(57)【要約】  本発明は、配列番号１に示す野生型リパーゼより高いカルバメート化活性を示す、配列番号１の１９３位のグルタミンを他のアミノ酸残基に置換した改変型リパーゼ、または、さらに１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位を有するその変異体、およびそれらを用いたカルバメート化合物の製造方法に関するに関する。また、公知の改変型リパーゼを用いたカルバメート化合物の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の１９３位のグルタミンを他のアミノ酸残基に置換した改変型リパーゼ、または、さらに１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位を有するその変異体であって、配列番号１に示す野生型リパーゼより高いカルバメート化活性を示す変異体。
【請求項２】
１９３位のグルタミンをグルタミン酸またはアスパラギン酸に置換した、請求項１記載の改変型リパーゼ、または、さらに１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位を有し、該改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体。
【請求項３】
更に、１０４位のトリプトファンがフェニルアラニンに置換される請求項１または２記載の改変型リパーゼ、または、さらに１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位を有し、該改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すそれらの変異体。
【請求項４】
更に、２７８位のロイシンがアルギニンまたはリジンに置換される請求項１または２記載の改変型リパーゼ、または、さらに１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位を有し、該改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すそれらの変異体。
【請求項５】
更に、２７８位のロイシンがアルギニンまたはリジンに置換される請求項３記載の改変型リパーゼ、または、さらに１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位を有し、該改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すそれらの変異体。
【請求項６】
更に、２８３位のアラニンがバリンに置換される請求項５記載の改変型リパーゼ、または、さらに１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位を有し、該改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すそれらの変異体。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項記載の改変型リパーゼまたはその変異体をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７記載のＤＮＡを含む形質転換微生物。
【請求項９】
請求項８記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および／又は微生物中に改変型リパーゼまたはその変異体を蓄積させることを特徴とする、改変型リパーゼまたはその変異体の製造方法。
【請求項１０】
請求項１から６のいずれか１項記載の改変型リパーゼまたはその変異体または請求項９記載の方法で得られた改変型リパーゼまたはその変異体を担体に固定化した改変型リパーゼまたはその変異体。
【請求項１１】
請求項１から６および１０のいずれか１項記載の改変型リパーゼまたはその変異体または請求項９記載の方法で得られた改変型リパーゼまたはその変異体の、カルバメート化反応における使用。
【請求項１２】
カルバメート化反応が、カーボネート化合物とアミン化合物とを反応させてカルバメート化合物を製造するものである、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
請求項１から６および１０のいずれか１項記載の改変型リパーゼまたはその変異体または請求項９記載の方法で得られた改変型リパーゼまたはその変異体の存在下で、ジアルキルカーボネート化合物とアミン化合物を基質として反応させることを特徴とする、カルバメート化合物の製造方法。
【請求項１４】
ジアルキルカーボネート化合物が、ジメチルカーボネート化合物である、請求項１３記載のカルバメート化合物の製造方法。
【請求項１５】
配列番号１の１０４位のトリプトファンをフェニルアラニンに置換した改変型リパーゼ、または、さらに１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位を有し、該改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体の、カルバメート化反応における使用。
【請求項１６】
カルバメート化反応が、カーボネート化合物とアミン化合物とを反応させてカルバメート化合物を製造するものである、請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
配列番号１の１０４位のトリプトファンをフェニルアラニンに置換した改変型リパーゼ、または、さらに１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位を有し、該改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体の存在下で、ジアルキルカーボネート化合物とアミン化合物を基質として反応させることを特徴とする、カルバメート化合物の製造方法。
【請求項１８】
カーボネート化合物が、ジメチルカーボネート化合物である、請求項１７記載のカルバメート化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な改変型リパーゼ及びその製造方法並びに当該酵素を用いた各種反応に関する。より詳しくは優れたカルバメート化活性を有する改変型リパーゼに関する。さらに、この改変型リパーゼを用いたカルバメート化合物の製造方法に関する。【０００２】
また、本発明は、既知の改変型リパーゼを用いたカルバメート化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
従来、リパーゼを触媒として用いてカルバメート化合物を得る方法（カルバメート化）は、例えば、リパーゼの存在下、３’，５’−ジアミノヌクレオシド（脂肪族アミン化合物）とジエチルカーボネート化合物との反応によるカルバメート化合物の合成方法が知られている（非特許文献１）。【０００４】
しかし、基質に対するリパーゼの添加量は多く、反応に長時間を有し、生成物の収率も低く、リパーゼを用いるカルバメート化合物製造方法は、産業的に満足する製造方法とはいい難い。これらの点から、優れたカルバメート化活性を有するリパーゼが求められていた。【０００５】
一方、リパーゼのアミノ酸配列を改変し、活性や安定性を向上させる研究が行われている（非特許文献２および３）。しかし、アミノ酸配列改変によりカルバメート化活性が向上したリパーゼについては知られていない。【０００６】
また、特許文献１は、リパーゼ（ＣＡＬＢ）のアミノ酸配列改変によるアクリレート活性の増加について記載するが、１０４位のトリプトファンのフェニルアラニンへの単独置換が活性の減少を生じることを記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００９／０８０６７６  Ａ１
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ.２００４年  ６９巻  ｐ．１７４８−１７５１
【非特許文献２】ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２０１０年  １１巻  ｐ．７８９−７９５
【非特許文献３】Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００５年  １２７巻  ｐ．１３４６６−１３４６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、優れたカルバメート化活性を有する改変型リパーゼ、およびこの改変型リパーゼを用いたカルバメート化合物の製造方法を提供することにある。【００１０】
また、本発明の目的は、公知の改変型リパーゼを用いたカルバメート化合物の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、リパーゼとしてＣＡＬＢを選択し、ＣＡＬＢの変異体を作製し、カルバメート化活性を向上させることでカルバメート化合物の製造に要するコスト削減を目指した。そして、鋭意検討を重ねた結果、野生型より高いカルバメート化活性を有する変異ＣＡＬＢを作製することに成功した。また、本発明者らは、公知の改変型ＣＡＬＢに高いカルバメート化活性があることも見出した。すなわち本発明は、以下の発明を提供するものである。【００１２】
（１）配列番号１の１９３位のグルタミンを他のアミノ酸残基に置換した改変型リパーゼ、または、さらに１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位を有するその変異体であって、配列番号１に示す野生型リパーゼより高いカルバメート化活性を示す変異体。すなわち、Ｑ１９３Ｘ（ここで、Ｘはグルタミン以外の任意のアミノ酸を示す）の配列番号１を有する単独改変型リパーゼまたはその変異体。【００１３】
（２）１９３位のグルタミンをグルタミン酸またはアスパラギン酸に置換した（１）記載の改変型リパーゼ、または、さらに１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位を有し、該改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体。すなわち、Ｑ１９３ＥまたはＱ１９３Ｄの配列番号１を有する単独改変型リパーゼまたはその変異体。【００１４】
（３）更に、１０４位のトリプトファンがフェニルアラニンに置換される（１）または（２）記載の改変型リパーゼ、または、さらに１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位を有し、該改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すそれらの変異体。すなわち、[Ｑ１９３Ｘ、Ｑ１９３ＥまたはＱ１９３Ｄ]＋Ｗ１０４Ｆの配列番号１を有する二重改変型リパーゼまたはその変異体。【００１５】
（４）更に、２７８位のロイシンがアルギニンまたはリジンに置換される（１）または（２）記載の改変型リパーゼ、または、さらに１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位を有し、該改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すそれらの変異体。すなわち、[Ｑ１９３Ｘ、Ｑ１９３ＥまたはＱ１９３Ｄ]＋[Ｌ２７８ＫまたはＬ２７８Ｒ] を有する配列番号１の二重改変型リパーゼまたはその変異体。【００１６】
（５）更に、２７８位のロイシンがアルギニンまたはリジンに置換される（３）記載の改変型リパーゼ、または、さらに１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位を有し、該改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すそれらの変異体。すなわち、[Ｑ１９３Ｘ、Ｑ１９３ＥまたはＱ１９３Ｄ]＋Ｗ１０４Ｆ＋[Ｌ２７８ＫまたはＬ２７８Ｒ] を有する配列番号１の三重改変型リパーゼまたはその変異体。【００１７】
（６）更に、２８３位のアラニンがバリンに置換される（５）記載の改変型リパーゼ、または、さらに１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位を有し、該改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すそれらの変異体。すなわち、[Ｑ１９３Ｘ、Ｑ１９３ＥまたはＱ１９３Ｄ]＋Ｗ１０４Ｆ＋[Ｌ２７８ＫまたはＬ２７８Ｒ]＋Ａ２８３Ｖを有する配列番号１の四重改変型リパーゼまたはその変異体。【００１８】
（７）（１）から（６）のいずれか１つに記載の改変型リパーゼまたはその変異体をコードするＤＮＡ。【００１９】
（８）（７）記載のＤＮＡを含む形質転換微生物。【００２０】
（９）（８）記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および／又は微生物中に改変型リパーゼまたはその変異体を蓄積させることを特徴とする、改変型リパーゼまたはその変異体の製造方法。【００２１】
（１０）（１）から（６）のいずれか１つに記載の改変型リパーゼまたはその変異体または（９）記載の方法で得られた改変型リパーゼまたはその変異体を担体に固定化した改変型リパーゼまたはその変異体。【００２２】
（１１）（１）から（６）および（１０）のいずれか１つ記載の改変型リパーゼまたはその変異体または（９）記載の方法で得られた改変型リパーゼまたはその変異体の、カルバメート化反応における使用。【００２３】
（１２）カルバメート化反応が、カーボネート化合物とアミン化合物とを反応させてカルバメート化合物を製造するものである、（１１）記載の使用。【００２４】
（１３）（１）から（６）および（１０）のいずれか１つ記載の改変型リパーゼまたはその変異体または（９）記載の方法で得られた改変型リパーゼまたはその変異体の存在下で、ジアルキルカーボネート化合物とアミン化合物を基質として反応させることを特徴とする、カルバメート化合物の製造方法。【００２５】
（１４）ジアルキルカーボネート化合物が、ジメチルカーボネート化合物である、（１３）記載のカルバメート化合物の製造方法。【００２６】
（１５）配列番号１の１０４位のトリプトファンをフェニルアラニンに置換した改変型リパーゼ、または、さらに１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位を有し、該改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体の、カルバメート化反応における使用。【００２７】
（１６）カルバメート化反応が、カーボネート化合物とアミン化合物とを反応させてカルバメート化合物を製造するものである、（１５）記載の使用。【００２８】
（１７）配列番号１の１０４位のトリプトファンをフェニルアラニンに置換した改変型リパーゼ、または、さらに１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位を有し、該改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体の存在下で、ジアルキルカーボネート化合物とアミン化合物を基質として反応させることを特徴とする、カルバメート化合物の製造方法。【００２９】
（１８）ジアルキルカーボネート化合物が、ジメチルカーボネート化合物である、（１７）記載のカルバメート化合物の製造方法。【００３０】
（１９）配列番号１の２７８位のロイシンを他のアミノ酸残基に置換した改変型リパーゼ、または、さらに１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位を有するその変異体であって、配列番号１に示す野生型リパーゼより高いカルバメート化活性を示す、改変型リパーゼまたはその変異体。すなわち、Ｌ２７８Ｘ１（ここで、Ｘ１はロイシン以外の任意のアミノ酸を示す）を有する配列番号１の改変型リパーゼまたはその変異体。【００３１】
（２０）２７８位のロイシンをアルギニンまたはリジンに置換した（１９）記載の改変型リパーゼ、または、さらに１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位を有し、該改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体。すなわち、Ｌ２７８ＫまたはＬ２７８Ｒを有する配列番号１の改変型リパーゼまたはその変異体。【００３２】
（２１）更に、１９３位のグルタミンがグルタミン酸またはアスパラギン酸に置換される（１９）または（２０）記載の改変型リパーゼ、または、さらに１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位を有し、該改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すそれらの変異体。すなわち、[Ｑ１９３ＥまたはＱ１９３Ｄ]＋[Ｌ２７８Ｘ１、Ｌ２７８ＫまたはＬ２７８Ｒ]を有する配列番号１の改変型リパーゼまたはその変異体。【００３３】
（２２）（１９）から（２１）のいずれか１つ記載の改変型リパーゼまたはその変異体をコードするＤＮＡ。【００３４】
（２３）（２２）記載のＤＮＡを含む形質転換微生物。【００３５】
（２４）（２３）記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および／又は微生物中に改変型リパーゼまたはその変異体を蓄積させることを特徴とする、改変型リパーゼまたはその変異体の製造方法。【００３６】
（２５）（１９）から（２１）のいずれか１つ記載の改変型リパーゼまたはその変異体または（２４）記載の方法で得られた改変型リパーゼまたはその変異体を担体に固定化した改変型リパーゼまたはその変異体。【００３７】
（２６）（１９）から（２１）および（２５）のいずれか１つ記載の改変型リパーゼまたはその変異体または（２４）記載の方法で得られた改変型リパーゼまたはその変異体の、カルバメート化反応における使用。【００３８】
（２７）カルバメート化反応が、カーボネート化合物とアミン化合物とを反応させてカルバメート化合物を製造するものである、（２６）記載の使用。【００３９】
（２８）（１９）から（２１）および（２５）のいずれか１つ記載の改変型リパーゼまたはその変異体または（２４）記載の方法で得られた改変型リパーゼまたはその変異体の存在下で、ジアルキルカーボネート化合物とアミン化合物を基質として反応させることを特徴とする、カルバメート化合物の製造方法。【００４０】
（２９）ジアルキルカーボネート化合物が、ジメチルカーボネート化合物である、（２８）記載のカルバメート化合物の製造方法。
【発明の効果】
【００４１】
本発明の改変型リパーゼまたはその変異体は、野生型リパーゼより優れたカルバメート化活性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】SUC2のシグナル配列に連結された成熟野生型ＣａｌＢ遺伝子を含む発現ベクターpYES2CT（pYES2CT/SUC2sig/mCALB）を示す。
【図２】pYES2CT/SUC2sig/mCALBベクターを保有する形質転換酵母のエステル化合物分解活性を示す。「−ＣＡＬＢ」はＣａｌＢ遺伝子を有さないpYES2CT/SUC2sigベクターを保有する形質転換酵母（コントロール）を示す。「＋ＣＡＬＢ」は、ＣａｌＢ遺伝子を有するpYES2CT/SUC2sig/mCALBベクターを保有する形質転換酵母を示す。
【図３】Ｗ１０４Ｆ、Ｑ１９３Ｅ、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ改変型リパーゼを用いた、炭酸ジメチル（ＤＭＣ）とｎ−ヘキシルアミンからのカルバメート化合物合成活性を示す。（Ａ）は、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ改変型リパーゼを用い、８ｈｒ後の反応液のＧＣクロマトを示す。ＩＳは内部標準を示す。（Ｂ）はメチルヘキシルカーバメートの収率(％)を示す。ｗ．ｔ．、Ｗ１０４Ｆ、Ｑ１９３ＥおよびＷ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅはそれぞれ野生型リパーゼ、Ｗ１０４Ｆ改変型リパーゼ、Ｑ１９３Ｅ改変型リパーゼおよびＷ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ改変型リパーゼを示す。
【図４】Ｗ１０４Ｆ、Ｑ１９３Ｅ、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ改変型リパーゼを用いた、炭酸ジメチル（ＤＭＣ）と１，３−ビスアミノメチルシクロヘキサン（１，３ＢＡＣ）からのカルバメート化合物合成活性を示す。
【図５】Ｗ１０４Ｆ、Ｑ１９３Ｅ、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ改変型リパーゼを用いた、炭酸ジメチル（ＤＭＣ）と１，１２−ジアミノドデカン（ＤＭＤ）からのカルバメート化合物合成活性を示す。
【図６】Ｗ１０４Ｆ、Ｑ１９３Ｅ、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ改変型リパーゼを用いた、炭酸ジメチル（ＤＭＣ）とキシリレンジアミン（ＸＤＡ）からのカルバメート化合物合成活性を示す。
【図７】Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ／Ａ２８３Ｖ、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｋ、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｋ、Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ、Ｌ２７８Ｒ、Ｌ２７８Ｋ、Ｑ１９３Ｄ、Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼを用いた、炭酸ジメチル（ＤＭＣ）とｎ−ヘキシルアミンからのカルバメート化合物合成活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明のリパーゼは、Candida antarcticaを起源とするリパーゼ（ＣＡＬＢ、Genebank ACCESSION No. P41365）を意味する。本発明のＣＡＬＢは、好ましくは成熟ＣＡＬＢを意味し、そのアミノ酸配列を配列番号１に示す。また、本発明のＣＡＬＢは、その機能を保持する断片を含んでも良い。そして、本発明の改変型リパーゼまたはその変異体もその機能を保持する断片を含んでも良い。以後、配列番号１のアミノ酸配列を有するリパーゼを、野生型リパーゼと称する。
【００４４】
本発明の改変型リパーゼは、野生型リパーゼよりも高いカルバメート化活性を示す、配列番号１における１９３位のグルタミンが他のアミノ酸残基に置換（Ｑ１９３Ｘ、Ｘはグルタミンを除く任意のアミノ酸）された改変型リパーゼ（以下、Ｑ１９３Ｘ改変型リパーゼと称する）を意味する。また、１０４位のトリプトファンがフェニルアラニンに置換（Ｗ１０４Ｆ）された改変型リパーゼ（以下、Ｗ１０４Ｆ改変型リパーゼ（配列番号３））を含んでもよい。
【００４５】
好適には、前記１９３位のグルタミンがグルタミン酸またはアスパラギン酸に置換（Ｑ１９３ＥまたはＱ１９３Ｄ）された単独改変型リパーゼ（以下、Ｑ１９３Ｅ改変型リパーゼ（配列番号２）またはＱ１９３Ｄ改変型リパーゼ（配列番号１９）と称する）である。
【００４６】
より好適には、前記１９３位のグルタミンがグルタミン酸またはアスパラギン酸に置換され、更に１０４位のトリプトファンがフェニルアラニンに置換された二重改変型リパーゼ（以下、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ改変型リパーゼ（配列番号４）またはＱ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ改変型リパーゼ（配列番号２０）と称する）である。
【００４７】
本発明の改変型リパーゼは、野生型リパーゼよりも高いカルバメート化活性を示す、配列番号１における２７８位のロイシンが他のアミノ酸残基に置換（Ｌ２７８Ｘ１、Ｘ１はロイシンを除く任意のアミノ酸）された改変型リパーゼ（以下、Ｌ２７８Ｘ１改変型リパーゼと称する）を意味する。
【００４８】
好適には、前記２７８位のロイシンがアルギニンまたはリジンに置換（Ｌ２７８ＲまたはＬ２７８Ｋ）された単独改変型リパーゼ（以下、Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼ（配列番号２１）またはＬ２７８Ｋ改変型リパーゼ（配列番号２２）と称する）である。
【００４９】
より好適には、前記１９３位のグルタミンがグルタミン酸またはアスパラギン酸に置換され、更に２７８位のロイシンがアルギニンまたはリジンに置換された二重改変型リパーゼ（以下、Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼ（配列番号２４）、Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼ（配列番号２３）、Ｑ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼ（配列番号２６）またはＱ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼ（配列番号２５）と称する）である。
【００５０】
より好適には、前記１９３位のグルタミンがグルタミン酸またはアスパラギン酸に置換され、１０４位のトリプトファンがフェニルアラニンに置換され、２７８位のロイシンがアルギニンまたはリジンに置換された三重改変型リパーゼ（以下、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼ（配列番号２８）、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼ（配列番号２７）、Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼ（配列番号３０）またはＱ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼ（配列番号２９）と称する）である。
【００５１】
より好適には、前記１９３位のグルタミンがグルタミン酸またはアスパラギン酸に置換され、１０４位のトリプトファンがフェニルアラニンに置換され、２７８位のロイシンがアルギニンまたはリジンに置換され、２８３位のアラニンがバリンに置換された四重改変型リパーゼ（以下、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼ（配列番号３２）、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼ（配列番号３１）、Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼ（配列番号３４）またはＱ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼ（配列番号３３）と称する）である。
【００５２】
本発明の改変型リパーゼは、上記１９３位、１０４位、２７８位および／または２８３位でアミノ酸置換が行われたアミノ酸配列を有することを特徴とするが、上記１９３位、１０４位、２７８位および／または２８３位以外の位置に、さらにアミノ酸変異を含んでもよい。よって、本発明は、上記１９３位、１０４位、２７８位および／または２８３位のアミノ酸置換を有する改変型リパーゼと比較した場合にその機能は同等であるが、上記１９３位、１０４位、２７８位および／または２８３位のアミノ酸置換を有する改変型リパーゼと一部においてアミノ酸配列が相違する変異体も提供する。
【００５３】
一部においてアミノ酸配列が相違するとは、典型的には、アミノ酸配列を構成する１〜数個のアミノ酸の欠失、置換、付加、挿入、逆位、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変異が生じていることをいう。
【００５４】
よって、本発明は、１９３位のグルタミンの他のアミノ酸残基への置換に加え、さらに１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、１９３改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体を含む。
【００５５】
また、本発明は、Ｗ１０４Ｆ置換に加え、さらに、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、Ｗ１０４Ｆ改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体を含む。
【００５６】
また、本発明は、Ｑ１９３Ｅ置換に加え、さらに、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、Ｑ１９３Ｅ改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体を含む。
【００５７】
本発明は、Ｑ１９３Ｄ置換に加え、さらに、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、Ｑ１９３Ｄ改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体を含む。
【００５８】
また、本発明は、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ置換に加え、さらに、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体も含む。
【００５９】
本発明は、Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ置換に加え、さらに、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体も含む。
【００６０】
本発明は、Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｋ置換に加え、さらに、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体も含む。
【００６１】
本発明は、Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ置換に加え、さらに、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体も含む。
【００６２】
本発明は、Ｑ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｋ置換に加え、さらに、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、Ｑ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体も含む。
【００６３】
本発明は、Ｑ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｒ置換に加え、さらに、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、Ｑ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体も含む。
【００６４】
本発明は、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ置換に加え、さらに、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体も含む。
【００６５】
本発明は、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ置換に加え、さらに、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体も含む。
【００６６】
本発明は、Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ置換に加え、さらに、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体も含む。
【００６７】
本発明は、Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ置換に加え、さらに、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体も含む。
【００６８】
本発明は、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ／Ａ２８３Ｖ置換に加え、さらに、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体も含む。
【００６９】
本発明は、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ／Ａ２８３Ｖ置換に加え、さらに、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体も含む。
【００７０】
本発明は、Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ／Ａ２８３Ｖ置換に加え、さらに、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体も含む。
【００７１】
本発明は、Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ／Ａ２８３Ｖ置換に加え、さらに、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体も含む。
【００７２】
本発明は、２７８位のロイシンの他のアミノ酸残基への置換に加え、さらに１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、２７８改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体を含む。
【００７３】
本発明は、Ｌ２７８Ｒ置換に加え、さらに、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体を含む。
【００７４】
本発明は、Ｌ２７８Ｋ置換に加え、さらに、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼと同じカルバメート化活性を示すその変異体を含む。
【００７５】
アミノ酸配列の相違は、カルバメート化反応に関わる特性が大幅に低下しない限度において（好ましくは実質的に保持される限度において）許容される。したがって、この条件を満たす限りアミノ酸配列が相違する位置は特に限定されなくともよい。また、複数の位置で相違が生じていてもよい。ここで複数とは、例えば全アミノ酸の約３０％未満に相当する数であり、好ましくは約２０％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。
【００７６】
したがって、一部においてアミノ酸配列が相違するタンパク質は、上記改変型リパーゼのアミノ酸配列のいずれかと例えば約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、より一層好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有する相同タンパク質であってもよい。アミノ酸配列同一性は、当業者に周知のＢＬＡＳＴを用い初期設定値で計算してもよい。ＢＬＡＳＴは、ウェブサイト（例えば、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=blastn&BLAST_INIT=blast2seq）で公開されている。
【００７７】
上記の相同タンパク質は、好ましくは、保存的アミノ酸置換をカルバメート化反応に関与しないアミノ酸残基に生じさせることによって得ることができる。ここで保存的アミノ酸置換とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパルギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は、好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
【００７８】
よって、Ｑ１９３Ｘ改変型リパーゼの変異体は、Ｑ１９３Ｘ改変型リパーゼと約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、１９３改変型リパーゼと同等のカルバメート化活性を示すものであってもよい。
【００７９】
また、Ｗ１０４Ｆ改変型リパーゼの変異体は、Ｗ１０４Ｆ改変型リパーゼと約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、Ｗ１０４Ｆ改変型リパーゼと同等のカルバメート化活性を示すものであってもよい。
【００８０】
また、Ｑ１９３Ｅ改変型リパーゼの変異体は、Ｑ１９３Ｅ改変型リパーゼと約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、Ｑ１９３Ｅ改変型リパーゼと同等のカルバメート化活性を示すものであってもよい。
【００８１】
Ｑ１９３Ｄ改変型リパーゼの変異体は、Ｑ１９３Ｄ改変型リパーゼと約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、Ｑ１９３Ｄ改変型リパーゼと同等のカルバメート化活性を示すものであってもよい。
【００８２】
また、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ改変型リパーゼの変異体は、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ改変型リパーゼと約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ改変型リパーゼと同等のカルバメート化活性を示すものであってもよい。
【００８３】
Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ改変型リパーゼの変異体は、Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ改変型リパーゼと約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ改変型リパーゼと同等のカルバメート化活性を示すものであってもよい。
【００８４】
Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼの変異体は、Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼと約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼと同等のカルバメート化活性を示すものであってもよい。
【００８５】
Ｑ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼの変異体は、Ｑ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼと約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、Ｑ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼと同等のカルバメート化活性を示すものであってもよい。
【００８６】
Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼの変異体は、Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼと約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼと同等のカルバメート化活性を示すものであってもよい。
【００８７】
Ｑ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼの変異体は、Ｑ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼと約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、Ｑ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼと同等のカルバメート化活性を示すものであってもよい。
【００８８】
Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼの変異体は、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼと約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼと同等のカルバメート化活性を示すものであってもよい。
【００８９】
Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼの変異体は、Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼと約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼと同等のカルバメート化活性を示すものであってもよい。
【００９０】
Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼの変異体は、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼと約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼと同等のカルバメート化活性を示すものであってもよい。
【００９１】
Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼの変異体は、Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼと約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼと同等のカルバメート化活性を示すものであってもよい。
【００９２】
Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼの変異体は、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼと約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼと同等のカルバメート化活性を示すものであってもよい。
【００９３】
Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼの変異体は、Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼと約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼと同等のカルバメート化活性を示すものであってもよい。
【００９４】
Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼの変異体は、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼと約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼと同等のカルバメート化活性を示すものであってもよい。
【００９５】
Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼの変異体は、Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼと約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼと同等のカルバメート化活性を示すものであってもよい。
【００９６】
Ｌ２７８Ｘ１改変型リパーゼの変異体は、Ｌ２７８Ｘ１改変型リパーゼと約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、Ｌ２７８Ｘ１改変型リパーゼと同等のカルバメート化活性を示すものであってもよい。
【００９７】
Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼの変異体は、Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼと約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼと同等のカルバメート化活性を示すものであってもよい。
【００９８】
Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼの変異体は、Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼと約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼと同等のカルバメート化活性を示すものであってもよい。
【００９９】
改変型リパーゼまたはその変異体をコードするＤＮＡは、改変型リパーゼまたはその変異体のアミノ酸配列をコードする核酸配列を有するＤＮＡを意味し、核酸配列は当業者に周知の遺伝コードに基づいてアミノ酸配列から決定することができる。
【０１００】
１以上のコドンが同じアミノ酸をコードできる（コドンの縮重）ので、１つのアミノ酸配列を１以上の核酸配列がコードできる。よって、改変型リパーゼまたはその変異体をコードする核酸配列であれば、改変型リパーゼまたはその変異体をコードするＤＮＡは限定されない。
【０１０１】
Ｑ１９３Ｅ改変型リパーゼ（配列番号２）またはＱ１９３Ｄ改変型リパーゼ（配列番号１９）のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、たとえば配列番号１４または３５の配列が挙げられる。Ｗ１０４Ｆ改変型リパーゼ（配列番号３）のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、たとえば配列番号１７の配列が挙げられる。
【０１０２】
Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ改変型リパーゼ（配列番号４）またはＱ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ改変型リパーゼ（配列番号２０）のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、例えば配列番号１８または３６の配列が挙げられる。
【０１０３】
Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼ（配列番号２３）、Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼ（配列番号２４）、Ｑ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼ（配列番号２５）またはＱ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼ（配列番号２６）のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、例えば配列番号３９、４０、４１または４２の配列が挙げられる。
【０１０４】
Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼ（配列番号２７）、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼ（配列番号２８）、Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼ（配列番号２９）またはＱ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼ（配列番号３０）のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、例えば配列番号４３、４４、４５または４６の配列が挙げられる。
【０１０５】
Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼ（配列番号３１）、Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼ（配列番号３２）、Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼ（配列番号３３）またはＱ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼ（配列番号３４）のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、例えば配列番号４７、４８、４９または５０の配列が挙げられる。
【０１０６】
Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼ（配列番号２１）またはＬ２７８Ｋ改変型リパーゼ（配列番号２２）のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、たとえば配列番号３７または３８の配列が挙げられる。
【０１０７】
改変型リパーゼの変異体は、改変型リパーゼ遺伝子とハイブリダイズし、改変型リパーゼと同等のカルバメート化活性を示すものであってもよい。
【０１０８】
ハイブリダイズとは、好ましくは、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションを意味する。特に好ましくは、下記：ハイブリダイゼーション緩衝液：２×ＳＳＣ；１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（フィコール４００＋ＰＥＧ＋ＢＳＡ；比率＝１：１：１）；０．１％ＳＤＳ；５mMＥＤＴＡ；５０ｍMＮａ2ＨＰＯ4；２５０μg/mlニシン精子ＤＮＡ；５０μg/ml ｔＲＮＡ；または２５Mリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２；１ｍM ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳ）、ハイブリダイゼーション温度：Ｔ＝６５〜６８℃、洗浄緩衝液：０．１×ＳＳＣ；０．１％ＳＤＳ、洗浄温度：Ｔ＝６５〜６８℃、の条件下のハイブリダイゼーションを意味する。
【０１０９】
改変型リパーゼまたはその変異体をコードするＤＮＡを含む形質転換微生物とは、改変型リパーゼまたはその変異体をコードするＤＮＡを微生物に導入して、改変型リパーゼまたはその変異体を生産するように形質転換された微生物を意味する。改変型リパーゼまたはその変異体をコードするＤＮＡは、微生物中でプラスミドで存在しても染色体に組み込まれても良い。
【０１１０】
微生物は、限定されないが、例えば、細菌、酵母、糸状菌などが挙げられる。好ましくは、大腸菌（Escherichia）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、バチルス（Bacillus）、乳酸菌（Lactobacillus、Bifidobacterium）、酵母（Saccharomyces、Pichia、Schizosaccharomyces、Kluyveromyces、Hansenula、Yarrowia）、糸状菌（Aspergillus）等が挙げられる。これらの中でも大腸菌（Escherichia coli）、酵母（Saccharomyces、Pichia、Schizosaccharomyces、Kluyveromyces、Hansenula、Yarrowia）、糸状菌（Aspergillus）がより好ましい。これらの微生物は、市場より入手できる。
【０１１１】
微生物に形質転換される改変型リパーゼまたはその変異体をコードするＤＮＡは、ベクターにあることが好ましい。ベクターは、ファージ、プラスミドなどが挙げられるが、プラスミドが好ましい。プラスミドは、発現のためのプロモーター、開始コドン、停止コドン、ポリアデニィレーションシグナル配列、マルチクローニングサイト、複製オリジン、選択マーカー等を有する発現用プラスミドが、より好ましい。
【０１１２】
大腸菌由来のプラスミドとしては、例えば、pBR322、pBR325、pUC18、pUC118が挙げられる。酵母由来プラスミドとしては、例えば、pSH19、pSH15、pYES2、糸状菌由来プラスミドとしては、例えば、pAUR316が挙げられる。これらのプラスミドは、市場より入手できる。
【０１１３】
微生物に形質転換される改変型リパーゼまたはその変異体をコードするＤＮＡは、微生物での発現を可能とするプロモーターと作動可能的に連結していることが好ましい。
【０１１４】
プロモーターは、微生物において、連結している改変型リパーゼまたはその変異体を発現させるものであれば限定されない。微生物が大腸菌である場合には、trpプロモーター、lacプロモーター、rec Aプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、T7プロモーターなど、微生物が酵母である場合には、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、GAL1プロモーターなどが好ましい。微生物が糸状菌である場合には、グルコアミラーゼ遺伝子のプロモーター、α-アミラーゼ遺伝子のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼＩ遺伝子のプロモーター、エノラーゼ遺伝子のプロモーターなどが好ましい。
【０１１５】
プロモーターに作動的に連結するとは、プロモーターの制御下で改変型リパーゼまたはその変異体を生産するようにプロモーターの下流に改変型リパーゼまたはその変異体を連結することを意味する。
【０１１６】
微生物の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことが出来る。例えば、エレクトロポレーション法やコンピテントセルとした微生物にカルシウム法によってＤＮＡを導入する方法などがある。
【０１１７】
本発明の改変型リパーゼまたはその変異体の製造は、好ましくは上記形質転換体を培地中で培養し、培地中および／又は形質転換体中に前記改変型リパーゼを蓄積させる方法によって行われる。
【０１１８】
形質転換体を培養するための培地は、該微生物が生育する培地であれば特に制限はなく、当該技術分野で公知の方法に従って培養することが出来る。例えば、グルコース、シュークロースなどの糖類を炭素源として、アンモニウム塩や硝酸塩などの無機窒素源、あるいは酵母エキスなどの有機窒素源、さらに各種無機塩やビタミン類などを含有した培養液で、場合により、誘導剤（ＩＰＴＧ等）や選択剤（アンピシリン、クロラムフェニコール、カルベニシリンなど抗生物質等）などを含んでもよい。培養条件(温度、時間、振とう、好気または嫌気)は、微生物が生育する条件であれば特に限定されない。
【０１１９】
培地中に改変型リパーゼまたはその変異体を分泌する場合、改変型リパーゼまたはその変異体をコードするＤＮＡは、分泌のためのシグナル配列と連結してもよい。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、インベルターゼ等のシグナル配列を使用することができる。また、精製を容易にするためのタグ配列、例えばヒスチジンタグ配列、フラッグタグ配列等と連結しても良い。また、タグ配列、シグナル配列と改変型リパーゼまたはその変異体の間に切断配列、たとえばエンドペプチダーゼの認識配列を連結してもよい。
【０１２０】
形質転換体により生産された改変型リパーゼまたはその変異体は、培養培地および／または培養形質転換体をそのまま用いてもよいし、さらに精製してもよい。培養培地および／または培養形質転換体からの精製は、従来のタンパク質の精製方法に従って、例えばクロマトグラフィー（ゲルろ過グロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等）等を用いて行うことができる。
【０１２１】
本発明の改変型リパーゼまたはその変異体は、不溶性の担体に結合させた固定化改変型リパーゼまたはその変異体が好ましい。
【０１２２】
担体は、担体結合法（物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法、生化学的特異結合法）のためには、例えば、多糖（セルロース、アガロース等）、無機物質（多孔質ガラス、金属酸化物等）、合成高分子（ポリアクリルアミド化合物、ポリスチレン樹脂、イオン交換樹脂等）が挙げられる。架橋法のためには、例えば、ＯＨＣ−（ＣＨ２）３−ＣＨＯ（グルタルアルデヒド）、Ｏ＝Ｎ＝Ｃ−（ＣＨ２）３−Ｃ＝Ｎ＝Ｏが挙げられる。包括法のためには、例えば、多糖（アルギン酸、カラギーナン等）、ポリアクリルアミド化合物、ENT、PU、ナイロンが挙げられる。
【０１２３】
担体への改変型リパーゼまたはその変異体の固定化は、タンパク質のための従来の固定化方法に従って行うことができる。
【０１２４】
本発明で使用する、微生物、組換えＤＮＡ、変異体作製、ＰＣＲ、発現、培養、精製、固定化等の実験技術は、当業者に周知であり、一般的な教科書（例えば、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al., eds., 1987 and annual updates); PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS (Innis et al., 1990, Academic Press, San Diego, CA); PCR: THE POLYMERASE CHAIN REACTION(Mullis et al., eds. , 1994); MANUAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Second Edition (A. L. Demain, et al., eds. 1999); 及び BIOTECHNOLOGY: A TEXTBOOK OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, (Thomas D. Brock) Second Edition (1989)Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Massなど）に詳細に記載されている。
【０１２５】
カルバメート化反応における、本発明の改変型リパーゼまたはその変異体の使用は、本発明の改変型リパーゼまたはその変異体によってカルバメート化反応が行われることを意味する。改変型リパーゼまたはその変異体は、固定化されているものが好ましい。
【０１２６】
カルバメート化反応は、下記反応式（Ａ）：
【化１】
2012150696.tif 000002
【０１２７】
（式中、Ｒは、水素原子又は置換基を有していても良い炭化水素基を示す）
で示されるとおり、アミン化合物とカーボネート化合物をカルバメート結合を形成させる反応を意味する。
【０１２８】
アミン化合物は、カーボネート化合物と反応させることによってカルバメート化合物を合成するものであれば特に限定されないが、本発明においては、モノアミン化合物又はジアミン化合物が好適に使用される。脂肪族モノアミン化合物又は脂肪族ジアミン化合物がより好適に使用される。脂肪族アミンとは、直鎖状炭化水素の水素原子が、アミノ基、-NH2と置換した化合物を意味する。
【０１２９】
モノアミン化合物は、一般式（Ｉ）：
【化２】
2012150696.tif 000003
（式中、Ｒ１は、置換基を有していてもよい、Ｃ１〜２０直鎖又は分岐鎖アルキル基、Ｃ２〜２０直鎖又は分岐鎖アルケニル基、Ｃ２〜２０直鎖又は分岐鎖アルキニル基、Ｃ４〜２４シクロアルキルアルキル基、Ｃ７〜２１アラルキル基、又はＣ３〜２０シクロアルキル基であり、ｎは、０又は１である）
で示される化合物が好適に使用される。
【０１３０】
Ｒ１における、置換基を有していてもよいＣ１〜２０直鎖又は分岐鎖アルキル基は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基、ｎ−ウンデシル基、ｎ−ドデシル基、イソプロピル基、イソブチル基、またはｔ−ブチル基等が挙げられる。Ｃ１〜１２直鎖又は分岐鎖アルキル基が好ましく、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ドデシル基、イソプロピル基またはｔ−ブチル基がより好ましい。
【０１３１】
Ｒ１における、置換基を有していてもよいＣ２〜２０直鎖又は分岐鎖アルケニル基は、アリル基、１−プロペニル基、１−ブテニル基、１−ペンテニル基、またはイソプロパニル基等が挙げられる。Ｃ２〜１２直鎖又は分岐鎖アルケニル基が好ましく、アリル基がより好ましい。
【０１３２】
Ｒ１における、置換基を有していてもよいＣ２〜２０直鎖又は分岐鎖アルキニル基は、エチニル基、プロパルギル基、ブテニル基、または１−メチル−２−プロピニル基等が挙げられる。Ｃ２〜１２直鎖又は分岐鎖アルキニル基が好ましく、エチニル基またはプロパルギル基がより好ましい。
【０１３３】
Ｒ１における、置換基を有していてもよいＣ３〜２０シクロアルキル基は、Ｃ１〜４直鎖アルキル基で置換されていても良い単環又は多環の脂環式炭化水素基であり、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル基、メチルシクロヘキシル基、ジメチルシクロヘキシル基、またはエチルシクロヘキシル基等が挙げられる。Ｃ３〜１２シクロアルキル基が好ましく、シクロヘキシル基またはビシクロ［２．２．１］ヘプチル基がより好ましい。ここで、Ｃ１〜４の直鎖アルキル基は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、またはｎ−ブチル基等が挙げられる。
【０１３４】
Ｒ１における、置換基を有していてもよいＣ４〜２４シクロアルキルアルキル基は、上記で定義されたＣ３〜２０シクロアルキル基で置換されたＣ１〜４直鎖アルキル基であり、例えばシクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基、トリメチルシクロヘキシルメチル基、またはノルボルニルメチル基等が挙げられる。Ｃ３〜１０シクロアルキル基で置換されたＣ１〜４直鎖アルキル基であるＣ４〜１４シクロアルキルアルキル基が好ましく、シクロヘキシルメチル基がより好ましい。
【０１３５】
Ｒ１における、置換基を有していてもよいＣ７〜２１アラルキル基は、Ｃ６〜２０アリール基で置換されたアルキル基が挙げられる。Ｃ６〜２０アリール基は、単環又は多環の芳香環を有する基であり、フェニル基、ナフチル基、ビフェニルイル基、またはターフェニルイル基（例えば、ｐ−ターフェニル−４−イル基、ｍ−ターフェニル−３−イル基）等が挙げられる。また、アルキル基の炭素原子数は、アラルキル基の炭素原子数から、アリール基の炭素原子数を減じた数である。よって、Ｃ７〜２１アラルキル基は、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、またはｍ−ターフェニル−３−イル−メチル基等が挙げられ、Ｃ７〜１３アラルキル基が好ましく、ベンジル基がより好ましい。なお、Ｒ１として挙げられた基は各種異性体を含む。
【０１３６】
前記Ｒ１として挙げられた基は、さらなる置換基を有していても良い。Ｒ１におけるさらなる置換基は、例えば、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子）；メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、またはブトキシ基等のＣ１〜４のアルコキシ基；ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、またはジプロピルアミノ基等のＣ１〜６のアルキル基で二置換されたジアルキルアミノ基；シアノ基；ニトロ基；アセチル基；及びＲ１がアラルキル基である場合のベンゼン環に直接結合するアミノ基等が挙げられる。
【０１３７】
上記より、Ｒ１は、好ましくは、メチル基、エチル基、ｎ-プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ドデシル基、フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、シアノメチル基、ニトロメチル基、フルオロエチル基、トリフルオロエチル基、トリクロロエチル基、シアノエチル基、ニトロエチル基、メトキシエチル基、エトキシエチル基、またはｔ−ブトキシエチル基等の置換基を有していても良い、Ｃ１〜１２直鎖又は分岐鎖アルキル基、Ｃ３〜１２シクロアルキル基、Ｃ４〜１４シクロアルキルアルキル基、ベンジル基、フルオロベンジル基、クロロベンジル基、ブロモベンジル基、ヨードベンジル基、メトキシベンジル基、ジメトキシベンジル基、ニトロベンジル基、ジニトロベンジル基、またはシアノベンジル基；及びアミノベンジル基等の置換基を有していても良いＣ７〜１３のアラルキル基であり；特に好ましくは、メチル基、エチル基、ｎ-プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ドデシル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシルメチル基、またはベンジル基である。
【０１３８】
以上より、一般式（Ｉ）で示されるモノアミン化合物は、ｎ−ヘキシルアミン化合物、ｎ−ドデシルアミン化合物、シクロヘキシルメチルアミン化合物、またはベンジルアミン化合物が特に好ましい。
【０１３９】
ジアミン化合物は、一般式（ＩＩ）：
【化３】
2012150696.tif 000004
（式中、Ｒ３は、置換基を有していてもよい、Ｃ１〜２０直鎖又は分岐鎖アルキレン基、Ｃ１〜４直鎖アルキレン−Ｃ３〜２０シクロアルキレン−Ｃ１〜４直鎖アルキレン基、Ｃ１〜４直鎖アルキレン−Ｃ６〜２０アリーレン−Ｃ１〜４直鎖アルキレン基、Ｃ３〜２０シクロアルキレン基、又はＣ１〜４直鎖アルキレン−Ｃ３〜２０シクロアルキレン基であり、ｍ及びｐは、互いに独立して、０又は１である）
で示される化合物が好適に使用される。
【０１４０】
Ｒ３における、置換基を有していてもよいＣ１〜２０直鎖又は分岐鎖アルキレン基は、メチレン基、エチレン基、ｎ−プロピレン基、ｎ−ブチレン基、ｎ−ペンチレン基、ｎ−へキシレン基、ｎ−ヘプチレン基、ｎ−オクチレン基、ｎ−ノニレン基、ｎ−デシレン基、またはｎ−ドデシレン基等の直鎖アルキレン基；または２−メチルプロピレン基、２−メチルへキシレン基、テトラメチルエチレン基等の分岐鎖アルキレン基が挙げられる。Ｃ１〜２０直鎖アルキレン基が好ましく、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基、ヘプチレン基、オクチレン基、ノニレン基、デシレン基、またはドデシレン基がより好ましい。
【０１４１】
Ｒ３における、置換基を有していてもよいＣ３〜２０シクロアルキレン基は、単環又は多環の炭化水素基であり、Ｃ１〜４直鎖アルキル基で置換されていてもよい、シクロプロピレン基、シクロブチレン基、シクロペンチレン基、シクロへキシレン基、またはビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，６−ジイル基が挙げられる。Ｃ３〜１２シクロアルキレン基が好ましく、シクロへキシレン基またはビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，６−ジイル基がより好ましい。
【０１４２】
Ｒ３における、置換基を有していてもよいＣ１〜４直鎖アルキレン−Ｃ３〜２０シクロアルキレン−Ｃ１〜４直鎖アルキレン基のＣ１〜４直鎖アルキレン基は、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、またはブチレン基が挙げられる。Ｃ１〜４直鎖アルキレン−Ｃ３〜２０シクロアルキレン−Ｃ１〜４直鎖アルキレン基は、メチレン−シクロペンチレン−メチレン基、エチレン−シクロペンチレン−エチレン基、またはメチレン−シクロへキシレン−メチレン基等が挙げられる。Ｃ１〜４直鎖アルキレン−Ｃ３〜１２シクロヘキシレン−Ｃ１〜４直鎖アルキレン基が好ましく、メチレン−シクロヘキシレン−メチレン基がより好ましい。
【０１４３】
Ｒ３における、置換基を有していてもよいＣ１〜４直鎖アルキレン−Ｃ３〜２０シクロアルキレン基は、Ｃ１〜４直鎖アルキレン−Ｃ１〜４直鎖アルキル基で置換されているＣ３〜１２シクロアルキレン基が好ましく、メチレン−トリメチルシクロヘキシレン基がより好ましい。
【０１４４】
Ｒ３における、置換基を有していてもよいＣ１〜４直鎖アルキレン−Ｃ６〜２０アリーレン−Ｃ１〜４直鎖アルキレン基は、Ｃ１〜４直鎖アルキレン−フェニレン−Ｃ１〜４直鎖アルキレン基が好ましく、キシリレン基がより好ましい。なお、これらの基は各種異性体を含む。
【０１４５】
Ｒ３における炭化水素基は、さらなる置換基を有していても良い。Ｒ３におけるさらなる置換基は、Ｒ１における炭化水素基の置換基と同義の基が挙げられる。また、Ｒ３が、Ｃ１〜４直鎖アルキレン−Ｃ６〜２０アリーレン−Ｃ１〜４直鎖アルキレン基である場合、Ｒ３における置換基は、アリーレン基の芳香族炭素原子に直接結合する第１級アミノ基が挙げられる。
【０１４６】
以上より、Ｒ３は、好ましくはＣ１〜２０直鎖又は分岐鎖アルキレン基、Ｃ１〜４直鎖アルキレン−Ｃ３〜２０シクロアルキレン−Ｃ１〜４直鎖アルキレン基、Ｃ１〜４直鎖アルキレン−Ｃ６〜２０アリーレン−Ｃ１〜４直鎖アルキレン基、Ｃ３〜２０シクロアルキレン基、又はＣ１〜４直鎖アルキレン−Ｃ３〜２０シクロアルキレン基であり；より好ましくは、Ｃ１〜１２直鎖アルキレン基、Ｃ１〜４直鎖アルキレン−Ｃ３〜１２シクロアルキレン−Ｃ１〜４直鎖アルキレン基、Ｃ１〜４直鎖アルキレン−フェニレン−Ｃ１〜４直鎖アルキレン基、Ｃ３〜１２シクロアルキレン基、またはＣ１〜４直鎖アルキレン−Ｃ１〜４直鎖アルキル基で置換されているＣ３〜１２シクロアルキレン基であり；特に好ましくは、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基、ヘプチレン基、オクチレン基、ノニレン基、デシレン基、ドデシレン基、シクロヘキシレン基、メチレン−トリメチルシクロヘキシレン基、シクロヘキシレンジメチレン基、またはキシリレン基である。
【０１４７】
本発明のジアミン化合物は、ジイソシアネートの原料となるビスカルバメート化合物が得られる化合物が好ましい。本発明において、１，６−ヘキサメチレンジアミン化合物、１，１２−ドデカメチレンジアミン化合物、イソホロンジアミン化合物、１，３−ビス（アミノメチルシクロヘキサン）、１，４−ビス（アミノメチルシクロヘキサン）、４，４’−メチレンビス（シクロヘキサンアミン化合物）、２，５−ビス（アミノメチル）ビシクロ[２，２，１]ヘプタン、２，６−ビス（アミノメチル）ビシクロ[２，２，１]ヘプタン、１，３−ビス（アミノメチル）ベンゼン、１，４−ビス（アミノメチル）ベンゼンからなる群より選ばれる少なくとも１種であることがより好ましい。
【０１４８】
本発明のカーボネート化合物は、一般式（ＩＩＩ）：
【化４】
2012150696.tif 000005
（式中、Ｒ２は、置換基を有していても良い炭化水素基を示し、Ｒ２は互いに独立して環を形成していても良い。）
で示される化合物が好適に使用される。
【０１４９】
一般式（ＩＩＩ）において、Ｒ２の置換基を有していても良い一価の炭化水素基は、一般式（Ｉ）で定義されたＲ１と同義の基が挙げられる。Ｒ２における炭化水素基として、好ましくは、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、またはｎ−ブチル基等のＣ１〜２０、好ましくはＣ１〜６直鎖又は分岐鎖アルキル基であり、特に好ましい基は、メチル基又はエチル基である。
【０１５０】
前記Ｒ２における炭化水素基は、さらなる置換基を有していても良い。さらなる置換基は、例えば、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子）；メトキシル基、エトキシル基、プロポキシル基、またはブトキシル基等のＣ１〜４アルコキシ基；ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、またはジプロピルアミノ基等のＣ１〜４のアルキル基で二置換されたジアルキルアミノ基；シアノ基；またはニトロ基が挙げられる。
【０１５１】
以上より、一般式（ＩＩＩ）で示されるカーボネート化合物は、好ましくはジメチルカーボネート化合物又はジエチルカーボネート化合物である。
【０１５２】
本発明の反応は、有機溶媒を使用して、又は無溶媒で行なうことができる。有機溶媒は、アミン化合物およびカーボネート化合物を溶解でき、かつ、改変型リパーゼまたはその変異体を失活させない溶媒であれば特に限定されないが、飽和環状炭化水素、不飽和環状炭化水素類、非環状エーテル類またはそれらの混合溶媒が好適である。
【０１５３】
飽和環状炭化水素類の溶媒は、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、またはイソプロピルシクロヘキサン等のＣ５〜１０非置換シクロアルカン類；クロロシクロペンタンまたはクロロシクロヘキサン等のハロゲンで置換されたＣ５〜１０シクロアルカン類等が挙げられる。好ましくは、Ｃ５〜１０非置換シクロアルカン類であり、より好ましくは、シクロヘキサンである。
【０１５４】
不飽和環状炭化水素類の溶媒は、ベンゼン、トルエン、キシレンまたはメシチレン等の芳香族炭化水素類；シクロペンテンまたはシクロヘキセン等のＣ５〜１０シクロアルケン類等が挙げられる。好ましくは、芳香族系炭化水素類であり、より好ましくは、トルエンまたはキシレンである。
【０１５５】
非環状エーテルは、脂肪族エーテル類、例えばジエチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、またはジイソプロピルエーテル等のＣ２〜８ジアルキルエーテル類；シクロペンチルメチルエーテルまたはシクロペンチルエチルエーテル等のＣ５〜１８シクロアルキルアルキルエーテル類；ベンジルフェニルエーテル、ベンジルメチルエーテル、アルキルフェニルエーテル、ジフェニルエーテル、ジ(ｐ−トリル)エーテル、またはジベンジルエーテル等のＣ７〜１８芳香族エーテル類等が挙げられる。好ましくは、脂肪族エーテル類、あるいは芳香族エーテル類であり、より好ましくはジイソプロピルエーテルまたはアニソールである。これらの有機溶媒は、単独又は二種以上を混合して使用しても良い。
【０１５６】
前記有機溶媒の使用量は、モノアミン化合物又はジアミン化合物１ｇに対して、好ましくは１〜２００ｍＬ、より好ましくは１〜５０ｍＬ、特に好ましくは１〜２０ｍＬである。
【０１５７】
本発明のカルバメート化反応は、下記反応式（Ｂ）および(Ｃ)で示されるように、例えば、モノアミン化合物又はジアミン化合物、カーボネート化合物、有機溶媒及び改変型リパーゼまたはその変異体（好ましくは、固定化改変型リパーゼまたはその変異体）を混合して、攪拌しながら反応させる。あるいは固定化改変型リパーゼまたはその変異体を充填したカラムに、モノアミン化合物又はジアミン化合物およびカーボネート化合物を含む有機溶媒を通過させる流通連続式等の方法によって行われる。
【０１５８】
流通連続式にて反応を行う場合、反応溶液中のモノアミン化合物又はジアミン化合物の濃度は、反応系の全質量に対して１０〜５０質量％とすることが好ましい。また、反応液の通液線速度は、好ましくは０．５〜４００ｍｍ／分、更に１〜２００ｍｍ／分であるのが好ましい。この通液線速度（ｍｍ／分）は、１分間当りの送液量（ｍｍ３／分）（又は送液速度（１０-３ｍＬ／分）ともいう）を充填層断面積（ｍｍ２）で除した商で表わされる値をいう。通液線速度を上げることによる充填塔内圧力の増大に伴い、通液が困難となり、耐圧性の高い酵素充填塔が必要となる他に、固定化酵素が塔内圧力増加により破砕される場合が生じることもあるため、通液線速度は４００ｍｍ／分以下とすることが好ましい。また、生産性の点から通液線速度は１ｍｍ／分以上とすることが好ましい。固定化酵素の発現活性は、通液線速度により変化するため、最適な通液線速度を選定して反応条件を決定することで、所望の生産能力、製造コストに見合った反応を行うことができる。反応容器中の反応溶液の流通時間は、３０秒〜６時間の範囲とすることができる。
【０１５９】
反応式（Ｂ）：
【化５】
2012150696.tif 000006
（式中、Ｒ１、Ｒ２、ｍ、ｎは前記と同義である。）
【０１６０】
反応式（Ｃ）：
【化６】
2012150696.tif 000007
（式中、Ｒ２、Ｒ３、ｍ、ｎ、ｐは前記と同義である。）
【０１６１】
本発明の反応における温度は、改変型リパーゼまたはその変異体が失活しない温度であれば特に制限されないが、収率良く、所望のカルバメート化合物を得るために、３０℃〜１２０℃が好ましく、６０℃〜９０℃がより好ましく、６５℃〜９０℃が特に好ましい。また、バッチ式反応における反応圧力は、特に制限されないが、常圧下又は減圧下で行なうことが好ましい。バッチ式反応における反応時間は、特に限定されないが０．５時間〜１２０時間が好ましく、０．５時間〜７２時間がより好ましい。
【０１６２】
本発明の反応は、使用するそれぞれの改変型リパーゼまたはその変異体の特性に合わせ、これが失活しない範囲にて行うことが望ましい。
【０１６３】
本発明は、反応が一般に不均一系であり、触媒再利用が可能かつ後処理が簡便であるという点で有利である。即ち、反応終了時にろ過により触媒を取り除き、得られた濾液を濃縮することにより生成物を取得できる。また得られた濾液からの晶析操作によって生成物を得ることもできる。
【０１６４】
本発明の反応のために用いられる製造装置は、特に制限されず、例えば、反応容器、加熱（冷却）装置等、一般的な製造装置が挙げられる。本発明の改変型リパーゼまたはその変異体が担体に固定化され、固定床として反応容器に内装されている装置が好ましい。よって、本発明の反応は、モノアミン化合物又はジアミン化合物と、カーボネート化合物とを、該反応容器に通す工程を含む反応であるのが好ましい。
【０１６５】
更に、本発明の製造方法によって得られた、一般式（ＩＶ）：
【化７】
2012150696.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ｒ２、ｎは前記と同義である。）
で示されるモノカルバメート化合物、又は、一般式（Ｖ）：
【化８】
2012150696.tif 000009
（式中、Ｒ２、Ｒ３、ｍ、ｐは前記と同義である。）
で示されるビスカルバメート化合物
は、蒸留、分液、抽出、晶析、再結晶及びカラムクロマトグラフィー等の一般的な方法によって、更に精製することも出来る。
【０１６６】
本発明の製造方法にて得られるモノカルバメート化合物、ビスカルバメート化合物は、本発明の改変型リパーゼまたはその変異体を使用して製造される。このため、従来のカルバメート化合物の製造方法において起こりうる、製品への金属塩又はハロゲン化物等の不純物混入の可能性は極めて低く、化学的により安全な製品が得られる。
【０１６７】
カルバメート化反応における、本発明の改変型リパーゼまたはその変異体の使用は、本発明の改変型リパーゼまたはその変異体によってカルバメート化反応が行われることを意味する。改変型リパーゼまたはその変異体は、固定化されているものが好ましい。
【０１６８】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【０１６９】
Candida antarctica由来リパーゼB（野生型、配列番号１）の酵母による発現
1）酵母インベルターゼ（SUC2）由来シグナル配列（配列番号６）をコードするDNA断片の増幅
SUC2由来シグナル配列（配列番号６の核酸配列および配列番号７のアミノ酸配列）を酵母発現用ベクターにクローニングするために、以下の二種類のプライマー、すなわちSUC2-F（配列番号８）：5'-gggaatattaagcttggtaccatgcttttgcaagctttccttttc-3'（下線なし部はpYES2/CTベクターに相同な配列、下線部はSUC2シグナル配列のN末端側をコードする塩基配列）およびSUC2-R（配列番号９：5'-tgctggatatctgcagaattctgcagatattttggctgcaaaac-3'（下線なし部はpYES2/CTベクターに相同な配列、下線部はSUC2シグナル配列のC末端側をコードする塩基配列）を用いてPCRにてDNA断片の増幅を行った。Saccharomyces serevisiae S288C株(Open Biosystems社製)の染色体DNAを鋳型として、KOD  Plus（東洋紡社製）を用いて94℃  5分加熱した後、94℃  15秒、54℃  30秒、68℃  18秒のサイクルを30回行った。プライマーなどオリゴヌクレオチドは、株式会社ファスマックから入手した。【０１７０】
2）pYES2/CTベクターの制限酵素による線状化
pYES2/CTベクター（Invitrogen社製）をGAL1プロモーター下流の位置で制限酵素Kpn I（東洋紡社製）で切断した（37℃、5時間）。切断されたDNA断片はQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて精製した。KpnI切断後のDNA断片をさらに制限酵素EcoR I（東洋紡社製）で切断し（37℃、16時間）、DNA断片をQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて精製した。これにより線状化されたpYES2/CTベクターを得た。【０１７１】
3）SUC2由来シグナル配列をコードするDNA断片のベクターへのクローニング
1）で得られたPCR産物5μLに、相同配列を利用したクローニング法であるIn-Fusion Advantage PCR Cloning Kit w/Cloning Enhancer（クロンテック社製）に添付のCloning Enhancerを2μL加え、37℃、15分の処理後、80℃、15分の処理を行い、Cloning Enhancer処理PCR産物を得た。得られたCloning Enhancer処理PCR産物と2）で得られた線状化されたpYES2/CTベクターをキットに添付の方法に従って反応した（37℃、15分の反応後、50℃、15分の反応）。反応後、TE緩衝液を40μL加えて希釈後、液の一部（2.5μL）を用いてECOS E. coli DH5αコンピテントセル（ニッポンジーン社製）50μLを形質転換した。形質転換液全量を50μg/mLカルベニシリン含有LB寒天培地に塗布し、37℃で16時間培養した。得られたコロニーから菌を単離し、50μg/mLカルベニシリン含有LB液体培地にて16時間培養後、プラスミドをWizard Plus Minipreps DNA Purification System（プロメガ社製）を用いて抽出した。得られたプラスミドについては塩基配列を分析し、目的の配列（配列番号６）であることを確認した。得られたSUC2由来シグナル配列が導入されたベクターをpYES2/CT-SUC2sigと称す。【０１７２】
4）Candida antarctica由来リパーゼB遺伝子（配列番号５）をコードするDNA断片の増幅
Candida antarctica由来リパーゼB（CALB）遺伝子（配列番号５）をコードするDNA断片を発現ベクターであるpYES2/CT-SUC2sigにクローニングするために、以下の二種類のプライマー、SUC2-mCALBf（配列番号１０）：5'-gccaaaatatctgcactaccttccggttcggac-3'（下線なし部はSUC2シグナル配列のC末端側をコードする塩基配列に相同な配列、下線部は成熟型CALBのN末端側をコードする塩基配列）およびCalBterminal-r（配列番号１１）：5'-cttaccttcgaagggccctctagactcgagtcagggggtgacgatg-3'（下線なし部はpYES2/CT-SUC2sigに相同な配列、下線部は成熟型CALBのC末端側をコードする塩基配列）を用いてPCRにてDNA断片の増幅を行った。CALB遺伝子（（株）タカラバイオにおいて配列番号５の配列のＤＮＡをオーダーメイドにて合成し、クローニングされたプラスミドを購入した）がクローニングされたベクターを鋳型として、KOD  Plus（東洋紡社製）を用いて94℃  2分加熱した後、94℃  15秒、55℃  30秒、68℃  60秒のサイクルを30回行った。【０１７３】
5）pYES2/CT-SUC2sigベクターの制限酵素による線状化
pYES2/CT-SUC2sigベクターを制限酵素EcoR I（東洋紡社製）で切断した（37℃、15時間）。切断されたDNA断片はQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて精製した。EcoR I切断後のDNA断片をさらに制限酵素Xba I（東洋紡社製）で切断し（37℃、16時間）、DNA断片をQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて精製した。これにより線状化されたpYES2/CT-SUC2sigベクターを得た。【０１７４】
6）Candida antarctica由来リパーゼB遺伝子のpYES2/CT-SUC2sigベクターへのクローニング
4）で得られたPCR産物5μLに、In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit w/Cloning Enhancer（クロンテック社製）に添付のCloning Enhancerを2μL加え、37℃、15分の処理後、80℃、15分の処理を行い、Cloning Enhancer処理PCR産物を得た。得られたCloning Enhancer処理PCR産物と5）で得られた線状化されたpYES2/CT-SUC2sigベクターをキットに添付の方法に従って反応した（37℃、15分の反応後、50℃、15分の反応）。反応後、TE緩衝液を40μL加えて希釈後、液の一部（2.5μL）を用いてECOS E. coli DH5αコンピテントセル（ニッポンジーン社製）50μLを形質転換した。形質転換液全量を50μg/mLカルベニシリン含有LB寒天培地に塗布し、37℃で16時間培養した。得られたコロニーから菌を単離し、50μg/mLカルベニシリン含有LB液体培地にて16時間培養後、プラスミドをWizard Plus Minipreps DNA Purification System（プロメガ社製）を用いて抽出した。得られたプラスミドについては塩基配列を分析し、目的の配列（配列番号５）であることを確認した。得られたSUC2由来シグナル配列が導入されたベクターをpYES2CT/SUC2sig/mCALBと称す（図１）。【０１７５】
7）pYES2CT/SUC2sig/mCALBベクターによる酵母の形質転換及び野生型CALB発現
酵母への形質転換は、S. cerevisiae Direct Transformation Kit Wako（和光純薬社製）を用いて、キット説明書に従って行った。酵母S. cerevisiae BY4742株（Open Biosystems，Inc.より購入）を、OD600＝0.01になるようにYPD液体培地（1％ yeast extract, 2% peptone, 2% glucose）で懸濁し、1mLを30℃、180rpmで27.5時間培養した。形質転換液（キット付属のSc Transformation Reagent 20μlにキット付属Carrier DNA 2μlと、プラスミドDNA 1μgを加えたもの）を調製し、42℃で2時間保温した。pYES2CT/SUC2sig/mCALBベクターと酵母培養液を含む混合液を調製し、形質転換を行った。形質転換液をSC-Ura寒天培地(0.67% yeast nitrogen base (アミノ酸不含)、2% グルコース、0.01% (adenine, arginine, cysteine, leucine, lysine, threonine, tryptophan)、0.005% (aspartic acid, histidine, isoleucine, methionine, phenylalanine, proline, serine, tyrosine, valine)、2% agar、pH 5.6)に塗布後、30℃で3日間培養し、形質転換された酵母コロニーを取得した。【０１７６】
pYES2CT/SUC2sig/mCALBベクターを保有する形質転換酵母を5mLのSC-Ura液体培地に接種し、30℃、200rpmで16時間培養した。得られた前培養液を100mLの発現用YPD液体培地（1％ yeast extract, 4% peptone, 2% glucose）に加え、500mLの坂口フラスコを用いて20℃、130rpmで3日間培養した。YG溶液（20% yeast extract, 40% galactose）を2mL加え、そのまま20℃、130rpmで3日間培養した。培養液を遠心分離後、上清を回収し、培養上清中の酵素活性（エステル化合物分解活性）を下記に示す方法にて測定した。【０１７７】
560μLの基質溶液（50mM Tris-HCl, 1% DMSO, 2.1mM p-nitrophenyl butyrate, pH7.0）をセルに入れて25℃で3分間プレインキュベーションした。次に培養上清を140μLを加えて撹拌し、405nmの吸光度を経時的に分光光度計で測定し、反応の初速を算出した。その結果、pYES2CT/SUC2sig/mCALBベクターを保有する形質転換酵母に高いエステル化合物分解活性が確認された（図２）。【０１７８】
8）リパーゼの精製
10mLのSC-Ura液体培地に菌を接種し、30℃、180rpmで一晩（16時間）振とう培養した。2Lのバッフルフラスコに準備したYPD培地（1% yeast extract, 4% tryptone, 2% glucose）500mLに前培養液10mLを加え、30℃、95rpmで8時間振とう培養した。20% yeast extract 25mL及び40% galactose 25mLを添加し、20℃、95rpmで3日間（約72時間）振とう培養し、発現を誘導した。遠心分離（8000g、10分間）により培養上清を回収後、20mM Tris-HCl緩衝液（pH7.5）で平衡化したButyl-TOYOPEARL 650M（東ソー製）に培養上清を通し、リパーゼを担体に吸着させた。同緩衝液で洗浄後、50%(v/v) EtOHを含む20mM Tris-HCl緩衝液（pH7.5）でリパーゼを溶出した。溶出液を20mM Tris-HCl緩衝液（pH7.5）で平衡化したSuperQ-650S（東ソー製）に通し、素通りした溶液を回収した。【０１７９】
リパーゼを含む溶液を遠心式限外ろ過フィルター（Amicon（登録商標） Ultra-15 Centrifugal Filter Devices、10000MWCO、Millipore製）を用いて1.0mLまで濃縮後、20mM Tris-HCl緩衝液（pH7.5）を10mL加えて混合し、さらに1.0mLまで濃縮した。この操作を計3回実施し、溶媒を緩衝液に置換したリパーゼ濃縮液を得た。20mM Tris-HCl緩衝液（pH7.5）で平衡化したSuperQ-650S（東ソー製）にリパーゼ濃縮液を通し、素通りした溶液を精製リパーゼ溶液とした。【０１８０】
9）リパーゼ固定化酵素の調製
担体としてイオン交換樹脂のLewatitt VPOC 1600（LANXESS社製）0.60gを試験管に準備し、3mLのエタノールを加えて撹はん後、ピペットを用いてエタノールを除去した。蒸留水を3mL加えて撹はん後、同様に水を除去した。水洗浄をさらに2回行い、1.5mg/mLの精製リパーゼ溶液6mL（20mM Tris-HCl緩衝液、pH7.0）に加え、10℃、180rpmで19時間撹はんした。溶液と担体を分離後、回収した担体を3mLの蒸留水で洗浄後、16時間の減圧乾燥を行い、担体重量比担持酵素量３ｗｔ％の固定化酵素を取得した。【０１８１】
固定化処理前後で、リパーゼ溶液中のタンパク質濃度をＢＣＡ法(基準タンパクＢＳＡ)により測定し、固定化処理により減少したタンパク量を担体への固定化タンパク量として、取得固定化酵素重量で除したものを酵素担持量とした。
【実施例２】
【０１８２】
Q193E改変型リパーゼ（配列番号２）の作製
1）Q193E変異の導入
Q193E改変型リパーゼを構築するために、pYES2CT/SUC2sig/mCALBベクターに対して部位変異導入を行った。部位変異導入はKOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社製）を用い、添付マニュアル記載の方法に従って変異導入操作を行った。【０１８３】
以下の二種類のプライマー、CalB-Q193E-F（配列番号１２）：5'-CCTGAGGTGTCCAACTCGCCACTCGACTCATCCTAC-3'（下線部はQ193E変異に相当する配列）およびCalB-Q193E-R（配列番号１３）：5'-CTGAACGATCTCGTCGGTCGC-3'と鋳型としてpYES2CT/SUC2sig/mCALBベクターを用いて変異導入反応（94℃  2分加熱した後、98℃  10秒、68℃  7分のサイクルを10回）を行った。反応液20μLに制限酵素Dpn Iを0.8μL加え、37℃で4時間反応した。この操作で得られた反応液の一部（5μL）を用い、ECOS E. coli DH5αコンピテントセル（ニッポンジーン社製）50μLを形質転換した。形質転換液全量を50μg/mLカルベニシリン含有LB寒天培地に塗布し、37℃で16時間培養した。得られたコロニーから菌を単離し、50μg/mLカルベニシリン含有LB液体培地にて16時間培養後、プラスミドをWizard Plus Minipreps DNA Purification System（プロメガ社製）を用いて抽出した。【０１８４】
得られたプラスミドについて塩基配列を分析し、目的の配列（配列番号１４）であることを確認した。変異が導入されたベクターをpYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193Eと称す。【０１８５】
2）酵母形質転換、Q193E改変型リパーゼの発現、精製及び固定化酵素の調製
実施例１の７）〜９）に記載の方法と同様に行った。
【実施例３】
【０１８６】
W104F改変型リパーゼ（配列番号３）の作製
1）W104F変異の導入
W104F改変型リパーゼを構築するために、pYES2CT/SUC2sig/mCALBベクターに対して部位変異導入を行った。部位変異導入はKOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社製）を用い、添付マニュアル記載の方法に従って変異導入操作を行った。【０１８７】
以下の二種類のプライマー、CalB-W104F-F（配列番号１５）：5'-ACCTTTTCCCAGGGTGGTCTGGTTGCACAG-3'下線部はW104F変異に相当する配列）およびCalB-W104F-R（配列番号１６）：5'-GAGCACGGGAAGCTTGTTGTTG-3'と鋳型としてpYES2CT/SUC2sig/mCALBベクターを用いて変異導入反応（94℃  2分加熱した後、98℃  10秒、68℃  7分のサイクルを10回）を行った。反応液20μLに制限酵素Dpn Iを0.8μL加え、37℃で4時間反応した。この操作で得られた反応液の一部（5μL）を用い、ECOS E. coli DH5αコンピテントセル（ニッポンジーン社製）50μLを形質転換した。形質転換液全量を50μg/mLカルベニシリン含有LB寒天培地に塗布し、37℃で16時間培養した。得られたコロニーから菌を単離し、50μg/mLカルベニシリン含有LB液体培地にて16時間培養後、プラスミドをWizard Plus Minipreps DNA Purification System（プロメガ社製）を用いて抽出した。【０１８８】
得られたプラスミドについて塩基配列を分析し、目的の配列（配列番号１７）であることを確認した。変異が導入されたベクターをpYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104Fと称す。【０１８９】
2）酵母形質転換、W104F改変型リパーゼの発現、精製及び固定化酵素の調製
実施例１の７）〜９）に記載の方法と同様に行った。
【実施例４】
【０１９０】
W104F/Q193E改変型リパーゼ（配列番号４）の作製
1）W104F/Q193E変異の導入
W104F/Q193E改変型リパーゼを構築するために、pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193Eベクターに対して部位変異導入を行った。部位変異導入はKOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社製）を用い、添付マニュアル記載の方法に従って変異導入操作を行った。【０１９１】
以下の二種類のプライマー、CalB-W104F-F（配列番号１５）およびCalB-W104F-R（配列番号１６）と鋳型としてpYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193Eベクターを用いて変異導入反応（94℃  2分加熱した後、98℃  10秒、68℃  7分のサイクルを10回）を行った。反応液20μLに制限酵素Dpn Iを0.8μL加え、37℃で4時間反応した。この操作で得られた反応液の一部（5μL）を用い、ECOS E. coli DH5αコンピテントセル（ニッポンジーン社製）50μLを形質転換した。形質転換液全量を50μg/mLカルベニシリン含有LB寒天培地に塗布し、37℃で16時間培養した。得られたコロニーから菌を単離し、50μg/mLカルベニシリン含有LB液体培地にて16時間培養後、プラスミドをWizard Plus Minipreps DNA Purification System（プロメガ社製）を用いて抽出した。【０１９２】
得られたプラスミドについて塩基配列を分析し、目的の配列（配列番号１８）であることを確認した。変異が導入されたベクターをpYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/Q193Eと称す。【０１９３】
2）酵母形質転換、W104F/Q193E改変型リパーゼの発現、精製及び固定化酵素の調製
実施例１の７）〜９）に記載の方法と同様に行った。
【実施例５】
【０１９４】
改変型リパーゼ（Ｗ１０４Ｆ、Ｑ１９３Ｅ、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ）を用い、カーボネート化合物とモノアミン化合物であるｎ−ヘキシルアミンからのカルバメート化合物合成活性を評価した。【０１９５】
【化９】
2012150696.tif 000010
【０１９６】
攪拌装置、温度調節及び上部冷却装置を備えた内容積約１９ｍｌのガラス製容器に、ｎ−ヘキシルアミン２００ｍｇ（１．９７ｍｍｏｌ）、炭酸ジメチル０．５３６ｇ（５．９５ｍｍｏｌ）、内部標準物質として、テトラエチレングリコールジメチルエーテル２０．０ｍｇを加えた後トルエンを加えて２．０ｍｌに定容した反応液に、実施例１〜４で調製した固定化リパーゼ（担持酵素量３ｗｔ％）１０．０ｍｇを混合し、攪拌しながら７０℃にて２４時間反応させた。反応中、経時的に反応液５０μｌを採取し、150μlメタノールを加えたものをろ過し、１．０μｌをガスクロマト分析に供した（図３Ａ）。反応収率は、生成物標準品と内標比の検量線から、生成物量を定量して算出した。【０１９７】
ガスクロマト分析条件
カラム：DB-5 30m×0.25mmID 0.25μm
カラム温度：80℃(2min)→10℃/min→250℃(2min)
INJ：200℃    DET：FID at 250℃
Carrier Gas ：He、線速度30cm/sec
Sprit ratio 50:1、注入量 ： 1.0μ
保持時間：テトラエチレングリコールジメチルエーテル：12.3min,
ｎ-ヘキシルアミン:3.15min
ｎ-ヘキシルカーバメート:8.84min 【０１９８】
結果
【表１】
2012150696.tif 000011
【０１９９】
上記表１および図３Ｂに示すとおり、Ｑ１９３Ｅ改変型リパーゼは、野生型リパーゼと比較して、カルバメート化合物の合成活性が約１．５倍向上した（反応時間３、６、８ｈ）。一方、Ｗ１０４Ｆ改変型リパーゼは、野生型リパーゼとほぼ同等の活性であった。驚くべきことに、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ改変型リパーゼでは、野生型リパーゼと比較して、カルバメート化合物の合成活性が約２．０倍向上した（反応時間３、６、８ｈ）。
【実施例６】
【０２００】
改変型リパーゼ（Ｗ１０４Ｆ、Ｑ１９３Ｅ、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ）を用い、カーボネート化合物とジアミン化合物である1,3-ビスアミノメチルシクロヘキサン（１，３−ＢＡＣ）からのカルバメート化合物合成活性を評価した。【０２０１】
【化１０】
2012150696.tif 000012
【０２０２】
攪拌装置、温度調節及び上部冷却装置を備えた内容積約１９ｍｌのガラス製容器に、1,3-ビスアミノメチルシクロヘキサン（１，３−ＢＡＣ）２００ｍｇ（１．４１ｍｍｏｌ）、炭酸ジメチル７６０ｍｇ（８．４３ｍｍｏｌ）、内部標準物質として、テトラデカン２０．０ｍｇを加えた後トルエンを加えて２．０ｍｌに定容した反応液に実施例１〜４で調製した固定化リパーゼ（担持酵素量３ｗｔ％）１０．０ｍｇを混合し、攪拌しながら７０℃にて４８時間反応させた。反応中、経時的に反応液５０μｌを採取し、１５０μlＤＭＦを加えたものをろ過し、１．０μｌをガスクロマト分析に供した。反応収率は、生成物標準品と内標比の検量線から、生成物量を定量して算出した。【０２０３】
ガスクロマト分析条件
カラム：DB-5 30m×0.25mmID 0.25μm
カラム温度：80℃(2min)→10℃/min→250℃(2min)
INJ：200℃    DET：FID at 250℃
Carrier Gas：He、線速度30cm/sec
Sprit ratio 50:1、注入量：1.0μ
保持時間：テトラデカン：１１．０min,
1,3BAC-モノカルバメート(異性体混合物)：１４．９min,
1,3BAC-ジカルバメート(異性体混合物)：１８．９，１９．２min, 【０２０４】
結果
【表２】
2012150696.tif 000013
【０２０５】
上記表２および図４に示すとおり、Ｑ１９３Ｅ改変型リパーゼは、野生型リパーゼと比較して、カルバメート化合物の合成活性が約１．５倍向上した（反応時間２４、４８ｈ）。一方、Ｗ１０４Ｆ改変型リパーゼは、本基質に対しては、野生型リパーゼと比べて合成活性がやや低下した。驚くべきことに、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ改変型リパーゼでは、野生型リパーゼと比較して、カルバメート化合物の合成活性が約２．０倍向上した（反応時間２４、４８ｈ）。
【実施例７】
【０２０６】
改変型リパーゼ（Ｗ１０４Ｆ、Ｑ１９３Ｅ、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ）を用い、カーボネート化合物とジアミン化合物である１，１２−ジアミノドデカンからのカルバメート化合物合成活性を評価した。【０２０７】
【化１１】
2012150696.tif 000014
【０２０８】
攪拌装置、温度調節及び上部冷却装置を備えた内容積約１９ｍｌのガラス製容器に、１，１２−ジアミノドデカン２００ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）、炭酸ジメチル５４０ｍｇ（６．０ｍｍｏｌ）を加えた後トルエンを加えて２．０ｍｌに定容した反応液に実施例１〜４で調製した固定化リパーゼ（担持酵素量３ｗｔ％）１０ｍｇを混合し、攪拌しながら７０℃にて４４時間反応させた。反応中、経時的に反応液５０μｌを採取し、反応停止のために１５０μｌメタノールを加えた。次いで、遠心濃縮器にて減圧濃縮した後、メタノール１．０ｍｌを加え溶解させたのち、０．４５μｍフィルターでろ過してHPLC分析に供した。反応収率は、あらかじめ生成物標準品のピーク面積から作製した検量線より、生成物量を定量して算出した。【０２０９】
ＨＰＬＣ分析条件
Column：Inertsil ODS-3V 4.6mm×250 mm（GLScienceInc）
Mobile Phase：MeOH/H2O(20mM KH2PO4, pH7.0) =70/30
Flow Rate：1.0ml/min
Detecter：RI
Column Temp：40℃
Injection Vol.    10μl
保持時間：DMD-ジカルバメート：１７．４min, 【０２１０】
結果
【表３】
2012150696.tif 000015
【０２１１】
上記表３および図５に示すとおり、Ｑ１９３Ｅ改変型リパーゼは、野生型リパーゼと比較して、ジカルバメート化合物の合成活性が約２倍向上した（反応時間２０、４４ｈ）。一方、Ｗ１０４Ｆ改変型リパーゼは、本基質に対しては、野生型リパーゼと比べて合成活性がやや低下した。驚くべきことに、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ改変型リパーゼでは、Ｑ１９３Ｅ改変型リパーゼと比較して、ジカルバメート化合物の合成活性が上回った。
【実施例８】
【０２１２】
改変型リパーゼ（Ｗ１０４Ｆ、Ｑ１９３Ｅ、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ）を用い、カーボネート化合物とジアミン化合物であるキシリレンジアミン（ＸＤＡ）からのカルバメート化合物合成活性を評価した。【０２１３】
【化１２】
2012150696.tif 000016
【０２１４】
攪拌装置、温度調節及び上部冷却装置を備えた内容積約１９ｍｌのガラス製容器に、キシリレンジアミン化合物２００ｍｇ（１．４６ｍｍｏｌ）、炭酸ジメチル０．７９ｇ（８．８１ｍｍｏｌ）、内部標準物質として、テトラデカン２０．０ｍｇを加えた後トルエンを加えて２．０ｍｌに定容した反応液に、実施例１〜４で調製した固定化リパーゼ（担持酵素量３ｗｔ％）１０ｍｇを混合し、攪拌しながら７０℃にて２４時間反応させた。反応中、経時的に反応液５０μｌを採取し、１５０μlＤＭＦを加えたものをろ過し、１．０μｌをガスクロマト分析に供した。反応収率は、生成物標準品と内標比の検量線から、生成物量を定量して算出した。【０２１５】
ガスクロマト分析条件
カラム：DB-5 30m×0.25mmID 0.25μm
カラム温度：80℃(2min)→10℃/min→250℃(2min)
INJ：200℃    DET：FID at 250℃
Carrier Gas ：He、線速度30cm/sec
Sprit ratio 50:1、注入量 ： 1.0μ
保持時間：テトラデカン：１１．０min,
ＸＤＡ-モノカルバメート：１５．５min,
ＸＤＡ-ジカルバメート：１９．６min, 【０２１６】
結果
【表４】
2012150696.tif 000017
【０２１７】
上記表４および図６に示すとおり、ジアミン化合物としてキシリレンジアミン化合物を基質とした場合、野生型と比較して、Ｑ１９３Ｅ改変型リパーゼとＷ１０４Ｆ改変型リパーゼのジカルバメート化合物の合成活性は、３倍程度向上し、さらに２重改変体であるＷ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ改変型リパーゼでは、野生型リパーゼと比較して５倍以上の活性の向上が認められた。
【実施例９】
【０２１８】
Ｑ１９３Ｄ（配列番号１９および３５）、Ｌ２７８Ｒ（配列番号２１および３７）、Ｌ２７８Ｋ（配列番号２２および３８）及びＡ２８３Ｖ（配列番号６０および６１）改変型リパーゼの合成
１）改変の導入
各改変型リパーゼを構築するために、実施例１で作成したpYES2CT/SUC2sig/mCALBベクター（図１）に対して部位変異導入を行った。部位変異導入はKOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社製）を用い、添付マニュアル記載の方法に従って変異導入操作を行った。
下表５に記載のプライマー（下線部は変異に相当する配列）を用いて変異導入反応（94℃  2分加熱した後、98℃  10秒、68℃  7分のサイクルを10回）を行った。【０２１９】
【表５】
2012150696.tif 000018
【０２２０】
反応液20 μLに制限酵素Dpn Iを0.8μL加え、37℃で4時間反応した。この操作で得られた反応液の一部（5μL）を用い、ECOS E. coli DH5αコンピテントセル（ニッポンジーン社製）50μLを形質転換した。形質転換液全量を50μg/mLカルベニシリン含有LB寒天培地に塗布し、37℃で16時間培養した。得られたコロニーから菌を単離し、50μg/mLカルベニシリン含有LB液体培地にて16時間培養後、プラスミドをWizard（登録商標） Plus Minipreps DNA Purification System（プロメガ社製）を用いて抽出した。【０２２１】
得られたプラスミドについては塩基配列を分析し、目的の配列であることを確認した。改変が導入されたベクターをそれぞれpYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193D、pYES2CT/SUC2sig/mCALB-L278R、pYES2CT/SUC2sig/mCALB-L278K及びpYES2CT/SUC2sig/mCALB-A283Vと称す。【０２２２】
２）酵母形質転換、Ｑ１９３Ｄ、Ｌ２７８Ｒ、Ｌ２７８Ｋ及びＡ２８３Ｖ改変型リパーゼの発現、精製及び固定化酵素の調製
実施例１に記載の方法と同様に行った。
【実施例１０】
【０２２３】
Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼ（配列番号２３および３９）の合成
１）変異の導入
Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼを構築するために、実施例２で作成したpYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193Eベクターに対して部位変異導入を行った。部位変異導入はKOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社製）を用い、添付マニュアル記載の方法に従って変異導入操作を行った。【０２２４】
以下の二種類のプライマー、すなわちCalB-L278Rf（配列番号５３）：5'-CTCAGGGCGCCGGCGGCTGCAGCCATCGTG-3’（下線部はL278R変異に相当する配列）およびCalB-L278r（配列番号５４）：5'-CGCAGCCGCGGCGACCTTTTGCTC-3’を用いて変異導入反応（94℃  2分加熱した後、98℃  10秒、68℃  7分のサイクルを10回）を行った。反応液20μLに制限酵素Dpn Iを0.8μL加え、37℃で4時間反応した。この操作で得られた反応液の一部（5μL）を用い、ECOS E. coli DH5αコンピテントセル（ニッポンジーン社製）50μLを形質転換した。形質転換液全量を50μg/mLカルベニシリン含有LB寒天培地に塗布し、37℃で16時間培養した。得られたコロニーから菌を単離し、50μg/mLカルベニシリン含有LB液体培地にて16時間培養後、プラスミドをWizard（登録商標） Plus Minipreps DNA Purification System（プロメガ社製）を用いて抽出した。【０２２５】
得られたプラスミドについては塩基配列を分析し、目的の配列であることを確認した。変異が導入されたベクターをpYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193E/L278Rと称す。【０２２６】
２）酵母形質転換、Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼの発現、精製及び固定化酵素の調製
実施例１に記載の方法と同様に行った。
【実施例１１】
【０２２７】
Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼ（配列番号２８および４４）の合成
１）改変の導入
改変型リパーゼを構築するために、まず実施例９で作成したpYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193Eベクターに対してL278K部位変異導入を行った。部位変異導入はKOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社製）を用い、添付マニュアル記載の方法に従って変異導入操作を行った。【０２２８】
以下の二種類のプライマー、すなわちCalB-L278Kf（配列番号５５）：5'-CTCAAGGCGCCGGCGGCTGCAGCCATCGTG-3’（下線部はL278K変異に相当する配列）およびCalB-L278r（配列番号５６）：5'-CGCAGCCGCGGCGACCTTTTGCTC-3’を用いて変異導入反応（94℃  2分加熱した後、98℃  10秒、68℃  7分のサイクルを10回）を行った。【０２２９】
反応液20μLに制限酵素Dpn Iを0.8μL加え、37℃で4時間反応した。この操作で得られた反応液の一部（5μL）を用い、ECOS E. coli DH5αコンピテントセル（ニッポンジーン社製）50 μLを形質転換した。形質転換液全量を50μg/mLカルベニシリン含有LB寒天培地に塗布し、37℃で16時間培養した。得られたコロニーから菌を単離し、50 μg/mLカルベニシリン含有LB液体培地にて16時間培養後、プラスミドをWizard（登録商標） Plus Minipreps DNA Purification System（プロメガ社製）を用いて抽出した。【０２３０】
得られたプラスミドについては塩基配列を分析し、目的の配列であることを確認した。変異が導入されたベクターをpYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193E/L278Kと称す。【０２３１】
次に、W104F変異を導入するために、pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193E/L278Kベクターに対して部位変異導入を行った。部位変異導入はKOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社製）を用い、添付マニュアル記載の方法に従って変異導入操作を行った。【０２３２】
以下の二種類のプライマー、すなわちCalB-W104Ff（配列番号１５）：5'-ACCTTTTCCCAGGGTGGTCTGGTTGCACAG-3’（下線部はW104F変異に相当する配列）およびCalB-W104r（配列番号１６）：5'-GAGCACGGGAAGCTTGTTGTTG-3’を用いて変異導入反応（94℃  2分加熱した後、98℃  10秒、68℃  7分のサイクルを10回）を行った。【０２３３】
反応液20μLに制限酵素Dpn Iを0.8μL加え、37℃で4時間反応した。この操作で得られた反応液の一部（5μL）を用い、ECOS E. coli DH5αコンピテントセル（ニッポンジーン社製）50μLを形質転換した。形質転換液全量を50μg/mLカルベニシリン含有LB寒天培地に塗布し、37℃で16時間培養した。得られたコロニーから菌を単離し、50μg/mLカルベニシリン含有LB液体培地にて16時間培養後、プラスミドをWizard（登録商標） Plus Minipreps DNA Purification System（プロメガ社製）を用いて抽出した。【０２３４】
得られたプラスミドについては塩基配列を分析し、目的の配列であることを確認した。変異が導入されたベクターをpYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/Q193E/L278Kと称す。【０２３５】
２）酵母形質転換、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼの発現、精製及び固定化酵素の調製
実施例１に記載の方法と同様に行った。
【実施例１２】
【０２３６】
Ｑ１９３Ｄ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼ（配列番号３０および４６）の合成
１）改変の導入
改変型リパーゼを構築するために、まず実施例９で作成したpYES2CT/SUC2sig/mCALB-L278Kベクターに対してW104F部位変異導入を行った。部位変異導入はKOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社製）を用い、添付マニュアル記載の方法に従って変異導入操作を行った。【０２３７】
以下の二種類のプライマー、すなわちCalB-W104Ff（配列番号１５）：5'-ACCTTTTCCCAGGGTGGTCTGGTTGCACAG-3’（下線部はW104F変異に相当する配列）およびCalB-W104r（配列番号１６）：5'-GAGCACGGGAAGCTTGTTGTTG-3’を用いて変異導入反応（94℃  2分加熱した後、98℃  10秒、68℃  7分のサイクルを10回）を行った。【０２３８】
反応液20μLに制限酵素Dpn Iを0.8 μL加え、37℃で4時間反応した。この操作で得られた反応液の一部（5μL）を用い、ECOS E. coli DH5αコンピテントセル（ニッポンジーン社製）50μLを形質転換した。形質転換液全量を50μg/mLカルベニシリン含有LB寒天培地に塗布し、37℃で16時間培養した。得られたコロニーから菌を単離し、50μg/mLカルベニシリン含有LB液体培地にて16時間培養後、プラスミドをWizard（登録商標） Plus Minipreps DNA Purification System（プロメガ社製）を用いて抽出した。【０２３９】
得られたプラスミドについては塩基配列を分析し、目的の配列であることを確認した。変異が導入されたベクターをpYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/L278Kと称す。【０２４０】
次に、Q193D変異を導入するために、pYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/L278Kベクターに対して部位変異導入を行った。部位変異導入はKOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社製）を用い、添付マニュアル記載の方法に従って変異導入操作を行った。【０２４１】
以下の二種類のプライマー、すなわちCalB-Q193Df（配列番号５１）：5'-CCTGACGTGTCCAACTCGCCACTCGACTCATCCTAC-3’（下線部はQ193D変異に相当する配列）およびCalB-Q193r（配列番号５２）：5'-CTGAACGATCTCGTCGGTCGC-3’を用いて変異導入反応（94℃  2分加熱した後、98℃  10秒、68℃  7分のサイクルを10回）を行った。【０２４２】
反応液20μLに制限酵素Dpn Iを0.8μL加え、37℃で4時間反応した。この操作で得られた反応液の一部（5μL）を用い、ECOS E. coli DH5αコンピテントセル（ニッポンジーン社製）50μLを形質転換した。形質転換液全量を50μg/mLカルベニシリン含有LB寒天培地に塗布し、37℃で16時間培養した。得られたコロニーから菌を単離し、50 μg/mLカルベニシリン含有LB液体培地にて16時間培養後、プラスミドをWizard（登録商標） Plus Minipreps DNA Purification System（プロメガ社製）を用いて抽出した。【０２４３】
得られたプラスミドについては塩基配列を分析し、目的の配列であることを確認した。変異が導入されたベクターをpYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/Q193D/L278Kと称す。【０２４４】
２）酵母形質転換、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼの発現、精製及び固定化酵素の調製
実施例１に記載の方法と同様に行った。
【実施例１３】
【０２４５】
Ｑ１９３Ｅ／Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｒ／Ａ２８３Ｖ変異型リパーゼ（配列番号３１および４７）の合成
１）改変の導入
各改変型リパーゼを構築するために、実施例４で作成したpYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/Q193Eベクターに対して部位変異導入を行った。部位変異導入はKOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社製）を用い、添付マニュアル記載の方法に従って変異導入操作を行った。【０２４６】
以下の二種類のプライマー、すなわちCalB-L278R/A283Vf（配列番号５９）：5'-CTCAGGGCGCCGGCGGCTGTAGCCATCGTG-3’（下線部はそれぞれL278R変異およびA283V変異に相当する配列）およびCalB-L278r（配列番号５４）：5'-CGCAGCCGCGGCGACCTTTTGCTC-3’を用いて変異導入反応（94℃  2分加熱した後、98℃  10秒、68℃  7分のサイクルを10回）を行った。反応液20μLに制限酵素Dpn Iを0.8μL加え、37℃で4時間反応した。この操作で得られた反応液の一部（5μL）を用い、ECOS E. coli DH5αコンピテントセル（ニッポンジーン社製）50μLを形質転換した。形質転換液全量を50μg/mLカルベニシリン含有LB寒天培地に塗布し、37℃で16時間培養した。得られたコロニーから菌を単離し、50μg/mLカルベニシリン含有LB液体培地にて16時間培養後、プラスミドをWizard Plus Minipreps DNA Purification System（プロメガ社製）を用いて抽出した。【０２４７】
得られたプラスミドについては塩基配列を分析し、目的の配列であることを確認した。変異が導入されたベクターをpYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/Q193E/L278R/A283Vと称す。【０２４８】
２）酵母形質転換、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ／Ａ２８３Ｖ改変型リパーゼの発現、精製及び固定化酵素の調製
実施例１に記載の方法と同様に行った。
【実施例１４】
【０２４９】
実施例９から１３で調製した改変型リパーゼ（Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ／Ａ２８３Ｖ、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｋ、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｋ、Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ、Ｌ２７８Ｒ、Ｌ２７８Ｋ、Ｑ１９３Ｄ、Ａ２８３Ｖ）を用い、実施例５と同様にカーボネート化合物（炭酸ジメチル）とモノアミン化合物（ｎ−ヘキシルアミン化合物）からのカルバメート化合物合成活性を評価した。【０２５０】
結果
【表６】
2012150696.tif 000019
野生型〜W104F/Q193Eは、比較のために実施例５の表１のデータを記載した。【０２５１】
上記表６および図７に示すとおり、W104F/Q193E/L278R/A283V、W104F/Q193D/L278K、W104F/Q193E/L278K、Q193E/L278R改変型リパーゼは、Q193E改変型リパーゼより、反応３、６、８時間における収率が有意に高く、さらなる反応速度の向上が認められた。
W104F/Q193E/L278R/A283V改変型リパーゼの反応３時間における収率は、野生型リパーゼと比較して、約４倍高い。
【実施例１５】
【０２５２】
実施例９から１３で調製した改変型リパーゼ（Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ／Ａ２８３Ｖ、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｋ、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｋ、Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ、Ｌ２７８Ｒ、Ｌ２７８Ｋ、Ｑ１９３Ｄ、Ａ２８３Ｖ）を用い、実施例６と同様にカーボネート化合物とジアミン化合物である１，３−ビスアミノメチルシクロヘキサン（１，３−ＢＡＣ）のカルバメート化合物合成活性を評価した。但し、実験条件が、以下の点で異なる。【０２５３】
実施例６では、２．０重量％の水分を含む１，３−ＢＡＣを用いたのに対して、実施例１４では、０．０３重量％の水分を含む１，３−ＢＡＣを用いた。なお、水分の測定はカールフィッシャー水分計による。【０２５４】
結果
【表７】
2012150696.tif 000020
【０２５５】
上記表７に示すとおり、W104F/Q193E/L278R/A283V、W104F/Q193D/L278K、W104F/Q193E/L278K、Q193E/L278R改変型リパーゼは、Q193E改変型リパーゼより、収率が有意に高く、さらなる反応速度の向上が認められた。特に、Q193E/L278R改変型リパーゼにおける収率および反応速度の向上は著しい。
【実施例１６】
【０２５６】
実施例９から１３で調製した改変型リパーゼ（Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ／Ａ２８３Ｖ、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｋ、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｋ、Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ、Ｌ２７８Ｒ、Ｌ２７８Ｋ、Ｑ１９３Ｄ、Ａ２８３Ｖ）を用い、実施例８と同様にカーボネート化合物とジアミン化合物であるキシリレンジアミン（ＸＤＡ）からのカルバメート化合物合成活性を評価した。【０２５７】
結果
【表８】
2012150696.tif 000021
【０２５８】
上記表８に示すとおり、W104F/Q193E/L278R/A283V、W104F/Q193D/L278K、W104F/Q193E/L278K、Q193E/L278R改変型リパーゼは、Q193E改変型リパーゼより、活性の向上が認められた。しかし、W104F/Q193E/L278R/A283V とW104F/Q193E 改変型リパーゼが最も高かった。基質によって、最適な改変型リパーゼは異なることが示された。
【実施例１７】
【０２５９】
実施例９から１３で調製した改変型リパーゼ（Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ／Ａ２８３Ｖ、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｋ、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｋ、Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ、Ｌ２７８Ｒ、Ｌ２７８Ｋ、Ｑ１９３Ｄ、Ａ２８３Ｖ）を用い、エステル化合物とアルコール化合物からのエステル交換活性を評価した。
【化１３】
2012150696.tif 000022
攪拌装置、温度調節及び上部冷却装置を備えた内容積約１９ｍｌのガラス製容器に、ｎ−ブタノール２００ｍｇ（２．６９ｍｍｏｌ）、酢酸ビニル０．４６３ｇ（５．３８ｍｍｏｌ）、内部標準物質として、テトラエチレングリコールジメチルエーテル２０．０ｍｇを加えた後トルエンを加えて２．０ｍｌに定容した反応液に実施例１および実施例９から１３で調製した固定化リパーゼ（担持酵素量３ｗｔ％）１０．０ｍｇを混合し、攪拌しながら３０℃にて３時間反応させた。反応中、経時的に反応液５０μｌを採取し、150μlアセトンを加えたものをろ過し、１．０μｌをガスクロマト分析に供した。
反応収率は、生成物標準品と内標比の検量線から、生成物量を定量して算出した。【０２６０】
ガスクロマト分析条件
GC Analysis（GC-1700)
カラム：DB-1701 30m×0.25mmID 0.25μm
Oven：40℃(2min)→10℃/min→250℃(2min)
INJ：Sprit at 250℃    DET：FID 250℃
Carrier Gas ：He
線速度30cm/sec
Sprit ratio 50:1
注入量 ： 1.0μ
保持時間：テトラエチレングリコールジメチルエーテル：１７．３min,
ｎ-ブチルアミン:３．２min
プロピオン酸ブチル:５．６min 【０２６１】
結果
【表９】
2012150696.tif 000023
【０２６２】
上記表９に示すとおり、Q193E/L278R、L278R、L278K改変型リパーゼは、野生型リパーゼより、顕著な反応速度の向上が認められた。
【実施例１８】
【０２６３】
Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼの合成
1）変異の導入
W104F/L278K（配列番号６２と６３）改変型リパーゼを構築するために、pYES2CT/SUC2sig/mCALB-L278Kベクターに対して部位変異導入を行った。部位変異導入はKOD -Plus- Mutagenesis Kit（東洋紡社製）を用い、添付マニュアル記載の方法に従って変異導入操作を行った。【０２６４】
以下の二種類のプライマー、すなわちCalB-W104Ff（配列番号１５）：5'-ACCTTTTCCCAGGGTGGTCTGGTTGCACAG-3’（下線部はW104F変異に相当する配列）およびCalB-W104Fr（配列番号１６）：5'-GAGCACGGGAAGCTTGTTGTTG-3’を用いて変異導入反応（94℃  2分加熱した後、98℃  10秒、68℃  7分のサイクルを10回）を行った。【０２６５】
反応液20 μLに制限酵素Dpn Iを0.8 μL加え、37℃で4時間反応した。この操作で得られた反応液の一部（5 μL）を用い、ECOS E. coli DH5αコンピテントセル（ニッポンジーン社製）50 μLを形質転換した。形質転換液全量を50 μg/mLカルベニシリン含有LB寒天培地に塗布し、37℃で16時間培養した。得られたコロニーから菌を単離し、50 μg/mLカルベニシリン含有LB液体培地にて16時間培養後、プラスミドをWizardR Plus Minipreps DNA Purification System（プロメガ社製）を用いて抽出した。【０２６６】
得られたプラスミドについては塩基配列を分析し、目的の配列であることを確認した。変異が導入されたベクターをpYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/L278Kと称す。【０２６７】
2）酵母形質転換、Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼの発現、精製及び固定化酵素の調製
実施例１に記載の方法と同様に行った。
【実施例１９】
【０２６８】
Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼの合成
1）変異の導入
Q193E/L278K（配列番号２４と４０）改変型リパーゼを構築するために、pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193Eベクターに対して部位変異導入を行った。部位変異導入はKOD -Plus- Mutagenesis Kit（東洋紡社製）を用い、添付マニュアル記載の方法に従って変異導入操作を行った。【０２６９】
以下の二種類のプライマー、すなわちCalB-L278Kf（配列番号５５）：5'- CTCAAGGCGCCGGCGGCTGCAGCCATCGTG-3’（下線部はL278K変異に相当する配列）およびCalB-L278r（配列番号５６）：5'-CGCAGCCGCGGCGACCTTTTGCTC-3’を用いて変異導入反応（94℃  2分加熱した後、98℃  10秒、68℃  7分のサイクルを10回）を行った。【０２７０】
反応液20 μLに制限酵素Dpn Iを0.8 μL加え、37℃で4時間反応した。この操作で得られた反応液の一部（5 μL）を用い、ECOS E. coli DH5αコンピテントセル（ニッポンジーン社製）50 μLを形質転換した。形質転換液全量を50 μg/mLカルベニシリン含有LB寒天培地に塗布し、37℃で16時間培養した。得られたコロニーから菌を単離し、50 μg/mLカルベニシリン含有LB液体培地にて16時間培養後、プラスミドをWizardR Plus Minipreps DNA Purification System（プロメガ社製）を用いて抽出した。【０２７１】
得られたプラスミドについては塩基配列を分析し、目的の配列であることを確認した。変異が導入されたベクターをpYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193E/L278Kと称す。【０２７２】
2）酵母形質転換、Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼの発現、精製及び固定化酵素の調製
実施例１に記載の方法と同様に行った。
【実施例２０】
【０２７３】
Ｑ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼの合成
1）変異の導入
Q193D/L278K（配列番号２６と４２）改変型リパーゼを構築するために、pYES2CT/SUC2sig/mCALB-L278Kベクターに対して部位変異導入を行った。部位変異導入はKOD -Plus- Mutagenesis Kit（東洋紡社製）を用い、添付マニュアル記載の方法に従って変異導入操作を行った。【０２７４】
以下の二種類のプライマー、すなわちCalB-Q193Df（配列番号５１）：5'- CCTGACGTGTCCAACTCGCCACTCGACTCATCCTAC-3’（下線部はQ193D変異に相当する配列）およびCalB-Q193r（配列番号５２）：5'-CTGAACGATCTCGTCGGTCGC-3’を用いて変異導入反応（94℃  2分加熱した後、98℃  10秒、68℃  7分のサイクルを10回）を行った。【０２７５】
反応液20 μLに制限酵素Dpn Iを0.8 μL加え、37℃で4時間反応した。この操作で得られた反応液の一部（5 μL）を用い、ECOS E. coli DH5αコンピテントセル（ニッポンジーン社製）50 μLを形質転換した。形質転換液全量を50 μg/mLカルベニシリン含有LB寒天培地に塗布し、37℃で16時間培養した。得られたコロニーから菌を単離し、50 μg/mLカルベニシリン含有LB液体培地にて16時間培養後、プラスミドをWizardR Plus Minipreps DNA Purification System（プロメガ社製）を用いて抽出した。【０２７６】
得られたプラスミドについては塩基配列を分析し、目的の配列であることを確認した。変異が導入されたベクターをpYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193D/L278Kと称す。【０２７７】
2）酵母形質転換、Ｑ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｋ改変型リパーゼの発現、精製及び固定化酵素の調製
実施例１に記載の方法と同様に行った。
【実施例２１】
【０２７８】
Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼの合成
1）変異の導入
W104F/Q193E/L278R（配列番号２７と４３）改変型リパーゼを構築するために、まずpYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/Q193Eベクターに対してL278R部位変異導入を行った。部位変異導入はKOD -Plus- Mutagenesis Kit（東洋紡社製）を用い、添付マニュアル記載の方法に従って変異導入操作を行った。【０２７９】
以下の二種類のプライマー、すなわちCalB-L278Rf（配列番号５３）：5'- CTCAGGGCGCCGGCGGCTGCAGCCATCGTG-3’（下線部はL278R変異に相当する配列）およびCalB-L278r（配列番号５４）：5'-CGCAGCCGCGGCGACCTTTTGCTC-3’を用いて変異導入反応（94℃  2分加熱した後、98℃  10秒、68℃  7分のサイクルを10回）を行った。
反応液20 μLに制限酵素Dpn Iを0.8 μL加え、37℃で4時間反応した。この操作で得られた反応液の一部（5 μL）を用い、ECOS E. coli DH5αコンピテントセル（ニッポンジーン社製）50 μLを形質転換した。形質転換液全量を50 μg/mLカルベニシリン含有LB寒天培地に塗布し、37℃で16時間培養した。得られたコロニーから菌を単離し、50 μg/mLカルベニシリン含有LB液体培地にて16時間培養後、プラスミドをWizardR Plus Minipreps DNA Purification System（プロメガ社製）を用いて抽出した。【０２８０】
得られたプラスミドについては塩基配列を分析し、目的の配列であることを確認した。変異が導入されたベクターをpYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/Q193E/L278Rと称す。【０２８１】
2）酵母形質転換、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ改変型リパーゼの発現、精製及び固定化酵素の調製
実施例１に記載の方法と同様に行った。
【実施例２２】
【０２８２】
実施例１８から２１で調製した改変型リパーゼ（Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ、Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ、Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｋ、Ｑ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｋ）を用い、実施例５と同様にカーボネート化合物（炭酸ジメチル）とモノアミン化合物（ｎ−ヘキシルアミン化合物）からのカルバメート化合物合成活性を評価した。【０２８３】
結果
【表１０】
2012150696.tif 000024
【０２８４】
比較のために、野生型〜Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅは、実施例５の表１のデータ、Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ／Ａ２８３Ｖ〜Ａ２８３Ｖは実施例１４の表６のデータを記載した。【０２８５】
上記表１０に示すとおり、W104F/Q193E/L278R改変型リパーゼは、野生型リパーゼより、反応３、６、８時間における収率が有意に高く、さらなる反応速度の向上が認められた。
【実施例２３】
【０２８６】
実施例１８から２１で調製した改変型リパーゼ（Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ、Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ、Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｋ、Ｑ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｋ）を用い、実施例１５と同様にカーボネート化合物とジアミン化合物である１，３−ビスアミノメチルシクロヘキサン（１，３−ＢＡＣ）のカルバメート化合物合成活性を評価した。実施例１４と同様に、０．０３重量％の水分を含む１，３−ＢＡＣを用いた。なお、水分の測定はカールフィッシャー水分計による。【０２８７】
結果
【表１１】
2012150696.tif 000025
【０２８８】
比較のために、野生型〜Ａ２８３Ｖは実施例１５の表７のデータを記載した。【０２８９】
上記表１１に示すとおり、W104F/Q193E/L278R改変型リパーゼは、野生型リパーゼより、収率が有意に高く、反応速度の向上が認められた。
【実施例２４】
【０２９０】
実施例１８から２１で調製した改変型リパーゼ（Ｗ１０４Ｆ／Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｒ、Ｗ１０４Ｆ／Ｌ２７８Ｋ、Ｑ１９３Ｅ／Ｌ２７８Ｋ、Ｑ１９３Ｄ／Ｌ２７８Ｋ）を用い、実施例１７と同様にエステル化合物とアルコール化合物からのエステル交換活性を評価した。【０２９１】
結果
【表１２】
2012150696.tif 000026
【０２９２】
比較のために、野生型〜Ａ２８３Ｖは実施例１７の表９のデータを記載した。
上記表１２に示すとおり、Q193D/L278K改変型リパーゼは、野生型リパーゼより、収率が有意に高く、反応速度の向上が認められた。
【産業上の利用可能性】
【０２９３】
本発明は、カーボネート化合物とアミン化合物からカルバメート化合物の工業的製造に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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