(57)【要約】  Ｇカルテット構造を有し、且つ、以下のポリヌクレオチドからなる群より選択された少なくとも１つであり、アミロイドタンパク質オリゴマーに対する結合性を有するアプタマー：（１）配列番号１〜配列番号１８のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、（２）少なくとも２連続のグアノシンヌクレオチドを、少なくとも４つ含み、配列番号１８のいずれかで示される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；（３）前記（１）又は（２）のポリヌクレオチドを構成単位として含む多量体であるポリヌクレオチド。
2012111842.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇカルテット構造を有し、且つ、以下のポリヌクレオチドからなる群より選択された少なくとも１つであり、アミロイドタンパク質オリゴマーに対する結合性を有するアプタマー：
（１）  配列番号１〜配列番号１８のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（２）  少なくとも２連続のグアノシンヌクレオチドを、少なくとも４つ含み、配列番号１〜配列番号１８のいずれかで示される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、並びに、
（３）前記（１）又は（２）のポリヌクレオチドを構成単位として含む多量体であるポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記（３）のポリヌクレオチドが、上記（１）又は（２）のポリヌクレオチドと、各（１）又は（２）のポリヌクレオチド間を連結するリンカー配列とを有する請求項１記載のアプタマー。
【請求項３】
請求項１又は請求項２記載のアプタマーを含むアミロイドタンパク質オリゴマー検出キット。
【請求項４】
請求項１又は請求項２記載のアプタマーと被検試料とを接触させること、及び、
前記被検試料中のアミロイドタンパク質オリゴマー及び前記アプタマーの複合体を検出すること、
を含むアミロイドタンパク質オリゴマーの検出方法。
【請求項５】
前記被検試料が、髄液、血清、血漿及びこれらの希釈物からなる群より選択された少なくとも１つである請求項４記載のアミロイドタンパク質オリゴマー検出方法。
【請求項６】
配列番号１〜配列番号１８のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１〜配列番号１８のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを構成単位として含む多量体であるポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマー及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
α−シヌクレイン（α−Ｓｙｎ）はパーキンソン病（ＰＤ）やＬｅｗｙ小体型認知症（ＤＬＢ）に見られる封入体の主構成タンパク質であり、凝集することで細胞毒性を獲得し、疾患を引き起こすと考えられている。α−Ｓｙｎの凝集中間体であるα−シヌクレインオリゴマーは、最終的に形成するアミロイド線維よりも高い細胞障害性を示すことが報告されていることから、α−シヌクレインオリゴマーはＰＤ、ＤＬＢの発症における毒性の本体である可能性が示唆されている。
またα−シヌクレインに限らず、アルツハイマー病、プリオン病、ポリグルタミン病、ハンチントン病などの発症には、それぞれ、βアミロイドペプチド及びタウタンパク質、プリオンタンパク質、ポリグルタミンペプチド、ハンチンチンなどのアミロイドタンパク質の蓄積が深く関っている。これらのアミロイドタンパク質もまた、体内において可溶化形態で常在しているタンパク質であり、何らかの刺激をきっかけにコンフォメーションを変化させてオリゴマーを形成し、その後、不溶化形態のアミロイド線維となる。【０００３】
これらのアミロイドタンパク質の沈着などが原因とされる疾患では、アミロイドタンパク質オリゴマーを特異的に検出することが、疾患の原因究明の解明には必要である。また、組織内でのオリゴマーの局在が把握できれば、予防や診断にも有効である。【０００４】
このため、オリゴマー形態のアミロイドタンパク質を特異的に検出するために種々の技術が開発されている。例えば、特表２０１０−５３１９９２号公報及び特表２０１０−５３０２２７には、アミロイドβペプチドに対する抗体が開示されている。また、特表２０１０−５０２９３８号公報及び特表２０１０−５３７９６２号公報には、アミロイドβタンパク質に対するモノクローナル抗体が開示されている。【０００５】
一方、任意の分子と特異的に結合するポリヌクレオチド分子であるアプタマーが知られている。アプタマーは、市販の核酸合成機を用いて化学的に全合成できるので、特異抗体に比べてはるかに安価であり、また、修飾が容易であるため、構造変化を設計できるという利点を有する。更には、ペプチドとは異なり高温で変性しても元に戻るため、安定性に優れている。アプタマーは、特定の三次元構造を形成し、標的の分子に対して選択的な分子認識能を発揮する。アプタマーの三次元構造としては、これまでに、ヘアピン型、シュードノット型、バルジ型、Ｇカルテット型といった様々な形をとることが報告されている。【０００６】
α−シヌクレインを検出するアプタマーとしては、複数のヘアピン型構造を有するアプタマー、Ｍ５−１５が知られている（Biotechnol. Lett., (2010) vol.32, pp.643-648参照）。このα−シヌクレイン結合アプタマーＭ５−１５は、オリゴマー型のシヌクレインのみならず、モノマー型のα−シヌクレインも認識すると記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、アミロイドタンパク質オリゴマーを特異的に認識することが要請されているが、アミロイドタンパク質オリゴマーを特異的に認識するために有用なアプタマーは得られていない。
従って本発明は、アミロイドタンパク質オリゴマーを特異的に認識可能なアプタマー及びこれを用いたアミロイドタンパク質オリゴマーの検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の態様を提供する。
［１］  Ｇカルテット構造を有し、かつ、以下のポリヌクレオチドからなる群より選択された少なくとも１つであり、アミロイドタンパク質オリゴマーに対する結合性を有するアプタマー：
（１）  配列番号１〜配列番号１８のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（２）  少なくとも２連続のグアノシンヌクレオチドを、少なくとも４つ含み、配列番号１〜配列番号１８のいずれかで示される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、並びに、
（３）  前記（１）又は（２）のポリヌクレオチドを構成単位として含む多量体であるポリヌクレオチド。
［２］  前記（３）のポリヌクレオチドが、上記（１）又は（２）のポリヌクレオチドと、各（１）又は（２）のポリヌクレオチド間を連結するリンカー配列とを有する［１］記載のアプタマー。
［３］  ［１］又は［２］記載のアプタマーを含むアミロイドタンパク質オリゴマー検出キット。
［４］  ［１］又は［２］記載のアプタマーと被検試料とを接触させること、及び、前記被検試料中のアミロイドタンパク質オリゴマー及び前記アプタマーの複合体を検出すること、を含むアミロイドタンパク質オリゴマーの検出方法。
［５］  前記被検試料が、髄液、血清、血漿及びこれらの希釈物からなる群より選択された少なくとも１つである［４］記載のアミロイドタンパク質オリゴマー検出方法。
［６］  配列番号１〜配列番号１８のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
［７］  配列番号１〜配列番号１８のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを構成単位として含む多量体である多量体ポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、アミロイドタンパク質オリゴマーを特異的に認識可能なアプタマー及びこれを用いたアミロイドタンパク質オリゴマーの検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１に係る各アプタマーのα−シヌクレインモノマー、オリゴマー又は線維に対する結合能を比較したアプタマーブロットアッセイの結果を示す図である。
【図２】実施例１に係る各アプタマーの種々のタンパク質に対する結合能を比較したアプタマーブロットアッセイの結果を示す図である。
【図３】実施例１に係る各アプタマーのβアミロイドペプチドＡβ１−４０に対する結合能を比較したアプタマーブロットアッセイの結果を示す図である。
【図４】実施例２に係る各アプタマーのα−シヌクレインモノマー、オリゴマー又は線維に対する結合能を比較したアプタマーブロットアッセイの結果を示す図である。
【図５】実施例３に係る各アプタマーのＡβタンパク質に対する結合能を示すグラフである。
【図６】実施例３に係るダイマー型アプタマーのβアミロイドペプチドＡβ１−４０に対する結合能を比較したアプタマーブロットアッセイの結果を示す図である。
【図７】実施例４に係る改良型アプタマーのＡβタンパク質に対する結合能を示すグラフである。
【図８】実施例４に係る２Ｇ１６及び３Ｇ４のＰＡＧＥ解析の結果を示す画像である。
【図９】実施例４に係るダイマー型アプタマーのβアミロイドペプチドＡβ１−４０に対する結合能を比較したアプタマーブロットアッセイの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のアプタマーは、Ｇカルテット構造を有するポリヌクレオチドであって、以下のポリヌクレオチドからなる群より選択された少なくとも１つであり、アミロイドタンパク質オリゴマーに対する結合性を有するアプタマー：
（１）  配列番号１〜配列番号１８のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（２）  少なくとも２連続のグアノシンヌクレオチドを、少なくとも４つ含み、配列番号１〜１８のいずれかで示される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、並びに、
（３）  少なくとも２量体以上の多量体の上記（１）又は（２）のポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチド。
【００１２】
本発明に係るアミロイドタンパク質オリゴマーに対する結合性を有するアプタマー（以下、「アミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマー」という）は、特定の塩基配列又はこれに類似した塩基配列を有し、Ｇカルテット構造を有するアプタマーであるので、アミロイドタンパク質のコンフォメーション変化に応じて、オリゴマーを特異的に認識し、結合することができる。
更に説明すれば、上述したようにアミロイドタンパク質は、モノマー型、オリゴマー型及び線維型にコンフォメーションを変更する。Ｇカルテット構造を有する特定の前記アプタマーは、オリゴマー型とモノマー型に対する結合能が異なることが本発明において見出された。このようなＧカルテット型アプタマーを用いることにより、オリゴマー型のアミロイドタンパク質を特異的に識別することができる。
【００１３】
前記アミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーの特異性は、アミロイドタンパク質とアミロイドタンパク質以外とを区別可能であり、且つアミロイドタンパク質モノマーとアミロイドタンパク質オリゴマーとを区別可能な特異性を意味する。また、前記アミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーは、アミロイドタンパク質線維に対する結合性を有していてもよい。
なお、本明細書における「アプタマー」とは、特定の分子に結合する核酸リガンドを表す。
【００１４】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
【００１５】
＜アミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマー＞
本発明のアミロイドタンパク質結合アプタマーは、Ｇカルテット構造を有するポリヌクレオチドであって、以下のポリヌクレオチドからなる群より選択された少なくとも１つであり、アミロイドタンパク質オリゴマーに対する結合性を有するアプタマーである。
（１）配列番号１〜配列番号１８のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び、
（２）少なくとも２連続のグアノシンヌクレオチドを、少なくとも４つ含み、配列番号１〜１８のいずれかで示される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（３）  少なくとも２量体以上の多量体の上記（１）又は（２）のポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチド。
このような配列であれば、Ｇカルテット構造を有し、アミロイドタンパク質オリゴマーを特異的に認識することができる。
Ｔ−ＳＯ５１７：GGTGGCTGGAGGGGGCGCGAACG （配列番号１）
Ｔ−ＳＯ６０６：GGGTCGGCTGTCCGTGGGTGGGGA（配列番号２）
Ｔ−ＳＯ５５４：CGAGGGGCGTCTGGGAGTGGTCGG（配列番号３）
Ｔ−ＳＯ５３０：GGTGCGGCGGGACTAGTGGGTGTG（配列番号４）
Ｔ−ＳＯ５５２：GCGTGTGGGGCTTGGGCAGCTGGG（配列番号５）
Ｔ−ＳＯ５０４：CAGGGGTGGGCAAAGGGCGGTGGTG（配列番号６）
Ｔ−ＳＯ５０８：GCCTGTGGTGTTGGGGCGGGTGCG（配列番号７）
Ｔ−ＳＯ６０２：GCGGTAGGGTGTGAGCGGAAGGGG（配列番号８）
２Ｇ１６      ：CGAGGGGCGTCTGGGGGGGAGGGA（配列番号９）
２Ｇ４        ：CGGGGGGCGTGTGGGAGAGGTCGG（配列番号１０）
２Ｇ１３      ：TGGGGGGCGTAGGGTCGCGAACGA（配列番号１１）
２Ｇ９        ：CGGGGGGCGTAGGGGAGAGGGGCG（配列番号１２）
３Ｇ４        ：CGGGGGGCCTGAGGGGGGGAGGGA（配列番号１３）
３Ｇ２１      ：CGGGGCGCATCTGGGGGGGAGGGA（配列番号１４）
３Ｇ１６      ：CGGGGGGCTTGTGGCGGGGAGGGA（配列番号１５）
３Ｇ２２      ：CGAGGGGAGTAGGGGGGAGGGGCG（配列番号１６）
３Ｇ１４      ：CGGGGGGCGTCTGGGCGCGAGGGA（配列番号１７）
３Ｇ９        ：CGGGGGCCGTTGGGGGGGGAGGGA（配列番号１８）
【００１６】
Ｇカルテット構造は、当業界では周知の構造である。この構造は、グアノシンヌクレオチド（Ｇ）に富むＤＮＡ又はＲＮＡにおける分子間及び分子内の四重鎖構造である。Ｇカルテット構造は、グアノシン塩基がその隣接するグアノシン塩基と共に２つの水素結合を形成し、環状Ｈｏｇｓｔｅｎ Ｈ結合配置に４つのグアノシン塩基が関連付けられることにより形成される。最終的にＧカルテット構造は互いに積み重なり、四分子らせん構造を採る。
Ｇカルテット構造を有するアプタマーであることは、公知の測定手段によって確認することができる。例えば、ＣＤスペクトルを用いて、所定の波形を確認することでＧカルテット構造を有するアプタマーであると確認できる。例えば、アプタマーをＴＢＳ緩衝液(１０ｍ ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４)に溶解して試料液を調製し、温度２０℃、波長２００ｎｍ〜３２０ｎｍ、走査速度１００ｎｍ／分、積算回数１０回の条件下でスペクトル測定したときの条件によるＣＤスペクトルにおいて、２４０ｎｍ近傍の極小値と２６０ｎｍ近傍での極大値の出現により確認できる。
【００１７】
アプタマーを構成するヌクレオチドの種類としては、ヌクレオチドに含まれる塩基の種類によってＧカルテット構造を構成することができるものであれば特に制限はなく、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド等が挙げられる。また、本発明のアプタマーにおけるヌクレオチドには、ペプチド核酸などの疑似核酸も包含してもよい。また前記ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含むものであってもよい。前記アプタマーとしては、標的物質の反応時における立体構造上の柔軟性の観点から、リボヌクレオチド、即ちＲＮＡであることが好ましい。
【００１８】
修飾ヌクレオチドとしては、例えばＲＮＡａｓｅに対する耐性を有する修飾ヌクレオチド、蛍光検出のための標識化ヌクレオチド等を挙げることができる。標識としては、この分野で使用可能な既知の標識を挙げることができ、ＦＩＴＣ等の蛍光物質、ビオチン、アビジンなどを挙げることができる。
【００１９】
前記（２）のアプタマーは、Ｇカルテット構造を有する少なくとも２連続のグアノシンヌクレオチドを少なくとも４つ含み、配列番号１〜１８のいずれかで示される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドである。このようなポリヌクレオチドであれば、前記配列番号１〜１８のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと同様に、Ｇカルテット構造を有し、アミロイドタンパク質オリゴマーに対して結合性を有することができる。
【００２０】
前記アミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーのヌクレオチド長は２０〜３０であり、アミロイドタンパク質に対する結合能の観点から、２３〜２５であることが好ましい。
【００２１】
前記（２）のアプタマーは、少なくとも２連続のグアノシンヌクレオチドを少なくとも４つ含むものである。ここで「少なくとも２連続のグアノシンヌクレオチド」とは、配列中のグアノシンヌクレオチドが２つ又はそれ以上の数で連続していることを意味する。また「少なくとも４つ含む」とは、少なくとも２連続のグアノシンヌクレオチドが、配列中に４つ以上含まれることを意味する。なお、例えば４個のグアノシンヌクレオチドが連続している場合には、２連続のグアノシンヌクレオチドが２つ連続していることを表す。Ｇカルテット構造を確実に構成してアミロイドタンパク質オリゴマーを確実に認識する観点から、２連続以上のグアノシンヌクレオチドが配列中に４つ含まれていることが好ましい。また、更に、２３〜２５のヌクレオチド長であって、配列中のグアノシンヌクレオチドが１４〜１５となるポリヌクレオチドであることが、アミロイドタンパク質オリゴマーをより確実に認識する観点から好ましい。
【００２２】
前記（２）のアプタマーにおけるグアノシンヌクレオチドの数の条件が満たされ、オリゴマー型アミロイドタンパク質に特異的に結合可能である限り、本発明にかかるアミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーは、配列番号１〜１８のいずれかで示される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、又は付加されていてもよい。前記数個としては、例えば２〜５個とすればよい。
このようなアミロイドタンパク質結合アプタマーであれば、オリゴマー型アミロイドタンパク質を特異的に認識可能である。
【００２３】
また、前記（２）のアプタマーにおけるグアノシンヌクレオチドの数の条件が満たされ、オリゴマー型アミロイドタンパク質に特異的に結合可能である限り、本発明にかかるアミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーは、配列番号１〜１８のいずれかで示される塩基配列の相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする配列を有していてもよい。
ここでストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。典型的なストリンジェントな条件とは、例えば、カリウム濃度は約２５mＭ〜約５０ｍＭ、及びマグネシウム濃度は約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭ中において、ハイブリダイゼーションを行う条件が挙げられる。
【００２４】
前記アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（systemic evolution of ligands by exponential enrichment）法による試験管内選別を行ってランダムなポリヌクレオチドライブラリーから、標的物質に対する結合能に基づいて選別することができる。
また、得られたアプタマーに対して、オリゴマー型アミロイドタンパク質に対する結合能を指標に、アプタマーの配列を更に最適化して、他のアプタマーを得ることができる。最適化する方法としては、いわゆる、In silico maturation法を挙げることができる。in silico maturation法では、in vitroでのアプタマーの評価および順位づけの操作と、配列の組換えやシャッフリング及び種々の変異導入などのin silico（コンピュータ上）での進化模倣アルゴリズムに基づく新規配列の作製の操作から成る。この二つの操作を合わせて一世代と呼び、何世代か操作を繰り返すことで目的の機能をもつアプタマー配列を獲得する（例えば、Nucleic Acids Res., (2005) vol.33(12), pp.e108; Biochem Biophys Res Commun., (2006) vol. 347(1), pp.226-31; Biosens Bioelectron., (2010) vol.15;26(4), pp.1386-91参照）。
また、配列が既知のものについては、常法により化学合成してもよい。
【００２５】
得られたアプタマーが、アミロイドタンパク質オリゴマーに対する結合性を有することは、ブロッティングアッセイ等の常法により確認することができる。
例えば、ブロッティングアッセイの場合には、以下のように行う。
アミロイドタンパク質オリゴマーを０．５μｇ〜１μｇ、ニトロセルロース膜に固定化して、ブロッティング用の膜を用意する。対象とするアプタマーに蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ）を連結して、試料アプタマーを調製する。
上記ブロッティング用膜に対して、得られた試料アプタマーを５０ｎＭ〜５μＭの濃度で含むＴＢＳ−Ｔ溶液（２５ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５Ｍ ＫＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を添加して、室温で１時間インキュベートする。その後、十分量のＴＢＳ−Ｔを用いて膜を洗浄する（２ｍｉｎ×２回、１０ｍｉｎ×１回）。
洗浄後のニトロセルロース膜を、ＴＢＳ−Ｔ で１０００倍希釈した検出用酵素（例えば、ＨＲＰ）で修飾した前記蛍光物質に対する抗体（例えば、抗ＦＩＴＣ抗体）と共に、室温で１時間インキュベートする。その後、十分量のＴＢＳ−Ｔを用いて膜を洗浄する（２ｍｉｎ×２回、１０ｍｉｎ×１回、５ｍｉｎ×２回）。
次いで、前記検出用酵素に対する基質を添加して、化学発光を検出することにより、試料アプタマーとアミロイドタンパク質オリゴマーとの結合を評価する。
【００２６】
アミロイドタンパク質結合アプタマーが認識可能なアミロイドタンパク質としては、コンフォメーション変化を生じうるものを挙げることができ、例えば、α−シヌクレイン（パーキンソン病関連アミロイドタンパク質）、βアミロイドペプチド（アルツハイマー型認知症関連アミロイドタンパク質）、プリオンタンパク質（所謂、狂牛病関連アミロイドタンパク質）、タウタンパク質（アルツハイマー型認知症関連アミロイドタンパク質）、ポリグルタミンペプチド（ポリグルタミン病関連アミロイドタンパク質）、ハンチンチン（ハンチントン病関連アミロイドタンパク質）、等を挙げることができる。
【００２７】
前記アミロイドタンパク質結合アプタマーは、上記（１）又は（２）のポリヌクレオチドを構成単位として含む多量体（以下、多量体アプタマーという）とすることができる。このような多量体アプタマーは、多量体アプタマーを構成する（１）又は（２）のポリヌクレオチド（以下、構成単位という）のみのアプタマーと比較して、アミロイドタンパク質オリゴマーに対する結合力を高くすることができる。
【００２８】
このような多量体アプタマーとしては、前記構成単位を２つ連結させたダイマー型、３つ連結させたトリマー型、３つ連結させたテトラマー型の他、５量体以上、例えば１０〜３０の前記構成単位から形成された多量体が挙げられる。また、多量体アプタマーは、２量体〜４量体程度とすることができる。２量体以上であれば、アミロイドタンパク質オリゴマーへの結合性が向上する傾向があり、４量体程度とすることにより、アミロイドタンパク質オリゴマーに対する前記構成単位の数に応じた結合性向上効果が得られる傾向がある。
前記多量体アプタマーとしては、前記構成単位をタンデムに連結したものであってもよく、デンドリマー型であってもよい。タンデムに連結した場合には、連結の形態としては、構成単位が同方向に連結したもの（すなわち、（頭−尾）（頭−尾）型）及び逆向きに連結したもの（すなわち、（頭−尾）（尾−頭）型）を挙げることができる。デンドリマー型の場合には、コア部分としてエチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン等を挙げることができる。
【００２９】
これらの多量体オリゴマー中のモノマー単位の間には、リンカー配列を含んでもよい。
リンカー配列としては、グアノシンヌクレオチド以外のヌクレオチド、チミジンヌクレオチド又はシトシンヌクレオチドが２つ以上連続することにより形成された配列など等を挙げることができる。リンカー配列の長さとしては、２〜１５とすることができ、３〜１０であることが結合能の向上の点で好ましい。
【００３０】
前記アミロイドタンパク質結合アプタマーは、単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせてもよい。また、多量体の場合には、前記構成単位の数が異なるものの組み合わせであってもよい。
【００３１】
また、前記アミロイドタンパク質結合アプタマーは、その両端に、付加的な配列を有するものであってもよい。このような付加的な配列としては、グアノシンヌクレオチド以外のヌクレオチド、チミジンヌクレオチド又はシトシンヌクレオチドが２つ以上連続することにより形成された配列などを挙げることができる。このような付加的な配列は、例えばオリゴヌクレオチドの末端の標識における標識物の機能保持のために設けることができる。前記付加的な配列としては、５連続のチミジンヌクレオチド、アデニンヌクレオチド等を挙げることができる。５連続のチミジンヌクレオチドを設けることにより、例えば蛍光標識した場合の蛍光強度の低下を防止することができる。
前記アミロイドタンパク質結合アプタマーは、既知の方法を用いて配列に従って化学合成すればよく、当業者であればアミロイドタンパク質結合アプタマーを得るための合成方法を適宜選択することができる。
【００３２】
＜アミロイドタンパク質オリゴマー検出方法＞
本発明のアミロイドタンパク質オリゴマーの検出方法は、前記アミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーと体液試料とを接触させること（接触工程）、及び、体液中のアミロイドタンパク質オリゴマー及び前記アミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーの複合体を検出すること（検出工程）、を含むものである。
上記アミロイドタンパク質オリゴマー検出方法では、上述した特定配列を有し、アミロイドタンパク質を特異的に結合し得るアミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーと、標的分子であるアミロイドタンパク質オリゴマーとを接触させて、これらから構成される複合体を検出するので、試料中のアミロイドタンパク質オリゴマーを特異的に検出することができる。
【００３３】
アミロイドタンパク質オリゴマーの検出対象となる体液試料は、アミロイドタンパク質オリゴマーが存在する可能性がある被検試料であれば特に制限はなく、髄液、血清及び血漿等の体液やその希釈物を用いることができる。これらの被検試料は、被検体から分離されたものであればよい。
アミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーと被検試料との接触前に、被検試料の調製工程を設けてもよい。このような調製工程としては、被検体からの採取、適切な希釈液を用いて検出に適した濃度に採取試料の希釈等を挙げることができる。
【００３４】
接触工程におけるアミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーと被検試料との接触については特に制限はなく、アプタマーと標的分子との接触に通常用いられる条件をそのまま適用すればよい。被検試料中に、標的となるアミロイドタンパク質オリゴマーが存在する場合には、アミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーと標的アミロイドタンパク質オリゴマーとの複合体が試料中に形成されうる。
【００３５】
検出工程では、接触工程において形成された前記複合体を検出する。なお、本検出工程における用語「検出」には、試料中における前記複合体の有無の検出のみならず、試料中における前記複合体の定量も包含される。また、検量線を用いることにより、前記複合体の検出又は定量から、試料中における標的アミロイドタンパク質オリゴマーの検出又は定量も、常法により行うことができる。
【００３６】
被検試料中の標的アミロイドタンパク質オリゴマーの検出又は定量は、アプタマーによる周知の通常の方法により行うことができ、例えば抗体の代わりにアプタマーを利用した免疫測定法（イムノクロマトグラフィーやELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay)又は、ＷＯ２００５／０４９８２６号又はＷＯ２００７／０８６４０３号に記載された測定方法、或いは、アプタマーブロッティング法（特開２００８−８２３７０４２号）、又は表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）等の周知の方法によっても行うことができる。
【００３７】
本検出方法により検出可能なアミロイドタンパク質オリゴマーとしては、コンフォメーション変化を生じ得るアミロイドタンパク質のオリゴマーを挙げることができる。このようなアミロイドタンパク質としては、例えば、α−シヌクレイン（パーキンソン病関連アミロイドタンパク質）、βアミロイドペプチド（アルツハイマー型認知症関連アミロイドタンパク質）、プリオンタンパク質（所謂、狂牛病関連アミロイドタンパク質）、タウタンパク質（アルツハイマー型認知症関連アミロイドタンパク質）、ポリグルタミンペプチド（ポリグルタミン病関連アミロイドタンパク質）、ハンチンチン（ハンチントン病関連アミロイドタンパク質）、さらには、ＳＯＤ１タンパク質、ＴＤＰ−４３タンパク質（筋萎縮性側索硬化症関連タンパク質）、アミリン（II型糖尿病関連タンパク質）、血漿アミロイドＡタンパク質、ライソゾーム（全身性アミロイドーシス関連タンパク質）、β２ミクログロブリン（透析アミロイドーシス関連タンパク質）等を挙げることができる。
【００３８】
＜アミロイドタンパク質オリゴマー検出キット＞
本発明のアミロイドタンパク質オリゴマー検出キットは、前記アミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーを含むものである。
本キットに含まれるアミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーは、上述したように、アミロイドタンパク質オリゴマーを特異的に検出することができるので、本キットを用いることにより、簡便にアミロイドタンパク質オリゴマーを検出することができる。
【００３９】
本キットは、前記アミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーを収容する収容部と、前記アミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーを用いたアミロイドタンパク質オリゴマーの検出方法を記載した製品説明書を含んでもよい。また、アミロイドタンパク質オリゴマーを検出する対象となる被検試料を適度な濃度に希釈するための希釈剤を収容する希釈剤用収容部を含んでもよく、これに加えて、又は、これに代えて、他の試薬を収容する試薬収容部を含むものであってもよい。
【００４０】
本キットにおける「収容部」とは、それぞれの薬剤が混合せずに独立して存在するために有効な形態であれば特に制限はなく、例えば、容器や個別包装形態などであってもよく、一のシート状で独立して区分けされた領域としての形態であってもよい。
キットに含むことが可能な他の試薬としては、前記複合体を検出するために使用可能な試薬、陽性又は陰性対照サンプルなどを挙げることができる。
【００４１】
＜その他の用途＞
上記のように本発明の一態様は、（１）配列番号１〜配列番号１８のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、（２）少なくとも２連続のグアノシンヌクレオチドを、少なくとも４つ含み、配列番号１〜１８のいずれかで示される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び（３）配列番号１〜配列番号１８のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを構成単位として含む多量体ポリヌクレオチドを提供するものである。
これらのポリヌクレオチド又は多量体ポリヌクレオチドは、上述した用途の他にも、種々の用途に利用可能である。
特に、前記ポリヌクレオチド又は多量体ポリヌクレオチドは、アミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーとして、アミロイドタンパク質オリゴマーに対する特異的な結合性を有するので、アミロイドタンパク質オリゴマーを標的とする種々の態様に使用可能である。
【００４２】
例えば、前記アミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーは、標的となるアミロイドタンパク質オリゴマーの種類に応じた疾患の治療もしくは予防剤又は治療又は予防用医薬組成物として適用してもよい。このような治療剤又は予防剤は、前記アミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーを有効成分として含む。また、治療用又は予防用医薬組成物は、前記アミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーと、医薬として許容可能な担体とを含む。医薬として許容可能な担体としては、この用途に一般に使用される各種有機あるいは無機担体物質が挙げられる。治療剤若しくは予防剤、又は治療用若しくは予防用医薬組成物の場合には、前記アミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーは、更に、治療用又は予防用の他の有効成分との結合体の形態として含まれていてもよい。
【００４３】
また、本発明は、標的となるアミロイドタンパク質オリゴマーの種類に応じた疾患の治療もしくは予防方法も包含する。本疾患の治療又は予防方法は、有効量の前記アミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーを、対象に投与することを含む。
これらの治療又は予防の対象となる疾患としては、アミロイドタンパク質オリゴマーに関連する疾患を挙げることができる。このような疾患としては、例えば、パーキンソン病、プリオン病（狂牛病）、ポリグルタミン病、ハンチントン病、アルツハイマー型認知症、Ｌｅｗｙ小体型認知症、パーキンソン病、多系統萎縮症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ウシ海綿状脳症やスクレイピー等のプリオン病、ピック病や進行性核上性麻痺等のタウオパチー、ハンチントン病等のポリグルタミン病、筋萎縮性側索硬化症、II型糖尿病、全身性アミロイドーシスや透析アミロイドーシス等のアミロイドーシスなどを挙げることができる。
また、投与対象としては、アミロイドタンパク質オリゴマーの蓄積を生じうる生物であればよく、ヒト、サル等の霊長類の他、牛、馬、羊等の家畜動物を挙げることができる。
【００４４】
また、前記（１）〜（３）のアミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーは、前記アミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーと、高周波誘導加熱によって発熱しうる導電性粒子とを有するアプタマー−導電性粒子結合体の一部を構成することができる。
ここで「高周波数誘導加熱」とは、高周波の周波数、高周波電圧などの加熱条件で所定の温度にして、加熱することをいう。
前記アプタマー−導電性粒子結合体は、前記アミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマー部分を含むので、アプタマー部分を介してアミロイドタンパク質オリゴマーに特異的に結合可能であり、また、前記導電性粒子を含むので、高周波誘導加熱によって導電性粒子が発熱して熱を発生させることができる。このアプタマー−導電性粒子結合体を用いることにより、高周波交流磁場が照射された領域のみを局所加熱することができ、発生させる熱を調整することにより、アプタマーに結合した標的物質を破壊することができる。これにより、標的となるアミロイドタンパク質オリゴマーを破壊して、アミロイドタンパク質オリゴマーの蓄積を予防又は解消することができ、アミロイドタンパク質オリゴマーの蓄積による各種症状の軽減又は発症予防を行うことができる。
【００４５】
導電性粒子の原料としては、高周波誘導加熱により発熱する材料であれば特に限定されず、例えば、金属、導電性ポリマーが挙げられる。金属としては、例えば、金、アルミ、銅、銀などの遷移金属が好ましく、金が特に好ましい。
【００４６】
導電性粒子として金粒子を用いる場合、金ナノ粒子複合体を使用することができる。金ナノ粒子複合体としては、例えば、ＮＡＮＯＧＯＬＤ（商標）（ナノプローブ社（Nanoprobes, Inc.）などの市販の金ナノ粒子複合体を用いることができる。金ナノ粒子は、銀イオンによる光学的シグナル増幅が可能であり、かつ、凝集による色の変化を観察する検出法の構築が可能であるという利点がある。このため、金ナノ粒子とアプタマーとを結合させることにより、高感度なタンパク質検出を達成することができる。
また、導電性粒子のかわりに、磁性粒子を使用してもよい。ここで、磁性粒子は、例えばＦｅ２Ｏ３やＦｅ３Ｏ４などの材料を含むことができる。
【００４７】
アプタマー−導電性粒子結合体の製造方法は、ヌクレオチド等に対して無機材料を結合するために通常用いられる手段をそのまま適用すればよく、例えば、チオール修飾アプタマーとマレイミド含有金粒子と反応させる方法等を挙げることができる。
高周波誘導加熱は、例えば、所定の電気制御回路に信号発生器からの出力を増幅し、電磁場照射コイルに供給するためのインピーダンス整合回路を付加した装置により実現できる。
【００４８】
前記アプタマー−導電性粒子結合体は、例えば以下のようにして作製することができる。
金ナノ粒子（直径１．４ｎｍ）３０ｎｍｏｌに１００μｌのイソプロパノールを添加して混合物を得、該混合物をミリＱで１／１０に希釈して、全量１０００μｌとする（金ナノ粒子溶液）。次に、前記アミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマー３ｎｍｏｌを金ナノ粒子溶液に添加し、４℃で２４時間インキュベートする。次いで、得られた混合溶液をについて、５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５で平衡化したゲルろ過カラム（Ｓｕｐｌｅｘ ７５１６／６０）を用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行う。次に、ゲルろ過クロマトグラフィーで得られた画分を脱塩し凍結乾燥を行うことにより、アプタマー・金粒子複合体を調製する。
【実施例】
【００４９】
以下に本発明の実施例について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。【００５０】
［実施例１］
＜α−シヌクレインオリゴマー特異的アプタマーの作製＞
（１）  α−シヌクレイン試料の調製
（１−１）モノマーの調製
α-シヌクレイン遺伝子の入ったプラスミドを持つ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）/ｐＥＴ−２８ａ（＋）α−シヌクレインを 終濃度３０μｇ/ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、ＩＰＴＧを添加することでα-シヌクレインの発現を誘導した。得られた湿菌体を懸濁後、破砕し、遠心分離（１５，０００ｇ、４℃、２０ｍｉｎ）を行い、上清を回収した。得られた上清を沸騰した湯の中で２０分間加熱した。加熱後、遠心分離 (１５，０００ｇ, ４℃, １５ｍｉｎ) を行い、熱によって変性・凝集したタンパク質を除去した。得られた上清を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で一晩透析した。透析後、微量超遠心（１５０，０００ｇ、４℃、２０ｍｉｎ）を行い、得られた上清を陰イオン交換カラム RESOURSE Q（ＧＥヘルスケア社）６ｍｌを用いてＦＰＬＣによる精製を行った。緩衝液には２種類のｂｕｆｆｅｒＡ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）とｂｕｆｆｅｒＢ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１Ｍ ＮａＣｌ）を用いた。段階的なグラジェントを設定し、流速、フラクション容量などはマニュアル、カラム容量にあわせて設定し精製を行った。【００５１】
得られたピークのフラクションに対し、Ｌｏｗｒｙ法でタンパク質濃度測定を行った。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、精製度を確認した。精製度を確認後、ＭｉｌｉＱまたはＰＢＳ（８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、３７ｍＭ ＮａＣｌ、２.７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．３)で透析を行った。得られた試料をα-シヌクレインモノマーとした。【００５２】
（１−２）オリゴマーの調製
組み換え発現及び精製したα-シヌクレインを、ＭｉｌｉＱで透析し、透析後のα-シヌクレインを４〜６ｍｇずつ分注し、凍結乾燥を行った。その後、ＭｉｌｉＱを用いて３０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように凍結乾燥後試料を復水し、３０〜６０分間程度撹拌することで十分溶解させた後、再び凍結乾燥を行った。この試料を、ＰＢＳ緩衝液を用いて３０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように復水し、３０〜６０分間程度撹拌することで十分溶解させた。得られた試料をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０/３００ ｃｏｌｕｎｍ（ＧＥヘルスケア社）を用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行うことで精製した。バッファーはＰＢＳ緩衝液を用い、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで分離を行った。分離後、オリゴマーが含まれていると考えられるフラクションを回収し、限外ろ過フィルター（ＭＷＣＯ１００ｋＤａ）を用いて濃縮した。濃縮後、終濃度が０．０２％になるようにアジ化ナトリウムを加え、４℃で保存した。得られた試料をα-シヌクレインオリゴマー試料とした。【００５３】
（１−３）線維試料の調製
ＰＢＳ緩衝液中に１〜２ｍｇ/ｍｌになるように溶解させたα−シヌクレインモノマーを、３７℃で振とうさせながらインキュベートし、線維形成を促進させた。α-シヌクレインの線維試料は、アミロイド線維に結合する蛍光色素 Thioflavin T（ＴｆＴ）（シグマ社）の蛍光を指標に調製した。ＴｆＴの蛍光強度を測定しながらインキュベートし、ＴｆＴの蛍光が飽和したところでインキュベートを止めた。インキュベート試料を遠心（１０，０００ｇ、２０℃、１０ｍｉｎ）し、上清を回収した。
ペレットに４００μｌのＰＢＳ緩衝液を加え、ボルテックスしてよく撹拌した。その後、再度同じ条件で遠心を行い、同様にペレットを洗浄した。これを３回行い、最終的に得られたペレットを５０μｌのＰＢＳ緩衝液に懸濁した。これをα-シヌクレイン線維試料とした。回収した上清のタンパク質濃度を測ることで、線維試料のタンパク質濃度を算出し、α−シヌクレイン線維試料の濃度を算出した。
なお、線維試料は未精製のため、α−シヌクレインオリゴマーがわずかに混入していることが予想される。【００５４】
（２）  α−シヌクレインオリゴマー特異的アプタマーの調製
（２−１）オリゴヌクレオチドの合成
下記（ａ）〜（ｅ）に示すランダムライブラリおよびプライマー（配列番号１９〜２３）をそれぞれ設計し、各種オリゴヌクレオチドを合成した。ランダムライブラリおよびフォワードプライマーには５’末端にＦＩＴＣ配列（下記塩基配列中、「FITC」と表す。）を、リバースプライマーには３’末端にビオチン配列（下記塩基配列中、「Biotin」と表す。）を付加し、ＦＩＴＣまたはビオチンで修飾されたものをそれぞれ構築した。また、３’末端側プライマー領域の相補鎖については、５’末端にＦＩＴＣ修飾配列を有するものと未修飾のものをそれぞれ作製した。【００５５】
（ａ）ランダムライブラリ（配列番号１９）
５’-FITC-ATA CTG CCA TTC ATT TCA TTT (N24) TTT AGA TAT CAG CAT GTG TCA-３’
（ｂ）５’末端側プライマー領域の相補鎖（配列番号２０）
５’-TGA AAT GAA TGG CAG TAT-３’
（ｃ）３’末端側プライマー領域の相補鎖（配列番号２１）
５’-TGA CAC ATG CTG ATA TCT-３’
（ｄ）フォワードプライマー（配列番号２２）
５’-FITC-ATA CTG CCA TTC ATT TCA-３’
（ｅ）リバースプライマー（配列番号２３）
５’-TGA CAC ATG CTG ATA TCT-Biotin-３’【００５６】
（２−２）ゲルシフトアッセイを用いたスクリーニング（１,２ラウンド目）
得られたオリゴヌクレオチドを、ゲルシフトアッセイを用いてスクリーニングした。スクリーニングは、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の操作を繰り返し、全部で２回行った。
（ｉ）α-シヌクレインオリゴマーに結合するｓｓＤＮＡの選択とｓｓＤＮＡライブラリの結合確認
５’末端にＦＩＴＣが修飾されたＤＮＡライブラリとプライマー領域の相補鎖ＤＮＡを等モル量ずつ混合し、ＴＢＳ緩衝液 (１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ, １５０ｍＭ ＮａＣｌ, ５ｍＭ ＫＣｌ、 ｐＨ７．４)中でフォールディングさせた後、α-シヌクレインオリゴマーとＤＮＡを混合し、高速振とう機で撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。フォールディングは９５℃で３分間加熱した後、３０分間かけて２５℃まで温度を下げることで行った。
その後、この混合溶液を３% アガロースゲルを用いて、ＴＡＥ緩衝液中で電気泳動を行った。バリアブルイメージアナライザ Tyhoon8600（ＧＥヘルスケア社、以下同じ）でＦＩＴＣの蛍光を検出することにより、オリゴマーとＤＮＡの結合を確認した。その後、ゲルをＣＢＢ染色し、タンパク質の位置を確認した。【００５７】
（ii）α-シヌクレインオリゴマーに結合するｓｓＤＮＡの抽出
上記（ｉ）で用いたα-シヌクレインオリゴマーとＤＮＡの混合溶液を泳動したゲルに対して、アルコールで洗浄し炙ったカッターとピンセットを用いて、タンパク質部分のゲルを切り取り、回収した。
このゲルからMERmaid kit（Q-biogene社）を用いて、α−シヌクレインオリゴマーに結合したＤＮＡの抽出を行った。実験操作は通常のプロトコールに従って行った。最終的にＤＮＡを１×ＴＥバッファー(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ)に溶出させ、次のライブラリのテンプレートとした。【００５８】
（iii）抽出したｓｓＤＮＡの増幅
抽出されたｓｓＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＦＩＴＣ修飾５’プライマー（終濃度０．４μＭ）、ビオチン修飾３’プライマー（終濃度０．４μＭ）、ｄＮＴＰ（終濃度０．２ｍＭ）、５Ｕ／μｌのＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、５μｌのテンプレートＤＮＡを含んだＰＣＲ反応液１００μｌを３０本調製した。
サーマルサイクラーで、９５℃で３分加熱した後、９５℃で１分、５２℃で１分、７２℃で１分を１サイクルとし、３０サイクル繰り返した。各ＰＣＲ産物は、ＴＡＥバッファー中で３％アガロース２１ゲルを用いて電気泳動を行い、テンプレートとなるＤＮＡが増幅されていることを確認した。【００５９】
（iv）増幅したｄｓＤＮＡの一本鎖化
アビジン固定化アガロース１２０μｌを５倍量のColumnバッファー(３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０)で２回洗浄した。これに、ＰＣＲ産物に、その１／１０倍量の×５０ ＴＥバッファーおよび１／５倍量の５Ｍ ＮａＣｌを添加し、この溶液を洗浄したアビジン固定化アガロースに加え、３０分間インキュベートした。
インキュベート後、上清を取り除き、アガロースを５倍量のColumnバッファーで２回洗浄した後、アガロースの１．５倍量の０．１５Ｍ ＮａＯＨを加えて１０分間攪拌し、上清を回収した後、再びアガロースに同量の０．１５Ｍ ＮａＯＨを加えて１０分間攪拌し、ｓｓＤＮＡを溶出させ上清を回収した。ｓｓＤＮＡを含む上清を２Ｍ ＨＣｌで中和し、エタノール沈殿によりｓｓＤＮＡを回収した。
得られたペレットを６０μｌのＴＥバッファーで溶解し、分光光度計を用いて２６０ ｎｍの吸収を測定することで、ＤＮＡ濃度を算出した。尚、操作はすべて室温で行った。【００６０】
（２−３）アプタマーブロッティングを用いた競合スクリーニング（３, ４, ５ラウンド目）
以下の(ｖ)〜(viii)の操作を繰り返し、アプタマーブロッティングを用いた競合スクリーニングを全部で３ラウンド行った。
（ｖ）α-シヌクレインオリゴマーに結合するｓｓＤＮＡの選択
ニトロセルロース膜に調製した種々の量のα-シヌクレインモノマー、オリゴマー及び線維をそれぞれ固定化し、乾燥後、膜をＴＢＳ−Ｔ（２５ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５Ｍ ＫＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で調製した４％ スキムミルクと室温で１時間インキュベートすることでブロッキングを行った。
その後、十分量のＴＢＳ−Ｔを用いて膜を洗浄した（２ｍｉｎ×２回、１０ｍｉｎ×１回）。上記(ｉ)と同様に５’末端にＦＩＴＣが修飾されたＤＮＡライブラリをフォールディングし、ＤＮＡと膜と室温で１時間インキュベートした後に、十分量のＴＢＳ−Ｔを用いて膜を洗浄した（２ｍｉｎ×２回、１０ｍｉｎ×１回、５ｍｉｎ×２回）。【００６１】
（vi）α-シヌクレインオリゴマーに結合するｓｓＤＮＡの抽出
オリゴマーを固定化した部分のニトロセルロース膜を切り抜き、２００μｌの８Ｍ 尿素および６００μｌのフェノールクロロホルムを添加し、３分間攪拌した後に、３０分間室温で静置した。これにＭｉｌｌｉＱ１００μｌを加え、３分間攪拌し、遠心分離（１２０００ｒｐｍ, １０〜２０℃）して得られた上清を新しいエッペンに移した。更に、上清と同量のクロロホルムを加え、３分間攪拌した後に、遠心分離（１２０００ｒｐｍ, １０〜２０℃）し、上清を新しいエッペンに移し、この中に含まれるｓｓＤＮＡ分子をエタノール沈殿により回収した後に得られたペレットを３０μｌのＴＥバッファー(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ)で溶解した。【００６２】
（vii）抽出したｓｓＤＮＡの増幅
上記（iii）と同様に操作した。
（viii）増幅したｄｓＤＮＡの一本鎖化
上記（iv）と同様に操作した。【００６３】
（２−４）得られたライブラリの配列解析
上述の４ラウンド目または５ラウンド目のスクリーニングにおいて抽出したＤＮＡをテンプレートとし、未修飾のプライマーを用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を、３％アガロースゲルを用いてＴＡＥバッファー中で電気泳動した後、目的の大きさのバンドを切り出し、MERmaid kitを用いてゲル精製を行った。
精製後、試料をＴＡクローニングに用い、ｐＧＥＭ−Ｔとライゲーションさせた。ＴＡクローニングはｐＧＥＭ−Ｔ Vector Systemを用いて行った。精製したｓｓＤＮＡ溶液を３μｌ、５μｌRapid Ligation Buffer、１μｌのｐＧＥＭ−Ｔ Vector(５０ｎｇ)、1μｌのＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅを加え、全量１０μｌとなるように調製した後、室温で１時間ライゲーションを行った。【００６４】
ライゲーションサンプルを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、１時間振とう機で前培養した後、１００μｇ/ｍｌ Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ、４０μｇ/ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ培地プレートにプレーティングした。これを３７℃で本培養し、カラーセレクションによって目的のＤＮＡが挿入されているプラスミドを含むコロニーを選択した。
目的のプラスミドを含む大腸菌ＤＨ５αを１ｍｌのＬＢ液体培地（Ａｍｐ １００μｇ/ｍｌ）で培養した後、集菌し、アルカリ-ＳＤＳ法によりプラスミド抽出を行った。抽出したプラスミドを用いてシーケンス解析を行った。【００６５】
（２−５）アプタマーブロッティングによる結合アッセイ
α-シヌクレインモノマー、オリゴマー、線維１μｇをニトロセルロース膜に固定し、乾燥後、膜をＴＢＳ−Ｔ（２５ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５Ｍ ＫＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で調製した４％スキムミルクと室温で１時間インキュベートすることでブロッキングを行った。その後、十分量のＴＢＳ−Ｔを用いて膜を洗浄した（２ｍｉｎ×２回、１０ｍｉｎ×１回）。５’末端にＦＩＴＣが修飾された得られた複数のオリゴヌクレオチドを(ｆ.ｃ. １００ ｎＭ)をフォールディングし、ＤＮＡと膜とを室温で１時間インキュベートした後に、十分量のＴＢＳ−Ｔ を用いて膜を洗浄した（２ｍｉｎ×２回、１０ｍｉｎ×１回、５ｍｉｎ×２回）。その後、ＴＢＳ−Ｔ で１０００倍希釈したＨＲＰ修飾抗ＦＩＴＣ抗体と膜を室温で１時間インキュベートした後に、十分量のＴＢＳ−Ｔを用いて膜を洗浄した（２ｍｉｎ×２回、１０ｍｉｎ×１回、５ｍｉｎ×２回）。ＥＣＬ Plus Western blotting detection reagents（ＧＥへスルケア社）を膜に添加し、ＨＲＰの化学発光をＴｙｐｈｏｏｎ８６００で検出することにより、ＤＮＡとタンパク質の結合を観察した。
この結果を図１に示す。【００６６】
図１に示されるように、α−シヌクレインモノマーには結合せず、オリゴマーに強く結合する以下の８種のα−シヌクレインオリゴマー結合アプタマーが得られたことが確認できた。
Ｔ−ＳＯ５１７：GGTGGCTGGAGGGGGCGCGAACG（配列番号１）
Ｔ−ＳＯ６０６：GGGTCGGCTGTCCGTGGGTGGGGA（配列番号２）
Ｔ−ＳＯ５５４：CGAGGGGCGTCTGGGAGTGGTCGG（配列番号３）
Ｔ−ＳＯ５３０：GGTGCGGCGGGACTAGTGGGTGTG（配列番号４）
Ｔ−ＳＯ５５２：GCGTGTGGGGCTTGGGCAGCTGGG（配列番号５）
Ｔ−ＳＯ５０４：CAGGGGTGGGCAAAGGGCGGTGGTG（配列番号６）
Ｔ−ＳＯ５０８：GCCTGTGGTGTTGGGGCGGGTGCG（配列番号７）
Ｔ−ＳＯ６０２：GCGGTAGGGTGTGAGCGGAAGGGG（配列番号８）【００６７】
また、得られたα−シヌクレインオリゴマー結合アプタマーがＧカルテット構造を有することを、ＣＤスペクトルを用いて確認した。
即ち、アプタマーをＴＢＳバッファー(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ ７．４)で２０μＭに調製し、フォールディングした。その後、円二色性分散計Ｊ−７２０を用いてＣＤスペクトルを測定した。測定は温度２０℃、波長２００〜３２０ｎｍ、走査速度１００ｎｍ／ｍｉｎ、積算回数１０回の条件下で行なった。
この結果、２４０ｎｍ近傍の極小値と２６０ｎｍ近傍の極大値の存在により、上述のα−シヌクレインオリゴマー結合アプタマーがＧカルテット構造を有することがわかった。【００６８】
（３）α−シヌクレインオリゴマー結合アプタマーの特異性の確認
上記で得られた８種類のアプタマーのうち、Ｔ−ＳＯ５１７及びＴ−ＳＯ６０６と、抗α−シヌクレインオリゴマー抗体Ａ１１（Life technologies社）との結合性の比較を行った。
同じニトロセルロース膜上にＰＱＱを補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）（国際試薬社）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）（Polyscience社）、ルシフェラーゼ、ＩｇＧ抗体（シグマ社）を５ｐｍｏｌずつ、およびα−シヌクレインオリゴマーを０．５μｇ固定した膜を用いて、アプタマーブロッティング法により特異性の評価を行った。【００６９】
また、抗オリゴマー抗体Ａ１１を用いて同様に特異性について評価した。操作は通常のプロトコールに従って行った。尚、ルシフェラーゼは大腸菌を用いた組み換え生産により調製されたものを用いた。
この結果を図２に示す。なお、ＰＱＱＧＤＨ、ＣＲＰ、ルシフェラーゼ、ＩｇＧ抗体及びα−シヌクレインオリゴマーは、いずれもβ構造に富むタンパク質である。【００７０】
図２に示されるように、Ａ１１抗体は、α−シヌクレインオリゴマーだけでなく、β構造に富む他のタンパク質に対しても結合性を示すのに対して、実施例１で得られたＴ−ＳＯ５１７及びＴ−ＳＯ６０６は、他のタンパク質に対して結合性を示さず、α−シヌクレインオリゴマーに対する高い特異性が確認できた。【００７１】
（４）βアミロイドペプチドに対する結合性
上記で得られた８種のアプタマーのβアミロイドペプチドに対する結合性を、以下のようにして確認した。
（４−１）βアミロイドペプチドＡβ１−４０の調製
βアミロイドペプチドとして、Ａβ１−４０（Peptide Institute,Inc社）を使用した。
ヘキサフロロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）で終濃度２．５ｍｇ／ｍｌに溶解した１００μＬのＡβ１−４０溶液を、９００μＬのＭilliＱと混合し、室温で撹拌した後、遠心（１４，０００ｇ，室温，１５ｍｉｎ）して上清を回収した。上清にＡｒガスをバブリングした後、高速振とう機を用いて２４時間撹拌した（８００ｒｐｍ，室温）。その後試料を遠心（１４，０００ｇ，４℃，２０ｍｉｎ）し、回収した上清を限外ろ過フィルター（ＭＷＣＯ：１０ｋＤａ）で濃縮した。これをＡβ１−４０オリゴマー試料とした。
なお、Ａβ１−４０モノマー試料は、上記にて調製したＡβ１−４０溶液を直ちに使用したものとした。
Ａβ１−４０線維試料は、以下のようにして調製した。まず、Ａβ１−４０を、ＤＭＳＯに終濃度４．３３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解して、ストック溶液を作製した。これをＰＢＳで５０μＭに希釈し、９日間程度３７℃で撹拌した。その後、１４，０００Ｇ、４℃、２０分間遠心し、ペレットを回収した。ペレットに５００μＬのＰＢＳを加え撹拌・遠心する操作を２回繰り返し、ペレットを洗浄した。各操作で得られた上清の２８０ｎｍにおける吸光度を上記と同様にして測定することで、ペレットに残ったタンパク質量を算出した。その後、ペレットを、所望の濃度にＰＢＳで復水し、線維試料として実験に用いた。【００７２】
（４−２）アプタマーブロットアッセイ
１２．５ｐｍｏｌのＡβ１−４０モノマー・オリゴマー・線維を同一のニトロセルロース膜に固定化し、５００ｎＭの各アプタマーを用いてアプタマーブロッティングにより結合特異性を評価した。コントロールとしてＡ１１を用い、同様の実験を行なった。
Ａβ１−４０オリゴマー試料を３μＬ、２μＬ、１μＬ、０．５μＬずつ、また、α−Ｓｙｎオリゴマーを３００ｎｇ、２００ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎｇずつ、それぞれニトロセルロース膜に固定化し、Ａ１１を用いてドットブロッティングを行なった。
α−Ｓｙｎオリゴマーを固定化した箇所のスポット強度を解析し、検量線を作製することでＡβ１−４０オリゴマー試料に含まれるオリゴマー濃度を概算した。その後、Ａ１１のスポット強度が同程度になるようにＡβ１−４０オリゴマーをニトロセルロース膜に固定化し、５００ｎＭの各アプタマーを用いてアプタマーブロッティングを行なった。コントロールとしてＡ１１を用い、同様の実験を行った。
結果を図３に示す。【００７３】
図３に示されるように、実施例１で得られた８種のアミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーはいずれも、Ａβ１−４０オリゴマーを認識するが、Ａβ１−４０モノマー又は線維には結合性を示さなかった。【００７４】
このように、本実施例に係るアミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーは、α−シヌクレインオリゴマーや、Ａβ１−４０オリゴマーを特異的に認識するものであることがわかった。【００７５】
［実施例２］
＜ダイマー型アプタマーの結合性１＞
実施例１で得られたアプタマー、Ｔ−ＳＯ５０４の配列を、５ｍｅｒのチミジン（ｔ）ヌクレオチドで連結して、アプタマーダイマー（５０４Ｗ）を合成した。
また、比較対照として、Ｔ−ＳＯ５０４の塩基配列から５’末端側の３塩基及び３’ 末端側の８塩基を削除したポリヌクレオチド５０４Ｍ１（GGGTGGGCAAAGGG：配列番号２４）、Ｔ−ＳＯ５０４の塩基配列５’末端側の７塩基及び３’末端側の８塩基を削除したポリヌクレオチド５０４Ｍ２（GGGCAAAGGG：配列番号２５）も同様に合成した。【００７６】
また、各ポリヌクレオチドについて、抗ＦＩＴＣ抗体の結合における立体障害の緩和とグアニンによるＦＩＴＣの消光を防ぐため、５’末端側にアデノシン（ａ）ヌクレオチド（Ｔ−ＳＯ５０４についてはチミン（ｔ）ヌクレオチドを付加：ｔＴ−ＳＯ５０４）をそれぞれ５ｍｅｒ付加し、更にＦＩＴＣを修飾した。なお、５０４Ｍ１及び５０４Ｍ２には更に、多量体形成の防止のため、３’末端側に２ｍｅｒのアデノシンヌクレオチドを付加した。
得られた各アプタマーの配列を表１に示す。表１中、小文字アルファベット（ｔ又はａ）は上記の付加的な配列を意味する。【００７７】
【表１】
2012111842.tif 000003
【００７８】
各アプタマーのα−シヌクレインモノマー、α−シヌクレインオリゴマー及びα−シヌクレイン線維に対する結合性を、上述の実施例１（２−５）と同様にして行った。なお、用いたα−シヌクレインモノマー、α−シヌクレインオリゴマー及びα−シヌクレイン線維は実施例１で用いたものと同一のものを使用した。
この結果を図４に示す。【００７９】
図４に示されるように、実施例１で得られたＴ−ＳＯ５０４のダイマーである５０４Ｗは、Ｔ−ＳＯ５０４と同じ特異性を示すと共に、結合能が上昇した。
これに対して、Ｔ−ＳＯ５０４の塩基配列の一部を削除して二連続のグアノシンヌクレオチドが３つのみとなった５０４Ｍ１と、２つのみとなった５０４Ｍ２では、Ｔ−ＳＯ５０４の結合性を保持できなかった。【００８０】
［実施例３］
＜ダイマー型アプタマーの結合性２＞
（１）ダイマー型アプタマーの作製
実施例１で得られたアプタマーＴ−ＳＯ５３０の配列に対して、５ｍｅｒ又は１０ｍｅｒのチミンリンカーを介して直列に並べたダイマー（以下５Ｔ ｄｉｍｅｒ、１０Ｔ ｄｉｍｅｒと表記）を設計し、合成した。各アプタマーに対して、ＦＩＴＣを５’末端に抗原として連結して修飾し、ＦＩＴＣとアプタマーの間には５ｍｅｒのチミンをリンカーとして挿入した。各アプタマー配列を表２に示す。【００８１】
【表２】
2012111842.tif 000004
【００８２】
（２）ダイマー型アプタマーの結合能評価
作製した５Ｔ ｄｉｍｅｒ、１０Ｔ ｄｉｍｅｒ、及び元のアプタマーであるＴ−ＳＯ５３０のＡβオリゴマーに対する結合能を評価した。【００８３】
１μＭのＡβオリゴマー溶液又はＰＢＳバッファーを１００μＬずつＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ社）の各ウェルに加え、３７℃で１．５ｈインキュベートし、ウェル上へＡβオリゴマーを固定した。各ウェルに対して２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ溶液（ＴＢＳ−Ｔ：２５ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５Ｍ ＫＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）でブロッキングを行って、Ａβオリゴマー固定化プレートを作製した。【００８４】
Ａβオリゴマー固定化プレートの各ウェルに、１ｎＭ、２．５ｎＭ、又は１０ｎＭの濃度に調製した上記の各ＦＩＴＣ標識アプタマーを加え、室温で６０分インキュベートした。ウェルを洗浄後、ＨＲＰ修飾抗ＦＩＴＣ抗体（コスモバイオ社）をウェルに添加し、室温でインキュベートした。ウェルを洗浄後、ＨＲＰの発光基質を加え、化学発光により各アプタマーのオリゴマーへの結合を検出した。結果を図５に示す。
また、１０Ｔ ｄｉｍｅｒと元のアプタマーであるＴ−ＳＯ５３０の濃度を、１ｎＭ、２．５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、又は６０ｎＭとして、上記と同様にＡβオリゴマーへの結合実験を行った。得られた結合シグナルに基づき、グラフパッドプリズム（GraphPad Prism；エムデーエフ社）を用いてカーブフィッティングを行い、結合解離定数（Ｋｄ）を算出した。【００８５】
図５に示されるように、Ｔ−ＳＯ５３０では１０ｎＭからシグナルが確認できたのに対して、５Ｔ ｄｉｍｅｒでは１ｎＭから、１０Ｔ ｄｉｍｅｒでは２．５ｎＭから、それぞれシグナルが得られた。この結果から、ダイマー型のアプタマーでは、モノマー型のアプタマーよりも結合力が強いことがわかった。
また、結合解離定数（Ｋｄ）については、Ｔ−ＳＯ５３０のＫｄは９．０３±３．０６ｎＭであり、１０Ｔ ｄｉｍｅｒのＫｄは１．４４±０．６８ｎＭであった。ダイマー型のＫｄ値は元のアプタマーに比べて６分の１程度に低下していたことから、ダイマー型のアプタマーでは、向上した結合親和性を有することがわかった。【００８６】
（３）βアミロイドペプチドに対する結合性
上記で得られた５Ｔ ｄｉｍｅｒと１０Ｔ ｄｉｍｅｒのβアミロイドペプチドに対する結合性を、以下のようにして確認した。
（３−１）βアミロイドモノマーの調製
βアミロイドペプチドとして、Ａβ１−４０（Peptide Institute,Inc社）を使用した。これをヘキサフロロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）溶液に終濃度２．５ｍｇ／ｍｌに溶解してストック溶液を調製した。このストック溶液を、ＰＢＳで所望の濃度に希釈して、直ちに用いたものをＡβ１−４０モノマーとした。２８０ｎｍにおける吸光度を紫外可視分光解析システムＤＵ  ８００（ベックマンコールター社）、又はＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００（Thermo Fisher Scientific社）により測定することにより、タンパク質濃度を確認し、βアミロイドモノマーとして実験に用いた。【００８７】
（３−２）βアミロイドオリゴマーの調製
Ａβ１−４０オリゴマーは、実施例１と同様にして調製した。２８０ｎｍにおける吸光度を、モノマー試料と同様にして測定し、タンパク質濃度を確認して、βアミロイドオリゴマー試料として実験に用いた。【００８８】
（３−３）βアミロイド線維の調製
Ａβ１−４０を、ＤＭＳＯに終濃度４．３３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解して、ストック溶液を作製した。これをＰＢＳで５０μＭに希釈し、９日間程度３７℃で撹拌した。その後、１４，０００Ｇ、４℃、２０分間遠心し、ペレットを回収した。ペレットに５００μＬのＰＢＳを加え撹拌・遠心する操作を２回繰り返し、ペレットを洗浄した。各操作で得られた上清の２８０ｎｍにおける吸光度を上記と同様にして測定することで、ペレットに残ったタンパク質量を算出した。その後、ペレットを、所望の濃度にＰＢＳで復水し、線維試料として実験に用いた。【００８９】
（３−４）アプタマーブロットアッセイ
得られたＡβ１−４０のモノマー、オリゴマー、線維試料を０．５μｇずつニトロセルロース膜に固定し、乾燥後、膜をＴＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で調製した４％スキムミルクと室温で１時間インキュベートすることでブロッキングを行って、Ａβ１−４０の各試料が固定化されたブロットアッセイ用のニトロセルロース膜を得た。このニトロセルロース膜に対して、各アプタマー２００ｎＭを用いた以外は、実施例１の（２−５）と同様にして、ブロットアッセイを行った。
結果を図６に示す。
図６に示されるように、５Ｔ ｄｉｍｅｒと１０Ｔ ｄｉｍｅｒはいずれも、オリゴマーを固定した位置に強いスポットが確認できた。このことから、５Ｔ ｄｉｍｅｒと１０Ｔ ｄｉｍｅｒはいずれも、Ａβ１−４０のオリゴマーに対して高い選択性を示すことがわかった。【００９０】
［実施例４］
（１）  改良型配列の作製
上記実施例１で得られた８種類のアプタマーの配列を親配列として、一点交叉及び２塩基の変異導入を行なうことで第一世代のアプタマー配列を２４本作製した。
得られた第一世代の各アプタマー配列の３’側に、１８ｍｅｒの相補鎖形成領域を付加したＤＮＡを合成した。この相補鎖形成領域に相補的となる１８ｍｅｒのＤＮＡを合成し、その５’末端側にＦＩＴＣを常法により結合した標識化配列を作製し、相補鎖形成領域を介して、第一世代のアプタマー配列にＦＩＴＣを修飾した。得られた各ＦＩＴＣ標識アプタマーをそれぞれＴＢＳバッファーに添加して、ＦＩＴＣ標識アプタマー溶液を調製した。【００９１】
２μＭのＡβオリゴマー溶液又はＰＢＳバッファーを１００μＬずつＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ社）の各ウェルに加え、３７℃で１．５ｈインキュベートし、ウェル上へＡβオリゴマーを固定した。各ウェルに対して４％（ｗ／ｖ）のスキムミルクでブロッキングを行って、Ａβオリゴマー固定化プレートを作製した。【００９２】
Ａβオリゴマー固定化プレートの各ウェルに、最終濃度５００ｎＭに調製したＦＩＴＣ標識アプタマーを加え、室温で３０分インキュベートした。
ウェルを洗浄後、ＨＲＰ修飾抗ＦＩＴＣ抗体（コスモバイオ社）をウェルに添加し、室温でインキュベートした。ウェルを洗浄後、ＨＲＰの発光基質を加え、化学発光により各アプタマーのオリゴマーへの結合を検出し、比較した。各プレート間のシグナル強度の標準化には、親配列であるＴ−ＳＯ５０８アプタマー配列の３’側に相補鎖形成を介してＦＩＴＣを修飾したアプタマー（３’ＦＣ５０８）を用いた。
Ａβオリゴマーに対する結合能に基づいて、第一世代のアプタマーのうち、最も結合能が高い６本の配列を選択した。【００９３】
得られた６本の第一世代のアプタマー配列を親配列として、一点交叉及び２塩基の変異導入を行なうことで、第二世代のアプタマー配列を２４本作製した。
第二世代のアプタマー配列に対して、上記と同様にして、Ａβオリゴマーに対する結合能を検出し、比較した。第二世代のアプタマー配列の中で結合能の高かった４本の配列を選択した。最も高い結合能を示した第二世代のアプタマー配列は、親配列の結合能と比較して、８．６９倍の化学発光を示した。【００９４】
得られた４本の第二世代のアプタマー配列を親配列として、一点交叉及び２塩基の変異導入を行なうことで、第三世代のアプタマー配列を２４本作製した。
第三世代のアプタマー配列に対して、上記と同様にして、Ａβオリゴマーに対する結合能を検出し、比較した。最も高い結合能を示した第三世代のアプタマー配列は、親配列の結合能と比較して、２２．５５倍の化学発光を示した。【００９５】
上記のようにして、Ａβオリゴマーに結合性を有する以下のアプタマーを得た。
２Ｇ１６      ：CGAGGGGCGTCTGGGGGGGAGGGA（配列番号９）
２Ｇ４        ：CGGGGGGCGTGTGGGAGAGGTCGG（配列番号１０）
２Ｇ１３      ：TGGGGGGCGTAGGGTCGCGAACGA（配列番号１１）
２Ｇ９        ：CGGGGGGCGTAGGGGAGAGGGGCG（配列番号１２）
３Ｇ４        ：CGGGGGGCCTGAGGGGGGGAGGGA（配列番号１３）
３Ｇ２１      ：CGGGGCGCATCTGGGGGGGAGGGA（配列番号１４）
３Ｇ１６      ：CGGGGGGCTTGTGGCGGGGAGGGA（配列番号１５）
３Ｇ２２      ：CGAGGGGAGTAGGGGGGAGGGGCG（配列番号１６）
３Ｇ１４      ：CGGGGGGCGTCTGGGCGCGAGGGA（配列番号１７）
３Ｇ９        ：CGGGGGCCGTTGGGGGGGGAGGGA（配列番号１８）【００９６】
（２）結合能評価
上記（１）で得られたアプタマーのうち、２Ｇ１６及び３Ｇ４と、親配列から得たアプタマー３’ＦＣ５０８について、結合能を評価した。
具体的には、各アプタマーの濃度を、１ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、又は２００ｎＭとして、上記（１）と同様にＡβオリゴマーに対する結合能を確認した。得られた結合シグナルに基づき、グラフパッドプリズム（GraphPad Prism；エムデーエフ社）を用いてカーブフィッティングを行い、結合解離定数（Ｋｄ）を算出した。結果を図７に示す。図７中の各シンボルにおいて、菱形は３’ＦＣ５０８を示し、四角は２Ｇ１６を示し、三角は３Ｇ４を示す。
その結果、３’ＦＣ５０８のＫｄは６７．７４ｎＭ、２Ｇ１６のＫｄは６７．１０ｎＭ、及び３Ｇ４のＫｄは７０．７５ｎＭであり、いずれのＫｄも７０ｎＭ程度と、結合解離定数に相違は見られなかった。【００９７】
（３）アプタマーの構造解析
上記（１）で得られたアプタマー、アプタマー３’ＦＣ５０８、２Ｇ１６、３Ｇ４の各構造を、１５質量％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により解析した。１５質量％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（ＷＡＫＯ）に、上記（１）で得られたＦＩＴＣ修飾された各アプタマー３’ＦＣ５０８、２Ｇ１６、３Ｇ４をアプライし、ＴＢＥバッファー中で電気泳動を行なった。その後、ＦＩＴＣの蛍光を観察することで各アプタマーの泳動位置を確認した。
ＰＡＧＥ解析の結果を図８に示す。図８において各レーンは、左からラダー、アプタマー３’ＦＣ５０８、２Ｇ１６、３Ｇ４を示す。
図８に示されるように、アプタマー２Ｇ１６及び３Ｇ４はいずれも、５０ｂｐ付近のバンドに加えて、１０００ｂｐと推測される泳動位置に複数のバンドが検出された。このことから、２Ｇ１６及び３Ｇ４は、単量体の形態を取るほか、それぞれのアプタマー配列が十数個以上集まって形成された多量体の形態も取ることがわかった。
また、上述した条件下でのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ法により、多量体化し、且つ、結合するアプタマーが得られることがわかった。【００９８】
（４）βアミロイドペプチドに対する結合性
上記で得られた２Ｇ１６と３Ｇ４のβアミロイドペプチドに対する結合性を確認した。
βアミロイドモノマー、オリゴマー、線維の各試料は、実施例３（３）で得られたものを使用した。
２Ｇ１６と３Ｇ４の各アプタマーを２００ｎＭの濃度で使用した以外は、実施例３（３）と同様にブロットアッセイを行った。結果を図９に示す。
図９に示されるように、２Ｇ１６と３Ｇ４は、いずれもオリゴマー及び線維を固定した位置にスポットが確認でき、特に、オリゴマーを固定した位置に強いスポットが確認できた。これに対して、いずれのアプタマーについても、モノマーを固定した位置にはスポットが確認できなかった。このことは、２Ｇ１６と３Ｇ４はいずれも、Ａβ１−４０のモノマーに対してオリゴマーと特異的に認識することがわかった。【００９９】
従って、本発明のアミロイドタンパク質オリゴマー結合アプタマーは、アミロイドタンパク質オリゴマーを特異的に認識することができる。【０１００】
２０１１年２月１８日に出願された日本国特許出願第２０１１−０３３９９８号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。
【図１】
2012111842.tif 000005
【図２】
2012111842.tif 000006
【図３】
2012111842.tif 000007
【図４】
2012111842.tif 000008
【図５】
2012111842.tif 000009
【図６】
2012111842.tif 000010
【図７】
2012111842.tif 000011
【図８】
2012111842.tif 000012
【図９】
2012111842.tif 000013
【配列表】
2012111842000001.app
【国際調査報告】
2012111842.tif 000014
2012111842.tif 000015
2012111842.tif 000016
2012111842.tif 000017