(57)【要約】パラゴムノキの成木に頼らない安定的なイソプレノイドの製造方法、該製造方法により得られるイソプレノイドを提供する。また、イソプレノイドを製造可能な新規なカルス、該カルスの誘導方法、該カルスの培養方法を提供する。イソプレノイド産生植物のカルスによりイソプレノイドを生合成するイソプレノイドの製造方法、該製造方法により得られるイソプレノイドに関する。また、イソプレノイド産生植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することにより誘導されたカルスに関する。また、イソプレノイド産生植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導するカルスの誘導方法に関する。また、イソプレノイド産生植物のカルスを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む生育培地中で培養することによりカルスを生育させるカルスの培養方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレノイド産生植物のカルスによりイソプレノイドを生合成するイソプレノイドの製造方法。
【請求項２】
イソプレノイド産生植物の組織片からカルスを誘導し、カルスによりイソプレノイドを生合成する請求項１記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項３】
イソプレノイド産生植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導する請求項２記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項４】
イソプレノイド産生植物の組織片からカルスを誘導した後、カルスを培養することにより、カルスによりイソプレノイドを生合成する請求項１〜３のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項５】
イソプレノイド産生植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導する誘導工程と、カルスを生育培地中で培養して増殖させる増殖工程と、増殖工程により増殖させたカルスを生産培地で培養し、カルスによりイソプレノイドを生合成する生産工程とを含む請求項１〜４のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項６】
生産工程が、増殖工程により増殖させたカルスを、カルスの細胞内にイソプレノイドが蓄積されるようにコントロールする生産培地で培養し、カルスによりイソプレノイドを生合成する工程である請求項５記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項７】
生産工程が、増殖工程により増殖させたカルスを、カルスの細胞内にイソプレノイドが蓄積され、蓄積されたイソプレノイドが細胞外に放出されるようにコントロールする生産培地で培養し、カルスによりイソプレノイドを生合成する工程である請求項５又は６記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項８】
誘導培地中の窒素濃度が０〜１００ｍＭである請求項３記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項９】
誘導培地中の微量無機塩類の濃度が０〜２ｍＭである請求項３又は８記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項１０】
誘導培地中の炭素源の濃度が０．１〜１０質量％である請求項３、８又は９のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項１１】
誘導培地中のカルシウムイオン濃度が０〜１０ｍＭである請求項３又は８〜１０のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項１２】
植物生長ホルモンがオーキシン系植物ホルモン及び／又はサイトカイニン系植物ホルモンである請求項３又は８〜１１のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項１３】
誘導培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度が０〜２０ｍｇ／ｌである請求項１２記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項１４】
誘導培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度が０〜１５ｍｇ／ｌである請求項１２記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項１５】
誘導培地が、ジャスモン酸、及びモノテルペン化合物からなる群より選択される少なくとも１種を含む請求項３又は８〜１４のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項１６】
誘導培地のｐＨが４．０〜１０．０である請求項３又は８〜１５のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項１７】
培養温度が０〜４０℃である請求項３又は８〜１６のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項１８】
生育培地中の窒素濃度が０〜１００ｍＭである請求項５記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項１９】
生育培地中の微量無機塩類の濃度が０〜２ｍＭである請求項５又は１８記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項２０】
生育培地中の炭素源の濃度が０．１〜１０質量％である請求項５、１８又は１９のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項２１】
生育培地中のカルシウムイオン濃度が０〜１０ｍＭである請求項５又は１８〜２０のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項２２】
生育培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度が０〜２０ｍｇ／ｌである請求項５又は１８〜２１のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項２３】
生育培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度が０〜１５ｍｇ／ｌである請求項５又は１８〜２２のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項２４】
生育培地が、ジャスモン酸、及びモノテルペン化合物からなる群より選択される少なくとも１種を含む請求項５又は１８〜２３のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項２５】
生育培地のｐＨが４．０〜１０．０である請求項５又は１８〜２４のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項２６】
培養温度が０〜４０℃である請求項５又は１８〜２５のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項２７】
生産培地中の窒素濃度が０〜１００ｍＭである請求項５記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項２８】
生産培地中の微量無機塩類の濃度が０〜２ｍＭである請求項５又は２７記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項２９】
生産培地中の炭素源の濃度が０．１〜１０質量％である請求項５、２７又は２８のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項３０】
生産培地中のカルシウムイオン濃度が０〜１０ｍＭである請求項５又は２７〜２９のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項３１】
生産培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度が０〜２０ｍｇ／ｌである請求項５又は２７〜３０のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項３２】
生産培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度が０〜１５ｍｇ／ｌである請求項５又は２７〜３１のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項３３】
生産培地が、ジャスモン酸、及びモノテルペン化合物からなる群より選択される少なくとも１種を含む請求項５又は２７〜３２のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項３４】
生産培地のｐＨが４．０〜１０．０である請求項５又は２７〜３３のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項３５】
培養温度が０〜４０℃である請求項５又は２７〜３４のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項３６】
イソプレノイド産生植物のカルスを液体培地で培養し、カルスによりイソプレノイドを生合成する請求項１記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項３７】
イソプレノイド産生植物のカルスを、カルスの細胞内にイソプレノイドが蓄積されるようにコントロールする液体の生産培地で培養し、カルスによりイソプレノイドを生合成する請求項３６記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項３８】
イソプレノイド産生植物のカルスを、カルスの細胞内にイソプレノイドが蓄積され、蓄積されたイソプレノイドが細胞外に放出されるようにコントロールする液体の生産培地で培養し、カルスによりイソプレノイドを生合成する請求項３６又は３７に記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項３９】
生産培地中の窒素濃度が０〜１００ｍＭである請求項３７又は３８に記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項４０】
生産培地中の微量無機塩類の濃度が０〜２ｍＭである請求項３７〜３９のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項４１】
生産培地中の炭素源の濃度が０．１〜１０質量％である請求項３７〜４０のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項４２】
生産培地中のカルシウムイオン濃度が０〜１０ｍＭである請求項３７〜４１のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項４３】
生産培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度が０〜２０ｍｇ／ｌである請求項３７〜４２のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項４４】
生産培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度が０〜１５ｍｇ／ｌである請求項３７〜４３のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項４５】
生産培地が、ジャスモン酸、及びモノテルペン化合物からなる群より選択される少なくとも１種を含む請求項３７〜４４のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項４６】
生産培地のｐＨが４．０〜１０．０である請求項３７〜４５のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項４７】
培養温度が０〜４０℃である請求項３６〜４６のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項４８】
培地中のイソプレノイドの濃度が０．００１ｍｇ／ｌ以上となる請求項３６〜４７のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項４９】
オーキシン系植物ホルモンが、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸、インドール酪酸、インドール酢酸、インドールプロピオン酸、クロロフェノキシ酢酸、ナフトキシ酢酸、フェニル酢酸、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸、パラクロロフェノキシ酢酸、２−メチル−４−クロロフェノキシ酢酸、４−フルオロフェノキシ酢酸、２−メトキシ−３，６−ジクロロ安息香酸、２−フェニル酸、ピクロラム、及びピコリン酸からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１２記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項５０】
サイトカイニン系植物ホルモンが、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチン、ベンジルアミノプリン、イソペンチニルアミノプリン、チジアズロン、イソペンテニルアデニン、ゼアチンリポシド、及びジヒドロゼアチンからなる群より選択される少なくとも１種である請求項１２記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項５１】
炭素源が、スクロース、グルコース、トレハロース、フルクトース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、アロース、タロース、グロース、アルトロース、マンノース、イドース、アラビノース、アピオース、エリスリトール、及びマルトースからなる群より選択される少なくとも１種である請求項３記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項５２】
イソプレノイド産生植物が、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＦｉｃｕｓ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物である請求項１〜５１のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項５３】
イソプレノイド産生植物が、パラゴムノキ、ノゲシ、セイタカアワダチソウ、ヒマワリ、タンポポ、カンサイタンポポ、及びイチジクからなる群より選択される少なくとも１種である請求項１〜５２のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項５４】
組織片が、葉、茎、根、芽、花弁、子葉、胚軸、葯、及び種子からなる群より選択される少なくとも１種である請求項２〜３５、４９〜５３のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項５５】
前記イソプレノイドに含まれるイソプレンユニット中の１，４−シス構造の含有量が１０モル％以上である請求項１〜５４のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項５６】
前記イソプレノイドの重量平均分子量が１０００以上である請求項１〜５５のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項５７】
前記イソプレノイドの重量平均分子量が１００００以上である請求項１〜５６のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項５８】
前記イソプレノイドの重量平均分子量が１０００００以上である請求項１〜５７のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項５９】
カルスの細胞内に蓄積されているイソプレノイドの量が、カルス乾燥質量に対し、０．００５質量％以上である請求項１〜５８のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項６０】
請求項１〜５９のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法により得られるイソプレノイド。
【請求項６１】
イソプレノイド産生植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することにより誘導されたカルス。
【請求項６２】
イソプレノイド産生植物が、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＦｉｃｕｓ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物である請求項６１記載のカルス。
【請求項６３】
イソプレノイド産生植物が、パラゴムノキ、ノゲシ、セイタカアワダチソウ、ヒマワリ、タンポポ、カンサイタンポポ、及びイチジクからなる群より選択される少なくとも１種の植物である請求項６２記載のカルス。
【請求項６４】
請求項６０記載のイソプレノイドを産生するカルス。
【請求項６５】
イソプレノイド産生植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導するカルスの誘導方法。
【請求項６６】
誘導培地中の窒素濃度が０〜１００ｍＭ、微量無機塩類の濃度が０〜２ｍＭ、炭素源の濃度が０．１〜１０質量％、カルシウムイオン濃度が０〜１０ｍＭ、オーキシン系植物ホルモンの濃度が０〜２０ｍｇ／ｌ、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が０〜１５ｍｇ／ｌである請求項６５記載のカルスの誘導方法。
【請求項６７】
誘導培地が、ジャスモン酸、及びモノテルペン化合物からなる群より選択される少なくとも１種を含む請求項６５又は６６に記載のカルスの誘導方法。
【請求項６８】
誘導培地のｐＨが４．０〜１０．０、培養温度が０〜４０℃である請求項６５〜６７のいずれかに記載のカルスの誘導方法。
【請求項６９】
イソプレノイド産生植物の組織片から誘導された細胞１００質量％中のカルスの割合が９０質量％以上である請求項６５〜６８のいずれかに記載のカルスの誘導方法。
【請求項７０】
イソプレノイド産生植物が、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＦｉｃｕｓ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物である請求項６５〜６９のいずれかに記載のカルスの誘導方法。
【請求項７１】
イソプレノイド産生植物が、パラゴムノキ、ノゲシ、セイタカアワダチソウ、ヒマワリ、タンポポ、カンサイタンポポ、及びイチジクからなる群より選択される少なくとも１種の植物である請求項６５〜７０のいずれかに記載のカルスの誘導方法。
【請求項７２】
イソプレノイド産生植物のカルスを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む生育培地中で培養することによりカルスを生育させるカルスの培養方法。
【請求項７３】
生育培地中の窒素濃度が０〜１００ｍＭ、微量無機塩類の濃度が０〜２ｍＭ、炭素源の濃度が０．１〜１０質量％、カルシウムイオン濃度が０〜１０ｍＭ、オーキシン系植物ホルモンの濃度が０〜２０ｍｇ／ｌ、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が０〜１５ｍｇ／ｌである請求項７２記載のカルスの培養方法。
【請求項７４】
生育培地のｐＨが４．０〜１０．０、培養温度が０〜４０℃である請求項７２又は７３に記載のカルスの培養方法。
【請求項７５】
生育培地が、ジャスモン酸、モノテルペン化合物、及び糖アルコールからなる群より選択される少なくとも１種を含む請求項７２〜７４のいずれかに記載のカルスの培養方法。
【請求項７６】
生育培地中のモノテルペン化合物の濃度が、０．０１〜１質量％である請求項７５に記載のカルスの培養方法。
【請求項７７】
生育培地中の糖アルコールの濃度が、０．０１〜１質量％である請求項７５に記載のカルスの培養方法。
【請求項７８】
モノテルペン化合物が、Ｄ−リモネン又はα−ピネンであり、糖アルコールが、エリスリトールである請求項７５に記載のカルスの培養方法。
【請求項７９】
４週間当たりの質量基準のカルスの生長率が１．５倍以上である請求項７２〜７８のいずれかに記載のカルスの培養方法。
【請求項８０】
イソプレノイド産生植物が、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＦｉｃｕｓ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物である請求項７２〜７９のいずれかに記載のカルスの培養方法。
【請求項８１】
イソプレノイド産生植物が、パラゴムノキ、ノゲシ、セイタカアワダチソウ、ヒマワリ、タンポポ、カンサイタンポポ、及びイチジクからなる群より選択される少なくとも１種の植物である請求項７２〜８０のいずれかに記載のカルスの培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イソプレノイドの製造方法、該製造方法により得られるイソプレノイド、新規なカルス、該カルスの誘導方法、及び該カルスの培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然ゴムは、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）や桑科植物のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）などのゴム産生植物を栽培し、その植物体が有する乳管細胞で天然ゴムを生合成させ、該天然ゴムを植物から手作業により採取することにより得られる。【０００３】
現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴムは、パラゴムノキを唯一の採取源としている。パラゴムノキは東南アジアや南米などの限られた地域でのみ生育可能な植物である。更に、パラゴムノキは、植樹からゴムの採取が可能な成木になるまでに７年程度を要し、また、天然ゴムを採取できる期間は２０〜３０年である。今後、開発途上国を中心に天然ゴムの需要の増大が見込まれているが、上述の理由によりパラゴムノキによる天然ゴムの大幅な増産は困難である。そのため、天然ゴム資源の枯渇が懸念されており、パラゴムノキの成木以外の安定的な天然ゴム（イソプレノイド）の供給源が望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、前記課題を解決し、パラゴムノキの成木に頼らない安定的なイソプレノイドの製造方法、該製造方法により得られるイソプレノイドを提供することを目的とする。また、イソプレノイドを製造可能な新規なカルス、該カルスの誘導方法、該カルスの培養方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従来から、完全な植物体でなくとも、カルスなどの未分化細胞を用いて、一部の二次代謝物を生合成できることは知られていた。天然ゴム（イソプレノイド）も二次代謝物ではあるが、天然ゴムは乳管細胞という特殊な細胞により生合成されることが知られており、乳管細胞以外の細胞（例えば、カルス）では、天然ゴムは生合成できないものと考えられていた。本発明者らは、鋭意検討した結果、イソプレノイド産生植物の組織片から誘導したカルスにより、イソプレノイド（天然ゴム）を生合成できることを見出した。この発見は、当業者の常識を覆す驚くべき発見である。
次に、本発明者らは、様々なイソプレノイド産生植物由来のカルスの取得を試みることとした。しかし、イソプレノイド産生植物のカルスやカルスへの誘導条件の詳細は明らかではなかった。一般に、カルスへの誘導条件やカルスの培養条件は、植物種により異なることが知られている。そこで、本発明者らは、鋭意検討した結果、カルスへの誘導条件が明らかでない複数のイソプレノイド産生植物から新規なカルスを取得することに成功した。そして、カルスへの誘導条件やカルスの培養条件の検討を行い、様々な知見を見出し、本発明を完成させた。
また、イソプレノイド産生植物のカルスを液体培地で培養することで、培養液中にイソプレノイドが放出されることも見出した。これは、培養液からイソプレノイドが得られることを意味しており、連続培養の可能性があることを示す画期的な発見である。【０００６】
すなわち、本発明は、イソプレノイド産生植物のカルスによりイソプレノイドを生合成するイソプレノイドの製造方法に関する。【０００７】
上記イソプレノイドの製造方法は、イソプレノイド産生植物の組織片からカルスを誘導し、カルスによりイソプレノイドを生合成することが好ましい。【０００８】
上記イソプレノイドの製造方法は、イソプレノイド産生植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導することが好ましい。【０００９】
上記イソプレノイドの製造方法は、イソプレノイド産生植物の組織片からカルスを誘導した後、カルスを培養することにより、カルスによりイソプレノイドを生合成することが好ましい。【００１０】
上記イソプレノイドの製造方法は、イソプレノイド産生植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導する誘導工程と、カルスを生育培地中で培養して増殖させる増殖工程と、増殖工程により増殖させたカルスを生産培地で培養し、カルスによりイソプレノイドを生合成する生産工程とを含むことが好ましい。【００１１】
上記生産工程が、増殖工程により増殖させたカルスを、カルスの細胞内にイソプレノイドが蓄積されるようにコントロールする生産培地で培養し、カルスによりイソプレノイドを生合成する工程であることが好ましい。【００１２】
上記生産工程が、増殖工程により増殖させたカルスを、カルスの細胞内にイソプレノイドが蓄積され、蓄積されたイソプレノイドが細胞外に放出されるようにコントロールする生産培地で培養し、カルスによりイソプレノイドを生合成する工程であることが好ましい。【００１３】
上記誘導培地中の窒素濃度が０〜１００ｍＭであることが好ましい。上記誘導培地中の微量無機塩類の濃度が０〜２ｍＭであることが好ましい。上記誘導培地中の炭素源の濃度が０．１〜１０質量％であることが好ましい。上記誘導培地中のカルシウムイオン濃度が０〜１０ｍＭであることが好ましい。【００１４】
上記植物生長ホルモンがオーキシン系植物ホルモン及び／又はサイトカイニン系植物ホルモンであることが好ましい。【００１５】
上記誘導培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度が０〜２０ｍｇ／ｌであることが好ましい。上記誘導培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度が０〜１５ｍｇ／ｌであることが好ましい。【００１６】
上記誘導培地が、ジャスモン酸、及びモノテルペン化合物からなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましいが、これらは必須成分ではない。【００１７】
誘導培地のｐＨが４．０〜１０．０であることが好ましい。培養温度が０〜４０℃であることが好ましい。【００１８】
上記生育培地中の窒素濃度が０〜１００ｍＭであることが好ましい。上記生育培地中の微量無機塩類の濃度が０〜２ｍＭであることが好ましい。上記生育培地中の炭素源の濃度が０．１〜１０質量％であることが好ましい。上記生育培地中のカルシウムイオン濃度が０〜１０ｍＭであることが好ましい。【００１９】
上記生育培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度が０〜２０ｍｇ／ｌであることが好ましい。上記生育培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度が０〜１５ｍｇ／ｌであることが好ましい。【００２０】
上記生育培地が、ジャスモン酸、及びモノテルペン化合物からなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましいが、これらは必須成分ではない。【００２１】
上記生育培地のｐＨが４．０〜１０．０であることが好ましい。培養温度が０〜４０℃であることが好ましい。【００２２】
上記生産培地中の窒素濃度が０〜１００ｍＭであることが好ましい。上記生産培地中の微量無機塩類の濃度が０〜２ｍＭであることが好ましい。上記生産培地中の炭素源の濃度が０．１〜１０質量％であることが好ましい。上記生産培地中のカルシウムイオン濃度が０〜１０ｍＭであることが好ましい。【００２３】
上記生産培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度が０〜２０ｍｇ／ｌであることが好ましい。上記生産培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度が０〜１５ｍｇ／ｌであることが好ましい。【００２４】
上記生産培地が、ジャスモン酸、及びモノテルペン化合物からなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましいが、これらは必須成分ではない。【００２５】
上記生産培地のｐＨが４．０〜１０．０であることが好ましい。培養温度が０〜４０℃であることが好ましい。【００２６】
上記イソプレノイドの製造方法は、イソプレノイド産生植物のカルスを液体培地で培養し、カルスによりイソプレノイドを生合成することが好ましい。【００２７】
上記イソプレノイドの製造方法は、イソプレノイド産生植物のカルスを、カルスの細胞内にイソプレノイドが蓄積されるようにコントロールする液体の生産培地で培養し、カルスによりイソプレノイドを生合成することが好ましい。【００２８】
上記イソプレノイドの製造方法は、イソプレノイド産生植物のカルスを、カルスの細胞内にイソプレノイドが蓄積され、蓄積されたイソプレノイドが細胞外に放出されるようにコントロールする液体の生産培地で培養し、カルスによりイソプレノイドを生合成することが好ましい。【００２９】
上記生産培地中の窒素濃度が０〜１００ｍＭであることが好ましい。上記生産培地中の微量無機塩類の濃度が０〜２ｍＭであることが好ましい。上記生産培地中の炭素源の濃度が０．１〜１０質量％であることが好ましい。上記生産培地中のカルシウムイオン濃度が０〜１０ｍＭであることが好ましい。【００３０】
上記生産培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度が０〜２０ｍｇ／ｌであることが好ましい。上記生産培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度が０〜１５ｍｇ／ｌであることが好ましい。【００３１】
上記生産培地が、ジャスモン酸、及びモノテルペン化合物からなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましいが、これらは必須成分ではない。【００３２】
上記生産培地のｐＨが４．０〜１０．０であることが好ましい。培養温度が０〜４０℃であることが好ましい。【００３３】
上記イソプレノイドの製造方法は、培地中のイソプレノイドの濃度が０．００１ｍｇ／ｌ以上となることが好ましい。【００３４】
上記オーキシン系植物ホルモンが、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸、インドール酪酸、インドール酢酸、インドールプロピオン酸、クロロフェノキシ酢酸、ナフトキシ酢酸、フェニル酢酸、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸、パラクロロフェノキシ酢酸、２−メチル−４−クロロフェノキシ酢酸、４−フルオロフェノキシ酢酸、２−メトキシ−３，６−ジクロロ安息香酸、２−フェニル酸、ピクロラム、及びピコリン酸からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。【００３５】
上記サイトカイニン系植物ホルモンが、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチン、ベンジルアミノプリン、イソペンチニルアミノプリン、チジアズロン、イソペンテニルアデニン、ゼアチンリポシド、及びジヒドロゼアチンからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。【００３６】
上記炭素源が、スクロース、グルコース、トレハロース、フルクトース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、アロース、タロース、グロース、アルトロース、マンノース、イドース、アラビノース、アピオース、エリスリトール、及びマルトースからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。【００３７】
上記イソプレノイド産生植物が、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＦｉｃｕｓ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物であることが好ましい。【００３８】
上記イソプレノイド産生植物が、パラゴムノキ、ノゲシ、セイタカアワダチソウ、ヒマワリ、タンポポ、カンサイタンポポ、及びイチジクからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。【００３９】
上記組織片が、葉、茎、根、芽、花弁、子葉、胚軸、葯、及び種子からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。【００４０】
上記イソプレノイドに含まれるイソプレンユニット中の１，４−シス構造の含有量が１０モル％以上であることが好ましい。【００４１】
上記イソプレノイドの重量平均分子量が１０００以上であることが好ましい。【００４２】
上記イソプレノイドの重量平均分子量が１００００以上であることがより好ましい。【００４３】
上記イソプレノイドの重量平均分子量が１０００００以上であることが更に好ましい。【００４４】
上記イソプレノイドの製造方法は、カルスの細胞内に蓄積されているイソプレノイドの量が、カルス乾燥質量に対し、０．００５質量％以上であることが好ましい。【００４５】
本発明はまた、上記イソプレノイドの製造方法により得られるイソプレノイドに関する。【００４６】
本発明はまた、イソプレノイド産生植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することにより誘導されたカルスに関する。【００４７】
上記イソプレノイド産生植物が、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＦｉｃｕｓ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物であることが好ましい。【００４８】
上記イソプレノイド産生植物が、パラゴムノキ、ノゲシ、セイタカアワダチソウ、ヒマワリ、タンポポ、カンサイタンポポ、及びイチジクからなる群より選択される少なくとも１種の植物であることが好ましい。【００４９】
本発明はまた、上記イソプレノイドを産生するカルス（イソプレノイド産生用カルス）に関する。【００５０】
本発明はまた、イソプレノイド産生植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導するカルスの誘導方法に関する。【００５１】
上記誘導培地中の窒素濃度が０〜１００ｍＭ、微量無機塩類の濃度が０〜２ｍＭ、炭素源の濃度が０．１〜１０質量％、カルシウムイオン濃度が０〜１０ｍＭ、オーキシン系植物ホルモンの濃度が０〜２０ｍｇ／ｌ、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が０〜１５ｍｇ／ｌであることが好ましい。【００５２】
上記誘導培地が、ジャスモン酸、及びモノテルペン化合物からなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましい。【００５３】
上記誘導培地のｐＨが４．０〜１０．０、培養温度が０〜４０℃であることが好ましい。【００５４】
上記カルスの誘導方法は、イソプレノイド産生植物の組織片から誘導された細胞１００質量％中のカルスの割合が９０質量％以上であることが好ましい。【００５５】
上記イソプレノイド産生植物が、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＦｉｃｕｓ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物であることが好ましい。【００５６】
上記イソプレノイド産生植物が、パラゴムノキ、ノゲシ、セイタカアワダチソウ、ヒマワリ、タンポポ、カンサイタンポポ、及びイチジクからなる群より選択される少なくとも１種の植物であることが好ましい。【００５７】
本発明はまた、イソプレノイド産生植物のカルスを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む生育培地中で培養することによりカルスを生育させるカルスの培養方法に関する。【００５８】
上記生育培地中の窒素濃度が０〜１００ｍＭ、微量無機塩類の濃度が０〜２ｍＭ、炭素源の濃度が０．１〜１０質量％、カルシウムイオン濃度が０〜１０ｍＭ、オーキシン系植物ホルモンの濃度が０〜２０ｍｇ／ｌ、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が０〜１５ｍｇ／ｌであることが好ましい。【００５９】
上記生育培地のｐＨが４．０〜１０．０、培養温度が０〜４０℃であることが好ましい。【００６０】
上記生育培地が、ジャスモン酸、モノテルペン化合物、及び糖アルコールからなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましい。【００６１】
上記生育培地中のモノテルペン化合物の濃度が、０．０１〜１質量％であることが好ましい。上記生育培地中の糖アルコールの濃度が、０．０１〜１質量％であることが好ましい。【００６２】
上記モノテルペン化合物が、Ｄ−リモネン又はα−ピネンであり、糖アルコールが、エリスリトールであることが好ましい。【００６３】
上記カルスの培養方法は、４週間当たりの質量基準のカルスの生長率が１．５倍以上であることが好ましい。【００６４】
上記イソプレノイド産生植物が、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＦｉｃｕｓ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物であることが好ましい。【００６５】
上記イソプレノイド産生植物が、パラゴムノキ、ノゲシ、セイタカアワダチソウ、ヒマワリ、タンポポ、カンサイタンポポ、及びイチジクからなる群より選択される少なくとも１種の植物であることが好ましい。
【発明の効果】
【００６６】
本発明によれば、イソプレノイド産生植物のカルスによりイソプレノイドを生合成するイソプレノイドの製造方法であるので、パラゴムノキの成木に頼らずに、イソプレノイドを供給できる。さらに、カルスの生合成によりイソプレノイドが得られるため、例えば、カルスをタンク内で液体培養することにより、天候や季節等に影響されずに安定的にイソプレノイドを供給できる。また、カルスの液体培養は、カルスを再分化させた組織（例えば、不定根等）の液体培養よりも制御が容易であるため、液体培養のスケールアップも比較的容易である。そのため、安定的にイソプレノイドを量産できる。また、植物体は各部位（葉、根、茎など）により、生成するイソプレノイドの含有量や分子量などが異なることが予想されるが、カルスを均一化し、均一化したカルスによりイソプレノイドを生合成することにより、得られるイソプレノイドの品質を一定に保つことができる。
また、イソプレノイド産生植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを効率的、安定的に誘導できる。そして、誘導された新規なカルスは、イソプレノイドの製造に優れている。さらに、イソプレノイド産生植物のカルスを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む生育培地中で培養することによりカルスを効率的、安定的に生育できる。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
本発明のイソプレノイドの製造方法は、イソプレノイド産生植物のカルスによりイソプレノイドを生合成する製造方法である。
具体的には、イソプレノイド産生植物の組織片から誘導されたカルスを培養することにより、カルスによりイソプレノイドを生合成すればよい。
より具体的には、イソプレノイド産生植物の組織片からカルスを誘導し、該カルスを培養することにより、カルスによりイソプレノイドを生合成すればよい。
【００６８】
誘導したカルスをそのまま培養してイソプレノイドを製造することとしてもよいが、より多量のイソプレノイドが得られるという理由から、誘導したカルスをまず増殖させ、増殖させたカルスによりイソプレノイドを製造することが好ましい。
【００６９】
具体的には、イソプレノイド産生植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導する誘導工程と、カルスを生育培地中で培養して増殖させる増殖工程と、増殖工程により増殖させたカルスを生産培地で培養し、カルスによりイソプレノイドを生合成する生産工程とを含む製造方法が好ましい。
【００７０】
カルスの培養は、固体培地で行っても液体培地で行ってもよいが、好適にイソプレノイドを製造できるという理由から、液体培地が好ましい。なお、増殖工程及び生産工程において液体培養を行う場合には、カルスの増殖が比較的速いため、増殖工程と生産工程を明確に分けずに、１つの工程でカルスを増殖させつつ、カルスによりイソプレノイドを生合成することとしてもよい。すなわち、液体培養を行う場合には、カルスを液体の生産培地で培養し、カルスによりイソプレノイドを生合成する生産工程を含む製造方法が好ましく、イソプレノイド産生植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導する誘導工程と、カルスを液体の生産培地で培養し、カルスによりイソプレノイドを生合成する生産工程とを含む製造方法がより好ましい。
【００７１】
（誘導工程）
誘導工程では、例えば、イソプレノイド産生植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導する。
【００７２】
イソプレノイド産生植物としては、イソプレノイドを産生可能な植物であれば特に限定されず、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃａｒｐａ  ｆ．  ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｇｉｇａｎｔｅａ  Ａｉｔ．  ｖａｒ．  ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａ  Ｆｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｖｅｎｕｓｔｕｍ  Ｈ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｈｏｎｄｏｅｎｓｅ  Ｎａｋａｉ）、カントウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍ  Ｄａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ  Ｗｅｂｅｒ）等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ  ｐｕｍｉｌａ  Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｒｅｃｔａ  Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ａｍｐｅｌａｓ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ  Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｉｒｉｓａｎａ  Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ  Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｓｅｐｔｉｃａ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓｅｒｒｉｏｌａ）、ベンガルボダイジュ等が挙げられる。なかでも、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＦｉｃｕｓ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物であることが好ましく、パラゴムノキ、ノゲシ、セイタカアワダチソウ、ヒマワリ、タンポポ、カンサイタンポポ、及びイチジクからなる群より選択される少なく���も１種であることがより好ましい。
【００７３】
なお、天然ゴムの唯一の採取源であるパラゴムノキの成木は、その生育可能な地域が東南アジアや南米に限定されるが、植物細胞であるカルスの培養により、ゴムを生産することにより、生産地域を限定することなく、広範囲での天然ゴムの採取が可能でとなる。さらに、パラゴムノキの成木は植樹からゴムの採取まで約７年を要するが、細胞培養は、数ヶ月の培養でゴム生産が可能であり、生育もより早い。
【００７４】
また、草本類の中では、比較的高分子量のイソプレノイドが生合成されている可能性があるため、ノゲシはパラゴムノキに代わる天然ゴム源として期待できる。また、パラゴムノキはその生育可能な地域が東南アジアや南米に限定されるが、ノゲシはヨーロッパ諸国や日本など、世界各地で自生しており、広範囲での栽培、採取が可能である。さらに、パラゴムノキは植樹からゴムの採取まで約７年を要するが、ノゲシは一年草であることから、生育もより早い。
【００７５】
また、草本類の中では、比較的高分子量のイソプレノイドが生合成されている可能性があるため、ヒマワリはパラゴムノキに代わる天然ゴム源として期待できる。また、パラゴムノキはその生育可能な地域が東南アジアや南米に限定されるが、ヒマワリはヨーロッパ諸国や日本など、世界各地で自生しており、広範囲での栽培、採取が可能である。さらに、パラゴムノキは植樹からゴムの採取まで約７年を要するが、ヒマワリは一年草であることから、生育もより早い。
【００７６】
また、草本類の中では、比較的高分子量のイソプレノイドが生合成されている可能性があるため、セイタカアワダチソウはパラゴムノキに代わる天然ゴム源として期待できる。また、パラゴムノキはその生育可能な地域が東南アジアや南米に限定されるが、セイタカアワダチソウは北アメリカや日本で自生しており、広範囲での栽培、採取が可能である。
【００７７】
また、草本類の中では、比較的高分子量のイソプレノイドが生合成されている可能性があるため、カンサイタンポポはパラゴムノキに代わる天然ゴム源として期待できる。また、パラゴムノキはその生育可能な地域が東南アジアや南米に限定されるが、カンサイタンポポは、日本の近畿地方以西の地域で多く自生しており、広範囲での栽培、採取が可能である。
【００７８】
また、木本類の中では、比較的高分子量のイソプレノイドが生合成されている可能性があるため、イチジクはパラゴムノキに代わる天然ゴム源として期待できる。また、パラゴムノキはその生育可能な地域が東南アジアや南米に限定されるが、イチジクは暖帯から温帯の世界各地で自生しており、日本、アジア地域、地中海沿岸地域、アメリカと広範囲での栽培、採取が可能であり、イチジクはパラゴムノキに代わる天然ゴム源として期待できる。
【００７９】
組織片としては、特に限定されないが、葉、茎、根、芽、花弁、子葉、胚軸、葯、及び種子からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。なかでも、葉、茎がより好ましい。
【００８０】
誘導工程では、まず、イソプレノイド産生植物の組織片の表面を洗浄する。組織片として植物の内部にある組織を利用する場合は、例えば、磨き粉で洗浄しても良いが、界面活性剤を約０．１％含む水で洗浄してもよい。葉などを利用する場合は、軟らかいスポンジで表面を洗浄することが好ましい。
【００８１】
次に、組織片を殺菌又は滅菌する。殺菌又は滅菌は、周知の殺菌剤、滅菌剤を用いて行うことができるが、エタノール、塩化ベンザルコニウム、次亜塩素酸ナトリウム水溶液が好ましい。
【００８２】
次に、殺菌又は滅菌した組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することにより、カルスの誘導を行う。なお、誘導培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地上に置床して培養することで、カルス化しやすいため、固体培養が好ましい。また、誘導培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【００８３】
植物生長ホルモンとしては、例えば、オーキシン系植物ホルモン及び／又はサイトカイニン系植物ホルモンが挙げられる。
【００８４】
オーキシン系植物ホルモンとしては、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸、インドール酪酸、インドール酢酸、インドールプロピオン酸、クロロフェノキシ酢酸、ナフトキシ酢酸、フェニル酢酸、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸、パラクロロフェノキシ酢酸、２−メチル−４−クロロフェノキシ酢酸、４−フルオロフェノキシ酢酸、２−メトキシ−３，６−ジクロロ安息香酸、２−フェニル酸、ピクロラム、ピコリン酸等が挙げられる。なかでも、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸、インドール酪酸が好ましい。
【００８５】
イソプレノイド産生植物が、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属に属する植物（特に、ヒマワリ）の場合、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸がより好ましく、ナフタレン酢酸が更に好ましい。また、イソプレノイド産生植物が、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）の場合、ナフタレン酢酸がより好ましい。また、イソプレノイド産生植物が、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物（特に、カンサイタンポポ）の場合、ナフタレン酢酸がより好ましい。また、イソプレノイド産生植物が、Ｆｉｃｕｓ属に属する植物（特に、イチジク）の場合、ナフタレン酢酸がより好ましい。また、イソプレノイド産生植物が、Ｈｅｖｅａ属に属する植物（特に、パラゴムノキ）の場合、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸がより好ましい。また、イソプレノイド産生植物が、Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物（特に、ノゲシ）の場合、ナフタレン酢酸がより好ましい。
【００８６】
サイトカイニン系植物ホルモンとしては、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチン、ベンジルアミノプリン、イソペンチニルアミノプリン、チジアズロン、イソペンテニルアデニン、ゼアチンリポシド、ジヒドロゼアチン等が挙げられる。なかでも、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンが好ましい。
【００８７】
イソプレノイド産生植物が、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属に属する植物（特に、ヒマワリ）の場合、ベンジルアデニン、カイネチンがより好ましく、ベンジルアデニンが更に好ましい。また、イソプレノイド産生植物が、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）の場合、ベンジルアデニンがより好ましい。また、イソプレノイド産生植物が、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物（特に、カンサイタンポポ）の場合、ベンジルアデニン、カイネチンがより好ましく、ベンジルアデニンが更に好ましい。また、イソプレノイド産生植物が、Ｆｉｃｕｓ属に属する植物（特に、イチジク）の場合、ベンジルアデニンがより好ましい。また、イソプレノイド産生植物が、Ｈｅｖｅａ属に属する植物（特に、パラゴムノキ）の場合、カイネチンがより好ましい。また、イソプレノイド産生植物が、Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物（特に、ノゲシ）の場合、ベンジルアデニンがより好ましい。
【００８８】
炭素源としては、特に限定されず、スクロース、グルコース、トレハロース、フルクトース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アロース、タロース、グロース、アルトロース、マンノース、イドース、アラビノース、アピオース、マルトース等の糖類が挙げられる。また、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、ラクチトール等の糖アルコールであってもよい。なかでもスクロースが好ましい。
【００８９】
特に、イソプレノイド産生植物が、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属に属する植物（特に、ヒマワリ）の場合、スクロース、グルコースが好ましく、スクロースがより好ましい。
【００９０】
誘導培地としては、Ｗｈｉｔｅの培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、Ｈｅｌｌｅｒの培地（Ｈｅｌｌｅｒ  Ｒ，  Ｂｏｔ．Ｂｉｏｌ．Ｖｅｇ．Ｐａｒｉｓ  １４  １−２２３（１９５３））、ＳＨ培地（ＳｃｈｅｎｋとＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔの培地）、ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地）（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、ＬＳ培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒとＳｋｏｏｇの培地）（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、Ｇａｍｂｏｒｇ培地、Ｂ５培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、ＭＢ培地、ＷＰ培地（Ｗｏｏｄｙ  Ｐｌａｎｔ：木本類用）等の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に植物生長ホルモンを加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に植物生長ホルモンを加えたものが好ましい。また、カルスの維持および細胞分裂の促進に適しているという理由から、オーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを含むことが好ましい。
【００９１】
誘導培地は、ジャスモン酸、及びモノテルペン化合物からなる群より選択される少なくとも１種を含んでもよい。
モノテルペン化合物としては、Ｄ−リモネン、α−ピネン、β−ピネン、ｌ−メントール、ゲラニオール、カラン、ピナン、ミルセン、オシメン、コスメン等が挙げられる。なかでも、Ｄ−リモネン、α−ピネンが好ましい。
【００９２】
誘導培地を固体培地とする場合、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。固形化剤としては、特に限定されず、寒天、ゲランガム、アガロース、ゲルライト、ゼラチン、シリカゲル等が挙げられる。
【００９３】
好適な誘導培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は以下の組成である。
【００９４】
誘導培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。
【００９５】
誘導培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
なお、本明細書において、微量無機塩類とは、ホウ素、マンガン、亜鉛、銅、モリブデン、塩素、コバルト、チタン、バナジウム、アルミニウム、ケイ素等の培地に少量含有させる無機塩類を意味する。すなわち、微量無機塩類には、カルシウム、マグネシウム、カリウム等の主要無機塩類（培地に多量に含めなければ培養が成立しない無機塩類）は含まれない。上記微量無機塩類のなかでも、ホウ素、マンガン、亜鉛が好ましく、ホウ素、マンガン、亜鉛の合計濃度が上記微量無機塩類の好ましい濃度範囲内であることがより好ましい。
【００９６】
誘導培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは３質量％以下である。なお、本明細書において、炭素源の濃度とは、糖類の濃度を意味する。
【００９７】
誘導培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは３ｍＭ以下である。
【００９８】
誘導培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下である。
【００９９】
誘導培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下である。
【０１００】
誘導培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは１×１０−６質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０１０１】
誘導培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは１×１０−６質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０１０２】
誘導培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３０℃がより好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましい。
なお、本明細書において、固体培地のｐＨは、固形化剤を除く全成分を添加した培地のｐＨを意味する。また、本明細書において、暗所とは、照度が０〜０．１ｌｘであることを意味し、明所とは、照度が０．１ｌｘを超えていることを意味する。
【０１０３】
固体培地の場合、誘導培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【０１０４】
（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属に属する植物（特に、ヒマワリ）の場合）
次に、イソプレノイド産生植物が、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属に属する植物（特に、ヒマワリ）の場合の好適な誘導培地の組成を示す。
【０１０５】
誘導培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。
【０１０６】
誘導培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
上記微量無機塩類のなかでも、ホウ素、マンガン、亜鉛が好ましく、ホウ素、マンガン、亜鉛の合計濃度が上記微量無機塩類の好ましい濃度範囲内であることがより好ましい。
【０１０７】
誘導培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは３質量％以下である。なお、本明細書において、炭素源の濃度とは、糖類の濃度を意味する。
【０１０８】
誘導培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上、更に好ましくは０．１ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは３ｍＭ以下である。
【０１０９】
誘導培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．２ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下である。
【０１１０】
誘導培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．２ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下である。
【０１１１】
誘導培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは１×１０−６質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０１１２】
誘導培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは１×１０−６質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０１１３】
誘導培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３０℃がより好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、０〜０．１ｌｘがより好ましい。
なお、本明細書において、固体培地のｐＨは、固形化剤を除く全成分を添加した培地のｐＨを意味する。
【０１１４】
固体培地の場合、誘導培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【０１１５】
上述の条件のなかでも、照度が０〜０．１ｌｘ（暗所）で、オーキシン系植物ホルモンがナフタレン酢酸又は２，４−ジクロロフェノキシ酢酸で、サイトカイニン系植物ホルモンが、ベンジルアデニン又はカイネチンで、炭素源がスクロース又はグルコースであることが特に好ましい。
【０１１６】
（Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）の場合）
次に、イソプレノイド産生植物が、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）の場合の好適な誘導培地の組成を示す。
【０１１７】
誘導培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上、好ましくは７．５ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。
【０１１８】
誘導培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
上記微量無機塩類のなかでも、ホウ素、マンガン、亜鉛が好ましく、ホウ素、マンガン、亜鉛の合計濃度が上記微量無機塩類の好ましい濃度範囲内であることがより好ましい。
【０１１９】
誘導培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは３質量％以下である。なお、本明細書において、炭素源の濃度とは、糖類の濃度を意味する。
【０１２０】
誘導培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは３ｍＭ以下である。
【０１２１】
誘導培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは５ｍｇ／ｌ以下である。
【０１２２】
誘導培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは２．５ｍｇ／ｌ以下である。
【０１２３】
誘導培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは１×１０−６質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．１質量％以下である。
【０１２４】
誘導培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは１×１０−６質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．１質量％以下である。
【０１２５】
誘導培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３０℃がより好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、０〜０．１ｌｘがより好ましい。
なお、本明細書において、固体培地のｐＨは、固形化剤を除く全成分を添加した培地のｐＨを意味する。
【０１２６】
固体培地の場合、誘導培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【０１２７】
上述の条件のなかでも、オーキシン系植物ホルモンがナフタレン酢酸で、サイトカイニン系植物ホルモンがベンジルアデニンで、炭素源がスクロースであることが特に好ましい。
【０１２８】
（Ｔａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物（特に、カンサイタンポポ）の場合）
次に、イソプレノイド産生植物が、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物（特に、カンサイタンポポ）の場合の好適な誘導培地の組成を示す。
【０１２９】
誘導培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上、更に好ましくは７．５ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。
【０１３０】
誘導培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
上記微量無機塩類のなかでも、ホウ素、マンガン、亜鉛が好ましく、ホウ素、マンガン、亜鉛の合計濃度が上記微量無機塩類の好ましい濃度範囲内であることがより好ましい。
【０１３１】
誘導培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上、更に好ましくは１．５質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは４質量％以下である。なお、本明細書において、炭素源の濃度とは、糖類の濃度を意味する。
【０１３２】
誘導培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上、更に好ましくは０．５ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは５ｍＭ以下である。
【０１３３】
誘導培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下である。
【０１３４】
誘導培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは３ｍｇ／ｌ以下である。
【０１３５】
誘導培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは１×１０−６質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０１３６】
誘導培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは１×１０−６質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０１３７】
誘導培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３０℃がより好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、０〜０．１ｌｘがより好ましい。
なお、本明細書において、固体培地のｐＨは、固形化剤を除く全成分を添加した培地のｐＨを意味する。
【０１３８】
固体培地の場合、誘導培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【０１３９】
上述の条件のなかでも、オーキシン系植物ホルモンがナフタレン酢酸で、サイトカイニン系植物ホルモンがベンジルアデニンで、炭素源がスクロースであることが特に好ましい。
【０１４０】
（Ｆｉｃｕｓ属に属する植物（特に、イチジク）の場合）
次に、イソプレノイド産生植物が、Ｆｉｃｕｓ属に属する植物（特に、イチジク）の場合の好適な誘導培地の組成を示す。
【０１４１】
誘導培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上、更に好ましくは７．５ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。
【０１４２】
誘導培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
上記微量無機塩類のなかでも、ホウ素、マンガン、亜鉛が好ましく、ホウ素、マンガン、亜鉛の合計濃度が上記微量無機塩類の好ましい濃度範囲内であることがより好ましい。
【０１４３】
誘導培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは３質量％以下である。なお、本明細書において、炭素源の濃度とは、糖類の濃度を意味する。
【０１４４】
誘導培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは３ｍＭ以下である。
【０１４５】
誘導培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは２．５ｍｇ／ｌ以下である。
【０１４６】
誘導培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは２．５ｍｇ／ｌ以下である。
【０１４７】
誘導培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは１×１０−６質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０１４８】
誘導培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは１×１０−６質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０１４９】
誘導培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３０℃がより好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、０〜０．１ｌｘがより好ましい。
なお、本明細書において、固体培地のｐＨは、固形化剤を除く全成分を添加した培地のｐＨを意味する。
【０１５０】
固体培地の場合、誘導培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【０１５１】
上述の条件のなかでも、オーキシン系植物ホルモンがナフタレン酢酸で、サイトカイニン系植物ホルモンがベンジルアデニンであり、炭素源がスクロースで、その濃度（スクロース濃度）が３質量％以下であることが特に好ましい。
【０１５２】
（Ｈｅｖｅａ属に属する植物（特に、パラゴムノキ）の場合）
次に、イソプレノイド産生植物が、Ｈｅｖｅａ属に属する植物（特に、パラゴムノキ）の場合の好適な誘導培地の組成を示す。
【０１５３】
誘導培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上、更に好ましくは２０ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは７０ｍＭ以下である。
【０１５４】
誘導培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
なお、本明細書において、微量無機塩類とは、ホウ素、マンガン、亜鉛、銅、モリブデン、塩素、コバルト、チタン、バナジウム、アルミニウム、ケイ素等の培地に少量含有させる無機塩類を意味する。すなわち、微量無機塩類には、カルシウム、マグネシウム、カリウム等の主要無機塩類（培地に多量に含めなければ培養が成立しない無機塩類）は含まれない。上記微量無機塩類のなかでも、ホウ素、マンガン、亜鉛が好ましく、ホウ素、マンガン、亜鉛の合計濃度が上記微量無機塩類の好ましい濃度範囲内であることがより好ましい。
【０１５５】
誘導培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは３質量％以下である。なお、本明細書において、炭素源の濃度とは、糖類の濃度を意味する。
【０１５６】
誘導培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上、更に好ましくは０．１ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは５ｍＭ以下である。
【０１５７】
誘導培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは１ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは１．５ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは３ｍｇ／ｌ以下、特に好ましくは２．５ｍｇ／ｌ以下である。
【０１５８】
誘導培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは０．８ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは３ｍｇ／ｌ以下、特に好ましくは１．５ｍｇ／ｌ以下、最も好ましくは１．２ｍｇ／ｌ以下である。
【０１５９】
誘導培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは１×１０−６質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０１６０】
誘導培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは１×１０−６質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０１６１】
誘導培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３０℃がより好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、０〜０．１ｌｘがより好ましい。
なお、本明細書において、固体培地のｐＨは、固形化剤を除く全成分を添加した培地のｐＨを意味する。
【０１６２】
固体培地の場合、誘導培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【０１６３】
上述の条件のなかでも、オーキシン系植物ホルモンが２，４−ジクロロフェノキシ酢酸で、その濃度が１．５〜２．５ｍｇ／ｌで、サイトカイニン系植物ホルモンがカイネチンで、その濃度が０．８〜１．２ｍｇ／ｌであることが特に好ましい。
【０１６４】
（Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物（特に、ノゲシ）の場合）
次に、イソプレノイド産生植物が、Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物（特に、ノゲシ）の場合の好適な誘導培地の組成を示す。
【０１６５】
誘導培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上、更に好ましくは２０ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは７０ｍＭ以下である。
【０１６６】
誘導培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
上記微量無機塩類のなかでも、ホウ素、マンガン、亜鉛が好ましく、ホウ素、マンガン、亜鉛の合計濃度が上記微量無機塩類の好ましい濃度範囲内であることがより好ましい。
【０１６７】
誘導培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは３質量％以下である。なお、本明細書において、炭素源の濃度とは、糖類の濃度を意味する。
【０１６８】
誘導培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上、更に好ましくは０．１ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは５ｍＭ以下である。
【０１６９】
誘導培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．０５ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは２．５ｍｇ／ｌ以下である。
【０１７０】
誘導培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは０．８ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは３ｍｇ／ｌ以下、特に好ましくは１．５ｍｇ／ｌ以下である。
【０１７１】
誘導培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは１×１０−６質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０１７２】
誘導培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは１×１０−６質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下、更に好ましくは０．０３質量％以下である。
【０１７３】
誘導培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２０〜２６℃がより好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、０〜０．１ｌｘがより好ましい。
なお、本明細書において、固体培地のｐＨは、固形化剤を除く全成分を添加した培地のｐＨを意味する。また、本明細書において、暗所とは、照度が０〜０．１ｌｘであることを意味し、明所とは、照度が０．１ｌｘを超えていることを意味する。
【０１７４】
固体培地の場合、誘導培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【０１７５】
上述の条件のなかでも、オーキシン系植物ホルモンがナフタレン酢酸で、その濃度が０．５〜２．５ｍｇ／ｌで、サイトカイニン系植物ホルモンがベンジルアデニンで、培養温度が２０〜２６℃であることが特に好ましい。
【０１７６】
以上のように、殺菌又は滅菌した組織片を上記誘導培地中で培養することにより、カルスの誘導を行うことが可能である。なお、イソプレノイド産生植物の組織片を上記誘導培地中で培養し、上記誘導培地で継代培養を繰り返すことにより、イソプレノイド産生植物の組織片から誘導された細胞１００質量％中のカルスの割合を２０質量％以上（好ましくは６０質量％以上、より好ましくは９０質量％以上）とすることが可能となり、カルスを効率的、安定的に誘導できる。この誘導工程により誘導されたカルスは、次の増殖工程に使用される。また、特に液体培養の場合、この誘導工程により誘導されたカルスを次の増殖工程に使用せずに直接生産工程に使用してもよい。なお、イソプレノイド産生植物（好ましくはＨｅｖｅａ属に属する植物（特に、パラゴムノキ）、Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物（特に、ノゲシ）、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属に属する植物（特に、ヒマワリ）、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物（特に、タンポポ、カンサイタンポポ）、Ｆｉｃｕｓ属に属する植物（特に、イチジク））の組織片から誘導されたカルスは、イソプレノイドの製造に優れている。
【０１７７】
本発明では、誘導されたカルスの遺伝子を組み替えてもよい。組み換え遺伝子の導入方法は一般的に用いられているものを、通常知られた条件で使用すればよく、例えば、プロトプラスト法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法（以上「生物化学実験法４１植物細胞工学入門」１９９８年９月１日、学会出版センター、第２５５頁〜３２６頁，「植物バイオテクノロジー」２００９年５月２５日、幸書房、第１３０頁〜１３６頁）などがあるが、これらに限らない。
【０１７８】
（増殖工程）
増殖工程では、例えば、誘導工程により誘導されたカルス（上述の方法等により遺伝子が組み替えられていてもよい）を生育培地中で培養して増殖させる。なお、生育培地は、液体であっても固体であってもよい。また、生育培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【０１７９】
生育培地としては、Ｗｈｉｔｅの培地、Ｈｅｌｌｅｒの培地、ＳＨ培地（ＳｃｈｅｎｋとＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔの培地）、ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地）、ＬＳ培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒとＳｋｏｏｇの培地）、Ｇａｍｂｏｒｇ培地、Ｂ５培地、ＭＢ培地、ＷＰ培地（Ｗｏｏｄｙ  Ｐｌａｎｔ：木本類用）等の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に必要に応じて植物生長ホルモンを加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に植物生長ホルモンを加えたものが好ましい。植物生長ホルモン、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。なお、生育培地と誘導培地の組成が同一であってもよい。また、カルスの維持および細胞分裂の促進に適しているという理由から、オーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを含むことが好ましい。
【０１８０】
なお、イソプレノイド産生植物が、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）の場合、植物生長ホルモンとしては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できるが、サイトカイニン系植物ホルモンとしては、ベンジルアデニンがより好ましい。同様に、イソプレノイド産生植物が、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）の場合、炭素源としては、スクロース、マルトース、グルコース、フルクトースが好ましく、マルトース、スクロースがより好ましい。また、イソプレノイド産生植物が、Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物（特に、ノゲシ）の場合、植物生長ホルモン、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できるが、サイトカイニン系植物ホルモンとしては、カイネチンがより好ましく、炭素源としては、スクロース、グルコース、トレハロースが好ましく、スクロースがより好ましい。
【０１８１】
生育培地は、ジャスモン酸、モノテルペン化合物、及び糖アルコールからなる群より選択される少なくとも１種を含んでもよい。なかでも、糖アルコールが好ましいが必須成分ではない。
【０１８２】
モノテルペン化合物としては、Ｄ−リモネン、α−ピネンが好ましく、Ｄ−リモネンがより好ましい。
【０１８３】
糖アルコールとしては、上述のエリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、ラクチトール等が挙げられるが、なかでも、エリスリトールが好ましい。
【０１８４】
生育培地が固体培地の場合、上記誘導培地の場合と同様に、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。
【０１８５】
好適な生育培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は以下の組成である。
【０１８６】
生育培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。
【０１８７】
生育培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
【０１８８】
生育培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下である。生育培地が液体培地の場合には、炭素源の濃度が２〜６質量％であることが更に好ましい。
【０１８９】
生育培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは４ｍＭ以下である。生育培地が液体培地の場合には、カルシウムイオン濃度が１×１０−５〜３ｍＭであることが更に好ましい。
【０１９０】
生育培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは６ｍｇ／ｌ以下である。生育培地が液体培地の場合には、オーキシン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１５ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０１９１】
生育培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは３ｍｇ／ｌ以下である。生育培地が液体培地の場合には、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１０ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０１９２】
生育培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０１９３】
生育培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０１９４】
生育培地中の糖アルコールの濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、更に好ましくは０．０５質量％以上、特に好ましくは０．２０質量％以上、最も好ましくは０．４０質量％以上である。該糖アルコールの濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．７５質量％以下、更に好ましくは０．６０質量％以下である。
【０１９５】
生育培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、固体培地の場合には、５．６〜５．８が更に好ましく、液体培地の場合には５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３６℃がより好ましい。なお、生育培地が液体培地の場合には、培養温度が２３〜３０℃であることが更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましい。なお、液体培養の場合には、暗所で培養を行うことが好ましい。
【０１９６】
固体培地の場合、生育培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【０１９７】
（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属に属する植物（特に、ヒマワリ）の場合）
次に、イソプレノイド産生植物が、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属に属する植物（特に、ヒマワリ）の場合の好適な生育培地の組成を示す。
【０１９８】
生育培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０１９９】
生育培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、更に好ましくは０．０５質量％以上、特に好ましくは０．１０質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．７５質量％以下、更に好ましくは０．５０質量％以下、特に好ましくは０．３０質量％以下である。
【０２００】
生育培地中の糖アルコールの濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、更に好ましくは０．０５質量％以上、特に好ましくは０．２０質量％以上、最も好ましくは０．４０質量％以上である。該糖アルコールの濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．７５質量％以下、更に好ましくは０．６０質量％以下である。
【０２０１】
生育培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５５ｍＭ以下である。
【０２０２】
生育培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
【０２０３】
生育培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは４質量％以下である。生育培地が液体培地の場合には、炭素源の濃度が２〜６質量％であることが更に好ましい。
【０２０４】
生育培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは４ｍＭ以下、更に好ましくは０．５ｍＭ以下である。生育培地が液体培地の場合には、カルシウムイオン濃度が１×１０−５〜３ｍＭであることが更に好ましい。
【０２０５】
生育培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは６ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは２ｍｇ／ｌ以下、特に好ましくは１．２ｍｇ／ｌ以下である。生育培地が液体培地の場合には、オーキシン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１５ｍｇ／ｌであることが更に好ましい。
【０２０６】
生育培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは１．５ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは３ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは２．５ｍｇ／ｌ以下である。生育培地が液体培地の場合には、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１０ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０２０７】
生育培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、固体培地の場合には、５．６〜５．８が更に好ましく、液体培地の場合には５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３６℃がより好ましい。なお、生育培地が液体培地の場合には、培養温度が２３〜３０℃であることが更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましい。なお、液体培養の場合には、暗所で培養を行うことが好ましい。
【０２０８】
固体培地の場合、生育培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【０２０９】
上述の条件のなかでも、オーキシン系植物ホルモンの濃度が０．５〜１．２ｍｇ／ｌで、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が１．５〜２．５ｍｇ／ｌで、窒素濃度が５５ｍＭ以下で、カルシウムイオン濃度が０．５ｍＭ以下であることが特に好ましい。
【０２１０】
（Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）の場合）
次に、イソプレノイド産生植物が、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）の場合の好適な生育培地の組成を示す。
【０２１１】
生育培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上、好ましくは７．５ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは７０ｍＭ以下、更に好ましくは５０ｍＭ以下である。
【０２１２】
生育培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
【０２１３】
生育培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下である。生育培地が液体培地の場合には、炭素源の濃度が２〜６質量％であることが更に好ましい。
【０２１４】
生育培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは４ｍＭ以下、更に好ましくは０．５ｍＭ以下である。生育培地が液体培地の場合には、カルシウムイオン濃度が１×１０−５〜３ｍＭであることが更に好ましい。
【０２１５】
生育培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは６ｍｇ／ｌ以下である。生育培地が液体培地の場合には、オーキシン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１５ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０２１６】
生育培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは３ｍｇ／ｌ以下である。生育培地が液体培地の場合には、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１０ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０２１７】
生育培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０２１８】
生育培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０２１９】
生育培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、固体培地の場合には、５．６〜５．８が更に好ましく、液体培地の場合には５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３６℃がより好ましい。なお、生育培地が液体培地の場合には、培養温度が２３〜３０℃であることが更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、０〜０．１ｌｘがより好ましい。なお、液体培養の場合には、暗所で培養を行うことが好ましい。
【０２２０】
固体培地の場合、生育培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【０２２１】
上述の条件のなかでも、カルシウムイオン濃度が０〜０．５ｍＭであることが特に好ましい。
【０２２２】
（Ｔａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物（特に、カンサイタンポポ）の場合）
次に、イソプレノイド産生植物が、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物（特に、カンサイタンポポ）の場合の好適な生育培地の組成を示す。
【０２２３】
生育培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上、更に好ましくは１０ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは８０ｍＭ以下である。
【０２２４】
生育培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
【０２２５】
生育培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下である。生育培地が液体培地の場合には、炭素源の濃度が２〜６質量％であることが更に好ましい。
【０２２６】
生育培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは４ｍＭ以下である。生育培地が液体培地の場合には、カルシウムイオン濃度が１×１０−５〜３ｍＭであることが更に好ましい。
【０２２７】
生育培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは６ｍｇ／ｌ以下である。生育培地が液体培地の場合には、オーキシン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１５ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０２２８】
生育培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは３ｍｇ／ｌ以下である。生育培地が液体培地の場合には、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１０ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０２２９】
生育培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０２３０】
生育培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０２３１】
生育培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、固体培地の場合には、５．６〜５．８が更に好ましく、液体培地の場合には５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３６℃がより好ましい。なお、生育培地が液体培地の場合には、培養温度が２３〜３０℃であることが更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、１０００〜１０００００ｌｘがより好ましい。なお、液体培養の場合には、暗所で培養を行うことが好ましい。
【０２３２】
固体培地の場合、生育培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【０２３３】
上述の条件のなかでも、オーキシン系植物ホルモンがナフタレン酢酸で、サイトカイニン系植物ホルモンがベンジルアデニンで、炭素源がスクロースで、カルシウムイオン濃度が１×１０−５ｍＭ以上、窒素濃度が１０ｍＭ以上であることが特に好ましい。
【０２３４】
（Ｆｉｃｕｓ属に属する植物（特に、イチジク）の場合）
次に、イソプレノイド産生植物が、Ｆｉｃｕｓ属に属する植物（特に、イチジク）の場合の好適な生育培地の組成を示す。
【０２３５】
生育培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上、更に好ましくは５ｍＭ以上、特に好ましくは２０ｍＭ以上、最も好ましくは４０ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは８０ｍＭ以下、更に好ましくは６０ｍＭ以下である。
【０２３６】
生育培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
【０２３７】
生育培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは３質量％以下である。生育培地が液体培地の場合には、炭素源の濃度が２〜６質量％であることが更に好ましい。
【０２３８】
生育培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは４ｍＭ以下である。生育培地が液体培地の場合には、カルシウムイオン濃度が１×１０−５〜３ｍＭであることが更に好ましい。
【０２３９】
生育培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは６ｍｇ／ｌ以下である。生育培地が液体培地の場合には、オーキシン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１５ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０２４０】
生育培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは３ｍｇ／ｌ以下である。生育培地が液体培地の場合には、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１０ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０２４１】
生育培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０２４２】
生育培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０２４３】
生育培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、固体培地の場合には、５．６〜５．８が更に好ましく、液体培地の場合には５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３６℃がより好ましい。なお、生育培地が液体培地の場合には、培養温度が２３〜３０℃であることが更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、０〜０．１ｌｘがより好ましい。なお、液体培養の場合には、暗所で培養を行うことが好ましい。
【０２４４】
固体培地の場合、生育培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【０２４５】
上述の条件のなかでも、オーキシン系植物ホルモンがナフタレン酢酸で、サイトカイニン系植物ホルモンがベンジルアデニンであり、炭素源がスクロースで、その濃度（スクロース濃度）が３質量％以下で、窒素濃度が６０ｍＭ以下であることが特に好ましい。
【０２４６】
（Ｈｅｖｅａ属に属する植物（特に、パラゴムノキ）の場合）
次に、イソプレノイド産生植物が、Ｈｅｖｅａ属に属する植物（特に、パラゴムノキ）の場合の好適な生育培地の組成を示す。
【０２４７】
生育培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上、更に好ましくは５ｍＭ以上、特に好ましくは３０ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは７０ｍＭ以下である。
【０２４８】
生育培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
【０２４９】
生育培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下である。生育培地が液体培地の場合には、炭素源の濃度が２〜６質量％であることが更に好ましい。
【０２５０】
生育培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは４ｍＭ以下、更に好ましくは３ｍＭ以下である。生育培地が液体培地の場合には、カルシウムイオン濃度が１×１０−５〜３ｍＭであることが更に好ましい。
【０２５１】
生育培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．１ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは１．５ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは６ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは２．５ｍｇ／ｌ以下である。生育培地が液体培地の場合には、オーキシン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１５ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０２５２】
生育培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは０．８ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは３ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは１．２ｍｇ／ｌ以下である。生育培地が液体培地の場合には、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１０ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０２５３】
生育培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０２５４】
生育培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０２５５】
生育培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、固体培地の場合には、５．６〜５．８が更に好ましく、液体培地の場合には５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３６℃がより好ましく、２４〜３６℃が更に好ましい。なお、生育培地が液体培地の場合には、培養温度が２３〜３０℃であることが更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、０〜０．１ｌｘがより好ましい。なお、液体培養の場合には、暗所で培養を行うことが好ましい。
【０２５６】
固体培地の場合、生育培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【０２５７】
上述の条件のなかでも、オーキシン系植物ホルモンが２，４−ジクロロフェノキシ酢酸で、その濃度が１．５〜２．５ｍｇ／ｌで、サイトカイニン系植物ホルモンがカイネチンで、その濃度が０．８〜１．２ｍｇ／ｌで、カルシウムイオン濃度が３ｍＭ以下で、窒素濃度が３０ｍＭ以上であることが特に好ましい。
【０２５８】
（Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物（特に、ノゲシ）の場合）
次に、イソプレノイド産生植物が、Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物（特に、ノゲシ）の場合の好適な生育培地の組成を示す。
【０２５９】
生育培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上、更に好ましくは５ｍＭ以上、特に好ましくは２０ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは８０ｍＭ以下である。
【０２６０】
生育培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
【０２６１】
生育培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下である。生育培地が液体培地の場合には、炭素源の濃度が２〜６質量％であることが更に好ましい。
【０２６２】
生育培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上、更に好ましくは０．５ｍＭ以上、特に好ましくは０．８ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは５ｍＭ以下、更に好ましくは２ｍＭ以下である。生育培地が液体培地の場合には、カルシウムイオン濃度が１×１０−５〜３ｍＭであることが更に好ましい。
【０２６３】
生育培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．１ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは１ｍｇ／ｌ以上、最も好ましくは２．５ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは６ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは３．５ｍｇ／ｌ以下である。生育培地が液体培地の場合には、オーキシン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１５ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０２６４】
生育培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．０５ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは３ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは２ｍｇ／ｌ以下、特に好ましくは１．５ｍｇ／ｌ以下である。生育培地が液体培地の場合には、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１０ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０２６５】
オーキシン系植物ホルモンとサイトカイニン系植物ホルモンの濃度比（オーキシン系植物ホルモンの濃度／サイトカイニン系植物ホルモンの濃度）（好ましくはナフタレン酢酸とカイネチンの濃度比（ナフタレン酢酸の濃度／カイネチンの濃度））は、好ましくは２．２以上、より好ましくは２．５以上、更に好ましくは２．８以上である。また、該比は、好ましくは５．５以下、より好ましくは４．５以下、更に好ましくは４以下、特に好ましくは３．５以下である。
【０２６６】
生育培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下、更に好ましくは０．０１質量％以下である。
【０２６７】
生育培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０２６８】
生育培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、固体培地の場合には、５．６〜５．８が更に好ましく、液体培地の場合には５．６〜５．８が特に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２０〜３６℃がより好ましく、２０〜３２℃が更に好ましい。なお、生育培地が液体培地の場合には、培養温度が２３〜３０℃であることが更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、１０００〜１０００００ｌｘがより好ましい。なお、液体培養の場合には、暗所で培養を行うことが好ましい。
【０２６９】
固体培地の場合、生育培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【０２７０】
上述の条件のなかでも、明所で培養を行い、オーキシン系植物ホルモンがナフタレン酢酸で、その濃度が２．５〜３．５ｍｇ／ｌで、サイトカイニン系植物ホルモンがカイネチンで、その濃度が０．５〜１．５ｍｇ／ｌであることが特に好ましい。
【０２７１】
以上のように、増殖工程では、カルスを上記生育培地中で培養することにより、カルスを増殖させることが可能である。この増殖工程により増殖させたカルスは、次の生産工程に使用される。なお、増殖工程では、カルスの増殖と共にイソプレノイドの生合成を行ってもよいし、イソプレノイドの生合成は行わずに、カルスの増殖のみを行ってもよい。これは、生育培地の組成や増殖工程の培養条件を適宜変更することにより制御可能である。
【０２７２】
なお、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属に属する植物（特に、ヒマワリ）のカルスを上記生育培地中で培養することにより、４週間当たりの質量基準のカルスの生長率を１．５倍以上（好ましくは２倍以上、より好ましくは２．５倍以上）とすることが可能となり、カルスを効率的、安定的に生育できる。
また、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）のカルスを上記生育培地中で培養することにより、４週間当たりの質量基準のカルスの生長率を１．５倍以上（好ましくは２倍以上、より好ましくは２．５倍以上）とすることが可能となり、カルスを効率的、安定的に生育できる。
また、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物（特に、カンサイタンポポ）のカルスを上記生育培地中で培養することにより、４週間当たりの質量基準のカルスの生長率を１．５倍以上（好ましくは２倍以上、より好ましくは２．５倍以上）とすることが可能となり、カルスを効率的、安定的に生育できる。
また、Ｆｉｃｕｓ属に属する植物（特に、イチジク）のカルスを上記生育培地中で培養することにより、４週間当たりの質量基準のカルスの生長率を１．５倍以上（好ましくは２倍以上）とすることが可能となり、カルスを効率的、安定的に生育できる。
また、Ｈｅｖｅａ属に属する植物（特に、パラゴムノキ）のカルスを上記生育培地中で培養することにより、４週間当たりの質量基準のカルスの生長率を１．５倍以上（好ましくは２倍以上）とすることが可能となり、カルスを効率的、安定的に生育できる。
本明細書において、４週間当たりの質量基準のカルスの生長率は、実施例に記載の方法により算出できる。
このように、イソプレノイド産生植物の組織片から誘導されたカルスを上記生育培地中で培養することにより、４週間当たりの質量基準のカルスの生長率を１．５倍以上（好ましくは２倍以上、より好ましくは２．５倍以上）とすることが可能となる。
また、Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物（特に、ノゲシ）のカルスを上記生育培地中で培養することにより、３０日間当たりの質量基準のカルスの生長率を１．５倍以上（好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上）とすることが可能となり、カルスを効率的、安定的に生育できる。３０日間当たりの質量基準のカルスの生長率は、実施例に記載の方法により算出できる。
【０２７３】
（生産工程）
生産工程では、例えば、増殖工程により増殖させたカルスを生産培地で培養し、カルスによりイソプレノイドを生合成する。なお、生産培地は、液体であっても固体であってもよい。また、生産培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。なお、上述のように、生産工程において液体培養を行う場合には、カルスの増殖が比較的速いため、増殖工程と生産工程を明確に分けずに、１つの工程でカルスを増殖させつつ、カルスによりイソプレノイドを生合成することとしてもよい。具体的には、例えば、誘導工程により誘導されたカルス（上述の方法等により遺伝子が組み替えられていてもよい）を液体の生産培地で培養し、カルスによりイソプレノイドを生合成すればよい。
【０２７４】
生産培地としては、Ｗｈｉｔｅの培地、Ｈｅｌｌｅｒの培地、ＳＨ培地（ＳｃｈｅｎｋとＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔの培地）、ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地）、ＬＳ培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒとＳｋｏｏｇの培地）、Ｇａｍｂｏｒｇ培地、Ｂ５培地、ＭＢ培地、ＷＰ培地（Ｗｏｏｄｙ  Ｐｌａｎｔ：木本類用）等の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に必要に応じて植物生長ホルモンを加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に植物生長ホルモンを加えたものが好ましい。植物生長ホルモン、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。なお、生産培地と、誘導培地及び／又は生育培地の組成が同一であってもよい。また、カルスの維持及び細胞分裂の促進に適しているという理由から、オーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを含むことが好ましい。
【０２７５】
なお、イソプレノイド産生植物が、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物（特に、カンサイタンポポ）の場合、植物生長ホルモン、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できるが、サイトカイニン系植物ホルモンとしては、ベンジルアデニン、カイネチンがより好ましく、ベンジルアデニンが更に好ましい。また、イソプレノイド産生植物が、Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物（特に、ノゲシ）の場合、植物生長ホルモン、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できるが、サイトカイニン系植物ホルモンとしては、より分子量の大きなイソプレノイドが得られるという点ではカイネチンがより好ましく、イソプレノイドの生産量を増大できるという点ではゼアチンがより好ましく、炭素源としては、スクロース、グルコースが好ましい。
【０２７６】
また、液体培養を行う場合には、イソプレノイド産生植物が、Ｈｅｖｅａ属に属する植物（特に、パラゴムノキ）の場合、オーキシン系植物ホルモンとしては、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸がより好ましく、サイトカイニン系植物ホルモンとしては、カイネチンがより好ましい。また、液体培養を行う場合には、イソプレノイド産生植物が、Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物（特に、ノゲシ）の場合、オーキシン系植物ホルモンとしては、ナフタレン酢酸がより好ましく、サイトカイニン系植物ホルモンとしてはベンジルアデニンがより好ましい。また、液体培養を行う場合には、イソプレノイド産生植物が、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）の場合、オーキシン系植物ホルモンとしては、ナフタレン酢酸がより好ましく、サイトカイニン系植物ホルモンとしてはベンジルアデニンがより好ましい。
【０２７７】
生産培地は、イソプレノイドの生産を促すという理由から、ジャスモン酸、及びモノテルペン化合物からなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましいが、これらは必須成分ではない。モノテルペン化合物を含む場合、Ｄ−リモネン、α−ピネンが好ましく、Ｄ−リモネンがより好ましい。
【０２７８】
生産培地が固体培地の場合、上記誘導培地の場合と同様に、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。
【０２７９】
好適な生産培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は以下の組成である。
【０２８０】
生産培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。
【０２８１】
生産培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
【０２８２】
生産培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下である。生産培地が液体培地の場合には、炭素源の濃度が２〜６質量％であることが更に好ましい。
【０２８３】
生産培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは４ｍＭ以下である。生産培地が液体培地の場合には、カルシウムイオン濃度が１×１０−５〜３ｍＭであることが更に好ましい。
【０２８４】
生産培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは６ｍｇ／ｌ以下である。生産培地が液体培地の場合には、オーキシン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１５ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０２８５】
生産培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは３ｍｇ／ｌ以下である。生産培地が液体培地の場合には、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１０ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０２８６】
生産培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０２８７】
生産培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０２８８】
生産培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、固体培地の場合には５．６〜５．８が更に好ましく、液体培地の場合には５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３６℃がより好ましい。なお、生産培地が液体培地の場合には、培養温度が２３〜３０℃であることが更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、１０００〜１０００００ｌｘが好ましい。なお、液体培養の場合には、暗所で培養を行うことが好ましい。
【０２８９】
固体培地の場合、生産培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【０２９０】
（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属に属する植物（特に、ヒマワリ）の場合）
次に、イソプレノイド産生植物が、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属に属する植物（特に、ヒマワリ）の場合の好適な生産培地の組成を示す。
【０２９１】
生産培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上、更に好ましくは７．５ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。
【０２９２】
生産培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
【０２９３】
生産培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは３質量％以下である。生産培地が液体培地の場合には、炭素源の濃度が２〜６質量％であることが更に好ましい。
【０２９４】
生産培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上、更に好ましくは０．５ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは４ｍＭ以下である。生産培地が液体培地の場合には、カルシウムイオン濃度が１×１０−５〜３ｍＭであることが更に好ましい。
【０２９５】
生産培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは６ｍｇ／ｌ以下である。生産培地が液体培地の場合には、オーキシン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１５ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０２９６】
生産培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．１ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは３ｍｇ／ｌ以下である。生産培地が液体培地の場合には、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１０ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０２９７】
生産培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０２９８】
生産培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、更に好ましくは０．０５質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０２９９】
生産培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、固体培地の場合には５．６〜５．８が更に好ましく、液体培地の場合には５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３６℃がより好ましい。なお、生産培地が液体培地の場合には、培養温度が２３〜３０℃であることが更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、０〜０．１ｌｘがより好ましい。なお、液体培養の場合には、暗所で培養を行うことが好ましい。
【０３００】
固体培地の場合、生産培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【０３０１】
上述の条件のなかでも、炭素源がスクロースで、その濃度が３質量％以下で、オーキシン系植物ホルモンがナフタレン酢酸で、サイトカイニン系植物ホルモンが、ベンジルアデニンであることが特に好ましい。
【０３０２】
（Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）の場合）
次に、イソプレノイド産生植物が、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）の場合の好適な生産培地の組成を示す。
【０３０３】
生産培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上、更に好ましくは７．５ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは７０ｍＭ以下、更に好ましくは５０ｍＭ以下である。
【０３０４】
生産培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
【０３０５】
生産培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下である。生産培地が液体培地の場合には、炭素源の濃度が２〜６質量％であることが更に好ましい。
【０３０６】
生産培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上、更に好ましくは０．１ｍＭ以上、特に好ましくは０．２ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは４ｍＭ以下、更に好ましくは２．０ｍＭ以下、特に好ましくは１．２ｍＭ以下である。生産培地が液体培地の場合には、カルシウムイオン濃度が１×１０−５〜３ｍＭであることが更に好ましい。
【０３０７】
生産培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは６ｍｇ／ｌ以下である。生産培地が液体培地の場合には、オーキシン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１５ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０３０８】
生産培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．２５ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは７ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは３ｍｇ／ｌ以下、特に好ましくは１．５ｍｇ／ｌ以下である。生産培地が液体培地の場合には、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１０ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０３０９】
生産培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０３１０】
生産培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０３１１】
生産培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３６℃がより好ましい。なお、生産培地が液体培地の場合には、培養温度が２３〜３０℃であることが更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、０〜０．１ｌｘがより好ましい。なお、液体培養の場合には、暗所で培養を行うことが好ましい。
【０３１２】
固体培地の場合、生産培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【０３１３】
上述の条件のなかでも、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が０．５〜１．５ｍｇ／ｌであり、更に、（１）カルシウムイオン濃度が１．０ｍＭ以上、又は（２）カルシウムイオン濃度が０．５ｍＭ以下で、更に、オーキシン系植物ホルモンの濃度が１０ｍｇ／ｌ以上若しくはオーキシン系植物ホルモンの濃度が１ｍｇ／ｌ以下であることが特に好ましい。
【０３１４】
（Ｔａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物（特に、カンサイタンポポ）の場合）
次に、イソプレノイド産生植物が、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物（特に、カンサイタンポポ）の場合の好適な生産培地の組成を示す。
【０３１５】
生産培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上、更に好ましくは７．５ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは７０ｍＭ以下、更に好ましくは５０ｍＭ以下である。
【０３１６】
生産培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
【０３１７】
生産培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上、更に好ましくは１．５質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは３質量％以下である。生産培地が液体培地の場合には、炭素源の濃度が２〜６質量％であることが更に好ましい。
【０３１８】
生産培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上、更に好ましくは０．５ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは４ｍＭ以下である。生産培地が液体培地の場合には、カルシウムイオン濃度が１×１０−５〜３ｍＭであることが更に好ましい。
【０３１９】
生産培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは６ｍｇ／ｌ以下である。生産培地が液体培地の場合には、オーキシン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１５ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０３２０】
生産培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは３ｍｇ／ｌ以下である。生産培地が液体培地の場合には、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１０ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０３２１】
生産培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０３２２】
生産培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．００５質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０３２３】
生産培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３６℃がより好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、０〜０．１ｌｘがより好ましい。
【０３２４】
固体培地の場合、生産培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【０３２５】
上述の条件のなかでも、炭素源がスクロースで、その濃度が３質量％以下で、オーキシン系植物ホルモンがナフタレン酢酸で、サイトカイニン系植物ホルモンが、ベンジルアデニンであることが特に好ましい。
【０３２６】
（Ｆｉｃｕｓ属に属する植物（特に、イチジク）の場合）
次に、イソプレノイド産生植物が、Ｆｉｃｕｓ属に属する植物（特に、イチジク）の場合の好適な生産培地の組成を示す。
【０３２７】
生産培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上、更に好ましくは７．５ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。
【０３２８】
生産培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
【０３２９】
生産培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは３質量％以下である。生産培地が液体培地の場合には、炭素源の濃度が２〜６質量％であることが更に好ましい。
【０３３０】
生産培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは４ｍＭ以下である。生産培地が液体培地の場合には、カルシウムイオン濃度が１×１０−５〜３ｍＭであることが更に好ましい。
【０３３１】
生産培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは６ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは２ｍｇ／ｌ以下である。生産培地が液体培地の場合には、オーキシン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１５ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０３３２】
生産培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは３ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは２ｍｇ／ｌ以下である。生産培地が液体培地の場合には、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１０ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０３３３】
生産培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０３３４】
生産培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０３３５】
生産培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、固体培地の場合には５．６〜５．８が更に好ましく、液体培地の場合にも５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３６℃がより好ましく、２６〜３６℃が更に好ましい。なお、生産培地が液体培地の場合には、培養温度が２３〜３０℃であることが更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、０〜０．１ｌｘがより好ましい。なお、液体培養の場合には、暗所で培養を行うことが好ましい。
【０３３６】
固体培地の場合、生産培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【０３３７】
上述の条件のなかでも、オーキシン系植物ホルモンがナフタレン酢酸で、サイトカイニン系植物ホルモンがベンジルアデニンであり、炭素源がスクロースで、その濃度（スクロース濃度）が３質量％以下で、培養温度が２６℃以上であることが特に好ましい。
【０３３８】
（Ｈｅｖｅａ属に属する植物（特に、パラゴムノキ）の場合）
次に、イソプレノイド産生植物が、Ｈｅｖｅａ属に属する植物（特に、パラゴムノキ）の場合の好適な生産培地の組成を示す。
【０３３９】
生産培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上、更に好ましくは６ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは７０ｍＭ以下である。
【０３４０】
生産培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
【０３４１】
生産培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは５質量％以下である。生産培地が液体培地の場合には、炭素源の濃度が２〜６質量％であることが更に好ましい。
【０３４２】
生産培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは４ｍＭ以下、更に好ましくは３ｍＭ以下である。生産培地が液体培地の場合には、カルシウムイオン濃度が１×１０−５〜３ｍＭであることが更に好ましい。
【０３４３】
生産培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは１．５ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは３ｍｇ／ｌ以下、特に好ましくは２．５ｍｇ／ｌ以下である。生産培地が液体培地の場合には、オーキシン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１５ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０３４４】
生産培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．１ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは３ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは１ｍｇ／ｌ以下である。生産培地が液体培地の場合には、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１０ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０３４５】
生産培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０３４６】
生産培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、更に好ましくは０．０５質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０３４７】
生産培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３６℃がより好ましく、３０〜３６℃が更に好ましく、３２〜３６℃が特に好ましい。なお、生産培地が液体培地の場合には、培養温度が２３〜３４℃であることが更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、０〜０．１ｌｘがより好ましい。なお、液体培養の場合には、暗所で培養を行うことが好ましい。
【０３４８】
固体培地の場合、生産培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【０３４９】
上述の条件のなかでも、オーキシン系植物ホルモンが２，４−ジクロロフェノキシ酢酸で、その濃度が１．５〜２．５ｍｇ／ｌで、サイトカイニン系植物ホルモンがカイネチンで、その濃度が０．５〜１ｍｇ／ｌで、カルシウムイオン濃度が３ｍＭ以下、培養温度が３０℃以上であることが特に好ましい。
【０３５０】
（Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物（特に、ノゲシ）の場合）
次に、イソプレノイド産生植物が、Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物（特に、ノゲシ）の場合の好適な生産培地の組成を示す。
【０３５１】
生産培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上、更に好ましくは７．５ｍＭ以上、特に好ましくは４０ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは７０ｍＭ以下である。
【０３５２】
生産培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
【０３５３】
生産培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上、更に好ましくは２質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下である。生産培地が液体培地の場合には、炭素源の濃度が２〜６質量％であることが更に好ましい。
【０３５４】
生産培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上、更に好ましくは０．５ｍＭ以上、特に好ましくは０．８ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは４ｍＭ以下である。生産培地が液体培地の場合には、カルシウムイオン濃度が１×１０−５〜３ｍＭであることが更に好ましい。
【０３５５】
より分子量の大きなイソプレノイドが得られるという点では、生産培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは０．８ｍｇ／ｌ以上、最も好ましくは２．５ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは６ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは４ｍｇ／ｌ以下、特に好ましくは３．５ｍｇ／ｌ以下である。生産培地が液体培地の場合には、オーキシン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１５ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０３５６】
イソプレノイドの生産量を増大できるという点では、生産培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは６ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは４ｍｇ／ｌ以下、特に好ましくは２．５ｍｇ／ｌ以下である。生産培地が液体培地の場合には、オーキシン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１５ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０３５７】
より分子量の大きなイソプレノイドが得られるという点では、生産培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．１ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは０．３ｍｇ／ｌ以上、最も好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは３ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは１．５ｍｇ／ｌ以下である。生産培地が液体培地の場合には、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１０ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０３５８】
イソプレノイドの生産量を増大できるという点では、生産培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．１ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは３ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは１．０ｍｇ／ｌ以下である。生産培地が液体培地の場合には、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１０ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【０３５９】
より分子量の大きなイソプレノイドが得られるという点では、オーキシン系植物ホルモンとサイトカイニン系植物ホルモンの濃度比（オーキシン系植物ホルモンの濃度／サイトカイニン系植物ホルモンの濃度）（好ましくはナフタレン酢酸とカイネチンの濃度比（ナフタレン酢酸の濃度／カイネチンの濃度））は、好ましくは２．２以上、より好ましくは２．５以上、更に好ましくは２．８以上である。また、該比は、好ましくは５．５以下、より好ましくは４．５以下、更に好ましくは４以下、特に好ましくは３．５以下である。
【０３６０】
イソプレノイドの生産量を増大できるという点では、オーキシン系植物ホルモンとサイトカイニン系植物ホルモンの濃度比（オーキシン系植物ホルモンの濃度／サイトカイニン系植物ホルモンの濃度）（好ましくはナフタレン酢酸とゼアチンの濃度比（ナフタレン酢酸の濃度／ゼアチンの濃度））は、好ましくは２．２以上、より好ましくは２．５以上、更に好ましくは３以上、特に好ましくは３．５以上である。また、該比は、好ましくは５．５以下、より好ましくは５以下、更に好ましくは４．５以下である。
【０３６１】
生産培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０３６２】
生産培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、更に好ましくは０．０５質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０３６３】
生産培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２０〜３６℃がより好ましい。なお、生産培地が液体培地の場合には、培養温度が２３〜３４℃であることが更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、１０００〜１０００００ｌｘがより好ましい。なお、液体培養の場合には、暗所で培養を行うことが好ましい。
【０３６４】
固体培地の場合、生産培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【０３６５】
より分子量の大きなイソプレノイドが得られるという点では、上述の条件のなかでも、明所で培養を行い、オーキシン系植物ホルモンがナフタレン酢酸で、その濃度が２．５〜３．５ｍｇ／ｌで、サイトカイニン系植物ホルモンがカイネチンで、その濃度が０．５〜１．５ｍｇ／ｌであることが特に好ましい。
【０３６６】
イソプレノイドの生産量を増大できるという点では、上述の条件のなかでも、明所で培養を行い、オーキシン系植物ホルモンがナフタレン酢酸で、その濃度が０．５〜２．５ｍｇ／ｌで、サイトカイニン系植物ホルモンがゼアチンで、その濃度が０．１〜１．０ｍｇ／ｌであることが特に好ましい。
【０３６７】
（液体培養の場合）
次に、液体培養を行う場合の好適な液体の生産培地の組成及び培養条件を以下に示す。通常は（特に、イソプレノイド産生植物が、Ｈｅｖｅａ属に属する植物（特に、パラゴムノキ）、Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物（特に、ノゲシ）、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）の場合）以下の組成及び培養条件である。
【０３６８】
生産培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上、更に好ましくは１０ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは７０ｍＭ以下、更に好ましくは５０ｍＭ以下である。
【０３６９】
生産培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下、更に好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
【０３７０】
生産培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは２質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは４質量％以下である。
【０３７１】
生産培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは５ｍＭ以下、更に好ましくは３ｍＭ以下である。Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）の場合、特に好ましくは１ｍＭ以下である。
【０３７２】
生産培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。Ｈｅｖｅａ属に属する植物（特に、パラゴムノキ）の場合、更に好ましくは０．３ｍｇ／ｌ以上である。Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）の場合、更に好ましくは１ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは６ｍｇ／ｌ以下である。Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物（特に、ノゲシ）の場合、特に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以下である。
【０３７３】
生産培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。Ｈｅｖｅａ属に属する植物（特に、パラゴムノキ）の場合、更に好ましくは０．１ｍｇ／ｌ以上である。Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）の場合、更に好ましくは０．３ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは３ｍｇ／ｌ以下である。Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物（特に、ノゲシ）の場合、特に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以下である。
【０３７４】
生産培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０３７５】
生産培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【０３７６】
生産培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２２〜３６℃がより好ましく、２２〜３２℃であることが更に好ましく、２２〜３０℃であることが特に好ましい。Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）の場合、より分子量の大きなイソプレノイドが得られるという点では、２８〜３２℃であることが特に好ましい。一方で、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）の場合、イソプレノイドの生産量を増大できるという点では、２２〜２６℃であることが特に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、０〜０．１ｌｘがより好ましい。培養中の振とう速度は、０〜３００ｒｐｍが好ましく、４０〜２５０ｒｐｍがより好ましい。Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）の場合、より分子量の大きなイソプレノイドが得られるという点では、１００ｒｐｍ以上が更に好ましい。一方で、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）の場合、イソプレノイドの生産量を増大できるという点では、１００ｒｐｍ以下が更に好ましい。
【０３７７】
上述の条件のなかでも、特に、イソプレノイド産生植物が、Ｈｅｖｅａ属に属する植物（特に、パラゴムノキ）の場合、オーキシン系植物ホルモンが２，４−ジクロロフェノキシ酢酸で、その濃度が０．３〜６ｍｇ／ｌであることが特に好ましい。同様に、Ｈｅｖｅａ属に属する植物（特に、パラゴムノキ）の場合、サイトカイニン系植物ホルモンが、カイネチンで、その濃度が０．１〜３ｍｇ／ｌであることが特に好ましい。
また、イソプレノイド産生植物が、Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物（特に、ノゲシ）の場合、オーキシン系植物ホルモンが、ナフタレン酢酸であることが特に好ましく、サイトカイニン系植物ホルモンが、ベンジルアデニンであることが特に好ましい。同様に、Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物（特に、ノゲシ）の場合、微量無機塩類の濃度が２ｍＭ以下であることが特に好ましい。
また、イソプレノイド産生植物が、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）の場合、より分子量の大きなイソプレノイドが得られるという理由から、生産培地中のカルシウムイオン濃度が１×１０−５〜１ｍＭ、培養温度が２８〜３２℃、振とう速度が１００ｒｐｍ以上であることが特に好ましい。また、イソプレノイド産生植物が、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）の場合、イソプレノイドの生産量を増大できるという理由から、生産培地中のカルシウムイオン濃度が１ｍＭ以下、培養温度が２２〜２６℃、振とう速度が１００ｒｐｍ以下であることが特に好ましい。なお、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）の場合、生産培地中のカルシウムイオン濃度を３ｍＭ以下（好ましくは１ｍＭ以下）、培養中の振とう速度を６０〜１００ｒｐｍとすることにより、得られるイソプレノイドの量を増大できる。
【０３７８】
以上のように、イソプレノイド産生植物のカルス（例えば、増殖工程により増殖させたカルス）を生産培地で培養することにより、カルスによりイソプレノイドを生合成できる。カルスにより生合成されたイソプレノイドは、細胞内に蓄積又は細胞外に放出（分泌）される。特に、生産培地（特に液体培地）の培地組成が上記好適な範囲内の場合には、カルスの細胞内にイソプレノイドが蓄積され、更に蓄積されたイソプレノイドが好適に細胞外に放出され、より好適にイソプレノイドを製造することができる。これにより、イソプレノイドの抽出が容易となるだけでなく、連続培養の可能性が広がる。
【０３７９】
細胞内にイソプレノイドが蓄積している場合には、例えば、公知の方法により細胞を破砕し、破砕物からイソプレノイドを公知の方法により抽出することによりイソプレノイドが得られる。また、イソプレノイドが細胞外に放出されている場合は、例えば、培養液から細胞（カルス）を分離した後に、細胞分離後の培養液からイソプレノイドをトルエン・ヘキサン混合溶媒により抽出することによりイソプレノイドが得られる。
【０３８０】
イソプレノイド産生植物の組織片から誘導されたカルス（好ましくは増殖工程により増殖させたカルス）を上記生産培地中で培養することにより、カルスの細胞内に蓄積されているイソプレノイドの量（イソプレノイド細胞内蓄積量）を、カルス乾燥質量に対し、０．００５質量％以上（好ましくは０．０１質量％以上）とすることが可能となり、イソプレノイドを好適に製造できる。ここで、イソプレノイド細胞内蓄積量は、カルスを凍結乾燥させ、該カルスから精製回収したイソプレノイドのカルス乾燥質量に対する割合（質量％）を意味し、実施例に記載の方法により算出できる。
【０３８１】
イソプレノイド産生植物の組織片から誘導されたカルスを上記液体の生産培地中で培養することにより、培地中のイソプレノイドの濃度が、好ましくは０．００１ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．１ｍｇ／ｌ以上とすることが可能となり、イソプレノイドを好適に製造できる。なお、培地中のイソプレノイドの濃度は、実施例に記載の方法により算出できる。
【０３８２】
本発明の製造方法により得られるイソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）が直鎖状に（共）重合した構造を有するゴム（天然ゴム）である。
【０３８３】
イソプレノイドの重量平均分子量（Ｍｗ）は、好ましくは１０００以上、より好ましくは１００００以上、更に好ましくは１０００００以上、特に好ましくは２０００００以上、最も好ましくは１００００００以上である。１０００未満では、ゴムとして利用しにくい傾向がある。また、上記重量平均分子量の上限は、特に限定されない。なお、本明細書において、重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）（東ソー社製ＧＰＣ−８０００シリーズ等、検出器：示差屈折計、ＵＶ）による測定値をもとに標準ポリイソプレン又は標準ポリスチレン換算により求めることができる。具体的には、実施例に記載の方法により測定できる。
【０３８４】
イソプレノイドの数平均分子量（Ｍｎ）は、好ましくは１０００以上、より好ましくは１００００以上、更に好ましくは１０００００以上、特に好ましくは４０００００以上である。１０００未満では、ゴムとして利用しにくい傾向がある。また、上記数平均分子量の上限は、特に限定されない。
なお、本明細書において、数平均分子量（Ｍｎ）は、実施例に記載の方法により測定される値である。
【０３８５】
植物体をカルス化し、カルスを培養することにより、植物（例えば、パラゴムノキの成木）から抽出したイソプレノイドと同等の重量平均分子量のイソプレノイドが生産されたことから、重量平均分子量の大きなイソプレノイドがカルスにより得られる可能性があることを示唆しており、パラゴムノキの成木によらない天然ゴム生産系として画期的な発見である。
【０３８６】
セイタカアワダチソウにおいて、植物体（土に植えた植物）から抽出したイソプレノイドに比べて、カルスにより生合成したイソプレノイドの方が、重量平均分子量が最大で約３倍、数平均分子量が最大で約１０倍大きい傾向が見られた。これは、植物体が製造するイソプレノイドの重量平均分子量が低い場合であっても、該植物体をカルス化することにより、重量平均分子量の大きなイソプレノイドが得られる可能性があることを示唆しており、画期的な発見である。
【０３８７】
また、ヒマワリにおいて、植物体（土に植えた植物）から抽出したイソプレノイドに比べて、カルスにより生合成したイソプレノイドの方が、重量平均分子量が最大で約３倍大きい傾向が見られた。これは、植物体が製造するイソプレノイドの重量平均分子量が低い場合であっても、該植物体をカルス化することにより、重量平均分子量の大きなイソプレノイドが得られる可能性があることを示唆しており、画期的な発見である。
【０３８８】
イソプレノイドに含まれるイソプレンユニット中の１，４−シス構造の含有量は、好ましくは１０モル％以上、より好ましくは３０モル％以上、更に好ましくは６０モル％以上、特に好ましくは９０モル％以上である。１，４−シス構造の含有量の上限は特に限定されない。
１，４−シス構造の含有量は、ＮＭＲにより測定できる。
【０３８９】
本発明のイソプレノイドの製造方法によれば、パラゴムノキの成木に頼らずに、安定的にイソプレノイドを供給できる。
【０３９０】
また、イソプレノイド産生植物（好ましくはＨｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＦｉｃｕｓ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物、より好ましくはパラゴムノキ、ノゲシ、セイタカアワダチソウ、ヒマワリ、タンポポ、カンサイタンポポ、及びイチジクからなる群より選択される少なくとも１種の植物）の組織片から誘導された新規なカルスは、イソプレノイドの製造に優れている。これらのカルスは、本発明のイソプレノイドの製造方法に好適に使用できる。
【０３９１】
また、イソプレノイド産生植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む上記誘導培地中で培養することによりカルスを効率的、安定的に誘導できる。さらに、イソプレノイド産生植物のカルスを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む上記生育培地中で培養することによりカルスを効率的、安定的に生育できる。
【実施例】
【０３９２】
実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。【０３９３】
以下、実施例及び比較例で使用した各種薬品について、まとめて説明する。
ＮＡＡ：ナフタレン酢酸
２，４−Ｄ：２，４−ジクロロフェノキシ酢酸
ＩＢＡ：インドール酪酸
ＢＡ：ベンジルアデニン
ＫＩ：カイネチン
リモネン：Ｄ−リモネン
ピネン：α−ピネン
固形化剤：寒天、アガロース、ゼラチン
パラゴムノキ：東京大学大学院農学生命科学研究科附属  科学の森教育研究センター  樹芸研究所より入手
ノゲシ：神戸市灘区に自生しているノゲシを採取して使用した、又は、神戸市灘区で自生しているノゲシの種子から、無菌的に発芽させた植物体を使用した
セイタカアワダチソウ：兵庫県淡路市、山形県山形市に自生しているセイタカアワダチソウを採取して使用した
ヒマワリ：（株）サカタのタネ製のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ（原産地：北アメリカ）の種子を無菌播種して使用した
タンポポ：神戸市灘区に自生しているタンポポを採取して使用した
カンサイタンポポ：神戸市灘区に自生しているカンサイタンポポを採取して使用した
イチジク：山形県山形市で自生しているイチジクを採取して使用した【０３９４】
実施例１〜３１及び比較例１〜７
各植物体から葉及び／又は茎を採取した。次に、採取した葉及び／又は茎の表面を流水で洗浄し、さらに７０％エタノールで洗浄した後、約５〜１０％に希釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌し、再度流水で洗浄した。【０３９５】
次に、滅菌した葉及び／又は茎の組織を誘導培地（固体培地）に差込み、培養を行った（誘導工程）。各植物のカルス化に用いた誘導培地の組成を表１〜６に示す。誘導培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）を基に、炭素源として糖類を０．２〜３質量％含み、更にオーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを添加し、固形化剤の濃度を０．２〜２質量％とした。また、オートクレーブ（１２１℃、２０分）前に、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した。【０３９６】
オーキシン系植物ホルモンとして、２，４−Ｄ、ＮＡＡ、ＩＢＡのいずれかと、サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンのいずれかを組み合わせて、暗所（０〜０．１ｌｘ）又は明所（１００００ｌｘ）で約１ヶ月培養し、各植物の組織片からカルス（未分化細胞）を誘導した。【０３９７】
次に、誘導されたカルスを約１ヶ月ごとに生育培地（固体培地）で継代培養してカルスを増殖させた（増殖工程）。生育培地は、本実験では誘導培地と同じ組成の培地を使用した。生長したカルスは数分割して、それぞれを植え継ぐことでより増殖させることが可能である。【０３９８】
この増殖工程において、カルス生長率を算出した。カルス生長率は、培養初期のカルス仕込み量（重量）と継代時に測定したカルス重量の差から生長率を算出した。そして、算出したカルス生長率を標準ＭＳ培地で培養したときの生長率を標準として、以下の基準で評価した。なお、比較例１〜７はカルス生長できなかった。
◎：標準より優れる
○：標準と同等
△：生長するものの標準より劣る
×：生長せず【０３９９】
次に、増殖させたカルスを生産培地（固体培地）で培養して、イソプレノイドの生産を行った（生産工程）。生産培地は、本実験では誘導培地と同じ組成の培地を使用した。次に、カルス約７０ｇを生産培地より回収し、液体窒素で凍結させた後、凍結乾燥させて、カルス中の水分を除去した。次いで、水分を除去したカルスを乳鉢で粉砕した後、ソックスレー抽出装置を用いて有機溶媒によりイソプレノイドの抽出を行った。まず、９９％メタノールで抽出を行い、不要な代謝物を除去した。その後９９％トルエンでさらに抽出することで、イソプレノイドを精製回収した。【０４００】
生産工程により製造されたイソプレノイドの量（カルスの細胞内に蓄積されているイソプレノイドの量（イソプレノイド細胞内蓄積量））を算出した。イソプレノイド細胞内蓄積量は、凍結乾燥させたのちのカルス乾燥質量に対し、該カルスから精製回収したイソプレノイドの割合（質量％）により算出した。
◎：０．０１質量％以上
○：０．０１質量％未満
△：検出は可能であるが、定量は不可
×：検出できず【０４０１】
実施例３２〜４３
セイタカアワダチソウを使用した実施例３２〜３９では、実施例１と同様の条件でカルスの誘導を行った。また、ノゲシを使用した実施例４０〜４３では、実施例１９と同様の条件でカルスの誘導を行った。【０４０２】
次に、誘導されたカルスを表７，８に示す液体培地で培養することにより、カルスの増殖（増殖工程）及びイソプレノイドの生産（生産工程）を行った。１〜６０日間培養を行った後、培養液をろ過することにより、培養ろ液を得た。次に、培養ろ液に、トルエン・ヘキサン混合溶媒を加えて混合溶液とし、振とうした。そして、振とうした後、混合溶液を遠心分離し、２相に分離した混合溶液から有機相を回収した。次に、回収した有機相からエバポレータにより溶媒を揮発することにより、培地中からイソプレノイドを精製回収した。【０４０３】
実施例１〜３１では、カルスの細胞内にイソプレノイドが蓄積していることを確認できた。また、実施例３２〜４３では、培地中にイソプレノイドが放出されていることが確認できた。以上の結果により、生合成されたイソプレノイドは、カルスの細胞内に蓄積されると共に、その一部が細胞外に放出されていることが分かった。【０４０４】
得られたイソプレノイドについて下記の評価を行った。結果を表１〜８に示す。【０４０５】
（重量平均分子量）
重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）（東ソー社製ＧＰＣ−８０００シリーズ等、検出器：示差屈折計、ＵＶ）による測定値をもとに標準ポリイソプレン又は標準ポリスチレン換算により求めた。
◎：１０００００以上
○：１００００以上１０００００未満
△：１００００未満
×：検出できず【０４０６】
【表１】
2012099100.tif 000002
【０４０７】
【表２】
2012099100.tif 000003
【０４０８】
【表３】
2012099100.tif 000004
【０４０９】
【表４】
2012099100.tif 000005
【０４１０】
【表５】
2012099100.tif 000006
【０４１１】
【表６】
2012099100.tif 000007
【０４１２】
【表７】
2012099100.tif 000008
【０４１３】
【表８】
2012099100.tif 000009
【０４１４】
表１〜８の結果より、パラゴムノキ、ノゲシ、セイタカアワダチソウ、ヒマワリ、タンポポ、イチジクの葉及び／又は茎から誘導したカルスを培養することにより、イソプレノイドを製造できることが確認できた。また、増殖工程のカルス生長率も非常に優れていた。また、得られたイソプレノイドの重量平均分子量も高かった。【０４１５】
次に、ヒマワリ、セイタカアワダチソウ、カンサイタンポポ、イチジク、パラゴムノキ、ノゲシについて、更に詳細に試験を行った。【０４１６】
（ヒマワリ）
実施例４４〜５１
ヒマワリから葉又は茎を採取した。次に、採取した葉又は茎の表面を流水で洗浄し、さらに７０％エタノールで洗浄した後、約５〜１０％に希釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌し、再度流水で洗浄した。【０４１７】
次に、滅菌した葉又は茎の組織を誘導培地（固体培地）に差込み、培養を行った（誘導工程）。ヒマワリのカルス化に用いた誘導培地の組成を表９に示す。誘導培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）を基に、炭素源として糖類を１〜３質量％含み、更にオーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを添加し、固形化剤の濃度を０．２〜１．１質量％とした。また、オートクレーブ（１２１℃、２０分）前に、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した。【０４１８】
オーキシン系植物ホルモンとして、２，４−Ｄ、ＮＡＡ、ＩＢＡのいずれかと、サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンのいずれかを組み合わせて、暗所（０〜０．１ｌｘ）又は明所（１００００ｌｘ）で約１ヶ月培養し、ヒマワリの組織片からカルス（未分化細胞）を誘導した。【０４１９】
上記誘導培地で継代培養を繰り返した後（合計培養日数：６０日）、目視によりカルスの誘導を確認し、誘導されたカルスの直径が３ｍｍ以上のものをカルスの誘導有りと判断して、以下の基準で評価した。なお、各例についてそれぞれ試験を１８回実施して各々の試験結果の評価を行い、その平均をその例での評価結果とした。結果を表９に示す。
◎：ほぼカルスのみが誘導される（イソプレノイド産生植物の組織片から誘導された細胞１００質量％中のカルスの割合（誘導効率）：９０質量％以上）
○：カルスと共に根または芽も誘導される（誘導効率：６０質量％以上９０質量％未満）
△：カルスと共に根または芽も誘導される（誘導効率：２０質量％以上６０質量％未満）
×：カルスがほとんど誘導されず（誘導効率：２０質量％未満）【０４２０】
【表９】
2012099100.tif 000010
【０４２１】
表９の結果より、誘導培地においてヒマワリの葉や茎から、カルスを新規誘導できることが確認できた。また、誘導効率が非常に優れた条件も確認できた。【０４２２】
次に、誘導されたカルス（表９に示す実施例４４の条件により誘導されたカルス）を約１ヶ月ごとに生育培地（固体培地）で継代培養してカルスを増殖させた（増殖工程）。生育培地の組成を表１０に示す。【０４２３】
この増殖工程において、カルスの生長率を算出した。カルスの生長率は、培養初期のカルス仕込み量（質量）と継代時（本例では、培養２８日間（４週間）終了時）に測定したカルス質量の比率（継代時に測定したカルス質量／培養初期のカルス仕込み量）から算出した。結果を表１０に示す。【０４２４】
【表１０】
2012099100.tif 000011
【０４２５】
表１０の結果より、カルスを生育培地で培養することにより、カルスを生育できることが確認できた。また、カルスの生長率が非常に優れた条件も確認できた。【０４２６】
次に、増殖させたカルス（表１０に示す実施例５２の条件により増殖させたカルス）を生産培地（固体培地）で培養して、イソプレノイドの生産を行った（生産工程）。生産培地の組成を表１１に示す。【０４２７】
生産培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）を基に、炭素源として糖類を１〜３質量％含み、更にオーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを添加し、固形化剤の濃度を０．２〜１．１質量％とした。また、オートクレーブ（１２１℃、２０分）前に、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した。【０４２８】
オーキシン系植物ホルモンとして、２，４−Ｄ、ＮＡＡ、ＩＢＡのいずれかと、サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンのいずれかを組み合わせて、暗所（０〜０．１ｌｘ）又は明所（１００００ｌｘ）で培養し、イソプレノイドの生産を促した。【０４２９】
生産培地で３０日間培養を行った後、カルス約７０ｇを生産培地より回収し、液体窒素で凍結させた後、凍結乾燥させて、カルス中の水分を除去した。次いで、水分を除去したカルスを乳鉢で粉砕した後、ソックスレー抽出装置を用いて有機溶媒によりイソプレノイドの抽出を行った。まず、９９％メタノールで抽出を行い、不要な代謝物を除去した。その後９９％トルエンでさらに抽出することで、イソプレノイドを精製回収した。【０４３０】
生産工程により製造されたイソプレノイドの量（カルスの細胞内に蓄積されているイソプレノイドの量（イソプレノイド細胞内蓄積量））を算出した。イソプレノイド細胞内蓄積量は、凍結乾燥させたのちのカルス乾燥質量に対し、該カルスから精製回収したイソプレノイドの割合（質量％）により算出した。【０４３１】
実施例６４〜６８では、カルスの細胞内にイソプレノイドが蓄積していることを確認できた。以上の結果により、生合成されたイソプレノイドは、カルスの細胞内に蓄積されることが分かった。【０４３２】
得られたイソプレノイドについて下記の評価を行った。結果を表１１に示す。【０４３３】
（重量平均分子量）
下記の条件（１）〜（７）でゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）法により、重量平均分子量（Ｍｗ）を測定した。結果を表１１に示す。
（１）装置：東ソー社製ＨＬＣ−８０２０
（２）分離カラム：東ソー社製ＧＭＨ−ＸＬ
（３）測定温度：４０℃
（４）キャリア：テトラヒドロフラン
（５）流量：０．６ｍＬ／分
（６）検出器：示差屈折、ＵＶ（２１５ｎｍ）
（７）分子量標準：標準ポリイソプレン又は標準ポリスチレン【０４３４】
【表１１】
2012099100.tif 000012
【０４３５】
表１１の結果より、ヒマワリのカルスを培養することにより、イソプレノイドを製造できることが確認できた。また、得られたイソプレノイドの重量平均分子量も高かった。【０４３６】
ヒマワリの葉及び茎から抽出したイソプレノイドの重量平均分子量を測定したところ、５０，０００〜１００，０００（標準ポリイソプレン換算）であった。ヒマワリの植物体から抽出したイソプレノイドの重量平均分子量と、表１１に記載のカルスから得られたイソプレノイドの重量平均分子量とを比較すると、植物体から抽出したイソプレノイドに比べて、カルスにより生合成したイソプレノイドの方が、重量平均分子量が最大で約３倍大きかった。【０４３７】
（セイタカアワダチソウ）
実施例６９〜７６
セイタカアワダチソウから葉又は茎を採取した。次に、採取した葉又は茎の表面を流水で洗浄し、さらに７０％エタノールで洗浄した後、約５〜１０％に希釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌し、再度流水で洗浄した。【０４３８】
次に、滅菌した葉又は茎の組織を誘導培地（固体培地）に差込み、培養を行った（誘導工程）。セイタカアワダチソウのカルス化に用いた誘導培地の組成を表１２に示す。誘導培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）を基に、炭素源として糖類を１〜３質量％含み、更にオーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを添加し、固形化剤の濃度を０．２〜１．１質量％とした。また、オートクレーブ（１２１℃、２０分）前に、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した。【０４３９】
オーキシン系植物ホルモンとして、２，４−Ｄ、ＮＡＡのいずれかと、サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンのいずれかを組み合わせて、暗所（０〜０．１ｌｘ）又は明所（１００００ｌｘ）で約１ヶ月培養し、セイタカアワダチソウの組織片からカルス（未分化細胞）を誘導した。【０４４０】
上記誘導培地で継代培養を繰り返した後（合計培養日数：６０日）、目視によりカルスの誘導を確認し、誘導されたカルスの直径が３ｍｍ以上のものをカルスの誘導有りと判断して、以下の基準で評価した。なお、各例についてそれぞれ試験を１８回実施して各々の試験結果の評価を行い、その平均をその例での評価結果とした。結果を表１２に示す。
◎：ほぼカルスのみが誘導される（イソプレノイド産生植物の組織片から誘導された細胞１００質量％中のカルスの割合（誘導効率）：９０質量％以上）
○：カルスと共に根または芽も誘導される（誘導効率：６０質量％以上９０質量％未満）
△：カルスと共に根または芽も誘導される（誘導効率：２０質量％以上６０質量％未満）
×：カルスがほとんど誘導されず（誘導効率：２０質量％未満）【０４４１】
【表１２】
2012099100.tif 000013
【０４４２】
表１２の結果より、誘導培地においてセイタカアワダチソウの葉や茎から、カルスを新規誘導できることが確認できた。また、誘導効率が非常に優れた条件も確認できた。【０４４３】
次に、誘導されたカルス（表１２に示す実施例６９の条件により誘導されたカルス）を約１ヶ月ごとに生育培地（固体培地）で継代培養してカルスを増殖させた（増殖工程）。生育培地の組成を表１３に示す。【０４４４】
この増殖工程において、カルスの生長率を算出した。カルスの生長率は、培養初期のカルス仕込み量（質量）と継代時（本例では、培養４週間終了時）に測定したカルス質量の比率（継代時に測定したカルス質量／培養初期のカルス仕込み量）から算出した。結果を表１３に示す。【０４４５】
【表１３】
2012099100.tif 000014
【０４４６】
表１３の結果より、カルスを生育培地で培養することにより、カルスを生育できることが確認できた。また、カルスの生長率が非常に優れた条件も確認できた。【０４４７】
次に、増殖させたカルス（表１３に示す実施例７７の条件により増殖させたカルス）を生産培地（固体培地）で培養して、イソプレノイドの生産を行った（生産工程）。生産培地の組成を表１４に示す。【０４４８】
生産培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）を基に、炭素源として糖類を１〜３質量％含み、更にオーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを添加し、固形化剤の濃度を０．２〜１．１質量％とした。また、オートクレーブ（１２１℃、２０分）前に、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した。【０４４９】
オーキシン系植物ホルモンとして、２，４−Ｄ、ＮＡＡのいずれかと、サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニン、カイネチンのいずれかを組み合わせて、暗所（０〜０．１ｌｘ）又は明所（１００００ｌｘ）で培養し、イソプレノイドの生産を促した。【０４５０】
生産培地で３０時間培養を行った後、カルス約７０ｇを生産培地より回収し、液体窒素で凍結させた後、凍結乾燥させて、カルス中の水分を除去した。次いで、水分を除去したカルスを乳鉢で粉砕した後、ソックスレー抽出装置を用いて有機溶媒によりイソプレノイドの抽出を行った。まず、９９％メタノールで抽出を行い、不要な代謝物を除去した。その後９９％トルエンでさらに抽出することで、イソプレノイドを精製回収した。【０４５１】
生産工程により製造されたイソプレノイドの量（カルスの細胞内に蓄積されているイソプレノイドの量（イソプレノイド細胞内蓄積量））を算出した。イソプレノイド細胞内蓄積量は、凍結乾燥させたのちのカルス乾燥質量に対し、該カルスから精製回収したイソプレノイドの割合（質量％）により算出した。【０４５２】
実施例８１〜９０では、カルスの細胞内にイソプレノイドが蓄積していることを確認できた。以上の結果により、生合成されたイソプレノイドは、カルスの細胞内に蓄積されることが分かった。【０４５３】
得られたイソプレノイドについて下記の評価を行った。結果を表１４に示す。【０４５４】
（重量平均分子量（Ｍｗ））
下記の条件（１）〜（７）でゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）法により、重量平均分子量（Ｍｗ）を測定した。結果を表１４に示す。
（１）装置：東ソー社製ＨＬＣ−８０２０
（２）分離カラム：東ソー社製ＧＭＨ−ＸＬ
（３）測定温度：４０℃
（４）キャリア：テトラヒドロフラン
（５）流量：０．６ｍＬ／分
（６）検出器：示差屈折、ＵＶ
（７）分子量標準：標準ポリスチレン【０４５５】
（数平均分子量（Ｍｎ））
下記の条件（８）〜（１４）でゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）法により、数平均分子量（Ｍｎ）を測定した。結果を表１４に示す。
（８）装置：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ａｇｉｌｅｎｔ  １１２０  Ｃｏｍｐａｃｔ  ＬＣ
（９）分離カラム：東ソー社製ＴＯＳＨＯ  ＴＳＫｇｅｌ  ＭｕｌｔｉｐｏｒｅＨＸ  Ｌ−Ｍ
（１０）測定温度：３０℃
（１１）キャリア：テトラヒドロフラン
（１２）流量：１．０ｍＬ／分
（１３）検出器：ＵＶ
（１４）分子量標準：標準ポリスチレン【０４５６】
【表１４】
2012099100.tif 000015
【０４５７】
表１４の結果より、セイタカアワダチソウのカルスを培養することにより、イソプレノイドを製造できることが確認できた。また、得られたイソプレノイドの重量平均分子量も高かった。【０４５８】
セイタカアワダチソウの葉及び茎から抽出したイソプレノイドの重量平均分子量を測定したところ、１００，０００〜３００，０００（標準ポリスチレン換算）であった。セイタカアワダチソウの植物体から抽出したイソプレノイドの重量平均分子量と、表１４に記載のカルスから得られたイソプレノイドの重量平均分子量とを比較すると、植物体から抽出したイソプレノイドに比べて、カルスにより生合成したイソプレノイドの方が、重量平均分子量が最大で約３倍、数平均分子量が最大で約１０倍大きかった。【０４５９】
（カンサイタンポポ）
実施例９１〜９８
カンサイタンポポから葉又は茎を採取した。次に、採取した葉又は茎の表面を流水で洗浄し、さらに７０％エタノールで洗浄した後、約５〜１０％に希釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌し、再度流水で洗浄した。【０４６０】
次に、滅菌した葉又は茎の組織を誘導培地（固体培地）に差込み、培養を行った（誘導工程）。カンサイタンポポのカルス化に用いた誘導培地の組成を表１５に示す。誘導培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）を基に、炭素源として糖類を１〜３質量％含み、更にオーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを添加し、固形化剤の濃度を０．２〜１．１質量％とした。また、オートクレーブ（１２１℃、２０分）前に、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した。【０４６１】
オーキシン系植物ホルモンとして、２，４−Ｄ、ＮＡＡのいずれかと、サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンのいずれかを組み合わせて、暗所（０〜０．１ｌｘ）又は明所（１００００ｌｘ）で約１ヶ月培養し、カンサイタンポポの組織片からカルス（未分化細胞）を誘導した。【０４６２】
上記誘導培地で継代培養を繰り返した後（合計培養日数：６０日）、目視によりカルスの誘導を確認し、誘導されたカルスの直径が３ｍｍ以上のものをカルスの誘導有りと判断して、以下の基準で評価した。なお、各例についてそれぞれ試験を１８回実施して各々の試験結果の評価を行い、その平均をその例での評価結果とした。結果を表１５に示す。
◎：ほぼカルスのみが誘導される（イソプレノイド産生植物の組織片から誘導された細胞１００質量％中のカルスの割合（誘導効率）：９０質量％以上）
○：カルスと共に根または芽も誘導される（誘導効率：６０質量％以上９０質量％未満）
△：カルスと共に根または芽も誘導される（誘導効率：２０質量％以上６０質量％未満）
×：カルスがほとんど誘導されず（誘導効率：２０質量％未満）【０４６３】
【表１５】
2012099100.tif 000016
【０４６４】
表１５の結果より、誘導培地においてカンサイタンポポの葉や茎から、カルスを新規誘導できることが確認できた。また、誘導効率が非常に優れた条件も確認できた。【０４６５】
次に、誘導されたカルス（表１５に示す実施例９１の条件により誘導されたカルス）を約１ヶ月ごとに生育培地（固体培地）で継代培養してカルスを増殖させた（増殖工程）。生育培地の組成を表１６に示す。【０４６６】
この増殖工程において、カルスの生長率を算出した。カルスの生長率は、培養初期のカルス仕込み量（質量）と継代時（本例では、培養２８日間（４週間）終了時）に測定したカルス質量の比率（継代時に測定したカルス質量／培養初期のカルス仕込み量）から算出した。結果を表１６に示す。【０４６７】
【表１６】
2012099100.tif 000017
【０４６８】
表１６の結果より、生育培地においてカンサイタンポポのカルスを増殖できることを確認できた。また、カルスの生長率が非常に優れた条件も確認できた。【０４６９】
次に、増殖させたカルス（表１６に示す実施例９９の条件により増殖させたカルス）を生産培地（固体培地）で培養して、イソプレノイドの生産を行った（生産工程）。生産培地の組成を表１７に示す。【０４７０】
生産培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）を基に、炭素源として糖類を１〜３質量％含み、更にオーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを添加し、固形化剤の濃度を０．２〜１．１質量％とした。また、オートクレーブ（１２１℃、２０分）前に、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した。【０４７１】
オーキシン系植物ホルモンとして、２，４−Ｄ、ＮＡＡ、ＩＢＡのいずれかと、サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンのいずれかを組み合わせて、暗所（０〜０．１ｌｘ）又は明所（１００００ｌｘ）で培養し、イソプレノイドの生産を促した。【０４７２】
生産培地で３０日間培養を行った後、カルス約７０ｇを生産培地より回収し、液体窒素で凍結させた後、凍結乾燥させて、カルス中の水分を除去した。次いで、水分を除去したカルスを乳鉢で粉砕した後、ソックスレー抽出装置を用いて有機溶媒によりイソプレノイドの抽出を行った。まず、９９％メタノールで抽出を行い、不要な代謝物を除去した。その後９９％トルエンでさらに抽出することで、イソプレノイドを精製回収した。【０４７３】
生産工程により製造されたイソプレノイドの量（カルスの細胞内に蓄積されているイソプレノイドの量（イソプレノイド細胞内蓄積量））を算出した。イソプレノイド細胞内蓄積量は、凍結乾燥させたのちのカルス乾燥質量に対し、該カルスから精製回収したイソプレノイドの割合（質量％）により算出した。【０４７４】
実施例１０８〜１１３では、カルスの細胞内にイソプレノイドが蓄積していることを確認できた。以上の結果により、生合成されたイソプレノイドは、カルスの細胞内に蓄積されることが分かった。【０４７５】
得られたイソプレノイドについて下記の評価を行った。結果を表１７に示す。【０４７６】
（重量平均分子量）
下記の条件（１）〜（７）でゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）法により、重量平均分子量（Ｍｗ）を測定した。結果を表１７に示す。
（１）装置：東ソー社製ＨＬＣ−８０２０
（２）分離カラム：東ソー社製ＧＭＨ−ＸＬ
（３）測定温度：４０℃
（４）キャリア：テトラヒドロフラン
（５）流量：０．６ｍＬ／分
（６）検出器：示差屈折、ＵＶ（２１５ｎｍ）
（７）分子量標準：標準ポリイソプレン又は標準ポリスチレン【０４７７】
【表１７】
2012099100.tif 000018
【０４７８】
表１７の結果より、カンサイタンポポのカルスを培養することにより、イソプレノイドを製造できることが確認できた。また、得られたイソプレノイドの重量平均分子量も高かった。【０４７９】
カンサイタンポポの葉及び茎から抽出したイソプレノイドの重量平均分子量を測定したところ、８００，０００程度（標準ポリイソプレン換算）であった。【０４８０】
（イチジク）
実施例１１４〜１２１
イチジクから葉又は茎を採取した。次に、採取した葉又は茎の表面を流水で洗浄し、さらに７０％エタノールで洗浄した後、約５〜１０％に希釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌し、再度流水で洗浄した。【０４８１】
次に、滅菌した葉又は茎の組織を誘導培地（固体培地）に差込み、培養を行った（誘導工程）。イチジクのカルス化に用いた誘導培地の組成を表１８に示す。誘導培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）を基に、炭素源として糖類を１〜３質量％含み、更にオーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを添加し、固形化剤の濃度を０．２〜１．１質量％とした。また、オートクレーブ（１２１℃、２０分）前に、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した。【０４８２】
オーキシン系植物ホルモンとして、２，４−Ｄ、ＮＡＡのいずれかと、サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンのいずれかを組み合わせて、暗所（０〜０．１ｌｘ）又は明所（１００００ｌｘ）で約１ヶ月培養し、イチジクの組織片からカルス（未分化細胞）を誘導した。【０４８３】
上記誘導培地で継代培養を繰り返した後（合計培養日数：６０日）、目視によりカルスの誘導を確認し、誘導されたカルスの直径が３ｍｍ以上のものをカルスの誘導有りと判断して、以下の基準で評価した。なお、各例についてそれぞれ試験を１８回実施して各々の試験結果の評価を行い、その平均をその例での評価結果とした。結果を表１８に示す。
◎：ほぼカルスのみが誘導される（イソプレノイド産生植物の組織片から誘導された細胞１００質量％中のカルスの割合（誘導効率）：９０質量％以上）
○：カルスと共に根または芽も誘導される（誘導効率：６０質量％以上９０質量％未満）
△：カルスと共に根または芽も誘導される（誘導効率：２０質量％以上６０質量％未満）
×：カルスがほとんど誘導されず（誘導効率：２０質量％未満）【０４８４】
【表１８】
2012099100.tif 000019
【０４８５】
表１８の結果より、誘導培地においてイチジクの葉や茎から、カルスを新規誘導できることが確認できた。また、誘導効率が非常に優れた条件も確認できた。【０４８６】
次に、誘導されたカルス（表１８に示す実施例１１５の条件により誘導されたカルス）を約１ヶ月ごとに生育培地（固体培地）で継代培養してカルスを増殖させた（増殖工程）。生育培地の組成を表１９に示す。【０４８７】
この増殖工程において、カルスの生長率を算出した。カルスの生長率は、培養初期のカルス仕込み量（質量）と継代時（本例では、培養２８日間（４週間）終了時）に測定したカルス質量の比率（継代時に測定したカルス質量／培養初期のカルス仕込み量）から算出した。結果を表１９に示す。【０４８８】
【表１９】
2012099100.tif 000020
【０４８９】
表１９の結果より、カルスを生育培地で培養することにより、カルスを生育できることが確認できた。また、カルスの生長率が非常に優れた条件も確認できた。【０４９０】
次に、増殖させたカルス（表１９に示す実施例１２２の条件により増殖させたカルス）を生産培地（固体培地）で培養して、イソプレノイドの生産を行った（生産工程）。生産培地の組成を表２０に示す。【０４９１】
生産培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）を基に、炭素源として糖類を１〜３質量％含み、更にオーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを添加し、固形化剤の濃度を０．２〜１．１質量％とした。また、オートクレーブ（１２１℃、２０分）前に、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した。【０４９２】
オーキシン系植物ホルモンとして、２，４−Ｄ、ＮＡＡ、ＩＢＡのいずれかと、サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンのいずれかを組み合わせて、暗所（０〜０．１ｌｘ）又は明所（１００００ｌｘ）で培養し、イソプレノイドの生産を促した。【０４９３】
生産培地で３０日間培養を行った後、カルス約７０ｇを生産培地より回収し、液体窒素で凍結させた後、凍結乾燥させて、カルス中の水分を除去した。次いで、水分を除去したカルスを乳鉢で粉砕した後、ソックスレー抽出装置を用いて有機溶媒によりイソプレノイドの抽出を行った。まず、９９％メタノールで抽出を行い、不要な代謝物を除去した。その後９９％トルエンでさらに抽出することで、イソプレノイドを精製回収した。【０４９４】
生産工程により製造されたイソプレノイドの量（カルスの細胞内に蓄積されているイソプレノイドの量（イソプレノイド細胞内蓄積量））を算出した。イソプレノイド細胞内蓄積量は、凍結乾燥させたのちのカルス乾燥質量に対し、該カルスから精製回収したイソプレノイドの割合（質量％）により算出した。【０４９５】
実施例１２８〜１３４では、カルスの細胞内にイソプレノイドが蓄積していることを確認できた。以上の結果により、生合成されたイソプレノイドは、カルスの細胞内に蓄積されることが分かった。【０４９６】
得られたイソプレノイドについて下記の評価を行った。結果を表２０に示す。【０４９７】
（重量平均分子量（Ｍｗ））
下記の条件（１）〜（７）でゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）法により、重量平均分子量（Ｍｗ）を測定した。結果を表２０に示す。
（１）装置：東ソー社製ＨＬＣ−８０２０
（２）分離カラム：東ソー社製ＧＭＨ−ＸＬ
（３）測定温度：４０℃
（４）キャリア：テトラヒドロフラン
（５）流量：０．６ｍＬ／分
（６）検出器：示差屈折、ＵＶ
（７）分子量標準：標準ポリスチレン【０４９８】
（数平均分子量（Ｍｎ））
下記の条件（８）〜（１４）でゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）法により、数平均分子量（Ｍｎ）を測定した。結果を表２０に示す。
（８）装置：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ａｇｉｌｅｎｔ  １１２０  Ｃｏｍｐａｃｔ  ＬＣ
（９）分離カラム：東ソー社製ＴＯＳＨＯ  ＴＳＫｇｅｌ  ＭｕｌｔｉｐｏｒｅＨＸ  Ｌ−Ｍ
（１０）測定温度：３０℃
（１１）キャリア：テトラヒドロフラン
（１２）流量：１．０ｍＬ／分
（１３）検出器：ＵＶ
（１４）分子量標準：標準ポリスチレン【０４９９】
【表２０】
2012099100.tif 000021
【０５００】
表２０の結果より、イチジクのカルスを培養することにより、イソプレノイドを製造できることが確認できた。また、得られたイソプレノイドの重量平均分子量も高かった。【０５０１】
イチジクの葉及び茎から抽出したイソプレノイドの重量平均分子量を測定したところ、５００，０００程度（標準ポリスチレン換算）であった。【０５０２】
（パラゴムノキ）
実施例１３５〜１４６
パラゴムノキから茎を採取した。次に、採取した茎の表面を流水で洗浄し、さらに７０％エタノールで洗浄した後、約５〜１０％に希釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌し、再度流水で洗浄した。【０５０３】
次に、滅菌した茎の組織を誘導培地（固体培地）に差込み、培養を行った（誘導工程）。パラゴムノキのカルス化に用いた誘導培地の組成を表２１に示す。誘導培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）を基に、炭素源として糖類を３質量％含み、更にオーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを添加し、固形化剤の濃度を１．１質量％とした。また、オートクレーブ（１２１℃、２０分）前に、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した。【０５０４】
オーキシン系植物ホルモンとして、２，４−Ｄと、サイトカイニン系植物ホルモンとしてカイネチンを組み合わせて、暗所（０〜０．１ｌｘ）で約１ヶ月培養し、パラゴムノキの組織片からカルス（未分化細胞）を誘導した。【０５０５】
上記誘導培地で継代培養を繰り返した後（合計培養日数：９０日）、目視によりカルスの誘導を確認し、誘導されたカルスの直径が３ｍｍ以上のものをカルスの誘導有りと判断して、以下の基準で評価した。なお、各例についてそれぞれ試験を１８回実施して各々の試験結果の評価を行い、その平均をその例での評価結果とした。結果を表２１に示す。
◎：ほぼカルスのみが誘導される（イソプレノイド産生植物の組織片から誘導された細胞１００質量％中のカルスの割合（誘導効率）：９０質量％以上）
○：カルスと共に根または芽も誘導される（誘導効率：６０質量％以上９０質量％未満）
△：カルスと共に根または芽も誘導される（誘導効率：２０質量％以上６０質量％未満）
×：カルスがほとんど誘導されず（誘導効率：２０質量％未満）【０５０６】
【表２１】
2012099100.tif 000022
【０５０７】
表２１の結果より、誘導培地においてパラゴムノキの茎から、カルスを新規誘導できることが確認できた。また、誘導効率が非常に優れた条件も確認できた。【０５０８】
次に、誘導されたカルス（表２１に示す実施例１４１の条件により誘導されたカルス）を約１ヶ月ごとに生育培地（固体培地）で継代培養してカルスを増殖させた（増殖工程）。生育培地の組成を表２２に示す。【０５０９】
生育培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）を基に、炭素源として糖類を２〜６質量％含み、更にオーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを添加し、固形化剤の濃度を０．２〜１．１質量％とした。また、オートクレーブ（１２１℃、２０分）前に、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した。【０５１０】
オーキシン系植物ホルモンとして、２，４−Ｄ、ＮＡＡ、ＩＢＡのいずれかと、サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンのいずれかを組み合わせて、暗所（０〜０．１ｌｘ）又は明所（１００００ｌｘ）で培養し、カルスの生育を促した。【０５１１】
この増殖工程において、カルスの生長率を算出した。カルスの生長率は、培養初期のカルス仕込み量（質量）と継代時（本例では、培養２８日間（４週間）終了時）に測定したカルス質量の比率（継代時に測定したカルス質量／培養初期のカルス仕込み量）から算出した。結果を表２２に示す。【０５１２】
【表２２】
2012099100.tif 000023
【０５１３】
表２２の結果より、カルスを生育培地で培養することにより、カルスを生育できることが確認できた。また、カルスの生長率が非常に優れた条件も確認できた。【０５１４】
次に、増殖させたカルス（実施例１６０〜１６５については、表２２に示す実施例１４７の条件により増殖させたカルス、実施例１６６〜１７１については、表２２に示す実施例１４９の条件により増殖させたカルス）を生産培地（固体培地）で培養して、イソプレノイドの生産を行った（生産工程）。生産培地の組成を表２３に示す。【０５１５】
生産培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）を基に、炭素源として糖類を２〜６質量％含み、更にオーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを添加し、固形化剤の濃度を０．２〜１．１質量％とした。また、オートクレーブ（１２１℃、２０分）前に、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した。【０５１６】
オーキシン系植物ホルモンとして、２，４−Ｄ、ＮＡＡ、ＩＢＡのいずれかと、サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンのいずれかを組み合わせて、暗所（０〜０．１ｌｘ）又は明所（１００００ｌｘ）で培養し、イソプレノイドの生産を促した。【０５１７】
生産培地で３０日間培養を行った後、カルス約７０ｇを生産培地より回収し、液体窒素で凍結させた後、凍結乾燥させて、カルス中の水分を除去した。次いで、水分を除去したカルスを乳鉢で粉砕した後、ソックスレー抽出装置を用いて有機溶媒によりイソプレノイドの抽出を行った。まず、９９％メタノールで抽出を行い、不要な代謝物を除去した。その後９９％トルエンでさらに抽出することで、イソプレノイドを精製回収した。【０５１８】
生産工程により製造されたイソプレノイドの量（カルスの細胞内に蓄積されているイソプレノイドの量（イソプレノイド細胞内蓄積量））を算出した。イソプレノイド細胞内蓄積量は、凍結乾燥させたのちのカルス乾燥質量に対し、該カルスから精製回収したイソプレノイドの割合（質量％）により算出した。【０５１９】
実施例１６０〜１７１では、カルスの細胞内にイソプレノイドが蓄積していることを確認できた。以上の結果により、生合成されたイソプレノイドは、カルスの細胞内に蓄積されることが分かった。【０５２０】
得られたイソプレノイドについて下記の評価を行った。結果を表２３に示す。【０５２１】
実施例１６０〜１７１では、下記の条件（１）〜（７）でゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）法により、重量平均分子量（Ｍｗ）を測定した。
（１）装置：東ソー社製ＨＬＣ−８０２０
（２）分離カラム：東ソー社製ＧＭＨ−ＸＬ
（３）測定温度：４０℃
（４）キャリア：テトラヒドロフラン
（５）流量：０．６ｍＬ／分
（６）検出器：示差屈折、ＵＶ
（７）分子量標準：標準ポリイソプレン又は標準ポリスチレン【０５２２】
実施例１６０〜１６５では、下記の条件（８）〜（１４）でゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）法により、数平均分子量（Ｍｎ）を測定した。
（８）装置：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ａｇｉｌｅｎｔ  １１２０  Ｃｏｍｐａｃｔ  ＬＣ
（９）分離カラム：東ソー社製ＴＯＳＨＯ  ＴＳＫｇｅｌ  ＭｕｌｔｉｐｏｒｅＨＸ  Ｌ−Ｍ
（１０）測定温度：３０℃
（１１）キャリア：テトラヒドロフラン
（１２）流量：１．０ｍＬ／分
（１３）検出器：ＵＶ
（１４）分子量標準：標準ポリスチレン【０５２３】
【表２３】
2012099100.tif 000024
【０５２４】
表２３の結果より、パラゴムノキのカルスを培養することにより、イソプレノイドを製造できることが確認できた。また、得られたイソプレノイドの重量平均分子量も高かった。【０５２５】
パラゴムノキのラテックスから抽出したイソプレノイドの重量平均分子量（ポリスチレン換算）を測定したところ、１，０００，０００程度であった。従って、表２３の結果より、カルスにおいても、パラゴムノキの成木と同等の重量平均分子量のイソプレノイドを生産できることが分かった。【０５２６】
（ノゲシ）
実施例１７２〜１８３
ノゲシから葉又は茎を採取した。次に、採取した葉又は茎の表面を流水で洗浄し、さらに７０％エタノールで洗浄した後、約５〜１０％に希釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌し、再度流水で洗浄した。【０５２７】
次に、滅菌した葉又は茎の組織を誘導培地（固体培地）に差込み、培養を行った（誘導工程）。ノゲシのカルス化に用いた誘導培地の組成を表２４に示す。誘導培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）を基に、炭素源として糖類を３質量％含み、更にオーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを添加し、固形化剤の濃度を１．１質量％とした。また、オートクレーブ（１２１℃、２０分）前に、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した。【０５２８】
オーキシン系植物ホルモンとして、ナフタレン酢酸と、サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニンを組み合わせて、暗所（０〜０．１ｌｘ）又は明所（１００００ｌｘ）で約１ヶ月培養し、ノゲシの組織片からカルス（未分化細胞）を誘導した。【０５２９】
上記誘導培地で継代培養を繰り返した後（合計培養日数：６０日）、目視によりカルスの誘導を確認し、誘導されたカルスの直径が３ｍｍ以上のものをカルスの誘導有りと判断して、以下の基準で評価した。なお、各例についてそれぞれ試験を１８回実施して各々の試験結果の評価を行い、その平均をその例での評価結果とした。結果を表２４に示す。
◎：ほぼカルスのみが誘導される（イソプレノイド産生植物の組織片から誘導された細胞１００質量％中のカルスの割合（誘導効率）：９０質量％以上）
○：カルスと共に根または芽も誘導される（誘導効率：６０質量％以上９０質量％未満）
△：カルスと共に根または芽も誘導される（誘導効率：２０質量％以上６０質量％未満）
×：カルスがほとんど誘導されず（誘導効率：２０質量％未満）【０５３０】
【表２４】
2012099100.tif 000025
【０５３１】
表２４の結果より、誘導培地においてノゲシの葉又は茎から、カルスを新規誘導できることが確認できた。また、誘導効率が非常に優れた条件も確認できた。【０５３２】
次に、誘導されたカルス（表２４に示す実施例１７２の条件により誘導されたカルス）を約１ヶ月ごとに生育培地（固体培地）で継代培養してカルスを増殖させた（増殖工程）。生育培地の組成を表２５〜３１に示す。【０５３３】
生育培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）を基に、炭素源として糖類を１〜５質量％含み、更にオーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを添加し、固形化剤の濃度を０．２質量％とした。また、オートクレーブ（１２１℃、２０分）前に、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した。【０５３４】
オーキシン系植物ホルモンとして、２，４−Ｄ、ＮＡＡ、ＩＢＡのいずれかと、サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンのいずれかを組み合わせて、暗所（０〜０．１ｌｘ）又は明所（１００００ｌｘ）で培養し、カルスの生育を促した。【０５３５】
この増殖工程において、カルスの生長率を算出した。カルスの生長率は、培養初期のカルス仕込み量（質量）と継代時（本例では、培養３０日間終了時）に測定したカルス質量の比率（継代時に測定したカルス質量／培養初期のカルス仕込み量）から算出した。結果を表２５〜３１に示す。【０５３６】
【表２５】
2012099100.tif 000026
【０５３７】
【表２６】
2012099100.tif 000027
【０５３８】
【表２７】
2012099100.tif 000028
【０５３９】
【表２８】
2012099100.tif 000029
【０５４０】
【表２９】
2012099100.tif 000030
【０５４１】
【表３０】
2012099100.tif 000031
【０５４２】
【表３１】
2012099100.tif 000032
【０５４３】
表２５〜３１の結果より、カルスを生育培地で培養することにより、カルスを生育できることが確認できた。また、カルスの生長率が非常に優れた条件も確認できた。【０５４４】
次に、増殖させたカルス（表２９に示す実施例２２３の条件により増殖させたカルス）を生産培地（固体培地）で培養して、イソプレノイドの生産を行った（生産工程）。生産培地の組成を表３２〜３４に示す。【０５４５】
生産培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）を基に、炭素源として糖類を１〜５質量％含み、更にオーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを添加し、固形化剤の濃度を０．２質量％とした。また、オートクレーブ（１２１℃、２０分）前に、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した。【０５４６】
オーキシン系植物ホルモンとして、２，４−Ｄ、ＮＡＡ、ＩＢＡのいずれかと、サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンのいずれかを組み合わせて、暗所（０〜０．１ｌｘ）又は明所（１００００ｌｘ）で培養し、イソプレノイドの生産を促した。【０５４７】
生産培地で３０日間培養を行った後、カルス約７０ｇを生産培地より回収し、液体窒素で凍結させた後、凍結乾燥させて、カルス中の水分を除去した。次いで、水分を除去したカルスを乳鉢で粉砕した後、ソックスレー抽出装置を用いて有機溶媒によりイソプレノイドの抽出を行った。まず、９９％メタノールで抽出を行い、不要な代謝物を除去した。その後９９％トルエンでさらに抽出することで、イソプレノイドを精製回収した。【０５４８】
生産工程により製造されたイソプレノイドの量（カルスの細胞内に蓄積されているイソプレノイドの量（イソプレノイド細胞内蓄積量））を算出した。イソプレノイド細胞内蓄積量は、凍結乾燥させたのちのカルス乾燥質量に対し、該カルスから精製回収したイソプレノイドの割合（質量％）により算出した。【０５４９】
実施例２３７〜２６２では、カルスの細胞内にイソプレノイドが蓄積していることを確認できた。以上の結果により、生合成されたイソプレノイドは、カルスの細胞内に蓄積されることが分かった。【０５５０】
得られたイソプレノイドについて下記の評価を行った。結果を表３２〜３４に示す。【０５５１】
（重量平均分子量）
下記の条件（１）〜（７）でゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）法により、重量平均分子量（Ｍｗ）を測定した。結果を表３２〜３４に示す。
（１）装置：東ソー社製ＨＬＣ−８０２０
（２）分離カラム：東ソー社製ＧＭＨ−ＸＬ
（３）測定温度：４０℃
（４）キャリア：テトラヒドロフラン
（５）流量：０．６ｍＬ／分
（６）検出器：示差屈折、ＵＶ（２１５ｎｍ）
（７）分子量標準：標準ポリイソプレン【０５５２】
【表３２】
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【０５５３】
【表３３】
2012099100.tif 000034
【０５５４】
【表３４】
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【０５５５】
表３２〜３４の結果より、ノゲシのカルスを培養することにより、イソプレノイドを製造できることが確認できた。また、得られたイソプレノイドの重量平均分子量も高かった。【０５５６】
ノゲシの葉及び茎から抽出したイソプレノイドの重量平均分子量（分子量標準：標準ポリイソプレン）を測定したところ、３００，０００〜１，０００，０００程度であった。従って、表３２〜３４の結果より、カルスにおいても、植物から抽出したイソプレノイドと同等の重量平均分子量のイソプレノイドを生産できることが分かった。【０５５７】
（液体培養）
各植物体（パラゴムノキ、ノゲシ、セイタカアワダチソウ）から葉及び茎を採取した。次に、採取した葉及び茎の表面を流水で洗浄し、さらに７０％エタノールで洗浄した後、約５〜１０％に希釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌し、再度流水で洗浄した。【０５５８】
次に、滅菌した葉及び茎の組織を誘導培地（固体培地）に差込み、培養を行った（誘導工程）。各植物のカルス化に用いた誘導培地の組成を表３５に示す。誘導培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）を基に、炭素源として糖類を含み、更にオーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを添加した。また、オートクレーブ（１２１℃、２０分）前に、培地のｐＨを５．６〜５．８に調整した。
各植物の組織片を表３５に示す誘導培地（固体培地）で、暗所（０〜０．１ｌｘ）又は明所（１００００ｌｘ）で約１ヶ月培養し、各植物の組織片からカルス（未分化細胞）を誘導した。【０５５９】
【表３５】
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【０５６０】
次に、誘導されたカルスを生産培地（液体培地）で培養して、イソプレノイドの生産を行った（生産工程）。生産培地の組成を表３６〜３８に示す。生産培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）を基に、炭素源として糖類を含み、更にオーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを添加した。また、オートクレーブ（１２１℃、２０分）前に、培地のｐＨを５．６〜５．８に調整した。【０５６１】
オーキシン系植物ホルモンとして、２，４−Ｄ、ＮＡＡ、ＩＢＡのいずれかと、サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンのいずれかを組み合わせて、暗所（０〜０．１ｌｘ）又は明所（１００００ｌｘ）で培養し、イソプレノイドの生産を促した。【０５６２】
誘導されたカルスを表３６〜３８に示す生産培地（液体培地）で培養を行った後、培養液をろ過することにより、培養ろ液を得た。次に、培養ろ液に、トルエン・ヘキサン混合溶媒を加えて混合溶液とし、振とうした。そして、振とうした後、混合溶液を遠心分離し、２相に分離した混合溶液から有機相を回収した。次に、回収した有機相からエバポレータにより溶媒を揮発することにより、培地中からイソプレノイドを精製回収した。精製回収したイソプレノイドの量から、培地中のイソプレノイドの濃度（ｍｇ／ｌ）を算出した。結果を表３６〜３８に示す。【０５６３】
また、一方、上述のように培養液をろ過することにより、カルスを生産培地より回収し、液体窒素で凍結させた後、凍結乾燥させて、カルス中の水分を除去した。次いで、水分を除去したカルスを乳鉢で粉砕した後、ソックスレー抽出装置を用いて有機溶媒によりイソプレノイドの抽出を行った。まず、９９％メタノールで抽出を行い、不要な代謝物を除去した。その後９９％トルエンでさらに抽出することで、カルスからイソプレノイドを精製回収した。【０５６４】
カルスの細胞内に蓄積されているイソプレノイドの量（イソプレノイド細胞内蓄積量）を算出した。イソプレノイド細胞内蓄積量は、凍結乾燥させたのちのカルス乾燥質量に対し、該カルスから精製回収したイソプレノイドの割合（質量％）により算出した。結果を表３６〜３８に示す。【０５６５】
実施例２６３〜２９４により、カルスの細胞内にイソプレノイドが蓄積していること、培地中にイソプレノイドが放出されていることを確認できた。以上の結果により、生合成されたイソプレノイドは、カルスの細胞内に蓄積されると共に、その一部が細胞外に放出されていることが分かった。【０５６６】
得られたイソプレノイドについて下記の評価を行った。結果を表３６〜３８に示す。【０５６７】
（重量平均分子量（Ｍｗ））
下記の条件（１）〜（７）でゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）法により、重量平均分子量（Ｍｗ）を測定した。結果を表３６、３７に示す。
（１）装置：東ソー社製ＨＬＣ−８０２０
（２）分離カラム：東ソー社製ＧＭＨ−ＸＬ
（３）測定温度：４０℃
（４）キャリア：テトラヒドロフラン
（５）流量：０．６ｍＬ／分
（６）検出器：示差屈折、ＵＶ
（７）分子量標準：標準ポリイソプレン又は標準ポリスチレン【０５６８】
（数平均分子量（Ｍｎ））
下記の条件（８）〜（１４）でゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）法により、数平均分子量（Ｍｎ）を測定した。結果を表３６、３８に示す。
（８）装置：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ａｇｉｌｅｎｔ  １１２０  Ｃｏｍｐａｃｔ  ＬＣ
（９）分離カラム：東ソー社製ＴＯＳＨＯ  ＴＳＫｇｅｌ  ＭｕｌｔｉｐｏｒｅＨＸ  Ｌ−Ｍ
（１０）測定温度：３０℃
（１１）キャリア：テトラヒドロフラン
（１２）流量：１．０ｍＬ／分
（１３）検出器：ＵＶ
（１４）分子量標準：標準ポリスチレン【０５６９】
【表３６】
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【０５７０】
【表３７】
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【０５７１】
【表３８】
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【０５７２】
表３６〜３８の結果より、パラゴムノキ、ノゲシ、セイタカアワダチソウのカルスを培養（液体培養）することにより、イソプレノイドを製造できることが確認できた。また、得られたイソプレノイドの重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）も高かった。
【国際調査報告】
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