(57)【要約】  本発明は、コラーゲン産生促進効果、ヒアルロン酸産生促進効果、線維芽細胞増殖促進効果、およびシワ改善効果に優れた植物種子の有機溶媒抽出物の処理物を提供する。本発明にかかるコラーゲン産生促進剤は、ヒノキ科（Cupressaceae）コノテガシワ属（Platycladus）に属する植物の種子を有機溶媒を用いて抽出して油性成分を含有する抽出物を得て、該抽出物の溶媒の一部または全部を留去した後、濃度０．５〜１５Ｎのアルカリ水溶液を添加、混合し、次いで酸処理後、水洗して得られることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒノキ科（Cupressaceae）コノテガシワ属（Platycladus）に属する植物の種子を有機溶媒を用いて抽出して油性成分を含有する抽出物を得て、該抽出物の溶媒の一部または全部を留去した後、濃度０．５〜１５Ｎのアルカリ水溶液を添加、混合し、次いで酸処理後、水洗して得られることを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
【請求項２】
ヒノキ科（Cupressaceae）コノテガシワ属（Platycladus）に属する植物の種子を有機溶媒を用いて抽出して油性成分を含有する抽出物を得て、該抽出物の溶媒の一部または全部を留去した後、濃度０．５〜１５Ｎのアルカリ水溶液を添加、混合し、次いで酸処理後、水洗して得られることを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項３】
ヒノキ科（Cupressaceae）コノテガシワ属（Platycladus）に属する植物の種子を有機溶媒を用いて抽出して油性成分を含有する抽出物を得て、該抽出物の溶媒の一部または全部を留去した後、濃度０．５〜１５Ｎのアルカリ水溶液を添加、混合し、次いで酸処理後、水洗して得られることを特徴とする線維芽細胞増殖促進剤。
【請求項４】
ヒノキ科（Cupressaceae）コノテガシワ属（Platycladus）に属する植物の種子を有機溶媒を用いて抽出して油性成分を含有する抽出物を得て、該抽出物の溶媒の一部または全部を留去した後、濃度０．５〜１５Ｎのアルカリ水溶液を添加、混合し、次いで酸処理後、水洗して得られることを特徴とする抗シワ剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の促進剤または抗シワ剤において、添加する純アルカリ量が１００〜３００ｇ／Ｌ抽出物であることを特徴とする促進剤または抗シワ剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の促進剤または抗シワ剤において、ヒノキ科コノテガシワ属に属する植物が、コノテガシワ（Platycladus  orientalis）であることを特徴とする促進剤または抗シワ剤。
【請求項７】
請求項１に記載のコラーゲン産生促進剤を塗布することを特徴とするコラーゲン産生促進方法。
【請求項８】
請求項２に記載のヒアルロン酸産生促進剤を塗布することを特徴とするヒアルロン酸産生促進方法。
【請求項９】
請求項３に記載の線維芽細胞増殖促進剤を塗布することを特徴とする線維芽細胞増殖促進方法。
【請求項１０】
請求項４に記載の抗シワ剤を塗布することを特徴とするシワ改善方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２０１０年１０月２７日付け出願の日本国特許出願２０１０−２４０６７４号の優先権を主張しており、ここに折り込まれるものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明はコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、線維芽細胞増殖促進剤、および抗シワ剤に関し、特にコラーゲン産生促進効果等に優れた、植物種子の有機溶媒抽出物の処理物に関する。
【背景技術】
【０００３】
皮膚は外側から角層、表皮、基底膜および真皮より構成されている。
真皮はその中でも最も領域の広い部分であり、表皮ほど細胞が密に詰まっていない。むしろ細胞外空間が多く、「細胞外マトリックス」と呼ばれる巨大分子の網目構造によって満たされている。この細胞外マトリックスは、真皮内の線維芽細胞等において産生され、ヒアルロン酸やデルマタン硫酸等の酸性ムコ多糖と呼ばれる多糖類と、コラーゲン、エラスチン等の線維性タンパク質で構成されている。細胞外マトリックスは、皮膚の弾力性、はり、みずみずしさ、新陳代謝等に直接的に関わっている。線維芽細胞等における細胞外マトリックスの産生が鈍ると、皮膚の弾力性やみずみずしさが失われ、肌荒れが発生しやすくなり、皮膚老化がもたらされる一因になる。【０００４】
上記線維性タンパク質は主にコラーゲンからなり、その中でもＩ型コラーゲンが全体の８０％を占める。Ｉ型コラーゲンのほかにはIII、Ｖ、XII、およびXIV型コラーゲンの存在が知られている。老化皮膚に見られるたるみの成因の一つは、皮膚組織が加齢に伴い菲薄化することによる。老化した皮膚では、真皮の主要なマトリックス成分であるコラーゲン線維の減少が著しく、このことが皮膚の厚さを薄くする主たる原因となっている可能性が高い。したがって、コラーゲンの産生を促進させてコラーゲン量を維持することが、たるみの予防・改善に有効であると考えられる。
またコラーゲンの産生促進は、上記以外にも、皮膚の創傷治癒の改善のほか、骨粗しょう症、関節炎、腱鞘炎等の治療、高血圧の防止等にも有効である。
これまでコラーゲン産生促進剤としては、水のみを抽出溶媒として、ハクシジン（コノテガシワの種子を乾燥させたもの）から抽出された生薬抽出物を含むコラーゲン産生促進剤が知られている（例えば特許文献１参照）。しかし、該生薬抽出物のコラーゲン産生促進効果には、改善の余地があった。【０００５】
一方、上記多糖類中のヒアルロン酸は、細胞間隙への水分の保持、組織内にジェリー状のマトリックスを形成することに基づく細胞の保持、組織の潤滑性と柔軟性の保持、機械的障害等の外力に対する抵抗、および細菌感染の防止等、多くの機能を有している。昨今、癌転移との関連についても多くの研究がなされている。
また、ヒアルロン酸は皮膚のほか、関節液、硝子体、靱帯等、生体に広く分布している。このため、ヒアルロン酸の産生促進は、保湿効果向上に加え、関節痛（変形性膝関節症）治療、皮膚のたるみ改善、ドライアイを主とした角結膜上皮障害治療、白内障・角膜移植手術時における前房保持等にも有効である。
これまでヒアルロン酸産生促進剤としては、ダービリア科ダービリア属に属する海藻の抽出物を有効成分として含有するヒアルロン酸産生促進剤が知られている（例えば特許文献２参照）。【０００６】
このようにコラーゲン、ヒアルロン酸は、肌のたるみ、肌荒れ等の改善・防止、皮膚老化の防止のほか、膝関節症の改善剤や眼科手術用製剤等に適用し得る。このため、コラーゲン、ヒアルロン酸の両者の産生促進効果のある物質が見出せれば、上記の症状改善や予防・治療等に広く適用することができるという利点がある。【０００７】
一方、特許文献３には、Thuja属植物、Rubus属植物、Vaccinium属植物、Actinidia属植物およびPerilla属植物の中から選ばれる植物の種子を抽出して植物抽出物とし、次いで該植物抽出物にアルカリ処理を施して得られる植物性美白剤の製造方法が知られている。
しかし、コノテガシワ有機溶媒抽出物の処理物が優れたコラーゲン産生促進効果およびヒアルロン酸産生促進効果を有することは、知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−２３５４８２号公報
【特許文献２】特開平９−１７６０３６号公報
【特許文献３】特開２００７−２２３９４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は前記従来技術に鑑みなされたものであり、その目的はコラーゲン産生促進効果およびヒアルロン酸産生促進効果等に優れた植物種子の有機溶媒抽出物の処理物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するために、本発明者らが鋭意検討を行った結果、ヒノキ科（Cupressaceae）コノテガシワ属（Platycladus）に属する植物の種子を有機溶媒を用いて抽出して油性成分を含有する抽出物を得て、該抽出物をアルカリ処理および酸処理後、水洗した処理物が、優れたコラーゲン産生促進効果等を有することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明にかかるコラーゲン産生促進剤は、ヒノキ科（Cupressaceae）コノテガシワ属（Platycladus）に属する植物の種子を有機溶媒を用いて抽出して油性成分を含有する抽出物を得て、該抽出物の溶媒の一部または全部を留去した後、濃度０．５〜１５Ｎのアルカリ水溶液を添加、混合し、次いで酸処理後、水洗して得られることを特徴とする。
本発明にかかるヒアルロン酸産生促進剤は、ヒノキ科（Cupressaceae）コノテガシワ属（Platycladus）に属する植物の種子を有機溶媒を用いて抽出して油性成分を含有する抽出物を得て、該抽出物の溶媒の一部または全部を留去した後、濃度０．５〜１５Ｎのアルカリ水溶液を添加、混合し、次いで酸処理後、水洗して得られることを特徴とする。
本発明にかかる線維芽細胞増殖促進剤は、ヒノキ科（Cupressaceae）コノテガシワ属（Platycladus）に属する植物の種子を有機溶媒を用いて抽出して油性成分を含有する抽出物を得て、該抽出物の溶媒の一部または全部を留去した後、濃度が０．５〜１５Ｎのアルカリ水溶液を添加、混合し、次いで酸処理後、水洗して得られることを特徴とする。
本発明にかかる抗シワ剤は、ヒノキ科（Cupressaceae）コノテガシワ属（Platycladus）に属する植物の種子を有機溶媒を用いて抽出して油性成分を含有する抽出物を得て、該抽出物の溶媒の一部または全部を留去した後、濃度０．５〜１５Ｎのアルカリ水溶液を添加、混合し、次いで酸処理後、水洗して得られることを特徴とする。
前記促進剤または抗シワ剤において、添加する純アルカリ量が１００〜３００ｇ／Ｌ抽出物であることが好適である。
前記促進剤または前記抗シワ剤において、ヒノキ科コノテガシワ属に属する植物が、コノテガシワ（Platycladus  orientalis）であることが好適である。【００１２】
本発明にかかるコラーゲン産生促進方法は、前記コラーゲン産生促進剤を塗布することを特徴とする。
本発明にかかるヒアルロン酸産生促進方法は、前記ヒアルロン酸産生促進剤を塗布することを特徴とする。
本発明にかかる線維芽細胞増殖促進方法は、前記線維芽細胞増殖促進剤を塗布することを特徴とする。
本発明にかかるシワ改善方法は、前記抗シワ剤を塗布することを特徴とする。
本発明にかかるコラーゲン産生促進方法は、前記コラーゲン産生促進剤を経口摂取することを特徴とする。
本発明にかかるヒアルロン酸産生促進方法は、前記ヒアルロン酸産生促進剤を経口摂取することを特徴とする。
本発明にかかる線維芽細胞増殖促進方法は、前記線維芽細胞増殖促進剤を経口摂取することを特徴とする。
本発明にかかるシワ改善方法は、前記抗シワ剤を経口摂取することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、線維芽細胞増殖促進剤、抗シワ剤として有用な植物種子の有機溶媒抽出物の処理物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】コノテガシワ種子の水抽出物と、該種子の有機溶媒抽出物の処理物との、コラーゲン産生促進効果の比較を示す図である。
【図２】コノテガシワ種子の有機溶媒抽出物の処理物のシワ改善効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明にかかるコラーゲン産生促進剤は、ヒノキ科（Cupressaceae）コノテガシワ属（Platycladus）に属する植物の種子を有機溶媒を用いて抽出して油性成分を含有する抽出物を得て、該抽出物の溶媒の一部または全部を留去した後、濃度０．５〜１５Ｎのアルカリ水溶液を添加、混合し、次いで酸処理後、水洗して得られることを特徴とする。
【００１６】
本発明で用いられる植物の種子は、ヒノキ科コノテガシワ属に属する植物の種子である。このうち、コノテガシワ（Platycladus  orientalis）の種子を用いることが好ましい。
コノテガシワは、中国、朝鮮半島の原産で、約２５０年前に日本に渡来し、現在は各地で植栽される樹高５〜１５ｍの常用低木または小高木である。
コノテガシワの種子は、黒褐色の長卵球形をしており、「柏子仁（ハクシニン）」とも呼ばれている。中医学で汎用されており、滋養強壮や消炎等に用いられている。
【００１７】
抽出物の具体的な抽出方法、アルカリ処理方法、酸処理方法は、例えば以下の方法を用いることができる。
【００１８】
ヒノキ科植物の種子の質量に対し、１〜１００倍、好ましくは１〜３０倍程度の質量の有機溶媒で一定期間抽出を行う。用いる種子は必要に応じて適度に粉砕することも可能であるが、ろ過時に目詰まりが問題となる場合等では未粉砕のまま用いても良い。
また、少量の有機溶媒で繰り返し抽出することも可能であり、ソックスレーのような還流装置を用いても良い。
【００１９】
抽出に用いる有機溶媒は、通常抽出に用いられる有機溶媒であれば特に限定されないが、揮発性有機溶媒であることが好ましい。
有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール等のアルコール類、含水アルコール類、アセトン、酢酸エチルエステル、ヘキサン、エーテル等の極性・非極性有機溶媒を、単独あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。この中でも、アセトン、酢酸エチル、ヘキサンは低価格であり、減圧濃縮が容易な点で特に好ましい。その他、超臨界炭酸ガスによる抽出や種子を圧搾し、搾汁を用いることもできる。
これに対して、水を含む抽出溶媒は、活性成分の抽出が抑制されるので好ましくない。
【００２０】
上記のようにして得られた抽出物から有機溶媒を除去した後、アルカリ処理を行う。
アルカリ処理の方法は特に限定されないが、例えば、有機溶媒抽出物の溶媒の一部または全部を留去した後、濃度０．５〜１５Ｎ、好ましくは１〜１０Ｎのアルカリ水溶液を添加、混合する方法により、得ることができる。
【００２１】
より具体的に言うと、例えば、溶媒留去後の抽出物に対し、０．２〜２倍容量の濃アルカリ水溶液を添加した後、充分撹拌混合し、３０分〜数日程度熟成を行う。濃アルカリ水溶液としては、０．５〜１５Ｎ、好ましくは１〜１０Ｎの濃度のＮａＯＨ、ＫＯＨ等からなる水溶液が挙げられる。なお、純アルカリ量が１００〜３００ｇ／Ｌ抽出物となるように濃アルカリ水溶液を添加することが好ましい。
混合の際の温度としては、室温〜７０℃の範囲が好ましく、３０〜６０℃の範囲がさらに好ましい。熟成時には親水性成分と親油性成分が分離しないように、適宜撹拌を行うことが望ましい。
【００２２】
上述のようにアルカリ処理した処理物は、酸処理を施される。
酸処理の方法は特に限定されないが、例えば、濃度０．５〜１５Ｎの酸溶液を添加し、ｐＨを０．５〜２程度まで下げる方法が挙げられる。
【００２３】
酸処理を施されると、液状（油状）物質が分離してくる。この液状物質はきわめて高いコラーゲン産生促進効果を有しながらも、肌に対して高い安全性を示す。
液状物質回収促進のために、水洗を行う。その後必要に応じて脱色、脱臭、脱塩、蒸留等の操作を行っても良い。
【００２４】
ヒノキ科コノテガシワ属に属する植物の種子から上記のように抽出・処理した成分は、コラーゲン産生促進効果の他に、表皮細胞のヒアルロン酸合成を促進する効果、線維芽細胞増殖促進効果、シワ改善効果を有している。
このため、本発明にかかるコラーゲン産生促進剤は、ヒアルロン酸産生促進剤、線維芽細胞増殖促進剤、抗シワ剤としても用いることができる。
【００２５】
本発明にかかるコラーゲン産生促進方法、ヒアルロン酸産生促進方法、線維芽細胞増殖促進方法、シワ改善方法は、本発明のコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、線維芽細胞増殖促進剤、抗シワ剤を塗布することを特徴とする。
【００２６】
上記促進方法またはシワ改善方法は、本発明の促進剤または抗シワ剤を含む皮膚外用組成物を塗布してもよい。
皮膚外用組成物は、極めて応用範囲が広く、種々の分野（例えば、医薬部外品を含む化粧品、医薬品、マイクロニードルによる注入剤等）に応用される。その製品形態は任意であり、例えば、軟膏、クリーム、乳液、化粧水、エッセンス、ゼリー、ジェル、パック、マスク、ファンデーション、マイクロニードル等が挙げられる。
【００２７】
皮膚外用組成物を調製する場合、有効成分である促進剤または抗シワ剤を、液状分として、０．０００１〜２０質量％配合することが好ましく、０．００１〜２質量％配合することが特に好ましい。
【００２８】
本発明にかかる促進剤または抗シワ剤を配合した皮膚外用組成物は、常法に従って製造することができる。皮膚外用組成物には、必須成分である促進剤または抗シワ剤以外に、通常皮膚外用組成物に用いられる任意の成分を、本発明の効果を損なわない範囲で、適宜配合することができる。
【００２９】
皮膚外用組成物に配合可能な任意成分としては、例えば、アミノ酸、脂質、糖、ホルモン、酵素、核酸等の生理活性物質等を挙げることができる。
また、水（精製水、温泉水、深層水等）、油剤、界面活性剤、金属セッケン、ゲル化剤、粉体、アルコール類、水溶性高分子、皮膜形成剤、樹脂、包接化合物、香料、消臭剤、塩類、ｐＨ調整剤、清涼剤、動物・微生物由来の抽出物、血行促進剤、収斂剤、抗脂漏剤、キレート剤、角質溶解剤、酵素、ホルモン類、ビタミン類、他の植物抽出物等を適宜配合することもできる。
【００３０】
その他、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸およびその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、火棘の果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、グルコース、フルクトース、プシコース、アロース、タガトース、マンノース、ショ糖、トレハロース、キシリトール等の糖類、βアラニン、グリシン、ＧＡＢＡ、サルコシン等のイオンチャネル制御物質、カルノシン、レチノイド等も適宜配合することができる。
【００３１】
また、本発明にかかる促進剤または抗シワ剤を、他の薬効剤の一種または二種以上と組み合わせて配合することによって、各効果をより高めた、もしくは各効果とともに他の薬効も奏する皮膚外用組成物を調製することもできる。
前記薬効剤としては、例えば、美白剤、紫外線防御剤、抗菌剤、抗炎症剤、血行促進剤、各種薬効成分、活性酸素除去剤、保湿剤、他の促進剤、他の抗シワ剤等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
本発明にかかる促進剤または抗シワ剤を配合した皮膚外用組成物の剤型は、本発明の効果を発揮できるものであれば特に限定されない。皮膚外用組成物の剤型は任意であり、例えば、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系、軟膏、ゲル、エアゾール等が挙げられる。
【００３３】
また、本発明にかかるコラーゲン産生促進方法、ヒアルロン酸産生促進方法、線維芽細胞増殖促進方法、シワ改善方法は、本発明のコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、線維芽細胞増殖促進剤、抗シワ剤を経口摂取することも好適である。
【００３４】
上記促進方法またはシワ改善方法は、本発明の促進剤または抗シワ剤を含む飲食品を経口摂取してもよい。
本発明のコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、線維芽細胞増殖促進剤、および抗シワ剤を飲食品に配合する場合、促進剤または抗シワ剤の配合量（乾燥質量）は、それらの種類、目的、形態、利用方法などに応じて、適宜決めることができる。例えば、配合量は、飲食品全量中に０．０００１〜５０質量％程度であることが好ましい。特に、特定保健用食品に配合する場合には、本発明の促進剤または抗シワ剤を効果が十分発揮されるような量で配合させることが好ましい。
【００３５】
飲食品の形態としては、例えば、顆粒状、ペースト状、ゲル状、固形状、液体状等に任意に成形することができる。
飲食品には、飲食品等に配合することが認められている公知の各種物質、例えば、結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤やｐＨ調製剤などの賦形剤を適宜含有させることができる。
【実施例】
【００３６】
本発明について以下に実施例を挙げてさらに詳述するが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。配合量は特記しない限り質量％で示す。【００３７】
はじめに、本発明者らは、ヒノキ科コノテガシワ属植物（コノテガシワ）種子の有機溶媒抽出物およびその処理物（Ａ）を、下記調製方法で調製した。そして、抽出物およびその処理物の線維芽細胞増殖促進効果および線維芽細胞によるＩ型コラーゲン産生促進効果について、以下に示す試験を行った。
抽出物およびその処理物無添加の場合を１００として、結果を表１に示す。【００３８】
コノテガシワ種子の有機溶媒抽出物の調製方法
コノテガシワの種子（未粉砕）をそれぞれ５倍量（ｖ／ｗ）の有機溶媒（アセトン）に浸漬し、室温にて１０日間抽出を行った。ナイロンメッシュ（１００メッシュ）であらかじめ残渣を除き、さらにろ紙にてろ過した。ロータリーエバポレータでろ液から溶媒を除去した。このようにして、抽出物を得た。【００３９】
コノテガシワ種子の有機溶媒抽出物の処理物の調製方法Ａ
上記のようにして得られた抽出物を、撹拌羽根で撹拌しながら、０．５〜１５ＮのＮａＯＨ溶液を、純ＮａＯＨとして１００〜３００ｇ／Ｌの範囲内で抽出物に添加した（温度５０℃）。２００ｒｐｍで撹拌しながら、５時間処理を行った。その後、５ＮのＨ２ＳＯ４を徐々に添加し、撹拌しながらｐＨを１付近まで下げ、分離してくる液状（油状）物質を回収した。回収した液状（油状）物質に等容量の水を加えて水洗し、不純物・塩・過剰の酸を除去した。液状（油状）物質を減圧乾燥し、液状の処理物（Ａ）を得た。【００４０】
＜細胞賦活試験＞
ヒト新生児由来の線維芽細胞ＨＦ０Ｋを１０％ウシ子牛血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ変法イーグルＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ、ニッスイ社製）中に接種し、続いて２４穴プレートに播種し、３７℃、二酸化炭素濃度５体積％の雰囲気中に静置した。細胞接着後、培地を低濃度血清（０．５％）を含む培地に交換し、１昼夜続けて培養した。その後、抽出物またはその処理物を、培地に対して０、０．５×１０−４、１×１０−４、２×１０−４、３×１０−４体積％となるように、検体調製液を添加して混和した。培養３日目に各検体調製液で生育させた線維芽細胞の細胞数を、ヘキスト３３３４２（同仁化学株式会社製）を用いて測定し求め、抽出物またはその処理物を添加しないものを対照として細胞賦活度を評価した。
細胞培養上清を集め、Ｉ型コラーゲン産生量を評価した。【００４１】
＜Ｉ型コラーゲン産生の測定＞
集めた細胞培養上清中のＩ型コラーゲンをProcollagen  Type  I  C−peptide（PIP）EIAキット（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて、キットに付属のマニュアルに従って培地上清中のＩ型コラーゲンＣ末端ペプチド測定し、Ｉ型コラーゲン産生量の指標とした。１ウェルあたりの細胞の量はヘキスト３３３４２を用いてＤＮＡ量として求め、抽出物またはその処理物によって合成促進されるＩ型コラーゲン量は単位細胞あたりとして評価した。【００４２】
【表１】
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【００４３】
表１によれば、コノテガシワ種子の有機溶媒抽出物に処理を施すことにより、ヒト新生児由来の線維芽細胞ＨＦ０Ｋに対して高い細胞賦活能を有することがわかった。
また、コノテガシワ種子の有機溶媒抽出物には、Ｉ型コラーゲン産生促進効果は見られなかったが、処理を施すことにより、Ｉ型コラーゲンの産生を極めて低濃度で高めていることが認められた。
したがって、本発明にかかるコラーゲン産生促進剤および線維芽細胞増殖促進剤は、コノテガシワ種子の有機溶媒抽出物をアルカリ処理および酸処理することが必要である。【００４４】
次に、上記試験とは異なるコノテガシワの種子を用いて、Ｉ型コラーゲン産生促進効果についてさらなる検討を行った。
本発明者らは、コノテガシワ種子を約３等分し、該種子の水（１０℃および２０℃）抽出物および有機溶媒抽出物の処理物（Ｂ）を、下記方法により調製した。そして、水抽出物および処理物（Ｂ）の単位細胞あたりのＩ型コラーゲン産生量を、上記試験により測定した。水抽出物および処理物（Ｂ）無添加の場合（コントロール）を１００として、結果を図１に示す。
なお、図１は平均値±ＳＤを示している。また、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定（有意水準＊ｐ＜０．１、＊＊ｐ＜０．０５）により統計処理を行い、コントロールに対し有意差または傾向差が認められたものを示した。【００４５】
コノテガシワ種子の水抽出物の調製方法
コノテガシワの種子を５倍量（ｖ／ｗ）の水に浸漬し、１０℃または２０℃で２４時間抽出を行った。ナイロンメッシュ（１００メッシュ）であらかじめ残渣を除き、さらにろ紙にてろ過した。このようにして、水抽出物を得た。【００４６】
コノテガシワ種子の有機溶媒抽出物の処理物の調製方法Ｂ
コノテガシワの種子を５倍量（ｖ／ｗ）の有機溶媒（アセトン）に浸漬し、２０℃で２４時間抽出を行った。ナイロンメッシュ（１００メッシュ）であらかじめ残渣を除き、さらにろ紙にてろ過した。ロータリーエバポレータでろ液から溶媒を除去した。
得られた抽出物を、撹拌羽根で撹拌しながら、０．５〜１５ＮのＮａＯＨ溶液を、純ＮａＯＨとして１００〜３００ｇ／Ｌの範囲内で抽出物に添加した（温度５０℃）。２００ｒｐｍで撹拌しながら、５時間処理を行った。その後、５ＮのＨ２ＳＯ４を徐々に添加し、撹拌しながらｐＨを１付近まで下げ、分離してくる液状（油状）物質を回収した。回収した液状（油状）物質に等容量の水を加えて水洗し、不純物・塩・過剰の酸を除去した。液状（油状）物質を減圧乾燥し、液状の処理物（Ｂ）を得た。【００４７】
図１によれば、有機溶媒抽出物の処理物は濃度依存的に有意なコラーゲン産生促進効果を有することが確認された。
しかし、水抽出物は、どの条件でもほとんど効果がなく、有意なコラーゲン産生促進効果が認められなかった。
したがって、本発明にかかるコラーゲン産生促進剤は、コノテガシワ種子の抽出に、水を含まない有機溶媒を用いることが必要である。【００４８】
次に、上記試験とは異なるコノテガシワの種子を用いて、該種子の処理物のヒアルロン酸合成促進効果についての検討と、Ｉ型コラーゲン産生促進効果および線維芽細胞増殖促進効果の確認を行った。
すなわち、上記調製方法Ａで調製したコノテガシワ種子の処理物について、以下に示す試験により表皮細胞によるヒアルロン酸合成促進効果を測定し、また上記試験により線維芽細胞増殖促進効果、線維芽細胞によるＩ型コラーゲン産生促進効果を測定した。処理物無添加の場合を１００として、結果を表２に示す。【００４９】
＜表皮細胞のヒアルロン酸合成促進試験＞
ヒト表皮由来角化細胞ＨａＣａＴを９６ウェルディッシュへ播種（６０００個／ウェル）し、１５％Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２（クラボー株式会社製）と８５％Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＢ２を含む培地で２４時間培養した。その後、調製したコノテガシワ種子の処理物（培地に対して０、０．００５、０．０１体積％）を含む１００％Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＢ２培地に交換した。２日間培養継続し、細胞の培養上清を集めた。
上清中に含まれるヒアルロン酸の量を、ヒアルロン酸測定キット（三菱化学メディエンス株式会社製）を用いて測定した。１ウェルあたりの細胞の量はヘキスト３３３４２（同仁化学株式会社製）を用いてＤＮＡ量として求めた。コノテガシワ種子の処理物によって合成促進されるヒアルロン酸量は単位細胞あたりとして評価した。【００５０】
【表２】
2012057123.tif 000003
【００５１】
表２によれば、本発明にかかるコノテガシワの種子、すなわち柏子仁の処理物は、表皮細胞のヒアルロン酸合成促進効果も有していることも認められた。
また、柏子仁の処理物は、線維芽細胞増殖促進効果、Ｉ型コラーゲン産生促進効果を有することも、再確認することができた。【００５２】
＜シワ改善効果試験＞
次に、上記試験とは異なるコノテガシワの種子を用いて、上記調製方法Ａで調製した該種子の処理物のシワ改善効果を確認した。
すなわち、０．３５％のコノテガシワ種子の有機溶媒抽出物の処理物を配合したもの（アクティブ）および配合していないもの（プラセボ）について、下記表３に示す配合組成の皮膚外用剤（クリーム）を調製した。そして、２８名の専門パネラーに２ヶ月間、１日２回、各皮膚外用剤を左右の目尻にそれぞれ塗布してもらい、どちらの小ジワが目立たなくなったかについて評価してもらった。結果を図２に示す。【００５３】
（表３）
クリーム                              アクティブ    プラセボ
ダイナマイトグリセリン                  １．０      １．０  質量％
ジプロピレングリコール                  ５．０      ５．０
１，３ブチレングリコール                ７．０      ７．０
カルボキシビニルポリマー                ０．３      ０．３
アクリル酸メタクリル酸アルキル重合体    ０．０５    ０．０５
オレフィンオリゴマー                    ８．０      ８．０
メチルポリシロキサン                    １．０      １．０
メチルフェニルポリシロキサン            １．０      １．０
コノテガシワ種子（柏子仁アセトン抽出物）の処理物
０．３５      −
苛性カリ                                ０．０９    ０．０９
ＥＤＴＡ                                ０．０１    ０．０１
防腐剤                                    適量        適量
香料                                      適量        適量
イオン交換水                              残余        残余
（製法）
イオン交換水にカルボキシビニルポリマーとアクリル酸メタクリル酸アルキル重合体を均一に溶解し、一方、オレフィンオリゴマーにコノテガシワ種子の処理物、メチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサンを溶解し、水相に添加した。次いで、その他の成分を加えた後、苛性ソーダで中和させ増粘して製造した。【００５４】
図１によれば、半数以上のパネラーが、コノテガシワ種子の処理物配合品にシワ改善効果を認めたことが明らかとなった。
したがって、本発明にかかるコノテガシワの種子、すなわち柏子仁の処理物は、シワ改善効果も有していることが認められた。【００５５】
以下に、本発明にかかるコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、線維芽細胞増殖促進剤、抗シワ剤の配合例として皮膚外用組成物および食品を示す。本発明はこの配合例によって限定されるものではない。なお、柏子仁の有機溶媒抽出物の処理物はいずれも、上記実施例と同様の試験において、優れたコラーゲン産生促進効果、ヒアルロン酸産生促進効果、線維芽細胞増殖促進効果、シワ改善効果を有していた。【００５６】
配合例１：クリーム
ステアリン酸                                      ５．０  質量％
ステアリルアルコール                              ４．０
イソプロピルミリステート                        １８．０
グリセリンモノステアリン酸エステル                ３．０
プロピレングリコール                            １０．０
本コラーゲン産生促進剤（柏子仁アセトン抽出物の処理物）
１．０
苛性カリ                                          ０．２
亜硫酸水素ナトリウム                              ０．０１
防腐剤                                              適量
香料                                                適量
イオン交換水                                        残余
（製法）
イオン交換水にプロピレングリコールと苛性カリを加え溶解し加熱して７０℃に保った（水相）。他の成分を混合し加熱融解して７０℃に保った（油相）。水相に油相を徐々に加え、全部加え終わってからしばらくその温度に保ち反応を起こさせた。その後ホモミキサーで均一に乳化し、よくかきまぜながら３０℃まで冷却して製造した。【００５７】
配合例２：クリーム
ステアリン酸                                      ６．０  質量％
ソルビタンモノステアリン酸エステル                ２．０
ポリオキシエチレン（２０モル）ソルビタンモノステアリン酸エステル
１．５
プロピレングリコール                            １０．０
本ヒアルロン酸産生促進剤（柏子仁酢酸エチル抽出物の処理物）
０．１
グリセリントリオクタノエート                    １０．０
スクワレン                                        ５．０
亜硫酸水素ナトリウム                              ０．０１
エチルパラベン                                    ０．３
香料                                                適量
イオン交換水                                        残余
（製法）
イオン交換水にプロピレングリコールを加え溶解し加熱して７０℃に保った（水相）。他の成分を混合し加熱融解して７０℃に保った（油相）。水相に油相を加え、予備乳化を行い、ホモミキサーで均一に乳化した後、よくかきまぜながら３０℃まで冷却して製造した。【００５８】
配合例３：クリーム
ステアリルアルコール                              ７．０  質量％
ステアリン酸                                      ２．０
水添ラノリン                                      ２．０
スクワラン                                        ５．０
２−オクチルドデシルアルコール                    ６．０
ポリオキシエチレン（２５モル）セチルアルコールエーテル
３．０
グリセリンモノステアリン酸エステル                ２．０
プロピレングリコール                              ５．０
本線維芽細胞増殖促進剤（柏子仁ヘキサン抽出物の処理物）
１．０
香料                                                適量
亜硫酸水素ナトリウム                              ０．０３
エチルパラベン                                    ０．３
イオン交換水                                        残余
（製法）
イオン交換水にプロピレングリコールを加え溶解し加熱して７０℃に保った（水相）。他の成分を混合し加熱融解して７０℃に保った（油相）。水相に油相を加え予備乳化を行い、ホモミキサーで均一に乳化した後、よくかきまぜながら３０℃まで冷却して製造した。【００５９】
配合例４：乳液
ステアリン酸                                      ２．５  質量％
セチルアルコール                                  １．５
ワセリン                                          ５．０
流動パラフィン                                  １０．０
ポリオキシエチレン（１０モル）モノオレイン酸エステル
２．０
ポリエチレングリコ−ル１５００                    ３．０
トリエタノールアミン                              １．０
本コラーゲン産生促進剤（柏子仁アセトン抽出物の処理物）
０．０４
カルノシン                                        ３．５
ニコチン酸アミド                                  １．０
亜硫酸水素ナトリウム                              ０．０１
エチルパラベン                                    ０．３
カルボキシビニルポリマー                          ０．０５
香料                                                適量
イオン交換水                                        残余
（製法）
少量のイオン交換水にカルボキシビニルポリマーを溶解した（Ａ相）。残りのイオン交換水にポリエチレングリコール１５００とトリエタノールアミン、カルノシン、ニコチン酸アミドを加え加熱溶解して７０℃に保った（水相）。他の成分を混合し加熱融解して７０℃に保った（油相）。水相に油相を加え予備乳化を行い、Ａ相を加えホモミキサーで均一に乳化し、乳化後よくかきまぜながら３０℃まで冷却して製造した。【００６０】
配合例５：乳液
（油相部）
ステアリルアルコール                              １．５  質量％
スクワレン                                        ２．０
ワセリン                                          ２．５
脱臭液状ラノリン                                  １．５
月見草油                                          ２．０
ミリスチン酸イソプロピル                          ５．０
グリセリンモノオレート                            ２．０
ポリオキシエチレン（６０モル）硬化ヒマシ油        ２．０
酢酸トコフェロール                                ０．０５
本ヒアルロン酸産生促進剤（柏子仁ヘキサン抽出物の処理物）
０．０１
エチルパラベン                                    ０．２
ブチルパラベン                                    ０．１
エチルグリシン                                    １．０
香料                                                適量
（水相部）
亜硫酸水素ナトリウム                              ０．０１
ニコチン酸アミド                                  ０．０５
グリセリン                                        ５．０
ヒアルロン酸ナトリウム                            ０．０１
カルボキシビニルポリマー                          ０．２
水酸化カリウム                                    ０．２
精製水                                              残余
（製法）
油相部を７０℃にて溶解した。水相部を７０℃にて溶解し、水相部に油相部を混合し、乳化機で乳化後、熱交換機で３０℃まで冷却して製造した。【００６１】
配合例６：ジェル状美容液
９５％エタノール                                １０．０  質量％
ジプロピレングリコール                          １５．０
ポリオキシエチレン（５０モル）オレイルアルコールエーテル
２．０
カルボキシビニルポリマー                          １．０
苛性ソーダ                                        ０．１５
本線維芽細胞増殖促進剤（柏子仁酢酸エチル抽出物の処理物）
２．０
レチノール                                        ０．０４
Ｌ−アルギニン                                    ０．１
サルコシン                                        １．０
メチルパラベン                                    ０．２
香料                                                適量
イオン交換水                                        残余
（製法）
イオン交換水にカルボキシビニルポリマーを均一に溶解し、一方、９５％エタノールに柏子仁酢酸エチル抽出物の処理物、ポリオキシエチレン（５０モル）オレイルアルコールエーテルを溶解し、水相に添加した。次いで、その他の成分を加えた後、苛性ソーダ、Ｌ−アルギニンで中和させ増粘して製造した。【００６２】
配合例７：美容液
（Ａ相）
エタノール（９５％）                              １０．０  質量％
ポリオキシエチレン（２０モル）オクチルドデカノール  １．０
本コラーゲン産生促進剤（柏子仁ヘキサン抽出物の処理物）
０．３
メチルパラベン                                      ０．１５
パントテニールエチルエーテル                        ０．１
（Ｂ相）
水酸化カリウム                                      ０．１
（Ｃ相）
グリセリン                                          ５．０
カルノシン                                          ３．０
ニコチン酸アミド                                    ３．０
ジプロピレングリコール                            １０．０
亜硫酸水素ナトリウム                                ０．０３
カルボキシビニルポリマー                            ０．２
精製水                                                残余
（製法）
Ａ相、Ｃ相をそれぞれ均一に溶解し、Ｃ相にＡ相を加えて可溶化した。次いで、Ｂ相を加えた後充填を行い製造した。【００６３】
配合例８：パック
（Ａ相）
ジプロピレングリコール                            ５．０  質量％
ポリオキシエチレン（６０モル）硬化ヒマシ油        ５．０
（Ｂ相）
オリーブ油                                        ５．０
本ヒアルロン酸産生促進剤（柏子仁アセトン抽出物の処理物）
１．０
酢酸トコフェノール                                ０．２
エチルパラベン                                    ０．２
香料                                              ０．２
（Ｃ相）
亜硫酸水素ナトリウム                              ０．０３
カルノシン                                        ０．１
ポリビニルアルコール（ケン化度９０、重合度２０００）
１３．０
エタノール                                        ７．０
精製水                                              残余
（製法）
Ａ相、Ｂ相、Ｃ相をそれぞれ均一に溶解し、Ａ相にＢ相を加えて可溶化した。ついで、これをＣ相に加えた後充填を行い製造した。【００６４】
配合例９：軟膏
ポリオキシエチレン（３０モル）セチルエーテル      ２．０  質量％
グリセリンモノステアレート                      １０．０
流動パラフィン                                  １０．０
ワセリン                                        ４０．０
セタノール                                        ６．０
メチルパラベン                                    ０．１
ブチルパラベン                                    ０．１
グリセリンモノステアリン酸エステル                ２．０
本線維芽細胞増殖促進剤（柏子仁アセトン抽出物の処理物）
５．０
プロピレングリコール                            １０．０
イオン交換水                                        残余
香料                                                適量
（製法）
イオン交換水にプロピレングリコールを加え、溶解し加熱して７０℃に保った（水相）。他の成分を７０℃にて混合溶解した（油相）。上記水相に油相を添加し、ホモミキサーで均一に乳化し、冷却後充填を行い製造した。【００６５】
以下、同様にして配合例１０〜１３のクリームを製造した。【００６６】
配合例１０：クリーム
流動パラフィン                                    ８．０  質量％
ワセリン                                          ３．０
ジメチルポリシロキサン                            ２．０
ステアリルアルコール                              ３．０
ベヘニルアルコール                                ２．０
グリセリン                                        ５．０
ジプロピレングリコール                            ４．０
トレハロース                                      １．０
テトラ２−エチルヘキサン酸ペンタエリスリット      ４．０
モノイソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル  ２．０
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリン      １．０
親油型モノステアリン酸グリセリン                  ２．０
クエン酸                                          ０．０５
クエン酸ナトリウム                                ０．０５
水酸化カリウム                                    ０．０１５
油溶性甘草エキス                                  ０．１
レチノールパルミテート（１００万単位）            ０．２５
本コラーゲン産生促進剤（柏子仁酢酸エチル抽出物の処理物）
０．３
カルノシン                                        ３．５
ニコチン酸アミド                                  ２．０
酢酸トコフェロール                                ０．１
パラオキシ安息香酸エステル                          適量
フェノキシエタノール                                適量
ジブチルヒドロキシトルエン                          適量
エデト酸三ナトリウム                              ０．０５
４−ｔ−ブチル−４’−メトキシジベンゾイルメタン  ０．０１
パラメトキシ桂皮酸２−エチルヘキシル              ０．１
β−カロチン                                      ０．０１
ポリビニルアルコール                              ０．５
ヒドロキシエチルセルロース                        ０．５
カルボキシビニルポリマー                          ０．０５
精製水                                              残余
香料                                                適量【００６７】
配合例１１：クリーム
ワセリン                                          ２．０  質量％
ジメチルポリシロキサン                            ２．０
エタノール                                        ５．０
ベヘニルアルコール                                ０．５
バチルアルコール                                  ０．２
グリセリン                                        ７．０
１，３−ブチレングリコール                        ５．０
ポリエチレングリコール２００００                  ０．５
ホホバ油                                          ３．０
スクワラン                                        ２．０
ヒドロキシステアリン酸フィトステリル              ０．５
テトラ２−エチルヘキサン酸ペンタエリスリット      １．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油                    １．０
水酸化カリウム                                    ０．１
ピロ亜硫酸ナトリウム                              ０．０１
ヘキサメタリン酸ナトリウム                        ０．０５
グリチルレチン酸ステアリル                        ０．１
パントテニルエチルエーテル                        ０．１
アルブチン                                        ７．０
トラネキサム酸メチルアミド塩酸塩                １１．０
本ヒアルロン酸産生促進剤（柏子仁ヘキサン抽出物の処理物）
０．００１
カルノシン                                        ３．５
酢酸トコフェロール                                ０．１
ヒアルロン酸ナトリウム                            ０．０５
パラオキシ安息香酸エステル                          適量
エデト酸三ナトリウム                              ０．０５
４−ｔ−ブチル−４’−メトキシジベンゾイルメタン  ０．１
ジパラメトキシ桂皮酸モノ−２−エチルヘキサン酸グリセリル
０．１
黄酸化鉄                                            適量
キサンタンガム                                    ０．１
カルボキシビニルポリマー                          ０．２
精製水                                              残余【００６８】
配合例１２：クリーム
ワセリン                                          ２．０  質量％
ジメチルポリシロキサン                            ２．０
エタノール                                        ５．０
ベヘニルアルコール                                ０．５
バチルアルコール                                  ０．２
グリセリン                                        ７．０
１，３−ブチレングリコール                        ５．０
ポリエチレングリコール２００００                  ０．５
ホホバ油                                          ３．０
スクワラン                                        ２．０
ヒドロキシステアリン酸フィトステリル              ０．５
テトラ２−エチルヘキサン酸ペンタエリスリット      １．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油                    １．０
水酸化カリウム                                    ０．１
ピロ亜硫酸ナトリウム                              ０．０１
ヘキサメタリン酸ナトリウム                        ０．０５
グリチルレチン酸ステアリル                        ０．１
パントテニルエチルエーテル                        ０．１
アルブチン                                        ７．０
トラネキサム酸メチルアミド塩酸塩                １１．０
本抗シワ剤（柏子仁アセトン抽出物の処理物）        １．０
酢酸トコフェロール                                ０．１
ヒアルロン酸ナトリウム                            ０．０５
パラオキシ安息香酸エステル                          適量
エデト酸三ナトリウム                              ０．０５
４−ｔ−ブチル−４’−メトキシジベンゾイルメタン  ０．１
ジパラメトキシ桂皮酸モノ−２−エチルヘキサン酸グリセリル
０．１
黄酸化鉄                                            適量
キサンタンガム                                    ０．１
カルボキシビニルポリマー                          ０．２
精製水                                              残余【００６９】
配合例１３：クリーム
ワセリン                                          ２．０  質量％
ジメチルポリシロキサン                            ２．０
エタノール                                        ５．０
ベヘニルアルコール                                ０．５
バチルアルコール                                  ０．２
グリセリン                                        ７．０
１，３−ブチレングリコール                        ５．０
ポリエチレングリコール２００００                  ０．５
ホホバ油                                          ３．０
スクワラン                                        ２．０
ヒドロキシステアリン酸フィトステリル              ０．５
テトラ２−エチルヘキサン酸ペンタエリスリット      １．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油                    １．０
水酸化カリウム                                    ０．１
ピロ亜硫酸ナトリウム                              ０．０１
ヘキサメタリン酸ナトリウム                        ０．０５
グリチルレチン酸ステアリル                        ０．１
パントテニルエチルエーテル                        ０．１
４メトキシ安息香酸                                ３．０
トラネキサム酸メチルアミド塩酸塩                １１．０
本コラーゲン産生促進剤（柏子仁ヘキサン抽出物の処理物）
０．１
カルノシン                                        ３．５
酢酸トコフェロール                                ０．１
ヒアルロン酸ナトリウム                            ０．０５
パラオキシ安息香酸エステル                          適量
エデト酸三ナトリウム                              ０．０５
４−ｔ−ブチル−４’−メトキシジベンゾイルメタン  ０．１
ジパラメトキシ桂皮酸モノ−２−エチルヘキサン酸グリセリル
０．１
黄酸化鉄                                            適量
キサンタンガム                                    ０．１
カルボキシビニルポリマー                          ０．２
精製水                                              残余【００７０】
配合例１４：マイクロニードル
特開２００５−１５２１８０に記載の方法による製造方法であって、以下の組成による
マルトース                                      ９４．５  質量％
デキストラン                                      ５．０
ロサルタン                                        ０．１
本ヒアルロン酸産生促進剤（柏子仁酢酸エチル抽出物の処理物）
０．４【００７１】
配合例１５：ソフトカプセル（１，５００ｍｇ／日）
食用大豆油                                      ５３０  ｍｇ
トチュウエキス                                    ５０
ニンジンエキス                                    ５０
本コラーゲン産生促進剤（柏子仁含水エタノール抽出物の処理物）
１００
ローヤルゼリー                                    ５０
マカ                                              ３０
γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）                        ３０
ミツロウ                                          ６０
ゼラチン                                        ３７５
グリセリン                                      １２０
グリセリン脂肪酸エステル                        １０５
【図１】
2012057123.tif 000004
【図２】
2012057123.tif 000005
【国際調査報告】
2012057123.tif 000006
2012057123.tif 000007
2012057123.tif 000008
2012057123.tif 000009
2012057123.tif 000010
2012057123.tif 000011
2012057123.tif 000012