(57)【要約】  本発明は、アペリン又はアペリン受容体のアゴニストを含む、ホットフラッシュの抑制剤、アペリン受容体のアゴニストがフユイチゴ、ヨメナ、ムベ、リュウキュウイチゴ、インドヨメナ、マテバシイ、ヤマモモ、フトモモ及びコナラの植物体又はその抽出物、さらにはサフランエキス、マツエキス、キナエキス及びコンフリーエキス、オウゴンエキス、ローズマリーエキス、アンズ核粒、ゲンチアナエキス、タイムエキス、ハッカ末、タイソウエキス、ホップエキス、キウイエキス、ローマカミツレエキス、リンゴエキス、サンザシエキス及びウコンエキスからなる群から選択されるホットフラッシュの抑制剤及びホットフラッシュを改善するための薬剤のスクリーニング方法を提供する。
2012133825.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アペリン又はアペリン受容体のアゴニストを含む、ホットフラッシュ抑制剤。
【請求項２】
前記アペリンが、以下の：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアペリン活性を有するタンパク質
である、請求項１に記載のホットフラッシュ抑制剤。
【請求項３】
前記アペリン受容体のアゴニストが、フユイチゴ、ヨメナ、ムベ、リュウキュウイチゴ、インドヨメナ、マテバシイ、ヤマモモ、フトモモ及びコナラの植物体又はその抽出物、さらにはサフランエキス、マツエキス、キナエキス及びコンフリーエキス、オウゴンエキス、ローズマリーエキス、アンズ核粒、ゲンチアナエキス、タイムエキス、ハッカ末、タイソウエキス、ホップエキス、キウイエキス、ローマカミツレエキス、リンゴエキス、サンザシエキス及びウコンエキスからなる群から選択される、（１）に記載のホットフラッシュ抑制剤。
【請求項４】
アペリン、又はアペリン受容体のアゴニストを投与することを含む、ホットフラッシュの治療、改善、又は予防方法。
【請求項５】
前記アペリンが、以下の：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアペリン活性を有するタンパク質 
である、請求項４に記載のホットフラッシュの治療、改善、又は予防方法。
【請求項６】
前記アペリン受容体のアゴニストが、フユイチゴ、ヨメナ、ムベ、リュウキュウイチゴ、インドヨメナ、マテバシイ、ヤマモモ、フトモモ及びコナラの植物体又はその抽出物、さらにはサフランエキス、マツエキス、キナエキス及びコンフリーエキス、オウゴンエキス、ローズマリーエキス、アンズ核粒、ゲンチアナエキス、タイムエキス、ハッカ末、タイソウエキス、ホップエキス、キウイエキス、ローマカミツレエキス、リンゴエキス、サンザシエキス及びウコンエキスからなる群から選択される、請求項４に記載のホットフラッシュの治療、改善、又は予防方法。
【請求項７】
アペリン受容体の活性またはアペリンの発現を指標としたホットフラッシュ抑制剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、更年期障害により生じるホットフラッシュの抑制剤、さらにホットフラッシュの改善方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
更年期障害の一つであるホットフラッシュ（体表面温度の局所的な上昇、およびそれに伴うのぼせ、ほてり、紅潮や多汗）は、閉経期／閉経後症候群の一般的な症状である。女性ホルモン（エストロゲン等）の低下がホットフラッシュを始めとした更年期障害の原因と考えられており、若年層の女性においても過度のストレスやダイエット等のためにホルモンバランスが崩れ更年期障害と同様の症状を呈することがある。これらの更年期障害及び更年期障害と同様の症状の治療法として女性ホルモンの補充が行われることがある。しかしながら女性ホルモンの補充療法は、乳癌、子宮内膜癌などの発癌リスクの上昇といった副作用が生じることが知られており、長期にわたる女性ホルモン補充療法は好ましくない。これまで、女性ホルモン補充療法に代わるホットフラッシュの予防又は治療のため、血管拡張特性を有するＣＧＲＰに対するアンタゴニスト（特開２００８−５２５５１０号公報）や、ホットフラッシュに関与する性腺刺激ホルモン放出ホルモンのアンタゴニスト（特表２００２−５１２９７６号公報、特開２００８−１９５７２８号公報）となる化合物が特定されている。【０００３】
アペリンは、１９９８年に、長らくオーファン受容体であった７回膜貫通型のＧタンパク質共役型受容体であるＡＰＪに対する結合因子として牛の胃の細胞抽出液から単離された分子である。アペリンのｃＤＮＡは７７アミノ酸をコードするが、この前駆体からロング・フォーム（４２〜７７アミノ酸）とショート・フォーム（６５〜７７アミノ酸）が形成される。どちらのアペリンもＡＰＪの活性化を誘導することが知られている。これまで、心血管系や中枢神経系で、ＡＰＪの発現が報告されてきており、心臓では心筋収縮作用、神経系ではバソプレシンの発現を制御するなど、体液の調節機構に関与することが示唆されてきている。また、ＡＰＪはエイズウイルスの受容体として感染にも関与することから、種々の観点からの創薬のターゲットとしてにわかに注目を浴びつつある受容体である。ＡＰＪの発現は、血管系においては、血管内皮細胞や壁細胞に発現するとされてきており、アフリカツメガエルを用いた遺伝子ノックダウンの実験にて、アペリン／ＡＰＪシステムが血管発生に必須の役割を果たすことが示され、またマウスやヒトにおいても本受容体の発現が内皮細胞に認められることから、哺乳類においても血管形成に関与することが予想されてきた（実験医学 Vol. 26, No.9(2008), pp. 1380-1383）。また、近年、アペリンのノックアウトマウスの解析や、試験管内での血管系解析を通して、血管内皮細胞がＡｎｇ１で刺激を受けた際に分泌するアペリンが血管径を制御することが報告されている（Kidoya et al, (2008) Spatial and temporal role of the apelin/APJ system in the caliber size regulation of blood vessels during angiogenesis. EMBO J 27: 522-534）。しかしながら、これまでにアペリンが、ホットフラッシュの抑制や改善に関与することについては全く明らかにされていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
更年期障害の一つであるホットフラッシュの抑制又は改善に関して、これまで臨床上十分に満足できる医薬品は報告されていない。そこで、本発明は、ホットフラッシュの抑制剤、及びホットフラッシュを改善するための方法を提供することを課題とする。なお、本発明において、抑制剤とは、治療剤、予防剤、及び改善剤を含めたものを意味し、改善方法は、治療方法、予防方法、及び抑制方法を含めたものを意味するものとする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、アペリンと更年期障害による体表面温度の局所的な上昇、およびそれに伴うほてりとの関係を調べるために、卵巣摘出を施した、アペリンを表皮で高発現させる遺伝子を導入したマウス（更年期アペリン高発現マウス）及び野生型マウス（更年期野生型マウス）において、血管拡張剤の投与後における尾部温度を比較した。更年期野生型マウスに血管拡張剤を投与した後の尾部温度の変化の測定は、更年期障害のホットフラッシュのモデルとして確立されている（Kai M, Yamauchi A, Tominaga K, Koga A, Kai H, Kataoka Y: Soybean isoflavones eliminate nifedipine induced flushing of tail skin in ovariectomized mice, J Pharmacol Sci 2004, 95: 476-478）。この実験において、本発明者らは、更年期野生型マウスでは、上昇した皮膚温度が長時間継続した一方で、更年期アペリン高発現マウスでは、更年期野生型マウスに比較して早い時期に尾部温度が正常値にまで減少したことを確認した。この結果は、アペリンがホットフラッシュの抑制又は改善に寄与することを示すものである。【０００６】
本発明者らは、上記知見に基づき、ホットフラッシュの抑制剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、皮膚細胞における内因性アペリンの発現を亢進する薬剤、またはアペリン受容体を活性化する薬剤をホットフラッシュ抑制剤として選定することを特徴とする。内因性アペリンの発現の亢進は、例えば皮膚細胞中のアペリンの量を直接測定することにより決定することができ、また、アペリン受容体の活性化は、皮膚細胞中のカルシウムイオン濃度、ｃＡＭＰ濃度等を測定することにより決定することができる。こうして決定されたアペリン受容体を活性化する薬剤、すなわちアペリン受容体のアゴニストは、好ましくはアペリン様の作用を有する物質である。【０００７】
こうして、本発明者らが、アペリン／ＡＰＪシグナル系を利用したスクリーニングを開発し、様々な物質に対してスクリーニングを行ったところ、アペリン様薬剤、すなわちアペリンと同様の機能を有する薬剤として、フユイチゴ、ヨメナ、ムベ、リュウキュウイチゴ、インドヨメナ、マテバシイ、ヤマモモ、フトモモ及びコナラの植物体又はそのエキス、さらにはサフランエキス、マツエキス、キナエキス及びコンフリーエキス、オウゴンエキス、ローズマリーエキス、アンズ核粒、ゲンチアナエキス、タイムエキス、ハッカ末、タイソウエキス、ホップエキス、キウイエキス、ローマカミツレエキス、リンゴエキス、サンザシエキス及びウコンエキスが、ＡＰＪを活性化し、アペリンと同様の機能を有するという驚くべき知見を得た。したがって、これらの物質は、アペリンと同様にホットフラッシュの抑制、改善、治療、及び／又は予防に有用である。【０００８】
本願は以下の発明を包含する：
（１）  アペリン、又はアペリン受容体のアゴニストを含んで成るホットフラッシュの抑制剤。
（２）  前記アペリンが、以下の：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアペリン活性を有するタンパク質 
である、（１）のホットフラッシュ抑制剤。
（３）  前記アペリン受容体のアゴニストが、フユイチゴ、ヨメナ、ムベ、リュウキュウイチゴ、インドヨメナ、マテバシイ、ヤマモモ、フトモモ及びコナラの植物体又はそのエキス、さらにはサフランエキス、マツエキス、キナエキス及びコンフリーエキス、オウゴンエキス、ローズマリーエキス、アンズ核粒、ゲンチアナエキス、タイムエキス、ハッカ末、タイソウエキス、ホップエキス、キウイエキス、ローマカミツレエキス、リンゴエキス、サンザシエキス及びウコンエキスからなる群から選択される、（１）に記載のホットフラッシュ抑制剤。
（４）  アペリン、又はアペリン受容体のアゴニストを、ホットフラッシュの改善を必要とする対象者に投与することを含む、ホットフラッシュの治療、改善、又は予防方法。
（５）  前記アペリンが、以下の：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアペリン活性を有するタンパク質である、（４）に記載のホットフラッシュの治療、改善、又は予防方法。
（６）  前記アペリン受容体のアゴニストが、フユイチゴ、ヨメナ、ムベ、リュウキュウイチゴ、インドヨメナ、マテバシイ、ヤマモモ、フトモモ及びコナラの植物体又はそのエキス、さらにはサフランエキス、マツエキス、キナエキス及びコンフリーエキス、オウゴンエキス、ローズマリーエキス、アンズ核粒、ゲンチアナエキス、タイムエキス、ハッカ末、タイソウエキス、ホップエキス、キウイエキス、ローマカミツレエキス、リンゴエキス、サンザシエキス及びウコンエキスからなる群から選択される、（４）に記載のホットフラッシュの治療、改善、又は予防方法。
（７）  アペリン、又はアペリン受容体のアゴニストのホットフラッシュの抑制のための使用。
（８）  前記アペリンが、以下の：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアペリン活性を有するタンパク質 
である、（７）に記載のホットフラッシュ抑制のための使用。
（９）  前記アペリン受容体のアゴニストが、フユイチゴ、ヨメナ、ムベ、リュウキュウイチゴ、インドヨメナ、マテバシイ、ヤマモモ、フトモモ及びコナラの植物体又はそのエキス、さらにはサフランエキス、マツエキス、キナエキス及びコンフリーエキス、オウゴンエキス、ローズマリーエキス、アンズ核粒、ゲンチアナエキス、タイムエキス、ハッカ末、タイソウエキス、ホップエキス、キウイエキス、ローマカミツレエキス、リンゴエキス、サンザシエキス及びウコンエキスからなる群から選択される、（７）に記載のホットフラッシュ抑制のための使用。
（１０）  ホットフラッシュの抑制のための製剤の製造ためのアペリン、又はアペリン受容体のアゴニストの使用。
（１１）  前記アペリンが、以下の：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアペリン活性を有するタンパク質 
である、（７）の使用。
（１２）  前記アペリン受容体のアゴニストが、フユイチゴ、ヨメナ、ムベ、リュウキュウイチゴ、インドヨメナ、マテバシイ、ヤマモモ、フトモモ及びコナラの植物体又はそのエキス、さらにはサフランエキス、マツエキス、キナエキス及びコンフリーエキス、オウゴンエキス、ローズマリーエキス、アンズ核粒、ゲンチアナエキス、タイムエキス、ハッカ末、タイソウエキス、ホップエキス、キウイエキス、ローマカミツレエキス、リンゴエキス、サンザシエキス及びウコンエキスからなる群から選択される、（７）に記載の使用。
（１３）フユイチゴ、ヨメナ、ムベ、リュウキュウイチゴ、インドヨメナ、マテバシイ、ヤマモモ、フトモモ及びコナラの植物体又はそのエキス、さらにはサフランエキス、マツエキス、キナエキス及びコンフリーエキス、オウゴンエキス、ローズマリーエキス、アンズ核粒、ゲンチアナエキス、タイムエキス、ハッカ末、タイソウエキス、ホップエキス、キウイエキス、ローマカミツレエキス、リンゴエキス、サンザシエキス及びウコンエキスからなる群から選択される、アペリン受容体のアゴニスト。
（１４）  アペリン受容体の活性またはアペリンの発現を指標としたホットフラッシュ抑制剤のスクリーニング方法。
（１５）  （１４）に記載のスクリーニング方法により得られた、ホットフラッシュ抑制剤。
（１６）  アペリンをコードする遺伝子を含んで成るベクターを含有するホットフラッシュの抑制剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のアペリン、又はアペリン受容体のアゴニストを含むホットフラッシュ抑制剤を使用することにより、更年期障害の一つであるホットフラッシュ、すなわち体表面温度の局所的な上昇、およびそれに伴うほてり、のぼせ、紅潮、多汗などの症状を抑制、治療、予防又は改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、血管拡張剤（ニフェジピン（Ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ））の投与後における更年期野生型マウス（ＯＶＸＷＴ）、更年期アペリン高発現マウス（ＯＶＸＴＧ）、及び偽手術野生型マウス（ｓｈａｍＷＴ）の各マウスにおける尾部の温度変化を示す。
【図２】図２は、ヒトアペリンのアミノ酸配列（配列番号１）及びＤＮＡ配列（配列番号２）を示す。
【図３】アペリンによる細胞内ｃＡＭＰ濃度の減少、及びアペリン中和抗体による細胞内ｃＡＭＰ濃度の減少の抑制を示すグラフである。
【図４】アペリン様薬剤（サフランエキス、マツエキス、キナエキス、コンフリーエキス、オウゴンエキス、ローズマリーエキス、アンズ核粒、ゲンチアナエキス、タイムエキス、ハッカ末、ウコンエキス、サンザシエキス、タイソウエキス、ホップエキス、リンゴエキス、ローマカミツレエキス、及びキウイエキス）単独（棒グラフ左）、及びアペリン様薬剤＋アペリン中和抗体（棒グラフ右）を添加した場合における細胞内ｃＡＭＰ濃度上昇のコントロールであるフォルスコリン添加群に対する割合を示すグラフである。
【図５】アペリン様薬剤（フユイチゴ、ヨメナ、ムベ、マテバシイ、リュウキュウイチゴ、インドヨメナ、コナラ、ヤマモモ、及びフトモモのエキス）単独（棒グラフ左）、及びアペリン様薬剤＋アペリン中和抗体（棒グラフ右）を添加した場合における細胞内ｃＡＭＰ濃度上昇のコントロールであるフォルスコリン添加群に対する割合を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の１の態様では、本発明は、アペリン、又はアペリン受容体のアゴニストを含んでなるホットフラッシュの抑制剤に関する。
【００１２】
ヒトアペリンは、心臓、肺、腎臓、脂肪、胃、脳、副腎、内皮など様々な部位での発現が報告されており、77アミノ酸の前駆タンパク質に由来する36アミノ酸から成るアペリンAPJ受容体のリガンドとして知られる（Kawamata Y et al, (2001) Molecular properties of apelin: tissue distribution and receptor binding. BIOCHMICA ET BIOPHYSICA ACTA. 2-3:162-171）。また、アペリンには、そのアミノ酸がＮ末端及び／又はＣ末端が欠落した変異体、例えばアペリン-13（アペリンの第24〜36番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド）なども知られ、よって本明細書において「アペリン」という場合、配列番号１により表される36アミノ酸からなる全長ヒトアペリンに限らず、アペリンの活性を有する限り、その１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアペリン変異体、並びにこれらのフラグメントも包含する。欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は、１〜５、１〜３、又は１〜２個であることが好ましい。また、アペリンには、ヒト由来のみならず、ヒト以外の霊長類や、ラット、マウス、ウサギなどといったげっ歯動物由来のものも含まれる。さらにアペリンには、配列番号１により表される３６アミノ酸からなる前長ヒトアペリンに対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する配列からなるアペリン変異体も包含するモノとする。さらに好ましい態様では上記アペリン変異体の配列同一性は、少なくとも９５％超、さらに好ましくは９８％超、より好ましくは９９％超である。
【００１３】
さらに、本明細書でいうアペリンをコードする遺伝子とは、アペリンをコードする遺伝子の他に、その１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたものであってアペリン活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、さらにはアペリンをコードする遺伝子に対し高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするものであってアペリン活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む。ここで「アペリン活性」とは、アペリンがその受容体であるAPJに結合することによって、細胞内シグナル伝達分子であるAktをリン酸化することや、細胞内のcAMP濃度を減少させることとして定義される。なお、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、例えばナトリウム濃度が約10〜40ｍＭ、好ましくは約20ｍＭ、温度が約50〜70℃、好ましくは約60〜65℃であることを含む条件をいう。
【００１４】
ＡＰＪ受容体は、ＡＧＴＲＬ１（アンジオテンシン受容体様１）とも称され、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の１つであり、３８０のアミノ酸から成る。この膜貫通領域は、アンジオテンシン（ＡＴ１）受容体と４０〜５０％の相同性を示す。アペリン／ＡＰＪシグナルは、血管ではＡＮＧ１／Ｔｉｅ２の下流シグナルであり、心筋の収縮や、血圧及び血流、並びに血管形成に関与することが報告されている（Kidoya et al, (2008) Spatial and temporal role of the apelin/APJ system in the caliber size regulation of blood vessels during angiogenesis. EMBO J 27: 522-534）。ＡＰＪ受容体は、αサブユニット（約４０〜５０ｋＤａ）、βサブユニット（約３５ｋＤａ）及びγサブユニット（約１０ｋＤａ）からなるヘテロ三量体Ｇタンパク質と共役しており、情報伝達（シグナル）カスケードに関連していることが知られている。ＡＰＪ受容体が活性化していない状態ではα，β，γの各々のサブユニットは強く結合しているが、ＡＰＪ受容体にアペリンが結合することにより、ＡＰＪ受容体が活性化し、αサブユニットに結合しているＧＤＰとＧＴＰの交換反応がおこり、ＧＴＰ結合型αサブユニットとβγサブユニットに解離する。これらのサブユニットは、各々の標的タンパク質・酵素を活性化し、シグナルを下流へと伝達する。その後、αサブユニットに結合したＧＴＰは、αサブユニットのＧＴＰａｓｅ活性により分解されてＧＤＰとなり、ＧＤＰ結合型αサブユニットはβγサブユニットと結合し、不活性型の三量体を再び形成する。三量体Ｇタンパク質はαサブユニットの機能及び遺伝子の相違から、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｏ、Ｇｑ、Ｇｔ、Ｇｏｌｆ等のサブファミリーに分類されている。ＧｓとＧｉはそれぞれアデニル酸シクラーゼの活性を亢進又は抑制し、Ｇｏは神経組織のシグナル伝達系に関係し、ＧｑはホスホリパーゼＣβを活性化し、そしてＧｔとＧｏｌｆはそれぞれ視細胞（網膜）と臭細胞のシグナル伝達系に重要な役割を果たしている。ＡＰＪ受容体がアペリンと結合した場合には、Ｇｉ経路を介してアデニル酸シクラーゼの活性が抑制されるため、その結果、細胞内のｃＡＭＰ濃度が減少する。
【００１５】
本発明においてアペリン受容体アゴニストとは、アペリンと同様の作用を発揮する物質であるアペリン様薬剤と同意義で用いられており、アペリン受容体を介してアペリンと同様の作用を発揮する物質のことをいう。アペリン受容体アゴニストとして、本明細書中に様々な物質が特定されているが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
本発明においてホットフラッシュとは、女性ホルモンの減少に伴い、脳の視床下部がコントロールする自立神経が乱れ、体温調節機能が低下することに起因する症状であり、体表面温度の局所的な上昇、およびそれに伴うほてり、のぼせ、紅潮、及び多汗といった症状を指す。本発明のホットフラッシュは、特に更年期障害として現れるホットフラッシュのことを指す。
【００１７】
本発明において、ホットフラッシュの抑制剤とは、ホットフラッシュの症状である体表面温度の局所的な上昇、およびそれに伴うほてり、のぼせ、紅潮、及び多汗といった症状を、抑制、軽減、治療、改善、又は予防する薬剤である。本発明のホットフラッシュ抑制剤は、アペリン、又はアペリン受容体のアゴニストを含むものであるが、これらの成分を単独で、又は複数の成分を組み合わせて含んでもよい。本発明において、抑制剤とは、治療剤、予防剤、及び改善剤を含めたものを意味する。
【００１８】
本発明のホットフラッシュ抑制剤は、単独で用いても、またその使用目的に合わせて溶媒、賦型剤や他の成分と組合せ、用量、用法、剤型を適宜決定することが可能である。例えば、本発明の抑制剤の投与形態は、経口、非経口、外用等であってよい。製剤の剤型としては、例えば錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤、又は注射剤、点滴剤、若しくは坐剤等の非経口投与剤軟膏、クリーム、乳液、ローション、浴用剤等の外用剤を挙げることができる。
【００１９】
本発明のホットフラッシュ抑制剤中の本発明のアペリン等、又はアペリン受容体アゴニスト等の抑制剤の配合量は、用途に応じて適宜決定できるが、一般には製剤中、0.00001〜20.0質量％、好適には0.00001〜10.0質量％である。
【００２０】
また、本発明のホットフラッシュ抑制剤には、アペリン又はアペリンアペリン受容体アゴニスト以外に、例えば、通常の食品や医薬品に使用される賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、増粘剤、乳化剤、酸化防止剤、甘味料、酸味料、調味料、着色料、香料等、化粧品等に通常用いられる美白剤、保湿剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００２１】
本発明の別の態様では、本発明は、アペリン又はアペリン受容体のアゴニストを投与することを含むホットフラッシュの改善方法に関する。この場合、アペリン又はアペリン受容体のアゴニストは、ホットフラッシュの症状である体表面温度の局所的な上昇、およびそれに伴うのぼせ、ほてり、紅潮や多汗のうちのいずれか又はその組合せを患うヒトに対して投与される。本発明の改善方法とは、治療方法、予防方法、及び抑制方法を含めたものを意味するものとする。アペリン又はアペリン受容体のアゴニストは、経口、非経口（静脈内、動脈内、経皮、経粘膜）投与により投与される。
【００２２】
本発明の別の態様では、本発明はホットフラッシュの抑制剤をスクリーニングする方法に関する。この方法は、アペリン受容体の活性又はアペリンの発現を指標とすることにより行われる。
【００２３】
アペリン受容体の活性を指標とする、ホットフラッシュの抑制剤をスクリーニングする方法は、皮膚細胞中のカルシウムイオン濃度、ｃＡＭＰ濃度等を測定することにより、アペリン受容体の活性化を指標とすることができる。ここで、アペリン受容体を活性化する薬剤は、アペリン受容体アゴニストであることから、本発明は、アペリン受容体アゴニストをスクリーニングする方法にも関する。候補薬剤が、皮膚細胞中のカルシウムイオン濃度、ｃＡＭＰを低下することができた場合、これらの候補薬剤を、アペリン受容体アゴニスト又はホットフラッシュの抑制剤と決定することができる。さらにこうして選択された候補薬剤と共にアペリン受容体の中和抗体を用いて二次スクリーニングを行い、カルシウムイオン濃度やｃＡＭＰ濃度がある程度回復した場合に、かかる候補薬剤をアペリン受容体アゴニスト又はホットフラッシュの抑制剤と決定することができる。こうして決定されたアペリン受容体を活性化する薬剤、すなわちアペリン受容体のアゴニストは、アペリン受容体を活性化すれば任意の物質であってもよく、例えば、化合物、エキスであり、好ましくはアペリン様のペプチドである。
【００２４】
より具体的に、本発明のアペリン様薬剤のスクリーニングは、まず、１次スクリーニングとして、ｃＡＭＰルシフェラーゼレポーターベクターをトランスフェクトした単離細胞（例えば、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞）を９６ウェルプレートに播種し、そこに候補薬剤を添加してプレインキュベートし、フォルスコリンによりアデニル酸シクラーゼを活性化させた後、ルシフェラーゼの発光をルミノメーター（例えば、ＧｌｏＭａｘTM  ９６  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ））によりｃＡＭＰ濃度を測定し、フォルスコリンによるｃＡＭＰ濃度上昇を抑制した薬剤を選定とする。そして、次に、ｃＡＭＰ濃度の減少がＡＰＪの活性化を介していることを確認するために、２次スクリーニングとして、１次スクリーニングで選定した薬剤とアペリン中和抗体（例えば、４Ｇ５）とを一緒に加え、１次スクリーニングと同様のルシフェラーゼアッセイを行う。その結果、中和抗体の添加により、ｃＡＭＰ濃度の減少が抑制され、８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％までｃＡＭＰ濃度の減少を回復する薬剤をアペリン様薬剤として選定することができる。
【００２５】
内因性アペリンを指標とする、ホットフラッシュの抑制剤をスクリーニングする方法は、皮膚細胞における内因性アペリンの発現を指標とし、皮膚細胞における内因性アペリンの発現を亢進する薬剤をホットフラッシュ抑制剤として選定することを特徴とする。ホットフラッシュの抑制剤をスクリーニングする方法の一態様である、内因性アペリンの発現の亢進は、例えば皮膚細胞中のアペリンの量を直接測定することにより決定することができる。皮膚細胞中のアペリンの量の測定は、アペリンに特異的な抗体を利用し、当業界において周知の方法、例えば蛍光物質、色素、酵素などを利用する免疫染色法、ウエスタンブロット法、免疫測定方法、例えばＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法など、様々な方法により実施できる。また、皮膚細胞からＲＮＡを抽出し、アペリンをコードするｍＲＮＡの量を測定することにより決定することもできる。ｍＲＮＡの抽出、その量の測定も当業界において周知であり、例えばＲＮＡの定量は定量ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により行われてもよい。以上の他、アペリンの既知の生物活性を測定することによりアペリンの発現量を測定することもできる。他に、アペリンの発現はin situハイブリダイゼーション法やその生物活性の測定を通じて決定することができる。例えば皮膚細胞中の内因性アペリンの発現がコントロール値と比べ30％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは70％以上、最も好ましくは100％以上亢進したら、「ホットフラッシュの抑制剤」と判断する、としてよい。コントロール値としては、限定されるものではないが、例えば統計学的に有意な数（例えば10人分以上、好ましくは100人分以上）の健常人の対応の部位における皮膚細胞の内因性アペリンの発現量の平均値であってよい。
【００２６】
本明細書中において、皮膚細胞には表皮細胞、線維芽細胞、血管・リンパ管内皮細胞、脂肪細胞が含まれ、特に表皮細胞には、角化細胞、顆粒細胞、有棘細胞等が含まれ、ヒト由来であっても、その他の動物、例えばラット、マウス、ウサギなどであってもよい。
【００２７】
好適な態様において、上記スクリーニング方法は更に、上記亢進能力を有する候補薬剤を、血管拡張剤を投与された更年期モデル動物、例えば卵巣除去動物、に適用し、内臓温度の影響を排除できる部位における、体温低下効果を確認することを含んで成る。好ましくは内臓温度の影響を排除できる部位は、尾部であり、尾部の体温は、サーモグラフィーを用いて測定することができる。
【００２８】
本発明者は、この度、アペリン受容体の活性を指標とするスクリーニング方法により、フユイチゴ、ヨメナ、ムベ、リュウキュウイチゴ、インドヨメナ、マテバシイ、ヤマモモ、フトモモ及びコナラの植物体又はそのエキス、さらにはサフランエキス、マツエキス、キナエキス及びコンフリーエキス、オウゴンエキス、ローズマリーエキス、アンズ核粒、ゲンチアナエキス、タイムエキス、ハッカ末、タイソウエキス、ホップエキス、キウイエキス、ローマカミツレエキス、リンゴエキス、サンザシエキス及びウコンエキスからなる植物体又はそのエキスが、アペリンの受容体であるＡＰＪを活性化させ、これにより、アペリンと同様の機能を有する蓋然性が極めて高いという知見を得た。したがって、本発明により、フユイチゴ、ヨメナ、ムベ、リュウキュウイチゴ、インドヨメナ、マテバシイ、ヤマモモ、フトモモ及びコナラの植物体又はそのエキス、さらにはサフランエキス、マツエキス、キナエキス及びコンフリーエキス、オウゴンエキス、ローズマリーエキス、アンズ核粒、ゲンチアナエキス、タイムエキス、ハッカ末、タイソウエキス、ホップエキス、キウイエキス、ローマカミツレエキス、リンゴエキス、サンザシエキス及びウコンエキスから成る群から選択される１又は複数の成分を含んで成るアペリン受容体アゴニストが提供される。
【００２９】
さらに、本発明者らは、上述のとおり、更年期障害のホットフラッシュのモデルにおいて、アペリンがホットフラッシュの抑制、改善、予防又は治療に寄与することを示す、という驚くべき知見を見出している。したがって、上記スクリーニング方法により得られたアペリン受容体を活性化するアペリン受容体アゴニストは、ホットフラッシュの抑制、改善、予防又は治療に有用である。したがって、上記アペリン受容体アゴニストの群から選択される１又は複数の成分を含んで成るホットフラッシュの抑制剤が提供される。
【００３０】
フユイチゴ(Rubus buergeri）はバラ科イチゴ属に分類される植物の一種であり、常緑のつる性小低木である。日本の九州・四国・関東以西の本州や中国中南部・台湾・朝鮮半島南部に分布しており、果実は11月から1月ころに熟し、いわゆる木苺の形で、食用とされる。
【００３１】
ヨメナ（Aster yomena）はキク科の多年草であり、日本の中部地方以西の本州・四国・九州に分布する。一般に、野菊の一種として知られており、秋に薄紫か白い菊の花をつける。若芽は食用とされる。
【００３２】
ムベ（Stauntonia hexaphylla）はアケビ科ムベ属の常緑つる性木本植物であり、トキワアケビとも称される。日本の本州・関東以西、台湾、中国に分布している。果実は食用とされ、また茎や根は利尿作用を有し、生薬として用いられている。
【００３３】
リュウキュウイチゴ（Rubus grayana）はバラ科キイチゴ属に分類される植物の一種であり、落葉低木である。シマアワイチゴとも称され、日本の種子島・屋久島以南から琉球各島沿岸の山地、台湾の暖帯、亜熱帯に分布している。４月〜５月にかけて花をつける。果実は橙色で食用とされる。
【００３４】
インドヨメナ（Kalimeris indica）はキク科ヨメナ属に分類される植物の一種であり、常緑の多年草である。南アジア原産であり、日本では、四国・九州南部以南の沖縄などに分布する。高さ３０ｃｍ程度であり、秋に開花する。ヨメナよりも一回り小さいことから、コヨメナとも称される。ヨメナと同様、若芽は食用とされる。
【００３５】
マテバシイ（Lithocarpus edulis）はブナ科の常緑高木であり、日本の本州の房総半島の南端、紀伊半島、九州から南西諸島の温暖な沿岸地に分布している。果実はタンニンをあまり含まないため、アク抜きを必要とせず、そのまま炒って食用とされる。粉状に粉砕してクッキーの生地に混ぜて食することもできる。
【００３６】
ヤマモモ（Myrica rubra）は、中国大陸や日本を原産とするヤマモモ目ヤマモモ科の常緑樹であり、果実は、生食用のほか、ジャムや果実酒などの飲食品に利用される。また、脂肪分解促進剤として使用できることも報告されている。
【００３７】
フトモモ（Syzygium jambos）は、東南アジアを原産とするフトモモ科の常緑高木であり、果実は、味は薄いがバラのような芳香があって食べられる。また、抗肥満剤として使用できることも報告されている。
【００３８】
コナラ（Quercus serrata）は、北海道、本州、四国、九州、朝鮮半島、中国に分布するブナ目ブナ科コナラ属の落葉広葉樹であり、材は木炭の原料や、シイタケの原木に使われており、実は灰汁抜きをすることによって食用とすることもできる。肥満予防剤として使用できることが報告されている。
【００３９】
これら９種の植物は日本にも広く分布し、また栽培もされているため、容易に入手可能な植物である。
【００４０】
サフランエキスは、地中海沿岸や小アジアを原産とするアヤメ科の多年草であるサフラン（Crocus sativus L.）に由来する抽出物であり、該植物の球根、根、葉、茎、花、花柱、植物全体、好ましくは花柱を原材料として用いることができる。サフランエキスはカロチノイド配糖体であるクロシン、ピクロクロシン、クロセチン等を成分として含み、血行促進作用や皮膚細胞活性作用を有することが知られている。
【００４１】
マツエキスは、シベリア、ヨーロッパ、アジアに広く分布し、日本でも一般的な植生として見られるクロマツ（Pinus thunbergii）、アカマツ（Pinus densiflora）などの常緑針葉樹であるマツ属（Pinus）植物に由来する抽出物であり、該植物の根、葉、樹皮、球果、植物全体、好ましくは樹皮を原材料として用いることができる。マツエキスは多糖類やアミノ酸等を成分として含み、保湿作用や柔軟作用を有することが知られている。
【００４２】
キナエキスは、熱帯地域を原産とする常緑樹であるキナ属（Cinchona）植物に由来する抽出物であり、該植物の根、葉、樹皮、花、植物全体、好ましくは樹皮を原材料として用いることができる。キナエキスはキニジン、キニーネ、シンコニン等を成分として含み、保湿作用や血行促進作用を有することが知られている。
【００４３】
コンフリーエキスは、ヨーロッパを原産とし、日本でも広く栽培されている多年生草木であるヒレハリソウ（英名：コンフリー）（Symphytum officinale）に由来する植物であり、根、葉、茎、花、植物全体、好ましくは葉を原材料として用いることができる。コンフリーエキスは、アラントイン、タンニン、ビタミン類等を成分として含み、消炎作用や保湿作用を有することが知られている。
【００４４】
オウゴンエキスは、シソ科タツナミソウ属の多年草で、中国大陸北部を原産とするコガネバナ（Scutellaria baicalensis）の根(オウゴン)に由来する抽出物であり、老化防止作用を有することが知られており、生活習慣病などの治療薬や化粧品などの有効成分として用いられている。
【００４５】
ローズマリーエキスは、地中海沿岸を原産とするシソ科の常緑低木であるローズマリー（Rosmarinus officinalis）に由来する芳香性の抽出物であり、該植物の根、葉、茎、花、植物全体を原材料として用いることができる。交感神経活性化作用や痩身作用を有することが知られており、医薬品、食品、化粧品などの有効成分として用いられている。
【００４６】
アンズ核粒は、中国大陸北部を原産とするホンアンズ(Prunus armeniaca L.) 又はその近縁植物の種子の内果皮を粉砕して作られた粒子状の原料である。アンズ核粒は、そのまま又は乾燥したものを粉砕して乾燥粉末として、あるいは、これら原料を溶媒で抽出し、抽出物として用いてもよい。アンズ核粒又はその抽出物は、脂肪分解促進作用や痩身作用を有することが知られており、医薬品や化粧品などの有効成分として用いられている。
【００４７】
ゲンチアナエキスは、ヨーロッパを原産とするリンドウ科の多年草であるゲンチアナ（Gentiana lutea）に由来する抽出物であり、該植物の根、葉、茎、花、植物全体を原材料として用いることができる。脂肪分解作用や痩身作用を有することが知られており、医薬品や化粧品などの有効成分として用いられている。
【００４８】
タイムエキスは、ヨーロッパ、北アフリカ、アジアを原産とするシソ科イブキジャコウソウ属 (Thymus)に属する植物、特にタチジャコウソウ（common thyme）に由来する抽出物であり、該植物の根、葉、茎、花、植物全体を原材料として用いることができる。脂肪分解作用を有することが知られており、医薬品や食品、化粧品などの成分として用いられている。
【００４９】
ハッカ末は、地中海沿岸、ヨーロッパ、アジア東部を原産とするシソ科ハッカ属（Mentha）の多年草植物の全草を乾燥させて粉末にしたものである。脂肪燃焼作用を有することが知られており、医薬品や食品、化粧品などの成分として広く用いられている。
【００５０】
タイソウエキスは、ヨーロッパを原産とするクロウメモドキ科ナツメ（Ziziphus jujuba）に由来する抽出物であり、該植物の植物全体、特に未成熟果実が原材料として用いられる。痩身作用を有することが知られており、医薬品や食品、化粧品などの成分として用いられている。
【００５１】
ホップエキスは、ヨーロッパを原産とするクワ科植物のホップ（Humulus lupulus）に由来する抽出物であり、該植物の植物全体、特に雌花穂が原材料として用いられる。脂肪細胞分化抑制作用や抗炎症作用を有することが知られており、肥満や肥満に伴う疾病、炎症応答と関連した病理学的状態の治療薬や、食品、化粧品の成分として用いられている。
【００５２】
キウイエキスは、中国を原産とするマタタビ科マタタビ属の雌雄異株のキウイフルーツ（Actinidia deliciosa）に由来する抽出物であり、該植物の植物全体、特に果実が原材料として用いられる。抗肥満作用を有することが報告されており、高血圧症、高脂血症、肥満症などの治療薬や、食品、化粧品の成分として用いられている。
【００５３】
ローマカミツレエキスは、ヨーロッパを原産とするキク科アンテミス属のローマカミツレ（Chamaemelum nobile）に由来する抽出物であり、該植物の植物全体、特に花が原材料として用いられる。デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）産生促進作用を有することが知られており、皮膚改善剤等のアンチエイジング剤、免疫賦活剤、抗糖尿病剤、抗骨粗しょう症剤、抗肥満剤、睡眠促進剤、抗中枢神経剤等の医薬品として使用できることが報告されている。
【００５４】
リンゴエキスは、中央アジアを原産とするバラ科リンゴ属のリンゴ（Malus domestica）に由来する抽出物であり、該植物の植物全体、特に果実が原材料として用いられる。プロシアニジンを成分として含み、抗肥満剤として使用できることが報告されている。
【００５５】
サンザシエキスは、バラ科サンザシ属のサンザシ（Crataegus cuneata）に由来する抽出物であり、該植物の花、葉、実、植物全体を原材料として用いることができる。脂肪燃焼促進作用を有することが知られており、飲食品の成分として用いられている。
【００５６】
ウコンエキスは、ショウガ目ショウガ科のウコン属のウコン（Curcuma longa）に由来する抽出物であり、脂質代謝改善作用や脂質分解促進作用を有することが知られており、医薬品や食品、化粧品などの成分として広く用いられている。
【００５７】
これらの植物抽出物の抽出方法は特に限定されるものではないが、溶媒を用いた抽出法が好ましい。抽出を行う際には、上記原材料をそのまま使用することもできるが、粉末状に粉砕・細断して抽出に供した方が、穏和な条件で短時間に高い抽出効率で有効成分の抽出を行うことができる。
【００５８】
尚、本発明で使用する各植物の植物体又はその抽出物とは、各々の植物体の各種部位（花、花穂、果皮、果実、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根茎、根皮、根、種子又は全草など）をそのまま又は乾燥したものを粉砕して乾燥粉末としたもの、又は、そのまま或いは乾燥・粉砕後、溶媒で抽出したものを意味する。
【００５９】
前記植物体の抽出部位としては、上記植物体のいずれの部位を用いてもかまわないが、フユイチゴについては葉、ヨメナ葉や茎、ムベについては茎や根、リュウキュウイチゴについては葉、インドヨメナについては葉や茎、マテバシイについては果実、ヤマモモについては、例えば樹皮、粘液、果実、種子、花、枝、葉、根等、特に葉や枝、フトモモについては、例えば樹皮、粘液、果実、種子、花、枝、葉、根等、特に葉や枝、コナラについては、例えば樹皮、粘液、果実、種子、花、枝、葉、根等、特に葉、樹皮、枝、根が好ましい。
【００６０】
抽出温度は特に限定されるものではなく、原材料の粉砕物の大きさや溶媒の種類等に応じて適宜設定すればよい。通常は、室温から溶媒の沸点までの範囲内で設定される。また、抽出時間も特に限定されるものではなく、原材料の粉砕物の大きさ、溶媒の種類、抽出温度等に応じて適宜設定すればよい。さらに、抽出時には、撹拌を行ってもよいし、撹拌せず静置してもよいし、超音波を加えてもよい。
【００６１】
例えば、上記植物抽出物は、原材料を溶媒中に浸漬し、室温又は８０℃〜１００℃にて抽出することができる。抽出処理により得られた抽出液をろ過後、そのまま又は必要に応じて濃縮若しくは乾固したものを、活性成分として使用することができる。なお、この抽出処理の際には、原材料は細断又は粉砕したものを用いてもよい。また、生の原材料又は乾燥した原材料を用いてもよいし、あるいは焙煎した原材料を用いてもよい。焙煎方法は特に限定されるものではないが、８０℃〜１２０℃で０．５時間〜２時間焙煎する方法が挙げられる。
【００６２】
抽出に使用される溶媒の種類は特に限定されるものではないが、水（熱水等を含む）、アルコール（例えばメタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、1-ブタノール、2-ブタノール）、グリコール（例えば1,3-ブチレングリコール、プロピレングリコール）、グリセリン、ケトン（例えばアセトン、メチルエチルケトン）、エーテル（例えばジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル）、アセトニトリル、エステル（例えば酢酸エチル、酢酸ブチル）、脂肪族炭化水素（例えばヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン）、芳香族炭化水素（例えばトルエン、キシレン）、ハロゲン化炭化水素（例えばクロロホルム）、又はこれらのうち２種以上の混合溶媒が好ましい。
【００６３】
このような抽出操作により、原材料から有効成分が抽出され、溶媒に溶け込む。抽出物を含む溶媒は、そのまま使用してもよいが、数日静置して熟成させてから用いても良い。さらに滅菌、洗浄、濾過、脱色、脱臭等の慣用の精製処理を加えてから使用してもよい。また、必要により濃縮又は希釈してから使用してもよい。さらに、溶媒を全て揮発させて固体状（乾燥物）としてから使用してもよいし、該乾燥物を任意の溶媒に再溶解して使用してもよい。
【００６４】
さらに、本発明のホットフラッシュ抑制剤やアペリン受容体アゴニストを皮膚外用剤として使用する場合、皮膚外用剤に慣用の助剤、例えばエデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸及びその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸及びその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール等のビタミンA類なども適宜配合することができる。
【００６５】
本発明に係るホットフラッシュ抑制剤やアペリン受容体アゴニストは、ホットフラッシュを患うヒトに対するホットフラッシュの改善を目的とする美容学的方法にも利用される。この美容学的方法は、例えば本発明に係るホットフラッシュ抑制剤を、ホットフラッシュを呈している部位に適用することによって行うことができる。この方法におけるホットフラッシュを呈している部分には全身のあらゆる部位が挙げられるが、特に顔面が好ましい。
【００６６】
本発明の別の態様では、アペリン遺伝子を組み込んだベクターを含むベクターを含有するホットフラッシュの抑制剤に関する。この抑制剤は、被験体におけるアペリンをコードする遺伝子（アペリン遺伝子）が不活性状態又は沈黙状態にあり、その結果細胞がアペリン欠損状態にある場合には、アペリン遺伝子自体を細胞内に導入するために用いられる。該ベクターにおいては、アペリン遺伝子の発現を亢進させる調節配列、例えばプロモーターやエンハンサーを、アペリン遺伝子に対し作動可能な位置に配置することが好ましい。
【００６７】
アペリン遺伝子を細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターを利用した遺伝子導入方法、あるいは非ウイルス性の遺伝子導入方法（日経サイエンス、1994年4月号、20-45頁、実験医学増刊、12(15)(1994)、及び実験医学別冊「遺伝子治療の基礎技術」、羊土社（1996））のいずれの方法も適用することができる。ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルス、又はＲＮＡウイルスに、アペリンをコードするＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。このうち、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が、特に好ましい。非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。また、上記遺伝子を実際に医薬として作用させるには、ＤＮＡを直接体内に導入するin vivo法、およびヒトからある種の細胞を取り出し体外でＤＮＡを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すex vivo法がある（日経サイエンス、1994年4月号、20-45頁、実験医学増刊、12(15)(1994)、及び月刊薬事、36(1), 23-48（1994））。in vivo法がより好ましい。in vivo法により投与される場合は、疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。 in vivo法により投与する場合は、一般的には注射剤等とされ、必要に応じて慣用の担体を加えてもよい。また、リポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（HVJ）−リポソーム等）の形態にした場合は、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤とすることができる。
【００６８】
したがって、本発明の更なる実施態様においては、ホットフラッシュの抑制又は改善するための、アペリンをコードする遺伝子を含んで成るベクター、もしくはアペリン受容体アゴニストを含む抑制剤が提供される。この場合、アペリンをコードする遺伝子は、アペリン遺伝子の発現を亢進させる調節配列と作動可能的に連結されていることが好ましい。
【００６９】
製剤中の本発明のアペリンをコードする遺伝子を含んで成るベクター（本発明の抑制剤）の配合量は、用途に応じて適宜決定できるが、一般には製剤剤中、0.00001〜20.0質量％、好適には0.00001〜10.0質量％である。
【００７０】
以下の実施例により、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００７１】
実施例１：アペリンのホットフラッシュ抑制作用
アペリンをＫ１４プロモーターの制御下で表皮に高発現させたＣ５７／ＢＬ６マウス（以下、アペリン高発現マウス、アペリンＴＧ、又はＴＧ）及び対応する野生型マウス（Ｃ５７／ＢＬ６）（Ｎ＝５、いずれも８〜１０週齢）に、卵巣摘出手術を施し、更年期アペリン高発現マウス、更年期野生型マウスとした。なお、対照として、偽手術を施した野生型マウスを用いた。４週間後、血管拡張剤としてニフェジピン（５０μｇ／ｋｇ）を腹腔内投与し、投与の１０分後、３０分後、４５分後において尾部の温度変化をサーモグラフィー（サーモトレーサＴＨ９１００ＭＲ、ＮＥＣ／Ａｖｉｏ赤外線テクノロジー）を用いて解析した。【００７２】
結果
対照の野生型マウス（ｓｈａｍＷＴ）では、血管拡張剤投与１０分後に上昇した皮膚温は、３０分後には定常状態に戻り、その後も一定のままであった（図１）。一方、更年期野生型マウス（ＯＶＸＷＴ）及び更年期アペリン高発現マウス（ＯＶＸＴＧ）では、１０分後に血管拡張剤投与後に対照（ｓｈａｍＷＴ）に比較して有意に体温が上昇し、ＯＶＸＷＴは、３０分後、４５分後のいずれにおいても、ｓｈａｍＷＴ及びＯＶＸＴＧのいずれに対しても有意に体温が高かった。一方で、ＯＶＸＴＧでは、３０分後にＯＶＸＷＴに比較して体温が低下し、４５分後では対照のｓｈａｍＷＴと同じ程度にまで体温が低下した。血管拡張剤を投与された更年期マウスの尾部の温度を計測することにより、更年期のホットフラッシュをモデル化することができる（Kai M, Yamauchi A, Tominaga K, Koga A, Kai H, Kataoka Y: Soybean isoflavones eliminate nifedipine induced flushing of tail skin in ovariectomized mice, J Pharmacol Sci 2004, 95: 476-478）。したがって、上記結果から、アペリンは、ホットフラッシュによる一時的な体温上昇を短期間で抑制又は改善することができることが示された。【００７３】
実施例２．アペリン様薬剤のスクリーニング系の確立
ＡＰＪ発現細胞の培養
ＮＩＨ３Ｔ３細胞にアペリン受容体ＡＰＪを高発現させ、ハイグロマイシンで選択した安定株（大阪大学微生物病研究所高倉伸幸教授より供与）にｃＡＭＰルシフェラーゼレポーターベクターをトランスフェクトし、これを以下のｃＡＭＰルシフェラーゼアッセイに用いた。培養は２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含む１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ）で行った。アッセイ前日に、９６穴プレートに１ウェルあたり２．０×１０5個の細胞を播種し、１０％ＦＢＳと２００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含むＤＭＥＭ培地で培養した。【００７４】
ｃＡＭＰルシフェラーゼアッセイ
一晩培養した後、培地をアスピレーターで除き、１ウェルあたり１００μｌの添加剤を含まないＤＭＥＭ培地に交換した。３時間後、ＧｌｏＳｅｎｓｏｒTM  ｃＡＭＰ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を１ウェルあたり４μｌずつ添加し、遮光し２時間室温で平衡化した。その後、アペリン１３（ペプチド研究所）を０．４μｇ／ｍｌとなるように添加剤を含まないＤＭＥＭ培地で希釈し、これを１ウェルあたり５０μｌずつ添加し（最終濃度は０．１μｇ／ｍｌ）、室温で５分間プレインキュベートした。更に、４０μＭに調整したフォルスコリン（Ｓｉｇｍａ）を５０μｌずつ添加し（最終濃度は１０μＭ）、１５分間処理した。その後、ＧｌｏＭａｘＴＭ  ９６  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて発光を測定した。また、上記と同様のルシフェラーゼアッセイを、アペリンと共にアペリン中和抗体である４Ｇ５（大阪大学より供与）を添加して行なった。この場合、５μｇ／ｍｌとなるように中和抗体を含まないＤＭＥＭ培地で希釈し、１ウェルあたり５０μｌずつ添加した（最終濃度０．５μｇ／ｍｌ）。同様に、最終濃度が１．５、５、１５及び５０μｇ／ｍｌとなるような中和抗体を調製し、それぞれウェルに添加した。コントロールとして、アペリンを添加せずに、２０μＭのフォルスコリンを１ウェルあたり１００μｌ添加した。【００７５】
上記ｃＡＭＰルシフェラーゼアッセイの結果を図３に示す。図３からもわかるように、アペリンによってｃＡＭＰ濃度が減少する一方、アペリン中和抗体によるアペリン活性の消失に伴いｃＡＭＰ濃度の減少は抑制されている。すなわち、上記のｃＡＭＰルシフェラーゼアッセイにおいて、まず、アペリンの代わりに候補薬剤を添加した場合にｃＡＭＰ濃度を減少させる薬剤を探索し（１次スクリーニング）、次に、これらの薬剤の中から、アペリン中和抗体と一緒に添加した場合にｃＡＭＰ濃度の減少が有意に抑制される薬剤をさらに選別すること（２次スクリーニング）により、アペリン受容体であるＡＰＪの活性化を介してｃＡＭＰ濃度を減少させる薬剤（すなわちアペリン様薬剤）を短時間かつ効率的に選定することが可能となる。【００７６】
実施例３．アペリン様薬剤のスクリーニング（１）
候補薬剤として、約２５０種の化粧品素材（株式会社資生堂）を用いて、実施例２において確立したスクリーニング系によりアペリン様薬剤の選定を行った。
具体的には、候補薬剤を４００μｇ／ｍｌに調製し、実施例２のｃＡＭＰルシフェラーゼアッセイで使用したアペリンの代わりに、１ウェルあたり５０μｌずつ添加し（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）、実施例２と同様のアッセイを行った。【００７７】
図４に示されるとおり、サフランエキス、マツエキス、キナエキス及びコンフリーエキス、オウゴンエキス、ローズマリーエキス、アンズ核粒、ゲンチアナエキス、タイムエキス、ハッカ末、タイソウエキス、ホップエキス、キウイエキス、ローマカミツレエキス、リンゴエキス、サンザシエキス及びウコンエキスは、細胞内のｃＡＭＰ濃度を有意に減少させ、またアペリン中和抗体（４Ｇ５）と共に添加した場合には、アペリン活性の消失によりｃＡＭＰ濃度の減少が有意に抑制されていることから、これらの植物抽出物は、アペリンと同様の機能を有することが示された。【００７８】
実施例４．アペリン様薬剤のスクリーニング（２）
候補薬剤として、約１１０種の食品素材（株式会社資生堂）を用いて、実施例２において確立したスクリーニング系によりアペリン様薬剤の選定を行った。
具体的には、候補薬剤を４００μｇ／ｍｌに調製し、実施例２のｃＡＭＰルシフェラーゼアッセイで使用したアペリンの代わりに、１ウェルあたり５０  μｌずつ添加し（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）、実施例２と同様のアッセイを行った。【００７９】
図５に示されるとおり、フユイチゴ、ヨメナ、ムベ、リュウキュウイチゴ、インドヨメナ、マテバシイ、ヤマモモ、フトモモ及びコナラの抽出物は、細胞内のｃＡＭＰ濃度を有意に減少させ、またアペリン中和抗体（４Ｇ５）と共に添加した場合には、アペリン活性の消失によりｃＡＭＰ濃度の減少が有意に抑制されていることから、これらの植物抽出物は、アペリンと同様の機能を有することが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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