(57)【要約】  近年、がんの治療方法のひとつとして、抗体医薬が注目を集めているが、抗体の活性が弱いために治療効果が十分得られないケースや、投与量が多くなることで患者のコスト負担が高くなるケースがある。そのため、免疫活性の増強が抗体治療薬の重要な課題になっており、抗体医薬の効果を増強したり、それにより使用量を抑えることができる、抗体療法の補助剤が求められている。腫瘍及びその近傍にこれらリンパ球を遊走・集積させることができれば、抗体医薬の有効性をさらに改善できる可能性がある。本発明の課題は、抗体医薬の効果を増強することができる安価で安全な抗体療法補助療法剤を提供することにある。β−リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）の緻密体を体内に移植することにより、免疫細胞を活性・遊走・集積させる機能がある。発明者らは、この機能を利用することにより抗体医薬による治療効果を増強できることを見出し、本発明を完成するに至った。
2012105219.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の体内に移植されて用いられるβ−リン酸三カルシウムを有効成分とする組成物と、抗体医薬組成物とを備えた抗体療法キット。
【請求項２】
体内が、皮下であることを特徴とする請求項１記載の抗体療法キット。
【請求項３】
β−リン酸三カルシウムが病変近傍に移植されることを特徴とする請求項１又は２記載の抗体療法キット。
【請求項４】
病変近傍が、病変から０．１〜１５ｃｍの距離にある領域であることを特徴とする請求項３記載の抗体療法キット。
【請求項５】
抗体医薬が、がん特異的抗体医薬であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の抗体療法キット。
【請求項６】
がん特異的抗体が、抗ＣＥＡ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、及び抗ＥＧＦＲ抗体から選ばれる１種又は２種以上の抗体であることを特徴とする請求項５記載の抗体療法キット。
【請求項７】
β−リン酸三カルシウムが、気孔率５０％以下の緻密体であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の抗体療法キット。
【請求項８】
β−リン酸三カルシウムが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、及びマクロファージを活性化、誘導、又は集積することを特徴とする請求項７記載の抗体療法キット。
【請求項９】
β−リン酸三カルシウムが、錠剤又は柱状体であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の抗体療法キット。
【請求項１０】
β−リン酸三カルシウムが、粒径０．０５〜２５μｍの粒子又は顆粒であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の抗体療法キット。
【請求項１１】
対象の体内に移植されて用いられるβ−リン酸三カルシウムを有効成分とする、抗体医薬組成物を用いる抗体療法の効果増強剤。
【請求項１２】
体内が、皮下であることを特徴とする請求項１１記載の抗体療法の効果増強剤。
【請求項１３】
β−リン酸三カルシウムが病変近傍に移植されることを特徴とする請求項１１又は１２記載の抗体療法の効果増強剤。
【請求項１４】
病変近傍が、病変から０．１〜１５ｃｍの距離にある領域であることを特徴とする請求項１３記載の抗体療法の効果増強剤。
【請求項１５】
抗体医薬が、がん特異的抗体医薬であることを特徴とする請求項１１〜１４のいずれか記載の抗体療法の効果増強剤。
【請求項１６】
がん特異的抗体が、抗ＣＥＡ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、及び抗ＥＧＦＲ抗体から選ばれる１種又は２種以上の抗体であることを特徴とする請求項１５記載の抗体療法の効果増強剤。
【請求項１７】
β−リン酸三カルシウムが、気孔率５０％以下の緻密体であることを特徴とする請求項１１〜１６のいずれか記載の抗体療法の効果増強剤。
【請求項１８】
β−リン酸三カルシウムが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、及びマクロファージを活性化、誘導、又は集積することを特徴とする請求項１７記載の抗体療法の効果増強剤。
【請求項１９】
β−リン酸三カルシウムが、錠剤又は柱状体であることを特徴とする請求項１１〜１８のいずれか記載の抗体療法の効果増強剤。
【請求項２０】
β−リン酸三カルシウムが、粒径０．０５〜２５μｍの粒子又は顆粒であることを特徴とする請求項１１〜１８のいずれか記載の抗体療法の効果増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体療法の効果増強剤（抗体療法補助療法剤）や抗体療法キット、より詳しくは、対象の体内に移植されて用いられるβ−リン酸三カルシウム（ＴＣＰ：Tricalcium phosphate）を有効成分とする、抗体医薬組成物を用いる抗体療法の効果増強剤や、β−リン酸三カルシウムを含む組成物と抗体医薬組成物とからなる抗体療法キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の化学療法による治療は、疾患にかかった異常な細胞と正常な細胞とに同等に影響を与え、それにより時に強い副作用が起こることが問題であった。そこで、異常な細胞のみに効果を発揮する、分子標的薬剤の開発が進められている。分子標的薬剤の中でも抗体医薬を用いた抗体療法は、正常細胞に発現していない、または発現していても非常に発現量が少ない抗原に対する抗体を用いることで、極力正常細胞に影響を与えず副作用の少ない、異常な細胞に選択性が高い治療効果が期待されている。【０００３】
例えばがん細胞は、正常細胞の増殖、分化、細胞死に重要な役割を果たす遺伝子の欠失、異常などにより、癌の生物学的特性ともいえる細胞増殖の促進、アポトーシス抑制、血管新生、転移などを示す。これらに関わる遺伝子ががん遺伝子やがん抑制遺伝子として同定されてきており、例えば、がん遺伝子の機能を抑制することにより、がんを治療することができると考えられている。すなわち、がんの原因となっている増殖因子や増殖因子受容体を標的とした抗体を投与することにより、正常細胞に及ぼす影響が少なく、がん細胞の増殖シグナルを抑制し、増殖を抑制または停止させることができると考えられている。【０００４】
そして、様々ながん細胞において過剰発現が観察されている上皮増殖因子受容体２型（ＨＥＲ２；Human Epidermal Growth Factor Receptor Type2；別名ｃ−ｅｒｂＢ−２）に対するモノクローナル抗体は、抗悪性腫瘍剤ハーセプチン（HERCEPTIN、登録商標；ロシュ社製）として、同様に様々な癌細胞において過剰発現が観察されている上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ；Epidermal Growthfactor Receptor）に対するモノクローナル抗体は、抗悪性腫瘍剤アービタックス（ERBITUX、登録商標；メルクセローノ株式会社製）として臨床において既に使用されている。【０００５】
しかしながら、抗体の活性が弱いために治療効果が十分得られないケースや、投与量が多くなることで患者のコスト負担が高くなるケース、あるいは、抗体医薬は高価であるため、抗体医薬の使用量が制限されるケースなどがある。そのため、免疫活性の増強が抗体治療薬の重要な課題になっており、抗体医薬の効果を増強したり、それにより使用量を抑えることができる、抗体療法の補助剤が求められている。【０００６】
他方、β−リン酸三カルシウムを含むリン酸カルシウム系化合物は、その優れた生体親和性により人工骨、人工歯根などの生体材料として応用研究が盛んに行われている（特許文献１，２）。本発明者らは気孔率７５％、粒径２５〜７５μｍ又は７５〜１０５μｍのβ−リン酸三カルシウムをシートにコーティングした、マクロファージの活動を活発化させる癌細胞抑制剤（特許文献３、非特許文献１）を開発している。しかしながら、β−リン酸三カルシウムと抗体医薬を併用する効果については全く知られていなかった。【０００７】
その他、これまでに人工的にリンパ節を構築する試みは幾つかあったが、自然のリンパ節と非常に類似した構造を持ち、しかも実際に生体内で強力な免疫機能を発揮する免疫装置の開発の成功は全くなかった。例えば、特許文献４〜６には、コラーゲンスポンジを用いた支持体に支持細胞（ストローマ細胞）を播き、かかる支持体を腎臓の被膜の下に埋め込むことで、人工リンパ節となり、抗体産生、がん細胞の排除などの免疫反応を強力に起こすことが開示されている。しかしこれらはいずれも細胞を使用しており、試験管の細胞培養や、人工材料を用いた構築などの工程が必要であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−２３３９１４号公報
【特許文献２】特開平７−１１６１７５号公報
【特許文献３】特開２０１０−１２６４３４号公報
【特許文献４】特開２００６−１２９８３９号公報
【特許文献５】特開２００４−２５５１１０号公報
【特許文献６】特開２００８−１６３０１５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J. Cheng et al., J. Biomed. Mater. Res. A, 92(2):542-547 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
近年、がんの治療方法のひとつとして、抗体医薬が注目を集めている。しかしながら、抗体の活性が弱いために治療効果が十分得られないケースや、投与量が多くなることで患者のコスト負担が高くなるケース、あるいは、抗体医薬は高価であるため、抗体医薬の使用量が制限されるケースなどがある。そのため、免疫活性の増強が抗体治療薬の重要な課題になっており、自然免疫系をターゲットし、抗体医薬の効果を増強したり、それにより使用量を抑えることができる、抗体療法の補助剤が求められている。本発明の課題は、抗体医薬の効果を増強することができる安価で安全な抗体療法補助療法剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明者らは、病変部位近傍に移植されたβ−リン酸三カルシウム緻密体（ここでは気孔率５０％以下のものを指す）により活性・誘導・集積されたＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞などのリンパ球や樹状細胞が高度に組織化された三次元構造をとることにより、リンパ球が抗原及び抗原提示細胞と相互作用して抗原特異的な免疫反応（適応免疫）を開始し、抗体医薬によるがん治療効果を増強できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は［１］対象の体内に移植されて用いられるβ−リン酸三カルシウムを有効成分とする組成物と、抗体医薬組成物とを備えた抗体療法キットや、［２］体内が、皮下であることを特徴とする［１］記載の抗体療法キットや、［３］β−リン酸三カルシウムが病変近傍に移植されることを特徴とする［１］又は［２］記載の抗体療法キットや、［４］病変近傍が、病変から０．１〜１５ｃｍの距離にある領域であることを特徴とする［３］記載の抗体療法キットや、［５］抗体医薬が、がん特異的抗体医薬であることを特徴とする［１］〜［４］のいずれか記載の抗体療法キットや、［６］がん特異的抗体が、抗ＣＥＡ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、及び抗ＥＧＦＲ抗体から選ばれる１種又は２種以上の抗体であることを特徴とする［５］記載の抗体療法キットに関する。【００１３】
また、本発明は［７］β−リン酸三カルシウムが、気孔率５０％以下の緻密体であることを特徴とする［１］〜［６］のいずれか記載の抗体療法キットや、［８］β−リン酸三カルシウムが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、及びマクロファージを活性化、誘導、又は集積することを特徴とする［７］記載の抗体療法キットや、［９］β−リン酸三カルシウムが、錠剤又は柱状体であることを特徴とする［１］〜［８］のいずれか記載の抗体療法キットや、［１０］β−リン酸三カルシウムが、粒径０．０５〜２５μｍの粒子又は顆粒であることを特徴とする［１］〜［８］のいずれか記載の抗体療法キットに関する。【００１４】
また、本発明は［１１］対象の体内に移植されて用いられるβ−リン酸三カルシウムを有効成分とする、抗体医薬組成物を用いる抗体療法の効果増強剤や、［１２］体内が、皮下であることを特徴とする［１１］記載の抗体療法の効果増強剤や、［１３］β−リン酸三カルシウムが病変近傍に移植されることを特徴とする［１１］又は［１２］記載の抗体療法の効果増強剤や、［１４］病変近傍が、病変から０．１〜１５ｃｍの距離にある領域であることを特徴とする［１３］記載の抗体療法の効果増強剤や、［１５］抗体医薬が、がん特異的抗体医薬であることを特徴とする［１１］〜［１４］のいずれか記載の抗体療法の効果増強剤や、［１６］がん特異的抗体が、抗ＣＥＡ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、及び抗ＥＧＦＲ抗体から選ばれる１種又は２種以上の抗体であることを特徴とする［１５］記載の抗体療法の効果増強剤に関する。【００１５】
また、本発明は［１７］β−リン酸三カルシウムが、気孔率５０％以下の緻密体であることを特徴とする［１１］〜［１６］のいずれか記載の抗体療法の効果増強剤や、［１８］β−リン酸三カルシウムが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞及びマクロファージを活性化、誘導、又は集積することを特徴とする［１７］記載の抗体療法の効果増強剤や、［１９］β−リン酸三カルシウムが、錠剤又は柱状体であることを特徴とする［１１］〜［１８］のいずれか記載の抗体療法の効果増強剤や、［２０］β−リン酸三カルシウムが、粒径０．０５〜２５μｍの粒子または顆粒であることを特徴とする［１１］〜［１８］のいずれか記載の抗体療法の効果増強剤に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、対象の体内に移植されて用いられるβ−リン酸三カルシウムを有効成分とする抗体療法の効果増強剤を提供することができ、抗体医薬の効果を増強することができる安価で安全な抗体療法補助療法剤により疾患を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】免疫細胞とβ−ＴＣＰ顆粒（サイズ２５〜７５μｍ）の結合を走査型電子顕微鏡にて観察した結果を示す。
【図２】β−ＴＣＰ緻密体（緻密体錠剤：φ５×２ｍｍ）を、走査型電子顕微鏡にて観察した結果を示す。直径２μｍの粒子は、マーカーとして用いられている。
【図３】β−ＴＣＰ緻密体（緻密体棒剤：φ０．９×５ｍｍ）を、走査型電子顕微鏡にて観察した結果を示す。
【図４】β−ＴＣＰ緻密体（錠剤）を正常マウスの皮下に移植して２週間経過後、組織サンプルをＨＥ染色し、顕微鏡にて観察した。リンパ球が集積し、天然のリンパ節と似た構造となっていることを示す図である。
【図５】β−ＴＣＰ緻密体（顆粒）サイズ０．０５〜１０５μｍを正常マウスの皮下に移植して２週間経過後、組織サンプルをＨＥ染色し、顕微鏡にて観察した。サイズ７５μｍ以上のβ−ＴＣＰ顆粒はマクロファージを誘導し（Ｎ＝１３）、７５μｍ以下の顆粒はリンパ球を集め（Ｎ＝１１）、サイズ０．０５〜２５μｍの微小顆粒はリンパ球集塊を形成すること（図中矢印）を示す図である
【図６】円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤φ５×２ｍｍを皮下に移植した正常マウスの組織サンプルを、抗ＣＤ４５Ｒ抗体を用いてＢ細胞を免疫組織染色し、顕微鏡にて観察した。β−ＴＣＰ緻密体によりＢ細胞が誘導されることを示す図である（左：弱拡 ×４、右：強拡 ×４０ 矢印部）。
【図７】円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤φ５×２ｍｍを皮下に移植した正常マウスの組織サンプルを、抗ＣＤ３抗体を用いてＴ細胞を免疫組織染色し、顕微鏡にて観察した。β−ＴＣＰ緻密体によりＴ細胞が誘導されることを示す図である（左：弱拡 ×４、右：強拡 ×４０ 矢印部）。
【図８】円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤φ５×２ｍｍを皮下に移植した正常マウスの組織サンプルを、抗ＣＤ４９ｂ抗体を用いてＮＫ細胞を免疫組織染色し、顕微鏡にて観察した。β−ＴＣＰ緻密体によりＮＫ細胞が誘導されることを示す図である（左：弱拡 ×４、右：強拡 ×４０ 矢印部）。
【図９】円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤φ５×２ｍｍを皮下に移植した正常マウスの組織サンプルを、抗ＣＤ１１ｃ抗体を用いて樹状細胞を免疫組織染色し、顕微鏡にて観察した。β−ＴＣＰ緻密体により樹状細胞が誘導されることを示す図である（左：弱拡 ×４、右：強拡 ×４０ 矢印部）。
【図１０】円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤φ５×２ｍｍを皮下に移植した正常マウスの組織サンプルを、抗Ｆ４／８０Ｒ抗体を用いてマクロファージを免疫組織染色し、顕微鏡にて観察した。β−ＴＣＰ緻密体によりマクロファージが誘導されることを示す図である（左：弱拡 ×４、右：強拡 ×４０ 矢印部）。
【図１１】円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤φ５×２ｍｍを皮下に移植した正常マウスの組織サンプルを、抗Ｄ２−４０抗体を用いてリンパ管内皮細胞を免疫組織染色し、顕微鏡にて観察した。β−ＴＣＰ緻密体によりリンパ管形成が誘導されることを示す図である（左：弱拡 ×４、右：強拡 ×４０ 矢印部）。
【図１２】円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤又は同サイズのプラスティック片をヌードマウスの皮下へ移植し、それと同時に抗ＣＥＡ抗体又はＩｇＧの腹腔内投与を開始し、週２回、計８回抗体又はＩｇＧを投与し、以降週２回腫瘍体積を測定した実験の概略を示す図である。
【図１３】円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤又は同サイズのプラスティック片をヌードマウスの皮下に移植した日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ０から抗ＣＥＡ抗体（ａ−ＣＥＡ）又はＩｇＧを週２回、計８回腹腔内に投与し、以降週２回腫瘍体積を測定した結果を示す。＊は、Ｄａｙ１８において抗ＣＥＡ抗体及びβ−ＴＣＰの群（第４群）の腫瘍体積が、プラスティック片及びＩｇＧのコントロール群（第１群）、又は、プラスティック片及び抗ＣＥＡ抗体の群（第３群）それぞれに対し、Tukey's testにより有意に小さいことを表す。また、＊＊は、Ｄａｙ２１において抗ＣＥＡ抗体及びβ−ＴＣＰの群（第４群）の腫瘍体積が、プラスティック片及びＩｇＧのコントロール群（第１群）に対し、Tukey's testにより有意に小さいことを表す。ＣＴＲＬはコントロールのＩｇＧ投与を、ａ−ＣＥＡは抗ＣＥＡ抗体を示す。
【図１４】円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤又は同サイズのプラスティック片をヌードマウスの皮下に移植した日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ０から抗ＥＧＦＲ抗体（Erbitax）又はＩｇＧを、計３回腹腔内に投与し、腫瘍体積を測定した結果を示す。＊は、Ｄａｙ１０において抗ＥＧＦＲ抗体及びβ−ＴＣＰの群（第４群）の腫瘍体積が、プラスティック片及びＩｇＧのコントロール群（第１群）対し、Tukey's testにより有意に小さいことを表す。
【図１５】円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤ヌードマウスの皮下に移植した日をＤａｙ０とし、抗ＨＥＲ２抗体（ハーセプチン）をＤａｙ３、９、１７の計３回腹腔内に投与し、腫瘍体積をＤａｙ１４、２１、２４に測定した結果を示す。＊は、各測定日において抗ＨＥＲ２抗体及びβ−ＴＣＰの群（第４群）の腫瘍体積が、コントロール群（第１群）対し、Tukey's testにより有意に小さいことを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の抗体療法キットとしては、体内に移植されて用いられる、換言すれば体内に移植するためのβ−リン酸三カルシウム（以下、「β−ＴＣＰ」という）を有効成分とする組成物と、抗体医薬組成物とを備えたものであれば特に制限されず、また本発明の抗体医薬組成物を用いる抗体療法の効果増強剤としては、β−ＴＣＰを有効成分とする組成物であれば特に制限されず、本発明の一形態として、対象の体内にβ−リン酸三カルシウムを有効成分とする組成物を移植した後に、抗体医薬組成物を投与する抗体療法や、抗体医薬組成物を用いる抗体療法の効果増強剤製造のための、対象の体内に移植されて用いられるβ−リン酸三カルシウムの使用を挙げることができる。上記β−ＴＣＰはＣａ３（ＰＯ４）２で表される組成物の一結晶形態であって、常温において安定であり生体親和性のある化合物である。β−ＴＣＰとしては、市販のβ−ＴＣＰ粉末やβ−ＴＣＰブロック、例えば人工骨として利用されるβ−ＴＣＰブロックなどを用いてもよいし、公知の方法（特開２００４−２６６４８など）により製造してもよく、またα−ＴＣＰ粉末から製造する（特開２００６−８９３１１など）こともできる。また、本発明のβ−ＴＣＰ組成物は、実質的にβ−ＴＣＰ組成からなるものや、界面活性剤や水などを混入して製造されたものでもよいが、β−ＴＣＰブロックを粒子又は顆粒状に加工したβ−ＴＣＰの粉末の他、β−ＴＣＰ粉末を打錠により緻密化、あるいは焼結により脱泡の上緻密化した、高強度、高密度、低気孔率である、多結晶体のβ−ＴＣＰ緻密体、中でも気孔率５０％以下のβ−ＴＣＰ緻密体であることが好ましい。本発明において、β−ＴＣＰ緻密体とは気孔率５０％以下のβ−ＴＣＰをいう。また本発明において、粉末、粒子、顆粒はいずれも粒状の形態を指し、実質的な区別はない。
【００１９】
かかるβ−ＴＣＰ緻密体を構成する多結晶体の粒子サイズとして、好ましくは０．００１〜５０μｍ、より好ましくは０．０１〜２０μｍ、さらに好ましくは０．７５〜１０．０μｍであり、平均の多結晶体の粒子サイズは好ましくは１．８０μｍである。さらに、多結晶体の粒子の隙間は好ましくは０．００１〜１０μｍ、より好ましくは０．００５〜５μｍ、０．０１〜１．０μｍであり、平均の多結晶体の粒子の隙間は好ましくは０．０５〜０．２μｍ、より好ましくは０．１μｍである。かかる多結晶体の粒子の隙間の大きさや数により、β−ＴＣＰ緻密体の気孔が定められる。
【００２０】
β−ＴＣＰの気孔率は、細孔に水銀を浸入させるために圧力を加え、圧力と圧入された水銀量から比表面積や細孔分布を求める水銀法や、検量線を用いて密度から測定することもできる。また、気孔率が０％のβ−ＴＣＰ石（測定対象の焼結体と同じ組成、結晶形の気孔をもたないβ−ＴＣＰ焼結体）の真密度ρを測定しておき、測定対象の焼結体の体積と重さから算出した見かけ密度ρ’とから気孔率Ｐ（％）＝（１−ρ’／ρ）×１００として算出することができる。また、気孔率Ｐは、例えば、アキュピック１３３０シリーズ（株式会社島津製作所製）を用いて測定することもできる。β−ＴＣＰブロックの水銀法にて計測した気孔率は、好ましくは５０〜９０％、より好ましくは６０〜８５％、さらに好ましくは７０〜８０％である。粒径７５〜１０５μｍのβ−ＴＣＰ粉末はβ−ＴＣＰブロックを粉砕して作製することもでき、これを水銀法にて計測したそれぞれの粉末の気孔率は、好ましくは５０〜９０％、より好ましくは５５〜８５％、さらに好ましくは５７〜８０％であり、好ましい平均気孔率は６０〜７０％である。また、粒径２５μｍ以下のβ−ＴＣＰミクロン顆粒はβ−ＴＣＰブロックを粒子状に粉砕して作製することもでき、これを水銀法にて計測した気孔率は好ましくは５０％以下、より好ましくは４０％以下、さらに好ましくは３０％以下であり、好ましい平均気孔率は３．５〜４．５％である。β−ＴＣＰ緻密体としては、気孔率が５０％以下であるβ−ＴＣＰ粉末、粒子、顆粒、錠剤、柱状体等を例示することができ、これらはβ−ＴＣＰのみからなるものであっても、β−ＴＣＰを有効成分とし、他の成分を含むものであってもよい。５０％以下のβ−ＴＣＰの気孔率は、４０％以下が好ましく、３０％以下がより好ましく、中でも２０％以下が特に好ましい。β−ＴＣＰ粉末を打錠により緻密化したβ−ＴＣＰ緻密体の、密度から算定した気孔率としては、好ましくは５０％以下、より好ましくは４０％以下、さらに好ましくは３０％以下、中でも２０％以下を好適に例示することができる。また、焼結により脱泡の上緻密化したβ−ＴＣＰ緻密体は、密度から算定した気孔率が、好ましくは５０％以下、より好ましくは４０％以下、さらに好ましくは３０％以下、中でも２０％以下を好適に例示することができる。
【００２１】
焼結による緻密化は、好ましくは６００℃超〜２０００℃、より好ましくは７５０〜１５００℃、さらに好ましくは９００〜１３００℃で、また好ましくは１〜１００時間、より好ましくは１０〜８０時間、さらに好ましくは２０〜５０時間焼結する例を挙げることができる。また、焼結は複数の温度にて複数回に分けて行ってもよい。例えば、錠剤のβ−ＴＣＰ緻密体は以下の方法で製造することもできる。リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム及び水を適切な割合で混合してスラリーを調製し、調製したスラリーを摩砕しながら反応させた後に乾燥させる。次に、乾燥して得られた固形物を粉砕して仮焼し、β−ＴＣＰ粉末が得られる。得られたβ−ＴＣＰ粉末を圧縮形成されることにより柱状体に賦形される。圧縮形成された柱状体を６００℃〜１３００℃で２０時間焼結する。
【００２２】
上記気孔率５０％以下の緻密体であるβ−ＴＣＰ粉末や粒子、顆粒の製造方法としては、例えば、リン酸水素カルシウムと炭酸カルシウムの粉末をモル比で１：１〜３、好ましくは１：１．５〜２．５になるように秤量して混合し、かかるリン酸水素カルシウム−炭酸カルシウム混合物に純水を添加してスラリーを調製し、調製されたスラリーをボールミルにより約２４時間湿式磨砕処理を行うことでメカノケミカル法による反応をすすめ、磨砕処理されたスラリーを、７０〜９０℃、好ましくは７５〜８５℃にて乾燥し、乾燥して得られた固形物を粉砕して得られたβ−ＴＣＰ粉末を７００〜８００℃にて、数時間仮焼することで、β−ＴＣＰ仮焼粉末を作製し、得られたβ−ＴＣＰ仮焼粉末をふるいにかけることで各粒径の分画を得ることができ、分画ごとの気孔率を測定することで、気孔率５０％以下の分画を得ることができる。具体的には、まずふるい目が１０５μｍのふるいを通過し、かつ、ふるい目が７５μｍのふるいにかけ残ったβ−ＴＣＰを分画（Ａ）とし、次にふるい目が７５μｍのふるいを通過し、かつ、ふるい目が２５μｍのふるいにかけ残ったβ−ＴＣＰを分画（Ｂ）とし、さらに２５μｍのふるいを通過したβ−ＴＣＰを分画（Ｃ）とした場合に、分画（Ｃ）は、気孔率が確実に５０％以下のβ−ＴＣＰとなる。
【００２３】
上記β−ＴＣＰ錠剤やβ−ＴＣＰ柱状体の製造方法としては、気孔率が５０％以下の、単一相又はほぼ単一相のβ−ＴＣＰの錠剤や柱状体を製造することができる方法を挙げることができる。具体的には、前述のようにβ−ＴＣＰ仮焼粉末を作製し、得られたβ−ＴＣＰ仮焼粉末を圧縮成形（打錠）することにより錠剤や柱状体に賦形し、かかる賦形されたβ−ＴＣＰ仮焼錠剤や柱状体を４５０〜６５０℃、好ましくは６００℃にて２．５〜３．５時間、好ましくは３時間焼結し、次いで８５０〜９５０℃、好ましくは９００℃で０．５〜１．５時間、好ましくは１時間焼結し、さらに１０００〜１３００℃で０．７５〜１．５時間、好ましくは１時間焼結することで燒結体としてのβ−ＴＣＰの錠剤や柱状体を得る方法を挙げることができ、また上記β−ＴＣＰ仮焼粉末を燒結し、β−ＴＣＰの焼結体としての粉体を得た後に圧縮成形（打錠）してβ−ＴＣＰの錠剤や柱状体を作製してもよい。なお、β−ＴＣＰ柱状体は、β−ＴＣＰ錠剤を柱状に打ち抜くことにより作製してもよい。
【００２４】
本発明のβ−ＴＣＰ組成物には、β−ＴＣＰの他に薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を含んでいてもよく、ゲル状やペースト状、微粒子の懸濁液や、固形状の製剤とすることができるが、好ましくは固形状であり、その形状としては、顆粒状、粉末状、粒子状の他、円板状（短円柱状）、棒状（長円柱状）の錠剤などを挙げることができる。
【００２５】
また、固形状のβ−ＴＣＰ組成物の粒径としては、例えば、β−ＴＣＰブロックを粒子状に加工したβ−ＴＣＰ粉末の場合は、粒径が好ましくは５０〜１２０μｍ、より好ましくは６０〜１１０μｍ、さらに好ましくは７５〜１０５μｍである。また、β−ＴＣＰブロックを粒子状に加工したβ−ＴＣＰミクロン顆粒の場合は、粒径が好ましくは５０μｍ以下、より好ましくは４０μｍ以下、さらに好ましくは３０μｍ以下である。中でも、粒径が０．０５〜５μｍのβ−ＴＣＰミクロン顆粒や、粒径が０．０５〜２５μｍのβ−ＴＣＰミクロン顆粒を好適に例示することができる。本発明において粒径０．０５〜２５μｍの粒子は、２５μｍのふるいを通過したものを指す。円板状又は柱状や棒状の錠剤のβ−ＴＣＰ組成物の大きさとしては、直径が好ましくは０．０１〜３０ｍｍ、より好ましくは０．１〜２０ｍｍ、さらに好ましくは１〜１０ｍｍであり、長さが好ましくは０．１〜４０ｍｍ、より好ましくは０．５〜３０ｍｍ、さらに好ましくは１〜２０ｍｍであるが、中でも直径５ｍｍで長さ２ｍｍの円板状の錠剤や、直径０．９ｍｍで長さ１０ｍｍの柱状の棒剤を好適に例示することができる。
【００２６】
本発明における体内としては、骨や歯以外の部位であれば特に制限されず、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、胸腔内、脳内を挙げることができ、好ましくは皮下、さらに好ましくは治療対象である病変の近傍を挙げることができる。病変の近傍に移植して用いられる場合は、好ましくは病変から１μｍ〜３０ｃｍ、より好ましくは１００μｍ〜２０ｃｍ、さらに好ましくは１ｍｍ〜１５ｃｍの距離にある領域に移植して用いることができる。本発明の治療対象の病変は、骨や歯以外における病変であれば特に制限はされず、がん、アレルギー免疫、感染症その他を例示することができ、中でもがんを好適に挙げることができ、頭蓋骨内組織、肺、皮膚、軟組織、膀胱、胃、すい臓、頭部、頸部、腎臓、前立腺、大腸、小腸、食道、女性器（例えば卵巣、子宮）又は甲状腺のがんを特に好適に例示することができる。
【００２７】
本発明のβ−ＴＣＰの投与方法としては、外科的処置により体内へ直接移植する方法であれば特に制限されず、他の目的の手術の際に、切開箇所に本発明のβ−ＴＣＰを移植することもできる。また生体への負担を軽減する観点から、通常の注射器や固形物の挿入用注射器によって、最小限の開口部から本発明のβ−ＴＣＰ組成物を体内に移植する方法を好適に例示することができる。この場合、本発明のβ−ＴＣＰ組成物としては、β−ＴＣＰ顆粒を含む懸濁液や、ゲル状やペースト状に調製されたβ−ＴＣＰや固形β−ＴＣＰを充填した注射器、例えば棒状（長円柱状）のβ−ＴＣＰ緻密体が充填されたデバイス（導入装置）や、棒状（長円柱状）β−ＴＣＰ緻密体とそのデバイス（導入装置）のセットを挙げることができる。また、投与量は、疾病の種類、病変の大きさ、患者の体重等により適宜選定することができ、好ましくは０．０１ｍｇ〜１００ｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｇ、さらに好ましくは１ｍｇ〜１ｇを例示することができる。
【００２８】
本発明における抗体医薬組成物としては抗体医薬を含む組成物であれば特に制限されず、好ましくはがん細胞に特異的に発現している抗原、あるいは正常細胞では低い発現を示すが、がん細胞で高い発現を示す抗原に対する抗体を含む組成物であり、抗体として作製することも、抗体あるいは抗体医薬組成物として市販品を入手することもできる。具体的には、抗ＣＥＡ抗体、抗ＨＥＲ２抗体（トラスツズマブ：Trastuzumab、商品名ハーセプチン（登録商標）（中外製薬株式会社）)、抗ＥＧＦＲ抗体（アービタックス：ERBITUX）、抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ：RITUXIMABやイブリツモマブ）、抗ＣＤ５２抗体（アレツズマブ；ALEMTUZUMAB、別名CAMPATH）、抗１７−１Ａ（ヒト腫瘍関連上皮細胞接着因子）抗体（エドレコロマブ：edrecolomab）、抗ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）抗体（ベバシツマブ：BEVACIZUMAB、商品名アバスチン（登録商標）（ジェネンテック社））、抗ＴＮＦ−α抗体（アダリムマブ：adalimumab、商品名ヒュミラ（登録商標）（エーザイ株式会社）や、インフリキシマブ：Infliximab、商品名レミケード（登録商標）（田辺三菱製薬株式会社））や、それらを含む医薬組成物を例示することができる。かかる抗体医薬組成物は薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を含んでいてもよく、経口的又は非経口的に投与することができ、例えば粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射により非経口投与することができる他、スプレー剤の形で鼻孔内投与することもできるが、注射や点滴による非経口投与を好適に例示することができる。
【００２９】
本発明の抗体療法キットや本発明の抗体療法の効果増強剤は、ａ）対象の体内にβ−リン酸三カルシウムを移植するステップ；及びｂ）対象に抗体医薬組成物を投与するステップ；を備える抗体医薬による抗体療法に用いることもできる。抗体医薬組成物は、β−ＴＣＰが移植されると同時、又はその前後に対象に投与され、投与量や投与回数は抗体医薬の活性の強さ、疾病の種類、患者の体重、投与形態等により適宜選定することができ、例えば、好ましくは１日あたり０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、より好ましくは０．０５〜７０ｍｇ／ｋｇ（体重）、さらに好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）を挙げることができる。好ましくは本発明のβ−ＴＣＰが移植されると同時、又はその後に抗体医薬組成物を対象への投与を開始し、一定期間ごと、好ましくは週２回ごとに、計８回投与する例を挙げることができる。また、本発明における抗体医薬は、抗体医薬以外の他の薬剤、サプリメントなどの投与と併用してもよく、また手術などの外科療法と併用することもできる。
【００３０】
本発明の抗体医薬品を用いる抗体療法の効果増強剤は、抗体医薬組成物の投与のみによる抗体療法と、コントロール又は本発明のβ−ＴＣＰ組成物及び抗体医薬組成物の投与を併用した場合の治療効果とを比較した場合に、β−ＴＣＰ組成物を併用した方が高い治療効果が得られるという効果を有する。例えば腫瘍マーカーの値の減少や、例えば腫瘍サイズを指標として比較した場合に、コントロールや抗体療法のみに比べ、抗体療法に加えてβ−ＴＣＰを併用した方が、腫瘍サイズが縮小、あるいは増加しないことを調べることにより、本発明の効果を具体的に確認することができる。
【００３１】
また本発明は、β−ＴＣＰを移植したマウスを、新たな抗体医薬組成物の効果の検証や、候補物質の段階では薬効の弱い抗体医薬組成物のスクリーニングにも用いることもできるという効果を有する。例えば、抗腫瘍効果の検証には多くの場合ヌードマウスが用いられるが、ヌードマウスでは抗腫瘍効果をもたらす可能性のあるエフェクター細胞がＮＫ細胞だけであるのに対し、本発明における実験系では正常なマウスを用いて、ＮＫ細胞だけでなくＴ細胞及びＢ細胞の関与についても検討できるため、よりヒトの臨床（癌患者）に近い試験を行うことができる。
【００３２】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
［β−ＴＣＰの作製方法］
β−ＴＣＰブロックは、人工骨として製品を購入することもできるが、原料のβ−ＴＣＰと水、界面活性剤、発泡剤を混ぜ、焼結することにより作製することもできる。かかるβ−ＴＣＰブロックは、気孔率７５％や気孔率６０％であった。また、β−ＴＣＰ粉末やβ−ＴＣＰ顆粒については、前記気孔率７５％のβ−ＴＣＰブロックを粉砕し、篩にかけて粒径７５〜１０５μｍのβ−ＴＣＰ粉末（気孔率：６０〜７０％）を得た。また、同様に篩にかけて得られた２５〜７５μｍのβ−ＴＣＰ（気孔率：４０〜５０％）とＰＢＳ溶液を混合後、すぐに液体上部４分の３部分の液体を採取し、１０００ｒｐｍにて３分間の遠心操作で沈殿から０．０５〜２５μｍのβ−ＴＣＰミクロン顆粒（気孔率：３５〜５０％）を、上清から０．０５〜５μｍのミクロン顆粒を採取した（気孔率：２０〜３０％）。また、リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム及び水を適切な割合で混合してスラリーを調製し、調製したスラリーを摩砕しながら反応させた後に乾燥させ、得られた固形物を粉砕して仮焼することでβ−ＴＣＰ粉末が得られ、その粉末を圧縮形成することによりφ５×２ｍｍ錠剤に賦形し、６００〜１５００℃で３０時間焼結することで、円板状のβ−ＴＣＰ緻密体錠剤を作製した（気孔率：０．１〜２０％）。また、β−ＴＣＰの原料粉末３０ｇ、界面活性剤６．０ｍｌ、水１０ｍｌとを遠心管に注入し、２５０ｒｐｍで４分間処理することで脱泡処理をし、型に注入して自然乾燥させ、離型後、１３００℃にて焼結することで、φ０．９×１０ｍｍの柱状のβ−ＴＣＰ緻密体棒剤を作製した（気孔率:１０〜３０％）。なお、作製した各β−ＴＣＰの気孔率は、水銀法にて、初期圧に対応する直径約１８０μｍの細孔にまで水銀が圧入された時の試料体積に対する値として測定された。【００３４】
作製したβ−ＴＣＰ顆粒（サイズ２５〜７５μｍ）と免疫細胞の結合を走査型電子顕微鏡にて観察した結果を図１に示す。また、作製したβ−ＴＣＰ緻密体錠剤、及び緻密体棒剤を、走査型電子顕微鏡にて観察した結果を図２、図３に示す。また、β−ＴＣＰ緻密体を皮下に移植した正常マウスから組織サンプルを採取し、ＨＥ染色し、顕微鏡にて観察した結果を図４に示す。リンパ球が集積し、天然のリンパ節と似た構造となっていることがわかった。また、サイズ０．０５〜１０５μｍのβ−ＴＣＰ顆粒（気孔率０〜７０％）を皮下に移植したマウスから組織サンプルを採取し、ＨＥ染色し、顕微鏡にて観察した結果を図５に示す。サイズ７５μｍ以上のβ−ＴＣＰ顆粒はマクロファージを誘導し（Ｎ＝１３）、７５μｍ以下の顆粒はリンパ球を集め（Ｎ＝１１）、サイズ０．０５〜２５μｍの微小顆粒はリンパ球集塊を形成した。また、φ５×２ｍｍのβ−ＴＣＰ緻密体（気孔率：１８％）を皮下に移植したマウスの組織サンプルを抗ＣＤ４５Ｒ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４９ｂ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗Ｆ４／８０Ｒ抗体、又は抗Ｄ２−４０抗体を用いて、それぞれＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、マクロファージ、リンパ管を免疫組織染色して顕微鏡にて観察した。結果を図６〜図１１に示す。以上の結果から、皮下に移植された焼結により緻密化したβ−ＴＣＰは、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）、樹状細胞、マクロファージを誘導し、人工リンパ節として利用できることが確認された。抗腫瘍効果の検証には、多くの場合ヌードマウスが用いられる。しかしながらヌードマウスでは抗腫瘍効果をもたらす可能性のあるエフェクター細胞がＮＫ細胞だけであるのに対し、本発明のβ−ＴＣＰを移植したマウスは、Ｔ細胞及びＢ細胞の関与についても検討できるため、よりヒトの臨床（癌患者）に近い状態での試験を行うことができることが確認できた。【００３５】
［β−ＴＣＰを用いた抗ＣＥＡ抗体による抗体療法］
６週齢の雄性ヌードマウス（BALB/c-nu/nu）皮内に２．５×１０６個のヒト大腸癌細胞COLO 205（ＡＴＣＣ社より購入）を移植し、５〜７日後、マウスに形成された腫瘍サイズを計測して腫瘍体積を算出した。腫瘍体積の算出は以下の数式によった。
腫瘍体積＝（長径×短径２）／２  （ｍｍ３）
そして、各群の腫瘍体積が均等になるように群分けを行い、以下の処置群を設定した。
１群：対照群
２群：β−ＴＣＰ移植群
３群：抗ＣＥＡ抗体（マウス抗ヒトCarcinoembryonic Antigen抗体）投与群
４群：β−ＴＣＰ移植＋抗ＣＥＡ抗体投与群【００３６】
円板状のβ−ＴＣＰ緻密体（気孔率：０．１〜１２％）の錠剤を、形成腫瘍から１５〜２０ｍｍ離れた部位の皮下に移植した。β−ＴＣＰを移植しない１群と３群では、同サイズの、免疫原性をもつ可能性のある異種蛋白を含まないプラスチックキャリアマテリアル（以下「プラスチック片」と呼ぶ）を皮下に移植し、コントロールとした。β−ＴＣＰ又はプラスチック片を移植した日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ０から週２回、の計８回、抗体を腹腔内に投与した。抗ＣＥＡ抗体は１回あたりの投与量５０μｇを、抗ＣＥＡ抗体を投与しない１群と２群ではコントロールとしてマウスＩｇＧ５０μｇを投与した。そして、実験群を設定後、約１ヶ月にわたり週２回の抗体またはＩｇＧ投与時に腫瘍サイズを計測、腫瘍の増殖に対するβ−ＴＣＰと抗体の作用を観察した。実験の概略を図１２に、結果を図１３に示す。コントロール及び抗ＣＥＡ抗体、β−ＴＣＰそれぞれ単独（１〜３群）では腫瘍増殖抑制の効果は見られなかったが、β−ＴＣＰ及び抗ＣＥＡ抗体を併用した４群では、腫瘍増殖抑制の効果が観察された。【００３７】
［β−ＴＣＰを用いた抗ＥＧＦＲ抗体による抗体療法］
６週齢の雄性ヌードマウス（BALB/c-nu/nu）皮内に５×１０６個のヒト肺癌細胞A549（ＡＴＣＣ社より購入）を移植し、７日後、ヌードマウスに形成された腫瘍サイズを計測して腫瘍体積を算出した。腫瘍体積の算出は以下の数式によった。
腫瘍体積＝（長径×短径２）／２  （ｍｍ３）
そして、各群の腫瘍体積が均等になるように群分けを行い、以下の処置群を設定した。
１群：対照群
２群：Erbitax；抗ＥＧＦＲ抗体（マウス抗ヒトＥＧＦＲ抗体）
３群：β−ＴＣＰ移植群
４群：β−ＴＣＰ移植＋抗ＥＧＦＲ抗体投与群【００３８】
円板状のβ−ＴＣＰ緻密体（気孔率：０．１〜１２％）の錠剤を、形成腫瘍から１５〜２０ｍｍ離れた部位の皮下に移植した。β−ＴＣＰを移植しない１群と２群では、同サイズの、免疫原性をもつ可能性のある異種蛋白を含まないプラスチックキャリアマテリアル（以下「プラスチック片」と呼ぶ）を皮下に移植し、コントロールとした。β−ＴＣＰ又はプラスチック片を移植した日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ０、Ｄａｙ３、Ｄａｙ７の計３回、抗体を腹腔内に投与した。抗ＥＧＦＲ抗体は１回あたりの投与量１００μｇを、抗ＥＧＦＲ抗体を投与しない１群と２群ではコントロールとしてマウスＩｇＧ１００μｇを投与した。そして、実験群を設定後、Ｄａｙ１０における腫瘍径を計測、上述の算定式から腫瘍体積を算出した。
実験結果を図１４に示す。コントロール及び抗ＥＧＦＲ抗体、β−ＴＣＰそれぞれ単独（１〜３群）では腫瘍増殖抑制の効果は見られなかったが、β−ＴＣＰ及び抗ＥＧＦＲ抗体を併用した４群では、腫瘍増殖抑制の効果が観察された。【００３９】
［β−ＴＣＰを用いた抗ＨＥＲ２抗体による抗体療法］
６週齢の雄性ヌードマウス（BALB/c-nu/nu）皮内に５×１０６個のヒト肺癌細胞Calu-3（ＡＴＣＣ社より購入）を移植し、ヌードマウスに形成された腫瘍サイズを計測して腫瘍体積を算出した。腫瘍体積の算出は以下の数式によった。
腫瘍体積＝（長径×短径２）／２  （ｍｍ３）
そして、腫瘍体積が５０−１５０ｍｍ３となった時点で各群の腫瘍体積が均等になるように群分けを行い、以下の処置群を設定した。
１群：対照群
２群：β−ＴＣＰ移植群
３群：抗ＨＥＲ２抗体（ハーセプチン）投与群
４群：β−ＴＣＰ移植＋抗ＨＥＲ２抗体投与群【００４０】
円板状のβ−ＴＣＰ緻密体（気孔率：０．１〜１２％）の錠剤を、形成腫瘍から１５〜２０ｍｍ離れた部位の皮下に移植した。β−ＴＣＰを移植した日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ３、Ｄａｙ９、Ｄａｙ１７の計３回、抗体を腹腔内に投与した。抗ＨＥＲ２抗体は１回あたりの投与量を１０ｍｇ／ｋｇ・body weightとした。そして、実験群を設定後、Ｄａｙ１４、Ｄａｙ２１、及びＤａｙ２４における腫瘍径を計測、上述の算定式から腫瘍体積を算出した。
実験結果を図１５に示す。コントロール及び抗ＨＥＲ２抗体、β−ＴＣＰそれぞれ単独（１〜３群）では腫瘍増殖抑制の効果は見られなかったが、β−ＴＣＰと抗ＨＥＲ２抗体を併用した４群では、有意な腫瘍増殖抑制効果が観察された。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明は、抗体療法、抗体療法の補助療法、腫瘍治療法などの医療分野などに好適に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2012105219.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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