(57)【要約】  本発明は、安定化された二次構造をもつペプチドを提供すること等を課題とする。  本発明は、架橋構造により安定化された二次構造を有するペプチドであって、以下の式(Ｉ)で表される特殊アミノ酸と、側鎖にスルファニル基を有するアミノ酸との組を少なくとも１つを含み、【化１】2012074129.tif 000029〔式中、（Ａ）は、単結合、又は主鎖の原子数が１−１０である連結基を示し；（Ｂ）は、少なくとも一つのπ結合を含む基を示し；（Ｃ）は、水素原子、又は置換基で置換されていてもよいアルキル基を示し；Ｘは、スルファニル基による置換反応で置換されうる基を示す。〕  前記特殊アミノ酸残基の側鎖と、前記スルファニル基とのチオエーテル結合による架橋構造が形成されている、ペプチドを提供する。
2012074129.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋構造により安定化された二次構造を有するペプチドであって、
以下の式(Ｉ)で表される特殊アミノ酸と、側鎖にスルファニル基を有するアミノ酸との組を少なくとも１つを含み、
【化１】
2012074129.tif 000022
〔式中、（Ａ）は、単結合、又は主鎖の原子数が１−１０である連結基を示し；（Ｂ）は、少なくとも一つのπ結合を含む基を示し；（Ｃ）は、水素原子、又は置換基で置換されていてもよいアルキル基を示し；Ｘは、スルファニル基による置換反応で置換されうる基を示す。〕
前記特殊アミノ酸残基の側鎖と、前記スルファニル基とのチオエーテル結合による架橋構造が形成されている、ペプチド。
【請求項２】
前記式（Ｉ）において、
（Ａ）は、単結合；置換基で置換されていてもよい、炭素数１−１０のアルキレン基、炭素数２−１０のアルケニレン基、又は炭素数２−１０のアルキニレン基；主鎖の１−２個の炭素原子が、酸素原子、窒素原子、若しくは硫黄原子に置換された、置換基で置換されていてもよい、主鎖の原子数が１０以下のアルキレン基、アルケニレン基、及びアルキニレン基からなる群より選択され、
（Ｂ）は、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｃ＝Ｃ−、−Ａｒ−、−Ａｒ−Ａｒ−、−Ａｒ−Ｃ≡Ｃ−、−Ａｒ−Ｃ＝Ｃ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ａｒ−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ａｒ−Ｃ（Ｏ）−からなる群より選択され、
（Ｃ）は、水素、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、及びペンチル基からなる群より選択され、
Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＯＳＯ2Ｍｅ、トシル基、ノシル基、−ＯＳＯ2−Ａｒ−Ｒ（式中、ＲはＣＨ3、ＮＯ2、ＣＦ3及びＨからなる群より選択される基を表す。）からなる群より選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記式（Ｉ）の特殊アミノ酸が、以下の式（ＩＩ）〜（ＩＶ）のいずれかで示される、
【化２】
2012074129.tif 000023
〔式中、ｍは１〜１０から選択される整数を示し、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＯＳＯ2Ｍｅ、トシル基、ノシル基、−ＯＳＯ2−Ａｒ−Ｒ（式中、ＲはＣＨ3、ＮＯ2、ＣＦ3及びＨからなる群より選択される基を表す。）からなる群より選択される。〕
請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記スルファニル基を有するアミノ酸が、システイン、並びに以下の式（Ｖ）及び（ＶＩ）で表されるシステインアナログからなる群より選択される、請求項１から３のいずれか１項に記載のペプチド。
【化３】
2012074129.tif 000024
【請求項５】
前記特殊アミノ酸残基と、前記側鎖にスルファニル基を有するアミノ酸残基とが、各組において、２、３、６又は１０アミノ酸残基隔てて配置されている、請求項１から４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
架橋構造により安定化された二次構造を有するペプチドの製造方法であって、
（i）スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸、および、以下の式（I）
【化４】
2012074129.tif 000025
〔式中、（Ａ）は、単結合、又は主鎖の原子数が１−１０である連結基を示し；（Ｂ）は、少なくとも一つのπ結合を含む基を示し；（Ｃ）は、水素原子、又は置換基で置換されていてもよいアルキル基を示し；Ｘは、スルファニル基による置換反応で置換されうる基を示す。〕
で表される特殊アミノ酸の組が、少なくとも１つ分子内に配置された特殊ペプチドを翻訳によって合成する工程；及び
（ii）前記各組において前記スルファニル基と式（I）の特殊アミノ酸の側鎖をチオエーテル結合させて架橋構造を形成する工程、
を含む前記方法。
【請求項７】
前記スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸と式（I)の特殊アミノ酸が、各組において、２、３、６、または１０アミノ酸残基隔てて配置される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記(i)の翻訳合成工程が、式（I)の特殊アミノ酸をtRNAに連結して得られるアミノアシルtRNAを利用して、該特殊アミノ酸をコードする改変コドンを有する鋳型mRNAを翻訳することを含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸が改変コドンでコードされる特殊アミノ酸であり、前記(i)の翻訳合成工程が、式（I)の特殊アミノ酸及び該スルファニル基を側鎖に持つ特殊アミノ酸をそれぞれtRNAに連結して得られるアミノアシルtRNAを利用して、それぞれの特殊アミノ酸をコードする改変コドンを有する鋳型mRNAを翻訳することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アミノアシルtRNAは、アシルtRNA合成酵素様活性を持つRNA触媒を用いて特殊アミノ酸をtRNAに連結して得られたものである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記式（Ｉ）で示される特殊アミノ酸が、以下の式（ＩＩ）〜（ＩＶ）のいずれかで示される、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【化５】
2012074129.tif 000026
【請求項１２】
前記スルファニル基を有するアミノ酸が、システイン、並びに以下の式（Ｖ）及び（ＶＩ）で示されるシステインアナログからなる群より選択される、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【化６】
2012074129.tif 000027
【請求項１３】
請求項１から５のいずれか１項に記載のペプチドを２種以上含む、ペプチドライブラリー。
【請求項１４】
前記各ペプチドが、それをコードするmRNAと連結されている、請求項１３に記載のペプチドライブラリー。
【請求項１５】
請求項１３に記載のペプチドライブラリーを構築する方法であって：
（i）ランダムなアミノ酸配列をコードするRNA中に、スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸を指定するコドン、および、請求項１に記載の式（I)で表される特殊アミノ酸を指定するコドンの組を少なくとも一つ含み、各組においてスルファニル基を側鎖に持つアミノ酸を指定するコドンと式（I)の特殊アミノ酸を指定するコドンが、２、３、６、または１０アミノ酸単位隔てて配置されているmRNAのライブラリーを調製する工程；
（ii)前記特殊アミノ酸を連結したtRNAを含む無細胞翻訳系で前記mRNAを翻訳して、ランダム配列中に前記特殊アミノ酸が配置されたペプチドの集合体を得る工程；及び
(iii)各ペプチドにおいてスルファニル基と式（I)の特殊アミノ酸の側鎖を結合させて架橋構造を形成する工程、
を含む方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載のペプチドライブラリーを構築する方法であって：
請求項１５に記載の工程(i)において、さらに、mRNAの３’末端にピューロマイシンを結合させ、ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを得る工程；、
工程(ii)において、前記ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを無細胞翻訳系で発現させ、ランダム配列中に前記特殊アミノ酸が配置されたペプチド−mRNA複合体を得る工程；及び
工程(iii)を行う工程、
を含む方法。
【請求項１７】
式（Ｉ）の特殊アミノ酸を指定する改変コドンがAUGコドンであり、mRNAランダム配列が、NNCまたはNNU配列（NはA,U,G,Cのいずれか一つの塩基を表す。）のいずれかのトリプレットの繰り返しからなる、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
以下の式(Ｉ)で表される特殊アミノ酸。
【化７】
2012074129.tif 000028
〔式中、（Ａ）は、単結合、又は主鎖の原子数が１−１０である連結基を示し；（Ｂ）は、少なくとも１つの炭素原子間の二重結合を含む基、少なくとも１つの炭素原子間の三重結合を含む基、又は少なくとも１つの芳香環を含む基を示し；（Ｃ）は、水素原子又は炭素数が１−３である置換基を有していてもよいアルキル基を示し；Ｘは、スルファニル基による置換反応で置換されうる基を示す。〕
【請求項１９】
請求項１３又は１４に記載のペプチドライブラリーから標的タンパク質に結合するペプチドを選択する方法であって、
(i)ペプチドライブラリーを標的タンパク質に接触させ、インキュベートする工程；及び
(ii)標的タンパク質に結合するペプチド分子を選択する工程、
を含む方法。
【請求項２０】
請求項１３又は１４に記載のペプチドライブラリーから標的タンパク質の分子間相互作用に対する阻害活性を有するペプチドを選択する方法であって、
(ア)請求項１９に記載の工程(i)及び(ii)を含む、標的タンパク質に結合するペプチドを選択する一次スクリーニング、および
(イ)一次スクリーニングで選択されたペプチドの標的タンパク質の分子間相互作用に対する阻害活性を評価し、前記ペプチドが標的タンパク質の分子間相互作用に対する阻害活性を有するペプチドであることを決定する二次スクリーニング、
を含む方法。
【請求項２１】
標的タンパク質に結合するペプチドの製造方法であって：
(i)請求項１４に記載のペプチドライブラリーを標的タンパク質に接触させ、インキュベートする工程；
(ii)標的タンパク質に結合するペプチド−mRNA複合体を選択する工程；
(iii)選択されたペプチド−mRNA複合体のmRNAを増幅し、ペプチド−mRNA複合体を得る工程；
(iv)(i)〜(iii)を1回以上繰り返して、親和性の高いペプチド−mRNA複合体を濃縮する工程；及び
(v)(iv)で濃縮されたペプチド−mRNA複合体のmRNAからペプチドを発現させる工程、
を含む方法。
【請求項２２】
標的タンパク質がアポトーシスを抑制する分子である、請求項１９〜２０のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特殊アミノ酸の導入により誘導される二次構造を固定したペプチド分子、その合成、そのようなペプチド分子の集合体からなるライブラリーを構築する方法、構築されたライブラリー、並びにライブラリーから活性ペプチドをスクリーニングする方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内分子間の相互作用に対する阻害分子種として、αヘリックス二次構造を有するペプチドが主に３つの点から注目されている。１つに、その相互作用にはαヘリックスを介したものが多く見受けられるためにその構造を起点とした阻害剤の開発が見込めること、２つに、ヘリックス構造が形成されたペプチドは細胞膜透過性を有する可能性が高いことから細胞内タンパクを標的としたペプチド創薬が展開できること、３つに、ペプチドでありながらもプロテアーゼへの安定性を獲得していることから一般のペプチドよりも長い血中半減期をもつことが期待できることである。しかし、αヘリックスを構成するアミノ酸配列情報に基づいて単純にペプチドを調製したのではこれらの優位性を獲得できない場合が多い。短鎖ペプチドでは３次元構造を有したタンパク質と異なりヘリックスを取り巻く環境が溶媒に曝露されているが故にその影響を強く受けることから、構造が維持できないからである。その解決策として、このヘリックス構造を形成している特異的な水素結合を補助する目的で適切な位置のアミノ酸側鎖同士を共有結合で架橋することよって、水溶液中であってもヘリックス構造を維持させるあるいは固定させる数多くの試みがなされてきた。しかしながら、このようなアプローチの多くは、ペプチド鎖に組み込まれた人工アミノ酸に対し化学触媒を用いて共有結合を形成させるため、ペプチド合成も含め全行程を化学合成に依存する。したがって、αヘリックス二次構造を固定した特殊ペプチドに生理活性を求める場合の多くは、既存のタンパク質のαへリックス部位の配列をもとに、デザインあるいは低多様性のフォーカスライブラリーを構築し、個々のペプチドの活性を評価することで薬剤候補ペプチドを見いだしてきた。【０００３】
一方、特定の標的に結合するペプチド性の分子を取得する際には、ランダムなペプチドライブラリーからスクリーニングを行う手法が広く使われている。最も一般的な手法はファージを用いるペプチドディスプレイ方法であるが、近年、大腸菌等の生物種を介さないペプチドディスプレイ法が用いられるようになった。すなわち、翻訳を利用したリボソームディスプレイ法やmRNAディスプレイ法などの各種in vitroディスプレイ法は、１本のチューブ内で短期間に高多様性のライブラリーを構築・スクリーニングできる点で優れている。In vitroディスプレイ法とは、表現型（phenotype）とその配列をコードした遺伝型（genotype）を非共有結合あるいは共有結合で連結することで表現型を遺伝型にディスプレイし、試験管に再構築された複製システムを用いて活性種を濃縮、増幅（セレクション）することを可能にするシステムを指す。本システムの最大の特徴は、原核・真核生命体を媒体としない点であり、このために非常に大きな多様性をもったライブラリーから、高活性の生理物質を単離することができる。その典型的な比較例としては、大腸菌を複製媒体とするファージディスプレイでは10の７乗の多様性ライブラリーのセレクションが可能であるが、 in vitroディスプレイでは10の12乗に及ぶ多様性ライブラリーの探索が可能となる。in vitroディスプレイには、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、RaPIDディスプレイ(未公開国際特許出願であるPCT/JP2010/68549)等がある。その一例として、mRNAディスプレイを例に挙げ下記に説明する。【０００４】
mRNAディスプレイ法は、ポリペプチドとその鋳型であるmRNAを結合させることにより、ポリペプチドのアミノ酸配列と核酸配列を対応付ける技術である。そのために、アシル化tRNAの末端アナログであるピューロマイシンを適当なリンカーを介してmRNAの３’末端に結合させ、これを翻訳反応に加えることで、ピューロマイシンがリボソームのA部位に入り込み、伸長中のペプチドと共有結合を形成し、結果として翻訳産物であるペプチド分子がピューロマイシンを介してmRNAと連結する（特許文献１〜３、非特許文献１、２）。【０００５】
このようにIn vitroディスプレイでは、10の12乗もの多様性を持つペプチドライブラリーをスクリーニングすることが可能であるが、生体の機能を利用してペプチドライブラリーを構築するために、従来はタンパク質性アミノ酸のみから構成されているペプチドライブラリーしか構築されていなかった。この構成要素の低さを乗り越え、天然にはない新たな機能をアミノ酸構造中に組み込むことで、通常では不安定なαヘリックス二次構造を安定化できる新規な骨格をもったペプチドライブラリーを構築してスクリーニングを行うことができれば、天然に存在するような単純なペプチド鎖では達成できない高い阻害能や選択性、安定性等を示すペプチドを獲得することが可能になると期待できる。【０００６】
近年、「遺伝暗号の拡張」や「遺伝暗号のリプログラミング」と呼ばれる技術の発展に伴い、実際にファージディスプレイを含む各種ディスプレイ法によって特殊なアミノ酸を有するペプチドライブラリーを調製・スクリーニングすることが可能となってきた。【０００７】
遺伝暗号の拡張では、天然の翻訳系でアミノ酸の指定に使われていない終止コドンや人工４塩基コドンを利用し、それらのコドンに特殊アミノ酸を割り当てることで、特殊アミノ酸を含むタンパク質・ペプチドの合成を可能にした。しかし、停止コドンや利用可能な４塩基コドンの数に限りがあるため、同時に利用可能な特殊アミノ酸の数に上限があった(実質３種類以下)。【０００８】
αヘリックスの安定化を目的とした架橋構造が導入されたペプチドに関する研究も精力的におこなわれている。現在、主としてアミド結合、ジスルフィド結合、そして、閉環メタセシス反応によるアルケンの形成による方法が報告されている（非特許文献３）。これらの共有結合の導入によりヘリックス構造が誘起されるのだが、一般に生体内での安定性に問題がある。すなわち、アミド構造やジスルフィド構造では、プロテアーゼや還元条件により容易に切断されてしまうため、阻害剤としての利用には不利であった。その点を克服したのがアルケンの形成による方法であり、この架橋構造が導入されたペプチドは生体内において活性を有することが分っている（非特許文献４）。現在、このアルケンの形成による架橋構造を用いた生理活性ペプチドの開発がおこなわれている。【０００９】
しかし、既知のアミノ酸配列から化学合成によってフォーカスライブラリーを構築した後、生理活性が失われない架橋構造位置を精査していく必要があることから、その開発には多大な労力を要する。さらに、上記のようなデザインによるフォーカスライブラリーの探索では、必ずしも得られたペプチド配列が最善の配列であり得る確証はない。残念ながら、上記のアルケン形成による架橋反応は、化学触媒を用いるため、in vitroディスプレイ法に適応する事が極めて難しい。すなわち、翻訳反応に必要なリボソームやタンパク質、ATP等の因子が共存した状態でアルケン形成を行わねばならないためにその反応効率の低下が危惧され、高品質のライブラリーを構築する事が困難である。したがって、より広範囲な標的に対し、αへリックス構造を固定させた生理活性特殊ペプチドを発見するためには、in vitroディスプレイ法に適用可能な架橋法の開発が不可欠である。その架橋法は、翻訳系の条件下で架橋反応が迅速かつ高選択的に起き、またその形成された架橋構造は生体内で容易に分解されない構造でなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第３６８３２８２号広報（国際公開ＷＯ９８／１６６３６）
【特許文献２】特許第３６８３９０２号広報（国際公開ＷＯ９８／３１７００）
【特許文献３】特許第３６９２５４２号広報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Roberts et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 1997, 94, 12297-12302、
【非特許文献２】Nemoto et al., FEBS Lett., 1997, 414, 405-408、
【非特許文献３】Taylor, W., J., Baum, J.et al., J. Am. Chem. Soc., Vol. 116, p.6431-6432 (1994), Schultz, P.G. et al., J. Am. Chem. Soc., Vol. 113, p.9391-9392 (1991), Phelan, J. C. et al., J. Am. Chem. Soc., Vol. 119, p.455-460 (1197), Grubbs, R.H., Blackwell, H. E. ,Angew. Chem. Int. Ed. Vol. 37, p.3281-3284 (1998)
【非特許文献４】Verdine, G. L., Korsmeyer, S. J. et al., Science, Vol 305, p.1466-1470 (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、翻訳合成条件下で架橋構造形成が自発的に起きるように設計された特殊アミノ酸をペプチド鎖に翻訳導入することで得られる、安定化された二次構造をもつペプチドを提供すること等を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らにより近年開発された遺伝暗号のリプログラミングによる特殊ペプチド合成技術を利用して、スルファニル基（-SH基）を側鎖にもつシステインあるいはその類縁体と反応し得る側鎖をもつ特殊ペプチドを合成し、目的の二次構造を固定した特殊ペプチドを翻訳合成する（図１）。
本発明について詳述する前に、以下ではまず背景技術となる「遺伝暗号のリプログラミング」について概説する。【００１４】
生体の翻訳では、mRNAの３つの塩基の並び（トリプレット）が一つのコドンとして一つのアミノ酸を指定しており、その並びに対応するペプチドが合成される。このとき、コドンとアミノ酸との対応付けは、以下の２段階で行われる。(i) tRNA の末端にアミノアシル tRNA 合成酵素（aminoacyl-tRNA synthetase：ＡＲＳ）が対応するアミノ酸を連結する。 (ii) tRNA のアンチコドンが対応する mRNA のコドンと対合することにより、mRNA の情報に沿って tRNA 上のアミノ酸が重合されペプチドが合成される。
こうしたコドンとアンチコドンとの対応関係は、ほとんど普遍的に決定されており、６４種類のコドンそれぞれに、２０種類のアミノ酸のいずれか一つが割り当てられている。普遍遺伝暗号表を以下に示す。
【表１】
2012074129.tif 000003
【００１５】
しかしながら、再構成型の翻訳系と人工アミノアシル化RNA触媒フレキシザイムを利用することで、この遺伝暗号をリプログラミングすることができる。【００１６】
再構成型の翻訳系とは、リボソーム、翻訳因子、tRNA、アミノ酸、およびATPやGTP等のエネルギーソースなど、タンパク質やペプチドの翻訳合成に関わる因子をそれぞれ単離・精製し、混ぜ合わせた翻訳系である。例えば、大腸菌のリボソームを用いる系として次の文献に記載された技術が公知である：H. F. Kung, B. Redfield, B. V. Treadwell, B. Eskin, C. Spears and H. Weissbach (1977) "DNA-directed in vitro synthesis of beta-galactosidase. Studies with purified factors" The Journal of Biological Chemistry Vol. 252, No. 19, 68896894 ; M. C. Gonza, C. Cunningham and R. M. Green (1985) "Isolation and point of action of a factor from Escherichia coli required to reconstruct translation" Proceeding of National Academy of Sciences of the United States of AmericaVol. 82, 1648-1652 ; M. Y. Pavlov and M. Ehrenberg (1996) "Rate of translation of natural mRNAs in an optimized in Vitro system" Archives of Biochemistry and Biophysics Vol. 328, No. 1, 9-16 ; Y. Shimizu, A. Inoue, Y. Tomari, T. Suzuki, T. Yokogawa, K. Nishikawa and T. Ueda (2001) "Cell-free translation reconstituted with purified components" Nature Biotechnology Vol. 19, No. 8, 751-755；H. Ohashi, Y. Shimizu, B. W. Ying, and T. Ueda (2007) “Efficient protein selection based on ribosome display system with purified components” Biochemical and Biophysical Research Communications Vol. 352, No. 1, 270-276。【００１７】
一方、フレキシザイム（flexizyme）は、任意のtRNAに任意のアミノ酸またはヒドロキシ酸を連結（アシル化）することのできる人工RNA触媒（アシルtRNA合成酵素様活性を持つRNA触媒）である。例えば、以下の文献に記載されたものが公知である：H. Murakami, H. Saito, and H. Suga, (2003), Chemistry & Biology, Vol. 10, 655-662； H. Murakami, D. Kourouklis, and H. Suga, (2003), Chemistry & Biology, Vol. 10, 1077-1084； H. Murakami, A. Ohta, H. Ashigai, H. Suga (2006) Nature Methods 3, 357-359 "The flexizyme system: a highly flexible tRNA aminoacylation tool for the synthesis of nonnatural peptides"；N. Niwa, Y. Yamagishi, H. Murakami, H. Suga (2009) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19, 3892-3894 "A flexizyme that selectively charges amino acids activated by a water-friendly leaving group"；及びWO2007/066627「多目的化アシル化触媒とその用途」）。フレキシザイムは、原型のフレキシザイム（Fx）、及び、これから改変されたジニトロベンジルフレキシザイム（dFx）、エンハンスドフレキシザイム（eFx）、アミノフレキシザイム（aFx）等の呼称でも知られる。【００１８】
あるいは、任意のtRNAに任意のアミノ酸を連結可能な方法の変法として、化学的アミノアシル化等の他の方法を用いることもできる。【００１９】
遺伝暗号のリプログラミングには、翻訳系の構成因子を目的に合わせて自由に取り除き、必要な成分だけを再構成してできる翻訳系を利用する。例えば、特定のアミノ酸を除去した翻訳系を再構成すると、当該アミノ酸に対応するコドンが空きコドンになる。続いて、フレキシザイム（あるいは化学的アミノアシル化、あるいは変異タンパク質酵素を用いたアミノアシル化）を利用して、その空きコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAに特殊なアミノ酸を連結し、これを加えて翻訳を行う。これによって、特殊なアミノ酸がそのコドンでコードされることになり、除去したアミノ酸の代わりに特殊なアミノ酸が導入されたペプチドが翻訳される。【００２０】
本発明における限定を意図しない一つの態様として、遺伝暗号のリプログラミング技術により、例えば、側鎖にプロパルギルクロリド構造を有する特殊なペプチドを合成する。このとき、ペプチド中に、上記側鎖構造を持つ残基の位置から適切な残基数を挟んでシステイン残基を配置しておくと、翻訳後に自発的にそのスルファニル基によるプロパルギル位上での置換反応が進行し、ペプチド側鎖間にチオエーテル結合による架橋構造が形成される。すなわち、求電子剤としてはプロパルギルクロリド構造を、求核剤としてはスルファニル基という結合形成が可能な一組の構造をアミノ酸内へ組み込むことにより、その間に結合を形成させ架橋構造を構築することができる。この架橋構造がヘリックス形成の鍵となる位置特異的な水素結合を補助してヘリックス構造を誘導させ、ペプチドに所望の二次構造を与える。このような結合形成が可能な分子構造の対は、プロパルギルクロリド構造とシステインに限定されない。詳細は後述する。
さらに、本発明では、上記の技術を利用して特殊なペプチドライブラリーを構築し、そこから生体内分子間相互作用の阻害剤を獲得する技術を提供する。
本発明の要旨は以下の通りである。
〔１〕架橋構造により安定化された二次構造を有するペプチドであって、
以下の式(Ｉ)で表される特殊アミノ酸と、側鎖にスルファニル基を有するアミノ酸との組を少なくとも１つを含み、
【化１】
2012074129.tif 000004
〔式中、（Ａ）は、単結合、又は主鎖の原子数が１−１０である連結基を示し；（Ｂ）は、少なくとも一つのπ結合を含む基を示し；（Ｃ）は、水素原子、又は置換基で置換されていてもよいアルキル基を示し；Ｘは、スルファニル基による置換反応で置換されうる基を示す。〕
前記特殊アミノ酸残基の側鎖と、前記スルファニル基とのチオエーテル結合による架橋構造が形成されている、ペプチド；
〔２〕前記式（Ｉ）において、
（Ａ）は、単結合；置換基で置換されていてもよい、炭素数１−１０のアルキレン基、炭素数２−１０のアルケニレン基、又は炭素数２−１０のアルキニレン基；主鎖の１−２個の炭素原子が、酸素原子、窒素原子、若しくは硫黄原子に置換された、置換基で置換されていてもよい、主鎖の原子数が１０以下のアルキレン基、アルケニレン基、及びアルキニレン基からなる群より選択され、
（Ｂ）は、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｃ＝Ｃ−、−Ａｒ−、−Ａｒ−Ａｒ−、−Ａｒ−Ｃ≡Ｃ−、−Ａｒ−Ｃ＝Ｃ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ａｒ−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ａｒ−Ｃ（Ｏ）−からなる群より選択され、
（Ｃ）は、水素、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、及びペンチル基からなる群より選択され、
Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＯＳＯ2Ｍｅ、トシル基、ノシル基、−ＯＳＯ2−Ａｒ−Ｒ（式中、ＲはＣＨ3、ＮＯ2、ＣＦ3及びＨからなる群より選択される基を表す。）からなる
群より選択される、上記〔１〕に記載のペプチド；
〔３〕前記式（Ｉ）の特殊アミノ酸が、以下の式（ＩＩ）〜（ＩＶ）のいずれかで示される、
【化２】
2012074129.tif 000005
〔式中、ｍは１〜１０から選択される整数を示し、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＯＳＯ2Ｍｅ、トシル基、ノシル基、−ＯＳＯ2−Ａｒ−Ｒ（式中、ＲはＣＨ3、ＮＯ2、ＣＦ3及びＨからなる群より選択される基を表す。）からなる群より選択される。〕
上記〔１〕又は〔２〕に記載のペプチド；
〔４〕前記スルファニル基を有するアミノ酸が、システイン、並びに以下の式（Ｖ）及び（ＶＩ）で表されるシステインアナログからなる群より選択される、上記〔１〕から〔３〕のいずれか１項に記載のペプチド；
【化３】
2012074129.tif 000006
〔５〕前記特殊アミノ酸残基と、前記側鎖にスルファニル基を有するアミノ酸残基とが、各組において、２、３、６又は１０アミノ酸残基隔てて配置されている、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載のペプチド；
〔６〕架橋構造により安定化された二次構造を有するペプチドの製造方法であって、
（i）スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸、および、以下の式（I）
【化４】
2012074129.tif 000007
〔式中、（Ａ）は、単結合、又は主鎖の原子数が１−１０である連結基を示し；（Ｂ）は、少なくとも一つのπ結合を含む基を示し；（Ｃ）は、水素原子、又は置換基で置換されていてもよいアルキル基を示し；Ｘは、スルファニル基による置換反応で置換されうる基を示す。〕
で表される特殊アミノ酸の組が、少なくとも１つ分子内に配置された特殊ペプチドを翻訳によって合成する工程；及び
（ii）前記各組において前記スルファニル基と式（I）の特殊アミノ酸の側鎖をチオエーテル結合させて架橋構造を形成する工程、
を含む前記方法；
〔７〕前記スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸と式（I)の特殊アミノ酸が、各組において、２、３、６、または１０アミノ酸残基隔てて配置される、上記〔６〕に記載の方法；
〔８〕前記(i)の翻訳合成工程が、式（I)の特殊アミノ酸をtRNAに連結して得られるアミノアシルtRNAを利用して、該特殊アミノ酸をコードする改変コドンを有する鋳型mRNAを翻訳することを含む、上記〔６〕又は〔７〕に記載の方法；
〔９〕前記スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸が改変コドンでコードされる特殊アミノ酸であり、前記(i)の翻訳合成工程が、式（I)の特殊アミノ酸及び該スルファニル基を側鎖に持つ特殊アミノ酸をそれぞれtRNAに連結して得られるアミノアシルtRNAを利用して、それぞれの特殊アミノ酸をコードする改変コドンを有する鋳型mRNAを翻訳することを含む、上記〔８〕に記載の方法；
〔１０〕前記アミノアシルtRNAは、アシルtRNA合成酵素様活性を持つRNA触媒を用いて特殊アミノ酸をtRNAに連結して得られたものである、上記〔８〕または〔９〕に記載の方法；
〔１１〕前記式（Ｉ）で示される特殊アミノ酸が、以下の式（ＩＩ）〜（ＩＶ）のいずれかで示される、上記〔６〕〜〔１０〕のいずれか１項に記載の方法；
【化５】
2012074129.tif 000008
〔１２〕前記スルファニル基を有するアミノ酸が、システイン、並びに以下の式（Ｖ）及び（ＶＩ）で示されるシステインアナログからなる群より選択される、上記〔６〕〜〔１１〕のいずれか１項に記載の方法；
【化６】
2012074129.tif 000009
〔１３〕上記〔１〕から〔５〕のいずれか１項に記載のペプチドを２種以上含む、ペプチドライブラリー；
〔１４〕前記各ペプチドが、それをコードするmRNAと連結されている、上記〔１３〕に記載のペプチドライブラリー；
〔１５〕上記〔１３〕に記載のペプチドライブラリーを構築する方法であって：
（i）ランダムなアミノ酸配列をコードするRNA中に、スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸を指定するコドン、および、上記〔１〕に記載の式（I)で表される特殊アミノ酸を指定するコドンの組を少なくとも一つ含み、各組においてスルファニル基を側鎖に持つアミノ酸を指定するコドンと式（I)の特殊アミノ酸を指定するコドンが、２、３、６、または１０アミノ酸単位隔てて配置されているmRNAのライブラリーを調製する工程；
（ii)前記特殊アミノ酸を連結したtRNAを含む無細胞翻訳系で前記mRNAを翻訳して、ランダム配列中に前記特殊アミノ酸が配置されたペプチドの集合体を得る工程；及び
(iii)各ペプチドにおいてスルファニル基と式（I)の特殊アミノ酸の側鎖を結合させて架橋構造を形成する工程、
を含む方法；
〔１６〕上記〔１４〕に記載のペプチドライブラリーを構築する方法であって：
上記〔１５〕に記載の工程(i)において、さらに、mRNAの３’末端にピューロマイシン
を結合させ、ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを得る工程；、
工程(ii)において、前記ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを無細胞翻訳系で発現させ、ランダム配列中に前記特殊アミノ酸が配置されたペプチド−mRNA複合体を得る工程；及び
工程(iii)を行う工程、
を含む方法；
〔１７〕式（Ｉ）の特殊アミノ酸を指定する改変コドンがAUGコドンであり、mRNAランダム配列が、NNCまたはNNU配列（NはA,U,G,Cのいずれか一つの塩基を表す。）のいずれかのトリプレットの繰り返しからなる、上記〔１５〕又は〔１６〕に記載の方法；
〔１８〕以下の式(Ｉ)で表される特殊アミノ酸；
【化７】
2012074129.tif 000010
〔式中、（Ａ）は、単結合、又は主鎖の原子数が１−１０である連結基を示し；（Ｂ）は、少なくとも１つの炭素原子間の二重結合を含む基、少なくとも１つの炭素原子間の三重結合を含む基、又は少なくとも１つの芳香環を含む基を示し；（Ｃ）は、水素原子又は炭素数が１−３である置換基を有していてもよいアルキル基を示し；Ｘは、スルファニル基による置換反応で置換されうる基を示す。〕
〔１９〕上記〔１３〕又は〔１４〕に記載のペプチドライブラリーから標的タンパク質に結合するペプチドを選択する方法であって、
(i)ペプチドライブラリーを標的タンパク質に接触させ、インキュベートする工程；及び
(ii)標的タンパク質に結合するペプチド分子を選択する工程、
を含む方法；
〔２０〕上記〔１３〕又は〔１４〕に記載のペプチドライブラリーから標的タンパク質の分子間相互作用に対する阻害活性を有するペプチドを選択する方法であって、
(ア)上記〔１９〕に記載の工程(i)及び(ii)を含む、標的タンパク質に結合するペプチドを選択する一次スクリーニング、および
(イ)一次スクリーニングで選択されたペプチドの標的タンパク質の分子間相互作用に対する阻害活性を評価し、前記ペプチドが標的タンパク質の分子間相互作用に対する阻害活性を有するペプチドであることを決定する二次スクリーニング、
を含む方法；
〔２１〕標的タンパク質に結合するペプチドの製造方法であって：
(i)上記〔１４〕に記載のペプチドライブラリーを標的タンパク質に接触させ、インキュベートする工程；
(ii)標的タンパク質に結合するペプチド−mRNA複合体を選択する工程；
(iii)選択されたペプチド−mRNA複合体のmRNAを増幅し、ペプチド−mRNA複合体を得る工程；
(iv)(i)〜(iii)を1回以上繰り返して、親和性の高いペプチド−mRNA複合体を濃縮する工程；及び
(v)(iv)で濃縮されたペプチド−mRNA複合体のmRNAからペプチドを発現させる工程、
を含む方法；及び
〔２２〕標的タンパク質がアポトーシスを抑制する分子である、上記〔１９〕〜〔２０〕のいずれか１項記載の方法、
に関する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、所望の位置に架橋構造が導入され、安定した二次構造（例えばαヘリックス構造）を持つペプチドを得ることが可能となる。かかるペプチドは、安定した二次構造を有するので、通常のペプチドでは持ち得ない機能、例えば標的に対する高親和性、高選択性、細胞膜透過性、安定性に優れる。
また、かかるペプチドにおいてアミノ酸配列をランダムにしたペプチドライブラリーを作製し、これを用いてスクリーニングを行うことにより、標的タンパク質等に対して高親和性を有するペプチドや、標的タンパク質の機能を阻害するペプチドなど生理活性を有するペプチドを得ることができる。
さらに、ペプチドライブラリーにおいて、ペプチドとこれをコードする核酸を連結させてin vitroディスプレイ法を適用することにより、選択されたペプチドの濃縮及び増幅を容易にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、αヘリックス二次構造を固定した特殊ペプチドの一例を示す。
【図２】図２は、架橋構造前駆体の配置例を示す。
【図３】図３は、選択的な架橋構造の形成を示す。
【図４】図４は、mRNAディスプレイによる架橋ペプチドライブラリーを用いたスクリーニングの概念を示す。
【図５】図５は、mRNAライブラリーの構築例を示す。
【図６】図６は、改変遺伝暗号表による翻訳の概念を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
架橋構造が導入されたペプチド
本発明は、架橋構造を備えることにより安定化した二次構造を有する新規なペプチドを提供する。本明細書において、「二次構造」とは、ペプチド主鎖中の水素結合によって形成される比較的狭い範囲にみられる特殊な構造をいい、ヘリックスやβ構造を意味する。本発明は、αヘリックス、３10ヘリックス構造等のヘリックス構造の安定化に適しているが、他の二次構造も安定化しうる。
また、本明細書において、ペプチドの「二次構造を安定化する」とは、ペプチドが標的分子にある程度の再現性をもって結合できる程度に二次構造が安定化されることを意味する。
【００２４】
ペプチドに架橋構造を付与して二次構造を安定化させると、(i)プロテアーゼ耐性が向上する、(ii)膜透過性が向上する。(iii)標的タンパク質との親和性が向上する、と考えられている。背景技術で述べたように、これまでも、アミノ酸側鎖間をアミド結合やジスルフィド結合で架橋することにより、ペプチド二次構造を安定化させる試みがなされてきた。また、化学触媒を用いたアルケン形成による架橋反応も報告されている。
【００２５】
しかしながら、これまでの方法と異なり、本発明のペプチドに形成された架橋構造は生体内で容易に分解されない構造であり、具体的には、アミド結合のように酵素的に分解されることも、ジスルフィド結合のように還元されてしまうこともない。
【００２６】
本発明のペプチドは、以下の式（Ｉ）で表される特殊アミノ酸と、側鎖にスルファニル基を有するアミノ酸との組を少なくとも１つ含み、特殊アミノ酸の側鎖とスルファニル基とのチオエーテル結合による架橋構造が形成されている。
【化８】
2012074129.tif 000011
式中、（Ａ）は、スペーサーとして機能を果たす部位を示す。（Ａ）は、単結合又は主鎖の原子数が１−１０の連結基であって、後述する（Ｂ）CH2−Ｘとスルファニル基との架橋反応が好適に生じる限り、どのような基であってもよいが、例えば、単結合；置換基で置換されていてもよい、炭素数１−１０のアルキレン基、炭素数２−１０のアルケニレン基、又は炭素数２−１０のアルキニレン基；主鎖の１−２個の炭素原子が、酸素原子、窒素原子、若しくは硫黄原子に置換された、置換基で置換されていてもよい、主鎖の原子数が１０以下のアルキレン基、アルケニレン基、又はアルキニレン基、等が挙げられるがこれらに限定されない。
なお、本発明のペプチドを翻訳合成法により合成する場合、（Ａ）があることが翻訳反応の進行に好ましいという利点もある。
【００２７】
（Ｂ）は、スルファニル基によるＸの置換反応を誘起させる限り、どのような基であってもよいが、例えば、少なくとも一つのπ結合を含む基とすることができる。π結合を含む基としては、置換基で置換されていてもよい、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基；置換基で置換されていてもよい少なくとも一つの芳香環を含む基；少なくとも一つのケトン又はアミドを含む基とすることができる。（Ｂ）の炭素数は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基の場合、例えば１−１０個、２−８個、２−５個等とすることができる。少なくとも一つの芳香環を含む基、少なくとも一つのケトン又アミドを含む基の場合、主鎖の原子数を例えば１−１０個、２−８個、２−５個等とすることができる。π結合の位置は、スルファニル基によるＸの置換反応が好適に進む限り特に限定されないが、π結合を構成している原子の少なくとも１つがスルファニル基による置換反応が行われる炭素原子と結合していることが望ましく、ＸからＣＨ2基を挟んで直接π結合が位置していることが最も好ましい。
（Ｂ）の例としては、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｃ＝Ｃ−、−Ａｒ−、−Ａｒ−Ａｒ−、−Ａｒ−Ｃ≡Ｃ−、−Ａｒ−Ｃ＝Ｃ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ａｒ−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ａｒ−Ｃ（Ｏ）−が挙げられるがこれらに限定されない。
スルファニル基と、式（Ｉ）で表される特殊アミノ酸の側鎖とのチオエーテル結合による架橋構造の例を以下に示す。
【表２】
2012074129.tif 000012
【００２８】
Ｘは、スルファニル基による置換反応により脱離されうる原子又は基であれば特に限定されないが、例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＯＳＯ2Ｍｅ、−ＯＳＯ2−Ａｒ−Ｒ（式中、ＲはＣＨ3、ＮＯ2、ＣＦ3及びＨからなる群より選択される基を表す。）であり得る。
【００２９】
（Ｃ）は、水素原子、又は置換基で置換されていてもよいアルキル基を示す。例えば、置換基で置換されていてもよいメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基であり、分岐していてもよい。
【００３０】
本明細書において、アルケニレン基とは、主鎖中に１−３個の二重結合を有するアルキレン基をいい、アルキニレン基とは、主鎖中に１−３個の三重結合を有するアルキレン基をいう。二重結合又は三重結合の位置は、ペプチドが目的とする効果を奏する限り特に限定されない。
本明細書において、置換基とは、特に限定されないが、ハロゲン原子、置換されていてもよい炭素数１−６のアルキル基、置換されていてもよい炭素数１−６のアルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アシル基、アミノ基、アリール基、ヘテロアリール基、フェノキシ基、非芳香族複素環基等が挙げられる。
【００３１】
本発明のペプチドにおいては、式（I）の特殊アミノ酸の側鎖部分とスルファニル基との結合形成によって架橋構造が形成されるため、このペプチドを構成する要素であるアミノ酸一残基を一つの単位として、これらの一組の官能基は、異なった構成要素の単位上に存在し、架橋構造が形成された際に二次構造が安定化されるように配置されることが必要である。説明の便宜のため、そのような構成要素の単位をアミノ酸単位と称する。
求電子剤となるアミノ酸単位（特殊アミノ酸に相当）とスルファニル基を有するアミノ酸単位は、(i, i+3)、(i, i+4)、(i, i+7)、又は(i, i+11)で示される位置に配置されることが好ましい。図２を参照されたい。ここで、iは０以上の任意の整数であり、架橋前駆体を含むペプチドのN末端の残基から数えたアミノ酸単位の位置を示す。たとえばi=3の場合、(i, i+4)はN末端（０番目）から数えて３アミノ酸単位の位置と７アミノ酸単位の位置に、求電子剤となるアミノ酸単位とスルファニル基を有するアミノ酸単位が配置され、架橋構造が形成されることを示す。
i+3やi+4の場合、αヘリックスであれば１ターンで架橋させることになり、i+7やi+11になると、それぞれ２ターン、３ターンで架橋させることになる。言い換えると、例えば、2、3、6又は10アミノ酸単位が架橋構造を形成するアミノ酸単位の間に存在することが好ましい。
架橋構造を形成するアミノ酸単位の間および前後に位置するアミノ酸単位は、Ｎ末端の開始アミノ酸を除き、分子内にアミノ基（−ＮＲ2）とカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）の二つの官能基を持つ化合物（アミノカルボン酸）である任意のアミノ酸であることが好ましく、典型的にはα−アミノカルボン酸であり、より好ましくはタンパク質性アミノ酸である。求電子剤となるアミノ酸単位とスルファニル基を有するアミノ酸単位の配置は、いずれがN末側でもC末側でも構わない。
【００３２】
特殊アミノ酸とは、天然の翻訳で使用される２０種類のタンパク質性アミノ酸とは構造の異なるアミノ酸全般を指し、人工的に合成したものであっても、自然界に存在するものであってもよい。つまり、タンパク質性アミノ酸の側鎖構造の一部が化学的に変更・修飾された非タンパク質性アミノ酸や人工アミノ酸、D体アミノ酸、N-メチルアミノ酸、N-アシルアミノ酸、β-アミノ酸、アミノ酸骨格上のアミノ基やカルボキシル基が置換された構造を有する誘導体等が全て含まれる。特殊ペプチドは、特殊アミノ酸を一つ以上含む、２個以上のアミノ酸が主にペプチド結合（環状構造やエステル結合が存在することもある）によって結合したものを指す。
【００３３】
本発明において、スルファニル基を有するアミノ酸の代表例はシステインまたはその類縁体（システインアナログ）であり、これと反応しうる求電子剤となるアミノ酸の代表例は式（I）の特殊アミノ酸である。後述のとおり、スルファニル基を有するアミノ酸について、これがシステインである場合は普遍コドンを使用できるが、非タンパク質性アミノ酸である場合は改変コドンでコードされる。一方、式（I）の特殊アミノ酸は、常に改変コドンによりコードされる。
【００３４】
また、本発明においては、ペプチド鎖N末端となる開始アミノ酸もメチオニンに限定されず、メチオニン以外の任意のタンパク質性アミノ酸あるいは任意の特殊アミノ酸であることができる。例えば、後述の実施例では、通常の２０種類のアミノ酸からメチオニンが除去された翻訳系を構築し、代わりに、開始tRNAにNα−アセチル化アミノ酸を連結させたものを用いて翻訳を開始している。このようなＮ末端修飾はペプチドの安定性を保つために有効であり得る。あるいは、架橋前駆体を構成するアミノ酸の一方が開始アミノ酸であることも可能である（すなわち、iが０の場合）。
【００３５】
架橋前駆体を構成するアミノ酸の配置に関してより典型的な態様は、これらのアミノ酸がいずれも伸長反応により導入され、ペプチド鎖内部に配置される態様であり、すなわちiが１以上の整数である場合である。また、本発明が適用されるペプチドの大きさには特に制限はないが、一般的に、ヘリックス構造を保ちにくい２５アミノ酸残基以下のペプチドに対して、本発明は好適に使用される。
式（I）の化合物の具体例としては、例えば、式（ＶＩＩ）：
【化９】
2012074129.tif 000013
の化合物が挙げられる。式中、ｍは１乃至１０の整数を表す。式（ＶＩＩ）の化合物の具体例としては、ｍが1の化合物を挙げることができ、この化合物は、例えば、Schollkopfの不斉補助基を利用して高い鏡像体過剰率で製造することができる。
また、式（ＶＩＩＩ）：
【化１０】
2012074129.tif 000014
の化合物も挙げられる。式中、ｍは前記と同義である。
また、式（ＩＸ）：
【化１１】
2012074129.tif 000015
の化合物も挙げられる。式中、ｍは前記と同義である。式（ＩＸ）の化合物の具体例としては、ｍが１になる下記の式（Ｘ）の化合物が挙げられる。
【化１２】
2012074129.tif 000016
さらに、式（Ｉ）において（Ｃ）がアルキル鎖である化合物の具体例としては、式（ＶＩＩ）に対応する式（ＸＩ）、式（Ｘ）に対応する式（ＸＩＩ）：
【化１３】
2012074129.tif 000017
の化合物が挙げられる。
一方、システインアナログの具体例としては、例えば、式（Ｖ）または式（ＶＩ）の化合物を挙げることができる。
【化１４】
2012074129.tif 000018
式（Ｖ）、（ＶＩ）中、ｍは前記と同義である。
また、ホモシステインやメルカプトノルバリン等のスルファニル基を有する特殊アミノ酸を挙げることもできる。
【００３６】
架橋構造が導入されたペプチドの製造方法
次に、本発明のペプチドの製造方法を説明する。
本発明のペプチドは、化学合成による方法や、翻訳合成系を用いる方法等、種々の公知の方法又はそれに準ずる方法を利用して製造することができる。例えば、化学合成の場合、液相合成、ＦｍｏｃやＢｏｃ等の保護基を用いた固相合成、液相合成と固相法を組み合わせたハイブリッド法等各種の方法で、式（Ｉ）の特殊アミノ酸と、スルファニル基を有するアミノ酸を含むペプチドを合成することができる。ペプチドを合成すると、後述のように、酵素等を用いることなく、式（Ｉ）の特殊アミノ酸の側鎖とスルファニル基との間にチオエーテル結合が自発的に形成され、架橋ペプチドを得ることができる。
【００３７】
本発明のぺプチドの製造方法の一例として、無細胞翻訳合成系を用いて製造する方法を以下に説明する。当該方法は、翻訳合成されたペプチド内に含まれる特殊アミノ酸が関与する高選択的な分子内反応を利用して、ペプチド側鎖間に共有結合を形成させ、架橋構造を構築するものであって、以下の工程を含む。
(i)スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸、および、式（Ｉ）で表される特殊アミノ酸の組が、少なくとも１つ分子内に配置された特殊ペプチドを翻訳によって合成する工程；及び
(ii)前記各組において前記スルファニル基と式（Ｉ）の特殊アミノ酸の側鎖をチオエーテル結合させて架橋構造を形成する工程、を含む。
工程(i)を翻訳合成工程、工程(ii)を架橋構造形成工程と呼ぶ。
【００３８】
工程(i)である翻訳合成工程においては、以下の二種類のアミノ酸
（ア）スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸、及び
（イ）式（Ｉ）で表される特殊アミノ酸
が、適切なアミノ酸残基数だけ離れて配置されたペプチドを、翻訳合成によって得る。
以降、工程(i)で合成される特殊ペプチドにおいて、スルファニル基及びこれと反応し得る特殊アミノ酸の官能基からなる一組の官能基を含む化学構造を架橋前駆体と呼ぶ。すなわち、適切なアミノ酸残基数だけ離れて配置された、これら（ア）及び（イ）のアミノ酸の組が架橋前駆体を構成する。
例えば図２の模式図を参照されたい。図２においては、これらのアミノ酸の組が、ペプチド鎖内部に配置された一組の濃い黒丸で表されている。また、一個のペプチド鎖に含まれることができる架橋前駆体は一組だけではなく、複数個の架橋前駆体を配置することもできる。複数個の架橋前駆体を含むペプチド鎖が翻訳合成された場合は、工程(ii)の架橋構造形成工程において複数個の架橋構造を形成することが可能である。
【００３９】
式（I）の特殊アミノ酸は、架橋のための共有結合の形成が可能な側鎖構造として、求核性官能基であるスルファニル基（−ＳＨ）と結合形成反応が可能な構造を有する。この反応の結果として、工程(ii)である架橋構造形成工程において、架橋前駆体を含むペプチドは架橋構造が形成されたペプチドへ変換される。本発明において、架橋前駆体からの架橋構造形成は、翻訳合成条件下で自発的に起きるため、化学触媒を必要としない。
【００４０】
工程(i)を無細胞翻訳系で行う場合、遺伝暗号リプログラミング技術を利用して既存コドンに特殊アミノ酸を人為的に割り当てることによりペプチド鎖に導入する。具体的には、特殊アミノ酸をコードするコドンを有するmRNAを調製し、これを改変遺伝暗号表の下で翻訳することにより、改変されたコドン（改変コドン）で指定された位置に特殊アミノ酸が導入されたペプチドを得ることができる。
本願において、コドンとは、改変コドンおよび天然の翻訳で使用される普遍コドンの両方を指す。改変コドンとは、遺伝暗号リプログラミングによってタンパク質性アミノ酸との対応付けが解消され、特殊アミノ酸と対応づけられたコドンを指す。特殊アミノ酸は、改変コドンでのみコードされ得る。
【００４１】
上述のようにして合成されたペプチド化合物に架橋構造を導入することによってヘリックスペプチド化合物が合成される。架橋構造形成のための反応の条件は官能基の組の種類に応じて設定されるが、一般に、このペプチド化合物を合成するための無細胞翻訳系の条件下において高選択的に反応は進行する。したがって、特段の反応条件の調整を行うことなく、自発的に結合が形成され、架橋ペプチド化合物を得ることができる。
【００４２】
例えば、図３を参照されたい。ホルミルメチオニンで翻訳を開始し、伸長コドンで導入された様々なアミノ酸の組合せが（i,i+4）の位置関係で配置されたペプチド鎖を合成したところ、式（Ｉ）の特殊アミノ酸ＸおよびシステインＣの組のみがチオエーテル結合で架橋構造を形成している。
同様に、後述の実施例においては、アミノ酸側鎖に配置されたプロパルギルクロリドを含む特殊アミノ酸とシステインを配置したペプチド配列を翻訳合成して得られる、架橋前駆体を含むペプチドが記載されている。例示された態様では、翻訳後にプロパルギル位へのスルファニル基による置換反応が自発的に進行し、チオエーテル結合が形成されることにより架橋構造が完成する。
【００４３】
無細胞（in vitro）翻訳系
翻訳系とは、ペプチド翻訳合成のための場であり、一般的には方法及びキット（物）の両方を含む概念である。本発明において使用される無細胞翻訳系は、公知の再構成型の翻訳系をさらに細分化し、より不純物の少ない系を構築して利用することが好ましい。従来の系と対比させながら、本発明で利用可能なキット（物）としての翻訳系の具体的な構成成分について説明する。
【００４４】
翻訳系の構成成分の具体例としては、リボソーム、IF群、EF群、RF群、RRF、目的のペプチド合成に最低限必要となる天然アミノ酸・tRNA・特異的なARSタンパク質酵素のセット、翻訳反応のためのエネルギーソース、などがある。
リボソームとしては、大腸菌から単離され、精製されたリボソームが好適に利用される。
タンパク質類では、翻訳開始因子（例えば、IF1、IF2、IF3）、翻訳伸長因子（例えばEF-Tu、EF-Ts、EF-G）、翻訳終結因子（例えば、RF1、RF2、RF3、RRF）、エネルギーソース再生のための酵素（例えばcreatine kinase, myokinase, pyrophosphatase, nucleotide-diphosphatase kinase）を使用する。この中で、翻訳終結因子・エネルギーソース再生のための酵素の添加は任意である。鋳型DNAからの転写を行うためにT7 RNA polymeraseを加えることもあるが、あらかじめ転写したmRNAを翻訳系に加える場合、RNA polymeraseの添加は不要である。
【００４５】
その他、従来の系と同様、適当な緩衝溶液、翻訳反応のエネルギーソースとしてのNTP類、Creatine phosphate、リボソーム活性化、RNA安定化、タンパク質安定化のために必要な因子等を適宜使用することができる。また、通常の翻訳反応では、開始コドンAUGには、開始tRNAにより、N-ホルミルメチオニンが規定されるため、10-formyl-5,6,7,8-tetrahydroforlic acid（Baggott et al., 1995）のようなホルミルドナーが必須であるが、本発明において特殊アミノ酸で翻訳反応を開始する場合は、ホルミルドナーは任意である。同様の理由で、methionyl-tRNA formyltransferase（MTF）も必須でない。
【００４６】
本発明で利用される翻訳系において、天然のタンパク質性アミノ酸に対しては、従来の系と同様に、対応する天然のtRNA及びARSを利用することができる。天然tRNAの例は、大腸菌を集め、破砕し、そこからtRNA画分を精製した混合物であり、市販品も入手可能である。天然tRNA中の特定のA、U、C、Gは、酵素によって化学修飾を受けている。あるいは、試験管内で転写した天然配列をもつtRNAの使用も可能である。
【００４７】
一方、特殊アミノ酸に対しては、天然tRNAではなく、オルソゴナルtRNAとしてtRNA転写産物である人工tRNAを利用することが好ましい。人工tRNAは、DNAを鋳型として適当なRNAポリメラーゼを用いたin vitro転写反応で調製可能である。このような人工tRNAには、化学修飾は全く存在しない。
翻訳産物であるペプチドに特殊アミノ酸を導入するためには、予め特殊アミノ酸でアシル化されたオルソゴナルtRNAを翻訳系に加える。好ましい態様において、特殊アミノ酸でアシル化されたtRNAは、他のtRNAやARSが存在しない条件で、フレキシザイムを用いて、単離されたオルソゴナルtRNAの3'末端に特殊アミノ酸を結合することにより調製される。あるいは、化学的あるいは酵素的に特殊アミノ酸をtRNAに結合したものも使用可能である。
【００４８】
ペプチドライブラリー
本明細書において、ペプチドライブラリーとは、上述した架橋構造が導入されたペプチドを２種以上含む、すなわち配列が異なる２種以上のペプチドを含むライブラリーをいう。ペプチドライブラリーを構成する各ペプチドにおいては、側鎖にスルファニル基を有するアミノ酸と式（Ｉ）で表される特殊アミノ酸以外のアミノ酸を、任意のアミノ酸とすることができる。したがって、例えば２５アミノ酸残基からなるペプチドは、スルファニル基を有するアミノ酸と式（Ｉ）で表される特殊アミノ酸を一組のみ含む場合、天然のアミノ酸２０種のみ使用するとしても理論的に２０23種あることになり、ライブラリーとしては十分なサイズとなる。
本発明のペプチドライブラリーは架橋により二次構造が安定していることから、細胞膜透過性にも優れており、これを用いてスクリーニングを行うことによって、標的に対して高い親和性を用いるペプチドや、標的タンパク質の機能を阻害するペプチドなど生理活性を有するペプチド等、有用なペプチドを得ることが可能である。
【００４９】
また、ペプチドライブラリーの一態様として、各ペプチドがそれをコードするｍＲＮＡと連結されていてもよい。これにより、表現型（ペプチドのアミノ酸配列）が遺伝型（核酸配列）にディスプレイされたライブラリーとなり、in vitroディスプレイに応用することができる。言い換えると、遺伝情報が、その翻訳産物であるペプチドとして提示（ディスプレイ）されているディスプレイライブラリーから、ペプチドの選択を行う。これにより、ライブラリー中のそれぞれのランダムペプチド分子に、分子生物学的手法により増幅及び読み取りが可能なタグが付加されている事になる。
【００５０】
in vitro ディスプレイとは、無細胞翻訳系（in vitro翻訳系ともいう）を用いて合成されたペプチドが遺伝情報と対応付けて提示されたものであり、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、DNAディスプレイ等が公知である。また、RAPIDディスプレイ（未公開）も利用可能である。いずれのディスプレイも、mRNAもしくはDNAに記録された遺伝情報と、その遺伝情報によってコードされるペプチドを連結することにより、[遺伝情報]−[翻訳産物]の複合体として対応付けるメカニズムを有する。リボソームディスプレイにおいては、mRNA−リボソーム−ペプチドの３者が複合体を形成する。mRNAディスプレイ及びRAPIDディスプレイにおいては、mRNA−ペプチドの複合体が形成される。DNAディスプレイにおいては、DNA−ペプチドの複合体が形成される。本発明においては任意のin vitro ディスプレイライブラリーの利用が可能である。
【００５１】
ペプチドライブラリーの製造方法
ランダム配列を持つペプチドのライブラリーの製造方法は特に限定されないが、例えば、無細胞翻訳系において、ペプチドをコードする領域にランダム配列を持つ鋳型核酸（mRNAもしくは対応するDNA）から翻訳合成を行うことにより得ることができる。
【００５２】
したがって、ペプチドライブラリーの製造方法の一態様は、
（i）ランダムなアミノ酸配列をコードするRNA中に、スルファニル基を側鎖に持つアミノ酸を指定するコドン、および、式（Ｉ）で表される特殊アミノ酸を指定するコドンの組を有し、各組においてスルファニル基を側鎖に持つアミノ酸を指定するコドンと式（I)の特殊アミノ酸を指定するコドンの位置が、２、３、６、または１０アミノ酸単位隔てて配置されている、mRNAのライブラリーを調製する工程；
（ii)前記特殊アミノ酸を連結したtRNAを含む無細胞翻訳系で前記mRNAを翻訳して、ランダム配列中に前記特殊アミノ酸が配置されたペプチドの集合体を得る工程；及び
(iii)各ペプチドにおいてスルファニル基と式（I)の特殊アミノ酸の側鎖を結合させて架橋構造を形成する工程、を含む。
【００５３】
ランダム配列を持つ架橋ペプチドライブラリーを構築するためには、mRNA配列中のペプチドをコードする領域中に、複数のトリプレットの繰り返しからなるランダム配列および架橋前駆体となるアミノ酸を指定するコドンが配置される。例えば、図５に示すように、プロパルギルクロリド構造を側鎖に持つ特殊アミノ酸を伸長コドンのひとつに割り当て、そこから適切なアミノ酸単位（上述で説明したように、例えば２、３、６又は１０アミノ酸単位）のランダム配列のコドン塩基だけ間を置いた位置へシステインを導入する。
さらに、これら二つのアミノ酸が割り当てられた各コドンおよび開始コドン以外に、任意の長さのランダム配列のコドン塩基を配置した鋳型mRNAを構築する。このmRNAを翻訳することにより、システインの側鎖に位置するスルファニル基によるプロパルギルクロリドとの求核置換反応によってチオエーテル結合が構築され、ランダム配列を持った架橋ペプチドライブラリーの構築が可能となる。
【００５４】
ランダム配列をもつライブラリーを構築するためには、２０種類全てのタンパク質性アミノ酸が無作為に出現するように、その鋳型となるmRNAのコドン配列をNNK（NはG,A,CあるいはUから選択される任意の塩基、KはUあるいはGを示す）にするのが一般的である。しかし、架橋構造を形成させるための求電子剤となる式（I)の特殊アミノ酸を伸張コドンのひとつ、例えばAUG（AUGは開始コドンと伸張コドンの両方に使える）に当てはめた場合、NNKのライブラリーでペプチドライブラリーを構築すると、NNKが表すコドンの一つとしてAUGが無作為に出現するために、ペプチドライブラリーには複数の上記の特殊アミノ酸が組み込まれる。
【００５５】
そこで、式（I)の特殊アミノ酸を指定するコドンをAUGとする場合、ランダム配列としてNNCもしくはNNU（NはA、U、G、Cのいずれか一つの塩基を表す）配列からなるトリプレットの繰り返しを用いる場合は、ランダム配列中にAUGが出現しないようにすることが可能となり、ランダム配列中の指定された位置にだけ式（I)の特殊アミノ酸を導入することができる。
NNUあるいはNNCのランダム配列の塩基のライブラリーを用いた場合は、５つのアミノ酸（Met, Trp, Gln, Lys, Glu）は出現しなくなる。これらを出現させることによるメリットが、本特殊アミノ酸が所望の位置以外に配置されることによるデメリットを超える場合などは、NNU、NNCに加えて、NNKを用いてもよい。
また、NNU又はNNCを用いた場合に出現しないアミノ酸に対応するコドンを、架橋構造を形成させるための別の特殊アミノ酸、あるいは別の付加的な機能を有する特殊アミノ酸を指定された位置に導入するために利用することも可能である。例えば、AUGに加えUGG, CAG, AAG, GAGの4つのコドンを利用して、かかる特殊アミノ酸を指定された位置に導入することも可能である。
NNU、NNC、NNKを含むmRNAは、例えば各種のDNA合成装置によって、NNT、NNC、NNKを含むDNAを合成し、これを転写することによって得ることができる。
【００５６】
上述の例示的な一態様において、式（I)の特殊アミノ酸は伸長用tRNAによりペプチド鎖伸長反応で導入される。ここで、開始tRNAは翻訳開始位置のAUGコドンに対合して連結されているアミノ酸をペプチドN-末端に導入するが、それ以外の位置のAUGコドンはCAUコドンを有する伸長用tRNAと対合する。このため、AUGコドンには２種類のtRNAによって２種類のアミノ酸が対応づけられる。本明細書では、開始tRNAと対合するAUGコドンを開始AUG、伸長用tRNAに対合するAUGコドンを単にAUGと呼ぶ。
【００５７】
本発明では、目的に合わせて最適化された成分からなる無細胞翻訳系に、翻訳の鋳型となる塩基配列に対応するDNAまたはRNA分子を加えて利用する。核酸配列には、生細胞を利用したタンパク質発現系と同様に、目的のアミノ酸配列をコードする領域に加えて、使用する翻訳系に合わせて、翻訳に有利な塩基配列を付加的に含むことができる。例えば、大腸菌由来のリボソームを利用する系の場合は、開始コドンの上流にShine-Dalgarno(SD)配列やイプシロン配列などを含むことにより翻訳反応の効率が上昇する。
【００５８】
ペプチドをコードする領域のN末端には、開始コドンが配置される。開始コドンは通常はトリプレット配列AUGである。しかしながら、in vitro転写反応により合成された開始tRNAにおいてアンチコドン配列を任意の配列とすることで、開始コドンのリプログラミングが可能であるので、AUGコドンに加えて、他の塩基配列も開始コドンとして利用できる。
【００５９】
C末端側には、in vitroディスプレイ用に、核酸分子とその翻訳産物であるペプチドを連結するための配列が含まれる。例えば、ピューロマイシンリンカーを用いたmRNAディスプレイ法を利用する場合、mRNAライブラリーにピューロマイシンリンカーが予め連結されたものを翻訳系に加えることにより、mRNA−ペプチドの複合体ライブラリーが形成される。ピューロマイシンをリボソームのＡサイトに効率良く取り込ませるために、通常、mRNAの３’末端側とピューロマイシンの間にリンカーが挿入される。
ピューロマイシンはリボソーム上でペプチド転移反応の基質（アミノアシルtRNA類似体）として機能し、伸長ペプチドのＣ末端に結合することにより、mRNAとペプチドを連結する。mRNAディスプレイ法は、in vitro翻訳系でmRNAとペプチドを適当なリンカーを介して連結することにより遺伝子型と表現型を一体化させる技術であり、このような目的が達成される限り、ピューロマイシンに代えて他の同様の機能を有する物質を含むリンカーも利用可能であることは当業者の認識の範囲内である。
【００６０】
また別の方法として、リンカーを予め連結したmRNAを用いるのではなく、in vitro翻訳系内でのリンカーとmRNAのハイブリダイゼーションにより、mRNA-ペプチドの複合体ライブラリーを形成する方法も利用可能である。例えば、フレキシザイムを利用して調製したフェニルアラニンリンカー(3'-フェニルアラニン-ACCA-PEG-[mRNAライブラリーの3'末端領域と相補的な塩基配列]-5')をmRNAライブラリーと相補鎖を組ませることで、mRNA-ペプチドの複合体ライブラリーが形成される（未公開出願であるPCT/JP2010/68549に記載される「RAPIDディスプレイ法」）。この場合、mRNAのペプチドをコードする領域の下流（3'末端領域）に、リンカーとハイブリダイゼーションするための塩基配列が含まれる。
【００６１】
後述の具体的な実施例においては、ペプチドのN末端に開始AUGコドンが、途中のいくつかのアミノ酸残基に相当するランダム配列のあとに、式（I)の特殊アミノ酸をコードする伸長AUGコドン（もしくはCysをコードするコドンUGC）が、さらに適切なアミノ酸単位のランダム配列が続いた後、CysをコードするコドンUGC（もしくは式（I)の特殊アミノ酸をコードする前述のコドン）が配置され、さらにランダム配列がC末端まで続く。図２および図５を参照されたい。その直後、リンカーとなるGlySerGlySerGlySerをコードするコドンが続くように配置される。
【００６２】
フレキシザイムによるアミノアシル化反応
フレキシザイムは、所望の構造を持つアミノ酸基質を任意のtRNAにアシル化する機能を有するRNA触媒（ARSリボザイム）である。フレキシザイムは、天然のARSタンパク質酵素とは異なり、各アミノ酸及び各tRNAに対して特異性を持たず、本来連結すべきアミノ酸以外の任意のアミノ酸を用いたアミノアシル化が可能である。具体的には、アミノ酸の認識部位にα位の置換基が含まれていないため、Ｌアミノ酸に限らず、ヒドロキシ酸（α位が水酸基）、α-N-メチルアミノ酸、α-N-アシルアミノ酸、D-アミノ酸なども基質とすることができる。また、ε-N-アセチルリシンやε-N-メチルリシンなどの翻訳後修飾を受けたようなアミノ酸も基質とすることが可能である。詳細については、前述のフレキシザイムに関する文献に加え、Y. Goto, H. Suga (2009) "Translation initiation with initiator tRNA charged with exotic peptides" Journal of the American Chemical Society, Vol. 131, No. 14, 5040-5041、WO2008/059823「N末端に非天然骨格をもつポリペプチドの翻訳合成とその応用」、Goto et al., ACS Chem. Biol., 2008, 3, 120-129、T. J. Kang, et al., Chem. Biol., 2008, 15, 1166-1174 "Expression of histone H3 tails with combinatorial lysine modifications under the reprogrammed genetic code for the investigation on epigenetic markers"、WO2008/117833「環状ペプチド化合物の合成方法」などにも記載されている。
本発明では、フレキシザイムを用いて特殊アミノ酸でアシル化された直交性（オルソゴナル）tRNAを、無細胞翻訳系に添加することにより、ペプチド配列に特殊アミノ酸が導入される。
【００６３】
オルソゴナルtRNAとは、翻訳系に内在する天然由来のARS（例えば大腸菌由来のＡＲＳタンパク質酵素）によって認識されないので、翻訳系内でアミノアシル化されることはないが、リボソーム上のペプチド合成反応では効率よくmRNAのコドンと対合して指定されたアミノ酸を発現させ得るtRNAである。オルソゴナルｔＲＮＡとして、例えば、異なる種に由来する天然のサプレッサーｔＲＮＡ、あるいは、人工的に構築したｔＲＮＡが使用される。上述のように、本発明において特殊アミノ酸の導入のために好適に使用されるものは、人工的な転写産物であるオルソゴナルｔＲＮＡである。
【００６４】
フレキシザイムは、活性化アミノ酸エステルを基質として、アミノ酸の反応点であるカルボニル基、及びアミノ酸側鎖あるいは脱離基である芳香環、並びにtRNAの３’末端に存在する5'-RCC-3'配列部分（R は A 又は G）を認識して、３’末端のアデノシンにアシル化する触媒能を有する。フレキシザイムは、tRNAのアンチコドン部分に対して特異性がない。つまり、tRNAのアンチコドン部分をどのような配列に変えても、アミノアシル化の効率には影響がない。フレキシザイムにより、任意の特殊アミノ酸を任意のアンチコドン配列を持つtRNAに連結することができるので、任意の特殊アミノ酸を任意のコドンに対応させることができる。従って、任意の特殊アミノ酸を導入したライブラリーの調製が可能である。
【００６５】
公知のフレキシザイムの構造（RNA配列）を以下に示す。
原型のフレキシザイム Fx
[GGAUCGAAAGAUUUCCGCAGGCCCGAAAGGGUAUUGGCGUUAGGU-3', 45nt]
ジニトロベンジルフレキシザイム dFx
[5'-GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU-3',46nt]
エンハンスドフレキシザイム eFx
[5'-GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU-3',45nt]
アミノフレキシザイム aFx
[5'-GGAUCGAAAGAUUUCCGCACCCCCGAAAGGGGUAAGUGGCGUUAGGU-3',47nt]
【００６６】
フレキシザイムは、天然のARSタンパク質酵素とは異なり、アミノアシル化反応の第１段階目である高エネルギー中間体（アミノアシルAMP）の生成の過程をスキップしてアミノ酸基質のtRNAへの結合の過程のみを触媒するため、アミノ酸基質としてはあらかじめ弱活性化されたアミノ酸を用いる必要がある。つまり、アミノ酸のアデニル化をスキップする代わりに、アシル化が進行するカルボニル基において弱活性化されたエステル結合を持つアミノ酸誘導体を使用する。一般にアシル基の活性化は電子求引性基を備えたエステル結合させることで達成できるが、あまり強力な電子求引性基を有するエステルでは水中で加水分解が起きるばかりか、ランダムなRNAへのアシル化が併発してしまう。したがって、アミノ酸基質としては無触媒状態でこのような副反応が起きにくいように弱活性化したものを用いる必要がある。このような弱活性化は、例えば、AMP、シアノメチルエステル、チオエステル、又はニトロ基やフッ素その他の電子求引性の官能基をもったベンジルエステル等を使用して行うことができる。
【００６７】
また、アミノ酸基質は、フレキシザイムで認識されるように、アミノ酸側鎖または脱離基内に芳香環を有していなければならない。活性化アミノ酸エステルは、天然のアミノアシル化反応におけるアミノアシルAMPのような弱活性化されたエステル結合を持ち、且つアミノ酸側鎖または脱離基内に芳香環を有するアミノ酸基質のことである。好適な活性化アミノ酸エステルの例としては、アミノアシル-シアノメチルエステル（CME：cyanomethyl ester）、アミノアシル-ジニトロベンジルエステル（DNB：3,5-dinitrobenzyl ester）、又はアミノアシル-4-クロロベンジルチオエステル（CBT：p-chloro-benzyl thioester）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
例えば、後述の実施例では、Nα-アセチル- L-フェニルアラニン（Ac-F）を人工的に構築された開始tRNAに連結させ、ペプチドN末端に導入を行うとともに、プロパルギルクロリドを側鎖に持つ (s)-2-アミノ-6-クロロヘキシ-４-イオニック酸、(s)-2-アミノ-7-クロロヘプト-5-イオニック酸、(s)-2-アミノ-8-クロロヘプト-6-イオニック酸の３つのアミノ酸（実施例中の表１下の構造式を参照されたい）をそれぞれ人工的に構築された伸長tRNAに連結させた。これら３つの化合物の場合、(s)-2-アミノ-6-クロロヘキシ-４-イオニック酸DNB、(s)-2-アミノ-7-クロロヘプト-5-イオニック酸DNB、(s)-2-アミノ-8-クロロヘプト-6-イオニック酸DNB、をそれぞれ基質として用いることで、dFx と tRNA を混合し、これらの結合されたtRNAを調製できる。一方、Nα-アセチル- L-フェニルアラニンの場合は、Nα-アセチル- L-フェニルアラニンCMEを基質として用いることで、eFxとtRNAを混合し、Nα-アセチル- L-フェニルアラニン結合 tRNA を調製することができる。
【表３】
2012074129.tif 000019
【００６９】
フレキシザイムによるアシル化反応は、溶液中で行ってもよいし、担体に固定化したARSリボザイムを用いたカラムを用いて反応させてもよい。例えば、もし翻訳の反応スケールが１００μｌ以下の少ない量であれば、溶液中でフレキシザイムによるｔＲＮＡのアシル化を行い、反応溶液をエタノール沈殿したペレットを適当な緩衝液（例えば１ｍＭの酢酸カリウム、ｐＨ５等）に溶解し、翻訳系に添加すれば良い。反応の条件は適宜好適な条件を選べばよいが、少量スケールの反応条件の一例としては、最終濃度で0.5〜20μMのtRNA、0.5〜20μMのフレキシザイム、2〜10mMのアミノ酸基質、0.6MのMgCl2を含むpH7.5、0.1Mの反応緩衝液を、0度（℃）で１時間〜２４時間、反応させるとよい。
【００７０】
翻訳の反応スケールが１００μｌを超える場合は、フレキシザイムの再利用を考慮し、担体に固定化したフレキシザイムを用いたほうが好都合である。担体として、例えば、樹脂、アガロース、セファロース、磁気ビーズなどを用いることもできるが、特に限定されない。フレキシザイムを担体に固定化して反応を行わせる場合は、例えば、Murakami, H., Bonzagni, N. J. and Suga, H. (2002). "Aminoacyl-tRNA synthesis by a resin-immobilized ribozyme." J. Am. Chem. Soc. 124(24): 6834-6835に記載の方法に従って行うことができる。反応産物であるアミノアシル化ｔＲＮＡの分離は、様々な方法で行える。一例としては、１０ｍＭ程度のＥＤＴＡを含有する緩衝液でカラムから溶出する方法がある。ARSリボザイムを固定化した樹脂は、例えば反応バッファーで平衡化することにより、十数回リサイクルすることができる。
【００７１】
開始tRNAと伸長tRNA
天然の翻訳反応において、開始tRNAは翻訳開始のみに用いられ、伸長反応では使用されず、反対に、伸長用tRNAは開始反応には使用されないことは重要である。このような開始tRNAと伸長用tRNAの区別は本願発明においても同様である。
本願では、特殊アミノ酸をアシル化するために人工tRNAが好適に用いられる。伸長tRNAである人工tRNAの非限定的な一例がtRNAAsn-E2である。このtRNAの塩基配列は、大腸菌由来の伸長反応用tRNAである天然tRNAAsn(5'-UCCUCUGs4UAGUUCAGDCGGDAGAACGGCGGACUQUUt6AAYCCGUAUm7GUCACUGGTYCGAGUCCAGUCAGAGGAGCCA-3') がベースになっている(s4U:4-チオウリジン、D:ジヒドロウリジン、Q:キューオシン、t6A:6-スレオニルカルバモイルアデニン、Y:ワイブシン、m7G:7-メチルグアノシン、T:リボチミジン)。本発明者らは、この天然tRNAに対して、修飾塩基を無くし、かつ変異を導入することで、大腸菌の20種類のアミノアシル化酵素によってアミノアシル化を受けない伸長反応用のtRNAであるtRNAAsn-E2をin vitro転写によって作製した。NNNの箇所がアンチコドンに相当し、コドンに対応するように変化させる。
(tRNAAsn-E2: 5'-GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGACUNNNAAUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGCCA-3'、[修飾を無くした箇所、合計8カ所。s4U8U、D16U、D20U、t6A37A、Y39U、m7G46G、T54U、Y55U。34番目のQに関しては、アンチコドンなので、コドンに対応して
変化させる。][変異の箇所 、合計4カ所。U1G、C2G、G71C、G72C])
【００７２】
開始tRNAである人工tRNAの非限定的な一例がtRNAfMetである。このtRNAの塩基配列は、大腸菌の天然tRNAfMet
(5'-CGCGGGGs4UGGAGCAGCCUGGDAGCUCGUCGGGCmUCAUAACCCGAAGAUCGUCGGTYCAAAUCCGGCCCCCGCAACCA-3' )がベースになっている。(Cm:2'-O-メチルシチジン)。本発明者らは、この天然tRNAに対して、修飾塩基を無くし、5'末端最初のCをGに変化させた開始反応用のtRNAであるtRNAfMetをin vitro転写によって作製した。CAUの箇所がアンチコドンに相当し、開始AUGコドンに対応する。(本願で使用したtRNAfMet: 5'-GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCUCAUAACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAACCA-3'、[修飾を無くした箇所、合計6カ所。s4U8U、D20U、Cm32C、T54U、Y55U。][変異の箇所 、合計1カ所。C1G]）開始tRNAにおいて重要な箇所は5'末端の最初の塩基(天然tRNAfMetではC、本願のtRNAfMetではG)が、72番目の塩基(天然tRNAfMet及び本願のtRNAfMetではA)と相補鎖を組まないことである。この非相補鎖によって、メチオニルホルミルトランスフェラーゼ(MTF)によりMet-tRNAfMetにホルミル基が転移されたり(但し、この部分に開始用特殊アミノ酸を利用する場合は、意味は無い)、またEF-Tuとの結合が抑制されたりする。
【００７３】
後述の実施例では、Nα-アセチル- L-フェニルアラニンをtRNAfMetCAUに連結させ、ペプチドN末端に導入を行うとともに、プロパルギルクロリドを側鎖に持つ３つの特殊アミノ酸をそれぞれtRNAAsnE2CAUに連結させた。tRNAAsn-E2NNNは、アンチコドン配列（NNN、Nは任意の塩基を表す）を様々に変化させて用いることができるが、プロパルギルクロリド構造を側鎖に備えた特殊アミノ酸を指定する改変コドンがAUGである場合、アンチコドン配列はCAUとなる。
【００７４】
これらの開始用及び伸長用の人工tRNAは天然のARSに対して直交性を持つため、翻訳系中で天然のアミノ酸が連結されることがないが、翻訳開始反応、リボソーム上のペプチド鎖伸長反応に際しては問題なく受け入れられる。これらの人工tRNAは実施例で使用された具体的な無細胞翻訳系において実際に使用可能であることが確認されている。しかしながら、本発明で使用可能な人工tRNAはこれに限定されない。当業者であれば、本発明において特殊アミノ酸を導入するために利用可能なtRNAは、使用する無細胞翻訳系の成分に合わせて適宜に選択可能であることが理解できるであろう。
【００７５】
in vitroセレクション
本発明において、無細胞翻訳系で構築される特殊ペプチドライブラリーは、mRNAディスプレイを始めとするin vitroディスプレイ技術と完全に適合可能であるため、1013種類以上の高い多様性からなる特殊ペプチドライブラリーから、標的に結合するペプチド分子の創出が可能である。
【００７６】
in vitroディスプレイ技術は、進化分子工学のツールとして利用される。進化分子工学では、所望の機能や性質を持つタンパク質やペプチドを創製することを目的として、可能性のある遺伝子を大規模に準備し、その中から所望の表現型を有するクローンを選択する。基本的には、最初にDNA集団（DNAライブラリー）を調製し、in vitro転写産物としてRNA集団（RNAライブラリー）を得て、in vitro翻訳産物としてペプチド集団（ペプチドライブラリー）を得る。このペプチドライブラリーから、所望の機能や性質を持つものを何らかのスクリーニング系で選択することになる。
例えば、特定のタンパク質に結合するペプチド分子を得たい場合は、標的タンパク質を固相化したカラムにペプチド集団を流し込み、カラムに結合したペプチド分子の混合物を回収することができる。このとき、in vitroディスプレイ技術により、各ペプチド分子には、その鋳型である核酸分子がタグのように付加されている。mRNAディスプレイライブラリーであれば、各ペプチド分子にはmRNAが付加されている。そこで、回収したペプチド−mRNA複合体の集団から逆転写酵素でDNAに戻し、PCRで増幅して所望の表現型を有するクローンが多く含まれるバイアスのかかったライブラリーを得た後に、再度同じような選択実験を行う。
あるいは、RNAアプタマーを回収してしまう可能性を回避するため、核酸部分を２本鎖（DNA/RNAハイブリッド）にする目的で、選択前に逆転写反応を行うことも可能である。この操作を繰り返すことで、世代の経過とともに所望の表現型を有するクローンが集団中で濃縮されていく。
【００７７】
ペプチドアプタマーを同定する場合、in vitro ディスプレイライブラリーと標的物質を混合し、標的物質に結合したペプチドを提示する対応付け分子（活性種）を選択し、選択された対応付け分子の核酸部分からPCRにより核酸ライブラリーを調製する工程を繰り返すことで、標的物質に結合するペプチドアプタマーの遺伝子をクローニングできる。
標的物質としては、一般的には、タンパク質、ペプチド、核酸、糖質、脂質、これらのいずれかの複合体、その他どのような化合物でもよい。
活性種を選択するためには、[遺伝情報]−[ペプチド]複合体を標的物質と接触させ、標的物質に結合したペプチドを提示する複合体を、標的物質に結合していない他の多数の複合体から適当な方法で分離して回収する必要がある。このような回収の方法としては多くの技術が公知である。
【００７８】
例えば、標的物質に、固相への結合により回収可能な修飾を施しておくと便利である。例えば、標的物質にポリヒスチジンタグを連結しておき、Ni-NTA が担持された担体へのポリヒスチジンタグの特異的な結合を利用して回収することができる。このような特異的な結合としてはポリヒスチジンペプチド/金属イオン（ニッケル、コバルトなど）の組合せの他にも、ビオチン結合タンパク質（アビジン、ストレプトアビジンなど）/ビオチン、マルトース結合タンパク質/マルトース、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ/グルタチオン、抗体/抗原（エピトープ）などの組み合わせが、利用可能であるが、これらに限定されるものではない。
【００７９】
本発明は、ペプチドライブラリーを標的物質と接触させ、標的物質に結合したぺプチドを提示する活性種を選択し、選択された活性種の核酸配列を増幅し、増幅された核酸配列を鋳型として無細胞翻訳系で再び合成されたペプチドのライブラリーから活性種を選択するというin vitroセレクションを繰り返すことにより、標的物質に結合する特殊ペプチドを創製することを含む。特に、直鎖状ペプチドへ架橋構造を組み込むことにより、ヘリックス構造という特定の二次構造を多く存在させることを目指したライブラリーである、二次構造指向性のペプチドを含むライブラリーを用いることで、分子間相互作用に適切と考えられる３次元構造が備わることから、単に標的タンパク質に結合しやすい分子が得られるのではなく、その分子間相互作用に関与する部位に結合して阻害活性を示すペプチドの獲得が可能である。
【００８０】
標的物質に結合する特殊ペプチド化合物の創製は、標的物質に結合したぺプチドを提示する活性種を回収して核酸配列を解析し、核酸配列からペプチド配列を決定し、得られたペプチド配列に基づき適当な特殊ペプチドを選択することにより、標的物質に結合する特殊ペプチドのアミノ酸配列及び核酸配列を得ることを含む。さらに、得られた配列情報に基づき、任意の方法を用いて、特殊ペプチドを合成、精製及び単離することが可能である。得られたペプチドを用いて、標的タンパク質の結合評価や阻害活性の確認を行い、活性の高い特殊ペプチドを得ることができる。
【００８１】
したがって、本発明は、
(ア)標的タンパク質に結合するペプチドを選択する一次スクリーニング段階と、
(イ)一次スクリーニングで選択されたペプチドの結合能力を評価し、前記ペプチドが確かな結合力を示すペプチドであることを決定する二次スクリーニング段階を含み、
前記一次スクリーニング段階が
(i)二次構造指向性を有するペプチドを含むライブラリーを用意し、
(ii)ペプチドライブラリーを標的タンパク質に接触させ；そして
(iii)標的タンパク質に結合するペプチド分子を選択する工程
を含む、ペプチドライブラリーから標的タンパク質の分子間相互作用に対する阻害活性を有するペプチドを得る方法を含む。
【００８２】
Bcl-2を標的とした場合のヘリックス含有ライブラリーの構築法とそこからの分子間相互作用を阻害するペプチドの取得法
以下では、後述の実施例の項で取り上げるBcl-2を標的タンパク質とした場合のペプチドライブラリーの構築法とそこからの阻害ペプチド取得法について述べる（図４）。ここで説明される態様はあくまで例示であり、本発明はこの態様に限定されない。
【００８３】
標的タンパク質Bcl-2
細胞のプログラムされた死であるアポトーシスにはさまざまな経路があるが、その１つとしてBcl-2タンパク質が寄与している制御機構が存在する。Bcl-2タンパク質はアポトーシスを誘導するタンパク質と結合することでその活性を抑制する。Bcl-2タンパク質は、癌化した細胞中では多く発現しているために、アポトーシスが誘導されにくくなっていることが知られている。
そこで、Bcl-2に高選択的かつ強力に結合する分子が獲得できれば、それがBcl-2とアポトーシス誘導タンパク質との結合を阻害し、癌化した細胞にアポトーシスを導くことが可能となる。したがって、近年この阻害分子が精力的に研究されてきたが、このようなタンパク質同士の相互作用を阻害する分子の開発は難しかった。この分子間相互作用にはBcl-2タンパク質に含まれるBH3ドメインと呼ばれるヘリックス構造が利用されていることから、ヘリックス構造を持つ分子のライブラリーを形成させることが出来れば、そこから高選択的、かつ強力な阻害剤を得ることが可能であると考えられ、前述のアルケン形成による架橋ペプチドによる化学ライブラリーからの探索もおこなわれた。しかし、強力な阻害活性を有する分子は得られていない。
【００８４】
mRNA ライブラリーの構築
まず、ペプチドライブラリーを翻訳で構築するために、鋳型となるmRNA ライブラリーを調製する。mRNA の翻訳される部分の配列の長さは、任意である。例えば、16〜24コドンを含む長さのものとすることができる（例えば、図５のpool 16-1から24-4）。このうち、N末端は開始AUGコドンである。また、C末端側にはリンカーとなるGlySerGlySerGlySerをコードするコドンが付加してもよい。開始AUGコドンの下流は、NNUもしくはNNCのランダムなコドン配列とすることができる（Nは A, U, G, C のいずれか一つの塩基をそれぞれ表す。）。このランダム配列中の特定の１コドンを、式（Ｉ）の特殊アミノ酸導入用にAUGコドンとし、そこから２、３、６、又は１０アミノ酸単位離れた位置にCysをコードするコドンUGCを配置する(例えば、図２及び図５)。
【００８５】
ペプチドライブラリーの構築
得られたmRNAライブラリーを改変された遺伝暗号表の下で翻訳する。例えば、通常の２０種類のアミノ酸からメチオニンが除去された翻訳系を構築し、代わりに、（i）tRNAfMetCAUにNα−アセチル化アミノ酸を連結させたもの、（ii）tRNAAsnE2CAUにプロパルギルクロリド構造を側鎖に持つ特殊アミノ酸を連結させたものを利用して鋳型mRNAを翻訳する。これら２つのアミノアシルtRNAは、フレキシザイムを用いて調製することができる。
ここで、（i）のアミノアシルtRNAは開始因子に認識されて開始AUGコドンに対合するのに対し、（ii）のアミノアシルtRNAは伸長因子に認識されてAUGコドンと対合する。このために、メチオニンを除去するだけで、AUGコドンに２種類のアミノ酸を導入することが可能である。翻訳されたペプチドにおいては、プロパルギルクロリド構造にシステインのスルファニル基が作用して得られるチオエーテル結合により、架橋構造が形成される。
さらに、mRNAライブラリーの各mRNAの3'末端にピューロマイシンを結合させておくことにより、翻訳後、ペプチドのC末端がPu（ピューロマイシン）を介してmRNAと連結される。開始には、Nα-アセチル- L-フェニルアラニン以外の任意の特殊アミノ酸、又はメチオニン若しくは他の19種類のタンパク質性アミノ酸を利用してもよい。
【００８６】
阻害ペプチドの獲得
得られたペプチドライブラリーをmRNA ディスプレイ法やリボソームディスプレイ法などの各種in vitro ディスプレイ法によりスクリーニングし、Bcl-2に結合するペプチドを選択する。
標的タンパク質と相互作用するBH3ドメインのようなヘリックス構造が翻訳ペプチド中で安定に形成されるように設計された、二次構造指向性のペプチドライブラリーを用いているので、結合だけを指標にスクリーニングを行っても、得られたペプチドは標的タンパク質の分子認識部位に結合し、その分子間相互作用を阻害する可能性が高い。
【００８７】
異なる標的に対するペプチドライブラリーの構築
本発明は、BCl-2に限らず、種々の分子を標的とするスクリーニングに応用される。標的分子としては、分子間相互作用がヘリックス構造を認識して行われるものが好ましく選択される。ヘリックス構造を認識して分子間相互作用をする分子としては、例えば、p53やhDM2が挙げられるが（F. Bernal, A. F. Tyler, S. J. Korsmeyer, L. D. Walensky, G. L. Verdine J. Am. Chem. Soc. 129 2456-2457 (2007).）、これらに限定されない。
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００８８】
Bcl-2のBH3ドメインによる分子間相互作用部位に結合しその分子間相互作用を阻害するペプチドを獲得するために、配列中に特殊アミノ酸とシステインから形成される架橋構造を備えたペプチドライブラリー（NNU mRNAライブラリー）を構築し、mRNA ディスプレイ法によって選択を行った。【００８９】
NNU mRNAライブラリー
まず、下記の配列を有する二本鎖DNAを調製した。（以下では、Forward 鎖のみを 5'→ 3'の順で記載する。）
TAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAT(ATG)(NNT)s(ATG)(NNT)3(TGC)(NNT)t(GGT)(AGC)(GGC)(AGC)(GGC)(AGC)(TAG)GACGGGGGGCGGAAA 
翻訳領域は一つのコドンを一つの( )で括った。Nは A, T, G, C のいずれか一つを表す。ｓとtはトリプレットの繰り返しの数を表し、それぞれ、２と８、あるいは６と４、あるいは２と１２、あるいは６と８、あるいは１０と４、あるいは２と１６、あるいは６と１２、あるいは１０と８、あるいは１４と４、に相当する。
続いてこれをT7 RNA ポリメラーゼを用いて転写し、下記の配列で表される mRNA プールからなるライブラリーを得た（図５の下の表を参照されたい。）。
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAU(AUG)(NNU)s(AUG)(NNU)3(UGC)(NNU)t(GGU)(AGC)(GGC)(AGC)(GGC)(AGC)(UAG)GACGGGGGGCGGAAA 
上記の転写産物を等量ずつ混合し、下記の実験に使用した。【００９０】
mRNA display
以下の「ピューロマイシンリンカーとの連結」から「回収したペプチドの配列情報の増幅」までのサイクルを繰り返すことで、ランダムなペプチドライブラリーからBcl-2に結合するペプチドを選択した（図４）。【００９１】
ピューロマイシンリンカーとの連結
下記の配列で表されるピューロマイシンリンカーを上記の mRNA ライブラリーとアニールさせ、T4 RNA ligase で連結した。SPC18 はCとOの総数が18であるPEGを表す。
pdCTCCCGCCCCCCGTCC(SPC18)5CC(Pu)【００９２】
翻訳
リンカーと連結された mRNA を改変された遺伝暗号表の下で翻訳した（図６）。本実施例では、通常の２０種類のアミノ酸からメチオニンを除去した翻訳系を構築し、代わりに、フレキシザイムを用いて調製された、以下の(i)及び(ii)の２種類のアミノアシルtRNA：
（i）tRNAfMetCAUにNα-アセチル- L-フェニルアラニンを連結させたもの、
（ii）tRNAAsnE2CAUに
(s)-2-アミノ-6-クロロヘキシ-４-イオニック酸(X0)、
(s)-2-アミノ-7-クロロヘプト-5-イオニック酸(X1)、
(s)-2-アミノ-8-クロロヘプト-6-イオニック酸(X2)
をそれぞれ連結させたものを添加して翻訳を行った。
翻訳に続き、これらの特殊アミノ酸に含まれるプロパルギルクロリド構造とシステインのスルファニル基との間でチオエーテル結合が形成され、架橋ペプチドライブラリーが合成され、ペプチドのC末端にPuを介してmRNAが結合した複合体が構築された。【００９３】
Bcl-2に結合するペプチドの取得
TALONビーズに固定化したBcl-2に、調製した架橋ペプチドライブラリーを混合し、4°Cで30分間撹拌した。磁石を利用して上澄みを除去し、残った磁性粒子をバッファーで洗浄した。ビーズにPCR用の溶液を加えて95°Cで５分間加熱し、ペプチドをビーズからはずし、上澄みを回収した。【００９４】
回収したペプチドの配列情報の増幅
Bcl-2に結合して回収されてきたペプチド−mRNAを、逆転写・PCRによってDNAとして増幅した。得られたDNAを転写してmRNAとした。【００９５】
選択されたペプチド配列の同定
上記の一連の操作を繰り返し、ペプチド−mRNAの回収率が飽和したところで、増幅されたDNAを用いてTAクローニングを行い、得られたペプチドの配列を同定した。【００９６】
結果
NNU mRNAライブラリーを翻訳すると、ランダム配列中のAUGコドンが側鎖にプロパルギルクロリドを備えた特殊アミノ酸分子に翻訳され、そこから４アミノ酸単位はなれた位置にコードされたシステインのスルファニル基との間に共有結合が形成され、架橋ペプチドライブラリーが生成する。このペプチドライブラリーを用いてmRNA ディスプレイを行ったところ、プロパルギルクロリドとアミノ酸主鎖構造の間のリンカー長の異なる３種類、すなわち、(s)-2-アミノ-6-クロロヘキシ-４-イオニック酸(X0)、(s)-2-アミノ-7-クロロヘプト-5-イオニック酸(X1)、(s)-2-アミノ-8-クロロヘプト-6-イオニック酸(X2)の３つの特殊アミノ酸のうち、いずれを用いたペプチドライブラリーにおいても、7ラウンド目でmRNAの回収率が飽和した。
そこで、6ラウンド後のペプチド配列を同定したところ、大部分の配列が架橋構造をもち、その配列の中央付近に２つのアスパラギン酸を有するペプチドが得られていることが分った（表１）。濃縮されたペプチド配列において、２つのアスパラギン酸を有する共通の構造が見られたことは、ｍＲＮＡディスプレイ法により、Ｂｃｌ−２との相互作用を阻害する分子が期待通り得られたことを示唆する。
【表４】
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以上の結果から、ペプチドの架橋構造を含むペプチドを用いて、in vitro ディスプレイが有効に機能することが確認できた。【００９７】
選択されたペプチドのBcl-2結合能力評価
次に、上表に示されたアミノ酸配列を有する架橋ペプチドをFmoc固相法により合成し、SPR(Surface Plasmon Resonance)を利用した評価法によって解離定数（KD）を算出することにより、結合能力を評価した。
具体的にはまず、Niを結合できる基板にNiCl2を含む溶液を流してから、His tagをC末端側に備えたBcl-2タンパク質を流すことによって基板上にタンパク質を固定化させた。その後、固相合成したペプチドを含む溶液を適切な濃度で順次加えていき、そのときに基板上の重さに依存した屈折率の変化を読み取ることによってそのペプチドの結合速度と解離速度を算出することによって結合力を評価した。結果を下表に示す。
【表５】
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合成したペプチド全てがKD=1 nMより小さな値を示す強力な結合能を示すことが分った。
【配列表フリーテキスト】
【００９８】
配列番号１  フレキシザイム Fx
配列番号２  ジニトロベンジルフレキシザイムdFx
配列番号３  エンハンスドフレキシザイムeFx
配列番号４  アミノフレキシザイム aFx
配列番号５  tRNAAsn-E2
配列番号６  tRNAfMet
配列番号７  大腸菌のtRNAAsn
配列番号８  大腸菌のtRNAfMet
【図３】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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