(57)【要約】  検体中の測定対象成分を過酸化水素に変換し、生成した過酸化水素をα−ケト酸存在下に酸化発色型色原体を用いて測定することを特徴とする、検体中の測定対象成分の測定方法。  検体中の測定対象成分を過酸化水素に変換し、生成した過酸化水素を、酸化発色型色原体を用いて測定する方法において、α−ケト酸を用いることを特徴とする、過酸化物の影響抑制方法。  本発明のα−ケト酸を用いる測定方法、および、抑制方法により、過酸化物の影響が抑制され、正確な検体中の測定対象成分の測定が可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の測定対象成分を過酸化水素に変換し、生成した過酸化水素をα−ケト酸存在下に酸化発色型色原体を用いて測定することを特徴とする、検体中の測定対象成分の測定方法。
【請求項２】
検体中の測定対象成分を過酸化水素に変換し、生成した過酸化水素を酸化発色型色原体と反応させる、検体中の測定対象成分の測定方法において、生成した過酸化水素と酸化発色型色原体との反応をα−ケト酸存在下に行うことを特徴とする、検体中の測定対象成分の測定方法における過酸化物の影響抑制方法。
【請求項３】
α−ケト酸が、ピルビン酸、α−ケトグルタル酸及びオキサロ酢酸からなる群より選ばれるα−ケト酸である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
酸化発色型色原体が、ロイコ型色原体である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ロイコ型色原体が、フェノチアジン誘導体である請求項４記載の方法。
【請求項６】
フェノチアジン誘導体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである請求項５記載の方法。
【請求項７】
酸化発色型色原体が、酸化カップリング型色原体である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
酸化カップリング型色原体が、カップラーと、アニリン誘導体又はフェノール誘導体との組み合わせである請求項７記載の方法。
【請求項９】
過酸化水素生成試薬、α−ケト酸、過酸化活性物質及び酸化発色型色原体を含有することを特徴とする、検体中の測定対象成分の測定用試薬。
【請求項１０】
α−ケト酸が、ピルビン酸、α−ケトグルタル酸及びオキサロ酢酸からなる群より選ばれるα−ケト酸である請求項９記載の試薬。
【請求項１１】
酸化発色型色原体が、ロイコ型色原体である請求項９又は１０記載の試薬。
【請求項１２】
ロイコ型色原体が、フェノチアジン誘導体である請求項１１記載の試薬。
【請求項１３】
フェノチアジン誘導体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである請求項１２記載の試薬。
【請求項１４】
酸化発色型色原体が、酸化カップリング型色原体である請求項９又は１０記載の試薬。
【請求項１５】
酸化カップリング型色原体が、カップラーと、アニリン誘導体又はフェノール誘導体との組み合わせである請求項１４記載の試薬。
【請求項１６】
第１試薬及び第２試薬を含む、検体中の測定対象成分の測定用キットであって、ロイコ型色原体と過酸化活性物質がそれぞれ、第１試薬及び第２試薬の別々の試薬に含まれ、過酸化水素生成試薬及びα−ケト酸がそれぞれ、第１試薬及び第２試薬の一方又は両方に含まれることを特徴とするキット。
【請求項１７】
ロイコ型色原体が、フェノチアジン誘導体である請求項１６記載のキット。
【請求項１８】
フェノチアジン誘導体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
第１試薬及び第２試薬を含む、検体中の測定対象成分の測定用キットであって、カップラーと、アニリン誘導体又はフェノール誘導体とがそれぞれ、第１試薬及び第２試薬の別々の試薬に含まれ、過酸化活性物質、過酸化水素生成試薬及びα−ケト酸がそれぞれ、第１試薬及び第２試薬の一方又は両方に含まれることを特徴とするキット。
【請求項２０】
α−ケト酸が、ピルビン酸、α−ケトグルタル酸及びオキサロ酢酸からなる群より選ばれるα−ケト酸である請求項１６〜１９のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の測定対象成分の測定方法、測定用試薬、及び、測定用キット、並びに、過酸化物の影響抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床診断においては、全血、血清、血漿、尿等の生体試料を用いて、生体試料中の測定対象成分の測定が行われる。生体試料中の測定対象成分は、酵素を用いる方法や抗原抗体を用いた免疫測定法等により測定される。酵素を用いる、生体試料中の測定対象成分の測定においては、測定対象成分を酸化酵素により過酸化水素に変換した後、生成した過酸化水素を、ペルオキシダーゼ存在下、酸化発色型色原体と反応させ、生成した色素の吸光度を測定することがしばしば行われる。【０００３】
この過酸化水素定量系に基づく生体試料中の測定対象成分の測定は、温和な反応条件や、操作の簡便性等から、自動分析装置を用いた多検体の連続測定に多用されている。しかしながら、この方法は、生体試料中に存在するビリルビンやヘモグロビン等の影響を受け、測定値が理論値よりも低くなるという、所謂、負の影響を受けることが問題となっている。この問題に対して、これまでに鉄シアノ化合物を用いる方法（例えば、非特許文献１）等の方法が報告されている。【０００４】
一方、過酸化水素定量系に基づく生体試料中の測定対象成分の測定においては、界面活性剤がしばしば用いられる。界面活性剤は、酵素の基質との相互作用による酵素の特異性制御や、酵素との相互作用による酵素の反応性制御、検体の前処理等のために用いられる。中でも、ポリオキシエチレン系界面活性剤、ポリオキシプロピレン系界面活性剤等のポリオキシアルキレン系界面活性剤は、その種類の多様性と入手可能性から多用される。【０００５】
しかしながら、ポリオキシアルキレン系界面活性剤は、その構造から過酸化物を生成し易く（例えば、特許文献１）、生成した過酸化物は、過酸化水素定量系に正の影響を与え、測定値が理論値よりも高くなることが問題となっている。特に、生体試料測定用試薬や生体試料測定用キットの保存状態が不十分の場合には、これらの試薬やキットにおいて、過酸化物がしばしば生成し、試薬やキットの性能の低下を引き起こしている。【０００６】
また、診断用キット中には、塩、緩衝剤、酵素、防腐剤等の添加物が含有される場合が多いが、これらの添加物を用いたキット製造工程の中で生成又は混入した過酸化物や、長期保存中に酸化により生成した過酸化物により、測定に正の影響を与えることがある。さらには、生体中での酸化ストレスや酵素反応等、あるいは薬剤投与等により、全血、血清、血漿、尿等の生体試料中に過酸化物が生成し、この過酸化物が測定に正の影響を与えることもある。【０００７】
ピルビン酸は、α−ケト酸の１つで、生体内では、解糖系において中間生成物として生成する。ピルビン酸は、比較的強い抗酸化活性を有することが知られており（例えば、特許文献２）、細胞中の酸素ラジカルを中和する作用が報告されている（例えば、特許文献３）。【０００８】
過酸化水素定量系に基づく生体試料中の測定対象成分の測定において、過酸化物の影響が抑制された測定方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００７−２０４７０１号公報
【特許文献２】特開２００４−２１７９３２号公報
【特許文献３】特表平９−５１１７４６号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】クリニカルケミストリー、26巻、2号、227-231頁（1980年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、過酸化水素定量系における過酸化物の影響が抑制された、検体中の測定対象成分の測定方法、測定用試薬、及び、測定用キット、並びに、過酸化物の影響抑制方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは本課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、検体中の測定対象成分を過酸化水素に変換し、生成した過酸化水素を測定する方法において、α−ケト酸を用いることにより、過酸化水素定量系に影響を及ぼすことなく、過酸化物の影響が抑制され、正確な検体中の測定対象成分の測定ができる、という知見を見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の［１］〜［２０］に関する。【００１３】
［１］  検体中の測定対象成分を過酸化水素に変換し、生成した過酸化水素をα−ケト酸存在下に酸化発色型色原体を用いて測定することを特徴とする、検体中の測定対象成分の測定方法。
［２］  検体中の測定対象成分を過酸化水素に変換し、生成した過酸化水素を酸化発色型色原体と反応させる、検体中の測定対象成分の測定方法において、生成した過酸化水素と酸化発色型色原体との反応をα−ケト酸存在下に行うことを特徴とする、検体中の測定対象成分の測定方法における過酸化物の影響抑制方法。
［３］  α−ケト酸が、ピルビン酸、α−ケトグルタル酸及びオキサロ酢酸からなる群より選ばれるα−ケト酸である［１］又は［２］記載の方法。
［４］  酸化発色型色原体が、ロイコ型色原体である［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］  ロイコ型色原体が、フェノチアジン誘導体である［４］記載の方法。
［６］  フェノチアジン誘導体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである［５］記載の方法。
［７］  酸化発色型色原体が、酸化カップリング型色原体である［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［８］  酸化カップリング型色原体が、カップラーと、アニリン誘導体又はフェノール誘導体との組み合わせである［７］記載の方法。【００１４】
［９］  過酸化水素生成試薬、α−ケト酸、過酸化活性物質及び酸化発色型色原体を含有することを特徴とする、検体中の測定対象成分の測定用試薬。
［１０］  α−ケト酸が、ピルビン酸、α−ケトグルタル酸及びオキサロ酢酸からなる群より選ばれるα−ケト酸である［９］記載の試薬。
［１１］  酸化発色型色原体が、ロイコ型色原体である［９］又は［１０］記載の試薬。
［１２］  ロイコ型色原体が、フェノチアジン誘導体である［１１］記載の試薬。
［１３］  フェノチアジン誘導体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである［１２］記載の試薬。
［１４］  酸化発色型色原体が、酸化カップリング型色原体である［９］又は［１０］記載の試薬。
［１５］  酸化カップリング型色原体が、カップラーと、アニリン誘導体又はフェノール誘導体との組み合わせである［１４］記載の試薬。【００１５】
［１６］  第１試薬及び第２試薬を含む、検体中の測定対象成分の測定用キットであって、ロイコ型色原体と過酸化活性物質がそれぞれ、第１試薬及び第２試薬の別々の試薬に含まれ、過酸化水素生成試薬及びα−ケト酸がそれぞれ、第１試薬及び第２試薬の一方又は両方に含まれることを特徴とするキット。
［１７］  ロイコ型色原体が、フェノチアジン誘導体である［１６］記載のキット。
［１８］  フェノチアジン誘導体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである［１７］記載のキット。
［１９］  第１試薬及び第２試薬を含む、検体中の測定対象成分の測定用キットであって、カップラーと、アニリン誘導体又はフェノール誘導体とがそれぞれ、第１試薬及び第２試薬の別々の試薬に含まれ、過酸化活性物質、過酸化水素生成試薬及びα−ケト酸がそれぞれ、第１試薬及び第２試薬の一方又は両方に含まれることを特徴とするキット。
［２０］  α−ケト酸が、ピルビン酸、α−ケトグルタル酸及びオキサロ酢酸からなる群より選ばれるα−ケト酸である［１６］〜［１９］のいずれかに記載のキット。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、過酸化物の影響が抑制された検体中の測定対象成分の測定方法、測定用試薬、及び、測定用キット、並びに、過酸化物の影響抑制方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例５（１）のピルビン酸を含有するヘモグロビンＡ１ｃ測定用キット、及び、実施例５（４）のα−ケト酸を含有しないヘモグロビンＡ１ｃ測定用キットを用いたヘモグロビンＡ１ｃ測定方法における、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度と吸光度との関係を表すグラフである。横軸はヘモグロビンＡ１ｃ濃度(μmol/L)を、縦軸は吸光度(Abs)を表す。○は、ピルビン酸を含有するキットを用いた測定のグラフを表し、△は、α−ケト酸を含有しないキットを用いた測定のグラフを表す。
【図２】実施例５（２）のα−ケトグルタル酸を含有するヘモグロビンＡ１ｃ測定用キット、及び、実施例５（４）のα−ケト酸を含有しないヘモグロビンＡ１ｃ測定用キットを用いたヘモグロビンＡ１ｃ測定方法における、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度と吸光度との関係を表すグラフである。横軸はヘモグロビンＡ１ｃ濃度(μmol/L)を、縦軸は吸光度(Abs)を表す。○は、α−ケトグルタル酸を含有するキットを用いた測定のグラフを表し、△は、α−ケト酸を含有しないキットを用いた測定のグラフを表す。
【図３】実施例５（３）のオキサロ酢酸を含有するヘモグロビンＡ１ｃ測定用キット、及び、実施例５（４）のα−ケト酸を含有しないヘモグロビンＡ１ｃ測定用キットを用いたヘモグロビンＡ１ｃ測定方法における、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度と吸光度との関係を表すグラフである。横軸はヘモグロビンＡ１ｃ濃度(μmol/L)を、縦軸は吸光度(Abs)を表す。○は、オキサロ酢酸を含有するキットを用いた測定のグラフを表し、△は、α−ケト酸を含有しないキットを用いた測定のグラフを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（１）測定対象成分の測定方法
本発明の測定対象成分の測定方法は、検体中の測定対象成分を過酸化水素に変換し、生成した過酸化水素をα−ケト酸存在下に酸化発色型色原体を用いて測定することを特徴とする。本発明の測定対象成分の測定方法は、検体中に存在する過酸化物の影響が抑制され、正確に検体中の測定対象成分を測定することができる。
【００１９】
本発明における検体としては、本発明の測定方法を可能とする限りでは特に制限はなく、例えば全血、血清、血漿、尿等が挙げられる。
【００２０】
本発明の測定方法は、過酸化物の影響が抑制される限りでは特に制限はなく、例えば以下の工程を含む方法等が挙げられる。
工程１：検体中の測定対象成分を過酸化水素生成試薬と反応させ、過酸化水素を生成させる工程；
工程２：工程１で生成した過酸化水素を、α−ケト酸及び過酸化活性物質の存在下、酸化発色型色原体と反応させて色素を生成させる工程；
工程３：工程２で生成した色素の吸光度を測定する工程；
工程４：既知濃度の測定対象成分を用いて作成された、測定対象成分の濃度又は活性と吸光度との関係を表す検量線に、工程３で測定した吸光度を相関させる工程；
工程５：検体中の測定対象成分の濃度又は活性を決定する工程。
【００２１】
上記工程１の反応は、α−ケト酸存在下に行ってもよい。また、工程１と工程２は、同時に行っても、段階的に行ってもよい。
【００２２】
工程１における、検体中の測定対象成分と過酸化水素生成試薬との反応は、過酸化水素を生成する条件であれば、いかなる反応条件でもよく、例えば１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で、１分間〜３時間、好ましくは２．５分間〜１時間行う。
【００２３】
工程２における、α−ケト酸及び過酸化活性物質の存在下での、過酸化水素と酸化発色型色原体との反応は、色素を生成する条件であれば、いかなる反応条件でもよく、例えば１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で、１分間〜３時間、好ましくは２．５分間〜１時間行う。この反応におけるα−ケト酸の濃度としては、過酸化物の影響を抑制し得る濃度であれば特に制限はなく、例えば０．００１〜２０ｇ／Ｌである。
【００２４】
工程３における、生成した色素の吸光度を測定する方法は、吸光度を測定し得る方法であれば、いかなる方法でもよく、例えば分光光度計を用いて測定する方法等が挙げられる。
【００２５】
工程１における過酸化水素生成試薬は、測定対象成分と反応して過酸化水素を生成させる試薬であり、例えば(A)測定対象成分を直接過酸化水素に変換する試薬［以下、試薬(A)と記す］、(B)測定対象成分を間接的に過酸化水素に変換する試薬［以下、試薬(B)と記す］、(C)測定対象成分から直接過酸化水素を生成させる試薬［以下、試薬(C)と記す］、(D)測定対象成分から間接的に過酸化水素を生成させる試薬［以下、試薬(D)と記す］等が挙げられる。
【００２６】
試薬(A)は、検体中の測定対象成分を直接過酸化水素に変換する試薬である。試薬(A)が適用される測定対象成分は、例えば酸化酵素の基質等である。試薬(A)としては、例えば測定対象成分の酸化酵素を含む試薬等が挙げられる。測定対象成分と試薬(A)との組み合わせの具体例を第１表に示す。
【００２７】
【表１】
2012081539.tif 000002
なお、上記において各種リポタンパクとは、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、レムナントリポタンパク、ｓｄＬＤＬ等をいう。以下、同様である。
【００２８】
また、測定対象となる酸化酵素の基質は、複数の反応を経て誘導されるものであってもよい。この場合、酸化酵素の基質へ変換される測定対象成分が、複数の反応を経て、酸化酵素の基質に変換された後、酸化酵素との反応により過酸化水素が生成される。この酸化酵素の基質へ変換される物質、酸化酵素の基質、及び、酸化酵素の組み合わせとしては、例えば第２表に示される組み合わせ等が挙げられる。
【００２９】
【表２】
2012081539.tif 000003
尚、総コレステロールは、全てのリポタンパク中の遊離型コレステロールとエステル型コレステロールとを合わせたものを意味し、各種リポタンパク中のコレステロールは、各種リポタンパク中の遊離型コレステロールとエステル型コレステロールとを合わせたものを意味し、総エステル型コレステロールは、全てのリポタンパク中のエステル型コレステロールを意味する。
【００３０】
試薬(B)は、検体中の測定対象成分を間接的に過酸化水素に変換する試薬である。試薬(B)が適用される測定対象成分は、例えば２つ以上の酵素反応により過酸化水素に変換されるような酵素の基質等が挙げられる。試薬(B)としては、例えば該基質と反応する酵素、該基質が変換されて生成する物質を対応する酸化酵素が存在する物質へ変換する酵素又は酵素とその基質、及び、該酸化酵素を含有する試薬等が挙げられる。測定対象成分と試薬(B)との組み合わせを第３表に示す。
【００３１】
【表３】
2012081539.tif 000004
試薬(C)は、測定対象成分から直接過酸化水素を生成させる試薬である。試薬(C)が適用される測定対象成分は、例えば過酸化水素を生成する酸化酵素等が挙げられる。試薬(C)としては、例えば該酸化酵素の基質を含有する試薬等が挙げられる。測定対象成分と試薬(C)との組み合わせの具体例を第４表に示す。
【００３２】
【表４】
2012081539.tif 000005
試薬(D)は、測定対象成分から間接的に過酸化水素を生成させる試薬である。試薬(D)が適用される測定対象成分は、例えば２つ以上の反応により過酸化水素を生成させるような酵素等が挙げられる。試薬(D)としては、例えば該酵素の基質、該酵素と該基質との反応により生成する物質を対応する酸化酵素が存在する物質へ変換する酵素又は酵素とその基質、及び、該酸化酵素を含有する試薬等が挙げられる。測定対象成分と試薬(D)との組み合わせの具体例を第５表に示す。
【００３３】
【表５】
2012081539.tif 000006
本発明において、酸化発色型色原体は、過酸化活性物質の存在下に、過酸化水素と反応し、色素が生成する。過酸化活性物質としては、例えばペルオキシダーゼ等が挙げられる。酸化発色型色原体としては、酸化カップリング型色原体、ロイコ型色原体等が挙げられ、ロイコ型色原体が好ましい。
【００３４】
ロイコ型色原体は、過酸化水素および過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。
【００３５】
ロイコ型色原体としては、例えばフェノチアジン系色原体、トリフェニルメタン系色原体、ジフェニルアミン系色原体、ｏ−フェニレンジアミン、ヒドロキシプロピオン酸、ジアミノベンジジン、テトラメチルベンジジン等が挙げられ、フェノチアジン系色原体が好ましい。
【００３６】
フェノチアジン系色原体としては、例えば１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、１０−Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ−６７）等が挙げられる。フェノチアジン系色原体の中でも、１０−Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ−６７）が特に好ましい。
【００３７】
トリフェニルメタン系色原体としては、例えばＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４’’−トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ−ＰＳ）等が挙げられる。
【００３８】
ジフェニルアミン系色原体としては、例えばＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。
【００３９】
酸化カップリング型色原体は、過酸化水素及び過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類（トリンダー試薬）との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等があげられる。
【００４０】
カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジン等があげられる。
【００４１】
アニリン類としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ビス（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）等があげられる。
【００４２】
フェノール類としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等があげられる。
【００４３】
本発明において、過酸化物とは、本発明の測定方法において、正の影響を与える物質であり、過酸化物を生成し得る界面活性剤に由来する過酸化物等が挙げられる。本発明において、過酸化物は検体由来の過酸化物であっても、測定試薬由来の過酸化物であってもよい。過酸化物を生成し得る界面活性剤としては、例えばポリオキシアルキレン系界面活性剤等が挙げられる。ポリオキシアルキレン系界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレン系界面活性剤、ポリオキシプロピレン系界面活性剤、ポリオキシブチレン系界面活性剤等が挙げられる。ポリオキシアルキレン系界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤等が挙げられ、非イオン性界面活性剤が好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体等が挙げられる。
【００４４】
過酸化物は、過酸化物価、カルボニル価、チオバルビツール酸価等の油脂酸化の指標により、検出、測定又は定量することができる。
【００４５】
本発明におけるα−ケト酸は、本発明の測定方法を可能とすることができる限りは特に制限はなく、例えばピルビン酸、オキサロ酢酸、α−ケトグルタル酸、シュウ酸等が挙げられ、ピルビン酸、オキサロ酢酸、α−ケトグルタル酸が好ましく、ピルビン酸が特に好ましい。本発明におけるα−ケト酸は、塩の形態でもよく、塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩等が挙げられる。
【００４６】
本発明の測定方法において使用されるα−ケト酸の濃度は、本発明の測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、例えば０．００１〜２０ｇ／Ｌである。
【００４７】
本発明の測定方法における、測定対象成分と過酸化水素生成試薬との反応は、水性媒体中で行われることが好ましい。また、測定対象成分と過酸化水素生成試薬との反応は、安定化剤、防腐剤、干渉物質消去剤、反応促進剤等を共存させて行うこともできる。
【００４８】
水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等があげられるが、緩衝液が好ましい。緩衝液のｐＨとしては、ｐＨ４．０〜１０．０であり、ｐＨ６．０〜８．０が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばリン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等があげられる。
【００４９】
グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等があげられる。
【００５０】
緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましい。
【００５１】
安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム、フェロシアン化カリウム、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等が挙げられる。干渉物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。反応促進剤としては、例えばコリパーゼ、ホスホリパーゼ等の酵素、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム等の塩類が挙げられる。
【００５２】
（２）測定対象成分の測定用試薬及び測定用キット
本発明の、検体中の測定対象成分の測定用試薬は、本発明の測定方法に用いられる試薬であり、過酸化水素生成試薬、α−ケト酸、過酸化活性物質及び酸化発色型色原体を含む。
【００５３】
本発明の、測定用試薬の具体的態様を以下に示す。
・測定用試薬１
過酸化水素生成試薬、α−ケト酸、過酸化活性物質及びロイコ型色原体を含む試薬。
・測定用試薬２
過酸化水素生成試薬、α−ケト酸、過酸化活性物質及びカップリング型色原体を含む試薬。
【００５４】
本発明の、検体中の測定対象成分の測定用試薬は、キットの形態で保存、流通、使用されてもよい。本発明の測定用キットは、本発明の測定方法に用いられ、２試薬系、３試薬系等のキットが挙げられ、２試薬系のキットが好ましい。
【００５５】
本発明の測定用キットについて、酸化発色型色原体としてロイコ型色原体を用いる２試薬系のキットの場合、ロイコ型色原体と過酸化活性物質がそれぞれ、第１試薬及び第２試薬の別々の試薬に含まれ、過酸化水素生成試薬及びα−ケト酸がそれぞれ、第１試薬及び第２試薬の一方又は両方に含まれるキット等が挙げられる。
【００５６】
また、本発明の測定用キットについて、酸化発色型色原体として酸化カップリング型色原体を用いる２試薬系のキットの場合、カップラーと、アニリン誘導体又はフェノール誘導体とがそれぞれ、第１試薬及び第２試薬の別々の試薬に含まれ、過酸化活性物質、過酸化水素生成試薬及びα−ケト酸がそれぞれ、第１試薬及び第２試薬の一方又は両方に含まれるキット等が挙げられる。
【００５７】
本発明の測定用キットの具体的態様を以下に記す。
・測定用キット１
第１試薬
ロイコ型色原体及びα−ケト酸を含む試薬。
第２試薬
過酸化活性物質及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
・測定用キット２
第１試薬
ロイコ型色原体、α−ケト酸及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
第２試薬
過酸化活性物質及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
・測定用キット３
第１試薬
ロイコ型色原体、α−ケト酸及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
第２試薬
過酸化活性物質、α−ケト酸及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
【００５８】
・測定用キット４
第１試薬
過酸化活性物質及びα−ケト酸を含む試薬。
第２試薬
ロイコ型色原体及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
・測定用キット５
第１試薬
過酸化活性物質、α−ケト酸及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
第２試薬
ロイコ型色原体及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
・測定用キット６
第１試薬
過酸化活性物質、α−ケト酸及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
第２試薬
ロイコ型色原体、α−ケト酸及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
【００５９】
・測定用キット７
第１試薬
カップラー及びα−ケト酸を含む試薬。
第２試薬
アニリン誘導体又はフェノール誘導体、過酸化活性物質、及び、過酸化水素生成試薬を含む試薬。
・測定用キット８
第１試薬
アニリン誘導体又はフェノール誘導体、及び、α−ケト酸を含む試薬。
第２試薬
カップラー、過酸化活性物質及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
【００６０】
・測定用キット９
第１試薬
カップラー、α−ケト酸及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
第２試薬
アニリン誘導体又はフェノール誘導体、過酸化活性物質、及び、過酸化水素生成試薬を含む試薬。
・測定用キット１０
第１試薬
アニリン誘導体又はフェノール誘導体、α−ケト酸、及び、過酸化水素生成試薬を含む試薬。
第２試薬
カップラー、過酸化活性物質及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
【００６１】
・測定用キット１１
第１試薬
カップラー、α−ケト酸及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
第２試薬
アニリン誘導体又はフェノール誘導体、過酸化活性物質、α−ケト酸、及び、過酸化水素生成試薬を含む試薬。
・測定用キット１２
第１試薬
アニリン誘導体又はフェノール誘導体、α−ケト酸、及び、過酸化水素生成試薬を含む試薬。
第２試薬
カップラー、過酸化活性物質、α−ケト酸及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
【００６２】
本発明の測定用試薬及び測定用キットにおける過酸化水素生成試薬としては、上記に示した、試薬(A)〜試薬(D)等が挙げられる。本発明の測定用試薬及び測定用キットにおけるα−ケト酸、過酸化活性物質及び酸化発色型色原体としては、上記（１）に記載したものが挙げられる。
【００６３】
本発明の測定用試薬及び測定用キットは、必要に応じて、安定化剤、防腐剤、干渉物質消去剤、反応促進剤等を含有してもよい。安定化剤、防腐剤、干渉物質消去剤、反応促進剤は上記（１）に記載したものが挙げられる。
【００６４】
（３）過酸化物の影響抑制方法
本発明の過酸化物の影響抑制方法は、検体中の測定対象成分を過酸化水素に変換し、生成した過酸化水素を酸化発色型色原体と反応させる、検体中の測定対象成分の測定方法において、生成した過酸化水素と酸化発色型色原体との反応をα−ケト酸存在下に行うことを特徴とする抑制方法である。
【００６５】
本発明の過酸化物の影響抑制方法における検体、測定対象成分、酸化発色型色原体、α−ケト酸としては、それぞれ、前述の検体、測定対象成分、酸化発色型色原体、α−ケト酸等が挙げられる。また、本発明の抑制方法によってその影響が抑制される過酸化物としては、例えば前述の過酸化物等が挙げられる。
本発明の過酸化物の影響抑制方法により、検体中の測定対象成分を正確に測定することができる。
【００６６】
本発明において、過酸化物の影響の抑制は、例えば以下の工程により評価することができる。
工程１：α−ケト酸を含む試薬［以下、試薬（＋）という］と、α−ケト酸を含まない試薬［以下、試薬（−）という］を調製する工程
工程２：検体と試薬（＋）とを反応させて、生成した色素の吸光度を測定する工程
工程３：検体と試薬（−）とを反応させて、生成した色素の吸光度を測定する工程
工程４：工程２で測定した吸光度と、工程３で測定した吸光度とを比較する工程。
【００６７】
上記工程４において、工程２で測定した吸光度、すなわち、試薬（＋）を用いた場合の吸光度が、工程３で測定した吸光度、すなわち、試薬（−）を用いた場合の吸光度に比較して低ければ、α−ケト酸によって過酸化物の影響が抑制されている、と評価することができる。
【００６８】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００６９】
尚、本実施例、比較例及び試験例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。
ＭＥＳ（同仁化学研究所社製）、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（同仁化学研究所社製）、ＡＤＡ（同仁化学研究所社製）、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ；東洋紡績社製）、ピルビン酸ナトリウム（関東化学社製）、α−ケトグルタル酸（関東化学社製）、オキサロ酢酸（関東化学社製）、ＤＡ−６７（和光純薬工業社製）、４−ＡＡ（埼京化成社製）、ＥＭＳＥ（ダイトーケミックス社製）、塩化カルシウム二水和物（和光純薬工業社製）、硫酸ナトリウム（関東化学社製）、硝酸ナトリウム（関東化学社製）、デシルトリメチルアンモニウム  ブロマイド（Ｃ１０ＴＭＡ；東京化成社製）、１−ドデシルピリジニウム  クロライド（東京化成社製）、グルコース（ＭＥＲＣＫ製）、フルクトシルＶＨＬＴＰＥ（フルクトシルヘキサペプチド；ペプチド研究所社製）、グルコース酸化酵素（ＧＯＤ；東洋紡績社製）、サーモリシン（プロテアーゼ；天野エンザイム社製）、アクチナーゼＥ（プロテアーゼ；科研製薬社製）、ＦＰＯＸ−ＣＥ（フルクトシルペプチド酸化酵素；キッコーマン社製）、ＦＰＯＸ−ＣＥＴ（フルクトシルペプチド酸化酵素；キッコーマン社製）、ディスパノールＴＯＣ（ポリオキシエチレントリデシルエーテル；日油社製）、ノニオンＥ２３０（ポリオキシエチレンオレイルエーテル；日油社製）。
【実施例１】
【００７０】
（１）ピルビン酸含有グルコース測定用キット
以下の組成からなるグルコース測定用キット（キットＡ）を調製した。
第１試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．２５）              ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                          ５０μｍｏｌ／Ｌ
ピルビン酸ナトリウム                ５ｇ／Ｌ
第２試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．２５）              ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＰＯＤ                              １０ｋＵ／Ｌ
ＧＯＤ                              ５ｋＵ／Ｌ【００７１】
（２）ピルビン酸非含有グルコース測定用キット
以下の組成からなるグルコース測定用キット（キットａ）を調製した。
第１試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．２５）              ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                          ５０μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．２５）              ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＰＯＤ                              １０ｋＵ／Ｌ
ＧＯＤ                              ５ｋＵ／Ｌ【００７２】
（３）過酸化物含有検体の調製
以下の４つの検体を調製した。
・検体１：グルコース及びディスパノールＴＯＣをそれぞれ９０μｍｏｌ／Ｌ、０％含有する水溶液
・検体２：グルコース及びディスパノールＴＯＣをそれぞれ９０μｍｏｌ／Ｌ、０．２５％含有する水溶液
・検体３：グルコース及びディスパノールＴＯＣをそれぞれ９０μｍｏｌ／Ｌ、０．５％含有する水溶液
・検体４：グルコース及びディスパノールＴＯＣをそれぞれ９０μｍｏｌ／Ｌ、１％含有する水溶液
ディスパノールＴＯＣは、ポリオキシエチレン系界面活性剤であり、過酸化物の生成源である。検体１〜４において、ディスパノールＴＯＣ濃度に依存して、過酸化物が多く含まれる。【００７３】
（４）ピルビン酸による、過酸化水素定量系における過酸化物の影響抑制効果の評価
上記（３）で調製した検体１（１．５μＬ）と、（１）で調製したキットＡの第１試薬（１５０μＬ）とを３７℃で５分間反応させて、吸光度（Ｅ１）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。次いで、キットＡの第２試薬（５０μＬ）を添加し、さらに３７℃で５分間反応させて、吸光度（Ｅ２）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。測定は、日立Ｈ７１８０にて行った。吸光度（Ｅ２）から吸光度（Ｅ１）を差し引いて、検体１の反応吸光度（Ｅ１Ａ）とした。【００７４】
次いで、検体１の代わりに生理食塩水を用いて同様の測定を行い、ブランク吸光度（Ｅブランク）とした。検体１の反応吸光度（Ｅ１Ａ）からブランク吸光度（Ｅブランク）を差し引き、検体１に対する吸光度（ΔＥ１Ａ）とした。【００７５】
検体１に対して行った一連の操作を、検体２〜４それぞれに対しても行い、検体２に対する吸光度（ΔＥ２Ａ）、検体３に対する吸光度（ΔＥ３Ａ）、検体４に対する吸光度の測定値（ΔＥ４Ａ）を決定した。検体１に対する吸光度（ΔＥ１Ａ）を１００とした時の、検体２〜４に対する吸光度（ΔＥ２Ａ〜ΔＥ４Ａ）の相対値を第６表に示す。【００７６】
さらに、（１）で調製したキットＡの代わりに、（２）で調製したキットａを用いる以外は、同様の方法を行い、検体１〜４それぞれに対する吸光度の相対値（ΔＥ１ａ〜ΔＥ４ａ)を決定した。検体１に対する吸光度（ΔＥ１ａ）を１００とした時の、検体２〜４に対する吸光度（ΔＥ２ａ〜ΔＥ４ａ）の相対値を第６表に示す。【００７７】
【表６】
2012081539.tif 000007
第６表から明らかな様に、ロイコ型色原体であるＤＡ−６７を用いるグルコース定量系において、ピルビン酸を含有するキットＡを用いた測定は、ピルビン酸を含有しないキットａを用いた測定に比較して、ディスパノールＴＯＣ由来の過酸化物による影響が顕著に抑制されており、より正確なグルコースの測定が可能であることが分かる。
【実施例２】
【００７８】
（１）ピルビン酸含有グルコース測定用キット
以下の組成からなるグルコース測定用キット（キットＢ）を調製した。
第１試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．２５）              ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                            ０．３ｇ／Ｌ
ピルビン酸ナトリウム                ５ｇ／Ｌ
第２試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．２５）              ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＰＯＤ                              １０ｋＵ／Ｌ
４−ＡＡ                            ０．１ｇ／Ｌ
ＧＯＤ                              ５ｋＵ／Ｌ【００７９】
（２）ピルビン酸非含有グルコース測定用キット
以下の組成からなるグルコース測定用キット（キットｂ）を調製した。
第１試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．２５）              ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                            ０．３ｇ／Ｌ
第２試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．２５）              ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＰＯＤ                              １０ｋＵ／Ｌ
４−ＡＡ                            ０．１ｇ／Ｌ
ＧＯＤ                              ５ｋＵ／Ｌ【００８０】
（３）過酸化物含有検体の調製
実施例１で調製した検体１〜４を用いた。【００８１】
（４）ピルビン酸による、過酸化水素定量系における過酸化物の影響抑制効果の評価
上記（３）で調製した検体１（１５μＬ）と、（１）で調製したキットＡの第１試薬（１５０μＬ）とを３７℃で５分間反応させて、吸光度（Ｅ１）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。次いで、キットＡの第２試薬（５０μＬ）を添加し、さらに３７℃で５分間反応させて、吸光度（Ｅ２）を主波長５４６ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。測定は、日立Ｈ７１８０にて行った。吸光度（Ｅ２）から吸光度（Ｅ１）を差し引いて、検体１の反応吸光度（Ｅ１Ｂ）とした。【００８２】
次いで、検体１の代わりに生理食塩水を用いて同様の測定を行い、ブランク吸光度（Ｅブランク）とした。検体１の反応吸光度（Ｅ１Ｂ）からブランク吸光度（Ｅブランク）を差し引き、検体１に対する吸光度（ΔＥ１Ｂ）とした。【００８３】
検体１に対して行った一連の操作を、検体２〜４それぞれに対しても行い、検体２に対する吸光度（ΔＥ２Ｂ）、検体３に対する吸光度（ΔＥ３Ｂ）、検体４に対する吸光度の測定値（ΔＥ４Ｂ）を決定した。検体１に対する吸光度（ΔＥ１Ｂ）を１００とした時の、検体２〜４に対する吸光度（ΔＥ２Ｂ〜ΔＥ４Ｂ）の相対値を第７表に示す。【００８４】
さらに、（１）で調製したキットＢの代わりに、（２）で調製したキットｂを用いる以外は、同様の方法を行い、検体１〜４それぞれに対する吸光度の相対値（ΔＥ１ｂ〜ΔＥ４ｂ)を決定した。検体１に対する吸光度（ΔＥ１ｂ）を１００とした時の、検体２〜４に対する吸光度（ΔＥ２ｂ〜ΔＥ４ｂ）の相対値を第７表に示す。【００８５】
【表７】
2012081539.tif 000008
第７表から明らかな様に、カップリング型色原体である４−ＡＡとＥＭＳＥとの組み合わせを用いるグルコース定量系において、ピルビン酸を含有するキットＢを用いた測定は、ピルビン酸を含有しないキットｂを用いた測定に比較して、ディスパノールＴＯＣ由来の過酸化物による影響が顕著に抑制されており、より正確なグルコースの測定が可能であることが分かる。
【実施例３】
【００８６】
（１）ピルビン酸含有フルクトシルＶＨＬＴＰＥ測定用キット
以下の組成からなるフルクトシルＶＨＬＴＰＥ測定用キット（キットＣ）を調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム二水和物              １０ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸ナトリウム                      ７．５ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１０ＴＭＡ                        １７ｇ／Ｌ
ＤＡ−６７                          ２０μｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                        １２００ｋＵ／Ｌ
ピルビン酸ナトリウム                ５ｇ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＰＯＤ                              １２０ｋＵ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                      １２ｋＵ／Ｌ【００８７】
（２）ピルビン酸非含有フルクトシルＶＨＬＴＰＥ測定用キット
以下の組成からなるフルクトシルＶＨＬＴＰＥ測定用キット（キットｃ）を調製した。
第１試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム二水和物              １０ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸ナトリウム                      ７．５ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｃ１０ＴＭＡ                        １７ｇ／Ｌ
ＤＡ−６７                          ２０μｍｏｌ／Ｌ
サーモリシン                        １２００ｋＵ／Ｌ
第２試薬
ＡＤＡ（ｐＨ７．０）                ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＰＯＤ                              １２０ｋＵ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥ                      １２ｋＵ／Ｌ【００８８】
（３）過酸化物含有検体の調製
以下の４つの検体を調製した。
・検体１：フルクトシルＶＨＬＴＰＥ及びディスパノールＴＯＣをそれぞれ１８μｍｏｌ／Ｌ、０％含有する水溶液
・検体２：フルクトシルＶＨＬＴＰＥ及びディスパノールＴＯＣをそれぞれ１８μｍｏｌ／Ｌ、０．０５％含有する水溶液
・検体３：フルクトシルＶＨＬＴＰＥ及びディスパノールＴＯＣをそれぞれ１８μｍｏｌ／Ｌ、０．１％含有する水溶液
・検体４：フルクトシルＶＨＬＴＰＥ及びディスパノールＴＯＣをそれぞれ１８μｍｏｌ／Ｌ、０．２％含有する水溶液
ディスパノールＴＯＣは、ポリオキシエチレン系界面活性剤であり、過酸化物の生成源である。検体１〜４において、ディスパノールＴＯＣ濃度に依存して、過酸化物が多く含まれる。【００８９】
（４）ピルビン酸による、過酸化水素定量系における過酸化物の影響抑制効果の評価
上記（３）で調製した検体１（９．６μＬ）と、（１）で調製したキットＣの第１試薬（１２０μＬ）とを３７℃で５分間反応させて、吸光度（Ｅ１）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。次いで、キットＣの第２試薬（４０μＬ）を添加し、さらに３７℃で５分間反応させて、吸光度（Ｅ２）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。測定は、日立Ｈ７１８０にて行った。吸光度（Ｅ２）から吸光度（Ｅ１）を差し引いて、検体１の反応吸光度（Ｅ１Ｃ）とした。【００９０】
次いで、検体１の代わりに生理食塩水を用いて同様の測定を行い、ブランク吸光度（Ｅブランク）とした。検体１の反応吸光度（Ｅ１Ｃ）からブランク吸光度（Ｅブランク）を差し引き、検体１に対する吸光度（ΔＥ１Ｃ）とした。
検体１に対して行った一連の操作を、検体２〜４それぞれに対しても行い、検体２に対する吸光度（ΔＥ２Ｃ）、検体３に対する吸光度（ΔＥ３Ｃ）、検体４に対する吸光度の相対値（ΔＥ４Ｃ）を決定した。検体１に対する吸光度（ΔＥ１Ｃ）を１００とした時の、検体２〜４に対する吸光度（ΔＥ２Ｃ〜ΔＥ４Ｃ）の相対値を第８表に示す。【００９１】
さらに、（１）で調製したキットＣの代わりに、（２）で調製したキットｃを用いる以外は、同様の方法を行い、検体１〜４それぞれに対する吸光度の相対値（ΔＥ１ｃ〜ΔＥ４ｃ)を決定した。検体１に対する吸光度（ΔＥ１ｃ）を１００とした時の、検体２〜４に対する吸光度（ΔＥ２ｃ〜ΔＥ４ｃ）の相対値を第８表に示す。【００９２】
【表８】
2012081539.tif 000009
第８表から明らかな様に、ロイコ型色原体であるＤＡ−６７を用いるフルクトシルＶＨＬＴＰＥ定量系において、ピルビン酸を含有するキットＣを用いた測定は、ピルビン酸を含有しないキットｃを用いた測定に比較して、ディスパノールＴＯＣ由来の過酸化物による影響が顕著に抑制されており、より正確なフルクトシルＶＨＬＴＰＥの測定が可能であることが分かる。
【実施例４】
【００９３】
グルコース測定系における、α−ケト酸による、試薬中の過酸化物の影響軽減効果の検討
（１）ピルビン酸含有グルコース測定用キット
以下の組成からなるグルコース測定用キット（キットＤ１〜Ｄ３）を調製した。キットＤ１は、第１試薬中のノニオンＥ２３０濃度が０％のキットを、キットＤ２は、第１試薬中のノニオンＥ２３０濃度が０．０２％のキットを、キットＤ３は、第１試薬中のノニオンＥ２３０濃度が０．１％のキットを表す。
第１試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．５）                ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                            ０．３ｇ／Ｌ
ノニオンＥ２３０                    ０，０．０２又は０．１％
ピルビン酸ナトリウム                ５ｇ／Ｌ
第２試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．５）                ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−ＡＡ                            ０．１ｇ／Ｌ
ＰＯＤ                              ４０ｋＵ／Ｌ
ＧＯＤ                              １００ｋＵ／Ｌ【００９４】
（２）α−ケトグルタル酸含有グルコース測定用キット
以下の組成からなるグルコース測定用キット（キットＥ１〜Ｅ３）を調製した。キットＥ１は、第１試薬中のノニオンＥ２３０濃度が０％のキットを、キットＥ２は、第１試薬中のノニオンＥ２３０濃度が０．０２％のキットを、キットＥ３は、第１試薬中のノニオンＥ２３０濃度が０．１％のキットを表す。
第１試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．５）                ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                            ０．３ｇ／Ｌ
ノニオンＥ２３０                    ０，０．０２又は０．１％
α−ケトグルタル酸                  １ｇ／Ｌ
第２試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．５）                ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−ＡＡ                            ０．１ｇ／Ｌ
ＰＯＤ                              ４０ｋＵ／Ｌ
ＧＯＤ                              １００ｋＵ／Ｌ【００９５】
（３）オキサロ酢酸含有グルコース測定用キット
以下の組成からなるグルコース測定用キット（キットＦ１〜Ｆ３）を調製した。キットＦ１は、第１試薬中のノニオンＥ２３０濃度が０％のキットを、キットＦ２は、第１試薬中のノニオンＥ２３０濃度が０．０２％のキットを、キットＦ３は、第１試薬中のノニオンＥ２３０濃度が０．１％のキットを表す。
第１試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．５）                ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                            ０．３ｇ／Ｌ
ノニオンＥ２３０                    ０，０．０２又は０．１％
オキサロ酢酸                        ０．２ｇ／Ｌ
第２試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．５）                ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−ＡＡ                            ０．１ｇ／Ｌ
ＰＯＤ                              ４０ｋＵ／Ｌ
ＧＯＤ                              １００ｋＵ／Ｌ【００９６】
（４）α−ケト酸非含有グルコース測定用キット
以下の組成からなるグルコース測定用キット（キットｄ１〜ｄ３）を調製した。キットｄ１は、第１試薬中のノニオンＥ２３０濃度が０％のキットを、キットｄ２は、第１試薬中のノニオンＥ２３０濃度が０．０２％のキットを、キットｄ３は、第１試薬中のノニオンＥ２３０濃度が０．１％のキットを表す。
第１試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．５）                ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                            ０．３ｇ／Ｌ
ノニオンＥ２３０                    ０，０．０２又は０．１％
第２試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．５）                ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−ＡＡ                            ０．１ｇ／Ｌ
ＰＯＤ                              ４０ｋＵ／Ｌ
ＧＯＤ                              １００ｋＵ／Ｌ【００９７】
（５）ピルビン酸による過酸化物の影響抑制効果の評価
生理食塩水（２．０μＬ）と、（１）で調製したキットＤ１の第１試薬（１８０μＬ）とを３７℃で５分間反応させて、吸光度（Ｅ１）を主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。次いで、キットＤ１の第２試薬（６０μＬ）を添加し、さらに３７℃で５分間反応させて、吸光度（Ｅ２）を主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。測定は、日立Ｈ７１７０にて行った。吸光度（Ｅ２）から吸光度（Ｅ１）を差し引いて、生理食塩水のブランク吸光度（ＥＤ１）とした。【００９８】
次いで、キットＤ１の代わりにキットＤ２を用いて同様の測定を行い、生理食塩水のブランク吸光度（ＥＤ２）を算出した。
さらに、キットＤ１の代わりにキットＤ３を用いて同様の測定を行い、生理食塩水のブランク吸光度（ＥＤ３）を算出した。【００９９】
キットＤ１のブランク吸光度（ΔＥＤ１）を０として、ブランク吸光度（ＥＤ２）からブランク吸光度（ＥＤ１）を差し引いて、キットＤ２のブランク吸光度（ΔＥＤ２）とした。同様に、ブランク吸光度（ＥＤ３）からブランク吸光度（ＥＤ１）を差し引いて、キットＤ３のブランク吸光度（ΔＥＤ３）とした。キットＤ１〜キットＤ３のそれぞれのキットのブランク吸光度（ΔＥＤ１〜ΔＥＤ３）を第９表に示す。【０１００】
（６）α−ケトグルタル酸による過酸化物の影響抑制効果の評価
キットＤ１〜Ｄ３の代わりに、上記（２）で調製したα−ケトグルタル酸を含有するキットＥ１〜Ｅ３をそれぞれ用いる以外は（５）と同様の方法により、キットＥ１〜Ｅ３のそれぞれのキットのブランク吸光度（ΔＥＥ１〜ΔＥＥ３）を算出した。キットＥ１〜キットＥ３のそれぞれのキットのブランク吸光度（ΔＥＥ１〜ΔＥＥ３）を第９表に示す。【０１０１】
（７）オキサロ酢酸による過酸化物の影響抑制効果の評価
キットＤ１〜Ｄ３の代わりに、上記（３）で調製したオキサロ酢酸を含有するキットＦ１〜Ｆ３をそれぞれ用いる以外は（５）と同様の方法により、キットＦ１〜Ｆ３のそれぞれのキットのブランク吸光度（ΔＥＦ１〜ΔＥＦ３）を算出した。キットＦ１〜キットＦ３のそれぞれのキットのブランク吸光度（ΔＥＦ１〜ΔＥＦ３）を第９表に示す。【０１０２】
（８）α−ケト酸非含有キットを用いた過酸化物の影響抑制効果の評価
キットＤ１〜Ｄ３の代わりに、上記（４）で調製したα−ケト酸を含有しないキットｄ１〜ｄ３をそれぞれ用いる以外は（５）と同様の方法により、キットｄ１〜ｄ３のそれぞれのキットのブランク吸光度（ΔＥｄ１〜ΔＥｄ３）を算出した。キットｄ１〜キットｄ３のそれぞれのキットのブランク吸光度（ΔＥｄ１〜ΔＥｄ３）を第９表に示す。【０１０３】
【表９】
2012081539.tif 000010
第９表から明らかな様に、α−ケト酸として、ピルビン酸、α−ケトグルタル酸又はオキサロ酢酸を含有するキットを用いた場合には、α−ケト酸を含有しないキットに比較して、ノニオンＥ２３０濃度が高くなった場合でも、ブランク吸光度が顕著に低くなっていることが判明した。ノニオンＥ２３０は、過酸化物を生成し易い界面活性剤である。従って、α−ケト酸により、ノニオンＥ２３０に起因する過酸化物の影響が顕著に抑制され、より正確なグルコースの測定が可能であることが判明した。
【実施例５】
【０１０４】
ヘモグロビンＡ１ｃ測定系における、α−ケト酸による、試薬中の過酸化物の影響抑制効果の検討
（１）ピルビン酸含有ヘモグロビンＡ１ｃ測定用キット
以下の組成からなるヘモグロビンＡ１ｃ測定用キット（キットＧ）を調製した。
第１試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．５）                  ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム二水和物                １０ｍｍｏｌ／Ｌ
硝酸ナトリウム                        １００ｍｍｏｌ／Ｌ
１−ドデシルピリジニウム  クロライド  １．４ｇ／Ｌ
アクチナーゼＥ                        ３４０ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                            ３０μｍｏｌ／Ｌ
ノニオンＥ２３０                      ０．０１％
ピルビン酸ナトリウム                  ２ｇ／Ｌ
第２試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）        ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥＴ                      ６ｋＵ／Ｌ
ＰＯＤ                                １２０ｋＵ／Ｌ【０１０５】
（２）α−ケトグルタル酸含有ヘモグロビンＡ１ｃ測定用キット
以下の組成からなるヘモグロビンＡ１ｃ測定用キット（キットＨ）を調製した。
第１試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．５）                  ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム二水和物                １０ｍｍｏｌ／Ｌ
硝酸ナトリウム                        １００ｍｍｏｌ／Ｌ
１−ドデシルピリジニウム  クロライド  １．４ｇ／Ｌ
アクチナーゼＥ                        ３４０ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                            ３０μｍｏｌ／Ｌ
ノニオンＥ２３０                      ０．０１％
α−ケトグルタル酸                    ０．３ｇ／Ｌ
第２試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）        ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥＴ                      ６ｋＵ／Ｌ
ＰＯＤ                                １２０ｋＵ／Ｌ【０１０６】
（３）オキサロ酢酸含有ヘモグロビンＡ１ｃ測定用キット
以下の組成からなるヘモグロビンＡ１ｃ測定用キット（キットＩ）を調製した。
第１試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．５）                  ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム二水和物                １０ｍｍｏｌ／Ｌ
硝酸ナトリウム                        １００ｍｍｏｌ／Ｌ
１−ドデシルピリジニウム  クロライド  １．４ｇ／Ｌ
アクチナーゼＥ                        ３４０ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                            ３０μｍｏｌ／Ｌ
ノニオンＥ２３０                      ０．０１％
オキサロ酢酸                          ０．３ｇ／Ｌ
第２試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）        ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥＴ                      ６ｋＵ／Ｌ
ＰＯＤ                                １２０ｋＵ／Ｌ【０１０７】
（４）α−ケト酸非含有ヘモグロビンＡ１ｃ測定用キット
以下の組成からなるヘモグロビンＡ１ｃ測定用キット（キットｅ）を調製した。
第１試薬
ＭＥＳ（ｐＨ６．５）                  ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム二水和物                １０ｍｍｏｌ／Ｌ
硝酸ナトリウム                        １００ｍｍｏｌ／Ｌ
１−ドデシルピリジニウム  クロライド  １．４ｇ／Ｌ
アクチナーゼＥ                        ３４０ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７                            ３０μｍｏｌ／Ｌ
ノニオンＥ２３０                      ０．０１％
第２試薬
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）        ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＦＰＯＸ−ＣＥＴ                      ６ｋＵ／Ｌ
ＰＯＤ                                １２０ｋＵ／Ｌ【０１０８】
（５）ピルビン酸による過酸化物の影響抑制効果の評価
ヘモグロビンＡ１ｃ濃度が３．２，４．０，４．９，５．６，６．５，７．６，９．７μｍｏｌ／Ｌである各血球、及び、生理食塩水（ヘモグロビンＡ１ｃ濃度：０μｍｏｌ／Ｌ）を検体として用いた。【０１０９】
各検体（１２μＬ）と、（１）で調製したピルビン酸を含有するキットＧの第１試薬（１５０μＬ）とを３７℃で５分間反応させて、吸光度（Ｅ１）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。次いで、キットＧの第２試薬（５０μＬ）を添加し、さらに３７℃で５分間反応させて、吸光度（Ｅ２）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。測定は、日立Ｈ７１７０にて行った。吸光度（Ｅ２）から吸光度（Ｅ１）を差し引いて、キットＧにおける各検体の反応吸光度（ＥＧ）とした。【０１１０】
α−ケト酸を含有しない上記（４）のキットｅを用いて同様に算出した、キットｅにおける各検体の反応吸光度（Ｅｅ）を対照とした。キットＧにおける各検体の反応吸光度（ＥＧ）及びキットｅにおける各検体の反応吸光度（Ｅｅ）を図１に示す。【０１１１】
（６）α−ケトグルタル酸による過酸化物の影響抑制効果の評価
キットＧの代わりに、上記（２）で調製したα−ケトグルタル酸を含有するキットＨを用いる以外は（５）と同様の方法により、キットＨにおける各検体の反応吸光度（ΔＥＨ）を算出した。キットＨにおける各検体の反応吸光度（ＥＨ）及びキットｅにおける各検体の反応吸光度（Ｅｅ）を図２に示す。【０１１２】
（７）オキサロ酢酸による過酸化物の影響抑制効果の評価
キットＧの代わりに、上記（３）で調製したオキサロ酢酸を含有するキットＩを用いる以外は（５）と同様の方法により、キットＩにおける各検体の反応吸光度（ΔＥＩ）を算出した。キットＩにおける各検体の反応吸光度（ＥＩ）及びキットｅにおける各検体の反応吸光度（Ｅｅ）を図３に示す。【０１１３】
図１〜図３から明らかな様に、α−ケト酸を含有しないキットを用いた測定においては、検体として生理食塩水を用いた場合には、ブランクとして、過酸化物由来の発色による吸光度が得られた。また、検体として、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度３．２μｍｏｌ／Ｌの血球を用いた場合には、ブランクの吸光度よりも低い吸光度が得られた。これは、血球中に含まれるヘモグロビンの還元作用により、過酸化物、及び、ヘモグロビンＡ１ｃ由来の過酸化水素が消去されたことによる、と考えられる。【０１１４】
一方、α−ケト酸を含有するキットを用いた測定においては、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度３．２μｍｏｌ／Ｌの血球を用いた場合でも吸光度の減少は見られず、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度と吸光度との間に良好な直線性が認められた。これは、α−ケト酸が過酸化物と相互作用し、過酸化物が消去される一方、α−ケト酸は過酸化水素とは相互作用せず、ヘモグロビンＡ１ｃ由来の過酸化水素は消去されないことによる、と考えられる。【０１１５】
この様に、ピルビン酸、α−ケトグルタル酸又はオキサロ酢酸を含有するキットを用いた測定においては、ノニオンＥ２３０由来の過酸化物の影響が抑制され、より正確なヘモグロビンＡ１ｃ濃度の測定が可能となることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明により、過酸化水素定量系における過酸化物の影響が抑制された検体中の測定対象成分の測定方法、測定用試薬、及び、測定用キット、並びに、過酸化物の影響抑制方法が提供される。本発明は、臨床診断等に有用である。
【図１】
2012081539.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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