(57)【要約】  本発明は、レチノイン酸による効果が十分に生かされる育毛剤及びその製造方法を提供することを課題とする。本発明は、レチノイン酸産生細胞を含む育毛剤を提供する。また、本発明は、育毛剤を投与する対象から採取した末梢血から単核球を得る工程と、前記単核球を培養して成熟樹状細胞を得る工程と、を含む育毛剤の製造方法を提供する。本発明の育毛剤によれば、レチノイン酸が変性することなく作用し、頭皮内で細胞が継続的にレチノイン酸を放出するので、効率よく発毛を促進できる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レチノイン酸産生細胞を含む育毛剤。
【請求項２】
前記レチノイン酸産生細胞は、樹状細胞である、請求項１に記載の育毛剤。
【請求項３】
前記樹状細胞は、レチノイン酸性能が通常の樹状細胞よりも有意に高い、請求項２に記載の育毛剤。
【請求項４】
前記レチノイン酸産生細胞は、育毛剤を投与する対象に由来する、請求項１から３のいずれか１項に記載の育毛剤。
【請求項５】
さらに、血管内皮前駆細胞を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の育毛剤。
【請求項６】
前記血管内皮前駆細胞が、ｅａｒｌｙＥＰＣ及びｌａｔｅＥＰＣを含む、請求項５に記載の育毛剤。
【請求項７】
育毛剤を投与する対象から採取された末梢血から単核球を得る工程と、
前記単核球を培養して成熟樹状細胞を得る工程と、を含む育毛剤の製造方法。
【請求項８】
前記成熟樹状細胞を得る工程は、
単核球から接着性及び／又は弱接着性の細胞を選択する工程と、
前記選択した細胞をＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４及びレチノイン酸からなる群から選択される少なくとも一つの存在下で培養する工程と、を含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
さらに、育毛剤を投与する対象から採取された末梢血から単核球を得て、該単核球を培養して血管内皮前駆細胞に分化させる工程を含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記血管内皮前駆細胞に分化させる工程は、ｌａｔｅＥＰＣが出現するまで培養を継続する、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レチノイン酸を産生する細胞を含む育毛剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
毛髪には、ヘアサイクル（毛周期）と呼ばれるサイクルがあり、成長期、退行期、休止期の３つの期間が繰り返される。成長期は、毛母細胞が分裂を繰り返し、毛髪が成長する期間であり、通常２年から６年続く。退行期は毛髪を成長させていた毛母細胞の分裂が減少する期間であり、２−３週間続く結果、毛球が退縮、退化して毛根が頭皮の浅いところに移動する。休止期は、毛母細胞の活動が完全に休止する期間であり、３−４ヶ月続く。この期間に脱毛する。
休止期から再び成長期に移行するためには、バルジ領域に存在する毛包幹細胞が深部に移動して毛乳頭を取り囲み、毛乳頭からのシグナルによって、毛包幹細胞が毛芽細胞を経て毛母細胞に分化することが必要である。【０００３】
脱毛症の原因には、男性ホルモン、遺伝的要素、ストレス、食事や生活習慣の乱れなどがあると考えられている。
例えば、男性型脱毛症の主な原因物質は、男性ホルモンの一種であるジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）であることが知られている。男性型脱毛症の頭皮には多量のＤＨＴが検出される。ＤＨＴが男性ホルモン受容体と結合することによってヘアサイクルが乱れ、成長期が通常より早く終了する。その結果、毛髪が十分に成長する前に抜けてしまい、細く短い毛髪が増える。【０００４】
ビタミンＡの分解産物であるレチノイン酸は、皮膚や毛髪を含む多くの組織の維持や発達に関与していることが知られている。特に毛髪については、ヘアサイクルを調節することが知られ（例えば、非特許文献１参照）、レチノイン酸を含む育毛・養毛用外用剤が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
しかしながら、レチノイン酸は光や熱によって変性しやすく、薬剤としての安定性が低いため、育毛効果が十分に得られにくいという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−０９４７８４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】FASEB, 1996, 10:1002-1013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、レチノイン酸による効果が十分に生かされる育毛剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、レチノイン酸を産生する細胞を頭皮に注入することにより、レチノイン酸が変性することなく局所に迅速に浸透し、且つ細胞がレチノイン酸を継続的に産生・放出するので持続的に効果を得られるようになり、効率よく発毛が促進されることを見出した。当該細胞として、発毛を促進しようとする対象に由来する細胞を用いれば、免疫拒絶反応も生じない。【０００９】
また、本発明者らはさらに、レチノイン酸を産生する細胞と共に血管内皮前駆細胞（Endothelial progenitor cell；ＥＰＣ）を投与することにより、さらに効率よく発毛を促進できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、
〔１〕レチノイン酸産生細胞を含む育毛剤；
〔２〕前記レチノイン酸産生細胞は、樹状細胞である、上記〔１〕に記載の育毛剤；
〔３〕前記樹状細胞は、レチノイン酸性能が通常の樹状細胞よりも有意に高い、上記〔２〕に記載の育毛剤；
〔４〕前記レチノイン酸産生細胞は、育毛剤を投与する対象に由来する、上記〔１〕から〔３〕のいずれか１項に記載の育毛剤；
〔５〕さらに、血管内皮前駆細胞を含む、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載の育毛剤；
〔６〕前記血管内皮前駆細胞が、ｅａｒｌｙＥＰＣ及びｌａｔｅＥＰＣを含む、上記〔５〕に記載の育毛剤；
〔７〕育毛剤を投与する対象から採取した末梢血から単核球を得る工程と、前記単核球を培養して成熟樹状細胞を得る工程と、を含む育毛剤の製造方法；
〔８〕前記成熟樹状細胞を得る工程は、単核球から接着性及び／又は弱接着性の細胞を選択する工程と、前記選択した細胞をＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４及びレチノイン酸からなる群から選択される少なくとも一つの存在下で培養する工程と、を含む上記〔７〕に記載の方法；
〔９〕さらに、育毛剤を投与する対象から採取した末梢血から単核球を得て、該単核球を培養して血管内皮前駆細胞に分化させる工程を含む、上記〔７〕又は〔８〕に記載の方法；及び
〔１０〕前記血管内皮前駆細胞に分化させる工程は、ｌａｔｅＥＰＣが出現するまで培養を継続する、上記〔９〕に記載の方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る育毛剤によれば、レチノイン酸が変性することなく局所に迅速に浸透して作用し、また、頭皮内で細胞が生存し、継続的にレチノイン酸を放出するので、従来技術と比較して著しく効率よく発毛を促進することができる。また、本発明に係る育毛剤は、本人に由来する細胞を利用するため、免疫拒絶反応を生じることがなく、安全性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、レチノイン酸産生細胞を培養後、免疫染色を行った結果を示す。図１Ａはコントロール、図１ＢはＡＬＤＨ１Ａ２、図１ＣはＣＤ８６、図１ＤはＨＬＡｃｌａｓｓＩＩの結果である。
【図２】図２は、培養したＥＰＣの顕微鏡写真である。図２Ａは、培養７日目以降にｌａｔｅＥＰＣが出現したことを示す。点線内の細胞がｌａｔｅＥＰＣ、点線外の細胞がｅａｒｌｙＥＰＣである。図２ＢはｌａｔｅＥＰＣが増殖し、画面の全面に広がったことを示す。図２ＣはｅａｒｌｙＥＰＣの強拡大図である。紡錘状の形態を示し細胞間接着がない。図２Ｄは、ｌａｔｅＥＰＣの強拡大図である。敷石状の形態を示し、細胞間接着がある。
【図３】図３Ａ及びＢは、ＥＰＣに、蛍光標識されたアセチル化ＬＤＬ（Ａｃ−ＬＤＬ）を取り込ませた後、ＦＩＴＣ標識レクチン（ＵＥＡ−Ｉ）によりレクチン染色を行ったものである。図３ＡはＡｃ−ＬＤＬを取り込んだＥＰＣを示す。図３Ｂはレクチン反応陽性細胞を示す。図３Ａ、Ｂは同一視野の蛍光顕微鏡写真であり、同一細胞がＡｃ−ＬＤＬの取り込み能力を有し、かつレクチン反応陽性細胞であることを示す。
【図４】図４は、ある被検者において、本発明の育毛剤を投与してから２週間後、５週間後および６ヶ月後の投与部位周辺の写真である。
【図５】図５は、図４とは別の被検者において、本発明の育毛剤を投与してから１ヶ月後及び３ヶ月後の投与部位周辺の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明に係る育毛剤は、レチノイン酸産生細胞を含む。
レチノイン酸は、皮膚や毛髪を含む多くの組織の維持や発達に関与していることが知られている。レチノイン酸は、バルジ領域に存在する毛包幹細胞に働きかけ、ヘアサイクルを成長期へと促進する。
【００１３】
レチノイン酸は、光や熱によって変性しやすく、頭皮に塗布しても皮膚の深部にまで浸透しにくいため、真皮や毛包細胞等に十分に作用しない。
しかしながら、本発明に係る育毛剤はレチノイン酸産生細胞を含むので、これを頭皮に注入すればレチノイン酸が変性しないまま深部に到達する。また、細胞が頭皮内で生存することにより、レチノイン酸の産生及び放出が継続するので、効果を持続させることができる。
【００１４】
レチノイン酸産生細胞の種類は特に限定されず、レチノイン酸を産生する限りあらゆる細胞を利用することができる。
【００１５】
細胞がレチノイン酸産生能を有するか否かは、細胞中のレチノイン酸やレチノイン酸産生酵素の発現を測定する方法、細胞表面マーカーの発現を測定する方法によって確認することができる。なお、本明細書において「発現」は、ＤＮＡを鋳型としてｍＲＮＡが産生される転写と、ｍＲＮＡの情報に従ってタンパク質が合成される翻訳の両方を含む。
【００１６】
レチノイン酸産生能を有する細胞表面マーカーとしては、ＣＤ１１ｃhigh、ＣＤ４-/low、ＣＤ８ａintermediate、ＣＤ１１ｂ-/low、Ｆ４／８０low/intermediate、ＣＤ４５ＲＢlow、ＣＤ８６high、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩhigh、Ｂ２２０-、ＣＤ１０３+などが挙げられるので、これらの細胞表面における発現を測定すればレチノイン酸産生細胞を選択することができる。
【００１７】
レチノイン酸を産生する細胞としては、例えば樹状細胞やマクロファージが知られており、中でも、ＣＤ１０３+及びＣＤ１１ｂ-/lowの樹状細胞や、ＣＤ１１ｂ+及びＦ４／８０+のマクロファージは、特に産生能が高い細胞として知られている。
【００１８】
レチノイン酸産生の指標となるレチノイン酸産生酵素としては、レチナールデヒドロゲナーゼ（ＲＡＬＤＨ）や、ＡＬＤＨ１Ａ２が挙げられ、常法（例えば免疫染色法）によりこれらの発現を測定することができる。
【００１９】
本発明の育毛剤は、レチノイン酸産生細胞に加え、ＥＰＣを含んでいてもよい。ＥＰＣは、成人の末梢血単核球から単離され、ＶＥＧＦなどの内皮細胞成長因子と培養することにより血管内皮細胞に分化する細胞である（Science, 1997, 275, 964-967）。これまでに自己ＥＰＣを虚血部位に移植する血管再生療法が試みられている。
【００２０】
毛包の周囲には血管が網状に存在し、ヘアサイクルにおいて、毛包の成長期にはこれらの血管が豊富に存在するが、退行期、休止期には減少することが知られている。従って、発毛の促進には、頭皮内の血流の改善が必要である。これまでに、血管新生促進因子であるＶＥＧＦの遺伝子をマウスに導入した実験において、毛包周囲血管網の構築が促進されたことが報告されている（J Clin Invest. 2001, 107, 409-417）。
本発明者らは、後述する実施例に示すとおり、レチノイン酸産生細胞に加え、ＥＰＣを頭皮に注入することにより、著しく発毛が促進されることを見出した。
【００２１】
ＥＰＣには、細胞の形状と培養可能な期間の違いなどから、ｅａｒｌｙＥＰＣとｌａｔｅＥＰＣの２種類がある（Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2004, 24, 288-293）。ｅａｒｌｙＥＰＣは、主にＶＥＧＦなどのサイトカインを産生し、ｌａｔｅＥＰＣは、既存の血管内皮細胞に取り込まれて管腔形成に寄与する。本発明の育毛剤は、ｅａｒｌｙＥＰＣとｌａｔｅＥＰＣのいずれかを含むものであっても、両方を含むものであってもよい。
ＥＰＣは、培養開始後、例えば７日目以降のものを用いてもよく、１０−１４日目のものが好ましく用いられる。
【００２２】
本発明の育毛剤に用いられるレチノイン酸産生細胞及び血管内皮前駆細胞は、育毛剤を投与する対象に由来するものを用いることができる。育毛剤を投与する対象に由来する細胞を用いることにより、免疫拒絶反応が起こることなく、頭皮内で細胞が生存することができるので、それぞれの細胞による育毛効果が持続的に発揮される。
【００２３】
対象から採取した細胞は、そのまま育毛剤として頭皮内に注入することもできるし、一定期間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、レチノイン酸産生能を上昇させてから頭皮内に注入してもよい。
注入時に、生理食塩水等の溶媒で希釈してから頭皮内に注入してもよい。この場合、例えば、０．１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜１×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、０．２×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ等とすることができるが、これらの濃度に限定されない。
【００２４】
本明細書において「育毛剤」は最も広い意味で用いられ、毛髪を増加させる効果、発毛及び育毛の速度を増加させる効果、毛髪を太くする効果等のいずれを奏するものであってもよい。
本発明に係る育毛剤が用いられる脱毛症は、特に限定されず、例えば、男性型脱毛症、円形脱毛症、脂漏性脱毛症、分娩後脱毛症、抗癌剤の副作用による脱毛、牽引性脱毛症、びまん性脱毛症が挙げられる。
【００２５】
また、本発明に係る育毛剤は、頭皮内に直接注入することが想定され、注射剤とすることが好ましい。
かかる注射剤は、例えば培養後の細胞を、適量（例えば２ｍＬ〜５ｍＬ）の生理食塩水に溶解して得ることができる。
注射剤には、添加剤を加えることもでき、かかる添加剤としては、例えば、保存剤、安定剤、防腐剤、緩衝剤、等張化剤、溶解補助剤等が挙げられる。
【００２６】
本発明の育毛剤は、レチノイン酸産生細胞とＥＰＣを一つの剤（例えば注射剤）中に混合した形態であってもよく、それぞれ別の剤として標的部位に個別に投与する形態であってもよい。
【００２７】
レチノイン酸産生細胞を含む育毛剤は、例えば、育毛剤を投与する対象に由来する樹状細胞の前駆細胞を培養し分化させることによって製造することができる。樹状細胞の前駆細胞としては、骨髄細胞、臍帯血由来細胞、末梢血由来細胞等が用いられる。
【００２８】
レチノイン酸産生樹状細胞を培養するための培地、培養期間、添加物等は、レチノイン酸を産生する樹状細胞が得られる限り特に限定されない。レチノイン酸産生樹状細胞は、例えば以下の方法により得ることができる。
【００２９】
まず、対象から採取した末梢血から常法に従って末梢血単核球（ＰＢＭＣ）層を分離し、このうち接着性又は弱接着性の細胞を選択する。
選択した細胞を、サイトカイン類の存在下で培養することにより、樹状細胞に分化させることができる。
【００３０】
培地としては、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イスコフ培地（ＩＭＤＭ）、ＡＩＭ−Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などを用いることができるがこれらに限定されない。
【００３１】
培地に加える血清は、ウシ血清、ウシ胎児血清、ヒト血清等を用いることができるが、１０％加熱非動化自己血清または自己血漿を用いることが好ましい。無血清で培養し、ウシアルブミンやヒトアルブミンを添加して培養することもできる。
また、培地には、必要に応じて、各種の添加剤を加えてもよい。
【００３２】
サイトカイン類は特に限定されないが、例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、ステムセルファクター（ＳＣＦ）、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ｐｉｃｉｂａｎｉｌ、抗原、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３が挙げられる。この中でも、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で培養することにより、レチノイン酸産生能の高い樹状細胞に分化させることができる（Internal Immunology, 2009, 21:361-377）。サイトカイン類は、ヒトに由来するものを用いることが好ましい。
また、レチノイン酸自身が樹状細胞のレチノイン酸産生を促進するため、樹状細胞の培地にレチノイン酸を加えてもよい。
【００３３】
培養期間は当業者が適宜決定することができるが、例えば７−１０日間とすることができる。育毛剤として投与する前（例えば２日前）に分化誘導剤をさらに加えることも好ましく、これによって成熟した樹状細胞へと分化させることができる。
【００３４】
培養細胞がレチノイン酸産生可能であることは、上述のとおり、細胞中のレチノイン酸及び／又はレチノイン酸産生酵素の発現を測定する方法、細胞表面マーカーの発現を測定する方法等によって確認することができる。
【００３５】
ＥＰＣの調製も公知の方法に従って行うことができるが、例えば、対象から採取した末梢血から常法に従って末梢血単核球（ＰＢＭＣ）層を分離し、これを培養することによって得ることができる。ＰＢＭＣ層は、レチノイン酸産生細胞を培養する際に得たものの一部を用いてもよいし、新たに採血を行って調製してもよい。
培地としては、レチノイン酸産生細胞と同様のものを使用し、同様の血清を加えることができる。培養容器はヒトフィブロネクチンをコーティングしたものが望ましいが、タイプIコラーゲンやラミニンなど、フィブロネクチン以外の細胞外マトリクスをコーティングしたものでもよい。
【００３６】
さらに、添加物として、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、アスコルビン酸、ヘパリン、ＧＡ−１０００、ハイドロコーチゾン等を加え、７−１０日培養することにより、分化を誘導することができる。培地及び添加剤として、市販の血管内皮細胞培養液（例えば、ＥＧＭTM−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔTM；Ｌｏｎｚａ社製）を使用することもできる。
【００３７】
培養細胞が、ＥＰＣであることは、例えば、レクチン染色が陽性であること、アセチル化したＬＤＬの取り込み能力があることによって確認することができる。また、血管内皮細胞マーカー（ＣＤ３１、ＶＥＧＦＲ２、ｅＮＯＳなど）を免疫染色などの方法で検出して確認することもできる。顕微鏡によって形態を観察し、確認してもよい。
【実施例】
【００３８】
１．レチノイン酸産生能を上昇させた樹状細胞の調製
育毛剤を投与する対象者からヒト末梢血を採取し、比重遠心法により、赤血球層とＰＢＭＣ層に分離した。得られたＰＢＭＣのうち、細胞培養用皿に接着性の細胞を、１０％自己血漿を含有し、さらに５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｉｘ社）とＩＬ−４（Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｉｘ社）を加えたＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で７〜１０日間培養した。【００３９】
細胞移植の２日前に分化誘導剤（ｐｉｃｉｂａｎｉｌ：０．０５ＫＥ）を加え、成熟した樹状細胞へと分化させた。
培養細胞がレチノイン酸を産生していることを確認するために、レチノールデヒドロゲナーゼのＡＬＤＨ１Ａ２の存在を、常法に従って免疫染色法により確認した。また、培養細胞が、成熟した樹状細胞の細胞表面マーカーであり、かつレチノイン酸高産生細胞のマーカーでもあるＣＤ８６とＨＬＡｃｌａｓｓＩＩを発現していることを、免疫染色法により確認した。具体的には、樹状細胞を８ウェルのチャンバースライドに播種し、細胞が接着した後、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定した。ブロッキング後、ＡＬＤＨ１Ａ２、ＣＤ８６及びＨＬＡｃｌａｓｓＩＩに対する抗体（いずれも２μｇ／ｍＬ）とインキュベートし、洗浄した後、ＥｎｖｉｓｉｏｎＫｉｔ（Ｄａｋｏ社）を用い、使用説明書に従って発色させてＡＬＤＨ１Ａ２、ＣＤ８６、ＨＬＡｃｌａｓｓＩＩの発現を確認した。
結果を図１に示す。図１Ａはコントロール、図１Ｂは、ＡＬＤＨ１Ａ２、同図ＣはＣＤ８６、同図ＤはＨＬＡｃｌａｓｓＩＩの免疫染色の結果である。【００４０】
２．ＥＰＣの調製
上記１．で得られたＰＢＭＣ層の一部を、１０％加熱非動化自己血清または自己血漿を含有し、ヒト上皮成長因子（epidermal growth factor；ＥＧＦ）、ヒト血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor；ＶＥＧＦ）、ヒト線維芽細胞増殖因子（fibroblast growth factor-2；ＦＧＦ−２）、ヒトインスリン様成長因子−１；ＩＧＦ−１）、アスコルビン酸、ヘパリン、ＧＡ−１０００、ハイドロコーチゾンを添加した培地（ＥＧＭTM−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔTM；Ｌｏｎｚａ社製）を使用し、フィブロネクチンコートディッシュ（ＢＤ社製）上で７〜１０日間培養し分化誘導した。添加物の添加は、キットの使用説明書に従って行った。
顕微鏡で観察した結果の一例を図２に示す。ｌａｔｅＥＰＣが、培養７日以上で出現したものもあった。ｌａｔｅＥＰＣが出現したものについては、図２Ａに示すような、ｅａｒｌｙＥＰＣとｌａｔｅＥＰＣが混在した状態のものを育毛剤として用いた。【００４１】
また、ＥＰＣの同定方法として、アセチル化ＬＤＬの取り込み実験と、レクチン染色も行った。具体的には、ＥＰＣを、８ウェルチャンバースライドに播種し、細胞が接着したのち、細胞が生存している状態で蛍光標識されたアセチル化ＬＤＬを添加し、３７度、ＣＯ2インキュベーターで２時間培養を続けた。次いで、細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、ＦＩＴＣ標識されたＵＥＡ−１（ヒト血管内皮細胞に結合するレクチン）とインキュベートし、レクチン反応陽性細胞かどうかを蛍光顕微鏡により確認した。
アセチル化ＬＤＬの蛍光標識の検出結果を図３Ａに、ＦＩＴＣ標識の検出結果を図３Ｂに示す。アセチル化したＬＤＬの取り込み能力があり、かつレクチン染色が陽性であるため、ＥＰＣと同定した。【００４２】
３．育毛剤の投与
上述のように得られた樹状細胞及びＥＰＣを生理食塩水で約０．２〜１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬに適宜希釈し、髪の生え際の部分に万遍なくいきわたるように注射した。
結果の一例を図４に示す。移植２週間後に比較して、移植５週間後では毛髪の密度が著しく上昇し、発毛が促進されたことが確認された。また、移植６ヶ月後には、毛髪が伸長しているのが観察された。
別の被検者の例を図５に示す。移植から３ヶ月後は、１ヶ月後を比較して毛髪の密度が著しく上昇し、発毛が促進されたことが確認された。なお、この例では、移植後１ヶ月から３ヶ月の間に３回移植を繰り返した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年5月9日(2012.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹状細胞を含む育毛剤。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
前記樹状細胞は、レチノイン酸産性能が通常の樹状細胞よりも有意に高い、請求項１に記載の育毛剤。
【請求項４】
前記樹状細胞は、育毛剤を投与する対象に由来する、請求項１又は３に記載の育毛剤。
【請求項５】
さらに、血管内皮前駆細胞を含む、請求項１、３及び４のいずれか１項に記載の育毛剤。
【請求項６】
前記血管内皮前駆細胞が、ｅａｒｌｙＥＰＣ及びｌａｔｅＥＰＣを含む、請求項５に記載の育毛剤。
【請求項７】
育毛剤を投与する対象から採取した末梢血から単核球を得る工程と、
前記単核球を培養して成熟樹状細胞を得る工程と、を含む育毛剤の製造方法。
【請求項８】
前記成熟樹状細胞を得る工程は、
単核球から接着性及び／又は弱接着性の細胞を選択する工程と、
前記選択した細胞をＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４及びレチノイン酸からなる群から選択される少なくとも一つの存在下で培養する工程と、を含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
さらに、育毛剤を投与する対象から採取した末梢血から単核球を得て、該単核球を培養して血管内皮前駆細胞に分化させる工程を含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記血管内皮前駆細胞に分化させる工程は、ｌａｔｅＥＰＣが出現するまで培養を継続する、請求項９に記載の方法。
【国際調査報告】
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