(57)【要約】本発明の目的は、天然の非病原性微生物が細胞外に分泌し、かつ、従来のヌクレアーゼよりも比活性が高い、工業的規模での核酸分解に有用なヌクレアーゼを提供することにある。上記目的は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを基質とし、かつ、精製後に１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ  ８．５において３７℃で３０分間二本鎖ＤＮＡに供した際の比活性がベンゾナーゼ（登録商標）の比活性と同程度またはそれより高い、ストレプトマイセス属細菌由来の細胞外分泌型ヌクレアーゼにより解決される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを基質とし、かつ、精製後に１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ  ８．５において３７℃で３０分間二本鎖ＤＮＡに供した際の比活性がベンゾナーゼ（登録商標）の比活性と同程度またはそれより高い、ストレプトマイセス属細菌由来の細胞外分泌型ヌクレアーゼ。
【請求項２】
分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で１７，０００〜２１，０００である、請求項１に記載のヌクレアーゼ。
【請求項３】
二価金属イオンとして、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋を要求する、請求項１に記載のヌクレアーゼ。
【請求項４】
ストレプトマイセス属細菌が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８７）である、請求項１に記載のヌクレアーゼ。
【請求項５】
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列、
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、または
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含む、ヌクレアーゼ。
【請求項６】
二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡを基質とし、かつ、１００ｍＭ  Ｎａ＋の存在下での比活性がＮａ＋を添加しない場合の比活性と比べて６０％以上である、ストレプトマイセス属細菌由来の細胞外分泌型ヌクレアーゼ。
【請求項７】
分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で約６６，５００である、請求項６に記載のヌクレアーゼ。
【請求項８】
二価金属イオンとして、Ｍｇ２＋を要求する、請求項６に記載のヌクレアーゼ。
【請求項９】
ストレプトマイセス属細菌が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８７）である、請求項６に記載のヌクレアーゼ。
【請求項１０】
（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、または
（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含む、ヌクレアーゼ。
【請求項１１】
ヌクレアーゼ活性成分として請求項１〜５のいずれか１項に記載のヌクレアーゼおよび／または請求項６〜１０のいずれか１項に記載のヌクレアーゼを含む粗酵素。
【請求項１２】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８７）を培養して、少なくとも１種の細胞外分泌型ヌクレアーゼを得ることを含む、細胞外分泌型ヌクレアーゼの製造方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の製造方法により得られる、細胞外分泌型ヌクレアーゼまたはその粗酵素。
【請求項１４】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８７）。
【請求項１５】
核酸を含む試料に請求項１〜５のいずれか１項に記載のヌクレアーゼおよび／または請求項６〜１０のいずれか１項に記載のヌクレアーゼを供して前記核酸を分解することを含む、核酸を分解する方法。
【請求項１６】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１０年９月１６日出願の日本特願２０１０−２０７５９８号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、新規な細胞外分泌型ヌクレアーゼ、その製造方法、および該製造方法に用いられる新規なストレプトマイセス属細菌に関する。また、本発明は、該細胞外分泌型ヌクレアーゼを用いた、核酸を分解する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヌクレアーゼ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ）とは核酸を特異的に分解する核酸分解酵素の総称である。ヌクレアーゼをデオキシリボ核酸やリボ核酸などの核酸へ作用させると、核酸中の糖とリン酸との間のホスホジエステル結合は加水分解し、ヌクレオシドが生成する。【０００４】
ヌクレアーゼは、ＥＣ番号（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒｓ）としてＥＣ．３．１であるエステル加水分解酵素の一つとして分類されている。また、ヌクレアーゼは、ＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼとＤＮＡを分解するデオキシリボヌクレアーゼとに分類される他、分解の型式によっても分類され得る。【０００５】
核酸を配列途中の内部（ｅｎｄｏ−）から切断するのを触媒する酵素はエンドヌクレアーゼと呼ばれる。エンドヌクレアーゼの代表的なものとしては、種々の制限酵素が挙げられる。それに対して、核酸配列の外側（ｅｘｏ−）から内部に向けて、核酸の５’端または３’端から削るように核酸を切断するのを触媒する酵素をエキソヌクレアーゼと呼ぶ。エキソヌクレアーゼの代表的なものとしては、エキソヌクレアーゼＩＩＩなどが知られている。【０００６】
現在、ヌクレアーゼは、研究室スケールから工業スケールまで、多種多様な場面で使用されている。たとえば、ヌクレアーゼを用いれば、その核酸分解活性により細胞抽出液の粘性を下げることができる。そこで、細胞抽出液中のタンパク質その他の目的物質を単離および精製する際に、ヌクレアーゼを用いれば、プロセス時間の短縮、目的物質の収量向上、遠心分離法による分画の改善（ペレットと上清との分離性）、溶液の円滑なろ過（特に限外ろ過）、クロマトグラフィー工程の効率向上などが期待できる。また、核酸が非特異的に吸着するウイルスやインクルージョンボディなどを単離および精製する際にヌクレアーゼを用いれば、これらの収率を向上させることが期待できる。さらに、生体試料を解析するためのＥＬＩＳＡ、クロマトグラフィー、２Ｄ−ＰＡＧＥやフットプリント解析などのサンプル調製にヌクレアーゼを用いれば、不要な核酸による測定誤差を回避できる。【０００７】
このような種々のスケールおよび場面で使用できるヌクレアーゼとして、セラチア  ｓｐｐ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．）に由来するエンドヌクレアーゼが知られている（それぞれ特許文献１および２として特許第２６０４３６５号明細書および米国特許第５１７３４１８号明細書を参照、特許文献１および２の記載はここに特に開示として援用される）。セラチア属微生物の中には日和見感染菌として、病原性をもつものがある。そこで、特許文献１に記載のエンドヌクレアーゼは、遺伝子組換え技術により大腸菌を用いて細胞外に分泌される細胞外分泌型酵素として製造されている。なお、特許文献１に記載のセラチア  ｓｐｐに由来するエンドヌクレアーゼは、商品名ベンゾナーゼ（登録商標）として市販されている（非特許文献１として"ベンゾナーゼ  ユニークなエンドヌクレアーゼ"、［online］、平成２０年１月１日、メルク株式会社、［平成２２年７月３０日検索］、インターネット〈URL：http://www2.merck.co.jp/japan/chemical/pdf/info_pdf/071225_Benzonase_16p.pdf〉を参照、非特許文献１の記載はここに特に開示として援用される）。【０００８】
非病原性微生物由来のヌクレアーゼとしては、放線菌の一種ストレプトマイセス属細菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）が産生するヌクレアーゼが知られている（それぞれ非特許文献２〜７としてＢｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９５  ３０６，９３−１００；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９２  ２８１，２３１−２３７；Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９５  Ｎｏｖ；４３（６）：１０５６−１０６０；Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  １７２１，  Ｉｓｓｕｅｓ  １−３，１８  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００５，１１６−１２３；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２３７，Ｉｓｓｕｅ  ２，１５  Ａｕｇｕｓｔ  ２００４，２７３−２７８；およびＰｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ４０，Ｉｓｓｕｅｓ  ３−４，Ｍａｒｃｈ  ２００５，１２７１−１２７８を参照、非特許文献２〜７の記載はここに特に開示として援用される）。非特許文献２および３に記載のヌクレアーゼは細胞内蓄積型酵素として生産される。それに対して、非特許文献４〜７に記載のヌクレアーゼは細胞外に分泌される細胞外分泌型酵素である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第２６０４３６５号明細書
【特許文献２】米国特許第５１７３４１８号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】"ベンゾナーゼ  ユニークなエンドヌクレアーゼ"、［online］、平成２０年１月１日、メルク株式会社、［平成２２年７月３０日検索］、インターネット〈URL：http://www2.merck.co.jp/japan/chemical/pdf/info_pdf/071225_Benzonase_16p.pdf〉
【非特許文献２】Santiago CAL, Jesus F. APARICIO, Clara G.DE LOS REYES-GAVILAN, Rebeca G. NICIEZA and Jesus  SANCHEZ, Biochem. J. 1995 306, 93-100
【非特許文献３】Jesus F. APARICIO, Carlos HARDISSON andJesus SANCHEZ, Biochem.J. 1992 281, 231-237
【非特許文献４】Vukelic B, Ritonja A, Vitale L., ApplMicrobiol Biotechnol. 1995 Nov;43(6):1056-1060.
【非特許文献５】Zuzana Brnakova, Andrej Godany and JozefTimko, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, Volume 1721,Issues 1-3, 18 January 2005, 116-123
【非特許文献６】Sumedha S. Deshmukh and Vepatu Shankar,FEMS Microbiology Letters, Volume 237, Issue 2, 15 August 2004, Pages 273-278
【非特許文献７】Nitin S. Patil, Sumedha S. Deshmukh andVepatu Shankar, Process Biochemistry Volume 40, Issues 3-4, March 2005, Pages1271-1278
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
特許文献１および２に記載のヌクレアーゼならびに非特許文献１に記載のベンゾナーゼは、非病原性微生物を用いて製造せしめるものである。しかし、これらのヌクレアーゼは、遺伝子組換え大腸菌によって生産されるため、由来微生物の生産性と比べて生産性が低い。したがって、工業的規模のヌクレアーゼを得るためには、生産工程の繰返しまたは長期化などが必要となり、作業的、経済的および時間的な負担の増大が問題となる。そこで、ヌクレアーゼの生産方法としては、遺伝子組換え技術を使わず、天然の非病原性微生物を用いて生産するのが望ましい。【００１２】
非特許文献２および３に記載のヌクレアーゼは、非病原性微生物体内に蓄積される、細胞内蓄積型の酵素である。したがって、これらのヌクレアーゼを得るためには、ヌクレアーゼを蓄積させた微生物体を破砕し、次いで得られた微生物破砕物からヌクレアーゼを分離精製しなければならない。そこで、非特許文献２および３に記載のヌクレアーゼを得る工程は複雑であり、かつ、不純物が混入する可能性が高いとの問題がある。【００１３】
それに対して、非特許文献４〜７に記載のヌクレアーゼは、非病原性微生物の体外に分泌される細胞外分泌型の酵素であり、上記した特許文献１および２ならびに非特許文献１〜３に記載のヌクレアーゼを製造する際に生じる問題は起こらない。【００１４】
しかし、非特許文献４〜７に記載のヌクレアーゼは、非常に活性が低いという共通の問題がある。非特許文献４〜７に記載のヌクレアーゼの比活性は、非特許文献１に記載の単位に換算すると、それぞれ、３．５×１０５Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ、９．７×１０３Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ、１．３×１０４Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎおよび３．２×１０４Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎであり、非特許文献１に記載のヌクレアーゼと比較して３〜１００倍程度活性が低い。【００１５】
また、非特許文献４および５に記載のヌクレアーゼは、ＮａＣｌによって酵素活性阻害を受け易い。非特許文献４に記載のヌクレアーゼの１０ｍＭ  ＮａＣｌの存在下での比活性は、非特許文献４に記載の標準活性条件と比べて、３２％である。非特許文献５に記載のヌクレアーゼの１００ｍＭ  ＮａＣｌの存在下での比活性は、非特許文献５に記載の標準活性条件と比べて、４０〜５０％である。したがって、非特許文献４および５に記載のヌクレアーゼを希釈等する際に、一般的に広く用いられているＰＢＳなどのＮａＣｌ含有緩衝液を使用することができない。また、微生物の培養を介する産業的な製造工程では、菌体濁度を上げるために１００ｍＭ以上の一価金属塩が含まれる高栄養の培地を用いて微生物を培養するのが一般的である。このような培養により得た培養液中の核酸の分解は、塩濃度が高い条件下で実施され得る。【００１６】
非特許文献６および７に記載のヌクレアーゼは、精製酵素としてＥＤＴＡによって透析した場合、完全に活性を喪失する。この活性を回復させるにはＭｎ２＋が要求され、Ｍｇ２＋などの他の二価金属イオンでは代用できない。マンガン塩は非常に高価であり、かつ、残留毒性の危険がある。【００１７】
したがって、非特許文献４〜７に記載のヌクレアーゼは、比活性が低い、ＮａＣｌによって酵素活性阻害を受け易い、酵素活性について要求される二価金属イオンがＭｎ２＋に限定されるといった問題により、工業的規模での核酸分解に際して利用されていなかった。【００１８】
そこで、天然の非病原性微生物が細胞外に分泌し、かつ、従来のヌクレアーゼよりも比活性が高い、工業的規模での核酸分解に有用なヌクレアーゼを提供することを、本発明が解決しようとする第１の課題とした。また、天然の非病原性微生物が細胞外に分泌し、酵素活性に対するＮａＣｌの影響が小さく、かつ、酵素活性についてマンガンよりも安価かつ毒性の小さい二価金属イオンを要求する、工業的規模での核酸分解に有用なヌクレアーゼを提供することを、本発明が解決しようとする第２の課題とした。さらに本発明が解決しようとする別の課題として、上記ヌクレアーゼを製造する方法および該方法に供され得る非病原性微生物を提供することがある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、鋭意研究を積み重ねた結果、培養液中に比活性の高いヌクレアーゼを分泌する微生物を深海から単離することに成功した。次いで該微生物を同定した結果、放線菌の一種である非病原性のストレプトマイセス属細菌であることがわかり、本発明者らはこの微生物をＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４と名付けた。【００２０】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４の培養液からヌクレアーゼ活性を示すタンパク質分画を分離および精製したところ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを基質とし、かつ、非特許文献１に記載のベンゾナーゼより比活性が高いヌクレアーゼ（ＮｕｃＳ）と、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡを基質とし、高濃度のＮａ＋の存在下で比活性を維持し、かつ、マンガンよりも安価かつ毒性の小さいマグネシウムを要求し得るヌクレアーゼ（ＮｕｃＬ）との２種類のヌクレアーゼが得られた。【００２１】
上記ＮｕｃＳおよびＮｕｃＬは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４の増殖とともに、ヌクレアーゼ活性を維持して培養液中に分泌されるものであった。したがって、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４の培養液やこの培養液の乾燥物および簡易に精製したものは、ＮｕｃＳおよびＮｕｃＬの２種類のヌクレアーゼを含む粗酵素として、工業的規模での核酸分解に供され得る、有用性の高いものである。
本発明は、上記知見に基づいて完成された発明である。【００２２】
したがって、本発明によれば、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを基質とし、かつ、精製後に１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ  ８．５において３７℃で３０分間二本鎖ＤＮＡに供した際の比活性がベンゾナーゼ（登録商標）の比活性と同程度またはそれより高い、ストレプトマイセス属細菌由来の細胞外分泌型ヌクレアーゼが本発明の第一の態様のヌクレアーゼとして提供される。
好ましくは、分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で１７，０００〜２１，０００である。
好ましくは、二価金属イオンとして、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋を要求する。
好ましくは、ストレプトマイセス属細菌が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８７）である。【００２３】
本発明の別の側面によれば、
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列、
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、または
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含む、ヌクレアーゼが本発明の第二の態様のヌクレアーゼとして提供される。【００２４】
本発明の別の側面によれば、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡを基質とし、かつ、１００ｍＭ  Ｎａ＋の存在下での比活性がＮａ＋を添加しない場合の比活性と比べて６０％以上である、ストレプトマイセス属細菌由来の細胞外分泌型ヌクレアーゼが本発明の第三の態様のヌクレアーゼとして提供される。
好ましくは、分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で約６６，５００である。
好ましくは、二価金属イオンとして、Ｍｇ２＋を要求する。
好ましくは、ストレプトマイセス属細菌が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８７）である。【００２５】
本発明の別の側面によれば、
（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、または
（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含む、ヌクレアーゼが本発明の第四の態様のヌクレアーゼとして提供される。【００２６】
本発明の別の側面によれば、ヌクレアーゼ活性成分として本発明の第一または第二の態様のヌクレアーゼおよび／または本発明の第三または第四の態様のヌクレアーゼを含む粗酵素が提供される。【００２７】
本発明の別の側面によれば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８７）を培養して、少なくとも１種の細胞外分泌型ヌクレアーゼを得ることを含む、細胞外分泌型ヌクレアーゼの製造方法が提供される。【００２８】
本発明の別の側面によれば、本発明の製造方法により得られる、細胞外分泌型ヌクレアーゼまたはその粗酵素が提供される。【００２９】
本発明の別の側面によれば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８７）が提供される。【００３０】
本発明の別の側面によれば、核酸を含む試料に本発明の第一または第二の態様のヌクレアーゼおよび／または本発明の第三または第四の態様のヌクレアーゼを供して前記核酸を分解することを含む、核酸を分解する方法が提供される。
好ましくは、前記核酸がＤＮＡである。
【発明の効果】
【００３１】
本発明のヌクレアーゼは天然の非病原性微生物であるストレプトマイセス属細菌の一種が細胞外に分泌するものであることから、本発明のヌクレアーゼを生産するストレプトマイセス属細菌の培養液や該培養液の乾燥物や粗精製物を粗酵素として利用することができる。また、本発明のヌクレアーゼは、従来のヌクレアーゼと比べて比活性が高い、または、高塩濃度存在下でも活性を維持しつつ、要求される二価金属イオンがマグネシウムであるとの特徴を有することから、工業的規模での核酸分解に供され得るものである。【００３２】
本発明の２種のヌクレアーゼは、たとえば、塩濃度によって使い分けができる。具体的には、低塩濃度の環境下では、比活性の大きい一方の酵素（たとえば、ＮｕｃＳ）による迅速なＤＮＡおよびＲＮＡの分解が可能であり、高塩濃度の環境下では他方の酵素（たとえば、ＮｕｃＬ）によるＤＮＡ分解およびＲＮＡの蓄積が期待できる。したがって、本発明の２種のヌクレアーゼを含む混合物を用意すれば、塩濃度を変化させることによって、所望の核酸の分解および蓄積が達成できる。【００３３】
また、本発明の高塩濃度の環境下で活性を維持する酵素（たとえば、ＮｕｃＬ）は、ＲＮＡを分解せずに、ＤＮＡを分解できる。このようなＲＮＡを分解しないという特性を活かして、たとえば本発明の酵素を、ＲＮＡを特異的に調製する方法へ使用することが可能である。【００３４】
本発明のヌクレアーゼを用いれば、細胞抽出液中のタンパク質その他の目的物質を単離および精製する場合に、プロセス時間の短縮、目的物質の収量向上、遠心分離法による分画の改善（ペレットと上清との分離性）、溶液の円滑なろ過（特に限外ろ過）、クロマトグラフィー工程の効率向上、ウイルスやインクルージョンボディなどの収率向上、ＥＬＩＳＡ、クロマトグラフィー、２Ｄ−ＰＡＧＥやフットプリント解析などの測定誤差の回避などが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】部分精製ＮｕｃＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥと活性染色を示した図である。
【図２】精製ＮｕｃＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥと活性染色を示した図である。
【図３】ＮｕｃＳのｐＨと活性との関係性を示した図である。
【図４】ＮｕｃＬのｐＨと活性との関係性を示した図である。
【図５】ＮｕｃＳおよびＮｕｃＬの温度と活性との関係性を示した図である。
【図６】ＮｕｃＳおよびＮｕｃＬの熱安定性試験の結果を示した図である。
【図７】ＮｕｃＬの酵素活性に対する一価塩（ＮａＣｌ）の影響を示した図である。
【図８】ＮｕｃＬの酵素活性に対する一価塩（ＫＣｌ）の影響を示した図である。
【図９】ＮｕｃＳおよびＮｕｃＬの酵素活性に対する二価金属塩（ＭｇＣｌ２）の影響を示した図である。
【図１０】ＮｕｃＳおよびＮｕｃＬの酵素活性に対する二価金属塩（ＭｎＣｌ２）の影響を示した図である。
【図１１】ＮｕｃＬの酵素活性に対するリン酸塩の影響を示した図である。
【図１２】環状プラスミドＤＮＡに対するＮｕｃＳ、ＮｕｃＬおよびベンゾナーゼの分解様式の解析結果を示した図である。
【図１３】ＮｕｃＬによる環状プラスミドＤＮＡの分解結果を示した図である。
【図１４】ＮｕｃＳによる環状プラスミドＤＮＡに対する分解反応初期における反応結果を示した図である。
【図１５】ＮｕｃＬによる環状プラスミドＤＮＡに対する分解反応初期における反応結果を示した図である。
【図１６】ＮｕｃＳによる直鎖二本鎖ＤＮＡの分解結果を示した図である。
【図１７】ＮｕｃＬによる直鎖二本鎖ＤＮＡの分解結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下、本発明の詳細について説明する。
本発明のヌクレアーゼは、ストレプトマイセス属細菌由来の細胞外分泌型ヌクレアーゼに関する。本発明のヌクレアーゼは、その性質、機能および構造により２つの酵素群に分類される。以下では本発明のヌクレアーゼを「ヌクレアーゼＡ」および「ヌクレアーゼＢ」という名称により説明する。
【００３７】
［１］本発明のヌクレアーゼＡ
本発明のヌクレアーゼＡは、二本鎖ＤＮＡ、たとえば、スーパーコイル型およびリラックス型などの二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを基質とするヌクレアーゼに関する。本発明のヌクレアーゼＡは、精製後に１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ  ８．５において３７℃で３０分間二本鎖ＤＮＡに供した際の比活性がベンゾナーゼ（登録商標）の比活性と同程度またはそれより高いとの特徴を有する。
【００３８】
本明細書における「ベンゾナーゼ（登録商標）」とは、非特許文献１において製品名「ベンゾナーゼ  グレードＩ（９９％）  ２５０Ｕ／μＬ  ｆｏｒ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」として記載されている、市販のヌクレアーゼをいう。後述する実施例により示される１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ  ８．５において３７℃で３０分間二本鎖ＤＮＡに供した際のベンゾナーゼ（登録商標）の比活性は、９．４×１０５Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎである。
【００３９】
本明細書における「ベンゾナーゼ（登録商標）の比活性と同程度」とは、ベンゾナーゼの比活性に近似する値であれば特に制限されず、たとえば、ベンゾナーゼの比活性の±１０％以内、好ましくは±５％以内、より好ましくは±２％以内をいう。本明細書における「ベンゾナーゼ（登録商標）の比活性より高い」とは、ベンゾナーゼの比活性より高ければ特に制限されず、たとえば、ベンゾナーゼの比活性の１．１倍以上、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２．０倍以上、さらに好ましくは２．５倍以上、より好ましくは３．０倍以上である。
【００４０】
ベンゾナーゼの比活性と比べる際は、本発明のヌクレアーゼＡは精製されたものを用いる。本発明のヌクレアーゼＡの精製は、陰イオン交換（ＳｕｐｅｒＱ）、ハイドロキシアパタイト、陽イオン交換（ＣＭセファロース）、ヘパリンアフィニティーおよびゲルろ過クロマトグラフィーを用いて精製される。本発明の好ましい態様である、後述する実施例に記載のＮｕｃＳは、精製後の比活性が３．６×１０６Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎである。それに対して、ベンゾナーゼ（登録商標）の比活性は、９．４×１０５Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎである。したがって、精製後の本発明のヌクレアーゼＡの比活性は、ベンゾナーゼの比活性の約３．８倍であることが好ましい。
【００４１】
本発明のヌクレアーゼＡの基質特異性は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡなどの種々の核酸を基質として１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ  ８．５において３７℃で３０分間供して、これらの基質の分解活性を調べることで測定する。
【００４２】
本発明のヌクレアーゼＡは、基質および比活性が上記した通りのものであれば特に制限されないが、好ましくは、分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で１７，０００〜２１，０００であり、および／または二価金属イオンとしてＭｇ２＋またはＭｎ２＋を要求する。
【００４３】
本発明のヌクレアーゼＡは、上記した基質への触媒活性および比活性の他、分子量および二価金属要求性などを指標として、ストレプトマイセス属細菌、たとえば、深海（水面下２００ｍ以下の海）に生息するストレプトマイセス属細菌を培養した培養上清中のヌクレアーゼ活性を調べるスクリーニング法により単離することが可能である。深海に生息するストレプトマイセス属細菌として好ましいのは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４である。なお、このＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４は、独立行政法人産業技術総合研究所の特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター  中央第６）に２０１０年７月２７日付けで受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８７として寄託されている。
【００４４】
本発明のヌクレアーゼＡの具体的な態様は、（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列、（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、または（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む、ヌクレアーゼである。
【００４５】
上記（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むヌクレアーゼは、分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で１７，０００〜２１，０００である酵素群であり、共通配列としてＡＬＰＴＰＶＳＡＡＴＡＲ（配列表の配列番号２７）を有する。配列表の配列番号１は、共通アミノ酸配列ＡＬＰＴＰＶＳＡＡＴＡＲをＮ末端の起点として１７ｋＤａと算出される共通アミノ酸配列（１５７アミノ酸）を指す。本発明のヌクレアーゼＡのより具体的な態様は、後述する実施例に記載のＮｕｃＳであり、２１４アミノ酸（配列表の配列番号３）からなるヌクレアーゼである。
【００４６】
上記（２）のアミノ酸配列の「１から数個のアミノ酸の欠失、置換または付加」における「１から数個」の範囲は、上記（２）のアミノ酸配列を含むヌクレアーゼの精製後の比活性が、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ  ８．５において３７℃で３０分間二本鎖ＤＮＡに供する条件下で、ベンゾナーゼ（登録商標）の比活性と同程度またはそれより高くなる範囲であれば特に限定されないが、たとえば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。また、「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基の欠落もしくは消失を意味し、「アミノ酸の置換」は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていること、および「アミノ酸の付加」とは配列中に新たなアミノ酸残基が付け加えられていることをそれぞれ意味する。
【００４７】
「１から数個のアミノ酸の欠失、置換または付加」の具体的な態様としては、１から数個のアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えらた態様がある。たとえば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合などを挙げることができる。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００４８】
上記（３）のアミノ酸配列における「相同性」は、上記（３）のアミノ酸配列を含むヌクレアーゼの精製後の比活性が、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ  ８．５において３７℃で３０分間二本鎖ＤＮＡに供する条件下で、ベンゾナーゼ（登録商標）の比活性と同程度またはそれより高くなる範囲である９０％以上であり、好ましくは９３％以上であり、より好ましくは９５％以上であり、さらに好ましくは９７％以上、なおさらに好ましくは９９％以上である。
【００４９】
本発明のヌクレアーゼＡを取得する方法は制限されるものではなく、上記したスクリーニング法以外にも、たとえば、配列表の配列番号１および３の記載を参照して、物理化学的に合成してもよいし、遺伝子工学的に配列表の配列番号１および３に記載のアミノ酸配列をコードする核酸から作成してもよい。
【００５０】
［２］本発明のヌクレアーゼＢ
本発明のヌクレアーゼＢは、二本鎖ＤＮＡ、たとえば、スーパーコイル型およびリラックス型などの二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡを基質とし、かつ、ＲＮＡを実質的に基質としないヌクレアーゼに関する。
【００５１】
本発明のヌクレアーゼＢは、１００ｍＭ  Ｎａ＋の存在下での比活性がＮａ＋を添加しない場合の比活性と比べて６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上であるとの特徴を有する。
【００５２】
本発明のヌクレアーゼＢの比活性に対するＮａ＋の影響は、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２と０〜１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５中で、Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｆｒｏｍ  ｓａｌｍｏｎ  ｔｅｓｔｅｓ  ０．４ｍｇ／ｍＬ（シグマアルドリッチ社製、Ｃａｔ  ｎｏ．Ｄ１６２６−１Ｇ）を基質として、各ＮａＣｌ濃度の核酸分解活性を２５℃で測定することにより調べることができる。
【００５３】
本発明のヌクレアーゼＢの基質特異性は、本発明のヌクレアーゼＡの基質特異性と同様にして調べることができる。
【００５４】
本発明のヌクレアーゼＢは、基質およびＮａ＋に対する安定性が上記した通りのものであれば特に制限されないが、好ましくは、分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で約６６，５００であり、および／または二価金属イオンとしてＭｇ２＋を要求する。
【００５５】
本発明のヌクレアーゼＢは、上記した基質への触媒活性およびＮａ＋に対する安定性の他、分子量および二価金属要求性などを指標として、ストレプトマイセス属細菌、たとえば、深海（水面下２００ｍ以下の海）に生息するストレプトマイセス属細菌を培養した培養上清中のヌクレアーゼ活性を調べるスクリーニング法により単離することが可能である。深海に生息するストレプトマイセス属細菌として好ましいのは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８７）である。
【００５６】
本発明のヌクレアーゼＢの具体的な態様は、（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列、（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、または（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む、ヌクレアーゼである。
【００５７】
上記（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むヌクレアーゼは、分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で６６，５００であり、Ｎ末端部にシグナルペプチドを含まない成熟タンパク（５７５アミノ酸）である。本発明のヌクレアーゼＢのより具体的な態様は、後述する実施例に記載のＮｕｃＬであり、６０７アミノ酸（配列表の配列番号４）からなり、Ｎ末端にシグナルペプチドを含む。
【００５８】
上記（ｂ）のアミノ酸配列の「１から数個のアミノ酸の欠失、置換または付加」における「１から数個」の範囲は、上記（ｂ）のアミノ酸配列を含むヌクレアーゼの１００ｍＭ  Ｎａ＋の存在下での比活性がＮａ＋を添加しない場合の比活性と比べて６０％以上である範囲であれば特に限定されないが、たとえば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。また、上記（ｂ）のアミノ酸配列における「アミノ酸の欠失」、「アミノ酸の置換」および「アミノ酸の付加」の意味ならびに「１から数個のアミノ酸の欠失、置換または付加」の具体的な態様は、本発明のヌクレアーゼＡの具体的態様である（２）のアミノ酸配列で説明したのと同様である。
【００５９】
上記（ｃ）のアミノ酸配列における「相同性」は、上記（ｃ）のアミノ酸配列を含むヌクレアーゼの１００ｍＭ  Ｎａ＋の存在下での比活性がＮａ＋を添加しない場合の比活性と比べて６０％以上である範囲である８５％以上であり、好ましくは８８％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上、なおさらに好ましくは９９％以上である。
【００６０】
本発明のヌクレアーゼＢを取得する方法は制限されるものではなく、上記したスクリーニング法以外にも、たとえば、配列表の配列番号２および４の記載を参照して、物理化学的に合成してもよいし、遺伝子工学的に配列表の配列番号２および４に記載のアミノ酸配列をコードする核酸から作成してもよい。
【００６１】
［３］本発明の粗酵素
本発明の粗酵素は、ヌクレアーゼ活性成分として本発明のヌクレアーゼＡ、本発明のヌクレアーゼＢまたはこれら２種のヌクレアーゼを含む。本発明の粗酵素において、本発明のヌクレアーゼＡおよびヌクレアーゼＢの存在比は特に制限されず、基質となる核酸の種類や濃度、これらのヌクレアーゼの活性に影響を与える物質の種類や濃度などに応じて適宜選択できる。
【００６２】
本発明の粗酵素は、含有する本発明のヌクレアーゼＡおよび／またはヌクレアーゼＢの性質を示す。本発明の粗酵素によれば、たとえば、低塩濃度の環境下では、比活性の大きい本発明のヌクレアーゼＡによる迅速なＤＮＡおよびＲＮＡの分解が期待でき、高塩濃度の環境下では本発明のヌクレアーゼＢによるＤＮＡ分解およびＲＮＡの蓄積が期待できる。したがって、本発明の粗酵素によれば、塩濃度を変化させることによって、所望の核酸の分解および蓄積が達成できる。
【００６３】
本発明の粗酵素は、本発明のヌクレアーゼＡおよびヌクレアーゼＢを生産するストレプトマイセス属細菌、好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８７）を培養して得られる培養物として製造可能である。
【００６４】
［４］本発明の製造方法
本発明の製造方法は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８７）を培養して、少なくとも１種の細胞外分泌型ヌクレアーゼを得ることを含む、細胞外分泌型ヌクレアーゼの製造方法である。具体的には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８７）を常法にしたがって適当な培地に接種して適切な条件下で培養し、得られた培養物から細胞外分泌型ヌクレアーゼを採取してなる、細胞外分泌型ヌクレアーゼの製造方法である。細胞外分泌型ヌクレアーゼとして好ましいのは、本発明のヌクレアーゼＡおよび／または本発明のヌクレアーゼＢである。
【００６５】
本発明の製造方法は、大別すると、（ａ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８７）を培養して、細胞外分泌型ヌクレアーゼ含有培養物を得る工程、及び（ｂ）該培養物から細胞外分泌型ヌクレアーゼを得る工程の二つの工程を含む。
【００６６】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８７）の培養に用いる栄養培地としては、ストレプトマイセス属細菌用の培地として知られているものを広く使用でき、たとえば、ＹＭＡ（Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ−Ｍａｌｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  Ａｇａｒ）培地（イーストエキス  ４．０ｇ／ｌ、モルトエキス  １０．０ｇ／ｌ、グルコース  ４．０ｇ／ｌ、寒天  １８．０ｇ／ｌ；ｐＨ  ７．３）やアルブミン培地（エッグアルブミン  ０．２５ｇ／ｌ、グルコース  １．０ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ／ｌ、Ｆｅ２（ＳＯ４）３  １％溶液  １ｍｌ、寒天  １８．０ｇ／ｌ；ｐＨ  ６．８−７．０）などの合成培地の他に天然培地も使用でき、好ましくはイーストエキス  ４．０ｇ／ｌ、モルトエキス  １０．０ｇ／ｌ、グルコース  ３０．０ｇ／ｌ、ポリペプトンS  ５０．０ｇ／ｌ、炭酸カルシウム ６．０ｇ／ｌ；ｐＨ無調整を使用できる。ただし、培養物をそのまま粗酵素として用いる場合、培地調製において、ｐＨや一価塩、二価金属塩、リン酸塩、その他酵素活性に影響する化合物の濃度には注意を要する。所望のヌクレアーゼ活性に応じて、これらの濃度を増減させることが好ましい。
【００６７】
培養法としては液体培養法（振とう培養法もしくは通気攪拌培養法）が好ましく、工業的には通気攪拌培養法が好ましい。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８７）の培養は、通常、温度２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃、ｐＨ５〜９、好ましくは６〜８から選ばれる条件で好気的に実施する。培養時間はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８７）が増殖し始める時間以上の時間であればよく、好ましくは８〜１２０時間であり、さらに好ましくは所望のヌクレアーゼ活性が最大値に達成する時間までである。菌体増殖を確認する方法は特に制限はないが、たとえば、培養物を採取して顕微鏡で観察してもよいし、吸光度で観察してもよい。また、培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、０．５〜２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、撹拌したり、通気に酸素を追加したりすればよい。培養方式は、回分培養、流加培養、連続培養または灌流培養のいずれでもよい。
【００６８】
上記のようにして培養して得られた培養物から、細胞外分泌型ヌクレアーゼを採取する。細胞外分泌型ヌクレアーゼの採取法は、一般の酵素の採取の手段に準じて行うことができる。たとえば、固液分離などの通常知られる手段によって細胞を除いた後に培養上清を粗酵素として用いることができる。固液分離には、通常知られる方法を制限なく利用することができ、例えば、培養物そのものをそのまま遠心分離する方法、培養物に濾過助剤を加えることや濾過助剤をプレコートしたプレコートフィルターなどにより濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などを用いる膜濾過分離する方法などが採用される。
【００６９】
粗酵素は、そのままで使用することもできるが、精製して使用することもできる。例えば、ここに挙げるものに限定されるものではないが、得られた粗酵素を、熱処理などの耐熱性の差を利用する方法；透析、限外ろ過、レジンカラム、ゲルろ過、ゲルろ過クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの分子量の差を利用する方法；塩沈澱、硫安沈殿、アルコール沈殿およびその他の溶媒沈澱などの溶解性の差を利用する方法；ＤＥＡＥ−トヨパール樹脂などを用いるイオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；ブチルトヨパール樹脂などを用いる疎水クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；吸着クロマトグラフィーなどの物理化学的な吸着性の差を利用する方法；等電点電気泳動および等電点クロマトグラフィーなどの等電点の差を利用する方法といった通常知られる方法を単独または組み合わせて供することにより、工業用途の精製酵素を調製できる。
【００７０】
粗酵素及び精製酵素は、固定化することもできる。たとえば、イオン交換体への結合法、樹脂および膜などとの共有結合・吸着法、高分子物質を用いた包括法などを採用することができる。
【００７１】
本発明の製造方法によって得られる細胞外分泌型ヌクレアーゼまたはその粗酵素は、本発明の別の態様として提供される。また、本発明の製造方法に用いられるストレプトマイセス属細菌であるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８７）もまた、本発明の別の態様として提供される。
【００７２】
本発明の製造方法の別の態様としては、本発明のヌクレアーゼＡをコードするＤＮＡの塩基配列、たとえば、配列表の配列番号５に記載の塩基配列や本発明のヌクレアーゼＢをコードするＤＮＡの塩基配列、たとえば、配列表の配列番号６に記載の塩基配列を参照して、本発明のヌクレアーゼＡおよびヌクレアーゼＢをコードするＤＮＡ断片を物理化学的または遺伝子工学的に合成し、次いで合成したＤＮＡ断片をベクターに組み込み、次いでＤＮＡ断片を組み込んだ組換えベクターを宿主細胞に挿入して形質転換体を作製し、この形質転換体を培養することにより細胞外分泌型ヌクレアーゼを得ることを含む、細胞外分泌型ヌクレアーゼを製造する方法が提供される。
【００７３】
［５］本発明の方法
本発明の方法は、核酸を含む試料に本発明のヌクレアーゼＡ、本発明のヌクレアーゼＢまたはこれら両方を供して前記核酸を分解することを含む、核酸を分解する方法に関する。
【００７４】
本発明のヌクレアーゼＡおよびヌクレアーゼＢは、固体状または液体状の粗酵素および精製酵素として利用することができる。本発明のヌクレアーゼＡおよびヌクレアーゼＢは、通常知られる方法で固定化させた固定化酵素として使用することもできる。
【００７５】
核酸を含む試料における水性媒体としては、核酸分解反応を妨げるものでなければ特に制限されないが、たとえば、水、緩衝液などが挙げられる。緩衝液としては、たとえば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などが採用されるが、本発明のヌクレアーゼＡはリン酸イオンやナトリウムイオンにより活性阻害が生じる可能性があるため、これらを含まないトリス塩酸緩衝液などが好ましい。
【００７６】
本発明のヌクレアーゼＡおよびヌクレアーゼＢの使用量は特に制限はないが、核酸分解の効率および経済性の観点から、たとえば、本発明のヌクレアーゼＡの使用量は核酸１０μｇに対して１×１０−６から５０Ｕ（単位）であり、好ましくは１×１０−５から１０Ｕであり、より好ましくは１×１０−４から１Ｕであり、さらに好ましくは１×１０−３から１×１０−１Ｕであり；本発明のヌクレアーゼＢの使用量は核酸１０μｇに対して１×１０−４から５０Ｕであり、好ましくは１×１０−３から２０Ｕであり、より好ましくは１×１０−２から１０Ｕであり、さらに好ましくは１×１０−１から１Ｕである。核酸の濃度は、溶液に溶解し得る範囲であれば特に限定されない。
【００７７】
核酸分解反応は本発明のヌクレアーゼＡおよびヌクレアーゼＢが活性を有し、安定に維持される温度付近、たとえば、２５〜３５℃で実施することが好ましい。ｐＨは本発明のヌクレアーゼＡおよびヌクレアーゼＢが活性を有し、安定に維持される条件下で行うことが好ましく、たとえば、７．５〜９．５で行うのが適当である。上記条件で十分な核酸分解が見られた時点で反応を終了するが、反応は通常１〜１００時間で終了する。
【００７８】
核酸分解反応終了後、核酸を含む試料中に標的物質が含まれている場合は、標的物質を分離精製し、本発明のヌクレアーゼＡおよびヌクレアーゼＢは別途回収する。標的物質や核酸を含む試料の性質に応じて、反応液を６０〜１３５℃、好ましくは６５〜１００℃に加熱して酵素を失活させるか、またはｐＨの低下（塩酸等の酸の添加）などの適当な手段によって酵素を失活させて反応を停止してもよい。
【００７９】
核酸を含む試料としては、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡなどを含む試料が想定されるが、本発明のヌクレアーゼＡおよびヌクレアーゼＢのいずれの酵素の基質となり得る二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡなどのＤＮＡを含む試料であることが好ましい。
【００８０】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００８１】
１．培養上清中に存在する核酸分解酵素の活性染色による検出
プラスミドＤＮＡに対する核酸分解活性を指標としたスクリーニングにより、培養上清中に核酸分解酵素を分泌高生産する深海由来Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４（以下、ＭＢＥ１７４ともよぶ）を単離した。本菌株が培養上清中に生産する核酸分解酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｆｒｏｍ  ｓａｌｍｏｎ  ｔｅｓｔｅｓ（シグマアルドリッチ社製、Ｃａｔ  ｎｏ．Ｄ１６２６−１Ｇ）を基質とした活性染色により、分子量約６６．５ｋＤａおよび１７〜２１ｋＤａの低分子領域に分布を持つ複数個のタンパクであることが分かった。【００８２】
２．ＭＢＥ１７４の分類学的位置
ＭＢＥ１７４の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（１４８３塩基対）を解析したところ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｋｉｙｏｓｈｉｅｎｓｉｓ  ＮＢＲＣ１２４３４Ｔ（ＡＢ１８４０９５）、Ｓ．ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ  ＮＢＲＣ３１１３Ｔ（ＡＢ１８４７２８）、Ｓ．ｐａｒａｄｏｘｕｓ  ＮＢＲＣ１４８８７Ｔ（ＡＢ１８４６２８）、Ｓ．ｃｏｌｌｉｎｕｓ  ＮＢＲＣ１２７５９Ｔ（ＡＢ１８４１２３）、Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ  ＬＭＧ１９３４４Ｔ（ＡＪ７８１３２２）に９９％一致した。これより、本菌株はストレプトマイセス属細菌であると判断される。種レベルでの同定には更なる分類学的解析を要する。【００８３】
３．低分子核酸分解酵素Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓの精製
分子量約１７〜２１ｋＤａの低分子核酸分解酵素（Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓと命名、以下ＮｕｃＳと省略する）を、陰イオン交換（ＳｕｐｅｒＱ）、ハイドロキシアパタイト、陽イオン交換（ＣＭセファロース）、ヘパリンアフィニティー（図１を参照）、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて精製した。精製の概要を表１に示した。
【表１】
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【００８４】
ＮｕｃＳについて、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５中で３７℃における比活性を測定したところ（以下、この条件の測定法を標準比活性測定法ともよぶ）、３．６×１０６Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎであり、非常に高い比活性を示した。ここで１Ｕは、サケ精子ＤＮＡ  １ｍｇ／ｍＬ（インビトロジェン社製、Ｃａｔ  ｎｏ．１５６３２−０１１）を基質とし、酵素を作用させた場合に、３０分間に２６０ｎｍの吸光度を１上昇させる酵素量を示している。参考として、ＮｕｃＳについて、最も比活性が高いとカタログに記載されている市販の核酸分解酵素であるベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（登録商標）の比活性をカタログ記載の条件（３７℃）で、同基質を用いて、測定したところ、９．４×１０５Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎであった。この結果から、ＮｕｃＳはベンゾナーゼの約３．８倍高い比活性を有することが分かった。【００８５】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ７５（ＧＥヘルスケア社製）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより分子量を測定したところ、分子量約１６ｋＤａの溶出位置をピークトップとしてカラムより溶出された。この値は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で産出された酵素の分子量（約１７〜２１ｋＤａ）とよく一致したことから、ＮｕｃＳはモノマーとして存在していると判断される。Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＩＥＦ  ｐＨ３−１０  ｇｅｌ（インビトロジェン社製）を用いて等電点を測定したところ、ｐＩは１０であった。【００８６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の酵素タンパク質を分子量ごとに切り出し、トリプシン消化後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供したところ、切り出したすべてのタンパク質において共通のアミノ酸配列を持つペプチドＡＬＰＴＰＶＳＡＡＴＡＲ（配列表の配列番号２７）を検出した。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）、ＢＬＡＳＴＰ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ２．２．２４＋（引用文献：Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ  （１９９７），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照、本文献の記載はここに特に開示として援用される）を用いて、Ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅに対して相同性検索を行なった。その結果、このアミノ酸配列は、データベース上に登録されている分泌型タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）分子量２３ｋＤａ（Ｓ．ｓｃａｂｉｅｉ  ８７．２２由来、Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ  Ｔｕ４０００由来他）の一部に一致した。また、これまで生化学的性質が発表されているＳ．ｒｉｍｏｓｕｓ由来核酸分解酵素のＮ末端配列ＡＰＰＴＰＰＤＴＡＴＡＲにも相同性（８／１２アミノ酸）を示した。これらの結果より、ＭＢＥ１７４の生産する１７〜２１ｋＤａの低分子量の核酸分解酵素群は同一遺伝子から転写翻訳された後に、酵素タンパク質Ｃ末端部分においてプロテアーゼ等により低分子化を受けた産物であると判断された。【００８７】
本アミノ酸配列を用いた、上記のＢＬＡＳＴＰ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ２．２．２４＋による相同性検索の結果、上述のｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ  Ｔｕ４０００由来］（アクセッション番号ＺＰ＿０５５４１５０４）に加えて、ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ、［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＭＡ−４６８０由来］（アクセッション番号ＮＰ＿８２７００４）、ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）由来］（アクセッション番号ＮＰ＿６２６５９５．１）などの一部に含まれるアミノ酸配列に完全に一致した。続いて、これらのアミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその１０００ｂｐ上流、１０００ｂｐ下流の塩基配列をＮＣＢＩデータベースより取得し、ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）−ＭＡＣ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １２．１．０  ソフトウエアを用いて、アライメントした。本アライメント塩基配列に基づき、フォワードとリバースプライマーからなるプライマーセットＡ（配列表の配列番号７および８）およびＢ（配列表の配列番号９および１０）を設計した。プライマーセットＡのフォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ａ  Ｆ、およびｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ａ  Ｒとも表記し、後述のいずれのプライマーセットに用いられたプライマーもこれらに準じて表記した。ＭＢＥ１７４の総ＤＮＡを鋳型として、プライマーセットＡを用いたＰＣＲにより約０．３ｋｂの増幅ＤＮＡ断片、プライマーセットＢを用いたＰＣＲにより約０．５ｋｂ増幅ＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ反応は、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（登録商標）ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）および製品に添付のバッファーを使用し、熱変性９７℃にて２０秒、アニーリング５５−６３℃にて１分、伸長反応７２℃  １．５分からなるサイクルを３０回繰り返す方法を用いた。続いてこの増幅断片の塩基配列の解析を行なった。得られた塩基配列に基づき、プライマーセットＣ（配列表の配列番号１１および１２）を作成した。ＭＢＥ１７４の総ＤＮＡを鋳型として、プライマーセットＣを用いたＰＣＲにより約０．３ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を取得し、本断片の塩基配列を解析した。上記アライメント塩基配列とＮｕｃＳの塩基配列解析により得られた塩基配列に基づき、プライマーセットＤ（配列表の配列番号１３および１４）を作成した。ＭＢＥ１７４の総ＤＮＡを鋳型として、プライマーセットＤを用いたＰＣＲにより約０．３ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を取得し、本断片の塩基配列を解析しｎｕｃＳ遺伝子５’末端配列を得た。一方で、ＭＢＥ１７４の総ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで消化し、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製、Ｃａｔ  ｎｏ．ＲＲ０１５）に含まれるＰｓｔＩカセットを連結した。このＤＮＡ混合物を鋳型として、プライマーセットＥ（配列表の配列番号１５および１６）を用いてＰＣＲ反応を行なった。得られたＰＣＲ反応物を鋳型として、さらにプライマーセットＦ（配列表の配列番号１７および１８）を用いて、約１．２ｋｂの増幅断片を取得し、ｎｕｃＳ遺伝子の３’末端塩基配列を解析した。上記プライマーセットＡ〜Ｆを用いたＰＣＲにより得られたＤＮＡ増幅断片の全塩基配列をアセンブルし、ｎｕｃＳ遺伝子全長の塩基配列（配列表の配列番号５）を明らかにした。本酵素の遺伝子配列は、最も近いもので、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）ゲノム配列上のｐｕｔａｔｉｖｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎをコードする領域に８８％（５５２／６２６塩基）、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＭＡ−４６８０ゲノム配列上のｐｕｔａｔｉｖｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎをコードする領域に８５％（５３３／６２３塩基）、Ｓ．ｓｃａｂｉｅｉ  ８７．２２ゲノム配列上のｐｕｔａｔｉｖｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎをコードする領域に８５％（５３３／６２４塩基）一致した。また、本遺伝子がコードするアミノ酸配列（配列表の配列番号３）は、最も近いもので、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）のｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎに８３％（１７８／２１４アミノ酸）、Ｓ．ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ  ＤＳＭ４０７３６およびＳ．ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ  Ｔｕ４０００のｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎに８２％（１７７／２１４アミノ酸）一致した。データベースに登録されているすべての遺伝子やタンパク質を対象とした検索により、本遺伝子とそのアミノ酸配列に相同性を示す塩基配列は検出されるものの、単離精製・機能的、酵素化学的解析がなされた報告例のあるタンパクは皆無である。したがって、ＮｕｃＳタンパク質およびｎｕｃＳ遺伝子は、これまでに報告のない新規なものと推察される。【００８８】
分子量が約１７〜２１ｋＤａであるＮｕｃＳは（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のその分子領域に含まれる全てのタンパク質を分子量ごとに切り出し、トリプシン消化後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供した結果）、上記のように、全てのタンパク質において共通のアミノ酸配列を持つペプチドＡＬＰＴＰＶＳＡＡＴＡＲがあった。ＮｕｃＳの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により最も分子量が小さい場合が約１７ｋＤａであることより、ＮｕｃＳのアミノ酸配列（２１４アミノ酸）のうち、共通アミノ酸配列ＡＬＰＴＰＶＳＡＡＴＡＲをＮ末端の起点として１７ｋＤａと算出される共通アミノ酸配列（１５７アミノ酸）を、ＮｕｃＳのコア配列（配列表の配列番号１）とした。データベースに登録されている配列との比較により、ＮｕｃＳのコア配列はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ  Ｔｕ４０００のｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎあるいはＳ−ｌａｙｅｒ  ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎに８６％（１３６／１５７アミノ酸）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）のｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎとＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２４のｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  等に８５％（１３５／１５７アミノ酸）一致した。【００８９】
４．６６．５ｋＤａの核酸分解酵素Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｌの精製
分子量約６６．５ｋＤａの核酸分解酵素（Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｌと命名、以下ＮｕｃＬと省略する）を疎水性（ブチルトヨパールおよびフェニルセファロース）、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを用いて電気泳動的に単一バンドになるまで精製した（図２を参照）。精製の概要を表２に示した。
【表２】
2012036241.tif 000003
【００９０】
ＮｕｃＬについて、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５中、３７℃における比活性は５．６×１０４Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎであった。Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＩＥＦ  ｐＨ３−１０  ｇｅｌ（インビトロジェン社製）を用いて、等電点を測定したところ、ｐＩは７．０であった。次に、精製酵素のＮ末端アミノ酸配列を決定したところ、ＤＳＶＲＩＨＤＩＱＧＴＴＲであることが分かった。この配列は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｉ  ８７．２２のゲノムにコードされる推定タンパク質（ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＭＡ−４６８０のゲノム上にコードされる推定タンパク質（ｌａｒｇｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）にそれぞれ１２／１３アミノ酸、一致した。【００９１】
さらに精製酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にトリプシン消化し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供したところ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＭＡ−４６８０、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ  Ｔｕ４０００のゲノム配列にコードされる２つの推定タンパク質ｌａｒｇｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ  Ｔｕ４０００由来］（アクセッション番号ＺＰ＿０５５４１９８８）、ｌａｒｇｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＭＡ−４６８０由来］（アクセッション番号ＮＰ＿８２７５２３）のアミノ酸配列と一致する、短いアミノ酸配列（６−２１アミノ酸）が計８カ所検出された。続いて、ｌａｒｇｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＭＡ−４６８０由来］（アクセッション番号ＮＰ＿８２７５２３）のアミノ酸配列を用いて、ＢＬＡＳＴＰ  ｐｒｏｇｒａｍｓによる相同性検索を行なったところ、ｌａｒｇｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｖｉｃｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９０８３］（アクセッション番号ＺＰ＿０６９１６２３７）、ｌａｒｇｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ  ＤＳＭ  ４０７３６由来］（アクセッション番号ＺＰ＿０５５３０６４８）、ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｉ  ８７．２２由来］（アクセッション番号ＹＰ＿００３４９２５５７）ｌａｒｇｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）由来］（アクセッション番号ＮＰ＿６２６１７４）、ｌａｒｇｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ  ＡＴＣＣ  １４６７２由来］（アクセッション番号ＺＰ＿０４６８８９５２）、ｌａｒｇｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ  Ｔｕ４０００由来］（アクセッション番号ＺＰ＿０５５４１９８８）に約８０％の相同性を示した。これらのタンパクのアミノ酸配列をＮＣＢＩデータベースより取得し、ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）−ＭＡＣ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １２．１．０  ソフトウエアを用いて、アライメントした。本アライメントアミノ酸配列に基づき、保存性の高い領域を選択し、プライマーセットＧ（配列表の配列番号１９および２０）を作成した。ＭＢＥ１７４の総ＤＮＡを鋳型として、プライマーセットＧを用いたＰＣＲにより約１．６ｋｂの増幅ＤＮＡ断片配列を取得し、塩基配列の解析を行なった。得られた塩基配列を基に、ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ｈ  Ｒ（配列表の配列番号２１）を設計した。また一方で、ｌａｒｇｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ  Ｔｕ４０００由来］（アクセッション番号ＺＰ＿０５５４１９８８）をコードする塩基配列の上流に存在する塩基配列１０００ｂｐおよび）ｌａｒｇｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）由来］（アクセッション番号ＮＰ＿６２６１７４）をコードするを塩基配列の上流に存在する塩基配列１０００ｂｐをＮＣＢＩデータベースより取得し、これらに保存された配列に基づき、ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ｈ  Ｆ（配列表の配列番号２２）を作成した。ＭＢＥ１７４の総ＤＮＡを鋳型として、ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ｈ  Ｒ、ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ｈ  Ｆの組み合わせからなるプライマーセットＨを用いたＰＣＲにより約０．５ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を取得し、塩基配列の解析を行ない、ｎｕｃＬ遺伝子５’末端配列を得た。またＭＢＥ１７４の総ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで消化し、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製、Ｃａｔ  ｎｏ．  ＲＲ０１５）に含まれるＰｓｔＩカセットを連結しＤＮＡ混合物を鋳型として、プライマーセットＩ（配列表の配列番号２３および２４）を用いてＰＣＲ反応を行なった。得られたＰＣＲ反応物を鋳型として、さらにプライマーセットＪ（配列表の配列番号２５および２６）を用いて、約１．３ｋｂの増幅断片を取得し、ｎｕｃＬ遺伝子の３’末端塩基配列を解析した。上記プライマーセットＧ〜Jを用いたＰＣＲにより得られたＤＮＡ増幅断片の全塩基配列をアセンブルし、ｎｕｃＬ遺伝子全長の塩基配列（配列表の配列番号６）を明らかにした。本酵素の遺伝子配列は、最も近縁なもので、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）のゲノム配列のｐｕｔａｔｉｖｅ  ｌａｒｇｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎをコードする領域に８４％（１５８７／１８７２塩基）、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＭＡ−４６８０ゲノム上のｐｕｔａｔｉｖｅ  ｌａｒｇｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎをコードする領域に８１％（１５０８／１８５９塩基）一致した。また、本遺伝子がコードするアミノ酸配列（配列表の配列番号４）は、最も近縁なもので、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）のゲノム上にコードされるｐｕｔａｔｉｖｅ  ｌａｒｇｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎに８０％（４９１／６１３アミノ酸）、Ｓ．ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ  ＡＴＣＣ１４６７２のゲノム上にコードされるｌａｒｇｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎに８０％（４８８／６０９アミノ酸）一致した。データベースに登録されているすべての遺伝子やタンパクを対象とした検索により、本遺伝子に相同性を示す塩基配列は検出されるものの、単離精製・機能的、酵素化学的解析がなされた報告例のあるタンパクは皆無である。したがって、ＮｕｃＬタンパク質およびｎｕｃＬ遺伝子は、これまでに報告のない新規なものと推察される。【００９２】
ｎｕｃＬがコードする全アミノ酸配列（６０７アミノ酸）のうち、Ｎ末端のシグナルペプチドを切断した配列をＮｕｃＬ成熟タンパク（５７５アミノ酸）とした（配列表の配列番号２）。このＮｕｃＬ成熟タンパクは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）、ＢＬＡＳＴＰ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ２．２．２４＋を用いて、Ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅに対する相同性検索の結果、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２４の（ｐｕｔａｔｉｖｅ）ｌａｒｇｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎと８１％（４６５／５７４アミノ酸）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ  ＡＴＣＣ  １４６７２のｌａｒｇｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎに８０％（４６７／５７７アミノ酸）一致した。【００９３】
５．ＮｕｃＳとＮｕｃＬの生化学的性質
ＮｕｃＳとＮｕｃＬの生化学的性質の試験結果を以下に示す。
（１）酵素活性に対するｐＨの影響
各ｐＨにおける核酸分解活性は、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  ２−モルホリノエタンスルホン酸，一水和物／ＮａＯＨ（ＭＥＳ，ｐＨ５．５〜７．０）、３−モルホリノプロパンスルホン酸／ＮａＯＨ（ＭＯＰＳ，ｐＨ７〜８）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸／ＮａＯＨ（ＴＡＰＳ，ｐＨ８〜９）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸／ＮａＯＨ（ＣＨＥＳ，ｐＨ９〜９．５）、またはＮ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸／ＮａＯＨ（ＣＡＰＳ，９．５〜１０）中で、Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｆｒｏｍ  ｓａｌｍｏｎ  ｔｅｓｔｅｓ  ０．４ｍｇ／ｍＬ（シグマアルドリッチ社製、Ｃａｔ  ｎｏ．Ｄ１６２６−１Ｇ）を基質として、２５℃で１５分間測定した。ＮｕｃＳはｐＨ  ８．５、ＮｕｃＬはｐＨ  ８．８付近が最適反応ｐＨであることが分かった（図３および図４を参照）。【００９４】
（２）酵素活性に対する温度の影響
１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５中で１５分間、各温度条件における核酸分解活性を測定したところ、ＮｕｃＳは５５℃、ＮｕｃＬは４５℃付近が最適反応温度であることが分かった（図５を参照）。【００９５】
（３）熱安定性試験
１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５中で、各温度で３０分熱処理後の残存活性を測定した（図６を参照）。氷浴中に保存しておいた酵素の活性を１００％とした。その結果、ＮｕｃＳは４５℃まで安定であり、ＮｕｃＬは３５℃まで安定であった。【００９６】
（４）酵素活性に対する一価塩の影響
ＮｕｃＳおよびＮｕｃＬについて一価塩の影響を調べた。１ｍＭ  ＭｇＣｌ２と０〜１０００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５中で、Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｆｒｏｍ  ｓａｌｍｏｎ  ｔｅｓｔｅｓ  ０．４ｍｇ／ｍＬ（シグマアルドリッチ社製、Ｃａｔ  ｎｏ．Ｄ１６２６−１Ｇ）を基質として、各ＮａＣｌ濃度の核酸分解活性を２５℃で１５分間測定した。ＮｕｃＳ活性はＮａＣｌ濃度が低い場合に高く、ＮｕｃＬは１０００ｍＭまでのＮａＣｌ濃度存在条件でも活性を維持することが分かった（図７を参照）。ＫＣｌを用いた場合にもほぼ同様の結果が得られた（図８を参照）。【００９７】
（５）酵素活性に対する二価金属塩の影響
ＮｕｃＳおよびＮｕｃＬについて二価金属塩の影響を調べた。１ｍＭ  ＣａＣｌ２と、０〜２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２あるいはＭｎＣｌ２を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５中に、基質としてＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｆｒｏｍ  ｓａｌｍｏｎ  ｔｅｓｔｅｓ  ０．４ｍｇ／ｍＬ（シグマアルドリッチ社製、Ｃａｔ  ｎｏ．Ｄ１６２６−１Ｇ）を加えた反応液に、ＮｕｃＳあるいはＮｕｃＬを添加、氷中で３０分間インキュベートした後、核酸分解活性を２５℃で１５分間測定した。ＮｕｃＳ、ＮｕｃＬは活性に二価の金属塩を要求した。ＮｕｃＳ、ＮｕｃＬは０．２５〜５ｍＭ  ＭｇＣｌ２存在下で高い活性を示した（図９を参照）。またＮｕｃＳは１〜２ｍＭ  ＭｎＣｌ２存在下でＭｇＣｌ２存在下とほぼ同等の活性を示した（図１０を参照）。なお、本試験では酵素安定性を高めるために、すべての反応液に１ｍＭ  ＣａＣｌ２を添加した。【００９８】
（６）酵素活性に対するリン酸塩の影響
ＮｕｃＳおよびＮｕｃＬについてリン酸塩の影響を調べた。１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む０〜４０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．５中で、Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  ｆｒｏｍ  ｓａｌｍｏｎ  ｔｅｓｔｅｓ  ０．４ｍｇ／ｍＬ（シグマアルドリッチ社製、Ｃａｔ  ｎｏ．Ｄ１６２６−１Ｇ）を基質として、核酸分解活性を２５℃で１５分間測定した。ＮｕｃＳはリン酸塩に強く阻害され、０．５ｍＭ以上のリン酸塩により活性を失った。一方、ＮｕｃＬはＮｕｃＳと比較して、リン酸塩に対して優れた耐性を示し、１０ｍＭのリン酸カリウム存在下でも５０％の活性を保持することができた。（図１１を参照）【００９９】
（７）酵素活性に対する各種化学物質の影響
氷浴上で表３中の化合物と１時間接触させたのち、標準比活性測定方法で酵素活性を測定した（表３を参照）。表３に示すように、ＮｕｃＳとＮｕｃＬはＺｎＣｌ２、ＣｕＣｌ２、ＥＤＴＡによって強く阻害された。また、ＮｕｃＳはジメチルスルホキシドやジメチルホルムアミドに高い耐性を示し、ＮｕｃＬはＳＤＳに高い耐性を示した。なお、水に難溶の化合物はジメチルスルホキシドに溶解した後、酵素液に添加した。添加後のジメチルスルホキシドの終濃度は５％とし、５％  ジメチルスルホキシド存在下での活性を１００％とした。
【表３】
2012036241.tif 000004
【０１００】
６．ＮｕｃＳとＮｕｃＬによる核酸分解のパターンと基質特異性
（１）ＮｕｃＳおよびＮｕｃＬの環状プラスミドＤＮＡに対する分解様式の解析
プラスミド精製キット（ＨｉＳｐｅｅｄ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ；キアゲン社製、Ｃａｔ  ｎｏ．１２６４３）を用いて精製した環状プラスミドＤＮＡ（ｐＵＣ１８）を基質として、ＮｕｃＳおよびＮｕｃＬそれぞれの核酸分解様式を解析した。標準比活性測定方法による、プラスミド溶液（約２〜１０μｇ）に対して、下の表にある異なる酵素量の酵素液をそれぞれ添加して、２５℃で１５分間核酸分解反応を行なった。分解後の反応液を１％アガロースゲル電気泳動に供し、その分解されたＤＮＡの分解様式を解析した。酵素濃度を変化させて分解したときの様子（２５℃の反応）を図１２に示した。参考として、ベンゾナーゼ（同ユニット数）を用いた場合の試験結果も合わせて図１２に示した。なお、各レーンの説明は表４に示した。
【表４】
2012036241.tif 000005
【０１０１】
続いて、ＮｕｃＬの酵素量を０．５Ｕに上げ、プラスミドが完全に分解できるか試験した（図１３を参照）。これらの結果より、ＮｕｃＳおよびＮｕｃＬは、環状プラスミドＤＮＡを、スーパーコイル型、リラックス型の形状に関わらず、単独酵素でプラスミドを完全に分解することが可能であることが分かった。【０１０２】
（２）ＮｕｃＳおよびＮｕｃＬの環状ＤＮＡに対する分解反応初期における反応様式の解析
標準比活性測定方法による、ＮｕｃＳおよびＮｕｃＬの環状ＤＮＡ（ｐＵＣ１８プラスミド）に対する分解反応初期における反応様式を解析した（図１４および図１５を参照）。本結果より、ＮｕｃＳはエンド型様式の分解活性を持つと推察される。また、ＮｕｃＬは、Ｄｅｓａｉ  ａｎｄ  Ｓｈａｎｋａｒ（Eur. J. Biochem.267,5123-5135,2000を参照、本文献の記載はここに特に開示として援用される）によって報告例のある一本鎖特異的なエンド型核酸分解酵素に類似した反応パターンを示した。一本鎖特異的核酸分解酵素による環状プラスミドＤＮＡの分解は、一本鎖のエンド型切断の蓄積による低分子化によって進むと考えられている。【０１０３】
（３）二本鎖直鎖ＤＮＡの分解パターン
標準比活性測定方法による、環状ＤＮＡ（ｐＵＣ１８プラスミド）を制限ヌクレアーゼＢａｍＨＩ（５’−突出末端を生じる）、ＳａｃＩ（３’−突出末端を生じる）、ＳｍａＩ（平滑末端を生じる）を用いて直鎖状にした基質を用いて、ＮｕｃＳおよびＮｕｃＬを用いた分解反応を行なった（図１６および図１７を参照）。なお、各レーンの説明は表５に示した。
【表５】
2012036241.tif 000006
【０１０４】
本結果により、ＮｕｃＳおよびＮｕｃＬは、ＤＮＡ鎖末端の構造に関わらず直鎖状二本鎖ＤＮＡを単独酵素で分解することが可能であることが分かった。また、図１２と図１６および図１７との比較により、ＮｕｃＳは、環状ＤＮＡと直鎖状二本鎖ＤＮＡを同様の効率で分解することが分かった。一方、ＮｕｃＬは環状ＤＮＡに比べて、直鎖状二本鎖ＤＮＡをより効率良く分解した。また、反応途中で観察される分解の進んでいないＤＮＡの最大サイズがＮｕｃＳでは反応開始から一定であるのに対し（図１６のレーン５〜８の主なバンド）、ＮｕｃＬではサイズの低下が起きている（図１７のレーン３とレーン４〜８の主なバンドを比較）。これはＮｕｃＬによるＤＮＡ分解が、ランダムな位置というよりもむしろ末端部分でより効率良く起きていること、すなわちエキソ型分解反応が進んでいること示唆する。以上の結果から、ＮｕｃＬはエンドエキソ型と呼ばれる反応様式を有すると推定される。【０１０５】
（４）一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡに対する反応性試験
１５分間の標準比活性測定方法による、低温で溶解したサケＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）と９５℃、１０分間の熱変性後の同ＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）に対する各酵素の反応性を試験した。その結果、ＮｕｃＳは未変性ＤＮＡと熱変性ＤＮＡを同程度の効率で分解するが、ＮｕｃＬは未変性ＤＮＡに比べて熱変性後ＤＮＡを、約５倍の高い効率で分解することが分かった。すなわち、ＮｕｃＬは一本鎖ＤＮＡに効率良く作用する酵素であると言える。また、ＲＮＡ（酵母由来ｍＲＮＡ）に対する分解活性を測定した結果、ＮｕｃＳはＲＮＡ分解活性を示したが、ＮｕｃＬはＲＮＡ分解活性を示さなかった。【０１０６】
（５）ホスホジエステラーゼ、ホスファターゼ活性試験
ビス（ｐ−ニトロフェニル）リン酸、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として、Ｔｏｍｏｙｅｄａら（Archives of biochemistry and biophysics.131(1),191-202,1969を参照、本文献の記載はここに特に開示として援用される）の方法に従い、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２および１％グリセロールを含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５中で、０．２％上記基質とする反応液を用いて、両方酵素のホスホジエステラーゼ活性、ホスファターゼ活性を２５℃で測定した。その結果、ＮｕｃＳはホスホジエステラーゼおよびホスファターゼ活性をどちらも持たないが、ＮｕｃＬはホスホジエステラーゼおよびホスファターゼの両活性を有することが分かった。【０１０７】
７．まとめ
ＮｕｃＳは、市販核酸分解酵素に比べて格段に高い比活性を持ち、低塩濃度条件下で種々の核酸（一本鎖と二本鎖の直鎖および環状ＤＮＡ、ＲＮＡ）を効率良くエンド型に分解する。ＮｕｃＬは広い塩濃度条件下でＤＮＡ（一本鎖と二本鎖の直鎖および環状ＤＮＡ）をエンドエキソ型に分解する。したがってＮｕｃＳおよびＮｕｃＬを併用することにより、広範な条件において優れた核酸分解活性が期待される。また両酵素は、Ｍｎ２＋の添加を必要とせず、低濃度（１ｍＭ）のＭｇ２＋およびＣａ２＋存在下で高い活性を示すこと、また本酵素の生産菌は培養が容易で、安全性が高いと考えられるストレプトマイセス属細菌であることから、食品や医薬品製造時の核酸分解工業用酵素として有望と考えられる。核酸分解酵素高生産放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＭＢＥ１７４を培養することによって、また本酵素をコードする新規遺伝子を用いて、核酸分解酵素を安価に提供することが可能であると考えられる。【０１０８】
配列表に記載の配列は以下の通りである：
Ｎｏ．１  ＮｕｃＳのコア配列
ALPTPVSAATARGYLASLKVAPENRTGYKRDLFPHWITQSGTCNTRETVLKRDGTNVVTDAACAATSGSWYSPFDGATWTAASDVDIDHLVPLAEAWDSGASAWTTAQRQAFANDLTRPQLLAVTDTVNQSKGDKDPAEWMPPRAAYHCTYVRAWVQ；
Ｎｏ．２  ＮｕｃＬ成熟タンパク
DSVRIHDIQGTTRISPYAGRQVADVPGVVTGVRDHGSSRGFWFQDPRPDDDPATSEGVFVFTGSAPGVEAGDAVTVSGTVSEFVPGGTASGNQSLTEITRPTVTVVSRGNPVPDPVVVSARSVPHAYAPAGDAAANGSVNALPLRPDRYALDYYESLEGMNVQVADARVVGATDPYTELWVTVKPGENASPRGGTVYGSRDAQNTGRLQIQTLGVPAGFPAADVGDTLAGATTGPLDYNQFGGYTLVARSLGTLTAGGLARETTREQHRDELSVATYNVENLDPSDGTFAAHAEAIVRNLRSPDIVSLEEIQDDNGATDDGTVTAGVTVGKLIDAVVAAGGPRYDWRSVDPVDKADGGQPGGNIRQVFLFDPRRVSFADRPGGDAVTATGVVKVRGKAALTHSPGRVDPANPAWLNSRKPLAGEFSFRGRTVFVIANHFASKGGDQGLTSQYQPPARSSETQRHLQATAVNTFVKQILAVQKNADVIALGDINDFEFSGTTERLEAGGALWSAVRSLPPGERYSYVYQGNSQVLDQILVSPSIRRGHLSYDSVHINAEFHDQISDHDPQVLRYRP；
Ｎｏ．３  ＮｕｃＳ
MPKLYARRRFAVLAALTGLIASAGLFHGPAASAALPTPVSAATARGYLASLKVAPENRTGYKRDLFPHWITQSGTCNTRETVLKRDGTNVVTDAACAATSGSWYSPFDGATWTAASDVDIDHLVPLAEAWDSGASAWTTAQRQAFANDLTRPQLLAVTDTVNQSKGDKDPAEWMPPRAAYHCTYVRAWVQVKYYYGLSVDTAEKTALTNRLAGC；
Ｎｏ．４  ＮｕｃＬ
MASQSVTRLAALTVAATCSAASVVVLGPPAHADSVRIHDIQGTTRISPYAGRQVADVPGVVTGVRDHGSSRGFWFQDPRPDDDPATSEGVFVFTGSAPGVEAGDAVTVSGTVSEFVPGGTASGNQSLTEITRPTVTVVSRGNPVPDPVVVSARSVPHAYAPAGDAAANGSVNALPLRPDRYALDYYESLEGMNVQVADARVVGATDPYTELWVTVKPGENASPRGGTVYGSRDAQNTGRLQIQTLGVPAGFPAADVGDTLAGATTGPLDYNQFGGYTLVARSLGTLTAGGLARETTREQHRDELSVATYNVENLDPSDGTFAAHAEAIVRNLRSPDIVSLEEIQDDNGATDDGTVTAGVTVGKLIDAVVAAGGPRYDWRSVDPVDKADGGQPGGNIRQVFLFDPRRVSFADRPGGDAVTATGVVKVRGKAALTHSPGRVDPANPAWLNSRKPLAGEFSFRGRTVFVIANHFASKGGDQGLTSQYQPPARSSETQRHLQATAVNTFVKQILAVQKNADVIALGDINDFEFSGTTERLEAGGALWSAVRSLPPGERYSYVYQGNSQVLDQILVSPSIRRGHLSYDSVHINAEFHDQISDHDPQVLRYRP；
Ｎｏ．５  ｎｕｃＳ遺伝子
ATGCCGAAGCTCTACGCGCGTCGACGGTTCGCCGTCCTCGCCGCGCTCACCGGACTCATAGCCTCCGCCGGGCTCTTCCACGGTCCGGCCGCCTCCGCCGCCCTCCCCACGCCGGTCAGCGCCGCCACCGCCCGCGGCTACCTCGCCTCCCTGAAGGTGGCCCCCGAGAACCGCACCGGCTACAAGCGCGACCTCTTCCCCCACTGGATCACGCAGTCCGGCACCTGCAACACCCGCGAGACCGTCCTCAAACGCGACGGCACCAACGTCGTCACCGACGCCGCCTGCGCCGCCACCAGCGGCAGTTGGTACTCGCCCTTCGACGGGGCCACCTGGACCGCCGCCTCCGACGTCGACATCGACCACCTCGTCCCGCTGGCCGAGGCGTGGGACTCCGGCGCGAGCGCCTGGACCACGGCCCAGCGCCAGGCGTTCGCCAACGACCTGACACGTCCTCAGCTCCTCGCCGTCACCGACACCGTGAACCAGTCCAAGGGCGACAAGGACCCGGCCGAGTGGATGCCGCCCCGGGCCGCCTACCACTGCACCTACGTACGCGCCTGGGTGCAGGTGAAGTACTACTACGGCCTCTCGGTCGACACCGCCGAGAAGACGGCGCTCACGAACCGGCTCGCCGGCTGCTGA；
Ｎｏ．６  ｎｕｃＬ遺伝子
TTGGCCAGCCAGTCCGTCACGCGCCTCGCCGCGCTCACCGTCGCCGCCACCTGTTCGGCGGCGTCCGTCGTCGTCCTCGGTCCGCCCGCGCACGCCGACTCCGTGCGCATCCACGACATCCAGGGCACCACCAGGATCTCCCCGTACGCCGGCCGCCAGGTCGCCGACGTGCCCGGCGTCGTCACCGGAGTCCGCGACCACGGCTCCTCCCGGGGCTTCTGGTTCCAGGACCCGCGGCCCGACGACGACCCCGCCACCAGCGAGGGAGTGTTCGTCTTCACCGGCTCGGCCCCCGGGGTCGAGGCCGGCGACGCGGTCACCGTCTCCGGCACGGTCTCGGAGTTCGTGCCCGGCGGGACCGCCTCCGGCAACCAGTCGCTCACCGAGATCACCCGGCCCACGGTCACCGTGGTCTCCCGCGGCAACCCGGTGCCGGACCCGGTCGTCGTCTCGGCCCGCTCCGTGCCGCACGCCTACGCCCCGGCGGGCGACGCCGCCGCGAACGGCTCCGTCAACGCCCTGCCCCTGCGGCCCGACCGCTACGCCCTGGACTACTACGAGTCCCTGGAGGGCATGAACGTCCAGGTGGCCGACGCCCGCGTGGTCGGCGCGACCGACCCGTACACCGAGCTGTGGGTGACGGTGAAGCCCGGCGAGAACGCGAGCCCCCGGGGCGGCACCGTCTACGGCTCCCGCGACGCGCAGAACACCGGGCGGCTGCAGATCCAGACCCTGGGCGTACCAGCCGGCTTCCCCGCCGCCGACGTGGGCGACACCCTCGCGGGCGCCACCACCGGCCCGCTCGACTACAACCAGTTCGGCGGCTACACCCTGGTCGCCCGTAGTCTCGGCACGCTCACCGCCGGCGGGCTCGCCCGCGAGACGACCCGGGAGCAGCACCGCGACGAGCTGTCGGTGGCCACGTACAACGTCGAGAACCTCGACCCCTCCGACGGCACCTTCGCCGCGCACGCGGAGGCGATCGTCCGGAACCTGCGCTCACCGGACATCGTGTCCCTGGAGGAGATCCAGGACGACAACGGCGCCACGGACGACGGCACGGTGACCGCCGGCGTGACGGTGGGCAAGCTGATCGACGCCGTCGTCGCGGCCGGCGGCCCGCGCTACGACTGGCGCTCGGTGGACCCCGTCGACAAGGCGGACGGCGGGCAGCCGGGCGGCAACATCCGCCAGGTGTTCCTCTTCGACCCGCGGCGGGTCTCCTTCGCCGACCGTCCCGGCGGGGACGCGGTCACCGCGACCGGGGTGGTGAAGGTGCGCGGCAAGGCGGCGCTGACCCACTCCCCCGGCCGGGTCGACCCCGCGAACCCCGCCTGGCTGAACAGCCGCAAGCCGCTGGCCGGCGAGTTCTCGTTCCGCGGGCGGACGGTCTTCGTGATCGCCAACCACTTCGCGTCCAAGGGCGGCGACCAGGGGCTGACCTCCCAGTACCAGCCGCCGGCGCGGAGTTCGGAGACCCAGCGCCACCTCCAGGCGACGGCGGTGAACACCTTCGTCAAGCAGATCCTGGCGGTCCAGAAGAACGCGGACGTCATCGCCCTCGGCGACATCAACGACTTCGAGTTCTCCGGCACGACGGAACGCCTGGAGGCCGGCGGCGCGCTCTGGTCGGCGGTCAGGTCGCTGCCGCCGGGCGAGCGCTACTCGTACGTCTACCAGGGCAACAGCCAGGTGCTCGACCAGATCCTGGTGAGCCCGTCGATCCGGCGCGGGCACCTGTCCTACGACAGCGTGCACATCAACGCCGAGTTCCACGACCAGATCAGCGACCACGACCCGCAGGTGCTGCGGTACCGCCCCTGA；
Ｎｏ．７  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ａ  Ｆ
CGCATG(C/T)C(A/G)AAG(G/T)TCTACG；
Ｎｏ．８  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ａ  Ｒ
A(A/G)CTGCCGCTGGTGG；
Ｎｏ．９  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ｂ  Ｆ
AGCGGCAG(C/T)TGGTACTC；
Ｎｏ．１０  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ｂ  Ｒ
ACCCGCGATCTGGAAGG；
Ｎｏ．１１  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ｃ  Ｆ
GCTACAAGCGCGACCTCTTC；
Ｎｏ．１２  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ｃ  Ｒ
TGGACTGGTTCACGGTGTC；
Ｎｏ．１３  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ｄ  Ｆ
AACTGCCGCTGGTGG；
Ｎｏ．１４  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ｄ  Ｒ
CTGAGCAGTATGTCGACGGTC；
Ｎｏ．１５  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ｅ  Ｆ
GCTACAAGCGCGACCTCTTC；
Ｎｏ．１６  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ｅ  Ｒ
GTTAGAACGCGTAATACGAC；
Ｎｏ．１７  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ｆ  Ｆ
CTGGGTGCAGGTGAAGTACTAC；
Ｎｏ．１８  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ｆ  Ｒ
GTAATACGACTCACTATAGG；
Ｎｏ．１９  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ｇ  Ｆ
GGCTTCTGGAT(A/G/C)CAGGACCC；
Ｎｏ．２０  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ｇ  Ｒ
CTGCGGGTCGTGGTCG；
Ｎｏ．２１  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ｈ  Ｒ
CGGTGAGCGACTGGTTG；
Ｎｏ．２２  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ｈ  Ｆ
CAGTACATGGC(C/T)GAAACCTTGAC；
Ｎｏ．２３  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ｉ  Ｆ
CGAGTTCTCGTTCCGCG；
Ｎｏ．２４  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ｉ  Ｒ
GTTAGAACGCGTAATACGAC；
Ｎｏ．２５  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ｊ  Ｆ
ATCGCCAACCACTTCGC；
Ｎｏ．２６  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  Ｊ  Ｒ
GTAATACGACTCACTATAGG；
Ｎｏ．２７  ＮｕｃＳの共通配列
ALPTPVSAATAR。
【受託番号】
【０１０９】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＭＢＥ１７４  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８７
【図１】
2012036241.tif 000007
【図２】
2012036241.tif 000008
【図３】
2012036241.tif 000009
【図４】
2012036241.tif 000010
【図５】
2012036241.tif 000011
【図６】
2012036241.tif 000012
【図７】
2012036241.tif 000013
【図８】
2012036241.tif 000014
【図９】
2012036241.tif 000015
【図１０】
2012036241.tif 000016
【図１１】
2012036241.tif 000017
【図１２】
2012036241.tif 000018
【図１３】
2012036241.tif 000019
【図１４】
2012036241.tif 000020
【図１５】
2012036241.tif 000021
【図１６】
2012036241.tif 000022
【図１７】
2012036241.tif 000023
【配列表】
2012036241000001.app
【国際調査報告】
2012036241.tif 000024
2012036241.tif 000025
2012036241.tif 000026
2012036241.tif 000027
2012036241.tif 000028
2012036241.tif 000029
2012036241.tif 000030
2012036241.tif 000031