(57)【要約】  安定性が高いヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を明らかにする。  ２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下であり、チオ硫酸金属塩類、チオシアン酸金属塩類、チオケトン類、スルフィド類、チオ尿素類、およびチオセミカルバジド類からなる群から選ばれる１種以上に分類される還元剤を含有する、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を提供する。
2012118190.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下であり、
チオ硫酸金属塩類、チオシアン酸金属塩類、チオケトン類、スルフィド類、チオ尿素類、およびチオセミカルバジド類からなる群から選ばれる１種以上に分類される還元剤を含有する、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸またはその塩の濃度が、５〜１５ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液。
【請求項３】
前記還元剤が、Ｌ−メチオニンまたはチオ硫酸ナトリウムである、請求項１または２に記載のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液。
【請求項４】
前記還元剤の含有量が１０〜１００００μｇ／ｍＬである、請求項１〜３いずれかに記載のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液。
【請求項５】
前記ヒアルロン酸またはその塩の平均分子量が１００万以上である、請求項１〜４いずれかに記載のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液。
【請求項６】
前記ヒアルロン酸の前記塩が、ヒアルロン酸ナトリウムである、請求項１〜５いずれかに記載のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液。
【請求項７】
請求項１〜６いずれかに記載のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を含む、医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜６いずれかに記載のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を含む、関節症治療用注射剤。
【請求項９】
請求項１〜６いずれかに記載のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を含む、化粧料組成物。
【請求項１０】
ヒアルロン酸またはその塩、および２価の溶解性鉄を含有する組成物と、
チオ硫酸金属塩類、チオシアン酸金属塩類、チオケトン類、スルフィド類、チオ尿素類、およびチオセミカルバジド類からなる群から選ばれる１種以上に分類される還元剤と、
を水溶液に溶解させる工程を含み、
前記組成物は、ヒアルロン酸またはその塩の濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように水溶液に溶解した時の、水溶液中の２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下である、
ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の生産方法。
【請求項１１】
ヒアルロン酸またはその塩、および２価の溶解性鉄を含有する組成物と、
チオ硫酸金属塩類、チオシアン酸金属塩類、チオケトン類、スルフィド類、チオ尿素類、およびチオセミカルバジド類からなる群から選ばれる１種以上に分類される還元剤と、
を水溶液に溶解させる工程を含み、
前記組成物は、ヒアルロン酸またはその塩の濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように水溶液に溶解した時の、水溶液中の２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下である、
ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の安定化促進方法。
【請求項１２】
チオ硫酸金属塩類、チオシアン酸金属塩類、チオケトン類、スルフィド類、チオ尿素類、およびチオセミカルバジド類からなる群から選ばれる１種以上に分類される還元剤を含む、
２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を安定化するための、安定化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２価の溶解性鉄の含有率が低く、チオ硫酸金属塩類、チオシアン酸金属塩類、チオケトン類、スルフィド類、チオ尿素類、およびチオセミカルバジド類からなる群から選ばれる１種以上に分類される還元剤を含有する、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸とは、N-アセチルグルコサミンとグルクロン酸の二糖単位が連結して構成されている多糖として知られている。ヒアルロン酸は、一般的に医薬品・化粧品・食品等の原材料として使用されている。ヒアルロン酸の生産方法としては、鶏の鶏冠等からの抽出物により製造する方法や、微生物を用いた発酵法により生産する方法がある。【０００３】
例えば、特許文献１にはストレプトコッカスズーエピデミカスを用いて、発酵法によりヒアルロン酸を生産したことが記載されている。この特許文献１には、培養中に硫酸第一鉄を３倍の濃度になるように添加した場合（実施例３）、添加しない場合（実施例１）よりもヒアルロン酸の収率および分子量が増加したことが記載されている。【０００４】
また、特許文献２にはストレプトコッカス・エクイ（ATCC9527）を用いて、発酵法によりヒアルロン酸粉末を生産したことが記載されている。特許文献３には、特許文献２の方法に基づいて生産したヒアルロン酸ナトリウム結晶には、カルシウム、マグネシウム、および鉄が多く含有されていることを表す実験データが記載されている。また特許文献３には、特許文献２の方法に基づいて得たヒアルロン酸含有液にさらにキレート樹脂を接触させることで、カルシウム、マグネシウム、および鉄の含有率が１０ｐｐｍ未満に減少したヒアルロン酸ナトリウム結晶を得たことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平9-56394
【特許文献２】特公平7-2117
【特許文献３】特開2008-280430
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記文献記載の従来技術は以下の点で改善の余地を有していた。
第一に特許文献１の生産方法では、硫酸第一鉄（硫酸鉄（II）、ＦｅＳＯ４）を大量に培地に添加しているため、精製後のヒアルロン酸含有溶液に鉄が混入しやすいと考えられる。また、硫酸第一鉄を大量に含む培地から鉄を取り除くには、通常よりも多くのコストが必要になる。【０００７】
第二に特許文献２の生産方法では、ヒアルロン酸粉末にカルシウム、マグネシウム、および鉄が多く含まれており、ヒアルロン酸ナトリウムの純度が低かった。【０００８】
第三に特許文献３の生産方法では、ヒアルロン酸ナトリウム結晶中のカルシウム、マグネシウム、および鉄の含有率を１０ｐｐｍ未満に減少させたことが記載されているが、具体的に含有率がいくつであったかは不明である。またその分析結果はｐｐｍオーダーであり、精密性に欠けている。さらに、カルシウム、マグネシウム、および鉄の含有率を減少させたことによって、具体的にどのような効果が得られるのかは記載されていない。【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下であり、チオ硫酸金属塩類、チオシアン酸金属塩類、チオケトン類、スルフィド類、チオ尿素類、およびチオセミカルバジド類からなる群から選ばれる１種以上に分類される還元剤を含むために、安定性が高いヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液に含まれる不純物に関する研究を行った結果、ヒアルロン酸塩水溶液中に混入している２価の溶解性鉄の含有率が高いほどヒアルロン酸分子の安定性が減少することを初めて見出した。また、本発明者らは、驚くべきことに、３価の溶解性鉄の含有率が大きくてもヒアルロン酸分子の安定性は減少せず、２価の溶解性鉄の含有率が大きい場合に限ってヒアルロン酸分子の安定性の減少が起こっていることも見出した。【００１１】
そこで、本発明者らは、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液中に混入している２価の溶解性鉄の含有率を低減させるとともに、２価の溶解性鉄によるヒアルロン酸分子の安定性の減少を抑制する添加物を探し求めたところ、チオ硫酸金属塩類、チオシアン酸金属塩類、チオケトン類、スルフィド類、チオ尿素類、およびチオセミカルバジド類のいずれかに分類される還元剤を添加することによって、２価の溶解性鉄によるヒアルロン酸分子の安定性の減少を抑制することができることを初めて見出した。また、本発明者らは、驚くべきことに、還元性の化合物であっても、臭化Ｎａ、亜硫酸水素Ｎａ、硫化Ｎａ、チオグリコール酸Ｎａ、ブドウ糖、およびアスコルビン酸を添加した場合には、２価の溶解性鉄によるヒアルロン酸分子の安定性の減少が抑制されず、かえって添加したことによって安定性が減少することも多いことを見出し、本発明を完成した。【００１２】
即ち、本発明によれば、２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下であり、チオ硫酸金属塩類、チオシアン酸金属塩類、チオケトン類、スルフィド類、チオ尿素類、およびチオセミカルバジド類からなる群から選ばれる１種以上に分類される還元剤を含有する、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液が提供される。このヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液は、保存後の極限粘度残存率が良好であることが、後述する実施例で実証されている。そのため、医薬品・化粧品・食品等の原材料に好適である。【００１３】
また、本発明によれば、上記ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を含む、医薬組成物が提供される。この医薬組成物は、保存後の極限粘度残存率が良好なヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を含む。そのため、時間経過とともに生じる粘度の低下、または品質の低下が生じにくい。【００１４】
また、本発明によれば、上記ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を含む、関節症治療用注射剤が提供される。この関節症治療用注射剤は、保存後の極限粘度残存率が良好なヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を含む。そのため、関節内またはその周辺に投与した場合に、良好な滞留性が得られる。【００１５】
また、本発明によれば、上記ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を含む、化粧料組成物が提供される。この化粧料組成物は、保存後の極限粘度残存率が良好なヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を含む。そのため、時間経過とともに生じる粘度の低下、または品質の低下が生じにくい。【００１６】
また、本発明によれば、ヒアルロン酸またはその塩、および２価の溶解性鉄を含有する組成物と、チオ硫酸金属塩類、チオシアン酸金属塩類、チオケトン類、スルフィド類、チオ尿素類、およびチオセミカルバジド類からなる群から選ばれる１種以上に分類される還元剤と、を水溶液に溶解させる工程を含み、上記組成物は、ヒアルロン酸またはその塩の濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように水溶液に溶解した時の、水溶液中の２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下である、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の生産方法が提供される。この生産方法によれば、保存後の極限粘度残存率が良好なヒアルロン酸またはその塩を生産できる。【００１７】
また、本発明によれば、ヒアルロン酸またはその塩、および２価の溶解性鉄を含有する組成物と、チオ硫酸金属塩類、チオシアン酸金属塩類、チオケトン類、スルフィド類、チオ尿素類、およびチオセミカルバジド類からなる群から選ばれる１種以上に分類される還元剤と、を水溶液に溶解させる工程を含み、上記組成物は、ヒアルロン酸またはその塩の濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように水溶液に溶解した時の、水溶液中の２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下である、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の安定化促進方法が提供される。上記還元剤を、２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液に含有させれば、保存後の極限粘度残存率が顕著に向上することが、後述する実施例で実証されている。そのため、この安定化促進方法によれば、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の安定化を顕著に促進することができる。【００１８】
また、本発明によれば、チオ硫酸金属塩類、チオシアン酸金属塩類、チオケトン類、スルフィド類、チオ尿素類、およびチオセミカルバジド類からなる群から選ばれる１種以上に分類される還元剤を含む、２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を安定化するための、安定化剤が提供される。上記還元剤を、２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液に含有させれば、保存後の極限粘度残存率が顕著に向上することが、後述する実施例で実証されている。そのため、この安定化剤を、２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液に添加すれば、顕著に安定化させることができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下であり、チオ硫酸金属塩類、チオシアン酸金属塩類、チオケトン類、スルフィド類、チオ尿素類、およびチオセミカルバジド類からなる群から選ばれる１種以上に分類される還元剤を含むために、安定性が高いヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、２価の溶解性鉄およびＬ-メチオニンを含有する水溶液に、ヒアルロン酸ナトリウム粉末を添加したときの、極限粘度残存率の変化を表したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、同様な内容については繰り返しの煩雑を避けるために、適宜説明を省略する。【００２２】
＜ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液＞
本発明の一実施形態は、２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下であり、チオ硫酸金属塩類、チオシアン酸金属塩類、チオケトン類、スルフィド類、チオ尿素類、およびチオセミカルバジド類からなる群から選ばれる１種以上に分類される還元剤を含む、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液である。このような組成からなるヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液は、後述する実施例で実証されているように、保存後の極限粘度残存率が高く、物理的な安定性に優れている。また、長期保存後または長期時間経過後にも粘度や品質の低下が生じにくく、例えば医薬品・化粧品・食品等の原材料に好適である。【００２３】
上記の還元剤は、全て硫黄含有の還元剤である。上記のチオ硫酸金属塩類は、例えばチオ硫酸カリウムまたはチオ硫酸ナトリウム等であってもよい。上記のチオシアン酸金属塩類は、例えばチオシアン酸カリウムまたはチオシアン酸ナトリウム等であってもよい。上記のチオケトン類は、例えばチオペンタール等であってもよい。上記のスルフィド類は、例えばＬ−メチオニンまたはＤＬ−メチオニン等であってもよい。上記のチオ尿素類は、R-N-C(=S)-N-Rの構造を有する化合物であり、例えばH2N-C(=S)-NH2等であってもよい。上記のチオセミカルバジド類は、R-N-C(=S)-NH-N-Rの構造を有する化合物であり、例えばH2-N-C(=S)-NH-NH2等であってもよい。ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の安定性をより向上させるという観点からは、Ｌ−メチオニンまたはチオ硫酸ナトリウムが好ましい。【００２４】
上記の５ｐｐｂ以下は、例えば0.001、0.01、0.1、0.5、1、2、4、または５ｐｐｂであってもよい。またこの含有率は、ここで例示した値以下、またはいずれか２つの値の範囲内であってもよい。この含有率は、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の安定性を向上させるという観点からは、より少ない方が好ましい。【００２５】
本実施形態のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液に含まれる、上記の還元剤の含有率は、例えば5、10、30、50、100、150、300、500、800、1000、1500、2000、5000または10000μｇ/ｍＬであってもよい。またこの含有率は、ここで例示したいずれか２つの値の範囲内であってもよい。またこの含有率は、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の安定性をより向上させるという観点からは、10μｇ/ｍＬ以上が好ましく、100μｇ/ｍＬ以上がより好ましい。またこの含有率は、生産コスト低減、または操作性向上の観点からは2000μｇ/ｍＬ以下が好ましく、1500μｇ/ｍＬ以下がより好ましい。【００２６】
本実施形態のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液に含まれる、ヒアルロン酸ナトリウムまたはその塩の平均分子量は、例えば50万、80万、100万、150万、180万、200万、250万、300万、500万、または800万であってもよい。この平均分子量は、ここで例示したいずれか２つの値の範囲内であってもよい。ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の粘性をより向上させるという観点からは、100万以上が好ましく、150万以上がより好ましい。粘性の高いヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液は、関節症治療用の注射剤として使用した場合、患部での滞留性に優れている。ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液に含まれるヒアルロン酸またはその塩の平均分子量は、極限粘度を測定した後、Ｌａｕｒｅｎｔの式（LAURENT et al., Biochim Biophys Acta. 1960 Aug 26;42:476-485.）を用いて算出することができる。【００２７】
本実施形態のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液に含まれる、ヒアルロン酸またはその塩の含有量は、例えば、0.1、1、5、8、9、10、11、12、15、または20ｍｇ／ｍＬであってもよい。この含有率は、ここで例示したいずれか２つの値の範囲内であってもよい。治療効果、または注射剤等に使用する際の操作性の観点からは、5と15ｍｇ／ｍＬの値の範囲内が好ましく、8と12ｍｇ／ｍＬの値の範囲内がより好ましい。【００２８】
本実施形態のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液のｐＨは、例えば5.5、6、6.5、6.8、7、7.8、8、8.5、または9であってもよい。このｐＨは、ここで例示したいずれか２つの値の範囲内であってもよい。またこのｐＨは、安定性の観点からは、6.5と8の値の範囲内が好ましく、6.8と7.8の値の範囲内がより好ましい。【００２９】
本実施形態のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液は、例えば、ヒアルロン酸またはその塩、および２価の溶解性鉄を含有する組成物と、チオ硫酸金属塩類、チオシアン酸金属塩類、チオケトン類、スルフィド類、チオ尿素類、およびチオセミカルバジド類からなる群から選ばれる１種以上に分類される還元剤と、を水溶液に溶解させる工程を含み、上記組成物は、ヒアルロン酸またはその塩の濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように水溶液に溶解した時の、水溶液中の２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下である、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の生産方法によって得ることができる。この生産方法は複雑な工程を必ずしも必要とせず、生産性またはコスト面で優れている。【００３０】
本明細書において「ヒアルロン酸の塩」とは、例えばヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸亜鉛、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、またはヒアルロン酸アンモニウムであってもよい。この中でも、所望の粘性、または関節症への治療効果が期待できるという観点からは、ヒアルロン酸ナトリウムが好ましい。ヒアルロン酸ナトリウムの化学名は、例えば[→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-sodium glucopyranosyluronate-(1→]n(IUPAC)で表すことができる。【００３１】
本明細書において「２価の溶解性鉄」とは、溶解性の状態にある鉄で２価のものである。Ｆｅ２＋や２価鉄と表記することもできる。【００３２】
＜医薬組成物等＞
本実施形態のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液は、医薬組成物の原材料として使用できる。この場合、上記医薬組成物は安定性に優れたヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を含むため、長期保存後にも粘度や品質の低下が生じにくい。また、例えば関節内またはその周辺に投与した場合に、患部に長時間または所望の時間滞留することができる。この医薬組成物の剤形は特に限定されないが、関節等の患部へ直接投与することができるという観点からは注射剤が好ましい。注射剤の容器としては、例えばシリンジ、バイアル、またはアンプルを使用できる。投与に際しては、単独で投与することも可能ではあるが、薬理学的に許容される１つまたはそれ以上の担体もしくは賦形剤と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供することが好ましい。この医薬組成物は投与形態に合わせて、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸リドカイン、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。またこの医薬組成物は、添加剤としてリン酸水素ナトリウム、結晶リン酸二水素ナトリウム、塩化ナトリウムを含んでいてもよい。調整された医薬組成物は、例えばヒトや哺乳動物（例えばラット、マウス、ウサギ、イヌ、サル、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコなど）に対して投与することができる。なお医薬組成物には、予防を目的として使用される組成物を含む。【００３３】
この医薬組成物の投与方法は被験者の年齢、症状、患部等により適宜選択することができる。変形性膝関節症の治療に使用する場合には、例えば、成人１回2.5mLを１週間毎に連続５回膝関節腔内に投与することができる。または、症状の維持を目的とする場合は、2〜4週間隔で投与することができる。また肩関節周囲炎の治療に使用する場合には、例えば、成人１回2.5mLを１週間毎に連続５回肩関節（肩関節腔、肩峰下滑液包、または上腕二頭筋長頭腱腱鞘）内に投与することができる。また関節リウマチにおける膝関節痛の治療に使用する場合には、例えば、成人１回2.5mLを１週間毎に連続５回膝関節腔内に投与することができる。また、適切な化学療法薬と併用で投与してもよい。【００３４】
この医薬組成物の薬理作用としては、例えば、a)ヒアルロン酸塩が軟骨組織に結合し表面を被覆することによる粘弾性もしくは潤滑作用、b)軟骨基質の安定化による関節軟骨保護作用(変性抑制作用、修復作用等)、c)炎症性細胞及び滑膜細胞の表面を被覆することによる、もしくは発痛増強物質の産生抑制等による鎮痛作用、またはd)滑膜及び軟骨変性を伴う関節炎と密接な関わりをもつ滑膜細胞、軟骨細胞、もしくは好中球やマクロファージといった炎症性細胞に影響を及ぼして発現される炎症作用、を挙げることができる。これら作用により、例えば疼痛の軽減、または日常生活活動や関節可動域の改善が期待される。【００３５】
本実施形態のヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液は、化粧料組成物の原材料として使用できる。この場合、上記化粧料組成物は、安定性に優れたヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を含むため、長期保存後にも粘度や品質の低下が生じにくい。また、保湿用の化粧料組成物として使用する場合、保湿効果が持続しやすい。【００３６】
＜安定化方法等＞
他の実施形態は、ヒアルロン酸またはその塩、および２価の溶解性鉄を含有する組成物と、チオ硫酸金属塩類、チオシアン酸金属塩類、チオケトン類、スルフィド類、チオ尿素類、およびチオセミカルバジド類からなる群から選ばれる１種以上に分類される還元剤と、を水溶液に溶解させる工程を含み、上記組成物は、ヒアルロン酸またはその塩の濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように水溶液に溶解した時の、水溶液中の２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下である、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の安定化促進方法である。この方法によれば、物理的な安定性が高い、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液を得ることができる。またこの方法は、複雑な工程を必ずしも必要とせず、利便性に優れている。【００３７】
また、上記還元剤はヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の安定化剤の原材料として使用できる。この安定化剤を用いれば、２価の溶解性鉄の含有率が５ｐｐｂ以下の、ヒアルロン酸またはその塩を含む水溶液の、物理的な安定性を向上させることができる。この安定化剤は、粉末状または液状であってもよい。また液状の場合には緩衝剤を含んでいてもよい。【００３８】
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。また、上記実施形態に記載の構成を組み合わせて採用することもできる。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００４０】
＜実施例１＞
以下の手順で、ヒアルロン酸Ｎａ水溶液を調整した。まず、グルコース５％、リン酸第１カリウム０．２％、ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．５％からなる培地１リットルを加熱殺菌後、ストレプトコッカス・エキＦＭ−１００（微工研条寄第９０２７号）を接種した。空気を１ｖｖｍで通気しながら、撹拌２００回転／分、温度３３℃、ｐＨ８．５（２０％水酸化ナトリウムの自動滴下によるコントロール）で２０時間培養した。この液を菌体ろ過装置によりろ過し、水に対して１２時間透析して透析膜内のヒアルロン酸溶液を回収した。回収容器は、鉄の混入を防ぐため、内表面がガラス製のものを用いた。ここに塩化ナトリウムを２．５％となるように添加し、エタノールをヒアルロン酸溶液の２倍量加えてヒアルロン酸Ｎａを沈殿させた。沈殿をエタノールで５回洗浄し、不純物を十分に洗い流してから４０℃で１０時間風乾し、ヒアルロン酸Ｎａの粉末を得た。【００４１】
次に、得られたヒアルロン酸Ｎａ粉末を、２ｍＭリン酸バッファーおよび０．９％塩化ナトリウムを含む水溶液に溶解し、ヒアルロン酸Ｎａをそれぞれ５、８、１０、１２、１５ｍｇ／ｍＬ含むヒアルロン酸Ｎａ水溶液を得た。さらに、極限粘度を測定し、Ｌａｕｒｅｎｔの式を用いてヒアルロン酸Ｎａの分子量を求めた結果、２５３万であった。【００４２】
＜比較例１＞
実施例１に記載の手順でストレプトコッカス・エキＦＭ−１００を培養し、特許文献３（特開2008-280430）の実施例１に記載の手順と同様の手順で、ヒアルロン酸Ｎａ水溶液を精製した。具体的には、まず、グルコース５％、リン酸第１カリウム０．２％、ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．５％からなる培地１リットルを加熱殺菌後、ストレプトコッカス・エキＦＭ−１００を接種した。空気を１ｖｖｍで通気しながら、撹拌２００回転／分、温度３３℃、ｐＨ８．５（２０％水酸化ナトリウムの自動滴下によるコントロール）で２０時間培養した。培養液を、イオン交換水を用いて１０倍に希釈し、その２．５Ｌ水溶液に活性炭（武田薬品社製の白鷺ＲＷ５０−Ｔ）を５ｇ、パーライト（三井金属鉱業株式会社のロカヘルプ♯４０９）を３０ｇ添加して１時間処理し、ヌッチェを用いて濾過した。この操作を２回繰り返して培地中の有機成分を除去し、ヒアルロン酸Ｎａ含有液を調整した。次に、内径１５ｍｍ、高さ３００ｍｍのクロマトカラムに三菱化学社製ダイヤイオンＣＲ１１を６８ｍｌ充填し、樹脂を再生した。このクロマトカラムに上記ヒアルロン酸Ｎａ含有液２．５Ｌを、ＳＶ＝１８（１２００ｍｌ／ｈｒ）で通液した。クロマトカラム通過液１Ｌに食塩２ｇを溶解し、ｐＨ７に調整後、２−プロパノールで析出を行い、４０℃で真空乾燥し、ヒアルロン酸Ｎａの粉末を得た。【００４３】
次に、得られたヒアルロン酸Ｎａ粉末を、２ｍＭリン酸バッファーおよび０．９％塩化ナトリウムを含む水溶液に溶解し、ヒアルロン酸Ｎａをそれぞれ５、８、１０、１２、１５ｍｇ／ｍＬ含むヒアルロン酸Ｎａ水溶液を得た。さらに、極限粘度を測定し、Ｌａｕｒｅｎｔの式を用いてヒアルロン酸Ｎａの分子量を求めた結果、２４０万であった。【００４４】
＜評価例１＞
（１）溶解性鉄の分析
実施例１および比較例１で調製したヒアルロン酸Ｎａの粉末を、２ｍＭリン酸バッファーおよび０．９％塩化ナトリウムを含む水溶液に溶解し、ヒアルロン酸Ｎａを５、８、１０、１２、または１５ｍｇ／ｍＬ含有するヒアルロン酸Ｎａ水溶液をそれぞれ調製した（No.1〜10）。次に、それぞれの水溶液について、鉄量２価の溶解性鉄量、２価および３価の溶解性鉄量、および全鉄量を下記（１−１）〜（１−３）の手順で測定した。全鉄量には溶解性および不溶解性の鉄量を含む。鉄量２価の溶解性鉄量、２価および３価の溶解性鉄量、および全鉄量の検出限界は、５ｐｐｂであった。【００４５】
（１−１）２価の溶解性鉄の分析方法
ａ）ヒアルロン酸Ｎａ水溶液２．７５ｇをサンプル瓶に分取する。
ｂ）チオシアン酸カリウム溶液０．１ｍＬ、１，１０−フェナントロリン溶液０．０５ｍＬを添加して混合する。
ｃ）約１０ｍＬに希釈した後、約１０分間放置する。
ｄ）クロロホルム５ｍＬを加えた後、密栓する。５分間振り混ぜ、抽出する。
ｅ）静置後、クロロホルム相を４ｍＬ分取し、別のサンプル瓶に移す。
ｆ）ホットプレート上で蒸発乾固した後、濃硝酸０．５ｍＬを加え酸分解する。
ｇ）希硝酸（１＋１００）２ｍＬを加え、残分を溶解する。
ｈ）ＩＣＰ発光分析でＦｅを定量する。【００４６】
（１−２）２価および３価の溶解性鉄の分析方法
ａ）ヒアルロン酸Ｎａ水溶液２．７５ｇをサンプル瓶に分取する。
ｂ）塩酸ヒドロキシルアミン溶液０．２ｍＬを添加する。
ｃ）１，１０−フェナントロリン溶液０．２ｍＬ、チオシアン酸カリウム溶液０．５ｍＬを添加する。
ｄ）約１０ｍＬに希釈した後、約１０分間放置する。
ｅ）４−メチル−２−ペンタノン５ｍＬを加えた後、密栓する。１分間振り混ぜ、抽出する。
ｆ）静置後、４−メチル−２−ペンタノン相を４ｍＬ分取し、別のサンプル瓶に移す。
ｇ）ホットプレート上で蒸発乾固した後、濃硝酸０．５ｍＬを加え酸分解する。
ｈ）希硝酸（１＋１００）２ｍＬを加え、残分を溶解する。
ｉ）ＩＣＰ発光分析でＦｅを定量する。【００４７】
（１−３）全鉄の分析方法
ａ）ヒアルロン酸Ｎａ水溶液２．７５ｇをサンプル瓶に分取する。
ｂ）ＨＣｌ（１＋１）０．１ｍＬを加えホットプレートで加熱する。
ｃ）上記（１−２）２価および３価の溶解性鉄の分析方法のｂ）以降の操作を行う。【００４８】
（１−４）鉄量の分析結果
上記（１−１）〜（１−３）の分析結果を表１に示す。【００４９】
【表１】
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【００５０】
（２）極限粘度測定
２ｍＭリン酸バッファーおよび０．９％塩化ナトリウムを含む水溶液に対して、実施例１または比較例１で調製したヒアルロン酸Ｎａの粉末を、ヒアルロン酸Ｎａ濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ溶解した（No.11〜12）。さらに、８０°Ｃで２４時間保存した後、極限粘度および極限粘度残存率（％）を測定した結果を表２に示す。なお、極限粘度は第十五改正日本薬局方第二追補「精製ヒアルロン酸ナトリウム」の粘度の項の記載に従い測定した。その結果を表２に示す。【００５１】
【表２】
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【００５２】
２ｍＭリン酸バッファーおよび０．９％塩化ナトリウムを含む水溶液に対して、表３に示すように塩化鉄（II）（FeCl2）を溶解した（No.13〜19）。次に、それぞれの水溶液に実施例１で調製したヒアルロン酸Ｎａの粉末を、ヒアルロン酸Ｎａ濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。さらに、８０°Ｃで２４時間保存した後、極限粘度および極限粘度残存率（％）を測定した。その結果を表３に示す。【００５３】
【表３】
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【００５４】
２ｍＭリン酸バッファーおよび０．９％塩化ナトリウムを含む水溶液に対して、表４に示すように塩化鉄（III）（FeCl3）を溶解した（No.20〜22）。次に、それぞれの水溶液に実施例１で調製したヒアルロン酸Ｎａの粉末を、ヒアルロン酸Ｎａ濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。さらに、８０°Ｃで２４時間保存した後、極限粘度および極限粘度残存率（％）を測定した。その結果を表４に示す。【００５５】
【表４】
2012118190.tif 000006
【００５６】
以上の結果から、１）実施例１に記載の方法を用いれば、２価の溶解性鉄の混入量が５ｐｐｂ以下のヒアルロン酸Ｎａ水溶液を調整できること、２）２価の溶解性鉄によって、ヒアルロン酸Ｎａ水溶液の保存後の極限粘度が低下すること、３）３価の溶解性鉄は、ヒアルロン酸Ｎａ水溶液の保存後の極限粘度に影響を与えないこと、がわかった。【００５７】
＜評価例２＞
２ｍＭリン酸バッファーおよび０．９％塩化ナトリウムを含む水溶液に対して、表５に示すように各種添加物を溶解した（No.23〜34）。次に、それぞれの水溶液に実施例１で調製したヒアルロン酸Ｎａの粉末を、濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。さらに、８０°Ｃで２４時間保存した後、極限粘度および極限粘度残存率（％）を測定した。なお、上記添加物のうち、グリシン、L-アスパラギン酸Na、精製白糖は非還元性の化合物である。Ｌ−メチオニン、チオ硫酸Ｎａ、臭化Ｎａ、亜硫酸水素Ｎａ、硫化Ｎａ、チオグリコール酸Na、ブドウ糖、およびアスコルビン酸は還元性の化合物である。【００５８】
【表５】
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・添加剤
L-メチオニン：和光純薬社、133-01602
チオ硫酸Ｎａ：和光純薬社、190-13845
グリシン：和光純薬社、036435
L-アスパラギン酸Na：和光純薬社、193-01262
臭化Na：和光純薬社、193-01505
亜硫酸水素Na：和光純薬社、190-01375
硫化Na：和光純薬社、197-03362
チオグリコール酸Na：和光純薬社、590-11762
ブドウ糖：和光純薬社、076-05705
精製白糖（ショ糖）：和光純薬社、196-13705
アスコルビン酸Na：和光純薬社、196-01252【００５９】
以上の結果、実施例１で調製したヒアルロン酸Ｎａの粉末を溶解させた水溶液は、Ｌ−メチオニンまたはチオ硫酸Ｎａを含有させると、ヒアルロン酸Ｎａ水溶液の安定性が向上することがわかった。また、Ｌ−メチオニンおよびチオ硫酸Ｎａと同じく還元性の性質を有する化合物であっても、亜硫酸水素Na、硫化Ｎａ、チオグリコール酸Ｎａ、ブドウ糖、およびアスコルビン酸を含有させた場合には、むしろ安定性が低下していた。【００６０】
＜評価例３＞
２ｍＭリン酸バッファーおよび０．９％塩化ナトリウムを含む水溶液に対して、表６に示すように各種添加物を溶解した（No.35〜41）。さらに、それぞれの水溶液に塩化鉄（II）を１１．３ｐｐｂ（２価の溶解性鉄として５ｐｐｂ）添加した。次に、それぞれの水溶液に実施例１で調製したヒアルロン酸Ｎａの粉末を、濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。その後、８０°Ｃで２４時間保存した後、極限粘度および極限粘度残存率（％）を測定した。【００６１】
【表６】
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【００６２】
以上の結果、実施例１で調製したヒアルロン酸Ｎａの粉末を溶解させた水溶液は、２価の溶解性鉄を５ｐｐｂ含有させると、ヒアルロン酸Ｎａ水溶液の安定性が低下することが示された。さらには、その安定性の低下は、Ｌ−メチオニンまたはチオ硫酸Ｎａによって顕著に抑制されることがわかった。【００６３】
＜評価例４＞
２ｍＭリン酸バッファーおよび０．９％塩化ナトリウムを含む水溶液に対して、表７に示す濃度でＬ−メチオニンを溶解した（No.42〜48）。次に、それぞれの水溶液に実施例１で調製したヒアルロン酸Ｎａの粉末を、濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。さらに、８０°Ｃで２４時間保存した後、極限粘度および極限粘度残存率（％）を測定した。【００６４】
【表７】
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【００６５】
以上の結果から、実施例１で調製したヒアルロン酸Ｎａの粉末を溶解させた水溶液は、Ｌ−メチオニンを１０μg／ｍＬ以上含有させると、ヒアルロン酸Ｎａ水溶液の安定性が向上することがわかった。また、その安定性の向上は、Ｌ−メチオニンを１００μg／ｍＬ含有したあたりで緩やかになった。【００６６】
＜評価例５＞
２ｍＭリン酸バッファーおよび０．９％塩化ナトリウムを含む水溶液に対して、Ｌ−メチオニンを、濃度が１０００μg／ｍＬとなるように溶解した。さらに、それぞれの水溶液に表８に示す濃度の塩化鉄（II）を添加した（No.49〜54）。次に、それぞれの水溶液に実施例１で調製したヒアルロン酸Ｎａの粉末を、濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。その後、８０°Ｃで２４時間保存した後、極限粘度および極限粘度残存率（％）を測定した。【００６７】
【表８】
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【００６８】
表８の結果と、表３の結果をグラフにすると、図１の通りである。この図１から、２価の溶解性鉄濃度が低濃度含まれているヒアルロン溶液に、Ｌ−メチオニンを１０００μg／ｍＬ含有させると、ヒアルロン酸Ｎａ水溶液の安定性が向上することがわかる。この安定化効果は、特に２価の溶解性鉄濃度が５ｐｐｂ以下のときに顕著であった。【００６９】
以上のように、２価の溶解性鉄の含有率が低いヒアルロン酸Ｎａ水溶液は、保存後の極限粘度残存率が向上していた。さらには、そのヒアルロン酸Ｎａ水溶液にＬ−メチオニンを含有させると、より一層極限粘度残存率が向上した。このヒアルロン酸Ｎａ水溶液は安定性が高く、長期保存後にも粘度や品質の低下が生じにくいため、例えば医薬組成物等の原材料として優れている。また、長期保存に適しているためコストも抑えられる。【００７０】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【図１】
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【国際調査報告】
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