(57)【要約】  癌患者と健常者におけるタンパク質の発現量の多寡にのみ依存することなく、簡便で高感度に肺癌の罹患を判定できる肺癌鑑別マーカーの開発とその提供を課題とする。さらに、本願発明は、肺癌の組織型を区別できる糖鎖マーカーの開発とその提供を課題とする。  血清糖タンパク質のうち、肺癌培養細胞上清において糖鎖構造が特異的に変化した糖ペプチド及び糖タンパク質群を同定し、それを肺癌鑑別マーカーとして提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表１又は表２に記載の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質であって、表１又は表２に示す糖付加位置のアスパラギン残基に糖鎖が付加された前記糖タンパク質。
【表１】
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2012036094.tif 000017
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【表２】
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2012036094.tif 000021
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2012036094.tif 000025
【請求項２】
前記糖鎖がフコース修飾を伴う糖鎖、高マンノース型糖鎖、混成型糖鎖、複合型二本鎖糖鎖、キチン、ポリラクトサミン及びβ1-3ガラクトースエピトープからなる群より選択される一以上の糖鎖である、請求項１に記載の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質。
【請求項３】
肺小細胞癌又は肺腺癌の鑑別用である、請求項２に記載の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質。
【請求項４】
肺小細胞癌鑑別用であって、前記糖タンパク質が神経細胞接着分子（NCAM1）、セクレトグラニンIII及びインスリン様成長因子結合タンパク質-L1（IGFBP-L1）からなる群より選択される一以上の糖タンパク質である、請求項３に記載の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質。
【請求項５】
肺腺癌鑑別用であって、前記糖タンパク質がフィブロネクチン１である、請求項３に記載の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質。
【請求項６】
糖鎖が付加された、表１又は表２に示す糖付加位置のアスパラギン残基を少なくとも一つ含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質の断片。
【請求項７】
被験者より採取された試料から、表１又は表２に示す糖付加位置のアスパラギン残基に糖鎖が付加された表１又は表２に記載の一以上の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質、及び／又は糖鎖が付加された、表１又は表２に示す糖付加位置のアスパラギン残基を少なくとも一つ含む一以上の前記糖タンパク質の断片を検出することによって、該被験者が肺癌に罹患していると判定する、肺癌罹患判定方法。
【請求項８】
前記肺癌鑑別マーカー糖タンパク質及び／又はその糖タンパク質の断片を、前記糖鎖に結合する一以上の糖鎖プローブを用いて検出する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記糖鎖プローブがフコース修飾を伴う糖鎖、高マンノース型糖鎖、混成型糖鎖、複合型二本鎖糖鎖、キチン、ポリラクトサミン又はβ1-3ガラクトースエピトープに結合する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記糖鎖プローブがレクチン、抗体又はファージ抗体である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記レクチンがAAL、ConA、PWM又はPNAである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記肺癌鑑別マーカー糖タンパク質が神経細胞接着分子（NCAM1）であり、AALとの結合を検出することによって、肺癌の組織型が小細胞癌であることを判定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記肺癌鑑別マーカー糖タンパク質がセクレトグラニンIIIであり、AAL及び／又はConAとの結合を検出することによって、肺癌の組織型が小細胞癌であることを判定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記肺癌鑑別マーカー糖タンパク質がインスリン様成長因子結合タンパク質-L1（IGFBP-L1）であり、ConA及び／又はPWMとの結合を検出することによって、肺癌の組織型が小細胞癌であることを判定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記肺癌鑑別マーカー糖タンパク質がフィブロネクチン１であり、AAL及び／又はPNAとの結合を検出することによって、肺癌の組織型が腺癌であることを判定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記肺癌鑑別マーカー糖タンパク質及び／又はその糖タンパク質の断片の糖鎖に対する前記糖鎖プローブの結合結果及び表１又は表２に記載の前記肺癌鑑別マーカー糖タンパク質及び／又はその糖タンパク質の断片の前記糖鎖プローブに対する結合態様に基づいて、肺癌の組織型が小細胞癌又は腺癌であることを判定する、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料が体液、細胞又は肺洗浄液である、請求項７〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記体液が、血液（血清、血漿及び間質液を含む）、リンパ液、細胞の抽出液、痰又は胸水である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
表１又は表２に示す糖付加位置のアスパラギン残基に糖鎖が付加された表１又は表２に記載の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質、及び／又は糖鎖が付加された、表１又は表２に示す糖付加位置のアスパラギン残基を少なくとも一つ含む前記糖タンパク質断片に結合して、肺癌を鑑別する組織染色用肺癌細胞鑑別抗体。
【請求項２０】
肺癌細胞の組織型を鑑別可能な、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２１】
前記肺癌鑑別マーカー糖タンパク質が神経ペントラキシン受容体であり、かつ肺癌細胞の組織型が小細胞癌由来の細胞であることを鑑別する、請求項２０に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、糖鎖を有する肺癌鑑別マーカー糖タンパク質又はその糖タンパク質断片、及びそれを用いた肺癌の罹患又は肺癌の組織型を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、難治性癌の代表例であり、2009年の日本における男性癌死の第一位、また女性癌死の第二位を占めている。肺癌は、約10％を占める小細胞癌（肺小細胞癌）と約90％を占める非小細胞癌に大別され、非小細胞癌は、さらに腺癌（肺腺癌）（60％）、扁平上皮癌（肺扁平上皮癌）（25％）及び大細胞癌（肺大細胞癌）（5％）に分類される。【０００３】
肺小細胞癌は、非常に悪性度の高い癌であるため、早期においても転移傾向が強く、これまでの症例から発見時には既に全身へと転移している可能性が高い。したがって、通常はリンパや他の組織への転移が確認できなくても、非手術療法が選択されることが多い。一方でこの癌は、化学療法や放射線に対する感受性が高いことから、非手術療法のうち化学療法が治療の中心となる。【０００４】
これに対して、肺癌の大部分を占める肺非小細胞癌は、化学療法や放射線に対する感受性が低いため、治療には比較的に早期に発見し、手術療法によって病巣を取り除くことが重要となる。【０００５】
肺癌の検査は、その検査目的によって、（１）肺癌に罹患している可能性があるか否かを検査する肺癌罹患判定、（２）罹患の可能性がある場合、それが肺癌であることを確認し、結論付ける肺癌罹患確定、（３）肺癌が確定した場合、その癌組織型及び進行度がどの程度であるかを検査する肺癌進行度決定の３つに大別することができる。【０００６】
これらの検査では、胸部X線検査やCT検査による肺野異常影の確認を行い、続いて、気管支鏡検査やバイオプシー等を用いた生検サンプルの病理診断によって癌種の確定及び進行度を総合的に判定していく方法が、一般的には採用されている。しかし、小細胞癌と非小細胞癌が混在する症例や境界領域の癌においては、病理医の間でも鑑別結果が分かれるケースもあり、未だに正確な確定診断を行うには至っていない。【０００７】
また、近年では、腫瘍マーカーが癌の予後診断等に用いられている。腫瘍マーカーとは、癌細胞が産生する物質又は癌細胞に反応して細胞が産生する物質である。血清中に包含される当該腫瘍マーカーの量は、腫瘍量や組織型を反映することから、腫瘍マーカーは、癌判定等の鑑別子となり得、診断の補助、組織型や進行度の推測、治療の効果判定や再発予測、予後の推定等に利用することができる。肺癌においても、現在、CEA、CYFRA、NSE、ProGRP、SCC及びSLX等のいくつかの腫瘍マーカーが知られている（非特許文献１〜３）。しかし、いずれの腫瘍マーカーも、健常者と肺癌患者における血液中又は組織中のタンパク質の発現量の差異、すなわち、発現の多寡に基づくものであり、通常、正常細胞でも発現しているため、肺癌特異性は低い。それ故、得られた結果の信頼性や検出感度も低いという問題を包含していた。さらに、肺癌がいずれの組織型に属するのかを判定する有用な肺癌マーカーは、これまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Molina R, et al., (2005) Anticancer Res 25: 1773-1778.
【非特許文献２】Mizuguchi S, et al., (2007) Ann Thorac Surg 83: 216-221.
【非特許文献３】Holdenrieder S, et al., (2008) Clin Cancer Res 14: 7813-7821.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本願発明は、癌患者と健常者におけるタンパク質の発現量の多寡にのみ依存することなく、簡便で高感度に肺癌の罹患を判定できる肺癌鑑別マーカーの開発を課題とする。より具体的には、肺癌罹患時の指標となる肺癌特異的な鑑別マーカー糖タンパク質及びその糖タンパク質断片の開発を課題とする。【００１０】
また、本願発明は、肺癌における組織型を鑑別できる肺癌鑑別マーカーの開発も課題とする。【００１１】
さらに、本願発明は、組織染色において肺癌、さらにはその組織型を鑑別する肺癌鑑別用糖鎖プローブの開発も課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
細胞から分泌されるタンパク質上の糖鎖の組成及び構造多様性は、数百もの糖鎖関連遺伝子の発現バランスに基づき制御され、細胞の分化、癌の進展の程度に応じて変動する。この糖鎖構造が変化する糖タンパク質は、腫瘍マーカーを含む疾患病態指標マーカーとして利用できる。近年、このようなプロテオミクスを基盤とした糖鎖関連腫瘍マーカーの探索が盛んに進められている。前記マーカー探索のパイプラインでは、まず、フェーズ１として、大規模解析により候補分子が同定される。続いて、フェーズ２として、定量的解析により候補分子が検証され、その候補が絞り込まれる。さらに、フェーズ３として、バリデーション試験がなされる。【００１３】
本発明者らは、前記課題を解決するために、上記マーカー探索パイプラインをベースにしたグライコプロテオミクスを利用して、肺癌鑑別マーカーの探索を行った。その結果、血清糖タンパク質のうち、肺癌培養細胞上清において検出された肺癌特異的な構造を有する新規の糖タンパク質群又は糖ペプチド群を同定することができた。また、これらの糖タンパク質群又は糖ペプチド群を用いて、肺癌の罹患及び肺癌の組織型を鑑別できることが明らかとなった。本発明は、これらの知見に基づくものであって、以下を提供する。【００１４】
（１）表１又は表２に記載の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質であって、表１又は表２に示す糖付加位置のアスパラギン残基に糖鎖が付加された前記糖タンパク質。
【表１】
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【００１５】
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【００１６】
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【００１７】
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【表２】
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【００１８】
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【００１９】
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【００２０】
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【００２１】
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【００２２】
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【００２３】
（２）前記糖鎖がフコース修飾を伴う糖鎖、高マンノース型糖鎖、混成型糖鎖、複合型二本鎖糖鎖、キチン、ポリラクトサミン及びβ1-3ガラクトースエピトープからなる群より選択される一以上の糖鎖である、（１）に記載の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質。【００２４】
（３）肺小細胞癌又は肺腺癌の鑑別用である、（２）に記載の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質。【００２５】
（４）肺小細胞癌鑑別用であって、前記糖タンパク質が神経細胞接着分子（NCAM1）、セクレトグラニンIII及びインスリン様成長因子結合タンパク質-L1（IGFBP-L1）からなる群より選択される一以上の糖タンパク質である、（３）に記載の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質。【００２６】
（５）肺腺癌鑑別用であって、前記糖タンパク質がフィブロネクチン１である、（３）に記載の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質。【００２７】
（６）糖鎖が付加された、表１又は表２に示す糖付加位置のアスパラギン残基を少なくとも一つ含む（１）〜（５）のいずれかに記載の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質の断片。【００２８】
（７）被験者より採取された試料から、表１又は表２に示す糖付加位置のアスパラギン残基に糖鎖が付加された表１又は表２に記載の一以上の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質、及び／又は糖鎖が付加された、表１又は表２に示す糖付加位置のアスパラギン残基を少なくとも一つ含む一以上の前記糖タンパク質の断片を検出することによって、該被験者が肺癌に罹患していると判定する、肺癌罹患判定方法。【００２９】
（８）前記肺癌鑑別マーカー糖タンパク質及び／又はその糖タンパク質の断片を、前記糖鎖に結合する一以上の糖鎖プローブを用いて検出する、（７）に記載の方法。【００３０】
（９）前記糖鎖プローブがフコース修飾を伴う糖鎖、高マンノース型糖鎖、混成型糖鎖、複合型二本鎖糖鎖、キチン、ポリラクトサミン又はβ1-3ガラクトースエピトープに結合する、（８）に記載の方法。【００３１】
（１０）前記糖鎖プローブがレクチン、抗体又はファージ抗体である、（８）又は（９）に記載の方法。【００３２】
（１１）前記レクチンがAAL、ConA、PWM又はPNAである、（１０）に記載の方法。【００３３】
（１２）前記肺癌鑑別マーカー糖タンパク質が神経細胞接着分子（NCAM1）であり、AALとの結合を検出することによって、肺癌の組織型が小細胞癌であることを判定する、（１１）に記載の方法。【００３４】
（１３）前記肺癌鑑別マーカー糖タンパク質がセクレトグラニンIIIであり、AAL及び／又はConAとの結合を検出することによって、肺癌の組織型が小細胞癌であることを判定する、（１１）に記載の方法。【００３５】
（１４）前記肺癌鑑別マーカー糖タンパク質がインスリン様成長因子結合タンパク質-L1（IGFBP-L1）であり、ConA及び／又はPWMとの結合を検出することによって、肺癌の組織型が小細胞癌であることを判定する、（１１）に記載の方法。【００３６】
（１５）前記肺癌鑑別マーカー糖タンパク質がフィブロネクチン１であり、AAL及び／又はPNAとの結合を検出することによって、肺癌の組織型が腺癌であることを判定する、（１１）に記載の方法。【００３７】
（１６）前記肺癌鑑別マーカー糖タンパク質及び／又はその糖タンパク質の断片の糖鎖に対する前記糖鎖プローブの結合結果及び表１又は表２に記載の前記肺癌鑑別マーカー糖タンパク質及び／又はその糖タンパク質の断片の前記糖鎖プローブに対する結合態様に基づいて、肺癌の組織型が小細胞癌又は腺癌であることを判定する、（８）〜（１１）のいずれかに記載の方法。【００３８】
（１７）前記試料が体液、細胞又は肺洗浄液である、（７）〜（１６）のいずれかに記載の方法。【００３９】
（１８）前記体液が、血液（血清、血漿及び間質液を含む）、リンパ液、細胞の抽出液、痰又は胸水である、（１７）に記載の方法。【００４０】
（１９）表１又は表２に示す糖付加位置のアスパラギン残基に糖鎖が付加された表１又は表２に記載の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質、及び／又は糖鎖が付加された、表１又は表２に示す糖付加位置のアスパラギン残基を少なくとも一つ含む前記糖タンパク質断片に結合して、肺癌を鑑別する組織染色用肺癌細胞鑑別抗体。【００４１】
（２０）肺癌細胞の組織型を鑑別可能な、（１９）に記載の抗体。【００４２】
（２１）前記肺癌鑑別マーカー糖タンパク質が神経ペントラキシン受容体（neuronal pentraxin receptor; NPR）であり、かつ肺癌細胞の組織型が小細胞癌由来の細胞であることを鑑別する、（２０）に記載の抗体。【００４３】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010-209932号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００４４】
本願発明の肺癌鑑別マーカーによれば、体液、細胞又は肺洗浄液を検査することにより簡便に、高い信頼性で肺癌の罹患の有無を判定することができる。さらに、本願の肺癌鑑別マーカーによれば、肺癌の組織型を鑑別することができる。【００４５】
また、本願発明の方法によれば、体液、細胞又は肺洗浄液から既存の腫瘍マーカーよりも高い正診率で、かつ低侵襲性で、肺癌罹患及び肺癌組織型を判定することができる。【００４６】
さらに、本願発明の肺癌鑑別用糖鎖プローブによれば、組織染色において肺癌、さらにはその組織型を鑑別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】肺小細胞癌培養細胞（Sc）と肺腺癌培養細胞（Ad）の培養上清中における肺小細胞癌鑑別マーカー糖タンパク質の発現を示すウェスタンブロッティング図
【図２】肺小細胞癌培養細胞（Sc）と肺腺癌培養細胞（Ad）の培養上清中における肺腺癌鑑別マーカー糖タンパク質の発現を示すウェスタンブロッティング図
【図３】各レクチンによって分画した肺小細胞癌培養細胞（Sc）と肺腺癌培養細胞（Ad）の培養上清中の各々の抗肺癌鑑別マーカータンパク質抗体で検出したウェスタンブロッティング図
【図４】抗体（抗フィブロネクチン１抗体）によって分画した肺小細胞癌培養細胞（Sc）と肺腺癌培養細胞（Ad）の培養上清中の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質（フィブロネクチン１）をAALレクチンで検出したブロッティング図
【図５】AALレクチンによって分画した肺小細胞癌患者（Sc）と肺腺癌患者（Ad）の血清中の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質（NCAM、フィブロネクチン１）を各々の抗肺癌鑑別マーカー糖タンパク質抗体で検出したウェスタンブロッティング図
【図６】連続クロマトグラフィー処理血清によって分画した肺小細胞癌患者（Sc）と肺腺癌患者（Ad）の血清中の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質（セクレトグラニンIII）を抗体（抗セクレトグラニンIII抗体）で検出したウェスタンブロッティング図
【図７】抗神経ペントラキシン受容体（NPR）抗体を用いた肺癌の各組織型における組織染色図
【図８】連続クロマトグラフィー処理多検体血清によって分画した肺小細胞癌患者（Sc）と肺腺癌患者（Ad）の血清中の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質（セクレトグラニンIII）を抗体（抗セクレトグラニンIII抗体）で検出したウェスタンブロッティング図
【図９】肺小細胞癌培養細胞（Sc）と肺腺癌培養細胞（Ad）の培養上清より抗体（抗インスリン様成長因子結合タンパク質-L1抗体）によって精製した溶出液を用いた抗体オーバーレイ・レクチンアレイでの肺癌鑑別マーカー糖タンパク質（インスリン様成長因子結合タンパク質-L1）によるPWMレクチンスポット上の蛍光シグナル強度の比較図
【図１０】肺小細胞癌培養細胞（Sc）と肺腺癌培養細胞（Ad）の培養上清より抗体（抗フィブロネクチン１抗体）によって精製した溶出液を用いた抗体オーバーレイ・レクチンアレイでの肺癌鑑別マーカー糖タンパク質（フィブロネクチン１）によるPNAレクチンスポット上の蛍光シグナル強度の比較図
【発明を実施するための形態】
【００４８】
１．肺癌鑑別マーカー糖タンパク質及びその糖タンパク質断片
本発明の第１の実施形態は、前記表１又は表２に記載の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質及びその糖タンパク質の断片である。
【００４９】
１−１．肺癌鑑別マーカー糖タンパク質
本実施形態の「肺癌鑑別マーカー糖タンパク質」は、表１においてタンパク質番号＃１〜３１で、及び表２においてタンパク質＃１〜４８で、それぞれ示されるタンパク質が該当する。これらのタンパク質は、いずれもそのアミノ酸配列において、少なくとも表中の「糖鎖付加位置」で示される位置（開始アミノ酸残基の位置を１とする）のアスパラギン残基に糖鎖が付加された肺癌特異的な糖タンパク質である。例えば、表１のタンパク質＃１のacid alpha-glucosidase（酸性αグルコシダーゼ）であれば、そのタンパク質のアミノ酸配列上の少なくとも３９０位、４７０位及び８８２位のアスパラギン残基に糖鎖が付加されている。以降本明細書では、糖鎖が付加されたタンパク質を「糖タンパク質」として表す。
【００５０】
表中の「gi(ID)」は、本実施形態の糖タンパク質におけるID番号を示す。一つのタンパク質に複数のgi(ID)が登録されている場合には、それらを全て表中に記載している。また、一つのタンパク質に複数のアイソフォームが存在する場合にも、それらのgi(ID)をそのアイソフォーム番号と共に記載している。
【００５１】
上記アスパラギン残基に付加された糖鎖は、肺癌特異的に付加された糖鎖であれば特に制限はしない。例えば、フコース修飾（フコシル化）を伴う糖鎖、高マンノース型糖鎖、混成型糖鎖、複合型二本鎖糖鎖、キチン、ポリラクトサミン又はβ1-3ガラクトースエピトープ等が挙げられる。ここで、「肺癌特異的に付加された糖鎖」とは、前記表中の「糖鎖付加位置」で示されるアスパラギン残基において、肺癌細胞由来のタンパク質にのみ付加される糖鎖をいう。それ故、原則として、本実施形態の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質とは、肺癌細胞から産生される糖タンパク質である。したがって、これらの糖タンパク質を認識する糖鎖プローブを用いて、例えば、被験者の血清中におけるその糖タンパク質の有無を検出することで、その糖タンパク質を有する個体は、肺癌に罹患していると判定することができる。
【００５２】
本明細書において「糖鎖プローブ」とは、特定の糖鎖及び／又は糖タンパク質等の複合糖質を特異的に認識し、それに結合する判定子をいう。例えば、レクチン、抗体又はファージ抗体が挙げられる。
【００５３】
「肺癌」には、前述のように、小細胞癌と、非小細胞癌である腺癌、扁平上皮癌及び大細胞癌からなる組織型が知られている。また、肺において神経内分泌型の癌も知られており、その多くは小細胞癌に分類されるが、その他の組織型の癌でも同様に見られる場合が知られている。本実施形態の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質は、前記所定のアスパラギン残基に付加された糖鎖の種類によって、いずれの組織型に該当するかを鑑別することができる。例えば、表１においてタンパク質＃１で示されるacid alpha-glucosidase（酸性αグルコシダーゼ）では、肺小細胞癌由来の糖タンパク質のみに前記所定のアスパラギン残基にフコース修飾を伴う糖鎖が付加されている。したがって、フコース修飾を伴う糖鎖に結合し、それを認識できるレクチン又は抗体を用いれば、acid alpha-glucosidaseは、肺癌鑑別マーカー糖タンパク質として肺癌を鑑別できると共に、その肺癌が小細胞癌であることを鑑別するマーカーにもなり得る。また、表１においてタンパク質＃２で示されるbiotinidase（ビオチニダーゼ）では、肺腺癌由来の糖タンパク質でのみ前記所定のアスパラギン残基にフコース修飾を伴う糖鎖が付加されている。したがって、フコース修飾を伴う糖鎖に結合し、それを認識できるレクチン又は抗体を用いれば、biotinidaseは、肺癌鑑別マーカー糖タンパク質として肺癌を鑑別できると共に、その肺癌が腺癌であることを鑑別するマーカーにもなり得る。
【００５４】
フコース修飾を伴う糖鎖は、AALレクチンによって検出することができ、高マンノース型糖鎖、混成型糖鎖及び複合型二本鎖糖鎖は、ConAレクチンによって検出することができ、キチン及びポリラクトサミンは、PWMレクチンによって検出することができ、そしてβ1-3ガラクトースエピトープは、PNAレクチンによって検出することができる。表１では、肺癌鑑別マーカー糖タンパク質がAALレクチン又はConAレクチンと結合する場合には「○」で、結合しない場合には「×」で、それぞれ示している。タンパク質＃１で示されるacid alpha-glucosidaseを例に挙げれば、肺小細胞癌由来の糖タンパク質のみがフコース修飾を伴う糖鎖を所定のアスパラギン残基に有することから、「小細胞癌」の「AAL」のみが「○」で示され、他は「×」となっている。表１及び表２における他の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質についても同様である。したがって、表１及び表２で示した各肺癌鑑別マーカー糖タンパク質（その肺癌鑑別マーカー糖タンパク質断片を含む）は、表１及び表２の「小細胞癌」と「腺癌」に対するAALレクチンとConAレクチンとの結合態様に基づいて、肺小細胞癌又は肺腺癌の鑑別用マーカーとなり得る。
【００５５】
１−２．肺癌鑑別マーカー糖タンパク質の断片
本実施形態の「肺癌鑑別マーカー糖タンパク質（の）断片」とは、前記肺癌鑑別マーカー糖タンパク質の一部からなるオリゴペプチド又はポリペプチドの断片であって、そのアミノ酸配列中に表１又は表２に示す糖付加位置のアスパラギン残基を少なくとも一つ含み、かつそのアスパラギン残基に前記「１−１．肺癌鑑別マーカー糖タンパク質」で説明した肺癌特異的な糖鎖が付加されていることを特徴とする。
【００５６】
肺癌鑑別マーカー糖タンパク質断片のアミノ酸の長さは、特に限定はしないが、好ましくは、５〜１００アミノ酸、８〜８０アミノ酸又は８〜５０アミノ酸である。本明細書では、肺癌鑑別マーカー糖タンパク質断片を、以降しばしば「糖タンパク質断片」又は「糖ペプチド」として表す。また、前記肺癌鑑別マーカー糖タンパク質とその糖タンパク質断片をまとめて表す場合、以降「肺癌鑑別マーカー」とする。
【００５７】
肺癌鑑別マーカー糖タンパク質断片の具体的な例としては、表１及び表２に記載の配列番号１〜２２３で示されるアミノ酸配列からなる糖ペプチドが挙げられる。これらは、本実施形態の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質を同定する際に、後述するIGOT法で得られた糖タンパク質断片であって、いずれも前記肺癌鑑別マーカー糖タンパク質と同様に、肺癌鑑別マーカーとして、肺癌に罹患しているか否かを、また、前記所定のアスパラギン残基に付加された糖鎖の種類によって、いずれの組織型に該当するかを、鑑別することができる。表１及び表２に示したアミノ酸配列中、下線を引いたアスパラギン残基（N）は、糖鎖が付加されているアスパラギン残基であることを示す。
【００５８】
１−３．肺癌鑑別マーカー糖タンパク質の取得
本実施形態の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質断片及び肺癌鑑別マーカー糖タンパク質を取得及び同定した方法について、以下で説明をする。
【００５９】
１−３−１．肺癌特異的候補糖タンパク質の大規模同定 
肺癌特異的糖タンパク質の大規模な選択的捕集、濃縮は、大きく分けて、糖鎖との親和性を有するプローブを用いる方法、糖鎖との化学反応を利用する方法（Zhang H.et al.Nat Biotechnol 21、660-666 (2003)）、糖鎖への親和性タグを導入する方法等、いずれの方法も利用することができるが、ここでは、表１及び表２の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質の取得に用いたプローブを用いる方法について説明する。
【００６０】
まず、癌細胞が特徴的に産生する糖鎖に反応するレクチン又は糖鎖抗体をプローブとして選択する。
【００６１】
プローブレクチンは、レクチンマイクロアレイを用いた糖鎖プロファイルの統計解析により選出することができる。その他に、文献情報（癌化に伴うフコシル化の亢進等、使うべきプローブレクチンを予想できるものもある）や、組織型鑑別性を加味して選択することもできる。基本的にはプロファイルの統計解析から選択し、選択されたレクチンの結合特異性から選択の妥当性を判断する。肺癌を標的とする場合には、例えば、フコシル化を検出できるヒイロチャワンタケ(Aleuria aurantia)由来のAALレクチン、高マンノース型糖鎖、混成型糖鎖又は複合型二本鎖糖鎖を検出できるタチナタマメ（Canavalia ensiformis）由来のConAレクチン、キチン又はポリラクトサミンを検出できるヨウシュヤマゴボウ（Phytolacca americana）由来のPWMレクチン、及び／又はβ1-3ガラクトースエピトープを検出できるラッカセイ（Arachis hypogaea）由来のPNAレクチン等を用いることができる。
【００６２】
抗体プローブ又はファージ抗体プローブは、抗原（糖鎖）の構造を明白にしてから作製することもできるが、必要条件ではなく、抗原糖鎖又は糖ペプチドの構造が未知のままでも作製することもできる。
【００６３】
候補糖タンパク質の大規模同定は、具体的には、まず、前記糖鎖プローブ（プローブレクチン及び／又は抗体プローブ、ファージ抗体プローブ）を用いて肺癌由来の培養細胞株の培地上清から候補糖タンパク質を捕集する。肺癌由来の培養細胞上清を用いることで、癌細胞由来の糖タンパク質を特定することが出来るため、健常者の血清由来の糖タンパク質上に存在する糖鎖との違いを容易に検出することができ、これは血清から候補分子の選択的取得を行うために有用な情報となり得る。肺癌は、小細胞癌又は非小細胞癌（腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌）のいずれの肺癌の組織型を用いてもよい。それぞれの組織型から候補糖タンパク質を捕集し、その結果を対比し、分析することで、組織型非特異的肺癌鑑別マーカーや組織型特異的肺癌鑑別マーカーを取得することもできる。
【００６４】
１−３−２．IGOT法による糖ペプチドの同定
捕集された肺癌鑑別マーカー候補糖タンパクは、次に、IGOT法（isotope-coded glycosylation site-specific tagging：糖鎖付加位置安定同位体標識法）と質量分析法に基づく方法で処理され、その候補糖タンパクのコア糖ペプチドが同定される。例えば、特開2004-233303号公報（特許第4220257号）やKaji H,ほかMass spectrometric identification of N-linked glycopeptides using lectin-mediated affinity capture and glycosylation site-specific stable isotope tagging. Nature Protocols 1, 3019-3027 (2006)に記載のLec-IGOT-LC/MS法により前記糖ペプチドを分析することができる。具体的な方法について、一例を挙げて、以下で説明をする。
【００６５】
（１）糖鎖切除とIGOT法
プローブレクチン又はプローブ抗体で捕集された前記候補糖タンパク質群をプロテアーゼで消化して、得られたペプチド群から試料となる候補糖ペプチド群を、同じプローブを用いて再捕集する。又は、試料粗タンパク質混合物から候補糖タンパク質群を分離することなく、粗タンパク質混合物をプロテアーゼ消化して、得られた粗ペプチド群より、直接プローブレクチン又はプローブ抗体で捕集することもできる。続いて、得られた候補糖ペプチドをIGOT法により標識する。IGOT法では、同位体酸素でラベルされた水の中でグリコペプチダーゼ等の酵素で処理して糖鎖を解離させ、この処理によって、糖鎖結合部位のアスパラギンがアスパラギン酸となり、このときに水中の同位体酸素（18O）が候補糖ペプチドに取り込まれる。
【００６６】
（２）標識ペプチドのLC/MSショットガン分析
IGOT法で標識された候補糖ペプチドを液体カラムクロマトグラフィー（LC）で分離し、質量分析（MS）に導入し、タンデム質量分析法により、そのアミノ酸配列を網羅的に同定する。
【００６７】
（３）候補糖ペプチドの同定
例えば、標準技術集（特許庁編）、質量分析の３−６−２−２アミノ酸配列解析に示されるMS/MSイオンサーチ法により、得られた各候補糖ペプチドのMS/MSペプチド測定結果に対して、データベースに登録された全タンパク質のアミノ酸配列から、実際に使用したプロテアーゼの特異性にしたがって予測される全ペプチドの仮想的MS/MSスペクトルと比較して、検索することができる。検索においては、アミノ酸の修飾、すなわち、メチオニン残基側鎖の酸化、アミノ末端グルタミンのピロ化（脱アミド化、環化）、アミノ末端の脱アミノ化（カルバミドメチルシステイン）アスパラギン残基側鎖の脱アミド化（ただし、安定同位体酸素の取り込みが生じたもの）を勘案する。その候補糖ペプチドを含む候補糖タンパク質の同定は、検索ソフトMascotにより行う。
【００６８】
（４）糖鎖結合位置の同定
MS/MSイオンサーチ法によって同定された候補糖ペプチドのうち、アスパラギン残基側鎖に脱アミド化（安定同位体取り込み）が生じ、かつN結合型糖鎖付加のコンセンサス配列（Asn-Xaa-[Ser/Thr]、ただしXaaはProでない）を含む候補糖ペプチドを本実施形態の糖タンパク質断片とする。また、得られた糖タンパク質断片のコンセンサス配列中のアスパラギン残基を糖鎖結合部位とする。なお、XaaがLys/Argであり、同定されたペプチド配列がこの位置で切除されている場合には、そのタンパク質全体のアミノ酸配列を参照し、Xaaの次の残基が[Ser/Thr]であれば、その候補糖ペプチドも糖タンパク質断片に含めるものとする。原則的にはコンセンサス配列が糖鎖結合位置であるが、これに則らない部位も報告されている。本願ではペプチド-N-グリカナーゼ（グリコペプチダーゼF、PNGase）処理で切除される糖鎖結合位置を同定することができる。
【００６９】
上記方法によって選択された肺癌鑑別マーカー糖タンパク質断片群及びそのアミノ酸配列に基づいて同定されたその断片を含む肺癌鑑別マーカー糖タンパク質が、表１及び表２に示した糖タンパク質断片群及び糖タンパク質である。
【００７０】
上記糖タンパク質断片群及び糖タンパク質は、それを認識するレクチン又は抗体を用いて、例えば、被験者の血清中の有無を検証することで、その被験者の肺癌の罹患を判定する肺癌鑑別マーカーとなり得る。
【００７１】
１−３−３．肺癌鑑別マーカーの検証
前記１−３−２の項で絞り込まれた肺癌鑑別マーカーについては、その有意性をさらに検証することができる。例えば、肺癌培養細胞上清中からプローブレクチンで捕集した糖タンパク質及び／又は糖タンパク質断片を、前記分離・同定された肺癌鑑別マーカーを特異的に認識する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング又は免疫沈降によって検出し、確認することができる。本明細書においては、表１に示した３１種の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質及びその糖タンパク質断片が、上記抗体検出によって、さらに選択された肺癌鑑別マーカーに該当する。
【００７２】
また、前記抗体検出によって選択された肺癌鑑別マーカーをさらに検証してもよい。例えば、肺癌患者の血清中からプローブレクチンを用いて捕集し、前記特異的抗体を用いて検出することもできる。一例として、図５で示す表１に記載の神経細胞接着分子（NCAM1）（表１におけるタンパク質＃１９）及びフィブロネクチン１（表１におけるタンパク質＃８）、並びに図６及び８で示すセクレトグラニンIII（表１におけるタンパク質＃２３）は、このさらなる検証によってその有用性が確認された肺癌鑑別マーカー糖タンパク質である。ここで、神経細胞接着分子は、表１より肺小細胞癌でのみAALレクチンと結合することから、肺小細胞癌を鑑別可能な肺癌鑑別マーカーとなり得る。また、セクレトグラニンIIIは、表１より肺小細胞癌でのみAALレクチン及びConAレクチンと結合することから、肺小細胞癌を鑑別可能な肺癌鑑別マーカーとなり得る。一方、フィブロネクチン１は、表１より肺腺癌でのみAALレクチンと結合することから、肺腺癌を鑑別可能な肺癌鑑別マーカーとなり得る。  あるいは、例えば、肺癌細胞株の培養上清中から前記特異的抗体を用いて捕集し、レクチンアレイを用いて検出してもよい。一例として、図９で示す表１に記載のインスリン様成長因子結合タンパク質-L1（IGFBP-L1）（表１におけるタンパク質＃１２）、図１０で示す表１に記載のフィブロネクチン１（表１におけるタンパク質＃８）は、当該さらなる検証によってその有用性が確認された肺癌鑑別マーカー糖タンパク質である。ここで、インスリン様成長因子結合タンパク質-L1（IGFBP-L1）は、図９より肺小細胞癌で強いPWMレクチンスポット上の蛍光シグナルを検出できることから、肺小細胞癌を鑑別可能な肺癌鑑別マーカーとなり得る。一方、フィブロネクチン１は、図１０より肺腺癌でのみPNAレクチンスポット上の蛍光シグナルを検出できることから、肺腺癌を鑑別可能な肺癌鑑別マーカーとなり得る。
【００７３】
１−４．肺癌鑑別マーカー糖ペプチド及び糖タンパク質の検出
１−４−１．質量分析法
肺癌鑑別マーカー糖ペプチド及び糖タンパク質は、糖鎖に結合するプローブレクチン等で捕集した試料について、質量分析計を検出器として検出することができる。
【００７４】
肺癌鑑別マーカー糖ペプチドの検出は、好適には捕集した糖ペプチドの糖鎖を切除処理した後、液体クロマトグラフィー（LC）で分離し、溶出したペプチドを順次、直接オンラインで質量分析計（MS）に導入し、検出することができる。質量スペクトルの収集は、単に質量スペクトルを取得することに加え、衝突誘起解離（CID）等の破断法を利用したMS/MSスペクトルの取得、さらには、予め選択したイオンが検出された場合のみCID等で破断し、生じた複数のフラグメントイオンを検出すること（シングルリアクションモニタリング、あるいはマルチリアクションモニタリングと呼ばれる手法）もできる。さらに分析試料に、肺癌鑑別マーカー糖ペプチドのコアペプチド部分を合成し、その一部に安定同位体を取り込ませて質量差を生じさせた対象ペプチドを加え、それぞれのシグナル強度を比較することで相対的あるいは絶対的定量分析を行うこともできる。簡易的には検出されたイオンのシグナル強度を複数の試料間あるいは標準試料と比較し、簡易定量することもできる。
【００７５】
肺癌鑑別マーカー糖タンパク質の検出には、様々な公知のプロテオミクスの手法を用いることができる。例えば、捕集したタンパク質を一次元あるいは二次元のゲル電気泳動を用いて分離し、標的スポットの検出強度（染色、蛍光等）を標準試料と比較し、定量することができる。質量分析計を利用した検出法としては、捕集したタンパク質群をプロテアーゼで消化し、生じたペプチドをLC/MS法で分析検出することができる。定量するには安定同位体標識を利用した各種方法（ICAT、MCAT、iTRAQ、SILAC法等）や非標識の簡易定量法（ペプチドカウント法、エリア積算法等）を併用することができる。さらに後述するように、ELISA法によって定量することも可能である。
【００７６】
１−４−２．レクチンマイクロアレイ
（１）レクチンマイクロアレイによる糖鎖プロファイリング
（ａ）レクチンマイクロアレイ（単にレクチンアレイとも呼ぶ）
レクチンアレイは、糖鎖プローブとして、複数種の特異性の異なるレクチンを1つの基板上に並列に固定（アレイ化）したもので、分析対象となる複合糖質にどのレクチンがどれだけ相互作用したかを一斉に解析できるものである。レクチンアレイを用いることで、糖鎖構造推定に必要な情報が一度の分析で取得でき、かつ、サンプル調製からスキャンまでの操作工程は迅速かつ簡便にできる。質量分析等の糖鎖プロファイリングシステムでは、糖タンパク質をそのまま分析することはできず、あらかじめ糖ペプチドや遊離糖鎖の状態にまで処理をしなければならない。一方、レクチンマイクロアレイでは、例えば、コアタンパク質部分へ直接蛍光体を導入するだけで、そのまま分析できるという利点がある。レクチンマイクロアレイ技術は、本発明者等が開発したもので、その原理・基礎は、例えば、Kuno A., et al. Nat. Methods 2,851-856(2005).に記載されている。
【００７７】
レクチンアレイに用いる代表的なレクチンとしては、例えば、次の表３に記載のものが挙げられる。
【表３】
2012036094.tif 000012
【００７８】
例えば、上記４３種類のレクチンを含む４５種類のレクチンを基盤に固定化したレクチンアレイ（GPバイオサイエンス社製のLecChip）が既に商用上入手可能である。
【００７９】
（２）レクチンアレイによる糖鎖プロファイルの統計解析
レクチンアレイは、現在では、精製標品だけでなく、血清や細胞ライセート等の混合試料の定量比較糖鎖プロファイリングができる実用化技術にまで発展してきている。特に細胞表層糖鎖の比較糖鎖プロファイリングはその発展がめざましい（Ebe, Y. et al. J. Biochem. 139, 323-327(2006)、Pilobello, K.T. et al. Proc Natl Acad Sci USA.104,11534-11539(2007)、Tateno, H. et al. Glycobiology 17, 1138-1146(2007)）。
【００８０】
また、糖鎖プロファイルの統計解析によるデータマイニングについては、例えば、「Kuno A, et al. J Proteomics Bioinform. 1, 68-72(2008).」、あるいは、「日本糖質学会2008/8/18レクチンマイクロアレイ応用技術開発〜生体試料の比較糖鎖プロファイリングと統計解析〜久野敦、松田厚志、板倉陽子、松崎英樹、成松久、平林淳」及び「Matsuda A, et al. Biochem Biophys Res Commun. 370, 259-263(2008).」に示される方法で行うことができる。
【００８１】
（３）抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイ法
レクチンマイクロアレイのプラットフォームは基本的に上記の通りとし、検出に際しては上記被験者の試料を直接蛍光等で標識するのではなく、抗体を介して間接的に蛍光基等を被験者の試料に導入することで、一斉に多検体に対する分析を簡便、高速化することができる応用法である（「Kuno A, Kato Y, Matsuda A, Kaneko MK, Ito H, Amano K, Chiba Y, Narimatsu H, Hirabayashi J. Mol Cell Proteomics. 8, 99-108(2009)」、「平林淳、久野敦、内山昇「レクチンマイクロアレイを用いた糖鎖プロファイリング応用技術の開発」、実験医学増刊「分子レベルから迫る癌診断研究〜臨床応用への挑戦〜」、羊土社、Vol25(17)164-171(2007)」、久野敦、平林淳「レクチンマイクロアレイによる糖鎖プロファイリングシステムの糖鎖バイオマーカー探索への活用」、遺伝子医学MOOK11号「臨床糖鎖バイオマーカーの開発と糖鎖機能の解明」、pp.34-39、メディカルドゥ（2008）参照）。
【００８２】
例えば、糖タンパク質が被験者の試料であれば糖鎖部分はレクチンマイクロアレイ上のレクチンによって認識されるため、コアタンパク質部分に対する抗体をその上から被せる（オーバーレイ）ことによって、被検糖タンパク質を標識したり、あるいは高度に精製したりすることなく、特定的に感度高く検出することができる。
【００８３】
（４）レクチンオーバーレイ・抗体マイクロアレイ法
レクチンマイクロアレイの代わりにコアタンパク質に対する抗体をガラス基板等の基板上に並列に固定（アレイ化）した抗体マイクロアレイを用いる方法である。調べるマーカーに対するだけの数の抗体が必要である。糖鎖変化を検出するレクチンをあらかじめ確定することが必要である。
【００８４】
１−４−３  レクチン―抗体サンドイッチ免疫学的検出
レクチンアレイの結果をもとに簡易で安価なサンドイッチ検出法をデザインできる。基本的には２種の抗体を用いたサンドイッチ検出法に用いられるプロトコルのうち、一方の抗体をレクチンに置き換えるだけで適用できる。したがって、この手法は既存の自動免疫検出装置を用いた自動化にも適用可能である。唯一考慮しなければならない点は、サンドイッチに用いる抗体とレクチン間の反応である。抗体は、少なくとも２本のN結合型糖鎖を有する。したがって、使用するレクチンが抗体上の糖鎖を認識する場合は、サンドイッチ検出時にその結合反応に起因するバックグランドノイズを生じてしまう。このノイズシグナルの発生を抑制するのに抗体上の糖鎖部分に修飾を導入する方法や、糖鎖部分を含まないFabのみを用いる方法が考えられるが、これらは公知の手法を用いればよい。糖鎖部分への修飾方法としては、例えばChen SらNat Methods. 4, 437-44 (2007)やComunale MAらJ Proteome Res. 8, 595-602 (2009)等があり、Fabを用いる方法としては例えばMatsumoto HらClin Chem Lab Med 48, 505-512 (2010)等がある。
【００８５】
１−４−４．連続クロマトグラフィーを用いる方法
抗体オーバーレイ・レクチンアレイは、肺癌鑑別マーカー糖タンパク質上の疾患特異的糖鎖変化を最も反映するレクチンを、統計学的に見出す最善の手法である。一方で、免疫沈降及びオーバーレイ検出が可能な抗体が必須である。しかしながら、そのような抗体が必ずしも入手できるとは限らない。したがって、より多くの候補分子を肺癌検出に利用するための手段として、プローブレクチンで捕集した糖タンパク質に対する、標的糖タンパク質の免疫学的定量検出を行うのが一般的である。具体的にはSDS-PAGEを行い、膜転写後にウェスタンブロットにより免疫学的な検出をする。得られたバンドのシグナル強度の比較より、各試料間での変動を定量的に見積もることができる。癌性糖鎖を持つタンパク質の量的変動から各マーカー候補の有意性を確証した絞り込みができる。本実施形態では、候補分子の同定工程において使用したAALレクチンを、検証時においてもプローブタンパク質として用いるのが一般的である。例えば、その様な戦略で実施している例として、Liu YらJ Proteome Res. 9, 798-805 (2010)の報告等が挙げられる。血清中のタンパク質は、その種類によってN結合型糖鎖の構造（分岐の度合い等）、フコース修飾（コアフコース、血液型抗原等）は異なることが知られている。それ故、同一分子であっても異なるフコース修飾を受ける場合があることも報じられている。例えば、Nakagawa TらJ. Biol. Chem. 281, 29797-29806 (2006)では、α１アンチトリプシンが異なるフコース修飾を受けていることが開示されている。これらは、疾患の種類、進展度合いによる増加の有無、タイミングを異にするため、ほぼすべてのフコース修飾を認識し、捕集できるAALをプローブとして用い、フコース含有糖タンパク質全体を捕集し、量的比較するのは理想的とはいえない。そこでわれわれは２つの異なるフコース認識レクチンを用いて連続クロマトグラフィーにより分離分画し、それぞれの画分を定量比較解析することを考えた。このときに使用するレクチンはLCAとAALである。これまでのレクチン特異性解析によりLCAはN結合型糖鎖のうち低分岐型のコアフコース修飾を受けたものを認識するレクチンであることが知られている。AALはN結合型糖鎖のどのような分岐のコアフコースでも認識することができ、かつABOやルイス抗原等に代表される非還元末端側のフコース修飾をも認識することができることも知られている。つまり、LCAは特異性が高く、AALは低い。そこで第一段階としてLCAカラムクロマトグラフィーを行い、LCAに結合するフコース含有糖タンパク質を捕獲する。これをLCA結合性フコース含有糖タンパク質とする。クロマトグラフィー時において、コアフコース修飾を受けている低分岐型N結合型糖鎖を有さないフコース含有糖タンパク質はLCAカラムには結合せず、非結合画分に分画される。このようなフコース含有糖タンパク質群をLCA非結合画分から捕獲するために、LCA非結合画分に対しAALカラムクロマトフラフィーを行う。この時にAALに捕獲された糖タンパク質群をLCA非結合／AAL結合性フコース含有糖タンパク質とする。この操作により、疾患に伴う同一タンパク質上のフコシル化の増減を修飾の種類ごとに評価することができると推測される。
【００８６】
２．肺癌罹患判定方法
本発明の第２の実施形態は、肺癌罹患判定方法である。本実施形態の方法は、被験者より採取された試料から、前記実施形態１に記載の肺癌鑑別マーカーを検出することによって、該被験者が肺癌に罹患していると判定することを特徴とする。
【００８７】
２−１．定義及び概要
本明細書において「被験者」とは、検査に供される者、すなわち後述する試料を提供する者を指す。被験者は、何らかの疾患を有する患者又は健常者のいずれであってもよい。好ましくは、肺癌に罹患している可能性がある者又は肺癌患者である。
【００８８】
「試料」とは、前記被験者から採取され、本実施形態の判定方法に供されるものであって、例えば、体液、癌組織等の細胞又は手術中に採取された肺洗浄液が該当する。
【００８９】
「体液」とは、被験者から採取された液体状の生体試料をいう。例えば、血液（血清、血漿及び間質液を含む）、リンパ液、各組織若しくは細胞の抽出液、胸水、痰、髄液、涙液、鼻汁、唾液、尿、膣液、精液等が挙げられる。好ましくは、血液、リンパ液、胸水又は痰である。体液は、被験者から採取したものを必要に応じて希釈若しくは濃縮、又はヘパリンのような血液凝固阻止剤を添加する等の処理を行なった後に使用してもよいし、そのような前処理を行なうことなく、そのまま使用してもよい。体液の採取は、当該分野の公知の方法に基づいて行なえばよい。例えば、血液やリンパ液であれば、公知の採血方法に従えばよい。具体的には、末梢血であれば、末梢部の静脈等に注射をして採取することができる。体液は、採取後直ちに利用してもよいし、冷凍又は冷蔵により一定期間保存した後、必要に応じて解凍等の処理を行ない利用することもできる。本実施形態において、血清を用いる場合には、10μL〜100μL、20μL〜80μL、30μL〜70μL、40μL〜60μL又は45μL〜55μLの容量を用いれば、十分量の肺癌鑑別マーカーを検出することができる。
【００９０】
本実施形態の判定方法において検出に使用する肺癌鑑別マーカーは、表１又は表２に示す糖付加位置のアスパラギン残基に糖鎖が付加された表１又は表２に記載の肺癌マーカー糖タンパク質又は糖鎖が付加された、表１又は表２に示す糖付加位置のアスパラギン残基を少なくとも一つ含む糖タンパク質断片であれば、いずれの肺癌鑑別マーカーも用いることができる。これらの肺癌鑑別マーカーは、本実施形態の判定方法で単独で用いてもよいし、二以上を組合せて用いてもよい。例えば、二以上の異なる肺癌鑑別マーカー糖タンパク質を用いてもよいし、同一肺癌鑑別マーカー糖タンパク質における二以上の異なるその肺癌鑑別マーカー糖タンパク質断片を用いてもよい。好ましくは、表１における肺癌鑑別マーカーを用いることであり、より好ましくは、肺小細胞癌と肺腺癌に対して同一の又は異なる鑑別特性を有する肺癌鑑別マーカーを用いることである。例えば、肺小細胞癌鑑別用の表１に記載の神経細胞接着分子（NCAM1）、セクレトグラニンIII及び／又はインスリン様成長因子結合タンパク質-L1（IGFBP-L1）と、肺腺癌鑑別用の表１に記載のフィブロネクチン１を本実施形態の肺癌鑑別マーカーとして組み合わせる方法が挙げられる。これにより、被験者の肺癌罹患を判定すると同時に、その肺癌が小細胞癌であるか腺癌であるかを同時に判定することができるので便利である。被験者の試料から、フコース修飾を伴う糖鎖又は高マンノース型糖鎖、混成型糖鎖、複合型2本鎖糖鎖、キチン、ポリラクトサミン及び／又はβ1-3ガラクトースエピトープに結合するレクチン又は抗体を単独で又は組合せて用いて、いずれかの方法により表１又は表２に記載の肺癌鑑別マーカーが検出された場合には、その被験者は肺癌に罹患しているか、その可能性が非常に高いと判定することができる。例えば、フコース修飾を伴う糖鎖の検出には、それに特異的に結合するAALレクチンを、高マンノース型糖鎖、混成型糖鎖、複合型2本鎖糖鎖の検出には、それに特異的に結合するConAレクチンを、キチン及びポリラクトサミンの検出には、それに特異的に結合するPWMレクチンを、又はβ1-3ガラクトースエピトープの検出には、それに特異的に結合するPNAレクチンを用いることができる。
【００９１】
一方、被験者より採取された試料から、前記肺癌鑑別マーカーの糖鎖に対する前記レクチンの結合結果及び表１又は表２に記載の前記肺癌鑑別マーカー糖タンパク質及び／又はその糖タンパク質断片の前記レクチンに対する結合態様に基づいて、該被験者における肺癌の組織型が小細胞癌又は腺癌であることを判定することもできる。例えば、表１のレクチン結合態様によれば、タンパク質＃１で示されるacid alpha-glucosidaseの糖鎖は、肺小細胞癌においてのみAALレクチンと結合する。したがって、被験者より採取された試料から、AALレクチンに結合するacid alpha-glucosidaseが検出された場合には、その被験者は、肺癌に罹患しており、しかもその組織型は小細胞癌であると判定することができる。また、肺癌鑑別マーカー糖タンパク質が神経細胞接着分子（NCAM1）又はその糖タンパク質断片で、AALレクチンとの結合が検出された場合には、肺癌の組織型が小細胞癌であることを判定することができる。さらに、肺癌鑑別マーカー糖タンパク質がフィブロネクチン１又はその糖タンパク質断片で、AALレクチン又は抗体との結合を検出することによって、肺癌の組織型が腺癌であることを判定することができる。
【００９２】
２−２．肺癌鑑別マーカーの検出方法
肺癌鑑別マーカーの検出方法としては、例えば、2つの方法、すなわち、肺癌鑑別マーカーの糖鎖と特異的に結合するレクチン（本明細書では、便宜的に、以下、レクチンAとする）を用いて当該糖鎖を有する肺癌鑑別マーカーを選択する方法と肺癌鑑別マーカーの糖鎖以外の部分(コアタンパク質)を検出することによって当該肺癌鑑別マーカーを検出する方法の組合せ、又はレクチンAと特異的に結合する糖鎖を有する肺癌鑑別マーカーに対する特異的な抗体であって、糖鎖結合部分近傍をエピトープとする抗体を用いて目的の肺癌鑑別マーカーを検出する方法を挙げることができる。
【００９３】
ここで、前記レクチンAと特異的に結合する糖鎖を検出する方法及びコアタンパク質を検出する方法は、それぞれ、レクチンAと特異的に結合する糖鎖を測定する方法、及びコアタンパク質を測定する方法であってもよい。例えば、コアタンパク質に対する抗体及びレクチンAを用いて、肺癌鑑別マーカーを検出することにより、肺癌患者を健常者と区別して検出することができる。好適には、レクチンアレイを用いる抗体オーバーレイ法(Kuno A, Kato Y, Matsuda A, Kaneko MK, Ito H, Amano K, Chiba Y, Narimatsu H, Hirabayashi J. Mol Cell Proteomics. 8, 99-108(2009)）を用いることができる。より簡易に検出するための方法としては、レクチン‐抗体サンドイッチ免疫学的検出法を用いることができる。
【００９４】
レクチンAと特異的に結合する糖鎖を有する肺癌鑑別マーカーを用いて肺癌の罹患を判定する具体的な方法として、例えば、以下の方法が挙げられる。
【００９５】
（１）被験者から得られた血清中の肺癌鑑別マーカーを、レクチンAを用いて分離する。これによって、レクチンAと特異的に結合する糖鎖を有するタンパク質群が選択される。
【００９６】
（２）続いて、前記肺癌鑑別マーカーにおいて、レクチンAと特異的に結合する糖鎖以外の部分を特異的に認識する抗肺癌鑑別マーカー糖タンパク質抗体を用いて検出する。これによって、目的とするレクチンAと特異的に結合する糖鎖を有する肺癌鑑別マーカーを検出することができ、このマーカーが検出された場合には、その被験者は肺癌に罹患していると判定する。
【００９７】
レクチンAと特異的に反応する糖鎖を有する肺癌鑑別マーカーの選択には、例えば、レクチンAに特異的に結合する糖鎖を測定する方法、具体的には、レクチンAを固定したカラムやアレイ、及び肺癌鑑別マーカーを測定する手段、具体的には、新規肺癌鑑別マーカー糖タンパク質又はその断片に対する抗体を用いて行なうことができる。好適には、レクチン‐抗体サンドイッチELISAや抗体オーバーレイ・レクチンアレイ法を用いることができる。
【００９８】
また、レクチンAと特異的に反応する糖鎖を有する肺癌鑑別マーカーの濃度を計測することもでき、これには、レクチンアレイを用いた抗体オーバーレイ・レクチンアレイ法、LC-MS、免疫学的測定法、酵素活性測定法、キャピラリー電気泳動法等が挙げられる。好適には、LC-MS、レクチンAと特異的に反応する糖鎖を有する新規肺癌鑑別マーカー糖タンパク質又はその断片に特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いた、酵素免疫測定法、二抗体サンドイッチELISA法、金コロイド法、放射免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、蛍光免疫測定法、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、表面プラズモン共鳴法（SPR法）又は水晶振動子マイクロバランス（QCM）法等による定性的又は定量的手法を用いることができる。
【００９９】
２−３．肺癌鑑別マーカー糖タンパク質又はその糖ペプチドを用いた特異的ポリクローナル抗体及び／又はモノクローナル抗体の調製
新規肺癌鑑別マーカー糖タンパク質又はその断片である糖ペプチドを利用する肺癌の検出方法において、前記鑑別マーカー糖タンパク質又はその糖ペプチドに特異的なポリクローナル抗体及び／又はモノクローナル抗体用いてもよい。例えば、市販の抗体のように、前記糖タンパク質等に対する特異的抗体を容易に入手することができる場合には、それらを用いることができる。しかし、容易に入手できない場合は、例えば、以下の方法で調製できる。
【０１００】
例えば、抗肺癌鑑別マーカー糖ペプチドポリクローナル抗体は、周知の方法を用いて調製することができる。具体的には、得られた抗原用の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質又は糖ペプチドにアジュバントを添加する。抗原は、糖鎖結合部位（アスパラギン）を含む肺癌鑑別マーカー糖ペプチドを合成し、それを用いてもよい。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント等が挙げられ、それらを混合して用いることもできる。前記抗原と共にアジュバントを抗体産生動物に同時接種して抗体の生成をブーストすることもできる。また、このペプチドを市販キーホール・リンペット（スカシ貝）ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin、KLH）に共有結合させ、抗体産生動物に接種してもよい。なお、このとき顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF）を同時に投与して抗体産生をブーストすることもできる。抗原を接種する抗体産生動物は、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウマ、サル、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等を利用することができる。免疫は、既存の方法であれば、何れの方法をも用いることができるが、主として静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射等により行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは４〜２１日間隔で免疫する。
【０１０１】
最終の免疫日から２〜３日後に免疫動物から全血を採取し、血清を分離後、ポリクローナル抗体を調製することができる。
【０１０２】
また、例えば、抗肺癌マーカー糖ペプチドモノクローナル抗体は、ケラーとミルシュタインの方法で調製することができる（Nature Vol.256,pp495-497 (1975)）。例えば、抗原で免疫した動物から得られる抗体産生細胞と、ミエローマ細胞との細胞融合によりハイブリドーマを調製し、得られるハイブリドーマから抗肺癌鑑別マーカー糖ペプチドモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することにより調製することができる。
【０１０３】
具体的には、前記ポリクローナル抗体の作製で、最終の免疫日から２〜３日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞が挙げられる。
【０１０４】
抗体産生細胞と融合させるミエローマ（骨髄腫）細胞として、マウス、ラット、ヒト等種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地（例えばHAT培地）で生存できず、融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが用いられる。一般的に8-アザグアニン耐性株が用いられ、この細胞株は、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地に生育できないものである。
【０１０５】
ミエローマ細胞は、既に公知の種々の細胞株、例えば、P3(P3x63Ag8.653)(J. Immunol. 123, 1548-1550 1979))、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology 81, 1-7 (1978))、NS-1(Kohler, G. and Milstein, C., Eur. J. Immunol. 6,511-519(1976))、MPC-11 (Margulies, D.H. et al., Cell  8,405-415(1976))、SP2/0(Shulman, M. et al., Nature 276,269-270(1978)) 、FO(de St.Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods 35, 1-21(1980))、S194(Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. 148, 313-323(1978))、R210(Galfre, G. et al.,Nature 277, 131-133(1979))等が好適に使用される。
【０１０６】
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、MEM、DMEM、RPMI-1640培地等の動物細胞培養用培地中で、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを、混合比１：１〜１：１０で融合促進剤の存在下、30〜37℃で１〜１５分間接触させることによって行われる。細胞融合を促進させるためには、平均分子量1,000〜6,000のポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール又はセンダイウイルス等の融合促進剤や融合ウイルスを使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【０１０７】
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、選択培地における細胞の選択的増殖を利用する方法等が挙げられる。すなわち、細胞懸濁液を適切な培地で希釈後、マイクロタイタープレート上にまき、各ウェルに選択培地（HAT培地等）を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【０１０８】
ハイブリドーマのスクリーニングは、限界希釈法、蛍光励起セルソーター法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得する。取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法等が挙げられる。
【０１０９】
３．組織染色用肺癌細胞鑑別抗体
本発明の第３の実施形態は、組織染色用肺癌細胞鑑別抗体である。本実施形態の抗体は、前記実施形態１に記載の肺癌鑑別マーカー、すなわち表１又は表２に示す糖付加位置のアスパラギン残基に糖鎖が付加された表１又は表２に記載の一以上の肺癌鑑別マーカー糖タンパク質、及び／又は糖鎖が付加された、表１又は表２に示す糖付加位置のアスパラギン残基を少なくとも一つ含む一以上の前記糖タンパク質断片を特異的に認識して、それに結合することで、組織染色において肺癌細胞を特異的に鑑別することのできる抗体である。
【０１１０】
本実施形態の抗体が認識する前記実施形態１に記載の肺癌鑑別マーカーのエピトープは、特に限定はしない。好ましくはコアタンパク質又はそのコアタンパク質断片である。より好ましくは糖鎖および糖鎖付加周辺のペプチド配列のいずれも包含する部分である。この場合、ペプチド配列の長さは５〜１５アミノ酸、５〜１０アミノ酸又は５〜８アミノ酸である。プローブとしては上記抗体プローブの他に、ファージを用いたファージ抗体プローブ等も肺癌細胞識別用糖鎖プローブとなり得る。
【０１１１】
本実施形態の抗体は、肺癌細胞の組織型を鑑別することができる。例えば、表１においてタンパク質＃２１で示す神経ペントラキシン受容体（NPR）に対する抗体 (R&D SYSTEMS Anti-human Neuronal Pentraxin Receptor Antibody)が挙げられる。この抗神経ペントラキシン受容体抗体は、図７で示すように、小細胞癌由来の細胞を特異的に鑑別できることから、小細胞癌細胞鑑別用抗体となり得る。このように、癌性糖鎖プローブレクチンで捕集、同定されたタンパク質は、通常、他の組織や正常部位での発現が極めて少ないことから、レクチン等による由来細胞の区別を要することなく、抗体又はファージ抗体のみで組織マーカーとなり得るものも含まれる。
【実施例】
【０１１２】
＜実施例1＞
グライコプロテオミクス（IGOT-LC/MS法）による糖ペプチドマーカーの選択
１．ヒト肺癌培養細胞上清の調製法
肺腺癌３種（H358、H1975、LX-1）及び肺小細胞癌３種（H2171、H524、H526）を、それぞれ高グルコース含有90%DMEM、10%FBS（PS+）の培地を用いて、直径14cmのディッシュで３日間培養し、80〜90％コンフルエントとした。前記FBS血清含有培培地を吸引して廃棄し、無血清培地10mL／ディッシュ（100%DMEM−高グルコース、添加物無し）で洗浄した。無血清培地を30mL／ディッシュで添加して、４８時間培養した。培養後、1000rpm×３０分で遠心し、さらに上清を回収し3000rpm×３０分で上清（培養上清）を回収し、−80℃で凍結保存した。前記温度下で保存した培養上清は、使用前に融解し、0.45μmフィルターろ過後、以下の実施例に用いた。なお、終濃度0.1%となるようにNaN3を添加した。【０１１３】
２．糖タンパク質の大規模同定法
（１）ペプチド試料の調製
前記調製した培養上清に、終濃度10％となるようトリクロロ酢酸（TCA、100％飽和水溶液）を加え、氷上で１０〜６０分間冷却し、タンパク質を沈殿させた。4℃で高速遠心分離して前記沈殿物を回収した。沈殿物は、氷冷したアセトンに懸濁し、２回の洗浄によってTCAを除去した。沈殿物に可溶化緩衝液（0.5Mトリス−塩酸緩衝液、pH8-8.5、7Mグアニジン塩酸、10mM  EDTAを含む）を、タンパク質濃度がおよそ5〜10mg/mLとなるように加え、溶解した。別法として、培養上清を4℃、分子量１万カットの限外濾過膜により、タンパク質を濃縮し、これに可溶化緩衝液を加え、再度濾過することにより、試料タンパク質溶液とした。【０１１４】
高速遠心分離により、上清の抽出液を回収した。抽出液に窒素ガスを通すか又は吹きつけて、溶存酸素を除いた後、タンパク質重量と等量のジチオスレイトール（DTT）を粉末又は少量の可溶化緩衝液に溶かして加えた。窒素ガスを通しながら又は窒素ガス雰囲気下で、ジスルフィド結合を還元させるため室温で１〜２時間反応させた。次いで、S-アルキル化のため、タンパク質重量の２．５倍のヨード酢酸アミドを加え、遮光下、室温で１〜２時間反応させた。反応後、５０〜１００倍量の緩衝液（一般的には10ｍM 重炭酸アンモニウム緩衝液pH8.6）を外液として、4℃（冷室）で透析した。外液を適当な時間をおいて3-5回交換し、変性剤（グアニジン塩酸）や過剰の試薬を除いた。タンパク質が部分的に沈殿することがあったが、懸濁液のままタンパク質定量した。タンパク質量の1/100〜1/50重量のトリプシン（シークエンスグレード以上）を加え、37℃、終夜（約１６時間）消化した。消化の進行はSDS-ゲル電気泳動法により確認し、十分に消化されていると判断されたときに、終濃度5mM のフッ化フェニルメタンスルフォニル（PMSF）を加え、反応を停止した。【０１１５】
（２）候補糖ペプチドの捕集・精製
前記工程で調製された試料ペプチドを、プローブレクチン（AALレクチン又はConAレクチン）を固定化したカラムに供し、洗浄後、レクチンの特異性に応じた方法、すなわち、AALレクチンについては、5mMフコースを含有する緩衝液により、ConAレクチンについては、0.2Mメチルマンノシドを含む緩衝液により、候補糖ペプチドを溶出した。得られた候補糖ペプチド溶液に等容量のエタノール及び４倍容量の１-ブタノールを加え、水：エタノール：1-ブタノール（１：１：４（v/v））で予め平衡化したSepharoseカラムに供した。カラムを同平衡化溶媒で洗浄後、50％エタノール（v/v）で候補糖ペプチドを溶出した。候補糖ペプチド画分を、2μLのグリセロールの入ったマイクロチューブに少量ずつ移し、減圧遠心濃縮、すなわち、減圧遠心によって水を除去し、その操作を繰り返すことによって、全ての候補糖ペプチド画分を濃縮した。【０１１６】
（３）糖鎖切除と糖鎖付加位置安定同位体標識法（IGOT法）
精製した候補糖ペプチド（グリセロール溶液）に必要量の緩衝液を加え、再度減圧遠心濃縮した後、安定同位体酸素-18（18O）で標識した水（H218O）を加え、溶解した（グリセロール濃度は、10％以下とする）。これに標識水で調製したペプチド-N-グリカナーゼ（グリコペプチダーゼF、PNGase）を加え、37℃で終夜反応させた。この反応により、糖鎖結合部位のアスパラギンがアスパラギン酸となり、このときに水中の同位体酸素（18O）が候補糖ペプチドに取り込まれることで、候補糖ペプチドが標識される。【０１１７】
（４）標識ペプチドのLC/MSショットガン分析
IGOT反応液を0.1％ギ酸で希釈し、LC/MSショットガン分析した。このとき高分離能、高再現性、高感度に検出するため、ダイレクトナノフローポンプを基礎とするナノLCシステムを利用した。インジェクトした候補糖ペプチドは脱塩を目的としたトラップカラム(逆相C18シリカゲル系の担体)上に一旦捕集し、洗浄後、同じ樹脂を詰めたスプレーチップの形状をしたフリットレス微小カラム（内径150μm×50mL）を用い、アセトニトリルの濃度グラジェント法により分離した。溶出液は、エレクトロスプレーインターフェースを介してイオン化し、直接質量分析機に導入した。質量分析はデータ依存モードで最大２つのイオンを選択しながら、衝突誘起解離（CID）によるタンデム質量分析を行った。【０１１８】
（５）MS/MS-イオンサーチ法による候補糖ペプチドの検索
得られた数千のMS/MSスペクトルについて、個々にスムージング、中心化処理を行ってピークリストを作成し、このデータを元にタンパク質アミノ酸配列データベースを用いてMS/MSイオンサーチ法で、候補糖ペプチドを同定した。検索エンジンにはマトリックスサイエンス社のMascotを用いた。検索条件のパラメータとして、使用した断片化法（トリプシン消化）、ミスクリーベージ許容数：２、固定する修飾：システインのカルバミドメチル化、変動的な修飾：N末端アミノ基の脱アミノ化（末端グルタミン）、酸化（メチオニン）、18Oを取り込んだ脱アミド化(アスパラギン:糖鎖付加部位)、MSスペクトルの許容誤差：500ppm、MS/MSスペクトルの許容誤差：0.5Daを用いた。【０１１９】
（６）候補糖ペプチドの同定
上述の条件で検索し、得られた結果より、下記の同定確認処理を行った。得られた候補糖ペプチドを肺癌鑑別マーカー糖ペプチド（肺癌鑑別マーカー糖タンパク質断片）とした。【０１２０】
（i）同定の確からしさのスコア（偶然の一致の確率：Expect値）が0.05以下であること。【０１２１】
（ii）同定に寄与したフラグメントイオンの数が４つ以上であること。【０１２２】
（iii）誤差（ppm）が系統的誤差より大きくずれていないこと（質量誤差が0.5Da以下であること）。【０１２３】
（iv）同定されたペプチドにコンセンサス配列があり、その数以下のAsn修飾（Aspへの変換、及び18Oの取り込み）があること。【０１２４】
（７）肺癌鑑別マーカー糖タンパク質の同定
選別された肺癌鑑別マーカー糖ペプチドの配列から、この配列を含む糖タンパク質を規定することができる。より具体的には、表１及び表２において配列番号１〜２２３で示す肺癌鑑別マーカー糖ペプチドの「ペプチド配列」に基づいてアミノ酸配列データベースNCBI-Refseqより対応する肺癌鑑別マーカー糖タンパク質の全アミノ酸配列を同定した。【０１２５】
（結果）
上記工程によって得られた肺癌鑑別マーカー糖タンパク質を表２に示す。【０１２６】
３．培養上清由来のタンパク質のイムノブロットによる検証
無血清培地で２４時間培養した肺癌細胞株（肺腺癌３種：H358、H1975、LX-1；肺小細胞癌３種：H2171、H524、H526）の培養上清をAmicon Ultra-154 centrifugal filter units （10kDaカットオフ、ミリポア社）で１０倍濃縮し、そのサンプル10μLをXV PANTERA SYSYTEM の10%、12.5%若しくは17%アクリルアミドゲル（丸幸商会社）を用いてSDS-PAGEで展開した後、200 mA、40minでPVDF膜（Amarsham社）に転写した。ブロッキング剤は、PBS（ダルベッコ社）に1% Triton X-100を加えたPBSTxに溶解した5%スキムミルク又は5% BSAを使用し、室温で１時間ブロッキングした。PBSTxで１０分間の洗浄を3回行った後、予めBiotin Labeling Kit-NH2（同仁化学研究所）でビオチン化した一次抗体（表４）とメンブレンを１時間反応させた。再びPBSTxで１０分間の洗浄を3回行った後、二次抗体HRP-conjugated streptavidin（1：3000希釈、GEヘルスケア社） で１時間反応させた。PBSTxで１０分間の洗浄を３回行った後、Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus （パーキンエルマー社）によってHRPの酵素反応を行い、得られたシグナルをAmersham Hyperfilm ECL （GEヘルスケア社）に現像し、肺腺癌と肺小細胞癌の細胞株由来の培養上清に存在しているタンパク量について比較解析を行った。
【表４】
2012036094.tif 000013
【０１２７】
2012036094.tif 000014
【０１２８】
2012036094.tif 000015
【０１２９】
（結果）
上記工程によって得られた肺癌鑑別マーカー糖タンパク質を表１、図１、図２に示す。【０１３０】
４．AALレクチンによる培養上清のバッチフラクショネーション
AALレクチンを用いて培養上清を分画した。具体的にはAALレジンは３倍量のPBSで５回洗浄を行った後、50%スラリー溶液に調製した。調製したAALレジン30μLに対し培養上清30μLを加え4℃で５時間震盪させた。遠心後（2,000rpm、２分間）上清を除去した後、Wash Buffer（0.1% SDS in PBST,0.1% Triton X-100）50μLを加え遠心（2,000rpm、２分間）を２回繰り返した後Wash Bufferを500μL加え、遠心（2,000rpm、２分間）し、上清を除去洗浄した。洗浄後の溶出には0.02% SDS を含む0.2 M Fucose in PBSを15μL加え4℃で５時間震盪させた。遠心後（2,000rpm、２分間）上清を回収しさらにElution Bufferを15μL加え遠心（2,000rpm、２分間）を行いAAL結合画分として溶出した。溶出した画分10μLをそれぞれSDS-PAGEに展開してウェスタンブロットで検出した。ConAレクチンを用いる場合も同様な操作を行った。ただし、溶出には0.5M メチルマンノシドを用いた。【０１３１】
（結果）
上記工程によって得られた肺癌鑑別マーカー糖タンパク質を図３に示す。【０１３２】
５．免疫沈降による分画
表１に記載の全ての候補糖タンパク質抗体についてビオチン化されていないものについてはBiotin Labeling Kit-NH2（同仁化学研究所）を用いて、マニュアルに従いビオチン化した。培養上清100μLに対してビオチン化抗体を1μg加え、20℃で２時間1,400rpmで振盪した。磁気ビーズ(invitrogen社)の洗浄は、20μLの磁気ビーズに対して100μLのTBSTx（50mM Tris-HCl (pH 8.0)、150mM NaCl、1% Triton X-100）を加えて、撹拌後遠心（10,000 rpm、３秒）し、上清の除去を３回行った。反応させた培養上清と抗体を磁気ビーズに移し、20℃で１時間1,400 rpmで振盪した。磁気スタンドを用いて磁気ビーズと結合した抗体を回収した。回収した磁気ビーズは1mLのTBSTxで３回洗浄した。溶出バッファー(0.2% SDS in TBS)20 ulを加え撹拌後98℃または60℃で５分加熱を２回行い、溶出した。溶出したサンプルの抗体を除去するために同様に洗浄した40μLの磁気ビーズを溶出サンプルに加え20℃で２時間1,400rpmで振盪した。磁気スタンドで抗体-磁気ビーズを取り除いたものをサンプルとして用いた。調製したサンプルをSDS-PAGEで展開した後レクチンブロットを行った。【０１３３】
（結果）
上記工程によって得られた肺癌鑑別マーカー糖タンパク質を図４に示す。【０１３４】
６．レクチンブロットによる評価
免疫沈降したサンプル10μLを10% SDS-PAGEに展開した。SDS-PAGE後タンパク質をPVDF膜(Amersham)に転写した。PVDF膜を5% BSAで１時間室温にてブロッキングした後、すでにビオチン化されたAALレクチン(生化学工業)で１時間室温にて反応させた。その後二次抗体HRP-conjugated streptavidinで１時間室温にて反応させた。Western Lightningを用い検出した。レクチンの希釈にはPBS-Tを用いた。【０１３５】
（結果）
上記工程によって得られた肺癌鑑別マーカー糖タンパク質を図４に示す。【０１３６】
７．AALレクチンによる血清のカラムフラクショネーション
AALレクチンを用いて血清を分画した。具体的には市販のカラムにAALレジンを1mL充填し、レジンの１０倍量のTBSで洗浄、レジンの２倍量の0.5MのNaClで洗浄、レジンの１０倍量のTBSで洗浄を行い、AALカラムを調製した。血清をAALカラムに加えた後、レジン中で１時間反応させた後、レジンの５倍量のTBSで洗浄を行った。溶出には20 mM Fucoseを1mL加えレジン中で１時間反応させた後さらに20mM Fucoseを4mL加え全量5mLで溶出した。【０１３７】
（結果）
上記工程によって得られた肺癌鑑別マーカー糖タンパク質を図５に示す。【０１３８】
８．連続クロマトグラフィー方法よる血清のフラクショネーション
連続クロマトグラフィーを用いた血清の分画は、LCAアガロース（J-オイルミルズ社）とAALアガロース（J-オイルミルズ社）を用いて低温下で行った。100μLの血清をPBSで４倍希釈して、まず、カラムに充填した5mLのLCAアガロース（0.7×13cm）に血清サンプルを興じた。次に、得られた非結合血清画分をカラムに充填した2.5mLのAALアガロース（0.7×5.5cm）に興じ、PBSで十分に洗浄を行った後0.2M フコースを含むPBSで溶出を行った。溶出画分をウルトラフリー遠心濃縮デバイス（カットオフ: 30kDa、ミリポア社）で濃縮し、得られたサンプルを上記と同様にイムノブロットにより候補分子の比較解析を行った。【０１３９】
（結果）
上記工程によって得られた肺癌鑑別マーカー糖タンパク質を図６に示す。【０１４０】
９．連続クロマトグラフィー方法よる多検体血清のフラクショネーション
多検体血清の比較解析を行う際に、少量の血清サンプルを短時間でフラクショネーションする必要があるため、高スループットな連続クロマトグラフィー方法を確立した。連続クロマトグラフィーを用いた血清の分画は、LCAアガロース（J-オイルミルズ社）とAALアガロース（Vector社）を用いて行った。チップカラムに充填した300μLのLCAアガロース（0.37×2.3cm）に50μLの血清サンプルを興じた。次に、得られた非結合血清画分をオープンカラムに充填した250μLのAALアガロース（0.8×0.5cm）に興じ、PBSで十分に洗浄を行った後0.02M フコースを含むPBSで溶出を行った。溶出画分をウルトラフリー遠心濃縮デバイス（カットオフ: 10kDa、ミリポア社）で濃縮し、得られたサンプルのうち血清10μL相当を上記と同様にイムノブロットにより候補分子の比較解析を行った。【０１４１】
（結果）
上記工程によって得られた肺癌鑑別マーカー糖タンパク質を図８に示す。【０１４２】
１０.抗体オーバーレイ・レクチンアレイ
上記「５．免疫沈降による分画」で得られた糖タンパク質溶液を適当量とり、レクチンアレイ反応バッファーである1% Triton X-100含有Phosphate-buffered saline (PBSTx)で60μLに調製した。この溶液をガラス1枚当たり８つの反応槽が形成されているレクチンアレイの各反応槽へ添加し、20℃で１０時間以上反応した。この８つの反応槽からなるレクチンアレイ基盤の作製は、内山ら(Proteomics 8, 3042-3050 (2008))の手法に従った。これにより糖タンパク質上の糖鎖とアレイ基板上に固定されている４３種のレクチンとの結合反応が平衡状態に達する。未反応の基板上のレクチンに検出用抗体の糖鎖が結合して、ノイズを発生することを防止するため、その後、ヒト血清由来IgG溶液（シグマ社製）を2μL加えて、３０分反応させた。60μLのPBSTxで各反応槽を３回洗浄した後、再度ヒト血清由来IgG溶液を2μL加え、若干撹拌した。続いて、検出用の該糖タンパク質に対する抗体（ビオチン化物）を100ng相当加え、20℃で１時間反応させた。抗原抗体反応後、60μLのPBSTxで各反応槽を３回洗浄した後、モリテックス社製アレイスキャナーGlycoStationによりアレイスキャンを行い、肺癌組織特異的に反応するレクチンスポット上の蛍光強度について比較を行った。【０１４３】
（結果）
上記工程によって得られた肺癌鑑別マーカー糖タンパク質を図９及び図１０に示す。【０１４４】
今回の実験により、AAL又はConA及びこれらのリガンドに関連する特異性をもつレクチン以外においても、PNAやPWMのように肺癌鑑別に有効なレクチンが存在することが明らかになった。これは、糖タンパク質上の複数のレクチンシグナルを組み合わせ、その組み合わせ方にバリエーションを持たせることにより、肺癌組織型の鑑別をより精度高く検出できる可能性を意味している。【０１４５】
＜実施例２＞肺癌鑑別マーカーを用いた肺癌細胞の組織染色
肺癌鑑別マーカーを用いて抗体による組織染色について検証した。【０１４６】
まず、ホルマリン固定肺癌組織切片（5μm厚）を定法に従い組織切片上に被覆しているパラフィンを脱パラフィン化した。脱パラフィン化した組織切片はPBSにて洗浄し、風乾後、10mMクエン酸バッファー中に浸し、121℃、１５分間オートクレーブすることで、ホルマリンによる分子間（分子内）架橋を解離した。処理後の切片は室温でしばらく放置した後、PBSに５分間３回繰り返し浸し、組織表面を洗浄した。次いで0.3% H2O2-MeOHにて10分間、室温で処理することで、内在性ペルオキシダーゼのブロッキング反応を行った。PBSにて洗浄 （５分、３回）後、一次抗体溶液（R&D社製。抗NPR 3μg/mLになるようPBSで懸濁) を組織切片上へ添加し、保湿箱中にて20℃で２時間結合反応した。PBS にて洗浄 (５分、３回)した後、次いで二次抗体として抗ヒツジFITC conjugate(SantaCruz社)と、酵素標識抗体としてanti-FITC HRP conjugate(タカラバイオ株式会社)を用いて発色反応した。反応を停止するため、ミリQ水に５分間３回浸した。最後にヘマトキシリンで、室温、1分間処理し、核酸を染色後、流水にて洗浄した。【０１４７】
（結果）
上記工程によって得られた肺癌鑑別マーカー糖タンパク質を図7に示す。小細胞癌にのみ特異的に染色されているのがわかる。【０１４８】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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