(57)【要約】  本発明の目的は、脂肪滴に特異的な局在性を示す新規なタンパク質を提供することにある。本発明によれば、(Ａ)配列番号２で表されるアミノ酸配列の第５０番から第７３番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ1nで表されるアミノ酸配列(０≦ｎ≦４９であり、ｎが２以上の場合、Ｘ1は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ａ）のＣ末端に、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ2mで表されるアミノ酸配列(０≦ｍ≦２６であり、ｍが２以上の場合、Ｘ2は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ｂ）のＮ末端が結合してなるタンパク質であって、脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；(Ｂ)（Ａ)に規定されるタンパク質において上記第５０番から第７３番までアミノ酸配列および／または上記第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列の領域中に１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；または（Ｃ）（Ａ)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(Ａ)配列番号２で表されるアミノ酸配列の第５０番から第７３番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ1nで表されるアミノ酸配列(０≦ｎ≦４９であり、ｎが２以上の場合、Ｘ1は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ａ）のＣ末端に、
配列番号２で表されるアミノ酸配列の第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ2mで表されるアミノ酸配列(０≦ｍ≦２６であり、ｍが２以上の場合、Ｘ2は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ｂ）のＮ末端が結合してなるタンパク質であって、脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；
(Ｂ)（Ａ)に規定されるタンパク質において上記第５０番から第７３番までアミノ酸配列および／または上記第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列の領域中に１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；または
（Ｃ）（Ａ)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質。
【請求項２】
(Ａ)配列番号２で表されるアミノ酸配列の第５０番から第７３番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ1nで表されるアミノ酸配列(０≦ｎ≦４９であり、ｎが２以上の場合、Ｘ1は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ａ）のＣ末端に、
配列番号２で表されるアミノ酸配列の第２２９番から第２６１番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ2mで表されるアミノ酸配列(０≦ｍ≦３７であり、ｍが２以上の場合、Ｘ2は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ｂ）のＮ末端が結合してなるタンパク質であって、脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；
(Ｂ)（Ａ)に規定されるタンパク質において上記第５０番から第７３番までアミノ酸配列および／または上記第２２９番から第２６１番までのアミノ酸配列の領域中に１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；または
（Ｃ）（Ａ)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質。
【請求項３】
Ｘ1nで表されるアミノ酸配列が、配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１番から第４９番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｎ（１≦ｎ≦４９）のアミノ酸配列であるか（但し、配列番号２１における第２番目及び第８番目のアミノ酸「Ｘａａ」、並びに配列番号２３における第６番目のアミノ酸「Ｘａａ」は、任意のアミノ酸である。）；又は、Ｘ1nで表されるアミノ酸配列が、配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１番から第４８番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｎ（１≦ｎ≦４８）のアミノ酸配列である、請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】
Ｘ2mで表されるアミノ酸配列が、配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１９２番から第２１７番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｍ（１≦ｍ≦２６）のアミノ酸配列若しくは配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１９２番から第２２８番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｍ（１≦ｍ≦３７）のアミノ酸配列であるか；又は、Ｘ2mで表されるアミノ酸配列が、配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１９１番から第２１６番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｍ（１≦ｍ≦２６）のアミノ酸配列若しくは配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１９１番から第２２７番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｍ（１≦ｍ≦３７）のアミノ酸配列である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
Ｘ1nで表されるアミノ酸配列が、配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１番から第４９番、第２６番から第４９番、第４０番から第４９番、または第４３番から第４９番までのアミノ酸配列であるか（但し、配列番号２１における第２番目及び第８番目のアミノ酸「Ｘａａ」、並びに配列番号２３における第６番目のアミノ酸「Ｘａａ」は、任意のアミノ酸である。）；又は、Ｘ1nで表されるアミノ酸配列が、配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１番から第４８番、第２６番から第４８番、第４０番から第４８番、または第４３番から第４８番までのアミノ酸配列である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
Ｘ2mで表されるアミノ酸配列が、配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第１９２番から第２１７番までのアミノ酸配列若しくは配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第１９２番から第２２８番までのアミノ酸配列であるか；又は、Ｘ2mで表されるアミノ酸配列が、配列番号１１で表わされるアミノ酸配列の第１９１番から第２１６番までのアミノ酸配列若しくは配列番号１１で表わされるアミノ酸配列の第１９１番から第２２７番までのアミノ酸配列である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項７】
Ｘ1nで表されるアミノ酸配列が配列番号２に表されるアミノ酸配列の第１番から第４９番または第２６番から第４９番までのアミノ酸配列であり、かつ、Ｘ2mで表されるアミノ酸配列が配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１９２番から第２１７番までのアミノ酸配列または配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１９２番から第２２８番までのアミノ酸配列である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記タンパク質が、（Ａ）に規定されるタンパク質である、請求項1〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記タンパク質が、（Ａ）に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示す、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
標識タンパク質及び／又はアフィニティタグとの融合タンパク質である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１１】
被導入物質により修飾された請求項１〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１２】
被導入物質が、蛍光化合物である、請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含む、発現用ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現用ベクターにより形質転換された、形質転換体。
【請求項１６】
哺乳細胞において脂肪滴の可視化に用いるための、請求項１３に記載の発現用ベクター。
【請求項１７】
哺乳細胞において脂肪滴の可視化に用いるための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１０年１１月５日出願の日本特願２０１０−２４８７７３号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、脂肪滴に特異的な局在性を示す新規なタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００３】
脂肪滴は細胞内小器官の一つであり、内部に脂質を含み、表面をリン脂質一重膜に覆われた球状の構造物である（非特許文献１参照）。内部の脂質としてはトリグリセリド、ステロールエステルが主体で、他の中性脂質も少量含む。大きさは様々で、１μｍ以下から１００μｍ程度のものまである。最も極端な例は、脂肪細胞であり、細胞体の大部分を肥大化した脂肪滴が占めている。その他の細胞では、肝細胞が脂肪滴を多く含むが、どのような種類の細胞でも脂肪滴の形成能力を持つ。【０００４】
脂肪細胞の脂肪滴は、脂質の貯蔵庫として機能し、個体のエネルギー源となる。飢餓状態や栄養過多といったエネルギー環境に応じて、脂肪滴量は、ホルモンによる調節を受け、増減する。一方、その他の細胞の脂肪滴は、細胞のエネルギー源として機能する他、細胞膜や細胞内小器官（小胞体（endoplasmic reticulum；ＥＲ）、ミトコンドリア、ペルオキソゾーム、エンドゾームなど）とも相互作用し、脂質二重膜への脂質の供給源としても機能する。これらの機能を果たすため、細胞の活動や増殖の際に脂肪滴の大きさや局在が変化する。また、分泌性のリポタンパク（ＶＬＤＬ）が肝細胞などで形成される際に、脂肪滴が脂質の供給を担っているとも考えられている。【０００５】
脂肪滴膜には複数のタンパク質が局在しており、最も良く知られているのはADRP (adipocyte differentiation-related protein, 別名adipophilin, ADFP), perilipin, Tip47などであり、リパーゼ類や脂質合成酵素などもある。細胞の種類によって、タンパク質の種類に違いがあり、例えばperilipinは脂肪細胞とステロイド産生性細胞のみに存在する一方、ADRPは広汎な細胞種に存在する。【０００６】
現時点では、脂肪滴の正確な形成機構についてはコンセンサスが得られていないが、ＥＲの脂質二重膜の二層の中間に合成された脂質が蓄積し、次第に細胞質側に突出・出芽し、ついにはＥＲと分離して脂質一重膜に覆われた独立した構造物になると推測されている。【０００７】
脂肪肝においては、肝細胞内の脂肪滴が肥大する。またアテローム性動脈硬化で病態の中核を成す泡沫化マクロファージも、マクロファージ内部の脂肪滴が極端に肥大化して泡沫状の形態を示したものである。このように脂肪滴は脂質関連疾患やメタボリックシンドロームとも密接に関連するため、その動態や制御についての研究は重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−２１３６８５
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Zehmer et al, Proteomics, 9, 914-921, 2009; Beller et al, FEBS Lett. 584, 2176-2182, 2010; Olofsson et al, Biochim. Biophys. Acta, 1791, 448-458, 2009, Thiele et al, Current Opin. Cell Biol. 20, 378-385, 2008
【非特許文献２】Fukumoto et al, Histochem. Cell Biol. 118, 423-428, 2002
【非特許文献３】Ohsaki et al, Histochem. Cell Biol. 133, 477-480, 2010
【非特許文献４】Targett-Adams et al, J. Biol. Chem. 278, 15998-16007, 2003
【非特許文献５】Bostrom et al, Arterioscler. Thromb. Vas. Biol. 25, 1945-1951, 2005
【非特許文献６】Pol et al, J. Cell Biol. 152, 1057-1070, 2001
【非特許文献７】Turro et al, Traffic 7, 1254-1269, 2006
【非特許文献８】Spandl et al, Traffic 10, 1579-1584, 2009
【非特許文献９】Brasemle et al, J. Lipid Res. 38, 2249-2263, 1997
【非特許文献１０】Ohsaki et al, Histochem. Cell Biol. 124, 445-452, 2005; Thiele et al, Curr. Opin. Cell Biol. 20, 378-385, 2008
【非特許文献１１】Liefhebber JM, et al., Virology Journal 2009, 6:62: "Hepatitis C virus NS4B carboxy terminal domain is a membrane binding domain."
【非特許文献１２】Journal of Virology, May 2003, p. 5428-5438
【非特許文献１３】Arch Virol. 1999;144(2):329-43.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
脂肪滴の染色には従来Sudan III（赤色色素）、Oil Red O（赤色色素）、Nile Red（黄色蛍光色素）、Bodipy493/503（緑色蛍光色素）などが用いられてきた。いずれも脂溶性化合物であり、中性脂肪に親和性が高いため、脂肪滴内部の脂質自体を染色する（顕微鏡観察で円形（三次元であれば球形）の像が得られる）。Sudan IIIや Oil Red Oは７０％エタノールなどに溶解して使用するが、実はこのような高濃度のエタノールは脂肪滴を融合させてしまい正しい像が得られないと言う問題がある(非特許文献２参照)。また、グリセロールを含む包埋剤を用いると、アルデヒド類で固定した後でもやはり脂肪滴の融合が見られる（非特許文献２参照）。Nile RedやBodipy 493/503は水系の溶液で使用できるが、Bodipy493/503の方が、相対的に脂肪滴特異性に優れている。【００１１】
また、Bodipy493/503と、化学構造の若干異なるその誘導体が開発されており、脂肪滴に親和性のある赤色蛍光色素もある(例えば、Bodipy558/568C12, LD540など)。これらの色素は、トリグリセリドなどの中性脂肪に対する親和性を利用するもので、原理的に必ずしも脂肪滴に特異的に作用するものではない。現在最も汎用されているBodipy493/503は、条件によって赤色の蛍光が出てしまい、多色の蛍光観察に問題を起こしうることが発見された（非特許文献３参照）。【００１２】
また、細胞内在性の脂肪滴膜局在タンパク質に蛍光タンパク質を融合させたコンストラクトも多数作製され、脂肪滴の染色（イメージング）に利用されている。しかし、これらは本来的には当該タンパク質の機能を調べる道具であるから、発現させた当該タンパク質の機能が強く現れる可能性があり、脂肪滴が当該タンパク質の影響を受けて細胞内の状態が変化する可能性もある。したがって、これら従来技術では、細胞内における本来の脂肪滴の正確な情報が得られないという問題がある。また、小胞体（ＥＲ）など他の部位に局在したり、全部の脂肪滴を均一にイメージングできないという問題がある（非特許文献４〜８）。【００１３】
上述の従来技術では、ADRPと蛍光タンパク質の融合体（EGFP-ADRP）が脂肪滴のイメージングツールとして優れている（非特許文献４参照）。しかし、ADRPは脂肪滴の成長や動態に密接に関連しているタンパク質であり（非特許文献９参照）、それ自体の強制発現の影響を考慮する必要がある。また、EGFP-ADRPを発現させた場合、本来細胞で発現しているADRPを検出することが手技的に煩雑となり、評価が難しい。【００１４】
抗体を用いて脂肪滴を可視化する方法では、抗ADRP抗体が汎用されている。抗体染色の場合、固定や透過処理（permeabilization）の工程において脂肪滴や脂肪滴膜の形態が変化する場合が多いこと、必ずしも細胞性の抗原が全ての脂肪滴膜に均一に存在しないことから、全ての脂肪滴膜を完全に均一に染めだすことは困難である（非特許文献１０参照）。【００１５】
本発明の課題は、上記従来技術における問題点を解決できる細胞内脂肪滴の可視化（イメージング）技術を提供することにある。具体的には、本発明の課題は、正確な像（イメージ）として、細胞内における脂肪滴のみを特異的に可視化する技術を提供することにある。また、同時に、本発明の課題は、本来の細胞の状態、及び細胞内における本来の脂肪滴の状態を変化させることなく、該脂肪滴のみを特異的に可視化する技術を提供することにある。【００１６】
なお、特許文献１には、Ｃ型肝炎ウイルスの非構造タンパク質４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）のＮ末端側５０番から７４番のアミノ酸からなるポリペプチド、及びＮＳ４ＢのＮ末端側４０番から６３番のアミノ酸からなるポリペプチドが記載されている。しかしながら、特許文献１に記載される技術は、脂肪滴の可視化技術に関するものではない。【００１７】
非特許文献１１には、ＮＳ４ＢのＣ末端領域をＨｕｈ７細胞に発現させた場合、点状の構造が観察されたことが記載され、さらに、ＮＳ４ＢのＣ末端領域は膜に関係するであろうことが示唆されている。しかしながら、非特許文献１１には、ＮＳ４ＢのＣ末端領域は脂肪滴には局在しなかった事が記載されている。したがって、非特許文献１１に記載の技術は、脂肪滴の可視化技術に関するものではない。【００１８】
非特許文献１２には、ＮＳ４ＢのＣ末端側にＥＧＦＰを融合させたタンパク質（ＮＳ４Ｂ−ＥＧＦＰ）を細胞で発現させたところ、ＮＳ４Ｂ−ＥＧＦＰがＥＲに局在して観察されたことが記載されている。非特許文献１２には、脂肪滴の可視化技術に関する知見は記載されていない。【００１９】
非特許文献１３には、ＮＳ４Ｂは、細胞質に渡って点状のパターン（spot-like pattern）を示したことが記載されている。非特許文献１３には、脂肪滴の可視化技術に関する知見は記載されていない。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、Ｃ型肝炎ウイルス（hepatitis C Virus；ＨＣＶ）の非構造タンパク質４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）のＮ末端側領域とＣ末端側領域を融合させたタンパク質が脂肪滴に特異的に局在することを見出した。本発明は、係る知見により完成されたものである。【００２１】
すなわち、本発明は以下に関する。
〔１〕  (Ａ)配列番号２で表されるアミノ酸配列の第５０番から第７３番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ1nで表されるアミノ酸配列(０≦ｎ≦４９であり、ｎが２以上の場合、Ｘ1は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ａ）のＣ末端に、
配列番号２で表されるアミノ酸配列の第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ2mで表されるアミノ酸配列(０≦ｍ≦２６であり、ｍが２以上の場合、Ｘ2は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ｂ）のＮ末端が結合してなるタンパク質であって、脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；
(Ｂ)（Ａ)に規定されるタンパク質において上記第５０番から第７３番までアミノ酸配列および／または上記第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列の領域中に１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；または
（Ｃ）（Ａ)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質。【００２２】
〔２〕  (Ａ)配列番号２で表されるアミノ酸配列の第５０番から第７３番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ1nで表されるアミノ酸配列(０≦ｎ≦４９であり、ｎが２以上の場合、Ｘ1は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ａ）のＣ末端に、
配列番号２で表されるアミノ酸配列の第２２９番から第２６１番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ2mで表されるアミノ酸配列(０≦ｍ≦３７であり、ｍが２以上の場合、Ｘ2は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ｂ）のＮ末端が結合してなるタンパク質であって、脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；
(Ｂ)（Ａ)に規定されるタンパク質において上記第５０番から第７３番までアミノ酸配列および／または上記第２２９番から第２６１番までのアミノ酸配列の領域中に１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；または
（Ｃ）（Ａ)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質。【００２３】
〔３〕  Ｘ1nで表されるアミノ酸配列が、配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１番から第４９番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｎ（１≦ｎ≦４９）のアミノ酸配列であるか（但し、配列番号２１における第２番目及び第８番目のアミノ酸「Ｘａａ」、並びに配列番号２３における第６番目のアミノ酸「Ｘａａ」は、任意のアミノ酸である。）；又は、Ｘ1nで表されるアミノ酸配列が、配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１番から第４８番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｎ（１≦ｎ≦４８）のアミノ酸配列である、〔１〕又は〔２〕に記載のタンパク質。【００２４】
〔４〕  Ｘ2mで表されるアミノ酸配列が、配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１９２番から第２１７番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｍ（１≦ｍ≦２６）のアミノ酸配列若しくは配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１９２番から第２２８番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｍ（１≦ｍ≦３７）のアミノ酸配列であるか；又は、Ｘ2mで表されるアミノ酸配列が、配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１９１番から第２１６番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｍ（１≦ｍ≦２６）のアミノ酸配列若しくは配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１９１番から第２２７番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｍ（１≦ｍ≦３７）のアミノ酸配列である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のタンパク質。【００２５】
〔５〕  Ｘ1nで表されるアミノ酸配列が、配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１番から第４９番、第２６番から第４９番、第４０番から第４９番、または第４３番から第４９番までのアミノ酸配列であるか（但し、配列番号２１における第２番目及び第８番目のアミノ酸「Ｘａａ」、並びに配列番号２３における第６番目のアミノ酸「Ｘａａ」は、任意のアミノ酸である。）；又は、Ｘ1nで表されるアミノ酸配列が、配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１番から第４８番、第２６番から第４８番、第４０番から第４８番、または第４３番から第４８番までのアミノ酸配列である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のタンパク質。【００２６】
〔６〕  Ｘ2mで表されるアミノ酸配列が、配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第１９２番から第２１７番までのアミノ酸配列若しくは配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第１９２番から第２２８番までのアミノ酸配列であるか；又は、Ｘ2mで表されるアミノ酸配列が、配列番号１１で表わされるアミノ酸配列の第１９１番から第２１６番までのアミノ酸配列若しくは配列番号１１で表わされるアミノ酸配列の第１９１番から第２２７番までのアミノ酸配列である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のタンパク質。【００２７】
〔７〕  Ｘ1nで表されるアミノ酸配列が配列番号２に表されるアミノ酸配列の第１番から第４９番または第２６番から第４９番までのアミノ酸配列であり、かつ、Ｘ2mで表されるアミノ酸配列が配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１９２番から第２１７番までのアミノ酸配列または配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１９２番から第２２８番までのアミノ酸配列である、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のタンパク質。【００２８】
〔８〕  前記タンパク質が、（Ａ）に規定されるタンパク質である、〔1〕〜〔７〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔９〕  前記タンパク質が、（Ａ）に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示す、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のタンパク質。【００２９】
〔１０〕  標識タンパク質及び／又はアフィニティタグとの融合タンパク質である、〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔１１〕  被導入物質により修飾された〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔１２〕  被導入物質が、蛍光化合物である、〔１１〕に記載のタンパク質。【００３０】
〔１３〕  〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
〔１４〕  〔１３〕に記載の核酸を含む、発現用ベクター。
〔１５〕  〔１４〕に記載の発現用ベクターにより形質転換された、形質転換体。
〔１６〕  哺乳細胞において脂肪滴の可視化に用いるための、〔１３〕に記載の発現用ベクター。
〔１７〕  哺乳細胞において脂肪滴の可視化に用いるための、〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔１８〕  〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載のタンパク質に対する抗体。
【発明の効果】
【００３１】
本発明のタンパク質は、細胞内小器官である脂肪滴への特異的局在性を示す。また、本発明のタンパク質によれば、生細胞又は固定細胞において脂肪滴を特異的に可視化（イメージング）することが可能となる。さらに、本発明のタンパク質によれば、正確な像として、細胞内における脂肪滴のみを特異的に可視化することができる。同時に、本発明のタンパク質によれば、本来の細胞の状態、及び細胞内における本来の脂肪滴の状態を変化させることなく、該脂肪滴のみを特異的に可視化することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、実施例で用いた１ｂ型のＨＣＶ−Ｏ株のＮＳ４Ｂタンパク質をコードする塩基配列を示す。
【図２】図２は、上記１ｂ型のＨＣＶ−Ｏ株のＮＳ４Ｂタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、各種ＨＣＶサブタイプ間で、ＮＳ４Ｂタンパク質のアミノ酸配列を比較（アライメント解析）した結果を示す。
【図４】図４は、ＮＳ４Ｂタンパク質の構造（三つの領域）を示す模式図である。
【図５】図５は、実施例で製造した本発明のタンパク質（脂肪滴への特異的局在性を示す４ＢＮＣ）の模式図である。図５において、４ＢＮＣは、二ヶ所の脂肪滴局在性の配列（４ＢＮ及び４ＢＣ）を連結して作成したタンパク質であり、該タンパク質は極めて高い特異性で脂肪滴膜に局在することが判明した。図５において、Cherry−4BNCは、上記４BNCを蛍光タンパク質mCherryと融合させて得られるタンパク質の構造を示す。図５において、EGFP−4BNCは、上記４BNCを蛍光タンパク質EGFPと融合させて得られるタンパク質の構造を示す。これら異なる蛍光タンパク質を４BNCに連結しても脂肪滴膜への局在性に変化はなく、４BNCを蛍光タンパク質と連結して細胞に発現させると、脂肪滴の膜が描出され、Bodipy493/503などの従来の脂肪滴染色試薬とは異なる、新しい脂肪滴のイメージングが可能になった。
【図６】図６は、実施例で製造したＣｈｅｒｒｙ-４ＢＮと脂肪滴との相互作用を解析した結果を示す。
【図７】図７は、実施例で製造したＣｈｅｒｒｙ-４ＢＣと脂肪滴との相互作用を解析した結果を示す。
【図８】図８は、実施例で製造したＣｈｅｒｒｙ-４ＴＭと脂肪滴との相互作用を解析した結果を示す。
【図９】図９は、実施例で製造したＣｈｅｒｒｙ-４ＢＮＣ（本発明のタンパク質の一例）と脂肪滴との相互作用を解析した結果（脂肪滴のイメージング）を示す。
【図１０】図１０は、実施例で製造したＥＧＦＰ-４ＢＮＣ（本発明のタンパク質の一例）と脂肪滴との相互作用を解析した結果（脂肪滴のイメージング）を示す。
【図１１】図１１は、上記Ｃｈｅｒｒｙ-４ＢＮＣ（本発明のタンパク質の一例）を用いて、脂肪滴の少ないヒトＨＥＫ２９３細胞（ヒト由来培養細胞）において脂肪滴の可視化（イメージング）を行った結果を示す。脂肪滴を誘導するために脂肪酸（stearic acid, 50μＭ）を添加してある。
【図１２】図１２は、実施例で製造した各種ＮＳ４Ｂ融合タンパク質（コンストラクト）の構造を示す図である。
【図１３】図１３は、実施例で製造したＣｈｅｒｒｙ−４Ｂｆｕｌｌ（ＮＳ４Ｂ全長）と脂肪滴との相互作用を解析した結果を示す。
【図１４】図１４は、各種ＮＳ４Ｂ融合タンパク質と脂肪滴との相互作用を解析した結果を示す。
【図１５】図１５は、ＮＳ４Ｂに存在するamphipathic α-helixの位置を示す図である。
【図１６】図１６は、ＮＳ４Ｂのamphipathic α-helixの長軸方向から見たアミノ酸配置を示す図である。
【図１７】図１７は、実施例で製造したＮＳ４Ｂの各種変異体を説明する図である。
【図１８】図１８は、実施例で製造したＮＳ４Ｂの各種変異体を説明する図である。
【図１９】図１９は、各種ＨＣＶサブタイプ間で、ＮＳ４Ｂにおける脂肪滴との相互作用に重要なアミノ酸を比較した結果を示す
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の第一の態様は、
「(Ａ)配列番号２で表されるアミノ酸配列の第５０番から第７３番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ1nで表されるアミノ酸配列(０≦ｎ≦４９であり、ｎが２以上の場合、Ｘ1は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ａ）のＣ末端に、
配列番号２で表されるアミノ酸配列の第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ2mで表されるアミノ酸配列(０≦ｍ≦２６であり、ｍが２以上の場合、Ｘ2は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ｂ）のＮ末端が結合してなるタンパク質であって、脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；
(Ｂ)（Ａ)に規定されるタンパク質において上記第５０番から第７３番までアミノ酸配列および／又は上記第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列の領域中に１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；または
（Ｃ）（Ａ)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質」に関する。
【００３４】
本発明において、タンパク質が「脂肪滴への特異的局在性」を有するとは、蛍光タンパク質であるｍＣｈｅｒｒｙと対象タンパク質との融合タンパク質をコードする領域を含む哺乳細胞用発現ベクターでＯｃ細胞を形質転換（トランスフェクション）し、蛍光顕微鏡により該細胞を観察した場合に、融合タンパク質が脂肪滴膜にのみ局在する細胞数が５０％を超え、該融合タンパク質が脂肪滴膜及び細胞内の他の部位（例えば、細胞質、ＥＲ等の細胞小器官）に局在する細胞数が５０％未満であり、かつ該融合タンパク質が脂肪滴には局在せず細胞内の他の部位に局在する細胞数が０％であることを意味する。形質転換（トランスフェクション）及び蛍光顕微鏡による観察の具体的な方法は、実施例に記載する通りである。該融合タンパク質が脂肪滴膜にのみ局在する細胞の数は、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上、最も好ましくは８０％以上、９０％以上、９５％以上である。
【００３５】
本発明の第一の態様において、（Ａ）に規定されるタンパク質は、以下の構造からなる。
Ｘ1n−WAKHMWNFISGIQYLAGLSTLPGN−Ｘ2m−VSPTHYVPESDAAARVTQILSSLTITQLLKRLHQWINEDCSTPC
上記の構造において、Ｘ1n−WAKHMWNFISGIQYLAGLSTLPGNは、ポリペプチド（ａ)に相当する。Ｘ2m−VSPTHYVPESDAAARVTQILSSLTITQLLKRLHQWINEDCSTPCは、ポリペプチド（ｂ）に相当する。ここで、例えば、ｎ＝５である場合には、Ｘ15は、「ＡＡＳＳＷ」のように、相互に同一又は異なるアミノ酸を含み得る。また、例えば、ｍ＝５である場合には、Ｘ25は、「ＡＡＳＳＷ」のように、相互に同一又は異なるアミノ酸を含み得る。
【００３６】
上記の通り、（Ａ）に規定されるタンパク質は、上記ポリペプチド(ａ)のＣ末端に上記ポリペプチド（ｂ）のＮ末端が結合してなるタンパク質である。ポリペプチド（ａ)は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の第５０番から第７３番までのアミノ酸配列をそのＣ末端領域に有する。第５０番から第７３番までの上記アミノ酸配列の領域は、この領域の中に、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示すために機能する領域を含むからである。一方、ポリペプチド（ｂ）は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列をそのＣ末端領域に有する。第２１８番から第２６１番までの上記アミノ酸配列も、この領域の中に、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示すために機能する領域を含むからである。
【００３７】
ポリペプチド（ａ）のＮ末端領域は、Ｘ1nで表わされるアミノ酸配列で構成され、そのアミノ酸残基の数（ｎ）は、上記の通り、０〜４９の範囲であり、好ましくは７〜４９の範囲、より好ましくは１０〜４９の範囲、さらに好ましくは２４〜４９の範囲である。本発明のタンパク質が脂肪滴に特異的な局在性を示す限り、アミノ酸配列Ｘ1nを構成するアミノ酸の種類は特に限定されるものではない。例えば、アミノ酸配列Ｘ1nは、配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１番から第４９番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｎ（１≦ｎ≦４９）のアミノ酸配列であってもよい（但し、配列番号２１における第２番目及び第８番目のアミノ酸「Ｘａａ」、並びに配列番号２３における第６番目のアミノ酸「Ｘａａ」は、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示す限り、任意のアミノ酸を取り得る）。或いは、アミノ酸配列Ｘ1nは、配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１番から第４８番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｎ（１≦ｎ≦４８）のアミノ酸配列であってもよい。
【００３８】
脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質を提供するという観点から、アミノ酸配列Ｘ1nは、配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第４３番から第４９番までのアミノ酸配列であるか、配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第４０番から第４９番までのアミノ酸配列であるか、配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第２６番から第４９番までのアミノ酸配列であるか、または、配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第１番から第４９番までのアミノ酸配列であることが好ましい（但し、配列番号２１における第２番目及び第８番目のアミノ酸「Ｘａａ」、並びに配列番号２３における第６番目のアミノ酸「Ｘａａ」は、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示す限り、任意のアミノ酸を取り得る）。或いは、アミノ酸配列Ｘ1nは、配列番号１１に表わされるアミノ酸配列の第４３番から第４８番までのアミノ酸配列であるか、配列番号１１に表わされるアミノ酸配列の第４０番から第４８番までのアミノ酸配列であるか、配列番号１１に表わされるアミノ酸配列の第２６番から第４８番までのアミノ酸配列であるか、または、配列番号１１に表わされるアミノ酸配列の第１番から第４８番までのアミノ酸配列であることが好ましい。アミノ酸配列Ｘ1nが、これらのアミノ酸配列である場合には、本発明のタンパク質が有する脂肪滴に対する特異的局在性が強まるからである。
【００３９】
一方、ポリペプチド（ｂ）のＮ末端領域は、アミノ酸配列Ｘ2mで構成され、そのアミノ酸残基の数（ｍ）は、上記の通り、０〜２６である。アミノ酸配列Ｘ2mを構成するアミノ酸の種類は特に限定されるものではない。例えば、アミノ酸配列Ｘ2mは、配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１９２番から第２１７番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｍ（１≦ｍ≦２６）のアミノ酸配列であってもよい。或いは、アミノ酸配列Ｘ2mは、配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１９１番から第２１６番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｍ（１≦ｍ≦２６）のアミノ酸配列であってもよい。
【００４０】
脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質を提供するという観点から、アミノ酸配列Ｘ2mは、配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第１９２番から第２１７番までのアミノ酸配列であることが好ましい。或いは、アミノ酸配列Ｘ2mは、配列番号１１で表わされるアミノ酸配列の第１９１番から第２１６番までのアミノ酸配列であることが好ましい。アミノ酸配列Ｘ2mが、これらのアミノ酸配列である場合には、本発明のタンパク質が有する脂肪滴に対する特異的局在性が強まるからである。
【００４１】
また、本発明の第二の態様は、
「(Ａ)配列番号２で表されるアミノ酸配列の第５０番から第７３番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ1nで表されるアミノ酸配列(０≦ｎ≦４９であり、ｎが２以上の場合、Ｘ1は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ａ）のＣ末端に、
配列番号２で表されるアミノ酸配列の第２２９番から第２６１番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ2mで表されるアミノ酸配列(０≦ｍ≦３７であり、ｍが２以上の場合、Ｘ2は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ｂ）のＮ末端が結合してなるタンパク質であって、脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；
(Ｂ)（Ａ)に規定されるタンパク質において上記第５０番から第７３番までアミノ酸配列および／または上記第２２９番から第２６１番までのアミノ酸配列の領域中に１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；または
（Ｃ）（Ａ)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質」に関する。
【００４２】
本発明の第二の態様において、（Ａ）に規定されるタンパク質は、以下の構造からなる。
Ｘ1n−WAKHMWNFISGIQYLAGLSTLPGN−Ｘ2m−AAARVTQILSSLTITQLLKRLHQWINEDCSTPC
上記の構造において、Ｘ1n−WAKHMWNFISGIQYLAGLSTLPGNは、ポリペプチド（ａ)に相当する。Ｘ2m−AAARVTQILSSLTITQLLKRLHQWINEDCSTPCは、ポリペプチド（ｂ）に相当する。ここで、例えば、ｎ＝５である場合には、Ｘ15は、「ＡＡＳＳＷ」のように、相互に同一又は異なるアミノ酸を含み得る。また、例えば、ｍ＝５である場合には、Ｘ25は、「ＡＡＳＳＷ」のように、相互に同一又は異なるアミノ酸を含み得る。
【００４３】
上記の通り、（Ａ）に規定されるタンパク質は、上記ポリペプチド(ａ)のＣ末端に上記ポリペプチド（ｂ）のＮ末端が結合してなるタンパク質である。ポリペプチド（ａ)は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の第５０番から第７３番までのアミノ酸配列をそのＣ末端領域に有する。第５０番から第７３番までの上記アミノ酸配列の領域は、この領域の中に、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示すために機能する領域を含むからである。一方、ポリペプチド（ｂ）は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の第２２９番から第２６１番までのアミノ酸配列をそのＣ末端領域に有する。第２２９番から第２６１番までの上記アミノ酸配列も、この領域の中に、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示すために機能する領域を含むからである。
【００４４】
ポリペプチド（ａ）のＮ末端領域は、Ｘ1nで表わされるアミノ酸配列で構成され、そのアミノ酸残基の数（ｎ）は、上記の通り、０〜４９の範囲であり、好ましくは７〜４９の範囲、より好ましくは１０〜４９の範囲、さらに好ましくは２４〜４９の範囲である。本発明のタンパク質が脂肪滴に特異的な局在性を示す限り、アミノ酸配列Ｘ1nを構成するアミノ酸の種類は特に限定されるものではない。例えば、アミノ酸配列Ｘ1nは、配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１番から第４９番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｎ（１≦ｎ≦４９）のアミノ酸配列であってもよい（但し、配列番号２１における第２番目及び第８番目のアミノ酸「Ｘａａ」、並びに配列番号２３における第６番目のアミノ酸「Ｘａａ」は、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示す限り、任意のアミノ酸を取り得る）。或いは、アミノ酸配列Ｘ1nは、配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１番から第４８番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｎ（１≦ｎ≦４８）のアミノ酸配列であってもよい。
【００４５】
脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質を提供するという観点から、アミノ酸配列Ｘ1nは、配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第４３番から第４９番までのアミノ酸配列であるか、配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第４０番から第４９番までのアミノ酸配列であるか、配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第２６番から第４９番までのアミノ酸配列であるか、または、配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第１番から第４９番までのアミノ酸配列であることが好ましい（但し、配列番号２１における第２番目及び第８番目のアミノ酸「Ｘａａ」、並びに配列番号２３における第６番目のアミノ酸「Ｘａａ」は、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示す限り、任意のアミノ酸を取り得る）。或いは、アミノ酸配列Ｘ1nは、配列番号１１に表わされるアミノ酸配列の第４３番から第４８番までのアミノ酸配列であるか、配列番号１１に表わされるアミノ酸配列の第４０番から第４８番までのアミノ酸配列であるか、配列番号１１に表わされるアミノ酸配列の第２６番から第４８番までのアミノ酸配列であるか、または、配列番号１１に表わされるアミノ酸配列の第１番から第４８番までのアミノ酸配列であることが好ましい。アミノ酸配列Ｘ1nが、これらのアミノ酸配列である場合には、本発明のタンパク質が脂肪滴により特異的に局在するからである。
【００４６】
一方、ポリペプチド（ｂ）のＮ末端領域は、アミノ酸配列Ｘ2mで構成され、そのアミノ酸残基の数（ｍ）は、上記の通り、０〜３７である。アミノ酸配列Ｘ2mを構成するアミノ酸の種類は特に限定されるものではない。例えば、アミノ酸配列Ｘ2mは、配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１９２番から第２２８番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｍ（１≦ｍ≦３７）のアミノ酸配列であってもよい。或いは、アミノ酸配列Ｘ2mは、配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１９１番から第２２７番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｍ（１≦ｍ≦２６）のアミノ酸配列であってもよい。
【００４７】
脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質を提供するという観点から、アミノ酸配列Ｘ2mは、配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第１９２番から第２２８番までのアミノ酸配列であることが好ましい。或いは、アミノ酸配列Ｘ2mは、配列番号１１で表わされるアミノ酸配列の第１９１番から第２２７番までのアミノ酸配列であることが好ましい。アミノ酸配列Ｘ2mが、これらのアミノ酸配列である場合には、本発明のタンパク質が脂肪滴により特異的に局在するからである。
【００４８】
ところで、配列番号２に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が１ｂ型であるＨＣＶ−Ｏ株（ゲノム塩基配列のGenBank Accession number: AB19133、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: BAD91386）の非構造タンパク質４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）のアミノ酸配列である。配列番号３に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が１ａ型であるＨＣＶ（isolate H）（ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: P27958）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号４に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が１ｃ型であるＨＣＶ(isolate HC-G9)（ゲノム塩基配列のAccession number: D14853、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: BAA03581）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号５に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が２ａ型であるＨＣＶ（ポリプロテインｃｄｓ領域の塩基配列のAccession number: AY746460、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: AAU89634）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号６に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が２ｂ型であるＨＣＶ(strain MD2b-1)（ゲノム塩基配列のAccession number: AF238486、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: AAF59945）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号７に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が２ｃ型であるＨＣＶ(isolate BEBE1)（ゲノム塩基配列のAccession number: D50409、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: Q68749）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号８に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が２ｋ型であるＨＣＶ(isolate VAT96)（ゲノム塩基配列のAccession number: AB031663、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: BAA88057）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号９に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が３ａ型であるＨＣＶ(isolate HCV-K3a/650)（ゲノム塩基配列のAccession number: D28917、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: Q81495）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号１０に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が３ｂ型であるＨＣＶ(isolate Tr Kj)（ゲノム塩基配列のAccession number: D49374、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: BAA08372）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号１１に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が４ａ型であるＨＣＶ（isolate 02-42）（ポリプロテインｃｄｓ領域の塩基配列のAccession number: DQ418783、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: ABD75825）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号１２に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が４ｄ型であるＨＣＶ（ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: ABD75828）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号１３に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が５ａ型であるＨＣＶ(isolate EUH1480)（ポリプロテイン・コード領域塩基配列のAccession number: Y13184、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: CAA73640）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号１４に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が６ａ型であるＨＣＶ(isolate EUHK2)（ポリプロテイン・コード領域塩基配列のAccession number: Y12083、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: CAA72801）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号１５に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が６ｂ型であるＨＣＶ(isolate Th580)（ゲノム塩基配列のAccession number: D84262、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: BAA32664）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号１６に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が６ｆ型であるＨＣＶ(isolate C-0044)（ゲノム塩基配列のAccession number: DQ835760、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: ABI36963）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号１７に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が６ｇ型であるＨＣＶ(isolate JK046)（ゲノム塩基配列のAccession number: D63822、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: BAA09891）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号１８に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が６ｈ型であるＨＣＶ(isolate VN004)（ゲノム塩基配列のAccession number: D84265、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: BAA32667）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号１９に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が６ｉ型であるＨＣＶ(isolate C-0159)（ゲノム塩基配列のAccession number: DQ835762、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: ABI36965）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号２０に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が６ｋ型であるＨＣＶ(isolate VN405)（ゲノム塩基配列のAccession number: D84264、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: BAA32666）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号２１に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が６ｌ型であるＨＣＶ(isolate 537796)（ゲノム塩基配列のAccession number: EF424628、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: ABP88847）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号２２に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が６ｍ型であるＨＣＶ(isolate C-0208)（ゲノム塩基配列のAccession number: DQ835763、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: ABI36966）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号２３に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が６o型であるＨＣＶ(isolate QC227)（ゲノム塩基配列のAccession number: EF424627、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: ABP88846）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。図３に、配列番号２〜２３に示されるアミノ酸配列について、アライメント解析を行った結果が示されている。図３に示される配列は、上から順に、配列番号３、２、４〜２３に示すアミノ酸配列である。上記の通り、配列番号２〜２３に示されるＮＳ４Ｂのアミノ酸配列は、上記遺伝子型（サブタイプ）の特定のＨＣＶに由来するものであるが、上記以外の遺伝子型（サブタイプ）のＨＣＶが多数存在し、さらに、同じ遺伝子型（サブタイプ）の中でも塩基配列及びアミノ酸配列が異なるものも存在する。本発明のタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２〜２３に基づいて設計してもよいが、その他公知のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列に基づいて設計してもよい。
【００４９】
本発明において、（Ｂ）に規定されるタンパク質は、（Ａ）に規定されるタンパク質において、配列番号２における上記第５０番から第７３番までのアミノ酸配列の領域（ポリペプチド（ａ）に存在する領域）、及び／又は上記第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列の領域（ポリペプチド（ｂ）に存在する領域）中に１もしくは数個のアミノ酸が、欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質である。ここで、「１もしくは数個」の範囲は、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示す限り、特に限定されない。例えば、上記第５０番から第７３番までのアミノ酸配列の領域（ポリペプチド（ａ）に存在する領域）について言えば、１から２０個、好ましくは１から９個、より好ましくは１から５個、特に好ましくは１から４個、１から３個、１から２個、１個とすることができる。一方、上記第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列の領域（ポリペプチド（ｂ）に存在する領域）について言えば、例えば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から９個、特に好ましくは１から５個、１から４個、１から３個、１から２個、１個とすることができる。さらに、本発明のタンパク質（Ｂ）において上記第５０番から第７３番までのアミノ酸配列の領域、及び／又は上記第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列の領域中に、このようなアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加がある場合において、アミノ酸配列Ｘ1n及びＸ2mの好ましい配列は、上記タンパク質（Ａ）について記載した通りである。
【００５０】
さらに、図３のアライメント解析の結果を考慮すると、（Ｂ）に規定されるタンパク質は、例えば、配列番号２における上記第５０番から第７０番までのアミノ酸配列の領域において、第５１番目のアラニン（Ａ）がヒスチジン（Ｈ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、チロシン（Ｙ）又はトレオニン（Ｔ）に置換され；第５２番目のリシン（Ｋ）がグルタミン（Ｑ）に置換され；第５３番目のヒスチジン（Ｈ）がグルタミン（Ｑ）に置換され；第５４番目のメチオニン（Ｍ）がロイシン（Ｌ）に置換され；第５８番目のイソロイシン（Ｉ）がバリン（Ｖ）に置換され；及び／又は第７３番目のアスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）に置換されたものが挙げられる。
【００５１】
また、図３のアライメント解析の結果を考慮すると、（Ｂ）に規定されるタンパク質は、例えば、配列番号２における上記第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列の領域において、第２１８番目のバリン（Ｖ）がグリシン（Ｇ）に置換され；第２１９番目のセリン（Ｓ）がアラニン（Ａ）に置換され；第２２１番目のトレオニン（Ｔ）がアラニン（Ａ）に置換され；第２２５番目のプロリン（Ｐ）がトレオニン（Ｔ）又はアラニン（Ａ）に置換され；第２２７番目のセリン（Ｓ）がトレオニン（Ｔ）に置換され；第２２９番目のアラニンがトレオニン（Ｔ）に置換され；第２３０番目のアラニン（Ａ）がセリン（Ｓ）に置換され；第２３１番目のアラニン（Ａ）がバリン（Ｖ）、グルタミン（Ｑ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）又はアルギニン（Ｒ）に置換され；第２３２番目のアルギニン（Ｒ）がリシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、アラニン（Ａ）又はグルタミン（Ｑ）に置換され；第２３３番目のバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）に置換され；第２３４番目のトレオニン（Ｔ）がメチオニン（Ｍ）に置換され；第２３５番目のグルタミン（Ｑ）がヒスチジン（Ｈ）、アラニン（Ａ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、トレオニン（Ｔ）又はセリン（Ｓ）に置換され；第２３６番目のイソロイシン（Ｉ）がロイシン（Ｌ）に置換され；第２３８番目のセリン（Ｓ）がトレオニン（Ｔ）又はグリシン（Ｇ）に置換され；第２４２番目のイソロイシン（Ｉ）がバリン（Ｖ）に置換され；第２４４番目のグルタミン（Ｑ）がセリン（Ｓ）又はアルギニン（Ｒ）に置換され；第２４６番目のロイシン（Ｌ）がプロリン（Ｐ）に置換され；第２４７番目のリシン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）に置換され；第２４８番目のアルギニン（Ｒ）がリシン（Ｋ）に置換され；第２５１番目のグルタミン（Ｑ）がバリン（Ｖ）、アスパラギン（Ｎ）、アラニン（Ａ）、トレオニン（Ｔ）、リシン（Ｋ）、グルタミン酸（Ｅ）又はヒスチジン（Ｈ）に置換され；第２５３番目のイソロイシン（Ｉ）がバリン（Ｖ）に置換され；第２５４番目のアスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）又はヒスチジン（Ｈ）に置換され；第２５５番目のグルタミン酸（Ｅ）がセリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）又はトレオニン（Ｔ）に置換され；第２５６番目のアスパラギン酸（Ｄ）がグルタミン酸（Ｅ）に置換され；第２５７番目のシステイン（Ｃ）がチロシン（Ｙ）、トレオニン（Ｔ）又はトリプトファン（Ｗ）に置換され；第２５８番目のセリン（Ｓ）がトレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）又はアラニン（Ａ）に置換され；及び／又は第２５９番目のトレオニン（Ｔ）がアラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）又はセリン（Ｓ）に置換されたものが挙げられる。
【００５２】
本発明において、（Ｃ）に規定されるタンパク質は、上記（Ａ)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質である。（Ｃ）に規定されるタンパク質は、脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質であって、上記（Ａ）に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の配列相同性を有する。本発明において「配列相同性」という語は、２以上のアミノ酸配列の互いに対する同一性の程度を指す。したがって、ある二つのアミノ酸配列の相同性が高い程、それらの配列の同一性又は類似性は高い。２種類のアミノ酸配列が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較によって解析することが可能であり、具体的には、市販の配列解析ソフトウェア等を用いて解析することができる。
【００５３】
さらに、本発明のタンパク質は、上記タンパク質（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）と、標識タンパク質及び／又はアフィニティタグとの融合タンパク質を含む。本発明の融合タンパク質において、標識タンパク質及び／又はアフィニティタグは、上記タンパク質（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のＮ末端側及び／又はＣ末端側に位置し得る。また、本発明の融合タンパク質は、当該タンパク質が脂肪滴への特異的局在性を有する限りにおいて、複数種の標識タンパク質及び／又はアフィニティタグも含み得る。本発明の融合タンパク質において、上記タンパク質（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）と標識タンパク質及び／又はアフィニティタグとは直接連結していてもよいし、各種リンカーを介して結合していてもよい。
【００５４】
上記標識タンパク質としては、蛍光タンパク質が挙げられ、その具体例としては、ＧＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰ、ＲＦＰ、ｍＷａｓａｂｉ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＤｓＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲｕｂｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＢａｎａｎａ、Ｄｅｎｄｒａ２、Ｅ２−Ｃｒｉｍｓｏｎ、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏなどが挙げられる。上記アフィニティタグの例としては、Ｈｉｓタグ、HAタグ、mycタグ、FLAGタグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｅタグ、Ｓタグ、ＨＳＶタグ、Ｈａｌｏタグ等が挙げられる。
【００５５】
さらに、本発明のタンパク質は、上記タンパク質（Ａ）、（Ｂ）若しくは（Ｃ）、又は上記融合タンパク質が被導入物質により修飾されたものを含む。標的細胞において所望の被導入物質を脂肪滴に局在させることが可能となるからである。被導入物質の具体例としては、脂肪を分解する物質（例えば、各種リパーゼ）、ビオチン等のタンパク質標識化合物、蛍光化合物等が挙げられる。脂肪を分解する物質で修飾された本発明のタンパク質の用途としては、例えば、肥満の治療又は予防が想定される。蛍光化合物により標識された本発明のタンパク質の用途としては、細胞内における脂肪滴の可視化（イメージング）が想定される。蛍光化合物の具体例としては、フルオロセイン（fluorescein）、ローダミン（rhodamine）、Cy色素（例えば、Cy3、Cy 5）、アレクサ色素等が挙げられる。
【００５６】
本発明のタンパク質は、公知の各種遺伝子工学的技術により製造してもよいし、化学合成により製造してもよい。
【００５７】
本発明者は、後述の実施例に示す通り、1b型であるＨＣＶ−Ｏ株の全長を含むプラスミドpON/C-5B/KE (Ikeda M. et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 329（2005)１３５０−１３５９）を鋳型ＤＮＡとして、ＮＳ４Ｂコード領域のうち、そのＮ末端領域及びＣ末端領域をＰＣＲによりそれぞれ増幅し、オーバーラップＰＣＲにより各断片を連結した。次いで、連結した断片を、各種発現ベクターに増幅断片を導入することにより、本発明の一例であるタンパク質をコードする哺乳動物発現プラスミドを作成した。しかしながら、本発明のタンパク質を遺伝子工学的に作成する上で、出発材料は上記プラスミドに限定されるものでもなく、その具体的な発現系の構築方法も上記方法に限定されるものではない。
【００５８】
上述のタンパク質（Ａ）、（Ｂ）若しくは（Ｃ）、又は上記融合タンパク質をコードする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を作成し、公知の各種発現ベクターに組み込むことにより、本発明のタンパク質を発現させることができる。本発明のタンパク質をコードする核酸を作成する上で、アミノ酸の欠失、置換及び／または付加を施すためには、例えば、エラープローンＰＣＲ法、ＤＮＡシャッフリング法、各種部位特異的変異導入法などにより、任意の塩基の欠失、置換及び／または挿入を行うことができる。
【００５９】
本発明において用いられる発現ベクターの種類は特に限定されず、細菌（例えば、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis））、真菌類（例えば、酵母類）等の微生物、植物、昆虫細胞、哺乳細胞などのホストにおいてタンパク質の発現を可能とする各種発現ベクターを用いることができ、ウイルスベクター（ファージベクターを含む）でもプラスミドベクターであってもよい。あるいは、ウサギ網状赤血球ライセート、小麦胚芽ライセート、大腸菌ライセート等を用いた無細胞タンパク質合成系を用いて、本発明のタンパク質を製造することもできる。このうち、本発明のタンパク質を用いて哺乳細胞の脂肪滴を観察又は解析する場合には、哺乳細胞発現用のプラスミドベクター又はウイルスベクターを用いることが好ましい。哺乳細胞において本発明のタンパク質を発現させると、発現した本発明のタンパク質は細胞内の脂肪滴に特異的に局在する。したがって、本発明のタンパク質をコードする核酸を哺乳細胞発現用のプラスミドベクター又はウイルスベクターに組み込み、該プラスミドベクター又はウイルスベクターを哺乳細胞で形質転換すれば、本発明のタンパク質を哺乳細胞において直接発現させることが可能であり、発現した本発明のタンパク質は細胞内の脂肪滴に特異的に局在し、哺乳細胞の脂肪滴を観察又は解析することができる。また、脂肪滴は、哺乳細胞だけでなく、広く真核生物（植物を含む）や原核生物（例えば、細菌）にも存在することが知られている（Murphy DJ: Prog. Lipid Res. 40, 325-438, 2001）。細胞内に脂肪滴を有する生物種をホストとして、それらの生物種に応じた各種タンパク質発現ベクターを用い、本発明のタンパク質を発現させてもよい。各種生物種において発現した本発明のタンパク質は、細胞内の脂肪滴に局在し、それら生物種の脂肪滴を観察又は解析することができる。
【００６０】
また、上記タンパク質（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）と蛍光タンパク質との融合タンパク質を、所望の哺乳細胞において発現させれば、直接的に、脂肪滴を可視化することができる。また、上記タンパク質（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）とアフィニティタグとの融合タンパク質を遺伝子工学的に発現させた場合には、各種アフィニティ精製法により、本発明のタンパク質を精製することが可能となる。
【００６１】
本発明のタンパク質は、上記の通り、所望の哺乳細胞において直接発現させることにより、脂肪滴の解析等に用いることも可能である。しかしながら、各種公知の方法により精製した本発明のタンパク質を、所望の哺乳細胞における脂肪滴の解析等に用いることもできる。具体的には、精製した本発明のタンパク質を所望の哺乳細胞へ導入することにより、細胞内脂肪滴の解析等を行うことができる。精製した本発明のタンパク質を所望の哺乳細胞へ導入するためには、例えば、脂質ベースのタンパク質導入試薬等を用いることができる。このようなタンパク質導入試薬は、試薬メーカーから入手可能である（例えば、LSin(PPU 社)；Pro-DeliverIN(OZB 社)；BioPORTER Protein Delivery Reagent(GTS 社)；アパキャリー1(CLG 社)；Ab-DeliverIN(OZB 社)）。
【００６２】
本発明のタンパク質は、細胞内脂肪滴に特異的な局在性を示すことから、生細胞又は固定細胞において、脂肪滴の可視化（イメージング）ツールとして用いることができる。具体的には、上記タンパク質（Ａ）、（Ｂ）若しくは（Ｃ）に対する抗体、又はそれに融合させる標識タンパク質若しくはアフィニティタグに対する抗体を用いて、本発明のタンパク質を導入した細胞を免疫染色すれば、脂肪滴を可視化することができる。免疫染色の方法は公知の手法を用いることができる。また、本発明のタンパク質に蛍光タンパク質を融合させたものを細胞で発現させ、共焦点レーザー顕微鏡等を用いて該細胞を観察すれば、細胞内脂肪滴の精彩なイメージングが可能となる。さらに、本発明のタンパク質を蛍光化合物等で修飾したものを細胞に導入することによっても、同様に細胞内脂肪滴の精彩なイメージングが可能となる。
【００６３】
さらに、本発明のタンパク質は細胞内脂肪滴に特異的な結合能力を有することから、脂肪分解物質（例えば、リパーゼ）等の被導入物質で修飾した本発明のタンパク質を脂肪細胞などの標的細胞に導入し、細胞内脂肪滴を分解することにより、肥満などの疾患の治療又は予防を行うことも可能となる。
【００６４】
上述の通り、本発明のタンパク質は、細胞内脂肪滴の可視化ツール、薬物を含む被導入物質を脂肪滴に送達させるための薬物送達ツール等として用いることができる。
【００６５】
また、本発明の別の態様は、以下のタンパク質に関する
（１）配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１番から第７３番までのアミノ酸配列において、第４３番、第４６番、第５０番、第５７番、第６１番及び第６４番のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに変異したタンパク質；又は配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１番から第７２番までのアミノ酸配列において、第４３番、第４９番、第５６番、第６０番及び第６３番のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに変異したタンパク質。
（２）配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１９２番から第２６１番までのアミノ酸配列において、第２４２番、第２４６番、第２４９番及び第２５３番のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに変異したタンパク質；又は配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１９１番から第２６０番までのアミノ酸配列において、第２４１番、第２４５番、第２４８番及び第２５２番のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに変異したタンパク質。
（３）配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１番から第７３番までのアミノ酸配列のＣ末端に、配列番号２〜１０及び１２〜２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１９２番から第２６１番までのアミノ酸配列のＮ末端が結合してなるアミノ酸配列において、第４３番、第４６番、第５０番、第５７番、第６１番、第６４番、第２４２番、第２４６番、第２４９番及び第２５３番のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに変異したタンパク質；又は配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１番から第７２番までのアミノ酸配列のＣ末端に、配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１９１番から第２６０番までのアミノ酸配列のＮ末端が結合してなるアミノ酸配列において、第４３番、第４９番、第５６番、第６０番、第６３番、第２４１番、第２４５番、第２４８番及び第２５２番のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに変異したタンパク質。
【００６６】
上記（１）のタンパク質において、例えば、第４３番、第４６番及び第５０番（第４９番）のアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに置換されていてもよいし、第５７番（第５６番）、第６１番（第６０番）及び第６４番（第６３番）が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに置換されていてもよいし、あるいは、第４３番、第４６番、第５０番（第４９番）、第５７番（第５６番）、第６１番（第６０番）及び第６４番（第６３番）のアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに置換されていてもよい。
【００６７】
上記（２）のタンパク質において、例えば、第２４２番（第２４１番）、第２４６番（第２４５番）、第２４９番（第２４８番）及び第２５３番（２５２番）のアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに置換されていてもよい。
【００６８】
上記（３）のタンパク質において、例えば、第４３番、第４６番、第５０番（第４９番）、第５７番（第５６番）、第６１番（第６０番）及び第６４番（第６３番）のアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに置換されていてもよいし、第４３番、第４６番、第５０番（第４９番）、第５７番（第５６番）、第６１番（第６０番）、第６４番（第６３番）、第２４２番（第２４１番）、第２４６番（第２４５番）、第２４９番（第２４８番）及び第２５３番（２５２番）のアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに置換されていてもよいし、あるいは、第４３番、第４６番、第５０番（第４９番）、第２４２番（第２４１番）、第２４６番（第２４５番）、第２４９番（第２４８番）及び第２５３番（２５２番）のアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに置換されていてもよい。
【００６９】
上記（１）、（２）及び（３）のタンパク質において、各基準となるアミノ酸配列は配列番号２から選ばれることが好ましい。さらに、上記（１）、（２）及び（３）のタンパク質において、上記したアミノ酸の変異は、アラニンによる変異であることが好ましい。
【００７０】
さらに、本発明は、上記（１）、（２）又は（３）のタンパク質をコードする核酸に関する。
【００７１】
さらに、本発明は上記核酸を含む、発現用ベクターに関する。また、本発明は、前記発現用ベクターにより形質転換体に関する。
【００７２】
以下、本発明について、実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７３】
１．Ｃ型肝炎ウイルスＯ株の配列
本実施例では、1b型のＨＣＶ−Ｏ株（DDBJ/EMBL/GenBank Accession number, AB191333, Ikeda et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 329, 1350-1359, 2005）の配列を用いた。
ＮＳ４Ｂはこの配列のヌクレオチド番号5475〜6257によってコードされるタンパク質であり、２６１アミノ酸から成る。ＨＣＶ−Ｏ株ＮＳ４Ｂのヌクレオチド配列を図１及び配列番号１に示す。また、ＨＣＶ−Ｏ株ＮＳ４Ｂのアミノ酸配列を図２及び配列番号２に示す。【００７４】
２．ＮＳ４Ｂの機能領域（ドメイン）の設定
ＮＳ４Ｂは小胞体（ＥＲ；endoplasmic reticulum）に局在する膜タンパク質であり、その中央部がＥＲ膜に埋め込まれ、Ｎ末端側の一部とＣ末端側の一部が細胞質側に出ていると考えられている。つまり、ＮＳ４Ｂタンパク質は、Ｎ末端側細胞質ドメイン（４ＢＮ）、膜貫通ドメイン（４ＢＴＭ）、及びＣ末端側細胞質ドメイン（４ＢＣ）の三つの領域に分類することができる（図４参照）。【００７５】
現在、ＮＳ４Ｂの結晶構造解析が為されていないため、正確な立体構造は不明である。４ＢＮと４ＢＴＭの境界はアミノ酸残基７０〜７５番付近と考えられているが定まっていない。複数のタンパク質二次構造予測プログラムでアミノ酸残基７４番からαへリックスが始まることが予測されている（Gouttenoire et al, J. Virol. 83, 6257-6268, 2009）。そこで、このαへリックスを最初の膜貫通αへリックスと考え、アミノ酸残基１〜７３を４ＢＮとした。４ＢＴＭと４ＢＣの境界は配列の特徴からおおむねコンセンサスが得られており、４ＢＴＭはアミノ酸残基７４〜１９１、４ＢＣはアミノ酸残基１９２〜２６１とした(Jones et al, J. Virol. 83, 2163-2177, 2009)。下記の通り、これらの各領域と蛍光タンパク質との融合タンパク質を作出した。さらに、ＮＳ４Ｂの全長アミノ配列（アミノ酸残基１〜２６１）からなる４Ｂｆｕｌｌ、アミノ酸残基１〜２５からなる４Ｂ１（４ＢＮの一部）、アミノ酸残基２６〜４９からなる４Ｂ２（４ＢＮの一部）、アミノ酸残基５０〜７３からなる４Ｂ３（４ＢＮの一部）、アミノ酸残基１〜４９からなる４Ｂ１−２（４ＢＮの一部）、アミノ酸残基２６〜７３からなる４Ｂ２−３（４ＢＮの一部）、アミノ酸残基１９２〜２１７からなる４Ｂ９（４ＢＣの一部）、アミノ酸残基２１８〜２３９からなる４Ｂ１０（４ＢＣの一部）、アミノ酸残基２４０〜２６１からなる４Ｂ１１（４ＢＣの一部）、アミノ酸残基１９２〜２３９からなる４Ｂ９−１０（４ＢＣの一部）、アミノ酸残基２１８〜２６１からなる４Ｂ１０−１１（４ＢＣの一部）についても、同様に蛍光タンパク質との融合タンパク質を作出した。蛍光タンパク質として例えばｍＣｈｅｒｒｙを用いる場合、各融合タンパク質は、Ｃｈｅｒｒｙ−に領域名を付してＣｈｅｒｒｙ-４ＢＮなどの名前で表す。【００７６】
３．４Ｂｆｕｌｌ、４ＢＮ、４ＢＴＭ、４ＢＣ、４Ｂ１、４Ｂ２、４Ｂ３、４Ｂ１−２、４Ｂ２−３、４Ｂ９、４Ｂ１０、４Ｂ１１、４Ｂ９−１０、４Ｂ１０−１１をコードする遺伝子断片の作製
ＮＳ４Ｂの各領域をＰＣＲにより増幅した。各増幅断片を蛍光タンパク質発現ベクターに組み込むために、ＰＣＲに用いたプライマーには制限酵素認識配列を付加した（Ｕ側：Bgl II サイト, Ｒ側：Eco RIサイト）。また、Ｒ側プライマーでは４Ｂ配列の最後に終止コドンを挿入した。鋳型として、ＨＣＶ−Ｏ株の全長を含むプラスミドpON/C-5B/KE (Ikeda M. et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 329（2005)１３５０−１３５９）又は以下に示す各プラスミドを用い、ＤＮＡポリメラーゼは高フィデリティのPrimeSTAR HS DNA polymerase (タカラバイオ社、以下ＰＳと略す)を用いた。【００７７】
以下に、各プライマーの配列を示す。
４Ｂｆｕｌｌ用プライマー
Ｕ側  5'-TTTAGATCTGCCTCGCACCTCCCTTAC-3'（配列番号２４）（４ＢＮ用Ｕ側プライマー）
Ｒ側  5'-TTTGAATTCTTAGCATGGCGTGGAGCAGTC-3'（配列番号２９）（４ＢＣ用Ｒ側プライマー）【００７８】
4BN用プライマー
Ｕ側   5'-TTTAGATCTGCCTCGCACCTCCCTTAC-3'（配列番号２４）
Ｒ側   5'-TTTGAATTCTTAGTTCCCAGGCAGAGTGGA-3'（配列番号２５）【００７９】
4BTM用プライマー
Ｕ側    5'-TTTAGATCTCCCCCGATAGCTTCACTG-3'（配列番号２６）
Ｒ側    5'-TTTGAATTCTTACAGTATTGCCGCGCACAC-3'（配列番号２７）【００８０】
4BC用プライマー
Ｕ側    5'-TTTAGATCTCGCCGGCACGTGGGC-3'（配列番号２８）
Ｒ側    5'-TTTGAATTCTTAGCATGGCGTGGAGCAGTC-3'（配列番号２９）【００８１】
4B1用プライマー
Ｕ側：４ＢＮ用Ｕ側プライマー
Ｒ側：5'-TTTGAATTCTTACAGCAACCCGAGCGCCTT-3'（配列番号３０）
鋳型：Cherry-4BNプラスミド【００８２】
4B2用プライマー
Ｕ側：４Ｂ２−３用Ｕ側プライマー
Ｒ側：5'-TTTGAATTCTTAAAAGGCCTCAAGGGCTTGC-3'（配列番号３１）
鋳型：Cherry-4BNプラスミド【００８３】
４Ｂ３用プライマー
Ｕ側    5'-TTTAGATCTTGGGCGAAGCACATGTGG-3'（配列番号３２）
Ｒ側    ４ＢＮ用のＲ側プライマー【００８４】
4B1-2用プライマー
Ｕ側：４ＢＮ用Ｕ側プライマー
Ｒ側：４Ｂ２用Ｒ側プライマー
鋳型：Cherry-4BNプラスミド【００８５】
４Ｂ２−３用プライマー
Ｕ側    5'-TTTAGATCTCAAGCAGCCACCAAGCAAG-3'（配列番号３３）
Ｒ側    ４ＢＮ用のＲ側プライマー【００８６】
4B9用プライマー
Ｕ側：４ＢＣ用Ｕ側プライマー
Ｒ側：5'-TTTGAATTCTTAATGGTTACCCCGCGAAGCG-3'（配列番号３４）
鋳型：Cherry-4BCプラスミド【００８７】
4B10用プライマー
Ｕ側：４Ｂ１０−１１用Ｕ側プライマー
Ｒ側：5'-TTTGAATTCTTAGCTGGAGAGGATCTGAGTG-3'（配列番号３５）
鋳型：Cherry-4BCプラスミド【００８８】
4B11用プライマー
Ｕ側：5'-TTTAGATCTCTTACCATCACCCAGCTGTT-3'（配列番号３６）
Ｒ側：４ＢＣ用Ｒ側プライマー
鋳型：Cherry-4BCプラスミド【００８９】
4B9-10用プライマー
Ｕ側：４ＢＣ用Ｕ側プライマー
Ｒ側：４Ｂ１０用Ｒ側プライマー
鋳型：Cherry-4BCプラスミド【００９０】
４Ｂ１０−１１用プライマー
Ｕ側    5'-TTTAGATCTGTTTCCCCCACGCACTATG-3'（配列番号３７）
Ｒ側    4BC用のＲ側プライマー【００９１】
（反応液の組成）
ＰＳバッファー１０μＬ、dNTP(各2.5 mM)４μＬ、Ｕ側プライマー(0.1 mM)０．４μＬ、Ｒ側プライマー(0.1 mM)０．４μＬ、鋳型プラスミド１０ｎｇ、ＰＳ ０．５μＬ、残部を超純水とし、最終容量を50μＬとしてＰＣＲ反応を行った。【００９２】
（ＰＣＲ反応）
それぞれのプライマーペアを含む上記の反応液を作製し（４Ｂｆｕｌｌ用、４ＢＮ用、４ＢＴＭ用、４ＢＣ用、４Ｂ１用、４Ｂ２用、４Ｂ３用、４Ｂ１−２用、４Ｂ２−３用、４Ｂ９用、４Ｂ１０用、４Ｂ１１用、４Ｂ９−１０用、４Ｂ１０−１１用）、９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃３０秒｝を２５サイクル繰返した。【００９３】
４．４ＢＮＣをコードする遺伝子断片の作製
４ＢＮＣとは、４ＢＮと４ＢＣを連結した配列である（図５参照）。４ＢＮの３’側と４ＢＣの５’側で配列が一部重複するような二つの断片を作製すれば、その二つの断片を直接ＰＣＲで連結できる。これら二つの断片を以下に示すプライマーを用いて、ＰＣＲにより作成した。【００９４】
４ＢＮ側断片用プライマー
Ｕ側    ４ＢＮ用のＵ側プライマー
Ｒ側    5'-CTCCCCCGGGCCCACGTGCCGGCGGTTCCCAGGCAGAGTGGA-3'（配列番号３８）【００９５】
４ＢＣ側断片用プライマー
Ｕ側    5'-CGCCGGCACGTGGGCC-3'（配列番号３９）
Ｒ側    ４ＢＣ用のＲ側プライマー【００９６】
まず、４ＢＮ側断片と４ＢＣ側断片を各々ＰＣＲで作成する。上記に示すプライマーを使用した以外、反応液組成及び反応条件は上記３．に準じたものである。ＰＣＲ反応後、MARLIGEN 社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。次に各断片の連結ＰＣＲを行った。【００９７】
（各断片の連結ＰＣＲのための反応液）
ＰＳバッファー１０μＬ、dNTP(各2.5 mM)４μＬ、４ＢＮ側精製断片２００ｎｇ、４ＢＣ側精製断片２００ｎｇ、ＰＳ ０．５μＬとし、超純水で最終容量を５０μＬとしてＰＣＲ反応を行った。【００９８】
（連結ＰＣＲの反応条件）
９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃２０秒、７２℃６０秒｝を６サイクル繰返した。このＰＣＲ反応により、４ＢＮ側断片と４ＢＣ側断片を連結した。【００９９】
上記の連結ＰＣＲの後、反応液に、直接、以下のプライマーを加え、増幅ＰＣＲを行う。
Ｕ側プライマー  ４ＢＮ用のＵ側プライマー  (0.1 mM) ０．４μＬ
Ｒ側プライマー  ４ＢＣ用のＲ側プライマー  (0.1 mM) ０．４μＬ【０１００】
（増幅ＰＣＲの反応条件）
９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃６０秒｝を８サイクル繰り返した。この反応により、４ＢＮＣをコードするＤＮＡ断片を得た。【０１０１】
５．各ＮＳ４Ｂ断片の蛍光タンパク質発現プラスミドへの組み込み
蛍光タンパク質発現用ベクターは、pmCherry-C1とpEGFP-C1 (いずれもClontech社)とを用いた。【０１０２】
ベクターは定法によりBgl IIおよびEco RIで消化後、Calf intestine alkaline phosphatase （TOYOBO社）で処理し、さらにアガロースゲル電気泳動を行い、ゲルよりベクターＤＮＡを切り出し、QIAGEN社 MinElute gel extraction kitによって精製した。ＴＥバッファー(10 mM Tris-Cl pH 7.4, 1 mM EDTA) でＤＮＡ濃度が５０ng/μＬになるように調整した。【０１０３】
上記の各ＰＣＲ産物（４Ｂｆｕｌｌ、４ＢＮ、４ＢＴＭ、４ＢＣ、４Ｂ１、４Ｂ２、４Ｂ３、４Ｂ１−２、４Ｂ２−３、４Ｂ９、４Ｂ１０、４Ｂ１１、４Ｂ９−１０、４Ｂ１０−１１、４ＢＮＣ）は、MARLIGEN 社Rapid PCR purification systemキットで精製した。次いで、各ＰＣＲ産物について、定法によりBgl IIおよびEco RIで消化し、さらにアガロースゲル電気泳動を行い、ＤＮＡを切り出してQIAGEN社 MinElute gel extraction kitによって精製した。ＴＥバッファー(10 mM Tris-Cl pH 7.4, 1 mM EDTA) でＤＮＡ濃度が５０ｎｇ/μlになるように調整する。【０１０４】
上記の処理後ベクター０．５μＬ（２５ｎｇ）、 処理後ＰＣＲ断片０．５μＬ（２５ｎｇ）、Ligation High １μＬ（TOYOBO社)を混合し、１６℃で、３０分間ライゲーション反応を行った。【０１０５】
ライゲーションしたＤＮＡを、エレクトロポレーションにより、ＴＧ１株大腸菌にトランスフォームした(Tanaka et al, Nihon Univ. J. Med. 47, 43-56, 2005)。トランスフォームした菌体はカナマイシン ２５μｇ/ｍＬを含むLBプレート上で選択し、得られたコロニーを1mlスケールで培養し、プラスミドＤＮＡをMarligen社Rapid plasmid miniprep systemにより抽出した。【０１０６】
BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kitによりベクターに挿入されたＮＳ４Ｂ各断片のヌクレオチド配列が正しいことを確認した。塩基配列の決定には、以下のプライマーを用いた。
pmCherry-C1用
Ｕ側    5'-GTGGAACAGTACGAACGC-3'（配列番号４０）
Ｒ側    5'-TGTGGGAGGTTTTTTAAAGC-3'（配列番号４１）
pEGFP-C1用
Ｕ側    5'-AGCGCGATCACATGGTCC-3'（配列番号４２）
Ｒ側    5'-CTCTACAAATGTGGTATGGC-3'（配列番号４３）【０１０７】
正しい配列を確認した後、50 ml の培養スケールで形質転換体を培養し、Machery-Nagel社 Nucleobond PC500キットでプラスミドを抽出した。得られたプラスミドを定法によりフェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、１μｇ/μＬの濃度になるようにＴＥバッファーに溶解した。【０１０８】
６．各コンストラクトの細胞へのトランスフェクション
各コンストラクトは便宜上、以下の名前で表す。
Cherry-4Bfull、Cherry-4BN、Cherry-4BTM、Cherry-4BC、Cherry-4B1、Cherry-4B2、Cherry-4B3、Cherry-4B1-2、Cherry-4B2-3、Cherry-4B9、Cherry-4B10、Cherry-4B11、Cherry-4B9-10、Cherry-4B10-11、Cherry-4BNC、
EGFP-4BN、EGFP-4BTM、EGFP-4BC、EGFP-4B2-3、EGFP-4B3、EGFP-4B10-11、EGFP-4BNC【０１０９】
実験には脂肪滴を豊富に持つＯｃ細胞(Ikeda et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 329, 1350-1359, 2005)を用いた。蛍光顕微鏡で観察可能なガラス底の２４ウェルプレート（EZViewカルチャープレートLBガラスボトム、IWAKI社）に７０〜８０％コンフルエントになるようOc細胞を播き、Lipofectamin 2000 (Invitrogen社)を用いてプロトコールに従い、各プラスミドをトランスフェクションした。１ウェルあたりプラスミ１．６μｇ、Lipofectamin 2000を４．０μＬ使用した。トランスフェクションの２４時間または４８時間後に、各Oc細胞を観察した。【０１１０】
７．細胞の固定、染色
細胞をＴＢＳ（20 mM Tris-Cl pH 7.4, 0.15 M NaCl）でリンスした後、４％パラフォルムアルデヒドで１５分間固定した。全ての反応はシーソーシェーカー上で行った。【０１１１】
上記Cherry融合タンパク質を発現させた細胞については、脂肪滴をBodipy493/503 (Invitrogen社)で２０分間染色した（Ohsaki et al, Histochem. Cell Biol. 124, 445-452, 2005）。【０１１２】
上記EGFP融合タンパク質を発現させた細胞については、脂肪滴膜を抗ADRP抗体で染色した。固定後0.01% digitonin /TBS で３０分インキュベートし、1% BSA/TBSで１時間ブロッキングした。抗ADRP抗体（Acris社）／1% BSA/TBS（抗体終濃度5μｇ/ｍＬ）で１時間インキュベートし、次に２次抗体として抗mouse IgG-AlexaFluor 647 (Invitrogen社) １０００倍希釈／1% BSA/TBSで３０分間インキュベートした。【０１１３】
いずれの場合も、核をHechst 33342色素（終濃度５μg/ｍＬ ＴＢＳ）で２０分間染色した。【０１１４】
８．顕微鏡観察
上記細胞を、共焦点レーザー走査型顕微鏡（FV1000, オリンパス社）を用いてシークエンシャルスキャンモードで鏡検した。【０１１５】
９．ＮＳ４Ｂ−Ｃｈｅｒｒｙ融合タンパク質の脂肪滴局在についての定量的解析の方法
細胞数あたりどれぐらいの頻度で、Cherry-4Bfull、Cherry-4BN、Cherry-4BTM、Cherry-4BC、Cherry-4B1、Cherry-4B2、Cherry-4B3、Cherry-4B1-2、Cherry-4B2-3、Cherry-4B9、Cherry-4B10、Cherry-4B11、Cherry-4B9-10、Cherry-4B10-11、Cherry-4BNCが脂肪滴膜へ局在するかをカウントした。【０１１６】
各サンプルで１０〜２０視野鏡検し、Cherry融合タンパク質を発現しているすべての細胞について次の基準で判定した。
（１）カテゴリーＡ：Cherry融合タンパク質が脂肪滴膜のみに局在する。
（２）カテゴリーＢ：Cherry融合タンパク質が脂肪滴膜および他の部位（例えば細胞質、ＥＲなど）に局在する。
（３）カテゴリーＣ：Cherry融合タンパク質が脂肪滴膜には局在せず、他の部位に局在する。【０１１７】
共焦点顕微鏡(FV1000)による撮影は、PLAPO 100X OTIRFM 対物レンズにて、126.852μｍ×126.852μｍを一視野（1024×1024 pixel）の画像として撮影し解析した。共焦点顕微鏡(FV1000)は、４種類の励起用レーザー（405nm、488nm、543nm、633nm；各々青色蛍光用、緑色蛍光用、赤色蛍光用、赤外部蛍光用）を持ち、各レーザー光によって励起されてサンプルより発せられる各蛍光を独立に撮像する。撮像後に、コンピュータによって各蛍光画像を作成した。なお、蛍光像は適宜色を選択して着色像を描くことができる。【０１１８】
各融合タンパク質が脂肪滴に局在するか否かの判定は、すべてコンピュータの画像上で赤色蛍光像、緑色蛍光像、さらに両者のマージ（merge）像（合成像）を比較することにより行った。【０１１９】
Cherry融合タンパク質を発現させた場合は、脂肪滴内部を染色するBodipyによる円形の緑色蛍光を縁取る、リング状の赤色蛍光像が得られた場合に、脂肪滴膜にCherry融合タンパク質が局在するものと判定した。【０１２０】
ＥＧＦＰ融合タンパク質を発現させた場合は、ＥＧＦＰの緑色蛍光とBodipyの緑色蛍光が区別できないため、脂肪滴膜を抗ＡＤＲＰ抗体およびローダミン（赤色蛍光）ラベル二次抗体で染色した後、蛍光の撮像を行った。この場合には、ＥＧＦＰ由来の緑色蛍光像として示されるリング状構造と、抗ＡＤＲＰ抗体で染色される脂肪滴膜のリング状の赤色蛍光像とが一致した場合に、ＥＧＦＰ融合タンパク質が脂肪滴膜に局在するものと判定した。【０１２１】
＜結果＞
１．４ＢＮの細胞内局在
Cherry-4BNをOc細胞にトランスフェクションし、２４時間後に共焦点顕微鏡観察を行った。図６に、観察された典型的細胞像を、Cherry-4BNを赤、Bodipy493/503を緑、コンピュータ上で赤と緑を重ね合わせた像（merge像）に核染色（青）を加えて示した。Cherry-4BNは緑で描出される脂肪滴の周囲に集積する明るい赤色の輪として描出される（つまり、脂肪滴膜に結合している）他、細胞質、細胞質の網状構造（ＥＲと推定される）、核に分布する。なお、４８時間後の観察でもほぼ同様の結果が得られたが、トランスフェクションのダメージと思われる細胞の変性が著しかった。以下２４時間後の観察のみ示す。また、EGFP-4BNでもほぼ同様の結果を得た（データ省略）。【０１２２】
データには示さないが、Cherryタンパク質単体では細胞全体（核に若干強い）に分布し、EGFPタンパク質単体も細胞全体に分布する。従って、図６の観察結果から、蛍光タンパク質に４ＢＮを融合させることによって、脂肪滴膜およびＥＲへ局在する性質が新たに生じたことがわかり、４ＢＮは脂肪滴膜およびＥＲに親和性を持つものと推定された。【０１２３】
２．４ＢＣの細胞内局在
Cherry-4BCをOc細胞にトランスフェクションし、２４時間後に共焦点顕微鏡観察を行った。図７に、観察された典型的細胞像を、Cherry-4BCを赤、Bodipy493/503を緑、コンピュータ上で赤と緑を重ね合わせた像（merge像）に核染色（青）を加えて示した。Cherry-4BCはCherry-4BNと同様に脂肪滴周囲に集積する他、細胞質、細胞質の網状構造（ＥＲと推定される）に分布した。EGFP-4BCでもほぼ同様の結果を得た（データ省略）。上記４ＢＮと同様に、４ＢＣは脂肪滴膜およびＥＲに親和性を持つものと推定される。【０１２４】
３．４ＢＴＭの細胞内局在
Cherry-4BTMをOc細胞にトランスフェクションし、２４時間後に共焦点顕微鏡観察を行った。図８に、観察された典型的細胞像を、Cherry-4BTMを赤、Bodipy493/503を緑、コンピュータ上で赤と緑を重ね合わせた像（merge像）に核染色（青）を加えて示した。Cherry-4BTMは細胞質内で輪状の構造を示すが、この可視化された輪状構造は緑で示す脂肪滴とは全く無関係であった。EGFP-4BTMでもほぼ同様の結果が得られた（データ省略）。４ＢＴＭの局在部位は正確には同定できないが、おそらく４ＢＴＭによって形態変化を受けたＥＲではないかと推定される。【０１２５】
４．４Ｂ２−３の細胞内局在
EGFP-4B2-3をOc細胞にトランスフェクションし、２４時間後に共焦点顕微鏡観察を行った。色の関係上Bodipy493/503が使えないため、脂肪滴膜局在タンパク質のＡＤＲＰに対する抗体を用いて脂肪滴の染色を行った。観察の結果、細胞内において、EGFP-4B2-3は、脂肪滴周囲への集積が認められたが、細胞質やＥＲと推定される網目状構造にも分布した。【０１２６】
５．４Ｂ３の細胞内局在
EGFP-4B3をOc細胞にトランスフェクションし、２４時間後に共焦点顕微鏡観察を行った。色の関係上Bodipy493/503が使えないため、脂肪滴膜局在タンパク質のＡＤＲＰに対する抗体を用いて脂肪滴の染色を行った。観察の結果、細胞内において、EGFP-4B3は、脂肪滴周囲への集積が認められたが、細胞質やＥＲと推定される網目状構造にも分布した。【０１２７】
６．４Ｂ１０−１１の細胞内局在
EGFP-4B10-11をOc細胞にトランスフェクションし、２４時間後に共焦点顕微鏡観察を行った。色の関係上Bodipy493/503が使えないため、脂肪滴膜局在タンパク質のＡＤＲＰに対する抗体を用いて脂肪滴の染色を行った。観察の結果、細胞内において、EGFP-4B10-11は、脂肪滴周囲への集積が認められたが、細胞質やＥＲと推定される網目状構造にも分布した。【０１２８】
７．４ＢＮＣの細胞内局在
Cherry-4BNCをOc細胞にトランスフェクションし、２４時間後に共焦点顕微鏡観察を行った。図９に、観察された典型的細胞像を、Cherry-4BNCを赤、Bodipy493/503を緑、コンピュータ上で赤と緑を重ね合わせた像（merge像）に核染色（青）を加えて示した。Cherry-4BNCは輪状に描出され、かつその位置は緑で示される脂肪滴と完全に一致していた。細胞内の他の部位にはほとんどCherry-4BNCの分布は見られなかった。Cherry-4BNCは脂肪滴の周囲に限局して分布し、すなわち脂肪滴膜に高度に特異的に結合することがわかった。【０１２９】
EGFP-4BNCをOc細胞にトランスフェクションし、２４時間後に共焦点顕微鏡観察を行った。色の関係上Bodipy493/503が使えないため、脂肪滴膜局在タンパク質のＡＤＲＰに対する抗体を用いて脂肪滴の染色を行った。図１０に、観察された典型的細胞像を、EGFP-4BNCを緑、ADRPをマゼンタ色で示した。 EGFP-4BNCとADRPの分布はほぼ完全に一致し、脂肪滴膜へのEGFP-4BNCの結合を示すとともに、EGFP-4BNCの方がADFP抗体より精彩に脂肪滴膜を描出することがわかった。【０１３０】
脂肪滴の乏しい他の細胞の例として、ヒト腎由来のHEK293細胞に脂肪酸（stearic acid 50μＭ）を添加して脂肪滴を誘導し、Cherry-4BNCを用いて上記同様の観察を行った。図１１に、観察された典型的細胞像を、Cherry-4BNCを赤、Bodipy493/503を緑、コンピュータ上で赤と緑を重ね合わせた像（merge像）に核染色（青）を加えて示した。この観察結果から異なる細胞種においても高い特異性をもってCherry-4BNCが脂肪滴膜に結合することがわかった。【０１３１】
図９、１０、及び１１に示す結果から、４ＢＮＣは脂肪滴膜のみに特異的に結合することが示された。【０１３２】
８．ＮＳ４Ｂ−Ｃｈｅｒｒｙ融合タンパク質の脂肪滴局在についての定量的解析
細胞数あたりどれぐらいの頻度でCherry-4Bfull、Cherry-4BN、Cherry-4BTM、Cherry-4BC、Cherry-4B1、Cherry-4B2、Cherry-4B3、Cherry-4B1-2、Cherry-4B2-3、Cherry-4B9、Cherry-4B10、Cherry-4B11、Cherry-4B9-10、Cherry-4B10-11、Cherry-4BNCが脂肪滴膜へ局在するかをカウントした結果は、以下の通りである。なお、各コンストラクトの構造は図１２に示す。【０１３３】
（１）Cherry-4Bfull
カテゴリーＡ：  ０（細胞数）      ０（％）
カテゴリーＢ：１２              ２０
カテゴリーＣ：４７              ８０【０１３４】
（２）Cherry-4BN
カテゴリーＡ：１７（細胞数）  ２５（％）
カテゴリーＢ：５０            ７５
カテゴリーＣ：  ０              ０【０１３５】
（３）Cherry-4BC
カテゴリーＡ：  ０（細胞数）    ０（％）
カテゴリーＢ：３０            ４１
カテゴリーＣ：４４            ５９【０１３６】
（４）Cherry-4BTM
カテゴリーＡ：  ０（細胞数）      ０（％）
カテゴリーＢ：  ０                ０
カテゴリーＣ：４８            １００【０１３７】
（５）Cherry-4B1
カテゴリーＡ：  ０（細胞数）      ０（％）
カテゴリーＢ：  ０                ０
カテゴリーＣ：６２            １００【０１３８】
（６）Cherry-4B2
カテゴリーＡ：  ０（細胞数）      ０（％）
カテゴリーＢ：  ０                ０
カテゴリーＣ：６２            １００【０１３９】
（７）Cherry-4B3
カテゴリーＡ：  ０（細胞数）      ０（％）
カテゴリーＢ：  ５                ６
カテゴリーＣ：７３              ９４【０１４０】
（８）Cherry-4B9
カテゴリーＡ：  ０（細胞数）      ０（％）
カテゴリーＢ：  １                ２
カテゴリーＣ：５１              ９８【０１４１】
（９）Cherry-4B10
カテゴリーＡ：  ０（細胞数）      ０（％）
カテゴリーＢ：  ０                ０
カテゴリーＣ：６０            １００【０１４２】
（１０）Cherry-4B11
カテゴリーＡ：  ０（細胞数）      ０（％）
カテゴリーＢ：  １                ２
カテゴリーＣ：５２              ９８【０１４３】
（１１）Cherry-4B1-2
カテゴリーＡ：  ０（細胞数）      ０（％）
カテゴリーＢ：  ０                ０
カテゴリーＣ：４３            １００【０１４４】
（１２）Cherry-4B2-3
カテゴリーＡ：  ０（細胞数）      ０（％）
カテゴリーＢ：３８              ６１
カテゴリーＣ：２４              ３９【０１４５】
（１３）Cherry-4B9-10
カテゴリーＡ：  ０（細胞数）      ０（％）
カテゴリーＢ：  ０                ０
カテゴリーＣ：６２            １００【０１４６】
（１４）Cherry-4B10-11
カテゴリーＡ：  ０（細胞数）      ０（％）
カテゴリーＢ：  ４                ６
カテゴリーＣ：６６              ９４【０１４７】
（１５）Cherry-4BNC
カテゴリーＡ：６２（細胞数）  ９５（％）
カテゴリーＢ：  ３              ５
カテゴリーＣ：  ０              ０【０１４８】
上記の結果によれば、４ＢＮＣは、９５％（６５細胞のうち６２細胞）という高い確率で脂肪滴膜のみに特異的に結合することが示された。一方、Cherry-4BNについては、脂肪滴膜に局在性を示すものの、その他の部位にも局在性を示した細胞の方が多かった（７５％）。さらに、Cherry-4BCに関しては、脂肪滴にのみ局在性を示した細胞の数は０であり、脂肪滴膜には局在せずに他の部位への局在が認められた細胞（カテゴリーＣ）が過半数を超えた（５９％）。これらの結果からも、４ＢＮＣは脂肪滴膜のみに特異的に結合することが実証された。【０１４９】
なお、ＮＳ４Ｂ全長をＣｈｅｒｒｙに融合させたＣｈｅｒｒｙ−４Ｂｆｕｌｌは２０％の細胞で脂肪滴への局在が観察された。図１３に、観察された典型的細胞像を、Ｃｈｅｒｒｙ−４Ｂｆｕｌｌを赤、Bodipy493/503を緑、コンピュータ上で赤と緑を重ね合わせた像（merge像）に核染色（青）を加えて示した。【０１５０】
Cherry-4Bfull、Cherry-4BN、Cherry-4BTM、Cherry-4BC、Cherry-4B1、Cherry-4B2、Cherry-4B3、Cherry-4B1-2、Cherry-4B2-3、Cherry-4B9、Cherry-4B10、Cherry-4B11、Cherry-4B9-10、Cherry-4B10-11についての上記定量的解析の結果を図１４に要約した。【０１５１】
＜ＮＳ４Ｂにおける脂肪滴との相互作用に重要なアミノ酸残基の同定＞
上記の結果から、ＮＳ４Ｂにおいて脂肪滴局在のために重要なアミノ酸配列は、Ｎ末端領域では4B3部位（より強い局在を示すのは4B2-3部位）に存在し、Ｃ末端領域では4B10-11部位に存在することが推定できる（図１４参照）。【０１５２】
最近の報告において、タンパク質が脂肪滴に局在するときに、amphipathic α-helix（αへリックスを軸方向から見たときに、一方の側に疎水性アミノ酸残基が、他方の側に親水性アミノ酸残基が偏って存在する構造）が重要な働きをすることが示唆されている（Boulant et al, J. Biol. Chem. 281, 22236-22247, 2006; Shavinskaya et al, J. Biol. Chem. 282, 37158-37169, 2007）。【０１５３】
ＮＳ４Ｂにおいて脂肪滴局在のために重要なアミノ酸配列が存在するものと推定される上記部位、すなわち4B2-3および4B10-11部位にもそれぞれ一つずつのamphipathic α-helixが存在することが知られている（Elazar et al, J. Virol. 78, 11393-11400, 2004; Gouttenoire et al, J. Virol. 83, 11378-11384, 2009）。当該部位をＮＳ４Ｂ全体と対比させて図１５に示す。【０１５４】
そこで、上記の二つのamphipathic α-helixにおいて脂肪滴膜と相互作用する可能性のある疎水性残基を、長軸方向から見たアミノ酸配置図（図１６）を参考にして選び出し、アラニンに置換する変異体を作製した。対象として選んだアミノ酸残基は43W, 46L, 50W, 57F, 61I, 64L, 242I, 246L, 249L, 253I，計１０残基であった。【０１５５】
ちなみにαへリックスにおいては、アミノ酸が１残基進むとちょうど１００度長軸方向から見た角度がずれる。つまりアミノ酸3.6残基ごとに長軸方向からみて同じ位置に残基が出現する。従っておおむね３〜４残基ごとのアミノ酸が同じ側に存在する。【０１５６】
実施したアラニン置換は4B2-3領域ではW43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64Aの全部または前半ないし後半の３残基ずつであり、4B10-11領域ではI242A, L246A, L249A, I253Aの全部である。【０１５７】
これら変異をCherry-4BN、Cherry-4BCまたはCherry-4BNCに導入して脂肪滴への局在を共焦点顕微鏡によって解析した。
細胞数あたりどれぐらいの頻度で各変異体が脂肪滴膜へ局在するかをカウントした結果を以下に示す（図１７及び１８を参照）。【０１５８】
（１）Cherry-4BN変異１（Cherry-4BNにW43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64Aの変異を入れたもの）
カテゴリーＡ：  ０（細胞数）      ０（％）
カテゴリーＢ：  ０                ０
カテゴリーＣ：５８            １００【０１５９】
（３）Cherry-4BN変異２(Cherry-4BNにW43A, L46A, W50Aの変異を入れたもの)
カテゴリーＡ：  ０（細胞数）      ０（％）
カテゴリーＢ：１８              ３５
カテゴリーＣ：３３              ６５【０１６０】
（４）Cherry-4BN変異３(Cherry-4BNにF57A, I61A, L64Aの変異を入れたもの)
カテゴリーＡ：  ３（細胞数）      ５（％）
カテゴリーＢ：５５              ９５
カテゴリーＣ：  ０                ０【０１６１】
（５）Cherry-4BC変異１(Cherry-4BCにI242A, L246A, L249A, I253Aの変異を入れたもの)
カテゴリーＡ：  ０（細胞数）      ０（％）
カテゴリーＢ：  ０                ０
カテゴリーＣ：６５            １００【０１６２】
（６）Cherry-4BNC変異１(Cherry-4BNCにW43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64Aの変異を入れたもの)
カテゴリーＡ：  ９（細胞数）    １７（％）
カテゴリーＢ：４１              ７７
カテゴリーＣ：  ３                ６【０１６３】
（７）Cherry-4BNC変異２(Cherry-4BNCにW43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A, I242A, L246A, L249A, I253Aの変異を入れたもの)
カテゴリーＡ：  ０（細胞数）      ０（％）
カテゴリーＢ：  ５                ８
カテゴリーＣ：５４              ９２【０１６４】
（８）Cherry-4BNC変異３(Cherry-4BNCにW43A, L46A, W50A, I242A, L246A, L249A, I253Aの変異を入れたもの)
カテゴリーＡ：１５（細胞数）    ２０．３（％）
カテゴリーＢ：５５              ７４．３
カテゴリーＣ：  ４                ５．４【０１６５】
Cherry-4BNにW43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64Aの変異を入れたCherry-4BN変異１では脂肪滴への局在は全く見られなくなった。次に、この前半３残基のみの変異体つまりCherry-4BN変異２(Cherry-4BNにW43A, L46A, W50Aの変異を入れたもの)では、脂肪滴への局在は若干見られるもののCherry-4BNよりは大幅に減少していた。一方、後半３残基のみの変異体、つまりCherry-4BN変異３(Cherry-4BNにF57A, I61A, L64Aの変異を入れたもの)では、Cherry-4BNよりも若干脂肪滴への局在が弱まる程度であった。【０１６６】
Cherry-4BCはCherry-4BNより弱いが脂肪滴への局在を示す。 Cherry-4BCにI242A, L246A, L249A, I253Aの変異を入れたCherry-4BC変異１は、脂肪滴への局在を全く示さなかった。【０１６７】
本発明によるCherry-4BNCは特異的な脂肪滴への局在を示す。Cherry-4BNCにW43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64Aの変異を入れたCherry-4BNC変異１は相対的に強い脂肪滴への局在を示した。これらの変異をCherry-4BNに入れた場合（すなわちCherry4BN変異１）は大幅に局在が弱まるのに対し、Cherry-4BNCにこれらの変異を入れた場合の影響は少なかった。つまりＣ末端領域（4B10-11）がかなり強い作用を持つことが推測された。そこで上記の変異に加え、Ｃ末端領域の４残基にも変異を入れたCherry-4BNC変異２(Cherry-4BNCにW43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A, I242A, L246A, L249A, I253Aの変異を入れたもの)を作製して解析したところ、ほぼ完全に脂肪滴への局在が無くなった。念のため、Ｎ末端領域の前半３残基とＣ末端領域の４残基に変異を入れたCherry-4BNC変異３(Cherry-4BNCにW43A, L46A, W50A, I242A, L246A, L249A, I253Aの変異を入れたもの)についても観察を行ったが、脂肪滴への局在は相対的に強かった（つまり変異によって脂肪滴への局在が完全には阻害されなかった）。【０１６８】
以上の結果から、αへリックスの一方の側に連続して出現してくる３ないし４つの疎水性アミノ酸を一つのクラスターとすると、43W, 46L, 50Wから成るクラスターが単独では最も強い脂肪滴局在能を持つと考えられる。【０１６９】
単独では57F, 61A, 64Lのクラスターと242I, 246L, 249L, 253Iのクラスターは脂肪滴への局在能は強くないと考えられる。しかしながら、Cherry-4BNCにおいては、３つのクラスターを全て変異させないと脂肪滴への局在能は無くならないことから、単独では作用の強くないこれらのクラスター（57F, 61A, 64Lおよび242I, 246L, 249L, 253I）が、43W, 46L, 50Wから成るクラスターと協調的に作用することによって、全体としてはきわめて強い脂肪滴への局在を示すものと考えられる。【０１７０】
なお、Cherry-4BNCにおいて上記３つのクラスターを変異させても、ごくわずか脂肪滴への局在活性が残っており、未同定の残基による弱い相互作用も推定される。【０１７１】
上記の通り同定したアミノ酸残基（43W, 46L, 50W, 57F, 61A, 64L, 242I, 246L, 249L, 253I）は、ＨＣＶの各サブタイプ間で高度に保存されている（図１９参照）。一部のサブタイプにおいて置換が見られるが、出現するアミノ酸残基は性質の類似した疎水性アミノ酸に限られている。従って、これらの残基によって仲介されるNS4Bと脂肪滴との相互作用（NS4Bの脂肪滴膜への局在）は、ＨＣＶが増殖する過程において極めて重要な役割を負っていることが推定される。このことは、逆にこれらのアミノ酸残基をターゲットにして脂肪滴への局在を阻害する方法を講じてやれば、ＨＣＶの増殖を抑制できることを示唆する。【０１７２】
上記各変異体の作製方法については、以下に記載の通りである。【０１７３】
＜変異体作製方法＞
アラニン残基のコドンには、すべて真核細胞でのコドン使用率の最も高いGCCを用いた。所定の位置にヌクレオチドの変異を含ませたプライマーを用いて適切なＰＣＲ断片を作製し、既述のように重複部分を利用して断片同志をさらにＰＣＲで連結し、目的のＤＮＡ断片を作製した。以降は既述の方法に準じ制限酵素消化などの処理の後pmCherry-C1ベクターに断片を挿入し、完成コンストラクトを得た。全てのコンストラクトについて、プラスミドを精製し、ＤＮＡシークエンシングを行って所定の変異が成功していることを確認した。【０１７４】
以下各コンストラクトの断片の作製方法を述べる。プライマー配列の下線部はアラニン置換変異に該当する部位を表す。【０１７５】
1. Cherry-4BN変異１（W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A）
・断片Ａ（アミノ酸１−４８）作製ＰＣＲ
Ｕ側：４ＢＮ用Ｕ側プライマー
Ｒ側：5'-GGCCTCGGCGGCTTGGGCCTTGGACTCCACCACGGG-3'（配列番号４４）
Cherry-4B1-2プラスミド１ngを鋳型とし、９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃３０秒｝の反応を２８サイクル繰り返した。反応後、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。【０１７６】
・断片Ｂ（アミノ酸４３−６４）作製ＰＣＲ
Ｕ側：5'-GCCCAAGCCGCCGAGGCCTTTGCCGCGAAGCACATGTGGAAT-3'（配列番号４５）
Ｒ側：5'-GGCGTACTGGGCCCCGCTGATGGCATTCCACATGTGCTTCGCG-3'（配列番号４６）
両者のプライマーが一部相補的配列を持つように設計してあり、鋳型を加えずに９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５０℃２０秒、７２℃３０秒｝の反応を１０サイクル繰り返し、プライマーダイマーを形成させた。【０１７７】
・断片Ａ、Ｂ連結及び増幅
断片Ａ（10 μＬ），断片Ｂ（4 μＬ）、ＰＳバッファー１０μＬ，dNTP(各2.5 mM)，ＰＳ 0.5 μＬ，超純水で５０μＬとした反応液で９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５０℃２０秒、７２℃３０秒｝のＰＣＲ反応を１０サイクル繰り返して断片Ａ，Ｂを連結した。【０１７８】
連結反応後、反応液に次のプライマー（0.1 mM）を0.4 μＬ ずつ加え、断片にさらに配列を付加しつつ増幅した。
Ｕ側：４ＢＮ用Ｕ側プライマー
Ｒ側：5'-TTTGAATTCTTAGTTCCCAGGCAGAGTGGACAAGCCTGCGGCGTACTGGGCCCCGCT-3'（配列番号４７）【０１７９】
９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃３０秒｝のＰＣＲ反応を２０サイクル繰り返した。反応後、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。【０１８０】
2. Cherry-4BN変異２（W43A, L46A, W50A,）
・断片Ｃ（アミノ酸１−５０）作製ＰＣＲ
Ｕ側：４ＢＮ用Ｕ側プライマー
Ｒ側：5'-GGCAAAGGCCTCGGCGGCTTGGGCCTTGGACTCCACCACGGG-3'（配列番号４８）
pcDNA4BFLAGプラスミド1ngを鋳型とし、９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃４５秒｝のＰＣＲ反応を３０サイクル繰り返した。反応後、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。上記pcDNA4BFLAGプラスミドは、pcDNA3.1(+)ベクター（Invitrogen社）に、ＮＳ４Ｂ全長配列とそのＣ末端部位にアミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（ＦＬＡＧタグ）を付加した配列を挿入してあるプラスミドである。【０１８１】
・断片Ｄ（アミノ酸４３−７３）作製ＰＣＲ
Ｕ側：断片Ｂ用Ｕ側プライマー
Ｒ側：４ＢＮ用Ｒ側プライマー
pcDNA4BFLAGプラスミド1ngを鋳型とし、９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃４５秒｝のＰＣＲ反応を３０サイクル繰り返した。【０１８２】
・断片Ｃ，Ｄ連結及び増幅
断片Ｃ（10 μＬ）、断片Ｄ（5μＬ）、ＰＳバッファー１０μＬ，dNTP(各2.5 mM)，ＰＳ 0.5 μＬ，超純水で５０μＬとした反応液で９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃２０秒、７２℃６０秒｝のＰＣＲ反応を１０サイクル繰り返して断片Ｃ，Ｄを連結した。【０１８３】
連結反応後、反応液に次のプライマー（0.1 mM）を0.4 μＬ ずつ加え、ＰＣＲで増幅した。
Ｕ側：４ＢＮ用Ｕ側プライマー
Ｒ側：４ＢＮ用Ｒ側プライマー
９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃６０秒｝のＰＣＲ反応を１０サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。【０１８４】
3. Cherry-4BN変異３(F57A, I61A, L64A)
・断片Ｅ（アミノ酸１−６４）作製ＰＣＲ
Ｕ側：４ＢＮ用Ｕ側プライマー
Ｒ側：5'-GGCGTACTGGGCCCCGCTGATGGCATTCCACATGTGCTTCGC-3'（配列番号４９）【０１８５】
pcDNA4BFLAGプラスミド1ngを鋳型とし、９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃４５秒｝のＰＣＲ反応を３０サイクル繰り返した。反応後、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。【０１８６】
・断片Ｆ（アミノ酸５７−７３）作製ＰＣＲ
Ｕ側：5'-GCCATCAGCGGGGCCCAGTACGCCGCAGGCTTGTCCACTCTG-3'（配列番号５０）
Ｒ側：４ＢＮ用Ｒ側プライマー
pcDNA4BFLAGプラスミド1ngを鋳型とし、９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃４５秒｝のＰＣＲ反応を３０サイクル繰り返した。【０１８７】
・断片Ｅ，Ｆ連結及び増幅
断片Ｅ（5 μＬ），断片Ｆ（5 μＬ）、ＰＳバッファー１０μＬ，dNTP(各2.5 mM)，ＰＳ 0.5 μＬ，超純水で５０μｌとした反応液で９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃２０秒、７２℃６０秒｝のＰＣＲ反応を１０サイクル繰り返して断片Ｅ，Ｆを連結した。連結反応後、反応液に次のプライマー（0.1 mM）を0.4 μＬ ずつ加え、ＰＣＲで増幅した。【０１８８】
Ｕ側：４ＢＮ用Ｕ側プライマー
Ｒ側：４ＢＮ用Ｒ側プライマー
９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃６０秒｝のＰＣＲ反応を１０サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。【０１８９】
4. Cherry-4BC変異１（I242A, L246A, L249A, I253A）
・断片Ｇ（アミノ酸１９２−２６１）作製ＰＣＲ
Ｕ側：４ＢＣ用Ｕ側プライマー
Ｒ側：5'-TTTGAATTCTTAGCATGGCGTGGAGCAGTCCTCATTGGCCCACTGGTGGGCTCT
CTTGGCCAGCTGGGTGGCGGTAAGGCTGGAGAGGAT-3'（配列番号５１）【０１９０】
Cherry-4Bfullプラスミド10 ngを鋳型とし、９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃２０秒、７２℃６０秒｝のＰＣＲ反応を２７サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
【０１９１】
5. Cherry-4BNC変異１（W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A）
・断片Ｈ（アミノ酸１−７３）作製ＰＣＲ
Ｕ側：４ＢＮＵ側プライマー
Ｒ側：5'-GTTCCCAGGCAGAGTGGACAA-3'（配列番号５２）【０１９２】
Cherry-4BN変異１プラスミド10 ngを鋳型として、９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃３０秒｝のＰＣＲ反応を２５サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。【０１９３】
・断片Ｉ（アミノ酸６５−７３および１９２−２１７）作製ＰＣＲ
Ｕ側：5'-GCAGGCTTGTCCACTCTGC-3'（配列番号５３）
Ｒ側：４ＢＣ用Ｒ側プライマー
Cherry-4BNCプラスミド10 ngを鋳型として、９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃６０秒｝のＰＣＲ反応を２５サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。【０１９４】
・断片Ｈ，Ｉの連結及び増幅
断片Ｈ（200 ng），断片Ｉ（200 ng）、ＰＳバッファー１０μＬ，dNTP(各2.5 mM)，ＰＳ 0.5μＬ，超純水で５０μＬとした反応液で９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃２０秒、７２℃６０秒｝のＰＣＲ反応を１０サイクル繰り返して断片Ｈ，Ｉを連結した。連結反応後、反応液に次のプライマー（0.1 mM）を0.4 μＬ ずつ加え、ＰＣＲで増幅した。【０１９５】
Ｕ側：４ＢＮ用Ｕ側プライマー
Ｒ側：４ＢＣ用Ｒ側プライマー
９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃６０秒｝のＰＣＲ反応を８サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。【０１９６】
6. Cherry-4BNC変異２（W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A, I242A, L246A, L249A, I253A）
・断片Ｊ（アミノ酸１−７３及び１９２−２６１）作製ＰＣＲ
Ｕ側プライマー：４ＢＮ用Ｕ側プライマー
Ｒ側プライマー：断片Ｇ用Ｒ側プライマー
Cherry-4BNC変異１プラスミド10 ngを鋳型として、９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃２０秒、７２℃６０秒｝のＰＣＲ反応を２７サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。【０１９７】
7. Cherry-4BNC変異３（W43A, L46A, W50A, I242A, L246A, L249A, I253A）
・断片Ｋ（アミノ酸１−７３）作製ＰＣＲ
Ｕ側：４ＢＮ用Ｕ側プライマー
Ｒ側：断片Ｈ用Ｒ側プライマー
Cherry-4BN変異２プラスミド10 ngを鋳型として、９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃３０秒｝のＰＣＲ反応を２８サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。【０１９８】
・断片Ｌ（アミノ酸６５−７３および１９２−２１７）作製ＰＣＲ
Ｕ側：断片Ｉ用Ｕ側プライマー
Ｒ側：断片Ｇ用Ｒ側プライマー
Cherry-4BNC変異２プラスミド10 ngを鋳型として、９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃３０秒｝のＰＣＲ反応を２８サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。【０１９９】
・断片Ｋ，Ｌの連結及び増幅
断片Ｋ（200 ng），断片Ｌ（200 ng）、ＰＳバッファー１０μＬ，dNTP(各2.5 mM)，ＰＳ 0.5 μＬ，超純水で５０μｌとした反応液で９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃２０秒、７２℃３０秒｝のＰＣＲ反応を１０サイクル繰り返して断片Ｋ，Ｌを連結した。連結反応後、反応液に次のプライマー（0.1 mM）を0.4 μＬ ずつ加え、ＰＣＲで増幅した。【０２００】
Ｕ側：４ＢＮ用Ｕ側プライマー
Ｒ側：断片Ｇ用Ｒ側プライマー
９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃３０秒｝のＰＣＲ反応を８サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
【図１】
2012060120.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
2012060120000001.app
【国際調査報告】
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2012060120.tif 000022
2012060120.tif 000023
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