倍とやや増強がみられた（図４）。
（３）培養後のニューロン、アストロサイト及びミクログリアから採取したmRNAを用いて、ADAMTS-4の発現をみたところ、ニューロンに比べてアストロサイト及びミクログリアでより強い発現を認めた（図５）。
（４）ラット脳より採取したPGを用いた分解アッセイの結果より、ADAMTS-4のみがブレビカン、ニューロカン及びフォスファカンを分解し、不活化したADAMTS-4及びADAMTS-13は分解活性を示さないことが判明した（図６〜８）。即ち、ADAMTS-4が特異的にこれらプロテオグリカンの分解に関与していることが示唆された。
（５）ADAMTS-4を用いた軸索伸長アッセイでは、コントロール（PG単独）及びADAMTS-13添加群と比較し、ADAMTS-4添加群及びC-ABC添加群で有意な軸索伸長を認めた（図９）。細胞接着数についてもADAMTS-4添加群及びC-ABC添加群で有意に多い（図１０）。この結果は、その神経軸索伸長効果によってADAMTS-4が中枢神経系の再生に有効であることを示唆する。
（６）BBBスケールを用いた後肢運動機能評価においては、ADAMTS-4およびC-ABCを用いて治療介入を行ったラットはVehicle群と比べて有意な改善を示した（図１１）。改善の程度はADAMTS-4およびC-ABCに有意差はなく、同等であった。このように、ADAMTS-4の治療効果が動物レベルで確認された。尚、ADAMTS-4がC-ABCと同等の治療効果を示したことは、ADAMTS-4を使用すればバクテリア由来のC-ABCによらずとも高い治療効果が得られることを意味し、より安全な治療戦略を可能にする。
（７）Vehicle群に比べ、ADAMTS-4で治療介入を行ったラットでは、損傷脊髄の尾側前角において有意に多い5-HT陽性線維を認めた（図１２）。即ち、免疫組織学的にも機能改善が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明の治療剤を適用可能な疾患として、脊髄損傷、脊髄炎、脳損傷、脳虚血や脳内出血に伴う脳梗塞による神経細胞の変性・脱落、及び神経細胞の障害を伴う網膜疾患等が想定される。【００５３】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【配列表フリーテキスト】
【００５４】
配列番号５〜１２：人工配列の説明：PCR用プライマー
【図１】
2012086474.tif 000002
【図２】
2012086474.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
2012086474.tif 000006
【図６】
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【図７】
2012086474.tif 000008
【図８】
2012086474.tif 000009
【図９】
2012086474.tif 000010
【図１０】
2012086474.tif 000011
【図１１】
2012086474.tif 000012
【図１２】
2012086474.tif 000013
【配列表】
2012086474000001.app
【国際調査報告】
2012086474.tif 000014
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2012086474.tif 000016
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