(57)【要約】  本発明のマラリアの治療方法は、マラリア原虫の細胞内小器官内から細胞内小器官外へのカルシウムイオンの搬出、及び／又は、マラリア原虫の細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの搬入、を抑制する薬剤を、ヒト又は動物に対して、治療有効量投与する工程を含む方法である。
2012057294.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マラリアの治療方法であって、
マラリア原虫の細胞内小器官内から細胞内小器官外へのカルシウムイオンの搬出、及び／又は、マラリア原虫の細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの搬入、を抑制する薬剤を、ヒト又は動物に対して治療有効量投与する工程を含む、マラリアの治療方法。
【請求項２】
上記薬剤は、上記細胞内小器官としての小胞体内から小胞体外へのカルシウムイオンの搬出を抑制するものである、請求項１に記載の治療方法。
【請求項３】
上記薬剤が、マラリア原虫の輪状体及び／又はトロホゾイトにおけるカルシウムイオンの搬出を抑制する薬剤である請求項１に記載の治療方法。
【請求項４】
上記薬剤が、メラトニンに対する阻害剤、マラリア原虫におけるメラトニンのホモログに対する阻害剤、メラトニン受容体に対する阻害剤、又は、マラリア原虫におけるメラトニン受容体のホモログに対する阻害剤を含んでいる請求項１に記載の治療方法。
【請求項５】
上記薬剤が、イノシトール三リン酸受容体に対する阻害剤、又はマラリア原虫におけるイノシトール三リン酸受容体のホモログに対する阻害剤を含んでいる請求項１に記載の治療方法。
【請求項６】
上記薬剤が、イノシトール三リン酸と特異的な結合活性を有する化合物、ペプチド、又は当該ペプチドをコードする核酸を含んでいる請求項１に記載の治療方法。
【請求項７】
上記薬剤が、配列番号１に示すペプチドを上記ペプチドとして含んでいる請求項６に記載の治療方法。
【請求項８】
上記薬剤が、上記ペプチドをコードする核酸と、当該核酸に連結され当該核酸をマラリア原虫に特異的に発現させる発現調節配列と、を含むベクターからなる請求項６に記載の治療方法。
【請求項９】
ヒト又は動物に対して、マラリア原虫の感染前のタイミングで予防的に投与される請求項１〜８の何れか一項に記載の治療方法。
【請求項１０】
上記薬剤の投与タイミングが、上記ヒト又は動物におけるマラリア原虫の生育ステージに応じて決定される請求項１〜８の何れか一項に記載の治療方法。
【請求項１１】
上記ヒト又は動物におけるマラリア原虫の生育ステージが輪状体の段階から初期のシゾント段階の間に、当該薬剤の血中濃度が治療有効量となるように、上記薬剤の投与タイミングが決定される請求項１０に記載の治療方法。
【請求項１２】
マラリア原虫の殺虫方法であって、
マラリア原虫の細胞内小器官内から細胞内小器官外へのカルシウムイオンの搬出、及び／又は、マラリア原虫の細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの搬入、を抑制する薬剤を、マラリア原虫に対して、有効量供給する工程を含む、マラリア原虫の殺虫方法。
【請求項１３】
マラリアの治療薬であって、
マラリア原虫の細胞内小器官内から細胞内小器官外へのカルシウムイオンの搬出、及び／又は、マラリア原虫の細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの搬入、を抑制する薬剤を含んでいるマラリアの治療薬。
【請求項１４】
マラリアの治療薬候補のスクリーニング方法であって、
イン・ビトロでマラリア原虫を同調培養し、当該マラリア原虫の生育ステージが輪状体の段階から初期のシゾント段階の間において、スクリーニング対象となる薬剤を添加する第一工程と、次いで、
上記薬剤の添加により、上記マラリア原虫の生育が抑制された、又はマラリア原虫が死滅した場合に、当該薬剤をマラリアの治療薬候補として選択する第二工程と、
を含んでいるマラリアの治療薬候補のスクリーニング方法。
【請求項１５】
マラリアの治療薬候補のスクリーニング方法であって、
イン・ビトロで培養しているマラリア原虫に対して、スクリーニング対象となる薬剤を添加する第一工程と、次いで、
マラリア原虫の細胞内小器官内から細胞内小器官外へのカルシウムイオンの搬出量、及び／又は、マラリア原虫の細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの搬入量を測定する第二工程と、次いで、
上記薬剤の添加により、カルシウムイオンの上記搬出量、及び／又は、搬入量が減少した場合に、当該薬剤をマラリアの治療薬候補として選択する第三工程と、
を含んでいるマラリアの治療薬候補のスクリーニング方法。
【請求項１６】
マラリアへの二次感染の防止方法であって、
マラリア原虫が感染した血液又は感染の虞がある血液であって、ヒト又は動物の体外に存在するものに対して、マラリア原虫の細胞内小器官内から細胞内小器官外へのカルシウムイオンの搬出、及び／又は、マラリア原虫の細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの搬入、を抑制する薬剤を供給する工程を含む、マラリアへの二次感染の防止方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マラリアの新規な治療方法、マラリア原虫の新規な殺虫方法、及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは、熱帯性の蚊であるハマダラカが媒介する原虫病の一つである。ハマダラカの体内に棲息するマラリア原虫は、ハマダラカの吸血行動の際にその口吻を介して、ヒト又は動物の体内に侵入する。【０００３】
ヒト又は動物は、マラリア原虫にとっての中間宿主である。ヒト又は動物の体内に侵入したマラリア原虫は、はじめに肝臓細胞に集積して増殖する。次いで、増殖したマラリア原虫は、血管内に侵入した後に、赤血球内に侵入してさらなる増殖を繰返す。【０００４】
マラリアの治療法は幾つか確立されたものが存在する。例えば、元々は天然由来成分であるキニーネはマラリアの特効薬として知られており、現在では化学合成により生産が可能である。或いは、キニーネからの派生物であるクロロキン、メフロキン等もマラリアの治療薬として知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Flavio H. Beraldo, Katsuhiko Mikoshiba and Celia R.S. Garcia; J. Pineal Res. 2007, 43: p360-364
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、キニーネの全合成の収率は、これまでの工程改良の努力にも関わらず一桁台に留まっており、収率が不十分という問題が解消されていない。さらに、キニーネは非常に副作用が強いという問題を有し、さらに薬剤耐性の問題も生じ始めている。また、キニーネからの派生物であるクロロキンは、キニーネと比較して副作用は低減されているが、キニーネと同様に薬剤耐性の問題が生じ始めている。現在最も広汎に用いられている抗マラリア薬はアルテミシニン誘導体であり、耐性獲得を遅らせるためにＷＨＯの推奨に従い、他の抗マラリア薬との合剤として使用されている。今後、アルテミシニン誘導体に耐性を持つマラリア原虫が蔓延した場合、それに代わる特効薬が存在しないことが現在最も問題となっている。上記の問題に鑑み、新たなメカニズムに基づくマラリアの治療法及び治療薬の開発が切望されているという状況にある。【０００７】
なお、マラリアの治療法及び治療薬の開発に結びつくか否かとは無関係に、ヒト又は動物の体内に侵入したマラリア原虫の生態を、メラトニンとの関係において解明する研究上のアプローチは様々行われている。例えば、非特許文献１には、ヒトのメラトニンが、ホスホリパーゼＣの活性化を通じてマラリア原虫の概日周期を調整すること、及び、メラトニンを介したシグナル伝達系が、マラリア原虫の侵入、成熟、及び増殖に深く関与していることが記載されている。より具体的には、非特許文献１には、InsP3（IP3）受容体の調整物質であるジフェニルボリン酸２−アミノエチル（２−ＡＰＢ）をマラリア原虫に投与すると、メラトニンによりもたらされる細胞質内のカルシウムイオン濃度の増大が抑えられることが記載されている。加えて、非特許文献１の３６２頁右欄最終行〜３６３頁左欄２行目等には、２−ＡＰＢ自身は、マラリア原虫におけるカルシウム放出の促進には何らの効果もないことが記載されている。【０００８】
しかし、非特許文献１はマラリア原虫の生態の一端を解明するアプローチに過ぎず、マラリア原虫が死滅した等の結果も得られていないため、当該文献はマラリアの治療法及び治療薬の開発に示唆を与えるものではないのが現状である。【０００９】
本願発明は、上記の課題を解決するためになされたものであり、従来とは異なるメカニズムを利用したマラリアの治療方法、マラリア原虫の殺虫方法、及びその利用を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の課題を解決するために、本願発明者らは鋭意検討を行なった。その結果、マラリア原虫細胞質におけるカルシウムイオンの搬出（放出）及び／又は搬入（流入）を制御するという作用機序により、マラリア原虫の殺虫、及びマラリアの治療に極めて優れた効果があることを新たに見出し、本願発明を想到するに至った。【００１１】
すなわち、本発明にかかるマラリアの治療方法は、マラリア原虫の細胞内小器官内から細胞内小器官外へのカルシウムイオンの搬出、及び／又は、マラリア原虫の細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの搬入、を抑制する薬剤を、ヒト又は動物に対して、治療有効量投与する工程を含む方法である。【００１２】
本発明にかかるマラリア原虫の殺虫方法は、マラリア原虫の細胞内小器官内から細胞内小器官外へのカルシウムイオンの搬出、及び／又は、マラリア原虫の細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの搬入、を抑制する薬剤を、マラリア原虫に対して、有効量供給する工程を含む方法である。【００１３】
本発明にかかるマラリアの治療薬は、マラリア原虫の細胞内小器官内から細胞内小器官外へのカルシウムイオンの搬出、及び／又は、マラリア原虫の細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの搬入、を抑制する薬剤を含んでいるものである。【００１４】
本発明にかかるマラリアの治療薬候補のスクリーニング方法は、イン・ビトロでマラリア原虫を同調培養し、当該マラリア原虫の生育ステージが輪状体の段階から初期のシゾント段階の間において、スクリーニング対象となる薬剤を添加する第一工程と、次いで、上記薬剤の添加により、上記マラリア原虫の生育が抑制された、又はマラリア原虫が死滅した場合に、当該薬剤をマラリアの治療薬候補として選択する第二工程と、を含んでいる方法である。なお、スクリーニング対象となる薬剤を添加するタイミングは、より好ましくは輪状体の段階からトロホゾイトの段階の間であり、さらに好ましくは初期の輪状体又はトロホゾイトの段階であり、特に好ましくはトロホゾイトの段階である。【００１５】
本発明にかかるマラリアの治療薬候補のスクリーニング方法は、イン・ビトロで培養しているマラリア原虫に対して、スクリーニング対象となる薬剤を添加する第一工程と、次いで、マラリア原虫の細胞内小器官内から細胞内小器官外へのカルシウムイオンの搬出量、及び／又は、マラリア原虫の細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの搬入量を測定する第二工程と、次いで、上記薬剤の添加により、カルシウムイオンの上記搬出量、及び／又は、搬入量が減少した場合に、当該薬剤をマラリアの治療薬候補として選択する第三工程と、を含んでいる方法である。【００１６】
本発明にかかるマラリアへの二次感染の防止法は、マラリア原虫が感染した血液又は感染の虞がある血液であって、ヒト又は動物の体外に存在するものに対して、マラリア原虫の細胞内小器官内から細胞内小器官外へのカルシウムイオンの搬出、及び／又は、マラリア原虫の細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの搬入、を抑制する薬剤を供給する工程を含む方法である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、従来とは異なるメカニズムを利用したマラリアの治療方法、マラリア原虫の殺虫方法、及びその利用を提供することが出来るという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１中の（ａ）は熱帯熱マラリア原虫の生活環を赤血球寄生ステージを中心に図示したものである。（ｂ）〜（ｋ）は、初期の輪状体からシゾントの各段階における、熱帯熱マラリア原虫細胞内の蛍光Ｃａ２＋イメージングの結果を示す図である。図中の画像写真は蛍光Ｃａ２＋指示薬を導入した各段階の原虫の赤血球中の像を示す。（ｌ）は、マラリア原虫の後期の輪状体、シゾント及びメロゾイトにおけるＣａ２＋の周期的な変動の振幅の大きさに２−ＡＰＢが与える影響を分析した結果を示す。
【図２】図２中の（ａ）及び（ｂ）は、Ｕ７３１２２で処理した初期の輪状体及びトロホゾイトの段階の熱帯熱マラリア原虫細胞内の蛍光Ｃａ２＋イメージングの結果を示す図であり、（ｃ）及び（ｄ）は、タプシガルギンで処理した初期の輪状体及びトロホゾイトの段階の熱帯熱マラリア原虫細胞内の蛍光Ｃａ２＋イメージングの結果を示す図であり、（ｅ）及び（ｆ）は、コンカナマイシンＡで処理した初期の輪状体及びトロホゾイトの段階の熱帯熱マラリア原虫細胞内の蛍光Ｃａ２＋イメージングの結果を示す図である。
【図３】図３中の（ａ）・（ｂ）はそれぞれ、灌流試験による、タプシガルギン、コンカナマイシンＡで処理した初期の輪状体及びトロホゾイトの段階の熱帯熱マラリア原虫細胞内のＣａ２＋のイメージングの結果を示す図である。
【図４】図４は、２−ＡＰＢによる、熱帯熱マラリア原虫の赤血球内での生育阻害の実験結果を示す図である。（ａ）は４０時間にわたり同調培養を行った結果を示し、(ｂ)は４０時間にわたり同調培養を行った熱帯熱マラリア原虫の形態を示し、（ｃ）はマラリア原虫細胞の占める面積、周囲長、及び最大直径の分析結果を示し、（ｄ）は７０時間にわたり同調培養を行った結果を示し、（ｅ）は熱帯熱マラリア原虫のクロロキン耐性株へ２−ＡＰＢを処置した結果を示す。
【図５】図５中の（ａ）・（ｂ）はそれぞれ、２−ＡＰＢで事前に処理した赤血球を用いた、熱帯熱マラリア原虫の同調培養開始後２０時間、４０時間の結果を示す図である。
【図６】図６は、異なる生育段階にある熱帯熱マラリア原虫の培養に対する、２−ＡＰＢの効果を実験した結果を示す図である。（ａ）は培養開始時に２−ＡＰＢを添加し、１０時間後に２−ＡＰＢを含まない培地に交換し、（ｂ）は培養開始時に２−ＡＰＢを添加し、２１時間後に２−ＡＰＢを含まない培地に交換し、（ｃ）は培養開始後２１時間のタイミングで２−ＡＰＢを添加し、（ｅ）は培養開始後２８時間のタイミングで２−ＡＰＢを添加し、（ａ）〜（ｃ）は培養開始後４０時間、（ｅ）は培養開始後４５時間の結果を示す図である。（ｆ）は、１００μＭの２−ＡＰＢが、マラリア原虫細胞の占める面積、周囲長、及び最大直径に及ぼす影響を分析した結果を示す。
【図７】図７は、ルジンドール（ＬＺ）による、熱帯熱マラリア原虫の赤血球内での生育阻害の実験結果を示す図である。（ａ）は２０時間、（ｂ）は４０時間、（ｃ）は７０時間にわたり同調培養を行った結果を示す。
【図８】図８は、コントロール、及び２−ＡＰＢで処置された熱帯熱マラリア原虫を電子顕微鏡で観察した様子を示す図であり、（ａ）はＤＭＳＯを投与後、３０時間培養したものであり（コントロール群：オリジナル倍率×３０，０００）、（ｂ）は１００μＭの２−ＡＰＢを投与後、３０時間培養したものであり（オリジナル倍率×３０，０００）、（ｃ）は１００μＭの２−ＡＰＢを投与後、３０時間培養したものであり（オリジナル倍率×３０，０００）、（ｄ）は１００μＭの２−ＡＰＢを投与後、３０時間培養したものであって、矢印で示す網目状小胞体構造が観察されるものであり（オリジナル倍率×５０，０００）、（ｅ）は１００μＭの２−ＡＰＢを投与後、４０時間培養したものであって、矢印で示す核膜(NE)がリボゾームの顆粒(Ri)に取り囲まれた構造が観察されるものであり（オリジナル倍率×５０，０００）、（ｆ）は１００μＭの２−ＡＰＢを投与後、４０時間培養したものであって、かん小体(Rh)及び他の微小オルガネラが観察されるものであり（オリジナル倍率×５０，０００）、Nは核を、MPはマラリアピグメントを、MCはマウレル裂を示す。
【図９】図９は、２−ＡＰＢが小胞体の構造に与える影響を示す図であり、ＤＭＳＯの投与下（上側のパネル）、又は２−ＡＰＢの投与下（下側のパネル）で３０時間培養した熱帯熱マラリア原虫の核及び小胞体がHoechst 33342 (青色)及びER-Tracker (赤)で同時に染色されたものを示し、右側にはHoechst 33342 (青色)及びER-Tracker (赤)による染色結果の両方を併合した図(Merge)を示す。
【図１０】図１０は、赤血球内に寄生したマラリア原虫のクロロキン耐性株に関し、２４時間にわたり同調培養を行い、１００μＭのＤＭＳＯを添加した群と、１００μＭの２−ＡＰＢを添加した群との間で、マラリア原虫細胞の面積、周囲長、及び最大直径を観察した結果を示す。エラーバーは平均+ S.D.(ｎ＝５０)を示し、各パネルにP値を示す(two-tailed unpaired t 検定)。
【図１１】図１１は、DMSOコントロール培養中におけるマラリア原虫を電子顕微鏡で観察した様子を示す図であり、（ａ）はアッセイ開始後３０時間のものを(オリジナル倍率, ×３０，０００)、（ｂ）は、（ａ）中でアステリスクで示した部位をより高倍率で示すものを(オリジナル倍率，×８０，０００)、（ｃ）は、アッセイ開始後３０時間のものを(オリジナル倍率，×２０，０００)、（ｄ）は、（ｃ）中でアステリスクで示した部位をより高倍率で示すものを(オリジナル倍率，×８０，０００)示し、Nは核を示し、NEは核膜（nuclear envelope）を示し、Riはリボソームを示し、Rhはかん小体（rhoptry）を示す。
【図１２】図１２は、各シゾント中のメロゾイト数に対する２−ＡＰＢの影響を示す図であり、（ａ）は、DMSO(白いボックス)または２−ＡＰＢ(塗りつぶしボックス)の共存下で熱帯熱マラリア原虫を４０時間培養をした場合の、各シゾント（Ｓ）中に形成されたメロゾイト（Ｍ）の数をボックスプロットで示すものである。真ん中に位置する長方形は第一クォンタイル(quantile)から第三クォンタイルまでの範囲に相当し、長方形内のセグメントは中央値（median）を示し、各ボックスの上下のひげは最小値と最大値とを示す。（ｂ）は（ａ）のデータをヒストグラムで表した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００２０】
〔１．マラリアの治療方法〕
（治療方法の概要）
本発明にかかるマラリアの治療方法は、マラリア原虫の細胞内小器官内から細胞内小器官外へのカルシウムイオンの搬出、及び／又は、マラリア原虫の細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの搬入、を抑制する薬剤（以下「Ｃａ輸送抑制剤」と総称する）を、ヒト又は動物に対して、治療有効量投与する工程を含む方法である。
【００２１】
本発明の治療方法は、従来のマラリア治療薬とは全く異なるメカニズムを利用した新規な治療方法である。そのため、キニーネ又はクロロキン等、従来のマラリア治療薬では薬剤耐性が生じたマラリア原虫による感染の治療にも有効である。また、有効成分として用いられるＣａ輸送抑制剤は、合成が容易な化合物からも選択可能であり、その場合は、安価かつ大量な供給も可能である。さらに、当該Ｃａ輸送抑制剤は、治療対象となるヒト又は動物に対する副作用が比較的弱いものからも適宜選択可能であるという利点を有する。
【００２２】
マラリア原虫において、上記カルシウムイオンの能動的な搬出又は搬入は、主に、カルシウムイオンチャネル型受容体と総称される受容体群により行われると推定される。本発明者らは、後述する実施例に示すように、ヒトメラトニン受容体の阻害剤、ヒトイノシトール三リン酸受容体の阻害剤、及び、イノシトール三リン酸（イノシトール１,４,５−三リン酸）と特異的な結合活性を有する化合物、を夫々別々にマラリア原虫に投与することによって、何れの場合もマラリア原虫が死滅したという事実に基づき本発明をなすに至っている。これら三種類の阻害剤等は、ヒトにおいて、イノシトール三リン酸受容体を介した一連のシグナル伝達系を阻害し、細胞におけるカルシウムイオンの放出又は流入を制御する。また、上記薬剤においては、マラリア原虫の輪状体及び／又はトロホゾイトにおける、細胞内小器官内から細胞内小器官外へのカルシウムイオンの搬出、及び／又は、マラリア原虫の細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの搬入を特に阻害するものであることが好ましいことを見出した。よって、マラリア原虫も、ヒトと同様のシグナル伝達系を備えることが示唆される。
【００２３】
とりわけ、ヒトイノシトール三リン酸受容体の阻害剤等又はイノシトール三リン酸と特異的な結合活性を有するペプチド等の化合物を用いて、マラリア原虫をイノシトール三リン酸が欠乏した状態においた場合に、マラリア原虫が死滅したという事実は、マラリア原虫においてイノシトール三リン酸の受容体が存在するという事実を示唆する。なお、マラリア原虫のゲノム配列中には、ヒトイノシトール三リン酸受容体と相同性を示す配列はこれまで知られていない。
【００２４】
なお、ヒトにおいて、イノシトール三リン酸受容体は、細胞小器官である小胞体のみならず、核及び細胞膜にも存在して、細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの能動的な搬入、或いは、細胞内小器官内から細胞内小器官外へのカルシウムイオンの能動的な搬出に寄与することが知られている。この中で、とりわけ本発明にとって重要性の高い機能は、細胞内小器官である小胞体内から小胞体外（細胞質）へのカルシウムイオンの搬出であり、また、マラリア原虫の輪状体及び／又はトロホゾイトにおける、細胞内小器官内から細胞内小器官外へのカルシウムイオンの搬出を特に阻害するものであることが好ましい。
【００２５】
（マラリアの治療とは）
本発明において治療の対象となるマラリアは、Plasmodium属マラリア原虫がヒト又は動物に感染している状態を広く指し、ヒト又は動物において、マラリアに特有の症状が顕在化している状態はもちろん、当該症状が顕在化する以前の状態も含む概念である。なお、マラリアに特有の症状とは、特に限定されないが、頭痛、倦怠感、貧血、脾腫、ならびに、亜寒期、灼熱期及び発汗期を伴う発熱発作等の症状が挙げられる。
【００２６】
本発明において治療とは、何らの措置をしない場合と比較して、ヒト又は動物内におけるマラリア原虫の活動を抑制することを指し、好ましくはマラリア原虫を死滅させることを指す。治療の一つの側面には、マラリアに関連する少なくとも１つの症状を軽減又は緩和すること、例えば、頭痛、倦怠感、貧血、脾腫、ならびに亜寒期、灼熱期及び発汗期を伴う発熱発作の軽減又は緩和することが含まれる。
【００２７】
（治療対象となるヒト又は動物）
治療対象は、マラリア原虫の宿主となっているヒト又は動物であり、より具体的には、マラリア原虫が寄生可能なことが知られた爬虫類、鳥類、及びヒトを含む哺乳類からなる群より選択される何れかである。中でも、哺乳類に対して特に好適に本発明の治療方法が適用される。治療対象となる哺乳類の種類は特に限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒトを除く霊長類等の実験動物；イヌ、ネコ等の愛玩動物（ペット）；ウシ、ウマ等の家畜；ヒト；が挙げられ、特に好ましくはヒトである。
【００２８】
ヒト又は動物に対する、マラリア原虫の感染ルートは特に限定されず、例えば、ハマダラカ属の蚊に刺された伝染、マラリア原虫を含む血液（感染血）を輸血、胎盤経由の母子感染、及び注射針を介した感染、等が挙げられる。
【００２９】
（マラリア原虫の種類、生育段階）
治療及び殺虫の対象となるマラリア原虫の種類は、上記ヒト又は動物に寄生可能なマラリア原虫であれば特に限定されない。ヒトに感染可能なマラリア原虫として、例えば、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、卵型マラリア原虫（P. ovale）、及びP. knowlesiの５種が代表的なものとして挙げられる。また、P. cynomolgiなど、サルマラリア原虫として知られるマラリア原虫についても、将来的にヒトへの感染が報告される可能性が高いものとして重要である。
【００３０】
治療及び殺虫の対象となるマラリア原虫の成育段階は特に限定されるものではない。しかし、治療及び殺虫効果を最大化するためには、生育ステージが輪状体から初期のシゾントの間である、赤血球内にいるマラリア原虫を対象として、治療及び殺虫を行うことが好ましい場合がある。また、生育ステージが輪状体からトロホゾイトの間である、赤血球内にいるマラリア原虫を対象として、治療及び殺虫を行うことがより好ましい場合があり、生育ステージが初期の輪状体又はトロホゾイトであるマラリア原虫を対象とすることが特に好ましい場合があり、生育ステージがトロホゾイトであるマラリア原虫を対象とすることが最も好ましい場合がある。
【００３１】
（有効成分としてのＣａ輸送抑制剤）
本発明にかかるマラリアの治療方法では、Ｃａ輸送抑制剤を、マラリア治療の有効成分として使用する。ここで、Ｃａ輸送抑制剤は、マラリア原虫の細胞内小器官内から細胞内小器官外へのカルシウムイオンの搬出、及び／又は、マラリア原虫の細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの搬入、を抑制する機能を有する化合物であれば特に限定されずに使用可能である。Ｃａ輸送抑制剤は、好ましくは、マラリア原虫の細胞内小器官内から細胞内小器官外へのカルシウムイオンの能動的な搬出を抑制する機能を有する化合物から選択され、さらに好ましくは、上記抑制剤は、マラリア原虫の輪状体及び／又はトロホゾイトにおける、細胞内小器官内から細胞内小器官外へのカルシウムイオンの搬出を特に阻害するものである。ここで、細胞内小器官とは、例えば、マラリア原虫の小胞体が意図される。
【００３２】
マラリア原虫の細胞内小器官内から細胞内小器官外へのカルシウムイオンの能動的な搬出を抑制する機能を有する化合物としては、例えば、（１）メラトニンに対する阻害剤、マラリア原虫におけるメラトニンのホモログに対する阻害剤、メラトニン受容体に対する阻害剤、又は、マラリア原虫におけるメラトニン受容体のホモログに対する阻害剤、（２）イノシトール三リン酸受容体に対する阻害剤、又はマラリア原虫におけるイノシトール三リン酸受容体のホモログに対する阻害剤、或いは、（３）イノシトール三リン酸と特異的な結合活性を有する化合物、ペプチド、又は当該ペプチドをコードする核酸が挙げられる。これら、（１）〜（３）に挙げる阻害剤等は何れも、イノシトール三リン酸誘導型のカルシウム搬出（放出）を抑制する作用を有する。
【００３３】
ここで、イノシトール三リン酸誘導型のカルシウム搬出とは、生体において、メラトニン又はそのホモログがイノシトール三リン酸の産生を誘導し、次いで、イノシトール三リン酸がトリガーとなりカルシウムイオン（２価）の搬出が誘導されるという生理的な現象を指す。イノシトール三リン酸は、一般的には、カルシウムイオンチャネル型受容体として機能するイノシトール三リン酸受容体又はそのホモログに結合することで、カルシウムイオンの搬出を誘導する。
【００３４】
上記メラトニンに対する阻害剤、マラリア原虫におけるメラトニンのホモログに対する阻害剤、メラトニン受容体に対する阻害剤、又は、マラリア原虫におけるメラトニン受容体のホモログに対する阻害剤は、何れも、メラトニン又はそのホモログが、対応する受容体（メラトニン受容体又はメラトニン受容体のホモログ）に結合することを妨げて、下流側へのシグナル伝達を遮断又は抑制するものであれば特に限定されない。
【００３５】
メラトニン受容体に対する阻害剤、又はマラリア原虫におけるメラトニン受容体のホモログに対する阻害剤の具体例は特に限定されないが、例えば、ヒトメラトニン受容体のモジュレーター又はアンタゴニスト等、或いは、メラトニンと構造が類似した生理活性物質であるセロトニンアゴニスト、セロトニンアンタゴニスト等が挙げられ、中でも、ルジンドール、4P-ADOT、4P-PDOT、等が好適なものとして挙げられる。
【００３６】
メラトニンに対する阻害剤、又はマラリア原虫におけるメラトニンのホモログに対する阻害剤の具体例は特に限定されないが、例えば、メラトニン又はそのホモログと特異的な結合活性を有する化合物、ペプチド、又は当該ペプチドをコードする核酸等が挙げられる。ここで、メラトニン又はそのホモログと特異的な結合活性を有するペプチドの一例は、メラトニン受容体又はそのホモログが有する、メラトニン（又はそのホモログ）結合ドメインを構成するペプチドである。
【００３７】
なお、ここで、単にメラトニン又はメラトニン受容体と称する場合、由来する動物種（ヒトを含む）は、マラリア原虫を除く全ての動物種が意図され、特に治療対象となるヒト又は動物が意図される。また、ここで、メラトニンのホモログ、又はメラトニン受容体のホモログとは、マラリア原虫由来のものが意図される。
【００３８】
上記イノシトール三リン酸受容体に対する阻害剤、又はマラリア原虫におけるイノシトール三リン酸受容体のホモログに対する阻害剤の具体例は特に限定されないが、参照として組み込まれる日本国公開特許公報：特開２００７−１６９２７２に記載の化合物群（ヒトイノシトール三リン酸受容体のモジュレーター、アンタゴニスト）が挙げられる。中でも、ジフェニルボリン酸２−アミノエチル（２−ＡＰＢ）、ヘパリン（heparin）、ゼストスポンジンＣ（Xestospongin C）等がより好ましい。これらの阻害剤は、何れも、イノシトール三リン酸が、対応する受容体（イノシトール三リン酸受容体又はそのホモログ）に結合することを妨げて、下流側へのシグナル伝達を遮断又は抑制するものである。
【００３９】
イノシトール三リン酸と特異的な結合活性を有する化合物、ペプチド、及び当該ペプチドをコードする核酸の具体例は特に限定されないが、参照として組み込まれる米国特許６４６５２１１及び７０４１４４０（対応日本特許出願：特開２０００−１３５０９５参照）に記載のイノシトール三リン酸高親和性ポリペプチド、及び当該ペプチドをコードする核酸が挙げられる。中でも、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるペプチド、及び当該ペプチドをコードする配列番号２で示す塩基配列をもつ核酸を含むものがより好ましい。また、当該ペプチドは、イノシトール三リン酸と特異的な結合活性を有するという機能が損われない限り、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるペプチドに対して８０％以上、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の配列相同性を有するペプチドであっても良い。また、当業者であれば、上記ペプチドをコードする塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされるペプチドを適宜使用することもできる。なお、ストリンジェントな条件下とは、例えば60℃、１×SSC、0.1% SDS、好ましくは0.1×SSC、0.1% SDS、に相当する塩濃度で、1回好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。これらの化合物又はペプチドは、何れも、イノシトール三リン酸が、対応する受容体（イノシトール三リン酸受容体又はそのホモログ）に結合することを妨げて、下流側へのシグナル伝達を遮断又は抑制するものである。
【００４０】
なお、上記ペプチドは、例えば、Ｎ末端側にGST tagを付与して哺乳類細胞内での発現をより安定化することもできる。配列番号３で示すアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側にリンカー配列とGST tagとを付与した配列に相当する。また、配列番号４で示す塩基配列をもつ核酸は、配列番号３で示すアミノ酸配列からなるペプチドをコードするものである。
【００４１】
なお、ここで、単にイノシトール三リン酸受容体と称する場合、由来する動物種（ヒトを含む）は、マラリア原虫を除く全ての動物種が意図され、特に治療対象となるヒト又は動物が意図される。また、ここで、イノシトール三リン酸受容体のホモログとは、マラリア原虫由来のものが意図される。
【００４２】
なお、より直接的かつ効果的な治療効果を得るという観点では、メラトニン及びイノシトール三リン酸が関わるシグナル伝達系のより下流側において、シグナル伝達を遮断又は抑制することが好ましい場合がある。すなわち、イノシトール三リン酸受容体に対する阻害剤、又はマラリア原虫におけるイノシトール三リン酸受容体のホモログに対する阻害剤がより好ましい場合がある。
【００４３】
また、治療対象となるヒト又は動物へ実質的に影響を及ぼさないという観点では、Ｃａ輸送抑制剤は、マラリア原虫におけるメラトニンのホモログに特異的に作用する阻害剤、マラリア原虫におけるメラトニン受容体のホモログに特異的に作用する阻害剤、又は、マラリア原虫におけるイノシトール三リン酸受容体のホモログに特異的に作用する阻害剤、から選択されることが好ましい場合がある。ただし、メラトニン及びイノシトール三リン酸が関わるシグナル伝達系を一時的に遮断又は抑制しても、ヒト又は動物に致命的な影響を与えることはない。
【００４４】
（投与方法・用量）
本発明にかかるマラリアの治療方法は、上記Ｃａ輸送抑制剤の少なくとも一種を、マラリア原虫が感染しているヒト又は動物に対して、治療有効量投与する工程を含む。ここで、Ｃａ輸送抑制剤は、当該剤のみを単独で投与してもよく、又は、投与の目的に適した薬学的組成物の一構成成分として投与してもよい。
【００４５】
上記Ｃａ輸送抑制剤の投与方法は特に限定されず、経口投与、静脈内又は動脈内への血管内投与、腸内投与といった手法により全身投与されてもよく、経皮投与、舌下投与といった手法により局所投与されてもよい。好ましい一つの投与態様では、血管系（赤血球内）に棲息するマラリア原虫に作用を及ぼすために、Ｃａ輸送抑制剤は、静脈内投与又は動脈内投与によって全身投与される。好ましい他の投与態様では、投与の容易さ等の観点で優れるため、経口投与される。
【００４６】
上記Ｃａ輸送抑制剤の投与量（治療有効量）は、投与対象となる上記ヒト又は動物の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数等に応じて適宜設定すればよい。また、必要であれば、Ｃａ輸送抑制剤を用いたインビボアッセイを事前に行い、過度の実験を要することなく上記投与量を決定することができる。
【００４７】
例えば、上記Ｃａ輸送抑制剤がいわゆる低分子化合物である場合、上記投与量の好ましい一例は、ヒト又は動物のキログラム体重あたり、０．５ｍｇ以上で２０ｍｇ以下の範囲内であり、０．５ｍｇ以上で１０ｍｇ以下の範囲内であり、１ｍｇ以上で５ｍｇ以下の範囲内である。
【００４８】
上記Ｃａ輸送抑制剤の投与回数も治療効果が得られる限り特に限定されず、例えば、Ｃａ輸送抑制剤の種類、上記投与量、投与経路、症状、ヒト又は動物の年齢や性別に応じて適宜設定すればよい。
【００４９】
上記Ｃａ輸送抑制剤の投与タイミングも、治療効果が得られる限り特に限定されないが、治療効果を最大化するために、マラリア原虫の生育ステージに応じて決定することが好ましい場合がある。より具体的には、上記マラリア原虫がヒト又は動物の赤血球内に存在し、かつその生育ステージが輪状体から初期のシゾントの間に、Ｃａ輸送抑制剤の血中濃度が治療有効量となるように、上記薬剤の投与タイミングが決定されることがより好ましい場合がある。さらに好ましくは、マラリア原虫の生育ステージが輪状体からトロホゾイトの間に、Ｃａ輸送抑制剤の血中濃度が治療有効量となるタイミングで投与され、特に好ましくは、マラリア原虫の生育ステージが初期の輪状体又はトロホゾイトの間に、Ｃａ輸送抑制剤の血中濃度が治療有効量となるタイミングで投与され、最も好ましくは生育ステージがトロホゾイトの間にＣａ輸送抑制剤の血中濃度が治療有効量となるタイミングで投与される。
【００５０】
なお、ヒト又は動物に対して、マラリア原虫の感染前のタイミングでＣａ輸送抑制剤が投与される、いわゆる予防投与のような投与形態も、本発明の治療方法の範疇に含まれる。すなわち、ヒト又は動物にマラリア原虫が感染する前に、Ｃａ輸送抑制剤の血中濃度が治療有効量以上に保たれた状態にし、マラリア原虫が感染した際に治療効果を奏するという態様である。
【００５１】
また、薬剤の投与と同時に、又は先立って、ヒト又は動物の体内に寄生したマラリア原虫の生育ステージを同調させてもよい。生育ステージの同調は、例えば、ヒト又は動物の体内にメラトニンを投与する等の方法で行いうる。
【００５２】
なお、ヒト又は動物におけるマラリア原虫の生育ステージは、当業者であれば容易に把握することができる。当該生育ステージを把握する方法の一例は、赤血球の薄層塗抹を調製して、ギムザ染色法等の方法で染色した後に、マラリア原虫を顕微鏡観察する方法が挙げられる。マラリア原虫の生育に周期性が見られる場合には、一度、生育ステージを確認しておけば、所定時間経過後の生育ステージも予見可能となる。
【００５３】
また、必要に応じてインビボアッセイ等を行うことにより、ヒト又は動物におけるＣａ輸送抑制剤の血中濃度、より具体的には、Ｃａ輸送抑制剤の投与量、投与タイミング及びその血中濃度の関係も、当業者であれば容易に把握することができる。
【００５４】
（併用療法）
本発明に係るマラリアの治療方法は、キニーネ、クロロキン、メフロキン、アルテミシニン誘導体等の、本発明に係る以外のマラリア治療方法と組合せてもよい（併用療法）。本発明に係るマラリアの治療方法は、従来のマラリア治療薬とは異なるメカニズムを利用した新規な治療方法である。それゆえ、本併用療法を採用すれば、従来治療法との間で相乗的な治療効果を示し、治療成績が飛躍的に向上することが期待される。また、アルテミシニン誘導体と組合せることにより、マラリア原虫の耐性獲得を遅らせることができるという効果も期待される。
【００５５】
〔２．マラリアの殺虫方法〕
本発明に係るマラリア原虫の殺虫方法は、上記Ｃａ輸送抑制剤を、マラリア原虫に対して、「有効量」供給する工程を含む方法である。
【００５６】
ここで、「有効量」とは、マラリア原虫を死滅させることが出来る量を意図しており、上記薬剤が投与されるマラリア原虫の棲息環境等の条件に応じて、当業者により適宜設定される。
【００５７】
マラリア原虫の殺虫方法の応用例としては、マラリア原虫の感染が判明した又は感染の虞がある血液に対して上記Ｃａ輸送抑制剤を供給することで、マラリアへの二次感染リスクを抑制することが挙げられる。例えば、上記の血液とは、特に限定されないが、献血活動において回収した血液、輸血用血液、野外活動（交通事故等を含む）における流血、医療現場における流血等、ヒト又は動物の体外に取り出された血液も意図した概念である。
【００５８】
なお、マラリア原虫の殺虫効果を確認する方法の一例は、赤血球の薄層塗抹を調製して、ギムザ染色法等の方法で染色した後に、マラリア原虫を顕微鏡観察する方法が挙げられる。
【００５９】
その他、本殺虫方法が適用される、マラリア原虫の種類、生育段階等については、上記した〔１．マラリアの治療方法〕の欄の記載を、そのまま参照可能である。
【００６０】
〔３．マラリアの治療薬〕
本発明に係るマラリアの治療薬は、上記Ｃａ輸送抑制剤を含むものである。
【００６１】
マラリアの治療薬は、上記Ｃａ輸送抑制剤のみから構成されるものでもよく、又は、上記Ｃａ輸送抑制剤を一構成成分として含む薬学的組成物として構成されるものであってもよい。
【００６２】
上記薬学的組成物を構成するＣａ輸送抑制剤以外の成分は特に限定されず、例えば、薬学的に許容される担体、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧調整用の塩類、緩衝剤、着色剤、香味料、甘味料、抗酸化剤、粘度調整剤、等と混合することができる。また、必要に応じて、キニーネ、クロロキン、メフロキン、アルテミシニン誘導体等のマラリア治療薬を、上記薬学的組成物の一構成として加えて複合剤を構成してもよい。
【００６３】
上記薬学的に許容される担体は、特に限定されないが、担体であって、Ｃａ輸送抑制剤と同時投与された場合にＣａ輸送抑制剤の機能（マラリアの治療）を阻害せず、かつ、治療薬の投与対象となるヒト又は動物に対して実質的な悪影響を及ぼさないという性質を備えることが好ましい。
【００６４】
上記担体としては、この分野で従来公知のものを広く使用でき、具体的には、例えば、水、各種塩溶液、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、パラフィン、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリド、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられるが、特にこれらに限定されない。担体の種類は、薬学的組成物の剤型、薬学的組成物の投与方法、等に応じて、適宜選択すればよい。
【００６５】
上記薬学的組成物の剤型も特に限定されず、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤等が挙げられ、好ましくは注射剤、又は経口投与用の剤型である。例えば、携帯性及び投与の容易さ等の観点では、錠剤等の経口投与の剤型が好ましく、所定のタイミングでＣａ輸送抑制剤の血中濃度を所定の範囲内に制御することがより容易という観点では注射剤が好ましい。
【００６６】
また、本発明におけるマラリアの治療薬は、遺伝子治療剤でありえる。より具体的には、例えば、１）イノシトール三リン酸と特異的な結合活性を有するペプチドをコードする核酸、又は、２）メラトニン又はそのホモログと特異的な結合活性を有するペプチドをコードする核酸、の少なくとも一方を治療有効成分として含むものが挙げられる。
【００６７】
上記遺伝子治療剤は、上記治療有効成分たる核酸を、注射によりヒト又は動物に直接投与する形態のものであってもよく、或いは、上記治療有効成分たる核酸が組み込まれたベクターを、注射によりヒト又は動物に直接投与する形態のものであってもよい。また、上記ベクターは、特に限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター等、遺伝子治療に適用可能なベクターが挙げられる。なお、上記遺伝子治療剤はリポソーム製剤であってもよい。
【００６８】
上記遺伝子治療剤を構成する上記ベクターには、上記ペプチドをコードする核酸をマラリア原虫に特異的に発現させる発現調節配列が組み込まれていることが好ましい。ここで、発現調節配列とは、例えば、プロモータ又はエンハンサであり、より具体的には、マラリア由来のカルモジュリンのプロモータ配列、及びヒートショックタンパク質８６（ＨＳＰ８６）のプロモータ配列、等が挙げられる。
【００６９】
なお、「核酸をマラリア原虫に特異的に発現させる」とは、治療対象となるヒト又は動物では当該核酸が実質的に発現せず、マラリア原虫内でのみ当該核酸が発現する状態を指し、これによりマラリア原虫に選択的に遺伝子治療剤の効果を及ぼすことができる。
【００７０】
その他、本発明の治療剤に関しては、上記した〔１．マラリアの治療方法〕の欄の記載を、そのまま参照可能である。
【００７１】
〔４．マラリアの治療薬候補のスクリーニング方法〕
本発明に係るマラリアの治療薬候補のスクリーニング方法（１）は、イン・ビトロでマラリア原虫を同調培養し、当該マラリア原虫の生育ステージが輪状体の段階から初期のシゾント段階の間において、スクリーニング対象となる薬剤を添加する第一工程と、次いで、上記薬剤の添加により、上記マラリア原虫の生育が抑制された、又はマラリア原虫が死滅した場合に、当該薬剤をマラリアの治療薬候補として選択する第二工程と、を含む方法である。
【００７２】
なお、スクリーニング対象となる薬剤を添加する第一工程は、マラリア原虫の生育ステージが輪状体の段階からトロホゾイトの段階の間に行うことが好ましく、初期の輪状体の段階又はトロホゾイトの段階に行うことがより好ましく、トロホゾイトの段階に行うことが特に好ましい。
【００７３】
上記方法（１）は、「マラリア原虫が、輪状体の段階から初期のシゾント段階にある場合に、メラトニン及びイノシトール三リン酸の双方が関与するカルシウム振動を抑制可能な剤を投与すれば、マラリア原虫が死滅する」との知見に基づく方法であり、従来とは異なる作用機序を示す治療薬候補のスクリーニングを可能とする。
【００７４】
なお、上記第一工程における同調培養の方法、及びマラリア原虫の生育ステージを確認する方法は特に限定されず、例えば、後述する実施例に記載の方法を採用すればよい。
【００７５】
また、本発明に係るマラリアの治療薬候補のスクリーニング方法（２）は、イン・ビトロで培養しているマラリア原虫に対して、スクリーニング対象となる薬剤を添加する第一工程と、次いで、マラリア原虫の細胞内小器官内から細胞内小器官外へのカルシウムイオンの搬出量、及び／又は、マラリア原虫の細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの搬入量を測定する第二工程と、次いで、上記薬剤の添加により、カルシウムイオンの上記搬出量、及び／又は、搬入量が減少した場合に、当該薬剤をマラリアの治療薬候補として選択する第三工程と、を含む方法である。
【００７６】
上記方法（２）は、「メラトニン及びイノシトール三リン酸の双方が関与するカルシウム振動を抑制可能な剤を投与すれば、マラリア原虫が死滅する」との知見に基づく方法であり、従来とは異なる作用機序を示す治療薬候補のスクリーニングを可能とする。
【００７７】
なお、上記第二工程におけるカルシウムイオンの搬出量及び搬入量の測定の方法は特に限定されず、例えば、後述する実施例に記載の方法を採用すればよい。
【００７８】
上記スクリーニング方法（１）及び（２）は、マラリアの殺虫剤候補のスクリーニング方法と捉えることもできる。
【００７９】
〔５．本発明に係る治療方法に関する諸態様〕
本発明に係る治療方法において、上記薬剤は、上記細胞内小器官としての小胞体内から小胞体外へのカルシウムイオンの搬出を抑制するものであることが好ましい。
【００８０】
本発明に係る治療法において、上記薬剤は、マラリア原虫の輪状体及び／又はトロホゾイトにおける、細胞内小器官内から細胞内小器官外へのカルシウムイオンの搬出、及び／又は、マラリア原虫の細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの搬入を阻害するものであることが好ましい。
【００８１】
本発明に係る治療方法において、上記薬剤が、メラトニンに対する阻害剤、マラリア原虫におけるメラトニンのホモログに対する阻害剤、メラトニン受容体に対する阻害剤、又は、マラリア原虫におけるメラトニン受容体のホモログに対する阻害剤を含んでいることが好ましい。
【００８２】
本発明に係る治療方法において、上記薬剤が、イノシトール三リン酸受容体に対する阻害剤、又はマラリア原虫におけるイノシトール三リン酸受容体のホモログに対する阻害剤を含んでいることが好ましい。
【００８３】
本発明に係る治療方法において、上記薬剤が、イノシトール三リン酸と特異的な結合活性を有する化合物、ペプチド、又は当該ペプチドをコードする核酸を含んでいることが好ましい。また、上記薬剤が、配列番号１に示すペプチドを上記ペプチドとして含んでいることがより好ましい。また、上記薬剤は、イノシトール三リン酸と特異的な結合活性を有するという機能が損われない限り配列番号１に示すペプチドに対して８０％以上、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の配列相同性を有するペプチドを含むものであっても良い。また、当業者であれば、上記薬剤に含まれるペプチドとして、上記ペプチドをコードする塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列にコードされるペプチドを適宜使用することもできる。なお、ストリンジェントな条件下とは、例えば60℃、１×SSC、0.1% SDS、好ましくは0.1×SSC、0.1% SDS、に相当する塩濃度で、1回好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。また、上記薬剤が、上記ペプチドをコードする核酸と、当該核酸に連結され当該核酸をマラリア原虫に特異的に発現させる発現調節配列と、を含むベクターからなることがさらに好ましい。
【００８４】
本発明に係る治療方法において、上記薬剤の投与タイミングが、上記ヒト又は動物におけるマラリア原虫の生育ステージに応じて決定されることが好ましい。また、上記ヒト又は動物におけるマラリア原虫の生育ステージが輪状体の段階から初期のシゾント段階の間に、当該薬剤の血中濃度が治療有効量となるように、上記薬剤の投与タイミングが決定されることがより好ましく、さらに好ましくは輪状体の段階からトロホゾイトの段階の間に、特に好ましくは初期の輪状体の段階又はトロホゾイトの段階に、最も好ましくはトロホゾイトの段階に、上記薬剤の血中濃度が治療有効量となるように投与タイミングが決定される。
【実施例】
【００８５】
本発明について、以下の実施例等に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。【００８６】
〔材料及び方法〕
初めに、実施例に共通する材料及び方法について、以下に説明する。【００８７】
（１）熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）の培養
Plasmodium falciparum（P. falciparum）のＦＣＲ−３株（参照文献：Hatabu T, Takada T, Taguchi N, Suzuki M, Sato K, Kano S. (2005) Antimicrob Agents Chemother. 2005 Feb;49(2):493-6.）を、Trager and Jensenの方法（参照文献：Trager, W. & Jensen, J. B. (1976) Science 193, 673-675.）に従い、RPMI培地(Invitrogen社/GIBCO社)中で培養した。ＦＣＲ-３株は、媒虫体（メロゾイト）の赤血球侵入から、輪状体（リング型）の形成、栄養体（トロホゾイト）の形成、分裂体（シゾント）の形成、成熟メロゾイトの放出と当該成熟メロゾイトの赤血球侵入までの発育・増殖の１サイクルが約４０時間の株である。なお、培養に際して、RPMI培地には、０．５重量％のAlubumaxI (Invitrogen社)、２５ｍＭのHEPES、２４ｍＭの炭酸水素ナトリウム、０．５ｇ／ＬのＬ-グルタミン、５０ｍｇ／Ｌのヒポキサンチン、２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン(Sigma社), 及び５％ヘマトクリットのヒト赤血球(健常な日本人ボランティアより提供)を添加した。また、５重量％のｄ−ソルビトールを用いてP. falciparumの生育を同調させる同調培養を行った（参照文献：Lambros, C. & Vanderberg, J. P. (1979) J. Parasitol. 65, 418-420.）。【００８８】
（２）P. falciparumの生育阻害アッセイ
初期の赤血球の原虫寄生率（parasitemia）が約１％でかつ輪状体の段階にある熱帯熱マラリア原虫の培養（カルチャー）を対象とし、熱帯熱マラリア原虫の赤血球内での生育に対する２−ＡＰＢ（2-aminoethyl diphenylborinate：ジフェニルボリン酸２−アミノエチル）及びＬＺ(luzindole：ルジンドール)の影響を調べた。【００８９】
まず、組織培養プレート(２４ウェル平底プレート, Corning社)の各ウェル内に、５００μlの上記培養（カルチャー）を注入した。２−ＡＰＢ及びＬＺをそれぞれ１０ｍＭ及び１００ｍＭ濃度となるように、ジメチルスルホキシド(DMSO, HYBRI-MAX（登録商標）, Sigma社)に溶解して、これら化合物のストック溶液を調製した。このストック溶液はRPMI培地で希釈し、所定の最終濃度となるように組織培養プレートの各ウェルに加えた。また、DMSOをPPMI培地で希釈し、所定の最終濃度となるように組織培養プレートのウェルに加え、コントロールとして使用した。そして、各ウェルで、所定の期間、培養を行った。【００９０】
次いで、所定の期間経過後、上記組織培養プレートの各ウェル内に存在する赤血球を含む培養を一滴、スライドガラス上に展開し、ギムザ染色を行った。２０００個の赤血球のうち、熱帯熱マラリア原虫が感染した赤血球の数を計数し、原虫寄生率を決定した。【００９１】
（３）赤血球内に存在するステージでのP. falciparum細胞内の蛍光Ｃａ２＋イメージング、及びデータ解析（実施例１に対応）
感染した赤血球の培養物(赤血球５×１０８ 個／ｍｌ)を０．５ｍｌ採り、当該培養物をＣａ２＋イメージング用のＢＳＡ（−）培地（フェノールレッド(Invitrogen/GIBCO)を含まないRPMI1640培地であって、２５ｍＭのHEPES、２４ｍＭの炭酸水素ナトリウム, ０．５ｇ／ＬのＬ−グルタミン、５０ｍｇ／Ｌのヒポキサンチンを添加したもの）で１０倍希釈した。次いで、当該希釈後の赤血球の培養物１ｍｌを遠心分離(室温下、１，０００ｇ、５分間)にかけて回収し、上記と同成分のＢＳＡ（−）培地３５０μＬ中に再懸濁した（赤血球再懸濁液（１）と称する）。【００９２】
Ｃａ２＋蛍光指示薬（fluo4-AM ）の導入とHoechst 33342による核染色とを行うために、ロード用溶液（Loading Solution）を調製し、fluo4-AM （ＢＳＡ（−）培地中に、０．１ｍｇ／ｍｌのHoechst 33342(Dojindo社)、１００μＭのfluo4-AM (Invitrogen社/Molecular Probes社)、及び１００倍希釈したPowerLoad (Invitrogen社)を含むもの）をロードした。上記赤血球再懸濁液（１）３５０μＬを、このロード用溶液１５０μＬと混合して、３７℃で３０分〜６０分間、２００ｒｐｍで振とうした。【００９３】
次いで、赤血球を一度、１０ｍＬのＢＳＡ（−）培地で洗浄し(室温、１，０００ｇで５分間)、６００μＬのＢＳＡ（＋）培地（上記ＢＡＳ（−）培地に、０．５重量％のAlubumaxI、及び２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン(Sigma社)を添加したもの）に再懸濁した（赤血球再懸濁液（２）と称する）。次いで、１００μＬの赤血球再懸濁液（２）を、０．１ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ−Ｌ−リジンでコートした３５ｍｍ径のガラス底ディッシュ(MatTek Corp.)に接種した。O2, CO2インキュベータ中で３０分間インキュベーションを行った後、懸濁した赤血球は、緩和な条件下、ＢＳＡ（＋）培地で洗浄をした後に、回収した。【００９４】
次いで、上記ガラス底ディッシュを、Ｏ2濃度、ＣＯ2濃度、温度、及び湿度の各条件が、通常、マラリア原虫のイン・ビトロ培養を行う場合と同じ条件（Ｏ2濃度５％、ＣＯ2濃度５％、温度３７℃）に保たれた培養チャンバー中にセットした。【００９５】
ライカ社製の共焦点電子顕微鏡システム(Leica TCS SP5 II, Leica Microsystems社)を用いて、Hoechst 33342, fluo4-AMの連続的なタイムラプスイメージング、及び透過像（transparent image）の取得を実施した。イメージングに用いた対物レンズは、倍率63x (N.A.  1.42) のオイル浸潤対物レンズ（oil immersion objective lens）であり、Hoechst 33342は励起波長４１０ｎｍ（ダイオードレーザ使用）で、fluo4-AMは励起波長４８８ｎｍ(アルゴンレーザ使用)でそれぞれ励起した。透過像の取得、及び励起により生じた発光の取得は、Leica Microsystems社が開発したthe true spectral detection methodを用いて行った。イメージングは、５秒〜１５秒間隔で、３００秒〜６００秒間にわたり実施した。fluo4-AMの蛍光強度は、バックグラウンドの蛍光を差し引き（Ｆ）、イメージング期間における蛍光強度の最小値(Fmin)により標準化（normalized）した。【００９６】
（４）統計学的分析の手法
アッセイ間の差異は、Student’s t-testを用いて評価した。テストで得られたp値が０．０５未満（ｐ＜０．０５）を満たせば統計学的に有意であるとみなした。【００９７】
（５）マラリア原虫のサイズ測定、及び電子顕微鏡による観察
ギムザ染色した塗抹(smear)を、Nikon Eclipse 80i 顕微鏡(Nikon社製)で観察し、Nikon DXM 1200F カメラ（Nikon社製）を用いて写真撮影をし、デジタル写真マネジャーソフトウェア(ACT-1; Nikon社製)を用いてパーソナルコンピュータにアップロードした。熱帯熱マラリア原虫のサイズを測定するため、任意に５０個の熱帯熱マラリア原虫を選択し、スクリーン上にこれら熱帯熱マラリア原虫を含む領域をマニュアルで線引きした。熱帯熱マラリア原虫細胞の占める面積、周囲長、及び最大直径の解析は、WinROOF software package Ver.5.8.1 (Mitani, Japan)を用いて行った。【００９８】
（６）透過型電子顕微鏡による観察
既報（参考文献：Kawai, S., Kano, S., Chang, C. & Suzuki, M. The effects of pyronaridine on the morphology of Plasmodium falciparum in Aotus trivirgatus. Am. J. Trop. Med. Hyg. 55, 223−229 (1996)）に従い、透過型電子顕微鏡による観察を行った。電子顕微鏡観察の対象となる試料は、０．１Mリン酸バッファー（ｐＨ７．４，４°C）でバッファーされた２．５%（Ｖ／Ｖ）グルタルアルデヒド中で約２時間固定した。次いで、１%（w／Ｖ）の四酸化オスミウム（osmium tetroxide）で１時間、当該試料を後固定した。固定された試料は、エタノール濃度の上昇系を用いて脱水を行い、次いで、プロピレンオキシドで１５分間処理をし、Epon 812樹脂に包埋した。得られたEpon 812樹脂のブロックから、ダイヤモンドナイフ(Diatome)を備えたウルトラミクロトーム(Porter-Blim MT-2; Ivan Sorvall)を用いて切片を切り出した。得られた切片は、２００−メッシュの銅グリッド上にマウントし、酢酸ウラニル（uranyl acetate）及びクエン酸鉛（lead citrate）で染色し、JEOL JEM-1011透過型電子顕微鏡で観察した。【００９９】
（７）核及び小胞体の染色
熱帯熱マラリア原虫の核及び小胞体は、Hoechst 33342及びER-Tracker Red (Invitrogen)で染色した。Hoechst 33342を用いた染色は、蛍光 Ca2+ イメージングの目的で、上記した通りに行われた。ER-Tracker Redは、最終濃度が０．５μＭとなるように赤血球の懸濁液に添加され、３７°Ｃ、２００ｒｐｍの条件で３０分間振とうした。【０１００】
〔実施例１〕
（１）熱帯熱マラリア原虫の内生的なＣａ２＋振動と、２−ＡＰＢによるＣａ２＋振動の阻害
上記Ｃａ２＋振動の観察結果、及びＣａ２＋振動の阻害実験の結果を図１及び図２にまとめて示す。【０１０１】
図１中の（ｂ）及び（ｆ）はそれぞれ、コントロールとして１００μＭのDMSOを初期の輪状体（ＥＲ）の段階、及びトロホゾイト（Ｔ）の段階で添加して熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）の培養を行い、その細胞質でのＣａ２＋の動態を、蛍光Ｃａ２＋イメージングにより観察した結果を示すグラフである。【０１０２】
また、図１中の（ｃ）及び（ｇ）はそれぞれ、１００μＭの２−ＡＰＢを初期の輪状体（ＥＲ）の段階、及びトロホゾイト（Ｔ）の段階で添加して熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）の培養を行い、その細胞質でのＣａ２＋の動態を、蛍光Ｃａ２＋イメージングにより観察した結果を示すグラフである。ここで、２−ＡＰＢ（ジフェニルボリン酸２−アミノエチル）は、本願発明者らにより開発され、イノシトール１,４,５−三リン酸受容体型のＣａ２＋チャネルの阻害剤として確立されたものである。【０１０３】
また、図１中の（ｄ）、（ｈ）、（ｊ）はそれぞれ、コントロールとして１００μＭのDMSOを後期の輪状体（ＬＲ）の段階、シゾント（Ｓ）の段階、及びメロゾイト（Ｍ）の段階で添加して熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）の培養を行い、その細胞質でのＣａ２＋の動態を、蛍光Ｃａ２＋イメージングにより観察した結果を示すグラフである。【０１０４】
また、図１中の（ｅ）、（ｉ）、（ｋ）はそれぞれ、１００μＭの２−ＡＰＢを後期の輪状体（ＬＲ）の段階、シゾント（Ｓ）の段階、及びメロゾイト（Ｍ）の段階で添加して熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）の培養を行い、その細胞質でのＣａ２＋の動態を、蛍光Ｃａ２＋イメージングにより観察した結果を示すグラフである。【０１０５】
なお、図１中の（ｂ）〜（ｋ）で、異なる態様で標記されたドットは、別々のマラリア原虫での結果を示す。また、図１中の（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）、（ｈ）、（ｊ）において、矢頭は、赤血球中のＥＲ（初期の輪状体）、ＬＲ（後期の輪状体）、Ｔ（トロホゾイト）、Ｓ（シゾント）、及びＭ（メロゾイト）のイメージング時の像をそれぞれ示し、スケールバーは５μｍである。【０１０６】
図１中の（ｂ）及び（ｆ）に示すように、初期の輪状体の段階、及びトロホゾイトの段階にあるコントロールは何れも、内生的なＣａ２＋の振動を示した。また、Ｃａ２＋の振動周期は、初期の輪状体の方が、トロホゾイトと比較してより高周期であった。なお、初期の輪状体とは、細胞サイズがトロホゾイトより小さく、かつヘモゾイン（hemozoine）が細胞質に形成された単核の状態にあるマラリア原虫を指し、トロホゾイトとは単核のマラリア原虫を指す。【０１０７】
対照的に、図１中の（ｃ）及び（ｇ）に示すように、１００μＭの２−ＡＰＢでマラリア原虫を処理することにより、コントロールで見られた上記Ｃａ２＋の振動がほぼ完全に阻害された。【０１０８】
一方、図１中の（ｄ）、（ｈ）、（ｊ）に示すように、熱帯熱マラリア原虫が、後期の輪状体の段階（ＬＲ）、シゾントの段階（Ｓ）、メロゾイトの段階（Ｍ）にある場合は、観察されるＣａ２＋の振動は相対的に非常に小さく、１００μＭの２−ＡＰＢで処理しても特段の効果は生じなかった（図１中の（ｅ）、（ｉ）、（ｋ）参照）。なお、後期の輪状体とは、細胞サイズが初期の輪状体とトロホゾイトとの間の大きさであり、かつヘモゾイン（hemozoine）を有しないものを指す。【０１０９】
次に、観察されるＣａ２＋の振動が非常に小さかった、後期の輪状体の段階（ＬＲ）、シゾントの段階（Ｓ）、及びメロゾイトの段階（Ｍ）におけるＣａ２＋の周期的な変動の振幅の大きさに２−ＡＰＢが与える影響に関し、量的な解析を行った。Ｆ／Ｆｍinの最大値の平均値から、Ｆ／Ｆｍinの最小値の平均値を差し引くことで、平均振幅を計算した。その結果、メロゾイトの段階のみで、統計学的に有意な２−ＡＰＢの効果が観察された（図１中の（ｌ）参照）。【０１１０】
（２）Ｕ７３１２２、Ｔｇ、及びＣＭＡを用いた確認実験
図１に結果を示すように、初期の輪状体及びトロホゾイトにおいて、２−ＡＰＢの添加により、内生的なＣａ２＋の振動が阻害された。この事実は、当該Ｃａ２＋の振動が、イノシトール三リン酸の結合により活性化される、イノシトール三リン酸受容体型のＣａ２＋チャネルにより制御されていることを示唆している。【０１１１】
そこで、上記の示唆を確認するために、まず、ホスホリパーゼＣの阻害剤として汎用されるＵ７３１２２を用いた確認実験を行った。なお、マラリア原虫では、ホスホリパーゼＣのシグナル伝達経路が、マラリア原虫内のＣａ２＋貯蔵体からのＣａ２＋の放出に関与していることが示唆されている（参考文献：Hotta, C.T., Markus, R.P. & Garcia, C.R. Braz J Med Biol Res 36, 1583-1587 (2003).）。【０１１２】
図２中の（ａ）及び（ｂ）はそれぞれ、初期の輪状体（ＥＲ）及びトロホゾイト（Ｔ）の段階にある熱帯熱マラリア原虫を、１０μＭのＵ７３１２２で、５分間、前処理した後に、当該マラリア原虫の蛍光Ｃａ２＋イメージングを行った結果を示すグラフである。同図に示すように、当該前処理を行った結果、初期の輪状体（ＥＲ）及びトロホゾイト（Ｔ）の双方で、Ｃａ２＋の振動がほぼ完全に消失した。【０１１３】
さらに、Ｃａ２＋の振動に関わるＣａ２＋の供給源を特定するため、蛍光Ｃａ２＋イメージングを行う前に、タプシガルギン(Ｔｇ)又はコンカナマイシンＡ（ＣＭＡ）を用いてＣａ２＋を人為的に放出させる前処理を行った。具体的には、以下の通りである。【０１１４】
アピコンプレクサ群の寄生虫において、細胞内のＣａ２＋貯蔵体としての小胞体及びアシドカルシソーム（acidocalcisome）が、Ｃａ２＋の放出に関与していることが知られている。そこで、小胞体及びアシドカルシソームからの何れか一方からＣａ２＋を選択的に放出させるため、筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅの特異的阻害剤であるタプシガルギン(Ｔｇ)、及び液胞型Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅの特異的阻害剤であるコンカナマイシンＡ（ＣＭＡ）を夫々用いて、熱帯熱マラリア原虫を前処理した。【０１１５】
Ｃａ２＋のリークの増大にこれら化合物が及ぼす効果は、図３中の（ａ）及び（ｂ）に結果を示すように、灌流試験により、輪状体（○）及びトロホゾイト（黒塗り四角）の双方でＣａ２＋のイメージングを行うことにより確かめた。また、図２中の（ｃ）及び（ｄ）に示すように、２μＭのＴｇで３０分間の前処理を行い、予め小胞体のＣａ２＋を放出させることで、初期の輪状体（ＥＲ）、及びトロホゾイト（Ｔ）においてＣａ２＋の振動が消失した。対照的に、図３中の（ｅ）及び（ｆ）に示すように、１００ｎＭのＣＭＡで３０分間の前処理を行い、予めアシドカルシソーム中のＣａ２＋を放出させた場合には、初期の輪状体（ＥＲ）、及びトロホゾイト（Ｔ）においてＣａ２＋の振動に何らの影響も現れなかった。【０１１６】
これらの結果は、熱帯熱マラリア原虫の赤血球内での生育段階における初期の輪状体及びトロホゾイトで、内生的な、小胞体からのイノシトール三リン酸誘導型のＣａ２＋の放出（ＩＩＣＲ）が生じたことを示す。【０１１７】
〔実施例２：２−ＡＰＢの処置による、熱帯熱マラリア原虫の生育阻害・死滅〕
（１）２−ＡＰＢによる、熱帯熱マラリア原虫の赤血球内での生育阻害
上記生育阻害の実験結果を、図４の（ａ）〜（ｄ）にまとめて示す。なお、図４の（ｄ）は特に後述の項目（２）に関する。【０１１８】
図４中の（ａ）は、同調培養を開始後４０時間にわたり、２４ウェル組織培養プレート内で、熱帯熱マラリア原虫ＦＣＲ−３株を培養した結果を示す。培養は、各実験群当り３ウェルを用い、それぞれ、２０時間、３０時間、及び４０時間培養してアッセイに供した。また、熱帯熱マラリア原虫の計数のため、赤血球の薄層塗抹（erythrocytes thin-smears）を調製した。なお、図４中の（ａ）及び（ｄ）における、輪状体（Ｒ）、トロホゾイト（Ｔ）、初期のシゾント（ＥＳ）、及び後期のシゾント（ＬＳ）の原虫寄生率（％）は、各実験群３カウントの平均＋ＳＤである。原虫寄生率が、０．１％未満の段階は図示していない。【０１１９】
また、図４中の（ｂ）は、図４中の（ａ）に示す各培養における、赤血球内での熱帯熱マラリア原虫の形態を示す図である。【０１２０】
図４中の（ａ）及び（ｂ）に示す通り、１００μＭの２−ＡＰＢの存在下では、DMSOを用いたコントロールと比較して、熱帯熱マラリア原虫の赤血球内での生育が明らかに遅くなった。また、コントロールでは熱帯熱マラリア原虫の形態は培養期間を通じて正常であった一方で、２−ＡＰＢの存在下で培養した場合、熱帯熱マラリア原虫は何れも形態的異常を伴っていた。【０１２１】
すなわち、コントロールの培養中における熱帯熱マラリア原虫は、同調培養開始後２０時間の時点において、初期のシゾント（early schizonts：核数が８個未満の熱帯熱マラリア原虫）に生育していた。このシゾントは、同調培養開始後３０時間の時点において健全な後期のシゾント (late schizonts：核数が８個を超える熱帯熱マラリア原虫)に生育し、その後、成熟メロゾイトが放出され、同調培養開始後４０時間の時点において次のサイクルの感染が成立し、形成された輪状体（ring forms）が観察された。【０１２２】
一方、２−ＡＰＢが存在する条件で培養された熱帯熱マラリア原虫は、同調培養開始後２０時間の時点において、トロホゾイト(trophozoites：単一核を有する熱帯熱マラリア原虫)の状態に留まり、かつ形態的な異常が観察された。このトロホゾイトは、同調培養開始後３０時間の時点で初期のシゾントに、次いで同調培養開始後４０時間の時点で後期のシゾントに生育可能であったが、何れも形態的な異常を伴った（図４中の（ｂ）も参照）。【０１２３】
さらに、赤血球内での熱帯熱マラリア原虫の生育に対する２−ＡＰＢの効果を量的に評価するために、同調培養開始後１５時間、３０時間、４０時間における熱帯熱マラリア原虫細胞の占める面積、周囲長、及び最大直径（３つのパラメータと総称する）を分析した。なお、同調培養開始後４０時間の場合は、シゾントのみを解析した。同調培養開始後１５時間、３０時間、及び４０時間の何れの条件においても、１００μＭの２−ＡＰＢの存在下で培養された熱帯熱マラリア原虫は、ＤＭＳＯの存在下で培養された熱帯熱マラリア原虫と比較して、３つのパラメータが著しく減少した。このことは、２−ＡＰＢが熱帯熱マラリア原虫の赤血球内での生育を遅らせることを示唆している（図４中の（ｃ）参照）。さらに、熱帯熱マラリア原虫のサイズの解析によって、これら３つのパラメータの増加は、２−ＡＰＢで処置してから３０時間後に終わることが分かり、２−ＡＰＢの効果の臨界時間は約３０時間であることが示唆された。【０１２４】
なお、図４中の（ｃ）において、カラム及びエラーバーは平均＋S.D.を指す。各時点において５０個の熱帯熱マラリア原虫を対象に上記３つのパラメータを測定した。DMSOを用いたコントロールとの比較に関するＰ値は各図の下に記載した(Welch’s補正を行ったcorrection two-tailed unpaired t検定)。【０１２５】
（２）２−ＡＰＢの処置による、熱帯熱マラリア原虫の死滅
２−ＡＰＢが存在する条件で培養して得られた、形態異常を伴うシゾントの命運を確認するために、同調培養をさらに３０時間継続した。図４中の（ｄ）はすなわち、同調培養開始後４０時間（図４中の（ａ）の最終段階と同じ）、及び７０時間で培養を終了し、熱帯熱マラリア原虫の計数を行った結果を示す。なお、DMSO又は２−ＡＰＢを含む培養用の培地は、同調培養開始後４０時間の時点で、これらを含まない培養用の培地に置換した。同図に示すデータは、各実験群当り３ウェルの試験を行ったうちの代表値を示す。【０１２６】
コントロール（DMSO）の培養中における熱帯熱マラリア原虫は、７０時間の培養終了時に、輪状体を一部に含む後期のシゾントに生育した。一方、２−ＡＰＢが存在する条件下での培養では、７０時間の培養終了時に、形態的な異常を伴う後期のシゾント又は輪状体が見られた（赤血球５０００個〜８０００個当り１個程度の頻度）。また、２−ＡＰＢが存在する条件での培養中における熱帯熱マラリア原虫は、その赤血球の原虫寄生率が時間の経過とともに次第に減少し、同調培養開始後７０時間が経過した時点では原虫寄生率が実質的にゼロとなり死滅した。【０１２７】
図５に示すように、熱帯熱マラリア原虫は、２−ＡＰＢで事前にのみ処理した赤血球を用いた培養では、DMSOで事前に処理した赤血球を用いた培養の場合と同様に、同調培養開始後２０時間後（図中の（ａ））、４０時間後（図中の（ｂ））ともに正常に生育することができた。このことから、２−ＡＰＢを用いた効果は、赤血球の生理学的性質を阻害した結果生じたものではないことが示唆された。これらの結果から、２−ＡＰＢは、熱帯熱マラリア原虫の正常な細胞周期の進行を阻害することによって、熱帯熱マラリア原虫の赤血球内における生育を阻害し、最終的には死滅に至らしめることが示唆された。【０１２８】
（３）２−ＡＰＢの処置が、熱帯熱マラリア原虫のクロロキン耐性株へ与える影響
初期の原虫寄生率を約２％にセットして、輪状体の段階にあるマラリア原虫を同調培養する手法を用いて、熱帯熱マラリア（P. falciparum）のクロロキン耐性株であるＫ−１株の赤血球内での生育に対して２−ＡＰＢが及ぼす影響を調べた。培養は、同調培養を開始後２４時間、４８時間、及び７２時間の時点で終了し、熱帯熱マラリア原虫をカウントするため赤血球の薄層塗抹を調製した。１００μＭのDMSO 又は１００μＭの２−ＡＰＢが添加された培養培地は、２４時間及び４８時間経過した段階で交換した。典型的な結果が得られた３回の独立した試験の結果を図４中の（ｅ）に示す。輪状体（Ｒｆ）、トロホゾイト（Ｔ）、初期のシゾント(ＥＳ)及び後期のシゾント(ＬＳ)夫々の原虫寄生率は、３つのウェルの平均+ S.D.として示す。原虫寄生率が０．１％未満の段階は示していない。
１００μＭの２−ＡＰＢを添加して培養した系では、アッセイ開始後２４時間において、トロホゾイトの段階にある熱帯熱マラリア原虫が減少する傾向が再現性をもって観察された(図４中の（ｅ）参照)。２−ＡＰＢが示すこの阻害効は、アッセイ開始後２４時間において、熱帯熱マラリア原虫細胞の占める面積、周囲長、及び最大直径を測定することで確認した(図１０参照)。アッセイ開始後４８時間において、２−ＡＰＢの存在下ではＤＭＳＯの存在下と比較して赤血球内でのマラリア原虫の成育が遅れる傾向にあった。この傾向は、ＦＣＲ３株での観察と同様であった。アッセイをさらに２４時間行った結果（アッセイ開始後７２時間）、熱帯熱マラリア原虫に感染した赤血球(非常の高レベルの原虫寄生率を示す)の数は、２−ＡＰＢの存在下では DMSOの存在下と比較してずっと少ないことが判明した。【０１２９】
なお、アッセイ開始後２４時間における、Ｋ−１株に対する２−ＡＰＢの効果は比較的弱いが（図４中の（ｅ）も参照）、これには、大部分の熱帯熱マラリア原虫Ｋ−１株は、２−ＡＰＢがＦＣＲ−３株に致死的な影響を与えた段階（トロホゾイトから初期のシゾントの段階：実施例３及び図６も参照）に達していないという事実が寄与していると考えられる。【０１３０】
〔実施例３〕
（１）２−ＡＰＢは、熱帯熱マラリア原虫の赤血球内での生育を初期段階で阻害する
次に、熱帯熱マラリア原虫の赤血球内での生育阻害が生じる段階を調査するため、２−ＡＰＢを異なるタイミングで培養中に添加した。図６は、異なる生育段階にある熱帯熱マラリア原虫の培養に対する、２−ＡＰＢの効果を実験した結果を示す図である。独立に２回の試験（Ｅｘ−１及びＥｘ−２）を代表的な結果として示した。この実験では、２４ウェル組織培養プレートを用いて、熱帯熱マラリア原虫のＦＣＲ−３株を同調培養した。同調培養開始後４０時間で培養を終了し、熱帯熱マラリア原虫の計数を行った（各実験群当り３ウェル。原虫寄生率が、０．１％未満の段階は図示していない。）。【０１３１】
なお、図６中の（ａ）及び（ｂ）はそれぞれ、同調培養開始時に２−ＡＰＢを添加し、熱帯熱マラリア原虫が輪状体の段階にある１０時間後、及びトロホゾイト／初期のシゾントの遷移段階に生育した、２１時間後のタイミングで２−ＡＰＢを含まない培地に交換した培養の結果を示す図である。図６中の（ｃ）は、培養開始後２１時間のタイミングで２−ＡＰＢを添加した培養の結果を示す図である。図６中の（ｄ）は、熱帯熱マラリア原虫が後期のシゾントに成育した、培養開始後２８時間のタイミングで２−ＡＰＢを添加した培養の結果を示す図である。トータルの培養時間は４５時間である。なお、図６中の（ａ）〜（ｃ）、（ｅ）における、輪状体（Ｒ）、トロホゾイト（Ｔ）、初期のシゾント（ＥＳ）、及び後期のシゾント（ＬＳ）の原虫寄生率（％）は、各実験群を構成する３ウェルの平均＋ＳＤである。原虫寄生率が、０．１％未満の段階は図示していない。【０１３２】
２−ＡＰＢをアッセイ開始時に添加し、輪状体の段階で除いた場合も、トロホゾイトから初期のシゾント段階の間で除いた場合も、アッセイ開始４０時間後の輪状体の原虫寄生率に有意な差が見られたが、トロホゾイトから初期のシゾント段階まで２−ＡＰＢを加えていた場合の方が、その効果は大きかった。【０１３３】
また、２−ＡＰＢをトロホゾイトから初期のシゾント段階の間で添加した場合は、輪状体の段階あるいはトロホゾイトから初期のシゾント段階に２−ＡＰＢを除いた場合と比べて、アッセイ開始４０時間後の輪状体の原虫寄生率により大きな効果が見られた。なお、トロホゾイトから初期のシゾント段階の間に２−ＡＰＢを添加した２回の試験の結果において、アッセイ開始４０時間後の輪状体の原虫寄生率に顕著な差が見られたが、これは２−ＡＰＢ添加時のトロホゾイトとシゾントの存在率と関係があることが、図６中の（ｄ）により推察される。（ａ）〜（ｃ）の結果を総合すると、トロホゾイトの段階で２−ＡＰＢに暴露されることが、アッセイ開始４０時間後の輪状体の原虫寄生率（次の発育サイクルに入る際の原虫寄生率）に重篤な影響を及ぼすことが強く示唆された。【０１３４】
一方、２−ＡＰＢがより遅いタイミング、例えば後期のシゾント段階で添加された場合、コントロールの培養での観察と同様に、熱帯熱マラリア原虫は輪状体を形成した。しかし、２−ＡＰＢの添加により、アッセイ開始後４５時間が経過した段階での、輪状体の原虫寄生率は、有意に減少した（図６中の（ｅ）：*ｐ＜０．０５）。【０１３５】
この結果は、後期のシゾントの成熟、メロゾイトの赤血球外への放出、及び／又は、メロゾイトの赤血球への侵入を２−ＡＰＢが阻害することを示唆する。【０１３６】
Ｃａ２＋イメージングの実験結果とあわせて、トロホゾイトの段階での、イノシトール三リン酸誘導型の内生的なＣａ２＋の振動が、赤血球内での熱帯熱マラリア原虫の生育に極めて重要であることを初めて証明した。あわせて、メロゾイトの段階での、イノシトール三リン酸誘導型の内生的なＣａ２＋の周期変動が、熱帯熱マラリア原虫の赤血球への侵入に重要な役割を果たしていると結論付けた。【０１３７】
また、輪状体の段階における２−ＡＰＢの効果を調べるために、同調培養中の熱帯熱マラリア原虫に対して１００μＭの２−ＡＰＢを添加して培養を継続した後、１０時間後及び２０時間後に熱帯熱マラリア原虫のサイズを測定した。なお、一部のアッセイ（図６中の（ｆ）におけるremoved at 10h）では、１００μＭの２−ＡＰＢを添加して培養を継続した後、１０時間後に２−ＡＰＢを取り除いて引き続き培養を行い、２０時間後に熱帯熱マラリア原虫のサイズを測定した（図６中の（ｆ）を参照）。また、同様の実験を、コントロールとしての１００μＭのＤＭＳＯの存在下で培養した熱帯熱マラリア原虫に対しても行った。なお、各実験群では、５０個の熱帯熱マラリア原虫を測定の対象とし、コントロール（ＤＭＳＯの存在下）と比較したＰ値は図中の各パネルに記載した(Welch’s補正を行ったtwo-tailed unpaired t検定)。【０１３８】
コントロールである１００μＭのＤＭＳＯの存在下で培養した熱帯熱マラリア原虫では、アッセイ開始後２０時間における熱帯熱マラリア原虫細胞の占める面積、周囲長、及び最大直径の増加は、アッセイ開始後１０時間におけるこれらの増加よりも大きかった。同様の結果は、アッセイ開始後１０時間でＤＭＳＯを取り除いた系でも得られた。対照的に、１００μＭの２−ＡＰＢの存在下で、アッセイ開始後１０時間及び２０時間培養した場合には、ＤＭＳＯの存在下で培養した系と比較してこれら３つのパラメータは顕著に小さくなった。しかし、アッセイ開始後１０時間の時点で２−ＡＰＢを取り除いた場合には、ＤＭＳＯを添加して培養した場合と比較して３つのパラメーターは全て僅かに小さくなるに過ぎず、統計的に有意な差が見られない程度にまで回復した。【０１３９】
初期の輪状体の段階における２−ＡＰＢの可逆的効果（図６中の（ｆ）を参照）を考慮すれば、２−ＡＰＢが熱帯熱マラリア原虫の赤血球内での生育を致死的に阻害する効果は、主にトロホゾイトの段階においてＣａ２＋の振動をブロックしたことに起因すると推定される。【０１４０】
〔実施例４〕
（１）ＬＺによる、熱帯熱マラリア原虫の赤血球内での生育阻害
２５０μＭのＬＺの存在下での、上記生育阻害の実験結果を、図７の（ａ）から（ｃ）にまとめて示す。なお、ＬＺの濃度は、熱帯熱マラリア原虫に関する既報（参照文献：Beraldo F. H., Mikoshiba K. & Garcia C. R. (2007) J. Pineal. Res. 43, 360-364.）に基づき決定した。また、DMSOの存在下での培養実験をコントロールとして使用した。同図には、同調培養を開始後７０時間にわたり、２４ウェル組織培養プレート内で、熱帯熱マラリア原虫ＦＣＲ−３株を培養した結果を示す。培養は、各実験群当り３ウェルを用い、それぞれ、２０時間（図中の（ａ））、４０時間（図中の（ｂ））及び７０時間（図中の（ｃ））培養してアッセイに供した。また、熱帯熱マラリア原虫の計数のため、赤血球の薄層塗抹を調製した。なお、図７における、輪状体（Ｒ）、トロホゾイト（Ｔ）、初期のシゾント（ＥＳ）、及び後期のシゾント（ＬＳ）の原虫寄生率（％）は、各実験群を構成する３ウェルの平均＋ＳＤである。原虫寄生率が、０．１％未満の段階は図示していない。【０１４１】
図７に示すように、２５０μＭのＬＺの存在下では、熱帯熱マラリア原虫の赤血球内での生育は明らかに阻害された。【０１４２】
すなわち、コントロールの培養中における熱帯熱マラリア原虫は、アッセイ開始後２０時間の時点において、後期トロホゾイト及び初期のシゾントに生育した。これら熱帯熱マラリア原虫は、アッセイ開始後４０時間の時点において、健全な初期・後期のシゾント及び次の生育サイクル中に位置づけられる輪状体／初期トロホゾイトの遷移段階に生育した。さらに、アッセイ開始後７０時間において、健全なトロホゾイト及び初期・後期シゾントに、そして次の生育サイクル中に位置づけられる輪状体に生育した。【０１４３】
一方、ＬＺの存在下での培養中における熱帯熱マラリア原虫は、アッセイ開始後２０時間の時点において、輪状体／初期トロホゾイトの遷移段階に留まっていた。一部の輪状体／初期トロホゾイトは、初期のシゾントまで生育可能であった。しかし、大部分の熱帯熱マラリア原虫は、アッセイ開始後４０時間の時点においても、輪状体／初期トロホゾイトの遷移段階に留まったままであった。さらにアッセイ開始後７０時間においても、熱帯熱マラリア原虫は輪状体／初期トロホゾイトの遷移段階に留まったままであり、アッセイ開始後４０時間に観察された初期シゾントは生育を停止し死滅したと予想された。【０１４４】
上記の結果は、ＬＺは、正常な細胞周期の進行を阻害することで、熱帯熱マラリア原虫の赤血球での生育を阻害することを示唆した。なお、ＬＺは、メラトニン受容体の遮断薬（アンタゴニスト）である。【０１４５】
〔実施例５：２−ＡＰＢにより引き起こされるマラリア原虫の重篤な変性〕
透過型電子顕微鏡を用いて、２−ＡＰＢにより引き起こされた超微細構造の変性を観察した。図８中の（ａ）に示すように、ＤＭＳＯの存在下で培養された熱帯熱マラリア原虫は、アッセイ開始後３０時間において、通常の構造を維持していた。対照的に、１００μＭの２−ＡＰＢ存在下で培養された熱帯熱マラリア原虫は、アッセイ開始後３０時間において、核中に非常に濃密なクロマチンの塊、及び非常に濃密なその変性物が観察された（図８中の（ｂ）及び（ｃ）参照）。食胞中にマウレル裂（Maurer’s cleft）及びマラリアピグメント（malaria pigment）が形成されているという事実は、２−ＡＰＢにより引き起こされる変性は、ある程度、赤血球内でのマラリア原虫の生育が進んでから引き起こされることを示唆する（図８中の（ｂ））。【０１４６】
Plasmodium属の種においては、核膜（nuclear envelope）は、主要な小胞体（ER）コンパートメントと考えられている。図９で示すように、ＤＭＳＯの存在下で熱帯熱マラリア原虫を培養した場合に、Hoechst 33342により青色に染色された小胞体トラッカーシグナル（ER-Tracker signals）が熱帯熱マラリア原虫の核を取り囲んで現れる一方で、２−ＡＰＢの存在下で熱帯熱マラリア原虫を培養した場合には、小胞体トラッカーシグナルはよりブロードになり、細胞質にも広がることが確認された。同様に、電子顕微鏡での観察において、２−ＡＰＢの存在下で培養された熱帯熱マラリア原虫では、核膜（nuclear envelope）及び小胞体が膨張しており（図８中の（ｂ）及び（ｃ）参照）、膨張した核膜（nuclear envelopes）と膨張した小胞体とが結合して、網目状小胞体（reticular ER）構造を形成していた（図８中の（ｄ）及び図９参照）。電子顕微鏡を用いたマラリア原虫の観察に関する既報（参考文献：Bannister, L.H., Hopkins, J.M., Fowler, R.E., Krishna, S. & Mitchell, G.H. Ultrastructure of rhoptry development in Plasmodium falciparum erythrocytic schizonts. Parasitology 121 ( Pt 3), 273−287 (2000).）では、後期のシゾントの段階において、粗面小胞体により取り囲まれた核は、沢山のリボゾームの顆粒を保持した核膜（nuclear envelope）を備えていると報告されている。そして、同様の電子顕微鏡写真が、ＤＭＳＯの存在下で培養した熱帯熱マラリア原虫でも得られた（図１１を参照）。また、２−ＡＰＢの存在下で培養した熱帯熱マラリア原虫でも、膨張した核膜（nuclear envelope）に沿ったラインそれぞれの間で、しばしばリボゾームの顆粒数が増加することが見られた（図８中の（ｅ）を参照）。【０１４７】
２−ＡＰＢの存在下で培養された大部分の熱帯熱マラリア原虫が、重篤な変性を示すが（図８中の（ｂ）及び（ｃ）参照）、正常なマイクロオルガネラを持つメロゾイトが形成されたシゾントもまた存在する（図８中の（ｆ）参照）。アッセイ開始後４０時間経過した段階において、２−ＡＰＢの存在下で培養された、熱帯熱マラリア原虫の各シゾント中に形成されたメロゾイトの数は、ＤＭＳＯの存在下で培養されたものと比較して著しく少なくなる（図１２中の（ａ）及び（ｂ）を参照。Welch’s補正をしたtwo-tailed unpaired t 検定を行っており、（ｂ）は（ａ）で示した頻度分布の生データである。）が、このことは、正常にメロゾイトが形成された熱帯熱マラリア原虫においても、その生育が２−ＡＰＢにより阻害されることを示唆する。【０１４８】
本発明は上述した各実施形態及び実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１４９】
本発明は、従来とは異なるメカニズムを利用したマラリアの治療方法、マラリア原虫の殺虫方法、及びその利用を提供することが出来る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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