(57)【要約】【課題】補助受容体として機能するCXCR4をブロックしてX4ウイルスの感染を阻止する物質を提供するとともに、X4ウイルスのみならずR5ウイルスにも有効なヒト免疫不全ウイルス感染阻害物質を提供し、ヒト免疫不全症候群の発症を有効に阻止することにある。【解決手段】ヒト免疫不全ウイルスの標的細胞への感染を阻害する阻害物質に関する。  この阻害物質は、標的細胞に発現するα-ケモカイン受容体に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。  このα-ケモカイン受容体はCXCR4であり、阻害物質であるモノクローナル抗体は抗CXCR4モノクローナル抗体である。
2012160678.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫不全ウイルスの標的細胞への感染を阻害する阻害物質であって、
該阻害物質は、前記標的細胞に発現するα-ケモカイン受容体に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体であることを特徴とするヒト免疫不全ウイルス感染阻害物質。
【請求項２】
前記α-ケモカイン受容体はCXCR4であり、前記阻害物質である前記モノクローナル抗体は抗CXCR4モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１に記載のヒト免疫不全ウイルス感染阻害物質。
【請求項３】
前記阻害物質は、前記ヒト免疫不全ウイルスのうち、前記標的細胞に発現するβ-ケモカイン受容体CCR5を補助受容体として利用するHIV-1 R5ウイルス、前記標的細胞に発現するα-ケモカイン受容体CXCR4を補助受容体として利用するHIV-1 X4ウイルス、前記標的細胞に発現するβ-ケモカイン受容体CCR5及びα-ケモカイン受容体CXCR4の双方を補助受容体として利用するHIV-1 R5X4ウイルス、全ての感染を阻害することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のヒト免疫不全ウイルス感染阻害物質。
【請求項４】
前記α-ケモカイン受容体はCXCR4であるとともに、前記阻害物質である前記モノクローナル抗体は抗CXCR4モノクローナル抗体であり、
前記抗CXCR4モノクローナル抗体は、前記標的細胞表面より外側へ突出している前記CXCR4の複数のループドメインのうち、少なくとも第１ループドメイン及び第２ループドメインの一方を有する三次元エピトープを認識する抗体、若しくは、第３ループドメインを有する三次元エピトープを認識する抗体であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のヒト免疫不全ウイルス感染阻害物質。
【請求項５】
前記α-ケモカイン受容体はCXCR4であるとともに、前記阻害物質である前記モノクローナル抗体は抗CXCR4モノクローナル抗体であり、
前記抗CXCR4モノクローナル抗体は、前記標的細胞表面より外側へ突出している前記CXCR4の複数のループドメインのうち、少なくとも第１ループドメイン及び第２ループドメインの一方を有する三次元エピトープを認識する抗体であり、
前記抗CXCR4モノクローナル抗体は、前記CXCR4に結合することにより、前記標的細胞に発現するα-ケモカイン受容体CXCR4を補助受容体として利用するHIV-1 X4ウイルスの前記CXCR4への結合を阻害することにより、前記HIV-1
X4ウイルスの感染を阻止するとともに、前記抗CXCR4モノクローナル抗体の前記CXCR4への結合により誘起されるβ-ケモカインにより、前記標的細胞に発現するβ-ケモカイン受容体CCR5がダウンモデュレーションされた結果、前記β-ケモカイン受容体CCR5を補助受容体として利用するHIV-1 R5ウイルスの感染を阻止することを特徴とする請求項１乃至請求項３いずれか一項に記載のヒト免疫不全ウイルス感染阻害物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス感染阻害物質に関し、特に、ヒト免疫不全ウイルスの感染増殖を阻害することによりAIDS発症を防止することが可能なヒト免疫不全ウイルス感染阻害物質に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトに感染するウイルスによって様々な感染症が引き起こされることは従来より知られており、この感染症の撲滅は世界平和を実現するための世界共通課題の一つである。
このようなウイルス感染症の一種である後天性免疫不全症候群（エイズ；AIDS）は、ヒト免疫不全ウイルス（以下、「HIVウイルス」と記す）の感染によるものである。
これは、ヘルパーＴ細胞が破壊された結果、免疫能力が極端に低下することにより、他の病原体に日和見感染することが原因で罹患する疾病である。
なお、HIVには、ウイルスの起源によりHIV-1とHIV-2の２つのタイプが存在する。【０００３】
HIV-1ウイルスが増殖するとともに細胞死を誘導する細胞が、主としてCD4陽性のTリンパ球やマクロファージであることから、このHIV-1ウイルスの主要な受容体がCD4分子であることは、従来より知られている。
これは、CD4分子の対するモノクローナル抗体が感染を阻害することや、CD4を発現していないヒト上皮系細胞にCD4を発現させることにより感染が成立することなどから検証されている。
しかし、CD4を強制発現させても、完全に感染が成立するわけではないことから、CD4は主要な受容体ではあっても、これのみでは完全に感染が起こるわけではなく、何らかの要因が必要であることがわかっていた。【０００４】
このような状況下、HIV-1ウイルスの感染においては、受容体としてのCD4必要であるとともに、補助受容体として、CXCR4とCCR5が関与していることがわかった。
CXCR4及びCCR5は、白血球遊走活性を有するたんぱく質であるケモカイン（chemokine）の受容体である。
このケモカイン受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体（GPCR）であり、一般的には、ホモオリゴマー若しくはヘテロオリゴマーとして細胞表面に存在する。【０００５】
HIV-1ウイルスは、自己のエンベロープスパイクであるgp120を、感染標的細胞表面の受容体CD4に結合させることにより感染標的細胞表面に連結する。
次いで、gp120の立体構造を変化させることにより、gp120を補助受容体（CXCR4又は／及びCCR5）に結合させる。
そして、この状態で、gp41のＮ末端に存在するフュージョンペプチドを細胞の脂質二重膜に突き刺す。
次いで、gp41の２個のα―ヘリックス構造がお互いに反応することにより、ヘアピン構造がとられ、HIV-1ウイルスは細胞表面に近接していく。
最終的には、膜融合が起こり、HIV-1ウイルスは自身のゲノムを細胞内に侵入させて感染が実行される。【０００６】
一方、HIV-1ウイルスには、CD4陽性の抹消血リンパ球とマクロファージで増殖可能なウイルス（マクロファージ指向性HIV-1ウイルス）と、CD4陽性のＴリンパ球とT細胞株で増殖可能なウイルス（T細胞株指向性HIV-1ウイルス）とが存在している。
そして、マクロファージ指向性HIV-1ウイルスは、CCR5分子を補助受容体として必要とすることが検証されているとともに、T細胞株指向性HIV-1ウイルスは、CXCR4を補助受容体として必要とすることが検証されている。
なお、このような補助受容体の利用能力により、HIV-1ウイルスを分類することもあり、補助受容体としてCCR5を利用するHIV-1ウイルスはR5ウイルスと命名されており、補助受容体としてCXCR4を利用するHIV-1ウイルスはX4ウイルスと命名されている。
また、補助受容体としてCCR5及びCXCR4の双方を利用するものは、R5X4ウイルスと命名されている。【０００７】
このように、HIV-1ウイルスは、感染のために補助受容体を使用するのであるから、これらの補助受容体にHIV-1ウイルスが結合する前に、補助受容体をブロックすることにより、HIV-1ウイルスの感染を阻害することができることが示唆される。
実際、R5ウイルスの感染は、CCR5の正常リガンドのケモカインであるMIP-1α、MIP-1β、RANTES等で阻害され、X4ウイルスの感染は、CXCR4の正常リガンドのケモカインであるSDF-1αで阻害される。
以上の知見により、CCR5及び／又はCXCR4へのHIV-1ウイルスの結合を阻害して、HIV-1ウイルス感染を阻害する技術が開発されている（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−１８８４４５号公報
【特許文献２】特表２００６−５０３８４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような知見の元、多剤併用療法に変わる新たな治療薬として、ケモカイン受容体阻害剤が開発されている。
例えば、CCR5阻害剤としては、「Maraviroc」や「Vicriviroc」が例示される。
しかし、CXCR4阻害剤として開発された「AMD3100」は、一部の患者に重篤な副作用が認められたことからHIV-1ウイルス感染阻害剤としての臨床は打ち切られている（他の疾病用の薬剤としては使用されている）。【００１０】
このような状況下、感染に補助受容体としてCXCR4を利用するX4ウイルスに対して有効に感染を阻止する物質の開発が早急に望まれており、また、更に、CCR5及びCXCR4双方への結合を阻害することが可能であり、感染に補助受容体としてCCR5を利用するR5ウイルスにも併せて効果を有する物質の開発が望まれていた。【００１１】
このような状況下、発明者らは鋭意研究を重ね、ある種のCXCケモカイン受容体抗体を(α-ケモカイン受容体抗体)を用いることによって、X4ウイルスの感染のみならず、R5ウイルスの感染もまた阻害することが可能であるという知見を得た。
つまり、CXCケモカイン受容体抗体であるAnti-CXCR4 ECL 3抗体（以下、単に「A80抗体」と記載）、Anti-CXCR4 ECL 2抗体であるMAB171抗体，MAB172抗体，MAB173抗体が、CXCR4をブロックしてX4ウイルスの結合を阻害するだけではなく、これらの抗体がR5ウイルスの感染もまた阻害するという知見を得たものである。
また、特に、CXCケモカイン受容体抗体であるAnti-CXCR4 ECL 1&2抗体（以下、単に「A120抗体」と記載）が、CXCR4をブロックしてX4ウイルスの結合を顕著に阻害するだけではなく、このA120抗体がR5ウイルスの感染もまた顕著に阻害するという知見を同時に得たものである。【００１２】
本発明の目的は、上記課題に鑑み、補助受容体として機能するCXCR4をブロックしてX4ウイルスの感染を阻止する物質を提供するとともに、X4ウイルスのみならずR5ウイルスにも有効なヒト免疫不全ウイルス感染阻害物質を提供し、ヒト免疫不全症候群の発症を有効に阻止することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題は、本発明によれば、ヒト免疫不全ウイルスの標的細胞への感染を阻害する阻害物質を提供することにより解決される。
この阻害物質は、前記標的細胞に発現するα-ケモカイン受容体に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。
また、前記α-ケモカイン受容体はCXCR4であり、前記阻害物質である前記モノクローナル抗体は抗CXCR4モノクローナル抗体である。
なお、このα-ケモカイン受容体CXCR4は、α-ケモカイン（CXCケモカイン）であるSDF-1α/β、I-TACの受容体である。【００１４】
更に、前記阻害物質は、前記ヒト免疫不全ウイルスのうち、前記標的細胞に発現するβ-ケモカイン受容体CCR5を補助受容体として利用するHIV-1 R5ウイルス、前記標的細胞に発現するα-ケモカイン受容体CXCR4を補助受容体として利用するHIV-1 X4ウイルス、前記標的細胞に発現するβ-ケモカイン受容体CCR5及びα-ケモカイン受容体CXCR4の双方を補助受容体として利用するHIV-1 R5X4ウイルス、全ての感染を阻害する。【００１５】
そして、前記α-ケモカイン受容体はCXCR4であるとともに、前記阻害物質である前記モノクローナル抗体は抗CXCR4モノクローナル抗体であり、前記抗CXCR4モノクローナル抗体は、前記標的細胞表面より外側へ突出している前記CXCR4の複数のループドメインのうち、少なくとも第１ループドメイン及び第２ループドメインの一方を有する三次元エピトープを認識する抗体、若しくは、第３ループドメインを有する三次元エピトープを認識する抗体である。
なお、少なくとも第１ループドメイン及び第２ループドメインの一方を有する三次元エピトープを認識する抗体とは、第１ループドメイン又は第２ループドメインの一方を認識する抗体、第１ループドメイン及び第２ループドメイン双方を認識する抗体を含み、このCXCR4の複数のループドメインうち、第１ループドメイン及び第２ループドメイン双方を有する三次元エピトープを認識する抗体が、本明細書中の「A120抗体」（Anti-CXCR4 ECL 1&2抗体）若しくは12G5抗体であり、第３ループドメインを有する三次元エピトープを認識する抗体が、本明細書中の「A80抗体」（Anti-CXCR4 ECL 3抗体）である。
また、第２ループドメインを有する三次元エピトープを認識する抗体は、MAB171抗体，MAB172抗体，MAB173抗体である。【００１６】
また、前記α-ケモカイン受容体はCXCR4であるとともに、前記阻害物質である前記モノクローナル抗体は抗CXCR4モノクローナル抗体であり、前記抗CXCR4モノクローナル抗体は、前記標的細胞表面より外側へ突出している前記CXCR4の複数のループドメインのうち、少なくとも第１ループドメイン及び第２ループドメインの一方を有する三次元エピトープを認識する抗体であり、前記抗CXCR4モノクローナル抗体は、前記CXCR4に結合することにより、前記標的細胞に発現するα-ケモカイン受容体CXCR4を補助受容体として利用するHIV-1 X4ウイルスの前記CXCR4への結合を阻害することにより、前記HIV-1 X4ウイルスの感染を阻止するとともに、前記抗CXCR4モノクローナル抗体の前記CXCR4への結合により誘起されるβ-ケモカインにより、前記標的細胞に発現するβ-ケモカイン受容体CCR5をダウンモデュレーションさせ、結果としてこのCCR5を補助受容体として利用するHIV-1 R5ウイルスの感染を阻止する。
なお、前述のとおり、少なくとも第１ループドメイン及び第２ループドメインの一方を有する三次元エピトープを認識する抗体とは、第１ループドメイン又は第２ループドメインの一方を認識する抗体、第１ループドメイン及び第２ループドメイン双方を認識する抗体を含む。
つまり、A120抗体を筆頭に、前段落に例示した各抗体は、HIV-1 X4ウイルス及びHIV-1 R5ウイルス双方の感染を有効に阻止する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係るヒト免疫不全ウイルス感染阻害物質は、HIV-1ウイルスの補助受容体であるCXCR４をブロックすることにより、X4ウイルスの感染を有効に阻止できる。
また、ヒト免疫不全ウイルス感染阻害物質の中でも、標的細胞表面より外側へ突出しているCXCR4の複数のループドメインのうち、第１ループドメイン及び第２ループドメインを有する三次元エピトープを認識する抗体であるA120抗体は、CXCR4に結合することによりダウンモデュレーションを誘起して、R5ウイルスの感染も同時に阻止することができる。
このように、本発明に係るヒト免疫不全ウイルス感染阻害物質は、X4ウイルスのみならず、R5ウイルスの感染も同時に阻止することができる。
よって、特に、X4ウイルス及びR5ウイルスの感染によるヒト免疫不全症候群の発症を有効に防止することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】X4ウイルスの感染についての模式図である。
【図２】PBMC（抹消血単核球）の活性化とHIV-1の感染スキームを示す流れ図である。
【図３】活性化PBMC（一次）へのＲ5ウイルス及びX4ウイルスの感染に対する抗CXCR4モノクローナル抗体の効果を示すグラフである。
【図４】A120モノクローナル抗体のX4ウイルス及びR５ウイルス感染抑制効果を示すグラフである。
【図５】関連性のない複数のドナー由来の活性化PBMCに対するA120モノクローナル抗体のHIV-1生成抑制効果を示すグラフである。
【図６】活性化PBMCでのR5ウイルス及びX4ウイルス抑制効果におけるA120モノクローナル抗体の濃度依存性を示すグラフである。
【図７】HIV-1産生細胞株及びHTLV-1産生細胞株に対するA120モノクローナル抗体の影響を示すグラフである。
【図８】活性化PBMCにおけるA120モノクローナル抗体によるCCR５結合性β−ケモカイン産生の増加を示すグラフである。
【図９】A120モノクローナル抗体添加によるCCR５結合性β−ケモカイン産生の誘導とCCR発現のダウンモデュレーションを示すグラフである。
【図１０】A120モノクローナル抗体添加によるCCR５結合性β−ケモカイン産生の誘導とCCR発現のダウンモデュレーションを示すヒストグラムである。
【図１１】A120モノクローナル抗体添加によるCCR５結合性β−ケモカイン産生の誘導とCCR発現のダウンモデュレーションを示すヒストグラムである。
【図１２】Ｔ細胞と単核球におけるA120モノクローナル抗体の刺激によるβ-ケモカイン産生を示すグラフである。
【図１３】様々なHIV-１株種に対するA120モノクローナル抗体の感染抑制効果を示すグラフである。
【図１４】活性化PBMC（一次）へのＲ5ウイルス及びX4ウイルスの感染に対する抗CXCR4モノクローナル抗体の効果を示すグラフである。
【図１５】活性化PBMCにおけるA120モノクローナル抗体及びMAB173モノクローナル抗体によるCCR５結合性β−ケモカイン産生の増加を示すグラフである。
【図１６】A120モノクローナル抗体のX4ウイルス及びR５ウイルス感染阻害メカニズムを示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の一実施形態について説明する。
なお、以下に説明する部材、配置等は、本発明を限定するものではなく、本発明の趣旨に沿って各種改変することができることは勿論である。
【００２０】
以下に、実験系及び結果について説明する。
図１に、X4ウイルスの感染についての模式図を示す。
上述したように、X4ウイルスが細胞に感染する際には、そのエンベロープスパイクであるgp120を細胞表面の受容体CD4に結合させることが必要であるとともに、そのgp120の立体構造を変化させることにより、gp120を補助受容体であるCXCR4に結合させることが必要である。
補助受容体として作用するCXCR4は、ケモカイン受容体であるが、このCXCR4は、細胞表面に、複数のループドメインを突出させた状態で存在することが知られている。
【００２１】
発明者らは、この中で、第３ループドメインを有する三次元エピトープを認識する抗体であるA80（クローン）、第３ループドメインを有する三次元エピトープを認識する抗体であるMAB171,MAB172,MAB173が特異的性質を有することを見出し、これらのモノクローナル抗体とCXCR4との連結体が、X4ウイルスの活性化PBMC（末梢血単核球）への感染を阻害するのみではなく、R5ウイルスの活性化PBMCへの感染をもまた阻害することを確認した（in vitro）。
また、この中で特に、第１ループドメイン及び第２ループドメインを有する三次元エピトープを認識する抗体であるA120（クローン）が特異的性質を顕著に有することを見出し、このA120とCXCR4との連結体が、X4ウイルスの活性化PBMC（末梢血単核球）への感染を阻害するのみではなく、R5ウイルスの活性化PBMCへの感染をもまた大きく阻害することを確認した（in vitro）。
以下、その検証を示す。
【００２２】
１．使用試薬及び方法等
（１）培地
RPMI 1640培地(Sigma-Aldrich.Inc.St.Louis,MO)に、10%ウシ胎児血清(FCS)100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを加えて調整した（以下、単に「RPMI培地」と記す）。
抗ヒトCD3(clone OKT-3)及び抗CD28(clone 28.2)は、それぞれAmerican Type Culture Collection(Rockville,MD)及びBioLegend(SanDiego,CA)のものである。
【００２３】
（２）抗体等
抗CXCR4モノクローナル抗体のクローンは、当研究室のWKAラットを免疫して作成した。
A145クローン（IgG1）、A120クローン（IgG2b）、A80クローン（IgG1）も同様である。
これらの構造及び作成方法の詳細は、文献１「Uniqe monoclonal antibody recognizing the third extracellular loop of CXCR4 induces lymphocyte agglutination and enhances human immunodeficiency virus type 1-mediated syncytium formation and productive infection」Journal of virology 2001;75(23):11534-11543 Prepublished on 2001/11/02 as DOI 10.1128/JVI.75.23.11534-11543.2001,Tanaka R,Yoshida A,Murakami T,et al.参照のこと。
また、これらのモノクローナル抗体によって認識されるエピトープの解析も、上記文献１参照のこと。
なお、12Ｇ5モノクローナル抗体、MAB171モノクローナル抗体、MAB172モノクローナル抗体、MAB173モノクローナル抗体は、R&Dより購入した。
【００２４】
使用したラットIgGアイソタイプコントロールは、IgG2b anti-HTLV-1 gp46(LAT-27クローン)とIgG1 anti-HCV envelope2(Mo-8クローン)である。
これについての詳細は、文献２「New monoclonal antibodies against a recombinant second envelope protein of Hepatitis C virus」Microbiol Immunol 1988;42(12):875-877. Prepublished on 1999/02/26 as DOI,Inudoh M,Kato N,Tanaka Y参照のこと。
ラット抗ヒトＣＣＲ５モノクローナル抗体は、T312 rat IgG1クローン由来のものであり、詳細は、上記文献１参照のこと。
【００２５】
これらのモノクローナル抗体は、CB.17-SCIDマウス腹水の硫酸アンモニウム沈殿、Superdex G200(GE)でのゲルろ過を行うことにより精製した。
これらの抗体の調整は、polymixin B columnを通すことにより行い、リポ多糖(LPS)の混入は、LAL法により確認し、リポ多糖(LPS)の濃度は検出下限界外であることが確認された。
【００２６】
IgGの一部は、既存の標識キットを取扱説明書に沿って使用し、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647(Invitrogen)、Cy5(GE)、horseradishperoxidaseによって標識した（Dojin,Kumamoto,Japan）。
FITC（フルオロセインイソチアネート）標識若しくはPE（フィコエリトリン）標識抗ヒトCD4、CD8、CD14、CD19モノクローナル抗体は、Beckman-Coulter若しくはBioLegendより購入した。
【００２７】
使用した抗HIV-1 P24モノクローナル抗体は、発明者の研究室で作成した。
詳細は、文献３「Suppression of CCR5-tropic HIV type 1 infection by OX40 stimulation via enhanced production of beta-chemokines」AIDS research and human retroviruses 2010;26(10):1147-1154 Prepublished on 2010/09/22 as DOI 10.1089/aid.2010.0043,Tanaka R,Takahashi Y,Kodama A,Saito M,Ansari AA,Tanaka Y参照のこと。
【００２８】
抗ヒトCD4、CD8、CD14、CD19モノクローナル抗体を抱合したマグネットビーズは、Dynalandより購入し、取扱説明書に沿って使用した。
12G5を含有する低エンドトキシンマウス抗CXCR4モノクローナル抗体は、BioLegend and R&Dより購入した。
【００２９】
（３）HIV調整
HIV-1(JR-FL)、HIV-1(JR-CSF)、HIV-1(NL4-3)は、リン酸カルシウム法により、HIV-1感染性プラスミドＤＮＡを有する293T細胞のトランスフェクションにより作成した。
詳細は、文献４「Induction of protective immune responses against R5 human immunodeficiency virus type 1(HIV-1) infection in hu-PBL-SCID
mice by intrasplenic immunization with HIV-1-pulsed dendritic cells:possible involvement of novel factor of human CD4(+)T-cell origin」Journal of virology 2003;77(16):8719-8728 Prepublished on 2003/07/30 as DOI,Yoshida A,Tanaka R,Murakami T et al.参照のこと。
【００３０】
遺伝子導入細胞は、RPMI培地にて４日間培養した（in vitro）。上清を回収し、ウイルス力価を決定した。詳細は、上記文献４参照。
HIV−1（IIIB）は、Molt-4/III cell lineで作成し、培養上清は回収して使用した。
その他のHIV-1は、HIV subtype infectivity panel PRD320(BBI Diagnostics,West Bridgewater,MA,USA)から得たものである。
HIV-1は、使用するまで、−80℃で保存した。
【００３１】
（４）PBMC（末梢血単核球）の活性化とHIV-1の感染
健康なドナーから採取されたPBMC（末梢血単核球）を活性化した。詳細は、上記文献３参照のこと。
簡単なスキームを図２に示す。
【００３２】
以下、簡略に説明する。
密度勾配遠心（HistoPAQUE-1077:Sigma-Aldrich）によって得られたPBMCをRPMI培地に懸濁させ（濃度：2×106cells/ml）、OKT3（濃度：5μg/ml）でプレコートした1ml/wellのプレート（24well:BD）に分注して、0.1μg/mlの抗CD28モノクローナル抗体の存在下２４時間培養した（５％炭酸ガス雰囲気下）。
【００３３】
活性化PBMCを回収して一度洗浄し、HIV-1クローン（感染多重度0.005〜0.01m.o.i.）又は一次分離物（細胞数2×106に対してp24が10ng）を感染させた（2時間）。
次いで三回洗浄し、20Uml IL-2を含有するRPMI培地に再度懸濁させ（濃度：1×106cells/ml）、0.5ml/wellのプレート（48well:BD）に分注して、様々な濃度の抗CXCR4モノクローナル抗体の存在又は非存在下及びコントロールを培養した。
【００３４】
選択実験としては、抗CD3/CD28抗体（1day）を感作した活性化PBMCを、20Uml IL-2を含有するRPMI培地にて、A120モノクローナル抗体の存在下又は非存在下、24時間培養し（濃度：1×106cells/ml）、β-ケモカインの量をELISAにより定量した。
HIV-1の増殖は、培養液上清中に生成されたHIV-1 core p24を、抗HIV-1 P24モノクローナル抗体との結合を利用したキャプチャーELISAにより定量ことにより同定した。なお、スタンダードとして組換え型HIV-1 P24蛋白（Bio Academia,Canada）を使用した。
ヒトβ-ケモカインに適用するELISAキットは、Biosource(Camerillo)若しくはBiolegendより購入した。
【００３５】
（５）フローサイトメトリー（Flow Cytometry：以下、単に「FCM」と記す）
生細胞のFCM分析についての詳細は、上記文献３参照のこと。
以下、簡略に説明する。
分析を行う細胞は、2mg/mlのヒトIgGでFc受容体をブロックし（氷冷15分）、これらの細胞の一定量を、モノクローナル抗体と結合した蛍光染料（予め決定した濃度）で染色した（氷冷30分）。
細胞は、FACS緩衝液（2%FCSと0.1%アジ化ナトリウムを含むPBS）で洗浄して、FACS緩衝液中の1％パラホルムアルデヒド（以下、単に「PFA」と記す）で固定し、FACS Caliburを使用して分析した。
【００３６】
得た分析データは、Cell Quest softwear（BD）で解析した。
HIV-1感染細胞を検出するために、細胞を4%のPFAを含むPBSで固定し（室温5分）、0.1%のサポニンを含むFACS緩衝液で洗浄した。
これらの細胞は、2mg/mlのヒトIgGでFc受容体をブロックし（氷冷15分）、これらの細胞の一定量を、抗HIV-1 p24モノクローナル抗体（クローン2C2）と結合したAlexa Fluor 488で染色した（氷冷30分）。
細胞は、FACS緩衝液で洗浄し、p24+細胞の細胞頻度分布と絶対数を、細胞計測キット（BD）を使用してFCMによりマニュアルに沿って計測した。
【００３７】
（６）統計解析
データは、Prism software(Graph Pad)を使用し、スチューデントt検定により有意差の有無を解析した。
【００３８】
２．実験及び結果
（１）活性化PBMC（一次）へのＲ5ウイルス及びX4ウイルスの感染に対する抗CXCR4モノクローナル抗体の効果
研究室で調整した10μg/ml抗CXCR4モノクローナル抗体（A145クローン、A120クローンA80クローン）の存在下及び非存在下において、抗CD3/CD28抗体で活性化したPBMC（初代培養）へのＲ5ウイルス及びX4ウイルス（JR-FL株及びNL4-3株）の感染性を分析した。
これらのPBMCは、低感染多重度（0.005〜0.01）でHIV-1にプレ感染させており、検証するモノクローナル抗体の存在下又は非存在下で培養を行った。
【００３９】
その結果を図３に示す。
図３に示すように、A120モノクローナル抗体及びA80モノクローナル抗体は、Ｒ5ウイルス及びX4ウイルス双方の生成（HIV-1 P24）を顕著に抑制したが、A145モノクローナル抗体は、大きな増殖抑制効果は認められなかった。
【００４０】
（２）A120モノクローナル抗体の更なる評価
上記実験において、A120モノクローナル抗体のHIV-1抑制効果が、その他のモノクローナル抗体の中で最も高かったので、A120モノクローナル抗体のウイルス感染抑制効果の更なる評価を行った。
HIV-1株として、R5 HIV-1 JR-FL、R5 HIV-1 JR-CSF、X4 HIV-1 NL4-3、X4 HIV-1 IIIBを使用した。
【００４１】
その結果を図４に示す。
図４に示すように、R5 HIV-1 JR-FL、R5 HIV-1 JR-CSF、X4 HIV-1 NL4-3、X4 HIV-1 IIIB全ての株において、A120モノクローナル抗体がHIV-1生成抑制効果を示すことが認められた。
【００４２】
（３）関連性のない複数のドナー由来の活性化PBMCに対するA120モノクローナル抗体のHIV-1生成抑制効果
関連性のないドナー由来の活性化PBMCに対するA120モノクローナル抗体のR5 HIV-1 JR-FL及び X4 HIV-1 NL4-3生成及び増殖抑制効果を検証した。
６例のドナーから採取したPBMCは、固定化したOKT-3と溶液状の抗CD28モノクローナル抗体で予め活性化し、R5 HIV-1 JR-FL及び X4 HIV-1 NL4-3に感染させた（感染多重度0.01m.o.i）。
細胞は洗浄後、A120モノクローナル抗体及びコントロール(rat isotype)とともに４日間培養した。
ウイルスの増殖は、p24濃度、及び１．（５）において記載したFCMによる感染細胞の頻度分布により評価した。
【００４３】
その結果を図５に示す。
図５に示すように、R5 HIV-1 JR-FL及び X4 HIV-1 NL4-3生成及び増殖抑制効果には確かにドナー毎のばらつきがあるが、どのケースにおいても、A120モノクローナル抗体を添加することにより、顕著な抑制効果を示すことがわかる。
更に、図５（ｂ）によると、どのケースにおいても、感染細胞の頻度分布が減少していることから、A120モノクローナル抗体を感作させると、ウイルスの細胞伝播が抑制されることがわかる。
このように、R5ウイルス及びX4ウイルス双方の感染及び増殖を抑制する抗CXCR4モノクローナル抗体（A120モノクローナル抗体）は、現在知られている限りにおいては初めての知見である。
【００４４】
（４）活性化PBMCでのR5ウイルス及びX4ウイルス抑制効果におけるA120モノクローナル抗体の濃度依存性
X4ウイルスと比較してR5ウイルスの抑制効果に違いがあるのか否かを検証した。
X4ウイルス及びR5ウイルスに感染した活性化PBMCを各濃度のA120モノクローナル抗体濃度存在下で４日間培養した。
培養上清におけるHIV-1感染は、p24 ELISAにより評価した。
【００４５】
その結果を図６に示す。
図６に示すように、最大の抑制効果を顕すA120モノクローナル抗体濃度は、R5ウイルスでは5μg/ml以上であり、X4ウイルスでは0.6μg/ml以上であった。
しかし、図５のグラフの形状が示す通り、A120モノクローナル抗体によるR5ウイルス及びX4ウイルス抑制のメカニズムは異なることが示唆された。
【００４６】
（５）HIV-1産生細胞株及びHTLV-1産生細胞株に対するA120モノクローナル抗体の影響
上記のような結果が得られているが、A120モノクローナル抗体の添加によるウイルスの感染及び増殖抑制は、A120モノクローナル抗体に混入していた非特異的な阻害物質の存在により二次的に引き起こされたものではない。
これを示すために、同濃度及び同量のA120モノクローナル抗体をHIV-1産生細胞株Molt-4/IIIB及びHTLV-1産生細胞株MT-2に添加して検証した。
HIV-1産生細胞株Molt-4/IIIB及びHTLV-1産生細胞株MT-2は、A120モノクローナル抗体（10ug/ml）又はコントロール存在下で１日間培養した。
培養上清におけるHIV-1 p24、HTLV-1 p24は ELISAにより評価した。
【００４７】
その結果を図７に示す。
図７に示すように、A120モノクローナル抗体を添加したことによる影響は認められなかった。
【００４８】
（６）活性化PBMCにおけるA120モノクローナル抗体によるCCR５結合性β−ケモカイン産生の増加
ヒトMIP-1α、ヒトMIP-1β、ヒトRANTESに対する中和モノクローナル抗体を使用し、これらの中和モノクローナル抗体がR5ウイルスの感染及び増殖に対するA120モノクローナル抗体の効果を逆転させるか否かを検討した。
６例のドナーから採取したPBMCは、固定化したOKT-3と溶液状の抗CD28モノクローナル抗体で予め活性化し、洗浄後、A120モノクローナル抗体及びコントロール(rat isotype)で１日間感作した。
培養上清におけるβ-ケモカインは ELISAにより評価した。
【００４９】
その結果を図８に示す。
図８に示す通り、A120モノクローナル抗体を媒介したR5ウイルス抑制効果は、抗MIP-1αモノクローナル抗体及び抗MIP-1βモノクローナル抗体の添加により逆転したが、抗RANTESモノクローナル抗体の添加によっては逆転しなかった。
【００５０】
（７）A120モノクローナル抗体添加によるCCR５結合性β−ケモカイン産生の誘導とCCR発現のダウンモデュレーション
A120モノクローナル抗体とCXCR4の結合によって、MIP-1α、MIP-1β、RANTESが生成するのか否かを確認するため、１日A120モノクローナル抗体を感作した培養液の上清中のケモカイン濃度を測定した。
【００５１】
その結果を図９乃至図１１に示す。
図９に示す通り、A120モノクローナル抗体の存在下で培養した抗CD3/CD28活性化PBMCは、全てのドナーにおいて、MIP-1α及びMIP-1βの生成量を顕著に増加させた。
なお、RANTESにおいては、半数のドナーで増加が認められた。
【００５２】
また、図１０に示す通り、A120モノクローナル抗体が存在する培地の活性化PBMCは、CCR5+細胞頻度及びCD4+T細胞の表面でのCCR5発現平均密度を顕著に低下させる。
逆に、CD4+T細胞によって発現するCXCR4の平均密度は僅かに増加する。なお、これは、同じPBMC培養においてA145モノクローナル抗体（A120モノクローナル抗体とは交差反応を起こさない）を使用して検出した。
【００５３】
更に、図１１に示す通り、活性化PBMCがA120モノクローナル抗体とともにインキュベートされることにより引き起こされるCCR5発現の低下は、MIP-1αモノクローナル抗体及び抗MIP-1βモノクローナル抗体の添加により逆転するが、抗RANTESモノクローナル抗体の添加によっては逆転しない。
以上のように、これらの結果により、抗CD3/CD28活性化PBMCをA120モノクローナル抗体とともにインキュベートすることにより、X4ウイルス及びR5ウイルス双方の感染が抑制されることがわかる。これは、X4ウイルスに対してはCXCR4をブロックすることによりもたらされる作用であり、R5 ウイルスに対してはMIP-1α及びMIP-1βのようなCCR5結合性β-ケモカインの合成によるところであると示唆される。
【００５４】
（８）Ｔ細胞と単核球におけるA120モノクローナル抗体の刺激によるβ-ケモカイン産生
A120モノクローナル抗体存在下での活性化PBMCのインキュベートに伴いβ-ケモカインの合成を行う細胞を同定するために、細胞除去実験を行った。
一定分量の抗CD3/CD28活性化PBMCから、適切な系列特異的モノクローナル抗体を抱合した免疫ビーズを使用してCD19+B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD14+単核球を除去した。
除去処理を行わないもの（mock）と各々の細胞除去処理を行った活性化PBMCを10μg/mlのA120モノクローナル抗体存在下及び非存在下で培養した。
24時間後、培養液上清中のケモカインをELISAにより定量した。
【００５５】
その結果を図１２に示す。
図１２に示す通り、CD14+単核球を除去した場合に、β-ケモカインの合成が最も顕著に減少し、次いで、CD4+T細胞及びCD8+T細胞を除去した場合に、β-ケモカインの合成が減少する傾向があった。
しかしながら、CD19+B細胞を欠損させた場合のβ-ケモカインの合成は、最も減少しなかった。
これらの結果は、単核球とともに活性化T細胞が、A120モノクローナル抗体に応答して、β-ケモカインを分泌していたことを示唆している。
【００５６】
（９）様々なHIV-１株種に対するA120モノクローナル抗体の感染抑制効果
A120モノクローナル抗体の抑制範囲を検証した。
一定分量の抗CD3/CD28活性化PBMCを15種類の異なったHIV-1株に感染させ、10μg/mlのA120モノクローナル抗体存在下若しくはコントロールとしてのIgGの存在下培養を行った。そして、感染5日後、上清中のp24濃度を定量した。
【００５７】
結果を図１３に示す。
図１３に示す通り、A120モノクローナル抗体存在下培養したものは、10種のR5ウイルス株、3種のX4ウイルス株、2種のR5/X4両指向性ウイルス株全てにおいて一様にp24の濃度減少が認められた。
【００５８】
（１０）その他の抗CXCR4モノクローナル抗体の評価
12Ｇ5モノクローナル抗体、MAB171モノクローナル抗体、MAB172モノクローナル抗体、MAB173モノクローナル抗体による抑制効果を図１４及び図１５に示す。
なお、実験方法及び評価方法等は、上記「（１）活性化PBMC（一次）へのＲ5ウイルス及びX4ウイルスの感染に対する抗CXCR4モノクローナル抗体の効果」の項及び「（７）A120モノクローナル抗体添加によるCCR５結合性β−ケモカイン産生の誘導とCCR発現のダウンモデュレーション」の項と同様である。
また、12Ｇ5モノクローナル抗体は、ECL1及びECL2を有するエピトープと結合し、MAB171モノクローナル抗体、MAB172モノクローナル抗体、MAB173モノクローナル抗体は、ECL2を有するエピトープと結合する。
【００５９】
図１４（ａ）及び図１４（ｂ）に示すように、12Ｇ5モノクローナル抗体、MAB171モノクローナル抗体、MAB172モノクローナル抗体、MAB173モノクローナル抗体、全てにおいて、R5ウイルス及びX4ウイルスの増殖が抑制されることがわかる。
更に、図１５に示すように、MAB173モノクローナル抗体の感作によって、A120モノクローナル抗体感作時と同様に、CCR５結合性β−ケモカインであるMIP-1α産生が誘導されていることがわかり、CCR5受容体のダウンモデュレーションが起こっていることがわかる。
つまり、これらの結果により、ECL2を有するエピトープと結合するモノクローナル抗体もまた、X4ウイルスのみならずR5ウイルスの感染を阻害することがわかる。
【００６０】
以上のように、本件においては、ECL3を有するエピトープと結合するラット抗ヒトCXCR4 A80モノクローナル抗体、ECL2を有するエピトープと結合するマウス抗ヒトCXCR4 MB173（MB171及びMB172）モノクローナル抗体がR5ウイルス株及びX4ウイルス株双方の活性化PBMCへの感染を阻害することがわかった。
そして、特に、ECL1及びECL2を有するエピトープと結合するラット抗ヒトCXCR4 A120モノクローナル抗体は、R5ウイルス株及びX4ウイルス株双方の活性化PBMCへの感染を顕著に阻害することがわかった。
このメカニズムの模式図を図１６に示す。
X4ウイルス株の感染抑制に関しては、A120モノクローナル抗体及び他のECL2領域に反応する抗体は、X4ウイルスがCXCR4に結合することを直接的に妨害する。
つまり、A120モノクローナル抗体及び他のECL2領域に反応する抗体自らがCXCR4受容体に結合して、X4ウイルスがCXCR4に結合することを阻止する。
また、R5ウイルス株の感染抑制に関しては、主として、A120モノクローナル抗体及び他のECL2領域に反応する抗体の刺激によりCCR5結合性β‐ケモカイン（特に、MIP-1α）の産生が促されることによってCCR5受容体のダウンモデュレーションが起こり、R5ウイルスが感染することが阻止される。
このように、本発明に係るCXCケモカイン受容体抗体であるA120抗体（Anti-CXCR4 ECL 1&2抗体）等は、X4ウイルスのみならずR5ウイルスへの感染をも阻害するものであり、今後、臨床的な利用をも期待されるものであるとともに、AIDS撲滅の一助となることが大きく期待されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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