(57)【要約】  配列番号１で示されるポリペプチドＦＮIII１４のうち、第１番目から第１３番目のアミノ酸残基の１つ以上がＤ体アミノ酸残基であるＤ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドを有効成分とする抗癌剤の活性増強剤と、当該抗癌剤の活性増強剤及び抗癌剤を含む抗癌組成物。
2012124641.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるポリペプチドＦＮIII１４のうち、第１番目から第１３番目のアミノ酸残基の１つ以上がＤ体アミノ酸残基であるＤ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドを有効成分とする、抗癌剤の活性増強剤。
【請求項２】
前記Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドが、１個〜６個のＤ体アミノ酸残基を含む請求項１記載の抗癌剤の活性増強剤。
【請求項３】
前記Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドが、前記Ｄ体アミノ酸残基を、配列番号１で示されるポリペプチドの第１番目〜第１０番目に有する請求項１又は請求項２記載の抗癌剤の活性増強剤。
【請求項４】
前記Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドが、１のＤ体グルタミン酸残基を含み、当該１のＤ体グルタミン酸残基が、配列番号１で示されるポリペプチドの第２番目のアミノ酸残基に対応するグルタミン酸残基である請求項１〜請求項３のいずれか１項記載の抗癌剤の活性増強剤。
【請求項５】
前記Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドが、多量体Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドである請求項１〜請求項４のいずれか１項記載の抗癌剤の活性増強剤。
【請求項６】
白血病に対する抗癌剤と組み合わせて用いられる請求項１〜請求項５のいずれか１項記載の抗癌剤の活性増強剤。
【請求項７】
前記抗癌剤が、シタラビン（ＡｒａＣ）、エノシタビン（Enocitabine）及びエラシタラビン（Elacytarabine）からなる群より選択された少なくとも１つである請求項１〜請求項６のいずれか１項記載の抗癌剤の活性増強剤。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のいずれか１項記載の抗癌剤の活性増強剤と、薬学的に許容可能な担体とを含む癌治療用の医薬組成物。
【請求項９】
抗癌剤を更に含む請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜請求項７のいずれか１項記載の抗癌剤の活性増強剤を含む第一の収容部と、抗癌剤を含む第二の収容部とを備えた抗癌治療剤セット。
【請求項１１】
以下のいずれかであるポリペプチド：
（１）  配列番号１で示されるポリペプチドのうち、第１番目から第１３番目のアミノ酸残基の１つ以上がＤ体アミノ酸残基であるポリペプチド、
（２）  前記（１）のポリペプチドを構成単位とする多量体であるポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌剤の活性増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学療法は、腫瘍医学が発展した現在に於いてもなお癌治療の重要な位置を占めている。特に、白血病の治療においては化学療法が中心をなしており、固形癌に比べて高い治療効果が得られている。なかでも急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞は、高い薬剤感受性を示す細胞であることが知られている。このため、急性骨髄白血病の治療として寛解導入療法を適用した場合、約８０％の症例が完全寛解となる。しかしながら、再発することが多く長期生存率は３０％〜４０％でしかないのが現状である。化学療法後の完全寛解期に患者骨髄に残存する白血病細胞の微少残存が再発の原因であると考えられている。
末梢血／体液中で非接着状態にある白血病細胞は、抗癌剤によって比較的効率よく殺滅される。これに対して、骨髄中の白血病細胞は、細胞外マトリックス（例えばフィブロネクチン（ＦＮ）や骨髄間質細胞）に、接着分子（例えばインテグリン）を介して接着し、これにより抗癌剤耐性を獲得して、化学療法施行後も微少残存することが知られている。この現象は、接着依存性薬物耐性（ＣＡＭ−ＤＲ）と呼ばれ、白血病の抗癌剤治療において克服すべき最も重要な課題の一つである。【０００３】
細胞の接着や脱着に関与するフィブロネクチンは、代表的な細胞外マトリックスタンパク質分子の一つで、ほとんど全ての組織に分布し、組織を構築する骨組みとしての役割のみならず、細胞膜上の接着分子に結合して、細胞機能調節のためのシグナル分子としても機能している。
フィブロネクチン分子を構成するポリペプチドは、I型、II型、III型の繰り返し配列から構成されている。なかでも、フィブロネクチン（ＦＮ）III型様リピート、（ＦＮIII）には、種々の機能が知られている。【０００４】
例えば、ＦＮIIIは、細胞接着阻害活性（例えば、特開平１０−１４７６００号公報及び特開２０００−２６４９０号、参照）を有することが知られている。特開平１０−１４７６００号には、癌の転移抑制作用について可能性を言及しているが、実施例の記載はない。また、ＦＮIIIの細胞死誘導活性に基づく抗癌活性を増強する作用については、国際公開第０１／０８６９８号に開示されている。しかし、国際公開第０１／０８６９８号の実施例はin vitroの試験結果のみであり、in vivoでの有効性までは検討されておらず、血液中での安定性など全く不明である。【０００５】
さらに、国際公開第０１／０８６９８号では、in vitroの試験が開示されているのみであるため、生体内での効果については開示がなく、このため、ＦＮIIIの細胞死誘導活性に基づく抗癌活性の増強強化について実用的な判断ができない。
具体的には国際公開第０１／０８６９８号では図１〜図８まで、いくつかのガン細胞に対して、ビンクリスチン又はアクチノマイシンＤと、配列番号２で表されるポリペプチドとの混合効果を調べているが、図１、２、３、４及び８では添加効果が最大でも３０％程度であったり、図２のように濃度で効果が反転したりと、実用的に有望なデータは示されていない。図５及び図７には薬剤の添加効果が示されているが、薬剤の効果自体に濃度依存はないので、有効性について判断できない。唯一図６で示されるように、胃ガン由来のＧＴ３ＴＫＢ細胞を用いた場合に、ビンクリスチンに対して、配列番号２で示されるポリペプチドの添加効果が認められる傾向があった。
このように、実際に医療現場で使用することを考慮すると、配列番号２で示されるポリペプチドでは、特定のがんの種類と特定の薬剤に対してのみ添加効果が認められるものであり、このポリペプチドがすべての薬剤の効果を増強するものではないと考えられる。さらに、配列番号２で示されるポリペプチドは、制癌剤のうち、作用機構の異なるピリミジン代謝拮抗剤である、シタラビン等との効果は示されていなかった。【０００６】
特開２００６−３２７９８０号には、動物実験で白血病治療薬とＦＮIII様ペプチドの併用でマウスの寛解を目指した実施例が記載されている。
しかしながら、実施例ではＦＮIII様ペプチドの濃度は１ｍｇであり、それよりも低い濃度による効果は確認されていない。
また、Leukemia(2008),Vol.22,353-360では特開２００６−３２７９８０号と同様の実験が報告されているが、修飾したＦＮIII様ペプチドであっても、生理活性が向上していないことが示されている。【０００７】
このような化学修飾に関してはいくつか報告がある。特開２０１０−０４３０８７号では、ネイティブＨＢＨＡを大腸菌（E.Coli）の遺伝子組換えで生産させても、ミコバクテリアが生産したＨＢＨＡとは生理活性が異なることから、Ｃ末端のリジン基をメチル化することで本来の生理活性が再現できたと報告している。これは、メチル化することで本来の活性を取り戻したこと示したに過ぎず、本来持っていた生理活性以上の効果を示したものではない。特開平６−７３０９３号では、「オピオイド系鎮痛剤が有していた依存性、耐性など欠点を解決する目的」で、Ｄ体のアミノ酸としてTrp、His、Pheなどを導入した例が報告されている。しかし、特開平６−７３０９３号に記載してあるように、化合物としての安定性や活性の向上を達成したというものではなかった。また、Ｄ体のアミノ酸を用いることは、一般的にプロテアーゼに認識されないために、分解を受けないだろうと思われるが、得られるペプチドのコンフォメーションも変化するために、その生理活性が維持できなくなることが推定されている。Biochem Pharmacol. 1999 Dec 1;58(11):1775-80では、Ｎ端とＣ端を２残基ずつＤアミノ酸に変え、血清酵素処理で安定性が増加したことを報告しているが、生理活性は高くならなかった。Neuropeptides. 1984 Dec;5(1-3):177-80では、オピオイドペプチド群で、例えばエンケファリン（Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu）の２番目のアミノ酸を置換してTyr-D-Ala-Gly-Phe-Leuに改変しても、活性が高くなることはなかったことが報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、要求されるレベルのペプチドの安定化と活性向上を達成したものや、要求されるレベルまでペプチドの安定性と活性を向上させるための方法は、いまだに知られていない。
以上のように、フィブロネクチンとその関連ペプチドの欠点を改善し、抗癌剤又は他の抗癌剤との併用投与することで急性骨髄白血病などを根絶する治療が望まれていた。【０００９】
従って本発明の目的は、急性骨髄性白血病をはじめとする化学療法後の再発が多い悪性腫瘍の根絶治療を目的として、併用する抗癌剤の活性をより高くする増強可能な活性増強剤及び、これを含む医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために選ばれた生理活性に必須のペプチドを用い、生理活性をさらにあげ、多くの抗癌剤と相乗効果を示して薬量が下げることができ、さらに血液中での安定性を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ペプチドＦＮIII１４の誘導体でこれらの問題を解決することができる新規のペプチドを見いだすことに成功し、単独または制癌剤との併用で、急性骨髄白血病根絶治療をはじめとした、その他の癌の寛解治療ができることに成功した。
本発明は、以下の各態様を提供する。【００１１】
［１］  配列番号１で示されるポリペプチドＦＮIII１４のうち、第１番目から第１３番目のアミノ酸残基の１つ以上がＤ体アミノ酸残基であるＤ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドを有効成分とする、抗癌剤の活性増強剤。
［２］  前記Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドが、１個〜６個のＤ体アミノ酸残基を含む［１］に記載の抗癌剤の活性増強剤。
［３］  前記Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドが、前記Ｄ体アミノ酸残基を、配列番号１で示されるポリペプチドの第１番目〜１０番目に有する［１］又は［２］に記載の抗癌剤の活性増強剤。
［４］  前記Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドが、１のＤ体グルタミン酸残基を含み、当該１のＤ体グルタミン酸残基が、配列番号１で示されるポリペプチドの第２番目のアミノ酸残基に対応するグルタミン酸残基である［１］〜［３］のいずれかに記載の抗癌剤の活性増強剤。
［５］  前記Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドが、多量体Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドである［１］〜［４］のいずれかに記載の抗癌剤の活性増強剤。
［６］  白血病に対する抗癌剤と組み合わせて用いられる［１］〜［５］のいずれかに記載の抗癌剤の活性増強剤。
［７］  前記抗癌剤が、シタラビン（ＡｒａＣ）、エノシタビン（Enocitabine）及びエラシタラビン（Elacytarabine）からなる群より選択された少なくとも１つである［１］〜［６］のいずれかに記載の抗癌剤の活性増強剤。
［８］  ［１］〜［７］のいずれかに記載の抗癌剤の活性増強剤と、薬学的に許容可能な担体とを含む癌治療用医薬組成物。
［９］  抗癌剤を更に含む［８］に記載の医薬組成物。
［１０］  ［１］〜［７］のいずれかに記載の抗癌剤の活性増強剤を含む第一の収容部と、抗癌剤を含む第二の収容部とを備えた抗癌治療剤セット。
［１１］  以下のいずれかであるポリペプチド：
（１）  配列番号１で示されるポリペプチドのうち、第１番目から第１３番目のアミノ酸残基の１つ以上がＤ体アミノ酸残基であるポリペプチド、
（２）  前記（１）のポリペプチドを構成単位とする多量体であるポリペプチド。
［１２］  ［１］〜［５］のいずれかに記載の抗癌剤の活性増強剤、又は［８］に記載の医薬組成物を、癌治療を必要とする患者へ投与することを含む癌の治療方法。
［１３］  ［１］〜［５］のいずれかに記載の抗癌剤の活性増強剤、又は［８］に記載の医薬組成物と、白血病に対する抗癌剤とを、白血病治療を必要とする対象へ投与することを含む［１２］記載の癌の治療方法。
［１４］  ［１］〜［７］のいずれかに記載の抗癌剤の活性増強剤、又は［８］若しくは［９］に記載の癌治療用医薬組成物の製造における前記Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドの使用。
［１５］  癌の治療方法に使用される［１］〜［７］のいずれかに記載の抗癌剤の活性増強剤、又は［８］若しくは［９］に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、抗癌剤の活性をより高く増強可能な抗癌剤の活性増強剤及び、これを含む抗癌組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施例１に係るポリペプチドの細胞接着阻害活性を示すグラフである。
【図２Ａ】本発明の実施例３に係るポリペプチドの血清中での安定性を示すグラフである。
【図２Ｂ】本発明の実施例３に係るポリペプチドの血清中での安定性を示すグラフである。
【図２Ｃ】本発明の実施例３に係るポリペプチドの血清中での安定性を示すグラフである。
【図２Ｄ】本発明の実施例３に係るポリペプチドの血清中での安定性を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例１に係るポリペプチドの白血病細胞株に対する抗癌剤の活性増強効果を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例１に係るポリペプチドのマウスにおける抗癌剤の活性増強効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の抗癌剤の活性増強剤（以下、単に活性増強剤ということがある）は、配列番号１で示されるポリペプチドＦＮIII１４のうち、第１番目から第１３番目のアミノ酸残基の１つ以上がＤ体アミノ酸残基であるＤ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドを有効成分とする抗癌剤の活性増強剤である。
また、本発明の癌治療用の医薬組成物は、前記活性増強剤と抗癌剤とを含む組成物である。
本発明のポリペプチドは次のいずれかのポリペプチドである：（１）配列番号１で示されるポリペプチドのうち、第１番目から第１３番目のアミノ酸残基の１つ以上がＤ体アミノ酸残基であるポリペプチド、（２）前記（１）のポリペプチドを構成単位とする多量体であるポリペプチド。
【００１５】
本発明によれば、配列番号１で示されるＦＮIII１４ポリペプチドのアミノ酸配列のうちＮ末端側のアミノ酸残基の１つ以上がＤ体である特定のＤ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドが、血清中で良好な安定性を示し、また抗癌剤の抗癌活性を相乗的に高めることができる。
これにより、抗癌剤と共に使用することにより当該抗癌剤の効果をより高く増強することができる。また、Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４と、併用する抗癌剤との双方の薬剤量を少なくすることができ、患者に対するリスクを低減することができる。
【００１６】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
本発明において、ポリペプチドを構成するアミノ酸配列のアミノ酸残基を、当技術分野で周知の一文字表記（例えば、グリシン残基の場合は「Ｇ」）又は三文字表記（例えば、グリシン残基の場合は「Ｇｌｙ」）を用いて表現する場合がある。
以下、本発明について説明する。
【００１７】
本発明におけるＤ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドは、配列番号１で示されるＦＮIII１４のうち、第１番目から第１３番目のアミノ酸残基の１つ以上がＤ体アミノ酸残基であるＤ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドである。
本発明にかかる配列番号１で示されるポリペプチドFNIII１４は、ヒトフィブロネクチンの１４番目のフィブロネクチンIII様反復配列（ＦＮIII）に由来する配列である。
配列番号１で示される配列のうち第１番目から第１３番目のアミノ酸残基を除く部分は、活性配列であるＹＴＩＹＶＩＡＬであるので、この活性配列を除いたＮ末端側のアミノ酸残基の１つ以上がＤ体アミノ酸残基であればよい。このようなＤ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドは、ＦＮIII１４の血清中での安定化を高めると共に、併用される抗癌剤の抗癌剤活性をより強く増強することができる。ＦＮIII１４は、ＴＥＡＴＩＴＧＬＥＰＧＴＥＹＴＩＹＶＩＡＬ（配列番号１）で示される２１個のアミノ酸残基で構成されたポリペプチドであり、この２１のアミノ酸残基のうち、１４番目のチロシン（Ｙ）からの８アミノ酸残基（YTIYVIAL）が活性中心であることは既に知られている。
【００１８】
配列番号１で示されるＦＮIII１４の第１番目から第１３番目のアミノ酸残基に含まれうるＤ体アミノ酸残基の数は、血液中での安定性、ＦＮIII１４の生理活性の向上、抗癌剤との相乗効果などの観点から１個〜６個であることが好ましく、１個〜３個であることがより好ましく、１個であることが更に好ましい。また、Ｄ体アミノ酸残基となり得るアミノ酸残基の位置としては、いずれの位置であってもよいが、配列番号１で示されるポリペプチドの第１番目〜第１０番目に位置することが好ましく、第１番目〜第６番目に位置することがより好ましく、第２番目であることが更に好ましい。
【００１９】
更には、Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドにおけるＤ体アミノ酸残基の数及びその位置の組み合わせは、上述した好ましいＤ体アミノ酸残基の数と、好ましいＤ体アミノ酸残基の位置の組み合わせとすることができる。
【００２０】
例えば、前記Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドの好ましい態様としては、以下のポリペプチドを挙げることができる：
（１）Ｄ体アミノ酸残基を、配列番号１で示されるポリペプチドの第１番目〜第１０番目のいずれかの位置に１個〜６個有しているポリペプチド；
（２）Ｄ体アミノ酸残基を、配列番号１で示されるポリペプチドの１番目〜第６番目のいずれかの位置に１個〜３個有しているポリペプチド；
（３）Ｄ体アミノ酸残基を、配列番号１で示されるポリペプチドの第１番目〜第１０番目のいずれかの位置に１個有しているポリペプチド。
抗癌剤の活性増強効果の観点から、Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドは、１のＤ体グルタミン酸残基を含み、当該１のＤ体グルタミン酸残基が配列番号１で示されるポリペプチドの第２番目のアミノ酸残基に対応するグルタミン酸残基であるＤ体グルタミン酸含有ポリペプチドがより好ましい。
【００２１】
また、Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドは、活性配列が保持され且つＤ体アミノ酸残基を１つ以上有するものであれば、生理活性の向上などのために他の修飾を含んでもよい。
例えば、配列番号１で示される前記ポリペプチドＦＮIII１４のアミノ酸残基の１つ以上が他の標準アミノ酸（遺伝子にコードされているアミノ酸の意味）もしくは、上述したＤ体アミノ酸残基以外のＤ体アミノ酸を代表とする異常アミノ酸（天然に見られる非標準アミノ酸や人工的に調製された立体制約アミノ酸などを含む）である修飾アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチド、さらにこれらの活性ペプチド複数個をペプチド結合やジスルフィド結合をはじめとする共有結合を利用して、複数の官能基を有するテンプレート分子上で束ねた多価ペプチドとしてもよい。
【００２２】
ここで、「異常アミノ酸」に含まれる非標準アミノ酸としては、Ｄメチルロイシン、Ｎ−ヒドロキシ−Ｌ−アラニン、β―ヒドロキシロイシン、などを挙げることができる。立体制約アミノ酸としては、たとえば２−アミノイソ酪酸などのα、α―２置換アミノ酸やβ―メチルフェニルアラニン、シクロプロパンアミノ酸などを挙げることができる。
【００２３】
また、「テンプレート分子」としては、例えば、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、マレイミド基などの官能基を１つ又は２つ以上有するペプチドを挙げることができる。これらのテンプレート分子であれば、１つ又は複数の前記Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１３ポリペプチドと当該ポリペプチド上の官能基を介して結合することができる。これにより、前記Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１３ポリペプチドの血清中での安定性が更に向上すること、及び取扱い性がより向上することなどが期待できる。ポリペプチド上の官能基は、ポリペプチドにおけるペプチド結合、ジスルフィド結合などの結合部分を、例えば切断する公知の手段を用いて前記ポリペプチド鎖上に作り出すことができる。
【００２４】
また、血清中での安定化のための修飾としては、１番目のアミノ酸残基、即ちスレオニン残基のアセチル化などを挙げることができる。
【００２５】
本発明のＤ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドは、例えば、固相合成法等の化学的合成法、又はアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をプラスミドベクターに挿入し大腸菌等の微生物を形質転換することにより該ペプチドを生産する遺伝子組み換え手法を用いた合成法等により合成することが可能である。化学的な合成は固相ペプチド合成法を用いて行なうのが最も一般的である。合成方法の例として次に説明するが、これに限定されるものではない。
【００２６】
ポリエチレングリコール鎖を持つポリスチレン樹脂上に保護アミノ酸、具体的には、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OBzl)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Pro-OHなどを導入する。
導入法は、例えば、アミノ酸（1mmol）を2-(1-H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronium(HBTU) とN-hydroxybenzotriazole (HOBt)各1mmolを含むN,N,-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液に溶解した後、ポリスチレン樹脂と混合する。３０分後、不溶性樹脂をＤＭＦで洗浄し、その後、樹脂を２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液に懸濁する（Fmoc基を除去する）。その後、目的のペプチド鎖が得られるまでこの操作を繰り返す。目的のペプチドをポリスチレン樹脂から切断するため、及びベンジル基などの保護基を除去するため、トリフルオロ酢酸中で１時間反応させる。得られた粗生成物はＨＰＬＣで精製し、均一なペプチドを得ることができる。また、合成されたペプチドの構造を、飛行時間型分子量測定装置により確認できる。
【００２７】
遺伝子組み換え手法を用いた合成法では、細胞接着阻害ペプチドをコードする遺伝子を、例えば、ＤＮＡ合成装置（ＤＮＡシンセサイザー）により合成し、公知のプラスミドベクターに該遺伝子を組み込み、得られた組み換えベクターを宿主となる微生物に導入し、形質転換体を作成することにより該細胞接着阻害ペプチドを生産することができる。
ここで用いられるプラスミドベクターはタンパク質生産用の発現ベクターであれば特に限定なく用いることができる。また、宿主は微生物に限定されることなく、ＣＯＳ細胞等の真核細胞を用いることができる。
【００２８】
Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドを作製する方法は、特に制限されず、公知のポリペプチド合成方法を適用可能であり、ポリペプチド合成工程において特定のアミノ酸残基をＤ体とする工程を含む公知の方法のいずれを用いてもよい。
【００２９】
得られた粗ペプチドの精製方法としては、例えば、各種イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーに付し、目的とするペプチドを分離、精製する方法を挙げることができる。
【００３０】
前記Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドは、多量体化、例えば、トリマー化したり、デンドリマー化することができる。多量体化により得られた前記Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドを構成単位とする多量体は、血清中での更に良好な安定性を有し、抗癌剤の活性をより効果的に増強させ、癌に対する良好な治療効果を得ることができる。
【００３１】
前記Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４の多量体は、多量体化の公知の方法を用いて得ることができる。
例えば、トリマー（三量体）の製造方法としては、調製した単量体ペプチドＦＮIII１４を、ＤＭＳＯとＰＢＳに溶解し、ＴＭＥＡ（Tris[2-maleimidoethyl]amine）のＤＭＳＯ溶液を滴下することで得られる。得られた生成物の純度と構造は、ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析で確認できる。
デンドリマー（樹状構造体）の製造方法としては、単量体ペプチドの固相合成法では、ペプチドの末端に、ＢＭＰＡ（N-β-Maleimidopropionic acid）を持つペプチドを調製し、ペプチドをＤＭＳＯとＰＢＳに溶解し、システイン残基を３〜６個含む環状ペプチドのＤＭＳＯ溶液を滴下する。その他にも適当な官能基を有するビルディングブリックをペプチドの末端に導入し、デンドリマーの合成が可能である。合成上、アミノ基とカルボキシル基や、チオール基とマレイミド基、又はチオール基の組合せが利用できる。得られた生成物の純度と構造はＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析で確認できる。
トリマーもデンドリマーも、上記以外の製造方法により得ることも可能であり、上記の製造方法に限定されない。
【００３２】
また、前記Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４の多量体としては、以下の構成単位（１）〜（３）の組み合わせ、又は以下の構成単位（１）〜（３）のいずれか１種のみで構成された多量体も含まれる：
（１）Ｄ体アミノ酸残基を、配列番号１で示されるポリペプチドの第１番目〜第１０番目のいずれかの位置に１個〜６個有しているポリペプチドからなる構成単位；
（２）Ｄ体アミノ酸残基を、配列番号１で示されるポリペプチドの１番目〜第６番目のいずれかの位置に１個〜３個有しているポリペプチドからなる構成単位；
（３）Ｄ体アミノ酸残基を、配列番号１で示されるポリペプチドの第１番目〜第１０番目のいずれかの位置に１個有しているポリペプチドからなる構成単位。
好ましくは、前記Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４の多量体は、すべての構成単位が同数且つ同一の位置にＤ体アミノ酸残基を有するものである。
【００３３】
本発明に係わる癌の治療により治療が可能な癌の種類には、特に制限がない。例えば、急性白血病、および慢性の骨髄性およびリンパ性など全ての白血病、頭部癌、口腔・舌癌、咽頭癌、甲状腺癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頚部癌、子宮体部癌、卵巣癌、皮膚癌、骨部癌、軟部組織癌等の癌が挙げられるが、これらの臓器或いは、組織に限定されない。
【００３４】
Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドによって増強される抗癌剤としては、固形癌又は白血病に対する治療効果を有する抗癌剤のいずれであってもよい。例示すると、次のようなものが挙げられる：ニトロジェンマスタード（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍｕｓｔａｒｄ）、シクロフォスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イフォスファミド（Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メルファラン（Ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆａｎ）、イムプロスルファントシレート（Ｉｍｐｒｏｓｕ１ｆａｎ  Ｔｏｓｙｌａｔｅ）、ミトブロニトール（Ｍｉｔｏｂｒｏｎｉｔｏｌ）、カーボクオン（Ｃａｒｂｏｑｕｏｎｅ）、チオテパ（Ｔｈｉｏｔｅｐａ）、ラニムスチン（Ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ニムスチン（Ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）等のアルキル化剤；メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、６−メルカプトプリンリボシド、メルカプトプリン（Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、テガフール（Ｔｅｇａｆｕｒ）、ＵＦＴ、ドキシフルリジン（Ｄｏｘｉｆ１ｕｒｉｄｉｎｅ）、カルモフール（Ｃａｒｍｏｆｕｒ）、シタラビン（Ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、シタラビンオクフォスフェート（Ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ  Ｏｃｆｏｓｆａｔｅ）、エラシタラビン（Ｅｌａｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、エノシタビン（Ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）のような代謝拮抗剤＋アクチノマイシンＤ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ）、ドクソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ネオカルジノスタチン（Ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ペプロマイシン（Ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ）、アクラルビシン（Ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、ピラルビシン（Ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ジノスタチンスチマレマー（Ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ  Ｓｔｉｍａｌａｍｅｒ）、イダルビシン（Ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）等の抗癌性抗生物質；ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチン（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（Ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、イリノテカン（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、ソブゾキサン（Ｓｏｂｕｚｏｘａｎｅ）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）等の植物アルカロイド系の抗癌剤；シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ネダプラチン（Ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）等の白金錯化合物；その他上記の分類に含まれないミトキサントロン（Ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、Ｌ−アスパラギナーゼ、プロカルバジン（Ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、デカルバジン（Ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ヒドロキシカルバミド（Ｈｙｄｒｏｘｙｃａｒｂａｍｉｄｅ）、ペントスタチン（Ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、トレチノン（Ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）のような抗癌剤。
中でも、シタラビン（Ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ、ＡｒａＣ）、エラシタラビン（Ｅｌａｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、エノシタビン（Ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）等の白血病に対する抗癌活性を有する抗癌剤であることが、Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドの増強効果の点で好ましい。Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドと、白血病に対する抗癌活性を有するこれらの抗癌剤とを組み合わせることにより、特に、ＡＭＬの再発の原因である骨髄微少残存を根絶する可能性を高めることができる。
【００３５】
本発明の抗癌剤の活性増強剤は単独で、又は、上記の抗癌剤の１種と組み合わせた癌治療用の医薬組成物として、患者に投与し得る。なお、特定の癌に対して複数の抗癌剤の臨床的使用が認められている場合、それらに本発明の増強剤を組み合わせた抗癌組成物を用いてもよい。また、異なる２種以上の癌に対して、複数の抗癌剤の投与が行われる場合も、それらに本発明の増強剤を組み合わせて用いることができる。
【００３６】
前記抗癌剤の活性増強剤を、前記抗癌剤と共に用いる場合、他の癌治療法と組み合わせて実施することが可能であり、それぞれの治療法を単独で実施したときに比べてより効果的な治療効果が期待できる。例えば、外科的切除と組み合わせて実施する場合は、手術の前後を問わず化学療法を継続することが可能である。また、放射線療法と組み合わせて治療することも可能である。
【００３７】
前記抗癌剤と組み合わせる前記活性増強剤の投与量は、患者の年齢、症状等により適宜選択することができ、抗癌剤の抗癌活性を増強する量であれば、特に制限はない。実際には、抗癌剤の所定の投与量に従って、広範囲に変動しうる。通常、１回の投与あたりの投与量（単位投与量）は０．０１ｍｇ〜１０ｇ／ｋｇ体重である。
【００３８】
一方、前記抗癌剤の投与量としては、用いる抗癌剤の種類によって異なるが、例えば、アクチノマイシンＤの場合、０．００１μｇ〜０．５ｍｇ／Ｋｇ体重（静脈内投与）、ドクソルビシンの場合、０．０５ｍｇ〜６００ｍｇ／ｍ２体表面積（静脈内投与）、ビンクリスチンの場合、１ｎｇ〜０．５ｍｇ／Ｋｇ体重（静脈内投与）、５−フルオロウラシルの場合、１ｍｇ〜１２５ｍｇ／ｋｇ体重（静脈内投与）、或いは２．５ｍｇ〜３ｇ／Ｋｇ体重、シクロフォスファミドの場合、０．０５ｍｇ〜５ｇ／ｍ２体表面積（静脈内投与）の範囲で使用するのが望ましい。
【００３９】
前記活性増強剤は、いかなる投与経路からでも患者に投与可能であるが、静脈内投与、患部への局所投与、経口投与が好ましい。特に、静脈内投与、患部への局所投与がより好ましい。
前記活性増強剤と抗癌剤とは、両者を混和後、単一の混合製剤（抗癌組成物）として患者に投与することが好ましい。ただし、それぞれ別の投与経路（例えば、活性増強剤は静脈内投与、抗癌剤は経口投与）で投与しても同様の治療効果が期待できる。
【００４０】
活性増強剤と、抗癌剤とを別々に投与する場合、投与する抗癌剤の種類、患者の病状等に合わせてそれぞれの投与量等を決定することが可能である。活性増強剤は、抗癌剤の投与の前、或いは投与の後、投与できるが、その投与間隔はあまり長くないのが好ましい。例えば、一時間以内くらいが好ましい。
【００４１】
上記の投与に際して、前記活性増強剤および抗癌剤をそれぞれ単独で、またはこれらを共に含む癌治療用の医薬組成物（抗癌組成物）として、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、安定化剤等の任意の担体及び添加剤を場合により含んだ製剤として投与することが好ましい。この目的で用いられる薬学的に許容可能な担体及び添加剤は、当業者によく知られている。
【００４２】
本発明に用いられ得る薬学的に許容可能な担体及び添加剤は、前記抗癌剤の活性増強剤又は抗癌組成物の投与経路に応じて適宜選択され得る。このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜選択されるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
本発明の抗癌治療剤セットは、前記活性増強剤を含む第一の収容部と、抗癌剤を含む第二の収容部とを備えたものである。
本キットにおける「収容部」とは、それぞれの薬剤が混合せずに独立して存在するために有効な形態であれば特に制限はなく、例えば、容器や個別包装形態などであってもよく、一のシート状で独立して区分けされた領域としての形態であってもよい。
前記抗癌治療剤セットは、それぞれを単独で投与してもよく、必要時にそれぞれの収容部から前記活性増強剤と抗癌剤とを取り出して混合し、製剤（抗癌組成物）を調製してもよい。前記活性増強剤及び前記抗癌剤の種類、投与経路、及び投与量等については、前述した事項をそのまま適用することができる。
【００４４】
また、本発明は、腫瘍若しくは癌の疑いのある患者、腫瘍若しくは癌が既に発生している患者、又は腫瘍若しくは癌の治療を必要とする患者に対して、本発明にかかる抗癌剤の活性増強剤又は抗癌組成物を投与すること（投与工程）を含む癌の治療方法を含む。ここで、「治療」には、症状の改善であればよく、病巣の肥大抑制又は縮小、転移速度の緩和又は転移の停止も、確認できる範囲でこの用語に包含される。
【００４５】
投与工程は、活性増強剤と抗癌剤とが同一の個体に対して投与されればよく、投与の順序、形態等に制限はない。例えば、投与工程は、活性増強剤を投与する工程と、抗癌剤を投与する工程とをそれぞれ含んでもよく、活性増強剤及び抗癌剤を同時に投与する工程であってもよく、また、抗癌組成物として投与する工程であってもよい。
本治療方法において使用される抗癌剤の活性増強剤及び抗癌剤の種類、投与経路、投与量等については、前述した事項を、本治療方法に関する事項としてそのまま適用することができる。
【００４６】
また、本発明は、前記抗癌剤の活性増強剤又は癌治療用医薬組成物の製造における前記Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４ポリペプチドの使用を含む。これにより、抗癌剤と共に使用することにより当該抗癌剤の効果をより高く増強できる抗癌剤の活性増強剤又は癌治療用医薬組成物を提供できる。
【００４７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。
【実施例】
【００４８】
［実施例１］
＜各ポリペプチドの作製＞
試験に用いたポリペプチドＦＮIII１４（配列番号１）は、ＳＡＷＡＤＹ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．ＬＴＤ，Ｔｏｋｙｏに依頼し、ペプチドシンセサイザー（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ［ＳＹＲＯＩＩ］、Ｍｕｌｔｉ ＳｙｎＴｅｃ ＧｍｂＨ製）を用いて合成した。また、合成されたペプチドの配列は、ペプチドシークエンサー（Ｍｏｄｅｌ ４７６Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）で確認した。【００４９】
また、ＦＮIII１４の配列において２番目のアミノ酸残基がＤ−グルタミン酸であるＤ−ｇｌｕ−ＦＮIII１４（T-[D-Glu]-ATITGLEPGTEYTITVIAL）は、次の方法で合成した。
ポリエチレングリコール鎖を持つポリスチレン樹脂上にまず、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)-Leu-OHを導入した。Fmoc-Leu-OH（1mmol）を、2-(1-H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronium (HBTU) とN-hydroxybenzotriazole(HOBt)を各1mmol含むN,N,-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液に溶解した後、ポリスチレン樹脂と混合した。３０分後、不溶性樹脂をＤＭＦで洗浄した。その後、樹脂を２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液に懸濁し（Fmoc基を除去し）た。その後、Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OBzl)-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Glu(OBzl)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-D-Glu(OBzl)-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OHを同じ操作で導入した。得られたペプチドを樹脂から切断し、また、Ｂｚｌ基（ベンジル基）などの保護基を除去するため、トリフルオロ酢酸中で１時間反応した。得られた粗生成物はＨＰＬＣで精製し、均一なペプチドを得た。また、合成されたペプチドの構造を、飛行時間型分子量測定装置により確認した。【００５０】
Ace-FNIII14の合成法は以下の通り。
ポリエチレングリコール鎖を持つポリスチレン樹脂上にまず、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)-Leu-OHを導入した。Fmoc-Leu-OH（1mmol）を2-(1-H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronium (HBTU) とN-hydroxybenzotriazole(HOBt)各1mmolを含むN,N,-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液に溶解した後、ポリスチレン樹脂と混合した。３０分後、不溶性樹脂をＤＭＦで洗浄した。その後、樹脂を２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液に懸濁し、Fmoc基を除去した。その後、Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OBzl)-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Glu(OBzl)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OBzl)-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OHを同じ操作で導入した。２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液に不溶性樹脂を懸濁しFmoc基を除去した。別途、酢酸、ジシクロヘキシルカルボジイミド、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール各５ｍｍｏｌをジクロロメタン中で３０分反応させ、ろ液を不溶性樹脂に加えた。３０分後不溶性樹脂をＤＭＦで洗浄した。目的のペプチドの樹脂からの切断、及び、Ｂｚｌ基などの保護基を除去するため、トリフルオロ酢酸中で１時間反応した。得られた粗生成物はＨＰＬＣで精製し、均一なペプチドを得た。また、合成されたペプチドの構造を、飛行時間型分子量測定装置により確認した。【００５１】
Ｍet化-FNIII14の合成法（[N-Me-Glu]2-FNIII14）は以下の通り。
ポリエチレングリコール鎖を持つポリスチレン樹脂上にまず、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)-Leu-OHを導入した。Fmoc-Leu-OH（1mmol）を2-(1-H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronium (HBTU) とN-hydroxybenzotriazole(HOBt)各1mmolを含むN,N,-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液に溶解した後、ポリスチレン樹脂と混合した。３０分後、不溶性樹脂をＤＭＦで洗浄した。その後、樹脂を２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液に懸濁し（Fmoc基を除去し）た。その後、Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OBzl)-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Glu(OBzl)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Glu(OBzl)-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OHを同じ操作で導入した。目的のペプチドの樹脂からの切断、及び、Ｂｚｌ基などの保護基を除去するため、トリフルオロ酢酸中で１時間反応した。得られた粗生成物はＨＰＬＣで精製し、均一なペプチドを得た。また、合成されたペプチドの構造を、飛行時間型分子量測定装置により確認した。【００５２】
＜評価＞  細胞接着阻害活性
９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を０．５μｇ／ｍＬの濃度のヒト由来血漿性フィブロネクチン（以下、「ＦＮ」とする。Ｆｕｋａｉらの方法で調製、（Fukai et al.,J.Biol.Chem.,266,8807,1991）でコーティングした。無血清培地で２×１０５細胞／ｍｌとなるように、Ａ３７５ＳＭ細胞を懸濁し（２×１０４細胞）にＤ−ｇｌｕ−ＦＮIII１４と、ＦＮIII１４を含むペプチド溶液（リン酸緩衝生理食塩水に溶解）を最終濃度３．１２５〜２５μｇ／ｍｌになるように混合したものを、上記のプレートの各ウェルに播種した。対照として、ペプチドを含まないＰＢＳのみを同様に各ウェルへ添加した。なお、培地は、ＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を使用した。
プレートを３７℃、５v/v％ＣＯ２雰囲気下で１時間培養した。４％ホルマリンと５％スクロースを含むＰＢＳ（−）溶液を１００μＬ静かにウェルに加え、室温で１時間放置することで細胞を固定した。固定後、PBS中での非接着細胞を洗浄除去した後、あらかじめ決められた４視野内の細胞数を計測し接着細胞数とした。結果を図１に示す。【００５３】
図１に示されるように、Ｄ−ｇｌｕ−ＦＮIII１４は、ＦＮIII１４と同程度の接着阻害活性を保持することが示された。よって、Ｄ−ｇｌｕ−ＦＮIII１４は、Ｎ末端側にＤ体アミノ酸を含んでいても、ＦＮIII１４としての活性低下は見られないことが示された。【００５４】
［実施例２］
＜トリマーおよびデンドリマーの製造＞
（１）  トリマー（三量体Ac-FNIII14）の製造方法
上記の方法で調製した単量体ペプチドFNIII14をＤＭＳＯとＰＢＳに溶解し、ＴＭＥＡ (Tris[2-maleimidoethyl]amine)のＤＭＳＯ溶液を滴下して得た。
トリマーが得られたことは、合成されたペプチドの構造を、飛行時間型分子量測定装置により確認した。
また同様の手順に従えば、Ｄ−ｇｌｕ−ＦＮIII１４の単量体からＤ−ｇｌｕ−ＦＮIII１４の三量体を得ることができる。【００５５】
（２）  デンドリマーの製造方法
単量体ペプチドFNIII14の固相合成法で、ペプチドの末端に、ＢＭＰＡ(N-β-Maleimidopropionic acid)を持つペプチドを調製した。ペプチドをＤＭＳＯとＰＢＳに溶解し、システイン残基を６個含む環状ペプチドのＤＭＳＯ溶液を滴下して得た。
デンドリマーが得られたことは、合成されたペプチドの構造を、飛行時間型分子量測定装置により確認した。
また同様の手順に従えば、Ｄ−ｇｌｕ−ＦＮIII１４の単量体からＤ−ｇｌｕ−ＦＮIII１４の多量体（デンドリマー）を得ることができる。【００５６】
［実施例３］
＜ヒト血清中におけるペプチドの安定性の評価＞
FNIII14（500μg/mL）、各修飾ペプチド（500μg/mL）または溶解液を、それぞれヒト血清中（終濃度９０％）（防腐剤としてsodium azide ０．０１％添加）にて０〜５６時間、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一定時間インキュベートした。その後、各ウェル中のペプチド濃度が２５μg/mLになるようにＤＭＥＭ（−）で希釈した各試料を、１．５×１０４/ウェルに調整した Ａ３７５ＳＭ細胞と共に、ＦＮ  ０．５μｇ／ｍＬでコート済みの９６穴ウェル組織培養プレートに播種し、一定時間培養した後、４％ホルマリンと５％スクロースを含むＰＢＳ（−）溶液を１００ｍｌ静かに各ウェルに加え、室温で１時間放置することで細胞を固定した。固定後、あらかじめ決められた４視野内の細胞数を計測し全細胞数とした。ＰＢＳ（−）溶液で３回洗浄することで非接着細胞を除去した後、上記と同じ４視野内の接着細胞数を顕微鏡下に計測した。血清処理していないFNIII14の接着阻害活性を１００とし、それに対するFNIII14又は修飾ペプチドの血清処理後の残存接着阻害活性の割合を百分率で評価した。結果を図２Ａ〜図２Ｄに示す。なお、図２Ａ〜図２Ｃにおいて、白菱形はＦＮIII１４、白四角はＡｃｅ−ＦＮIII１４、白丸はＭｅｔ−ＦＮIII１４、白三角はＤ−ＦＮIII１４を、それぞれ用いた場合の結果を表す。また図２Ｄにおいて、黒丸は、ＦＮIII１４の活性を示し、黒三角はＤ−ｇｌｕ−ＦＮIII１４の活性を示す。【００５７】
図２Ａに示されるように、ＦＮIII１４が２時間で急激に活性を失い、２０時間後には６０％程度になっていた。これに対して、Ａｃｅ−ＦＮIII１４（図２Ｂ参照）やＭｅｔ−ＦＮIII１４（図２Ｃ参照）は、ＦＮIII１４よりも安定化させることができた。さらに、Ｄ−ｇｌｕ−ＦＮIII１４は、ヒト血清中においてアミノペプチダーゼなどによる分解への抵抗性を示した。また、Ｄ−ｇｌｕ−ＦＮIII１４は、血清中で活性の低下を起こさず、むしろ２０％以上活性が高まることが見出された。【００５８】
本バイオアッセイ方法でヒト血清を用いているが、この血液中の阻害因子をこのペプチドはさけることができるために、１００％を越えている。このことは、治療のために血中濃度を維持するためには、ＦＮIII１４は１時間程度の間隔で静脈注射する必要があるのに対して、Ｄ−ｇｌｕ−ＦＮIII１４であれば１日以上の間隔をあけて静脈注射すればよいことが期待される。さらに、Ｄ−ｇｌｕ−ＦＮIII１４であれば、図２Ｄに示すように６０時間の長期の安定性を示したが、５０時間以降で分解の傾向を示しているので、不必要に長期に血液中に残留することを避けることができることが示された。この物性を達成できたことから、ＤＤＳの手法で必要な放出制御が容易となった。【００５９】
［実施例４］
＜抗癌剤補強活性評価＞
白血病細胞株Ｕ９３７を含む細胞懸濁液（１ｍＭの塩化マグネシウム及び２０％ヒト血清含有ＤＭＥＭ培地）を、２．５×１０４細胞／ウェルとなるように、ＦＮ１０μｇ／ｍＬでコート済みの９６−ｗｅｌｌ組織培養プレートに播種した。各ウェルに、ＦＮIII１４またはＤ−ｇｌｕ−ＦＮIII１４をそれぞれ１００μｇ／ｍＬの濃度及びとなるように添加して、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２時間培養した。その後、０、１０８Ｍ、１０７Ｍ、１０６Ｍ、１０５Ｍの各濃度のシタラビン（ＡｒａＣ、協和醗酵社）を添加し、２４時間培養した後、ＷＳＴ法に準じてＣｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（和光純薬）により生細胞数を測定した（測定波長：４５０ｎｍ、参照波長：６５５ｎｍ）。なお、すべてヒト血清（４人の健常ボランティアからの血清の混合物）を２０％添加した培地ＲＰＭＩ１６４０を用いて行った。結果を図３に示す。【００６０】
その結果を図３に示す。図３に示されるように、ＡｒａＣ存在下におけるＵ９３７細胞の生存の減少に対して、Ｄ−ｇｌｕ−ＦＮIII１４は、ＦＮIII１４よりも優れた効果を有することがわかった。また、Ｄ−ｇｌｕ−ＦＮIII１４存在下におけるＡｒａＣのＩＣ５０として、ペプチド非存在下と比較して約１００倍、またＦＮIII１４と比べても更に約１０倍となる阻害効果が認められた。【００６１】
また、この図３を見ると、Ｄ−ｇｌｕ−ＦＮIII１４との併用は曲線が大きく下に振れ相乗効果が認められている。一方ＦＮIII１４ではほぼ直線で相乗効果が認められなかった。相乗効果の指標であるコンビネーションインデックスを  Drewinko等の報告 (Drewinko, B., Green, C., and Loo, T.L. (1976) Combination chemotherapy in vitro with cis-dichlorodiammineplatinum(II) Cancer Treat Rep 60(11): 1619-1625)に従ってＤ−ｇｌｕ−ＦＮIII１４とＡｒａ−Ｃの相乗効果に関して計算した。本薬剤の有効血中濃度範囲である、１０６ＭのＡｒａ−Ｃで０．１８８と極めて高く、ＦＮIII１４とは著しく異なり、Ｄ−ｇｌｕ―ＦＮIII１４は高い相乗効果が得られ、実用場面で効率的な治療効果ができることが明らかとなった。【００６２】
Combination Index (CI)＝Ｖ３／（Ｖ１×Ｖ２）
Ｖ１＝抗がん剤をある濃度作用させた時の細胞生存率
Ｖ２＝被験物質をある濃度作用させた時の細胞生存率
Ｖ３＝両者を併用して作用させた時の細胞生存率
ＣＩ＝１：相加効果
ＣＩ＞１：拮抗効果 
ＣＩ＜１：相乗効果【００６３】
［実施例５］
実施例１で得られたＤ−ｇｌｕ−ＦＮIII１４のマウスにおける効果を以下のようにして確認した。
６週齢のＳＣＩＤマウス（チャールスリバー、日本）を各群６匹ずつに分け、それぞれ４グレイの放射線を照射した後に、５×１０６個のＵ９３７細胞株を尾静脈投与した。投与後７日目に、１．０ｍｇ若しくは０．５ｍｇのＦＮIII１４、又は１．０ｍｇ若しくは０．５ｍｇのＤ−ｇｌｕ−ＦＮIII１４をそれぞれ尾静脈から注入し、同時にＡｒａＣ（２０ｍｇ）又は生理食塩水を腹腔内投与した。その後、通常の飼育環境下で飼育を継続し、各ペプチドの効果を評価した。結果を図４に示す。【００６４】
図４に示されるように、Ｄ−ｇｌｕ−ＦＮIII１４を投与した群では、１ｍｇでも０．５ｍｇでも６０日以上の生存が確認され、完全寛解を期待できることが分かった。これに対して、ＦＮIII１４では、１ｍｇの場合には、Ｄ−ｇｌｕ−ＦＮIII１４と同様に６０日以上の生存が確認できるが、０．５ｍｇの場合では５０日程度で生存率が０となる。このことから、Ｄ−ｇｌｕ−ＦＮIII１４の必要最小投与量は、Ｄ−グルタミン酸を有しないＦＮIII１４の半量であり、Ｄ−ｇｌｕ−ＦＮIII１４はＦＮIII１４よりも抗癌剤の活性増強効果が驚くことに２倍以上高いことが示された。図２、図３の結果を踏まえるとさらに低薬量でも効果が期待できる。【００６５】
このように、Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮIII１４は、併用される抗癌剤に対して高い活性増強効果を有すると共に、抗癌剤と併用することにより抗癌剤の効果を相乗的に高めることがわかった。
従って、本発明によれば、併用される抗癌剤の治療効果を増強可能な抗癌剤の活性増強剤及び、これを含む癌治療用医薬組成物を提供することができる。【００６６】
２０１１年３月１１日に出願された日本国特許出願第２０１１−０５４４７５号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。
【図１】
2012124641.tif 000003
【図２Ａ】
2012124641.tif 000004
【図２Ｂ】
2012124641.tif 000005
【図２Ｃ】
2012124641.tif 000006
【図２Ｄ】
2012124641.tif 000007
【図３】
2012124641.tif 000008
【図４】
2012124641.tif 000009
【配列表】
2012124641000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年10月31日(2012.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるポリペプチドＦＮＩＩＩ１４のうち、第２番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸残基がＤ体アミノ酸残基であるＤ体アミノ酸残基含有ＦＮＩＩＩ１４ポリペプチドを有効成分とする、抗癌剤の活性増強剤。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
前記Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮＩＩＩ１４ポリペプチドが、多量体Ｄ体アミノ酸残基含有ＦＮＩＩＩ１４ポリペプチドである請求項１記載の抗癌剤の活性増強剤。
【請求項６】
白血病に対する抗癌剤と組み合わせて用いられる請求項１記載の抗癌剤の活性増強剤。
【請求項７】
前記抗癌剤が、シタラビン（ＡｒａＣ）、エノシタビン（Ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）及びエラシタラビン（Ｅｌａｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）からなる群より選択された少なくとも１つである請求項６記載の抗癌剤の活性増強剤。
【請求項８】
請求項１又は請求項５〜請求項７のいずれか１項記載の抗癌剤の活性増強剤と、薬学的に許容可能な担体とを含む癌治療用の医薬組成物。
【請求項９】
抗癌剤を更に含む請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１又は請求項５〜請求項７のいずれか１項記載の抗癌剤の活性増強剤を含む第一の収容部と、抗癌剤を含む第二の収容部とを備えた抗癌治療剤セット。
【請求項１１】
以下のいずれかであるポリペプチド：
（１）  配列番号１で示されるポリペプチドのうち、第２番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸残基がＤ体アミノ酸残基であるポリペプチド、
（２）  前記（１）のポリペプチドを構成単位とする多量体であるポリペプチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
に長期に血液中に残留することを避けることができることが示された。この物性を達成できたことから、ＤＤＳの手法で必要な放出制御が容易となった。
［００５９］
［実施例４］
＜抗癌剤補強活性評価＞
白血病細胞株Ｕ９３７を含む細胞懸濁液（１ｍＭの塩化マグネシウム及び２０％ヒト血清含有ＤＭＥＭ培地）を、２．５×１０４細胞／ウェルとなるように、ＦＮ１０μｇ／ｍＬでコート済みの９６−ｗｅｌｌ組織培養プレートに播種した。各ウェルに、ＦＮＩＩＩ１４またはＤ−ｇｌｕ−ＦＮＩＩＩ１４をそれぞれ１００μｇ／ｍＬの濃度及びとなるように添加して、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２時間培養した。その後、０、１０−８Ｍ、１０−７Ｍ、１０−６Ｍ、１０−５Ｍの各濃度のシタラビン（ＡｒａＣ、協和醗酵社）を添加し、２４時間培養した後、ＷＳＴ法に準じてＣｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（和光純薬）により生細胞数を測定した（測定波長：４５０ｎｍ、参照波長：６５５ｎｍ）。なお、すべてヒト血清（４人の健常ボランティアからの血清の混合物）を２０％添加した培地ＲＰＭＩ１６４０を用いて行った。結果を図３に示す。
［００６０］
その結果を図３に示す。図３に示されるように、ＡｒａＣ存在下におけるＵ９３７細胞の生存の減少に対して、Ｄ−ｇｌｕ−ＦＮＩＩＩ１４は、ＦＮＩＩＩ１４よりも優れた効果を有することがわかった。また、Ｄ−ｇｌｕ−ＦＮＩＩＩ１４存在下におけるＡｒａＣのＩＣ５０として、ペプチド非存在下と比較して約１００倍、またＦＮＩＩＩ１４と比べても更に約１０倍となる阻害効果が認められた。
［００６１］
また、この図３を見ると、Ｄ−ｇｌｕ−ＦＮＩＩＩ１４との併用は曲線が大きく下に振れ相乗効果が認められている。一方ＦＮＩＩＩ１４ではほぼ直線で相乗効果が認められなかった。相乗効果の指標であるコンビネーションインデックスをＤｒｅｗｉｎｋｏ等の報告（Ｄｒｅｗｉｎｋｏ，Ｂ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｌｏｏ，Ｔ．Ｌ．（１９７６）Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｗｉｔｈ  ｃｉｓ−ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉａｍｍｉｎｅｐｌａｔｉｎｕ
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
ｍ（ＩＩ）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｐ  ６０（１１）：１６１９−１６２５）に従ってＤ−ｇｌｕ−ＦＮＩＩＩ１４とＡｒａ−Ｃの相乗効果に関して計算した。本薬剤の有効血中濃度範囲である、１０−６ＭのＡｒａ−Ｃで０．１８８と極めて高く、ＦＮＩＩＩ１４とは著しく異なり、Ｄ−ｇｌｕ−ＦＮＩＩＩ１４は高い相乗効果が得られ、実用場面で効率的な治療効果ができることが明らかとなった。
［００６２］
Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ（ＣＩ）＝Ｖ３／（Ｖ１×Ｖ２）
Ｖ１＝抗がん剤をある濃度作用させた時の細胞生存率
Ｖ２＝被験物質をある濃度作用させた時の細胞生存率
Ｖ３＝両者を併用して作用させた時の細胞生存率
ＣＩ＝１：相加効果
ＣＩ＞１：拮抗効果
ＣＩ＜１：相乗効果
［００６３］
［実施例５］
実施例１で得られたＤ−ｇｌｕ−ＦＮＩＩＩ１４のマウスにおける効果を以下のようにして確認した。
６週齢のＳＣＩＤマウス（チャールスリバー、日本）を各群６匹ずつに分け、それぞれ４グレイの放射線を照射した後に、５×１０６個のＵ９３７細胞株を尾静脈投与した。投与後７日目に、１．０ｍｇ若しくは０．５ｍｇのＦＮＩＩＩ１４、又は１．０ｍｇ若しくは０．５ｍｇのＤ−ｇｌｕ−ＦＮＩＩＩ１４をそれぞれ尾静脈から注入し、同時にＡｒａＣ（２０ｍｇ）又は生理食塩水を腹腔内投与した。その後、通常の飼育環境下で飼育を継続し、各ペプチドの効果を評価した。結果を図４に示す。
［００６４］
図４に示されるように、Ｄ−ｇｌｕ−ＦＮＩＩＩ１４を投与した群では、１ｍｇでも０．５ｍｇでも６０日以上の生存が確認され、完全寛解を期待できることが分かった。これに対して、ＦＮＩＩＩ１４では、１ｍｇの場合には、Ｄ−ｇｌｕ−ＦＮＩＩＩ１４と同様に６０日以上の生存が確認できるが、０．５ｍｇの場合では５０日程度で生存率が０となる。このことから、Ｄ−ｇｌｕ−ＦＮＩＩＩ１４の必要最小投与量は、Ｄ−グルタミン酸を有しないＦＮＩＩＩ１４の
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2012124641.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成26年2月6日(2014.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
また、ＦＮIII１４の配列において２番目のアミノ酸残基がＤ−グルタミン酸であるＤ−Ｇｌｕ−ＦＮIII１４（T-[D-Glu]-ATITGLEPGTEYTIYVIAL）は、次の方法で合成した。
ポリエチレングリコール鎖を持つポリスチレン樹脂上にまず、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)-Leu-OHを導入した。Fmoc-Leu-OH（1mmol）を、2-(1-H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronium (HBTU) とN-hydroxybenzotriazole(HOBt)を各1mmol含むN,N,-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液に溶解した後、ポリスチレン樹脂と混合した。３０分後、不溶性樹脂をＤＭＦで洗浄した。その後、樹脂を２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液に懸濁し（Fmoc基を除去し）た。その後、Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OBzl)-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Glu(OBzl)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-D-Glu(OBzl)-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OHを同じ操作で導入した。得られたペプチドを樹脂から切断し、また、Ｂｚｌ基（ベンジル基）などの保護基を除去するため、トリフルオロ酢酸中で１時間反応した。得られた粗生成物はＨＰＬＣで精製し、均一なペプチドを得た。また、合成されたペプチドの構造を、飛行時間型分子量測定装置により確認した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
Ace-FNIII14の合成法は以下の通り。
ポリエチレングリコール鎖を持つポリスチレン樹脂上にまず、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)-Leu-OHを導入した。Fmoc-Leu-OH（1mmol）を2-(1-H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronium (HBTU) とN-hydroxybenzotriazole(HOBt)各1mmolを含むN,N,-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液に溶解した後、ポリスチレン樹脂と混合した。３０分後、不溶性樹脂をＤＭＦで洗浄した。その後、樹脂を２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液に懸濁し、Fmoc基を除去した。その後、Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OBzl)-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Glu(OBzl)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OBzl)-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OHを同じ操作で導入した。２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液に不溶性樹脂を懸濁しFmoc基を除去した。別途、酢酸、ジシクロヘキシルカルボジイミド、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール各５ｍｍｏｌをジクロロメタン中で３０分反応させ、ろ液を不溶性樹脂に加えた。３０分後不溶性樹脂をＤＭＦで洗浄した。目的のペプチドの樹脂からの切断、及び、Ｂｚｌ基などの保護基を除去するため、トリフルオロ酢酸中で１時間反応した。得られた粗生成物はＨＰＬＣで精製し、均一なペプチドを得た。また、合成されたペプチドの構造を、飛行時間型分子量測定装置により確認した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
Ｍet化-FNIII14の合成法（[N-Me-Glu]2-FNIII14）は以下の通り。
ポリエチレングリコール鎖を持つポリスチレン樹脂上にまず、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)-Leu-OHを導入した。Fmoc-Leu-OH（1mmol）を2-(1-H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronium (HBTU) とN-hydroxybenzotriazole(HOBt)各1mmolを含むN,N,-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液に溶解した後、ポリスチレン樹脂と混合した。３０分後、不溶性樹脂をＤＭＦで洗浄した。その後、樹脂を２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液に懸濁し（Fmoc基を除去し）た。その後、Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OBzl)-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Glu(OBzl)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Glu(OBzl)-OH, Fmoc-Thr(Bzl)-OHを同じ操作で導入した。目的のペプチドの樹脂からの切断、及び、Ｂｚｌ基などの保護基を除去するため、トリフルオロ酢酸中で１時間反応した。得られた粗生成物はＨＰＬＣで精製し、均一なペプチドを得た。また、合成されたペプチドの構造を、飛行時間型分子量測定装置により確認した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
＜評価＞  細胞接着阻害活性
９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を０．５μｇ／ｍＬの濃度のヒト由来血漿性フィブロネクチン（以下、「ＦＮ」とする。Ｆｕｋａｉらの方法で調製、（Fukai et al.,J.Biol.Chem.,266,8807,1991）でコーティングした。無血清培地で２×１０５細胞／ｍｌとなるように、Ａ３７５ＳＭ細胞を懸濁し（２×１０４細胞）にＤ−Ｇｌｕ−ＦＮIII１４と、ＦＮIII１４を含むペプチド溶液（リン酸緩衝生理食塩水に溶解）を最終濃度３．１２５〜２５μｇ／ｍｌになるように混合したものを、上記のプレートの各ウェルに播種した。対照として、ペプチドを含まないＰＢＳのみを同様に各ウェルへ添加した。なお、培地は、ＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を使用した。
プレートを３７℃、５v/v％ＣＯ２雰囲気下で１時間培養した。４％ホルマリンと５％スクロースを含むＰＢＳ（−）溶液を１００μＬ静かにウェルに加え、室温で１時間放置することで細胞を固定した。固定後、PBS中での非接着細胞を洗浄除去した後、あらかじめ決められた４視野内の細胞数を計測し接着細胞数とした。結果を図１に示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
図１に示されるように、Ｄ−Ｇｌｕ−ＦＮIII１４は、ＦＮIII１４と同程度の接着阻害活性を保持することが示された。よって、Ｄ−Ｇｌｕ−ＦＮIII１４は、Ｎ末端側にＤ体アミノ酸を含んでいても、ＦＮIII１４としての活性低下は見られないことが示された。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
［実施例２］
＜トリマーおよびデンドリマーの製造＞
（１）  トリマー（三量体Ac-FNIII14）の製造方法
上記の方法で調製した単量体ペプチドFNIII14をＤＭＳＯとＰＢＳに溶解し、ＴＭＥＡ (Tris[2-maleimidoethyl]amine)のＤＭＳＯ溶液を滴下して得た。
トリマーが得られたことは、合成されたペプチドの構造を、飛行時間型分子量測定装置により確認した。
また同様の手順に従えば、Ｄ−Ｇｌｕ−ＦＮIII１４の単量体からＤ−Ｇｌｕ−ＦＮIII１４の三量体を得ることができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
（２）  デンドリマーの製造方法
単量体ペプチドFNIII14の固相合成法で、ペプチドの末端に、ＢＭＰＡ(N-β-Maleimidopropionic acid)を持つペプチドを調製した。ペプチドをＤＭＳＯとＰＢＳに溶解し、システイン残基を６個含む環状ペプチドのＤＭＳＯ溶液を滴下して得た。
デンドリマーが得られたことは、合成されたペプチドの構造を、飛行時間型分子量測定装置により確認した。
また同様の手順に従えば、Ｄ−Ｇｌｕ−ＦＮIII１４の単量体からＤ−Ｇｌｕ−ＦＮIII１４の多量体（デンドリマー）を得ることができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
［実施例３］
＜ヒト血清中におけるペプチドの安定性の評価＞
FNIII14（500μg/mL）、各修飾ペプチド（500μg/mL）または溶解液を、それぞれヒト血清中（終濃度９０％）（防腐剤としてsodium azide ０．０１％添加）にて０〜５６時間、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一定時間インキュベートした。その後、各ウェル中のペプチド濃度が２５μg/mLになるようにＤＭＥＭ（−）で希釈した各試料を、１．５×１０４/ウェルに調整した Ａ３７５ＳＭ細胞と共に、ＦＮ  ０．５μｇ／ｍＬでコート済みの９６穴ウェル組織培養プレートに播種し、一定時間培養した後、４％ホルマリンと５％スクロースを含むＰＢＳ（−）溶液を１００ｍｌ静かに各ウェルに加え、室温で１時間放置することで細胞を固定した。固定後、あらかじめ決められた４視野内の細胞数を計測し全細胞数とした。ＰＢＳ（−）溶液で３回洗浄することで非接着細胞を除去した後、上記と同じ４視野内の接着細胞数を顕微鏡下に計測した。血清処理していないFNIII14の接着阻害活性を１００とし、それに対するFNIII14又は修飾ペプチドの血清処理後の残存接着阻害活性の割合を百分率で評価した。結果を図２Ａ〜図２Ｄに示す。なお、図２Ａ〜図２Ｃにおいて、白菱形はＦＮIII１４、白四角はＡｃｅ−ＦＮIII１４、白丸はＭｅｔ−ＦＮIII１４、白三角はＤ−ＦＮIII１４を、それぞれ用いた場合の結果を表す。また図２Ｄにおいて、黒丸は、ＦＮIII１４の活性を示し、黒三角はＤ−Ｇｌｕ−ＦＮIII１４の活性を示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
図２Ａに示されるように、ＦＮIII１４が２時間で急激に活性を失い、２０時間後には６０％程度になっていた。これに対して、Ａｃｅ−ＦＮIII１４（図２Ｂ参照）やＭｅｔ−ＦＮIII１４（図２Ｃ参照）は、ＦＮIII１４よりも安定化させることができた。さらに、Ｄ−Ｇｌｕ−ＦＮIII１４は、ヒト血清中においてアミノペプチダーゼなどによる分解への抵抗性を示した。また、Ｄ−Ｇｌｕ−ＦＮIII１４は、血清中で活性の低下を起こさず、むしろ２０％以上活性が高まることが見出された。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
本バイオアッセイ方法でヒト血清を用いているが、この血液中の阻害因子をこのペプチドはさけることができるために、１００％を越えている。このことは、治療のために血中濃度を維持するためには、ＦＮIII１４は１時間程度の間隔で静脈注射する必要があるのに対して、Ｄ−Ｇｌｕ−ＦＮIII１４であれば１日以上の間隔をあけて静脈注射すればよいことが期待される。さらに、Ｄ−Ｇｌｕ−ＦＮIII１４であれば、図２Ｄに示すように６０時間の長期の安定性を示したが、５０時間以降で分解の傾向を示しているので、不必要に長期に血液中に残留することを避けることができることが示された。この物性を達成できたことから、ＤＤＳの手法で必要な放出制御が容易となった。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
［実施例４］
＜抗癌剤補強活性評価＞
白血病細胞株Ｕ９３７を含む細胞懸濁液（１ｍＭの塩化マグネシウム及び２０％ヒト血清含有ＤＭＥＭ培地）を、２．５×１０４細胞／ウェルとなるように、ＦＮ１０μｇ／ｍＬでコート済みの９６−ｗｅｌｌ組織培養プレートに播種した。各ウェルに、ＦＮIII１４またはＤ−Ｇｌｕ−ＦＮIII１４をそれぞれ１００μｇ／ｍＬの濃度及びとなるように添加して、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２時間培養した。その後、０、１０-８Ｍ、１０-７Ｍ、１０-６Ｍ、１０-５Ｍの各濃度のシタラビン（ＡｒａＣ、協和醗酵社）を添加し、２４時間培養した後、ＷＳＴ法に準じてＣｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（和光純薬）により生細胞数を測定した（測定波長：４５０ｎｍ、参照波長：６５５ｎｍ）。なお、すべてヒト血清（４人の健常ボランティアからの血清の混合物）を２０％添加した培地ＲＰＭＩ１６４０を用いて行った。結果を図３に示す。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
その結果を図３に示す。図３に示されるように、ＡｒａＣ存在下におけるＵ９３７細胞の生存の減少に対して、Ｄ−Ｇｌｕ−ＦＮIII１４は、ＦＮIII１４よりも優れた効果を有することがわかった。また、Ｄ−Ｇｌｕ−ＦＮIII１４存在下におけるＡｒａＣのＩＣ５０として、ペプチド非存在下と比較して約１００倍、またＦＮIII１４と比べても更に約１０倍となる阻害効果が認められた。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
また、この図３を見ると、Ｄ−Ｇｌｕ−ＦＮIII１４との併用は曲線が大きく下に振れ相乗効果が認められている。一方ＦＮIII１４ではほぼ直線で相乗効果が認められなかった。相乗効果の指標であるコンビネーションインデックスを  Drewinko等の報告 (Drewinko, B., Green, C., and Loo, T.L. (1976) Combination chemotherapy in vitro with cis-dichlorodiammineplatinum(II) Cancer Treat Rep 60(11): 1619-1625)に従ってＤ−Ｇｌｕ−ＦＮIII１４とＡｒａ−Ｃの相乗効果に関して計算した。本薬剤の有効血中濃度範囲である、１０-６ＭのＡｒａ−Ｃで０．１８８と極めて高く、ＦＮIII１４とは著しく異なり、Ｄ−Ｇｌｕ―ＦＮIII１４は高い相乗効果が得られ、実用場面で効率的な治療効果ができることが明らかとなった。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
［実施例５］
実施例１で得られたＤ−Ｇｌｕ−ＦＮIII１４のマウスにおける効果を以下のようにして確認した。
６週齢のＳＣＩＤマウス（チャールスリバー、日本）を各群６匹ずつに分け、それぞれ４グレイの放射線を照射した後に、５×１０６個のＵ９３７細胞株を尾静脈投与した。投与後７日目に、１．０ｍｇ若しくは０．５ｍｇのＦＮIII１４、又は１．０ｍｇ若しくは０．５ｍｇのＤ−Ｇｌｕ−ＦＮIII１４をそれぞれ尾静脈から注入し、同時にＡｒａＣ（２０ｍｇ）又は生理食塩水を腹腔内投与した。その後、通常の飼育環境下で飼育を継続し、各ペプチドの効果を評価した。結果を図４に示す。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
図４に示されるように、Ｄ−Ｇｌｕ−ＦＮIII１４を投与した群では、１ｍｇでも０．５ｍｇでも６０日以上の生存が確認され、完全寛解を期待できることが分かった。これに対して、ＦＮIII１４では、１ｍｇの場合には、Ｄ−Ｇｌｕ−ＦＮIII１４と同様に６０日以上の生存が確認できるが、０．５ｍｇの場合では５０日程度で生存率が０となる。このことから、Ｄ−Ｇｌｕ−ＦＮIII１４の必要最小投与量は、Ｄ−グルタミン酸を有しないＦＮIII１４の半量であり、Ｄ−Ｇｌｕ−ＦＮIII１４はＦＮIII１４よりも抗癌剤の活性増強効果が驚くことに２倍以上高いことが示された。図２、図３の結果を踏まえるとさらに低薬量でも効果が期待できる。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2012124641.tif 000011
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2012124641000001.app
【国際調査報告】
2012124641.tif 000012
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