(57)【要約】ＲＮＡ分解酵素に安定な、ＲＮＡ干渉作用を有するポリヌクレオチド等を提供すること。  標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有する２本鎖ポリヌクレオチドを由来とし、このアンチセンス鎖の５’末端およびセンス鎖の３’末端が、各々においてリン酸ジエステル構造を形成したフェニル基を含有するリンカーによって結合されている構造を有する１本鎖ポリヌクレオチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドであって、該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端と該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端の各々において、リン酸ジエステル構造を形成している次式で示される構造のリンカーによって結合されたポリヌクレオチド又はその塩
【化１】
2012074038.tif 000025
式中、
フェニル基に結合している酸素原子は、アンチセンス鎖の５’末端に結合してリン酸ジエステル構造を形成し、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のいずれか１個は、次式で示される構造：
−Ｌ１−（ＣＨ２）ｍ−Ｌ２−Ｌ３−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）n1−（ＣＨ２）n2−Ｏ→
を示すが、式中、
ｍは、０から４の整数を示し、
ｎ1は、０から４の整数を示し、
ｎ2は、０又は２から１０の整数を示し、
Ｌ１は、単結合又は−Ｏ−を示し、
Ｌ２は、単結合又は−ＣＨ（−ＮＨ−Ｌ４−Ｒ）−を示し、
Ｌ３は、Ｌ２との結合を基点として、単結合、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、又は−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−を示すが、
Ｌ３が単結合以外のとき、ｎ2は、２から１０の整数を示す。
Ｌ１及びＬ２が単結合であって、ｍが１、ｎ1およびｎ2が０であるときに、Ｌ３−Ｏ→は、
−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ−（アミノ酸残基）ｊ−Ｓｅｒ、
−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ−（アミノ酸残基）ｊ−Ｔｈｒ、
−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ−（アミノ酸残基）ｊ−Ｓｅｒ、又は
−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ−（アミノ酸残基）ｊ−Ｔｈｒ、
を示すが、これらのセリンおよびトレオニンの水酸基部分は、センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端のリン酸基と結合しており、さらにセリンおよびトレオニンのアミノ基はアシル基で置換されていてもよく、
ｊは、０から２の整数を示し、
Ｌ４は、単結合、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｋ−ＮＨ−、又は−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｋ−を示し、
ｋは１から６の整数を示し、
Ｒは、水素原子、炭素数１から６のアルキル基、飽和又は不飽和であってもよい炭素数２から３０の炭化水素カルボニル基、飽和又は不飽和であってもよい炭素数２から３０の炭化水素オキシカルボニル基を示す。
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうちの残りの２個は、各々独立に、
水素原子、
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基、
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルコキシ基、
ハロゲン原子、
炭素数１から９のアルキル基を有するアルキルカルボニルアミノ基、及び
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基を含むアルキルカルボニル基、
からなる群の基から選ばれる基を示す。
【請求項２】
Ｒ１及びＲ３が水素原子である、請求項１に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項３】
Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、ｍとｎ2の和が３以上の整数である、請求項２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項４】
Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、ｍとｎ2の和が８以上の整数である、請求項２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項５】
Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、ｍが０又は２であり、ｎ2が６以上の整数である、請求項２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項６】
Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、ｍが０又は２であり、ｎ2が６又は８である、請求項２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項７】
Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、ｍが０又は２であり、ｎ2が８である、請求項２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項８】
Ｒ１及びＲ３が水素原子であり、Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、ｍが２であり、ｎ2が８である、請求項１に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項９】
標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドであって、該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端と該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端がリン酸ジエステル結合を介してリンカーによって結合された次式で示される構造のポリヌクレオチド又はその塩
【化２】
2012074038.tif 000026
式中、
ｐは、０から４の整数を示し、
ｑは、４から１０の整数を示し、
Ｌ５は、単結合又は−Ｏ−を示し、
Ｌ６は、（ＣＨ２）ｐとの結合を基点として、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、又は−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−を示し、
Ｌ５のベンゼン環上の結合位置はパラ位又はメタ位であり、
Ｌ５が−Ｏ−であるときは、ｐは１から４の整数を示す。
【請求項１０】
ｐとｑの和が３以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項９に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項１１】
ｐとｑの和が８以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項９に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項１２】
ｐが０又は２であり、ｑが６以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項９に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項１３】
ｐが０又は２であり、ｑが６又は８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項９に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項１４】
ｐが０又は２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項９に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項１５】
ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項９に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項１６】
センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩：
５’−（γ−β）９−γ−λｔ−３’（ＩＩ）
５’−β−（γ−β）９−υｕ−３’（ＩＩＩ）
（ａ）γはＲＮＡ、βは２’−ＯＭｅＲＮＡ、λ及びυはＤＮＡを示す；
（ｂ）ｔ及びｕは同一又は異なって、０〜５のいずれかの整数を示す。；
（ｃ）式（ＩＩ）で示されるポリヌクレオチドのうち、（γ−β）９−γは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＩＩ）における（γ−β）９−γと式（ＩＩＩ）におけるβ―（γ−β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
【請求項１７】
センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＶ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（Ｖ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩：
５’−（α−β）９−αｐ−λｔ−３’（ＩＶ）
５’−δｓ−（α−β）９−υｕ−３’（Ｖ）
（ａ）α及びβは異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、δ及びλは同一又は異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、υは同一又は異なってはＤＮＡ、ＲＮＡ及び２’−ＯＭｅＲＮＡから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す；
（ｂ）ｐは０又は１の整数を示し、ｔはｐが０のときは０であり、ｐが１のときは０〜５のいずれかの整数を示す。ｓは０又は１の整数を示し、ｕは０〜５のいずれかの整数を示す。；
（ｃ）式（ＩＶ）で示されるポリヌクレオチドのうち、（α−β）９−αｐは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＩＶ）における（α−β）９と式（Ｖ）における（α−β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
【請求項１８】
センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に、以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩：
５’−β−（α−β）８−αｐ−λｔ−３’（ＶＩ）
５’−δｓ−（α−β）８−（α―β）−υｕ−３’（ＶＩＩ）
（ａ）α及びβは異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、δ及びλは同一又は異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、υは同一又は異なってはＤＮＡ、ＲＮＡ及び２’−ＯＭｅＲＮＡから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す；
（ｂ）ｐは０又は１の整数を示し、ｔはｐが０のときは０であり、ｐが１のときは０〜５のいずれかの整数を示す。ｓは０又は１の整数を示し、ｕは０〜５のいずれかの整数を示す；
（ｃ）式（ＶＩ）で示されるポリヌクレオチドのうち、β−（α−β）８−αｐは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＶＩ）における（α−β）８と式（ＶＩＩ）における（α−β）８は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
【請求項１９】
αがＤＮＡ、βが２’−ＯＭｅＲＮＡであることを特徴とする、請求項１７又は１８に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項２０】
λｔ及びυｕが同一又は異なってチミン塩基、アデニン塩基又はグアニン塩基を有するＤＮＡ、又は、ウラシル塩基、アデニン塩基又はグアニン塩基を有する２’−ＯＭｅＲＮＡのいずれかであることを特徴とする、請求項１６乃至１９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項２１】
ｔが０、ｕが２であることを特徴とする、請求項１６乃至２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項２２】
ｐ及びｔが０、ｓが１、ｕが２であることを特徴とする、請求項１７乃至２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項２３】
ｐ及びｔが０、ｓが０又は１、ｕが２であり、υ２がＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡであることを特徴とする、請求項１７乃至２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項２４】
センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＸ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に、以下の（ａ）乃至（ｃ）に示される特徴を有する、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩：
５’−（α−β）９−３’（ＶＩＩＩ）
５’−β−（α−β）９−（α−β）−３’（ＩＸ）
（ａ）αがＤＮＡ、βが２’−ＯＭｅＲＮＡである；
（ｂ）式（ＩＸ）で示されるポリヌクレオチドのうち、β−（α−β）９は標的遺伝子と相補的なヌクレオチド配列からなる；
（ｃ）式（ＶＩＩＩ）における（α−β）９と式（ＩＸ）における（α−β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
【請求項２５】
２’−ＯＭｅＲＮＡの任意の１〜４残基がＥＮＡ又は２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡに置換されていることを特徴とする、請求項１６乃至２４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項２６】
ＤＮＡの任意の１〜４残基がＲＮＡ、ＥＮＡ又は２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡに置換されていることを特徴とする、請求項１６乃至２５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項２７】
各ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合又はホスホロチオエート結合で結合していることを特徴とする、請求項１乃至２６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項２８】
請求項１乃至２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩を有効成分として含有する医薬。
【請求項２９】
遺伝子発現に由来する疾患を治療するための、請求項２８に記載の医薬。
【請求項３０】
請求項１乃至２９から選択されるポリヌクレオチド又はその塩を哺乳動物に投与することによる、標的遺伝子の発現抑制方法。
【請求項３１】
請求項１乃至２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩を含有する試薬。
【請求項３２】
式（Ｘ）
【化３】
2012074038.tif 000027
[式中、Ｔｒは、水酸基の保護基を示し、ｐは、０から４の整数を示し、ｑは、４から１０の整数を示し、Ｌ５は、単結合又は−Ｏ−を示し、Ｌ６は、（ＣＨ２）ｐとの結合を基点として、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、又は−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−を示し、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置はパラ位又はメタ位である。]を有する化合物又はその塩。
【請求項３３】
Ｔｒが４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、ピクシル基、トリチル基、レブリニル基、又はビス（トリメチルシリルオキシ）（シクロヘキシルオキシ）シリル基である、請求項３２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項３４】
Ｔｒが４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐとｑの和が３以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項３２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項３５】
Ｔｒが４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐとｑの和が８以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項３２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項３６】
Ｔｒが４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが６以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項３２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項３７】
Ｔｒが４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが６又は８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項３２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項３８】
Ｔｒが４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項３２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項３９】
Ｔｒが４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項３２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項４０】
Ｔｒが４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項３２に記載の化合物又はその塩。
【請求項４１】
標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドであって、該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端と該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端がリン酸ジエステル結合を介してＸによって結合された、式（ＸＩ）
【化４】
2012074038.tif 000028
を有する化合物[式中、Ｗ２’は、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いたセンス鎖ポリヌクレオチドを示し、Ｗ１’−Ｙ’は、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いたアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを示し、Ｘは、式（ＸＩＩ）
【化５】
2012074038.tif 000029
[式中、ｐは、０から４の整数を示し、ｑは、４から１０の整数を示し、Ｌ５は、単結合又は−Ｏ−を示し、Ｌ６は、（ＣＨ２）ｐとの結合を基点として、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、又は−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−を示し、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置はパラ位又はメタ位であり、Ｌ５が−Ｏ−であるときは、ｐは１から４の整数を示す。] を示し、末端のメチレン基は該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成し、フェニル基に結合している酸素原子は該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成する。]を製造する方法であって、
（i）式Ｔｒ−Ｏ−Ｘ−Ｈ[式中、Ｔｒは、水酸基の保護基を示し、Ｘの−（ＣＨ２）ｑ−はＴｒ−Ｏ−に結合し、フェニル基に結合している酸素原子は水素に結合する。]を有する化合物の水酸基を、式（ＸＩＩＩ）
【化６】
2012074038.tif 000030
又は、式（ＸＩＶ）
【化７】
2012074038.tif 000031
[式中、Ｒ４は、２−シアノエチル基、メチル基、メタンスルホニルエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、又は４−クロロフェニルメチル基を示し、Ｒ５は、モルホリノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、又はジメチルアミノ基を示す。] を有する化合物と反応させて、式（ＸＶ）
【化８】
2012074038.tif 000032
を有する化合物を製造する工程；
（ii）上記（i）で得られた化合物をホスホロアミダイト法により、式ＨＯ−Ｗ１−Ｙ−ＣＰＧ[式中、Ｗ１−Ｙは、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いた保護されたアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを示し、ＣＰＧは、ポリヌクレオチドと結合しうるリンカーを有するポリマーサポートを示す。]を有する化合物と反応させて、続いて、ホスホロアミダイト法により、式Ｔｒ１−Ｏ−Ｗ２−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ４）−Ｏ−[式中、Ｔｒ１は、水酸基の保護基を示し、Ｗ２は、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いた保護されたセンス鎖ポリヌクレオチドを示す。]部分を製造し、式（ＸＶＩ）
【化９】
2012074038.tif 000033
を有する化合物を製造する工程；及び、
（iii）上記（ii）で得られた化合物をＣＰＧより切り出し、保護基の除去を行う工程からなる、式（ＸＩ）を有する化合物を製造する方法。
【請求項４２】
Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、ピクシル基、トリチル基、レブリニル基、又はビス（トリメチルシリルオキシ）（シクロヘキシルオキシ）シリル基である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐとｑの和が３以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐとｑの和が８以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが６以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが６又は８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
Ｔｒ及びＴｒ１が、４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
Ｒ４が２−シアノエチル基、メチル基、メタンスルホニルエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、又は４−クロロフェニルメチル基であり、Ｒ５がモルホリノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、又はジメチルアミノ基である、請求項４１乃至４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
Ｒ４が２−シアノエチル基又はメチル基であり、Ｒ５がモルホリノ基又はジイソプロピルアミノ基である、請求項４１乃至４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
式（ＸＩＩＩ）を有する化合物が、クロロ（モルホリノ）メトキシホスフィン、クロロ（モルホリノ）シアノエトキシホスフィン、クロロ（ジイソプロピルアミノ）メトキシホスフィン又はクロロ（ジイソプロピルアミノ）シアノエトキシホスフィンである、請求項４１乃至４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
式（ＸＩＶ）を有する化合物が、ビス（ジイソプロピルアミノ）シアノエトキシホスフィンである、請求項４１乃至４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
下記から選択されるポリヌクレオチド又はその塩
ＨＯ−Ｃｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＨＳ−００５）、
ＨＯ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＨＳ−００６）、
ＨＯ−Ｃｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｓ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＨＳ−００５ｓ）、又は、
ＨＯ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｓ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＨＳ−００６ｓ）
[式中、Ａｐ、Ｇｐ、Ｃｐ、Ｔｐ、Ｔｓ、Ａｍ１ｐ、Ｇｍ１ｐ、Ｃｍ１ｐ、Ｕｍ１ｐ、Ｕｍ１ｔは次式で示される構造のヌクレオシド、又は、ヌクレオチドを示し、
【化１０】
2012074038.tif 000034
Ｘの前方は、標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチドを示し、Ｘの後方は、該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを示し、Ｘは式（ＸＶＩＩ）
【化１１】
2012074038.tif 000035
で示される構造のリンカーを示し、末端のメチレン基は該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成し、フェニル基に結合している酸素原子は該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成する。]。
【請求項５５】
請求項５４に記載のポリヌクレオチド又はその塩を有効成分として含有する医薬。
【請求項５６】
Ｈｓｐ４７遺伝子の発現に由来する疾患を治療するための、請求項５５に記載の医薬。
【請求項５７】
Ｈｓｐ４７遺伝子の発現に由来する疾患が線維症である、請求項５６に記載の医薬。
【請求項５８】
請求項５４に記載のポリヌクレオチド又はその塩を哺乳動物に投与することによる、Ｈｓｐ４７遺伝子の発現抑制方法。
【請求項５９】
請求項５４に記載のポリヌクレオチド又はその塩を含有する試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する１本鎖ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドの使用、該ポリヌクレオチドを用いた遺伝子発現抑制方法、該ポリヌクレオチドを含有する医薬等に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞、組織、あるいは個体内の標的遺伝子の発現を阻害する方法として、当該細胞、組織、あるいは個体内に２本鎖ＲＮＡを導入する手法がある。２本鎖ＲＮＡの導入によって、その配列に相同性を持つｍＲＮＡが分解され、標的遺伝子の発現が阻害される。この効果は「ＲＮＡ干渉」又は「ＲＮＡｉ」と呼ばれている。ＲＮＡ干渉は最初に線虫で報告され（例えば、非特許文献１参照。）、その後に植物でも報告されている（例えば、非特許文献２参照。）。【０００３】
３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有する、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれ２１ヌクレオチドからなる２本鎖ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ）は、脊椎動物の培養細胞において、ＲＮＡ干渉作用を有することが報告されている（例えば、非特許文献３参照。）。ｓｉＲＮＡは遺伝子機能の同定、有用物質生産に適した細胞株のスクリーニング、疾患に関与する遺伝子の制御等に有用であるとされているが、ＲＮＡ分解酵素によって容易に分解されるという性質を有する（例えば、非特許文献４参照。）。【０００４】
ＲＮＡ分解酵素に対して安定なＲＮＡ干渉作用を有する２本鎖ポリヌクレオチドとしては、ｓｉＲＮＡを構成するＲＮＡの代わりにＤＮＡ及び２’−ＯＭｅＲＮＡを交互に組み合わせたヌクレオチドユニットを有する２本鎖ポリヌクレオチドが報告されている（特許文献１参照）。【０００５】
ｓｉＲＮＡのセンス鎖、アンチセンス鎖の５’末端の修飾に関しては、幾つかの報告がある。センス鎖、又は、アンチセンス鎖の５’末端に６−アミノヘキシルリン酸基を有するｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ発現抑制活性があると報告されている（例えば、非特許文献５参照。）。一方、アンチセンス鎖の５’末端に同じ６−アミノヘキシルリン酸基を有するｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ発現抑制活性がないと報告されている（例えば、非特許文献６参照。）。また、センス鎖の５’末端に３−アミノプロピルリン酸基を有するｓｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡ発現抑制活性があるが、アンチセンス鎖の５’末端に３−アミノプロピルリン酸基を有するｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ発現抑制活性がないと報告されている（例えば、非特許文献７参照。）。アンチセンス鎖の５’末端に同様の６−アミノヘキシルリン酸基又は３−アミノプロピルリン酸基を有するｓｉＲＮＡは、未修飾ｓｉＲＮＡと比較し、標的ｍＲＮＡ発現抑制活性の低下が見られるが完全に活性が失われるものでないと報告されている（例えば、非特許文献８参照。）。【０００６】
センス鎖又はアンチセンス鎖の５’末端にフルオレセインを有するｓｉＲＮＡにおいても標的ｍＲＮＡ発現抑制活性を有すると報告されている（例えば、非特許文献９参照。）。センス鎖又はアンチセンス鎖の５’末端にステロイド又は脂質の構造を有するｓｉＲＮＡにおいて、センス鎖の５’末端にステロイド又は脂質の構造を有するｓｉＲＮＡでは、標的ｍＲＮＡの発現を抑制する活性を有すると報告されている（例えば、非特許文献８参照。）。ＵＶ照射により脱離することができるオルトニトロベンジル誘導体をアンチセンス鎖の５’末端に有する場合、ＵＶ照射を用いて標的ｍＲＮＡ発現抑制する活性を制御できると報告している（例えば、非特許文献１０参照。）。【０００７】
センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端を、４つ程度のヌクレオチドユニットからなるループで結合したsiRNAは、１本鎖ポリヌクレオチドになり、short hairpin RNA（ｓｈRNA)と呼ばれている。ステム部分が１９塩基対であるｓｈRNAは、それと同じ塩基配列を有する１９塩基対のsiRNAと比較して、活性が低下することが示されている（例えば、非特許文献９参照。）。また、ループ内の２つのヌクレオチドをプロピルリン酸ユニットなどの非ヌクレオチドリンカーで置き換えた１９塩基対のステムからなるｓｈＲＮＡが合成され、標的mRNA発現抑制活性が測定されたが、未修飾shRNAと比較して活性の向上は認められていない（例えば、非特許文献９参照。）。センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端を非ヌクレオチドリンカーで結合したsiRNAとして、オルトニトロベンジル誘導体を用いた例がある（例えば、非特許文献８参照。）。このオルトニトロベンジル誘導体で結合した１９塩基対のsiRNAは、未修飾siRNAと比較して標的mRNA発現抑制活性が低下している。さらに、このsiRNAをトランスフェクトした培養細胞に１０分間UV照射し、標的mRNA発現抑制活性が測定されたが、未修飾siRNAと比較して標的mRNA発現抑制活性が低下している。アンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端が、各々においてリン酸ジエステル構造を形成したフェニル基を含有するリンカーによって結合されている構造を有する１本鎖ポリヌクレオチドは知られていない。【０００８】
ＲＮＡｉ活性に関与することが知られているＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質（Ａｇｏ）とアンチセンス鎖の複合体Ｘ線解析から、アンチセンス鎖の５’末端のリン酸基及びその近傍のヌクレオチドがＡｇｏのＰＩＷＩドメインに強く結合していることが示されている（例えば、非特許文献１１参照。）。化学合成したｓｉＲＮＡを細胞内へ導入すると、センス鎖とアンチセンス鎖の両方の５’末端がリン酸化されることが報告されている（例えば、非特許文献１２参照。）。ヒトの細胞においては、ＲＮＡキナーゼ  ｈＣｌｐ１がｓｉＲＮＡの５’−リン酸化を担っていることが報告されている（例えば、非特許文献１３参照。）。５’末端をリン酸化したｓｉＲＮＡと、５’末端をリン酸化していないｓｉＲＮＡを細胞内に導入しＲＮＡｉ活性を比較すると、両者の活性に差が見られなかったことから、５’末端非リン酸化ｓｉＲＮＡは細胞内で容易にリン酸化を受けると考えられている（例えば、非特許文献９参照。）。【０００９】
センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端がループで結合したｓｈRNAを用いた場合は、細胞内でDicer若しくはエンドヌクレアーゼによって切断され、５’末端のリン酸基を有するアンチセンス鎖が生成する（例えば、非特許文献９参照。）。ループ内の２つのヌクレオチドをプロピルリン酸ユニットで置き換えた１９塩基対のステムからなるｓｈＲＮＡでは、プロピルリン酸ユニットがヌクレアーゼ耐性であるために、細胞内でDicer若しくはエンドヌクレアーゼによる切断が期待できない（例えば、非特許文献９参照。）。また、オルトニトロベンジル誘導体をループに持つ１９塩基対のshRNAは、UV照射により５’末端のリン酸基を有するアンチセンス鎖が生成することが期待できるが、副作用の懸念や生体内部への送達を考慮すると、UV照射を生体へ応用することが困難である（例えば、非特許文献８参照。）。UV照射することなく、細胞内でDicer若しくはエンドヌクレアーゼによって切断されて５’末端のリン酸基を有するアンチセンス鎖が生成し、非ヌクレオチドのみからなるリンカーをループに持ち、１９塩基対以下のステムからなる１本鎖ポリヌクレオチドは知られていない。【００１０】
本発明者らは、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有するポリヌクレオチドを取得すべく、鋭意研究を行ったところ、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する、標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有する２本鎖ポリヌクレオチドを由来とし、このアンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端が、各々においてリン酸ジエステル構造を形成したフェニル基を含有するリンカーによって結合されている構造を有する１本鎖ポリヌクレオチドを見出し、本発明を完成させた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２０１０／００１９０９号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ、１９９８年、第３９１巻、ｐ．８０６−８１１
【非特許文献２】Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、第２８６巻、ｐ．９５０−９５２
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ、２００１年、第４１１巻、ｐ．４９４−４９８
【非特許文献４】Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２年、第４８巻、ｐ．１６４７−１６５３
【非特許文献５】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ、２００２年、第１０巻、ｐ．５３７−５４８
【非特許文献６】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３年、第３１巻、ｐ．２７０５−２７１６
【非特許文献７】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ、２００２年、第１０巻、ｐ．５４９−５６１
【非特許文献８】Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、２００７年、第１７巻、ｐ．３５−４３
【非特許文献９】Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２００３年、第１３巻、ｐ．８３−１０５
【非特許文献１０】Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、２００６年、第１７５８巻、ｐ．  ３９４−４０３
【非特許文献１１】Ｎａｔｕｒｅ，２００５年、第４３４巻、ｐ．６６３−６６６
【非特許文献１２】Ｃｅｌｌ、２００１年、第１０７巻、ｐ．３０９−３２１
【非特許文献１３】Ｎａｔｕｒｅ、２００７年、第４４７巻、ｐ．２２２−２２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の一つの課題は、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有するポリヌクレオチドを提供することである。【００１４】
本発明の一つの課題は、ＲＮＡ分解酵素に安定なＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有するポリヌクレオチドを提供することである。【００１５】
本発明の他の一つの課題は上記ポリヌクレオチドによって遺伝子発現を抑制する方法を提供することである。【００１６】
本発明の他の一つの課題は上記ポリヌクレオチドを含有する医薬品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
すなわち、本発明は、
（１）標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドであって、該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端と該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端の各々において、リン酸ジエステル構造を形成している次式で示される構造のリンカーによって結合されたポリヌクレオチド又はその塩【００１８】
【化１】
2012074038.tif 000002
【００１９】
式中、
フェニル基に結合している酸素原子は、アンチセンス鎖の５’末端に結合してリン酸ジエステル構造を形成し、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のいずれか１個は、次式で示される構造：
−Ｌ１−（ＣＨ２）ｍ−Ｌ２−Ｌ３−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）n1−（ＣＨ２）n2−Ｏ→
を示すが、式中、
ｍは、０から４の整数を示し、
ｎ1は、０から４の整数を示し、
ｎ2は、０又は２から１０の整数を示し、
Ｌ１は、単結合又は−Ｏ−を示し、
Ｌ２は、単結合又は−ＣＨ（−ＮＨ−Ｌ４−Ｒ）−を示し、
Ｌ３は、Ｌ２との結合を基点として、単結合、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、又は−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−を示すが、
Ｌ３が単結合以外のとき、ｎ2は、２から１０の整数を示す。
Ｌ１及びＬ２が単結合であって、ｍが１、ｎ1およびｎ2が０であるときに、Ｌ３−Ｏ→は、
−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ−（アミノ酸残基）ｊ−Ｓｅｒ、
−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ−（アミノ酸残基）ｊ−Ｔｈｒ、
−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ−（アミノ酸残基）ｊ−Ｓｅｒ、又は
−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ−（アミノ酸残基）ｊ−Ｔｈｒ、
を示すが、これらのセリンおよびトレオニンの水酸基部分は、センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端のリン酸基と結合しており、さらにセリンおよびトレオニンのアミノ基はアシル基で置換されていてもよく、
ｊは、０から２の整数を示し、
Ｌ４は、単結合、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｋ−ＮＨ−、又は−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｋ−を示し、
ｋは１から６の整数を示し、
Ｒは、水素原子、炭素数１から６のアルキル基、飽和又は不飽和であってもよい炭素数２から３０の炭化水素カルボニル基、飽和又は不飽和であってもよい炭素数２から３０の炭化水素オキシカルボニル基を示す。
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうちの残りの２個は、各々独立に、
水素原子、
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基、
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルコキシ基、
ハロゲン原子、
炭素数１から９のアルキル基を有するアルキルカルボニルアミノ基、及び
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基を含むアルキルカルボニル基、
からなる群の基から選ばれる基を示す、
（２）Ｒ１及びＲ３が水素原子である、（１）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（３）Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、ｍとｎ2の和が３以上の整数である、（２）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（４）Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、ｍとｎ2の和が８以上の整数である、（２）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（５）Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、ｍが０又は２であり、ｎ2が６以上の整数である、（２）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（６）Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、ｍが０又は２であり、ｎ2が６又は８である、（２）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（７）Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、ｍが０又は２であり、ｎ2が８である、（２）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（８）Ｒ１及びＲ３が水素原子であり、Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、ｍが２であり、ｎ2が８である、（１）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（９）標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドであって、該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端と該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端がリン酸ジエステル結合を介してリンカーによって結合された次式で示される構造のポリヌクレオチド又はその塩【００２０】
【化２】
2012074038.tif 000003
【００２１】
式中、
ｐは、０から４の整数を示し、
ｑは、４から１０の整数を示し、
Ｌ５は、単結合又は−Ｏ−を示し、
Ｌ６は、（ＣＨ２）ｐとの結合を基点として、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、又は−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−を示し、
Ｌ５のベンゼン環上の結合位置はパラ位又はメタ位であり、
Ｌ５が−Ｏ−であるときは、ｐは１から４の整数を示す、
（１０）ｐとｑの和が３以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（９）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（１１）ｐとｑの和が８以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（９）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（１２）ｐが０又は２であり、ｑが６以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（９）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（１３）ｐが０又は２であり、ｑが６又は８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（９）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（１４）ｐが０又は２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（９）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（１５）ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（９）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（１６）センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、（１）乃至（１５）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩：
５’−（γ−β）９−γ−λｔ−３’（ＩＩ）
５’−β−（γ−β）９−υｕ−３’（ＩＩＩ）
（ａ）γはＲＮＡ、βは２’−ＯＭｅＲＮＡ、λ及びυはＤＮＡを示す；
（ｂ）ｔ及びｕは同一又は異なって、０〜５のいずれかの整数を示す。；
（ｃ）式（ＩＩ）で示されるポリヌクレオチドのうち、（γ−β）９−γは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＩＩ）における（γ−β）９−γと式（ＩＩＩ）におけるβ―（γ−β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる、
（１７）センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＶ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（Ｖ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、（１）乃至（１５）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩：
５’−（α−β）９−αｐ−λｔ−３’（ＩＶ）
５’−δｓ−（α−β）９−υｕ−３’（Ｖ）
（ａ）α及びβは異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、δ及びλは同一又は異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、υは同一又は異なってはＤＮＡ、ＲＮＡ及び２’−ＯＭｅＲＮＡから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す；
（ｂ）ｐは０又は１の整数を示し、ｔはｐが０のときは０であり、ｐが１のときは０〜５のいずれかの整数を示す。ｓは０又は１の整数を示し、ｕは０〜５のいずれかの整数を示す。；
（ｃ）式（ＩＶ）で示されるポリヌクレオチドのうち、（α−β）９−αｐは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＩＶ）における（α−β）９と式（Ｖ）における（α−β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる、
（１８）センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に、以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、（１）乃至（１５）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩：
５’−β−（α−β）８−αｐ−λｔ−３’（ＶＩ）
５’−δｓ−（α−β）８−（α―β）−υｕ−３’（ＶＩＩ）
（ａ）α及びβは異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、δ及びλは同一又は異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、υは同一又は異なってはＤＮＡ、ＲＮＡ及び２’−ＯＭｅＲＮＡから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す；
（ｂ）ｐは０又は１の整数を示し、ｔはｐが０のときは０であり、ｐが１のときは０〜５のいずれかの整数を示す。ｓは０又は１の整数を示し、ｕは０〜５のいずれかの整数を示す；
（ｃ）式（ＶＩ）で示されるポリヌクレオチドのうち、β−（α−β）８−αｐは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＶＩ）における（α−β）８と式（ＶＩＩ）における（α−β）８は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる、
（１９）αがＤＮＡ、βが２’−ＯＭｅＲＮＡであることを特徴とする、（１７）又は（１８）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（２０）λｔ及びυｕが同一又は異なってチミン塩基、アデニン塩基又はグアニン塩基を有するＤＮＡ、又は、ウラシル塩基、アデニン塩基又はグアニン塩基を有する２’−ＯＭｅＲＮＡのいずれかであることを特徴とする、（１６）乃至（１９）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（２１）ｔが０、ｕが２であることを特徴とする、（１６）乃至（２０）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（２２）ｐ及びｔが０、ｓが１、ｕが２であることを特徴とする、（１７）乃至（２０）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（２３）ｐ及びｔが０、ｓが０又は１、ｕが２であり、υ２がＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡであることを特徴とする、（１７）乃至（２０）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（２４）センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＸ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に、以下の（ａ）乃至（ｃ）に示される特徴を有する、（１）乃至（１５）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩：
５’−（α−β）９−３’（ＶＩＩＩ）
５’−β−（α−β）９−（α−β）−３’（ＩＸ）
（ａ）αがＤＮＡ、βが２’−ＯＭｅＲＮＡである；
（ｂ）式（ＩＸ）で示されるポリヌクレオチドのうち、β−（α−β）９は標的遺伝子と相補的なヌクレオチド配列からなる；
（ｃ）式（ＶＩＩＩ）における（α−β）９と式（ＩＸ）における（α−β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる、
（２５）２’−ＯＭｅＲＮＡの任意の１〜４残基がＥＮＡ又は２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡに置換されていることを特徴とする、（１６）乃至（２４）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（２６）ＤＮＡの任意の１〜４残基がＲＮＡ、ＥＮＡ又は２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡに置換されていることを特徴とする、（１６）乃至（２５）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（２７）各ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合又はホスホロチオエート結合で結合していることを特徴とする、（１）乃至（２６）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（２８）（１）乃至（２７）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩を有効成分として含有する医薬、
（２９）遺伝子発現に由来する疾患を治療するための、（２９）に記載の医薬、
（３０）（１）乃至（２９）から選択されるポリヌクレオチド又はその塩を哺乳動物に投与することによる、標的遺伝子の発現抑制方法、
（３１）（１）乃至（２７）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩を含有する試薬。
（３２）式（Ｘ）【００２２】
【化３】
2012074038.tif 000004
【００２３】
[式中、Ｔｒは、水酸基の保護基を示し、ｐは、０から４の整数を示し、ｑは、４から１０の整数を示し、Ｌ５は、単結合又は−Ｏ−を示し、Ｌ６は、（ＣＨ２）ｐとの結合を基点として、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、又は−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−を示し、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置はパラ位又はメタ位である。]を有する化合物又はその塩、
（３３）Ｔｒが４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、ピクシル基、トリチル基、レブリニル基、又はビス（トリメチルシリルオキシ）（シクロヘキシルオキシ）シリル基である、（３２）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（３４）Ｔｒが４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐとｑの和が３以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（３２）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（３５）Ｔｒが４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐとｑの和が８以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（３２）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（３６）Ｔｒが４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが６以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（３２）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（３７）Ｔｒが４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが６又は８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（３２）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（３８）Ｔｒが４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（３２）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（３９）Ｔｒが４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（３２）に記載のポリヌクレオチド又はその塩、
（４０）Ｔｒが４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（３２）に記載の化合物又はその塩、
（４１）標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドであって、該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端と該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端がリン酸ジエステル結合を介してＸによって結合された、式（ＸＩ）【００２４】
【化４】
2012074038.tif 000005
【００２５】
を有する化合物[式中、Ｗ２’は、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いたセンス鎖ポリヌクレオチドを示し、Ｗ１’−Ｙ’は、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いたアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを示し、Ｘは、式（ＸＩＩ）【００２６】
【化５】
2012074038.tif 000006
【００２７】
[式中、ｐは、０から４の整数を示し、ｑは、４から１０の整数を示し、Ｌ５は、単結合又は−Ｏ−を示し、Ｌ６は、（ＣＨ２）ｐとの結合を基点として、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、又は−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−を示し、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置はパラ位又はメタ位であり、Ｌ５が−Ｏ−であるときは、ｐは１から４の整数を示す。] を示し、末端のメチレン基は該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成し、フェニル基に結合している酸素原子は該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成する。]を製造する方法であって、
（i）式Ｔｒ−Ｏ−Ｘ−Ｈ[式中、Ｔｒは、水酸基の保護基を示し、Ｘの−（ＣＨ２）ｑ−はＴｒ−Ｏ−に結合し、フェニル基に結合している酸素原子は水素に結合する。]を有する化合物の水酸基を、式（ＸＩＩＩ）【００２８】
【化６】
2012074038.tif 000007
【００２９】
又は、式（ＸＩＶ）【００３０】
【化７】
2012074038.tif 000008
【００３１】
[式中、Ｒ４は、２−シアノエチル基、メチル基、メタンスルホニルエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、又は４−クロロフェニルメチル基を示し、Ｒ５は、モルホリノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、又はジメチルアミノ基を示す。] を有する化合物と反応させて、式（ＸＶ）【００３２】
【化８】
2012074038.tif 000009
【００３３】
を有する化合物を製造する工程；
（ii）上記（i）で得られた化合物をホスホロアミダイト法により、式ＨＯ−Ｗ１−Ｙ−ＣＰＧ[式中、Ｗ１−Ｙは、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いた保護されたアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを示し、ＣＰＧは、ポリヌクレオチドと結合しうるリンカーを有するポリマーサポートを示す。]を有する化合物と反応させて、続いて、ホスホロアミダイト法により、式Ｔｒ１−Ｏ−Ｗ２−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ４）−Ｏ−[式中、Ｔｒ１は、水酸基の保護基を示し、Ｗ２は、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いた保護されたセンス鎖ポリヌクレオチドを示す。]部分を製造し、式（ＸＶＩ）【００３４】
【化９】
2012074038.tif 000010
【００３５】
を有する化合物を製造する工程；及び、
（iii）上記（ii）で得られた化合物をＣＰＧより切り出し、保護基の除去を行う工程からなる、式（ＸＩ）を有する化合物を製造する方法、
（４２）Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、ピクシル基、トリチル基、レブリニル基、又はビス（トリメチルシリルオキシ）（シクロヘキシルオキシ）シリル基である、（４１）に記載の方法、
（４３）Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐとｑの和が３以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（４１）に記載の方法、
（４４）Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐとｑの和が８以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（４１）に記載の方法、
（４５）Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが６以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（４１）に記載の方法、
（４６）Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが６又は８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（４１）に記載の方法、
（４７）Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（４１）に記載の方法、
（４８）Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（４１）に記載の方法、
（４９）Ｔｒ及びＴｒ１が、４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、（４１）に記載の方法、
（５０）Ｒ４が２−シアノエチル基、メチル基、メタンスルホニルエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、又は４−クロロフェニルメチル基であり、Ｒ５がモルホリノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、又はジメチルアミノ基である、（４１）乃至（４９）のいずれか１項に記載の方法、
（５１）Ｒ４が２−シアノエチル基又はメチル基であり、Ｒ５がモルホリノ基又はジイソプロピルアミノ基である、（４１）乃至（４９）のいずれか１項に記載の方法、
（５２）式（ＸＩＩＩ）を有する化合物が、クロロ（モルホリノ）メトキシホスフィン、クロロ（モルホリノ）シアノエトキシホスフィン、クロロ（ジイソプロピルアミノ）メトキシホスフィン又はクロロ（ジイソプロピルアミノ）シアノエトキシホスフィンである、（４１）乃至（４９）のいずれか１項に記載の方法、
（５３）式（ＸＩＶ）を有する化合物が、ビス（ジイソプロピルアミノ）シアノエトキシホスフィンである、（４１）乃至（４９）のいずれか１項に記載の方法、
（５４）下記から選択されるポリヌクレオチド又はその塩
ＨＯ−Ｃｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＨＳ−００５）、
ＨＯ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＨＳ−００６）、
ＨＯ−Ｃｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｓ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＨＳ−００５ｓ）、又は、
ＨＯ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｓ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＨＳ−００６ｓ）
[式中、Ａｐ、Ｇｐ、Ｃｐ、Ｔｐ、Ｔｓ、Ａｍ１ｐ、Ｇｍ１ｐ、Ｃｍ１ｐ、Ｕｍ１ｐ、Ｕｍ１ｔは次式で示される構造のヌクレオシド、又は、ヌクレオチドを示し、【００３６】
【化１０】
2012074038.tif 000011
【００３７】
Ｘの前方は、標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチドを示し、Ｘの後方は、該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを示し、Ｘは式（ＸＶＩＩ）【００３８】
【化１１】
2012074038.tif 000012
【００３９】
で示される構造のリンカーを示し、末端のメチレン基は該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成し、フェニル基に結合している酸素原子は該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成する。]、
（５５）（５４）に記載のポリヌクレオチド又はその塩を有効成分として含有する医薬、
（５６）Ｈｓｐ４７遺伝子の発現に由来する疾患を治療するための、（５５）に記載の医薬、
（５７）Ｈｓｐ４７遺伝子の発現に由来する疾患が線維症である、（５６）に記載の医薬、
（５８）（５４）に記載のポリヌクレオチド又はその塩を哺乳動物に投与することによる、Ｈｓｐ４７遺伝子の発現抑制方法、
（５９）（５４）に記載のポリヌクレオチド又はその塩を含有する試薬、
からなる。
【発明の効果】
【００４０】
本発明により、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有するポリヌクレオチドが提供された。また、本発明により、ＲＮＡ分解酵素、ホスファターゼ、及びエキソヌクレアーゼから選択される少なくともいずれか一つに対して安定なＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有するポリヌクレオチドが提供された。また本発明により、ＲＮＡ分解酵素、ホスファターゼ、及びエキソヌクレアーゼに対して安定なＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有するポリヌクレオチドが提供された。また、本発明により、センス鎖ポリヌクレオチドとアンチセンス鎖ポリヌクレオチドをそれぞれ製造する工程が不要であり、かつ両鎖が同量になるように正確に混合し２本鎖を形成させる煩雑な操作が不要であって、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有するポリヌクレオチドが提供された。該ポリヌクレオチドを用いて各種遺伝子の機能解析が可能になり、また、該ポリヌクレオチドを含む医薬品が提供される。【００４１】
また本発明により、該ポリヌクレオチドを得るために有用な合成中間体が提供された。また本発明により、該ポリヌクレオチドの製造方法が提供された。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】Ａ−１工程の概要を示す図。
【図２】Ｃ法及びＤ法の概要を示す図。
【図３】Ｅ法及びＦ法の概要を示す図。
【図４】Ｇ法の概要を示す図。
【図５】参考例３〜参考例１４、参考例１７、参考例２１〜参考例２３に記載の化合物の構造を示す図。
【図６】ヒトβ−カテニン遺伝子に対するポリヌクレオチドを示す図。以下、各図中、センス鎖、アンチセンス鎖の実施例のポリヌクレオチドの組み合わせを示す。シンボルのうち、黒丸（●）はＤＮＡ、白丸（○）は２’−Ｏ−メチルＲＮＡを示す。黒丸-白丸間の線は、ヌクレオシド間のリン酸ジエステル結合を示す。図中のｐは−Ｐ(＝Ｏ)(ＯＨ)−を示し、ｐが結合している場合、ポリヌクレオチドの末端の水酸基の水素原子は除かれる。ポリヌクレオチドの末端に何も結合してない場合、ＤＮＡ、或いは、２’−Ｏ−メチルＲＮＡの３’末端或いは５’末端はＯＨ基である。ｎは炭素数を示す。図７および図１１でも同じである。また、各ポリヌクレオチドの塩基配列も示す。
【図７】ヒトβ−カテニン遺伝子に対するポリヌクレオチドを示す図。
【図８】リアルタイムＰＣＲ解析によるポリヌクレオチドの遺伝子抑制活性を示す図。
【図９】リアルタイムＰＣＲ解析によるポリヌクレオチドの遺伝子抑制活性を示す図。
【図１０】参考例２４〜参考例３１に記載の化合物の構造を示す図。
【図１１】ヒトβ−カテニン遺伝子に対するポリヌクレオチドを示す図。
【図１２】リアルタイムＰＣＲ解析によるポリヌクレオチドの遺伝子抑制活性を示す図。
【図１３】ヒトβ−カテニン遺伝子に対するポリヌクレオチドを示す図。シンボルのうち、白四角（□）はＲＮＡ、黒丸（●）はＤＮＡ、白丸（○）は２’−Ｏ−メチルＲＮＡを示す。各ヌクレオシド間を結ぶ線は、リン酸ジエステル結合を示す。図中のｐは−Ｐ(＝Ｏ)(ＯＨ)−を示し、ｐが結合している場合、ポリヌクレオチドの末端の水酸基の水素原子は除かれる。ポリヌクレオチドの末端に何も結合してない場合、ＲＮＡ、ＤＮＡ、或いは、２’−Ｏ−メチルＲＮＡの３’末端或いは５’末端はＯＨ基である。ｎは炭素数を示す。図１５、図１６および図１９でも同じである。また、各ポリヌクレオチドの塩基配列も示す。
【図１４】リアルタイムＰＣＲ解析によるポリヌクレオチドの遺伝子抑制活性を示す図。
【図１５】マウスPKR遺伝子に対するポリヌクレオチドを示す図。
【図１６】ラット、ヒトＨｓｐ４７遺伝子に対するポリヌクレオチドを示す図。図中のｓはホスホロチオエート結合を示す。
【図１７】リアルタイムＰＣＲ解析によるポリヌクレオチドを遺伝子抑制活性を示す図。ポリヌクレオチドの濃度として、白色のバーは０．１ｎＭの場合を示し、黒色のバーは、１ｎＭの場合を示す。図１８および図２０でも同じである。
【図１８】リアルタイムＰＣＲ解析によるポリヌクレオチドを遺伝子抑制活性を示す図。
【図１９】ラット、ヒトＨｓｐ４７遺伝子に対するポリヌクレオチドを示す図。
【図２０】リアルタイムＰＣＲ解析によるポリヌクレオチドを遺伝子抑制活性を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
１．用語の説明
本明細書において、「標的遺伝子」とは、これを導入する細胞、組織、あるいは固体（以下これを「被導入体」と称することがある。）においてＲＮＡであれば特に制限されず、タンパク質に翻訳されるｍＲＮＡであってもタンパク質に翻訳されないノンコーディングＲＮＡであってもよい。ノンコーディングＲＮＡとしては、機能性ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡの非翻訳領域、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ型ｎｃＲＮＡ（ｍＲＮＡ−ｌｉｋｅｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ）、長鎖ｎｃＲＮＡ（ｌｏｎｇ  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）等が挙げられる。具体的には、導入する被導入体に内在性のものでも、遺伝子導入等の手法によって導入される外来性のものでもよい。また、染色体上に存在する遺伝子でも、染色体外のものでもよい。外来性の遺伝子としては、例えば、被導入体に感染可能なウイルス、バクテリア、真菌又は原生動物由来のものが挙げられるがこれらに制限されない。遺伝子の機能については既知のものでも未知のものでもよい。
【００４４】
そのような標的遺伝子の例としては、特定の疾患を有する患者において特異的に発現が上昇している及び／又は特異的に変異している遺伝子を挙げることができ、疾患としては、中枢疾患（例えば、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、炎症性疾患（例えば、アレルギー、リュウマチ、変形性関節症、エリテマトーデスなど）、循環器疾患（例えば、高血圧症、心肥大、狭心症、動脈硬化症、高コレステロール血症等）、癌（例えば、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膵臓癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌等）、呼吸器疾患（例えば、肺炎、気管支炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患など）、糖尿病、糖尿病網膜症、糖尿病性腎症、貧血（例えば、慢性疾患に伴う貧血、鉄不応性鉄欠乏性貧血等）、加齢性黄斑変性症、免疫系疾患（例えば、クローン病、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾患、免疫不全、白血病等）、肝臓・胆のう疾患（例えば、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変、肝炎、肝不全、胆汁うっ滞症、結石等）、消化管疾患（例えば、潰瘍、腸炎、吸収不良等）、感染症、肥満、線維症（肺線維症、肝線維症、腎線維症、骨髄線維症等）を挙げることができ、これらの疾患の原因遺伝子としては、例えば、ｋｉｎｅｓｉｎ  ｓｐｉｎｄｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＫＳＰ）、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，  （ＶＥＧＦ）、ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ  （ＴＴＲ）、ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｎ／ｋｅｘｉｎ  ｔｙｐｅ  ９（ＰＣＳＫ９）、ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ（ＰＬＫ）、ＡｐｏＢ−１００、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  Ｍ２  ｓｕｂｕｎｉｔ  （ＲＲＭ２）、ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２７（Ｈｓｐ２７）、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−４Ｅ  （ｅＩＦ−４Ｅ）、ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １（ＩＣＡＭ−１）、ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＩＬ−４Ｒ−ａｌｐｈａ）、Ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ、  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ、Ｎ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−ｘＬ、Ｈｅｒ−１、Ｈｅｒ−２、Ｈｅｒ−３、Ｈｅｒ−４、ＭＤＲ−１、ヒトβ−カテニン遺伝子、ＤＤＸ３（ＤＥＡＤ  （Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ）  ｂｏｘ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ３，  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ）、Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  １（ＭＣＬ１）遺伝子、ＰＫＲ（Ｅｉｆ２ａｋ２）、Ｈｓｐ４７（Ｓｅｒｐｉｎｈ１）、Ｈｅｐｃｉｄｉｎ、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ(ＳＴＡＴ３)を挙げることが出来るがこれらに限定されない。
【００４５】
本明細書において、「天然型のヌクレオシド」とは、２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシシチジン、２’−デオキシ−５−メチルシチジン、チミジン等の２’−デオキシヌクレオシド、アデノシン、グアノシン、シチジン、５−メチルシチジン、ウリジン等のリボヌクレオシドをいう。また、「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオシドの糖部分がリン酸とエステルを形成している化合物から構成されるオリゴヌクレオチドのことをいう。本明細書においては、オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチドとは同一の意味で用いている。
【００４６】
本明細書においては２’−デオキシアデノシンをＡｔ、２’−デオキシグアノシンをＧｔ、２’−デオキシシチジンをＣｔ、２’−デオキシ−５−メチルシチジンを５ｍｅＣｔ、チミジンをＴｔ、２’−デオキシウリジンをＵｔ、アデノシンをＡｒｔ、グアノシンをＧｒｔ、シチジンをＣｒｔ、５−メチルシチジンを５ｍｅＣｒｔ、ウリジンをＵｒｔと表すこともある。また、本明細書中においては、２’−デオキシアデノシンヌクレオチドをＡｐ、２’−デオキシグアノシンヌクレオチドをＧｐ、２’−デオキシシチジンヌクレオチドをＣｐ、２’−デオキシ−５−メチルシチジンヌクレオチドを５ｍｅＣｐ、チミジンヌクレオチドをＴｐ、２’−デオキシウリジンヌクレオチドをＵｐ、アデノシンヌクレオチドをＡｒｐ、グアノシンヌクレオチドをＧｒｐ、シチジンヌクレオチドをＣｒｐ、５−メチルシチジンヌクレオチドを５ｍｅＣｒｐ、ウラシルヌクレオチドをＵｒｐと表すこともある。
【００４７】
本明細書においてはヌクレオチドのリン酸エステルの代わりにホスホロチオエートエステルとなっているホスホロチオエートエステルについて、Ａｐに対応するものとしてＡｓ、Ｇｐに対応するものとしてＧｓ、Ｃｐに対応するものとしてＣｓ、５ｍｅＣｐに対応するものとして５ｍｅＣｓ、Ｔｐに対応するものとしてＴｓ、Ｕｐに対応するものとしてＵｓ、Ａｒｐに対応するものとしてＡｒｓ、Ｇｒｐに対応するものとしてＧｒｓ、Ｃｒｐに対応するものとしてＣｒｓ、５ｍｅＣｒｐに対応するものとして５ｍｅＣｒｓ、Ｕｒｐに対応するものとしてＵｒｓと表すこともある。
【００４８】
本明細書における、「糖修飾ヌクレオシド」とは、ヌクレオシドの糖部分が修飾されているヌクレオシドをいう。
【００４９】
このうち、２’−Ｏ−メチル修飾の例としては、２’−Ｏ−メチルヌクレオシド及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドがあり、Ａｒｔに対応するものとしてＡｍ１ｔ、Ｇｒｔに対応するものとしてＧｍ１ｔ、Ｃｒｔに対応するものとしてＣｍ１ｔ、５ｍｅＣｒｔに対応するものとして５ｍｅＣｍ１ｔ、Ｕｒｔに対応するものとしてＵｍ１ｔ、Ａｒｐに対応するものとしてＡｍ１ｐ、Ｇｒｐに対応するものとしてＧｍ１ｐ、Ｃｒｐに対応するものとしてＣｍ１ｐ、５ｍｅＣｒｐに対応するものとして５ｍｅＣｍ１ｐ、Ｕｒｐに対応するものとしてＵｍ１ｐ、Ａｒｓに対応するものとしてＡｍ１ｓ、Ｇｒｓに対応するものとしてＧｍ１ｓ、Ｃｒｓに対応するものとしてＣｍ１ｓ、５ｍｅＣｓに対応するものとして５ｍｅＣｍ１ｓ、Ｕｒｓに対応するものとしてＵｍ１ｓと表すこともある。
【００５０】
本明細書において２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオチド  ユニット及び「ＥＮＡユニット」とは上記の各ヌクレオシド、各ヌクレオチドにおいてＥＮＡを有するものをいい、Ａｔに対応するものとしてＡ２ｔ、Ａｐに対応するものとしてＡｅ２ｐ、Ａｓに対してはＡｅ２ｓ、Ｇｔに対応するものとしてＧ２ｔ、Ｇｐに対応するものとしてＧｅ２ｐ、Ｇｓに対してはＧｅ２ｓ、５ｍｅＣｔに対応するものとしてＣ２ｔ、５ｍｅＣｐに対応するものとしてＣｅ２ｐ、５ｍｅＣｓに対してはＣｅ２ｓ、Ｔｔに対応するものとしてＴ２ｔ、Ｔｐに対応するものとしてＴｅ２ｐ、Ｔｓに対してはＴｅ２ｓというようにＥＮＡユニットを有するヌクレオシド及びヌクレオチドを表わすこともある。
【００５１】
本明細書において２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンヌクレオチド  ユニット及び「２’、４’−ＢＮＡ／ＬＮＡユニット」とは上記の各ヌクレオシド、各ヌクレオチドにおいて２’、４’−ＢＮＡ／ＬＮＡを有するものをいい、Ａｔに対応するものとしてＡ１ｔ、Ａｐに対応するものとしてＡｅ１ｐ、Ａｓに対してはＡｅ１ｓ、Ｇｔに対応するものとしてＧ１ｔ、Ｇｐに対応するものとしてＧｅ１ｐ、Ｇｓに対してはＧｅ１ｓ、５ｍｅＣｔに対応するものとしてＣ１ｔ、５ｍｅＣｐに対応するものとしてＣｅ１ｐ、５ｍｅＣｓに対してはＣｅ１ｓ、Ｔｔに対応するものとしてＴ１ｔ、Ｔｐに対応するものとしてＴｅ１ｐ、Ｔｓに対してはＴｅ１ｓというように２’、４’−ＢＮＡ／ＬＮＡユニットを有するヌクレオシド及びヌクレオチドを表わすこともある。
【００５２】
以下に各ヌクレオチドの構造式を示す。
【００５３】
【化１２】
2012074038.tif 000013
【００５４】
【化１３】
2012074038.tif 000014
【００５５】
【化１４】
2012074038.tif 000015
【００５６】
【化１５】
2012074038.tif 000016
【００５７】
【化１６】
2012074038.tif 000017
【００５８】
【化１７】
2012074038.tif 000018
【００５９】
本明細書中におけるポリヌクレオチド又はその塩は、標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有する２本鎖ポリヌクレオチドを由来とし、このアンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端が、各々においてリン酸ジエステル構造を形成した下記の構造式で示される構造のリンカーによって結合されている１本鎖構造を有することが特徴である。すなわち、ポリヌクレオチド−３’−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−［リンカー］−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−５’−ポリヌクレオチドの構造を形成している。［ここで，『ポリヌクレオチド−３’』は、ポリヌクレオチドの３’末端の水酸基上の水素原子を持たない構造を表し、『５’−ポリヌクレオチド』は、ポリヌクレオチドの５’末端の水酸基上の水素原子を持たない構造を示す。］
このリンカーは、フェニル基を含有しており、このフェニル基に結合する酸素原子部分、次の化１８の構造式において明示されている酸素原子を示す、がアンチセンス鎖の５’末端との結合部分であり、５’末端においてリン酸ジエステル結合を形成して結合している。このフェニル基は、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３をさらに有しており、そのうちの１個がセンス鎖の３’末端との結合部位となっていてリン酸ジエステル結合を形成して結合する。なお，Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のフェニル基への結合が酸素原子を介していてもこれらの酸素原子はアンチセンス鎖の５’末端への結合部位とはならない。このリンカーの構造は次の通りである。
【００６０】
【化１８】
2012074038.tif 000019
【００６１】
式中、
明示されているフェニル基に結合した酸素原子は、アンチセンス鎖の５’末端に結合してリン酸ジエステル構造を形成し、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のいずれか１個は、次式で示される構造：
−Ｌ１−（ＣＨ２）ｍ−Ｌ２−Ｌ３−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）n1−（ＣＨ２）n2−Ｏ→
を示すが、式中、
ｍは、０から４の整数を示し、
ｎ1は、０から４の整数を示し、
ｎ2は、０又は２から１０の整数を示し、
Ｌ１は、単結合又は−Ｏ−を示し、
Ｌ２は、単結合又は−ＣＨ（−ＮＨ−Ｌ４−Ｒ）−を示し、
Ｌ３は、単結合、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、又は−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−を示すが、
Ｌ３が単結合以外のとき、ｎ2は、２から１０の整数を示す。
Ｌ１及びＬ２が単結合であって、ｍが１、ｎ1およびｎ2が０であるときに、Ｌ３−Ｏ→は、
−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ−（アミノ酸残基）ｊ−Ｓｅｒ、
−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ−（アミノ酸残基）ｊ−Ｔｈｒ、
−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ−（アミノ酸残基）ｊ−Ｓｅｒ、又は
−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ−（アミノ酸残基）ｊ−Ｔｈｒ、
を示すが、これらのセリン又はトレオニンの水酸基部分は、センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端のリン酸基と結合してリン酸ジエステル構造を形成しており、
ｊは、０から２の整数を示し、
Ｌ４は、単結合、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｋ−ＮＨ−、又は−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｋ−を示し、
ｋは１から６の整数を示し、
Ｒは、水素原子、炭素数１から６のアルキル基、飽和又は不飽和であってもよい炭素数２から３０の炭化水素カルボニル基、飽和又は不飽和であってもよい炭素数２から３０の炭化水素オキシカルボニル基を示す。
【００６２】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうちの残りの２個は、各々独立に、
水素原子、
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基、
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルコキシ基、
ハロゲン原子、
炭素数１から９のアルキル基を有するアルキルカルボニルアミノ基、及び
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基を含むアルキルカルボニル基、
からなる群の基から選ばれる基を示す。
【００６３】
リンカーに含まれるフェニル基にはＲ１、Ｒ２及びＲ３が存在するが、そのうちの１個はリンカー機能を有した、センス鎖の３’末端との結合部位となっており、構造的にはリン酸ジエステル構造を形成することを特徴としている。残りの２個はリンカー機能はなく、フェニル基上の単なる置換基である。
【００６４】
リンカー機能を果たす構造のうちのフェニル基部分を除いた部分、すなわち、−Ｌ１−（ＣＨ２）ｍ−Ｌ２−Ｌ３−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）n1−（ＣＨ２）n2−Ｏ→、について説明する。
【００６５】
Ｌ１は、単結合であるか、又は２価の酸素原子の−Ｏ−である。
【００６６】
Ｌ２は、単結合であるか、又はメチレン炭素原子上に置換基を有していてもよいアミノ基を有する構造である。このアミノ基は、リンカー構造Ｌ４を介して置換基Ｒを有する。
【００６７】
Ｌ４は、単結合であるか、メチレン基もしくは炭素数２から４のポリメチレン基であるか、又は−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−構造である。−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−構造のカルボニル基は、アミノ基とは構造式の左端で結合し、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−の構造を形成する。
【００６８】
Ｒが、炭素数１から６のアルキル基であるとき、このアルキル基は直鎖状でも分枝鎖状であってもいずれでもよい。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第二級ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等を挙げることができる。
【００６９】
Ｒが、炭素数１から６のアルキル基であるとき、これは直鎖状又は分枝鎖状のいずれであってもよい。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第二級ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等を挙げることができる。
【００７０】
Ｒが、飽和又は不飽和であってもよい炭素数２から３０の炭化水素カルボニル基（炭化水素基−（Ｃ＝Ｏ）−）であるとき、あるいは飽和又は不飽和であってもよい炭素数２から３０の炭化水素オキシカルボニル基（炭化水素基−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−）であるとき、これらの炭化水素基部分は直鎖状又は分枝鎖状であってもよい。また、炭化水素基は飽和であってよいが、不飽和となっていてもよい。このような炭化水素基としては脂肪族炭化水素から導かれた基を挙げることができる。炭化水素基としては炭素数３０までのアルキル基を挙げることができる。この他にこのアルキル基内の炭素炭素結合が二重結合となって不飽和となったアルカン類であってもよい。さらに、この炭化水素基部分は、不飽和結合を含んで、縮合環状構造となっていてもよい。このような環状炭化水素基としてコレステリル基を挙げることができる。
【００７１】
【化１９】
2012074038.tif 000020
【００７２】
Ｌ３は、単結合であるか、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−又は−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−の構造となる。Ｌ３は左端がＬ２と結合しており、場合によっては化８に示されているフェニル基と直結することもある。なおＬ３が単結合ではないとき、すなわちＬ３が−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−又は−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−であるとき、これらに結合する下記の構造において、メチレン基又はポリメチレン基が必ず存在する。すなわち、この場合においてｎ2は０とはならない。
【００７３】
Ｌ３の右端には−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）n1−（ＣＨ２）n2−Ｏ→が結合する構造である。ジメチレンオキシ構造は１個（ｎ1＝１）、あるいはこれを１単位として反復された２から４個（ｎ1＝２〜４）が結合してもよい。なお、場合によってはこのジメチレンオキシ構造は存在しないこともある。ジメチレンオキシ構造は、２または３個の反復のものが好ましい。すなわち、ｎ1としては２または３が好ましい。より好ましくはジメチレンオキシ構造が２個の場合であり、ｎ1としては２がより好ましい。
このジメチレンオキシ構造の右端にはメチレン基または９までのポリメチレン基が結合するが、このメチレン基またはポリメチレン基は存在しないこともある。メチレン基またはポリメチレン基としては、ポリメチレン基が好ましい。ポリメチレン基として存在する場合、鎖長は炭素数で２から１０となるものが好ましい。ポリメチレン鎖は鎖長の長いものの方が好ましく、炭素数５以上のポリメチレン鎖が好ましい。さらに好ましくは炭素数７以上のポリメチレン鎖である。
ジメチレンオキシ構造とメチレン基もしくはポリメチレン基は混在していてもよく、この場合、鎖長として原子数２から１０程度のものであればよい。
【００７４】
Ｌ１及びＬ２が単結合であって、ｍが１でｎ1およびｎ2が０であるとき、−Ｌ１−（ＣＨ２）ｍ−Ｌ２−Ｌ３−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）n1−（ＣＨ２）n2−Ｏ→部分は、Ｌ３−Ｏ→となるが、このＬ３−Ｏ→は、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ−（アミノ酸残基）ｊ−Ｓｅｒ、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ−（アミノ酸残基）ｊ−Ｔｈｒ、−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ−（アミノ酸残基）ｊ−Ｓｅｒ、又は−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ−（アミノ酸残基）ｊ−Ｔｈｒの各々の構造を示す。
【００７５】
この各構造は、ポリペプチドとなっているが、そのポリペプチドの一端はチロシンであり、他端は水酸基含有アミノ酸であればよい。さらに，チロシンのフェニル基は、５’末端とのリン酸ジエステル構造の結合部位であり、他端のアミノ酸の水酸基部分は、３’末端とのリン酸ジエステル構造の結合部位となっている。３’末端と結合しているアミノ酸は水酸基を含有するアミノ酸であればいずれでもよく、セリン又はトレオニンであればよい。なお、このセリンおよびトレオニンのアミノ基はアシル基によって置換されていてもよい。このアシル基は、フェニルカルボニル基またはアルキルカルボニル基でよい。フェニルカルボニル基のフェニル基は、炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルキコキシ基、ハロゲン原子等で置換されていてもよい。アルキルカルボニル基のアルキル基は、炭素数１から６のアルキル基であればよく、直鎖状でも分枝鎖状であってもよく、炭素数１から６のアルキコキシ基、ハロゲン原子等でさらに置換されていてもよい。このようなアシル基のうちではアルキルカルボニル基がよく、特にアセチル基が好ましい。
【００７６】
例えば、←Ｏ−Ｐｈ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ−（アミノ酸残基）ｊ−Ｓｅｒの構造は、チロシンのアミノ基にセリン，又はセリンが末端であるポリペプチドが結合した構造である。このペプチド構造は、←Ｏ−Ｐｈ−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ−（アミノ酸残基）ｊ−Ｓｅｒの様に、チロシンのカルボキシ末端でポリペプチドを形成してもよい。
【００７７】
ポリペプチドを形成するアミノ酸は、Ｌ−型、Ｄ−型、ＤＬ−型のいずれであってもよい。
【００７８】
ポリペプチドとしては、ジペプチドからテトラペプチドであればよい。チロシンとセリン又はトレオニンの中間に結合するアミノ酸としては特に制限はないが、グリシン、アラニン、β−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、システイン、グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸であればよい。アミノ酸として好ましいものは、グリシン、アラニン、β−アラニンである。チロシンとセリン又はトレオニンの中間に結合するジアミノ酸としては特に制限はないが、上記アミノ酸から構成されるジアミノ酸であればよい。アミノ酸として好ましいものは、グリシン−グリシン、グリシン−アラニン、グリシン−β−アラニン、アラニン−グリシン、アラニン−アラニン、アラニン−β−アラニン、β−アラニン−グリシン、β−アラニン−アラニン、β−アラニン−β−アラニンである。
【００７９】
リンカーを構成するフェニル基上に存在しているＲ１、Ｒ２及びＲ３のうちのいずれか１個は、−Ｌ１−（ＣＨ２）ｍ−Ｌ２−Ｌ３−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）n1−（ＣＨ２）n2−Ｏ→で示される構造でリンカー機能を果たす。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内の２個はフェニル基上の置換基である。このような置換基としては、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルコキシ基、ハロゲン原子、炭素数１から９のアルキル基を有するアルキルカルボニルアミノ基、及び置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基を含むアルキルカルボニル基からなる群の基から選ばれる基であればよい。
【００８０】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内の２個が置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基であるとき、アルキル基としては、直鎖状又は分枝鎖状のいずれであってもよい。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第二級ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基等を挙げることができる。アルキル基が置換基を有するとき、置換基としては、水酸基、アミノ基、ハロゲン原子、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のアルコキシ基、カルボキシ基、炭素数１から６のアルコキシ基を含有するアルコキシカルボニル基からなる群の基から選ばれる基１又は１以上の基を置換基として有していてもよい。置換基が１以上の場合は、同一であっても異なっていてもいずれでもよい。水酸基又はアミノ基がアルキル基の置換基のとき、これらはアルキル基の末端の炭素原子上に置換したものがより好ましい。水酸基を有するアルキル基としてヒドロキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基が好ましい。ハロゲン原子をアルキル基の置換基として有する場合、アルキル基は、炭素数１から６の直鎖状又は分枝状のいずれでもよいが、より好ましくはメチル基又はエチル基上にハロゲン原子を有するものであり、特にメチル基が好ましい。ハロゲン原子がアルキル基の置換基であるとき、ハロゲン原子としてはフッ素原子が好ましい。フッ素原子の数は、モノ置換からパーフルオロ置換までのいずれでもよい。モノフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、及び２，２，２−トリフルオロエチル基を例示することができる。モノフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、及びトリフルオロメチル基が好ましい。炭素数１から６のアルキルチオ基及び炭素数１から６のアルコキシ基としては、直鎖状又は分枝鎖状のいずれであってもよく、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第二級ブチル基等を挙げることができる。カルボキシ基又は炭素数１から６のアルコキシ基を含有するアルコキシカルボニル基がアルキル基の置換基のとき、これらはアルキル基の末端の炭素原子上に置換したものがより好ましい。炭素数１から６のアルコキシ基を含有するアルコキシカルボニル基のアルキル基は、直鎖状又は分枝鎖状のいずれであってもよく、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第二級ブチル基等を挙げることができる。
【００８１】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内の２個が、置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルコキシ基であるとき、このアルコキシ基は上記に示したアルキル基と酸素原子とから構成されたアルコキシ基であればよい。
【００８２】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内の２個がハロゲン原子である場合、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子であればよい。これらのうちでは塩素原子またはフッ素原子が好ましく，より好ましくはフッ素原子である。
【００８３】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内の２個が置換基を有していてもよい炭素数１から９のアルキル基を含むアルキルカルボニル基（脂肪族アシル基）であるとき、このアルキル部分は上記で示した炭素数１から８のアルキル基を含む炭素数９までのアルキル基であればよく、アルキルカルボニル基はこのようなアルキル基とカルボニル基とから構成されるものであればよい。アルキルカルボニル基としては，アセチル基が好ましい。
【００８４】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３としては、Ｒ１及びＲ３が水素原子であり、Ｒ２が−Ｌ１−（ＣＨ２）ｍ−Ｌ２−Ｌ３−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）n1−（ＣＨ２）n2−Ｏ→で示されるリンカー構造である場合が好ましい。
【００８５】
さらに、Ｒ１及びＲ３が水素原子であるときに以下の組み合わせが好ましい；
Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、ｍとｎ2の和が３以上の整数である場合。
【００８６】
Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、ｍとｎ2の和が８以上の整数である場合。
【００８７】
Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、ｍが０又は２であり、ｎ2が６以上の整数である場合。
【００８８】
Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、ｍが０又は２であり、ｎ2が６又は８であるである場合。
【００８９】
Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、ｍが０又は２であり、ｎ2が８である場合。
【００９０】
Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、ｍが２であり、ｎ2が８である場合。
【００９１】
本明細書中においては、上記、標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有する２本鎖ポリヌクレオチドを由来とし、このアンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端が、各々においてリン酸ジエステル構造を形成した下記の構造式で示される構造のリンカーによって結合されている１本鎖構造を有することを特徴とし、ポリヌクレオチド−３’−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−［リンカー］−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−５’−ポリヌクレオチドの構造を形成しているポリヌクレオチドを「３Ｌ５−ポリヌクレオチド」ともいう。
【００９２】
３Ｌ５−ポリヌクレオチドとしては、次式で示される構造のポリヌクレオチドが好ましい。
【００９３】
【化２０】
2012074038.tif 000021
【００９４】
式中、
ｐは、０から４の整数を示し、
ｑは、４から１０の整数を示し、
Ｌ５は、単結合又は−Ｏ−を示し、
Ｌ６は、（ＣＨ２）ｐとの結合を基点として、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、又は−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−を示し、
Ｌ５のベンゼン環上の結合位置はパラ位又はメタ位であり、
Ｌ５が−Ｏ−であるときは、ｐは１から４の整数を示す。
【００９５】
さらに、以下の組み合わせがより好ましい；
ｐとｑの和が３以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である場合。
【００９６】
ｐとｑの和が８以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である場合。
【００９７】
ｐが０又は２であり、ｑが６以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である場合。
【００９８】
ｐが０又は２であり、ｑが６又は８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である場合。
【００９９】
ｐが０又は２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である場合。
【０１００】
ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である場合。
【０１０１】
本明細書中における、「相補的なヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの塩基部分が相補するヌクレオチドのことをいい、例えば、塩基部分がアデニンとチミン、グアニンとシトシン、グアニンと５−メチルシトシン及びアデニンとウラシルであるヌクレオチドは互いに相補的なヌクレオチドである。
【０１０２】
本明細書中における、「相補的なヌクレオチド配列」とは、対象となるヌクレオチド配列に対して、全てが相補的なヌクレオチドからなるヌクレオチド配列に加え、１又は数個のヌクレオチドが相補的なヌクレオチドではないが、ポリヌクレオチド同士が塩基対を形成するヌクレオチド配列も含む。
【０１０３】
本明細書中におけるポリヌクレオチドの２本鎖構造とは、２種のポリヌクレオチドの互いに相補的なヌクレオチド配列同士がワトソン−クリック塩基対を形成し２本鎖の構造を有しているもの及び１本鎖ポリヌクレオチドの内部における相補的な配列同士がワトソン−クリック塩基対を形成し１本鎖ポリヌクレオチド内部において２本鎖構造を有するものもいう。
【０１０４】
本明細書中における３Ｌ５−ポリヌクレオチドは相補的なヌクレオチド同士がワトソン−クリック塩基対を形成し、２本鎖構造を形成する１本鎖ポリヌクレオチドであるが、全てのポリヌクレオチドがワトソン−クリック塩基対を形成していなくてもよい。
【０１０５】
本明細書中では、３Ｌ５−ポリヌクレオチドを構成するポリヌクレオチドのうち、標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列を含むものを標的遺伝子に対するパッセンジャー鎖（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）又はセンス鎖と呼び、標的遺伝子と相補的なヌクレオチド配列を含むものを標的遺伝子に対するガイド鎖（ｇｕｉｄｅ  ｓｔｒａｎｄ）又はアンチセンス鎖と呼ぶ。標的遺伝子に対するアンチセンス鎖は標的遺伝子のｍＲＮＡと相補的なヌクレオチド配列を有する。
【０１０６】
本明細書中において、標的遺伝子「標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる」とは、標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列と同一の配列からなることをいうが、完全に同一の配列に加え、３Ｌ５−ポリヌクレオチドが標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限りにおいて、実質的に同一な配列も含む。「標的遺伝子と相補的なヌクレオチド配列からなる」とは、標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列と相補的な配列からなることをいうが、完全に相補的な配列に加え、３Ｌ５−ポリヌクレオチドが標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限りにおいて、実質的に同一な配列も含む。また、標的遺伝子にＳＮＰｓ等が知られている場合、それらの変異を有する配列も同一のヌクレオチド配列に含まれる。本明細書中において、標的遺伝子と相補的なヌクレオチド配列を含み標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有するポリヌクレオチドを標的遺伝子に対するポリヌクレオチドという。
【０１０７】
標的遺伝子に対する３Ｌ５−ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限りにおいて特に制限されないが、例えば、コンピュータソフトウエア（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）：ＧＥＮＥＴＹＸ  ＣＯＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製等。）を用いて標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有すると予想された配列に基づいてセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列を決定することによって決定することもできるし、更に選択された配列に基づいて作製した３Ｌ５−ポリヌクレオチドのＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を確認することによって決定することもできる。
【０１０８】
本明細書中において遺伝子発現抑制作用とは、遺伝子の発現を完全に抑制する作用の他に、コントロールに比して遺伝子の発現を減少させる作用も含まれ、遺伝子抑制（gene silencing）も遺伝子発現抑制作用に含まれる。また、本明細書においては、遺伝子発現抑制作用と遺伝子発現抑制活性を同じ意味に用いている。
【０１０９】
ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用は、当業者が通常行う方法で確認することができるが、例えば、標的遺伝子が発現している細胞に標的遺伝子に対する３Ｌ５−ポリヌクレオチドを投与して一定時間経過後の標的遺伝子の翻訳産物であるタンパク質をウエスタンブロット解析によって定量しタンパク質の発現量をコントロールと比較することによって確認することが出来る。また、リアルタイムＰＣＲの手法により標的遺伝子に対する１本鎖ポリヌクレオチド投与後の標的遺伝子の発現量をリアルタイムで測定することによっても確認することができる。
【０１１０】
標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列と同一又は実質的に同一な配列を有するポリヌクレオチドとは、標的遺伝子のヌクレオチド配列のうち、いずれの部分でもよい１８ヌクレオチド以上の配列と同一又は実質的に同一な配列からなるポリヌクレオチドである。ここで、「実質的に同一な配列」とは、標的遺伝子のヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する配列のことをいう。ヌクレオチド配列の相同性はＢＬＡＳＴ（登録商標）等の公知の遺伝子解析ソフトウエアを用いて計算することが出来る。
【０１１１】
本明細書に添付する配列表において、各配列の＜２２３＞の項目中で“ｃｍ”は２’−Ｏ−メチルシチジン（２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）を示し、“ｕｍ”は２’−Ｏ−メチルウリジン（２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌｕｒｉｄｉｎｅ）を示し、“ｇｍ”は２’−Ｏ−メチルグアノシン（２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｏｓｉｎｅ）を示す。
【０１１２】
２．３Ｌ５−ポリヌクレオチド
本発明における３Ｌ５−ポリヌクレオチドを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖の鎖長は、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限り、１８ヌクレオチドから、標的遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長までのいかなる長さでもよい。センス鎖としては、１８〜２１の鎖長のものが好ましく、１８〜１９の鎖長のものが更に好ましい。アンチセンス鎖としては、１９〜２１の鎖長のものが好ましく、２１鎖長のものが更に好ましい。３Ｌ５−ポリヌクレオチドはその全体が２本鎖構造である必要はなく５’及び／又は３’末端が一部突出したものも含み、その突出末端は１〜５ヌクレオチド、好ましくは１〜３ヌクレオチド、さらに好ましくは２ヌクレオチドである。また、最も好ましい例としては、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドの３’末端が２ヌクレオチド突出している（オーバーハング構造）構造を有し、１８塩基対を形成しているポリヌクレオチドが挙げられる。
【０１１３】
３Ｌ５−ポリヌクレオチドは、下記の（ａ）〜（ｈ）から選択される少なくともいずれか一つの性質を有する。
（ａ）標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（ｂ）ＲＮＡ分解酵素に安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（ｃ）ホスファターゼに対して安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（ｄ）エキソヌクレアーゼに対して安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（ｅ）ＲＮＡ分解酵素、ホスファターゼ及びエキソヌクレアーゼに対して安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（ｆ）アンチセンス鎖がホスファターゼに対して安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（ｇ）アンチセンス鎖がエキソヌクレアーゼに対して安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（ｈ）アンチセンス鎖が５’−３’エキソヌクレアーゼに対して安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する。
【０１１４】
２−１．
３Ｌ５−ポリヌクレオチドの一例としては、標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有する２本鎖ポリヌクレオチドを由来とし、このアンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端が、各々においてリン酸ジエステル構造を形成した下記の構造式で示される構造のリンカーによって結合されている構造を有することが特徴である、すなわち、ポリヌクレオチド−３’−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−［リンカー］−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−５’−ポリヌクレオチドの構造を形成している［ここで，『ポリヌクレオチド−３’』は、ポリヌクレオチドの３’末端の水酸基上の水素原子を持たない構造を表し、『５’−ポリヌクレオチド』は、ポリヌクレオチドの５’末端の水酸基上の水素原子を持たない構造を示す。］ポリヌクレオチドを挙げることができる。
【０１１５】
３Ｌ５−ポリヌクレオチドの他の一例としては、センス鎖及びアンチセンス鎖が１８乃至２３塩基長のからなり、単離された二本鎖構造を有するＲＮＡ分子であって、各ＲＮＡ鎖が１８〜２３塩基長を有し、少なくとも１つの鎖が１〜３塩基からなる３’突出部を有するものであり、該ＲＮＡ分子は標的特異的なＲＮＡ干渉が可能なものであり、３’突出部を除く該ＲＮＡ分子の１つの鎖が、予め決定したｍＲＮＡ標的分子に対して１００％の同一性を有する配列からなり、かつ、該ｍＲＮＡ標的分子が細胞又は生物中に存在するものである、上記ＲＮＡ分子であり、アンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端が、各々においてリン酸ジエステル構造を形成したリンカーによって結合されている構造を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【０１１６】
３Ｌ５−ポリヌクレオチドの他の一例としては、センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端が、各々においてリン酸ジエステル構造を形成したリンカーによって結合されている構造を有し、更に以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、ポリヌクレオチド又はその塩を挙げることができる：
５’−（γ−β）９−γ−λｔ−３’（ＩＩ）
５’−β−（γ−β）９−υｕ−３’（ＩＩＩ）
（ａ）γはＲＮＡ、βは２’−ＯＭｅＲＮＡ、λ及びυはＤＮＡを示す；
（ｂ）ｔ及びｕは同一又は異なって、０〜５のいずれかの整数を示す；
（ｃ）式（ＩＩＩ）で示されるポリヌクレオチドのうち、（γ−β）９−γは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＩＩ）における（γ−β）９−γと式（ＩＩＩ）におけるβ―（γ−β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
【０１１７】
γ、β、λおよびυは、ヌクレオシドユニットを示し、各ヌクレオシド間を結ぶ線はリン酸ジエステル結合またはホスホロチオエート結合を示す。ヌクレオシドユニットとは、上述の「天然型のヌクレオシド」や「糖修飾ヌクレオシド」のような核酸塩基のＮ−グルコシル体でポリヌクレオチドの構成単位を示す。
【０１１８】
３Ｌ５−ポリヌクレオチドの他の一例としては、センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＶ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（Ｖ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端が、各々においてリン酸ジエステル構造を形成したリンカーによって結合されている構造を有し、更に以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、ポリヌクレオチド又はその塩を挙げることができる：
５’−（α−β）９−αｐ−λｔ−３’（ＩＶ）
５’−δｓ−（α−β）９−υｕ−３’（Ｖ）
（ａ）α及びβは異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、δ及びλは同一又は異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、υは同一又は異なってはＤＮＡ、ＲＮＡ及び２’−ＯＭｅＲＮＡから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す；
（ｂ）ｐは０又は１の整数を示し、ｔはｐが０のときは０であり、ｐが１のときは０〜５のいずれかの整数を示す。ｓは０又は１の整数を示し、ｕは０〜５のいずれかの整数を示す。；
（ｃ）式（ＩＶ）で示されるポリヌクレオチドのうち、（α−β）９−αｐは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＩＶ）における（α−β）９と式（Ｖ）における（α−β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
【０１１９】
α、β、δおよびλは、ヌクレオシドユニットを示し、各ヌクレオシド間を結ぶ線はリン酸ジエステル結合またはホスホロチオエート結合を示す。ヌクレオシドユニットとは、上述の「天然型のヌクレオシド」や「糖修飾ヌクレオシド」のような核酸塩基のＮ−グルコシル体でポリヌクレオチドの構成単位を示す。
【０１２０】
３Ｌ５−ポリヌクレオチドの他の一例としては、センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端が、各々においてリン酸ジエステル構造を形成したリンカーによって結合されている構造を有し、更に、以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、ポリヌクレオチド又はその塩を挙げることができる：
５’−β−（α−β）８−αｐ−λｔ−３’（ＶＩ）
５’−δｓ−（α−β）８−（α―β）−υｕ−３’（ＶＩＩ）
（ａ）α及びβは異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、δ及びλは同一又は異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、υは同一又は異なってはＤＮＡ、ＲＮＡ及び２’−ＯＭｅＲＮＡから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す；
（ｂ）ｐは０又は１の整数を示し、ｔはｐが０のときは０であり、ｐが１のときは０〜５のいずれかの整数を示す。ｓは０又は１の整数を示し、ｕは０〜５のいずれかの整数を示す；
（ｃ）式（ＶＩ）で示されるポリヌクレオチドのうち、β−（α−β）８−αｐは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＶＩ）における（α−β）８と式（ＶＩＩ）における（α−β）８は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
【０１２１】
３Ｌ５−ポリヌクレオチドの他の一例としては、センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＸ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端が、各々においてリン酸ジエステル構造を形成したリンカーによって結合されている構造を有し、更に、以下の（ａ）乃至（ｃ）に示される特徴を有する、（１）に記載のポリヌクレオチド又はその塩を挙げることができる：
５’−（α−β）９−３’（ＶＩＩＩ）
５’−β−（α−β）９−（α−β）−３’（ＩＸ）
（ａ）αがＤＮＡ、βが２’−ＯＭｅＲＮＡである；
（ｂ）式（ＩＸ）で示されるポリヌクレオチドのうち、β−（α−β）９は標的遺伝子と相補的なヌクレオチド配列からなる；
（ｃ）式（ＶＩＩＩ）における（α−β）９と式（ＩＸ）における（α−β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
【０１２２】
３Ｌ５−ポリヌクレオチドには、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限りにおいて、３Ｌ５−ポリヌクレオチド中の任意の１〜４残基を他の糖修飾ヌクレオチドで置換したものも含まれる。
【０１２３】
糖修飾ヌクレオチドには、本発明の属する技術分野で知られている糖修飾の全ての様式を含む。糖修飾ヌクレオチドは、あらゆる複素環塩基部位及びインターヌクレオシド結合を保持することができ、さらに前記糖修飾とは独立したグループを含む。糖修飾ヌクレオチドのグループは、２’−修飾ヌクレオシド、４’−チオ修飾ヌクレオシド、４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシド及び二環式糖修飾ヌクレオシドを含む。
【０１２４】
２’−修飾ヌクレオチドの例としては、ハロ、アリル、アミノ、アジド、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、ＯＣＦ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、又はＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）であり、各ＲｍとＲｎが個別にＨ、アミノ保護基、又は置換あるいは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルである。好ましい２’−修飾は−Ｆ、−ＯＣＨ３、又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３である。さらに好ましくは−ＯＣＨ３である。
【０１２５】
４’−チオ修飾ヌクレオシドの例としては、４’−酸素原子が硫黄原子で置換されたβ−Ｄ−リボヌクレオシドを挙げることができる（Ｈｏｓｈｉｋａ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５７９，ｐ．３１１５−３１１８，（２００５）；  Ｄａｎｄｅ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４９，  ｐ．１６２４−１６３４（２００６）；Ｈｏｓｈｉｋａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．  ８，  ｐ．２１３３−２１３８，（２００７））。
【０１２６】
４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシドの例としては、２’−Ｈ、又は、２’−Ｏ−メチルを保持する４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシドを挙げることができ（Ｍａｔｓｕｇａｍｉ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３６，  １８０５  （２００８））。
【０１２７】
二環式糖修飾ヌクレオシドの例としては、リボース環の２原子を架橋することによって形成された第二の環を保持するヌクレオシドを挙げることができ、そのようなヌクレオシドの例としては、２’−酸素原子と４’−炭素原子をメチレン鎖で架橋した２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡ（ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ／ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）（Ｏｂｉｋａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３８，  ｐ．８７３５−  （１９９７）．；  Ｏｂｉｋａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３９，  ｐ．５４０１−  （１９９８）．；  Ａ．  Ａ．  Ｋｏｓｈｋｉｎ，  Ａ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  ５４，  ｐ．３６０７（１９９８）．；  Ｏｂｉｋａ，  Ｓ．  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ９，ｐ．１００１（２００１）．）、２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡのメチレン鎖を一炭素延ばしたエチレン鎖で架橋したＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）を挙げることができる（Ｍｏｒｉｔａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  １２，  ｐ．７３（２００２）．；  Ｍｏｒｉｔａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  １１，ｐ．２２１１（２００３）．）。
【０１２８】
２’−ＯＭｅＲＮＡを含む３Ｌ５−ポリヌクレオチド中の２’−ＯＭｅＲＮＡの任意の１〜４残基が糖修飾ヌクレオチドで置換されている場合に、より好ましい糖修飾ヌクレオチドは上記の糖修飾ヌクレオチドのうち、同一又は異なってＥＮＡ又は２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡである。
【０１２９】
３Ｌ５−ポリヌクレオチドには、ポリヌクレオチド中のＤＮＡの１〜４残基が同一又は異なって、ＲＮＡ、ＥＮＡ又は２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡに置換されているポリヌクレオチドも含まれる。
【０１３０】
２−２  ３Ｌ５−ポリヌクレオチドセンス鎖の合成方法
３Ｌ５−ポリヌクレオチドを構成するポリヌクレオチドの調製方法としては所望のポリヌクレオチドが合成できる限り特に制限はないが、既知の化学合成法（リン酸トリエステル法、ホスホロアミダイト法、又は、Ｈ−ホスホネート法等）を用いることができる。例えば、市販の核酸合成機を用いて、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ合成に使われる試薬を用いて合成することが出来る。
【０１３１】
２−３  ３Ｌ５−ポリヌクレオチドの合成方法
３Ｌ５−ポリヌクレオチドを合成できる限りその製造方法に制限は無いが、例えば、以下の方法により合成することができる。
【０１３２】
２−３−１  Ａ法
２−３−１−１  Ａ−１工程
Ａ−１工程の概要を図１に示す。
【０１３３】
本工程は、所望のヌクレオシドが結合したポリマーサポート（１）（Ａ−１法中、Ｔｒ１−Ｏ−Ｙ−ＣＰＧと表す。式中、ＣＰＧは、ポリヌクレオチドと結合しうるリンカーを有するポリマーサポートを示し、Ｙは、５’−及び３’−水酸基を除いた、核酸塩基部のアミノ基が保護されたヌクレオシドユニットを示す。）を用いて、所望のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド類縁体である化合物（２）を製造する工程である（Ａ法中、ＨＯ−Ｗ１−Ｙ−ＣＰＧと表す。式中、Ｗ１−Ｙは、５’−末端及び３’−末端の水酸基を除いた保護されたポリヌクレオチドを表す。Ｔｒ１は、水酸基の保護基を示す。）。
【０１３４】
Ｔｒ１は、核酸の保護基を脱離することなく脱保護が可能な水酸基の保護基であれば、特に限定はないが、例えば、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、ピクシル基、トリチル基、レブリニル基、ビス（トリメチルシリルオキシ）（シクロヘキシルオキシ）シリル基を挙げることができ、好適には、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基である。
【０１３５】
核酸塩基部のアミノ基の保護基としては、通常用いられるものであれば特に制限はないが、例えば、ベンゾイル基、イソブチリル基、アセチル基、フェノキシアセチル基、４−（ｔ−ブチル）フェノキシアセチル基、アリルオキシカルボニル基、ｐ−ニトロフェニルエチルカルボニル基が挙げられる。
【０１３６】
ＣＰＧとしては、コントロールド  ポア  グラス、ロング  チェーン  アルキルアミノ  コントロールド  ポア  グラス（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８４，  ｐｐ８４−１１５），ポリスチレンビーズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３４，３３７３（１９９４））等が挙げられる。その際にポリマーサポート上にアミノプロピル基、アミノヘキシル基のようなアミノアルキル基を有するものが挙げられる。
【０１３７】
ポリヌクレオチドと結合しうるリンカーとしては、Ｙの３’位に対して酸素原子を介して、コハク酸を使ってエステル結合した、−ＯＣ（＝Ｏ）−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−が使用され、コハク酸の他方のカルボン酸は、ポリマーサポート上のアミノ基とアミド結合をしているものを挙げられる。コハク酸の他に、ザルコシン（−ＯＣ（＝Ｏ）−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−）、シュウ酸リンカー（−ＯＣ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）―）等が挙げられる。
【０１３８】
Ｔｒ１−Ｏ−Ｙ−ＣＰＧであって、Ｔｒ１が、４，４’−ジメトシキトリチル基であり、ＣＰＧが、Ｙの３’位に対して酸素原子を介して、コハク酸を使ってエステル結合した、−ＯＣ（＝Ｏ）−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−が使用され、コハク酸の他方のカルボン酸がポリマーサポート上のアミノ基とアミド結合をしているものの市販品の例として、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社の２’−ＯＭｅ−Ａ−ＲＮＡ−ＣＰＧ（２０−３６００−１０）、２’−ＯＭｅ−Ｃ−ＲＮＡ−ＣＰＧ（２０−３６１０−１０）、２’−ＯＭｅ−Ｇ−ＲＮＡ−ＣＰＧ（２０−３６２１−１０）、２’−ＯＭｅ−Ｕ−ＲＮＡ−ＣＰＧ（２０−３６３０−１０）、Ｂｚ−Ａ−ＲＮＡ−ＣＰＧ（２０−３３０３−１０）、Ａｃ−Ｃ−ＲＮＡ−ＣＰＧ（２０−３３１５−１０）、ｉＰｒ−Ｐａｃ−Ｇ−ＲＮＡ−ＣＰＧ（２０−３３２４−１０）、Ｕ−ＲＮＡ−ＣＰＧ（２０−３３３０−１０）、ｄＡ−ＣＰＧ（２０−２０００−１０）、ｄＣ−ＣＰＧ（２０−２０１０−１０）ｄＧ−ＣＰＧ（２０−２０２０−１０）、ｄＴ−ＣＰＧ（２０−２０３０−１０）、等が挙げられる。
【０１３９】
化合物（２）を製造するのに必要なホスホロアミダイト試薬等を使用して、ＤＮＡ自動合成機を用いた通常のホスホロアミダイト法により、化合物（２）を製造する。所望のヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチド類縁体は、ＤＮＡ合成機、例えばパーキンエルマー社のホスホロアミダイト法によるモデル３９２などを用いて文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １２，  ４５３９（１９８４））記載の方法に準じて合成することが出来る。
【０１４０】
また所望により、オリゴヌクレオチド類縁体をチオエート化する場合は、硫黄のほかテトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ、アプライドバイオシステムズ社）、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬、フェニルアセチルジスルフィド／ピリジン−アセトニトリル（１：１  ｖ／ｖ）溶液（Ｒａｖｉｋｕｍａｒ，  Ｖ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（２００６）  １６，ｐ．２５１３−２５１７）等の試薬を用い、文献（Ｔｅｔａｒｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ３２，  ３００５（１９９１）、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １１２，  １２５３（１９９０））記載の方法に準じてチオエート誘導体を得る事ができる。
【０１４１】
２−３−２  Ｃ法
Ｃ法の概要を図２に示す。
【０１４２】
２−３−２−１  Ｃ−１工程
本工程は、不活性溶剤中、化合物（９）に、脱酸剤の存在下、酸性条件下で除去し得る保護化試薬（好適にはジメトキシトリチルクロリド）を反応させて、化合物（９）の水酸基を保護した化合物（１０）を得る工程である。
【０１４３】
使用される溶剤としては、反応を阻害せず、出発物質をある程度溶解するものであれば特に限定はないがベンゼン、トルエン、キシレンのような芳香族炭化水素類；メチレンクロリド、クロロホルムのようなハロゲン化炭化水素類；エーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタンのようなエーテル類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホロトリアミドのようなアミド類；ジメチルスルホキシドのようなスルホキシド類；アセトン、メチルエチルケトンのようなケトン類；ピリジンのような複素環アミン類又はアセトニトリルのようなニトリル類をあげることができ、好適には、複素環アミン類（特にピリジン）をあげられる。
【０１４４】
使用される保護化試薬としては、トリチルクロリド、モノメトキシトリチルクロリド、ジメトキシトリチルクロリド、トリメトキシトリチルクロリドなどのトリチルハライド類があげられるが、好適にはモノメトキシトリチルクロリド、ジメトキシトリチルクロリドである。
【０１４５】
使用される脱酸剤としては反応を阻害せず、生成物及び出発物質を分解しないものであれば特に限定はないが、好適にはピリジン、ジメチルアミノピリジンのような芳香族アミン類である。
【０１４６】
反応温度と反応時間については使用する保護化試薬や脱酸剤の種類によって異なるが、保護化試薬としてジメトキシトリチルクロリドを用いて、ピリジンを溶剤と脱酸剤と兼ねて、使用する場合は室温で２時間である。
【０１４７】
反応終了後、目的の化合物は常法に従って、反応混合物から採取される。例えば、反応混合物を適宜中和し、又、不溶物が存在する場合には濾過により除去した後、水と酢酸エチルのような混和しない有機溶媒を加え、水洗後、目的化合物を含む有機層を分離し、無水硫酸マグネシウム等で乾燥後、溶剤を留去することによって得られる。得られた目的化合物は必要ならば、常法、例えば再結晶、再沈殿又はクロマトグラフィ−等によって更に精製できる。
【０１４８】
２−３−２−２  Ｃ−２工程
本工程は、不活性溶剤中、化合物（１０）のカルボキシル基に、アミノ基を有しているフェノールと反応させ、アミド結合を有する化合物（１１）を形成させる工程である。
【０１４９】
使用される溶剤としては、反応を阻害しないものであれば特に限定はないが、ベンゼン、トルエン、キシレンのような芳香族炭化水素類；メチレンクロリド、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼンのようなハロゲン化炭化水素類；蟻酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、炭酸ジエチルのようなエステル類、アセトン、メチルエチルケトンメチルイソブチルケトン、イソホロン、シクロヘキサノンのようなケトン類；ニトロエタン、ニトロベンゼンのようなニトロ化合物類；アセトニトリル、イソブチロニトリルのようなニトリル類；ホルムアミド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホロトリアミドのようなアミド類；ジメチルスルホキシド、スルホランのようなスルホキシド類があげられ、好適にはハロゲン化炭化水素類（特にメチレンクロリド）、アミド類（特にジメチルホルムアミド）である。
【０１５０】
使用されるフェノールとしては、４−アミノフェノール、３−アミノフェノールをあげることができるが、好適には４−アミノフェノールである。
【０１５１】
使用されるアミド形成試薬としては、例えば、Ｎ−ヒドロキシサクシイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドのようなＮ−ヒドロキシ化合物類；１，１′−オキザリルジイミダゾール、Ｎ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾールのようなジイミダゾール化合物類；２，２′−ジピリジルジサルファイドのようなジサルファイド化合物類；Ｎ，Ｎ′−ジサクシンイミジルカーボネートのようなコハク酸化合物類；Ｎ，Ｎ′−ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィニッククロライドのようなホスフィニッククロライド化合物類；Ｎ，Ｎ′−ジサクシンイミジルオキザレート（ＤＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジフタールイミジルオキザレート（ＤＰＯ）、Ｎ，Ｎ′−ビス（ノルボルネニルサクシンイミジル）オキザレート（ＢＮＯ）、１，１′−ビス（ベンゾトリアゾリル）オキザレート（ＢＢＴＯ）、１，１′−ビス（６−クロロベンゾトリアゾリル）オキザレート（ＢＣＴＯ）、１，１′−ビス（６−トリフルオロメチルベンゾトリアゾリル）オキザレート（ＢＴＢＯ）のようなオキザレート化合物類、ジシクロヘキシルカーボジイミド（ＤＣＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカーボジイミド（ＥＤＣ）などのカーボジイミド類があげられ、好適にはジイミダゾール化合物類、カーボジイミド類（特に、ＥＤＣ）である。
【０１５２】
反応補助試薬として、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）を添加してもよい。
【０１５３】
反応温度及び反応時間は、使用されるアミド形成試薬及び溶剤の種類によって異なるが、０℃乃至１００℃で５乃至５０時間、特に４−アミノフェノールとＥＤＣをメチレンクロリド中で使用する場合には室温で１８時間である。
【０１５４】
反応終了後、目的の化合物は常法に従って、反応混合物から採取される。例えば、反応混合物を適宜中和し、又、不溶物が存在する場合には濾過により除去した後、水と酢酸エチルのような混和しない有機溶媒を加え、水洗後、目的化合物を含む有機層を分離し、無水硫酸マグネシウム等で乾燥後、溶剤を留去することによって得られる。得られた目的化合物は必要ならば、常法、例えば再結晶、再沈殿又はクロマトグラフィ−等によって更に精製できる。
【０１５５】
２−３−３  Ｄ法
Ｄ法の概要を図２に示す。図中、ｎ1、ｎ2、ｍ、及びＬ１は、上記と同じものを示し、具体的には、ｍは、０から４の整数を示し、Ｌ１は、単結合又は−Ｏ−を示す。
【０１５６】
２−３−３−１  Ｄ−１ａ工程
本工程は、不活性溶剤中、化合物（１２ａ）のアミノ基に、カルボキシル基を有しているフェノールと反応させ、アミド結合を有する化合物（１３ａ）を形成させる工程である。
【０１５７】
使用されるフェノールとしては、３−ヒドロキシフェニル酢酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（３−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、４−（３−ヒドロキシフェニル）吉草酸、４−（４−ヒドロキシフェニル）吉草酸、３-ヒドロキシフェノキシ酢酸、４-ヒドロキシフェノキシ酢酸などをあげることができるが、好適には３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸である。
【０１５８】
本工程は、Ｃ−２工程と同様の方法で行うことができる。
【０１５９】
２−３−３−２  Ｄ−２ａ工程
本工程は、不活性溶剤中、化合物（１３ａ）に、脱酸剤の存在下、酸性条件下で除去し得る保護化試薬（好適にはジメトキシトリチルクロリド）を反応させて、化合物（１３ａ）の水酸基を保護した化合物（１４ａ）を得る工程である。
【０１６０】
本工程は、Ｃ−１工程と同様の方法で行うことができる。
【０１６１】
２−３−３−３  Ｄ−１ｂ工程
本工程は、不活性溶剤中、化合物（１２ｂ）のアミノ基に、カルボキシル基を有しているフェノールと反応させ、アミド結合を有する化合物（１３ｂ）を形成させる工程である。
【０１６２】
使用されるフェノールとしては、３−ヒドロキシフェニル酢酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（３−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、４−（３−ヒドロキシフェニル）吉草酸、４−（４−ヒドロキシフェニル）吉草酸、３-ヒドロキシフェノキシ酢酸、４-ヒドロキシフェノキシ酢酸などをあげることができるが、好適には３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸である。
【０１６３】
本工程は、Ｃ−２工程と同様の方法で行うことができる。
【０１６４】
２−３−３−４  Ｄ−２ｂ工程
本工程は、不活性溶剤中、化合物（１３ｂ）に、脱酸剤の存在下、酸性条件下で除去し得る保護化試薬（好適にはジメトキシトリチルクロリド）を反応させて、化合物（１３ｂ）の水酸基を保護した化合物（１４ｂ）を得る工程である。
【０１６５】
本工程は、Ｃ−１工程と同様の方法で行うことができる。
【０１６６】
２−３−３−５  Ｄ−１ｃ工程
本工程は、不活性溶剤中、化合物（１２ａ）のアミノ基に、カルボキシル基を有しているフェノールと反応させ、アミド結合を有する化合物（１３ｃ）を形成させる工程である。
【０１６７】
使用されるフェノールとしては、Ｎ-[(９Ｈ-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]-Ｌ-チロシンをあげることができる。
【０１６８】
本工程は、Ｃ−２工程と同様の方法で行うことができる。
【０１６９】
２−３−３−６  Ｄ−２ｃ工程
本工程は、不活性溶剤中、化合物（１３ｃ）に、脱酸剤の存在下、酸性条件下で除去し得る保護化試薬（好適にはジメトキシトリチルクロリド）を反応させて、化合物（１３ｃ）の水酸基を保護した化合物（１４ｃ）を得る工程である。
【０１７０】
本工程は、Ｃ−１工程と同様の方法で行うことができる。
【０１７１】
２−３−４  Ｅ法
Ｅ法の概要を図３に示す。
【０１７２】
２−３−４−１  Ｅ−１工程
本工程は、不活性溶剤中、化合物（１５）に、脱酸剤の存在下、酸性条件下で除去し得る保護化試薬（好適にはモノメトキシトリチルクロリド）を反応させて、化合物（１５）の水酸基を保護した化合物（１６）を得る工程である。
【０１７３】
本工程は、Ｃ−１工程と同様の方法で行うことができる。
【０１７４】
２−３−４−２  Ｅ−２工程
本工程は、不活性溶剤中、化合物（１６）のカルボキシル基に、チロシンエステルと反応させ、アミド結合を有する化合物（１７）を形成させる工程である。
【０１７５】
使用されるチロシンエステルとしては、チロシンメチルエステル、チロシンエチルエステルなどをあげることができるが、好適にはチロシンエチルエステルである。
【０１７６】
本工程は、Ｃ−２工程と同様の方法で行うことができる。
【０１７７】
Ｅ法の概要を図３に示す。
【０１７８】
２−３−５  Ｆ法
Ｆ法の概要を図３に示す。図中、Ａは、−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ［ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２］−、及び、−ＣＨ［ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３］−を表す。
【０１７９】
２−３−５−１  Ｆ−１工程
本工程は、不活性溶剤中、化合物（１８）のアミノ基に、アミノ基がｔ−Ｂｏｃ基で保護されたアミノ酸（１９）と反応させ、アミド結合を有する化合物（２０）を形成させる工程である。
【０１８０】
ｔ−Ｂｏｃ基で保護されたアミノ酸の種類としては、グリシン、アラニン、β―アラニン、ロイシン、イソロイシンなどをあげることができるが、好適には、グリシン、アラニン、β―アラニンである。
【０１８１】
本工程は、Ｃ−２工程と同様の方法で行うことができる。
【０１８２】
２−３−５−２  Ｆ−２工程
本工程は、不活性溶剤中、化合物（２０）に脱保護化試薬を反応させて、アミノ基の保護基を選択的に除去して、化合物（２１）を製造する工程である。
【０１８３】
使用される溶剤としては、好適には、ベンゼン、トルエン、キシレンのような芳香族炭化水素類；メチレンクロリド、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼンのようなハロゲン化炭化水素類；蟻酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、炭酸ジエチルのようなエステル類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、ジエチレングリコールジメチルエーテルのようなエーテル類；メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール、イソアミルアルコール、ジエチレングリコール、グリセリン、オクタノール、シクロヘキサノール、メチルセロソルブ、のようなアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、イソホロン、シクロヘキサノンのようなケトン類；ニトロエタン、ニトロベンゼンのようなニトロ化合物類；アセトニトリル、イソブチロニトリルのようなニトリル類；ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホロトリアミドのようなアミド類；ジメチルスルホキシド、スルホランのようなスルホキシド類があげられ、さらに好適には、アルコール類（特にメタノール、エタノール）や塩化メチレン及び脱保護化試薬として酢酸を用いる場合は酢酸と水の混液があげられる。
【０１８４】
使用される脱保護化試薬としては、通常用いられるものであれば、特に制限はないが、保護基がｔ−Ｂｏｃ基の場合には、例えば酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、塩酸及び臭化亜鉛のようなルイス酸類があげられ、好適には酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸である。
【０１８５】
反応温度は使用される試薬、原料、溶剤などにより異なるが、通常−１０乃至１００℃であり、好適には０乃至５０℃である。
【０１８６】
反応時間は使用される原料、溶剤、反応温度などにより異なるが、通常１分間乃至５０時間であり、好適には、１分間乃至２４時間である。
【０１８７】
反応終了後、目的の化合物は常法に従って、反応混合物から採取される。
【０１８８】
２−３−５−３  Ｆ−３工程
本工程は、不活性溶剤中、化合物（２１）のアミノ基に、化合物（１６）と反応させ、アミド結合を有する化合物（２２）を形成させる工程である。
【０１８９】
本工程は、Ｃ−２工程と同様の方法で行うことができる。
【０１９０】
２−３−６  Ｇ法
Ｇ法の概要を図４に示す。
【０１９１】
２−３−６−１  Ｇ−１工程
本工程は、Ｃ−２工程で製造される化合物（１１）、Ｄ−２ａ工程で製造される化合物（１４ａ）、Ｄ−２ｂ工程で製造される化合物（１４ｂ）、Ｄ−２ｃ工程で製造される化合物（１４ｃ）、Ｅ−２工程で製造される化合物（１７）、及び、Ｆ−３工程で製造される化合物（２２）のフェノール（図４中、Ｔｒ−Ｏ−Ｘ−Ｈと表す。Ｔｒは、水酸基の保護基を表す。）の水酸基に、アミダイト化に用いるモノ置換―クロロ（アルコキシ）ホスフィン類（図４中、Ｒ５−Ｐ(−Ｏ−Ｒ４)−Ｃｌと表す。）又はジ置換―アルコキシホスフィン類（図４中、（Ｒ５−）２Ｐ(−Ｏ−Ｒ４)と表す。）を反応して、化合物（２３）を製造する工程である。
【０１９２】
Ｔｒは、核酸の保護基を脱離することなく脱保護が可能な水酸基の保護基であれば、特に限定はないが、例えば、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、ピクシル基、トリチル基、レブリニル基、ビス（トリメチルシリルオキシ）（シクロヘキシルオキシ）シリル基を挙げることができ、好適には、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基である。
【０１９３】
使用される溶剤としては、反応に影響を与えないものであれば、特に限定はないが、好適には、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジオキサンのようなエーテル類；メチレンクロリド、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼンのようなハロゲン化炭化水素類が挙げられる。
【０１９４】
本工程中のＲ４は、２−シアノエチル基、メチル基、メタンスルホニルエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、アリル基をあげることができ、好適には、シアノエチル基、メチル基である。
【０１９５】
本工程中のＲ５は、モルホリノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジメチルアミノ基を挙げることができ、好適には、ジイソプロピルアミノ基である。
【０１９６】
使用されるモノ置換−クロロ（アルコキシ）ホスフィン類としては、例えば、クロロ（モルホリノ）メトキシホスフィン、クロロ（モルホリノ）シアノエトキシホスフィン、クロロ（ジメチルアミノ）メトキシホスフィン、クロロ（ジメチルアミノ）シアノエトキシホスフィン、クロロ（ジイソプロピルアミノ）メトキシホスフィン、クロロ（ジイソプロピルアミノ）シアノエトキシホスフィンのようなホスフィン類があげられ、好適には、クロロ（モルホリノ）メトキシホスフィン、クロロ（モルホリノ）シアノエトキシホスフィン、クロロ（ジイソプロピルアミノ）メトキシホスフィン、クロロ（ジイソプロピルアミノ）シアノエトキシホスフィンである。
【０１９７】
モノ置換−クロロ（アルコキシ）ホスフィン類を用いる場合には、脱酸剤が使用され、その場合に、使用される脱酸剤としては、ピリジン、ジメチルアミノピリジンのような複素環アミン類、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンのような脂肪族アミン類があげられるが、好適には、脂肪族アミン類（特にジイソプロピルエチルアミン）である。
【０１９８】
使用されるジ置換−アルコキシホスフィン類としては、例えば、ビス（ジイソプロピルアミノ）シアノエトキシホスフィン、ビス（ジエチルアミノ）メタンスルホニルエトキシホスフィン、ビス（ジイソプロピルアミノ）（２，２，２−トリクロロエトキシ）ホスフィン、ビス（ジイソプロピルアミノ）（４−クロロフェニルメトキシ）ホスフィンのようなホスフィン類をあげることができ、好適には、ビス（ジイソプロピルアミノ）シアノエトキシホスフィンである。
【０１９９】
ジ置換−アルコキシホスフィン類を用いる場合には、酸が使用され、その場合に、使用される酸としては、好適には、テトラゾール、酢酸又はｐ−トルエンスルホン酸である。
【０２００】
反応温度は、特に限定はないが、通常０乃至８０℃であり、好適には、室温である。
【０２０１】
反応時間は、使用する原料、試薬、温度等により異なるが、通常、５分乃至３０時間であり、好適には、室温で反応した場合、３０分乃至１０時間である。
【０２０２】
反応終了後、本反応の目的化合物（７）は、例えば、反応混合物を適宜中和し、又、不溶物が存在する場合には、濾過により除去した後、水と酢酸エチルのような混和しない有機溶媒を加え、水洗後、目的化合物を含む有機層を分離し、無水硫酸マグネシウム等で乾燥後、溶剤を留去することによって得られる。
【０２０３】
得られた目的化合物は必要ならば、常法、例えば、再結晶、再沈殿又はクロマトグラフィ−等によって更に精製できる。
【０２０４】
２−３−６−２  Ｇ−２工程
本工程は、Ａ−１で製造される化合物（２）にＧ−１で製造される化合物（２３）をＤＮＡ自動合成機を用いた通常のホスホロアミダイト法により化合物（２４）を製造する工程である（図中、Ｗ２は、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いた保護されたセンス鎖ポリヌクレオチドを表し、Ｗ１−Ｙは、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いた保護されたアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを表し、Ｔｒ１は水酸基の保護基を表す。）。
【０２０５】
Ｔｒ１は、核酸の保護基を脱離することなく脱保護が可能な水酸基の保護基であれば、特に限定はないが、例えば、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、ピクシル基、トリチル基、レブリニル基、ビス（トリメチルシリルオキシ）（シクロヘキシルオキシ）シリル基を挙げることができ、好適には、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基である。
【０２０６】
ＤＮＡ自動合成機を用いた通常のホスホロアミダイト法により、化合物（２４）を製造する。所望のヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチド類縁体は、ＤＮＡ合成機、例えばパーキンエルマー社のホスホロアミダイト法によるモデル３９２などを用いて文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １２，  ４５３９（１９８４））記載の方法に準じて合成することが出来る。
【０２０７】
また所望により、オリゴヌクレオチド類縁体をチオエート化する場合は、硫黄のほかテトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ、アプライドバイオシステムズ社）、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬、フェニルアセチルジスルフィド／ピリジン−アセトニトリル（１：１  ｖ／ｖ）溶液（Ｒａｖｉｋｕｍａｒ，  Ｖ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（２００６）  １６，ｐ．２５１３−２５１７）等の試薬を用い、文献（Ｔｅｔａｒｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ３２，  ３００５（１９９１）、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １１２，  １２５３（１９９０））記載の方法に準じてチオエート誘導体を得る事ができる。
【０２０８】
２−３−６−３  Ｇ−３工程
本工程は、Ｇ−２で製造される化合物（２４）のＣＰＧより切り出し、保護基の除去を行い、最終化合物（２５）を製造する工程である（図中、式中、Ｗ２’は、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いたセンス鎖ポリヌクレオチドを示し、Ｗ１’−Ｙ’は、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いたアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを表す。）。
【０２０９】
用いる塩基としては、濃アンモニア水、メタノール性アンモニア、エタノール性アンモニア、濃アンモニア水―エタノール（３：１Ｖ／Ｖ）混液、濃アンモニア水―４０％メチルアミン水溶液（１：１Ｖ／Ｖ）混液、メチルアミン、０．５Ｍ  ＬｉＯＨ水溶液、３．５Ｍ  トリエチルアミン/メタノール溶液の（１：１０Ｖ／Ｖ）混液を挙げることができ、好適には濃アンモニア水、濃アンモニア水―エタノール混液（３：１Ｖ／Ｖ）である。
【０２１０】
反応温度は、特に限定はないが、通常−５０乃至８０℃であり、好適には室温乃至６０℃である。
【０２１１】
反応時間は、使用する原料、試薬、温度等により異なるが、通常、５分から３０時間であり、好適には、６０℃で反応した場合、５時間である。
【０２１２】
反応終了後、溶剤を留去することによって得られる化合物が、Ｔｒ１が結合している場合、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（高速液体クロマトグラフィーを含む。）等の各種クロマトグラフィーなどの精製操作で精製することができる。
【０２１３】
Ｔｒ１が、例えば４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、ピクシル基、トリチル基等が塩基性条件で脱保護していない場合、Ｆ−２工程と同様の方法の酸性条件でＴｒ１を脱保護することができる。好適には、８０％酢酸水である。
【０２１４】
このようにして得られる化合物（２５）を含む反応混合物を、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（高速液体クロマトグラフィーを含む。）等の各種クロマトグラフィーなど、通常の核酸の精製に用いられる精製操作で精製することにより、化合物（２５）を得ることができる。
【０２１５】
本方法により、３Ｌ５−ポリヌクレオチド及びセンス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端のリン酸が修飾されていない２本鎖ポリヌクレオチドを取得することができる。
【０２１６】
３Ｌ５−ポリヌクレオチドには、３Ｌ５−ポリヌクレオチドにコレステロールユニット、脂質ユニット又は、ビタミンＥユニットを導入したもの（例えば、Ｌｏｒｅｎｚ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，１４，ｐ．４９７５−４９７７（２００４）；Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，４３２，ｐ．１７３−１７８，  （２００４）；  Ｗｏｌｆｒｕｍ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２５，ｐ．１１４９−１１５７，（２００７））Ｋｕｂｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  １７，  ｐ．１−２０，（２００７）；  Ｋｕｂｏ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  ３６５，ｐ．５４−６１，（２００８）；  Ｎｉｓｈｉｎａ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １６，ｐ．７３４−７４０，（２００８）参照。）、及び３Ｌ５−ポリヌクレオチドの末端に、タンパク質に結合する核酸分子であるアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）を結合したものも含む。
【０２１７】
３Ｌ５−ポリヌクレオチドには、３Ｌ５−ポリヌクレオチドとモノクローナル抗体（又はその適切な結合部分）や、タンパク質（又はその適切なオリゴペプチドフラグメント）が結合したものも含む（例えば、Ｓｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２３，ｐ．７０９−７１７（２００５）；  Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ２４，ｐ．２３０９−２３１６（２００７）、Ｋｕｍａｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，４４８，ｐ．３９−４３（２００７）参照。）。
【０２１８】
また、３Ｌ５−ポリヌクレオチドには、３Ｌ５−ポリヌクレオチドにカチオニックポリマーを加えることで、正電荷を帯びた複合体としたものも含む（臓器及び細胞への分布を達成することができた例として、Ｌｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｅｄ．  ７，ｐ．９７７−９８６（２００５），Ｂａｉｇｕｄｅ  ｅｔ  ａｌ．２，ｐ．２３７−２４１，  ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．（２００７），Ｙａｄａｖａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  １７，ｐ．２１３−２２２（２００７）参照）。
【０２１９】
３Ｌ５−ポリヌクレオチドには、上記３Ｌ５−ポリヌクレオチドのあらゆる薬学的に許容可能な塩類、エステル、又はそのようなエステルの塩類を含む。
【０２２０】
３Ｌ５−ポリヌクレオチドの薬学的に許容可能な塩類としては、好適にはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリ−ルスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマ−ル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；及び、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。
【０２２１】
３Ｌ５−ポリヌクレオチドを含有する組成物は、例えばリポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所的又は取り込み、分配及び／又は吸収を補助するための他の処方として、他の分子、分子構造又は化合物の混合物と混合される、封入される、共役される。
【０２２２】
３Ｌ５−ポリヌクレオチドを、疾患の予防薬又は治療薬として使用する場合には、前記ポリヌクレオチド、又は、その薬理学上許容される塩を、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容される、賦形剤、希釈剤等と混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等により経口的に、又は、注射剤、坐剤、貼付剤、若しくは、外用剤等により非経口的に投与することができる。
【０２２３】
これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤；及び、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤を挙げることができる。）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体を挙げることができる。）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；及び、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤を挙げることができる。）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸を挙げることができる。）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。
【０２２４】
３．３Ｌ５−ポリヌクレオチドの細胞、組織あるいは個体への導入、及び標的遺伝子の発現調節
上記のように調製された３Ｌ５−ポリヌクレオチドを導入する被導入体としては、標的遺伝子がその細胞内でＲＮＡに転写され得るものであれば、特に制限されない。被導入体としては細胞、組織、あるいは個体を意味する。
【０２２５】
３Ｌ５−ポリヌクレオチドが用いられる細胞としては、生殖系列細胞、体性細胞、分化全能性細胞、多分化能細胞、分割細胞、非分割細胞、実質組織細胞、上皮細胞、不滅化細胞、形質転換細胞、神経細胞又は免疫細胞のいずれのものであってもよい。
【０２２６】
組織としては単一細胞胚又は構成性細胞、又は多重細胞胚、胎児組織等を含む。また、上記分化細胞としては、例えば、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞及び内分泌線又は外分泌腺の細胞等が挙げられる。このような細胞の例としては、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  ｂａｎｋ）、ショウジョウバエＳ２細胞（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｍｂｒｙｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｍｏｒｐｈ．，  ２７，ｐ．３５３−３６５（１９７２）、ヒトＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２）、あるいは、ヒトＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）等が好ましく用いられる。
【０２２７】
さらに３Ｌ５−ポリヌクレオチドの被導入体として用いられる個体として、具体的には、植物、動物、原生動物、ウイルス、バクテリア、又は真菌類に属するもの等が挙げられる。植物は単子葉植物、双子葉植物又は裸子植物であってよく、動物は、脊椎動物又は無脊椎動物であってもよい。脊椎動物としてはマウス、ラット、サル、イヌ及びヒトを含む哺乳類が好ましい。
【０２２８】
被導入体への３Ｌ５−ポリヌクレオチドの導入方法としては、被導入体が細胞、あるいは組織の場合は、カルシウムフォスフェート法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウイルス感染、３Ｌ５−ポリヌクレオチド溶液への浸漬、あるいは形質転換法等が用いられる。また、胚に導入する方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション法、あるいはウイルス感染等が挙げられる。被導入体が植物の場合には植物体の体腔又は間質細胞等への注入又は灌流、あるいは噴霧による方法が用いられる。また、動物個体の場合には、経口、局所、皮下、筋肉内及び静脈内投与、非経口、経膣、経直腸、経鼻、経眼、経膜内投与等によって全身的に導入する方法、あるいはエレクトロポレーション法やウイルス感染等が用いられる。経口導入の方法としては、３Ｌ５−ポリヌクレオチドを生物の食物と直接混合する方法を使うこともできる。
【０２２９】
３Ｌ５−ポリヌクレオチドを患者へ導入する方法については、上記に加えてコロイド分散系を用いることができる。
【０２３０】
コロイド分散系は化合物の生体内の安定性を高める効果や、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。
【０２３１】
コロイド分散系は、通常用いられるものであれば限定しないが、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げる事ができ、好ましくは、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果のある、複数のリポソーム、人工膜の小胞である（Ｍａｎｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８８，６，ｐ．６８２−；Ｂｌｕｍｅ  ａｎｄ  Ｃｅｖｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，ｐ．９１−；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．，１９９４，２３，ｐ．１１９−；Ｃｈｏｎｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｌｉｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９５，６，ｐ．６９８−）。
【０２３２】
０．２−０．４μｍのサイズ範囲をとる単膜リポソームは、巨大分子を含有する水性緩衝液のかなりの割合を被包化し得、化合物はこの水性内膜に被胞化され、生物学的に活性な形態で脳細胞へ輸送される（Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９８１，６，ｐ．７７−）。
【０２３３】
リポソームの組成は、通常、脂質、特にリン脂質、とりわけ相転移温度の高いリン脂質を１種又はそれ以上のステロイド、特にコレステロールと通常複合したものである。
【０２３４】
リポソーム生産に有用な脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド及びガングリオシドのようなホスファチジル化合物を包含する。
【０２３５】
特に有用なのはジアシルホスファチジルグリセロールであり、ここでは脂質部分が１４−１８の炭素原子、特に１６−１８の炭素原子を含有し、飽和している（１４−１８の炭素原子鎖の内部に二重結合を欠いている）。
【０２３６】
代表的なリン脂質は、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンを包含する。
【０２３７】
リポソームを包含するコロイド分散系の標的化は、受動的又は能動的のいずれかであってもよい。
【０２３８】
受動的な標的化は、洞様毛細血管を含有する臓器の網内系細胞へ分布しようとするリポソーム本来の傾向を利用することによって達成される。
【０２３９】
一方、能動的な標的化は、例えば、ウイルスのタンパク質コート（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．），１９９３，９０，ｐ．８４７４−）、モノクローナル抗体（又はその適切な結合部分）、糖、糖脂質又はタンパク質（又はその適切なオリゴペプチドフラグメント）のような特定のリガンドをリポソームへ結合させること、又は天然に存在する局在部位以外の臓器及び細胞型への分布を達成するためにリポソームの組成を変えることによってリポソームを修飾する手法等を挙げることができる。
【０２４０】
標的化されたコロイド分散系の表面は様々なやり方で修飾され得る。
【０２４１】
リポソームで標的したデリバリーシステムでは、脂質二重層との緊密な会合において標的リガンドを維持するために、リポソームの脂質二重層へ脂質基が取込まれ得る。
脂質鎖を標的リガンドと結びつけるために様々な連結基が使用され得る。
【０２４２】
３Ｌ５−ポリヌクレオチドのデリバリーが所望される細胞の上に支配的に見出される特定の細胞表面分子に結合する標的リガンドは、例えば、（１）デリバリーが所望される細胞によって支配的に発現される特定の細胞受容体と結合している、ホルモン、成長因子又はその適切なオリゴペプチドフラグメント、又は（２）標的細胞上で支配的に見出される抗原性エピトープと特異的に結合する、ポリクローナル又はモノクローナル抗体、又はその適切なフラグメント（例えば、Ｆａｂ；Ｆ（ａｂ’）２）、であり得る。
２種又はそれ以上の生物活性剤は、単一のリポソーム内部で複合し、投与することもできる。
【０２４３】
内容物の細胞内安定性及び／又は標的化を高める薬剤をコロイド分散系へ追加することも可能である。
【０２４４】
３Ｌ５−ポリヌクレオチド又はその薬理学上許容される塩の使用量は症状、年齢等により異なるが、経口投与の場合には、１回当り下限１ｍｇ（好適には、３０ｍｇ）、上限２０００ｍｇ（好適には、１５００ｍｇ）を、静脈内投与または皮下投与の場合には、１回当り下限０．５ｍｇ（好適には、５ｍｇ）、上限５００ｍｇ（好適には、２５０ｍｇ）を、気管内投与の場合には、１回当り下限０．５ｍｇ（好適には、５ｍｇ）、上限５００ｍｇ（好適には、２５０ｍｇ）を、眼球内投与の場合には、１回当り下限０．０５ｍｇ（好適には、０．５ｍｇ）、上限１０ｍｇ（好適には、５ｍｇ）を、成人に対して、１日当り１乃至３回症状に応じて投与することが望ましい。また、安定性が高められた薬剤の場合は、１週間に１乃至３回、さらに安定性が高められた薬剤の場合は、１ヶ月に１乃至３回症状に応じて投与することが望ましい。
【０２４５】
局所的投与に対する薬学的組成物及び処方は、経皮的パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、飴、坐薬、スプレー、液体及び粉末を含む。
【実施例】
【０２４６】
以下、実施例、参考例及び試験例にて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例において、遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊］に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。実施例で合成された各ポリヌクレオチドのＸの構造式、質量分析計で測定された各ポリヌクレオチドの分子量の測定値、を表１に示した。【０２４７】
（参考例１）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号１）（ＣＴ−１６９）の合成
核酸自動合成機（パーキンエルマー社製  ＡＢＩ  ｍｏｄｅｌ  ３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用い、０．２μｍｏｌスケールのＲＮＡ合成プログラムに従って行った。各合成サイクルにおける溶媒、試薬、ホスホロアミダイトの濃度は天然オリゴデオキシヌクレオチド合成の場合と同じものを用いた。【０２４８】
デオキシヌクレオシドホスホロアミダイトを用いる場合は、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシアデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｎ−イソブチリル−２’−デオキシグアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトをＰｒｏｌｉｇｏ社より購入し適宜調整し用いた。【０２４９】
２’−Ｏ−メチルヌクレオシドホスホロアミダイトを用いる場合は、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−メチルアデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｎ−イソブチリル−２’−Ｏ−メチルグアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｎ−アセチル−２’−Ｏ−メチルシチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチルウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトをＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈより購入し適宜調製し用いた。【０２５０】
リボヌクレオシドホスホロアミダイトを用いる場合は、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）アデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｎ−ジメチルホルムアミジン−２’  −Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）グアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｎ−アセチル−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）シチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトをＰｒｏｌｉｇｏ社より購入し適宜調製し用いた。
２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドホスホロアミダイトを用いる場合は、特許３４２０９８４号の実施例１４（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト）、実施例２７（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−２−Ｎ−イソブチリルグアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト）、実施例２２（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチルシチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト）、実施例９（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト）、の化合物を適宜調製し用いた。【０２５１】
５’−末端にリン酸基部分がある場合は、フォスファリンク（ＡＢＩ製）を適宜調製し用いた。【０２５２】
ホスホロアミダイトは、適宜核酸自動合成機に取り付け、所望の配列を有するポリヌクレオチドを合成した。固相担体として、所望のヌクレオシドが結合したＣＰＧ（コントロールド  ポア  グラス；アプライドバイオシステム製、又は、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ製）０．５μｍｏｌを用い、表記のポリヌクレオチドを合成した。核酸自動合成機の最終工程で、酸処理をしなかった（ジメトキシトリチル基がオリゴヌクレオチド上に結合している）。本ポリヌクレオチドにおいては、アンモニア水で処理した後、逆相ＨＰＬＣ（島津製作所製ＬＣ−１０ＶＰ、カラム（Ｍｅｒｃｋ，  Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＲＰ−１８ｅ  （４．６×１００ｍｍ））、Ａ溶液：５％アセトニトリル、０．１Ｍ  酢酸トリエチルアミン水溶液（ＴＥＡＡ），  ｐＨ７．０、Ｂ溶液：アセトニトリル、Ｂ％：１０％→６０％（１０ｍｉｎ，  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）；６０℃；２ｍｌ／ｍｉｎ；２６０ｎｍ）にて精製し、ジメトキシトリチル基を有する目的物のピークを集めた。水を加え、減圧下留去することで、ＴＥＡＡを除いた。ジメトキシトリチル基が結合している場合は、８０％酢酸水溶液（２ｍＬ）を加え、２０分放置することで、ジメトキシトリチル基の脱保護を行った。溶媒を留去したのち、残渣を５００μｌの水に溶解し、酢酸エチルで洗浄し、凍結乾燥後、目的とするオリゴヌクレオチドを得た。また必要に応じて、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１ｘ  ＴＢＥ、６００Ｖ、４時間）で精製した。電気泳動後、ＵＶランプを用いてバンドを可視化し、ナイフを使ってバンドを切り出し、１ｍＬの０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）の溶液を加えて、一晩放置し、ポリヌクレオチドをゲル片から溶出させた。エタノールを加え、オリゴヌクレオチドを沈殿させ、遠心し回収した。本ポリヌクレオチドの分子量は、負イオンＥＳＩ質量分析により同定した。
分子量：計算値：５７６７．８６、測定値：５７６７．７８
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５６の配列を含む。【０２５３】
（実施例１）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＣＴ−４３７）の合成
ＣＴ−４３７は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。【０２５４】
参考例１と同様にＣＴ−４３７を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分に以下のように調製したＸアミダイト試薬をカップリングした。参考例３で取得された化合物（２０ｍｇ）をアセトニトリル：塩化メチレン（１：１ｖ／ｖ）２ｍＬに溶解し、２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ  ｔｅｔｒａｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄｉｔｅ  （７４μＬ、０．２３ｍｍｏｌ）、１Ｈ  Ｔｅｔｒａｚｏｌｅ  ０．４５Ｍアセトニトリル溶液３６０μＬを加え２時間攪拌した。ＴＬＣで反応の進行を確認後、フィルターろ過を行い、Ｘアミダイト試薬を調製した。ＣＴ−４３７の構造を図６に示す。【０２５５】
（実施例２）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＣＴ−４５５）の合成
実施例１と同様にＣＴ−４５５を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例４で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。
ＣＴ−４５５は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４５５の構造を図６に示す。【０２５６】
（実施例３）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＣＴ−４５６）の合成
実施例１と同様にＣＴ−４５６を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例５で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２５７】
ＣＴ−４５６は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４５６の構造を図６に示す。【０２５８】
（実施例４）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＣＴ−４４６）の合成
実施例１と同様にＣＴ−４４６を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例６で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２５９】
ＣＴ−４４６は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４４６の構造を図６に示す。【０２６０】
（実施例５）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＣＴ−４４７）の合成
実施例１と同様にＣＴ−４４７を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例７で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２６１】
ＣＴ−４４７は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４４７の構造を図６に示す。【０２６２】
（実施例６）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＣＴ−４４８）の合成
実施例１と同様にＣＴ−４４８を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例８で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２６３】
ＣＴ−４４８は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４４８の構造を図６に示す。【０２６４】
（実施例７）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＣＴ−４４９）の合成
実施例１と同様にＣＴ−４４９を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例９で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２６５】
ＣＴ−４４９は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４４９の構造を図６に示す。【０２６６】
（実施例８）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＣＴ−４５０）の合成
実施例１と同様にＣＴ−４５０を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１０で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２６７】
ＣＴ−４５０は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４５０の構造を図６に示す。【０２６８】
（実施例９）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＣＴ−４５１）の合成
実施例９０と同様にＣＴ−４５１を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１１で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２６９】
ＣＴ−４５１は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４５１の構造を図６に示す。【０２７０】
（実施例１０）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＣＴ−４５２）の合成
実施例１と同様にＣＴ−４５２を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１２で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２７１】
ＣＴ−４５２は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４５２の構造を図６に示す。【０２７２】
（実施例１１）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＣＴ−４５３）の合成
実施例１と同様にＣＴ−４５３を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１３で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２７３】
ＣＴ−４５３は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４５３の構造を図６に示す。【０２７４】
（実施例１２）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＣＴ−４５４）の合成
実施例１と同様にＣＴ−４５４を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１４で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２７５】
ＣＴ−４５４は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４５４の構造を図６に示す。【０２７６】
（実施例１３）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＣＴ−４６０）の合成
実施例１と同様にＣＴ−４６０を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１７で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２７７】
ＣＴ−４６０は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４６０の構造を図７に示す。【０２７８】
（実施例１４）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＣＴ−４６１）の合成
実施例１と同様にＣＴ−４６１を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例２１で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２７９】
ＣＴ−４６１は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４６１の構造を図７に示す。【０２８０】
（実施例１５）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＣＴ−４６２）の合成
実施例１と同様にＣＴ−４６２を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例２２で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２８１】
ＣＴ−４６２は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４６２の構造を図７に示す。【０２８２】
（実施例１６）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＣＴ−４６３）の合成
実施例１と同様にＣＴ−４６３を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例２３で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２８３】
ＣＴ−４６３は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４６３の構造を図７に示す。【０２８４】
（実施例１７）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＣＴ−４６４）の合成
実施例１と同様にＣＴ−４６４を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例２６で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２８５】
ＣＴ−４６４は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４６４の構造を図７に示す。【０２８６】
（実施例１８）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＣＴ−４６５）の合成
実施例１と同様にＣＴ−４６５を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例２４で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２８７】
ＣＴ−４６５は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４６５の構造を図７に示す。【０２８８】
（実施例１９）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＣＴ−４６６）の合成
実施例１と同様にＣＴ−４６６を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例２５で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２８９】
ＣＴ−４６６は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４６６の構造を図７に示す。【０２９０】
（実施例２０）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＣＴ−４６７）の合成
実施例１と同様にＣＴ−４６７を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例２７で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２９１】
ＣＴ−４６７は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４６７の構造を図７に示す。【０２９２】
（実施例２１）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＣＴ−４６８）の合成
実施例１と同様にＣＴ−４６８を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例２８で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２９３】
ＣＴ−４６８は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４６８の構造を図７に示す。【０２９４】
（実施例２２）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＣＴ−４６９）の合成
実施例１と同様にＣＴ−４６９を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例２９で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２９５】
ＣＴ−４６９は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４６９の構造を図７に示す。【０２９６】
（実施例２３）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＣＴ−４７０）の合成
実施例１と同様にＣＴ−４７０を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例３０で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２９７】
ＣＴ−４７０は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４７０の構造を図７に示す。【０２９８】
（実施例２４）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＣＴ−４７１）の合成
実施例１と同様にＣＴ−４７１を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例３１で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２９９】
ＣＴ−４７１は、配列表の配列番号１に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４７１の構造を図７に示す。【０３００】
（実施例２５）
ＨＯ−Ｇｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ａｒｐ−Ｇｒｐ−Ａｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｇｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｃｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｔ−Ｈ（ＣＴ−４７２）の合成
実施例１と同様にＣＴ−４７２を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１４で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０３０１】
ＣＴ−４７２は、配列表の配列番号３に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号４に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４７２の構造を図７に示す。【０３０２】
（実施例２６）
ＨＯ−Ｇｒｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｒｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｒｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｒｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｒｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｒｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｒｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｒｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｒｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｒｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｕｒｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｕｒｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｒｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｒｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｒｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｕｒｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｕｒｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｒｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｒｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｔ−Ｈ（ＣＴ−４７３）の合成
実施例１と同様にＣＴ−４７３を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１４で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０３０３】
ＣＴ−４７３は、配列表の配列番号５に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号６に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＣＴ−４７３の構造を図７に示す。【０３０４】
実施例１〜１６に記載のポリヌクレオチドのX部分の構造と分子量を表１に示す。表中、Xの末端のメチレン基はセンス鎖ポリヌクレオチドの３’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成し、フェニル基に結合している酸素原子はアンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成する。【０３０５】
【表１】
2012074038.tif 000022
実施例１７〜２６に記載のポリヌクレオチドのX部分の構造と分子量を表２に示す。表中、Xの末端のメチレン基はセンス鎖ポリヌクレオチドの３’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成し、フェニル基に結合している酸素原子はアンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成する。【０３０６】
【表２】
2012074038.tif 000023
【０３０７】
（参考例２）
ＨＯ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−１５７）の合成
参考例１と同様にＣＴ−１５７を合成した。ＣＴ−１５７の構造を図６に示す。
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５７に相補的な配列を含む。【０３０８】
（参考例３）
６−（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙ）ｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（７２２  ｍｇ，  １．６７  ｍｍｏｌ，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９５，  ６０，  ３３５８-３３６４）をメチレンクロリド２ｍＬに溶解し、４−アミノフェノール（２００  ｍｇ、１．８４  ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２８８  ｍｇ、２．５  ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（２２５  ｍｇ，  ２．５  ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２６０μＬ）を加え、一晩撹拌した。反応の終結をＴＬＣで確認後、メチレンクロリド、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で分液し、有機相を飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（３０ｇ、２％メタノール／メチレンクロリド）で精製し、アモルファス状の化合物を得た（６４９ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４３−６．７５（１７Ｈ，ｍ），  ３．７８（６Ｈ，ｓ），  ３．０８−３．０２（２Ｈ，ｍ），２．３２−２．２８（２Ｈ，ｍ），  １．７３−１．５９（４Ｈ，ｍ），  １．４９−１．３８（２Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５２５  Ｍ＋
（参考例４）
８−ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  （１００ｍｇ，  ０．５９  ｍｍｏｌ）をピリジン１．５ｍＬに溶解し、４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  （２３７ｍｇ，  ０．７  ｍｍｏｌ）を加え、一晩撹拌した。反応の終結をＴＬＣで確認後、メチレンクロリド、水で分液し、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（４ｇ、メチレンクロリド）で精製し、アモルファス状の８−（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙ）ｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄを得た（３４８ｍｇ）。得られた８−（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙ）ｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄをメチレンクロリド１ｍＬに溶解し、４−アミノフェノール（７０．９  ｍｇ、０．６４  ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１０１．６  ｍｇ、０．８８  ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（７９  ｍｇ，  ０．８８６  ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（９２  μＬ）を加え、一晩撹拌した。反応の終結をＴＬＣで確認後、シリカゲルカラム（５  ｇ、３０％→５０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサン）で精製し、アモルファス状の化合物を得た（１４８ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５２−６．５９（１７Ｈ，ｍ），  ３．７９（６Ｈ，ｓ），  ３．０５−３．０１（２Ｈ，ｍ），２．３１−２．２７（２Ｈ，ｍ），  １．７１−１．５８（４Ｈ，ｍ），  １．３５−１．２４（６Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ＋ＫＩ）：  ５９２  （Ｍ＋Ｋ）＋
（参考例５）
１０−（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙ）ｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（０．７０７  ｇ，  １．１９  ｍｍｏｌ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  １９９４，  ３５，  ２３５３−２３５６）を  メチレンクロリド２ｍＬに溶解し、４−アミノフェノール（１４１．８  ｍｇ、１．２８  ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２０３  ｍｇ、１．７６  ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（１５８  ｍｇ，  １．７６  ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１８３μＬ）を加え、一晩撹拌した。反応の終結をＴＬＣで確認後、シリカゲルカラム（７．５  ｇ、３０％→５０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサン）で精製し、アモルファス状の化合物を得た（４８５ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５２−６．５９（１７Ｈ，ｍ），  ３．７８（６Ｈ，ｓ），  ３．０４−３．０１（２Ｈ，ｍ），２．３３−２．２９（２Ｈ，ｍ），  １．７４−１．５６（４Ｈ，ｍ），  １．３３−１．２４（１０Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５８０  （Ｍ−Ｈ）＋
（参考例６）
４−アミノ−１−ブタノール（１６０．４５  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）、４−ヒドロキシ安息香酸（２０７．１８  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）に対して、ＥＤＣ（３８３  ｍｇ、２  ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（６７．５  ｍｇ，  ０．５  ｍｍｏｌ）がメチレンクロリド３  ｍＬに溶解した溶液を加え、さらにトリエチルアミン（２６０  μＬ）を加え、一晩振とうした。反応の終結をＴＬＣで確認後、シリカゲルカラム（５  ｇ、メチレンクロリド→酢酸エチルで溶出）で精製し、オイル状のアミド化合物を得た（０．２０  ｇ）。これをピリジン１．５  ｍＬに溶解し、４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  （５００  ｍｇ，  １．５  ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応の終結をＴＬＣで確認後、メタノール０．５  ｍＬを加え、酢酸エチル、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で分液し、有機相の溶媒を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（１０ｇ、４０％→５０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサン）で精製し、アモルファス状の化合物を得た（３２５ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．７０−６．７８（１７Ｈ，ｍ），  ６．１１（１Ｈ，  ｂｒｓ），  ５．６９（１Ｈ，  ｓ），  ３．７８（６Ｈ，ｓ），  ３．４４−３．４１（２Ｈ，ｍ），  ３．１３−３．１０（２Ｈ，ｍ），  １．７０−１．６９（４Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５１１  Ｍ＋
（参考例７）
６−アミノ−１−ヘキサノール（２１０．９４  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）、４−ヒドロキシ安息香酸（２０７．１８  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（４４５ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．６７−６．７９（１７Ｈ，ｍ），  ５．９７（１Ｈ，  ｂｒｓ），  ５．５６（１Ｈ，  ｓ），  ３．７８（６Ｈ，ｓ），  ３．４３−３．３８（２Ｈ，ｍ），  ３．０６−３．０２（２Ｈ，ｍ），  １．６３−１．５５（４Ｈ，ｍ），  １．４５−１．３４（４Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５３９  Ｍ＋
（参考例８）
８−アミノ−１−オクタノール（２６１．４３  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）、４−ヒドロキシ安息香酸（２０７．１８  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（４８６ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．６８−６．８０（１７Ｈ，ｍ），  ５．９８（１Ｈ，  ｂｒｓ），  ５．５４（１Ｈ，  ｓ），  ３．７９（６Ｈ，ｓ），  ３．４４−３．３９（２Ｈ，ｍ），  ３．０４−３．０１（２Ｈ，ｍ），  １．６２−１．５５（４Ｈ，ｍ），  １．３４−１．２４（８Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５６７  Ｍ＋
（参考例９）
４−アミノ−１−ブタノール（１６０．４５  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）、３−ヒドロキシ安息香酸（２０７．１８  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（５６６ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５２−６．７９（１７Ｈ，ｍ），  ６．２５（１Ｈ，  ｂｒｓ），  ６．０６（１Ｈ，  ｓ），  ３．７８（６Ｈ，ｓ），  ３．４７−３．４７−３．４２（２Ｈ，ｍ），  ３．１５−３．１２（２Ｈ，ｍ），  １．７２−１．６６（４Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５１１  Ｍ＋
（参考例１０）
６−アミノ−１−ヘキサノール（２１０．９４  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）、３−ヒドロキシ安息香酸（２０７．１８  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（５８０ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５２−６．８０（１７Ｈ，ｍ），  ６．０８（１Ｈ，  ｂｒｓ），  ６．０４（１Ｈ，  ｓ），  ３．７８（６Ｈ，ｓ），  ３．４５−３．４０（２Ｈ，ｍ），  ３．０６−３．０３（２Ｈ，ｍ），  １．６５−１．５６（４Ｈ，ｍ），  １．４５−１．３４（４Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５３９  Ｍ＋
（参考例１１）
８−アミノ−１−オクタノール（２６１．４３  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）、３−ヒドロキシ安息香酸（２０７．１８  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（６７５ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５２−６．８０（１７Ｈ，ｍ），  ６．２１（１Ｈ，  ｂｒｓ），  ６．１１（１Ｈ，  ｓ），  ３．７８（６Ｈ，ｓ），  ３．４６−３．４１（２Ｈ，ｍ），  ３．０４−３．０１（２Ｈ，ｍ），  １．６３−１．５８（４Ｈ，ｍ），  １．３９−１．３３（８Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５６６  （Ｍ−Ｈ）＋
（参考例１２）
４−アミノ−１−ブタノール（１６０．４５  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸
（２４９．２６  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（５４０ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５２−６．６８（１７Ｈ，ｍ），  ５．３７（１Ｈ，  ｂｒｓ），  ４．８７（１Ｈ，  ｓ），  ３．７９（６Ｈ，ｓ），  ３．２１−３．１６（２Ｈ，ｍ），  ３．０６−３．０３（２Ｈ，ｍ），  ２．８６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５６Ｈｚ），  ２．３５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５６Ｈｚ），  １．５４−１．４８（４Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５４０  （Ｍ＋Ｈ）＋
（参考例１３）
６−アミノ−１−ヘキサノール（２１０．９４  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（２４９．２６  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（５５９ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４４−６．７０（１７Ｈ，ｍ），  ５．２１（１Ｈ，ｂｒｓ），  ５．０３（１Ｈ，ｓ），  ３．７９（６Ｈ，ｓ），  ３．１８−３．１３（２Ｈ，ｍ），  ３．０５−３．０２（２Ｈ，ｍ），  ２．８７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３３Ｈｚ），  ２．３９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５６Ｈｚ），  １．５９−１．１３（８Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５６８  （Ｍ＋Ｈ）＋
（参考例１４）
８−アミノ−１−オクタノール（２６１．４３  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（２４９．２６  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、あめ状の化合物を得た（７２０ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５２−６．７１（１７Ｈ，ｍ），  ５．２６（１Ｈ，ｂｒｓ），  ５．１０（１Ｈ，ｓ），  ３．７８（６Ｈ，ｓ），  ３．２０−３．１５（２Ｈ，ｍ），  ３．０５−３．０１（２Ｈ，ｍ），  ２．８８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５６Ｈｚ），  ２．４１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５６Ｈｚ），  １．６２−１．１７（１２Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５９４  （Ｍ−Ｈ）＋
（参考例１５）
Ｎ−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）−Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ
Ｌ−チロシン  エチル（４１８ｍｇ，  ２ｍｍｏｌ）をピリジン５  ｍＬに溶解し、４−ｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  （７４１  ｍｇ，  ２．４  ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間撹拌した。反応の終結をＴＬＣで確認後、酢酸エチル、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で分液し、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、有溶媒を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（３０ｇ、３０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサン）で精製し、アモルファス状の化合物を得た（６８７ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４２−６．７２（１８Ｈ，ｍ），  ４．６９（１Ｈ，ｓ），  ３．７６（３Ｈ，ｓ），  ３．５３−３．３３（３Ｈ，ｍ），  ２．９４−２．８１（２Ｈ，ｍ），  ２．５８（１Ｈ，ｄ），  ０．８８−０．８５（３Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ４８２  （Ｍ＋Ｈ）＋
（参考例１６）
３−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙ）−２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  （Ａｃ−Ｓｅｒ（ＭＭＴｒ）−ＯＨ）
Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−セリン（１．７７５ｇ，  １２ｍｍｏｌ）をピリジン２０  ｍＬに溶解し、４−ｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  （４．１ｇ，  １３．２  ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応の終結をＴＬＣで確認後、酢酸エチル、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で分液し、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（１２０ｇ、３０％アセトン／ｎ−ヘキサン）で精製し、アモルファス状の化合物を得た（３．９３ｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４１−６．８１（１４Ｈ，ｍ），  ６．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３３Ｈｚ），  ４．７０−４．６６（１Ｈ，ｍ），  ３．７８（３Ｈ，ｓ），  ３．７７−３．７３（１Ｈ，ｍ），  ３．４２−３．３８（１Ｈ，ｍ），  ２．０２（３Ｈ，ｓ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ４１９  Ｍ＋
（参考例１７）
Ａｃ−Ｓｅｒ（ＭＭＴｒ）−Ｔｙｒ−ＯＥｔ
参考例１６の化合物（６２９  ｍｇ，  １．５  ｍｍｏｌ  Ａｃ−Ｓｅｒ（ＭＭＴｒ）−ＯＨ）をメチレンクロリド３ｍＬに溶解し、Ｌ−チロシン  エチル（３３４ｍｇ，  １．６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（３８３  ｍｇ、２  ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（６７．５  ｍｇ，  ０．５  ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２６０μＬ）を加え、４時間撹拌した。反応液をシリカゲルカラム（１５ｇ、４０％→５０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサン）で精製し、アモルファス状の化合物を得た（４６０ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４０−６．６１（１８Ｈ，ｍ），  ６．１１−６．０６（１Ｈ，ｍ），  ４．８７−４．７７（１Ｈ，ｍ），  ４．５６−４．４８（１Ｈ，ｍ），  ４．１９−４．０５（２Ｈ，ｍ），  ３．７９，３．７８（３Ｈ，ｄｓ），  ３．７３−３．５９（１Ｈ，ｍ），  ３．１９−２．９６（３Ｈ，ｍ），  １．９３，１．９１  （１Ｈ，ｄｓ），  １．２８−１．２２（３Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ６１１  （Ｍ＋Ｈ）＋
（参考例１８）
ｔ−Ｂｏｃ−βＡｌａ−Ｔｙｒ−ＯＥｔ
Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−β−Ａｌａｎｉｎｅ（２８３ｍｇ，  １．５ｍｍｏｌ，  ｔ−Ｂｏｃ−βＡｌａ−ＯＨ）、Ｌ−チロシン  エチル（３７６  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ，  Ｈ−Ｔｙｒ−ＯＥｔ）を用いて参考例１７と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（４９７ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）６．９７−６．７４（４Ｈ，ｍ），  ６．０３（１Ｈ，  ｂｒｓ），  ５．１１（１Ｈ，  ｂｒｓ），  ４．８０（１Ｈ，ｑ，  Ｊ＝６．７２Ｈｚ），  ４．２２−４．１５（２Ｈ，ｍ），  ３．３７−３．３６（２Ｈ，ｍ），  ３．１０−３．０１（２Ｈ，ｍ），  ２．３８（２Ｈ，ｍ），  １．４１（９Ｈ，ｓ），  １．２９−１．２３（３Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ３８１  （Ｍ＋Ｈ）＋
（参考例１９）
ｔ−Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−ＯＥｔ
Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ａｌａｎｉｎｅ（２８３ｍｇ，  １．５ｍｍｏｌ，  ｔ−Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ）、Ｌ−チロシン  エチル（３７６  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）を用いて参考例１７と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（４９０ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）６．９８−６．７１（４Ｈ，ｍ），  ６．４９（１Ｈ，ｄ），  ５．１６（１Ｈ，ｓ），  ４．９５−４．７６（１Ｈ，ｍ），  ４．２０−４．１３（３Ｈ，ｍ），  ３．１１−２．９９（２Ｈ，ｍ），  １．４１（９Ｈ，ｓ），  １．３３，１．３１（３Ｈ，ｄｓ），  １．２８−１．２１（３Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ３８１  （Ｍ＋Ｈ）＋
（参考例２０）
ｔ−Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＯＥｔ
Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｇｌｙｃｉｎｅ（２６３  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）、Ｌ−チロシン  エチル（３７６  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）を用いて参考例１７と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（４３４ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）６．９８−６．７２（４Ｈ，ｍ），  ６．４６（１Ｈ，  ｄ），  ５．０６（１Ｈ，  ｂｒｓ），  ４．８４−４．７９（１Ｈ，ｍ），  ４．２１−４．１３（２Ｈ，ｍ），  ３．８５−３．７２（２Ｈ，ｍ），  ３．１０−３．０１（２Ｈ，ｍ），  １．４１（９Ｈ，ｓ），  １．２９−１．２４（３Ｈ，ｍ），  １．２８−１．２１（３Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ３６７  （Ｍ＋Ｈ）＋
（参考例２１）
Ａｃ−Ｓｅｒ（ＭＭＴｒ）−βＡｌａ−Ｔｙｒ−ＯＥｔ
参考例１８で取得された化合物（４９０ｍｇ，  １．２９ｍｍｏｌ）をメチレンクロリド４ｍＬに溶解し、ＴＦＡ４ｍＬを加え、室温で１５分放置後、溶媒を減圧下濃縮した。残渣をメチレンクロリド３ｍＬ、トリエチルアミン（２６０μＬ）に溶解し、参考例１６で取得された化合物（５４４ｍｇ，  １．３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（３８３  ｍｇ、２  ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（６７．５  ｍｇ，  ０．５  ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２６０μＬ）を加え、一晩撹拌した。反応液をシリカゲルカラム（２０ｇ、８０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサン→酢酸エチル）で精製し、アモルファス状の化合物を得た（４６９ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４１−６．７１（１８Ｈ，ｍ），  ４．９１−４．７５（１Ｈ，ｍ），  ４．５４−４．４４（１Ｈ，ｍ），  ４．２６−４．１５（２Ｈ，ｍ），  ３．７８（３Ｈ，ｓ），  ３．４６−２．２０（８Ｈ，ｍ），  ２．０２，１．９８（３Ｈ，ｄｓ），  １．３４−１．２４（３Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ６８２  （Ｍ＋Ｈ）＋
（参考例２２）
Ａｃ−Ｓｅｒ（ＭＭＴｒ）−Ａｌａ−Ｔｙｒ−ＯＥｔ
参考例１９の化合物（４８５ｍｇ，  １．２６ｍｍｏｌ）、参考例１６で取得された化合物（５４４ｍｇ，  １．３ｍｍｏｌ）を用いて、参考例２１と同様に合成し、白色固体の化合物を得た（４４８ｍｇ）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４１−６．４９（１８Ｈ，ｍ），  ４．８１−４．７１（１Ｈ，ｍ），  ４．５６−４．４３（２Ｈ，ｍ），  ４．２１−４．１１（２Ｈ，ｍ），  ３．７９、３．７８（３Ｈ，ｄｓ），  ３．４６−２．８３（４Ｈ，ｍ），  ２．０１，１．９４（３Ｈ，ｄｓ），  １．３７−１．１７（６Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ６８２  （Ｍ＋Ｈ）＋
（参考例２３）
Ａｃ−Ｓｅｒ（ＭＭＴｒ）−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＯＥｔ
参考例２０で取得された化合物（４３０ｍｇ，  １．１７ｍｍｏｌ）、参考例１６で取得された化合物（５４４ｍｇ，  １．３ｍｍｏｌ）を用いて、参考例２１と同様に合成し、白色固体の化合物を得た（４８６ｍｇ）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）９．２２（１Ｈ，ｓ），  ８．４１−８．３４（１Ｈ，ｍ），  ８．２４−８．２０（１Ｈ，ｍ），  ８．０８−８．０５（１Ｈ，ｍ），  ７．３８−６．６３（１８Ｈ，ｍ），  ４．６２−４．５８（１Ｈ，  ｍ），  ４．３９−４．３３（１Ｈ，  ｍ），  ４．０４−３．９７（２Ｈ，ｍ），  ３．９２−３．６１（２Ｈ，ｍ），  ３．７４（３Ｈ，ｓ），  ３．０９−３．０８（１Ｈ，ｍ），  ２．８６−２．５０（１Ｈ，ｍ），  １．８５（３Ｈ，ｓ），  １．１１−１．０６（３Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ６６８  （Ｍ＋Ｈ）＋
（参考例２４）
１０−アミノ−１−デカノール（２６０  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）、４−ヒドロキシ安息香酸（２９９  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（５６８  ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．６７−６．８０（１７Ｈ，ｍ），  ６．０１−５．９９（２Ｈ，ｍ），  ３．７８（６Ｈ，ｓ），  ３．４５−３．４０（２Ｈ，ｍ），  ３．０２（２Ｈ，ｔ、Ｊ＝６．６４Ｈｚ），  １．６３−１．２４（１４Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５９５  Ｍ＋
（参考例２５）
１０−アミノ−１−デカノール（２６０  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）、３-(４-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸（２４９  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、あめ状の化合物を得た（４１１  ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４５−６．７１（１７Ｈ，ｍ），  ５．２７（１Ｈ，ｂｒｓ），  ５．０３（１Ｈ，ｓ），  ３．７９（６Ｈ，ｓ），  ３．２１−３．１６（２Ｈ，ｍ），３．０３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６４Ｈｚ），２．８８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５６Ｈｚ），  ２．４１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５６Ｈｚ），  １．６２−１．１７（１４Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ６４６  （Ｍ＋Ｎａ）＋
（参考例２６）
８−アミノ−１−オクタノール（２１８  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）、(４-ヒドロキシフェノキシ)酢酸（３０３  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、あめ状の化合物を得た（４８９  ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４５−６．７４（１７Ｈ，ｍ），  ６．５６（１Ｈ，ｂｒｓ），  ４．９５（１Ｈ，ｓ），４．４６（２Ｈ，ｓ），  ３．７９（６Ｈ，ｓ），３．３４−３．２９（２Ｈ，ｍ），  ３．０３（２Ｈ，ｔ、Ｊ＝６．６４Ｈｚ），  １．６３−１．２４（１２Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５９６  （Ｍ−Ｈ）＋
（参考例２７）
１０−アミノ−１−デカノール（２６０  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）、(４-ヒドロキシフェノキシ)酢酸（３０３  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、あめ状の化合物を得た（５７９  ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４５−６．７５（１７Ｈ，ｍ），  ６．５６（１Ｈ，ｂｒｓ），  ５．０２（１Ｈ，ｓ），４．４２（２Ｈ，ｓ），  ３．７９（６Ｈ，ｓ），３．３５−３．３０（２Ｈ，ｍ），  ３．０３（２Ｈ，ｔ、Ｊ＝６．６４Ｈｚ），  １．６３−１．２４（１４Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ６２４  （Ｍ−Ｈ）＋
（参考例２８）
（ＰＥＯ）３−ｍｏｎｏ-ａｍｉｎｅ（ＣＨＥＭ−ＩＰＥＸ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ、２２４  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）、４−ヒドロキシ安息香酸（２９９  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（５２０  ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５８−６．６４（１７Ｈ，ｍ），  ６．６１（１Ｈ，ｂｒｓ），  ５．８１（１Ｈ，ｓ），  ３．７８（６Ｈ，ｓ），３．７１−３．６０（１０Ｈ，ｍ），  ３．２３（２Ｈ，ｔ、Ｊ＝５．２７Ｈｚ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５７１  Ｍ＋
（参考例２９）
（ＰＥＯ）３−ｍｏｎｏ-ａｍｉｎｅ（ＣＨＥＭ−ＩＰＥＸ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ、２２４  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）、３-(４-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸（２４９  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、あめ状の化合物を得た（５４３  ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４６−６．６８（１７Ｈ，ｍ），  ５．８８（１Ｈ，ｂｒｓ），  ５．３０（１Ｈ，ｓ），  ３．７７（６Ｈ，ｓ），３．６７−３．６４（４Ｈ，ｍ），３．５８−３．５６（２Ｈ，ｍ），３．５１−３．４７（２Ｈ，ｍ），３．４３−３．３８（２Ｈ，ｍ），３．２６−３．２３（２Ｈ，ｍ），２．８３−２．８１（２Ｈ，ｍ），  ２．２７（２Ｈ，ｔ、Ｊ＝７．７９Ｈｚ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ６２２  （Ｍ＋Ｎａ）＋
（参考例３０）
（ＰＥＯ）３−ｍｏｎｏ-ａｍｉｎｅ（ＣＨＥＭ−ＩＰＥＸ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ、２２４  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）、(４-ヒドロキシフェノキシ)酢酸（３０３  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、あめ状の化合物を得た（４７１  ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５２−６．６８（１８Ｈ，ｍ），  ５．０５（１Ｈ，ｓ），  ４．３９（２Ｈ，ｓ），  ３．７８（６Ｈ，ｓ），  ３．６７−３．５１（１０Ｈ，ｍ），  ３．２３（２Ｈ，ｔ、Ｊ＝５．２７Ｈｚ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ６００  （Ｍ−Ｈ）＋
（参考例３１）
８−アミノ−１−オクタノール（２１８  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）、Ｎ-[(９Ｈ-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]-Ｌ-チロシン（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−チロシン、７２６  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）を用いて参考例６と同様に合成し、アモルファス状の化合物を得た（３５８  ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．７７−６．７１（２５Ｈ，ｍ），  ５．４６（１Ｈ，ｂｒｓ），  ５．３９（１Ｈ，ｂｒｓ），５．０６（１Ｈ，ｓ），  ４．４３−４．１８（４Ｈ，ｍ），  ３．７８（６Ｈ，ｓ），  ３．１２−３．０２（６Ｈ，ｍ），  １．６２−１．１２（１２Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ８３３  Ｍ＋
（参考例３２）
ＨＯ−Ｇｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ａｒｐ−Ｇｒｐ−Ａｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｇｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｔ−Ｈ（配列表の配列番号７）（ＣＴ−１０６）の合成
参考例１と同様にＣＴ−１０６を合成した。但し、目的配列を有する保護されたポリヌクレオチド類縁体をアンモニア水：エタノール溶液（３：１ｖ／ｖ）２  ｍＬで５５℃、１６時間処理することによってオリゴマーを支持体から切り出すとともに、リン酸基の保護基のシアノエチル基と核酸塩基上の保護基をはずした。ＣＰＧをろ過して除き、エタノールで洗浄し、ろ液と洗液と合わせて、溶媒を減圧下留去した。残った残渣に、Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ  ｔｒｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｄｅを０．３ｍＬ加え、室温で１９時間放置後、精製した。ＣＴ−１０６の構造を図１３に示す。
分子量：計算値：６７２７．１６、測定値：６７２６．７３
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５７の配列を含む。【０３０９】
（参考例３３）
ＨＯ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｃｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｔ−Ｈ（配列表の配列番号８）（ＣＴ−０４１）の合成
参考例３２と同様にＣＴ−０４１を合成した。ＣＴ−０４１の構造を図１３に示す。
分子量：計算値：６５６５．８８、測定値：６５６５．３４
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５７に相補的な配列を含む。【０３１０】
（参考例３４）ＣＴ−００１
ＨＯ−Ｇｒｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｒｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｒｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｒｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｒｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｒｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｒｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｒｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｒｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｒｐ−Ｔｐ−Ｔｔ−Ｈ（配列表の配列番号９）（ＣＴ−００１）の合成
参考例３２と同様にＣＴ−００１を合成した。ＣＴ−００１の構造を図１３に示す。
分子量：計算値：６８４９．４６、測定値：６８５０．８
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５７の配列を含む。【０３１１】
（参考例３５）ＣＴ−００５
ＨＯ−Ｕｍ１ｐ−Ｕｒｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｕｒｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｒｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｒｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｒｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｕｒｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｕｒｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｒｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｒｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｔｔ−Ｈ（配列表の配列番号１０）（ＣＴ−００５）の合成
参考例３２と同様にＣＴ−００５を合成した。ＣＴ−００５の構造を図１３に示す。
分子量：計算値：６７０２．２０、測定値：６７０２．２
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５７に相補的な配列を含む。【０３１２】
参考例３〜１４、１７及び２１〜２３に記載の化合物の構造を図５に示し、参考例２４〜３１に記載の化合物の構造を図１０に示す。【０３１３】
（実施例２７）２本鎖構造形成のためのアニーリング
上記、参考例１及び参考例２の組み合わせで、センス鎖及びアンチセンス鎖を３００ｐｍｏｌずつ１つのチューブに入れて、減圧下乾燥し、３０μＬのｓｉＲＮＡ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ）を加え、６５℃、１分間加温した後、室温に５分間放置し、センス鎖及びアンチセンス鎖をアニーリングさせ、１０μＭの２本鎖ポリヌクレオチド溶液を得た。【０３１４】
２本鎖ポリヌクレオチドは、センス鎖、アンチセンス鎖の組み合わせのみで表すこともある。すなわち、例えば、ＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７の組み合わせからなる２本鎖ポリヌクレオチドは、単に、「ＣＴ１６９／ＣＴ１５７」または、「ＣＴ１６９／１５７」とも表す。）
本方法により、図６及び７に示す、２本鎖ポリヌクレオチド及びアンチセンス鎖の５’とセンス鎖の３’がリン酸ジエステル結合を介してリンカーで結合している３Ｌ５−ポリヌクレオチドを取得することができる。【０３１５】
（試験例１）
以下のように１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチドによるヒトβ−カテニン遺伝子発現抑制活性の強さを比較した。【０３１６】
（１）トランスフェクション
ヒト大腸癌ＳＷ４８０細胞株（ヒト大腸腺癌由来）を、１０％  Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中に１０００００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調製した。そして、１２穴平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１ｍＬずつ播種し、３７℃、５．０％炭酸ガス下で１日間培養した。リポフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を７．５μＬ、１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチド溶液を最終濃度が、０．３、０．０３、及び０．００３ｎＭとなるようにＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地中で混合し、２０分室温で静置した。各ウェルに混合液を添加して、さらに３日間培養を継続した。【０３１７】
（２）リアルタイムＰＣＲ
トランスフェクション後、ウェルより培養上清を除いて、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）でｍＲＮＡを抽出した。得られたｍＲＮＡをｉＳｃｒｉｐｔＴＭｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて説明書の記載に従い０．５μｇＲＮＡよりｃＤＮＡを調製した。次に、リアルタイムＰＣＲのためにヒトβ−カテニン遺伝子ＰＣＲプライマー（ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  ＩＤ：  ＨＡ１３５６６４、タカラバイオ社製）、内部標準としてヒト−ＧＡＰＤＨ遺伝子に対するＰＣＲプライマー（ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  ＩＤ：  ＨＡ０６７８１２、タカラバイオ社製）及びＰＣＲに必要な薬剤を含むリアルタイムＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて次のようにｍＲＮＡの定量を行った。
βカテニン遺伝子  ID：HA135664
フォワードプライマー  5'-TCTGAGGACAAGCCACAAGATTACA-3'（配列番号１１）
リバースプライマー  5'-TGGGCACCAATATCAAGTCCAA-3'（配列番号１２）
ＧＡＰＤＨ遺伝子  ID：HA067812
フォワードプライマー  5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'（配列番号１３）
リバースプライマー  5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'（配列番号１４）
９６穴ＰＣＲプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）１ウェルあたり、リアルタイムＰＣＲキットに含まれる２×ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを２５μＬ、ＲＮａｓｅ―Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒを１８μＬ、各ＰＣＲプライマーを５μＬ（最終濃度  ０．３μＭ）、調製したｃＤＮＡ溶液を２μＬ添加して総量を５０μＬとし、Ｍｘ３０００Ｐ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）にセットし、以下の条件でＰＣＲを実施した。
ＰＣＲ初期活性化  ９５℃、１５分間
ＰＣＲ  ９４℃、１５秒間
５６℃、３０秒
７２℃、３０秒
このＰＣＲサイクルは４０回繰り返した。検量線は、リポフェクション試薬のみで処理した細胞（＝ＮＣ）から抽出したｍＲＮＡより調製したｃＤＮＡ５倍希釈列したものを用いた。検量線を元に、各トランスフェクタントのヒトβ−カテニンとヒトＧＡＰＤＨを定量し、ヒトβ−カテニン遺伝子量をヒトＧＡＰＤＨ量で割った相対量をグラフにプロットした。リアルタイムＰＣＲはＮ＝２で実施し、グラフにはその平均を示した（ポリヌクレオチドの構造及びそのヌクレオチド配列は図６及び図７に示している。）
（３）リアルタイムＰＣＲ解析
（ａ）遺伝子抑制活性解析１
ＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７、ＣＴ−４３７、ＣＴ−４５５、ＣＴ−４５６、ＣＴ−４４６、ＣＴ−４４７、ＣＴ−４４８、ＣＴ−４４９、ＣＴ−４５０、ＣＴ−４５１、ＣＴ−４５２、ＣＴ−４５３、ＣＴ−４５４、及び、ＣＴ−４６１（構造は図６及び図７参照。）のβ−カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。【０３１８】
図８に示すように、ＣＴ−４３７、ＣＴ−４５５、ＣＴ−４５６、ＣＴ−４４６、ＣＴ−４４７、ＣＴ−４４８、ＣＴ−４４９、ＣＴ−４５０、ＣＴ−４５１、ＣＴ−４５２、ＣＴ−４５３、ＣＴ−４５４、及び、ＣＴ−４６１は、ＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７と同様にβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。ＣＴ−４４８、及び、ＣＴ−４５４は、ＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７よりも強い活性を示した。このことは、アンチセンス鎖５’末端とセンス鎖３’末端とを修飾フェニル基を用いてリン酸基を介して結合した１本鎖ポリヌクレオチドが強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。【０３１９】
（試験例２）
試験例１と同様に１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチドによるヒトβ−カテニン遺伝子発現抑制活性の強さを比較した。
リアルタイムＰＣＲ解析
ａ）遺伝子抑制活性解析１
ＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７、ＣＴ−４６０、ＣＴ−４６１、ＣＴ−４６２、及び、ＣＴ−４６３（構造は図７参照。）のβ−カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。【０３２０】
図９に示すように、ＣＴ−４６０、ＣＴ−４６１、ＣＴ−４６２、及び、ＣＴ−４６３は、ＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７よりもβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。このことは、アンチセンス鎖５’末端とセンス鎖３’末端を修飾フェニル基を用いてリン酸基を介して結合した１本鎖ポリヌクレオチドが強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。【０３２１】
（試験例３）
１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチドによるヒトβ−カテニン遺伝子発現抑制活性の強さを比較した。
（１）トランスフェクション
ヒト大腸癌ＳＷ４８０細胞株（ヒト大腸腺癌由来）を、１０％  Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中に１０００００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調製した。そして、１２穴平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１ｍＬずつ播種した。次に、リポフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を７．５μＬ、１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチド溶液を最終濃度が、０．３、０．０３、及び０．００３ｎＭとなるようにＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地中で混合し、２０分室温で静置した。各ウェルに混合液を添加し、
３７℃、５．０％炭酸ガス下３日間培養を継続した。
（２）リアルタイムＰＣＲ
試験例１と同様の方法で行った。
（３）リアルタイムＰＣＲ解析
a）遺伝子抑制活性解析1
ＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７、ＣＴ−４４８、ＣＴ−４５４、ＣＴ−４６４、ＣＴ−４６５、ＣＴ−４６６、ＣＴ−４６７、ＣＴ−４６８、ＣＴ−４６９、ＣＴ−４７０、及び、ＣＴ−４７１（構造は図１１参照。）のβ−カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。【０３２２】
図１２に示すように、ＣＴ−４７０は、ＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７と同様にβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。ＣＴ−４４８、ＣＴ−４５４、ＣＴ−４６４、ＣＴ−４６５、ＣＴ−４６６、ＣＴ−４６７、ＣＴ−４６８、ＣＴ−４６９、及び、ＣＴ−４７１は、ＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７よりも強い活性を示した。このことは、アンチセンス鎖５’末端とセンス鎖３’末端を修飾フェニル基を用いてリン酸基を介して結合した１本鎖ポリヌクレオチドが強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。
b）遺伝子抑制活性解析２
ＣＴ−１０６／ＣＴ−０４１、及び、ＣＴ−４７２（構造は図１３参照。）のβ−カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。
図１４に示すように、ＣＴ−４７２は、ＣＴ−１０６／ＣＴ−０４１と同様にβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。このことは、アンチセンス鎖５’末端とセンス鎖３’末端を修飾フェニル基を用いてリン酸基を介して結合した１本鎖ポリヌクレオチドが強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。
ｃ）遺伝子抑制活性解析４
ＣＴ−００１／ＣＴ−００５、及び、ＣＴ−４７３（構造は図１３参照。）のβ−カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。
図１４に示すように、ＣＴ−４７３は、ＣＴ−００１／ＣＴ−００５よりもβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。このことは、アンチセンス鎖５’末端とセンス鎖３’末端を修飾フェニル基を用いてリン酸基を介して結合した１本鎖ポリヌクレオチドが強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。【０３２３】
（実施例２７）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＰＫ−００９）の合成
実施例１と同様にＰＫ−００９を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１４で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０３２４】
ＰＫ−００９は、配列表の配列番号１７に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号１８に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＰＫ−００９の構造を図１５に示す。【０３２５】
（実施例２８）
ＨＯ−Ｃｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＨＳ−００５）の合成
実施例１と同様にＨＳ−００５を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１４で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０３２６】
ＨＳ−００５は、配列表の配列番号２３に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２４に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＨＳ−００５の構造を図１６に示す。【０３２７】
（実施例２９）
ＨＯ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＨＳ−００６）の合成
実施例１と同様にＨＳ−００６を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１４で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０３２８】
ＨＳ−００６は、配列表の配列番号２５に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２６に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＨＳ−００６の構造を図１６に示す。【０３２９】
（実施例３０）
ＨＯ−Ｃｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｓ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＨＳ−００５ｓ）の合成
実施例１と同様にＨＳ−００５を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１４で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。本ポリヌクレオチドにおいては、ホスホロチオエート結合部分は、０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド／ピリジン−アセトニトリル（１：１  ｖ／ｖ）溶液３分間処理することで調製した。【０３３０】
ＨＳ−００５ｓは、配列表の配列番号２７に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号２８に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＨＳ−００５ｓの構造を図１６に示す。【０３３１】
（実施例３１）
ＨＯ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｓ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＨＳ−００６ｓ）の合成
実施例１と同様にＨＳ−００６ｓを合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１４で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。本ポリヌクレオチドにおいては、ホスホロチオエート結合部分は、０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド／ピリジン−アセトニトリル（１：１  ｖ／ｖ）溶液３分間処理することで調製した。【０３３２】
ＨＳ−００６ｓは、配列表の配列番号２９に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号３０に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＨＳ−００６ｓの構造を図１６に示す。【０３３３】
（実施例３２）
ＨＯ−Ｃｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＨＳ−０１２）の合成
実施例１と同様にＨＳ−０１２を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例１４で取得された化合物（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０３３４】
ＨＳ−０１２は、配列表の配列番号３３に示されるポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと配列番号３４に示されるポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがＸとのリン酸ジエステル結合を介して結合しているポリヌクレオチドである。ＨＳ−０１２の構造を図１９に示す。【０３３５】
実施例２７〜３２に記載のポリヌクレオチドのX部分の構造と分子量を表３に示す。表中、Xの末端のメチレン基はセンス鎖ポリヌクレオチドの３’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成し、フェニル基に結合している酸素原子はアンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成する。【０３３６】
【表３】
2012074038.tif 000024
【０３３７】
（参考例３６）
ＨＯ−Ｇｒｐ−Ｃｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ｇｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ｕｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ａｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ａｒｐ−Ｇｒｐ−Ｕｒｐ−Ａｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｈ（配列表の配列番号１５）（ＰＫ−００１）の合成
参考例３２と同様にＰＫ−００１を合成した。ＰＫ−００１の構造を図１５に示す。
分子量：計算値：６６５８．０４、測定値：６６５８．２３
塩基配列：ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿０１１１６３）のヌクレオチド番号７４３−７６２の配列を含む。【０３３８】
（参考例３７）
ＨＯ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ａｒｐ−Ｃｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ａｒｐ−Ｇｒｐ−Ａｒｐ−Ｃｒｐ−Ｇｒｐ−Ａｒｐ−Ｇｒｐ−Ｃｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇ−Ｈ（配列表の配列番号１６）（ＰＫ−００２）の合成
参考例３２と同様にＰＫ−００２を合成した。ＰＫ−００２の構造を図１５に示す。
分子量：計算値：６６７４．０４、測定値：６６７３．９１
塩基配列：ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿０１１１６３）のヌクレオチド番号７４３−７６２に相補的な配列を含む。【０３３９】
（参考例３８）
ＨＯ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ａｒｐ−Ｇｒｐ−Ａｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｇｒｐ−Ｇｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｃｒｐ−Ｕｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｔｐ−Ｔｔ−Ｈ（配列表の配列番号１９）（ＨＳ−００１のセンス鎖）の合成
参考例３２と同様にＨＳ−００１のセンス鎖を合成した。ＨＳ−００１のセンス鎖の構造を図１６に示す。
分子量：計算値：６７１０．１２、測定値：６７１０．３７
塩基配列：ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ ４７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１２３５）のヌクレオチド番号１６０１−１６１９の配列を含む。【０３４０】
（参考例３９）
ＨＯ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ａｒｐ−Ｇｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ｃｒｐ−Ｃｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ｔｐ−Ｔｔ−Ｈ（配列表の配列番号２０）（ＨＳ−００１のアンチセンス鎖）の合成
参考例３２と同様にＨＳ−００１のセンス鎖を合成した。ＨＳ−００１のアンチセンス鎖の構造を図１６に示す。
分子量：計算値：６５９０．０４、測定値：６５８９．８８
塩基配列：ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ ４７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１２３５）のヌクレオチド番号１６０１−１６１９のに相補的な配列を含む。【０３４１】
（参考例４０）
ＨＯ−Ｇｒｐ−Ａｒｐ−Ｇｒｐ−Ａｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｇｒｐ−Ｇｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｃｒｐ−Ｕｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ａｒｐ−Ｔｐ−Ｔｔ−Ｈ（配列表の配列番号２１）（ＨＳ−００２のセンス鎖）の合成
参考例３２と同様にＨＳ−００１のセンス鎖を合成した。ＨＳ−００１のセンス鎖の構造を図１６に示す。
分子量：計算値：６７３３．１６、測定値：６７３３．２２
塩基配列：ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ ４７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１２３５）のヌクレオチド番号１６０２−１６１９の配列を含む。【０３４２】
（参考例４１）
ＨＯ−Ｕｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ａｒｐ−Ｇｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ｃｒｐ−Ｃｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ｔｐ−Ｔｔ−Ｈ（配列表の配列番号２２）（ＨＳ−００２のアンチセンス鎖）の合成
参考例３２と同様にＨＳ−００１のセンス鎖を合成した。ＨＳ−００１のアンチセンス鎖の構造を図１６に示す。
分子量：計算値：６５６７．００、測定値：６５６６．９９
塩基配列：ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ ４７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１２３５）のヌクレオチド番号１６０２−１６１９に相補的な配列を含む。
（試験例４）
１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチドによるマウスＰＫＲ（Ｅｉｆ２ａｋ２）遺伝子発現抑制活性測定法を示す。【０３４３】
Ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔにリポフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて図１５に記載の１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチドを導入することができる。【０３４４】
トランスフェクション２４から４８時間後に、細胞からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｕｐｅｒ  Ｍｉｘ  ｆｏｒ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｃＤＮＡに逆転写する。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを用いた定量的ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりＰＫＲ遺伝子、内部標準として３６Ｂ４遺伝子の発現量を測定する。プライマーは参考文献（Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  １４０，  ３３８−３４８  （２０１０））に従い、ＰＫＲ：  ５’−ＡＡＡＡＣＡＡＧＧＴＧＧＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＧ−３’と５’−ＧＴＴＧＧＧＣＴＣＡＣＡＣＴＧＴＴＣＡＴＡＡＴ−３’，  ３６Ｂ４：  ５’−ＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＧＧＡＣＣＣＧＡＧＡＡ−３’と５’−ＡＧＧＧＧＧＡＧＡＴＧＴＴＣＡＧＣＡＴＧＴ−３’を用いる。各サンプルのＰＫＲ  ｍＲＮＡ量を同じサンプルの３６Ｂ４  ｍＲＮＡ量で割ることにより補正し、１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチドによる相対的な遺伝子抑制の強さを測ることができる。
（試験例５）
以下のように１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチドによるラットＨｓｐ４７（Ｓｅｒｐｉｎｈ１）遺伝子発現抑制活性を測定した。【０３４５】
（１）トランスフェクション
１２穴平底プレート（住友ベークライト社製）に２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチド溶液（最終濃度１及び０．１ｎＭ）を加えた。ネガティブコントロールとしてＱｉａｇｅｎ社より購入したＡｌｌＳｔａｒｓ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡを用いた。そこにリポフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１．２μＬ加え混ぜて１０分間から２０分間室温で静置した。その間にラットＮＲＫ−５２Ｅ細胞株を、１０％  Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中に６２５００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調製した。そして、リポソームーポリヌクレオチド希釈液が入ったプレートの各ウェルに１ｍＬずつ播種し、３７℃、５％二酸化炭素条件下において培養した。【０３４６】
（２）リアルタイムＰＣＲ
トランスフェクション２７時間後、細胞からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。Ｈｓｐ４７  ｍＲＮＡレベルは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｕｐｅｒ  Ｍｉｘ  ｆｏｒ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｃＤＮＡに逆転写をしたのちＴａｑＭａｎプローブを用いた定量的ＰＣＲにより測定した。Ｈｓｐ４７遺伝子に対するプライマー、プローブはＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製  Ａｓｓａｙ  ＩＤ  Ｒｎ００５６７７７７＿ｍ１）を用いた。ＴａｑＭａｎ反応はＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。内部標準として同じサンプルのｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の発現レベルを測定した。ｒＲＮＡ測定のプライマー、プローブにはＴａｑＭａｎ  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ＶＩＣTM  Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号：４３０８３２９）を用いた。【０３４７】
各サンプルのＨｓｐ４７  ｍＲＮＡ量をｒＲＮＡ量で割り、トランスフェクション試薬のみを加えてポリヌクレオチドを加えていない細胞の値を１として相対量を図１７にプロットした（図中、ＡｌｌＳｔａｒｓ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ（カタログ番号：１０２７２８０）を用いた場合は、ｎａｇｔｉｖｅ  ｓｉと表記した）。図１７は独立した３回の実験結果の平均とそのＳ．Ｄ．値を示した（ポリヌクレオチドの構造及びそのヌクレオチド配列は図１６に示している。）。【０３４８】
（２）リアルタイムＰＣＲ解析
（ａ）遺伝子抑制活性解析１
２本鎖ポリヌクレオチドＨＳ−００１、２本鎖ポリヌクレオチドＨＳ−００２、１本鎖ポリヌクレオチドＨＳ−００５、及び、１本鎖ポリヌクレオチドＨＳ−００６（構造は図１６参照。）のラットＨｓｐ４７遺伝子発現抑制活性を調べた。【０３４９】
図１７に示すように、ＨＳ−００５は、ＨＳ−００１よりもラットＨｓｐ４７遺伝子の発現を強く抑制し、ＨＳ−００６は、ＨＳ−００２よりもラットＨｓｐ４７遺伝子の発現を強く抑制した。この際、ＡｌｌＳｔａｒｓ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡは、Ｈｓｐ４７遺伝子の抑制活性を示さなかった。このことは、アンチセンス鎖５’末端とセンス鎖３’末端を修飾フェニル基を用いてリン酸基を介して結合した１本鎖ポリヌクレオチドが２本鎖ポリヌクレオチドよりも強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。
（試験例６）
１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチドによるラットＨｓｐ４７（Ｓｅｒｐｉｎｈ１）遺伝子発現抑制活性を測定した。【０３５０】
（１）トランスフェクション
２本鎖ポリヌクレオチドであるＨＳ−００１、ＨＳ−００２、１本鎖ポリヌクレオチドＨＳ−００５ｓ、及び、ＨＳ−００６ｓ（構造は図１６参照。）を用いて、試験例５と同様に行った。但し、ＮＲＫ―５２Ｅ細胞への核酸の導入は、２４穴平底プレート（住友ベークライト社製）を用い、試験例５の半分の量の系で行った。【０３５１】
（２）リアルタイムＰＣＲ
試験例５と同様に行った。【０３５２】
（ａ）遺伝子抑制活性解析１
２本鎖ポリヌクレオチドであるＨＳ−００１、ＨＳ−００２、１本鎖ポリヌクレオチドＨＳ−００５ｓ、及び、ＨＳ−００６ｓのラットＨｓｐ４７遺伝子発現抑制活性を調べた。【０３５３】
図１８に示すように、ＨＳ−００５ｓ、及び、ＨＳ−００６ｓは、ＨＳ−００１、及びＨＳ−００２と比較して、同等またはそれ以上にラットＨｓｐ４７遺伝子の発現を強く抑制した。このことは、アンチセンス鎖５’末端とセンス鎖３’末端を修飾フェニル基を用いてリン酸基を介して結合した１本鎖ポリヌクレオチドが２本鎖ポリヌクレオチドよりも強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。
（試験例７）
１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチドによるラットＨｓｐ４７（Ｓｅｒｐｉｎｈ１）遺伝子発現抑制活性を測定した。【０３５４】
（１）トランスフェクション
国際公開第２０１１/０７２０８２記載の２本鎖ポリヌクレオチドであるｓｉＨＳＰ４７Ｃ（配列表の配列番号３１及び３２、構造は図１９参照。）、及び、１本鎖ポリヌクレオチドＨＳ−０１２（構造は図１９参照。）を用いて、試験例６と同様に行った。
ｓｉＨＳＰ４７Ｃセンス鎖  5'-GGACAGGCCUCUACAACUATT-3'（配列番号３１）
ｓｉＨＳＰ４７Ｃアンチセンス鎖  5'-UAGUUGUAGAGGCCUGUCCTT-3'（配列番号３２）
（２）リアルタイムＰＣＲ
試験例５と同様に行った。【０３５５】
（ａ）遺伝子抑制活性解析１
２本鎖ポリヌクレオチドであるｓｉＨＳＰ４７Ｃ、及び、１本鎖ポリヌクレオチドＨＳ−０１２のラットＨｓｐ４７遺伝子発現抑制活性を調べた。【０３５６】
図２０に示すように、ＨＳ−０１２は、ｓｉＨＳＰ４７Ｃと比較して、同等またはそれ以上にラットＨｓｐ４７遺伝子の発現を強く抑制した。このことは、アンチセンス鎖５’末端とセンス鎖３’末端を修飾フェニル基を用いてリン酸基を介して結合した１本鎖ポリヌクレオチドが２本鎖ポリヌクレオチドよりも強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。
【産業上の利用可能性】
【０３５７】
本発明により、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する１本鎖ポリヌクレオチドを提供することができた。また、本発明により、ＲＮＡ分解酵素に対して安定で、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する１本鎖ポリヌクレオチドを提供することができた。【０３５８】
該１本鎖ポリヌクレオチドは遺伝子の機能解析、医薬品等に利用することが可能であるが、本１本鎖ポリヌクレオチドが利用できる限りにおいてその産業分野は制限されない。
【配列表フリーテキスト】
【０３５９】
配列番号１：ＣＴ−１６９
配列番号２：ＣＴ−１５７
配列番号３：ＣＴ−４７２のセンス鎖領域
配列番号４：ＣＴ−４７２のアンチセンス鎖領域
配列番号５：ＣＴ−４７３のセンス鎖領域
配列番号６：ＣＴ−４７３のアンチセンス鎖領域
配列番号７：ＣＴ−１０６
配列番号８：ＣＴ−０４１
配列番号９：ＣＴ−００１
配列番号１０：ＣＴ−００５
配列番号１１：βカテニン遺伝子フォワードプライマー
配列番号１２：βカテニン遺伝子リバースプライマー
配列番号１３：ＧＡＰＤＨ遺伝子フォワードプライマー
配列番号１４：ＧＡＰＤＨ遺伝子リバースプライマー
配列番号１５：ＰＫ−００１
配列番号１６：ＰＫ−００２
配列番号１７：ＰＫ−００９のセンス鎖領域
配列番号１８：ＰＫ−００９のアンチセンス鎖領域
配列番号１９：ＨＳ−００１のセンス鎖
配列番号２０：ＨＳ−００１のアンチセンス鎖
配列番号２１：ＨＳ−００２のセンス鎖
配列番号２２：ＨＳ−００２のアンチセンス鎖
配列番号２３：ＨＳ−００５のセンス鎖領域
配列番号２４：ＨＳ−００５のアンチセンス鎖領域
配列番号２５：ＨＳ−００６のセンス鎖領域
配列番号２６：ＨＳ−００６のアンチセンス鎖領域
配列番号２７：ＨＳ−００５ｓのセンス鎖領域
配列番号２８：ＨＳ−００５ｓのアンチセンス鎖領域
配列番号２９：ＨＳ−００６ｓのセンス鎖領域
配列番号３０：ＨＳ−００６ｓのアンチセンス鎖領域
配列番号３１：ｓｉＨＳＰ４７Ｃのセンス鎖
配列番号３２：ｓｉＨＳＰ４７Ｃのアンチセンス鎖
配列番号３３：ＨＳ−０１２のセンス鎖領域
配列番号３４：ＨＳ−０１２のアンチセンス鎖領域
【図１】
2012074038.tif 000036
【図２】
2012074038.tif 000037
【図３】
2012074038.tif 000038
【図４】
2012074038.tif 000039
【図５】
2012074038.tif 000040
【図６】
2012074038.tif 000041
【図７】
2012074038.tif 000042
【図８】
2012074038.tif 000043
【図９】
2012074038.tif 000044
【図１０】
2012074038.tif 000045
【図１１】
2012074038.tif 000046
【図１２】
2012074038.tif 000047
【図１３】
2012074038.tif 000048
【図１４】
2012074038.tif 000049
【図１５】
2012074038.tif 000050
【図１６】
2012074038.tif 000051
【図１７】
2012074038.tif 000052
【図１８】
2012074038.tif 000053
【図１９】
2012074038.tif 000054
【図２０】
2012074038.tif 000055
【配列表】
2012074038000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年7月5日(2013.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドであって、該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端と該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端の各々において、リン酸ジエステル構造を形成している次式で示される構造のリンカーによって結合されたポリヌクレオチド又はその塩
【化１】
2012074038.tif 000056
式中、
フェニル基に結合している酸素原子は、アンチセンス鎖の５’末端に結合してリン酸ジエステル構造を形成し、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のいずれか１個は、次式で示される構造：
−Ｌ１−（ＣＨ２）ｍ−Ｌ２−Ｌ３−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）n1−（ＣＨ２）n2−Ｏ→
を示すが、式中、
ｍは、０から４の整数を示し、
ｎ1は、０から４の整数を示し、
ｎ2は、０又は２から１０の整数を示し、
Ｌ１は、単結合又は−Ｏ−を示し、
Ｌ２は、単結合又は−ＣＨ（−ＮＨ−Ｌ４−Ｒ）−を示し、
Ｌ３は、Ｌ２との結合を基点として、単結合、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、又は−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−を示すが、
Ｌ３が単結合以外のとき、ｎ2は、２から１０の整数を示す。
Ｌ１及びＬ２が単結合であって、ｍが１、ｎ1およびｎ2が０であるときに、Ｌ３−Ｏ→は、
−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ−（アミノ酸残基）ｊ−Ｓｅｒ、
−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ−（アミノ酸残基）ｊ−Ｔｈｒ、
−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ−（アミノ酸残基）ｊ−Ｓｅｒ、又は
−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ−（アミノ酸残基）ｊ−Ｔｈｒ、
を示すが、これらのセリンおよびトレオニンの水酸基部分は、センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端のリン酸基と結合しており、さらにセリンおよびトレオニンのアミノ基はアシル基で置換されていてもよく、
ｊは、０から２の整数を示し、
Ｌ４は、単結合、メチレン基、炭素数２から４のポリメチレン基、又は−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−構造であり、−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−構造のカルボニル基は、アミノ基とは構造式の左端で結合し、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−の構造を形成し、
Ｒは、水素原子、炭素数１から６のアルキル基、飽和又は不飽和であってもよい炭素数２から３０の炭化水素カルボニル基、飽和又は不飽和であってもよい炭素数２から３０の炭化水素オキシカルボニル基を示す。
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうちの残りの２個は、各々独立に、
水素原子、
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基、
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルコキシ基、
ハロゲン原子、
炭素数１から９のアルキル基を有するアルキルカルボニルアミノ基、及び
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基を含むアルキルカルボニル基、
からなる群の基から選ばれる基を示す。
【請求項２】
Ｒ１及びＲ３が水素原子である、請求項１に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項３】
Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、ｍとｎ2の和が３以上の整数である、請求項２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項４】
Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、ｍとｎ2の和が８以上の整数である、請求項２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項５】
Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、ｍが０又は２であり、ｎ2が６以上の整数である、請求項２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項６】
Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、ｍが０又は２であり、ｎ2が６又は８である、請求項２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項７】
Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、ｍが０又は２であり、ｎ2が８である、請求項２に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項８】
Ｒ１及びＲ３が水素原子であり、Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、ｍが２であり、ｎ2が８である、請求項１に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項９】
標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドであって、該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端と該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端がリン酸ジエステル結合を介してリンカーによって結合された次式で示される構造のポリヌクレオチド又はその塩
【化２】
2012074038.tif 000057
式中、
ｐは、０から４の整数を示し、
ｑは、４から１０の整数を示し、
Ｌ５は、単結合又は−Ｏ−を示し、
Ｌ６は、（ＣＨ２）ｐとの結合を基点として、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、又は−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−を示し、
Ｌ５のベンゼン環上の結合位置はパラ位又はメタ位であり、
Ｌ５が−Ｏ−であるときは、ｐは１から４の整数を示す。
【請求項１０】
ｐとｑの和が４以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項９に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項１１】
ｐとｑの和が８以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項９に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項１２】
ｐが０又は２であり、ｑが６以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項９に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項１３】
ｐが０又は２であり、ｑが６又は８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項９に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項１４】
ｐが０又は２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項９に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項１５】
ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項９に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項１６】
センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩：
５’−（γ−β）９−γ−λｔ−３’（ＩＩ）
５’−β−（γ−β）９−υｕ−３’（ＩＩＩ）
（ａ）γはＲＮＡ、βは２’−ＯＭｅＲＮＡ、λ及びυはＤＮＡを示す；
（ｂ）ｔ及びｕは同一又は異なって、０〜５のいずれかの整数を示す。；
（ｃ）式（ＩＩ）で示されるポリヌクレオチドのうち、（γ−β）９−γは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＩＩ）における（γ−β）９−γと式（ＩＩＩ）におけるβ―（γ−β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
【請求項１７】
センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＶ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（Ｖ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩：
５’−（α−β）９−αｐ−λｔ−３’（ＩＶ）
５’−δｓ−（α−β）９−υｕ−３’（Ｖ）
（ａ）α及びβは異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、δ及びλは同一又は異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、υは同一又は異なってはＤＮＡ、ＲＮＡ及び２’−ＯＭｅＲＮＡから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す；
（ｂ）ｐは０又は１の整数を示し、ｔはｐが０のときは０であり、ｐが１のときは０〜５のいずれかの整数を示す。ｓは０又は１の整数を示し、ｕは０〜５のいずれかの整数を示す。；
（ｃ）式（ＩＶ）で示されるポリヌクレオチドのうち、（α−β）９−αｐは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＩＶ）における（α−β）９と式（Ｖ）における（α−β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
【請求項１８】
センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に、以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩：
５’−β−（α−β）８−αｐ−λｔ−３’（ＶＩ）
５’−δｓ−（α−β）８−（α―β）−υｕ−３’（ＶＩＩ）
（ａ）α及びβは異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、δ及びλは同一又は異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、υは同一又は異なってはＤＮＡ、ＲＮＡ及び２’−ＯＭｅＲＮＡから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す；
（ｂ）ｐは０又は１の整数を示し、ｔはｐが０のときは０であり、ｐが１のときは０〜５のいずれかの整数を示す。ｓは０又は１の整数を示し、ｕは０〜５のいずれかの整数を示す；
（ｃ）式（ＶＩ）で示されるポリヌクレオチドのうち、β−（α−β）８−αｐは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＶＩ）における（α−β）８と式（ＶＩＩ）における（α−β）８は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
【請求項１９】
αがＤＮＡ、βが２’−ＯＭｅＲＮＡであることを特徴とする、請求項１７又は１８に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項２０】
λｔ及びυｕが同一又は異なってチミン塩基、アデニン塩基又はグアニン塩基を有するＤＮＡ、又は、ウラシル塩基、アデニン塩基又はグアニン塩基を有する２’−ＯＭｅＲＮＡのいずれかであることを特徴とする、請求項１６乃至１９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項２１】
ｔが０、ｕが２であることを特徴とする、請求項１６乃至２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項２２】
ｐ及びｔが０、ｓが１、ｕが２であることを特徴とする、請求項１７乃至２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項２３】
ｐ及びｔが０、ｓが０又は１、ｕが２であり、υ２がＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡであることを特徴とする、請求項１７乃至２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項２４】
センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＸ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に、以下の（ａ）乃至（ｃ）に示される特徴を有する、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩：
５’−（α−β）９−３’（ＶＩＩＩ）
５’−β−（α−β）９−（α−β）−３’（ＩＸ）
（ａ）αがＤＮＡ、βが２’−ＯＭｅＲＮＡである；
（ｂ）式（ＩＸ）で示されるポリヌクレオチドのうち、β−（α−β）９は標的遺伝子と相補的なヌクレオチド配列からなる；
（ｃ）式（ＶＩＩＩ）における（α−β）９と式（ＩＸ）における（α−β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
【請求項２５】
２’−ＯＭｅＲＮＡの任意の１〜４残基がＥＮＡ又は２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡに置換されていることを特徴とする、請求項１６乃至２４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項２６】
ＤＮＡの任意の１〜４残基がＲＮＡ、ＥＮＡ又は２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡに置換されていることを特徴とする、請求項１６乃至２５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項２７】
各ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合又はホスホロチオエート結合で結合していることを特徴とする、請求項１乃至２６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項２８】
請求項１乃至２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩を有効成分として含有する医薬。
【請求項２９】
遺伝子発現に由来する疾患を治療するための、請求項２８に記載の医薬。
【請求項３０】
請求項１乃至２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はその塩を含有する試薬。
【請求項３１】
式（Ｘ）
【化３】
2012074038.tif 000058
[式中、Ｔｒは、水酸基の保護基を示し、ｐは、０から４の整数を示し、ｑは、４から１０の整数を示し、Ｌ５は、単結合又は−Ｏ−を示し、Ｌ６は、（ＣＨ２）ｐとの結合を基点として、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、又は−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−を示し、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置はパラ位又はメタ位である。]を有する化合物又はその塩。
【請求項３２】
Ｔｒが４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、ピクシル基、トリチル基、レブリニル基、又はビス（トリメチルシリルオキシ）（シクロヘキシルオキシ）シリル基である、請求項３１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３３】
Ｔｒが４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐとｑの和が４以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項３１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３４】
Ｔｒが４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐとｑの和が８以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項３１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３５】
Ｔｒが４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが６以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項３１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３６】
Ｔｒが４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが６又は８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項３１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３７】
Ｔｒが４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項３１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３８】
Ｔｒが４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項３１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３９】
Ｔｒが４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項３１に記載の化合物又はその塩。
【請求項４０】
標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドであって、該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端と該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端がリン酸ジエステル結合を介してＸによって結合された、式（ＸＩ）
【化４】
2012074038.tif 000059
を有する化合物[式中、Ｗ２’は、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いたセンス鎖ポリヌクレオチドを示し、Ｗ１’−Ｙ’は、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いたアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを示し、Ｘは、式（ＸＩＩ）
【化５】
2012074038.tif 000060
[式中、ｐは、０から４の整数を示し、ｑは、４から１０の整数を示し、Ｌ５は、単結合又は−Ｏ−を示し、Ｌ６は、（ＣＨ２）ｐとの結合を基点として、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、又は−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−を示し、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置はパラ位又はメタ位であり、Ｌ５が−Ｏ−であるときは、ｐは１から４の整数を示す。] を示し、末端のメチレン基は該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成し、フェニル基に結合している酸素原子は該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成する。]を製造する方法であって、
（i）式Ｔｒ−Ｏ−Ｘ−Ｈ[式中、Ｔｒは、水酸基の保護基を示し、Ｘの−（ＣＨ２）ｑ−はＴｒ−Ｏ−に結合し、フェニル基に結合している酸素原子は水素に結合する。]を有する化合物の水酸基を、式（ＸＩＩＩ）
【化６】
2012074038.tif 000061
又は、式（ＸＩＶ）
【化７】
2012074038.tif 000062
[式中、Ｒ４は、２−シアノエチル基、メチル基、メタンスルホニルエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、又は４−クロロフェニルメチル基を示し、Ｒ５は、モルホリノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、又はジメチルアミノ基を示す。] を有する化合物と反応させて、式（ＸＶ）
【化８】
2012074038.tif 000063
を有する化合物を製造する工程；
（ii）上記（i）で得られた化合物をホスホロアミダイト法により、式ＨＯ−Ｗ１−Ｙ−ＣＰＧ[式中、Ｗ１−Ｙは、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いた保護されたアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを示し、ＣＰＧは、ポリヌクレオチドと結合しうるリンカーを有するポリマーサポートを示す。]を有する化合物と反応させて、続いて、ホスホロアミダイト法により、式Ｔｒ１−Ｏ−Ｗ２−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ４）−Ｏ−[式中、Ｔｒ１は、水酸基の保護基を示し、Ｗ２は、５’末端、及び３’末端の水酸基を除いた保護されたセンス鎖ポリヌクレオチドを示す。]部分を製造し、式（ＸＶＩ）
【化９】
2012074038.tif 000064
を有する化合物を製造する工程；及び、
（iii）上記（ii）で得られた化合物をＣＰＧより切り出し、保護基の除去を行う工程からなる、式（ＸＩ）を有する化合物を製造する方法。
【請求項４１】
Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、ピクシル基、トリチル基、レブリニル基、又はビス（トリメチルシリルオキシ）（シクロヘキシルオキシ）シリル基である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐとｑの和が３以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐとｑの和が８以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが６以上の整数であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが６又は８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが０又は２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
Ｔｒ及びＴｒ１が同一又は異なって、４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）-ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
Ｔｒ及びＴｒ１が、４，４’−ジメトキシトリチル基であり、ｐが２であり、ｑが８であり、Ｌ５が単結合であり、Ｌ６が−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−であり、Ｌ５のベンゼン環上の結合位置がパラ位である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
Ｒ４が２−シアノエチル基、メチル基、メタンスルホニルエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、又は４−クロロフェニルメチル基であり、Ｒ５がモルホリノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、又はジメチルアミノ基である、請求項４０乃至４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
Ｒ４が２−シアノエチル基又はメチル基であり、Ｒ５がモルホリノ基又はジイソプロピルアミノ基である、請求項４０乃至４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
式（ＸＩＩＩ）を有する化合物が、クロロ（モルホリノ）メトキシホスフィン、クロロ（モルホリノ）シアノエトキシホスフィン、クロロ（ジイソプロピルアミノ）メトキシホスフィン又はクロロ（ジイソプロピルアミノ）シアノエトキシホスフィンである、請求項４０乃至４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
式（ＸＩＶ）を有する化合物が、ビス（ジイソプロピルアミノ）シアノエトキシホスフィンである、請求項４０乃至４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
下記から選択されるポリヌクレオチド又はその塩
ＨＯ−Ｃｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＨＳ−００５）、
ＨＯ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＨＳ−００６）、
ＨＯ−Ｃｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ａｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｓ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＨＳ−００５ｓ）、又は、
ＨＯ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｓ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（ＨＳ−００６ｓ）
[式中、Ａｐ、Ｇｐ、Ｃｐ、Ｔｐ、Ｔｓ、Ａｍ１ｐ、Ｇｍ１ｐ、Ｃｍ１ｐ、Ｕｍ１ｐ、Ｕｍ１ｔは次式で示される構造のヌクレオシド、又は、ヌクレオチドを示し、
【化１０】
2012074038.tif 000065
Ｘの前方は、標的遺伝子に対するセンス鎖ポリヌクレオチドを示し、Ｘの後方は、該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを示し、Ｘは式（ＸＶＩＩ）
【化１１】
2012074038.tif 000066
で示される構造のリンカーを示し、末端のメチレン基は該センス鎖ポリヌクレオチドの３’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成し、フェニル基に結合している酸素原子は該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端に結合してリン酸ジエステル結合を形成する。]。
【請求項５４】
請求項５３に記載のポリヌクレオチド又はその塩を有効成分として含有する医薬。
【請求項５５】
Ｈｓｐ４７遺伝子の発現に由来する疾患を治療するための、請求項５４に記載の医薬。
【請求項５６】
Ｈｓｐ４７遺伝子の発現に由来する疾患が線維症である、請求項５５に記載の医薬。
【請求項５７】
請求項５３に記載のポリヌクレオチド又はその塩を含有する試薬。
【国際調査報告】
2012074038.tif 000067
2012074038.tif 000068
2012074038.tif 000069
2012074038.tif 000070
2012074038.tif 000071
2012074038.tif 000072
2012074038.tif 000073