(57)【要約】  骨髄幹細胞を誘引できる骨髄幹細胞の誘引剤を提供することなどを課題とする。デアセチルサイトカラシンＣ、Eupenicillium ludwigiiの培養物、及び、Talaromyces trachyspermusの培養物からなる群より選択された少なくとも１種を含む骨髄幹細胞の誘引剤などを提供する。
2012063514.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デアセチルサイトカラシンＣ、Eupenicillium ludwigiiの培養物、及び、Talaromyces trachyspermusの培養物からなる群より選択された少なくとも１種を含むことを特徴とする骨髄幹細胞の誘引剤。
【請求項２】
デアセチルサイトカラシンＣ、Eupenicillium ludwigiiの培養物、及び、Talaromyces trachyspermusの培養物からなる群より選択された少なくとも１種を含む骨髄幹細胞の誘引剤により骨髄幹細胞を誘引することを特徴とする骨髄幹細胞の誘引方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄幹細胞の誘引剤及び骨髄幹細胞の誘引方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄幹細胞は、骨髄において生じた未だ分化していない細胞であり、様々な体内組織の細胞へ分化し得るものとして知られている。また、分化を誘導する分化誘導剤の影響を受けて、機能が失われた組織においてその組織細胞に分化することにより組織の機能を回復させ得るものとして注目されている。【０００３】
具体的には、骨髄幹細胞は、例えば、炎症のある組織又は損傷を受けた組織へ血流にのって骨髄から移動した後に、分化誘導剤の影響を受けてその組織細胞へ分化し得るものとして注目されている。【０００４】
ところで、従来、骨髄幹細胞を各種の細胞に分化させ得る分化誘導剤としては、様々なものが知られており、例えば、骨髄幹細胞を心臓の筋肉細胞に分化させ得る線維芽細胞増殖因子（Fibroblast Growth Factor  ＦＧＦ）や血小板由来成長因子（Platelet-Derived Growth Factor  ＰＤＧＦ）などが知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００５／０６３９６７号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、この種の分化誘導剤は、骨髄幹細胞を所定の組織細胞へと分化させる性能を有するものの、骨髄幹細胞を誘引する性能、具体的には例えば、血流にのって体内を循環している骨髄幹細胞を所定の体内組織へ誘引する性能が、必ずしも十分なものではないという問題がある。【０００７】
本発明は、上記の問題点等に鑑み、骨髄幹細胞を誘引できる骨髄幹細胞の誘引剤を提供することを課題とする。また、前記誘引剤により骨髄幹細胞を誘引する骨髄幹細胞の誘引方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る骨髄幹細胞の誘引剤は、デアセチルサイトカラシンＣ、エウペニシリウム  ルドウィギイ（Eupenicillium ludwigii）の培養物、及び、タラロマイセス  トラキスペルムス（Talaromyces trachyspermus）の培養物からなる群より選択された少なくとも１種を含むことを特徴としている。【０００９】
本発明に係る骨髄幹細胞の誘引方法は、前記誘引剤により骨髄幹細胞を誘引することを特徴としている。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の骨髄幹細胞の誘引剤は、骨髄幹細胞を誘引できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】１次元１Ｈ−ＮＭＲスペクトルデータを表す図。
【図２】１次元１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータを表す図。
【図３】２次元ＮＭＲ（Ｈ−Ｈ  ＣＯＳＹ）スペクトルデータを表す図。
【図４】２次元ＮＭＲ（ＨＭＱＣ）スペクトルデータを表す図。
【図５】２次元ＮＭＲ（ＨＭＢＣ）スペクトルデータを表す図。
【図６】ＭＳスペクトルデータを表す図。
【図７】実施例２の誘引剤及びデアセチルサイトカラシンＣにおける１次元ＮＭＲアサインデータの対照表。
【図８】デアセチルサイトカラシンＣの分子構造を表す図。
【図９】生体外における細胞誘引試験の様子を模式的に示した図。
【図１０】生体外における細胞誘引試験の結果を示す図。
【図１１】生体外における細胞誘引試験の結果を示す図。
【図１２】陰性対照サンプル及び陽性対照サンプルを用いた、生体外における細胞誘引試験の結果を示すグラフ。
【図１３】分画したフラクションを用いた生体外における細胞誘引試験の結果を示すグラフ。
【図１４】分画したフラクションを用いた生体外における細胞誘引試験の結果を示すグラフ。
【図１５】生体における細胞誘引試験の結果を示すグラフ。
【図１６】生体における細胞誘引試験の結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明に係る骨髄幹細胞の誘引剤の実施形態について説明する。
【００１３】
本実施形態の骨髄幹細胞の誘引剤は、デアセチルサイトカラシンＣ、エウペニシリウム  ルドウィギイ（Eupenicillium ludwigii）の培養物、及び、タラロマイセス  トラキスペルムス（Talaromyces trachyspermus）の培養物からなる群より選択された少なくとも１種を含むものである。
【００１４】
前記デアセチルサイトカラシンＣは、下記式（１）の分子構造を有する化合物である。
前記骨髄幹細胞の誘引剤に含まれるデアセチルサイトカラシンＣの濃度は、特に限定されず、該濃度としては、例えば、０．００１〜１００重量％が挙げられる。
【００１５】
【化１】
2012063514.tif 000003
前記デアセチルサイトカラシンＣを含む骨髄幹細胞の誘引剤としては、製造が比較的容易であり骨髄幹細胞の誘引性能に優れるという点で、子のう菌類微生物に分類される黒彊病菌（メタリジウム  アニソプリエ  Metarhizium anisopliae）を培養することにより生成された生成物を含むものが好ましい。即ち、黒彊病菌（メタリジウム  アニソプリエ  Metarhizium anisopliae）の培養物が好ましい。
【００１６】
前記エウペニシリウム  ルドウィギイ（Eupenicillium ludwigii）の培養物は、子のう菌類微生物に分類されるエウペニシリウム  ルドウィギイ（Eupenicillium ludwigii）を培養することにより生成された生成物を含むものである。
【００１７】
前記タラロマイセス  トラキスペルムス（Talaromyces trachyspermus）の培養物は、不整子のう菌類微生物に分類されるタラロマイセス  トラキスペルムス（Talaromyces trachyspermus）を培養することにより生成された生成物を含むものである。
【００１８】
上述したエウペニシリウム  ルドウィギイ（Eupenicillium ludwigii）又はタラロマイセス  トラキスペルムス（Talaromyces trachyspermus）の培養物は、培養後の培地及び菌体を含む粗培養物、その希釈物若しくは濃縮物、又は、抽出溶媒を用いて培養後の培地及び菌体に抽出処理を施した培養抽出物などの態様で用いられ得る。好ましくは、培養により生成された生成物の含有濃度がより高くなり前記誘引剤の誘引性能がより優れたものになり得るという点で、前記培養抽出物の態様で用いられることが好ましい。
【００１９】
前記培養抽出物の態様としては、抽出溶媒により得られた抽出液、その希釈液、その濃縮液、又はその抽出溶媒を除去した乾燥物などが挙げられる。具体的には、例えば、溶液状、ペースト状、ゲル状、粉末状のものなどが挙げられる。
【００２０】
前記骨髄幹細胞の誘引剤に含まれる培養物の濃度は、特に限定されず、通常、乾燥物換算で０．００１〜２０重量％である。
なお、乾燥物換算とは、培養後の培地及び菌体に含まれる培養生成物の乾燥物に換算することである。乾燥物の重量は、所定量の培養後の培地及び菌体に対して抽出溶媒を用いて抽出処理を施したものから培地、菌体、及び抽出溶媒を除いた残渣の重量により求める。
【００２１】
次に、前記骨髄幹細胞の誘引剤を製造する方法について説明する。
【００２２】
前記デアセチルサイトカラシンＣを含む骨髄幹細胞の誘引剤の製造方法は、特に限定されるものではなく、該誘引剤は、例えば、黒彊病菌（Metarhizium anisopliae）を培養することによりデアセチルサイトカラシンＣを生成させて製造することができる。
具体的には、前記デアセチルサイトカラシンＣを含む骨髄幹細胞の誘引剤は、例えば、培地の存在下で黒彊病菌（Metarhizium anisopliae）を培養し、培養後の培地及び菌体に抽出処理を施して培養抽出物を得ることにより調製でき、必要に応じて、デアセチルサイトカラシンＣ濃度を高めるべく、培養抽出物にさらに精製処理を行うことにより製造することができる。より具体的には、例えば、実施例に記載されている方法によって製造することができる。
【００２３】
前記培養においては、従来公知の一般的な方法を採用することができ、例えば、固体状の培地を用いて培養する方法、液体状の培地を用いて培養する方法などを採用することができる。
前記培地を構成する成分は、特に限定されるものではなく、該成分としては、例えば、微生物を増殖させ得る一般的な有機化合物や無機塩類などを用いることができる。
前記培養においては、培養時間、培養温度などの培養条件が適宜調整される。
【００２４】
前記抽出処理の方法としては、例えば、抽出溶媒を用いて培養後の培地及び菌体からデアセチルサイトカラシンＣを抽出する溶媒抽出法などを採用することができる。
該溶媒抽出法としては、従来公知の一般的な方法を採用することができる。具体的には、例えば、培養後の培地と菌体と抽出溶媒とを混合して懸濁液を調製し、懸濁液を遠心分離により分離して、デアセチルサイトカラシンＣを含む上清液を採取する方法などを採用することができる。
【００２５】
前記溶媒抽出法における抽出溶媒としては、水又は有機溶媒を用いることができる。
前記有機溶媒としては、具体的には例えば、メタノール、エタノール、ブタノール、プロパノールなどの脂肪族１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどの脂肪族多価アルコール；アセトンなどのケトン類；ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルエステルなどのエステル類；キシレン、ベンゼン、トルエンなどの芳香族類；クロロホルムなどハロゲン化アルキル類などを用いることができる。
前記抽出溶媒は、１種が単独で、又は２種以上が混合されて用いられる。混合されてなる混合抽出溶媒の混合比は、特に限定されるものではなく、適宜調整される。
前記抽出溶媒としては、デアセチルサイトカラシンＣがより抽出されやすいという点で、アセトンと水との混合抽出溶媒が好適に用いられる。
【００２６】
前記精製処理の方法としては、従来公知の一般的な方法を採用することができる。好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのカラムクロマトグラフィーを採用する。
具体的には、前記精製処理の方法としては、例えば、上述のように抽出処理を施した培養抽出物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって複数のフラクションに分画し、デアセチルサイトカラシンＣの濃度がより高まったフラクションを得る方法を採用することができる。
【００２７】
前記高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって複数のフラクションに分画する方法においては、骨髄幹細胞の誘引剤に含まれるデアセチルサイトカラシンＣの濃度がさらに高まり得るという点で、デアセチルサイトカラシンＣの濃度が高まったフラクションに対して同様な分画操作を再度行うことが好ましい。
なお、前記高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による精製処理を行う前には、上述のように抽出処理を施した培養抽出物を粗精製することが好ましい。具体的には、例えば、固体状の担体が樹脂製シリンジに保持されてなる固相抽出カートリッジを用いて粗精製することが好ましい。
【００２８】
以上のようにして、デアセチルサイトカラシンＣを含む骨髄幹細胞の誘引剤として、黒彊病菌（Metarhizium anisopliae）の培養物を製造することができ、さらに、精製されたデアセチルサイトカラシンＣを製造することができる。
【００２９】
一方、エウペニシリウム  ルドウィギイ（Eupenicillium ludwigii）の培養物、又は、タラロマイセス  トラキスペルムス（Talaromyces trachyspermus）の培養物を含む骨髄幹細胞の誘引剤は、エウペニシリウム  ルドウィギイ（Eupenicillium ludwigii）、又は、タラロマイセス  トラキスペルムス（Talaromyces trachyspermus）を従来公知の一般的な方法によって培養することにより製造することができる。
【００３０】
エウペニシリウム  ルドウィギイ（Eupenicillium ludwigii）の培養物、又は、タラロマイセス  トラキスペルムス（Talaromyces trachyspermus）の培養物を含む骨髄幹細胞の誘引剤の製造においては、上述した培養の方法と同様の方法を採用することができる。
【００３１】
また、上記の培養物を含む骨髄幹細胞の誘引剤の製造においては、誘引剤の細胞誘引性能がより優れたものになり得るという点で、上述した抽出処理と同様の抽出処理を実施してなる培養抽出物を調製することが好ましい。
該抽出処理のために用いる抽出溶媒としては、上記の培養物を含む誘引剤が骨髄幹細胞をより誘引できるものになり得るという点で、前記脂肪族１価アルコールが好ましく、ブタノールがより好ましい。
【００３２】
続いて、本発明の骨髄幹細胞の誘引方法の実施形態について説明する。本実施形態の骨髄幹細胞の誘引方法は、前記骨髄幹細胞の誘引剤により骨髄幹細胞を誘引するものである。
【００３３】
骨髄幹細胞は、骨髄組織に含まれており、さらに骨髄組織内で分化したり又は血流にのって骨髄組織から他の体内組織へ移動したりし得る。
前記骨髄幹細胞としては、軟骨細胞、脂肪細胞、筋肉細胞などの中胚葉性組織の細胞へ分化し得る骨髄間葉系幹細胞、赤血球や白血球などの血液細胞へ分化し得る造血幹細胞などが挙げられる。
前記骨髄幹細胞のなかでも骨髄間葉系幹細胞は、中胚葉性組織の細胞に分化するだけでなく、神経などの外胚葉性組織、肝臓などの内胚葉性組織の細胞へも分化し得る。本発明の誘引方法において誘引される骨髄幹細胞としては、誘引された後に、より多様な細胞に分化し得るという点で、骨髄間葉系幹細胞が好ましい。
【００３４】
前記骨髄幹細胞の誘引方法においては、例えば、生体外において、又は生体において前記骨髄幹細胞の誘引剤により骨髄幹細胞を誘引することができる。
【００３５】
具体的には、生体外での骨髄幹細胞の誘引方法においては、例えば、厚み方向に貫通する微細孔を有するメンブレン（膜）を備えた装置を用い、メンブレンの一方側に骨髄幹細胞を配し、他方側に前記骨髄幹細胞の誘引剤を配し、所定時間をおいて骨髄幹細胞をメンブレンの他方側へ誘引する方法などを実施することができる。骨髄幹細胞の誘引の程度は、他方側へ誘引された骨髄幹細胞を染色し、染色度を測定することにより評価できる。
また、生体外での骨髄幹細胞の誘引方法においては、例えば、スライドグラス上に播種した骨髄幹細胞の一部を掻き取り、掻き取った部分に骨髄幹細胞の誘引剤を含む培地を加えて培養することにより、掻き取った部分へ骨髄幹細胞を誘引する方法などを実施することができる。骨髄幹細胞の誘引の程度は、掻き取った部分における骨髄幹細胞の増殖を確認することにより評価できる。
このような生体外での骨髄幹細胞の誘引方法は、比較的簡便に実施できることから、例えば、後述する生体での骨髄幹細胞の誘引方法における誘引剤の最適濃度を決定する目的で予備実験的に実施することができる。
【００３６】
一方、生体での骨髄幹細胞の誘引方法においては、例えば、前記骨髄幹細胞の誘引剤を含む水性ゲルを通常のマウスの皮下に埋め込み、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein，以下ＧＦＰともいう）を発現させたマウスの骨髄幹細胞をこのマウスの静脈に注入し、所定期間マウスを飼育することにより、骨髄幹細胞を水性ゲルに誘引する方法などを実施することができる。骨髄幹細胞の誘引の程度は、水性ゲルにおける蛍光の強度を測定することにより評価できる。
また、生体での骨髄幹細胞の誘引方法においては、例えば、ＧＦＰを発現させたマウスの骨髄幹細胞を、創傷モデルマウスの骨髄に移植するとともに、該マウスの創傷部に前記骨髄幹細胞の誘引剤を塗布することにより、創傷部にＧＦＰマウス由来の骨髄幹細胞を誘引する方法などを実施することができる。骨髄幹細胞の誘引の程度は、創傷部における蛍光の強度を測定することにより評価できる。
【００３７】
さらに、生体での骨髄幹細胞の誘引方法においては、例えば、所定の体内組織に骨髄幹細胞の誘引剤を含有させる処置を施し、その組織に骨髄幹細胞を誘引する方法などを実施することができる。より具体的には、例えば、皮膚の表皮組織に前記骨髄幹細胞の誘引剤を塗布などにより含有させて、血液中に存在する骨髄間葉系幹細胞を表皮組織に誘引する方法などを実施することができる。
なお、生体での誘引方法において骨髄幹細胞が誘引されて来る体内組織としては、表皮組織の他に、筋肉組織、軟骨組織、肝臓組織などの各種組織が挙げられる。
【００３８】
生体での骨髄幹細胞の誘引方法は、例えば、骨髄幹細胞を各種の組織細胞へ分化させる前に、骨髄幹細胞をその組織へ集積させる目的で実施することができる。
【００３９】
前記骨髄幹細胞の誘引方法は、ヒトの生体又はヒト以外の動物の生体において実施することができる。好ましくは、ヒトの生体において、具体的には例えば美容上の目的で、非治療的に実施する。
【００４０】
前記骨髄幹細胞の誘引方法においては、前記骨髄幹細胞の誘引剤を希釈して使用することができる。希釈するための液としては、特に限定されるものではなく、例えば、水、生理食塩水、骨髄幹細胞の培養液などを用いることができる。
前記デアセチルサイトカラシンＣを含む骨髄幹細胞の誘引剤は、希釈により１〜１０００μＭのデアセチルサイトカラシンＣ濃度にて使用され、好ましくは、１〜１００μＭのデアセチルサイトカラシンＣ濃度にて使用される。
また、黒彊病菌（Metarhizium anisopliae）の培養物を含む骨髄幹細胞の誘引剤は、希釈により例えば、乾燥物換算で０．００００１〜０．２重量％の濃度にて使用され、好ましくは、０．０１〜０．２重量％の濃度にて使用される。
また、エウペニシリウム  ルドウィギイ（Eupenicillium ludwigii）の培養物、又は、タラロマイセス  トラキスペルムス（Talaromyces trachyspermus）の培養物を含む骨髄幹細胞の誘引剤は、希釈により例えば、乾燥物換算で０．００００１〜０．２重量％の濃度にて使用され、好ましくは、０．０１〜０．１重量％の濃度にて使用される。
【００４１】
本実施形態の骨髄幹細胞の誘引剤及び骨髄幹細胞の誘引方法は、上記例示の通りであるが、本発明は、上記例示の骨髄幹細胞の誘引剤及び骨髄幹細胞の誘引方法に限定されるものではない。また、本発明では、一般の骨髄幹細胞の誘引剤及び骨髄幹細胞の誘引方法において採用される種々の形態を、本発明の効果を損ねない範囲で採用することができる。
【実施例】
【００４２】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００４３】
（実施例１）
下記に示すように、デアセチルサイトカラシンＣを含む誘引剤を製造した。
即ち、黒彊病菌（メタリジウム  アニソプリエ（Metarhizium anisopliae））を培養し、培養後の培地及び菌体を含む粗培養物を得た。この粗培養物に対して抽出処理を施すことにより培養抽出物を調製した。詳細について、以下に説明する。【００４４】
まず、メタリジウム  アニソプリエ（Metarhizium anisopliae）の前培養を行うために、グリセロールストックから取り出した種菌を下記の培養条件に従って培養した。
・前培養条件：温度２８℃、４０日間
・前培養培地組成：下記に示すＬＣＡ寒天培地
グルコース                １ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                １ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ        ０．２ｇ
ＫＣｌ                    ０．２ｇ
ＮａＮＯ３                  ２ｇ
バクト-酵母エキス          ０．２ｇ
（Becton, Dickinson and Company社製）
寒天（和光純薬社製）      ２０ｇ
水道水                    １Ｌ
ＮａＯＨ                  ６４．８ｍｇ
前培養後、菌糸体を含む寒天培地をストローで打ち抜いた。一方、３．５ｍＬの滅菌水道水を１５ｍＬ容量の遠心管に分注した。打ち抜いた寒天培地の５片を遠心管に入れ、綿棒で寒天培地を押し潰して懸濁液を調製した。
続いて、本培養のための培地として、５０ｍＬ容量の遠心管中に下記組成の本培養培地を作製し、本培養用の遠心管に１ｍＬの上記懸濁液を添加し、下記の培養条件で本培養した。
・本培養条件：温度２８℃、２週間
・本培養培地組成：下記に示す固形状培地
野菜ジュース                        １０ｍＬ
（キャンベル・スープ・カンパニー社製  商品名「Ｖ８ジュース」）
オートミール                          ３ｇ
（雪印乳業（クエーカー）社製）
本培養後の遠心管に抽出溶媒としての８０容量％アセトン水溶液を加え、粗培養物に対して抽出溶媒による抽出処理を行った。
詳しくは、遠心管に抽出溶媒を加えた後、遠心管を激しく上下に振って内容物を撹拌し、室温で３０分間静置した。その後、遠心管に対して回転数３５００ｒｐｍ、２３℃で５分間の遠心分離操作を行い、遠心分離後の上清約１５ｍＬをデカンテーションにより回収した。
続いて、上清をドラフトで約１５時間静置することにより抽出溶媒を揮発させて濃縮した後、濃縮された上清が約１０ｍＬになるまで−２０℃で保存した。
保存した後の上清をマイクロチューブに入れ、１３，０００ｒｐｍの遠心分離により、沈殿物と沈殿物以外のサンプル液とを得た。
サンプル液の２２５．６μＬ（本培養ブロス２００μＬに相当）を遠心エバポレーターで乾固させ、−２０℃で保存した。乾固させたサンプルを８０容量％メタノール水溶液１００μＬに溶解し、ボルテックスミキサーを用いて３０分間懸濁させた後、１３，５００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心分離により上清を得て、培養抽出物を調製し、誘引剤を製造した。
該誘引剤は、溶媒を除去したあとの乾燥物重量から計算すると、乾燥物を１５重量％含むものであった。
以上のようにして実施例１の骨髄幹細胞の誘引剤を製造した。実施例１の誘引剤がデアセチルサイトカラシンＣを含むことは、続く実施例２の誘引剤を核磁気共鳴法（ＮＭＲ）、質量分析（ＭＳ）法により解析した結果によって示す。【００４５】
（実施例２）
実施例１の骨髄幹細胞の誘引剤に対して、さらに精製処理を施すことにより実施例２の誘引剤を製造した。詳しくは、実施例１の骨髄幹細胞の誘引剤に対して固相抽出カートリッジを用いて粗精製の処理を施し、該処理を施した後に９０容量％アセトニトリルで溶出させたものに対して、さらに高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製処理を施した。詳細について、以下に説明する。
・粗精製（固相抽出カートリッジ）
商品名「Oasis  HLB」（ウォーターズ社製）  200 mg/6 cc
続いて、ＨＰＬＣを用いた精製処理によって、粗精製された液を２５のフラクションに分画した（第１分画操作）。第１分画操作におけるＨＰＬＣ条件を下記に示す。
・ＨＰＬＣ条件（第１分画操作）
分画：リテンションタイム３分以降、１０分間隔で分画
カラム：Ｃ１８逆相カラム
（品名：「Cosmosil 5C18-AR-II」250×10 mm  ナカライテスク社製）
カラム温度：２５℃
移動相流速：４ｍＬ／分
移動相グラジエント条件：
０分−１０％の１％ギ酸水溶液／５０％水／４０％アセトニトリル  混合液
２３分−１０％の１％ギ酸水溶液／９０％アセトニトリル  混合液
２８分−アセトニトリル（１００％）
第１分画操作によって得られた各フラクションについては、生体外における細胞誘引試験（後述）を行い、最も細胞誘引性能に優れた分画（６番目）について、ＨＰＬＣを用いてさらなる分画操作を行った（第２分画操作）。第２分画操作におけるＨＰＬＣ条件を下記に示す。
・ＨＰＬＣ条件（第２分画操作）
分画：リテンションタイム０分以降、１０分間隔で計２５のフラクションに分画
カラム：Ｃ１８逆相カラム
（品名：「Cosmosil 5C18-AR-II」250×4.6 mm  ナカライテスク社製）
カラム温度：２５℃
移動相流速：０．８５ｍＬ／分
移動相グラジエント条件：
０分−１０％の１％ギ酸水溶液／５０％水／４０％アセトニトリル  混合液
２０分−１０％の１％ギ酸水溶液／２０％水／７０％アセトニトリル  混合液
２２分−アセトニトリル（１００％）
上記の第２分画操作で得られたフラクションのうち、後述する生体外における細胞誘引試験において最も細胞誘引性能に優れたもの（１０番目）の溶媒を除去し、固形物（白色粉体）を得て、実施例２の誘引剤を製造した。【００４６】
実施例２の誘引剤で製造した白色粉体については、１次元及び２次元の核磁気共鳴法（１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ）、及び、質量分析法（ＭＳ）によって、デアセチルサイトカラシンＣであると同定した。測定方法の詳細について、以下に示す。【００４７】
＜核磁気共鳴法＞
・測定条件
測定装置：日本電子社製  装置名「ＪＮＭ−ＥＣＡ」
溶媒：ＣＤ３ＯＤ
１次元ＮＭＲ：１Ｈ−ＮＭＲ（600MHz）
１３Ｃ−ＮＭＲ（150MHz）
２次元ＮＭＲ：Ｈ−Ｈ ＣＯＳＹ （600MHz）
ＨＭＱＣ （600MHz）
ＨＭＢＣ （600MHz）
１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、Ｈ−Ｈ ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣの各スペクトルデータをそれぞれ図１〜図５に示す。【００４８】
＜質量分析法＞
・測定条件
測定装置：アプライドバイオシステムズ社製  装置名「Voyager DE-STR」
測定方法：マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（正イオン検出））
マトリックス：α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸
スペクトルデータを図６に示す。【００４９】
実施例２で得られた物質の１次元ＮＭＲアサインデータと、デアセチルサイトカラシンＣの１次元ＮＭＲアサインデータとの対照表を図７に示す。図７におけるデアセチルサイトカラシンＣの１次元ＮＭＲアサインデータは、Fujii, Y.ら, J. Nat. Prod., 2000, 63,132-135を参照した。また、図７中に＊を付したものは、溶媒の影響による明瞭でないシグナルであると判断した。
さらに、デアセチルサイトカラシンＣの分子構造に位置番号が付与されたものを図８に示す。【００５０】
（実施例３）
エウペニシリウム  ルドウィギイ（Eupenicillium ludwigii）を培養することにより、培養後の培地及び菌体を含む粗培養物を得た。粗培養物に対して抽出処理を施して培養抽出物を得て、骨髄幹細胞の誘引剤を製造した。その詳細について以下に説明する。
即ち、まず、グリセロールストックから取り出した菌体を傾斜培地（麦芽エキス寒天培地（ＭＡ培地））に植え付け、１週間の前培養を行った。次に、前培養後の菌体を白金耳で取り出し、５ｍＬの滅菌生理食塩水に懸濁させた後、下記組成の培地が入った１５０ｍＬ容量のポリプロピレン製フラスコ内に懸濁液の全部を入れて植菌し、静置培養（２５℃、１２日間）した。
・培地組成
そば粉            １０ｇ
ＳＢ溶液          １０ｍＬ  （計２０ｇ／フラスコ）
・ＳＢ溶液の組成
酒石酸ナトリウム                      0.005%
ＫＨ２ＰＯ４                            0.005%
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                    0.005%
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                    0.0005%
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                    0.0005%
酵母エキス（オリエンタル酵母社製）    0.01%
水                                    残部
続いて、培養後の培地及び菌体の混合液（粗培養物）２４０μＬに対して、抽出溶媒としての１００％ブタノール（１００μＬ）を用いて抽出処理を施し、遠心分離により分離した上清を凍結乾燥して溶媒を除去した。
さらに、ブタノールで抽出した後の凍結乾燥物に５０μＬのメタノールを加え、ボルテックスミキサーによって３０分間撹拌して懸濁させた後、１３，５００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心分離によって上清を得た。
このようにして、エウペニシリウム  ルドウィギイ（Eupenicillium ludwigii）の培養抽出物を含む骨髄幹細胞の誘引剤を製造した。
該誘引剤は、溶媒を除去したあとの乾燥物重量から計算すると、乾燥物を２重量％含むものであった。【００５１】
（実施例４）
エウペニシリウム  ルドウィギイ（Eupenicillium ludwigii）に代えて、タラロマイセス  トラキスペルムス（Talaromyces trachyspermus）を用いた点以外は、実施例３と同様にして骨髄幹細胞の誘引剤を製造した。該誘引剤は、乾燥物を２重量％含むものであった。【００５２】
製造した各実施例の骨髄幹細胞の誘引剤を使用し、生体外における細胞誘引試験による評価を行った。図９は、該評価方法の様子を模式的に示したものである。以下、図９を参照しながら評価方法の詳細を説明する。【００５３】
＜生体外における細胞誘引試験＞
実施例２のデアセチルサイトカラシンＣの濃度が６．３μＭ、２１μＭ、及び６３μＭの濃度になるように、また、実施例１，３及び４の誘引剤が０．０１容量％、０．１容量％、又は１容量％になるように希釈し、試験用サンプルを調製した。
希釈には、ダルベッコ変法イーグル培地［ＤＭＥＭ「ＦＢＳ（−）、Ｐ／Ｓ（−）」］を用いた。ここで、［  ］内におけるＦＢＳは、１０％ウシ胎児血清を示し、Ｐ／Ｓは、１００ユニットペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを示している。また（−）の記号は、配合していないことを示している。
一方、陰性対照サンプル（以下、Ｎ．Ｃ．ともいう）として、ＤＭＥＭ「ＦＢＳ（−）、Ｐ／Ｓ（−）」を用意し、陽性対照サンプル（以下、Ｐ．Ｃ．ともいう）として、２０ｎｇ／ｍＬ  ＰＤＧＦ−ＢＢ（血小板由来成長因子  ＰＥＰＲＯ  ＴＥＣＨ社製）を用意した。
また、マウス骨髄間葉系幹細胞（以下、ｍＭＳＣともいう）をコンフルエントまで培養して回収し、１０％  ＦＢＳ／ＤＭＥＭ「Ｐ／Ｓ（−）」で１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁し、細胞懸濁液を用意した。
次に、複数の独立したウェルを備え、図９（ａ）に示すようにメンブレンＭによりウェルが上部ウェルＰと下部ウェルＱとに仕切られているボイデンチャンバー（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ社製）を用意した。各試験用サンプルのいずれか１種と陰性対照サンプル及び陽性対照サンプルとが同一のボイデンチャンバーにおいて試験できるように設定し、該チャンバーの各下部ウェルに各サンプルをそれぞれ２８μＬずつアプライした。なお、ボイデンチャンバーのメンブレンとしては、商品名「Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ」（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ社製  細孔サイズ８μｍ）を用いた。
続いて、上部ウェルＰに上記細胞懸濁液を５０μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した（図９（ｂ）を参照）。
４時間培養後、図９（ｃ）に示すように、移動していないｍＭＳＣを付属のフィルターワイパーＲではぎ取り、メンブレンの下側へ移動したｍＭＳＣのみをディフ・クイック染色（Ｓｙｓｍｅｘ社製キットを使用）により染色した。
そして、染色像をデジタル化してコンピュータに取り込み、画像を黒と白に２値化すべく青色に染色された部分が白色になるように変換したうえで、各ウェル範囲内の輝度の平均値を画像編集ソフトウェア（商品名「フォトショップ」）の機能を用いて測定した。陰性対照サンプルおよび陽性対照サンプルにおける輝度を各試験用サンプルにおける輝度と比較することにより、骨髄幹細胞の誘引剤のｍＭＳＣ誘引活性を評価した。【００５４】
実施例１の誘引剤における評価結果を、染色像及び輝度のグラフによって図１０（ａ）に示す。また、実施例２の誘引剤における評価結果を同様に図１０（ｂ）に示す。
実施例３及び４の誘引剤における評価結果を同様にそれぞれ図１１（ａ），（ｂ）に示す。
さらに、参考実験として、陽性対照サンプルであるＰＤＧＦ−ＢＢの濃度を変えて上記と同様の方法で細胞誘引試験を行った。その結果を図１２に示す。【００５５】
実施例２における第１分画操作によって分画した各フラクション、陰性対照サンプル、及び陽性対照サンプルにおける試験の評価結果について、縦軸に輝度を示したグラフを図１３に示す。
また、実施例２における第２分画操作によって分画した各フラクション、陰性対照サンプル、及び陽性対照サンプルにおける試験の評価結果について、縦軸に輝度を示したグラフを図１４に示す。【００５６】
＜マウスの生体における細胞誘引試験＞
実施例１で製造した誘引剤（メタリジウム  アニソプリエ（Metarhizium anisopliae）の培養抽出物）、及び、実施例２で製造した誘引剤（デアセチルサイトカラシンＣ）を使用して、生体における細胞誘引試験を行った。試験は、マトリゲルプラグ法を採用することにより行った。試験方法の詳細を以下に示す。
実施例１の誘引剤が１．７重量％濃度（０．０３重量％のデアセチルサイトカラシンＣ濃度に相当）となるように、また、実施例２の誘引剤が８０μＭ濃度のデアセチルサイトカラシンＣ濃度となるように、それぞれの誘引剤及び細胞外基底膜のゲル（マトリゲル）を混合し、樹脂性チューブに入れた。
続いて、上記のごとく用意したチューブを７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの背部（左右）に移植し、２週間飼育した。飼育後、移植したチューブを取り出し、チューブ内のマトリゲルを溶解させてチューブ内の細胞を回収した。
さらに、陰性対照サンプルとして、上記マトリゲルのみを入れた同様のチューブを用意し、また、陽性対照サンプルとして、５００ｎｇ／ｍＬ濃度となる線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）を含むチューブを用意した。そして、同様にして細胞誘引試験を行った。
試験後のチューブに誘引された細胞における蛍光強度を測定することにより、実施例の誘引剤、陰性対照、及び陽性対照の細胞誘引能を比較した。詳しくは、チューブから回収された細胞にＦＩＴＣ標識レクチンを結合させ、測定波長４８５ｎｍ、対照波長５１０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。なお、各試験においてマウスの数は、４匹とし、得られた値（蛍光強度）の平均値を評価結果とした。【００５７】
一方、７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスにエックス線を１０Ｇｙ（グレイ）照射することによって、骨髄細胞を死滅させた。このマウスに対し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で標識されたマウスの骨髄細胞（４×１０６ cells）を移植した。
６週間後、移植を受けたマウスの骨髄に含まれるＧＦＰ陽性の細胞の割合をフローサイトメトリー（日本ベクトンディッキンソン社製、機器名「BD FACSCantoII  フローサイトメーター」を使用）により解析した結果、骨髄細胞の約９８％がＧＦＰ陽性であった。
さらに、上記と同様にして、試験サンプル、陰性対照サンプル、陽性対照サンプルのチューブを用いて細胞誘引試験を行い、回収した細胞をフローサイトメトリーにより解析した結果、各サンプルのマトリゲルに含まれる細胞の９０％以上がＧＦＰ陽性であった。このことから、マトリゲル内に誘引された細胞の９０％以上が骨髄由来であると判断した。なお、骨髄細胞は、主に骨髄幹細胞で構成されている。【００５８】
細胞誘引試験の結果について、蛍光強度を示したグラフを図１５及び図１６に示す。詳しくは、図１５は、実施例１の誘引剤（メタリジウム  アニソプリエ（Metarhizium anisopliae）の培養抽出物）、陰性対照、及び陽性対照における結果を示している。また、図１６は、実施例２の誘引剤（デアセチルサイトカラシンＣ）、陰性対照、及び陽性対照における結果を示している。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明の骨髄幹細胞の誘引剤及び骨髄幹細胞の誘引方法は、例えば、所定の体内組織において骨髄幹細胞を分化させる前に、骨髄で生じた骨髄幹細胞を所定の体内組織に誘引するために使用される。即ち、例えば、所定の体内組織に誘引剤を注入又は塗布することにより、血流にのって体内を循環している骨髄幹細胞をその体内組織に誘引して集積させる目的で好適に使用される。
【符号の説明】
【００６０】
Ｐ：上部ウェル、  Ｑ：下部ウェル、  Ｍ：メンブレン、  Ｒ：フィルターワイパー
【図１】
2012063514.tif 000004
【図２】
2012063514.tif 000005
【図３】
2012063514.tif 000006
【図４】
2012063514.tif 000007
【図５】
2012063514.tif 000008
【図６】
2012063514.tif 000009
【図７】
2012063514.tif 000010
【図８】
2012063514.tif 000011
【図９】
2012063514.tif 000012
【図１０】
2012063514.tif 000013
【図１１】
2012063514.tif 000014
【図１２】
2012063514.tif 000015
【図１３】
2012063514.tif 000016
【図１４】
2012063514.tif 000017
【図１５】
2012063514.tif 000018
【図１６】
2012063514.tif 000019
【国際調査報告】
2012063514.tif 000020
2012063514.tif 000021