(57)【要約】  Ｄ−グルコースに対する基質特異性が高いフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）を効率的に製造する。  ケカビ由来の野生型ＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列からそのＮ末端領域に存在するＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡに相当するアミノ酸配列を含むＮ末端領域を欠失させた変異型ＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子を大腸菌に導入し、大腸菌形質転換体を得る。次いで、この大腸菌形質転換体を培養し、Ｎ末端の特定領域が欠失したＦＡＤ−ＧＤＨを取得する。  本来の由来微生物により生産される場合と比較して、短時間で多量のＧＤＨを取得することができ、溶存酸素の影響を受けにくく、試料中にグルコース以外の糖化合物が存在する場合でもグルコース量を正確に測定できるＦＡＤ−ＧＤＨを効率的に製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケカビ亜門、好ましくは、ケカビ綱、より好ましくは、ケカビ目、さらに好ましくはケカビ科に分類される微生物に由来する野生型フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列からそのＮ末端領域に存在するＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡに相当するアミノ酸配列を含むＮ末端領域を欠失させた変異型フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を大腸菌に導入して得られる大腸菌形質転換体。
【請求項２】
配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と８５％以上同一なアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列からそのＮ末端領域に存在するＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡに相当するアミノ酸配列を含むＮ末端領域を欠失させた変異型フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を大腸菌に導入して得られる大腸菌形質転換体。
【請求項３】
請求項１〜２記載の大腸菌形質転換体を培養し、該培養物よりフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
【請求項４】
配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と８５％以上同一なアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列からそのＮ末端領域に存在するＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡに相当するアミノ酸配列を含むＮ末端領域を欠失させたフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケカビ由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを大腸菌で効率的に組換え生産するための大腸菌形質転換体と、それを用いたフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法、および、変異型フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
血中グルコース濃度（血糖値）は、糖尿病の重要なマーカーである。糖尿病患者が自己の血糖値を管理するための装置としては、電気化学的バイオセンサを用いた自己血糖測定（Ｓｅｌｆ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ：ＳＭＢＧ）機器が広く利用されている。ＳＭＢＧ機器に用いられるバイオセンサには、従来、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）等のグルコースを基質とする酵素が利用されている。しかしながら、ＧＯＤは酸素を電子受容体とするという特性を備えているため、ＧＯＤを用いたＳＭＢＧ機器では、測定サンプル中の溶存酸素が測定値に影響を与え、正確な測定値が得られない場合が起こりうる。【０００３】
一方、グルコースを基質とするが、酸素を電子受容体としない別の酵素として、各種のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）が知られている。具体的には、ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ）やニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素とするタイプのＧＤＨ（ＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨ）や、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするＧＤＨ（ＰＱＱ−ＧＤＨ）が見出されており、ＳＭＢＧ機器のバイオセンサに使用されている。しかしながら、ＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨは、酵素の安定性が乏しく、かつ、補酵素の添加が必要という問題を有し、また、ＰＱＱ−ＧＤＨは基質特異性が低く、測定対象であるグルコース以外にも、マルトース、Ｄ−ガラクトースおよびＤ−キシロースなどの糖化合物に対して作用してしまうため、測定サンプル中のグルコース以外の糖化合物が測定値に影響し、正確な測定値が得られないという問題点が存在する。【０００４】
近年、ＰＱＱ−ＧＤＨをバイオセンサとして用いたＳＭＢＧ機器を用いて、輸液投与を受けていた糖尿病患者の血糖値を測定する際に、ＰＱＱ−ＧＤＨが輸液中に含まれるマルトースにも作用して、実際の血糖値よりも高い測定値が得られ、この値に基づく処置が原因となって患者が低血糖等を発症した例が報告されている。また、同様の事象はガラクトース負荷試験およびキシロース吸収試験を実施中の患者にも起こり得ることも判明している（例えば、非特許文献１参照）。これを受け、厚生労働省医薬食品局は、グルコース溶液に各糖類を添加した場合における血糖測定値への影響を調査する目的で交差反応性試験を行ったところ、６００ｍｇ／ｄＬのマルトース、３００ｍｇ／ｄＬのＤ−ガラクトース、あるいは、２００ｍｇ／ｄＬのＤ−キシロース添加を行った場合には、ＰＱＱ−ＧＤＨ法を用いた血糖測定キットの測定値は、実際のグルコース濃度より２．５〜３倍ほど高い値を示した。すなわち、測定試料中に存在し得るマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースにより測定値が不正確になることが判明し、このような測定誤差の原因となる糖化合物の影響を受けず、グルコースを特異的に測定可能な基質特異性の高いＧＤＨの開発が切に望まれている。【０００５】
上記のような背景の下、上記以外の補酵素を利用するタイプのＧＤＨが着目されるようになってきている。例えば、基質特異性に関する詳細な記載はないが、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来のＧＤＨについての報告（例えば、非特許文献２〜５参照）が知られている。また、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属由来のフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）が開示されており（例えば、特許文献１〜３参照）、Ｄ−キシロースに対する作用性を低減させたアスペルギルス属由来のＦＡＤ−ＧＤＨも開示されている（例えば、特許文献４参照）。【０００６】
上記のとおり、Ｄ−グルコースではない１種または数種の糖化合物に対して反応性が低いＦＡＤ−ＧＤＨがいくつか知られてはいるが、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースのいずれに対しても反応性が十分に低いという特性を有するフラビン結合型ＧＤＨは知られていない。また、Ｄ−グルコース、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースが存在する条件下において、それらの糖化合物による影響を受けることなくグルコース濃度を正確に測定することが可能なフラビン結合型ＧＤＨも知られていない。さらに、そのような優れた基質特異性を有するフラビン結合型ＧＤＨを効率的に製造する方法および手段については、これまでに全く報告されていない。【０００７】
有用な酵素を効率よく製造するための一手段として、目的とする酵素の遺伝子を適当な宿主に導入して形質転換体を作製し、この形質転換体を培養して製造を行う方法は、従来知られている。中でも大腸菌への導入は、効率的な物質生産の手段として広く行われることが多い方法である。しかしながら、ＦＡＤ−ＧＤＨに関して、大腸菌による組換え生産の知見は未だ乏しく、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属とペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属由来のＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子を大腸菌宿主Ｋ１２株へと導入して組換え発現を行わせる方法がわずかに開示されている（例えば、特許文献５参照）程度である。
ある遺伝子を何らかの宿主に導入して発現させる際には、実際にどのような遺伝子を、どのような異種宿主にどのように導入するかによって、効果の度合いは一律ではない。特に、異種宿主への導入、中でも、真核生物由来の遺伝子を大腸菌へと導入しようとする場合には、公知の方法を用い、同種の酵素に関する知見を参考にした場合であっても、導入自体うまくいかないか、宿主での発現がうまくいかないことが多くある。大腸菌は翻訳後修飾系を持たないため、例えばカビ等の真核生物由来の酵素であって、その酵素活性にとって翻訳後修飾が必要である場合等に、この酵素を大腸菌で活性を発現させることは一般に非常に困難を伴うことが多い。例えば、カビ由来の酵素を大腸菌で発現させた場合、発現できた場合でも不溶性の封入体となってしまう場合がほとんどである。
そのような背景の下、カビ等の真核生物由来の酵素を大腸菌において活性型として発現させ、さらに効率的に生産させることのできる遺伝子、宿主、導入方法等の組み合わせを個々に見出すことは、産業上非常に有用であり、優れた性質を有するＦＡＤ−ＧＤＨが求められていることと併せて、そのような優れた性質を有する酵素を工業生産に有利な大腸菌において効率的に生産できる技術の確立も、強く求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−２８９１４８号公報
【特許文献２】国際公開第０４／０５８９５８号
【特許文献３】国際公開第０７／１３９０１３号
【特許文献４】特開２００８−２３７２１０号公報
【特許文献５】特許第４５６１７６４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】医薬品・医療用具等安全性情報２０６号（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２０６）、２００４年１０月、厚生労働省医薬食品局
【非特許文献２】Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ．  Ｉ．  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ｐ−ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ，  Ｔ．  Ｃ．  Ｂａｋ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｓａｔｏ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １３９，  ２６５−２７６  （１９６７）．
【非特許文献３】Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ.  ＩＩ．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｔ．Ｃ．  Ｂａｋ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １３９，  ２７７−２９３  （１９６７）．
【非特許文献４】Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ.  ＩＩＩ．  Ｇｅｎｅｒａｌ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｔ．Ｃ．  Ｂａｋ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １４６，  ３１７−３２７  （１９６７）．
【非特許文献５】Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ.  ＩＶ．  Ｈｉｓｔｉｄｙｌ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ａｓ  ａｎ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ，  Ｔ．Ｃ．  Ｂａｋ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｓａｔｏ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １４６，  ３２８−３３５  （１９６７）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、Ｄ−グルコースに特異性が高く、Ｄ−グルコース以外の糖化合物の共存条件下においてもＤ−グルコース量を正確に測定できるＧＤＨを効率良く製造するための大腸菌形質転換体と、それを用いたフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法および変異型フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の課題を解決するために、本発明者等は鋭意検討を重ね、グルコース量の正確な測定を可能とする新規なＧＤＨを生産する微生物のスクリーニングを実施した結果、ケカビ亜門に属する菌株から、グルコースに特異性が高く、グルコース以外の糖化合物の共存条件下で測定を行った場合でもグルコースを正確に測定できるＧＤＨ活性を有する新規なＧＤＨを見出した。
本発明者等は、このＧＤＨを精製し諸性質を決定した結果、この酵素が新規なフラビン結合型ＧＤＨであることを確認し、実際にマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース存在下でのＤ−グルコース測定を実施するとともに、その新規なＧＤＨのアミノ酸配列とそれをコードする遺伝子配列情報を取得した。さらに、本来の由来微生物の培養物からでは十分な量の酵素を取得することが困難であるという課題を解決するために、同種および異種の各種微生物にこの遺伝子を導入することを着想し、検討を重ねた。その一環として、例えば、発明者等は、同じカビ類に属するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の微生物（Aspergillus  sojae）を宿主とする形質転換体の作製を試みた。しかしながら、この方法によって得られるＧＤＨのほとんどは本来の由来微生物で生産する場合と同様、菌体内で生産され、酵素の抽出工程等に同様の時間と手間を要すること、また、同じカビ類であるために、本来の由来微生物を培養する場合と比較して培養時間の短縮という観点からも大幅な改良効果が得られないことが判明した。
そこで発明者等は、培養時間の短縮や菌体破砕の容易性等の点でより有利な宿主候補である大腸菌を宿主の候補とし、ケカビ由来フラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子を大腸菌へと導入して形質転換体を得て、この大腸菌形質転換体を培養し、この培養物よりフラビン結合型ＧＤＨを取得することを試みた。しかしながら、本発明者等が見出した新規なＧＤＨは、その全長遺伝子を導入した際には、大腸菌での発現量が非常に低いことが確認された。
そこで、この問題を解決するために発明者等はさらに検討を重ねた結果、このＧＤＨのＮ末端領域に存在するＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡに相当するアミノ酸配列を欠失させた変異型フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を作製して適当なベクター等に導入し、これを用いて大腸菌を形質転換して大腸菌形質転換体を得た。そして、この大腸菌形質転換体を培養し、該培養物よりＮ末端欠失型の変異型フラビン結合型ＧＤＨを採取することにより、より多くのフラビン結合型ＧＤＨを効率的に取得できることを見出し、本発明を完成した。【００１２】
すなわち、本発明は以下に関する。
（１）ケカビ亜門、好ましくは、ケカビ綱、より好ましくは、ケカビ目、さらに好ましくはケカビ科に分類される微生物に由来する野生型フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列からそのＮ末端領域に存在するＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡに相当するアミノ酸配列を含むＮ末端領域を欠失させた変異型フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を大腸菌に導入して得られる大腸菌形質転換体。
（２）配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と８５％以上同一なアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列からそのＮ末端領域に存在するＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡに相当するアミノ酸配列を含むＮ末端領域を欠失させた変異型フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を大腸菌に導入して得られる大腸菌形質転換体。
（３）上記（１）〜（２）記載の大腸菌形質転換体を培養し、該培養物よりフラビン結合型ＧＤＨを採取することを特徴とする、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
（４）配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と８５％以上同一なアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるフラビン結合型ＧＤＨのアミノ酸配列からそのＮ末端領域に存在するＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡに相当するアミノ酸配列を含むＮ末端領域を欠失させたフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の大腸菌形質転換体および、それを用いたフラビン結合型ＧＤＨの製造法によれば、グルコース量の正確な測定を可能とする新規なＧＤＨを効率的に製造できる。具体的には、測定試料に含まれるマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース等の糖化合物の影響を受けることなく、正確にＤ−グルコース量を測定することが可能なフラビン結合型ＧＤＨを効率的に取得できる。これにより、マルトースを含む輸液の投与を受けている患者や、ガラクトース負荷試験およびキシロース吸収試験を実施中の患者の試料についても、正確に血糖値を測定することが可能な実用性に優れたＧＤＨを効率的に提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明に使用するフラビン結合型ＧＤＨの一例の吸収スペクトルを示す図である。
【図２】本発明に使用するフラビン結合型ＧＤＨの一例の至適ｐＨを示す図である。
【図３】本発明に使用するフラビン結合型ＧＤＨの一例の至適温度を示す図である。
【図４】本発明に使用するフラビン結合型ＧＤＨの一例の熱安定性を示す図である。
【図５】本発明に使用するフラビン結合型ＧＤＨの一例のｐＨ安定性を示す図である。
【図６】本発明に使用するフラビン結合型ＧＤＨの一例のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動結果である。
【図７】本発明に使用するフラビン結合型ＧＤＨの一例を用いて測定した、Ｄ−グルコース量の測定結果を示す図である。
【図８】本発明に使用するフラビン結合型ＧＤＨの一例のシグナルペプチド予想切断部位である。
【図９】本発明のシグナルペプチド欠失型フラビン結合型ＧＤＨの一例におけるＮ末端部分のアミノ酸配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（フラビン結合型ＧＤＨ）
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨは、ケカビ亜門、好ましくは、ケカビ綱、より好ましくは、ケカビ目、さらに好ましくは、ケカビ科に分類される微生物から得ることができる。ケカビ亜門、好ましくは、ケカビ綱、より好ましくは、ケカビ目、さらに好ましくは、ケカビ科に分類される微生物としては、例えば、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属等が挙げられる。Ｍｕｃｏｒ属に分類される微生物であって、本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨを生産する具体的な好ましい微生物の例としては、ムコール・プライニ（Mucor prainii）、ムコール・ジャバニカス（Mucor javanicus）もしくはムコール・シルシネロイデス・ｆ・シルシネロイデス（Mucor circinelloides f. circinelloides）が挙げられる。より具体的には、Mucor prainii NISL0103、Mucor javanicus NISL0111もしくはMucor circinelloides f. circinelloides NISL0117が挙げられる。Ａｂｓｉｄｉａ属に分類される微生物であって、本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨを生産する具体的な好ましい微生物の例としては、アブシジア・シリンドロスポラ（Absidia cylindrospora）、アブシジア・ヒアロスポラ（Absidia hyalospora）を挙げることができる。より具体的には、Absidia cylindrospora NISL0211、Absidia hyalospora NISL0218を挙げることができる。Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ属に分類される微生物であって、本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨを生産する具体的な好ましい微生物の例としては、アクチノムコール・エレガンス（Actinomucor elegans）を挙げることができる。より具体的には、Actinomucor elegans NISL9082を挙げることができる。なお、上記の菌株はＮＩＳＬ（財団法人  野田産業科学研究所）の保管菌株であり、所定の手続きを経ることにより、分譲を受けることができる。【００１６】
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨは、上述の通り、「ケカビ亜門、好ましくは、ケカビ綱、より好ましくは、ケカビ目、さらに好ましくは、ケカビ科に分類される微生物に由来し、上述の各種性質を具備するフラビン結合型ＧＤＨ」である。さらにまた、それらのフラビン結合型ＧＤＨ生産微生物から公知の遺伝子工学的手法によって取得したフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子を利用し、必要によりそれを一部改変して、適当な宿主微生物に各種公知の手法により導入して生産された組換えフラビン結合型ＧＤＨもまた、本発明に用いる「ケカビ亜門、好ましくは、ケカビ綱、より好ましくは、ケカビ目、さらに好ましくは、ケカビ科に分類される微生物に由来し、上述の各種性質を具備するフラビン結合型ＧＤＨ」に含まれる。同様に、「Ｍｕｃｏｒ属に分類される微生物」、あるいは、特定の生産微生物菌株名を記載したフラビン結合型ＧＤＨについても、各々に由来する遺伝子情報を元に取得される、上述の各種性質を具備するフラビン結合型ＧＤＨをも本発明に包含する。【００１７】
（フラビン結合型ＧＤＨの基質特異性）
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨは、本発明者等が見出したもので、基質特異性に優れ、Ｄ−グルコースに対する選択性が極めて高いことを特徴とする。具体的には、本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨは、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースに対する反応性が極めて低い。具体的には、Ｄ−グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、マルトース、Ｄ−ガラクトースおよびＤ−キシロースに対する反応性がいずれも２％以下であることを特徴とする。本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨは、このような高い基質特異性を有するため、マルトースを含む輸液の投与を受けている患者や、ガラクトース負荷試験およびキシロース吸収試験を実施中の患者の試料についても、測定試料に含まれるマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース等の糖化合物の影響を受けることなく、正確にＤ−グルコース量を測定することが可能となる。【００１８】
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨは、上述のようにＤ−グルコースの代わりにマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース等の糖化合物を基質として測定を行った際の測定値が非常に低く、さらに、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース等の糖化合物が夾雑する条件下でも正確にグルコース測定値を測定できることを特徴とする。具体的には、それらの夾雑糖化合物が存在しない条件でのＤ−グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、夾雑糖化合物としてマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースから選択される１以上が存在する場合の測定値が９６％〜１０３％であり、夾雑糖化合物としてマルトース、Ｄ−ガラクトースおよびＤ−キシロースの３種が同時に存在する場合でも、測定値が９６％〜１０４％であることを特徴とする。このような特性を有するフラビン結合型ＧＤＨを用いた場合には、測定試料中にマルトースやＤ−ガラクトース、Ｄ−キシロースが存在している状況でも、グルコース量を正確に測定することが可能であり、好ましい。【００１９】
（本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨの酵素化学的特徴）
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨとして好ましい酵素の例としては、以下の酵素化学的特徴を有するものが挙げられる。
（１）作用：電子受容体存在下でＧＤＨ活性を示す
（２）分子量：タンパク質のポリペプチド鎖部分の分子量が約８０ｋＤａである
（３）基質特異性：Ｄ-グルコースに対する反応性と比較して、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースに対する反応性が低い
（４）至適ｐＨ：ｐＨ６．５〜７．０
（５）至適温度：３７〜４０℃
（６）安定ｐＨ範囲：ｐＨ３．５〜７．０
（７）熱安定性：４０℃、１５分間の熱処理後に８０％以上の残存活性を有する
（８）フラビン化合物を補酵素とする
（９）Ｋｍ値：Ｄ−グルコースに対するＫｍ値が２６〜３３ｍＭである
上記のような酵素化学的特徴を有するＧＤＨであれば、測定試料に含まれるマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース等の糖化合物の影響を受けることなく、正確にＤ−グルコース量を測定することが可能となる。また、血糖値の測定等の臨床診断に応用するために好適なｐＨ範囲、温度範囲で良好に作用するので、診断用測定試薬等の用途に好適に使用することができる。
なお、上記の諸性質パラメータは典型的な例であるが、所定の測定条件においてＤ−グルコースの測定を行う際に本発明の効果を達成可能である範囲で、上記パラメータのうちには、許容可能な変動の幅を有するものがある。例えば、安定ｐＨ範囲や至適ｐＨ範囲、至適温度範囲等のパラメータは、所定の測定条件を含む範囲で、上記の典型的な範囲よりやや広くてもよいし、逆に、上記の典型的な範囲よりやや狭い場合でも、測定条件において十分な活性および／または安定性が確保されていればよい。Ｋｍ値は一般的には小さくなるほど基質特異性が良いとされるが、本発明の酵素としては、所定の測定条件において実質的に十分な基質の選択が実現される範囲の値を有していればよい。【００２０】
上記の各種の酵素化学的性質は、酵素の諸性質を特定するための公知の手法、例えば、以下の実施例に記載の方法を用いて調べることができる。酵素の諸性質は、本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨを生産する微生物の培養液や、精製工程の途中段階において、ある程度調べることもでき、より詳細には、精製酵素を用いて調べることができる。
精製酵素とは、当該酵素以外の成分、特に当該酵素以外のタンパク質（夾雑タンパク質）を実質的に含まない状態に分離された酵素をいう。具体的には、例えば、夾雑タンパク質の含有量が重量換算で全体の約２０％未満、好ましくは約１０％未満、更に好ましくは約５％未満、より一層好ましくは約１％未満である。なお、本明細書中に後述する「ＭｐＧＤＨ」、「ＭｊＧＤＨ」および「ＭｃＧＤＨ」は、特に断りの無い限り、精製酵素をいう。【００２１】
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨが利用する電子受容体は、特に限定されず、例えば、血糖値測定に用いるために好適な試薬成分として公知の任意の電子受容体を用いることができる。【００２２】
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨが利用する補酵素は、フラビン化合物であることを特徴とする。フラビン化合物には、例えば、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）等が挙げられる。【００２３】
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨとして好ましい酵素の例としては、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定したときに、タンパク質のポリペプチド鎖部分の分子量が約８０ｋＤａであるフラビン結合型ＧＤＨが挙げられる。なお、本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨには糖鎖が結合していると考えられ、糖鎖を除去する操作を行わない場合、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定した際の分子量はこれより大きめに測定される傾向を有する。
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨとして好ましい酵素の例としては、Ｄ−グルコースに対するＫｍ値が２６〜３３ｍＭであるフラビン結合型ＧＤＨが挙げられる。【００２４】
（フラビン結合型ＧＤＨの作用原理および活性測定法）
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。
したがって、この原理を利用して、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）および２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いた以下の測定系により、本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨの活性を測定することができる。
（反応１）  Ｄ−グルコ−ス ＋ ＰＭＳ（酸化型）
→ Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン ＋ ＰＭＳ（還元型）
（反応２）  ＰＭＳ（還元型） ＋ ＤＣＩＰ（酸化型）
→ ＰＭＳ ＋ ＤＣＩＰ（還元型）【００２５】
まず、（反応１）において、グルコースの酸化に伴いＰＭＳ（還元型）が生成する。続いて進行する（反応２）により、ＰＭＳの酸化と共にＤＣＩＰが還元されるため、酸化型ＤＣＩＰの消失を６００ｎｍの波長の吸光度変化量から測定することができる。
具体的には、フラビン結合型ＧＤＨの活性は、以下の手順に従って測定する。１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １．７９ｍＬ、１．２５Ｍ Ｄ−グルコース溶液 ０．０８ｍＬおよび２０ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．０１ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温する。次いで、２０ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．０２ｍＬおよび酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始する。反応開始時、および、経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を求め、次式に従いフラビン結合型ＧＤＨ活性を算出する。この際、フラビン結合型ＧＤＨ活性は、３７℃において濃度５０ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。【００２６】
【数１】
2012073987.tif 000002
【００２７】
なお、式中の２．０は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは１０ｍＭ 酢酸緩衝液を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。【００２８】
（フラビン結合型ＧＤＨのアミノ酸配列）
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨは、配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８５％以上相同なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする。配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するフラビン結合型ＧＤＨは、上述の各種の性質を有する。また、配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するフラビン結合型ＧＤＨと同様な諸性質を有するＧＤＨも、本発明のフラビン結合型ＧＤＨに含まれる。【００２９】
（フラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子配列）
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子とは、配列番号１又は配列番号３で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８５％以上相同なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するフラビン結合型ＧＤＨをコードするＤＮＡをいう。または、本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子とは、配列番号２又は配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡをいう。あるいは、本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子とは、配列番号２又は配列番号４で示される塩基配列と８５％以上の相同性、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を有し、且つフラビン結合型ＧＤＨ酵素活性をもつタンパク質をコードするＤＮＡをいう。【００３０】
（フラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子配列を含むベクター、形質転換体）
本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子は、適当な公知の各種ベクター中に挿入することができる。さらに、このベクターを適当な公知の各宿主に導入して、フラビン結合型ＧＤＨ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡが導入されている形質転換体を作製することができる。これらの遺伝子の取得方法や、遺伝子配列、アミノ酸配列情報の取得方法、各種ベクターの製造方法や形質転換体の作製方法は、当業者にとって公知であり、一例を後述する。【００３１】
フラビン結合型ＧＤＨを生産する微生物からフラビン結合型ＧＤＨ遺伝子を取得するには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、フラビン結合型ＧＤＨ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ＷＩＬＥＹ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。【００３２】
次いで、フラビン結合型ＧＤＨのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーからスクリーニングする方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の目的遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。【００３３】
このようにして得られたフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子の好ましい一例として、Ｍｕｃｏｒ属由来のフラビン結合型ＧＤＨ遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子は、常法通り各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましく、例えば、単離したＭｕｃｏｒ属由来のフラビン結合型ＧＤＨをコードする遺伝子を含む組換え体プラスミドを作製し、そこから例えば、ＱＩＡＧＥＮ（キアゲン社製）を用いることにより、抽出、精製して得ることができる。本発明において用いることのできるベクターＤＮＡとしては、例えば、プラスミドベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等を用いることができる。具体的には、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋  （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等が好ましい。【００３４】
上記方法により得られたフラビン結合型ＧＤＨ遺伝子の塩基配列の決定・確認は、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）等を用いることにより行い得る。【００３５】
得られたフラビン結合型ＧＤＨ遺伝子を、後述するように、常法により、適当なベクターに組込み、各々のベクターに対応する宿主を、常法により、形質転換または形質導入することができる。具体的には、例えば、フラビン結合型ＧＤＨ遺伝子を適当なベクター上に連結することにより組換えベクターを得ることができる。ベクターとしては、形質転換する宿主中でフラビン結合型ＧＤＨを生産させ得るものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、染色体組込み型、人工染色体等のベクターを用いることができる。ベクターとしてプラスミドを用いる場合、例えば、エシェリヒア・コリーを宿主微生物とする場合にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，ｐＵＣ１８，ｐＥＴ−２２ｂ（＋），ｐＥＴ−１６ｂなどが使用できる。【００３６】
また、上記ベクターには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ３、ｎｉａＤのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子又はアンピシリン、カナマイシンあるいはオリゴマイシン等の薬剤に対する抵抗遺伝子等が挙げられる。また、組換えベクターは、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列（例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ａｍｙＢプロモーター、ｌａｃプロモーター等が挙げられる。また、精製のためのタグをつけることもできる。例えば、フラビン結合型ＧＤＨ遺伝子の下流に適宜リンカー配列を接続し、ヒスチジンをコードする塩基配列を６コドン以上接続することにより、ニッケルカラムを用いた精製を可能にすることができる。【００３７】
（本発明の形質転換体に使用する宿主）
上記の組換えベクターで宿主微生物を形質転換することにより、本発明の形質転換体が得られる。本発明の形質転換体における宿主の例としては、大腸菌（エシェリヒア・コリー、Escherichia coli）に属する微生物が挙げられる。エシェリヒア・コリーに分類される具体的な好ましい微生物としては、エシェリヒア・コリー  Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリーＢＬ２１（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５αなどの細菌が挙げられ、これらの菌株は各種市販されている。【００３８】
（形質転換）
大腸菌の形質転換は、宿主により公知の方法で行うことができる。宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、また、エレクトロポレーションによる方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １９４，  １８２−１８７（１９９０））等を用いることができる。さらには、市販のコンピテントセル（例えば、ＥＣＯＳ ＢＬ２１（ＤＥ３）；ニッポンジーン社製）を用いても良いが、これらに限定されず、任意の手法で形質転換を行えば良い。【００３９】
（Ｎ末端ペプチドの削除）
本発明の大腸菌形質転換体およびそれを用いたＦＡＤ−ＧＤＨの製造方法は、ＦＡＤ−ＧＤＨの組換え発現において、そのＮ末端領域に存在する一定の長さのペプチド配列を欠失させた変異型ＧＤＨ遺伝子を大腸菌に導入することを特徴とする。このことにより、ペプチド配列を欠失させない野生型ＧＤＨ遺伝子を大腸菌に導入させた場合と比較して、および／または、本来の由来微生物を培養してＧＤＨを生産させた場合と比較して、酵素の生産性を顕著に増加させることができる。
本発明に使用するケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨは実用性に優れた新規酵素であり、そのアミノ酸配列および遺伝子配列もこれまで知られていなかった。したがって、組換え生産はもとより、異種宿主での発現を想定して効率的な生産を行うための着想についても当然ながら全く知られていなかった。実際、本発明者等がケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨを見出した後に解明したアミノ酸配列および遺伝子配列も、従来知られていたいくつかのＦＡＤ−ＧＤＨとの相同性が極めて低いものである。すなわち、本発明に使用するＦＡＤ−ＧＤＨの組換え生産性の効率化に関しては、由来や構造が大幅に異なる他のＦＡＤ−ＧＤＨの知見をそのまま参照し適用することは困難であることが強く示唆され、個別的な試行錯誤が必要とされた。【００４０】
（Ｎ末端ペプチドの削除領域の予測）
本発明に使用するＦＡＤ−ＧＤＨの組換え生産性の効率化に寄与するＮ末端の削除領域を検討するにあたり、シグナルペプチドの予測は有効な手段のひとつである。シグナルペプチドは、成熟型タンパク質のＮ末端に残基数１５〜３０個に及ぶ延長ペプチドとして存在する。シグナルペプチド配列中には疎水性アミノ酸領域が存在して新生ポリペプチド鎖の小胞体膜への付着および膜通過を先導し、膜通過後にはシグナルペプチドは切断される。すなわち、シグナルペプチドは細胞内の輸送に利用されるものであり、輸送後には切断されてしまう性質のものであるため、ＧＤＨのシグナルペプチド領域はＧＤＨの活性自体には関与しないものである。したがって、シグナルペプチドであるとわかっている領域内での削除によって、酵素活性そのものが損なわれる恐れは低いと考えられる。
さらに、本発明に使用するケカビ由来ＦＡＤ−ＧＤＨを大腸菌宿主において異種発現させる場合には、シグナルペプチドは、原株において認められる輸送の機能をもたないばかりか、大腸菌内では疎水性の高いペプチド鎖が付加されたままで存在することとなり、ＧＤＨの安定性を下げるなど、むしろ発現量を下げる要因になってしまう可能性があることが示唆される。
上記のような理由から、適当なツールを用いて、シグナルペプチドの長さを予測し、その近傍の位置でＮ末端を欠失させた変異型ＧＤＨ遺伝子を作製し、これらを大腸菌に導入して酵素発現の状態を比較することは、好適な長さのＮ末端欠失領域の決定にとって有効な手段である。こうしたシグナルペプチド予測用のツールとしては、例えば、ＷＥＢ上のシグナルペプチド予想プログラム（ＳｉｇｎａｌＰ、「ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ−２．０／」）等が知られている。【００４１】
（本発明におけるＧＤＨのＮ末端ペプチドの削除領域）
本発明の大腸菌形質転換体およびそれを用いたＦＡＤ−ＧＤＨの製造方法では、ケカビ由来ＧＤＨのＮ末端領域に存在するシグナルペプチドに相当する領域を含むＮ末端領域を欠失させることにより、大腸菌で発現させた際の発現量を向上させることができる。具体的には、例えば、配列番号１または配列番号３に記載されたアミノ酸配列を有するＧＤＨにおいては、そのＮ末端に存在するＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡのアミノ酸配列を含むＮ末端領域をコードするＤＮＡを削除して発現させることにより、シグナルペプチドを欠失させることができる。この領域を削除することにより、本発明の大腸菌形質転換体によって生産されるＧＤＨの発現量および／または生産量を顕著に増加させることができる。
なお、本発明における「そのＮ末端に存在するＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡに相当するアミノ酸配列」とは、配列番号１、または配列番号３に記載されたアミノ酸配列を有するＧＤＨと一定の相同性（例えば、８５％以上、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上の同一性）を有するＧＤＨにおいて相当するアミノ酸配列をいう。これらの一定以上のアミノ酸配列同一性を有するＧＤＨ間における、「相当する位置・配列」の対応関係は、既製のアミノ酸の相同性解析用ソフト、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ−Ｍａｃ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）等を用いて、各種ＧＤＨのアミノ酸配列と配列番号１、または配列番号３のＧＤＨのアミノ酸配列とを比較することにより、容易に知ることができる。
本発明者等が見出したケカビ由来のＧＤＨと相同性が高いＧＤＨは、現状では他に報告されてはいない。しかし、一般に、互いに相同性が高い酵素タンパク質においては、相同性の高い領域でのタンパク質構造が類似している可能性が高いことから、一定以上のアミノ酸配列同一性を有する複数の酵素の相同性解析によりそれらのアミノ酸配列の対応関係を解析し、一方における特定のアミノ酸の位置またはアミノ酸配列領域に相当する他方のアミノ酸の位置またはアミノ酸配列領域に同様の変異や削除等を導入することによって、酵素の性質に関して同様の効果を与えることができる例も多く知られている。従って、ＧＤＨに関しても、配列番号１または３で例示された本発明におけるＧＤＨのＮ末端ペプチドの削除領域に関する本発明の知見を利用し、これらのＧＤＨに関しても同様の効果を得るための方策として、その他のＧＤＨにおいて相当する領域のアミノ酸配列を同様に削除する試みを容易に行うことができる。【００４２】
また、本発明におけるＧＤＨのＮ末端ペプチドの削除領域が、必ずしもシグナルペプチド領域のみである必要はない。例えば、Ｎ末端シグナルペプチド領域のみを削除する以外にも、シグナルペプチド領域そのものに加え、シグナルペプチド領域に隣接し、酵素活性に悪影響を及ぼさない範囲の領域までを含む領域を削除することもできる。具体的には、例えば、配列番号３に記載されたアミノ酸配列を有するＧＤＨにおいては、そのＮ末端に存在するＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡを削除してもよいし、さらに１残基多く削除された形となるＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡＱのアミノ酸配列を削除してもよい。酵素活性に悪影響を及ぼさない範囲であれば、さらに多くの残基までを削除してもよい。例えば、配列番号３に記載されたアミノ酸配列を有するＧＤＨにおいては、そのＮ末端に存在するＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡＱＱＤＴＮＳＳを削除してもよいし、さらに１残基多く削除された形となるＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡＱＱＤＴＮＳＳＳのアミノ酸配列を削除してもよい。本発明において重要なのは、Ｎ末端シグナルペプチド領域が実質的に削除されていることであって、Ｎ末端シグナルペプチド領域に加えて若干の領域が併せて削除されているかどうかは本発明の必須要件ではなく、同様の効果を奏する限り、複数のＮ末端領域削除のバリエーションが本発明のＧＤＨに包含される。また、ＧＤＨの由来や宿主によっては、Ｎ末端シグナルペプチド領域とされる領域からわずかに短いＮ末端領域、例えば、１残基ないし数残基短いＮ末端領域を削除する場合に関しても、この削除による効果とＮ末端シグナルペプチド領域とされる領域全体を削除した時の効果、または、Ｎ末端シグナルペプチド領域とされる領域全体を含み、さらに長いＮ末端領域を削除した時の効果との間に実質的な差異が認められない場合には、そのような削除もまた、本発明のバリエーションに包含され得る。
Ｎ末端ペプチドの削除方法は限定されないが、公知の手段を用い、例えば、シグナルペプチド切断によりＮ末端となるアミノ酸を開始コドンであるメチオニンに変えて発現させる方法が挙げられる。または、シグナルペプチド切断によりＮ末端となるアミノ酸に開始コドンであるメチオニンを付加することで、シグナルペプチド欠失型のＧＤＨを大腸菌で発現させることも可能である。あるいは、上述の通り、シグナルペプチドを含み若干の隣接領域を含むペプチドを削除することを想定し、想定される領域での切断を行った場合にＮ末端となるアミノ酸を開始コドンであるメチオニンに変えて発現させる方法や、切断によりＮ末端となるアミノ酸に開始コドンであるメチオニンを付加する方法も考えられる。
一定のＮ末端領域を切断する際に、新たにできるＮ末端をメチオニンに置換するか、あるいは置換せずにメチオニンを付加するかによって、得られるＧＤＨのアミノ酸配列は１残基違ってくるが、これはシグナルペプチドの削除によって新たにできるＮ末端がメチオニンでなくなった場合に開始コドンを付与して遺伝子からのタンパク質発現を正常に行わせるために行う操作であって、本発明の必須要件ではない。【００４３】
該目的酵素の発現量がシグナルペプチド配列の存在する状態と比べて高まったかどうかは、該配列への変異導入前後における培養液１ｍｌあたりの総活性値を比較して確認することが出来る。なお、シグナルペプチドの欠失の確認には、エドマン分解を用いたＮ末端アミノ酸シーケンスにより確かめることも可能である。シグナルペプチドの予測プログラムとしては、ＰＳＯＲＴ、ＳｉｇｎａｌＰがよく利用されている。それぞれ、ｗｅｂにて「ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．ａｃ．ｊｐ／」、あるいは「ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ−２．０／」のアドレスから利用することができる。【００４４】
（フラビン結合型ＧＤＨの製造）
上記の形質転換により得られる大腸菌形質転換体を用いて、フラビン結合型ＧＤＨを製造する。具体的には、上記の形質転換により得られる大腸菌形質転換体を培養し、該培養物よりフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを取得することができる。
ある有用なタンパク質をコードする遺伝子を異種の宿主に導入することによって生産させる技術は、理論的には公知である。しかしながら、実際には、どのような遺伝子を、どのような異種宿主にどのように導入するかによって、その効果の度合いは一律ではなく、異種宿主へ導入しようとしても導入自体うまくいかないか、異種宿主での発現がうまくいかないことは多くある。すなわち、個々の物質生産において、具体的にどのような遺伝子を、どのような宿主にどのように導入した場合に効率的な製造が可能となるかを見出すことは容易とはいいがたく、効率的な製造を実現し得る遺伝子、宿主、導入方法等の組み合わせを見出すことは、産業上非常に有用である。
本発明の大腸菌形質転換体を培養することにより、本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨの由来微生物（すなわち、ケカビ）そのものを培養して製造を行う場合と比較して、格段に効率の良い酵素の製造を実現できる。具体的には、より多くの酵素を製造できるようになる。本発明に使用する各種ケカビ由来のフラビン結合型ＧＤＨは、本来の由来微生物を培養した場合には、フラビン結合型ＧＤＨの生産量は十分とはいいがたく、より大スケールでの菌体培養が必要となる。また、培養にも３〜５日を要するとともに、培養後の菌体を遠心分離で菌体を取得し菌体破砕（酵素抽出）を行う工程、さらに、再度遠心分離して粗酵素液を調製するという工程を必要とする。本発明の形質転換体（すなわち、大腸菌）を用いれば、培養日数および、菌体破砕（酵素抽出）工程を大幅に短縮することができ、効率的な製造が可能となる。【００４５】
（大腸菌形質転換体の培養）
本発明の大腸菌形質転換体の培養は、通常の固体培養法で培養してもよいが、可能なかぎり液体培養法を採用して培養するのが好ましい。培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適宜含有するものであればよく、また、合成培地、天然培地の何れでもよく、目的の酵素を効率よく製造することのできる培地であれば、如何なる培地でもよい。
培地に使用する炭素源としては、同化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、デンプン加水分解物、グリセリン、フラクトース、糖蜜などが挙げられる。窒素源としては、利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、大豆粉、マルツエキス、アミノ酸、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどが挙げられる。無機物としては、例えば、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、硫酸第１鉄、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、炭酸ナトリウム、塩化カルシウムなどの種々の塩が挙げられる。その他、必要に応じてビタミン類、消泡剤などを添加してもよい。
その他にも、添加することにより本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨの製造量を向上させることができる栄養源や成分があれば、単独で、あるいは組み合わせて用いてもよい。【００４６】
培養条件は、培養する微生物により異なっても良いが、例えば、培地の初発ｐＨは、ｐＨ５〜１０に調整し、培養温度は、２０〜４０℃、培養時間は、１５〜２５時間、１〜２日間、あるいは１０〜５０時間等、適宜設定することができる。培養方法は、通気撹拌深部培養、振盪培養、静地培養など任意の方法を採用すればよい。例えば、大腸菌等の微生物を培養する培地および培養条件の一例として、イーストエキス０．１％、マルツエキス０．１％、リン酸二水素カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、ｐＨ７．３の培地を用いた、２５℃、１２０ｒｐｍで４日間の振盪培養が挙げられる。本発明の大腸菌形質転換体を培養するための培養条件のさらなる一例としては、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１ｍＭのＩＰＴＧを含む１０ｍＬのＴＹ培地（１％  バクトトリプトン、０．５％  バクトイースト・エクストラクト、０．５％  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃、４時間振とう培養後、さらに２０℃で一晩、振とう培養を行う方法も挙げられる。使用する形質転換体によって培養条件を最適化することにより、培養時間の短縮や酵素生産量の増加が実現され、より効率的な酵素製造に貢献することとなる。【００４７】
培養終了後、該培養物あるいは培養菌体内部からフラビン結合型ＧＤＨを採取するには、通常の酵素の採取手段を用いることができる。上記酵素が菌体内に存在する場合には、培養物から、例えば、濾過、遠心分離などの操作により菌体を分離し、この菌体から酵素を採取するのが好ましい。例えば、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイノミルなどの、通常の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームなどの細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ−１００などの界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法などを単独または組み合わせて採用することができる。【００４８】
次いで、濾過または遠心分離などにより不溶物を取りのぞき、酵素抽出液を得る。得られた抽出液から、フラビン結合型ＧＤＨを、必要に応じて単離、精製するには、必要により核酸を除去したのち、これに硫酸アンモニウム、アルコール、アセトンなどを添加して分画し、沈殿物を採取する。さらに精製度の高い酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトラゲルもしくはバイオゲルなどを用いるゲル濾過法、イオン交換体、ヒドロキシアパタイトなどを用いる吸着溶出法、アフィニティクロマト法、分子ふるい膜もしくは中空糸膜などを用いる分画法などを適宜選択し、またこれらを組み合わせて実施する。【００４９】
本発明に使用するフラビン結合型ＧＤＨは、公知の遺伝子組換え手法を用いて遺伝子配列およびアミノ酸配列の一部を欠失、置換、付加および／または挿入により改変したものであってもよい。このように所望の特性を付与させたフラビン結合型ＧＤＨについても、本発明の大腸菌形質転換体を用いて効率よく製造することが可能である。【００５０】
上記のような方法で製造されたフラビン結合型ＧＤＨは、夾雑糖化合物の存在下においても正確にグルコース量を測定できることから、グルコースセンサなどへの応用・実用化に好適に用いることができる。【００５１】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００５２】
（ケカビ由来のフラビン結合型ＧＤＨの取得）
１．ＧＤＨ生産菌のスクリーニング
自然界から分離した菌株および微生物保存機関（（財）野田産業科学研究所）から分与された保存菌約５００株から、ＧＤＨ生産菌のスクリーニングを行った。マルツエキス培地（マルツエキス２．０％、Ｄ−グルコース２．０％、ポリペプトン０．１％、ｐＨ６．０）３ｍｌに供試菌株をそれぞれ接種し、３〜５日、３０℃で振とう培養した。この培養液を８００×ｇ、１０分間遠心分離して菌体を沈殿として得た。その後、この菌体を１０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に懸濁し、ビーズショッカー（安井器械（株）製）により菌体を破砕（２，０００ｒｐｍ、６０秒、１６回）し、４℃、２０,０００×ｇ、１０分間の遠心によって回収された上清を粗酵素液とした。【００５３】
２．ＧＤＨ活性の確認
以下の手順に従って各溶液を混合し、吸光度を測定して、粗酵素液中のＧＤＨ活性を調べた。１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １．７９ｍＬ、１．２５Ｍ Ｄ−グルコース溶液 ０．０８ｍＬおよび２０ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．０１ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温後、２０ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．０２ｍＬおよび酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始した。反応開始時から酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を測定し、次式に従いＧＤＨ活性を算出した。この際、ＧＤＨ活性は、３７℃において濃度５０ｍＭのＤ−グルコ−ス存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義した。【００５４】
【数２】
2012073987.tif 000003
【００５５】
なお、式中の２．０は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは１０ｍＭ 酢酸緩衝液を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。【００５６】
各菌株の粗酵素液について、上記活性測定法に基づいてＧＤＨ活性の有無を調べた結果を表１に示す。【００５７】
【表１】
2012073987.tif 000004
【００５８】
その結果、Mucor prainii NISL0103、Mucor javanicus NISL0107、Mucor javanicus NISL0108、Mucor javanicus NISL0111、Mucor javanicus NISL0112、Mucor javanicus NISL0115、Mucor circinelloides f. circinelloides NISL0116、Mucor circinelloides f. circinelloides NISL0117、Mucor hiemalis f. silvaticus NISL0118、Absidia cylindrospora NISL0211、Absidia hyalospora NISL0218、Actinomucor elegans NISL9082由来の粗酵素液中にＧＤＨ活性が検出された。
【実施例２】
【００５９】
（ケカビ由来フラビン結合型ＧＤＨの精製）
前培養用培地（イーストエキス ２．０ ％、グルコース ４％、ｐＨ６．０）０．１Ｌを０．５Ｌ容坂口フラスコに入れ、予めプレート培地上で培養したMucor prainii NISL0103、Mucor javanicus NISL0111、Mucor circinelloides f. circinelloides NISL0117を、約１ｃｍ２分それぞれ接種し、３０℃、１３０ｒｐｍで２日間回転振とう培養した。これを種培養として、３０Ｌ容ジャーファメンターに入れた上記培地２０Ｌに０．２Ｌずつ接種し（ジャーファメンター２基）、３０℃、２００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍで３日間培養した。培養終了後、培養液４０Ｌをろ布でろ過し、菌体を回収した。次いで、得られた菌体を１０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に懸濁した。【００６０】
上記の菌体懸濁液を、ダイノミルに送液（１５０ｍｌ／分）して破砕し、６,０００×ｇで３０分遠心して上清を回収した。この上清を分画分子量６，０００の中空糸膜ＡＩＰ２０１３（旭化成ケミカルズ社製）を用いて濃縮し、濃縮後の酵素液に硫酸アンモニウムを７０％飽和となるよう徐々に添加し、余分な蛋白質を沈殿させた。一晩、４℃で放置後、遠心分離（２００,０００×ｇ、６０分）により上清を回収した。
この上清を、緩衝液Ａ（１０ｍＭ 酢酸緩衝液、２Ｍ 硫酸アンモニウム、ｐＨ５．０）にて予め平衡化したブチルトヨパール６５０Ｃ（東ソー社製）カラム（２６φ×２８．５ｃｍ）にかけ、緩衝液Ａから緩衝液Ｂ（１０ｍＭ 酢酸緩衝液、ｐＨ５．０）のリニアグラジエントによって溶出させた。溶出された活性画分をセントリコンプラス−７０（ミリポア社製）で濃縮後、緩衝液Ｃ（１０ｍＭ 酢酸緩衝液、ｐＨ４．５）で透析し、予め緩衝液Ｃで平衡化したＳＰセファロースＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）カラム（２６φ×２８．５ｃｍ）にかけ、緩衝液Ｃから緩衝液Ｄ（１０ｍＭ 酢酸緩衝液、２００ｍＭ 塩化カリウム、ｐＨ４．５）のリニアグラジエントで溶出させた。溶出された活性画分を濃縮し、精製酵素を得た。
以降、各精製酵素について、Mucor prainii NISL0103由来のＧＤＨをＭｐＧＤＨ、Mucor javanicus NISL0111由来のＧＤＨをＭｊＧＤＨ、Mucor circinelloides f. circinelloides NISL0117由来のＧＤＨをＭｃＧＤＨと表記する。
【実施例３】
【００６１】
（Ｍｕｃｏｒ属由来フラビン結合型ＧＤＨの酵素化学的性質の検討）
実施例２により得られた各精製ＧＤＨの諸性質を調べた。
（ａ）吸収スペクトルの測定
ＭｐＧＤＨ、ＭｊＧＤＨおよびＭｃＧＤＨを１０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で透析し、２５０−８００ｎｍにおける吸収スペクトルを分光光度計Ｕ−３０１０（日立ハイテクノロジーズ社製）により測定した。測定結果を図１に示す（図１（Ａ）はＭｐＧＤＨの吸収スペクトル、図１（Ｂ）はＭｊＧＤＨの吸収スペクトル、図１（Ｃ）はＭｃＧＤＨの吸収スペクトルを示す）。いずれのＧＤＨについても、波長３４０〜３５０ｎｍ付近および波長４２０〜４３０ｎｍ付近に極大を示す２つのピークが確認され、このような吸収スペクトルの形状がフラビン酵素に特有の形状であることから、本発明のＧＤＨがフラビン結合型タンパク質であることが強く示唆された。【００６２】
（ｂ）ＧＯＤ活性の測定
実施例２により得られたＭｐＧＤＨ、ＭｊＧＤＨおよびＭｃＧＤＨと、Aspergillus niger由来の市販のグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ、ｂｉｏｚｙｍｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて、ＧＤＨ活性およびＧＯＤ活性を測定した。結果を表２に示す。
ＧＤＨ活性は、実施例１の方法に準じ、ＧＯＤ活性は、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、およびＮ−エチルーＮ−（２−ヒドロキシー３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）を使用した以下の方法で測定した。１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） ３０．０ｍＬ、８３３ｍＭ Ｄ−グルコース溶液 ６．０ｍＬ、２５ｍＭ ４−ＡＡ溶液 ０．３ｍＬ、４０ｍＭ ＴＯＯＳ溶液 ０．３ｍＬおよび５００Ｕ／ｍＬ ＰＯＤ溶液 ０．３ｍＬを混合後、３．０ｍＬを試験管に移し、３７℃で５分間保温後、酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加して反応を開始した。酵素反応の進行に伴う５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの増加量（ΔＡ５５５）を測定し、次式に従ってＧＯＤ活性を算出した。この際、ＧＯＤ活性は、３７℃において濃度１３１ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＨ２Ｏ２を生成する酵素量を１Ｕと定義した。【００６３】
【数３】
2012073987.tif 000005
【００６４】
なお、式中の３．１は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、３２．８は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．５は１分子のＨ２Ｏ２が還元されるときに生じるキノンイミン染料の分子数、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ５５５ｂｌａｎｋは１０ｍＭ 酢酸緩衝液を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの増加量、ｄｆは希釈倍数を表す。【００６５】
【表２】
2012073987.tif 000006
【００６６】
表２に示す通り、ＭｐＧＤＨ、ＭｊＧＤＨおよびＭｃＧＤＨはいずれも全くＧＯＤ活性を示さず、専らＧＤＨ活性を示した。一方、ＧＯＤは主としてＧＯＤ活性を示すが、ＧＤＨ活性も併せ持つことが判明した。すなわち、本発明のＧＤＨは酸素を電子受容体として利用しないため、Ｄ−グルコースを定量する際に反応系の溶存酸素の影響を極めて受けにくいことが示された。【００６７】
（ｃ）至適ｐＨ
上記のフラビン結合型ＧＤＨにおける至適ｐＨを調べた。結果を図２に示す（図２（Ａ）はＭｐＧＤＨ、（Ｂ）はＭｊＧＤＨ、（Ｃ）はＭｃＧＤＨの結果を示す）。具体的には、１００ｍＭ 酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０−５．５、図中△印でプロット）、１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．５−６．５、図中斜め四角印でプロット）、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０−８．０、図中丸印でプロット）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５−９．０、図中×印でプロット）を用い、それぞれのｐＨにおいて、温度３７℃にて酵素反応を行い、相対活性を比較した。
その結果、上記のフラビン結合型ＧＤＨはいずれも、ｐＨ６．５もしくはｐＨ７．０において最も高い活性を示し、ｐＨ７．０付近に至適ｐＨを有していた。個別にみると、ＭｐＧＤＨおよびＭｃＧＤＨの相対活性が最も高かったのはｐＨ７．０においてであり、その周辺域として、ｐＨ６．５−７．５の範囲で最大相対活性値の８０％以上を示したことから、この範囲で好適に使用できると考えられた。また、ＭｊＧＤＨの相対活性が最も高かったのはｐＨ６．５においてであり、その周辺域として、ｐＨ６．０−７．０の範囲で最大相対活性値の８０％以上を示したことから、この範囲で好適に使用できると考えられた。【００６８】
（ｄ）至適温度範囲
実施例１記載の活性測定法に準じ、種々の温度にて本酵素の活性測定を行った。具体的には、１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １．７９ｍＬ、１．２５Ｍ Ｄ−グルコース溶液 ０．０８ｍＬおよび２０ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．０１ｍＬを混合し、３７℃で保温する代わりに各温度で５分間保温後、２０ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．０２ｍＬおよび酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、各温度にて反応を開始した。反応開始時、および、２分後の吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量を求めた。結果を図３に示す（図３（Ａ）はＭｐＧＤＨ、（Ｂ）はＭｊＧＤＨ、（Ｃ）はＭｃＧＤＨの結果を示す）。いずれも３７℃付近で最大の活性を示し、最大活性に対して８０％以上の活性を示す温度範囲は３０〜４０℃であった。以上より、本発明のフラビン結合型ＧＤＨの至適温度範囲は、３０〜４０℃、最も好ましい温度は３７℃であると考えられた。【００６９】
（ｅ）Ｄ−グルコースに対するＫｍ値
前記活性測定法において、基質であるＤ−グルコース濃度を変化させて活性測定を行い、ラインウェーバー・バークプロットから、ミカエリス定数（Ｋｍ）を求めた。この結果、Ｄ−グルコースに対するＫｍ値は、ＭｐＧＤＨで３１．１ｍＭ、ＭｊＧＤＨで２６．４ｍＭ、ＭｃＧＤＨで３３．２ｍＭであった。【００７０】
（ｆ）熱安定性
１００ｍＭ 酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて、本発明のフラビン結合型ＧＤＨを各温度で１５分間処理した時の熱安定性の結果を図４に示す（図４（Ａ）はＭｐＧＤＨ、（Ｂ）はＭｊＧＤＨ、（Ｃ）はＭｃＧＤＨの結果を示す）。本発明のフラビン結合型ＧＤＨは、４０℃、１５分間の熱処理後に８０％以上の残存活性を有しており、約４０℃まで安定であることがわかった。【００７１】
（ｇ）安定ｐＨの範囲
次いでこれらのフラビン結合型ＧＤＨにおける安定ｐＨを調べた。結果を図５に示す（図５（Ａ）はＭｐＧＤＨ、（Ｂ）はＭｊＧＤＨ、（Ｃ）はＭｃＧＤＨの結果を示す）。具体的には、１００ｍＭ グリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．５−３．５、図中四角印でプロット）、１００ｍＭ 酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ３．５−５．５、図中△印でプロット）、１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．５−６．５、図中斜め四角印でプロット）、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０−８．０、図中丸印でプロット）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５−９．０、図中×印でプロット）を用い、それぞれのｐＨにおいて２５℃で１６時間処理した後、フラビン結合型ＧＤＨの残存活性をそれぞれ測定した。その結果、いずれも、最大の残存活性を示したｐＨ５．０付近での活性に対し８０％以上の活性を示すｐＨ範囲はｐＨ３．５−７．０であった。以上から、これらのフラビン結合型ＧＤＨの安定ｐＨ範囲はｐＨ３．５−７．０であることが判った。【００７２】
（ｈ）分子量
スーパーセップエース １０−２０％（和光純薬工業社製）を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によりＭｐＧＤＨ、ＭｊＧＤＨおよびＭｃＧＤＨの分子量を求めた。また、脱糖鎖キット（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＰＺＭ製）を用いて、各フラビン結合型ＧＤＨを脱糖鎖処理し、同様に電気泳動に供した。結果を図６に示す。泳動サンプルは以下の通りである。
レーン１：分子量マーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（１０−２５０ｋＤａ），上から２５０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、８０ｋＤａ、６０ｋＤａ、５０ｋＤａ、４０ｋＤａ、３０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２０ｋＤａ、１５ｋＤａ）
レーン２：ＭｐＧＤＨ
レーン３：脱糖鎖処理後のＭｐＧＤＨ
レーン４：ＭｊＧＤＨ
レーン５：脱糖鎖処理後のＭｊＧＤＨ
レーン６：ＭｃＧＤＨ
レーン７：脱糖鎖処理後のＭｃＧＤＨ
レーン８：脱糖鎖反応に使用した酵素【００７３】
図６より、これらのフラビン結合型ＧＤＨの分子量は、ＭｐＧＤＨで約９０〜１３０ｋＤａ、ＭｊＧＤＨで約１００〜１５０ｋＤａ、ＭｃＧＤＨで約１３０〜２００ｋＤａであり、脱糖鎖キット（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＰＺＭ製）により糖鎖を除去した後の分子量はＭｐＧＤＨ、ＭｊＧＤＨおよびＭｃＧＤＨいずれも約８０ｋＤａであった。【００７４】
（ｉ）基質特異性
実施例１の酵素活性測定方法に準じ、基質としてはＤ−グルコース、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、マンノース、スクロース、トレハロース、マルトトリオース、マルトテトラオースをそれぞれ用いて、各基質に対するフラビン結合型ＧＤＨの活性を測定した。基質濃度は５０ｍＭとした。結果を表３に示す。【００７５】
【表３】
2012073987.tif 000007
【００７６】
その結果、これらのフラビン結合型ＧＤＨは、Ｄ−グルコースに対する活性を１００％とした場合に、各種の糖化合物に対し、いずれも反応性が非常に低いことが判明した。そして、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースに対する活性は、いずれも、２％以下であった。【００７７】
（ｊ）１，１０−フェナントロリンによる阻害効果
これらのフラビン結合型ＧＤＨの活性に対する１，１０−フェナントロリンの阻害効果を、以下の方法で調べた。実施例１の酵素活性の測定方法に準じ、ただし、終濃度が１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２５ｍＭおよび５０ｍＭとなるように１，１０−フェナントロリンを添加した場合の酵素活性を求め、１，１０−フェナントロリン無添加の阻害率を０％として、その阻害率を計算した。結果を表４に示す。【００７８】
【表４】
2012073987.tif 000008
【００７９】
本発明のフラビン結合型ＧＤＨに対する１，１０−フェナントロリンの阻害効果は低く、１ｍＭの１，１０−フェナントロリン添加では２〜４％程度の阻害効果が認められるに過ぎず、５ｍＭの添加でも阻害率は１０％程度であった。
【実施例４】
【００８０】
（ケカビ由来フラビン結合型ＧＤＨを用いたグルコース濃度の定量性の検証１）
上述のフラビン結合型ＧＤＨを用いて、グルコースの測定を行った。具体的には、１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １．７９ｍＬ、Ｄ−グルコース溶液（２５０、７５０、１，２５０、１，７５０、２，５００、３，２５０、４，０００、５，０００ｍｇ／ｄＬ） ０．０８ｍＬおよび２０ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．０１ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温後、２０ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．０２ｍＬおよび０．８Ｕ／ｍＬ ＧＤＨ溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始した。酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）とグルコースの終濃度の関係を図７に示す（図７（Ａ）はＭｐＧＤＨを用いた測定結果、（Ｂ）はＭｊＧＤＨを用いた測定結果、（Ｃ）はＭｃＧＤＨを用いた測定結果を示す）。【００８１】
図７に示す通り、ケカビ由来のフラビン結合型ＧＤＨを用いることにより、終濃度２００ｍｇ／ｄＬ以下のグルコース濃度であれば、測定試料中のグルコース濃度を精度良く測定できることが確認された。
【実施例５】
【００８２】
（ケカビ由来のフラビン結合型ＧＤＨを用いたグルコース濃度の定量性の検証２）
１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １．７７ｍＬ、Ｄ−グルコース溶液（１０，０００、１６，０００ｍｇ／ｄＬ） ０．０２ｍＬおよび２０ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．０１ｍＬを混合した。続いて、マルトース溶液（３，０００、６，０００、９，０００、１２，０００、１５，０００ｍｇ／ｄＬ）もしくはＤ−ガラクトース溶液（１，５００、３，０００、４，５００、６，０００、７，５００ｍｇ／ｄＬ）もしくはＤ−キシロース溶液（１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００ｍｇ／ｄＬ） ０．０８ｍＬを添加して３７℃で５分間保温した後、２０ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．０２ｍＬおよび２．０Ｕ／ｍＬ ＧＤＨ溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始した。酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）、およびグルコースの終濃度の関係を表５〜７に示す。【００８３】
【表５】
2012073987.tif 000009
【００８４】
【表６】
2012073987.tif 000010
【００８５】
【表７】
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【００８６】
表５〜７より、ケカビ由来のこれらのＧＤＨは、終濃度６００ｍｇ／ｄＬ以下のマルトース、または、終濃度３００ｍｇ／ｄＬ以下のＤ−ガラクトース、あるいは終濃度２００ｍｇ／ｄＬ以下のＤ−キシロースを含有するサンプルのグルコース濃度を精度良く定量できることが示された。
【実施例６】
【００８７】
（フラビン結合型ＧＤＨを用いたグルコース濃度の定量性の検証３）
１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １．６１ｍＬ、Ｄ−グルコース溶液（１０，０００、１６，０００ｍｇ／ｄＬ） ０．０２ｍＬおよび２０ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．０１ｍＬを混合した。続いて、マルトース溶液（３，０００、６，０００、９，０００、１２，０００、１５，０００ｍｇ／ｄＬ）、Ｄ−ガラクトース溶液（１，５００、３，０００、４，５００、６，０００、７，５００ｍｇ／ｄＬ）およびＤ−キシロース溶液（１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００ｍｇ／ｄＬ） をそれぞれ０．０８ｍＬ添加して３７℃で５分間保温した後、２０ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．０２ｍＬおよび２．０Ｕ／ｍＬ のフラビン結合型ＧＤＨ溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始した。酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）とグルコースの終濃度の関係を表８〜９に示した。【００８８】
【表８】
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【００８９】
【表９】
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【００９０】
表８〜９より、ＭｐＧＤＨまたはＭｊＧＤＨは、終濃度６００ｍｇ／ｄＬ以下のマルトース、終濃度３００ｍｇ／ｄＬ以下のＤ−ガラクトースおよび終濃度２００ｍｇ／ｄＬ以下のＤ−キシロースを含有する試料中のグルコース濃度を、極めて精度良く定量できることが示された。
【実施例７】
【００９１】
（Ｍｕｃｏｒ属由来フラビン結合型ＧＤＨ遺伝子のクローニングと大腸菌形質転換体の作製）
（１）ｍＲＮＡの調製
Mucor prainii NISL0103をマルツエキス培地（マルツエキス  ２．０％、グルコース  ４．０％、ポリペプトン  ０．１％、ｐＨ６．０）３ｍＬに接種し、２日、３０℃で振とう培養した。この培養液を濾紙濾過し、菌糸体を回収した。得られた菌糸を液体窒素中で凍結させ、乳鉢を用いて菌糸を粉砕した。次いで、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いて、本キットのプロトコールに従って、粉砕した菌体からｍＲＮＡを得た。【００９２】
（２）ＧＤＨ部分アミノ酸配列の決定
実施例２より得られたＭｐＧＤＨをスーパーセップエース  １０−２０％（和光純薬工業社製）に供し、電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをＱｕｉｃｋ−ＣＢＢ（和光純薬工業社製）を用いて染色し、当該酵素の分子量に相当するバンド部分を切り出した。切り出したゲル断片を外部機関に委託し、その中に含まれるタンパク質の内部アミノ酸配列情報を取得した。その結果、得られたアミノ酸配列は、ＬＶＥＮＦＴＰＰＴＰＡＱＩＥ（配列番号５）およびＩＲＮＳＴＤＥＷＡＮＹＹ（配列番号６）であった。【００９３】
（３）ＧＤＨ遺伝子配列の決定
上記の部分アミノ酸配列情報に基づき、ミックス塩基を含有するディジェネレートプライマー（プライマーの一例を配列番号７（フォワードプライマー）、配列番号８（リバースプライマー）に示す）を作製した。なお、配列番号７および８に記載の１文字表記において、混合塩基はそれぞれ、ｈ＝ａ＋ｃ＋ｔ、ｒ＝ａ＋ｇ、ｙ＝ｃ＋ｔ、ｄ＝ａ＋ｇ＋ｔを表す。上記（１）にて調製したMucor prainii NISL0103のｍＲＮＡをテンプレートとし、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、本キットのプロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲを行った。逆転写反応には本キット付属のオリゴｄＴプライマーを、ＰＣＲによるｃＤＮＡ増幅には配列番号７、８に示すディジェネレートプライマーを用いた。反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、８００ｂｐ程度の長さに相当するシングルバンドが確認された。このバンドに含まれる増幅ＤＮＡ断片を精製し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ  Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）を用いて、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）に前記増幅ＤＮＡ断片をライゲーションすることにより、組換えプラスミドｐＴＭＧＤ−１を構築した。【００９４】
次いで、得られたｐＴＭＧＤ−１を用い、公知のヒートショック法により大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（ニッポンジーン社製）を形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（シグマ社製）を用いてプラスミドを抽出・精製し、プラスミド中に含まれる前記増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した（７６７ｂｐ）。【００９５】
得られた前記増幅ＤＮＡ断片の配列情報を元に、３’−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔ（タカラバイオ社製）を用いて３’側のＧＤＨ遺伝子未知領域を、また、５’−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔ（タカラバイオ社製）を用いて５’側のＧＤＨ遺伝子未知領域を決定した。いずれも各キットのプロトコールに従い、３’−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔでは本キット付属の３サイトアダプタープライマーおよび配列番号９に示すプライマーを用い、また、５’−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔでは配列番号１０、１１、１２、１３、１４に示すプライマーをそれぞれ用いた。前記の方法に従って得られた複数のプラスミド中に含まれるＤＮＡ断片の塩基配列解析を行った結果、配列番号２および配列番号４に示す全鎖長１９２６ｂｐのMucor prainii NISL0103由来ＧＤＨ遺伝子配列が明らかとなった。当該遺伝子配列により予測した当該酵素遺伝子のアミノ酸配列を配列番号１および配列番号３に示す。【００９６】
（４）大腸菌の形質転換とＧＤＨ活性の確認
Ｎ末領域のプライマー（配列番号１５）およびＣ末領域のプライマー(配列番号１６)を作製し、これらのプライマーおよび上記（１）にて調製したMucor prainii NISL0103のｍＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。
反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約２ｋｂｐ程度の長さに相当するシングルバンドが確認された。このバンドに含まれる増幅ＤＮＡ断片を精製し、制限酵素ＳｍａＩで消化したプラスミドｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）とライゲーションを行って、組換えプラスミドｐｕｃ−ＭＧＤを構築した。【００９７】
得られた組換えプラスミドｐｕｃ−ＭＧＤを用い、公知のヒートショック法により大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（ニッポンジーン社製）を形質転換した。次いで、形質転換した大腸菌ＪＭ１０９（ｐｕｃ−ＭＧＤ）菌体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＴＹ培地（１％  バクトトリプトン、０．５％  バクトイースト・エクストラクト、０．５％  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）１０ｍＬ中で３７℃、２時間振とう培養後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように添加し、さらに３０℃、６時間振とう培養を行った。
この培養液を氷上で冷却下、超音波破砕器（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｇｅｎｅｒａｔｏｒ、Ｎｉｓｓｅｉ社製）を用いて２０秒間、４回処理し、破砕した。破砕液をエッペンドルフチューブに入れ、微量遠心機を用い、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上清画分を別のエッペンドルフチューブに移しかえ、粗酵素液とした。前述の酵素活性測定法によりこの粗酵素液中のＧＤＨ活性を測定したところ、本発明のフラビン結合型ＧＤＨ活性が確認された。【００９８】
（５）Ｎ末端配列を欠失したＭｕｃｏｒ属由来フラビン結合型ＧＤＨ遺伝子の大腸菌への導入とＧＤＨ活性の確認
大腸菌による組換え発現に適したＭｕｃｏｒ属由来ＧＤＨをコードするＤＮＡを取得するため、コドン使用頻度を大腸菌にあわせた遺伝子配列を設計し、該遺伝子を全合成した。この全合成したＤＮＡ配列を配列番号１７に示す。この合成ＤＮＡを鋳型とし、Ｎ末領域のプライマー（配列番号１８）およびＣ末領域のプライマー(配列番号２１)を作製し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）により、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、組換えプラスミド（ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＦｕｌｌ）を構築した。
この組換えプラスミドを、公知のヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（ニッポンジーン社製）に導入した。常法に従いプラスミドを抽出し、全長Ｍｕｃｏｒ属由来ＧＤＨ遺伝子の塩基配列の確認を行った結果、配列番号１７と一致し、ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸残基は６４１アミノ酸（配列番号３）であった。【００９９】
次いで、ＷＥＢ上のシグナルペプチド予想プログラム（ＳｉｇｎａｌＰ、「ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ−２．０／」）を用いて、上記のＭｕｃｏｒ属由来ＧＤＨの配列全長を解析した結果、このＧＤＨにおいては、Ｎ末端から２０番目のＡｌａと２１番目のＧｌｎの間でシグナルペプチドの切断が起こる可能性が予想された（図８）。これにより、２０番目のＡｌａまでＮ末端配列を欠失させてみることにより、大腸菌での酵素生産が向上する可能性があることが推測された。そこで、２０番目のＡｌａまで欠失させ、２１番目のＧｌｎにＭｅｔを付加したＧＤＨ（ＮＳ１と称する）をコードする遺伝子を下記の要領で取得した。さらに、２０番目のＡｌａまで欠失させ、２１番目のＧｌｎをＭｅｔに置換したＧＤＨ（ＮＳ２と称する）をコードする遺伝子も、同様に取得した（図９）。【０１００】
まず、ＮＳ１に関し、配列番号１９のオリゴヌクレオチドをＮ末端側プライマーとし、配列番号２１のプライマーとの組み合わせによるＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングを行った。次いで、前述のｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＦｕｌｌを作製したのと同様の手順にて、ＮＳ１をコードするＤＮＡ配列をもつ組換えプラスミド（ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１）を構築し、これをヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（ニッポンジーン社製）に導入し、本発明の大腸菌形質転換体を取得した。
次いで、同様に、ＮＳ２に関し、配列番号２０のオリゴヌクレオチドをＮ末端側プライマーとして、配列番号２１のプライマーとの組み合わせによるＰＣＲを行い、ＮＳ２をコードするＤＮＡ配列をもつ組換えプラスミド（ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ２）を構築し、大腸菌形質転換体を取得した。なお、それぞれの改変フラビン結合型ＧＤＨのＤＮＡ配列を持つプラスミドは、ＤＮＡシーケンシングにて配列に誤りがないことを確認した。配列番号２２は、上記で決定したシグナルペプチド欠失変異体ＮＳ１をコードするＤＮＡ配列を示す。配列番号２３はその対応するアミノ酸配列を示す。配列番号２４は、上記で決定したシグナルペプチド欠失変異体ＮＳ２をコードするＤＮＡ配列を示す。配列番号２５はその対応するアミノ酸配列を示す。【０１０１】
上記の通り取得した各種組換えプラスミドｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＦｕｌｌ、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ２をそれぞれ用いて形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＦｕｌｌ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ２菌体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１ｍＭのＩＰＴＧを含む１０ｍＬのＴＹ培地（１％  バクトトリプトン、０．５％  バクトイースト・エクストラクト、０．５％  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃、４時間振とう培養後、さらに２０℃で一晩、振とう培養を行った。
この培養液を、氷冷下にて、超音波破砕器（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｇｅｎｅｒａｔｏｒ、Ｎｉｓｓｅｉ社製）を用いて１０秒間、１回処理して破砕した。破砕液をエッペンドルフチューブに入れ、微量遠心機を用い、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上清画分を別のエッペンドルフチューブに移しかえて粗酵素液とした。前述の酵素活性測定法により、得られた粗酵素液中のＧＤＨ活性を測定し、１ｍｌ培養液あたりのＧＤＨ活性量を比較した結果、野生型の全長ＧＤＨ遺伝子を導入した大腸菌形質転換体ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＦｕｌｌでは、０．０８１５Ｕ／ｍｌに留まっていた。一方、Ｎ末端のＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡを欠失させＭを付加した改変型ＧＤＨの遺伝子を導入した大腸菌形質転換体ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１では４．１０Ｕ／ｍｌ、Ｎ末端のＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡを欠失させ２１番目のＱをＭに置換した改変型ＧＤＨの遺伝子を導入した大腸菌形質転換体ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ２では３．４３Ｕ／ｍｌの活性が見られた。すなわち、Ｎ末端を特定の長さで欠失した本発明の大腸菌形質転換体（ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ１およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ２）では、シグナルペプチドと予想されるアミノ酸配列を欠失させることにより、そのＧＤＨ生産性が約４２〜５０倍増大することがわかった。
すなわち、本発明の大腸菌形質転換体を用いることによって、実用性に優れた性質を有する本発明のＧＤＨを、より小さい設備で効率よく製造できるようになる。さらに、これら本来のＧＤＨ由来微生物（すなわち、ケカビ）の培養工程には、３〜５日という長期間培養工程と、遠心分離で菌体を取得し菌体破砕（酵素抽出）を行う工程、そして、その後に再度遠心分離して粗酵素液を調製するという工程が含まれていたが、本発明の大腸菌形質転換体を用いることによって、培養日数が大幅に短縮できるとともに、宿主が大腸菌となることによって菌体破砕（酵素抽出）工程の負荷も軽減される結果、効率的なＧＤＨの製造が可能となる。【０１０２】
また、図８より、切断サイトスコア（Ｃ、Ｙ）が若干高い、Ｎ末端から２７番目のＳｅｒ付近でシグナルペプチドが切断される可能性も僅かに示されたため、ＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡＱＱＤＴＮＳＳを欠損させたＧＤＨを大腸菌で発現させてみることにした。まず、Ｎ末端から２７番目のＳｅｒまで欠失させ、２８番目のＳｅｒにＭｅｔを付加したＧＤＨ（ＮＳ３と称する）をコードする遺伝子を下記の要領で取得した。さらに、２７番目のＳｅｒまで欠失させ、２８番目のＳｅｒをＭｅｔに置換したＧＤＨ（ＮＳ４と称する）をコードする遺伝子も同様に取得した（図９）。【０１０３】
まず、ＮＳ３に関し、配列番号２６のプライマーと配列番号２７のプライマーを組み合わせ、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＦｕｌｌを鋳型としたＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ増幅断片をＮｄｅＩで切断し、反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、７４００ｂｐ程度の長さに相当するシングルバンドが確認された。このバンドに含まれる増幅ＤＮＡ断片を精製し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ  Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）を用いてライゲーションすることにより、ＮＳ３をコードするＤＮＡ配列をもつ組換えプラスミド（ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ３）を構築した。次いで、これをヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（ニッポンジーン社製）に導入し、本発明の大腸菌形質転換体を取得した。【０１０４】
次いで、同様にＮＳ４に関し、配列番号２８のプライマーと配列番号２７のプライマーの組み合わせ、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＦｕｌｌを鋳型としたＰＣＲを行った。ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ３を作成した時と同様の方法により、ＮＳ４をコードするＤＮＡ配列をもつ組換えプラスミド（ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ４）を構築し、大腸菌形質転換体を取得した。なお、それぞれの改変フラビン結合型ＧＤＨのＤＮＡ配列を持つプラスミドは、ＤＮＡシーケンシングにて配列に誤りがないことを確認した。
配列番号２９は、上記で決定したシグナルペプチド欠失変異体ＮＳ３をコードするＤＮＡ配列を示す。配列番号３０はその対応するアミノ酸配列を示す。配列番号３１は、上記で決定したシグナルペプチド欠失変異体ＮＳ４をコードするＤＮＡ配列を示す。配列番号３２はその対応するアミノ酸配列を示す。【０１０５】
上記の通り取得した各種組換えプラスミドｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＦｕｌｌ、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ３、ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ４をそれぞれ用いて形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＦｕｌｌ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ３、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ４菌体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび０．１ｍＭのＩＰＴＧを含む２ｍＬのＴＹ培地（１％  バクトトリプトン、０．５％  バクトイースト・エクストラクト、０．５％  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃、３時間振とう培養後、さらに２０℃で一晩、振とう培養を行った。
この培養液を、氷冷下にて、超音波破砕器（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｇｅｎｅｒａｔｏｒ、Ｎｉｓｓｅｉ社製）を用いて１０秒間、１回処理して破砕した。破砕液をエッペンドルフチューブに入れ、微量遠心機を用い、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上清画分を別のエッペンドルフチューブに移しかえて粗酵素液とした。前述の酵素活性測定法により、得られた粗酵素液中のＧＤＨ活性を測定し、１ｍｌ培養液あたりのＧＤＨ活性量を比較した結果、野生型の全長ＧＤＨ遺伝子を導入した大腸菌形質転換体ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＦｕｌｌでは、０．０１９６Ｕ／ｍｌに留まっていた。一方、Ｎ末端のＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡＱＱＤＴＮＳＳを欠失させＭを付加した改変型ＧＤＨの遺伝子を導入した大腸菌形質転換体ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ３では０．０６４４Ｕ／ｍｌ、Ｎ末端のＭＫＩＴＡＡＩＩＴＶＡＴＡＦＡＳＦＡＳＡＱＱＤＴＮＳＳを欠失させ２８番目のＳをＭに置換した改変型ＧＤＨの遺伝子を導入した大腸菌形質転換体ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ４では０．０６８１Ｕ／ｍｌの活性が見られた。すなわち、Ｎ末端を特定の長さで欠失した本発明の大腸菌形質転換体（ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ３およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ−ＭｐＮＳ４）では、シグナルペプチドと予想されるアミノ酸配列を欠失させることにより、そのＧＤＨ生産性が約３．３〜３．５倍増大することがわかった。
なお、本発明の大腸菌形質転換体により生産される本発明ＧＤＨ（ＮＳ１，ＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４）の基質特異性を実施例３，５に準じて調べた結果、それらは実施例２で得られた精製ＧＤＨと概ね同等であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
溶存酸素の影響を受けにくく、試料中にグルコース以外の糖化合物が存在する場合でも、グルコース量を正確に測定できるＦＡＤ−ＧＤＨを効率的に製造することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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