(57)【要約】  Ｇｉａｎｔｉｎの発現をｍＲＮＡレベルで抑制しうるＲＮＡｉ誘導性核酸、又は該ＲＮＡｉ誘導性核酸を投与対象内で発現可能である発現ベクターを有効成分とすることを特徴とする分泌機能改善剤。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇｉａｎｔｉｎの発現をｍＲＮＡレベルで抑制しうるＲＮＡｉ誘導性核酸、又は該ＲＮＡｉ誘導性核酸を投与対象内で発現可能である発現ベクターを有効成分とすることを特徴とする分泌機能改善剤。
【請求項２】
ＲＮＡｉ誘導性核酸が、ＧｉａｎｔｉｎのＤＮＡ塩基配列中の１９〜２３塩基からなる塩基配列に基づいて設計されるｓｉＲＮＡである請求項１に記載の分泌機能改善剤。
【請求項３】
ＲＮＡｉ誘導性核酸が、二重鎖ＲＮＡ部分が配列番号１で表される塩基配列における第１番目〜第１９番目の塩基を含むｓｉＲＮＡである請求項１又は２に記載の分泌機能改善剤。
【請求項４】
ｓｉＲＮＡが、配列番号１で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなる請求項３に記載の分泌機能改善剤。
【請求項５】
二重鎖ＲＮＡ部分が、配列番号１で表される塩基配列における第１番目〜第１９番目の塩基を含むことを特徴とするｓｉＲＮＡ。
【請求項６】
配列番号１で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなる請求項５に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項７】
請求項５又は６に記載のｓｉＲＮＡを投与対象内で発現可能であることを特徴とする発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇｉａｎｔｉｎを標的としたｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、等のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）誘導性核酸を含有する分泌機能改善剤及び新規なｓｉＲＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
ホルモン、酵素などの欠乏・過剰に起因する疾患に対する治療方法の一つとして細胞内で産生された生成物の分泌を制御する方法がある。かかる治療方法には、通常、細胞膜表面の受容体に作用するアゴニストやアンタゴニストが用いられる。【０００３】
例えば、糖尿病治療薬として最も多く用いられているスルフォニル尿素剤は、インスリンを産生する膵臓ランゲルハンス島（膵島）のβ細胞表面の受容体に結合することにより、最終的にインスリン分泌を促し、治療効果を発揮する（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｈｅｅｈａｎ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ＆  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１巻、第１８９〜２００頁、２００３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、スルフォニル尿素剤は、耐性が生じやすいため、使用していくうちに効果が薄れてくるという問題がある。また、このような耐性の問題は、他の受容体作用薬においても見られ、新しい作用機序を有する分泌機能改善薬が求められている。
更に、外界の刺激に依存して分泌する調節性分泌異常のみならず、細胞が常時行っている構成性分泌異常については、改善薬が発見されていないため、上記のような分泌機能改善薬が期待されている。【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、新しい作用機序を有する分泌機能改善剤、及びその有効成分として有用な新規ｓｉＲＮＡを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、細胞内輸送に関与するタンパク質であるＧｉａｎｔｉｎの発現をｍＲＮＡレベルで抑制することにより、課題を解決できることを見出した。【０００８】
すなわち本発明は、下記（１）〜（７）を提供するものである。
（１）Ｇｉａｎｔｉｎの発現をｍＲＮＡレベルで抑制しうるＲＮＡｉ誘導性核酸、又は該ＲＮＡｉ誘導性核酸を投与対象内で発現可能である発現ベクターを有効成分とすることを特徴とする分泌機能改善剤。
（２）ＲＮＡｉ誘導性核酸が、ＧｉａｎｔｉｎのＤＮＡ塩基配列中の１９〜２３塩基からなる塩基配列に基づいて設計されるｓｉＲＮＡである前記（１）に記載の分泌機能改善剤。
（３）ＲＮＡｉ誘導性核酸が、二重鎖ＲＮＡ部分が配列番号１で表される塩基配列における第１番目〜第１９番目の塩基を含むｓｉＲＮＡである前記（１）又は（２）に記載の分泌機能改善剤。
（４）ｓｉＲＮＡが、配列番号１で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなる前記（３）に記載の分泌機能改善剤。
（５）二重鎖ＲＮＡ部分が、配列番号１で表される塩基配列における第１番目〜第１９番目の塩基を含むことを特徴とするｓｉＲＮＡ。
（６）配列番号１で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなる前記（５）に記載のｓｉＲＮＡ。
（７）前記（５）又は（６）のｓｉＲＮＡを投与対象内で発現可能であることを特徴とする発現ベクター。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、新しい作用機序に基づいた、ホルモン分泌や酵素の分泌低下等に起因した疾患の治療薬の開発に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１におけるウエスタンブロット解析を行った結果図である。
【図２】実施例２におけるＡＬＰ（アルカリフォスファターゼ）分泌量を測定した結果図である。
【図３】実施例３におけるＶＳＶＧ−ｔｓＯ４５（水疱性口内炎ウィルス由来膜タンパク質）の細胞膜表面露出量を測定した結果図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［ＲＮＡｉ誘導性核酸］
本発明のＲＮＡｉ誘導性核酸は、細胞内輸送に関与するタンパク質であるＧｉａｎｔｉｎを標的とするものである。後述するように、本発明のＲＮＡｉ誘導性核酸は、Ｇｉａｎｔｉｎの発現を抑制し、細胞内輸送機能を促進する。
【００１２】
細胞内で作られた全タンパク質のうち約３０％は、小胞体からゴルジ体へ輸送され、適宜修飾を受けたのち、エキソサイトーシスにより細胞膜を通過してそれぞれの目的地へと輸送される。
この輸送は、主に小胞によって行われる。中でもゴルジ体周辺の輸送は、ＣＯＰＩ（ｃｏａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｉ）小胞によって行われていると考えられている。ゴルジ体表面へのＣＯＰＩ小胞の接近、ゴルジ体との相互作用の開始には、ゴルジ体とＣＯＰＩ小胞上に分布するゴルジンと呼ばれるタンパク質ファミリーに属する物質が重要な役割を担っている。
【００１３】
ゴルジンファミリーは、ゴルジ体表面、及びＣＯＰＩ小胞上に非対象に分布する長い竿状のコイルドコイル構造を持つタンパク質群である。これらのタンパク質のうち、ＧＭ１３０、ｐ１１５、Ｇｏｌｇｉｎ−８４、ＣＡＳＰについては、その発現低下が輸送の低下を招くことが示されている（Ａｉｐｏら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、第１６０巻、第２０１〜２１２頁、２００３年）。
【００１４】
本発明者は、ゴルジンタンパク質のＣＯＰＩ小胞輸送調節機能やゴルジ体形成能に着目して機能解析を行っており、ゴルジンファミリーの一つであるＧｉａｎｔｉｎの発現を抑制したところ、細胞内輸送機能が促進されることを見出した。これは、ゴルジンタンパク質ファミリーに属する他のタンパク質の発現を抑制した場合と正反対の現象であり、新規の知見である。
従って、本発明によれば、細胞内輸送機構の更なる解明に貢献することができる。
【００１５】
本発明において、Ｇｉａｎｔｉｎは、任意の哺乳動物由来の膜タンパク質である。哺乳動物としては、ヒト及びヒトを除く哺乳動物が挙げられ、ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等 のペット、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類が挙げられる。ヒトＧｉａｎｔｉｎの塩基配列及びアミノ酸配列は公知（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００４４８７）である。また、ラット（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿１３８８８５）及びマウス（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿０３００３５）も公知である。
【００１６】
前記ＲＮＡｉ誘導性核酸とは、細胞内に導入されることにより、ＲＮＡ干渉を誘導しうる少なくとも１９塩基長の核酸を意味する。ただし、Ｇｉａｎｔｉｎ抑制作用を有する限り、１９塩基長よりも短いＲＮＡであってもよい。ＲＮＡｉ誘導性核酸としては、例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）などが挙げられるが、ｓｉＲＮＡが好ましい。
【００１７】
[ｓｉＲＮＡ］
本発明のｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖からなる二重鎖のＲＮＡ部分と、好ましくはセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端が数塩基分突出した構造（オーバーハング）とからなる。かかるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡｉ）と呼ばれる配列特異的な遺伝子発現抑制を誘導する。本発明のｓｉＲＮＡは、Ｇｉａｎｔｉｎの発現を抑制することができる限り、ｍＲＮＡの任意の部分を標的とするものであってよい。塩基の長さは、例えば１９〜２７塩基長、好ましくは２１〜２５塩基長である。ｓｉＲＮＡの設計方法は、当業者に公知であり、様々な設計ソフトウエア又はアルゴリズムを用いて、公知のＧｉａｎｔｉｎの配列から適切なｓｉＲＮＡの塩基配列を選択することができる。
【００１８】
ＲＮＡ干渉とは、ｍＲＮＡと同一の塩基配列（又はその部分配列）を含む二本鎖構造のＲＮＡが、当該ｍＲＮＡの発現を抑制する効果をいう。このＲＮＡｉ効果を得るには、通常、標的ｍＲＮＡと同一の連続する塩基配列（又はその部分配列）を有する二本鎖構造のＲＮＡを用いる。二本鎖構造は、センス鎖とアンチセンス鎖の異なるストランドで構成されていてもよいし、後述するように、一つのＲＮＡのステムループ構造によって与えられる二本鎖 （ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ／ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ；ｓｈＲＮＡ）であってもよい。
【００１９】
本発明のｓｉＲＮＡは、二重鎖ＲＮＡ部分が、配列番号１で表される塩基配列における第１番目〜第１９番目の塩基を含有することが好ましい。配列番号１で規定される本発明のｓｉＲＮＡは新規である。この塩基配列は、Ｇｉａｎｔｉｎのアミノ酸配列上、４５０番目付近に相当するが、本発明は、Ｇｉａｎｔｉｎの発現を抑制することを条件として、Ｇｉａｎｔｉｎの他の部位に対応するｓｉＲＮＡをも包含する。
前記二重鎖ＲＮＡ部分において、センス鎖とアンチセンス鎖は完全に相補する関係にあっても、部分的に相補する関係にあってもよいが、完全に相補する関係にあることが好ましい。
また、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ塩基数であっても、異なる塩基数であってもよいが、同じ塩基数であることが好ましい。
【００２０】
本発明において、前記オーバーハングは０〜２塩基の任意の核酸（リボ核酸又はデオキシリボ核酸）であることが好ましく、２塩基の任意の核酸であることがより好ましい。
前記オーバーハングを構成するリボ核酸としては、Ｕ（ウリジン）、Ａ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、又はＣ（シチジン）が挙げられる。
また、前記オーバーハングを構成するデオキシリボ核酸としては、ｄＴ（デオキシチミジン）、ｄＡ（デオキシアデノシン）、ｄＧ（デオキシグアノシン）、又はｄＣ（デオキシシチジン）が挙げられる。
中でも、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端に、それぞれ独立して、１又は２塩基のＵ又はｄＴが付加されたオーバーハングが好ましく、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端に、それぞれ独立して、１又は２塩基のＵ又はｄＴが付加されたオーバーハングがより好ましく、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端に、２塩基のＵ又はｄＴが付加されたオーバーハングが特に好ましく、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端に、２塩基のｄＴが付加されたオーバーハングが最も好ましい。
【００２１】
更に、本発明のｓｉＲＮＡとしては、配列番号１で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなるものが特に好ましい配列番号１で表される塩基配列からなるセンス鎖及び配列番号２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖は、それぞれ、第１番目〜第１９番目の塩基からなるＲＮＡ部分の３’側に、ｄＴが２つ付加されたＲＮＡ／ＤＮＡキメラポリヌクレオチドである。このセンス鎖とこのアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡにおいては、第１番目〜第１９番目の塩基からなるＲＮＡ部分が二重鎖を形成し、第２０番目及び第２１番目のｄＴが３’側オーバーハングを形成する。
【００２２】
本発明において、細胞へのトランスフェクションに用いられるＲＮＡｉ誘導性核酸の最終濃度としては、用いる細胞の種類や、トランスフェクション試薬の種類によって異なるため、特に限定されないが、ｓｉＲＮＡの場合、１〜２００ｎＭが好ましく、３０〜１８０ｎＭがより好ましく、５０〜１６０ｎＭが特に好ましい。ｓｉＲＮＡの濃度が上記範囲内にある場合、好適に、Ｇｉａｎｔｉｎの発現を抑制し、かつｓｉＲＮＡ自体の有する毒性を回避することができる。
【００２３】
［ｓｈＲＮＡ］
本発明のベクターは、上記した本発明のＲＮＡｉ誘導性核酸、好ましくはｓｉＲＮＡを投与対象内で発現可能とするものである。ベクターを用いることにより、長期のＲＮＡｉ効果を得ることができる。かかるベクターとしては、特に限定されないが、例えばヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ／ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ；ｓｈＲＮＡ）発現ベクターが好ましく挙げられる。
ｓｈＲＮＡとは、部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡを発現するベクターが、細胞内に導入されると、ｓｈＲＮＡを発現し、該ｓｈＲＮＡは細胞内で約２０塩基の長さに分解され、ｓｉＲＮＡ と同様にＲＮＡｉを引き起こすことができる。
かかるｓｈＲＮＡは、本発明のｓｉＲＮＡに基づいて設計することができる。例えば、配列番号１で表される塩基配列における第１番目〜第１９番目の塩基、スペーサー、配列番号２で表される塩基配列における第１番目〜第１９番目の塩基の順でこれらの配列が一本のＲＮＡ鎖に存在するように連結し、全体で４５〜６０塩基の長さとなるように設計する。このようにして設計されたｓｈＲＮＡは、細胞内で、ステムループ構造を形成した後、スペーサー部分で切断され、本発明のｓｉＲＮＡと同様に機能する。
【００２４】
本発明のベクターの投与対象は、発現ベクターの有するプロモーターに依存する。本発明のＲＮＡｉ誘導性核酸がヒトＧｉａｎｔｉｎに対するｓｉＲＮＡである場合、該ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖が、ヒトＧｉａｎｔｉｎ遺伝子に由来するものであることから、哺乳動物の細胞又は個体が好ましく、ヒトの細胞又は個体がより好ましい。
【００２５】
［分泌機能改善剤］
本発明の分泌機能改善剤は、上述したＧｉａｎｔｉｎの発現をｍＲＮＡレベルで抑制しうる、ＲＮＡｉ誘導性核酸、好ましくはＧｉａｎｔｉｎ標的ｓｉＲＮＡ、又はそれらを投与対象内で発現可能なベクター（以下、「本発明の発現ベクター」と称する。）を有効成分とするものである。前記分泌機能改善剤は、Ｇｉａｎｔｉｎの発現を抑制することにより、細胞内輸送機能の促進を介して、細胞内の分泌機能の異常を改善させるという新規の作用機序を有する。
【００２６】
本発明のＲＮＡｉ誘導性核酸、好ましくはｓｉＲＮＡ、又は本発明の発現ベクターは、それ単独で、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、投与対象に、有効量で投与することができる。
【００２７】
また、本発明の分泌機能改善剤は、他の薬剤と併用して投与してもよく、例えば、スルフォニル尿素剤と併用することにより、糖尿病治療の過程で生じやすいスルフォニル尿素剤耐性を克服することができる。
【００２８】
本発明の分泌機能改善剤の有効成分である、本発明のＲＮＡｉ誘導性核酸（ｓｉＲＮＡ等）は、公知の製造方法、例えば、化学合成により製造することもできるし、又は、適当な発現ベクターに挿入し、遺伝子工学的に製造することもできる。
また、本発明の分泌機能改善剤の有効成分として、本発明の発現ベクターを用いる場合には、例えば、本発明のｓｉＲＮＡをコードすることのできるＤＮＡを、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、又はレンチウイルスベクター等適当な遺伝子治療用ベクターに挿入することにより構築した発現ベクターを、投与対象に投与することにより、本発明のｓｉＲＮＡを投与対象内で発現させることができる。
【００２９】
本発明の分泌機能改善剤の投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
【００３０】
非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。
例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、本発明の分泌機能改善剤は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の分泌機能改善剤をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。
【００３１】
本発明の分泌機能改善剤は、これに限定されるものではないが、０．０１〜９９重量％ 、好ましくは０．１〜８０重量％の量で、有効成分を含有することができる。
本発明の分泌機能改善剤を用いる場合の投与量は、例えば、使用する有効成分の種類、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。
【００３２】
以上、本発明によれば、新しい作用機序に基づいた、ホルモン分泌や酵素の分泌低下等に起因した疾患の治療薬の開発に貢献することができる。かかる治療薬は、従来の受容体作用薬に対する耐性が生じた場合にも有用である。
更に本発明によれば、インスリン等の外界の刺激に依存する調節性分泌の異常に起因した疾患に対する治療薬に限らず、アルブミン等の血清タンパク質や細胞表面受容体等の発現異常に関与する、細胞が恒常的に行う構成性分泌の異常に起因した疾患に対する治療薬の開発に貢献することができる。構成性分泌の異常の改善薬は、未だ発見されていないため、かかる治療薬の開発が期待される。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００３４】
［実施例１］
＜Ｇｉａｎｔｉｎ標的ｓｉＲＮＡを用いたＧｉａｎｔｉｎタンパク質発現抑制＞
（Ｇｉａｎｔｉｎ標的ｓｉＲＮＡの作製）
ＧｉａｎｔｉｎのｍＲＮＡの塩基配列の中から、配列番号１で表される塩基配列を選び出し、配列番号１で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とをそれぞれ化学合成した後に２重鎖を形成させ、Ｇｉａｎｔｉｎ標的ｓｉＲＮＡとして使用した。また、コントロールｓｉＲＮＡとして、配列番号３で表される非特異的塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号４で表される非特異的塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなるＤｈａｒｍａｃｏｎ社製のｓｉＲＮＡを使用した。【００３５】
（トランスフェクション）
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標名）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社）を用い、ＨｅＬａ細胞にＧｉａｎｔｉｎ標的ｓｉＲＮＡ１４０ｎＭ（最終濃度）をトランスフェクトした。トランスフェクションの条件は、Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社の標準プロトコールに従った。
詳細には、トランスフェクションの前日に、ＨｅＬａ細胞をｓｉＲＮＡ導入時に３０〜５０％コンフルエントになるように播き、抗生物質を含まない培地で培養した。翌日、Ｇｉａｎｔｉｎ標的ｓｉＲＮＡ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸをそれぞれ、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製）で希釈し、５分間室温でインキュベーションした。次に、ＯｐｔｉＭＥＭ／ｓｉＲＮＡ混合物と、ＯｐｔｉＭＥＭ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標名）ＲＮＡｉＭＡＸ混合物を混合し、室温に放置した。この混合物を培地に加え、培養プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ中でインキュベートした。
９６時間培養後、細胞を回収した。【００３６】
回収した各細胞から得られた細胞抽出液を抗Ｇｉａｎｔｉｎ抗体及び抗γ−Ｔｕｂｕｌｉｎ抗体を用いてウエスタンブロット解析を行った。結果を図１に示す。  
図１において、左側のレーン（Ｍｏｃｋ）は、コントロールｓｉＲＮＡを用いたＭｏｃｋの結果であり、右側のレーン（ＲＮＡｉ）は、Ｇｉａｎｔｉｎ標的ｓｉＲＮＡを用いた場合の結果である。
図１に示すように、Ｇｉａｎｔｉｎ標的ｓｉＲＮＡを添加した場合に、Ｇｉａｎｔｉｎタンパク質の発現が９０％以上低下していることが確認された。一方、Ｍｏｃｋにおいては、このような効果は観察されなかった。また、両サンプルにおいて、内在性のローディングコントロールとして用いたγ−Ｔｕｂｕｌｉｎの発現には変化は観察されなかった。
これらのことから、Ｇｉａｎｔｉｎ標的ｓｉＲＮＡが、特異的にＧｉａｎｔｉｎタンパク質の発現を抑制することが確認された。【００３７】
［実施例２］
＜Ｇｉａｎｔｉｎ標的ｓｉＲＮＡによるアルカリフォスファターゼの分泌増大＞
（アルカリフォスファターゼ安定発現細胞の作製）
ＨｅＬａ細胞を用い、常法に従いアルカリフォスファターゼ安定発現細胞を作製した。
詳細には、アルカリフォスファターゼｃＤＮＡをＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）の制御下にあるｐＱＣＸＩＨベクター（クロンテック社製）に挿入し、アルカリフォスファターゼ（以下、ＡＬＰ）発現ベクターを作製した。
次いで、Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社の標準プロトコールに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標名）ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社）を用い、ＡＬＰ発現ベクターをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。ＡＬＰ発現ベクターが有するハイグロマイシン耐性遺伝子を利用して、トランスフェクション後のＨｅＬａ細胞を４００ｍｇ／ｌハイグロマイシン（ナカライ）、１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製）を含有するＤＭＥＭ（Ｄｏｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製）で１０日間培養し、ＡＬＰ安定性発現細胞を選択した。作製した細胞におけるＡＬＰの発現をウエスタンブロット解析により確認した。【００３８】
（Ｇｉａｎｔｉｎ標的ｓｉＲＮＡによるＡＬＰ分泌量の測定）
実施例１で述べたトランスフェクションの方法に従い、ＡＬＰ安定性発現細胞にＧｉａｎｔｉｎ標的ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクション７２時間後、培地交換を行い、培地交換から４８時間後の培地上清を回収した。
次いで、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＰｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ（商標名）システムを用い、上清中に分泌されたＡＬＰ（ＳＥＡＰ）及び細胞内に残存するＡＬＰの活性をそれぞれ測定した。詳細には、培地交換から４８時間後の培地上清２５μｌに、７５μｌのＤｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ（商標名）システムに付属）を加え、６５℃で３０分加熱した。その後、２５μｌのＲｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ（商標名）システムに付属）を加え、２０分室温に置いた後、ＡＬＰ活性の指標である発光をＭＴＰ−８００(コロナ社製)にて測定した。各サンプルにつき、３連の測定を行い、その平均値及び標準誤差を計算した。
細胞内に残存するＡＬＰの活性は、培地交換から４８時間後の細胞を１００μｌの０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００(Ｓｉｇｍａ社製)を含むＰＢＳ(Ｓｉｇｍａ社製)に溶解した後、その溶解液中の２μｌに、９８μｌのＤｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ（商標名）システムに付属）を加えた。６５℃処理以降は、上記の上清の測定法と同様の方法でＡＬＰの活性を測定した。Ｇｉａｎｔｉｎ標的ｓｉＲＮＡ処理細胞（ＲＮＡｉ）及びコントロールｓｉＲＮＡ処理細胞（Ｍｏｃｋ）それぞれにおけるＡＬＰ分泌量を上清のＡＬＰ活性と細胞内に残存するＡＬＰ活性との比（上清のＡＬＰ活性／細胞内に残存するＡＬＰ活性）で表した。培地交換から４８時間後の結果を図２に示す。【００３９】
図２中、Ｍｏｃｋは、コントロールｓｉＲＮＡ処理細胞を示し、ＲＮＡｉは、Ｇｉａｎｔｉｎ標的ｓｉＲＮＡ処理細胞を示す。また、横軸は、上述のようにして算出したＡＬＰ分泌量を示す。
図２に示すように、Ｇｉａｎｔｉｎ標的ｓｉＲＮＡを添加した場合に、Ｍｏｃｋと比較してＡＬＰの分泌量が２倍以上促進されていることが確認された。【００４０】
［実施例３］
＜Ｇｉａｎｔｉｎ標的ｓｉＲＮＡによる水疱性口内炎ウィルス由来膜タンパク質ＶＳＶＧ（ｔｓＯ４５）の細胞膜表面露出量の増大＞
実施例２において確認されたＧｉａｎｔｉｎ標的ｓｉＲＮＡによる分泌促進効果を、水疱性口内炎ウィルス由来膜タンパク質ＶＳＶＧ（ｔｓＯ４５）のＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）融合タンパク質を用いて確認した。
水疱性口内炎ウィルス由来膜タンパク質（ＶＳＶＧ）の温度感受性変異体ＶＳＶＧ（ｔｓＯ４５）は、培養温度を４０℃にするとミスフォールディングにより小胞体に滞留したままになるが、培養温度を３２℃に下げるとすぐにフォールディングが再開され、小胞体から輸出されることが分かっている。
実施例１で述べたトランスフェクションの方法に従い、Ｇｉａｎｔｉｎ標的ｓｉＲＮＡ又はコントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、７２時間培養した。
次いで、ＶＳＶＧ（ｔｓＯ４５）−ＧＦＰをＩｎｖｉｔｏｇｅｎ社の標準プロトコールに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標名）ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社）を用い、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション５時間後、細胞を４０℃で一晩培養し、ＶＳＶＧ（ｔｓＯ４５）−ＧＦＰタンパク質を小胞体に滞留させた。次いで、細胞を３２℃で２時間培養した後、蛍光顕微鏡を用いて、細胞膜表面におけるＶＳＶＧ（ｔｓＯ４５）の蛍光強度を測定した。Ｇｉａｎｔｉｎ標的ｓｉＲＮＡ処理細胞（ＲＮＡｉ）及びコントロールｓｉＲＮＡ処理細胞（Ｍｏｃｋ）それぞれにおけるＶＳＶＧ（ｔｓＯ４５）の細胞膜表面への局在の割合を細胞膜表面における蛍光強度と細胞全体における蛍光強度との比（細胞膜表面における蛍光強度／細胞全体における蛍光強度）で表した。結果を図３に示す。【００４１】
図３中、Ｍｏｃｋは、コントロールｓｉＲＮＡ処理細胞を示し、ＲＮＡｉは、Ｇｉａｎｔｉｎ標的ｓｉＲＮＡ処理細胞を示す。また、横軸は、上述のようにして算出したＶＳＶＧ（ｔｓＯ４５）の細胞膜表面における局在の割合を示す。
図３に示すように、Ｇｉａｎｔｉｎ標的ｓｉＲＮＡを添加した場合に、Ｍｏｃｋと比較してＶＳＶＧ（ｔｓＯ４５）の細胞膜表面への局在が優位に促進されていることが確認された。【００４２】
以上の結果から、本発明によれば、Ｇｉａｎｔｉｎの発現を抑制することにより、細胞内で産生されたタンパク質等の分泌を促進することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、ホルモンや酵素等の分泌異常に起因した疾患を対象とする医薬品の分野において利用が可能である。
【図２】
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【図３】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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