(57)【要約】  本発明は、高い内在化能を有する抗カドヘリン抗体を提供し、さらにこれを用いてカドヘリンを発現する癌細胞を効率的に殺傷する抗カドヘリン抗体薬剤コンジュゲートを提供することを解決すべき課題とした。本発明によれば、カドヘリンのカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）を認識し、かつ高い内在化能を示す抗カドヘリン抗体が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カドヘリンのカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）を認識し、かつ高い内在化能を示す抗カドヘリン抗体。
【請求項２】
カドヘリンがＰカドヘリンである、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ＰカドヘリンまたはＰカドヘリンを発現している細胞を免疫原として投与した免疫動物から取得した抗体産生細胞が産生する抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
Ｐカドヘリンが全長、あるいは細胞外領域のみを発現させた可溶型Ｐカドヘリン、またはその断片である、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
モノクローナル抗体である、請求項１から４の何れかに記載の抗体。
【請求項６】
モノクローナル抗体が、キメラ化抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−９８８、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４５、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４７又はＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４８を有する細胞が産生するモノクローナル抗体。
【請求項８】
請求項７に記載のモノクローナル抗体を改変して作られたキメラ化抗体又はヒト化抗体。
【請求項９】
請求項７に記載のモノクローナル抗体のＶＨ及び／またはＶＬドメインのアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＨ及び／またはＶＬドメインを有する抗体またはその断片。
【請求項１０】
抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）
、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、請求項１から９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項５から１０の何れか１項に記載の抗体を産生する細胞株。
【請求項１２】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−９８８、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４５、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４７又はＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４８を有する細胞株。
【請求項１３】
請求項１から１０の何れかに記載の抗体を含む、細胞傷害剤。
【請求項１４】
上記抗体に、細胞傷害性物質が結合している、請求項１３に記載の細胞傷害剤。
【請求項１５】
細胞傷害性物質が薬剤、トキシン、又は放射性物質である、請求項１４に記載の細胞傷害剤。
【請求項１６】
細胞傷害性物質が、メイタンシノイド又はその誘導体あるいはアウリスタチン又はその誘導体から選択される薬剤である、請求項１５に記載の細胞傷害剤。
【請求項１７】
細胞傷害性物質が、ＤＭ１、ＤＭ３又はＤＭ４から選択されるメイタンシノイド誘導体、またはＭＭＡＥ又はＭＭＡＦから選択されるアウリスタチン誘導体である、請求項１６に記載の細胞傷害剤。
【請求項１８】
抗体と細胞傷害性物質とがリンカーにより連結している、請求項１４から１７のいずれか１項に記載の細胞傷害剤。
【請求項１９】
リンカーが、２価反応性架橋試薬である、請求項１８に記載の細胞傷害剤。
【請求項２０】
リンカーが、スルフォスクシイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート  （Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）（ＬＣ−ＳＭＣＣ）、ｒｃ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）、およびＮ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）、６−マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボンイル（ＰＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジル４（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）及びＮ−スクシンイミジル（４−イオドーアセチル）アミノ安息香酸エステル（ＳＩＡＢ）、バリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｌａ−ｐｈｅ）から成る群より選択される、請求項１８又は１９に記載の細胞傷害剤。
【請求項２１】
抗体１分子あたり１〜１０個のＤＭ１がリンカーを介して結合している、請求項１９又は２０に記載の細胞傷害剤。
【請求項２２】
請求項１３から２１のいずれか１項に記載の細胞傷害剤を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１３から２１のいずれか１項に記載の細胞傷害剤を有効成分として含有するヒトＣＤＨ３高発現疾患の治療薬。
【請求項２４】
ヒトＣＤＨ３高発現疾患が癌である、請求項２３に記載の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カドヘリンの特定のドメインを認識し、かつ高い内在化能を有する抗カドヘリン抗体に関する。本発明はさらに、抗カドヘリン抗体の薬剤コンジュゲートに関する。本発明はさらに抗カドヘリン抗体の薬剤コンジュゲートの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、死亡原因の上位を占める重要な疾患であるが、その治療ニーズはいまだ満たされていない。近年、従来の化学療法の正常細胞にもダメージを与えるという問題点を解決するために、癌細胞に特異的に発現する特定の分子を標的として薬剤を設計し治療を行う分子標的薬による癌治療が盛んに研究されている。【０００３】
癌における分子治療薬の標的となりうる分子として、カドヘリンが挙げられる。カドヘリンは、カルシウム依存的に同種親和性の細胞接着に関与する分子として発見された膜タンパク質である（非特許文献１）。相互にホモロジーが高い約１１０アミノ酸残基からなるカドヘリンリピート（ＥＣｓ）を持つタンパク質はカドヘリンスーパーファミリーと呼ばれ、１２０種類以上のタンパク質が存在し、多細胞構造の維持に重要な役割を果たしている。【０００４】
癌細胞で発現が上昇する例が報告されており、正常組織と比較して癌組織でのカドヘリンの発現が高い癌細胞に対しては、カドヘリンを認識する抗体に抗癌剤を結合させた薬剤や、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を有する抗体を癌の治療に用いることが検討されている（特許文献１、特許文献２）。【０００５】
カドヘリンスーパーファミリーに属するタンパク質は、その構造の特徴により１）古典的カドヘリン、２）デスモゾームカドヘリン、３）プロトカドヘリン、４）その他  に大きく分類することができる。カドヘリンスーパーファミリーの主要なメンバーであるＥカドヘリン（ＣＤＨ１）、Ｎカドヘリン（ＣＤＨ２）、Ｐカドヘリン（ＣＤＨ３）といった古典的カドヘリンは相互にホモロジーが高い（図１）。すなわち、２量体を形成するとされている１回膜貫通型タンパク質で、細胞外領域にＥＣ１−ＥＣ５の５つのカドヘリンドメインと細胞内ドメインを持つ。古典的カドヘリンを介する細胞接着は同種細胞間での接着という特徴があり、細胞種により特異的に発現の状態が異なる同種のカドヘリン分子を細胞が相互に認識することによって行われる。ＣＤＨ１はＣＤＨ１を認識して結合し、ＣＤＨ３はＣＤＨ３を認識して結合するという機序で同種細胞相互が接着する（図２）。【０００６】
カドヘリン相互の同種／異種の認識は細胞外ドメインのＮ端に位置するカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）によるとされる（非特許文献２）。Ｋｌｉｎｇｅｌ等は、ヒトＣＤＨ３のアミノ酸配列の第１位〜第２１３位（配列番号２）とヒトＣＤＨ１の対応する領域を入れ替えると、ＣＤＨ１とは結合せず、ＣＤＨ３と結合することを示している（非特許文献３）。このように、ＣＤＨ１、ＣＤＨ３をはじめとする古典的カドヘリンは同一の機序で相互に結合すると考えられる。【０００７】
近年、分子標的薬として多くの癌治療用の抗体医薬が実際に上市され、その多くはＡＤＣＣを作用機序としてあげている。しかしその薬効は必ずしも十分なものではなく、より強力な抗腫瘍効果を示す技術開発が進められている。【０００８】
抗体の抗腫瘍能を増強する有効な手段の一つとして抗体と強力な毒性を有する薬剤（毒素）との連結があげられる。毒素はそれ単独で患者に投与すると、正常組織にも障害を及ぼし、有効な治療手段とはなり得ない。しかしながら、腫瘍細胞特異的な抗原と結合する抗体と連結する事により、正常な組織に悪影響を及ぼさず、腫瘍細胞のみ殺傷しえる能力を持つに至る。こうした薬剤は抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）と呼ばれる。即ち、毒素は抗体と結合している状態では何ら毒性を示さない。しかし、ある種の抗体は標的とする抗原に結合すると細胞内に取り込まれ、リソソームにて分解される。したがって、毒素を結合したその種の抗体が細胞内に取り込まれ、細胞内で分解される事で毒素が放出され、特定の細胞内部においてのみ毒性が発現し、その効果により細胞は殺傷される。【０００９】
ＡＤＣにおいては、抗体に結合している薬剤は血液中を循環し、標的とする腫瘍に集積し薬効をしめす。腫瘍部位以外での薬剤の放出（抗体からの離脱）は、副作用を生じる危険性があるため必ずしも好ましくはない。つまり、抗体に結合している薬剤は細胞内に取り込まれた後抗体から離脱する設計が好ましい。近年ジェネンテック社は、このような観点からトラスツズマブに毒素を結合した薬剤（Ｔ−ＤＭ１）を開発、臨床試験がすすめられ、非常に高い臨床効果を示している。つまりＡＤＣにおいては、抗体は、標的となる癌に集積するだけではなく、効率よく癌細胞内に取り込まれなければならない。この能力（抗体の内在化能）はＡＤＣの薬効と密接な関係をもつことになる。【００１０】
抗体の内在化能は、抗体の結合する膜表面蛋白質と抗体両方に由来するものであり、分子構造、抗体物性等から一義的に推測することはできない。そのため、各抗原に対して、高い内在化能を有する抗体を探索することはＡＤＣを開発する上での大きな課題となっている。本発明においては、ＣＤＨ３抗原に対して当該課題を解決するための道筋を与えている。【００１１】
上記の通り、ＡＤＣにより癌を治療するというコンセプトは公知である。しかし、内在化能の高い抗カドヘリン抗体に薬物をコンジュゲートさせた免疫複合体の効能を示唆したものはない。また、ドメイン構造とカドヘリンの機能との関連については報告があるが、内在化能との関連を示唆するものはない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＷＯ２００２／０９７３９５号公報
【特許文献２】ＷＯ２００７／１０２５２５号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｙｏｓｈｉｄａ  ａｎｄ  Ｔａｋｅｉｃｈｉ，  Ｃｅｌｌ  ２８：２１７−２２４，１９８２
【非特許文献２】Ｎｏｓｅ  Ａ．ｅｔａｌ，  Ｃｅｌｌ  ６１；１４７−１５５，１９９０
【非特許文献３】Ｋｌｉｎｇｅｌ  Ｈ．ｅｔａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ    Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１３：２８２９−３６，２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、高い内在化能を有する抗カドヘリン抗体を提供し、さらにこれを用いてカドヘリンを発現する癌細胞を効率的に殺傷する抗カドヘリン抗体薬剤コンジュゲートを提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討し、抗ヒトＣＤＨ３抗体の内在化能を測定したところ、抗体によって内在化能が異なることを見出した。そこで、各抗体をその認識している領域により分類したところ、内在化能が強い抗体は、カドヘリンドメイン１（ＥＣ１）を高い確率で認識していることが判明した。【００１６】
抗体の内在化能を規定する要素としては、抗体の抗原に対する親和性、抗体が認識するエピトープなどが挙げられるが、詳細は不明である。そこで、本発明は特に抗体と認識エピトープとの関係に注目した検索を行なう事により完成したものである。【００１７】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  カドヘリンのカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）を認識し、かつ高い内在化能を示す抗カドヘリン抗体。
（２）  カドヘリンがＰカドヘリンである、（１）に記載の抗体。
（３）  ＰカドヘリンまたはＰカドヘリンを発現している細胞を免疫原として投与した免疫動物から取得した抗体産生細胞が産生する抗体である、（１）又は（２）に記載の抗体。
（４）  Ｐカドヘリンが全長、あるいは細胞外領域のみを発現させた可溶型Ｐカドヘリン、またはその断片である、（３）に記載の抗体。
（５）  モノクローナル抗体である、（１）から（４）の何れかに記載の抗体。
（６）  モノクローナル抗体が、キメラ化抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、（５）に記載の抗体。【００１８】
（７）  受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−９８８、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４５、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４７又はＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４８を有する細胞が産生するモノクローナル抗体。
（８）  （７）に記載のモノクローナル抗体を改変して作られたキメラ化抗体又はヒト化抗体。
（９）  （７）に記載のモノクローナル抗体のＶＨ及び／またはＶＬドメインのアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＨ及び／またはＶＬドメインを有する抗体またはその断片。
（１０）  抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、（１）から（９）のいずれか１項に記載の抗体。【００１９】
（１１）  （５）から（１０）の何れか１項に記載の抗体を産生する細胞株。
（１２）  受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−９８８、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４５、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４７又はＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４８を有する細胞株。
（１３）  （１）から（１０）の何れかに記載の抗体を含む、細胞傷害剤。
（１４）  上記抗体に、細胞傷害性物質が結合している、（１３）に記載の細胞傷害剤。
（１５）  細胞傷害性物質が薬剤、トキシン、又は放射性物質である、（１４）に記載の細胞傷害剤。【００２０】
（１６）  細胞傷害性物質が、メイタンシノイド又はその誘導体あるいはアウリスタチン又はその誘導体から選択される薬剤である、（１５）に記載の細胞傷害剤。
（１７）  細胞傷害性物質が、ＤＭ１、ＤＭ３又はＤＭ４から選択されるメイタンシノイド誘導体、またはＭＭＡＥ又はＭＭＡＦから選択されるアウリスタチン誘導体である、（１６）に記載の細胞傷害剤。
（１８）  抗体と細胞傷害性物質とがリンカーにより連結している、（１４）から（１７）のいずれか１項に記載の細胞傷害剤。
（１９）  リンカーが、２価反応性架橋試薬である、（１８）に記載の細胞傷害剤。
（２０）  リンカーが、スルフォスクシイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート  （Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）（ＬＣ−ＳＭＣＣ）、ｒｃ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）、およびＮ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）、６−マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボンイル（ＰＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジル４（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）及びＮ−スクシンイミジル（４−イオドーアセチル）アミノ安息香酸エステル（ＳＩＡＢ）、バリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｌａ−ｐｈｅ）から成る群より選択される、（１８）又は（１９）に記載の細胞傷害剤。【００２１】
（２１）  抗体１分子あたり１〜１０個のＤＭ１がリンカーを介して結合している、（１９）又は（２０）に記載の細胞傷害剤。
（２２）  （１３）から（２１）のいずれか１項に記載の細胞傷害剤を有効成分として含有する医薬組成物。
（２３）  （１３）から（２１）のいずれか１項に記載の細胞傷害剤を有効成分として含有するヒトＣＤＨ３高発現疾患の治療薬。
（２４）  ヒトＣＤＨ３高発現疾患が癌である、（２３）に記載の治療薬。【００２２】
更に本発明によれば、上記した本発明の抗体又は細胞傷害剤を、カドヘリン高発現の患者に投与することを含む、上記患者におけるカドヘリン高発現細胞を傷害する方法が提供される。更に本発明によれば、上記した本発明の抗体又は細胞傷害剤を、カドヘリン高発現の患者に投与することを含む、カドヘリン高発現疾患の治療方法が提供される。
更に本発明によれば、細胞傷害剤の製造のための、上記した本発明の抗体の使用が提供される。更に本発明によれば、カドヘリン高発現疾患の治療薬の製造のための、上記した本発明の抗体の使用が提供される。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の抗カドヘリン抗体は、カドヘリンのカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）を認識し、高い内在化能を有することを特徴とする。高い内在化能を発揮しうる抗体は、修飾抗体、改変抗体を作製するための材料として有用である。また、本発明の抗カドヘリン抗体に、例えば細胞内で毒性を発揮する薬剤を結合し、カドヘリンを発現する癌細胞を有する患者に投与することにより、高い抗癌作用の発揮が期待できる。即ち、本発明の抗カドヘリン抗体は、抗癌剤として有用である。本発明によれば、上記抗体と化学療法剤とリンカーにより連結して成る免疫複合体が提供される。本免疫複合体は化学療法剤を結合しない抗体と比較して、カドヘリンを発現する癌細胞株に、より強力な細胞傷害活性を示す。従って、上記の免疫複合体は、カドヘリンを発現する癌細胞を有する患者に投与することにより、高い抗癌作用の発揮が期待できる。即ち、本発明の免疫複合体は、抗癌剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、ＣＤＨ１（Ｅカドヘリン）、ＣＤＨ２（Ｎカドヘリン）、ＣＤＨ３（Ｐカドヘリン）のシグナル及びプロペプチド配列を除いた成熟タンパク質の配列を示す。
【図２】図２は、古典的カドヘリンファミリーに属する分子の接着機序を示す。
【図３】図３は、各種腫瘍組織のヒトＣＤＨ３のｍＲＮＡ発現結果を示す。Ａ：正常組織、Ｂ：各種癌組織、Ｃ：膵臓癌分化度
【図４】図４は、各種腫瘍組織でのヒトＣＤＨ３の免疫染色結果を示す。
【図５】図５は、ヒトＣＤＨ３強制発現細胞株と市販抗ヒトＣＤＨ３抗体を反応させたフローサイトメトリの結果を示す。Ａ：ＣＨＯ細胞、Ｂ：ヒトＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞。ａ：抗ヒトＣＤＨ３抗体０．０１ｍｇ／ｍｌ、ｂ：抗ヒトＣＤＨ３抗体０．１ｍｇ／ｍｌ、ｃ：抗ヒトＣＤＨ３抗体１ｍｇ／ｍｌ
【図６】図６は、取得抗体３例と各細胞株との典型的なフローサイトメトリ結果を示す。Ａ：ヒトＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞、Ｂ：ＣＨＯ細胞、Ｃ：肺がん由来細胞株ＮＣＩ−Ｈ３５８。  ａ：抗ヒトＣＤＨ３抗体０．０１ｍｇ／ｍＬ、ｂ：抗ヒトＣＤＨ３抗体０．１ｍｇ／ｍＬ、ｃ：抗ヒトＣＤＨ３抗体１ｍｇ／ｍＬ
【図７】図７は、抗ヒトＣＤＨ３マウス抗体の内在化能を示す。各抗体とサポリン標識抗マウスＩｇＧ抗体を投与したヒトＣＤＨ３発現細胞の生存率（抗体未添加時の細胞生存率を１００％とした相対率で表したもの）を示す。抗体を変えて複数回実施した（Ａ，Ｂ）。
【図８】図８は、ヒトＣＤＨ３部分長タンパク質断片１から５のヒトＣＤＨ３細胞外領域との対応を示す。
【図９】図９は、ヒトＣＤＨ３部分長タンパク質の発現結果を示す。Ａ：断片１、Ｂ：断片２、Ｃ：断片３、Ｄ：断片４、Ｅ：断片５
【図１０】図１０は、ヒトＣＤＨ３部分長タンパク質と各抗体のウェスタンブロット法による反応を示す。Ａ：断片１、Ｂ：断片２、Ｃ：断片３、Ｄ：断片４、Ｅ：断片５
【図１１】図１１は、ペプチドアレイを用いたＰＰＡＴ−０５５−１３のエピトープ解析の結果を示す。Ｘ軸の数値はペプチドアレイの番号を示す。Ａ；ＰＰＡＴ−０５５−１３、Ｂ：１次抗体無し
【図１２】図１２は、ＤＭ１ＳＭｅの構造を示す。
【図１３】図１３は、抗ヒトＣＤＨ３キメラ化抗体薬剤コンジュゲートのインビトロでの細胞傷害性試験結果を示す。ＡＤＣ：抗ヒトＣＤＨ３キメラ化抗体各クローンに薬剤コンジュゲートを施したもの、Ｎａｋｅｄ：薬剤を結合していない抗ヒトＣＤＨ３キメラ化抗体。
【図１４】図１４は、ＨＣＣ１９５４細胞株をマウスに移植して形成させた腫瘍塊におけるヒトＣＤＨ３発現の免疫組織染色結果を示す。
【図１５】図１５は、ヒトＣＤＨ３キメラ化抗体薬剤コンジュゲートのインビボでの細胞傷害性試験結果を示す。抗ヒトＣＤＨ３キメラ化抗体各クローンに薬剤コンジュゲートを施したもの、Ｎａｋｅｄ：薬剤を結合していない抗ヒトＣＤＨ３キメラ化抗体。Ｖｅｈｉｃｌｅ：各抗体を溶解した溶液。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明の抗体は、カドヘリンのカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）を認識し、かつ高い内在化能を有する抗カドヘリン抗体である。
【００２６】
本明細書においてＰカドヘリン（ＣＤＨ３）、Ｅカドヘリン（ＣＤＨ１）およびＮカドヘリン（ＣＤＨ２）のカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）、カドヘリンドメイン２（ＥＣ２）、カドヘリンドメイン３（ＥＣ３）、カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）、カドヘリンドメイン５（ＥＣ５）は、それぞれ次の領域を示す。また、他のカドヘリンの対応する領域は、Ｇｅｎｂａｎｋ等より得られる公知のカドヘリンタンパク質の配列を比較することによって決定することができる。配列の比較は公知のプログラム、例えばＣｌｕｓｔａｌＷ２（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ.,  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２  （２２）：  ３６７３ー３６８０、１９９４）またはＣｌｕｓｔａｌＸ２（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ.,  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５  （２４）：  ４８７６ー４８８２,  １９９７）などを用いて行うことが可能である。
【００２７】
・Ｐカドヘリン（ＣＤＨ３）
カドヘリンドメイン１（ＥＣ１）：配列番号２のアミノ酸配列の第１０８位〜第２３６位
カドヘリンドメイン２（ＥＣ２）：配列番号２のアミノ酸配列の第２３７位〜第３４８位
カドヘリンドメイン３（ＥＣ３）：配列番号２のアミノ酸配列の第３４９位〜第４６１位
カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）：配列番号２のアミノ酸配列の第４６２位〜第５５０位
カドヘリンドメイン５（ＥＣ５）：配列番号２のアミノ酸配列の第５５１位〜第６５４位
・Ｅカドヘリン（ＣＤＨ１）
カドヘリンドメイン１（ＥＣ１）：配列番号４のアミノ酸配列の第１５５位〜第２８３位
カドヘリンドメイン２（ＥＣ２）：配列番号４のアミノ酸配列の第２８４位〜第３９５位
カドヘリンドメイン３（ＥＣ３）：配列番号４のアミノ酸配列の第３９６位〜第５０７位
カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）：配列番号４のアミノ酸配列の第５０８位〜第５９７位
カドヘリンドメイン５（ＥＣ５）：配列番号４のアミノ酸配列の第５９８位〜第７０４位
・Ｎカドヘリン（ＣＤＨ２）
カドヘリンドメイン１（ＥＣ１）：配列番号６のアミノ酸配列の第１６０位〜第２８８位
カドヘリンドメイン２（ＥＣ２）：配列番号６のアミノ酸配列の第２８９位〜第４０２位
カドヘリンドメイン３（ＥＣ３）：配列番号６のアミノ酸配列の第４０３位〜第５１８位
カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）：配列番号６のアミノ酸配列の第５１９位〜第６０７位
カドヘリンドメイン５（ＥＣ５）：配列番号６のアミノ酸配列の第６０８位〜第７１９位
【００２８】
抗体の内在化能は、公知の方法で測定することが可能である。例えば、抗体（または２次抗体）をＲＩ、蛍光色素等で標識し、取込まれた量（ＲＩ，蛍光強度）を測定する方法や、サポリン等の毒素（例えば、サポリン標識抗マウスＩｇＧ抗体）を用い細胞死を測定する方法が知られているが、感度・簡便性でサポリン毒素を標識した抗体を用いる方法が優れている。本明細書の内在化能の数値は、実施例６あるいは１５における測定と同様の条件で測定した場合を意味する。具体的には以下の通りである。
【００２９】
（１）内在化能の測定
ヒトＣＤＨ３発現細胞に抗ヒトＣＤＨ３抗体１００ｎｇ、サポリン標識抗体（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）１００ｎｇを加え、３７℃、３日間、５％ＣＯ２インキュベーターにて保温した。その後、生細胞数計測試薬であるＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８（同仁化学研究所社）を使用することで各抗体の細胞殺傷性を評価した。細胞殺傷性は抗体を加えなかった時の細胞生存率を１００％とした相対活性で表した。
【００３０】
本明細書で言う「高い内在化能」とは、当該抗体とサポリン標識抗マウスＩｇＧ抗体を投与したＣＤＨ３発現細胞の生存率（抗体未添加時の細胞生存率を１００％とした相対率で表したもの）が、好ましくは７０％以下、より好ましくは６０％以下、より好ましくは５０％以下、より好ましくは４５％以下、さらに好ましくは４０％以下、特に好ましくは３５％以下であることを意味する。
【００３１】
本発明の抗体が認識するカドヘリンの種類は古典的カドヘリンが望ましい。例としてＥカドヘリン、Ｎカドヘリン、Ｐカドヘリンを挙げる事ができるが、これに限定されるものではない。
【００３２】
本発明の抗体を作成するための抗原としては、カドヘリン又はその部分ペプチドを用いることができる。一例としては、可溶型ＣＤＨ３タンパク質などを用いることができるが、これに限定されるものではない。
【００３３】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。本発明の抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体）は、種々の方法のいずれかによって製造することができる。このような抗体の製造法は当該分野で周知である［例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊｅｔａ１．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照］。この明細書では、“モノクローナル抗体”は、ハイブリドーマ法で作られた抗体に限定されない。“モノクローナル抗体”という用語は、単一のクローン（例えば真核生物、原核生物、ファージのクローン）に由来する抗体を意味し、どの方法で作ったかは問題とされない。本発明のモノクローナル抗体は、従来技術で知られている多彩な方法で調製することができる。方法としては、例えば、ハイブリドーマ法、組み換え法、ファージ提示法や、これらの組み合わせがある。その全体がこの明細書に組み込まれているものとする。
【００３４】
（ａ）ポリクローナル抗体の作製
ポリクローナル抗体を作製するためには、カドヘリン、カドヘリン細胞外領域発現物又はその部分ペプチド（ＥＣ１が好ましい）を抗原として、これを哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは０．１〜１００ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１〜１００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜５週問間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から６〜６０目後に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００３５】
（ｂ）モノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体を作製するためには、カドヘリン、カドヘリン細胞外領域発現物又はその部分ペプチド（ＥＣ１が好ましい）を抗原として、これを哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは０．１〜１００ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１〜１００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜５週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から１〜６０日後、好ましくは１〜１４日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
【００３６】
細胞融合ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノブテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばＰ３×６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＮＳ−１などのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
【００３７】
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、１×１０6〜１×１０7個／ｍｌの抗体産生細胞と２×１０5〜２×１０6個／ｍｌのミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比５：１が好ましい）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１０００〜６０００ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【００３８】
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に３×１０5個／ｗｅｌ１程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【００３９】
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によって、カドヘリンのカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）と結合する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立することができる。
【００４０】
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水採取法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ2濃度）で７〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
【００４１】
腹水採取法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×１０7個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採集する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００４２】
本発明の抗体の種類は特に制限されず、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、トリ抗体等や、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体等の何れでもよい。遺伝子組換え型抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  Ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（ＥＰ２３９４００号公報、国際公開ＷＯ９６／０２５７６号公報など）。
【００４３】
ヒト型キメラ化抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【００４４】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体を意味する。
【００４５】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、カドヘリンに特異的に反応するヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００４６】
タンパク質発現に使用する宿主細胞系は、抗体生産系では哺乳動物起源のものが多い。該生産者は発現したい遺伝子産物に最も適する特定の宿主細胞系を優先的に決定できる。一般的な宿主細胞系としては、ＣＨＯ由来細胞株（チャイニーズハムスター卵巣細胞系）、ＣＶ１（サル腎臓系）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原をするＣＶ１の誘導体）、ＳＰ２／０（マウスミエローマ）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウスミエローマ）、および２９３（ヒト腎臓）、２９３Ｔ（ＳＶ４０Ｔ抗原をする２９３の誘導体）が挙げられるがそれらに限定されない。宿主細胞系は商業施設やｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から、または発表された文献の発表機関から入手することができる。
【００４７】
宿主細胞系として、好ましくはｄｇｆｒ遺伝子の発現欠損であるＣＨＯ由来細胞株かＳＰ２／０のいずれかである（Ｕｒｌａｎｄ，  Ｇ．ｅｔａｌ、Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｇａｍｍａ  ｒａｙｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｌｏｃｕｓ：  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｉｎｖｅｒｓｉｏｎｓ，  Ｓｏｍａｔ．  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｖｏｌ．  １２，  １９８６，  ｐ５５５５−５６６、および、Ｓｃｈｕｌｍａｎ，  Ｍ．ｅｔａｌ、Ａ  ｂｅｔｔｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｍａｋｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．  ２７６，  １９７８，  ｐ２６９−２７０  をそれぞれ参照のこと）。最も好ましくは、宿主細胞系はＤＨＦＲ欠失ＣＨＯである。
【００４８】
宿主細胞中へのプラスミドのトランスフェクションは、任意の技術を使って達成できる。具体的な方法としては、トランスフェクション（リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ法、リポフェクション、およびエレクトロポレーションを含む）、センダイウイルス等のエンベロープを利用してＤＮＡを導入する方法、マイクロインジェクション、およびレトロウイルスウイルスやアデノウイルス等のウイルスベクターを用いた感染が挙げられるが、それらに限定されない（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ９  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．を参照のこと）。最も好ましいのは、エレクトロポレーションによる宿主中へのプラスミド導入である。
【００４９】
また、別のヒト化、キメラ化抗体の作製の手法としては例えば、ＣＤＲと枠組構造残基の相互作用をモデル化して抗原が結合する上で重要な枠組構造残基を同定し、配列を比較して特定の位置にある通常とは異なる枠組構造残基を同定するという方法がある。例えばＱｕｅｅｎ他、アメリカ合衆国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、第６，１８０，３７０号を参照のこと（それぞれの特許は、参考としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする）。抗体は従来技術で知られている多彩な方法でヒト化することができる。例えばＣＤＲグラフティング（ヨーロッパ特許第２３９，４００号；ＰＣＴ公開公報ＷＯ９１／０９９６７；アメリカ合衆国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号）、ベニアリングまたはリサーフェシング（ヨーロッパ特許第５９２，１０６号、第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第２８巻、４８９〜４９８ページ、１９９１年；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ他、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．、第７巻、８０５〜８１４ページ、１９９４年；Ｒｏｇｕｓｋａ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第９１巻、９６９〜９７３ページ、１９９４年）、鎖シャッフリング（アメリカ合衆国特許第５，５６５，３３２号）。また、キメラ化抗体の作製方法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６，３９（２００４），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５，  １９１（１９８９）に記載されている。なおこれら文献は、参考としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする。
【００５０】
キメラ化、ヒト化抗体のアミノ酸配列は、寄託ハイブリドーマの発現するｃＤＮＡに由来するＶＨ又はＶＬ領域のアミノ酸配列と１００％同一であることも好ましいが、遺伝子工学的な改変により、９０％以上同一である配列を有する抗体であることも好ましい。ヒト化、キメラ化の過程で抗原の結合を改善することを目的とした残基置換の調整は従来から行われている。このような、配列を一部改変した抗体は、基本的にはもとのハイブリドーマに由来する抗体と考えられるからである。
【００５１】
遺伝子工学的な手法を用いる、キメラ化抗体や、ヒト化抗体の作成方法は既に既知のものである。つまり、確認された基となるモノクローナル抗体のＶＨ、ＶＬ配列を、遺伝子工学的に改変したのち、通常の方法により、キメラ化またはヒト化する。
【００５２】
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をインビトロで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９３／１２２２７，ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２，ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列から適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，  ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
【００５３】
また、これらの抗体は、カドヘリンのカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）を認識し、内在化能が高い抗体であるという特性を失わない限り、一価抗体、二価抗体、多価抗体のいずれでもよく、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、およびＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。また、抗体断片や低分子化抗体、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、Ｆｖ、ＳｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ）、ＤｉａｂｏｄｙなどにＦｃ部分を融合しＡＤＣＣ活性を付加したものでもよい。このような抗体を得るには、これら抗体をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい。
【００５４】
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００５５】
本発明のＦａｂは、カドヘリンに特異的に反応する抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することができる。
【００５６】
Ｆ（ａｂ'）2は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００５７】
本発明のＦ（ａｂ'）2は、カドヘリンに特異的に反応する抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ'をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
【００５８】
Ｆａｂ'は、上記Ｆ（ａｂ'）2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂ'は、カドヘリンに特異的に反応するＦ（ａｂ'）2を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ'断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することによりＦａｂ'を発現させ、製造することができる。
【００５９】
ｓｃＦｖは、一本のＶＨと一本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドを示す。本発明のｓｃＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは、本発明のカドヘリンに特異的に反応する抗体、例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。
【００６０】
本発明のｓｃＦｖは、カドヘリンに特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｓｃＦｖを製造することができる。
【００６１】
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４））に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明のｄｓＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは本発明のカドヘリンに特異的に反応する抗体、例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。
【００６２】
本発明のｄｓＦｖは、カドヘリンに特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｄｓＦｖを製造することができる。
【００６３】
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｈ鎖またはＬ鎖ＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、カドヘリンに特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得した後、ＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ＣＤＲを含むペプチドを製造することができる。
【００６４】
また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
【００６５】
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。特に薬剤結合抗体は有用である。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法は当業者に公知である。
【００６６】
本発明の抗体は、高い内在化能を示すことから、毒素を結合し細胞傷害剤として使用することができる。本発明の細胞傷害剤は、例えばカドヘリンを発現している癌細胞と接触させることにより癌細胞を傷害することができる。
【００６７】
本発明における抗体の好ましい態様としては抗体に薬剤等の細胞傷害性物質を結合した、いわゆるＡＤＣをあげることができる。
【００６８】
本発明で用いられる薬剤の例としては例えばデュオカルマイシン、デュオカルマイシンのアナログ及び誘導剤、ＣＣ−１０６５、ＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ＭＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ＣＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ドキソルビシン、ドキソルビシンコンジュゲート、モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、ドラスタチン、ドレスタチン−１０、コンブレタスタチン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、メイタンシン、メイタンシンアナログ、ＤＭ１，ＤＭ２，ＤＭ３，ＤＭ４、ＤＭＩ、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、アウリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、５−ベンゾイルバレリン酸ＡＥエステル（ＡＥＶＢ）、チューブリシン、ジソラゾール、エポシロン、パクリタキセル、ドセタキセル、ＳＮ−３８、トポテカン、リゾキシン、エキノマイシン、コルヒチン、ビンブラスチン、ビンデシン、エストラムスチン、セマドチン、エリューテロビン、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、リューロシン、リューロシダイン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ダウノルビシンコンジュゲート、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン、ポドフィロトキシン誘導体、エトポシド、エトポシドリン酸塩、ビンクリスチン、タキソール、タキソテールレチノイン酸、酪酸、Ｎ8−アセチルスペルミジン並びにカンプトセシン等をあげることができるが、これだけに限定されるわけではない。
【００６９】
本発明におけるＡＤＣは、前記の薬剤と抗体と結合し、公知の方法により作製できる。抗体と薬剤は、それら自身が有する連結基などを介して直接結合されてもよいし、また、リンカーや他の物質を介して間接的に結合されてもよい。
【００７０】
薬剤が直接結合される場合の連結基は、例えばＳＨ基を用いたジスルフィド結合やマレイミドを介する結合が挙げられる。例えば、抗体のＦｃ領域の分子内ジスルフィド結合と、薬剤のジスルフィド結合を還元して、両者をジスルフィド結合にて結合する。また、マレイミドを介する方法もある。また別の方法として、抗体内にシステインを遺伝子工学的に導入する方法もある。
【００７１】
抗体と薬剤を、他の物質（リンカー）を介して間接的に結合することも可能である。リンカーには、抗体または薬剤または両方と反応する官能基を１または２種類以上有することが望ましい。官能基の例としてはアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、，マレイミド基、ピリジニル基等をあげることができる。
【００７２】
リンカーの例としては、スルフォスクシイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート  （Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）  （ＬＣ−ＳＭＣＣ）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）、およびＮ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）、６−マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボンイル（ＰＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジル４（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）  及びＮ−スクシンイミジル（４−イオド−アセチル）アミノ安息香酸エステル（ＳＩＡＢ）等があげられるが、これらに限定されるものではない。また、このリンカーは例えば、バリン−シトルリン（Ｖａｌ−Ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｌａ−ｐｈｅ）のようなペプチドリンカーであってもよいし、上記にあげたリンカーをそれぞれ適時組み合わせて使用しても良い。
【００７３】
薬剤と抗体との結合方法に関しては、例えば、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ；６８  （２２）  ９２８０（２００８）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；２６（８）  ９２５（２００８）、Ｂｉｏ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；１９、１６７３  （２００８）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ；６８  （１５）  ６３００（２００８）、又は特表２００８−５１６８９６号公報などに記載の方法に準じて行うことができる。
【００７４】
本発明の別の実施形態としては、抗体に毒素（トキシン）を化学的または遺伝子工学的に結合した、いわゆるイムノトキシンをあげることができる。
【００７５】
本発明で用いられるトキシンとしては、例えば、ジフテリアトキシンＡ鎖、シュードモナスエンドトキシン、リシン鎖；無糖鎖リシンＡ鎖ゲロニン（Ｇｅｌｏｎｉｎ）サポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ）等をあげることができる。
【００７６】
本発明の抗体の別の実施態様としては、本発明の抗体と放射性物質とを結合したいわゆるＲＩ標識抗体をあげることができる。
【００７７】
放射性物質としては、癌治療薬として用いる場合には細胞傷害性放射性金属が好ましく、癌診断薬として用いる場合には細胞非傷害性放射性金属であるのが好ましい。また、ヨウド１２３（１２３Ｉ）、ヨウド１３１（１３１Ｉ）を使用する方法もある。
【００７８】
このような細胞傷害性放射性金属としては、例えばイットリウム９０（９０Ｙ）、レニウム１８６（１８６Ｒｅ）、レニウム１８８（１８８Ｒｅ）、銅６７（６７Ｃｕ）、鉄５９（５９Ｆｅ）、ストロンチウム８９（８９Ｓｒ）、金１９８（１９８Ａｕ）、水銀２０３（２０３Ｈｇ）、鉛２１２（２１２Ｐｂ）、ジスプロシウム１６５（１６５Ｄｙ）、ルテニウム１０３（１０３Ｒｕ）、ビスマス２１２（２１２Ｂｉ）、ビスマス２１３（２１３Ｂｉ）、ホルミウム１６６（１６６Ｈｏ）、サマリウム１５３（１５３Ｓｍ）、ルテチウム１７７（１７７Ｌｕ）などを挙げることができる。
【００７９】
これらの放射性金属の中でも、９０Ｙ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕが、半減期、放射線エネルギー、容易な標識反応、標識率、錯体の安定性等の点から好ましい。
【００８０】
一方、診断薬に用いる細胞非傷害性放射性金属としては、テクネシウム９９ｍ（９９ｍＴｃ）、インジウム１１１（１１１Ｉｎ）、インジウム１１３ｍ（１１３ｍＩｎ）、ガリウム６７（６７Ｇａ）、ガリウム６８（６８Ｇａ）、タリウム２０１（２０１Ｔｌ）、クロム５１（５１Ｃｒ）、コバルト５７（５７Ｃｏ）、コバルト５８（５８Ｃｏ）、コバルト６０（６０Ｃｏ）、ストロンチウム８５（８５Ｓｒ）、水銀１９７（１９７Ｈｇ）、銅６４（６４Ｃｕ）が好適に用いられるが、これに限定されるものではない。
【００８１】
これらの放射性金属元素を本発明の抗体に結合させるには、該抗体に金属キレート試薬を反応させ、これに放射性金属元素を反応させて錯体とするのが好ましい。このようにして得られた修飾抗体は、放射性金属元素が金属キレート試薬を介して本発明の抗体に結合している。
【００８２】
このような錯体形成に用いられる金属キレート試薬の例としては、例えば（１）８−ヒドロキシキノリン、８−アセトキシキノリン、８−ヒドロキシキナルジン、硫酸オキシキノリン、Ｏ−アセチルオキシン、Ｏ−ベンゾイルオキシン、Ｏ−ｐ−ニトロベンゾイルオキシン、キノリン骨格を有するキノロン系化合物であるノルフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、シプロフロキサシン、ロメフロキサシン、トスフロキサシン、フレロキサシン、スパルフロキサシン等のキノリン誘導体；（２）クロラニル酸、アルミノン、チオ尿素、ピロガロール、クペロン、ビスムチオール（ＩＩ）、ガロイル没食子酸、チオリド、２−メルカプトベンゾチアゾール、テトラフェニルアルソニウムクロライド等の化合物；（３）エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびこれらに類似した骨格を有するジヒドロキシエチルグリシン、ジアミノプロパノール四酢酸、エチレンジアミン二酢酸、エチレンジアミン二プロピオン酸塩酸塩、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、エチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヘキサメチレンジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、イミノ二酢酸、ジアミノプロパン四酢酸、ニトリロ三酢酸、ニトリロ三プロピオン酸、ニトリロトリス（メチレンスルホン酸）三ナトリウム塩、トリエチレンテトラミン六酢酸、メチルＤＴＰＡ、シクロヘキシルＤＴＰＡ、アミノベンジルＥＤＴＡ、イソチオシアノベンジルＥＤＴＡ、イソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、メチルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、シクロヘキシルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、マレイミドプロピルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドペンチルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドペンチルアミドベンジルＤＴＰＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＤＴＰＡ；（４）１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（Ｃｙｃｌｅｎ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（Ｃｙｃｌａｍ）、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡ、イソチオシアノベンジルＮＯＴＡ等が挙げられる。
【００８３】
これらの金属キレート試薬のうち、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡ、メチルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、シクロヘキシルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡが金属キレートの容易な抗体への導入反応、標識率、錯体の安定性等の点で好ましい。
【００８４】
本発明の抗体への放射性金属元素の結合は、当業者であれば常法に従って行うことができる。例えば本発明の抗体に金属キレート試薬を反応させ、予め標識前駆体を調製しておき、次いで放射性金属元素を反応させることにより行うことができる。
【００８５】
本発明の細胞傷害剤には、本発明の抗体（所望により薬剤、トキシン、又は放射性物質を含む細胞障害性物質が結合していてもよい）の他に、必要に応じて薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤などを適宜含有させることができる。本発明の細胞傷害剤としては、例えば注射剤として製剤することができる。本発明の細胞傷害剤の投与量は、患者の症状の程度、年令及び体重、投与方法などに依存し、有効成分である抗体の重量としては通常、約１０ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
【００８６】
本発明の医薬組成物は、特に、カドヘリン（好ましくはＣＤＨ３）高発現疾患の治療薬として有用である。カドヘリン（好ましくはＣＤＨ３）高発現疾患の種類は特に限定されないが、好ましくは癌であり、例えば、大腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、肺癌、移行上皮癌、膵臓癌、肝癌、腎癌、胆道癌、甲状腺癌、頭頚部癌、食道癌、皮膚扁平上皮癌、メラノーマ、胃癌、前立腺癌、骨肉腫又は軟組織肉腫などを挙げることができる。
【００８７】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００８８】
実施例１  正常組織および癌組織でのヒトＣＤＨ３ｍＲＮＡの発現
正常ヒト組織および各種癌組織より、レーザーマイクロダイセクション法（Ｌａｓｅｒ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）で回収したサンプルよりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用い定法に従って全ＲＮＡを調製した。ＲＮＡ各１０ｎｇをＧｅｎｅＣｈｉｐＵ−１３３Ｂ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用い、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）に準じて遺伝子発現を解析した。全遺伝子の発現スコアの平均値を１００とし、癌細胞において発現が亢進する遺伝子を探索したところ、ヒトＣＤＨ３は正常ヒト組織では発現が限られ、肺癌、大腸癌、膵臓癌で発現が高かった（図３Ａ、Ｂ）。また、分化度の異なる膵臓癌組織におけるＣＤＨ３ｍＲＮＡの発現を検討したところ、分化度に関わらず発現が高い組織が認められた（図３Ｃ）。【００８９】
実施例２  免疫組織化学染色による癌組織でのヒトＣＤＨ３タンパク質の発現
癌臨床検体でのＣＤＨ３タンパク質の発現を確認するため、癌検体組織アレイで免疫染色を行った。
癌細胞組織アレイは、上海芯超生物科技有限公司社（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｏｕｔｄｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）製の、膵癌（腺癌）、肺癌（腺癌）、肺癌（扁平上皮癌）および大腸癌（腺癌）を使用した。【００９０】
各組織アレイスライドを脱パラフィン処理し、１０ｍＭＴｒｉｓ  １ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ９．０）で９５℃４０分賦活化を行った。ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋Ｋｉｔ（Ｄａｋｏ社）付属のブロッキング試薬にて内在性ペルオキシダーゼの不活性化を行った後、抗ＣＤＨ３抗体６１０２２７（ＢＤ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社）、およびネガティブコントロールとして抗ＨＢｓ抗体Ｈｙｂ−３４２３と５μｇ／ｍＬの濃度で４℃一晩反応させた。抗体溶液を洗い流した後に、ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋Ｋｉｔ付属のポリマー二次抗体試薬と室温３０分間反応させた。ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋Ｋｉｔ付属の発色試薬にて発色を行い、ヘマトキシリンエオジン溶液にて核染色を行った。
図４に結果を示す。癌細胞は抗ヒトＣＤＨ３抗体で染色され正常細胞は染色されなかった。【００９１】
実施例３  ヒトＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株の樹立
抗ヒトＣＤＨ３抗体スクリーニング用細胞株を得るため、全長ＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞の樹立を行った。
（１）ＣＤＨ３遺伝子発現ベクターの作製
配列番号１に示す全長ヒトＣＤＨ３ＤＮＡを哺乳類発現ベクターｐＥＦ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＢ（インビトロジェン社）へ挿入するため、２種類の制限酵素ＫｐｎＩ（タカラバイオ社）及びＸｂａＩ（タカラバイオ社）で３７℃、１時間処理した後、同じくＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理したｐＥＦ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＢへＴ４  ＤＮＡリガーゼ（プロメガ社）により常法に従って挿入し、発現ベクターｐＥＦ４―ＣＤＨ３―ｍｙｃ−Ｈｉｓを得た。【００９２】
（２）ＣＤＨ３安定発現株の取得
ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６トランスフェクション試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社）のプロトコールに準じ、トランスフェクション前日に径１０ｃｍディッシュに８×１０5細胞のＣＨＯ細胞を播種し一晩培養後、８μｇの発現ベクターｐＥＦ４―ＣＤＨ３―ｍｙｃ−Ｈｉｓと１６μＬのＦｕＧＥＮＥ６試薬を４００μＬの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ社）に混合し１５分間室温放置後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌々日に選択試薬（Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標））を用いて限界希釈法にてクローニングを行った。【００９３】
ＣＤＨ３全長発現ＣＨＯのクローン選抜は、抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）を用いたウェスタンブロット法により行い、その結果発現量が高く、かつ増殖が良好なＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１５０１）を得た。この細胞株及び親株であるＣＨＯ細胞と市販抗ＣＤＨ３抗体（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ社）のフローサイトメーターによる測定結果を図５に示す。【００９４】
実施例４  ヒトＣＤＨ３細胞外領域抗原の作製
抗ヒトＣＤＨ３抗体作製の免疫原とするため、Ｃ末端膜貫通領域以降を欠損させたヒトＣＤＨ３細胞外領域（ｓＣＤＨ３）タンパク質を作製した。
（１）ｓＣＤＨ３抗原発現ベクターの作製
ヒトＣＤＨ３全長ｃＤＮＡをテンプレートとして、ヒトＣＤＨ３細胞外領域に相当する部分（配列番号２の１−６５４に相当、以下ｓＣＤＨ３ｃＤＮＡ）を増幅するように設計されたフォワードプライマー（配列番号７：ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＧＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴ）とリバースプライマー（配列番号８：ＣＣＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＣ）を用いてＰＣＲ反応を行った。反応にはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡社）を用い、９４℃−１５秒、５５℃−３０秒、６８℃−９０秒、３０サイクルの反応条件で行った。【００９５】
その後、アガロースゲル電気泳動で目的サイズである約２．０ｋｂｐのバンドを含むゲル断片を切り出し、ＱＩＡ（登録商標）クイックゲル抽出キット（キアゲン社）を用いて、目的のｓＣＤＨ３ｃＤＮＡを得た。【００９６】
このｓＣＤＨ３ｃＤＮＡを発現用ベクターｐＥＦ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＢへ挿入するために、２種類の制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理した後、同じくＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理したｐＥＦ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＢにＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて常法に従い挿入し、発現ベクターｐＥＦ４−ｓＣＤＨ３−ｍｙｃ−Ｈｉｓを得た。【００９７】
（２）可溶型ＣＤＨ３タンパク質の発現
ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬のプロトコールに準じ、トランスフェクション前日に径１０ｃｍディッシュに８×１０5個のＣＨＯ細胞を播種し一晩培養後、８μｇの発現ベクターｐＥＦ４−ｓＣＤＨ３−ｍｙｃ−Ｈｉｓと１６μＬのＦｕＧＥＮＥ６試薬を４００μＬの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地に混合、１５分間室温放置後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌々日に選択試薬（Ｚｅｏｃｉｎ）を用いて限界希釈法にてクローニングを行った。【００９８】
可溶型ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞の選抜は、抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）を用いたウェスタンブロット法で行った。培養上清中への分泌量が多く増殖が良好な細胞株を選択した結果、可溶型ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１７０２）が得られた。選択されたＥＸＺ１７０２は、培養面積１，５００ｃｍ2のローラーボトル３本を用い、ローラーボトル１本あたり無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ−ＩＩ（インビトロジェン社）３３３ｍＬにて７２時間培養を行い、培養上清を回収した。得られた培養上清からＨｉｓＴｒａｐ（登録商標）ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）によるアフィニティークロマトグラフィーとＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ｐｇカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）によるゲル濾過クロマトグラフィーにより可溶型ＣＤＨ３細胞外領域タンパク質を得た。【００９９】
実施例５  抗ヒトＣＤＨ３モノクローナル抗体の作製
（１）可溶型ＣＤＨ３たんぱく質を免疫原としたモノクローナル抗体の作製
生理食塩水に溶解した５０μｇの可溶型ＣＤＨ３タンパク質とＴｉｔｅｒ−ＭＡＸ  Ｇｏｌｄ（登録商標）（タイターマックス社）を等量混合し、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス（日本エスエルシー株式会社）の腹腔内および皮下に注射する事により初回免疫を行った。２回目以降の免疫は同様に調製した２５μｇタンパク質量相当の可溶型ＣＤＨ３タンパク質とＴｉｔｅｒ−ＭＡＸ  Ｇｏｌｄを混合して腹腔内および皮下に注射することにより実施した。最終免疫から３日後にマウスから脾臓細胞を無菌的に調製し、常法に従って、ポリエチレングリコール法によりマウスミエローマ細胞ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４あるいはＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３との細胞融合を行った。【０１００】
（２）抗ヒトＣＤＨ３抗体産生ハイブリドーマの選抜
抗ヒトＣＤＨ３抗体の選抜は、ＥＸＺ１５０１を用いたフローサイトメトリで行った。
すなわち、ＥＸＺ１５０１を２ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳで処理することで培養プレートから剥離後、１×１０6個／ｍＬとなるようにＦＡＣＳ溶液に懸濁した。この細胞懸濁液を５０μＬ／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種し、ハイブリドーマ培養上清を加えて４℃で６０分間反応させ、ＦＡＣＳ溶液（２００μＬ／ウェル）で２回洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗マウスＩｇＧ・ヤギＦ（ａｂ'）2（インビトロジェン社）を加えて、４℃で３０分間反応させた。その後ＦＡＣＳ溶液で２回洗浄した後、フローサイトメトリを実施し、ＥＸＺ１５０１との反応が認められるハイブリドーマを選抜した。【０１０１】
当該ハイブリドーマより得られた抗体と、ＥＸＺ１５０１、親株であるＣＨＯ細胞及びＣＤＨ３が高発現であると確認されているヒト細気管支肺胞上皮癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ３５８との典型的な反応結果を図６に示す。選抜したハイブリドーマ全てが、ＥＸＺ１５０１およびＮＣＩ−Ｈ３５８と反応し、ＣＨＯ細胞とは反応しないことを確認した。【０１０２】
実施例６  サポリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＭａｂＺＡＰ）による抗ヒトＣＤＨ３マウス抗体の内在化能評価
内在化能の測定は、タンパク質合成を阻害する毒素（サポリン）を標識した抗マウスＩｇＧ抗体を使用して行なった。サポリンによる細胞殺傷は細胞内部移行が必須であるため、ＭａｂＺＡＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を２次抗体とした抗ヒトＣＤＨ３抗体のヒトＣＤＨ３発現細胞に対する殺傷程度を測定する事で抗ヒトＣＤＨ３抗体の内在化能を評価する事が可能である。【０１０３】
ヒトＣＤＨ３発現細胞としてヒト乳がん由来細胞株ＨＣＣ１９５４（１ウェルあたり５０００個）を用い、そこに抗ヒトＣＤＨ３マウス抗体１００ｎｇ、ＭａｂＺＡＰ１００ｎｇを加え、３７℃、３日間、５％ＣＯ２インキュベーターにて保温した。その後、生細胞数計測試薬であるＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所社製）を使用して各抗体の細胞殺傷性を評価した。細胞殺傷性は抗体を加えなかった時の細胞生存率を１００％とした相対活性で表記した。抗体を変えて複数回実施した結果を表１及び図７Ａ及びＢに示す。【０１０４】
【表１】
2012057328.tif 000002
【０１０５】
ＮｅｇａｔｉｖｅＡｂ１、ＮｅｇａｔｉｖｅＡｂ２は、ヒト細胞株では発現しておらず、かつＣＤＨ３とは無関係な抗原を認識する抗体を示す。【０１０６】
抗体ＰＰＡＴ−０５５−０３を産生するハイブリドーマＰＰＡＴ−０５５−０３は、２０１０年１０月１５日に独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(郵便番号２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−９８８として寄託され、２０１１年９月７日に、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−９８８としてブタベスト条約に基づく国際寄託に移管された。【０１０７】
また、抗体ＰＰＡＴ−０５５−０９、ＰＰＡＴ−０５５−２４をそれぞれ産生するハイブリドーマＰＰＡＴ−０５５−０９、ＰＰＡＴ−０５５−２４は、２０１０年１０月１５日に独立行政法人 製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（郵便番号２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−９８９、ＮＩＴＥ  Ｐ−９９１として寄託され、２０１１年９月７日に、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−９８９、ＮＩＴＥ  ＢＰ−９９１としてブタベスト条約に基づく国際寄託に移管された。【０１０８】
また、抗体ＰＰＡＴ−０５５−１５を産生するハイブリドーマＰＰＡＴ−０５５−１５は、２０１１年９月２７日に独立行政法人 製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（郵便番号２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４５としてブタベスト条約に基づいて国際寄託されている。【０１０９】
実施例７  抗ＣＤＨ３モノクローナル抗体のエピトープ分類
得られた抗ヒトＣＤＨ３抗体のエピトープ分類は、ヒトＣＤＨ３部分配列発現物とのウェスタンブロット法により行った。ヒトＣＤＨ３部分配列発現物は各断片間で十分に配列が重複するように断片１から５を設計した（図８）。【０１１０】
（１）  ヒトＣＤＨ３部分配列発現物の発現ベクターの作製
実施例３の全長ヒトＣＤＨ３ｃＤＮＡをテンプレートとし、後述のプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行った。この反応にはｉＰｒｏｏｆＨｉｇｈＦｉｄｅＩｉｔｙＤＮＡポリメラーゼ（バイオラッド社）を用い、条件は９８℃−１０秒、６０℃−１０秒、７２℃−３０秒、３５サイクルで行なった。アガロースゲル電気泳動により目的のサイズに近いバンドを含むゲルを切り出し、ＱＩＡ（登録商標）クイックゲル抽出キットを用いて、目的のヒトＣＤＨ３ｃＤＮＡ部分断片を得た。【０１１１】
このヒトＣＤＨ３部分断片を大腸菌発現ベクターｐＣｏｌｄ（登録商標）ＴＦ（タカラバイオ社）へ挿入するために、２種類の制限酵素ＫｐｌｌＩ及びＸｂａＩで処理した後、同じくＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理したｐＣｏＩｄＴＦにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて常法に従い挿入し、各断片を発現するための発現ベクターを得た。以下のプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行い各断片を得た。【０１１２】
断片１（配列番号２の１０８位一２３６位）
フォワードプライマー：ＴＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＧＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＣＣＡＡＴＡＴＣＴＧ（配列番号：９）
リバースプライマー：ＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＣＴＧＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＧＴＡＣＣＴＧＧＴＡＧＧ（配列番号：１０）【０１１３】
断片２（配列番号２の１３２位一３４８位）
フォワードプライマー：ＴＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＡＡＧＴＣＴＡＡＴＡＡＡＧＡＴＡＧＡＧＡＣＡＣＣＡＡＧ（配列番号：１１）
リバースプライマー：ＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＣＡＴＧＧＣＣＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＣＡ（配列番号：１２）【０１１４】
断片３（配列番号２の２３７位一４６１位）
フォワードプライマー：ＴＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＧＴＧＡＣＡＧＣＣＡＣＧＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧ（配列番号：１３）
リバースプライマー：ＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＡＣＡＣＡＣＡＣＡＧＧＣＴＣＣＣＣＡＧＴＧ（配列番号：１４）【０１１５】
断片４（配列番号２の３４９位一５５０位）
フォワードプライマー：ＴＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＧＡＣＧＧＴＣＡＣＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＧ（配列番号；１５）
リバースプライマー：ＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＡＣＴＧＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＴＴＧ（配列番号：１６）【０１１６】
断片５（配列番号２の４６２位一６５４位）
フォワードプライマー：ＴＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＴＡＣＡＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＧＧ（配列番号：１７）
リバースプライマー：ＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＴＣＧ（配列番号：１８）【０１１７】
（２）ヒトＣＤＨ３部分配列の発現
（１）のＣＤＨ３断片の発現ベクターを使用して、常法により大腸菌Ｒｏｓｓｅｔｔａ（登録商標）２（メルク社）を形質転換し、ＬＢ培地中で培養。６００ｎｍの吸光値が０．４となった段階で、３０分間氷冷し、イソプロピルーβ一チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）濃度を０．５ｍＭとし、２０℃で１８時間培養後、回収した。【０１１８】
ヒトＣＤＨ３部分配列の発現は、大腸菌培養液を電気泳動後、抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体（キアゲン社）によるウェスタンブロット法を実施し、予想された位置にバンドが存在する事で確認した。
即ち、上述した大腸菌培養液量の１／１０量に相当する泳動緩衝液を加え、還元条件下５−２０％グラジエントゲル（バイオラッド社）にチャージして電気泳動後、イモビロン（登録商標）Ｐ（ミリポア社）に転写した。転写膜は、ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ＴＢＳ）で軽く洗った後、４０％ＢＳＡ入りＴＢＳで１時間振とう後、１０％ブロックエー・一ス（登録商標）（雪印乳業社）入りＴＢＳ−Ｔで希釈した各抗ＣＤＨ３抗体を加え１時間振とうした。ＴＢＳ−Ｔで洗った後１０％ブロックエー一ス入りＴＢＳ−Ｔで希釈したＨＲＰ一抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）で１時間振とう後、ＴＢＳ−Ｔで洗った。発色はメーカーの解説書に従い、ＥＣＬ（登録商標）−Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて、Ｘ線フィルムＲＸ−ｕ（富士フイルム社）にて検出した。得られた結果を図９に示す。【０１１９】
（３）ＣＤＨ３部分配列発現物を用いた抗体エピトープ分類
上述の各ＣＤＨ３部分配列を発現させた大腸菌溶解物を還元条件下、５−２０％グラジエントゲル（バイオラッド社）にチャージして電気泳動後、プロッティング装置（バイオラッド社）を用いて、イモビロンＰ（ミリポア社）に転写した。転写膜は、ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ）で軽く洗った後、４０％ＢＳＡ入りＴＢＳで１時間振とう後、短冊状に等間隔で切断し、１０％ブロックエース入りＴＢＳ−Ｔで希釈した各抗ＣＤＨ３抗体を加え１時間振とうした。ＴＢＳ−Ｔで洗った後１０％ブロックエース入りＴＢＳ−Ｔで希釈したＨＲＰ一抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）で１時間振とう後、ＴＢＳ−Ｔで洗った。発色はメーカーの解説書に従い、ＥｃＬ−ＰＩｕｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて、ｘ線ＦｉｌｍＲｘ−ｕ（富士フイルム社）にて検出した。ここで得られた結果を図１０に示す。各ＣＤＨ３部分配列発現物との反応性により、各抗体が認識する領域を決定した。【０１２０】
（４）ペプチドアレイを用いた抗ＣＤＨ３モノクローナル抗体エピトープ決定
（３）のＣＤＨ３部分配列発現物によるエピトープ決定において、その境界領域に相当したと考えられる抗体ＰＰＡＴ−０５５−１３を対象に、ペプチドアレイ（ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＴｅｃｈｎｏＩｏｇｉｅｓ社製Ｒｅｐｌｉｔｏｐｅ）を用いてより詳細にエピトープ決定を行った。具体的には、ＣＤＨ３の細胞外領域に相当する領域（配列番号２の１０８位一５６３位に相当）を、Ｎ端から１３残基ずつ、２アミノ酸残基ずつスライドして合成したペプチド（１０８位一１２０位、１１０位一１２２位…５５１位一５６３位）をガラススライドに固相化、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）にてブロッキングしたものを調製し、１次抗体としてエピトープ検索対象の抗体と反応させた。ＴＢＳ−Ｔで３度洗浄後、ＤｙＬｉｇｈｔ６４９蛍光標識した抗マウス抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で検出した。エピトープ検索対象の抗体を反応させないものを陰性コントロールとして測定した。測定結果を図１１に示す。配列番号２に示されたＣＤＨ３のアミノ酸配列４４６位一４７２位、４９０位一５０４位に相当する領域に強いシグナルが観察され、当該抗体のエピトープと推定された。【０１２１】
以上の実験から推定されたＣＤＨ３配列上の各抗体が認識する領域との対応関係を表１で示した内在性試験結果と共に表２に示す。【０１２２】
【表２】
2012057328.tif 000003
【０１２３】
表中の認識ドメインと配列番号２で示されるアミノ酸位置との関係は以下に示される。
ＥＣ１：１０８位一２３６位
ＥＣ２：２３７位一３４８位
ＥＣ３：３４９位一４６１位
ＥＣ４：４６２位一５５０位
ＥＣ５：５５１位一６５４位【０１２４】
ここで決定された抗体の認識領域の結果と併せ、内在化能との関連を検討したところ、ヒトＣＤＨ３のＥＣ１領域に高い内在化能を示す抗体が集中している事が示された。【０１２５】
実施例８  ハイブリドーマからのＲＮＡの精製
ハイブリドーマＰＰＡＴ−０５５−０９（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−９８９）、及びハイブリドーマＰＰＡＴ−０５５−２４（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−９９１）から、細胞質に存在するＲＮＡをＧｏｕｇｈ，  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ＲＮＡ  ｆｒｏｍ  ｓｍａｌｌ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ，  １７３，  ｐ９３−９５  （１９８８）により記載されている方法（ただし、この論文に記されている溶解緩衝液のかわりに別のＴＮＥ緩衝液（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５、１％  ＮＰ−４０、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．０）を用いた）に従って単離した。具体的な操作方法としては、５ｘ１０6個のハイブリドーマ細胞を０．２ｍＬのＴＮＥ緩衝液に懸濁して細胞膜を溶解後、遠心により細胞核を除去した。得られた約０．２ｍＬ細胞質上清に０．２ｍＬの抽出緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．３５ＭＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、７Ｍ尿素）を加えた。この混合物をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、得られたＲＮＡ溶液にキャリアとしてグリコーゲン（ロッシュ社、Ｃａｔ  Ｎｏ．９０１３９３）を加えてから、エタノールで沈澱させた。次にＲＮＡ沈殿物を、細胞質ＲＮＡ濃度が０．５〜２ｕｇ／ｕＬになるように１０〜５０ｕＬの滅菌蒸留水を加えて溶解した。【０１２６】
実施例９  ハイブリドーマから調製したＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの作製
一本鎖ｃＤＮＡを合成するため、前記のように調製した細胞質ＲＮＡの０．５〜３ｕｇを５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ  ８．３（室温）、７５ｍＭＫＣｌ、３ｍＭＭｇＣｌ2、１０ｍＭＤＴＴ、１００ｎｇのランダムプライマー、０．５ｍＭｄＮＴＰ、２００ユニットのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（逆転写酵素、インビトロジェン社）を含む２０マイクロリットル反応混合液を調製し、４２℃で５０分間インキュベートした。このように合成したｃＤＮＡライブラリーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の鋳型として直接使用した。【０１２７】
実施例１０  抗ヒトＣＤＨ３抗体可変領域をコードする遺伝子のＰＣＲ法による増幅
実験に用いたプライマーはすべて北海道システムサイエンス株式会社で合成した。
Ａ．マウス軽鎖の可変領域をコードする遺伝子をＰＣＲ法で増幅するために使用するプライマー
５’末端においてＦＲ１部分と相同性を有するＤＮＡプライマーと３’末端においてマウスＬ鎖内のＪ鎖遺伝子と相同性を有する４セットプライマー（１）、あるいは、５’末端においてＬ鎖シグナル部分（７セットプライマー）と３’末端においてＫＣ部分（ＫＶＬアンチセンスプライマー）と相同性を有するプライマーセット（２）の２種類のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応により、該ｃＤＮＡからマウス免疫グロブリンＬ鎖可変域ＤＮＡを単離した。プライマー配列は次のとおりであった。【０１２８】
（１）  マウスＬ鎖可変域クローニング４セットセンスプライマー
「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  -Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ，  Ｂａｒｂａｓ  Ｂｕｒｔｏｎ  Ｓｃｏｔｔ  Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ」  ＰＲＯＴＯＣＯＬ９．５を参考にＳｅｎｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  １７種、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  ３種を北海道システムサイエンス社で合成した。【０１２９】
ＶＫセンス（ＦＲ１部分）下記１７のプライマーの混合物をＶＫセンスプライマーとして使用した。なお、塩基配列において、ＷはＡ又はＴを示し、ＲはＡ又はＧを示し、ＭはＡ又はＣを示し、ＫはＴ又はＧを示し、ＹはＴ又はＣを示し、ＳはＧ又はＣを示し、ＨはＡ、Ｃ又はＴを示し、ＢはＧ、Ｃ又はＴを示し、ＶはＡ、Ｇ又はＣを示し、ＤはＡ、Ｇ又はＴを示し、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを示す。【０１３０】
配列番号１９：５’-ＧＡＹＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣ-３’（縮重度２）
配列番号２０：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＴＣＴＣＷＣＣＣＡＧＴＣ-３’（縮重度４）
配列番号２１：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＭＴＭＡＣＴＣＡＧＴＣ-３’（縮重度８）
配列番号２２：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＹＴＲＡＣＡＣＡＧＴＣ-３’（縮重度８）
配列番号２３：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＲＡＴＧＡＣＭＣＡＧＴＣ-３’（縮重度８）
配列番号２４：５’-ＧＡＹＡＴＴＭＡＧＡＴＲＡＭＣＣＡＧＴＣ-３’（縮重度１６）
配列番号２５：５’-ＧＡＹＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＹＤＣＡＧＴＣ-３’（縮重度１２）
配列番号２６：５’-ＧＡＹＡＴＹＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＡＣ-３’（縮重度４）
配列番号２７：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＷＣＣＡＧＴＣ-３’（縮重度４）
配列番号２８：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＷＧＣＴＳＡＣＣＣＡＡＴＣ-３’（縮重度８）
配列番号２９：５’-ＧＡＹＡＴＴＳＴＲＡＴＧＡＣＣＣＡＲＴＣ-３’（縮重度１６）
配列番号３０：５’-ＧＡＹＲＴＴＫＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＲＡＣ-３’（縮重度１６）
配列番号３１：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＢＣＡＧＫＣ-３’（縮重度１２）
配列番号３２：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＡＡＣＹＣＡＧＧＡ-３’（縮重度４）
配列番号３３：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＷＴ-３’（縮重度４）
配列番号３４：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＡＣＣ-３’（縮重度２）
配列番号３５：５’-ＧＡＹＡＴＴＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣ-３’（縮重度２）【０１３１】
Ｊアンチセンス（４セットプライマー）
Ｊ１  ／  Ｊ２アンチセンスプライマー  （１）
配列番号３６：５’-ＧＧＳＡＣＣＡＡＲＣＴＧＧＡＡＡＴＭＡＡＡ-３’（縮重度：８）
Ｊ４アンチセンスプライマー  （２）
配列番号３７：５’-ＧＧＧＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡ-３’
Ｊ５アンチセンスプライマー（３）
配列番号３８：５’-ＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡ-３’
Ｊ１  ／  Ｊ２，  Ｊ４，  Ｊ５アンチセンスプライマー混合物  （４）【０１３２】
（２）  マウスＬ鎖可変域クローニング７セットプライマー
ＶＫセンス（シグナルペプチド部分）
このプライマーはノバジェン社のマウスＩｇ-プライマーセット（Ｎｏｖａｇｅｎ；  Ｍｅｒｃｋ，  Ｃａｔ．Ｎｏ．６９８３１-３）を元に制限酵素部位を除去するように塩基配列を改変した。【０１３３】
Ａセットセンスプライマー
配列番号３９：５’-ＡＴＧＲＡＧＷＣＡＣＡＫＷＣＹＣＡＧＧＴＣＴＴＴ-３’
Ｂセットセンスプライマー
配列番号４０：５’-ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴ-３’
Ｃセットセンスプライマー
配列番号４１：５’-ＡＴＧＧＡＧＷＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＳＣＴＧＹＴＡＴＧＧＧＴ-３’
Ｄセットセンスプライマー（下記２種類のプライマーの混合物を使用）
配列番号４２：５’-ＡＴＧＡＧＧＲＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＷＴＴＹＴＴＧＧＩＷＴＣＴＴ-３’
配列番号４３：５’-ＡＴＧＧＧＣＷＴＣＡＡＧＡＴＧＲＡＧＴＣＡＣＡＫＷＹＹＣＷＧＧ-３’
Ｅセットセンスプライマー（下記３種類のプライマーの混合物を使用）
配列番号４４：５’-ＡＴＧＡＧＴＧＴＧＣＹＣＡＣＴＣＡＧＧＴＣＣＴＧＧＳＧＴＴ-３’
配列番号４５：５’-ＡＴＧＴＧＧＧＧＡＹＣＧＫＴＴＴＹＡＭＭＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＧ-３’
配列番号４６：５’-ＡＴＧＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣ-３’
Ｆセットセンスプライマー（下記４種類のプライマーの混合物を使用）
配列番号４７：５’-ＡＴＧＡＧＩＭＭＫＴＣＩＭＴＴＣＡＩＴＴＣＹＴＧＧＧ-３’
配列番号４８：５’-ＡＴＧＡＫＧＴＨＣＹＣＩＧＣＴＣＡＧＹＴＹＣＴＩＲＧ-３’
配列番号４９：５’-ＡＴＧＧＴＲＴＣＣＷＣＡＳＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧ-３’
配列番号５０：５’-ＡＴＧＴＡＴＡＴＡＴＧＴＴＴＧＴＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴ-３’
Ｇセットセンスプライマー（下記４種類のプライマーの混合物を使用）
配列番号５１：５’-ＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＧＧＴＧＣＴ-３’
配列番号５２：５’-ＡＴＧＧＡＴＴＴＷＣＡＲＧＴＧＣＡＧＡＴＴＷＴＣＡＧＣＴＴ-３’
配列番号５３：５’-ＡＴＧＧＴＹＣＴＹＡＴＶＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴＣＴＧＧ-３’
配列番号５４：５’-ＡＴＧＧＴＹＣＴＹＡＴＶＴＴＲＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＧ-３’
ＫＶＬアンチセンスプライマー
配列番号５５：５’-ＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡ-３’【０１３４】
Ｂ．マウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子をＰＣＲ法で増幅するために使用するプライマー
５'末端においてマウスＨ鎖シグナル部分（４セットプライマー）と相同性を有するプライマーと３'末端においてＫＣ部分と相同性を有するプライマー、あるいは５'末端においてＦＲ１部分と相同性を有する１セットのプライマーと３'末端においてマウスＨ鎖の定常領域（ＩＧＨＣ）と相同性を有する２種類のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応により、該ｃＤＮＡからマウス免疫グロブリンＨ鎖可変域ＤＮＡを単離した。プライマー配列は次のとおりであった。【０１３５】
（３）  マウスＨ鎖可変域クローニングプライマー
ＶＨセンス（シグナル部分：４セットプライマー）
このプライマーはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．），  Ｕｎｉｔ  ２．１２  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖ  ＲｅｇｉｏｎｓのＴａｂｌｅ  ２．１２．２を参考にした。
配列番号５６：５’-ＡＴＧＧＲＡＴＧＳＡＧＣＴＧＫＧＴＭＡＴＳＣＴＣＴＴ-３’（縮重度：３２）
配列番号５７：５’-ＡＴＧＲＡＣＴＴＣＧＧＧＹＴＧＡＧＣＴＫＧＧＴＴＴＴ-３’（縮重度：８）
配列番号５８：５’-ＡＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴ-３’
配列番号５９：５’-ＡＴＧＧＲＣＡＧＲＣＴＴＡＣＷＴＹＹ-３’（縮重度：３２）【０１３６】
（４）  マウスＨ鎖可変域クローニングプライマー
ＶＨセンス（ＦＲ１部分）
このプライマーはＴａｎ等、“Ｓｕｐｅｒｈｕｍａｎｉｚｅｄ”  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｂｙ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｎ  Ａｎｔｉ−ＣＤ２８１，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６９（２００２）ｐ１１１９−１１２５のセンスプライマーの塩基配列を改変してデザインした。
配列番号６０：５’-ＳＡＧＧＴＳＭＡＲＣＴＫＳＡＧＳＡＧＴＣＷＧＧ-３’（縮重度：２５６）
ＶＨアンチセンス（３，４に共通のアンチセンスプライマー）
マウスＩｇＧすべてのアイソフォームとアニーリングできるように塩基配列を縮重してデザインした。
配列番号６１：５’-ＣＡＳＣＣＣＣＡＴＣＤＧＴＣＴＡＴＣＣ-３’（縮重度：６）【０１３７】
実施例１１  キメラ抗ヒトＣＤＨ３免疫グロブリンの一過性発現ベクターの作製
発現プラスミドの作製：ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  （Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ，バイオラッド社）を用いたＰＣＲ法により抗ＣＤＨ３マウスモノクローナル抗体Ｌ鎖、Ｈ鎖それぞれの可変領域を実施例１０に示したプライマーを用いて増幅した。増幅したＤＮＡフラグメントはサブクローニングベクターｐＧＥＭ（プロメガ社）に組み込んで、このベクターのＴ７，ＳＰ６ユニバーサルプライマーで塩基配列を決定した。【０１３８】
キメラ抗ヒトＣＤＨ３抗体のＬ鎖、および、Ｈ鎖の可変域塩基配列はＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ  Ｓｅａｒｃｈ  ｐａｇｅ  （ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｖｑｕｅｓｔ？ｌｉｖｒｅｔ＝０＆Ｏｐｔｉｏｎ＝ｍｏｕｓｅＩｇ）で検索して、確かに抗体遺伝子がクローニングできていることを確認した。【０１３９】
次に、クローン化された抗ヒトＣＤＨ３抗体のＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域をコードする遺伝子は、キメラＬ鎖発現ベクターにはヒトＣｋ領域をコードする遺伝子を、キメラＨ鎖発現ベクターにはヒトＣｇ１領域をコードする遺伝子をそれぞれ接続した遺伝子をデザインして、これらＬ鎖、Ｈ鎖キメラ抗体遺伝子をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社によって全長人工合成した。その際、ＣＨＯ生産細胞での遺伝子発現が有利なようにコドン使用頻度の最適化（Ｋｉｍら、Ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ）  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，  Ｇｅｎｅ，  １９９，  １９９７，  ｐ２９３−３０１の方法に従った）をおこなった。具体的には、Ｌ鎖の場合、効率的な翻訳のために必須のＤＮＡ配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．，  Ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｓｉｘ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｐｒｅｃｅｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ＡＵＧ  ｉｎｉｔｉａｔｏｒ  ｃｏｄｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６，  ｐ９４７−９５０，  １９８７）、マウスＩＧＫＶ（ｋ鎖可変領域）遺伝子のシグナルペプチド、抗ヒトＣＤＨ３抗体のＬ鎖のＶ領域、ヒトＫＣ（ｋ鎖定常域）の順に遺伝子を並列し、その両端には制限酵素部位（５’側にＮｈｅＩ，  ３’側にＥｃｏＲＩ）を付加した。キメラＨ鎖も同様に作製した。これら人工合成遺伝子をＮｈｅＩとＥｃｏＲＩで切断し、発現ベクターｐＣＡＧＧＳのＮｈｅＩとＥｃｏＲＩ部位に組み込み、抗ヒトＣＤＨ３キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターｐＣＡＧＧＳ−ＩＧＫ，  Ｈ鎖発現ベクターｐＣＡＧＧＳ−ＩＧＨを得た。【０１４０】
実施例１２  抗ヒトＣＤＨ３キメラ化抗体の安定発現ベクターの作製
遺伝子操作された抗体遺伝子をＣＨＯ細胞を用いて高レベルで発現させるために、ＣＭＶプロモーター配列に連結し、ポリＡシグナルを有したジヒドロフォレートレダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を組み込んだ発現ベクターを作製した。【０１４１】
キメラ化抗体の安定発現生産細胞株をつくるために、ｄｈｆｒ遺伝子を組み込んだｐＣＡＧＧＳ発現ベクターを作製した。具体的には、一過性の発現ベクターであるｐＣＡＧＧＳ−ＩＧＨ、およびｐＣＡＧＧＳ−ＩＧＫに、ＣＭＶプロモーターとポリＡシグナルを有したｄｈｆｒ遺伝子を組み込むことである。ＣＭＶプロモーター、Ｋｏｚａｋ配列をもつマウスｄｈｆｒ遺伝子、ＳＶ４０ポリＡシグナルをそれぞれＰＣＲ法によって増幅し、これらの遺伝子の混合物をＰＣＲ法で接続するとともに両端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加して、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＣＭＶプロモーター−Ｋｏｚａｋ−ｄｈｆｒ−ポリＡ−ＨｉｎｄＩＩＩという遺伝子フラグメントを得た。このフラグメントをｐＣＡＧＧＳ−ＩＧＨ、あるいは、ｐＣＡＧＧＳ−ＩＧＫのＨｉｎｄＩＩＩ部位に組み込んでｐＣＡＧＧＳ−ＩＧＨ−ＣＭＶｐ−ｄｈｆｒ−Ａ、および、ｐＣＡＧＧＳ−ＩＧＫ−ＣＭＶｐ−ｄｈｆｒ−Ａを得た。これらの発現ベクターはキメラ抗体をＣＡＧプロモーターで、ｄｈｆｒ遺伝子をＣＭＶプロモーターで発現させることができ、効率的に遺伝子増幅を利用してキメラ化抗体を生産することができた。【０１４２】
実施例１３  抗ヒトＣＤＨ３キメラ化抗体生産ＣＨＯ細胞株の樹立
ＣＨＯ  ｄｈｆｒ（−）細胞（Ｇ．  Ｕｒｌａｕｂら、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７，  ｐ４２１６−４２２０，  １９８０）を用いて、２種類のプラスミド（アンピシリン耐性遺伝子内のＰｖｕＩでプラスミドを切断して環状プラスミドから線状プラスミドにした）すなわち、キメラ抗ＣＤＨ３Ｌ鎖を発現するためのｐＣＡＧＧＳ−ＩＧＫ−ＣＭＶ−ｄｈｆｒ−Ａベクター、および、キメラ抗ＣＤＨ３Ｈ鎖を発現するためのｐＣＡＧＧＳ−ＩＧＨ−ＣＭＶ−ｄｈｆｒ−Ａベクターにより同時形質転換した。エレクトロポレーションはロンザ社製のＡｍａｘａでおこなった。ＤＮＡ（Ｌ鎖、Ｈ鎖各プラスミドにつき０．００２ｍｇ／試料）を３ｘ１０ｅ３  細胞の０．１ｍＬのＡｍａｘａエレクトロポレーションＣＨＯ用緩衝液に加えてパルスを与えた。【０１４３】
エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％の透析済みＦＢＳを含有し、ＨＴ（Ｈ，ヒポキサンチン  ：  Ｔ，チミジン）を含まないＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）に加えた。遺伝子導入から３日後、１０％透析ＦＢＳ、２  ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ＨＴを含まないＩＭＤＭに培地を交換して１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８でｎｅｏ＋形質転換細胞の選択をおこない、キメラ抗体産生陽性細胞株クローンを得た。次に、Ｇ４１８で選択されたクローンを用いて遺伝子増幅をおこなった。０．２５ｍＭ、１ｍＭの２ラウンドのメソトレキセート（ＭＴＸ）中での増幅の後、１リットルあたり約５０〜１００ｍｇのキメラ抗ヒトＣＤＨ３抗体を生産する細胞株を樹立できた。【０１４４】
実施例１４  酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるキメラ化抗体の定量
遺伝子導入したＣＨＯ細胞の培養上清をＥＬＩＳＡにより測定して、キメラ化抗体が生産されていることを確認した。キメラ抗体を検出するため、プレートをヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（マウス、ウサギ、ウシ、マウスＩｇＧに対して吸収済み）（コスモバイオ：ＡＱＩ，  Ｃａｔ．Ａ−１１０ＵＤ）でコートした。ブロックした後、抗ＣＤＨ３キメラ抗体産生ＣＨＯ細胞からの培養上清を段階希釈し、各ウエルに加えた。プレートをインキュベーション、および洗浄後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（マウス、ウサギ、ウシ、マウスＩｇＧに対して吸収済み）−ＨＲＰ（コスモバイオ：ＡＱＩ，  Ｃａｔ．  Ａ−１１０ＰＤ）を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。さらにインキュベーションした後、反応を停止しそして４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。標準として精製ヒトＩｇＧを用いた。【０１４５】
実施例１５  キメラ化抗体の内在化能の評価
作製したキメラ化抗体の内在化能は、実施例６で示したものと同様の方法で行なった。但し、サポリン標識抗体はキメラ化抗体に対応するため、ＨｕｍＺＡＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用した。その結果、親抗体で示されていた内在化能はキメラ化後もそのまま保持していた。表１で示した親抗体の結果を併せ、キメラ化後の内在性試験結果を表３に示す。【０１４６】
【表３】
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【０１４７】
キメラ抗体ＰＰＡＴ−０５５−９Ｃ及びＰＰＡＴ−０５５−２４Ｃを産生する細胞株ＰＰＡＴ−０５５−９Ｃ及びＰＰＡＴ−０５５−２４Ｃは、２０１１年９月２７日に独立行政法人 製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（郵便番号２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４７及びＮＩＴＥ  ＢＰ−１１４８としてブタベスト条約に基づいて国際寄託されている。【０１４８】
実施例１６  薬剤の合成
ＤＭ１ＳＭｅは、米国特許第５，２０８，０２０号および６，３３３，４１０Ｂ１号に以前に記載されたように調製した（図１２）。【０１４９】
実施例１７  薬剤結合抗体の調製
（１）結合薬剤の還元処理
エタノール３００μｕＬで溶解した０．７８ｍｇのＤＭ１ＳＭｅと５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１８０ｕＬ，ＴＣＥＰｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｏｎｄ  Ｂｒｅａｋｅｒ，  サーモフィッシャーサイエンティフィック社）２０ｕＬを混合し、窒素雰囲気下、室温で３０分以上、攪拌しながら反応させ、薬剤を還元した。
還元薬剤はＨＰＬＣを使用して精製した後に溶媒留去後、１０ｍｇ／ｍＬになるようにジメチルアセトアミドに溶解した。【０１５０】
（２）マレイミド化抗体の調製
１ｍｇ／ｍＬ抗ヒトＣＤＨ３キメラ化抗体にモル比３０倍過剰となる量のｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を加え、３０℃、１時間反応させた。
過剰な架橋剤を除くため、５０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）で平衡化した脱塩カラムで脱塩処理（ＺｅｂａＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ，サーモフィッシャーサイエンティフィック社）した。【０１５１】
（３）薬剤による抗体の修飾
１ｍｇ／ｍＬのマレイミド化した抗ＣＤＨ３キメラ抗体と、結合したマレイミド基数の１．７倍に相当する還元薬剤とを５０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）中で、室温にて一晩反応させた。過剰な薬剤を除くため、ＨＰＬＣを使用してゲルろ過を実施した。【０１５２】
実施例１８  抗体薬剤結合量の定量
抗体当たりの薬剤結合数は、２５２ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度を測定する事で決定した。決定方法は非特許文献（Ｗｉｄｄｉｓｏｎ，Ｗ．Ｃ．，Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｓ．Ｄ．，Ｃａｖａｎａｇｈ，Ｅ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４９，４３９２−４４０８）に記載の吸光係数εＡｂ280＝２２３，０００Ｍ-1ｃｍ-1，  εＡｂ252＝８２，５１０Ｍ-1ｃｍ-1，  εＤＭ１280＝５，１８０Ｍ-1ｃｍ-1，  εＤＭ１252＝２６，１６０Ｍ-1ｃｍ-1を利用した。その結果、各抗体１分子辺り３〜４個程度の薬剤が導入されていると見積もられた。測定結果を表４に示す。【０１５３】
【表４】
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【０１５４】
実施例１９  インビトロ試験
薬剤結合抗体の細胞毒性と特異性はＷＳＴ−８を発色基質とした細胞増殖測定試薬（同仁化学研究所社，Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ−８）を使用して評価した。
即ち、ヒトＣＤＨ３が高発現であると確認されているヒト乳がん細胞株ＨＣＣ１９５４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２３３８）と薬剤結合抗体（ＡＤＣ）あるいは薬剤を結合していない抗体（Ｎａｋｅｄ）を任意の量共存させ、３７度で３日間、、５％ＣＯ2環境下でインキュベートした。その後、細胞増殖測定試薬を添加放置後Ａ４５０／６２０の吸光度を測定し、癌細胞株のみで抗体を加えないウェルより得られた吸光度の値を１００％としたときの相対的な値を細胞生存率として表記した（図１３）。【０１５５】
実施例２０  インビボ試験
薬剤結合抗体のインビボでの腫瘍縮小効果を、乳がん細胞株ＨＣＣ１９５４を移植したゼノグラフトモデルにて確認した。投与は、抗アシアロＧＭ１抗体（ＷＡＫＯ  ０１４−０９８０１）を、大塚蒸留水１ｍＬで溶解後、大塚生理食塩水４ｍＬを加えて全量５ｍＬとした後、この溶液を、マウス１匹あたり１００ｕＬ腹腔内投与。ＨＣＣ１９５４は１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養し、ＳＣＩＤマウス（メス、日本クレア）の右腹側部皮下に５ｘ１０6個／マウスになるように移植した。【０１５６】
試験に先立ち、移植ＨＣＣ１９５４腫瘍塊のＣＤＨ３発現を０５６実施例５と同様の手順で免疫組織化学（ＩＨＣ）により確認した。その結果を図１４に示す。
インビボ試験は各群５匹とし、１５ｍｇ／ｋｇを尾静脈より投与した。投与は平均腫瘍径が１００−１５０ｍｍ3となった時点で開始し、１週間後に更に同量、計２回行なった。
腫瘍サイズの推移を図１５に示す。
【図１】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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