(57)【要約】  癌の治療及び／又は予防剤等として有用な新規な免疫誘導剤を提供する。  以下の(a)、(b)及び(c)、すなわち(a) 配列表の配列番号４、２、８、１０、１２に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸から成るポリペプチド、(b) 前記(a)のポリペプチドと８５％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸から成るポリペプチド、及び(c) 前記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドのポリペプチド類から選択されかつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター、を有効成分として含有する免疫誘導剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)ないし(c)のいずれかのポリペプチド類から選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター、を有効成分として含有する免疫誘導剤。
(a)配列表の配列番号４、２、８、１０、１２に記載のアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸から成るポリペプチド。
(b)前記(a)のポリペプチドと８５％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸から成るポリペプチド。
(c)前記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド。
【請求項２】
前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが配列表の配列番号４、２、８、１０、１２記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載の免疫誘導剤。
【請求項３】
抗原提示細胞の処理剤である、請求項１又は２に記載の免疫誘導剤。
【請求項４】
癌の治療及び／又は予防剤である、請求項１又は２に記載の免疫誘導剤。
【請求項５】
前記癌がＫＡＴＮＡＬ１を発現する癌である、請求項４に記載の免疫誘導剤。
【請求項６】
前記癌が乳癌、脳腫瘍、肛門周囲腺癌、神経芽腫、肥満細胞腫、肝臓癌、前立腺癌、肺癌、甲状腺癌又は白血病である、請求項４又は５に記載の免疫誘導剤。
【請求項７】
免疫増強剤をさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の免疫誘導剤。
【請求項８】
前記免疫増強剤が、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド、ポリＩＣおよびその誘導体、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、インターロイキン１２、インターロイキン１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ並びにＦｌｔ３リガンドから成る群より選ばれる少なくとも一つである、請求項７記載の免疫誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療及び／又は予防剤等として有用な新規な免疫誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。近年、分子生物学や癌免疫学の進歩で癌に反応する細胞障害性Ｔ細胞により認識される癌抗原や癌抗原をコードする遺伝子が同定されてき、抗原特異性免疫療法への期待が高まっている。【０００３】
免疫療法においては、副作用を軽減するため、その抗原として認識されるペプチド又はタンパクは、正常細胞にはほとんど存在せず、癌細胞に特異的に存在していることが必要とされる。１９９１年、ベルギーＬｕｄｗｉｇ研究所のＢｏｏｎらは自己癌細胞株と癌反応性Ｔ細胞を用いたｃＤＮＡ発現クローニング法によりＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するヒトメラノーマ抗原ＭＡＧＥ１を単離した（非特許文献１）。その後、癌患者の生体内で自己の癌に反応して産生される抗体が認識する腫瘍抗原を遺伝子の発現クローニングの手法を取り入れて同定する、ＳＥＲＥＸ（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ）法が報告され（特許文献１、非特許文献２）、この方法により、いくつかの癌抗原が単離されている。さらに、その一部をターゲットにして癌免疫療法の臨床試験が開始されている。【０００４】
一方、ヒトと同様、イヌやネコにも乳腺腫瘍、扁平上皮癌など多数の腫瘍が知られており、イヌやネコの疾病統計でも上位にランクされている。しかしながらイヌやネコの癌に対する有効な治療薬、予防薬及び診断薬は現在のところ存在しない。大部分のイヌやネコの腫瘍は、進行して腫瘤が大きくなってから飼い主が気付くケースがほとんどで、来院して外科的手術により切除したり、人体薬（抗癌剤など）を投与しても、すでに手遅れで処置後まもなく死亡することが多い。このような現状の中で、イヌやネコに有効な癌の治療薬及び予防薬が入手可能になれば、イヌの癌に対する用途が開かれると期待される。【０００５】
ｋａｔａｎｉｎ  ｐ６０  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ａ−ｌｉｋｅ１（ＫＡＴＮＡＬ１）は微小管結合ドメインを有するタンパク質として同定された（特許文献２、非特許文献３）。しかし、ＫＡＴＮＡＬ１タンパク質が癌細胞に対する免疫誘導活性を有し、それによって該タンパク質が癌の治療や予防に有用であるという報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５６９８３９６号
【特許文献２】特開２００４−８２１６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Bruggen P. et al., Science, 254:1643-1647(1991)
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11810-11813(1995)
【非特許文献３】Rigden DJ. et al.FEBS Lett. Mar 4;583(5):872-8(2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、癌の治療及び／又は予防剤等として有用な新規なポリペプチドを見出し、該ポリペプチドの免疫誘導剤への使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、イヌ精巣由来ｃＤＮＡライブラリーと担癌犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌生体由来の血清中に存在する抗体と結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡを取得し、そのｃＤＮＡを基にして、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するイヌｋａｔａｎｉｎ  ｐ６０  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ａ−ｌｉｋｅ１（以下、ＫＡＴＮＡＬ１と記載する）のポリペプチドを作製した。また、取得した遺伝子のヒト及びマウス相同性遺伝子を基にして、配列番号４及び６で示されるアミノ酸配列を有するヒト及びマウスＫＡＴＮＡＬ１を作製した。そしてこれらＫＡＴＮＡＬ１ポリペプチドが乳癌、脳腫瘍、肛門周囲腺癌、神経芽腫、肥満細胞腫、肝臓癌、前立腺癌、肺癌、甲状腺癌又は白血病の組織又は細胞に特異的に発現していることを見出した。さらにまた、これらＫＡＴＮＡＬ１を生体に投与することによって、生体内にＫＡＴＮＡＬ１に対する免疫細胞を誘導することができること、及びＫＡＴＮＡＬ１を発現する生体内の腫瘍を退縮させることができることを見出した。さらにまた、ＫＡＴＮＡＬ１のポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドを発現可能な組換えベクターが、ＫＡＴＮＡＬ１を発現する癌に対し生体内で抗腫瘍効果を誘導することを見出した。【００１０】
さらにまた、ＫＡＴＮＡＬ１のポリペプチドが、抗原提示細胞により提示されて、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を活性化及び増殖させる能力（免疫誘導活性）を有すること、このため、該ポリペプチドが癌の治療及び／又は予防に有用であり、また、該ポリペプチドと接触した抗原提示細胞や、該抗原提示細胞と接触したＴ細胞が癌の治療及び／又は予防に有用であることを見出し、本発明を完成した。【００１１】
従って、本発明は、以下の特徴を有する。
(1)以下の(a)ないし(c)のいずれかのポリペプチド類から選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター、を有効成分として含有する免疫誘導剤。
(a)配列表の配列番号４、２、８、１０、１２に記載のアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸から成るポリペプチド。
(b)前記(a)のポリペプチドと８５％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸から成るポリペプチド。
(c)前記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド。
(2)前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが配列表の配列番号４、２、８、１０、１２記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、(1)に記載の免疫誘導剤。
(3)抗原提示細胞の処理剤である、(1)又は(2)記載の免疫誘導剤。
(4)癌の治療及び／又は予防剤である、(1)又は(2)に記載の免疫誘導剤。
(5)前記癌がＫＡＴＮＡＬ１を発現する癌である、(4)に記載の免疫誘導剤。
(6)前記癌が乳癌、脳腫瘍、肛門周囲腺癌、神経芽腫、肥満細胞腫、肝臓癌、前立腺癌、肺癌、甲状腺癌又は白血病である、(4)又は(5)に記載の免疫誘導剤。
(7)免疫増強剤をさらに含む(1)〜(6)のいずれかに記載の免疫誘導剤。
(8)前記免疫増強剤が、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド、ポリＩＣおよびその誘導体、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、インターロイキン１２、インターロイキン１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ並びにＦｌｔ３リガンドから成る群より選ばれる少なくとも一つである、(7)記載の免疫誘導剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、癌の治療及び／又は予防等に有用な新規な免疫誘導剤が提供される。後述の実施例において具体的に示されるように、本発明で用いられるポリペプチドを生体に投与すると、生体内において免疫細胞を誘導することができ、さらに、既に生じている癌を縮小もしくは退縮させることができる。従って、該ポリペプチドは癌の治療や予防に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】同定したＫＡＴＮＡＬ１遺伝子の、イヌ正常組織及び腫瘍組織あるいは癌細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号１；イヌＫＡＴＮＡＬ１遺伝子のイヌの各組織及び細胞株での発現パターン、参照番号２；イヌＧＡＰＤＨ遺伝子のイヌの各組織及び細胞株での発現パターン。
【図２】同定したＫＡＴＮＡＬ１遺伝子の、ヒト正常組織及び腫瘍組織あるいは癌細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号３；ヒトＫＡＴＮＡＬ１遺伝子のヒトの各組織及び細胞株での発現パターン、参照番号４；ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のヒトの各組織及び細胞株での発現パターン。
【図３】同定したＫＡＴＮＡＬ１遺伝子の、マウス正常組織及び腫瘍組織あるいは癌細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号５；マウスＫＡＴＮＡＬ１遺伝子のマウスの各組織及び細胞株での発現パターン、参照番号６；マウスＧＡＰＤＨ遺伝子のマウスの各組織及び細胞株での発現パターンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の免疫誘導剤に有効成分として含まれるポリペプチドとしては、以下のものが挙げられる。なお、本発明において、「ポリペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合することによって形成される分子をいい、構成するアミノ酸数が多いポリペプチド分子のみならず、アミノ酸数が少ない低分子量の分子（オリゴペプチド）や、全長タンパク質も包含され、本発明では配列番号２、４、８、１０、１２に示すアミノ酸配列を有するＫＡＴＮＡＬ１の全長タンパク質も包含される。
【００１５】
(a)配列表の配列番号４、２、８、１０、１２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド中の連続する７個以上のアミノ酸から成り、免疫誘導活性を有するポリペプチド
(b)(a)のポリペプチドと８５％以上の配列同一性を有し、７個以上のアミノ酸から成る、免疫誘導活性を有するポリペプチド
(c)(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含み、免疫誘導活性を有するポリペプチド。
【００１６】
なお、本発明において、「アミノ酸配列を有する」とは、アミノ酸残基がそのような順序で配列しているという意味である。従って、例えば、「配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、配列番号２に示されるＭｅｔ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｌａ・・(中略)・・Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｌａのアミノ酸配列を持つ、４９０アミノ酸残基のサイズのポリペプチドを意味する。また、例えば、「配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」を「配列番号２のポリペプチド」と略記することがある。「塩基配列を有する」という表現についても同様である。この場合、「有する」という用語は、「からなる」という表現で置き換えてもよい。
【００１７】
ここで、「免疫誘導活性」とは、生体内でインターフェロン等のサイトカインを分泌する免疫細胞を誘導する能力を意味する。
【００１８】
上記ポリペプチドが免疫誘導活性を有するか否かは、例えば公知のエリスポットアッセイ等を用いて確認することができる。具体的には、例えば後述の実施例に記載されるように、免疫誘導活性を評価すべきポリペプチドを投与した生体から末梢血単核球等の細胞を得て、該細胞を該ポリペプチドと共存培養し、該細胞からのサイトカイン産生量を、特異抗体を用いて測定することにより、該細胞中の免疫細胞数を測定することができるので、これにより免疫誘導活性を評価することができる。
【００１９】
また、後述の実施例に記載されるように、上記(a)〜(c)の組換えポリペプチドを担癌生体に投与すると、その免疫誘導活性により腫瘍を退縮させることもできる。よって、上記免疫誘導活性は、癌細胞の増殖を抑制し又は癌組織（腫瘍）を縮小若しくは消滅させる能力（以下、「抗腫瘍活性」という）として評価することもできる。ポリペプチドの抗腫瘍活性は、例えば後述の実施例に具体的に記載されるように、実際に該ポリペプチドを担癌生体に投与して腫瘍が縮小等されるか否かを調べることよって確認することができる。
【００２０】
あるいは、該ポリペプチドで刺激したＴ細胞（すなわち、該ポリペプチドを提示する抗原提示細胞と接触させたＴ細胞）が、生体外で腫瘍細胞に対して細胞障害活性を示すか否かを調べることによって、ポリペプチドの抗腫瘍活性を評価することもできる。Ｔ細胞と抗原提示細胞との接触は、後述するように、両者を液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。細胞障害活性の測定は、例えばInt.J.Cancer,58:p317,1994に記載された５１Ｃｒリリースアッセイと呼ばれる公知の方法により行なうことができる。上記ポリペプチドを癌の治療及び／又は予防用途に用いる場合には、特に限定されないが、抗腫瘍活性を指標として免疫誘導活性を評価することが好ましい。
【００２１】
本発明が開示する配列表の配列番号２、４、８、１０、１２にそれぞれ示されるアミノ酸配列は、イヌ精巣由来ｃＤＮＡライブラリーと担癌犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌犬由来の血清中に特異的に存在する抗体と結合するポリペプチド及びそのヒト、ウシ、ウマ、ニワトリ相同因子として単離された、ＫＡＴＮＡＬ１タンパク質のアミノ酸配列である（実施例１参照）。イヌＫＡＴＮＡＬ１のヒト相同因子であるヒトＫＡＴＮＡＬ１では、配列同一性が塩基配列９５％、アミノ酸配列９８％であり、ウシ相同因子であるウシＫＡＴＮＡＬ１では配列同一性は塩基配列９１％、アミノ酸配列９７％、ウマ相同因子であるウマＫＡＴＮＡＬ１では配列同一性は塩基配列８７％、アミノ酸配列８８％、ニワトリ相同因子であるニワトリＫＡＴＮＡＬ１では配列同一性は塩基配列８１％、アミノ酸配列９０％である。
【００２２】
上記(a)のポリペプチドは、配列番号２、４、８、１０、１２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド中の連続する７個以上、好ましくは連続する８、９又は１０個以上のアミノ酸から成るポリペプチドであって、免疫誘導活性を有するものである。より好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号４で示されるアミノ酸配列と配列同一性が８５％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、特に好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号２、４、８、１０、１２で示されるアミノ酸配列を有する。なお、この分野で公知の通り、約７アミノ酸残基以上のポリペプチドであれば抗原性及び免疫原性を発揮できる。従って、配列番号２、４のアミノ酸配列中の連続する７アミノ酸残基以上のポリペプチドであれば、免疫誘導活性を有し得るので、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。
【００２３】
また、癌抗原ポリペプチドを投与することによる免疫誘導の原理として、ポリペプチドが抗原提示細胞に取り込まれ、その後該細胞内でペプチダーゼによる分解を受けてより小さな断片となり、該細胞の表面上に提示され、それを細胞障害性Ｔ細胞等が認識し、その抗原を提示している細胞を選択的に殺していくということが知られている。抗原提示細胞の表面上に提示されるポリペプチドのサイズは比較的小さく、アミノ酸数で７〜３０程度である。従って、抗原提示細胞上に提示させるという観点からは、上記(a)のポリペプチドとしては、配列番号２、４、８、１０、１２で示されるアミノ酸配列中の連続する７〜３０程度であることが好ましい態様のひとつであり、より好ましくは８〜３０もしくは９〜３０程度のアミノ酸から成るものであれば十分である。これら比較的小さなサイズのポリペプチドは、抗原提示細胞内に取り込まれることなく、直接抗原提示細胞上の細胞表面に提示される場合もある。
【００２４】
また、抗原提示細胞に取り込まれたポリペプチドは、該細胞内のペプチダーゼによりランダムな位置で切断を受けて、種々のポリペプチド断片が生じ、これらのポリペプチド断片が抗原提示細胞表面上に提示されるので、配列番号２、４、８、１０、１２の全長領域のように大きなサイズのポリペプチドを投与すれば、抗原提示細胞内での分解によって、抗原提示細胞を介する免疫誘導に有効なポリペプチド断片が必然的に生じる。従って、抗原提示細胞を介する免疫誘導にとっても、サイズの大きなポリペプチドを好ましく用いることができ、アミノ酸数を３０以上、さらに好ましくは１００以上、さらに好ましくは２００以上、さらに好ましくは２５０以上、さらに好ましくは配列番号２、４、８、１０、１２の全長領域のポリペプチドとしてもよい。
【００２５】
上記(b)のポリペプチドは、上記(a)のポリペプチドのうちの少数の（好ましくは、１個もしくは数個の）アミノ酸残基が置換し、欠失し及び／又は挿入されたポリペプチドであって、元の配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上又は９９．５％以上の配列同一性を有し、かつ、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。一般に、タンパク質抗原において、該タンパク質のアミノ酸配列のうち少数のアミノ酸残基が置換され、欠失され又は挿入された場合であっても、元のタンパク質とほぼ同じ抗原性を有している場合があることは当業者において広く知られている。従って、上記(b)のポリペプチドも免疫誘導活性を発揮し得るので、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。また、上記(b)のポリペプチドは、配列番号２、４、８、１０、１２で示されるアミノ酸配列のうち、１個ないし数個のアミノ酸残基が置換し、欠失し及び／又は挿入されたポリペプチドであることも好ましい。本明細書中の「数個」とは、２〜１０の整数、好ましくは２〜６の整数、さらに好ましくは２〜４の整数を表す。
【００２６】
ここで、アミノ酸配列又は塩基配列の「配列同一性」とは、比較すべき２つのアミノ酸配列（又は塩基配列）のアミノ酸残基（又は塩基）ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列（又は塩基配列）を整列させ、一致したアミノ酸残基数（又は一致した塩基数）を全アミノ酸残基数（又は全塩基数）で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ等の周知のプログラムを用いて行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全アミノ酸残基数は、１つのギャップを１つのアミノ酸残基として数えた残基数となる。このようにして数えた全アミノ酸残基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、配列同一性（％）は、長い方の配列の全アミノ酸残基数で、一致したアミノ酸残基数を除して算出される。
【００２７】
なお、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Ｇｌｙ,Ｉｌｅ,Ｖａｌ，Ｌｅｕ,Ａｌａ,Ｍｅｔ,Ｐｒｏ）、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Ａｓｎ,Ｇｌｎ,Ｔｈｒ,Ｓｅｒ,Ｔｙｒ，Ｃｙｓ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ,Ｇｌｕ）、塩基性アミノ酸（Ａｒｇ,Ｌｙｓ,Ｈｉｓ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ,Ｔｙｒ,Ｔｒｐ）のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればポリペプチドの性質が変化しないことが多いことが知られている。従って、本発明の上記(a)のポリペプチド中のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループの間で置換することにより、免疫誘導活性を維持できる可能性が高くなるため、好ましい。
【００２８】
上記(c)のポリペプチドは、上記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含み、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。すなわち、(a)又は(b)のポリペプチドの一端又は両端に他のアミノ酸又はポリペプチドが付加されたものであって、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。このようなポリペプチドも、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる
上記したポリペプチドは、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（t−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。また、公知の遺伝子工学的手法を用いて、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し、該宿主細胞中でポリペプチドを生産させることにより、目的とするポリペプチドを得ることができる。
【００２９】
上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法や市販の核酸合成機を用いた常法により、容易に調製することができる。例えば、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡは、イヌ染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した一対のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより調製することができる。配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡであれば、上記鋳型としてヒト染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを使用することで同様に調製できる。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応行程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができるが、これに限定されない。また、本明細書中の配列表の配列番号１、３に示される塩基配列及びアミノ酸配列の情報に基づいて、適当なプローブやプライマーを調製し、それを用いてイヌやヒトなどのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、所望のＤＮＡを単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、配列番号２、４のタンパク質を発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、ならびに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークロニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラバイオロジー等に記載された方法に準じて行うことができる。このようにして得られたＤＮＡから、上記(a)のポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。また、各アミノ酸をコードするコドンは公知であるから、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は容易に特定することができる。従って、上記した(b)又は(c)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列も容易に特定することができるので、そのようなポリヌクレオチドも、市販の核酸合成機を用いて常法により容易に合成することができる。
【００３０】
上記宿主細胞としては、上記ポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよく、原核細胞の例としては大腸菌など、真核細胞の例としてはサル腎臓細胞ＣＯＳ１、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ等の哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、原核細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、該ポリペプチドを、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。
【００３２】
宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（A）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＳＧ、ｐＹＥＳ２等が例示できる。上記と同様に、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１等を用いた場合には、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグＨＡタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合タンパク質として、上記ポリペプチドを発現させることができる。
【００３３】
発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の周知の方法を用いることができる。
【００３４】
宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
以上の方法によって得られるポリペプチドには、上述した通り、他の任意のタンパク質との融合タンパク質の形態にあるものも含まれる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やＨｉｓタグとの融合タンパク質などが例示できる。このような融合タンパク質の形態のポリペプチドも、上記した(c)のポリペプチドとして本発明の範囲に含まれる。さらに、形質転換細胞で発現されたポリペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。このような翻訳後修飾されたポリペプチドも、免疫誘導活性を有する限り、本発明の範囲に含まれる。この様な翻訳修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。
【００３６】
後述の実施例に具体的に記載される通り、上記した免疫誘導活性を有するポリペプチドを担癌生体に投与すると、既に生じている腫瘍を退縮させることができる。従って、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療及び／又は予防剤として用いることができる。また、上記した免疫誘導活性を有するポリペプチドは、免疫誘導による癌の治療及び／又は予防方法に用いることができる。
【００３７】
ここで、「腫瘍」及び「癌」という用語は、悪性新生物を意味し、互換的に使用される。
【００３８】
この場合、対象となる癌としては、配列番号ＫＡＴＮＡＬ１のポリペプチドをコードする遺伝子を発現している癌であれば特に限定されないが、好ましくは乳癌、脳腫瘍、肛門周囲腺癌、神経芽腫、肥満細胞腫、肝臓癌、前立腺癌、肺癌、甲状腺癌又は白血病である。
【００３９】
また、対象となる動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは霊長類、ペット動物、家畜類、競技用動物などを含む哺乳動物であり、特に好ましくはヒト、イヌ又はネコである。
【００４０】
本発明の免疫誘導剤の生体への投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよいが、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。癌の治療目的で該免疫誘導剤を用いる場合には、抗癌作用を高めるため、後述の実施例に記載するように、治療対象となる腫瘍の近傍の所属リンパ節に投与することもできる。投与量は、免疫誘導するのに有効な量であればよく、例えば癌の治療及び／又は予防に用いるのであれば、癌の治療及び／又は予防に有効な量であればよい。癌の治療及び／又は予防に有効な量は、腫瘍の大きさや症状等に応じて適宜選択されるが、通常、対象動物に対し１日当りの有効量として０．０００１〜１０００μｇ、好ましくは０．００１〜１０００μｇであり、１回又は数回に分けて投与することができる。好ましくは、数回に分け、数日ないし数月おきに投与する。後述の実施例に具体的に示されるとおり、本発明の免疫誘導剤は、既に形成されている腫瘍を退縮させることができる。従って、発生初期の少数の癌細胞にも抗癌作用を発揮し得るので、癌の発症前や癌の治療後に用いれば、癌の発症や再発を防止することができる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療と予防の双方に有用である。
【００４１】
本発明の免疫誘導剤は、ポリペプチドのみから成っていてもよいし、各投与形態に適した、薬理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤等の添加剤を適宜混合させて製剤することもできる。製剤方法及び使用可能な添加剤は、医薬製剤の分野において周知であり、いずれの方法及び添加剤をも用いることができる。添加剤の具体例としては、生理緩衝液のような希釈剤；砂糖、乳糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等のような賦形剤；シロップ、ゼラチン、アラビアゴム、ソルビトール、ポリビニルクロリド、トラガント等のような結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、タルク、シリカ等の滑沢剤等が挙げられるが、これらに限定されない。製剤形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤、吸入剤、注射剤、座剤、液剤などの非経口剤などを挙げることができる。これらの製剤は一般的に知られている製法によって作ることができる。
【００４２】
本発明の免疫誘導剤は、生体内での免疫学的応答を強化することができる免疫増強剤と組み合わせて用いることができる。免疫増強剤は、本発明の免疫誘導剤に含まれていてもよいし、別個の組成物として本発明の免疫誘導剤と併用して患者に投与してもよい。
【００４３】
上記免疫増強剤としては、例えばアジュバントを挙げることができる。アジュバントは、抗原の貯蔵所（細胞外又はマクロファージ内）を提供し、マクロファージを活性化し、かつ特定組のリンパ球を刺激することにより、免疫学的応答を強化し得るので、抗癌作用を高めることができる。従って、特に、本発明の免疫誘導剤を癌の治療及び／又は予防に用いる場合、免疫誘導剤は、有効成分たる上記ポリペプチドに加えてさらにアジュバントを含むことが好ましい。多数の種類のアジュバントが当業界で周知であり、いずれのアジュバントでも用いることができる。アジュバントの具体例としては、ＭＰＬ（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）、サルモネラ属のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｒｅ ５９５リポ多糖類の精製及び酸加水分解後に得られる同類物；ＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）、Ｑｕｉｌｌｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ抽出物から精製される純ＱＡ−２１サポニン；ＰＣＴ出願ＷＯ９６/３３７３９（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）に記載されたＤＱＳ２１；ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８及びＱＳ−Ｌ１（ソ（So）、外１０名、「モレキュルズ・アンド・セル（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｓ）」、１９９７年、第７巻、ｐ．１７８−１８６）；フロイントの不完全アジュバント；フロイントの完全アジュバント；ビタミンＥ；モンタニド；ミョウバン；ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、クレイグ（Ｋｒｅｉｇ）、外７名、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、第３７４巻、ｐ．５４６−５４９）を参照）；ポリＩＣ及びその誘導体（ポリＩＣＬＣ等）ならびにスクアレン及び／又はトコフェロールのような生分解性油から調製される種々の油中水エマルションが挙げられる。中でも、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド、ポリＩＣ及びその誘導体並びにＣｐＧオリゴヌクレオチドが好ましい。上記アジュバントとポリペプチドの混合比は、典型的には約１：１０〜１０：１、好ましくは約１：５〜５：１、より好ましくは約１：１である。ただし、アジュバントは上記例示に限定されず、当業界で公知の上記以外のアジュバントも本発明の免疫誘導剤を投与する際に用いられ得る（例えば、ゴッディング（Ｇｏｄｉｎｇ）著、「モノクローナル・アンチボディーズ：プリンシプル・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、第２版、１９８６年を参照）。ポリペプチド及びアジュバントの混合物又はエマルションの調製方法は、予防接種の当業者には周知である。
【００４４】
また、上記免疫増強剤としては、上記アジュバント以外にも、対象の免疫応答を刺激する因子を用いることもできる。例えば、リンパ球や抗原提示細胞を刺激する特性を有する各種サイトカインを免疫増強剤として本発明の免疫誘導剤と組み合わせて用いることができる。そのような免疫学的応答を増強可能な多数のサイトカインが当業者に公知であり、その例としては、ワクチンの防御作用を強化することが示されているインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ及びＦｌｔ３リガンドが挙げられるが、これらに限定されない。このような因子も上記免疫増強剤として用いることができ、本発明の免疫誘導剤に含ませて又は別個の組成物として本発明の免疫誘導剤と併用して患者に投与することができる。
【００４５】
また、上記ポリペプチドと抗原提示細胞とをインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドを抗原提示細胞に提示させることができる。すなわち、上記した(a)ないし(c)のポリペプチドは、抗原提示細胞の処理剤として利用し得る。ここで、抗原提示細胞としては、ＭＨＣクラスＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞を好ましく用いることができる。種々のＭＨＣクラスＩ分子が同定されており、周知である。ヒトにおけるＭＨＣ分子はＨＬＡと呼ぶ。ＨＬＡクラスＩ分子としては、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃを挙げることができ、より具体的には、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａ０２０４、ＨＬＡ−Ａ０２０５、ＨＬＡ−Ａ０２０６、ＨＬＡ−Ａ０２０７、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ６８０１、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ２７０５、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｃｗ０４０１、ＨＬＡ−Ｃｗ０６０２などを挙げることができる。
【００４６】
ＭＨＣクラスＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞は、周知の方法により末梢血から調製することができる。例えば、骨髄、臍帯血あるいは患者末梢血から、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）とＩＬ−３（あるいはＩＬ−４）を用いて樹状細胞を誘導し、その培養系に腫瘍関連ペプチドを加えることにより、腫瘍特異的な樹状細胞を誘導することができる。
【００４７】
この樹状細胞を有効量投与することで、癌の治療に望ましい応答を誘導できる。用いる細胞は、健康人から提供された骨髄や臍帯血、患者本人の骨髄や末梢血等を用いることができるが、患者本来の自家細胞を使う場合は、安全性が高く、重篤な副作用を回避することも期待できる。末梢血又は骨髄は新鮮試料、低温保存試料及び凍結保存試料のいずれでもよい。末梢血は、全血を培養してもよいし、白血球成分だけを分離して培養してもよいが、後者の方が効率的で好ましい。さらに白血球成分の中でも単核球を分離してもよい。また、骨髄や臍帯血を起源とする場合には、骨髄を構成する細胞全体を培養してもよいし、これから単核球を分離して培養してもよい。末梢血やその白血球成分、骨髄細胞には、樹状細胞の起源となる単核球、造血幹細胞又は未成熟樹状細胞やＣＤ４陽性細胞等が含まれている。用いられるサイトカインは、安全性と生理活性が確認された特性のものであれば、天然型、あるいは遺伝子組み換え型等、その生産手法については問わないが、好ましくは医療用に用いられる品質が確保された標品が必要最低量で用いられる。添加するサイトカインの濃度は、樹状細胞が誘導される濃度であれば特に限定されず、通常サイトカインの合計濃度で１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ程度が好ましく、より好ましくは２０〜５００ｎｇ／ｍＬ程度である。培養は、白血球の培養に通常用いられている周知の培地を用いて行うことができる。培養温度は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、ヒトの体温である３７℃程度が最も好ましい。また、培養中の気体環境は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、５％ＣＯ２を通気することが好ましい。さらに培養期間は、必要数の細胞が誘導される期間であれば特に限定されないが、通常３日〜２週間の間で行われる。細胞の分離や培養に供される機器は、適宜適当なものを用いることができるが、医療用に安全性が確認され、かつ操作が安定して簡便であることが好ましい。特に細胞培養装置については、シャーレ、フラスコ、ボトル等の一般的容器に拘わらず、積層型容器や多段式容器、ローラーボトル、スピナー式ボトル、バッグ式培養器、中空糸カラム等も用いることができる。
【００４８】
上記ポリペプチドと抗原提示細胞とをインビトロで接触させる方法自体は、周知の方法により行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を、上記ポリペプチドを含む培養液中で培養することにより行なうことができる。培地中のペプチド濃度は、特に限定されないが、通常１〜１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは５〜２０μｇ／ｍｌ程度である。培養時の細胞密度は特に限定されないが、通常１０３〜１０７細胞／ｍｌ程度、好ましくは５ｘ１０４〜５ｘ１０６細胞／ｍｌ程度である。培養は、常法に従い、３７℃、５％  ＣＯ２雰囲気中で行なうことが好ましい。なお、抗原提示細胞が表面上に提示できるペプチドの長さは、通常、最大で３０アミノ酸残基程度である。従って、特に限定されないが、抗原提示細胞とポリペプチドをインビトロで接触させる場合、該ポリペプチドをおよそ３０アミノ酸残基以下の長さに調製してもよい。
【００４９】
上記したポリペプチドの共存下において抗原提示細胞を培養することにより、ペプチドが抗原提示細胞のＭＨＣ分子に取り込まれ、抗原提示細胞の表面に提示される。従って、上記ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞を調製することができる。このような抗原提示細胞は、生体内又はインビトロにおいて、Ｔ細胞に対して該ポリペプチドを提示し、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができる。
【００５０】
上記のようにして調製される、上記ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体とを含む抗原提示細胞を、Ｔ細胞とインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができる。これは、上記抗原提示細胞とＴ細胞とを液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を液体培地に懸濁して、マイクロプレートのウェル等の容器に入れ、これにＴ細胞を添加して培養することにより行なうことができる。共存培養時の抗原提示細胞とＴ細胞の混合比率は、特に限定されないが、通常、細胞数の比率で１：１〜１：１００程度、好ましくは１：５〜１：２０程度である。また、液体培地中に懸濁する抗原提示細胞の密度は、特に限定されないが、通常、１００〜１０００万細胞／ｍｌ程度、好ましくは１００００〜１００万細胞／ｍｌ程度である。共存培養は、常法に従い、３７℃、５％  ＣＯ２雰囲気中で行なうことが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、通常、２日〜３週間、好ましくは４日〜２週間程度である。また、共存培養は、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７及びＩＬ−１２のようなインターロイキンの１種又は複数の存在下で行なうことが好ましい。この場合、ＩＬ−２及びＩＬ−７の濃度は、通常５〜２０Ｕ／ｍｌ程度、ＩＬ−６の濃度は通常５００〜２０００Ｕ／ｍｌ程度、ＩＬ−１２の濃度は通常５〜２０ｎｇ／ｍｌ程度であるが、これらに限定されるものではない。上記の共存培養は、新鮮な抗原提示細胞を追加して１回ないし数回繰り返してもよい。例えば、共存培養後の培養上清を捨て、新鮮な抗原提示細胞の懸濁液を添加してさらに共存培養を行なうという操作を、１回ないし数回繰り返してもよい。各共存培養の条件は、上記と同様でよい。
【００５１】
上記の共存培養により、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞が誘導され、増殖される。従って、上記ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞を調製することができる。
【００５２】
後述の実施例に記載される通り、ＫＡＴＮＡＬ１遺伝子は、乳癌細胞、乳癌組織、脳腫瘍細胞、脳腫瘍組織、肛門周囲腺癌組織、肛門周囲腺癌細胞、肥満細胞腫組織、肥満細胞腫細胞、神経芽腫細胞、肝臓癌細胞、肝臓癌組織、前立腺癌細胞、前立腺癌組織、肺癌細胞、肺癌組織、甲状腺癌細胞、甲状腺癌組織及び白血病細胞に特異的に発現している。従って、これらの癌種においては、ＫＡＴＮＡＬ１遺伝子が正常細胞よりも有意に多く存在していると考えられる。従って癌細胞内に存在するＫＡＴＮＡＬ１のポリペプチドの一部が癌細胞表面上のＭＨＣ分子に提示され、上記のようにして調製した細胞障害性Ｔ細胞が生体内に投与されると、これを目印として細胞障害性Ｔ細胞が癌細胞を障害することができる。また、上記ポリペプチドを提示する抗原提示細胞は、生体内においても該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができるので、該抗原提示細胞を生体内に投与することによっても、癌細胞を障害することができる。すなわち、上記ポリペプチドを用いて調製された上記細胞障害性Ｔ細胞や上記抗原提示細胞もまた、本発明の免疫誘導剤と同様に、癌の治療及び／又は予防剤として有用である。
【００５３】
上記した単離抗原提示細胞や単離Ｔ細胞を生体に投与する場合には、これらの細胞を異物として攻撃する生体内での免疫応答を回避するために、治療を受ける患者から採取した抗原提示細胞又はＴ細胞を、上記のように上記(a)ないし(c)のポリペプチドを用いて調製したものであることが好ましい。
【００５４】
抗原提示細胞又は単離Ｔ細胞を有効成分として含む癌の治療及び／又は予防剤の投与経路は、静脈内投与や動脈内投与のような非経口投与が好ましい。また、投与量は、症状や投与目的等に応じて適宜選択されるが、通常１個〜１０兆個、好ましくは１００万個〜１０億個であり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。製剤は、例えば、細胞を生理緩衝食塩水に懸濁したもの等であってよく、他の抗癌剤やサイトカイン等と併用することもできる。また、製剤分野において周知の１又は２以上の添加剤を添加することもできる。
【００５５】
また、上記(a)ないし(c)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象動物の体内で発現させることによっても、該生体内で抗体生産や細胞障害性Ｔ細胞を誘導することができ、ポリペプチドを投与するのと同等の効果が得られる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、上記した(a)ないし(c)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分として含むものであってもよい。後述の実施例に示されるように、このような抗原ポリペプチドを発現可能な組換えベクターは、遺伝子ワクチンとも呼ばれる。
【００５６】
遺伝子ワクチンを製造するために用いるベクターは、対象動物細胞内（好ましくは哺乳動物細胞内）で発現可能なベクターであれば特に限定されず、プラスミドベクターでもウイルスベクターでもよく、遺伝子ワクチンの分野で公知のいかなるベクターを用いてもよい。なお、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡやＲＮＡ等のポリヌクレオチドは、上述した通り、常法により容易に調製することができる。また、ベクターへの該ポリヌクレオチドの組み込みは、当業者に周知の方法を用いて行なうことができる。
【００５７】
遺伝子ワクチンの投与経路は、好ましくは筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与経路であり、投与量は、抗原の種類等に応じて適宜選択することができるが、通常、体重１ｋｇ当たり、遺伝子ワクチンの重量で０．１μｇ〜１００ｍｇ程度、好ましくは１μｇ〜１０ｍｇ程度である。
【００５８】
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス等のＲＮＡウイルス又はＤＮＡウイルスに、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込み、これを対象動物に感染させる方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
【００５９】
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００６０】
本発明で用いられる上記ポリペプチドをコードする遺伝子を実際に医薬として作用させるには、遺伝子を直接体内に導入するｉｎ  ｖｉｖｏ方法、及び対象動物からある種の細胞を採取し体外で遺伝子を該細胞に導入しその細胞を体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ方法があるが（日経サイエンス，１９９４年４月，ｐ２０−４５、月刊薬事，１９９４年，第３６巻，第１号，ｐ．２３−４８、実験医学増刊，１９９４年，第１２巻，第１５号、及びこれらの引用文献等）、ｉｎ  ｖｉｖｏ方法がより好ましい。
【００６１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ方法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することが出来る。ｉｎ  ｖｉｖｏ方法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には、有効成分である本発明の上記ペプチドをコードするＤＮＡを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、該ＤＮＡを含有するリポソーム又は膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
【００６２】
なお、本発明において、「配列番号１に示される塩基配列」と言った場合には、配列番号１に実際に示されている塩基配列の他、これと相補的な配列も包含する。従って、「配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド」と言った場合には、配列番号１に実際に示されている塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、その相補的な塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、及びこれらから成る二本鎖ポリヌクレオチドが包含される。本発明で用いられるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製する場合には、適宜いずれかの塩基配列を選択することとなるが、当業者であれば容易にその選択をすることができる。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。【００６４】
実施例１：ＳＥＲＥＸ法による新規癌抗原タンパクの取得
（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
犬の精巣から酸−グアニジウム−フェノール−クロロフォルム法（Ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法）により全ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０  ｍＲＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造株式会社製）を用いてキット添付のプロトコールに従ってポリＡ  ＲＮＡを精製した。【００６５】
この得られたｍＲＮＡ（５μｇ）を用いてｃＤＮＡファージライブラリーを合成した。ｃＤＮＡファージライブラリーの作製にはｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ,Ｚａｐ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ,ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、キット添付のプロトコールに従ってライブラリーを作製した。作製したｃＤＮＡファージライブラリーのサイズは１×１０６ｐｆｕ／ｍｌであった。【００６６】
（２）血清によるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
上記作製したｃＤＮＡファージライブラリーを用いて、イムノスクリーニングを行った。具体的にはΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレートに２３４０クローンとなるように宿主大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ'）に感染させ、４２℃、３〜４時間培養し、溶菌斑（プラーク）を作らせ、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を浸透させたニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｃ  Ｅｘｔｒａ:ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｅｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｃｅ社製）でプレートを３７℃で４時間覆うことによりタンパク質を誘導・発現させ、メンブレンにタンパク質を転写した。その後メンブレンを回収し０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５）に浸し４℃で一晩振盪することによって非特異反応を抑制した。このフィルターを５００倍希釈した患犬血清と室温で２〜３時間反応させた。【００６７】
上記患犬血清としては、肛門近位腫瘍の患犬より採取した血清を用いた。これらの血清は−８０℃で保存し、使用直前に前処理を行った。血清の前処理方法は、以下の方法による。すなわち、外来遺伝子を挿入していないλ  ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓファージを宿主大腸菌（ＸＬ１−ＢＬｕｅ  ＭＲＦ'）に感染させた後、ＮＺＹプレート培地上で３７℃、一晩培養した。次で０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．３のバッファーをプレートに加え、４℃で１５時間静置後、上清を大腸菌／ファージ抽出液として回収した。次に、回収した大腸菌／ファージ抽出液をＮＨＳ−カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｅｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）に通液して、大腸菌・ファージ由来のタンパク質を固定化した。このタンパク固定化カラムに患犬血清を通液・反応させ、大腸菌及びファージに吸着する抗体を血清から取り除いた。カラムを素通りした血清画分は、０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５００倍希釈し、これをイムノスクリーニング材料とした。【００６８】
かかる処理血清と上記融合タンパク質をブロットしたメンブレンをＴＢＳ−Ｔ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）にて４回洗浄を行った後、二次抗体として０．５％  脱脂粉乳を含ＴＢＳにて５０００倍希釈を行ったヤギ抗イヌＩｇＧ（Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ  Ｄｏｇ  ＩｇＧ−ｈ＋Ｉ  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ:ＢＥＴＨＹＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を、室温1時間反応させ、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ反応液（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた酵素発色反応により検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌＳＯ４、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１％  ゼラチン  ｐＨ７．５）５００μlに溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、血清中のＩｇＧと反応する９１１０個のファージクローンをスクリーニングして、１個の陽性クローンを単離した。【００６９】
（３）単離抗原遺伝子の配列同一性検索
上記方法により単離した１個の陽性クローンを塩基配列解析に供するため、ファージベクターからプラスミドベクターに転換する操作を行った。具体的には宿主大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ'）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μlと、精製したファージ溶液１００μｌさらにＥｘＡｓｓｉｓｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）１μｌを混合した後３７℃で１５分間反応後、ＬＢ培地を３ｍｌ添加し３７℃で２．５〜３時間培養を行い、直ちに７０℃の水浴にて２０分間保温した後、４℃、１０００×ｇ、１５分間遠心を行い、上清をファージミド溶液として回収した。次いでファージミド宿主大腸菌（ＳＯＬＲ）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μlと、精製したファージ溶液１０μｌを混合した後３７℃で１５分間反応させ、５０μlをアンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に播き３７℃一晩培養した。トランスフォームしたＳＯＬＲのシングルコロニーを採取し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地３７℃にて培養後、ＱＩＡＧＥＮ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ(キアゲン社製）を使って目的のインサートを持つプラスミドＤＮＡを精製した。【００７０】
精製したプラスミドは、配列番号１３に記載のＴ３プライマーと配列番号１４に記載のＴ７プライマーを用いて、プライマーウォーキング法によるインサート全長配列の解析を行った。このシークエンス解析により配列番号１に記載の遺伝子配列を取得した。この遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を用いて、配列同一性検索プログラムＢＬＡＳＴサーチ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を行い既知遺伝子との配列同一性検索を行った結果、得られた遺伝子はＫＡＴＮＡＬ１遺伝子であることが判明した。イヌＫＡＴＮＡＬ１のヒト相同因子であるヒトＫＡＴＮＡＬ１では、配列同一性が塩基配列９５％、アミノ酸配列９８％であり、マウス相同因子であるマウスＫＡＴＮＡＬ１では配列同一性は塩基配列８５％、アミノ酸配列９４％、ウシ相同因子であるウシＫＡＴＮＡＬ１では配列同一性は塩基配列９１％、アミノ酸配列９７％、ウマ相同因子であるウマＫＡＴＮＡＬ１では配列同一性は塩基配列８７％、アミノ酸配列８８％、ニワトリ相同因子であるニワトリＫＡＴＮＡＬ１では配列同一性は塩基配列８１％、アミノ酸配列９０％であった。ヒトＫＡＴＮＡＬ１の塩基配列を配列番号３、アミノ酸配列を配列番号４に、マウスＫＡＴＮＡＬ１の塩基配列を配列番号５、アミノ酸配列を配列番号６に、ウシＫＡＴＮＡＬ１の塩基配列を配列番号７、アミノ酸配列を配列番号８に、ウマＫＡＴＮＡＬ１の塩基配列を配列番号９、アミノ酸配列を配列番号１０に、ニワトリＫＡＴＮＡＬ１の塩基配列を配列番号１１、アミノ酸配列を配列番号１２に示す。【００７１】
（４）各組織での発現解析
上記方法により得られた遺伝子に対しイヌ、ヒト及びマウスの正常組織及び各種細胞株における発現をＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ）法により調べた。逆転写反応は以下の通り行なった。すなわち、各組織５０〜１００ｍｇ及び各細胞株５〜１０×１０６個の細胞からＴＲＩＺＯＬ試薬（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを用いてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により添付のプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。ヒト正常組織（脳、海馬、精巣、結腸、胎盤）のｃＤＮＡは、ジーンプールｃＤＮＡ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ（クロンテック社製）及びＬａｒｇｅ−Ｉｎｓｅｒｔ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ（クロンテク社製）を用いた。ＰＣＲ反応は、取得した遺伝子特異的なプライマー（イヌプライマーは配列番号１５及び１６、ヒトプライマーは配列番号１７及び１８、マウスプライマーは配列番号１９及び２０に記載）を用いて以下の通り行った。すなわち、逆転写反応により調製したサンプル０．２５μｌ、上記プライマーを各２μＭ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．６５ＵのＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を２５μlとし、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ(ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）を用いて、９４℃−３０秒、５５℃−３０秒、７２℃−１分のサイクルを３０回繰り返して行った。比較対照のため、ＧＡＰＤＨ特異的なプライマー（イヌ及びヒトＧＡＰＤＨプライマーは配列番号２１及び２２、マウスＧＡＰＤＨプライマーは配列番号２３及び２４に記載）も同時に用いた。その結果、図１に示すように、イヌＫＡＴＮＡＬ１遺伝子は、健常なイヌ組織ではほとんどの組織で発現が見られず、一方イヌ腫瘍組織では強い発現が見られた。ヒト及びマウスＫＡＴＮＡＬ１遺伝子の発現も、イヌＫＡＴＮＡＬ１遺伝子と同様、ヒト及びマウス正常組織ではほとんど発現が確認できず、癌細胞では大部分の細胞株で発現が検出された（図２、３）。【００７２】
（５）各組織での定量的発現解析
上記方法により得られた遺伝子に対しヒトの正常組織における発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ）法により調べた。ヒト正常組織及び癌組織のｃＤＮＡは、Ｔｉｓｓｕｅ  ｓｃａｎ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｕｒｖｅｙ  Ｐａｎｅｌ  Ｉ（ＯＲＩＧＥＮＥ社製）を用いた。また定量ＲＴ―ＰＣＲはＢＩＯ  ＲＡＤ社製社製のＣＦＸ９６Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｃｙｓｔｅｍ―Ｃ１０００Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用いて実施した。ＰＣＲ反応は、取得した遺伝子特異的なプライマー（配列番号１７及び１８に記載）を用いて以下の通り行った。すなわち、ｃＤＮＡサンプル５μｌ、上記プライマーを各２μＭ、２ＸＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＩＩポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）の各試薬と添付バッファーを加え全量を２０μlとし、９４℃−３０秒、５５℃−３０秒、７２℃−１分のサイクルを３０回繰り返して行った。その結果、ＫＡＴＮＡＬ１遺伝子は、乳癌、大腸癌、甲状腺癌、肝臓癌、前立腺癌、肺癌においてそれぞれの正常組織と比較してすべて５倍以上発現が高かった。本結果は、ヒトＫＡＴＮＡＬ１を標的とした抗腫瘍剤が、正常組織での副作用を全く心配すること無く、薬剤の薬効と副作用の大きな乖離を期待させる。【００７３】
実施例２：ＫＡＴＮＡＬ１の生体内での癌抗原性の解析
（１）生体内でＫＡＴＮＡＬ１を発現する組換えベクターの作製
配列番号５の塩基配列を基に、以下の方法にて、生体内でＫＡＴＮＡＬ１を発現する組換えベクターを作製した。ＰＣＲは、実施例１において発現の見られたマウス癌細胞株Ｎ２ａ（ＡＴＣＣより購入）より調製した。ｃＤＮＡを１μｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号２５及び２６に記載）を各０．４μＭ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μlとし、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）を用いて、９８℃−１０秒、５５℃−１５秒、７２℃−４分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号５のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％  アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約１５００ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。【００７４】
精製したＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ制限酵素で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製後、目的遺伝子配列を、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ制限酵素で処理した哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入した。このベクターの使用により哺乳類の細胞内でＫＡＴＮＡＬ１タンパクが産生される。【００７５】
上記で作製したプラスミドＤＮＡ１００μｇに５０μｇの金粒子（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）、スペルミジン１００μｌ（ＳＩＧＭＡ社製）、１Ｍ  ＣａＣｌ２  １００μｌ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加し、ボルテックスによって攪拌し１０分室温で静置した（以後、金−ＤＮＡ粒子と記載する）。３０００ｒｐｍで１分遠心した後、上清を捨て１００％  エタノール（ＷＡＫＯ社製）によって３回洗浄した。金−ＤＮＡ粒子に１００％エタノール６ｍｌを加えボルテックスによって十分に攪拌した後、金−ＤＮＡ粒子をＴｅｆｚｅｌ Ｔｕｂｉｎｇ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）に流し込み、壁面に沈殿させた。金−ＤＮＡ粒子が付着したＴｅｆｚｅｌ  Ｔｕｂｉｎｇのエタノールを風乾し、遺伝子銃に適した長さにカットした。【００７６】
（２）ＤＮＡワクチン法によるＫＡＴＮＡＬ１の抗腫瘍効果
１０匹のＡ／Ｊマウス（７週齢、雄、日本ＳＬＣ社から購入）及びＢａｌｂ／ｃマウス（７週齢、雄、日本ＳＬＣ社から購入）に対して、上記で作製したチューブを遺伝子銃に固定し、純ヘリウムガスを用いて４００ｐｓｉの圧力で、剃毛したマウスの腹腔にＤＮＡワクチンを７日ごとに計３回、経皮投与した後に（プラスミドＤＮＡ接種量は２μｇ／匹になる）マウス神経芽腫細胞株Ｎ２ａ細胞、大腸癌細胞株ＣＴ２６を各々１×１０６個を移植して抗腫瘍効果を評価した（予防モデル）。なお、コントロールとして、ＫＡＴＮＡＬ１遺伝子が挿入されていないプラスミドＤＮＡを各モデルで１０匹ずつ投与した。【００７７】
抗腫瘍効果は、腫瘍の大きさ（長径×短径２／２）及び生存マウスの割合で評価した。本検討の結果、神経芽腫細胞株を用いた予防モデルにおいて、４３日後には、コントロール群及びＫＡＴＮＡＬ１プラスミド投与群で、それぞれ、２８８６ｍｍ３、６５９ｍｍ３となり、ＫＡＴＮＡＬ１プラスミド投与群では腫瘍の顕著な退縮が観察された。また、生存の経過を観察した結果、神経芽腫細胞株を用いた予防モデルにおいて、コントロール群では投与後７６日で全例死亡したのに対し、ＫＡＴＮＡＬ１プラスミド投与群では、６０％のマウスが生存していた。以上の結果から、ＫＡＴＮＡＬ１プラスミド投与群はコントロール群に比べて有意な抗腫瘍効果が認められた。同様に、大腸癌細胞株を用いた予防モデルにおいても、３５日後には、コントロール群及びＫＡＴＮＡＬ１プラスミド投与群で、それぞれ、２５９８ｍｍ３、７６３ｍｍ３となり、ＫＡＴＮＡＬ１プラスミド投与群では腫瘍の顕著な退縮が観察された。また、生存の経過を観察した結果、コントロール群では投与後５０日で全例死亡したのに対し、ＫＡＴＮＡＬ１プラスミド投与群では、５０％のマウスが生存していた。以上の結果から、ＫＡＴＮＡＬ１プラスミド投与群はコントロール群に比べて有意な抗腫瘍効果が認められた。【００７８】
実施例３：ヒト組換えＫＡＴＮＡＬ１タンパク質の作製及び免疫誘導能の評価
（１）ヒト組換えＫＡＴＮＡＬ１タンパク質の作製
配列番号３の遺伝子を基に、以下の方法にてヒトＫＡＴＮＡＬ１の組換えタンパク質を作製した。ＰＣＲは、実施例１で作製した各種組織・細胞ｃＤＮＡよりＲＴ−ＰＣＲ法による発現が確認できたｃＤＮＡを１μl、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号２７及び２８に記載）を各０．４μＭ，０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ，１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μlとし、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）を用いて、９８℃−１０秒、５５℃−１５秒、７２℃−４分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号４のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約１５００ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。【００７９】
精製したＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限酵素で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製後、目的遺伝子配列を、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ制限酵素で処理した大腸菌用発現ベクターｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入した。このベクターの使用によりＨｉｓタグ融合型の組換えタンパク質が産生できる。このプラスミドを発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、１ｍＭ  ＩＰＴＧによる発現誘導を行うことで目的タンパク質を大腸菌内で発現させた。【００８０】
(２)組換えＫＡＴＮＡＬ１タンパク質の精製
上記で得られた、配列番号４を発現する組換え大腸菌を１００μｇ／ｍｌ  アンピシリン含有ＬＢ培地にて６００ｎｍでの吸光度が０．７付近になるまで３７℃で培養後、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド終濃度が１ｍＭとなるよう添加し、さらに３７℃で４時間培養した。その後４８００ｒｐｍで１０分間遠心し集菌した。この菌体ペレットをリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁し、さらに４８００ｒｐｍで１０分間遠心し菌体の洗浄を行った。【００８１】
この菌体を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、氷上にて超音波破砕を行った。大腸菌超音波破砕液を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた上清を可溶性画分、沈殿物を不溶性画分とした。【００８２】
不溶性画分を５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて懸濁し６０００ｒｐｍで１５分間遠心した。本操作を２回繰り返し、脱プロテアーゼ操作を行った。【００８３】
この残渣を６Ｍ  グアニジン塩酸塩、０．１５Ｍ  塩化ナトリウム含有５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、４℃で２０時間静置しタンパク質を変性させた。この変性操作後、６０００ｒｐｍで３０分間遠心して得られた可溶性画分を、定法に従って調製したニッケルキレートカラム（担体：Ｃｈｅｌａｔｅｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ社）、カラム容量５ｍＬ、平衡化緩衝液：６Ｍ  グアニジン塩酸塩、０．１５Ｍ  塩化ナトリウム含有５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に添加し、さらに４℃で一晩静置しニッケルキレート化した担体への吸着を行った。このカラム担体を１５００ｒｐｍで５分間遠心して上清を回収し、カラム担体についてはリン酸緩衝化生理食塩水で懸濁後、カラムに再充填した。【００８４】
カラム未吸着画分をカラム容量の１０倍量の０．５Ｍ  塩化ナトリウム含有０．１Ｍ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）にて洗浄操作を行った後、直ちに、０．５Ｍ  塩化ナトリウム含有０．１Ｍ  酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）にて溶出を行い精製画分とし、以降この精製画分を投与試験用の材料とした。なお、各溶出画分中の目的タンパク質は、定法に従って行ったクマシー染色によって確認した。【００８５】
上記方法によって得られた精製標品を反応用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＣａＣｌ２（ｐＨ８．０））に置換した後、ＦａｃｔｏｒＸａ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて添付プロトコールに従ってＦａｃｔｏｒＸａプロテアーゼによるＨｉｓタグの切断及び目的タンパク質の精製を行った。次に、上記方法によって得られた精製標品１２ｍｌを、限外ろ過ＮＡＮＯＳＥＰ １０Ｋ ＯＭＥＧＡ（ＰＡＬＬ社製）を用いて、生理用リン酸緩衝液（日水製薬社製）置換した後、ＨＴタフリンアクロディスク０．２２μｍ（ＰＡＬＬ社製）にて無菌ろ過を行い、これを実験に用いた。【００８６】
（３）ヒト組換えＫＡＴＮＡＬ１タンパク質反応性のＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞の誘導
健常人から末梢血を分離し、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（ＯｒｇａｎｏｎｐＴｅｋｎｉｋａ,Ｄｕｒｈａｍ,ＮＣ）に重層して１，５００ｒｐｍで室温で２０分間遠心分離した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含有する画分を回収し、冷リン酸塩緩衝液中で３回（又はそれ以上）洗浄し、ＰＢＭＣを得た。得られたＰＢＭＣをＡＩＭ−Ｖ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｌｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，米国ニューヨーク州Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ）２０ｍｌに懸濁し、培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）中に３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間付着させた。非付着細胞はＴ細胞調製に用い、付着細胞は樹状細胞を調製するために用いた。【００８７】
一方、付着細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中でＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）及びＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）の存在下で培養した。６日後に得られた非付着細胞集団を回収し、ヒト組換えＫＡＴＮＡＬ１タンパク質を１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、ＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ、Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）及びＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地に交換してさらに２日間培養した後得られた非付着細胞集団を樹状細胞として用いた。【００８８】
調製した樹状細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中に１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁し、ヒト組換えＫＡＴＮＡＬ１タンパク質を再度１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、９６穴プレートを用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、Ｘ線照射（３０００ｒａｄ）し、ＡＩＭ−Ｖ培地で洗浄し、１０％ヒトＡＢ血清（Ｎａｂｉ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）及びＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０５細胞ずつ添加した。さらに調製したＴ細胞集団を１穴当りそれぞれ１×１０６細胞添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。７日後、それぞれの培養上清を捨て、上記と同様にヒト組換えタンパク質で処理後Ｘ線照射した樹状細胞を１０％ヒトＡＢ血清（Ｎａｂｉ，Ｍｉａｍｉ,ＦＬ）、ＩＬ−７（１０Ｕ／ｍｌ、Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）及びＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ、Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し（細胞密度：１×１０５細胞／ｍｌ）、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０５細胞ずつ添加し、さらに培養した。同様の操作を７日間おきに４〜６回繰返した後に刺激されたＴ細胞を回収し、フローサイトメトリーによりＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導を確認した。【００８９】
なお、陰性コントロールとして本発明の範囲外の配列であるタンパク質（配列番号２９）を使用した。【００９０】
次に、本ポリペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞がを発現する腫瘍細胞を障害することができるかを検討した。【００９１】
の発現が確認された悪性脳腫瘍細胞株、Ｔ９８Ｇ（Stein GH et al., J. Cell Physiol., 99:43-54 (1979)、ＡＴＣＣより購入）を１０５個を５０ｍｌ容量の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０３個ずつ添加し、さらにこれに後１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁された１０５、５ｘ１０４、２．５ｘ１０４及び１．２５ｘ１０４個のヒト組換えタンパク質で刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞をそれぞれ添加して、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量をガンマカウンターを用いて測定することによって、ヒト組換えタンパク質で刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を算出した。【００９２】
その結果、ヒト組換えタンパク質で刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞がＴ９８Ｇに対する細胞障害活性を有することが判明した。一方、陰性コントロールタンパク質（配列番号２９）を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞は細胞障害活性を示さなかった。従って、本発明で用いられるヒト組換えタンパク質は腫瘍細胞を障害することができるＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞を誘導する能力があることが明らかになった。【００９３】
なお、細胞障害活性は、上記のように刺激誘導されたＣＤ８陽性Ｔ細胞１０５個とクロミウム５１を取り込ませた１０３個の悪性脳腫瘍細胞株Ｔ９８Ｇとを混合して４時間培養し、培養後培地に放出されたクロミウム５１の量を測定して、式１により算出したＣＤ８陽性Ｔ細胞のＴ９８Ｇに対する細胞障害活性を示す。【００９４】
式１：細胞障害活性（％）＝ＣＤ８陽性Ｔ細胞を加えた際のＴ９８Ｇからのクロミウム５１遊離量（ｃｐｍ）÷１Ｎ塩酸を加えた標的細胞からのクロミウム５１遊離量（ｃｐｍ）ｘ１００。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明は、各種癌に対して抗腫瘍活性を発揮するポリペプチドを含む免疫誘導剤を提供するため、癌の治療及び／又は予防に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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