(57)【要約】  本発明は、生体にとって安全であり、かつ生体適合性が高く、細胞分化促進のために有用な医療用材料を提供することを目的とする。本発明は、ポリアミノ酸を主成分として含有させ、さらに、該ポリアミノ酸が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、フェニルアラニン残基、グリシン残基、グルタミン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいアスパラギン酸残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいチロシン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいトリプトファン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基、及び側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸残基を含有させることによって、細胞分化促進用医療用材料を製造する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリアミノ酸を主成分として含有する医療用材料において、該ポリアミノ酸が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、フェニルアラニン残基、グリシン残基、グルタミン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいアスパラギン酸残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいチロシン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいトリプトファン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基、及び側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸残基を含有することを特徴とする、細胞分化促進用医療用材料。
【請求項２】
ポリアミノ酸が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、フェニルアラニン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基、及び側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基からなる群より選択される２種のアミノ酸残基を含有する共重合体であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞分化促進用医療用材料。
【請求項３】
２種のアミノ酸残基のうちの一方が、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基である、請求項２に記載の細胞分化促進用医療用材料。
【請求項４】
２種のアミノ酸残基のうちの他方が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、又はフェニルアラニン残基である、請求項３に記載の細胞分化促進用医療用材料。
【請求項５】
２種のアミノ酸残基のうちの一方が、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基である、請求項２に記載の細胞分化促進用医療用材料。
【請求項６】
２種のアミノ酸残基のうちの他方が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、又はフェニルアラニン残基である、請求項５に記載の細胞分化促進用医療用材料。
【請求項７】
２種のアミノ酸残基のうちの一方が、フェニルアラニン残基である、請求項２に記載の細胞分化促進用医療用材料。
【請求項８】
２種のアミノ酸残基のうちの他方が、バリン残基、又はロイシン残基である、請求項７に記載の細胞分化促進用医療用材料。
【請求項９】
繊維構造体である、請求項１又は２に記載の細胞分化促進用医療用材料。
【請求項１０】
繊維の平均繊維径が５０ｎｍ以上５００ｎｍ未満であることを特徴とする、請求項９に記載の細胞分化促進用医療用材料。
【請求項１１】
ポリアミノ酸が、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基を含有することを特徴とする、請求項９又は１０に記載の細胞分化促進用医療用材料。
【請求項１２】
ポリアミノ酸が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、又はフェニルアラニン残基をさらに含有する、請求項１１に記載の細胞分化促進用医療用材料。
【請求項１３】
ポリアミノ酸が、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン酸残基を含有することを特徴とする、請求項９又は１０に記載の細胞分化促進用医療用材料。
【請求項１４】
ポリアミノ酸が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、又はフェニルアラニン残基をさらに含有する、請求項１３に記載の細胞分化促進用医療用材料。
【請求項１５】
ポリアミノ酸が、フェニルアラニン残基を含有することを特徴とする、請求項９又は１０に記載の細胞分化促進用医療用材料。
【請求項１６】
ポリアミノ酸が、バリン残基、又はロイシン残基をさらに含有する、請求項１５に記載の細胞分化促進用医療用材料。
【請求項１７】
フィルムである、請求項１又は２に記載の細胞分化促進用医療用材料。
【請求項１８】
ポリアミノ酸が、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基を含有することを特徴とする、請求項１７に記載の細胞分化促進用医療用材料。
【請求項１９】
ポリアミノ酸が、バリン残基、又はイソロイシン残基をさらに含有する、請求項１８に記載の細胞分化促進用医療用材料。
【請求項２０】
ポリアミノ酸が、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基を含有することを特徴とする、請求項１７に記載の細胞分化促進用医療用材料。
【請求項２１】
ポリアミノ酸が、アラニン残基、バリン残基、又はイソロイシン残基をさらに含有する、請求項２０に記載の細胞分化促進用医療用材料。
【請求項２２】
コーティングである、請求項１又は２に記載の細胞分化促進用医療用材料。
【請求項２３】
ポリアミノ酸が、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基を含有することを特徴とする、請求項２２に記載の細胞分化促進用医療用材料。
【請求項２４】
ポリアミノ酸が、アラニン残基、又はフェニルアラニン残基をさらに含有する、請求項２３に記載の細胞分化促進用医療用材料。
【請求項２５】
以下の工程を含むことを特徴とする、請求項９〜１６のいずれかに記載の細胞分化促進用医療用材料の製造方法：
工程１）ポリアミノ酸を溶媒に溶解して溶液とする工程、
工程２）シリンジ内に入れた前記溶液をシリンジの先に取り付けたノズルから連続的に吐出する工程、
工程３）前記吐出において高電圧発生装置でノズルとコレクターの間に高電圧を印加する工程、
工程４）ノズルとコレクターの間で前記吐出溶液を繊維の形状に変える工程、
工程５）当該繊維をコレクター上に捕集する工程。
【請求項２６】
工程１におけるポリアミノ酸の溶液濃度が１〜２０重量％であり、工程２におけるポリアミノ酸の溶液の吐出速度が１〜２０ｍｌ／時であり、工程３におけるノズルとコレクターの間に印加する電圧が１１〜４５ｋＶであり、工程４におけるノズルとコレクターの間隔が１０〜４０ｃｍであることを特徴とする請求項２５に記載の製造方法。
【請求項２７】
工程１における溶媒が、トリフルオロ酢酸、酢酸、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、２，２，２−トリフルオロエタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及び水からなる群より選ばれる１種又は２種以上であることを特徴とする請求項２５又は２６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞分化促進用等に有用な医療用材料及びその製造方法に関し、詳細には、特定のアミノ酸残基を有するポリアミノ酸を主成分として含有する医療用材料及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、損傷し、欠損した生体組織の再生を目指して、組織や細胞の足場材（scaffold）として機能する構造体の研究開発が、再生医療の一環として進められている。足場として機能する構造体としては、スポンジ体、ハニカム体、又は繊維を重層した不織布等の繊維構造体、あるいはフィルムやコーティングが知られている。【０００３】
組織や細胞の足場材をはじめとする医療用材料は、生分解性及び生体適合性を合わせもつことが望ましく、このような観点から、コラーゲン、ゼラチン、セルロース、キチン、キトサン、ポリ乳酸等を用いた医療用材料の製造例が多数開示されている。例えば、繊維構造体の医療用材料としては、キトサン、コンドロイチン硫酸及びペクチン等の多糖類が使用されたものが開示されている（特許文献１）。繊維構造体は、一般に、電界紡糸法（エレクトロスピニング法）と呼ばれる方法により形成させることができる。高分子化合物を溶媒に溶解して溶液とした後、高電圧を印加しながら高分子化合物溶液を吐出することで繊維化させ、これを基板（コレクター）上に累積させることで繊維構造体を得ることができる。かかる電界紡糸法の製造条件を調整して、キトサンを用いて製造された繊維構造体も開示されている（特許文献２、３）。しかしながら、上記の繊維構造体はいずれも生分解性を備えた医療用材料ではあるものの、繊維構造体として望ましい形状を有していない。例えば、繊維径の幅が極めて不均一であったり、繊維どうしの結着が見られたりする。繊維径の幅を制御することができたとしても、繊維形成段階において著しく時間を要する等、製造条件が実用的ではない。また、場合によってはキトサンが溶液に完全に溶解していないため、満足のいく繊維構造体になっていない。【０００４】
繊維構造体に関して、材料としてポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸を利用した方法が開示されている（非特許文献１）。当該方法では、極性が低い有機溶媒に材料を溶解させる際にその濃度を低くして、分子どうしの相互作用を抑制することによって繊維径を制御している。しかしながら、溶液濃度がある程度低くなると繊維は形成されにくくなってしまい、実際には繊維径を満足のいく細さにまで小さくするには至っていない。繊維構造体を医療用材料として用いる場合には、生体内における分解性の観点から、より細い繊維、特にナノメートルオーダーの繊維（ナノファイバー）で構成されることが望ましいが、ナノファイバーのような細い繊維での繊維構造体は、その製造条件及び使用材料等の精密な調整が必要となり、実際のところは電界紡糸法を用いて製造することが難しいのが現状である。【０００５】
その他の生分解性材料としては、ポリ乳酸を用いた繊維構造体の医療用材料が開示されている（特許文献４）。しかし、当該繊維構造体においても、実際にはナノメートルオーダーでの繊維径は得られていない。また、ポリ乳酸は柔軟性に欠けるため軟組織に対する適合性に乏しく、さらに生体に対して炎症反応を引き起こすことも示唆されており、医療用材料として十分に安全な生分解性材料であるとはいえない。【０００６】
繊維構造体以外にはフィルムやコーティングが利用されており、コラーゲン、フィブロネクチン及びラミニンのような細胞外マトリクス成分をフィルム化した細胞培養単体（特許文献５）、及び同様の細胞外マトリクス成分を被覆した細胞培養容器が開示されている（特許文献６）。しかしながら、細胞外マトリクス成分は非常に不安定であり、冷蔵保存をしても数ヶ月程度で性能が劣化するおそれがある。また、細胞外マトリクス成分の中でもコラーゲンが広く使用されているが、ＢＳＥ（牛海綿状脳症）や口蹄疫等の問題により使用が困難になっていることに加え、コラーゲン自体がフィルム化等の製造工程で変性を受けやすく、本来の機能を維持させながら取り扱うことが難しいのが現状である。強度を付与するためにホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドを用いて架橋することもできるが、これらの有機物質は極めて毒性が高いため、安全性の面で問題がある。【０００７】
特許文献７には、ポリアミノ酸とウレタンとの共重合体からなる細胞培養膜について記載されている。非特許文献２及び３には、３種のアミノ酸（グルタミン酸、リジン、ロイシン）のランダムコポリマーからなる樹脂が細胞接着性よく、肝細胞を増殖させることが記載されている。さらには、非特許文献４には、α−ポリグルタミン酸とキトサンとの積層フィルムが、筋芽細胞の１つの接着性が良く、また、増殖を促進させることが記載されている。しかしながら近年、ｉＰＳ細胞の研究の発展と共に、未分化細胞の分化を促進させる実用的な材料が求められており、この要求を満たす材料は見出されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−２９０６１０号公報
【特許文献２】特開２００８−１６３５２０号公報
【特許文献３】特開２００８−３０８７８０号公報
【特許文献４】国際公開第２００４／０８９４３３号パンフレット
【特許文献５】特開２００５−３１２３３８号公報
【特許文献６】特開２００６−８７３９６号公報
【特許文献７】特開２００１−１３６９６０号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ken-Ichi Minato et al, Macromolecular Bioscience, 2006, 6, 487-495.
【非特許文献２】POLYMER PREPRINTS, Vol. 40, No 9(1991), 3173-3175.
【非特許文献３】人工臓器 21(1), 212-216.(1992)
【非特許文献４】Macromol. Biosci. 2009, 9, 268-278.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明が解決しようとする課題は、生体にとって安全であり、かつ生体適合性が高く、生体組織又は細胞の足場材や細胞分化促進のために有用な医療用材料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意検討の結果、特定のアミノ酸残基を有するポリアミノ酸を主成分として医療用材料に含有させることにより、上記課題が達成されることを見出し、本発明を完成した。【００１２】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）ポリアミノ酸を主成分として含有する医療用材料において、該ポリアミノ酸が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、フェニルアラニン残基、グリシン残基、グルタミン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいアスパラギン酸残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいチロシン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいトリプトファン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基、及び側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸残基を含有することを特徴とする、細胞分化促進用医療用材料。
（２）ポリアミノ酸が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、フェニルアラニン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基、及び側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基からなる群より選択される２種のアミノ酸残基を含有する共重合体であることを特徴とする、（１）の細胞分化促進用医療用材料。
（３）２種のアミノ酸残基のうちの一方が、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基である、（２）の細胞分化促進用医療用材料。
（４）２種のアミノ酸残基のうちの他方が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、又はフェニルアラニン残基である、（３）の細胞分化促進用医療用材料。
（５）２種のアミノ酸残基のうちの一方が、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基である、（２）の細胞分化促進用医療用材料。
（６）２種のアミノ酸残基のうちの他方が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、又はフェニルアラニン残基である、（５）の細胞分化促進用医療用材料。
（７）２種のアミノ酸残基のうちの一方が、フェニルアラニン残基である、（２）の細胞分化促進用医療用材料。
（８）２種のアミノ酸残基のうちの他方が、バリン残基、又はロイシン残基である、（７）の細胞分化促進用医療用材料。
（９）繊維構造体である、（１）又は（２）の細胞分化促進用医療用材料。
（１０）繊維の平均繊維径が５０ｎｍ以上５００ｎｍ未満であることを特徴とする、（９）の細胞分化促進用医療用材料。
（１１）ポリアミノ酸が、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基を含有することを特徴とする、（９）又は（１０）の細胞分化促進用医療用材料。
（１２）ポリアミノ酸が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、又はフェニルアラニン残基をさらに含有する、（１１）の細胞分化促進用医療用材料。
（１３）ポリアミノ酸が、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン酸残基を含有することを特徴とする、（９）又は（１０）の細胞分化促進用医療用材料。
（１４）ポリアミノ酸が、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、又はフェニルアラニン残基をさらに含有する、（１３）の細胞分化促進用医療用材料。
（１５）ポリアミノ酸が、フェニルアラニン残基を含有することを特徴とする、（９）又は（１０）の細胞分化促進用医療用材料。
（１６）ポリアミノ酸が、バリン残基、又はロイシン残基をさらに含有する、（１５）の細胞分化促進用医療用材料。
（１７）フィルムである、（１）又は（２）の細胞分化促進用医療用材料。
（１８）ポリアミノ酸が、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基を含有することを特徴とする、（１７）の細胞分化促進用医療用材料。
（１９）ポリアミノ酸が、バリン残基、又はイソロイシン残基をさらに含有する、（１８）の細胞分化促進用医療用材料。
（２０）ポリアミノ酸が、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基を含有することを特徴とする、（１７）の細胞分化促進用医療用材料。
（２１）ポリアミノ酸が、アラニン残基、バリン残基、又はイソロイシン残基をさらに含有する、（２０）の細胞分化促進用医療用材料。
（２２）コーティングである、（１）又は（２）の細胞分化促進用医療用材料。
（２３）ポリアミノ酸が、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基を含有することを特徴とする、（２２）の細胞分化促進用医療用材料。
（２４）ポリアミノ酸が、アラニン残基、又はフェニルアラニン残基をさらに含有する、（２３）の細胞分化促進用医療用材料。
（２５）以下の工程を含むことを特徴とする、（９）〜（１６）のいずれかの細胞分化促進用医療用材料の製造方法：
工程１）ポリアミノ酸を溶媒に溶解して溶液とする工程、
工程２）シリンジ内に入れた前記溶液をシリンジの先に取り付けたノズルから連続的に吐出する工程、
工程３）前記吐出において高電圧発生装置でノズルとコレクターの間に高電圧を印加する工程、
工程４）ノズルとコレクターの間で前記吐出溶液を繊維の形状に変える工程、
工程５）当該繊維をコレクター上に捕集する工程。
（２６）工程１におけるポリアミノ酸の溶液濃度が１〜２０重量％であり、工程２におけるポリアミノ酸の溶液の吐出速度が１〜２０ｍｌ／時であり、工程３におけるノズルとコレクターの間に印加する電圧が１１〜４５ｋＶであり、工程４におけるノズルとコレクターの間隔が１０〜４０ｃｍであることを特徴とする（２５）の製造方法。
（２７）工程１における溶媒が、トリフルオロ酢酸、酢酸、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、２，２，２−トリフルオロエタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及び水からなる群より選ばれる１種又は２種以上であることを特徴とする（２５）又は（２６）の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の医療用材料は、細胞分化の促進のために有用である。本発明の医療用材料は、主成分として用いる材料が生体内に広く存在するアミノ酸で構成されているため生体にとって安全であり、生体適合性が高い。また、使用するアミノ酸の種類や保護基の状態に応じて、細胞や組織の接着抑制効果、または細胞接着効果に優れた医療用材料を形成することもできる。これによって、幅広い用途の足場材に本発明の医療用材料を利用することができる。本発明の医療用材料が繊維構造体である場合、当該繊維構造体は、均一に制御されたナノメートルオーダーの繊維径を有するため生体内での分解性に優れている。さらに、その繊維どうしが結着していないことから柔軟性にも優れている。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】製造例１の操作で得られたポリ−Ｌ−アラニンからなる繊維構造体の表面を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮影した写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００１６】
本発明の医療用材料は、ポリアミノ酸を主成分とすることを特徴とする。ポリアミノ酸は複数のアミノ酸残基で構成されるポリマーであり、各種アミノ酸又はその誘導体を用いて調製することができる。使用されるアミノ酸は、一般に、中性アミノ酸、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、芳香族アミノ酸等であり、中性アミノ酸としては、非極性の中性アミノ酸及び極性の中性アミノ酸が用いられる。ポリアミノ酸は、１種又は２種以上のアミノ酸残基で構成されたものを用いることができるが、本発明では１〜３種（より好ましくは１種又は２種）のアミノ酸残基で構成されたポリアミノ酸が好ましい。本明細書では、アミノ酸残基とは、ポリアミノ酸の構成成分となっている単位アミノ酸部分（アミノ酸が結合してポリアミノ酸となったときの、もとのアミノ酸の１単位にあたる部分）のことをいう。また、アミノ酸の種類が具体的に示されている場合は、その名称の末尾に「残基」を付すことによってアミノ酸残基であることが示される。例えば、アラニンがポリアミノ酸の構成に用いられている場合、当該ポリアミノ酸におけるアラニンに相当する部分はアラニン残基と称される。
【００１７】
上記ポリアミノ酸は、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、フェニルアラニン残基、グリシン残基、グルタミン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいアスパラギン酸残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいチロシン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいトリプトファン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基、及び側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸残基を含有することを特徴とする。
【００１８】
本発明の効果に影響を及ぼさない範囲であれば、その他のアミノ酸残基も含有することができる。その他のアミノ酸残基としては、例えば、サルコシン残基；Ｎ−メチルアラニン残基；β−アラニン残基；γ−アミノ酪酸残基；ノルバリン残基；ノルロイシン残基；フェニルグリシン残基；メチオニン残基；システイン残基；Ｓ−ベンジル−システイン残基等のシステイン誘導体残基；シスチン残基；アスパラギン残基；オルニチン残基；Ｎδ−ベンジルオキシカルボニル−オルニチン残基、Ｎα−ベンジルオキシカルボニル−オルニチン残基等のオルニチン誘導体残基；アルギニン残基；Ｎω−メチル−アルギニン残基、Ｎω−ニトロ−アルギニン残基等のアルギニン誘導体残基；ヒスチジン残基；Ｎ（Ｉｍ）−メチル−ヒスチジン残基等のヒスチジン誘導体残基；プロリン残基；ヒドロキシプロリン残基、Ｏ−ベンジルヒドロキシプロリン残基等のプロリン誘導体残基；セリン残基；Ｏ−ベンジル−セリン残基、Ｏ−アセチル−セリン残基等のセリン誘導体残基；スレオニン残基；Ｏ−ベンジル−スレオニン残基、Ｏ−アセチル−スレオニン残基等のスレオニン誘導体残基；ドーパ残基等を挙げることができる。なお、アミノ酸残基に不斉炭素原子が存在する場合、当該アミノ酸残基はＬ体、Ｄ体又はＤＬ体のいずれであってもよいが、Ｌ体であることが好ましい。
【００１９】
ポリアミノ酸を構成するアスパラギン酸残基、チロシン残基、トリプトファン残基、リジン残基又はグルタミン酸残基は、その側鎖に保護基が結合していてもよい。本明細書において、保護基とは、アミノ酸残基の側鎖における反応性の高い特性基を、他の化合物と反応しないように保護する目的で用いられる原子団のことをいう。保護基は、ポリアミノ酸の調製時に結合させていてもよく、又は調製した後に結合させてもよい。また、保護基は、ポリアミノ酸を構成する全てのアミノ酸残基の側鎖に結合していてもよく、あるいは一部のアミノ酸残基の側鎖のみに結合していてもよい。また、保護基は、１種類のみを使用していてもよく、あるいは２種以上の保護基を使用してもよい。
【００２０】
保護基としては、アミノ酸残基の側鎖における反応性の高い特性基を不活性な官能基に変換し得るものであれば特に限定されない。例えば、ポリアミノ酸を構成するアミノ酸残基がリジン残基であれば、アミノ基の保護基を用いることができる。アミノ基の保護基としては、Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis（Wiley-Interscience 2006）に記載の基が挙げられる。具体的には、アシル基、アルキル基、アラルキル基、シリル基、メトキシメチル基、メチルチオメチル基、ベンジルオキシメチル基、メトキシエトキシメチル基、テトラヒドロピラニル基、メトキシカルボニル基（Ｍｏｃ基）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ基）、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）、ｐ−ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル基、フタロイル基、トリフルオロアセチル基、ｐ−トルエンスルホニル基、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル基、トリチル基、ベンジル基、２−ベンゾイル−１−メチルビニル基、２−ヒドロキシアリリデン基等が挙げられる。アシル基としては、例えば、ホルミル基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基（例えば、アセチル基）、Ｃ６−８アリール−カルボニル基、Ｃ７−１１アラルキル−カルボニル基（例えば、フェニルアセチル基）等が挙げられる。また、これらのアミノ基の保護基は、ハロゲン原子（例えば、塩素原子、臭素原子、フッ素原子）、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基（例えば、メトキシ基）、炭素数１〜６のハロアルキル基（例えば、トリフルオロメチル基）、炭素数１〜６のハロアルコキシ基（例えば、トリフルオロメトキシ基）等で１又はそれ以上置換されていてもよい。本発明における好ましいアミノ基の保護基としては、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、トリフルオロアセチル基が挙げられる。
【００２１】
また、ポリアミノ酸を構成するアミノ酸残基が、例えばアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基であれば、カルボキシル基の保護基を用いることができる。カルボキシル基の保護基としては特に限定されず、例えば炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基、炭素数７〜１１のアラルキル基等を挙げることができる。具体的には、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、フェニル基、ベンジル基等を挙げることができる。又は、ｐ−ニトロベンジル基、フェナシル基、トリクロロエチル基、シクロヘキシル基等が挙げられ、主にエステルの形で保護することもできる。本発明における好ましいカルボキシル基の保護基としては、炭素数１〜４のアルキル基が挙げられ、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が挙げられる。またこれらのカルボキシル基の保護基は、ハロゲン原子（例えば、塩素原子、臭素原子、フッ素原子）、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基（例えば、メトキシ基）、炭素数１〜６のハロアルキル基（例えば、トリフルオロメチル基）、炭素数１〜６のハロアルコキシ基（例えば、トリフルオロメトキシ基）等で１又はそれ以上置換されていてもよい。
【００２２】
また、ポリアミノ酸を構成するアミノ酸残基が、例えばセリン残基又はスレオニン残基であれば、ヒドロキシ基の保護基を用いることができる。ヒドロキシ基の保護基としては、アシル基、アルコキシカルボニル基、アルキル基、アラルキル基、シリル基等が挙げられる。アシル基としては、例えば、ホルミル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、イソブチロイル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、４−トルオイル基、４−クロロベンゾイル基等の炭素数１〜８のアシル基が挙げられる。アルコキシカルボニル基としては、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、ｓｅｃ−ブトキシカルボニル基、２−トリメチルシリルエトキシカルボニル基などが挙げられる。アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等の炭素数１〜４のアルキル基が挙げられる。アラルキル基としては、例えば、ベンジル基、４−モノメトキシベンジル基、トリチル基、４−モノメトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基等の炭素数７〜２１のアラルキル基が挙げられる。シリル基としては、例えば、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基等の３置換シリル基が挙げられる。その他、メトキシメチル基、メチルチオメチル基、ベンジルオキシメチル基、メトキシエトキシメチル基、テトラヒドロピラニル基、メトキシカルボニル基、９−フルオレニルメトキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基等のヒドロキシ基の保護基を使用することができる。
【００２３】
また、ポリアミノ酸を構成するアミノ酸残基が、例えばトリプトファン残基であれば、インドリル基の保護基を用いることができる。インドリル基の保護基としては、ホルミル基等が挙げられる。ポリアミノ酸がアスパラギン酸残基、チロシン残基、トリプトファン残基、リジン残基及びグルタミン酸残基以外のアミノ酸残基を含有する場合、当該アミノ酸残基についても保護基を結合させることができる。上記の保護基以外には、アルギニン残基に用いられるグアニジノ基の保護基として、ニトロ基、ｐ−トルエンスルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基等が挙げられる。また、ヒスチジン残基に用いられるイミダゾリル基の保護基として、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−トルエンスルホニル基、トリチル基、ジフェニルメチル基、ジニトロフルオロベンゼン基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基等が挙げられる。また、メチオニン残基に用いられるメルカプト基の保護基として、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基等の置換ベンジル基；トリチル基；ベンズヒドリル基；アセタミドメチル基；カルボメトキシスルフェニル基等が挙げられる。
【００２４】
保護基を有するポリアミノ酸は、脱保護を行うことにより、その一部又は全部の保護基を除去することができる。本発明では、脱保護を行うことによりポリアミノ酸における保護基の割合（保護基含有率）を調整することができ、保護基含有率に応じて医療用材料の足場材としての用途を選択することができる。保護基含有率を適宜設定することにより、使用するアミノ酸残基の種類に応じて、細胞の分化促進効果、及び細胞の接着効果を制御することができる。本発明において、保護基含有率としては、好ましくは６５％以上１００％未満、より好ましくは７０％以上１００％未満であり、さらに好ましくは８０％以上１００％未満、さらにより好ましくは９０％以上１００％未満であり、殊更好ましくは９５％以上１００％未満、特に好ましくは９８％以上１００％未満である。
【００２５】
保護基含有率は、ポリアミノ酸に含まれるアミノ酸残基に結合した保護基の指標となるスペクトルを測定し、保護基が結合し得るアミノ酸残基全体において、保護基が結合したアミノ酸残基が存在する割合を算出することにより導き出される。保護基の指標となるスペクトルは固体又は液体の状態で測定することができ、例えば、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴ−ＩＲ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、昇温スペクトル、ラマンスペクトル、電子スピン共鳴、Ｘ線吸収微細構造（ＸＡＦＳ）、Ｘ線解析、蛍光Ｘ線、質量分析（ＭＳ）、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ、ＸＰＳ、紫外可視・光ルミネセンスなどを用いることができ、好ましくはＦＴ−ＩＲにおけるＦＴ−ＩＲ全反射測定法を利用することができる。ＦＴ−ＩＲ全反射測定法は、繊維構造体、フィルム、コーティング、パウダー、ペレットなどの形状で測定することができる。保護基含有率は、側鎖に保護基を有するポリアミノ酸と、一部又は全ての側鎖で保護基を有さないポリアミノ酸とで判別可能な指標を調べることにより算出することができるが、必要に応じて第２の指標を用いて換算もしくは補正を行うこともできる。保護基含有率を調べる詳細な方法は、後述の実施例に示される。
【００２６】
本発明において使用されるポリアミノ酸は、細胞分化促進活性を有することを特徴とする。ここで、「細胞分化促進活性」とは、未分化細胞を特定の機能又は構造を有する細胞に変化させ、さらにその変化の程度を促進し得る活性を意味する。当該未分化細胞は、特に限定されないが、好適には間葉系幹細胞である。細胞分化促進活性は、例えば、間葉系幹細胞を用いて測定することができる。具体的には、間葉系幹細胞を間葉系幹細胞用培地（例えば、「改訂  培養細胞実験ハンドブック」（羊土社、2009年刊）の314〜318頁に記載の間葉系幹細胞培養培地）にて５％ＣＯ２／３７℃の条件下で３日間培養した後、当該培地を脂肪細胞分化誘導培地（例えば、「改訂  培養細胞実験ハンドブック」（羊土社、2009年刊）の314〜318頁に記載の脂肪細胞分化誘導培地）に交換して、５％ＣＯ２／３７℃の条件下で４日間培養し、さらに培地を脂肪細胞分化維持培地（例えば、「改訂  培養細胞実験ハンドブック」（羊土社、2009年刊）の314〜318頁に記載の脂肪細胞分化維持培地）に交換して３日間培養する。脂肪細胞分化誘導培地及び脂肪細胞分化維持培地での培養を２〜３週間行った後、細胞内ＤＮＡ量及びグリセロール−３−リン酸脱水素酵素（ＧＰＤＨ）活性量を定量する。細胞内ＤＮＡ量は、ラウリル硫酸ナトリウム含有緩衝液で培養細胞を溶解して、ビスベンズイミドＨ３３２５８フルオロクロム三塩酸塩を添加することにより測定することができる。ＧＰＤＨ活性量は、市販のキット（例、プライマリーセル社、ＧＰＤＨ活性測定キット）を用いて測定することができる。ＧＰＤＨ活性量を細胞内ＤＮＡ量で除すことにより細胞分化促進活性が求められ、コントロールと比較することにより評価することができる。測定方法の詳細は、後述の実施例の通りである。
【００２７】
本発明の医療用材料に含有されるポリアミノ酸は、上記の各種アミノ酸残基を含有することができるが、ポリアミノ酸が１種のアミノ酸残基から構成される場合、かかるアミノ酸残基は、特に限定されないが、グリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基、又は側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基が好ましい。リジン残基及びグルタミン酸残基の各種アミノ酸残基はいずれも側鎖に保護基を含むことができるが、上記のように保護基含有率を調整するにおいては、保護基を含むアミノ酸残基と含まないアミノ酸残基とが混在することになる。このような場合であっても、本発明では、側鎖に保護基を含むアミノ酸残基と記載することによって、一部は、保護基を含まないアミノ酸残基が存在することも包含することを意味する。
【００２８】
ポリアミノ酸が２種のアミノ酸残基から構成される場合、当該２種のアミノ酸残基は、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、フェニルアラニン残基、グルタミン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基、及び側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基からなる群より選択される。当該２種のアミノ酸残基の組み合わせは特に限定されないが、そのうちの１種は、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基、又はフェニルアラニン残基であることが好ましい。
２種のアミノ酸残基のうちの１種が前記リジン残基である場合は、残りの１種は、特に限定されないが、アラニン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、フェニルアラニン残基、又はバリン残基であることが好ましい。即ち、２種のアミノ酸残基の組み合わせは、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基とアラニン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基とロイシン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基とイソロイシン残基、又は側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基とフェニルアラニン残基である。
２種のアミノ酸残基のうちの１種が前記グルタミン酸残基である場合は、残りの１種は、特に限定されないが、アラニン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、バリン残基、フェニルアラニン残基、又はグルタミン残基であることが好ましい。即ち、２種のアミノ酸残基の組み合わせは、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基とアラニン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基とロイシン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基とイソロイシン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基とバリン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基とフェニルアラニン残基、又は側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基とグルタミン残基である。
２種のアミノ酸残基のうちの１種が前記フェニルアラニン残基である場合は、残りの１種は、特に限定されないが、バリン残基又はロイシン残基であることが好ましい。即ち、２種のアミノ酸残基の組み合わせは、フェニルアラニン残基とバリン残基、又はフェニルアラニン残基とロイシン残基である。
【００２９】
ポリアミノ酸が３種のアミノ酸残基から構成される場合、当該３種のアミノ酸残基は、好ましくはロイシン残基、フェニルアラニン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいアスパラギン酸残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基からなる群より選択される。当該３種のアミノ酸残基の組み合わせは特に限定されないが、フェニルアラニン残基／側鎖に保護基を含んでいてもよいアスパラギン酸残基／側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基、フェニルアラニン残基／側鎖に保護基を含んでいてもよいアスパラギン酸残基／側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基、及びロイシン残基／側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基／側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基であり得る。
【００３０】
ポリアミノ酸が２種以上のアミノ酸残基から構成される場合、当該ポリアミノ酸は、各種アミノ酸残基によって形成される共重合体（コポリマー）とすることができる。ポリアミノ酸が共重合体である場合は、各種アミノ酸残基が交互に、又は所定の単位で規則正しく配置されるものであっても、あるいは不規則に順不同に配置されるものであってもよく、アミノ酸残基の配置の態様は任意のものが含まれる。ポリアミノ酸が２種のアミノ酸残基から構成される場合、その比率は、モル比として９９：１〜１：９９、好ましくは９５：５〜５：９５、より好ましくは９０：１０〜１０：９０、から適宜選択することができる。ポリアミノ酸が３種のアミノ酸残基から構成される場合は、それぞれのアミノ酸残基は、ポリアミノ酸に含まれる全アミノ酸残基に対して１〜９９モル％、好ましくは１０〜９０モル％の範囲内で含まれる。
【００３１】
本発明の医療用材料に使用されるポリアミノ酸は、上記のアミノ酸残基を含み、且つ細胞分化促進活性を有する限り特に限定されないが、具体的には、ポリ−Ｌ−アラニン、ポリ−Ｌ−バリン、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸、ＫＯＨ処理等により脱保護されたポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸、ポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン、ＫＯＨ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−アラニン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（６／４（モル比として６０：４０で混合された共重合体であることを示し、以下も同様にして示される））、ＫＯＨ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−ロイシン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（９／１〜６／４）、ＨＢｒ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−アラニン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（９／１〜３／７）、ＨＢｒ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−フェニルアラニン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（９／１〜３／７）、ポリ−Ｌ−バリン、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸、ポリ−Ｌ−アラニン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（９／１〜３／７）、ポリ−Ｌ−イソロイシン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（６／４）、ポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−フェニルアラニン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（６／４）、ポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン、ポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アラニン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（９／１）、ポリ−Ｌ−アラニン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（６／４）、ポリ−Ｌ−ロイシン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（９／１）、ポリ−Ｌ−ロイシン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（６／４）、ポリ−Ｌ−フェニルアラニン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（９／１〜３／７）、ポリ−Ｌ−バリン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（６／４）、ＨＢｒ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−バリン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（６／４）、ポリ−Ｌ−ロイシン、ポリ−Ｌ−バリン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（６／４）、ポリ−Ｌ−イソロイシン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（６／４）、ポリ−Ｌ−フェニルアラニン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（９／１〜６／４）、ポリ−Ｌ−ロイシン／Ｌ−フェニルアラニン（１／１）、ポリ−Ｌ−バリン／Ｌ−フェニルアラニン（１／１）、ポリ−Ｌ−ロイシン／Ｌ−グルタミン酸（８／２）、ポリ−Ｌ−ロイシン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（９／１〜６／４）、ポリ−Ｌ−ロイシン／Ｌ−リジン（８／２）、ＫＯＨ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−バリン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（６／４）、ＫＯＨ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−フェニルアラニン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（９／１〜６／４）、ＨＢｒ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−イソロイシン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（６／４）、ＨＢｒ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−ロイシン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（９／１〜６／４）、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸／ポリ−Ｌ−グルタミン酸（８／２）、ＫＯＨ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−イソロイシン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（６／４）、ポリ−Ｌ−グリシン、ポリ−Ｌ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン／ポリ−Ｌ−リジン（６／４）、ポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン／ポリ−Ｎε−t−ブトキシカルボニルグアニジノ−Ｌ−リジン（６／４）がより好ましい。
【００３２】
ポリアミノ酸が３種のアミノ酸残基で構成される場合は、特に限定されないが、具体的には、ポリ−Ｌ−フェニルアラニン／ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（３／２／５）、ポリ−Ｌ−フェニルアラニン／ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（３／２／５）、ポリ−Ｌ−ロイシン／Ｌ−グルタミン酸／Ｌ−リジン（８／１／１）、ＫＯＨ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−フェニルアラニン／ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（３／２／５）、ＨＢｒ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−フェニルアラニン／ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（３／２／５）、ポリ−Ｌ−ロイシン／Ｌ−グルタミン酸／Ｌ−リジン（６／１／３）が好ましい。      
【００３３】
本発明に使用されるポリアミノ酸の重量平均分子量は、特に限定されないが、１，０００以上である。本発明では、生体内での適合性を考慮して、好ましくは５，０００以上であり、より好ましくは１０，０００以上である。ポリアミノ酸の重量平均分子量は、特に限定されないが、測定機器を用いて測定することができ、一般にはゲルろ過クロマトグラフィー装置を用いて測定し、得られた値について標準物質を用いて較正して重量平均分子量を得ることができる。  
【００３４】
本発明に使用されるポリアミノ酸の粘度平均分子量は、特に限定されないが、１，０００以上である。本発明では、好ましくは５，０００以上であり、より好ましくは１０，０００以上である。ポリアミノ酸の粘度平均分子量は、特に限定されないが、測定機器を用いて測定することができ、一般には粘度計を用いて測定し、得られた値を既知の計算式を用いて換算して粘度平均分子量を得ることができる。
【００３５】
本発明に使用されるポリアミノ酸の重合度は、特に限定されないが、１０以上である。本発明では、生体内での適合性を考慮して、好ましくは５０以上であり、より好ましくは１００以上である。
【００３６】
本発明に使用されるポリアミノ酸は、その構造中の一部又は全ての極性を有する基に塩が配位した構造であっても良い。極性を有する基に対する塩の割合は、ポリアミノ酸の溶媒への溶解性及び／又は得られる医療用材料の物性から適宜決定される。塩としては、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩；マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属塩；アンモニア等の無機塩基；モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、リジン、オルニチン、アルギニン等の有機アミン塩；塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、グリコール酸塩、リンゴ酸塩、乳酸塩、脂肪酸塩、酸性アミノ酸塩、ピログルタミン酸塩等の有機酸塩を挙げることができる。これらは、１種単独又は２種以上の組み合わせの何れであっても良い。
【００３７】
本発明に使用されるポリアミノ酸は、上記アミノ酸残基に加えて、さらに、上記アミノ酸残基以外の化合物が重合した構造であっても良く、例えば、Ｎ−カルボキシ−α−アミノ酸無水物とウレタンプレポリマーとを重合して得られる共重合体等を挙げることができる。
【００３８】
本発明に使用されるポリアミノ酸の調製法は、アミノ酸又はその誘導体が重合した構造に調製される方法であれば特に制限されないが、例えば、Ｎ−カルボキシ−α−アミノ酸無水物又はＮ−カルボキシ−α−アミノ酸誘導体無水物を有機溶媒又は水に溶解又は懸濁させ、必要に応じてこれに重合開始剤を加える方法を挙げることができる。アミノ酸の種類によっては、上記に示したような保護基をあらかじめ結合させておいてから重合を行うことが好ましい。保護基を結合させるアミノ酸としては、特に限定されないが、アスパラギン酸、チロシン、トリプトファン、リジン及びグルタミン酸が好ましい。
【００３９】
前記有機溶媒の例としては、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、石油エーテル、１，４−ジオキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ヘキサン、シクロヘキサン、酢酸エチル、酢酸ブチル、トリフルオロ酢酸、酢酸、ギ酸、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、トリクロロエタン、トリクロロエチレン、トリフルオロエタン、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、２，２，２−トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロアセトン、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、ピリジン、アセトニトリル、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン等を挙げることができる。これらは、１種単独又は２種以上の組み合わせの何れであっても良い。
【００４０】
前記重合開始剤の例としては、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、１，４−シクロヘキサンジアミン、１，２−シクロヘキサンジアミン、ｏ−フェニレンジアミン、ｍ−フェニレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミン、トルエン−２，４−ジアミン、４，４’−ジフェニルメタンジアミン、イソホロンジアミン等の一級ジアミン、メチルアミン、エチルアミン、１−プロピルアミン等の一級モノアミン、メタノールアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン等のアルコールアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン等の二級アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン等の一級三級ジアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン等の三級アミン、ポリエーテルジアミン、ポリエステルジアミン等のアミノ基含有ポリマー、メタノール、エタノール等の一級アルコール、イソプロパノール等の二級アルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，４−ブタンジオール、ヘキサメチレングリコール等のグリコール類、ポリエーテルジオール、ポリエステルジオール等の水酸基含有ポリマー、チオール類等を挙げることができる。これらは、１種単独又は２種以上の組み合わせの何れであっても良い。
【００４１】
アミノ酸に保護基を結合させる方法は、以下のようにして行うことができる。例えば、Ｎ−カルボキシ−α−アミノ酸無水物に対応するアミノ酸が、グルタミン酸及びアスパラギン酸等のように、その側鎖にカルボキシル基を有する場合は、無機塩基又は有機塩基と反応させることで塩を形成することができる。またメチルアルコール、エチルアルコール又はベンジルアルコールなどと反応させることで一部又は全てをエステル基に変換させることが可能である。  当該アミノ酸が、リジン及びオルニチン等のようにアミノ基を有する場合は、無機酸又は有機酸と反応させることで塩を形成することができる。また、ベンジルオキシクロライド、ｔｅｒｔ−ブチルカルボニルクロライド又は９−フルオレニルメチルオキシカルボニルクロライドなどと反応させることで一部又は全てをカルバメート基に変換させることが可能である。
当該アミノ酸が、トリプトファン等のようにインドリル基を有する場合は、ギ酸等と反応させることで保護基を導入できる。当該アミノ酸が、アルギニン等のようにグアニジノ基を有する場合は、ベンジルオキシカルボニルクロライドやパラトルエンスルホニルクロライド等と反応させることで保護基を導入できる。当該アミノ酸が、ヒスチジン等のようにイミダゾール基を有する場合は、ベンジルオキシカルボニルクロリドやトリチルクロライドと反応させることで保護基を導入できる。当該アミノ酸が、グルタミン及びアスパラギン等のようにアミド基を有する場合は、トリチルアルコールや４，４’−ジメトキシベンズヒドリルアルコール等と反応させることで保護基を導入できる。当該アミノ酸が、セリン及びスレオニン等のようにヒドロキシ基を有する場合は、臭化ベンジル、ベンジルアルコール、臭化４−ニトロベンジル、２−メチルプロペン等と反応させることで保護基を導入することができる。当該アミノ酸が、チロシン等のようにフェノール性置換基を有する場合は、２−メチルプロペン、ｐ−ニトロフェニルｏ−ブロモベンジルカーボネート等と反応させることで保護基を導入できる。当該アミノ酸が、システイン等のようにチオエーテル基を有する場合は、過酸化水素水と反応させることでスルホキシド基等に変換することができる。当該アミノ酸が、メチオニン等のようにメルカプト基を有する場合は、トリチルアルコール、臭化４−メチルベンジル等と反応させることで保護基を導入できる。
【００４２】
２種以上のアミノ酸を用いてポリアミノ酸を調製する場合は、各種アミノ酸に対応するＮ−カルボキシ−α−アミノ酸（誘導体を含む）無水物を適宜混合して有機溶媒に溶解又は懸濁させ、必要に応じてこれに重合開始剤を加えて、共重合体を形成させることができる。アミノ酸の混合比は、例えば２種のアミノ酸であれば、モル比として９９：１〜１：９９、好ましくは９５：５〜５：９５、より好ましくは９０：１０〜１０：９０、から適宜選択することができる。また、例えば３種のアミノ酸であれば、それぞれのアミノ酸の混合量は、ポリアミノ酸に含まれる全アミノ酸残基に対して１〜９９モル％、好ましくは１０〜９０モル％の範囲内で含まれるように調整することができる。なお、当該混合比は、用いるＮ−カルボキシ−α−アミノ酸無水物のモル比に基づいて算出することができる。また、得られた共重合体は、通常、混合した各種アミノ酸のモル比に応じてアミノ酸残基が構成される。
【００４３】
Ｎ−カルボキシ−α−脂肪族アミノ酸無水物及びＮ−カルボキシ−α−芳香族アミノ酸無水物の何れとも異なるＮ−カルボキシ−α−アミノ酸無水物を、Ｎ−カルボキシ−α−脂肪族アミノ酸無水物もしくはＮ−カルボキシ−α−芳香族アミノ酸無水物と混合及び／又は重合してコポリマーを形成させることで、有機溶媒への溶解性を高くすることができる。かかるＮ−カルボキシ−α−アミノ酸無水物としては、アスパラギン酸−β−メチルエステル、アスパラギン酸−β−ベンジルエステル、グルタミン酸−γ−メチルエステル、Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−リジン、Ｎδ−ベンジルオキシカルボニル−オルニチン、Ｏ−ベンジル−セリン又はＯ−ベンジル−スレオニンに対応するＮ−カルボキシ−α−アミノ酸（誘導体を含む）無水物が好ましく、グルタミン酸−γ−メチルエステル又はＮε−ベンジルオキシカルボニル−リジンに対応するＮ−カルボキシ−α−アミノ酸無水物がより好ましい。これらは、１種単独又は２種以上の組み合わせの何れであっても良い。
【００４４】
本発明に使用されるポリアミノ酸の調製法としては、上述のＮ−カルボキシ−α−アミノ酸無水物又はＮ−カルボキシ−α−アミノ酸誘導体無水物を用いる方法の他に、微生物を使ってε−ポリリジンを調製する方法等を挙げることができる。
【００４５】
ポリアミノ酸は、上記のようにして調製した後、さらに脱保護を行うこともできる。即ち、ポリアミノ酸を構成するアミノ酸残基の側鎖に結合している保護基を除去することができる。脱保護は、ポリアミノ酸に含まれる一部の保護基又は全ての保護基について行うことができる。脱保護は、以下のように行われる。
【００４６】
例えば、保護基としてエステル基を含むアミノ酸残基については、ケン化処理や水素添加反応等によって、当該エステル基を除去することができる。また、保護基としてカルバメート基を含むアミノ酸残基については、酸、塩基又は水素添加等によって容易に除去することが可能である。なお、本発明の医療用材料については、後述の実施例にも示されたようにその表面を酸又は塩基等で処理することにより脱保護が行われることから、本明細書では、脱保護を行うことを「表面処理をする」、又は使用した化合物で「処理する」と表すことがある。
【００４７】
保護基の除去を行う反応試薬又は溶媒は特に制限されないが、例えばエステル基のケン化処理を行う場合に用いられる試薬としては、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化セシウム、水素化ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウムなどの塩基性無機化合物；ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、１，８−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン、ヒスチジン、ジアザビシクロウンデセン、ジアザビシクロノネンなどの塩基性有機化合物；酵素などが挙げられる。溶媒としては、メタノール、エタノール、２−プロパノール、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、石油エーテル、１，４−ジオキサン、ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、ベンゼン、トルエン、キシレン、ヘキサン、シクロヘキサン、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、トリクロロエタンのような有機溶媒、又は水を用いることができる。例えば、側鎖カルバメート基の除去を行う場合に用いる試薬としては、パラジウム黒、５〜１０％パラジウム炭素、臭化水素／酢酸、臭化水素／トリフルオロメタンスルホン酸、フッ化水素、トリフルオロ酢酸、塩化水素、ナトリウム／アンモニア、トリエチルシラン、トリクロロボラン、トリフルオロボランなどが挙げられ、紫外線照射によっても除去可能である。反応溶媒は、ギ酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、トリフルオロ酢酸のような有機酸；メタノール、エタノール、２−プロパノール、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、石油エーテル、１，４−ジオキサン、ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、ベンゼン、トルエン、キシレン、ヘキサン、シクロヘキサン、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、トリクロロエタンのような有機溶媒；又は水を用いることができる。これらの反応において、溶媒は１種又は２種以上の何れでも良い。
【００４８】
本発明では、脱保護が行われたポリアミノ酸又は脱保護を行う前のポリアミノ酸に対して、さらに保護基を結合させることもできる。保護基の結合は、上記と同様に各種アミノ酸残基に応じて保護基の種類を変えて行うことができる。また、当該保護基は、脱保護を行う前の保護基とは異なる種類のものを結合させることもできる。
【００４９】
ポリアミノ酸における保護基の結合状態を観察する方法としては、通常、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、オージェ電子分光法（ＡＥＳ）、飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）などを用いることができる。
【００５０】
本発明の医療用材料は、上記ポリアミノ酸を主成分として含有することを特徴とする。本明細書において、主成分とは、医療用材料の原料として含まれる主な成分をいい、その含有量は、通常、医療用材料の全重量に対して６０重量％以上、好ましくは８０重量％以上、より好ましくは９０重量％以上、さらにより好ましくは９５重量％以上、最も好ましくは１００重量％である。
【００５１】
本発明の医療用材料は、２種以上のポリアミノ酸を含有することもできる。２種のポリアミノ酸の組み合わせは、特に限定されないが、アラニン残基を含有するポリアミノ酸及び側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基を含有するポリアミノ酸の組み合わせが好ましい。ポリアミノ酸の混合比は、例えば２種のポリアミノ酸であれば、モル比として９９：１〜１：９９、好ましくは９５：５〜５：９５、より好ましくは９０：１０〜１０：９０、から適宜選択することができる。２種のポリアミノ酸としては、例えば、アラニン残基で構成されるポリアミノ酸と側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基で構成されるポリアミノ酸との組み合わせが挙げられる。具体的には、ポリ−Ｌ−アラニンとポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジンとの混合物（モル比として９：１〜６：４）でＨＢｒ処理等により脱保護されたものが好ましい。
【００５２】
本発明の医療用材料には、ポリアミノ酸に加えて、さらに、ポリアミノ酸以外の高分子化合物を含有することができる。このような高分子化合物としては、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリアクリロニトリル、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネート、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリヘキサメチレンカーボネート、ポリアリレート、ポリビニルイソシアネート、ポリブチルイソシアネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチルメタクリレート、ポリプロピルメタクリレート、ポリブチルメタクリレート、ポリメチルアクリレート、ポリエチルアクリレート、ポリブチルアクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリトリメチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリパラフェニレンテレフタルアミド、ポリパラフェニレンテレフタルアミド−３，４’−オキシジフェニレンテレフタルアミド共重合体、ポリメタフェニレンイソフタルアミド、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、メチルセルロース、プロピルセルロース、ベンジルセルロース、カルボキシセルロース、カルボキシメチルセルロース、酸化再生セルロース、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、フィブロイン、天然ゴム、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルエチルエーテル、ポリビニルプロピルエーテル、ポリビニルブチルエーテル、ポリビニリデンクロリド、ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、ポリ−Ｎ−ビニルカルバゾル、ポリ−Ｎ−ビニルピリジン、ポリビニルメチルケトン、ポリビニルイソプロペニルケトン、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリシクロペンテンオキシド、ポリスチレンサルホン、ナイロン６、ナイロン６６、ナイロン１１、ナイロン１２、ナイロン６１０、ナイロン６１２等の合成高分子化合物及びこれらの共重合体、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、セリシン等の蛋白質類、キチン、キトサン、セルロース等の多糖類等を挙げることができる。これらは、１種単独又は２種以上の組み合わせの何れであっても良い。
【００５３】
上記に例示した高分子化合物のうち、本発明の医療用材料の強度及び／又は形状を保持あるいは向上させる観点から、好ましくは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、カルボキシメチルセルロース、酸化再生セルロース、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、セリシン、キチン、キトサン、セルロースを用いることができ、より好ましくは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体、カルボキシメチルセルロース、酸化再生セルロース、ヒアルロン酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、コラーゲン、ゼラチンを用いることができる。これらは、１種単独又は２種以上の組み合わせの何れであっても良い。
【００５４】
前記高分子化合物は、本発明の医療用材料の用途等により適宜設定されるが、一般には、医療用材料の全重量に対して１〜４０重量％、好ましくは１〜２０重量％、より好ましくは１〜１０重量％、さらにより好ましくは１〜５重量％とすることができる。高分子化合物の割合を上記範囲の上限よりも高くすると、ポリアミノ酸に基づく細胞分化促進の機能又は医療用材料の物性が損なわれる傾向にあり、また、その割合を上記範囲の下限よりも低くすると、高分子化合物を含有した効果が認められにくくなる。
【００５５】
本発明の医療用材料は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば繊維構造体とすることができる。当該繊維構造体は、平均繊維径（直径）が５０ｎｍ以上、好ましくは１００ｎｍ以上、より好ましくは１５０ｎｍ以上、さらにより好ましくは２００ｎｍ以上であり、１，５００ｎｍ未満、好ましくは１，０００ｎｍ未満、より好ましくは５００ｎｍ未満のナノファイバーから構成される。繊維構造体の平均繊維径は、当業者に公知の方法を用いて測定することができる。具体的には、繊維構造体の表面を走査型電子顕微鏡で無作為に撮影した写真から、任意に１０箇所を選択して繊維の直径を測定し、その平均値を求めて平均繊維径とすることができる。繊維構造体の写真は、５００〜２００，０００倍の倍率で拡大して撮影したものを用いることができる。本発明においては、より具体的には、後述の実施例に従って繊維構造体の平均繊維径を測定することができる。
【００５６】
本明細書において、繊維構造体とは、単数又は複数の繊維により形成された構造体をいい、その形態としては、例えば、フィラメント、ステーブル、フィラメントヤーン、スパンヤーン（紡績糸）、織物、編物、不織布、紙、シート状物、チューブ、メッシュ、糸状物等が挙げられる。本発明において好ましい繊維構造体の形態は、不織布である。
【００５７】
繊維構造体に含有されるポリアミノ酸は上記の通りであるが、１〜３種のアミノ酸残基で構成されることが好ましい。ポリアミノ酸が１種のアミノ酸残基で構成される場合、当該アミノ酸残基は、上記に示されたアミノ酸残基であれば特に限定されないが、アラニン残基、ロイシン残基、バリン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいアスパラギン酸残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基、又は側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基であることが好ましい。また、ポリアミノ酸が２種のアミノ酸残基で構成される場合、２種のうちの１種のアミノ酸残基は、上記に示されたアミノ酸残基であれば特に限定されないが、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基、又はフェニルアラニン残基であることが好ましい。
２種のアミノ酸残基のうちの１種が前記リジン残基である場合は、残りの１種は、特に限定されないが、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基又はフェニルアラニン残基であることが好ましい。即ち、２種のアミノ酸残基の組み合わせは、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基とアラニン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基とバリン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基とロイシン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基とイソロイシン残基、又は側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基とフェニルアラニン残基である。
２種のアミノ酸残基のうちの１種が前記グルタミン酸残基である場合は、残りの１種は、特に限定されないが、アラニン残基、ロイシン残基、バリン残基、イソロイシン残基、又はフェニルアラニン残基であることが好ましい。即ち、２種のアミノ酸残基の組み合わせは、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基とアラニン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基とロイシン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基とバリン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基とイソロイシン残基、又は側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基とフェニルアラニン残基である。
２種のアミノ酸残基のうちの１種がフェニルアラニン残基である場合は、残りの１種は、特に限定されないが、ロイシン残基又はバリン残基であることが好ましい。即ち、２種のアミノ酸残基の組み合わせは、フェニルアラニン残基とロイシン残基、又はフェニルアラニン残基とバリン残基である。
【００５８】
ポリアミノ酸が３種のアミノ酸残基で構成される場合は、特に限定されないが、フェニルアラニン残基／側鎖に保護基を含んでいてもよいアスパラギン酸残基／側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基、フェニルアラニン残基／側鎖に保護基を含んでいてもよいアスパラギン酸残基／側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基、又はロイシン残基／側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基／側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基が好ましい。
なお、ポリアミノ酸の保護基含有率を調整する場合は、上記と同様に、側鎖に保護基を含むアスパラギン酸残基、リジン残基又はグルタミン酸残基と記載することによって、一部は保護基を含まないアスパラギン酸残基、リジン残基又はグルタミン酸残基が存在することも包含することを意味する。
【００５９】
繊維構造体は、電界紡糸装置を用いて電界紡糸することによって製造される。電界紡糸装置は、例えば、カトーテック社ナノファイバーエレクトロスピニングユニット（ＮＥＵ）を挙げることができ、シリンジ、ノズル（ニードル）、シリンジポンプ、高電圧発生装置、コレクターを備えている。
【００６０】
本発明の医療用材料が繊維構造体である場合、当該繊維構造体の製造方法は、以下の工程を含有することを特徴とする。
工程１）ポリアミノ酸を溶媒に溶解して溶液とする工程、
工程２）シリンジ内に入れた前記溶液をシリンジの先に取り付けたノズルから連続的に吐出する工程、
工程３）前記吐出において高電圧発生装置でノズルとコレクターの間に高電圧を印加する工程、
工程４）ノズルとコレクターの間で前記吐出溶液を繊維の形状に変える工程、
工程５）当該繊維をコレクター上に捕集する工程。
【００６１】
工程１における溶液中のポリアミノ酸の濃度は、使用するポリアミノ酸の種類、ポリアミノ酸を溶解する溶媒の種類等により適宜に設定されるが、一般には、０．１〜６０重量％、好ましくは１〜４５重量％、より好ましくは１〜２０重量％とすることができる。ポリアミノ酸の濃度を上記範囲より高くすると溶液の粘度が高くなり紡糸性が不良となる傾向がある。また、該濃度を上記範囲より低くすると、繊維構造体の製造に多大な時間を要することになる。２種以上のポリアミノ酸を用いる場合は、各種ポリアミノ酸を適宜混合して溶解させた溶液を調製すればよい。ポリアミノ酸の混合比は、例えば２種のポリアミノ酸であれば、重量比として９５：５〜５：９５、好ましくは９０：１０〜１０：９０とすることができる。
【００６２】
工程１における本発明に使用されるポリアミノ酸を溶解する溶媒としては、ポリアミノ酸を溶解し、かつ、繊維を形成する段階で蒸発等により除かれやすい溶媒であれば特に制限されないが、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、メタノール、エタノール、２−プロパノール、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、石油エーテル、１，４−ジオキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ヘキサン、シクロヘキサン、酢酸エチル、酢酸ブチル、トリフルオロ酢酸、酢酸、ギ酸、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、トリクロロエタン、トリクロロエチレン、トリフルオロエタン、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、２，２，２−トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロアセトン、ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ピリジン、アセトニトリル、水等が挙げられる。
【００６３】
得られる繊維構造体の平均繊維径を制御できるという観点から、トリフルオロ酢酸、酢酸、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、トリクロロエタン、トリクロロエチレン、トリフルオロエタン、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、２，２，２−トリフルオロエタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、水が好ましく、トリフルオロ酢酸、酢酸、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、２，２，２−トリフルオロエタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、水がより好ましい。これらは、１種単独又は２種以上の組み合わせの何れであっても良い。
【００６４】
工程１におけるポリアミノ酸の溶解については、必要に応じて、加温、超音波装置の使用、溶解補助剤の添加等の方法を用いることができる。溶解補助剤としては、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニア等の無機塩基、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、リジン、オルニチン、アルギニン等の有機アミン、塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸、酒石酸、クエン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、グリコール酸、リンゴ酸、乳酸、脂肪酸、酸性アミノ酸、ピログルタミン酸等の有機酸を挙げることができる。これらは、１種単独又は２種以上の組み合わせの何れであっても良い。
【００６５】
工程２におけるポリアミノ酸溶液を吐出する速度は、吐出する溶液の粘度、電界紡糸装置のスケール等により適宜に設定されるが、一般には、０．１〜６０ｍｌ／時、好ましくは１〜２０ｍｌ／時とすることができる。吐出する速度を上記範囲より速くすると、吐出した溶液が液滴状態のままコレクター上に到達して、繊維どうしの融合等を引き起こす傾向がある。また、吐出する速度を上記範囲より遅くすると、繊維構造体の製造に多大な時間を要することになる。
【００６６】
工程２において溶液が吐出されるノズルは１個又は２個以上の何れでも良く、従って、溶液の吐出は１箇所又は２箇所以上の何れで行われても良い。また、工程４において形成された繊維の付着、工程２における吐出溶液からの固形物の析出等により、ノズルの吐出口が塞がれて工程２における溶液の吐出が妨げられる場合には、適当な方法により、これら付着物、析出物等を除きながら吐出を行うことで、溶液の吐出が妨げられることを回避することができる。
【００６７】
工程３におけるノズルとコレクターの間に印加する電圧は、吐出する溶液の粘度、電界紡糸装置のスケール等により適宜に設定されるが、一般には、５〜５０ｋＶ、好ましくは１１〜４５ｋＶとすることができる。本発明では、該電圧を１１ｋＶ以上、好ましくは１３ｋＶ以上、より好ましくは１５ｋＶ以上、さらに好ましくは１７ｋＶ以上、特に好ましくは１９ｋＶ以上とすることができ、また該電圧を４５ｋＶ以下、好ましくは４０ｋＶ以下、より好ましくは３５ｋＶ以下、さらに好ましくは３０ｋＶ以下、特に好ましくは２５ｋＶ以下とすることができる。印加する電圧を上記範囲より高くすると、ノズルとコレクターの間で放電する危険性がある。また、印加する電圧を上記範囲より低くすると、繊維径が小さくならない上に紡糸性が不良となる傾向がある。
【００６８】
工程４におけるノズルとコレクターの間隔は、電界紡糸装置のスケール等により適宜に設定されるが、一般には、５〜５０ｃｍ、好ましくは１０〜４０ｃｍとすることができる。本発明では、該間隔を１０ｃｍ以上、好ましくは１２ｃｍ以上、より好ましくは１４ｃｍ以上、さらに好ましくは１６ｃｍ以上、特に好ましくは１８ｃｍ以上とすることができ、また該間隔を４０ｃｍ以下、好ましくは３５ｃｍ以下、より好ましくは３０ｃｍ以下、さらに好ましくは２５ｃｍ以下、特に好ましくは２０ｃｍ以下とすることができる。該間隔を上記範囲より長くすると、形成された繊維がコレクターに届かずに、ノズルとコレクターの間の部位に付着してしまうことになる。また、該間隔を上記範囲より短くすると、吐出した溶液が液滴状態のままコレクター上に到達して、繊維どうしの融合等を引き起こす傾向がある。
【００６９】
工程５によりコレクター上に形成された繊維構造体は、必要に応じて、中和、乾燥等の操作を行うことができる。例えば、本発明に使用されるポリアミノ酸を溶解する溶媒あるいは溶解補助剤に有機酸を用いた場合には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、重炭酸ナトリウム等のアルカリ水溶液に浸漬する、アルカリ水溶液を噴霧する、あるいはアンモニア飽和蒸気中に放置する等の方法により、繊維構造体中に残存する有機酸を中和することができる。また、本発明に使用されるポリアミノ酸を揮発性が低い溶媒に溶解した場合には、加温する、乾燥空気を吹き付ける、真空もしくは減圧下に放置する等の方法により、繊維構造体中に残存する溶媒を除くことができる。
【００７０】
工程５によりコレクター上に形成された繊維構造体の厚みは、用途に応じ任意であるが、例えば、組織や細胞の足場材として使用する場合は１〜１００μｍ程度、人工皮膚として使用する場合は５０〜１００μｍ程度である。
【００７１】
工程１〜５における電界紡糸を行う温度及び湿度は、本発明に使用されるポリアミノ酸を溶解する溶媒の種類等により適宜に設定されるが、一般には、５〜３０℃、相対湿度１０〜８０％に調整される。
【００７２】
工程１〜５において使用されるノズルは、工程２において溶液を吐出することができ、かつ、工程３において高電圧を印加する際に電極となり得るものであれば如何なる形状、大きさでも良いが、例えば、注射針を挙げることができる。工程１〜５を含有する電界紡糸に用いられる注射針の径は、一般には、０．０１〜２．０ｍｍ、好ましくは０．１〜１．５ｍｍとすることができる。注射針の径を上記範囲より大きくすると、吐出した溶液が液滴状態のままコレクター上に到達する傾向が高くなる。また、径を上記範囲より小さくすると、時間あたりの吐出量が少ないために繊維構造体の製造に多大な時間を要することになる。
【００７３】
工程１〜５において使用されるコレクターは、銅、アルミニウムあるいはステンレス鋼など導電性の良い金属を備え、工程３において高電圧を印加する際に電極となり得るものであれば如何なる形状、大きさでも良い。例えば、コレクターを円筒状の回転体とすることで、膜状、管状、あるいは、中空状の繊維構造体を得ることができる。さらに、繊維構造体をコレクターから容易に取り外すため、コレクターの電極としての機能を損なわないもの、例えば、アルミホイル、スパンボンド不織布、ガーゼ、マイクロナノファイバーシート等を、コレクター上に敷いて、これらの上に繊維構造体を形成させても良い。
【００７４】
本発明の医療用材料はまた、フィルムとすることができる。当該フィルムは、その厚さが、０．１μｍ以上、好ましくは１μｍ以上、より好ましくは１０μｍ以上であり、また２５０μｍ以下、好ましくは２００μｍ以下、より好ましくは１００μｍ以下である。本明細書において、フィルムとは、薄い膜状の形態を有する成形体であって、それ自体が単独で固形物として存在し得るものをいう。フィルムは単独で用いられてもよく、またプラスチック等の固相単体の表面に接触させるようにして当該固相単体と併せて用いられてもよい。フィルムの厚さは、当業者に公知の方法を用いて測定することができる。具体的には、一般的な膜厚計及び透過型赤外線膜厚計や正反射型赤外線膜厚計を用いることができ、測定機器はミツトヨ社、セイコーイーエム社、クラボウ社及び横河電気社などから購入することができる。
【００７５】
フィルムに含有されるポリアミノ酸は上記の通りであるが、１〜３種のアミノ酸残基で構成されることが好ましい。ポリアミノ酸が１種のアミノ酸残基で構成される場合、当該アミノ酸残基は、上記に示されたアミノ酸残基であれば特に限定されないが、バリン残基、又は側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基であることが好ましい。ポリアミノ酸が２種のアミノ酸残基で構成される場合、２種のうちの１種のアミノ酸残基は、上記に示されたアミノ酸残基であれば特に限定されないが、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基、リジン残基、又はフェニルアラニン残基であることが好ましい。
２種のアミノ酸残基のうちの１種が前記グルタミン酸残基である場合は、残りの１種は、特に限定されないが、バリン残基、イソロイシン残基、又は側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基であることが好ましい。即ち、２種のアミノ酸残基の組み合わせは、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基とバリン残基、又は側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基とイソロイシン残基である。
２種のアミノ酸残基のうちの１種が前記リジン残基である場合は、残りの１種は、特に限定されないが、アラニン残基、バリン残基、又はイソロイシン残基であることが好ましい。即ち、２種のアミノ酸残基の組み合わせは、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基とアラニン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基とバリン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基とイソロイシン残基である。
２種のアミノ酸残基のうちの１種がフェニルアラニン残基である場合は、残りの１種は、特に限定されないが、バリン残基であることが好ましい。即ち、２種のアミノ酸残基の組み合わせは、フェニルアラニン残基とバリン残基である。
ポリアミノ酸が３種のアミノ酸残基で構成される場合は、特に限定されないが、フェニルアラニン残基／側鎖に保護基を含んでいてもよいアスパラギン酸残基／側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基、又はフェニルアラニン残基／側鎖に保護基を含んでいてもよいアスパラギン酸残基／側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基が好ましい。
なお、ポリアミノ酸の保護基含有率を調整する場合は、上記と同様に、側鎖に保護基を含むアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、又はリジン残基と記載することによって、一部は保護基を含まないアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、又はリジン残基が存在することも包含することを意味する。
【００７６】
本発明に使用されるポリアミノ酸のフィルムの製造方法としては、特に限定されないが、例えば溶液キャスト製膜法が用いられる。具体的には、特開２００８−１０７４号公報に記載されているようにポリアミノ酸と溶媒とが含まれるドープを支持体に流延し、流延膜を形成する。支持体上で流延膜を乾燥して自己支持性を持たせたのちに支持体から剥離して必要に応じて乾燥工程を経る。このときのポリアミノ酸の濃度は、使用するポリアミノ酸の種類、ポリアミノ酸を溶解する溶媒の種類等により適宜に設定されるが、一般には０．１〜６０重量％である。２種以上のポリアミノ酸を用いる場合は、各種ポリアミノ酸を適宜混合して溶解させた溶液を調製する。なお、フィルムの製造方法は、上記の他にも溶融押出成型法、カレンダー法などを利用することもできる。溶融押出成型法としては、インフレーション法又はＴダイ法などが挙げられる。フィルムは、共押出法、ラミネート法やヒートシールなどの方法で複数の層を重ねた形状に加工することが可能である。
【００７７】
ポリアミノ酸を溶解する溶媒としては、ポリアミノ酸を溶解し、フィルムを形成する段階で蒸発等により除かれやすい溶媒であれば特に制限されないが、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、メタノール、エタノール、２−プロパノール、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、石油エーテル、１，４−ジオキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ヘキサン、シクロヘキサン、酢酸エチル、酢酸ブチル、トリフルオロ酢酸、酢酸、ギ酸、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、トリクロロエタン、トリクロロエチレン、トリフルオロエタン、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、２，２，２−トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロアセトン、ホルムアミド、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ピリジン、アセトニトリル、リン酸緩衝液、水等が挙げられる。
【００７８】
本発明の医療用材料はまた、コーティングとすることができる。本明細書において、コーティングとは、一般的な製品に使用される材料の表面を被覆した皮膜のことをいい、それ自体は支持力を有しないために単独で固形物としては存在し得ない。一般的な製品に使用される材料としては、例えば、ガラス、布（繊維）、金属、プラスチック等が挙げられる。当該コーティングの厚さは、０．１μｍ以上、好ましくは１μｍ以上、より好ましくは１０μｍ以上、２５０μｍ以下、好ましくは２００μｍ以下、より好ましくは１００μｍ以下である。その厚さは、当業者に公知の方法を用いて測定することができる。具体的には、一般的な膜厚計及び赤外線膜厚計、超音波厚さ計、電磁誘導式膜厚計、滑電流式膜厚計などを用いて測定することができ、測定機器は、ミツトヨ社、ＭＫサイエンティフィク社、ロイノス社、クラボウ社、ＧＥインスペクションテクノロジーズ社などで購入することができる。
【００７９】
コーティングは、ポリアミノ酸を溶媒に溶解し、ガラスやプラスチック等の固相単体の表面に塗布して、乾燥させることにより得ることができる。ポリアミノ酸を溶解させる溶媒としては、ポリアミノ酸を溶解し、かつ平滑に塗布できる溶媒であれば特に制限されないが、例えばアセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、メタノール、エタノール、２−プロパノール、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、石油エーテル、１，４−ジオキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ヘキサン、シクロヘキサン、酢酸エチル、酢酸ブチル、トリフルオロ酢酸、酢酸、ギ酸、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、トリクロロエタン、トリクロロエチレン、トリフルオロエタン、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、２，２，２−トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロアセトン、ホルムアミド、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ピリジン、アセトニトリル、リン酸緩衝液、水等が挙げられる。
【００８０】
ポリアミノ酸を溶解させた溶液は、スピンコート法、ディップコート法、ドロップキャスト法、スプレイコート法、インクジェット法、スクリーン印刷法、スタンプ等の接触印刷法、インラインコート法、オフラインコート法、ロールコート法、グラビアコート法、マイクログラビアコート法、リバースコート法、リバースグラビアコート法、バーコート法、ロールブラッシュ法、エアーナイフコート法、カーテンコート法、ダイコート法などの任意の方法を用いて固相単体表面に塗布することができる。これらの塗布方法は、単独で、又は組み合わせて用いることができる。例えば、バーコート法を用いる場合は、調製した溶液を固相単体上に垂らしてバーコータで引き伸ばし、最後に乾燥させることで薄膜を作製することができる。
【００８１】
ポリアミノ酸を溶解させた溶液を塗布した後、必要に応じて乾燥を促進するための特定の操作を行うこともできる。当該乾燥の操作は、使用するポリアミノ酸の種類、ポリアミノ酸を溶解した溶媒の種類等により適宜設定されるが、通常、風乾、乾燥空気の吹き付け、真空もしくは減圧下での放置等により行われる。このときの温度は、通常、室温〜１００℃程度である。
【００８２】
コーティングに含有されるポリアミノ酸は上記の通りであるが、１〜３種のアミノ酸残基で構成されることが好ましい。ポリアミノ酸が１種のアミノ酸残基で構成される場合、当該アミノ酸残基は、上記に示されたアミノ酸残基であれば特に限定されないが、グリシン残基、又は側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基であることが好ましい。ポリアミノ酸が２種のアミノ酸残基で構成される場合、２種のうちの１種のアミノ酸残基は、上記に示されたアミノ酸残基であれば特に限定されないが、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基であることが好ましい。
２種のアミノ酸残基のうちの１種が前記リジン残基である場合は、残りの１種は、特に限定されないが、アラニン残基、フェニルアラニン残基、又は側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基であることが好ましい。即ち、２種のアミノ酸残基の組み合わせは、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基とアラニン残基、又は側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基とフェニルアラニン残基である。
ポリアミノ酸が３種のアミノ酸残基で構成される場合は、特に限定されないが、ロイシン残基／側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基／側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基が好ましい。
なお、ポリアミノ酸の保護基含有率を調整する場合は、上記と同様に、側鎖に保護基を含むグルタミン酸残基又はリジン残基と記載することによって、一部は保護基を含まないグルタミン酸残基又はリジン残基が存在することも包含することを意味する。
【００８３】
本発明の医療用材料は、表面改質が行われていてもよい。特に、再生医療分野で使用する場合は、細胞培養、細胞足場材料への組込み、バイオリアクターでの培養等において様々な材料と接触し、表面からの影響を受ける場面が多いことから、当該医療用材料は表面改質が行われていることが好ましい。表面改質は、物理的表面改質、物理化学的表面改質、化学的表面改質に分類することができる。物理的表面改質としては、生体分子や高分子のコーティング、ハニカム加工や多孔質化などの形状改質等があげられる。物理化学的表面処理としては、紫外線処理、高圧放電処理、ガンマ線照射処理、イオンビーム処理、プラズマ処理等があげられる。化学的表面改質としては、ペプチドや蛋白質等の生物分子の固定化、高分子表面官能基の修飾、高分子グラフト化、ブレンド、結晶化、非晶化、パターンニングなどの相分離等があげられる。
【００８４】
本発明の医療用材料は、特に限定されないが、再生医療分野における生体組織又は細胞再生のための基材として使用することが好ましく、例えば、組織再生用足場材、手術用縫合糸、縫合補強材、ステント、骨折固定材、人工靭帯、創傷被覆材、人工硬膜、人工血管、人工基底膜、人工細胞外マトリクス、医療用接着剤、医療用接合材、薬物担持基材、ドラッグデリバリー（ＤＤＳ）基材、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞のような万能性若しくは多能性幹細胞、及びその他の各種幹細胞を分化誘導する際の担持基材等に利用することができる。本発明の医療用材料は単独で用いてもよく、あるいは、その他の医療用材料、医薬品、治療用細胞又は幹細胞等と組み合わせて用いてもよい。本発明の医療用材料を哺乳動物（例、ヒト）の体内に移入すると、当該医療用材料の移入部位において細胞（例、間葉系幹細胞）の分化が促進されるので、侵襲部位の早期修復等のような効果が期待できる。
【００８５】
本発明の医療用材料は、ポリアミノ酸を主成分として含有することから、生体内において容易に分解することができる。特に当該医療用材料が繊維構造体である場合は、当該繊維構造体はin vivoにおける細胞外マトリクスと同程度の繊維径を有していることから、生体内においてさらに容易に分解することが可能である。そのため、本発明の医療用材料は、生体内において生体組織や細胞が修復、再生された後には速やかに消失することが望まれる足場材に好適である。本明細書において、足場材とは、再生医療分野における生体組織又は細胞再生のための基材であって、生体組織の欠損を修復、再生、治療することを目的とした生体材料として機能する成形体をいう。
【００８６】
本発明の医療用材料は、欠損した生体組織又は細胞の部位に対応した形状又は構造に成形して、皮膚、血管、神経、骨、軟骨、食道、弁、その他臓器などの修復、再生、治療のために直接的又は間接的に使用することができる。また、細胞足場材又はその足場中に、細胞成長因子、細胞接着因子、細胞分化因子、抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗腫瘍剤、ビタミン類等の種々の薬剤を含有させることもできる。
【００８７】
また、本発明の医療用材料をin vitroで使用して、本発明の医療用材料の表面に細胞（例、未分化細胞）が接触するようにして細胞培養を行うことにより、細胞の分化を促進することができる。
【００８８】
分化促進の対象となる細胞は、培養により分化し得る細胞であれば特に限定されないが、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、核移植ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞等が挙げられる。好ましくは、間葉系幹細胞が用いられる。
【００８９】
当該方法は、特に限定されないが、生体外において使用することが好ましく、上記医療用材料の表面に細胞を接触させる工程、及び当該細胞を培養する工程を含むことができる。接触させる対象となる細胞は特に限定されないが、上記に例示された細胞と同様のものを用いることができる。
【００９０】
細胞を接触させる方法は、その後に細胞が培養され、且つ分化し得る状況にあれば特に限定されないが、例えば、細胞を液体培地等に懸濁した溶液を調製し、得られた溶液を、上記医療用材料を含む容器等に添加することにより行うことができる。
【００９１】
細胞を培養する培地としては、使用される細胞の種類によって適宜選択され、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、α−ＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＲＰＭＩ培地、ＳｔｅｍＳｐａｎ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ培地、及びこれらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。また、該培地は、血清含有培地又は無血清培地とすることができる。無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。また、培地中には、必要に応じて添加剤としてサイトカインや細胞増殖因子を含有させることができる。サイトカインや細胞増殖因子を含有することにより、さらに細胞の増殖速度を高めたり、細胞活性を高めたりすることができる。具体的には、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、幹細胞因子、Ｆｌｋ２／Ｆｌｋ３リガンド、トロンボポエチン、可溶性インターロイキン−６レセプター、インターロイキン−３等を挙げることができる。
【００９２】
細胞の培養条件は、用いられる培地により適宜設定することができる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、例えば、約１〜１０％、好ましくは約２〜７％である。培養期間は、約１週間以上、何回か継代を行い、好ましくは３〜５週間程度とすることができる。
【００９３】
また当該方法では、細胞が培養され、ある程度コロニーが大きくなった後で、当該細胞をフィーダー細胞上で継代培養することもできる。フィーダー細胞としては、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させた線維芽細胞（例えば、マウス胎仔由来の線維芽細胞（ＭＥＦ））等が挙げられる。ＭＥＦとしては、例えばＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62: 1073-1085 (1990)）等が用いられ得る。
【００９４】
当該方法において上記医療用材料はそのまま用いてもよく、又は使用に際して適当な形状に加工して用いてもよく、或いは当該医療用材料以外の別の基材の表面に被覆、塗布等により固定化して用いてもよい。特に本発明の医療用材料がコーティングである場合は、前記基材の表面に容易に塗布することができる。基材に使用される素材としては、医療用に用いられている素材が好ましく、例えば、ポリ塩化ビニル、セルロース系ポリマー、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ヒドロキシアパタイト、炭酸カルシウム、酸化チタン、チタン、タンタル、ジルコニア、アルミナ、シリカ等が挙げられる。
【００９５】
細胞の分化が促進されたか否かは、使用する細胞及び分化後の細胞の種類によって異なるが、上記医療用材料又は当該医療用材料を被覆した基材の表面で、培地を加えて細胞培養を行い、一定期間（例えば、１０〜４０日間）が経過した後に、分化した細胞において通常使用されるマーカーを測定することにより調べることができる。詳細には、後述の実施例において示されたとおりに行うことができる。
【００９６】
本発明においては、上記ポリアミノ酸のアミノ酸残基の種類、組成、又は保護基含有率を調整することにより、細胞分化促進効果を有する範囲内で細胞接着に関する特性を変化させることができる。具体的には、細胞接着抑制効果又は細胞接着効果を有し、且つ細胞分化促進効果を有する医療用材料とすることができる。
【００９７】
細胞や生体組織の接着抑制効果に優れた医療用材料を得るためには、本発明の医療用材料に含有されるポリアミノ酸は１種又は２種のアミノ酸残基で構成され得る。ポリアミノ酸が１種のアミノ酸残基で構成される場合、当該アミノ酸残基は、上記に示されたアミノ酸残基であれば特に限定されないが、アラニン残基、ロイシン残基、バリン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいアスパラギン酸残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基であり得る。また、ポリアミノ酸が２種のアミノ酸残基で構成される場合、２種のうちの１種のアミノ酸残基は、上記に示されたアミノ酸残基であれば特に限定されないが、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基、又はフェニルアラニン残基であり得る。このとき、本発明の医療用材料は繊維構造体であり得る。
２種のアミノ酸残基のうちの１種が前記リジン残基である場合は、残りの１種は、特に限定されないが、アラニン残基、バリン残基、又はイソロイシン残基であり得る。即ち、２種のアミノ酸残基の組み合わせは、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基とアラニン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基とバリン残基、又は側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基とイソロイシン残基である。このとき、本発明の医療用材料は繊維構造体であり得る。
２種のアミノ酸残基のうちの１種が前記グルタミン酸残基である場合は、残りの１種は、特に限定されないが、アラニン残基、ロイシン残基、バリン残基、イソロイシン残基、フェニルアラニン残基又はグルタミン残基であり得る。即ち、２種のアミノ酸残基の組み合わせは、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基とアラニン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基とバリン残基、又は側鎖に保護基を含んでいてもよいイソロイシン残基である。このとき、本発明の医療用材料は繊維構造体であり得る。
２種のアミノ酸残基のうちの１種がフェニルアラニン残基である場合は、残りの１種は、特に限定されないが、バリン残基であり得る。即ち、２種のアミノ酸残基の組み合わせは、フェニルアラニン残基とバリン残基である。このとき、本発明の用医療用材料は繊維構造体であり得る。
なお、ポリアミノ酸の保護基含有率を調整する場合は、上記と同様に、側鎖に保護基を含むアスパラギン酸残基、リジン残基、又はグルタミン酸残基と記載することによって、一部は保護基を含まないアスパラギン酸残基、リジン残基、又はグルタミン酸残基が存在することも包含することを意味する。
【００９８】
上記のポリアミノ酸は、特に限定されないが、具体的には、ポリ−Ｌ−アラニン、ポリ−Ｌ−ロイシン、ポリ−Ｌ−バリン、ポリ−β−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸、ポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アラニン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（９／１〜６／４）、ポリ−Ｌ−ロイシン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（９／１〜６／４）、ポリ−Ｌ−バリン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（６／４）、ポリ−Ｌ−イソロイシン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（６／４）、ポリ−Ｌ−フェニルアラニン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（９／１〜６／４）、ポリ−Ｌ−アラニン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（９／１〜３／７）、ポリ−Ｌ−バリン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（６／４）、ポリ−Ｌ−イソロイシン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（６／４）、ポリ−Ｌ−バリン／Ｌ−フェニルアラニン（１／１）、ポリ−Ｌ−グルタミン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸、ポリ−γ−（メチル／ポリエチレングリコール）−Ｌ−グルタミン酸、ポリ−Ｌ−アラニン／Ｌ−リジンが好ましく、ポリ−Ｌ−アラニン、ポリ−Ｌ−ロイシン、ポリ−Ｌ−バリン、ポリ−β−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸、ポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アラニン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（９／１〜６／４）、ポリ−Ｌ−バリン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（６／４）、ポリ−Ｌ−イソロイシン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（６／４）、ポリ−Ｌ−アラニン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（９／１）、ポリ−Ｌ−バリン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（６／４）、ポリ−Ｌ−イソロイシン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（６／４）、ポリ−Ｌ−バリン／Ｌ−フェニルアラニン（１／１）、ポリ−γ−（メチル／ポリエチレングリコール）−Ｌ−グルタミン酸、ポリ−Ｌ−アラニン／Ｌ−リジンがより好ましく、ポリ−Ｌ−アラニン、ポリ−Ｌ−ロイシン、ポリ−Ｌ−バリン、ポリ−Ｌ−アラニン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（９／１〜６／４）、ポリ−Ｌ−イソロイシン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（６／４）、ポリ−Ｌ−アラニン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（９／１）、ポリ−Ｌ−バリン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（６／４）、ポリ−Ｌ−アラニン／Ｌ−リジンが挙げられる。
【００９９】
上記のような細胞接着抑制効果を有する医療用材料は、例えば細胞凝集塊（スフェロイド）形成基材として有用である。
【０１００】
上記に示された効果により、本発明はまた、上記アミノ酸残基を含有するポリアミノ酸を主成分として含有する医療用材料を用いて、細胞同士の接着、細胞と生体組織との接着、生体組織同士の接着、及び細胞若しくは生体組織と固体物質との接着を抑制する方法も提供することができる。当該医療用材料を用いることにより、細胞接着を抑制しつつ、細胞分化を促進することができる。
【０１０１】
当該方法は、上記医療用材料を、それを必要とする対象に移植する工程を含むことができる。その移植に際しては、当該医療用材料を、接着抑制の対象とする物質の間に挿入して用いることが好ましい。具体的には、患部において再生しつつある生体組織が他の組織に接着（癒着）するのを防ぐような位置に置いたり、或いは人工臓器等の固体物質と生体組織との接着を防ぐために当該固体物質の表面を被覆するようにして用いることができる。上記医療用材料を適用する対象は、特に限定されないが、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ハムスター等）であることが好ましい。
【０１０２】
接着抑制の対象となる細胞又は生体組織は、特に限定されないが、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ハムスター等）のあらゆる細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞若しくは間質細胞、又はこれら細胞の前駆細胞、幹細胞若しくは癌細胞等］若しくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例、褐色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋等］とすることができる。
【０１０３】
当該方法において上記医療用材料はそのまま用いてもよく、又は使用に際して適当な形状に加工して用いてもよく、或いは当該医療用材料以外の別の基材の表面に被覆、塗布等により固定化して用いてもよい。特に上記医療用材料がコーティングである場合は、前記基材の表面に容易に塗布することができる。基材に使用される素材としては、医療用に用いられている素材が好ましく、例えば、ポリ塩化ビニル、セルロース系ポリマー、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ヒドロキシアパタイト、炭酸カルシウム、酸化チタン、チタン、タンタル、ジルコニア、アルミナ、シリカ等が挙げられる。
【０１０４】
細胞又は生体組織の接着抑制効果は、特に限定されないが、上記医療用材料又は当該医療用材料を被覆した基材の表面で、培地を加えて細胞培養を行い、一定期間（例えば、１０〜４０日間）が経過した後に当該培地を取り除いて、残存した細胞量を計測することにより調べることができる。詳細には、後述の実施例において示されたとおりに行うことができる。
【０１０５】
一方、細胞接着効果に優れた医療用材料を得る場合は、本発明の医療用材料に含有されるポリアミノ酸は１種又は２種のアミノ酸残基で構成され得る。ポリアミノ酸が１種のアミノ酸残基で構成される場合、当該アミノ酸残基は、上記に示されたアミノ酸残基であれば特に限定されないが、バリン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基、又は側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基であり得る。また、ポリアミノ酸が２種のアミノ酸残基で構成される場合、２種のうちの１種のアミノ酸残基は、上記に示されたアミノ酸残基であれば特に限定されないが、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基、又はフェニルアラニン残基であり得る。
２種のアミノ酸残基のうちの１種が前記リジン残基である場合は、残りの１種は、特に限定されないが、アラニン残基、バリン残基、フェニルアラニン残基、又はイソロイシン残基であり得る。即ち、２種のアミノ酸残基の組み合わせは、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基とアラニン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基とバリン残基、側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基とフェニルアラニン残基、又は側鎖に保護基を含んでいてもよいリジン残基とイソロイシン残基である。
２種のアミノ酸残基のうちの１種が前記グルタミン酸残基である場合は、残りの１種は、特に限定されないが、アラニン残基又はフェニルアラニン残基であり得る。即ち、２種のアミノ酸残基の組み合わせは、側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基とアラニン残基、又は側鎖に保護基を含んでいてもよいグルタミン酸残基とフェニルアラニン残基である。
２種のアミノ酸残基のうちの１種がフェニルアラニン残基である場合は、残りの１種は、特に限定されないが、バリン残基又はロイシン残基であり得る。即ち、２種のアミノ酸残基の組み合わせは、フェニルアラニン残基とバリン残基、又はフェニルアラニン残基とロイシン残基である。
なお、ポリアミノ酸の保護基含有率を調整する場合は、上記と同様に、側鎖に保護基を含むリジン残基又はグルタミン酸残基と記載することによって、一部は保護基を含まないリジン残基又はグルタミン酸残基が存在することも包含することを意味する。
【０１０６】
上記のポリアミノ酸は、特に限定されないが、具体的には、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸、ポリ−Ｌ−フェニルアラニン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（９／１〜３／７）、ＫＯＨ処理等により脱保護されたポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸、ＨＢｒ処理等により脱保護されたポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン、ＨＢｒ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−アラニン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（６／４〜３／７）、ＨＢｒ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−フェニルアラニン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（９／１〜３／７）が好ましく、ＫＯＨ処理等により脱保護されたポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸、ＨＢｒ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−アラニン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（３／７）が挙げられる。これらのポリアミノ酸を用いる場合、本発明の医療用材料は繊維構造体であり得る。
【０１０７】
また上記のポリアミノ酸は、特に限定されないが、ポリ−Ｌ−バリン、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸、ポリ−Ｌ−アラニン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（３／７）、ポリ−Ｌ−バリン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（６／４）、ポリ−Ｌ−イソロイシン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（６／４）、ポリ−Ｌ−バリン／Ｌ−フェニルアラニン（５／５）、ポリ−Ｌ−ロイシン／Ｌ−フェニルアラニン（５／５）、ＫＯＨ処理等により脱保護されたポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸、ＫＯＨ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−アラニン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（３／７）、ＫＯＨ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−フェニルアラニン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（６／４）、ＨＢｒ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−バリン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（６／４）、ＨＢｒ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−イソロイシン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（６／４）が好ましく、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸、ポリ−Ｌ−イソロイシン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（６／４）、ポリ−Ｌ−バリン／Ｌ−フェニルアラニン（５／５）、ＫＯＨ処理等により脱保護されたポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸、ＫＯＨ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−アラニン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（３／７）、ＫＯＨ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−フェニルアラニン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（６／４）、ＨＢｒ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−イソロイシン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（６／４）がより好ましく、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸、ポリ−Ｌ−バリン／Ｌ−フェニルアラニン（５／５）、ＫＯＨ処理等により脱保護されたポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸が挙げられる。これらのポリアミノ酸を用いる場合、本発明の医療用材料はフィルムであり得る。
【０１０８】
また上記のポリアミノ酸は、特に限定されないが、ポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アラニン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（６／４〜３／７）、ＨＢｒ処理等により脱保護されたポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン、ＨＢｒ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−アラニン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（６／４〜３／７）、ポリ−Ｌ−リジンが好ましく、ポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アラニン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（６／４）、ＨＢｒ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−アラニン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（６／４）、ポリ−Ｌ−リジンがより好ましく、ポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アラニン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（６／４）、ＨＢｒ処理等により脱保護されたポリ−Ｌ−アラニン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（６／４）が挙げられる。これらのポリアミノ酸を用いる場合、本発明の医療用材料はコーティングであり得る。
【０１０９】
上記のような細胞接着効果を有する医療用材料は、例えば、細胞培養装置における細胞担持基材、バイオリアクターにおける生物体等の担持基材等として有用である。
【０１１０】
上記に示された効果により、本発明はまた、上記アミノ酸残基を含有するポリアミノ酸を主成分として含有する医療用材料を用いて、細胞を接着させる方法も提供することができる。当該医療用材料を用いることにより、細胞を接着しつつ、細胞分化を促進することができる。
【０１１１】
当該方法は、上記医療用材料を、それを必要とする対象に移植する工程を含むことができる。その移植に際しては、当該医療用材料を、必要とされる患部に当てて用いることが好ましい。上記医療用材料を適用する対象は、特に限定されないが、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ハムスター等）であることが好ましい。
【０１１２】
接着される細胞は、特に限定されないが、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ハムスター等）のあらゆる細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞若しくは間質細胞、又はこれら細胞の前駆細胞、幹細胞若しくは癌細胞等］とすることができる。
【０１１３】
また当該方法は、生体外において使用することも可能であり、上記医療用材料の表面に細胞を接触させる工程、及び当該細胞を培養する工程を含むことができる。接触させる対象となる細胞は特に限定されないが、上記に例示された細胞と同様のものを用いることができ、それらの中でも、再生医療分野に利用できるという観点から前駆細胞や幹細胞を用いることが好ましい。
【０１１４】
細胞を接触させる方法は、その後に細胞が培養できる状況にあれば特に限定されないが、例えば、細胞を液体培地等に懸濁した溶液を調製し、得られた溶液を、上記医療用材料を含む容器等に添加することにより行うことができる。
【０１１５】
細胞を培養する培地としては、使用される細胞の種類によって適宜選択され、例えば、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、α−ＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＲＰＭＩ培地、ＳｔｅｍＳｐａｎ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ培地及びこれらの混合物等が挙げられるが、これらの培地に限定されない。また、培地中には、必要に応じて添加剤としてサイトカインや細胞増殖因子を含有させることができる。サイトカインや細胞増殖因子を含有することにより、さらに細胞の増殖速度を高めたり、細胞活性を高めたりすることができる。具体的には、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、幹細胞因子、Ｆｌｋ２／Ｆｌｋ３リガンド、トロンボポエチン、可溶性インターロイキン−６レセプター、インターロイキン−３等を挙げることができる。
【０１１６】
細胞の培養条件は、用いられる培地により適宜設定することができる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、例えば、約１〜１０％、好ましくは約２〜７％である。培養期間は、約１週間以上、何回か継代を行い、好ましくは３〜５週間程度とすることができる。細胞は、好ましくはインキュベーター内で培養され、培養培地は、静止しているか、又は例えばバイオリアクター等を利用して撹拌することができる。
【０１１７】
当該方法において上記医療用材料はそのまま用いてもよく、又は使用に際して適当な形状に加工して用いてもよく、或いは当該医療用材料以外の別の基材の表面に被覆、塗布等により固定化して用いてもよい。特に本発明の医療用材料がコーティングである場合は、前記基材の表面に容易に塗布することができる。基材に使用される素材としては、医療用に用いられている素材が好ましく、例えば、ポリ塩化ビニル、セルロース系ポリマー、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ヒドロキシアパタイト、炭酸カルシウム、酸化チタン、チタン、タンタル、ジルコニア、アルミナ、シリカ等が挙げられる。
【０１１８】
細胞接着効果は、特に限定されないが、上記医療用材料又は当該医療用材料を被覆した基材の表面で、培地を加えて細胞培養を行い、一定期間（例えば、１０〜４０日間）が経過した後に当該培地を取り除いて、接着増殖した細胞量を計測することにより調べることができる。詳細には、後述の実施例において示されたとおりに行うことができる。
【実施例】
【０１１９】
以下に、実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって何ら限定されるものではない。【０１２０】
医療用材料として、以下の通り、製造例１〜３２の繊維構造体を作製した。
〔製造例１〕  ポリ−Ｌ−アラニン繊維構造体
ベンゼンにＮ−カルボキシ−Ｌ−アラニン無水物を１．４重量％入れて２〜３日間撹拌を行い、ポリ−Ｌ−アラニンを得た。これをジクロロメタン−トリフルオロ酢酸混合溶媒（50：50（v/v））に溶かして、４重量％のポリ−Ｌ−アラニン溶液とした。この溶液を、直径９４０μｍのノズル（ニードル）をつないだシリンジ（テルモ社）に入れ、ノズルとコレクターとの間隔を１０〜１５ｃｍとして、その間に20〜38kVの電圧を印加しながら、溶液を吐出させて、コレクター上にポリ−Ｌ−アラニンからなる繊維構造体を得た。得られたポリ−Ｌ−アラニンからなる繊維構造体表面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を図１に示す。【０１２１】
〔製造例２〕  ポリ−Ｌ−ロイシン繊維構造体
１，２−ジクロロエタンにＮ−カルボキシ−Ｌ−ロイシン無水物を１１．１重量％入れた後、開始剤としてＮ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミンを加えた。２〜３日間撹拌を行い、ポリ−Ｌ−ロイシンを得た。これをジクロロメタン−トリフルオロ酢酸混合溶媒（30：70（v/v））に溶かして、４重量％のポリ−Ｌ−ロイシン溶液とした。この溶液から、製造例１と同様の方法により、ポリ−Ｌ−ロイシンからなる繊維構造体を得た。      【０１２２】
〔製造例３〜７〕  各種ポリアミノ酸繊維構造体
製造例１もしくは２と同様の方法により、重合溶媒に各種Ｎ−カルボキシ−Ｌ−アミノ酸無水物を入れ、必要に応じて重合開始剤を加え、２〜３日間撹拌を行い、各種ポリアミノ酸を得た。使用した重合溶媒及び重合開始剤は表１に示すとおりである。各種ポリアミノ酸を、表１に記載の溶媒を用いて溶液化し、これらの溶液から、製造例１と同様の方法により、各種ポリアミノ酸からなる繊維構造体を得た。【０１２３】
〔製造例８〕  ポリ−Ｌ−アラニン/γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸共重合体（９/１）の繊維構造体
ベンゼンにＮ−カルボキシ−Ｌ−アラニン無水物及びＮ−カルボキシ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸無水物をモル比で９：１、合計で１．４重量％となるように入れて２〜３日間撹拌を行い、ポリ−Ｌ−アラニン/γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸共重合体（９/１）を得た。これをジクロロメタン−トリフルオロ酢酸混合溶媒（50：50（v/v））に溶かして、８重量％のポリ−Ｌ−アラニン/γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸共重合体（９/１）溶液とした。この溶液から、製造例１と同様の方法により、ポリ−Ｌ−アラニン/γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸共重合体（９/１）からなる繊維構造体を得た。【０１２４】
〔製造例９〜２２〕  各種ポリアミノ酸共重合体の繊維構造体
製造例８と同様の方法により、重合溶媒に２種類のＮ−カルボキシ−Ｌ−アミノ酸無水物を入れ、必要に応じて重合開始剤を加え、２〜３日間撹拌を行い、各種ポリアミノ酸共重合体を得た。それぞれ表１に示した材料及び条件で行った。各種ポリアミノ酸共重合体を、表１に記載の溶媒を用いて溶液化し、これらの溶液から、製造例１と同様の方法により、各種ポリアミノ酸共重合体からなる繊維構造体を得た。【０１２５】
〔製造例２３〕  ポリ−Ｌ−グルタミン/γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸共重合体の繊維構造体
１，２−ジクロロエタンにＮ−カルボキシ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸無水物を１６．６重量％入れた後、開始剤としてＮ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミンを加えた。２〜３日間撹拌を行い、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸を得た。これに２，２，２−トリクロロ−１−エタノール（東京化成工業社製）及びｐ−トルエンスルホン酸１水和物（東京化成工業社製）をＮ−カルボキシ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸無水物のモル数に対し、それぞれ４当量及び０．８当量加え、８０℃で反応させてポリ−γ−メチル/（２，２，２−トリクロロエチル）−Ｌ−グルタミン酸共重合体を得た。これをテトラヒドロフラン中でＮ−カルボキシ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸無水物のモルに対し大過剰量となるアンモニアを作用させてポリ−Ｌ−グルタミン/γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸を得た。これをジクロロメタン−トリフルオロ酢酸混合溶媒（１：３（v/v））に溶かして、１４〜１５重量％のポリ−Ｌ−グルタミン/γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸共重合体溶液とした。この溶液から、製造例１と同様の方法により、ポリ−Ｌ−グルタミン/γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸共重合体からなる繊維構造体を得た。【０１２６】
〔製造例２４〕  ポリ−γ−メチル/（ポリエチレングリコール）−Ｌ−グルタミン酸共重合体の繊維構造体
製造例２３で得たポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸にポリエチレングリコールメチルエーテル（シグマアルドリッチ社製、平均分子量３５０）及びｐ−トルエンスルホン酸１水和物をＮ−カルボキシ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸無水物のモル数に対し２当量及び０．２当量加え、７５℃で反応させてポリ−γ−メチル/（ポリエチレングリコール）−Ｌ−グルタミン酸共重合体を得た。測定１記載の方法により重量平均分子量を測定したところ1.4×106であった。これを２，２，２−トリフルオロエタノールに溶かして、１０重量％のポリ−γ−メチル/（ポリエチレングリコール）−Ｌ−グルタミン酸共重合体溶液とした。この溶液から、製造例１と同様の方法により、ポリ−γ−メチル/（ポリエチレングリコール）−Ｌ−グルタミン酸共重合体からなる繊維構造体を得た。【０１２７】
〔製造例２５〕  ポリ−Ｌ−アラニン/Ｌ−リジン共重合体の繊維構造体
製造例１６で得たポリ−Ｌ−アラニン/Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン共重合体（９/１）にトリフルオロ酢酸（東京化成工業社製）及びチオアニソール（東京化成工業社製）をＮ−カルボキシ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン無水物のモル数に対し、それぞれ２７０当量及び５当量加え、室温で反応させてポリ−Ｌ−アラニン/Ｌ−リジン共重合体を得た。これをジクロロメタン−トリフルオロ酢酸混合溶媒（50：70（v/v））に溶かして、４．４重量％のポリ−Ｌ−アラニン/Ｌ−リジン共重合体溶液とした。この溶液から、製造例１と同様の方法により、ポリ−Ｌ−アラニン/Ｌ−リジン共重合体からなる繊維構造体を得た。【０１２８】
〔製造例２６〕  ポリ−Ｌ−アラニン−ポリ−Ｌ−リジン混合体の繊維構造体
製造例１で得たポリ−Ｌ−アラニン及びポリ−Ｌ−リジンハイドロブロマイド（シグマアルドリッチ社製、重量平均分子量＞３００，０００）を重量比９：１の割合で、ジクロロメタン−トリフルオロ酢酸−Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド混合溶媒（50：50：12.5（v/v））に溶かして、４重量％のポリ−Ｌ−アラニン−ポリ−Ｌ−リジン混合体溶液とした。この溶液から、製造例１と同様の方法により、ポリ−Ｌ−アラニン−ポリ−Ｌ−リジン混合体からなる繊維構造体を得た。【０１２９】
〔製造例２７〕  ポリ−Ｌ−アラニン−ポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン混合体（９/１）の繊維構造体
製造例１で得たポリ−Ｌ−アラニン及び製造例５で得たポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジンをモノマー換算したモル比９：１の割合で、ジクロロメタン−トリフルオロ酢酸混合溶媒（50：50（v/v））に溶かして、５．３重量％のポリ−Ｌ−アラニン−ポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン混合体（９/１）溶液とした。この溶液から、製造例１と同様の方法により、ポリ−Ｌ−アラニン−ポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン混合体（９/１）からなる繊維構造体を得た。【０１３０】
〔製造例２８〕  ポリ−Ｌ−アラニン−ポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン混合体（６/４）の繊維構造体
製造例１で得たポリ−Ｌ−アラニン及び製造例５で得たポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジンをモノマー換算したモル比６：４の割合で、ジクロロメタン−トリフルオロ酢酸混合溶媒（50：50（v/v））に溶かして、５．３重量％のポリ−Ｌ−アラニン−ポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン混合体（６/４）溶液とした。この溶液から、製造例１と同様の方法により、ポリ−Ｌ−アラニン−ポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン混合体（６/４）からなる繊維構造体を得た。【０１３１】
〔製造例２９〕  ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸繊維構造体
Ｎ−カルボキシ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸無水物を重合してポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸とした後、ジクロロメタン−トリフルオロ酢酸混合溶媒に溶かして、４重量％のポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸溶液とした。この溶液から、製造例１と同様の方法により、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸からなる繊維構造体を得た。【０１３２】
〔製造例３０〕  キトサン繊維構造体
キトサン粉末（和光純薬工業社）を酢酸−トリフルオロ酢酸混合溶媒（10：90（v/v））に溶かして、４重量％のキトサン溶液とした。この溶液から、製造例１と同様の方法により、キトサンからなる繊維構造体を得た。【０１３３】
〔製造例３１〕  セルロース繊維構造体
セルロース粉末（和光純薬工業社）を酢酸−トリフルオロ酢酸混合溶媒（10：90（v/v））に溶かして、４重量％のセルロース溶液とした。この溶液から、製造例１と同様の方法により、セルロースからなる繊維構造体を得た。【０１３４】
〔製造例３２〕  ゼラチン繊維構造体
ゼラチン粉末をトリフルオロ酢酸に溶かして、９重量％のゼラチン溶液とした。この溶液から、製造例１と同様の方法により、ゼラチンからなる繊維構造体を得た。【０１３５】
〔重量平均分子量の測定〕
重量平均分子量の測定は、ゲル浸透クロマトグラフィー装置（ＧＰＣ、日立社、ＬａＣｈｒｏｍ  Ｅｌｉｔｅ）に分析カラム（昭和電工社、Ｓｈｏｄｅｘ  Ｋ−８０２及びＫ−８０６Ｍ）を取り付けて行った。測定溶液の調製は、ポリアミノ酸濃度が０．２５〜１．０％（ｗ/ｖ）となるようにクロロホルムに溶かした後、フィルター濾過を行った。測定溶液を１０〜８０μｌ注入し、溶離液流速：１ｍｌ／分、カラム保持温度：４０℃の条件にて測定を行った。重量平均分子量の算出には、較正用ポリスチレンを用いた。【０１３６】
【表１】
2012077691.tif 000002
【０１３７】
〔評価１〕  電界紡糸における吐出速度の評価方法
工程１〜５を含有する電界紡糸法による繊維構造体の製造において、工程２におけるノズルからの溶液の吐出を開始してから終了するまでの間に、吐出した溶液の全量を、開始してから終了するまでの時間で除した値を吐出速度とした。評価基準は以下の通りである。
○：吐出速度が１０ｍｌ／時以上
×：吐出速度が１０ｍｌ／時未満【０１３８】
〔評価２〕  平均繊維径の評価方法
得られた繊維構造体の表面が均一であることを目視で確認した後、その表面の一部を採取し、直径12〜13mmの円形カバーグラスもしくはカバースリップ（Thermo Scientific社、Nunc Thermanox Plastic Coverslips）に装着した。採取した繊維構造体の表面を実体顕微鏡（ニコン社、SMZ800）で観察し（倍率10倍）、表面が均一であることを確認した後、走査型電子顕微鏡（SEM、日立社、S-4800）での表面観察に供した。初めに倍率500倍で測定試料の全体を俯瞰し、表面が均一であることを確認した後、倍率を5,000倍に切り替えて無作為に写真撮影を行った。得られた写真を横長に置き、横方向及び縦方向をそれぞれ5等分及び2等分することで、10個の等面積な区画に分けた。それぞれの区画の中央もしくは中央に最も近い繊維のうち焦点のあっているものを選びその径を測定し、それらの平均値を求めて平均繊維径とした。評価基準は以下の通りである。
◎：平均繊維径が１５０ｎｍ未満
○：平均繊維径が１５０ｎｍ以上５００ｎｍ未満
△：平均繊維径が５００ｎｍ以上１μｍ未満
×：平均繊維径が１μｍ以上  【０１３９】
〔評価３〕  繊維径均一性の評価方法
評価２で測定した平均繊維径の標準偏差値を求めた。評価基準は以下の通りである。
◎：標準偏差値が３０ｎｍ未満
○：標準偏差値が３０ｎｍ以上９０ｎｍ未満
△：標準偏差値が９０ｎｍ以上２００ｎｍ未満
×：標準偏差値が２００ｎｍ以上【０１４０】
〔評価４〕  液滴有無の評価方法
得られた繊維構造体の表面を走査型電子顕微鏡（SEM、日立社、S-4800）で無作為に撮影して得た写真（倍率1,000倍）の中に、最大径が５μｍ以上の円形物（液滴状態のままコレクター上に集積したことを示す痕跡）の個数を測定した。評価基準は以下の通りである。
◎：円形物の個数が３個以下
○：円形物の個数が４個以上７個以下
△：円形物の個数が８個以上１５個以下
×：円形物の個数が１６個以上【０１４１】
〔評価５〕  細胞接着抑制効果の評価方法（１）
得られた繊維構造体を直径12〜13mmの円形カバーグラスもしくはカバースリップ（Thermo Scientific社、Nunc  Thermanox Plastic Coverslips）に装着し、24ウェル培養プレート（日本ベクトンデッキンソン社、Falcon培養プレート）にセットした。コントロールとしてコラーゲンが塗布された24ウェル培養プレート（日本ベクトンデッキンソン社、Falconコラーゲンコート培養プレート）を用意した。滅菌のため70%エタノール水溶液に浸漬した後、リン酸緩衝生理食塩水（タカラバイオ社、PBS(-)）で洗浄した。ヒト骨髄間葉系幹細胞（Lonza社、Human Mesenchymal Stem Cell）を間葉系幹細胞培地（Lonza社、MSCGM）、又は、非働化したウシ胎児血清（Invitrogen社、GIBCO  FBS）及びペニシリン−ストレプトマイシン（Sigma-Aldrich社）を含んだダルベッコ変法イーグル培地（Invitrogen社、GIBCO  DMEM）に懸濁させて、20,000cell／ウェルずつ播種し、5%CO2／37℃の条件でインキュベーター（Thermo Scientific社、フォーマインキュベーター）内で3日間、培養した。培養後、培地を取り除き、ラウリル硫酸ナトリウム（ナカライテスク社）を含んだクエン酸（ナカライテスク社）−塩化ナトリウム（ナカライテスク社）緩衝液で細胞を溶解させた。これにビスベンズイミドH33258フルオロクロム三塩酸塩DMSO溶液（ナカライテスク社）を加え、細胞内DNA量を定量することにより、繊維構造体上で接着増殖した細胞数を求めた。評価基準は以下の通りである。
＋＋＋：細胞内DNA量がコントロールのそれに対して10%未満
＋＋：細胞内DNA量がコントロールのそれに対して10%以上30%未満
＋：細胞内DNA量がコントロールのそれに対して30%以上50%未満【０１４２】
〔評価６〕  細胞接着抑制効果の評価方法（２）
評価５と同様に、細胞の播種及び培養を行った。播種し3日間培養した後、培地に生細胞数測定試薬（ナカライテスク社、Cell Count Reagent SF）を添加した。再度、インキュベーター中に置いて４〜５時間経過した後、吸光度（測定波長：４５０ｎｍ）を測定した。
＋＋＋：吸光度がコントロールのそれに対して10%未満
＋＋：吸光度がコントロールのそれに対して10%以上30%未満
＋：吸光度がコントロールのそれに対して30%以上50%未満【０１４３】
評価５及び６に示す評価方法は、操作簡便性、測定精度等から、何れも細胞数を測定するのに汎用の方法である。【０１４４】
上記製造例１〜３２により得られた繊維構造体について、上記評価１〜６の評価を行った。その結果を表２及び表３に示す。なお、評価を実施しなかった箇所は「−」で示す。      【０１４５】
【表２】
2012077691.tif 000003
【０１４６】
【表３】
2012077691.tif 000004
【０１４７】
製造例１〜２８について、平均繊維径も十分に小さく、繊維径の均一性も満たされており、繊維構造体における液滴も観察されないような良好な繊維構造体を得ることができた。これらのうち、ポリ−Ｌ−アラニン、ポリ−Ｌ−ロイシン、ポリ−Ｌ−バリン、ポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アラニン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸  ９／１、ポリ−Ｌ−アラニン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸  ６／４、ポリ−Ｌ−イソロイシン／γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸  ６／４、ポリ−Ｌ−アラニン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン  ９／１、ポリ−Ｌ−バリン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン  ６／４、ポリ−Ｌ−アラニン／Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アラニン−ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アラニン−ポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン  ９／１の繊維構造体は、細胞接着抑制効果に優れた医療用材料であることがわかる（製造例１、２、３、５、８、９、１３、１６、１９、２５、２６、２７）。特にポリ−Ｌ−アラニンの場合は、平均繊維径、均一性、液滴問題、細胞接着抑制の全てにおいて好ましい結果であった。製造例２９については、良好な繊維構造体を作製することは難しいことがわかった。キトサン、セルロース、ゼラチンを用いた製造例３０〜３２については、ことごとく液滴が残り、平均繊維径の均一性にもばらつきが見られるなど、繊維構造体としての品質が十分なものは得られなかった。【０１４８】
〔評価７〕  製造条件（印加電圧、及びノズルとコレクターの距離の設定）の影響
製造例２２に示すポリ−Ｌ−バリン/Ｌ−フェニルアラニン（１/１）溶液に印加する電圧を19〜20kVに変えたことを除いて、製造例２２と同様の方法により、ポリ−Ｌ−バリン/Ｌ−フェニルアラニン（１/１）からなる繊維構造体の作製を試みた。
また、製造例２２に示すポリ−Ｌ−バリン/Ｌ−フェニルアラニン（１/１）溶液に印加する電圧を15kVに変えたことを除いて、製造例２２と同様の方法により、ポリ−Ｌ−バリン/Ｌ−フェニルアラニン（１/１）からなる繊維構造体の作製を試みた。
また、製造例２２に示すポリ−Ｌ−バリン/Ｌ−フェニルアラニン（１/１）溶液に印加する電圧を10kVに変えたことを除いて、製造例２２と同様の方法により、ポリ−Ｌ−バリン/Ｌ−フェニルアラニン（１/１）からなる繊維構造体の作製を試みた。
また、製造例２２に示すポリ−Ｌ−バリン/Ｌ−フェニルアラニン（１/１）溶液に印加する電圧を19〜20kVに変え、かつ該溶液を入れたノズルとコレクターとの間隔を５ｃｍに変えたことを除いて、製造例２２と同様の方法により、ポリ−Ｌ−バリン/Ｌ−フェニルアラニン（１/１）からなる繊維構造体の作製を試みた。
得られた繊維構造体の表面を目視で評価した。具体的には視認可能な粒状物の個数を測定した。粒状物に対する評価基準を下記の通りとして、その結果を表４に示す。
◎：粒状物の個数が１ｃｍ四方あたり０個
○：粒状物の個数が１ｃｍ四方あたり１個以上９個以下
△：粒状物の個数が１ｃｍ四方あたり１０個以上４９個以下
×：粒状物の個数が１ｃｍ四方あたり５０個以上
××：測定不可能【０１４９】
【表４】
2012077691.tif 000005
【０１５０】
ポリ−Ｌ−バリン/Ｌ−フェニルアラニン（１/１）繊維構造体の製造では、ノズルとコレクター間に印加する電圧を低くして、特に10kVにすると、紡糸性が不良となり、繊維構造体を得ることができなかった。また、電圧を15kVとした場合は、繊維構造体を製造することはできたが、吐出した溶液の多くが液滴状態のままコレクター上に到達し、繊維構造体の表面に10個以上の粒状物が視認された。また、ノズルとコレクター間の間隔を短くして、特に5cmにすると、吐出した溶液の殆どが液滴状態のままコレクター上に到達してしまった。【０１５１】
本実施例では、さらに以下の合成例の通りポリアミノ酸を合成し、繊維構造体、フィルム及びコーティングを作製して評価を行った。
〔合成例１〕ポリ−Ｌ−アラニンの合成
ベンゼン（関東化学社製）にＮ−カルボキシ−Ｌ−アラニン無水物を濃度が１．８重量％となるように加え、５５℃〜６５℃で３〜４日間攪拌を行い、ポリ−Ｌ−アラニンを得た。【０１５２】
〔合成例２〜５〕各種ポリアミノ酸の合成
表５−１に示したＮ−カルボキシ−Ｌ−アミノ酸無水物を用い、適宜、重合開始剤を用いて、合成例１と同様に各種ホモポリアミノ酸を得た。それぞれ表５−１に示した溶媒及び濃度で調製した。【０１５３】
〔合成例６〕ポリ−Ｌ−アラニン/γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸共重合体の合成
ベンゼンにＮ−カルボキシ−Ｌ−アラニン無水物及びＮ−カルボキシ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸無水物をモル比で９：１、合計で１．８重量％となるように入れて５５℃〜６５℃で３〜４日間攪拌を行い、ポリ−Ｌ−アラニン/γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸共重合体（モル比９：１）を得た。【０１５４】
〔合成例７〜２１〕各種ポリアミノ酸共重合体の合成
表５−１に示したＮ−カルボキシ−Ｌ−アミノ酸無水物を用い、適宜、重合開始剤を用いて、合成例６と同様の方法により、各種ポリアミノ酸共重合体を得た。それぞれ表５−１に示した溶媒及び濃度で調製した。【０１５５】
〔合成例２２〜３７〕各種ポリアミノ酸または共重合体の合成
表５−２に示したＮ−カルボキシ−Ｌ−アミノ酸無水物を用い、適宜、重合開始剤を用いて、合成例１または６と同様の方法により、各種ポリアミノ酸または共重合体を得た。それぞれ表５−２に示した溶媒及び濃度で調製した。【０１５６】
合成例６〜３７で合成した各種ポリアミノ酸共重合体について、下記に従って組成比を測定した。また、合成例６〜３７で合成した各種ポリアミノ酸の極限粘度を測定し、粘度平均分子量Ｍｖを算出した。【０１５７】
〔組成比の測定〕
ポリアミノ酸（１０ｍｇ程度）を重トリフルオロ酢酸に溶解させた後、１Ｈ核磁気共鳴スペクトル（１ＨＮＭＲ、４００ＭＨｚ、ＢＲＵＫＥＲ社）を測定し、それぞれのアミノ酸側鎖由来シグナルの面積比からアミノ酸組成率を算出した。【０１５８】
〔極限粘度の測定及び粘度平均分子量Ｍｖの算出〕
ポリアミノ酸５０ｍｇ程度を１１ｍｌのジクロロ酢酸（東京化成社製）に溶解させて溶液とした後、１０ｍｌをウベローデ粘度計（柴田科学社製）に入れて２５℃の恒温槽内にて、溶液の液面が標線間を通過する時間を測定した。第１回目の測定後、ジクロロ酢酸を１ｍｌ加えよく攪拌させて、第２回目の測定を行った。さらにジクロロ酢酸を１ｍｌ加えよく攪拌させて、第３回目の測定を行った後、３回の測定結果より極限粘度（［η］単位：ｄＬ／ｇ）を求めた。粘度平均分子量Ｍｖは、以下の４種の換算式（何れもMark−Houwink-Sakurada式：[η]＝KMＶａ）のうちの何れかにより算出した。【０１５９】
【数１】
2012077691.tif 000006
【０１６０】
【表５−１】
2012077691.tif 000007
【０１６１】
【表５−２】
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【０１６２】
〔製造例３３〕ポリ−Ｌ−アラニン繊維構造体
合成例１で合成したポリ−Ｌ−アラニンをジクロロメタン−トリフルオロ酢酸混合溶媒（５０：５０（ｖ／ｖ））に溶かして、４重量％のポリ−Ｌ−アラニン溶液とした。この溶液を、直径９４０μｍのノズル（ニードル）をつないだシリンジ（テルモ社製）に入れ、ノズルとコレクターとの間隔を１０〜１５ｃｍとして、その間に１５〜３８ｋＶの電圧を印加しながら、溶液を吐出させて、コレクター上にポリ−Ｌ−アラニンからなる繊維構造体を得た。【０１６３】
〔製造例３４〜４７〕各種ポリアミノ酸繊維構造体
製造例３３と同様に、合成例２〜７、９〜１４、１７〜１９で合成した各種ポリアミノ酸について表６−１−１記載の条件で溶液を調製し、繊維構造体を得た。【０１６４】
〔製造例４８〕ポリ−Ｌ−アラニン及びポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン  ブレンド体（モル比  ９：１）繊維構造体
合成例１で合成したポリ−Ｌ−アラニンと合成例５で合成したポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジンを９：１のモル比でジクロロメタン−トリフルオロ酢酸混合溶媒（５０／５０（ｖ／ｖ））に溶かして、５．３重量％のブレンド溶液とした。この溶液を、直径９４０μｍのノズルをつないだシリンジに入れ、ノズルとコレクターとの間隔を１０〜１５ｃｍとして、その間に１５〜３８ｋＶの電圧を印加しながら溶液を吐出させて、コレクター上にポリ−Ｌ−アラニン及びポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジンのブレンド体（モル比  ９：１）からなる繊維構造体を得た。【０１６５】
〔製造例４９〕ポリ−Ｌ−アラニン及びポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン  ブレンド体（モル比  ６：４）繊維構造体
合成例１で合成したポリ−Ｌ−アラニンと合成例５で合成したポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジンを６：４のモル比でジクロロメタン−トリフルオロ酢酸混合溶媒（５０／５０（ｖ／ｖ））に溶かして、５．３重量％のブレンド溶液とした。この溶液から、製造例４８と同様に繊維構造体を得た。【０１６６】
〔製造例９２〜９８〕各種ポリアミノ酸繊維構造体
製造例３３と同様に、合成例２２〜２８で合成した各種ポリアミノ酸について表６−１−２記載の条件で溶液を調製し、繊維構造体を得た。【０１６７】
【表６−１−１】
2012077691.tif 000009
【０１６８】
【表６−１−２】
2012077691.tif 000010
【０１６９】
〔製造例５０〕ポリ−Ｌ−バリンフィルム
合成例２で合成したポリ−Ｌ−バリンをトリフルオロ酢酸に溶かして、６．７重量％のポリ−Ｌ−バリン溶液とした。この溶液を、フッ素系ポリマーフィルム上に０．８０ｍｍの厚さに塗布し室温で２４時間さらに室温減圧下で２４時間乾燥し透明なフィルムを得た。【０１７０】
〔製造例５１〜６０〕各種ポリアミノ酸フィルム
製造例５０と同様に、合成例３、６〜８、１１〜１２、１５〜１６、２０〜２１で合成した各種ポリアミノ酸について表６−２−１記載の条件で溶液を調製し、フィルムを得た。【０１７１】
〔製造例９９〜１０４〕各種ポリアミノ酸フィルム
製造例５０と同様に、合成例２９〜３２、２２、２３で合成した各種ポリアミノ酸について表６−２−２記載の条件で溶液を調製し、フィルムを得た。【０１７２】
【表６−２−１】
2012077691.tif 000011
【０１７３】
【表６−２−２】
2012077691.tif 000012
【０１７４】
〔製造例６１〕ポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジンコーティング
合成例５で合成したポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジンをクロロホルムに溶かして１０．０重量％のポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン溶液とした。この溶液を、丸型カバーガラス（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、φ１２ｍｍ）上に、０．８０ｍｍの厚さに塗布し８０℃で１５分間熱乾燥しコーティングを得た。【０１７５】
〔製造例６２〜６４〕各種ポリアミノ酸コーティング
製造例６１と同様に、合成例１２、１４、１８で合成した各種ポリアミノ酸について表６−３−１記載の条件で溶液を調製し、コーティングを得た。【０１７６】
〔製造例１０５〜１０９〕各種ポリアミノ酸コーティング
製造例６１と同様に、合成例３３〜３７で合成した各種ポリアミノ酸について表６−３−２記載の条件で溶液を調製し、コーティングを得た。【０１７７】
【表６−３−１】
2012077691.tif 000013
【０１７８】
【表６−３−２】
2012077691.tif 000014
【０１７９】
〔製造例６５〕表面ケン化処理ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸繊維構造体
製造例３５で作製したポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸繊維構造体を、直径１２〜１３ｍｍの円形カバーグラスもしくはカバースリップ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｎｕｎｃ  Ｔｈｅｒｍａｎｏｘ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｓ）に装着した。装着したサンプルを０．５Ｎ水酸化カリウムエタノール溶液（国産化学社製）に９０分間浸漬させ、浸漬終了後、エタノール、純水、０．５Ｎ塩酸水溶液（国産化学）、純水の順番にサンプルを浸し、室温減圧下で乾燥させて表面処理繊維構造体を得た。【０１８０】
〔製造例６６〕表面ＨＢｒ処理ポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン繊維構造体
製造例３７で作製したポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン繊維構造体を、直径１２〜１３ｍｍの円形カバーグラスもしくはカバースリップ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｎｕｎｃ  Ｔｈｅｒｍａｎｏｘ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｓ）に装着した。装着したサンプルをジエチルエーテル（関東化学社製）で４００倍に希釈したＨＢｒ（東京化成社製、３０％酢酸溶液）溶液に４．５分間浸漬させた。浸漬終了後、純水、エタノール、２．０Ｍ炭酸ナトリウム水溶液（国産化学社製）、純水の順番にサンプルを浸し、室温減圧下で乾燥させて表面処理繊維構造体を得た。【０１８１】
〔製造例６７〜７０〕各種表面ケン化処理ポリアミノ酸繊維構造体
製造例６５と同様に、製造例３８〜４１で作製した繊維構造体について、表面ケン化処理方法を実施した。【０１８２】
〔製造例１１０〜１１４〕各種表面ケン化処理ポリアミノ酸繊維構造体
製造例６５と同様に、製造例１２〜１５、９２で作製した繊維構造体について、表面ケン化処理方法を実施した。【０１８３】
〔製造例７１〜７８〕各種表面ＨＢｒ処理ポリアミノ酸繊維構造体
製造例６６と同様に、製造例４２〜４９で作製した繊維構造体について、表面ＨＢｒ処理方法を実施した。【０１８４】
〔製造例１１５〜１１９〕各種表面ＨＢｒ処理ポリアミノ酸繊維構造体
製造例６６と同様に、製造例１９、１０、９３、９５，９６で作製した繊維構造体について、表面ＨＢｒ処理方法を実施した。【０１８５】
〔製造例７９〕表面ケン化処理ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸フィルム
製造例５１で作製したポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸フィルムを、０．５Ｎ水酸化カリウムエタノール溶液に９０分間浸漬させ、浸漬終了後、エタノール、純水、０．５Ｎ塩酸水溶液、純水の順番にサンプルを浸し、室温減圧下で乾燥させて表面処理フィルムを得た。【０１８６】
〔製造例８０〜８３〕各種表面ケン化処理ポリアミノ酸フィルム
製造例７９と同様に、製造例５２〜５５で作製したフィルムについて、表面ケン化処理方法を実施した。【０１８７】
〔製造例１２０〜１２２〕各種表面ケン化処理ポリアミノ酸フィルム
製造例７９と同様に、製造例１０１〜１０３で作製したフィルムについて、表面ケン化処理方法を実施した。【０１８８】
〔製造例８４〕表面ＨＢｒ処理ポリ−Ｌ−アラニン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン共重合体（モル比：９／１）フィルム
製造例５６で作製したポリ−Ｌ−アラニン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン共重合体フィルム（モル比：９／１）を、直径１２〜１３ｍｍの円形カバーグラスに装着した。装着したサンプルをジエチルエーテル（関東化学社製）で４００倍に希釈したＨＢｒ（３０％酢酸溶液）溶液に４．５分間浸漬させた。浸漬終了後、純水、エタノール、２．０Ｍ炭酸ナトリウム水溶液、純水の順番にサンプルを浸し、室温減圧下で乾燥させて表面処理フィルムを得た。【０１８９】
〔製造例８５、８６〕各種表面ＨＢｒ処理ポリアミノ酸フィルム
製造例８４と同様に、製造例５７、５８で作製したフィルムについて、表面ＨＢｒ処理方法を実施した。【０１９０】
〔製造例１２３〕各種表面ＨＢｒ処理ポリアミノ酸フィルム
製造例８４と同様に、製造例１０４で作製したフィルムについて、表面ＨＢｒ処理方法を実施した。【０１９１】
〔製造例８７〕表面ＨＢｒ処理ポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジンコーティング
製造例６１で作製したポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジンコーティングを、ジエチルエーテルで４００倍に希釈したＨＢｒ（３０％酢酸溶液）溶液に４．５分間浸漬させた。浸漬終了後、純水、エタノール、２．０Ｍ炭酸ナトリウム水溶液、純水の順番にサンプルを浸し、室温減圧下で乾燥させて目的とする表面処理コーティングを得た。【０１９２】
〔製造例８８〜９０〕各種表面ＨＢｒ処理ポリアミノ酸コーティング
製造例８７と同様に、製造例６２〜６４で作製したコーティングについて、表面ＨＢｒ処理方法を実施した。【０１９３】
製造例３３〜４９、６５〜７８で製造した繊維構造体について、下記に従って平均繊維径及び保護基含有率を測定した。これらの結果を表７−１−１に示す。また、製造例２、４、１２〜１５、１９〜２３、９２〜９８、１１０〜１１９で製造した繊維構造体の平均繊維径及び保護基含有率を表７−１−２に示す。
製造例５０〜６０、７９〜８６で製造したフィルムについて、下記に従って、膜厚及び保護基含有率を測定した。これらの結果を表７−２−１に示す。また、製造例９９、１００〜１０４、１２０〜１２３で製造したフィルムの膜厚を表７−２−２に示す。
製造例６１〜６４、８７〜９０で製造したコーティングについて、下記に従って膜厚及び保護基含有率を測定した。これらの結果を表７−３−１に示す。また、製造例３０、１０５〜１０９で製造したフィルムの膜厚を表７−３−２に示す。【０１９４】
〔繊維構造体の平均繊維径〕
得られた繊維構造体の表面が均一であることを目視で確認した後、その表面の一部を採取し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、日立社、Ｓ−４８００）で表面観察に供した。初めに倍率５００倍で測定試料の全体を俯瞰し、表面が均一であることを確認した後、倍率を１０００倍もしくは５０００倍にして写真撮影を行った。得られた写真を横長に置き、横方向及び縦方向をそれぞれ５等分及び２等分することで、１０個の等面積な区分に分けた。それぞれの区画の中央もしくは中央に最も近い繊維のうち焦点の合っているものを選び、その径を測定し、それらの平均値を求めて平均繊維径とした。【０１９５】
〔各種成形加工体の膜厚〕
得られた各種成形加工体の表面が均一であることを目視で確認した後、マイクロメーター（ミツトヨ社、MDC-25MJ）を用いて３〜５箇所の測定を行い、それらの平均値を求めて膜厚とした。【０１９６】
〔γ―メチル−Ｌ−グルタミン酸残基を含有するポリアミノ酸成形加工体の保護基含有率の算出〕
４種のメチルエステル含有率（53％、54％、81％、100％）既知のポリ−γ―メチル−Ｌ−グルタミン酸をそれぞれフィルム化してFT-IR全反射測定（FT-IR-ATR）を行った。測定には、島津製作所社製IR Prestige21及びATR測定機器としてSmiths社製DuraSampl IR IIを用いた。測定深さdpは下記の計算式で求められる。DuraSampl IR IIにおけるプリズムの屈折率Ncは2.4であり、λは波長、Nsはサンプルの屈折率を示す。【０１９７】
【数２】
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【０１９８】
得られたスペクトルからピーク面積を測定し、主鎖（α結合）アミド基由来のピーク面積に対するメチルエステル基由来のピーク面積の割合から、メチルエステル基含有率を算出する換算式を得た。次に、γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸残基を含有するポリアミノ酸成形加工体及びそのケン化処理品について、FT-IR全反射法スペクトル測定を行い、上記換算式からメチルエステル基含有率を算出した。【０１９９】
〔Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン残基を含有するポリアミノ酸成形加工体の保護基含有率の算出〕
３種のＮε−ベンジルオキシカルボニル含有率（60％、85％、100％）既知のポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジンについてFT-IR全反射測定法スペクトルを測定した。得られたスペクトルからピーク高さを測定し、主鎖（α結合）アミド基由来のピーク高さに対するベンジルオキシカルボニル基由来のピーク高さの割合から、ベンジルオキシカルボニル基含有率を算出する換算式を得た。次に、Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン残基を含有するポリアミノ酸成形加工体及びそのＨＢｒ処理品について、FT-IR全反射法スペクトル測定を行い、上記換算式からベンジルオキシカルボニル基含有率を算出した。【０２００】
【表７−１−１】
2012077691.tif 000016
【０２０１】
【表７−１−２】
2012077691.tif 000017
【０２０２】
【表７−２−１】
2012077691.tif 000018
【０２０３】
【表７−２−２】
2012077691.tif 000019
【０２０４】
【表７−３−１】
2012077691.tif 000020
【０２０５】
【表７−３−２】
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【０２０６】
上記の通り得られた繊維構造体、フィルム及びコーティングを用いた場合の細胞接着効果、及び細胞の分化促進効果を評価した。【０２０７】
〔評価８〕細胞接着効果の評価
製造例３３〜９１に示す各種ポリアミノ酸成形加工品を必要に応じて直径12〜13mmの円形カバーグラスもしくはカバースリップ（Thermo Scientific社、Nunc Thermanox Plastic Coverslips）に装着し、24ウェル培養プレート（日本ベクトンデッキンソン社、Falcon培養プレート）にセットした。コントロールとしてコラーゲンが塗布された24ウェル培養プレート（日本ベクトンデッキンソン社、Falconコラーゲンコート培養プレート）を用意した。滅菌のため70%エタノール水溶液に浸漬した後、リン酸緩衝生理食塩水（タカラバイオ社、PBS(-)）で洗浄した。ヒト骨髄間葉系幹細胞（Lonza社、Human Mesenchymal Stem Cell）を間葉系幹細胞培地（Lonza社、MSCGM）、又は、非働化したウシ胎児血清（Invitrogen社、GIBCO FBS）及びペニシリン−ストレプトマイシン（Sigma-Aldrich社）を含んだダルベッコ変法イーグル培地（Invitrogen社、GIBCO DMEM）に懸濁させて、20,000 cells／ウェルずつ播種し、5% CO2／37℃の条件でインキュベーター（Thermo Scientific社、フォーマインキュベーター）内で3日間、培養した。培養後、培地を取り除き、ラウリル硫酸ナトリウム（ナカライテスク社）を含んだクエン酸（ナカライテスク社）−塩化ナトリウム（ナカライテスク社）緩衝液で細胞を溶解させた。これにビスベンズイミドH33258フルオロクロム三塩酸塩DMSO溶液（ナカライテスク社）を加え、細胞内DNA量を定量することにより、ポリアミノ酸成形加工品上で接着増殖した細胞数を求めた。評価基準は以下の通りである。
＋＋＋：細胞内DNA量がコントロールのそれに対して90%以上
＋＋：細胞内DNA量がコントロールのそれに対して70%以上90%未満
＋：細胞内DNA量がコントロールのそれに対して50%以上70%未満
これらの結果を表８に示す。【０２０８】
【表８】
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【０２０９】
製造例３５、４５、４６、４７、６５、６６、７２、７３、７４、７６、５０、５１、５４、５７、５８、５９、６０、７９、８２、８３、８５、８６、６１、６２、６３、８７、８８、８９について、細胞接着効果に優れた医療用材料を得ることができた。このなかでも、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸（フィルム）、ポリ−Ｌ−バリン／Ｌ−フェニルアラニン  ５／５（フィルム）、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸  ＫＯＨ処理（フィルム）、ポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（コーティング）、ポリ−Ｌ−アラニン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン  ６／４（コーティング）、ポリ−Ｌ−アラニン／Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン  ６／４  ＨＢｒ処理（コーティング）、は、特に細胞接着効果に優れた医療用材料であることがわかる。【０２１０】
〔評価９〕細胞の分化促進効果の評価
上記細胞接着効果の評価方法と同様に、細胞の播種及び培養を行った。但し、播種した細胞数は40,000 cells／ウェルとした。播種し3日間培養した後、培地を非働化したウシ胎児血清（Invitrogen社、GIBCO FBS）、ペニシリン−ストレプトマイシン（Sigma-Aldrich社）、デキサメサゾン（ナカライテスク社）、イソブチルメチルキサンチン（ナカライテスク社）、インドメタシン（ナカライテスク社）及びインスリン（シグマアルドリッチ社）を含んだダルベッコ変法イーグル培地（Invitrogen社、GIBCO DMEM）（脂肪細胞分化誘導培地）に交換し４日間培養した後、培地を非働化したウシ胎児血清（Invitrogen社、GIBCO FBS）、ペニシリン−ストレプトマイシン（Sigma-Aldrich社）及びインスリン（シグマアルドリッチ社）を含んだダルベッコ変法イーグル培地（Invitrogen社、GIBCO DMEM）（脂肪細胞分化維持培地）に交換し３日間培養した。脂肪細胞分化誘導培地及び脂肪細胞分化維持培地による培養を２週間もしくは３週間行った後、細胞内DNA量及びグリセロール−３−リン酸脱水素酵素（GPDH）活性量を定量した。細胞内DNA量の定量は、上記細胞接着増殖効果の評価方法と同様に行い、GPDH活性量の定量は、GPDH活性測定キット（プライマリーセル社）を用いて行った。GPDH活性量を細胞内DNA量で除し、コントロールに対して何％であるかを求めた。
これらの結果を表９−１、表９−２、表９−３、表９−４に示す。【０２１１】
【表９−１】
2012077691.tif 000023
【０２１２】
【表９−２】
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【０２１３】
【表９−３】
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【０２１４】
【表９−４】
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【０２１５】
表８及び９−１に示すように、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸繊維構造体については、細胞接着効果を有することに加え、高い分化効率が示された（製造例３５）。ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸繊維構造体をＫＯＨ処理すると、細胞接着効果が向上した上に、高い分化効率が示された（製造例６５）。これらは、細胞の分化促進効果が要求される足場材として好適であることに加え、細胞接着効果が要求される足場材としても有用である。さらに、これらは何れも繊維径が制御された繊維構造体であることから、生体内で使用するのに好適である。ポリ−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジンコーティング及びそのＨＢｒ処理品もまた、細胞接着効果を有することに加え、高い分化効率が示された（製造例６１、８７）。これらもまた、細胞の分化促進効果が要求される足場材として好適であることに加え、細胞接着効果が要求される足場材としても有用である。さらに、これらは何れも膜厚が制御されたコーティングであることから、各種医療用基材もしくは担持基材の表面を被覆して、細胞足場機能を必要とする医療用材料もしくは細胞担持基材として使用するのに好適である。尚、上記分化効率は数値が高いほど細胞分化に効果的であることを示すが、その数値は１２０以上が好ましく、２００以上がより好ましい。
【産業上の利用可能性】
【０２１６】
本発明によれば、生体にとって安全であり、かつ生体適合性が高く、生体組織又は細胞の足場材として有用な細胞分化促進用医療用材料を提供することができる。さらに、本発明の細胞分化促進用医療用材料は、構成成分を適宜調整することによって細胞接着抑制効果または細胞接着効果を備えることができるため、幅広い用途の足場剤に利用することができる。【０２１７】
本出願は、日本で出願された特願２０１０−２７２０４３（出願日：２０１０年１２月６日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【国際調査報告】
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