(57)【要約】  ニッケルイオンを溶出せず、血管内皮形成能に優れたバイオハイブリッド材料、その製造方法及びステントを提供する。Ｎｉを含有しない合金部材（１１）と、２以上の活性エステルを有する有機酸（１２）と、サイトカイン（１３）とを有し、Ｎｉを含有しない合金部材（１１）と有機酸（１２）がエステル結合されており、有機酸（１２）とサイトカイン（１３）がアミド結合を介して固定化されているバイオハイブリッド材料（１０１）を用いる。
2012070608.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｉを含有しない合金部材と、
２以上の活性エステルを有する有機酸と、
サイトカインとを有し、
前記Ｎｉを含有しない合金部材と前記有機酸とがエステル結合されており、
前記有機酸と前記サイトカインとがアミド結合を介して固定化されていることを特徴とするバイオハイブリッド材料。
【請求項２】
前記サイトカインが、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ又はＢＭＰのいずれかであることを特徴とする請求項１に記載のバイオハイブリッド材料。
【請求項３】
前記２以上の活性エステルを有する有機酸が、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、オキサル酢酸、ｃｉｓ−アコニット酸、２−ケトグルタル酸、マレイン酸、フマル酸、又はそれらの誘導体のいずれかである請求項１又は請求項２に記載のバイオハイブリッド材料。
【請求項４】
Ｎｉを含有しない合金部材が、Ｆｅ、Ｍｏ、Ｃｏ又はＣｒの群から選ばれる元素を２種以上含有する合金である請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオハイブリッド材料。
【請求項５】
前記合金が、窒素を０．５以上１ｗｔ％以下の範囲で含有する請求項４に記載のバイオハイブリッド材料。
【請求項６】
Ｎｉを含有しない合金部材に親水化表面処理を行う表面処理工程と、
前記Ｎｉを含有しない合金部材に２以上の活性エステルを有する有機酸を固定化する有機酸固定化工程と、
前記有機酸にサイトカインを固定化するサイトカイン固定化工程と、を有することを特徴とするバイオハイブリッド材料の製造方法。
【請求項７】
前記親水化表面処理がＵＶ照射処理である請求項６に記載のバイオハイブリッド材料の製造方法。
【請求項８】
前記有機酸の固定化が室温以下にして行われる請求項６又は請求項７に記載のバイオハイブリッド材料の製造方法。
【請求項９】
前記サイトカインの固定化が１０℃以下で行われる請求項６〜請求項８のいずれか１項に記載のバイオハイブリッド材料の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜５に記載のバイオハイブリッド材料からなることを特徴とするステント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオハイブリッド材料、その製造方法及びステントに関する。
本願は、２０１０年１１月２６日に、日本に出願された特願２０１０−２６３４０３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
近年、心筋梗塞や狭心症に対する治療法として、ステントを用いた冠動脈インターベンション術が主流となっている。
しかし、ステントに用いられるＳＵＳ３１６ＬやＣｏＣｒ合金は、通常、ニッケルイオンを含有するので、生体に使用したときに、これらの合金からニッケルイオンが溶出され、再狭窄をもたらす原因となることが指摘されている（非特許文献１）。
そのため、ベアメタルステント埋入に伴う再狭窄を抑制するために、薬剤が搭載された薬剤溶出性ステント（Ｄｒｕｇ  Ｅｌｕｔｉｎｇ  Ｓｔｅｎｔｓ：ＤＥＳ）が開発されている。しかし、薬剤溶出性ステントでは、ステント埋入後の血管内皮形成能が悪いという問題があった。【０００３】
ステントに用いる材料として、ニッケルフリー高窒素ステンレス（以下、ＨＮＳという）が開発されている。非特許文献２には、Ｎ２ガス加圧式エレクトロスラ再溶解（Ｐ−ＥＳＲ）法により、ＨＮＳを作製できることが記載されている。しかし、ＨＮＳからなるステントも、ステント埋入後の血管内皮形成能が悪いという問題があった。
金属表面に、細胞に対して信号を与える分子であるサイトカインを固定化することにより、ニッケルイオンを溶出せず、血管内皮形成能に優れたステントを開発できる可能性がある。サイトカインには、例えば、血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）がある。特許文献１は、固定化されたＶＥＧＦの効果に関するものであり、人工血管上へのフィブロネクチンとの共固定により、血管内皮細胞の増殖が促進され、移動速度が上昇することが記載されている。また、非特許文献３は、サイトカインの固定化法に関するものであり、金属表面へのドーパミン処理あるいは進化分子工学により探索した結合性ペプチドを用いた手法により、サイトカインを固定化できることが記載されている。【０００４】
しかし、ＨＮＳからなるステントの表面にＶＥＧFを上記の方法で化学的あるいは物理的に接合した場合、結合力が強すぎるため、逆に内皮細胞の過増殖が引き起こされる可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−１３７３３４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｏｓｔｅｒ  Ｒ，Ｖｉｅｌｕｆ  Ｄ，ＫｉｅｈｎＭ，  ｅｔ  ａｌ，Ｌａｎｃｅｔ  ２０００；３５６：１８９５-７．
【非特許文献２】Ｎ．Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｍ．Ｓａｎｂｅ，Ｙ．Ｋａｔａｄａ，Ｋ．Ｋａｎａｚａｗａ，Ｊ．Ｊａｐａｎ  Ｉｎｓｔ．Ｍｅｔａｌｓ  ２００９；７３：７−１４．
【非特許文献３】姜延和、阿部祥子、北島隆、櫻木誠、和田章、阿部洋、伊藤嘉浩、第３９回医用高分子シンポジウム予稿集  pp.７３−７４（２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ニッケルイオンを溶出せず、血管内皮形成能に優れたバイオハイブリッド材料、その製造方法及びステントを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の構成を有する。
（１）Ｎｉを含有しない合金部材と、２以上の活性エステルを有する有機酸と、サイトカインとを有し、前記Ｎｉを含有しない合金部材と前記有機酸とがエステル結合されており、前記有機酸と前記サイトカインとがアミド結合を介して固定化されていることを特徴とするバイオハイブリッド材料。【０００９】
（２）前記サイトカインが、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ又はＢＭＰのいずれかである上記（１）記載のバイオハイブリッド材料。【００１０】
（３）前記２以上の活性エステルを有する有機酸が、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、オキサル酢酸、ｃｉｓ−アコニット酸、２−ケトグルタル酸、マレイン酸、フマル酸、又はそれらの誘導体のいずれかである上記（１）または（２）記載のバイオハイブリッド材料。【００１１】
（４）前記Ｎｉを含有しない合金部材が、Ｆｅ、Ｍｏ、Ｃｏ又はＣｒの群から選ばれる元素を２種以上含有する合金である上記（１）から（３）のいずれか一つに記載のバイオハイブリッド材料。【００１２】
（５）前記合金が、窒素を０．５以上１ｗｔ％以下の範囲で含有する上記（４）記載のバイオハイブリッド材料。【００１３】
（６）Ｎｉを含有しない合金部材に親水化表面処理を行う表面処理工程と、前記Ｎｉを含有しない合金部材に２以上の活性エステルを有する有機酸を固定化する有機酸固定化工程と、前記有機酸にサイトカインを固定化するサイトカイン固定化工程と、を有することを特徴とするバイオハイブリッド材料の製造方法。【００１４】
（７）前記親水化表面処理がＵＶ照射処理である上記（６）記載のバイオハイブリッド材料の製造方法。【００１５】
（８）前記有機酸の固定化が、室温以下で行われる上記（６）または（７）記載のバイオハイブリッド材料の製造方法。【００１６】
（９）前記サイトカインの固定化が、１０℃以下で行われる上記（６）から（８）のいずれか一つに記載のバイオハイブリッド材料の製造方法。【００１７】
（１０）上記（１）から（５）のいずれか一つに記載のバイオハイブリッド材料からなることを特徴とするステント。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の第一の態様のバイオハイブリッド材料は、Ｎｉを含有しない合金部材と、２以上の活性エステルを有する有機酸と、サイトカインとを有し、前記Ｎｉを含有しない合金部材と前記有機酸がエステル結合されており、前記有機酸と前記サイトカインがアミド結合を介して固定化されている。上記バイオハイブリッド材料には、Ｎｉを含有しない合金部材が使用されているため、ニッケルイオンの溶出を防ぐことが出来る。また、サイトカインを上記Ｎｉを含有しない合金部材状に固定することにより、血管内皮形成能を向上させることが出来る。さらに、合金層およびサイトカイン層を２以上の活性エステルを有する有機酸により強固に接合することが出来る。そして、これらの結果、安定なバイオハイブリッド材料とすることができる。【００１９】
本発明の第二の態様のバイオハイブリッド材料の製造方法は、Ｎｉを含有しない合金部材に親水化表面処理を行う表面処理工程と、前記Ｎｉを含有しない合金部材に２以上の活性エステルを有する有機酸を固定化する有機酸固定化工程と、前記有機酸にサイトカインを固定化するサイトカイン固定化工程と、を有する。上記バイオハイブリッド材料の製造方法により、ニッケルイオンを溶出せず、血管内皮形成能に優れたバイオハイブリッド材料を容易に製造することができる。【００２０】
本発明の第三の態様のステントは、先に記載のバイオハイブリッド材料からなる。上記ステントは、生体適合性及び加工性が高く、ニッケルイオンを溶出せず、血管内皮形成能に優れる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】本発明のバイオハイブリッド材料の一例を示す斜視図である。
【図１Ｂ】本発明のバイオハイブリッド材料の一例を示す側面図である。
【図２】本発明のバイオハイブリッド材料の一例を示す拡大概略図である。
【図３Ａ】本発明のバイオハイブリッド材料の製造方法の一例を示す工程図である。
【図３Ｂ】本発明のバイオハイブリッド材料の製造方法の一例を示す工程図である。
【図３Ｃ】本発明のバイオハイブリッド材料の製造方法の一例を示す工程図である。
【図４Ａ】基板と有機酸の接合状態の一例を示す拡大概略図である。
【図４Ｂ】基板と有機酸の接合状態の一例を示す拡大概略図である。
【図５Ａ】本発明のステントの一例を示す概略図である。
【図５Ｂ】本発明のステントの一例を示す概略図である。
【図６】接触角の相違を示す写真である。
【図７】試験例１のＸＰＳスペクトルである。
【図８】試験例２のＸＰＳスペクトルである。
【図９】試験例３のＸＰＳスペクトルである。
【図１０】試験例４のＸＰＳスペクトルである。
【図１１】試験例５のＸＰＳスペクトルである。
【図１２】測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（本発明の実施形態）
［バイオハイブリッド材料］
まず、本発明の実施形態であるバイオハイブリッド材料について説明する。
図１は、本発明の実施形態であるバイオハイブリッド材料の一例を示す概略図であって、図１Ａは斜視図であり、図１Ｂは側面図である。
図１Ａ及びＢに示すように、バイオハイブリッド材料１０１は、Ｎｉを含有しない合金部材１１と、有機酸１２と、サイトカイン１３とを有して概略構成されている。
Ｎｉを含有しない合金部材１１の一面１１ａに有機酸１２が接合され、有機酸１２の一面１２ａにサイトカイン１３が接合されている。
【００２３】
サイトカイン１３は、細胞に対して信号を与える分子であり、血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、上皮細胞増殖因子（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）、血小板由来増殖因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）又は骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＭＰ）のいずれかであることが好ましい。また、サイトカイン１３を用いることにより、血管内皮形成能に優れたバイオハイブリッド材料とすることができる。
【００２４】
有機酸１２は、２以上の活性エステルを有する。２以上の活性エステルを有することにより、活性エステルを置換して、サイトカイン１３に対して容易にアミド結合を形成することができる。また、有機酸１２は、そのカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を使って、Ｎｉを含有しない合金部材１１の一面１１ａの水酸基に対して、容易にエステル結合を形成することができる。
２以上の活性エステルを有する有機酸としては、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、オキサル酢酸、ｃｉｓ−アコニット酸、２−ケトグルタル酸、マレイン酸、フマル酸、又はそれらの誘導体のいずれかであることが好ましい。前記誘導体としては、例えば、クエン酸誘導体（Ｔｒｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｃｉｔｒａｔｅ：ＴＳＣ）を挙げることができる。ＴＳＣの場合、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：ＮＨＳ）基が活性エステル基である。
本明細書中で活性エステルとは、触媒等を添加することなく、アミノ基、水酸基、チオール基等と反応するエステルを意味する。
活性エステル基としては、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、パラニトロフェノールエステル等が例としてあげられる。
有機酸１２に含まれる２以上の活性エステルは、同一種であってもよいし、また、異なる種類のものであっても良い。
【００２５】
Ｎｉを含有しない合金部材１１は、Ｆｅ、Ｍｏ、Ｃｏ又はＣｒの群から選ばれる元素を２種以上有する合金であることが好ましい。これにより、高強度で安定なバイオハイブリッド材料とすることができる。
【００２６】
前記合金は、窒素を０．５以上１ｗｔ％以下の範囲で含有することが好ましい。窒素を０．５以上１ｗｔ％以下の範囲で含有する合金を用いることにより、加工性を向上させることができ、細い管であって容易に形成することができ、精密なステントであっても、高精度で加工することができる。窒素を０．５ｗｔ％未満とした場合には、生体適合性が低下し、窒素を１ｗｔ％超とした場合には、加工性が低下するので、それぞれ好ましくない。
窒素を０．５以上１ｗｔ％以下の範囲で含有するＮｉを含有しない合金部材１１の材料として、例えば、２３Ｃｒ−１Ｍｏ−１Ｎの合金を挙げることができる。
【００２７】
前記合金は、Ｔｉ、Ｂ、Ｎｂの群から選ばれる元素を含有することがより好ましい。Ｔｉ、Ｂ、Ｎｂの群から選ばれる元素を含有させることにより、内部に形成されるＴｉＮ、ＢＮ、ＮｂＮのいずれかが結晶粒の核となり、結晶粒を小さくすることができる。これにより、例えば、ステント等にこの合金を用いる場合、基板の厚さを薄くしても、粒結晶の成長を抑制し、結晶粒を小さくして、ステント等の強度を上げることができる。
【００２８】
図２は、本発明のバイオハイブリッド材料の一例を示す拡大概略図である。サイトカイン１３としてＶＥＧＦを用い、有機酸１２としてＴＳＣを用いた場合が示されている。
図２に示すように、ＴＳＣのカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）がＮｉを含有しない合金部材１１にエステル結合されている。また、ＴＳＣの２つの活性エステルがＶＥＧＦと置換され、ＴＳＣとＶＥＧＦはアミド結合で固定化されている。ＴＳＣを介在させることにより、各層が強く結合されている。
【００２９】
［バイオハイブリッド材料の製造方法］
次に、本発明の実施形態であるバイオハイブリッド材料の製造方法について説明する。
本発明の実施形態であるバイオハイブリッド材料の製造方法は、Ｎｉを含有しない合金部材に親水化表面処理を行う工程（第１工程）と、前記Ｎｉを含有しない合金部材に２以上の活性エステルを有する有機酸を固定化する工程（第２工程）と、前記有機酸にサイトカインを固定化する工程（第３工程）と、を有する。
図３は、本発明の実施形態であるバイオハイブリッド材料の製造方法の一例を示す工程図である。
【００３０】
（第１工程）
図３Ａに示すように、まず、Ｎｉを含有しない合金部材１１を用意する。例えば、ＨＮＳディスク（２３Ｃｒ−１Ｍｏ−１Ｎ、φ１０ｍｍ×Ｈ１ｍｍ）を用いることができる。Ｎｉを含有しない合金部材１１の大きさは特に限定されない。
次に、Ｎｉを含有しない合金部材１１の一面１１ａにＵＶ照射を行う。ＵＶ照射により、Ｎｉを含有しない合金部材１１の一面１１ａを親水化することができる。通常のＵＶ露光装置（定格電圧：８Ｗ、ランプ電流：９．５ｍＡ、紫外線強度：０．０８５ｍＷ／ｃｍ２（オゾン発生量１６ｍｇ／ｈ））を用いた場合、ＵＶ照射を３０分以上行うことにより、表面に吸着した有機分子層を除去して、合金表面に水酸基を増幅させることができ、合金部材１の表面を超親水性（接触角が１０°以下）とすることができる。前記ＵＶ照射時間は４５分以上とすることがより好ましく、６０分以上とすることが更に好ましい。
前記親水化表面処理はＵＶ照射処理であることが好ましい。これにより、容易に、且つ、一様に、親水化表面処理を行うことができる。
【００３１】
（第２工程）
次に、親水化処理を行ったＮｉを含有しない合金部材１１を基板ホルダーにセットする。基板ホルダーとしては、例えば、シリコーンシートを用いることができる。
次に、室温・乾燥雰囲気下、所定濃度の有機酸１２を含む溶液を、所定時間一定量滴下する。有機酸１２の濃度及び前記所定時間は、特に制限されない。これにより、Ｎｉを含有しない合金部材１１の親水化された一面１１ａに有機酸１２が固定化される。
【００３２】
図４は、基板と有機酸の接合状態の一例を示す拡大概略図である。有機酸としてＴＳＣを用いている。図４Ａは、ＴＳＣがＮｉを含有しない合金部材１１と１アームで結合する場合の図であり、図４Ｂは、ＴＳＣがＮｉを含有しない合金部材１１と２アームで結合する場合の図である。
図４Ａは、ＴＳＣがＮｉを含有しない合金部材１１と１アームで結合し、２つある活性エステル基が両方とも、Ｎｉを含有しない合金部材１１の接合に用いられない場合を示している。この場合、活性エステル基は両方とも、サイトカインとのアミド結合形成に用いることが可能である。また、Ｎｉを含有しない合金部材１１の一面に形成された水酸基のうちＢ部の水酸基は、有機酸１２との接合に用いられているが、Ａ部の水酸基は未接合の状態とされている。
一方、図４Ｂは、ＴＳＣがＮｉを含有しない合金部材１１と２アームで結合し、２つある活性エステルの一方が、Ｎｉを含有しない合金部材１１との接合に用いられた場合を示している。この場合、活性エステル基は一方のみが、サイトカインとのアミド結合形成に用いることが可能である。また、Ｎｉを含有しない合金部材１１の一面に形成された水酸基のうちＤ部の水酸基は、有機酸１２との接合に用いられているが、Ｃ部の水酸基は未接合の状態とされている。
【００３３】
有機酸１２の固定化は、室温以下（２５℃）にして行われることが好ましい。室温以下にして行うことにより、有機酸１２を分解することなく、固定化することができる。室温を超える条件にて有機酸１２の固定化を行った場合、有機酸１２が分解が発生する場合がある。
【００３４】
次に、有機酸１２が固定化されたＮｉを含有しない合金部材１１を窒素ブローし、有機溶媒で洗浄することを繰り返す。なお、窒素ブロー回数、洗浄回数及び有機溶媒の種類は特に限定されない。
次に、室温下、所定時間、有機溶媒に浸漬してから、再度、窒素ブローした後、室温下、所定時間、真空乾燥する。
【００３５】
以上の工程により、図３Ｂに示すように、Ｎｉを含有しない合金部材１１の一面１１ａに有機酸１２を固定化することができる。
なお、この工程において、有機溶媒はＤＭＳＯ、ヘキサフルオロイソプロパノール（Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ：以下、ＨＦＩＰという。）等から適宜選択して用いることができる。なお、窒素ブロー後の洗浄、浸漬に用いる有機溶媒は、ＨＦＩＰのような揮発性溶媒が好ましい。
【００３６】
（第３工程）
次に、有機酸１２が固定化されたＮｉを含有しない合金部材１１を基板ホルダーにセットする。
次に、所定濃度のサイトカイン１３を含む溶液を、有機酸１２が固定化されたＮｉを含有しない合金部材１１の有機酸１２の一面１２ａに、所定時間一定量滴下する。サイトカイン１３を含む溶液の溶媒には、例えば、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）溶媒を用いることができる。これにより、図３Ｃに示すように、有機酸１２が固定化されたＮｉを含有しない合金部材１１の有機酸１２上にサイトカイン１３が固定化される。
【００３７】
サイトカイン１３の固定化は、１０℃以下にして行われることが好ましく、４℃以下にして行われることがより好ましい。１０℃以下にしてサイトカイン１３を固定化することにより、サイトカインの分解を抑制することができる。１０℃を超える条件でサイトカイン１３の固定化を行った場合、サイトカイン１３が分解が発生する場合がある。
【００３８】
次に、サイトカイン１３及び有機酸１２が固定化されたＮｉを含有しない合金部材１１を窒素ブローし、蒸留水で洗浄することを繰り返す。なお、窒素ブロー回数、洗浄回数は特に限定されない。
次に、室温下、所定時間、蒸留水で洗浄してから、再度、窒素ブローした後、室温下、所定時間、真空乾燥する。
【００３９】
この工程により、図３Ｃに示すように、Ｎｉを含有しない合金部材１１の一面１１ａに固定化された有機酸１２の一面１２ａにサイトカイン１３を固定化することができる。
【００４０】
［ステント］
次に、本発明の実施形態であるステントについて説明する。
図５Ａおよび図５Ｂは、本発明の実施形態であるステントの一例を示す概略図である。
図５Ａに示すように、ステント２０１は、網状のチューブである。チューブを構成する材料に、本発明の実施形態であるバイオハイブリッド材料１０１が用いられている。これにより、狭くなったり詰まったりした心臓の血管（冠状動脈）を広げた後に、血流を確保するために生体に使用しても、ニッケルイオンを溶出せず、血管内皮形成能に優れたステント２０１として使用することができる。
チューブの大きさは特に限定されない。例えば、直径１．４ｍｍ、長さ１〜２ｃｍ、シームレス（継ぎ目のない）、厚み１００〜１５０μｍのもの等を用いることができる。
図５Ｂは、図５ＡのＧ部における図であって、ステント２０１を構成するチューブの部分断面図である。ステント２０１を構成するチューブは、筒状のサイトカイン１３と、サイトカイン１３を覆うように形成された有機酸１２と、有機酸１２を覆うように形成されたＮｉを含有しない合金部材１１と、合金部材１１を覆うように形成された有機酸１２と、有機酸１２を覆うように形成されたサイトカイン１３とからなるバイオハイブリッド材料１０１で概略構成されている。
【００４１】
本発明の実施形態であるバイオハイブリッド材料１０１は、Ｎｉを含有しない合金部材１１と、２以上の活性エステルを有する有機酸１２と、サイトカイン１３とを有し、Ｎｉを含有しない合金部材１１と有機酸１２がエステル結合されており、有機酸１２とサイトカイン１３とがアミド結合を介して固定化されている。上記バイオハイブリッド材料１０１は、Ｎｉを含有しない合金部材１１を使用しているので、ニッケルイオンを溶出しない。また、サイトカイン１３が固定化されているため、血管内皮形成能に優れる。さらに、合金層およびサイトカイン層を２以上の活性エステルを有する有機酸１２により強固に接合することが出来る。そして、これらの結果、安定なバイオハイブリッド材料とすることができる。
【００４２】
本発明の実施形態であるバイオハイブリッド材料１０１は、サイトカイン１３が、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ又はＢＭＰのいずれかである構成なので、血管内皮などの細胞層形成能に優れたバイオハイブリッド材料とすることができる。
【００４３】
本発明の実施形態であるバイオハイブリッド材料１０１は、２以上の活性エステルを有する有機酸１２が、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、オキサル酢酸、ｃｉｓ−アコニット酸、２−ケトグルタル酸、マレイン酸、フマル酸、又はそれらの誘導体のいずれかである構成なので、サイトカイン１３とＮｉを含有しない合金部材１１と強固に接合したバイオハイブリッド材料とすることができる。
【００４４】
本発明の実施形態であるバイオハイブリッド材料は、Ｎｉを含有しない合金部材が、Ｆｅ、Ｍｏ、Ｃｏ又はＣｒの群から選ばれる元素を２以上含有する合金である構成なので、ニッケルイオンを溶出せず、安定なバイオハイブリッド材料とすることができる。
【００４５】
本発明の実施形態であるバイオハイブリッド材料は、前記合金が、窒素を０．５以上１ｗｔ％以下の範囲で含有する構成なので、生体適合性及び加工性が高く、ニッケルイオンを溶出せず、安定なバイオハイブリッド材料とすることができる。
【００４６】
本発明の実施形態であるバイオハイブリッド材料の製造方法は、Ｎｉを含有しない合金部材１１に親水化表面処理を行う工程と、Ｎｉを含有しない合金部材１１に２以上の活性エステルを有する有機酸１２を固定化する工程と、有機酸１２にサイトカイン１３を固定化する工程と、を有する。したがって、上記バイオハイブリッド材料の製造方法により、ニッケルイオンを溶出せず、血管内皮形成能に優れたバイオハイブリッド材料１０１を容易に製造することができる。
【００４７】
本発明の実施形態であるバイオハイブリッド材料の製造方法は、前記親水化表面処理がＵＶ照射処理である構成なので、容易にＮｉを含有しない合金部材１１の親水化表面処理を行うことができ、バイオハイブリッド材料１０１を容易に製造することができる。
【００４８】
本発明の実施形態であるバイオハイブリッド材料の製造方法は、前記有機酸を固定化する工程が、室温以下の条件で行われる構成なので、有機酸１２を分解せず、バイオハイブリッド材料１０１を容易に製造することができる。
【００４９】
本発明の実施形態であるバイオハイブリッド材料の製造方法は、前記サイトカインを固定化する工程が、１０℃以下の条件で行われる構成なので、サイトカイン１３を分解せず、バイオハイブリッド材料１０１を容易に製造することができる。
【００５０】
本発明の実施形態であるステント２０１は、バイオハイブリッド材料１０１からなる構成なので、ニッケルイオンを溶出せず、血管内皮形成能に優れたステントとすることができる。
【００５１】
本発明の実施形態であるバイオハイブリッド材料、その製造方法及びステントは、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で、種々変更して実施することができる。本実施形態の具体例を以下の実施例で示す。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５２】
（実施例１）
以下のＵＶ照射（前処理）、ＴＳＣ固定化処理及びＶＥＧＦ固定化処理により、実施例１のバイオハイブリッド材料を作成した。【００５３】
［ＵＶ照射（前処理）］
まず、ＨＮＳディスク（２３Ｃｒ−１Ｍｏ−１Ｎ、φ１０ｍｍ×Ｈ１ｍｍ）を用意した。
次に、ＨＮＳディスクにＵＶ照射を行った。
ＵＶ照射時間を変化させて、ＨＮＳディスクの表面の接触角を測定した。表１に示す結果が得られた。また、図６は、ＵＶ照射前（０分時）のＨＮＳディスクの表面の疎水性の状態を示す写真と、ＵＶ照射前（６０分時）のＨＮＳディスクの表面の親水性の状態を示す写真である。表１及び図６に示すように、３０分で超親水性（接触角が１０°以下）となり、１時間でより超親水性（接触角が５°以下）となった。このことから、合金表面が親水性に改質され、水酸基が増幅したと判断した。【００５４】
【表１】
2012070608.tif 000003
【００５５】
［ＴＳＣ固定化処理］
ＵＶ照射時間を６０分としたＨＮＳディスクに、下記ＴＳＣ固定化プロトコールによって、表面にＴＳＣを固定化した。
（ＴＳＣ固定化プロトコール）
１）ＵＶ照射後、ＨＮＳディスクをシリコーンシートにセットする。
２）所定濃度のＴＳＣ／ＤＭＳＯ溶液を１００μｌ滴下する。（室温・乾燥雰囲気下、所定時間）
３）所定時間後、窒素ブローし、ＤＭＳＯで１回洗浄する。
４）窒素ブローし、ＨＦＩＰで２回洗浄した後、ＨＦＩＰに浸漬する。（室温、１時間）
５）１時間後、窒素ブローし、真空乾燥する。（室温、１２時間以上）【００５６】
［ＶＥＧＦ固定化処理］
下記のプロトコールによって、ＴＳＣ固定化ＨＮＳの表面にＶＥＧＦを固定化した。
（ＶＥＧＦ固定化プロトコール）
１）ＴＳＣ固定化後、ＨＮＳディスクをシリコーンシートにセットする。
２）１μｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ／ＰＢＳ溶液を１００μｌ滴下する。（４℃、３時間）
３）３時間後、窒素ブローし、蒸留水で３回洗浄する。
４）窒素ブローし、真空乾燥する。（室温、１２時間以上）【００５７】
以上の工程により、ＵＶを６０分照射したＨＮＳディスクに、濃度２０ｍＭ、時間６０分のＴＳＣ固定化処理を行った後、４℃で、３時間のＶＥＧＦ固定化処理を行った実施例１のバイオハイブリッド材料を作成した。【００５８】
固定化ＴＳＣのキャラクタリゼーションをすべく、接触角測定を行った。
なお、接触角測定では、以下で説明する試験例１の材料、及び試験例２〜６の材料も作成して、本実施例１と比較検討した。
上記試験例１の材料では、ＨＮＳディスクに対して、６０分のＵＶ照射処理を行い、ＴＳＣ固定化処理は行わなかった。
上記試験例２〜６の材料では、ＴＳＣ固定化処理時のＴＳＣ濃度を２０ｍＭ又は１００ｍＭとした。また、ＴＳＣ固定化処理時のＴＳＣ処理時間を５分、１５分又は６０分とした。【００５９】
上記の接触角測定により、表２に示す結果が得られた。表２に示すように、ＴＳＣ固定化処理が進むにつれて、接触角は大きくなり、疎水性側へシフトした。これにより、より多くのＴＳＣが固定化されたと判断した。
また、表２の試験例２〜６を比較することにより、滴下溶液濃度２０ｍＭ・時間１５分の処理で、ＨＮＳ表面上のＴＳＣ量が飽和に達していることが明らかとなった。
更に、実施例１のバイオハイブリッド材料は、接触角は６０°以上となった。【００６０】
【表２】
2012070608.tif 000004
【００６１】
（ＸＰＳ（Ｘ−ｒａｙ  Ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）測定）
次に、表２の試験例１、３〜６に対して、ＸＰＳ測定を行った。
図７〜１１は、ＸＰＳスペクトルの測定結果である。
図７に示すように、ＴＳＣ固定化処理を行わなかった試験例１のディスクには、ＣならびにＮのシグナルが観測されなかった。
一方、図８〜１１に示すように、ＴＳＣ固定化処理を行った試験例３〜６のディスクには、ＣならびにＮのシグナルが共に観測された。【００６２】
ＣならびにＮのシグナルから算出されたＣ：Ｎ比は、ＴＳＣ固定化処理条件によって、異なるものであった。
これは、濃度の増加あるいは時間の経過に伴ってＮＨＳ基が脱離したことが一つの原因であると考えた。Ｎは活性なＮＨＳ基由来のものであるため、その比率が高いほど、表面が活性であると言える。これから、滴下溶液濃度２０ｍＭ・時間１５分の処理が最適であることが証明された。【００６３】
また、別の原因として、水酸基との結合に使われたアームの数の違いに起因するものであると考えた。図４Ａで示したように、ＴＳＣが１アームで結合する場合、理論上、Ｃ：Ｎ比は７：１となる。一方、図４Ｂで示したように、ＴＳＣが２アームで結合する場合、Ｃ：Ｎ比は１０：１となる。
図７〜１１のＸＰＳスペクトルで観測される大きなＯのシグナルは、ＴＳＣの構造が障害となって、結合しないままで残存している水酸基に由来するものであると考えた。【００６４】
次に、ＴＳＣ固定化処理の時間を１５分とした他は実施例１と同様にして、実施例２のバイオハイブリッド材料を作成し、以下のキャラクタリゼーションを行った。【００６５】
次に、実施例１のバイオハイブリッド材料について、固定化ＶＥＧＦの定量をすべく、ＥＬＩＳＡ測定（酵素免疫測定）を行った。ＶＥＧＦ固定化量は１２．０±１．２ｎｇ／ｃｍ２であることが明らかとなった。【００６６】
次に、実施例１のバイオハイブリッド材料について、下記プロトコールに従う酵素標識ＶＥＧＦ抗体を用いた視覚化により、保持性の検討を行った。
（プロトコール）
１）ＶＥＧＦを固定化したＨＮＳディスクを、添加因子を含まない培地（後述の定性評価に用いた溶液）中に、３７℃で７日間浸漬する。
２）７日後、窒素ブローし、蒸留水で３回洗浄する。
３）ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ＶＥＧＦ抗体を含有する溶液に浸漬する（室温、２時間）。
４）バッファーで３回洗浄し、窒素ブローする。
５）ＨＮＳディスク上に、過酸化水素水およびテトラメチルベンジジンを含有する溶液を滴下する（室温、２時間）。【００６７】
ＨＮＳディスクにＶＥＧＦが固定化されている場合、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ＶＥＧＦ抗体が結合する。一方、テトラメチルベンジジンは、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよび過酸化水素水の共存下において染色される。
実施例１のバイオハイブリッド材料は、添加因子を含まない培地中において、７日間以上、脱離することなくＨＮＳ表面に固定化されていることが明らかとなった。【００６８】
次に、ＴＳＣ固定化処理の時間を１５分とした他は実施例１と同様にして、実施例２のバイオハイブリッド材料を作成し、以下の定性評価を行った。【００６９】
（定性評価）
ターゲットとなるディスクを、４８ｗｅｌｌの培養プレートにセットする。血管内皮細胞用基礎培地（ＥＢＭ−２培地、ＣＡＭＢＲＥＸ社製、添加因子含まない：以下、ＥＢＭ−２）０．５ｍｌを培地として、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ：以下、ＨＵＶＥＣ）を２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように各ｗｅｌｌに播種する。１、３、７日後の細胞数を、細胞数測定装置（Ｐｒｅｍｉｘ  ＷＳＴ−１  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ：以下、ＷＳＴ−１）にて測定する。【００７０】
ターゲットとしては、実施例２のバイオハイブリッド材料の他、表３に示す比較例１〜３のディスクを用いるとともに、試験例７として、ディスクを培養プレートにセットしない場合の測定も行った。【００７１】
【表３】
2012070608.tif 000005
【００７２】
上記測定の結果、図１２に示す結果が得られた。
比較例１〜３、試験例７に比較して、実施例２のバイオハイブリッド材料は、細胞数を増加させることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明は、ニッケルイオンを溶出せず、血管内皮形成能に優れたバイオハイブリッド材料、その製造方法及びステントに関するものであり、生体材料、医療機器産業等において利用可能性がある。
【符号の説明】
【００７４】
１１    Ｎｉを含有しない合金部材
１１ａ    一面
１２    ２以上の活性エステルを有する有機酸
１２ａ    一面
１３    サイトカイン
１０１    バイオハイブリッド材料
２０１    ステント
【図１Ａ】
2012070608.tif 000006
【図１Ｂ】
2012070608.tif 000007
【図２】
2012070608.tif 000008
【図３Ａ】
2012070608.tif 000009
【図３Ｂ】
2012070608.tif 000010
【図３Ｃ】
2012070608.tif 000011
【図４Ａ】
2012070608.tif 000012
【図４Ｂ】
2012070608.tif 000013
【図５Ｂ】
2012070608.tif 000014
【図７】
2012070608.tif 000015
【図８】
2012070608.tif 000016
【図９】
2012070608.tif 000017
【図１０】
2012070608.tif 000018
【図１１】
2012070608.tif 000019
【図１２】
2012070608.tif 000020
【図５Ａ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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