(57)【要約】  抗原の検出の感度及び精度を向上する表面プラズモン励起蛍光計測装置及び表面プラズモン励起蛍光計測方法を提供する。分析チップの抗原捕捉体に抗原が捕捉され、抗原捕捉体に捕捉された抗原に蛍光標識抗体が結合させられる。励起光が分析チップへ入射したときに蛍光標識から放射される表面プラズモン励起蛍光の光量が測定される。抗原捕捉体に抗原が捕捉された後であって蛍光標識抗体が抗原に結合させられる前に共鳴角θｒが測定される。共鳴角θｒから測定角θｍが決定される。反射面への励起光の入射角θが共鳴角θｒに設定され、表面プラズモン励起蛍光の光量が測定される。
2012108323.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン励起蛍光計測装置であって、
励起光を放射する光源と、
励起光が入射する入射面、前記入射面へ入射した励起光を全反射する反射面及び前記反射面に全反射された励起光が出射する出射面を備え、励起光に対して透明な誘電体媒体と、
前記反射面に密着する第１の主面及び前記反射面に密着しない第２の主面を備える導電体膜と、
抗原と結合する抗体を含み、前記第２の主面に定着する抗原捕捉体と、
前記反射面への励起光の入射角を調整する調整機構と、
前記導電体膜及び前記抗原捕捉体から前記第２の主面が向く方向へ出射する光の光量を測定する光量センサと、
試料及び抗原と結合する蛍光標識抗体を含む蛍光標識抗体含有物を前記抗原捕捉体に接触させる接触機構と、
前記接触機構に前記試料を前記抗原捕捉体へ接触させる第１の反応制御部と、
前記試料が前記抗原捕捉体へ接触させられた後に前記調整機構に入射角を走査させながら前記光量センサから光量の測定結果を取得し、入射角と光量との関係を得る第１の走査制御部と、
前記入射角と光量との関係が得られた後に前記接触機構に前記蛍光標識抗体含有物を前記抗原捕捉体へ接触させる第２の反応制御部と、
前記入射角と光量との関係から光量が極大になる共鳴角を特定し、前記共鳴角から測定が行われる測定角を決定する入射角決定部と、
前記調整機構に入射角を前記測定角に設定させる入射角設定部と、
前記蛍光標識抗体含有物が前記抗原捕捉体へ接触させられた後であって入射角が前記測定角に設定された後に前記光量センサから光量の測定結果を取得する第１の測定制御部と、
を備える表面プラズモン励起蛍光計測装置。
【請求項２】
表面プラズモン励起蛍光計測装置であって、
励起光を放射する光源と、
励起光が入射する入射面、前記入射面へ入射した励起光を全反射する反射面及び前記反射面に全反射された励起光が出射する出射面を備え、励起光に対して透明な誘電体媒体と、
前記反射面に密着する第１の主面及び前記反射面に密着しない第２の主面を備える導電体膜と、
抗原と結合する抗体を含み、前記第２の主面に定着する抗原捕捉体と、
前記反射面への励起光の入射角を調整する調整機構と、
前記出射面から出射する光の光量を測定する反射光量センサと、
前記導電体膜及び前記抗原捕捉体から前記第２の主面が向く方向へ出射する光の光量を測定する光量センサと、
試料及び抗原と結合する蛍光標識抗体を含む蛍光標識抗体含有物を前記抗原捕捉体へ接触させる接触機構と、
前記接触機構に前記試料を前記流路へ注入させる第１の反応制御部と、
前記試料が前記抗原捕捉体へ接触させられた後に前記調整機構に入射角を走査させながら前記反射光量センサから光量の測定結果を取得し入射角と光量との関係を得る第１の走査制御部と、
前記入射角と光量との関係が得られた後に前記接触機構に前記蛍光標識抗体含有物を前記抗原捕捉体へ接触させる第２の反応制御部と、
前記入射角と光量との関係から光量が極小になる共鳴角を特定し、前記共鳴角から測定が行われる測定角を決定する入射角決定部と、
前記調整機構に入射角を前記測定角に設定させる入射角設定部と、
前記蛍光標識抗体含有物が前記抗原捕捉体へ接触させられた後であって入射角が前記測定角に設定された後に前記光量センサから光量の測定結果を取得する第１の測定制御部と、
を備える表面プラズモン励起蛍光計測装置。
【請求項３】
請求項１又は請求項２の表面プラズモン励起蛍光計測装置において、
前記蛍光標識抗体含有物が前記抗原捕捉体に接触させられる前であって入射角が前記測定角に設定された後に前記光量センサから光量の測定結果を取得する第２の測定制御部と、
前記第１の測定制御部に取得された光量の測定結果から前記第２の測定制御部に取得された光量の測定結果を減ずる第１の補正部と、
をさらに備える表面プラズモン励起蛍光計測装置。
【請求項４】
請求項３の表面プラズモン励起蛍光計測装置において、
前記調整機構は、前記反射面における励起光の照射位置を調整し、
前記表面プラズモン励起蛍光計測装置は、
前記調整機構に照射位置を走査させながら前記光量センサから光量の測定結果を取得し、照射位置と光量との関係を得る第２の走査制御部と、
前記照射位置と光量との関係から光量が極大値から同値だけ減少する第１の照射位置及び第２の照射位置を特定し、前記第１の照射位置及び前記第２の照射位置の中間を測定が行われる測定位置に決定する照射位置決定部と、
前記調整機構に照射位置を前記測定位置に設定させる照射位置設定部と、
をさらに備える表面プラズモン励起蛍光計測装置。
【請求項５】
請求項１又は請求項２の表面プラズモン励起蛍光計測装置において、
前記調整機構は、励起光が前記入射面へ導かれる非遮断状態と導かれない遮断状態とを切り替え、
前記表面プラズモン励起蛍光計測装置は、
前記調整機構を一時的に前記遮断状態にする遮断制御部と、
前記調整機構が前記遮断状態にされている間に前記光量センサから光量の測定結果を取得する第３の測定制御部と、
前記第１の測定制御部に取得された光量の測定結果から前記第３の測定制御部に取得された光量の測定結果を減ずる第２の補正部と、
をさらに備える表面プラズモン励起蛍光計測装置。
【請求項６】
請求項１又は請求項２の表面プラズモン励起蛍光計測装置において、
励起光の偏光方向を調整する偏光方向調整機構と、
前記偏光方向調整機構に偏光方向を走査させながら前記光量センサから光量の測定結果を取得し、偏光方向と光量との関係を得る偏光方向走査部と、
前記偏光方向と光量との関係から光量が極大になる偏光方向を特定し、測定が行われる測定偏光方向を決定する偏光方向決定部と、
前記偏光方向調整機構に偏光方向を前記測定偏光方向に設定させる偏光方向設定部と、
をさらに備える
表面プラズモン励起蛍光計測装置。
【請求項７】
請求項１又は請求項２の表面プラズモン励起蛍光計測装置において、
励起光と同じ波長の光を選択的に減衰させるバンドパスフィルタと、
前記導電体膜及び前記抗原捕捉体から前記第２の主面が向く方向へ出射する光の光路に前記バンドパスフィルタを挿抜する挿抜機構と、
前記第１の測定制御部に光量の測定結果が取得される間に前記挿抜機構に前記バンドパスフィルタを挿入させる挿抜制御部と、
をさらに備える
表面プラズモン励起蛍光計測装置。
【請求項８】
表面プラズモン励起蛍光計測方法であって、
(a)  入射面、反射面及び出射面を備え励起光に対して透明な誘電体媒体、前記反射面に密着する第１の主面及び前記反射面に密着しない第２の主面を備える導電体膜並びに抗原と結合する抗体を含み前記第２の主面に定着する抗原捕捉体を備える構造体を準備する工程と、
(b)  試料を準備する工程と、
(c)  抗原と結合する蛍光標識抗体を含む蛍光標識抗体含有物を準備する工程と、
(d)  前記試料を前記抗原捕捉体に接触させる工程と、
(e)  前記入射面へ入射し前記反射面に全反射され前記出射面から出射する励起光を前記構造体に照射する工程と、
(f)  前記工程(d)の後に前記反射面への励起光の入射角を走査しながら第２の主面が向く方向へ出射する散乱光の光量を測定し、入射角と光量との関係を得る工程と、
(g)  前記工程(f)の後に前記蛍光標識抗体含有物を前記抗原捕捉体に接触させる工程と、
(h)  散乱光の光量が極大になる共鳴角を前記入射角と光量との関係から特定し、前記共鳴角から測定が行われる測定角を決定する工程と、
(i)  入射角を前記測定角に設定する工程と、
(j)  前記工程(g)及び前記工程(i)の後に表面プラズモン励起蛍光の光量を測定する工程と、
を備える表面プラズモン励起蛍光計測方法。
【請求項９】
表面プラズモン励起蛍光計測方法であって、
(a)  入射面、反射面及び出射面を備え励起光に対して透明な誘電体媒体、前記反射面に密着する第１の主面及び前記反射面に密着しない第２の主面を備える導電体膜並びに抗原と結合する抗体を含み前記第２の主面に定着する抗原捕捉体を備える構造体を準備する工程と、
(b)  試料を準備する工程と、
(c)  抗原と結合する蛍光標識抗体を含む蛍光標識抗体含有物を準備する工程と、
(d)  前記試料を前記抗原捕捉体に接触させる工程と、
(e)  前記入射面へ入射し前記反射面に全反射され前記出射面から出射する励起光を前記構造体に照射する工程と、
(f)  前記工程(d)の後に前記反射面への励起光の入射角を走査しながら前記出射面から出射する反射光の光量を測定し、入射角と光量との関係を得る工程と、
(g)  前記工程(f)の後に前記蛍光標識抗体含有物を前記抗原捕捉体に接触させる工程と、
(h)  反射光の光量が極小になる共鳴角を前記入射角と光量との関係から特定し、前記共鳴角から測定が行われる測定角を決定する工程と、
(i)  入射角を前記測定角に設定する工程と、
(j)  前記工程(g)及び前記工程(i)の後に表面プラズモン励起蛍光の光量を測定する工程と、
を備える表面プラズモン励起蛍光計測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン励起蛍光計測装置及び表面プラズモン励起蛍光計測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
誘電体媒体の中を進む励起光が金属膜と誘電体媒体との界面に全反射された場合は、界面からエバネッセント波がもれだし、金属膜の中のプラズモンとエバネッセント波とが干渉する。界面への励起光の入射角が共鳴角に設定されプラズモンとエバネッセント波とが共鳴する場合にエバネッセント波の電場は著しく増強される。表面プラズモン励起蛍光分光法（ＳＰＦＳ）においては、この増強された電場が用いられる。すなわち、金属膜の表面に抗原が捕捉され、捕捉された抗原が蛍光標識され、増強された電場が蛍光標識に作用させられる。増強された電場が蛍光標識に作用した場合は、蛍光標識から蛍光が放射される。表面プラズモン励起蛍光分光法においては、蛍光標識から放射された蛍光の光量が測定される。【０００３】
特許文献１は、表面プラズモン励起蛍光分光法による抗原の検出に関する。特許文献１においては、抗原が蛍光標識された後に共鳴角が測定される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４３７０３８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
電場の増強度は励起光の入射角が共鳴角に設定された場合に著しく大きくなるので、表面プラズモン励起蛍光分光法により抗原を検出する場合には共鳴角を正確に特定することが重要である。【０００６】
しかし、従来の技術においては、抗原が捕捉される前に共鳴角が測定され、抗原濃度等による共鳴角の変化及び変化量のばらつきが無視され、共鳴角が正確に特定されていなかった。又は、特許文献１のように、抗原が蛍光標識された後に共鳴角が測定され、蛍光色素の退色の原因となっていた。これらはいずれも、表面プラズモン励起蛍光の光量が減少する原因になり、表面プラズモン励起蛍光の光量のばらつきが大きくなる原因になっている。したがって、従来の技術においては、抗原の検出の感度及び精度が十分でなかった。【０００７】
本発明は、この問題を解決するためになされる。本発明の目的は、抗原の検出の感度及び精度を向上する表面プラズモン励起蛍光計測装置及び表面プラズモン励起蛍光計測方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１から第７までの局面は、表面プラズモン励起蛍光計測装置に関する。【０００９】
（１）第１の局面においては、誘電体媒体、導電体膜及び抗原捕捉体が設けられる。誘電体媒体は、励起光に対して透明である。導電体膜の第１の主面は誘電体媒体の反射面に密着する。導電体膜の第２の主面は誘電体媒体の反射面に密着しない。抗原捕捉体は第２の主面に定着する。抗原捕捉体は抗原と結合する抗体を含む。【００１０】
光源から放射される励起光は誘電体媒体の入射面へ入射する。入射面へ入射した励起光は反射面に全反射される。反射面に全反射された励起光は出射面から出射する。【００１１】
反射面への励起光の入射角が走査されながら導電体膜及び抗原捕捉体から第２の主面が向く方向へ出射する光の光量が測定され、入射角と光量との関係が得られる。入射角と光量との関係から光量が極大になる共鳴角が特定され、共鳴角から測定角が決定される。入射角が測定角に設定され、導電体膜及び抗原捕捉体から第２の主面が向く方向へ出射する光の光量が測定され、第１の測定結果が取得される。【００１２】
試料が抗原捕捉体へ接触した後であって蛍光標識抗体含有物が抗原捕捉体へ接触する前に入射角と光量との関係が得られる。蛍光標識抗体含有物は蛍光標識され抗原と結合する蛍光標識抗体を含む。【００１３】
（２）第１の局面と第２の局面との違いは、共鳴角の特定にある。第２の局面においては、反射面への励起光の入射角が走査されながら反射面から出射する光の光量が測定され、入射角と光量との関係から光量が極小になる共鳴角が特定される。【００１４】
（３）第３の局面は、第１又は第２の局面にさらなる事項を付加する。第３の局面においては、蛍光標識抗体含有物が抗原捕捉体に接触させられる前であって入射角が測定角に設定された後に導電体膜及び抗原捕捉体から第２の主面が向く方向へ出射する光の光量が測定され、第２の測定結果が取得される。また、第１の測定結果から第２の測定結果が減じられる。【００１５】
（４）第４の局面は、第３の局面にさらなる事項を付加する。第４の局面においては、励起光の照射位置が走査されながら導電体膜及び抗原捕捉体から第２の主面が向く方向へ出射する光の光量が測定され、照射位置と光量との関係が得られる。照射位置と光量との関係から光量が極大値から同値だけ減少する第１の照射位置及び第２の照射位置が特定され、第１の照射位置及び第２の照射位置の中間が測定位置に決定される。照射位置は測定位置に設定される。【００１６】
（５）第５の局面は、第１から第４までのいずれかの局面にさらなる事項を付加する。第５の局面においては、励起光が入射面へ導かれない遮断状態において導電体膜及び抗原捕捉体から第２の主面が向く方向へ出射する光の光量が測定され、第３の測定結果が取得される。また、第１の測定結果から第３の測定結果が減じられる。【００１７】
（６）第６の局面は、第１から第５までのいずれかの局面にさらなる事項を付加する。第６の局面においては、励起光の偏光方向が走査されながら導電体膜及び抗原捕捉体から第２の主面が向く方向へ出射する光の光量が測定され、偏光方向と光量との関係が得られる。偏光方向と光量との関係から光量が極大になる偏光方向が特定され、測定が行われる測定偏光方向が決定される。偏光方向は測定方法に設定される。【００１８】
（７）第７の局面は、第１から第６までのいずれかの局面にさらなる事項を付加する。第７の局面においては、第１の測定結果を得るために光量が測定されている間に励起光と同じ波長の光を選択的に減衰させるバンドパスフィルタが導電体膜及び抗原捕捉体から第２の主面が向く方向へ出射する光の光路に挿入される。【００１９】
本発明の第８及び第９の局面は、表面プラズモン励起蛍光計測方法に関する。【００２０】
（８）第８の局面においては、誘電体媒体、導電体膜及び抗原捕捉体を備える構造体が準備される。誘電体媒体は、励起光に対して透明である。導電体膜の第１の主面は誘電体媒体の反射面に密着する。導電体膜の第２の主面は誘電体媒体の反射面に密着しない。抗原捕捉体は抗原と結合する抗体を含む。抗原捕捉体は第２の主面に密着定着する。【００２１】
光源から放射される励起光は誘電体媒体の入射面へ入射し反射面に全反射され出射面から出射する。【００２２】
反射面への励起光の入射角が走査されながら散乱光の光量が測定され、入射角と光量との関係が得られる。入射角と光量との関係から光量が極大になる共鳴角が特定され、共鳴角から測定角が決定される。入射角が測定角に設定され、表面プラズモン励起蛍光の光量が測定される。【００２３】
試料が抗原捕捉体へ接触した後であって蛍光標識抗体含有物が抗原捕捉体へ接触する前に入射角と光量との関係が得られる。蛍光標識抗体含有物は蛍光標識され抗原と結合する蛍光標識抗体を含む。【００２４】
（９）第８の局面と第９の局面との違いは、共鳴角の特定にある。第９の局面においては、反射面への励起光の入射角が走査されながら反射光の光量が測定され、入射角と光量との関係から光量が極小になる共鳴角が特定される。
【発明の効果】
【００２５】
第１、第２、第８及び第９の局面によれば、試料が抗原捕捉体に接触した後に入射角と光量との関係が測定され、試料中の抗原濃度等によらず共鳴角が正確に特定される。また、蛍光標識抗体含有物が抗原捕捉体に接触する前に入射角と光量との関係が測定され、蛍光色素が励起光により退色しにくくなる。これらにより、抗原の検出の感度及び精度が向上する。【００２６】
第１及び第８の局面によれば、共鳴角と電場の増強度が最大になる入射角とのずれが小さくなり、抗原の検出の感度及び精度が向上する。【００２７】
本発明の第３の局面によれば、自家蛍光の光量の測定結果が減ぜられ、自家蛍光の影響が抑制され、抗原の検出の感度及び精度が向上する。【００２８】
本発明の第４の局面によれば、測定領域における励起光の光路長が一定になり、自家蛍光の光量の影響が一定になり、抗原の検出の感度及び精度が向上する。【００２９】
本発明の第５の局面によれば、暗ノイズの測定結果が減ぜられ、暗ノイズの影響が抑制され、抗原の検出の感度及び精度が向上する。【００３０】
本発明の第６の局面によれば、誘電体媒体の複屈折によるＰ波成分の減少が解消し、抗原の検出の感度及び精度が向上する。【００３１】
本発明の第７の局面によれば、主に表面プラズモン励起蛍光が光量センサへ導かれ、抗原の検出の感度及び精度が向上する。【００３２】
これらの及びこれら以外の本発明の目的、特徴、局面及び利点は、添付図面とともに考慮されたときに下記の本発明の詳細な説明によってより明白となる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】表面プラズモン励起蛍光計測装置の実施形態を示す模式図である。
【図２】制御演算部のブロック図である。
【図３】分析チップの断面図である。
【図４】レーザーダイオードユニットの模式図である。
【図５】第１の整波器の模式図である。
【図６】偏光方向調整機構の模式図である。
【図７】入射角調整機構の模式図である。
【図８】測定光光学系の模式図である。
【図９】反応領域、測定領域及び照射領域の関係を示す平面図である。
【図１０】抗原の検出の手順の概略のフローチャートである。
【図１１】測定の準備の手順のフローチャートである。
【図１２】入射角の測定角への設定の手順のフローチャートである。
【図１３】照射位置の最適化の手順のフローチャートである。
【図１４】照射位置と散乱光の光量との関係を示すグラフである。
【図１５】励起光の偏光方向の最適化の手順のフローチャートである。
【図１６】表面プラズモン励起蛍光の光量の測定の手順を示すフローチャートである。
【図１７】反射光量センサが付加された状態を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
（計測の概略）
この望ましい実施形態は、表面プラズモン励起蛍光分光法により抗原を検出する表面プラズモン励起蛍光計測装置及び表面プラズモン励起蛍光計測方法に関する。
【００３５】
この望ましい実施形態においては、分析チップの抗原捕捉体に抗原が捕捉され、抗原捕捉体に捕捉された抗原に蛍光標識抗体が結合させられる。励起光が分析チップへ入射したときに蛍光標識から放射される表面プラズモン励起蛍光の光量が測定される。抗原捕捉体に抗原が捕捉された後であって蛍光標識抗体が抗原に結合させられる前に共鳴角θｒが測定される。抗原捕捉体に抗原が捕捉された後に共鳴角θｒが測定されるので、抗原濃度等の共鳴角θｒのかく乱要因にかかわらず共鳴角θｒが正確に特定される。蛍光標識抗体が抗原に結合させられる前に共鳴角θｒが測定されるので、蛍光色素が励起光により退色しにくくなる。これらにより、抗原の検出の精度及び感度が向上する。
【００３６】
（表面プラズモン励起蛍光計測装置の概略）
図１の模式図は、表面プラズモン励起蛍光計測装置の望ましい実施形態を示す。
【００３７】
表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００においては、レーザーダイオードユニット１００２から放射された励起光９０００が励起光光学系１００４により分析チップ１００６へ導かれる。分析チップ１００６へ励起光９０００が入射している間は、分析チップ１００６から測定光９００２及び反射光９００４が出射する。測定光９００２は、測定光光学系１００８により光電子増倍管１０１０へ導かれる。反射光９００４は、光吸収体１０１２に吸収される。
【００３８】
分析チップ１００６には、送液機構１０１４により試料液９００６及び蛍光標識液９００８が順次に注入される。分析チップ１００６は、測定が行われるときには、測定室１０１６に配置され、分析チップ保持機構１０１８に保持される。分析チップ１００６は、試料液９００６又は蛍光標識液９００８が注入されるときには、前処理室１０２０に配置される。分析チップ１００６は、分析チップ搬送機構１０２２により、前処理室１０２０から測定室１０１６へロードされ、測定室１０１６から前処理室１０２０へアンロードされる。分析チップ１００６は、望ましくは、表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００に対して着脱され、検体９０２０ごとに交換される。ただし、分析チップ１００６が再利用されてもよい。
【００３９】
試料液９００６が分析チップ１００６に注入された後であって蛍光標識液９００８が分析チップ１００６に注入される前に、入射角調整機構１０３４により励起光９０００の入射角θが走査され、測定光９００２の光量が光電子増倍管１０１０に測定され、共鳴角θｒが特定される。蛍光標識液９００８が分析チップ１００６に注入され入射角θが測定角θｍに設定された後に、測定光９００２の光量が光電子増倍管１０１０に測定される。測定結果は、ディスプレイ１０２４に表示される。
【００４０】
表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００の構成物は制御演算部１０２６により制御され、制御演算部１０２６においては演算が行われる。
【００４１】
（制御演算部）
図２のブロック図は、制御演算部１０２６を示す。
【００４２】
図２に示される前処理制御部１１０４等の制御演算ブロック群による制御及び演算の内容は、抗原の検出の手順の説明の中で言及される。これらの制御演算ブロック群は、ソフトウエアを実行する組み込みコンピュータである。１個の組み込みコンピュータがこれらの制御演算ブロック群の機能を担ってもよいし、２個以上の組み込みコンピュータが分担してこれらの制御演算ブロック群の機能を担ってもよい。ソフトウエアを伴わないハードウエアがこれらの制御演算ブロック群の全部又は一部の機能を担ってもよい。ハードウエアは、電子回路であってもよいし、リンク機構等の機械的機構であってもよい。
【００４３】
（分析チップ）
図３の模式図は、分析チップの断面を示す。
【００４４】
図３に示すように、分析チップ１００６においては、導電体膜１２００の第１の主面１２０２がプリズム１２０４の反射面１２０６に密着し、導電体膜１２００の第２の主面１２１０は反射面１２０６に密着しない。第２の主面１２１０には、抗原捕捉体１２０８が定着させられ、流路形成体１２１２の接合面１２１４が接合される。プリズム１２０４へ導かれた励起光９０００は入射面１２１６へ入射し、入射面１２１６へ入射した励起光９０００は照射領域１８００において反射面１２０６に全反射され、反射光９００４は出射面１２１８から出射する。散乱光及び蛍光は、導電体膜１２００及び抗原捕捉体１２０８から第２の主面１２１０が向く側へ出射する。反射面１２０６に励起光９０００が全反射条件を満たして入射する場合であって反射面１２０６からしみだすエバネッセント波と導電体膜１２００の中のプラズモンとが共鳴するときには、導電体膜１２００によりエバネッセント波の電場が増強され、散乱光及び蛍光の光量が増加する。分析チップ１００６は、望ましくは、各片の長さが数ｍｍ〜数ｃｍである構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物又はより大型の構造物に置き換えられてもよい。
【００４５】
（プリズム）
プリズム１２０４は台形柱体である。台形柱体の一方の傾斜側面が入射面１２１６にされ、台形柱体の幅広の平行側面が反射面１２０６にされ、台形柱体の他方の傾斜側面が出射面１２１８にされる。プリズム１２０４は、望ましくは、等脚台形柱体である。これにより、入射面１２１６と出射面１２１８とが対称になり、反射光９００４のＳ波成分がプリズム１２０４の内部に滞留しにくくなる。入射面１２１６、反射面１２０６及び出射面１２１８が備えられる限り、プリズム１２０４が台形柱体以外でもよく、プリズム１２０４が「プリズム」の範疇に含まれない形状物に置き換えられてもよい。
【００４６】
プリズム１２０４は、励起光９０００に対して透明な材質からなる誘電体媒体である。プリズム１２０４は、ガラス、樹脂等からなる。プリズム１２０４は、望ましくは、屈折率が１．４〜１．６であって複屈折が小さい樹脂からなる。
【００４７】
（導電体膜）
導電体膜１２００は、表面プラズモン共鳴を発生させる導電体からなる。導電体膜１２００は、望ましくは、金からなる。ただし、導電体膜１２００が、銀、銅、アルミニウム等の金属又はこれらの金属を含む合金からなってもよい。
【００４８】
導電体膜１２００は、薄膜である。導電体膜１２００の膜厚は、望ましくは、３０〜７０ｎｍである。ただし、導電体膜１２００の膜厚がこの範囲外であってもよい。
【００４９】
導電体膜１２００は、スパッタリング、蒸着、メッキ等により形成される。ただし、導電体膜１２００が他の方法により形成されてもよい。
【００５０】
（抗原捕捉体）
抗原捕捉体１２０８は、非流動体からなる。したがって、試料液９００６又は蛍光標識液９００８が抗原捕捉体１２０８に接触しても、抗原捕捉体１２０８は移動しない。
【００５１】
抗原捕捉体１２０８は、検出対象の抗原と結合する抗体を含む。抗体は、均一に分布する。検出対象の抗原を含む試料液９００６が抗原捕捉体１２０８に接触した場合は、試料液９００６に含まれる検出対象の抗原が抗原捕捉体１２０８に含まれる抗体と結合し、試料液９００６に含まれる検出対象の抗原が抗原捕捉体１２０８に捕捉される。
【００５２】
（流路形成体）
流路形成体１２１２には、流路１２２０が形成される。流路１２２０の途中には反応室１２２２がある。反応室１２２２は、接合面１２１４に露出する。反応室１２２２の平面位置と抗原捕捉体１２０８の平面位置とは一致させられ、抗原捕捉体１２０８は反応室１２２２に露出する。流路１２２０へ試料液９００６又は蛍光標識液９００８が注入された場合は、それぞれ、試料液９００６又は蛍光標識液９００８で反応室１２２２が満たされ、試料液９００６又は蛍光標識液９００８が抗原捕捉体１２０８に接触する。流路１２２０は、流路形成体１２１２の非接合面１２２４に露出し、非接合面１２２４には試料液９００６及び蛍光標識液９００８の注入口１２２６が形成される。
【００５３】
接合面１２１４と第２の主面１２１０とは、接着、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ圧着等により接合される。ただし、接合面１２１４と第２の主面１２１０とが他の方法により接合されてもよい。
【００５４】
流路形成体１２１２は、散乱光及び表面プラズモン励起蛍光に対して透明な材質からなる。流路形成体１２１２は、例えば、樹脂等からなる。
【００５５】
流路形成体１２１２は、試料液９００６又は蛍光標識液９００８の飛散を防止し、抗原捕捉体１２０８に接触する試料液９００６又は蛍光標識液９００８の量を一定にすることに寄与する。しかし、流路形成体１２１２が省略され、抗原捕捉体１２０８の上に試料液９００６又は蛍光標識液９００８が直接的に滴下されてもよい。
【００５６】
（レーザーダイオードユニット）
図４の模式図は、レーザーダイオードユニットを示す。
【００５７】
図４に示すように、レーザーダイオードユニット１００２においては、レーザーダイオード１３００から放射されたビーム９０１０がビームスプリッタ１３０２により主ビーム９０１２と副ビーム９０１４とに分割される。主ビーム９０１２は、コリメータ１３０４によりコリメート化され、レーザーダイオードユニット１００２から励起光９０００として放射される。
【００５８】
励起光９０００がコリメート化されても励起光９０００のビームの断面形状は扁平形である。照射領域１８００の平面形状を円形に近づけるために、励起光９０００の光路を含み反射面１２０６に垂直な面に楕円形の短軸が含まれるような姿勢でレーザーダイオード１３００がレーザーダイオード保持機構１３０６により保持される。
【００５９】
レーザーダイオード１３００から放射されるレーザー光の波長及び光量が温度に依存する場合は、望ましくは、レーザーダイオード１３００が温度調整回路１３０８に制御される。温度調整回路１３０８においては、副ビーム９０１４の光量がフォトダイオード１３１０により測定され、副ビーム９０１４の光量の測定結果が一定に維持されるようにレーザーダイオード１３００へ供給される電力が電力供給制御回路１３１２により回帰制御される。これにより、レーザーダイオード１３００の温度が一定に維持され、励起光９０００の波長及び光量が一定に維持される。フォトダイオード１３１０がフォトトランジスタ、フォトレジスタ等の他の光量センサに置き換えられてもよい。励起光９０００の波長は共鳴角θｒ及びエバネッセント波のしみだし量に影響するので、温度調整回路１３０８は抗原の検出の精度及び感度の向上に寄与する。
【００６０】
レーザーダイオード１３００の温度が定常温度になるまでに長時間を要する場合は、表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００の運転が開始されたときからレーザーダイオード１３００へ電力が常時供給される。
【００６１】
レーザーダイオード１３００から放射される励起光９０００の偏光方向は、概ね、特定の方向に偏在する。
【００６２】
レーザーダイオード１３００が発光ダイオード、水銀灯、レーザーダイオード以外のレーザー等の他の光源に置き換えられてもよい。光源から放射される光がビームでない場合は、レンズ、鏡、スリット等により光がビームに変換される。光源から放射される光が単色光でない場合は、回折格子等により光が単色光に変換される。光源から放射される光が直線偏光でない場合は、偏光子等により光が直線偏光に変換される。
【００６３】
（励起光光学系）
図１に示すように、励起光９０００は、励起光光学系１００４によりレーザーダイオードユニット１００２から分析チップ１００６へ導かれる間に、第１の整波器１０２８、偏光方向調整機構１０３０、整形光学系１０３２及び入射角調整機構１０３４を順次に通過する。励起光９０００が第１の整波器１０２８を通過するときに励起光９０００が整波される。励起光９０００が偏光方向調整機構１０３０を通過するときに反射面１２０６に主にＰ波成分が入射するように励起光９０００の偏光方向が調整される。励起光９０００が整形光学系１０３２を通過するときに励起光９０００のビームの断面形状がスリット、ズーム光学系等により整形される。励起光９０００が入射角調整機構１０３４を通過するときに反射面１２０６への励起光９０００の入射角θが調整される。
【００６４】
（第１の整波器）
図５の模式図は、第１の整波器を示す。
【００６５】
図５に示すように、励起光９０００は、第１の整波器１０２８を通過するときに、第１のバンドパスフィルタ１４００、直線偏光フィルタ１４０２及び減光フィルタ１４０４を順次に通過する。第１の整波器１０２８がこれら以外の光学フィルタを備えてもよい。第１の整波器１０２８が光学フィルタ以外の光学素子を備えてもよい。
【００６６】
励起光９０００が第１のバンドパスフィルタ１４００を透過するときに、励起光９０００の波長の分布が狭められる。これにより、レーザーダイオードユニット１００２から放射された励起光９０００の波長の分布が広くても、波長の分布が狭い励起光９０００が得られる。レーザーダイオードユニット１００２から放射された励起光９０００の波長の分布が十分に狭い場合は、第１のバンドパスフィルタ１４００が省略されてもよい。
【００６７】
励起光９０００が直線偏光フィルタ１４０２を透過するときに、励起光９０００の偏光方向の分布が狭められる。これにより、レーザーダイオードユニット１００２から放射された励起光９０００の偏光方向の分布が広くても、偏光方向の分布が狭い励起光９０００が得られる。レーザーダイオードユニット１００２から放射された励起光９０００の偏光方向の分布が十分に狭い場合は、直線偏光フィルタ１４０２が省略されてもよい。
【００６８】
励起光９０００が減光フィルタ１４０４を透過するときに、励起光９０００の光量が減少させられる。レーザーダイオードユニット１００２から放射された励起光９０００の光量が適切である場合は、減光フィルタ１４０４が省略されてもよい。
【００６９】
（偏光方向調整機構）
図６の模式図は、偏光方向調整機構を示す。
【００７０】
図６に示すように、偏光方向調整機構１０３０においては、半波長板１５００に垂直な回転軸の周りに半波長板１５００が半波長板回転機構１５０２により回転させられる。半波長板回転機構１５０２は、ロータリーステッピングモータ等により半波長板１５００を自転させる。半波長板１５００を透過する励起光９０００の偏光方向は、半波長板１５００の回転角により調整される。励起光９０００の偏光方向は、反射面１２０６からのエバネッセント波のしみだしが最大になる偏光方向と反射面１２０６からのエバネッセント波のしみだしがなくなる偏光方向との間に調整されうる。初期状態においては、反射面１２０６に主にＰ波成分が入射すると予想される回転角に半波長板１５００の回転角が設定される。
【００７１】
偏光方向調整機構１０３０が、光軸の周りにレーザーダイオードユニット１００２又はレーザーダイオード１３００を回転させる機構に置き換えられてもよい。後記の偏光方向の最適化が省略される場合は、半波長板回転機構１５０２が省略され、半波長板１５００が固定されてもよい。後記の偏光方向の最適化が省略されるとともに反射面１２０６に主にＰ波成分が入射する姿勢でレーザーダイオードユニット１００２又はレーザーダイオード１３００が保持される場合は、半波長板１５００及び半波長板回転機構１５０２が省略されてもよい。
【００７２】
（入射角調整機構）
図７の模式図は、入射角調整機構を示す。
【００７３】
図７に示すように、励起光９０００は、入射角調整機構１０３４を通過するときに反射鏡１６００に反射され、励起光９０００の進む方向が第１の方向９０１６から分析チップ１００６へ向かう第２の方向９０１８へ屈曲させられる。
【００７４】
入射角調整機構１０３４により入射角θが調整される場合は、反射鏡角度調整機構１６０２により反射鏡角度が調整されながら、入射角θの変化による照射位置Ｘの移動をキャンセルするように反射鏡位置調整機構１６０４により反射鏡位置が調整される。これにより、入射角θのみが調整され、反射面１２０６における励起光９０００の照射位置Ｘが維持される。
【００７５】
入射角調整機構１０３４により照射位置Ｘが調整される場合は、反射鏡角度が固定され、反射鏡位置調整機構１６０４により反射鏡位置が調整される。これにより、照射位置Ｘのみが調整され、入射角θが維持される。
【００７６】
励起光９０００が入射面１２１６へ導かれない遮断状態に入射角調整機構１０３４がされる場合は、反射鏡角度調整機構１６０２により反射鏡角度が調整され、反射鏡１６００の光吸収面に励起光９０００が当てられる。励起光９０００が入射面１２１６へ導かれる非遮断状態に入射角調整機構１０３４がされる場合は、反射鏡角度調整機構１６０２により反射鏡角度が調整され、反射鏡１６００の鏡面に励起光９０００が当てられる。反射鏡角度調整機構１６０２以外の機構により遮断状態と非遮断状態とが切り替えられてもよい。例えば、励起光９０００の光路に光吸収体が挿抜されてもよい。
【００７７】
反射鏡角度調整機構１６０２は、ロータリーステッピングモータ等により鏡面に平行な回転軸の周りに反射鏡１６００を自転させ、反射鏡角度を調整する。
【００７８】
反射鏡位置調整機構１６０４は、リニアステージ等の上においてリニアステッピングモータ等により第１の方向９０１６に沿って反射鏡角度調整機構１６０２とともに反射鏡１６００を移動させ、反射鏡位置を調整する。
【００７９】
入射角調整機構１０３４には、簡単な機構により入射角θ及び照射位置Ｘを調整できるという利点がある。ただし、レーザーダイオードユニット１００２の位置及び姿勢を調整する機構により入射角θ及び照射位置Ｘが調整されてもよい。又は、分析チップ１００６の位置及び姿勢を調整する機構により入射角θ及び照射位置Ｘが調整されてもよい。
【００８０】
（測定光光学系）
図８の模式図は、測定光光学系を示す。
【００８１】
図８に示すように、第２の主面１２１０が向く側へ出射する測定光９００２は、測定光光学系１００８により光電子増倍管１０１０へ導かれる。測定光光学系１００８においては、測定光９００２は、集光レンズ１７００により集光され平行光に変換され、第２の整波器１７０２を通過し、結像レンズ１７０４により光電子増倍管１０１０に結像される。
【００８２】
集光レンズ１７００及び結像レンズ１７０４は共役光学系を構成する。これにより、迷光の影響が抑制される。
【００８３】
第２の整波器１７０２においては、第２のバンドパスフィルタ１７０６が挿抜機構１７０８により測定光９００２の光路に挿抜される。
【００８４】
表面プラズモン励起蛍光の光量が測定される場合は、測定光９００２の光路へ第２のバンドパスフィルタ１７０６が挿入され、第２のバンドパスフィルタ１７０６により励起光９０００と同じ波長の光が選択的に減衰させられる。これにより、散乱光が減衰し、主に表面プラズモン励起蛍光が光電子増倍管１０１０へ導かれ、抗原の検出の感度及び精度が向上する。散乱光の光量が測定される場合は、測定光９００２の光路から第２のバンドパスフィルタ１７０６が抜去される。
【００８５】
測定光９００２の光路に挿抜機構により減光フィルタが挿抜されてもよい。表面プラズモン励起蛍光の光量が測定される場合は、測定光９００２の光路から減光フィルタが抜去される。散乱光の光量が測定される場合は、測定光９００２の光路へ減光フィルタが挿入される。これにより、光電子増倍管１０１０へ導かれる表面プラズモン励起蛍光及び散乱光の光量の差が小さくなり、光量の測定が容易になる。表面プラズモン励起蛍光の光量が相対的に高感度の光電子増倍管１０１０により測定され、散乱光の光量が相対的に低感度のフォトダイオード、フォトトランジスタ、フォトレジスタ等により測定されてもよい。
【００８６】
（光電子増倍管）
測定光９００２の光量は光電子増倍管１０１０により測定される。光電子増倍管１０１０には感度及び信号対雑音比が良好であるという利点がある。ただし、光電子増倍管１０１０が冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ等の他の光量センサに置き換えられてもよい。
【００８７】
（送液機構）
図１に示すように、送液機構１０１４により流路１２２０へ試料液９００６が注入されるときは、分析チップ１００６及び試薬チップ１０３６が前処理室１０２０に配置される。また、送液ポンプ１０４０により試薬チップ１０３６の希釈容器１０４２から試料液９００６が吸引され、送液ポンプ１０４０が送液ポンプ搬送機構１０４４により搬送され、送液ポンプ１０４０により注入口１２２６へ試料液９００６が吐出される。
【００８８】
送液機構１０１４により流路１２２０へ蛍光標識液９００８が注入されるときも、分析チップ１００６及び試薬チップ１０３６が前処理室１０２０に配置される。また、送液ポンプ１０４０により試薬チップ１０３６の蛍光標識液容器１０４６から蛍光標識液９００８が吸引され、送液ポンプ１０４０が送液ポンプ搬送機構１０４４により搬送され、送液ポンプ１０４０により注入口１２２６へ蛍光標識液９００８が吐出される。
【００８９】
分析チップ１００６を前処理室１０２０へ退避させてから試料液９００６又は蛍光標識液９００８を分析チップ１００６へ注入することには、光学測定を阻害する構成物を測定室１０１６から排除し測定室１００６の汚染を抑制することに寄与する。ただし、前処理室１０２０への退避が省略されてもよい。
【００９０】
検体９０２０が希釈されるときには、試薬チップ１０３６が前処理室１０２０に配置される。送液機構１０１４により、検体容器１０４８から希釈容器１０４２へ検体９０２０が送液され、希釈液容器１０５０から希釈容器１０４２へ希釈液９０２２が送液され、試料液９００６が調製される。
【００９１】
送液ポンプ１０４０は、必要に応じて、洗浄液容器１０５２に収容された洗浄液９０２４で洗浄される。
【００９２】
検体９０２０が希釈されずに検体９０２０がそのまま試料液９００６になる場合もある。また、希釈に加えて又は希釈に代えて、血球分離、試薬の混合等の他の前処理が行われてもよい。
【００９３】
検体９０２０は、典型的には、血液等の人間からの採取物であるが、人間以外の生物からの採取物であってもよく、非生物からの採取物であってもよい。
【００９４】
蛍光標識液９００８は、検出対象の抗原と結合し蛍光標識された蛍光標識抗体を含む。
【００９５】
流路１２２０へ注入される注入物は典型的には液体であるが気体又は流動性を有する固体であってもよい。
【００９６】
送液ポンプ１０４０を送液元から送液先へ搬送する送液機構１０１４に代えて、チューブにより試料液９００６及び蛍光標識液９００８を送液する機構が設けられてもよい。
【００９７】
（反応領域、測定領域及び照射領域の関係）
図９の模式図は、反射面における照射領域、測定領域及び反応領域の望ましい関係を示す平面図である。照射領域１８００は、励起光９０００が照射される領域である。測定領域１８０２は、測定光９００２の光量が光電子増倍管１０１０により測定される領域である。反応領域１８０４は、抗原捕捉体１２０８が設けられ、抗原捕捉体１２０８に含まれる抗体と抗原とが結合する領域である。照射領域１８００及び測定領域１８０２の平面形状は、望ましくは、円形である。
【００９８】
照射領域１８００と測定領域１８０２とは少なくとも重なる。望ましくは照射領域１８００が測定領域１８０２に内包され、さらに望ましくは照射領域１８００が測定領域１８０２の中央に配置される。これにより、プリズム１２０４のばらつき等により照射位置がずれても照射領域１８００が測定領域１８０２から逸脱しにくくなり、測定光９００２の光量が維持される。
【００９９】
照射領域１８００と反応領域１８０４とは少なくとも重なり、望ましくは照射領域１８００が反応領域１８０４に内包され、さらに望ましくは照射領域１８００が反応領域１８０４の中央に配置される。
【０１００】
測定領域１８０２と反応領域１８０４とは少なくとも重なり、望ましくは測定領域１８０２が反応領域１８０４に内包され、さらに望ましくは測定領域１８０２が反応領域１８０４の中央に配置される。
【０１０１】
（抗原の検出の手順の概略）
図１０のフローチャートは、抗原の検出の手順の概略を示す。
【０１０２】
図１０に示すように、測定が準備され（ステップＳ１０１）、抗体と抗原とが反応させられ（ステップＳ１０２）、ロード制御部１１００が分析チップ搬送機構１０２２に分析チップ１００６をロードさせる（ステップＳ１０３）。ロードされた分析チップ１００６のプリズム１２０４には励起光９０００が照射される。分析チップ１００６に励起光９０００が照射されている状態において入射角θが測定角θｍに設定され（ステップＳ１０４）、望ましくは行われる処理が行われ（ステップＳ１０５〜Ｓ１０７）、アンロード制御部１１０２が分析チップ搬送機構１０２２に分析チップ１００６をアンロードさせ（ステップＳ１０８）、抗原と蛍光標識抗体とが反応させられる（ステップＳ１０９）。
【０１０３】
入射角θが測定角θｍに設定された後（ステップＳ１０４の後）であって分析チップ１００６がアンロードされる前（ステップＳ１０８の前）に、望ましくは、照射位置が最適化され（ステップＳ１０５）、自家蛍光の光量が測定され（ステップＳ１０６）、励起光９０００の偏光方向が最適化される（ステップＳ１０７）。照射位置の最適化（ステップＳ１０５）、自家蛍光の光量の測定（ステップＳ１０６）及び励起光９０００の偏光方向の最適化（ステップＳ１０７）の全部又は一部が省略されてもよい。
【０１０４】
抗原と蛍光標識抗体とが反応させられた後（ステップＳ１０９の後）に、再ロード制御部１１０４が分析チップ搬送機構１０２２に分析チップ１００６を再ロードさせ（ステップＳ１１０）、表面プラズモン励起蛍光の光量が測定され（ステップＳ１１１）、測定結果が検体番号等とともに記憶及び表示され（ステップＳ１１２）、表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００が初期化される（ステップＳ１１３）。表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００が初期化されるときには、反射鏡等の可動物が初期位置に復帰させられる。表面プラズモン励起蛍光の光量は、必要に応じて、抗原の絶対量、濃度等に換算される。
【０１０５】
（測定の準備）
図１１のフローチャートは、測定の準備（ステップＳ１０１）の手順を示す。
【０１０６】
図１１に示すように、分析チップ１００６が準備され（ステップＳ１０１１）、前処理室１０２０に分析チップ１００６が配置される（ステップＳ１０１２）。
【０１０７】
それとは別に、試薬チップ１０３６が準備され（ステップＳ１０１３）、前処理室１０２０に試薬チップ１０３６が配置され（ステップＳ１０１４）、前処理制御部１１０４が送液機構１０１４に試薬チップ１０３６を前処理させる（ステップＳ１０１５）。これにより、試料液９００６が調製され、試料液９００６の準備が完了する。また、蛍光標識液９００８の準備が完了する。
【０１０８】
分析チップ１００６の準備及び配置（ステップＳ１０１１及びＳ１０１２）は、試薬チップ１０３６の準備、配置及び前処理（ステップＳ１０１３、Ｓ１０１４及びＳ１０１５）の後に行われてもよく、試薬チップ１０３６の準備、配置及び前処理（ステップＳ１０１３、Ｓ１０１４及びＳ１０１５）と並行して行われてもよい。
【０１０９】
（抗体と抗原との反応）
抗体と抗原との反応（ステップＳ１０２）においては、第１の反応制御部１１０６が送液機構１０１４に試料液９００６を流路１２２０へ注入させる。
【０１１０】
試料液９００６が流路１２２０へ注入された場合は、試料液９００６が抗原捕捉体１２０８に接触し、試料液９００６に含まれる抗原が抗原捕捉体１２０８に含まれる抗体に結合し、試料液９００６に含まれる抗原が抗原捕捉体１２０８に捕捉される。
【０１１１】
（入射角θの測定角θｍへの設定）
図１２のフローチャートは、入射角θの測定角θｍへの設定（ステップＳ１０４）の手順を示す。
【０１１２】
図１２に示すように、フィルタ抜去制御部１１０８が挿抜機構１７０８に第２のバンドパスフィルタ１７０６を測定光９００２の光路から抜去させる（ステップＳ１０４１）。これにより、散乱光が遮蔽されなくなり、散乱光の光量が光電子増倍管１０１０により測定可能になる。
【０１１３】
第２のバンドパスフィルタ１７０６が抜去された状態において、入射角走査制御部１１１０が、入射角調整機構１０３４に入射角θを走査させながら光電子増倍管１０１０から光量Ｉの測定結果を取得する（ステップＳ１０４２）。これにより、入射角θの走査中に散乱光の光量Ｉｓが測定され、入射角θと散乱光の光量Ｉｓとの関係Ｉｓ（θ）が得られる。
【０１１４】
関係Ｉｓ（θ）が得られた後に、入射角決定部１１１２が、関係Ｉｓ（θ）から光量Ｉｓが極大になる入射角θである共鳴角θｒを特定し、共鳴角θｒから測定が行われる入射角θである測定角θｍを決定する（ステップＳ１０４３）。散乱光の光量Ｉｓが極大になる共鳴角θｒと電場の増強度が極大になる入射角θｍａｘとのずれは小さく、蛍光標識液９００８の注入が共鳴角θｒに与える影響は小さいので、蛍光標識液９００８の注入の前に決定された共鳴角θｒがそのまま測定角θｍにされても電場が十分に増強される。ただし、共鳴角θｒが補正されて測定角θｍにされてもよい。散乱光の光量Ｉｓが極大になる共鳴角θｒが求められる場合は、反射光の光量Ｉｒが極小になる共鳴角θｒが求められる場合と異なり、表面プラズモン励起蛍光の光量を測定する光量センサが援用可能になり、表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００の構造が簡略化される。
【０１１５】
測定角θｍが決定された後に、入射角設定部１１１４が、入射角調整機構１０３４に入射角θを測定角θｍに設定させる（ステップＳ１０４４）。
【０１１６】
試料液９００６が流路１２２０へ注入された後に関係Ｉｓ（θ）が測定された場合は、試料液９００６の抗原濃度等によらず共鳴角θｒが正確に特定される。また、蛍光標識液９００８が流路１２２０へ注入される前に関係Ｉｓ（θ）された場合は、蛍光色素が励起光９０００により退色しにくい。これらにより、抗原の検出の感度及び精度が向上する。
【０１１７】
蛍光標識液９００８が流路１２２０へ注入される前に関係Ｉｓ（θ）が得られること（ステップＳ１０４２）は必要であるが、蛍光標識液９００８が流路１２２０へ注入される前に測定角θｍが決定されること（ステップＳ１０４３）及び入射角θが測定角θｍに設定されること（ステップＳ１０４４）は必ずしも必要ではない。したがって、蛍光標識液９００８が流路１２２０へ注入された後に測定角θｍが決定されてもよく（ステップＳ１０４３）、入射角θが測定角θｍに設定されてもよい（ステップＳ１０４４）。
【０１１８】
（入射角θの走査範囲）
プリズム１２０４の材質及び形状、流路１２２０への注入物の屈折率等により、共鳴角θｒは概ね決まる。しかし、抗原捕捉体１２０８に捕捉された分子の種類及び量、プリズム１２０４のばらつき等によって共鳴角θｒはわずかに変化する。このため、入射角θの走査においては、全反射条件が満たされる範囲であって予想される共鳴角θｒを含む概ね１０°以下の範囲が重点的に走査される。
【０１１９】
（照射位置の最適化）
図１３のフローチャートは、照射位置の最適化（ステップＳ１０５）の手順を示す。
【０１２０】
図１３に示すように、照射位置走査部１１１６が反射鏡位置調整機構１６０４に反射鏡位置を走査させながら光電子増倍管１０１０から光量Ｉの測定結果を取得する（ステップＳ１０５１）。反射鏡位置が走査される間に、入射角θが測定角θｍに維持されたまま励起光９０００が平行移動し、照射位置１３００が直線に沿って走査される。これにより、照射位置Ｘの走査中に散乱光の光量Ｉｓが測定され、照射位置Ｘと散乱光の光量Ｉｓとの関係Ｉｓ（Ｘ）が得られる。
【０１２１】
図１４のグラフは、照射位置Ｘと散乱光の光量Ｉｓとの関係Ｉｓ（Ｘ）を示す。
【０１２２】
図１４に示すように、照射領域１８００が測定領域１８０２に内包される区間Ｒにおいては、光量Ｉｓはほぼ一定である。しかし、区間Ｒ以外においては、照射領域１８００が測定領域１８０２を逸脱し、照射位置Ｘが区間Ｒから離れるにしたがって光量Ｉｓが減少する。
【０１２３】
関係Ｉｓ（Ｘ）が得られた後に、照射位置決定部１１１８が、光量Ｉｓが極大値から同値ΔＩｓだけ減少する照射位置Ｘ１及びＸ２を関係Ｉｓ（Ｘ）から特定し、照射位置Ｘ１及びＸ２の中間を測定が行われる照射位置Ｘである測定位置Ｘｍに決定する（ステップＳ１０５２）。
【０１２４】
望ましくは、測定角θが測定角θｍに設定された後に関係Ｉｓ（Ｘ）が測定される。これにより、表面プラズモン励起蛍光の光量が測定されるときと同じ入射角θで照射位置Ｘが最適化され、照射位置Ｘが適切に最適化される。
【０１２５】
さらに続いて、照射位置設定部１１２０が反射鏡位置調整機構１６０４に反射鏡位置を照射位置Ｘが測定位置Ｘｍになる反射鏡位置に設定させる（ステップＳ１０５３）。
【０１２６】
共鳴角θｒの近傍の入射角θにおいては、反射光９００４の光量は小さく、反射光９００４はプリズム１２０４から放射される自家蛍光をほとんど発生させない。このため、測定領域１８０２における励起光９０００の光路長が自家蛍光の光量に大きく影響し、照射位置Ｘが変化すると自家蛍光の光量も変化する。自家蛍光の光量は励起光９０００の光量に比べると小さいが、表面プラズモン励起蛍光の光量と比べると無視できない。ただし、自家蛍光の光量は小さいため、表面プラズモン励起蛍光の光量の測定に影響を与えるのは、反射面１２０６の近くから放射された自家蛍光に限られる。
【０１２７】
照射位置Ｘの最適化（ステップＳ１０５）により照射領域１８００が測定領域１８０２の中央に配置された場合は、測定領域１８０２における励起光９０００の光路長が一定になり、自家蛍光の光量の影響が一定になり、抗原の検出の感度及び精度が向上する。望ましくは、照射位置Ｘの最適化（ステップＳ１０５）は、自家蛍光の光量の測定の前（ステップＳ１０６の前）に行われる。これにより、自家蛍光の光量の測定の精度が向上する。
【０１２８】
（自家蛍光の光量の測定）
自家蛍光の光量の測定（ステップＳ１０６）においては、自家蛍光測定部１１２２が光電子増倍管１０１０から光量Ｉの測定結果を取得する。これにより、自家蛍光の光量Ｉａｆが測定される。測定結果は、後記の自家蛍光の補正が完了するまで自家蛍光測定部１１２２に記憶される。
【０１２９】
（励起光の偏光方向の最適化）
図１５のフローチャートは、励起光の偏光方向の最適化（ステップＳ１０７）の手順を示す。
【０１３０】
図１５に示すように、偏光方向走査部１１２４が偏光方向調整機構１０３０に偏光方向αを走査させながら光電子増倍管１０１０から光量Ｉの測定結果を取得する（ステップＳ１０７１）。これにより、偏光方向αの走査中に散乱光の光量Ｉｓが測定され、励起光９０００の偏光方向αと散乱光の光量Ｉｓとの関係Ｉｓ（α）が得られる。
【０１３１】
望ましくは、測定角θが測定角θｍに設定された後に関係Ｉｓ（α）が測定される。これにより、表面プラズモン励起蛍光の光量が測定されるときと同じ入射角θで偏光方向αが最適化され、偏光方向αが適切に最適化される。さらに望ましくは、照射位置Ｘが最適化された後（ステップＳ１０５の後）に関係Ｉｓ（α）が測定される。これにより、表面プラズモン励起蛍光の光量が測定されるときと同じ照射位置Ｘで偏光方向が最適化され、偏光方向αが適切に最適される。
【０１３２】
関係Ｉｓ（α）が得られた後に、偏光方向決定部１１２６が光量Ｉｓが極大になる偏光方向αを関係Ｉｓ（α）から特定し、測定が行われる偏光方向αである測定偏光方向αｍを決定する（ステップＳ１０７２）。
【０１３３】
測定偏光方向αｍが決定された後に、偏光方向設定部１１２８が、偏光方向調整機構１０３０に偏光方向αを測定偏光方向αｍに設定させる（ステップＳ１０７３）。
【０１３４】
樹脂からなる媒体の中を光が進行する場合には無視できない複屈折が生じる。この複屈折は、位置による媒体の密度の変化等により生じる。位置による媒体の密度の変化は樹脂の成形のときに生じるため、複屈折の強さはプリズム１２０４ごとに異なる。このため、プリズム１２０４によっては、エバネッセント波のしみだしに寄与するＰ波成分のみを反射面１２０６へ入射させようとしても、Ｓ波成分が発生してＰ波成分が減少し、抗原の検出の感度及び精度が低下する。
【０１３５】
励起光の偏光方向の最適化（ステップＳ１０７）により、プリズム１２０４のばらつきによるＰ波成分の減少が解消し、抗原の検出の感度及び精度が向上する。
【０１３６】
（抗原と蛍光標識抗体との反応）
抗原と蛍光標識抗体との反応（ステップＳ１０９）においては、第２の反応制御部１１３０が送液機構１０１４に蛍光標識液９００８を流路１２２０へ注入させる。蛍光標識液９００８が流路１２２０へ注入された場合は、蛍光標識液９００８が抗原捕捉体１２０８に接触し、蛍光標識液９００８に含まれる蛍光標識抗体が抗原に結合する。
【０１３７】
（表面プラズモン励起蛍光の光量の測定）
図１６のフローチャートは、表面プラズモン励起蛍光の光量の測定（ステップＳ１１１）の手順を示す。
【０１３８】
図１６に示すように、フィルタ挿入制御部１１３２が挿抜機構１７０８に第２のバンドパスフィルタ１７０６を測定光９００２の光路へ挿入させる（ステップＳ１１１１）。これにより、光電子増倍管１０１０に届く散乱光が減り、抗原の検出の感度及び精度が向上する。
【０１３９】
第２のバンドパスフィルタ１７０６が挿入された後に、遮断制御部１１３４が反射鏡角度調整機構１６０２に励起光９０００を一時的に遮断させる（ステップＳ１１１２）。
【０１４０】
励起光９０００が遮断されている間に、暗ノイズ測定部１１３６が光電子増倍管１０１０から光量Ｉの測定結果を取得する（ステップＳ１１１３）。これにより、暗ノイズ量Ｉｎが測定される。
【０１４１】
望ましくは、励起光の遮断（ステップＳ１１１２）及び暗ノイズ量の測定（ステップＳ１１１３）は、後記の入射角θの測定角θｍへの再設定（ステップＳ１１１４）及び表面プラズモン励起蛍光の光量Ｉｆの測定（ステップＳ１１１５）の直前に行われるが、暗ノイズ補正（ステップＳ１１１７）の前であれば他のときに行われてもよい。
【０１４２】
暗ノイズ量Ｉｎが測定された後（ステップＳ１１１３の後）に、入射角再設定部１１３６が反射鏡角度調整機構１６０２に入射角θを測定角θｍに再設定させる（ステップＳ１１１４）。
【０１４３】
入射角θが測定角θｍに再設定された後に、蛍光測定部１１３８が光電子増倍管１０１０から光量Ｉの測定結果を取得する（ステップＳ１１１５）。これにより、測定角θｍにおける表面プラズモン励起蛍光の光量Ｉｆが測定される。
【０１４４】
表面プラズモン励起蛍光の光量Ｉｆが測定された後に、自家蛍光補正部１１０４が、表面プラズモン励起蛍光の光量Ｉｆから自家蛍光の光量Ｉａｆを減ずる補正を行い（ステップＳ１１１６）、暗ノイズ補正部１１４２が表面プラズモン励起蛍光の光量Ｉｆから暗ノイズ量Ｉｎを減じる補正を行う（ステップＳ１１１７）。これにより、抗原の検出の感度及び精度が向上する。自家蛍光の補正（ステップＳ１１１６）及び暗ノイズの補正（ステップＳ１１１７）が同時に行われてもよく、自家蛍光の補正（ステップＳ１１１６）が暗ノイズの補正（ステップＳ１１１７）の後に行われてもよい。
【０１４５】
上記の手順のうち表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００により実行される手順が手作業により実行されてもよいし、手作業で実行される手順が表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００により実行されてもよい。
【０１４６】
散乱光の光量Ｉｓが極大になる共鳴角θｒに代えて、反射光９００４の光量Ｉｒが極小になる共鳴角θｒが用いられてもよい。後者の共鳴角θｒが用いられる場合は、図１７に示すように、反射光９００４の光量を測定する反射光量センサ１９０２が表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００に付加される。また、ステップＳ１０４２においては、入射角走査制御部１１１０が、入射角調整機構１０３４に入射角θを走査させながら反射光量センサ１９０２から光量Ｉの測定結果を取得する。これにより、入射角θの走査中に反射光９００４の光量Ｉｒが測定され、入射角θと反射光９００４の光量Ｉｒとの関係Ｉｒ（θ）が得られる。また、ステップＳ１０４３においては、入射角決定部１１１２が光量Ｉｒが極小になる入射角θである共鳴角θｒを関係Ｉｒ（θ）から特定し、共鳴角θｒから測定角θｍを決定する。反射光の光量Ｉｒが極小になる共鳴角θｒと電場の増強度が極大になる入射角θｍａｘとにはずれがあるので、望ましくは、共鳴角θｒに微小角を増減する補正が行われ、測定角θｍが決定される。
【０１４７】
本発明は詳細に示され記述されたが、上記の記述は全ての局面において例示であって限定的ではない。しがって、本発明の範囲からはずれることなく無数の修正及び変形が案出されうると解される。
【符号の説明】
【０１４８】
１０００  表面プラズモン励起蛍光計測装置
１００２  レーザーダイオードユニット
１００６  分析チップ
１０１０  光電子増倍管
１０１４  送液機構
１０３０  偏光方向調整機構
１０３４  入射角調整機構
１２００  導電体膜
１２０４  プリズム
１２０６  反射面
１２１２  流路形成体
１２１６  入射面
１２１８  出射面
１２２０  流路
１７０６  第２のバンドパスフィルタ
９００６  試料液
９００８  蛍光標識液
【図１】
2012108323.tif 000003
【図２】
2012108323.tif 000004
【図３】
2012108323.tif 000005
【図４】
2012108323.tif 000006
【図５】
2012108323.tif 000007
【図６】
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【図７】
2012108323.tif 000009
【図８】
2012108323.tif 000010
【図９】
2012108323.tif 000011
【図１０】
2012108323.tif 000012
【図１１】
2012108323.tif 000013
【図１２】
2012108323.tif 000014
【図１３】
2012108323.tif 000015
【図１４】
2012108323.tif 000016
【図１５】
2012108323.tif 000017
【図１６】
2012108323.tif 000018
【図１７】
2012108323.tif 000019
【国際調査報告】
2012108323.tif 000020
2012108323.tif 000021
2012108323.tif 000022
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