(57)【要約】  本発明の目的は、自己組織化膜上に固定されるグルコースオキシダーゼの量を増加させる方法を提供することである。本発明にかかる方法は、自己組織化膜およびグルコースオキシダーゼの間には１分子のアミノ酸が挟まれていることを特徴とする。
2012053138.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースオキシダーゼを自己組織化膜上に固定する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｂ）をこの順に含有する。
１分子のアミノ酸および自己組織化膜を具備する基材を用意する工程（ａ）、
ここで、前記１分子のアミノ酸は、以下の化学式（Ｉ）により表されるペプチド結合により前記自己組織化膜に結合しており、
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択され、
【化１】
2012053138.tif 000014
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
前記基材上にグルコースオキシダーゼを供給し、前記１分子のアミノ酸のカルボキシル基と前記グルコースオキシダーゼのアミノ基との反応として以下の化学式（ＩＩ）よって表されるペプチド結合を形成する工程（ｂ）
【化２】
2012053138.tif 000015
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記工程（ａ）は、以下の工程（ａ１）および（ａ２）を具備する：
自己組織化膜を表面に具備する基材を用意する工程（ａ１）、ここで、前記自己組織化膜は一端にカルボキシル基を有し、
前記１分子のアミノ酸を前記基材に供給し、前記化学式（Ｉ）により表される前記自己組織化膜の一端の前記カルボキシル基と前記１分子のアミノ酸のアミノ基との間の反応としてペプチド結合を形成する工程（ａ２）
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記工程（ａ）および前記工程（ｂ）との間にさらに前記工程（ａｂ）を具備する：
前記１分子のアミノ酸のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル３−（３−ジメトシキアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の混合液により活性化する工程（ａｂ）。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、前記工程（ａ１）および前記工程（ａ２）との間にさらに前記工程（ａ１ａ）を具備する：
前記自己組織化膜のカルボキシル基を、N-Hydroxysuccinimideおよび1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride混合液により活性化する工程（ａ１ｂ）。
【請求項５】
前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、請求項１に記載の方法。
【化３】
2012053138.tif 000016
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
【請求項６】
請求項１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グリタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、バリン、アルギニン、およびプロリンからなる群から選択される。
【請求項７】
請求項１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グリタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、およびバリンからなる群から選択される。
【請求項８】
請求項１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、およびチロシンからなる群から選択される。
【請求項９】
請求項１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、およびアラニンからなる群から選択される。
【請求項１０】
自己組織化膜、１分子のアミノ酸、およびグルコースオキシダーゼを備えたセンサであって、
前記自己組織化膜および前記グルコースオキシダーゼの間には前記１分子のアミノ酸が挟まれており、
前記グルコースオキシダーゼが、以下の化学式（ＩＩ）によって表される２つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
【化４】
2012053138.tif 000017
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択される、センサ。
【請求項１１】
前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、請求項１０に記載のセンサ。
【化５】
2012053138.tif 000018
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
【請求項１２】
請求項１０のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グリタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、バリン、アルギニン、およびプロリンからなる群から選択される。
【請求項１３】
請求項１０のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グリタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、およびバリンからなる群から選択される。
【請求項１４】
請求項１０のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、およびチロシンからなる群から選択される。
【請求項１５】
請求項１０のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、およびアラニンからなる群から選択される。
【請求項１６】
センサを用いて試料に含まれるグルコースを検出または定量する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｃ）をこの順で具備する：
自己組織化膜、１分子のアミノ酸、およびグルコースオキシダーゼを備えたセンサを用意する工程（ａ）、ここで
前記自己組織化膜および前記グルコースオキシダーゼの間には前記１分子のアミノ酸が挟まれており、
前記グルコースオキシダーゼが、以下の化学式（ＩＩ）によって表される２つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
【化６】
2012053138.tif 000019
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択され、
前記センサに前記試料を供給し、前記グルコースオキシダーゼによる前記グルコースの分解によりグルコノラクトンおよび過酸化水素を生じる工程（ｂ）、
前記グルコノラクトンまたは過酸化水素の少なくともいずれか一方を検出または定量し、前記試料に含有されるグルコースを検出または定量する工程（ｃ）。
【請求項１７】
請求項１６の方法であって、前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される。
【化７】
2012053138.tif 000020
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
【請求項１８】
請求項１６の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グリタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、バリン、アルギニン、およびプロリンからなる群から選択される。
【請求項１９】
請求項１６の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グリタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、およびバリンからなる群から選択される。
【請求項２０】
請求項１６の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、およびチロシンからなる群から選択される。
【請求項２１】
請求項１６の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、およびアラニンからなる群から選択される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はグルコースオキシダーゼを自己組織化膜上に固定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料に含有される標的物質を検出または定量するために、バイオセンサが用いられる。いくつかのバイオセンサは、グルコースを検出または定量するためにグルコースオキシダーゼを具備する。【０００３】
グルコースを含有する試料がグルコースオキシダーゼを具備するバイオセンサに供給されると、グルコースは、グルコースオキシダーゼによって、グルコノラクトンおよび過酸化水素に分解される。当該グルコノラクトンまたは過酸化水素の少なくともいずれか一方が検出または定量され、試料に含有されるグルコースを検出または定量する。【０００４】
特許文献１は、酵素を具備する従来のバイオセンサを開示している。図２は、特許文献１の図７に開示されたバイオセンサを示す。【０００５】
特許文献１の図７に関する記述によれば、当該バイオセンサは、生体分子の活性をスクリーニングするために用いられる。当該バイオセンサは、単層７、親和性タグ８、アダプター分子９、およびタンパク質１０を具備している。単層７は、化学式Ｘ−Ｒ−Ｙによって表される自己組織化膜から構成される（段落番号００８０、００８２、００８４、００８５を参照）。Ｘ、Ｒ、およびＹの一例は、それぞれ、ＨＳ−、アルカン、およびカルボキシル基である（００８４、００８５、および００９５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第００／０４３８２号公報（この公報は、特表２００２−５２０６１８号公報に対応する。特に、段落番号００８０、００８２、００８４、００８５、００９５、０１０９、０１１８、および０１１９を参照）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
グルコースの検出感度または定量精度を向上させるためには、当該バイオセンサに固定されるグルコースオキシダーゼの量を増やすことが必要とされる。【０００８】
本発明者は、自己組織化膜に１分子のアミノ酸を結合させ、そしてグルコースオキシダーゼを固定することによって、単位面積あたりのグルコースオキシダーゼの固定量が著しく増加されるという知見を見いだした。本発明はこの知見を元に完成された。【０００９】
本発明の目的は、自己組織化膜上に固定されるグルコースオキシダーゼの量を増加させる方法、及び当該方法に従って固定されたグルコースオキシダーゼを有するセンサを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
以下の項目Ａ１、Ｂ１、およびＣ１は、上記課題を解決する。【００１１】
（Ａ１）  グルコースオキシダーゼを自己組織化膜上に固定する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｂ）をこの順に含有する。
１分子のアミノ酸および自己組織化膜を具備する基材を用意する工程（ａ）、
ここで、前記１分子のアミノ酸は、以下の化学式（Ｉ）により表されるペプチド結合により前記自己組織化膜に結合しており、
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択され、
【化１】
2012053138.tif 000003
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
前記基材上にグルコースオキシダーゼを供給し、前記１分子のアミノ酸のカルボキシル基と前記グルコースオキシダーゼのアミノ基との反応として以下の化学式（ＩＩ）よって表されるペプチド結合を形成する工程（ｂ）
【化２】
2012053138.tif 000004
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）【００１２】
（Ａ２）  Ａ１に記載の方法であって、前記工程（ａ）は、以下の工程（ａ１）および（ａ２）を具備する：
自己組織化膜を表面に具備する基材を用意する工程（ａ１）、ここで、前記自己組織化膜は一端にカルボキシル基を有し、
前記１分子のアミノ酸を前記基材に供給し、前記化学式（Ｉ）により表される前記自己組織化膜の一端の前記カルボキシル基と前記１分子のアミノ酸のアミノ基との間の反応としてペプチド結合を形成する工程（ａ２）【００１３】
（Ａ３）  Ａ１に記載の方法であって、前記工程（ａ）および前記工程（ｂ）との間にさらに前記工程（ａｂ）を具備する：
前記１分子のアミノ酸のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル３−（３−ジメトシキアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の混合液により活性化する工程（ａｂ）。【００１４】
（Ａ４）  Ａ２に記載の方法であって、前記工程（ａ１）および前記工程（ａ２）との間にさらに前記工程（ａ１ａ）を具備する：
前記自己組織化膜のカルボキシル基を、N-Hydroxysuccinimideおよび1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride混合液により活性化する工程（ａ１ｂ）。【００１５】
（Ａ５）  前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、Ａ１に記載の方法。
【化３】
2012053138.tif 000005
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）【００１６】
（Ａ６）  Ａ１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グリタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、バリン、アルギニン、およびプロリンからなる群から選択される。【００１７】
（Ａ７）  Ａ１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グリタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、およびバリンからなる群から選択される。【００１８】
（Ａ８）  Ａ１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、およびチロシンからなる群から選択される。【００１９】
（Ａ９）  Ａ１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、およびアラニンからなる群から選択される。【００２０】
（Ｂ１）  自己組織化膜、１分子のアミノ酸、およびグルコースオキシダーゼを備えたセンサであって、
前記自己組織化膜および前記グルコースオキシダーゼの間には前記１分子のアミノ酸が挟まれており、
前記グルコースオキシダーゼが、以下の化学式（ＩＩ）によって表される２つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
【化４】
2012053138.tif 000006
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択される、センサ。【００２１】
（Ｂ２）  前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、Ｂ１に記載のセンサ。
【化５】
2012053138.tif 000007
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）【００２２】
（Ｂ３）  Ｂ１のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グリタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、バリン、アルギニン、およびプロリンからなる群から選択される。【００２３】
（Ｂ４）  Ｂ１のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グリタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、およびバリンからなる群から選択される。【００２４】
（Ｂ５）  Ｂ１のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、およびチロシンからなる群から選択される。【００２５】
（Ｂ６）  Ｂ１のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、およびアラニンからなる群から選択される。【００２６】
（Ｃ１）  センサを用いて試料に含まれるグルコースを検出または定量する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｃ）をこの順で具備する：
自己組織化膜、１分子のアミノ酸、およびグルコースオキシダーゼを備えたセンサを用意する工程（ａ）、ここで
前記自己組織化膜および前記グルコースオキシダーゼの間には前記１分子のアミノ酸が挟まれており、
前記グルコースオキシダーゼが、以下の化学式（ＩＩ）によって表される２つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
【化６】
2012053138.tif 000008
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択され、
前記センサに前記試料を供給し、前記グルコースオキシダーゼによる前記グルコースの分解によりグルコノラクトンおよび過酸化水素を生じる工程（ｂ）、
前記グルコノラクトンまたは過酸化水素の少なくともいずれか一方を検出または定量し、前記試料に含有されるグルコースを検出または定量する工程（ｃ）。【００２７】
（Ｃ２）  Ｃ１の方法であって、前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される。
【化７】
2012053138.tif 000009
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）【００２８】
（C3）  Ｃ１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グリタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、バリン、アルギニン、およびプロリンからなる群から選択される。【００２９】
（C4）  Ｃ１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グリタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、およびバリンからなる群から選択される。【００３０】
（C5）  Ｃ１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、およびチロシンからなる群から選択される。【００３１】
（C6）  Ｃ１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、およびアラニンからなる群から選択される。
【発明の効果】
【００３２】
本発明は、単位面積あたりに固定されるグルコースオキシダーゼの量の著しい増加を達成する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は本発明による方法の概略図を示す。
【図２】図２は、特許文献１の図７である。
【図３】図３は従来技術による方法の概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
図１を参照しながら、本発明の実施の形態が、以下、説明される。
【００３５】
（実施の形態１）
図１は、グルコースオキシダーゼを自己組織化膜に固定するための本発明による方法を示す。
【００３６】
基材１は、好ましくは金基板である。金基板の一例は、表面に金を一様に有する基板である。具体的には、金基板は、ガラス、プラスチック、またはＳｉＯ2の表面にスパッタリング法により形成された金膜を有する基板であり得る。
【００３７】
まず、アルカンチオールを含有する溶液に基材１は浸漬される。好ましくは、浸漬前に基材１は洗浄される。当該アルカンチオールは、末端にカルボキシル基を有する。アルカンチオールは、６〜１８の範囲内の炭素数を有することが好ましい。このようにして、基材１上に自己組織化膜２が形成される。
【００３８】
アルカンチオールの好ましい濃度はおよそ１〜１０ｍＭである。アルカンチオールを溶解する限り、溶媒は限定されない。好ましい溶媒の一例は、エタノール、ジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」と記される）、およびジオキサンである。好ましい浸漬時間はおよそ１２〜４８時間である。
【００３９】
次に、自己組織化膜２にアミノ酸３が供給される。自己組織化膜２の上端に位置するカルボキシル基(-COOH)はアミノ酸３のアミノ基(-NH2)と反応して、以下の化学式（Ｉ）によって表されるペプチド結合を形成する。
【００４０】
【化８】
2012053138.tif 000010
（ここで、Ｒは１分子のアミノ酸の側鎖を表す）
【００４１】
化学式（Ｉ）においては、１分子のアミノ酸３が自己組織化膜２と結合する。
【００４２】
アミノ酸３は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択される。すなわち、化学式（Ｉ）において、Ｒはこれら２０種類のアミノ酸の側鎖である。
【００４３】
自己組織化膜２にアミノ酸３が供給される際に、２種類以上のアミノ酸が同時に供給され得る。すなわち、自己組織化膜２にアミノ酸３を含有する溶液が供給される際に、当該溶液は２種類以上のアミノ酸３を含有し得る。後述するグルコースオキシダーゼのアミノ酸３への均一な結合を考慮すれば、当該溶液は１種類のみのアミノ酸を含有することが好ましい。
【００４４】
続いて、グルコースオキシダーゼ４が供給される。グルコースオキシダーゼ４の５’末端のアミノ基が、アミノ酸３のカルボキシル基と反応する。グルコースオキシダーゼ４に含有されるリシンのアミノ+基も、アミノ酸３のカルボキシル基と反応する。このようにして、以下の化学式（ＩＩ）によって示される２つのペプチド結合が形成され、センサを得る。
【００４５】
【化９】
2012053138.tif 000011
（ここで、Ｒは１分子のアミノ酸の側鎖を表す）
【００４６】
１分子のグルコースオキシダーゼ４は、１つの５’末端のみを有する一方、１分子のグルコースオキシダーゼ４は、多数のリシン基を有する。従って、ほとんど全ての化学式（ＩＩ）は、詳細には、以下の化学式（ＩＩＩ）によって表される。
【化１０】
2012053138.tif 000012
（ここで、Ｒは１分子のアミノ酸の側鎖を表す）
【００４７】
得られたセンサは、試料に含有されるグルコースを検出または定量するために用いられる。
【００４８】
具体的には、グルコースは、電子メディエータまたはペルオキシターゼにより検出または定量される。
【００４９】
まず、電子メディエータによる検出または定量が以下、説明される。
【００５０】
グルコースを含有すると期待される試料に、電子メディエータ（酸化型）を加える。電子メディエータ（酸化型）の例は、フェリシアン化カリウムである。その後、当該試料は、センサに供給される。
【００５１】
当該試料がグルコースを含有すれば、以下の反応式（ＩＶ）によって表されるように、グルコースオキシターゼ（ＧＯＤ）はグルコースをグルコン酸に変換する。同時に、電子メディエータ（酸化型）は、電子メディエータ（還元型）に変換される。反応式（ＩＶ）では、電子メディエータ（酸化型）として、フェリシアン化カリウムが例示されている。
GOD
グルコース  ＋  2［Fe(CN)6］-3 ＋  e-  ――――→
グルコン酸  ＋  2[Fe(CN)6]-4    ・・・（ＩＶ）
【００５２】
得られた電子メディエータ（還元型）の量は、以下の反応式（Ｖ）によって表されるように電気化学的に測定され、グルコースを検出または定量し得る。
[Fe(CN)6]-4  →  [Fe(CN)6]-3  +  e-  ・・・（Ｖ）
【００５３】
次に、ペルオキシターゼによる検出または定量が以下、説明される。
【００５４】
酸素および水の存在下、グルコースを含有すると期待される試料がセンサに供給される。当該試料がグルコースを含有すれば、以下の反応式（ＶＩ）によって表されるように、グルコースオキシターゼ（ＧＯＤ）はグルコースをグルコン酸に変換する。同時に、過酸化水素が発生する。
GOD
グルコース  ＋  Ｏ２  ＋  Ｈ２Ｏ  ――――→
グルコン酸  ＋  Ｈ２Ｏ２・・・（ＶＩ）
【００５５】
発生した過酸化水素は、ペルオキシターゼを含有する色原体試薬に混合される。色原体の例は、４−アミノアンチピリン、２、２’−アジノ−ジ−〔３−エチルベンツチアゾリンスルホン酸（６）〕、３，３’−５，５’−テトラメチルベンチジン、およびシアミノベンジジンである。混合後、発色現象が生じ、グルコースを検出する。発色現象の程度により、グルコースの濃度がわかる。
【００５６】
（実施例）
以下の実施例および比較例は、本発明をさらに詳細に説明する。
【００５７】
（比較例）
図３に示されるように、金表面上に形成された自己組織化されたアルカンチオールの上端に位置するカルボキシル基に、直接、グルコースオキシダーゼがアミドカップリング反応により結合され、グルコースオキシダーゼを固定した。手順及び結果が以下に記述される。
【００５８】
[試料溶液の調製]
１０ｍＭの最終濃度を有する１６−メルカプトヘキサデカン酸（16-Mercaptohexadecanoic acid）の試料溶液が調製された。溶媒はエタノールであった。
【００５９】
［自己組織化膜の形成］
基材１として、ガラス上に蒸着された金を有する金基板（ＧＥヘルスケア社製；ＢＲ−１００４−０５）が用いられた。当該基材１は、濃硫酸および３０％過酸化水素水を含有するピラニア溶液で１０分間洗浄した。さらに純水を用いて洗浄して乾燥した。当該ピラニア溶液に含有される濃硫酸の３０％過酸化水素水に対する体積比は３であった。
【００６０】
続いて、金基板は試料溶液中に１８時間浸漬され、金基板の表面に自己組織化膜を形成した。最後に、純水により基材１は洗浄され、乾燥された。
【００６１】
［グルコースオキシダーゼの固定］
自己組織化膜を形成する１６−メルカプトヘキサデカン酸の上端に位置するカルボキシル基にグルコースオキシダーゼが結合され、グルコースオキシダーゼが固定された。
【００６２】
具体的には、０．１Ｍ  ＮＨＳ(N-Hydroxysuccinimide)および０．４Ｍ  ＥＤＣ(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)の３５マイクロリットルの混合液により、１６−メルカプトヘキサデカン酸の上端に位置するカルボキシル基が活性化された。その後、３５マイクロリットルのグルコースオキシダーゼ（４０ｕｇ／ｍｌ）が５マイクロリットル／分の流速で添加された。このようにして、１６−メルカプトヘキサデカン酸のカルボキシル基はグルコースオキシダーゼのアミノ基にカップリングされた。
【００６３】
（実施例１）
自己組織化膜の形成とグルコースオキシダーゼの固定との間に、１分子のアミノ酸としてグリシンが供給されたこと以外は、比較例と同様に、実験が行なわれた。手順及び結果は以下に記述される。
【００６４】
[アミノ酸（グリシン）の固定化]
自己組織化膜２を形成する１６−メルカプトヘキサデカン酸（16-Mercaptohexadecanoic acid）の上端に位置するカルボキシル基にグリシンが結合され、グリシンを固定した。
【００６５】
具体的には、比較例と同様にカルボキシル基が活性化された後に、３５マイクロリットルの０．１Ｍグリシン（ｐH：８．９）が５マイクロリットル／分の流速で添加された。このようにして、１６−メルカプトヘキサデカン酸のカルボキシル基がグリシンのアミノ基にカップリングされた。
【００６６】
[グルコースオキシダーゼの固定]
続いて、グリシンのカルボキシル基にグルコースオキシダーゼが結合され、グルコースオキシダーゼを固定した。具体的には、上記と同様にグリシンのカルボキシル基が活性化された後に、３５マイクロリットルのグルコースオキシダーゼ（濃度：２５０マイクログラム／ｍｌ）が５マイクロリットル／分の流速で添加された。このようにして、グリシンのカルボキシル基は、グルコースオキシダーゼの５’末端のアミノ基またはグルコースオキシダーゼに含有されるリジンのアミノ基にカップリングされた。
【００６７】
［固定量の比較］
SPR装置Biacore3000（GEヘルスケア社製）を用いて、実施例１および比較例におけるグルコースオキシダーゼの固定量が測定された。
本明細書において用いられる用語「固定量」とは、単位面積あたりに固定されたグルコースオキシダーゼの量を意味する。
【００６８】
比較例において測定された固定量に対する実施例１において測定された固定量の比は、およそ３０．３２：１であった。
【００６９】
（実施例２〜２０）
グリシンに代え、スレオニン、メチオニン、イソロイシン、プロリン、セリン、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、トロプトファン、システイン、ヒスチジン、アラニン、リジン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、アスパラギン酸、アルギニン、およびチロシンが用いられ、実施例１と同様に各固定量を測定した。これらのアミノ酸は、２０種類の天然アミノ酸である。表１は、測定された固定量を示す。
【００７０】
【表１】
2012053138.tif 000013
【００７１】
当業者は以下のことを表１から理解するであろう。
２０種類のアミノ酸が用いられた場合、比較例と比較して固定量が増加する。さらに、用いられるアミノ酸に応じて、固定量は変化する。
【００７２】
システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グリタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、バリン、アルギニン、およびプロリンが好ましい。なぜなら、これらのアミノ酸から選択される１のアミノ酸が供給された際には、測定された各固定量は５以上であるからである。
【００７３】
システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グリタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、およびバリンがより好ましい。なぜなら、これらのアミノ酸から選択される１のアミノ酸が供給された際には、測定された各固定量は５以上であるからである。
【００７４】
システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、およびチロシンがさらにより好ましい。なぜなら、これらのアミノ酸から選択される１のアミノ酸が供給された際には、測定された各固定量は平均値（２１．６）以上であるからである。
【００７５】
システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、およびアラニンが最も好ましい。なぜなら、これらのアミノ酸から選択される１のアミノ酸が供給された際には、測定された各固定量は平均値の１．２倍を超えるからである。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明は、単位面積あたりに固定されるグルコースオキシダーゼの量を著しく増加させ得る。このことにより、バイオセンサの感度を向上させることが可能になる。当該バイオセンサは、臨床現場において患者由来の生体試料に含有されるグルコースの検出または定量を必要とする検査および診断に用いられ得る。
【符号の説明】
【００７７】
１  金基材
２  アルカンチオール
３  アミノ酸
４  グルコースオキシダーゼ
【図１】
2012053138.tif 000021
【図２】
2012053138.tif 000022
【図３】
2012053138.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】平成24年5月11日(2012.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
（Ａ３）  Ａ１に記載の方法であって、前記工程（ａ）および前記工程（ｂ）との間にさらに工程（ａｂ）を具備する：
前記１分子のアミノ酸のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の混合液により活性化する工程（ａｂ）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
（Ａ４）  Ａ２に記載の方法であって、前記工程（ａ１）および前記工程（ａ２）との間にさらに工程（ａ１ａ）を具備する：
前記自己組織化膜のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の混合液により活性化する工程（ａ１ａ）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
（Ａ６）  Ａ１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グルタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、バリン、アルギニン、およびプロリンからなる群から選択される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
（Ａ７）  Ａ１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グルタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、およびバリンからなる群から選択される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
（Ｂ３）  Ｂ１のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グルタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、バリン、アルギニン、およびプロリンからなる群から選択される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
（C3）  Ｃ１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グルタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、バリン、アルギニン、およびプロリンからなる群から選択される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
（C4）  Ｃ１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グルタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、およびバリンからなる群から選択される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
具体的には、０．１Ｍ  ＮＨＳ(Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（(N-Hydroxysuccinimide）)および０．４Ｍ  ＥＤＣ(１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)）)の３５マイクロリットルの混合液により、１６−メルカプトヘキサデカン酸の上端に位置するカルボキシル基が活性化された。その後、３５マイクロリットルのグルコースオキシダーゼ（４０ｕｇ／ｍｌ）が５マイクロリットル／分の流速で添加された。このようにして、１６−メルカプトヘキサデカン酸のカルボキシル基はグルコースオキシダーゼのアミノ基にカップリングされた。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グルタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、バリン、アルギニン、およびプロリンが好ましい。なぜなら、これらのアミノ酸から選択される１のアミノ酸が供給された際には、測定された各固定量は５以上であるからである。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グルタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、およびバリンがより好ましい。なぜなら、これらのアミノ酸から選択される１のアミノ酸が供給された際には、測定された各固定量は５以上であるからである。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースオキシダーゼを自己組織化膜上に固定する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｂ）をこの順に含有する：
１分子のアミノ酸および自己組織化膜を具備する基材を用意する工程（ａ）、
ここで、前記１分子のアミノ酸は、以下の化学式（Ｉ）により表されるペプチド結合により前記自己組織化膜に結合しており、
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択され、
【化１】
2012053138.tif 000024
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
前記基材上にグルコースオキシダーゼを供給し、前記１分子のアミノ酸のカルボキシル基と前記グルコースオキシダーゼのアミノ基との反応として以下の化学式（ＩＩ）よって表されるペプチド結合を形成する工程（ｂ）。
【化２】
2012053138.tif 000025
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記工程（ａ）は、以下の工程（ａ１）および（ａ２）を具備する：
自己組織化膜を表面に具備する基材を用意する工程（ａ１）、ここで、前記自己組織化膜は一端にカルボキシル基を有し、
前記１分子のアミノ酸を前記基材に供給し、前記化学式（Ｉ）により表される前記自己組織化膜の一端の前記カルボキシル基と前記１分子のアミノ酸のアミノ基との間の反応としてペプチド結合を形成する工程（ａ２）。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記工程（ａ）および前記工程（ｂ）との間にさらに工程（ａｂ）を具備する：
前記１分子のアミノ酸のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の混合液により活性化する工程（ａｂ）。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、前記工程（ａ１）および前記工程（ａ２）との間にさらに工程（ａ１ａ）を具備する：
前記自己組織化膜のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の混合液により活性化する工程（ａ１ａ）。
【請求項５】
前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、請求項１に記載の方法。
【化３】
2012053138.tif 000026
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
【請求項６】
請求項１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グルタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、バリン、アルギニン、およびプロリンからなる群から選択される。
【請求項７】
請求項１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グルタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、およびバリンからなる群から選択される。
【請求項８】
請求項１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、およびチロシンからなる群から選択される。
【請求項９】
請求項１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、およびアラニンからなる群から選択される。
【請求項１０】
自己組織化膜、１分子のアミノ酸、およびグルコースオキシダーゼを備えたセンサであって、
前記自己組織化膜および前記グルコースオキシダーゼの間には前記１分子のアミノ酸が挟まれており、
前記グルコースオキシダーゼが、以下の化学式（ＩＩ）によって表される２つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
【化４】
2012053138.tif 000027
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択される、センサ。
【請求項１１】
前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、請求項１０に記載のセンサ。
【化５】
2012053138.tif 000028
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
【請求項１２】
請求項１０のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グルタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、バリン、アルギニン、およびプロリンからなる群から選択される。
【請求項１３】
請求項１０のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グルタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、およびバリンからなる群から選択される。
【請求項１４】
請求項１０のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、およびチロシンからなる群から選択される。
【請求項１５】
請求項１０のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、およびアラニンからなる群から選択される。
【請求項１６】
センサを用いて試料に含まれるグルコースを検出または定量する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｃ）をこの順で具備する：
自己組織化膜、１分子のアミノ酸、およびグルコースオキシダーゼを備えたセンサを用意する工程（ａ）、ここで
前記自己組織化膜および前記グルコースオキシダーゼの間には前記１分子のアミノ酸が挟まれており、
前記グルコースオキシダーゼが、以下の化学式（ＩＩ）によって表される２つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
【化６】
2012053138.tif 000029
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択され、
前記センサに前記試料を供給し、前記グルコースオキシダーゼによる前記グルコースの分解によりグルコノラクトンおよび過酸化水素を生じる工程（ｂ）、
前記グルコノラクトンまたは過酸化水素の少なくともいずれか一方を検出または定量し、前記試料に含有されるグルコースを検出または定量する工程（ｃ）。
【請求項１７】
請求項１６の方法であって、前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される。
【化７】
2012053138.tif 000030
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
【請求項１８】
請求項１６の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グルタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、バリン、アルギニン、およびプロリンからなる群から選択される。
【請求項１９】
請求項１６の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グルタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、およびバリンからなる群から選択される。
【請求項２０】
請求項１６の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、およびチロシンからなる群から選択される。
【請求項２１】
請求項１６の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、およびアラニンからなる群から選択される。
【手続補正書】
【提出日】平成24年8月22日(2012.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースオキシダーゼを自己組織化膜上に固定する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｂ）をこの順に含有する：
１分子のアミノ酸および自己組織化膜を具備する基材を用意する工程（ａ）、
ここで、前記１分子のアミノ酸は、以下の化学式（Ｉ）により表されるペプチド結合により前記自己組織化膜に結合しており、
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択され、
【化１】
2012053138.tif 000031
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
前記基材上にグルコースオキシダーゼを供給し、前記１分子のアミノ酸のカルボキシル基と前記グルコースオキシダーゼのアミノ基との反応として以下の化学式（ＩＩ）よって表されるペプチド結合を形成する工程（ｂ）。
【化２】
2012053138.tif 000032
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記工程（ａ）は、以下の工程（ａ１）および（ａ２）を具備する：
自己組織化膜を表面に具備する基材を用意する工程（ａ１）、ここで、前記自己組織化膜は一端にカルボキシル基を有し、
前記１分子のアミノ酸を前記基材に供給し、前記化学式（Ｉ）により表される前記自己組織化膜の一端の前記カルボキシル基と前記１分子のアミノ酸のアミノ基との間の反応としてペプチド結合を形成する工程（ａ２）。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記工程（ａ）および前記工程（ｂ）との間にさらに工程（ａｂ）を具備する：
前記１分子のアミノ酸のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の混合液により活性化する工程（ａｂ）。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、前記工程（ａ１）および前記工程（ａ２）との間にさらに工程（ａ１ａ）を具備する：
前記自己組織化膜のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の混合液により活性化する工程（ａ１ａ）。
【請求項５】
前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、請求項１に記載の方法。
【化３】
2012053138.tif 000033
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
【請求項６】
請求項１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グルタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、バリン、アルギニン、およびプロリンからなる群から選択される。
【請求項７】
請求項１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グルタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、およびバリンからなる群から選択される。
【請求項８】
請求項１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、およびチロシンからなる群から選択される。
【請求項９】
請求項１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、およびアラニンからなる群から選択される。
【請求項１０】
自己組織化膜、１分子のアミノ酸、およびグルコースオキシダーゼを備えたセンサであって、
前記自己組織化膜および前記グルコースオキシダーゼの間には前記１分子のアミノ酸が挟まれており、
前記グルコースオキシダーゼが、以下の化学式（ＩＩ）によって表される２つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
【化４】
2012053138.tif 000034
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択される、センサ。
【請求項１１】
前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、請求項１０に記載のセンサ。
【化５】
2012053138.tif 000035
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
【請求項１２】
請求項１０のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グルタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、バリン、アルギニン、およびプロリンからなる群から選択される。
【請求項１３】
請求項１０のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グルタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、およびバリンからなる群から選択される。
【請求項１４】
請求項１０のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、およびチロシンからなる群から選択される。
【請求項１５】
請求項１０のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、およびアラニンからなる群から選択される。
【請求項１６】
センサを用いて試料に含まれるグルコースを検出または定量する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｃ）をこの順で具備する：
自己組織化膜、１分子のアミノ酸、およびグルコースオキシダーゼを備えたセンサを用意する工程（ａ）、ここで
前記自己組織化膜および前記グルコースオキシダーゼの間には前記１分子のアミノ酸が挟まれており、
前記グルコースオキシダーゼが、以下の化学式（ＩＩ）によって表される２つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
【化６】
2012053138.tif 000036
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択され、
前記センサに前記試料を供給し、前記グルコースオキシダーゼによる前記グルコースの分解によりグルコノラクトンおよび過酸化水素を生じる工程（ｂ）、
前記グルコノラクトンまたは過酸化水素の少なくともいずれか一方を検出または定量し、前記試料に含有されるグルコースを検出または定量する工程（ｃ）。
【請求項１７】
請求項１６の方法であって、前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される。
【化７】
2012053138.tif 000037
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
【請求項１８】
請求項１６の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グルタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、バリン、アルギニン、およびプロリンからなる群から選択される。
【請求項１９】
請求項１６の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、チロシン、グルタミン酸、イソロイシン、スレオニン、アスパラギン酸、トリプトファン、およびバリンからなる群から選択される。
【請求項２０】
請求項１６の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、アラニン、アスパラギン、ロイシン、およびチロシンからなる群から選択される。
【請求項２１】
請求項１６の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、およびアラニンからなる群から選択される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
（Ａ５）前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、Ａ１に記載の方法。
【化３】
2012053138.tif 000038
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
（Ｂ２）前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、Ｂ１に記載のセンサ。
【化５】
2012053138.tif 000039
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
（Ｃ２）Ｃ１の方法であって、前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される。
【化７】
2012053138.tif 000040
（Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す）
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
１分子のグルコースオキシダーゼ４は、１つの５’末端のみを有する一方、１分子のグルコースオキシダーゼ４は、多数のリシン基を有する。従って、ほとんど全ての化学式（ＩＩ）は、詳細には、以下の化学式（ＩＩＩ）によって表される。
【化１０】
2012053138.tif 000041
（ここで、Ｒは１分子のアミノ酸の側鎖を表す）
【国際調査報告】
2012053138.tif 000042
2012053138.tif 000043
2012053138.tif 000044