(57)【要約】  平均粒子径の異なる担体を用いることなく、１段階の反応で、簡便かつ高精度で、PSAを測定する方法及びその試薬の提供。  遊離型PSA及び遊離型PSAとα1‐アンチキモトリプシンとの複合体であるPSA‐ACTの双方に反応する抗PSAモノクローナル抗体であって、互いにエピトープを異にする２種の抗PSAモノクローナル抗体で、平均粒子径が０.２０μmを超えて０.４０μm以下である同一平均粒子径の不溶性担体を感作し、凝集促進剤の共存下に、試料と接触させるPSAの測定方法及びこれに用いる試薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遊離型PSA及び遊離型PSAとα1‐アンチキモトリプシンとの複合体であるPSA‐ACTの双方に反応する抗PSAモノクローナル抗体であって、互いにエピトープを異にする２種の抗PSAモノクローナル抗体で、平均粒子径が０.２０μmを超えて０.４０μm以下である同一平均粒子径の不溶性担体を感作し、凝集促進剤の共存下に、試料と接触させることを特徴とするPSAの測定方法。
【請求項２】
凝集促進剤が、ポリエチレングリコール、多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリ塩化ビニル、ポリ-γ-グルタミン酸塩、及びポリ（２‐メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）から選ばれる１種以上である、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
不溶性担体が、合成高分子からなるラテックス、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体の材質よりなる粒子から選ばれる１種以上である、請求項１に記載の測定方法。
【請求項４】
凝集促進剤の濃度が、遊離型PSA及び遊離型PSAとα1‐アンチキモトリプシンとの複合体であるPSA‐ACTの双方と等モル反応性を示すよう調整されている請求項１に記載の測定方法。
【請求項５】
多糖類が、デキストラン、プルラン、メチルセルロース、エチルセルロースのアルキル化多糖類から選ばれる１種以上である、請求項２に記載の測定方法。
【請求項６】
合成高分子が、ポリスチレン、スチレン‐スルホン酸共重合体、スチレン‐メタクリル酸共重合体、アクリロニトリル‐ブタジエン‐スチレン共重合体、塩化ビニル‐アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル‐アクリル酸エステル共重合体から選ばれる１種以上である、請求項３に記載の測定方法。
【請求項７】
２種の抗PSAモノクローナル抗体の遊離型PSAに対する解離定数（fKd）と、遊離型PSAとα１‐アンチキモトリプシンとの複合体であるPSA‐ACTに対する解離定数（cKd）の比（fKd/cKd）が、いずれも０.１より大きく２.０以下、かつ遊離型PSAに対する解離定数（fKd値）が１０nM以下である請求項１〜６のいずれかに記載の測定方法。
【請求項８】
少なくとも次の１）および２）を含むPSA測定用試薬。
１）遊離型PSA及び遊離型PSAとα1‐アンチキモトリプシンとの複合体であるPSA‐ACTの双方に反応する抗PSAモノクローナル抗体であって、互いにエピトープを異にする２種の抗PSAモノクローナル抗体を、平均粒子径が０.２０μmを超えて０.４０μm以下である同一平均粒子径の不溶性担体にそれぞれ感作させた抗体感作担体
２）ポリエチレングリコール、多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリ塩化ビニル、ポリ‐γ‐グルタミン酸塩、及びポリ（２‐メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）から選ばれる１種以上の凝集促進剤
【請求項９】
請求項１に記載のPSAの測定方法において、
２種の抗PSAモノクローナル抗体の遊離型PSAに対する解離定数（fKd）と、遊離型PSAとα１‐アンチキモトリプシンとの複合体であるPSA‐ACTに対する解離定数（cKd）の比（fKd/cKd）が、いずれも０.１より大きく２.０以下、かつ遊離型PSAに対する解離定数（fKd値）が１０nM以下であり、
前記凝集促進剤が、ポリエチレングリコール、多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリ塩化ビニル、ポリ-γ-グルタミン酸塩、及びポリ（２‐メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）から選ばれる１種以上を用いて、
当該凝集促進剤の添加量を調整することにより、
遊離型PSAと、遊離型PSAとα1‐アンチキモトリプシンとの複合体であるPSA‐ACTの双方が、等モル反応性を示すように調整する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫凝集反応により遊離型の抗原と、遊離型の抗原と検体中の共存物質とで複合体を形成している複合体型の抗原の両者を等モルの反応性で測定する抗原の測定方法および試薬に関する。特には、前立腺特異抗原を測定するための方法及びそれに用いる試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は男性にみられる悪性疾患であり、米国や欧州で罹患数が多く、日本でも近年、患者数が急激に増加している。前立腺癌は増殖の遅い腫瘍であること、放射線療法や抗男性ホルモン療法が奏効しやすいという特徴があることから、早期発見が重要な課題である。【０００３】
前立腺特異抗原（Prostate Specific Antigen、以下、単に「PSA」ということがある）は、前立腺上皮細胞から分泌されるセリンプロテアーゼの一種で、分子量３３,０００〜３４,０００ダルトンの糖蛋白である。このPSAは、前立腺に疾患があると血液中の濃度が健常者よりも高くなるため、前立腺疾患（特に前立腺癌）の早期発見に有用となっている。PSAには、血中でプロテアーゼインヒビターと結合する複合体型と、非結合の遊離型PSA（以下、「fPSA」ということがある）があるが、血中のPSAの多くは複合体型であり、前立腺特異抗原‐α1‐アンチキモトリプシン複合体（以下、「PSA‐ACT」ということがある）や、前立腺特異抗原‐α2‐マクログロブリン複合体等が存在している。このうち、免疫学的測定方法で測定できるのは、fPSAとPSA‐ACTの２種類である。【０００４】
免疫学的測定方法としては、ラテックス等を用いた凝集反応による測定方法（いわゆる免疫凝集反応測定法）が用いられている。しかし、抗PSAモノクローナル抗体のfPSAに対する反応性と、PSA‐ACTに対する反応性が異なるため、総PSA量をうまく測定できないという問題があった。【０００５】
このような問題を解決する従来技術として、例えば特許文献１では、（１）測定対象物質が遊離状態であっても、それに対応する結合分子と結合した複合体であっても結合可能な第１モノクローナル抗体を感作した第１不溶性担体粒子を含む第１粒子懸濁液、（２）前記測定対象物質が遊離状態であっても、それに対応する結合分子と結合した複合体であっても結合可能であって、さらに前記第１モノクローナル抗体と競合しない第２モノクローナル抗体を感作した第２不溶性担体粒子を含む第２粒子懸濁液、及び、（３）前記測定対象物質が遊離状態では認識しないが前記測定対象物質がそれに対応する結合分子と結合した複合体を認識する第３モノクローナル抗体を感作した第３不溶性担体粒子を含む第３粒子懸濁液を含む免疫凝集測定用試薬及びそれを用いる方法が提案されている。【０００６】
また、特許文献２では、遊離型の抗原と複合体型の抗原の両方に反応性を有し、それぞれ認識部位が異なる３種類のモノクローナル抗体のうち、少なくとも１種類を、粒径が異なる２種類以上の担体のうち粒径が小さい方の担体に感作し、残りのモノクローナル抗体を粒径が大きい方の担体に感作することにより遊離型の抗原と複合体型の抗原の反応性を調整する測定試薬及びそれを用いる測定方法が提案されている。【０００７】
さらに、特許文献３では、測定対象物質が遊離体及び複合体で存在する検体と、測定対象物質に対するモノクローナル抗体１を固定化したラテックス１とを反応させて反応体１を得る工程（１）、並びに抗体１と測定対象物質に対する認識部位の異なるモノクローナル抗体２を固定化したラテックス２と、反応体１とを反応させて反応体２を得る工程（２）を含む、すなわち２段階で反応をさせる免疫測定方法が提案されている。【０００８】
またさらに、特許文献４では、前立腺特異抗原の遊離体と結合体の両者と反応性を有するモノクローナル抗体１が固定化されたラテックス１と、抗体１とは前立腺特異抗原に対する認識部位が異なる、前立腺特異抗原の遊離体と結合体の両者と反応性を有するモノクローナル抗体２が固定化された、ラテックス１とは平均粒径の異なるラテックス２とを含む、前立腺特異抗原測定用の免疫学的測定用試薬及びそれを用いる測定方法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００１−１０８６８１号公報
【特許文献２】ＷＯ２００６／０６８２０６パンフレット
【特許文献３】特開２００７−１６３３１９号公報
【特許文献４】特許第４２４１３０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上記特許文献１に記載の方法は、平均粒子径０.７８μmのポリスチレンラテックスに抗PSAモノクローナル抗体を感作して、fPSA及びPSA‐ACTを異なる割合で混合した試料の測定結果が示しているように、PSA‐ACTの混合割合が増加するに従い相対測定値の低下が認められている。すなわち、PSA‐ACTのみの場合は遊離のPSAに対する相対測定値が８１.４３％であり、等モル反応性は得られていない。また、特許文献２に記載の方法では、粒径の異なるラテックスを組合せる必要があり、特許文献３に記載の方法では、第１のモノクローナル抗体を反応させた後に第２のモノクローナル抗体を反応させるという２段階の反応を行わせる必要があった。さらに、特許文献４に記載の方法も、粒径の異なるラテックスを組合せる必要がある。なお、同文献４には、同一の平均粒径（０.２２μm）のラテックスを用いた比較例が示されているが、凝集促進剤を使用したものではなく、等モル反応性も得られていない。【００１１】
従って、より簡便かつ正確にPSAの総量（免疫学的測定方法で測定可能なfPSAとPSA‐ACTの和）を測定する方法の開発が望まれていた。
すなわち、本発明が解決しようとする課題は、平均粒子径の異なる担体を用いることなく、１段階の反応で、簡便かつ高精度で、PSAを測定する方法及びその試薬を提供することである。なお、特に断らない限りはPSAの測定とは、PSAの総量を測定することを意味する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
課題を解決するための手段としての本発明は、次のものを含む。
（１）遊離型PSA及び遊離型PSAとα1‐アンチキモトリプシンとの複合体であるPSA‐ACTの双方に反応する抗PSAモノクローナル抗体であって、互いにエピトープを異にする２種の抗PSAモノクローナル抗体で、平均粒子径が０.２０μmを超えて０.４０μm以下である同一平均粒子径の不溶性担体を感作し、凝集促進剤の共存下で、試料と接触させるPSAの測定方法。【００１３】
（２）凝集促進剤が、ポリエチレングリコール、多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリ塩化ビニル、ポリ-γ-グルタミン酸塩、及びポリ（２‐メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）から選ばれる１種以上である上記（１）に記載の測定方法。
（３）不溶性担体が、合成高分子からなるラテックス、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体の材質よりなる粒子から選ばれる１種以上である、上記（１）に記載の測定方法。【００１４】
（４）凝集促進剤の濃度が、遊離型PSA及び遊離型PSAとα1‐アンチキモトリプシンとの複合体であるPSA‐ACTの双方と等モル反応性を示すよう調整されている上記（１）に記載の測定方法。
（５）多糖類が、デキストラン、プルラン、メチルセルロース、エチルセルロースのアルキル化多糖類から選ばれる１種以上である、上記（２）に記載の測定方法。【００１５】
（６）合成高分子が、ポリスチレン、スチレン‐スルホン酸共重合体、スチレン‐メタクリル酸共重合体、アクリロニトリル‐ブタジエン‐スチレン共重合体、塩化ビニル‐アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル‐アクリル酸エステル共重合体から選ばれる１種以上である、上記（３）に記載の測定方法。
（７）２種の抗PSAモノクローナル抗体の遊離型PSAに対する解離定数（fKd）と、遊離型PSAとα1‐アンチキモトリプシンとの複合体であるPSA‐ACTに対する解離定数（cKd）の比（fKd/cKd）が、いずれも０.１より大きく２.０以下、かつ遊離型PSAに対する解離定数（fKd値）が１０nM以下である上記（１）〜（６）のいずれかに記載の測定方法。【００１６】
（８）少なくとも次の１）および２）を含むPSA測定用試薬。
１）遊離型PSA及び遊離型PSAとα1‐アンチキモトリプシンとの複合体であるPSA‐ACTの双方に反応する抗PSAモノクローナル抗体であって、互いにエピトープを異にする２種の抗PSAモノクローナル抗体を、平均粒子径が０.２０μmを超えて０.４０μm以下である同一平均粒子径の不溶性担体にそれぞれ感作させた抗体感作担体
２）ポリエチレングリコール、多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリ塩化ビニル、ポリ‐γ‐グルタミン酸塩、及びポリ（２‐メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）から選ばれる１種以上の凝集促進剤【００１７】
（９）上記（１）に記載のPSAの測定方法において、
２種の抗PSAモノクローナル抗体の遊離型PSAに対する解離定数（fKd）と、遊離型PSAとα１‐アンチキモトリプシンとの複合体であるPSA‐ACTに対する解離定数（cKd）の比（fKd/cKd）が、いずれも０.１より大きく２.０以下、かつ遊離型PSAに対する解離定数（fKd値）が１０nM以下であり、
前記凝集促進剤が、ポリエチレングリコール、多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリ塩化ビニル、ポリ-γ-グルタミン酸塩、及びポリ（２‐メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）から選ばれる１種以上を用いて、
当該凝集促進剤の添加量を調整することにより、
遊離型PSAと、遊離型PSAとα1‐アンチキモトリプシンとの複合体であるPSA‐ACTの双方が、等モル反応性を示すように調整する方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の測定方法は、平均粒子径の異なる担体を用いる必要がなく、測定も１段階の反応で行わせることができ、簡便かつ高精度にPSAを測定できる。従って、本発明によると、特殊な装置を必要とせず、汎用の自動分析装置を用いて高精度の測定をすることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（測定対象物質）
本発明は、前立腺特異抗原（PSA）を測定対象物質とするものである。免疫学的測定方法にて測定できるPSAは、血漿中では、遊離型（fPSA）と、fPSAとα1‐アンチキモトリプシンとの複合体型（PSA‐ACT）である。
対象試料としては、上記PSAを含有する試料であれば特に制限はされないが、例えば血液、血清、血漿等が好ましい。
【００２０】
（抗PSAモノクローナル抗体）
PSAに対するモノクローナル抗体としては、fPSAとPSA‐ACTの両者と反応性を有するものであり、互いにエピトープを異にする、少なくとも２種を用いる。なお、２種の抗体のエピトープが異なることは、抗原であるPSA及びこれらの抗体を用いて、通常のサンドイッチ免疫測定ができるか否かによって確認することができる。
【００２１】
（抗体の選択）
抗体は次のようにして選択する。
抗体は、まずELISA法などにより、PSA‐ACTとfPSAとの反応性が高い、つまり力価の高い抗体を選択することが望ましい。また、担体は、十分な測定感度が得られるものを選択することが望ましい。次に、選択された力価の高い抗体から、２種類の抗体を適当に選んでそれぞれ担体に感作し、PSA‐ACTとfPSAを試料として測定したとき、両試料との反応性の差が小さく、かつ十分な測定感度の得られる抗体の組み合わせを選択する。
【００２２】
なお、抗PSAモノクローナル抗体の遊離型PSAに対する解離定数（fKd）とα1‐アンチキモトリプシンとの複合体であるPSA‐ACTに対する解離定数（cKd）の比（fKd/cKd）は、０.１より大きい方が好ましく、０.２より大きい方がより好ましい。また、fKd/cKdの上限は、２.０以下が好ましく、１.５以下がより好ましい。さらに遊離型PSAに対する解離定数（fKd値）が１０nM以下が好ましく、６nM以下がより好ましい。
モノクローナル抗体は、パパイン等で部分分解して得られるFabフラグメント、ペプシン等で部分分解して得られるF(ab’)2及び／又はF(ab’)2を還元処理して得られるFab’等を含んでいてもよい。
【００２３】
（不溶性担体）
本発明で使用する抗体を感作する不溶性担体は、特に限定されないが、合成高分子からなるラテックス、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体の材質よりなる粒子から選ばれるものが好ましい。前記合成高分子としては、ポリスチレン、スチレン‐スルホン酸共重合体、スチレン‐メタクリル酸共重合体、アクリロニトリル‐ブタジエン‐スチレン共重合体、塩化ビニル‐アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル‐アクリル酸エステル共重合体から選ばれる１種以上であることが好ましい。
【００２４】
なお、これら粒子のうち、ソープフリー乳化重合によって得られるポリスチレンラテックスが、特に好ましい。このポリスチレンラテックスの作製方法としては、例えば国際公開パンフレットWO2003/005031に記載された方法などを用いることができる。すなわち、溶媒としての水が仕込まれた反応容器内に所定量のスチレンモノマー、過硫酸カリウムなどに代表される重合開始剤、スチレンスルホン酸ナトリウムなどに代表される重合安定剤を入れ、必要に応じてラウリル硫酸ナトリウムなどの乳化剤を加えて、窒素雰囲気下で、攪拌しながら加熱して重合する方法などである。
【００２５】
（不溶性担体の粒径）
この不溶性担体の粒径としては、平均粒子径が０.２０μmを超えて０.４０μm以下、好ましくは、０.２２μmを超えて０.４０μm以下、より好ましくは０.２３μm以上０.４０μm以下、更に好ましくは０.２３μm以上０.３４μm以下のものである。平均粒子径が０.２０μm以下の場合、及び平均粒子径が０.４０μmを超える場合は、等モル反応性が得られ難くなるため好ましくない。なお、本明細書において不溶性担体の平均粒子径（μm）は、後記する実施例に記載の透過型電子顕微鏡を用いた画像解析により得た平均粒子径の小数点3桁目を四捨五入した数値をいう（画像解析では小数点４桁目まで算出可能である）。
【００２６】
また、平均粒子径が０.２０μmを超えて０.４０μm以下である本発明の平均粒子径の範囲内においては、例えばロットが異なる２種類の粒子を使用する場合などにおいて、２種類の粒子の平均粒子径が以下の関係にあるときは同一の平均粒子径であるとみなす。
「一方の粒子（粒子A）の平均粒子径±SDをM±N、他方の粒子（粒子B）の平均粒子径±SDをP±Qとし、M＞PおよびN及びQがそれぞれ０.０２μm以下である２種類の粒子において、M−N≦P＋Qである。」
例えば、粒子A：０.２２±０.０２、粒子B：０.２１±０.０２の場合、M−Nは０.２０、P＋Qは０.２３であり、前記の関係を満たすので、粒子Aと粒子Bは同一の平均粒子径と見なすことができる。
また例えば、粒子A：０.４０±０.０２、粒子B：０.３７±０.０２の場合、M−Nは０.３８、P＋Qは０.３９であり、前記の関係を満たすので、粒子Aと粒子Bは同一の平均粒子径と見なすことができる。
なお、上記のような同一の平均粒子径と見なすことのできる粒子を適当な比率で混和して得られる粒子は本発明に含まれる。
本発明では、同一の平均粒子径の担体を用いるものであるが、材質の異なる２種類以上の担体の使用を排除するものではない。また、主反応を上記平均粒子径の担体を用いて等モル反応性を得ている限り、異なる平均粒子径の担体の使用を排除するものではない。
【００２７】
（抗体の感作方法）
不溶性担体に抗体を感作する方法は一般的に使用されている物理的吸着法が採用できるが、化学結合法や免疫的結合等も採用できる。また通常は、後述の実施例の如く、互いにエピトープを異にする２種のモノクローナル抗体を、それぞれ別々に感作した担体を適当な比で混和して使用するが、各モノクローナル抗体を適当な比で混和した後に同一担体上に感作するような態様を排除するものではない。
【００２８】
（凝集促進剤）
凝集促進剤としては、抗原抗体反応による、抗体を感作した不溶性担体の凝集を促進させる作用を有するものであればよく、公知のものが使用でき、ポリエチレングリコール、多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリ塩化ビニル、ポリ‐γ‐グルタミン酸塩、及びポリ（２‐メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（以下、「MPCポリマー」ということがある）等が挙げられる。なお、多糖類としては、デキストラン、プルラン、メチルセルロース、エチルセルロース等のアルキル化多糖類から選ばれる１種以上であることが好ましい。また、ポリ‐γ‐グルタミン酸塩の塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウムなどのアルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、バリウムなどのアルカリ土類金属、およびアンモニウム塩が例示される。
これらのうち、ポリエチレングリコール及びポリビニルピロリドンが好ましく、さらに好ましくはポリエチレングリコールである。なお、複数の凝集促進剤を組み合わせて使用することもできる。
【００２９】
上記の凝集促進剤として例示した物には、分子量の異なるものが市販されており、水溶性等を考慮して、適宜選択すればよい。ポリエチレングリコールでは、例えば数平均分子量が３,０００〜１,０００,０００のものが好ましく、さらに好ましくは５,０００〜１００,０００、特に好ましくは５,０００〜５０,０００のものである。この３,０００〜１,０００,０００の範囲のものであれば、測定感度が良好となる。また、ポリビニルピロリドンでは例えば重量平均分子量２５,０００〜１,２００,０００、好ましくは４０,０００〜３６０,０００のものが利用でき、ポリ‐γ‐グルタミン酸塩では例えば重量平均分子量２００,０００〜６,０００,０００のものが利用できる。MPCポリマーでは例えば分子量５,０００〜５,０００,０００の範囲のものが利用でき、５００,０００〜２,０００,０００のものが好ましい。
【００３０】
凝集促進剤の濃度は、使用する担体の平均粒子径や用いる凝集促進剤の種類を考慮して、等モル反応性が得られる濃度になるように、適宜設定することが好ましい。例えば、試料と接触させる際に、終濃度で０.１〜５重量％となるようにすることが好ましく、さらに好ましくは０.２〜２重量％、特に好ましくは０.２〜０.６重量％である。この０.１〜５重量％の範囲であれば、測定感度が良好となる。
【００３１】
（その他の添加剤）
上記抗PSAモノクローナル抗体とPSAとが反応することを妨げない範囲で、糖類（グルコース、シュークロース等）、無機塩（塩化ナトリウム等）、界面活性剤（モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン等）、防腐剤（アジ化ナトリウム等）及び／又は非特異反応防止剤等（正常動物由来のIgG抗体等）を試薬に含有させてもよい。
その場合、試薬中の糖類の含有量は０.１〜１０重量％程度、無機塩の含有量は０.０１〜５重量％程度、界面活性剤の含有量は０.０２〜５重量％程度、防腐剤の含有量は０.００１〜０.１重量％程度、非特異反応防止剤の含有量は０.００１〜５重量％程度が好ましい。
【００３２】
（緩衝液）
本発明における抗原抗体反応は緩衝液中で行われる。緩衝液の種類、濃度、およびｐＨは、該抗原抗体反応が起こる条件であれば特に限定されない。例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッドの緩衝液等を用いることができる。緩衝剤の濃度は、３mM〜５００mM程度で用いられ、好ましくは５mM〜１００mM、更に好ましくは５mM〜５０mMである。また、緩衝液のｐＨは、中性域から塩基性域が好ましく、通常６.５〜９.５の範囲で用いられる。
【００３３】
（凝集シグナルの測定方法）
凝集シグナルの測定は、凝集反応測定に用いられる通常の測定方法であればいずれでもよく、吸光度、粒子数、粒子サイズ測定、散乱光測定などがあげられる。
例えば、PSAの測定は、次の様に行われる。
fPSA及びPSA‐ACTの両方に反応する少なくとも２種類の抗体をラテックス等の担体に感作し、fPSA及び／又はPSA‐ACTを含む試料と反応させると凝集する。従って、その凝集の程度を測定し、PSA濃度既知の標準液を用いた場合の凝集の程度と比較することで、試料中の総PSA濃度を定量することができる。例えば、汎用の生化学自動分析装置を用いて、凝集の程度を吸光度の変化量として検出する方法が好ましく、この場合、通常５００〜９００nmの波長における吸光度変化量を定量に用いるのが好ましい。
【００３４】
（等モル反応性）
本発明の測定方法を用いれば、fPSA及びPSA‐ACTに対して等モル反応性が得られるため、高い精度でPSAを定量できる。
なお、fPSA及びPSA‐ACTの等モル反応とは、試料としてfPSAのみを含む試料を測定した際のシグナルと、同モルのPSA‐ACTのみを含む試料を測定した際のシグナルが、ほぼ１：１である反応を意味する。
具体的には、例えば、fPSA及びPSA‐ACTの両抗原が示す等モル当たりの凝集シグナルの比（PSA‐ACT／fPSA比、以下単にc/f比ということがある）を求め、該c/f比が８５〜１１５％、最も好ましくは９０〜１１０％のときに等モル反応しているとみなされる。
【００３５】
（試薬の製造方法）
本発明のPSA測定試薬の製造は、以下のようにして行う。
PSA‐ACT及びfPSAの両抗原に反応し、認識部位の異なる２種類の抗体を感作した担体を用意し、あらかじめ２種類の抗体をそれぞれ感作した同一の平均粒子径の担体（平均粒子径が０.２０μmを超えて０.４０μm以下）の混合比率を所定の範囲に設定し、凝集促進剤の濃度を両抗原と抗体が等モル反応性を示すように調整することにより製造することができる。なお、前記混合比率は１：１０〜１０：１、好ましくは１：５〜５：１、更に好ましくは１：２〜２：１である。
以下実施例によって本発明を説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【実施例】
【００３６】
（モノクローナル抗体の作製）
１．免疫
（１）免疫原
免疫原としてヒト精液由来精製PSA（SCIPAC社製、CodeNo.P117-7、精製度９６％）を用いた。精製PSAは、２０mM PBS（ｐＨ７.２）で透析後に使用した。
（２）免疫方法
上記PSA溶液とCFA（完全フロイントアジュバント：GIBCO社製）とを１対１で混和乳化し、６週齢の雌Balb/Cマウスの背部皮下に２５μgPSA／匹となるように投与した。２週間間隔で追加免疫を３回行い、更に細胞融合の３日前にPSA溶液（２５μgPSA/匹）をマウスの腹腔内に投与した。【００３７】
２．細胞融合
上記のPSAを免疫した後のマウスの脾臓を摘出し、脾臓細胞を取り出した。この脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞SP2/O‐Ag14とを６対１の割合で混合し、５０％ポリエチレングリコール1540（和光純薬工業社製）存在下にて細胞融合させた。融合細胞は脾臓細胞として２.５×１０６個となるようにHAT培地に懸濁し、９６穴培養プレート（CORNING社製）に０.２mLずつ分注した。これを５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて２週間培養した。【００３８】
３．スクリーニング
融合細胞を分注した培養プレートの各ウェルの培養上清を用い、次に示すELISA法にてfPSA及びPSA‐ACTの両者と反応するウェルを選択した。
（１）材料：抗原
１）PSA：SCIPAC、Code No. P117‐7
２）PSA‐ACT：SCIPAC、Code No. P192‐3【００３９】
（２）方法
１）ヤギ抗マウスIgG（Fc）抗体（Jackson社製）５μg/mLをELISA用プレート（Nunc）にコートし（５０μL/well）、４℃で一夜静置した。
２）洗浄液（０.０５％Tween20‐PBS）で３回洗浄後（４００μL/well）、ブロッキング液（０.０５％Tween20‐PBS）を各ウェルに２００μLとなるように分注し、室温で１時間静置した。
３）ブロッキング液を除去した後、融合細胞を分注したプレートの各ウェルの培養上清をELISA用プレートの各ウェルに５０μLずつ分注し、室温で１時間静置した。
４）洗浄液（０.０５％Tween20‐PBS）で３回洗浄後、０.０５％Tween20‐PBSで５ng/mLに希釈したfPSAまたはPSA‐ACTを、各ウェルに５０μLずつ分注し、室温で１時間静置した。【００４０】
５）洗浄液で３回洗浄後、HRP‐ウサギ抗ヒトPSA抗体（ｘ５００）を各ウェルに５０μLずつ分注し、室温で１時間静置した。なお、HRP‐ウサギ抗ヒトPSA抗体は、ウサギ抗ヒトPSA抗体（DAKO社）及びペルオキシダーゼ（東洋紡社製）を用い、過ヨウ素酸法にて作製した。
６）３回洗浄後、OPD発色液を各ウェルに５０μLずつ分注し、室温で１０分間静置した。
７）停止液（１.５N硫酸）を各ウェルに５０μLずつ分注し、反応を停止した後、プレートリーダーを用い波長４９２nmで吸光度を測定した。【００４１】
４．クローニング
上記スクリーニングにより、fPSAとPSA‐ACTの両者に反応したウェルの細胞株を限界希釈法によりクローン化を行い、ハイブリドーマを樹立した。この結果、樹立したハイブリドーマは２８種類得られた。【００４２】
５．モノクローナル抗体の調製
予め２週間前にプリスタン０.５mLを腹腔内に注射しておいた８週齢の雌Balb/Cマウスに、前記クローニングにより得られた各ハイブリドーマを細胞数０.５×１０６個の量で腹腔内に投与した。２週間後腹水を採取し、プロテインＡカラム（アマシャム社製）にてIgG画分を精製した。この結果２８種類の各モノクローナル抗体の精製画分が得られた。【００４３】
（モノクローナル抗体の組合せの予備検討）
上記で得られた２８種類のモノクローナル抗体について、各抗体をラテックスに感作してラテックス凝集の検討を以下の通り行った。シグナルが大きい２種類の抗体、＃９１抗体、＃５１抗体、及びそれらのラテックスとの組合せを得た。【００４４】
１．抗体の選択
（１）２０mM Tris‐HCl（pH８.５）で希釈した１％の０.３μmラテックス溶液と２８種のモノクローナル抗体溶液（０.５Abs）を１容：１容で混合し、４℃で２hr攪拌した。
（２）０.４％BSAを含む２０mM Tris‐HCl（pH８.５）を２容添加し、４℃で１hr攪拌した。
（３）遠心分離にて上清を除去し、５mM MOPS（pH７.０）で懸濁し、波長６００nmで２Absに調整した。
（４）２８種類から選ばれた２種類のMoAb‐Lx（抗体感作ラテックス）を１容：１容で混合し試薬２とする（全組合せについて同様に調製し検討した）。【００４５】
（５）試薬１（０.１％ BSA、０.５M NaCl、および０.３％ ポリビニルピロリドン K‐90（PVP K-90）を含む３０mM HEPES緩衝液（ｐＨ７.０））と前記試薬２を用い、２６ng/mLのfPSA及びPSA‐ACTを日立7170形自動分析装置で測定した。
（６）凝集するモノクローナル抗体の組合せより、エピトープが異なると考えられる２つの抗体グループが得られた。
ｉ）＃６３２１７、＃６３２５１、＃６３２７９
ｉｉ）＃６３２１４、＃６３２９１【００４６】
上記グループｉ）とグループｉｉ）の抗体の組合せで、凝集が可能であった。
上記抗体のうち、識別番号＃６３２５１、＃６３２７９、＃６３２９１のそれぞれの抗体を産生するハイブリドーマ３株は、受託番号FERM BP‐11453、同FERM BP‐11454、FERM BP‐11455として、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。なお、これらのハイブリドーマより得られるモノクローナル抗体を、それぞれ＃５１抗体、＃７９抗体、および＃９１抗体と識別番号の末尾２ケタで記すことがある。【００４７】
（粒径の異なるラテックスの製造）
１）０.２μm以下
攪拌機、還流用冷却器、温度計、窒素導入管及び加熱用油浴などを設けたガラス製反応容器（２L）に、水１２００g、スチレンモノマー２００g、過硫酸カリウム１.２g、スチレンスルホン酸ナトリウム０.２gを添加し、約２００rpmで攪拌しながら反応容器内を十分に窒素置換した。その後、７０℃に昇温し、約１８時間重合した後、反応溶液をろ紙（ADVANTEC No.2）にてろ過し、ラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の平均粒子径は、透過型電子顕微鏡を用いてラテックス粒子を撮影し、無作為に選んだ３視野について、それぞれ１００個以上の粒子を画像解析することにより、視野毎の「平均粒子径（±SD）」を求め、それらの値を更に平均することで、最終的な「平均粒子径（±SD）」を算出した。その結果、平均粒子径は、０.１９μm（±０.０１μm）であった。【００４８】
２−１）０.２３μm
水１２００g、スチレンモノマー２００g、過硫酸カリウム２.４g、スチレンスルホン酸ナトリウム０.１gに変更した以外は上記１）と同様の操作を行い、ラテックス粒子を得た。その結果、平均粒子径は、０.２３μm（±０.０１μm）であった。【００４９】
２−２）０.２５μm
水１２００g、スチレンモノマー２００g、過硫酸カリウム０.９g、スチレンスルホン酸ナトリウム０.２gに変更した以外は上記１）と同様の操作を行い、ラテックス粒子を得た。その結果、平均粒子径は、０.２５μm（±０.０１μm）であった。【００５０】
２−３）０.２９μm
水１２００g、スチレンモノマー２００g、過硫酸カリウム１.３g、スチレンスルホン酸ナトリウム０.１gに変更した以外は上記１）と同様の操作を行い、ラテックス粒子を得た。その結果、平均粒子径は、０.２９μm（±０.０１μm）であった。【００５１】
２−４）０.３４μm
水１２００g、スチレンモノマー２００g、過硫酸カリウム１.３g、スチレンスルホン酸ナトリウム０.０８gに変更した以外は上記１）と同様の操作を行い、ラテックス粒子を得た。その結果、平均粒子径は、０.３４μm（±０.０１μm）であった。【００５２】
２−５）０.４０μm
水１２００g、スチレンモノマー２００g、過硫酸カリウム１.３g、スチレンスルホン酸ナトリウム０.０３gに変更した以外は上記１）と同様の操作を行い、ラテックス粒子を得た。その結果、平均粒子径は、０.４０μm（±０.０１μm）であった。【００５３】
３）０.４μmを越える
水１２００g、スチレンモノマー２００g、過硫酸カリウム１.２g、スチレンスルホン酸ナトリウム０.０１gに変更した以外は上記１）と同様の操作を行い、ラテックス粒子を得た。その結果、平均粒子径は、０.４２μm（±０.０１μm）であった。【００５４】
（抗体感作ラテックスの調製）
前記で得られた２種類のモノクローナル抗体（＃９１、＃５１）を次に示す材料、方法により担体に感作させた。
１．材料
（１）抗PSAモノクローナル抗体
＃６３２９１（＃９１）
＃６３２５１（＃５１）
（上記モノクローナル抗体は全てPBS溶液である）
（２）ラテックス
上記方法で得られた平均粒子径０.１９〜４２μmのポリスチレンラテックス【００５５】
２．抗体感作ラテックス液の調製
（１）＃９１抗体‐ラテックス複合体（＃９１Lx）含有液の調製方法
１）ラテックス、＃９１抗体をそれぞれ２０mMグリシン緩衝液（ｐＨ９）で希釈し、１％ラテックス液、０.４mg/mLの＃９１抗体液を調製した。これらを１：１（１容＋１容）で混合し、約１時間攪拌した。
２）上記混合液２容に、ブロッキング液（１０％BSA）を０.１容添加し、約１時間攪拌した。
３）遠心分離にて上清を除去し、５mM MOPS緩衝液（ｐＨ７.０）溶液で懸濁し、３Abs/mL（６００nm）となるように希釈して＃９１抗体感作ラテックス（＃９１Lx）液を得た。【００５６】
（２）＃５１抗体‐ラテックス複合体（＃５１Lx）含有液の調製方法
１）ラテックス、抗体をそれぞれ２０mMトリス緩衝液（ｐＨ８）で希釈し、１％ラテックス液、０.４mg/mLの＃５１抗体液を調製した。これらを１：１（１容＋１容）で混合し、約１時間攪拌した。
２）上記混合液２容に、ブロッキング液（１０％BSA）を０.１容添加し、約１時間攪拌した。
３）遠心分離にて上清を除去し、５mM MOPS緩衝液（ｐＨ７.０）溶液で懸濁し、波長６００nmにおける吸光度が３Abs/mLとなるように希釈して＃５１抗体感作ラテックス（＃５１Lx）液を得た。【００５７】
〔試験例１〕
（ラテックスの平均粒子径変動時のc/f比の確認）
同濃度（５ng/mL）のfPSAとPSA‐ACTを測定試料とし、下記のPSA測定試薬、下記の測定条件、測定試料を用いて、fPSAとPSA‐ACTに対する反応性を確認した。fPSA及びPSA‐ACTの両抗原に対する反応性の比PSA‐ACT／fPSA（c/f比）を求め、この結果を表１に示した。【００５８】
（１）PSA測定試薬
第一試薬（緩衝液）
０.５M KCl、
０.１％ BSA（プロリアント）、
０.３％ PVP K-90、
を含む３０mM HEPES 緩衝液（ｐＨ７.０）【００５９】
第二試薬（抗体感作ラテックス液）
抗PSAマウスモノクローナル抗体感作ラテックス粒子（２種類の抗体感作ラテックス粒子の混合比、＃９１Lx含有液：＃５１Lx含有液＝１：１）を含む５mM MOPS 緩衝液（ｐＨ７.０）。
なお、本検討では、いずれも同一の平均粒子径（０.１９〜０.４２μm）のラテックス粒子に＃９１抗体及び＃５１抗体をそれぞれ感作した抗体含有液の組合せを使用した。【００６０】
（２）測定条件
測定装置：日立7170形自動分析装置（H‐7170）
測定パラメータ：
分析法；２ポイントエンド（測定ポイント１９‐３４）
液量（μＬ）；１４.４／９０／９０
測定波長（ｎｍ）；５７０（主）／８００（副）
キャリブレーション；スプライン
なお、キャリブレーションには、ナノピア(登録商標)PSA  PSAキャリブレーター（PSA濃度：０、４.２、１０、及び２９ng/mL、積水メディカル株式会社製を用いた。）【００６１】
（３）測定試料
fPSA、PSA−ACT（ともにFitzgerald社製）を、１％BSA及び０.１％NaN３を含むPBS（ｐＨ７.４）に溶解して試料とした。【００６２】
【表１】
2012133482.tif 000002
【００６３】
表１に示した結果によれば、平均粒子径が０.２０μmを超えて０.４０μm以下の範囲では、c/f比が８５％以上と１００％に近い値を示し、等モル反応性が得られることが判る。
平均粒子径が０.２０μm以下の場合、及び平均粒子径が０.４０μmを超える場合は、c/f比が８０％を下回り、等モル反応性が得られなかった。【００６４】
〔試験例２〕
（凝集促進剤の添加によるc/f比の調整）
同濃度（３５ng/mL）のfPSAとPSA‐ACTを測定試料とし、下記のPSA測定試薬を用いて、試験例１と同じ測定条件で、fPSAとPSA‐ACTに対する反応性を確認し、両抗原に対する反応性の比PSA−ACT／fPSA（c/f比）を求めた。これらの結果を表２〜４に示した。【００６５】
（１）PSA測定試薬
第一試薬（緩衝液）
０.５M KCl、
０.１％ BSA（プロリアント）、
０〜０.８％凝集促進剤〔表２〜４中に示した、PEG（ポリエチレングリコール、数値は数平均分子量）、PVP（ポリビニルピロリドン；PVP K-30の分子量は４万、PVP K-90の分子量は３６万、何れも和光純薬工業社製）、MPCポリマー（分子量100万）、プルランPI-20（分子量約２０万、林原商事社製）、及びPGA‐Na（ポリ‐γ‐グルタミン酸ナトリウム、数値は数平均分子量）、を用いた〕、を含む３０mM HEPES緩衝液（ｐＨ７.０）
（凝集促進剤無添加の場合を比較例とした）【００６６】
第二試薬（抗体感作ラテックス液）
抗PSAマウスモノクローナル抗体感作ラテックス粒子（２種類の抗体感作ラテックス粒子の混合比、＃９１Lx含有液：＃５１Lx含有液＝１：１）を含む５mM MOPS 緩衝液（ｐＨ７.０）なお、本検討では、いずれも同一の平均粒子径０.２９μmのラテックスに感作した抗体含有液を使用した。【００６７】
【表２】
2012133482.tif 000003
【００６８】
【表３】
2012133482.tif 000004
【００６９】
【表４】
2012133482.tif 000005
【００７０】
表２〜表４に示した結果によれば、凝集促進剤の添加、及び該添加量の増加に伴って、c/f比は約８２％から１００％へと近づき、凝集促進剤の添加量を適宜調整することにより、１段階反応で、c/f比が８５％以上と等モル反応性が得られる（c/f比が１００％付近に改善する効果がある）ことが明らかとなった。なお、「１段階反応」とは、２種の抗PSAモノクローナル抗体を１度に添加して反応させることを意味するものである。【００７１】
〔試験例３〕
（異なる抗体の組合せでの反応性確認）
モノクローナル抗体＃５１と＃９１の組合せに代えて、＃７９と＃９１、＃１４と＃５１、＃９１と＃１７、＃１４と＃１７の各組合せを用い、凝集促進剤として０.６％MPCポリマーを用いた下記測定試薬を用いてc/f比を求めた。なお、それ以外は試験例１と同様とした。同濃度（各３５ng/mL）のfPSA、PSA‐ACTをサンプルとした。【００７２】
（１）PSA測定試薬
第一試薬（緩衝液）
０.５M KCl、
０.１％ BSA（プロリアント）、
０.６％ MPCポリマー、
を含む３０mM HEPES 緩衝液（ｐＨ７.０）
これらの結果を表５に示した。【００７３】
【表５】
2012133482.tif 000006
【００７４】
この結果から、c/f比は８９.０％〜１０１.９％と何れの組合せを用いた場合も、等モル反応性が得られることが確認された。【００７５】
（検討に使用したモノクローナル抗体のKd値）
前記検討に使用したモノクローナル抗体のfPSA及びPSA‐ACTに対するKd値は、表６に示した通りである。表６より、抗PSAモノクローナル抗体の遊離型PSAに対する解離定数（fKd）と、遊離型PSAとα1‐アンチキモトリプシンとの複合体であるPSA‐ACTに対する解離定数（cKd）の比（fKd/cKd）が、０.１より大きく２.０以下、かつ遊離型PSAに対する解離定数（fKd値）が１０nM以下であることが好ましいことが判った。【００７６】
【表６】
2012133482.tif 000007
【００７７】
なお、前記試験例3‐3の＃９１抗体に代えて、＃１６抗体（fKd＝１.３３nM、cKd＝２３.１８nM、fKd/cKd＝０.０５７）を用いた場合には、c/f比（％）=５２.４となり、等モル反応性は得られなかった。【００７８】
なお、前記表６のKd値は、以下の実験条件により求めた。
１．Biacore（登録商標）機器及び専用試薬類一式（Biacore社製：現GE Healthcare社製、次の（i）〜（viii）はBiacore社製当時の製品及びカタログＮｏ．であるが、現在はGE Healthcare社より入手可能である。）
（i）Biacore（登録商標） T100：Biacore社製JJ‐1037‐02
（ii）Series S Sensor Chip CM5：Biacore社製BR‐1005‐30
（iii）Amine Coupling Kit：Biacore社製BR‐1000‐50
（iv）Acetate 5.0：Biacore社製BR‐1003‐51
（v）α‐Mouse Immunoglobulins：Biacore社製BR‐1005‐14
（vi）Glycine 1.5：Biacore社製BR‐1003‐54
（vii）Glycine 2.0：Biacore社製BR‐1003‐55
（viii）HBS−EP＋ １０×（ランニングバッファー）：Biacore社製BR−1006−69（使用時、NaOHでpH8.5に調製後、精製水にて１０倍希釈して用いる。）【００７９】
２．試験方法
（i）α-Mouse Immunogloblinsを固定化したセンサーチップCM5をBiacore機器にセットする。
（ii）ランニングバッファ(HBS-EP)に抗PSA抗体をそれぞれ1.0μg/mLとなるよう希釈し、流速30μL/minで60秒添加
（iii）ランニングバッファ(HBS-EP)にPSA抗原(fPSAまたはPSA-ACT)を5.0μg/mLとなるよう希釈し、流速30μL/minで120秒添加
（iv）ランニングバッファ(HBS-EP)でフリーランニングし、解離120秒(流速30μL/min)
（v）再生液(Glycine 1.5とGlycine 2.0を1:1で混合し、Glycine 1.75を調製)でセンサーチップを再生
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明の測定方法及びその試薬は、汎用の自動分析装置を用いて、簡便かつ高精度で、PSAを測定できるので、前立腺疾患、特には、前立腺癌の早期発見に有用である。
【受託番号】
【００８１】
〔寄託生物材料への言及〕
（１）FERM BP‐11453（＃51抗体産生ハイブリドーマ＃63251）
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２２年２月１９日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
FERM BP‐11453【００８２】
（２）FERM BP‐11454（＃79抗体産生ハイブリドーマ＃63279）
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２２年２月１９日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
FERM BP‐11454【００８３】
（３）FERM BP‐11455（＃91抗体産生ハイブリドーマ＃63291）
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２２年２月１９日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
FERM BP‐11455
【国際調査報告】
2012133482.tif 000008
2012133482.tif 000009
2012133482.tif 000010
2012133482.tif 000011