(57)【要約】  本発明は、補体依存性生物活性を有する抗体を各種動物細胞で生産するに際して、高い生物活性有する抗体を産生する方法を提供し、特に、高い補体依存性生物活性を有する抗体を動物細胞で産生するに際して、β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が発現した宿主動物細胞を用いることを特徴とする、抗体の産生法、その方法により産生される抗体、そのような抗体を安定的に発現する宿主細胞系を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および補体依存性生物活性を有する抗体をコードする遺伝子を発現する宿主動物細胞を培養する工程、および
培養した前記宿主動物細胞から、発現したＢ４Ｇａｌ−Ｔ活性により前記抗体のＦｃ領域に結合しているＮ−グリコシド結合複合型糖鎖が修飾された該抗体を精製する工程
を含む、補体依存性生物活性を有する抗体を産生する方法。
【請求項２】
前記培養する工程が、
(i) β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が安定的に発現している宿主動物細胞に補体依存性生物活性を有する抗体をコードする遺伝子を発現可能に導入した該細胞を培養すること、または
(ii) β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および補体依存性生物活性を有する抗体をコードする遺伝子の両方を発現可能に導入した宿主動物細胞を培養すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質をコードする遺伝子が、
(i) 配列番号７のポリヌクレオチド；
(ii) 配列番号７のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＢ４Ｇａｌ−Ｔ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(iii) 配列番号８のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；または
(iv) 配列番号８のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＢ４Ｇａｌ−Ｔ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
からなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記宿主動物細胞が、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、またはＣＨＯ細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
さらに、
(i) 前記抗体のＦｃ領域に結合しているＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の中で、Ｇ１およびＧ２複合型糖鎖の割合（該糖鎖の非還元末端の２つのＮ−アセチルグルコサミンの少なくとも一方にガラクトースが１分子結合しているものの割合）が５０％以上である抗体を単離する工程;または
(ii) 前記抗体のＦｃ領域に結合しているＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の中で、Ｇ２複合型糖鎖の割合（該糖鎖の非還元末端の２つのＮ−アセチルグルコサミンの両方にガラクトースがそれぞれ１分子結合しているものの割合）が５０％以上である抗体を単離する工程
を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記補体依存性生物活性が、補体依存性細胞障害活性、補体依存性のウイルス中和活性、補体依存性のＣＭＶの中和活性、および抗ＣＤ２０抗体の補体依存性細胞障害活性からなる群から選択される活性である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
さらに、
(i) 糖鎖が修飾されていない抗体と比較して３倍以上高い補体依存性生物活性を示す抗体を単離する工程；または
(ii) 糖鎖が修飾されていない抗体と比較して１０倍以上高い補体依存性生物活性を示す抗体を単離する工程
を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体がＩｇＧまたはＩｇＧ１である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法により産生された抗体。
【請求項１１】
請求項５または７に記載の方法により産生された抗体。
【請求項１２】
請求項１１に記載の抗体を安定的に発現する宿主細胞系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、補体依存性生物活性の高い抗体の産生方法に関する。特に、本発明は、高い補体依存性生物活性を有する抗体を動物細胞で産生するに際して、β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４Ｇａｌ−ＴまたはＢ１，４ＧＴと称する場合がある。）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が安定的に発現した宿主動物細胞を用いることを特徴とする、抗体の産生法、その方法により産生される抗体、そのような抗体を安定的に発現する宿主細胞系に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、その高い特異性、および高い結合活性を有することから、研究、各種診断薬、更には各種疾病の予防及び治療薬として広く使用されてきている。米国では、癌、自己免疫疾患、感染症、アレルギー疾患などの分野で既に２０種類を超える抗体医薬品が承認され使用されており、データモニター社の推計によると、その世界市場は２０１５年には６００億ドルを超すと予想されている。更にまた、現在、１４０種類以上のヒトモノクローナル抗体の臨床試験が進行中である（非特許文献１）。【０００３】
例えば、癌の分野では、近年になり、モノクローナル抗体医薬による癌治療の臨床応用が活発に進んでおり、各種化学療法剤との併用などにより一定の成果をあげるに至った（非特許文献２、３）。これらには、抗Her2/neu抗体（trastuzumab/Herceptin）、抗CD20抗体（rituximab/Rituxan）、抗EGFR抗体（cetuximab/Erbitux）、抗VEGF抗体（bevacizumab/Avastin）などが含まれ、乳癌、リンパ腫、大腸癌、肺癌などの一部の癌患者において効果を示している。【０００４】
また、自己免疫疾患の分野では、抗CD20抗体（rituximab/Rituxan）、抗TNFα抗体 （remicade/ Infliximab および humira/Adalimumab）、および抗IL-6R抗体（actemura/ Tocirizumab）、等が、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、および全身性エリトマトーデス等の分野で、臨床使用され大きな市場を形成している。更に、アレルギー疾患の分野では、抗IgE抗体（xolair/Omalizumab）が気管支喘息やアレルギー性鼻炎に使用されている。【０００５】
一方、感染症分野では、抗RSV抗体(synagis/Palivizumab)がRSV感染予防薬として使用され大きな市場を形成している。更に、現在では、HIV、インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、更には肝炎ウイルスに対しても、抗体医薬の臨床開発が進んでいる。【０００６】
しかしながら、上に挙げた抗体医薬を始め、現在開発されている抗体医薬についても、従来の薬剤に比較して改善されたとはいえ、その薬効はまだ限られたものであり、満足できる程度に達しているとは到底いえない。すなわち、より優れた生物活性を有する新たな抗体医薬、もしくは既存の抗体医薬の活性増強法の開発が強く要望されている状況である。【０００７】
そのような中、近年は、より生物活性の高い抗体の探索、既存の抗体の活性増強法の研究開発、および血中での半減期を延ばす方法等の研究開発等がなされている。具体的には、抗体の糖鎖修飾による抗体依存性細胞障害活性（antibody-dependent cellular cytotoxicity）（以下、「ＡＤＣＣ活性」と称する場合がある。）の増強法（特許文献１、２、３、非特許文献４、５、６）や抗体の定常領域（Ｆｃ領域）のＩｇＧ１／ＩｇＧ３の組換法による補体依存性細胞障害活性（complement dependent cytotoxicity）（以下、「ＣＤＣ活性」と称する場合がある。）の増強法（特許文献４、非特許文献７）などが、その代表的な事例である。しかしながら、高い補体依存性生物活性を有する抗体もしくはその工業化容易な産生法が、まだまだ、切望されているのが現状である。【０００８】
ところで、抗体のエフェクター活性の発現には、Ｆｃ領域の重要性が指摘されており、Ｆｃ領域を介したＡＤＣＣ活性、およびＣＤＣ活性が重要視されている。ＡＤＣＣ活性に関してみると、その活性増強のアプローチとして、抗体のＦｃ領域に結合している糖鎖を修飾する事例、およびＦｃ領域のペプチド配列を修飾する事例が報告されている。前者の事例としては、抗体のＦｃ領域のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端に結合しているフコースの欠失が高活性をもたらすことが報告されている（非特許文献４, ５, ８）。また、後者の事例としては、抗体のＦｃ領域のペプチド配列中の特定の部位のアミノ酸置換によっても、高いＡＤＣＣ活性をもたらすことが報告されている（非特許文献１０）。【０００９】
一方、ＣＤＣ活性に関しても、大きく分類して(i) Ｆｃ領域もしくはその他の領域のペプチド配列を修飾する事例、および(ii) Ｆｃ領域の糖鎖を修飾する事例がある。(i)の事例としては、前に述べたＩｇＧ１／ＩｇＧ３の組換法によるＣＤＣ活性の増強法（特許文献４、非特許文献７）が代表的であるが、ＩｇＧ３抗体が本来持つ課題（血液中での半減期の短さ、プロテインＡへの結合の弱さに由来する精製の困難さ、および凝集し易さ等）もあり、Ｆｃ領域のアミノ酸置換の事例（特許文献５）、ＣＤＲ（相補性決定領域）のアミノ酸置換の事例（特許文献６）、更にはヒンジ領域のアミノ酸置換の事例（特許文献７）などが相次いで報告されている。一方、(ii)の観点での事例としては、ガラクトースがＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の非還元末端に結合している糖鎖の割合の増加が、補体依存性生物活性に影響することが報告されているが、それらの増加がＣＤＣ活性を亢進するという報告（非特許文献９）と、増加がＣＤＣ活性の亢進に必ずしもつながらないとする報告（非特許文献８）があり、その活性の変化も２倍以内のためか明確な見解には至っていない。また、非特許文献８および９に開示されている糖鎖修飾法は、in vitroで酵素処理をする方法であり、到底、大量生産には適さない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許４２９０４２３
【特許文献２】特許４３６８５３０
【特許文献３】特開２００９−２７５０４９
【特許文献４】ＷＯ２００７／０１１０４１
【特許文献５】ＷＯ２０１１／０９１０７８
【特許文献６】ＷＯ２００９／０１８４１１
【特許文献７】ＷＯ２００９／００６５２０
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Nature reviews, 9, p767-774 (2010)
【非特許文献２】Lancet Oncol., 5, p.292-302（2004）
【非特許文献３】J. Clin. Oncology, 17, p268-276(1999)
【非特許文献４】J. Biol. Chem.,277, p26733-26740 (2002)
【非特許文献５】BMC Biotechnology, 7:84, p1-13(2007)
【非特許文献６】Biotechnology and Bioengineering, 87, p614-622(2004)
【非特許文献７】Cancer Res.，68,ｐ3863-3872(2008)
【非特許文献８】Biotechnol. Prog. 21, 1644-1652(2005)
【非特許文献９】Current Opinion in Immunology, 20, p471-478(2008)
【非特許文献１０】Mol. Cancer Ther. 7, p2517-2527(2008)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記のような背景の中、より有効で安価な抗体医薬を社会に供給するために、各種動物細胞で産生する抗体の補体依存性生物活性を高める大量生産が容易な抗体産生法を提供することが求められている。さらに、抗体医薬はその高い治療費のみならず、必要生産量の増加、種類の増加が相俟って世界的にも製造設備の不足が大きな問題となっており、これらの課題を解決するためにも抗体医薬には高い生物活性が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の課題を達成するために、種々の異なった宿主細胞で産生した抗体の補体依存性生物活性を調査し、特に顕著に違いがあった抗体に関しては、それらのＦｃ領域に結合している糖鎖の構造を解析、その生物活性の差異の原因を究明、対応策を検討した。その結果、高い補体依存性生物活性を有する抗体を得るには、β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が安定的に発現している細胞（好ましくは、脊椎動物細胞、特に哺乳動物細胞）、もしくはＢ４Ｇａｌ−Ｔ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入した動物細胞（好ましくは、脊椎動物細胞、特に哺乳動物細胞）を宿主細胞として用いることが有効であることを見出し、本発明を完成した。【００１４】
即ち、本発明は、以下に記載する抗体の産生法、その方法により産生された抗体、およびそのような抗体を安定的に発現する宿主細胞系に関する。【００１５】
［１］β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および補体依存性生物活性を有する抗体をコードする遺伝子を発現する宿主動物細胞を培養する工程、および
培養した上記宿主動物細胞から、発現したＢ４Ｇａｌ−Ｔ活性によりＦｃ領域に結合しているＮ−グリコシド結合複合型糖鎖が修飾された上記抗体を精製する工程
を含む、補体依存性生物活性を有する抗体を産生する方法。
［２］上記培養する工程が、
(i) β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が安定的に発現している宿主動物細胞に補体依存性生物活性を有する抗体をコードする遺伝子を発現可能に導入した該細胞を培養すること、または
(ii) β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および補体依存性生物活性を有する抗体をコードする遺伝子の両方を発現可能に導入した宿主動物細胞を培養すること、
を含む、上記［１］に記載の方法。
［３］上記タンパク質をコードする遺伝子が、
(i) 配列番号７のポリヌクレオチド；
(ii) 配列番号７のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＢ４Ｇａｌ−Ｔ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(iii) 配列番号８のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；または
(iv) 配列番号８のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＢ４Ｇａｌ−Ｔ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
からなる、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］上記宿主動物細胞が、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、またはＣＨＯ細胞である、上記［１］〜［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］さらに、
(i) 上記抗体のＦｃ領域に結合しているＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の中で、Ｇ１およびＧ２複合型糖鎖の割合が５０％以上である抗体を単離する工程;または
(ii) 上記抗体のＦｃ領域に結合しているＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の中で、Ｇ２複合型糖鎖の割合が５０％以上である抗体を単離する工程
を含む、上記［１］〜［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］上記補体依存性生物活性が、補体依存性細胞障害活性、補体依存性のウイルス中和活性、補体依存性のＣＭＶの中和活性、および抗ＣＤ２０抗体の補体依存性細胞障害活性からなる群から選択される活性である、上記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］さらに、
(i) 糖鎖が修飾されていない抗体と比較して３倍以上高い補体依存性生物活性を示す抗体を単離する工程；または
(ii) 糖鎖が修飾されていない抗体と比較して１０倍以上高い補体依存性生物活性を示す抗体を単離する工程
を含む、上記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］上記抗体がモノクローナル抗体である、上記［１］〜［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］上記抗体がＩｇＧまたはＩｇＧ１である、上記［１］〜［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］上記［１］〜［９］のいずれか一項に記載の方法により産生された抗体。
［１１］上記［５］または［７］に記載の方法により産生された抗体。
［１２］上記［１１］に記載の抗体を安定的に発現する宿主細胞系。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の方法で産生した抗体は、補体依存性生物活性が大幅に増強するため、抗腫瘍抗体のみならず病原微生物に対する抗体などの場合でも、それらの各種疾患に対する治療効果の増大が期待される。【００１７】
本発明に係る補体依存性生物活性の高い抗体の産生法は、各種補体依存性の生物活性を有する抗体を工業規模で製造する際に、特に有益な方法である。また、本発明の方法の好ましい態様では、産生される抗体のＦｃ領域に結合する糖鎖はヒト型であり、該抗体を医薬として使用した場合に抗原性の観点からも問題がない点で有利である。【００１８】
以上の性質より、本発明に係る生産法は、補体依存性の生物活性を有する抗腫瘍抗体、抗ウイルス抗体の産生に広く有効な方法である。また、本発明の方法により産生されるモノクローナル抗体を含む医薬組成物は、少ない量で有効であり、有効性の増大、副作用の軽減、もしくは医療費の軽減につながる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ｎ−グリコシド結合糖鎖の基本構造（（A））、およびＩｇＧ抗体中に認められるＮ-グリコシド結合複合型糖鎖の代表的な構造（（B）〜（E））を示す。
【図２】抗CMV抗体の糖鎖解析の結果をまとめた表を示す。
【図３】抗CMV抗体の中和活性の評価結果を表す（A）グラフおよび（B）表を示す。
【図４】Rituxanの補体依存性細胞障害活性（CDC）の評価結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本願発明に係る補体依存性生物活性の高い抗体の産生法およびその方法により産生される抗体に関して詳述する。
【００２１】
１．用語の説明
（抗体）
本明細書において「抗体」とは、通常の抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）を意味し、リンパ球のうちＢ細胞の産生する糖タンパク分子で、特定のタンパク質などの分子（抗原）を認識して結合する働きを有する分子を意味する。なお、「抗体」という名称は抗原に結合するという機能を重視した名称であり、物質としては免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）と呼ばれ、「Ｉｇ（アイジー）」と略される。特に、抗体医薬として使用されているＩｇＧは、４本のポリペプチド鎖、すなわち、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖であってジスルフィド結合によって相互接続されたものからなる免疫グロブリン分子である。本願発明におけるモノクローナル抗体も、各々２本の軽鎖（Ｌ鎖）および重鎖（Ｈ鎖）を含む免疫グロブリン分子からなる。各Ｈ鎖は、Ｈ鎖可変部領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」と称す場合がある）およびＨ鎖定常領域（Ｈ鎖定常領域は３つのドメインからなり、それぞれ「ＣＨ１」、「ＣＨ２」、「ＣＨ３」と称す場合がある（総称：ＣＨ））からなる。尚、Ｈ鎖にはヒンジ領域がＣＨ１とＣＨ２の間に存在する。一方、各Ｌ鎖は、Ｌ鎖可変部領域（「ＬＣＶＲ」または「ＶＬ」と称す場合がある）およびＬ鎖定常領域（Ｌ鎖定常領域は１つのドメインからなり、「ＣＬ」と称す場合がある）からなる。また、ＩｇＧをパパインで処理すると2個のＦａｂ断片と1個のＦｃ断片に切断されるが、Ｆｃ領域と言った場合主として上記の「ＣＨ２」と「ＣＨ３」を合わせた部分を指す。ヒト型のＩｇＧ抗体の場合、各Ｈ鎖の２９７番目のＡｓｎ残基にＮ−グリコシド結合でそれぞれ１本の糖鎖が結合している。
【００２２】
また、抗体は定常領域の構造の違いにより、いくつかのクラス（アイソタイプ）に分けられる。哺乳動物では、定常領域の構造の違いによりＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥの５種類のクラスの免疫グロブリンに分類される。ヒトの場合、ＩｇＧにはＩｇＧ１〜ＩｇＧ４の４つのサブクラスが、ＩｇＡにはＩｇＡ１とＩｇＡ２の２つのサブクラスがあり、それぞれ少しずつ構造が異なっている。ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥにはサブクラスはない。なお、本明細書では、「抗体」とは、上述のクラス・サブクラスの総称を意味し、さらにマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体（完全ヒト型）、およびＦｃ領域を有する二重特異性抗体、多重特異性抗体などが含まれる。
【００２３】
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域が担う機能であり、抗体クラスに大きく依存する。補体を活性化する機能はＩｇＭとＩｇＧクラスの抗体に限られ、抗体の可変領域が結合した細胞を溶解させる機能を特にＣＤＣ（補体依存性細胞障害）と呼ぶ。また、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡクラスの抗体のＦｃ領域はそれぞれに特異的なＦｃ受容体に結合し、Ｆｃ受容体をもつ細胞を活性化したり、抗体の細胞間トランスポートに働く。特に、ＩｇＧクラス抗体がＴ細胞、ＮＫ細胞、好中球、マクロファージ上のＦｃ受容体を介して、これらのエフェクター細胞を活性化し，抗体の可変領域が結合した標的細胞を殺すことをＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害）とよぶ。ＮＫ細胞を活性化する機能をＡＤＣＣ、マクロファージを活性化する機能をＡＤＭＣと区別して使用する場合がある。（＜URL:http://www.yodosha.co.jp/jikkenigaku/keyword/139.html＞（最終閲覧日：2012年1月27日））
【００２４】
（タンパク質）
本明細書において、「タンパク質」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。抗体もタンパク質であり、「組換え抗体」とは、遺伝子工学的手法を用いて製造される抗体を意味する。
【００２５】
（糖タンパク質）
本明細書において、「糖タンパク質」とは、通常の糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）を意味し、タンパク質を構成するアミノ酸の一部に糖鎖が結合したものである。動物においては、細胞表面や細胞外に分泌されているタンパク質のほとんどが糖タンパク質であるといわれている。タンパク質の修飾では、アスパラギンに結合したもの（Ｎ結合型）とセリンやスレオニンに結合したもの（O結合型、ムチン型）の２種類が頻繁に観察される。
【００２６】
糖タンパク質に結合している糖鎖を成す糖の種類はそれほど多くなく、よく見られるものは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、キシロースなど７〜８種程度である。構造様式もある程度限られており、その中のわずかな構造の違いが識別され、様々な生命現象が制御されている。抗体も代表的な糖タンパク質であり、それらの糖鎖構造と機能に関する研究も大いに進んでいる。特に、ＩｇＧのＦｃ領域に存在するＮ−グリコシド結合糖鎖の構造と機能に関しては、ＡＤＣＣ活性への影響等多くの報告がある。
【００２７】
（Ｎ−グリコシド結合糖鎖の構造）
Ｎ−グリコシド結合糖鎖（Ｎ−結合型糖鎖、もしくはＮ結合型糖鎖とも称する。）においては、タンパク質のＡｓｎ残基の窒素原子（N）にＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を介してＮ−グリコシド結合で糖鎖が結合している。Ａｓｎならどれでもよいわけではなく、Ａｓｎ−（任意アミノ酸）−Ｓｅｒ/Ｔｈｒという配列に限られる。ヒト型のＩｇＧ抗体の場合、各Ｈ鎖の２９７番目のＡｓｎ残基にＮ−グリコシド結合でそれぞれ１本の糖鎖が結合しており、それらには多くの種類の糖鎖構造が存在する。
【００２８】
Ｎ−グリコシド結合糖鎖は、大きく「高マンノース型」、「複合型」および「ハイブリッド型」に分かれるが、抗体のＦｃ領域に結合しているＮ−グリコシド結合糖鎖の大部分は、「複合型」と呼ばれる糖鎖構造を有する。図1は、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の基本構造（（A））、およびＩｇＧ抗体中に認められるＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の代表的な構造（（B）〜（E））を示す。基本構造(A)は、還元末端側に2分子のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が結合しその先にマンノース(Ｍａｎ)が１分子、さらにその先にマンノース(Ｍａｎ)が２分子、２つに枝分かれして結合している構造を有する。（B）の糖鎖は、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の基本構造の還元末端のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にフコースが結合し、非還元末端の２分子のマンノース（Ｍａｎ）には、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）がそれぞれ１分子ずつ結合している構造で、非還元末端にガラクトース（Ｇａｌ）は存在していない構造である。（C）〜（E）の糖鎖は、（B）の糖鎖の非還元末端のＧｌｃＮＡｃにＧａｌが１分子もしくは２分子結合した構造を有する。これらＧａｌが付加されるにはＢ４Ｇal-Ｔが重要な働きをする。ＣＨＯ細胞で産生されるＩｇＧ抗体においては、還元末端のＧｌｃＮＡｃにフコースが結合した糖鎖の割合が高いが、ＩｇＧ抗体中に認められる複合型糖鎖にはフコースが結合していないものも含まれる。それら以外にもまた、ＩｇＧ抗体中に認められる複合型糖鎖には、糖鎖構造（E）の非還元末端のＧａｌに、更に、シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）が1分子または２分子結合した糖鎖や、糖鎖が枝分かれしている部分のマンノースに、更に、ＧｌｃＮＡＣが結合している「バイセクティング」という構造を有する糖鎖も含まれる。本明細書においては、特にその中で、非還元末端側のＧｌｃＮＡｃにガラクトースが1分子結合した糖鎖構造を「Ｇ１複合型糖鎖（またはＧ１）」(代表例：図1の（C）および（D）)と、ガラクトースが２分子結合した糖鎖構造を「Ｇ２複合型糖鎖（またはＧ２）」（代表例：図1の（E））と、それら以外のガラクトースが全く結合していない場合を「Ｇ０複合型糖鎖（またはＧ０）」と称することとする。
【００２９】
尚、本明細書中の図１では、哺乳動物由来の抗体に見られる代表的なＮ-グリコシド結合複合型糖鎖の構造を示したが、これら糖鎖構造の還元末端のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にフコースが結合していない糖鎖の場合も、CDC活性は同等であることが既に示されており（非特許文献６）、特に断りが無い限り、本明細書で「Ｇ１複合型糖鎖」もしくは「Ｇ２複合型糖鎖」といった場合、フコースがない糖鎖も含めることとする。また、図1には記載がないが、上記のバイセクティング構造を有する場合もＧ１、およびＧ２の分類は、上記と同様とする。また、図２の中で示しているように、糖鎖構造（E）の非還元末端のガラクトースにシアル酸が付加した糖鎖構造も、「Ｇ２］に含めることとする。
【００３０】
これらＮ−グリコシド結合糖鎖も含めた抗体のＦｃ部分の構造は、当該抗体の抗原性に影響するのみならず、エフェクター機能を発現するためにも重要な部分であるとされている。
【００３１】
本発明の補体依存性生物活性を有する抗体を産生する方法によって産生される抗体としては、例えば、
(i) 抗体のＦｃ領域に結合しているＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の中で、Ｇ１およびＧ２複合型糖鎖の割合（該糖鎖の非還元末端の２つのＮ−アセチルグルコサミンの少なくとも一方にガラクトースが１分子結合しているものの割合）が少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、またはそれ以上である抗体；および
(ii) 抗体のＦｃ領域に結合しているＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の中で、Ｇ２複合型糖鎖の割合（該糖鎖の非還元末端の２つのＮ−アセチルグルコサミンの両方にガラクトースがそれぞれ１分子結合しているものの割合）が少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、またはそれ以上である抗体が含まれる。
【００３２】
（Ｎ−グリコシド結合糖鎖の生合成経路）
抗体に結合しているＮ−グリコシド結合糖鎖の生合成経路は、大きく３つのプロセスから構成されていると考えられている。すなわち、１）「リピド中間体またはコアオリゴ糖」と呼ばれる14個の糖がドリコールリン酸に結合した糖鎖の前駆体 （(Glc)3-(Man)9-(GlcNAc)2-P-P-Dol）の生合成のプロセス、２）オリゴ糖転移酵素によりリピド中間体から糖鎖部分（(Glc)3-(Man)9-(GlcNAc)2）をタンパク質のアスパラギン残基へ転移（オリゴ糖転移）を行うプロセス、そして、３）種々のグリコシダーゼ（糖加水分解酵素）および糖転移酵素により、タンパク上で糖鎖の修飾を行うプロセスで、それらが順次・連続的に進行する。このうち、１）および２）の過程は細胞内の小胞体という細胞内小器官で行われ、３）のプロセスは小胞体およびゴルジ体（同じく、細胞内小器官の一つ）で行われる。
【００３３】
特に、３）のプロセスでの修飾は種特異性があり、それぞれの種に固有の糖転移酵素が作用するため、下等な真核生物、植物、および動物で大きな違いがある。動物のＮ−グリコシド結合糖鎖は、5〜9個 のマンノース残基が付加した高マンノース型、GlcNAcや ガラクトース（Gal）、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）、フコース(Fuc)、シアル酸（Sia） などによって修飾された複合型、その中間体のような構造を持つ混成型などに分けられる。動物の中でもバイアンテナやトリアンテナなどの複合型糖鎖は、脊椎動物以外では見当たらない。
【００３４】
上記３）のプロセスでは、まず小胞体部分でαグルコシダーゼI  およびII、α-マンノシダーゼIおよびII等が作用し、次にゴルジ体部分に移ってα-マンノシダーゼIが作用し、Man残基が５個にまで減少した糖タンパク質が生成される。更に、ゴルジ体部分では、GlcNAcを付加するN-アセチルグルコサミン転移酵素I（GnTI）、２個のManを除去するα-マンノシダーゼII、およびN-アセチルグルコサミン転移酵素II（GnTII）が作用し、複合型糖鎖の基本構造（(Glc NAc)2-(Man)3-(GlcNAc)2 ）が形成される。更に、ゴルジ体部分では、還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースを付加するα-1,6-フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトースを付加するガラクトース転移酵素（Gal-T）、シアル酸を付加するN-アセチルノイラミン酸などのシアル酸転移酵素等が存在し、このような各種酵素の作用を受けてN-グリコシド結合糖鎖が生合成されることが知られている（Biol. Pharm. Bull., 2009 (vol.32) p767）。
【００３５】
一般に、糖タンパク質の糖鎖構造の改変には、(i)糖鎖の生合成酵素の阻害剤の応用、(ii)突然変異体の選択、および(iii)糖鎖生合成に関連する遺伝子の導入または欠失などが考えられる。ちなみに、(i)の事例としては、糖鎖のプロセシングに関与している各種グリコシダーゼの阻害剤に関する研究（J.Appl.Glycosci., 2006 (vol.53) p149 ）等がある。(ii)の事例としては、レクチン耐性株によるN-グリコシド結合糖鎖修飾の事例（特許第4741011）などがある。
【００３６】
本発明では、生産される抗体に付加された糖鎖の構造を改変（抗体の糖鎖組成を、Ｇ２ またはＧ１＋Ｇ２の割合を増加）させるために、上記Ｎ−グリコシド結合糖鎖の生合成経路の「３）のプロセス」の糖鎖修飾に係るガラクトース転移酵素（Gal-T）の安定発現を狙ったものである。本明細書の中では、遺伝子工学的な手法でヒト由来のβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ）活性を有するたんぱく質をコードする遺伝子を哺乳動物由来の宿主細胞に導入する手法を用いたが、本目的と同じ効果が期待できる手法であれば、遺伝子の変異手法、阻害物質/活性化物質による酵素反応の修飾なども本発明に含まれる。
【００３７】
（β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ））
本明細書では、「β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ）」とは、ＵＤＰ−ＧａｌからＧａｌを糖鎖末端のＧｌｃＮＡｃ残基に転移する酵素のことを意味する。この酵素には、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃという構造を形成する働きがある。本明細書中では、この酵素活性をβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ）活性と呼ぶものとする。この酵素については、アミノ酸配列のホモロジーや遺伝子バンクに登録された遺伝子断片の配列情報を利用して多くのファミリー遺伝子がクローニングされている。特に、Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ活性を有するヒト由来酵素に関しては、ヒトＢ４Ｇａｌ−Ｔ１のアミノ酸配列（配列番号８）（Swiss-Prot Accession No.: P15291）のホモログが存在し、Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ１との同一性の順番に従ってＢ４Ｇａｌ−Ｔ２（Swiss-Prot Accession No.: O60909），Ｔ３（GenBank Accession No.:CAH72145），Ｔ４（GenBank Accession No.:AAQ89367），Ｔ５（NCBI Accession No.:NP_004767），Ｔ６（NCBI Accession No.:NP_004766）と命名され、最近はＢ４Ｇａｌ−Ｔ７（NCBI Accession No.:NM_007255）も報告されている。それらのアミノ酸配列は、ヒトＢ４Ｇａｌ−Ｔ１のアミノ酸配列（配列番号８）と比較し、５５％〜２５％の同一性があると報告されている（Glycobiology, 1998 (vol.8) p517；Curr. Drug Targets, 2008 (vol.9) p292）。
【００３８】
また、各種動物由来のＢ４Ｇａｌ−Ｔ１ホモログも報告されており、例えば、ラット、マウス、ウシ、ブタ、パンダ等の各種哺乳動物のＢ４Ｇａｌ−Ｔ１ホモログ（NCBI Accession No.:NP_445739（ラット）、Swiss-Prot Accession No.: P15535（マウス）、Swiss-Prot Accession No.: P08037（ウシ）、NCBI Accession No.: XP_003130728（ブタ）、NCBI Accession No.: XP_002926218（パンダ））は、ヒトＢ４Ｇａｌ−Ｔ１のアミノ酸配列（配列番号８）と８０％以上の同一性を有する。
【００３９】
本明細書で、「β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ）活性を有するタンパク質」という場合、ヒト由来のＢ４Ｇａｌ−Ｔ１に限らず、Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ２，３，４，５，６等、各種動物由来のＢ４Ｇａｌ−Ｔ１活性を有する全ての酵素が含まれる。そのような酵素には、配列番号８のアミノ酸配列に対して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、元のタンパク質と実質的に同質の活性（すなわち、Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ活性）を有するタンパク質が含まれる。
【００４０】
本発明の１つの実施形態では、β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ）活性を有するタンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列を有するタンパク質；または配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の同一性を有するタンパク質であって、Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ活性を有するタンパク質である。
【００４１】
「実質的に同質の活性」とは、それらの活性が性質的に同等であることを示す。したがって、酵素活性が同等（例えば、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ活性の測定は、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：  ４６９２−４６９７,１９９９やＧｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：５８９−５９７，２００２などの文献に記載の公知の方法により、またはそれに準じる方法により行うことができる。
【００４２】
なお、アミノ酸配列やヌクレオチド配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８，１９９０；  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：  ５８７３，  １９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：  ４０３，１９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いてヌクレオチド配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００４３】
（ガラクトース）
本明細書では、「ガラクトース」とは、通常のガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）を意味し、化学式および分子量は、それぞれ、グルコースと同じＣ６Ｈ１２Ｏ６および１８０．０８である。立体配置は２位（Ｆｉｓｃｈｅｒ投影式で上から２番目）および５位の−ＯＨが同じ方向、３位および４位がその反対方向であり、Ｄ−ガラクトースは５位Ｄ−グリセルアルデヒドと同じ配向を有している。グルコースの４−エピマーである。天然ではＤ−ガラクトースがほとんどである。
【００４４】
（Ｎ−アセチルグルコサミン）
本明細書では、「Ｎ−アセチルグルコサミン」とは、通常のＮ−アセチルグルコサミン（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、ＧｌｃＮＡｃ、ＮＡＧ）を意味し、化学式および分子量は、それぞれＣ８Ｈ１５ＮＯ６および２２１.２１である。グルコースから誘導された単糖で、いくつかの生化学的機構にとって重要な物質である。化学的にはこの物質はグルコサミンと酢酸の間のアミドである。Ｎ−アセチルグルコサミンは、哺乳動物においては、糖タンパク質、ヒアルロン酸などグリコサミノグリカン（ムコ多糖）の成分となっている。Ｎ−アセチルグルコサミンは、アスパラギンマンノースを中心とするオリゴ糖鎖が結合するＮ結合型糖タンパク質の骨格をなすほか（キトビオース構造）、更に複雑構造を有する糖鎖の主要構成糖である。
【００４５】
（フコース）
本明細書では、「フコース」とは、通常のフコース（ｆｕｃｏｓｅ）を意味し、デオキシ糖の一種である６−デオキシ−ガラクトースであり、化学式Ｃ６Ｈ１２Ｏ５、分子量１６４．１６で六炭糖、単糖に分類される。天然にはＬ型がＬ−フコシドの形で、動植物に幅広く存在する。哺乳動物および植物では細胞表面のＮ結合糖鎖上で見つかる。
【００４６】
（ポリヌクレオチド）
本明細書では、「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が２個以上結合した分子を意味する。ポリヌクレオチドと他のポリヌクレオチドが「機能的に連結されている」とは、各々のポリヌクレオチドが有する機能が損なわれることなく、しかも連結によって所望の機能が発揮しうる状態が確保されている状態を意味する。具体的には、一方のポリヌクレオチドの３’端ヌクレオチドと他方のポリヌクレオチドの５’端ヌクレオチドが直接、または他のリンカー配列を介して結合している状態をいう。
【００４７】
（タンパク質をコードする遺伝子）
本明細書では、「タンパク質をコードする遺伝子」とは、タンパク質をコードする領域（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドであり、例えばタンパク質遺伝子のｃＤＮＡである。そのため、「抗体のＨ鎖をコードする遺伝子」または、「抗体のＬ鎖をコードする遺伝子」とは、抗体のＨ鎖またはＬ鎖をコードする領域（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドであり、例えばこれらをコードする遺伝子のｃＤＮＡである。
【００４８】
本発明において使用されるＢ４Ｇａｌ−Ｔタンパク質をコードする遺伝子には、配列番号７のヌクレオチド配列を有する遺伝子、または配列番号７のヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する遺伝子が含まれる。
【００４９】
（ハイブリダイゼーション条件）
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ．  ２００１）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００５０】
本発明において使用されるＢ４Ｇａｌ−Ｔ１タンパク質をコードする遺伝子にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号７の塩基配列と、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００５１】
（RT-PCR）
RT-PCRとは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）のことで、mRNA を鋳型に逆転写を行い、生成された cDNA に対して PCR を行う方法である。PCR法では鋳型となる DNA にプライマーを付着させ、DNAポリメラーゼによって目的のプライマー配列にはさまれる DNA を特異的に検出する。PCR法は DNA の検出に用いることは可能であるが、RNA の検出をすることができない。そこで、RNA を逆転写によって cDNA に変換し、その cDNA に対して PCR法を行う。本手法は、 例えば、レトロウイルスなどのRNAウイルスの検出、特定の遺伝子の遺伝子発現（ｍRNAへの転写）の検出等の目的に用いられる。
【００５２】
（補体および補体依存性生物活性）
補体（complement）は、動物血液中に含まれる免疫反応を媒介する血中タンパク質の一群で、補体成分はC1〜C9で表され、C1にはさらにC1q、C1r、C1sの３つの、その他はC5a、C5bといったように２つのそれぞれサブタイプが存在する。さらに、C1〜C9の補体タンパク質以外にB因子、D因子などを含めた16種類のタンパク質、液性の5つの調節因子、および細胞膜上の4種類の調節因子などのタンパク質も補体の機能の発現・調節に関与しており、これらを総称して補体系と呼ぶ。補体系は、生体が病原体を排除する際それを補助する生化学的カスケードである。補体系の活性化には3つの生化学的プロセスがある：古典経路、副経路、マンノース結合レクチン経路である。特に、古典（的）経路(classical pathway)とは、C1の活性化に始まる経路のことで、抗体抗原複合体に補体C1qが結合することでC1が活性化する。以降も基本的に数字順に活性化するが、C4は例外的に２番目に来る。『C1→C4→C2→C3b→C5b』まで活性化され、あとはC5bにC6〜C9が次々と結合、最終的にC5b6789にまでなる。C5b6789は「細胞膜障害性複合体」といわれ、病原微生物等の表面に取り付き細胞膜を破壊する。リツキシマブなどの抗腫瘍抗体の有する補体依存性細胞障害作用においても、同様な補体系の活性化がおき、補体の「細胞膜障害性複合体」による作用で最終的には細胞膜に穴があき、細胞を破壊すると考えられている。
【００５３】
本明細書において、「補体依存性生物活性」とは、補体依存性細胞障害作用、補体依存性のウイルス中和活性など、上記の様に抗体抗原複合体が、補体系の活性化を引き起こし、生じた補体系の成分が癌細胞や病原微生物もしくはそれらが感染した細胞を障害することにより認められる生物活性を指す。
【００５４】
（CDC活性）
本明細書において、「補体依存性細胞障害活性（complement-dependent cytotoxicity：CDC活性）」とは、補体依存性生物活性の１つで抗体抗原複合体により活性化した補体系による細胞障害活性を意味する。また「細胞障害活性」とは、個々の細胞の増殖を遅くすることであってもよいし、細胞の死を誘導することであってもよい。その活性は、当業者であれば、通常の生細胞数の測定法などで、評価可能である。
【００５５】
（ウイルス中和活性）
本明細書において、抗体の「ウイルス中和活性」とは、抗体によりウイルスの宿主細胞に感染・増殖する能力が阻害される活性であり、当該活性が補体依存的に認められる場合を、補体依存性ウイルス中和活性と呼ぶ。本活性は、通常のウイルス中和活性評価法で測定が可能である。ウイルスの中和活性評価においては、ウイルスの感染能力を５０％阻害する抗体濃度（IC50）でその活性の強さを表示する。抗体医薬分野で好ましい抗ウイルス抗体とは、通常IC50が１０μg/ml以下、好ましくは５μg/ml以下、より好ましくは1μg/ml以下である。
【００５６】
（補体依存性生物活性を有する抗体）
本明細書において、「補体依存性生物活性を有する抗体」とは、補体依存性細胞障害作用、補体依存性のウイルス中和活性などを有する抗体で、それらはin vitroで評価する際、補体依存的に中和活性・細胞障害活性を有する抗体群をさす。各種文献では、complement-dependent cytotoxicityのみならずcomplement-mediated cytotoxicityとの表現で記載されている場合もある。これら補体依存性生物活性を有する抗体には、多くの抗腫瘍活性を有する抗体、抗アレルギー/抗炎症性活性を有する抗体、および抗感染症/抗ウイルス活性を有する抗体などが含まれる。
【００５７】
例えば、抗腫瘍活性を有する抗体の例としては、抗CD20抗体（非特許文献10）、抗GD2抗体(Cancer Res., 2005 (vol.65) p10562)、抗GD3抗体(Cancer Immunity, 2002 (vol.2) p13)、抗HER2抗体(British J. Cancer, 2004 (vol.91) p1195)、抗CD52抗体(Clin. Cancer Res., 2008 (vol.14) p569)、抗EGFR(Cancer Res., 1986 (vol.46) p5592、抗HLA-DR抗体(Mol. Cancer, 2011 (vol.10);42)などがあげられる。また、抗アレルギー/抗炎症性活性を有する抗体としては、抗TNF-α抗体(Arthritis & Rheumatism, 2008 (vol.58) p1248)などがあげられる。
【００５８】
さらにまた、抗感染症/抗ウイルス活性を有する抗体としては、抗VZV抗体（J. Gen. Virol., 1991 (vol.72) p2065）, 抗CMV抗体(WO2007/084423, Virology, 1993 (vol.197) p143)、抗gp120抗体(J. Virol., 1996 (vol.70)p1100)、抗GM2抗体(J. Immunol., 1999 (vol.162) p533)などがあげられる。
【００５９】
なお、抗体の「補体依存性生物活性」は、例えば、後述する実施例に示すような方法によって測定することができる。
【００６０】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖がＢ４Ｇａｌ−Ｔ活性により修飾されている本発明の補体依存性生物活性を有する抗体を産生する方法によって産生される抗体としては、例えば、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖がＢ４Ｇａｌ−Ｔ活性により修飾されていない抗体と比較して、少なくとも１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、またはそれ以上高い補体依存性生物活性を示す抗体が含まれる。
【００６１】
（安定的に発現する細胞）
本明細書中、ある遺伝子またはタンパク質の「発現」とは遺伝子に担持された特定タンパク質の遺伝情報がmRNAに転写され、タンパク質として翻訳されることを意味する。また、ある遺伝子またはタンパク質を「安定的に発現する」とは、ある遺伝子またはタンパク質を一過性にのみ発現することと対比する意味で用いられる。したがって、ある遺伝子またはタンパク質を「安定的に発現する細胞」とは、ある遺伝子またはタンパク質を一過性ではなく安定的に（継続的に）発現する細胞を意味する。そのような細胞には、人為的に外部からある遺伝子を導入した細胞であって該遺伝子を安定的に発現している細胞、および元々（または内因的に）ある遺伝子を安定的に発現している細胞が含まれる。
【００６２】
（宿主細胞）
本発明の宿主細胞としては、抗体分子のFc領域に結合するN-グリコシド結合糖鎖の修飾に係わる酵素または酵素群の遺伝子を、遺伝子工学的な手法を用いて導入した、酵母、植物細胞、昆虫細胞、脊椎動物細胞等の細胞を宿主細胞として用いることもできる。しかしながら、酵母、カビ、植物、および昆虫等の下等な真核生物では、糖タンパクを修飾する糖鎖が哺乳動物とはあまりにもかけ離れており、脊椎動物由来の細胞（本明細書中、単に「動物細胞」ということがある。）がより好ましい。さらにまた、各種動物由来のイムノグロブリンの糖鎖構造の類似性を考慮すると、哺乳動物由来の細胞がさらにより好ましい。特に、哺乳動物細胞の中でも、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa）細胞、サルの細胞であるCOS細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣組織由来の細胞であるCHO細胞、ラットミエローマ細胞（例えばYB2/3HL細胞）、マウスミエローマ細胞（例えばNSO細胞、SP2/0細胞）、シリアンハムスター腎臓由来細胞（例えばBHK細胞）、胚性幹細胞、受精卵細胞等などがさらに好ましい。
【００６３】
以下に、本発明の主要な部分の操作方法（遺伝子の取得、安定発現株の作製、細胞培養、およびタンパク質精製等）に関して、それらの限られた事例を概説するが、必ずしも以下に記載の方法に限定されず、本発明の意図を実現するために、現在の科学・技術水準で当業者が使用可能な方法であれば、いずれの方法でもよい。
【００６４】
２．抗体遺伝子の取得
抗体遺伝子の取得には抗体を産生する細胞を材料とする。材料となる細胞にはヒトのBリンパ球やマウスの脾臓リンパ球など抗体を産生する細胞があげられ、また、そのような細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマも材料となる。
【００６５】
例えば、ヒトの血液からBリンパ球を分離し、該Bリンパ球の増殖を誘導する。増殖誘導の方法自体は公知であり、例えば、誘導に必要なサイトカインや刺激剤を使用したり、ガンの誘因因子となる「エプスタイン・バールウイルス（ＥＢウイルス）」（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）（以下、ＥＢＶと称す）を用いたトランスフォーム法（D.Kozborら）により、行うことができる。即ち、上記Bリンパ球をＥＢＶに感染させて増殖誘導し、増殖させた細胞を抗体産生細胞ライブラリとする。
【００６６】
増殖誘導させた細胞からモノクローナル抗体を回収する方法はモノクローナル抗体の作製において常用されている周知の方法により行うことができる。前記抗体産生細胞ライブラリの中から特定の抗原に結合する抗体を産生するリンパ球を選別する。選別の方法は、限界希釈法によりクローン化する方法や、セルマイクロアレイ法により単個細胞を回収する方法、FACSソーティング法により目的の抗体を産生する細胞を染色し、ソーティングで回収する方法などがあげられる。
【００６７】
特定の抗原と結合する画分の検出には、特定の抗原を用いたＥＬＩＳＡや免疫染色、特定の抗原を発現する細胞を用いた免疫染色、また、特定の抗原に結合することによって発現する抗体の活性（中和活性）を測定する方法を採用できる。
【００６８】
上記で得られた目的の抗体を産生する細胞集団からtotal−RNAを抽出し、Oligo-dTプライマーを用いて逆転写反応によりcDNAを合成する。このcDNAを鋳型としてPCR法による抗体遺伝子の増幅を行う。PCRに使用するプライマーは、抗体のH鎖およびL鎖をコードする遺伝子情報のデータベースをもとに設計する。抗体の遺伝子は全長を増幅してもよいし、可変部領域のみを増幅し、既知の定常部領域遺伝子と機能的に連結してもよい。
【００６９】
上記は、新規なヒト抗体をクローニングする事例であるが、抗体の遺伝子配列が既知であるモノクローナル抗体に関しては、当業者であれば、例えばGenBankに登録され公開されている当該遺伝子情報、公開特許情報等をもとに構築することが可能である。
【００７０】
３．塩基配列に基づく抗体のアミノ酸配列の決定
PCR法により増幅した抗体H鎖およびL鎖のcDNAをプラスミドベクターに挿入し、ABIシークエンサーによりそれぞれの塩基配列を確認する。得られた塩基配列より、抗体H鎖およびL鎖のアミノ酸配列を決定する。
【００７１】
４．β1,4−galactosyltransferase（B4Gal-T）遺伝子の取得
B4Gal-T遺伝子は、B4Gal-Tを発現している動物細胞のcDNAからPCR法により増幅する。選択する酵素により、当該酵素をコードする遺伝子を増幅するのに適したプライマーを作製、PCRにより増幅する。B4Gal-T遺伝子を適切なプラスミドベクターに挿入し、シークエンサーにより塩基配列を確認する。
【００７２】
５．抗体安定発現株の作製法
取得したH鎖およびL鎖の遺伝子は、ダブルジーンベクター作製用に構築されたベクターに挿入する。ダブルジーンベクターは適切な細胞に導入し、当該ダブルジーンベクター上の選択マーカーを使用して、ベクターの導入に成功した細胞クローンを選抜する。
【００７３】
例えば、ダブルジーンベクター作製用に構築されたベクターにH鎖およびL鎖の遺伝子を挿入後、抗体産生に適した細胞（例えばCHO-K1やNS0）に導入し、当該ダブルジーンベクター上の選択マーカー（例えば、GS選択）で、ベクターの導入に成功した細胞クローンを選抜する。
【００７４】
選抜した細胞は目的の抗体を産生しているかを確認する。抗体産生の確認には、上記で示した特定の抗原と結合する画分の検出方法や抗体定量ELISAが使用できる。
【００７５】
６．B4Gal-T安定発現株の作製法
取得したB4Gal-T遺伝子は適切な発現ベクターに挿入する。B4Gal-T発現ベクターは、適切な細胞に導入し、ベクター上の選択マーカーを使用して、ベクターの導入に成功した細胞クローンを選抜する。
例えば、遺伝子発現に適したベクター（pcDNA3.1,Invitrogen）にB4Gal-T遺伝子を挿入し、上記と同様に抗体産生に適した細胞（例えばCHO-K1やNS0）に導入し、当該ダブルジーンベクター上の選択マーカー（Geneticin）でベクターの導入に成功した細胞クローンを選抜する。
選抜した細胞はB4Gal-T遺伝子を発現しているかを確認する。
【００７６】
７．β1,4−galactosyltransferase（B4Gal-T）遺伝子発現の確認
B4Gal-T遺伝子の発現を確認する方法としてはRT-PCRをもちいる。具体的には、B4Gal-T発現ベクターを導入し、選抜した細胞からtotal-RNAを分離し、逆転写酵素によりcDNAに変換後、B4Gal-T遺伝子をPCRにより増幅し検出する。
【００７７】
例えば、cDNAの合成にはCells-to-cDNA IIKit (Ambion)を使用し、合成したcDNAを鋳型にして、B4Gal-T１遺伝子のPCRによる増幅を行う。また同時に、GAPDH遺伝子のPCRによる増幅を行う。GAPDH遺伝子は発現量が一定していることからRT-PCRにおいて発現量を比較するためのコントロールとする。
【００７８】
尚、増幅に使用するPrimerを以下に示す(表１)。B4Gal-T１遺伝子の増幅にはクローニングに使用した2種のPrimer（配列番号1/配列番号2）を使用し全長を増幅するか、もしくは、Primer（配列番号3/配列番号4）を使用してB4Gal-T１遺伝子の一部を増幅する。GAPDHの増幅にはPrimer（配列番号5/配列番号6）を使用し、GAPDH遺伝子の一部を増幅する。Primer（配列番号5/配列番号6）はヒトGAPDH増幅用であるが、CHO由来GAPDHの増幅に適用できる。
【表１】
2012105699.tif 000002
【００７９】
８．抗体/B4Gal-T同時安定発現株の作製法
抗体/B4Gal-T同時安定発現株は上記、抗体安定発現株の作製法とB4Gal-T安定発現株作製法を2段階に分けて行う。即ち、作製した抗体安定発現株にB4Gal-T遺伝子を導入し、選抜するか、もしくは作製したB4Gal-T安定発現株に抗体遺伝子を導入し、選抜する。この際、2段階の選抜で使用する選択マーカーは異なるものを使用する。但し、１つの発現ベクターに抗体のH鎖/L鎖の遺伝子およびB4Gal-T遺伝子をすべて挿入した場合は、上記、抗体安定発現株の作製法と同様に、1段階1選択マーカーで抗体/B4Gal-T同時安定発現株を選抜することが可能である。
【００８０】
９．抗体の産生および精製法
上記で得られた抗体安定発現株を用いて抗体を産生・精製する工程としては、一般的な抗体の生産・精製方法を用いることにより、均一な抗体を取得することができる。例えば、上記抗体安定発現株もしくは抗体/B4Gal-T同時安定発現株は無血清培地中で培養し、抗体を含む培養上清を回収し、精製の材料とする。抗体の精製は、ProteinAもしくはProteinGカラムを使用し、アフィニティー精製により行う。精製条件はカラムメーカー推奨条件とする。また、スモールスケールで抗体精製を行う場合は、ProteinAもしくはProteinGの磁気ビーズを使用する。精製条件は磁気ビーズメーカーの推奨条件とする。
【００８１】
１０．糖鎖の解析法
本発明における糖鎖の解析には、糖鎖を同定と定量することが含まれる。糖鎖の同定とは、解析対象試料に含まれる１つまたは複数の糖鎖成分を特定することである。糖タンパク質の糖鎖を同定する方法としては、糖タンパク質から糖鎖を分離し、得られた糖鎖の質量分析を行い、次いで得られた検出結果に基づいて糖鎖解析を行い、糖鎖を同定する方法があげられる。
【００８２】
また、糖鎖を定量には、例えば分析の対象となる試料に含まれる２以上の糖鎖の量比（モル比）を求めることを包含する。具体的にはＩｇＧまたはそのＦｃに結合する２以上の糖鎖の量比を求めることをいう。
【００８３】
本発明における糖鎖の検出とは、例えば質量分析で検出されたＦｃ部分由来の糖ペプチドのピークの大きさの比を計算することにより、ＩｇＧまたはそのＦｃに結合する糖鎖の定量を行うことができる。ピークの大きさは、例えば、ピークのある質量範囲の面積またはピーク全部の面積を指標として測定してもよいし、ピークの高さを指標として測定してもよい。
【００８４】
本発明において使用される糖鎖の質量分析の方法は当該分野において周知であり（丹羽、最新のマススペクトロメトリー、化学同人（１９９５））、エレクトロスプレー（ＥＳＩ）法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法を始めとした任意のイオン化手法を使用することができる。また質量分析には、飛行時間型（ＴＯＦ）、四重極型、磁場型など、任意の質量分離方式を使用することができるが、ＴＯＦを用いた方法が好ましく用いられる。
【００８５】
本発明においてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳとは、Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒの略語である。ＭＡＬＤＩとは、田中らによって見いだされ、Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐらによって開発された質量分析の技法である。この方法では、試料とマトリックス溶液を混合した後、混合溶液をプレート上で乾固し、結晶状態にする。パルスレーザー照射により、大きなエネルギーがマトリックス上に与えられ、（Ｍ＋Ｈ）＋、（Ｍ＋Ｎａ）＋などの試料由来イオンとマトリックス由来イオンとが脱離する。
【００８６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳは、ＭＡＬＤＩを利用して飛行時間を元に質量を測定するものであり、島津製作所のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ  ＡＸＩＭＡシリーズの機種やＢｒｕｋｅｒ社の ＡＵＴＯＦＬＥＸなどの質量分析計を使用することができる。
【００８７】
１１．抗体の活性の評価法
抗体がどの様な抗原と結合するか、どの様な生物活性を有するかにより、その活性測定法は決められる。例えば、ウイルスに対する抗体の活性評価法としては、「免疫染色法」と「プラーク法」によるウイルス中和活性評価法が代表的な方法である。また、抗腫瘍性抗体のように細胞膜上に存在する抗原を認識する抗体の場合、当該抗原を特異的に発現している細胞を用い活性を評価する。以下、それらについて述べるが、あくまでも1事例である。補体依存性の生物活性を求める際は、下記の系に抗体と同時もしくは抗体添加の後に補体を添加して評価する。
【００８８】
（１）免疫染色法
抗ウイルス抗体中和活性評価法の1つとして、免疫染色法が知られている。方法を要約すると以下の通りである。ウイルス液に精製抗体と補体を加えて適切な温度で1時間おき、その後、宿主細胞に接種する。接種後適切な時間培養し、その後、細胞は2回洗浄する。続けて適切な時間培養した後、ウイルス感染細胞で発現する特定のタンパク質に対する抗体で免疫染色を行い、染色された細胞を感染細胞数としてカウントする。感染細胞数の減少で感染阻止率を評価する。
【００８９】
（２）プラーク法
ウイルスの中和活性評価法の1つとして、プラーク法が知られている。古典的な方法で、細胞を塗布したプレート上で増殖したウイルスがプラークを形成することをもちいる。方法を要約すると以下の通りである。ウイルス液に精製抗体と補体を加えて適切な温度で1時間おき、その後、宿主細胞に接種する。適切な時間培養後、細胞は2回洗浄する。次に細胞は寒天もしくはメチルセルロースを含む培地を重層し、培養する。
【００９０】
ウイルス感染細胞の死による明瞭なプラークの形成が確認されるまで培養した後、細胞を固定化し、適切な染色試薬で染色する。染色後、プラーク数をカウントし、プラークの減少で感染阻止率を評価する。
【００９１】
（３）抗体のCDC活性評価法
抗体のCDC活性の評価法は、細胞膜上に存在する抗原を認識する抗体について行い、当該抗原を特異的に発現している細胞を用い活性を評価する。対象となる細胞は培地で2回洗浄後、適当数をプレートに播種する。細胞に抗体を添加後、適切な温度で30分〜1時間インキュベーター内に置く。その後、補体を添加し、2〜3時間インキュベーター内に置く。その後、MTTアッセイ法やWST-1アッセイ法による生細胞数評価を行い、抗体の補体依存性細胞障害活性により死滅した細胞数を評価する。
【００９２】
以下、本発明を、全く異なった抗原に対する2種類の抗体での実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。本実施例において使用する手順は、特に言及しない限り、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) (Sambrookら、Cold Spring Harbour Laboratory Press，2001）で参照することができる。
【実施例１】
【００９３】
（抗CMV抗体における定常領域Nグリコシド結合糖鎖の修飾の効果）
材料と方法
1．抗体遺伝子クローニングと抗体安定発現株の作製
抗CMV抗体産生LCL（lymphoblastoid Cell Line）からtotal-RNAを抽出し（TRIzol試薬，Invitrogen）、逆転写反応によりcDNAを合成した（SuperScriptII，Invitrogen）。PCRで増幅した抗体遺伝子（H鎖およびL鎖）はTAクローニングし（pGEM-T easy，Promega）、抗体遺伝子配列を決定した（WO2007/094423中の「G3D  No.9」の配列参照）。その後、抗体遺伝子（H鎖およびL鎖）はダブルジーンベクター作製用に構築されたベクターに挿入した。当該ダブルジーンベクターはCHO-K1細胞に導入し、Glutamine Synthetase（GS）選択培地（SAFC）で選抜を行い、抗体安定発現株をクローニングした。CHO-K1細胞の選抜にはGS阻害剤であるMethionine Sulfoximine（MSX, SIGMA）（final 2.5μM）を添加した。【００９４】
2．CHO-K1細胞産生抗CMV抗体の糖鎖修飾
β1,4−galactosyltransferase（B4Gal-T１）遺伝子は抗CMV抗体産生LCLのcDNAからPCR法により増幅した。使用したプライマー配列は以下のとおり。
B1,4GT-Fw: 5’-CACCCTTCTTAAAGCGGCGG-3’  （配列番号１）
B1,4GT-Rv: 5’-GTACCAAAACGCTAGCTCGG-3’  （配列番号２）【００９５】
PCR産物はpcDNA3.1D/V5-His-TOPOベクター（Invitrogen）にクローニングし、シークエンスを解析し(配列番号７および８)、B4Gal-T１タンパク（Swiss-Prot Accession No.: P15291）をコードする遺伝子（NCBI Accession No.：NM_001497）であることを確認した。B4Gal-T１発現ベクターは抗CMV抗体安定発現クローン（CHO-K1細胞）に導入し、MSX添加GS選択培地中でGeneticin（Gibco）（final 800μg/ml）による選抜を行い、抗CMV抗体およびB4Gal-T１を同時安定的に発現するクローンを得た。B4Gal-T１の発現確認はRT-PCRで行った。その中からB4Gal-T１の発現が良好な1クローンを選択し、産生抗体の精製を行った。また、B4Gal-T１発現ベクター導入前の抗CMV抗体安定発現クローンの産生する抗体についても同様に精製を行った。【００９６】
3．抗体精製
抗体精製はアフィニティーカラム（HiTrap rProteinA FF，GE Healthcare）を使用し、推奨の方法で行った。カラム溶出後の抗体はPBS（-）で透析し、UV法により濃度を決定した。精製後の抗体はSDS-PAGEに供し、抗体重鎖（約50kDa）および軽鎖（約25kDa）を確認した。【００９７】
4．糖鎖解析
抗体の糖鎖解析は株式会社グライエンスに外注した。解析は抗体を前処理後（脱塩，減圧乾燥）、タンパク質を変性させ、グリコペプチダーゼAによるタンパク質からの糖鎖の分離とペプシンによるタンパク質分解を同時に行った。さらにプロナーゼによるタンパク分解を経て、P2ゲル濾過カラムにより糖鎖とアミノ酸を分離した。オルシノール硫酸法により糖鎖画分を確認し、回収後、減圧乾燥した。分離した糖鎖はピリジルアミノ化（PA化）するため、糖鎖と2-アミノピリジンを結合させ、還元後にSephadex-G15ゲル濾過カラムでPA化糖鎖と余剰2-アミノピリジンを分離した。【００９８】
1次解析として、PA化糖鎖はDEAE陰イオン交換クロマトグラフィーにより中性糖とモノシアリル化糖、ジシアリル化糖の分離を行った。さらに、各画分は減圧乾燥後、ODSクロマトグラフィーにより糖鎖の分離を行い、各ピークをMALDI-TOF-MSにかけ、分子量から糖鎖か否かを確認した。【００９９】
2次解析として、糖鎖と判定した各ピークは順相Amideクロマトグラフィーにより分離した。ODSカラムとAmideカラムにより求めたGlc．Unit（GU）値と分子量から、糖鎖解析ソフトGALAXYにより候補糖鎖の絞り込みを行った。最終的にODSクロマトグラフィーに標準品と各ピークを共打ちし、糖鎖構造を同定した。【０１００】
5． CMVの調製
HEL細胞は10％FCS添加イーグルMEMを使用し、75mlフラスコで培養した。培地を除去後、5-10倍希釈したウイルス液（CMV AD169株）を1ml添加し、インキュベーター内で1時間ウイルスを吸着させた。ウイルス液を除去後、5％FCS添加イーグルMEMを15ml添加し、細胞変性効果（CPE）がみられるまで、2-3日毎に培地を交換しながら培養した。90％以上の細胞にCPEが観察されたら培地を交換し、さらに1日間培養した。感染細胞は培地の半量を除去後、滅菌ガラスビーズでフラスコから剥離して浮遊させ、プラスチックチューブに移した。その後、氷上で冷却しながら30秒間超音波処理して細胞を破砕し、3000rpm、15分間の遠心分離後、上清（ウイルス液）を回収した。回収したウイルス液は終濃度35％となるようソルビトールを添加し、分注後、−80℃に保存した。【０１０１】
6．中和活性評価
プラークアッセイ： CMV（AD169株）は10％FCS添加イーグルMEM（10%FCS-MEM)で1000PFU/100μlとなるように希釈した。精製抗CMV抗体は10%FCS-MEMで4倍段階希釈した。補体存在下での測定の場合は、抗体の希釈は10％モルモット補体を加えた10%FCS-MEMで同様に抗体を希釈した。ウイルスと抗体を等量で混和し、37℃で1時間反応させた。HEL細胞は10%FCS-MEM を使用して35mmシャーレで培養し、ウイルス接種前に培地を除き、0.3mlの10%FCS-MEMを添加した。ウイルスと抗体の反応液はHEL細胞に50μlずつ接種し、37℃で1時間の吸着後、10%FCS-MEMで洗浄し、1％メチルセルロースを含む10%FCS-MEMを重層して10日間培養した。測定はメチルセルロースを除去後、メチレンブルーで染色し、顕微鏡下でプラーク数をカウントした（参考文献：Masuho,Y.et al., J. Gen. Virol., 68,p1457-1461(1987)）。アッセイは3回ずつ行い、プラーク数の平均を算出した。【０１０２】
免疫染色： CMV（AD169株）は希釈バッファー[5％FCS添加PBS（-）]で2000PFU/100μlとなるように希釈した。精製抗CMV抗体は希釈バッファーで4倍段階希釈した。モルモット補体は希釈バッファーで5倍に希釈した。抗体と補体を等量で混和したものをウイルス液と等量で混和し、4℃で1時間反応させた。MRC-5細胞は10％FCS添加MEM-αを使用し、96ウェルハーフエリアプレートにおいて100μl/wellで培養した。ウイルスと抗体の反応液はMRC-5細胞に25μlずつ接種し、 37℃で1時間の吸着後、10％FCS添加MEM-αで2回洗浄し、20時間培養した。感染細胞の検出はCMV-IE1の染色で行った。細胞から培地を除去し、100％エタノールで20分間固定後、PBS（-）で10分間浸水化し、ブロッキング試薬[PBS（-），1％BSA，0.1％Tween20]で10分間ブロッキングした。IE1抗体（MAB810R，Millipore）は抗体希釈バッファー[PBS（-），0.1％Goat Serum，0.1％Tween200] で0.1μg/mlに希釈し、1次抗体として1ウェル25μlずつ添加して37℃で1時間反応させた。洗浄バッファー[PBS（-）， 0.1％Tween200]で3回洗浄後、2次抗体としてビオチン化標識anti-mouse IgG（115-065-062，Jackson）を抗体希釈バッファーで1000倍に希釈し、1ウェル25μlずつ添加して37℃で30分間反応させた、洗浄バッファーで3回洗浄後、Streptavidin-peroxidase（SIGMA）を抗体希釈バッファーで1000倍に希釈し、1ウェル25μlずつ添加して37℃で30分間反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄後、True Blue peroxidase substrate（KPL）を1ウェル25μlずつ添加して室温で15分間発色させた。蒸留水で洗浄後、100％エタノールで1回洗浄し、暗所で乾燥させた。感染細胞（CMV-IE1陽性細胞）は顕微鏡下でカウントした（参考文献：Abai, et al., J. of Immunol. Methods 322 p82-93（2007））。アッセイは2回行い、感染細胞数の平均を算出した。【０１０３】
結果
抗CMV抗体（G3D-LCL：LCL由来抗体，G3D-CHO：CHO-K1細胞由来抗体，G3D-CHO+Gal：糖鎖にガラクトースを付加したCHO-K1細胞由来抗体）の抗体定常領域のNグリコシド結合糖鎖の構造を解析した。結果を図２に示す。各糖鎖の割合を百分率で示す。1％以下の糖鎖はその他に分類した。糖鎖構造はガラクトース末端数に応じてＧ０、Ｇ１、およびＧ２に分類した。混成型糖鎖と推定される糖鎖は区分ごとに1つに分類した。糖鎖構造の表記はフコース（★）、 Nアセチルグルコサミン（●）、マンノース（■）、ガラクトース（▲）、シアル酸（Nアセチルノイラミン酸）（◆）とした。複合型糖鎖の結合様式の表記は省略した。アセチルノイラミン酸の結合様式はα2-6結合であった。【０１０４】
抗体定常領域に結合するNグリコシド結合糖鎖の末端構造はLCL由来抗体（G3D-LCL）では大半をG2が占めていた。また、モノシアリル化糖が25%存在した。一方、CHO-K1細胞由来抗体（G3D-CHO）では大半がG0であったが、糖鎖修飾後（G3D-CHO+Gal）では7割以上がG2となり、糖鎖修飾に成功した。【０１０５】
抗CMV抗体（G3D-LCL：LCL由来抗体，G3D-CHO：CHO-K1細胞由来抗体，G3D-CHO+Gal：糖鎖にガラクトースを付加したCHO-K1細胞由来抗体）およびコントロール抗体（hIgG）の中和活性評価を補体存在下で行った（プラークアッセイおよび免疫染色）。プラーク数および感染細胞数はコントロールアッセイでの数を100として百分率で算出した。【０１０６】
図３に、中和活性評価の結果を示す。 G3D-LCLのIC50は1.2μg/mlであったのに対し、G3D-CHOのIC50は46.2μg/mlとなり、中和活性に大きな違いが認められた。しかし、 G3D-CHO+Galでは中和活性はIC50で2.5μg/mlにまで回復した。よって、B4Gal-T１導入細胞では、CHO-K1細胞由来抗体へのガラクトース付加により、中和活性が増強し得ることが示された。
【実施例２】
【０１０７】
（抗CD20キメラ抗体における定常領域Nグリコシド結合糖鎖の修飾の効果）
材料と方法
１．抗CD20キメラ抗体（Rituxan）遺伝子の合成と抗体安定発現株の作製
抗CD20キメラ抗体（Rituxan）をコードする遺伝子をクローニングするため、当該抗体H鎖の可変領域のヌクレオチド配列（GenBank Accession No.AR000013）を16本のDNA断片として合成した（表2）。各DNA断片は約45塩基からなり、奇数番号のDNA断片はセンス方向、偶数番号のDNA断片はアンチセンス方向とし、それぞれ隣り合うDNA断片と15塩基が相補的に重なるように設計した。これらのDNA断片をすべて混合し、RTX-H01とRTX-H16を増幅Primerとして、全長をPCR法により増幅した。また、当該抗体L鎖の可変領域（GenBank Accession No.AR015962)およびヒトκ鎖の一部定常領域のヌクレオチド配列も同様に合成し（表3）、RTX-K01とRTX-K20を増幅PrimerとしてPCR法により増幅した。H鎖の増幅断片は制限酵素処理（HindIII,ApaI）後、ヒトIgG1 H鎖の定常領域を含むベクターに組み換え、キメラ抗体遺伝子としてクローニングした。一方、L鎖の増幅断片は制限酵素処理（HindIII,BbvCI）後、ヒトκ鎖の定常領域の一部を含むベクターに組み換え、キメラ抗体遺伝子としてクローニングした。その後、キメラ抗体遺伝子（H鎖およびL鎖）はダブルジーンベクター作製用に構築されたベクターに挿入した。【０１０８】
次に、当該ダブルジーンベクターをCHO-K1細胞に導入し、Glutamine Synthetase（GS）選択培地（SAFC）で選抜を行い、Rituxan安定発現株をクローニングした。CHO-K1細胞の選抜にはGS阻害剤であるMethionine Sulfoximine（MSX, SIGMA）（final 2.5μM）を添加した。
【表２】
2012105699.tif 000003
【表３】
2012105699.tif 000004
【０１０９】
2．CHO-K1細胞産生Rituxanの糖鎖修飾
B4Gal-T１発現ベクター（実施例1,材料と方法2．）はRituxan安定発現クローン（CHO-K1細胞）に導入し，MSX添加GS選択培地中でGeneticin（Gibco）（final 1200μg/ml）による選抜を行い、RituxanおよびB4Gal-T１を同時安定的に発現するクローンを得た。B4Gal-T１の発現の確認はRT-PCRで行った。その中からB4Gal-T１の発現が良好な2クローン（RTX-1,RTX-2）を選択し、産生抗体の精製を行った。また、B4Gal-T１発現ベクター導入前のRituxan安定発現クローンの産生する抗体についても同様に精製を行った。【０１１０】
3．Rituxanおよび糖鎖修飾Rituxanの精製
いずれの抗体も、精製にはProteinA Magnetic Beads（PureProteome，Millipore）を使用し、推奨の方法で行った。詳しくは、抗体産生細胞は無血清培地で培養し、回収した培養上清にビーズを添加し、室温で1時間反応させた。ビーズを回収し、PBS(-)で3回洗浄後、0.1M Citrate Buffer pH3.0により抗体を溶出し、1M Tris-HCl pH9.0で中和した。精製抗体はUV法およびELISA法により濃度を決定した。【０１１１】
4．Rituxanの補体依存性細胞障害活性（CDC活性）評価
Rituxan安定発現クローン由来の糖鎖修飾していないRituxan（Original）およびRituxanおよびB4Gal-T１同時安定発現クローン由来の糖鎖にガラクトースを付加したRituxan（RTX-1,RTX-2）について、CDC活性の評価を行った。対象にはCD20陽性細胞であるDaudi細胞を使用した（BioTechnol.Prog. 2005, 21 1644-1652）。【０１１２】
Daudi細胞は10％FCS添加RPMI1640（SIGMA）で1回洗浄、RPMIで再度洗浄し、RPMIに懸濁して、5×104cells/wellとなるよう25μl/wellで96ウェルプレートに播種した。次にRituxan（Original,RTX-1,RTX-2）の2倍希釈系列をRPMI1640で作製し（最終濃度2μg/mlから7段階）、25μl/wellでDaudi細胞に添加し、インキュベーター（37℃,5%CO2）で30分間反応させた。次に、RPMI1640で20%に希釈したヒト補体（SIGMA）を50μl/wellで添加し（最終濃度10%）、インキュベーター（37℃,5%CO2）で3時間培養した。また、コントロールとして抗体無添加ウェルを、ブランクとして細胞無添加ウェルを用意した。その後、各ウェルにはWST-1（Cell counting kit,  同仁化学）を10μl/wellで添加し、インキュベーター（37℃,5%CO2）で3‐5時間反応させた。反応終了後、吸光度（OD450nm-OD620nm）を測定した。アッセイは3回行い、結果は平均値で示した。CDC活性(%)は以下の式を用いて算出した。
CDC(%) = 100×{1-(S-B)/(C-B)} 
S : サンプルウェルの吸光度、B : ブランクウェルの吸光度、C ：コントロールの吸光度【０１１３】
結果
糖鎖修飾していないRituxan（Original）および糖鎖にガラクトースを付加したRituxan（RTX-1, RTX -2）のCDC評価結果を図4に示す。CDC活性評価の結果、RTX-1, RTX -2はOriginalと比較してCDC活性が高く、抗体濃度0.125μg/mlにおいて、およそ4−5倍高い結果となった。【０１１４】
上記の実施例では、抗CMV抗体（完全ヒト型抗体）および抗CD20抗体（キメラ抗体）での各1事例を取り上げて説明したが、実施例１で示したように得られた抗体は、ヒト由来リンパ芽球様細胞株（lymphoblastoid cell line：LCL）での糖鎖と非常に似た糖鎖組成であり、また、実施例１及び２で示したように、補体依存性生物活性が４−５倍から数十倍活性の上昇が認められた。即ち、本発明では、高い補体依存性生物活性を有する活性抗体で、かつヒト由来宿主細胞に近似した糖鎖組成を有する抗体を、遺伝子組み換え手法で産生するに際して、優れた宿主細胞系、および工業化容易な生産系を見出すことができたといえる。【０１１５】
また、抗体の起源に関しても、マウス由来抗体、ハイブリドーマ由来抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体により抗体遺伝子の取得経緯はそれぞれ異なるが、本発明がそれら抗体の由来に拘らず適用しうることは、当業者に明らかである。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明によれば、これまでの抗体医薬と比較し高い補体依存性生物活性を示す遺伝子組換え抗体を産生する宿主細胞系、該細胞を用いた抗体の大規模生産が容易な製造方法、および高い補体依存性生物活性を有する抗体が提供される。【０１１７】
本発明の抗体の産生方法、該方法により産生される抗体、およびそのような抗体を安定的に発現する宿主細胞系は、研究、または、各種疾患の予防及び／又は治療薬等の抗体医薬等の分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１１８】
配列番号１：プライマー配列（B1,4GT-Fw）
配列番号２：プライマー配列（B1,4GT-Rv）
配列番号３および４：プライマー配列（Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ１遺伝子の一部増幅用）
配列番号５および６：プライマー配列（ＧＡＰＤＨ遺伝子の一部増幅用）
配列番号７：Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ１遺伝子
配列番号８：Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ１のアミノ酸配列
配列番号９−２４：Rituxanの重鎖可変領域をクローニングするためのヌクレオチド配列
配列番号２５−４４：Rituxanの軽鎖可変領域及び一部定常領域をクローニングするためのヌクレオチド配列
【図１】
2012105699.tif 000005
【図２】
2012105699.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年9月24日(2012.9.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および補体依存性生物活性を有する抗体をコードする遺伝子を発現する宿主動物細胞を培養し、発現したＢ４Ｇａｌ−Ｔ活性により前記抗体のＦｃ領域に結合しているＮ−グリコシド結合複合型糖鎖が修飾された該抗体を産生する工程、および
前記抗体の補体依存性生物活性を測定する工程
を含む、補体依存性生物活性を有する抗体を産生する方法。
【請求項２】
前記培養する工程が、
（ｉ）β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が安定的に発現している宿主動物細胞に補体依存性生物活性を有する抗体をコードする遺伝子を発現可能に導入した該細胞を培養すること、または
（ｉｉ）β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および補体依存性生物活性を有する抗体をコードする遺伝子の両方を発現可能に導入した宿主動物細胞を培養すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、
（ｉ）配列番号７のポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号７のポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＢ４Ｇａｌ−Ｔ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；または
（ｉｖ）配列番号８のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＢ４Ｇａｌ−Ｔ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
からなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記宿主動物細胞が、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、またはＣＨＯ細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記産生された抗体が、
（ｉ）前記抗体のＦｃ領域に結合しているＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の中で、Ｇ１およびＧ２複合型糖鎖の割合（該糖鎖の非還元末端の２つのＮ−アセチルグルコサミンの少なくとも一方にガラクトースが１分子結合しているものの割合）が５０％以上である；または
（ｉｉ）前記抗体のＦｃ領域に結合しているＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の中で、Ｇ２複合型糖鎖の割合（該糖鎖の非還元末端の２つのＮ−アセチルグルコサミンの両方にガラクトースがそれぞれ１分子結合しているものの割合）が５０％以上である
ことによって特徴付けられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記補体依存性生物活性が、補体依存性細胞障害活性、補体依存性のウイルス中和活性、補体依存性のＣＭＶの中和活性、および抗ＣＤ２０抗体の補体依存性細胞障害活性からなる群から選択される活性である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記測定された補体依存性生物活性が、補体依存性細胞障害活性または補体依存性ウイルス中和活性であり、産生された前記抗体が、
（ｉ）Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入していない宿主細胞で産生された抗体と比較して４倍以上高い補体依存性細胞障害活性を示す抗体である；または
（ｉｉ）Ｂ４Ｇａｌ−Ｔ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入していない宿主細胞で産生された抗体と比較して１０倍以上高い補体依存性ウイルス中和活性を示す抗体である
を含む、請求項１〜４または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体がＩｇＧまたはＩｇＧ１である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法により産生された抗体。
【請求項１１】
請求項５または７に記載の方法により産生された抗体。
【請求項１２】
請求項１１に記載の抗体を安定的に発現する宿主細胞系。
【国際調査報告】
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