(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、ＣＴＲＰ６の生物学的機能の解明とその応用である。【解決手段】  ＣＴＲＰ６を含有する、自己免疫疾患の予防又は治療のための医薬組成物。特に好ましくは、自己免疫疾患に関連する炎症、例えば関節リウマチまたはＩ型糖尿病の予防又は治療のための医薬組成物が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＴＲＰ６を含有する、自己免疫疾患の予防又は治療のための医薬組成物。
【請求項２】
ＣＴＲＰ６が、以下の、
（１）ヒトＣＴＲＰ６配列（配列番号１）、又は
（２）マウスＣＴＲＰ６配列（配列番号２）で示されるアミノ酸配列から成るか、或いは
（３）上記配列番号１又は配列番号２に対して少なくとも８０％の配列相同性を有し、且つ補体活性化を抑制する活性を有するタンパク質であるか、又は
（４）上記配列番号１又は配列番号２において、１個ないし数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、且つ補体活性化を抑制する活性を有するタンパク質である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
自己免疫疾患が、関節リウマチ；リウマチ性脊椎炎；変形性関節症；痛風；１型糖尿病；白班；全身性エリテマトーデス；胆汁性肝硬変；ぶどう膜炎；水疱性類天疱瘡；グレーブス眼病；多発性硬化症；ループス；線維筋痛症；敗血症；敗血症性ショック；エンドトキシンショック；グラム陰性菌敗血症；毒素性ショック症候群；喘息；成人呼吸促迫症候群；慢性閉塞性肺疾患；慢性肺炎症；炎症性腸疾患；クローン病；乾癬；湿疹；潰瘍性大腸炎；膵線維症；肝線維症；急性および慢性腎疾患；過敏性腸症候群；発熱；再狭窄；脳性マラリア；虚血性傷害；神経外傷；アルツハイマー病；ハンチントン病；パーキンソン病；急性および慢性疼痛；アレルギー性鼻炎；アレルギー性結膜炎；慢性心不全；急性冠症候群；及び移植片対宿主反応から成る群から選択される炎症である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
自己免疫疾患が、補体第二経路に関連する疾患である、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
自己免疫疾患が、関節リウマチまたはＩ型糖尿病である、請求項３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＴＲＰ６を有効成分として含む医薬組成物に関する。特に、本発明は、ＣＴＲＰ６による自己免疫疾患の予防及び治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
補体系は、主に感染に対する防御を補助するセリンプロテアーゼによる酵素カスケードである。補体系は、抗体応答と免疫記憶の増幅や外来細胞の溶解、免疫複合体及びアポトーシス細胞の除去などにより、自然免疫と獲得免疫を橋渡しする。補体成分の多くは血清中に不活性チモーゲンとして存在するタンパク質であり幾つかの生物学的機能（走化性刺激、ＩｇＥ非依存的なマスト細胞の脱顆粒の誘発等）を担っている。また補体の活性化には、古典経路（classical pathway)、レクチン経路(lectin pathway)及び第二経路(alternative pathway)の３つの経路が知られている。【０００３】
古典経路は、補体成分であるＣ１タンパク質と抗原−ＩｇＭ複合体又は抗原−ＩｇＧ複合体凝集物との相互作用が活性化の開始点である。レクチン経路（マンノース結合性レクチン経路）は、マンノース結合性レクチンが細菌細胞壁上のマンノース基と結合することで抗体非依存的に活性化され、古典経路と類似した活性化経路を辿る。第二経路は、偶発的な加水分解によって生じたＣ３（Ｈ２Ｏ）がＢ因子およびＤ因子によって活性化される経路であり、常時自然に活性化されるが、Ｈ因子やＩ因子などの制御因子により制御されている。【０００４】
上記の３つの経路のいずれもが最終的には共通の経路に合流し、その共通経路はＣ３転換酵素がＣ３タンパク質をＣ３ａとＣ３ｂへと開裂することにより始まる。Ｃ３の開裂は、外来細胞などを溶解する膜侵襲複合体の形成等を促す。【０００５】
Ｃ１ｑ分子は、古典経路での標的認識タンパク質である。Ｃ１ｑ分子はＡ鎖、Ｂ鎖及びＣ鎖により構成されるヘテロ複合体であり、標的を認識する球状ドメイン（ｇＣ１ｑドメイン）を有している。それぞれの鎖は、短いＮ末端領域と、その次のコラーゲン様領域（ＣＬＲ）を有しており、コラーゲン様領域のＣ末端側にｇＣ１ｑドメインが位置する（非特許文献１）。【０００６】
Ｃ１ｑ分子のｇＣ１ｑドメイン（本明細書において、単に「Ｃ１ｑドメイン」と言うこともある。）に類似の構造を有する非補体タンパク質も多数知られている。ｇＣ１ｑドメインは三次構造がＴＮＦに類似していることからＣ１ＱＴＮＦスーパーファミリーと呼ばれるタンパク質群が存在する。このスーパーファミリーの中で、特に補体Ｃ１ｑに類似したサブファミリーとしてＣＴＲＰ（Ｃ１ＱＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ファミリーがある。ヒトでは１７のＣＴＲＰメンバーが見つかっている。【０００７】
ＣＴＲＰ１は、Ｇタンパク質共役受容体に関連するものとして見つけられたタンパク質であり、主に心臓で発現していて強力な抗トロンビン作用を有している。ＣＴＲＰ６及びＣＴＲＰ８は、ＣＴＲＰ１の同属体であり類似のドメイン構造を持つが、イントロン−エキソンパターンは異なっている。ＣＴＲＰ２及びＣＴＲＰ７は、配列の相同性、ドメイン構造の類似性及びイントロン−エキソンのパターンから同じサブファミリーに属すると思われる。ＣＴＲＰ３は、軟骨細胞の分化および増殖を促進することが知られている。ＣＴＲＰ４は、このグループの中で、唯一、一個以上のＣ１ｑドメインを持っている。ＣＴＲＰ５は、後期発症網膜変性と関連するものとして発見され、網膜色素上皮、肝臓、肺、能及び胎盤で主に発現している（特許文献１）。【０００８】
上記のとおり、ＣＴＲＰ１は、血小板活性化および動脈遮断の阻止において強力な効果を発揮し、その投与により誘導される出血合併症が見かけ上欠如しているため、冠動脈血管形成術、頚動脈血管内膜切除術および卒中を含む血管損傷に伴う様々な状態の処置における臨床有用性を有し得るとされる（特許文献２）。【０００９】
しかしながら、いずれの先行技術も、ＣＴＲＰ６と補体活性化による自己免疫疾患との関連を予想さえしていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許公開公報第２００４／０２４８１５６Ａ１号公報
【特許文献２】特表２００８−５０７５９１号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｋｉｓｈｏｒｅら、ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．１０，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００４，ｐｐ．５５１−５６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、ＣＴＲＰ６の生物学的機能の解明とその応用である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
ＣＴＲＰ６が、補体第二経路を特異的に抑制することが明らかとなった。したがって、ＣＴＲＰ６は、補体第二経路の新規阻害剤である。また、ＣＴＲＰ６の投与により関節炎を治療することができた。【００１４】
従って、本発明は、
（１）ＣＴＲＰ６を含有する、自己免疫疾患の予防又は治療のための医薬組成物、に係るものである。【００１５】
また、後記実施例のとおり、ヒトＣＴＲＰ６を用いてマウスの関節炎を治療することができた。更に、ヒトＣＴＲＰ６とマウスＣＴＲＰ６のＣ１ｑドメインは８２％のアミノ酸配列同一性を有している事実、及び両者とも補体活性化の抑制に関与することが見出されたので、本発明の態様は、
（２）ＣＴＲＰ６が、以下の、
ｉ）ヒトＣＴＲＰ６配列（配列番号１）、又は
ｉｉ）マウスＣＴＲＰ６配列（配列番号２）で示されるアミノ酸配列から成るか、或いは
ｉｉｉ）上記配列番号１又は配列番号２に対して少なくとも８０％の配列相同性を有し、且つ補体活性化を抑制する活性を有するタンパク質であるか、又は
ｉｖ）上記配列番号１又は配列番号２において、１個ないし数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、且つ補体活性化を抑制する活性を有するタンパク質である、上記（１）に記載の医薬組成物、を包含する。【００１６】
本発明の医薬組成物により好適に予防及び／又は治療される自己免疫疾患の例に関して、本発明の態様は、
(３）自己免疫疾患が、関節リウマチ；リウマチ性脊椎炎；変形性関節症；痛風；Ｉ型糖尿病；白班；全身性エリテマトーデス；胆汁性肝硬変；ぶどう膜炎；水疱性類天疱瘡；グレーブス眼病；多発性硬化症；ループス；線維筋痛症；敗血症；敗血症性ショック；エンドトキシンショック；グラム陰性菌敗血症；毒素性ショック症候群；喘息；成人呼吸促迫症候群；慢性閉塞性肺疾患；慢性肺炎症；炎症性腸疾患；クローン病；乾癬；湿疹；潰瘍性大腸炎；膵線維症；肝線維症；急性および慢性腎疾患；過敏性腸症候群；発熱；再狭窄；脳性マラリア；虚血性傷害；神経外傷；アルツハイマー病；ハンチントン病；パーキンソン病；急性および慢性疼痛；アレルギー性鼻炎；アレルギー性結膜炎；慢性心不全；急性冠症候群；及び移植片対宿主反応から成る群から選択される炎症である、上記(１)又は（２）に記載の医薬組成物、を包含する。【００１７】
また、後記実施例において、ＣＴＲＰ６と補体第二経路との間に極めて重要な関連性があることが示された。従って、本発明の別の局面は、
（４）自己免疫疾患が、補体第二経路に関連する自己免疫疾患である、上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の医薬組成物、である。【００１８】
さらに本発明の好適な用途に関する態様として、
（５）自己免疫疾患が、関節リウマチまたはＩ型糖尿病である、上記（３）に記載の医薬組成物、が提供される。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の医薬組成物は、補体第二経路を特異的に抑制すること、或いは補体Ｃ３の活性化を抑制することにより、関連する炎症や自己免疫疾患を予防及び／又は治療するための有効な医薬として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＣＴＲＰ６分子の構造と、ヒトＣＴＲＰ６及びマウスＣＴＲＰ６の配列同一性を示す。ＣＴＲＰ６分子は、図の左から順にシグナルペプチド、可変領域、コラーゲンドメイン及びＣ１ｑドメインの４つの領域から成る。それぞれの領域でのヒト分子とマウス分子の間のアミノ酸配列同一性は、それぞれ、５５、５１、６０及び８２％である。
【図２】図２ａの上段は、マウスＣ１ｑｔｎｆ６の野生型（ＷＴ）アレルの構造を、中段はターゲッティングベクターの構造を、下段は予測されるＣ１ｑｔｎｆ６の変異アレルの構造を示す。図中、エキソンは塗り潰した四角形で表される。Ｃ１ｑドメインをコードするＣ１ｑｔｎｆ６遺伝子のエキソン３がネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ）により置換された。ネガティブ選択のためにジフテリア・トキシン遺伝子（ＤＴ）をゲノムフラグメントの３’末端に結合させた。図２ｂは、Ｃ１ｑｔｎｆ６欠損アレルの生成を確認するために、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ（制限部位を図２ａ中で「Ｈ」で示す。）消化物をゲノムプローブとし、５’プローブ（図２ａ中で「５’ｐｒｏｂｅ」として示す。）を用いてサザンブロット分析を行った結果を示す。図２ｃは、Ｃ１ｑｔｎｆ６欠損アレルの生成を確認するために、Ｅｃｏ  ＲＶ（制限部位を図２ａ中で「Ｅ」で示す。）消化物をゲノムプローブとし、３’プローブ（図２ａ中で「３’ｐｒｏｂｅ」として示す。）を用いてサザンブロット分析を行った結果を示す。
【図３】図３ａは、Ｃ１ｑｔｎｆ６ノックアウトマウス（図中、「ＫＯ」で示す。）と野生型マウス（図中、「ＷＴ」で示す。）との間で、コラーゲン誘導関節炎の憎悪化を比較した結果を示す。図３ａの左側は関節炎の発生率（縦軸：Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ（％））を、右側は重篤度（縦軸：Ｓｃｏｒｅ／ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｍｉｃｅ）を、ＩＩ型コラーゲンによる初回免疫後２１日目（つまり、追加免疫実施日）以降から評価した結果である。発生率及び重篤度のスコアは、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．（２００８）、Ｖｏｌ．３（４），ｐｐ．６１２−６１８に記載の基準に従った。結果は、平均±標準誤差で表し（２回の独立した実験の合計で、ＷＴ：ｎ＝１８及びＫＯ：ｎ＝１６。）、図中の「＊」は危険率０．０５％の有意差（Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定）を表す。図３ｂは、初回免疫４２日後のマウスの関節の組織病理学的検査の結果を示す。ＫＯマウスの罹患関節（図３ｂ右側）において滑膜炎の典型的症状が見られる。写真内のスケールバーは３００μｍに相当する。図３ｃは、初回免疫前（図の横軸の「ｐｒｅ」）並びに初回免疫後１４、２８及び４２日目の、マウス血清中のＩＩ型コラーゲン（ＩＩＣ）特異的ＩｇＧレベルをＥＬＩＳＡにより検出した結果を示す。結果は、平均±標準誤差で表し（２回の独立した実験の合計で、ＷＴ：ｎ＝１８及びＫＯ：ｎ＝１６。）、図中の「＊」は危険率０．０５％の有意差を、「＊＊＊」は危険率０．００５％の有意差（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  Ｔ−ｔｅｓｔ）を表す。
【図４】図４ａは、初回免疫後０、１４及び３０日目のマウス血清中のＴＮＰ−ＫＬＨ特異的ＩｇＧ１レベルをＥＬＩＳＡにより検出した結果を示す。結果は、平均±標準誤差（各群とも、ｎ＝１０）で表す。図４ｂは、初回免疫後０及び７日目の、マウス血清中のＴＮＰ−Ｆｉｃｏｌｌ特異的ＩｇＧ３レベルをＥＬＩＳＡにより検出した結果を示す。結果は、平均±標準誤差（各群とも、ｎ＝９）で表す。図４ａ及び図４ｂともに、野生型マウス群を「ＷＴ」と、ノックアウトマウス群を「ＫＯ」と表記した。
【図５】図５は、初回免疫後７日目のマウスから採取したリンパ節細胞をＩＩ型コラーゲンの存在下（図中、「ＩＩＣ」で表す。）、或いは非存在下（図中、「Ｍｅｄ」で表す。）で培養した際のリンパ節細胞増殖を、［３Ｈ］ＴｄＲ取り込み量として示す図である。野生型マウス群を「ＷＴ」と、ノックアウトマウス群を「ＫＯ」と表記した。結果は、平均±標準誤差（各群とも、ｎ＝６）で表す。
【図６】図６ａは、初回免疫前及び初回免疫後７日目のマウス血漿中の補体Ｃ３ａ分子をＥＬＩＳＡにより検出した結果を示す。図６ｂは、初回免疫前及び初回免疫後７日目の血漿中の補体Ｃ５ａ分子をＥＬＩＳＡにより検出した結果を示す。図６ａ及び図６ｂともに、横軸の「ｐｒｅ」は初回免疫前の、「ＩＩＣ」はＩＩ型コラーゲンでの初回免疫後７日目のデータを示す。野生型マウス群を「ＷＴ」と、ノックアウトマウス群を「ＫＯ」と表記した。結果は、平均±標準誤差（各群とも、ｎ＝８）で表し、図中の「＊」は危険率０．０５％の有意差（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  Ｔ−ｔｅｓｔ）を表す。
【図７】図７ａは、通常飼育下のマウスから採取した血清中での補体古典経路の活性化を補体Ｃ３ｂ分子の沈着として測定した結果を示す。図７ｂは、通常飼育下のマウスから採取した血清中での補体レクチン経路の活性化を補体Ｃ３ｂ分子の沈着として測定した結果を示す。図７ｃは、通常飼育下のマウスから採取した血清中での補体第二経路の活性化を補体Ｃ３ｂ分子の沈着として測定した結果を示す。図７ａ〜図７ｃにおいて、横軸は血清の希釈率を、縦軸はプレートに結合した活性化Ｃ３ｂ分子のＥＬＩＳＡ測定結果を示す。野生型マウス群を「ＷＴ」と、ノックアウトマウス群を「ＫＯ」と表記した。結果は、平均±標準誤差（各群とも、ｎ＝８）で表し、図中の「＊＊」は危険率０．０１％の有意差を、「＊＊＊」は危険率０．００５％の有意差（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  Ｔ−ｔｅｓｔ）を表す。
【図８】図８ａは、通常飼育下のＣ１ｑｔｎｆ６ＫＯマウスから採取した血清（５％希釈液）に対して各種濃度のＣＴＲＰ６分子を予め添加した場合の、補体第二経路の活性化を補体Ｃ３ｂ分子の沈着として測定した結果を示す。図８ｂは、通常飼育下のＣ１ｑｔｎｆ６ＫＯマウスから採取した血清（１０％希釈液）に対して各種濃度のＣＴＲＰ６分子を予め添加した場合の、補体第二経路の活性化を補体Ｃ５ｂ−９複合体の沈着として測定した結果を示す。図８ａ及び図８ｂとも、横軸はＣＴＲＰ６の添加濃度を、縦軸はプレートに結合した活性化Ｃ３ｂ分子またはＣ５ｂ−９複合体のＥＬＩＳＡ測定結果を示す。結果は、平均±標準誤差（各群とも、ｎ＝８）で表し、図中の「＊」は危険率０．０５％の有意差を、「＊＊＊」は危険率０．００５％の有意差（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  Ｔ−ｔｅｓｔ）を表す。
【図９】図９ａは、Ｃ１ｑｔｎｆ６Ｔｇマウス（ｎ＝８）の血漿中のＣＴＲＰ６レベルをＥＬＩＳＡにより確認した結果を示す。縦軸はＣＴＲＰ値（ｎｇ／ｍｌ）を表す。図９ｂは、通常飼育下のＣ１ｑｔｎｆ６Ｔｇマウス（ｎ＝５）から採取した血清中での補体古典経路（ＣＰ）、レクチン経路（ＬＰ）及び第二経路（ＡＰ）の活性化を補体Ｃ３ｂ分子の沈着として測定した結果を示す。縦軸はプレートに結合した活性化Ｃ３ｂ分子のＥＬＩＳＡ測定結果を表す。図９ｃは、Ｃ１ｑｔｎｆ６Ｔｇマウス（図中、「Ｔｇ」で示す。）と野生型マウス（図中、「ＷＴ」で示す。）との間で、コラーゲン誘導関節炎の憎悪化を比較した結果を示す。図９ｃの上段は関節炎の発生率（縦軸：Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ（％））を、下段は重篤度（縦軸：Ｓｃｏｒｅ／ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｍｉｃｅ）を、ＩＩ型コラーゲンによる初回免疫後２１日目（つまり、追加免疫実施日）以降から評価した結果である。発生率及び重篤度のスコアは、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．（２００８）、Ｖｏｌ．３（４），ｐｐ．６１２−６１８に記載の基準に従った。２回の独立した実験の合計で、ＷＴ：ｎ＝３２及びＴｇ：ｎ＝２５である。図９ａ、ｂにおいて、結果は、平均±標準誤差で表し、図中の「＊＊＊」は危険率０．００５％の有意差を（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  Ｔ−ｔｅｓｔ）を表す。図９ｃにおいて、結果は、平均±標準誤差で表し、図中の「＊」は危険率０．０５％の有意差（Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定）を表す。
【図１０】図１０は、ＩＩ型コラーゲンで免疫してコラーゲン誘導関節炎を発症させたＤＢＡ／１Ｊマウスに対する、ヒトＣＴＲＰ６の治療効果を示す。図１０ａは、ＩＩ型コラーゲンによる初回免疫後２１日目（つまり、追加免疫実施日）以降からの目視観察結果であり、ＣＴＲＰ６は、初回免疫後２８日目から毎日投与された。縦軸の重篤度スコアは、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．（２００７）、Ｖｏｌ．２（５），ｐｐ．１２６９−１２７５に記載された０〜４の重篤度基準に従った。結果は、平均±標準誤差（ｎ＝１１）で表す。図１０ｂは、治療効果を示す写真である。ＩＩ型コラーゲンはマウスの尾の基部に注射された。マウスの左足（写真の左側）にはＣＴＲＰ６を、右足（写真の右側）には対照としてリン酸緩衝生理食塩水を注射した。図１０ａにおいて、結果は、平均±標準誤差で表し、図中の「＊」は危険率０．０５％の有意差（Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定）を表す。
【図１１】ヒトＣＴＲＰ６及びマウスＣＴＲＰ６をコードする塩基配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の医薬組成物における有効成分は、生体内においてＣＴＲＰ６活性を発揮するタンパク質であればいずれのものも使用できる。従って、本発明においては、それらのタンパク質をＣＴＲＰ６の「機能的類似物」と総称することがある。あるタンパク質ないしペプチドがＣＴＲＰ６の機能的類似物であることは、当該タンパク質が補体第二経路を特異的に抑制できることに関してかを、又は当該タンパク質が補体の活性化を抑制できるかどうかに関してかを、或いはその双方に関して確認することで判定し得、その具体的な方法の例は、補体Ｃ３ｂ及び／又はＣ５ｂ活性化を評価するＥＬＩＳＡ法として実施例中に記載される。
【００２２】
また、ヒトＣＴＲＰ６を用いてマウスを治療した後記の実施例から、ＣＴＲＰ６活性は種間での特異性が低いことが確認されたので、様々な動物由来のＣＴＲＰ６分子を使用することも可能である。更に、ヒトＣＴＲＰ６とマウスＣＴＲＰ６のＣ１ｑドメインは８２％のアミノ酸配列同一性を有しているから（その他のドメイン間では最大で６０％のアミノ酸同一性）、当業者は、ヒトＣＴＲＰ６（配列番号１）又はマウスＣＴＲＰ６（配列番号２）に対して少なくとも８０％の配列相同性を有するか、或いは少なくともそれらのＣＴＲＰ６のＣ１ｑドメインと８０％程度の配列相同性を有するタンパク質ないしペプチドの中から、前記の補体第二経路に特異的な抑制作用、或いは補体の活性化抑制作用を有するものを、ＣＴＲＰ６の機能的類似物として容易に選択することができる。そのような機能的類似物は、より好ましくは、ヒトＣＴＲＰ６（配列番号１）又はマウスＣＴＲＰ６（配列番号２）に対して少なくとも８５％、９０％又は９５％の配列相同性を有するか、或いは少なくともＣＴＲＰ６のＣ１ｑドメインと８０％、９０％又は９５％の配列相同性を有するものであり得る。なお、ここでいうアミノ酸配列の相同性は、プログラムのデフォルトパラメータ（マトリクス＝Ｂｌｏｓｕｍ６２；ギャップ存在コスト＝１１、ギャップ拡張コスト＝１）を用いた検索で、インターネットサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎ／ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｇｉ−ｇｉｎ／ＢＬＡＳＴで実装可能なＢＬＡＳＴＰアルゴリズムによって示される陽性のパーセンテージとして定義できる。
【化１】
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【００２３】
従ってまた、当業者は、上記のヒトＣＴＲＰ６（配列番号１）又はマウスＣＴＲＰ６（配列番号２）において、１個ないし数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質ないしペプチドの中から、前記の補体第二経路に特異的な抑制作用、或いは補体の活性化抑制作用を有するものを、本発明のＣＴＲＰ６の機能的類似物として容易に選択することができる。つまり、その２つの分子が実質的に類似の活性を有するならば、それらの分子の一方の構造が他方に無くとも、又は２つのアミノ酸配列が完全に同一でなくとも、それらの分子は機能的類似物と考えられる。例えば、ロイシンをバリンに、リシンをアルギニンに、グルタミンをアスパラギンに置換してもポリペプチドの機能を変化させないことがあり得る。
【００２４】
ヒトＣＴＲＰ６は、遺伝子組換生産されているものが市販品（Ｂｉｏ  Ｖｅｎｄｅｒ社やＡＤＩＰＯ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社）として入手可能である。仮に所望するＣＴＲＰ６又はその機能的類似物が入手可能でないとき、当業者は、公知のＣＴＲＰ６配列に基づいて当該類似物を調製することができる。例えば、ヒトＣＴＲＰ６（配列番号１）又はマウスＣＴＲＰ６（配列番号２）をコードする塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒとして、ヒト：ＣＵ０１３００２、マウス：ＢＣ０７１１８７。図１１も参照）は公知であるので、その配列を有するｃＤＮＡをそのまま利用するか、或いはそのようなｃＤＮＡに対して適切な緊縮条件下（例えば、３ｘＳＳＣ、６８℃でハイブリダイズし、２ｘＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ及び６８℃で洗浄）でハイブリダイズできるＤＮＡを利用して、適切なプロモーターと他の適切な転写制御要素を含む発現ベクターへの分子クローニングにより組換え的に発現させることができ、原核宿主細胞又は真核宿主細胞に移入されてＣＴＲＰ６の機能的類似物を産生できる。このような操作の技術はＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）に十分に記載され、当業界で公知である。
【００２５】
本発明の医薬組成物の投与方法は、全身投与あるいは局所投与のいずれでもよい。たとえば、全身投与としては、経口投与、あるいは皮下投与、腹腔内投与、筋肉注射、動脈内投与、又は静脈内投与を含む非経口投与などが挙げられ、局所投与としては表皮、眼、又は各種腫瘍への局所注射、あるいはエアロゾルの吸入等による肺や気管支への投与などが挙げられる。また本発明の医薬組成物の投与量については、患者の年齢、体格、性別、症状の程度、有効成分の比活性、薬剤形態などによって異なるが、例えば筋肉内注射として用いられるヒトＣＴＲＰ６の有効投与量は０．０１μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ／日であり、好ましくは０．１〜５００μｇ／ｋｇ／日であり、さらに好ましくは１〜５０μｇ／ｋｇ／日である。これらを参考に患者の状態や処置すべき炎症・疾患に合わせて適宜調整すればよい。なお、投与回数は１日１〜２回でもよく、また毎日または週１〜３回であってもよい。
【００２６】
本発明の医薬組成物には、本発明に用いられるＣＴＲＰ６又はその機能的類似物とともに、薬学的に許容される添加物が含まれ得る。例えば、注射用製剤形態の組成物では、必要に応じて、ｐＨ緩衝剤、保存剤、等張化剤を加えることができる。ｐＨ緩衝剤としては、注射用製剤に添加可能なｐＨ緩衝作用を有するものが用いられ、例えば酢酸、コハク酸、酒石酸、乳酸またはその塩などがあげられる。保存剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等のパラベン類、２−フェニルエタノール、エチルアルコール、クロロブタノール等のアルコール類、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等の界面活性剤を添加しても良い。等張化剤としては製剤学上許容されている一般的なものであればよく、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類、単糖類、二糖類等の糖類が使用できる。
【００２７】
本発明の医薬組成物は自己免疫疾患の予防及び／又は治療のために有利に用いられる。補体第二経路は、感受性表面上へのＣ３ｂの沈着によって活性化されるカスケードであり、この経路の活性化は、肥満細胞、マクロファージ、好中球、内皮細胞等の活性化や組織傷害を含む炎症活性を媒介する、補体タンパク質の生物学的に活性な断片、例えばＣ３ａ、Ｃ４ａ、Ｃ５ａアナフィラトキシンなどを産生すると共に感受性表面には膜侵襲複合体であるＣ５ｂ−９複合体を形成し細胞を障害する。従って、補体第二経路の活性化を抑制することより広範な自己免疫疾患を予防及び治療できると予測するのは合理的であろう。
【００２８】
補体の活性化を抑制したモデル動物実験等により、関節リウマチ（Ｙ．  Ｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９５），Ｖｏｌ．９２，ｐｐ．８９５５−８９５９）、全身性エリテマトーデス及び糸球体腎炎（Ｙ．  Ｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９６），Ｖｏｌ．９３，ｐｐ．８５６３−８５６８）、再灌流傷害（Ｅ．Ａ．  Ａｍｓｔｅｒｄａｍら，Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９５），Ｖｏｌ．２６８，ｐｐ．Ｈ４４８−Ｈ４５７）、成人呼吸促迫症候群（Ｒ．  Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｉら，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２），Ｖｏｌ．４９，ｐｐ．１７４４−１７５０）、心肺バイパス術及び血液透析  （Ｃ．Ｓ．  Ｒｉｎｄｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９５），Ｖｏｌ．９６，ｐｐ．１５６４−１５７２）、心筋梗塞（Ｊ．  Ｗ．  Ｈｏｍｅｉｓｔｅｒら，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３），Ｖｏｌ．１５０，ｐｐ．１０５５−１０６４：Ｈ．Ｆ．  Ｗｅｉｓｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０），Ｖｏｌ．２４９，ｐｐ．１４６−１５１）、臓器移植における超急性拒絶反応（Ｔ．Ｊ．  Ｋｒｏｓｈｕｓら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９９５），Ｖｏｌ．６０，ｐｐ．１１９４−１２０２）の治療に効果的であり得ることが報告されている。また、熱傷、重症喘息、アナフィラキシーショック、腸の炎症、蕁麻疹、血管浮腫、脈管炎、多発性硬化症、重症筋無力症、膜性増殖性糸球体腎炎などの他の炎症性症状及び自己免疫／免疫複合体疾患もまた補体活性化と密接に関連している（Ｖ．Ｍ．  Ｈｏｌｅｒｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（書籍），Ｒ．Ｒ．Ｒｉｃｈ編，Ｍｏｓｂｙ  Ｐｒｅｓｓ発行、１９９６年，ｐｐ．３６３−３９１：Ｂ．Ｐ．  Ｍｏｒｇａｎ，Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９４），Ｖｏｌ．２４，ｐｐ．２１９−２２８）。ＷＯ２００７／１０３５４９号は、補体の活性化を抑制することにより、ぶどう膜炎やアレルギー性結膜炎等の補体媒介性眼障害を治療および／または予防する方法を開示している。ＷＯ２００４／１０３２９４号は、補体阻害剤による敗血症及び敗血症ショックの予防及び治療方法を開示している。ＷＯ２００６／１０１８６０号は、補体カスケード系の阻害剤が、アルツハイマー病を含む神経変性疾患の治療に有用であり得ることを記載している。従って、本発明の医薬組成物により予防及び治療可能な自己免疫疾患及び付随する炎症症状としては、リウマチ様関節炎；リウマチ性脊椎炎；変形性関節症；痛風；Ｉ型糖尿病；白班；全身性エリテマトーデス；胆汁性肝硬変；ぶどう膜炎；水疱性類天疱瘡；グレーブス眼病；多発性硬化症；ループス；線維筋痛症；敗血症；敗血症性ショック；エンドトキシンショック；グラム陰性菌敗血症；毒素性ショック症候群；喘息；成人呼吸促迫症候群；慢性閉塞性肺疾患；慢性肺炎症；炎症性腸疾患；クローン病；乾癬；湿疹；潰瘍性大腸炎；膵線維症；肝線維症；急性および慢性腎疾患；過敏性腸症候群；発熱；再狭窄；脳性マラリア；虚血性傷害；神経外傷；アルツハイマー病；ハンチントン病；パーキンソン病；急性および慢性疼痛；アレルギー��鼻炎；アレルギー性結膜炎；慢性心不全；急性冠症候群；及び移植片対宿主反応が例示される。
【００２９】
特に後記の実施例のように、本発明のＣＴＲＰ６は補体第二経路の活性化を抑制し、補体Ｃ３ｂの沈着およびＣ５ｂ−９複合体の形成も抑制した。従って、とりわけ補体第二経路に関連する自己免疫疾患やそれに関連する炎症、具体的には関節リウマチまたはＩ型糖尿病の予防／治療は興味深い対象であるが、これらに限定されない。
【００３０】
本発明の医薬組成物は、患者に重篤な副作用を及ぼさない限り、その他の抗炎症薬または鎮痛薬と組合せて使用することができる。例えば、５−リポキシゲナーゼインヒビター、シクロオキシゲナーゼ−２インヒビター、インターロイキン−１インヒビター、ＮＭＤＡアンタゴニストおよび一酸化窒素インヒビターもしくは一酸化窒素合成インヒビター、非ステロイド系抗炎症薬またはサイトカイン抑制性抗炎症薬と併用し得る。
【００３１】
以下では、
（１）Ｃ１ｑｔｎｆ６（ＣＴＲＰ６遺伝子）ＫＯマウスを創製し、コラーゲン誘導関節炎を誘発した結果、Ｃ１ｑｔｎｆ６ＫＯマウスは野生型（ＷＴ）マウスと比較して有意に関節炎が憎悪化したこと、
（２）ＣＴＲＰ６が、補体第二経路を特異的に抑制したこと、
（３）Ｃ１ｑｔｎｆ６Ｔｇマウス（ＣＴＲＰ６過剰発現マウス）を創製し、当該マウスでは関節炎の症状が改善したこと、及び
（４）ヒトＣＴＲＰ６を投与することにより、マウスでの関節炎が治療できたことを実施例に基づき詳しく説明するが、本発明が実施例に限定されるものではないことは言うまでもない。
【実施例】
【００３２】
実施例１：Ｃ１ｑｔｎｆ６ＫＯマウスでは関節炎が憎悪化する
１−ａ．Ｃ１ｑｔｎｆ６ＫＯマウスの作製
Ｅ１４．１  ＥＳ細胞中での相同組換により、Ｃ１ｑｔｎｆ６遺伝子のＣ１ｑドメインをコードするエキソン３を、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ）で置換した。また、ネガティブ選択のために、ジフテリア・トキシン遺伝子（ＤＴ）を前記ゲノムフラグメントの３’末端に結合させた。
具体的には、Ｅ１４．１  ＥＳ細胞のゲノムＤＮＡから下記のプライマーを用いてＣ１ｑｔｎｆ６に相当するゲノムＤＮＡを増幅した。
【化２】
2012157479.tif 000003
当該増幅により、５’及び３’アームとして、それぞれ３．５ｋｂ及び６．９ｋｂのフラグメントが得られた。【００３３】
ターゲッティングベクターは、Ｃ１ｑｔｎｆ６遺伝子のエキソン３（Ｃ１ｑドメインをコードしている）に対応するゲノムフラグメントを、ポジティブ選択のためのＰＧＫ１プロモータ制御下のネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ）含有ＤＮＡフラグメントで置換することにより構築した。また、当該ターゲッティングベクターの３’末端には、ネガティブ選択のために、ＭＣ１プロモータ制御下のジフテリア・トキシン遺伝子（ＤＴ）を結合させた。更に、当該ターゲッティングベクターのエキソン２には終止コドンと、スクリーニングのためのＨｉｎｄＩＩＩ配列を導入した（図２を参照）。そのようにして構築したターゲッティングベクターをＥＳ細胞（Ｅ１４．１）にエレクトロポレーションで導入し、Ｇ４１８（ナカライ社製）で選択した。標的クローンをＰＣＲ及びサザン・ブロット・ハイブリダイゼーション分析でスクリーニングした。一回目のスクリーニングは、下記のプライマーを用いたＰＣＲにより行った。
【化３】
2012157479.tif 000004
上記のＰＣＲスクリーニングに続けてサザン・ブロット・ハイブリダイゼーション分析を行うことにより標的クローンを確認した。具体的には、ＥＳ細胞のゲノムをＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＶで消化し、それぞれ５’及び３’プローブとして用いた。つまり、５’プローブは以下のプライマーにより増幅した。
【化４】
2012157479.tif 000005
また、３’プローブは以下のプライマーにより増幅した。
【化５】
2012157479.tif 000006
【００３４】
上記のスクリーニングの結果として、１つの標的細胞が同定された（ターゲッティング効率  ０．５％）。当該標的クローンを用いて、文献（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，Ｖｏｌ．９０，ｐｐ．８４２４−８４２８、及びＪ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１８７，ｐｐ．１４６３−１４７５）に準じた凝集法により、キメラマウスを創製した。当該キメラマウスへのＥＳ細胞の寄与を毛色により確認した。次いで、異型接合の子孫を創製するために、雄のキメラマウスを雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交尾させた。Ｆ１子孫を交配して異型接合のＣ１ｑｔｎｆ６ＫＯマウスを得た。なお、以下の実施例では、ＩＩ型コラーゲン（以下、「ＩＩＣ」と略すことがある。）再刺激アッセイおよび補体アッセイ（Ｃ５ｂ−９の検出）に関してはＦ１（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×１２９Ｏｌａ／Ｈｓｄ）バックグラウンドの同腹Ｃ１ｑｔｎｆ６ＫＯマウスを用い、その他の実験ではＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドのマウスを用いた。Ｃ１ｑｔｎｆ６ＫＯマウスの遺伝子型決定には、以下のプライマーを用いた。
【化６】
2012157479.tif 000007
上記の共通アンチセンスプライマーとＷＴセンスプライマーをＷＴアレル（６８６ｂｐ）の検出に、また共通アンチセンスプライマーと変異種センスプライマーを変異アレル（４５４ｂｐ）の検出に用いた（図２を参照）。【００３５】
１−ｂ．Ｃ１ｑｔｎｆ６ＫＯマウスでは関節炎が憎悪化する
Ｃ１ｑｔｎｆ６ＫＯマウスでのコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）の憎悪化を、以下の方法により試験した。
不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ；Ｄｉｆｃｏ社製）に対して、２ｍｇ／ｍｌの濃度でＩＩ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ社製）及び１．６５ｍｇ／ｍｌの濃度で加熱殺菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｈ３７Ｒａ；Ｄｉｆｃｏ社製）を乳化した液を用いて、マウスの尾の基部付近３箇所に当該乳化液の１００μｌを皮内注射することで初回免疫（ｄａｙ０）を行った。追加免疫をｄａｙ２１に行い、その際には前記と同量のＩＩ型コラーゲン（ＩＩＣ）を完全フロイントアジュバントに乳化させた液の１００μｌで、前回の注射箇所の近傍に前記マウスに対して皮内注射した。その後、それらのマウスでの関節炎の発生率及び重篤度スコアを、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．（２００８）、Ｖｏｌ．３（４），ｐｐ．６１２−６１８に記載された基準に従って評価した。なお、実験は独立して２回行った（２回の合計の匹数として、ＷＴ：ｎ＝１８，ＫＯ：ｎ＝１６）。また、初回免疫の４２日後（ｄａｙ４２）に、関節の組織病理学検査を行った。更に、初回免疫の前後にマウスから血清を採取し、ＩＩＣ特異的ＩｇＧレベルをＥＬＩＳＡにより調べた。結果は図３に示した。【００３６】
図３ａに示したとおり、Ｃ１ｑｔｎｆ６ＫＯマウス（以下、「ＫＯマウス」と略すことがある。）では関節炎が有意に憎悪化していた。組織病理学検査結果に関する図３ｂは、ＫＯマウスの関節に典型的な滑膜炎が生じていたことを示している。更に図３ｃは、初回免疫後のＩＩＣ特異的ＩｇＧレベルの上昇が、ＫＯマウスではＷＴマウスよりも有意に大きなことを示している。【００３７】
１−ｃ．ＣＴＲＰ６は、Ｂ細胞による抗体産生に影響をあたえない
胸腺に依存的な（或いは非依存的な）抗体産生を、以下の方法により試験した。
胸腺依存性抗原に対する免疫反応を評価するために、２００μｇのトリニトロフェニル１６［ＴＮＰ（１６）］−キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）と、同量のＩｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ（商品名：Ｐｉｅｒｃｅ社製）を混合したもの腹腔内注射してＣ１ｑｔｎｆ６ＫＯマウスを免疫した。追加免疫をｄａｙ２１に行った。血清を、初回免疫時（ｄａｙ０）、及びその後のｄａｙ１４及びｄａｙ３０に採取して、上記ＴＮＰ−ＫＬＨ特異的ＩｇＧ１レベルをＥＬＩＳＡで定量した。当該ＥＬＩＳＡでは、採取した血清を１：５００に希釈したものを検査試料とし、該試料のＴＮＰ特異的抗体レベルを、２０μｇのＴＮＰ（３０）−ＢＳＡでコートしたプレートと、マウスＩｇＧ１に対するヤギ及びウサギ・ポリクローナル抗体とアルカリフォスファターゼのコンジュゲート（Ｚｙｍｅｄ社製）を用いて測定した。【００３８】
他方、胸腺非依存性抗原に対する免疫反応を評価するために、２００μｇのトリニトロフェニル６５−アミノエチル−カルボキシル−メチル（ＡＥＣＭ）−Ｆｉｃｏｌｌ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を腹腔内注射してＣ１ｑｔｎｆ６ＫＯマウスを免疫した。免疫の７日後に血清を採取し、ＴＮＰ−Ｆｉｃｏｌｌ特異的ＩｇＧ３を定量した。該定量は、前記血清を１：１００に希釈したものを試料とし、該試料のＴＮＰ特異的抗体レベルを、２０μｇのＴＮＰ（３０）−ＢＳＡでコートしたプレートと、マウスＩｇＧ３に対するヤギ及びウサギ・ポリクローナル抗体とアルカリフォスファターゼのコンジュゲート（Ｚｙｍｅｄ社製）を用いて、ＥＬＩＳＡにより行った。図４ａと図４ｂのいずれも、ＣＴＲＰ６は、Ｂ細胞による抗体産生に影響をあたえないことを示している。【００３９】
１−ｃ’．Ｃ１ｑｔｎｆ６ＫＯマウスでは、抗原に対するリンパ節細胞の増殖応答も正常
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；Ｄｉｆｃｏ社製）にて２ｍｇ／ｍｌの濃度でＩＩＣ及び５ｍｇ／ｍｌの濃度で加熱殺菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｈ３７Ｒａ；Ｄｉｆｃｏ社製）を乳化した液の１００μｌを用いて、１２９Ｏｌａ／Ｈｓｄ×Ｃ５７ＢＬ／６ＪのＦ１マウスを免疫した。免疫後７日目にリンパ節細胞を採取した。採取したリンパ節細胞（５ｘ１０５細胞／ウェル）を、１００ｍｇ／ｍｌの熱変性ＩＩＣの存在又は不存在下で３日間培養し、培養終了の６時間前から［３Ｈ］ＴｄＲ（０．２５  ｍＣｉ／ｍｌ）を細胞に取り込ませた。図５に示したとおり、Ｃ１ｑｔｎｆ６ＫＯマウスでは、抗原に対するリンパ節細胞の増殖応答もＷＴマウスと同様で、正常に応答した。【００４０】
１−ｄ．Ｃ１ｑｔｎｆ６ＫＯマウスでは補体Ｃ３ａが増加していた
不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ；Ｄｉｆｃｏ社製）に対して、２ｍｇ／ｍｌの濃度でＩＩ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ社製）及び１．６５ｍｇ／ｍｌの濃度で加熱殺菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｈ３７Ｒａ；Ｄｉｆｃｏ社製）を乳化した液を用いて、マウスの尾の基部付近３箇所に当該乳化液の１００μｌを皮内注射することで免疫を行った。当該ＩＩ型コラーゲン（ＩＩＣ）での免疫後７日目に血漿をマウスから採取した。抗マウスＣ３ａ捕獲用モノクローナル抗体又は抗マウスＣ５ａ捕獲用モノクローナル抗体（共にＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ社製）でコートしたプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社製）内で血漿をインキュベートし、ビオチン・コンジュゲート化検出用モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ社製）を用いて、マウス血漿中の補体Ｃ３ａ及び補体Ｃ５ａを検出した（ｎ＝８）。図６に示すとおり、Ｃ１ｑｔｎｆ６ＫＯマウスでは、ＩＩＣ刺激後に補体Ｃ３ａ及びＣ５ａ分子の産生がＷＴマウスに比べて有意に上昇していた。【００４１】
１−ｅ．Ｃ１ｑｔｎｆ６ＫＯマウスでは補体第二経路が特異的に活性化している
Ｂｌｏｏｄ  （２００８Ｊａｎ  １５），Ｖｏｌ．１１１（２），ｐｐ．７３２−７４０（Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｏｃｔ  ４）に準じた方法により、古典経路（ＣＰ）、レクチン経路（ＬＰ）及び第二経路（ＡＰ）による補体活性化をアッセイするために、プレート（Ｎｕｎｃ社製）を、それぞれ、ＯＶＡ／抗ＯＶＡ免疫複合体（ＯＶＡ；Ｓｉｇｍａ社製、抗ＯＶＡ抗体；ミリポア社製）、５０μｇ／ｍｌのマンナン（Ｓｉｇｍａ社製）及び２００μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ社製）でコートした。通常飼育下のマウス（ｎ＝８）から採取した血清を１、２及び４％に希釈したもの並びに血清を含まない液を前記プレート内で３７℃、１時間インキュベートし、次いでプレートに結合した活性化Ｃ３ｂを、抗マウスＣ３抗体（ａｂｃａｍ社製）を用いて定量した。ＣＰ及びＬＰ活性はＧＶＢ２＋バッファー中で、ＡＰ活性はＧＶＢ／ＭｇＥＧＴＡバッファー中でアッセイした。
つまり、図７に示したとおり、異なるプレート条件及びバッファー条件で血清を反応させることで古典経路（ＣＰ）、レクチン経路（ＬＰ）及び第二経路（ＡＰ）の３つの経路の活性化を調べてみた結果、ＫＯマウスでは第二経路（ＡＰ）のみが活性化しやすいことが判明した。【００４２】
実施例２：ＣＴＲＰ６は濃度依存的に補体第二経路の活性化を抑制する
上記１−ｅ．により、ＫＯマウスでは第二経路（ＡＰ）のみが活性化しやすいことが判明した。
そこで、再構成実験として、ＧＶＢ／ＭｇＥＧＴＡバッファー中のＣ１ｑｔｎｆ６ＫＯマウス血清（５％）に対して各種濃度の組換ＣＴＲＰ６（Ｂｉｏ  Ｖｅｎｄｅｒ社より入手）を予め混合し、上記１−ｅ．の手順でＡＰ活性をアッセイした。また、ここでは、Ｃ５ｂ−９複合体の形成についても、ＫＯマウス血清（１０％）に対して各種濃度のＣＴＲＰ６を予め混合し、２００μｇ／ｍｌの濃度でＬＰＳを固層化したプレートを用いる抗マウスＣ５ｂ−９抗体（ａｂｃａｍ社）のプロトコールによってアッセイした。
図８ａ及び図８ｂに示したとおり、ＣＴＲＰ６が生産されないＫＯマウスの血清（５％及び１０％）に濃度を変えてＣＴＲＰ６を加えた結果、濃度依存的にＣＴＲＰ６が第二経路を抑制することが、それぞれ、補体Ｃ３ｂ及び補体Ｃ５ｂの活性化抑制として確認された。【００４３】
実施例３：ＣＴＲＰ６の過剰発現により関節炎が抑制された
３−ａ．Ｃ１ｑｔｎｆ６Ｔｇマウスの作製
Ｃ１ｑｔｎｆ６Ｔｇマウス（ＣＴＲＰ６過剰発現マウス）を、以下のようにして創製した。詳細については、実施例１−ａ．も参照。
下記のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより増幅したマウスＣ１ｑｔｎｆ６（全長）ｃＤＮＡをｐＣＸＮベクター中のＣＡＧプロモータの下流に組み込んだ。
【化７】
2012157479.tif 000008
増幅したｃＤＮＡ断片は、シーケンスし正しい配列であることを確認した。当該ｃＤＮＡ断片をベクターに導入後、そのベクターをＢａｍＨ  Ｉ、Ｐｖｕ  Ｉで処理し精製した断片を得た。そのようにして精製した断片をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの卵の前核にマイクロインジェクションし、その卵を偽妊娠させたＩＣＲマウスの卵管に入れた。得られたマウスがＴｇマウスかどうかは、下記のプライマーを用いたＰＣＲで確認し、ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで処理しサザンブロットで確認した。
【化８】
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Ｔｇマウスの遺伝子決定には以下の３つのプライマーを用いた。
【化９】
2012157479.tif 000010
実験には同腹仔も用いた。
３−ｂ．Ｃ１ｑｔｎｆ６Ｔｇマウスでは関節炎が抑制される
１）  上記のようにして創製したＣ１ｑｔｎｆ６Ｔｇマウス（Ｔｇマウスと略すことがある。）の血漿中のＣＴＲＰ６をＥＬＩＳＡにより確認した。具体的には、抗ＣＴＲＰ６抗体（Ａｎａｓｐｅｃ社製）でコートしたプレート（Ｎｕｎｃ社製）内で、１０％に希釈したマウス血清を室温で１時間インキュベートし、次いで、プレートに結合したＣＴＲＰ６の量を、ビオチン化抗ＣＴＲＰ６抗体（Ａｎａｓｐｅｃ社製の抗体を、Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（コスモ・バイオ社製）を用いてビオチン化した。）を用いて決定した。
結果を図９ａに示した。目的どおり、Ｃ１ｑｔｎｆ６Ｔｇマウス血漿中のＣＴＲＰ６の量はＷＴのそれよりも有意に多かった。
２）  次いで、Ｃ１ｑｔｎｆ６Ｔｇマウスでのコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）の抑制を上記１-ｂ．の手順で試験した。但し、免疫に用いた乳化液の加熱殺菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｈ３７Ｒａ；Ｄｉｆｃｏ社製）の濃度は、結核死菌の量を増やすことでＷＴでの実験よりも症状を重篤化させるために、２．５ｍｇ／ｍｌとした。
図９ｃに示したとおり、Ｃ１ｑｔｎｆ６Ｔｇマウスマでは関節炎の憎悪化が、ＷＴと比べても有意に抑制された。
３）  更に、Ｃ１ｑｔｎｆ６Ｔｇマウスでは補体第二経路が特異的に抑制されていることを、上記１−ｅ．の手順で確かめた。
図９ｂの結果は、Ｃ１ｑｔｎｆ６Ｔｇマウスでは補体第二経路が特異的に抑制されることを確認した。【００４４】
実施例４：ＣＴＲＰ６を投与することにより関節炎が治療できる
関節炎の動物モデルは、ＤＢＡ／1Ｊマウスを基にして作製した。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；Ｄｉｆｃｏ社製）に対して、２ｍｇ／ｍｌの濃度でＩＩ型コラーゲンを乳化した液を用いて、マウスの尾の基部付近３箇所に当該乳化液の１００μｌを皮内注射することで初回免疫（ｄａｙ０）を行った。追加免疫をｄａｙ２１に行い、その際には前記と同量のＩＩ型コラーゲン（ＩＩＣ）を完全フロイントアジュバントに乳化させた液の１００μｌで、前回の注射箇所の近傍に前記マウスに対して皮内注射した。
関節炎に対するＣＴＲＰ６の効果を試験するために、初回免疫後のｄａｙ２８から毎日、ＡＤＩＰＯ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社から入手した組換ヒトＣＴＲＰ６の溶液（ＣＴＲＰ６の３００ｎｇ相当量）及びＰＢＳ（ｐＨ７．４）のそれぞれを、３０μｌの注射量で、ＤＢＡ／1Ｊマウス（ｎ＝１１）の左足にはＣＴＲＰ６を、右足にはＰＢＳを、膝関節の関節腔に注射した。
その後、左右それぞれの足について、関節の腫れと発赤を肉眼で観察し、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．（２００７）、Ｖｏｌ．２（５），ｐｐ．１２６９−１２７５に記載された０〜４の重篤度基準に従って評価した。
図１０の結果は、関節炎を発症したＤＢＡ／１ＪマウスへのＣＴＲＰ６投与により関節炎の症状が改善したことを明確に示した。加えて、１１匹中、８匹においてＣＴＲＰ６を注射した左足は治癒していた。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明に基づき自己免疫疾患の予防及び／又は治療のための医薬品が提供される。従って、本発明は、医薬品製造業等において利用可能である。
【図１】
2012157479.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2012157479.tif 000021
【配列表】
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【国際調査報告】
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2012157479.tif 000024
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