(57)【要約】[課題]  ウェル部材を用いても特定物質を精度良く検出することができ、構造を簡素化して製造コストを抑えることのできる表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこれを用いた蛍光検出方法を提供すること。[解決手段]  誘電体部材と、前記誘電体部材上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上に形成されたリガンド固定領域と、を備えたセンサ部材と、前記センサ部材上に固定され前記リガンド固定領域と対応する位置に貫通穴を有するウェル部材と、から成るセンサ構造体と、前記センサ構造体の金属薄膜に向かって励起光を照射する光源と、前記光源より前記金属薄膜に励起光を照射し、前記金属薄膜上の電場を増強させて前記金属薄膜上の前記リガンド固定領域に保持された蛍光物質を励起させ、これにより励起された蛍光を検出する光検出手段と、を少なくとも有する装置本体と、を備え、前記センサ構造体が、前記装置本体に対して着脱されて使用される、または前記装置本体に対して固定されて使用されるよう構成された表面プラズモン励起増強蛍光測定装置であって、前記センサ構造体のウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置から所定距離離間した位置に、前記励起光の光軸中心が位置するよう前記励起光の照射位置が設定されている。
2012157403.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘電体部材と、前記誘電体部材上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上に形成されたリガンド固定領域と、を備えたセンサ部材と、前記センサ部材上に固定され前記リガンド固定領域と対応する位置に貫通穴を有するウェル部材と、から成るセンサ構造体と、
前記センサ構造体の金属薄膜に向かって励起光を照射する光源と、前記光源より前記金属薄膜に励起光を照射し、前記金属薄膜上の電場を増強させて前記金属薄膜上の前記リガンド固定領域に保持された蛍光物質を励起させ、これにより励起された蛍光を検出する光検出手段と、を少なくとも有する装置本体と、
を備え、
前記センサ構造体が、前記装置本体に対して着脱されて使用される、または前記装置本体に対して固定されて使用されるよう構成された表面プラズモン励起増強蛍光測定装置であって、
前記センサ構造体のウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置から所定距離離間した位置に、前記励起光の光軸中心が位置するよう前記励起光の照射位置が設定されていることを特徴とする表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
【請求項２】
前記励起光の照射位置が、
前記ウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置から前記貫通穴の外形端までの最短距離を１００％とした場合、前記重心位置から１〜７５％の範囲で離間した位置であることを特徴とする請求項１に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
【請求項３】
前記センサ構造体は、撹拌されて使用されることを特徴とする請求項１または２に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
【請求項４】
前記ウェル部材の前記貫通穴には、前記貫通穴の底に向かって次第に径が小さくなる逆テーパーが付されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
【請求項５】
前記ウェル部材の前記貫通穴の形状が、点対称な形状であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
【請求項６】
前記リガンド固定領域に固定されるリガンドが１種類であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
【請求項７】
前記リガンド固定領域に固定されるリガンドが複数種類であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
【請求項８】
前記ウェル部材には、前記貫通穴が１つ設けられていることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
【請求項９】
前記ウェル部材には、前記貫通穴が複数設けられていることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
【請求項１０】
前記センサ構造体と前記光源とを、相対的に移動させて調整する位置調整手段を有することを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
【請求項１１】
前記ウェル部材の前記貫通穴の内壁面に、非特異吸着防止用の表面処理が施されていることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
【請求項１２】
誘電体部材と、前記誘電体部材上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上に形成されたリガンド固定領域と、を備えたセンサ部材と、前記センサ部材上に固定され、前記リガンド固定領域と対応する位置に貫通穴を有するウェル部材と、から成るセンサ構造体の前記リガンド固定領域に固定されたリガンドにアナライトを捕捉させ、さらに前記アナライトを蛍光物質で標識する工程と、
前記アナライトを蛍光物質で標識した状態で、前記センサ構造体の金属薄膜に前記誘電体部材側から励起光を照射して、前記蛍光物質を励起させる工程と、
励起された蛍光を光検出手段にて測定する工程と、
を少なくとも有する蛍光検出方法であって、
前記蛍光物質を励起させる工程において、
前記センサ構造体のウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置から所定距離離間した位置に、前記励起光の光軸中心が位置するよう前記励起光が照射されることを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項１３】
前記蛍光物質を励起させる工程において、
前記励起光の照射位置が、
前記ウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置から前記貫通穴の外形端までの最短距離を１００％とした場合、前記重心位置から１〜７５％の範囲で離間した位置であることを特徴とする請求項１２に記載の蛍光検出方法。
【請求項１４】
前記アナライトを蛍光物質で標識する工程において、
前記センサ構造体は、撹拌されることを特徴とする請求項１２または１３に記載の蛍光検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）の原理に基づいた表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこの表面プラズモン励起増強蛍光測定装置を用いた蛍光検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、ナノメートルレベルなどの微細領域中で電子と光とが共鳴することにより、高い光出力を得る現象（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Surface Plasmon Resonance）現象）を応用し、例えば生体内の極微少なアナライトの検出を行うようにした表面プラズモン共鳴装置（以下ＳＰＲ装置ともいう）が用いられている。【０００３】
このようなＳＰＲ装置１００は、図１２に示したように、誘電体部材１０２の上面に金属薄膜１０４が形成されており、この金属薄膜１０４上にリガンド固定領域１０６を有するリガンド含有層１０８が配設されて成るセンサ構造体１１０を備えている。【０００４】
さらに、センサ構造体１１０の誘電体部材１０２側には、金属薄膜１０４に向かって励起光１１２を照射する光源１１４を備え、さらに光源１１４から照射され、金属薄膜１０４で反射した反射光１１６を受光する受光手段１１８が備えられている。【０００５】
そして、ＳＰＲ装置１００の使用において、まず金属薄膜１０４上のリガンド固定領域１０６にリガンドを固定しておき、ここに特定のアナライトを含んだ試料溶液を供給する。【０００６】
さらにこの状態で、誘電体部材１０２の下方より金属薄膜１０４に向かって励起光１１２を共鳴角θ１で照射し、金属薄膜１０４に反射した反射光１１６を受光手段１１８で受光する。【０００７】
金属薄膜１０４に向かって共鳴角θ１で励起光１１２を照射すると、金属薄膜１０４上に粗密波（表面プラズモン）が生じ、励起光１１２と金属薄膜１０４中の電子振動とがカップリングして、反射光１１６の光量減少が生ずる。【０００８】
この現象は、アナライトの有無によって共鳴角θ１が変わるため、アナライトを含まない試料溶液をリガンド固定領域１０６に供給したときの共鳴角θ１を予め調べておくことで、この時の共鳴角θ１と異なった場合に所定のアナライトを有すると判断することができる。【０００９】
これにより、所定のアナライトが試料溶液中に含有されているか否かを知ることができる。
一方、このような表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象を応用した表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）の原理に基づき、ＳＰＲ装置１００よりもさらに高精度にアナライトの検出を行えるようにした表面プラズモン励起増強蛍光測定装置（以下、ＳＰＦＳ装置ともいう）も開発されている。【００１０】
このようなＳＰＦＳ装置２００は、図１３に示したように、まず誘電体部材２０２の上面に金属薄膜２０４が形成されており、さらにこの金属薄膜２０４上にリガンド固定領域２０６を有するリガンド含有層２０８が配設されて成るセンサ構造体２１０を備えている。【００１１】
そして、センサ構造体２１０の誘電体部材２０２側には、金属薄膜２０４に向かって励起光２１２を照射する光源２１４と、光源２１４から照射され金属薄膜２０４で反射した反射光２１６を受光する受光手段２１８が設けられている。【００１２】
一方、センサ構造体２１０のリガンド含有層２０８側には、リガンド固定領域２０６で捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質が発する蛍光２２０を受光する光検出手段２２２が設けられている。【００１３】
なお、リガンド含有層２０８と光検出手段２２２との間には、蛍光２２０を効率よく集めるための集光部材２２４と、蛍光２２０以外に含まれる光を除去し、必要な蛍光２２０のみを選択する波長選択機能部材２２６が設けられている。【００１４】
そして、ＳＰＦＳ装置２００の使用においては、まず金属薄膜２０４上のリガンド固定領域２０６にリガンドを固定しておき、このリガンドに蛍光物質で標識されたアナライトが捕捉された状態とする。【００１５】
そしてこの状態で、光源２１４より誘電体部材２０２内に励起光２１２を照射し、この励起光２１２が共鳴角θ２で金属薄膜２０４に入射することで、金属薄膜２０４上に粗密波（表面プラズモン）を生じさせる。【００１６】
なお、金属薄膜２０４上に粗密波（表面プラズモン）が生ずる際には、励起光２１２と金属薄膜２０４中の電子振動とがカップリングし、反射光２１６の光量減少が生ずるため、受光手段２１８で受光される反射光２１６のシグナルが変化（光量が減少）する地点を見つければ、粗密波（表面プラズモン）が生ずる共鳴角θ２を得ることができる。【００１７】
この粗密波（表面プラズモン）を生ずる現象により、金属薄膜２０４上のリガンド固定領域２０６の蛍光物質が効率良く励起され、これにより蛍光物質が発する蛍光２２０の光量が増大することとなる。【００１８】
この増大した蛍光２２０を、集光部材２２４および波長選択機能部材２２６を介して光検出手段２２２で受光することで、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる。【００１９】
近年、ＳＰＲ装置１００やＳＰＦＳ装置２００では、更なる精度向上に向けた技術開発が盛んに行われている。
ところで、ＳＰＲ装置１００のリガンド固定領域１０６やＳＰＦＳ装置２００のリガンド固定領域２０６へ試料溶液を供給する方法としては、例えば流路を用いて送液する供給方法が知られている。【００２０】
図１４に示したセンサ構造体３００は、金属薄膜３０４上のリガンド固定領域３０６が横形流路３０８の途中に配置されており、横形流路３０８内のリガンド固定領域３０６にリガンドを固定した後、横形流路３０８内に特定物質（アナライト）を含有した試料溶液３１０を送液することで、リガンド固定領域３０６にアナライトが捕捉されるようになっている。なお、図中の符号３０２は誘電体部材である。【００２１】
このような横形流路３０８を備えたセンサ構造体３００では、試料溶液３１０を、一方向送液ポンプを用いて循環させたり、往復送液ポンプを用いて往復送液させたりすることにより、リガンド固定領域３０６のいずれの箇所においても特定物質の反応が生じるように工夫されている。【００２２】
一方、ＳＰＲ装置１００においてリガンド固定領域１０６へ試料溶液を供給する別の方法としては、試料溶液を貯める方法も知られている。
特許文献１に開示されたセンサ構造体４００では、図１５に示したように金属薄膜４０４上のリガンド固定領域４０６の上に、複数の貫通穴４１０を有するウェル部材４０８を配設し、各貫通穴４１０内に試料溶液４１２を供給して貯留させることで、貫通穴４１０内のリガンド固定領域４０６にアナライトが捕捉されるようにしている。【００２３】
この方法は、流路を用いて送液を行う方法のように送液ポンプを用意する必要がないため、流路を用いた場合よりも構造を簡素化できる利点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】特許第３７４３５４１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
ところで、上記したようなウェル部材を備えたセンサ構造体をＳＰＦＳ装置でも用い、試料溶液を貯めて蛍光測定を行うようにすれば、ＳＰＲ装置と同様に構造を簡素化でき、製造コストを抑えることができると考えられる。【００２６】
しかしながら、ウェル部材を用いて試料溶液を貯める方法では、試料溶液の流れがウェル部材の貫通穴内で生じ難く、検出対象となる特定物質が極微量の場合、特定物質が確実にリガンド固定領域のリガンドに捕捉されない場合があった。【００２７】
特にこのことはＳＰＲ装置よりもさらに高精度が要求されるＳＰＦＳ装置にとって致命的な問題であり、この問題がＳＰＦＳ装置においてウェル部材を備えたセンサ構造体の使用を困難にさせている要因の一つとなっている。【００２８】
本発明は、このような現状に鑑み、ウェル部材を備えたセンサ構造体を用いても特定物質を精度良く検出することができ、流路を用いた送液方法よりも構造を簡素化して製造コストを抑えることのできる表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこれを用いた蛍光検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明は、前述したような従来技術における課題及び目的を達成するために発明されたものであって、
本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
誘電体部材と、前記誘電体部材上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上に形成されたリガンド固定領域と、を備えたセンサ部材と、前記センサ部材上に固定され前記リガンド固定領域と対応する位置に貫通穴を有するウェル部材と、から成るセンサ構造体と、
前記センサ構造体の金属薄膜に向かって励起光を照射する光源と、前記光源より前記金属薄膜に励起光を照射し、前記金属薄膜上の電場を増強させて前記金属薄膜上の前記リガンド固定領域に保持された蛍光物質を励起させ、これにより励起された蛍光を検出する光検出手段と、を少なくとも有する装置本体と、
を備え、
前記センサ構造体が、前記装置本体に対して着脱されて使用される、または前記装置本体に対して固定されて使用されるよう構成された表面プラズモン励起増強蛍光測定装置であって、
前記センサ構造体のウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置から所定距離離間した位置に、前記励起光の光軸中心が位置するよう前記励起光の照射位置が設定されていることを特徴とする。【００３０】
このように励起光の照射位置を変えれば特定物質を精度良く検出することができる。しかもウェル部材を備えたセンサ構造体は、流路やポンプなどの送液手段を必要としないので、装置にかかる製造コストを抑えることができる。【００３１】
さらに本発明の蛍光検出方法は、
誘電体部材と、前記誘電体部材上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上に形成されたリガンド固定領域と、を備えたセンサ部材と、前記センサ部材上に固定され、前記リガンド固定領域と対応する位置に貫通穴を有するウェル部材と、から成るセンサ構造体の前記リガンド固定領域に固定されたリガンドにアナライトを捕捉させ、さらに前記アナライトを蛍光物質で標識する工程と、
前記アナライトを蛍光物質で標識した状態で、前記センサ構造体の金属薄膜に前記誘電体部材側から励起光を照射して、前記蛍光物質を励起させる工程と、
励起された蛍光を光検出手段にて測定する工程と、
を少なくとも有する蛍光検出方法であって、
前記蛍光物質を励起させる工程において、
前記センサ構造体のウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置から所定距離離間した位置に、前記励起光の光軸中心が位置するよう前記励起光が照射されることを特徴とする。
このような蛍光検出方法であれば、特定物質を精度良く検出することができる。【００３２】
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
前記励起光の照射位置が、
前記ウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置から前記貫通穴の外形端までの最短距離を１００％とした場合、前記重心位置から１〜７５％の範囲で離間した位置であることを特徴とする。【００３３】
さらに本発明の蛍光検出方法は、
前記蛍光物質を励起させる工程において、
前記励起光の照射位置が、
前記ウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置から前記貫通穴の外形端までの最短距離を１００％とした場合、前記重心位置から１〜７５％の範囲で離間した位置であることを特徴とする。
このような範囲に励起光の照射位置を規定すれば、精度良く特定物質を検出することができる。【００３４】
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
前記センサ構造体は、撹拌されて使用されることを特徴とする。【００３５】
さらに本発明の蛍光検出方法は、
前記アナライトを蛍光物質で標識する工程において、
前記センサ構造体は、撹拌されることを特徴とする。【００３６】
このように撹拌がなされれば、貫通穴内に試料溶液を供給した際に、アナライトを確実にリガンド固定領域のリガンドに捕捉させることができる。したがって、精度良く特定物質を検出することができる。【００３７】
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
前記ウェル部材の前記貫通穴には、前記貫通穴の底に向かって次第に径が小さくなる逆テーパーが付されていることを特徴とする。
このように貫通穴が構成されていれば、蛍光検出の際に放射状に生ずる蛍光を確実に集光することができる。したがって、精度良く特定物質を検出することができる。【００３８】
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
前記ウェル部材の前記貫通穴の形状が、点対称な形状であることを特徴とする。【００３９】
このような形状であれば、貫通穴内に試料溶液を貯めた際に貫通穴内で試料溶液の流れを生じ易くすることができ、アナライトを確実にリガンド固定領域のリガンドに捕捉させることができる。したがって、精度良く特定物質を検出することができる。【００４０】
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
前記リガンド固定領域に固定されるリガンドが１種類であることを特徴とする。
このように構成すれば、１種類のアナライトを検出することができる。【００４１】
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
前記リガンド固定領域に固定されるリガンドが複数種類であることを特徴とする。
このように構成すれば、同一条件での検査や多項目検査、さらにはリファレンスなどを１つのセンサ構造体で行うことができる。【００４２】
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
前記ウェル部材には、前記貫通穴が１つ設けられていることを特徴とする。
このように貫通穴が１つであれば、加工が容易であり、リガンド固定領域の高い位置決め精度も要求されないのでセンサ構造体の製造を容易に行うことができる。【００４３】
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
前記ウェル部材には、前記貫通穴が複数設けられていることを特徴とする。
このように貫通穴が複数で有れば、同一条件での検査や多項目検査、さらにはリファレンスなどを１つのセンサ構造体で行うことができる。【００４４】
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
前記センサ構造体と前記光源とを、相対的に移動させて調整する位置調整手段を有することを特徴とする。【００４５】
このように構成すれば、ウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置に対して離間した位置に励起光を照射する際に、正確な位置調整を容易に行うことができる。【００４６】
さらに貫通穴を複数有するセンサ構造体や複数種類のリガンドが固定されたセンサ構造体を用いた場合には、同一条件での検査や多項目検査、さらにはリファレンスなどを効率良く進めることができる。【００４７】
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
前記ウェル部材の前記貫通穴の内壁面に、非特異吸着防止用の表面処理が施されていることを特徴とする。【００４８】
このように構成されていれば、貫通穴内に試料溶液を供給した際に、貫通穴の内壁面に試料溶液中の検体（アナライト）が吸着し難くなるため、試料溶液中の特定物質が貫通穴底面に位置するリガンド固定領域で捕捉される条件が高まり、結果として検出精度を向上させることができる。
【発明の効果】
【００４９】
本発明によれば、ウェル部材を備えたセンサ構造体を用いても、特定物質を精度良く検出することができ、しかも構造が簡単であるため、製造コストを抑えることのできる表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこれを用いた蛍光検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、本発明のＳＰＦＳ装置の概略図である。
【図２】図２は、本発明のＳＰＦＳ装置で用いられるセンサ構造体の斜視図である。
【図３】図３は、本発明のＳＰＦＳ装置で用いられるセンサ構造体において、励起光の照射位置を説明するための概略図である。
【図４】図４は、本発明のＳＰＦＳ装置で用いられるセンサ構造体において、励起光の照射位置を説明するための上面図である。
【図５】図５は、本発明のＳＰＦＳ装置で用いられるセンサ構造体において、ウェル部材の貫通穴内に位置するリガンド含有層の反応量の分布を示したグラフである。
【図６】図６は、本発明のＳＰＦＳ装置で用いられるセンサ構造体において、ウェル部材の貫通穴に付された逆テーパーについて説明するための概略図である。
【図７】図７は、本発明のＳＰＦＳ装置で用いられるセンサ構造体において、ウェル部材の貫通穴の形状を説明するための上面図である。
【図８】図８は、本発明のＳＰＦＳ装置で用いられるセンサ構造体において、複数種類のリガンドを１つの貫通穴内に位置するリガンド固定領域に固定した状態を説明するための上面図である。
【図９】図９は、本発明のＳＰＦＳ装置で用いられるセンサ構造体において、複数の貫通穴内のそれぞれの貫通穴内に位置するリガンド固定領域に、それぞれ異なる種類のリガンドを固定した状態を説明するための上面図である。
【図１０】図１０は、本発明のＳＰＦＳ装置で用いられる別の実施例におけるセンサ構造体の概略図である。
【図１１】図１１は、実施例１〜３のセンサ構造体において、ウェル部材の貫通穴内に位置するリガンド含有層の反応量の分布を示したグラフである。
【図１２】図１２は、従来のＳＰＲ装置の概略図である。
【図１３】図１３は、従来のＳＰＦＳ装置の概略図である。
【図１４】図１４は、従来のセンサ構造体において、リガンド固定領域へ試料溶液を供給する方法として流路を用いた供給方法について説明するための概略図である。
【図１５】図１５は、従来のセンサ構造体において、リガンド固定領域へ試料溶液を供給する方法としてウェル部材を用いた供給方法について説明するための概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
以下、本発明の実施の形態について、図面に基づいてより詳細に説明する。
本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）は、リガンド固定領域に固定されたリガンドに捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を、確実に励起させて高感度に蛍光検出を行うものである。
【００５２】
また、本明細書中でいう「表面プラズモン」とは、広義の意味で用いられるものであって、「局在プラズモン」も含まれるものである。
さらに「ウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域」とは、貫通穴の金属薄膜側の開口端で区画された領域のことである。
【００５３】
本発明のＳＰＦＳ装置１は、図１に示したように、まず誘電体部材１２と、誘電体部材１２の上面に形成された金属薄膜１４と、金属薄膜１４上面に検出対象となるアナライトと特異的に吸着するリガンドを固定するためのリガンド固定領域１６と、を備えたセンサ部材１０を有し、このセンサ部材１０の上に、リガンド固定領域１６と対応する位置に貫通穴２０を有するウェル部材１８が固定されたセンサ構造体２２が備えられている。
【００５４】
このようなセンサ構造体２２は、例えば誘電体部材１２の上面に金属薄膜１４を成膜した後、金属薄膜１４の全面にリガンドを固定しておき、この状態で金属薄膜１４上にウェル部材１８を固定することで製造できる。
【００５５】
この製造方法はウェル部材１８を固定する前に、既にリガンドを金属薄膜１４上のリガンド固定領域１６に固定化しているので、ウェル部材１８の貫通穴２０の内壁面にリガンドが付かず、検出効率を高める上で好ましい。また金属薄膜１４の全面にリガンドを固定するので、リガンドを固定化する際に、リガンドの固定をリガンド固定領域１６のみに制限するための別部材を用いる必要がなく簡易な製造ができる。
【００５６】
なお、リガンドを必ずしも金属薄膜１４上の全面に固定する必要がないことは勿論であり、リガンド固定領域１６と同一の領域、或いはリガンド固定領域１６を含み、それよりも僅かに広い領域に固定することもできる。この場合には、ウェル部材１８と異なる枠部材を用いてリガンドを金属薄膜１４上に固定化することが好ましい。
【００５７】
このようにウェル部材１８の貫通穴２０で規定される底面領域の全域にわたりリガンドを固定することが、非特異吸着を防止してノイズを低減する上では好ましい。
また別の製造方法として、誘電体部材１２の上面に金属薄膜１４を成膜した後、金属薄膜１４上に、予め貫通穴２０の内壁面に非特異吸着防止用の表面処理を施したウェル部材１８を配設し、貫通穴２０内にリガンドを含有した溶液を注入することで、貫通穴２０の底面に位置する金属薄膜１４の上にのみリガンドを固定化させるようにしても良い。
【００５８】
なお貫通穴２０の内壁面に施された表面処理については、公知の処理方法を用いることができ、例えばＢＳＡやカゼインなどのタンパク質を含有した溶液やリン脂質類似合成ポリマー（日油株式会社）を含んだ溶液を用いれば、非特異吸着を効果的に防止することができる。
【００５９】
またセンサ構造体２２は、図２に示したように誘電体部材１２が断面略台形形状の六面体（截頭四角錐形状）であり、ウェル部材１８が誘電体部材１２の形状に合わせて方形に構成されている。
【００６０】
なお、誘電体部材１２の形状は図２に示した形態に限定されるものではなく、例えば四角錐，円錐，三角錐，多角錐などの角錐形状、または截頭角錐形状などであっても良いものである。
【００６１】
図２に示したような截頭四角錐形状の誘電体部材１２を用いた場合には、センサ構造体２２の高さを低く抑えることができ、ＳＰＦＳ装置１の小型化に寄与することができる。
そして、センサ構造体２２の誘電体部材１２側には、誘電体部材１２内に入射され、金属薄膜１４に向かって励起光２４を照射する光源２６を備え、さらに光源２６から照射され金属薄膜１４に反射した反射光２８を受光する受光手段３０が備えられている。
【００６２】
ここで光源２６および受光手段３０には、照射位置や受光位置を調整するための位置調整手段４０，４２が設けられている。
光源２６から照射される励起光２４としてはレーザ光が好ましく、波長２００〜９００ｎｍ、０．００１〜１，０００ｍＷのＬＤレーザ、または波長２３０〜８００ｎｍ、０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザが好適である。
【００６３】
一方、センサ構造体２２のウェル部材１８側には、リガンド固定領域１６で生じた蛍光３２を受光するための光検出手段３４が設けられている。
光検出手段３４としては、超高感度の光電子増倍管、または多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサを用いることが好ましい。
【００６４】
また、センサ構造体２２のリガンド固定領域１６と光検出手段３４との間には、光を効率よく集光するための集光部材３６と、光の内で蛍光３２のみを選択するように形成された波長選択機能部材３８が設けられており、これにて装置本体を構成している。
【００６５】
なお、図１に示したＳＰＦＳ装置１は、センサ構造体２２が装置本体に対して着脱されて使用されるような形態を意図しているが、このような形態に限定されるものではなく、センサ構造体２２が装置本体に対して固定されて使用されるような形態であっても良いものである。
【００６６】
ここで集光部材３６としては、蛍光シグナルを効率よく集光するものであれば、任意の集光系を用いることができる。簡易な集光系としては、顕微鏡などで使用されている市販の対物レンズを転用することができる。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。
【００６７】
一方、波長選択機能部材３８としては、光学フィルタ，カットフィルタなどを用いることができる。
光学フィルタとしては、減光（ＮＤ）フィルタ，ダイアフラムレンズなどが挙げられる。
【００６８】
さらにカットフィルタとしては、外光（装置外の照明光），励起光（励起光の透過成分），迷光（各所での励起光の散乱成分），プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、センサ構造体２２の面に付着した付着物などの影響で発生する散乱光），酵素蛍光基質の自家蛍光などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば干渉フィルタ，色フィルタなどが挙げられる。
【００６９】
このようにして構成されるＳＰＦＳ装置１を用いて蛍光を検出する方法としては、まずセンサ構造体２２の金属薄膜１４上のリガンド固定領域１６に検出対象となるアナライトと特異的に吸着するリガンドを固定した状態で検出対象となるアナライトを含んだ試料溶液を貫通穴２０内に供給し、センサ構造体２２を撹拌する。
【００７０】
ここでリガンド固定領域１６へのリガンドの固定は、蛍光検出を行う前から予め行っておくことが蛍光検出に要する時間を少なくする上で好ましいが、特にこれに限定されるものではなく、蛍光検出の直前に行っても良いものである。
【００７１】
さらに貫通穴２０内を洗浄した後、検体（アナライト）に捕捉される蛍光物質を含んだ溶液を貫通穴２０内に供給し撹拌した後、再度貫通穴２０内を洗浄する。これにより蛍光物質で標識されたアナライトがリガンドに捕捉された状態となる。
【００７２】
この状態で、光源２６より金属薄膜１４に励起光２４を照射し、この励起光２４が特定の角度（共鳴角（電場増強時に励起光２４と金属薄膜１４の垂線とから成る角度）θａ）で金属薄膜１４に入射することで、金属薄膜１４上に粗密波（表面プラズモン）を生ずるようになる。
【００７３】
なお、金属薄膜１４上に粗密波（表面プラズモン）が生ずる際には、励起光２４と金属薄膜１４中の電子振動とがカップリングし、反射光２８のシグナルが変化（光量が減少）することとなるため、受光手段３０で受光される反射光２８のシグナルが変化（光量が減少）する地点を見つければ、粗密波（表面プラズモン）が生ずる共鳴角θａを得ることができる。
【００７４】
そして、この粗密波（表面プラズモン）により、金属薄膜１４上のリガンド固定領域１６で生じた蛍光物質が効率良く励起され、これにより蛍光物質が発する蛍光３２の光量が増大し、この蛍光３２を集光部材３６および波長選択機能部材３８を介して光検出手段３４で受光することで、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる。
【００７５】
なお、センサ構造体２２の金属薄膜１４の材質としては、好ましくは金，銀，アルミニウム，銅，および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは金からなり、さらにこれら金属の合金から成ることである。このような金属は、酸化に対して安定であり、かつ粗密波（表面プラズモン）による電場増強が大きくなることから金属薄膜１４に好適である。
【００７６】
また、金属薄膜１４の形成方法としては、例えばスパッタリング法，蒸着法（抵抗加熱蒸着法，電子線蒸着法など），電解メッキ，無電解メッキ法などが挙げられる。中でもスパッタリング法，蒸着法は、薄膜形成条件の調整が容易であるため好ましい。
【００７７】
さらに金属薄膜１４の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、およびそれらの合金：５〜５００ｎｍの範囲内であることが好ましい。電場増強効果の観点からは、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍの範囲内であることがより好ましい。
【００７８】
金属薄膜１４の厚さが上記範囲内であれば、粗密波（表面プラズモン）が発生し易く好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜１４であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されないものである。
【００７９】
さらに、アナライト検出時に用いられる検体としては、血液，血清，血漿，尿，鼻孔液，唾液，便，体腔液（髄液，腹水，胸水等）などが挙げられる。
また、検体中に含有されるアナライトは、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド，ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子），タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等），アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。），糖質（オリゴ糖，多糖類，糖鎖等），脂質，またはこれらの修飾分子，複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー，シグナル伝達物質，ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
【００８０】
さらに蛍光物質としては、所定の励起光２４を照射するか、または電界効果を利用することで励起し、蛍光３２を発する物質であれば特に限定されないものである。なお本明細書でいう蛍光３２とは、燐光など各種の発光も含まれるものである。
【００８１】
また、誘電体部材１２としては、光学的に透明な各種の無機物，天然ポリマー，合成ポリマーを用いることができ、化学的安定性，製造安定性および光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）を含むことが好ましい。
【００８２】
さらにウェル部材１８としては、合成樹脂，金属，セラミックスなど種々の材料を用いることができ、例えば機械加工で貫通穴２０を設けることができる。
また、センサ部材１０上にウェル部材１８を固定する際には、誘電体部材１２と同じ光屈折率を有する接着剤,マッチングオイル，透明粘着シートなどを用いることが好ましい。
【００８３】
さらにウェル部材１８の貫通穴２０の大きさとしては、例えば８０〜１００μｌの容量となるように設定することが好ましい。
また、このようなＳＰＦＳ装置１は、光源２６から金属薄膜１４に照射される励起光２４による表面プラズモン共鳴の最適角（共鳴角θａ）を調整するため、角度可変部（図示せず）や、光検出手段３４に入力された情報を処理するためのコンピュータ（図示せず）などを有しても良いものである。
【００８４】
ここで、角度可変部（図示せず）は、サーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるために受光手段３０と光源２６とを同期し、４５〜８５°の角度変更を可能とし、分解能が０．０１°以上であることが好ましい。
【００８５】
このような構成を有する本発明のＳＰＦＳ装置１では、図３および図４に示したように、リガンド固定領域１６で生ずる蛍光３２を励起させる際において、光源２６から金属薄膜１４に照射される励起光２４の照射位置Ｂを、ウェル部材１８の貫通穴２０によって規定された底面領域の重心位置Ａから所定距離Ｈだけ離間した位置に、励起光２４の光軸中心が位置するよう、励起光２４の照射位置が設定されている。なお、図中符号ｒは貫通穴２０の底面領域の重心位置Ａから貫通穴２０の外形端までの最短距離である。
【００８６】
ここで励起光２４の照射位置を移動させる際には、先に説明した位置調整手段４０を用いて光源２６を移動させることが好ましいが、センサ構造体２２自体を移動させるよう構成しても良く、光源２６とセンサ構造体２２とを相対的に移動させることができれば特に限定されないものである。
【００８７】
上記した本発明のＳＰＦＳ装置１では、リガンド固定領域１６で固定されたリガンドに検体（アナライト）が確実に捕捉されるよう、ウェル部材１８の貫通穴２０内に検体を含んだ試料溶液を供給した後、センサ構造体２２を撹拌するようにしている。
【００８８】
ここでの撹拌方法は円運動による撹拌が好ましく、例えば専用の撹拌装置（図示せず）を用いて行うことができる。
なおセンサ構造体２２を円運動で撹拌すると、ウェル部材１８の貫通穴２０内で試料溶液が円を描くように移動される。この時、リガンド固定領域１６におけるリガンドとアナライトとの反応量がどのように分布するか、撹拌後のリガンド固定領域１６に金コロイドで染色して調べたところ、ウェル部材１８の貫通穴２０によって規定された底面領域の重心位置Ａを起点にして、ドーナッツ状に反応量の高い箇所が分布していることが確認された。
【００８９】
この反応量の分布をグラフ化すると、図５に示したようにウェル部材１８の貫通穴２０によって規定された底面領域の重心位置Ａから所定距離移動した位置Ｂで最も反応量の値が高くなっていることが分かる。
【００９０】
したがって本発明者は、励起光２４の照射位置Ｂを、反応量の値が最も高くなった位置に合わせて設定すれば、蛍光３２の検出効率を効果的に高めることができることを見出した。
【００９１】
また貫通穴２０の大きさやリガンドの種類などの測定条件が異なれば反応量の分布も異なると考えられるが、本発明者は貫通穴２０の底面領域の重心位置Ａから貫通穴２０の外形端までの最短距離ｒを１００％とした際、重心位置Ａから１〜７５％の範囲の位置であれば、概ね反応量の値が高くなることを見出した。
【００９２】
このため、予めこの範囲内に励起光２４の照射位置を設定するようにすれば、蛍光３２の検出効率を効果的に高めることができる。ただし、励起光２４の照射位置の移動範囲は、励起光２４の光軸の直径が、貫通穴２０内に収まる範囲内である。
【００９３】
このように本発明のＳＰＦＳ装置１では、センサ構造体２２の撹拌後の反応量の分布を調べておき、反応量の値が最も高くなった位置に励起光２４の照射位置を設定することで、蛍光３２の検出効率を効果的に高めることができる。
【００９４】
さらに本発明のＳＰＦＳ装置１で用いられるセンサ構造体２２はウェル部材１８を用いたものであるため、図１４に示したような流路型のセンサ構造体３００のようにポンプなどの送液手段を用意する必要がなく、装置を簡素化して製造コストを抑えることができる。
【００９５】
なお、上記説明したＳＰＦＳ装置１におけるセンサ構造体２２では、ウェル部材１８の貫通穴２０はストレートであるが、図６に示したように貫通穴２０の底に向かって次第に径が小さくなる逆テーパー４４が付されていても良いものである。
【００９６】
理由としては、蛍光物質から生ずる蛍光３２が放射状に拡散され、拡散された蛍光３２を光検出手段３４で効率良く集光するためである。
逆テーパー４４の傾斜角度θｂとしては、集光効率を高める上で０°より大きく４５°以下の範囲内であることが好ましい。
【００９７】
また、貫通穴２０の形状としては本実施例のように円形に限定されるものではなく、楕円形や三角形などであっても良いものであるが、図７（ａ）に示した四角形、図７（ｂ）に示した六角形のように点対称な形状であれば、撹拌を行った際に反応分布が顕著に現れるので好ましい。
【００９８】
このような円形以外の形状を有する貫通穴２０の場合にも、貫通穴２０の底面領域の重心位置Ａから貫通穴２０の外形端までの最短距離ｒを１００％として励起光２４の照射位置を規定するようにすれば良い。
【００９９】
さらに、図８に示したように、リガンド固定領域１６に固定されるリガンド１６ａ〜１６ｄの種類は一箇所の貫通穴２０に対して、複数であっても良い。
また、図９に示したように、複数の貫通穴２０を有するウェル部材１８を用いても良く、この場合には貫通穴２０毎に異なるリガンド１６ｅ〜１６ｈを固定化するようにしても良いものである。
【０１００】
なお、１つの貫通穴２０に対して複数種類のリガンドを固定した場合や、複数の貫通穴２０を有するウェル部材１８を用いた場合には、例えば光源２６に対してセンサ構造体２２が回転移動するような移動手段（図示せず）を別途設けておけば、蛍光検出をスムーズに行うことができる。
【０１０１】
さらに、上記したセンサ構造体２２では、金属薄膜１４上にウェル部材１８が固定されているが、図１０に示したように、センサ構造体２２上にパターニングなどの方法で部分的に金属薄膜１４を成膜しておき、さらに金属薄膜１４上にリガンド固定領域１６を形成し、リガンド固定領域１６および金属薄膜１４を囲うようにウェル部材１８を誘電体部材１２上に設置した形態でも構わないものである。
【０１０２】
以上、本発明のＳＰＦＳ装置１およびこれを用いた蛍光検出方法について説明したが、本発明は上記の形態に限定されるものではなく、例えば上記実施形態で説明した装置本体の構成を更に簡略化することも可能であり、本発明の目的を逸脱しない範囲で種々の変更が可能なものである。
【実施例】
【０１０３】
［実施例１］
誘電体部材１２の上面に金属薄膜１４を成膜した後、金属薄膜１４上に検出対象となるアナライトと特異的に吸着するリガンドを固定してリガンド固定領域１６を形成した。【０１０４】
直径φ５ｍｍの円形の貫通穴２０を有するウェル部材１８を用意し、これを金属薄膜１４上にマッチングオイルを介して固定し、センサ構造体２２とした。
次いでセンサ構造体２２の貫通穴２０内に検体（アナライト）を含有した試料溶液を注入し、これを円運動で撹拌する撹拌装置にセットして撹拌させた。【０１０５】
撹拌させたセンサ構造体２２から試料溶液を抜取って洗浄した後、リガンド固定領域１６の検体（アナライト）を金コロイドで染色し、染色状況をＣＣＤカメラで確認したところ、ウェル部材１８の貫通穴２０によって規定された底面領域の重心位置Ａを起点としてドーナッツ状に反応分布が生じていることが確認できた。【０１０６】
この反応分布を図１１に示したようにグラフ化した。グラフのＸ軸は、ウェル部材１８の貫通穴２０の底面領域の重心位置Ａから貫通穴２０の外形端までの最短距離ｒを１００％とした場合、貫通穴２０の底面領域の重心位置Ａからの移動距離を示しており、Ｙ軸は反応量であり、反応量の最大値を１００％とした時の割合を表したものである。【０１０７】
グラフから明らかなように、貫通穴２０の底面領域の重心位置Ａから貫通穴２０の外形端までの最短距離ｒを１００％とした際に、貫通穴２０の底面領域の重心位置Ａから８％離間した位置で、反応量が最大値を示すことが確認された。【０１０８】
［実施例２］
直径φ６．５ｍｍの円形の貫通穴２０を有するウェル部材１８を用いたこと以外は実施例１と同様にしてセンサ構造体２２を製造し、これを円運動で撹拌する撹拌装置にセットして撹拌させた。【０１０９】
撹拌させたセンサ構造体２２から試料溶液を抜取って洗浄した後、リガンド固定領域１６の検体を金コロイドで染色し、染色状況をＣＣＤカメラで確認したところ、ウェル部材１８の貫通穴２０によって規定された底面領域の重心位置Ａを起点としてドーナッツ状に反応分布が生じていることが確認できた。【０１１０】
この反応分布を図１１に示したようにグラフ化したところ、ウェル部材１８の貫通穴２０によって規定された底面領域の重心位置Ａから１５％離間した位置で、反応量が最大値を示すことが確認された。【０１１１】
［実施例３］
直径φ１２ｍｍの円形の貫通穴２０を有するウェル部材１８を用いたこと以外は実施例１と同様にしてセンサ構造体２２を製造し、これを円運動で撹拌する撹拌装置にセットして撹拌させた。【０１１２】
撹拌させたセンサ構造体２２から試料溶液を抜取って洗浄した後、リガンド固定領域１６の検体を金コロイドで染色し、染色状況をＣＣＤカメラで確認したところ、ウェル部材１８の貫通穴２０によって規定された底面領域の重心位置Ａを起点としてドーナッツ状に反応分布が生じていることが確認できた。【０１１３】
この反応分布を図１１に示したようにグラフ化したところ、ウェル部材１８の貫通穴２０によって規定された底面領域の重心位置Ａから５０％離間した位置で、反応量が最大値を示すことが確認された。【０１１４】
［実施例４］
直径φ１８ｍｍの円形の貫通穴２０を有するウェル部材１８を用いたこと以外は実施例１と同様にしてセンサ構造体２２を製造し、これを円運動で撹拌する撹拌装置にセットして撹拌させた。【０１１５】
撹拌させたセンサ構造体２２から試料溶液を抜取って洗浄した後、リガンド固定領域１６の検体を金コロイドで染色し、染色状況をＣＣＤカメラで確認したところ、ウェル部材１８の貫通穴２０によって規定された底面領域の重心位置Ａを起点としてドーナッツ状に反応分布が生じていることが確認できた。【０１１６】
この反応分布を図１１に示したようにグラフ化したところ、ウェル部材１８の貫通穴２０によって規定された底面領域の重心位置Ａから６１％離間した位置で、反応量が最大値を示すことが確認された。【０１１７】
なお、実施例１〜４の貫通穴２０の大きさは、概ね市販されているウェル部材１８の貫通穴２０の最小サイズから最大サイズである。したがって実施例１〜４の結果から、ウェル部材１８の貫通穴２０の大きさが変わっても、ウェル部材１８の貫通穴２０によって規定された底面領域の重心位置Ａからの移動距離が１〜７５％の範囲内の位置に励起光２４の照射位置を設定すれば、概ね良好な反応が生ずることが確認できた。
【符号の説明】
【０１１８】
１・・・表面プラズモン励起増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）
１０・・・センサ部材
１２・・・誘電体部材
１４・・・金属薄膜
１６・・・リガンド固定領域
１６ａ〜１６ｈ・・リガンド
１８・・・ウェル部材
２０・・・貫通穴
２０ａ〜２０ｄ・・貫通穴
２２・・・センサ構造体
２４・・・励起光
２６・・・光源
２８・・・反射光
３０・・・受光手段
３２・・・蛍光
３４・・・光検出手段
３６・・・集光部材
３８・・・波長選択機能部材
４０・・・位置調整手段
４２・・・位置調整手段
４４・・・逆テーパー
θａ・・・共鳴角
θｂ・・・逆テーパーの傾斜角度
Ａ・・・ウェル部材の貫通穴によって規定された底面領域の重心位置
Ｂ・・・光源から金属薄膜に照射される励起光の照射位置
Ｈ・・・離間距離（所定距離）
ｒ・・・貫通穴の底面領域の重心位置から貫通穴の外形端までの最短距離
１００・・・表面プラズモン共鳴装置（ＳＰＲ装置）
１０２・・・誘電体部材
１０４・・・金属薄膜
１０６・・・リガンド固定領域
１０８・・・リガンド含有層
１１０・・・センサ構造体
１１２・・・励起光
１１４・・・光源
１１６・・・反射光
１１８・・・受光手段
θ１・・・共鳴角
θ２・・・共鳴角
２００・・・表面プラズモン励起増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）
２０２・・・誘電体部材
２０４・・・金属薄膜
２０６・・・リガンド固定領域
２０８・・・リガンド含有層
２１０・・・センサ構造体
２１２・・・励起光
２１４・・・光源
２１６・・・反射光
２１８・・・受光手段
２２０・・・蛍光
２２２・・・光検出手段
２２４・・・集光部材
２２６・・・波長選択機能部材
３００・・・センサ構造体
３０２・・・誘電体部材
３０４・・・金属薄膜
３０６・・・リガンド固定領域
３０８・・・横形流路
３１０・・・試料溶液
４００・・・センサ構造体
４０２・・・誘電体部材
４０４・・・金属薄膜
４０６・・・リガンド固定領域
４０８・・・ウェル部材
４１０・・・貫通穴
４１２・・・試料溶液
【図１】
2012157403.tif 000003
【図２】
2012157403.tif 000004
【図３】
2012157403.tif 000005
【図４】
2012157403.tif 000006
【図５】
2012157403.tif 000007
【図６】
2012157403.tif 000008
【図７】
2012157403.tif 000009
【図８】
2012157403.tif 000010
【図９】
2012157403.tif 000011
【図１０】
2012157403.tif 000012
【図１１】
2012157403.tif 000013
【図１２】
2012157403.tif 000014
【図１３】
2012157403.tif 000015
【図１４】
2012157403.tif 000016
【図１５】
2012157403.tif 000017
【国際調査報告】
2012157403.tif 000018
2012157403.tif 000019
2012157403.tif 000020
2012157403.tif 000021