(57)【要約】  従来の人工授精用ストローの改良を行うことにより、凍結保存後の精液の受胎性を改善することを課題とする。解決手段として、人工授精用ストロー内に隔離層を導入して層を分離し、一方に精液と耐凍剤を含む水溶液からなる精液保存層、もう一方に耐凍剤を含まない希釈層を含むように凍結用ストローを作製し、希釈層にトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）、クエン酸、グルコース、塩化ナトリウムを含む水溶液からなる希釈液を用いることによる。
2012074060.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストローと、前記ストローの腔内に配置された、
緩衝剤、糖又は塩のいずれか一つ以上を含む水溶液からなる希釈層；
隔離層；及び
精液及び耐凍剤を含む水溶液からなる精液保存層
とを含み、希釈層と精液保存層とが隔離層により隔てられており、希釈層：精液保存層の体積比率が、３：２〜１：４である、人工授精用ストロー。
【請求項２】
前記希釈層が、グリセリンを含まない、請求項１に記載の人工授精用ストロー。
【請求項３】
前記希釈層において、前記緩衝剤が、トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）及びクエン酸を含み、前記糖が、グルコースを含み、かつ前記塩が、塩化ナトリウムを含む、請求項１又は２に記載の人工授精用ストロー。
【請求項４】
前記希釈層の水溶液の浸透圧が２３０〜４００ｍＯｓｍ、かつｐＨ６．４〜７．５である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
【請求項５】
前記人工授精用ストローの液量が、０．２５〜０．５ｍlである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
【請求項６】
前記精液が、ウシ又はイヌの精液である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工授精の際に用いる希釈層、隔離層、及び精液保存層を含む人工授精用ストローに関する。
【背景技術】
【０００２】
ウシの繁殖においては、我が国では人工授精の普及率はほぼ１００％になっている。しかしながら、ウシの受胎率は、年々低下しており、１９８９年では初回受胎率で６２．４％、１〜３回の受胎率で６２％であったところ、２００８年では初回受胎率で４６．１％、１〜３回の受胎率で４４．６％にまで低下している。受胎率の低下には、様々な要因が考えられるが、乳用牛の乳の高生産化によるストレス等が考えられる。【０００３】
受胎が失敗した場合、不受胎の牝ウシに対して再度の人工授精を行う必要が生じ、費用及び労力の点で育種農家の負担となっている。そこで、受胎率の向上に対する必要性が、牝ウシの点のみならず、牡ウシの点からも求められている。【０００４】
家畜の人工授精には、ストロー精液管に分注した凍結精液が一般的に用いられている。凍結保存用のストロー精液管は、精液を、凍結保存用の一次希釈液に希釈し、次に一次希釈液に耐凍剤を加えた二次希釈液で希釈したものを、ストロー中に充填して得られるもので、液体窒素中で凍結保存される（非特許文献１）。従来は、単一の精液保存層のみを含む単層式のストローが使用されていたが、近年、二層充填可能な精液充填装置が開発された（特許文献１）。この二層充填可能な精液充填装置は、精液保存層が綿栓に接触することによる精液の逸失を防ぐことを目的として、綿栓側に精液保存層の凍結保存液と同じ凍結保存液を配置するものであった。【０００５】
精液を凍結するために使用する精液希釈液については、凍結融解後の精子生存率・受精活性の改善を目的としてその成分の改良が行われている。希釈液として、卵黄、糖類及び緩衝剤を主成分とする卵黄系保存液と、牛乳を主成分とする牛乳系保存液が一般的に知られており、卵黄系保存液が世界的に多く用いられている。卵黄は低温衝撃の緩和、細胞膜の保護、精子の生存維持等の効果があり、これらの効果は卵黄中のリポタンパク質とリン脂質に起因すると考えられている。また、精子の凍害を予防するために様々な凍結保存剤（特許文献２）、受精率を増加させるための精子の活性化剤（特許文献３）等について研究がされている。凍結・融解過程においては、塩類が精子に悪影響を及ぼすことから、一般的に凍結用の希釈液には塩類は添加されることはない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１０−５０３４３８号公報
【特許文献２】特開２００５−２７０００６号公報
【特許文献３】特開２００５−２１３１４７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】家畜人工授精講習会テキスト
【非特許文献２】Guthrieら、Biology of Reproduction 67, 1811-1816 (2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決すべき課題は、従来の人工授精用ストローの改良を行うことにより、受胎率を改善することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らが、人工授精用ストローに充填された精子の生存性、並びに人工授精用ストローを用いた人工授精における受胎率について鋭意研究を行った結果、人工授精用ストロー内に隔離層を導入して層を分離し、一方に精液と耐凍剤を含む水溶液からなる精液保存層、もう一方に緩衝剤、糖又は塩のいずれか一つ以上を含む水溶液からなる希釈層を含むように人工授精用ストローを作製した場合に、驚くべきことに受胎率が向上したことが判明し本発明に到った。【００１０】
したがって、本発明は、以下の発明を包含する：
［１］  ストローと、前記ストローの腔内に配置された、緩衝剤、糖又は塩のいずれか一つ以上を含む水溶液からなる希釈層；隔離層；及び精液及び耐凍剤を含む水溶液からなる精液保存層とを含み、希釈層と精液保存層とが隔離層により隔てられている、人工授精用ストロー。
［２］  前記希釈層：前記精液保存層が、３：２〜１：４である、［１］に記載の人工授精用ストロー。
［３］  前記希釈層：前記精液保存層が３：２〜１：２である［１］又は［２］に記載の人工授精用ストロー。
［４］  前記希釈層：前記精液保存層が１：１である、［３］に記載の人工授精用ストロー。
［５］  前記希釈層の水溶液が、グリセリンを含有しない、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
［６］  前記希釈層の緩衝剤がトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）及びクエン酸であり、糖がグルコースであり、そして塩が塩化ナトリウムである、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
［７］  前記希釈層の水溶液の浸透圧が、２３０〜４００ｍＯｓｍである、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
［８］  前記希釈層の水溶液のｐＨが６．４〜７．５である、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
［９］  前記グルコース濃度が１０ｍＭ〜５０ｍＭであり、塩化ナトリウム濃度が５０〜１００ｍＭである、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
［１０］  前記希釈層が、卵黄及び耐凍剤を含まない、［１］〜［９］のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
［１１］  前記トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）が１４０．６ｍＭ、前記クエン酸が４５．３ｍＭ、前記グルコースが１６．７ｍＭ、前記塩化ナトリウムが７９．１ｍＭである、［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
［１２］  前記ストローの容量が、０．２５〜０．５ｍｌである、［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
［１３］  前記精液が、哺乳動物の精液である、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
［１４］  前記精液が、ウシ又はイヌの精液である、［１］〜［１３］のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
［１５］  前記希釈層の水溶液にさらに精子運動活性剤を含んでなる、［１］〜［１４］のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
［１６］  前記人工授精用ストローが、凍結されている、［１］〜［１５］のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
【発明の効果】
【００１１】
ストロー腔内において隔離層により分離された緩衝剤、糖又は塩のいずれか一つ以上を含む水溶液からなる希釈層と精液及び耐凍剤を含む水溶液からなる精液保存層とを含む人工授精用ストローを人工授精に用いることにより、従来の単層式人工授精用ストローを用いた人工授精に比較して受胎率が改善する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、綿栓を入れたストロー腔内において希釈層＋隔離層＋精液保存層を含む人工授精用ストローの概略図である。
【図２】図２は、ストロー腔内において希釈層＋隔離層＋精液保存層を含む人工授精用ストローにおいて、希釈層を種々の水溶液に変更して得た人工授精用ストローを凍結保存し、融解した後における生存し、かつ正常なアクロソームを有する精子の率を示すグラフである。希釈層として、ＴＣＧＮを用いた際に最も生存し、かつ正常なアクロソームを有する精子の率が高いことが示される。
【図３】図３は、ストロー腔内のＴＣＧＮ希釈層と精液保存層との比率を変更して、人工授精用ストローを凍結保存し、融解した後の精子運動性を調べたグラフである。ＴＣＧＮ希釈層の長さ＋精液保存層の長さ＝８０ｍｍとして、精液保存層の長さを４〜７２ｍｍに変更して、融解後の精子運動性が調べられた。ＴＣＧＮ希釈層：精液保存層＝２：３〜４：１において精子運動性が優れており、特に１：１のときにその運動性が最も優れていることが示される。
【図４】図４は、未経産の牝ウシにおける受胎試験結果を示すグラフである。ストロー腔内にＴＣＧＮ希釈層、隔離層、及び精液保存層を含む複層式ストローを用いた場合に、対照に比較して受胎率の向上がみられた。対照は、精液保存層と同一成分であるが、精液を含まない水溶液（グリセリン加卵黄トリス糖液）からなる希釈層、隔離層、及び精液保存層を含む複層式ストローを用いた場合の受胎率である。
【図５】図５は、経産の牝ウシにおける受胎試験結果を示すグラフである。ストロー腔内にＴＣＧＮ希釈層、隔離層、及び精液保存層を含む人工授精用ストローを用いた場合に、対照に比較して受胎率の向上がみられた。対照は、精液保存層と同一成分であるが、精液を含まない水溶液（グリセリン加卵黄トリス糖液）からなる希釈層、隔離層、及び精液保存層を含む人工授精用ストローを用いた場合の受胎率である。
【図６】図６は、未経産の牝ウシについての受胎試験結果と各産次の牝ウシについての受胎試験結果とを分けて示した実験結果を示すグラフである。ストロー腔内にＴＣＧＮ希釈層、隔離層、及び精液保存層を含む人工授精用ストローを用いた場合に、対照に比較して受胎率の向上がみられた。対照は、精液保存層と同一成分であるが、精液を含まない水溶液（グリセリン加卵黄トリス糖液）からなる希釈層、隔離層、及び精液保存層を含む人工授精用ストローを用いた場合の受胎率である。
【図７】図７は、凍結保存後に融解された人工授精用ストロー内の精液のアクロソーム正常率を示すグラフである。ストロー腔内にグリセリン加卵黄トリス糖（ＥＴＧ）層＋隔離層＋精液保存層、ＴＣＧＮ希釈層＋隔離層＋精液保存層、又は精液保存層（単層、４５０μｌ）を含む人工授精用ストローについて実験が行われた。値は、平均値と標準偏差で示す（Ｎ＝４）。ストロー腔内にＴＣＧＮ希釈層＋隔離層＋精液保存層を含む人工授精用ストローを用いた場合に、アクロソームの正常率が最も高いことが示される。
【図８】図８は、ストロー腔内にグリセリン加卵黄トリス糖（ＥＴＧ）層＋隔離層＋精液保存層、ＴＣＧＮ希釈層＋隔離層＋精液保存層、又は精液保存層（単層）を含む人工授精用ストローを液体窒素蒸気で凍結する際における精液保存層の過冷却時間を示すグラフである。値は、平均値と標準偏差で示す（Ｎ＝１０）。希釈層として、ＴＣＧＮ希釈層を用いた場合に過冷却の時間が少なくなることが示される。
【図９】図９は、ストロー腔内にグリセリン加卵黄トリス糖（ＥＴＧ）層＋隔離層＋精液保存層、ＴＣＧＮ希釈層＋隔離層＋精液保存層、又は精液保存層（単層）を含む人工授精用ストローを液体窒素蒸気で凍結する際において、精液保存層に氷が析出した温度を示すグラフである。値は、平均値と標準偏差で示す（Ｎ＝１０）。希釈層として、ＴＣＧＮ希釈層を用いた場合に高い温度で氷が析出することが示される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、ストローと、前記ストローの腔内に配置された、（１）緩衝剤、糖又は塩のいずれか一つ以上を含む水溶液からなる希釈層；（２）隔離層；及び（３）精液及び耐凍剤を含む水溶液からなる精液保存層とを含み、希釈層と精液保存層とが隔離層により隔てられている、人工授精用ストローに関する。
【００１４】
本発明の人工授精用ストローに用いられるストローは、任意の材料で製造することができるが、１回で使い捨てされることから、例えばポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）等のプラスチック製の円筒管である。任意の長さ、直径のストローが用いられるが、市販されているストローの多くは、長さ１３３ｍｍであり、直径が１．９５ｍｍ又は２．８５ｍｍである。綿栓をいれたストローに、希釈層、隔離層、及び精液保存層となる液体又は気体を順次注入し、超音波によって熱圧着して閉封される。希釈層、隔離層、及び精液保存層となる液体又は気体を手動で分注することもできるが、例えば特許文献１に記載される充填装置を用いて充填することができる。閉封後に、７〜１０分かけて液体窒素蒸気で凍結され、液体窒素中に浸漬して保存される。
【００１５】
本発明の人工授精用ストローに用いられるストローの容量は、人工授精に用いられるものであれば任意の容量であってもよく、例えば０．２５〜５ｍｌである。ストローの容量は、動物種によって変更され、ウシやイヌの精液を凍結するという観点では、０．２５〜０．５ｍｌのものが好ましい。ストローの一方の端が綿栓等の栓により閉封されており、希釈層、隔離層、そして精液保存層の順に入れられ、そして他方の端が、熱圧着等がなされて閉封されている。希釈層又は精液保存層と閉封部とは、それぞれ接触していてもよいし、気体層により隔てられていてもよい。希釈層と精液保存層との順序は入れ替えられてもよい。また、本発明の例として、希釈層、隔離層、及び精液保存層を含む複層式ストローを示したが、希釈層や精液保存層をそれぞれ２層以上含む複層式ストローとしてもよい。
【００１６】
前記希釈層において、好ましくは緩衝剤がトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）及びクエン酸であり、糖がグルコースであり、そして塩が塩化ナトリウムである。このような希釈層を、本明細書においてＴＣＧＮ希釈層という。好ましくは、希釈層には、グリセリンが含まれない。
【００１７】
本発明の希釈層の水溶液の浸透圧は、精子の受精活性が維持できる浸透圧であれば任意の浸透圧であってもよいが、通常は２３０〜４００ｍＯｓｍである。この範囲は、非特許文献２の記載により、精子の運動活性を維持できる範囲として特定されている。好ましくは、希釈層の水溶液の浸透圧は、２６０〜３５０ｍＯｓｍ、さらに好ましくは２８０〜３３０ｍＯｓｍである。２９５〜３２０ｍＯｓｍが特に好ましい。浸透圧は、溶質の濃度、解離度等から理論値を計算することもできるが、溶液を構成する物質の相互作用等を考慮して、浸透圧計（オズモメーター）を用いて決定される。本発明の希釈層の水溶液におけるグルコース濃度及び塩化ナトリウム濃度は、水溶液の浸透圧が、上記範囲となるように決定される。グルコース濃度は、５ｍＭ〜１００ｍＭであり、好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭである。塩化ナトリウム濃度は５０〜２００ｍＭであり、好ましくは５０〜１５０ｍＭであり、さらに好ましくは５０〜１００ｍＭである。
【００１８】
本発明の希釈層の水溶液のｐＨは、精子への毒性が無いｐＨ範囲であれば任意のｐＨであってもよく、例えば６．０〜８．０である。好ましくは、６．４〜７．５であり、さらに好ましくは６．８〜７．２である。本発明の希釈層の水溶液中のトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）とクエン酸の濃度は、最終的な水溶液のｐＨが、上記のｐＨ範囲となるように決定される。より具体的に、本願発明のトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）の濃度は、５０〜３００ｍＭ、好ましくは７５〜２００ｍＭである。クエン酸濃度は、２０〜１００ｍＭ、好ましくは２５〜７５ｍＭである。
【００１９】
本発明の希釈層は、トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）、クエン酸、グルコース及び塩化ナトリウムを含む水溶液からなることが好ましいが、所望のｐＨを達成するものであれば、トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）及びクエン酸の代わりの緩衝剤が使用されうる。使用できる緩衝剤として、中性付近に緩衝作用を持つ緩衝剤であれば任意のものを選択でき、例えば、メス、ヘペス、テス、トリシン等のグッド緩衝剤、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液等が挙げられる。同様に、グルコースは精子のエネルギー源となる物質であるが、精子が利用可能な他の糖やエネルギー源に代えることもできる。他の例として、キシロース、ラムロース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、メリビオース、ラフィノース、メレチロース、スタキオース、デキストリン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−グルクロン酸等が挙げられる。また、塩化ナトリウムの代わりに、他の塩類、例えば塩化カリウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等が使用されることもある。
【００２０】
本発明の希釈層の水溶液には、さらに精子を活性化させる活性化剤を含めることができる。活性化剤の具体的な例として、カテキン、カフェイン、テオフィリン、ペントキシフィリン、プロカイン、イミダゾール、ピルビン酸ナトリウム、ハイポタウリン、ポリフェノール、Ｌ−グルタミン、ＳＯＤ、ビタミンＢ２、ビタミンＣ、ビタミンＥ、フラボノイド、スペルミン、βカロテン、グルタチオン、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ、カタラーゼ、カルニチン、アルブミン、トランスフェリン、セルロプラスミン、グルコースホスフェートＤデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。活性化剤を、精液保存層と隔離層により隔てられた希釈層に含めることで、凍結前に精子を活性化することなく、融解後内子宮口又は子宮体腔内に注入された際に活性化を促進することができる。これにより、凍結前の段階で、精子のエネルギーを浪費することなく、適切なタイミングで活性化することが可能になる。また、希釈層の水溶液には、保存のため抗生物質が含まれうる。
【００２１】
なお、本発明の希釈層に用いることができる活性剤を含むか又は含まない水溶液は、本発明の人工授精用ストローとは別個に人工授精の際に添加することもできる。例えば、精液保存層を含む一層式の人工授精用ストローを解凍し、牝ウシの内子宮口又は子宮体腔内に注入する前、又は後に、本発明の希釈層に用いることができる水溶液を注入することで、牝ウシの子宮内で希釈層の水溶液と精液保存層の水溶液が混合されてもよい。
【００２２】
隔離層は、希釈層と精液保存層とが直接接触し混合することを妨げる任意の固体、液体又は気体の層である。好ましい隔離層の例として、空気、不活性ガス、例えば窒素、希ガス等の気体、油（植物油、動物油）、水と分離する有機溶媒等の液体、並びに任意の物質でできた仕切りとなる固体が挙げられる。気体や液体の隔離層は、凍結保存する温度によっては、凝固してもよい。隔離層の長さは、希釈層と精液保存層とを分離することができれば任意の長さであってよく、人工授精用ストローの長さや内径の観点から、例えば０．５ｃｍ〜２ｃｍの長さであり、１ｃｍの長さが一般的に用いられる。
【００２３】
なお、本明細書において、各層の長さとは、ストローの長手方向における長さを指す。ストローの内径は通常一定であるので各層の「長さ」は、各層の体積に比例する。
【００２４】
精液保存層は、精液及び耐凍剤を含む水溶液からなる。この水溶液は、精液を凍結保存するために用いられる凍結保存液であれば任意の凍結保存液であってもよい。一般的に精液凍結保存液として、卵黄、牛乳、大豆レシチン等を用いた凍結保存液が用いられている。卵黄系凍結保存液は、例えばクエン酸ナトリウムと鶏卵の卵黄の水溶液、トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）、クエン酸、ラクトース、ラフィノース、卵黄を含む卵黄トリス糖液があり、さらに抗生物質（例えば、ペニシリンやストレプトマイシン等）、適切な試薬等を添加することにより製造される。卵黄トリス糖液は、トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）の濃度が７５〜２００ｍＭ、好ましくは１００〜１５０ｍＭ、クエン酸濃度が２５〜７５ｍＭ、好ましくは３０〜６０ｍＭ、ラクトース濃度が１０〜１００ｍＭ、好ましくは２５〜７５ｍＭ、ラフィノース濃度が１０〜１００ｍＭ、好ましくは２５〜７５ｍＭ、卵黄濃度が１５〜２５％である（非特許文献１）。例えば、卵黄トリス糖液にグリセリンを６．５％の濃度になるように加えたグリセリン加卵黄トリス糖液は、社団法人家畜改良事業団が販売する雌雄産み分け用選別精液ストロー（Ｓｏｒｔ９０）や一般凍結精液ストローで用いられており、Ｓｏｒｔ９０から取得可能である。牛乳系凍結保存液では、加熱殺菌された全乳又は脱脂乳に緩衝剤、抗生物質等が添加された水溶液である。これらの水溶液は、動物種に応じて適切に変更する必要があるが、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ、その他の哺乳動物に対して適した凍結保存液が知られている（非特許文献１）。
【００２５】
精液保存層に含まれる耐凍剤は、細胞内の自由水と置換して細胞の収縮及び細胞内凍結を防止するとともに、細胞内の塩類の濃縮による細胞構成タンパク質の変性を防止する薬剤である。耐凍剤は、凍結による細胞外液中の氷量を抑えて、凍結及び融解過程の物理的損傷を緩和することができるものの、濃度によっては耐凍剤の毒性が表れる。耐凍剤の毒性の影響を低減するため、精液希釈液の作製の際に、耐凍剤を含有しない一次希釈液で原精液を希釈後、耐凍剤を含む二次希釈液に段階的に希釈し、精液の凍結保存が行われている。一般に一次希釈液と二次希釈液とは、耐凍剤を含むか否かの点でのみ異なっている。本発明において用いられる耐凍剤は、精液の凍結保存に適した耐凍剤であれば、任意のものを使用することができ、例えばグリセリン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール、又はそれらの混合液等を使用することができるが、特に精液保存の観点からは、グリセリンが好ましい。
【００２６】
本発明のストロー中の希釈層：精液保存層の体積比は、任意の比率であってもよい。しかしながら、融解後の混合液における精子運動性の観点から、希釈層：精液保存層が３：２〜１：４の範囲であることが好ましく、さらに３：２〜１：２の範囲も好ましい。最も好ましくは１：１である。
【００２７】
本発明の人工授精用ストローに含まれる精液保存層に含まれる精子数は、十分な受胎性を維持できれば任意の数であってもよいが、通常、精子数が多ければ受胎率が高くなる。精子濃度をできるだけ薄くすることで、本発明の構成、すなわちストロー腔内に緩衝剤、糖又は塩のいずれか一つ以上を含む水溶液からなる希釈層、隔離層、及び精液保存層を含む人工授精用ストローにより生じる効果をより明確に調べることができると考えられるため、後述の実施例では、１ストローあたり約３００万個の精子数で実験を行っている。しかしながら、本発明の人工授精用ストローに含まれる精子数は３００万個に限定されることはなく、例えば１ストローあたり約１００万個、約３００万個、約５００万個、約７００万個、約１０００万個又はそれより多くの精子が含まれていてもよい。中でも約３００万個より多くの精子を含むことが好ましい。
【００２８】
本発明の人工授精用ストローに含まれる精液は、人工授精が行われる動物であれば任意の動物由来の精液である。人工授精が行われる動物の例として、ヒトを含む任意の哺乳動物、例えば家畜動物、愛玩動物、動物園動物、実験動物が挙げられる。家畜動物として、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギ等が挙げられ、愛玩動物として、イヌ、ネコ、ウサギ等が挙げられる。本発明は、動物園動物として、パンダ等の絶滅が恐れられている種の精液を含む人工授精用ストローにも関する。
【００２９】
本発明の別の態様では、本願の人工授精用ストローを用いた人工授精方法にも関する。本発明の人工授精用ストローを３０〜４０℃の温浴で融解し、融解後、プラスチック製の注入器（例えばカスーガン）に装填し、発情末期の牝ウシの内子宮口又は子宮体腔内に注入することにより、人工授精が行われる。この人工授精方法を用いることにより、受胎率が向上する。
【００３０】
この受胎率の向上は、様々な要因のため生じるものと考えられるが、耐凍剤を含む精液保存層の水溶液が、解凍後家畜の内子宮口又は子宮体腔内への注入の際に耐凍剤を含まない希釈層の水溶液により希釈されることにより、耐凍剤の有する毒性の影響が低減されること、希釈層の植氷効果による精液保存層の過冷却が防止されること、並びに精子のエネルギー源となるグルコースが適切なタイミング、すなわち内子宮口又は子宮体腔内へと注入される際に供給される等が考えられる。
【実施例】
【００３１】
実施例１：ＴＣＧＮ希釈液、卵黄トリス糖液（ＥＴ液）、グリセリン加卵黄トリス糖液（ＥＴＧ液）、精子洗浄液の調製
１７．０３１ｇのトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）（和光純薬工業）、９．５１９ｇのクエン酸一水和物（和光純薬工業）、３．０００ｇのグルコース（和光純薬工業）、及び４．６２５ｇの塩化ナトリウム（和光純薬工業）、さらに１００万ＩＵ／４．６ｍｌＳＰＵＦのペニシリンＧカリウム（万有製薬）を３ｍｌ、１０００ｍｇ力価／４．３ｍｌＳＰＵＦのストレプトマイシン（明治製菓）を３ｍｌ加え、蒸留水で１０００ｍｌにメスアップして、１４０．６ｍＭのトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）、４５．３ｍＭのクエン酸、１６．７ｍＭのグルコース、７９．１ｍＭの塩化ナトリウムを含む水溶液（ＴＣＧＮ希釈液）を得た。【００３２】
卵黄トリス糖液（ＥＴ）は、社団法人家畜改良事業団がＳｏｒｔ９０や一般凍結精液で使用する精液一次希釈液を用いた。グリセリン加卵黄トリス糖液（ＥＴＧ）は、卵黄トリス糖液（ＥＴ）にグリセリンを６．５％となるように添加した水溶液であり、社団法人家畜改良事業団がＳｏｒｔ９０から取得可能であり、精液保存層の水溶液と、精液を含まないという点を除き同一である。【００３３】
精子洗浄液は、０．３ｇのウシ血清アルブミン（和光純薬工業）を、上で調製したＴＣＧＮ希釈液に溶解して１００ｍｌにすることにより調製した。【００３４】
実施例２：人工授精用ストローの作製
常法に従い、牡ウシから採取した原精液１０μｌをＮｕｃｌｅｏ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＳＰ−１００（ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社）で用いるＲｅａｇｅｎｔＳ１００で４００倍希釈し、精子数を計測し、原精液の精子濃度を測定した。精子濃度に応じて原精液を、精液の一次希釈液である卵黄トリス糖液（ＥＴ液）で１ｍｌあたり約４０００万の精子数となるように希釈した。こうして得られた一次希釈精液を精液の二次希釈液で１：１の体積比で希釈し、１ｍｌあたり約２０００万の精子数を含むグリセリン加卵黄トリス糖液（ＥＴＧ）を得た。【００３５】
綿栓を入れたプラスチック製ストロー（富士平工業、０．５ｍｌ細１３３型）に、希釈液１５０μｌを注入して希釈層とし、隔離層が１ｃｍとなるように隔離し、そして二次希釈精液を１５０μｌ注入し精液保存層とし、熱圧着を行って密封した。人工授精用ストローの概略図を図１として示す。これにより、１ストローあたりの精子数を約３００万とした。希釈層の水溶液として、ＴＣＧＮ希釈液又はグリセリン加卵黄トリス糖液をそれぞれ用いた。さらに、綿栓を入れたストローに４５０μｌの二次希釈精液を注入した単層の人工授精用ストローを作製した。これらの人工授精用ストローに液体窒素蒸気をあてて７〜１０分かけて凍結させ、液体窒素中に浸漬することにより保存した。【００３６】
実施例３：希釈層における希釈液の種類が、凍結融解後の生存し、かつ正常なアクロソームを有する精子の率に及ぼす影響
希釈層の水溶液として、ＴＣＧＮ希釈液の他に、ＴＣＧＮ２倍希釈液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水、Ｇ１００ｍＭ（グルコース１００ｍＭ）、グリセリン加卵黄トリス糖液について、その有効性を試験した。具体的には、これらの希釈液からなる希釈層、空気の隔離層、精液保存層を含む人工授精用ストローを作製し、常法に従い３８℃で融解した。ストローの中身をポリスチレンコニカルチューブに全量移し入れ、よく撹拌後、精子洗浄液を用いて室温、５分間、２０００ｒｐｍで２回遠心洗浄を行った。その後、洗浄した精子を１０００万／ｍｌに調整し、２μｇ／ｍｌのＰＩ（Ｓｉｇｍａ）及び２μｇ／ｍｌのＰＮＡ−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）を加えて２５℃で１０分間インキュベーションした。次に、精子洗浄液を用いて室温、５分間、３０００ｒｐｍで１回遠心洗浄を行った。そして、フローサイトメーター（Ｃｅｌｌ  Ｌａｂ  Ｑｕａｎｔａ  ＳＣ、ベックマン）を用いて、１サンプルあたり２万個の精子について生存し、かつ正常なアクロソームを有する精子の率を測定した。ＰＩで染色されない精子は生存精子と判定し、ＰＮＡ−ＦＩＴＣで染色されない精子はアクロソーム正常精子と判定した。測定結果を図２として示す。ＴＣＧＮ希釈液を希釈層とする人工授精用ストローにおいて、最も生存し、かつ正常なアクロソームを有する精子の率が高かった。また、生理食塩水を希釈層とする人工授精用ストローにおいても、生存し、かつ正常なアクロソームを有する率が高かった。【００３７】
実施例４：ストロー腔内にＴＣＧＮ希釈層、隔離層、及び精液保存層を含む人工授精用ストローにおけるＴＣＧＮ希釈層と精液保存層の比が、凍結融解後の精子運動性に与える影響
綿栓を入れたプラスチック製ストロー中に、下記の表に記載される比でＴＣＧＮ希釈層と精液保存層、並びに隔離層として１０ｍｍの空気の隔離層を含む人工授精用ストローを作製した。
【表１】
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これらの人工授精用ストローを、常法に従い液体窒素で凍結保存し、融解後、人工授精用ストローの内容液を精液保存層の部分のみコニカルチューブに移し、ＣＡＳＡを用いて３８℃において精子の運動性を試験した。運動性は、１秒間に５０μｍ以上動いた精子の割合（Ｒａｐｉｄ（％））で示した。実験結果を図３に示す。精液保存層の長さが３２、４０、４８、５６、６４ｍｍであるとき、すなわちＴＣＧＮ希釈層：精液保存層が、３：２〜１：４の範囲の際に、融解後の精子運動性が高いことが示された。さらに、ＴＣＧＮ希釈層：精液保存層＝１：１であるとき、融解後の精子運動性が最も高かった。【００３８】
実施例５：ストロー腔内にＴＣＧＮ希釈層、隔離層、及び精液保存層を含む人工授精用ストローを用いた受胎試験
ストロー腔内にＴＣＧＮ希釈層、空気の隔離層、及び精液保存層を含む人工授精用ストロー、並びに対照としてストロー腔内にグリセリン加卵黄トリス糖液希釈層、空気の隔離層、及び精液保存層を含む人工授精用ストローを常法に従い、３８℃で融解させ、プラスチック製の注入器に装填し、発情末期の牝ウシの内子宮口又は子宮体腔内に注入した。注入後、ノンリターン法又は胎膜触知法（６０日）で受胎の有無を調べ、受胎率を測定した。【００３９】
一般に出産を経験した牝ウシでは受胎率が下がるため、未経産の牝ウシと経産の牝ウシの二群について実験を行った。実験結果は以下の通りであり、この結果を図４及び図５に示す。
【表２】
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【００４０】
平成１３年から平成２２年までの受胎試験結果（試験区３８２頭、対照区３８７頭）を、未経産と各産次に分けて表示した結果を図６に示す。図６において、未経産と各産次の全てについて、試験区で受胎率の向上がみられた。未経産についての結果と経産の各産次についての結果を合計したところ、試験区は対照区と比較して有意な受胎率の向上がみられた（χ２乗検定：Ｐ＜０．１）。【００４１】
実施例６：人工授精用ストローの凍結融解後における精子のアクロソーム正常率の測定
液体窒素中で凍結保存されている（１）ストロー腔内にグリセリン加卵黄トリス糖液希釈層と空気の隔離層と精液保存層（ＥＴＧ層＋隔離層＋精液保存層）を含む人工授精用ストロー、（２）ストロー腔内にＴＣＧＮ希釈層、空気の隔離層、及び精液保存層（ＴＣＧＮ層＋隔離層＋精液保存層）を含む人工授精用ストロー、（３）ストロー腔内に単層の精液保存層（４５０μｌ）を含む人工授精用ストローを常法に従い、３８℃で融解した。ストローの中身をポリスチレンコニカルチューブに全量移し入れ、よく撹拌後、精液５〜１０μｌをスライドグラスに載せ塗沫をし、２〜３時間風乾し、ギムザ染色を行い、３００〜５００個の精子について、形態を検査して、アクロソーム正常率を測定した。測定結果を図７に示す。【００４２】
実施例７：人工授精用ストローの凍結の際における過冷却の影響の測定
（１）ストロー腔内にグリセリン加卵黄トリス糖液希釈層と空気の隔離層と精液保存層（ＥＴＧ層＋隔離層＋精液保存層）を含む人工授精用ストロー、（２）ストロー腔内にＴＣＧＮ希釈層、空気の隔離層、及び精液保存層（ＴＣＧＮ層＋隔離層＋精液保存層）を含む人工授精用ストロー、及び（３）ストロー腔内に単層の精液保存層（４５０μｌ）を含む人工授精用ストローを、常法に従い、液体窒素蒸気にあてて凍結を行った。この際、精液保存層に対して温度センサーを入れて、精液保存層の過冷却の時間及び凝固開始温度を測定した。結果をそれぞれ図８及び図９に示す。単層精液保存層のストローにおいて、最も過冷却の時間が長く（図８）、かつ凝固開始温度が低かった（図９）。隔離層を導入して精液保存層と希釈層を分離することにより、過冷却時間が短くなり、凝固開始温度が上がり、さらに希釈液からグリセリンを除くことにより、さらに過冷却時間が短くなり、凝固開始温度が上昇した。この実験により、精液単層のストローから、希釈層、隔離層及び精液保存層を含む複層に変更し、また希釈液からグリセリンを除くことにより、過冷却による精子の損傷を最小限にすることができることが示された。過冷却の減少の結果として、実施例６のアクロソーム正常率が向上したと考えられる。過冷却の防止は、グリセリンを含まない希釈層が先に氷結することにより植氷効果によるものと考えられる。希釈層と精液保存層との間には空気の隔離層があるものの、希釈液が先にストローを通過するため、ストロー内腔に微量に付着した希釈液が氷結し、精液保存層の氷結を促進すると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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