(57)【要約】  本発明の目的は、特には、ES細胞からのインスリン産生細胞への分化誘導を促進する低分子化合物を提供することである。本発明の目的はまた、そのような化合物を用いたES細胞からのインスリン産生細胞の分化誘導方法およびインスリン産生細胞の分化誘導促進剤を提供することである。本発明の目的はまた、そのようにして誘導されたインスリン産生細胞を提供することである。  ドーパミン代謝阻害剤またはセロトニン代謝阻害剤、あるいはアセチルコチンあるいはアセチルコリン分解酵素阻害剤または受容体活性化剤からなる群より選ばれる化合物を含む、哺乳類動物由来の幹細胞からインスリン産生細胞を分化誘導する分化誘導促進剤、ならびに該分化誘導促進剤用いた分化誘導方法が提供される。
2012150707.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドーパミン代謝阻害剤およびセロトニン代謝阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物を含む、哺乳類動物由来の幹細胞からインスリン産生細胞を分化誘導する分化誘導促進剤。
【請求項２】
前記化合物が、小胞モノアミントランスポーター（VMAT２）阻害剤、ドーパミンまたはセロトニンの合成阻害剤、ドーパミンD2受容体阻害剤、ドーパミンまたはセロトニンのアゴニスト、モノアミンオキシダーゼ阻害剤、MAO-A阻害剤、抗ヒスタミン、Ｈ１アンタゴニスト、ヒスタミンＨ２レセプター阻害剤、ヒスタミンＨ２レセプターアゴニスト、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、ドーパミンアンタゴニスト、および５−ＨＴ３受容体アンタゴニストからなる群より選ばれる少なくともひとつの化合物である、請求項１に記載の分化誘導促進剤。
【請求項３】
前記化合物が、小胞モノアミントランスポーター（VMAT２）阻害剤である、請求項２に記載の分化誘導促進剤。
【請求項４】
前記化合物が、レセルピン、テトラベナジン、カルビドパ、α−メチルチロシン、５ＨＴＰ、ブロモクリプチン、キナクリン二塩酸塩二水和物、ピルリンドールメシル酸塩、塩酸パルギリン、フェキソフェナジン塩酸塩、ヒドロキシジン二塩酸塩、マレイン酸クロルフェニラミン、シメチジン、ジマプリット二塩酸塩、マレイン酸フルボキサミン、アザペロン、および塩酸オンダンセトロンからなる群より選ばれる、請求項１に記載の分化誘導促進剤。
【請求項５】
前記化合物が、レセルピンまたはテトラベナジンである請求項１に記載の分化誘導促進剤。
【請求項６】
さらに、cAMP、cAMPアナログ、Gαsタンパク質カップル受容体アゴニスト、およびGαiタンパク質カップル受容体アンタゴニストからなる群より選ばれる少なくとも一つを含む、請求項１から５のいずれかひとつに記載の分化誘導促進剤。
【請求項７】
レセルピンまたはテトラベナジンの少なくとも一つ、および、cAMPまたはcAMPアナログの少なくとも一つを含む、請求項５に記載の分化誘導促進剤。
【請求項８】
アセチルコチン、アセチルコリン分解酵素阻害剤、アセチルコリン受容体活性化剤およびコリン作動性アンタゴニストからなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物を含む、哺乳類動物由来の幹細胞からインスリン産生細胞を分化誘導する分化誘導促進剤。
【請求項９】
前記化合物が、アセチルコチン、エセロリンフマル酸塩、塩化パルマチン、およびギンゴライドＡからなる群より選ばれる化合物である、請求項８に記載の分化誘導促進剤。
【請求項１０】
葉酸を含む、哺乳類動物由来の幹細胞からインスリン産生細胞を分化誘導する分化誘導促進剤。
【請求項１１】
前記哺乳類動物由来の幹細胞が、胚性幹細胞（ES細胞）、組織幹細胞または人工多能性幹細胞（iPS細胞）である請求項１から１０のいずれかに記載の分化誘導促進剤。
【請求項１２】
前記哺乳類動物由来の幹細胞が、胚性幹細胞（ES細胞）である請求項１１に記載の分化誘導促進剤。
【請求項１３】
前記哺乳類動物由来の幹細胞が、多能性幹細胞から誘導されたpdx1陽性細胞である請求項１１に記載の分化誘導促進剤。
【請求項１４】
哺乳類動物由来の幹細胞を、ドーパミン代謝阻害剤およびセロトニン代謝阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物を含む培地で培養することを含む、哺乳類動物由来の幹細胞からインスリン産生細胞を分化誘導する方法。
【請求項１５】
前記化合物が、小胞モノアミントランスポーター（VMAT２）阻害剤、ドーパミンまたはセロトニンの合成阻害剤、ドーパミンD2受容体阻害剤、ドーパミンまたはセロトニンのアゴニスト、モノアミンオキシダーゼ阻害剤、MAO-A阻害剤、抗ヒスタミン、Ｈ１アンタゴニスト、ヒスタミンＨ２レセプター阻害剤、ヒスタミンＨ２レセプターアゴニスト、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、ドーパミンアンタゴニスト、および５−ＨＴ３受容体アンタゴニストからなる群より選ばれる少なくともひとつの化合物である、請求項１４に記載の分化誘導方法。
【請求項１６】
前記化合物が、小胞モノアミントランスポーター（VMAT２）阻害剤である、請求項１５に記載の分化誘導方法。
【請求項１７】
前記化合物が、レセルピン、テトラベナジン、カルビドパ、α−メチルチロシン、５ＨＴＰ、ブロモクリプチン、キナクリン二塩酸塩二水和物、ピルリンドールメシル酸塩、塩酸パルギリン、フェキソフェナジン塩酸塩、ヒドロキシジン二塩酸塩、マレイン酸クロルフェニラミン、シメチジン、ジマプリット二塩酸塩、マレイン酸フルボキサミン、アザペロン、および塩酸オンダンセトロンからなる群より選ばれる化合物である、請求項１４に記載の分化誘導方法。
【請求項１８】
前記化合物が、レセルピンまたはテトラベナジンである請求項１４に記載の分化誘導方法。
【請求項１９】
前記培地がさらに、cAMP、cAMPアナログ、Gαsタンパク質カップル受容体アゴニスト、およびGαiタンパク質カップル受容体アンタゴニストからなる群より選ばれる少なくとも一つを含む培地である、請求項１４から１８のいずれかひとつに記載の分化誘導方法。
【請求項２０】
前記培地が、レセルピンまたはテトラベナジンの少なくとも一つ、および、cAMPまたはcAMPアナログの少なくとも一つを含む、請求項１９に記載の分化誘導方法。
【請求項２１】
哺乳類動物由来の幹細胞を、アセチルコチン、アセチルコリン分解酵素阻害剤、アセチルコリン受容体活性化剤、およびコリン作動性アンタゴニストからなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物を含む培地で培養することを含む、哺乳類動物由来の幹細胞からインスリン産生細胞を分化誘導する方法。
【請求項２２】
前記化合物が、アセチルコチン、エセロリンフマル酸塩、塩化パルマチン、カルバコール、ギンゴライドＡからなる群より選ばれる、請求項２１に記載の分化誘導方法。
【請求項２３】
哺乳類動物由来の幹細胞を、葉酸を含む培地で培養することを含む、哺乳類動物由来の幹細胞からインスリン産生細胞を分化誘導する方法。
【請求項２４】
前記哺乳類動物由来の幹細胞が、胚性幹細胞（ES細胞）、組織幹細胞または人工多能性幹細胞（iPS細胞）である請求項１４から２３のいずれかひとつに記載の分化誘導方法。
【請求項２５】
前記哺乳類動物由来の幹細胞がES細胞である請求項２４に記載の分化誘導方法。
【請求項２６】
前記分化誘導方法は、
（１）アクチビンおよびbFGFを含有する培地、
（２）レチノイン酸、FGF-10、B27 SUPPLEMENTおよびShhシグナル伝達アンタゴニストを含有する培地、および
（３）ニコチン酸アミドを含有する培地、の培地条件の中から選択される少なくとも一つの培地条件下において幹細胞を培養する工程を含む請求項１４から２５に記載の分化誘導方法。
【請求項２７】
合成ナノ繊維存在環境下において前記培地条件が選択されることを特徴とする請求項２６に記載の分化誘導方法。
【請求項２８】
請求項１４から２７のいずれか一つに記載の方法により分化誘導されたインスリン産生細胞。
【請求項２９】
請求項１から１３のいずれか一つに記載の分化誘導促進剤を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導を促進する低分子化合物および該化合物を含む幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導促進剤に関する。本発明はまた、該化合物を用いた幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導方法および該方法により誘導されたインスリン産生細胞に関する。本発明は、特には、ES細胞からインスリン産生細胞への分化誘導を促進する化合物および該化合物を含むES細胞からのインスリン産生細胞への分化誘導促進剤、ならびに該化合物を用いたES細胞からのインスリン産生細胞への分化誘導方法および該方法により誘導されたインスリン産生細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵島移植はインスリン依存型糖尿病患者にとって有用な治療法である。膵臓は外分泌腺と内分泌腺から構成されている。体内のホルモンで唯一血糖を下げる作用をもつインスリンは膵島（islet）のβ細胞から分泌される。この膵島を膵臓から単離し、インスリン依存型糖尿病の患者に移植して血糖降下システムの置換再生を目指すのが膵島移植である。【０００３】
糖尿病は大きく二つに分類される。一つは何らかの原因によって膵β細胞が破壊、障害されてインスリンの分泌がなくなるもの、もう一つは血中にインスリンが正常あるいは正常以上に存在するのだがインスリン抵抗性が末梢組織に存在するためインスリンの作用が低下しているものである。前者が１型糖尿病あるいは若年型糖尿病、後者が２型糖尿病と呼ばれる。膵島移植の適応は１型糖尿病である。【０００４】
１型糖尿病は自己免疫の異常によって、インスリンを産生する膵β細胞が特異的に破壊されることで発症する。その根本的治療には、膵β細胞の再生置換療法のひとつである膵島移植が考えられるが、現行の膵島移植には、その供給量が不足しているという大きな問題点がある。一般には、移植の恩恵を得るには数年から十数年を要する。そのため、１型糖尿病患者が日常臨床で提示される治療法の選択肢として移植が挙げられることはない。【０００５】
上記の理由より、膵島あるいは膵β細胞に匹敵する機能をもつ細胞を作製することが望まれてきた。また、近年急速に進歩し注目を集めている幹細胞研究でも膵内分泌細胞への分化誘導の可能性が報告されている（非特許文献１〜３）。そこで、ヒト成熟膵島β細胞にかわる細胞の供給源として、胚性幹細胞（ES細胞）、組織幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）からのインスリン分泌細胞の分化誘導が注目されてきており、これまで多くの報告がなされている。【０００６】
ES細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞である。ES細胞を胚性間葉系細胞と一緒に培養すると、ES細胞は膵および肝系譜に向かうことが示されている。本発明者らは、支持細胞株であるM15細胞上でES細胞を培養することにより高効率で肝臓へ分化誘導できることを報告している（非特許文献４）。本発明者らは、支持細胞を用いる方法により、平面培養によりES細胞から胚性内胚葉性の呼吸器・消化器官への高効率分化誘導技術を確立している（特許文献１および２）。さらに、M15細胞を使用することにより、ES細胞はインビトロにおいて中内胚葉、胚体内胚葉、並びに最終的に領域特異的な胚体内胚葉に由来する器官に経時的に誘導することができる。M15フィーダー細胞は、3種の胚葉（神経外胚葉、中胚葉および胚体内胚葉）に属する、ES細胞由来の系譜特異的な細胞型を発生させるための有用なツールである（非特許文献６）。本発明者らはさらに、M15 細胞を利用した、ES細胞からの膵臓および肝臓への効率的な分化誘導方法を報告している（特許文献３）。しかしながら、上記方法は生きた支持細胞を利用する方法であり、ES細胞の分化誘導に影響を及ぼす低分子化合物をスクリーニングする場合には、支持細胞が関与する影響を排除できず、効率よく目的化合物をスクリーニングするには問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００６／１２６５７４号公報
【特許文献２】ＷＯ２００８／１４９８０７号公報
【特許文献３】特開２０１１−０１０６５３
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】D'Amour, K. A. et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 24, 1392-401 (2006).
【非特許文献２】Kroon, E. et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol 26, 443-52 (2008).
【非特許文献３】Tateishi, K. et al. Generation of insulin-secreting islet-like clusters from human skin fibroblasts. J Biol Chem 283, 31601-7 (2008).
【非特許文献４】Shiraki N, Umeda K, Sakashita N, et al. Differentiation of mouse and human embryonic stem cells into hepatic lineages. Genes Cells. 2008;13:731-746.
【非特許文献５】Shiraki N, Yoshida T, Araki K, et al. Guided differentiation of embryonic stem cells into Pdx1-expressing regional-specific definitive endoderm. Stem Cells. 2008;26:874-885.
【非特許文献６】Shiraki N, Higuchi Y, Harada S, et al. Differentiation and characterization of embryonic stem cells into three germ layers. Biochem Biophys Res Commun. 2009;381:694-699.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、幹細胞からインスリン産生細胞の分化誘導を促進する物質を提供することである。本発明の目的は、特には、ES細胞からのインスリン産生細胞への分化誘導を促進する低分子化合物を提供することである。本発明の目的はまた、そのような化合物を用いたES細胞からのインスリン産生細胞の分化誘導方法およびインスリン産生細胞の分化誘導促進剤を提供することである。本発明の目的はまた、そのようにして誘導されたインスリン産生細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
そこで、本発明者らは、合成ナノ繊維(sNF)マトリックスを使用して、ES細胞を培養することによって、支持細胞を使用することなく、内胚葉系、中胚葉系および外胚葉系へと分化誘導できることを見いだした。即ち、合成ナノ繊維マトリックス上で成長させたES細胞は、内胚葉に誘導され、膵臓へと誘導することができることを見いだした。この方法における誘導効率は十分に高いので、低分子化合物のハイスループットスクリーニングにおいてPdx1/GFP ES細胞株またはIns1/GFP ES細胞株を使用することにより、インスリン発現細胞の割合を増加させる候補化合物を得ることができる。これらの内容は、既に特願２０１０−２４８６６５号として特許出願している。この出願は、引用することにより、そのすべての開示内容は本明細書の一部である。本発明は、この方法を用いることにより、インスリン産生細胞への分化誘導を促進する低分子化合物を見いだし、完成した。【００１１】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）ドーパミン代謝阻害剤およびセロトニン代謝阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物を含む、哺乳類動物由来の幹細胞からインスリン産生細胞を分化誘導する分化誘導促進剤。
（２）前記化合物が、小胞モノアミントランスポーター（VMAT２）阻害剤、ドーパミンまたはセロトニンの合成阻害剤、ドーパミンD2受容体阻害剤、ドーパミンまたはセロトニンのアゴニスト、モノアミンオキシダーゼ阻害剤、MAO-A阻害剤、抗ヒスタミン、Ｈ１アンタゴニスト、ヒスタミンＨ２レセプター阻害剤、ヒスタミンＨ２レセプターアゴニスト、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、ドーパミンアンタゴニスト、および５−ＨＴ３受容体アンタゴニストからなる群より選ばれる少なくともひとつの化合物である、上記（１）に記載の分化誘導促進剤。
（３）前記化合物が、小胞モノアミントランスポーター（VMAT２）阻害剤である、上記（２）に記載の分化誘導促進剤。
（４）前記化合物が、レセルピン、テトラベナジン、カルビドパ、α−メチルチロシン、５HTP、ブロモクリプチン、キナクリン二塩酸塩二水和物、ピルリンドールメシル酸塩、塩酸パルギリン、フェキソフェナジン塩酸塩、ヒドロキシジン二塩酸塩、マレイン酸クロルフェニラミン、シメチジン、ジマプリット二塩酸塩、マレイン酸フルボキサミン、アザペロン、および塩酸オンダンセトロンからなる群より選ばれる化合物である、上記（１）に記載の分化誘導促進剤。
（５）前記化合物が、レセルピンまたはテトラベナジンである上記（１）に記載の分化誘導促進剤。
（６）さらに、cAMP、cAMPアナログ、Gαsタンパク質カップル受容体アゴニスト、およびGαiタンパク質カップル受容体アンタゴニストからなる群より選ばれる少なくとも一つを含む、上記（１）から（５）のいずれかひとつに記載の分化誘導促進剤。
（７）レセルピンまたはテトラベナジンの少なくとも一つ、およびcAMPまたはcAMPアナログの少なくとも一つを含む、上記（６）に記載の分化誘導促進剤。
（８）アセチルコチン、アセチルコリン分解酵素阻害剤、アセチルコリン受容体活性化剤、およびコリン作動性アンタゴニストからなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物を含む、哺乳類動物由来の幹細胞からインスリン産生細胞を分化誘導する分化誘導促進剤。
（９）前記化合物が、アセチルコチン、エセロリンフマル酸塩、塩化パルマチン、カルバコール、およびギンゴライドＡからなる群より選ばれる化合物である、上記（８）に記載の分化誘導促進剤。
（１０）葉酸を含む、哺乳類動物由来の幹細胞からインスリン産生細胞を分化誘導する分化誘導促進剤。
（１１）前記哺乳類動物由来の幹細胞が、胚性幹細胞（ES細胞）、組織幹細胞または人工多能性幹細胞（iPS細胞）である上記（１）から（１０）のいずれかひとつに記載の分化誘導促進剤。
（１２）前記哺乳類動物由来の幹細胞が、胚性幹細胞（ES細胞）である上記（１１）に記載の分化誘導促進剤。
（１３）前記哺乳類動物由来の幹細胞が、多能性幹細胞から誘導されたpdx1陽性細胞である請求項１１に記載の分化誘導促進剤。【００１２】
（１４）哺乳類動物由来の幹細胞を、ドーパミン代謝阻害剤およびセロトニン代謝阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物を含む培地で培養または処理することを含む、哺乳類動物由来の幹細胞からインスリン産生細胞を分化誘導する方法。
（１５）前記化合物が、小胞モノアミントランスポーター（VMAT２）阻害剤、ドーパミンまたはセロトニンの合成阻害剤、ドーパミンD2受容体阻害剤、ドーパミンまたはセロトニンのアゴニスト、モノアミンオキシダーゼ阻害剤、MAO-A阻害剤、抗ヒスタミン、Ｈ１アンタゴニスト、ヒスタミンＨ２レセプター阻害剤、ヒスタミンＨ２レセプターアゴニスト、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、ドーパミンアンタゴニスト、および５−ＨＴ３受容体アンタゴニストからなる群より選ばれる少なくともひとつの化合物である、上記（１４）に記載の分化誘導方法。
（１６）前記化合物が、小胞モノアミントランスポーター（VMAT２）阻害剤である、上記（１５）に記載の分化誘導方法。
（１７）前記化合物が、レセルピン、テトラベナジン、カルビドパ、α−メチルチロシン、５ＨＴＰ、ブロモクリプチン、キナクリン二塩酸塩二水和物、ピルリンドールメシル酸塩、塩酸パルギリン、フェキソフェナジン塩酸塩、ヒドロキシジン二塩酸塩、マレイン酸クロルフェニラミン、シメチジン、ジマプリット二塩酸塩、マレイン酸フルボキサミン、アザペロン、および塩酸オンダンセトロンからなる群より選ばれる化合物である、上記（１４）に記載の分化誘導方法。
（１８）前記化合物が、レセルピンまたはテトラベナジンである、上記（１４）に記載の分化誘導方法。
（１９）前記培地がさらに、cAMP、cAMPアナログ、Gαsタンパク質カップル受容体アゴニスト、およびGαiタンパク質カップル受容体アンタゴニストからなる群より選ばれる少なくとも一つを含む培地である、上記（１４）から（１８）のいずれかひとつに記載の分化誘導方法。
（２０）前記培地が、レセルピンまたはテトラベナジンの少なくとも一つ、および、cAMPまたはcAMPアナログの少なくとも一つを含む、上記（１９）に記載の分化誘導方法。
（２１）哺乳類動物由来の幹細胞を、アセチルコチン、アセチルコリン分解酵素阻害剤アセチルコリン受容体活性化剤、およびコリン作動性アンタゴニストからなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物を含む培地で培養または処理することを含む、哺乳類動物由来の幹細胞からインスリン産生細胞を分化誘導する方法。
（２２）前記化合物が、アセチルコチン、エセロリンフマル酸塩、塩化パルマチン、カルバコール、およびギンゴライドＡからなる群より選ばれる、上記（２１）に記載の分化誘導方法。
（２３）哺乳類動物由来の幹細胞を、葉酸を含む培地で培養または処理することを含む、哺乳類動物由来の幹細胞からインスリン産生細胞を分化誘導する方法。
（２４）前記哺乳類動物由来の幹細胞が、胚性幹細胞（ES細胞）、組織幹細胞または人工多能性幹細胞（iPS細胞）である上記（１４）から（２３）のいずれかひとつに記載の分化誘導方法。
（２５）前記哺乳類動物由来の幹細胞がES細胞である上記（２４）に記載の分化誘導方法。
（２６）前記分化誘導方法は、
（１）アクチビンおよびbFGFを含有する培地、
（２）レチノイン酸、FGF-10、B27 SUPPLEMENTおよびShhシグナル伝達アンタゴニストを含有する培地、および
（３）ニコチン酸アミドを含有する培地、の培地条件の中から選択される少なくとも一つの培地条件下において幹細胞を培養する工程を含む前記（１４）から（２５）に記載の分化誘導方法。
（２７）合成ナノ繊維存在環境下において前記培地条件が選択されることを特徴とする前記（２６）に記載の分化誘導方法。
（２８）前記（１４）から（２７）のいずれか一つに記載の方法により分化誘導されたインスリン産生細胞。
（２９）前記（１）から（１３）のいずれか一つに記載の分化誘導促進剤を含む医薬組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の分化誘導促進剤および分化誘導方法を用いることにより、哺乳類動物由来の幹細胞を、インスリン産生細胞へと効率よく分化誘導できる。また、そのようにして分化誘導されたインスリン産生細胞や本発明の分化誘導促進剤は、幹細胞の膵臓細胞への分化誘導の研究に有用であるばかりでなく、１型糖尿病の治療薬としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ナノファイバープレートを用いたマウスES細胞分化を促進する低分子化合物スクリーニング方法の概要を示した図である。
【図２】図２は、化合物のスクリーニングにおける定量的画像解析において、化合物候補と判断するためのスキームの概要を示した図である。図２Ａは、画像解析において、DAPIによる核染色に加え、Pdx1をAlexa 488、InsulinをAlexa 568で染色し蛍光観察することを示している。図２Ｂは、MetaXpressソフトウエアを用いた画像解析によりDAPI、Pdx1、Insulinの三重陽性の細胞の占める面積を算出し、これをインスリン陽性細胞の数を反映する数値とすることを示している。
【図３】図３は、スクリーニングのプロセスを示した図である。
【図４】図４は、本発明の一つであるレセルピンの濃度依存的効果を調べた結果を示した図である。Pdx1をAlexa 488、InsulinをAlexa 568で染色し蛍光観察した結果を示している。
【図５】図５は、化合物スクリーニングにより選択された各化合物のインスリン発現細胞への分化促進効果を比較した図である。Pdx1をAlexa 488、InsulinをAlexa 568で染色し蛍光観察した結果を示している。
【図６】図６は、モノアミンオキシダーゼ阻害剤（MAOBi）のインスリン発現細胞への分化に対する影響、およびレセルピンの分化促進効果に対する影響を示した図である。Pdx1をAlexa 488、InsulinをAlexa 568で染色し蛍光観察した結果を示している。
【図７】図６の結果を、全細胞に対する比で示した図である。
【図８】図８は、ドーパミンのインスリン産生細胞への分化に対する影響を示した図である。
【図９】図９は、ドーパミンD2受容体ノックダウン細胞セルラインの分化に対するレセルピンの影響を見た図である。図９Ａは、Drd2の発現を示す図である。図９Ｂは、通常ES細胞（NS）およびドーパミンD2受容体ノックダウン細胞セルライン（KD）のインスリン産生細胞への分化の増加を、対照に対する比で示した図である。Resは、レセルピンを添加した場合を示している。
【図１０】図１０は、通常ES細胞（NS）および小胞モノアミントランスポーターノックダウンセルライン（VMAT2KD）のインスリン産生細胞への分化に対するcAMPアナログの影響を調べた結果を示している。
【図１１】図１１Ａは、図１０の結果を、対照（cAMPアナログ無添加の正常細胞を１とする）に対する比で示した図である。図１１Ｂは、レセルピン、ドーパミンおよびdBu-cAMPの相乗効果を示した図である。
【図１２】図１２Ａは、本発明の化合物を用いて分化した細胞のインスリン量を調べた結果を示した図である。図１２Ｂは、本発明の化合物を用いて分化した細胞のグルコース濃度依存的インスリン分泌量を調べた結果を示した図である。
【図１３】図１３は、本発明の化合物を用いて分化した細胞における、グルコース感知および分泌に対する応答分子の発現を、リアルタイムPCRを用いて調べた結果を示した図である。
【図１４】図１４は、セロトニンおよびヒスタミン添加によるPdx1/GFP陽性細胞数とインスリン陽性細胞数の変化を示した図である。
【図１５】図１５は、4つの化合物添加条件下で培養した場合のNgn3、Nkx6.1、MafAおよびInsulin1遺伝子の発現量変化を示した図である。
【図１６】図１６は、TBZまたはdBu-cAMPの添加が、Ngn3陽性細胞誘導率に与える影響について示した図である。Ａは、TBZまたはdBu-cAMPの添加期間を示した模式図である。Ｂは、Ngn3/GFPマウスES細胞の可視光写真と蛍光写真を示している。Ｃは、GFP陽性細胞の割合の比率を示した図である。
【図１７】図１７は、培養11日目から17日目におけるdBu-cAMPの添加が、糖応答性C-peptide分泌に与える影響について示した図である。上段は添加期間を示した模式図である。
【図１８】図１８は、各化合物を添加した場合において、GFP陽性細胞をセルソーターにより分取し、C-peptide含量とグルコース濃度依存的なインスリン分泌量を測定した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態についてさらに詳細に説明する。
本発明は、哺乳類動物由来の幹細胞をインスリン産生細胞に分化誘導する、またはそれらの細胞のインスリン産生細胞への分化を促進する化合物、ならびにそれらの化合物を含む分化誘導促進剤である。本発明はさらには、それらの化合物を含むインスリン産生を促進するための医薬組成物に関する。
本発明はまた、哺乳類動物由来の幹細胞をインスリン産生細胞に分化誘導する方法、またはそれらの細胞のインスリン産生細胞への分化を促進する方法である。
本発明はさらには、本発明の上記方法によって分化したインスリン産生細胞である。
【００１６】
本発明で用いる哺乳類動物由来の幹細胞は、哺乳動物由来の幹細胞であればよく、その種類などは特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、サルまたはヒト由来の細胞を使用することができるが、好ましくはマウスまたはヒト由来である。
本発明で用いる哺乳類動物由来の幹細胞とは、哺乳類動物由来の、胚性幹細胞（ES細胞）、組織幹細胞または人工多能性幹細胞（iPS細胞：人工多能性幹細胞：induced pluripotent stem cell）であり、好ましくは、ES細胞である。これらの幹細胞は、本技術分野で公知の方法で調製または培養することができる。
【００１７】
哺乳動物由来のES細胞の培養方法は常法により行うことができ、例えば、必要によりフィーダー細胞としてマイトマイシンC処理マウス胚線維芽細胞（MEF）の存在下において、1000ユニット/ml白血病抑制因子（LIF;Chemicon）、15%ノックアウト血清リプレースメント（KSR;Gibco）、1%ウシ胎児血清（FBS;Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（NEAA;Invitrogen）、2mM L-グルタミン（L-Gln;Invitrogen）、1mMピルビン酸ナトリウム（Invitrogen）、50ユニット/mlペニシリンおよび50μg/mlストレプトマイシン（PS;Invitrogen）、および100μM β-メルカプトエタノール（β-ME;Sigma）を含むグラスゴー最小必須培地（Invitrogen）中で維持することができる。但し、この培地に制限されず、本発明の目的に適する任意の培地を使用することができる。
【００１８】
iPS細胞とは、体細胞を初期化することによって得られる多能性を有する細胞である。人工多能性幹細胞の作製は、京都大学の山中伸弥教授らのグループ、マサチューセッツ工科大学のルドルフ・ヤニッシュ(Rudolf Jaenisch)らのグループ、ウイスコンシン大学のジェームス・トムソン（James Thomson）らのグループ、ハーバード大学のコンラッド・ホッケドリンガー（Konrad Hochedlinger）らのグループなどを含む複数のグループが成功している。人工多能性幹細胞は、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞として大きな期待を集めている。例えば、国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６号公報には、Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、およびMycファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子、並びにOctファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子およびMycファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子が記載されており、さらに体細胞に上記核初期化因子を接触させる工程を含む、体細胞の核初期化により誘導多能性幹細胞を製造する方法が記載されている。
【００１９】
本発明で用いるiPS細胞は、体細胞を初期化することにより製造することができる。ここで用いる体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を用いることができる。即ち、本発明で言う体細胞とは、生体を構成する細胞の内生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。体細胞の由来は、哺乳動物（例えば、マウスなどのげっ歯類、またはヒトなどの霊長類）であり、特に好ましくはマウスまたはヒトである。また、ヒトの体細胞を用いる場合、胎児、新生児又は成人の何れの体細胞を用いてもよい。
【００２０】
本発明で言うiPS細胞は、所定の培養条件下（例えば、ＥＳ細胞を培養する条件下）において長期にわたって自己複製能を有し、また所定の分化誘導条件下において外胚葉、中胚葉および内胚葉への多分化能を有する幹細胞のことを言う。また、本発明における人工多能性幹細胞はマウスなどの試験動物に移植した場合にテラトーマを形成する能力を有する幹細胞でもよい。
【００２１】
体細胞からiPS細胞を製造するためには、まず、少なくとも１種類以上の初期化因子を体細胞に導入する。本発明において、初期化因子とは、体細胞に導入することにより、あるいはiPS細胞の樹立効率改善因子と共に体細胞に接触させることにより、iPS細胞を誘導することができる物質（群）のことであり、タンパク性因子またはそれをコードする遺伝子、あるいは低分子化合物である。初期化因子の組み合わせの具体例としては、以下の組み合わせをあげることができるが、これらに限定されるものではない。
（i）Octファミリー、Klfファミリー、Soxファミリー、Mycファミリー、
（ii）Octファミリー、Soxファミリー、Nanogファミリー、Lin28ファミリー、
（iii）Octファミリー、Klfファミリー、Soxファミリー、Mycファミリー、hTERTファミリー、SV40 large Tファミリー、
（iv）Octファミリー、Klfファミリー、Soxファミリー、
（v）Octファミリー、Klfファミリー、Soxファミリー、Mycファミリー、Glisファミリー、または
（vi）Octファミリー、Klfファミリー、Soxファミリー、Glisファミリー。
ここで示すファミリーとは、一次構造上の相同性により同定された、即ち類似構造を有するタンパク質群のことであり、例えばOctファミリーとしてはiPS細胞の代表的な初期化因子であるOct3/4の他にOct1A, Oct6等を含み、KlfファミリーとしてはKlf4, Klf1, Klf5等を含み、SoxファミリーとしてはSox2, Sox1, Sox3, Sox7等を含み、Mycファミリーとしてはc-Myc, L-Myc等、LIN28ファミリーとしてはLin28, Lin28B等を含み、GlisファミリーとしてはGlis1, Glis2, Glis3等を含む。また、初期化因子の体細胞への導入にあたっては、Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006)、Okita, K. et al., Nature, 448: 313-317 (2007)、Okita, K. et al., Nature Method, 8(5): 409-412 (2011)に記載の導入方法に従って、ウイルス系ベクターあるいは非ウイルス系ベクターを用いて各種初期化因子の導入を行うことができる。
【００２２】
本発明でいう、「幹細胞からインスリン産生細胞を分化誘導する」とは、幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導を引き起こす場合に加えて、幹細胞からインスリン産生細胞へと分化誘導する活性をもつ他の物質と併用することによりその分化誘導を促進する場合の両者を含む意味である。
【００２３】
本発明の一つの実施態様において、本発明の分化誘導促進剤は、ドーパミン代謝阻害剤およびセロトニン代謝阻害剤からなる群より選ばれる化合物の少なくとも一つを含む。
本発明において、ドーパミン代謝阻害剤またはセロトニン代謝阻害剤から選ばれる化合物とは、ドーパミンまたはセロトニンのトランスポーターの阻害剤、例えば、小胞モノアミントランスポーター（VMAT2）阻害剤、ドーパミンまたはセロトニンの合成阻害剤、ドーパミンD2受容体阻害剤、ドーパミンまたはセロトニンのアゴニスト、モノアミンオキシダーゼ阻害剤、MAO-A阻害剤、抗ヒスタミン、Ｈ１アンタゴニスト、ヒスタミンＨ２レセプター阻害剤、ヒスタミンＨ２レセプターアゴニスト、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、ドーパミンアンタゴニスト、または、５−ＨＴ３受容体アンタゴニストをあげることができる。合成阻害剤は、合成を阻害する化合物を意味するが、例えば、合成に関与する酵素の阻害剤、フィードバック作用により合成系を阻害する合成産物を含む。
本発明における、ドーパミン代謝阻害剤またはセロトニン代謝阻害剤とは、これには限定されないが、例えば、VMAT2阻害剤であるレセルピンまたはテトラベナジン、レボドパの脱炭酸酵素阻害剤であるカルビドパ、セロトニン合成阻害剤である5-ヒドロキシトリプトファン（5-HTP）、ドーパミン合成阻害剤であるα−メチルチロシン、ドーパミンアゴニストであるブロモクリプチン、モノアミンオキシダーゼ阻害剤であるキナクリン二塩酸塩二水和物または塩酸パルギリン、MAO-A阻害剤であるピルリンドールメシル酸塩、抗ヒスタミンであるフェキソフェナジン塩酸塩、Ｈ１アンタゴニストであるヒドロキシジン二塩酸塩またはマレイン酸クロルフェニラミン、ヒスタミンＨ２レセプター阻害剤であるシメチジン、ヒスタミンＨ２レセプターアゴニストであるジマプリット二塩酸塩、選択的セロトニン再取り込み阻害剤であるマレイン酸フルボキサミン、ドーパミンアンタゴニストであるアザペロン、５−ＨＴ３受容体のアンタゴニストである塩酸オンダンセトロン等をあげることができる。好ましくは、レセルピンまたはテトラベナジンである。
【００２４】
本発明の他の一つの実施態様において、本発明の分化誘導促進剤は、ドーパミン代謝阻害剤およびセロトニン代謝阻害剤からなる群より選ばれる化合物に加えてさらに、cAMP、cAMPアナログ、Gαsタンパク質カップル受容体のアゴニスト、またはGαiタンパク質カップル受容体のアンタゴニストを含むことができる。これにより、より強い分化誘導または促進効果を得ることができる。ここで、ドーパミン代謝阻害剤またはセロトニン代謝阻害剤とは、上記定義と同じくするものである。
本発明で言う、cAMPアナログとは、cAMPの塩基部分または糖部分の構造を変化させることで細胞膜透過性を有する物質であり、具体的には、例えば、ジブチレート-cAMPおよび8-CPT-2-Me-cAMPをあげることができる。
好ましくは、本発明の分化誘導促進剤は、レセルピンまたはテトラベナジンの少なくとも一つ、および、cAMPまたはcAMPアナログを含む。
【００２５】
本発明の他の一つの実施態様において、本発明の分化誘導促進剤は、アセチルコリン、アセチルコリン分解酵素阻害剤、アセチルコリン受容体活性化剤、およびコリン作動性アンタゴニストからなる群より選ばれる化合物を含む。アセチルコリン分解酵素阻害剤とは、これに限定されないが、例えば、エセロリンフマル酸塩および塩化パルマチンをあげることができる。アセチルコリン受容体活性化剤とは、これに限定されないが、例えば、カルバコールをあげることができる。コリン作動性アンタゴニストとは、これに限定されないが、例えばギンゴライドＡをあげることができる。
【００２６】
本発明の分化誘導促進剤は、他の、幹細胞をインスリン産生細胞へと分化誘導する物質と併用して用いることもできる。これにより、インスリン産生細胞の分化誘導をより効率よく達成し、インスリンの分泌をもたらすことができる。他のインスリン産生細胞を分化誘導する物質としては、例えば、ニコチンアミドおよびグルカゴン様ペプチド-1をあげることができるが、これらには限定されない。
【００２７】
本発明の分化誘導促進剤は、医薬組成物をして用いることもでき、それにより、１型糖尿病感謝や分化誘導した膵臓細胞・組織を移植した患者の膵臓機能の改善が期待できる。かかる場合は、分化誘導活性を有する上記化合物を含む本発明の分化誘導促進剤および任意の既知の製薬上許容できるキャリアを含む医薬組成物としてもよい。本発明の分化誘導促進剤を含む医薬組成物は、経口的または非経口的に投与されうる。経口投与の場合、カプセル、錠剤、顆粒剤、液剤などの形態で投与されうる。非経口投与の場合、注射液、点滴製剤などの形態で投与されうる。
本発明の分化誘導促進剤を医薬組成物として用いる場合は、本発明の化合物の含有量は、化合物の種類、投与対象、症状および投与方法によって異なる。例えば、レセルピンでは、１日あたり0.01mg〜100mg、好ましくは0.1mg〜10mgであり、テトラベナジン、カルビドパ、またはエセロリンフマル酸塩では、1日あたり１mg〜1000mg、好ましくは、10mg〜500mgであり、ブロモクリプチンでは、1日あたり1mg〜1000mg、好ましくは1mg〜100mgである。
【００２８】
本発明の他の一つの実施態様において、本発明の方法は、哺乳類動物由来の幹細胞を、ドーパミン代謝阻害剤およびセロトニン代謝阻害剤からなる群より選ばれる化合物を含む培地で培養または処理することを含む、幹細胞からインスリン産生細胞を分化誘導する方法である。ここで、ドーパミン代謝阻害剤またはセロトニン代謝阻害剤とは、上記定義と同じくするものである。
培地中に添加する、ドーパミン代謝阻害剤またはセロトニン代謝阻害剤の濃度は、幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導を促進する濃度であり、添加する物質に応じて、また同時に添加する分化促進に影響する他の物質の濃度に応じて適宜変更できる。特に制限されるものではないが、レセルピンでは、培地中の濃度は、0.15〜10.0μM、好ましくは0.15〜2.5μM、さらに好ましくは0.63μM〜1.25μMであり、テラベナジンでは、培地中の濃度は、0.15〜10.0μM、好ましくは1.25〜5.0μMである。
培地は、幹細胞の培養または維持に適した公知の培地を使用でき、例えば、グラスゴー最小必須培地やダルベッコ改変イーグル培地をあげることができる。
【００２９】
本発明の分化誘導方法においては、ドーパミン代謝阻害剤またはセロトニン代謝阻害剤からなる群より選ばれる化合物に加えてさらに、cAMP、cAMPアナログ、Gαsタンパク質カップル受容体のアゴニスト、またはGαiタンパク質カップル受容体のアンタゴニストを培地中に含むことができる。cAMPまたはcAMP アナログの培地中の濃度は、0.15μM〜5.0μM、好ましくは0.3μM〜0.6μMである。これにより、より強い分化誘導または促進効果を得ることができる。
【００３０】
本発明の他の一つの実施態様において、本発明の分化誘導促進剤は葉酸を含み、また、本発明の分化誘導方法は、哺乳類動物由来の幹細胞を、葉酸を含む培地で培養または処理することを含む、幹細胞からインスリン産生細胞を分化誘導する方法である。培地中の葉酸の濃度は、0.08〜10.0μM、好ましくは0.15〜0.63μMである。
【００３１】
本発明の他の一つの実施態様において、本発明の方法は、哺乳類動物由来の幹細胞を、アセチルコチン、アセチルコリン分解酵素阻害剤、アセチルコリン受容体活性化剤およびコリン作動性アンタゴニストからなる群より選ばれる化合物を含む培地で培養または処理することを含む、幹細胞からインスリン産生細胞を分化誘導する方法である。アセチルコリン分解酵素阻害剤、アセチルコリン受容体活性化剤またはコリン作動性アンタゴニストとは、上記定義と同じである。
培地中に添加する、アセチルコチン、アセチルコリン分解酵素阻害剤、アセチルコリン受容体活性化剤またはコリン作動性アンタゴニストの濃度は、幹細胞からインスリン産生細胞への分化誘導を促進する濃度であり、添加する物質に応じて、また同時に添加する分化促進に影響をする他の物質の濃度に応じて適宜変更できる。特に制限されるものではないが、例えば、塩化パルマチンでは、培地中の濃度は、0.08〜10.0μM、好ましくは0.15〜0.63μMであり、エセロリンフマル酸塩では培地中の濃度は、0.15〜10.0μM、好ましくは0.32〜2.5μMであり、アセチルコリンでは、培地中の濃度は、0.15〜5.0μM、好ましくは0.63〜2.5μMである。
【００３２】
本発明の幹細胞からインスリン産生細胞を分化誘導する方法において本発明の化合物を添加する時期は、インスリン産生細胞への分化を有効に誘導できる時期であれば特に制限されないが、好ましくは、Pdx1陽性細胞が出現する時期あるいはそれ以前である。
【００３３】
本発明の他の一つの実施態様において、本発明の分化誘導促進剤または本発明の分化誘導方法を用いて、幹細胞から誘導されたインスリン産生細胞が提供される。本発明のインスリン産生細胞は、糖尿病患者への膵島移植治療法において、ヒト成熟膵島β細胞にかわる細胞の供給源として有用である。
【００３４】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３５】
（材料および方法）
（１）ES細胞株
２つのES細胞株を使用した。一方は、インスリン1プロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現し、INGと命名される細胞である[Higuchi Y., Shiraki N., Yamane K, Qin Z., Mochitate K., Araki K., Senokuchi K., Yamagata K., Hara M., Kume K., and Kume S., Synthesized basement membranes direct the differentiation of mouse embryonic stem cells into pancreatic lineages. J. Cell Science, 123, 2733-2742, 2010]。他方は、Pdx1プロモーターの制御下でGFPを発現し、SK7と命名される細胞である[Shiraki N, Yoshida T, Araki K, et al. Guided differentiation of embryonic stem cells into Pdx1-expressing regional-specific definitive endoderm. Stem Cells. 2008;26:874-885]。両細胞株は、ES維持培地である、1000ユニット/ml白血病抑制因子（LIF;Chemicon）、15%ノックアウト血清リプレースメント（KSR;Gibco）、1%ウシ胎児血清（FBS;Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（NEAA;Invitrogen）、2mM L-グルタミン（L-Gln;Invitrogen）、1mMピルビン酸ナトリウム（Invitrogen）、50ユニット/mlペニシリンおよび50μg/mlストレプトマイシン（PS;Invitrogen）、および100μM β-メルカプトエタノール（β-ME;Sigma）を含むグラスゴー最小必須培地（Invitrogen）中のマウス胚線維芽細胞（MEF)フィーダー上で維持した。【００３６】
（２）エレクトロスピニングによる合成ナノ繊維の作製
合成ナノ繊維（sNF）マトリックスは、30kVの電界強度を用いて、工業用エレクトロスピニングプロセスを使用してエレクトロスピニングによって作製した。sNFマトリックスは、酸触媒の存在下で架橋結合された２種類のポリアミドポリマーＡ(C28O4N4H47)nおよびＢ(C28O4.4N4H47)nからなる。sNFマトリックスは、直径200〜400nmを有し、平均直径は280nmである。ポアサイズは約700nmであり、これは細胞の基底膜に類似している。【００３７】
（３）ES細胞の膵臓β細胞への分化
分化試験のために、ES細胞を、ウルトラウェブ合成ポリアミン表面をもつ96ウェルプレート（Ultra-Web Synthetic Polyamine Surface（#3873XX1、Corning Coster、Cambridge、MS））中で、ウェル当たり5,000細胞で平面培養した。細胞は、4500mg/Lグルコースを含有し、NEAA、L-Gln、PS、β-ME、10μg/mlインスリン（Sigma-Aldrich）、5.5μg/mlトランスフェリン（Sigma-Aldrich）、6.7pg/mlセレン（Sigma-Aldrich）、および0.25%Albmax（Invitrogen）、10ng/mL組み換えヒトアクチビン-A（R&D Systems、Minneapolis、MN）、5ng/ml;組み換えヒトbFGFを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM:Invitrogen、Glasgow、UK）中で7日間培養（d1〜d7）した（図１中のＩ）。次いで、培地は、2000mg/Lグルコース（Sigma、St Louis、MO）、1μMレチノイン酸（Sigma-Aldrich）、50ng/mlヒト組み換え線維芽細胞成長因子-10（Peprotech、Rocky Hill、NJ）、B27 SUPPLEMENT（Invitrogen）、および0.25μM 3-ケト-N-(アミノエチル-アミノカプロイル-ジヒドロシンナモイル)シクロパミンShhシグナル伝達アンタゴニストII（Calbiochem、San Diego、CA）を含有するRPMI 1640培地（Invitrogen）にd7〜d11の間交換した（図１中のII）。最終的に、培地は、1000mg/Lグルコースを含有し、NEAA、L-Gln、PS、β-ME、10μg/mlインスリン（Sigma-Aldrich）、5.5μg/mlトランスフェリン（Sigma-Aldrich）、6.7pg/mlセレン（Sigma-Aldrich）、0.25%Albmax（Invitrogen）、および10mMニコチン酸アミド（Sigma-Aldrich）を含むDMEMに11日目（d11）〜17日目（d17）に切り替えた（図１中のIII）。培地は、d17まで、新しい培地および成長因子を用いて2日ごとに交換した。【００３８】
（４）ES細胞からインスリン発現細胞への分化の低分子化合物による増強
すべての試験化合物は、任意の濃度になるようにしてジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、化合物の溶液を、d11、d13およびd15に培地に添加した。培地中のDMSOの最終濃度は、すべての化合物の実験において、1.0％になるように調製した。【００３９】
（５）免疫細胞化学
17日間の細胞培養後、培養ES細胞を室温で30分間、4%パラホルムアルデヒドPBS溶液で固定し、PBSで数回すすいだ。次に、細胞を加湿チャンバー中で、PBST（PBS中0.1% Tween-20）で20％としたBlocking One（Nacalai tesque、Tokyo、Japan）を用いて希釈した一次抗体を添加し、4℃で一晩インキュベートした。PBST中で細胞を洗浄した後に、暗中、室温で2時間、20% Blocking Oneで希釈した二次抗体と共に細胞をインキュベートした。PBST中で二次抗体を洗い流した後に、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）（Roche Diagnostics、 Basel、Switzerland）を用いて細胞を対比染色した。以下の抗体を一次抗体として使用した；ウサギ抗GFP（MBL International Corp、Woburn、MA）、マウス抗インスリン（Sigma）。以下の抗体を二次抗体として使用した；Alexa568結合抗体およびAlexa488結合抗体（Invitrogen）。【００４０】
（６）ナノファイバープレートを用いたマウスES細胞分化を促進する低分子化合物スクリーニング方法
図１にスクリーニング方法の概略を示す。マウスES細胞（Pdx1/GFP）を17日間分化誘導し、インスリン陽性細胞を分化させた。培養11日目でPdx1陽性の膵前駆細胞が誘導され遺伝子発現量が最大値に達する。培養11、13、15日目にDMSOに溶解した試験化合物を添加した。化合物ライブラリー／DMSO溶液は各ウェルに百分の１量添加することとした。これによりDMSO濃度は最終濃度1%となった。培養17日目に細胞を4%PFAで固定した後、免疫組織学的手法により解析した。【００４１】
（７）定量的画像解析
サンプル画像の撮影を共焦点レーザースキャン型ハイスループットコンフォーカルシステム（ImageXpress Ultra; Molecular Device社製）により行った（図２Ａ）。さらにMetaXpressソフトウエアを用いた画像解析によりDAPI、Pdx1、Insulinの三重陽性の細胞の占める面積を算出し、これをインスリン陽性細胞の数を反映する数値とした（図２Ｂ）。スクリーニングのプロセスを図３に示した。一次スクリーニング行い、次いで、用量反応性試験を行った。具体的には、全ウェルの平均値より1.7倍以上インスリン陽性細胞の占める面積が増加したものをヒット化合物とみなした。試験化合物の中から1.7倍以上の増加を示したものをヒット化合物候補とし、さらにそれらの化合物の濃度依存的効果を調べるために0〜10μMの濃度で再度効果を検討した。【００４２】
全1120化合物の中から5種の化合物が1.7倍以上の増加を示したのでヒット化合物候補とした（図３）。さらにこれらの5つの化合物の濃度依存的効果を調べるために0〜10μMの濃度で再度効果を検討した。図４にはその一例として、本発明の一態様である分化誘導促進剤の成分であるレセルピンの効果を示している。この場合、0.63μMが最大効果を示しており濃度依存的な効果が観察された。この実験においては、最終的に4つのヒット化合物を得た。【００４３】
（８）遺伝子抑制
Vmat2-ノックダウンおよびDrd2-ノックダウンアッセイにおいて、Expression Arrest non-silencing control shRNA（Open Biosystems, #RHS4080）、Vmat2 hRNA （Open Biosystems, #RMM3981-97058457 および #RMM3981-97058458）または Drd2 hRNA （Open Biosystems, #RMM3981-9594258）レンチウィルスベクターを用いた。ウィルスの調製は、HEK293-FT細胞（Invitrogen）を、トランスフェクションの前日に平板培地に播種した。一晩培養した後、メーカーのプロトコルに従い、FuGENE6 Transfection Reagent（Roche）を用いて細胞に、レンチウィルスベクターおよびViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix（Invitrogen）を導入した。細胞を、ES維持培地で24時間培養し、ウィルス上清を回収した。次いで、SK7細胞に、ウィルス上清液を感染させた。24時間培養後、ウィルス含有培地を、新鮮なES維持培地に交換した。さらに24時間培養し、1.5μg/mlピューロマイシンを用いて、感染細胞を選択した。生存細胞を、ノックダウンセルラインとしてクローン化した。【００４４】
（９）RT-PCR解析
RNA抽出、逆転写反応、PCR解析およびリアルタイムPCR解析は、白木らの報告（Shiraki et al., Biochem Biophys Res Commun. 2009;381:694-699; Shiraki et al., Genes Cells. 2008;13:731-746; Shiraki et al., Stem Cells. 2008;26:874-885：非特許文献４〜６）に記載の方法に従って行った。各プライマーのプライマー配列を表１に示す。各サイクルのPCR条件は以下の通りとした: 96℃で30秒間の変性、60℃で2秒間のアニーリングおよび72℃で45秒間の伸長。RT−PCR産物を、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、SYBR Green I （Molecular Probes）で染色した後、Gel Logic 200 Imaging System （Kodak）を用いて確認した。リアルタイムPCR条件は以下の通りとした: 95℃で3秒間の変性、ならびに60℃で30秒間のアニーリングおよび伸長を40サイクルまで。任意単位として表される標的mRNAレベルは、標準曲線を用いて決定した。【００４５】
【表１】
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【００４６】
（９）酵素免疫測定法による分泌インスリンおよび細胞内インスリン量の測定
分化したES細胞を、低グルコース濃度（5.5ｍM）のダルベッコ改変最小必須培地（1％牛胎児血清含有）で、4時間前培養した。細胞を、2回PBSで洗浄し、次いで、低（5.5mM）または高（27.5mM）グルコース濃度のダルベッコ改変最小必須培地（1％牛胎児血清含有）で2時間培養した。培養液を回収し、細胞を溶解緩衝液（0.1% Trioton X-100、1/100(v/v)プロテアーゼ阻害剤を混合したPBS）で溶解した。培地中へのインスリンの分泌および細胞溶解物のインスリン量を、マウスCペプチドELISAキット（Shibayagi. Co. Ltd., Japan）を用いて測定した。【００４７】
（実験および結果）
（１）ES細胞のインスリン発現細胞への分化を促進する化合物候補のハイスループットスクリーニング
再現可能な結果がハイスループットアッセイで得られるように培養条件を改変した。アッセイ手順の概要を図１に示す。SK7 Pdx1/GFP ES 細胞または ING Ins1/GFP ES 細胞を用いた。ES細胞を、０日目（d0）に、sNF（96ウェルマイクロタイタープレート）上に接種し、低分子化合物の誘導活性をアッセイした。個々の化合物は、11日目（d11）に各ウェルに添加した。DMSO中に溶解した各化合物（アレイ上に配列した1120の生物活性化合物のライブラリー）をスクリーニングした。ライブラリーは、DMSOで1:100に希釈し、上記実験方法に従って培地中に添加し、d13とd15において2回化合物を含有した培地に交換した。d1７に、細胞を、抗インスリン抗体で染色して分析した。抗体によるIns1/GFP染色またはインスリン染色の、数および割合の両者を増加させる化合物を、一次ヒットとして選択した。次いで、一次ヒットした化合物を、SK7 ES 細胞を用いて、0.08〜10μMになるように希釈した種々の濃度の範囲でアッセイを行った。ヒット化合物を用量反応性により確認した。その結果、５つの化合物（レセルピン、エリプチシン、塩化パルマチン、エセロリンフマル酸塩、および葉酸）が陽性として同定された。
ヒット化合物の一つであるレセルピンについての濃度依存活性を測定した結果を図４に示す。【００４８】
（２）レセルピンおよびテラベナジン（TBZ）による、Vmat2阻害を介した、インスリン発現細胞への分化促進
レセルピンは、インドールアルカロイドの抗精神病薬および抗高血圧剤であり、強い効果および増加したインスリン陽性染色を示した。レセルピンによる降圧作用は、小胞モノアミントランスポーター（VMAT2）を遮断することにより、末梢シナプス神経終末からカテコールアミンを枯渇させる作用の結果として知られているので、次いで、他のVMAT2阻害剤である、テラベナジン（TBZ）を検討した。図５に示すように、テラベナジンの添加も、同様の効果を示し、インスリン発現細胞への分化を促進した。テラベナジンの添加は、インスリン発現細胞の強さと数がともに増加をもたらした。これらの結果は、VMAT2が、Pdx1陽性細胞のインスリン産生細胞への分化を負に制御していることを強く示唆している。【００４９】
（３）他の化合物のインスリン産生細胞への分化促進効果
レセルピンはVMAT2の阻害剤であり、またTBZも同様にVMAT2阻害剤である。そこでさらに、VMAT2により細胞内顆粒に取り込まれるモノアミンについて着目し、ドーパミン、セロトニンの生合成と分解に関わる、カルビドパ、α−メチルチロシン、5HTP、ブロモクリプチンを検討した結果、同様の効果を示した。さらに、エセロリンフマル酸塩と塩化パルマチンを調べたところ、どちらもインスリン陽性細胞を増やした（図５）。エセロリンフマル酸塩と塩化パルマチンはアセチルコリン分解酵素の阻害剤であることからアセチルコリン（図５）とアセチルコリン受容体の活性化剤であるカルバコール（図示せず）を試したところどちらもインスリン陽性細胞を増やした。【００５０】
上記の結果は、モノアミンのVMAT2陽性小胞への取り込が、インスリン発現細胞への分化を負に制御（分化抑制）していることを強く示唆している。モノアミンによるインスリン発現細胞への分化抑制を調べるために、モノアミンオキシダーゼ（MAO）阻害剤を添加することにより、細胞内顆粒へのモノアミンの取り込み量を増加させることを試みた。MAOは、モノアミンの酸化を触媒する酵素ファミリーであり、細胞内のモノアミン濃度を減少させる。結果を図６および図７に示す。レセルピンのアンタゴニストであるMAO阻害剤（MAOBi）1μM Pargylineは、Pdx1陽性細胞からインスリン産生細胞への分化を阻害するがその効果は0.63μMのレセルピンにより解除された。レセルピンは、インスリン産生細胞を増加させるものの膵前駆細胞数は変化させなかった。MAO阻害剤の添加は、Pdx1発現細胞の比率に影響なしに、インスリン発現細胞に対するレセルピンの効果を抑制した。この結果は、VMAT2陽性小胞へのモノアミンの取り込みが、インスリン産生細胞への分化を抑制していることを強く示唆している。【００５１】
最終的に表２に示される14の化合物を同定した。それぞれのインスリン陽性細胞の数を化合物無添加の場合を１として相対値で示した。【００５２】
【表２】
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【００５３】
モノアミンがインスリン発現細胞への分化を阻害するという考えと適合して、α−メチルチロシン（α-MT）、カルビドパ、5HTPおよびブロモクリプチンは、表２に示すように、ドーパミンまたはセロトニン代謝を阻害する化合物である。α-MTは、カテコールアミンの合成をもたらす酵素であるチロシン3-モノオキシゲナーゼの阻害剤である。さらに、ドーパミンは、図８に示すように、用量依存的に膵臓の分化を抑制し、100 nM以上の濃度で完全にβ細胞分化を阻害した。これらの結果は、モノアミンが、インスリン発現細胞への分化において負の制御因子であることを示した。【００５４】
また同様の別の実験により、モノアミンオキシダーゼ阻害剤であるキナクリン二塩酸塩二水和物（Quinacrine dihydrochloride dihydrate）および塩酸パルギリン（Pargyline hydrochloride）、MAO-A阻害剤であるピルリンドールメシル酸塩（Pirlindole mesylate）、抗ヒスタミンであるフェキソフェナジン塩酸塩（Fexofenadine HCl）、Ｈ１アンタゴニストであるヒドロキシジン二塩酸塩（Hydroxyzine dihydrochloride）およびマレイン酸クロルフェニラミン（Chlorpheniramine maleate）、ヒスタミンＨ２レセプター阻害剤であるシメチジン（Cimetidine）、ヒスタミンＨ２レセプターアゴニストであるジマプリット二塩酸塩（Dimaprit dihydrochloride）、選択的セロトニン再取り込み阻害剤であるマレイン酸フルボキサミン（Fluvoxamine maleate）、ドーパミンアンタゴニストであるアザペロン（Azaperone）、および５−ＨＴ３受容体のアンタゴニストである塩酸オンダンセトロン（Ondansetron Hydrochloride）、コリン作動性アンタゴニストであるギンゴライドＡ（Ginkgolide A）も、幹細胞からインスリン産生細胞への分化を誘導することが確認できた。【００５５】
（４）ドーパミンによる、Drd2レセプター活性化を介した、インスリン発現細胞への分化抑制
ドーパミンシグナルが、その受容体の活性化を通じてインスリン発現細胞への分化を抑制することを確認するために、ドーパミンD2受容体ノックダウン細胞セルライン、Drd2KDを確立した（図９Ａ）。図９Ｂに示すように、Drd2KD細胞（ドーパミンD2受容体の阻害）は、インスリン産生細胞へ分化する能力が、2.5倍にまで増加したことを示した。興味深いことに、0.63μMレセルピンの添加は、Drd2KD細胞においては、分化を促進しなかった。
上記の結果は、モノアミン、特にはドーパミンが、そのレセプターの活性化を介して、インスリン発現細胞への分化を負に制御（分化抑制）していることを示している。【００５６】
（５）ベータ細胞の分化を正に制御する第二のメッセンジャーであるサイクリックAMP
Drd2は、Gαi/oタンパク質を活性化し、アデニルシクラーゼに対して阻害活性をもつ、Gタンパク質共役型受容体として知られている。Drd2による細胞内シグナル伝達現象を同定するために、cAMPの効果を調べた。細胞透過性cAMPアナログである、0.63μMジブチレート-cAMP（dBu-cAMP）の分化培地へのd11−d17における添加は、インスリン発現細胞の分化を高めた（図１０）。この増強は、dBu-cAMPをVMAT2KD ES 細胞に添加したときにはより強かった（図１０）。定量的分析は、NS細胞において、dBu-cAMPを加えたときには、インスリン発現細胞の数が2.9倍にまで増加したことを明らかにした。VMAT2KDのみでは、8倍の増加を示し、さらに、dBu-cAMP の添加は、31.4倍の増加をもたらした。すなわち、cAMPアナログの添加はVMAT2のノックダウンと相乗効果を示した。これらの結果は、cAMPおよびVMAT2KDが、インスリン生産細胞の数の増加において、相乗的に働いていることを示している（図１１Ａ）。
次いで、レセルピン、ドーパミンおよびdBu-cAMPの相乗効果を確かめた。それぞれの添加濃度は、レセルピン（0.6μM）、ドーパミン（0.1μM）、およびdBu-cAMP（0.6μM）である。ドーパミンの添加はインスリン陽性細胞を減少させた。レセルピンにより仲介されるインスリン発現細胞の増加は、ドーパミンの添加により完全に阻害された（図１１Ｂ）。このことは、ドーパミンがVMAT2の主要な下流分子であることと関係していると考えられる。この結果はVMAT2がドーパミンを細胞内顆粒に取り込むことでシグナル伝達を行っていることを示唆するものであった。一方、cAMPアナログ（dBu−cAMP）によってもインスリン陽性細胞は約７倍まで増加したが、dBu-cAMPの増強効果は、ドーパミンによってほとんど影響されなかった。さらに、レセルピンおよびdBu-cAMPの同時添加は、インスリン発現細胞への分化促進において著しい相乗効果を示し、β細胞の成熟化マーカーの発現が亢進した（図１１Ｂ）。これらの結果は、cAMPの産生を刺激する他の平行経路の存在を示唆した。【００５７】
次いで、分化した細胞のインスリン量を調べた。TBZ（2.5μM）およびdBu-cAMP（0.6μM）を同時添加して分化させたES細胞、またはdBu-cAMP（0.6μM）を添加したVMAT2KD ES細胞は、c-ペプチド量の大きな増加を示し、その値は、一膵島に相当していた（図１２Ａ）。さらに、インスリン分泌アッセイにおいて、TBZおよびdBu-cAMPの存在下で得られた、誘導インスリン発現細胞は、グルコース濃度依存的インスリン分泌を示した（図１２Ｂ）。これらの結果により、モノアミンの放出抑制とcAMPの活性化が相乗作用を示すことがわかった。【００５８】
次いで、リアルタイムPCRを用いて、グルコース感知および分泌に対する応答分子の発現を調べた。それぞれの添加濃度は、TBZ（2.5μoM）、およびdBu-cAMP（0.6μM）である。図１３に示されるように、以下のことがわかった。Stx1およびMafAの発現は、TBZおよびdBu-cAMPによって僅かに増加していた。Abcc8およびGlut2は、TBZによって増加しなかったが、dBu-cAMPによって著しく増加した。Abcc8およびGlut2は、dBu-cAMPおよびTBZの場合は、TBZのみの場合に比べて、それぞれ、78倍と15倍に増加した。TBZとcAMPアナログの同時添加によりIns1とIns2遺伝子の発現量が上昇したが、Snap25は低下した。Abcc8, Glut2は、大規模SNP解析において、2型糖尿病の原因遺伝子として同定されている遺伝子であり、同じ原因遺伝子のうちでも、膵臓β細胞機能を担う重要な遺伝子として分類されている。また、糖感受性、インスリン分泌の機能を果たすために重要な遺伝子です。本発明の化合物ならびに方法により、これらの遺伝子の発現量が上昇していることが示された。【００５９】
（６）セロトニンおよびヒスタミン添加によるPdx1/GFP陽性細胞数とインスリン陽性細胞数の変化
セロトニンまたはヒスタミンの添加による、Pdx1/GFP陽性細胞数とインスリン陽性細胞数の変化に対する影響を確認するために、培養11日目（d11）に、セロトニンまたはヒスタミンを0、0.08、0.16、0.31、0.63、1.25、2.5、5.0、10μMの濃度で添加した。以降17日目まで2日おきに培地交換をした。17日目に培養を停止し、抗GFP抗体および抗インスリン抗体を用いた抗体免疫染色により細胞を染色し、細胞数を計測した。
結果を図１４に示す。セトロニンまたはヒスタミンの添加により、濃度依存的にインスリン陽性細胞数が減少した。一方、Pdx1/GFP陽性細胞数には変化がなかった。【００６０】
（７）Ngn3、Nkx6.1、MafAおよびInsulin1遺伝子の発現量の変化
膵内分泌細胞への分化マーカーであるNgn3、膵β細胞への分化マーカーであるNkx6.1、膵臓ランゲルハンス島β細胞に特異的に発現するMafA、及びInsulin1遺伝子の発現に対する、TBZ、dBu-cAMP、およびTBZとdBu-cAMPの影響を確認した。
培養0、9、11日の細胞からRNAを抽出した。さらに11日から17日目まで2日おきに化合物なし、TBZ（2.5μM）、dBu-cAMP（0.6μM）、TBZとdBu-cAMP（それぞれ、2.5μMと0.6μM）を添加した4条件において13、15、17日目にRNAを回収した。それぞれのRNA試料をもとにRT-PCR法によりmRNA発現量を測定した。発現量は化合物を添加しない場合での培養13日目の発現量を１とした比率で示している。
結果は、Ngn3の発現量は13日目と15日目にTBZにより著しく増加し、dBu-cAMPによっても増加した。Nkx6.1の発現量は、15日目以降TBZにより強く促進され、その効果がdBu-cAMPによって増強された。MafAは13日目以降TBZとdBu-cAMPにより促進され、その両方の添加により相乗的に発現量が増加した。Insulin1は13日目以降TBZとdBu-cAMPにより促進され、15日目以降はその両方による相乗的な増加効果がみられた。【００６１】
（８）TBZまたはdBu-cAMPの添加によるNgn3陽性細胞誘導率に与える影響
TBZ（2.5μM）またはdBu-cAMP（0.6μM）の添加によるNgn3陽性細胞誘導率に与える影響を確認した。図１６Ａは、TBZまたはdBu-cAMPの添加期間を模式的に示した図であり、それぞれ添加期間を、a)培養9日目から11日目、b)培養11日目から13日目、c)培養9日目から13日目とした。
まず、化合物無添加または培養9日目から13日目（期間c））にTBZを添加し、培養13日目におけるNgn3/GFPマウスES細胞の可視光写真と蛍光写真を観察した。結果を図１６Ｂに示す。左が可視光写真であり、右が蛍光写真である。TBZの添加により、Ngn3陽性細胞の増加が確認できた。
次いで、化合物無添加、およびTBZまたはdBu-cAMPを上記a)、b)、c)の条件で添加した場合の培養１３日目におけるGFP陽性細胞の割合を確認した。無添加の場合を１として、GFP陽性細胞とNgn3陽性細胞の割合比率を図１６Cに示す。結果は、すべての条件においてGFP陽性細胞数が増加した。その効果は強いものからa)、c)、 b)の順であった。【００６２】
（９）dBu-cAMP添加の糖応答性C-peptide分泌に与える影響
培養11日目から17日目にdBu-cAMP（0.6μM）を添加し（TBZ無添加）、糖応答性C-peptide分泌に与える影響を確認した。図１７の上図が、dBu-cAMPの添加期間を模式的に示した図であり、それぞれ添加期間を、a)培養11日目から17日目、b)培養11日目から15日目、c)培養13日目から17日目とした。dBu-cAMPを上記a)、b)、c)の条件で添加した場合の、培養17日目における糖応答性C-peptide分泌量を上記（材料及び方法）の（９）に従い確認した。結果は、すべての条件においてGFP陽性細胞数が増加した。その効果は強いものからc)、a)、 b)の順であった。【００６３】
（１０）各化合物添加における、C-peptide含量とグルコース濃度依存的なインスリン分泌量の測定
化合物無添加、およびTBZ（2.5μM）、dBu-cAMP（0.6μM）、TBZとdBu-cAMP（それぞれ2.5μMと0.6μM）を添加した4条件で培養した後、17日目におけるGFP陽性細胞をセルソーターにより分取し、上記（材料と方法）の（９）に従い、C-peptide含量とグルコース濃度依存的なインスリン分泌量を測定した。
図１８Aは、その工程を模式的に示した図である。培養17日目における培養細胞のGFPの蛍光強度の分布を測定した結果を図１８Ｂに示す。得られた培養17日目における培養細胞のGFP陽性細胞と陰性細胞の可視光写真（左）と蛍光写真（右）を図１８Ｃに示す。上段は、GFP陰性細胞を示しており、下段は、GFP陽性細胞を示している。
培養11日から17日目まで2日おきに化合物なし、TBZ、dBu-cAMP、TBZとdBu-cAMPを添加した4条件で培養を行い、17日目におけるGFP陽性細胞のC-peptide含量を測定した。結果を図１８Ｄに示す。コントロールとして、6週令のICRオスマウスから精製した膵島および未分化マウスES細胞を用いてC-peptide含量を測定した。TBZ、およびTBZとdBu-cAMPの添加により、C-peptide含量が増加した。
培養11日から17日目まで2日おきに化合物なし、TBZ、dBu-cAMP、TBZとdBu-cAMPを添加した4条件で培養を行った細胞を用いて、グルコース濃度を5.5 mM または27.5 mMとした場合におけるC-peptide分泌量を測定した。結果を図１８Ｅに示す。コントロールとして、6週令のICRオスマウスから精製した膵島および未分化マウスES細胞を用いてC-peptide含量を測定した。結果は、dBu-cAMPの添加によりグルコース濃度が27.5 mMの場合にC-peptideの分泌がみられた。【００６４】
上記の記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の分化誘導促進剤及び方法は、幹細胞を用いた分野、例えば医療再生関連分野において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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