(57)【要約】  医薬品や農薬等の中間体として有用な光学活性アミノ化合物を、ケトン化合物から効率よく製造するための方法を提供する。  水溶性有機溶媒に高い耐性を持ち、かつ、（Ｓ）−１−ベンジル−３−ピロリジノンを９３％以上の高い光学純度で生成する新規アミノ基転移酵素活性を有するポリペプチド、これをコードする遺伝子、その遺伝子を高発現する形質転換体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のポリペプチド：
（ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アミノ基供与体の存在下で１−ベンジル−３−ピロリジノンに作用して光学純度９３％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを生成する活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アミノ基供与体の存在下で１−ベンジル−３−ピロリジノンに作用して光学純度９３％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを生成する活性を有するポリペプチド、
（ｄ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アミノ基供与体の存在下で１−ベンジル−３−ピロリジノンに作用して光学純度９３％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを生成する活性を有し、かつ、下記（１）および／または（２）の性質を有するポリペプチド：
（１）基質特異性：
（ａ）アミノ基供与体：（Ｓ）−１−フェネチルアミン、ベンジルアミンおよび±２−ブチルアミンに対して活性を示し、β−アラニン、および４−アミノ酪酸に対して実質的に活性を示さない、
（ｂ）アミノ基受容体：ピルビン酸およびグリオキシル酸のそれぞれに対し活性を示す、
（２）水溶性有機溶媒耐性：終濃度８０％ｖ／ｖの１−プロパノール、２−プロパノール、アセトンのいずれかで２時間処理後の残存活性が処理前の全活性の１０％以上を保持する。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項３】
下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに記載の請求項２に記載のＤＮＡ：
（Ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２または３に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項６】
ケトン化合物に、アミノ基供与体の存在下、請求項１に記載のポリペプチド、あるいは請求項５に記載の形質転換体の培養物を作用させることを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法。
【請求項７】
一般式（１）：
【化１】
2012043622.tif 000014
（式中、Ｒ１およびＲ２は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアラルキル基もしくは置換されていてもよいアリール基を示し、Ｒ１とＲ２の両者が互いに結合して環を形成していてもよい。但し、Ｒ１とＲ２は構造が異なる。）で表されるケトン化合物に、アミノ基供与体の存在下、請求項１に記載のポリペプチド、または請求項５に記載の形質転換体の培養物を作用させることを特徴とする、一般式（２）：
【化２】
2012043622.tif 000015
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（１）と同じ。＊は不斉炭素原子を示す。）で表される光学活性アミノ化合物の製造方法。
【請求項８】
アミノ化合物のエナンチオマー混合物にアミノ基受容体の存在下、請求項１に記載のポリペプチド、または請求項５に記載の形質転換体の培養物を作用させることを特徴とする光学活性アミノ化合物の製造方法。
【請求項９】
一般式（３）：
【化３】
2012043622.tif 000016
（式中、Ｒ１およびＲ２は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアラルキル基もしくは置換されていてもよいアリール基を示し、Ｒ１とＲ２の両者が互いに結合して環を形成していてもよい。但し、Ｒ１とＲ２は構造が異なる。）で表わされるアミノ化合物のエナンチオマー混合物に、アミノ基受容体の存在下、請求項１に記載のポリペプチド、または請求項５に記載の形質転換体の培養物を作用させることにより、一般式（４）：
【化４】
2012043622.tif 000017
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（３）と同じ。＊は不斉炭素原子を示す）で表わされる光学活性アミノ化合物を得ることを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法。
【請求項１０】
前記式（１）で表されるケトン化合物が、１−テトラロン、２−テトラロン、５−メトキシ−２−テトラロン、６−メトキシ−２−テトラロン、７−メトキシ−２−テトラロン、８−メトキシ−２−テトラロン、１−ベンジル−３−ピロリジノン、１−Ｂｏｃ−３−ピロリジノン、１−Ｃｂｚ−３−ピロリジノン、１−ベンジル−３−ピペリジノン、１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノン、１−Ｃｂｚ−３−ピペリジノン、アセトフェノン、３，４−ジメトキシフェニルアセトン、からなる群から選ばれる１以上のケトン化合物である請求項７に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記式（３）で表されるアミノ化合物が、１−アミノテトラリン、２−アミノテトラリン、５−メトキシ−２−アミノテトラリン、６−メトキシ−２−アミノテトラリン、７−メトキシ−２−アミノテトラリン、８−メトキシ−２−アミノテトラリン、１−ベンジル−３−アミノピロリジン、１−Ｂｏｃ−３−アミノピロリジン、１−Ｃｂｚ−３−アミノピロリジン、１−ベンジル−３−アミノピペリジン、１−Ｂｏｃ−３−アミノピペリジン、１−Ｃｂｚ−３−アミノピペリジン、１−フェネチルアミン、３，４−ジメトキシアンフェタミン、からなる群から選ばれる１以上のアミノ化合物である請求項９に記載の製造方法。
【請求項１２】
アミノ基供与体が、１−フェネチルアミン、２−ブチルアミン、２−ペンチルアミン、２−ヘプチルアミン、３−ヘプチルアミン、ｎ−エチルアミン、ｎ−プロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｎ−アミルアミン、イソプロピルアミン、イソブチルアミン、グリシン、アラニン、３−アミノ−１−フェニルブタン、ベンジルアミン、β−フェネチルアミン、シクロヘキシルアミンおよびそれらの光学活性体からなる群より選ばれる１以上の化合物である請求項６または７に記載の製造方法。
【請求項１３】
アミノ基受容体が、ピルビン酸またはグリオキシル酸である請求項８または９に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ基転移反応により、ケトン化合物を効率よく光学活性アミノ化合物に変換しうる酵素および該酵素を用いた光学活性アミノ化合物の製造方法に関する。得られる光学活性アミノ化合物は、医薬品や農薬等の中間体として利用しうる。
【背景技術】
【０００２】
アミノ基転移酵素を用いた光学活性アミノ化合物の製法に関して、これまでにα−アミノ酸の製法については多くの報告があるが、α−アミノ酸以外の光学活性アミノ化合物の製法については報告例が少ない。近年、α−アミノ酸以外の光学活性アミノ化合物を生成するアミノ基転移酵素が見出され、一般的な光学活性アミノ化合物の効率的な製法としての利用が期待されている。【０００３】
しかし、これまでに知られているα−アミノ酸以外の光学活性アミノ化合物を生成するアミノ基転移酵素には課題が多い（非特許文献１）。【０００４】
例えば、水溶性有機溶媒に対する耐性が低く、メタノール、ＴＨＦ、ＤＭＦを１０％ｖ／ｖ添加することで、酵素活性の半減期が約５時間から３．５時間以下へと低下する。【０００５】
また、α−アミノ酸以外の光学活性アミノ化合物の中でも、特に医薬中間体として有用な（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを、９３％ｅ．ｅ．以上の高光学純度で生成するアミノ基転移酵素は見出されていない（特許文献１，２、非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−１８５１３３
【特許文献２】ＷＯ２００６／１２６４９８
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｏｒｇ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ８，  １２８０−１２８３（２０１０）
【非特許文献２】Ａｄｖ．  Ｓｙｎｔｈ．  Ｃａｔａｌ．  ３５０，  ８０７−８１２（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、医薬品や農薬等の中間体として有用な光学活性アミノ化合物を、ケトン化合物から効率よく製造するための方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、様々な土壌分離菌を対象としたスクリーニングを行なった結果、水溶性有機溶媒に高い耐性を持ち、かつ、（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを９３％以上の高い光学純度で生成する微生物を見出した。また、その微生物から該活性を有するポリペプチドの単離精製に成功した。また、このポリペプチドの反応特性について詳細な検討を行った結果、広範なケトン化合物に対して高い活性を示し、光学活性アミノ化合物を高い光学純度で生成し、水溶性有機溶媒中でも高い安定性を有することを見出した。さらに、該ポリペプチドをコードする遺伝子を後述の遺伝子工学的手法で取得し、その塩基配列を明らかにするとともに、該遺伝子を用いて当該ポリペプチドを高生産する形質転換体を取得した。さらに、育種条件を検討することにより、より高活性な光学活性アミノ化合物を工業的に製造し得る方法を確立した。【００１０】
即ち、本発明は、下記（１）から（６）の理化学的性質を有するポリペプチドである：
（１）作用：アミノ基供与体と１−ベンジル−３−ピロリジノンとに作用して光学純度９３％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを生成するアミノ基転移反応を触媒する。【００１１】
（２）基質特異性：
（ａ）アミノ基供与体：（Ｓ）−１−フェネチルアミン、ベンジルアミンおよび±２−ブチルアミンに対し活性を示し、β−アラニン、および４−アミノ酪酸に対し実質的に活性を示さない。
（ｂ）アミノ基受容体：ピルビン酸およびグリオキシル酸のそれぞれに対し活性を示す。【００１２】
（３）水溶性有機溶媒耐性：終濃度８０％ｖ／ｖの１−プロパノール、２−プロパノール、アセトンのいずれかで２時間処理後の残存活性が、処理前の全活性の１０％以上を保持する。
（４）至適ｐＨ：６．０〜８．５、
（５）作用至適温度：６０℃、
（６）熱安定性：３０〜６０℃で３０分間熱処理したときの残存活性が、処理前の全活性の９０％以上を保持する。【００１３】
また、本発明は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミノ基供与体の存在下で１−ベンジル−３−ピロリジノンに作用して光学純度９３％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを生成する活性を有するポリペプチドである。【００１４】
または、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アミノ基供与体の存在下で１−ベンジル−３−ピロリジノンに作用して光学純度９３％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを生成する活性を有するポリペプチドである。【００１５】
また、本発明は、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、および、このベクターにより形質転換された形質転換体でもある。【００１６】
また、本発明は、ケトン化合物に、アミノ基供与体の存在下、前記ポリペプチド、あるいは前記形質転換体の培養物を作用させることを特徴とする光学活性アミノ化合物の製造方法である。【００１７】
また、アミノ化合物のエナンチオマー混合物にアミノ基受容体の存在下、前記ポリペプチド、または前記形質転換体の培養物を作用させることを特徴とする光学活性アミノ化合物の製造方法である。【００１８】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１０−２１６５４７号に記載された全ての内容を包含する。
【発明の効果】
【００１９】
広範なケトン化合物に対して高い活性を示し、光学活性アミノ化合物を高い光学純度で生成し、水溶性有機溶媒中でも高い活性を維持するポリペプチドの単離、および、該ポリペプチド産生能の高い形質転換体の取得により、目的の光学活性アミノ化合物を効率良く製造することが可能となった。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書において記述されている、ＤＮＡの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）」等の成書に記載されている方法により行なうことができる。また、酵素活性の単位は特に明記しない限り、１分間に１μｍｏｌの生成物を与える酵素量を１Ｕとする。
【００２１】
１．本発明のポリペプチドの理化学的諸性質
本発明において後述の方法により単離されたポリペプチドは、以下の理化学的性質を有するポリペプチドである。
【００２２】
（１）作用：アミノ基供与体の存在下で１−ベンジル−３−ピロリジノンに作用して光学純度９３％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを生成するアミノ基転移反応を触媒する。
【００２３】
（２）基質特異性：
（ａ）アミノ基供与体：（Ｓ）−１−フェネチルアミン、ベンジルアミンおよび±２−ブチルアミンに対して活性を示し、β−アラニン、および、４−アミノ酪酸に対して実質的に活性を示さない。
（ｂ）アミノ基受容体：ピルビン酸およびグリオキシル酸のそれぞれに対し活性を示す。
【００２４】
（３）水溶性有機溶媒耐性：終濃度８０％ｖ／ｖの１−プロパノール、２−プロパノール、アセトンのいずれかで２時間処理後の残存活性が処理前の全活性の１０％以上を保持する。
【００２５】
（４）至適ｐＨ：６．０〜８．５、
（５）作用至適温度：６０℃、
（６）熱安定性：３０〜６０℃で３０分間熱処理したときの残存活性が、処理前の全活性の９０％以上を保持する。
【００２６】
（１−ベンジル−３−ピロリジノンへの立体選択性の測定方法）
本発明のポリペプチドは、アミノ基供与体の存在下で１−ベンジル−３−ピロリジノンに作用して光学純度９３％ｅ．ｅ．以上、好ましくは９５％ｅ．ｅ．以上、さらに好ましくは９７％ｅ．ｅ．以上、最も好ましくは９８％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを生成するアミノ基転移反応を触媒する。
【００２７】
上記の性質は、以下の方法により測定することができる。すなわち、精製ポリペプチドを終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬとなるように下記組成を有する基質溶液に添加し、３０℃で反応させる。さらに、下記定量分析により、０．６ｍＭ以上の１−ベンジル−３−アミノピロリジンが生成するまで反応を継続させ、反応終了後、反応液中に生成した１−ベンジルー３−アミノピロリジンの光学純度を下記条件のＨＰＬＣで分析することにより測定しうる。酵素使用量や反応時間によって、生成（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンの光学純度が変化する場合には、最も高い光学純度の値を採用する。
【００２８】
［基質溶液組成］
（Ｓ）−１−フェネチルアミン          ８５．６ｍＭ
１−ベンジル−３−ピロリジノン        ５７．１ｍＭ        
ピリドキサルリン酸                    ０．５ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）    ０．１Ｍ
【００２９】
［高速液体クロマトグラフィーによる測定条件］
＜定量分析＞
カラム：Ｆｉｎｅｐａｋ  ＳＩＬ  Ｃ１８−Ｔ  （日本分光社製）
溶離液：蒸留水  １２６０ｍＬ／アセトニトリル  ７４０ｍＬ／ＫＨ２ＰＯ４  １０ｇ／ＳＤＳ  ２．８８ｇ（ｐＨ３．６）
流速：１ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：４０℃
【００３０】
＜光学純度分析＞
反応液を適量の炭酸ナトリウムで塩基性にした後、ジニトロベンゾイルクロリドで誘導体化する。その後、必要に応じてシリカゲルクロマトグラフィー等により精製して、以下の条件で分析する。
カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＩＡ（ダイセル化学工業社製）
溶離液：ヘキサン／エタノール／ジエチルアミン／アセトニトリル＝８００／２００／１／５（体積比）
流速：０．８ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：３０℃
【００３１】
（基質特異性１：各種アミンに対する活性）
本発明のポリペプチドは、（Ｓ）−１−フェネチルアミン、ベンジルアミンおよび±２−ブチルアミンに対して活性を示し、β−アラニン、および４−アミノ酪酸に対して実質的に活性を示さない。ここで、（Ｓ）−１−フェネチルアミンに活性を示すとは、以下の方法でアミノ基転移活性を測定した場合において、１分間に生成するアセトフェノンの量が精製ポリペプチド１ｍｇに対し０．１μｍｏｌ以上、好ましくは１μｍｏｌ以上、より好ましくは１０μｍｏｌ以上であることを意味する。
【００３２】
上記アミノ基転移活性は、以下の方法で測定することができる。すなわち、まず、精製ポリペプチドを下記組成の基質溶液に添加して総容量を１ｍＬとし、３０℃で５分間反応後、６規定の塩酸０．０５ｍＬを添加して反応を停止させる。その後、下記条件のＨＰＬＣで分析し、生成したアセトフェノンを定量する（以下、活性測定法Ａとする）。
【００３３】
活性測定法Ａ
［基質溶液組成］
（Ｓ）−１−フェネチルアミン            ２５ｍＭ
ピルビン酸ナトリウム                    ２５ｍＭ
ピリドキサルリン酸                      ２．５ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）          ０．１Ｍ
【００３４】
［高速液体クロマトグラフィーによる測定条件］
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ  ５Ｃ１８  ＲＳ（和光純薬社製）
溶離液：１０ｍＭ  りん酸カリウム緩衝液  （ｐＨ５．３）：アセトニトリル＝３：２
流速：１ｍＬ／分
検出：２４１ｎｍ
【００３５】
また、ベンジルアミンおよび±２−ブチルアミンに対して活性を示すとは、以下の方法でアミノ基転移活性を測定した場合において、上記アミノ化合物をアミノ基供与体として用いた場合の活性が、（Ｓ）−１−フェネチルアミンを用いた場合の１／１０以上、好ましくは１／５以上、更に好ましくは１／２以上であることを意味する。また、β−アラニン、および４−アミノ酪酸に対して実質的に活性を示さないとは、以下の方法でアミノ基転移活性を測定した場合において、上記アミノ化合物をアミノ基供与体として用いた場合の活性が（Ｓ）−１−フェネチルアミンを用いた場合の１／５０以下、好ましくは１／１００以下、更に好ましくは１／１０００以下であることを意味する。
【００３６】
上記のアミノ基供与体を用いた際のアミノ基転移活性は、以下の方法で測定することができる。すなわち、まず、精製ポリペプチドを下記組成の基質溶液に添加して４００ｕＬとし、３０℃、１時間反応後、３規定の塩酸２０μＬを加えて反応を停止させる。次に、得られた反応液２０μＬに０．２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液８０μＬ、３．３ｍｇ／ｍＬダブシルクロリドのアセトン溶液２００μＬをそれぞれ加え、７０℃で１０分間反応させる。これに酢酸２０μＬを加えて攪拌し、この反応液を下記条件のＨＰＬＣで分析し、ダブシル化したアラニンを定量する。なお、使用する精製ポリペプチドの濃度は、本測定方法において、生成アラニン量が２．８ｍＭ以下となるように調整する（以下、活性測定法Ｂとする）。
【００３７】
活性測定法Ｂ
［基質溶液組成］
各種アミノ化合物                      １４ｍＭ
ピルビン酸                            １４ｍＭ
ピリドキサルリン酸                    ０．０２ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）    ０．１Ｍ
【００３８】
［高速液体クロマトグラフィーによる測定条件］
カラム：Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ  ＯＤＳ−ＨＧ−３（ＮＯＭＵＲＡ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ製）
溶離液：アセトニトリル／０．０４５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．１）＝３５／６５（体積比）
流速：０．９ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
【００３９】
（基質特異性２：グリオキシル酸に対する活性）
本発明のポリペプチドは、ピルビン酸に代えて、グリオキシル酸をアミノ基受容体としても活性を示す。すなわち、前記活性測定法Ａにおいて、ピルビン酸に代えてグリオキシル酸をアミノ基受容体として測定したアミノ基転移活性が、ピルビン酸をアミノ基受容体として測定した活性を１００％とした相対活性で１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上の活性を示す。
【００４０】
（水溶性有機溶媒に対する耐性）
本発明のポリペプチドは、水溶性有機溶媒に高い耐性を示す。すなわち、終濃度８０％ｖ／ｖの１−プロパノール、２−プロパノール、アセトンのいずれかで２時間処理後の残存活性が、処理前の全活性の１０％以上を保持する。
【００４１】
使用する水溶性有機溶媒の濃度は、１０％ｖ／ｖ、好ましくは３０％ｖ／ｖ、より好ましくは５０％ｖ／ｖ、最も好ましくは８０％ｖ／ｖである。水溶性溶媒処理後の残存活性は、１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは５０％、最も好ましくは８０％以上を保持する。
【００４２】
ここで、水溶性有機溶媒とは、水と任意の比率で混合する溶媒を指す。例えば、酢酸、アセトン、アセトニトリル、DMF、DMSO、エタノール、メタノール、２−プロパノール、１−プロパノール、THFなどが挙げられる。好ましくは、１−プロパノール、２−プロパノール、アセトンである。
【００４３】
水溶性有機溶媒耐性が高いことにより、例えば、水溶性の低い基質に対しても反応性の向上が期待できる。
【００４４】
水溶性有機溶媒耐性は、以下の方法により測定することができる。すなわち、まず、精製ポリペプチドを含む０．５ｍＭのＰＬＰを添加した０．１Ｍリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．５）２００ｕＬに、各水溶性有機溶媒８００ｕＬを添加し、３０℃で２ｈｒ接触させる。その後、０．５ｍＭのＰＬＰを添加した０．１Ｍリン酸カリウム水溶液で希釈する。この希釈液と、溶媒添加前の精製ポリペプチド溶液の活性を前述の活性測定法Ａを用いて比較する。
【００４５】
（至適ｐＨ）
アミノ基転移反応の至適ｐＨは、前述の活性測定法Ａを用いて、以下に記載の緩衝液とｐＨの組み合わせで測定する。至適ｐＨとは、本測定にて最も高い活性値を１００としたきに、８０以上の活性を示すｐＨとする。同一ｐＨであっても緩衝液の種類によって活性値が異なる場合には、より高い活性値を採用する。
ｐＨ４．０、４．５、５．０、５．５の場合：０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０の場合：０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液
ｐＨ７．５、８．０、８．５、９．０の場合：０．１Ｍトリス塩酸緩衝液
【００４６】
（至適温度）
アミノ基転移反応の至適温度は、前述の活性測定法Ａを用いた測定において、反応温度が１０℃、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃の中で最大の活性値を示した温度とする。
【００４７】
（熱安定性）
ポリペプチドの熱安定性は、精製ポリペプチドを、０．５ｍＭのピリドキサルリン酸を含む、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃で３０分間熱処理した後、前述の活性測定法Ａを用いた測定において、熱処理前の活性を１００％としたとき、熱処理後９０％以上の残存活性を有する範囲とする。
【００４８】
（分子量）
本発明のポリペプチドの分子量はおよそ５０，０００であり、１０％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、標準蛋白質に対する相対移動度から決定しうる。
【００４９】
２．本発明のポリペプチドの単離
本発明のポリペプチドは、上記性質を示すポリペプチドであれば、いかなるポリペプチドであっても含まれるが、例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の微生物から取得できる。本発明の実施形態のポリペプチドの起源となる微生物としては、好ましくは当業者が公的保存機関（例えばＮＢＲＣ等）より容易に入手可能なシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）が挙げられ、さらに好ましくは、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＭＶ３７が挙げられる。この、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＭＶ３７は、２０１０年６月１１日付けで、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−９５３として、独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。
【００５０】
（培地成分）
本発明のポリペプチドを有する微生物のための培養培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地が用いられ得る。
【００５１】
なお、前記微生物を培養する際に、本発明のポリペプチドの誘導物質として、プロピルアミン、１−ブチルアミン、２−ブチルアミン、２−ペンチルアミン、イソプロピルアミン、イソブチルアミン、７−メトキシ−２−アミノテトラリン、１−フェネチルアミン、１−ベンジル−３−アミノピロリジンなどのアミノ化合物を培地に添加し、培養することもできる。前記誘導物質は、単独でまたは２種類以上を混合して用いてもよい。前記誘導物質の添加量は、特に制限されるものではないが、菌の生育阻害などの観点から、通常培地組成中１重量％以下が好ましい。また、前記誘導物質の添加時期は、特に制限されるものではなく、培養開始時、または、培養途中のいずれでもよい。また、前記誘導物質の効果を高めるために、前記誘導物質以外の通常の炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素を少なくすることが有効な場合がある。
【００５２】
（ポリペプチドの精製）
本発明のポリペプチドを生産する微生物から該ポリペプチドを精製するには、当業者に周知の蛋白質精製法が利用できる。例えば、当該微生物の培養液から遠心分離、あるいは、濾過により菌体を集め、得られた菌体を、超音波破砕機あるいはグラスビーズ等を用いた物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残さを除いて無細胞抽出液を調製し、この無細胞抽出液を、分別沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等に供することにより、目的のポリペプチドを単離できる。
【００５３】
３．本発明のポリペプチドのアミノ酸配列
本発明のポリペプチドとしては以下の（ａ）〜（ｃ）のポリペプチドを挙げることができる。
【００５４】
（ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アミノ基供与体の存在下で１−ベンジル−３−ピロリジノンに作用して光学純度９３％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを生成する活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミノ基供与体の存在下で１−ベンジル−３−ピロリジノンに作用して光学純度９３％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを生成する活性を有するポリペプチド。
【００５５】
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドは、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８９）」等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、アミノ基供与体の存在下で１−ベンジル−３−ピロリジノンに作用して光学純度９３％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを生成する活性を有する限り上記ポリペプチドに包含される。
【００５６】
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において、アミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加される場所は特に制限されないが、高度保存領域を避けるのが好ましい。ここで、高度保存領域とは、由来の異なる複数の酵素（ポリペプチド）ついて、アミノ酸配列を最適に整列させて比較した場合に、複数の配列間でアミノ酸が一致している位置を表す。高度保存領域は、配列番号１に示したアミノ酸配列と、前述した他の微生物由来のアミノ基転移酵素（ポリペプチド）のアミノ酸配列とを、ＧＥＮＥＴＹＸ等のツールを用いて比較することにより確認することができる。
【００５７】
置換、挿入、欠失および／または付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。ここでは、以下に挙げる各群の同一群内のアミノ酸を同族アミノ酸とする。
【００５８】
（第１群：中性非極性アミノ酸）Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｍｅｔ，Ｃｙｓ，Ｐｒｏ，Ｐｈｅ
（第２群：中性極性アミノ酸）Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ
（第３群：酸性アミノ酸）Ｇｌｕ，Ａｓｐ
（第４群：塩基性アミノ酸）Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ。
【００５９】
上記の記載で複数個のアミノ酸とは、例えば、６０個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、さらに好ましくは５個、４個、３個、または２個以下のアミノ酸を意味する。
【００６０】
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列との配列同一性は、６０％以上が好ましいが、７０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、８５％以上がさらに好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が最も好ましい。
【００６１】
アミノ酸配列の配列同一性は、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列と評価したいアミノ酸配列とを比較し、両方の配列でアミノ酸が一致した位置の数を比較総アミノ酸数で除して、さらに１００を乗じた値で表される。
【００６２】
アミノ基供与体の存在下で１−ベンジル−３−ピロリジノンに作用して光学純度９３％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンを生成する活性を有する限り、配列番号１に記載のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。たとえば、ヒスチジンタグやＨＡタグのような、タグ配列を付加することができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また、アミノ基転移の上記活性を有する限り、ペプチド断片であってもよい。
【００６３】
４．本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニング
本発明のＤＮＡは、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡであり、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で上記ポリペプチドを発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。本発明のＤＮＡは配列表の配列番号２に従い、当業者であれば化学的に合成することにより容易に入手できる。他の方法としては、精製された上記ポリペプチドが取得できれば、当業者であれば公知の方法により、該ポリペプチドの起源となる微生物より上記ＤＮＡを取得することができる。
【００６４】
以下に、本発明のＤＮＡを取得する方法として、上記シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）MV37を用いた例を記載するが、本発明はこれに限定されない。
【００６５】
まず、該微生物の無細胞抽出液より精製した上記ポリペプチドを、適当なエンドペプチダーゼにより消化し、逆相ＨＰＬＣにより切断された断片を精製後、例えば、ＡＢＩ４９２型プロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によりアミノ酸配列の一部または全部を決定する。このようにして得られたアミノ酸配列情報をもとにして、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅するためのＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）プライマーを合成する。次に、通常のＤＮＡ単離法、例えば、Ｖｉｓｓｅｒ等の方法（Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ５３，  ４１５  （２０００））により、該ポリペプチドの起源となる微生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅し、その塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、例えば、ＡＢＩ３７３Ａ型  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等を用いて行うことができる。該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、インバースＰＣＲ法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，８１８６（１９８８））によりその全体の配列を決定することができる。
【００６６】
このようにして得られるポリペプチドのＤＮＡとして、例えば、配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡを挙げることができる。
【００６７】
以下に、配列表の配列番号２に示す塩基配列について説明する。
【００６８】
５．本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のＤＮＡを挙げることができる。
【００６９】
（Ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されたＤＮＡ。
【００７０】
ここで、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。
【００７１】
ハイブリダイゼーションは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）」等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡをあげることができる。好ましくは６５℃で１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、さらに好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、最も好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡである。
【００７２】
以上のようにハイブリダイゼーション条件を記載したが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００７３】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号２に示されるＤＮＡとの配列同一性が７０％以上、好ましくは７４％以上、より好ましくは７９％以上、さらにより好ましくは８５％以上、最も好ましくは９０％以上のＤＮＡをあげることができ、コードされるポリペプチドが、上記のアミノ基転移活性を有する限り、上記ＤＮＡに包含される。
【００７４】
ここで、ＤＮＡの配列同一性（％）とは、対比される２つのＤＮＡを最適に整列させ、核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。
【００７５】
ＤＮＡの配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ８，  １９９４年９月，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍｅｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  ＵＳＡ  ５３７１１；  Ｒｉｃｅ，  Ｐ．  （１９９６）  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ＥＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｐｅｔｅｒ  Ｒｉｃｅ，  Ｔｈｅ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ，  Ｈｉｎｘｔｏｎ  Ｈａｌｌ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＣＢ１０  １ＲＱ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）、および、ｔｈｅ．ｅ．ｘＰＡＳｙ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ分子生物学用サーバー（Ｇｅｎｅｖａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｖａ，  Ｇｅｎｅｖａ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
【００７６】
ここで、配列表の配列番号２に記載の塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されたＤＮＡとは、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８９）」等に記載の公知の方法に準じて調製することができる。
【００７７】
配列表の配列番号２に示した塩基配列において、塩基が置換、挿入、欠失および／または付加される場所は特に制限されないが、高度保存領域を避け、フレームシフトが生じないようにするのが好ましい。ここで、高度保存領域とは、由来の異なる複数の酵素について、塩基配列を最適に整列させて比較した場合に、複数の配列間で塩基が一致している位置を表す。高度保存領域は、配列番号２に示した塩基配列と、公知の微生物由来のアミノ基転移酵素遺伝子の塩基配列とをＧＥＮＥＴＹＸ等のツールを用いて比較することで確認することができる。
【００７８】
置換、挿入、欠失および／または付加により改変された塩基配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種類以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。
【００７９】
上記の記載の複数個の塩基とは例えば１５０個、好ましくは１００個、より好ましくは５０個、さらに好ましくは２０個、１０個、５個、４個、３個、または２個以下の塩基、を意味する。
【００８０】
６．ベクター
本発明の実施形態のＤＮＡを宿主微生物内に導入して発現させるために用いるベクターＤＮＡとしては、適切な宿主微生物内で該ＤＮＡがコードする遺伝子を発現できるものであればいずれでもよい。このようなベクターＤＮＡとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられる。また、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用され得る。
【００８１】
このようなベクターは、作動可能に連結されたプロモーター（ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等）の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含むベクターとして好適に用いられ得る。例えば、ｐＵＣ１８（東洋紡社製）、ｐＵＣ１９（東洋紡社製）、ｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報）などが挙げられる。
【００８２】
制御因子とは、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
【００８３】
また、作動可能に連結とは、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプおよび種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【００８４】
各種生物において利用可能なベクター、プロモーター等に関しては、「微生物学基礎講座８遺伝子工学（共立出版、１９８７）」などに詳細に記述されている。
【００８５】
７．宿主および形質転換体
本発明の実施形態のＤＮＡを発現させるために用いる宿主生物は、各ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターにより形質転換され、ＤＮＡを導入したポリペプチドを発現することができる生物であれば、特に制限はされない。利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発されている細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発されている放線菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、およびキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの宿主ベクター系の開発されている酵母、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの宿主ベクター系の開発されているカビ、などが挙げられる。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Ｎａｔｕｒｅ３１５，５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。これらのうち、導入および発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。
【００８６】
本発明のＤＮＡを含む発現ベクターは、公知の方法により宿主微生物に導入できる。例えば、宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、市販のＥ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入できる。
【００８７】
８．光学活性アミノ化合物の製造方法
次に、本発明の実施形態のポリペプチドまたは当該ポリペプチドの生産能を持つ微生物を用いて光学活性アミノ化合物を製造する方法について説明する。
【００８８】
本発明の実施形態のポリペプチドの生産能を持つ微生物としては、例えば、前記シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＭＶ３７、および、実施形態のＤＮＡを含むベクターを導入された形質転換体が挙げられる。
【００８９】
本発明の光学活性アミノ化合物の製造方法としては、目的とするアミノ化合物と同じ骨格のケトン化合物に、アミノ基供与体からアミノ基を転移させ、生成する光学活性アミノ化合物を採取する方法（以下、製造方法Ｉとする）と、アミノ化合物のエナンチオマー混合物のうち、一方のエナンチオマーのアミノ基を選択的にアミノ基受容体に転移させ、残存するエナンチオマー（光学活性アミノ化合物）を採取する方法（以下、製造方法ＩＩという）が挙げられる。
【００９０】
まず、製造方法Ｉについて説明する。
【００９１】
（製造方法Ｉ）
製造方法Ｉは、ケトン化合物に、アミノ基供与体の存在下、本発明のポリペプチド、あるいは該ポリペプチド生産能を持つ形質転換体の培養物を作用させ、光学活性アミノ化合物を製造する方法である。
【００９２】
本製造方法は、例えば、一般式（１）：
【化１】
2012043622.tif 000002
【００９３】
で表されるケトン化合物に、アミノ基供与体の存在下、本発明のポリペプチドあるいは該ポリペプチド生産能を持つ微生物の培養物を作用させることにより、一般式（２）：
【化２】
2012043622.tif 000003
【００９４】
で表される光学活性アミノ化合物の製造方法である。
【００９５】
前記式（１）および（２）において、Ｒ１およびＲ２は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアラルキル基もしくは置換されていてもよいアリール基を示し、Ｒ１とＲ２の両者が互いに結合して環を形成していてもよい。但し、Ｒ１とＲ２は構造が異なる。
【００９６】
Ｒ１とＲ２は、好ましくは炭素数１から２０の置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアラルキル基もしくは置換されていてもよいアリール基であり、より好ましくは、炭素数１から１０の置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアラルキル基もしくは置換されていてもよいアリール基である。
【００９７】
アリール基としては、フェニル基、ナフチル基、ピリジル基、チエニル基、オキサジアゾリル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、フリル基、ピロリル基、フェノキシ基、ナフトキシ基、ピリジルオキシ基、チエニルオキシ基、オキサジアゾリルオキシ基、イミダゾリルオキシ基、チアゾリルオキシ基、フリルオキシ基、ピロリルオキシ基等が挙げられる。
【００９８】
アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、イソプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、メトキシ基、エトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ビニル基、アリル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等が挙げられる。アラルキル基としては、ベンジル基等が挙げられる。
【００９９】
これらの基は、更に置換されていてもよく、その置換基としては、ハロゲン原子、窒素原子、硫黄原子、水酸基、ニトロ基、シアノ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基やメチレンジオキシ等が挙げられる。また、環の形成は置換基を介してもよい。
【０１００】
上記ケトン化合物の具体的な化合物としては、例えば、１−テトラロン、２−テトラロン、５−メトキシ−２−テトラロン、６−メトキシ−２−テトラロン、７−メトキシ−２−テトラロン、８−メトキシ−２−テトラロン、１−ベンジル−３−ピロリジノン、１−Ｂｏｃ−３−ピロリジノン、１−Ｃｂｚ−３−ピロリジノン、１−ベンジル−３−ピペリジノン、１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノン、１−Ｃｂｚ−３−ピペリジノン、アセトフェノン、３，４−ジメトキシフェニルアセトンなどが挙げられる。
【０１０１】
（アミノ基供与体）
アミノ基供与体としては、本発明のポリペプチドが作用するアミノ化合物であればいかなるものでも使用できる。具体例としては、１−フェネチルアミン、２−ブチルアミン、２−ペンチルアミン、２−ヘプチルアミン、３−ヘプチルアミン、ｎ−エチルアミン、ｎ−プロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｎ−アミルアミン、イソプロピルアミン、イソブチルアミン、グリシン、アラニン、３−アミノ−１−フェニルブタン、ベンジルアミン、β−フェネチルアミン、シクロヘキシルアミンおよびそれらの光学活性体が挙げられる。なかでも、１−フェネチルアミン、アラニンが好ましい。
【０１０２】
（ポリペプチドの形態）
製造方法Ｉにおいては、前記ケトン化合物に、アミノ基供与体の存在下、前記本発明のポリペプチドまたは当該ポリペプチドの生産能を有する微生物の培養物を作用させる。
【０１０３】
ここで、培養物とは、菌体を含む培養液、培養菌体、またはその処理物を意味する。ここでその処理物とは、例えば、無細胞抽出液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、またはそれら菌体の磨砕物等を意味する。さらに、これらポリペプチドおよび培養物は、固定化酵素あるいは固定化菌体として用いることもできる。なお、固定化は、当業者に周知の方法（例えば架橋法、物理的吸着法、包括法等）で行なうことができる。
【０１０４】
（反応平衡、生成物阻害の解消による反応性の改善）
アミノ基転移反応を用いたアミノ化反応は一般的に可逆反応であるため、一般的に平衡点で見かけ上反応が停止する。これらの反応平衡を解消する公知の方法を組み合わせることで、本発明のポリペプチドを用いた反応を改善することができる。例えば、ＷＯ２００７／１３９０５５公報に記載のように、アミノ基供与体としてアラニンを用いて、副生成するピルビン酸を乳酸脱水素酵素と補酵素再生用のグルコース脱水素酵素を共役させることで乳酸へ変換し、反応平衡を解消する方法が有効である。同様に、アミノ基供与体としてアラニンを用いて、副生成するピルビン酸を、ピルビン酸デカルボキシラーゼで除く方法（ＷＯ２００７／０９３３７２Ａ１公報）、アラニン脱水素酵素を用いる方法（ＵＳ２００９／０１１７６２７Ａ１公報、  Ｅｖｏｎｉｋ  Ｄｅｇｕｓｓａ  ＧｍｂＨ）、過酸化水素で除く方法（ＵＳ２００８／０２１３８４５Ａ１公報）、アセト酪酸合成酵素を用いる方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２（１１），３０３０−３０３３（２００８））なども有効である。
【０１０５】
（基質濃度）
反応に用いる基質の濃度としては、ケトン化合物は、反応液組成中、０．１〜８０重量％、好ましくは１〜５０重量％であり、また、アミノ基供与体は、キラルアミンの場合は、ケトン化合物に対し、８０〜１２００モル％、好ましくは１００〜６００モル％の濃度になるように用いることが好ましい。なお、前記アミノ基供与体としてラセミ体のアミノ化合物の場合は、一方の立体が上記の濃度となるように使用することもできる。
【０１０６】
（反応ｐＨ）
本発明のポリペプチドの至適ｐＨは、下限は、好ましくはｐＨ５．０以上であり、より好ましくはｐＨ６．０以上である。上限は、好ましくはｐＨ１０．０以下であり、より好ましくはｐＨ９．０以下であることが望ましい。
複数のポリペプチドを共役させる場合には、使用する全てのポリペプチドが安定的かつ高活性に作用するｐＨを選択することが好ましい。
【０１０７】
（反応温度）
本発明のポリペプチドの反応温度は、至適温度および熱安定性の観点から、好ましくは２５℃以上であり、より好ましくは３０℃以上であり、好ましくは６０℃以下であり、より好ましくは５０℃以下である。
複数のポリペプチドを共役させる場合には、使用する全てのポリペプチドが安定的かつ高活性に作用する反応温度を選択することが好ましい
【０１０８】
（溶媒）
反応溶媒は、通常、イオン交換水、緩衝液等の水性媒体を使用するが、有機溶媒を含んだ系でも反応を行なうことができる。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２―プロパノール、１−ブタノール等のアルコール系溶媒、ペンタン、ヘキサン等の脂肪族炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒、塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒、その他、アセトニトリル等を適宜使用できる。
【０１０９】
（２相系）
必要に応じて、上記の有機溶媒を水への溶解度以上に加えて２相系で反応を行なうこともできる。有機溶媒を反応系に共存させることで、選択率、変換率、収率などが向上する場合も多い。
【０１１０】
（反応時間）
反応は、通常、１時間〜１週間、好ましくは１〜７２時間であり、そのような時間で反応が終了する反応条件を選択することが好ましい。
【０１１１】
（抽出精製）
上記の反応により、光学活性アミノ化合物が生成する。生成した光学活性アミノ化合物は、反応混合液から抽出、蒸留、再結晶、カラム分離など公知の方法によって単離することができる。
【０１１２】
例えば、ｐＨを酸性に調整後、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類；ヘキサン、オクタン、ベンゼン等の炭化水素類；塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素等一般的な溶媒により、生成した光学活性アミノ化合物を水相に残したまま、未反応の基質およびアミノ基転移反応により生じたアミノ基供与体に対応するケトン化合物を選択的に除くことができる。
【０１１３】
生成した光学活性アミノ化合物および未反応のアミノ基供与体は、例えば、ｐＨを塩基性に調節し、同様に一般的な有機溶媒で抽出することができる。生成した光学活性アミノ化合物と未反応のアミノ基供与体は、例えば、蒸留により分離することができる。
【０１１４】
（製造方法ＩＩ）
次に本発明の製造方法ＩＩについて説明する。
本製造方法は、アミノ化合物のエナンチオマー混合物に、アミノ基受容体の存在下、本発明のポリペプチドあるいは該ポリペプチド生産能を持つ形質転換体の培養物を作用させる光学活性アミノ化合物の製造方法である。
【０１１５】
本製造方法は、例えば、一般式（３）：
【化３】
2012043622.tif 000004
【０１１６】
で表わされるアミノ化合物のエナンチオマー混合物に、アミノ基受容体の存在下、本発明のポリペプチドあるいは該ポリペプチド生産能を持つ微生物の培養物を作用させることにより、一般式（４）：
【化４】
2012043622.tif 000005
【０１１７】
で表わされる光学活性アミノ化合物を得ることができる。
【０１１８】
前記式（３）および（４）におけるＲ１、Ｒ２は、前記式（１）および（２）におけるＲ１、Ｒ２と同じである。
【０１１９】
上記光学活性アミノ化合物の具体的な化合物としては、例えば、１−アミノテトラリン、２−アミノテトラリン、５−メトキシ−２−アミノテトラリン、６−メトキシ−２−アミノテトラリン、７−メトキシ−２−アミノテトラリン、８−メトキシ−２−アミノテトラリン、１−ベンジル−３−アミノピロリジン、１−Ｂｏｃ−３−アミノピロリジン、１−Ｃｂｚ−３−アミノピロリジン、１−ベンジル−３−アミノピペリジン、１−Ｂｏｃ−３−アミノピペリジン、１−Ｃｂｚ−３−アミノピペリジン、１−フェネチルアミン、３，４−ジメトキシアンフェタミン、などが挙げられる。
【０１２０】
（アミノ基受容体）
本方法においては、ケトン化合物をアミノ基受容体として用いる。
ケトン化合物としては、アミノ基受容体としての活性があればいかなるものでもよいが、好ましくは、ピルビン酸あるいはグリオキシル酸である。
【０１２１】
製造方法ＩＩにおいては、アミノ化合物のエナンチオマー混合物に、上記アミノ基受容体の存在下、本発明のポリペプチドあるいは該ポリペプチドの生産能を有する形質転換体の培養物を作用させる。
【０１２２】
ここで、アミノ化合物のエナンチオマー混合物とは、エナンチオマーとその鏡像体の混合物をいう。通常は、ラセミ体が安価で入手しやすいため、ラセミ体を用いることが好ましい。ただし、ラセミ体に限定されず、例えば、エナンチオマーが鏡像体よりも若干過剰に含まれる混合物を用いて、製造方法ＩＩにより、その光学純度を高めることも好ましく行ない得る。
【０１２３】
なお、培養物の意味するところは、前述の製造方法Ｉの場合と同様である。
また、アミノ化合物の濃度は、反応液組成中、０．１〜８０重量％、好ましくは１〜５０重量％である。アミノ基受容体の濃度は、アミノ化合物に対し、３０〜１００モル％、好ましくは５０〜６０モル％で用いることが好ましい。反応ｐＨ、反応温度、反応溶媒は製造方法Ｉと同様の条件が用いられ得る。
上記の反応により、光学活性アミノ化合物が生成する。生成した光学活性アミノ化合物は、製造方法Ｉと同様の方法で反応混合液から単離することができる。
【実施例】
【０１２４】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。【０１２５】
（実施例１）土壌分離菌の取得、解析
土壌より分離したＭＶ３７株、ＭＶ３８株、ＭＶ４５株、ＭＶ４８株のそれぞれを、Ｎ培地（組成：５０ｇ／Ｌ  ポリペプトン（日本製薬社製）、３０ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース、２０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、２ｇ／Ｌ  イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、１ｇ／Ｌ（ＲＳ）−１−フェネチルアミン（ｐＨ７．０））を用いて２８℃で６２時間通気培養した。その後、培養液２ｍＬを遠心分離して得られた菌体に下記基質溶液４００ｕＬを添加し、３０℃で２時間攪拌して反応させた。生成したベンジルアミノピロリジンは、下記条件にて定量分析、および光学純度分析を行なった。【０１２６】
その結果、ＭＶ３７株は変換率２．０％、光学純度９８．０％ｅ．ｅ．（Ｓ体）、ＭＶ３８株は変換率１．３％、光学純度９７．４％ｅ．ｅ．（Ｓ体）、ＭＶ４５株は変換率１．８％、光学純度９７．９％ｅ．ｅ．（Ｓ体）、ＭＶ４８株は変換率２．５％、光学純度９７．６％ｅ．ｅ．（Ｓ体）であった。【０１２７】
また、ＭＶ３８株、ＭＶ４５株、ＭＶ４８株の１６ＳｒＤＮＡの部分配列（約５００ｂｐ）を解析したところ、いずれもＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属であると推定された。ＭＶ３７株については、１６ＳｒＤＮＡ１４９２ｂｐを解析したところ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｖａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａに近縁なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．であると推定された。【０１２８】
［基質溶液組成］
Ｌ−アラニン                        １００ｍＭ
１−ベンジル−３−ピロリジノン      ７．５ｍＭ
ピリドキサルリン酸                  ０．５ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）  ０．０５Ｍ【０１２９】
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による定量条件］
＜定量分析＞
カラム：Ｆｉｎｅｐａｋ  ＳＩＬ  Ｃ１８−Ｔ  （日本分光社製）
溶離液：蒸留水  １２６０ｍＬ／アセトニトリル  ７４０ｍＬ／ＫＨ２ＰＯ４  １０ｇ／ＳＤＳ  ２．８８ｇ（ｐＨ３．６）
流速：１ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：４０℃【０１３０】
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による光学純度分析条件］
反応液を適量の炭酸ナトリウムで塩基性にした後、ジニトロベンゾイルクロリドで誘導体化し、以下の条件で分析した。
カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＩＡ（ダイセル化学工業社製）
溶離液：ヘキサン／エタノール／ジエチルアミン／アセトニトリル＝８００／２００／１／５（体積比）
流速：０．８ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ【０１３１】
（実施例２）精製ＴＰＭの調製１
実施例１で解析したシュードモナス・エスピー  ＭＶ３７（ＮＩＴＥ  Ｐ−９５３）を５ｍＬのＮｐｒｅ培地（組成：５０ｇ／Ｌ  ポリペプトン（日本製薬社製）、３０ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース、２０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、２ｇ／Ｌ  イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ社製）（ｐＨ７．０））を用いて３０℃で１日培養し、第一種母培養液を得た。【０１３２】
次に、５００ｍＬ容の坂口フラスコ中で、Ｎ培地（組成：５０ｇ／Ｌ  ポリペプトン（日本製薬社製）、３０ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース、２０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、２ｇ／Ｌ  イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、１ｇ／Ｌ（ＲＳ）−１−フェネチルアミン（ｐＨ７．０））６０ｍＬに、第一種母培養液を５００μL植菌し、２８℃で７時間培養し、第二種母培養液を得た。【０１３３】
次に、５リットル容のミニジャー中でＮ培地３．０Ｌに、第二種母培養液を３０ｍL植菌し、０．３ｖｖｍ、４５０ｒｐｍ、２８℃で１４時間培養した。【０１３４】
その後、遠心分離により培養液から菌体を集め、Ｎ緩衝液（０．０１％２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、０．５ｍＭピリドキサルリン酸、０．０１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ８．０））に懸濁して、超音波破砕を行った。さらに、該破砕物中の固形物を遠心分離により除去し、無細胞抽出液を調製した。【０１３５】
得られた無細胞抽出液は、５０℃で３０分間攪拌後、遠心分離により上清を回収し、３０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して溶解させ、生じた沈殿を遠心分離により除去した。さらに、この上清に７５％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して溶解させ生じた沈殿を遠心分離により回収した。【０１３６】
この沈殿をＮ緩衝液に溶解させ、さらに同緩衝液に対して透析を行なった。これを、同じ緩衝液で平衡化させたＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（３００ｍＬ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウムのリニアグラジエント（０Ｍから０．４５Ｍまで）により活性画分を溶出させた。【０１３７】
溶出させた活性画分を集めて、これに、終濃度０．８Ｍとなるように硫酸ナトリウムを溶解し、０．８Ｍの硫酸ナトリウムを含むＮ緩衝液をあらかじめ平衡化したＢｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｓ（東ソー株式会社製）カラム（１２０ｍＬ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸ナトリウムのリニアグラジエント（０．８Ｍから０．２４Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、限外ろ過（Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ  ＹＭ−１０）にて濃縮した。【０１３８】
濃縮した粗ポリペプチド溶液を、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを添加したＮ緩衝液であらかじめ平衡化させたＨｉ  ＬＯＡＤ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐ／ｇカラム（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）に供し、電気泳動的に単一な精製ポリペプチド標品を得た。また、得られた精製ポリペプチドの分子量をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定したところ、約５０，０００であった。以下、本ポリペプチドをＴＰＭと記載する。【０１３９】
（実施例３）ＴＰＭ遺伝子のクローニング
（ＰＣＲプライマーの作成）
実施例２で得られた精製ＴＰＭのＮ末端アミノ酸配列を、ＰＰＳＱ−３３Ａ型プロテインシーケンサー（島津製作所製）により決定した。また、精製ＴＰＭを８Ｍ尿素存在下で変性させた後、アクロモバクター由来のリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業株式会社製）で消化し、得られたペプチド断片のＮ末端アミノ酸配列も同様に決定した。このアミノ酸配列から塩基配列を予測し、ＴＰＭ遺伝子の一部をＰＣＲにより増幅するためのプライマー１（配列表の配列番号３）、および、プライマー２（配列表の配列番号４）を合成した。【０１４０】
（ＰＣＲによるＴＰＭ遺伝子の増幅）
シュードモナス・エスピーＭＶ３７の培養液から、Ｍｕｒｒａｙ等の方法（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ８，  ４３２１，  １９８０）に従って染色体ＤＮＡを抽出した。得られた染色体ＤＮＡを鋳型に、上記で合成したプライマーを用いてＰＣＲを行った。その結果、ＴＰＭ遺伝子の一部と考えられる約８３０ｂｐのＤＮＡ断片を取得した。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてＰｒｉｍｅＳｔａｒ（タカラバイオ株式会社製）を用いて行い、反応条件はその取扱説明書に従った。このＤＮＡ断片をダイレクトシーケンスにより塩基配列を決定した。その塩基配列を配列表の配列番号５に示した。【０１４１】
（ｉｎｖｅｒｓｅ−ＰＣＲ法によるＴＰＭ遺伝子の全長配列の決定）
シュードモナス・エスピーＭＶ３７の染色体ＤＮＡを制限酵素ＦｂａＩ、ＰｓｔＩ、ＸｈｏＩまたはＳｐｈＩを用いて完全消化し、得られた消化物をＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造株式会社製）を用いて各々分子内環化させた。これを鋳型として用い、上記で判明したＴＰＭ遺伝子の部分塩基配列情報をもとに、ｉｎｖｅｒｓｅ−ＰＣＲ法（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １６，  ８１８６  （１９８８））により、染色体ＤＮＡ上のＴＰＭ遺伝子の全塩基配列を決定した。ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ  ｗｉｔｈ  ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造株式会社製）を用いて行い、反応条件はその取扱説明書に従った。決定した塩基配列を配列表の配列番号２に示した。また、該塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示した。【０１４２】
（実施例４）ＴＰＭ遺伝子を含む組換えプラスミドの作製
実施例３で決定した塩基配列に基づき、ＴＰＭ遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加したプライマー３（配列表の配列番号６）と、ＴＰＭ遺伝子の終始コドンの直後にＳａｃＩ部位を付加したプライマー４（配列表の配列番号７）とを合成した。実施例３で得たシュードモナス・エスピーＭＶ３７の染色体ＤＮＡを鋳型とし、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＴＰＭ遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加し、かつ終始コドンの直後にＳａｃＩ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを取得した。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ（タカラバイオ株式会社製）を用いて行い、反応条件はその取扱説明書に従った。このＤＮＡをＮｄｅＩおよびＳａｃＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＳａｃＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＴＴＰＭを得た。【０１４３】
（実施例５）組換え大腸菌の作製
実施例４で得た組換えベクターｐＮＴＴＰＭを用いて大腸菌Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（タカラバイオ株式会社製）を形質転換し、組換え大腸菌Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＴＰＭ）を得た。【０１４４】
（実施例６）組換え大腸菌を用いたＴＰＭ遺伝子の発現
実施例５で得たＥ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＴＰＭ）を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ７．０）で培養し、集菌後、Ｎ緩衝液に懸濁し、超音波破砕により無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液を下記組成の基質溶液に添加し、３０℃で１時間反応後、反応液１ｍＬに対し５０μＬの６規定塩酸を添加し、遠心分離したのち、その上清のアセトフェノン濃度をＨＰＬＣで定量することにより、アミノ基転移活性を測定した。その結果、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＴＰＭ）の無細胞抽出液では、ブロス１ｍＬあたり１分間に９μｍｏｌのアセトフェノンを生成する活性が見られた。【０１４５】
［基質溶液組成］
（Ｓ）−１−フェネチルアミン          ２５ｍＭ
ピルビン酸ナトリウム                  ２５ｍＭ
ピリドキサルリン酸                    ２．５ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）        ０．１Ｍ【０１４６】
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定条件］
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ８−ＭＳ（ナカライテスク社製）
溶離液：３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル／メタノール＝４／１／１（体積比）
流速：１ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ【０１４７】
（実施例７）精製ＴＰＭの調製２
実施例６と同様の方法で得られた組換え大腸菌の培養液から遠心分離により菌体を集め、標準緩衝液（０．５ｍＭピリドキサルリン酸、０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．５））に懸濁し超音波破砕を行った。次に、破砕物中の固形物を遠心分離により除去し、無細胞抽出液を調製した。得られた無細胞抽出液を３０分間攪拌しながら５０℃で処理し、遠心分離により上清を回収した。【０１４８】
これを、標準緩衝液で平衡化させたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に供し、活性画分を吸着させた。塩化ナトリウム０．１Ｍを含む標準緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム０．２Ｍを含むＮ緩衝液で活性画分を溶出させた。【０１４９】
溶出させた活性画分を集めて、これに、終濃度１．０Ｍとなるように硫酸ナトリウムを溶解し、１．０Ｍの硫酸ナトリウムを含む標準緩衝液であらかじめ平衡化したＢｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラムに供し、活性画分を吸着させた。０．８Ｍの硫酸ナトリウムを含む標準緩衝液でカラムを洗浄した後、０．５Ｍの硫酸ナトリウムを含む同一緩衝液で活性画分を溶出させた。活性画分を集め、標準緩衝液で透析し、電気泳動的に単一な精製ＴＰＭを得た。本精製ＴＰＭを用いてポリペプチドの理化学的性質を調べた。【０１５０】
（実施例８）精製ＴＰＭの理化学的性質１
実施例７で得られた精製ＴＰＭについて、１−ベンジル−３−ピロリジノンに対する活性と生成（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンの光学純度を調べた。【０１５１】
実施例７で得られた精製ＴＰＭを、下記組成の基質溶液に添加し、３０℃で２時間反応後、下記条件のＨＰＬＣで分析した。その結果、（Ｓ）−１−ベンジル−３−アミノピロリジンが変換率９０％で生成し、その光学純度は９８．０％ｅ．ｅ．であった。【０１５２】
［基質溶液組成］
（Ｓ）−１−フェネチルアミン        ８５．６ｍＭ
１−ベンジル−３−ピロリジノン      ５７．１ｍＭ
ピリドキサルリン酸                  ０．５ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）  ０．１Ｍ【０１５３】
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定条件］
＜定量分析＞
カラム：Ｆｉｎｅｐａｋ  ＳＩＬ  Ｃ１８−Ｔ  （日本分光社製）
溶離液：蒸留水  １２６０ｍＬ／アセトニトリル  ７４０ｍＬ／ＫＨ２ＰＯ４  １０ｇ／ＳＤＳ  ２．８８ｇ（ｐＨ３．６）
流速：１ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：４０℃【０１５４】
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による光学純度分析条件］
反応液を適量の炭酸ナトリウムで塩基性にした後、ジニトロベンゾイルクロリドで誘導体化し、以下の条件で分析した。
カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＩＡ（ダイセル化学工業社製）
溶離液：ヘキサン／エタノール／ジエチルアミン／アセトニトリル＝８００／２００／１／５（体積比）
流速：０．８ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ【０１５５】
（実施例９）精製ＴＰＭの理化学的性質２
実施例７で得られた精製ＴＰＭについて、その（Ｓ）−１−フェネチルアミンに対する活性、至適ｐＨ、至適温度、熱安定性、水溶性有機溶媒耐性について調べた。
以下に示す活性測定条件にて、精製ＴＰＭのアミノ基転移活性を調べた。すなわち、精製ＴＰＭを下記組成の基質溶液に添加して総量を１ｍLとし、３０℃で５分間反応後、６規定の塩酸を０．０５ｍＬ添加して反応を停止させ、下記条件のＨＰＬＣで分析した。【０１５６】
［基質溶液組成］
（Ｓ）−１−フェネチルアミン      ２５ｍＭ
ピルビン酸ナトリウム              ２５ｍＭ
ピリドキサルリン酸                ２．５ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）    ０．１Ｍ【０１５７】
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定条件］
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ  ５Ｃ１８  ＲＳ（和光純薬社製）
溶離液：１０ｍＭ  りん酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．３）：アセトニトリル＝３：２
流速：１ｍＬ／分
検出：２４１ｎｍ【０１５８】
（１）（Ｓ）−１−フェネチルアミンに対する活性：
上記の方法でアミノ基転移活性を測定したところ、精製ＴＰＭの活性は１１．８Ｕ／ｍｇであった。【０１５９】
（２）至適ｐＨ：
ｐＨ４．０〜９．０の範囲で、上記と同様にしてアミノ基転移活性を測定し、ＴＰＭの至適ｐＨを調べた。
測定するｐＨの応じて緩衝液は下記のものを用いた結果、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液でｐＨ７．０が最も活性が高く、至適ｐＨは６．０〜８．５と考えられた（ｐＨ７を１００としたときの相対活性を表１に示す）。
【表１】
2012043622.tif 000006
【０１６０】
［緩衝液］
ｐＨ４．０、４．５、５．０、５．５の場合：０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０の場合：０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液
ｐＨ７．５、８．０、８．５、９．０の場合：０．１Ｍトリス塩酸緩衝液【０１６１】
（３）至適温度：
上記と同じ条件で、１０℃、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃のアミノ基転移活性を測定した結果、６０℃がＴＰＭの至適温度と考えられた（最も高活性であった６０℃の活性を１００としたときの相対活性を表２に示す）。
【表２】
2012043622.tif 000007
【０１６２】
（４）熱安定性：
精製ＴＰＭを、０．５ｍＭピリドキサルリン酸を含む、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃にて３０分間反応した後、同様に活性測定を行なった。その結果、熱処理前に比べて、３０℃〜６０℃処理では９０％以上の活性が残存していた（熱処理前の活性を１００としたときの残存活性を表３に示す）。
【表３】
2012043622.tif 000008
【０１６３】
（５）水溶性有機溶媒耐性：精製ＴＰＭを添加した０．５ｍＭピリドキサルリン酸を含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）２００μＬに１−プロパノール、２−プロパノール、アセトンを８００μＬ添加し、３０℃で２時間処理した。処理後、０．５ｍＭピリドキサルリン酸を含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で２０倍に希釈し、希釈液の活性を上記と同様の条件で活性測定した。その結果、ＴＰＭは１−プロパノール、２−プロパノール、アセトンに対して極めて安定であった（表４）。
【表４】
2012043622.tif 000009
【０１６４】
（比較例１）市販アミノ基転移酵素の水溶性有機溶媒耐性
実施例９（５）水溶性有機溶媒耐性と同様の方法で、市販のＶｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓ由来のω−Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ  ＶＦ（Julich−Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）の水溶性有機溶媒耐性を調べた結果、１−プロパノール、２−プロパノール、アセトンを８０％ｖ／ｖ添加すると２時間で完全に活性を失った(表５)。
【表５】
2012043622.tif 000010
【０１６５】
（実施例１０）精製ＴＰＭの理化学的性質３：アミノ基供与体特異性
実施例７で得た精製ＴＰＭについて、アミノ基供与体の特異性について調べた。まず、精製ＴＰＭ溶液２０μＬを下記組成の基質溶液３８０μＬに添加し、３０℃で１時間反応後、３規定の塩酸２０μＬを加えて反応を停止させた。次に、得られた反応液２０μＬに０．２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液８０μＬ、３．３ｍｇ／ｍＬダブシルクロリドのアセトン溶液２００μＬをそれぞれ加え、７０℃で１０分間反応させた。これに酢酸２０μＬを加えて攪拌し、この反応液を下記条件のＨＰＬＣで分析し、ダブシル化したアラニンを定量した。その結果ＴＰＭは、ｎ−ブチルアミン、ベンジルアミン、±２−ブチルアミンにも活性を示すことが判明した（ｎ−ブチルアミンをアミノ基供与体として用いたときの活性を１００％とした相対活性として表６に示す）。【０１６６】
［基質溶液組成］
各種アミノ化合物                    １４ｍＭ  （ラセミ体の場合２８ｍＭ）
ピルビン酸                          １４ｍＭ
ピリドキサルリン酸                  ０．５ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）  ０．１Ｍ【０１６７】
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定条件］
カラム：Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ  ＯＤＳ−ＨＧ−３（ＮＯＭＵＲＡ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ）
溶離液：アセトニトリル／０．０４５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．１）＝３５／６５（体積比）
流速：０．９ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
【表６】
2012043622.tif 000011
【０１６８】
（実施例１１）精製ＴＰＭの理化学的性質４：アミノ基供与体特異性２
実施例７で得られた精製ＴＰＭについて、代表的なω―アミノ酸トランスアミナーゼの基質に対する反応性について調べた。まず、精製ＴＰＭ溶液２０μＬを下記組成の基質溶液３８０μＬに添加し、３０℃で１時間反応後、３規定の塩酸２０μＬを加えて反応を停止させた。次に、得られた反応液２０μＬに０．２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液８０μＬ、３．３ｍｇ／ｍＬダブシルクロリドのアセトン溶液２００μＬをそれぞれ加え、７０℃で１０分間反応させた。これに酢酸２０μＬを加えて攪拌し、この反応液を下記条件のＨＰＬＣで分析し、ダブシル化したアラニンを定量した。その結果、ＴＰＭはω―アミノ酸トランスアミナーゼの代表的な基質であるβ―アラニン、４−アミノ酪酸、Ｌ−オルニチン、Ｌ−リジン、プトレッシン、タウリンに対しては活性を示さないことが判明した（（Ｓ）−１−フェネチルアミンをアミノ基供与体として用いたときの活性を１００とした相対活性として表７に示す）。【０１６９】
［基質溶液組成］
各種アミノ化合物                    １４ｍＭ
ピルビン酸                          １４ｍＭ
ピリドキサルリン酸                  ０．０２ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）  ０．１Ｍ【０１７０】
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定条件］
カラム：Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ  ＯＤＳ−ＨＧ−３（ＮＯＭＵＲＡ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ）
溶離液：アセトニトリル／０．０４５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．１）＝３５／６５（体積比）
流速：０．９ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
【表７】
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【０１７１】
（実施例１２）精製ＴＰＭの理化学的性質５：アミノ基受容体特異性
実施例７で得られた精製ＴＰＭについて、アミノ基受容体に対する基質特異性について調べた。精製ＴＰＭ溶液に終濃度が下記組成となるような基質溶液を添加し、３０℃で５分間反応させた後、６規定の塩酸を反応液１ｍＬあたり５０μＬ添加し、反応を停止させた。この反応液を下記条件のＨＰＬＣで分析した結果、ＴＰＭは広範な基質に対して活性を示すことが判明した（表８）。【０１７２】
［基質溶液組成］
（Ｓ）−１−フェネチルアミン    ２５ｍＭ
各アミノ基受容体                ２５ｍＭ  あるいは  ２．５ｍＭ
ピリドキサルリン酸              ２．５ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）  ０．１Ｍ
ポリペプチド溶液【０１７３】
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定条件］
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ  ５Ｃ１８  ＲＳ（和光純薬社製）
溶離液：１０ｍＭ  りん酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．３）：アセトニトリル＝３：２
流速：１ｍＬ／分
検出：２４１ｎｍ
【表８】
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【０１７４】
（実施例１３）製造方法Ｉによる光学活性１−ベンジル−３−アミノピロリジンの製造
実施例６と同様の方法で得られた組換え大腸菌の培養液を遠心分離により集菌した。また、ＷＯ２００７／１３９０５５公報の実施例１３に記載のペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）  ＪＣＭ８７９７株由来のＬ−乳酸脱水素酵素ＰＡＬＤＨとバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＭ１０３０由来グルコース脱水素酵素ＧＤＨを共発現する組換え大腸菌を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ７．０）で培養し、遠心分離により集菌した。【０１７５】
ＴＰＭ１５．８Ｕ／ｍＬ、ＰＡＬＤＨ３８０Ｕ／ｍＬ、ＧＤＨ４１Ｕ／ｍＬとなるように上記培養液を混合し、あらかじめ基質である１−ベンジル−３−ピロリジノン９００ｍｇ、および、Ｌアラニン３７３０ｍｇ、Ｄ−グルコース１３９０ｍｇ、ＮＡＤ＋  ４ｍｇ、を入れたフラスコに上記菌体懸濁液３ｍｌ、ピリドキサルリン酸４ｍｇ、１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）３ｍＬを入れて、脱イオン水を加えて全体積を３０ｍＬとした。これを、３０℃で、水酸化ナトリウムでｐＨ６．８に調整しながら５時間攪拌しながら反応させた。反応終了後、この反応液を下記条件のＨＰＬＣで分析した。その結果、１−ベンジル−３−アミノピロリジンが変換率１００％で生成しており、立体配置は（Ｓ）体で光学純度は９８．３％ｅ．ｅ．であった。【０１７６】
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による定量分析条件］
＜定量分析＞
カラム：Ｆｉｎｅｐａｋ  ＳＩＬ  Ｃ１８−Ｔ  （日本分光社製）
溶離液：蒸留水  １２６０ｍＬ／アセトニトリル  ７４０ｍＬ／ＫＨ２ＰＯ４  １０ｇ／ＳＤＳ  ２．８８ｇ（ｐＨ３．６）
流速：１ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：４０℃【０１７７】
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による光学純度測定条件］
反応液を適量の炭酸ナトリウムで塩基性にしたのち、ジニトロベンゾイルクロライドで誘導体化した後、以下の条件で分析した。
カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＩＡ（ダイセル化学工業社製）
溶離液：ヘキサン／エタノール／ジエチルアミン／アセトニトリル＝８００／２００／１／５（体積比）
流速：０．８ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：３０℃【０１７８】
（実施例１４）製造方法Ｉによる光学活性２−アミノヘプタンの製造
実施例１３と同様の方法で得られたＴＰＭ、ＰＡＬＤＨおよびＧＤＨをそれぞれＴＰＭ１６．７Ｕ／ｍＬ、ＰＡＬＤＨ２９７Ｕ／ｍＬ、ＧＤＨ３０Ｕ／ｍＬとなるように上記培養液を混合し、あらかじめ基質である２−ヘプタノン３００ｍｇ、および、Ｌアラニン１５９００ｍｇ、Ｄ−グルコース７１０ｍｇ、ＮＡＤ＋  ４ｍｇ、を入れたフラスコに上記菌体懸濁液３ｍｌ、ピリドキサルリン酸１．３ｍｇ、１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）１ｍＬを入れて、脱イオン水を加えて全体積を１０ｍＬとした。これを、３０℃で、水酸化ナトリウムでｐＨ６．８に調整しながら３０時間攪拌しながら反応させた。反応終了後、この反応液を下記条件のＨＰＬＣで分析した。その結果、２−アミノヘプタンが変換率９９％で生成しており、立体配置は（Ｓ）体で光学純度は９９．２％ｅ．ｅ．であった。【０１７９】
［ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による定量分析条件］
カラム：Ｒｔｘ−５  Ａｍｉｎｅ（３０ｍ，０．２５ｍｍＩＤ）（ＲＥＳＴＥＫ社製）
カラム温度：５０℃
注入口温度：２５０℃
検出器温度：２２０℃
検出：ＦＩＤ
キャリアーガス：Ｈｅ、１５０ｋＰａ【０１８０】
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による光学純度測定条件］
反応液を適量の炭酸ナトリウムで塩基性にしたのち、ジニトロベンゾイルクロライドで誘導体化した後、以下の条件で分析した。
カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
溶離液：ｎ−ヘキサン／エタノール／ジエチルアミン＝９０／１０／０．１（体積比）
流速：１．０ｍＬ／分
検出：２４０ｎｍ
カラム温度：３５℃
本明細書で引用した全ての刊行物、特許、及び特許出願をそのまま参考として本明細書に取り入れるものとする。
【配列表】
2012043622000001.app
【国際調査報告】
2012043622.tif 000018
2012043622.tif 000019
2012043622.tif 000020
2012043622.tif 000021