(57)【要約】  より具体的なＤＥＣ１における他の脂肪関連因子との作用機序および概日リズムの影響を利用した、確実性を有する脂質代謝関連疾患の検査方法、ならびに脂質代謝関連疾患の予防および／または治療剤の評価方法を提供する。脂質代謝関連疾患の検査方法は、被検体から採取した試料における、ＤＥＣ１により概日リズムを誘導される少なくとも一つの脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量を指標とすることを特徴とする。好ましくは、当該試料は、脂肪細胞、脂肪組織、または、脂肪細胞から分泌される物質を含む生体試料のいずれかである。
2012105630.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体から採取した試料における、ＤＥＣ１により概日リズムを誘導される少なくとも一つの脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量を指標とすることを特徴とする、脂質代謝関連疾患の検査方法。
【請求項２】
前記試料は、脂肪細胞、脂肪組織、または、脂肪細胞から分泌される物質を含む生体試料のいずれかであることを特徴とする、請求項１に記載の脂質代謝関連疾患の検査方法。
【請求項３】
前記少なくとも一つの脂肪関連遺伝子は、Ａｂｃａ１、Ａｃｓｌ１、Ａｄｆｐ、Ａｇｐａｔ２、Ｃｄ３６、Ｃｉｄｅｃ、Ｆａｂｐ４、Ｆａｓｎ、Ｇｐａｔ３、Ｌｉｐｅ、Ｌｐｉｎ１、Ｐｌｉｎ、Ｐｎｐｌａ２、Ｓ３−１２、Ｃｅｂｐα、Ｃｅｂｐβ、Ｃｅｂｐδ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｋｌｆ−４、Ｋｌｆ−１５、Ｒｅｔｎ、Ａｃｏｔ２、Ｃｈｋａ、Ｋｌｆ−５、Ｐｇｃ−ｌα、Ｓｒｅｂｐ２、Ｔｃ１０−like、ＩＬ−６、Ｒｂｐ４、Ａｄｉｐｏｑおよび／またはＬｅｐｔｉｎであることを特徴とする、請求項１または２に記載の脂質代謝関連疾患の検査方法。
【請求項４】
前記少なくとも一つの脂肪関連遺伝子は、アディポサイトカインの発現に関連する遺伝子であることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の脂質代謝関連疾患の検査方法。
【請求項５】
前記アディポサイトカインは、アディポネクチンであることを特徴とする、請求項４に記載の脂質代謝関連疾患の検査方法。
【請求項６】
被験物質の存在下および非存在下での、被検体から採取した試料における、ＤＥＣ１により概日リズムを誘導される少なくとも一つの脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量を測定する測定工程と、
前記被験物質の非存在下での前記試料における前記少なくとも一つの脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量に対する、前記被験物質の存在下での前記試料における前記少なくとも一つの脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量を比較する比較工程と、
を含むことを特徴とする、脂質代謝関連疾患の予防および／または治療剤の評価方法。
【請求項７】
前記試料は、脂肪細胞、脂肪組織、または、脂肪細胞から分泌される物質を含む生体試料のいずれかであることを特徴とする、請求項６に記載の脂質代謝関連疾患の予防および／または治療剤の評価方法。
【請求項８】
前記少なくとも一つの脂肪関連遺伝子は、Ａｂｃａ１、Ａｃｓｌ１、Ａｄｆｐ、Ａｇｐａｔ２、Ｃｄ３６、Ｃｉｄｅｃ、Ｆａｂｐ４、Ｆａｓｎ、Ｇｐａｔ３、Ｌｉｐｅ、Ｌｐｉｎ１、Ｐｌｉｎ、Ｐｎｐｌａ２、Ｓ３−１２、Ｃｅｂｐα、Ｃｅｂｐβ、Ｃｅｂｐδ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｋｌｆ−４、Ｋｌｆ−１５、Ｒｅｔｎ、Ａｃｏｔ２、Ｃｈｋａ、Ｋｌｆ−５、Ｐｇｃ−ｌα、Ｓｒｅｂｐ２、Ｔｃ１０−like、ＩＬ−６、Ｒｂｐ４、Ａｄｉｐｏｑおよび／またはＬｅｐｔｉｎであることを特徴とする、請求項６または７に記載の脂質代謝関連疾患の予防および／または治療剤の評価方法。
【請求項９】
前記少なくとも一つの脂肪関連遺伝子は、アディポサイトカインの発現に関連する遺伝子であることを特徴とする、請求項６ないし８のいずれか１項に記載の脂質代謝関連疾患の予防および／または治療剤の評価方法。
【請求項１０】
前記アディポサイトカインは、アディポネクチンであることを特徴とする、請求項９に記載の脂質代謝関連疾患の予防および／または治療剤の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪調節因子ＤＥＣ１を利用する、脂質代謝関連疾患の検査方法、ならびに脂質代謝関連疾患の予防および／または治療剤の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂質代謝関連疾患、例えば、メタボリックシンドローム・肥満は多因子性疾患であり、病態または病因には不明な点が多い。その為、多くの製薬会社がメタボリックシンドローム・肥満の診断、予防および治療薬等を研究、開発している。【０００３】
近年報告されたメタボリックシンドローム・肥満等に関連する脂肪調節因子として、例えば、basic helix-loop-helix型転写調節因子であるＤＥＣ１（種々の動物において、ＳＨＡＲＰ−２、ＳＴＲＡ１３またはＢＨＬＨＢ２ともいう）が挙げられる（特許文献１参照）。さらに、特許文献２には、ＤＥＣ１と脂肪酸代謝との関係が示されており、根拠としてＤＥＣ１制御に基づくマウス筋芽細胞株における脂肪酸のβ酸化（脂肪酸を酸化して脂肪酸アシルＣｏＡを生成し、アセチルＣｏＡを取り出す代謝経路）の抑制に係る実施例が記載されている。【０００４】
さらに、ＤＥＣ１は脂肪酸代謝調節に関連する因子である以外にも、多様な機能を持っていることが知られている。その一つとして、ＤＥＣ１は体内時計自体を制御する時計転写因子でもあり、概日リズムにおける発現をしていることが分かっている。例えば、特許文献３および非特許文献１には、分子時計としてのＤＥＣ１の役割が詳細に記載されており、ＤＥＣ１を用いて概日リズムを調節する方法が記載されている。具体的には、Ｅ−ｂｏｘエンハンサを通してＤＥＣ１を用い、同様に分子時計として機能しているＣＬＯＣＫおよびＢＭＡＬ１の誘発する転写活性化を制御し調節する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００６−５１４１１３号公報
【特許文献２】特開２００９−１６７１１７号公報
【特許文献３】特開２００５−２０４５０１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kawamoto, Ｔ., Ｍ. Noshiro, Ｆ. Sato, Ｋ. Maemura, Ｎ. Takeda, Ｒ. Nagai, Ｔ. Iwata, Ｋ. Fujimoto, Ｍ. Furukawa, Ｋ. Miyazaki, Ｓ. Honma, Ｋ. Honma, and Ｙ. Kato.、２００４、A novel autofeedback loop of Ｄｅｃ１ transcription involved in circadian rhythm regulation.、Biochem Biophys Res Commun ３１３、１１７−１２４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述したとおり、特許文献２には、ＤＥＣ１と脂肪酸代謝との関係が示されており、ＤＥＣ１制御に基づく肝細胞での脂肪酸β酸化代謝経路における抑制に係る実施例が記載されている。しかし、メタボリックシンドローム・肥満等が関連する全ての脂肪酸代謝調節、すなわち脂肪細胞での脂肪の貯蔵等をも含む脂肪酸代謝におけるＤＥＣ１の作用は未だ完全には実証されていない。さらに、脂肪調節因子（脂肪酸代謝調節因子）としてのＤＥＣ１と、他の脂肪関連因子との具体的な作用機序についても解明されていない。【０００８】
このような場合、脂肪調節因子のＤＥＣ１制御を、メタボリックシンドローム・肥満等の診断、予防および副作用のない実用的な治療薬等の研究、開発において直接的に繋げ、利用することは難しい。【０００９】
また、特許文献３に記載されているように、一般的にＤＥＣ１は概日リズムにおける発現をしている。その為、ＤＥＣ１制御による脂肪酸代謝の作用機序が明らかとなった場合でも、メタボリックシンドローム・肥満等の診断、予防および副作用のない実用的な治療薬等の研究、開発には、当該ＤＥＣ１の概日リズムでの発現を考慮しなければならない。【００１０】
しかし、前述したように、ＤＥＣ１が他の脂肪関連因子とどのように作用しているかは完全には明らかとなっていない為、当該ＤＥＣ１の概日リズム発現と脂肪酸代謝調節とを単純に組み合わせるのみでは、メタボリックシンドローム・肥満等の診断、予防および副作用のない実用的な治療薬等の研究、開発が可能であるとは言い難い。【００１１】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、より具体的なＤＥＣ１における他の脂肪関連因子との作用機序および概日リズムの影響を利用した、確実性を有する脂質代謝関連疾患の検査方法、ならびに脂質代謝関連疾患の予防および／または治療剤の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成する為、本発明者らは、ルシフェラーゼレポーターアッセイ、クロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰアッセイ）、ゲルシフトアッセイおよびリアルタイムＰＣＲ等の実験方法を用い、核内受容体によるＤｅｃ１の発現調節機構の解析、マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪分化モデルを用いたＤＥＣ１の役割解析、および、ＤＥＣ１ノックアウトマウスの脂肪分化・脂質代謝調節における標的遺伝子の解析（実施例参照）を行った。【００１３】
本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、ＤＥＣ１は脂肪関連遺伝子カセット全体の概日リズムを誘導するとともに、脂肪分化、脂肪代謝およびアディポサイトカイン産生を統合的に制御する転写因子であることが解明された（ＤＥＣ１−脂肪関連遺伝子系）。具体的には、まず、ＲＯＲαがＤＥＣ１発現を促進し、ＤＥＣ１がＰＰＡＲγのパートナーのＲＸＲαに結合する。その結果、ＰＰＡＲγ２：ＲＸＲα作用が抑制され、ＰＰＡＲγ２とその標的遺伝子群の発現も抑制される。最後には、脂肪代謝抑制および脂肪分化抑制に至るということが解明された。【００１４】
なお、Choらの最近の報告でも、ＤＥＣ１は核内受容体等とヘテロ二量体をつくるＲＸＲαと相互作用し、抑制因子として機能することがわかっている（Cho, Ｙ., Ｍ. Noshiro, Ｍ. Choi, Ｋ. Morita, Ｔ. Kawamoto, Ｋ. Fujimoto, Ｋ. Kato, and Ｍ. Makishima、２００９、The basic helix-loop-helix proteins differentiated embryo chondrocyte （Ｄｅｃ）１ and ＤＥＣ２ function as corepressors of retinoid Ｘ receptors.、Mol Pharmacol ７６、１３６０−１３６９参照 ）。【００１５】
さらには、このようなＤＥＣ１−脂肪関連遺伝子系は、主として脂肪組織選択的に作動するということも示唆された。具体的には、肝臓の場合、ＤＥＣ１により概日リズムを誘導される脂肪関連遺伝子は少ないか、または存在しないということが解明された（実施例および比較例参照）。【００１６】
そこで、本発明の第１の態様に係る脂質代謝関連疾患の検査方法は、被検体から採取した試料における、ＤＥＣ１により概日リズムを誘導される少なくとも一つの脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量を指標とすることを特徴とする。【００１７】
好ましくは、前記試料は、脂肪細胞、脂肪組織、または、脂肪細胞から分泌される物質を含む生体試料のいずれかであることを特徴とする。【００１８】
また、好ましくは、前記少なくとも一つの脂肪関連遺伝子は、Ａｂｃａ１、Ａｃｓｌ１、Ａｄｆｐ、Ａｇｐａｔ２、Ｃｄ３６、Ｃｉｄｅｃ、Ｆａｂｐ４、Ｆａｓｎ、Ｇｐａｔ３、Ｌｉｐｅ、Ｌｐｉｎ１、Ｐｌｉｎ、Ｐｎｐｌａ２、Ｓ３−１２、Ｃｅｂｐα、Ｃｅｂｐβ、Ｃｅｂｐδ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｋｌｆ−４、Ｋｌｆ−１５、Ｒｅｔｎ、Ａｃｏｔ２、Ｃｈｋａ、Ｋｌｆ−５、Ｐｇｃ−ｌα、Ｓｒｅｂｐ２、Ｔｃ１０−like、ＩＬ−６、Ｒｂｐ４、Ａｄｉｐｏｑおよび／またはＬｅｐｔｉｎであることを特徴とする。【００１９】
より好ましくは、前記少なくとも一つの脂肪関連遺伝子は、アディポサイトカインの発現に関連する遺伝子であることを特徴とする。【００２０】
さらに好ましくは、前記アディポサイトカインは、アディポネクチンであることを特徴とする。【００２１】
本発明の第２の態様に係る脂質代謝関連疾患の予防および／または治療剤の評価方法は、
被験物質の存在下および非存在下での、被検体から採取した試料における、ＤＥＣ１により概日リズムを誘導される少なくとも一つの脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量を測定する測定工程と、
前記被験物質の非存在下での前記試料における前記少なくとも一つの脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量に対する、前記被験物質の存在下での前記試料における前記少なくとも一つの脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量を比較する比較工程と、
を含むことを特徴とする。【００２２】
好ましくは、前記試料は、脂肪細胞、脂肪組織、または、脂肪細胞から分泌される物質を含む生体試料のいずれかであることを特徴とする。【００２３】
また、好ましくは、前記少なくとも一つの脂肪関連遺伝子は、Ａｂｃａ１、Ａｃｓｌ１、Ａｄｆｐ、Ａｇｐａｔ２、Ｃｄ３６、Ｃｉｄｅｃ、Ｆａｂｐ４、Ｆａｓｎ、Ｇｐａｔ３、Ｌｉｐｅ、Ｌｐｉｎ１、Ｐｌｉｎ、Ｐｎｐｌａ２、Ｓ３−１２、Ｃｅｂｐα、Ｃｅｂｐβ、Ｃｅｂｐδ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｋｌｆ−４、Ｋｌｆ−１５、Ｒｅｔｎ、Ａｃｏｔ２、Ｃｈｋａ、Ｋｌｆ−５、Ｐｇｃ−ｌα、Ｓｒｅｂｐ２、Ｔｃ１０−like、ＩＬ−６、Ｒｂｐ４、Ａｄｉｐｏｑおよび／またはＬｅｐｔｉｎであることを特徴とする。【００２４】
より好ましくは、前記少なくとも一つの脂肪関連遺伝子は、アディポサイトカインの発現に関連する遺伝子であることを特徴とする。【００２５】
さらに好ましくは、前記アディポサイトカインは、アディポネクチンであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、より具体的なＤＥＣ１における他の脂肪関連因子との作用機序および概日リズムの影響を利用した、確実性を有する脂質代謝関連疾患の検査方法、ならびに脂質代謝関連疾患の予防および／または治療剤の評価方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪分化の経時変化を示す図である。
【図２】マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪分化過程における分化関連および脂質代謝遺伝子の発現を示す図である。
【図３】脂肪細胞における中性脂肪代謝関連遺伝子を示す図である。
【図４】ＮＩＨ３Ｔ３細胞系におけるＤＥＣ１のＰＰＲＥレポーターへの影響を示す図である。
【図５】マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞系におけるＤＥＣ１のＰＰＲＥレポーターへの影響を示す図である。
【図６】Ｐｐａｒγ２、Ｌｐｌ、PerilipinおよびResistinの各遺伝子のＰＰＲＥ領域に係るＣｈＩＰアッセイの結果を示す図である。
【図７】ＤＥＣ１が直接作用するタンパク質を解析した免疫沈降法の結果を示す図である。
【図８】ＤＥＣ１による標的遺伝子発現抑制の二重の機構を示す図である。
【図９】実施例に係るＤＥＣ１ノックアウトマウスが時計遺伝子の発現に及ぼす影響を示す図である。
【図１０】実施例に係るＤＥＣ１ノックアウトマウスが脂肪代謝調節因子の発現に及ぼす影響を示す図である。
【図１１】実施例に係るＤＥＣ１ノックアウトマウスが中性脂肪代謝関連遺伝子の発現に及ぼす影響を示す図である。
【図１２】実施例に係るＤＥＣ１ノックアウトマウスがその他の脂質代謝酵素遺伝子の発現に及ぼす影響を示す図である。
【図１３】実施例に係るＤＥＣ１ノックアウトマウスがアディポサイトカインの発現に及ぼす影響を示す図である。
【図１４】実施例に係るＤＥＣ１ノックアウトマウスの脂肪代謝調節遺伝子、中性脂肪代謝関連遺伝子およびアディポサイトカインの発現のリズム性を示す図である。
【図１５】脂肪組織でのＤＥＣ１ノックアウトマウスが脂肪関連遺伝子の発現に及ぼす影響を示す図である。
【図１６】肝臓でのＤＥＣ１ノックアウトマウスが脂肪関連遺伝子の発現に及ぼす影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。本明細書において「含む」または「含有する」といった表現は、「からなる」または「から構成される」という意も含むものとする。
【００２９】
（脂質代謝関連疾患の検査方法）
本発明の実施の形態１は、脂質代謝関連疾患の検査（診断）方法に関する。具体的には、被検体から採取した試料における、ＤＥＣ１により概日リズムを誘導される少なくとも一つの脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量を指標とすることを特徴とする。
【００３０】
なお、本明細書において「脂質代謝関連疾患」とは、脂質代謝（体内における脂肪の流れ）が関連している多くの疾患を意味する。例えば、メタボリックシンドロームまたは肥満等を挙げることができる。本明細書において「被検体」とは、検査対象となり得る生物、例えば動物、植物または微生物等を意味する。特に、動物（最も好ましくは、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコまたはイヌ等の哺乳動物）が好ましい。
【００３１】
本明細書において、「試料」とは、前述した任意の被検体から採取することが可能であり、かつ「ＤＥＣ１により概日リズムを誘導される少なくとも一つの脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量」を測定することが可能である、当業者が一般的に利用しうる任意の対象試料を意味する。例えば、細胞、組織または液体成分等の生体試料が挙げられる。後の実施例において詳細に説明するが、ＤＥＣ１−脂肪関連遺伝子系は、脂肪組織選択的に作動することが示唆される。その為、このような試料は脂肪細胞、脂肪組織、または、脂肪細胞から分泌される物質を含む生体試料のいずれかが好ましい。
【００３２】
最も好ましくは、被検体から採取した試料とは、ヒトから採取した脂肪細胞から分泌される物質を含む末梢血である。試料の採取方法については、被検体および試料に適宜合った当業者が一般的に利用しうる任意の方法において採取することが可能である。例えば、ヒトの末梢血を採取する場合には、注射器等により静脈から５ｍｌ程度の末梢血を採取すればよい。
【００３３】
「ＤＥＣ１により概日リズムを誘導される脂肪関連遺伝子」は、脂肪代謝調節因子の発現に関連する遺伝子、中性脂肪代謝関連遺伝子、その他の脂質代謝酵素遺伝子およびアディポサイトカインの発現に関連する遺伝子等が含まれ、かつこれらのうちＤＥＣ１によって概日リズムを誘導されるものを意味する。特に、Ａｂｃａ１、Ａｃｓｌ１、Ａｄｆｐ、Ａｇｐａｔ２、Ｃｄ３６、Ｃｉｄｅｃ、Ｆａｂｐ４、Ｆａｓｎ、Ｇｐａｔ３、Ｌｉｐｅ、Ｌｐｉｎ１、Ｐｌｉｎ、Ｐｎｐｌａ２、Ｓ３−１２、Ｃｅｂｐα、Ｃｅｂｐβ、Ｃｅｂｐδ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｋｌｆ−４、Ｋｌｆ−１５、Ｒｅｔｎ、Ａｃｏｔ２、Ｃｈｋａ、Ｋｌｆ−５、Ｐｇｃ−ｌα、Ｓｒｅｂｐ２、Ｔｃ１０−like、ＩＬ−６、Ｒｂｐ４、Ａｄｉｐｏｑおよび／またはＬｅｐｔｉｎが好ましい。
【００３４】
このうち、前述したように、被検体の試料としてヒトの末梢血を採取する場合には、アディポサイトカインの発現に関連する遺伝子が好ましく、例えばＡｄｉｐｏｑ（アディポネクチン）、ＩＬ−６、Ｌｅｐｔｉｎ、Ｒｂｐ４および／またはＲｅｔｎ等を挙げることができる。これらのうち、アディポネクチンが最も好ましい。
【００３５】
これらの脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量（一日２４時間周期で変動する発現量）の測定方法は、被検体および試料に適宜合わせ、当該技術分野において公知である方法なら限定されない。例えば、転写産物の発現量は、細胞または組織から調整したTotal  ＲＮＡでの定量リアルタイムＰＣＲまたはノザンブロッティング等により測定され得る。また、翻訳産物の発現量は、細胞または組織から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定され得る。免疫学的手法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法または蛍光抗体法等により測定され得る。
【００３６】
具体的には、例えば、まず複数の脂質代謝関連疾患の検体および非脂質代謝関連疾患の検体（検体によって異なるが、被検体と同齢および同姓等の同条件の正常かつ健康な検体が好ましい）から採取した末梢血内の、（少なくとも一つ以上の）アディポサイトカインの概日リズムに基づく発現量のデータを定量リアルタイムＰＣＲ等によって収集しておく。次に、当該概日リズム全体におけるそれぞれの検体の発現量の平均データと、定量リアルタイムＰＣＲ等によって測定した被検体から採取した末梢血の当該概日リズム全体とを比較することによって、被検体が脂質代謝関連疾患であるか否かを検査（診断）することができる。
【００３７】
また、概日リズム全体において比較せずとも、概日リズムにおける任意の時間帯においても、脂質代謝関連疾患であるか否かを検査（診断）することができる。具体的には、例えば、まず同様に、複数の脂質代謝関連疾患の検体および非脂質代謝関連疾患の検体の末梢血中のアディポサイトカインの時間帯別の概日リズムの平均データをＲＩＡ法等によって収集しておく。次は、被検体から末梢血を採取し、アディポサイトカインの量をＲＩＡ法等により測定する。平均データと被検体から採取した末梢血中のアディポサイトカインの量とを比較する際に、当該平均データにおいて、被検体から末梢血を採取した時間帯における、当該時間帯の平均データでのアディポサイトカインの量と比較することによって、被検体が脂質代謝関連疾患であるか否かを容易に検査（診断）することができる。
【００３８】
これらのように、概日リズムを有して発現するＤＥＣ１により、前述したような特定の脂肪関連遺伝子が特定の概日リズムを持って発現するという現象を利用した検査方法のことを、本明細書においては、ＤＥＣ１により概日リズムを誘導される脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量を指標とする検査方法、として示している。
【００３９】
すなわち、本明細書における「（概日リズムに基づく）発現量を指標とする」とは、正常かつ健康な同種の検体から採取した同種の試料における、ＤＥＣ１により概日リズムを誘導される少なくとも一つの同脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量と比較した場合において、当該被検体の概日リズムに基づく発現量がどのように変化しているのか（例えば、同様の概日リズムを有しているか否か、時間帯による発現量が同様であるか否か、または同様の位相を有しているか否か等）を判断するという意味を示す。より具体的には、当該被検体の概日リズムに基づく発現量の変化が比較対象と同様の場合は非脂質代謝関連疾患（正常かつ健康）であるとの検査結果である可能性が高く、前述したような差異を有する場合は脂質代謝関連疾患であるとの検査結果である可能性が高い。非脂質代謝関連疾患（正常かつ健康）である場合の概日リズムに基づく発現量の変化パターンについては、後述の実施例および図１４を参照されたい。
【００４０】
なお、一つ以上の脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量を指標としても構わない為、多変量解析を用いることも可能である。例えば、前述と同様に、採取した末梢血から予めアディポサイトカインの概日リズムに基づく発現量のデータを収集しておき、統計ソフト等を用いたクラスタリング（好ましくは完全連結法の階層的クラスタリング）解析を行い検査することも可能である。
【００４１】
このように、本実施の形態１に係る脂質代謝関連疾患の検査方法では、本発明者らによって解明された、より具体的なＤＥＣ１における他の脂肪関連因子との作用機序および概日リズムの影響が利用されている。この場合、概日リズムに合致した脂質代謝関連疾患の検査（診断）ができる為、より確実性を有する検査（診断）をすることが可能となり、また、実用的な（例えば、薬の投与時間等を取り入れた）脂質代謝関連疾患の予防薬および／または治療薬等の研究、開発に直接的に繋げて利用することも可能となる。
【００４２】
特に、試料を脂肪細胞、脂肪組織、または、脂肪細胞から分泌される物質を含む生体試料とした場合、本発明者らによりＤＥＣ１−脂肪関連遺伝子系は脂肪組織選択的に作動することが示唆された為、脂肪組織のみに作用・発現する薬剤等を利用し、副作用が少ない脂質代謝関連疾患の予防薬および／または治療薬等の研究、開発が可能となる。また、試料をヒトの末梢血とし、アディポサイトカインの発現量を指標として検査、すなわち診断を行う場合には、生きているヒトに対し苦痛を伴わずに正確な脂質代謝関連疾患の診断を行うことができる為、さらに有利な効果を奏する。
【００４３】
（脂質代謝関連疾患の予防および／または治療剤の評価方法）
本発明の実施の形態２は、脂質代謝関連疾患の予防および／または治療剤の評価方法に関する。なお、本明細書において「脂質代謝関連疾患の予防および／または治療剤の評価方法」とは、「脂質代謝関連疾患の予防および／または治療剤のスクリーニング方法」の意を含む。
【００４４】
本実施の形態２では、具体的には、測定工程と比較工程とを含む。測定工程とは、被験物質の存在下および非存在下での、被検体から採取した試料における、ＤＥＣ１により概日リズムを誘導される少なくとも一つの脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量を測定する工程である。比較工程とは、被験物質の非存在下での試料における当該少なくとも一つの脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量に対する、当該被験物質の存在下での当該試料における当該少なくとも一つの脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量を比較する工程である。
【００４５】
本明細書において「被験物質」とは、脂質代謝関連疾患の予防および／または治療剤となるか否かの評価の対象となり得るあらゆる物質を意味する。例えば、低分子化合物、核酸またはポリペプチド等が挙げられる。低分子化合物、核酸またはポリペプチド等は、天然物から抽出および精製されたものであってもよく、人工的に合成されたものであっても構わない。また、精製されたものに限らず、未精製のものでも被験物質として使用することができる。また、新規な物質に限らず、公知の物質またはその改良物であってもよい。例えば、既存の治療薬もしくは予防薬またはその誘導体であっても、評価をすることが可能である。
【００４６】
なお、被検体から採取した試料の意味および好ましい例、ＤＥＣ１により概日リズムを誘導される少なくとも一つの脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量の意味および好ましい例、ならびにその発現量の測定方法については、前述の実施の形態１と同様である。
【００４７】
本実施の形態２は、具体的には、例えば、まず脂質代謝関連疾患の被検体から採取した末梢血の、（少なくとも一つ以上の）アディポサイトカインの概日リズムに基づく発現量を定量リアルタイムＰＣＲ等によって測定しておく。次に、被検体に対し被験物質の経口投与または静脈内投与等を行う。その後、同様に被検体から採取した末梢血のアディポサイトカインの概日リズムに基づく発現量を定量リアルタイムＰＣＲ等によって測定し、それぞれの測定した当該概日リズムに基づく発現量を比較することによって、当該被験物質が脂質代謝関連疾患の予防および／または治療剤であるか否かを評価することができる。
【００４８】
また、概日リズム全体において比較せずとも、概日リズムにおける任意の時間帯においても、脂質代謝関連疾患の治療剤であるか否かを評価することができる。具体的には、例えば、まず脂質代謝関連疾患の被検体の末梢血中のアディポサイトカインの発現量を特定の時間帯においてＲＩＡ法等によって測定しておく。次に、同様に、被検体に対し被験物質の経口投与または静脈内投与等を行う。その後、最初に測定した特定の時間帯と同様の時間帯において、被検体から採取した末梢血のアディポサイトカインの発現量をＲＩＡ法等によって測定する。最後に、それぞれの測定した当該発現量を比較することによって、当該被験物質が脂質代謝関連疾患の予防および／または治療剤であるか否かを評価することができる。
【００４９】
また、それぞれの測定した概日リズム全体または特定の時間帯の発現量を比較することによる脂質代謝関連疾患の治療剤等となるか否かの評価は、例えば、予め非脂質代謝関連疾患の検体（検体によって異なるが、例えば、被検体と同齢および同姓等の同条件の正常かつ健康な検体が好ましい）の概日リズム全体または特定の時間帯における発現量を測定しておき、これらを基準とすればよい。すなわち、被験物質非存在下では概日リズム全体または特定の時間帯における発現量が当該測定基準と離れていた被検体の測定結果が、被験物質存在下では当該測定基準に近づくか否か判断すればよい。例えば、当該測定基準と比較し、同様の概日リズムを有するようになるか否か、時間帯による発現量が同様となるか否か、または同様の位相を有するようになるか否か等を判断すればよい。判断の結果、当該測定基準に近づいた場合、脂質代謝関連疾患の治療剤等となる可能性が高い。
【００５０】
なお、一つ以上の脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量を測定・比較しても構わない為、多変量解析を用いることも可能である。例えば、前述の実施の形態１と同様に、統計ソフト等を用いたクラスタリング（好ましくは完全連結法の階層的クラスタリング）解析を行い検査することも可能である。
【００５１】
このように、本実施の形態２に係る脂質代謝関連疾患の予防および／または治療剤の評価方法では、前述の実施の形態１と同様に、より具体的なＤＥＣ１における他の脂肪関連因子との作用機序および概日リズムの影響が利用されている。この場合、概日リズムに合致した脂質代謝関連疾患の予防および／または治療剤の評価ができる為、より正確に評価・スクリーニングをすることが可能となる。すなわち、実用的な（例えば、薬の投与時間等を取り入れた）脂質代謝関連疾患の予防薬および／または治療薬等の研究、開発に直接的に繋げて利用することも可能となる。
【００５２】
特に、前述の実施の形態１と同様に、試料を脂肪細胞、脂肪組織、または、脂肪細胞から分泌される物質を含む生体試料とした場合、脂肪組織のみに作用・発現する薬剤等を利用し、副作用が少ない脂質代謝関連疾患の予防薬および／または治療薬等の研究、開発が可能となる。さらに、試料をヒトの末梢血とし、アディポサイトカインの発現量を基準として評価（スクリーニング）を行う場合には、生きているヒトに対し苦痛を伴わず、ヒトに対して直接的な脂質代謝関連疾患の予防薬および／または治療薬がスクリーニングできることも思慮される為、新薬に対し大いに貢献する可能性が高い。
【００５３】
また、本発明者らにより示唆された、ＤＥＣ１−脂肪関連遺伝子系の脂肪組織特異的な作用機序を考慮すると、脂肪組織におけるＤｅｃ１およびＤＥＣ１により概日リズムを誘導される脂肪関連遺伝子の発現量調節を利用した、脂質代謝系の調節方法が示唆される。
【００５４】
前述の実施の形態１と同様に、ＤＥＣ１により概日リズムを誘導される脂肪関連遺伝子は、Ａｂｃａ１、Ａｃｓｌ１、Ａｄｆｐ、Ａｇｐａｔ２、Ｃｄ３６、Ｃｉｄｅｃ、Ｆａｂｐ４、Ｆａｓｎ、Ｇｐａｔ３、Ｌｉｐｅ、Ｌｐｉｎ１、Ｐｌｉｎ、Ｐｎｐｌａ２、Ｓ３−１２、Ｃｅｂｐα、Ｃｅｂｐβ、Ｃｅｂｐδ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｋｌｆ−４、Ｋｌｆ−１５、Ｒｅｔｎ、Ａｃｏｔ２、Ｃｈｋａ、Ｌｄｌｒ、Ｋｌｆ−５、Ｐｇｃ−ｌα、Ｒｇｓ２、Ｒｘｒα、Ｓｒｅｂｐ２、Ｔｃ１０−like、ＩＬ−６、Ｒｂｐ４、Ａｄｉｐｏｑおよび／またはＬｅｐｔｉｎ等が挙げられる。なお、当該脂質代謝系の調節方法には、これらの他にもＤｅｃ１自身も含まれる。
【００５５】
簡潔に説明すると、Ｄｅｃ１およびＤＥＣ１により概日リズムを誘導される脂肪関連遺伝子の発現の阻害剤（例えば、ＲＮＡｉ等）あるいは促進剤（例えば、薬剤、成長因子またはホルモン等）を利用し、脂質代謝を促進あるいは調整することによって、脂質代謝系を正常に調節する。このような脂質代謝の調節により、脂質代謝関連疾患（メタボリックシンドロームおよび肥満等）の改善が示唆される。
【００５６】
より具体的に説明すると、前述したように、ＤＥＣ１−脂肪関連遺伝子系が作動する脂肪組織においては、Ｄｅｃ１も含めＤＥＣ１により概日リズムを誘導される脂肪関連遺伝子の発現は概日リズムを有している。そこで、脂質代謝関連疾患の被検体における少なくとも一つ以上のこれらの遺伝子の発現の概日リズム全体を測定し、非脂質代謝関連疾患の検体における少なくとも一つ以上のこれらの遺伝子の発現の概日リズム全体に近似するよう、前述のＤｅｃ１およびＤＥＣ１により概日リズムを誘導される脂肪関連遺伝子の発現の阻害剤あるいは促進剤を概日リズムに基づき投与等行う脂質代謝系の調節方法が示唆される。すなわち、前述したような、適切な薬の投与時間が開発可能であることを意味する。
【実施例】
【００５７】
まず、マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪分化過程における、分化関連および脂質代謝遺伝子の発現に与えるＤＥＣ１の役割について実験を行い検討した。【００５８】
マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞を、６−wellプレートを用い、インスリン１０μｇ／ｍＬ、イソブチルメチルキサンチン５００μＭおよびデキサメタゾン１μＭを含む培地にて分化誘導をしながら培養し、２日後ごとにインスリン１０μｇ／ｍＬを含む分化維持培地に交換しながら培養した。後にリアルタイムＰＣＲを行うため、分化誘導前２日から、分化誘導後８日まで経時的にＲＮＡ回収を行っておいた。【００５９】
図１は、マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪分化の経時変化を示す図である。図１に示すように、最終的な脂肪分化は、オイルレッド染色にて確認した。その結果、油滴は分化誘導後４日目には見られ、分化誘導後８日目にはかなりの油滴を有する細胞が観察された。【００６０】
次に、前述の回収したＲＮＡサンプルを用い、脂肪分化段階における様々な脂肪分化関連および脂質代謝関連遺伝子の発現パターンをリアルタイムＰＣＲにて解析する実験を行った。図２は、マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪分化過程における分化関連および脂質代謝遺伝子の発現を示す図である。図２のグラフは、それぞれの発現レベルの最大値を１００（％）とした相対値（％）で以て示されている。図２に示すように、脂肪分化誘導初期にｃ−Ｆｏｓおよびｃ−Ｊｕｎといった前初期遺伝子の発現量が上昇し、そのすぐ後にＣ／ｅｂｐβが上昇する。分化誘導２日目からは、脂肪分化において最も重要とされるＰｐａｒγ、ＲｏｒαおよびＬｐｌ等が上昇し、最終的にはＦａｂｐ４、Ｌｉｐｉｎ、ＭｇｌｌおよびPerilipin等の脂肪代謝関連遺伝子が上昇し、脂肪分化が進む。【００６１】
ＲＯＲαおよびＤＥＣ１が、ＰＰＡＲγに作用し、脂肪分化抑制因子として機能することは背景技術として知られている。しかし、前述したように、ＤＥＣ１は他の脂肪関連因子も含め、ＲＯＲαさらにはＰＰＡＲγとどのような作用で機能しているか、詳細は完全には明らかとなっていない。そこで、本発明者らは、ＤＥＣ１とＰＰＡＲγとの関連性についてより詳細に調べた。【００６２】
図３は、脂肪細胞における中性脂肪代謝関連遺伝子を示す図である。図３に示すように、脂肪細胞における中性脂肪代謝経路は、Very low density lipoprotein（ＶＬＤＬ）等から遊離脂肪酸（ＦＦＡ、free fatty acid）を取り込み、中性脂肪を再合成し油滴として蓄積するとともに、必要に応じて遊離脂肪酸を放出する。なお、調べた１４遺伝子全てのｍＲＮＡ発現レベルが野生型で同様の概日リズムを有し、Ｄｅｃ１ノックアウトで夜間に上昇し当該リズム性を減少させた（図３右下グラフ、および後述の（実施例）参照）。【００６３】
ここで、後に（実施例）にて具体的に説明するが、本発明者が鋭意研究した結果、脂肪組織における脂質関連遺伝子の多くがＤｅｃ１により発現抑制されていることが明らかとなった。これらの遺伝子は、ＰＰＡＲγのターゲットであると示唆される。このことを検証するために、同定されているＰＰＲＥコンセンサス配列（配列番号１に示す（３９））を含む領域を三個繋いだＤＮＡを組み込んだConsensusＰＰＲＥ−Ｌｕｃと、同定されているＬｐｌのＰＰＲＥのエレメント（配列番号２に示す（４０））を含む領域を三個繋いだＤＮＡを組み込んだＬｐｌ−ＰＰＲＥ−Ｌｕｃとで、ルシフェラーゼレポーターを構築した（ＰＧＬ−４Minimalプロモーターを含む）。次いで、ＤＥＣ１、ＰＰＡＲγ、および、ＰＰＡＲγとヘテロ二量体を形成するＲＸＲαの発現プラスミドと共に、脂肪分化後のＮＩＨ３Ｔ３細胞にFuGENE HD Transfection Reagentを用いて導入し、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。ＲＸＲαおよびＰＰＡＲγのそれぞれのリガンドとして、９−cis retinoic acid（５×１０−７Ｍ）およびtroglitazone（５×１０−６Ｍ）を培養液に加えた。【００６４】
図４は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞系におけるＤＥＣ１のＰＰＲＥレポーターへの影響を示す図である。なお、図４の上のグラフの実験系では、ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１であり、同様の実験を繰り返し行い再現性を確認した。図４の下に示す概要図は、当該実験系による結果を示している。すなわち、ＰＰＡＲγおよびＲＸＲαは、ConsensusＰＰＲＥ−ＬｕｃおよびＬｐｌ−ＰＰＲＥ−Ｌｕｃのプロモーター活性を促進した。一方、ＤＥＣ１は、両プロモーターに対するＲＸＲα−ＰＰＡＲγヘテロ二量体による促進効果を抑制した。【００６５】
同様に、脂肪分化能を有するマウス３Ｔ３−Ｌ１細胞系に変えて実験を行った。同様の方法にて、分化前（Preadipocytes）と脂肪分化後（Adipocytes）との両方のマウス３Ｔ３−Ｌ１細胞に導入し、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。図５は、マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞系におけるＤＥＣ１のＰＰＲＥレポーターへの影響を示す図である。図５に示すように、ＰＰＡＲγおよびＲＸＲαは、ConsensusＰＰＲＥ−ＬｕｃおよびＬｐｌ−ＰＰＲＥ−Ｌｕｃのプロモーター活性を促進した。一方、ＤＥＣ１は、両プロモーターに対するＲＸＲα−ＰＰＡＲγヘテロ二量体による促進効果を抑制した。また、ＤＥＣ１単独では殆ど影響しなかった。【００６６】
次に、脂質代謝関連遺伝子のＰＰＲＥへのＤＥＣ１の結合について解析する実験を行った。【００６７】
後に（実施例）にて詳細に述べるＤｅｃ１ノックアウトマウスで発現レベルが上昇した脂質代謝関連遺伝子の中で、Ｌｐｌ、Perilipin、および、Resistin等は、ＰＰＡＲγの標的としてＰＰＲＥサイトが同定されている。また、マウスまたはヒトのＰｐａｒγ遺伝子には、エクソンの使い分けで生じるアイソフォームＰＰＡＲγ１とＰＰＡＲγ２とが知られており、それぞれのプロモーターも異なる。後者のＰｐａｒγ２遺伝子は、ＰＰＡＲγ自身の標的となり、そのおおよその結合サイトが解析されている。そこで、これらの情報に基づいて、四つの遺伝子Ｐｐａｒγ２、Ｌｐｌ、Perilipin、および、Resistinに対するＤＥＣ１の結合をクロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰアッセイ）にて検討した。これらのＰＰＲＥを含むプロモーター領域には、Ｅ−Boxは存在しない。そこで、脂肪分化誘導後６日目のマウス３Ｔ３−Ｌ１細胞をサンプリングし、Ｐｐａｒγ２、Ｌｐｌ、Perilipin、および、ResistinのＰＰＲＥ領域に対し、ＤＥＣ１抗体を用いて共沈してくるＤＮＡ断片について各遺伝子のＰＰＲＥ領域を増幅するプライマーを設計し、ＰＣＲ解析を行った。【００６８】
図６は、Ｐｐａｒγ２、Ｌｐｌ、PerilipinおよびResistinの各遺伝子のＰＰＲＥ領域に係るCHIPアッセイの結果を示す図である。図６に示すように、Ｐｐａｒγ２、Ｌｐｌ、PerilipinおよびResistinのいずれの遺伝子においても、ＤＥＣ１が結合しているという結果が出た。【００６９】
このように、ＤＥＣ１タンパクがＲＸＲα−ＰＰＡＲγヘテロ二量体に作用することが明らかとなったが、そのどちらのタンパク質へ直接作用を持つのかを調べるために免疫沈降法で解析した。Flagを付したＤＥＣ１タンパク質、Flagのみ、ＰＰＡＲγおよびＲＸＲαの四つのタンパク質を組み合わせ、これらをＨＥＫ２９３細胞系で発現させ、その後ＤＥＣ１抗体で沈降させたものにＰＰＡＲγまたはＲＸＲαの何れのタンパクが共沈殿してくるかを調べた。図７は、ＤＥＣ１が直接作用するタンパク質を解析した免疫沈降法の結果を示す図である。図７に示すように、ＲＸＲαは単独でも、ＰＰＡＲγ共存でも、ＤＥＣ１によって沈降してきたが、ＰＰＡＲγはＲＸＲαが共存しなければ沈降してこなかった。この結果から、ＤＥＣ１が結合するのはＲＸＲαタンパク質であることが明らかになった。【００７０】
図８は、ＤＥＣ１による標的遺伝子発現抑制の二重の機構を示す図である。すなわち、図８は、上述した種々の結果を模式的に示した図である。具体的には、Ｐｐａｒγ遺伝子はＰＰＡＲ応答配列ＰＰＲＥを持っており、自身の遺伝子産物ＰＰＡＲγタンパクによっても制御されている。ＰＰＡＲγの標的遺伝子も同様の制御を受ける。ＤＥＣ１は核内受容体のパートナーであるＲＸＲαに結合し、その標的遺伝子を抑制する。すなわち、ＤＥＣ１はＰｐａｒγ遺伝子の転写抑制と、ＰＰＡＲγ生成の低下による抑制の二つのモードで抑制制御することが考えられる。Ｐｐａｒγ遺伝子自身とその標的遺伝子がＤＥＣ１によって抑制されることにより、ＲＸＲα−ＰＰＡＲγヘテロ二量体の作用はＤＥＣ１の制御を強く受けていると思われる。それによって、ＲＸＲα−ＰＰＡＲγの多様な作用がＤＥＣ１の影響を受けることが示唆される。【００７１】
以下、実施例および比較例を用いて本発明をより詳細に説明するが、実施例および比較例は本発明を限定するものではない。【００７２】
（実施例）
本実施例では、Ｄｅｃ１ノックアウトマウスが、時計関連遺伝子および脂肪関連遺伝子に及ぼす影響について検討した。【００７３】
Ｄｅｃ１ノックアウトマウスは、inGenious Targeting LaboratoryのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを使用した（Nakashima Ａ. et al、２００８、ＤＥＣ１ modulates the circadian phase of clock gene expression.、Mol Cell Biol ２８、４０８０−４０９２参照）。雄性の生後４から６ヶ月の野生型マウス（ＷＴ）およびＤｅｃ１ノックアウト（−／−）マウスを、１２時間ごとの明暗条件下において２から３週間飼育し、６時間ごとに各グループ３匹ずつ合計２４匹屠殺し、腹腔内鼠径部白色脂肪を採取した。【００７４】
このように採取した脂肪組織からＲＮＡを抽出し、定量リアルタイムＰＣＲによって各遺伝子の発現量の概日リズムを調査した。この際、ＲＮＡはTRIzol reagent（Invitrogen）を用いて抽出し、Total ＲＮＡはRNeasy mini kit（QIAGEN）を用いて精製した。定量リアルタイムＰＣＲは、精製したTotal ＲＮＡ（０．５μｇ）からReverTraAce（東洋紡）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＡＢＩ Prism ７９００ sequence detection system（Applied Biosystems）を用いて解析を行った。【００７５】
各遺伝子の発現量の測定には、それぞれに特異的なCustomized Taqman プローブとプライマーとの組み合わせ、またはUniversal Taqman Probe（Roche Diagnostics）とプライマーとの組み合わせを使用した。【００７６】
図９は、実施例に係るＤＥＣ１ノックアウトマウスが時計遺伝子の発現に及ぼす影響を示す図である。詳細には、時計遺伝子Ｄｅｃ１、Ｄｅｃ２、Ｒｏｒα、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｂｍａｌ１、Ｃｌｏｃｋ、Ｄｂｐ、Ｐｅｒ２およびＮｐａｓ２における、ＺＴ（Zeitgeber Time）４、ＺＴ１０、ＺＴ１６およびＺＴ２２での発現量を示している。ＺＴ０は点灯時刻、ＺＴ１２は消灯時刻である。なお、Ｄｅｃ１以外は、左側のグラフが野生型マウスであり、右側のグラフがＤｅｃ１ノックアウト（−／−）マウスである。【００７７】
以下、同様に脂肪関連遺伝子の発現量を測定した結果を示す。図１０は、実施例に係るＤＥＣ１ノックアウトマウスが脂肪代謝調節因子の発現に及ぼす影響を示す図である。詳細には、脂肪代謝調節因子ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｃｅｂｐα、Ｃｅｂｐβ、Ｃｅｂｐδ、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ１５およびＰｐａｒγにおける、ＺＴ４、ＺＴ１０、ＺＴ１６およびＺＴ２２での発現量を示している。【００７８】
図１１は、実施例に係るＤＥＣ１ノックアウトマウスが中性脂肪代謝関連遺伝子の発現に及ぼす影響を示す図である。詳細には、中性脂肪関連遺伝子Ｌｐｌ、Ａｃｓｌ１、Ｃｄ３６、Ｇｐａｔ３、Ａｇｐａｔ２、Ｌｉｐｉｎ、Ｄｇａｔ２、Ｐｌｉｎ、Adipophilin（Ａｄｆｐ）、Ｃｉｄｅｃ、Ｓ３−１２、Ａｔｇｌ、ＬｉｐｅおよびＭｇｌｌにおける、ＺＴ４、ＺＴ１０、ＺＴ１６およびＺＴ２２での発現量を示している。【００７９】
図１２は、実施例に係るＤＥＣ１ノックアウトマウスがその他の脂質代謝酵素遺伝子の発現に及ぼす影響を示す図である。詳細には、その他の脂質代謝酵素遺伝子Ａｂｃａ１、Ｆａｂｐ４、ＦａｓｎおよびＡｃａｔ２における、ＺＴ４、ＺＴ１０、ＺＴ１６およびＺＴ２２での発現量を示している。図１３は、実施例に係るＤＥＣ１ノックアウトマウスがアディポサイトカインの発現に及ぼす影響を示す図である。詳細には、アディポサイトカインのAdiponectin（Ａｄｉｐｏｑ）、Resistin（Ｒｅｔｎ）およびLeptinにおける、ＺＴ４、ＺＴ１０、ＺＴ１６およびＺＴ２２での発現量を示している。【００８０】
図１０ないし図１３に示すように、これらの脂肪関連遺伝子の発現量の概日リズムは、野生型マウスと比較し有意に低下するもの、上昇するものまたは変化が少ないものなど、様々な遺伝子による個別差があった。しかし、これらを観察すると、野生型マウスには、多くの脂肪関連遺伝子に発現量の共通する概日リズムの変化パターンが存在することが観察された。また、このような共通する変化パターンは、野生型マウスとＤＥＣ１ノックアウトマウスのいずれにも観察され、それぞれの共通する概日リズムの変化パターンは異なるパターンであることも確認された。【００８１】
図１４は、実施例に係るＤＥＣ１ノックアウトマウスの脂肪代謝調節遺伝子、中性脂肪代謝関連遺伝子およびアディポサイトカインの発現のリズム性を示す図である。図１４の各グラフは、図１０ないし図１３に示した脂肪関連遺伝子から数個の遺伝子のグラフを選別し、発現量の概日リズムの変化パターンが確認し易いよう、野生型マウスでの発現量の概日リズムの変化パターンを線により繋いだものである。図１４に示すように、野生型マウスの場合、脂肪代謝調節遺伝子、中性脂肪代謝関連遺伝子およびアディポサイトカインの発現量の概日リズムの変化パターンは、ＺＴ１０にピークを持つ概日リズムが観察された。一方、ＤＥＣ１ノックアウトマウスの場合、いずれの脂肪代謝調節遺伝子、中性脂肪代謝関連遺伝子およびアディポサイトカインの発現量の概日リズムの変化パターンでも夜間に発現の上昇が観察され、さらにはリズム性が失われたり、位相がずれたりしていた。【００８２】
すなわち、ＤＥＣ１が作用機構に含まれる、多くの脂肪代謝調節遺伝子、中性脂肪代謝関連遺伝子およびアディポサイトカインの野生型での発現量の概日リズムの変化パターン（具体的には、マウスの場合、ＺＴ４からＺＴ１０にかけて上昇し、ＺＴ１０にピークを持ち、ＺＴ１０からＺＴ１６へ、さらにはＺＴ２２へと発現量が減少する変化パターン）を指標とすることにより、これら脂肪代謝調節遺伝子、中性脂肪代謝関連遺伝子およびアディポサイトカインの発現が関連する脂肪代謝関連疾患についての検査、さらには脂肪代謝関連疾患に対する予防薬または治療薬等の開発に繋がることが考えられる。【００８３】
図１５は、脂肪組織でのＤＥＣ１ノックアウトマウスが脂肪関連遺伝子の発現に及ぼす影響を示す図である。すなわち、図１０ないし図１３により示された結果を簡単に表にしたものである。図１５では、脂肪関連遺伝子を、脂肪代謝調節因子、中性脂肪代謝関連遺伝子、その他の脂質代謝酵素遺伝子、およびアディポサイトカインに分けて記載されている。【００８４】
また、Rhythm in ＷＴの欄には、野生型のマウスにおいて当該遺伝子の発現に概日リズムがあるか否かが記載されており、ある場合にはRhysmicと記載されている（記載されていない場合は、概日リズムを有さないか、または発現していない事を意味する）。UpまたはDown by Ｄｅｃ１ ＫＯの欄は、具体的にどの時間帯において低下または上昇したかが記載されている（記載されていない場合は、野生型マウスと比較しても変化がない、または変化が少ない事を意味する）。【００８５】
（比較例）
本比較例では、前述の実施例におけるＤｅｃ１ノックアウトマウスの脂肪組織の脂肪関連遺伝子に及ぼす影響と、Ｄｅｃ１ノックアウトマウスの肝臓の脂肪関連遺伝子に及ぼす影響とについて検討した。【００８６】
実施例において前述した方法と同様の方法において、野生型マウスおよびＤｅｃ１ノックアウト（−／−）マウスの肝臓を採取し、採取した肝臓からＲＮＡを抽出し、定量リアルタイムＰＣＲによって各遺伝子の発現量の概日リズムを調査した。【００８７】
なお、本比較例においては、前述の図１５のように結果を簡単に表にしたもののみを示す。図１６は、肝臓でのＤｅｃ１ノックアウトマウスが脂肪関連遺伝子の発現に及ぼす影響を示す図である。図１６に示すように、肝臓における脂肪関連遺伝子のうち同様の概日リズムを有するものは少なかった。また、概日リズムを有している場合でも、脂肪組織（図１０ないし図１５）と比較すると、Ｄｅｃ１のノックアウトによる各脂肪関連遺伝子の発現量の変化に共通性が少なく、発現量が変化する時間帯はランダムである場合が多かった。【００８８】
この結果から、ＤＥＣ１は、脂肪組織選択的に脂肪関連遺伝子カセット全体の概日リズムを誘導するとともに、脂肪分化、脂肪代謝およびアディポサイトカイン産生を統合的に制御する転写因子であることが考えられる。すなわち、脂質代謝関連疾患の診断、予防薬または治療薬等の効率的な開発・研究の為には、肝臓における脂肪関連遺伝子により解析を行うのではなく、脂肪細胞、脂肪組織または脂肪細胞から分泌される物質を含む生体試料（特に、アディポサイトカイン）等における脂肪関連遺伝子により解析を行うべきであることが示唆される。【００８９】
本発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。【００９０】
本明細書の中で明示した論文および公開特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。【００９１】
本出願は、２０１１年２月３日に出願された日本国特許出願２０１１−２２１７２号に基づく。本明細書中に、日本国特許出願２０１１−２２１７２号の、明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、ＤＥＣ１は脂肪関連遺伝子カセット全体の概日リズムを誘導するとともに、脂肪分化、脂肪代謝およびアディポサイトカイン産生を統合的に制御する転写因子であることが解明された（ＤＥＣ１−脂肪関連遺伝子系）。さらに、当該ＤＥＣ１−脂肪関連遺伝子系は、脂肪組織選択的に作動するということも示唆された。【００９３】
そこで、本発明によれば、より具体的なＤＥＣ１における他の脂肪関連因子との作用機序および概日リズムの影響を利用した、確実性を有する脂質代謝関連疾患の検査方法、ならびに、脂質代謝関連疾患の予防および／または治療剤の評価方法を提供することができる。
【図２】
2012105630.tif 000003
【図１５】
2012105630.tif 000004
【図１６】
2012105630.tif 000005
【図１】
2012105630.tif 000006
【図３】
2012105630.tif 000007
【図４】
2012105630.tif 000008
【図５】
2012105630.tif 000009
【図６】
2012105630.tif 000010
【図７】
2012105630.tif 000011
【図８】
2012105630.tif 000012
【図９】
2012105630.tif 000013
【図１０】
2012105630.tif 000014
【図１１】
2012105630.tif 000015
【図１２】
2012105630.tif 000016
【図１３】
2012105630.tif 000017
【図１４】
2012105630.tif 000018
【配列表】
2012105630000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年12月3日(2012.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体から採取した試料における、ＤＥＣ１により概日リズムを調節されるＡｂｃａ１、Ａｃｓｌ１、Ａｄｆｐ、Ａｇｐａｔ２、Ｃｄ３６、Ｃｉｄｅｃ、Ｆａｂｐ４、Ｆａｓｎ、Ｇｐａｔ３、Ｌｉｐｅ、Ｌｐｉｎ１、Ｐｌｉｎ、Ｐｎｐｌａ２、Ｓ３−１２、Ｃｅｂｐα、Ｃｅｂｐβ、Ｃｅｂｐδ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｋｌｆ−４、Ｋｌｆ−１５、Ａｃｏｔ２、Ｃｈｋａ、Ｋｌｆ−５、Ｐｇｃ−ｌα、Ｓｒｅｂｐ２、および、Ｔｃ１０−Ｌｉｋｅからなる脂肪関連遺伝子群のうち、少なくとも一つの脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量を指標とすることを特徴とする、脂質代謝関連疾患の検査方法。
【請求項２】
前記試料は、脂肪細胞、脂肪組織、または、脂肪細胞から分泌される物質を含む生体試料のいずれかであることを特徴とする、請求項１に記載の脂質代謝関連疾患の検査方法。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
被験物質の存在下および非存在下での、被検体から採取した試料における、ＤＥＣ１により概日リズムを調節されるＡｂｃａ１、Ａｃｓｌ１、Ａｄｆｐ、Ａｇｐａｔ２、Ｃｄ３６、Ｃｉｄｅｃ、Ｆａｂｐ４、Ｆａｓｎ、Ｇｐａｔ３、Ｌｉｐｅ、Ｌｐｉｎ１、Ｐｌｉｎ、Ｐｎｐｌａ２、Ｓ３−１２、Ｃｅｂｐα、Ｃｅｂｐβ、Ｃｅｂｐδ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｋｌｆ−４、Ｋｌｆ−１５、Ａｃｏｔ２、Ｃｈｋａ、Ｋｌｆ−５、Ｐｇｃ−ｌα、Ｓｒｅｂｐ２、および、Ｔｃ１０−Ｌｉｋｅからなる脂肪関連遺伝子群のうち、少なくとも一つの脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量を測定する測定工程と、
前記被験物質の非存在下での前記試料における前記少なくとも一つの脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量に対する、前記被験物質の存在下での前記試料における前記少なくとも一つの脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量を比較する比較工程と、
を含むことを特徴とする、脂質代謝関連疾患の予防および／または治療剤の評価方法。
【請求項７】
前記試料は、脂肪細胞、脂肪組織、または、脂肪細胞から分泌される物質を含む生体試料のいずれかであることを特徴とする、請求項６に記載の脂質代謝関連疾患の予防および／または治療剤の評価方法。
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
被検体から採取した試料における、ＤＥＣ１により概日リズムを調節されるＡｂｃａ１、Ａｃｓｌ１、Ａｄｆｐ、Ａｇｐａｔ２、Ｃｄ３６、Ｃｉｄｅｃ、Ｆａｂｐ４、Ｆａｓｎ、Ｇｐａｔ３、Ｌｉｐｅ、Ｌｐｉｎ１、Ｐｌｉｎ、Ｐｎｐｌａ２、Ｓ３−１２、Ｃｅｂｐα、Ｃｅｂｐβ、Ｃｅｂｐδ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｋｌｆ−４、Ｋｌｆ−１５、Ａｃｏｔ２、Ｃｈｋａ、Ｋｌｆ−５、Ｐｇｃ−ｌα、Ｓｒｅｂｐ２、および、Ｔｃ１０−Ｌｉｋｅからなる脂肪関連遺伝子群のうち、少なくとも一つの脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量を指標とすることを特徴とする、脂質代謝の概日リズムの検査方法。
【請求項１２】
被験物質の存在下および非存在下での、被検体から採取した試料における、ＤＥＣ１により概日リズムを誘導されるＡｂｃａ１、Ａｃｓｌ１、Ａｄｆｐ、Ａｇｐａｔ２、Ｃｄ３６、Ｃｉｄｅｃ、Ｆａｂｐ４、Ｆａｓｎ、Ｇｐａｔ３、Ｌｉｐｅ、Ｌｐｉｎ１、Ｐｌｉｎ、Ｐｎｐｌａ２、Ｓ３−１２、Ｃｅｂｐα、Ｃｅｂｐβ、Ｃｅｂｐδ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｋｌｆ−４、Ｋｌｆ−１５、Ａｃｏｔ２、Ｃｈｋａ、Ｋｌｆ−５、Ｐｇｃ−ｌα、Ｓｒｅｂｐ２、および、Ｔｃ１０−Ｌｉｋｅからなる脂肪関連遺伝子群のうち、少なくとも一つの脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量を測定する測定工程と、
前記被験物質の非存在下での前記試料における前記少なくとも一つの脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量に対する、前記被験物質の存在下での前記試料における前記少なくとも一つの脂肪関連遺伝子の概日リズムに基づく発現量を比較する比較工程と、
を含むことを特徴とする、被験物質の脂質代謝の概日リズムに対する影響の評価方法。
【国際調査報告】
2012105630.tif 000019
2012105630.tif 000020
2012105630.tif 000021
2012105630.tif 000022