(57)【要約】  本発明の課題は、ウイルスを含む液からウイルスを捕捉或いは濃縮する工程で目詰まりを起こすことなく、ウイルスを含む液から簡便にウイルスを捕捉し、さらに捕捉したウイルス量を正確且つ簡便に評価する方法を提供することである。課題を解決するための手段は、表面処理した中空糸にウイルスを含む液を接触させることにより、又は通じることによりウイルスを捕捉し、該捕捉したウイルスの量を算出することにより液中に含まれるウイルスの濃度を評価する方法を提供することによる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
電荷を有する化合物、或いは電荷を有しない化合物で表面処理された中空糸にウイルスを含む液を通じて、或いは接触させてウイルスを捕捉し、捕捉したウイルスの量を算出することにより前記ウイルスを含む液中に含まれるウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項２】
請求項１に記載のウイルスの濃度を評価する方法において、
１）ウイルスを含む液（Ａ液）から一定量の液（Ｂ液）を採取する第一工程
２）Ｂ液を、前記中空糸に通じて、或いは接触させてウイルスを中空糸に捕捉させる第二工程
３）前記中空糸に捕捉されたＢ液中のウイルスの量を算出する第三工程
の各工程を含むことを特徴とするウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項３】
中空糸が、ポリオレフィン、ポリエーテルスルホン、又はセルロース混合エステルから構成されるものである請求項１又は２に記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項４】
中空糸が多孔性中空糸である、請求項１〜３の何れかに記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項５】
ポリオレフィンが、ポリエチレン、ポリプロピレン又はポリ−４−メチルペンテンである請求項３又は４に記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項６】
電荷を有する化合物が、（メタ）アクリル酸塩、スルホン酸塩、アンモニウム基を有する化合物、スルホニウム基を有する化合物、カルボキシレート基を有する化合物、又はホスフェート基を有する化合物である請求項１〜５の何れかに記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項７】
電荷を有しない化合物が、（メタ）アクリル酸、スルホン酸、アミノ基を有する化合物、スルホ基を有する化合物、カルボキシ基を有する化合物、又はホスホ基を有する化合物である請求項１〜５の何れかに記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項８】
スルホニウム基又はスルホ基を有する化合物が硫酸化糖である請求項６又は７に記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項９】
硫酸化糖が、ヘパリン、ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体、デキストラン硫酸、又はフコイダンである請求項８に記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項１０】
ウイルスの量を算出する方法が、ポリメラーゼ連鎖反応によるもの、抗原抗体反応によるもの、又は培養法によるものである請求項１〜９の何れかに記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項１１】
ウイルスが、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ノロウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ロタウイルス、又はポリオウイルスである請求項１〜１０の何れかに記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項１２】
前記３）前記中空糸に捕捉されたＢ液中のウイルスの量を算出する第三工程において、
ウイルスを捕捉させた中空糸から、フェノール水溶液、アルカリ性水溶液、又は無機塩水溶液によりウイルスを回収する工程を有する、請求項２〜１１に記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２の何れかに記載の方法によりウイルスの濃度を評価する機能を備えたウイルス濃度評価キット。
【請求項１４】
請求項１〜１２の何れかに記載のウイルスの濃度を評価する方法に用いられる、アミノ基を有する化合物、又はアンモニウム基を有する化合物が固定化されたウイルス捕捉用中空糸。
【請求項１５】
アミノ基を有する化合物、又はアンモニウム基を有する化合物が、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、アミノ酸、及びそれらの塩から選ばれる化合物である、請求項１４に記載のウイルス捕捉用中空糸。
【請求項１６】
請求項１４又は１５に記載のアミノ基を有する化合物、又はアンモニウム基を有する化合物が固定化されたウイルス捕捉用中空糸において、
水酸基を有する高分子材で表面処理された中空糸に、水酸基、及びアミノ基又はアンモニウム基と反応し得る基を有する化合物を介して前記アミノ基を有する化合物、又はアンモニウム基を有する化合物が固定化されたことを特徴とするウイルス捕捉用中空糸。
【請求項１７】
水酸基を有する高分子材で表面処理された中空糸が、エチレン−ビニルアルコール共重合体、エチレン−ビニルアルコール−酢酸ビニル共重合体、エチレン−酢酸ビニル共重合体の部分けん化物、ビニルアルコール−酢酸ビニル共重合体、ヒドロキシメタクリレート共重合体、酢酸セルロースの部分けん化物、又はグリセリン誘導体で表面処理された中空糸である請求項１４〜１６の何れかに記載のウイルス捕捉用中空糸。
【請求項１８】
水酸基、及びアミノ基又はアンモニウム基と反応し得る基を有する化合物が、エピクロロヒドリン、又はジエポキシ化合物である請求項１６又は１７に記載のウイルス捕捉用中空糸。
【請求項１９】
請求項１４又は１５に記載のアミノ基を有する化合物、又はアンモニウム基を有する化合物が固定化されたウイルス捕捉用中空糸において、
グラフト重合反応により前記アミノ基を有する化合物、又はアンモニウム基を有する化合物が中空糸に固定化されたウイルス捕捉用中空糸。
【請求項２０】
請求項１４又は１５に記載のアミノ基を有する化合物、又はアンモニウム基を有する化合物が固定化されたウイルス捕捉用中空糸において、
前記アミノ基を有する化合物、又はアンモニウム基を有する化合物で中空糸を表面処理することによりアミノ基を有する化合物、又はアンモニウム基を有する化合物が固定化されたウイルス捕捉用中空糸。
【請求項２１】
中空糸が、多孔性中空糸である請求項１４〜２０の何れかに記載のウイルス捕捉用中空糸。
【請求項２２】
中空糸が、ポリエチレン、ポリプロピレン又はポリ−４−メチルペンテンを基質とするものである請求項１４〜２１の何れかに記載のウイルス捕捉用中空糸。
【請求項２３】
アミノ基を有する化合物、又はアンモニウム基を有する化合物の固定化量が１〜１００μｇ/ｃｍ２の範囲である請求項１４〜２２の何れかに記載のウイルス捕捉用中空糸。
【請求項２４】
ウイルスが、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ノロウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ロタウイルス、又はポリオウイルスである請求項１４〜２３の何れかに記載のウイルス捕捉用中空糸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面処理した中空糸にウイルスを含む液を通じて、或いは接触させてウイルスを捕捉し、該捕捉したウイルスの量を算出することにより液中に含まれるウイルスの濃度を評価する方法、及び当該ウイルスの濃度を評価する方法によりウイルスの濃度を評価する機能を備えたウイルス濃度評価キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
下水、河川水、水道水等が各種ウイルスによって汚染されると、近隣住民の健康が損なわれる危険性が高まる。特に、開発途上地域における生活水のウイルス汚染は、住民の健康障害への大きな脅威となっている。また、例えば不特定多数の人々が利用するプール等の公共施設において、その水が経口感染性ウイルスによって汚染された場合には、ウイルス感染が一気に広がる恐れがある。これらに鑑み、水環境のウイルス汚染を恒常的に監視することは国民生活の安心安全を維持していく上で非常に重要であり、そのためには簡便で正確なウイルス量の評価技術が必須である。【０００３】
これまでウイルス量の評価方法としては、例えば、ウイルスを含む環境水の濃縮を陰電荷膜法（ニトロセルロースとセルロースアセテートの混合膜、平膜カートリッジ）でウイルスを吸着、誘出して濃縮した後ウイルスを検出する方法が知られている（非特許文献１）。その際には、必要に応じて更に限外ろ過膜を用いて２次濃縮を行う場合もある。この方法では、ウイルスの回収率は高いものの、環境水の由来によっては濃縮時に膜に目詰まりを生じることがあり、問題となっている。【０００４】
また、特許文献１には、いくつかの隣接するゾーンが提供される固形支持体を含む、生物試料中の分析物またはそのアナログを検出するための装置が記載されている。【０００５】
特許文献２には、生物学的サンプル中の被分析物を検出するための装置、方法及びキットが記載されており、検出前に生物学的サンプルから抽出を必要とするアナライトが１段階で抽出され、かつ、検出される手段を提供することができると記載されている。【０００６】
特許文献３には、吸収剤あるいは吸着物質からなる回収装置手段を用い所定の方法により表面の一定範囲内を拭って、（微生物その他分析対象物を含む）表面サンプルを回収する方法が記載されている。【０００７】
その他、特許文献４には、ウイルスを含み得る被検試料をウイルス分離用細胞に接触させ、次いで得られた細胞に対してｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダーゼーションを行うウイルスの検出方法が記載されており、当該被検試料として、鼻汁、鼻腔ぬぐい液、眼結膜ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、喀痰、糞便、血液（血清、血漿）、髄液、唾液、尿、汗、精液または組織が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００９−５１８６３６号公報
【特許文献２】特表平９−５０１４９４号公報
【特許文献３】特表２００２−５１４９１６号公報
【特許文献４】特開２００３−０２４０７７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】モダンメディア  ５２巻６号  ２００６  Ｐ．１８５−１９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これまでの技術では、ウイルスを含む液からウイルスを捕捉或いは濃縮する工程で目詰まり等のトラブルを生じる問題があった。
そこで、本発明の課題は、ウイルスを含む液からウイルスを捕捉或いは濃縮する工程で目詰まりを起こすことなく、ウイルスを含む液から簡便にウイルスを捕捉し、さらに捕捉したウイルス量を正確且つ簡便に評価する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明者らはウイルスの捕捉方法、及び該補足したウイルスの評価方法を検討し、本発明を完成させるに至った。【００１２】
即ち、本発明は、表面処理した中空糸にウイルスを含む液を接触させることにより、又は通じることによりウイルスを捕捉し、該捕捉したウイルスの量を算出することにより液中に含まれるウイルスの濃度を評価する方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ウイルスを含む液から簡便にウイルスを捕捉する方法、捕捉したウイルス量を正確且つ簡便に評価することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
即ち、本発明は、
１．電荷を有する化合物、或いは電荷を有しない化合物で表面処理された中空糸にウイルスを含む液を通じて、或いは接触させてウイルスを捕捉し、捕捉したウイルスの量を算出することにより前記ウイルスを含む液中に含まれるウイルスの濃度を評価する方法、
２．１．に記載のウイルスの濃度を評価する方法において、
１）ウイルスを含む液（Ａ液）から一定量の液（Ｂ液）を採取する第一工程
２）Ｂ液を、前記中空糸に通じて、或いは接触させてウイルスを中空糸に捕捉させる第二工程
３）前記中空糸に捕捉されたＢ液中のウイルスの量を算出する第三工程
の各工程を含むことを特徴とするウイルスの濃度を評価する方法、
３．中空糸が、ポリオレフィン、ポリエーテルスルホン、又はセルロース混合エステルから構成されるものである１．又は２．に記載のウイルスの濃度を評価する方法、
４．中空糸が多孔性中空糸である、１．〜３．の何れかに記載のウイルスの濃度を評価する方法、
５．ポリオレフィンが、ポリエチレン、ポリプロピレン又はポリ−４−メチルペンテンである３．又は４．に記載のウイルスの濃度を評価する方法、
６．電荷を有する化合物が、（メタ）アクリル酸塩、スルホン酸塩、アンモニウム基を有する化合物、スルホニウム基を有する化合物、カルボキシレート基を有する化合物、又はホスフェート基を有する化合物である１．〜５．の何れかに記載のウイルスの濃度を評価する方法、
７．電荷を有しない化合物が、（メタ）アクリル酸、スルホン酸、アミノ基を有する化合物、スルホ基を有する化合物、カルボキシ基を有する化合物、又はホスホ基を有する化合物である１．〜５．の何れかに記載のウイルスの濃度を評価する方法、
８．スルホニウム基又はスルホ基を有する化合物が硫酸化糖である６．又は７．に記載のウイルスの濃度を評価する方法、
９．硫酸化糖が、ヘパリン、ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体、デキストラン硫酸、又はフコイダンである８．に記載のウイルスの濃度を評価する方法、
１０．ウイルスの量を算出する方法が、ポリメラーゼ連鎖反応によるもの、抗原抗体反応によるもの、又は培養法によるものである１．〜９．の何れかに記載のウイルスの濃度を評価する方法、
１１．ウイルスが、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ノロウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ロタウイルス、又はポリオウイルスである１．〜１０．の何れかに記載のウイルスの濃度を評価する方法、
１２．前記３）前記中空糸に捕捉されたＢ液中のウイルスの量を算出する第三工程において、
ウイルスを捕捉させた中空糸から、フェノール水溶液、アルカリ性水溶液、又は無機塩水溶液によりウイルスを回収する工程を有する、２．〜１１．に記載のウイルスの濃度を評価する方法、
１３．１．〜１２．の何れかに記載の方法によりウイルスの濃度を評価する機能を備えたウイルス濃度評価キット、
１４．１．〜１２．の何れかに記載のウイルスの濃度を評価する方法に用いられる、アミノ基を有する化合物、又はアンモニウム基を有する化合物が固定化されたウイルス捕捉用中空糸、
１５．アミノ基を有する化合物、又はアンモニウム基を有する化合物が、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、アミノ酸、及びそれらの塩から選ばれる化合物である、１４．に記載のウイルス捕捉用中空糸、
１６．１４．又は１５．に記載のアミノ基を有する化合物、又はアンモニウム基を有する化合物が固定化されたウイルス捕捉用中空糸において、
水酸基を有する高分子材で表面処理された中空糸に、水酸基、及びアミノ基又はアンモニウム基と反応し得る基を有する化合物を介して前記アミノ基を有する化合物、又はアンモニウム基を有する化合物が固定化されたことを特徴とするウイルス捕捉用中空糸、
１７．水酸基を有する高分子材で表面処理された中空糸が、エチレン−ビニルアルコール共重合体、エチレン−ビニルアルコール−酢酸ビニル共重合体、エチレン−酢酸ビニル共重合体の部分けん化物、ビニルアルコール−酢酸ビニル共重合体、ヒドロキシメタクリレート共重合体、酢酸セルロースの部分けん化物、又はグリセリン誘導体で表面処理された中空糸である１４．〜１６．の何れかに記載のウイルス捕捉用中空糸、
１８．水酸基、及びアミノ基又はアンモニウム基と反応し得る基を有する化合物が、エピクロロヒドリン、又はジエポキシ化合物である１６．又は１７．に記載のウイルス捕捉用中空糸、
１９．１４．又は１５．に記載のアミノ基を有する化合物、又はアンモニウム基を有する化合物が固定化されたウイルス捕捉用中空糸において、
グラフト重合反応により前記アミノ基を有する化合物、又はアンモニウム基を有する化合物が中空糸に固定化されたウイルス捕捉用中空糸、
２０．１４．又は１５．に記載のアミノ基を有する化合物、又はアンモニウム基を有する化合物が固定化されたウイルス捕捉用中空糸において、
前記アミノ基を有する化合物、又はアンモニウム基を有する化合物で中空糸を表面処理することによりアミノ基を有する化合物、又はアンモニウム基を有する化合物が固定化されたウイルス捕捉用中空糸、
２１．中空糸が、多孔性中空糸である１４．〜２０．の何れかに記載のウイルス捕捉用中空糸、
２２．中空糸が、ポリエチレン、ポリプロピレン又はポリ−４−メチルペンテンを基質とするものである１４．〜２１．の何れかに記載のウイルス捕捉用中空糸、
２３．アミノ基を有する化合物、又はアンモニウム基を有する化合物の固定化量が１〜１００μｇ/ｃｍ２の範囲である１４．〜２２．の何れかに記載のウイルス捕捉用中空糸、
２４．ウイルスが、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ノロウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ロタウイルス、又はポリオウイルスである１４．〜２３．の何れかに記載のウイルス捕捉用中空糸に関する。
【００１５】
以下、本発明で行われる中空糸の表面処理について説明する。
・中空糸
本発明に用いる中空糸は、本発明で対象とするウイルスを捕捉するものであれば制限なく用いることができる。
中空糸を構成する基材としては、ウイルスを捕捉する観点から、オレフィン系樹脂、スチレン系樹脂、スルホン系樹脂、アクリル系樹脂、ウレタン系樹脂、エステル系樹脂、エーテル系樹脂又はセルロース混合エステル等が挙げられ、より具体的にはポリエチレンテレフタレート、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリメチルメタクリレート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリエチレン、ポリプロピレン又はポリ−４−メチルペンテン等を例示できる。
本発明で用いることのできる中空糸は特に制限はないが、ウイルスを効率的に捕捉することができる点で多孔性中空糸が好ましい。また、目詰まりの軽減を考慮して、中空糸内壁面は多孔性でありながら外壁面にスキン層を有する非濾過型の中空糸を用いてもよい。当該多孔性中空糸は、延伸法等の公知慣用の製造方法によって製造することができる。
【００１６】
・表面処理に用いる化合物
中空糸の表面処理に用いる化合物としては、ウイルスを捕捉する能力を有している限り特に制限されるものではなく、電荷を有する化合物、電荷を有しない化合物のいずれであっても良い。そのような化合物として、以下のようなものが挙げられる。例えば電荷を有するものとしては、（メタ）アクリル酸塩、スルホン酸塩、アンモニウム基を有する化合物、スルホニウム基を有する化合物、カルボキシレート基を有する化合物、又はホスフェート基を有する化合物等が例示される。また電荷を有しないものとして、（メタ）アクリル酸、スルホン酸、アミノ基を有する化合物、スルホ基を有する化合物、カルボキシ基を有する化合物、又はホスホ基を有する化合物等が例示される。アミノ基を有する化合物、又はアンモニウム基を有する化合物としては、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、アミノ酸、及びそれらの塩から選ばれる化合物等を挙げることができる。アミノ酸に関しては、分子内で塩を形成されたものも本発明に含まれる。
【００１７】
前記スルホニウム基又はスルホ基を有する化合物は硫酸化糖であってもよく、更に詳しくはヘパリン、ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体、デキストラン硫酸、又はフコイダンであってもよい。
【００１８】
・表面処理方法
上記化合物で中空糸の表面処理を行う方法としては公知慣用の方法を用いることができ、そのような方法として、例えばラジカル重合性化合物によるグラフト重合や濃硫酸等によるスルホン酸化、及びグラフト重合後に該グラフト鎖と反応し得る化合物とを反応させる方法等が挙げられる。
【００１９】
また、水酸基を有する高分子材で中空糸を表面処理することもできる。その際には、更に、水酸基を利用して、水酸基、及びアミノ基又はアンモニウム基と反応し得る基を有する化合物を介してアミノ基を有する化合物、又はアンモニウム基を有する化合物を固定化することも可能である。
【００２０】
以下、それぞれのケースごとに詳述する。
・・グラフト重合によるラジカル重合性基を有する化合物の導入
電離放射線を照射することによるラジカル重合性基を有する化合物とのグラフト重合反応による処理方法は以下のようにして行うことができる。
中空糸に電離放射線を照射して発生させたラジカルにより、例えば（メタ）アクリル酸等のラジカル重合性基を有する化合物のエチレン性不飽和基を中空糸にグラフト重合させる。グラフト重合に際して用いる電離放射線源としては、公知慣用のα線、β線、γ線、加速電子線、Ｘ線等があげられ、実用的にはγ線、加速電子線が望ましい。
【００２１】
グラフト重合法は、前記中空糸とラジカル重合性基を有する化合物とを接触させて電離放射線を照射する同時照射グラフト重合法と、中空糸に予め照射した後でラジカル重合性基を有する化合物と接触させる前照射グラフト重合法のいずれでも可能であり、目的に合わせて選択できる。
【００２２】
本発明に用いる電離放射線を用いたグラフト重合法において、最適な照射線量や加速電圧は中空糸によって異なるため一概には範囲を決めることができず、中空糸の素材、厚みなどを考慮し適宜調整することが必要である。例えば、照射量が多いと帯電による絶縁破壊が発生し、照射量が少ないと重合反応が進行しない。このため、中空糸の材質や形態などを考慮し、帯電による絶縁破壊が発生せず、かつ重合反応が充分に進む照射量を適宜調整すればよい。また、加速電圧は透過性に関係し、中空糸の厚みによって異なる。厚みが薄い場合、加速電圧は一般には小さくて済み、厚い場合には大きくする必要がある。
【００２３】
例えば、中空糸がポリ−４−メチルペンテンからなる厚さ１０μｍ〜１００μｍの中空糸の場合においては、１０ｋＧｙ以上、３００ｋＧｙ以下、さらに望ましくは９０ｋＧｙ以下であればよく、加速電圧は適宜選択することができる。
その他、中空糸が、ポリエチレン、ポリプロピレンから構成されるものであっても同様にグラフト重合を行うことができる。
【００２４】
前記電離放射線照射後の中空糸基材中のラジカルは温度の上昇、酸素との接触によって速やかに不活化される。従って、照射後は十分に酸素を除いた状態で低温にて貯蔵し、速やかにグラフト重合反応を行うことが好ましい。また前記の理由から、反応は脱酸素下、又は不活性ガス下で実施することが望ましい。グラフト重合反応後の中空糸は、溶媒による洗浄など種々の方法で未反応のラジカル重合性基を有する化合物を除去すればよい。
【００２５】
なお、中空糸へのラジカル重合性基を有する化合物の導入に際しては、実施形態に応じて中空糸の内面、外面のどちらか、又は両方を選択して行うことができる。例えば中空糸内面に通液してウイルスを捕捉する場合には、中空糸内面に該化合物を導入しておけばよく、逆に、外面に通液して用いる場合には中空糸外面に導入しておけばよい。中空糸の基材としては電離放射線照射によってラジカルを生成しやすいことから、主鎖にメチレン基を有するような高分子化合物が特に好ましい。
グラフト重合反応により中空糸に導入した前記化合物は、公知慣用の方法により塩とすることができる。このような塩としては、ウイルスを捕捉することができるものであれば特に制限はないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等の金属イオンと形成される塩、トリアルキルアミン類、芳香族アミン類と形成される塩等を好ましい塩として挙げることができる。
【００２６】
・・スルホン酸化によるスルホン酸又はスルホン酸塩の導入
本発明の中空糸のスルホン酸化は、濃硫酸又は発煙硫酸等のスルホン酸化剤を用いた通常公知の方法で行うことが可能である。また、得られたスルホン酸基は、公知慣用の方法により、スルホン酸塩とすることができる。このような塩としては、ウイルスを捕捉することができるものであれば特に制限はないが、スルホン酸のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の金属イオンと形成される塩、トリアルキルアミン類、芳香族アミン類と形成される塩等を好ましい塩として挙げることができる。
【００２７】
・・アミノ基又はアンモニウム基を有する化合物の導入
本発明においてアミノ基の導入法に制限はないが、好ましい導入法としては、グラフト重合が可能なラジカル重合性基とアミノ基と反応し得る基とを有する化合物（Ｉ）を中空糸に導入した後に、アミノ基を有する化合物（ＩＩ）又はアンモニアと反応させる方法を挙げることができる。アミノ基を有する化合物（ＩＩ）は、アミノ基の他に水酸基等の官能基を有していてもよい。
【００２８】
グラフト重合が可能なラジカル重合性基とアミノ基と反応し得る基とを有する化合物（Ｉ）として好ましい化合物は、例えば、（メタ）アクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート等のエポキシ基を有する（メタ）アクリレート、（メタ）アクリロイルオキシアルキルイソシアネート等のイソシアネート基を有する（メタ）アクリレート等を挙げることができる。
好ましいアミノ基を有する化合物（ＩＩ）としては、例えば、水酸基若しくはアミノ基が保護基を有してもよいヒドロキシアルキルアミン誘導体、又はアミノ基が保護基を有してもよい分子内に少なくとも２個のアミノ基を有するアミン誘導体であって、水酸基若しくはアミノ基が保護基を有してもよい、２−アミノエタノール、エチレンジアミン、ブチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、１，２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン等を挙げることができる。
また、ラジカル重合性基とアミノ基と反応し得る基とを有する化合物（Ｉ）と反応する化合物としてアンモニアも挙げることができる。
使用される保護基としては、カーバメート結合により保護する基、エステル結合により保護する基、アミド結合により保護する基又はエーテル結合により保護する基等を挙げることができるが、これらに限らない。
【００２９】
カーバメート結合により保護する基としては、例えばｔ−ブチルカーバメート（Ｂｏｃ基）、ベンジルカーバメート等が挙げられ、エステル結合により保護する基としては、例えば、アセチル基、ベンゾイル基等が挙げられ、アミド結合により保護する基としては、アセチルアミド基、ベンゾイルアミド基等が挙げられ、エーテル結合により保護する基としては、メトキシメチルエーテル基、ベンジルエーテル基等の基を挙げることができる。これらの基は、ラジカル重合性基を有する化合物との間で行われる反応の種類・条件等により適宜選択して行うことができる。
【００３０】
グラフト重合が可能なラジカル重合性基とアミノ基と反応し得る基とを有する化合物（Ｉ）として（メタ）アクリル酸を用いた場合、アミノ基を有する化合物（ＩＩ）との反応は、アミド化法を行えばよい。アミド化反応の方法は、例えば、活性エステルによるアミド化、縮合剤によるアミド化、これらの併用、混合酸無水物法、アジド法、酸化還元法、ＤＰＰＡ法、ウッドワード法など、ペプチド合成などで用いられている公知慣用のアミド化反応を適宜行えばよい。
【００３１】
活性エステルによるアミド化としては、例えば、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノール、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）、ＨＯＢＴ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）、ＨＯＡＴ（ヒドロキシアザベンゾトリアゾール）等を用いて、脱離能の高い基をカルボキシ基と一旦縮合させた活性エステルを形成させておき、これにアミノ基を反応させる方法が挙げられる。縮合剤によるアミド化は、それ単独で用いても良いが、上記活性エステルと併用することができる。縮合剤としては、ＥＤＣ（１−（３−ジメチルアミノプロピル−３−エチル−カルボジイミドヒドロクロライド）、ＨＯＮＢ（エンド−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキサミド）、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＴＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）、ＨＯＯＢｔ（３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン）、ジ−ｐ−トリオイルカルボジイミド、ＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）、ＢＤＰ（１−ベンゾトリアゾールジエチルホスフェート−１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニルエチル）カルボジイミド）、フッ化シアヌル、塩化シアヌル、ＴＦＦＨ（テトラメチルフルオロホルムアミジニウムヘキサフルオロホスホスフェート）、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホラジデート）、ＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシニミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）、ＨＡＴＵ（Ｎ−［（ジメチルアミノ）−１−Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５，６］−ピリジン−１−イルメチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウム・ヘキサフルオロホスフェート・Ｎ−オキシド）、ＢＯＰ−Ｃｌ（ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィンクロライド）、ＰｙＢＯＰ（（１−Ｈ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）−トリス（ピロリジノ）ホスホニウム・テトラフルオロホスフェート）、ＢｒＯＰ（ブロモトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート）、ＤＥＰＢＴ（３−（ジエトキシホスホリルオキシ）−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン）、ＰｙＢｒＯＰ（ブロモトリス（ピロリジノ）ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート）などが挙げられる。
【００３２】
このうち、（メタ）アクリル酸のカルボキシ基を一旦、ＮＨＳ化した後に、アミノ基を有する化合物（ＩＩ）のアミノ基と反応させアミド化する方法が好ましい。
【００３３】
これらのアミド化方法において利用できる溶媒としては、水及びペプチド合成に用いられる有機溶媒を使用することができ、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル等、更にはこれらの混合溶媒やこれらを含む水溶液が挙げられる。
【００３４】
カルボキシ基への活性化エステル残基導入割合は、用いる活性化剤の種類や、試薬の使用量に依存する。一般的に、溶液中での反応と比較し、重合性化合物から得られる重合体が結合されていることで、反応性が落ちる為、導入量を上げる為には反応試薬をかなり過剰量用いる必要があると考えられる。従って、中空糸に重合せしめた（メタ）アクリル酸のカルボキシ基に対する活性化剤と縮合剤反応試薬の量比は一概には規定できないが、カルボキシル基に活性エステル基を等量的に導入するためには、概ねモル比で、１から１０程度用いることが望ましい。さらに、反応試薬の過剰量を調整することで、活性エステル基の導入割合を０．０１から１００％の範囲で、任意に調整することが可能である。
【００３５】
ラジカル重合性基とアミノ基と反応し得る基とを有する化合物（Ｉ）として、グリシジル（メタ）アクリレートを用いた場合には、アミノ基を有する化合物（ＩＩ）の水酸基或いはアミノ基と、グリシジル基と反応させることにより結合することができる。
反応条件は、通常の水酸基若しくはアミノ基とグリシジル基の反応で使用される溶媒、反応温度、反応時間を挙げることができる。好ましい条件の一例として、水酸基若しくはアミノ基を有する化合物が溶液の場合には、直接使用しても良く、溶媒を使用する場合には、中空糸を溶解又は膨潤させない溶媒で、より好ましくは、中空糸を溶解及び膨潤せずにラジカル重合性基を有する化合物の重合物を溶解できる溶媒が使用でき、水酸基若しくはアミノ基を有する化合物の濃度は任意に選択することができ、好ましくは、重量濃度０．１〜５０％の濃度に調製して使用できる。
【００３６】
反応温度は、アミノ基を有する化合物（ＩＩ）や溶媒が気化しない温度から選択でき、好ましくは０〜７０℃、より好ましくは、２０〜６０℃である。反応時間は、アミノ基を有する化合物（ＩＩ）の種類、濃度、及び反応温度により異なるが、反応溶液中のアミノ基を有する化合物（ＩＩ）の含有量をガスクロマトグラフ、液体クロマトグラフ、滴定などでモニターしながら、アミノ基を有する化合物（ＩＩ）が消費されなくなるまで行うことが好ましい。一般的には、３０分から１２時間で完結することができるが、これらに限定されず、適宜反応条件を選択・設定することができる。
【００３７】
ラジカル重合性基とアミノ基と反応し得る基とを有する化合物（Ｉ）として、（メタ）アクリロイルオキシアルキルイソシアネートを用いた場合には、アミノ基を有する化合物（ＩＩ）の水酸基若しくはアミノ基と、ラジカル重合性基を有する化合物の有するイソシアネート基と反応させることにより結合することができる。
反応条件は、通常の水酸基若しくはアミノ基とイソシアネート基の反応で使用される溶媒、反応温度、反応時間を挙げることができる。好ましい条件の一例として、溶媒として、酢酸エチルやアセトニトリルなど、中空糸を溶解及び膨潤せず、イソシアネートと反応しない溶媒から適宜選択することができる。反応濃度は任意に選択することが可能であり、具体的には重量濃度で０．５〜１５％から選択することができる。反応温度はイソシアネートとの反応が発熱反応であることから、０〜５０℃が好ましい。反応時間は、２〜２４時間を挙げることができるが、これらに限定されず、適宜選択して反応条件を設定することができる。
【００３８】
また、上記の方法により導入されたアミノ基は、公知慣用の方法でアンモニウム塩とすることができる。
好ましいアンモニウム塩としては、ウイルスを捕捉する機能があれば特に制限はないが、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機塩類、ギ酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩等の有機塩類を挙げることができる。
【００３９】
水酸基を有する高分子材で中空糸を表面処理した後に、水酸基、及びアミノ基又はアンモニウム基と反応し得る基を有する化合物を介してアミノ基を有する化合物、又はアンモニウム基を有する化合物を固定化する方法は、以下が挙げられる。
【００４０】
本発明で使用が可能な水酸基を有する高分子材としては、例えば、エチレン−ビニルアルコール共重合体、エチレン−ビニルアルコール−酢酸ビニル共重合体、エチレン−酢酸ビニル共重合体の部分けん化物、ビニルアルコール−酢酸ビニル共重合体などのビニルアルコール共重合体を含んだもの、ヒドロキシメタクリレート共重合体を含んだもの、酢酸セルロースの部分けん化物又はグリセリン誘導体を例示することができる。ただし、例示したもの以外にも、水酸基を有する樹脂であれば特に制限はない。
【００４１】
水酸基を有する高分子材での表面処理は、公知慣用の方法で行うことができ、例えば多孔化されたポリオレフィンを、水酸基を有する高分子材を溶解させた溶液中に浸漬し、引き上げた後乾燥する等を好ましい方法として挙げることができる。中でもエチレン−ビニルアルコール共重合体は、特開昭６１−２７１００３などにもあるように、ポリオレフィン多孔中空糸を簡便に親水化することができる点で好ましい。もしくは、予めポリオレフィン等と水酸基を有する高分子材を混合させたものを多孔化する手法を用いることも可能である。
【００４２】
本発明で使用される水酸基、及びアミノ基又はアンモニウム基と反応し得る基を有する化合物は、表面処理された中空糸の表面に存在する水酸基と反応しえる基を有し、固定化後にアミノ基又はアンモニウム基と容易に反応する官能基などを有していれば特に制限はない。例えば、エピクロロヒドリン、カルボン酸無水物、ジカルボン酸、ジカルボン酸塩化物、ジイソシアネート、ジエポキシ化合物等の化合物が挙げられる。基材にグラフト重合できる化合物として、（メタ）アクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリロイルオキシアルキルイソシアネート、無水マレイン酸等が挙げられる。
【００４３】
中空糸の表面に存在する水酸基に、水酸基、及びアミノ基又はアンモニウム基と反応し得る基を有する化合物を反応させて固定化する場合は、例えば公知慣用の水酸基とエポキシ基との反応、水酸基とカルボキシ基との反応、水酸基とカルボン酸無水物との反応、水酸基とイソシアネートとの反応に用いる条件等で行うことができる。
また、エチレン性不飽和基を有する化合物をグラフト重合させる場合には、水酸基を有する高分子材にラジカルを生成させることによるグラフト重合反応により、（メタ）アクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリロイルオキシアルキルイソシアネート、又は無水マレイン酸等を固定化することが可能である。
ラジカルを生成させる方法としては、セルロースやポリビニルアルコール等の水酸基を有する高分子材のラジカル重合開始剤に広く用いられている硝酸二アンモニウムセリウム等の試薬を用いる方法を挙げることが出来る。
【００４４】
なお、水酸基、及びアミノ基又はアンモニウム基と反応し得る基を有する化合物を固定化する場合には、実施形態に応じて糸の内面、外面のどちらか又は両方に固定化することができる。例えば中空糸内表面に血液を灌流させる時は、中空糸内表面に水酸基、及びアミノ基又はアンモニウム基と反応し得る基を有する化合物を接触させて固定化すれば良く、逆に、外部灌流させる時には、中空糸外表面に水酸基、及びアミノ基又はアンモニウム基と反応し得る基を有する化合物を接触させれば良い。糸の細孔内も含めて内外表面に固定化したい場合は、糸を束ねて反応溶液に浸漬してもよいし、モジュールとして組み立ててから反応溶液を循環させる方法などが挙げられる。
【００４５】
本発明で使用されるアミノ基又はアンモニウム基を有する化合物は、水酸基、及びアミノ基又はアンモニウム基と反応し得る基を有する化合物と反応し得るものであれば特に制限はない。このような化合物としては、例えば、ポリアリルアミン、アンモニア、２−アミノエタノール、エチレンジアミン、ブチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、１，２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン、３，３’−ジアミノジプロピルアミン、ジエチレントリアミン、フェニレンジアミン又はポリエチレンイミン等のアミン類又はそのアンモニウム塩を挙げることができる。
【００４６】
アミノ基又はアンモニウム基を有する化合物と水酸基、及びアミノ基又はアンモニウム基と反応し得る基を有する化合物との反応は、公知慣用のアミノ基又はアンモニウム基とエポキシ基との反応、アミノ基又はアンモニウム基とカルボキシ基との反応、アミノ基又はアンモニウム基とカルボン酸無水物との反応、アミノ基又はアンモニウム基とイソシアネートとの反応に用いる条件で適宜行うことができる。
【００４７】
・・硫酸化糖の導入
本発明のスルホニウム基を有する化合物、又はスルホ基を有する化合物として、硫酸化糖を用いることができる。このような本発明に用いられる硫酸化糖として、ヘパリン、ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体、デキストラン硫酸、又はフコイダン等のスルホニウム基、又はスルホ基を有する硫酸化糖等を挙げることができる。
本発明で使用されるヘパリンは通常公知のものを制限なく使用することができる。ヘパリンは、小腸、筋肉、肺、脾や肥満細胞など体内で幅広く存在し、化学的にはグリコサミノグリカンであるヘパラン硫酸の一種であり、β−Ｄ−グルクロン酸、或いはα−Ｌ−イズロン酸とＤ−グルコサミンが１，４−結合により重合した高分子であって、ヘパラン硫酸と比べて硫酸化の度合いが特に高いという特徴を有する。ヘパリンの平均分子量についても特に制限はないが、平均分子量が大きい場合には水酸基若しくはアミノ基を有する化合物との反応性が低くなる為、ヘパリンの固定化の効率が悪いと考えられる。従って、ヘパリンの分子量は、概ね、５００から５００，０００ダルトン、より好ましくは１,２００から５０，０００ダルトン、更に好ましくは５，０００〜２０，０００ダルトンであることが好ましい。
【００４８】
ヘパリンの他に使用できる硫酸化糖としては、上記ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体又は該ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体が例示される。硫酸エステル化は通常公知の方法で行うことができる。
【００４９】
ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体を合成する場合には、例えば、ヘパリンのアルカリ塩類をイオン交換樹脂（Ｈ＋）等に通じ、アミン類と処理することによりヘパリンアミン塩を調整する。その後に、硫酸化剤で処理して目的とするヘパリン誘導体とすることができる。硫酸化剤としては、公知慣用のＳＯ３・ピリジン等が好ましい。
【００５０】
また、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体を合成する場合には、例えば、ヘパリンＮ−アセチル基をヒドラジン等で脱アセチル化した後に、硫酸化剤で処理して目的とするヘパリン誘導体とすることができる。硫酸化剤としては、公知慣用のＳＯ３・ＮＭｅ３等が好ましい。
また、デキストラン硫酸又はフコイダンは、公知慣用のものを用いることができる。
【００５１】
ここで、ラジカル重合性基とアミノ基と反応し得る基を有する化合物（Ｉ）をグラフト重合反応に供してから、アミノ基を有する化合物（ＩＩ）又はアンモニアと反応させた後に硫酸化糖を固定化させても良いし、ラジカル重合性基とアミノ基と反応し得る基を有する化合物（Ｉ）とアミノ基を有する化合物（ＩＩ）又はアンモニアを反応させた後に、グラフト重合反応を行い、硫酸化糖を固定化させてもよい。本発明の硫酸化糖とアミノ基を有する化合物（ＩＩ）との結合は、例えば上記アミド化反応により行うことができる。
【００５２】
本発明で用いられる中空糸の平均孔径は、ウイルスを効率的に除去させうる孔径のものであれば、特に制限はない。ウイルスの捕捉効率を考慮して、捕捉するウイルスの種類により異なり、適宜選択して使用することができるが、例えば、平均流量孔径として５０〜５００ｎｍの範囲であることが好ましい。
用いられる多孔性中空糸の内径は、ウイルスを効率的に除去させうる内径のものであれば、特に制限はない。内径が大きい場合は、モジュールに入れられる糸の本数が少なくなるため、接触面積が減少してしまうことや線速が劣って被験物質（環境水等）が滞留してしまう恐れがある。一方、内径が小さくなりすぎる場合は、血球成分が詰まりやすくなることが考えられる。それらの点を考慮した場合、内径は１５０〜５００μｍが好ましく、さらに好ましく１６０〜４００μｍ、さらに好ましくは１７０〜３５０μｍとなる。
【００５３】
用いられる多孔性中空糸の膜厚は、上記のウイルスを効率的に除去させうる膜厚のものであれば、特に制限はない。好ましい膜厚としては、３０〜１００μｍ、さらに好ましくは３５〜８０μｍ、さらに好ましくは４０〜６０μｍを挙げることができる。
また、本発明の中空糸の表面処理に用いられる化合物の固定化量は、ウイルスを効率的に除去させうる量であれば、特に制限はない。ウイルスの捕捉効率を考慮して、捕捉するウイルスの種類により異なり、適宜選択して使用することができるが、好ましい固定化量としては、例えば、ポリオレフィンを基材とする中空糸の場合、１×１０−６〜１×１０−２ｍｏｌ／ｇである場合を挙げることができる。
【００５４】
また、本発明の中空糸の表面処理に用いられる化合物の水蒸気吸着量は、ウイルスを効率的に除去させうる量であれば、特に制限はない。ウイルスの捕捉効率を考慮して、捕捉するウイルスの種類により異なり、適宜選択して使用することができるが、好ましい水蒸気吸着量は、１〜１００ｍＬ／ｇの場合を挙げることができる。ここで、水蒸気吸着量は、公知慣用の方法で測定することができる。
【００５５】
以下にその一例を示す。
粉砕した中空糸試料５０ｍｇを精秤し、試験管内に入れ室温で５時間減圧乾燥させた。その後ガス吸着量測定装置（ＢＥＬＳＯＲＰ−ｍａｘ、日本ベル(株)製）を用いて、水蒸気分子をプローブとした吸着等温線を測定を行い、相対圧０．５における水蒸気吸着量を比較することで試料の親水性を評価した。
【００５６】
・捕捉されたウイルスの回収
本発明では、中空糸に捕捉されたウイルスを回収し、その量を算定して、もとのウイルスを含む液中に含まれるウイルスの量を評価することに特徴を有する。
【００５７】
ウイルスを回収する方法は、効率よくウイルスを回収することのできる方法であれば、特に制限はないが、フェノール水溶液、アルカリ性水溶液、無機塩水溶液（無機塩の水溶液）で、中空糸を洗浄する方法が、特に好ましい。
【００５８】
フェノール水溶液は、フェノールと水の混合溶液であり、該溶液中に含まれるフェノールの含有量は適宜調整して使用することができるが、フェノール／水＝４／１〜２／３(質量換算)を好ましい質量比として挙げることができる。
【００５９】
また、アルカリ性水溶液は、アルカリ性を呈する水溶液であれば、制限なく使用することが可能であるが、ウイルスの回収率が良好であることから、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物の水溶液、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等の炭酸塩類等を挙げることができる。無機塩水溶液は、塩化ナトリウム水溶液を挙げることができる。
【００６０】
ウイルスを回収する方法は、前記フェノール水溶液、アルカリ性水溶液、ビーフエキス等有機高分子水溶液、又は無機塩水溶液を単独で、或いは併用して、ウイルスが捕捉された中空糸を洗浄することにより行うことができる。洗浄方法は、中空糸からウイルスを溶出できる方法であれば特に制限されるものではないが、好ましくは、中空糸の浸漬や中空糸モジュール中であれば通液により行うことができる。
【００６１】
以下、本発明のキット及び評価方法について説明する。
・キットの形態
本発明の中空糸を備えてなる評価キットの形態としては、前記用途に適用可能な形状であれば特に限定されるものではないが、例えば中空糸モジュールが挙げられる。中空糸モジュールにおいて、容器の形状及び材質は特に限定されず、使用するウイルスを含む液の量や性状にあわせて都合のよい大きさ、形状、材質とすればよい。
【００６２】
・評価対象ウイルス
本発明で対象とするウイルスは、本発明の中空糸で捕捉が可能なウイルスである。このようなウイルスとしては、例えばＡ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ノロウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ロタウイルス、又はポリオウイルス等を挙げることができる。
【００６３】
・評価対象液
本発明で対象とするウイルスを含む液は、例えば、ウイルスを含み得る環境水、ヒトの体内液体成分である体液、ウイルスを含んだ培養液、生活用水等を挙げることができる。体液のより具体的な例としては、血液、唾液、汗、尿、鼻水、精液、血漿、リンパ液、組織液等を挙げることができる。環境水の具体的な例としては、河川水、湖沼水、地下水、海水等が挙げられる。生活用水としては、水道水、井戸水、温泉、プール水等が挙げられる。
【００６４】
・評価方法
本発明のウイルス濃度の評価は、「ウイルスを含む液の採取」→「ウイルスの捕捉」→（「ウイルスの遊離」→「不要物の除去」→）「ウイルス量の算出」の各工程を経て行う。
ウイルスの捕捉は、表面処理した中空糸にウイルスを含む液を通じることにより、又は接触させることにより行うことができる。該工程において、中空糸として非濾過型中空糸用いたり、通液又は接触させる際の圧力を低く抑えることにより目詰まりを軽減することができる。
ウイルスを捕捉した後、ウイルス量を算出するに先立ち、ウイルスを中空糸から遊離させる工程を加えてもよい。遊離工程の手法としては、例えば塩、酸、アルカリ、あるいは界面活性剤等で処理する方法が挙げられる。更にその後、遊離工程で加えた物質を除去する工程を追加してもよい。
【００６５】
ウイルス量を算出する方法は、上記ウイルスの検出が可能な方法であれば特に制限はないが、好ましい方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、抗原抗体反応法（エンベロープタンパク質検出法、コアタンパク質検出法）、培養法等を挙げることができる。これらのうち、ＰＣＲ法は核酸を増幅するための原理またはそれを用いた手法で、次の様な優れた特徴を有する。
１）非常に長大な核酸分子の中から、自分の望んだ特定の核酸断片（数十から数千塩基対）だけを選択的に増幅させることができ、且つ微量な核酸溶液で目的を達成できる。
２）増幅に要する時間が２時間程度と短い。
３）プロセスが単純で、全自動の卓上用装置で増幅できる。
【００６６】
より具体的には、ウイルスを含む液（Ａ液）から、一定量の液（Ｂ液）を採取し、下記実施例に示す方法にて、Ｂ液中のウイルスを捕捉し、捕捉率（Ｘ％）を算出する。その後、捕捉したウイルスを下記実施例で示す方法で、回収を行い、回収率（Ｙ％）を算出する。
さらに、Ａ液中のウイルスの濃度（例えば、ウイルスコピー数／Ｌ）を算出するには、例えば以下の式を用いて計算を行えばよい。
ここで、希釈倍率は、Ａ液からＢ液を作製する場合の、希釈倍率を示す。
Ａ液中のウイルスの濃度（個／Ｌ）＝算出したＢ液中のウイルスコピー数（個／Ｌ）／｛回収率（％）×捕捉率（％）｝×希釈倍率
ここで、ウイルスコピー数とはＰＣＲ法にて測定・算出される検体中のウイルス量を表す。
【実施例】
【００６７】
以下の実施例により本発明を更に詳細に説明する。【００６８】
（調製例１）＜ヘパリン表面処理中空糸モジュールの作製＞
試験管にアセトン２０ｍＬ、エピクロロヒドリン１６ｍＬ、４０％ＮａＯＨ水溶液４ｍＬを入れ、そこへエチレン・ビニルアルコール共重合体（以下、ＥＶＯＨとする）によって親水化処理された濾過型中空糸（約１３ｃｍ、約１５０本、３５１ｍｇ）を浸漬した。超音波をかけながら、３０〜４０℃で５時間反応させた。反応終了後、アセトンと水で洗浄し、真空乾燥してエポキシ基が導入された中空糸を得た（３５４ｍｇ）。【００６９】
２８％アンモニア水にエポキシ基を導入した中空糸を浸漬し、４０℃で２時間反応させた。反応終了後は水で洗浄し、１級アミノ基が導入された中空糸を得た。【００７０】
試験管にヘパリン１５０ｍｇとシアノ水素化ホウ素ナトリウム２０ｍｇを入れ、ＰＢＳ３０ｍＬに溶解し、前記中空糸を浸漬して、４０℃で３日間反応させた。反応終了後、水で洗浄した。該中空糸に０．２Ｍ ＡｃＯＮａ水溶液２６ｍＬを加え、氷冷しながら無水酢酸１３ｍＬをゆっくり滴下した。続いて氷冷下、超音波で３０分反応させた。更に、室温に戻しながら３０分間反応させた。反応終了後、２０％ＮａＣｌ、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３水溶液、水、ＰＢＳで洗浄し、ヘパリン表面処理中空糸を得た。【００７１】
該ヘパリン表面処理中空糸（１３ｃｍ×３本）を用いて、少量サンプル用モジュール（内径３ｍｍ、外径５ｍｍ、長さ７．４ｍｍ）を作製した。【００７２】
（実施例１）＜Ｂ型肝炎ウイルス様粒子の捕捉＞
Ｂ型肝炎ウイルス様粒子（Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原ＨＢｓＡｇ−ＸＴ、株式会社ビークル製）を０．１ｎｇ／ｍＬの濃度で含む０．００２％ＢＳＡ−ＰＢＳ  ８０ｍＬを調製例２で作製した少量サンプル用モジュールに通液し、濾液画分４２ｍＬと素通り画分３８ｍＬを回収した。各画分のＢ型肝炎ウイルス様粒子濃度をマイクロウェルＥＬＩＳＡ  ＨＢｓＡｇ  Ｂ型肝炎表面抗原用（ＨＯＰＥ研究所製）を使用し測定した。その結果、モジュール内の中空糸に５７％のＢ型肝炎ウイルス様粒子が捕捉されていることが確認された。【００７３】
（調製例２）＜ポリアクリル酸表面処理中空糸モジュールの作製＞
アクリル酸モノマー１ｇを水１００ｇに溶解して１質量％水溶液とし、撹拌しながら減圧することで水溶液中の溶存酸素を除去した。【００７４】
一方、ポリ−４−メチルペンテン（以下ＰＭＰとする）製の非濾過型中空糸束（中空糸表面積：２００ｃｍ２、ＤＩＣ（株）製）をガラス製試験管に入れ、ゴム栓にて密閉し、試験管内部を窒素置換した。その後、ＲＤＩ社製の電子線照射装置「ダイナミトロン５ＭｅＶ―１５０ｋＷ」にて４．８ＭｅＶの加速エネルギーで９０ｋＧｙの電子線を照射した。【００７５】
次に、電子線を照射した中空糸束入り試験管内を真空にし、２３℃条件下、脱酸素したアクリル酸モノマー水溶液を加えてグラフト重合を開始した。４時間静置後、中空糸束を取り出し、未反応のモノマー等がＧＰＣ測定で検出限界（１μｇ／ｍＬ）以下になるまで水洗を繰り返した後、真空乾燥した。得られたポリアクリル酸表面処理中空糸におけるポリアクリル酸の結合量は２５ｍｇ、結合密度（モノマー換算）は１．７×１０−６ｍｏｌ／ｃｍ２（１．０×１０−３ｍｏｌ／ｇ）であった。【００７６】
（調製例３）＜ポリエチレンイミン表面処理中空糸モジュールの作製＞
ＰＭＰ製の中空糸束（中空糸表面積：２００ｃｍ２、ＤＩＣ（株）製）をガラス製試験管に入れ、ゴム栓にて密閉し、試験管内部を窒素置換してから、ＲＤＩ社製の電子線照射装置「ダイナミトロン５ＭｅＶ―１５０ｋＷ」にて４．８ＭｅＶの加速エネルギーで９０ｋＧｙの電子線を照射した。【００７７】
次に、脱酸素した５０ｍｇ/ｍＬのグリシジルメタクリレート（以下、ＧＭＡとする）メタノール溶液を前記試験管に注入し、２３℃で所定時間静置して反応させた。中空糸束を取り出し、メタノールで洗浄、真空乾燥してポリＧＭＡ表面処理中空糸を得た。中空糸の重量増加から算出したポリＧＭＡの導入量は中空糸１ｃｍ２あたり０．１９０ｍｇであった。
該ポリＧＭＡ表面処理中空糸を、３０質量％のポリエチレンイミン（分子量６００、和光純薬製）アセトニトリル溶液に浸漬し、６０℃で３時間加熱後、メタノールで洗浄、真空乾燥し、表面処理中空糸を得た。ポリエチレンイミンの導入量は、中空糸１ｃｍ２あたり８．５８μｇ（８．５×１０−６ｍｏｌ／ｇ）であった。【００７８】
（調製例４）＜ポリエチレンイミン（分子量６００）表面処理中空糸の作製＞
一方、ＰＭＰ製の中空糸束（中空糸表面積：２００ｃｍ２、ＤＩＣ（株）製）をガラス製試験管に入れ、ゴム栓にて密閉し、試験管内部を窒素置換した。その後、ドライアイスにて冷却しながら４．８ＭｅＶの加速エネルギーで９０ｋＧｙの電子線を照射した。【００７９】
次に、電子線を照射した中空糸束入り試験管内を真空にし、２３℃条件下、脱酸素した５０ｍｇ／ｍＬのＧＭＡ／メタノール溶液を前記試験管に加えてグラフト重合を開始した。３時間静置後、中空糸束を取り出し、酢酸エチル及びメタノールにて洗浄、真空乾燥してポリＧＭＡ表面処理中空糸を得た。中空糸の重量増加から算出したポリＧＭＡの導入量は中空糸１ｃｍ２あたり約４．０ｍｇ（１．７×１０−２ｍｏｌ／ｇ）であった。【００８０】
該ポリＧＭＡ表面処理中空糸を、３０質量％のポリエチレンイミン（分子量６００、和光純薬製）アセトニトリル溶液に浸漬し、６０℃で３時間加熱後、メタノール及びアセトニトリルにて洗浄、真空乾燥し、ポリエチレンイミン表面処理中空糸を得た。ポリエチレンイミンの導入量は、中空糸１ｃｍ２あたり約１．０ｍｇ（１．０×１０−３ｍｏｌ／ｇ）であった。【００８１】
（実施例２）＜ポリエチレンイミン（分子量６００）表面処理中空糸のＨＥＶ捕捉＞
ブタ肝臓由来Ｅ型肝炎ウイルス（以下ＨＥＶとする）を、ＤＭＥＭ（和光純薬製）と１９９培地（ライフテクノロジーズ製）を１：１に混合しウシ胎児血清２％を添加した培地にて、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（ヒト肝癌由来細胞）細胞に感染、増殖させたＨＥＶ培養液を調製した。リアルタイム逆転写ＰＣＲ（以下、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲとする）測定した結果、培養液中のＨＥＶは２×１０５コピー数／μＬであった。【００８２】
調製例４にて作製した中空糸５ｃｍ２を切り出し、ＰＢＳ（−）１ｍＬに１６時間浸漬後、更にＰＢＳ（−）にて２回洗浄して試験に供した。これを１．５ｍＬ容量マイクロチューブに移し、希釈した前記ウイルス液１ｍＬを加えて室温にて１時間往復振盪した。その後上清を回収し、上清中のＨＥＶ−ＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製、４０％フェノール水溶液）で抽出し、クロロホルム及びイソプロパノールにて単離した。単離したＨＥＶ−ＲＮＡをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて測定した。その結果、中空糸に７４％のＨＥＶが捕捉されていることが確認された。【００８３】
更に、該中空糸を回収しＰＢＳ（−）にて３回洗浄した後、中空糸から直接ＨＥＶ−ＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ、クロロホルム及びイソプロパノールにて単離した。単離したＨＥＶ−ＲＮＡをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて測定した。その結果、捕捉されたＨＥＶの４２％が回収された事を確認した。【００８４】
（実施例３）＜ポリエチレンイミン（分子量１，８００）表面処理中空糸の作製＞
調製例４と同様の操作により、ポリＧＭＡ表面処理中空糸を得た。その後ポリエチレンイミン（分子量１，８００、和光純薬製）を用いて調製例４と同様の操作にてポリエチレンイミン表面処理中空糸を得た。ポリエチレンイミンの導入量は、中空糸１ｃｍ２あたり約０．９ｍｇ（２．９×１０−４ｍｏｌ／ｇ）であった。該中空糸を実施例２と同様にＨＥＶ捕捉試験に供した。その結果、中空糸に７６％のＨＥＶが捕捉されていることが確認された。実施例２と同様に捕捉されたウイルスを回収・単離した。(回収率：２２％)【００８５】
（実施例４）＜アクリル酸表面処理中空糸のＨＥＶ捕捉＞
調製例２で作製したアクリル酸表面中空糸を実施例２と同様にＨＥＶ捕捉試験に供した。その結果、中空糸に３０％のＨＥＶが捕捉されていることが確認された。【００８６】
（調製例５）＜ポリエチレンイミン（分子量  １，８００）固定化中空糸の作製＞
特開平２−０２９２６０に従い、試験管にアセトン２６ｍＬ、エピクロロヒドリン２１ｍＬ、４０％ＮａＯＨ水溶液５ｍＬを入れ、そこへ内径２８７μｍ、膜厚５２μｍ、平均孔径１０２ｎｍのＥＶＯＨ親水化処理ポリエチレン製多孔性中空糸を浸漬した。超音波をかけながら、３０〜４０℃で５時間反応させた。反応終了後、アセトンと水で洗浄し、エポキシ基が導入された中空糸を得た。導入されたエポキシ基量は、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液を用い、ＮａＯＨで滴定を行った結果、約０．０１μｍｏｌ／ｃｍ２（４．８×１０−６ｍｏｌ／ｇ）導入されている事が確認された。【００８７】
次に、３．２質量％ポリエチレンイミン（分子量  １，８００  和光純薬製）水溶液にエポキシ基を導入した中空糸を浸漬し、４０℃で３日間反応させた。反応終了後は水で洗浄し、ポリエチレンイミンが導入された中空糸を得た。固定化量を測定したところ、約２７μｇ／ｃｍ２（７．１×１０−６ｍｏｌ／ｇ）導入されていることが確認された。【００８８】
（実施例５）＜ポリエチレンイミン（分子量  １，８００）のＨＥＶ捕捉・回収試験＞
上記で作製した中空糸を実施例１と同様にＨＥＶ捕捉試験に供した。その結果、中空糸に９５％のＨＥＶが捕捉されていることが確認された。【００８９】
次に、中空糸を回収し、ＰＢＳ（−）にて３回洗浄し、１０ｍＭ  ＮａＯＨ水溶液に浸漬して上清を回収、１００ｍＭ ＨＣｌ水溶液を１／１０量加えて中和し、ＨＥＶ−ＲＮＡを単離・リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて測定した。その結果、捕捉された中空糸よりＨＥＶを１００％回収できることが分かった。
次に、一定量の液（Ｂ液）に相当する本実施例で用いた液中に含まれるウイルスの濃度は、６．８４×１０７コピー数／ｍＬ×１００／９５＝７．２×１０７コピー数／ｍＬと算出された。更にウイルス液（Ａ液）からＢ液採取時の希釈倍率は２．８倍であったことから、本実施例で用いたウイルス液（Ａ液）中に含まれるウイルス濃度は７．２×１０７コピー数／ｍＬ×２．８＝２．０×１０８コピー数／ｍＬであると算出された。【００９０】
（実施例６）
＜ポリエチレンイミン（分子量  １０，０００）固定化中空糸のＨＥＶ捕捉・回収試験＞
ポリエチレンイミン（分子量  １０，０００  和光純薬製）を用いた以外は、実施例４と同様の操作を行い、ポリエチレンイミン（分子量１０，０００）が導入された中空糸を得た。固定化量を測定したところ、約６７μｇ／ｃｍ２（３．２×１０−６ｍｏｌ／ｇ）導入されていることが分かった。【００９１】
上記で作製した中空糸を調製例３と同様にＨＥＶ捕捉試験に供した。その結果、中空糸に９６％のＨＥＶが捕捉されていることが確認された。【００９２】
次に、中空糸を回収し、ＰＢＳ（−）にて３回洗浄し、１０ｍＭ  ＮａＯＨ水溶液に浸漬して上清を回収、１００ｍＭ ＨＣｌ水溶液を１／１０量加えて中和し、ＩＳＯＧＥＮを用いてＨＥＶ−ＲＮＡを単離・リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて測定した。その結果、捕捉された中空糸よりＨＥＶを１２％回収できることが分かった。【００９３】
次に、一定量の液（Ｂ液）に相当する本実施例で用いた液中に含まれるウイルスの濃度は、８．２３×１０７コピー数／ｍＬ／（０．９６×０．１２）＝７．２×１０７コピー数／ｍＬと算出された。更にウイルス液（Ａ液）からＢ液採取時の希釈倍率は２．８倍であったことから、本実施例で用いたウイルス液（Ａ液）中に含まれるウイルス濃度は７．２×１０７コピー数／ｍＬ×２．８＝２．０×１０８コピー数／ｍＬであると算出された。【００９４】
更に、上記中空糸をＰＢＳ（−）にて３回洗浄し、中空糸から直接ＨＥＶ−ＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ、クロロホルム及びイソプロパノールにて単離した。単離したＨＥＶ−ＲＮＡをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて測定した。その結果、捕捉されたＨＥＶの８８％が回収された事を確認した。
次に、一定量の液（Ｂ液）に相当する本実施例で用いた液中に含まれるウイルスの濃度は、６．０８×１０７コピー数／ｍＬ／（０．９６×０．８８）＝７．２×１０７コピー数／ｍＬと算出された。更にウイルス液（Ａ液）からＢ液採取時の希釈倍率は２．８倍であったことから、本実施例で用いたウイルス液（Ａ液）中に含まれるウイルス濃度は７．２×１０７コピー数／ｍＬ×２．８＝２．０×１０８コピー数／ｍＬであると算出された。【００９５】
（実施例７）
＜フェニルアラニン固定化中空糸のＨＥＶ捕捉・溶出・回収試験＞
ポリエチレンイミンの代わりに３．０質量％フェニルアラニン／０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液を用いた以外は、調製例５と同様の操作を行い、フェニルアラニンが導入された中空糸を得た。固定化量を測定したところ、約７μｇ／ｃｍ２（１．１×１０−５ｍｏｌ／ｇ）導入されていることが分かった。該中空糸を実施例２と同様にＨＥＶ捕捉試験に供した。その結果、中空糸に４１％のＨＥＶが捕捉されていることが確認された。実施例２と同様に捕捉されたウイルスを回収・単離した。(回収率：１３％)【００９６】
（実施例８）
＜セチルアミン固定化中空糸のＨＥＶ捕捉・溶出・回収試験＞
ポリエチレンイミンの代わりに１０質量％セチルアミン（Ｃ１６−ＮＨ２  東京化成製）／エタノール溶液を用いた以外は、調製例３と同様の操作を行い、フェニルアラニンが導入された中空糸を得た。固定化量を測定したところ、約１６μｇ／ｃｍ２（３．３×１０−５ｍｏｌ／ｇ）導入されていることが確認された。該中空糸を実施例２と同様にＨＥＶ捕捉試験に供した。その結果、中空糸に５８％のＨＥＶが捕捉されていることが確認された。【００９７】
次に中空糸を回収し、ＰＢＳ（−）にて３回洗浄した後、中空糸から直接ＨＥＶ−ＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ、クロロホルム及びイソプロパノールにて単離した。単離したＨＥＶ−ＲＮＡをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて測定した。その結果、捕捉されたＨＥＶの８０％が回収された事を確認した。【００９８】
（実施例９）＜ポリエチレンイミン（分子量  １，８００）のＨＡＶ捕捉・回収試験＞
Ａ型肝炎ウイルス（以下ＨＡＶとする）を、終濃度０．１５％となるよう重曹を添加したＥａｇｌｅ‘ｓ  ＭＥＭ（和光純薬製）にウシ胎児血清２％（終濃度）を添加した培地にて、ＧＬ３７（アフリカミドリザル腎臓由来培養細胞）細胞に感染、増殖させウイルス培養液を調製した。更に細胞を破砕してショ糖密度勾配遠心分離により精製したＨＡＶ液を調製した。ＲＴ−ＰＣＲ測定した結果、培養液中のＨＡＶ量は２．０×１０６コピー数／μＬであった。【００９９】
調製例５にて作製した中空糸５ｃｍ２を切り出し、ＰＢＳ（−）１ｍＬに１６時間浸漬後、更にＰＢＳ（−）にて２回洗浄して試験に供した。これを１．５ｍＬ容量マイクロチューブに移し、希釈した前記ウイルス液１ｍＬを加えて室温にて１時間往復振盪した。その後上清を回収し、上清中のＨＡＶ−ＲＮＡをＩＳＯＧＥＮで抽出し、クロロホルム及びイソプロパノールにて単離した。単離したＨＡＶ−ＲＮＡをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて測定した。その結果、中空糸に８８％のＨＥＶが捕捉されていることが確認された。【０１００】
次に、中空糸を回収し、ＰＢＳ（−）にて３回洗浄し、１０ｍＭ  ＮａＯＨ水溶液に浸漬して上清を回収、１００ｍＭ ＨＣｌ水溶液を１／１０量加えて中和し、ＩＳＯＧＥＮを用いてＨＡＶ−ＲＮＡを単離・リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて測定した。その結果、捕捉された中空糸よりＨＥＶを６６％回収できることが分かった。【０１０１】
一定量の液（Ｂ液）に相当する本実施例で用いた液中に含まれるウイルスの濃度は、１．１４×１０８コピー数／ｍＬ／（０．８８×０．６６）＝１．９×１０８コピー数／ｍＬと算出された。更にウイルス液（Ａ液）からＢ液採取時の希釈倍率は１０倍であったことから、本実施例で用いたウイルス液（Ａ液）中に含まれるウイルス濃度は１．９×１０８コピー数／ｍＬ×１０＝２．０×１０９コピー数／ｍＬであると算出された。【０１０２】
更に、上記中空糸をＰＢＳ（−）にて３回洗浄し、中空糸から直接ＨＡＶ−ＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ、クロロホルム及びイソプロパノールにて単離した。単離したＨＡＶ−ＲＮＡをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて測定した。その結果、捕捉されたＨＡＶの３４％が回収された事を確認した。【０１０３】
一定量の液（Ｂ液）に相当する本実施例で用いた液中に含まれるウイルスの濃度は、５．９×１０７コピー数／ｍＬ／（０．８８×０．３４）＝１．９×１０８コピー数／ｍＬと算出された。更にウイルス液（Ａ液）からＢ液採取時の希釈倍率は１０倍であったことから、本実施例で用いたウイルス液（Ａ液）中に含まれるウイルス濃度は１．９×１０７コピー数／ｍＬ×１０＝１．９×１０９コピー数／ｍＬであると算出された。【０１０４】
（比較例１）＜ポリ−４−メチルペンテン製中空糸のＨＥＶ捕捉・溶出・回収試験＞
ポリＧＭＡ導入済みポリ−４−メチルペンテン製中空糸を実施例１と同様にＨＥＶ捕捉試験に供した。その結果、中空糸にはＨＥＶが全く捕捉されていなかった。【０１０５】
（比較例２）＜ポリエチレン製中空糸のＨＥＶ捕捉・回収試験＞
エポキシ基導入ＥＶＯＨ親水化処理ポリエチレン製多孔性中空糸を実施例１と同様にＨＥＶ捕捉試験に供した。その結果、中空糸にはＨＥＶが全く捕捉されていなかった。【０１０６】
各種基材とリガンド、及びウイルス捕捉能、回収性能を表１に示した。
実施例６において、水酸化ナトリウム水溶液を用いた回収結果（NaOH水溶液回収）、及びフェノール水溶液を用いた回収結果（フェノール水溶液回収）を示した。【０１０７】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明の評価方法及びキットは、環境水、体液、生活用水等におけるウイルス汚染の評価に利用可能である。
【手続補正書】
【提出日】平成25年4月22日(2013.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電荷を有する化合物、或いは電荷を有しない化合物で表面処理された中空糸にウイルスを含む液を通じて、或いは接触させてウイルスを捕捉し、捕捉したウイルスの量を算出することにより前記ウイルスを含む液中に含まれるウイルスの濃度を評価する方法であって、
電荷を有する化合物が、（メタ）アクリル酸塩、スルホン酸塩、アンモニウム基を有する化合物、スルホニウム基を有する化合物、カルボキシレート基を有する化合物、又はホスフェート基を有する化合物であり、
電荷を有しない化合物が、（メタ）アクリル酸、スルホン酸、アミノ基を有する化合物、スルホ基を有する化合物、カルボキシ基を有する化合物、又はホスホ基を有する化合物であり、
且つ以下の各工程を有することを特徴とするウイルスの濃度を評価する方法。
１）ウイルスを含む液（Ａ液）から一定量の液（Ｂ液）を採取する第一工程
２）Ｂ液を、前記中空糸に通じて、ウイルスを中空糸に捕捉させる第二工程
３）前記中空糸に捕捉されたＢ液中のウイルスの量を算出する第三工程
【請求項２】
アンモニウム基を有する化合物又はアミノ基を有する化合物が、水酸基を有する高分子材で表面処理された中空糸に、水酸基、及びアミノ基又はアンモニウム基と反応し得る基を有する化合物を介して前記アミノ基を有する化合物、又はアンモニウム基を有する化合物が固定化されたことを特徴とする請求項１に記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項３】
アミノ基又はアンモニウム基と反応し得る基を有する化合物が、エピクロロヒドリン、又はジエポキシ化合物である請求項２に記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項４】
中空糸が、ポリオレフィン、ポリエーテルスルホン、又はセルロース混合エステルから構成されるものである請求項１〜３の何れかに記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項５】
中空糸が多孔性中空糸である、請求項１〜４の何れかに記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項６】
ポリオレフィンが、ポリエチレン、ポリプロピレン又はポリ−４−メチルペンテンである請求項４又は５に記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項７】
スルホニウム基又はスルホ基を有する化合物が硫酸化糖である請求項１〜６の何れかに記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項８】
硫酸化糖が、ヘパリン、ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体、デキストラン硫酸、又はフコイダンである請求項７に記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項９】
ウイルスの量を算出する方法が、ポリメラーゼ連鎖反応によるもの、抗原抗体反応によるもの、又は培養法によるものである請求項１〜８の何れかに記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項１０】
ウイルスが、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ノロウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ロタウイルス、又はポリオウイルスである請求項１〜９の何れかに記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項１１】
前記３）前記中空糸に捕捉されたＢ液中のウイルスの量を算出する第三工程において、
ウイルスを捕捉させた中空糸から、フェノール水溶液、アルカリ性水溶液、又は無機塩水溶液によりウイルスを回収する工程を有する、請求項１〜１０の何れかに記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れかに記載の方法によりウイルスの濃度を評価する機能を備えたウイルス濃度評価キット。
【手続補正書】
【提出日】平成25年8月16日(2013.8.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電荷を有する化合物、或いは電荷を有しない化合物で表面処理された中空糸にウイルスを含む液を通じて、或いは接触させてウイルスを捕捉し、捕捉したウイルスの量を算出することにより前記ウイルスを含む液中に含まれるウイルスの濃度を評価する方法であって、電荷を有する化合物が、（メタ）アクリル酸塩、スルホン酸塩、アンモニウム基を有する化合物、スルホニウム基を有する化合物、カルボキシレート基を有する化合物、又はホスフェート基を有する化合物であり、電荷を有しない化合物が、（メタ）アクリル酸、スルホン酸、アミノ基を有する化合物、スルホ基を有する化合物、カルボキシ基を有する化合物、又はホスホ基を有する化合物であり、且つ以下の各工程を有することを特徴とするウイルスの濃度を評価する方法。
１）ウイルスを含む液（Ａ液）から一定量の液（Ｂ液）を採取する第一工程
２）Ｂ液を、前記中空糸に通じて、ウイルスを中空糸に捕捉させる第二工程
３）前記ウイルスを捕捉させた中空糸から、フェノール水溶液によりウイルスを回収し、Ｂ液中のウイルスの量を算出する第三工程
【請求項２】
電荷を有しない化合物で表面処理された中空糸にウイルスを含む液を通じて、或いは接触させてウイルスを捕捉し、捕捉したウイルスの量を算出することにより前記ウイルスを含む液中に含まれるウイルスの濃度を評価する方法であって、
電荷を有しない化合物が中空糸に対する固定化量が１−１００μｇ／ｃｍ２であるポリエチレンイミンであり、且つ以下の各工程を有することを特徴とするウイルスの濃度を評価する方法。
１）ウイルスを含む液（Ａ液）から一定量の液（Ｂ液）を採取する第一工程
２）Ｂ液を、前記中空糸に通じて、ウイルスを中空糸に捕捉させる第二工程
３）前記中空糸に捕捉されたＢ液中のウイルスの量を算出する第三工程    
【請求項３】
請求項１に記載のアンモニウム基を有する化合物又はアミノ基を有する化合物で表面処理された中空糸において、
該アンモニウム基を有する化合物又はアミノ基を有する化合物が、水酸基、及びアミノ基またはアンモニウム基と反応する基を有する化合物を介して中空糸に固定されたことを特徴とする、請求項１に記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項４】
上記アミノ基またはアンモニウム基と反応する基を有する化合物が、エピクロロヒドリン、又は時エポキシ化合物である、請求項３に記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項５】
中空糸が、ポリオレフィン、ポリエーテスルホン、またはセルロース混合エステルから構成されるものである請求項１~４の何れかに記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項６】
中空糸が多孔性中空糸である、請求項１〜４の何れかに記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項７】
ポリオレフィンが、ポリエチレン、ポリプロピレン、またはポリ−４−メチルペンテンである請求項５または６に記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項８】
スルホニウム基又はスルホ基を有する化合物が硫酸化糖である請求項１に記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項９】
硫酸化糖が、ヘパリン、ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体、デキストラン硫酸、又はフコイダンである請求項８に記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項１０】
ウイルスの量を算出する方法が、ポリメラーゼ連鎖反応によるもの、抗原抗体反応によるもの、又は培養法によるものである請求項１〜９の何れかに記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項１１】
ウイルスが、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ノロウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ロタウイルス、又はポリオウイルスである請求項１〜９の何れかに記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項１２】
前記３）前記中空糸に捕捉されたＢ液中のウイルスの量を算出する第三工程において、ウイルスを捕捉させた中空糸から、フェノール水溶液、アルカリ性水溶液、又は無機塩水溶液によりウイルスを回収する工程を有する、請求項２に記載のウイルスの濃度を評価する方法。
【請求項１３】
電荷を有する化合物、或いは電荷を有しない化合物で表面処理された中空糸を有するウイルス評価キットであって、
電荷を有する化合物が、（メタ）アクリル酸塩、スルホン酸塩、アンモニウム基を有する化合物、スルホニウム基を有する化合物、カルボキシレート基を有する化合物、又はホスフェート基を有する化合物であり、電荷を有しない化合物が、（メタ）アクリル酸、スルホン酸、アミノ基を有する化合物、スルホ基を有する化合物、カルボキシ基を有する化合物、又はホスホ基を有する化合物であり、
上記ウイルス評価キットが、上記電荷を有する化合物、或いは電荷を有しない化合物で表面処理された中空糸にウイルスを含む液を通じて、或いは接触させてウイルスを捕捉し、捕捉したウイルスの量を算出することにより前記ウイルスを含む液中に含まれるウイルスの濃度を評価する方法であって、且つ以下の各工程を有することによってウイルスの濃度を評価するものである、ウイルス評価キット。
１）ウイルスを含む液（Ａ液）から一定量の液（Ｂ液）を採取する第一工程
２）Ｂ液を、前記中空糸に通じて、ウイルスを中空糸に捕捉させる第二工程
３）前記ウイルスを捕捉させた中空糸から、フェノール水溶液によりウイルスを回収し、Ｂ液中のウイルスの量を算出する第三工程
【請求項１４】
電荷を有しない化合物で表面処理された中空糸を有するウイルス評価キットであって、電荷を有しない化合物が、中空糸に対する固定化量が１−１００μｇ／ｃｍ２であるポリエチレンイミンであり、
上記ウイルス評価キットが、上記電荷を有する化合物、或いは電荷を有しない化合物で表面処理された中空糸にウイルスを含む液を通じて、或いは接触させてウイルスを捕捉し、捕捉したウイルスの量を算出することにより前記ウイルスを含む液中に含まれるウイルスの濃度を評価する方法であって、
且つ以下の各工程を有することによってウイルスの濃度を評価するものである、ウイルス評価キット。
且つ以下の各工程を有することを特徴とするウイルスの濃度を評価する方法。
１）ウイルスを含む液（Ａ液）から一定量の液（Ｂ液）を採取する第一工程
２）Ｂ液を、前記中空糸に通じて、ウイルスを中空糸に捕捉させる第二工程
３）前記中空糸に捕捉されたＢ液中のウイルスの量を算出する第三工程    
【国際調査報告】
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2012144554.tif 000004
2012144554.tif 000005
2012144554.tif 000006