(57)【要約】  下記配列番号：１から４で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかを含むペプチドである。  ＡＬＧＤＳＬＹＧＡＡＳＬＮ  （配列番号：１）  ＭＴＶＤＮＰＡＳＴＴＮＫＤＫＬＦＳＶＷＫ  （配列番号：２）  ＰＧＡＶＰＥＫ  （配列番号：３）  ＳＴＫＤＬＴＴＹ  （配列番号：４）
2012105595.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記配列番号：１から４で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかを含むことを特徴とするペプチド。
ＡＬＧＤＳＬＹＧＡＡＳＬＮ  （配列番号：１）
ＭＴＶＤＮＰＡＳＴＴＮＫＤＫＬＦＳＶＷＫ  （配列番号：２）
ＰＧＡＶＰＥＫ  （配列番号：３）
ＳＴＫＤＬＴＴＹ  （配列番号：４）
【請求項２】
下記配列番号：５から８で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかと結合する請求項１に記載のペプチド。
ＴＱＦＰＰＳＱＳＳ  （配列番号：５）
ＴＱＦＰＰＳＲＳＳ  （配列番号：６）
ＴＱＦＰＰＶＡＳＳ  （配列番号：７）
ＴＱＦＰＰＶＥＳＳ  （配列番号：８）
【請求項３】
請求項１から２のいずれかに記載のペプチドを含有することを特徴とする薬物輸送体。
【請求項４】
更に担体を含む請求項３に記載の薬物輸送体。
【請求項５】
担体が、巨大分子、微小集合体、微小粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、リポソーム、及びエマルジョンから選択される少なくともいずれかである請求項４に記載の薬物輸送体。
【請求項６】
担体の内部に診断、予防、及び治療の少なくともいずれかを行うための薬物が担持される請求項４から５のいずれかに記載の薬物輸送体。
【請求項７】
請求項１から２のいずれかに記載のペプチドを含有し、ポリオウイルスによる疾患発症を予防することを特徴とする抗ポリオウイルス剤。
【請求項８】
請求項１から２のいずれかに記載のペプチドを含有し、血液脳関門を透過することを特徴とする血液脳関門透過剤。
【請求項９】
請求項１から２のいずれかに記載のペプチドを含有し、トランスフェリン受容体と結合することを特徴とするトランスフェリン受容体捕捉体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液脳関門を透過するペプチド、薬物輸送体、抗ポリオウイルス剤、血液脳関門透過剤、及びトランスフェリン受容体捕捉体に関する。
【背景技術】
【０００２】
中枢神経系における血液脳関門（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ）は、血管内皮細胞などが密集しており物理的に狭くなっていることや、これらの細胞の生理学的機能などにより、中枢神経系への物質の取り込みが非常に制限されている。この血液脳関門の透過の機構は未だ解明されておらず、中枢神経系に障害が生じても、薬物を中枢神経系の目的とする領域に到達させることができないのが現状である。【０００３】
中枢神経系の障害としては、例えば、ポリオウイルス、日本脳炎ウイルスなどによる感染症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病等の神経変性疾患などが挙げられる。中枢神経系における感染症に対しては、ワクチン投与による予防、感染後は対症療法が主流となっており、有効な治療方法は未だ見出されていない。
例えば、ポリオウイルスに対する治療薬としてはクエン酸及び／又は亜鉛及びＬ−アルギニンを可能な担体とともに含有する抗ウイルス剤組成物（特許文献１参照）や、セレギリンを有効成分とする抗ウイルス剤（特許文献２参照）などの治療薬も提案されているが、これらの抗ウイルス剤を用いても、血液脳関門を透過することができない点で問題である。【０００４】
近年、薬物のより安全でより有効な利用を図るため、薬物に適した剤型だけでなく、薬物を標的となる生体内の部位に効率よく薬物送達（ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）する方法が注目されている。特に、薬物を必要な時に必要な量を必要な場所へ効率よく運ぶ輸送システムとして薬物送達システム（ＤＤＳ；Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）の実用化が求められている。
中枢神経系においては、ウイルスベクターを用いた方法が提案されている（例えば、特許文献３参照）。しかし、この方法は、安全性の面で問題であり、実用化には至っていない。したがって、血液脳関門を透過できるようなＤＤＳは見出されていないのが現状である。【０００５】
一方で、ウイルスは血液脳関門を透過して中枢神経系に感染する。例えば、ピコナウイルス科エンテロウイルス属に属するプラス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスであるポリオウイルス（ＰＶ；ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）は、小児マヒ（ポリオ；急性灰白髄炎）の病因であり、向神経性を有することが知られている。自然宿主はヒトのみであるが、実験的に霊長類には感染が成立する。ヒトには経口感染し、消化管で増殖後、扁桃腺やパイエル板を介し血液中に侵入する。やがてポリオウイルスは、血液脳関門を透過して中枢神経系に侵入し、そこで主に運動神経細胞に感染し細胞機能を破壊する。その結果、感染者の四肢に麻痺が生じる。中枢神経系には骨格筋から逆行性に神経軸索を輸送され運動神経細胞に到達する経路が存在することも知られている。【０００６】
ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ：ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）としては、ＣＤ１５５が、その感染に関与することが知られている（非特許文献２参照）。
しかし、ＰＶＲ遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの研究から、ポリオウイルスの血液脳関門の透過には、ＣＤ１５５は関与していないことが示唆された（非特許文献１参照）。これより、ポリオウイルスの血液脳関門の透過には、別の受容体が関与していることが推察される。【０００７】
したがって、ポリオウイルスの感染機構を解明することができれば、血液中から中枢神経系への血液脳関門透過機構も解明することができることが考えられるが、その機構は未だ解明されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−２９８８００号公報
【特許文献２】特開２００４−２９２３９９号公報
【特許文献３】特開２００９−１５９９８８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｙａｎｇ  ＷＸ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．  １９９７  Ｍａｒ  １７；２２９（２）：４２１−８．
【非特許文献２】Ｋｏｉｋｅ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １９９０  Ｏｃｔ；  ９（１０）：  ３２１７−２４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、血液脳関門を透過することができるペプチド、中枢神経系の目的とする細胞に薬物を輸送することができる薬物輸送体、ポリオウイルスによる疾患発症を予防できる抗ポリオウイルス剤、血液脳関門透過剤、及びトランスフェリン受容体捕捉体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、下記配列番号：１から４で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかを含むペプチドが血液脳関門を透過することを知見し、本発明の完成に至った。【００１２】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  下記配列番号：１から４で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかを含むことを特徴とするペプチドである。
ＡＬＧＤＳＬＹＧＡＡＳＬＮ  （配列番号：１）
ＭＴＶＤＮＰＡＳＴＴＮＫＤＫＬＦＳＶＷＫ  （配列番号：２）
ＰＧＡＶＰＥＫ  （配列番号：３）
ＳＴＫＤＬＴＴＹ  （配列番号：４）
＜２＞  血液脳関門を透過する前記＜１＞に記載のペプチドである。
＜３＞  トランスフェリン受容体と結合する前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のペプチドである。
＜４＞  トランスフェリン受容体のＡＤ（Ａｐｉｃａｌ  ｄｏｍａｉｎ）と結合する前記＜３＞に記載のペプチドである。
＜５＞  下記配列番号：５から８で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかと結合する前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のペプチドである。
ＴＱＦＰＰＳＱＳＳ  （配列番号：５）
ＴＱＦＰＰＳＲＳＳ  （配列番号：６）
ＴＱＦＰＰＶＡＳＳ  （配列番号：７）
ＴＱＦＰＰＶＥＳＳ  （配列番号：８）
＜６＞  前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のペプチドを含有することを特徴とする薬物輸送体である。
＜７＞  更に担体を含む前記＜６＞に記載の薬物輸送体である。
＜８＞  担体が、巨大分子、微小集合体、微小粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、リポソーム、及びエマルジョンから選択される少なくともいずれかである前記＜７＞に記載の薬物輸送体である。
＜９＞  担体の内部に診断、予防、及び治療の少なくともいずれかを行うための薬物が担持される前記＜７＞から＜８＞のいずれかに記載の薬物輸送体である。
＜１０＞  診断、予防、及び治療の少なくともいずれかを行うための薬物が、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子、及びこれらの類縁体、グリコサミノグリカン及びその誘導体、オリゴ糖、多糖及びこれらの誘導体、タンパク質及びペプチド、抗神経剤、抗ウイルス剤、抗癌剤、抗生物質、酵素剤、抗酸化剤、抗炎症剤、ステロイド剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、血管拡張剤、平滑筋細胞の増殖及び／又は遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、抗凝固剤、ケミカルメディエーターの遊離抑制剤、免疫抑制剤、脂質取込み阻害剤、ホルモン剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、血管内皮細胞の増殖又は抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫賦活剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、一酸化窒素合成酵素阻害剤、終末糖化産物阻害剤、及びラジカルスカベンジャーから選択される少なくともいずれかである前記＜９＞に記載の薬物輸送体である。
＜１１＞  エンドサイトーシスにより細胞内に輸送される前記＜６＞から＜１０＞のいずれかに記載の薬物輸送体である。
＜１２＞  細胞が血管内皮細胞である前記＜１１＞に記載の薬物輸送体である。
＜１３＞  経口投与に用いられる前記＜６＞から＜１２＞のいずれかに記載の薬物輸送体である。
＜１４＞  前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のペプチドを含有し、ポリオウイルスによる疾患発症を予防することを特徴とする抗ポリオウイルス剤である。
＜１５＞  前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のペプチドを含有し、血液脳関門を透過することを特徴とする血液脳関門透過剤である。
＜１６＞  前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のペプチドを含有し、トランスフェリン受容体と結合することを特徴とするトランスフェリン受容体捕捉体である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、血液脳関門を透過することができるペプチド、中枢神経系の目的とする細胞に薬物を輸送することができる薬物輸送体、ポリオウイルスによる疾患発症を予防できる抗ポリオウイルス剤、血液脳関門透過剤、及びトランスフェリン受容体捕捉体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、試験例１における、ポリオウイルスの血液脳関門透過試験の結果を示す図である。縦軸：透過量（μＬ）、横軸：時間（分間）。
【図２】図２は、試験例２の概略説明図である。
【図３】図３は、試験例２のウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図４】図４は、マウスのトランスフェリン受容体１（ｍＴｆＲ１）のドメイン構造の概略説明図である。
【図５】図５は、試験例３で作製したコンストラクトの概略説明図である。
【図６】図６は、試験例４−１及び試験例４−２のウエスタンブロットによる検討の概略説明図である。
【図７−１】図７−１は、試験例４−１のウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図７−２】図７−２は、試験例４−２のウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図８】図８は、ポリオウイルス（Ｍａｈｏｎｅｙ株）のＸ線結晶解析（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＨＸＳ）により決定された立体構造の（２．２Å）を示す図である。
【図９】図９は、試験例５のウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図１０】図１０は、試験例６のウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図１１】図１１は、試験例７における、配列番号：１で表されるペプチドの血液脳関門透過試験の結果を示す図である。縦軸：透過量（μＬ）、横軸：時間（分間）。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ポリオウイルスのＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の複合体のシュミレーションモデル図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ポリオウイルスのＶＰ１を拡大したシュミレーションモデル図である。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、トランスフェリン受容体のシュミレーションモデル図である。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、ポリオウイルスのＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の複合体とトランスフェリン受容体とが結合したシュミレーションモデル図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（ペプチド）
本発明のペプチドは、下記配列番号：１から４で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかを含む。前記ペプチドは、主に血液脳関門を透過する機能を有する。
Ｎ末端−ＡＬＧＤＳＬＹＧＡＡＳＬＮ−Ｃ末端  （配列番号：１）
Ｎ末端−ＭＴＶＤＮＰＡＳＴＴＮＫＤＫＬＦＳＶＷＫ−Ｃ末端  （配列番号：２）
Ｎ末端−ＰＧＡＶＰＥＫ−Ｃ末端  （配列番号：３）
Ｎ末端−ＳＴＫＤＬＴＴＹ−Ｃ末端  （配列番号：４）
前記ペプチドとしては、血液脳関門を透過する限りは、前記配列番号：１から４で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかの全体又は一部において、１個若しくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるものであってもよい。また、前記ペプチドは、Ｎ末端若しくはＣ末端に化学修飾が施されたものであってもよい。前記化学修飾としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アセチル化、ミリストイル化、アミド化、シスチニル化などが挙げられる。
また、前記ペプチドは、前記配列番号：１から４で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかからなるものであってもよい。
【００１６】
前記ペプチドの入手方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成する方法、ポリオウイルス（ＰＶ；Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）の遺伝子配列に基づき分子生物学的手法により得る方法などが挙げられる。
【００１７】
前記ペプチドの化学合成の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ペプチド合成装置（例えば、株式会社島津製作所製）を用いて化学合成する方法などが挙げられる。
【００１８】
前記ポリオウイルスの遺伝子配列に基づき分子生物学的手法により得る方法としては、特に制限はなく、前記ペプチドの配列などに応じて適宜選択することができ、例えば、ポリオウイルスから調製したゲノムＲＮＡを逆転写酵素によってｃＤＮＡとして合成したものを鋳型とし、ＰＣＲ法により増幅させ、クローニングする方法などが挙げられる。
【００１９】
前記ＰＣＲ法に用いるプライマーとしては、前記配列番号：１から４で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかを増幅させることができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記配列番号：１で表されるアミノ酸配列の場合は、下記配列番号：９で表されるセンスプライマー及び下記配列番号：１０で表されるアンチセンスプライマーを用いることが好ましく、前記配列番号：２で表されるアミノ酸配列の場合は、下記配列番号：１１で表されるセンスプライマー及び下記配列番号：１２で表されるアンチセンスプライマーを用いることが好ましく、前記配列番号：３で表されるアミノ酸配列の場合は、下記配列番号：１３で表されるセンスプライマー及び下記配列番号：１４で表されるアンチセンスプライマーを用いることが好ましく、前記配列番号：４で表されるアミノ酸配列の場合は、下記配列番号：１５で表されるセンスプライマー及び下記配列番号：１６で表されるアンチセンスプライマーを用いることが好ましい。
センスプライマー：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＴＧＧＧＣＧＡＴＴＣＡＣＴＴＴＡＴＧＧＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣ−３’  （配列番号：９）
アンチセンスプライマー：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＴＴＡＴＴＡＧＴＴＣＡＡＧＧＡＴＧＣＡＧＣＡＣＣＡＴＡＡＡＧＴＧＡＡＴＣ−３’  （配列番号：１０）
センスプライマー：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＣＴＧＴＧＧＡＣＡＡＣＣＣＧＧＣＴＴＣＴＡＣＴＡＣＡＡＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡＡＴＴＧＴＴＴＴＣＴ−３’  （配列番号：１１）
アンチセンスプライマー：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＴＴＡＴＴＡＣＴＴＣＣＡＣＡＣＡＧＡＡＡＡＣＡＡＴＴＴＧＴＣＴＴＴＧＴＴＴＧＴＡＧＴ−３’  （配列番号：１２）
センスプライマー：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡＧＧＧＧＣＡＣＣＧＧＴＧＣＣＡＧＡＧＡＡＡＴＡＡＴ−３’  （配列番号：１３）
アンチセンスプライマー：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＴＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＧＴＧＣ−３’  （配列番号：１４）
センスプライマー：  ５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＣＴＣＣＣＴＴＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＧＡＣＣＴＧＡＣＡＡＣＧＴＡＣＧＣＴＡＧ−３’  （配列番号：１５）
アンチセンスプライマー：  ５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＴＴＡＴＴＡＧＴＡＣＧＴＴＧＴＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧＧＴＧＧＡＴ−３’  （配列番号：１６）
【００２０】
＜ペプチドの結合対象＞
前記ペプチドの結合対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トランスフェリン受容体などが挙げられる。
【００２１】
−トランスフェリン受容体−
前記トランスフェリン受容体（ＴｆＲ；Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の細胞外ドメインは、図４に示すように、第１のプロテアーゼ様ドメイン（ＰＤ１；Ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ１）、アピカルドメイン（ＡＤ；Ａｐｉｃａｌ  ｄｏｍａｉｎ）、第２のプロテアーゼ様ドメイン（ＰＤ２；Ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ２）、ヘリカルドメイン（ＨＤ；Ｈｅｌｉｃａｌ  ｄｏｍａｉｎ）を含むことが知られている。
これらの中でも、前記ペプチドは、ＡＤに結合することが好ましく、下記配列番号：５から８で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかに結合することがより好ましい。なお、下記配列番号：５で表されるアミノ酸配列は、マウスのトランスフェリン１受容体由来の配列であり、下記配列番号：６で表されるアミノ酸配列は、ヒトのトランスフェリン１受容体由来の配列であり、下記配列番号：７で表されるアミノ酸配列は、ヒトのトランスフェリン２受容体由来の配列であり、下記配列番号：８で表されるアミノ酸配列は、マウスのトランスフェリン２受容体由来の配列である。
Ｎ末端（３２１）−ＴＱＦＰＰＳＱＳＳ−（３２９）Ｃ末端  （配列番号：５）
Ｎ末端（３１８）−ＴＱＦＰＰＳＲＳＳ−（３２６）Ｃ末端  （配列番号：６）
Ｎ末端（３４１）−ＴＱＦＰＰＶＡＳＳ−（３４９）Ｃ末端  （配列番号：７）
Ｎ末端（３３６）−ＴＱＦＰＰＶＥＳＳ−（３４４）Ｃ末端  （配列番号：８）
【００２２】
前記ペプチドの機能としては、血液脳関門を透過するだけでなく、前記配列番号：５から８で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかを含む受容体などを有する細胞であれば、どのような細胞であっても結合でき、細胞の種類に応じて、該細胞内に取り込まれる。また、前記ペプチドが結合する対象としては、受容体に限られるものではなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２３】
＜用途＞
前記ペプチドの用途としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、後述する本発明の薬物輸送体、抗ポリオウイルス剤、血液脳関門透過剤、トランスフェリン受容体捕捉体などに好適に用いられる。
【００２４】
（薬物輸送体）
本発明の薬物輸送体は、少なくとも本発明の前記ペプチドを含有し、更に必要に応じて、担体、薬物などのその他の成分を含有する。
【００２５】
＜ペプチド＞
前記薬物輸送体中の前記ペプチドの含有量としては、薬物を輸送することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記ペプチドは、上述のとおり、前記配列番号：１から４で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかの全体又は一部において、１個若しくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるものであってもよく、Ｎ末端若しくはＣ末端に化学修飾が施されたものであってもよい。これらのアミノ酸の置換、欠失、付加、又は化学修飾は、前記薬物輸送体において、特に制限はなく、輸送対象の薬物などに応じて適宜選択することができる。即ち、前記薬物は、前記ペプチドに担持されて輸送されてもよく、後述する担体に担持されて輸送されてもよい。
【００２６】
＜担体＞
前記担体の形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記薬物を、膜で形成された閉鎖空間内に内包した形態、膜間に内包した形態、膜内に包含した形態などが挙げられ、これらの組合せによる形態であってもよい。このように、前記担体としては様々な形態が考えられ、したがって「担持」は、その形態により、内包、封入、相互作用などを広く意味する。
前記担体の形態の具体例としては、巨大分子、微小集合体、微小粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、リポソーム、エマルジョンなどが挙げられる。前記担体としては、特に制限はなく、医薬製剤の分野で公知のものの中から目的に応じて適宜選択することができる。
【００２７】
前記薬物輸送体の平均粒子径としては、特に制限はなく、細胞内に輸送され得る限り、目的に応じて適宜選択することができる。
細胞への前記薬物輸送体の取り込み方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ファゴサイトーシス、エンドサイトーシス、ピノサイトーシス、マクロピノサイトーシスなどが挙げられる。
多くの細胞ではエンドサイトーシスによることが知られている。エンドサイトーシスで取り込むことができる大きさとしては、最大約３００ｎｍ程度であり、それ以上になると極端に取り込み量が減少することがある。
したがって、前記薬物輸送体の平均粒子径としては、３００ｎｍより小さいことが好ましい。前記平均粒子径は、粒度分布測定装置で測定することができる。
【００２８】
＜薬物＞
前記薬物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、予防、治療、及び診断の少なくともいずれかを行うための薬物や、その他の薬理学的に許容し得る薬理的活性物質、生理的活性物質、診断用物質などが挙げられる。
前記薬物の性質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、親水性の薬物であってもよく、疎水性の薬物であってもよい。
【００２９】
前記薬物の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子、及びこれらの類縁体、グリコサミノグリカン及びその誘導体、オリゴ糖、多糖及びこれらの誘導体、タンパク質及びペプチドなどの生理活性的物質；抗神経剤、抗ウイルス剤、抗癌剤、抗生物質、酵素剤、抗酸化剤、抗炎症剤、ステロイド剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、血管拡張剤、平滑筋細胞の増殖及び／又は遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、抗凝固剤、ケミカルメディエーターの遊離抑制剤、免疫抑制剤、脂質取込み阻害剤、ホルモン剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、血管内皮細胞の増殖又は抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫賦活剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ；：Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ）阻害剤、終末糖化産物（ＡＧＥｓ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ）阻害剤、及びラジカルスカベンジャー等の薬理的活性物質などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記薬物輸送体は、血液脳関門を好適に透過できることから、これらの薬物の中でも、中枢神経系の治療及び／又は診断に用いることができる薬物が好ましく、ポリオウイルスによる感染を治療できる薬物がより好ましい。
【００３０】
前記抗神経剤の具体例としては、コンスタン、セパゾン、セルシン、セレナール、ソラナックス、デパス、バランス、メイラックス、リーゼ、リボトリール、レキソタン、ワイバックス、セディール、グランダキシン、エリスパン等の抗不安剤；アナフラニール、トフラニール、トリプタノール、アモキサン、アンプリット、プロチアデン、テシプール、テトラミド、ルジオミール、デジレル、レスリン、アビリット、ドグマチール、ミラドール、リタリン、デプロメール、パキシル、ルボックス、トレドミン等の抗うつ剤；アモバン、ハルシオン、エバミール、マイスリー、リスミー、レンドルミン、ロラメット、サイレース、ドラール、ベンザリン、ユーロジン、ロヒプノール、インスミン、ソメリン、ダルメート、フェノバール、イソミタール等の抗不眠剤；ウインタミン、コントミン、ニューレプチル、ヒルナミン、ＰＺＣ、メレリル、インプロメン、セレネース、オーラップ、クレミン、クロフェクトン、デフェクトン、ホーリット、ロドピン、アタラックス等の精神安定剤；リーマス、テグレトール等の躁鬱剤；エトトイン、フェニトイン、アセチルフェネトライド、プリミドン、スルチアム、エトスクシミド、クロナゼパム、カルバマゼピン、バルプロ酸ナトリウム、ゾニサミド等の抗てんかん剤；レボドパ剤、メシル酸ペルゴリド、塩酸アマンダジン、塩酸トリヘキシフェニジル、塩酸ピロヘプチン、塩酸マザチコ−ル、塩酸メチキセン、ビペリデン、プロフェナミン、ドロキシドパ等のパーキンソン病治療剤などが挙げられる。
【００３１】
前記抗ウイルス剤の具体例としては、アシクロビル、ガンシクロビル、ジダノシン、ジドブジン、ソリブジン、ビダラビンなどが挙げられる。
【００３２】
前記抗癌剤の具体例としては、シクロフォスファミド、イフォスファミド、塩酸ナイトロジェンマスタード−Ｎ−オキシド、チオテパ、ブルスファン、カルボコン、塩酸ニムスチン、ラニムスチン、メルファラン、トシル酸インプロスルファン、ダカルバジン、塩酸プロカルバジン、シタラビン、シタラビンオクスファート、エノシタビン、メルカプトプリン、チオイノシン、フルオロウラシル、ドキシフルリジン、テガフール、メトトレキサート、カルモフール、ヒドロキシカルバミド、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンデシン、エトポシド、クロモマイシンＡ３、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アラクルビシン、ピラルビシン、塩酸エピルビシン、ダクチノマイシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、ネオカルノスタチン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アセグラトンミトプロニトール、デキストラン硫酸ナトリウム、酢酸オクトレオチド、シスプラチン、カルボプラチン、クエン酸タモキシフェン、酢酸メドロキシプロゲステロン、リン酸エストラムスチンナトリウム、酢酸ゴセレリン、酢酸リュープロレリンなどが挙げられる。
【００３３】
前記抗生物質の具体例としては、ベンジルペニシリンカリウム、ベンジルペニシリンベンザチン、フェノキシメチルペニシリンカリウム、フェネチシリンカリウム、クロキサシリンナトリウム、フルクロキサシリンナトリウム、アンピシリン、トシル酸スルタミシリン、塩酸バカンピシリン、塩酸タランピシリン、レナンピシリン、ヘタシリンカリウム、シクラシリン、アモキシシリン、塩酸ピブメシリナム、アスポキシシリン、カルベニシリンナトリウム、カリンダシリンナトリウム、スルベニシリンナトリウム、チカルシリンナトリウム、ピペラシリンナトリウム、セファロリジン、セファロチンナトリウム、セファゾリンナトリウム、セファピリンナトリウム、セフラジン、セファレキシン、セファトリジンプロピレングリコール、セフロキサジン、セファクロル、セファドロキシル、塩酸セフォチアム、塩酸セフォチアムヘキセチル、セフロキシムナトリウム、セフロキシムアキセチル、セファマンドールナトリウム、セフジニル、塩酸セフェタメトピポキシル、セフチプテン、セフメタゾールナトリウム、セフォキシチンナトリウム、セフォテタンナトリウム、セフミノクスナトリウム、セフプペラゾンナトリウム、セフピラミドナトリウム、セフスロジンナトリウム、セフォタキシムナトリウム、セフォペラゾンナトリウム、セフチゾキシムナトリウム、塩酸セフメノキシム、セフトリアキソンナトリウム、セフタジジム、セフピミゾールナトリウム、セフィキシム、セフテラムピポキシル、セフゾナムナトリウム、セフポドキシプロキセチル、セフォジジム、硫酸セフピロム、ラタモキセフナトリウム、フロモキセフナトリウム、イミペネム、シラスタチンナトリウム、アズトレオナム、カルモナムナトリウム、硫酸ステレプトマイシン、硫酸カナマイシン、硫酸フラジオマイシン、硫酸アミカシン、硫酸ゲンタマイシン、硫酸パロモマイシン、硫酸ペカナマイシン、硫酸リポスタマイシン、硫酸ジベカシン、トブラマイシン、硫酸シソマイシン、硫酸ミスロノマイシン、硫酸アストロマイシン、硫酸ネチルマイシン、硫酸イセパマイシン、硫酸アルベカシン、エリスロマイシン、キタサマイシン、アセチルキタサマイシン、リン酸オレアンドマイシン、ジョサマイシン、アセチルスピラマイシン、ミデカマイシン、酢酸ミデカマイシン、ロキタマイシン、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、塩酸テトラサイクリン、塩酸オキシテトラサイクリン、メタリン酸テトラサイクリン、塩酸デメチルクロルテトラサイクリン、ロリテトラサイクリン、塩酸ドキシサイクリン、塩酸ミノサイクリン、クロラムフェニコール、コハク酸クロラムフェニコールナトリウム、パルミチン酸クロラムフェニコール、チアンフェニコール、塩酸アミノ酢酸チアンフェニコール、硫酸コリスチン、コリスチンメタンスルホン酸ナトリウム、硫酸ポリミキシンＢ、バシトラシン、塩酸バンコマイシン、塩酸リンコマイシン、クリンダマイシン、塩酸スペクチノマイシン、フォスフォマイシンナトリウム、フォスフォマイシンカルシウムなどが挙げられる。
【００３４】
前記酵素剤の具体例としては、キモトリプシン、結晶トリプシン、ストレプトキナーゼ・ストレプトドルナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ウロキナーゼ、ナサルプラーゼ、アルテプラーゼ、塩化リゾチーム、セミアルカリプロティナーゼ、セラペプターゼ、チソキナーゼ、デュテプラーゼ、バトロキソビン、プロナーゼ、プロメラインなどが挙げられる。
【００３５】
前記抗酸化剤の具体例としては、トコフェロール、アスコルビン酸、尿酸などが挙げられる。
【００３６】
前記抗炎症剤の具体例としては、サリチル酸コリン、サザピリン、サリチル酸ナトリウム、アスピリン、ジフルニサル、フルフェナム酸、メフェナム酸、フロクタフェニン、トルフェナム酸、ジクロフェナクナトリム、トルメチンナトリウム、スリンダク、フェンブフェン、フェルビナクエチル、インドメタシン、インドメタシンファルネシル、アセメタシン、マレイン酸プログルメタシン、アンフェナクナトリウム、ナブメトン、イブプロフェン、フルルビプロフェン、フルルビプロフェンアキセチル、ケトプロフェン、ナプロキセン、プロチジン酸、プラノプロフェン、フェノプロフェンカルシウム、チアプロフェン酸、オキサプロジン、ロキソプロフェンナトリウム、アルミノプロフェン、ザルトプロフェン、フェニルブタゾン、クロフェゾン、ケトフェニルブタゾン、ピロキシカム、テノキシカム、アンピロキシカム、塩酸チアラミド、塩酸チノリジン、塩酸ベンジダミン、エピリゾール、エルモファゾンなどが挙げられる。
【００３７】
前記ステロイド剤の具体例としては、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン（リン酸エステル、酢酸塩）、酪酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、プレドニゾロン（アセテート、サクシネート、第三級ブチル酢酸エステル、リン酸エステル）、メチルプレドニゾロン（アセテート）、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド（酢酸トリアムシノロン）、デキサメタゾン（リン酸エステル、酢酸塩、リン酸ナトリウム塩、硫酸エステル）、パルミチン酸デキサメタゾン、ベタメタゾン（リン酸塩、２ナトリウム塩）、酢酸パラメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、酢酸ハロプレドン、プロピオン酸クロベタゾール、ハルシノニド、プロピオン酸ベクロメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、酢酸ベタメタゾン、酢酸コルチゾンなどが挙げられる。
【００３８】
前記アンジオテンシン変換酵素阻害剤の具体例としては、アラセプリル、塩酸イミダプリル、塩酸テモカプリル、塩酸デラプリル、塩酸ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル、マレイン酸エナラプリル、リシノプリルなどが挙げられる。
【００３９】
前記血管拡張剤の具体例としては、テオフィリン、ジプロフィリン、プロキシフィリン、アミノフィリン、コリンテオフィリン、プロスタグランジン、プロスタグランジン誘導体、アルプロスタジルアルファデクス、アルプロスタジル、リマプロストアルファデクス、パパベリン、シクランデラート、シンナリジン、フマル酸ベンシクラン、マレイン酸シネパジド、塩酸ジラゼプ、トラピジル、塩酸ジフェニドール、ニコチン酸、イノシトールヘキサニコチネート、クエン酸ニカメタート、酒石酸ニコチニックアルコール、ニコチン酸トコフェロール、ヘプロニカート、塩酸イソクスプリン、硫酸バメタン、塩酸トラリゾン、メシル酸ジヒドロエルゴトキシン、酒石酸イフェンプロジル、塩酸モキシシリト、ニセルゴリン、塩酸ニカルジピン、ニルバジピン、ニフェジピン、塩酸ベニジピン、塩酸ジルチアゼム、ニソルジピン、ニトレンジピン、塩酸マニジピン、塩酸バルニジピン、塩酸エホニジピン、塩酸ベラパミル、塩酸トリメタジジン、カプトプリル、マレイン酸エナラプリル、アラセプリル、塩酸デラプリル、シラザプリル、リシノプリル、塩酸ベナゼプリル、塩酸ヒドララジン、塩酸トドララジン、ブドララジン、カドララジン、インダパミド、塩酸カルボクロメン、エフロキサート、塩酸エタフェノン塩酸オキシフェドリン、ニコランジル、亜硝酸アミル、硝酸イソソルビドなどが挙げられる。
【００４０】
前記平滑筋細胞の増殖及び／又は遊走阻害剤の具体例としては、ヘパリンナトリウム、ダルテパリンナトリウム（低分子ヘパリン）、ヘパリンカルシウム、デキストラン硫酸などが挙げられる。
【００４１】
前記血小板凝集阻害剤の具体例としては、塩酸チクロピジン、シロスタゾール、イコサペント酸エチル、ベラプロストナトリウム、塩酸サルプグレラート、バトロキソビン、ジピリダモールなどが挙げられる。
【００４２】
前記抗凝固剤の具体例としては、ヘパリンナトリウム、ダルテパリンナトリウム（低分子ヘパリン）、ヘパリンカルシウム、デキストラン硫酸、ワルファリンカリウム、アルガトロバンなどが挙げられる。
【００４３】
前記ケミカルメディエーター遊離抑制剤の具体例としては、トラニラスト、フマル酸ケトフェチン、塩酸アゼラスチン、オキサトミド、アンレキサノクス、レピリナストなどが挙げられる。
【００４４】
前記免疫抑制剤の例としては、シクロスポリンなどが挙げられる。
【００４５】
また、診断に用いられる薬剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｘ線造影剤、放射性同位元素標識核医学診断薬、核磁気共鳴診断用診断薬等の体内診断薬などが挙げられる。
【００４６】
前記Ｘ線造影剤の具体例としては、アミドトリゾ酸メグルミン、イオタラム酸ナトリウム、イオタラム酸メグルミン、ガストログラフィン、ヨーダミドメグルミン、リピオドールウルトラフルイド、アジピオドンメグルミン、イオキサグル酸、イオトロクス酸メグルミン、イオトロラン、イオパノ酸、イオパミドール、イオヘキソール、イオベルソール、イオポダートナトリウム、イオメプロール、イソペーク、ヨードキサム酸などが挙げられる。
【００４７】
前記薬物輸送体に担持される薬物の量としては、特に制限はなく、薬物の種類などに応じて適宜選択することができる。
【００４８】
＜その他の成分＞
前記薬物輸送体中のその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、添加剤、補助剤、水などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記添加剤又は前記補助剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、殺菌剤、保存剤、粘結剤、増粘剤、固着剤、結合剤、着色剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、溶剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、結晶析出防止剤、消泡剤、物性向上剤、防腐剤などが挙げられる。
前記その他の成分は、前記薬物輸送体と共に配合されていてもよく、前記担体中に配合されていてもよい。
【００４９】
前記殺菌剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウムなどのカチオン性界面活性剤などが挙げられる。
【００５０】
前記保存剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、クレゾールなどが挙げられる。
【００５１】
前記粘結剤、増粘剤、固着剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、澱粉、デキストリン、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、プルラン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、グアーガム、ローカストビーンガム、アラビアゴム、キサンタンガム、ゼラチン、カゼイン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、エチレン・プロピレンブロックポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００５２】
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００５３】
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
【００５４】
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。
【００５５】
前記ｐＨ調整剤及び前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００５６】
前記等張化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。
【００５７】
前記薬物輸送体中の前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５８】
＜薬物輸送体の輸送＞
前記薬物輸送体を細胞内に輸送する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、輸送対象の細胞の機能や特性を利用して行う方法などが挙げられる。
前記薬物輸送体の輸送に利用可能な細胞の機能や特性としては、例えば、細胞のファゴサイトーシスやエンドサイトーシスなどが挙げられる。
前記薬物輸送体を投与する前に、ファゴサイトーシスやエンドサイトーシスが起こりやすくするために予め細胞を活性化させておいてもよい。また、細胞が高度に活性化し、粘着性が亢進しすぎたり、凝集が生じたりする場合は、適宜選択した方法により細胞を不活性化してもよい。
【００５９】
前記薬物輸送体を適用できる細胞としては、前記配列番号：１から４で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかを認識できる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。これらの中でも、本発明のペプチドは、血液脳関門を透過でき、即ち、前記薬物輸送体は血液脳関門を透過できるため、中枢神経系の予防、治療、又は診断などに好適に用いられる。
中枢神経系を構成する細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、神経細胞、グリア細胞、血管内皮細胞、周皮細胞などが挙げられる。これらの中でも、前記薬物輸送体は、血管内皮細胞内に好適に輸送される。
【００６０】
＜投与＞
前記薬物輸送体の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、局所投与法、経腸投与法、非経口投与法などが挙げられる。
前記局所投与法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、皮膚上投与法、吸入投与法、注投与法、結膜上への点眼、経鼻投与法、膣内投与法などが挙げられる。
前記経腸投与法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与法、経管栄養法、注腸投与法などが挙げられる。
前記非経口投与法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経静脈投与法、経動脈投与法、筋肉内投与法、心臓内投与法、皮下投与法、骨内投与法、皮内投与法、くも膜下投与法、腹腔内投与法、膀胱内投与法、経皮投与法、経粘膜投与法、吸入投与法、硬膜外投与法、硝子体内投与法などが挙げられる。
【００６１】
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
【００６２】
前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられる。これらの中でもヒトに好適に用いられる。
【００６３】
＜使用＞
【００６４】
前記薬物輸送体は、１種単独で使用してもよく、他の成分を有効性分とする医薬や薬物輸送体と併せて使用してもよい。また、他の成分を有効成分とする医薬に配合された状態で使用してもよい。
【００６５】
＜用途＞
本発明の薬物輸送体は、血液脳関門を透過できるため、中枢神経系における障害の予防、治療又は診断に好適に用いられる。これらの中でも、特にポリオウイルスによる感染の予防、治療又は診断に好適に用いられる。
【００６６】
（抗ポリオウイルス剤、血液脳関門透過剤）
＜抗ポリオウイルス剤＞
本発明の抗ポリオウイルス剤は、本発明の前記ペプチドを含有し、更に必要に応じて、その他の成分を含む。
前記抗ポリオウイルス剤は、中枢神経系の血管内皮細胞、特に血液脳関門を構成する血管内皮細胞に存在するポリオウイルスの受容体としてのトランスフェリン受容体に好適に結合することができる。前記抗ポリオウイルス剤が前記トランスフェリン受容体に結合すると、エンドサイトーシス等により該トランスフェリン受容体を有する血管内皮細胞内に取り込まれる。したがって、前記抗ポリオウイルス剤は、ポリオウイルスの血液脳関門の透過に対する拮抗阻害作用を有し、ポリオウイルスの血液脳関門の透過を予防することができ、ポリオウイルス感染に伴う神経障害を予防することができる。
前記抗ポリオウイルス剤中の前記ペプチドの含有量としては、ポリオウイルスの血液脳関門の透過を予防することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記抗ポリオウイルス剤は、前記ペプチドそのものであってもよい。
【００６７】
＜血液脳関門透過剤＞
本発明の血液脳関門透過剤は、本発明の前記ペプチドを含有し、更に必要に応じて、その他の成分を含む。
前記血液脳関門透過剤中の前記ペプチドの含有量としては、血液脳関門を透過することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記血液脳関門透過剤は、前記ペプチドそのものであってもよい。
【００６８】
＜その他の成分＞
前記抗ポリオウイルス剤及び前記血液脳関門透過剤中のその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬理学的に許容される担体などが挙げられる。
前記担体としても、特に制限はなく、前記抗ポリオウイルス剤の剤型などに応じて適宜選択することができ、例えば、前記薬物輸送体のその他の成分で記載したものなどが挙げられる。
また、前記抗ポリオウイルス剤及び前記血液脳関門透過剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６９】
前記抗ポリオウイルス剤及び前記血液脳関門透過剤は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよく、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記抗ポリオウイルス剤及び前記血液脳関門透過剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用してもよい。
【００７０】
＜剤型＞
前記抗ポリオウイルス剤及び前記血液脳関門透過剤の剤型としては、特に制限はなく、所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、固形剤、半固形剤、液剤などが挙げられる。
前記抗ポリオウイルス剤及び前記血液脳関門透過剤の製造方法としては、特に制限はなく、剤型に応じて常法の中から適宜選択することができる。
【００７１】
−固形剤−
前記固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内容剤として用いられる場合、例えば、錠剤、チュアブル錠、発泡錠、口腔内崩壊錠、トローチ剤、ドロップ剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、ドライシロップ剤、浸剤などが挙げられる。
前記固形剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、坐剤、パップ剤、プラスター剤などが挙げられる。
【００７２】
−半固形剤−
前記半固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、舐剤、チューインガム剤、ホイップ剤、ゼリー剤などが挙げられる。
前記半固形剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ムース剤、インヘラー剤、ナザールジェル剤などが挙げられる。
【００７３】
−液剤−
前記液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、シロップ剤、ドリンク剤、懸濁剤、酒精剤などが挙げられる。
前記液剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、液剤、点眼剤、エアゾール剤、噴霧剤などが挙げられる。
【００７４】
＜投与＞
前記抗ポリオウイルス剤及び前記血液脳関門透過剤の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、局所投与法、経腸投与法、非経口投与法などが挙げられる。
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられるが、これらの中でもヒトに好適に用いられる。
【００７５】
（トランスフェリン受容体捕捉体）
本発明のトランスフェリン受容体捕捉体は、本発明の前記ペプチドを含有し、更に必要に応じて、その他の成分を含む。前記トランスフェリン受容体捕捉体は、トランスフェリンを好適に捕捉することができる。
前記トランスフェリン受容体捕捉体中の前記ペプチドの含有量としては、トランスフェリン受容体を捕捉することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記トランスフェリン受容体捕捉体は、前記ペプチドそのものであってもよい。
【００７６】
＜その他の成分＞
前記トランスフェリン受容体捕捉体中のその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬理学的に許容される担体などが挙げられる。
前記担体としても、特に制限はなく、目的応じて適宜選択することができ、例えば、前記薬物輸送体のその他の成分で記載したものなどが挙げられる。
また、前記トランスフェリン受容体捕捉体中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００７７】
前記トランスフェリン受容体捕捉体は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよく、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記トランスフェリン受容体捕捉体は、他の成分を有効成分とする医薬中に配合された状態で使用してもよい。
【実施例】
【００７８】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。【００７９】
（試験例１：ポリオウイルスの血液脳関門透過におけるトランスフェリンの影響）
−脳血管内皮細胞の調製−
マウス由来脳血管内皮細胞（ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌ；ＭＢＥＣ）４株は、１０質量％  非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（コスモバイオ社製）含有Ｄ−ＭＥＭ（シグマ社製）を用いて培養を行った。
この脳血管内皮細胞は、トリプシン−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）処理することにより分散させた。
なお、ＭＢＥＣは、Ｓｈｉｒａｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．,  ＢＢＡ；１９９４  Ｊｕｌ  ２１；１２２２（３）：４００−４０４に基づき調製した。【００８０】
−ポリオウイルスの調製−
精製ポリオウイルス（ＰＶ）の調製方法は、本発明者らが以前に報告したＹａｎｇ  ＷＸ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．２２９，  ｐ４２１−ｐ４２８に基づいて行った。
ポリオウイルス（Ｍａｈｏｎｅｙ株）を感染させた浮遊ＨｅＬａ細胞を、バッファー（１０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１．５ｍＭ  塩化マグネシウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中でＤｏｕｎｃｅ型ホモジェナイザーを用いて細胞破砕を行い、その細胞質画分をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商品名：ＣＬ−６Ｂ、ＧＥヘルスケア社製）処理後、ショ糖密度勾配遠心、塩化セシウム密度勾配遠心を経た後、脱塩カラム（商品名：ＰＤ−１０、ＧＥヘルスケア社製）処理を行い、ポリオウイルス粒子を精製した。【００８１】
−蛍光ラベル化ポリオウイルスの調製−
前記精製したポリオウイルスに、商品名：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５６８−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いて蛍光ラベルを付した。この蛍光ラベル化ポリオウイルスは、ＰＢＳにて濃度０．４ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。
なお、前記ＰＢＳの組成は、２．７ｍＭ  塩化カルシウム、１．４７ｍＭ  リン酸二水素カリウム（無水）、１３７ｍＭ  塩化ナトリウム、８．１ｍＭ  リン酸−水素ナトリウム（無水）である。【００８２】
＜ポリオウイルスの血液脳関門透過試験＞
トランズウェルプレート（商品名：Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（１２ｗｅｌｌ）、コーニング社製）はＩ型コラーゲン（シグマ社製）で３７℃にて４時間コーティングを行い、一晩乾燥させたものを用いた。
トランズウェルプレートの上層部に前記調製した脳血管内皮細胞（７×１０４細胞／ウェル）を播種し、１０質量％  非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（コスモバイオ社製）含有Ｄ−ＭＥＭ（シグマ社製）で３７℃、５％ＣＯ２にて７２時間培養することにより、血液脳関門のインビトロモデル培養系を作製した。【００８３】
トランズウエル内の脳血管内皮細胞の培養液に、前記蛍光ラベル化ポリオウイルス１２７μｇ／ｍＬ、及び、蛍光ラベル化トランスフェリン（商品名：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５５５−ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、インビトロジェン社製）１８０μｇ／ｍＬ、又は、前記ＦＩＴＣ標識デキストラン（シグマ社製）１８０μｇ／ｍＬをそれぞれ添加し、５分間後、１０分間後、１５分間後のトランズウェルプレート下層部内の培養液をそれぞれ回収し、分光蛍光光度計（商品名：Ｆ−２５００、株式会社日立ハイテクノロジーズ製）にて蛍光強度を観察し、これをトランズウェルプレート内の脳血管内皮細胞を透過した量として測定した。【００８４】
結果を図１に示す。ポリウイルスのみを添加した場合（図１の「ＰＶ」）のＰＳ値（透過速度、透過活性）は１．８９であり、ポリオウイルス及びトランスフェリンを添加した場合（図１の「ＰＶ＋Ｔｆ」）のＰＳ値は１．０２であり、デキストランを添加した場合のＰＳ値は０．２０であった。
ポリオウイルスを単独で脳血管内皮細胞に添加した場合（ＰＶ）と比較して、ポリオウイルスとトランスフェリンとを混合して脳血管内皮細胞に添加した場合（ＰＶ＋Ｔｆ）は透過速度が遅かったことから、トランスフェリンがポリオウイルスの血液脳関門の透過を阻害していることがわかった。この結果より、ポリオウイルスは、トランスフェリンと共通の受容体を介して脳血管内皮細胞を透過することが示唆された。【００８５】
（試験例２：ポリオウイルスとトランスフェリン受容体との結合の確認）
次に、ポリオウイルスがトランスフェリン受容体と直接結合していることをウエスタンブロットにより以下の方法で確認した。図２に、試験例２の概略説明図を示す。【００８６】
−トランスフェリン受容体の調製−
−−マウストランスフェリン受容体１（ｍＴｆＲ１）のクローニング−−
マウス肝臓から調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＰｔｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  １ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いてｃＤＮＡを調製し、これをｍＴｆＲ１可溶性領域（Ｒ１２３〜Ｆ７６３）のクローニング用の鋳型として用いた。プライマーは、ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号  ＢＣ０５４５２２．１の配列情報を基に、センスプライマーとしてＳａｃＩＩ切断部位（下線部）を含む下記配列番号：１７で表されるプライマー配列、及びアンチセンスプライマーとしてＸｈｏＩ切断部位（下線部）を含む下記配列番号：１８で表されるプライマー配列（終始コドンから３’側１５０塩基下流）を用いてＰＣＲ法によりｍＴｆＲ１遺伝子断片を増幅し、Ｎ末端Ｓｔｒｅｐタグ融合タンパク質発現用ベクター（商品名：ｐＡＳＫ−ＩＢＡ７（＋）、ＩＢＡ社製）のＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩ切断部位に挿入した。作製した発現ベクターを以下、ｐＡＳＫ−ｍＴｆＲ１と称することがある。
センスプライマー：５’−ＴＣＣＣＣＧＣＧＧＴＣＧＣＴＴＡＴＡＴＴＧＧＧＣＡＧＡＣＣＴＣＡＡＡ−３’  （配列番号：１７）
アンチセンスプライマー：５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＣＧＣＡＣＴＡＡＡＡＧＣＴＧ−３’  （配列番号：１８）【００８７】
−−Ｓｔｒｅｐ−ｍＴｆＲ１の発現及び精製−−
構築した発現ベクターｐＡＳＫ−ｍＴｆＲ１を大腸菌ＪＭ１０９株（東洋紡株式会社製）に形質転換し、ＯＤ６００における濁度が０．５となるまで３７℃で培養後、２００ｎｇ／ｍＬのテトラサイクリンを添加し、ｍＴｆＲ１の誘導後、３時間で集菌を行った。集菌した細胞をＳＴＤバッファー（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム）で洗浄した。ＳＴＤバッファーで懸濁した細胞は、超音波破砕を２０秒間（３０秒間インターバル）で１０回繰り返した後、１０，０００×ｇ、４℃、１５分間、遠心を行い、未破砕細胞を除いたものをライセート（上清）として用いた。精製Ｓｔｒｅｐ−ｍＴｆＲ１は、その上清からカラム（商品名：Ｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎ  ｓｕｐｐｅｒ−ｆｌｏｗ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム、ＩＢＡ社製）を用いたアフィニティー精製及びゲルろ過（商品名：ＮＡＰ−１０カラム、ＧＥヘルスケア社製）を行い調製した。【００８８】
−生ポリオウイルスの調製−
５質量％  ウシ胎児血清（ＮＣＳ）含有Ｄ−ＭＥＭで培養したＡＧＭＫ（アフリカミドリザル腎臓）細胞にポリオウイルス（Ｍａｈｏｎｅｙ株）を感染させ、ＡＧＭＫ細胞の培養上清から生ポリオウイルスを調製した。この生ポリオウイルスのウイルス力価は１０８ｐｆｕ／ｍＬであった。【００８９】
−混合液２−１の調製−
１５０μＬの前記生ポリオウイルスと、１０μｇの前記Ｓｔｒｅｐ−ｍＴｆＲ１とをＳＴＤバッファー中に混合し、混合液の量を合計０．２５ｍＬになるように調製し、３７℃にて２時間インキュベートし、次いで、４℃で１６時間インキュベートした。【００９０】
−混合液２−２の調製−
混合液２−１の調製において、Ｓｔｒｅｐ−ｍＴｆＲ１を添加しなかったこと以外は、混合液２−１と同様の方法で混合液２−２を調製した。【００９１】
−混合液２−３の調製−
混合液２−１の調製において、Ｓｔｒｅｐ−ｍＴｆＲ１に代えて、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ（ＩＢＡ社製）を用いたこと以外は、混合液２−１と同様の方法で混合液２−３を調製した。【００９２】
＜ポリオウイルスとトランスフェリン受容体との結合試験＞
混合液２−１〜混合液２−３を、それぞれＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｓｕｐｅｒ  ｆｌｏｗ）（ＩＢＡ社製）に添加し、４℃で１時間インキュベートした。次いで、９００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を捨てた後、沈殿に２００μＬのＳＴＤバッファーを添加し、９００ｒｐｍで３分間遠心することにより該沈殿を洗浄した。この洗浄を合計５回行うことで精製した。この精製により、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｓｕｐｅｒ  ｆｌｏｗ）に結合したもの（Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇを有するもの及び／又はそれと結合したもの）は沈殿に残り、結合しなかったものは洗浄される。
精製後、得られた沈殿に、ＳＴＤバッファーに懸濁した５ｍＭ  Ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎ（シグマ社製）を８μＬ添加し、９００ｒｐｍで３分間遠心し、この上清を得た。これにより、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｓｕｐｅｒ  ｆｌｏｗ）と、該Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合したものとの結合がはずれ、上清中に溶出される。【００９３】
精製した混合液２−１〜混合液２−３の上清にＳＤＳ−ＰＡＧＥ用５×サンプルバッファーを添加した。また、ポジティブコントロールとして、未精製の混合液２−１を２５μＬ（混合液合計量の１０質量％）採取し、これにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用５×サンプルバッファーを添加した。これらを、９５℃で３分間インキュベートした後、９００ｒｐｍで３分間遠心して得られた上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルとした。
なお、前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用５×サンプルバッファーの組成は、０．３１２Ｍ  トリス塩酸（ｐＨ６．８）、５質量％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０質量％  グリセロール、０．０２５質量％  ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、５ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）である。以下の試験例においても、同様にこのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用５×サンプルバッファーを使用した。【００９４】
これらのサンプルを用いて、常法に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットを行った。なお、ウエスタンブロットは、１次抗体として、抗ポリオウイルス粒子抗体（商品名：ウサギ由来ポリクローナル抗体）又は、抗ウシ血清抗体（商品名：Ａｎｔｉ  Ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＳＨＯＰ社製）を用い、２次抗体として、抗ウサギＩｇ−ＨＲＰ抗体（商品名：Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  Ｉｇ−ＨＲＰ、ＤＡＫＯ社製）を用いて行った。【００９５】
結果を図３に示す。ポリオウイルスとＳｔｒｅｐ−ｍＴｆＲ１とを含む混合液２−１を用いた場合、精製後においてもバンドが検出された。この結果より、ポリオウイルスは、トランスフェリン受容体と直接結合することがわかった。【００９６】
（試験例３：トランスフェリン受容体におけるポリオウイルスの結合領域の同定）
次に、ポリオウイルスがトランスフェリン受容体のどの領域で結合しているかを以下の方法で確認した。【００９７】
図４に示すように、マウスのトランスフェリン受容体１（ｍＴｆＲ１）は、Ｎ末端側からアミノ酸の、第１２４残基〜第１８５残基が第１のプロテアーゼ様ドメイン（ＰＤ１）、第１８６残基〜３８７残基がアピカルドメイン（ＡＤ）、第３８８残基〜６０８残基が第２のプロテアーゼ様ドメイン（ＰＤ２）、第６０９残基〜第７６３残基がヘリカルドメイン（ＨＤ）であることが知られている。これらは、細胞外ドメインを構成するドメインである。
試験例２で調製したｐＡＳＫ−ｍＴｆＲ１を鋳型としてＰＣＲ法により常法で、細胞外ドメイン全長からなるコンストラクト１、ＰＤ１及びＡＤからなるコンストラクト２、細胞外ドメイン全長からＡＤを除いた（ΔＡＤ）コンストラクト３、ＡＤのみからなるコンストラクト４、ＰＤ２及びＨＤからなるコンストラクト５、及び、ＰＤ１のみからなるコンストラクト６の６種類のコンストラクトを作製した。コンストラクト１〜６の概略説明図を図５に示す。
作製したコンストラクト１から５は、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ発現ベクター（商品名：ｐＡＳＫ−ＩＢＡ７（＋）、ＩＢＡ社製）にクローニングした。また、コンストラクト６は、ＧＳＴ−ｔａｇ発現ベクター（商品名：ｐＧＥＸ−ｐ４Ｘ、プロメガ社製）にクローニングした。
以下、前記コンストラクト１を含む発現ベクターを「ｐＡＳＫ−コンストラクト１」、前記コンストラクト２を含む発現ベクターを「ｐＡＳＫ−コンストラクト２」、前記コンストラクト３を含む発現ベクターを「ｐＡＳＫ−コンストラクト３」、前記コンストラクト４を含む発現ベクターを「ｐＡＳＫ−コンストラクト４」、前記コンストラクト５を含む発現ベクターを「ｐＡＳＫ−コンストラクト５」、前記コンストラクト６を含む発現ベクターを「ｐＧＥＸ−コンストラクト６」とそれぞれ称することがある。【００９８】
次いで、前記ｐＡＳＫ−コンストラクト１を大腸菌ＪＭ１０９株（東洋紡株式会社製）に導入し、組換え体タンパク質１（細胞外ドメイン全長）を発現させた。
前記ｐＡＳＫ−コンストラクト１の場合と同様にして、ｐＡＳＫ−コンストラクト２を用いて組換え体タンパク質２（ＰＤ１＋ＡＤ）を、ｐＡＳＫ−コンストラクト３を用いて組換え体タンパク質３（ΔＡＤ）を、ｐＡＳＫ−コンストラクト４を用いて組換え体タンパク質４（ＡＤ）を、ｐＡＳＫ−コンストラクト５を用いて組換え体タンパク質５（ＰＤ２＋ＨＤ）を、ｐＧＥＸ−コンストラクト６を用いて組換え体タンパク質６（ＧＳＴ−ＰＤ１）をそれぞれ発現させた。【００９９】
試験例２で調製した生ポリオウイルス  １５０μＬと、前記組換え体タンパク質１〜６のいずれか  １０μｇと、ＳＴＤバッファーとをそれぞれ混合した混合液を合計０．３ｍＬとなるように調製し、３７℃にて２時間インキュベートし、次いで、４℃で１６時間インキュベートした。
これらの混合液を、試験例２と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルとし、試験例２と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットを行った。【０１００】
結果を下記表１に示す。下記表１において、「○」は、組換え体タンパク質とポリオウイルスとが結合したもの（ウエスタンブロットでバンドが検出されたもの）を示し、「×」は結合しなかったもの（ウエスタンブロットバンドが検出されなかったもの）を示す。
表１の結果より、ポリオウイルスは、トランスフェリン受容体のＡＤと結合することがわかった。なお、トランスフェリン等のトランスフェリン受容体と結合することが知られている他のリガンドは、ＰＤ２＋ＨＤに結合することが報告されており（Ｃｈｅｎｇ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．,  ２００４,  Ｃｅｌｌ，  １１６：５６５−５７６参照）、ポリオウイルスの結合部位はこれらの公知のリガンドの結合部位とは異なっていた。【０１０１】
【表１】
2012105595.tif 000003
【０１０２】
（試験例４−１：トランスフェリン受容体におけるポリオウイルスの結合部位の同定）
ポリオウイルスと、マウスのトランスフェリン受容体１（ｍＴｆＲ１）との結合能をウエスタンブロットにより検討した。図６に、試験例４−１のウエスタンブロットによる検討の概略説明図を示す。【０１０３】
−ＧＳＴ−ｍＴｆＲ１の調製−
下記配列番号：５で表されるアミノ酸配列は、マウスのトランスフェリン受容体１（ｍＴｆＲ１）の一部の配列である。この下記配列番号：５で表されるアミノ酸配列を、ＧＳＴ−ｔａｇ発現ベクター（商品名：ｐＧＥＸ−ｐ４Ｘ、プロメガ社製）にクローニングし、試験例３と同様の方法でＧＳＴ融合組換え体タンパク質（以下、「ＧＳＴ−ｍＴｆＲ１」と称することがある。）を調製した。
３２１−ＴＱＦＰＰＳＱＳＳ−３２９  （配列番号：５）【０１０４】
−混合液４−１の調製−
試験例２で調製した生ポリオウイルス  １５０μＬと、前記ＧＳＴ−ｍＴｆＲ１  １０μｇと、ＳＴＤバッファーとを混合した混合液を合計０．２ｍＬとなるように調製し、３７℃にて２時間インキュベートし、次いで、４℃で１６時間インキュベートした。【０１０５】
−混合液４−２の調製−
混合液４−１の調製において、ＧＳＴ−ｍＴｆＲ１に代えて、ＧＳＴ−ｔａｇ（プロメガ社製）を用いたこと以外は、混合液４−１と同様の方法で混合液４−２を調製した。【０１０６】
−混合液４−３の調製−
混合液４−１の調製において、ポリオウイルスを添加しなかったこと以外は、混合液４−１と同様の方法で混合液４−３を調製した。【０１０７】
−混合液４−４の調製−
混合液４−１の調製において、ＧＳＴ−ｍＴｆＲ１を添加しなかったこと以外は、混合液４−１と同様の方法で混合液４−４を調製した。【０１０８】
−混合液４−５の調製−
混合液４−１の調製において、ＧＳＴ−ｍＴｆＲ１に代えて、試験例２で調製したＳｔｒｅｐ−ｍＴｆＲ１を用いたこと以外は、混合液４−１と同様の方法で混合液４−５を調製した。【０１０９】
＜トランスフェリン受容体とポリオウイルスとの結合試験＞
混合液４−１〜混合液４−４を、それぞれＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ―Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ｆａｓｔ−ｆｌｏｗ）（ＧＥヘルスケア社製）に添加し、４℃で１時間インキュベートした。次いで、９００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を捨てた後、沈殿に２００μＬのＳＴＤバッファーを添加し、９００ｒｐｍで３分間遠心することにより該沈殿を洗浄した。この洗浄を合計５回行うことで精製した。この精製により、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合したもの（ＧＳＴ−ｔａｇを有するもの及び／又はそれと結合したもの）は沈殿に残り、結合しなかったものは洗浄される。
精製後、得られた沈殿に、ＳＴＤバッファーに懸濁した１０ｍＭグルタチオンを８μＬ添加し、９００ｒｐｍで３分間遠心し、この上清を得た。これにより、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅと、該Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合したものとの結合がはずれ、上清中に溶出される。【０１１０】
また、混合液４−５は、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｓｕｐｅｒ  ｆｌｏｗ）（ＩＢＡ社製）に添加し、４℃で１時間インキュベートした。次いで、９００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を捨てた後、沈殿に２００μＬのＳＴＤバッファーを添加し、９００ｒｐｍで３分間遠心することにより該沈殿を洗浄した。この洗浄を合計５回行うことで精製した。
精製後、得られた沈殿に、ＳＴＤバッファーに懸濁した５ｍＭ  Ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎ（シグマ社製）を８μＬ添加し、９００ｒｐｍで３分間遠心し、この上清を得た。【０１１１】
精製した混合液４−１〜混合液４−５の上清、及び未精製の混合液４−１を試験例２と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルとし、試験例２と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットを行った。【０１１２】
結果を図７−１に示す。ポリオウイルスと、Ｓｔｒｅｐ−ｍＴｆＲ１とを含む混合液を用いたポジティブコントロールでは、精製後にバンドが検出された。これと同様に、ポリオウイルスと、ＧＳＴ−ｍＴｆＲ１とを含む混合液を用いた場合も、精製後においてバンドが検出された。
この結果より、配列番号：５で表されるアミノ酸配列がポリオウイスルとの結合に直接関与していることがわかった。【０１１３】
（試験例４−２：トランスフェリン受容体におけるポリオウイルスの結合部位の同定）
ポリオウイルスと、マウスのトランスフェリン受容体１（ｍＴｆＲ１）以外のトランスフェリン受容体との結合能についても、試験例４−１と同様の方法で検討した。【０１１４】
−ＧＳＴ−ｈＴｆＲ１の調製−
下記配列番号：６で表されるアミノ酸配列は、ヒトのトランスフェリン受容体１（ｈＴｆＲ１）の一部の配列である。この下記配列番号：６で表されるアミノ酸配列を、ＧＳＴ−ｔａｇ発現ベクター（商品名：ｐＧＥＸ−ｐ４Ｘ、プロメガ社製）にクローニングし、試験例３と同様の方法でＧＳＴ融合組換え体タンパク質（以下、「ＧＳＴ−ｈＴｆＲ１」と称することがある。）を調製した。
３１８−ＴＱＦＰＰＳＲＳＳ−３２６  （配列番号：６）【０１１５】
−ＧＳＴ−ｈＴｆＲ２の調製−
下記配列番号：７で表されるアミノ酸配列は、ヒトのトランスフェリン受容体２（ｈＴｆＲ２）の一部の配列である。この下記配列番号：７で表されるアミノ酸配列を、ＧＳＴ−ｔａｇ発現ベクター（商品名：ｐＧＥＸ−ｐ４Ｘ、プロメガ社製）にクローニングし、試験例３と同様の方法でＧＳＴ融合組換え体タンパク質（以下、「ＧＳＴ−ｈＴｆＲ２」と称することがある。）を調製した。
３４１−ＴＱＦＰＰＶＡＳＳ−３４９  （配列番号：７）【０１１６】
−ＧＳＴ−ｍＴｆＲ２の調製−
下記配列番号：８で表されるアミノ酸配列は、マウスのトランスフェリン受容体２（ｍＴｆＲ２）の一部の配列である。この下記配列番号：８で表されるアミノ酸配列を、ＧＳＴ−ｔａｇ発現ベクター（商品名：ｐＧＥＸ−ｐ４Ｘ、プロメガ社製）にクローニングし、試験例３と同様の方法でＧＳＴ融合組換え体タンパク質（以下、「ＧＳＴ−ｍＴｆＲ２」と称することがある。）を調製した。
３３６−ＴＱＦＰＰＶＥＳＳ−３４４  （配列番号：８）【０１１７】
−混合液４−６の調製−
試験例２で調製した生ポリオウイルス  １００μＬと、前記ＧＳＴ−ｈＴｆＲ１  ５μｇと、ＳＴＤバッファーとを混合した混合液を合計０．２ｍＬとなるように調製し、３７℃にて２時間インキュベートし、次いで、４℃で１６時間インキュベートした。【０１１８】
−混合液４−７の調製−
混合液４−６の調製において、ＧＳＴ−ｈＴｆＲ１に代えて、試験例４−１で調製したＧＳＴ−ｍＴｆＲ１を用いたこと以外は、混合液４−６と同様の方法で混合液４−７を調製した。【０１１９】
−混合液４−８の調製−
混合液４−６の調製において、ＧＳＴ−ｈＴｆＲ１に代えて、ＧＳＴ−ｈＴｆＲ２を用いたこと以外は、混合液４−６と同様の方法で混合液４−８を調製した。【０１２０】
−混合液４−９の調製−
混合液４−６の調製において、ＧＳＴ−ｈＴｆＲ１に代えて、ＧＳＴ−ｍＴｆＲ２を用いたこと以外は、混合液４−６と同様の方法で混合液４−９を調製した。【０１２１】
−混合液４−１０の調製−
混合液４−６の調製において、ＧＳＴ−ｈＴｆＲ１に代えて、ＧＳＴ−ｔａｇ（プロメガ社製）を用いたこと以外は、混合液４−６と同様の方法で混合液４−１０を調製した。【０１２２】
−混合液４−１１の調製−
混合液４−６の調製において、ＧＳＴ−ｈＴｆＲ１を添加しなかったこと以外は、混合液４−６と同様の方法で混合液４−１１を調製した。【０１２３】
＜トランスフェリン受容体とポリオウイルスとの結合試験＞
混合液４−６〜混合液４−１１を用いて、試験例４−１と同様の方法で、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ―Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ｆａｓｔ−ｆｌｏｗ）（ＧＥヘルスケア社製）を用いたトランスフェリン受容体とポリオウイルスとの結合試験を行った。
精製した混合液４−６〜混合液４−１１の上清、及び前記試験例４−１における未精製の混合液４−１を試験例２と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルとし、試験例２と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットを行った。【０１２４】
結果を図７−２に示す。マウスのトランスフェリン受容体１（ｍＴｆＲ１）の部分配列（配列番号：５）の結果と同様に、ヒトのトランスフェリン受容体１（ｈＴｆＲ１）の部分配列（配列番号：６）、ヒトのトランスフェリン受容体２（ｈＴｆＲ２）の部分配列（配列番号：７）、及びマウスのトランスフェリン受容体２（ｍＴｆＲ２）の部分配列（配列番号：８）も、ポリオウイスルとの結合に直接関与していることがわかった。【０１２５】
（試験例５：ポリオウイルスにおけるトランスフェリン受容体結合部位の同定）
ポリオウイルス（Ｍａｈｏｎｅｙ株）をＸ線結晶解析（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＨＸＳ）により決定された立体構造の（２．２Å）結果を図８に示す。ウイルス粒子径は３０ｎｍであった。ポリオウイルス表面において黒く見える箇所は、ポリオウイルス粒子の中でへこんでいる箇所であり、キャニオンと呼ばれる。ここには、ＶＰ１、ＶＰ２、及び、ＶＰ３と呼ばれるタンパク質が存在する。前記ＶＰ１におけるトランスフェリン受容体の結合能を以下の方法で検討した。【０１２６】
−ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨストランドＩの調製−
ＧｅｎｅＢａｎＫ登録番号：ＥＦ３７４０１５．１のポリオウイルスのＲＮＡゲノム配列情報を基にプライマーを設計し、ポリオウイルスのｃＤＮＡ配列を鋳型としてＰＣＲ法により常法で、ポリオウイルスのＶＰ１におけるＧＨストランドと呼ばれる領域（第６３７塩基〜第７３５塩基）を増幅させた。
増幅したＶＰ１ＧＨストランドＩの遺伝子断片をＭＢＰ発現ベクター（商品名：ｐＭＡＬ−ｐ４Ｘ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）社製）にクローニングし、試験例３と同様の方法で形質転換を行い、ＶＰ１ＧＨストランドＩとＭＢＰとの融合組換え体タンパク質（以下、「ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨストランドＩ」と称することがある。）を調製した。
なお、前記ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨストランドＩは、下記配列番号：１９で表される、ポリオウイルスのＶＰ１におけるＧＨストランドの第２１３残基〜第２４５残基のアミノ酸配列を有する。
２１３−ＳＫＶＰＬＫＤＱＳＡＥＬＧＤＳＬＹＧＡＡＳＬＮＤＦＧＩＬＡＶＲＶＶ−２４５  （配列番号：１９）【０１２７】
−ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨストランドＩＩの調製−
ＧｅｎｅＢａｎＫ登録番号：Ｖ０１１４９のポリオウイルスのＲＮＡゲノム配列情報を基にプライマーを設計し、ポリオウイルスのｃＤＮＡ配列を鋳型としてＰＣＲ法により常法で、ポリオウイルスのＶＰ１におけるＧＨストランドと呼ばれる領域（第６３７塩基〜第７３９塩基）を増幅させた。
前記ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨストランドＩの調製において、ＶＰ１ＧＨストランドＩの遺伝子断片に代えて、ＶＰ１ＧＨストランドＩＩの遺伝子断片を用いたこと以外は前記ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨストランドＩの調製と同様の方法で、ＶＰ１ＧＨストランドＩＩとＭＢＰとの融合組換え体タンパク質（以下、「ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨストランドＩＩ」と称することがある。）を調製した。
なお、前記ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨストランドＩＩは、下記配列番号：２０で表される、ポリオウイルスのＶＰ１におけるＧＨストランドの第２１３残基〜第２４５残基のアミノ酸配列を有する。
２１３−ＳＫＶＰＬＫＤＱＳＡＡＬＧＤＳＬＹＧＡＡＳＬＮＤＦＧＩＬＡＶＲＶＶ−２４５  （配列番号：２０）【０１２８】
−ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨループの調製−
ＧｅｎｅＢａｎＫ登録番号：Ｖ０１１４９のポリオウイルスのＲＮＡゲノム配列情報に従い、下記配列番号：９で表されるセンスプライマー及び下記配列番号：１０で表されるアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲ法により常法で、ポリオウイルスのＶＰ１におけるＧＨループと呼ばれる領域をコードする（第６６７塩基〜第１,００６塩基）を増幅させた。
前記ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨストランドＩの調製において、ＶＰ１ＧＨストランドＩの遺伝子断片に代えて、ＶＰ１ＧＨループの遺伝子断片を用いたこと以外は前記ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨストランドＩの調製と同様の方法で、ＶＰ１ＧＨループとＭＢＰとの融合組換え体タンパク質（以下、「ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨループ」と称することがある。）を調製した。
なお、前記ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨループは、下記配列番号：１で表される、ポリオウイルスのＶＰ１におけるＧＨループの第２２３残基〜第２３５残基のアミノ酸配列を有する。
センスプライマー：  ５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＴＧＧＧＣＧＡＴＴＣＡＣＴＴＴＡＴＧＧＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣ−３’  （配列番号：９）
アンチセンスプライマー：  ５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＴＴＡＴＴＡＧＴＴＣＡＡＧＧＡＴＧＣＡＧＣＡＣＣＡＴＡＡＡＧＴＧＡＡＴＣ−３’  （配列番号：１０）
２２３−ＡＬＧＤＳＬＹＧＡＡＳＬＮ−２３５  （配列番号：１）【０１２９】
−混合液５−１の調製−
０．５μｇのＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨループと、５μｇの試験例４−１で調製したＧＳＴ−ｍＴｆＲ１と、ＳＴＤバッファーとを混合した混合液を合計１０μＬとなるように調製し、２３℃にて２時間インキュベートし、次いで、４℃で１６時間インキュベートした。【０１３０】
−混合液５−２の調製−
混合液５−１の調製において、ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨループを添加しなかったこと以外は、混合液５−１と同様の方法で混合液５−２を調製した。【０１３１】
−混合液５−３の調製−
混合液５−１の調製において、ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨループに代えて、ＭＢＰ（ＮＥＢ社製）を用いたこと以外は、混合液５−１と同様の方法で混合液５−３を調製した。【０１３２】
−混合液５−４の調製−
混合液５−１の調製において、ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨループに代えて、ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨストランドＩを用いたこと以外は、混合液５−１と同様の方法で混合液５−４を調製した。【０１３３】
−混合液５−５の調製−
混合液５−１の調製において、ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨループに代えて、ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨストランドＩＩを用いたこと以外は、混合液５−１と同様の方法で混合液５−５を調製した。【０１３４】
＜ポリオウイルスとトランスフェリン受容体との結合試験＞
混合液５−１〜混合液５−５を、それぞれアミロースレジン（商品名：Ａｍｙｌｏｓｅ−ｒｅｓｉｎ、ＮＥＢ社製）に添加し、４℃で１時間インキュベートした。次いで、９００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を捨てた後、沈殿に２００μＬの１質量％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有ＳＴＤバッファーを添加し、９００ｒｐｍで３分間遠心することにより該沈殿を洗浄した。この洗浄を合計５回行うことで精製した。この精製により、アミロースレジンに結合したもの（ＭＢＰを有するもの及び／又はそれと結合したもの）は沈殿に残り、結合しなかったものは洗浄される。
精製後、得られた沈殿に、１質量％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有ＳＴＤバッファーに懸濁した２０ｍＭマルトースを８μＬ添加し、９００ｒｐｍで３分間遠心し、この上清を得た。これにより、アミロースレジン、該アミロースレジンに結合したものとの結合がはずれ、上清中に溶出される。【０１３５】
精製した混合液５−１〜混合液５−５の上清、及び未精製の混合液５−１を試験例２と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルとし、常法に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットを行った。
なお、ウエスタンブロットは、１次抗体として、抗ＧＳＴ抗体（商品名：Ａｎｔｉ−ＧＳＴ−ｔａｇ，ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＭＢＬ社製）を用い、２次抗体として、抗マウスＩＧ−ＨＲＰ抗体（商品名：Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ−ＨＲＰ、Ｄａｋｏ社製）を用いて行った。【０１３６】
結果を図９に示す。ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨループとＧＳＴ−ｍＴｆＲ１とを含む混合液５−１を用いた場合、精製後においてもバンドが検出された。また、ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨストランドＩとＧＳＴ−ｍＴｆＲ１とを含む混合液５−４を精製したもの、及び、ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨストランドＩＩとＧＳＴ−ｍＴｆＲ１とを含む混合液５−５を精製したものについてもバンドが検出された。
この結果より、ポリオウイルスとトランスフェリン受容体との結合には、ポリオウイルスのＶＰ１における配列番号：１で表されるアミノ酸配列と、トランスフェリン受容体のＡＤにおける配列番号：５で表されるアミノ酸配列とが結合することによるものであることが明らかになった。【０１３７】
（試験例６：ポリオウイルスにおけるトランスフェリン受容体結合部位の同定）
ＶＰ１の試験例５とは異なる領域におけるトランスフェリン受容体の結合能を以下の方法で検討した。【０１３８】
−ＭＢＰ−ＶＰ１ＢＣループの調製−
ＧｅｎｅＢａｎＫ登録番号：Ｖ０１１４９のポリオウイルスのＲＮＡゲノム配列情報を基に、下記配列番号：１１で表されるセンスプライマー及び下記配列番号：１２で表されるアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲ法により常法で、ポリオウイルスのＶＰ１におけるＢＣループと呼ばれる領域をコードする（第２６８塩基〜第３２７塩基）を増幅させた。
増幅したＶＰ１ＢＣループの遺伝子断片をＭＢＰ発現ベクター（商品名：ｐＭＡＬ−ｐ４Ｘ、ＮＥＢ社製）にクローニングし、試験例３と同様の方法で形質転換を行い、ＶＰ１ＢＣループとＭＢＰとの融合組換え体タンパク質（以下、「ＭＢＰ−ＶＰ１ＢＣループ」と称することがある。）を調製した。
なお、前記ＭＢＰ−ＶＰ１ＢＣループは、下記配列番号：２で表される、ポリオウイルスのＶＰ１におけるＢＣループの第９１残基〜第１０９残基のアミノ酸配列を有する。
センスプライマー：  ５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＣＴＧＴＧＧＡＣＡＡＣＣＣＧＧＣＴＴＣＴＡＣＴＡＣＡＡＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡＡＴＴＧＴＴＴＴＣＴ−３’  （配列番号：１１）
アンチセンスプライマー：  ５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＴＴＡＴＴＡＣＴＴＣＣＡＣＡＣＡＧＡＡＡＡＣＡＡＴＴＴＧＴＣＴＴＴＧＴＴＴＧＴＡＧＴ−３’  （配列番号：１２）
９１−ＭＴＶＤＮＰＡＳＴＴＮＫＤＫＬＦＳＶＷＫ−１０９  （配列番号：２）【０１３９】
−ＭＢＰ−ＶＰ１ＥＦループの調製−
ＧｅｎｅＢａｎＫ登録番号：Ｖ０１１４９のポリオウイルスのＲＮＡゲノム配列情報を基に、下記配列番号：１３で表されるセンスプライマー及び下記配列番号：１４で表されるアンチセンスプライマーを設計し、ポリオウイルスのｃＤＮＡ配列を鋳型としてＰＣＲ法により常法で、ポリオウイルスのＶＰ１におけるＥＦループと呼ばれる領域（第４８４塩基〜第５０７塩基）を増幅させた。
前記ＭＢＰ−ＶＰ１ＢＣループの調製において、ＶＰ１ＢＣループの遺伝子断片に代えて、ＶＰ１ＥＦループの遺伝子断片を用いたこと以外は前記ＭＢＰ−ＶＰ１ＢＣループの調製と同様の方法で、ＶＰ１ＢＣループとＭＢＰとの融合組換え体タンパク質（以下、「ＭＢＰ−ＶＰ１ＢＣループ」と称することがある。）を調製した。
なお、前記ＭＢＰ−ＶＰ１ＥＦループは、ポリオウイルスのＶＰ１におけるＥＦループの第１６２残基〜第１６９残基のアミノ酸配列（下記配列番号：３で表されるアミノ酸配列）を有する。
センスプライマー：  ５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡＧＧＧＧＣＡＣＣＧＧＴＧＣＣＡＧＡＧＡＡＡＴＡＡＴ−３’  （配列番号：１３）
アンチセンスプライマー：  ５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＴＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＧＴＧＣ−３’  （配列番号：１４）
１６２−ＰＧＡＶＰＥＫ−１６９  （配列番号：３）【０１４０】
−ＭＢＰ−ＶＰ１ＦＧループの調製−
ＧｅｎｅＢａｎＫ登録番号：Ｖ０１１４９のポリオウイルスのＲＮＡゲノム配列情報を基に、下記配列番号：２１で表されるセンスプライマー及び下記配列番号：２２で表されるアンチセンスプライマーを設計し、ポリオウイルスのｃＤＮＡ配列を鋳型としてＰＣＲ法により常法で、ポリオウイルスのＶＰ１におけるＦＧループと呼ばれる領域（第５２８塩基〜第６１７塩基）を増幅させた。
前記ＭＢＰ−ＶＰ１ＢＣループの調製において、ＶＰ１ＢＣループの遺伝子断片に代えて、ＶＰ１ＦＧループの遺伝子断片を用いたこと以外は前記ＭＢＰ−ＶＰ１ＢＣループの調製と同様の方法で、ＶＰ１ＦＧループとＭＢＰとの融合組換え体タンパク質（以下、「ＭＢＰ−ＶＰ１ＦＧループ」と称することがある。）を調製した。
なお、前記ＭＢＰ−ＶＰ１ＦＧループは、ポリオウイルスのＶＰ１におけるＦＧループの第１７６残基〜第２０５残基のアミノ酸配列（下記配列番号：２３で表されるアミノ酸配列）を有する。
センスプライマー：  ５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＡＡＡＣＧＴＣＣＴＣＣＡＡＣＣＣＡＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴ−３’  （配列番号：２１）
アンチセンスプライマー：  ５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＴＡＴＴＡＡＴＡＣＧＣＧＴＴＡＧＡＡＡＴＧＣＣＡＡＣＧＴＡＴＧＧＡＡＣＣＧＡＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＧＧＴＧＣＣＧＴＧＣＣＧＴＡＧＧＴ−３’  （配列番号：２２）
１７６−ＰＳＩＦＹＴＹＧＴＡＰＡＲＩＳＶＰＹＶＧＩＳＮＡＹ−２０５  （配列番号：２３）【０１４１】
−ＭＢＰ−ＶＰ１Ｃ末端の調製−
ＧｅｎｅＢａｎＫ登録番号：Ｖ０１１４９のポリオウイルスのＲＮＡゲノム配列情報を基に、下記配列番号：１５で表されるセンスプライマー及び下記配列番号：１６で表されるアンチセンスプライマーを設計し、ポリオウイルスのｃＤＮＡ配列を鋳型としてＰＣＲ法により常法で、ポリオウイルスのＶＰ１におけるＣ末端領域（第８８３塩基〜第９０６塩基）を増幅させた。
前記ＭＢＰ−ＶＰ１ＢＣループの調製において、ＶＰ１ＢＣループの遺伝子断片に代えて、ＶＰ１Ｃ末端領域の遺伝子断片を用いたこと以外は前記ＭＢＰ−ＶＰ１ＢＣループの調製と同様の方法で、ＶＰ１Ｃ末端領域とＭＢＰとの融合組換え体タンパク質（以下、「ＭＢＰ−ＶＰ１Ｃ末端領域」と称することがある。）を調製した。
なお、前記ＭＢＰ−ＶＰ１Ｃ末端は、ポリオウイルスのＶＰ１におけるＣ末端の第２９５残基〜第３０２残基のアミノ酸配列（下記配列番号：４で表されるアミノ酸配列）を有する。
センスプライマー：  ５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＣＴＣＣＣＴＴＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＧＡＣＣＴＧＡＣＡＡＣＧＴＡＣＧＣＴＡＧ−３’  （配列番号：１５）
アンチセンスプライマー：  ５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＴＴＡＴＴＡＧＴＡＣＧＴＴＧＴＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧＧＴＧＧＡＴ−３’  （配列番号：１６）
２９５−ＳＴＫＤＬＴＴＹ−３０２  （配列番号：４）【０１４２】
−混合液６−１の調製−
０．５μｇのＭＢＰ−ＶＰ１ＦＧループと、５μｇの試験例４−１で調製したＧＳＴ−ｍＴｆＲ１と、ＳＴＤバッファーとを混合した混合液を合計１０μＬとなるように調製し、２３℃にて２時間インキュベートし、次いで、４℃で１６時間インキュベートした。【０１４３】
−混合液６−２の調製−
混合液６−１の調製において、ＭＢＰ−ＶＰ１ＦＧループに代えて、ＭＢＰを用いたこと以外は、混合液６−１と同様の方法で混合液６−２を調製した。【０１４４】
−混合液６−３の調製−
混合液６−１の調製において、ＭＢＰ−ＶＰ１ＦＧループに代えて、ＭＢＰ−ＶＰ１ＢＣループを用いたこと以外は、混合液６−１と同様の方法で混合液６−３を調製した。【０１４５】
−混合液６−４の調製−
混合液６−１の調製において、ＭＢＰ−ＶＰ１ＦＧループに代えて、ＭＢＰ−ＶＰ１ＥＦループを用いたこと以外は、混合液６−１と同様の方法で混合液６−４を調製した。【０１４６】
−混合液６−５の調製−
混合液６−１の調製において、ＭＢＰ−ＶＰ１ＦＧループに代えて、試験例５で調製したＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨループを用いたこと以外は、混合液６−１と同様の方法で混合液６−５を調製した。【０１４７】
−混合液６−６の調製−
混合液６−１の調製において、ＭＢＰ−ＶＰ１ＦＧループに代えて、ＭＢＰ−ＶＰ１Ｃ末端を用いたこと以外は、混合液６−１と同様の方法で混合液６−６を調製した。【０１４８】
＜ポリオウイルスとトランスフェリン受容体との結合試験＞
試験例５のポリオウイルスとトランスフェリン受容体との結合試験において、混合液５−１〜混合液５−５に代えて、混合液６−１〜混合液６−６を用いたこと以外は、試験例５と同様の方法で結合試験を行った。【０１４９】
精製した混合液６−１〜混合液６−６の上清、及び未精製の混合液６−１を試験例２と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルとし、試験例５と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットを行った。【０１５０】
結果を図１０に示す。ＧＳＴ−ｍＴｆＲ１にＭＢＰのみを混合した混合液６−２以外は全てバンドが検出された。
この結果より、ポリオウイルスとトランスフェリン受容体との結合には、ポリオウイルスのＶＰ１における配列番号：２から４で表されるアミノ酸配列と、トランスフェリン受容体のＡＤにおける配列番号：５で表されるアミノ酸配列との結合が関与することが明らかになった。【０１５１】
（試験例７：配列番号：１で表されるペプチドの血液脳関門の透過）
−Ａｌｅｘａ４８８−ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨループの調製−
試験例５で調製したＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨループのＭＢＰタグのアミノ酸側鎖の一級アミノ酸部位にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８を導入した。蛍光ラベルを付したＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨループを、以下「Ａｌｅｘａ４８８−ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨループ」と称することがある。
このＡｌｅｘａ４８８−ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨループは、ＳＴＤバッファーにて濃度２ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。【０１５２】
−Ａｌｅｘａ４８８−ＭＢＰの調製−
Ａｌｅｘａ４８８−ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨループの調製において、ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨループに代えて、ＭＢＰ２を用いたこと以外は、Ａｌｅｘａ４８８−ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨループの調製と同様の方法でＭＢＰに蛍光ラベルを付した。蛍光ラベルを付したＭＢＰを、以下「Ａｌｅｘａ４８８−ＭＢＰ」と称することがある。
このＡｌｅｘａ４８８−ＭＢＰは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いて、濃度２ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。【０１５３】
＜配列番号：１で表されるペプチドの血液脳関門透過試験＞
試験例１と同様の血液脳関門のインビトロモデル培養系を用いて試験を行った。
トランズウェル内の脳血管内皮細胞の培養液に、前記Ａｌｅｘａ４８８−ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨループ９０μｇ／ｍＬ、蛍光ラベル化トランスフェリン（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８−ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（インビトロジェン社製）、以下、「Ａｌｅｘａ４８８−Ｔｆ」と称することがある。）１８０μｇ／ｍＬ、前記Ａｌｅｘａ４８８−ＭＢＰ９０μｇ／ｍＬ、又は前記デキストランの蛍光標識体（重量平均分子量：７０ｋＤａのＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｒ（登録商標）  ４８８標識体、インビトロジェン社製）１８０μｇ／ｍＬをそれぞれトランズウェル培養プレート（コーニング社製）上層部に添加し、１０分間後、２０分間後、３０分間後のトランズウェル培養プレート下層部の培養液をそれぞれ回収し、分光蛍光光度計（商品名：Ｆ−２５００、株式会社日立ハイテクノロジーズ製）にて蛍光強度を観察し、これをトランズウェル内の脳血管内皮細胞を透過した量として測定した。【０１５４】
結果を図１１に示す。Ａｌｅｘａ４８８−ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨループのＰＳ値は０．８２であり、蛍光ラベル化トランスフェリンのＰＳ値は０．３３であり、Ａｌｅｘａ４８８−ＭＢＰのＰＳ値は０．２８であり、デキストランの蛍光標識体のＰＳ値は０．３３であった。
Ａｌｅｘａ４８８−ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨループは、トランスフェリンと同様に、脳血管内皮細胞を透過し、その透過速度も同程度であった。
この結果より、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含むペプチドは、血液脳関門を透過できることがわかった。【０１５５】
＜共焦点顕微鏡観察による血液脳関門透過の確認＞
マウス由来ｃＤＮＡを用いてトランスフェリンレセプター１（ｍＴｆＲ１）の全長遺伝子を、試験例２と同様に、ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号  ＢＣ０５４５２２．１の情報を基に設計した下記配列番号：２４で表されるセンスプライマー及び下記配列番号：２５で表されるアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ法で調製した。
センスプライマー：５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＧＣＣＡＧＡＴＣＡ−３’  （配列番号：２４）
アンチセンスプライマー：５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＧＡＡＡＣＴＣＡＴＴＧＴＣＡＡＴＡＴＴＣＣ−３’  （配列番号：２５）【０１５６】
増幅した遺伝子断片を赤色蛍光タンパク質発現ベクター（商品名：ｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｎ１、クロンテック社製）のＸｈｏＩとＢａｍＨＩとの切断部位に挿入することにより、ｍＴｆＲ１のカルボキシル末端にｍＣｈｅｒｒｙを融合した発現ベクター（以下、「ｐｍＣｈｅｒｒｙ−ｍＴｆＲ１」と称することがある。）を得た。これを試験例１で用いた脳血管内皮細胞にＦｕＧＥＮＥ６（ＮＥＢ社製）を用いてトランスフェクションし、ｍＣｈｅｒｒｙ−ｍＴｆＲ１の発現を行った。
このｍＣｈｅｒｒｙ−ｍＴｆＲ１を発現させた脳血管内皮細胞に、前記Ａｌｅｘａ４８８−ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨループを添加し、共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製）で６０分間観察した。
その結果、トランスフェリン受容体とＡｌｅｘａ４８８−ＭＢＰ−ＶＰ１ＧＨループとが結合し、約２０分間で脳血管内皮細胞内に取り込まれる様子が観察された。一方、Ａｌｅｘａ４８８−ＭＢＰは取り込まれなかった。【０１５７】
これまでの結果に基づき、タンパク質−タンパク質間の相互作用をＥ＿ＲＤｏｃｋ及びＺＤｏｃｋを用いてドッキングシュミレーションを行った。解析プログラムは、ＡＣＣＥＬＹＳ社製を使用した。図１２Ａは、ポリオウイルスのＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の複合体のシュミレーションモデル図であり、図１２Ｂは、ＶＰ１を拡大したシュミレーションモデル図であり、図１２Ｃは、トランスフェリン受容体のシュミレーションモデル図であり、図１２Ｄは、図１２Ａの複合体と図１２Ｃのトランスフェリン受容体とが結合したシュミレーションモデル図である。この計算値によっても、ポリオウイルスが有する配列番号：１で表されるアミノ酸配列と、トランスフェリン受容体が有する配列番号：５で表されるアミノ酸配列とが結合することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１５８】
本発明のペプチドは、血液脳関門を透過することができるため、細胞内、特に中枢神経系の細胞に薬物を輸送することができる薬物輸送体、抗ポリオウイルス剤、血液脳関門透過剤、及びトランスフェリン受容体捕捉体などに好適に利用可能である。
【図１】
2012105595.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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