(57)【要約】【課題】  細胞性免疫および液性免疫の両方を賦活でき、一般にワクチン療法が困難とされる病原微生物による感染症や悪性腫瘍に対して有効なプライム／ブーストワクチンの製造に用いることのできるウイルスベクターを提供する。【解決手段】  下記（ａ）および（ｂ）からなるプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター；（ａ）免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクター、（ｂ）前記免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するセンダイウイルスベクター。
2012053646.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）および（ｂ）からなるプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター；
（ａ）免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクター、
（ｂ）前記免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するセンダイウイルスベクター。
【請求項２】
下記（ｃ）を含んでなる、請求項１に記載のプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター；
（ｃ）ＣＤ４０リガンド非切断型変異体をコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクター。
【請求項３】
免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクターが、免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子およびＣＤ４０リガンド非切断型変異体をコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクターである、請求項１に記載のプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター。
【請求項４】
プライミング用ウイルスベクターが（ａ）または（ａ）および（ｃ）であって、かつブースティング用ウイルスベクターが（ｂ）である、請求項１から請求項３のいずれかに記載のプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター。
【請求項５】
ワクシニアウイルスベクターが、ワクシニアウイルスＬＣ１６株、ＬＣ１６ｍ８株もしくはＬｃ１６ｍＯ株であって、かつＢ５Ｒ遺伝子において１または複数のヌクレオチドが置換、付加、挿入および／または欠失されていて正常な機能を有するＢ５Ｒ遺伝子産物を産生しないワクシニアウイルスベクターである、請求項１から請求項４のいずれかに記載のプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター。
【請求項６】
免疫原性を有するポリペプチドがヒトに対する病原微生物の抗原タンパク質またはその部分ペプチド、もしくはヒト腫瘍抗原タンパク質またはその部分ペプチドである、請求項１から請求項５のいずれかに記載のプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター。
【請求項７】
病原微生物が、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヘルペスウイルス、フラビウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス、日本脳炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、黄熱ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、ラッサウイルス、ポリオウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、コレラ菌、結核菌、ジフテリア菌、チフス菌、百日咳菌、髄膜炎菌、破傷風菌、ミコバクテリアおよびマラリア原虫よりなる群から選択される病原微生物である、請求項６に記載のプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プライム／ブーストワクチン用ウイルスベクターに関し、特に、細胞性免疫および液性免疫のいずれも賦活可能なプライム／ブーストワクチンに用いることのできるプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトは、ウイルス、細菌、糸状菌その他の様々な生物による感染と、それによる感染症の危険に晒されている。こうした感染症を克服する一つの手段がワクチンの投与である。ワクチンには、毒性を弱めた細菌やウイルスなど病原微生物そのものを使用する生ワクチンと、化学処理などにより死んだ病原微生物、あるいは抗原性を示すそれらの一部分を使用する不活化ワクチンに大別される。【０００３】
ワクチンは細胞性免疫と液性免疫の両方を賦活できることが強い免疫力を付与する上で望ましく、生ワクチンは、その両方を賦活できるために獲得免疫力が強い点、免疫持続期間も長い点などで有効であるが、弱毒化してあるものの病原微生物そのものを生体に投与するために、病原微生物の感染による副反応や弱毒化した病原微生物のリバージョンによる強毒化（復帰突然変異または先祖返り）などのおそれを完全に払拭することは難しい。【０００４】
そのため、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）やヒト肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などのように、いったん感染すると極めて重篤な疾患を発症し得るような病原微生物については、不活化ワクチン、特にヒトに対する安全性が高い感染性ウイルスのゲノムに遺伝子組換え手法によって病原微生物由来の抗原タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ、ウイルスベクターワクチンが利用される。【０００５】
このようなウイルスベクターワクチンには、生体に対する高度な安全性と、組換え遺伝子の高発現性とを備えたウイルスベクターが必要である。その様なウイルスベクターとしては、ほ乳類では増殖できない性質を有するウイルスや、感染はするが宿主において子孫ウイルスを作れないようにゲノムを改変したウイルスなどが利用されており、具体的には、カナリーポックスウイルス、ワクシニアウイルスＭＶＡ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ）、ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８株、ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８株のＢ５Ｒ遺伝子が欠失されて正常な機能を有するＢ５Ｒ遺伝子産物を産生しないワクシニアウイルスｍ８ΔＢ５Ｒ株（特許文献１）、ベクターサブタイプ５のＥ１遺伝子およびＥ３遺伝子を欠損したアデノウイルス、センダイウイルスなどが利用されている。【０００６】
また、ウイルスベクターワクチンとしては、ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８株をベクターとするヒトＢ型肝炎ワクチン（非特許文献１）の他、ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８株にＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１６０（ＧｅｎＢａｎｋ番号 Ｕ２１１３５）を組み込んだＨＩＶワクチン（特許文献２）、センダイウイルスベクターにＨＩＶのｇａｇタンパク質を組み込んだＨＩＶワクチン（特許文献３）といった、種々のウイルスベクター（アデノウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、カナリーポックスウイルスベクターなど）にＨＩＶ−１の構成タンパク質遺伝子を組み込んだＨＩＶワクチンが多数開発されている。【０００７】
一方のワクチネーション手法は、一種類のワクチンのみを使用する方法から、二種類以上のワクチンを組み合わせたプライム／ブーストワクチンを使用する方法へと、主流が移行してきている。プライム／ブーストワクチンとしては、抗原タンパク質遺伝子を組み込んだプラスミド（ＤＮＡワクチン）と種々のウイルスベクターの組み合わせたプライム／ブーストワクチンが数多く試みられている他、安全性の高いＢＣＧにＨＩＶ−１のｇａｇ遺伝子を挿入したｒＢＣＧ／ＨＩＶ−１ｇａｇＥワクチンをプライミング用とし、ヒトの体内では増殖しない弱毒ワクシニアウイルスであるワクシニアウイルスＤＩｓ株にＨＩＶ−１のｇａｇタンパク質遺伝子を挿入したワクシニアＤＩｓ／ＨＩＶ−１ｇａｇＥワクチンをブースティング用としたプライム／ブーストＨＩＶワクチン（特許文献４）や、カナリーポックスウイルスベクターとＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１２０とを組み合わせたプライム／ブーストＨＩＶワクチン（非特許文献２）が開発されている。【０００８】
一方、活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞や活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞などの免疫細胞で発現しているＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）は、樹状細胞を活性化させる因子であることから、これを用いて免疫を賦活する方法が報告されており、可溶性ＣＤ４０Ｌタンパク質を投与して免疫を賦活する方法や、ＣＤ４０Ｌ発現ベクターを導入して活性化させた樹状細胞を用いた悪性腫瘍の免疫療法、可溶性ＣＤ４０Ｌタンパク質とプラスミドや非増殖性ワクシニアウイルスベクターとを混合し投与して免疫を賦活する方法（非特許文献３）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、さらにはその非切断型変異体ＣＤ４０Ｌｍを組換え細胞で発現させることで、該細胞の免疫反応性を改変する方法（特許文献５）などが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００５／０５４４５１号
【特許文献２】特開２００３−３２１３９１号
【特許文献３】国際公開第２００１／０７２３４０号
【特許文献４】特開２００６−１４９２３４号
【特許文献５】国際公開第２００５／１００５５８号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】橋爪壮、新しい弱毒痘菌株ＬＣ１６ｍ８株の基礎、臨床とウイルス、第３巻、第３号、第２２９頁、１９７５年
【非特許文献２】Ｐｅｒｋｓ−Ｎｇａｒｍ Ｓ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第３６１巻、第２２０９−２２２０頁、２００９年
【非特許文献３】Ｃ．Ｅ．Ｇｏｍｅｚら、Ｖａｃｃｉｎｅ、第２７巻、第３１６５−３１７４頁、２００９年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、種々のウイルスベクターにＨＩＶ−１の構成タンパク質遺伝子を組み込んだＨＩＶワクチンは、細胞性免疫は賦活するものの液性免疫の賦活は微弱である。また、細胞性免疫を賦活するアデノウイルスベクターを用いたＨＩＶワクチンはＨＩＶ−１の感染抑制効果がないことが臨床試験で示されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３２１巻、第５３０頁、２００８年）。さらに、非特許文献３に記載の、可溶性ＣＤ４０Ｌタンパク質とプラスミドや非増殖性ワクシニアウイルスベクターとを混合して投与して免疫を賦活する方法も、細胞性免疫は賦活するものの液性免疫の賦活効果は限定的である。【００１２】
一方、プラスミドと種々のウイルスベクターを組み合わせた従来のプライム／ブーストワクチンも、細胞性免疫は賦活するものの抗体誘導能は微弱であった。非特許文献２に記載のカナリーポックスウイルスベクターとＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１２０とを組み合わせたプライム／ブーストＨＩＶワクチンは、ＨＩＶ−１の感染率を若干（３０％）減少させることが臨床試験で示されたが、十分な感染抑制効果とは言い難い。【００１３】
すなわち、未だにＨＩＶやＨＣＶなどの重篤な疾患に対して決め手となり得る、液性免疫と細胞性免疫との両方を賦活するベクターワクチンやプライム／ブーストワクチンは完成されていない。特に、ＨＩＶに対しては液性免疫と細胞性免疫との両方を賦活することが必須であると考えられているところ、現行のＨＩＶ用ベクターワクチンでは産生される中和抗体価が低く、実用レベルとは言い難いため、液性免疫と細胞性免疫との両方を誘導するベクターワクチンの開発が望まれている。【００１４】
また、プライム／ブーストワクチンは、様々なベクターワクチンの組み合わせ、いずれをプライミング用とし、いずれをブースティング用とするかの順序、免疫原性タンパク質の種類、発現量の調節などによって免疫賦活効果が異なるため、それらの選択や決定、すなわちワクチンデザインは依然として試行錯誤を経て行わなければならない状況にある。【００１５】
さらに、ウイルスなどの感染症の他に、ヒトの主要な死亡原因の一つである悪性腫瘍の治療にも、腫瘍抗原に関するワクチン、いわゆる癌ワクチンの利用が開発されつつある。癌ワクチン療法は、悪性腫瘍組織あるいは腫瘍細胞で特異的あるいは有意に発現している抗原性物質を特定し、この抗原性物質に対する患者自身の免疫力を高めることで、悪性腫瘍を治療しようとする試みである。悪性腫瘍の場合には悪性腫瘍をそのまま生ワクチンとすることは事実上不可能であるから、不活化ワクチン、特に腫瘍抗原を生体内で発現し得るベクターワクチン、特に悪性腫瘍に対するプライム／ブーストワクチンの開発が望まれている。【００１６】
本発明は、細胞性免疫および液性免疫の両方を賦活でき、一般にワクチン療法が困難とされる病原微生物による感染症や悪性腫瘍に対して有効なプライム／ブーストワクチンの製造に用いることのできるウイルスベクターを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、病原微生物に対するプライム／ブーストワクチンを製造するためのワクチンデザインにおいて、抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクターをプライミングし、抗原タンパク質発現センダイウイルスベクターをブースティングすることにより、細胞性免疫と液性免疫の両方を賦活することができること、およびプライミングにおいて抗原タンパク質と共にＣＤ４０Ｌｍを発現させることにより免疫賦活効果が増強されることを見出し、下記の各発明を完成させた。【００１８】
（１）下記（ａ）および（ｂ）からなるプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター；
（ａ）免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクター、
（ｂ）前記免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するセンダイウイルスベクター。【００１９】
（２）下記（ｃ）を含んでなる、（１）に記載のプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター；
（ｃ）ＣＤ４０リガンド非切断型変異体をコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクター。【００２０】
（３）免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクターが、免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子およびＣＤ４０リガンド非切断型変異体をコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクターである、（１）に記載のプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター。【００２１】
（４）プライミング用ウイルスベクターが（ａ）または（ａ）および（ｃ）であって、かつブースティング用ウイルスベクターが（ｂ）である、（１）から（３）のいずれかに記載のプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター。【００２２】
（５）ワクシニアウイルスベクターが、ワクシニアウイルスＬＣ１６株、ＬＣ１６ｍ８株もしくはＬｃ１６ｍＯ株であって、かつＢ５Ｒ遺伝子において１または複数のヌクレオチドが置換、付加、挿入および／または欠失されていて正常な機能を有するＢ５Ｒ遺伝子産物を産生しないワクシニアウイルスベクターである、（１）から（４）のいずれかに記載のプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター。【００２３】
（６）免疫原性を有するポリペプチドがヒトに対する病原微生物の抗原タンパク質またはその部分ペプチド、もしくはヒト腫瘍抗原タンパク質またはその部分ペプチドである、（１）から（５）のいずれかに記載のプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター。【００２４】
（７）病原微生物が、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヘルペスウイルス、フラビウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス、日本脳炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、黄熱ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、ラッサウイルス、ポリオウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、コレラ菌、結核菌、ジフテリア菌、チフス菌、百日咳菌、髄膜炎菌、破傷風菌、ミコバクテリアおよびマラリア原虫よりなる群から選択される病原微生物である、（６）に記載のプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター。
【発明の効果】
【００２５】
本発明のプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクターによれば、病原微生物特異的なサイトカインの産生などの細胞性免疫の賦活に加え、病原微生物特異的な抗体の産生などの液性免疫の賦活を行うことができることから、プライム／ブーストワクチンに用いることができる。すなわち、本発明のプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクターを用いたプライム／ブーストワクチンによれば、従来、十分な感染抑制を行うことができなかったＨＩＶなどの病原微生物の感染を抑制することができる。さらに、本発明のプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクターが保持する、免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を、種々の病原微生物や悪性腫瘍に由来するものに適宜変更することによって、種々の感染症や悪性腫瘍の予防や治療に有効なプライム／ブーストワクチンを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ、ｍ８Δ−〈低ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍ、ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍおよびｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍのゲノムに挿入した遺伝子およびプロモーターの構成を示す模式図である。
【図２】ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ、ｍ８Δ−〈低ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍ、ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍおよびｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍをそれぞれ感染させたウサギ腎由来細胞（ＲＫ１３細胞）におけるｅｎｖおよびｈＣＤ４０Ｌｍの発現を、ウエスタンブロットにより検出した結果を示す図である。
【図３】抗原タンパク質発現プラスミド（ＤＮＡ−ｅｎｖ）をプライミングした後、それぞれ、ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉）をブースティングしたマウス（コントロール群）、抗原タンパク質およびＣＤ４０Ｌｍ共発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍ）をブースティングしたマウス（Ａ群）、および抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ）をブースティングしたマウス（Ｂ群）の脾臓におけるＣＤ８陽性ＩＦＮ−γ産生細胞数の測定結果を示す図である。
【図４】抗原タンパク質発現プラスミド（ＤＮＡ−ｅｎｖ）をプライミングした後、抗原タンパク質およびＣＤ４０Ｌｍ共発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍ）を二又針による乱刺接種（マウスＡ）、ならびに抗原タンパク質およびＣＤ４０Ｌｍ共発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍ）を皮内注射（マウスＢ）によりブースティングしたマウスの脾臓におけるＣＤ８陽性ＩＦＮ−γ産生細胞数の測定結果を示す図である。
【図５】抗原タンパク質発現プラスミド（ＤＮＡ−ｅｎｖ）をプライミングした後に抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ）をブースティングしたマウス（マウスＡ）の血清における抗ｅｎｖ抗体の結合活性の測定結果を示す図（左図）、および抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ）をプライミングした後に抗原タンパク質発現センダイウイルスベクター（Ｓｅｖ−ｅｎｖ）をブースティングしたマウス（マウスＢ）の血清における抗ｅｎｖ抗体の結合活性の測定結果を示す図（右図）である。
【図６】抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ）をプライミングした後に抗原タンパク質発現センダイウイルスベクター（Ｓｅｖ−ｅｎｖ）をブースティングしたマウス（Ａ群）、抗原タンパク質およびＣＤ４０Ｌｍ共発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍ）をプライミングした後に抗原タンパク質発現センダイウイルスベクター（Ｓｅｖ−ｅｎｖ）をブースティングしたマウス（Ｂ群）、ならびに何も接種していないマウス（コントロール群）の脾臓におけるＣＤ８陽性ＩＦＮ−γ産生細胞数の測定結果を示す図である。
【図７】抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ）をプライミングした後に抗原タンパク質発現センダイウイルスベクター（Ｓｅｖ−ｅｎｖ）をブースティングしたマウス（Ａ群）、ならびに抗原タンパク質およびＣＤ４０Ｌｍ共発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍ）をプライミングした後に抗原タンパク質発現センダイウイルスベクター（Ｓｅｖ−ｅｎｖ）をブースティングしたマウス（Ｂ群）の血清における抗ｅｎｖ抗体の結合活性を示す図（右図）、ならびにＡ群およびＢ群の血清における抗ｅｎｖ抗体の中和活性の測定結果を示す図（左図）である。
【図８】抗原タンパク質発現プラスミド（ＤＮＡ−ｅｎｖ）をプライミングした後、それぞれ、抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ）およびＣＤ４０Ｌｍ低発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈低ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍ）をブースティングしたマウス（Ａ群）、抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ）およびＣＤ４０Ｌｍ高発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍ）をブースティングしたマウス（Ｂ群）、ならびに抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ）およびワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉）をブースティングしたマウス（コントロール群）の脾臓におけるＣＤ８陽性ＩＦＮ−γ産生細胞数の測定結果を示す図である。
【図９】抗原タンパク質発現プラスミド（ＤＮＡ−ｅｎｖ）をプライミングした後、抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ）およびＣＤ４０Ｌｍ高発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍ）をブースティングしたマウス（Ａ群）の血清における抗ｅｎｖ抗体の結合活性の測定結果のうち、代表的なものを示す図である。
【図１０】抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ）およびＣＤ４０Ｌｍ低発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈低ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍ）をプライミングした後に抗原タンパク質発現センダイウイルスベクター（Ｓｅｖ−ｅｎｖ）をブースティングしたマウス（Ａ群）、抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ）およびワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉）をプライミングした後に抗原タンパク質発現センダイウイルスベクター（Ｓｅｖ−ｅｎｖ）をブースティングしたマウス（Ｂ群）、および何も接種していないマウス（コントロール群）の脾臓におけるＣＤ８陽性ＩＦＮ−γ産生細胞数の測定結果を示す図である。
【図１１】抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ）およびＣＤ４０Ｌｍ低発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈低ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍ）をプライミングした後に抗原タンパク質発現センダイウイルスベクター（Ｓｅｖ−ｅｎｖ）をブースティングしたマウス（Ａ群）、ならびに抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ）およびワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉）をプライミングした後に抗原タンパク質発現センダイウイルスベクター（Ｓｅｖ−ｅｎｖ）をブースティングしたマウス（Ｂ群）の血清における抗ｅｎｖ抗体の結合活性（右図）、ならびにＡ群およびＢ群の血清における抗ｅｎｖ抗体の中和活性（左図）の測定結果を示す図である。
【図１２】抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ）およびＣＤ４０Ｌｍ低発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈低ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍ）をプライミングした後に抗原タンパク質発現センダイウイルスベクター（Ｓｅｖ−ｅｎｖ）をブースティングしたマウス（Ａ群）、抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ）およびワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉）をプライミングした後に抗原タンパク質発現センダイウイルスベクター（Ｓｅｖ−ｅｎｖ）をブースティングしたマウス（Ｂ群）、抗原タンパク質およびＣＤ４０Ｌｍ共発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍ）をプライミングした後に抗原タンパク質発現センダイウイルスベクター（Ｓｅｖ−ｅｎｖ）をブースティングしたマウス（Ｃ群）、抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクター（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ）をプライミングした後に抗原タンパク質発現センダイウイルスベクター（Ｓｅｖ−ｅｎｖ）をブースティングしたマウス（Ｄ群）、ならびに何も接種していないマウス（コントロール群）の脾臓におけるＣＤ４陽性ＩＦＮ−γ産生細胞数およびＣＤ４陽性ＩＬ−４産生細胞の平均蛍光強度の測定結果を示す図（それぞれ左図および右図）である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明に係るプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクターについて詳細に説明する。本発明に係るプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクターは、（ａ）免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクターおよび（ｂ）前記免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するセンダイウイルスベクターからなるプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクターである。
【００２８】
プライム／ブーストワクチンとは、初回免疫（プライム、プライミング）において用いられるワクチンと追加免疫（ブースト、ブースティング）において用いられるワクチンとを含んでなる二種類以上のワクチンからなるワクチンであって、通常、初回免疫において用いられるワクチンと追加免疫において用いられるワクチンとは、それぞれ異なるものをいう。
【００２９】
本発明に係るプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクターは、免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクターを含んでなる。ワクシニアウイルスベクターは、その安全性に加え、ヒトに対して好適な免疫反応を誘発する点において優れたベクターである。本発明で用いることができるワクシニアウイルスベクターとしては、例えば、ＬＣ１６株、ＬＣ１６ｍ８株、ＬＣ１６ｍＯ株、ＤＩｓ株、ＭＶＡ株などを挙げることができるが、特に、それらのＢ５Ｒ遺伝子において１または複数のヌクレオチドが置換、付加、挿入および／または欠失されていて正常な機能を有するＢ５Ｒ遺伝子産物を産生しないワクシニアウイルスベクター（前記特許文献１）を用いるのが好ましい。正常な機能を有するＢ５Ｒ遺伝子産物を産生しないことによって、ワクシニアウイルスのリバージョンによる強毒化、すなわち復帰突然変異やいわゆる先祖返りという問題は解消され得る。この様な正常な機能を有するＢ５Ｒ遺伝子産物を産生しないワクシニアウイルスベクターには、Ｂ５Ｒ遺伝子を欠失したＬＣ１６株、ｍ８ΔＢ５Ｒ（ＬＣ１６ｍ８Δ株）、ｍＯΔＢ５Ｒ（ＬＣ１６ｍＯΔ株）、ｍ８ｐｒｏＢ５ＲｄＴＭ、ｍＯｐｒｏＢ５ＲｄＴＭなどがあるが、中でもＢ５Ｒ遺伝子を欠失したＬＣ１６株、ｍ８ΔＢ５Ｒ（ＬＣ１６ｍ８Δ株）およびｍＯΔＢ５Ｒ（ＬＣ１６ｍＯΔ株）を用いることが特に好ましい。なお、正常な機能を有するＢ５Ｒ遺伝子産物を産生しないワクシニアウイルスベクターの詳細は、特許文献１に記載されているとおりである。
【００３０】
種痘として用いられたＬＣ１６ｍ８株は、約１０万人の乳幼児と約３千人の成人に接種されているが、重篤な副作用の報告はない。しかしながら、ＬＣ１６ｍ８株は遺伝的に不安定で強毒復帰変異株を生じる欠点を有していことから、本発明者らによって復帰変異株を生まないＬＣ１６ｍ８Δ株が作製されている。ＬＣ１６ｍ８Δ株は、増殖できないワクシニアウイルス株であるＤＩｓ株やＭＶＡ株と比較して、優れた免疫誘導を有しており（Ｍ．Ｋｉｄｏｋｏｒｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第１０２巻、第４１５２−４１５７頁、２００５年，Ｈ．Ｓｕｚｕｋｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ、第２７巻、第９６６−９７１頁、２００９）、猿においても高病原性の猿痘の感染を防いだとの報告がされている（２００６年日本ウイルス学会）。以上より、ＬＣ１６ｍ８Δ株は、ヒトに安全かつ優れた免疫力を誘導できることが期待されている。
【００３１】
なお、本発明において、「１または複数のヌクレオチドが置換、付加、挿入および／または欠失されていて」というときの、欠失、置換、挿入および／または付加されるヌクレオチドの個数は、転写および翻訳された場合に正常な機能を有するＢ５Ｒ遺伝子産物を産生しない限り、特に限定されないが、例えば１〜９９７個、好ましくは１００〜９９７個、より好ましくは３００〜９９７個、さらに好ましくは５００〜９９７個、よりさらに好ましくは７００〜９９７個の任意の個数を挙げることができる。
【００３２】
本発明に係る、免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクターは、免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子およびＣＤ４０リガンド非切断型変異体（ＣＤ４０Ｌｍ）をコードする遺伝子をいずれも発現可能に保持するワクシニアウイルスベクター（共発現ワクシニアウイルスベクター）であってもよい。なお、ＣＤ４０Ｌｍの機能やＣＤ４０Ｌｍ遺伝子の配列情報などの詳細は、特許文献４に記載されているとおりである。
【００３３】
本発明において、免疫原性を有するポリペプチドとは、生体に投与した場合に、投与された生体において細胞性免疫および／または液性免疫の免疫反応を誘導し得るポリペプチドのことをいい、そのようなポリペプチドとしては、例えば、ヒトに対する病原微生物の抗原タンパク質やヒト腫瘍抗原タンパク質、またはそれらの部分ペプチドなどを挙げることができる。なお、本発明において、「賦活する」は「誘導する」または「活性化する」と交換可能に用いられる。
【００３４】
また、本発明においてポリペプチドとは、２以上のアミノ酸がペプチド結合により結合してなる化合物のことをいい、構成するアミノ酸数は特に限定されず、例えば、２アミノ酸からなるジペプチド、３アミノ酸からなるトリペプチド、４アミノ酸からなるテトラペプチド、１０程度のアミノ酸からなるオリゴペプチド、２０以上のアミノ酸からなるペプチドやタンパク質が包含される。
【００３５】
本発明において、ヒトに対する病原微生物としては、例えば、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヘルペスウイルス、フラビウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス、日本脳炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、黄熱ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、ラッサウイルス、ポリオウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、コレラ菌、結核菌、ジフテリア菌、チフス菌、百日咳菌、髄膜炎菌、破傷風菌、ミコバクテリアおよびマラリア原虫、Ａ群β溶連菌、肺炎球菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、腸球菌、リステリア、髄膜炎球菌、淋菌、病原性大腸菌、肺炎桿菌、プロテウス菌、緑膿菌、セラチア菌、シトロバクター、アシネトバクター、エンテロバクター、マイコプラズマ、クラミジア、クロストリジウムなどを挙げることができ、ヒトに対する病原微生物の抗原タンパク質としては、例えば、ヒト免疫不全ウイルスのエンベロープタンパク質ｇｐ１６０およびｇｐ１２０（ｅｎｖ）、ｇｐ４１、ｐｏｌタンパク質逆転写酵素、ｎｅｆタンパク質、ｔａｔタンパク質、ｇａｇ前駆体ｐ５５、ｐ２４タンパク質、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、Ｍ２、Ｃ型肝炎ウイルスのエンベロープタンパク質Ｅ１やＥ２、Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｓ抗原などを挙げることができる。
【００３６】
また、ヒト腫瘍抗原タンパク質としては、例えば、メラノサイト組織特異的タンパク質であるｇｐ１００（Ｂａｋｋｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１７９巻、第１００５頁、１９９４年）、子宮頸癌のヒトパピローマウイルスＥ６タンパク質やＥ７タンパク質、ＭＡＲＴ−１（Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第９１巻、第３５１５頁、１９９４年）やチロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１７８巻、第４８９頁、１９９３年）などのメラノソーム抗原、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ｆｉｓｋ  Ｂ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１８１巻、第２１０９頁、１９９５年）、ＣＥＡ（Ｔｓａｎｇ Ｋ．Ｙ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、第８７巻、第９８２頁、１９９５年）、ＰＳＡ（Ｃｏｒｒｅａｌｅ Ｐ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、第８９巻、第２９３頁、１９９７年）などを挙げることができる。
【００３７】
本発明において、免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクターは、導入すべき免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を連結したプラスミド（トランスファーベクター）を作製し、これを、ワクシニアウイルスを感染させた細胞の中に導入し、その細胞の中で相同組み換えを生じさせることにより作製することができる。また、別の方法としては、導入すべき免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子断片を適当な制限酵素で消化して、同酵素で消化したワクシニアウイルスゲノムに直接連結し、この組み換えワクシニアウイルスゲノムを、ウイルス感染細胞に導入することによっても、作製することができる。
【００３８】
免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクターの作製において、用いることができるプラスミドとしては、例えば、ｐＳＦＪ１−１０、ｐＳＦＪ２−１６、ｐＭＭ４、ｐＧＳ２０、ｐＳＣ１１、ｐＭＪ６０１、ｐ２００１、ｐＢＣＢ０１−３，０６、ｐＴＫｇｐｔ−Ｆ１−３ｓ、ｐＴＭ１、ｐＴＭ３、ｐＰＲ３４，３５、ｐｇｐｔ−ＡＴＡ１８−２、ｐＨＥＳ１−３、ｐＪＷ３２２、ｐＶＲ１、ｐＣＡ、ｐＢＨＡＲなどを挙げることができる。
【００３９】
免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の導入領域は、ワクシニアウイルスの生活環に必須でない遺伝子領域であり、例えば、赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、Ｂ５Ｒ遺伝子（Ｂ４Ｒ遺伝子とＢ６Ｒ遺伝子の間）、Ｆフラグメントなどの領域を挙げることができる。例えば、ＨＡ遺伝子中に免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が導入された組換え体では、ＨＡ遺伝子が導入された外来遺伝子によって分断され、機能を失う。そのためプラークはニワトリの赤血球を吸着しなくなるため白く見えるようになるので、組換え体を容易に選別することができる。また、ＴＫ遺伝子中に免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が導入された組換え体では、ＴＫ遺伝子の機能が失われ、５−ブロモデオキシウリジン（ＢｕｄＲ）が致死的に作用しないので、ＢｕｄＲにより選別することができる。また、Ｂ５Ｒ遺伝子中に免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を導入した場合は、組換え体のプラークが小さくなるのでプラークのサイズで選別することができる。なお、導入する部分の遺伝子は、１または複数のヌクレオチドが置換、付加、挿入および／または欠失されていることによりウイルスの形質に変化し組換え体の選択が容易になるものが望ましい。
【００４０】
ワクシニアウイルスベクターを感染させる細胞としては、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ１細胞、ＣＯＳ細胞、ＲＫ１３細胞、ＢＨＫ細胞、初代ウサギ腎細胞、ＢＳＣ−１細胞、ＨＴＫ−１４３細胞、Ｈｅｐ２細胞、ＭＤＣＫ細胞など、ワクシニアウイルスが感染しうる細胞を用い得る。
【００４１】
免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を導入する際、免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の上流に適当なプロモーターを機能し得る形で連結させることができる。そのようなプロモーターは特に限定されないが、例えば、ＡＴ１プロモーター、ＰＳＦＪ１−１０や、ＰＳＦＪ２−１６、ｐ７．５プロモーター、ｐ７．５プロモーターの改良型プロモーター（７．５Ｅ）、ｐ１１Ｋプロモーター、Ｔ７．１０プロモーター、ＣＰＸプロモーター、ＨＦプロモーター、Ｈ６プロモーター、Ｔ７ハイブリッドプロモーターなどを用いることができる。
【００４２】
ワクシニアウイルスベクターに免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を導入する方法は、組換えワクシニアウイルスベクターを構築する公知の方法により行うことができ、例えば、「別冊実験医学 ザ・プロトコールシリーズ 遺伝子導入＆発現解析実験法（斎藤泉他編集、羊土社、１９９７年９月１日発行）」、あるいは、「ＤＮＡクローニング４−哺乳類のシステム−第２版（Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ他編、加藤郁之進監訳、ＴａＫａＲａ）、「Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、第６巻、第３３７９−３３８４頁、１９８７年」などの記載に従って行うことができる。
【００４３】
次に、本発明に係るプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクターは、前記免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するセンダイウイルスベクターを含んでなる。ここで、「前記免疫原性」とは、本発明に係るワクシニアウイルスベクターが発現可能に保持するポリペプチドが有する免疫原性のこという。すなわち、本発明に係るセンダイウイルスベクターが発現可能に保持する、免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子は、本発明に係るワクシニアウイルスベクターが保持する、免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子と同一であってもよく、同じ免疫原性を有する限りにおいて異なったものでもよい。
【００４４】
センダイウイルスは、宿主のゲノムと相互作用せずに複製し、かつヒトへの病原性も有さないことから、ベクターとして利用するにあたり、ヒトへの応用に際して安全性が高いと考えられるウイルスである。本発明において、センダイウイルスベクターは野生型と同等の複製能力を有していてもよく、複製能を有さない欠損型ベクターであってもよい。また、本発明に係るセンダイウイルスベクターは、野生型センダイウイルスの遺伝子の配置やゲノムの塩基配列が改変されたものでもよい。更には、エンベロープ蛋白質や外殻蛋白質において弱毒化変異や温度感受性変異を含むセンダイウイルス変異株に由来するセンダイウイルスベクターを用いてもかまわない。
【００４５】
本発明において、前記免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するセンダイウイルスベクターは、上述の、免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクターの作製方法と同様の方法において、特許文献３の記載に従い、ワクシニアウイルスをセンダイウイルスに代え、ウイルスベクターを感染させる細胞としてＬＬＣ−ＭＫ２細胞、ＣＶ１細胞、ＢＨＫ細胞、ヒト由来細胞などセンダイウイルスが感染し得る細胞を用いて行うことにより、作製することができるほか、別の方法としては、導入すべき免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子断片を適当な制限酵素で消化して、同酵素認識サイトを付加したセンダイウイルスゲノムに直接連結し、この組み換えセンダイウイルスゲノムを、適当なサポーティングプラスミドと共にセンダイウイルスが感染し得る細胞に導入することによっても、作製することができる。また、Ｆタンパク質を欠失したセンダイウイルスベクターの作製は、既報（国際公開第２０００／７００５５号、国際公開第２０００／７００７０号）に従い行うことができる。
【００４６】
次に、本発明に係るプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクターの異なる態様は（ａ）免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクター、（ｂ）前記免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するセンダイウイルスベクターおよび（ｃ）ＣＤ４０リガンド非切断型変異体をコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクターからなるプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクターである。
【００４７】
本発明において、ＣＤ４０Ｌｍをコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクターは、上述の、免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクターの作製方法と同様の方法において、免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子をＣＤ４０Ｌｍ遺伝子に代えて行うことにより作製することができる。なお、本発明に係るＣＤ４０Ｌｍをコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクターにおいて、ＣＤ４０Ｌｍの発現を誘導するプロモーターは、ｐ７．５プロモーターなどの比較的中程度の発現量を与えるプロモーターを用いることが好ましい。
【００４８】
本発明に係るプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクターにおいては、いずれのウイルスベクターをプライミング用とし、いずれのウイルスベクターをブースティング用として用いてもよいが、（ｉ）免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクター、（ｉｉ）免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子およびＣＤ４０Ｌｍをコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクター、または（ｉｉｉ）免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクターおよびＣＤ４０Ｌｍをコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクターの（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかをプライミング用とし、前記免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するセンダイウイルスベクターをブースティング用とすることが好ましい。
【００４９】
なお、本発明の属する技術分野における当業者であれば、本発明に係るプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクターを用いて哺乳動物、特にヒトを免疫する方法や免疫賦活方法、前記ベクターをワクチンとして使用する方法（ワクチンとしての使用を含む）、前記ベクターを医薬の製造のために用いる方法、前記ベクターと薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物などとして表される発明が、本明細書の記載、特に下記の実施例の記載によって開示されていると理解することは、いうまでもない。
【００５０】
以下、本発明に係るワクシニアウイルスベクターおよびセンダイウイルスベクターからなるプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクターについて、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００５１】
＜実施例１＞
（１）ヒト免疫不全ウイルスエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を保持するワクシニアウイルスベクターの作製
［１−１］ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖの作製
〈１−１−１〉ｅｎｖ遺伝子の調製
ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ−１ＪＲ−ＣＳＦ株のエンベロープタンパク質ｇｐ１６０およびｇｐ１２０（ｅｎｖ）をコードする遺伝子（アクセッション番号Ｍ３８４２９）をｐＪＷ３２２のＡｖｒII／ＸｈｏIサイトに挿入することにより、ｐＪＷ３２２−ｅｎｖを得た。次に、ｅｎｖを効率良く発現させるため、ｅｎｖ遺伝子中、６７５１番目から６７５７番目、７３６７番目から７３７３番目、および８３０５番目から８３１１番目に存在するワクシニアウイルスの転写終結配列をｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法により、下記のとおり変異させて、これをｐＪＷ３２２−ｅｎｖ２とした。なお、この変異により、ｅｎｖのアミノ酸配列は変化しない。【００５２】
６７５１番目から６７５７番目
変異前：ＴＴＴＴＴＡＴ（配列番号１）
変異後：ＴＴＴＣＴＡＴ（配列番号２）
７３６７番目から７３７３番目
変異前：ＴＴＴＴＴＣＴ（配列番号３）
変異後：ＴＴＣＴＴＣＴ（配列番号４）
８３０５番目から８３１１番目
変異前：ＴＴＴＴＴＣＴ（配列番号５）
変異後：ＴＴＴＣＴＣＴ（配列番号６）【００５３】
続いて、ｐＪＷ３２２−ｅｎｖ２を鋳型として、下記のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｅｎｖ遺伝子を増幅して単離した。【００５４】
フォワードプライマー；５’−ＴＴＴＣＧＧＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＧＧＧＧＡＴＣＡＧＧ−３’（配列番号７）、
リバースプライマー  ；５’−ＡＴＡＧＧＣＣＧＧＣＣＴＴＡＴＡＧＣＡＡＡＧＣＣＣＴＴＴＣＣＡＡＧＣ−３’（配列番号８）。【００５５】
得られたＰＣＲ産物を精製した後、制限酵素ＦｓｅIおよびＲｓｒIIで消化した。【００５６】
〈１−１−２〉ワクシニアウイルスゲノムへの遺伝子挿入
ＡＴ１プロモーター、改良型ｐ７．５プロモーター（７．５Ｅ）を１０個連続したものおよびマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）が挿入されたゲノムを保持するワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８Δ株（ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉）（Ｓｕｚｕｋｉ Ｈ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ、第２７巻、第９６６−９７１頁、２００９年）を、２０−４０％ショ糖勾配を用いた超遠心によって精製した。ＡＴ１プロモーターおよび１０個重複した７．５Ｅは、その下流に存在する遺伝子を高効率に発現させるプロモーター（高発現プロモーター）である。【００５７】
続いて、精製したｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉からフェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコール法によりゲノムＤＮＡを抽出し、エタノール沈殿により濃縮した。このゲノムＤＮＡのＦｓｅI／ＲｓｒIIサイトに、本実施例（１）［１−１］〈１−１−１〉のｅｎｖ遺伝子を挿入し、高発現プロモーターおよびｅｎｖ遺伝子が挿入されたゲノムを保持するワクシニアウイルスベクターｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖのゲノムを得た。【００５８】
〈１−１−３〉遺伝子が挿入されたワクシニアウイルスの精製
１００ｍｍディッシュに２．４×１０５個のベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ細胞）を播いて一晩培養した後、カナリーポックスウイルスを重複感染度（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ＭＯＩ）＝１０となるよう培地に加え、３３℃で１時間培養した。【００５９】
続いて、未吸着のカナリーポックスウイルスを洗浄した後、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と本実施例（１）［１−１］〈１−１−２〉のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖのゲノムとを添付の仕様書に従って混合したものを添加して一晩培養した。その後、培養したＢＨＫ細胞を凍結融解して得た溶解液を希釈して、２４ウェルプレートで培養したウサギ腎由来細胞（ＲＫ１３細胞）に添加し、３３℃にて培養して、シングルプラークを形成させた。得られたシングルプラークは、再度凍結融解して溶解液を得た後、これを希釈して、２４ウェルプレートで培養したＲＫ１３細胞に添加し、３３℃にて培養して、シングルプラークを形成させた。シングルプラークを回収して、これを、高発現プロモーターおよびｅｎｖ遺伝子が挿入されたゲノムを保持するワクシニアウイルスベクターｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖとした。【００６０】
〈１−１−４〉ｅｎｖ発現の確認；プラークＥＬＩＳＡ
本実施例（１）［１−１］〈１−１−３〉で回収したｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖのプラークを２％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液で固定した後、ＰＢＳで洗浄し、さらに５％（ｗ／ｗ）スキムミルク／ＰＢＳ溶液でブロッキングした後、ＰＢＳで洗浄した。続いて、１次抗体として抗ｅｎｖヒト抗体、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ結合抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて、常法に従ってＥＬＩＳＡ法を行い、プラークにおいてｅｎｖが発現していることを確認した。【００６１】
〈１−１−５〉ｅｎｖ発現の確認；ウエスタンブロット
本実施例（１）［１−１］〈１−１−３〉のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖを、ＭＯＩ＝１０でＲＫ１３細胞に添加し、３３℃で１時間吸着した。続いて、未吸着のウイルスを洗浄した後、培地を加えて一晩培養した。【００６２】
続いて、このＲＫ１３細胞約１μｇを１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＨＩＶ−１感染者血清を用いて、常法に従ってウエスタンブロットを行い、ｅｎｖが発現していることを確認した。その結果を図２に示す。【００６３】
〈１−１−６〉ワクシニアウイルスベクターの大量培養
本実施例（１）［１−１］〈１−１−３〉のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖを、ＲＫ１３細胞にて大量培養した後、３６％（ｗ／ｖ）ショ糖クッションを用いた超遠心によって精製濃縮し、ＲＫ１３細胞にてウイルス力価を測定した。【００６４】
［１−２］ｍ８Δ−〈低ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍの作製
〈１−２−１〉プラスミドの調製
ヒトＣＤ４０リガンド非切断型変異体（ｈＣＤ４０Ｌｍ）遺伝子が挿入されたｐＣＡ−ｈＣＤ４０Ｌｍ３を鋳型として、下記のプライマーを用いてＰＣＲを行いｐ７．５プロモーターおよびｈＣＤ４０Ｌｍ遺伝子を増幅して単離した。ｐ７．５プロモーターは、一般に頻用されているワクシニアウイルス由来のプロモーターであり、その下流に存在する遺伝子を発現させるが、上記の高発現プロモーターと比較すると下流遺伝子の発現量は小さいプロモーターである。【００６５】
フォワードプライマー；５’−ＡＧＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＧＣＡＴＧＡＴＣＧＡＡＡＣＡＴＡＣＡＡＣＣＡＡ−３’（配列番号９）、
リバースプライマー  ；５’−ＡＧＡＣＣＣＧＡＧＴＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＡ−３’（配列番号１０）。【００６６】
得られたＰＣＲ産物を精製した後、制限酵素ＢａｍＨIおよびＡｖａIで消化して、プラスミドｐＶＲ１（Ｓｈｉｄａ Ｈ．ら、ＥＭＢＯ．Ｊ．、第６巻、第３３７９−３３８４頁、１９８７年）のヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子中のＢａｍＨI／ＡｖａIサイトに挿入し、ｐＶＲ１−ｈＣＤ４０Ｌｍを得た。【００６７】
〈１−２−２〉ワクシニアウイルスゲノムへの遺伝子挿入
６０ｍｍディッシュにおいて８０％コンフルエントとなるまで培養したＢＨＫ細胞に、ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８Δ株をＭＯＩ＝０．０５となるよう加えて３３℃にて１時間培養した。【００６８】
続いて、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と本実施例（１）［１−２］〈１−２−１〉のｐＶＲ１−ｈＣＤ４０Ｌｍとを添付の仕様書に従って混合したものを添加して、３３℃にて２４時間培養することにより、ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８Δ株が保持するゲノムのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子と、ｐＶＲ１−ｈＣＤ４０Ｌｍのｐ７．５プロモーターおよびｈＣＤ４０Ｌｍ遺伝子挿入部位との間で相同組み換えを生じさせた。【００６９】
〈１−２−３〉遺伝子が挿入されたワクシニアウイルスの粗精製
本実施例（１）［１−２］〈１−２−２〉のＢＨＫ細胞を凍結融解して得た溶解液を、ＲＫ１３細胞に添加して３３℃にて３日間培養し、プラークを形成させた。【００７０】
続いて、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンを含有するＰＢＳ（Ｃａ２＋−Ｍｇ２＋−ＰＢＳ）に０．５−２．０％（ｗ／ｖ）となるよう鶏赤血球を懸濁し赤血球吸着試験（ＨＡＤテスト）溶液を調製した。プラークを形成させたＲＫ１３細胞の培地をＨＡＤテスト溶液に交換して、室温にて１時間静置した後、Ｃａ２＋−Ｍｇ２＋−ＰＢＳで洗浄し、赤血球の凝集が見られない無色のプラークを掻き採って回収した。【００７１】
〈１−２−４〉遺伝子が挿入されたワクシニアウイルスの精製
本実施例（１）［１−２］〈１−２−３〉で回収したプラークについて、本実施例（１）［１−２］〈１−２−３〉の操作をさらに２回行うことにより、ＨＡ遺伝子の部位にｐ７．５プロモーターおよびｈＣＤ４０Ｌｍ遺伝子が挿入されたゲノムを保持するワクシニアウイルスを精製し、これをｍ８Δ−〈低ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍとした。【００７２】
〈１−２−５〉ＣＤ４０Ｌｍ発現の確認；ウエスタンブロット
本実施例（１）［１−２］〈１−２−４〉のｍ８Δ−〈低ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍについて、本実施例（１）［１−１］〈１−１−５〉に記載の方法により、ウエスタンブロットを行い、ｈＣＤ４０Ｌｍが発現していることを確認した。ただし、電気泳動に供した細胞は１μｇに代えて１０μｇとし、ｈＣＤ４０Ｌｍの検出にはＨＩＶ−１感染者血清に代えて抗ＣＤ４０Ｌマウスモノクローナル抗体を用いた。その結果を図２に示す。【００７３】
〈１−２−６〉ワクシニアウイルスベクターの大量培養
本実施例（１）［１−１］〈１−１−６〉に記載の方法により、本実施例（１）〈１−２−４〉のｍ８Δ−〈低ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍを大量培養して精製濃縮し、ウイルス力価を測定した。【００７４】
［１−３］ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍの作製
〈１−３−１〉プラスミドの調製
本実施例（１）［１−１］〈１−１−１〉のｐＪＷ３２２−ｅｎｖ２を鋳型として、下記のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｅｎｖ遺伝子を増幅して単離した。【００７５】
フォワードプライマー；５’−ＣＴＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＧＧＧＧＡＴＣＡＧＧＡＡＧ−３’（配列番号１１）、
リバースプライマー  ；５’−ＣＧＴＧＡＧＣＴＣＴＴＡＴＡＧＣＡＡＡＧＣＣＣＴＴＴＣＣＡＡＧＣＣ−３’（配列番号１２）。【００７６】
得られたＰＣＲ産物を精製した後、制限酵素ＥｃｏＲIおよびＳａｃIで消化した。【００７７】
また、本実施例（１）［１−２］〈１−２−１〉のｐＶＲ１−ｈＣＤ４０Ｌｍを鋳型として、下記のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｐ７．５プロモーターおよびｈＣＤ４０Ｌｍ遺伝子を増幅して単離した。【００７８】
フォワードプライマー；５’−ＣＴＡＧＡＧＣＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＡＴＡＣＴＡＴＡＴＡＧＴＡＡＴＡＣＣＡＡＴＡ−３’（配列番号１３）、
リバースプライマー  ；５’−ＧＴＡＣＣＣＧＧＧＴＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧ−３’（配列番号１４）。【００７９】
得られたＰＣＲ産物を精製した後、制限酵素ＳａｃIおよびＸｍａIで消化した。【００８０】
続いて、このｅｎｖ遺伝子のＰＣＲ産物とｐ７．５プロモーターおよびｈＣＤ４０Ｌｍ遺伝子のＰＣＲ産物とをｐＪＷ３２２のＥｃｏＲI／ＸｍａIサイトに挿入し、ｐＪＷ３２２−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍを得た。【００８１】
次に、ｐＪＷ３２２−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍを鋳型として、下記のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｅｎｖ遺伝子、ｐ７．５プロモーターおよびｈＣＤ４０Ｌｍ遺伝子の領域を増幅して単離した。【００８２】
フォワードプライマー；５’−ＴＴＴＣＧＧＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＧＧＧＧＡＴＣＡＧＧＡＡＧ−３’（配列番号１５）、
リバースプライマー  ；５’−ＡＧＡＧＧＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＡ−３’（配列番号１６）。【００８３】
得られたＰＣＲ産物を精製した後、制限酵素ＦｓｅIおよびＲｓｒIIで消化した。【００８４】
〈１−３−２〉ワクシニアウイルスゲノムへの遺伝子挿入
本実施例（１）［１−１］〈１−１−２〉に記載の方法により、ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉が保持するゲノムＤＮＡのＦｓｅI／ＲｓｒIIサイトに、本実施例（１）［１−３］〈１−３−１〉のｅｎｖ遺伝子、ｐ７．５プロモーターおよびｈＣＤ４０Ｌｍ遺伝子の領域を挿入し、高発現プロモーター、ｅｎｖ遺伝子およびｈＣＤ４０Ｌｍ遺伝子が挿入されたゲノムを保持するワクシニアウイルスベクターｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍのゲノムを得た。【００８５】
〈１−３−３〉遺伝子が挿入されたワクシニアウイルスの精製
本実施例（１）［１−１］〈１−１−３〉に記載の方法により、高発現プロモーター、ｅｎｖ遺伝子およびｈＣＤ４０Ｌｍ遺伝子が挿入されたゲノムを保持するワクシニアウイルスベクターｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍを精製した。【００８６】
〈１−３−４〉ｅｎｖ発現の確認；プラークＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット
本実施例（１）［１−３］〈１−３−３〉のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍについて、本実施例（１）［１−１］〈１−１−４〉に記載の方法によりＥＬＩＳＡ法を行い、プラークにおいてｅｎｖが発現していることを確認した。また、本実施例（１）［１−３］〈１−３−３〉のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍについて、本実施例（１）［１−１］〈１−１−５〉および本実施例（１）［１−２］〈１−２−５〉に記載の方法によりウエスタンブロットを行い、ｅｎｖおよびｈＣＤ４０Ｌｍが発現していることを確認した。その結果を図２に示す。【００８７】
〈１−３−５〉ワクシニアウイルスベクターの大量培養
本実施例（１）［１−１］〈１−１−６〉に記載の方法により、本実施例（１）［１−３］〈１−３−３〉のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍを大量培養して精製濃縮し、ウイルス力価を測定した。【００８８】
［１−４］ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍの作製
〈１−４−１〉プラスミドの調製
ｈＣＤ４０Ｌｍ遺伝子が挿入されたｐＣＡ−ｈＣＤ４０Ｌｍ３を鋳型として、下記のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｈＣＤ４０Ｌｍ遺伝子を増幅して単離した。【００８９】
フォワードプライマー；５’−ＡＡＡＣＣＣＧＧＧＣＡＴＧＡＴＣＧＡＡＡＣＡＴＡＣＡＡＣＣＡＡＡ−３’（配列番号１７）、
リバースプライマー  ；５’−ＣＣＡＴＣＴＡＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡ−３’（配列番号１８）。【００９０】
得られたＰＣＲ産物を精製して制限酵素ＸｍａIおよびＮｏｔIで消化した後、ＡＴ１プロモーターおよび７．５Ｅ（高発現プロモーター）を１０個連続して有するｐＢＨＡＲ（Ｊｉｎ Ｎ−Ｙ．ら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．、第１３８巻、第３１５−３３０頁、１９９４年）のＸｍａI／ＮｏｔIサイトに挿入し、ｐＢＨＡＲ−ｈＣＤ４０Ｌｍを得た。【００９１】
〈１−４−２〉ワクシニアウイルスゲノムへの遺伝子挿入
本実施例（１）［１−２］〈１−２−２〉に記載の方法により、ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８Δ株が保持するゲノムに、本実施例（１）［１−４］〈１−４−１〉の高発現プロモーターおよびｈＣＤ４０Ｌｍ遺伝子の領域を挿入した。【００９２】
〈１−４−３〉遺伝子が挿入されたワクシニアウイルスの精製
本実施例（１）［１−２］〈１−２−３〉および〈１−２−４〉に記載の方法により、高発現プロモーターおよびｈＣＤ４０Ｌｍ遺伝子が挿入されたゲノムを保持するワクシニアウイルスベクターｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍを精製した。【００９３】
〈１−４−４〉ｈＣＤ４０Ｌｍ発現の確認；ウエスタンブロット
本実施例（１）［１−４］〈１−４−３〉のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍについて、本実施例（１）［１−２］〈１−２−５〉に記載の方法により、ウエスタンブロットを行い、ｈＣＤ４０Ｌｍが発現していることを確認した。その結果を図２に示す。【００９４】
図２に示すように、ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍを感染させた細胞におけるｈＣＤ４０Ｌｍの発現量は、ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍを感染させた細胞におけるｈＣＤ４０Ｌｍの発現量およびｍ８Δ−〈低ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍを感染させた細胞におけるｈＣＤ４０Ｌｍの発現量と比較して大きいことが確認された。【００９５】
〈１−４−５〉ワクシニアウイルスベクターの大量培養
本実施例（１）［１−１］〈１−１−６〉に記載の方法により、本実施例（１）［１−４］〈１−４−３〉のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍを大量培養して精製濃縮し、ウイルス力価を測定した。【００９６】
以上、本実施例（１）のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ、ｍ８Δ−〈低ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍ、ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍおよびｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍに挿入した遺伝子およびプロモーターの構成を図１に示す。【００９７】
（２）ｅｎｖを保持するセンダイウイルスベクター（ＳｅＶ−ｅｎｖ）の作製
［２−１］プラスミドの調製
、ＮｏｔI認識配列を両端に付加したｅｎｖ遺伝子を
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＮｏｔIサイトに挿入して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｅｎｖを得た。【００９８】
続いて、センダイウイルスの遺伝子発現における転写終結配列であるＡおよびＴの連続配列がｅｎｖ遺伝子中に３ヶ所存在しているため、下記のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、この配列に変異を導入して、変異を導入したｅｎｖ遺伝子（ｅｎｖ−ｍｕｔ遺伝子）が挿入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｅｎｖ−ｍｕｔを得た。【００９９】
変異導入に用いたプライマー
変異１；
フォワードプライマー；５’−ＣＣＡＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＡＣＴＣＣＴＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＡＡＴＴＧ−３’（配列番号１９）
リバースプライマー  ；５’−ＧＡＡＴＡＡＣＡＣＴＴＴＡＡＡＡＣＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＧＡＡＧＣＴＣＣＧＣＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＡＣＣＡＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＡＣＴＣＣＴＣＡＧＧＡＧ−３’（配列番号２０）
変異２；
フォワードプライマー；５’−ＧＴＧＡＡＧＡＴＣＧＡＡＣＣＡＴＴＡＧＧＡＧＴＡＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧ−３’（配列番号２１）
リバースプライマー  ；５’−ＧＡＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＡＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＧＴＧＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＧＴＡＣＡＡＧＧＴＣＧＴＧＡＡＧＡＴＣＧＡＡＣＣＡＴＴＡＧＧＡＧＴＡ−３’（配列番号２２）
変異３；
フォワードプライマー；５’−ＣＧＣＡＴＣＧＴＧＴＴＣＴＣＴＧＴＡＣＴＴＴＣＴＡＴＡＧＴＧＡＡＴＡＧＡＧＴＴＡＧＧＣＡＧＧ−３’（配列番号２３）
リバースプライマー  ；５’−ＧＴＴＴＧＡＣＡＴＡＡＣＡＡＡＡＴＧＧＣＴＧＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＧＧＡＧＧＣＣＴＧＡＴＣＧＧＴＣＴＣＣＧＣＡＴＣＧＴＧＴＴＣＴＣＴＧＴＡＣＴＴＴＣＴＡＴＡＧ−３’（配列番号２４）【０１００】
［２−２］センダイウイルスゲノムへの遺伝子挿入
本実施例（２）［２−１］のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｅｎｖ−ｍｕｔをＮｏｔIで消化して、ｅｎｖ−ｍｕｔ遺伝子断片を切り出し、これを、センダイウイルスゲノムの３’末端にＮｏｔI認識配列が付加された配列を有し、かつセンダイウイルスの表面タンパク質ｆｕｓｉｏｎをコードする遺伝子（Ｆ）を有さないプラスミドｐＳｅＶ／ΔＦのＮｏｔIサイトに挿入して、ｐＳｅＶ−ｅｎｖ−ｍｕｔ／ΔＦを得た。【０１０１】
［２−３］遺伝子が挿入されたセンダイウイルスの精製
本実施例（２）［２−２］のｐＳｅＶ−ｅｎｖ−ｍｕｔ／ΔＦ、サポーティングプラスミドとしてｐＣＡＧＧＳ−ＮＰ、ｐＣＡＧＧＳ−Ｐ、ｐＣＡＧＧＳ−ＬおよびｐＣＡＧＧＳ−Ｔ７を、混合して、２９３Ｔ細胞にトランスフェクションして培養した。【０１０２】
続いて、培養した２９３Ｔ細胞の上清を、Ｆ発現細胞であるＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ／Ａｄ細胞に添加して培養し、培養上清を回収した。【０１０３】
次に、回収した培養上清を限界希釈して９６ウェルプレートを用いてＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ／Ａｄ細胞に感染させて、ｐＳｅＶ−ｅｎｖ−ｍｕｔ／ΔＦを有するウイルスをクローニングした。【０１０４】
クローン化したウイルスを、ｅｎｖ遺伝子が挿入されたゲノムを保持するセンダイウイルスベクターＳｅＶ−ｅｎｖとした。なお、ＳｅＶ−ｅｎｖが有するｅｎｖ遺伝子の塩基配列を確認したところ、４５０番目のＡがＧに変異し、アミノ酸配列ではアスパラギンがアスパラギン酸に変異していた。ＳｅＶ−ｅｎｖはＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ／Ａｄ細胞に感染させて増殖させた。【０１０５】
［２−４］センダイウイルスベクターの大量培養
ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ／Ａｄ細胞を培養した、培養面積２２５ｃｍ２のフラスコ３６枚に実施例（２）［２−３］のＳｅＶ−ｅｎｖを添加して２４時間培養し、培地を交換してさらに４８時間培養した。その後、培養上清を回収して濾過し、限外濾過フィルターで濃縮した。【０１０６】
（３）ｅｎｖ遺伝子を保持するプラスミド（ＤＮＡ−ｅｎｖ）の作製
［３−１］プラスミドへの遺伝子挿入
本実施例（１）［１−１］〈１−１−１〉のｐＪＷ３２２−ｅｎｖ２を鋳型として、下記のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｅｎｖ遺伝子を増幅して単離した。【０１０７】
フォワードプライマー；５’−ＣＴＡＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧ−３’（配列番号２５）、
リバースプライマー  ；５’−ＣＧＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣＣＡＴＣＴＴＡＴＡＧＣＡＡＡＧＣＣＣＴＴ−３’（配列番号２６）。【０１０８】
得られたＰＣＲ産物を精製した後、制限酵素ＥｃｏＲIで消化した後、哺乳類細胞発現ベクタープラスミドｐＣＡＧＧＳのＥｃｏＲIサイトに挿入して、ｅｎｖ遺伝子を保持するｐＣＡＧＧＳプラスミド（ＤＮＡ−ｅｎｖ）を得た。【０１０９】
［３−２］ｅｎｖ発現の確認
本実施例（３）［３−１］のＤＮＡ−ｅｎｖをポリエチレンイミン（ＰＥＩ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社）と混合し、２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした後、この細胞を２日間培養した。続いて、実施例（１）［１−１］〈１−１−５〉に記載の方法によりウエスタンブロットを行い、ｅｎｖが発現していることを確認した。【０１１０】
［３−３］ＤＮＡ−ｅｎｖの大量培養
本実施例（３）［３−１］のＤＮＡ−ｅｎｖを大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅに形質転換して大量に培養した後、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（キアゲン社）を用いて精製した。【０１１１】
＜実施例２＞細胞性免疫賦活効果の確認：プライミング；ＤＮＡ−ｅｎｖ／ブースティング；ワクシニアウイルスベクターにおける共発現ワクシニアウイルスベクター接種
（１）初回免疫（プライミング）
実施例１（３）［３−３］のＤＮＡ−ｅｎｖをＰＢＳに１μｇ／ｍＬとなるよう溶解してＤＮＡ−ｅｎｖ溶液を調製した。これを、Ｃ５７ＢＬ／６マウス９匹に対し、常法に従って５０μＬ（５０μｇ）ずつ筋肉注射（プライミング）した後、２週間飼育した。続いて、再度、ＤＮＡ−ｅｎｖ溶液を常法に従って５０μＬ（５０μｇ）ずつ筋肉注射（プライミング）した後、８週間飼育した。【０１１２】
（２）追加免疫（ブースティング）
実施例１（１）［１−１］〈１−１−２〉のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉、実施例１（１）［１−１］〈１−１−６〉のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖおよび実施例１（１）［１−３］〈１−３−５〉のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍを、それぞれＰＢＳに１×１０８ＰＦＵ／ｍＬとなるよう溶解して、ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉溶液、ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ溶液およびｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍ溶液を調製した。【０１１３】
続いて、本実施例（１）のマウスを３匹ずつ３群に分け、コントロール群、Ａ群およびＢ群とした。コントロール群のマウスにはｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉溶液を、Ａ群のマウスにはｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ溶液を、Ｂ群のマウスにはｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍ溶液を、それぞれ常法に従って１００μＬ（１×１０７ＰＦＵ）ずつ皮内注射（ブースティング）した後、２週間飼育した。【０１１４】
（３）Ｔ細胞の採取
本実施例（２）の各群のマウスから、常法に従い、脾臓を摘出して脾臓細胞を採取した。採取した脾臓細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した後、２００×ｇ、室温の条件下で１０分間遠心分離を行って上清を除去し、０．８％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウム水溶液を添加して溶血させ、赤血球を除去した。残りの脾臓細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、ナイロンメッシュに通してＴ細胞を濃縮した後、常法に従い細胞数をカウントした。【０１１５】
（４）細胞内サイトカイン染色
ＨＩＶ−１ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｓｕｂｔｙｐｅ Ｂ Ｅｎｖ（１５−ｍｅｒ）Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）を用いて、添付の仕様書に従い、本実施例（３）のＴ細胞を刺激した。続いて、標識抗体としてＡＰＣ−ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ−γ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）およびＰＥ−ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＣＤ８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ならびにＦｉｘａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ＢＤ ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（日本ＢＤ社）を用いて、添付の仕様書に従い、Ｔ細胞のうちのＣＤ８陽性ＩＦＮ−γ産生細胞を染色した。【０１１６】
（５）ＦＡＣＳによる染色細胞数の測定
ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏII（日本ＢＤ社）を用いて、本実施例（４）で染色したＣＤ８陽性ＩＦＮ−γ産生細胞数を測定した。測定した結果について、各群における平均値を求め、グラフに表した。その結果を図３に示す。【０１１７】
図３に示すように、ＣＤ８陽性ＩＦＮ−γ産生細胞は、コントロール群では検出されなかった一方で、Ａ群では平均値として約１．２５％、Ｂ群では平均値として約１％であった。【０１１８】
これらの結果から、抗原タンパク質発現プラスミドをプライミングした後、抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクターをブースティングすることにより、細胞性免疫が賦活されることが明らかになった。また、この場合のワクシニアウイルスベクターを、抗原タンパク質に加えてＣＤ４０Ｌｍを共発現するものにした場合、細胞性免疫賦活の増強効果はほとんど見られないことが明らかになった。【０１１９】
＜実施例３＞細胞性免疫賦活効果の確認：プライミング；ＤＮＡ−ｅｎｖ／ブースティング；ワクシニアウイルスベクターにおける共発現ワクシニアウイルスベクターの乱刺接種
（１）プライミングおよびブースティング
Ｃ５７ＢＬ／６マウス２匹をそれぞれマウスＡおよびマウスＢとし、これらのマウスについて、実施例２（１）および（２）に記載の方法により、プライミングおよびブースティングを行った。ただし、ブースティングの際、実施例１（１）［１−３］〈１−３−５〉のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０ＬｍをＰＢＳに１×１０９ＰＦＵ／ｍＬとなるよう溶解したｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍ溶液を調製し、マウスＡには、これを１０μＬ（１×１０７ＰＦＵ）二又針による乱刺接種し、マウスＢには実施例２（２）の１×１０８ＰＦＵ／ｍＬのｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍ溶液を１００μＬ（１×１０７ＰＦＵ）皮内注射により接種した。【０１２０】
（２）Ｔ細胞の採取、細胞内サイトカイン染色およびＦＡＣＳによる染色細胞数の測定
本実施例（１）のマウスＡおよびマウスＢについて、実施例２（３）から（５）に記載の方法により、Ｔ細胞の採取、細胞内サイトカイン染色およびＦＡＣＳによる染色細胞数の測定を行った。その結果を図４に示す。【０１２１】
図４に示すように、ＣＤ８陽性ＩＦＮ−γ産生細胞は、マウスＢにおいて約１．２５％であったのに対し、マウスＡにおいては約３．２５％であった。【０１２２】
この結果から、抗原タンパク質発現プラスミドをプライミングした後、抗原タンパク質およびｈＣＤ４０Ｌｍを共発現するワクシニアウイルスベクターをブースティングして細胞性免疫を賦活する場合に、ブースティングにおける接種方法を皮内注射に代えて二又針による乱刺接種とすることにより、細胞性免疫賦活効果が増強されることが明らかになった。【０１２３】
＜実施例４＞液性免疫賦活効果の確認；プライミング；ＤＮＡ−ｅｎｖ／ブースティング；ワクシニアウイルスベクターとプライミング；ワクシニアウイルスベクター／ブースティング；センダイウイルスベクターとの比較
（１）プライミング
Ｃ５７ＢＬ／６マウス２匹をマウスＡおよびマウスＢとした。マウスＡには、実施例２（１）に記載の方法により、マウスＢには、実施例１（１）［１−１］〈１−１−６〉のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖをＰＢＳに１×１０９ＰＦＵ／ｍＬとなるよう溶解したｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ溶液を調製し、これを１０μＬ（１×１０７ＰＦＵ）二又針により乱刺接種（プライミング）した後、８週間飼育した。【０１２４】
（２）ブースティング
本実施例（１）のマウスＡには、本実施例（１）のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ溶液１０μＬ（１×１０７ＰＦＵ）を二又針により乱刺接種（ブースティング）した後、２週間飼育した。一方、本実施例（１）のマウスＢには、実施例１（２）［２−４］のＳｅＶ−ｅｎｖをＰＢＳに４×１０９ＣＦＵ／ｍＬとなるよう溶解して得られたＳｅＶ−ｅｎｖ溶液１０μＬ（４×１０７ＣＦＵ）を経鼻注射（ブースティング）した後、２週間飼育した。【０１２５】
（３）血清の採取
本実施例（２）のマウスＡおよびマウスＢから、常法に従い、採血して血清を分離した。【０１２６】
（４）ＥＬＩＳＡ
［４−１］ｅｎｖ固着プレートの作製
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＣｌ２を３ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮＰ４０を０．５％（ｖ／ｖ）含むＴＭＮ緩衝液を調製した。１００ｍｍディッシュに８０％コンフルエントとなるまで培養した２９３Ｔ細胞に、実施例１（３）［３−３］のＤＮＡ−ｅｎｖをトランスフェクションして２日間培養した。この２９３Ｔ細胞を、ＴＭＮ緩衝液に溶解した後、限外濾過に供して、１００ｋＤａより小さい分子量のタンパク質を除去したタンパク質溶液を調製した。これをＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに添加してインキュベートすることにより、ｅｎｖを含む抗原タンパク質が固着したｅｎｖ固着プレートを得た。【０１２７】
［４−２］ｅｎｖ固着プレートを用いたＥＬＩＳＡ
１次抗体として本実施例（３）の血清を１００倍（１／１００）、３００倍（１／３００）、９００倍（１／９００）２７００倍（１／２７００）にそれぞれ希釈したものおよびＨＩＶ−１感染者血清（ポジティブコントロール）、２次抗体としてｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ結合抗ラットＩｇＧ抗体またはｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ結合抗ヒトＩｇＧ抗体、および発色試薬としてＴＭＢ ＥＬＩＳＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、常法に従ってＥＬＩＳＡ法を行い、波長４５０ｎｍで吸光度を測定した。その結果を図５に示す。【０１２８】
図５左図に示すように、マウスＡにおける吸光度は１／１００、１／３００、１／９００および１／２７００のいずれにおいても０であり、抗ｅｎｖ抗体の結合活性が認められなかった。これに対し、図５右図に示すように、マウスＢにおける吸光度は１／１００および１／３００では約２．４であり、１／９００では約２．２５、１／２７００では約１．５であることから、抗ｅｎｖ抗体の結合活性が認められた。【０１２９】
これらの結果から、抗原タンパク質発現プラスミドをプライミングした後、抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクターをブースティングした場合は、液性免疫が賦活されないのに対し、抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクターをプライミングした後、抗原タンパク質発現センダイウイルスベクターをブースティングした場合は、液性免疫が賦活されることが明らかになった。【０１３０】
＜実施例５＞免疫賦活効果の確認；プライミング；ＤＮＡ−ｅｎｖ／ブースティング；ワクシニアウイルスベクターにおける共発現ベクター接種
（１）プライミング
Ｃ５７ＢＬ／６マウス１５匹を５匹ずつ３群に分け、それぞれコントロール群、Ａ群およびＢ群とした。Ａ群のマウスには実施例４（１）のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ溶液を、Ｂ群のマウスには実施例３（１）のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍ溶液を、それぞれ１０μＬ（１×１０７ＰＦＵ）ずつ二又針により乱刺接種（プライミング）した後、８週間飼育した。なお、コントロール群のマウスには何も接種しなかった。【０１３１】
（２）ブースティング
本実施例（１）のＡ群およびＢ群のマウスに、実施例４（２）のＳｅＶ−ｅｎｖ溶液をそれぞれ１０μＬ（４×１０７ＣＦＵ）ずつ経鼻注射（ブースティング）した後、２週間飼育した。【０１３２】
（３）Ｔ細胞および血清の採取
本実施例（２）の各群のマウスから血清を採取し、実施例２（３）に記載の方法によりＴ細胞を採取した。【０１３３】
（４）細胞内サイトカイン染色およびＦＡＣＳによる染色細胞数の測定
本実施例（３）で採取したＴ細胞について、実施例２（４）および（５）に記載の方法により細胞内サイトカイン染色およびＦＡＣＳによる染色細胞数の測定を行った。また、測定した結果について、Ａ群とＢ群との間で検定を行った。その結果を図６に示す。【０１３４】
図６に示すように、ＣＤ８陽性ＩＦＮ−γ産生細胞は、コントロール群においては検出されず、Ａ群においては平均値として約７．２％、Ｂ群においては平均値として約６％であった。また、Ａ群における測定値とＢ群における測定値との間に有意差はなかった。【０１３５】
これらの結果から、抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクターまたは抗原タンパク質およびｈＣＤ４０Ｌｍを共発現するワクシニアウイルスベクターをプライミングした後、抗原タンパク質発現センダイウイルスベクターをブースティングした場合は、細胞性免疫が賦活されることが明らかになった。また、この場合のワクシニアウイルスベクターを、抗原タンパク質およびＣＤ４０Ｌｍを共発現するものにした場合、細胞性免疫賦活の増強効果は見られないことが明らかになった。【０１３６】
（５）ＥＬＩＳＡ                
本実施例（３）で採取した血清のうち、Ａ群およびＢ群の血清について、実施例４（４）に記載の方法によりＥＬＩＳＡを行った。また、得られた結果について、各群における平均値を求めた。その結果を図７左図に示す。【０１３７】
図７左図に示すように、Ａ群における吸光度は１／１００および１／３００では約２．４であり、１／９００では約２．２、１／２７００では約１．４であった。一方、Ｂ群における吸光度は１／１００および１／３００では約２．４であり、１／９００では約２．３、１／２７００では約１．９５であった。よって、Ａ群およびＢ群のいずれにおいても、抗ｅｎｖ抗体の結合活性が認められた。また、Ｂ群において、Ａ群と比較して抗ｅｎｖ抗体の結合活性が大きいことが確認された。【０１３８】
（６）ＴＺＭ−ｂｌアッセイ      
本実施例（３）で採取した各群の血清について、既報（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、第７９巻、第１０１０８−１０１２５頁、２００５年）に従いＴＺＭ−ｂｌアッセイを行って、血清中に含まれる抗ｅｎｖ抗体の中和活性を測定した。具体的には、まず、１００ｍｍディッシュに８０％コンフルエントとなるまで培養した２９３Ｔ細胞にｐＣＡＧＧＳ−ＳＦ１６２ｅｎｖ３．３μｇおよびｅｎｖ遺伝子を欠くＨＩＶ−１ゲノムを持つプラスミドｐＳＧ３−ΔＥｎｖ６．６μｇをトランスフェクションして４８時間培養した後、上清を回収して、ｅｎｖのエンベロープで覆われたシュードタイプウイルスが含まれるシュードタイプウイルス液を得た。このウイルス液を０．４５ｕｍフィルターに通し、?８０℃で保存した。【０１３９】
続いて、９６ウェルプレートに培養したＴＺＭ−ｂｌ細胞に、シュードタイプウイルス液を５倍希釈列で添加して４８時間培養した後、Ｂｒｉｇｈｔ Ｇｌｏ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてルシフェラーゼの発光を測定することにより、シュードタイプウイルス液のＴＣＩＤ５０を求めた。【０１４０】
次に、本実施例（３）で採取した血清の希釈列を調製し、２００ＴＣＩＤ５０のシュードタイプウイルス液をそれぞれ添加して１００μＬずつ混合液を調製し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、９６ウェルプレートに８０％コンフルエントとなるまで培養したＴＺＭ−ｂｌ細胞に、調製した混合液を添加して、７２時間培養した後、Ｂｒｉｇｈｔ Ｇｌｏ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてルシフェラーゼの発光を測定することにより、シュードタイプウイルスのＴＺＭ−ｂｌ細胞への感染を５０％阻害する血清の希釈倍数（ＩＤ５０）を求めた。その結果を図７右図に示す。【０１４１】
図７右図に示すように、ＩＤ５０は、Ａ群では平均値が３００であったのに対し、Ｂ群では平均値が８０２２であり、Ｂ群において、Ａ群と比較して抗ｅｎｖ抗体の中和活性が顕著に大きいことが確認された。【０１４２】
これらの結果から、抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクターまたは抗原タンパク質およびｈＣＤ４０Ｌｍを共発現するワクシニアウイルスベクターをプライミングした後、抗原タンパク質発現センダイウイルスベクターをブースティングした場合は、液性免疫が賦活されることが明らかになった。また、この場合のワクシニアウイルスベクターを、抗原タンパク質およびＣＤ４０Ｌｍを共発現するものにした場合、液性免疫の賦活が増強されることが明らかになった。【０１４３】
＜実施例６＞免疫賦活効果の確認；プライミング；ＤＮＡ−ｅｎｖ／ブースティング；ワクシニアウイルスベクターにおけるウイルスベクター混合接種
（１）プライミング
Ｃ５７ＢＬ／６マウス９匹について、実施例２（１）に記載の方法によりプライミングを行った。【０１４４】
（２）ブースティング
本実施例（１）のマウスを３匹ずつ３群に分け、Ａ群、Ｂ群およびコントロール群とした。また、実施例１（１）［１−２］〈１−２−６〉のｍ８Δ−〈低ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍ、実施例１（１）［１−４］〈１−４−５〉のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍおよび実施例１（１）［１−１］〈１−１−２〉のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉を、それぞれＰＢＳに１×１０９ＰＦＵ／ｍＬとなるよう溶解して、ｍ８Δ−〈低ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍ溶液ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍ溶液およびｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉溶液を調製した。【０１４５】
Ａ群、Ｂ群およびコントロール群のマウスに、本実施例（２）において調製したｍ８Δ−〈低ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍ溶液、ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍ溶液およびｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉溶液、ならびに実施例４（１）のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ溶液を下記のとおりの組み合わせで混合したものを、それぞれ１０μＬ（１×１０７ＰＦＵ）ずつ二又針により乱刺接種（ブースティング）した後、２週間飼育した。【０１４６】
Ａ群；ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ溶液およびｍ８Δ−〈低ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍ溶液
Ｂ群；ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ溶液およびｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍ溶液
コントロール群；ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ溶液およびｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉溶液【０１４７】
（３）Ｔ細胞および血清の採取
本実施例（２）の各群のマウスから、常法に従い、血清を採取し、実施例２（３）に記載の方法によりＴ細胞を採取した。【０１４８】
（４）細胞内サイトカイン染色およびＦＡＣＳによる染色細胞数の測定
本実施例（３）で採取したＴ細胞について、実施例２（４）および（５）に記載の方法により細胞内サイトカイン染色およびＦＡＣＳによる染色細胞数の測定を行った。その結果を図８に示す。【０１４９】
図８に示すように、ＣＤ８陽性ＩＦＮ−γ産生細胞は、Ａ群においては平均値として約７％、Ｂ群においては平均値として約３．５％、コントロール群においては平均値として約３．２％であった。【０１５０】
これらの結果から、抗原タンパク質発現プラスミドをプライミングした後、抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクターをブースティングすることにより細胞性免疫を賦活する場合に、ブースティングにおいて、抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクターおよびＣＤ４０Ｌｍ発現ワクシニアウイルスベクターを混合して接種すると、細胞性免疫の賦活が増強されることが明らかになった。さらに、この細胞性免疫賦活の増強効果は、ＣＤ４０Ｌｍの発現量が比較的大きいときは得られず、ＣＤ４０Ｌｍの発現量が比較的小さいときに得られることが明らかになった。【０１５１】
（５）ＥＬＩＳＡ                  
本実施例（３）で採取した血清について、実施例４（４）に記載の方法によりＥＬＩＳＡを行った。Ａ群の血清の結果のうち、代表的なものを図９に示す。【０１５２】
図９の代表的な結果に示すように、Ａ群における吸光度はいずれの希釈倍率でも０であり、抗ｅｎｖ抗体の結合活性は認められなかった。また、Ｂ群およびコントロール群においても、抗ｅｎｖ抗体の結合活性は認められなかった（図示しない）。【０１５３】
（６）ＴＺＭ−ｂｌアッセイ        
本実施例（３）で採取した血清について、実施例５（６）に記載の方法によりＴＺＭ−ｂｌアッセイを行ったところ、Ａ群、Ｂ群およびコントロール群のいずれの血清においても、抗ｅｎｖ抗体の中和活性は認められなかった（図示しない）。【０１５４】
これらの結果から、抗原タンパク質発現プラスミドをプライミングした後、抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクターおよびＣＤ４０Ｌｍ発現ワクシニアウイルスベクターを混合してブースティングした場合は、液性免疫が賦活されないことが明らかになった。【０１５５】
＜実施例７＞免疫賦活効果の確認；プライミング；ワクシニアウイルスベクター／ブースティング；センダイウイルスベクターにおけるウイルスベクター混合接種
（１）プライミング
Ｃ５７ＢＬ／６マウス１５匹を５匹ずつ３群に分け、それぞれコントロール群、Ａ群およびＢ群としたＡ群およびＢ群のマウスに、実施例４（１）のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ溶液、実施例６（２）のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉溶液および実施例６（２）のｍ８Δ−〈低ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍ溶液を下記のとおりの組み合わせで混合したものを、それぞれ１０μＬ（１×１０７ＰＦＵ）ずつ二又針により乱刺接種（プライミング）した後、８週間飼育した。なお、コントロール群のマウスには何も接種しなかった。【０１５６】
Ａ群；ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ溶液とｍ８Δ−〈低ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍ溶液
Ｂ群；ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ溶液とｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉溶液【０１５７】
（２）ブースティング
本実施例（１）のＡ群およびＢ群のマウスに、実施例４（２）のＳｅＶ−ｅｎｖ溶液をそれぞれ１０μＬ（４×１０７ＣＦＵ）ずつ経鼻注射（ブースティング）した後、２週間飼育した。【０１５８】
（３）Ｔ細胞および血清の採取
本実施例（１）の各群のマウスから血清を採取し、実施例２（３）に記載の方法によりＴ細胞を採取した。【０１５９】
（４）細胞内サイトカイン染色およびＦＡＣＳによる染色細胞数の測定
本実施例（３）で採取したＴ細胞について、実施例２（４）および（５）に記載の方法により細胞内サイトカイン染色およびＦＡＣＳによる染色細胞数の測定を行った。また、測定した結果について、Ａ群とＢ群との間で検定を行った。その結果を図１０に示す。【０１６０】
図１０に示すように、ＣＤ８陽性ＩＦＮ−γ産生細胞は、Ａ群においては平均値として約１２％、Ｂ群においては平均値として約６％であった一方、コントロール群においては検出されなかった。また、Ａ群の測定値は、Ｂ群の測定値と比較して有意に大きいことが確認された。【０１６１】
これらの結果から、抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクターをプライミングした後、抗原タンパク質発現センダイウイルスベクターをブースティングすることにより細胞性免疫を賦活する場合に、プライミングにおいて、抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクターおよびＣＤ４０Ｌｍ発現ワクシニアウイルスベクターを混合して接種すると、細胞性免疫の賦活が増強されることが明らかになった。【０１６２】
（５）ＥＬＩＳＡ
本実施例（３）で採取した血清のうち、Ａ群およびＢ群の血清について、実施例４（４）に記載の方法によりＥＬＩＳＡを行った。また、得られた結果について、各群における平均値を求めた。その結果を図１１左図に示す。【０１６３】
図１１左図に示すように、Ａ群における吸光度は、１／１００および１／３００では約２．４、１／９００では約２．２５、１／２７００では約１．６であった。一方、Ｂ群における吸光度は、１／１００では約２．３、１／３００では約２．１、１／９００では約１．６、１／２７００では約０．７５であった。よって、Ａ群において、Ｂ群と比較して抗ｅｎｖ抗体の結合活性が大きいことが確認された。【０１６４】
（６）ＴＺＭ−ｂｌアッセイ
本実施例（３）で採取した血清のうち、Ａ群およびＢ群の血清について、実施例５（６）に記載の方法によりＴＺＭ−ｂｌアッセイを行った。また、得られた結果について、各群における平均値を求めた。その結果を図１１右図に示す。【０１６５】
図１１右図に示すように、ＩＤ５０は、Ａ群では平均値として１５４２．６であったのに対し、Ｂ群では平均値として１５８１．６であり、Ａ群およびＢ群の抗ｅｎｖ抗体の中和活性は同程度であることが確認された。【０１６６】
これらの結果から、抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクターをプライミングした後、抗原タンパク質発現センダイウイルスベクターをブースティングすることにより液性免疫を賦活する場合に、プライミングにおいて、抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクターおよびＣＤ４０Ｌｍ発現ワクシニアウイルスベクターを混合して接種すると、液性免疫の賦活が増強されることが明らかになった。【０１６７】
＜実施例８＞免疫賦活効果の確認；プライミング；ワクシニアウイルスベクター／ブースティング；センダイウイルスベクターにおける共発現ベクター接種およびウイルスベクター混合接種
（１）プライミング
Ｃ５７ＢＬ／６マウス２５匹を５匹ずつ５群に分け、それぞれコントロール群、Ａ群、Ｂ群、Ｃ群およびＤ群とした。Ａ群、Ｂ群、Ｃ群およびＤ群のマウスに、実施例４（１）のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ溶液、実施例６（２）のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉溶液、実施例３（１）のｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍ溶液および実施例６（２）のｍ８Δ−〈低ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍ溶液を下記のとおりの組み合わせで混合したものを、それぞれ１０μＬ（１×１０７ＰＦＵ）ずつ二又針により乱刺接種（プライミング）した後、８週間飼育した。なお、コントロール群のマウスには何も接種しなかった。【０１６８】
Ａ群；ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ溶液とｍ８Δ−〈低ｐｒｏ〉−ｈＣＤ４０Ｌｍ
Ｂ群；ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ溶液とｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉
Ｃ群；ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ−ｈＣＤ４０Ｌｍ溶液
Ｄ群；ｍ８Δ−〈高ｐｒｏ〉−ｅｎｖ溶液【０１６９】
（２）ブースティング
本実施例（１）［１−１］のＡ群、Ｂ群、Ｃ群およびＤ群のマウスに、実施例４（２）のＳｅＶ−ｅｎｖ溶液をそれぞれ１０μＬ（４×１０７ＣＦＵ）ずつ経鼻注射（ブースティング）した後、２週間飼育した。【０１７０】
（３）Ｔ細胞および血清の採取
本実施例（１）［１−１］の各群のマウスから血清を採取し、実施例２（３）に記載の方法によりＴ細胞を採取した。【０１７１】
（４）細胞内サイトカイン染色およびＦＡＣＳによる染色細胞数の測定
本実施例［１−３］で採取した各群のＴ細胞をそれぞれ２群分けた。その一方の群についてはＣＤ４陽性ＩＦＮ−γ産生細胞を、標識抗体としてＡＰＣ−ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ−γ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）およびＶ４５０ Ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＣＤ４（日本ＢＤ社）を用いて、実施例２（４）に記載の方法により染色し、もう一方の群についてはＣＤ４陽性ＩＬ−４産生細胞を、標識抗体としてＰＥ−Ｃｙ７ Ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩＬ−４（日本ＢＤ社）およびＶ４５０ Ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＣＤ４（日本ＢＤ社）を用いて、実施例２（４）に記載の方法により染色した。【０１７２】
続いて、実施例２（５）に記載の方法により、ＦＡＣＳによる染色細胞数の測定を行った。なお、ＣＤ４陽性ＩＦＮ−γ産生細胞の測定結果については、Ａ群およびＢ群、ならびにＣ群およびＤ群の間で、ＣＤ４陽性ＩＬ−４産生細胞の測定結果については、各群とコントロール群との間でそれぞれ検定を行った。その結果を図１２に示す。【０１７３】
図１２左図に示すように、ＣＤ４陽性ＩＦＮ−γ産生細胞数は、コントロール群においては検出されなかった一方で、Ａ群においては平均値として約０．２％、Ｂ群においては平均値として約０．４％、Ｃ群においては平均値として約０．２２％、Ｄ群においては平均値として約０．３５％検出された。また、図１２右図に示すように、ＣＤ４陽性ＩＬ−４産生細胞の平均蛍光強度は、Ａ群においては平均値として約２３、Ｂ群においては平均値として約１９、Ｃ群においては平均値として約２９、Ｄ群においては平均値として約１７、コントロール群においては平均値として約１０であった。【０１７４】
これらの結果から、抗原タンパク質発現ワクシニアウイルスベクターをプライミングした後、抗原タンパク質発現センダイウイルスベクターをブースティングする場合に、プライミングにおいて、ＣＤ４０Ｌｍを混合接種または共発現により発現させた場合は、ＣＤ４０Ｌｍ発現させない場合と比較して、ＣＤ４陽性ＩＦＮ−γ産生細胞が減少し、ＣＤ４陽性ＩＬ−４産生細胞がやや増加することが明らかになった。
【図１】
2012053646.tif 000003
【図２】
2012053646.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年5月31日(2012.5.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞性免疫および液性免疫を賦活するプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクターであって、下記（ａ）および（ｂ）からなるプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター；
（ａ）免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクター、
（ｂ）前記免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するセンダイウイルスベクター。
【請求項２】
免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクターが、免疫原性を有するポリペプチドをコードする遺伝子およびＣＤ４０リガンド非切断型変異体をコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクターである、請求項１に記載のプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター。
【請求項３】
プライミング用ウイルスベクターが（ａ）であって、かつブースティング用ウイルスベクターが（ｂ）である、請求項１または請求項２に記載のプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター。
【請求項４】
下記（ｃ）を含んでなる、請求項１に記載のプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター；
（ｃ）ＣＤ４０リガンド非切断型変異体をコードする遺伝子を発現可能に保持するワクシニアウイルスベクター。
【請求項５】
プライミング用ウイルスベクターが（ａ）および（ｃ）であって、かつブースティング用ウイルスベクターが（ｂ）である、請求項４に記載のプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター。
【請求項６】
ワクシニアウイルスベクターが、ワクシニアウイルスＬＣ１６株、ＬＣ１６ｍ８株もしくはＬＣ１６ｍＯ株であって、かつＢ５Ｒ遺伝子において１または複数のヌクレオチドが置換、付加、挿入および／または欠失されていて正常な機能を有するＢ５Ｒ遺伝子産物を産生しないワクシニアウイルスベクターである、請求項１から請求項５のいずれかに記載のプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター。
【請求項７】
免疫原性を有するポリペプチドがヒトに対する病原微生物の抗原タンパク質またはその部分ペプチド、もしくはヒト腫瘍抗原タンパク質またはその部分ペプチドである、請求項１から請求項６のいずれかに記載のプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター。
【請求項８】
病原微生物が、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヘルペスウイルス、フラビウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス、日本脳炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、黄熱ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、ラッサウイルス、ポリオウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、コレラ菌、結核菌、ジフテリア菌、チフス菌、百日咳菌、髄膜炎菌、破傷風菌、ミコバクテリアおよびマラリア原虫よりなる群から選択される病原微生物である、請求項７に記載のプライム／ブーストワクチン用ウイルスベクター。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
よびＣＤ４０Ｌｍを共発現するものにした場合、細胞性免疫賦活の増強効果は見られないことが明らかになった。
［０１３６］
（５）ＥＬＩＳＡ
本実施例（３）で採取した血清のうち、Ａ群およびＢ群の血清について、実施例４（４）に記載の方法によりＥＬＩＳＡを行った。また、得られた結果について、各群における平均値を求めた。その結果を図７左図に示す。
［０１３７］
（５）ＥＬＩＳＡ
図７左図に示すように、Ａ群における吸光度は１／１００および１／３００では約２．４であり、１／９００では約２．２、１／２７００では約１．４であった。一方、Ｂ群における吸光度は１／１００および１／３００では約２．４であり、１／９００では約２．３、１／２７００では約１．９５であった。よって、Ａ群およびＢ群のいずれにおいても、抗ｅｎｖ抗体の結合活性が認められた。また、Ｂ群において、Ａ群と比較して抗ｅｎｖ抗体の結合活性が大きいことが確認された。
［０１３８］
（６）ＴＺＭ−ｂｌアッセイ
本実施例（３）で採取した各群の血清について、既報（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、第７９巻、第１０１０８−１０１２５頁、２００５年）に従いＴＺＭ−ｂｌアッセイを行って、血清中に含まれる抗ｅｎｖ抗体の中和活性を測定した。具体的には、まず、１００ｍｍディッシュに８０％コンフルエントとなるまで培養した２９３Ｔ細胞にｐＣＡＧＧＳ−ＳＦ１６２ｅｎｖ３．３μｇおよびｅｎｖ遺伝子を欠くＨＩＶ−１ゲノムを持つプラスミドｐＳＧ３−ΔＥｎｖ６．６μｇをトランスフェクションして４８時間培養した後、上清を回収して、ｅｎｖのエンベロープで覆われたシュードタイプウイルスが含まれるシュードタイプウイルス液を得た。このウイルス液を０．４５ｕｍフィルターに通し、−８０℃で保存した。
［０１３９］
続いて、９６ウェルプレートに培養したＴＺＭ−ｂｌ細胞に、シュードタイプウイルス液を５倍希釈列で添加して４８時間培養した後、Ｂｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてルシフェラーゼの発光を測定することにより、シュードタイプウイルス液のＴＣＩＤ５０を求めた。
【手続補正書】
【提出日】平成25年4月17日(2013.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
［４−２］ｅｎｖ固着プレートを用いたＥＬＩＳＡ
１次抗体として本実施例（３）の血清を１００倍（１／１００）、３００倍（１／３００）、９００倍（１／９００）２７００倍（１／２７００）にそれぞれ希釈したものおよびＨＩＶ−１感染者血清（ポジティブコントロール）、２次抗体としてｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ結合抗マウスＩｇＧ抗体またはｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ結合抗ヒトＩｇＧ抗体、および発色試薬としてＴＭＢ ＥＬＩＳＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、常法に従ってＥＬＩＳＡ法を行い、波長４５０ｎｍで吸光度を測定した。その結果を図５に示す。
【国際調査報告】
2012053646.tif 000015
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2012053646.tif 000017
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