(57)【要約】  Alum等の既存のアジュバントと比較して安全性および利便性に優れた新規なアジュバント組成物を提供する。生体内に存在する水溶性物質であるシトルリン類および／またはその塩を含有するアジュバント組成物、および当該アジュバント組成物と抗原を含有するワクチン組成物、当該アジュバント組成物およびワクチン組成物の製造方法、および当該アジュバント組成物およびワクチン組成物の投与方法を提供する。
2012124631.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトルリン類を含有するアジュバント組成物。
【請求項２】
前記シトルリン類が、Ｌ−シトルリン、Ｄ−シトルリン、Ｌ−チオシトルリン、Ｌ−ホモチオシトルリン、Ｓ−メチル−Ｌ−チオシトルリンおよびＳ−エチル−Ｌ−チオシトルリンからなる群より選択される１種または２種以上である、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項３】
前記シトルリン類が、Ｌ−シトルリンまたはＤ−シトルリンである、請求項２に記載のアジュバント組成物。
【請求項４】
前記シトルリン類が１ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬで含まれる、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のアジュバント組成物。
【請求項５】
アジュバント組成物が、ペプチド抗原用のアジュバント組成物である、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載のアジュバント組成物。
【請求項６】
抗酸化物質をさらに含む、請求項１から請求項５のいずれか一項に記載のアジュバント組成物。
【請求項７】
抗酸化物質が、アスコルビン酸である、請求項６に記載のアジュバント組成物。
【請求項８】
前記シトルリン類と抗酸化物質の重量比が１：２〜２：１である、請求項６または請求項７に記載のアジュバント組成物。
【請求項９】
前記抗酸化物質が１〜１０ｍｇ／ｍＬで含まれる、請求項６から請求項８のいずれか一項に記載のアジュバント組成物。
【請求項１０】
請求項１から請求項９のいずれか一項に記載のシトルリン類を含有するアジュバント組成物と抗原を含有するワクチン組成物。
【請求項１１】
前記抗原とシトルリン類の重量比が１：Ｎであって、Ｎが１００以上である、ワクチン組成物。
【請求項１２】
前記抗原が、インフルエンザウイルス抗原である、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
前記インフルエンザウイルス抗原が、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックス１（Ｍ１）、マトリックス２（Ｍ２）および核タンパク（ＮＰ）からなる群より選ばれた少なくとも１種または２種以上の抗原である、請求項１２に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
前記インフルエンザウイルス抗原が、ヘマグルチニン（ＨＡ）である、請求項１３に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
前記インフルエンザウイルス抗原が、マトリックス２（Ｍ２）である、請求項１３に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
前記インフルエンザウイルス抗原とシトルリン類の重量比が１：Ｎであって、Ｎが３００以上である、請求項１２から請求項１５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
前記抗原がペプチドである、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
前記ペプチドとシトルリン類の重量比が１：Ｎであって、Ｎが１００以上である、請求項１７に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
前記ペプチドが、Ｍ２ｅペプチド、Ｍ２ｅペプチドに１もしくは数個のシステインが付加もしくは挿入されたペプチド、またはＭ２ｅペプチドにシステインを含むペプチドが付加されたペプチドである、請求項１７に記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
前記ペプチドが、Ｍ２ｅペプチドにおいて、Ｎ末端から数えて２０番目と２１番目の間、２１番目と２２番目の間、および２２番目と２３番目の間にそれぞれシステイン残基を挿入した合成ペプチドである、請求項１９に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
前記Ｍ２ｅペプチドとシトルリン類の重量比が１：Ｎであって、Ｎが２００以上である、請求項１９または請求項２０に記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
前記ペプチドが、アミロイドβ（Ａβ）ペプチド、アミロイドβ（Ａβ）ペプチドの一部のアミノ酸配列からなるペプチド、または前記ペプチドに１もしくは数個のシステインが付加もしくは挿入されたペプチドである、請求項１７に記載のワクチン組成物。
【請求項２３】
前記ペプチドがアミロイドβ（Ａβ）ペプチドのＮ末端より２８個のアミノ酸からなるペプチドのＣ末端にシステイン残基を１個付加したペプチドである、請求項２２に記載のワクチン組成物。
【請求項２４】
前記アミロイドβペプチドとシトルリン類の重量比が１：Ｎであって、Ｎが１００以上である、請求項２２または請求項２３に記載のワクチン組成物。
【請求項２５】
前記抗原が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群より選ばれた少なくとも１種または２種以上のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項２６】
ワクチンにアジュバントとしてのシトルリン類を添加することからなる、該ワクチンに含まれる抗原に対する抗体産生能の増強したワクチンの製造方法。
【請求項２７】
前記シトルリン類が、Ｌ−シトルリン、Ｄ−シトルリン、Ｌ−チオシトルリン、Ｌ−ホモチオシトルリン、Ｓ−メチル−Ｌ−チオシトルリンおよびＳ−エチル−Ｌ−チオシトルリンからなる群より選択される１種または２種以上である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記シトルリン類が、Ｌ−シトルリンまたはＤ−シトルリンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記シトルリン類を１ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬで添加する、請求項２６から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記抗原とシトルリン類の重量比が１：Ｎであって、Ｎが１００以上である、請求項２６から２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記抗原が、インフルエンザウイルス抗原である、請求項２６から２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記インフルエンザウイルス抗原が、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックス１（Ｍ１）、マトリックス２（Ｍ２）および核タンパク（ＮＰ）からなる群より選ばれた少なくとも１種または２種以上の抗原である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記インフルエンザウイルス抗原が、ヘマグルチニン（ＨＡ）である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記インフルエンザウイルス抗原が、マトリックス２（Ｍ２）である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記インフルエンザウイルス抗原とシトルリン類の重量比が１：Ｎであって、Ｎが３００以上である、請求項３１から３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記抗原がペプチドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記ペプチドとシトルリン類の重量比が１：Ｎであって、Ｎが１００以上である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ペプチドが、Ｍ２ｅペプチド、Ｍ２ｅペプチドに１もしくは数個のシステインが付加もしくは挿入されたペプチド、またはＭ２ｅペプチドにシステインを含むペプチドが付加されたペプチドである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記ペプチドが、Ｍ２ｅペプチドにおいて、Ｎ末端から数えて２０番目と２１番目の間、２１番目と２２番目の間、および２２番目と２３番目の間にそれぞれシステイン残基を挿入した合成ペプチドである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記Ｍ２ｅペプチドとシトルリン類の重量比が１：Ｎであって、Ｎが２００以上である、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ペプチドが、アミロイドβ（Ａβ）ペプチド、アミロイドβ（Ａβ）ペプチドの一部のアミノ酸配列からなるペプチド、または前記ペプチドに１もしくは数個のシステインが付加もしくは挿入されたペプチドである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記ペプチドがアミロイドβ（Ａβ）ペプチドのＮ末端より２８個のアミノ酸からなるペプチドのＣ末端にシステイン残基を１個付加したペプチドである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記アミロイドβペプチドとシトルリン類の重量比が１：Ｎであって、Ｎが１００以上である、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗原が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群より選ばれた少なくとも１種または２種以上のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項４５】
シトルリン類とともに抗酸化物質をも添加する、請求項２６から４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記抗酸化物質が、アスコルビン酸である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記シトルリン類と抗酸化物質を重量比１：２〜２：１で添加する、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗酸化物質を１〜１０ｍｇ／ｍＬで添加する、請求項４５から４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
アジュバントとしてのシトルリン類の使用。
【請求項５０】
前記シトルリン類が、Ｌ−シトルリン、Ｄ−シトルリン、Ｌ−チオシトルリン、Ｌ−ホモチオシトルリン、Ｓ−メチル−Ｌ−チオシトルリンおよびＳ−エチル−Ｌ−チオシトルリンからなる群より選択される１種または２種以上である、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記シトルリン類が、Ｌ−シトルリンまたはＤ−シトルリンである、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
１ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの前記シトルリン類をワクチンに添加する、請求項４９から５１のいずれかに記載の使用。
【請求項５３】
抗酸化物質を併用する、請求項４９から５２のいずれかに記載の使用。
【請求項５４】
前記抗酸化物質が、アスコルビン酸である、請求項５３に記載の使用。
【請求項５５】
前記シトルリン類と抗酸化物質を重量比１：２〜２：１でワクチンに添加する、請求項５３または５４に記載の使用。
【請求項５６】
１〜１０ｍｇ／ｍＬの前記抗酸化物質をワクチンに添加する、請求項５３から５５のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シトルリン類を含有するアジュバント組成物、シトルリン類と抗酸化物質（例えばアスコルビン酸）を含有するアジュバント組成物、上記のアジュバント組成物と抗原を含有するワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンは抗原性物質とともに、アジュバント、希釈剤、保存剤、安定化剤および緩衝化剤を必要に応じて含みうる。特に、アジュバントは、抗原と共に投与され、投与した抗原に対する免疫応答を増強する物質であり、その作用は（１）抗原を吸着して抗原提示細胞への取り込みを高めたり、（２）抗原を局所に長時間とどめて、徐々に放出することにより抗原刺激を持続させたり、（３）直接免疫担当細胞を活性化するなどアジュバントの種類によって様々である。従って、アジュバントはワクチンの用量や投与回数、ワクチン中の抗原量を低減させる点で非常に有用である。そのため、これまでワクチンの作用を増強させるアジュバントに関する様々な研究がなされているが、実際に医療現場で使用されているものは極めて少ない。【０００３】
代表的なアジュバントとして、多くのワクチンに利用されているのが水酸化アルミニウム（以下、「Alumアジュバント」という）であるが、可溶性でないために抗原との均一な混合化が困難であり、経鼻または経皮投与用デバイスとの組合せが難しい等の利便性の観点から、理想的なアジュバントとは言い難い。Alumアジュバント以外では、スクアレンやＭＰＬ（monophosphoryl lipid）などを利用したものがあるが、アジュバント活性が強い反面、副反応も強く、水に溶けにくいという弱点を有している。そのため、医療現場では、人体へ高い免疫反応を惹起し、副作用が少なく、利便性の向上したアジュバントの開発が切望されている。【０００４】
一方、シトルリン（citrulline）は、アミノ酸の一種で尿素回路を構成する化合物のひとつであり、動物、特に哺乳類で広く存在する（化学式C6H13N3O3、別名２−アミノ−５−（カルバモイルアミノ）ペンタン酸、分子量１７５.２ｇ／ｍｏｌ）。シトルリンは１９３０年に日本でスイカから発見されており、スイカの学名Citrullus vulgaris（シトルラス・ブルガリス）から名づけられたものである。【０００５】
シトルリンは生体内のタンパク質を構成するアミノ酸ではないが、尿素回路の中間体の一つであり、アルギニンから血管拡張作用を有する物質として知られる一酸化窒素（ＮＯ）とともに生成され、さらにアスパラギン酸と縮合してアルギニンに再生される。シトルリンにはアンモニア代謝促進（非特許文献１）や血管拡張による血流改善（非特許文献２）、血圧低下（非特許文献３）、神経伝達（非特許文献４）、活性酸素消去（特許文献１）などの有用な作用が知られている。【０００６】
そのため、シトルリンは日本では２００７年よりサプリメントなどの食品素材として新たに使用が認められている。また、海外ではそれ以前から使用されており、米国では血流改善、動脈硬化予防、精力増強などを目的としたサプリメント、欧州ではシトルリン−リンゴ酸塩が疲労回復の医薬品として販売されている。【０００７】
このようにシトルリンは多様な作用が報告されているにも拘らず、シトルリンがアジュバント活性を有することは知られておらず、シトルリンと抗原を含有させたワクチンやシトルリンを含有するアジュバントの報告も未だなされていない。また、シトルリンと抗酸化物質を併用してアジュバントとする知見も報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−２２６３７０号公報
【特許文献２】特開昭５３−０７５３８７号公報
【特許文献３】特開昭６３−０６８０９１号公報
【特許文献４】国際公開２０１１０２４７４８号パンフレット
【特許文献５】国際公開２００８１３３２０８号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Cell Biochemistry and Function, "Effect of arginine, ornithine and citrulline supplementation upon performance and metabolism of trained rats", ２００３年、第２１巻、ｐ.８５−９１
【非特許文献２】European Journal of Pharmacology, "L-Citrulline mediated relaxation in the control and lipopolysaccharide-treated rat aortic rings", ２００１年、第４３１巻、ｐ.６１−６９
【非特許文献３】Journal of Clinical Investigation, "L-arginine abrogates salt-sensitive hypertension in Dahl/Rapp rats", １９９１年、第８８巻、ｐ.１５５９−１５６７
【非特許文献４】Gastroenterology, "L-citrulline recycling in opossum internal anal sphincter relaxation by nonadrenergic, noncholinergic nerve stimulation", １９９７年、第１１２巻、ｐ.１２５０−１２５９
【非特許文献５】The Journal of Biological Chemistry, "A SIMPLE SYNTHESIS OF dl-CITRULLINE", １９３８年、第１２２巻、ｐ.４７７−ｐ４８４
【非特許文献６】The Journal of Organic Chemistry, "THE SYNTHESIS OF d,l-CITRULLINE FROM NON-BIOLOGICAL PRECURSORS", １９４１年、第６巻、ｐ.４１０−４１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者等は、従来から汎用されているAlumアジュバントの欠点（不溶性に伴う利便性の悪さ等）、スクアレンなどの新しいアジュバントの欠点（副反応の強さ）を克服できるようなアジュバントを検討した。すなわち、本発明は、抗原の免疫原性を高め、人体への安全性に富み、利便性の向上したアジュバンドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
斯かる実情を鑑みて、本発明者等は、十分な抗体産生能を発揮し、安全性に優れ、利便性の向上したワクチンおよびアジュバントを鋭意検討した結果、シトルリンが優れたアジュバント効果を発揮するという従来の報告に無い極めて新しい知見を見出した。加えて、シトルリンは水溶性物質であるため、抗原との調剤が容易であり、哺乳動物の体内や各種食料品にも含まれるため、人体への安全性も優れている。そのため、本発明では、シトルリンを用いることで、抗体産生能、安全性、および利便性に優れる、ワクチンまたはアジュバントを提供することが可能になった。【００１２】
本願発明は、以下に示す通りである。
［１］シトルリン類を含有するアジュバント組成物。
［２］前記シトルリン類が、Ｌ−シトルリン、Ｄ−シトルリン、Ｌ−チオシトルリン、Ｌ−ホモチオシトルリン、Ｓ−メチル−Ｌ−チオシトルリンおよびＳ−エチル−Ｌ−チオシトルリンからなる群より選択される１種または２種以上である、［１］に記載のアジュバント組成物。
［３］前記シトルリン類が、Ｌ−シトルリンまたはＤ−シトルリンである、［２］に記載のアジュバント組成物。
［４］前記シトルリン類が１ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬで含まれる、［１］から［３］のいずれかに記載のアジュバント組成物。
［５］アジュバント組成物が、ペプチド抗原用のアジュバント組成物である、［１］から［４］のいずれかに記載のアジュバント組成物。
［６］抗酸化物質をさらに含む、［１］から［５］のいずれかに記載のアジュバント組成物。
［７］前記抗酸化物質が、アスコルビン酸である、［６］に記載のアジュバント組成物。
［８］前記シトルリン類と抗酸化物質の重量比が１：２〜２：１である、［６］または［７］に記載のアジュバント組成物。
［９］前記抗酸化物質が１〜１０ｍｇ／ｍＬで含まれる、［６］から［８］のいずれかに記載のアジュバント組成物。
［１０］［１］から［９］のいずれかに記載のシトルリン類を含有するアジュバント組成物と抗原を含有するワクチン組成物。
［１１］前記抗原とシトルリン類の重量比が１：Ｎであって、Ｎが１００以上である、［１０］に記載のワクチン組成物。
［１２］前記抗原が、インフルエンザウイルス抗原である、［１０］に記載のワクチン組成物。
［１３］前記インフルエンザウイルス抗原が、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックス１（Ｍ１）、マトリックス２（Ｍ２）、および核タンパク（ＮＰ）からなる群より選ばれた少なくとも１種または２種以上の抗原である、［１２］に記載のワクチン組成物。
［１４］前記インフルエンザウイルス抗原が、ヘマグルチニン（ＨＡ）である、［１３］に記載のワクチン組成物。
［１５］前記インフルエンザウイルス抗原が、マトリックス２（Ｍ２）である、［１３］に記載のワクチン組成物。
［１６］前記インフルエンザウイルス抗原とシトルリン類の重量比が１：Ｎであって、Ｎが３００以上である、［１２］から［１５］のいずれかに記載のワクチン組成物。
［１７］前記抗原がペプチドである、［１０］に記載のワクチン組成物。
［１８］前記ペプチドとシトルリン類の重量比が１：Ｎであって、Ｎが１００以上である、［１７］に記載のワクチン組成物。
［１９］前記ペプチドが、Ｍ２ｅペプチド、Ｍ２ｅペプチドに１もしくは数個のシステインが付加もしくは挿入されたペプチド、またはＭ２ｅペプチドにシステインを含むペプチドが付加されたペプチドである、［１７］に記載のワクチン組成物。
［２０］前記ペプチドが、Ｍ２ｅペプチドにおいて、Ｎ末端から数えて２０番目と２１番目の間、２１番目と２２番目の間、および２２番目と２３番目の間にそれぞれシステイン残基を挿入した合成ペプチドである、［１９］に記載のワクチン組成物。
［２１］前記Ｍ２ｅペプチドとシトルリン類の重量比が１：Ｎであって、Ｎが２００以上である、［１９］または［２０］に記載のワクチン組成物。
［２２］前記ペプチドが、アミロイドβ（Ａβ）ペプチド、アミロイドβ（Ａβ）ペプチドの一部のアミノ酸配列からなるペプチド、または前記ペプチドに１もしくは数個のシステインが付加もしくは挿入されたペプチドである、［１７］に記載のワクチン組成物。
［２３］前記ペプチドがアミロイドβ（Ａβ）ペプチドのＮ末端より２８個のアミノ酸からなるペプチドのＣ末端にシステイン残基を１個付加したペプチドである、［２２］に記載のワクチン組成物。
［２４］前記アミロイドβペプチドとシトルリン類の重量比が１：Ｎであって、Ｎが１００以上である、［２２］または［２３］に記載のワクチン組成物。
［２５］前記抗原が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群より選ばれた少なくとも１種または２種以上のアミノ酸配列からなるペプチドである、［１０］に記載のワクチン組成物。
［２６］ワクチンにアジュバントとしてのシトルリン類を添加することからなる、該ワクチンに含まれる抗原に対する抗体産生能の増強したワクチンの製造方法。
［２７］前記シトルリン類が、Ｌ−シトルリン、Ｄ−シトルリン、Ｌ−チオシトルリン、Ｌ−ホモチオシトルリン、Ｓ−メチル−Ｌ−チオシトルリンおよびＳ−エチル−Ｌ−チオシトルリンからなる群より選択される１種または２種以上である、［２６］に記載の方法。
［２８］前記シトルリン類が、Ｌ−シトルリンまたはＤ−シトルリンである、［２７］に記載の方法。
［２９］前記シトルリン類を１ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬで添加する、［２６］から［２８］のいずれかに記載の方法。
［３０］前記抗原とシトルリン類の重量比が１：Ｎであって、Ｎが１００以上である、［２６］から［２９］のいずれかに記載の方法。
［３１］前記抗原が、インフルエンザウイルス抗原である、［２６］から［２９］のいずれかに記載の方法。
［３２］前記インフルエンザウイルス抗原が、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックス１（Ｍ１）、マトリックス２（Ｍ２）および核タンパク（ＮＰ）からなる群より選ばれた少なくとも１種または２種以上の抗原である、［３１］に記載の方法。
［３３］前記インフルエンザウイルス抗原が、ヘマグルチニン（ＨＡ）である、［３２］に記載の方法。
［３４］前記インフルエンザウイルス抗原が、マトリックス２（Ｍ２）である、［３２］に記載の方法。
［３５］前記インフルエンザウイルス抗原とシトルリン類の重量比が１：Ｎであって、Ｎが３００以上である、［３１］から［３４］のいずれかに記載の方法。
［３６］前記抗原がペプチドである、［２６］に記載の方法。
［３７］前記ペプチドとシトルリン類の重量比が１：Ｎであって、Ｎが１００以上である、［３６］に記載の方法。
［３８］前記ペプチドが、Ｍ２ｅペプチド、Ｍ２ｅペプチドに１もしくは数個のシステインが付加もしくは挿入されたペプチド、またはＭ２ｅペプチドにシステインを含むペプチドが付加されたペプチドである、［３６］に記載の方法。
［３９］前記ペプチドが、Ｍ２ｅペプチドにおいて、Ｎ末端から数えて２０番目と２１番目の間、２１番目と２２番目の間、および２２番目と２３番目の間にそれぞれシステイン残基を挿入した合成ペプチドである、［３８］に記載の方法。
［４０］前記Ｍ２ｅペプチドとシトルリン類の重量比が１：Ｎであって、Ｎが２００以上である、［３８］または［３９］に記載の方法。
［４１］前記ペプチドが、アミロイドβ（Ａβ）ペプチド、アミロイドβ（Ａβ）ペプチドの一部のアミノ酸配列からなるペプチド、または前記ペプチドに１もしくは数個のシステインが付加もしくは挿入されたペプチドである、［３６］に記載の方法。
［４２］前記ペプチドがアミロイドβ（Ａβ）ペプチドのＮ末端より２８個のアミノ酸からなるペプチドのＣ末端にシステイン残基を１個付加したペプチドである、［４１］に記載の方法。
［４３］前記アミロイドβペプチドとシトルリン類の重量比が１：Ｎであって、Ｎが１００以上である、［４１］または［４２］に記載の方法。
［４４］前記抗原が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群より選ばれた少なくとも１種または２種以上のアミノ酸配列からなるペプチドである、［２６］に記載の方法。
［４５］シトルリン類とともに抗酸化物質をも添加する、［２６］から［４４］のいずれかに記載の方法。
［４６］前記抗酸化物質が、アスコルビン酸である、［４５］に記載の方法。
［４７］前記シトルリン類と抗酸化物質を重量比１：２〜２：１で添加する、［４５］または［４６］に記載の方法。
［４８］前記抗酸化物質を１〜１０ｍｇ／ｍＬで添加する、［４５］から［４７］のいずれかに記載の方法。
［４９］アジュバントとしてのシトルリン類の使用。
［５０］前記シトルリン類が、Ｌ−シトルリン、Ｄ−シトルリン、Ｌ−チオシトルリン、Ｌ−ホモチオシトルリン、Ｓ−メチル−Ｌ−チオシトルリンおよびＳ−エチル−Ｌ−チオシトルリンからなる群より選択される１種または２種以上である、［４９］に記載の使用。
［５１］前記シトルリン類が、Ｌ−シトルリンまたはＤ−シトルリンである、［５０］に記載の使用。
［５２］１ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの前記シトルリン類をワクチンに添加する、［４９］から［５１］のいずれかに記載の使用。
［５３］抗酸化物質を併用する、［４９］から［５２］のいずれかに記載の使用。
［５４］前記抗酸化物質が、アスコルビン酸である、［５３］に記載の使用。
［５５］前記シトルリン類と抗酸化物質を重量比１：２〜２：１でワクチンに添加する、［５３］または［５４］に記載の使用。
［５６］１〜１０ｍｇ／ｍＬの前記抗酸化物質をワクチンに添加する、［５３］から［５５］のいずれかに記載の使用。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、シトルリン類と抗原を共に投与することで、抗原単独で投与した場合と比較して、免疫原性を向上させることが可能となる。また、シトルリン類は既存のアジュバント（Alumアジュバント）と比較しても同程度の抗体産生効果を奏し、ペプチドを抗原とする場合にはAlumアジュバントと比較しても優れた抗体産生効果が見出された。さらに、シトルリン類と抗酸化物質（例えばアスコルビン酸）を併用してアジュバントとして使用することによって、シトルリン類を単独でアジュバントに使用する場合と比較して、抗体産生効果が向上することが見出された。【００１４】
また、シトルリンは生体内に元来存在する水溶性の物質であるため、従来のAlumアジュバントやオイル系アジュバントと比べて、抗原との調剤も容易であり、副作用発生のリスクが軽減される。そのため、本発明のシトルリン類を含有するアジュバント組成物やワクチン組成物は、従来のアジュバントやそれを含有するワクチンと比べて、利便性が向上し、人体への安全性に優れている。また、シトルリン類は、化学合成や微生物などによる量産化も可能であるため、医薬品の製造規模でワクチン用アジュバントとして提供することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】シトルリンを１〜５ｍｇ／ｂｏｄｙでマウスへ投与した際のＨＡ抗原に対する抗体価の測定結果である。
【図２】シトルリンを４ｍｇ／ｂｏｄｙでマウスへ投与した際のＭ２ｅに対する抗体価の測定結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の第一の態様はシトルリン類を含有するアジュバント組成物である。
【００１７】
本発明のアジュバント組成物に含まれるシトルリン類としては、シトルリン、シトルリンの誘導体、シトルリンの塩が含まれる。前記のシトルリンとしては、Ｌ−シトルリンおよびＤ−シトルリンが含まれ、好ましくはＬ−シトルリンである。前記のシトルリン誘導体としては、Ｌ−チオシトルリン（L-thiocitrulline）、Ｌ−ホモチオシトルリン（L-thiohomocitrulline）、Ｓ−メチル−Ｌ−チオシトルリン（S-methyl-L-thiocitrulline）、Ｓ−エチル−Ｌ−チオシトルリンが挙げられる。すなわち、本発明のシトルリン類にはＬ−シトルリン、Ｄ−シトルリン、Ｌ−チオシトルリン、Ｌ−ホモチオシトルリン、Ｓ−メチル−Ｌ−チオシトルリン、Ｓ−エチル−Ｌ−チオシトルリンが含まれる。
【００１８】
本発明のアジュバント組成物に含まれるシトルリン類はシトルリンの塩であってもよい。シトルリン類の塩としては、酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、乳酸塩、α−ケトグルタル酸塩、グルコン酸塩、カプリル酸塩等の有機酸塩が挙げられる。金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられる。アンモニウム塩としては、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられる。有機アミン付加塩としては、モルホリン、ピペリジン等の塩が挙げられる。アミノ酸付加塩としては、グリシン、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸等の塩が挙げられる。
【００１９】
シトルリン類は、化学的に合成する方法、発酵生産する方法等により取得することができる。シトルリン類を化学的に合成する方法としては、例えば、Gastroenterology, １９９７年、第１１２巻、ｐ.１２５０−１２５９（非特許文献４）やThe Journal of Biological Chemistry, １９３８年、第１２２巻、ｐ.４７７−ｐ４８４（非特許文献５）に記載の方法が挙げられる。また、Ｌ−シトルリンを発酵生産する方法としては、例えば、特開昭５３−０７５３８７号（特許文献２）や特開昭６３−０６８０９１号（特許文献３）に記載の方法が挙げられる。また、シトルリン類は市販品を購入することにより取得することができ、一例として、Ｌ−シトルリン（シグマ−アルドリッチ社：Code No.27510やC7629）、Ｌ−チオシトルリン（シグマ−アルドリッチ社：Code No.88544、和光純薬工業株式会社：Code No.205-13861）、Ｓ−メチル−Ｌ−チオシトルリン（和光純薬工業株式会社：Code No.139-12611）が挙げられる。
【００２０】
本発明のアジュバント組成物に含まれるシトルリン類の濃度は、抗原の種類、剤形、投与方法、対象患者などに応じて適宜変更してよいが、シトルリン類をＡｍｇ／ｍＬ〜Ｂｍｇ／ｍＬで含んでいてよい（ＡおよびＢは、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００からなる群より選択される異なる数値であって、ＡはＢよりも小さい数値である）。
【００２１】
本発明のアジュバント組成物を用いたシトルリン類の投与量は、抗原の種類、薬剤の剤形、投与方法などに応じて適宜変更してよい。
【００２２】
本発明のアジュバント組成物は、シトルリン類に加えて、抗酸化物質を含んでいてもよい。かかる抗酸化物質としては、例えば、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、α−トコフェロール（ビタミンＥ）、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、ブチルヒドロキシアニソール、カテキン、クエルセチン、尿酸、ビリルビン、グルコース、フラボノイド、セルロプラスミン、アルブミン、フェリチン、メタロチオネイン、スーパーオキシドディスムターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、カタラーゼ、チオレドキシンが挙げられる。アスコルビン酸およびα−トコフェロールが好ましい。
【００２３】
ワクチン組成物やアジュバント組成物にシトルリン類に加えて抗酸化物質を含む場合には、シトルリン類と抗酸化物質の重量比は１：２〜２：１、好ましくは１：１であってよい。また、本発明のアジュバント組成物に含まれる抗酸化物質は１〜１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５ｍｇ／ｍＬであってよい。
【００２４】
本発明の第二の態様は前記のシトルリン類を含有するアジュバント組成物と抗原とを含有するワクチン組成物である。
【００２５】
前記抗原としては、通常、ワクチンに含まれるものであればいかなるものであってもよく、例えば、炭水化物、糖脂質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、リン脂質、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはこれらの誘導体が挙げられる。本発明において、「ペプチド」とは２〜数十個のアミノ酸からなるものを指し、「ポリペプチド」とは数十個以上のアミノ酸からなるものを指す。上記抗原の中でもタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが好ましい。本発明のシトルリン類を含有するアジュバント組成物は、ペプチドを抗原として用いた場合に特に優れた抗体産生効果が認められるので、ペプチドを抗原として用いるのが特に好ましい。
【００２６】
前記抗原の入手方法は、遺伝子組換え、化学合成、または天然物から取得する方法のいずれであってもよい。
【００２７】
前記抗原は、病原体（ウイルス、細菌、真菌、寄生虫微生物）、ウイルス様粒子、ヴィロソーム、癌細胞、アレルゲン、または自己分子を由来とする抗原であってもよい。
【００２８】
前記の病原体を由来とする抗原は、サブユニット抗原、ペプチド抗原、不活性化した病原体、弱毒化した病原体、組換え体抗原であってもよい。
【００２９】
前記ウイルスとしては、例えば、肝炎ウイルス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、アブラウイルス、イサウイルス、イヌジステンパーウイルス、インフルエンザウイルスＡ−Ｃ、ウマ動脈炎ウイルス、エボラウイルス、エンテロウイルス、カリチウイルス、コロナウイルス、サル免疫不全ウイルス、ソゴトウイルス、デングウイルス、トガウイルス、トリ感染性滑液嚢疾患ウイルス、トリ肺炎ウイルス（以前はシチメンチョウ鼻気管炎ウイルス）、ニパーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニューモウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ノーウォークウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス、パラインフルエンザウイルスタイプ１−３、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、ブタ呼吸傷害・繁殖症候群ウイルス、フラビウイルス、ヘニパウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、ヘンドラウイルス、ポリオウイルス、マレック病ウイルス、メタニューモウイルス、モルビリウイルス、ライノウイルス、ルブラウイルス、レスピロウイルス、レトロウイルス、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、黄熱ウイルス、感染性鼻気管炎ウイルス、牛疫ウイルス、狂犬病ウイルス、水痘ウイルス、脳炎ウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルスが挙げられる。好ましくはインフルエンザウイルスである。
【００３０】
前記インフルエンザウイルスは、オルソミクソウイルス科に属する直径約１００ｎｍの粒子径サイズを有するＲＮＡエンベロープウイルスであり、内部タンパク質の抗原性に基づいて、Ａ、ＢおよびＣ型に分けられる。そのなかでヒトと動物の両方に感染するのがＡ型で多様性も多い。そのＡ型は、ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）の２種類のエンベロープ糖タンパク質を有し、抗原性の違いによってＨＡでは１６種類、ＮＡでは９種類が存在するために、その組み合わせにより多くの種類のＡ型インフルエンザウイルスが存在する。過去に発生していない組み合わせのインフルエンザウイルスが出現したときには、それに対する免疫がないために大流行となる。所謂、インフルエンザパンデミックである。
【００３１】
本発明で抗原とするインフルエンザウイルスは、型、亜型、株の種類は特に限定されない。インフルエンザウイルスを由来とする抗原としては、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＰが挙げられる。特に好ましいのはＨＡ、Ｍ２である。その理由は、現状のインフルエンザワクチン組成物で使用されている抗原がＨＡであるため、ＨＡを抗原として含有するワクチンは汎用性が高いためである。また、国際公開２０１１０２４７４８号（特許文献４）に開示されているように、インフルエンザウイルス間でアミノ酸配列に変異が少ないＭ２タンパク質は、広域なインフルエンザウイルスに対する免疫を付与する観点から抗原として有用である。Ｍ２タンパク質は疎水性膜貫通ドメインを除去した２３アミノ酸配列からなる領域に相当するペプチド（Ｍ２ｅ、配列番号１：Ｎ末−ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮＤＳＳＤ−Ｃ末）や、Ｍ２ｅペプチドの抗原性を高める目的で、１もしくは数個のシステインが付加もしくは挿入されたＭ２ｅペプチドまたはシステインを含むペプチドが付加されたＭ２ｅペプチドであってもよい。上記のシステインで修飾されたＭ２ｅペプチドとしては、国際公開２０１１０２４７４８号（特許文献４）に記載されたペプチドが挙げられ、具体的にはＮ末端から数えて２０番目と２１番目の間、２１番目と２２番目の間、および２２番目と２３番目の間にそれぞれシステイン残基を挿入した合成ペプチドＭ２ｅＣ２１２２２３（配列番号２：Ｎ末−ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮＣＤＣＳＣＳＤ−Ｃ末）が挙げられる。
【００３２】
前記インフルエンザウイルス抗原の調製方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法がいずれも使用できる。例えば、インフルエンザ感染動物またはインフルエンザ患者から単離されたウイルス株を鶏卵や細胞などに感染させて常法により培養し、精製したウイルス原液から抗原を調製してよい。また、遺伝子工学的に組換えウイルスあるいは特定の抗原を種々の細胞で産生あるいは発現させたものを材料として抗原を調製することも可能である。
【００３３】
前記の抗原に使用される自己分子としては、アミロイドβペプチド、またはアミロイドβペプチドの一部のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。アミロイドβペプチドまたは前記一部のアミノ酸配列からなるペプチドは、１もしくは数個のシステインが付加もしくは挿入されたペプチドまたはシステインを含むペプチドが付加されたペプチドであってよい。上記のペプチドとしては、国際公開２００８１３３２０８号（特許文献５）に開示されているペプチドが挙げられる。具体的には、アミロイドβペプチドは４２アミノ酸からなるアミロイドβペプチド（配列番号３：Ｎ末−ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ−Ｃ末）、アミロイドβペプチドの一部のアミノ酸配列からなるペプチドはＮ末端から数えて２８アミノ酸からなるペプチド（配列番号４：Ｎ末−ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫ−Ｃ末）、システインが付加されたペプチドはＮ末端から数えて２８アミノ酸からなるペプチドのＣ末端側にシステイン残基を１個付加したペプチド２８ＡＡＣｙｓ（配列番号５：Ｎ末−ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＣ−Ｃ末）であってよい。
【００３４】
前記細菌としては、例えば、アクチノバチラス・プルロニューモニエ、アロイオコックス・オティディティス、インフルエンザ菌（型分類可能および型分類不可能の双方）、エルシニア菌、オウム病クラミジア、キャンピロバクター、クラミジア肺炎病原体、クロストリジア種、コレラ菌、サルモネラ・コレレシウス、ジアルジア、ジフテリア菌、シュードモナス種、ストレプトコッカス・ゴルドニ、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトコッカス・ボビス、ストレプトコックス・アガラクチエ、トラコーマクラミジア、トリ結核菌群、ネズミチフス菌、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・マルトシダ、ヒト結核菌、ブタ連鎖球菌、プロテウス・ブルガリス、プロテウス・ミラビリス、ヘモフィルス・ソムヌス、ヘリコバクター・ピロリ、ボレリア・ブルグドルフェリ、マイコプラスマ・ガリセプチクム、モラクセラ・カタラリス、レプトスピラ・インテロガンス、黄色ブドウ球菌、化膿連鎖球菌、髄膜炎菌、赤痢菌、腺疫菌、大腸菌、炭疽菌、腸チフス菌、破傷風菌、肺炎連鎖球菌、百日咳菌、表皮ブドウ球菌、糞便連鎖球菌、緑色連鎖球菌、淋菌が挙げられる。
【００３５】
前記寄生虫としては、例えば、赤痢アメーバ、プラスモジウム属、森林型熱帯リーシュマニア、回虫属、鞭虫属、ジアルジア属、住吸血虫属、クリプトスポリジウム属、トリコモナス属、トキソプラスマ、ニューモシスティス・カリニが挙げられる。
【００３６】
本発明のワクチン組成物に含まれる抗原の濃度は、抗原の種類、ワクチン組成物の投与形態や剤形等に応じて適宜変更してよい。
【００３７】
本発明のワクチン組成物に含まれる抗原とシトルリン類の重量比は１：Ｎであって、好ましくはＮが１００以上、２００以上、３００以上、３３３以上、４００以上、８００以上、３０００以上、３３３３以上、６０００以上、６６６６以上、１００００以上、１３０００以上、１３３３３以上、１６００００以上、または１６６６６以上である。抗原とシトルリン類の重量比はまた、１：Ａ〜１：Ｂである（ＡおよびＢは１００、２００、３００、３３３、４００、８００、３０００、３３３３、６０００、６６６６、１００００、１３０００、１３３３３、１６０００、１６６６６から選択される異なる数値であって、ＡはＢよりも小さい数値である）。
【００３８】
抗原がＨＡタンパク質である場合、ワクチン組成物に含まれる抗原とシトルリン類の重量比は１：Ｎであって、好ましくはＮが３００以上、３３３以上、３０００以上、３３３３以上、６０００以上、６６６６以上、１００００以上、１３０００以上、１３３３３以上、１６００００以上、または１６６６６以上である。抗原とシトルリン類の重量比はまた、１：Ａ〜１：Ｂである（ＡおよびＢは３００、３３３、３０００、３３３３、６０００、６６６６、１００００、１３０００、１３３３３、１６０００、１６６６６から選択される異なる数値であって、ＡはＢよりも小さい数値である）。
【００３９】
抗原がペププチである場合、ワクチン組成物に含まれる抗原とシトルリン類の重量比は１：Ｎであって、好ましくはＮが１００以上、２００以上、４００以上、８００以上である。抗原とシトルリン類の重量比はまた、１：Ａ〜１：Ｂである（ＡおよびＢは１００、２００、４００、８００から選択される異なる数値であって、ＡはＢよりも小さい数値である）。
【００４０】
抗原がＭ２ｅペプチドである場合、ワクチン組成物に含まれる抗原とシトルリン類の重量比は１：Ｎであって、好ましくはＮが２００以上である。
【００４１】
抗原がアミロイドβペプチドである場合、ワクチン組成物に含まれる抗原とシトルリン類の重量比は１：Ｎであって、好ましくはＮが１００以上、２００以上、４００以上、８００以上である。抗原とシトルリン類の重量比はまた、１：Ａ〜１：Ｂである（ＡおよびＢは１００、２００、４００、８００から選択される異なる数値であって、ＡはＢよりも小さい数値である）。
【００４２】
また、本発明のワクチン組成物における抗原の投与量は、抗原の種類、ワクチン組成物の投与形態や剤形等に応じて適宜変更してよい。
【００４３】
本発明のワクチン組成物は、単一の抗原を含んでいてもよいし、または複数種の抗原の組み合わせを含んでいてもよい。複数種の抗原の組み合わせを含む場合、同一のウイルスや細菌等で異なる型の抗原を複数種含んでいてもよいし、異なるウイルスや細菌等の抗原を複数種含んでいてもよい。インフルエンザウイルスワクチン組成物の場合、インフルエンザウイルスＡ型とＢ型の異なる型の抗原を含んでいるのが好ましい。
【００４４】
前記ワクチン組成物の剤形は、シトルリン類と抗原が単一容器にて製剤化されたものであってもよいし、シトルリン類を含有するアジュバント組成物と抗原を含有する免疫原性組成物がそれぞれ個別の容器に製剤化されたものであってもよい。なお、製剤化される際の剤形は、例えば、液状、粉末状（凍結乾燥粉末、乾燥粉末）、カプセル状、錠剤、凍結状態等であってよい。
【００４５】
前記アジュバント組成物およびワクチン組成物の剤形は、例えば、液状、粉末状（凍結乾燥粉末、乾燥粉末）、カプセル状、錠剤、凍結状態等であってもよい。
【００４６】
前記アジュバント組成物およびワクチン組成物は、シトルリン類や抗原以外に、医薬として許容されうる担体を含んでいてもよい。前記医薬として許容されうる担体としては、ワクチンの製造に通常用いられる担体であればいずれも使用することができる。具体的には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液およびそれらの組み合わせが挙げられ、さらに、乳化剤、保存剤（例、チメロサール）、等張化剤、ｐＨ調整剤および不活化剤（例、ホルマリン）などを適宜配合してよい。
【００４７】
前記アジュバント組成物およびワクチン組成物の投与対象としては、免疫可能な任意の生物、特に、ヒトおよび他の哺乳動物（例えば、家畜、ペット、および野生動物）が挙げられる。
【００４８】
前記アジュバント組成物およびワクチン組成物の投与経路としては、例えば、経皮投与、舌下投与、点眼投与、皮内投与、筋肉内投与、経口投与、経腸投与、経鼻投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、口から肺への吸入投与等が挙げられる。
【００４９】
前記アジュバント組成物およびワクチン組成物の投与方法は、例えば、ステント、カテーテル、経皮的パッチ、マイクロニードル、移植可能な徐放性デバイス、シリンジ、マイクロニードルを付けたシリンジ、無針装置、スプレーによるものであってよい。また、抗原とアジュバント組成物が個別の容器にて製剤されている場合には、製剤された抗原とアジュバント組成物を同時に投与してもよいし、あるいは、抗原またはアジュバント組成物を投与して一定期間後にもう一方を投与してもよい。
【００５０】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００５１】
アジュバントとして使用したシトルリン溶液は以下のようにして調製した。Ｌ−シトルリン（シグマ、Ｃ７６２９−１Ｇ）を注射用蒸留水（大塚製薬株式会社製）に溶解し、終濃度８０ｍｇ／ｍＬとした。これを０.２２μｍで無菌ろ過し、使用時まで−２０℃に凍結保存した。【００５２】
（１）シトルリン含有組成物の調製
抗原として、インフルエンザウイルスＨＡ抗原を作成した（株：Ａ／ソロモン株、組成：１２００μｇ／ｍＬ ＨＡ）。ＨＡ抗原を様々なシトルリン濃度となるよう混合して、表１の組成物１〜４を作成した（なお、組成物１はシトルリンを含まない）。比較対照として、ＨＡ抗原とAlumアジュバント（Imject Alum（PIERCE社）またはALHYDROGEL（BRENNTAG社））の混合液を作成した（表１の比較対照）。【００５３】
【表１】
2012124631.tif 000003
【００５４】
（２）マウスへの免疫と血清回収
上記の組成物１〜４、または比較対照を下記の方法にてマウス１匹あたり１００μＬで投与した（マウス１匹あたりの投与量は表１に記載）。ＢＡＬＢ／ｃマウス６週齢の雌の体重を測定し、均等になるように１群３匹、４群に分けた。各個体はアニマルマーカーで個体識別した。被験物投与の当日、イソフルラン吸入麻酔下で眼窩静脈叢より、キャピラリーを用いて採血した。遠心分離後、血清をチューブに分取した。被験物はディスポーザブルの１ｍＬ用シリンジ（テルモ社製）に０.１ｍＬとり、マウスの頸背部皮下に投与した。被験物投与後１４日目にイソフルラン吸入麻酔下で開腹し、腹腔内後大静脈より全採血した。血液は室温で３０分以上静置したのち、遠心して（３０００ｒｐｍ、１０分間）血清を分離した。このようにして得られた血清中のＨＡ抗原に対する抗体を下記のＥＬＩＳＡ法にて測定した。
（３）ＥＬＩＳＡによる抗ＨＡ抗体価の測定
免疫した抗原と同じものを１μｇ／ｍＬ濃度で、ＥＬＩＳＡプレートへ５０μＬ／ｗｅｌｌ投入し、自然吸着により４℃で一晩静置して固相化した。ＰＢＳ（当日調製）にて３回洗浄後、BlockerTM Casein in PBS（Thermo社製）を２００μＬ／ｗｅｌｌで投入し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳにて３回洗浄後、抗血清（ｄａｙ０、１４）をBlockerTM Casein in PBSにて２００倍希釈し、５０μＬ／ｗｅｌｌで投入し室温で２時間反応させた。抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ標識抗体（Thermo社製）をBlockerTM Casein in PBSで２０００倍に希釈したものを５０μＬ／ｗｅｌｌ投入し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳにて４回洗浄後、基質ＴＭＢ（BioFX社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌ投入し、室温で１５分反応後、１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を５０μＬ／ｗｅｌｌ投入し反応を停止させた。４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（４）結果
ＥＬＩＳＡの結果を表１に示した。シトルリンと抗原を共に免疫した群において、特にシトルリンを１００μｇ／ｂｏｄｙ、１０００μｇ／ｂｏｄｙにて投与した群では、抗原だけを免疫した群と比較して明らかにシトルリンのアジュバント効果が認められ、１００μｇ／ｂｏｄｙ投与群では約１.３倍、１０００μｇ／ｂｏｄｙ投与群では約１.９倍の抗体産生効果が認められた。特に、シトルリンを１０００μｇ／ｂｏｄｙ投与した群では、Alumアジュバントと同等程度のアジュバント効果が認められた。また、シトルリン投与量の増加に応じて抗体の増加も認められた。
【実施例２】
【００５５】
実施例１の結果から、シトルリンにアジュバント効果が認められたので、その最適量を検討した。実施例１ではシトルリンの投与量を１０〜１０００μｇ／ｂｏｄｙと変化させた結果、１０００μｇ／ｂｏｄｙが最も高いアジュバント効果を示したので、さらにシトルリンの投与量を増やした場合の効果を調べた。
（１）シトルリン含有組成物の調製
実施例１の調製方法と同様の方法にて、シトルリンの濃度が異なる組成物５〜１０を作成した（表２；なお、組成物５はシトルリンを含まない）。【００５６】
【表２】
2012124631.tif 000004
【００５７】
（２）マウスへの免疫と血清回収
実施例１と同様の方法にて、マウス１匹あたりに組成物５〜１０を１００μＬ投与し、血清を回収した（マウス１匹当たりの投与量は表２に記載）。【００５８】
（３）ＥＬＩＳＡによる抗ＨＡ抗体価の測定
実施例１のＥＬＩＳＡと同様の方法で抗体価を測定した。
（４）結果
ＥＬＩＳＡの結果を図１に示した。全てのシトルリン投与群においてアジュバント効果が認められ、この範囲内ではある程度の用量依存性が認められた。
【実施例３】
【００５９】
（１）シトルリン含有組成物の調製
抗原として、Ａ型インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質のうちウイルス表面に提示される２３アミノ酸からなる領域（Ｍ２ｅ、配列番号１：Ｎ末−ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮＤＳＳＤ−Ｃ末）において、Ｎ末端から数えて２０番目と２１番目の間、２１番目と２２番目の間、および２２番目と２３番目の間にそれぞれシステイン残基を挿入した合成ペプチドＭ２ｅＣ２１２２２３（配列番号２：Ｎ末−ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮＣＤＣＳＣＳＤ−Ｃ末）を使用した。【００６０】
国際公開２０１１０２４７４８号（特許文献４）に記載されているように、Ｍ２ｅＣ２１２２２３ペプチドを合成した。合成した各ペプチドは１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する窒素ガス置換した注射用蒸留水にて５ｍｇ／ｍＬに調製し、これを原液として使用時まで−８０℃以下で保存した。被験物質としてシトルリンを含まない組成物１１、実施例１で調製したシトルリン溶液を混合した組成物１２を作成した（表３）。【００６１】
【表３】
2012124631.tif 000005
【００６２】
（２）マウスへの免疫と血清回収
マウスへの免疫は次のように行った。ＢＡＬＢ／ｃマウス７週齢の雌を１群５匹、２群に分けた。各個体はアニマルマーカーで個体識別した。被験物はディスポーザブルの１ｍＬ用シリンジ（テルモ社製）にとり、マウスの頸背部皮下に１匹あたり０.１ｍＬ投与した（マウス１匹当たりの投与量は表３に記載）。被験物を２週間間隔で２回投与し、２回目の投与から１週間後にソムノペンチル（共立製薬）麻酔下で開腹し、腹腔内後大静脈より全採血した。血清分離は実施例１と同様に行った。
（３）ＥＬＩＳＡによる抗Ｍ２ｅ抗体価の測定
血清中のＭ２ｅに対する抗体価を国際公開２０１１０２４７４８号（特許文献４）に記載した方法にて測定した。すなわち、Ｍ２ｅを０.１Ｍ Carbonate buffer，ｐＨ９.６で２μｇ／ｍＬに希釈し、９６−well plate（Nunc社、Immobilizer Amino）に１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、４℃で一夜静置して固相化した。翌日、各ｗｅｌｌを３００μＬの０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、０.１Ｍ Carbonate buffer，ｐＨ９.６で１０ｍＭに希釈したモノエタノールアミン（和光純薬）を３００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して、室温で１時間静置した。その後、１０ｍＭモノエタノールアミンを十分に除き、ＰＢＳＴで検体を希釈して１００μＬ／ｗｅｌｌにて添加した（各検体ともduplicate）。室温、１時間の反応の後、添加した各希釈血清を捨て、３００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄後、ｗｅｌｌ内の洗浄液を十分に除き、ＰＢＳＴで２０００倍希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体（American Qualax社、Ａ１３１ＰＳ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温、１時間反応した。反応後、標識抗体希釈液を捨て、３００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴで２回、同量の蒸留水で２回洗浄し、発色基質液ＴＭＢ＋（Dako社）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加して遮光下、室温で３０分間反応した。その後、１Ｎ硫酸を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加して発色を停止し、４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ４５０値）を測定した。
（４）結果
ＥＬＩＳＡの結果を図２に示した。シトルリンをアジュバントとして使用した場合は、シトルリンを含まない場合と比べて、約１４倍の抗体産生効果が認められた。これにより、シトルリンはインフルエンザウイルスＨＡ抗原だけでなく、合成ペプチドであるＭ２ｅＣ２１２２２３に対してもアジュバント効果を示すことが確認できた。
【実施例４】
【００６３】
（１）シトルリン含有組成物の調製
抗原として、４２アミノ酸残基からなるアミロイドβ（Ａβ）ペプチド（配列番号３：Ｎ末−ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ−Ｃ末）のうち、Ｎ末端より２８個のアミノ酸からなるペプチド（配列番号４：Ｎ末−ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫ−Ｃ末）のＣ末端にシステイン残基を１個付加した合成ペプチド２８ＡＡＣｙｓ（配列番号５：Ｎ末−ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＣ−Ｃ末）を使用した。【００６４】
上記の合成ペプチドを国際公開２００８１３３２０８号（特許文献５）に記載したようにして合成し（北海道システム・サイエンス社）、生理食塩液で５ｍｇ／ｍＬに調製しこれを原液とし、使用時まで−８０℃以下で保存した。投与時には１０μｇ／ｂｏｄｙになるように調製した。【００６５】
アジュバントとして使用したシトルリン溶液は以下のようにして調製した。Ｌ−シトルリン（シグマ、Ｃ７６２９−１Ｇ）を生理食塩液（大塚製薬株式会社製）に溶解し、終濃度５０ｍｇ／ｍＬとした。使用時まで−３０℃に凍結保存した。Ｌ−アスコルビン酸（和光製薬株式会社）も同様に生理食塩液（大塚製薬株式会社製）に溶解し、終濃度５０ｍｇ／ｍＬとし、使用時まで４℃に冷蔵保存した。また、対照としてAlum（ALHYDROGEL）を用いた。上記のシトルリン溶液、２８ＡＡＣｙｓ、アスコルビン酸溶液を混合して表４の比較対照１と２、および組成物１３〜１８を作製した。【００６６】
【表４】
2012124631.tif 000006
【００６７】
（２）マウスへの免疫と血清回収
マウスへの免疫は次のように行った。Ｃ５７ＢＬ／６マウス７週齢の雄を１群４匹、８群に分けた。各組成物をマウス１匹あたり２００μＬずつ１ｍＬツベルクリン用注射器（テルモ、ＳＳ−０１Ｔ２６１３Ｓ）を用い、腹部皮下内に投与した（マウス１匹当たりの投与量は表４に示した）。マウスへの免疫は２週間隔で２回の免疫を行った。２回目免疫から１４日目にペントバルビタールナトリウム（共立製薬、ソムノペンチル）麻酔下、腹部大静脈より採血して殺処分した。採取した血液はマイクロティナ（BECTON DICKINSON社）に移し、室温にて十分に凝固させた後、遠心分離した（５０００回転、１０分間）。分離した血清は各々０.５ｍＬチューブ２本に分注し、測定まで−８０℃にて保存した。血清中のＡβペプチドに対する抗体を下記のＥＬＩＳＡ法にて測定した。【００６８】
（３）ＥＬＩＳＡによる抗ＡβＩｇＧ抗体価の測定
Ａβペプチド（１−４０のアミノ酸配列：Ｎ末−ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号６）、北海道システム・サイエンス社合成）を０.１Ｍ Carbonate buffer，ｐＨ９.６で１０μｇ／ｍＬに希釈し、８well strips（Nalgen-Nunc社、Immobilizer Amino）に１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、４℃で一夜静置して固相化した。翌日、各ｗｅｌｌを３００μＬの０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、１０ｍＭ ethanolamineを３００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して、室温で１時間静置した。その後、１０ｍＭ ethanolamineを十分に除き、ＰＢＳＴで検体を５０倍〜１００００倍に希釈して１００μＬ／ｗｅｌｌにて添加した（各検体ともduplicate）。室温で１時間の反応の後、添加した各希釈血清を捨て、３００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄後、ｗｅｌｌ内の洗浄液を十分に除き、検体希釈液を用いて２０００倍希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体（American Qualax社、Ａ１３１ＰＳ）を１００μＬ／ｗｅｌｌにて添加し、室温で１時間反応した。反応後、標識抗体希釈液を捨て、３００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴで２回、同量の蒸留水で２回洗浄し、発色基質液ＴＭＢ＋（Ｄａｋｏ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加して遮光下、室温で３０分間反応した。その後、１Ｎ硫酸を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加して発色を停止し、４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ４５０値）を測定した。【００６９】
市販のＡβに対するモノクローナル抗体（CHEMICON社；MAB1560）を標準血清として用いた。標準血清をＰＢＳＴにて０.１５６、０.３１２５、０.６２５、１.２５、２.５、５、１０ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、抗体価測定時のスタンダードを調製した。各被検マウス血清の抗ＡβＩｇＧ抗体測定と同時に、各希釈検体をduplicateにてそれらのＯＤ４５０値を測定した。得られたスタンダードの単位とＯＤ４５０値の標準直線より各被検マウス血清の抗ＡβＩｇＧ抗体価を算出した。
（４）結果
算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Ａβ抗体価を表４に示した。シトルリンを添加した群（組成物１３〜１６、１８）では、アジュバント未投与群（比較対照１）と比べて、抗体産生効果が増強していた。すなわち、アジュバント未投与群と比べて、１ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群で約１１.６倍（組成物１３）、２ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群で約４２.２倍（組成物１４）、４ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群で約１２５.８倍（組成物１５）、８ｍｇ／ｂｏｄｙ投与群で約１４１.７倍（組成物１６）といった極めて顕著な抗体産生効果が認められた。【００７０】
また、Ｌ−アスコルビン酸単独を投与した群では殆ど抗体産生効果は認められなかったが（比較対照１と組成物１７の比較）、Ｌ−アスコルビン酸とシトルリンを併用して添加した群では、シトルリン単独投与群と比べて約４.０倍（組成物１３と１８の比較）、Ｌ−アスコルビン酸単独投与群と比べて約１２.１倍（組成物１７と１８の比較）、Alum投与群と比べて約３９.４倍（比較対照２と組成物１８）、シトルリン未投与群と比べて約４６.９倍（比較対照１と組成物１８）、抗体産生効果が増強していた。【００７１】
シトルリン投与群およびシトルリンとアスコルビン酸の併用投与群のいずれにおいても、Alum投与群よりも抗体産生効果が優れており（組成物１３で約９.８倍、組成物１４で約３５.５倍、組成物１５で約１０５.６倍、組成物１６で約１１９倍、組成物１８で約３９.４倍）、既存のAlumアジュバントと比べても極めて優れた抗体産生効果を示した。【００７２】
実施例１、２、３および４の結果から、抗原の種類を問わず、シトルリンには明らかなアジュバント効果が観察された。その効果は、シトルリンの濃度によっては、既存のAlumアジュバントと同等の効果を有しており、特にペプチド抗原では既存のAlumアジュバントよりも優れた抗体産生効果を示していた。さらに、シトルリンはアスコルビン酸と併用して使用することによって、アジュバント効果が向上することが見出された。【００７３】
加えて、シトルリンを投与されたマウスには異常は認められず、Alum使用群に認められる投与局所の硬結も認められなかったことから、安全性に優れている。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明ではシトルリン類を含有するアジュバント組成物、当該アジュバント組成物と抗原を含有するワクチン組成物を提供する。シトルリンは、生体にとっても有用であり、水溶性の物質であるため、従来のAlumアジュバントやオイル系アジュバントと比べて、安全性が高く、調剤面で利便性に優れたアジュバント組成物およびワクチン組成物を提供することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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