(57)【要約】  新規な遺伝子型１ｂのＨＣＶ由来の、自律複製能の優れたサブゲノムレプリコンＲＮＡ（核酸）並びに、自律複製能及び感染性ＨＣＶ粒子産生能の優れたフルゲノムレプリコンＲＮＡ（核酸）を提供する。特に、急性重症Ｃ型肝炎患者から分離した新規な遺伝子型１ｂのＨＣＶであるＮＣ１株のＨＣＶゲノム由来の、サブゲノムレプリコンＲＮＡ（核酸）及びフルゲノムレプリコンＲＮＡ（核酸）を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示される塩基配列を含む核酸（ただし、該核酸がＲＮＡの場合は、配列番号１に示される塩基配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）に読み替えるものとする）。
【請求項２】
請求項１記載の核酸の塩基配列に変異を有する核酸であり、配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列（配列表の配列番号１に示される塩基番号３４２〜９３７４の配列によってコードされるアミノ酸配列）を基準とした場合に、以下の(i)又は（ii）の置換を引き起こす変異を有する、核酸。
（i）  第２１９７番目のセリンのチロシンへの置換
（ii）  第２２０４番目のセリンのグリシンへの置換
【請求項３】
請求項２記載の核酸の塩基配列に変異を有する核酸であり、配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列（配列表の配列番号１に示される塩基番号３４２〜９３７４の配列によってコードされるアミノ酸配列）を基準とした場合に、以下の(iii）の置換を引き起こす変異を有する、核酸。
（iii）  第１２０２番目のグルタミン酸のグリシンへの置換
【請求項４】
請求項２又は３記載の核酸をウイルスゲノムとして含有する、Ｃ型肝炎ウイルス。
【請求項５】
２種以上のＣ型肝炎ウイルスゲノムに由来する、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をそれぞれコードする塩基配列を５’側から３’側に向かってこの順番で含む核酸であって、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするそれぞれの塩基配列は請求項２又は３に記載の核酸に由来する、核酸。
【請求項６】
ＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列の少なくとも一部が請求項２又は３に記載の核酸に由来する、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
前記Ｃｏｒｅタンパク質をコードする塩基配列の５’側に、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムの５’非翻訳領域を含み、
前記ＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列の３’側に、請求項２又は３に記載の核酸に由来する３’非翻訳領域を含む、請求項５又は６記載の核酸。
【請求項８】
前記２種以上のＣ型肝炎ウイルスゲノムは、ＪＦＨ−１株、Ｊ６ＣＦ株又はＴＨ株のゲノムを含む、請求項５〜７のいずれか一項記載の核酸。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか一項記載の核酸をウイルスゲノムとして含有する、Ｃ型肝炎ウイルス。
【請求項１０】
請求項２、３又は５〜８のいずれか一項記載の核酸を含む、Ｃ型肝炎ウイルスのフルゲノムレプリコンＲＮＡ。
【請求項１１】
請求項２、３又は５〜８のいずれか一項記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１２】
請求項２、３若しくは５〜８のいずれか一項記載の核酸又は請求項１０記載のフルゲノムレプリコンＲＮＡが導入されるか、あるいは、請求項４若しくは９記載のＣ型肝炎ウイルスに感染され、Ｃ型肝炎ウイルス粒子を産生する、細胞。
【請求項１３】
請求項４又は９記載のＣ型肝炎ウイルス又はその一部分を含有する、Ｃ型肝炎ウイルスワクチン。
【請求項１４】
請求項４又は９記載のＣ型肝炎ウイルスを抗原として認識する、Ｃ型肝炎ウイルスの中和抗体。
【請求項１５】
被験物質の存在下及び非存在下の双方で、請求項１２記載の細胞、又は、請求項４若しくは９記載のＣ型肝炎ウイルスとＣ型肝炎ウイルス感受性細胞との混合物、を培養する培養ステップと、
前記培養ステップで培養物中に得られたＣ型肝炎ウイルス由来のＲＮＡ又はＣ型肝炎ウイルス粒子の量を定量する定量ステップと、
前記定量ステップの結果、前記被験物質の存在下で培養した培養物中で検出されたＣ型肝炎ウイルス由来のＲＮＡ又はＣ型肝炎ウイルス粒子の量が、前記被験物質の非存在下で培養した培養物中で検出されたＣ型肝炎ウイルス由来のＲＮＡ又はＣ型肝炎ウイルス粒子の量より少ない場合に、前記被験物質は抗Ｃ型肝炎ウイルス活性を有すると評価する評価ステップと、
を備える、抗Ｃ型肝炎ウイルス物質をスクリーニングする方法。
【請求項１６】
配列表の配列番号１の、塩基番号１〜３４１の配列からなる５’非翻訳領域と、塩基番号３４２０〜５３１２の配列からなるＮＳ３タンパク質をコードする塩基配列と、塩基番号５３１３〜５４７４の配列からなるＮＳ４Ａタンパク質をコードする塩基配列と、塩基番号５４７５〜６２５７の配列からなるＮＳ４Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、塩基番号６２５８〜７５９８の配列からなるＮＳ５Ａタンパク質をコードする塩基配列と、塩基番号７５９９〜９３７４の配列からなるＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、塩基番号９３７５〜９６０７の配列からなる３’非翻訳領域と、
を含む、核酸。
【請求項１７】
請求項１６記載の核酸の塩基配列に変異を有する核酸であり、配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列（配列表の配列番号１に示される塩基番号３４２〜９３７４の配列によってコードされるアミノ酸配列）を基準とした場合に、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの置換を引き起こす変異を有する、核酸。
（ａ）  第２１９７番目のセリンのチロシンへの置換
（ｂ）  第２２０４番目のセリンのグリシンへの置換
（ｃ）  第２１９７番目のセリンのチロシンへの置換及び第１２０２番目のグルタミン酸のグリシンへの置換
（ｄ）  第２２０４番目のセリンのグリシンへの置換及び第１２０２番目のグルタミン酸のグリシンへの置換
（ｅ）  第２１６１番目のプロリンのアルギニンへの置換
【請求項１８】
請求項１６又は１７記載の核酸を含む、Ｃ型肝炎ウイルスのサブゲノムレプリコンＲＮＡ。
【請求項１９】
請求項１６又は１７記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２０】
被験物質の存在下及び非存在下の双方で、請求項１８記載のサブゲノムレプリコンＲＮＡが導入されたＣ型肝炎ウイルス感受性細胞を培養する培養ステップと、
前記培養ステップで培養物中に得られたサブゲノムレプリコンＲＮＡの量を定量する定量ステップと、
前記定量ステップの結果、前記被験物質の存在下で培養した培養物中で検出されたサブゲノムレプリコンＲＮＡの量が、前記被験物質の非存在下で培養した培養物中で検出されたサブゲノムレプリコンＲＮＡの量より少ない場合に、前記被験物質は抗Ｃ型肝炎ウイルス活性を有すると評価する評価ステップと、
を備える、抗Ｃ型肝炎ウイルス物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子型１ｂ由来のＣ型肝炎ウイルスゲノムを含む核酸構築物、及び該核酸構築物が導入されたＣ型肝炎ウイルスゲノム複製細胞、並びに感染性Ｃ型肝炎ウイルス粒子の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ；以下、ＨＣＶ）の基礎研究及び抗ＨＣＶ薬の開発研究では、ＨＣＶを効率よく増幅できる実験系が必要不可欠である。具体的には、培養細胞においてＨＣＶを増幅させる系や培養細胞においてＨＣＶの増殖を評価する系が必要であり、これらの系が構築できれば上記の研究は飛躍的に進歩すると考えられる。【０００３】
ＨＣＶは、フラビウイルス科に属する一本鎖の（＋）鎖センスＲＮＡをゲノムとするウイルスで、Ｃ型肝炎の原因になることが知られている。近年、ＨＣＶは遺伝子型又は血清型により多数の型に分類されることが明らかとなり、ＨＣＶ株の塩基配列を用いたＳｉｍｍｏｎｄｓらによる系統解析法によれば、ＨＣＶの遺伝子型は６タイプに分類され、さらにそれらはサブタイプに分類されることがわかってきた（非特許文献１）。現在では、ＨＣＶの複数の遺伝子型については、ゲノム全長の塩基配列についても決定されている（非特許文献２〜５）。【０００４】
近年までは、ＨＣＶを培養細胞に感染させたり、ＨＣＶゲノムを培養細胞中で複製させたりすることはできなかったため、ＨＣＶの複製機構や感染機構についての研究は、チンパンジーを実験動物として用いたｉｎ  ｖｉｖｏの実験をする必要があった。しかし、遺伝子型１ｂのＨＣＶであるＣｏｎ１株（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＪ２３８７９９）、ＨＣＶ−Ｎ株（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＦ１３９５９４）及びＨＣＶ−Ｏ株（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＢ１９１３３３）並びに遺伝子型１ａのＨＣＶであるＨ７７ｃ株（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＦ０１１７５１）からサブゲノムレプリコンＲＮＡが作製されたことにより、ＨＣＶの複製機構の研究については、培養細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験をすることが可能となった（特許文献１及び非特許文献６〜９）。ここで、ＨＣＶのサブゲノムレプリコンＲＮＡとは、ＨＣＶゲノムの一部を含むＲＮＡで、感染性ＨＣＶ粒子の産生能はないが、培養細胞に導入した場合にＨＣＶゲノム由来のＲＮＡを自律複製できるＲＮＡのことである。【０００５】
また、遺伝子型２ａのＨＣＶであるＪＦＨ−１株からは、サブゲノムレプリコンＲＮＡやｉｎ  ｖｉｔｒｏで感染性ＨＣＶ粒子を産生するフルゲノムレプリコンＲＮＡが作製され、ＨＣＶの感染機構の研究についても、培養細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験をすることが可能となった（非特許文献１０及び１１）。ここで、ＨＣＶのフルゲノムレプリコンＲＮＡとは、ＨＣＶゲノムの全長、すなわち、５’ＵＴＲ、構造遺伝子、非構造遺伝子及び３’ＵＴＲを含むＲＮＡで、培養細胞に導入した場合にＨＣＶゲノム由来のＲＮＡを自律複製できるＲＮＡのことである。【０００６】
Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎらは、遺伝子型１ｂのＣｏｎ１株及びその複製増強変異（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を持つ変異体のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを用いて、感染性ＨＣＶ粒子の産生に関する検討を行っている。しかしながら、ウイルスゲノムの複製レベルは極めて低く、遺伝子型１ｂのＨＣＶ粒子を検出するには、ＨＣＶのレプリコンＲＮＡの複製を増強するカゼインキナーゼＩ阻害剤を細胞培養系に添加するか、動物を用いたｉｎ  ｖｉｖｏの系で感染実験を実施する必要があるのが現状である（非特許文献１２）。このことは、培養細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏの系で感染性ＨＣＶ粒子を産生する能力を有するＲＮＡは、今のところ遺伝子型２ａのＪＦＨ−１株由来のＲＮＡだけであり、ＨＣＶワクチンの原料を得るためにｉｎ  ｖｉｔｒｏの系でＨＣＶ粒子を大量調製できるのは、ＪＦＨ−１株のＨＣＶ又はＪＦＨ−１株由来のフルゲノムレプリコンに限られることを意味している。【０００７】
一方、現在のＣ型肝炎に対する主な治療は、インターフェロン−αやインターフェロン−βの単独療法及びインターフェロン−αとプリン−ヌクレオシド誘導体であるリバビリンとの併用療法により行われている。しかしながら、これらの治療を行っても、全治療者の約６０％に治療効果が認められるだけであり、効果が出た患者であっても治療を中止すれば半分以上で再燃することがわかっている。また、インターフェロンの治療効果は、ＨＣＶの遺伝子型と関連し、遺伝子型１ｂに対しては効果が低く、遺伝子型２ａに対してはより効果が高いことが知られている（非特許文献１３）。インターフェロンの治療効果がＨＣＶの遺伝子型によって異なる原因については未だ明らかにされていないが、この原因の一つは、ＨＣＶの複製機構や複製効率に違いがあることによると考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−１７１８７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｉｍｍｏｎｄｓら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９９４年、第１０巻、ｐ．１３２１−１３２４
【非特許文献２】Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９年、第２４４巻、ｐ．３５９−３６２
【非特許文献３】Ｋａｔｏら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９２年、第６４巻、ｐ．３３４−３３９
【非特許文献４】Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．、１９９２年、第７３巻、ｐ．６７３−６７９
【非特許文献５】Ｙｏｓｈｉｏｋａら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９９２年、第１６巻、  ｐ．２９３−２９９
【非特許文献６】Ｌｏｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、第２８５巻、ｐ．１１０−１１３
【非特許文献７】Ｂｌｉｇｈｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年、第２９０巻、ｐ．１９７２−１９７４
【非特許文献８】Ｆｒｉｅｂｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００１年、第７５巻、ｐ．１２０４７−１２０５７
【非特許文献９】Ｉｋｅｄａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００２年、第７６巻、ｐ．２９９７−３００６
【非特許文献１０】Ｋａｔｏら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００３年、  第１２５巻、ｐ．１８０８−１８１７
【非特許文献１１】Ｗａｋｉｔａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００５年、  第１１巻、ｐ．７９１−７９６
【非特許文献１２】Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎら、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．、２００９年、第５巻：ｅ１０００４７５
【非特許文献１３】Ｍｏｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｉｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９２年、第１８３巻、ｐ．３３４−３４２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、ＨＣＶのサブゲノムレプリコンＲＮＡは、遺伝子型１ａ、１ｂ及び２ａのＨＣＶ株由来の数種類に限られ、感染性ＨＣＶ粒子を産生するフルゲノムレプリコンＲＮＡについては、遺伝子型２ａのＪＦＨ−１株のゲノム由来又はＪＦＨ−１株と異なる株由来の構造遺伝子とＪＦＨ−１株の非構造遺伝子とのキメラからなるゲノム由来のもののみであるため、ＨＣＶの遺伝子型と、ＨＣＶの複製機構又は複製効率との関係を解明することは困難であり、ＨＣＶワクチンの原料となる人為的に調製可能なＨＣＶ粒子の種類についても遺伝子型２ａに限定されるのが現状である。【００１１】
また、同じ遺伝子型のＨＣＶ由来のサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はフルゲノムレプリコンＲＮＡを用いた研究では、異なる遺伝子型間でＨＣＶの複製機構又は複製効率の差異を比較することができず、新たな抗ＨＣＶ薬のターゲットとなり得る複製に必要な因子の同定や、複製機構又は複製効率に非依存的に薬効を発揮し得る抗ＨＣＶ薬のスクリーニングを実施することは困難なため、インターフェロンによる治療効果が低い遺伝子型１ｂのＨＣＶに対する抗ＨＣＶ薬の開発の糸口が未だ見つかっていないのが現状である。【００１２】
すなわち、ＨＣＶの研究分野及び医療分野においては、ＨＣＶの遺伝子型に依存するインターフェロンの薬効メカニズムの研究やインターフェロンの治療効果の低い遺伝子型１ｂのＨＣＶに対する抗ＨＣＶ薬の開発のためには、複製効率の優れた遺伝子型１ｂのＨＣＶの株の取得及び感染性ＨＣＶ粒子を産生可能なフルゲノムレプリコンＲＮＡの作製が強く望まれていると考えられる。【００１３】
そこで本発明は、新規な遺伝子型１ｂのＨＣＶ由来の、自律複製能の優れたサブゲノムレプリコンＲＮＡ並びに、自律複製能及び感染性ＨＣＶ粒子産生能の優れたフルゲノムレプリコンＲＮＡを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、急性重症Ｃ型肝炎患者から分離した新規な遺伝子型１ｂのＨＣＶであるＮＣ１株のＨＣＶゲノムから作製したＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを培養細胞に導入し、自律複製されたＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡに生じた変異について鋭意研究した結果、自律複製能が顕著に高まる変異を明らかにした。次に、この変異を導入したＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを作製し、該ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを培養細胞に導入することにより、ＨＣＶ粒子産生能のある変異を明らかにした。さらに、自律複製能を顕著に高める当該変異の組み合わせを見出し、培養細胞において感染性ＨＣＶ粒子を高産生する遺伝子型１ｂのＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（遺伝子型１ｂ由来感染性ＨＣＶ粒子産生フルゲノムレプリコンＲＮＡ）を作製することに成功し、本発明を完成させるに至った。【００１５】
すなわち、本発明は、
[１]  配列表の配列番号１に示される塩基配列を含む核酸（ただし、該核酸がＲＮＡの場合は、配列番号１に示される塩基配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）に読み替えるものとする）。【００１６】
[２]  上記[１]の核酸の塩基配列に変異を有する核酸であり、配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列（配列表の配列番号１に示される塩基番号３４２〜９３７４の配列によってコードされるアミノ酸配列）を基準とした場合に、以下の(i)又は（ii）の置換を引き起こす変異を有する、核酸。【００１７】
（i）  第２１９７番目のセリンのチロシンへの置換
（ii）  第２２０４番目のセリンのグリシンへの置換
[３]  上記[２]の核酸の塩基配列に変異を有する核酸であり、配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列（配列表の配列番号１に示される塩基番号３４２〜９３７４の配列によってコードされるアミノ酸配列）を基準とした場合に、以下の(iii）の置換を引き起こす変異を有する、核酸。【００１８】
（iii）  第１２０２番目のグルタミン酸のグリシンへの置換
[４]  上記[２]又は[３]の核酸をウイルスゲノムとして含有する、Ｃ型肝炎ウイルス。【００１９】
[５]  ２種以上のＣ型肝炎ウイルスゲノムに由来する、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をそれぞれコードする塩基配列を５’側から３’側に向かってこの順番で含む核酸であって、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするそれぞれの塩基配列は請求項２又は３に記載の核酸に由来する、核酸。【００２０】
[６]  ＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列の少なくとも一部が上記［２］又は［３］の核酸に由来する、上記[５]の核酸。【００２１】
[７]  上記Ｃｏｒｅタンパク質をコードする塩基配列の５’側に、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムの５’非翻訳領域を含み、
上記ＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列の３’側に、上記［２］又は［３］の核酸に由来する３’非翻訳領域を含む、上記[５]又は［６］の核酸。【００２２】
[８]  上記２種以上のＣ型肝炎ウイルスゲノムは、ＪＦＨ−１株、Ｊ６ＣＦ株又はＴＨ株のゲノムを含む、上記[５]〜[７]のいずれかの核酸。【００２３】
なお、一実施形態では、上記[５]の核酸は、Ｃ型肝炎ウイルスの既存株のＣｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質及びｐ７タンパク質と、
上記[４]のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ２タンパク質、Ｃ型肝炎ウイルスの既存株のＮＳ２タンパク質、又は、上記[４]のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ２タンパク質の一部とＣ型肝炎ウイルスの既存株のＮＳ２タンパク質の一部とが連結されたキメラ型のＮＳ２タンパク質と、
上記[４]のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質と、
をコードするそれぞれの塩基配列が、
５’側から３’側に向かって、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質、をコードする塩基配列の順に配置されたキメラ型のＣ型肝炎ウイルスゲノムを含む、核酸であってよい。【００２４】
この核酸は、上記Ｃｏｒｅタンパク質をコードする塩基配列の５’側に、Ｃ型肝炎ウイルスの既存株のウイルスゲノムの５’非翻訳領域を含み、
上記ＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列の３’側に、上記[４]のＣ型肝炎ウイルスのウイルスゲノムの３’非翻訳領域を含むことも好ましい。そのような核酸について、上記Ｃ型肝炎ウイルスの既存株は、好ましくは、ＪＦＨ−１株、Ｊ６ＣＦ株又はＴＨ株である。【００２５】
[９]  上記[５]〜[８]のいずれかの核酸をウイルスゲノムとして含有する、Ｃ型肝炎ウイルス。【００２６】
なお、上記[１]〜[３]のいずれか又は上記[５]〜[８]のいずれの核酸を含む、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムも好ましい。【００２７】
[１０]  上記[２]、[３]又は上記[５]〜[８]のいずれかの核酸を含む、Ｃ型肝炎ウイルスのフルゲノムレプリコンＲＮＡ。【００２８】
[１１]  上記[２]、[３]又は上記[５]〜[８]のいずれかの核酸を含む、発現ベクター。【００２９】
[１２]  上記[２]、[３]若しくは上記[５]〜[８]のいずれか一項記載の核酸又は上記[１０]のフルゲノムレプリコンＲＮＡが導入されるか、あるいは、上記[４]若しくは[９]のＣ型肝炎ウイルスに感染され、Ｃ型肝炎ウイルス粒子を産生する、細胞。【００３０】
[１３]  上記[４]又は[９]のＣ型肝炎ウイルス又はその一部分を含有する、Ｃ型肝炎ウイルスワクチン。【００３１】
[１４]  上記[４]又は[９]のＣ型肝炎ウイルスを抗原として認識する、Ｃ型肝炎ウイルスの中和抗体。【００３２】
[１５]  被験物質の存在下及び非存在下の双方で、上記[１２]の細胞、又は、上記[４]若しくは[９]のＣ型肝炎ウイルスとＣ型肝炎ウイルス感受性細胞との混合物、を培養する培養ステップと、
上記培養ステップで培養物中に得られたＣ型肝炎ウイルス由来のＲＮＡ又はＣ型肝炎ウイルス粒子の量を定量する定量ステップと、
上記定量ステップの結果、上記被験物質の存在下で培養した培養物中で検出されたＣ型肝炎ウイルス由来のＲＮＡ又はＣ型肝炎ウイルス粒子の量が、上記被験物質の非存在下で培養した培養物中で検出されたＣ型肝炎ウイルス由来のＲＮＡ又はＣ型肝炎ウイルス粒子の量より少ない場合に、上記被験物質は抗Ｃ型肝炎ウイルス活性を有すると評価する評価ステップと、
を備える、抗Ｃ型肝炎ウイルス物質をスクリーニングする方法。【００３３】
[１６]  配列表の配列番号１の、塩基番号１〜３４１の配列からなる５’非翻訳領域と、塩基番号３４２０〜５３１２の配列からなるＮＳ３タンパク質をコードする塩基配列と、塩基番号５３１３〜５４７４の配列からなるＮＳ４Ａタンパク質をコードする塩基配列と、塩基番号５４７５〜６２５７の配列からなるＮＳ４Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、塩基番号６２５８〜７５９８の配列からなるＮＳ５Ａタンパク質をコードする塩基配列と、塩基番号７５９９〜９３７４の配列からなるＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、塩基番号９３７５〜９６０７の配列からなる３’非翻訳領域と、
を含む、核酸。【００３４】
[１７]  上記[１６]の核酸の塩基配列に変異を有する核酸であり、配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列（配列表の配列番号１に示される塩基番号３４２〜９３７４の配列によってコードされるアミノ酸配列）を基準とした場合に、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの置換を引き起こす変異を有する、核酸。【００３５】
（ａ）  第２１９７番目のセリンのチロシンへの置換
（ｂ）  第２２０４番目のセリンのグリシンへの置換
（ｃ）  第２１９７番目のセリンのチロシンへの置換及び第１２０２番目のグルタミン酸のグリシンへの置換
（ｄ）  第２２０４番目のセリンのグリシンへの置換及び第１２０２番目のグルタミン酸のグリシンへの置換
（ｅ）  第２１６１番目のプロリンのアルギニンへの置換
[１８]  上記[１６]又は[１７]の核酸を含む、Ｃ型肝炎ウイルスのサブゲノムレプリコンＲＮＡ。【００３６】
[１９]  上記[１６]又は[１７]の核酸を含む、発現ベクター。【００３７】
[２０]  被験物質の存在下及び非存在下の双方で、上記[１８]のサブゲノムレプリコンＲＮＡが導入されたＣ型肝炎ウイルス感受性細胞を培養する培養ステップと、
上記培養ステップで培養物中に得られたサブゲノムレプリコンＲＮＡの量を定量する定量ステップと、
上記定量ステップの結果、上記被験物質の存在下で培養した培養物中で検出されたサブゲノムレプリコンＲＮＡの量が、上記被験物質の非存在下で培養した培養物中で検出されたサブゲノムレプリコンＲＮＡの量より少ない場合に、上記被験物質は抗Ｃ型肝炎ウイルス活性を有すると評価する評価ステップと、
を備える、抗Ｃ型肝炎ウイルス物質をスクリーニングする方法。【００３８】
[２１]  上記Ｃ型肝炎ウイルスは、不活化又は弱毒化されている、上記[１３]のＣ型肝炎ウイルスワクチン。【００３９】
[２２]  上記[４]又は[９]のＣ型肝炎ウイルスが感染した、Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞。【００４０】
[２３]  配列番号１９に示される、第２１９７位のセリンのチロシンへの置換を引き起こす変異を有する塩基配列からなる核酸、又は配列番号２０に示される、第２２０４位のセリンのグリシンへの置換を引き起こす変異を有する塩基配列からなる核酸である、上記[２]の核酸。【００４１】
[２４]  配列番号２１に示される、第２１９７位のセリンのチロシンへの置換を引き起こす変異及び第１２０２位のグルタミン酸のグリシンへの置換を引き起こす変異を有する塩基配列からなる核酸、又は配列番号２２に示される、第２２０４位のセリンのグリシンへの置換を引き起こす変異及び第１２０２位のグルタミン酸のグリシンへの置換を引き起こす変異を有する塩基配列からなる核酸である、上記[３]の核酸。【００４２】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2011-080678号の明細書および図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００４３】
本発明によれば、培養細胞において増幅が可能な遺伝子型１ｂのＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ及び感染性ＨＣＶ粒子を産生するＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを提供でき、遺伝子型１ｂのＨＣＶの感染及び複製を阻害する抗ＨＣＶ薬のスクリーニングや、ＨＣＶの複製機構を解明するための研究、さらにはＨＣＶ粒子を用いたＨＣＶワクチンの開発に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ＨＣＶ  ＮＣ１株（野生型）の全長ゲノム（Ａ）、ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを合成するための発現ベクターｐＮＣ１の構造（Ｂ）、ＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを合成するための発現ベクターｐＳＧＲ−ＮＣ１の構造（Ｃ）及びｐＳＧＲ−ＮＣ１からＴ７ポリメラーゼで合成されたＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの構造（Ｄ）を示す図である。
【図２】野生型ＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを導入した細胞のコロニー形成の結果を示す。
【図３】野生型ＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコン複製細胞より同定したアミノ酸置換（変異）の位置を、ｐＳＧＲ−ＮＣ１上に示した図である。
【図４】変異体ＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを合成するための発現ベクターの構造を示す図である。
【図５】野生型ＮＣ１株及びその変異体のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを導入した細胞のコロニー形成の結果を示す。
【図６】変異体ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを合成するための発現ベクターの構造を示す図である。
【図７】野生型ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ及びその変異体（Ｐ２１６１Ｒ、Ｒ２１９２Ｌ、Ｒ２１９２Ｑ、Ｓ２１９７Ｙ、Ｓ２２０４Ｇ、Ｙ２８７１Ｃ変異）を導入したＨｕｈ７細胞の培養上清中のＣｏｒｅタンパク質量の経時的変化（ＨＣＶ粒子産生能）を示す図である。
【図８】変異体ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの発現ベクターであるｐＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ、ｐＮＣ１  Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２１９７Ｙ及びｐＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２１９７Ｙの構造を示す図である。
【図９】変異体ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの発現ベクターであるｐＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇ、ｐＮＣ１  Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２２０４Ｇ及びｐＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２２０４Ｇの構造を示す図である。
【図１０】野生型ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ及びその変異体（Ｅ１２０２Ｇ、Ｋ２０４０Ｒ、Ｓ２１９７Ｙ及びＳ２２０４Ｇ変異並びにその組み合わせ変異）を導入したＨｕｈ７細胞内のＣｏｒｅタンパク質量の経時的変化（ＨＣＶ複製能）を示す図である。
【図１１】野生型ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ及びその変異体（Ｅ１２０２Ｇ、Ｋ２０４０Ｒ、Ｓ２１９７Ｙ及びＳ２２０４Ｇ変異並びにその組み合わせ変異）を導入したＨｕｈ７細胞の培養上清中のＣｏｒｅタンパク質量の経時的変化（ＨＣＶ粒子産生能）を示す図である。
【図１２】ＮＣ１株変異体（適応変異が導入されたＮＣ１株）、Ｊ６ＣＦ株、ＪＦＨ−１株及びＴＨ株のＨＣＶのＨＣＶゲノムの構造、並びにＮＣ１株変異体（適応変異が導入されたＮＣ１株）の非構造遺伝子とＪ６ＣＦ株、ＪＦＨ−１株又はＴＨ株の構造遺伝子とを含む、キメラ型のＨＣＶゲノムの構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本明細書で使用される科学用語、技術用語及び命名法は、特に定義されない限り、当業者により普通に理解されるものと同じ意味を有する。また、分子生物学及び免疫学の分野における一般的技術及び学術用語については、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１年）及びＥｄ  ＨａｒｌｏｗらのＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８年）に記載された手法及び定義に基づくものである。さらに、本明細書中に引用されている全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が本明細書に参考として援用されるものである。
【００４６】
（１）本発明に係る核酸及びＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）レプリコンＲＮＡ
「核酸」には、ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれるものとする。また、本明細書における「タンパク質コード領域」、「タンパク質をコードする塩基配列」、「タンパク質をコードする配列」及び「タンパク質コード配列」とは、所定のタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列のことをいい、開始コドン及び終止コドンは含んでいても含まなくてもよいものとする。
【００４７】
本明細書において、核酸がＲＮＡである場合に配列表の配列番号を引用してＲＮＡの塩基配列又は塩基を特定するときは、その配列番号に示される塩基配列中のチミン（ｔ）はウラシル（ｕ）に読み替えるものとする。
【００４８】
ＨＣＶは、一本鎖の（＋）鎖センスＲＮＡをゲノムとするウイルスで、そのゲノムは５’非翻訳領域（以下、５’ＵＴＲ）、構造遺伝子、非構造遺伝子及び３’非翻訳領域（以下、３’ＵＴＲ）からなる。ＨＣＶは、その実態としては、ウイルス粒子として存在する。ＨＣＶのウイルス粒子（ＨＣＶ粒子）は、ＨＣＶ粒子を形成する「構造タンパク質」の内部にＨＣＶゲノムを含有している。
【００４９】
ＨＣＶの「構造遺伝子」とは、ＨＣＶ粒子を構成する特定構造機能を有する構造タンパク質をコードする核酸である。「構造タンパク質」とは、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質及びｐ７タンパク質のことをいう。
【００５０】
ＨＣＶの「非構造遺伝子」とは、ＨＣＶゲノムの複製、ＨＣＶタンパク質のプロセッシング等に関与する機能を有する非構造タンパク質をコードする核酸である。「非構造タンパク質」とは、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質のことをいう。
【００５１】
ＨＣＶの５’ＵＴＲは、タンパク質翻訳のための内部リボソーム進入部位（以下、ＩＲＥＳ）及び複製に必要なエレメントを提供する。ＨＣＶの５’ＵＴＲは、ゲノムの５’末端から約３４０ヌクレオチドの領域である。
【００５２】
ＨＣＶの３’ＵＴＲは、ＨＣＶの複製を補助する。ＨＣＶの３’ＵＴＲは、ポリＵ領域及び約１００ヌクレオチドの追加領域を含む。
【００５３】
「レプリコンＲＮＡ」とは、ＨＣＶ感受性細胞内で自律複製されるＲＮＡのことをいう。レプリコンＲＮＡは、細胞に導入された場合にＲＮＡが自律的に複製し、複製されたＲＮＡのコピーが細胞分裂後に娘細胞に分離する場合にＲＮＡで安定に存在し得る。ＨＣＶのレプリコンＲＮＡ（ＨＣＶレプリコンＲＮＡ）とは、ＨＣＶゲノムＲＮＡの一部又は全長を含む、自律複製されるＲＮＡのことをいい、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ及びＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを含む。
【００５４】
「ＨＣＶ全長ゲノム」とは、５’側から３’側に順番に、ＨＣＶの５’ＵＴＲ、構造遺伝子、非構造遺伝子及び３’ＵＴＲの全長ゲノムの配列からなるＲＮＡである。「ＨＣＶのサブゲノム」とは、ＨＣＶ全長ゲノムの一部を含むＲＮＡである。特に、「ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ」とは、ＨＣＶの５’ＵＴＲ、非構造遺伝子の一部及び３’ＵＴＲを含むＲＮＡであり、感染性ＨＣＶ粒子の産生能はないが、細胞に導入した場合にＨＣＶゲノム由来のＲＮＡを自律複製できるＲＮＡのことである。
【００５５】
ＨＣＶ全長ゲノムが自律複製能を持てば、該ゲノムはレプリコンＲＮＡである。サブゲノムレプリコンＲＮＡと区別するために、ＨＣＶ全長ゲノムを含むレプリコンＲＮＡを、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡと呼ぶ。したがって、ＨＣＶ全長ゲノム配列からなるＲＮＡ（ＨＣＶ全長ゲノムＲＮＡ）が自律複製能を持てば、それはＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡである。すなわち、「ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ」とは、ＨＣＶの５’ＵＴＲ、構造遺伝子、非構造遺伝子及び３’ＵＴＲを含むＲＮＡであり、好ましくは、ＨＣＶの５’ＵＴＲと、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列と、３’ＵＴＲを含むＲＮＡである。ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、さらに好ましくは、５’側から３’側に順番に、ＨＣＶの５’ＵＴＲと、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列と、３’ＵＴＲを含むＲＮＡである。
【００５６】
ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、さらに、薬剤耐性遺伝子又は／及びレポーター遺伝子などの外来遺伝子、ＩＲＥＳ配列を含んでも良い。外来遺伝子及びＩＲＥＳ配列を含む場合、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、好ましくは、５’側から３’側に順番に、ＨＣＶの５’ＵＴＲと、外来遺伝子と、ＩＲＥＳ配列と、ＨＣＶのＣｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列と、ＨＣＶの３’ＵＴＲを含むＲＮＡである。
【００５７】
ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡは、好ましくは、ＨＣＶの５’ＵＴＲと、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列と、３’ＵＴＲを含むＲＮＡである。ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡは、さらに好ましくは、５’側から３’側に順番に、ＨＣＶの５’ＵＴＲと、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列と、３’ＵＴＲを含むＲＮＡである。
【００５８】
また、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡは、さらに薬剤耐性遺伝子又は／及びレポーター遺伝子などの外来遺伝子、ＩＲＥＳ配列を含んでも良い。特に、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを、抗ＨＣＶ物質のスクリーニングに使用する場合は、レプリコンＲＮＡを容易に検出するために薬剤耐性遺伝子又は／及びレポーター遺伝子及びＩＲＥＳ配列を含むことが好ましい。外来遺伝子及びＩＲＥＳ配列を含む場合、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡは、好ましくは、５’側から３’側に順番に、ＨＣＶの５’ＵＴＲと、外来遺伝子と、ＩＲＥＳ配列と、ＨＣＶのＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列と、ＨＣＶの３’ＵＴＲを含むＲＮＡである。
【００５９】
ＨＣＶレプリコンＲＮＡ（ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ及びＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ）が含み得る薬剤耐性遺伝子の例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ピリチアミン耐性遺伝子、アデニリルトランスフェラーゼ遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子などが挙げられるが、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子が好ましく、ネオマイシン耐性遺伝子がさらに好ましい。
【００６０】
ＨＣＶレプリコンＲＮＡが含み得るレポーター遺伝子の例としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が挙げられる。好ましいレポーター遺伝子の例としては、トランスポゾンＴｎ９由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、大腸菌由来のβグルクロニダーゼ又はβガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、クラゲ由来のエクオリン遺伝子、分泌型胎盤アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子等が挙げられる。
【００６１】
薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子は、ＨＣＶレプリコンＲＮＡ中にどちらか一方のみが含まれていてもよいし、両方が含まれていてもよい。薬剤耐性遺伝子又はリポーター遺伝子は、ＨＣＶレプリコンＲＮＡに１つ含まれていてもよいし、２つ以上含まれていてもよい。
【００６２】
ＨＣＶレプリコンＲＮＡが含み得るＩＲＥＳ配列とは、ＲＮＡの内部にリボソームを結合させて翻訳を開始させることが可能な内部リボゾーム結合部位を意味する。ＩＲＥＳ配列の好ましい例としては、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）、ＦＭＤＶ ＩＲＥＳ、ＨＣＶ ＩＲＥＳ等が挙げられるが、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ及びＨＣＶ ＩＲＥＳがより好ましく、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳが最も好ましい。
【００６３】
ＨＣＶレプリコンＲＮＡにおいては、薬剤耐性遺伝子及び／又はレポーター遺伝子が、ＨＣＶレプリコンＲＮＡから正しい読み枠（インフレーム）で翻訳されるように連結される。ＨＣＶレプリコンＲＮＡにコードされるタンパク質は、一続きのポリペプチドとして翻訳され発現された後でプロテアーゼによって各タンパク質へと切断され、遊離するように、プロテアーゼ切断部位等を介して互いに連結させることが好ましい。
【００６４】
ＨＣＶ感受性細胞とは、細胞培養系でＨＣＶ粒子の感染やＨＣＶレプリコンＲＮＡの複製を許容する細胞を指し、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞や、Ｈｕｈ７細胞の派生株であるＨｕｈ７．５細胞、Ｈｕｈ７．５．１細胞が挙げられる。また、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞又は２９３細胞にＣＤ８１遺伝子及び／又はＣｌａｕｄｉｎ１遺伝子を発現させた細胞も挙げることができる（Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ，Ｂ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００５年、第３０９巻、ｐ．６２３−６２６；Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７年、第４４６巻、ｐ．８０１−８０５；Ａｋａｚａｗａ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００７年、第８１巻、ｐ．５０３６−５０４５）。中でも、Ｈｕｈ７細胞又はＨｕｈ７細胞の派生株が特に好ましく使用される。なお、本発明において「派生株」とは、当該細胞から誘導された株をいう。
【００６５】
ＨＣＶ全長ゲノムが翻訳されてできる一続きの、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をＨＣＶ前駆体タンパク質という。ＨＣＶのＣｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質は、該ＨＣＶ前駆体タンパク質が細胞内のプロテアーゼ及びウイルスのプロテアーゼにより切断されることにより生成される。
【００６６】
本明細書において、配列番号で示されるアミノ酸配列上のアミノ酸の位置を「配列番号１４に示されるアミノ酸配列を基準とした場合に…第“Ｘ”番目の（アミノ酸）」という記載により表す。この記載は、そのアミノ酸が、配列番号１４に示されるアミノ酸配列においてＮ末端の第１アミノ酸（メチオニン）を第１番目としたときに第“Ｘ”番目に位置するアミノ酸残基であることを意味する。「配列番号１４に示されるアミノ酸配列を基準とした場合に第“Ｘ”番目の（アミノ酸）」という表現を用いて配列番号１４以外のアミノ酸配列中のアミノ酸を指定する場合、その指定するアミノ酸がそのアミノ酸配列中に存在する実際の位置は、その第“Ｘ”番目であってもよいが、配列番号１４の第“Ｘ”番目のアミノ酸とアラインメントされるアミノ酸である限り第“Ｘ”番目でなくてもよい。
【００６７】
また、本明細書において、例えばアミノ酸変異Ｓ２１９７Ｙは、第２１９７番目のアミノ酸残基がＳ（セリン）からＹ（チロシン）に置換される変異を意味する。他のアミノ酸変異を示す表記も同様に理解される。なお、ここではアミノ酸は、生物学分野で通常用いられるアミノ酸の１文字表記（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８９年）によって記載されている。
【００６８】
本明細書においては、アミノ酸又はアミノ酸残基を、生物学分野で通常用いられるアミノ酸の１文字表記又は３文字表記で記載し、それは水酸化、糖鎖付加、硫酸化等の翻訳後修飾を受けたアミノ酸も包含するものとする。
【００６９】
また、本明細書において、配列番号に示される塩基配列の塩基番号は、配列番号に示される塩基配列において５’末端の第１塩基を第１番目として塩基番号をつけたものを基準とする。
【００７０】
好ましい実施形態において、本発明は、配列表の配列番号１に示される塩基配列を含む核酸（ただし、該核酸がＲＮＡの場合は、配列番号１に示される塩基配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）に読み替えるものとする）を提供する。この核酸は、Ｃ型肝炎ウイルスのフルゲノム（全長ゲノム）配列を含み、すなわち、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムの５’非翻訳領域；Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をそれぞれコードする塩基配列；並びに５’非翻訳領域を５’側から３’側に向かってこの順番で含む。本発明はさらに、この核酸の変異体であって、配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列（配列表の配列番号１に示される塩基番号３４２〜９３７４の配列によってコードされるアミノ酸配列）を基準とした場合に、（i）  第２１９７番目のセリンのチロシンへの置換又は（ii）  第２２０４番目のセリンのグリシンへの置換を引き起こす変異を有する核酸も提供する。上記の配列番号１の核酸又はその変異体は、配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列（配列表の配列番号１に示される塩基番号３４２〜９３７４の配列によってコードされるアミノ酸配列）を基準とした場合に、（iii）  第１２０２番目のグルタミン酸のグリシンへの置換を引き起こす変異をさらに有してもよい。これらの核酸は、単離されたものであることが好ましい。
【００７１】
このような核酸の好適例として、以下に限定するものではないが、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、又は配列番号２２に示される塩基配列を含む核酸が挙げられる。
【００７２】
これらの核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。これらの核酸はフルゲノムレプリコンＲＮＡであってもよい。ＤＮＡであるこれらの核酸は、フルゲノムレプリコンＲＮＡを作製するための鋳型として用いることもできる。
【００７３】
好ましい別の実施形態において、本発明は、２種以上のＣ型肝炎ウイルスゲノムに由来する、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をそれぞれコードする塩基配列を５’側から３’側に向かってこの順番で含む核酸であって、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするそれぞれの塩基配列が、上記の配列番号１の核酸又はその変異体に由来するものである核酸（キメラ核酸）も、提供する。さらに、このような核酸において、ＮＳ２タンパク質をコードする塩基配列の少なくとも一部が上記の配列番号１の核酸又はその変異体に由来するものも好ましい。それらの核酸は、Ｃｏｒｅタンパク質をコードする塩基配列の５’側に、Ｃ型肝炎ウイルス（好ましくはＣ型肝炎ウイルスの既存株）のウイルスゲノムの５’非翻訳領域を含み、かつ、ＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列の３’側に、上記の配列番号１の核酸又はその変異体（本発明に係るＣ型肝炎ウイルスのゲノム）由来の３’非翻訳領域を含むことも好ましい。また、前記２種以上のＣ型肝炎ウイルスゲノムは、Ｃ型肝炎ウイルスの既存株のゲノム、例えば上記のような配列番号１の核酸及びその変異体を除くＣ型肝炎ウイルスゲノム核酸、好ましくはＪＦＨ−１株、Ｊ６ＣＦ株又はＴＨ株のゲノムを、好ましくは含む。
【００７４】
このような本発明の核酸の一実施形態は、
Ｃ型肝炎ウイルスの既存株のＣｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質及びｐ７タンパク質と、
上記の配列番号１の核酸又はその変異体をウイルスゲノムとして有するＣ型肝炎ウイルスのＮＳ２タンパク質、Ｃ型肝炎ウイルスの既存株のＮＳ２タンパク質、又は、上記の配列番号１の核酸又はその変異体をウイルスゲノムとして有するＣ型肝炎ウイルスのＮＳ２タンパク質の一部とＣ型肝炎ウイルスの既存株のＮＳ２タンパク質の一部とが連結されたキメラ型のＮＳ２タンパク質と、
上記の配列番号１の核酸又はその変異体をウイルスゲノムとして有するＣ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質と、
をコードするそれぞれの塩基配列が、
５’側から３’側に向かって、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質、をコードする塩基配列の順に配置されたキメラ型のＣ型肝炎ウイルスゲノムを含む、核酸であってもよい。
【００７５】
これらの核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。これらの核酸はフルゲノムレプリコンＲＮＡであってもよい。ＤＮＡであるこれらの核酸は、フルゲノムレプリコンＲＮＡを作製するための鋳型として用いることもできる。
【００７６】
好ましい一実施形態において、本発明は、配列表の配列番号１の、塩基番号１〜３４１の配列からなる５’非翻訳領域と、塩基番号３４２０〜５３１２の配列からなるＮＳ３タンパク質をコードする塩基配列と、塩基番号５３１３〜５４７４の配列からなるＮＳ４Ａタンパク質をコードする塩基配列と、塩基番号５４７５〜６２５７の配列からなるＮＳ４Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、塩基番号６２５８〜７５９８の配列からなるＮＳ５Ａタンパク質をコードする塩基配列と、塩基番号７５９９〜９３７４の配列からなるＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、塩基番号９３７５〜９６０７の配列からなる３’非翻訳領域と、
を含む、核酸も提供する。さらに、この核酸の変異体であって、配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列（配列表の配列番号１に示される塩基番号３４２〜９３７４の配列によってコードされるアミノ酸配列）を基準とした場合に、以下：（ａ）  第２１９７番目のセリンのチロシンへの置換、（ｂ）  第２２０４番目のセリンのグリシンへの置換、（ｃ）  第２１９７番目のセリンのチロシンへの置換及び第１２０２番目のグルタミン酸のグリシンへの置換、（ｄ）  第２２０４番目のセリンのグリシンへの置換及び第１２０２番目のグルタミン酸のグリシンへの置換、及び（ｅ）  第２１６１番目のプロリンのアルギニンへの置換からなる群から選ばれる置換を引き起こす変異を有する核酸も提供する。
【００７７】
このような核酸の好適例として、以下に限定するものではないが、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号５２に示される塩基配列を含む核酸が挙げられる。
【００７８】
これらの核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。これらの核酸はＨＣＶサブゲノム配列を含み、例えば、サブゲノムレプリコンＲＮＡであってもよい。ＤＮＡであるこれらの核酸は、サブゲノムレプリコンＲＮＡを作製するための鋳型として用いることもできる。
【００７９】
（２）培養細胞で複製が高められたＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの取得
配列表の配列番号１の塩基配列からなる核酸は、急性重症Ｃ型肝炎患者から分離された新規な遺伝子型１ｂのＨＣＶであるＮＣ１株の全長ゲノム核酸である。この配列は、野生型ＮＣ１株の全長ゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ配列でありうるが、該塩基配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）に読み替えたものがＲＮＡ配列である。患者からＨＣＶゲノムを分離する方法は、Ｋａｔｏ，Ｔら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００３年、第１２５巻、ｐ．１８０８−１８１７に記載されている。
【００８０】
上記のＮＣ１株の全長ＨＣＶゲノム（配列番号１）の５’ＵＴＲは、配列番号１の塩基番号１〜３４１の配列からなり、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列は、配列番号１の塩基番号３４２〜９１４の配列からなり、Ｅ１タンパク質コード配列は、配列番号１の塩基番号９１５〜１４９０の配列からなり、Ｅ２タンパク質コード配列は、配列番号１の塩基番号１４９１〜２５７９の配列からなり、ｐ７タンパク質コード配列は、配列番号１の塩基番号２５８０〜２７６８の配列からなり、ＮＳ２タンパク質コード配列は、配列番号１の塩基番号２７６９〜３４１９の配列からなり、ＮＳ３タンパク質コード配列は、配列番号１の塩基番号３４２０〜５３１２の配列からなり、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列は、配列番号１の塩基番号５３１３〜５４７４の配列からなり、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列は、配列番号１の塩基番号５４７５〜６２５７の配列からなり、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列は、配列番号１の塩基番号６２５８〜７５９８の配列からなり、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列は、配列番号１の塩基番号７５９９〜９３７４の配列からなり、３’ＵＴＲは、配列番号１の塩基番号９３７５〜９６０７の配列からなる。このＮＣ１株の全長ＨＣＶゲノムの構造については、図１Ａに示す。
【００８１】
具体的には、ＮＣ１株の全長ＨＣＶゲノム（配列番号１）の５’ＵＴＲは配列番号２に示す塩基配列からなり、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列は配列番号３に示す塩基配列からなり、Ｅ１タンパク質コード配列は配列番号４に示す塩基配列からなり、Ｅ２タンパク質コード配列は配列番号５に示す塩基配列からなり、ｐ７タンパク質コード配列は配列番号６に示す塩基配列からなり、ＮＳ２タンパク質コード配列は配列番号７に示す塩基配列からなり、ＮＳ３タンパク質コード配列は配列番号８に示す塩基配列からなり、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列は配列番号９に示す塩基配列からなり、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列は配列番号１０に示す塩基配列からなり、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列は配列番号１１に示す塩基配列からなり、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列は配列番号１２に示す塩基配列からなり、３’ＵＴＲは配列番号１３に示す塩基配列からなる。
【００８２】
ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡについては、発現ベクターから転写することにより取得できる。ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ作製用発現ベクターの構築に関する基本技術は、Ｌｏｈｍａｎｎ  Ｖら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、第２８５巻、ｐ．１１０−１１３及びＫａｔｏ，Ｔら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００３年、第１２５巻、ｐ．１８０８−１８１７に記載されている。具体的には、例えば、５’から３’の方向に、５’ＵＴＲ、Ｃｏｒｅタンパク質をコードする領域の３６ヌクレオチド、外来遺伝子（薬剤耐性遺伝子又はレポーター遺伝子）、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ配列、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、ＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列及び３’ＵＴＲの順に連結されたｃＤＮＡをＴ７プロモーターの下流に挿入し、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ作製用発現ベクターを構築することができる。なお、各塩基配列の連結において、連結部位には制限酵素部位などの付加配列を含みうる。
【００８３】
上記のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡは、構築されたＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ作製用発現ベクターからポリメラーゼにより合成することができる。例えば、Ｔ７プロモーターの制御下にＨＣＶ  ｃＤＮＡをクローン化した核酸を鋳型として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡを作製する方法として、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）などによる合成が挙げられる。このベクターから転写されたＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡは、細胞に導入されると自律複製する。本発明は、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡが導入された細胞を包含する。
【００８４】
プロモーターとしては、Ｔ７プロモーターだけでなく、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターなども用いることができるが、Ｔ７プロモーターが好ましい。
【００８５】
ベクターとしては、ｐＵＣ１９（ＴａＫａＲａ社）、ｐＢＲ３２２（ＴａＫａＲａ社）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ、ｐＧＥＭ−３Ｚ（いずれもＰｒｏｍｅｇａ社）、ｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）などを使用することができる。
【００８６】
ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを導入する細胞としては、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製を許容する細胞であればよく、上記のＨＣＶ感受性細胞が挙げられる。Ｈｕｈ７細胞又はＨｕｈ７細胞の派生株が特に好ましく使用される。
【００８７】
ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを細胞に導入する方法としては、公知の任意の方法を用いることができる。例えば、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法を挙げることができるが、好ましくはリポフェクション法及びエレクトロポレーション法が、さらに好ましくはエレクトロポレーション法が挙げられる。
【００８８】
導入したＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製能を評価する方法としては、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡに連結された外来遺伝子の機能、すなわち該遺伝子の発現により表れる機能を測定することが挙げられる。外来遺伝子が薬剤耐性遺伝子の場合、薬剤を含有した選択培地で増殖する細胞数又は細胞のコロニー数を計測することにより、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製能を評価できる。この場合、細胞数又は細胞のコロニー数が多いほど複製能が高いと評価することができる。外来遺伝子が酵素の場合は、その酵素活性を計測することにより、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製能を評価できる。この場合、酵素活性が高いほど複製能が高いと評価することができる。また別の方法として、定量的ＲＴ−ＰＣＲにて複製したＲＮＡの量を定量することによっても、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製能を直接評価することができる。
【００８９】
ＨＣＶゲノムの効率的な複製には、ゲノムの塩基配列に変異が起こることが必要であることが示されている（Ｌｏｈｍａｎｎ，Ｖ．ら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、２００１年、第７５巻、ｐ．１４３７−１４４９）。複製能を向上させる変異は適応変異（ａｄａｐｔｉｖｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）と呼ばれている。上記により作製したＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡが導入された細胞を継代培養することにより、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製が向上した細胞株を得ることができる場合がある。細胞培養を続けることにより、ＨＣＶゲノムに適応変異が起こり、複製が著しく向上することがある。
【００９０】
適応変異の例として、遺伝子型２ａのＪＦＨ−１株の適応変異及び、遺伝子型１ａのＨ７７株とＪＦＨ−１株からなるキメラＨＣＶ粒子の適応変異を挙げることができる（Ｚｈｏｎｇ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００６年、第８０巻、ｐ．１１０８２−１１０９３；Ｋａｕｌ，Ａ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００７年、第８１巻、ｐ．２３１３１６８−２３１３１７９；国際公開第０８／１４７７３５号；国際公開第０９／００１９７５号；ＭｉｎＫｙｕｎｇ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００７年、第８１巻、ｐ．６２９−６３８）。しかし、適応変異の組み合わせによっては、ＲＮＡ複製の効率が２００倍以上になることや、逆に１／５以下になることも示されており、適応変異の数を単に増やせばよいというわけではない（Ｌｏｈｍａｎｎ，Ｖ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３年、第７７巻、ｐ．３００７−３０１９）。また、ＨＣＶ株が異なると適応変異の効果も異なってくることから、適応変異がどのような理由によりＨＣＶゲノムの複製効率に影響を与えているかの詳細は分かっていない。
【００９１】
したがって、許容される変異は、ウイルスの株、ＨＣＶのゲノムの設計（コンストラクト）、実験条件により異なると考えられる。よって、許容される変異を決定するためには、所望するコンストラクト毎に実験を行い、許容変異体を取得する必要がある。また、核酸の塩基の変異により引き起こされる１アミノ酸の変異で複製能やＨＣＶ粒子産生能は大きく変化する。ハイブリダイゼーション技術では１アミノ酸の変異に対応する核酸の変異を検出できないため、１アミノ酸の変異を検出するためには、ＨＣＶゲノムの塩基配列をシークエンスする必要がある。ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製が向上した細胞株からＨＣＶゲノムＲＮＡを単離し、塩基配列を決定することで、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製が向上したＨＣＶゲノム配列を明らかにすることができる。
【００９２】
ＨＣＶゲノムＲＮＡの変異が、ＨＣＶ複製能に関与しているか確認するためには、野生型のＨＣＶゲノム（変異のないＨＣＶゲノム）に該変異を導入して、ＨＣＶ複製能の変化が再現されるかを確認すればよい。ＨＣＶゲノムＲＮＡの変異が、使用したＨＣＶゲノムに特異的であるか、又は他のＨＣＶゲノムにも効果的であるかについても、野生型のＨＣＶゲノムに該変異を導入して確認することができる。
【００９３】
野生型のＨＣＶゲノムに変異を導入するには、ＰＣＲ法や市販の変異導入キット（例えば、東洋紡社製のＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔなど）を用いることができる。ＰＣＲ法としては、例えば、野生型のＨＣＶゲノムＲＮＡのｃＤＮＡをクローン化したベクターを鋳型とし、該ｃＤＮＡの配列から設計された正方向及び逆方向プライマーを用いたＰＣＲを実施することによって、目的の配列部分を増幅することができる。具体的には、互いに重複配列を有する異なるＰＣＲ産物を複数合成し、それらのＰＣＲ産物を混合し、これを鋳型として、目的核酸の５’端を含む正方向プライマーと、該核酸の相補鎖の５’端を含む逆方向プライマーを用いるＰＣＲを実施することによって該目的核酸を増幅することができる。合成した核酸の各末端を制限酵素で切断し、同じ酵素で切断した野生型のＨＣＶゲノムＲＮＡのｃＤＮＡをクローン化したベクターに連結する。このような操作の基本技術は、例えば、国際公開第０４／１０４１９８号、国際公開第０６／０２２４２２号、Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．ら、２００５年、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、第１１号、ｐ．７９１−７９６、及びＬｉｎｄｅｎｂａｃｈ，Ｂ．Ｄ．ら、２００５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３０９号、ｐ．６２３−６２６にも記載されている。
【００９４】
ＨＣＶは１０種類のウイルスタンパク質（Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質）がこの順番で連結した１つの前駆体タンパク質として翻訳され、その後、細胞内及びウイルスのプロテアーゼにより、それぞれ、１０種類のウイルスタンパク質（Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質）となる。ＮＣ１株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１４に示されている。配列番号１４に示されるＮＣ１株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示される野生型ＮＣ１株の全長ゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ配列の塩基番号３４２〜９３７４（終止コドンを含む）の配列からなる部分の配列によりコードされる。本発明において、ＨＣＶタンパク質のアミノ酸の変異の位置は、前駆体タンパク質の翻訳開始部位となるメチオニン（Ｍ）を第１番目として、アミノ酸番号をつけたものを基準とする。すなわち、配列番号１４に示す前駆体タンパク質のアミノ酸配列を基準とし、該アミノ酸配列における位置から変異を示すアミノ酸の番号が決められる。例えば、ＮＣ１株のタンパク質は、翻訳開始部位のメチオニンから数えて第３０１０番目のアルギニン（Ｒ）までの３０１０残基のアミノ酸からなる（配列番号１４）。ＮＣ１株の第２１９７番目のアミノ酸は、ＮＳ５Ａタンパク質に含まれるセリン（Ｓ）であり、セリン（Ｓ）がチロシン（Ｙ）に変異した場合は、Ｓ２１９７Ｙ、２１９７ＳＹ又は２１９７Ｓ→Ｙと示すことができる。Ｓ２１９７Ｙ等は、特定の位置のアミノ酸の変異を示すが、本明細書においては、Ｓ２１９７Ｙ等の変異を示す記載はその変異アミノ酸をコードする核酸における変異をも示す。例えば、核酸の塩基が変異し、元の核酸がコードするアミノ酸配列における第２１９７番目のセリン（Ｓ）がチロシン（Ｙ）に置換された場合、該変異を有するアミノ酸配列をコードする核酸を、Ｓ２１９７Ｙの変異を含む核酸又はＳ２１９７Ｙの変異が導入された核酸という。また、これらの核酸の変異を、アミノ酸配列におけるＳ２１９７Ｙの変異を引き起こす核酸の変異ということもある。さらに、例えば、Ｓ２１９７Ｙの変異が導入されたＨＣＶレプリコンＲＮＡをＳ２１９７Ｙ変異体ＨＣＶレプリコンＲＮＡということがある。また、同時に２つの変異を有する場合、例えば、Ｅ１２０２Ｇの変異とＳ２１９７Ｙの変異を有する場合、Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙの変異を含むと表現する。特定のアミノ酸変異をもたらす塩基の変異は、遺伝暗号に基づいて決定することができる。
【００９５】
上記のＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製能が向上する適応変異は、Ｐ２１６１Ｒ（第２１６１番目のプロリン（Ｐ）がアルギニン（Ｒ）に変異）、Ｒ２１９２Ｌ（第２１９２番目のアルギニン（Ｒ）がロイシン（Ｌ）に変異）、Ｒ２１９２Ｑ（第２１９２番目のアルギニン（Ｒ）がグルタミン（Ｑ）に変異）、Ｓ２１９７Ｙ（第２１９７番目のセリン（Ｓ）がチロシン（Ｙ）に変異）、Ｓ２２０４Ｇ（第２２０４番目のセリン（Ｓ）がグリシン（Ｇ）に変異）、Ｙ２８７１Ｃ（第２８７１番目のチロシン（Ｙ）がシステイン（Ｃ）に変異）である。これら適応変異を、単独で又は組み合わせてＨＣＶゲノムに導入することにより、複製能の向上したＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを取得できる。また、さらに公知文献（Ｋｒｉｅｇｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００１年、第７５巻、ｐ．４６１４−４６２４）の変異と組み合わせて導入することもできる。公知文献の変異としては、本発明で見出された変異と組み合わせることにより、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製能が向上するものであればよく、Ｅ１２０２Ｇ（第１２０２番目のグルタミン酸（Ｅ）がグリシン（Ｇ）に変異）（Ｋｒｉｅｇｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００１年、第７５巻、ｐ．４６１４−４６２４）がある。本発明において、好ましい変異は、Ｓ２１９７Ｙ又はＳ２２０４Ｇである。さらに好ましい変異は、Ｅ１２０２ＧとＳ２１９７Ｙを組み合わせた変異（以下、Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ）、又はＥ１２０２ＧとＳ２２０４Ｇを組み合わせた変異（以下、Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇ）である。なお、Ｅ１２０２ＧはＨＣＶゲノムのＮＳ３タンパク質上の変異であり、Ｓ２１９７Ｙ、Ｓ２２０４Ｇは、ＮＳ５Ａタンパク質上の変異である（図８及び図９参照）。
【００９６】
上記のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの一つの実施形態は、上記のＮＣ１株の５’ＵＴＲと、前駆体タンパク質中のＮＳ３タンパク質からＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と３’ＵＴＲとを含む核酸、又は、該核酸であり、かつ、Ｓ２１９７Ｙ、Ｓ２２０４Ｇ、Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ又はＥ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇの変異を含む核酸である。
【００９７】
上記のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの一つの好ましい実施形態としては、上記のＮＣ１株の全長ＨＣＶゲノム（配列番号１）中の、５’ＵＴＲ（配列番号２）、ＮＳ３タンパク質コード配列（配列番号８）、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列（配列番号９）、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列（配列番号１０）、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列（配列番号１１）、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列（配列番号１２）、３’ＵＴＲ（配列番号１３）を含む核酸が挙げられ、好ましくは、上記のＮＣ１株の全長ＨＣＶゲノム中の、５’ＵＴＲ、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、３’ＵＴＲを含む核酸であり、かつ、Ｓ２１９７Ｙ又はＳ２２０４Ｇの変異を含む核酸、又は、上記のＮＣ１株の全長ＨＣＶゲノム中の、５’ＵＴＲ、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、３’ＵＴＲを含む核酸であり、かつ、Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ又はＥ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇの変異を含む核酸を例示できる。
【００９８】
また、上記のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのもう一つの好ましい実施形態としては、上記のＮＣ１株の全長ＨＣＶゲノム中の、５’ＵＴＲ、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、３’ＵＴＲを含む核酸であり、かつ、Ｐ２１６１Ｒ、Ｒ２１９２Ｌ、Ｒ２１９２Ｑ又はＹ２８７１Ｃの変異を含む核酸を挙げられ、好ましくは、上記のＮＣ１株の全長ＨＣＶゲノム中の、５’ＵＴＲ、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、３’ＵＴＲを含む核酸であり、かつ、Ｐ２１６１Ｒの変異を含む核酸を例示できる。
【００９９】
これらＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡは、５’ＵＴＲ、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列及び３’ＵＴＲを、５’から３’の順に向かってこの順序で配置してなるものがさらに好ましい。
【０１００】
上記ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡは、薬剤耐性遺伝子及び／又はレポーター遺伝子並びにＩＲＥＳ配列をさらに含んでいてもよい。この際、５’ＵＴＲの下流に、薬剤耐性遺伝子又は／及びレポーター遺伝子を、さらにその下流にＩＲＥＳ配列を、挿入することが好ましい。
【０１０１】
上記のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのさらに好ましい実施形態としては、配列番号１６に示される塩基配列からなる核酸（野生型ＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ）又は、該核酸であり、かつ、Ｓ２１９７Ｙ、Ｓ２２０４Ｇ、Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ、Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇ又は、Ｐ２１６１Ｒの変異が導入されたＲＮＡを挙げられ、より好ましくは、配列番号１７（野生型ＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡにおいて、Ｓ２１９７Ｙの変異を含む配列）、配列番号１８（野生型ＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡにおいて、Ｓ２２０４Ｇの変異を含む配列）又は、配列番号５２（野生型ＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡにおいて、Ｐ２１６１Ｒの変異を含む配列）に示される塩基配列からなる核酸を例示できる。
【０１０２】
上記のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを構成する核酸は、上記の変異を引き起こす塩基以外の塩基において、さらに他の変異を有しており、上記の変異を含む核酸と同等の複製能及び感染性をもたらす核酸も含む。そのような他の変異としては、１又は複数の塩基の置換が挙げられ、該他の変異を有する核酸は元の核酸と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上の塩基配列同一性を有する。
【０１０３】
（３）ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの作製
ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、ＨＣＶ全長ゲノムＲＮＡそのものも包含するものであり、上記のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製能が向上する適応変異を野生型のＮＣ１株由来のＨＣＶ全長ゲノムＲＮＡに導入することで、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを作製することができる。ここで、野生型のＮＣ１株のＨＣＶ全長ゲノムＲＮＡに、上記の適応変異が導入されたＨＣＶゲノムを、ＮＣ１株変異体又は変異体ＮＣ１株と呼ぶ。
【０１０４】
変異の導入の方法としては、野生型のＮＣ１株のＨＣＶ全長ゲノムに上記の方法を利用して変異を導入してもよく、サブゲノムレプリコン変異体に野生型のＨＣＶゲノムの構造遺伝子部分を連結させることによって変異を導入してもよい。
【０１０５】
上記のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの作製に用いる発現ベクターは、国際公開第０５／０８０５７５号に記載された技術を使用することで作製できる。具体的には、ＨＣＶの全長ゲノムＲＮＡに対応するｃＤＮＡを、常法により再構築してプロモーターの下流に挿入して、ＤＮＡクローンを作製する。上記プロモーターは、プラスミドクローン中に含まれるものであることが好ましい。プロモーターとしては、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターなどを用いることができるが、Ｔ７プロモーターが好ましい。ベクターとしては、ｐＵＣ１９（ＴａＫａＲａ社）、ｐＢＲ３２２（ＴａＫａＲａ社）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ、ｐＧＥＭ−３Ｚ（いずれもＰｒｏｍｅｇａ社）、ｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）などを使用することができる。
【０１０６】
発現ベクターからＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを作製するには、作製された上記ＤＮＡクローンを鋳型として、ポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。Ｔ７プロモーターの制御下にＨＣＶ  ｃＤＮＡをクローン化した核酸を鋳型として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡを作製する場合は、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）などで合成することができる。ＲＮＡ合成は、５’ＵＴＲから、常法により開始させることができる。ＤＮＡクローンがプラスミドクローンの場合には、プラスミドクローンから制限酵素によって切り出したＤＮＡ断片を鋳型として用いてＲＮＡを合成することもできる。なお、合成されるＲＮＡの３’末端がＨＣＶゲノムＲＮＡの３’ＵＴＲの末端と一致しており、他の配列が付加されたり削除されたりしないことが好ましい。
【０１０７】
このようにして合成されるＲＮＡが、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡである。具体的には、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、５’から３’の方向に順に、ＨＣＶの５’ＵＴＲと、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、ＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、３’ＵＴＲが連結されたＲＮＡである。
【０１０８】
上記のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの一つの実施形態は、ＮＣ１株の全長ゲノムＲＮＡに、上記の適応変異が導入された核酸である。このＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの好ましい実施形態としては、上記のＮＣ１株の全長ゲノムＲＮＡ（配列番号１）、すなわち、５’ＵＴＲ（配列番号２）、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列（配列番号３）、Ｅ１タンパク質コード配列（配列番号４）、Ｅ２タンパク質コード配列（配列番号５）、ｐ７タンパク質コード配列（配列番号６）、ＮＳ２タンパク質コード配列（配列番号７）、ＮＳ３タンパク質コード配列（配列番号８）、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列（配列番号９）、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列（配列番号１０）、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列（配列番号１１）、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列（配列番号１２）及び３’ＵＴＲ（配列番号１３）を含み、かつ、Ｓ２１９７Ｙ又はＳ２２０４Ｇの変異を含む核酸が挙げられ、好ましくは、ＮＣ１株の全長ゲノムＲＮＡ（配列番号１）、すなわち、５’ＵＴＲ、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列及び３’ＵＴＲを含み、かつ、Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ又はＥ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇの変異を含む核酸を例示でき、より好ましくは、５’ＵＴＲ、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列及び３’ＵＴＲを、５’から３’の順に向かってこの順序で配置してなる核酸を例示できる。
【０１０９】
ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、薬剤耐性遺伝子及び／又はレポーター遺伝子、並びにＩＲＥＳ配列をさらに含んでいてもよい。この際、５’ＵＴＲの下流に、薬剤耐性遺伝子又は／及びレポーター遺伝子を、さらにその下流にＩＲＥＳ配列を、挿入することが好ましい。
【０１１０】
上記ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡのさらに好ましい実施形態としては、配列番号１９（Ｓ２１９７Ｙの変異を含むフルゲノム塩基配列）、配列番号２０（Ｓ２２０４Ｇの変異を含むフルゲノム塩基配列）、配列番号２１（Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙの変異を含むフルゲノム塩基配列）又は配列番号２２（Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇの変異を含むフルゲノム塩基配列）に示される塩基配列を含むＲＮＡが挙げられる。中でも、配列番号２１（Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙの変異を含むフルゲノム塩基配列）又は配列番号２２（Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇの変異を含むフルゲノム塩基配列）に示される塩基配列を含むＲＮＡが特に好ましい。具体的には、配列番号１９に示される、第２１９７位のセリンのチロシンへの置換を引き起こす変異を有する塩基配列からなる核酸、配列番号２０に示される、第２２０４位のセリンのグリシンへの置換を引き起こす変異を有する塩基配列からなる核酸、配列番号２１に示される、第２１９７位のセリンのチロシンへの置換を引き起こす変異及び第１２０２位のグルタミン酸のグリシンへの置換を引き起こす変異を有する塩基配列からなる核酸、並びに配列番号２２に示される、第２２０４位のセリンのグリシンへの置換を引き起こす変異及び第１２０２位のグルタミン酸のグリシンへの置換を引き起こす変異を有する塩基配列からなる核酸が該当する。
【０１１１】
上記ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ又は上記核酸は、ＨＣＶ感受性細胞に導入されると自律複製し、ＨＣＶ粒子が産生されることとなり、また、上記核酸をウイルスゲノムとして含有するＣ型肝炎ウイルスをＨＣＶ感受性細胞に感染させると、ＨＣＶ粒子が産生されることとなる。すなわち、上記のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ若しくは上記核酸が導入された細胞、又は、上記の核酸をウイルスゲノムとして含有するＣ型肝炎ウイルスに感染された細胞は、ＨＣＶ粒子の大量生産への利用が可能となる。
【０１１２】
より具体的には、上記ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ若しくは上記核酸が導入されたＨＣＶ感受性細胞、又は、上記核酸をウイルスゲノムとして含有するＣ型肝炎ウイルスに感染されたＨＣＶ感受性細胞から産生されたＨＣＶ粒子は、さらに別のＨＣＶ感受性細胞に感染し、細胞内でＨＣＶのゲノムＲＮＡが複製され、パッケージングされ、ＨＣＶ粒子を繰り返し産生することを可能にする。ＨＣＶ粒子の細胞への感染は、例えば、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ又は上記核酸を導入した細胞の培養上清を、ＨＣＶ感受性細胞（例えば、Ｈｕｈ７細胞）に添加することで実施できる。
【０１１３】
上記ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ若しくは上記核酸を導入する細胞、又は、上記Ｃ型肝炎ウイルスを感染させる細胞としては、培養細胞が好ましく、それはＨＣＶレプリコンＲＮＡの複製やＨＣＶ粒子形成を許容する細胞であればよく、上記のＨＣＶ感受性細胞が挙げられる。Ｈｕｈ７細胞又はＨｕｈ７細胞の派生株が特に好ましく使用される。
【０１１４】
ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを細胞に導入する方法としては、公知の任意の方法を用いることができる。例えば、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法を挙げることができるが、好ましくはリポフェクション法及びエレクトロポレーション法が、さらに好ましくはエレクトロポレーション法が挙げられる。
【０１１５】
導入したＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの複製能を評価する方法としては、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡに連結された外来遺伝子の機能、すなわち該遺伝子の発現により表れる機能を測定することが挙げられる。外来遺伝子が薬剤耐性遺伝子の場合、薬剤を含有した選択培地で増殖する細胞数又は細胞のコロニー数を計測することにより、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの複製能を評価できる。この場合、細胞数又は細胞のコロニー数が多いほど複製能が高いと評価することができる。外来遺伝子が酵素の場合は、その酵素活性を計測することにより、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの複製能を評価できる。この場合、酵素活性が高いほど複製能が高いと評価することができる。また別の方法として、定量的ＲＴ−ＰＣＲにて複製したＲＮＡの量を定量することによっても、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの複製能を直接評価することができる。
【０１１６】
なお、本発明は、上記核酸を含むウイルスゲノム及び上記核酸をウイルスゲノムとして含有するＣ型肝炎ウイルスをも包含している。
【０１１７】
（４）感染性ＨＣＶ粒子の産生
上記のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、培養細胞においてＨＣＶ粒子産生能を有している。ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡが、ＨＣＶ粒子産生能を有しているか否かを評価するには、該ＲＮＡを細胞に導入して、その細胞培養上清中のＨＣＶ粒子の存在を測定すればよい。
【０１１８】
細胞のＨＣＶ粒子産生能は、培養上清中に放出されたＨＣＶ粒子を構成するタンパク質、例えば、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、又はＥ２タンパク質に対する抗体を用いて検出することができる。また、培養上清中のＨＣＶ粒子が含有するＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを、特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法により増幅して検出することによって、ＨＣＶ粒子の存在を間接的に検出することもできる。
【０１１９】
産生されたＨＣＶ粒子が感染能を有しているか否かの評価方法としては、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを導入した細胞の培養上清を、ＨＣＶ感受性細胞（例えば、Ｈｕｈ７細胞）に処理して、例えば４８時間後に細胞を抗Ｃｏｒｅ抗体で免疫染色して感染細胞数を数えるか、細胞の抽出物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、ウエスタンブロットにて、Ｃｏｒｅタンパク質を検出することで判断できる。
【０１２０】
ＨＣＶ粒子の感染能が低い場合、カゼインキナーゼＩ阻害剤の存在下で評価することにより感染能が検出できることが報告されているが、この方法で感染能が検出できても実用的ではない（Ｎｅｄｄｅｒｍａｎｎ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００４年、第７８巻、ｐ．１３３０６−１３３１４）。
【０１２１】
（５）キメラ型のＨＣＶ粒子の産生
キメラ型のＨＣＶ粒子（キメラＨＣＶ粒子）とは、２以上の異なる株のＨＣＶのゲノム配列を含むキメラ型のＨＣＶゲノム（キメラＨＣＶゲノム）又はキメラ型のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（キメラＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ）から産生されるＨＣＶ粒子をいう。
【０１２２】
上記のキメラＨＣＶゲノムは、ＮＣ１株変異体（適応変異が導入されたＮＣ１株）の非構造遺伝子と、それ以外のＨＣＶ株（ＮＣ１株及びＮＣ１株変異体とは異なるＨＣＶ株）の構造遺伝子とを含む、ＨＣＶのキメラ遺伝子であることを特徴としている。上記のキメラＨＣＶゲノムに用いるＮＣ１株変異体は、具体的には、ＮＣ１株にＳ２１９７Ｙ、Ｓ２２０４Ｇ、Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ又はＥ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇの変異を含んでいる。さらに具体的には、ＮＣ１株変異体は、配列番号１９（Ｓ２１９７Ｙの変異を含むフルゲノム塩基配列）、配列番号２０（Ｓ２２０４Ｇの変異を含むフルゲノム塩基配列）、配列番号２１（Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙの変異を含むフルゲノム塩基配列）又は配列番号２２（Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇの変異を含むフルゲノム塩基配列）に示される塩基配列を含むＲＮＡである。
【０１２３】
キメラＨＣＶゲノムの作製は、例えば、ＮＣ１株変異体のゲノムの構造遺伝子であるＣｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質及びｐ７タンパク質のコード配列を、他のＨＣＶ株の構造遺伝子と組換えることにより作製することができる。この基本技術は、例えば、Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．ら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．、２００５年、第１１巻、ｐ．７９１−７９６；Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ，Ｂ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００５年、第３０９巻、ｐ．６２３−６２６；Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００７年、第１０３巻、ｐ．７４０８−７４１３に記載されている。
【０１２４】
ＨＣＶ株の塩基配列を用いた系統解析法では、ＨＣＶは遺伝子型１から遺伝子型６までの６タイプに分類され、さらにそれら各タイプがいくつかのサブタイプに分類される。そして、ＨＣＶの複数の遺伝子型についてはそのゲノム全長の塩基配列も決定されている（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｐ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９９４年、第１０巻、ｐ．１３２１−１３２４；Ｃｈｏｏ，Ｑ．Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９年、第２４４巻、ｐ．３５９−３６２；Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９２年、第７３巻、ｐ．７３−６７９；Ｍｏｒｉ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９２年、第１８３巻、ｐ．３３４−３４２）。既に知られているＨＣＶの既存株の例としては、具体的には、遺伝子型１ａのＨＣＶ株としては、Ｈ７７株（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＦ０１１７５１）、遺伝型１ｂ型のＨＣＶ株としては、Ｊ１株（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号Ｄ８９８１５）、Ｃｏｎ１株（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＪ２３８７９９、Ｃｏｎ−１株、ｃｏｎ１株と称することもある）及びＴＨ株（Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．  ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９４年、第２６９巻、ｐ．１４２０５−１４２１０；特開２００４−１７９号公報）、遺伝子型２ａのＨＣＶ株としては、ＪＦＨ−１株（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＢ０４７６３９、ＪＦＨ１株と称することもある）、Ｊ６ＣＦ株（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＦ１７７０３６）、ＪＣＨ−１（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＢ０４７６４０）、ＪＣＨ−２（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＢ０４７６４１）、ＪＣＨ−３（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＢ０４７６４２）、ＪＣＨ−４（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＢ０４７６４３）、ＪＣＨ−５（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＢ０４７６４４）及びＪＣＨ−６（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＢ０４７６４５）が知られている。さらに遺伝子型２ｂのＨＣＶ株としては、ＨＣ−Ｊ８株（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号Ｄ０１２２１）などが、遺伝子型３ａのＨＣＶ株としてはＮＺＬ１株（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号Ｄ１７７６３）、Ｓ５２（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＧＵ８１４２６３）などが、遺伝子型３ｂのＨＣＶ株としては、Ｔｒ−Ｋｊ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号Ｄ４９３７４）などが、遺伝子型４ａのＨＣＶ株としては、ＥＤ４３（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号Ｙ１１６０４）などが知られている。その他の株についても既にＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号のリストが報告されている（Ｔｏｋｉｔａ，Ｔ．  ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９８年、第７９巻、ｐ．１８４７−１８５７；Ｃｒｉｓｔｉｎａ，Ｊ．＆  Ｃｏｌｉｎａ，Ｒ．、Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．、２００６年、第３巻、ｐ．１−８）。
【０１２５】
上記のキメラＨＣＶゲノムは、ＮＣ１株及びＮＣ１株変異体とは異なるＨＣＶ株由来のＣｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質及びｐ７タンパク質、ＮＣ１株変異体若しくはＮＣ１株及びＮＣ１株変異体とは異なるＨＣＶ株由来のＮＳ２タンパク質、及び、ＮＣ１株変異体由来のＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするそれぞれの塩基配列を、５’側から３’側に向かってＣｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列の順序で配置してなるＨＣＶ由来のキメラ遺伝子を含む、核酸である。また、上記のＮＳ２タンパク質は、ＮＣ１株変異体のＮＳ２タンパク質と、ＮＣ１株及びＮＣ１株変異体とは異なるＨＣＶ株由来のＮＳ２タンパク質との、キメラ型のＮＳ２タンパク質（キメラＮＳ２タンパク質）であってもよい。ここで、ＨＣＶのＮＣ１株及びＮＣ１株変異体とは異なるＨＣＶ株は、好ましくは上記のＨＣＶの既存株である。
【０１２６】
ここでキメラＮＳ２タンパク質は、ＮＣ１株変異体のＮＳ２タンパク質のアミノ酸配列の一部と、ＮＣ１株及びＮＣ１株変異体とは異なるＨＣＶ株由来のＮＳ２タンパク質のアミノ酸配列の一部とが連結し、全体としてＮＳ２の全長アミノ酸配列からなるＮＳ２タンパク質をいう。上記のキメラＨＣＶゲノムの核酸において、ＮＳ２タンパク質は、ＮＣ１株変異体由来であってもよいし、又は、ＮＣ１株及びＮＣ１株変異体とは異なるＨＣＶ株由来のＮＳ２タンパク質の一部と、ＮＣ１株変異体由来のＮＳ２タンパク質の残部からなるキメラＮＳ２タンパク質であってもよい。この場合、該キメラＮＳ２タンパク質はキメラではないＮＳ２タンパク質と同様の機能を有するものである。例えば、ＮＣ１株及びＮＣ１株変異体とは異なるＨＣＶ株由来のＮＳ２タンパク質の一部が、ＮＳ２タンパク質のＮ末端のアミノ酸残基から第１６番目のアミノ酸残基までをコードする塩基配列からなる場合、ＮＣ１株変異体由来のＮＳ２タンパク質の残部は、Ｎ末端から第１７番目のアミノ酸残基からＣ末端のアミノ酸残基までをコードする塩基配列からなる。
【０１２７】
上記のキメラＨＣＶゲノムの核酸はさらに、上記Ｃｏｒｅタンパク質をコードする塩基配列の５’側に５’ＵＴＲ及び、上記ＮＳ５Ｂタンパク質をコードする領域の３’側に３’ＵＴＲを含むことが好ましい。５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲは、任意のＨＣＶ株由来の配列でよいが、好ましくは、ＮＣ１株及びＮＣ１株変異体とは異なるＨＣＶ株由来の５’ＵＴＲと、ＮＣ１株変異体由来の３’ＵＴＲである。
【０１２８】
上記のキメラＨＣＶゲノムにおいて、ＮＣ１株及びＮＣ１株変異体とは異なるＨＣＶ株、即ちＨＣＶの既存株は、遺伝子型１ａ、１ｂ又は２ａに属する株である。遺伝子型１ａに属する株には、例えばＨ７７株が含まれる。遺伝子型１ｂに属する株には、例えばＴＨ株、Ｃｏｎ１株、Ｊ１株及びそれらの派生株が含まれる。遺伝子型２ａに属する株には、例えばＪＦＨ−１株、Ｊ６ＣＦ株などが含まれる。好ましい株は、ＪＦＨ−１株、Ｊ６ＣＦ株又はＴＨ株であり、特に好ましくは、ＪＦＨ−１株である。なお、ＮＣ１株及びＮＣ１株変異体とは異なるＨＣＶ株のゲノム塩基配列情報は、上記の文献又はＧｅｎＢａｎｋから入手可能である。
【０１２９】
上記のキメラＨＣＶゲノムの核酸は、Ｊ６ＣＦ株とＮＣ１株とに由来するキメラ核酸であり、かつ、Ｓ２１９７Ｙ、Ｓ２２０４Ｇ、Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ又はＥ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇの変異を含んでいる。上記のキメラＨＣＶゲノムの核酸は、ＪＦＨ−１株とＮＣ１株とに由来するキメラ核酸であり、かつ、Ｓ２１９７Ｙ、Ｓ２２０４Ｇ、Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ又はＥ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇの変異を含んでいる。上記のキメラＨＣＶゲノムの核酸は、ＴＨ株とＮＣ１株とに由来するキメラ核酸であり、かつ、Ｓ２１９７Ｙ、Ｓ２２０４Ｇ、Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ又はＥ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇの変異を含んでいる。
【０１３０】
図１２に、ＮＣ１株変異体（Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇの適応変異が導入されたＮＣ１株）、Ｊ６ＣＦ株、ＪＦＨ−１株及びＴＨ株のＨＣＶのＨＣＶゲノムの構造、並びにＮＣ１株変異体（Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇの適応変異が導入されたＮＣ１株）の非構造遺伝子とＪ６ＣＦ株、ＪＦＨ−１株又はＴＨ株の構造遺伝子とを含む、キメラＨＣＶゲノムの構造を示す。
【０１３１】
本発明は、上記核酸（キメラ遺伝子）を含むＨＣＶウイルスゲノム、上記核酸をウイルスゲノムとして含むＣ型肝炎ウイルス、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ、発現ベクター又はキメラＨＣＶ粒子を提供する。このキメラＨＣＶ粒子は、細胞培養系において高効率で産生可能であり、また高い感染性を有しているという特徴をもつ。
【０１３２】
キメラＨＣＶ遺伝子は、各ＨＣＶゲノムＲＮＡのｃＤＮＡをクローン化したベクターを鋳型にして、合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行い、それぞれのＨＣＶ遺伝子の必要な領域を増幅し、連結することにより作製することができる。
【０１３３】
さらに、キメラＨＣＶ遺伝子ｃＤＮＡを、Ｔ７プロモーターなどのプロモーターの下流の適切な制限酵素サイトに連結し、ＨＣＶゲノムＲＮＡを合成するための発現ベクターを作製することができる。この発現ベクターから転写されたＲＮＡをＨＣＶ感受性細胞（例えば、Ｈｕｈ７細胞など）に導入すると、ウイルスの複製及びパッケージングが起こり、感染性ＨＣＶ粒子を産生することができる。
【０１３４】
上記キメラＨＣＶ遺伝子を含むＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡが細胞内で複製能を有することや、ＨＣＶ粒子産生能を有すること、産生されたＨＣＶ粒子の感染性は、上記（３）及び（４）に記載の方法で確認できる。
【０１３５】
（６）ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの利用
上記のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを導入した細胞は、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製を阻害する化合物のスクリーニングに使用することができる。すなわち、被験物質の存在下で、上記のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを導入した細胞を培養し、得られる培養物中のレプリコンＲＮＡを検出することにより、抗ＨＣＶ物質をスクリーニングすることができる。ここで、培養物とは培養上清や細胞破砕物を含む。この場合、培養物中にレプリコンＲＮＡが存在しないか、あるいは被験物質の非存在下に比べ少ない場合に、上記被験物質はＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製を阻害し得ると判定することができる。
【０１３６】
例えば、５’から３’の方向に、上記ＮＣ１株又はその変異体の、５’ＵＴＲ（配列番号２）、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列（配列番号３）の３６ヌクレオチド、ルシフェラーゼ遺伝子、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ配列、ＮＳ３タンパク質コード配列（配列番号８）、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列（配列番号９）、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列（配列番号１０）、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列（配列番号１１）、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列（配列番号１２）及び３’ＵＴＲ（配列番号１３）の順に連結されたＲＮＡからなるＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡをＨｕｈ７細胞に導入し、引き続いて、被験物質を添加し、４８〜７２時間後にルシフェラーゼの活性を測定する。被験物質未添加と比較してルシフェラーゼ活性を抑制し得る被験物質は、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製を抑制する作用があると判定できる。
【０１３７】
（７）ＨＣＶ粒子の利用
上記核酸又は上記ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡをＨＣＶ感受性細胞に導入等して得られるＨＣＶ粒子（キメラＨＣＶ粒子を含む）は、ＨＣＶの感染を阻害する中和抗体や化合物及びＨＣＶの複製を阻害する化合物のスクリーニングに使用することができるほか、ワクチンとしての用途、抗ＨＣＶ抗体作製のための抗原としての用途に好適に用いることができる。
【０１３８】
上記ＨＣＶ粒子を、ＨＣＶの感染や複製を阻害する物質のスクリーニングに使用するには、被験物質の存在下又は非存在下で、上記ＨＣＶ粒子を産生する細胞を培養するか、又は上記ＨＣＶ粒子をＨＣＶ感受性細胞と培養し、すなわちＨＣＶ粒子とＨＣＶ感受性細胞の混合物を培養し、あるいは、上記ＨＣＶ粒子が感染したＨＣＶ感染細胞を培養し、得られる培養物中のＨＣＶレプリコンＲＮＡ又はＨＣＶ粒子を検出する方法が挙げられる。ここで、検出とは培養物中のＨＣＶレプリコンＲＮＡ又はＨＣＶ粒子の量を定量することをいう。この場合、培養物中にＨＣＶレプリコンＲＮＡ及びＨＣＶ粒子が存在しないか、あるいは被験物質の非存在下に比べ少ない場合に、上記被験物質はＨＣＶの感染や複製を阻害し得ると評価することができる。
【０１３９】
具体的には、例えば、被験物質の存在下及び非存在下で、上記ＨＣＶ粒子とともにＨＣＶ感受性細胞を培養し、得られる培養物中のＨＣＶレプリコンＲＮＡ又はＨＣＶ粒子を検出し、その被験物質がＨＣＶレプリコンＲＮＡの複製又はＨＣＶ粒子の形成を抑制するかどうかを判定することにより、抗ＨＣＶ物質をスクリーニングすることができる。
【０１４０】
培養物中のＨＣＶレプリコンＲＮＡの検出は、ＨＣＶレプリコンＲＮＡに連結された外来遺伝子の機能、すなわち該遺伝子の発現により表れる機能を測定することが挙げられる。例えば、外来遺伝子が酵素の場合は、その酵素活性を計測することにより、ＨＣＶレプリコンＲＮＡを検出できる。また別の方法として、定量的ＲＴ−ＰＣＲにて複製したＲＮＡの量を定量することによっても、ＨＣＶレプリコンＲＮＡを検出することができる。
【０１４１】
培養物中のＨＣＶ粒子の存在を検出するには、培養液中に放出されたＨＣＶ粒子を構成するタンパク質（例えば、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質又はＥ２タンパク質）に対する抗体を用いて検出するか、感染細胞中の非構造タンパク質の存在を非構造タンパク質に対する抗体で免疫染色を行い検出するか、又は、培養上清中のＨＣＶ粒子が含有するＨＣＶゲノムＲＮＡを、特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法により増幅して検出することによって、ＨＣＶ粒子の存在を間接的に検出することもできる。
【０１４２】
また、スクリーニングに用いるＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡが外来遺伝子を含む場合として、具体的には例えば、ＮＣ１株変異体のＨＣＶの、５’ＵＴＲ、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列の３６ヌクレオチド、ルシフェラーゼ遺伝子、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ配列、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列及び３’ＵＴＲが、５’から３’の方向に順に連結されたＲＮＡからなるＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡが挙げられる。なお、各塩基配列の連結において、連結部位には制限酵素部位などの付加配列を含みうる。上記ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡをＨｕｈ７細胞に導入し、ＨＣＶ粒子を得て、該ＨＣＶ粒子をＨＣＶ感受性細胞に感染させると同時に、被験物質を添加し、４８〜７２時間後にルシフェラーゼの活性を測定する。被験物質未添加と比較してルシフェラーゼ活性を抑制する物質はＨＣＶの感染を抑制する作用があると判定できる。
【０１４３】
上記方法では、抗ＨＣＶ物質は、ウイルス感染又は複製を抑制可能なものとして選択される。
【０１４４】
また、上記方法において、上記核酸を含むウイルスゲノム及び上記核酸をウイルスゲノムとして含有するＣ型肝炎ウイルスを用いることもできる。
【０１４５】
さらに、上記ＨＣＶ粒子は、ワクチンとして用いることができる。ワクチンとしての用途では、具体的には、上記ＨＣＶ粒子又はその一部分をそのままワクチンとして使用することもできるが、当該分野で既知の方法により弱毒化又は不活化して用いることが好ましい。ウイルスの不活化は、ホルマリン，β−プロピオラクトン，グルタルジアルデヒド等の不活化剤を，例えば、ウイルス浮遊液に添加混合し，ウイルスと反応させることにより達成することができる（Ａｐｐａｉａｈｇａｒｉ，Ｍ．Ｂ．＆Ｖｒａｔｉ，  Ｓ．、Ｖａｃｃｉｎｅ、２００４年、第２２巻、ｐ．３６６９−３６７５）。
【０１４６】
上記ＨＣＶワクチンは、溶液又は懸濁液のいずれかとして、投与可能に調製され得る。あるいは、使用直前に再構成可能なように、液体中の溶解又は懸濁に適した固形物（例えば凍結乾燥調製物）の形態で調製することができる。そのような固形物又は調製物は、乳濁されてもよいし、又はリポソームにカプセル化されてもよい。
【０１４７】
ＨＣＶ粒子などの活性免疫原性成分は、薬学的に許容可能であって、活性成分に適合した賦形剤がしばしば混合され得る。適切な賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、又はそれらの混合物がある。
【０１４８】
さらに、所望であれば、上記ＨＣＶワクチンは、少量の補助剤（例えば、加湿剤又は乳化剤）、ｐＨ緩衝剤、及び／又はワクチンの効能を高めるアジュバントを含有し得る。
【０１４９】
アジュバントは、該免疫系の非特異的刺激因子である。それらは、上記ＨＣＶワクチンに対する宿主の免疫応答を増強する。したがって、好ましい形態においては、上記ＨＣＶワクチンはアジュバントを含む。アジュバントの効能は、ＨＣＶ粒子から構成されるワクチンを投与することにより生じる抗体の量を測定することにより決定され得る。
【０１５０】
有効であり得るアジュバントの例は、限定されないが、以下を包含する。水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと称せられる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称せられる）及びＲＩＢＩ。ＲＩＢＩは、バクテリアから抽出した３成分、すなわちモノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート及び細胞壁骨格（ＨＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０エマルジョン中に含有している。
【０１５１】
所望により、アジュバント活性を有する１以上の化合物を上記ＨＣＶワクチンに加えることができる。当技術分野で公知のアジュバントの具体例としては、フロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオンブロック重合体、ムラミルジペプチド、サポニン、鉱油、植物油及びＣａｒｂｏｐｏｌが挙げられる。粘膜適用に特に適したアジュバントとしては、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素（ＬＴ）又はコレラ（Ｃｈｏｌｅｒａ）毒素（ＣＴ）が挙げられる。他の適当なアジュバントとしては、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは酸化アルミニウム、油性乳剤（例えば、Ｂａｙｏｌ（登録商標）又はＭａｒｃｏｌ  ５２（登録商標））、サポニン又はビタミンＥソリュビリゼートが挙げられる。
【０１５２】
上記ＨＣＶワクチンは、通常、非経口的に、例えば皮下注射又は筋肉内注射のような、注射により投与される。他の投与態様に適切な別の処方としては、坐薬、及びある場合には経口処方薬が挙げられる。
【０１５３】
皮下、皮内、筋肉内、静脈内に投与する注射剤において、上記ＨＣＶワクチンと医薬上許容される担体又は希釈剤の具体例としては、安定化剤、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、グルコース、デキストラン）、アルブミン又はカゼインなどのタンパク質、ウシ血清又は脱脂乳などのタンパク質含有物質、及びバッファー（例えば、リン酸バッファー）が挙げられる。
【０１５４】
坐薬に使用される従来の結合剤及び担体としては、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドが含まれ得る。このような坐薬は、活性成分を０．５％〜５０％までの範囲で、好ましくは１％〜２０％までの範囲で含有する混合物から形成され得る。経口処方薬は、通常用いられる賦形剤を含有する。この賦形剤としては、例えば、薬学的なグレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。
【０１５５】
上記ＨＣＶワクチンは、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出処方剤、又は粉末剤の形態をとり、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の活性成分（ＨＣＶ粒子又はその一部分）を含有する。このＨＣＶワクチンは、投与剤形に適した方法で、そして予防及び／又は治療効果を有するような量で投与される。投与されるべき抗原量は、通常投与当たり０．０１μｇ〜１００，０００μｇまでの範囲であるが、これは、投与される患者、その患者の免疫系での抗体合成能、及び所望の防御の程度に依存する。また、経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈内投与経路などの投与経路にも依存する。
【０１５６】
また、上記ＨＣＶワクチンは、単独投与スケジュールで又は複合投与スケジュールで与えられ得る。好ましくは、複合投与スケジュールである。複合投与スケジュールでは、接種の開始時期に１〜１０の個別の投与を行い、続いて免疫応答を維持する及び／又は強化するのに必要とされる時間間隔で、例えば２回目の投与として１〜４ヵ月後に、別の投与を行い得る。必要であれば、数ヶ月後に引き続き投与を行い得る。投与のレジメもまた、少なくとも部分的には、個体の必要性により決定され、医師の判断に依存する。上記ＨＣＶワクチンは、健常人に投与し、健常人にＨＣＶに対する免疫応答を誘導し、新たなＨＣＶ感染に対して予防的に使用する方法がある。さらに、ＨＣＶに感染した患者に投与し、生体内にＨＣＶに対する強い免疫反応を誘導することにより、ＨＣＶを排除する治療的ワクチンとしての使用方法がある。
【０１５７】
さらに、上記ＨＣＶ粒子は、抗ＨＣＶ抗体作製のための抗原として有用である。上記ＨＣＶ粒子を、哺乳類又は鳥類に投与することにより、抗体を作製することができる。哺乳類動物として、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、モルモット、ヒトコブラクダ、フタコブラクダ、ラマなどを挙げることができる。ヒトコブラクダ、フタコブラクダ及びラマはＨ鎖のみからなる抗体を作製するには好適である。鳥類動物としては、ニワトリ、ガチョウ、ダチョウなどを挙げることができる。上記ＨＣＶ粒子を投与された動物の血清を採取して、既知の方法に従って抗体を取得することができる。
【０１５８】
本発明はこれらの抗ＨＣＶ抗体も提供し、この抗ＨＣＶ抗体はＨＣＶを不活化し得る中和抗体として利用できる。
【０１５９】
上記ＨＣＶ粒子を免疫した動物の細胞を用いて、モノクローナル抗体産生細胞を産生するハイブリドーマを作製することができる。ハイブリドーマを製造する方法は周知であり、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年）に記載された方法を用いることができる。
【０１６０】
モノクローナル抗体産生細胞は、細胞融合により作製してもよく、また癌遺伝子ＤＮＡの導入やＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスの感染によりＢリンパ球を不死化させるような他の方法で作製してもよい。
【０１６１】
これらの方法によって得られたモノクローナル抗体や、ポリクローナル抗体はＨＣＶの診断や治療、予防に有用である。
【０１６２】
上記ＨＣＶ粒子を抗原として用いて作製された抗体は、医薬として、医薬上許容される溶解剤、添加剤、安定剤、バッファーなどとともに投与され得る。投与経路はいずれの投与経路でもよいが、好ましくは、皮下、皮内、筋肉内投与であり、より好ましくは、静脈内投与が好ましい。
【実施例】
【０１６３】
以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。【０１６４】
（実施例１）野生型ＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターの構築
急性重症Ｃ型肝炎の患者から分離された新規な遺伝子型１ｂのＨＣＶである、ＮＣ１株の全長ゲノムＲＮＡに対応するクローンＤＮＡ（全長ゲノムクローンＤＮＡ）の非構造領域を用いて、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターであるプラスミドｐＳＧＲ−ＮＣ１を構築した。【０１６５】
具体的には、患者血清からＩｓｏｇｅｎ−ＬＳ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ社）を用いてＲＮＡを抽出精製し、ランダムヘキサマープライマーでｃＤＮＡを合成した。既知の遺伝子型１ｂのＨＣＶゲノムの保存された配列（Ｃｏｎ１株：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＡＪ２３８７９９）を元にＰＣＲプライマーを設計した。設計したＰＣＲプライマーと、鋳型として上記で合成したｃＤＮＡを用いて、５つのフラグメントに分けてｃＤＮＡを増幅した。増幅産物の取得が困難な５’末端の配列は５’ＲＡＣＥ法を用いて増幅産物を得た。それぞれのフラグメントはシークエンス用クローニングベクターであるｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）中にクローン化した。常法により、これらのクローンの塩基配列を解析し、ＮＣ１株の全長ゲノムＲＮＡ配列を決定した。【０１６６】
ＮＣ１株の全長ゲノムクローンＤＮＡの塩基配列を、配列番号１に示す。また、ＮＣ１株の５’ＵＴＲを配列番号２、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列を配列番号３、Ｅ１タンパク質コード配列を配列番号４、Ｅ２タンパク質コード配列を配列番号５、ｐ７タンパク質コード配列を配列番号６、ＮＳ２タンパク質コード配列を配列番号７、ＮＳ３タンパク質コード配列を配列番号８、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列を配列番号９、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列を配列番号１０、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列を配列番号１１、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列を配列番号１２、３’ＵＴＲを配列番号１３に、それぞれ示す。【０１６７】
配列番号１の塩基配列によってコードされるＨＣＶ前駆体タンパク質（ポリペプチド）のアミノ酸配列を配列番号１４に示す。配列番号１４に示されるアミノ酸配列は、配列番号１の塩基配列の塩基番号３４２〜９３７４（終止コドンを含む）にコードされている。また、ＮＣ１株の前駆体タンパク質中のＮＳ３タンパク質からＮＳ５Ｂタンパク質までの領域のアミノ酸配列を配列番号１５に示す。この配列番号１５のアミノ酸配列（ＮＳ３〜ＮＳ５Ｂ領域）は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１０２７番目〜３０１０番目に対応する。【０１６８】
プラスミドｐＳＧＲ−ＮＣ１は、Ｋａｔｏらの文献（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００３年、第１２５巻、ｐ．１８０８−１８１７）及び国際公開第０５／０２８６５２号に示した手順に基づいて構築した。【０１６９】
具体的には、まず、ＮＣ１株の全長ゲノムＲＮＡ（図１Ａ）のｃＤＮＡを、プラスミドベクターｐＵＣ１９中に挿入されたＴ７プロモーターの制御下に挿入し、組換えプラスミドｐＮＣ１を作製した（図１Ｂ）。次いで、組換えプラスミドｐＮＣ１の構造領域（Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質及びｐ７タンパク質）と非構造領域の一部を、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ：ネオマイシンホスホトランフェラーゼ遺伝子とも称する）、及びＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）で置換することにより、プラスミドｐＳＧＲ−ＮＣ１を構築した。これを、発現ベクターｐＳＧＲ−ＮＣ１とする。【０１７０】
図１Ｃは、発現ベクターｐＳＧＲ−ＮＣ１の構造を示している。発現ベクターｐＳＧＲ−ＮＣ１において、５’ＵＴＲ、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列の３６ヌクレオチド（ＨＣＶ−ＩＲＥＳ）、ＮＳ３〜ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、３’ＵＴＲが、ＮＣ１株に由来する配列である。図中、「Ｔ７」はＴ７プロモーターを意味する。Ｔ７プロモーターは、それぞれの発現ベクターからＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いてＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを転写させるために必要な配列エレメントである。「ｎｅｏ」はネオマイシン耐性遺伝子、「ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ」は脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム結合部位を示す。「Ｃ」はＣｏｒｅタンパク質、「Ｅ１」はＥ１タンパク質、「Ｅ２」はＥ２タンパク質、「ｐ７」はｐ７タンパク質、「ＮＳ２」はＮＳ２タンパク質、「ＮＳ３」はＮＳ３タンパク質、「４Ａ」はＮＳ４Ａタンパク質、「４Ｂ」はＮＳ４Ｂタンパク質、「ＮＳ５Ａ」はＮＳ５Ａタンパク質及び「ＮＳ５Ｂ」はＮＳ５Ｂタンパク質を示す。発現ベクターｐＳＧＲ−ＮＣ１から作製されるＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ（ＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ）は、図１Ｄに示すように、Ｔ７プロモーターより下流の領域が転写されたＲＮＡである。また、図中の「ＸｂａＩ」及び「ＰｍｅＩ」は制限酵素サイトを示す。なお、図３、４、６、８、９、１２においても同様である。【０１７１】
発現ベクターｐＳＧＲ−ＮＣ１のＴ７プロモーターの下流にＮＣ１サブゲノムレプリコンＲＮＡのｃＤＮＡが連結されている。ＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのｃＤＮＡ塩基配列を配列番号１６に示した。また配列番号１５に示されるアミノ酸配列は、ＮＣ１株のＮＳ３タンパク質からＮＳ５Ｂタンパク質までの領域を示し、これは、配列番号１の塩基配列の塩基番号３４２０〜９３７４（終止コドンを含む）にコードされている。【０１７２】
（実施例２）野生型ＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの作製
実施例１で構築した発現ベクターｐＳＧＲ−ＮＣ１を、制限酵素ＸｂａＩで切断した。次いで、ＸｂａＩ切断断片  １０〜２０μｇに、Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ２０Ｕ（トータル反応液量  ５０μＬ）を加えて３０℃で３０分間インキュベートした。Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅは、二本鎖ＤＮＡ中の一本鎖部分を選択的に分解して平滑化する反応を触媒する酵素である。通常、上記ＸｂａＩ切断断片をそのまま鋳型ＤＮＡとして用いてＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写を行うと、ＸｂａＩの認識配列の一部であるＣＵＡＧの４塩基が３’末端に余分に付加されたレプリコンＲＮＡが合成されてしまう。そこで本実施例では、ＸｂａＩ切断断片をＭｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅで処理することにより、ＸｂａＩ切断断片からＣＴＡＧの４塩基を除去した。【０１７３】
次いで、ＸｂａＩ切断断片を含むＭｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ処理後溶液について、常法に従ったタンパク質除去処理を行うことにより、ＣＴＡＧの４塩基が除去されたＸｂａＩ切断断片を精製し、これを次の反応で用いる鋳型ＤＮＡとした。この鋳型ＤＮＡから、Ａｍｂｉｏｎ社のＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）を用いて、Ｔ７プロモーターを利用した転写反応によりＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成した。具体的には、鋳型ＤＮＡを０．５〜１．０μｇ含む反応液２０μＬを製造業者の使用説明書に基づいて調製し、３７℃で３時間〜１６時間反応させた。【０１７４】
ＲＮＡ合成終了後、反応溶液にＤＮａｓｅ（２Ｕ）を添加して３７℃で１５分間反応させることにより鋳型ＤＮＡを除去し、さらに酸性フェノールによるＲＮＡ抽出を行うことにより、ｐＳＧＲ−ＮＣ１から転写されたＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ（図１Ｄ）を取得した。【０１７５】
（実施例３）ＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコン複製細胞クローンの樹立
実施例２で作製した野生型ＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ１μｇを、Ｈｕｈ７細胞から常法により抽出したトータル細胞性ＲＮＡと混合して、ＲＮＡ総量が１０μｇとなるように調整した。次いで、その混合ＲＮＡをエレクトロポレーション法によりＨｕｈ７細胞に導入した。エレクトロポレーション処理を行ったＨｕｈ７細胞を培養ディッシュに播種し、１６時間〜２４時間培養した後に、培養ディッシュにＧ４１８（ネオマイシン）を添加した。その後、週に２回培養液を交換しながら培養を継続した。【０１７６】
播種時から２１日間培養した後、クリスタルバイオレットで生存細胞を染色した。その結果、ＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを導入した細胞について、コロニー形成が確認できた。コロニー形成は、その細胞においてＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡが複製されていることを示している（図２）。【０１７７】
コロニー形成が認められた上記サブゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞について、上記の培養２１日後の培養ディッシュから、生存細胞のコロニーをさらにクローン化し、培養を継続した。このようなコロニーのクローニングにより、細胞クローンを複数株樹立することができた。これらの細胞クローンを、ＮＣ１サブゲノムレプリコン細胞と名付けた。こうして樹立された細胞クローンにおいては、導入されたＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡが自律複製していると考えられる。【０１７８】
（実施例４）ＮＣ１サブゲノムレプリコン細胞内のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの配列解析
実施例３で樹立したＮＣ１サブゲノムレプリコン細胞内に存在するＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの配列解析を行った。まず、樹立した３２クローンのＮＣ１サブゲノムレプリコン細胞からトータルＲＮＡを抽出し、この中に含まれるＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法を用いて増幅した。この増幅には、５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’（配列番号２７）と５’−ＧＣＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＣＣＴＴＴＣＡＣ−３’（配列番号２８）をプライマーとして使用した。増幅産物はシークエンス用クローニングベクター中にクローン化し、常法により配列解析を行った。【０１７９】
その結果、細胞内から得られたＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡに、非構造領域であるＮＳ５Ａタンパク質領域で５箇所（Ｐ２１６１Ｒ、Ｒ２１９２Ｌ、Ｒ２１９２Ｑ、Ｓ２１９７Ｙ、Ｓ２２０４Ｇ）及びＮＳ５Ｂタンパク質領域で１箇所（Ｙ２８７１Ｃ）の、アミノ酸置換を引き起こす塩基置換が見出された。これらアミノ酸置換の位置を、発現ベクターｐＳＧＲ−ＮＣ１上に記載したものを、図３に示す。なお、これらのアミノ酸置換の位置は、ＮＣ１株の前駆体タンパク質の全長アミノ酸配列（配列番号１４）に基づいて記載されている。【０１８０】
（実施例５）野生型ＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡへの変異導入及びその解析
実施例４で見出された塩基置換、すなわち塩基変異が細胞内での上記野生型ＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製に影響を与えるかどうかを調べた。【０１８１】
ＮＳ５Ａタンパク質領域で５箇所（Ｐ２１６１Ｒ、Ｒ２１９２Ｌ、Ｒ２１９２Ｑ、Ｓ２１９７Ｙ、Ｓ２２０４Ｇ）及びＮＳ５Ｂタンパク質領域で１箇所（Ｙ２８７１Ｃ）の、それぞれのアミノ酸置換を引き起こす塩基置換をそれぞれ、実施例１で作製したＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターｐＳＧＲ−ＮＣ１に導入した。【０１８２】
図４に、これらアミノ酸置換を導入したＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現プラスミドベクターの構造を示す。なお、発現ベクターｐＳＧＲ−ＮＣ１に、Ｐ２１６１Ｒ置換を導入したものを「ｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｐ２１６１Ｒ」と呼ぶ。他のアミノ酸置換を導入した発現ベクターもこれと同様に名付けた。なお、図中の「ＥｃｏＲＩ」、「ＰｍｅＩ」、「ＢｓｒＧＩ」及び「ＸｂａＩ」は制限酵素サイトを示す。【０１８３】
具体的には、ｐＳＧＲ−ＮＣ１及びそのＰＣＲ産物を鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲを繰り返すことにより、ｐＳＧＲ−ＮＣ１に塩基置換を導入した。ＰＣＲ条件は以下のとおりである。まず、ＰＣＲの鋳型ＤＮＡに、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付の、５×緩衝液を１０μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μＬ、１００μＭのプライマー（フォワード及びリバースそれぞれ）を０．２５μＬ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μＬとした。その後、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μＬ加え、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５５℃で１５秒及び７２℃で５０秒を１サイクルとして、３０サイクル行った。【０１８４】
まず、ｐＳＧＲ−ＮＣ１を鋳型ＤＮＡとし、６６２０Ｓ−Ｃｏｎ．１（５’−ＴＡＣＧＣＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＣＴＡ−３’（配列番号２９））及び３１９７ＳＹ−Ｒ（５’−ＧＣＴＧＧＣＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＣＣＴＣＧＧＧＣ−３’（配列番号３０））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１とした。【０１８５】
次に、ｐＳＧＲ−ＮＣ１を鋳型ＤＮＡとし、３１９７ＳＹ−Ｓ（５’−ＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＡＴＴＴＧＧＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴ−３’（配列番号３１））及び６４４７Ｒ−１ｂ−ｒｅｐ（５’−ＡＣＧＡＴＡＡＧＡＣＧＡＧＣＴＧＧＣＴＴ−３’（配列番号３２））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．２とした。【０１８６】
それぞれのＰＣＲ産物を精製し、１５μＬのＨ２Ｏに溶解した。ＰＣＲ産物ｎｏ．１とＰＣＲ産物ｎｏ．２のＤＮＡを、１μＬずつ混合した。これを鋳型ＤＮＡとし、６６２０Ｓ−Ｃｏｎ．１（５’−ＴＡＣＧＣＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＣＴＡ−３’（配列番号２９））及び６４４７Ｒ−１ｂ−ｒｅｐ（５’−ＡＣＧＡＴＡＡＧＡＣＧＡＧＣＴＧＧＣＴＴ−３’（配列番号３２））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．３とした。このＰＣＲ産物を精製し、３０μＬのＨ２Ｏに溶解した。【０１８７】
ｐＳＧＲ−ＮＣ１及び精製したＰＣＲ産物ｎｏ．３を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＭｕｎＩで消化し、各ＨＣＶ  ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。こうして得られた組換え発現ベクター（アミノ酸置換Ｓ２１９７Ｙを引き起こす塩基置換を有する）をｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙと名付けた。なお、ｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙから合成されるＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの配列を配列番号１７に示す。【０１８８】
ｐＳＧＲ−ＮＣ１を鋳型ＤＮＡとし、６６２０Ｓ−Ｃｏｎ．１（５’−ＴＡＣＧＣＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＣＴＡ−３’（配列番号２９））及び２２０４ＳＧ−Ｒ（５’−ＧＡＣＡＡＣＴＧＡＣＣＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＣＴＧＧＣＣＡＡＡ−３’（配列番号３３））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．４とした。【０１８９】
次に、ｐＳＧＲ−ＮＣ１を鋳型ＤＮＡとし、２２０４ＳＧ−Ｓ（５’−ＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＣＡＧＴＴＧＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＣ−３’（配列番号３４））及び６４４７Ｒ−１ｂ−ｒｅｐ（５’−ＡＣＧＡＴＡＡＧＡＣＧＡＧＣＴＧＧＣＴＴ−３’（配列番号３２））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．５とした。【０１９０】
それぞれのＰＣＲ産物を精製し、１５μＬのＨ２Ｏに溶解した。ＰＣＲ産物ｎｏ．４とＰＣＲ産物ｎｏ．５のＤＮＡを１μＬずつ混合した。これを鋳型ＤＮＡとし、６６２０Ｓ−Ｃｏｎ．１（５’−ＴＡＣＧＣＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＣＴＡ−３’（配列番号２９））及び６４４７Ｒ−１ｂ−ｒｅｐ（５’−ＡＣＧＡＴＡＡＧＡＣＧＡＧＣＴＧＧＣＴＴ−３’（配列番号３２））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．６とした。ＰＣＲ産物を精製し、３０μＬのＨ２Ｏに溶解した。【０１９１】
ｐＳＧＲ−ＮＣ１及び精製したＰＣＲ産物ｎｏ．６を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＭｕｎＩで消化し、各ＨＣＶ  ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。こうして得られた組換え発現ベクター（アミノ酸置換Ｓ２２０４Ｇを引き起こす塩基置換を有する）をｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇと名付けた。なお、ｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇから合成されるＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの配列を配列番号１８に示す。【０１９２】
ｐＳＧＲ−ＮＣ１を鋳型ＤＮＡとし、６６２０Ｓ−Ｃｏｎ．１（５’−ＴＡＣＧＣＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＣＴＡ−３’（配列番号２９））及び２１６１ＰＲ−Ｒ（５’−ＧＧＧＴＴＣＡＣＡＴＣＧＡＡＧＣＴＧＴＧＡＣＣＣＧＡＣＣ−３’（配列番号３５））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．７とした。【０１９３】
次に、ｐＳＧＲ−ＮＣ１を鋳型ＤＮＡとし、２１６１ＰＲ−Ｓ（５’−ＴＣＡＣＡＧＣＴＴＣＧＡＴＧＴＧＡＡＣＣＣＧＡＧＣＣＧＧＡＴ−３’（配列番号３６））及び６４４７Ｒ−１ｂ−ｒｅｐ（５’−ＡＣＧＡＴＡＡＧＡＣＧＡＧＣＴＧＧＣＴＴ−３’（配列番号３２））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．８とした。【０１９４】
それぞれのＰＣＲ産物を精製し、１５μＬのＨ２Ｏに溶解した。ＰＣＲ産物ｎｏ．７とＰＣＲ産物ｎｏ．８のＤＮＡを１μＬずつ混合した。これを鋳型ＤＮＡとし、６６２０Ｓ−Ｃｏｎ．１（５’−ＴＡＣＧＣＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＣＴＡ−３’（配列番号２９））及び６４４７Ｒ−１ｂ−ｒｅｐ（５’−ＡＣＧＡＴＡＡＧＡＣＧＡＧＣＴＧＧＣＴＴ−３’（配列番号３２））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．９とした。ＰＣＲ産物を精製し、３０μＬのＨ２Ｏに溶かした。【０１９５】
ｐＳＧＲ−ＮＣ１及び精製したＰＣＲ産物ｎｏ．９を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＭｕｎＩで消化し、各ＨＣＶ  ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。こうして得られた組換え発現ベクター（アミノ酸置換Ｐ２１６１Ｒを引き起こす塩基置換を有する）をｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｐ２１６１Ｒと名付けた。なお、ｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｐ２１６１Ｒから合成されるＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの配列を配列番号５２に示す。【０１９６】
ｐＳＧＲ−ＮＣ１を鋳型ＤＮＡとし、６６２０Ｓ−Ｃｏｎ．１（５’−ＴＡＣＧＣＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＣＴＡ−３’（配列番号２９））及び２１９２ＲＬ−Ｒ（５’−ＧＧＧＧＧＡＣＣＣＴＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＴＴＡＧＣ−３’（配列番号３７））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１０とした。【０１９７】
次に、ｐＳＧＲ−ＮＣ１を鋳型ＤＮＡとし、２１９２ＲＬ−Ｓ（５’−ＡＧＧＣＴＧＧＣＣＣＴＡＧＧＧＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＴＴＴ−３’（配列番号３８））及び６４４７Ｒ−１ｂ−ｒｅｐ（５’−ＡＣＧＡＴＡＡＧＡＣＧＡＧＣＴＧＧＣＴＴ−３’（配列番号３２））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１１とした。【０１９８】
それぞれのＰＣＲ産物を精製し、１５μＬのＨ２Ｏに溶解した。ＰＣＲ産物ｎｏ．１０とＰＣＲ産物ｎｏ．１１のＤＮＡを１μＬずつ混合した。これを鋳型ＤＮＡとし、６６２０Ｓ−Ｃｏｎ．１（５’−ＴＡＣＧＣＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＣＴＡ−３’（配列番号２９））及び６４４７Ｒ−１ｂ−ｒｅｐ（５’−ＡＣＧＡＴＡＡＧＡＣＧＡＧＣＴＧＧＣＴＴ−３’（配列番号３２））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１２とした。ＰＣＲ産物を精製し、３０μＬのＨ２Ｏに溶かした。【０１９９】
ｐＳＧＲ−ＮＣ１及び精製したＰＣＲ産物ｎｏ．１２を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＭｕｎＩで消化し、各ＨＣＶ  ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。こうして得られた組換え発現ベクター（アミノ酸置換Ｒ２１９２Ｌを引き起こす塩基置換を有する）をｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｒ２１９２Ｌと名付けた。【０２００】
ｐＳＧＲ−ＮＣ１を鋳型ＤＮＡとし、６６２０Ｓ−Ｃｏｎ．１（５’−ＴＡＣＧＣＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＣＴＡ−３’（配列番号２９））及び２１９２ＲＱ−Ｒ（５’−ＧＧＧＧＧＡＣＣＣＴＴＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＴＴＡＧＣ−３’（配列番号３９））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１３とした。【０２０１】
次に、ｐＳＧＲ−ＮＣ１を鋳型ＤＮＡとし、２１９２ＲＱ−Ｓ（５’−ＡＧＧＣＴＧＧＣＣＣＡＡＧＧＧＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＴＴＴ−３’（配列番号４０））及び６４４７Ｒ−１ｂ−ｒｅｐ（５’−ＡＣＧＡＴＡＡＧＡＣＧＡＧＣＴＧＧＣＴＴ−３’（配列番号３２））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１４とした。【０２０２】
それぞれのＰＣＲ産物を精製し、１５μＬのＨ２Ｏに溶解した。ＰＣＲ産物ｎｏ．１３とＰＣＲ産物ｎｏ．１４のＤＮＡを１μＬずつ混合した。これを鋳型ＤＮＡとし、６６２０Ｓ−Ｃｏｎ．１（５’−ＴＡＣＧＣＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＣＴＡ−３’（配列番号２９））及び６４４７Ｒ−１ｂ−ｒｅｐ（５’−ＡＣＧＡＴＡＡＧＡＣＧＡＧＣＴＧＧＣＴＴ−３’（配列番号３２））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１５とした。ＰＣＲ産物を精製し、３０μＬのＨ２Ｏに溶解した。【０２０３】
ｐＳＧＲ−ＮＣ１及び精製したＰＣＲ産物ｎｏ．１５を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＭｕｎＩで消化し、各ＨＣＶ  ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。こうして得られた組換え発現ベクター（アミノ酸置換Ｒ２１９２Ｑを引き起こす塩基置換を有する）をｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｒ２１９２Ｑと名付けた。【０２０４】
ｐＳＧＲ−ＮＣ１を鋳型ＤＮＡとし、７０９４Ｓ−１ｂ−ｒｅｐ（５’−ＧＴＣＧＧＴＣＧＣＧＣＡＣＧＡＴＧＣＡＴ−３’（配列番号４１））及び２８７１ＹＣ−Ｒ（５’−ＴＴＣＡＡＴＧＧＡＧＣＡＡＧＴＧＧＣＣＣＣＧＴＡＧＡＴＣＴ−３’（配列番号４２））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１６とした。【０２０５】
次に、ｐＳＧＲ−ＮＣ１を鋳型ＤＮＡとし、２８７１ＹＣ−Ｓ（５’−ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＴＧＣＴＣＣＡＴＴＧＡＡＣＣＡＣＴＴＧＡＣ−３’（配列番号４３））及び６４４７Ｒ−１ｂ−ｒｅｐ（５’−ＡＣＧＡＴＡＡＧＡＣＧＡＧＣＴＧＧＣＴＴ−３’（配列番号３２））をＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１７とした。【０２０６】
それぞれのＰＣＲ産物を精製し、１５μＬのＨ２Ｏに溶かした。ＰＣＲ産物ｎｏ．１６とＰＣＲ産物ｎｏ．１７のＤＮＡを１μＬずつ混合した。これを鋳型ＤＮＡとし、７０９４Ｓ−１ｂ−ｒｅｐ（５’−ＧＴＣＧＧＴＣＧＣＧＣＡＣＧＡＴＧＣＡＴ−３’（配列番号４１））及び６４４７Ｒ−１ｂ−ｒｅｐ（５’−ＡＣＧＡＴＡＡＧＡＣＧＡＧＣＴＧＧＣＴＴ−３’（配列番号３２））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１８とした。ＰＣＲ産物を精製し、３０μＬのＨ２Ｏに溶解した。【０２０７】
ｐＳＧＲ−ＮＣ１及び精製したＰＣＲ産物ｎｏ．１８を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＭｕｎＩで消化し、各ＨＣＶ  ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。こうして得られた組換え発現ベクター（アミノ酸置換Ｙ２８７１Ｃを引き起こす塩基置換を有する）をｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｙ２８７１Ｃと名付けた。【０２０８】
実施例２と同様の方法で、発現ベクターｐＳＧＲ−ＮＣ１、ｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙ、ｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇ、ｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｐ２１６１Ｒ、ｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｒ２１９２Ｌ、ｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｒ２１９２Ｑ及びｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｙ２８７１Ｃから、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを合成した。作製した合成ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡについて、各サブゲノムレプリコンＲＮＡ  １μｇをエレクトロポレーション法によりＨｕｈ７細胞に導入した。エレクトロポレーション処理を行ったＨｕｈ７細胞を培養ディッシュに播種し、１６時間〜２４時間培養した後に、培養ディッシュにＧ４１８（ネオマイシン）を添加した。その後、週に２回培養液を交換しながら培養を継続した。播種時から２１日間培養した後、クリスタルバイオレットで生存細胞を染色した。【０２０９】
その結果を図５に示す。図中、「Ｐ２１６１Ｒ」はｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｐ２１６１Ｒ、「Ｒ２１９２Ｌ」はｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｒ２１９２Ｌ、「Ｒ２１９２Ｑ」はｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｒ２１９２Ｑ、「Ｓ２１９７Ｙ」はｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙ、「Ｓ２２０４Ｇ」はｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇ、「野生型」はｐＳＧＲ−ＮＣ１、「Ｙ２８７１Ｃ」はｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｙ２８７１Ｃから作製したＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞の染色結果を示す。【０２１０】
その結果、いずれのサブゲノムレプリコンＲＮＡを導入した細胞についても、コロニー形成が確認できた。また、ｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｐ２１６１Ｒ、ｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｒ２１９２Ｑ、ｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙ、ｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｓ２２０４ＧのサブゲノムレプリコンＲＮＡを導入した場合にコロニー形成能が高く、ｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｐ２１６１Ｒ、ｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙのコロニー形成能が特に高かった（図５）。【０２１１】
よって、ＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡに、上記アミノ酸変異を導入しても自律複製能は維持されるか又は高まることが示された。特に、Ｐ２１６１Ｒ又はＳ２１９７Ｙのアミノ酸変異を導入することにより、ＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの自律複製能が顕著に高まることが示された。【０２１２】
（実施例６）変異体ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ゲノムＲＮＡ）発現ベクターの構築
実施例４で見出されたアミノ酸置換をＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡに導入することにより、培養細胞でＨＣＶ粒子の産生が可能であるかどうかを評価するため、全長ＨＣＶゲノム配列を有するＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを発現するプラスミドベクターの構築を行った。【０２１３】
具体的には、実施例１で作製したｐＮＣ１及び実施例５で作製した各ｐＳＧＲ−ＮＣ１変異体（ｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙ、ｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇ、ｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｐ２１６１Ｒ、ｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｒ２１９２Ｌ、ｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｒ２１９２Ｑ及びｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｙ２８７１Ｃ）を、制限酵素ＢｓｒＧＩ及びＸｂａＩで消化し、各ＨＣＶ  ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し精製した。ｐＮＣ１のＤＮＡ断片と各ｐＳＧＲ−ＮＣ１変異体のＤＮＡ断片にＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社）を加え混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。こうして得られたアミノ酸置換を有するＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの発現ベクターを、ｐＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙ、ｐＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇ、ｐＮＣ１  Ｐ２１６１Ｒ、ｐＮＣ１  Ｒ２１９２Ｌ、ｐＮＣ１  Ｒ２１９２Ｑ及びｐＮＣ１  Ｙ２８７１Ｃと名付けた（図６）。なお、図中の「ＢｓｒＧＩ」及び「ＸｂａＩ」は制限酵素サイトを示す。【０２１４】
（実施例７）変異体ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞におけるＨＣＶ粒子産生能の評価
実施例６で得られた各発現ベクターを制限酵素ＸｂａＩで切断し、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行った。次いで、ＸｂａＩ切断断片を、Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ処理し、ＸｂａＩ切断断片からＸｂａＩ認識配列由来の余分な３’末端のＣＴＡＧの４塩基を除去した。次いで、ＸｂａＩ切断断片を含むＭｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ処理後溶液について、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ処理、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行ってＤＮＡ断片を精製した。これを鋳型ＤＮＡとして、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）  Ｔ７  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いてＲＮＡの合成を行った。【０２１５】
ＲＮＡ合成終了後、反応溶液にＤＮａｓｅ（２Ｕ）を添加して３７℃で１５分間反応させることにより鋳型ＤＮＡを除去し、さらに酸性フェノールによるＲＮＡ抽出を行うことにより、変異体ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを取得した。【０２１６】
ここで得られた変異体ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、ＮＣ１全長ゲノムＲＮＡの変異体でもある。なお、Ｓ２１９７Ｙ、Ｓ２２０４Ｇ、Ｐ２１６１Ｒ、Ｒ２１９２Ｌ、Ｒ２１９２Ｑ及びＹ２８７１Ｃの変異が導入されたＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ、すなわちＮＣ１全長ゲノムＲＮＡ変異体を、それぞれ、「ＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙ」、「ＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇ」、「ＮＣ１  Ｐ２１６１Ｒ」、「ＮＣ１  Ｒ２１９２Ｌ」、「ＮＣ１  Ｒ２１９２Ｑ」及び「ＮＣ１  Ｙ２８７１Ｃ」と呼ぶ。【０２１７】
得られた変異体ＮＣ１のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（１０μｇ）を、エレクトロポレーション法によりＨｕｈ７細胞に導入（トランスフェクト）した。このエレクトロポレーション処理後のＨｕｈ７細胞を培養ディッシュに播種し、１６時間〜２４時間培養した後に、培養ディッシュにＧ４１８（ネオマイシン）を添加した。その後、週に２回継代しながら培養を継続した。経時的に、培養上清中に含まれるＨＣＶのＣｏｒｅタンパク質を、ＨＣＶ抗原ＥＬＩＳＡテストキット（オーソ社）を用いて定量することにより、ＨＣＶ粒子産生の確認を行った。【０２１８】
図７に結果を示す。図中の「ＮＣ１／ｗｔ」は変異のない野生型のＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞を示す。また、「Ｐ２１６１Ｒ」、「Ｒ２１９２Ｌ」、「Ｒ２１９２Ｑ」、「Ｓ２１９７Ｙ」、「Ｓ２２０４Ｇ」及び「Ｙ２８７１Ｃ」は、それぞれ各変異が導入された変異体ＮＣ１のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞を示す。【０２１９】
野生型のＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞では、培養上清中にＣｏｒｅタンパク質がほとんど検出されなかった。一方、Ｓ２１９７Ｙ及びＳ２２０４Ｇの変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞においては、ＲＮＡ導入後から培養上清中にＣｏｒｅタンパク質が検出され、特に、Ｓ２１９７ＹにおいてＣｏｒｅタンパク質量が多かった。このことから、野生型のＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡにＳ２１９７Ｙ又はＳ２２０４Ｇの変異を導入した変異体（ＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙ又はＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇ）は、培養細胞に導入した場合に、細胞外へＨＣＶ粒子を産生することが示された。興味深いことに、サブゲノムレプリコンでコロニー形成能（自律複製能）が高いＰ２１６１Ｒは、フルゲノムレプリコンでは、培養上清中に、Ｃｏｒｅタンパク質がほとんど検出されなかった。【０２２０】
配列番号２３にｐＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙがコードする前駆体タンパク質（Ｃｏｒｅタンパク質〜ＮＳ５Ｂタンパク質）のアミノ酸配列を、配列番号２４にｐＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇがコードする前駆体タンパク質のアミノ酸配列を示す。また、配列番号１９にＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙの全長ゲノムＲＮＡ（ｐＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙから合成される変異体ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ）のｃＤＮＡ塩基配列を、配列番号２０にＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇの全長ゲノムＲＮＡ（ｐＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇから合成される変異体ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ）のｃＤＮＡ塩基配列を示す。【０２２１】
（実施例８）ＮＣ１  Ｓ２１９７ＹのＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ゲノムＲＮＡ）由来のＨＣＶ粒子の感染性の評価
実施例７で産生が確認されたＮＣ１  Ｓ２１９７ＹのＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ゲノムＲＮＡ）由来のＨＣＶ粒子（以下、ＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙ  ＨＣＶ粒子）が感染性を有しているかどうかについて確認を行った。【０２２２】
実施例７と同様に、ＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙ  ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ゲノムＲＮＡ）をエレクトロポレーション法によりＨｕｈ７細胞に導入（トランスフェクト）し、３〜７日おきに継代培養を行った。細胞導入から２日目又は１５日目の培養上清を採取し、培養上清中に含まれるＨＣＶのＣｏｒｅタンパク質を、ＨＣＶ抗原ＥＬＩＳＡテストキット（オーソ社）を用いて定量した。【０２２３】
また、採取した培養上清を別のＨｕｈ７細胞に添加し、７２時間後のＨＣＶ感染細胞数をフォーカス法により計測することにより感染力価を算出した。より具体的には、培養ディッシュにＨｕｈ７細胞を播種し、翌日、培地で段階希釈した培養上清を細胞に感染させ、３７℃、７２時間培養した。ウイルス感染細胞の検出は抗原抗体反応による免疫染色法により行った。感染７２時間後の細胞を室温で２０分にわたり１０％ホルマリン−ＰＢＳ（−）溶液中で固定化した後、室温で１０分間、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−ＰＢＳ（−）で処理した。その後、１次抗体として５％スキムミルク−ＰＢＳ（−）で希釈した抗ＨＣＶ−Ｃｏｒｅ（クローンＣＰ１４）モノクローナル抗体（３００倍希釈物）を加えて室温で１時間反応させた。さらに、ＰＢＳ（−）で３回洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウス抗体（３００倍希釈物）を加えて室温で１時間反応させた。ＰＢＳ（−）で３回洗浄した後に、コニカイムノステインＨＲＰ−１０００（コニカミノルタ社）を加え、青色に染色したウイルス抗原陽性細胞集団（免疫フォーカス；フォーカスとも呼ぶ）の数を顕微鏡下で測定した。【０２２４】
その結果を表１に示す。表中の「ＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙ（Ｄ２）」は、ＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙ導入から２日目の培養上清を示し、「ＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙ（Ｄ１５）」は導入後１５日目の培養上清を示す。
【表１】
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【０２２５】
感染力価は２日目の培養上清で３ｆｆｕ／ｍＬ、１５日目の培養上清で１６ｆｆｕ／ｍＬとなった。この値を培養上清中のＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質量（それぞれ１，７２１及び１，００９ｆｍｏｌ／Ｌ）で除した、単位ＨＣＶタンパク質当たりの感染力価は、２日目の培養上清で０．００２（感染力価／Ｃｏｒｅ値）、１５日目の培養上清で０．０１６（感染力価／Ｃｏｒｅ値）となった。【０２２６】
このことから、ＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙ  ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ゲノムＲＮＡ）の細胞導入により産生されたＨＣＶ粒子は、感染性を有することが示された。【０２２７】
（実施例９）Ｅ１２０２Ｇ／Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２１９７Ｙが導入された変異体ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ゲノムＲＮＡ）の発現ベクター構築
公知文献によると、非構造領域であるＮＳ３タンパク質領域の第１２０２番目のアミノ酸置換、すなわちＥ１２０２Ｇを引き起こす塩基置換（Ｋｒｉｅｇｅｒら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．、２００１年、第７５巻、ｐ．４６１４−４６２４）及び、同じく非構造領域であるＮＳ５Ａタンパク質領域の第２０４０番目のアミノ酸置換、すなわちＫ２０４０Ｒを引き起こす塩基置換（Ｙｉら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．、２００４年、第７８巻、ｐ．７９０４−７９１５）は、ＨＣＶ複製の適応変異と報告されている。上記実施例で得られた、ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ゲノムＲＮＡ）の感染性ＨＣＶ粒子分泌を促進する適応変異とともに、これら公知文献記載の適応変異を導入した。【０２２８】
具体的には、変異の導入は実施例５と同様にＰＣＲを用いて行った。ＰＣＲ条件は以下のとおりである。まず、ＰＣＲの鋳型ＤＮＡに、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付の、５×緩衝液を１０μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μＬ、１００μＭのプライマー（フォワード及びリバースそれぞれ）を０．２５μＬ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μＬとした。その後、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μＬ加え、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５５℃で１５秒及び７２℃で８０秒を１サイクルとして、２５サイクル行った。【０２２９】
まず、ｐＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙを鋳型ＤＮＡとし、３７５１Ｓ−ＮＣ１（５’−ＴＧＴＧＴＴＧＧＡＣＣＧＴＣＴＡＣＣＡＴ−３’（配列番号４４））及び１ｂ−１２０２ＥＧ−Ｒ（５’−ＧＣＡＴＧＧＴＧＧＴＴＣＣＣＡＴＧＧＡＣＴＣＡＡＣＧＧＧＴＡ−３’（配列番号４５））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．１９とした。【０２３０】
次に、ｐＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙを鋳型ＤＮＡとし、１ｂ−１２０２ＥＧ−Ｓ（５’−ＧＴＣＣＡＴＧＧＧＡＡＣＣＡＣＣＡＴＧＣＧＧＴＣＴＣＣＧＧＴ−３’（配列番号４６））及び４５９８Ｒ−ＮＣ１（５’−ＣＧＧＴＡＧＴＡＣＧＣＴＡＣＡＧＣＡＴＴ−３’（配列番号４７））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．２０とした。【０２３１】
それぞれのＰＣＲ産物を精製し、１５μＬのＨ２Ｏに溶解した。ＰＣＲ産物ｎｏ．１９とＰＣＲ産物ｎｏ．２０のＤＮＡを１μＬずつ混合した。これを鋳型ＤＮＡとし、３７５１Ｓ−ＮＣ１（５’−ＴＧＴＧＴＴＧＧＡＣＣＧＴＣＴＡＣＣＡＴ−３’（配列番号４４））及び４５９８Ｒ−ＮＣ１（５’−ＣＧＧＴＡＧＴＡＣＧＣＴＡＣＡＧＣＡＴＴ−３’（配列番号４７））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．２１とした。ＰＣＲ産物を精製し、３０μＬのＨ２Ｏに溶解した。【０２３２】
ｐＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙ及び精製したＰＣＲ産物ｎｏ．２１を制限酵素ＢｓｒＧＩ及びＸｈｏＩで消化し、各ＨＣＶ  ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。こうして得られた組換え発現ベクター（アミノ酸置換Ｓ２１９７Ｙ及びＥ１２０２Ｇを引き起こす塩基置換を有する）をｐＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙと名付けた。なお、ｐＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙから合成されるＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ゲノムＲＮＡ）の配列を配列番号２１に示す。【０２３３】
ｐＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙを鋳型ＤＮＡとし、５２９２Ｓ−ＮＣ１（５’−ＧＣＣＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＴＣＧＴＣＡＣ−３’（配列番号４８））及び１ｂ−２０４０ＫＲ−Ｒ（５’−ＧＡＡＣＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＴＧＡＴＣＴＧＴ−３’（配列番号４９））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．２２とした。【０２３４】
次に、ｐＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙを鋳型ＤＮＡとし、１ｂ−２０４０ＫＲ−Ｓ（５’−ＧＧＡＣＡＴＧＴＣＡＧＧＡＡＣＧＧＴＴＣＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣ−３’（配列番号５０））及び６７８９Ｒ−ＮＣ１（５’−ＧＡＣＣＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＣＣＴＣＡＴ−３’（配列番号５１））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．２３とした。【０２３５】
それぞれのＰＣＲ産物を精製し、１５μＬのＨ２Ｏに溶解した。ＰＣＲ産物ｎｏ．２２とＰＣＲ産物ｎｏ．２３のＤＮＡを１μｌずつ混合した。これを鋳型ＤＮＡとし、５２９２Ｓ−ＮＣ１（５’−ＧＣＣＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＴＣＧＴＣＡＣ−３’（配列番号４８））及び６７８９Ｒ−ＮＣ１（５’−ＧＡＣＣＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＣＣＴＣＡＴ−３’（配列番号５１））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．２４とした。ＰＣＲ産物を精製し、３０μＬのＨ２Ｏに溶解した。【０２３６】
ｐＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙ及び精製したＰＣＲ産物ｎｏ．２４を制限酵素ＦｓｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、各ＨＣＶ  ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。こうして得られた組換え発現ベクター（アミノ酸置換Ｓ２１９７Ｙ及びＫ２０４０Ｒ）を引き起こす塩基置換を有する）をｐＮＣ１  Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２１９７Ｙと名付けた。【０２３７】
同様の操作を行って、アミノ酸置換Ｅ１２０２Ｇ、Ｋ２０４０Ｒ及びＳ２１９７Ｙを引き起こす塩基置換を有する組換え発現ベクターｐＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２１９７Ｙを作製した。これらの組換え発現ベクターの構造を図８に示す。【０２３８】
（実施例１０）Ｅ１２０２Ｇ／Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２２０４Ｇが導入された変異体ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ゲノムＲＮＡ）の発現ベクター構築
変異の導入は実施例５と同様にＰＣＲを用いて行った。ＰＣＲ条件は以下のとおりである。まず、ＰＣＲの鋳型ＤＮＡに、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）に添付の、５×緩衝液を１０μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を４μＬ、１００μＭのプライマー（フォワード及びリバースそれぞれ）を０．２５μＬ加え、最終的に脱イオン水を加え全量を４９．５μＬとした。その後、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社）を０．５μＬ加え、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５５℃で１５秒及び７２℃で８０秒を１サイクルとして、２５サイクル行った。    
ｐＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇを鋳型ＤＮＡとし、３７５１Ｓ−ＮＣ１（５’−ＴＧＴＧＴＴＧＧＡＣＣＧＴＣＴＡＣＣＡＴ−３’（配列番号４４））及び１ｂ−１２０２ＥＧ−Ｒ（５’−ＧＣＡＴＧＧＴＧＧＴＴＣＣＣＡＴＧＧＡＣＴＣＡＡＣＧＧＧＴＡ−３’（配列番号４５））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．２５とした。【０２３９】
次に、ｐＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇを鋳型ＤＮＡとし、１ｂ−１２０２ＥＧ−Ｓ（５’−ＧＴＣＣＡＴＧＧＧＡＡＣＣＡＣＣＡＴＧＣＧＧＴＣＴＣＣＧＧＴ−３’（配列番号４６））及び４５９８Ｒ−ＮＣ１（５’−ＣＧＧＴＡＧＴＡＣＧＣＴＡＣＡＧＣＡＴＴ−３’（配列番号４７））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．２６とした。【０２４０】
それぞれのＰＣＲ産物を精製し、１５μＬのＨ２Ｏに溶解した。ＰＣＲ産物ｎｏ．２５とＰＣＲ産物ｎｏ．２６のＤＮＡを１μＬずつ混合した。これを鋳型ＤＮＡとし、３７５１Ｓ−ＮＣ１（５’−ＴＧＴＧＴＴＧＧＡＣＣＧＴＣＴＡＣＣＡＴ−３’（配列番号４４））及び４５９８Ｒ−ＮＣ１（５’−ＣＧＧＴＡＧＴＡＣＧＣＴＡＣＡＧＣＡＴＴ−３’（配列番号４７））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．２７とした。ＰＣＲ産物を精製し、３０μＬのＨ２Ｏに溶解した。【０２４１】
ｐＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇ及び精製したＰＣＲ産物ｎｏ．２７を制限酵素ＢｓｒＧＩ及びＸｈｏＩで消化し、各ＨＣＶ  ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。こうして得られた組換え発現ベクター（アミノ酸置換Ｓ２２０４Ｇ及びＥ１２０２Ｇを引き起こす塩基置換を有する）をｐＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇと名付けた。なお、ｐＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇから合成されるＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ゲノムＲＮＡ）の配列を配列番号２２に示す。【０２４２】
ｐＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇを鋳型ＤＮＡとし、５２９２Ｓ−ＮＣ１（５’−ＧＣＣＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＴＣＧＴＣＡＣ−３’（配列番号４８））及び１ｂ−２０４０ＫＲ−Ｒ（５’−ＧＡＡＣＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＴＧＡＴＣＴＧＴ−３’（配列番号４９））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．２８とした。【０２４３】
次に、ｐＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇを鋳型ＤＮＡとし、１ｂ−２０４０ＫＲ−Ｓ（５’−ＧＧＡＣＡＴＧＴＣＡＧＧＡＡＣＧＧＴＴＣＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣ−３’（配列番号５０））及び６７８９Ｒ−ＮＣ１（５’−ＧＡＣＣＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＣＣＴＣＡＴ−３’（配列番号５１））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．２９とした。【０２４４】
それぞれのＰＣＲ産物を精製し、１５μＬのＨ２Ｏに溶解した。ＰＣＲ産物ｎｏ．２８とＰＣＲ産物ｎｏ．２９のＤＮＡを１μＬずつ混合した。これを鋳型ＤＮＡとし、５２９２Ｓ−ＮＣ１（５’−ＧＣＣＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＴＣＧＴＣＡＣ−３’（配列番号４８））及び６７８９Ｒ−ＮＣ１（５’−ＧＡＣＣＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＣＣＴＣＡＴ−３’（配列番号５１））をプライマーとして、上記ＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｎｏ．３０とした。ＰＣＲ産物を精製し、３０μＬのＨ２Ｏに溶かした。【０２４５】
ｐＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇ及び精製したＰＣＲ産物ｎｏ．３０を制限酵素ＦｓｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、各ＨＣＶ  ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画し、精製した。これら２つのＤＮＡ断片とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。こうして得られた組換え発現ベクター（アミノ酸置換Ｓ２２０４Ｇ及びＫ２０４０Ｒ）を引き起こす塩基置換を有する）をｐＮＣ１  Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２２０４Ｇと名付けた。【０２４６】
同様の操作を行って、アミノ酸置換Ｅ１２０２Ｇ、Ｋ２０４０Ｒ及びＳ２２０４Ｇを引き起こす塩基置換を有する組換え発現ベクターｐＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２２０４Ｇを作製した。これらの組換え発現ベクターの構造を図９に示す。【０２４７】
（実施例１１）Ｓ２１９７Ｙ、Ｓ２２０４Ｇ、Ｅ１２０２Ｇ及びＫ２０４０Ｒの組み合わせ変異体ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞におけるＨＣＶ複製能の評価
実施例１で構築した発現ベクターｐＮＣ１、実施例６で構築した発現ベクターｐＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙ及びｐＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇ、実施例９で構築した発現ベクターｐＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ、ｐＮＣ１  Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２１９７Ｙ及びｐＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２１９７Ｙ並びに実施例１０で構築した発現ベクターｐＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇ、ｐＮＣ１  Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２２０４Ｇ及びｐＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２２０４Ｇを用いて、実施例７と同様の手法でＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ゲノムＲＮＡ）を作製した。【０２４８】
なお、Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ、Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２１９７Ｙ、Ｅ１２０２Ｇ／Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２１９７Ｙ、Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇ、Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２２０４Ｇ及びＥ１２０２Ｇ／Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２２０４Ｇの変異が導入されたＮＣ１株由来ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（ＮＣ１全長ゲノムＲＮＡ変異体）を、それぞれ、「ＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ」、「ＮＣ１  Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２１９７Ｙ」、「ＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２１９７Ｙ」、「ＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇ」、「ＮＣ１  Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２２０４Ｇ」及び「ＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２２０４Ｇ」と呼ぶ。【０２４９】
得られたＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ゲノムＲＮＡ）である、ＮＣ１（野生型）（配列番号１）、ＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙ（配列番号１９）、ＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇ（配列番号２０）、ＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ（配列番号２１）、ＮＣ１  Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２１９７Ｙ、ＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２１９７Ｙ、ＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇ（配列番号２２）、ＮＣ１  Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２２０４Ｇ及びＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２２０４Ｇを、それぞれ、エレクトロポレーション法によりＨｕｈ７細胞に導入（トランスフェクト）した。導入から４、２４、４８、７２及び９６時間後の細胞を回収し、ＨＣＶ抗原ＥＬＩＳＡテストキット（オーソ社）を用いてその細胞内に含まれるＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質を定量することにより、細胞内でのＨＣＶ複製能の評価を行った。【０２５０】
その結果を図１０に示す。図中の「ＮＣ１／ｗｔ」は変異のない野生型のＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞を示す。また、「Ｓ２１９７Ｙ」、「Ｓ２２０４Ｇ」、「Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ」、「Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇ」、「Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２１９７Ｙ」、「Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２２０４Ｇ」、「Ｅ１２０２Ｇ／Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２１９７Ｙ」及び「Ｅ１２０２Ｇ／Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２２０４Ｇ」は、それぞれ各変異が導入された変異体ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞を示す。【０２５１】
野生型のＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞では、細胞中のＣｏｒｅタンパク質の発現がほとんど検出されなかった。一方、変異体ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞においては、ＲＮＡ導入後から細胞内Ｃｏｒｅタンパク質量が上昇し、特に、Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ及びＥ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇの変異体が高値を示した。これら変異にさらにＫ２０４０Ｒの変異を導入したＥ１２０２Ｇ／Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２１９７Ｙ及びＥ１２０２Ｇ／Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２２０４Ｇの変異導入の場合は、むしろその細胞内Ｃｏｒｅタンパク質量は減少した。【０２５２】
このことから、野生型のＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡにＥ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ又はＥ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇの変異を導入した変異体（ＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ（配列番号２１）又はＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇ（配列番号２２））は、培養細胞に導入した場合に、細胞内で効率良く自律複製することが示された。【０２５３】
（実施例１２）Ｓ２１９７Ｙ、Ｓ２２０４Ｇ、Ｅ１２０２Ｇ及びＫ２０４０Ｒの組み合わせ変異体ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞におけるＨＣＶ粒子産生能の評価
実施例１１でＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ゲノムＲＮＡ）を導入（トランスフェクト）されたＨｕｈ７細胞の培養上清中のＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質を定量することによってＨＣＶ粒子産生量を評価した。ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの導入から４、２４、４８、７２及び９６時間後の培養上清を回収し、ＨＣＶ抗原ＥＬＩＳＡテストキット（オーソ社）を用いてその培養上清中に含まれるＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質の定量を行った。【０２５４】
その結果を図１１に示す。図中の「ＮＣ１／ｗｔ」は変異のない野生型のＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞を示す。また、「Ｓ２１９７Ｙ」、「Ｓ２２０４Ｇ」、「Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ」、「Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇ」、「Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２１９７Ｙ」、「Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２２０４Ｇ」、「Ｅ１２０２Ｇ／Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２１９７Ｙ」及び「Ｅ１２０２Ｇ／Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２２０４Ｇ」は、それぞれ各変異が導入された変異体ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞を示す。【０２５５】
野生型のＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの導入細胞では、培養上清中のＣｏｒｅタンパク質がほとんど検出されなかった。一方、変異体ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの導入においては、ＲＮＡ導入後から培養上清中のＣｏｒｅタンパク質量が上昇し、特に、Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ及びＥ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇの変異体が高値を示した。これら変異にさらにＫ２０４０Ｒの変異を導入したＥ１２０２Ｇ／Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２１９７Ｙ及びＥ１２０２Ｇ／Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２２０４Ｇの変異導入の場合は、むしろその培養上清中のＣｏｒｅタンパク質は減少した。【０２５６】
このことから、野生型のＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡにＥ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ又はＥ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇの変異を導入した変異体（ＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ（配列番号２１）又はＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇ（配列番号２２））は、培養細胞に導入した場合に、培養上清中に効率良くＨＣＶ粒子を産生することが示された。【０２５７】
配列番号２５にｐＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙがコードする前駆体タンパク質（Ｃｏｒｅタンパク質〜ＮＳ５Ｂタンパク質）のアミノ酸配列を、配列番号２６にｐＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇがコードする前駆体タンパク質のアミノ酸配列を示す。また、配列番号２１にＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙの全長ゲノムＲＮＡ（ｐＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙから合成される変異体ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ）のｃＤＮＡ塩基配列を、配列番号２２にＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇの全長ゲノムＲＮＡ（ｐＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇから合成される変異体ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ）のｃＤＮＡの塩基配列を示す。【０２５８】
（実施例１３）ＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ及びＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４ＧのＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ゲノムＲＮＡ）由来のＨＣＶ粒子の感染性の評価
実施例１２で産生が確認されたＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙ、ＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ、ＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２１９７Ｙ、ＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇ、ＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇ及びＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｋ２０４０Ｒ／Ｓ２２０４ＧのＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ゲノムＲＮＡ）由来のＨＣＶ粒子が感染性を有しているかどうかについて確認を行った。【０２５９】
実施例１２で、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ゲノムＲＮＡ）をＨｕｈ７細胞に導入（トランスフェクト）した７２時間後の培養上清を用いて、実施例８と同様にＨＣＶ感染細胞数をフォーカス法により計測することにより感染力価を算出した。また、実施例８と同様に、培養上清中に含まれるＨＣＶのＣｏｒｅタンパク質を、ＨＣＶ抗原ＥＬＩＳＡテストキット（オーソ社）を用いて定量した。【０２６０】
その結果を表２に示す。感染力価はＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙの培養上清で２３．３ｆｆｕ／ｍＬ、ＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇの培養上清で１３．３ｆｆｕ／ｍＬであるのに対し、ＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙの培養上清では７９２．０ｆｆｕ／ｍＬ、ＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇの培養上清では６７５．０ｆｆｕ／ｍＬと高値を示した。また、培養上清中のＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質量で各々の感染力価を除した値は、ＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙの培養上清で０．００９、ＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇの培養上清で０．００８であるのに対し、ＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙの培養上清では０．０９７、ＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇの培養上清では０．０９７であった。
【表２】
2012133735.tif 000003
【０２６１】
このことから、野生型のＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡにＥ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ又はＥ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇの変異を導入した変異体（ＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙ（配列番号２１）又はＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇ（配列番号２２））を導入された細胞から産生されたＨＣＶ粒子は、高い感染性を有することが示された。【０２６２】
配列表に記載の配列は以下の通りである。【０２６３】
配列番号１：野生型ＮＣ１株の全長ゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ配列（図１Ａ)
配列番号２：野生型ＮＣ１株ゲノムＲＮＡの５’ＵＴＲのｃＤＮＡ塩基配列
配列番号３：野生型ＮＣ１株ゲノムＲＮＡのＣｏｒｅタンパク質コード配列のｃＤＮＡ塩基配列
配列番号４：野生型ＮＣ１株ゲノムＲＮＡのＥ１タンパク質コード配列のｃＤＮＡ塩基配列
配列番号５：野生型ＮＣ１株ゲノムＲＮＡのＥ２タンパク質コード配列のｃＤＮＡ塩基配列
配列番号６：野生型ＮＣ１株ゲノムＲＮＡのｐ７タンパク質コード配列のｃＤＮＡ塩基配列
配列番号７：野生型ＮＣ１株ゲノムＲＮＡのＮＳ２タンパク質コード配列のｃＤＮＡ塩基配列
配列番号８：野生型ＮＣ１株ゲノムＲＮＡのＮＳ３タンパク質コード配列のｃＤＮＡ塩基配列
配列番号９：野生型ＮＣ１株ゲノムＲＮＡのＮＳ４Ａタンパク質コード配列のｃＤＮＡ塩基配列
配列番号１０：野生型ＮＣ１株ゲノムＲＮＡのＮＳ４Ｂタンパク質コード配列のｃＤＮＡ塩基配列
配列番号１１：野生型ＮＣ１株ゲノムＲＮＡのＮＳ５Ａタンパク質コード配列のｃＤＮＡ塩基配列
配列番号１２：野生型ＮＣ１株ゲノムＲＮＡのＮＳ５Ｂタンパク質コード配列のｃＤＮＡ塩基配列
配列番号１３：野生型ＮＣ１株ゲノムＲＮＡの３’ＵＴＲのｃＤＮＡ塩基配列
配列番号１４：野生型ＮＣ１株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１５：野生型ＮＣ１株の前駆体タンパク質中のＮＳ３タンパク質からＮＳ５Ｂタンパク質までの領域のアミノ酸配列
配列番号１６：野生型ＮＣ１株のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのｃＤＮＡ塩基配列（図１Ｄ）
配列番号１７：ｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙから合成される、変異体ＮＣ１  Ｓ２１９７ＹのＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのｃＤＮＡ塩基配列
配列番号１８：ｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇから合成される、変異体ＮＣ１  Ｓ２２０４ＧのＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのｃＤＮＡ塩基配列
配列番号１９：変異体ＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙの全長ゲノムＲＮＡ（ｐＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙから合成される変異体ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ）のｃＤＮＡ塩基配列
配列番号２０：変異体ＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇの全長ゲノムＲＮＡ（ｐＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇから合成される変異体ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ）のｃＤＮＡ塩基配列
配列番号２１：変異体ＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙの全長ゲノムＲＮＡ（ｐＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙから合成される変異体ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ）のｃＤＮＡ塩基配列
配列番号２２：変異体ＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇの全長ゲノムＲＮＡ（ｐＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇから合成される変異体ＮＣ１株のＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ）のｃＤＮＡ塩基配列
配列番号２３：ｐＮＣ１  Ｓ２１９７Ｙがコードする前駆体タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２４：ｐＮＣ１  Ｓ２２０４Ｇがコードする前駆体タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２５：ｐＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２１９７Ｙがコードする前駆体タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２６：ｐＮＣ１  Ｅ１２０２Ｇ／Ｓ２２０４Ｇがコードする前駆体タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２７：プライマー
５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’
配列番号２８：プライマー
５’−ＧＣＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＣＣＴＴＴＣＡＣ−３’
配列番号２９：プライマー６６２０Ｓ−Ｃｏｎ．１
５’−ＴＡＣＧＣＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＣＴＡ−３’
配列番号３０：プライマー３１９７ＳＹ−Ｒ
５’−ＧＣＴＧＧＣＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＣＣＴＣＧＧＧＣ−３’
配列番号３１：プライマー３１９７ＳＹ−Ｓ
５’−ＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＡＴＴＴＧＧＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴ−３’
配列番号３２：プライマー６４４７Ｒ−１ｂ−ｒｅｐ
５’−ＡＣＧＡＴＡＡＧＡＣＧＡＧＣＴＧＧＣＴＴ−３’
配列番号３３：プライマー２２０４ＳＧ−Ｒ
５’−ＧＡＣＡＡＣＴＧＡＣＣＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＣＴＧＧＣＣＡＡＡ−３’
配列番号３４：プライマー２２０４ＳＧ−Ｓ
５’−ＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＣＡＧＴＴＧＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＣ−３’
配列番号３５：プライマー２１６１ＰＲ−Ｒ
５’−ＧＧＧＴＴＣＡＣＡＴＣＧＡＡＧＣＴＧＴＧＡＣＣＣＧＡＣＣ−３’
配列番号３６：プライマー２１６１ＰＲ−Ｓ
５’−ＴＣＡＣＡＧＣＴＴＣＧＡＴＧＴＧＡＡＣＣＣＧＡＧＣＣＧＧＡＴ−３’
配列番号３７：プライマー２１９２ＲＬ−Ｒ
５’−ＧＧＧＧＧＡＣＣＣＴＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＴＴＡＧＣ−３’
配列番号３８：プライマー２１９２ＲＬ−Ｓ
５’−ＡＧＧＣＴＧＧＣＣＣＴＡＧＧＧＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＴＴＴ−３’
配列番号３９：プライマー２１９２ＲＱ−Ｒ
５’−ＧＧＧＧＧＡＣＣＣＴＴＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＴＴＡＧＣ−３’
配列番号４０：プライマー２１９２ＲＱ−Ｓ
５’−ＡＧＧＣＴＧＧＣＣＣＡＡＧＧＧＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＴＴＴ−３’
配列番号４１：プライマー７０９４Ｓ−１ｂ−ｒｅｐ
５’−ＧＴＣＧＧＴＣＧＣＧＣＡＣＧＡＴＧＣＡＴ−３’
配列番号４２：プライマー２８７１ＹＣ−Ｒ
５’−ＴＴＣＡＡＴＧＧＡＧＣＡＡＧＴＧＧＣＣＣＣＧＴＡＧＡＴＣＴ−３’
配列番号４３：プライマー２８７１ＹＣ−Ｓ
５’−ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＴＧＣＴＣＣＡＴＴＧＡＡＣＣＡＣＴＴＧＡＣ−３’
配列番号４４：プライマー３７５１Ｓ−ＮＣ１
５’−ＴＧＴＧＴＴＧＧＡＣＣＧＴＣＴＡＣＣＡＴ−３’
配列番号４５：プライマー１ｂ−１２０２ＥＧ−Ｒ
５’−ＧＣＡＴＧＧＴＧＧＴＴＣＣＣＡＴＧＧＡＣＴＣＡＡＣＧＧＧＴＡ−３’
配列番号４６：プライマー１ｂ−１２０２ＥＧ−Ｓ
５’−ＧＴＣＣＡＴＧＧＧＡＡＣＣＡＣＣＡＴＧＣＧＧＴＣＴＣＣＧＧＴ−３’
配列番号４７：プライマー４５９８Ｒ−ＮＣ１
５’−ＣＧＧＴＡＧＴＡＣＧＣＴＡＣＡＧＣＡＴＴ−３’
配列番号４８：プライマー５２９２Ｓ−ＮＣ１
５’−ＧＣＣＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＴＣＧＴＣＡＣ−３’
配列番号４９：プライマー１ｂ−２０４０ＫＲ−Ｒ
５’−ＧＡＡＣＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＴＧＡＴＣＴＧＴ−３’
配列番号５０：プライマー１ｂ−２０４０ＫＲ−Ｓ
５’−ＧＧＡＣＡＴＧＴＣＡＧＧＡＡＣＧＧＴＴＣＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣ−３’
配列番号５１：プライマー６７８９Ｒ−ＮＣ１
５’−ＧＡＣＣＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＣＣＴＣＡＴ−３’
配列番号５２：ｐＳＧＲ−ＮＣ１  Ｐ２１６１Ｒから合成される、変異体ＮＣ１  Ｐ２１６１ＲのＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのｃＤＮＡ塩基配列
【産業上の利用可能性】
【０２６４】
培養細胞において増幅が可能な、遺伝子型１ｂの感染性ＨＣＶ粒子を産生するフルゲノムレプリコンＲＮＡを提供でき、遺伝子型１ｂのＨＣＶの感染及び複製を阻害する抗ＨＣＶ薬のスクリーニング、ＨＣＶの複製機構を解明するための研究、ＨＣＶワクチンの開発などに利用できる。また、高い複製能を有するサブゲノムレプリコンＲＮＡも提供でき、遺伝子型１ｂのＨＣＶの複製を阻害する抗ＨＣＶ薬のスクリーニングに利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０２６５】
配列番号２７〜５１：プライマー
【図１】
2012133735.tif 000004
【図２】
2012133735.tif 000005
【図３】
2012133735.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2012133735.tif 000012
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
2012133735000001.app
【国際調査報告】
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2012133735.tif 000017
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