(57)【要約】顕著なヒアルロン酸産生促進能を有する新規組成物を提供する。本発明は、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびフィチン酸を含む、ヒアルロン酸産生促進用組成物を提供する。本発明者らは、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびフィチン酸を含む組成物がヒアルロン酸産生を促進することを予想外に発見し、これに基づいて上記課題を解決した。本発明者らは、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびフィチン酸の各々の成分はヒアルロン酸産生を何ら促進しないにも関わらず、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびフィチン酸を含む組成物によって、ヒアルロン酸産生が促進されることを実証した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ−アデノシルメチオニンおよびフィチン酸を含む、ヒアルロン酸産生促進用組成物。
【請求項２】
さらにシクロデキストリンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記シクロデキストリンがγ−シクロデキストリンである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
さらに酵母を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
関節症の処置のための、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
美容改善用の、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
化粧品である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１に記載のヒアルロン酸産生促進用組成物の製造方法であって、
酵母を培養して、Ｓ−アデノシルメチオニンを産生させる工程、および
該酵母の培養液に、フィチン酸を添加する工程
を包含する製造方法。
【請求項９】
前記培養液にシクロデキストリンを添加する工程をさらに包含する、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記シクロデキストリンがγ−シクロデキストリンである、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記フィチン酸の添加後に、前記培養液に前記シクロデキストリンを添加する、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記培養液が菌体濃縮液である、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記フィチン酸の添加後の前記培養液のｐＨが３以下である、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記培養液を乾燥する工程をさらに包含する、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記組成物が、関節症の処置のための組成物であるか、美容改善用の組成物であるか、または化粧品である、請求項１０に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸産生促進剤に関する。より具体的には、本発明は、Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸およびシクロデキストリンを含むヒアルロン酸産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とβ−Ｄ−グルクロン酸とがβ１→３結合した二糖繰り返し単位を有する直鎖高分子多糖である。ヒアルロン酸は、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸とともに、グリコサミノグリカンの一種であるが、他のグリコサミノグリカンと異なり硫酸基を有さず、またタンパク質との共有結合体の存在は知られていない。ヒアルロン酸は、分子量については多分散性を示すが、それ以外には構造の不均一性は知られておらず、種特異性および臓器特異性はない。軟骨プロテオグリカンは、ヒアルロン酸を軸として巨大な会合体をつくる。また、ヒアルロン酸は、コラーゲン、フィブロネクチン、プロテオグリカンとともに細胞外マトリックスを構成している。さらに、ヒアルロン酸については、特異的な受容体を介して細胞接着や細胞の移動などを制御していることも知られている。【０００３】
ヒトの関節嚢は、外側の繊維層と内側の滑膜層とから構成されている。滑膜に含まれる滑液は、ヒアルロン酸と糖タンパク質とを含んでおり、この二つの成分は、関節を潤滑させる作用を奏する。変形性関節症を発症すると、関節内の潤滑作用を奏するヒアルロン酸の産生が減少し、酵素による破壊が増大して、関節内のヒアルロン酸量が減少する。関節内のヒアルロン酸の減少に伴い、関節における外部衝撃の吸収や分散が困難になる。そこで、ヒアルロン酸を関節に注入して関節炎を緩和させる方法が、１９９７年に米国のＦＤＡで承認されており、現在も施術がなされている。しかしながら、このような方法は、関節機能の一時的な改善が見込める点において有効であるものの、定期的な関節内注入を必要とするので侵襲性が高く、苦痛を伴うものである。【０００４】
また、哺乳動物の生体内に存在するヒアルロン酸のうちの５０％以上が、皮膚に、特に、表皮の細胞間と真皮の結合組織に分布すると報告されている。ヒトの皮膚におけるヒアルロン酸の量は、老化に伴い減少する。皮膚におけるヒアルロン酸量の減少が、老化に伴う皮膚の弾力の低下および水分含有量の減少の直接的な原因の一つであると考えられている。【０００５】
関節や皮膚にヒアルロン酸を補給する目的で、ヒアルロン酸を外用または経口にて投与することが試みられている。しかしながら、ヒアルロン酸は組織内に存在するので、経皮で投与しても組織内にそのまま取り込まれることはなく、経口では消化器官において分解された状態でしか吸収されないため、ヒアルロン酸の経皮投与または経口投与の効果は、限られたものにしかすぎなかった。【０００６】
Ｓ−アデノシルメチオニンは、骨関節症に対して有意な治療効果を奏することが知られている。例えば、非特許文献１には、Ｓ−アデノシルメチオニンの骨関節症に対する治療効果を、プラシーボおよび非ステロイド系抗炎症剤と、痛みの軽減効果、機能回復、副作用について比較検討した結果が記載されている。その結果、Ｓ−アデノシルメチオニンは、痛みの軽減および機能回復において、非ステロイド系抗炎症剤と同程度の治療効果を奏していた。このＳ−アデノシルメチオニンの関節症における種々の効果は、Ｓ−アデノシルメチオニンによりプロテオグリカン産生が促進されることに起因することが示唆されていた（非特許文献２および非特許文献３）が、Ｓ−アデノシルメチオニンとヒアルロン酸産生との関係は知られていなかった。【０００７】
フィチン酸についてもまた、ヒアルロン酸産生との関係は知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｗａｄｉｅ  Ｉ  Ｎａｊｍら、ＢＭＣ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ２００４，５：６
【非特許文献２】Ｌｏｕｉｓ  Ｌｉｐｐｉｅｌｌｏら、Ｉｎｔｅｒｎ  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｒｅｓ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．１，２００５
【非特許文献３】Ｈｅａｔｈｅｒ  Ｊｏｙ  Ｈｏｓｅａ  Ｂｌｅｗｅｔｔ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，４８：４５８−４６３（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、顕著なヒアルロン酸産生促進能を有する新規組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびフィチン酸を含む組成物がヒアルロン酸産生を促進することを予想外に発見し、これに基づいて上記課題を解決した。本発明者らは、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびフィチン酸の各々の成分はヒアルロン酸産生を何ら促進しないにも関わらず、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびフィチン酸を含む組成物によって、ヒアルロン酸産生が促進されることを実証した。本発明の組成物を、健康食品（サプリメント）、医薬品または皮膚外用剤（化粧品等）として使用することにより、あるいは本発明の組成物を食品添加物または食品補填物として食品に添加または配合することにより、関節症の予防、軽減または改善、関節症に関する疼痛の除去または軽減、肌のハリや潤いの維持、シワ、タルミ、シミ、クスミ、乾燥肌または日焼け肌等の改善、皮膚老化症状の防止または改善において、優れた効果を提供することができる。【００１１】
したがって、代表的な実施形態において、本発明は、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびフィチン酸を含む、ヒアルロン酸産生促進用組成物を提供する。【００１２】
ある局面において、上記組成物は、さらにシクロデキストリンを含む。【００１３】
別の局面において、上記シクロデキストリンはγ−シクロデキストリンである。【００１４】
別の局面において、上記組成物はさらに酵母を含む。【００１５】
ある局面において、上記組成物は、関節症の処置のための組成物である。【００１６】
別の実施形態において、本発明は、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびフィチン酸を含む、美容改善用組成物を提供する。【００１７】
ある局面において、上記組成物は、さらにシクロデキストリンを含む。【００１８】
別の局面において、上記シクロデキストリンはγ−シクロデキストリンである。【００１９】
別の局面において、上記組成物は、さらに酵母を含む。【００２０】
ある局面において、上記組成物は、化粧品である。【００２１】
別の実施形態において、本発明は、ヒアルロン酸産生促進用組成物の製造方法であって、
酵母を培養して、Ｓ−アデノシルメチオニンを産生させる工程、および
該酵母の培養液に、フィチン酸を添加する工程
を包含する製造方法を提供する。【００２２】
ある局面において、上記方法は、上記培養液にシクロデキストリンを添加する工程をさらに包含する。【００２３】
別の局面において、上記シクロデキストリンは、γ−シクロデキストリンである。【００２４】
別の局面において、上記方法において、上記フィチン酸の添加後に、上記培養液に上記シクロデキストリンが添加される。【００２５】
別の局面において、上記培養液は菌体濃縮液である。【００２６】
別の局面において、上記フィチン酸の添加後の前記培養液のｐＨは３以下である。【００２７】
別の局面において、上記方法は、上記培養液を乾燥する工程をさらに包含する。【００２８】
ある局面において、上記組成物は、関節症の処置のための組成物である。【００２９】
別の実施形態において、本発明は、美容改善用組成物の製造方法であって、
酵母を培養して、Ｓ−アデノシルメチオニンを産生させる工程、および
該酵母の培養液に、フィチン酸を添加する工程
を包含する製造方法を提供する。【００３０】
ある局面において、上記方法は、上記培養液にシクロデキストリンを添加する工程をさらに包含する。【００３１】
別の局面において、上記シクロデキストリンはγ−シクロデキストリンである。【００３２】
別の局面において、上記方法において、上記フィチン酸の添加後に、上記培養液に前記シクロデキストリンが添加される。【００３３】
別の局面において、上記培養液は菌体濃縮液である。【００３４】
別の局面において、上記フィチン酸の添加後の前記培養液のｐＨは３以下である。【００３５】
別の局面において、上記方法は、上記培養液を乾燥する工程をさらに包含する。【００３６】
ある局面において、上記組成物は、化粧品である。
【発明の効果】
【００３７】
本発明により、顕著なヒアルロン酸産生促進能を有する新規組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、ヒアルロン酸産生促進能を有する物質を添加せずに（データ１）、グルコサミンを添加して（データ２）、またはＳ−アデノシルメチオニン、フィチン酸およびγ−シクロデキストリン含有酵母組成物を添加して（データ３）培養した場合の、ヒト軟骨細胞株（ＳＷ１３５３）のヒアルロン酸産生量を示すグラフである。
【図２】図２は、ヒアルロン酸産生促進能を有する物質を添加せずに（データ１）、グルコサミンを添加して（データ２）、またはＳ−アデノシルメチオニン、フィチン酸およびγ−シクロデキストリン含有酵母組成物を添加して（データ３）培養した場合の、ヒト滑膜細胞株（ＭＨ７Ａ）のヒアルロン酸産生量を示すグラフである。
【図３】図３は、以下の条件で培養した場合の、ヒト軟骨細胞株（ＳＷ１３５３）のヒアルロン酸産生量を示すグラフである。データ１；ヒアルロン酸産生促進能を有する物質を添加せず。データ２；酵母のみを添加（Ｓ−アデノシルメチオニンもフィチン酸も含まず）。データ３；Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸およびγ−シクロデキストリン含有酵母組成物を添加。データ４；Ｓ−アデノシルメチオニンのみを添加。データ５；γ−シクロデキストリンのみを添加。データ６；フィチン酸のみを添加。データ７；酵母およびＳ−アデノシルメチオニンを添加。データ８；フィチン酸およびＳ−アデノシルメチオニンを添加。データ９；γ−シクロデキストリンおよびＳ−アデノシルメチオニンを添加。
【図４】図４は、以下の条件で培養した場合の、ヒト真皮線維芽細胞株のヒアルロン酸産生量を示すグラフである。データ１；ヒアルロン酸産生促進能を有する物質を添加せず。データ２；０．５０μｇ／ｍＬのＳ−アデノシルメチオニンおよび１．２５μｇ／ｍＬのフィチン酸を添加。データ３；１．００μｇ／ｍＬのＳ−アデノシルメチオニンおよび２．５０μｇ／ｍＬのフィチン酸を添加。データ４；１０．００μｇ／ｍＬのＳ−アデノシルメチオニンおよび２５．００μｇ／ｍＬのフィチン酸を添加。データ５；Ｓ−アデノシルメチオニン量０．５０μｇ／ｍＬに相当する、Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸およびγ−シクロデキストリン含有酵母組成物（０．００５ｗ／ｗ％）を添加。データ６；Ｓ−アデノシルメチオニン量１．００μｇ／ｍＬに相当する、Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸およびγ−シクロデキストリン含有酵母組成物（０．０１０ｗ／ｗ％）を添加。データ７；Ｓ−アデノシルメチオニン量１０．００μｇ／ｍＬに相当する、Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸およびγ−シクロデキストリン含有酵母組成物（０．１００ｗ／ｗ％）を添加。データ８；０．００５ｗ／ｗ％の、フィチン酸（１．２５μｇ／ｍＬ）、γ−シクロデキストリン（２．００μｇ／ｍＬ）含有酵母混合物（Ｓ−アデノシルメチオニンを含まず）を添加。データ９；０．０１０ｗ／ｗ％の、フィチン酸（２．５０μｇ／ｍＬ）、γ−シクロデキストリン（４．００μｇ／ｍＬ）含有酵母混合物（Ｓ−アデノシルメチオニンを含まず）を添加。データ１０；０．１００ｗ／ｗ％の、フィチン酸（２５．００μｇ／ｍＬ）、γ−シクロデキストリン（４０．００μｇ／ｍＬ）含有酵母混合物（Ｓ−アデノシルメチオニンを含まず）を添加。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下に本発明を、必要に応じて、添付の図面を参照して例示の実施例により説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書が優先される。
【００４０】
（定義）
本明細書における「Ｓ−アデノシルメチオニン」とは、活性メチオニン、メチオニルアデノシンとも称され、「ＳＡＭｅ」または「ＡｄｏＭｅｔ」と略称される、分子式Ｃ１５Ｈ２３Ｎ６Ｏ５Ｓ（平均分子量３９９．４４７）の物質である。
【００４１】
本明細書における「フィチン酸」とは、分子式Ｃ６Ｈ１８Ｏ２４Ｐ６で表される生体物質の一種であり、ｍｙｏ−イノシトールの６リン酸エステルである。ｍｙｏ−イノシトール−１，２，３，４，５，６−６リン酸や、ｍｙｏ−イノシトール−１，２，３，４，５，６−ヘキサホスファート、またはヘキサキスホスファートまたはヘキサキス（リン酸二水素）ともいわれ、ＩＰ６と略される。
【００４２】
本明細書における「シクロデキストリン」とは、数分子のグルコースが環状に結合した任意の環状オリゴ糖をいう。シクロデキストリンとしては、グルコースが５個以上結合したものがよく知られており、特に一般的なものとしては、グルコースが６個結合した分子量９７３のα−シクロデキストリン（シクロデキストリン）（シクロヘキサアミロース）、７個結合した分子量１１３５のβ−シクロデキストリン（シクロデキストリン）（シクロヘプタアミロース）、８個結合した分子量１２９７のγ−シクロデキストリン（シクロデキストリン）（シクロオクタアミロース）が挙げられる。本発明における「シクロデキストリン」とは、特にこれらの重合度のものに限定されず、任意の重合度のグルコース結合環状オリゴ糖をいう。本発明における「シクロデキストリン」は、分枝であっても、非分枝であってもよい。
【００４３】
本明細書における「ヒアルロン酸」とは、β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とβ−Ｄ−グルクロン酸とがβ１→３結合した二糖繰り返し単位を有する直鎖高分子多糖をいう。本発明におけるヒアルロン酸は、特定の分子量のものに限定されない。また、本発明のヒアルロン酸は、ほとんどすべての組織の細胞外基質であるが、例えば、軟骨細胞、滑膜細胞、繊維芽細胞等の任意のヒアルロン酸産生細胞によって産生されたヒアルロン酸を包含する。
【００４４】
本明細書における「ヒアルロン酸産生」とは、任意の部位または任意の細胞におけるヒアルロン酸の産生をいう。この部位としては、関節、軟骨、皮膚（顔、手、頭皮、頚部等）が挙げられるが、これらに限定されない。この細胞としては、軟骨細胞、滑膜細胞、繊維芽細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
本明細書において、ある物質の非存在下でのヒアルロン酸産生細胞によるヒアルロン酸産生量と比較して、その物質の存在下で当該ヒアルロン酸産生細胞によるヒアルロン酸産生量が有意に増加した場合、ヒアルロン酸産生が「促進」されたという。このヒアルロン酸産生細胞としては、軟骨細胞、滑膜細胞、繊維芽細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。以下に記載されるとおり、ヒアルロン酸産生細胞によるヒアルロン酸産生量の測定方法は当業者に周知であり、例えば市販のキット等（例えば、生化学バイオビジネス株式会社から販売されているヒアルロン酸測定キット）を用いて測定することができる。
【００４６】
ある物質の非存在下でのヒアルロン酸産生量に対して、その物質の存在下でのヒアルロン酸産生量があるパーセンテージ分増加した場合、「ヒアルロン酸産生を〜％促進する」という。例えば、本発明の組成物の非存在下でのヒアルロン酸産生量に対して、本発明の組成物の存在下でのヒアルロン酸産生量が５０％増加した場合、本発明の組成物が「ヒアルロン酸産生を５０％促進する」という。
【００４７】
本明細書において、ある物質がヒアルロン酸産生を少なくとも１０％促進する場合、その物質は「ヒアルロン酸産生促進能を有する」という。
【００４８】
本明細書における「酵母」とは、経口摂取可能な任意の酵母をいう。本発明における酵母は、粉末、ペースト、懸濁液、凍結乾燥物などを含むが、これらに限定されない任意の形態であってよい。
【００４９】
本明細書における「美容改善」とは、肌のハリや潤いの維持、シワ、タルミ、シミ、クスミ、乾燥肌または日焼け肌等の改善、皮膚老化症状の防止または改善をいう。
【００５０】
（好ましい実施形態）
本発明者らは、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびフィチン酸の各々の成分はヒアルロン酸産生を何ら促進しないにも関わらず、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびフィチン酸を含む組成物によって、ヒアルロン酸産生が促進されることを実証した。本発明の組成物を、健康食品（サプリメント）、医薬品または皮膚外用剤として使用することにより、あるいは本発明の組成物を食品添加物または食品補填物として食品に添加または配合することにより、関節症の予防、軽減または改善、関節症に関する疼痛の除去または軽減、肌のハリや潤いの維持、シワ、タルミ、シミ、クスミ、乾燥肌または日焼け肌等の改善、皮膚老化症状の防止または改善において、優れた効果を提供することができる。
【００５１】
（本発明の組成物）
本発明の組成物は、Ｓ−アデノシルメチオニン１モルに対して、フィチン酸を０．５〜５モル含む。より好ましくは、Ｓ−アデノシルメチオニン１モルに対して、フィチン酸を１．５〜２．５モル含む。本発明の組成物は、この範囲内の量でＳ−アデノシルメチオニンおよびフィチン酸を含めば、所望のヒアルロン酸産生促進効果および美容改善効果を奏する。
【００５２】
本発明の組成物は、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびフィチン酸だけでなく、賦形剤または添加剤などの任意の他の成分を含むことができる。特定の実施形態において、本発明の組成物は、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびフィチン酸に加えて、シクロデキストリンをさらに含む。好ましくは、本発明の組成物は、Ｓ−アデノシルメチオニン１モルに対して、シクロデキストリンを０．５〜５モル含む。より好ましくは、Ｓ−アデノシルメチオニン１モルに対して、シクロデキストリンを１〜２モル含む。本発明の組成物は、この範囲内の量でＳ−アデノシルメチオニン、フィチン酸およびシクロデキストリンを含むことにより、所望のヒアルロン酸産生促進効果および美容改善効果を奏するとともに、通常は不安定なＳ−アデノシルメチオニンが顕著に安定になり、本発明の組成物の保存安定性が飛躍的に向上する。
【００５３】
好ましい実施形態において、本発明の組成物に含まれるシクロデキストリンはγ−シクロデキストリンである。好ましくは、本発明の組成物は、Ｓ−アデノシルメチオニン１モルに対して、γ−シクロデキストリンを０．５〜５モル含む。より好ましくは、Ｓ−アデノシルメチオニン１モルに対して、γ−シクロデキストリンを１〜２モル含む。本発明の組成物の保存安定性はシクロデキストリンを添加することによって向上されるが、特にγ−シクロデキストリンにおいて安定性の向上が顕著である。
【００５４】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸およびシクロデキストリンに加えて、さらに酵母を含む組成物である。この酵母は、Ｓ−アデノシルメチオニン産生能を有するもの、および／または、細胞内にＳ−アデノシルメチオニンを含むものであり得る。好ましい実施形態において、本発明の組成物におけるＳ−アデノシルメチオニンは、酵母によって産生されたものである。本発明における酵母は、経口摂取可能な任意の酵母を包含するが、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが好ましい。Ｓ−アデノシルメチオニン産生能を有する酵母を培養してＳ−アデノシルメチオニンを産生させ、これにフィチン酸と、必要に応じてγ−シクロデキストリンのような他の成分を添加し、Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸、シクロデキストリンおよび酵母を含む組成物を得ることができる。このＳ−アデノシルメチオニン、フィチン酸、シクロデキストリンおよび酵母を含む組成物は、どのような形態で使用されてもよいが、代表的にはペースト状または粉末状である。好ましくは、Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸、シクロデキストリンおよび酵母を含む組成物は、粉末状である。
【００５５】
以下の実施例に記載される通り、Ｓ−アデノシルメチオニンとフィチン酸の組み合わせが、ヒアルロン酸産生促進効果を有していることが実証された。したがって、本発明の組成物は、Ｓ−アデノシルメチオニンとフィチン酸の組み合わせを含む。本発明の組成物は、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびフィチン酸に加えて、酵母を含んでもよい。より好ましくは、本発明の組成物は、さらにシクロデキストリン、特にγ−シクロデキストリンを含む。なぜなら、フィチン酸とγ−シクロデキストリンの組み合わせによって、Ｓ−アデノシルメチオニンの保存安定性が顕著に向上されるからである（特開２０１０−１８５９６号を参照のこと）。したがって、本発明の組成物は、Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸およびシクロデキストリン（好ましくは、γ−シクロデキストリン）に加えて、酵母を含んでもよい。
【００５６】
（本発明の組成物の製造）
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、Ｓ−アデノシルメチオニン産生能を有する酵母を培養し、Ｓ−アデノシルメチオニンを産生させ、この酵母にフィチン酸を添加することによって製造される。この酵母は、好ましくは酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｋ−７株（清酒酵母協会７号）である。酵母へのフィチン酸の添加は、酵母の培養中に行われてもよいし、培養後に行われてもよい。好ましくは、酵母を培養してＳ−アデノシルメチオニンを産生させた後に培養液を除き、酵母菌体の濃縮液を得て、その濃縮液にフィチン酸を添加する。この酵母菌体の濃縮液は、培養液を遠心分離（例えば、８，０００ｒｐｍ）し、上清を除いて、菌体を回収し、その回収した菌体に除いた上清液を適量加え、菌体濃縮液とすることによって調製され得る。
【００５７】
特定の実施形態において、Ｓ−アデノシルメチオニンを産生した酵母を含む濃縮液にフィチン酸を添加した後、この混合物を乾燥し得る。乾燥方法としては、凍結乾燥、噴霧乾燥または減圧乾燥などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明における乾燥方法としては凍結乾燥が好ましい。特定の実施形態において、上記混合物を、−８０℃で一晩凍結し、凍結乾燥を７２ｈ行うことによって乾燥させることができる。
【００５８】
上記酵母を培養する際に使用する炭素源は、酵母が資化し得るものであれば特に制限はなく、例えば、グルコース、ショ糖、澱粉、廃糖蜜等の炭水化物、エタノール等のアルコール、または酢酸等の有機酸が挙げられる。窒素源は、使用する酵母が資化し得るものであれば特に制限はなく、例えば、アンモニア、硝酸、尿素等の無機体窒素化合物、または酵母エキス、麦芽エキス等の有機体窒素化合物を含むものが挙げられる。また、無機塩類としては、リン酸、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、亜鉛、マンガン、コバルト、銅、モリブデン等の塩が用いられ得る。さらに、Ｓ−アデノシルメチオニンの骨格を構成するメチオニン、アデニン、アデノシルリボヌクレオシドを添加して培養することもできる。
【００５９】
本発明におけるＳ−アデノシルメチオニン産生酵母の培養は、嫌気条件、好気条件のいずれでも実施可能であるが、酵母菌体を効率良く増殖させるために好気条件が好ましい。本発明におけるＳ−アデノシルメチオニン産生酵母の培養温度は、酵母が増殖できる範囲内の任意の温度であるが、１５〜４０℃の範囲での培養が好ましく、２５〜３５℃の範囲がさらに好ましい。本発明におけるＳ−アデノシルメチオニン産生酵母の培養時のｐＨは、酵母が増殖できる範囲内の任意のｐＨであるが、ｐＨ３．５〜８．０の範囲での培養が好ましく、ｐＨ４．０〜６．５の範囲がさらに好ましい。その他、本発明におけるＳ−アデノシルメチオニン産生酵母の培養方法および培養条件は、当業者は一般的な酵母の培養方法または培養条件に従って適切に決定することができる。特定の実施形態において、酵母は５Ｌ容ジャーファーメンター（仕込み培地量：３Ｌ）を用いて、培養温度２８℃、攪拌速度  ５００ｒｐｍ、培養時間３６−４８ｈ、通気量０．５ＶＶＭ、培地組成（ｗ／１００ｍＬ）：グルコース５％、酵母エキス０．７５％、ペプトン２．０％、メチオニン０．１５％の条件で培養される。
【００６０】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、Ｓ−アデノシルメチオニン産生能を有する酵母を培養してＳ−アデノシルメチオニンを産生させ、この酵母にフィチン酸およびシクロデキストリンを添加することによって製造される。酵母へのフィチン酸およびシクロデキストリンの添加は、酵母の培養中であってもよいし、酵母の培養後に行われてもよい。酵母へのフィチン酸の添加は、酵母の培養中に行われてもよいし、培養後に行われてもよい。好ましくは、酵母を培養してＳ−アデノシルメチオニンを産生させた後に培養液を除き、酵母菌体の濃縮液を得て、その濃縮液にフィチン酸およびシクロデキストリンを添加する。特定の実施形態において、Ｓ−アデノシルメチオニンを産生した酵母を含む濃縮液にフィチン酸およびシクロデキストリンを添加した後、この混合物を乾燥し得る。乾燥方法としては、凍結乾燥、噴霧乾燥または減圧乾燥などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明における乾燥方法としては凍結乾燥が好ましい。
【００６１】
フィチン酸およびシクロデキストリンの添加は、フィチン酸が先に添加された後にシクロデキストリンが添加されてもよいし、シクロデキストリンが先に添加された後にフィチン酸が添加されてもよいし、同時であってもよい。本発明の好ましい実施形態においては、酵母または酵母濃縮液にまず最初にフィチン酸が添加され、その後シクロデキストリンが添加される。理論に束縛されることを望まないが、フィチン酸およびシクロデキストリンをこのような順序で添加することにより、静電相互作用によって形成された複数のフィチン酸−Ｓ−アデノシルメチオニン複合体をシクロデキストリンがカバーして集合体を形成し、その結果、不安定なＳ−アデノシルメチオニンの顕著な安定化が達成され得ると考えられる。
【００６２】
特定の実施形態において、本発明の組成物の製造において、フィチン酸添加後の酵母培養液（または、酵母菌体濃縮液）のｐＨは３以下である。代表的な実施形態において、この３以下のｐＨは、酵母培養液（または、酵母菌体濃縮液）へのフィチン酸の添加によって達成される。別の実施形態においては、フィチン酸の添加以外に、ｐＨの調整が行われ得る。ｐＨの調整法は当業者に周知であり、例えばクエン酸の添加などにより行われ得る。理論に束縛されることを望まないが、４以下の低いｐＨでフィチン酸が添加されると、Ｓ−アデノシルメチオニンとフィチン酸とは、塩を形成するのではなく、カチオンを介して結合すると考えられる。
【００６３】
（ヒアルロン酸産生）
例えば、ヒト軟骨細胞のヒアルロン酸産生量は、以下のように測定され得る。
【００６４】
ヒト軟骨細胞株（ＳＷ１３５３）を、１０％ウシ胎仔血清および抗生物質を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５培地にて３７℃で培養し、維持する。例えば１ウェルにつき１．５×１０５細胞となるような量で、この細胞を１２ウェルプレートに播種し、一晩前培養する。その後、ヒアルロン酸産生能について試験する添加剤を加え、２４時間培養する。次いで培養上清を回収し、培養上清中に含まれるヒアルロン酸量を市販のキット等（例えば、生化学バイオビジネス株式会社（東京）から販売されているヒアルロン酸測定キット）を用いて測定する。このヒアルロン酸量を、添加剤を加えない場合のヒアルロン酸量と比較する。
【００６５】
滑膜細胞のヒアルロン酸産生量は、以下のように測定され得る。
【００６６】
ヒト滑膜細胞培養細胞株（ＭＨ７Ａ）を、１０％ウシ胎仔血清および抗生物質を含むＲＰＭＩ−１６４０培地にて５％  ＣＯ２条件下３７℃で培養し、維持する。例えば１ウェルにつき１．０×１０５細胞となるような量で、この細胞を１２ウェルプレートに播種し、一晩前培養する。その後、ヒアルロン酸産生能について試験する添加剤を加え、２４時間培養する。次いで培養上清を回収し、培養上清中に含まれるヒアルロン酸量を市販のキット等（例えば、生化学バイオビジネス株式会社から販売されているヒアルロン酸測定キット）を用いて測定する。このヒアルロン酸量を、添加剤を加えない場合のヒアルロン酸量と比較する。
【００６７】
例えば、皮膚線維芽細胞のヒアルロン酸産生量は、以下のように測定され得る。
【００６８】
正常ヒト皮膚線維芽細胞株（ＮＨＤＦ）を、２％ウシ胎児血清、ヘパリン１０μｇ／ｍｌ、ハイドロコーチゾン１μｇ／ｍｌ、ヒト組換え型上皮成長因子１０ｎｇ／ｍｌ、ヒト組換え型塩基性線維芽細胞成長因子３ｎｇ／ｍｌを含む基礎培地Ｍｅｄｉｕｍ１０６Ｓにて３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養し、例えば１ウェルにつき５．０×１０４細胞となるような量で、この細胞を２４ウェルマイクロプレートに播種する。播種時には同培地を用い、細胞がコンフルエントになるまで培養した後、ヒアルロン酸産生能について試験する添加剤を添加した２％ウシ胎児血清、ヘパリン１０μｇ／ｍｌ、ハイドロコーチゾン１μｇ／ｍｌ、アスコルビン酸２リン酸マグネシウム１００μＭを含むＭｅｄｉｕｍ１０６Ｓに交換し、さらに４８時間培養する。次いで培養上清を回収し、培養上清中に含まれるヒアルロン酸量を市販のキット等（例えば、生化学バイオビジネス株式会社から販売されているヒアルロン酸測定キット）を用いて測定する。このヒアルロン酸量を、添加剤を加えない場合のヒアルロン酸量と比較する。
【００６９】
本発明の組成物は、ヒアルロン酸産生を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、２５％、４０％、４５％、５０％またはそれ以上促進する。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ヒアルロン酸産生を３０％以上促進し、より好ましい実施形態においては、本発明の組成物は、ヒアルロン酸産生を４５％以上促進する。
【００７０】
本発明の組成物は、軟骨細胞におけるヒアルロン酸産生を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、２５％、４０％、４５％、５０％またはそれ以上促進する。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、軟骨細胞におけるヒアルロン酸産生を３０％以上促進し、より好ましい実施形態においては、本発明の組成物は、軟骨細胞におけるヒアルロン酸産生を４５％以上促進する。
【００７１】
本発明の組成物は、滑膜細胞におけるヒアルロン酸産生を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、２５％、４０％、４５％、５０％またはそれ以上促進する。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、滑膜細胞におけるヒアルロン酸産生を３０％以上促進し、より好ましい実施形態においては、本発明の組成物は、滑膜細胞におけるヒアルロン酸産生を４５％以上促進する。
【００７２】
本発明の組成物は、皮膚線維芽細胞におけるヒアルロン酸産生を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、２５％、４０％、４５％、５０％またはそれ以上促進する。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、皮膚線維芽細胞におけるヒアルロン酸産生を３０％以上促進し、より好ましい実施形態においては、本発明の組成物は、皮膚線維芽細胞におけるヒアルロン酸産生を４５％以上促進する。
【００７３】
（美容改善）
本発明の組成物は、軟骨細胞および滑膜細胞によるヒアルロン酸産生を促進するだけでなく、皮膚細胞によるヒアルロン酸産生も促進することができる。本発明の組成物は、皮膚細胞（表皮線維芽細胞、真皮線維芽細胞等を含む）によるヒアルロン酸産生を促進することにより、肌のハリや潤いの維持、シワ、タルミ、シミ、クスミ、乾燥肌または日焼け肌等の改善、皮膚老化症状の防止または改善において、優れた効果を提供することができる。
【００７４】
（本発明の組成物の適用）
本発明の組成物は、食品組成物、医薬品（医薬部外品を含む）または皮膚外用剤（化粧品を含む）などであり得る。
【００７５】
本発明の組成物を食品としたもの（以下、本発明の食品組成物という）は、健康食品（特定保健用食品、栄養機能食品）、サプリメント（栄養補助食品）、食品添加物または食品補填物などを包含する。代表的には、本発明の食品組成物は、Ｓ−アデノシルメチオニン、これを産生する酵母、フィチン酸、および必要に応じてその他成分（特に、シクロデキストリン）を含む組成物を乾燥させて粉末としたものである。粉末状の本発明の食品組成物は、食品添加物または食品補填物として他の食品に添加して摂取されてもよいし、粉末状の本発明の食品組成物自体が、健康食品またはサプリメント等として単独で摂取されてもよい。本発明の組成物は、必要に応じてデキストリン、乳糖、澱粉等の賦型剤や香料、色素等とともにペレット、錠剤、顆粒等に加工されたり、またゼラチン等で被覆してカプセルに成形加工されてもよい。本発明の組成物は、健康食品またはサプリメントとして用いるのに特に適している。代表的には、本発明の食品組成物は、１００ｇ当たり約３ｇまたはそれ以上のＳ−アデノシルメチオニンを含む。
【００７６】
本発明の食品組成物におけるＳ−アデノシルメチオニンまたはフィチン酸等の配合量は、当該食品の種類や状態等により一律に規定しがたいが、Ｓ−アデノシルメチオニン含量で１０〜５０００ｍｇ／１食、好ましくは１００〜１０００ｍｇ／１食であり、サプリメントの場合には約１０〜１００％（好ましくは、３０〜１００％、より好ましくは５０〜１００％、さらにより好ましくは８０〜１００％）、飲料もしくは一般食品などの場合には約０．０１％以下であり得る。
【００７７】
本発明の食品組成物は、食品に通常用いられる賦形剤または添加剤を配合して、錠剤、タブレット剤、丸剤、顆粒剤、散剤、粉剤、カプセル剤、水和剤、乳剤、液剤、エキス剤、またはエリキシル剤等の剤型に調製することもできる。食品に通常用いられる賦形剤としては、シロップ、アラビアゴム、ショ糖、乳糖、粉末還元麦芽糖、セルロース糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、デンプン類、ゼラチン、ソルビット、トラガント、ポリビニルピロリドンのような結合剤；ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、ポリエチレングリコールのような潤沢剤；ジャガイモ澱粉のような崩壊剤；ラウリル硫酸ナトリウムのような湿潤剤等が挙げられる。添加剤としては、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤などが挙げられる。
【００７８】
本発明の組成物を医薬品に製剤化したもの（以下、本発明の医薬品という）は、経口投与製剤であり得る。固形製剤としては、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、タブレット剤、丸剤、カプセル剤、チュアブル剤などが挙げられ、液体製剤としては、乳剤、液剤、シロップ剤などが挙げられる。本発明の医薬品は、１００ｇ当たり約３ｇまたはそれ以上のＳ−アデノシルメチオニンを含む。
【００７９】
固形製剤は、有効成分である本発明のＳ−アデノシルメチオニンおよびフィチン酸、ならびに必要に応じて酵母、シクロデキストリン等に、薬学的に受容可能なキャリアまたは添加剤を配合することによって調製され得る。例えば、白糖、乳糖、ブドウ糖、でんぷん、マンニットのような賦形剤；アラビアゴム、ゼラチン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロースのような結合剤；カルメロース、デンプンのような崩壊剤；無水クエン酸、ラウリン酸ナトリウム、グリセロールのような安定剤などが、本発明の医薬品の製剤化のために配合され得る。さらに、本発明の医薬品は、ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナバロウなどでコーティングまたはカプセル化され得る。また、液体製剤は、例えば、効成分である本発明のＳ−アデノシルメチオニンおよびフィチン酸、ならびに必要に応じて酵母、シクロデキストリン等を、水、エタノール、グリセリン、シロップ、またはこれらの混合液に溶解または分散させることにより、調製され得る。本発明の医薬品には、さらに、甘味料、防腐剤、粘滑剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、または着色剤のような添加剤が添加され得る。
【００８０】
（皮膚外用剤）
本発明の組成物を皮膚外用剤に製剤化したもの（以下、本発明の皮膚外用剤という）は、代表的には、化粧品であり得る。本発明の皮膚外用剤の剤型は特に限定されず、化粧品であれば、例えば、化粧水、化粧用乳液、化粧用クリーム、化粧用ゲル、美容液、パック剤、ファウンデーション、口紅、リップクリーム、リップグロス、洗顔剤、ボディソープ、ハンドクリーム、シャンプー、リンス、整髪料等のスキンケア用品又はメイクアップ用品の形態が挙げられる。本発明の皮膚外用剤は、１００ｇ当たり約３ｇまたはそれ以上のＳ−アデノシルメチオニンを含む。
【００８１】
本発明の皮膚外用剤は、本発明の組成物に加えて、化粧品に通常用いられる成分、例えば、精製水、アルコール類（低級アルコール、多価アルコールなど）、油脂類、ロウ類、炭化水素類のような基剤と、必要に応じて、界面活性剤、増粘剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、安定剤、防腐剤、着色剤、香料のような添加剤とを配合して調製することができる。
【００８２】
医薬又は医薬部外品としての皮膚外用剤であれば、軟膏剤、ゲル剤、リニメント剤、ローション剤、乳剤、粉剤、懸濁剤、エアゾール剤、液剤などや、基剤を支持体上に支持させた硬膏剤、パップ剤、テープ剤、プラスター剤などの剤型が挙げられる。
【００８３】
医薬又は医薬部外品としての皮膚外用剤は、本発明の組成物を適当な基剤に配合して調製することができる。基剤としては、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、キサンタンガム、カラギーナン、マンナン、アガロース、デキストリン、カルボキシメチルデンプン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、メトキシエチレン−無水マレイン酸共重合体、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プルラン等のポリマー類；白色ワセリン、黄色ワセリン、パラフィン、セレシンワックス、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素類；ステアリン酸等の高級脂肪酸；セタノール、オクチルドデカノール、ステアリルアルコール等の高級アルコール；ポリエチレングリコール（例えば、マクロゴール４０００等）；プロピレングリコール、グリセリン、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、濃グリセリン等の多価アルコール；モノオレイン酸エステル、ステアリン酸グリセリド等の脂肪酸エステル類；リン酸緩衝液などが挙げられる。さらに、溶解補助剤、無機充填剤、ｐＨ調節剤、保湿剤、防腐剤、粘稠剤、酸化防止剤、清涼化剤などの添加剤が添加されていてもよい。
【００８４】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００８５】
以上、本発明を理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明した。以下に実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではないことが理解されるべきである。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００８６】
（実施例１．Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸、γ−シクロデキストリンおよび酵母を含む粉末組成物の調製）
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｋ−７株（清酒酵母協会７号）を、５Ｌ容ジャーファーメンター（仕込み培地量：３Ｌ）を用いて、培養温度２８℃、攪拌速度  ５００ｒｐｍ、培養時間３６−４８ｈ、通気量０．５ＶＶＭ、培地組成（ｗ／１００ｍＬ）：グルコース５％、酵母エキス０．７５％、ペプトン２．０％、メチオニン０．１５％で培養した。この培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ）し、上清を除いて、菌体を回収した。回収した菌体に除いた上清液を適量加え、菌体濃縮液を調製した。【００８７】
濃縮液中のＳ−アデノシルメチオニン濃度を測定し、含有Ｓ−アデノシルメチオニン１モルに対して１．５モルのフィチン酸（築野食品工業株式会社（和歌山）のＴＳＵＮＯフィチン酸）を菌体濃縮液に添加し、さらに含有Ｓ−アデノシルメチオニン１モルに対して１．２モルのγ−シクロデキストリン（γ−１００；パールエース株式会社（東京））を添加した。これを次いで−８０℃で一晩凍結した。凍結乾燥を７２ｈ行い、Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸、γ−シクロデキストリンおよび酵母を含む粉末組成物を調製した。【００８８】
（実施例２．軟骨細胞におけるヒアルロン酸産生促進）
ヒト軟骨細胞株（ＳＷ１３５３）を、１０％ウシ胎仔血清および抗生物質を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５培地にて３７℃で培養し、維持した。１ウェル当たり１．５×１０５細胞となるようにこの細胞を１２ウェルプレートに播種し、一晩前培養した。その後、以下の３通りの方法で細胞を培養した。
（１）ヒアルロン酸産生促進能を有する物質を添加せずに、上記軟骨細胞を２４時間培養した（図１におけるデータ１）。
（２）ヒアルロン酸産生促進能を有することが公知のグルコサミン（特開２００１−２５５１を参照のこと）を添加して、上記軟骨細胞を２４時間培養した（図１におけるデータ２）。培養では、０．５ｍＭのグルコサミンを培地に添加した。
（３）実施例１において調製したＳ−アデノシルメチオニン、フィチン酸、γ−シクロデキストリンおよび酵母を含む粉末組成物を添加して、上記軟骨細胞を２４時間培養した（図１におけるデータ３）。培養では、Ｓ−アデノシルメチオニン濃度が０．５２μｇ／ｍｌになるように、Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸、γ−シクロデキストリンおよび酵母を含む粉末組成物を培地に添加した。【００８９】
次いで上記３つの群の培養上清を回収し、培養上清中に含まれるヒアルロン酸量を、生化学バイオビジネス株式会社から販売されているヒアルロン酸測定キットを用いて測定した。それぞれの群のヒアルロン酸量を、図１に示す。驚くべきことに、Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸およびγ−シクロデキストリン含有酵母を添加した軟骨細胞において、いわゆるポジティブコントロールであるグルコサミンを添加した軟骨細胞よりも多量のヒアルロン酸が産生された（ｐ＝０．００３）。図１に示す結果より、Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸、γ−シクロデキストリンおよび酵母を含む粉末組成物は、軟骨細胞において４０％以上ヒアルロン酸産生を促進することが実証された。グルコサミンは、軟骨細胞において約１０％ヒアルロン酸産生を促進した。このことは、Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸、γ−シクロデキストリンおよび酵母を含む粉末組成物が、従来ヒアルロン酸産生を促進することが公知であったグルコサミンよりも顕著にヒアルロン酸産生を促進することを示している。【００９０】
（実施例３．滑膜細胞におけるヒアルロン酸産生促進）
ヒト滑膜細胞培養細胞株（ＭＨ７Ａ）を、１０％ウシ胎仔血清および抗生物質を含むＲＰＭＩ−１６４０培地にて５％  ＣＯ２条件下３７℃で培養し、維持した。１ウェル当たり１．０×１０５細胞となるようにこの細胞を１２ウェルプレートに播種し、一晩前培養した。その後、以下の３通りの方法で細胞を培養した。
（１）ヒアルロン酸産生促進能を有する物質を添加せずに、上記滑膜細胞を２４時間培養した（図２におけるデータ１）。
（２）ヒアルロン酸産生促進能を有することが公知のグルコサミンを添加して、上記滑膜細胞を２４時間培養した（図２におけるデータ２）。培養では、０．５ｍＭのグルコサミンを培地に添加した。
（３）実施例１において調製したＳ−アデノシルメチオニン、フィチン酸、γ−シクロデキストリンおよび酵母を含む粉末組成物を添加して、上記滑膜細胞を２４時間培養した（図２におけるデータ３）。培養では、Ｓ−アデノシルメチオニン濃度が０．５２μｇ／ｍｌになるように、Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸、γ−シクロデキストリンおよび酵母を含む粉末組成物を培地に添加した。【００９１】
次いで上記３つの群の培養上清を回収し、培養上清中に含まれるヒアルロン酸量を、生化学バイオビジネス株式会社から販売されているヒアルロン酸測定キットを用いて測定した。それぞれの群のヒアルロン酸量を、図２に示す。驚くべきことに、Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸およびγ−シクロデキストリン含有酵母を添加した滑膜細胞（図２におけるデータ３）において、いわゆるポジティブコントロールであるグルコサミンを添加した滑膜細胞（図２におけるデータ２）よりも多量のヒアルロン酸が産生された。図２に示す結果より、Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸およびγ−シクロデキストリン含有酵母は、滑膜細胞において５０％以上ヒアルロン酸産生を促進することが実証された。グルコサミンは、滑膜細胞において約１０％ヒアルロン酸産生を促進した。このことは、Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸、γ−シクロデキストリンおよび酵母を含む粉末組成物が、従来ヒアルロン酸産生を促進することが公知であったグルコサミンよりも顕著にヒアルロン酸産生を促進することを示している。【００９２】
（実施例４．各種成分のヒアルロン酸産生促進能）
実施例２および３の結果から、Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸、γ−シクロデキストリンおよび酵母を含む粉末組成物が、軟骨細胞および滑膜細胞において高いヒアルロン酸産生促進能を有することが明らかになった。本実施例では、Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸、γ−シクロデキストリンおよび酵母を含む粉末組成物に含まれる成分のうち、どの成分が特にヒアルロン酸産生促進に寄与するのかをより詳細に検証した。【００９３】
ヒト軟骨細胞株（ＳＷ１３５３）を、１０％ウシ胎仔血清および抗生物質を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５培地にて３７℃で培養し、維持した。１ウェル当たり１．５×１０５細胞となるようにこの細胞を１２ウェルプレートに播種し、一晩前培養した。その後、以下の方法で細胞を培養した。
（１）ヒアルロン酸産生促進能を有する物質を添加せずに、上記軟骨細胞を２４時間培養した（図３におけるデータ１）。
（２）Ｓ−アデノシルメチオニンもフィチン酸も含まない酵母を添加して、上記軟骨細胞を２４時間培養した（図３におけるデータ２）。この酵母は、以下のように調製した。【００９４】
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｋ−７株（清酒酵母協会７号）、５Ｌ容ジャーファーメンター（仕込み培地量：３Ｌ）を、培養温度２８℃、攪拌速度  ５００ｒｐｍ、培養時間３６−４８ｈ、通気量０．５ＶＶＭ、培地組成（ｗ／１００ｍＬ）：グルコース５％、酵母エキス０．７５％、ペプトン２．０％で培養した。この培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ）し、菌体を回収した。回収した菌体に上清液を加え、菌体濃縮液を調製した。調製したサンプルを−８０℃で一晩凍結した。凍結乾燥を７２ｈ行い、酵母粉末を調製した。培養では、１４．４６μｇ／ｍＬになるように酵母を培地に添加した。
（３）Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸、γ−シクロデキストリンおよび酵母を含む粉末組成物を添加して、上記軟骨細胞を２４時間培養した（図３におけるデータ３）。培養では、Ｓ−アデノシルメチオニン濃度が０．５２μｇ／ｍｌになるように、Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸、γ−シクロデキストリンおよび酵母を含む粉末組成物を添加した。
（４）Ｓ−アデノシルメチオニン（Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−Ｌ−Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  Ｄｉｓｕｌｆａｔｅ  ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ，  ＣＨＥＭａｓｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）のみを添加して、上記軟骨細胞を２４時間培養した（図３におけるデータ４）。培養では、Ｓ−アデノシルメチオニン濃度が０．５２μｇ／ｍＬになるように、Ｓ−アデノシルメチオニンを添加した。
（５）γ−シクロデキストリンのみを添加して、上記軟骨細胞を２４時間培養した（図３におけるデータ５）。培養では、γ−シクロデキストリン濃度が２．６μｇ／ｍＬになるように、γ−シクロデキストリンを添加した。
（６）フィチン酸のみを添加して、上記軟骨細胞を２４時間培養した（図３におけるデータ６）。培養では、フィチン酸濃度が１．３μｇ／ｍＬになるように、フィチン酸を添加した。
（７）酵母およびＳ−アデノシルメチオニンを添加して、上記軟骨細胞を２４時間培養した（図３におけるデータ７）。培養では、酵母濃度が１４．４６μｇ／ｍＬになるように酵母粉末を、そしてＳ−アデノシルメチオニン濃度が０．５２μｇ／ｍＬになるようにＳ−アデノシルメチオニンをそれぞれ添加した。
（８）フィチン酸およびＳ−アデノシルメチオニンを添加して、上記軟骨細胞を２４時間培養した（図３におけるデータ８）。培養では、フィチン酸濃度が１．３μｇ／ｍＬになるようにフィチン酸を、そしてＳ−アデノシルメチオニン濃度が０．５２μｇ／ｍＬになるようにＳ−アデノシルメチオニンをそれぞれ添加した。
（９）γ−シクロデキストリンおよびＳ−アデノシルメチオニンを添加して、上記軟骨細胞を２４時間培養した（図３におけるデータ９）。培養では、γ−シクロデキストリン濃度が２．６μｇ／ｍＬになるようにγ−シクロデキストリンを、そしてＳ−アデノシルメチオニン濃度が０．５２μｇ／ｍＬになるようにＳ−アデノシルメチオニンをそれぞれ添加した。【００９５】
図３に示されるように、酵母、Ｓ−アデノシルメチオニン、γ−シクロデキストリンおよびフィチン酸の各成分のみを培地にそれぞれ添加しても、軟骨細胞のヒアルロン酸産生能には影響しなかった（図３におけるデータ２、４、５および６を参照のこと）一方で、Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸、γ−シクロデキストリンおよび酵母を含む粉末組成物（図３におけるデータ３）を添加した場合と、フィチン酸およびＳ−アデノシルメチオニン（図３におけるデータ８）を添加した場合には、軟骨細胞によって産生されるヒアルロン酸量がコントロールに対して有意に増加した（データ３について、ｐ＝０．０２７；データ８について、ｐ＝０．００２）。この結果から、Ｓ−アデノシルメチオニンとフィチン酸の組み合せが、ヒアルロン酸産生促進効果を有していることが実証された。【００９６】
（実施例５．皮膚線維芽細胞におけるヒアルロン酸産生促進）
正常ヒト真皮線維芽細胞株を、０．５％仔牛血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ変法ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）を用いて９６穴マイクロプレートに、２．０×１０４細胞／ウェルの細胞密度にて播種した。播種２４時間後、以下の濃度の試験試料を含む０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地にて２４時間培養した（ｎ＝５）。２４時間培養後、培養上清中のヒアルロン酸量をＥＬＩＳＡ法で分析した。ＥＬＩＳＡ法による分析には市販されている測定キットを用いて定法に従い定量した。ヒアルロン酸測定において使用したＥＬＩＳＡ法は競合法であり、得られた比色変化はサンプル中に含まれるヒアルロン酸量に反比例する。キットに従い、サンプルに酵素標識抗体と比色検出試薬を用いて比色変化量を数値化する。この数値を用いて標準品から得られた検量線により定量する。
結果を図４に示す。
（１）さらなる物質を添加せず（図４のデータ１を参照のこと）。
（２）０．５０μｇ／ｍＬのＳ−アデノシルメチオニンおよび１．２５μｇ／ｍＬのフィチン酸（図４のデータ２を参照のこと）。
（３）１．００μｇ／ｍＬのＳ−アデノシルメチオニンおよび２．５０μｇ／ｍＬのフィチン酸（図４のデータ３を参照のこと）。
（４）１０．００μｇ／ｍＬのＳ−アデノシルメチオニンおよび２５．００μｇ／ｍＬのフィチン酸（図４のデータ４を参照のこと）。
（５）０．００５ｗ／ｗ％の、実施例１で調製したＳ−アデノシルメチオニン、フィチン酸、γ−シクロデキストリンおよび酵母を含む粉末組成物（Ｓ−アデノシルメチオニン量０．５０μｇ／ｍＬに相当）（図４のデータ５を参照のこと）。
（６）０．０１０ｗ／ｗ％の、実施例１で調製したＳ−アデノシルメチオニン、フィチン酸、γ−シクロデキストリンおよび酵母を含む粉末組成物（Ｓ−アデノシルメチオニン量１．００μｇ／ｍＬに相当）（図４のデータ６を参照のこと）。
（７）０．１００ｗ／ｗ％の、実施例１で調製したＳ−アデノシルメチオニン、フィチン酸、γ−シクロデキストリンおよび酵母を含む粉末組成物（Ｓ−アデノシルメチオニン量１０．００μｇ／ｍＬに相当）（図４のデータ７を参照のこと）。
（８）０．００５ｗ／ｗ％の、フィチン酸（１．２５μｇ／ｍＬ）およびγ−シクロデキストリン（２．００μｇ／ｍＬ）含有酵母（図４のデータ８を参照のこと）。
（９）０．０１０ｗ／ｗ％の、フィチン酸（２．５０μｇ／ｍＬ）およびγ−シクロデキストリン（４．００μｇ／ｍＬ）含有酵母（図４のデータ９を参照のこと）。
（１０）０．１００ｗ／ｗ％の、フィチン酸（２５．００μｇ／ｍＬ）およびγ−シクロデキストリン（４０．００μｇ／ｍＬ）含有酵母（図４のデータ１０を参照のこと）。
図４に示す結果から明らかなとおり、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびフィチン酸添加群（図４のデータ２〜４）、ならびに、実施例１で調製したＳ−アデノシルメチオニン、フィチン酸、γ−シクロデキストリンおよび酵母を含む粉末組成物添加群（図４のデータ６〜７）におけるヒアルロン酸産生量は、未処理のヒト真皮線維芽細胞株培養物（図４のデータ１）、または、フィチン酸およびγ−シクロデキストリン含有酵母添加群（図４のデータ８〜１０）におけるヒアルロン酸産生量と比較して、有意に増加した。
なお、軟骨細胞および滑膜細胞に対しては、いずれも、Ｓ−アデノシルメチオニン量０．５２μｇ／ｍＬに相当する量のＳ−アデノシルメチオニン、フィチン酸およびγ−シクロデキストリン含有酵母を添加した場合にヒアルロン酸産生促進が観察されたが、ヒト真皮線維芽細胞では、ほぼ同量のＳ−アデノシルメチオニン量に相当する量（０．５０μｇ／ｍＬ）のＳ−アデノシルメチオニン、フィチン酸、γ−シクロデキストリンおよび酵母を含む粉末組成物を添加した場合（図４のデータ５を参照のこと）には有意な効果は確認されず、より高い濃度（１．００μｇ／ｍＬおよび１０．００μｇ／ｍＬ）のＳ−アデノシルメチオニン量を添加した場合にヒアルロン酸産生促進が観察された（図４のデータ６および７を参照のこと）。この結果から、Ｓ−アデノシルメチオニン、フィチン酸、γ−シクロデキストリンおよび酵母を含む粉末組成物の、ヒアルロン酸産生促進に適切な量は、対象の細胞によって変動することが示唆された。【００９７】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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