(57)【要約】本発明は、水棲動物組織から有用な抽出物を得ることを課題とする。本発明により、分子量２５０万以上のプロテオグリカンを含有する、魚類軟骨水抽出物が提供される。当該抽出物は、皮膚に対する優れた抗老化効果（特に抗炎症効果、皮膚バリア機能改善効果、皮膚保水性改善効果）を有する。しかも、本発明の魚類軟骨水抽出物は、皮膚に塗布するのみならず、経口摂取することによっても当該効果を奏する。
2012099224.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量１８０万以上のプロテオグリカンを含有する、魚類軟骨水抽出物。
【請求項２】
分子量２５０万以上のプロテオグリカンを含有する、請求項１に記載の魚類軟骨水抽出物。
【請求項３】
分子量５００万以上のプロテオグリカンを含有する、請求項２に記載の魚類軟骨水抽出物。
【請求項４】
分子量５００万以上のプロテオグリカンが、乾燥質量換算で、９質量％以上含まれる、請求項３に記載の魚類軟骨水抽出物。
【請求項５】
コラーゲンが、乾燥質量換算で、３０質量％以上含まれる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の魚類軟骨水抽出物。
【請求項６】
魚類がサケ又はマスであり、軟骨が鼻軟骨である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の魚類軟骨水抽出物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の魚類軟骨水抽出物を含む飲食品組成物、口腔用組成物、又は化粧品組成物。
【請求項８】
炎症改善用又は抗老化用である、請求項７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水棲動物軟骨抽出物に関する。より詳細には、本発明は、高分子量プロテオグリカンを含有する水棲動物軟骨抽出物に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテオグリカンは、コラーゲンなどとともに結合組織の細胞外マトリックス中の基質を形成している主要な生体高分子である。プロテオグリカンは、従来哺乳動物（特に牛）の軟骨に含まれるものを抽出分離して得ていたが、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）発症が報告されてから、哺乳動物軟骨から抽出されるものは忌避されるようになり、これに代わるプロテオグリカン供給源が求められている。また、従来のプロテオグリカン抽出工程は煩雑で収量も悪いことから製造コストが非常に高く、産業への活用が充分なされていないため、より簡便で収量が高い製造方法が求められている。【０００３】
水棲動物組織は有力なプロテオグリカン供給源代替候補である。水棲動物である鯨やサメの軟骨に含まれるプロテオグリカンの抽出が試みられている。しかし、これらの水棲動物の捕獲量には限りがあるため、大量のプロテオグリカンを製造することは困難であった。また、抽出分離操作も煩雑であり、抽出に用いられる溶媒等には毒性が高いものが存在するなどした。【０００４】
このような問題を解決するため、大量廃棄される水棲動物組織からプロテオグリカンを抽出する試みもなされている。例えば、特許文献１には、エタノールを用いて、サケの鼻軟骨からプロテオグリカンを含む組成物（鼻軟骨粉末）を製造する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−１７３７０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、水棲動物組織から効率よくプロテオグリカンを抽出することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、驚くべき事に、水棲動物である魚類の軟骨から、水を用いてプロテオグリカンを抽出することができる方法を見出した。さらに、当該方法により魚類軟骨から抽出される魚類軟骨水抽出物は、従来の方法により得られていた魚類軟骨抽出物に含有されるプロテオグリカンに比べ、高分子量のプロテオグリカンを含有しており、さらに当該高分子量のプロテオグリカンは優れた効果を有することも見出した。本発明は、これらの知見に基づき、さらに改良を重ねてなされたものである。【０００８】
すなわち、本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
分子量１８０万以上のプロテオグリカンを含有する、魚類軟骨水抽出物。
項２．
分子量２５０万以上のプロテオグリカンを含有する、項１に記載の魚類軟骨水抽出物。
項３．
分子量５００万以上のプロテオグリカンを含有する、項２に記載の魚類軟骨水抽出物。
項４．
分子量５００万以上のプロテオグリカンが、乾燥質量換算で、９質量％以上含まれる、項３に記載の魚類軟骨水抽出物。
項５−１．
コラーゲンが、乾燥質量換算で、３０質量％以上含まれる、項１〜４のいずれか１項に記載の魚類軟骨水抽出物。
項５−２
分子量２５０万以上のプロテオグリカンが含むウロン酸量が、抽出物に含まれるウロン酸全量の１０％以上である、項１〜５−１のいずれか１項に記載の魚類軟骨水抽出物。
項５−３．
抽出物に含まれるウロン酸量が、乾燥質量換算で、抽出物全量に対して１０質量％以上である、項１〜５−２のいずれかに記載の魚類軟骨水抽出物。
項６−１．
魚類が、サケ又はマスである、項１〜５のいずれかに記載の魚類軟骨水抽出物。
項６−２．
軟骨が、鼻軟骨である、項１〜６−１のいずれかに記載の魚類軟骨水抽出物。
項７−１．
項１〜６−２のいずれかに記載の魚類軟骨水抽出物を含む外用組成物又は経口組成物。
項７−２．
項１〜６−２のいずれかに記載の魚類軟骨水抽出物を含む飲食品組成物、口腔用組成物、又は化粧品組成物。
項８−１．
炎症改善用又は抗老化用である、項７−１又は７−２に記載の組成物。
項８−２．
炎症改善用又は抗老化用である、項１〜６−２のいずれかに記載の魚類軟骨水抽出物。
項９−１．
７０℃〜１００℃の水で抽出された、項１〜６−２のいずれかに記載の魚類軟骨水抽出物。
項９−２．
７０℃〜１００℃の水で３〜４時間抽出された、項９−１に記載の魚類軟骨水抽出物。
項１０−１．
単離された、分子量５００万以上のプロテオグリカン。
項１０−２．
単離された、分子量５００万以上の、魚類軟骨由来プロテオグリカン。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の魚類軟骨水抽出物は、従来の方法により得られていた魚類軟骨抽出物に含有されるプロテオグリカンに比べ、高分子量のプロテオグリカンを含有する。そして、本発明の魚類軟骨水抽出物は皮膚に対する優れた抗老化効果（特に抗炎症効果、皮膚バリア機能改善効果、皮膚保水性改善効果）を有する。しかも、本発明の魚類軟骨水抽出物は、皮膚に塗布することにより当該効果を奏するのみならず、経口摂取することによっても当該効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１ａ】トレイに入った凍結サケ鼻軟骨ブロックの写真である。
【図１ｂ】ビニール袋に入った凍結サケ鼻軟骨小片の写真である。
【図１ｃ】ビニール袋に入った脱脂サケ鼻軟骨粉末の写真である。
【図２】凍結サケ鼻軟骨小片に水を加え100℃で抽出した際の、時間によるプロテオグリカン収量の変化を示すグラフである。なお、当該収量は凍結サケ鼻軟骨１ｇあたりの値である。
【図３】脱脂サケ鼻軟骨粉末（粉末）、凍結サケ鼻軟骨ブロック（ブロック）又は凍結サケ鼻軟骨小片（小片）からプロテオグリカンを抽出した際の、ウロン酸（GlcAで示す）及びタンパク質（Proteinで示す）の収量を比較したグラフである。GlcA及びProteinの収量値は、凍結サケ鼻軟骨ブロック１００ｇあたりから抽出した場合に換算されている。なお、ウロン酸量はプロテオグリカン量を反映する。
【図４ａ】本発明の魚類軟骨水抽出物の一例（サンプルＮｏ．１０）を、ゲル濾過クロマトグラフィーにより解析して得たウロン酸量クロマトグラム及び２８０ｎｍタンパク質量クロマトグラムを重ねて描いた図を示す。
【図４ｂ】本発明の魚類軟骨水抽出物の一例（サンプルＮｏ．１０）を、ゲル濾過クロマトグラフィーにより解析して得たウロン酸量クロマトグラムを各分子量マーカーが溶出されたフラクションの位置とともに示す。
【図５】本発明の魚類軟骨水抽出物の一例（サンプルＮｏ．１０）をイオン交換クロマトグラフィーで解析して得たウロン酸量クロマトグラムを示す。
【図６】図５のプロテオグリカン画分をゲル濾過クロマトグラフィーで解析して得たウロン酸量クロマトグラム及び２８０ｎｍタンパク質量クロマトグラムを示す。
【図７】本発明の魚類軟骨水抽出物の一例（サンプルＮｏ．１０）を経口摂取することにより、炎症改善効果が得られるか検討した結果を示す。左側のグラフがUVB照射４週間後の結果を、右側のグラフがUVB照射７週間後の結果を、それぞれ示す。
【図８】本発明の魚類軟骨水抽出物の一例（サンプルＮｏ．１０）を経口摂取することにより、皮膚バリア機能増強及び改善効果が得られるか検討した結果を示す。左側のグラフがUVB照射４週間後の結果を、右側のグラフがUVB照射７週間後の結果を、それぞれ示す。
【図９】サンプルＮｏ．１０、並びに、サンプルＮｏ．１０をさらに精製したＰＧ−１抽出物及びＰＧ−２抽出物を経口摂取することにより、炎症改善効果が得られるか検討した結果を示す。左側のグラフがUVB照射４週間後の結果を、右側のグラフがUVB照射７週間後の結果を、それぞれ示す。
【図１０】サンプルＮｏ．１０、並びに、サンプルＮｏ．１０をさらに精製したＰＧ−１抽出物及びＰＧ−２抽出物を経口摂取することにより、皮膚バリア機能増強及び改善効果が得られるか検討した結果を示す。左側のグラフがUVB照射４週間後の結果を、右側のグラフがUVB照射７週間後の結果を、それぞれ示す。
【図１１】サンプルＮｏ．１０、並びに、サンプルＮｏ．１０をさらに精製したＰＧ−１抽出物及びＰＧ−２抽出物を経口摂取することにより、皮膚保水性増強及び改善効果が得られるか検討した結果を示す。左側のグラフがUVB照射４週間後の結果を、右側のグラフがUVB照射７週間後の結果を、それぞれ示す。
【図１２】サンプルＮｏ．１０を経口摂取することにより、皮膚バリア機能増強及び改善効果が得られるか検討した臨床試験結果を示す。
【図１３】サンプルＮｏ．１０を経口摂取することにより、皮膚保水性増強及び改善効果が得られるか検討した臨床試験結果を示す。
【図１４】５０℃、７０℃、９０℃、１００℃及び１００℃過加熱の温度条件で抽出した抽出物、及び市販品Ａを添加した場合の細胞増殖試験結果を示す。＊はコントロールに対して０．１％危険率で有意差を認めたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。なお、本明細書中「質量」は「重量」と読み替えてもよい。
【００１２】
プロテオグリカンは、グリコサミノグリカン（ムコ多糖）及びタンパク質が結合した構造を有する化合物である。グリコサミノグリカンは、2糖の繰り返し構造を有する酸性糖であり、具体的にはコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸等が例示できる。これら酸性糖成分が有する２糖の繰り返し構造において、当該２糖のうち通常１つはアミノ糖、もう１つはウロン酸である。従って、プロテオグリカンの検出には、ウロン酸検出法の常法の１つであるカルバゾール硫酸法を用いることができる。
【００１３】
また、タンパク質に対し、櫛の歯状にグリコサミノグリカンが結合した化合物はプロテオグリカンモノマーとも呼ばれる（プロテオグリカンモノマーにおける当該タンパク質はコアタンパク質と呼ばれる。）。特に生体内では、このプロテオグリカンモノマーがリンクタンパク質を介してヒアルロン酸と結合した会合体を形成していると考えられており、当該会合体はプロテオグリカン集合体（proteoglycan aggregate）とも呼ばれる。本明細書における用語「プロテオグリカン」は、プロテオグリカンモノマー及びプロテオグリカン集合体を包含する意味で用いられる。なお、ヒアルロン酸もグリコサミノグリカンの一種である。
【００１４】
本発明の魚類軟骨水抽出物は、高分子量プロテオグリカンを含む。ここでの高分子量プロテオグリカンとは、具体的には分子量１８０万以上のプロテオグリカンであり、好ましくは分子量２５０万以上、３００万以上、４００万以上、５００万以上、６００万以上、７００万以上、８００万以上、９００万以上、１０００万以上、１１００万以上、１２００万以上、１３００万以上、１４００万以上、１５００万以上、１６００万以上、１７００万以上、１８００万以上、１９００万以上、又は２０００万以上のプロテオグリカンである。分子量が大きいものほど好ましく、特に分子量５００万以上が好ましい。本発明の魚類軟骨水抽出物を、下記条件のゲル濾過クロマトグラフィーにより処理し、得られる各フラクションに含まれるウロン酸量（プロテオグリカン量を反映する）をカルバゾール硫酸法で定量し、当該ウロン酸量に基づくクロマトグラムを作成することにより、上記の分子量以上のプロテオグリカンの存在を確認することができる。このようなウロン酸量に基づくクロマトグラムを以下「ウロン酸量クロマトグラム」ということがある。また、各フラクションの２８０ｎｍでの吸光度を測定することで、含まれるタンパク質量を相対値化し（すなわち、含まれるタンパク質量を反映する値とし）、当該吸光度に基づくクロマトグラムを描くこともできる。このようなクロマトグラムを以下「２８０ｎｍタンパク質量クロマトグラム」ということがある。
【００１５】
〔ゲル濾過クロマトグラフィー条件〕
カラム： Sepharose CL-2B 充填カラム（Sepharose CL-2Bを担体としてφ1cm×50cmのカラムに充填したもの。Sepharose CL-2Bのデキストランの分画範囲は100〜20,000kDaであり、GE Healthcare社等から入手できる。Sepharose CL-2Bは、２％架橋アガロース、粒子径６０〜２００μｍ（レーザー回折散乱法による）、CAS登録番号65099-79-8である。）
バッファー： 0.1Mリン酸緩衝液（pＨ 7.1, 0.2M NaCl含有）
アプライサンプル量：魚類軟骨水抽出物4mg（乾燥質量換算）（１ｍＬバッファーに溶解させて使用）
流速： 0.15ｍＬ/min
分画フラクション量： 1ｍＬ/tube
分子量検量線：次の各種デキストラン分子量マーカーについて上記と同様の条件でゲル濾過クロマトグラフィーを行い、糖検出のための周知の方法であるフェノール・硫酸法により各フラクションの吸光度（デキストラン量を反映する）を測定し、各マーカーが溶出されたフラクションを求め、当該条件のゲル濾過クロマトグラフィーの各フラクションに含まれる成分の分子量を反映する検量線を作成する。“各マーカーが溶出されたフラクション”とは、各マーカーが最も多く溶出されたフラクションをいう。換言すれば、各デキストラン分子量マーカーをゲル濾過した際の、デキストラン量を反映するクロマトグラムにおけるピークトップに相当するフラクションである。
【００１６】
＜デキストラン分子量マーカー＞
Dextran from Leuconostoc mesenteroides（mol wt 5,000,000−40,000,000）（SIGMA）・・・カラムのvoid volume測定用、20000kDa
Dextran Standard 1,400,000（SIGMA）・・・1400kDa
Dextran Standard 670,000（SIGMA）  ・・・670kDa
Dextran Standard 410,000（SIGMA）  ・・・410kDa
Dextran Standard 270,000（SIGMA）  ・・・270kDa
【００１７】
但し、Dextran from Leuconostoc mesenteroidesについては、これに含まれる低分子のデキストランを除去する前処理を行った後、マーカーとして用いる。当該前処理は、上述の〔ゲル濾過クロマトグラフィー条件〕によりDextran from Leuconostoc mesenteroidesそのものを溶出させ、分子量20,000kDa以上の分子を回収し、凍結乾燥させることで行う。具体的には、フェノール・硫酸法により各フラクションの吸光度を測定して作成した、デキストラン量を反映するクロマトグラムにおいて、最初に出現したピークに相当するフラクションを回収し、これを凍結乾燥する（これにより、分子量20,000kDa以上の分子を回収、凍結乾燥できると考えられる）。この凍結乾燥物を実際にマーカー（カラムのvoid volume測定用）として用いる。
【００１８】
デキストラン量を反映するクロマトグラムを得るための吸光度測定は、Hodge, J. E. and Hofreiter, B. T., Method in Carbohydrate Chemistry, 1, 338 (1962)に記載の方法（フェノール・硫酸法）に従う。具体的には、次のようにして行う。
〔１〕105×15mmの試験管に試料水溶液を500μＬ加える。
〔２〕フェノール試薬（5 v/v%フェノール水溶液）を500μＬ加え、撹拌する。
〔３〕濃硫酸を２．５ｍＬ加え、すぐに１０秒間激しく撹拌する。
〔４〕室温に２０分以上放置する。
〔５〕分光光度計で４９０ｎｍの吸収を測定する。
【００１９】
なお、カルバゾール硫酸法とは、ウロン酸（グルクロン酸（ＧｌｃＡ）、イズロン酸等）の発色色素であるカルバゾール溶液を測定検体に添加し、分光光度計を用いて吸光度を測定し、当該吸光度を基にウロン酸量を算出する周知の方法である。濃度を規定したグルクロン酸標準溶液を用いて検量線を作成し、検体中のグルクロン酸含量を求める。より具体的には、次のようにして行う。ホウ酸ナトリウム・１０水和物０．９５ｇを濃硫酸１００ｍＬに溶解した試薬２．５ｍＬを試験管にとり、氷冷する。これに被検体０．５ｍＬ（２〜２０μｇのウロン酸を含むようにするのが好ましい）を静かに重層する。室温以上にならないように水冷しながらよく攪拌する。ガラス球で蓋をした後に、沸騰湯浴中で１０分間加熱し、室温まで水冷する。これに、カルバゾール１２５ｍｇを無水メチルアルコール１００ｍＬに溶解した試薬を０．１ｍＬ加えて混合し、更に１５分間沸騰湯浴中で加熱する。その後、室温まで水冷し530ｎｍにおける吸光度を測定する。ブランクは蒸留水０．５ｍＬを用いる。同時に、グルクロン酸を用いて検量線を作成する。（下述する実施例のカルバゾール硫酸法も、ここに記載した方法で行った。）
【００２０】
乾燥質量換算で、本発明の魚類軟骨水抽出物に含まれるウロン酸量（カルバゾール硫酸法により定量）全量のうち、１０質量％以上は、分子量２５０万以上のプロテオグリカンに由来するのが好ましい。換言すれば、本発明の魚類軟骨水抽出物は、乾燥質量換算で、分子量２５０万以上のプロテオグリカンが含むウロン酸量が、抽出物に含まれるウロン酸全量の１０質量％以上であることが好ましい。より好ましくは、１５質量％以上、２０質量％以上、２５質量％以上、３０質量％以上、３５質量％以上、４０質量％以上、４５質量％以上、５０質量％以上、５５質量％以上、又は６０質量％以上である。当該割合は大きい程好ましい。また、本発明の魚類軟骨水抽出物は、乾燥質量換算で、分子量５００万以上のプロテオグリカンが含むウロン酸量が、抽出物に含まれるウロン酸全量の７質量％以上であることが好ましい。より好ましくは、１０質量％以上、１３質量％以上、１６質量％以上、２０質量％以上、２４質量％以上、２７質量％以上、３０質量％以上、３４質量％以上、３７質量％以上、又は４０質量％以上である。当該割合は大きいほど好ましい。
【００２１】
なお、特定の分子量（仮にＸとする）以上のプロテオグリカンが含むウロン酸量が、抽出物に含まれるウロン酸全量のどの程度の割合を占めるのかは、上述したウロン酸量クロマトグラムのピーク面積から求めることができる。具体的には、当該ウロン酸量クロマトグラムのピーク面積全体に対して、分子量Ｘ以上のウロン酸が占める面積割合を求めればよい。より具体的には、縦軸がウロン酸量、横軸がフラクションＮｏ．であるウロン酸量クロマトグラムにおいて、分子量Ｘのプロテオグリカンを含むフラクションを通るように垂線を引き、その垂線で分断されたピーク部分のうち、分子量のより大きいプロテオグリカンを含むピーク部分の面積が、ピーク全体の面積のどの程度の割合を占めるかを求めればよい。
【００２２】
また、本発明の魚類軟骨水抽出物に含まれるウロン酸量（カルバゾール硫酸法により測定）は、乾燥質量換算で、当該抽出物の好ましくは５質量％以上、より好ましくは１０質量％以上、さらに好ましくは１５質量％以上、よりさらに好ましくは２０質量％以上、特に好ましくは２５質量％以上である。なお、本明細書（特に図表）において、ウロン酸量を示す際にグルクロン酸の略記であるＧｌｃＡを用いて「ＧｌｃＡ（μｇ）」などと表す場合がある。
【００２３】
また、本発明の魚類軟骨水抽出物には、分子量１８０万以上のプロテオグリカンが、乾燥質量換算で、当該抽出物の好ましくは３０質量％以上、より好ましくは３５質量％以上含まれる。
【００２４】
さらに、本発明の魚類軟骨水抽出物には、分子量５００万以上のプロテオグリカンが、乾燥質量換算で、当該抽出物の好ましくは５質量％以上、１０質量％以上、１５質量％以上、２０質量％以上、２５質量％以上、３０質量％以上、又は３５質量％以上含まれる。当該含有比率は、大きい値であるほど好ましい。
【００２５】
また、本発明の魚類軟骨水抽出物は、脂質含有量が少ない。本発明の魚類軟骨水抽出物が含む脂質量とプロテオグリカン量の質量比（脂質量／プロテオグリカン量）は、当該抽出物の原料である魚類軟骨が含む脂質量とプロテオグリカン量の質量比（脂質量／プロテオグリカン量）よりも小さいことが好ましい。本発明の魚類軟骨水抽出物の脂質含有量は、乾燥質量換算で、好ましくは５質量％以下、より好ましくは４質量％以下、さらに好ましくは３質量％以下、さらにより好ましくは２質量％以下、特に好ましくは１質量％以下である。このような魚類軟骨水抽出物は、後述のように、抽出物の原料である魚類軟骨を脱脂（すなわち脂肪除去）した上で用いることにより、得ることができる。また、抽出物をさらに公知の脱脂方法により脱脂することによっても得ることができる。
【００２６】
また、本発明の魚類軟骨抽出物は、好ましくは、含まれるタンパク質量のほとんどがコラーゲン（好ましくはＩＩ型コラーゲン）であることが好ましい。具体的には、含まれるタンパク質量の好ましくは８０質量％以上、より好ましくは８５質量％以上が、コラーゲンであることが好ましい。なお、本発明の魚類軟骨抽出物に含まれるコラーゲン量は、乾燥質量換算で、好ましくは３０質量％以上、より好ましくは３０〜６０質量％である。
【００２７】
また、本発明の魚類軟骨抽出物に含まれる灰分は、乾燥質量換算で、好ましくは１５質量％以下、より好ましくは５〜１５質量％、さらに好ましくは５〜１０質量％である。
【００２８】
なお、当該タンパク質量は、ケルダール法でサンプル中の窒素量を測定し、当該窒素量から、グリコサミノグリカン由来の窒素量を差し引いて求めた値（すなわち、当該タンパク質量は、プロテオグリカン由来のタンパク質量を含まない値）である。また、当該灰分は直接灰化法により算出した値である。また、当該コラーゲン量は、アミノ酸自動分析法（ＨＰＬＣ法）によってサンプル中のヒドロキシプロリン量を測定し、コラーゲン中にはヒドロキシプロリンが６．７％含まれるとして算出して求めた値である。
【００２９】
本発明の魚類軟骨水抽出物は、魚類軟骨（魚類の軟骨）から抽出される。魚類としては、サケ科サケ属の魚が好ましく、具体的にはマス（カラフトマス、サクラマス、サツキマス等）、サケ（シロザケ、ベニザケ、ギンザケ、マスノスケ、スチールヘッド等）、等が例示される。また、サメ、タラ等も用いることができる。特にサケ又はマスが好ましい。また、軟骨としては、特に制限されないが、頭部軟骨、中でも鼻軟骨が好ましい。また、通常、魚類（特にサケやマス）が食品製品等へ加工される際に頭部は廃棄されることから、頭部軟骨の入手コストは安く、大量に安定供給され得るという利点もある。
【００３０】
抽出は、水を用いて行われる。魚類軟骨は、生体から採取した軟骨をそのまま抽出に供してもよいが、微細化（より具体的には、小片化又は粉末化）してから抽出に供してもよい。また、下述するように、抽出前にエタノールなどの有機溶媒を用いて魚類軟骨に脱脂処理を施しても良い。このようにして、水によりプロテオグリカン（高分子量プロテオグリカンを含む）を抽出することができる。つまり、本発明の魚類軟骨水抽出物は、魚類軟骨から水により抽出して好ましく得ることができる。また、あるいは、水抽出を行う際、水を加熱しつつ行なうことにより、もしくは熱水や沸騰水を用いることにより、効率的により効果が高い魚類軟骨水抽出物を得ることができる。
【００３１】
小片化魚類軟骨は、魚類軟骨を小片化したものである。小片化は、公知の方法により行うことができる。例えば、公知のブレンダーやミル等の機器を用いて、魚類軟骨（好ましくは凍結魚類軟骨）を小片化することができる。小片化操作は、できるだけ低温で行うことが好ましい。例えば、小片化された魚類軟骨が凍結状態を保持可能な温度であることが好ましい。具体的には０℃以下が例示できる。
【００３２】
また、小片化魚類軟骨は、抽出効率の観点からは、凍結された小片化魚類軟骨（凍結小片化魚類軟骨）であることが好ましい。凍結小片化魚類軟骨は、（ｉ）魚類軟骨を凍結した後小片化することで、又は（ｉｉ）魚類軟骨を小片化した後凍結することで、得ることができるが、（ｉ）により得られるものが特に好ましい。凍結方法は特に制限されず、公知の凍結方法を用いることができる。例えば、フリーザーを用いて、魚類軟骨を−２０〜−８０℃程度で２４〜７２時間程度保存する方法が例示できる。
【００３３】
小片化魚類軟骨又は凍結小片化魚類軟骨は、１小片あたり０．００１〜０．５ｇ程度が好ましく、０．００５〜０．３ｇ程度がより好ましく、０．０１〜０．１ｇ程度がさらに好ましい。小片化操作は、このような小片が得られるように行われるのが好ましい（使用機器条件を検討することにより、このような小片が得られる機器使用条件は簡単に決定できる）。
【００３４】
粉末化魚類軟骨は、魚類軟骨を粉末化したもの（魚類軟骨粉末）である。粉末化は、公知の方法により行うことができる。例えば、公知のブレンダーやミル等の機器を用いて、魚類軟骨（好ましくは凍結魚類軟骨）を粉末化することができる。粉末化操作は、できるだけ低温（例えば０℃以下）で行うことが好ましい。
【００３５】
また、粉末化魚類軟骨は、抽出効率の観点からは、凍結された粉末化魚類軟骨（凍結粉末化魚類軟骨）であることが好ましい。凍結粉末化魚類軟骨は、（ｉ’）魚類軟骨を凍結した後粉末化することで、又は（ｉｉ’）魚類軟骨を粉末化した後凍結することで、得ることができるが、（ｉ’）により得られるものが特に好ましい。凍結方法は特に制限されず、公知の凍結方法を用いることができる。例えば、フリーザーを用いて、魚類軟骨を−２０〜−８０℃程度で２４〜７２時間程度保存する方法が例示できる。
【００３６】
なお、「粉末」は「小片」に比べて、小さいものを指すが、明確に区別することを意図する訳ではない。魚類軟骨を微細化したもののうち、比較的大きめの欠片のものを「小片」、比較的小さめの欠片のものを「粉末」と称している。従って、特に制限される訳ではないが、粉末としては、粒径約１０〜１０００μｍ程度、好ましくは５０〜５００μｍ程度、より好ましくは１００〜２００μｍ程度（レーザー回折散乱法により測定）の粒径を有する粒子を含む粉末が望ましい。これらの粒径を有する粒子は、粉末中多く（例えば５０質量％以上、好ましくは７０質量％以上）含まれることが好ましい。
【００３７】
用いられる小片化魚類軟骨又は粉末化魚類軟骨は、脱脂（すなわち脂肪除去）されているものも使用できる。つまり、小片化脱脂魚類軟骨又は粉末化脱脂魚類軟骨も使用できる。脱脂処理されたものを用いることで、脂質の混入が少ない精製度の高い魚類軟骨水抽出物を得ることができるからである。小片化脱脂魚類軟骨又は粉末化脱脂魚類軟骨は、（α）脱脂処理された魚類軟骨を小片化又は粉末化することにより、あるいは（β）魚類軟骨を小片化又は粉末化した後に脱脂処理することにより、得ることができる。
【００３８】
脱脂方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、上記（α）において魚類軟骨を脱脂処理する方法としては、例えば、魚類軟骨を１〜２４時間程度流水（例えば水道蛇口からの流水）にさらす方法が例示される。また、魚類軟骨の入手は公知の方法で行うことができ、例えば魚類組織（好ましくは魚類頭部）を水に１〜２４時間程度漬けて膨潤させ、軟骨（好ましくは鼻軟骨）以外の組織を除去する方法や、あるいは、凍結サケ頭部を解凍後、直ちに鼻軟骨を取り出し、さらに流水に１〜２４時間程度さらして洗浄及び脱脂する方法が例示される。肉片等が残存する場合は、ピンセット等により残存する肉片等を取り除くことが好ましい。なお、この段階では魚類軟骨は小片化又は粉末化されていないため、流水にさらす等しても、ほとんどプロテオグリカンは抽出されないと考えられる。また、下記の（β）の場合と同様に、有機溶媒により脂質を抽出除去する方法も用いることができる。
【００３９】
また、例えば、上記（β）において、小片化魚類軟骨又は粉末化魚類軟骨を脱脂処理する方法としては、例えば、有機溶媒により脂質を抽出除去する方法が例示される。有機溶媒としては、エタノール、ヘキサン、アセトン等が例示される。より具体的には、上記（β）の方法として、特許文献１（特開２００９−１７３７０２号公報）に記載される方法を好ましく用いることができる。つまり、例えば、以下の工程Ａ〜Ｅを含む方法により、粉末化脱脂魚類軟骨を得、これを本発明に好ましく用いることができる（より詳細な条件も特許文献１に記載されている）。
Ａ．凍結した水棲動物組織（魚類組織）を破砕し、これに水を加え、温度０〜２０℃、ｐＨ４．８〜７で処理する工程
Ｂ．Ａの固液混合物を遠心分離し、最上部の脂質層と中間層の水層を取り除き、沈殿物を回収する工程
Ｃ．沈殿物を乾燥し、微粉末化する工程
Ｄ．得られた乾燥微粉末に、溶媒としてヘキサン、アセトン又はエタノールを加え、残存脂質を抽出除去する工程
Ｅ．溶媒を除去する工程
【００４０】
なお、凍結処理及び脱脂処理が両方なされた小片化魚類軟骨又は粉末化魚類軟骨（凍結小片化脱脂魚類軟骨又は凍結粉末化脱脂魚類軟骨）を用いるのが、さらに好ましい。これらは、例えば、脱脂処理された魚類軟骨を凍結し、これを小片化又は粉末化することにより得ることができる。
【００４１】
魚類軟骨、好ましくは小片化魚類軟骨又は粉末化魚類軟骨（以下まとめて「微細化魚類軟骨」ということがある）は水抽出に供される。水抽出に用いる水（以下「抽出水」という場合がある）としては、例えば、ミリＱ水、蒸留水、脱イオン水、精製水、水道水等が例示される。また、抽出水のｐＨは、通常５．５〜８．０程度、好ましくはｐＨ６．０〜７．５程度、より好ましくはｐＨ６．５〜７．５程度である。酸やアルカリ、塩基類などｐＨを大きく変動される物質を溶解させるのは好ましくない。なお、有機酸や無機酸等の酸化合物や水酸化ナトリウム等のアルカリ化合物を抽出水に添加すると、高分子量プロテオグリカン（特に分子量が１０００万を超える高分子量プロテオグリカン）が減少若しくは消失するため、酸化合物やアルカリ化合物は添加しないことが好ましい。なお、限定的な解釈を望むものではないが、これは、酸化合物やアルカリ化合物の影響により、抽出処理中にプロテオグリカン集合体が崩壊することが原因ではないかと推測される。
【００４２】
水抽出は、例えば、魚類軟骨を水に適当時間（例えば３０分以上、好ましくは３０分〜２４時間程度、より好ましくは１〜１２時間程度、さらに好ましくは２〜６時間程度、よりさらに好ましくは３〜４時間程度）浸漬させることで行うことができる。水の量は、特に制限されないが、例えば抽出に供される小片化魚類軟骨又は粉末化魚類軟骨が全て水に浸かる程度の量が例示される。水抽出の際、静置してもよいし、撹拌してもよい。撹拌することが好ましい。また、抽出時の水の温度は、特に制限はされないが、好ましくは５０℃以上、より好ましくは７０℃以上である。そのため、抽出時に加温してもよいし、抽出前に予め温めておいてもよい。加熱温度（すなわち用いる水の温度）は、具体的には、好ましくは５０〜１００℃程度、より好ましくは７０〜１００℃程度、さらに好ましくは８０〜１００℃程度が例示される。また、加圧下で加熱してもよい。また、加熱を行う場合は、高分子量プロテオグリカンが熱により分解されるおそれがあるため、加熱された抽出水を抽出処理中に置換してもよい。抽出水を置換する場合の各抽出水における抽出時間間隔は、例えば１５分〜４時間毎、好ましくは３０分〜２時間又は1時間程度が例示される。好ましい一態様としては、魚類軟骨に、これらを全量浸漬できる量の水（好ましくは加熱された水）を加え、３〜４時間加熱しつつ静置若しくは撹拌する、という方法が挙げられる。また、他の好ましい一態様としては、“魚類軟骨に、これらを全量浸漬できる量の水（好ましくは加熱された水）を加え、１時間加熱しつつ静置し、この水を回収する”という工程を４回繰り返す方法が挙げられる（この場合、合計４時間の水抽出を行うことになる）。
【００４３】
水抽出後は、液体部分を回収することで、魚類軟骨水抽出物を得ることができる。液体部分の回収は、例えば遠心分離（例えば５０００ｒｐｍ、２０分、４℃での遠心分離が例示できる）処理や連続遠心分離処理などを行い、上清を回収することで行い得る。当該液体（上清）をそのまま本発明の魚類軟骨水抽出物として用いてもよいし、公知の方法により更に精製（例えば脱脂）してもよい。あるいは、減圧蒸留法等により、濃縮してもよい。またあるいは、凍結乾燥法やスプレードライ法等により、乾燥や粉末化してもよい。このような、本発明の魚類軟骨水抽出物は、例えば、食品、化粧品、口腔用組成物、医薬品等の原材料として好ましく用いることができる。
【００４４】
本発明の魚類軟骨水抽出物は、特に、皮膚の抗老化のために好ましく用いることができる。皮膚は、様々な要因により、日々ダメージを受けている。例えば、表皮層においては、外的要因（例えば紫外線等の光照射等）や内的要因（例えば老齢化等）により表皮バリア機能が低下し、経表皮透過蒸散水分量（transepidermal water loss：ＴＥＷＬ）が上昇する。このため、肌が乾燥したり、肌あれが起こる等する。また、同様の理由により、真皮においても、コラーゲン産生能の低下、皮膚弾力性の低下、真皮層の肥厚等が起こり、皮膚の硬直化が進行する。このため、皮膚にシワが生じる等する。
【００４５】
本発明の魚類軟骨水抽出物は、このような皮膚の症状を抑制及び改善する効果（抗炎症効果、皮膚バリア機能改善効果、皮膚保水性改善効果、細胞増殖促進効果）を有しており、特に光（中でも紫外線）照射（暴露）により起こる上述の皮膚症状の予防及び改善に好ましく用いることができる。なお、細胞増殖促進効果は、特に抽出時の抽出温度を変わると、効果の大小も変化する。これは、抽出温度が変わることにより、魚類軟骨水抽出物の組成が変化したことに起因すると考えられる。
【００４６】
本発明の魚類軟骨水抽出物は、その使用態様は特に制限されない。本発明の魚類軟骨水抽出物は塗布することにより、又は経口摂取することにより、上述の効果を奏するため、外用組成物又は経口組成物として用いるのが好適である。すなわち、本発明の魚類軟骨水抽出物を含む外用組成物又は経口組成物として用いることが好ましい。これらの組成物は、医薬品組成物、医薬部外品組成物、口腔用組成物、化粧品組成物、食品組成物等として用いることができる。これらは、本発明の魚類軟骨水抽出物を用いて常法により製造することができる。特にこれらの組成物は、オーラルケア分野、スキンケア分野、ヘアケア分野及びヘルスケア分野で好ましく用いることができる。
【００４７】
オーラルケア分野にて用いられる、本発明の魚類軟骨水抽出物を含む口腔用組成物（以下「本発明に係る口腔用組成物」と記載することがある）は、本発明の魚類軟骨水抽出物そのものであってもよいし、当該抽出物と口腔用組成物に用いられる他の成分（例えば研磨剤、粘結剤、界面活性剤、賦形剤、湿潤剤、pH調整剤、増粘剤、甘味剤、保存剤、薬効成分、着色剤、香味剤等）を適宜配合して製造され得るものであってもよい。例えば、常法によりペースト剤、軟膏剤、ジェル剤、塗布剤、スプレー剤、補填剤、液剤、洗口剤、パスタ、チューイングガム、トローチ、タブレット等の形態に製造することができる。
【００４８】
このような本発明に係る口腔用組成物は、口腔組織の炎症改善用、抗老化用、乾燥予防/改善用として好ましく用いられる。すなわち、本発明に係る口腔用組成物は、炎症改善用口腔用組成物、抗老化用口腔用組成物、組織修復用口腔用組成物、口腔乾燥予防/改善口腔用組成物を包含する。
【００４９】
ヘアケア分野又はスキンケア分野にて用いられる、本発明の魚類軟骨水抽出物を含む化粧品組成物（以下「本発明に係る化粧品組成物」と記載することがある）は、本発明の魚類軟骨水抽出物そのものであってもよいし、当該抽出物と化粧品用として許容される界面活性剤、湿潤剤、高分子剤、粉体、エステル類、アルコール類、動植物油脂、薬効剤、保存剤、着色剤、香料や、その他化粧品用として許容される成分、材料を適宜配合して、常法に従って製造されるものであってもよい。具体的には、本発明の魚類軟骨水抽出物を配合して製造される育毛剤、ヘアトニック、乳液、化粧水、クリーム、美容液、フェイスパック、フェイスマスク、日焼け止め等を挙げることができる。このような本発明に係る化粧品組成物は、炎症改善用又は抗老化用、保湿用として好ましく用いることができ、より具体的には、例えば、育毛用、頭皮手入れ用、日焼け予防用、日焼け手入れ用、保湿用及び抗皮膚老化用（例えば乾燥肌、肌荒れ、肌のシワ・たるみ等の予防又は改善用）として好ましく用いることができる。
【００５０】
ヘルスケア分野にて用いられる、本発明の魚類軟骨水抽出物を含む飲食品組成物（飲料及び食品）（以下「本発明に係る飲食品組成物」と記載することがある）は、本発明の魚類軟骨水抽出物そのものであってもよいし、当該抽出物と、食品衛生学上許容される基剤、担体、添加剤や、その他食品として利用され得る成分・材料等が適宜配合されたものであってもよい。例えば、本発明の魚類軟骨水抽出物を含む、保湿用及び抗皮膚老化用（例えば乾燥肌、肌荒れ、肌のシワ・たるみ等の予防又は改善用）の加工食品、飲料、栄養補助食品、特別用途食品（病者用食品、特定保健用食品、えん下困難者用食品等）、美容食品等が例示できる。さらに、このような本発明に係る飲食品組成物からなる保湿剤、抗皮膚老化剤も本発明に包含される。当該保湿剤、抗皮膚老化剤は、美容用や抗皮膚老化用（例えば乾燥肌、肌荒れ、肌のシワ・たるみ等の予防又は改善用）のドリンク剤、錠剤、タブレット剤、カプセル剤、顆粒剤、ゼリー剤、トローチ剤、ペースト剤、粘稠剤、粉末剤、ブロックバーなどの形態で供給され得る。
【００５１】
本発明の魚類軟骨水抽出物を含む外用組成物又は経口組成物（特に本発明に係る口腔用組成物、化粧品組成物、又は飲食品組成物）においては、特に制限されるものではないが、これらの組成物に含まれる魚類軟骨水抽出物量は、例えば組成物全体に対し、通常０．０００１〜１００質量％、好ましくは０．００１〜５０質量％、より好ましくは０．００５〜３０質量％、さらにより好ましくは０．０１〜２０質量％である。また、組成物に含まれる、分子量２５０万以上のプロテオグリカンに由来するウロン酸の量は、例えば組成物全体に対し、０．００００１〜１０質量％、好ましくは０．０００１〜５質量％、さらに好ましくは、０．０００５〜１質量％程度である。
【００５２】
また本発明は、本発明の魚類軟骨水抽出物を皮膚又は口腔内へ塗布することにより、皮膚又は口腔内の炎症を改善させる方法、又はバリア機能を増強又は改善させる方法、細胞（特に線維芽細胞）増殖を促進する方法等、本明細書に記載の効果を得る方法をも包含する。当該方法には、本発明の魚類軟骨水抽出物をそのまま用いてもよい。また、上述の外用組成物、或いは、本発明に係る口腔用組成物又は化粧品組成物を好ましく用いることができる。当該方法を適用する対象は特に制限されないが、特に炎症を有する対象や、老化や日焼けにより皮膚バリア機能が低下した対象が好ましい。また、治療目的ではなく美容目的で適用してもよい。特にバリア機能を増強することを意図して美容目的で好ましく適用することができる。対象は、ヒトを含む哺乳動物が好ましい。つまり、ヒトのみならず、非ヒト哺乳動物であってもよい。非ヒト哺乳動物としては、例えばペットや家畜が例示され、より具体的には、イヌ、ネコ、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、リャマ、ラクダ等が例示される。適用量も特に制限されず、必要量を適宜設定できる。特にヒトに適用する場合は、例えば、分子量２５０万以上（さらに好ましくは５００万以上）の高分子量プロテオグリカンに由来するウロン酸の量が、成人一日あたり好ましくは０．１〜５００ｍｇ程度、より好ましくは０．５〜２５０ｍｇ程度、さらに好ましくは１〜１００ｍｇ程度となるプロテオグリカンが含まれるよう、適用される魚類軟骨水抽出物の量を設定するのが望ましい。
【００５３】
又さらに本発明は、本発明の魚類軟骨水抽出物を経口摂取することにより、皮膚又は口腔内の炎症を改善させる方法、皮膚バリア機能を増強・改善させる方法、皮膚の肥厚を抑制する方法、皮膚保水性を改善させる方法等、本明細書に記載の効果を得る方法をも包含する。当該方法には、本発明の魚類軟骨水抽出物をそのまま用いてもよい。また、上述の経口組成物、或いは本発明に係る飲食品組成物を好ましく用いることができる。さらには、本発明の魚類軟骨水抽出物を含む医薬品組成物を好ましく用いることもできる。当該方法を適用する対象は特に制限されないが、特に炎症を発症した対象、老化や日焼けにより皮膚バリア機能が低下した対象、皮膚保水性が低下した対象、等が好ましい。また、美容目的で適用してもよい。対象は、ヒトを含む哺乳動物が好ましい。つまり、ヒトのみならず、非ヒト哺乳動物であってもよい。非ヒト哺乳動物としては、例えばペットや家畜が例示され、より具体的には、イヌ、ネコ、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、リャマ、ラクダ等が例示される。適用量も特に制限されず、必要量を適宜設定できる。例えば、分子量２５０万以上（さらに好ましくは５００万以上）の高分子量プロテオグリカンに由来するウロン酸の量が、成人一日あたり好ましくは０．２〜１０００ｍｇ程度、より好ましくは１〜８００ｍｇ程度、さらに好ましくは２〜５００ｍｇ程度となるプロテオグリカンが含まれるよう、適用される魚類軟骨水抽出物の量を設定するのが望ましい。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
サケ鼻軟骨からのプロテオグリカンの抽出検討
＜抽出に用いた試料＞
以下の３種類（（１）〜（３））のサケ鼻軟骨由来試料を、プロテオグリカン抽出検討に用いた。なお、サケ鼻軟骨としては、凍結サケ頭部を解凍後、直ちに鼻軟骨を取り出し、さらに流水に６時間さらして洗浄及び脱脂した後、さらにピンセットで肉片等を取り除き、手で水洗いして得られたサケ鼻軟骨を用いた。【００５５】
（１）凍結サケ鼻軟骨ブロック
サケ鼻軟骨をフリーザーに保存して凍結させ、これを凍結サケ鼻軟骨ブロックとして用いた。なお、用いたサケ頭部の大きさにもよるが、凍結サケ鼻軟骨ブロックは、およそ、大きさ 2.5×1.5 〜 4.5×2 cm、重さ 1.71 〜 6.91 gの塊（7個あたりの平均の重さは3.701g）であった。凍結サケ鼻軟骨ブロックの写真を図１ａに示す。【００５６】
（２）凍結サケ鼻軟骨小片
（１）の凍結サケ鼻軟骨ブロックをブレンダーに入れて１０秒間破砕し、凍結サケ鼻軟骨小片を得た。凍結サケ鼻軟骨小片の写真を図１ｂに示す。なお、ランダムに２０小片を採取して、各小片の大きさ及び質量を検討したところ、大きさはおよそ0.2 〜 0.7 cm、質量は約0.0890 〜 0.0116 g（20個の平均の重さは0.033 g）であった。また、凍結サケ鼻軟骨ブロック１００ｇから９５．６ｇの凍結サケ鼻軟骨小片が得られた。【００５７】
（３）脱脂サケ鼻軟骨粉末
（１）の凍結サケ鼻軟骨を用いて、特許文献１（特開２００９−１７３７０２号公報）の実施例１に記載の方法により、脱脂サケ鼻軟骨粉末を得た。凍結サケ鼻軟骨ブロック１００ｇから、脱脂サケ鼻軟骨粉末は５．８３ｇ得られた。脱脂サケ鼻軟骨粉末の写真を図１ｃに示す。【００５８】
特許文献１の実施例１の記載を次に抜粋する。
『凍結サケ鼻軟骨１００ｇを破砕し、これに１５℃の水道水を同容量加え、緩やかに撹件して十分混ぜ合わせ、５℃前後に維持された混合物をただちに遠心分離器９，０００ｒｐｍ、３０分、４℃で遠心分離し、脂質とプロテオグリカン他組成物を分けた。遠心分離層は３層に分かれ、最上部の脂質層と中間層の水層を取り除き、沈殿物を回収した。沈殿物は凍結乾燥後、遠心式粉砕機で粉砕し、水脱脂微粉末を得た。この段階で、一部をエーテル抽出にて脂質を測定した結果、脂質は８．８％残存しており、脱脂前の脂質を１００％とした場合の除去率は７５．０％となり、弱い異臭を含んでいた。ついで、水脱脂微粉末に１０倍容量のエタノールを加えて、異臭を含む脂質を溶解抽出した。本操作を２回繰り返してエタノール溶液を濾過除去し、溶媒を蒸発させると微黄褐色無臭のプロテオグリカン組成物粉末を得た。サケ鼻軟骨に対する収率５８．７％（ドライベース）、プロテオグリカン含有率７７．７％であった。プロテオグリカン組成物粉末の異臭は全く消失した。』
特許文献１実施例１の「凍結サケ鼻軟骨」は、上記「凍結サケ鼻軟骨ブロック」に相当する。また、「ドライベース」とは、乾燥質量換算のことである。【００５９】
＜凍結サケ鼻軟骨小片を用いたプロテオグリカン抽出検討＞
上述のようにして得られた（２）凍結サケ鼻軟骨小片に水を加え、静置又は１００℃で加熱することによりプロテオグリカンの抽出を試みた。具体的には、次のようにして検討を行った。凍結サケ鼻軟骨小片約12gに対し60mLの蒸留水を加えたサンプルを４サンプル調製し、これらを100℃で1時間、2時間、3時間、4時間それぞれ加熱し、それらを遠心分離機により5,000rpm、20分、4℃で遠心分離し、不溶物（残渣）を取り除き上清を回収した。回収上清液量を測定した後、回収上清液中のウロン酸量をカルバゾール硫酸法により測定した（ウロン酸量は、プロテオグリカン量を反映する。図表中では、ウロン酸量を、ウロン酸の１種であるグルクロン酸の略記「ＧｌｃＡ」を用いて表すことがある。）。また、回収上清液中のタンパク質量をブラッドフォード法にて測定した。結果を表１に示す。また、表１をグラフにした図を図２に示す。【００６０】
【表１】
2012099224.tif 000003
【００６１】
表１及び図２から、加熱時間の増加とともにプロテオグリカン抽出量が増加することがわかった。また、特に３時間より長く（例えば４時間）加熱することで、特にプロテオグリカン抽出量が大幅に増加することがわかった。【００６２】
＜凍結サケ鼻軟骨小片と、凍結サケ鼻軟骨ブロック及び脱脂サケ鼻軟骨粉末との比較＞
（１）凍結サケ鼻軟骨ブロック及び（３）脱脂サケ鼻軟骨粉末についても、上記（２）凍結サケ鼻軟骨小片の場合と同様にして（但し、加熱時間及び加熱温度は変化させた）プロテオグリカンを抽出し、その抽出量を比較した。結果を表２に示す。なお、表２には、抽出されたウロン酸量及びタンパク質量を、凍結サケ鼻軟骨ブロック100g当たりの量に換算して示した。タンパク質量はブラッドフォード法にて測定した値である。また、表２をグラフにした図を図３に示す。図３に示される各試料の記載（１〜９）は、表２の「サンプルＮｏ．」欄の１〜９の記載と対応する。【００６３】
【表２】
2012099224.tif 000004
【００６４】
凍結サケ鼻軟骨ブロックをそのまま水抽出に供し、加熱も行わない場合は、タンパク質が抽出されなかった。従って、当該抽出条件では、プロテオグリカンは抽出されないことがわかった。【００６５】
特に、凍結サケ鼻軟骨小片を水中で４時間100℃で加熱した場合、抽出されるウロン酸量（プロテオグリカン量を反映する）が顕著に増加することがわかった。【００６６】
＜プロテオグリカンの分子量の検討＞
上記脱脂サケ鼻軟骨粉末２０ｇに１０００ｍＬの常温の精製水（ｐH６．５）を加え、３０分間撹拌した後、遠心分離（８０００ｒｐｍ，３０分，４℃）を行い、上清を回収し、当該上清を凍結乾燥して魚類軟骨水抽出物を得た。当該魚類軟骨水抽出物を以下サンプルＮｏ．１０とよぶことがある。【００６７】
このサンプルＮｏ．１０を、下記条件のゲル濾過クロマトグラフィーにより各フラクションに分離した。そして、各フラクションに含まれるウロン酸量をカルバゾール硫酸法により定量した。また、各フラクションの２８０ｎｍでの吸光度を測定し、当該吸光度を、含まれるタンパク質量を反映する値とした。そして、これらの結果を基にして、ウロン酸量クロマトグラム及び２８０ｎｍタンパク質量クロマトグラムを描いた。ウロン酸量クロマトグラム及び２８０ｎｍタンパク質量クロマトグラムを重ねて描いた図を図４ａに、また、ウロン酸量クロマトグラムにおいて各分子量マーカーが溶出されたフラクションの位置を示した図を図４ｂに、それぞれ示す。なお、ゲル濾過クロマトグラフィーの分画フラクション量は下記の通り 1ｍＬ/tubeとしたため、図４の横軸「Elution Volume(mL)」は、フラクションＮｏ．も反映する。【００６８】
『〔ゲル濾過クロマトグラフィー条件〕
カラム： Sepharose CL-2B 充填カラム（Sepharose CL-2Bを担体としてφ1cm×50cmのカラムに充填したもの。Sepharose CL-2Bのデキストランの分画範囲は100〜20,000kDaであり、GE Healthcare社等から入手できる。Sepharose CL-2Bは、２％架橋アガロース、粒子径６０〜２００μｍ（レーザー回折散乱法による）、CAS登録番号65099-79-8である。）
バッファー： 0.1Mリン酸緩衝液（pＨ 7.1, 0.2M NaCl含有）
アプライサンプル量：サンプルＮｏ．１０を4mg（１ｍＬバッファーに溶解させて使用）
流速： 0.15ｍＬ/min
分画フラクション量： 1ｍＬ/tube
分子量検量線：次の各種デキストラン分子量マーカーについて上記と同様の条件（但しサンプル量は１ｍｇ／１ｍＬバッファー）でゲル濾過クロマトグラフィーを行い、フェノール・硫酸法により各フラクションの吸光度（デキストラン量を反映する）を測定し、検量線を作製した。【００６９】
＜デキストラン分子量マーカー＞
Dextran from Leuconostoc mesenteroides（mol wt 5,000,000−40,000,000）（SIGMA）・・・カラムのvoid volume測定用、20000kDa
Dextran Standard 1,400,000（SIGMA）・・・1400kDa
Dextran Standard 670,000（SIGMA）  ・・・670kDa
Dextran Standard 410,000（SIGMA）  ・・・410kDa
Dextran Standard 270,000（SIGMA）  ・・・270kDa【００７０】
但し、Dextran from Leuconostoc mesenteroidesについては、当該マーカーに含まれる低分子のデキストランを除去する前処理を行った後、用いた。当該前処理は、上述の〔ゲル濾過クロマトグラフィー条件〕（アプライ量はマーカー用の量）によりDextran from Leuconostoc mesenteroidesそのものを溶出させ、分子量２０００万以上の分子を回収し、凍結乾燥させることで行った。具体的には、フェノール・硫酸法により各フラクションの吸光度を測定して作成した、デキストラン量を反映するクロマトグラムにおいて、最初に出現したピークに相当するフラクションを回収し、これを凍結乾燥した（これにより、分子量20,000kDa以上の分子を回収、凍結乾燥できると考えられる）。この凍結乾燥物を実際にマーカー（カラムのvoid volume測定用）として用いた。
デキストラン量を反映するクロマトグラムを得るための吸光度測定は、Hodge, J. E. and Hofreiter, B. T., Method in Carbohydrate Chemistry, 1, 338 (1962)に記載の方法（フェノール・硫酸法）に従った。具体的には、次のようにして行った。
〔１〕105×15mmの試験管に試料水溶液を500μＬ加える。
〔２〕フェノール試薬（5 v/v%フェノール水溶液）を500μＬ加え、撹拌する。
〔３〕濃硫酸を２．５ｍＬ加え、すぐに１０秒間激しく撹拌する。
〔４〕室温に２０分以上放置する。
〔５〕分光光度計で４９０ｎｍの吸収を測定する。』
なお、得られた検量線は（y = −4.1355Ln(x)＋59.47 ； Ｒ２＝０．９８６９）であり、Ｒ２値から考えて分子量とフラクションNo.（即ち溶出液量）はよく相関していることがわかった。【００７１】
図４ｂに示されるように、サンプルＮｏ．１０には、少なくとも分子量２００万以上（さらには分子量２５０万以上）のプロテオグリカンが含まれることがわかった。なお、図４ｂに示すように、ウロン酸量クロマトグラムにおいて、特定の分子量に相当する溶出液量点に垂線を引き、該クロマトグラムを分割した際の２部分の面積比を求めることで、その特定の分子量以上（又は以下）の成分が魚類軟骨水抽出物に含有される比率を求めることができる。【００７２】
次に、サンプルＮｏ．１０をさらに詳しく分析した。具体的には次のようにして行った。サンプルＮｏ．１０を、下記条件のイオン交換クロマトグラフィーに供し、プロテオグリカンを分画した。具体的には、溶出フラクションを１６mＬずつ採取して、ウロン酸量をカルバゾール硫酸法により定量した。【００７３】
『〔イオン交換クロマトグラフィー条件〕
カラム：ＤＥＡＥ充填カラム（ＤＥＡＥ（ＧＥヘルスケア社）を担体として、φ5.0cm×20cmのカラムに充填したもの）
バッファー： 7M尿素-トリス-塩酸緩衝液 (pＨ 7.2)
グラジェント： NaCl 濃度  0 → 0.75Ｍ  
アプライサンプル量： サンプルＮｏ．１０（魚類軟骨水抽出物の凍結乾燥物）200mg （５０ｍＬバッファーに溶解させてアプライ）
流速： 2.0mL/min
フラクション量： 16mL/tube  』【００７４】
得られたウロン酸量クロマトグラムを図５に示す。ウロン酸を含むフラクション（図６において両方向矢印で示される）を集め、透析した後、凍結乾燥を行ない、粉末を得た。当該粉末を「プロテオグリカン画分」とし、以下の検討に用いた。【００７５】
上記のようにして得られたプロテオグリカン画分を、下記条件のゲル濾過クロマトグラフィーに供し、分画した。そして、各フラクションに含まれるウロン酸量をカルバゾール硫酸法により定量した。また、各フラクションの２８０ｎｍでの吸光度を測定し、当該吸光度値を含まれるタンパク質量を反映する値とした。そして、これらの結果を基にして、ウロン酸量クロマトグラム及び２８０ｎｍタンパク質量クロマトグラムを描いた。【００７６】
『〔ゲル濾過クロマトグラフィー条件〕
カラム： Sepharose CL-2B充填カラム（Sepharose CL-2B（ＧＥヘルスケア社）を担体として、φ５．０cm×５０cmのカラムに充填したもの）
バッファー： 0.1M リン酸緩衝液 (pH7.1, 0.2M NaCl含有)
アプライサンプル量： 150mg
流速： 2.0mL/min
フラクション量：16mL/tube  』【００７７】
また下記の各種デキストラン分子量マーカーについても、同様の条件（但しサンプル量は５０mg）でゲル濾過クロマトグラフィーを行ない、フェノール・硫酸法により各溶出フラクションの吸光度（デキストラン量を反映する）を測定し、分子量とフラクションNo.の検量線を作成して、分子量が５００万、４０万となるフラクションNo.を求めた。【００７８】
『＜デキストラン分子量マーカー＞
Dextran from Leuconostoc mesenteroides (mol wt 5,000,000 - 40,000,000)(SIGMA)・・・20,000ｋDa
Dextran Standard 1,400,000（SIGMA）・・・1,400ｋDa
Dextran Standard 270,000（SIGMA）・・・270ｋDa  【００７９】
但し、Dextran from Leuconostoc mesenteroidesについては、当該マーカーに含まれる低分子のデキストランを除去する前処理を行った後、用いた。当該前処理は、上述の〔ゲル濾過クロマトグラフィー条件〕（アプライ量はマーカー処理時の量）によりDextran from Leuconostoc mesenteroidesを溶出させ、分子量２０００万以上の分子を回収し、凍結乾燥させることで行った。具体的には、デキストラン量を反映するクロマトグラムにおいて、最初に出現したピークに相当するフラクションを回収し、これを凍結乾燥した（これにより、分子量20,000kDa以上の分子を回収、凍結乾燥できると考えられる）。この凍結乾燥物を実際にマーカー（カラムのvoid volume測定用）として用いた。デキストラン量を反映するクロマトグラムを得るための吸光度測定は、上記と同様に行った。』【００８０】
得られたクロマトグラムを図６に示す。ウロン酸を含むフラクションのうち、分子量５００万以上、４０万以上〜５００万未満、４０万未満の３区分で、それぞれフラクションを集め、透析後、凍結乾燥を行ない、３種の分子量違い魚類軟骨水抽出物（粉末）を得た。これらの3種の魚類軟骨水抽出物を、ＰＧ−１抽出物（分子量５００万以上のプロテオグリカンを含有）、ＰＧ−２抽出物（分子量４０万以上〜５００万未満のプロテオグリカンを含有）、ＰＧ−３抽出物（分子量４０万未満のプロテオグリカンを含有）とする。なお、この結果から、サンプルＮｏ．１０には、少なくとも分子量５００万以上のプロテオグリカンが含まれることが確認できた。【００８１】
経口摂取による皮膚抗老化能評価１
実際に哺乳動物に魚類軟骨水抽出物を摂取させ、その効果を検討した。
＜使用実験動物＞
ヘアレスマウス（Hr-/Kud ♂）（九動社）を実験に用いた。エストロゲン変動による皮膚状態への影響がないオス（６週齢）を予備飼育後、実験に供した。【００８２】
＜実験方法＞
マウスを３つの飼育ケージに表３のとおり割りふり、それぞれ異なる群（群１〜群３）とした（１群につき６匹）。また被検体は固体識別できるよう尾部に印を付けた。検討開始時まで予備飼育を続けた。試験時の平均体重は３７ｇであった。なお、表３の群３の評価素材である「魚類軟骨水抽出物」としてはサンプルＮｏ．１０を用いた。【００８３】
【表３】
2012099224.tif 000005
【００８４】
＜評価素材の経口投与サンプル調製＞
サンプルＮｏ．１０を0.35mg/mLになるように水に溶解して、投与サンプルを調製した。【００８５】
＜経口投与方法＞
ヘアレスマウスが８週齢に達した段階で、各投与サンプル０．５ｍＬを１日１回、ゾンデによる強制経口投与により投与した（0.175mg/day/匹）。コントロールは、蒸留水を０．５ｍＬ投与した。この投与を６回／週（月〜土の６日間の各日に１回）の頻度で、試験が終了するまで続けた。【００８６】
＜ＵＶＢ照射方法＞
ＵＶＢ照射は、経口投与開始３週間後より開始した。ＵＶＢ照射用ケージにマウスを入れ、ＵＶＢ照射装置内に入れて、１．０mW/ cm2の強度でUVBを６回／週（月〜土の６日間の各日に１回）照射した。照射１週目のみ６０mＪ/ cm2の照射量とし、２週目以降１２０mＪ/ cm2の照射量とした。なお、UVBは、波長280-315nmの紫外線である。【００８７】
＜抗炎症評価＞
マルチプローブ式皮膚計測器（MPA580：Courage-Khazaka社）のMaxameterにより、UVB照射４週間後および７週間後の紅斑量を測定し、抗炎症を評価した。各マウス背部５ヶ所を測定し、平均値を算出した。UVB照射による炎症は、紅斑を発生させる。よって、紅斑量が多いほど、炎症が激しいことを示す。
UVB照射４週間後及び７週間後の紅斑量測定結果を図７に示す。結果より、魚類軟骨水抽出物であるサンプルＮｏ．１０は、経口投与により紅斑を抑えることがわかった。従って、当該魚類軟骨水抽出物は、紫外線照射による炎症を抑えることがわかった。【００８８】
＜皮膚バリア機能評価＞
マルチプローブ式皮膚計測器（MPA580：Courage-Khazaka社）のTewameterにより、UVB照射４週間後および７週間後の経表皮透過蒸散水分量（TEWL）を測定し、皮膚バリア機能を評価した。各マウス背部３ヶ所を測定し、平均値を算出した。なお、TEWL値が大きいほど皮膚バリア機能（皮膚の外から体内への異物の侵入を防ぐ機能及び体内の水分が外へ逃げていくのを防ぐ機能）が低下していることを示す。
UVB照射４週間後及び７週間後のTEWL測定結果を図８に示す。結果より、魚類軟骨水抽出物であるサンプルＮｏ．１０は、経口投与によりTEWL値を下げ、皮膚バリア機能を改善することがわかった。【００８９】
経口摂取による皮膚抗老化能評価２ （分子量の違いによる効果の違いの検討）
サンプルＮｏ．１０、並びに、サンプルＮｏ．１０をさらに精製したＰＧ−１抽出物及びＰＧ−２抽出物を用いて、皮膚抗老化能を検討した。【００９０】
＜使用実験動物＞
ヘアレスマウス（Hr-/Kud ♂）（九動社）を実験に用いた。エストロゲン変動による皮膚状態への影響がないオス（６週齢）を予備飼育後、実験に供した。【００９１】
＜実験方法＞
マウスを５つの飼育ケージに表４のとおり割りふり、それぞれ異なる群（群１〜群５）とした（１群６匹）。また被検体は固体識別できるよう尾部に印を付けた。検討開始まで予備飼育を続けた。【００９２】
【表４】
2012099224.tif 000006
【００９３】
＜評価素材の経口投与サンプル調製＞
各評価素材を、0.2mg/mLになるように水に溶解して、投与サンプルを調製した。【００９４】
＜経口投与方法＞
ヘアレスマウスが８週齢に達した段階で、各投与サンプル０．５ｍＬを１日１回、ゾンデによる強制経口投与により投与した（0.1mg/day）。コントロールは、蒸留水を０．５ｍＬ投与した。この投与を６回／週（月〜土の６日間の各日に１回）の頻度で、試験が終了するまで続けた。【００９５】
＜ＵＶＢ照射方法＞
ＵＶＢ照射は、経口投与開始３週間後より開始した。ＵＶＢ照射用ケージにマウスを入れ、ＵＶＢ照射装置内に入れて、１．０mW/ cm2の強度でUVBを６回／週（月〜土の６日間の各日に１回）照射した。照射１週目のみ６０mＪ/ cm2の照射量とし、２週目以降１２０mＪ/ cm2の照射量とした。なお、UVBは、波長280-315nmの紫外線である。【００９６】
＜抗炎症評価＞
マルチプローブ式皮膚計測器（MPA580：Courage-Khazaka社）のMaxameterにより、UVB照射４週間後および７週間後の紅斑量を測定し、抗炎症を評価した。各マウス背部５ヶ所を測定し、平均値を算出した。UVB照射による炎症は、紅斑を発生させるため、紅斑量が高いほど、炎症が激しいことを示す。
UVB照射４週間後及び７週間後の紅斑量測定結果を図９に示す。結果より、用いた魚類軟骨水抽出物は、経口投与により紅斑を抑えており、従って紫外線照射による炎症を抑えることがわかった。また魚類軟骨水抽出物に含まれるプロテオグリカンのうち、分子量５００万以上の高分子量のプロテオグリカン（ＰＧ−１抽出物）が特に高い効果を発揮していることがわかった。【００９７】
＜皮膚バリア機能評価＞
マルチプローブ式皮膚計測器（MPA580：Courage-Khazaka社）のTewameterにより、UVB照射４週間後および７週間後の経表皮透過蒸散水分量（TEWL）を測定し、皮膚バリア機能を評価した。各マウス背部３ヶ所を測定し、平均値を算出した。なお、TEWL値が大きいほど皮膚バリア機能（皮膚の外から体内への異物の侵入を防ぐ機能及び体内の水分が外へ逃げていくのを防ぐ機能）が低下していることを示す。
UVB照射４週間後及び７週間後のTEWL測定結果を図１０に示す。結果より、用いた魚類軟骨水抽出物は、経口投与によりTEWL値を下げ、皮膚バリア機能を改善することがわかった。【００９８】
＜皮膚保水性評価＞
マルチプローブ式皮膚計測器（MPA580：Courage-Khazaka社）のCorneometer により、UVB照射４週間後および７週間後の角層水分量を測定し、皮膚保水性を評価した。各マウス背部１０ヶ所を測定し、平均値を算出した。
UVB照射４週間後及び７週間後のTEWL測定結果を図１１に示す。結果より、用いた魚類軟骨水抽出物は、経口投与により角層水分量を上げ、皮膚保水性を改善することがわかった。また魚類軟骨水抽出物に含まれるプロテオグリカンのうち、分子量５００万以上の分子量を有するプロテオグリカン（ＰＧ−１抽出物）が特に高い効果を発揮していることがわかった。【００９９】
なお、図７〜図１１において、図中の記号はそれぞれ次の意味を示す。
＊＊＊；ｐ＜０．００１
＊＊  ；ｐ＜０．０１
＊    ；ｐ＜０．０５
＋    ；ｐ＜０．１【０１００】
経口摂取による皮膚抗老化能評価３ （臨床試験）
被験者（健常な25歳〜55歳の女性14名）の前腕及び上腕内側皮膚に、下記に示す方法により、ラウリル硫酸ナトリウム（SLS）を含浸させたチャンバーで刺激し、刺激後の紅斑消失速度（前腕部で測定）および経表皮透過蒸散水分量（TEWL）（上腕部で測定）の変化を比較した（試験方法の詳細は下記）。【０１０１】
試験群として、サンプルＮｏ．１０を５００ｍｇ、プラセボとして「結晶セルロース粉末（セオラス（登録商標）ＦＤ−３０１（旭化成ケミカルズ（株）製））」５００ｍｇを、それぞれハードカプセル6粒に分けて封入し、１回につき３カプセルの割合で、１日２回被験者に飲用させた（すなわち、１日摂取量は５００ｍｇ）。なお、サンプルＮｏ．１０飲用被験者は７名、プラセボ飲用被験者は７名であった。【０１０２】
なお、サンプルＮｏ．１０の５００ｍｇ中には、分子量５００万以上のプロテオグリカンが約８０ｍｇ含まれる。当該値（約８０ｍｇ）は、図４のサンプルＮｏ．１０のウロン酸量クロマトグラムにおいて、分子量５００万以上のプロテオグリカンに相当するフラクション（Ｎｏ．１６〜２３）を集め、透析後、凍結乾燥させて乾燥重量を測定し、図４のクロマトグラムを描く際にＮｏ．１０をカラムにアプライした量（４ｍｇ）と、当該乾燥重量との比を求め、当該比を５００ｍｇに乗じて算出したものである。【０１０３】
飲用開始から５週目（測定終了時まで飲用を継続）に、各被験者の前腕及び上腕内側皮膚にSLSを含浸させたチャンバーを貼付して皮膚を刺激し、その後、腕の刺激部位と非刺激部位において、刺激後の前腕部の紅斑の色（Ｌ＊ａ＊ｂ＊表色系におけるａ＊値）、及び刺激後の上腕部の経表皮透過蒸散水分量（TEWL）値、をそれぞれ測定した。そして、非刺激部位の測定値に対する刺激部位の測定値の相対値（コントロール比）を算出し、紅斑消失速度およびTEWLの変動を調べた。結果を図１２及び図１３にそれぞれ示す。【０１０４】
なお、皮膚刺激及び測定は、より具体的には、次のようにして行った。
・SLSパッチ貼付による刺激方法及び測定方法
被験者の腕内側を洗浄後、22℃ 60％設定の恒温恒湿室に15分以上入室した後に0.5% SLS（Sodium dodecyl sulfate : 和光純薬工業株式会社 Lot.STQ8638）を30μＬ含んだろ紙付きのチャンバー（200 LARGE FINN CHAMBERS ON SCANPOR, NORGESPLASTER Ltd.）を貼り付け、4時間閉塞刺激した。その後チャンバーを剥がし、1時間後、1日後、2日後に、色彩色差計CR-400 （KONICA MINOLTA） にて刺激部位の紅斑の色（ａ＊値）および、Tewameter TM-300  （Courage+Khazaka） にて刺激部のTEWL値を測定した。【０１０５】
図１２から、サンプルＮｏ．１０を経口摂取することにより、紅斑が消失する速度が速まる（すなわち、炎症が改善される）ことが確認できた。また、図１３から、サンプルＮｏ．１０を経口摂取することにより、ＴＥＷＬ値が低下する（すなわち、皮膚バリア機能が改善・増強される）ことが確認できた。【０１０６】
細胞増殖効果の検討
上記脱脂サケ鼻軟骨小片５００ｇに、質量比で２．５倍量の精製水を加え、１００℃、９０℃、７０℃、又は５０℃で加熱した。１００℃と９０℃については３時間、７０℃と５０℃については６時間加熱した。１００℃と９０℃では軟骨は完全に溶解したが、７０℃と５０℃は軟骨が溶解しきれず一部残存した状態で抽出を終了した。そして、遠心分離機により8,000rpm、30分、4℃で遠心分離し、不溶物（残渣）を取り除いて上清を回収し、凍結乾燥して乾燥凍結サンプル（ＦＤサンプル）を得た。以下、これらのサンプルを、それぞれ、１００℃抽出ＦＤサンプル、９０℃抽出ＦＤサンプル、７０℃抽出ＦＤサンプル、及び５０℃抽出ＦＤサンプルともいう。また、１００℃で３時間加熱した後、さらに３時間加熱してから、同様に遠心分離及び凍結乾燥をして、乾燥凍結サンプルを得た。当該サンプルを以下１００℃（３ｈ）抽出ＦＤサンプルともいう。【０１０７】
これらＦＤサンプルを、それぞれＧｌｃＡ濃度が１ｍｇ/１ｍＬバッファーとなるよう調整し、上記＜プロテオグリカンの分子量の検討＞において最初にサンプルＮｏ．１０を解析したクロマトグラフィー（結果が図４に示されるもの）と同様にしてゲル濾過クロマトグラフィーによる解析を行い、それぞれのサンプルの分子量について検討した。具体的には、ウロン酸クロマトグラムから、分子量が５００万以上の成分が含まれる比率、分子量が２５０万以上の成分が含まれる比率、及び分子量が１８０万以上の成分が含まれる比率、をそれぞれ求めた。結果を表５に示す。【０１０８】
【表５】
2012099224.tif 000007
【０１０９】
次に、これらのサンプルの細胞増殖能を次のようにして検討した。すなわち、培養シャーレ内で、10% fetal bovine serum (FBS) を含む minimum essential medium (最小必須培地：MEM培地)中に、ヒト皮膚線維芽細胞（HDF53：CELL APPLICATIONS, INC）を1.5×104cells播種し、各サンプルを22μｍフィルターで濾過滅菌した後、MEM倍地中、20μｇ/mLの濃度になるように添加した。添加後、5日間培養した。培養後、MEM培地を除去し、Trypsin-EDTA (invitrogen) で細胞を剥がし懸濁させた後、トリパンブルー染色液を添加し、計測盤にて細胞数を計測した。【０１１０】
なお、コントロールとして水を用いた。また、比較のため、プロテオグリカンとして市販されている製品（市販品Ａとする）も同様に検討を行った。【０１１１】
結果を図１４に示す。９０℃抽出ＦＤサンプルは、コントロールに比べて有意に細胞増殖を促進した。また、７０℃抽出ＦＤサンプル、１００℃抽出ＦＤサンプルも細胞増殖を促進する傾向を示した。なお、当該検討における、コントロール、５０℃抽出ＦＤサンプル、７０℃抽出ＦＤサンプル、９０℃抽出ＦＤサンプル、１００℃抽出ＦＤサンプル、１００℃（３ｈ）抽出ＦＤサンプル、及び市販品Ａのｎ数は、それぞれこの順に、１１、３、６、１１、６、６、及び５である。統計処理はスチューデントのｔ検定により行った。【０１１２】
さらに、当該検討に用いた各サンプルの組成を分析した。各成分の分析は、次のようにして行った。タンパク質、脂質、灰分、水分、ヒドロキシプロリン量（コラーゲン量測定のために用いる）は、財団法人日本食品分析センターに委託して、各サンプル１００ｇあたりの成分分析を実施した。タンパク質量はケルダール法、脂質量は酸分解法、灰分量は直接灰化法、水分量は常圧加熱乾燥法、ヒドロキシプロリン量はアミノ酸自動分析法（ＨＰＬＣ法）によって測定した。炭水化物量はタンパク質量、脂質量、灰分量及び水分量を１００（ｇ）から減じることにより算出した。【０１１３】
なお、タンパク質量は、上記の通りケルダール法で測定したが、当該方法は窒素量を指標とする方法であり、グリコサミノグリカン由来の窒素も測定対象となるなどするため、以下のように補正した。【０１１４】
まず、非タンパク質であるグリコサミノグリカン由来の窒素を差し引くため、カルバゾール硫酸法により求めたウロン酸量から酸性糖成分量（コンドロイチン硫酸換算）を算出し（具体的には、ウロン酸量に換算係数２．５９３を乗じる）、コンドロイチン硫酸由来の窒素は分子量の２．９％に相当するため、得られた酸性糖成分量に２．９％を乗じることによりグリコサミノグリカン由来の窒素を算出した。【０１１５】
グリコサミノグリカン由来の窒素を差し引いて得られた窒素には、コラーゲン由来の窒素とコラーゲン以外のタンパク質由来の窒素が含まれている。コラーゲンとその他のタンパク質では、いわゆるタンパク係数が異なるため、それぞれの由来の窒素量を把握する必要がある。【０１１６】
コラーゲンの定量は、上述の通り、コラーゲンに特異的に存在するアミノ酸である「ヒドロキシプロリン」を定量することにより行った。具体的には、コラーゲン含有量は、コラーゲン特異的に存在するアミノ酸であるヒドロキシプロリン(Ｈｙｐ)を測定し、コラーゲン中にＨｙｐが６．７％含まれるとして算出した。このようにして得られたコラーゲン量に対してコラーゲンのタンパク係数５．５５を除することにより、コラーゲン由来の窒素量を算出した。【０１１７】
ケルダール法により得られた窒素定量値から、グリコサミノグリカン由来の窒素量およびコラーゲン由来の窒素量を差し引いて得られた値に、一般のタンパク質のタンパク係数である６．２５を乗じてコラーゲン以外のタンパク質量を算出した。【０１１８】
そして、タンパク質量は、コラーゲン量と前記算出にて得られたコラーゲン以外のタンパク質量を足すことで算出した。【０１１９】
結果を下記表６に示す。表６の値は、（g／抽出FDサンプル100g）を示す。なお、表６には、分子量１８０万以上のプロテオグリカンの量も併せて示す。当該分子量１８０万以上のプロテオグリカンの量の値は、表６の「グリコサミノグリカン量」に、表５の「１８０万以上の成分が含まれる比率」を乗じた値である。【０１２０】
【表６】
2012099224.tif 000008
【０１２１】
また、表６における「10%EtOH処理→90℃抽出FD」とは、１０％エタノールを用いて魚類軟骨の脱脂処理を行った後、９０℃の水で抽出を行って得たサンプルである。より具体的には、５００ｇの凍結サケ鼻軟骨小片に２．５倍量の１０％ＥｔＯＨ溶液を加えて、２４時間、室温でスターラー攪拌し、8,000rpm、30分、4℃で遠心分離し、回収した不溶物（軟骨を含む残渣）を９０℃、プロペラ攪拌抽出で軟骨が完全溶解するまで加熱して、その後表５に示すＦＤサンプルと同様の遠心分離、濾過処理をして得た凍結乾燥（ＦＤ）サンプルである。【０１２２】
表６に示されるように、本発明に係る魚類軟骨水抽出物は、含有されるタンパク質のほとんどがコラーゲンである。また、特に、脂質や灰分の含有量が少ないものほど、細胞増殖能を有する（すなわち、細胞増殖促進効果を奏する）であろうことがわかる。細胞増殖能を有することにより、より効率的に炎症改善効果又は抗老化効果を奏すると考えられる。
【図１ａ】
2012099224.tif 000009
【図１ｂ】
2012099224.tif 000010
【図１ｃ】
2012099224.tif 000011
【図２】
2012099224.tif 000012
【図３】
2012099224.tif 000013
【図４ａ】
2012099224.tif 000014
【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2012099224.tif 000019
【図９】
2012099224.tif 000020
【図１０】
2012099224.tif 000021
【図１１】
2012099224.tif 000022
【図１２】
2012099224.tif 000023
【図１３】
2012099224.tif 000024
【図１４】
2012099224.tif 000025
【国際調査報告】
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