(57)【要約】  サーファクチンまたはその塩の製造方法は、  式（１）： 2012043800.tif 000008 （式中、＊は光学活性点を表す。Ｘは、ロイシン、イソロイシン、バリン、から選ばれるアミノ酸を表し、Ｒは、炭素数９〜１３のアルキル基、及び分岐アルキル基を表す。Ｍは、アルカリ金属、アルカリ土類金属、置換されていても良いアミンなどを表す。）で表されるサーファクチンもしくはその塩を含む培養液、または培養液から不溶分を除いた溶液に、分岐アルキルアルコールを含む有機溶媒を加えて、サーファクチンまたはその塩を抽出する工程を含む。
2012043800.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）：
【化１】
2012043800.tif 000007
（式中、＊は光学活性点を表す。Ｘは、ロイシン、イソロイシン、バリン、から選ばれるアミノ酸を表し、Ｒは、炭素数９〜１３のアルキル基、及び分岐アルキル基を表す。Ｍは、アルカリ金属、アルカリ土類金属、置換されていても良いアミンなどを表す。）で表されるサーファクチンもしくはその塩を含む培養液、または培養液から不溶分を除いた溶液に、分岐アルキルアルコールを含む有機溶媒を加えて、サーファクチンまたはその塩を抽出する工程を含むことを特徴とするサーファクチンまたはその塩の製造方法。
【請求項２】
抽出時の水層のｐＨが酸性であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抽出時の水層のｐＨが１〜５であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
分岐アルキルアルコールの炭素数が３〜１０である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
有機溶媒中の分岐アルキルアルコール含量が３０ｗｔ％以上である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
有機溶媒が補助溶媒を含み、分岐アルキルアルコールと補助溶媒の合計量が培養液１重量部に対して、０．６〜１．５重量部である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ａ）前記サーファクチンを含む抽出液と、塩基水溶液とを混合した後、有機層を分離してサーファクチン塩を含む水溶液を得る工程と、
ｂ）上記サーファクチン塩を含む水溶液と無機酸とを混合して、当該混合液からサーファクチンを固体として析出させる工程
とを含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記サーファクチンを含む抽出液と、塩基を混合して、当該混合液からサーファクチン塩を固体として得る工程を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかで得られたサーファクチンと、塩基を混合して、サーファクチン塩またはその溶液を得ることを特徴とするサーファクチン塩の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、界面活性能を有するサーファクチン又はその塩の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サーファクチンは、高い界面活性能の他、抗菌活性、溶血性、蛋白変性阻害など多彩な機能を有することが報告されている。このように機能性素材として有用なサーファクチンは、バチルス（Bacillus）属微生物によって産生されることが知られており、工業的なサーファクチンの量産は、該バチルス属微生物を培養することで可能である（特許文献１など）。このサーファクチンを含む培養液からサーファクチン及びその塩を製造する方法としては、例えば、
１）培養液を酸性化し、塩化メチレンとメタノールを（塩化メチレン：メタノール）＝２：１（体積比）となるように加えてサーファクチンを有機層に抽出し、濃縮した後薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で精製する方法（特許文献２）
２）培養液（ｐＨ６）にオクタンを加えた後、有機層を濃縮して限外ろ過により精製する方法（非特許文献１）
３）培養液から菌体などの不溶分を遠心分離などで分離した後にろ液を酸性化して沈殿物を取得し、これに塩化メチレンを加えてサーファクチンを固液抽出した後、有機層を濃縮する。次いでアルカリ水を加えてから有機層を廃棄し、水層を酸性化して得た沈殿物を凍結乾燥する方法（特許文献３）
が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００２−１７６９９３号公報
【特許文献２】韓国公開特許第２００５−０００７６７０号公報
【特許文献３】中国特許出願公開第１０１０４１８４６号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２００８、４２、２４８―２５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、これらの培養液からの製造方法は以下の理由から工業的実施に適しているとは言い難い。例えば、１）の方法は、培養液から直接サーファクチンを抽出できるものの、抽出溶剤として環境負荷の高い塩化メチレンを使用しているだけでなく、薄層クロマトグラフィーにて精製していることから、操作面でも工業的実施に適しているとは言えない。２）は、サーファクチン１重量部に対して溶剤が２５００重量部（サーファクチン１ｋｇ生産では溶媒が２．５トン）必要であって、環境やコストの面で工業的実施に適しているとは言えない。３）は、菌体分離の後にろ液を酸性化して沈殿物を採取し、沈殿物から塩化メチレンにて抽出するなど、操作が煩雑な上に、環境負荷の大きい溶媒を使用しているため工業的実施に適しているとは言えない。【０００６】
本願は、上記に鑑み、煩雑な操作を必要とせず、且つ、経済的に有利な、工業的実施に適したサーファクチン及びその塩の製造方法を提供することを課題とする。例えば、不溶物（菌体）の分離を必要としない、培養液からの直接のサーファクチン抽出方法の提供を課題とする。
本願は、前記課題に加えて、或いは前記課題に代えて、低環境負荷型の溶剤を用いても、培養液から効率よくサーファクチンを抽出可能なサーファクチン及びその塩の製造方法の提供も課題とする。    
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは工業的実施に適したサーファクチン及びその塩の製造方法について鋭意検討した結果、抽出溶剤として分岐アルキルアルコールを使用する事で、培養液から不溶物を除かずとも、容易にサーファクチンを抽出、精製できることを見出した。【０００８】
即ち、本発明は、サーファクチンもしくはその塩を含む培養液、または培養液から不溶分を除いた溶液に、分岐アルキルアルコールを含む有機溶媒を加えて、サーファクチンまたはその塩を抽出することを特徴とするサーファクチンまたはその塩の製造方法である。なお前記サーファクチンまたはその塩は、下記式で表される。  
【化１】
2012043800.tif 000003
（式中、＊は光学活性点を表す。Ｘは、ロイシン、イソロイシン、バリン、から選ばれるアミノ酸を表し、Ｒは、炭素数９〜１３のアルキル基、及び分岐アルキル基を表す。Ｍは、アルカリ金属、アルカリ土類金属、置換されていても良いアミンなどを表す。）
抽出時の水層のｐＨは酸性（特に１〜５）であるのが望ましく、分岐アルコールは、例えば、炭素数が３〜１０であり、有機溶媒中の含量が３０ｗｔ％以上であるのが好ましい。前記有機溶媒は、補助溶媒を含んでいてもよく、分岐アルキルアルコールと補助溶媒の合計量が培養液１重量部に対して、０．６〜１．５重量部であることが推奨される。
抽出後の液は、塩基水溶液と混合した後、有機層を分離して水溶液を得て、次いでこの水溶液と無機酸とを混合することで、この混合液からサーファクチンを固体として析出させることができる。また抽出後の液に塩基を混合し、この混合液からサーファクチン塩を固体として得ることもできる。以上の製造方法によって得られたサーファクチンと、塩基を混合して、サーファクチン塩またはその溶液を得ることもできる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明にかかる方法によれば、煩雑な操作が不要であって、効率的かつ経済的に有利にサーファクチン及びその塩を精製できる。また、抽出に用いる分岐アルキルアルコールは、環境への負荷も小さい。従って、本発明にかかる方法は、工業的生産に好適に使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本願発明について、以下に詳述する。
【００１１】
本願発明においては、分岐アルキルアルコールを用いて培養液からサーファクチンまたはその塩を抽出する。
【００１２】
培養液から抽出されるサーファクチンまたはその塩は、下記式（１）：
【００１３】
【化２】
2012043800.tif 000004
【００１４】
（以下、化合物（１）とする）で表される。なお式中の略語の意味は、以下の通りである。
Ｌ−Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン
Ｄ−Ｌｅｕ：Ｄ−ロイシン
Ｌ−Ｖａｌ：Ｌ−バリン
【００１５】
式（１）中、＊は光学活性点（Optically Active Center）を表す。
【００１６】
Ｘは、L−ロイシン、L−イソロイシン、およびL−バリンから選ばれる、いずれか１種のアミノ酸を表す。
【００１７】
Ｒは、炭素数９〜１３の直鎖アルキル基または分岐アルキル基を表す。ここで、炭素数９〜１３の直鎖アルキル基としては、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基などが例示できる。また炭素数９〜１３の分岐アルキル基としては、例えば、７−メチルオクチル基、８−メチルノニル基、９−メチルデシル基、１０−メチルウンデシル基、１１−メチルドデシル基、６−メチルオクチル基、７−メチルノニル基、８−メチルデシル基、９−メチルウンデシル基、１０−メチルドデシル基などが挙げられる。これらは、１または２以上の置換基で置換されていてもよい。置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基、フェニル基、アリール基、アルカノイル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、ニトロ基、ハロゲン原子等が挙げられる。
【００１８】
Ｍは、水素、アルカリ金属、アルカリ土類金属、置換されていても良いアミン（置換されていてもよいアンモニウムを含む）などを表す。ここで、アルカリ金属とは、特に限定されないが、リチウム、ナトリウム、カリウムなどを表す。アルカリ土類金属とは、特に限定されないが、ベリウム、マグネシウム、カルシウムなどを表す。置換されていても良いアミンは、サーファクチンと塩を形成するものであれば特に限定されず、アンモニアの他、一置換アミン（ＲＮＨ3）、二置換アミン、三置換アミンを表す。アミンの置換基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等のアルキル基、ベンジル基、メチルベンジル基、フェニルエチル基等のアラルキル基、フェニル基、トルイル基、キシリル基等のアリール基、等の有機基が挙げられる。具体的には、メチルアミン、エチルアミン、ベンジルアミン、アニリン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、ピロリジン、モルホリン、Ｎ−ベンジル−Ｎ−エチルアミン、Ｎ−エチルアニリン、トリエチルアミン、ピリジン等が挙げられる。前記アミンは、さらにプロトンが付加してアンモニウムイオンになっていてもよい。これらの有機基は、更に１または２以上の置換基で置換されていても良い。
好ましいＭは、アルカリ金属（ナトリウム、カリウムなど）、特にナトリウムである。
【００１９】
上記サーファクチンは、微生物の培養液に含まれている。この培養液は、例えば、特開２００２−１７６９９３に記載の方法にて好適に調製できる。より具体的には、前記微生物として、バチルス属微生物、好ましくはバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、より好ましくはバチルス・ズブチリスＳＤ９０１（国際寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６６６）を用いる。
【００２０】
前記微生物は、通常、栄養培地（例えば、１ｗｔ／ｖ％ポリペプトン、０．５ｗｔ／ｖ％酵母エキス、０．５ｗ／ｖ％ＮａＣｌ、残部水からなるＬ培地など）中で予備培養して菌数を増やしておき、この予備培養液を本培養液に植菌することで培養する。なお前記予備培養では、他の微生物の増殖を防止する目的で、必要に応じて抗生物質（例えば、クロラムフェニコール、テトラサイクリンなど）を適量（例えば、１〜３０ｐｐｍ（質量基準；以下、同じ））添加しておいてもよい。
【００２１】
本培養液は、通常、炭素源、窒素源、金属イオン、ｐＨ調整剤を含む。炭素源には、糖類（グルコース、マルトース、ショ糖など）、でん粉類、アルコール類、有機酸類などが含まれる。本培養液中の炭素源の量は、例えば、１〜４０質量％程度である。
【００２２】
窒素源としては、大豆粉又はその抽出物、アンモニウム塩、硝酸類、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどが含まれる。大豆粉又はその抽出物を単独で、又は他の窒素源（酵母エキスなど）と組み合わせて用いてもよい。窒素源の量は、例えば、０．１〜２０質量％程度である。大豆粉又はその抽出物と酵母エキスとを組み合わせて用いる場合、大豆粉又はその抽出物は、例えば、０．１〜２０質量％程度であり、酵母エキスは、例えば、０．００１〜１質量％程度である。
【００２３】
金属イオン（ミネラル）には、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、亜鉛イオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、銅イオン、モリブデンイオンなどが含まれる。これらは、通常、２種以上が組み合わせて使用され、金属塩（硫酸塩、塩化物塩、リン酸塩など）として添加される。金属塩の量は、例えば、１０〜１０００ｐｐｍ程度である。なお前記金属イオンにはカリウムイオン、ナトリウムイオンなどのアルカリ金属イオンも含まれるが、これらはｐＨ調整剤を使用することで多量に添加される事が多いため、金属イオンの量を規定する際には、金属イオンにはアルカリ金属イオンを含めないものとする。
【００２４】
ｐＨ調整剤としては、リン酸塩（リン酸ナトリウム、リン酸カリウムなど）などが使用される。ｐＨ調整剤の量は、例えば、０．１〜１０質量％程度である。
なお前記本培養液は、必要に応じて、アミノ酸（例えば、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−アルギニンなど）を適量（例えば、１ｗ／ｗ％以下）添加してもよく、ビタミン類を適量（例えば１００ｐｐｍ以下）添加してもよい。
【００２５】
予備培養及び本培養の温度は、例えば、２５〜４２℃である。本培養後のサーファクチンの濃度は、例えば、１〜１０質量％程度である。
【００２６】
最も好ましくは、例えば、バチルス・ズブチリスＳＤ９０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６６６）を、テトラサイクリンを１０ｐｐｍ含む栄養培地で、温度２５〜４２℃条件下、５〜２４時間程度培養する。大豆粉、或はその抽出物を窒素源として含む培地に、上記で得た培養液を０．１〜１０ｗｔ％植菌する。これを温度２５〜４２℃にて２０〜９０時間培養することによってサーファクチンを好適に得ることができる。
【００２７】
本発明では、抽出溶剤として分岐アルキルアルコールを使用しているため、培養液から不溶物を除かなくても、容易にサーファクチンを抽出できる。しかし、必要に応じて、培養液から不溶物を除いてもよい。培養で生成した不溶分は、例えば、遠心分離や加圧ろ過、フィルタープレス機などによる常套法にて除くことができる。
【００２８】
次に、抽出操作について例を挙げて説明する。なお、抽出溶剤として分岐アルキルアルコールを使用する限りは本願発明に含まれるものであって、抽出方法については、特に限定するものではない。
【００２９】
サーファクチンまたはその塩を含む培養液に、分岐アルキルアルコールを含む有機溶媒を加え、必要に応じて更に酸を加えて酸性条件とした後、所定時間攪拌する。これを静置した後、水層を廃棄する。尚、培養液、分岐アルキルアルコールを含む有機溶媒の混合順序は特に制限されず、分岐アルキルアルコールを含む有機溶媒中に培養液を加えても良い。もちろん、分岐アルキルアルコールとその他の溶媒を別々に加えることも可能である。
【００３０】
使用する分岐アルキルアルコールとしては、例えば、アルキル基部分の炭素数が３から１０、好ましくは３〜６、さらに好ましくは３〜５のものが挙げられる。分岐の基点となる炭素は、２級炭素及び３級炭素のどちらでもよいが、３級炭素が好ましい。分岐の数（２級又は３級炭素の数）は、例えば、１〜３程度、好ましくは１〜２程度、特に１である。このような分岐アルコールとしては、具体的には、例えばイソプロピルアルコール、イソブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコール、ネオペンチルアルコール、ｔ−ペンチルアルコール、イソヘキシルアルコール、５−メチルヘキシルアルコール、６−メチルヘプチルアルコール、７−メチルオクチルアルコール等が挙げられる。上記アルキル基は無置換であってもよく、また置換基を有していてもよい。置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基、フェニル基、アリール基、アルカノイル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、ニトロ基、ハロゲン原子等が挙げられる。上記のアルコール中でも、とりわけイソプロピルアルコール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコールが好ましい。このように分岐アルキルアルコールを用いることにより、サーファクチンおよびその塩の抽出が容易になる。
【００３１】
抽出溶剤として用いられる有機溶媒としては、分岐アルキルアルコールの他、補助溶媒を更に用いることも可能である。
【００３２】
補助溶媒としては、例えば、炭化水素系溶媒や、エステル系溶媒、エーテル系溶媒、ケトン系溶媒、ニトリル系溶媒などを用いることができる。炭化水素系溶媒としては、トルエン、ベンゼン、キシレン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタンなど、エステル系溶媒としては、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチルなど、エーテル系溶媒としては、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサンなど、ケトン系溶媒としては、アセトン、メチルエチルケトンなど、ニトリル系溶媒としては、アセトニトリル、プロピオニトリルなどが挙げられる。中でも好ましくは、トルエン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリルである。
【００３３】
分岐アルキルアルコールと補助溶媒との比率は分液速度に影響し、分岐アルキルアルコールの種類や、分岐アルキルアルコールと各補助溶媒との組み合わせにより比率を適宜調整する。
【００３４】
例えば分岐の基点が３級炭素であるアルコール（ｔ−ブチルアルコールなど）の場合は単独でも分液可能であり、単独で使用することが可能であるが、必要に応じて補助溶媒と組み合わせて用いても良い。一方、分岐の基点が２級炭素であるアルコール（特に、炭素数が４以下のアルコール；例えば、イソプロピルアルコールなど）のように培養液と分層しにくい溶媒を用いる場合は、補助溶媒にて有機層を希釈するのが好ましい。分岐の基点が２級炭素であるアルコールと補助溶剤（例えば、酢酸エチルなどのエステル系溶媒）を組み合わせて用いる場合、有機溶媒中の分岐の基点が２級炭素であるアルコール（イソプロパノールなど）の含量を、例えば、９０ｗｔ％以下、好ましくは８０ｗｔ％以下に調整するとよい。
【００３５】
補助溶媒を使用する場合、好適に分液できる有機溶媒中の分岐アルキルアルコール含量の目安としては、例えば、１０〜９０ｗｔ％、好ましくは２０〜８０ｗｔ％、より好ましくは３０〜８０ｗｔ％、特に４５〜６０ｗｔ％の範囲である。
【００３６】
抽出溶剤量（有機溶媒量）は、使用する溶媒の種類により異なるが、あまりに少ないと分液速度が遅くなる可能性があり、効率が悪くなる。一方、過度に多いと経済的に不利である。適量としては、培養液１重量部に対して、例えば、０．２〜２．５重量部であり、好ましくは０．４〜２．０重量部であり、更に好ましくは０．６〜１．５重量部である。
【００３７】
培養液に酸を加える場合の酸性条件としては、通常は、ｐＨを７より低くするとよい。これにより、抽出が良好に実施できる。ただし、ｐＨが５よりも高い場合は抽出率が低くなり、溶媒量が過剰に必要となるか、抽出回数が増加する傾向にある。このため、操作が煩雑になり、工業的及び経済的に不利になる。従って、ｐＨが５よりも高い場合は、酸を用いてｐＨを調整するのが好ましい。前記ｐＨは４以下にしてもよい。
【００３８】
一方、ｐＨが過度に低いと収率面では問題ないものの設備的な制約があるため、概ねｐＨ１以上（例えば、３以上）が好ましい。
【００３９】
使用する酸は特に制限されず、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸など有機酸が挙げられる。
【００４０】
分液温度は、培養液が固化又は蒸発しない限りにおいては特に制限されないが、通常０〜８０℃、好ましくは０〜６０℃、とりわけ０〜４０℃で、分液が良好に実施できる。
【００４１】
上記好ましい条件にてサーファクチンまたはその塩を抽出した場合、通常、その分液速度は工業的にも適した速度となる。上層及び下層が完全に分層する速度を有機層の液深／分層時間で表すと、通常、０．０１ｃｍ／分以上となるようにするのが好ましく、更に好ましくは０．０５ｃｍ／分以上である。条件を適切に調節することにより０．１０ｃｍ／分以上（例えば、０．５ｃｍ／分以上、さらに１ｃｍ／分以上）の速度で分液することも可能である。
【００４２】
上記のように溶媒やｐＨ等を調整することにより、化合物（１）をサーファクチンのフリー体（Ｍ＝水素）として、有機層から効率よく取り出すことができる。
【００４３】
上記好ましい条件にて抽出した場合、抽出一回当たりの収率は、通常６０ｍｏｌ％以上であり、分岐アルキルアルコール含量及び溶媒量を調節することにより９０ｍｏｌ％以上で回収できる。
【００４４】
以上のように取得した抽出液（有機層）は、そのまま濃縮、乾燥してサーファクチンを単離しても良い。或は、塩基を加えてサーファクチン塩を固体として析出させて乾燥しても良いし、サーファクチン塩が固体として析出しない場合は、その溶液を濃縮、乾燥しても良い。必要であれば抽出液を活性炭処理した後、上記操作を実施しても良い。
【００４５】
尚、サーファクチン塩を形成するために使用する塩基は特に限定されず、例えばリチウム、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、ベリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属を含む塩基を使用することが可能である。具体的には、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどが挙げられる。また、アンモニアの他、以下のようなアミン塩基（置換されていてもよいアンモニウムを含む）を用いてもよい。尚、アミンとは、一置換アミン、二置換アミン、三置換アミンを表す。アミンの置換基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等のアルキル基、ベンジル基、メチルベンジル基、フェニルエチル基等のアラルキル基、フェニル基、トルイル基、キシリル基等のアリール基、等の有機基が挙げられる。具体的には、メチルアミン、エチルアミン、ベンジルアミン、アニリン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、ピロリジン、モルホリン、Ｎ−ベンジル−Ｎ−エチルアミン、Ｎ−エチルアニリン、トリエチルアミン、ピリジン等が挙げられる。前記アミンは、さらにプロトンが付加してアンモニウムイオンになっていてもよい。これらの有機基は、更に１または２以上の置換基で置換されていても良い。
【００４６】
塩基の量は、サーファクチンと塩を形成する量であれば特に制限されず、通常、サーファクチンに対して０．５〜４モル当量である。
【００４７】
また、上記のようにして得られた抽出液およびその濃縮液は、転溶操作を導入することで、更に精製効果を付与することが出来る。即ち、塩基を含む水と混合して、化合物（１）を水溶性の塩に変換し、有機層を分離してサーファクチン塩の水溶液を得て、その後、この水溶液と酸を混合して、溶液を酸性化する。これにより、化合物（１）のフリー体（Ｍは水素）を、溶液から固体として析出させることが可能である。
【００４８】
抽出液と水、及び塩基を混合する方法は特に限定されず、抽出液または濃縮液に水を加えてから塩基を加えても良いし、抽出液または濃縮液と所定量の塩基を含む水を混合してもよいし、最後に抽出液または濃縮液を加えて混合してもよい。
【００４９】
ここで使用する塩基は特に制限されず、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、ベリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属を含む塩基を使用することが可能である。また、アンモニアの他、トリエチルアミンなどの有機塩基を用いてもよい。好ましくは、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどのアルカリ金属塩である。
【００５０】
塩基の量は、化合物（１）が水層に溶解する量であればよく、通常、化合物（１）に対して０．５〜４モル当量使用する。
【００５１】
フリー体を水溶液から析出させる際に使用する酸は、特に制限されず、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸など有機酸が挙げられる。塩酸や硫酸などの無機酸が好ましい。
【００５２】
サーファクチン塩の水溶液と、酸を混合する際は、予め調整した酸性水溶液にサーファクチン塩の水溶液を添加しても良いし、サーファクチン水溶液に酸を加えても良い。このうち、操作性の観点から、中和時の粘性がより低い、酸性水にサーファクチン塩の水溶液を加える方法が好ましい。
【００５３】
混合時の温度は、サーファクチンが分解しない限りにおいては特に制限されず、通常０〜８０℃、好ましくは０〜６０℃、更に好ましくは０〜４０℃の範囲で好適に実施できる。
【００５４】
サーファクチン塩の水溶液と、酸とを混合した後は、しばらく放置して、熟成させる。
【００５５】
熟成時の温度は、上記の酸と混合する時と同様の温度範囲で好適に実施できる。
【００５６】
析出したサーファクチンの固体は、遠心分離機や加圧ろ過機など常套法にて固液分離して単離することができる。
【００５７】
上記のようにして得られたサーファクチンは、更に、水溶液中または有機溶媒中で塩基と混合して、サーファクチン塩としてもよい。必要に応じて濃縮、乾燥することでサーファクチン塩の固体を取得することが出来る。また、必要に応じて、乾燥処理を行う前に活性炭処理を施すことで、より高純度のサーファクチン塩を取得できる。
【００５８】
使用する塩基としては、前記のサーファクチン塩を形成するために使用する塩基と同じものが挙げられる。
【００５９】
塩基の量は、サーファクチンと塩を形成する量であれば特に制限されず、サーファクチンに対して０．５〜４モル当量使用するのが好ましい。
【００６０】
得られた固体の乾燥方法は特に制限されず、スプレードライ法や凍結乾燥法など常套法にて好適に実施できる。
【００６１】
上記の方法により、サーファクチンまたはその塩を、培養液１ｋｇ当たり、３５ｇ以上取得することが可能である。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例をもって本発明を具体的に説明するが、これら実施例に限定されるものではない。【００６３】
なお下記実施例では、以下の様にして調製した培養液を使用した。
バチルス・ズブチリスＳＤ９０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６６６）を、テトラサイクリンを１０ｐｐｍ添加したＬ平板培地に画線し、３５℃で一晩生育させた。そこからテトラサイクリンを１０ｐｐｍ添加したＬ培地１００ｍｌをバッフル付きフラスコに作成し、１白金耳植菌し、３５℃、１５０ｒｐｍで１２時間培養した。下記組成の培地２Ｌを５Ｌ容の発酵槽に作成し、Ｌ培地の培養液を添加し、２０％  ＮａＯＨでｐＨを６．５〜７．５に調整しながら３５℃で培養を行った。所定のサーファクチンナトリウム濃度になった時点で培養を終了した。
培地組成（ｗ／ｗ％）              
大豆粉                  １０％
Ｋ2ＨＰＯ4            ０．５％
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０５％
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ      ２５ｐｐｍ
ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ      ２２ｐｐｍ
酵母エキス            ０．１％
マルトース              １７％
Ｌ−トリプトファン    ０．１％
Ｌ−アルギニン        ０．１％      
【００６４】
（実施例１）
サーファクチンナトリウムを含む培養液６００ｇ（純分３４ｇ）にイソプロパノール２６４ｇ、酢酸エチル１９８ｇを加えた（有機溶媒／培養液＝０．７７（質量比）、イソプロパノール／培養液＝０．４４（質量比）、有機溶媒中のイソプロパノール濃度５７質量％）。２５℃にて５５％硫酸を１５ｇ加えてｐＨ３．８に調整し、８分間静置した後、水層を除去し、有機層（抽出液）５７３ｇ（純分３１ｇ、抽出収率９１ｍｏｌ％）を得た。この時の分液速度は、有機層の深さ６．４ｃｍと、分液時間８分間から計算すると０．８ｃｍ／分であった。【００６５】
（実施例２）
サーファクチンを含む培養液２０ｇ（純分：０．９ｇ）に、表１に記載の量のイソプロパノールと酢酸エチルを加え、５５％硫酸にてｐＨ４に調整した後、各条件の分液速度を比較した。【００６６】
分液速度は、完全に分層した後の有機層の深さと、完全に分層するまでの時間とから計算した。以下のように、抽出溶剤中のイソプロパノール含量が高いと、分液速度が速いことが分かった。【００６７】
【表１】
2012043800.tif 000005
【００６８】
（実施例３）
サーファクチンを含む培養液３０ｇ（純分：０．９ｇ）に表２に記載の溶媒を５ｇ添加した後、激しく振とうして２日間静置した後、分液の有無を確認した。アルキル基が分岐しており、高級アルコールになるほど分液が有利になる傾向であった。【００６９】
【表２】
2012043800.tif 000006
【００７０】
優良；分液性良好
可  ；エマルション部分多く分液困難【００７１】
（実施例４）
実施例１と同様にして得られたサーファクチン抽出液２１ｇ（純分５ｇ）に活性炭５ｇを加えて１７時間攪拌した。活性炭をろ別し、ろ液を減圧濃縮した。残渣にヘキサンを加えて減圧濃縮する操作を２回実施した後、真空乾燥してサーファクチン４．８ｇを得た。【００７２】
（実施例５）
実施例１と同様にして得られたサーファクチン抽出液２１ｇ（純分５ｇ）に活性炭５ｇを加えて１７時間攪拌した。活性炭をろ別し、ろ液を３０％水酸化ナトリウムにてｐＨ７に調整した後、減圧濃縮した。残渣にヘキサンを加えて減圧濃縮する操作を２回実施し後、真空乾燥することでサーファクチンナトリウム塩の固体５．６ｇを得た。【００７３】
（実施例６）
実施例１と同様にして得られた培養液７２６ｇにイソプロパノール２９０ｇ、酢酸エチル２９０ｇを加えて４７％硫酸にてｐＨ４に調整した。３時間静置した後分液し、第１の上層（有機層（水を含む））５３２ｇを取得した。続いて下層（水層）にイソプロパノール１４５ｇ、酢酸エチル１４５ｇを添加、混合し、１時間静置した後、第２の上層（有機層（水を含む））５４５ｇを取得した。第１および第２の上層を混合した後（純分３９ｇ）、残渣が３７８ｇとなるまで減圧濃縮し、これに酢酸エチル９６ｇを加えた後、水層を除いた。得られた有機層をろ過した後、ろ液に活性炭３９ｇを加えて１４時間攪拌した。活性炭をろ別および酢酸エチル５５ｇにて洗浄した後、ろ液に水８３ｇ、３０％水酸化ナトリウム水溶液７ｇを加えた。その後、有機層を除き、水層を１４３ｇまで減圧濃縮した。このようにして得られた水溶液を、２％硫酸水１１７ｇに、１３℃下、３時間かけて滴下し、スラリーを１３時間熟成した後、固体をろ別、水洗し、サーファクチンの湿固体９２ｇ（純分２８ｇ）を得た。この固体９２ｇに水１０８ｇに加え、３０％水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ７に調整した。活性炭９ｇを加えて１４時間熟成し、活性炭をろ別した後、ろ液を凍結乾燥し、サーファクチンナトリウム塩の固体２７ｇを得た。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明によれば、サーファクチンの培養液からの抽出を改善できるため、サーファクチン又はその塩の製造に有用である。サーファクチンは、高い界面活性能を有しており、また抗菌活性、溶血性、蛋白変性阻害など多彩な機能も有しているため、産業上、有用である。
【国際調査報告】
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