(57)【要約】  本発明は、２Ｒ，４Ｒ−モナティンの収率を改善する方法論を提供することを提供する。具体的には、本発明は、Ｌ−アミノ酸の存在下において、４Ｒ−ＩＨＯＧをＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼに接触させて、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成することを含む、２Ｓ，４Ｒ−モナティンまたはその塩の製造方法、ならびに２Ｓ，４Ｒ−モナティンを異性化させて、２Ｒ，４Ｒ−モナティンを生成することを含む、２Ｒ，４Ｒ−モナティンまたはその塩の製造方法などを提供する。これらの製造方法は、インドール−３−ピルビン酸およびピルビン酸を縮合して、４Ｒ−ＩＨＯＧを生成すること、ならびにトリプトファンを脱アミノ化して、インドール−３−ピルビン酸を生成することをさらに含んでいてもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸の存在下において、４Ｒ−ＩＨＯＧをＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼに接触させて、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成することを含む、２Ｓ，４Ｒ−モナティンまたはその塩の製造方法。
【請求項２】
Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの作用によりＬ−アミノ酸から生成したケト酸を、デカルボキシラーゼに接触させて分解することをさらに含む、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
Ｌ−アミノ酸がＬ−アスパラギン酸である、請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの作用によりＬ−アスパラギン酸から生成したオキサロ酢酸を、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼに接触させて、ピルビン酸を不可逆的に生成することをさらに含む、請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼが、アルスロバクター属、バチルス属、カンジダ属、コリネバクテリウム属、ロデロミセス属、マイクロコッカス属、マイクロバクテリウム属、ノカルディア属、シュードモナス属、リゾビウム属、ステノトロホモナス属、ディエジア属、オクロバクトラム属、ブレブンディモナス属、バークホルデリア属、カーニモナス属、ヤロウィア属、クロストリジウム属、デイノコッカス属、ユーバクテリウム属、ラクトバチルス属、メタノサーモバクター属、ホルミジウム属、ピロコッカス属、ロドコッカス属、サッカロマイセス属、サッカロファガス属、シノリゾビウム属、サーモアナエロバクター属、サーモトガ属、またはサーマス属に属する微生物に由来する、請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼが、アルスロバクター・エスピー、バチルス・アルティトゥディニス、バチルス・セルロシリティカス、バチルス・プミルス、バチルス・エスピー、カンジダ・ノルベゲンシス、カンジダ・インコンスピクア、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・グルタミカム、ロデロミセス・エロンギスポルス、マイクロコッカス・ルテウス、マイクロバクテリウム・エスピー、ノカルディア・グロベルラ、シュードモナス・クロロラフィス、シュードモナス・シトロノクロリス、シュードモナス・フラギ、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・シンキサンタ、シュードモナス・タエトロレンス、シュードモナス・エスピー、リゾビウム・ラディオバクター、リゾビウム・エスピー、ステノトロホモナス・エスピー、ディエジア・マリス、オクロバクトラム・シュードグリグノネンス、ブレブンディモナス・ディミヌタ、バークホルデリア・エスピー、カーニモナス・エスピー、ヤロウィア・リポリティカ、クロストリジウム・セルロリティカム、デイノコッカス・ゲオサーマリス、ユーバクテリウム・レクタル、ラクトバチルス・アシドフィルス、メタノサーモバクター・サーマウトトロフィカス、ホルミジウム・ラピデウム、ピロコッカス・ホリコシイ、ロドコッカス・エリスロポリス、サッカロマイセス・セレビジアエ、サッカロファガス・デグラダンス、シノリゾビウム・メリロティ、サーモアナエロバクター・テングコンゲネシス、サーモトガ・マリチマ、またはサーマス・サーモフィラスに属する微生物に由来する、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼが、配列番号２、配列番号４８、配列番号５３、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、または配列番号１１１により表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなる、請求項１記載の製造方法。
【請求項８】
Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼが、配列番号２により表されるアミノ酸配列において３９位、１０９位、１２８位、１５０位、２５８位、２８７位、２８８位、２８９位、３０３位、３５８位、及び４３１位のアミノ酸残基から選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異を含む、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
１個以上のアミノ酸残基の変異が、以下からなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の置換である、請求項８記載の製造方法：
１）３９位のリジンのアルギニンへの置換；
２）２５８位のセリンのグリシンへの置換；
３）２８７位のグルタミンのグルタミン酸への置換；
４）２８８位のスレオニンのグリシンへの置換；
５）２８９位のイソロイシンのアラニンへの置換；
６）１０９位のアスパラギン酸のグリシンへの置換；
７）１５０位のヒスチジンのチロシンへの置換；
８）３０３位のフェニルアラニンのロイシンへの置換；
９）３５８位のアスパラギン酸のチロシンへの置換；
１０）４３１位のセリンのスレオニンへの置換；及び
１１）１２８位のグルタミン酸のグリシンへの置換。
【請求項１０】
Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼを発現する形質転換体を用いて、４Ｒ−ＩＨＯＧをＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼに接触させる、請求項１記載の製造方法。
【請求項１１】
インドール−３−ピルビン酸およびピルビン酸を縮合して、４Ｒ−ＩＨＯＧを生成することをさらに含む、請求項１記載の製造方法。
【請求項１２】
インドール−３−ピルビン酸およびピルビン酸をアルドラーゼに接触させることにより、インドール−３−ピルビン酸およびピルビン酸を縮合する、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】
４Ｒ−ＩＨＯＧの生成に用いられるピルビン酸の少なくとも一部が、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼの作用によりオキサロ酢酸から生成したピルビン酸に由来する、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１４】
トリプトファンを脱アミノ化して、インドール−３−ピルビン酸を生成することをさらに含む、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１５】
トリプトファンを脱アミノ化酵素に接触させることにより、トリプトファンを脱アミノ化する、請求項１４記載の製造方法。
【請求項１６】
２Ｓ，４Ｒ−モナティンまたはその塩の製造が１つの反応槽中で行われる、請求項１１または１４記載の製造方法。
【請求項１７】
以下（Ｉ）および（ＩＩ）を含む、２Ｒ，４Ｒ−モナティンまたはその塩の製造方法：
（Ｉ）請求項１記載の方法により、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成すること；および
（ＩＩ）２Ｓ，４Ｒ−モナティンを異性化させて、２Ｒ，４Ｒ−モナティンを生成すること。
【請求項１８】
芳香族アルデヒドの存在下において、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを異性化する、請求項１７記載の製造方法。
【請求項１９】
塩がナトリウム塩またはカリウム塩である、請求項１７記載の製造方法。
【請求項２０】
下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選ばれるタンパク質である、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ：
（Ａ）配列番号２、配列番号４８、配列番号５３、または配列番号６１により表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ）配列番号２、配列番号４８、配列番号５３、または配列番号６１により表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｃ）配列番号２、配列番号４８、配列番号５３、または配列番号６１により表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する、タンパク質；ならびに
（Ｄ）配列番号２、配列番号４８、配列番号５３、または配列番号６１により表されるアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる、１または数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する、タンパク質。
【請求項２１】
Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼが、配列番号２により表されるアミノ酸配列において３９位、１０９位、１２８位、１５０位、２５８位、２８７位、２８８位、２８９位、３０３位、３５８位、及び４３１位のアミノ酸残基から選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異を含む、請求項２０記載のＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ。
【請求項２２】
１個以上のアミノ酸残基の変異が、以下からなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の置換である、請求項２１記載のＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ：
１）３９位のリジンのアルギニンへの置換；
２）２５８位のセリンのグリシンへの置換；
３）２８７位のグルタミンのグルタミン酸への置換；
４）２８８位のスレオニンのグリシンへの置換；
５）２８９位のイソロイシンのアラニンへの置換；
６）１０９位のアスパラギン酸のグリシンへの置換；
７）１５０位のヒスチジンのチロシンへの置換；
８）３０３位のフェニルアラニンのロイシンへの置換；
９）３５８位のアスパラギン酸のチロシンへの置換；
１０）４３１位のセリンのスレオニンへの置換；及び
１１）１２８位のグルタミン酸のグリシンへの置換。
【請求項２３】
下記（ａ）〜（ｅ）からなる群より選ばれる、ポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１、配列番号４７、配列番号５２、または配列番号６０により表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１、配列番号４７、配列番号５２、または配列番号６０により表されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１、配列番号４７、配列番号５２、または配列番号６０により表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すヌクレオチド配列からなり、かつＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１、配列番号４７、配列番号５２、または配列番号６０により表されるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；ならびに
（ｅ）請求項２０記載のＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項２３記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２４記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
【請求項２６】
請求項２５記載の形質転換体を培地中で培養して、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼを得ることを含む、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの製造方法。
【請求項２７】
Ｌ−アミノ酸の存在下において、４Ｒ−ＩＨＯＧを請求項２０記載のＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼに接触させて、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成することを含む、２Ｓ，４Ｒ−モナティンまたはその塩の製造方法。
【請求項２８】
以下（Ｉ’）および（ＩＩ’）を含む、２Ｒ，４Ｒ−モナティンまたはその塩の製造方法：
（Ｉ’）請求項２７記載の方法により、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成すること；および
（ＩＩ’）２Ｓ，４Ｒ−モナティンを異性化させて、２Ｒ，４Ｒ−モナティンを生成すること。
【請求項２９】
芳香族アルデヒドの存在下において、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを異性化する、請求項２８記載の製造方法。
【請求項３０】
塩がナトリウム塩またはカリウム塩である、請求項２８記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼを用いたモナティンの製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
モナティン〔４−（インドール−３−イル−メチル）−４−ヒドロキシ−グルタミン酸〕は、南アフリカの潅木シュレロチトン・イリシホリアス（Ｓｃｈｌｅｒｏｃｈｉｔｏｍ  ｉｌｉｃｉｆｏｌｉｕｓ）の根に含有されるアミノ酸の一種であり、ショ糖の千数百倍の甘味を有していることから、特に低カロリー甘味料として期待される化合物である（特許文献１を参照）。モナティンは、２位と４位に不斉炭素を有しており、モナティンの天然型の立体異性体は（２Ｓ，４Ｓ）体である。また、非天然型の３種の立体異性体が、有機化学的手法により合成されている。これらの全ての立体異性体が甘味に優れており、甘味料としての利用が期待される。【０００３】
モナティンの製造方法としては、幾つかの方法が報告されている（例、特許文献２を参照）。しかしながら、報告されている方法はいずれも多段階の工程を必要とするものであり、モナティンの合成収率の改善が求められている。【０００４】
具体的には、モナティンの製造方法としては、Ｌ−トリプトファン（Ｌ−Ｔｒｐ）からインドール−３−ピルビン酸（以下、必要に応じて「ＩＰＡ」と称する）を合成し、得られたＩＰＡおよびピルビン酸から４Ｒ体の４−（インドール−３−イル−メチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（以下、必要に応じて「４Ｒ−ＩＨＯＧ」と称する）を合成し、続いて得られた４Ｒ−ＩＨＯＧをオキシム化反応、還元反応およびエピ化晶析法に付すことにより、２Ｒ，４Ｒ−モナティンを製造する下記の方法（従来の方法（１））が知られている（特許文献２を参照）。
しかしながら、アルドラーゼ工程（第二工程）は平衡反応ゆえ、必ずしも満足いく収率が得られる反応とは言えなかった。【０００５】
【化１】
2012050125.tif 000002
【０００６】
また、２Ｒ，４Ｒ−モナティンの収率を改善するため、ワンポット（ｏｎｅ−ｐｏｔ）酵素反応により２Ｒ，４Ｒ−モナティンを製造する方法（従来の方法（２））が考案されている（特許文献３〜６を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭６４−２５７５７号公報
【特許文献２】国際公開第２００３／０５９８６５号
【特許文献３】国際公開第２００７／１３３１８４号
【特許文献４】国際公開第２００５／０４２７５６号
【特許文献５】米国特許出願公開第２００６／０２５２１３５号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００８／０２０４３４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、良好な収率でモナティンを製造する方法を提供することである。【０００９】
本発明者らは、鋭意検討した結果、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼを用いることにより上記課題を解決しうることを見出し、本願発明を完成するに至った。４Ｒ−ＩＨＯＧに作用するＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼは、これまで知られていない。【００１０】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕Ｌ−アミノ酸の存在下において、４Ｒ−ＩＨＯＧをＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼに接触させて、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成することを含む、２Ｓ，４Ｒ−モナティンまたはその塩の製造方法。
〔２〕Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの作用によりＬ−アミノ酸から生成したケト酸を、デカルボキシラーゼに接触させて分解することをさらに含む、〔１〕の製造方法。
〔３〕Ｌ−アミノ酸がＬ−アスパラギン酸である、〔１〕の製造方法。
〔４〕Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの作用によりＬ−アスパラギン酸から生成したオキサロ酢酸を、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼに接触させて、ピルビン酸を不可逆的に生成することをさらに含む、〔３〕の製造方法。
〔５〕Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼが、アルスロバクター属、バチルス属、カンジダ属、コリネバクテリウム属、ロデロミセス属、マイクロコッカス属、マイクロバクテリウム属、ノカルディア属、シュードモナス属、リゾビウム属、ステノトロホモナス属、ディエジア属、オクロバクトラム属、ブレブンディモナス属、バークホルデリア属、カーニモナス属、ヤロウィア属、クロストリジウム属、デイノコッカス属、ユーバクテリウム属、ラクトバチルス属、メタノサーモバクター属、ホルミジウム属、ピロコッカス属、ロドコッカス属、サッカロマイセス属、サッカロファガス属、シノリゾビウム属、サーモアナエロバクター属、サーモトガ属、またはサーマス属に属する微生物に由来する、〔１〕の製造方法。
〔６〕Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼが、アルスロバクター・エスピー、バチルス・アルティトゥディニス、バチルス・セルロシリティカス、バチルス・プミルス、バチルス・エスピー、カンジダ・ノルベゲンシス、カンジダ・インコンスピクア、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・グルタミカム、ロデロミセス・エロンギスポルス、マイクロコッカス・ルテウス、マイクロバクテリウム・エスピー、ノカルディア・グロベルラ、シュードモナス・クロロラフィス、シュードモナス・シトロノクロリス、シュードモナス・フラギ、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・シンキサンタ、シュードモナス・タエトロレンス、シュードモナス・エスピー、リゾビウム・ラディオバクター、リゾビウム・エスピー、ステノトロホモナス・エスピー、ディエジア・マリス、オクロバクトラム・シュードグリグノネンス、ブレブンディモナス・ディミヌタ、バークホルデリア・エスピー、カーニモナス・エスピー、ヤロウィア・リポリティカ、クロストリジウム・セルロリティカム、デイノコッカス・ゲオサーマリス、ユーバクテリウム・レクタル、ラクトバチルス・アシドフィルス、メタノサーモバクター・サーマウトトロフィカス、ホルミジウム・ラピデウム、ピロコッカス・ホリコシイ、ロドコッカス・エリスロポリス、サッカロマイセス・セレビジアエ、サッカロファガス・デグラダンス、シノリゾビウム・メリロティ、サーモアナエロバクター・テングコンゲネシス、サーモトガ・マリチマ、またはサーマス・サーモフィラスに属する微生物に由来する、〔５〕の製造方法。
〔７〕Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼが、配列番号２、配列番号４８、配列番号５３、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、または配列番号１１１により表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなる、〔１〕の製造方法。
〔８〕Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼが、配列番号２により表されるアミノ酸配列において３９位、１０９位、１２８位、１５０位、２５８位、２８７位、２８８位、２８９位、３０３位、３５８位、及び４３１位のアミノ酸残基から選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異を含む、〔７〕の製造方法。
〔９〕１個以上のアミノ酸残基の変異が、以下からなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の置換である、〔８〕の製造方法：
１）３９位のリジンのアルギニンへの置換；
２）２５８位のセリンのグリシンへの置換；
３）２８７位のグルタミンのグルタミン酸への置換；
４）２８８位のスレオニンのグリシンへの置換；
５）２８９位のイソロイシンのアラニンへの置換；
６）１０９位のアスパラギン酸のグリシンへの置換；
７）１５０位のヒスチジンのチロシンへの置換；
８）３０３位のフェニルアラニンのロイシンへの置換；
９）３５８位のアスパラギン酸のチロシンへの置換；
１０）４３１位のセリンのスレオニンへの置換；及び
１１）１２８位のグルタミン酸のグリシンへの置換。
〔１０〕Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼを発現する形質転換体を用いて、４Ｒ−ＩＨＯＧをＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼに接触させる、〔１〕の製造方法。
〔１１〕インドール−３−ピルビン酸およびピルビン酸を縮合して、４Ｒ−ＩＨＯＧを生成することをさらに含む、〔１〕の製造方法。
〔１２〕インドール−３−ピルビン酸およびピルビン酸をアルドラーゼに接触させることにより、インドール−３−ピルビン酸およびピルビン酸を縮合する、〔１１〕の製造方法。
〔１３〕４Ｒ−ＩＨＯＧの生成に用いられるピルビン酸の少なくとも一部が、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼの作用によりオキサロ酢酸から生成したピルビン酸に由来する、〔１１〕の製造方法。
〔１４〕トリプトファンを脱アミノ化して、インドール−３−ピルビン酸を生成することをさらに含む、〔１１〕の製造方法。
〔１５〕トリプトファンを脱アミノ化酵素に接触させることにより、トリプトファンを脱アミノ化する、〔１４〕の製造方法。
〔１６〕２Ｓ，４Ｒ−モナティンまたはその塩の製造が１つの反応槽中で行われる、〔１１〕または〔１４〕の製造方法。
〔１７〕以下（Ｉ）および（ＩＩ）を含む、２Ｒ，４Ｒ−モナティンまたはその塩の製造方法：
（Ｉ）〔１〕の方法により、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成すること；および
（ＩＩ）２Ｓ，４Ｒ−モナティンを異性化させて、２Ｒ，４Ｒ−モナティンを生成すること。
〔１８〕芳香族アルデヒドの存在下において、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを異性化する、〔１７〕の製造方法。
〔１９〕塩がナトリウム塩またはカリウム塩である、〔１７〕の製造方法。
〔２０〕下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選ばれるタンパク質である、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ：
（Ａ）配列番号２、配列番号４８、配列番号５３、または配列番号６１により表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ）配列番号２、配列番号４８、配列番号５３、または配列番号６１により表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｃ）配列番号２、配列番号４８、配列番号５３、または配列番号６１により表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する、タンパク質；ならびに
（Ｄ）配列番号２、配列番号４８、配列番号５３、または配列番号６１により表されるアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる、１または数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する、タンパク質。
〔２１〕Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼが、配列番号２により表されるアミノ酸配列において３９位、１０９位、１２８位、１５０位、２５８位、２８７位、２８８位、２８９位、３０３位、３５８位、及び４３１位のアミノ酸残基から選ばれる１個以上のアミノ酸残基の変異を含む、〔２０〕のＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ。
〔２２〕１個以上のアミノ酸残基の変異が、以下からなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸残基の置換である、〔２１〕のＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ：
１）３９位のリジンのアルギニンへの置換；
２）２５８位のセリンのグリシンへの置換；
３）２８７位のグルタミンのグルタミン酸への置換；
４）２８８位のスレオニンのグリシンへの置換；
５）２８９位のイソロイシンのアラニンへの置換；
６）１０９位のアスパラギン酸のグリシンへの置換；
７）１５０位のヒスチジンのチロシンへの置換；
８）３０３位のフェニルアラニンのロイシンへの置換；
９）３５８位のアスパラギン酸のチロシンへの置換；
１０）４３１位のセリンのスレオニンへの置換；及び
１１）１２８位のグルタミン酸のグリシンへの置換。
〔２３〕下記（ａ）〜（ｅ）からなる群より選ばれる、ポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１、配列番号４７、配列番号５２、または配列番号６０により表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１、配列番号４７、配列番号５２、または配列番号６０により表されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１、配列番号４７、配列番号５２、または配列番号６０により表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すヌクレオチド配列からなり、かつＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１、配列番号４７、配列番号５２、または配列番号６０により表されるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；ならびに
（ｅ）〔２０〕のＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド。
〔２４〕〔２３〕のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔２５〕〔２４〕の発現ベクターが導入された形質転換体。
〔２６〕〔２５〕の形質転換体を培地中で培養して、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼを得ることを含む、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの製造方法。
〔２７〕Ｌ−アミノ酸の存在下において、４Ｒ−ＩＨＯＧを〔２０〕のＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼに接触させて、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成することを含む、２Ｓ，４Ｒ−モナティンまたはその塩の製造方法。
〔２８〕以下（Ｉ’）および（ＩＩ’）を含む、２Ｒ，４Ｒ−モナティンまたはその塩の製造方法：
（Ｉ’）〔２７〕の方法により、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成すること；および
（ＩＩ’）２Ｓ，４Ｒ−モナティンを異性化させて、２Ｒ，４Ｒ−モナティンを生成すること。
〔２９〕芳香族アルデヒドの存在下において、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを異性化する、〔２８〕の製造方法。
〔３０〕塩がナトリウム塩またはカリウム塩である、〔２８〕の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法は、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼを用いて４Ｒ−ＩＨＯＧから２Ｓ，４Ｒ−モナティンを良好な収率で製造することにより、２Ｒ，４Ｒ−モナティンの収率の改善に寄与できる。本発明の方法はまた、ＩＨＯＧから２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成する際、高価なＤ−アミノ酸（Ｄ−Ａｓｐなど）を基質として使用する必要がない、あるいはＬ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を生成するラセマーゼなどの酵素を添加する必要がない、といった利点を有する。本発明の方法はさらに、４Ｒ−ＩＨＯＧから２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成する反応（第３工程）のみならず、Ｌ−ＴｒｐからＩＰＡを生成する反応（第１工程）、およびＩＰＡから４Ｒ−ＩＨＯＧを生成する反応（第２工程）を実施する場合、全体の反応平衡を第３工程で規定することが可能であり、第２工程の反応平衡を４Ｒ−ＩＨＯＧの生成方向に大きくシフトさせることができる。この場合、本発明の方法は、Ｌ−Ｔｒｐの副生（第１工程の逆反応の進行）を回避することにより、非常に良好な収率で２Ｓ，４Ｒ−モナティンを製造することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の製造方法の一例を示す図である。Ｔｒｐ：トリプトファン；ＩＰＡ：インドール−３−ピルビン酸；ＩＨＯＧ：４−（インドール−３−イル−メチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸；モナティン：４−（インドール−３−イル−メチル）−４−ヒドロキシ−グルタミン酸。
【図２】図２は、本発明の製造方法の一例を示す図である。略号は、図１と同様である。
【図３】図３は、本発明の製造方法の好ましい例を示す図である。Ｌ−Ｔｒｐ：Ｌ−トリプトファン；Ｌ−Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸；ＯＡＡ：オキサロ酢酸；ＰＡ：ピルビン酸。他の略号は、図１と同様である。
【図４】図４は、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ変異体（ＩＤ１６６）を用いた、４００ｍｌスケールにおけるＬ−Ｔｒｐからの２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成反応を示す図である。ＳＲ−Ｍｏｎａｔｉｎ：２Ｓ，４Ｒ−モナティン；ＳＳ−Ｍｏｎａｔｉｎ：２Ｓ，４Ｓ−モナティン；ＩＨＯＧ：４Ｒ−ＩＨＯＧ；Ｔｒｐ：Ｌ−Ｔｒｐ。
【図５】図５は、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ変異体（ＩＤ１８９）を用いた、８０ｍｌスケールにおけるＬ−Ｔｒｐからの２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成反応を示す図である。略称は、図４と同様である。
【図６】図５は、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ変異体（ＩＤ２９６）を用いた、８０ｍｌスケールにおけるＬ−Ｔｒｐからの２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成反応を示す図である。略称は、図４と同様である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（１）２Ｓ，４Ｒ−モナティンまたはその塩の製造方法
本発明は、２Ｓ，４Ｒ−モナティンまたはその塩の製造方法（１）を提供する。本発明の製造方法は、（１−１）４Ｒ−ＩＨＯＧから２Ｓ，４Ｒ−モナティンを製造する方法、（１−２）ＩＰＡおよびピルビン酸から２Ｓ，４Ｒ−モナティンを製造する方法、（１−３）トリプトファンから２Ｓ，４Ｒ−モナティンを製造する方法に分類できる。（１−１）、（１−２）、（１−３）の方法は、Ｌ−アミノ酸の存在下において、４Ｒ−ＩＨＯＧをＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼに接触させて、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成することを含むという点で共通する。
【００１４】
（１−１）４Ｒ−ＩＨＯＧから２Ｓ，４Ｒ−モナティンを製造する方法
本方法は、Ｌ−アミノ酸の存在下において、４Ｒ−ＩＨＯＧをＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼに接触させて、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成すること（反応１）を含む。Ｌ−アミノ酸の存在下において、４Ｒ−ＩＨＯＧをＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼに接触させることにより、Ｌ−アミノ酸のアミノ基が４Ｒ−ＩＨＯＧに転移して、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成し得る。
【００１５】
【化２】
2012050125.tif 000003
【００１６】
Ｌ−アミノ酸の種類は、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼによりそのアミノ基が目的の基質である４Ｒ−ＩＨＯＧに転移され得るＬ−アミノ酸である限り特に限定されない。このようなＬ−アミノ酸としては、Ｌ−α−アミノ酸等の種々のＬ−アミノ酸が知られている。具体的には、このようなＬ−アミノ酸としては、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−システイン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファンが挙げられる。Ｌ−アミノ酸は、塩の形態で反応液中に添加されたものであってもよい。反応液中のＬ−アミノ酸の濃度は、例えば、１ｍＭ〜３Ｍであり、好ましくは２０ｍＭ〜１Ｍであり、より好ましくは１００ｍＭ〜５００ｍＭである。
【００１７】
一実施形態では、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼは、細菌、放線菌、酵母等の微生物に由来するタンパク質であり得る。微生物の分類は、当該分野で周知の分類法、例えば、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｔａｘｏｎｏｍｙ／Ｂｒｏｗｓｅｒ／ｗｗｗｔａｘ．ｃｇｉ？ｉｄ＝９１３４７）で用いられている分類法により行うことができる。Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼが由来する微生物の例としては、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ロデロミセス（Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、マイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属、ディエジア（Ｄｉｅｔｚｉａ）属、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属、ブレブンンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、カーニモナス（Ｃａｒｎｉｍｏｎａｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、メタノサーモバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ）属、ホルミジウム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ）属、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロファガス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ）属、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属、およびサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属に属する微生物が挙げられる。
【００１８】
具体的には、アルスロバクター属に属する微生物の例としては、アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）が挙げられる。
【００１９】
バチルス属に属する微生物の例としては、バチルス・アルティトゥディニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ）、バチルス・セルロシリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）が挙げられる。カンジダ属に属する微生物の例としては、カンジダ・ノルベゲンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｎｏｒｖｅｇｅｎｓｉｓ）、カンジダ・インコンスピクア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｉｎｃｏｎｓｐｉｃｕａ）が挙げられる。コリネバクテリウム属に属する微生物の例としては、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が挙げられる。ロデロミセス属に属する微生物の例としては、ロデロミセス・エロンギスポルス（Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ）が挙げられる。マイクロコッカス属に属する微生物の例としては、マイクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）が挙げられる。マイクロバクテリウム属に属する微生物の例としては、マイクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）が挙げられる。ノカルディア属に属する微生物の例としては、ノカルディア・グロベルラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｇｌｏｂｅｒｕｌａ）が挙げられる。
【００２０】
シュードモナス属に属する微生物の例としては、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）〔例、シュードモナス・クロロラフィス・サブエスピー・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）〕、シュードモナス・シトロノクロリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｏｎｏｃｌｌｏｌｉｓ）、シュードモナス・フラギ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・シンキサンタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｎｘａｎｔｈａ）、シュードモナス・タエトロレンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ）、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）が挙げられる。
【００２１】
リゾビウム属に属する微生物の例としては、リゾビウム・ラディオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム・エスピー（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）が挙げられる。ステノトロホモナス属に属する微生物の例としては、ステノトロホモナス・エスピー（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）が挙げられる。ディエジア属に属する微生物の例としては、ディエジア・マリス（Ｄｉｅｔｚｉａ  ｍａｒｉｓ）が挙げられる。オクロバクトラム属に属する微生物の例としては、オクロバクトラム・シュードグリグノネンス（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｇｒｉｇｎｏｎｅｎｓｅ）が挙げられる。ブレブンディモナス属に属する微生物の例としては、ブレブンディモナス・ディミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）が挙げられる。バークホルデリア属に属する微生物の例としては、バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）が挙げられる。カーニモナス属に属する微生物の例としては、カーニモナス・エスピー（Ｃａｒｎｉｍｏｎａｓ  ｓｐ．）が挙げられる。ヤロウィア属に属する微生物の例としては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｙｐｏｌｙｔｉｃａ）が挙げられる。
【００２２】
クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属に属する微生物の例としては、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）が挙げられる。デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物の例としては、デイノコッカス・ゲオサーマリス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）が挙げられる。ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物の例としては、ユーバクテリウム・レクタル（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ）が挙げられる。ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）属に属する微生物の例としては、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）が挙げられる。メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物の例としては、メタノコッカス・ヤナシュイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）が挙げられる。メタノサーモバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物の例としては、メタノサーモバクター・サーマウトトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）が挙げられる。ホルミジウム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ）属に属する微生物の例としては、ホルミジウム・ラピデウム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｌａｐｉｄｅｕｍ）が挙げられる。ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物の例としては、ピロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）が挙げられる。ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物の例としては、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）が挙げられる。サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物の例としては、サッカロマイセス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。サッカロファガス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ）属に属する微生物の例としては、サッカロファガス・デグラダンス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ  ｄｅｇｒａｄａｎｓ）が挙げられる。シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属する微生物の例としては、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）が挙げられる。サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物の例としては、サーモアナエロバクター・テングコンゲネシス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ）が挙げられる。サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属に属する微生物の例としては、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）が挙げられる。サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属に属する微生物の例としては、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）が挙げられる。
【００２３】
別の実施形態では、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼは、天然のタンパク質もしくは人工の変異型タンパク質であり得る。このようなＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼとしては、配列番号２、配列番号４８、配列番号５３、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、または配列番号１１１で表されるアミノ酸配列と高い相同性（例、類似性、同一性）を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するものが挙げられる。用語「Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性」とは、Ｌ−アミノ酸のアミノ基を目的の基質である４Ｒ−ＩＨＯＧに転移して、アミノ基を有する目的化合物である２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成する活性をいう。具体的には、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼとしては、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上または９９％以上の相同性（例、類似性、同一性）を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００２４】
アミノ酸配列および塩基配列の相同性は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））やＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、アミノ酸配列および塩基配列の相同性を計算してもよい。また、アミノ酸配列の相同性としては、例えば、株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド鎖全長を用いて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＭａｒｃｈｉｎｇ  ｃｏｕｎｔをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。アミノ酸配列および塩基配列の相同性として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
【００２５】
さらに別の実施形態では、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼは、配列番号２、配列番号４８、配列番号５３、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、または配列番号１１１により表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の変異（例、欠失、置換、付加および挿入）を含むアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質であり得る。１または数個のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１または数個」は、タンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲を示すものである。タンパク質の場合における用語「１または数個」が示す数は、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個または１〜５個である。このような変異は、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子を保持する微生物の個体差および種差等に基づく天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）に起因していてもよい。
【００２６】
アミノ酸配列において変異を導入すべきアミノ酸残基の位置は、当業者に自明である。具体的には、当業者は、１）同種の活性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列（例、配列番号２により表されるアミノ酸配列、および他のＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列）を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列において変異を導入すべきアミノ酸残基の位置を特定できる。
【００２７】
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００２８】
さらに別の実施形態では、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼは、配列番号１、配列番号４７、配列番号５２、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、または配列番号１１０で表される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このような条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性（例、同一性）が高いポリヌクレオチド同士、例えば８０％、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い相同性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。具体的には、このような条件としては、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での１または２回以上の洗浄が挙げられる。
【００２９】
好ましい実施形態では、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列における３９位、１０９位、１２８位、１５０位、２５８位、２８７位、２８８位、２８９位、３０３位、３５８位、及び４３１位のアミノ酸残基から選ばれる１個以上（例、１個または２個）の任意のアミノ酸残基が置換等により変異しているＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ変異体であってもよい。Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ変異体の好ましい例は、以下からなる群より選ばれる１個以上（例、１個または２個）の置換を含むものである：
１）３９位のリジンのアルギニンへの置換；
２）２５８位のセリンのグリシンへの置換；
３）２８７位のグルタミンのグルタミン酸への置換；
４）２８８位のスレオニンのグリシンへの置換；
５）２８９位のイソロイシンのアラニンへの置換；
６）１０９位のアスパラギン酸のグリシンへの置換；
７）１５０位のヒスチジンのチロシンへの置換；
８）３０３位のフェニルアラニンのロイシンへの置換；
９）３５８位のアスパラギン酸のチロシンへの置換；
１０）４３１位のセリンのスレオニンへの置換；及び
１１）１２８位のグルタミン酸のグリシンへの置換
【００３０】
配列番号２で表されるアミノ酸配列における３９位、１０９位、１２８位、１５０位、２５８位、２８７位、２８８位、２８９位、３０３位、３５８位、及び４３１位のアミノ酸残基から選ばれる１個以上（例、１個または２個）の任意のアミノ酸残基の置換の組み合わせに関しては、例えば以下に示すような組み合わせの変異を導入することもできるが、本発明において用いることの出来るアミノ酸置換の組み合わせは以下に限定されるものではない。
ａ）Ｔ２８８Ｇ
ｂ）Ｓ２５８Ｇ／Ｉ２８９Ａ
ｃ）Ｋ３９Ｒ／Ｔ２８８Ｇ
ｄ）Ｑ２８７Ｅ／Ｔ２８８Ｇ
ｅ）Ｋ３９Ｒ／Ｄ１０９Ｒ／Ｔ２８８Ｇ／Ｓ４３１Ｔ
ｆ）Ｋ３９Ｒ／Ｄ１０９Ｒ／Ｔ２８８Ｇ／Ｆ３０３Ｌ
ｇ）Ｄ１０９Ｒ／Ｑ２８７Ｅ／Ｔ２８８Ｇ／Ｆ３０３Ｌ
ｈ）Ｄ１０９Ｒ／Ｓ２５８Ｇ／Ｉ２８９Ａ／Ｆ３０３Ｌ
ｉ）Ｄ１０９Ｒ／Ｑ２８７Ｅ／Ｔ２８８Ｇ／Ｓ４３１Ｔ
ｊ）Ｄ１０９Ｒ／Ｓ２５８Ｇ／Ｉ２８９Ａ／Ｓ４３１Ｔ
ｋ）Ｋ３９Ｒ／Ｄ１０９Ｒ／Ｅ１２８Ｇ／Ｔ２８８Ｇ／Ｆ３０３Ｌ
ｌ）Ｋ３９Ｒ／Ｄ１０９Ｇ／Ｅ１２８Ｇ／Ｔ２８８Ｇ／Ｆ３０３Ｌ
ｍ）Ｄ１０９Ｒ／Ｅ１２８Ｇ／Ｑ２８７Ｅ／Ｔ２８８Ｇ／Ｆ３０３Ｌ
ｎ）Ｄ１０９Ｒ／Ｅ１２８Ｇ／Ｓ２５８Ｇ／Ｉ２８９Ａ／Ｓ４３１Ｔ
ｏ）Ｄ１０９Ｇ／Ｅ１２８Ｇ／Ｑ２８７Ｅ／Ｔ２８８Ｇ／Ｆ３０３Ｌ
ｐ）Ｄ１０９Ｇ／Ｅ１２８Ｇ／Ｓ２５８Ｇ／Ｉ２８９Ａ／Ｆ３０３Ｌ
ｑ）Ｋ３９Ｒ／Ｄ１０９Ｇ／Ｈ１５０Ｙ／Ｔ２８８Ｇ／Ｆ３０３Ｌ／Ｄ３５８Ｙ／Ｓ４３１Ｔ
ｒ）Ｋ３９Ｒ／Ｄ１０９Ｇ／Ｅ１２８Ｇ／Ｈ１５０Ｙ／Ｔ２８８Ｇ／Ｆ３０３Ｌ／Ｄ３５８Ｙ
ｓ）Ｄ１０９Ｇ／Ｈ１５０Ｙ／Ｑ２８７Ｅ／Ｔ２８８Ｇ／Ｆ３０３Ｌ／Ｄ３５８Ｙ／Ｓ４３１Ｔ
ｔ）Ｄ１０９Ｇ／Ｈ１５０Ｙ／Ｓ２５８Ｇ／Ｉ２８９Ａ／Ｆ３０３Ｌ／Ｄ３５８Ｙ／Ｓ４３１Ｔ
ｕ）Ｄ１０９Ｇ／Ｅ１２８Ｇ／Ｈ１５０Ｙ／Ｑ２８７Ｅ／Ｔ２８８Ｇ／Ｆ３０３Ｌ／Ｄ３５８Ｙ
ｖ）Ｄ１０９Ｇ／Ｅ１２８Ｇ／Ｈ１５０Ｙ／Ｓ２５８Ｇ／Ｉ２８９Ａ／Ｆ３０３Ｌ／Ｄ３５８Ｙ
【００３１】
一実施形態では、４Ｒ−ＩＨＯＧのＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼとの接触は、４Ｒ−ＩＨＯＧ、およびＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの産生菌から抽出されたＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（抽出酵素）を、反応液中に共存させることにより達成できる。Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの産生菌としては、例えば、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼを天然で産生している菌（例、上述した微生物）、およびＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼを発現する形質転換体が挙げられる。具体的には、抽出酵素としては、例えば、精製酵素、粗酵素、固定化酵素、培養ブロス、培養ブロス処理物（例、上記産生菌から調製されたＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ含有画分、上記産生菌の破砕物および溶解物）が挙げられる。培養ブロスから培養ブロス処理物を得るための処理としては、例えば、熱処理（４２℃〜８０℃、ｐＨ３〜１２、１分〜２４時間）、溶剤処理（例、キシレン、トルエン、エタノール、イソプロピルアルコール）、界面活性剤（例、Ｔｗｅｅｎ２０，Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、溶菌酵素処理（例：リゾチーム処理）が挙げられる。あるいは、培養ブロスを温度、ｐＨ等を調整しながら保持することによりブロス中に検出される酵素活性を上昇せしめた後に反応に供してもよい。この場合の温度は４℃〜６０℃で、好ましくは２０℃から３７℃に設定されうる。また、ｐＨは３〜１２に、好ましくはｐＨ７〜９に設定されうる。時間は５分〜２０日間程度、好ましくは１時間〜７日間程度に設定されうる。ブロス保持中に通気攪拌をしても良いし、しなくとも良い。
【００３２】
別の実施形態では、４Ｒ−ＩＨＯＧのＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼとの接触は、４Ｒ−ＩＨＯＧ、およびＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの産生菌を、反応液（例、培養液）中に共存させることにより達成できる。
【００３３】
本発明の製造方法（１）で用いられる反応液としては、目的の反応が進行する限り特に限定されず、例えば、水、緩衝液が用いられる。緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液（例、ＫＨ２ＰＯ４）、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液が挙げられる。緩衝液の濃度は、例えば０．１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは１ｍＭ〜１Ｍであってもよい。本発明の製造方法においてＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの産生菌が用いられる場合、培養液が反応液として用いられてもよい。このような培養液は、例えば、後述する培地を用いて調製できる。本発明の製造方法で用いられる反応液は、補酵素としてピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）をさらに含んでいてもよい。ＰＬＰは、塩の形態で反応液中に添加されたものであってもよい。反応液中のＰＬＰの濃度は、例えば、１μＭ〜１００ｍＭであり、好ましくは１０μＭ〜１ｍＭであってもよい。反応液がＰＬＰを含む場合、ＰＬＰにより触媒され得る異性化反応により、２Ｓ，４Ｒ−モナティンから２Ｒ，４Ｒ−モナティンを生成する効果もまた期待され得る（例、実施例１１を参照）。
【００３４】
本発明の製造方法（１）で用いられる反応液のｐＨは、目的の反応が進行する限り特に限定されないが、例えばｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜９、より好ましくはｐＨ７〜８である。
【００３５】
本発明の製造方法（１）における反応温度は、目的の反応が進行する限り特に限定されないが、例えば１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃、より好ましくは２５〜３５℃である。
【００３６】
本発明の製造方法（１）における反応時間は、２Ｓ，４Ｒ−モナティンが生成するのに十分な時間である限り特に限定されないが、例えば、２〜１００時間、好ましくは４〜５０時間、より好ましくは８〜２５時間である。
【００３７】
Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの産生菌として、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼを発現する形質転換体が用いられる場合、この形質転換体は、例えば、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの発現ベクターを作製し、次いで、この発現ベクターを宿主に導入することにより作製できる。例えば、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを作製して適切な宿主に導入することにより、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼを発現する形質転換体を得ることができる。Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼを発現させるための宿主としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌（例、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））、およびバチルス属細菌（例、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス属細菌（例、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、ピヒア属細菌（例、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ））、アスペルギルス属細菌（例、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ））をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。宿主としては、所定の遺伝子を欠損する株を用いてもよい。欠損され得るこのような遺伝子としては、例えば、ＡｓｐＣ、宿主由来Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、宿主由来アルドラーゼ、宿主由来脱アミノ化酵素が挙げられる。形質転換体としては、例えば、細胞質中にベクターを保有する形質転換体、およびゲノム上に目的遺伝子が導入された形質転換体が挙げられる。
【００３８】
Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの産生菌は、所定の培養装置（例、試験管、フラスコ、ジャーファーメンターなど）を用いて、後述の組成を有する培地において培養することができる。培養条件は適宜設定することができる。具体的には、培養温度は、２５℃〜３７℃であってもよく、ｐＨは６．５〜７．５であってもよく、培養時間は１ｈ〜１００ｈであってもよい。また、溶存酸素濃度を管理しつつ培養を行っても良い。この場合、培養液中の溶存酸素濃度（ＤＯ値）を制御の指標として用いることがある。大気中の酸素濃度を２１％とした場合の相対的な溶存酸素濃度ＤＯ値が、例えば１〜１０％を、好ましくは３％〜８％を下回らない様に、通気・攪拌条件を制御することが出来る。また、培養はバッチ培養であっても、フェドバッチ培養であっても良い。フェドバッチ培養の場合は糖源となる溶液やリン酸を含む溶液を培養液に連続的あるいは不連続的に逐次添加して、培養を継続することも出来る。
【００３９】
形質転換される宿主は、上述したとおりであるが、大腸菌について詳述すると、大腸菌Ｋ１２株亜種のエシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株などから選択することが出来る。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ  （２００１／０１／１５）などにも記載されている。以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いて所定の酵素を製造する方法を、一例としてより具体的に説明する。
【００４０】
Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを発現させるプロモータとしては、通常Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ、Ｔ５プロモータ等の強力なプロモータが挙げられ、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、ｌａｃが好ましい。また、ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体等を用いてもよい。他のベクターとしては、ファージＤＮＡのベクターを利用してもよい。さらに、プロモータを含み、挿入ＤＮＡ配列を発現させることができる発現ベクターを使用してもよい。好ましくは、ベクターは、ｐＵＣ、ｐＳＴＶ、ｐＭＷであってもよい。
【００４１】
また、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネータを連結してもよい。このようなターミネータとしては、例えば、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータが挙げられる。
【００４２】
Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう「改変」とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
【００４３】
また、形質転換体を選別するために、ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ発現ベクターが市販されている（例、ｐＵＣ系（タカラバイオ社製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製））。
【００４４】
得られた発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼが発現される。
【００４５】
培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。培地は、所定の炭素源、窒素源、補酵素（例、塩酸ピリドキシン）を含有していてもよい。具体的には、ペプトン、酵母エキス、ＮａＣｌ、グルコース、ＭｇＳＯ４，硫酸アンモニウム、リン酸２水素カリウム、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、チアミン、大豆塩酸加水分解物、ディスホームＧＤ１１３―Ｋ（日本油脂）などを用いても良い。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
【００４６】
Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼを回収するには、以下の方法などがある。Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼは、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ産生菌を回収した後、菌体を破砕（例、ソニケーション、ホモジナイゼーション）あるいは溶解（例、リゾチーム処理）することにより、破砕物および溶解物として得ることができる。このような破砕物および溶解物を、抽出、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法に供することにより、精製酵素、粗酵素、またはＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ含有画分等を得ることもできる。
【００４７】
好ましい実施形態では、本発明の製造方法は、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの作用によりＬ−アミノ酸（例、Ｌ−α−アミノ酸）から生成したケト酸（Ｒ−ＣＯＣＯＯＨ）を、デカルボキシラーゼに接触させて分解することをさらに含む（反応１’を参照）。Ｌ−アミノ酸からアミノ基転移反応により生成したケト酸の分解を促進することにより、４Ｒ−ＩＨＯＧから２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成する反応の平衡を、より多量の２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成するようにシフトさせることができる。
【００４８】
【化３】
2012050125.tif 000004
【００４９】
本発明で用いられるデカルボキシラーゼは、ケト酸の脱炭酸反応を触媒する酵素である。デカルボキシラーゼによる脱炭酸反応は、不可逆的であり得る。ケト酸の不可逆的な脱炭酸反応のために用いられるデカルボキシラーゼとしては、種々の酵素が知られており、例えば、シュードモナス・スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）由来オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３６５，１７−２４，１９９９）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）由来ピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，１５２−１５７，１９８３）が挙げられる。
【００５０】
特に好ましい実施形態では、本発明の製造方法は、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの作用によりＬ−アスパラギン酸（Ｌ−Ａｓｐ）から生成したオキサロ酢酸（ＯＡＡ）を、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼに接触させて、ピルビン酸（ＰＡ）を生成することを含む（反応１’’を参照）。オキサロ酢酸からのピルビン酸の不可逆的生成を促進することにより、４Ｒ−ＩＨＯＧから２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成する反応の平衡を、より多量の２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成するようにシフトさせることができる。Ｌ−アスパラギン酸は、塩の形態で反応液中に添加されたものであってもよい。反応液中のＬ−アスパラギン酸の濃度は、１ｍＭ〜３Ｍであり、好ましくは２０ｍＭ〜１Ｍであり、より好ましくは１００ｍＭ〜５００ｍＭである。
【００５１】
【化４】
2012050125.tif 000005
【００５２】
本発明で用いられるオキサロ酢酸デカルボキシラーゼは、オキサロ酢酸の脱炭酸反応を触媒して、ピルビン酸を生成する酵素である。オキサロ酢酸デカルボキシラーゼによる脱炭酸反応は、不可逆的であり得る。オキサロ酢酸の不可逆的な脱炭酸反応のために用いられるオキサロ酢酸デカルボキシラーゼとしては、種々の酵素が知られている。このようなオキサロ酢酸デカルボキシラーゼの例としては、例えば、シュードモナス・スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）由来オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３６５，１７−２４，１９９９）、クレブシエラ・アエロゲネス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）由来オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１４１，５９−６２，１９８２）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）由来オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．，９５７，３０１−３１１，１９８８）が挙げられる。
【００５３】
４Ｒ−ＩＨＯＧからの２Ｓ，４Ｒ−モナティンの製造においてデカルボキシラーゼが使用される場合、Ｌ−アミノ酸から生成したケト酸のデカルボキシラーゼとの接触は、ケト酸、およびデカルボキシラーゼの産生菌から抽出されたデカルボキシラーゼ（抽出酵素）、またはデカルボキシラーゼの産生菌を、反応液（例、培養液）中に共存させることにより達成できる。デカルボキシラーゼの産生菌としては、例えば、デカルボキシラーゼを天然で産生している菌、およびデカルボキシラーゼを発現する形質転換体が挙げられる。抽出酵素としては、例えば、精製酵素、粗酵素、固定化酵素、培養ブロス、培養ブロス処理物（例、上記産生菌から調製されたデカルボキシラーゼ含有画分、上記産生菌の破砕物および溶解物）が挙げられる。培養ブロスから培養ブロス処理物を得るための処理としては、例えば、熱処理（４２℃〜８０℃、ｐＨ３〜１２、１分〜２４時間）、溶剤処理（例、キシレン、トルエン、エタノール、イソプロピルアルコール）、界面活性剤（例、Ｔｗｅｅｎ２０，Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、溶菌酵素処理（例：リゾチーム処理）が挙げられる。あるいは、培養ブロスを温度、ｐＨ等を調整しながら保持することによりブロス中に検出される酵素活性を上昇せしめた後に反応に供してもよい。この場合の温度は４℃〜６０℃で、好ましくは２０℃から３７℃に設定されうる。また、ｐＨは３〜１２に、好ましくはｐＨ７〜９に設定されうる。時間は５分〜２０日間程度、好ましくは１時間〜７日間程度に設定されうる。ブロス保持中に通気攪拌をしても良いし、しなくとも良い。
【００５４】
４Ｒ−ＩＨＯＧからの２Ｓ，４Ｒ−モナティンの製造においてＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼおよびデカルボキシラーゼの両方が使用される場合、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼおよびデカルボキシラーゼは、以下の様式で反応液中に提供されてもよい。
・Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（抽出酵素）およびデカルボキシラーゼ（抽出酵素）
・Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの産生菌およびデカルボキシラーゼ（抽出酵素）
・Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（抽出酵素）およびデカルボキシラーゼの産生菌
・Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの産生菌およびデカルボキシラーゼの産生菌
・Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼおよびデカルボキシラーゼの産生菌
【００５５】
好ましくは、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼおよびデカルボキシラーゼの産生菌は、形質転換体であってもよい。このような形質転換体は、ｉ）Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの発現ベクターを、デカルボキシラーゼの産生菌に導入することにより、ｉｉ）デカルボキシラーゼの発現ベクターを、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの産生菌に導入することにより、ｉｉｉ）Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの第１の発現ベクターおよびデカルボキシラーゼの第２の発現ベクターを、宿主の微生物に導入することにより、ｉｖ）Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼおよびデカルボキシラーゼの発現ベクターを、宿主の微生物に導入することにより、作製できる。Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼおよびデカルボキシラーゼの発現ベクターとしては、例えば、ｉ’）Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および当該第１のポリヌクレオチドに機能可能に連結された第１のプロモーターから構成される第１の発現単位、ならびにデカルボキシラーゼをコードする第２のポリヌクレオチド、および当該第２のポリヌクレオチドに機能可能に連結された第２のプロモーターから構成される第２の発現単位を含む発現ベクター、ならびにｉｉ’）Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする第１のポリヌクレオチドおよびデカルボキシラーゼをコードする第２のポリヌクレオチド、ならびに当該第１および第２のポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクター（ポリシストロニックｍＲＮＡを発現し得るベクター）が挙げられる。Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする第１のポリヌクレオチドは、デカルボキシラーゼをコードする第２のポリヌクレオチドに対して上流に位置していてもよいし、下流に位置していてもよい。
【００５６】
（１−２）ＩＰＡおよびピルビン酸から２Ｓ，４Ｒ−モナティンを製造する方法
本発明の製造方法は、４Ｒ−ＩＨＯＧを調製するために、ＩＰＡおよびピルビン酸を縮合させて、４Ｒ−ＩＨＯＧを生成することをさらに含んでいてもよい。ＩＰＡおよびピルビン酸の縮合は、有機化学的手法、およびアルドラーゼを用いる酵素法により行うことができる。有機化学的手法によりＩＰＡおよびピルビン酸を縮合させて４Ｒ−ＩＨＯＧを生成する方法は、例えば、国際公開第２００３／０５９８６５号、米国特許出願公開第２００８／０２０７９２０号明細書に開示されている。アルドラーゼを用いる酵素法によりＩＰＡおよびピルビン酸を縮合させて４Ｒ−ＩＨＯＧを生成する方法は、例えば、国際公開第２００３／０５６０２６号、特開２００６−２０４２８５、米国特許出願公開第２００５／０２４４９３９号明細書、国際公開第２００７／１０３９８９号に開示されている。したがって、本発明では、ＩＰＡおよびピルビン酸から４Ｒ−ＩＨＯＧを調製するために、これらの方法を用いることができる。
【００５７】
４Ｒ−ＩＨＯＧの調製に用いられるＩＰＡは、不安定な化合物である。したがって、ＩＰＡおよびピルビン酸の縮合は、ＩＰＡの安定化因子の存在下において行なわれてもよい。ＩＰＡの安定化因子としては、例えば、スーパーオキシドジムスターゼ（例、国際公開第２００９／０２８３３８号を参照）、メルカプトエタノール（例、国際公開第２００９／０２８３３８号）を参照）が挙げられる。例えば、国際公開第２００９／０２８３３８号には、スーパーオキシドジムスターゼを発現する形質転換体が開示されているので、本発明の方法では、このような形質転換体を用いてもよい。
【００５８】
ＩＰＡおよびピルビン酸から４Ｒ−ＩＨＯＧを生成する反応、ならびに４Ｒ−ＩＨＯＧから２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成する反応は、別々にまたは並行して進行させてもよい。また、これらの反応は、１つの反応槽中で実施してもよい。１つの反応槽中でこれらの反応を実施する場合、これらの反応は、基質および酵素を順番にまたは同時に添加することにより行われ得る。具体的には、アルドラーゼを用いる酵素法によりＩＰＡおよびピルビン酸から４Ｒ−ＩＨＯＧを生成する反応、およびＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼにより４Ｒ−ＩＨＯＧから２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成する反応が行なわれる場合、（１）ＩＰＡ、ピルビン酸およびアルドラーゼ、ならびに（２）Ｌ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼを、１つの反応槽中に順番にまたは同時に添加してもよい。ピルビン酸は、塩（例、ナトリウム塩）の形態で反応液中に添加されたものであってもよい。ピルビン酸は、任意の方法（例、バッチ法、フィード法）で反応液中に添加されてもよい。反応液中のピルビン酸の濃度は、例えば０．１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは１ｍＭ〜１Ｍであってもよい。
【００５９】
好ましい実施形態では、本発明の製造方法は、以下のように上記反応１’’と併用される。この場合、オキサロ酢酸から不可逆的に生成したピルビン酸が、４Ｒ−ＩＨＯＧの調製のために利用される。換言すれば、４Ｒ−ＩＨＯＧの生成に用いられるピルビン酸の少なくとも一部が、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼの作用によりオキサロ酢酸から生成したピルビン酸に由来し得る。この場合、２Ｓ，４Ｒ−モナティンの生成と連動してピルビン酸がオキサロ酢酸から生成するので、反応系中のＬ−アミノ酸の存在量が十分であれば、反応系中のピルビン酸の初期量は必ずしも重要でない点に留意すべきである。したがって、反応系中に、Ｌ−アミノ酸を、ピルビン酸に比し、より多量に添加してもよい。
【００６０】
【化５】
2012050125.tif 000006
【００６１】
ＩＰＡおよびピルビン酸からの４Ｒ−ＩＨＯＧの製造においてアルドラーゼが使用される場合、ＩＰＡおよびピルビン酸とのアルドラーゼとの接触は、ＩＰＡおよびピルビン酸、ならびにアルドラーゼの産生菌から抽出されたアルドラーゼ（抽出酵素）、またはアルドラーゼの産生菌を、反応液（例、培養液）中に共存させることにより達成できる。アルドラーゼの産生菌としては、例えば、アルドラーゼを天然で産生している菌、およびアルドラーゼを発現する形質転換体が挙げられる。抽出酵素としては、例えば、精製酵素、粗酵素、固定化酵素、培養ブロス、培養ブロス処理物（例、上記産生菌から調製されたアルドラーゼ含有画分、上記産生菌の破砕物および溶解物）が挙げられる。培養ブロスから培養ブロス処理物を得るための処理としては、例えば、熱処理（４２℃〜８０℃、ｐＨ３〜１２、１分〜２４時間）、溶剤処理（例、キシレン、トルエン）、界面活性剤処理が挙げられる。培養ブロスは、４℃〜６０℃、ｐＨ３〜１２、５分〜２０日間（通気攪拌あり／なし）の条件下で用いられてもよい。アルドラーゼの産生菌は、他の酵素（例、スーパーオキシドジムスターゼ、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、デカルボキシラーゼ）をさらに発現していてもよい。あるいは、アルドラーゼの産生菌に加えて、他の酵素の産生菌を、反応液中に共存させてもよい。反応液としては、例えば、本発明の製造方法（１−１）で述べたものを使用できる。
【００６２】
好ましくは、アルドラーゼ、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼおよびデカルボキシラーゼの産生菌は、形質転換体であってもよい。アルドラーゼ、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ及びデカルボキシラーゼの発現は、同一の形質転換体を用いて行われても良いし、２つの形質転換体の組み合わせで行われても良いし、３種類別々の形質転換体で発現させても良い。アルドラーゼ、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ及びデカルボキシラーゼ遺伝子を同一の形質転換体で発現させる場合には、染色体にこれらの遺伝子を組み込んでも良いし、一つのベクターにアルドラーゼ、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ及びデカルボキシラーゼの遺伝子を連結しても良い。あるいは、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの発現ベクターを、デカルボキシラーゼ及びアルドラーゼの産生菌に導入しても良いし、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの第１の発現ベクターおよびデカルボキシラーゼ及びアルドラーゼの第２の発現ベクターを、宿主の微生物に導入しても良い。アルドラーゼ、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼおよびデカルボキシラーゼの発現ベクターとしては、例えば、ｉ’）Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする第１のポリヌクレオチド、および当該第１のポリヌクレオチドに機能可能に連結された第１のプロモーターから構成される第１の発現単位、ならびにデカルボキシラーゼをコードする第２のポリヌクレオチド、および当該第２のポリヌクレオチドに機能可能に連結された第２のプロモーターから構成される第２の発現単位、およびアルドラーゼをコードする第３のポリヌクレオチド、及び当該第３のポリヌクレオチドに機能可能に連結された第３のプロモーターから構成される第３の発現単位を含む発現ベクター、ならびにｉｉ’）Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードする第１のポリヌクレオチドおよびデカルボキシラーゼをコードする第２のポリヌクレオチド、ならびに当該第１および第２のポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターから構成される第１の発現単位、及びアルドラーゼをコードする第３のポリヌクレオチド及び第３のポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターから構成される第２の発現単位を含む発現ベクター（ポリシストロニックｍＲＮＡを発現し得るベクター）が挙げられる。Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、デカルボキシラーゼ及びアルドラーゼをコードする遺伝子のプラスミド上での配置には特段の制約は無い。
【００６３】
反応の温度、ｐＨ、時間等の種々の条件は、目的の反応が進行し得る限り適宜設定できるが、例えば、アルドラーゼを用いる酵素法の条件は、本発明の製造方法（１−１）で述べたものと同様であってもよい。
【００６４】
（１−３）トリプトファンまたはその塩から２Ｓ，４Ｒ−モナティンまたはその塩を製造する方法
本発明の製造方法は、ＩＰＡを調製するために、トリプトファン（Ｔｒｐ）を脱アミノ化することをさらに含んでいてもよい。Ｔｒｐとしては、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ、ならびにＬ−ＴｒｐおよびＤ−Ｔｒｐの混合物が挙げられる。Ｔｒｐの脱アミノ化は、有機化学的手法、および脱アミノ化酵素を用いる酵素法により行うことができる。
【００６５】
有機化学的手法によりＴｒｐを脱アミノ化してＩＰＡを生成する方法としては、種々の方法が知られている。このような方法としては、例えば、トリプトファンを出発原料とし、プロトン受容体脱水用塩基の存在下、ピリジンアルデヒドと反応させる方法（例、特表昭６２−５０１９１２号公報、国際公開第１９８７／０００１６９号を参照）、インドールとｅｔｈｙｌ−３−ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ｅｓｔｅｒ  ｏｘｉｍｅとを原料に用いた縮合反応の後、酸加水分解に付す方法（例、欧州特許出願公開第４２１９４６号明細書を参照）が挙げられる。
【００６６】
本明細書中で用いられる場合、用語「脱アミノ化酵素」とは、ＴｒｐからＩＰＡを生成し得る酵素をいう。ＴｒｐからのＩＰＡの生成は、本質的には、Ｔｒｐのアミノ基（−ＮＨ２）をオキシ基（＝Ｏ）に変換することである。したがって、この反応を触媒する酵素は、アミノ酸デアミナーゼ、アミノトランスフェラーゼ、アミノ酸オキシダーゼ等の別称で称呼される場合がある。したがって、用語「脱アミノ化酵素」は、ＴｒｐからＩＰＡを生成し得る任意の酵素を意味するものとし、ＴｒｐからＩＰＡを生成する反応を触媒する別名の酵素（例、アミノ酸デアミナーゼ、アミノトランスフェラーゼ、アミノ酸オキシダーゼ）も「脱アミノ化酵素」に含まれるものとする。
アミノ酸デアミナーゼまたはその産生菌を用いてＴｒｐからＩＰＡを生成する方法としては、例えば、国際公開第２００９／０２８３３８号に開示される方法が挙げられる。アミノ酸デアミナーゼ触媒する反応の一般式としては、以下が挙げられる＜式：アミノ酸＋Ｈ２Ｏ→２−オキソ酸＋ＮＨ３＞。
また、アミノトランスフェラーゼまたはその産生菌を用いてＴｒｐからＩＰＡを生成する方法としては、例えば、東ドイツ特許ＤＤ  ２９７１９０、特開昭５９−９５８９４号公報、国際公開第２００３／０９１３９６号、米国特許出願公開２００５／０２８２２６０号明細書に開示される方法が挙げられる。
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼまたはその産生菌を用いてＴｒｐからＩＰＡを生成する方法としては、例えば、米国特許第５，００２，９６３号公報、Ｊｏｈｎ  Ａ．Ｄｕｅｒｒｅら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １９７５，ｖｏｌ１２１，Ｎｏ．２，ｐ６５６−６６３）、特開昭５７−１４６５７３号公報、国際公開第２００３／０５６０２６号、国際公開第２００９／０２８３３８号に開示される方法が挙げられる。アミノ酸オキシダーゼの触媒する反応の一般式としては、以下が挙げられる＜式：アミノ酸＋Ｏ２＋Ｈ２Ｏ→２−オキソ酸＋Ｈ２Ｏ２＋ＮＨ３＞。この際、副生する過酸化水素による化合物の分解を抑制する目的で、カタラーゼなどの過酸化水素分解酵素を反応液に添加してもよい。
【００６７】
ＴｒｐからＩＰＡを生成する反応、ＩＰＡおよびピルビン酸から４Ｒ−ＩＨＯＧを生成する反応、ならびに４Ｒ−ＩＨＯＧから２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成する反応は、別々にまたは並行して進行させてもよい。これらの反応は、１つの反応槽中で実施してもよい。１つの反応槽中でこれらの反応を実施する場合、これらの反応は、基質および酵素を順番にまたは同時に添加することにより行われ得る。具体的には、脱アミノ化酵素を用いる酵素法によりＴｒｐを脱アミノ化してＩＰＡを生成する反応、アルドラーゼを用いる酵素法によりＩＰＡおよびピルビン酸から４Ｒ−ＩＨＯＧを生成する反応、ならびにＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼにより４Ｒ−ＩＨＯＧから２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成する反応が行なわれる場合、（１）Ｔｒｐおよび脱アミノ化酵素、（２）ピルビン酸およびアルドラーゼ、ならびに（３）Ｌ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼを、１つの反応槽中に順番にまたは同時に添加してもよい。
【００６８】
ＴｒｐからＩＰＡの製造において脱アミノ化酵素が使用される場合、Ｔｒｐとの脱アミノ化酵素との接触は、Ｔｒｐ、および脱アミノ化酵素の産生菌から抽出された脱アミノ化酵素（抽出酵素）、または脱アミノ化酵素の産生菌を、反応液（例、培養液）中に共存させることにより達成できる。脱アミノ化酵素の産生菌としては、例えば、脱アミノ化酵素を天然で産生している菌、および脱アミノ化酵素を発現する形質転換体が挙げられる。例えば、国際公開第２００９／０２８３３８号、実施例２に記載のｐＴＢ２株（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ株由来アミノ酸デアミナーゼ遺伝子を導入したＥ．ｃｏｌｉ組み換え株）を用いてもよい。さらには当該プラスミドのデアミナーゼ遺伝子に機能可能なプロモーター（例、ｐｈｏＡ、ｐｈｏＣ、ｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃプロモーター）を連結しても良い。また、Ｅ．ｃｏｌｉを宿主として用いる場合には特定の遺伝子、例えばａｓｐＣ遺伝子を欠損させた宿主にデアミナーゼ発現プラスミドを導入しても良い。抽出酵素としては、例えば、精製酵素、粗酵素、固定化酵素、培養ブロス、培養ブロス処理物（例、上記産生菌から調製された脱アミノ化酵素含有画分、上記産生菌の破砕物および溶解物）が挙げられる。培養ブロスから培養ブロス処理物を得るための処理としては、例えば、熱処理（４２℃〜８０℃、ｐＨ３〜１２、１分〜２４時間）、溶剤処理（例、キシレン、トルエン、エタノール、イソプロピルアルコール）、界面活性剤（例、Ｔｗｅｅｎ２０，Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、溶菌酵素処理（例：リゾチーム処理）が挙げられる。あるいは、培養ブロスを温度、ｐＨ等を調整しながら保持することによりブロス中に検出される酵素活性を上昇せしめた後に反応に供してもよい。この場合の温度は４℃〜６０℃で、好ましくは２０℃から３７℃に設定されうる。また、ｐＨは３〜１２に、好ましくはｐＨ７〜９に設定されうる。時間は５分〜２０日間程度、好ましくは１時間〜７日間程度に設定されうる。ブロス保持中に通気攪拌をしても良いし、しなくとも良い。脱アミノ化酵素の産生菌は、他の酵素（例、アルドラーゼ、スーパーオキシドジムスターゼ、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、デカルボキシラーゼ）をさらに発現していてもよい。あるいは、脱アミノ化酵素の産生菌に加えて、他の酵素の産生菌を、反応液中に共存させてもよい。反応液としては、例えば、本発明の製造方法（１−１）で述べたものを使用できる。Ｔｒｐは、好ましくはＬ−Ｔｒｐである。Ｔｒｐは、塩の形態で反応液中に添加されたものであってもよい。反応液中のＴｒｐの濃度は、例えば、１ｍＭ〜３Ｍであり、好ましくは２０ｍＭ〜１Ｍであり、より好ましくは２０ｍＭ〜３００ｍＭである。
【００６９】
反応の温度、ｐＨ、時間等の種々の条件は、目的の反応が進行し得る限り適宜設定できるが、例えば、脱アミノ化酵素を用いる酵素法の条件は、本発明の製造方法（１−１）で述べたものと同様であってもよい。
【００７０】
好ましい実施形態では、本発明の製造方法（１−３）が１つの反応槽中で行われる場合、デアミナーゼ、アルドラーゼ、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、およびオキサロ酢酸デカルボキシラーゼ、ならびに／あるいはそれらを発現する１以上の形質転換体が用いられる。スーパーオキシドジムスターゼ、ならびに／あるいはそれを発現する形質転換体がさらに用いられてもよい。これらの酵素は、変異体であってもよい。酵素の発現系としては、上述したような形質転換体を用いることができる。具体的には、細胞質中に目的遺伝子の発現ベクターを保有する形質転換体、およびゲノム上に目的遺伝子が導入された形質転換体、ならびに細胞質中に目的遺伝子の発現ベクターを保有し、かつゲノム上に目的遺伝子が導入された形質転換体が挙げられる。形質転換体の作製に用いられる発現ベクターとしては、上述したような発現ベクターを用いることができる。
【００７１】
好ましい実施形態では、本発明の製造方法（１−３）が１つの反応槽中で行われる場合、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ａｓｐ、ＰＡ、緩衝液（例、リン酸緩衝液、トリス緩衝液）、ＰＬＰを、所定の濃度で含む反応液を用いることができる。Ｌ−Ｔｒｐ濃度は、例えば１ｍＭ〜３Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜１Ｍ、より好ましくは５０ｍＭ〜３００ｍＭである。Ｌ−Ａｓｐ濃度は、例えば１ｍＭ〜３Ｍ、好ましくは１００ｍＭ〜１Ｍ、より好ましくは２００ｍＭ〜４００ｍＭである。Ｌ−Ａｓｐは、塩の形態（例、ナトリウム塩、カリウム塩）であっても、フリーの形態であってもよい。Ｌ−Ａｓｐがフリーの形態で用いられる場合、反応液への投入後に、ｐＨを適宜調整しても構わない。この場合、ｐＨの調整には、アルカリ溶液（例、ＮａＯＨ水溶液、ＫＯＨ水溶液）が用いられてもよい。ＰＡ濃度は、例えば１ｍＭ〜３Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭである。ＰＡは、塩の形態（例、ナトリウム塩、カリウム塩）であっても、フリーの形態であってもよい。ＰＡがフリーの形態で用いられる場合、反応液への投入後にｐＨを適宜調整しても構わない。ＰＬＰ濃度は、例えば１μＭ〜１００ｍＭ，好ましくは１０μＭ〜１ｍＭである。反応液は、マグネシウム、リン酸、消泡剤をさらに含んでいてもよい。マグネシウムが塩として用いられる場合、マグネシウム塩の形態としては、特段の制約はなく、例えば、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムが挙げられる。マグネシウム濃度は、例えば０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ〜５ｍＭである。また、リン酸が塩として用いられる場合、リン酸塩の形態としては、特段の制約は無く、例えば、カリウム塩（例、１カリウム塩、２カリウム塩、３カリウム塩）、ナトリウム塩（例、１ナトリウム塩、２ナトリウム塩、３ナトリウム塩）が挙げられる。リン酸濃度は、例えば１ｍＭ〜１００ｍＭ，好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭである。消泡剤としては、特段の制約は無く、例えばＧＤ１１３Ｋが挙げられる。消泡剤の濃度は、特段の制約は無いが、例えば０．０００１％〜１％（ｖ／ｖ）、好ましくは０．００１％〜０．１％（ｖ／ｖ）である。ｐＨ、温度、通気、攪拌、時間等の反応条件は、適宜設定することができる。反応液のｐＨは、例えば５〜１０、好ましくはｐＨ６〜９、より好ましくはｐＨ７〜８である。反応中のｐＨの制御は、酸またはアルカリを適宜添加することにより達成し得る。この場合に使用する酸、アルカリとしては、特段の制約は無いが、例えば塩酸、リン酸、硫酸、アンモニアガス、アンモニア水、ＮａＯＨ水溶液、ＫＯＨ水溶液が挙げられる。ｐＨ調整に用いる酸、アルカリの濃度は、特段の制約は無く、例えば溶液が用いられる場合には０．１Ｎ〜２０Ｎ、好ましくは３Ｎ〜１２Ｎである。反応温度は、例えば１０℃〜５０℃、好ましくは２０℃〜４０℃、より好ましくは２５℃〜３５℃である。反応にジャーファーメンターなどの通気・攪拌制御が可能な容器を用いる場合、反応液中の溶存酸素濃度は、通気・攪拌条件を制御することにより設定することができる。当業者であれば使用する容器に応じた通気・攪拌条件の設定をすることは可能である。例えば１Ｌ容ジャーファーメンターを使用する場合、通気条件は、例えば１／２００��１ｖｖｍ、好ましくは１／１００〜１／１０ｖｖｍであり、攪拌条件は、例えば１００ｒｐｍ〜１０００ｒｐｍ、好ましくは４００ｒｐｍ〜７００ｒｐｍである。反応に添加する酵素としては、精製酵素、酵素発現菌体、酵素発現菌体処理物、酵素発現菌体を含む培養液ブロス、および酵素発現菌体を含む培養液ブロスの処理物が挙げられる。培養ブロスから培養ブロス処理物を得るための処理としては、例えば、熱処理（例、４２℃〜８０℃、ｐＨ３〜１２、１分〜２４時間）、溶剤処理（例、キシレン、トルエン、エタノール、イソプロピルアルコール）、界面活性剤（例、Ｔｗｅｅｎ２０，Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、溶菌酵素処理（例、リゾチーム処理）が挙げられる。あるいは、培養ブロスを温度、ｐＨ等の条件を調整しながら保持することによりブロス中に検出される酵素活性を上昇せしめた後に反応に供してもよい。この場合、培養ブロスの温度は、例えば４℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜３７℃である。また、培養ブロスのｐＨは、例えば３〜１２、好ましくは７〜９である。保持時間は、例えば５分〜２０日間程度、好ましくは１時間〜７日間程度である。培養ブロスの保持中に通気攪拌をしても良いし、しなくともよい。
【００７２】
反応液に添加するそれぞれの酵素量は、予め各々の酵素活性値を測定することにより、適宜設定することができる。デアミナーゼ活性、アルドラーゼ活性、Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性、及びオキザロ酢酸デカルボキシラーゼ活性は、例えば、以下の方法により測定することができる。
デアミナーゼ活性：１０ｍＭ  Ｌ−Ｐｈｅ、１００ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２５ｍＭ  ＮＡＤＨ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ユニチカ社製、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ由来）、２５℃。３４０ｎｍの減少から活性を算出。
Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ活性（Ｌ−Ａｓｐ／α−ＫＧ活性）：１００ｍＭ  Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ、１０ｍＭ  α−ＫＧ−２Ｎａ、５０μＭ  ＰＬＰ、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２５ｍＭ  ＮＡＤＨ、ＭＤＨ  ２Ｕ／ｍｌ、２５℃。３４０ｎｍの減少から活性を算出。ＭＤＨはＭａｌｉｃ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｈｅａｒｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。
アルドラーゼ活性：２ｍＭ  ４−ｐｈｅｎｙｌ−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｏｘｏ  ｇｌｕｔａｒａｔｅ（ＰＨＯＧ）、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭ  ＮＡＤＨ、１０Ｕ／ｍｌ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（オリエンタル酵母社製、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来），２５℃。３４０ｎｍの減少から活性を算出。
オキザロ酢酸デカルボキシラーゼ活性：１ｍＭ  オキザロ酢酸、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２５ｍＭ  ＮＡＤＨ、１０Ｕ／ｍｌ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（オリエンタル酵母社製、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来），２５℃。３４０ｎｍの減少から活性を算出。
このようにして決定された酵素活性に基づくと、反応液中に添加される酵素量は、以下のとおりであってもよい。反応液中に添加されるデアミナーゼの量は、例えば０．１〜２０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２  Ｕ／ｍｌである。反応液中に添加されるアルドラーゼの量は、例えば１〜１０００Ｕ／ｍｌ，好ましくは１０〜１００Ｕ／ｍｌである。反応液中に添加されるＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼの量は、例えば１〜１０００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１０〜１００Ｕ／ｍｌである。反応液中に添加されるオキザロ酢酸デカルボキシラーゼの量は、例えば０．０１Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは０．１Ｕ／ｍｌ以上である。各基質は、バッチ法またはフィード法により反応系に添加されてもよい。酵素、酵素発現菌体、酵素発現菌体処理物、培養ブロス、または培養ブロス処理物もまた、バッチ法またはフィード法により反応系に添加されてもよい。反応時間は、例えば２〜１００時間、好ましくは４〜５０時間、より好ましくは８〜２５時間である。反応液は、適切な条件（例、温度、ｐＨ、時間）下で殺菌されてもよい。
【００７３】
本発明の製造方法（１−２）が１つの反応槽中で行われる場合、このような製造方法は、上述した本発明の製造方法（１−３）に準じて行うことができる。
【００７４】
本発明の製造方法（１−１）（１−２）（１−３）のいずれかによって得られた２Ｓ，４Ｒ−モナティン含有反応液を、カラム処理、晶析処理、抽出処理等の既知の精製方法を駆使することによって、精製された２Ｓ，４Ｒ−モナティンを得ることができる。精製された２Ｓ，４Ｒ−モナティンを、２Ｒ，４Ｒ−モナティンまたはその塩の製造方法（２）に供することができる。また、本発明の製造方法（１−１）（１−２）（１−３）のいずれかによって得られた２Ｓ，４Ｒ−モナティン含有反応液をそのまま、２Ｒ，４Ｒ−モナティンまたはその塩の製造方法（２）に供することができる。
【００７５】
（２）２Ｒ，４Ｒ−モナティンまたはその塩の製造方法
本発明は、２Ｒ，４Ｒ−モナティンまたはその塩の製造方法（２）を提供する。本発明の製造方法は、本発明の製造方法（１）により２Ｓ，４Ｒ−モナティンまたはその塩を製造すること、ならびに２Ｓ，４Ｒ−モナティンまたはその塩を異性化して、２Ｒ，４Ｒ−モナティンまたはその塩を生成することを含む。
【００７６】
２Ｓ，４Ｒ−モナティンの２Ｒ，４Ｒ−モナティンへの異性化は、当該異性化を可能にする任意の方法により行うことができる（例、国際公開第２００５／０８２８５０号、国際公開第０３／０５９８６５号を参照）。しかしながら、２Ｒ，４Ｒ−モナティンの収率を向上させるという観点からは、２Ｓ，４Ｒ−モナティンの異性化は、好ましくは、エピ化晶析により行われる（例、国際公開第２００５／０８２８５０号を参照）。エピ化晶析とは、異性化反応および晶析を同時に行う方法である。本件の場合、エピ化晶析により、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを２Ｒ，４Ｒ−モナティンに変換する２位の異性化反応、および変換された２Ｒ，４Ｒ−モナティンの晶析が同時に行われる。
【００７７】
エピ化晶析においては、アルデヒドの存在下において異性化反応が行われてもよい。アルデヒドとしては、脂肪族アルデヒドまたは芳香族アルデヒドが挙げられるが、芳香族アルデヒドが好ましい。異性化反応に用いられる２Ｓ，４Ｒ−モナティンとしては、精製された２Ｓ，４Ｒ−モナティンを用いてもよいし、２Ｓ，４Ｒ−モナティン含有する反応液を用いてもよい。
【００７８】
脂肪族アルデヒドとしては、例えばホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ｎ−ブチルアルデヒド、１−ブチルアルデヒド、ｎ−バレル  アルデヒド、カプロンアルデヒド、ｎ−ヘプチルアルデヒド、アクロレイン、メタクロレイン等の炭素数１〜７の飽和または不飽和アルデヒドを用いることができる。
【００７９】
芳香族アルデヒドとしては、例えばベンズアルデヒド、サリチルアルデヒド、ｍ−ヒドロキシベンズアルデヒド、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド、ｏ−ニトロベンズアルデヒド、ｐ−ニトロベンズアルデヒド、５−ニトロサリチルアルデヒド、３，５−ジクロロサリチルアルデヒド、アニスアルデヒド、ｏ−バニリン、バニリン、フルフラール、ピリドキサール、５−リン酸ピリドキサール等を用いることができる。芳香族アルデヒドとしては、特に、ピリドキサール、５−ニトロサリチルアルデヒド、３，５−ジクロロサリチルアルデヒドが好ましい。
【００８０】
アルデヒドは、系に存在するモナティンに対して０．０１〜１モル当量、より好ましくは０．０５〜０．５モル当量の範囲で使用することができる。
【００８１】
エピ化晶析は、アルデヒドの存在下に行われ、溶媒としては水と有機溶媒との混合溶媒が使用される。有機溶媒としては、水と混和する有機溶媒が使用されるが、特にメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等のアルコールが好ましい、有機溶媒は異なる２種以上のものを混合して用いてもよい。有機溶媒と水の比率は、好ましくは体積比で有機溶媒：水＝１：０．０１〜１：１、更に好ましくは１：０．１〜１：０．５の範囲で設定される。
【００８２】
エピ化晶析の温度は、好ましくは０〜１００℃、更に好ましくは４０〜８０℃の範囲で設定される。エピ化晶析を行う時間は、好ましくは１０時間から１週間、更に好ましくは１５時間から９６時間の範囲で設定される。
【００８３】
ｐＨは、４〜１３、好ましくは４．５〜１０、更に好ましくは５〜９の範囲で設定される。ｐＨの調整は酸およびアルカリを用いて行うことができる。用いられる酸は特に限定されず、酢酸などの有機酸、または塩酸、硫酸などの無機酸を使用することができる。アルカリも特に限定されず、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、アンモニア、アミン等の有機塩基を使用することができる。
【００８４】
上記方法で得られる各化合物は、公知の分離精製手段、例えば、濃縮、減圧濃縮、溶媒抽出、晶出、再結晶、転溶、活性炭処理、イオン交換樹脂又は合成吸着樹脂等を用いたクロマトグラフィーなどの処理を必要に応じて組み合せることにより単離精製することができる。本発明の方法において用いられる化合物および本発明の方法により製造される化合物（目的化合物）の塩は、それ自体公知の手段に従い、例えば、目的化合物に無機酸または有機酸を加えることによって製造することができる。また、目的化合物またはその塩は、水和物であってもよく、水和物および非水和物のいずれも本発明の範囲に包含されるものである。本発明の製造方法に用いられる化合物（例、Ｔｒｐ、ＩＰＡ、４Ｒ−ＩＨＯＧ、２Ｓ，４Ｒ−モナティン）は、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等の各種塩の形態であってもよい。また、本発明の製造方法により得られる化合物（例、ＩＰＡ、４Ｒ−ＩＨＯＧ、２Ｓ，４Ｒ−モナティン、２Ｒ，４Ｒ−モナティン）もまた、各種塩の形態であってもよい。
【００８５】
以下の実施例により、本発明を詳細に説明するが、これらの実施例により本発明が限定されるものではない。
【実施例】
【００８６】
（ＨＰＬＣ分析条件）
実施例１〜７では、ＨＰＬＣ分析を実施した場合、当該実施例に示す条件にてＨＰＬＣ分析を実施した。
一方、実施例８〜１５では、以下に示す条件にてＨＰＬＣ分析を実施した。
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：２１０ｎｍ）
カラム温度：４０℃
カラム    ：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  Ｃ１８  Ｔｙｐｅ  ＭＧＩＩ，内径３ｍｍ，
長さ２５ｃｍ，粒径５μｍ、資生堂（株）
移動相    ：Ａ液  ２０ｍＭ燐酸二水素カリウム水溶液：アセトニトリル＝９５：５
Ｂ液  ２０ｍＭ燐酸二水素カリウム水溶液：アセトニトリル＝６０：４０
グラジエントプログラム：以下の表１を参照【００８７】
【表１】
2012050125.tif 000007
【００８８】
流量      ：毎分０．４５ｍＬ
注入量    ：２０μＬ
分析時間  ：６０分【００８９】
実施例１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ  ＡＪ１６１６菌体抽出液を用いた４Ｒ−ＩＨＯＧからの２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成
ＣＭ２Ｇ寒天培地（酵母エキス  １０ｇ／ｌ、ポリペプトン  １０ｇ／ｌ、グルコース  ５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム  ５ｇ／ｌ、寒天  １５ｇ／ｌ、ｐＨ７．０）にＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ  ＡＪ１６１６を塗布し、３０℃で２日間培養した。
得られた菌体を酵素生産培地（酵母エキス  １０ｇ／ｌ、ポリペプトン  １０ｇ／ｌ、グルコース  １ｇ／ｌ、リン酸水素二カリウム  ３ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム  １ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム七水和物  ０．１ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム  ５ｇ／ｌ）３ｍｌに一白金耳接種し、試験管で３０℃にて１６時間振とう培養した。培養液２ｍｌより菌体を遠心分離により集め、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭにて洗浄、懸濁し、菌体懸濁液を１ｍｌ調製した。
この菌体懸濁液１ｍｌにガラスビーズ（０．１ｍｍ）を１ｇ添加し、マルチビーズショッカー（安井器械）を用いて菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離し、上清を菌体抽出液とした。
２Ｓ，４Ｒ−モナティン合成反応液（４Ｒ−ＩＨＯＧ  ９．５ｍＭ、４Ｓ−ＩＨＯＧ  ０．５ｍＭ、Ｌ−Ａｓｐ  １００ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １００ｍＭ、ｐＨ８．０）０．１ｍｌに、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ  ＡＪ１６１６菌体抽出液が０．０５ｍｌ含まれるよう調製し、３０℃で２０時間反応させた。反応終了後、生成した２Ｓ，４Ｒ−モナティンを定量したところ、０．２１ｍＭであった。【００９０】
２Ｓ，４Ｒ−モナティンの定量は、ＵＰＬＣ（ウォーターズ）を用いて行った。分析条件は以下に示す通りである。
移動相：２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／アセトニトリル  ＝  １００／５
流速：０．１５ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ  ２１０ｎｍ
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８、２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ（ウォーターズ）【００９１】
実施例２：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ  ＡＪ１６１６由来アミノトランスフェラーゼの精製
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ  ＡＪ１６１６の可溶性画分から、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成するアミノトランスフェラーゼの精製を以下の通り行った。実施例１と同様にして、２Ｓ，４Ｒ−モナティン合成反応および２Ｓ，４Ｒ−モナティンの定量を行った。【００９２】
（１）可溶性画分の調製
ＣＭ２Ｇ寒天培地（酵母エキス  １０ｇ／ｌ、ポリペプトン  １０ｇ／ｌ、グルコース  ５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム  ５ｇ／ｌ、寒天  １５ｇ／ｌ、ｐＨ７．０）にＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ  ＡＪ１６１６を塗布し、３０℃で２日間培養した。
得られた菌体をＴＢ（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ）培地１６０ｍｌに一白金耳接種し、５００ｍｌ容坂口フラスコで３０℃にて１６時間振とう培養した。得られた培養液約２０００ｍｌより菌体を遠心分離により集め、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭにて洗浄、懸濁し、４℃で３０分間超音波破砕した。遠心分離により破砕液から菌体残渣を除き、得られた上清を可溶性画分とした。【００９３】
（２）陰イオン交換クロマトグラフィー
上記の可溶性画分を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＨｉＬｏａｄ  ２６／１０  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＣＶ＝５３ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭで用いて洗い流した後、ＮａＣｌ濃度を１００ｍＭから５００ｍＭまで直線的に変化させて、８ｍｌ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。各溶出画分について２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性を検出したところ、約２００ｍＭ  ＮａＣｌ相当の画分に２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が認められた。【００９４】
（３）疎水性クロマトグラフィー
２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が検出された画分を集めて、硫酸アンモニウム  １．４Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ（ｐＨ７．６）となるよう、硫酸アンモニウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を添加した。この溶液を硫酸アンモニウム  １．４Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ（ｐＨ７．６）で平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラムＨｉＬｏａｄ  １６／１０  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、ＣＶ＝２０ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかった非吸着タンパク質を硫酸アンモニウム１．４Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭを用いて洗い流した後、硫酸アンモニウム濃度を１．４Ｍから０Ｍまで直線的に変化させて、３ｍｌ／ｍｉｎの流速で２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成酵素を溶出させた。得られた各溶出画分について２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性を測定したところ、約１．０Ｍ硫酸アンモニウム相当の画分に２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が認められた。【００９５】
（４）ゲル濾過クロマトグラフィー
２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が検出された画分を集めて、アミコン  ウルトラ−１５  ３０ｋ（ミリポア）を用いて濃縮した。得られた濃縮液を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭで希釈した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭで平衡化されたゲルろ過カラムＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｇ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＣＶ＝１２０ｍｌ）に供し、１ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出した。この操作により分子量約１２０ｋＤａと見積もられる位置で２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が確認された。【００９６】
（５）陰イオン交換クロマトグラフィー
２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が検出された画分を集めて、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＭｏｎｏ  Ｑ  ５／５（ファルマシア（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）製、ＣＶ＝１ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭで用いて洗い流した後、ＮａＣｌ濃度を１００ｍＭから５００ｍＭまで直線的に変化させて、０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。得られた各溶出画分について２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性を検出したところ、約２００ｍＭ  ＮａＣｌ相当の画分に２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が認められた。【００９７】
（６）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、活性画分には４５ｋＤａ付近にバンドが１本認められた。このバンドを、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成するアミノトランスフェラーゼの候補としてＮ末端アミノ酸配列解析に供した。また、内部アミノ酸配列解析に供した。【００９８】
実施例３：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ  ＡＪ１６１６由来アミノトランスフェラーゼのＮ末端および内部アミノ酸配列決定
実施例２で得られた精製酵素溶液をＮ末端アミノ酸配列解析に供したところ、ＳＧＦＴＡＬＳＥＡＥＬＮＤＬＹ（配列番号４）のＮ末端アミノ酸配列が得られた。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中の試料をトリプシン処理し（ｐＨ８．０、３５℃、２０時間）、逆相ＨＰＬＣに供して断片ペプチドを分離した。分取した画分についてアミノ酸配列解析を行ったところ、ＱＬＤＬＳＭＧＭＬＤＶＶ（配列番号５）の内部アミノ酸配列が得られた。Ｎ末端アミノ酸配列、内部アミノ酸配列ともに、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ＳＡＦＲ−０３２由来アミノトランスフェラーゼ（ＹＰ＿００１４８７３４３）と高い相同性を示した。【００９９】
実施例４：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ  ＡＪ１６１６由来アミノトランスフェラーゼ遺伝子のクローニング
実施例１と同様の方法でＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ  ＡＪ１６１６を培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、ゲノムＤＮＡを抽出した。
得られたゲノムＤＮＡを鋳型にして、アミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。プライマーは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ＳＡＦＲ−０３２のゲノムＤＮＡ配列（ＣＰ０００８１３）を参考にして、アミノトランスフェラーゼ遺伝子の上流３００ｂｐと、下流２００ｂｐのＤＮＡ配列から設計した、プライマーＢｐ−ｕ３００−ｆ（５’−ｃｔｃａｇｇａａｇｃａｇｇｃｇｃａａａａａｇａｔｔａａｔｔｔ−３’：配列番号６）およびプライマーＢｐ−ｄ２００−ｒ（５’−ｇｇａｔｇｃｔｇｔｃｔｔｔｇｔｃａｔｃｃｃａａａｇｔｇｇａｔ−３’：配列番号７）を用いた。ＰＣＲは、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（東洋紡）を用いて以下の条件で行った。【０１００】
１  ｃｙｃｌｅ        ９４℃、２ｍｉｎ
２５  ｃｙｃｌｅｓ    ９８℃、１０ｓｅｃ
５５℃、１０ｓｅｃ
６８℃、６０ｓｅｃ
１  ｃｙｃｌｅ        ６８℃、６０ｓｅｃ
４℃【０１０１】
増幅した約１８００ｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ＳＡＦＲ−０３２アミノトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＣ＿００９８４８）と相同性の高い、１３０８ｂｐのＯＲＦを含む塩基配列が明らかとなった。相同性はＤＮＡ配列で８９％、アミノ酸配列で９３％であった。
実施例３で得られたＮ末端アミノ酸配列、内部アミノ酸配列とも一致したため、２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性を有するアミノトランスフェラーゼの遺伝子を取得できたと考えられた。【０１０２】
実施例５：Ｅ．ｃｏｌｉでのＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ  ＡＪ１６１６由来アミノトランスフェラーゼ発現
（１）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ  ＡＪ１６１６由来アミノトランスフェラーゼ発現プラスミドの構築
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ  ＡＪ１６１６のゲノムＤＮＡを鋳型にして、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ  ＡＪ１６１６由来アミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。プライマーは、プライマー１６１６ＡＴ−Ｎｄｅ−ｆ（５’−ｇｇａａｔｔｃｃａｔＡＴＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＡＣＡＧＣＧＴＴ−３’：配列番号８）およびプライマー１６１６−ｘｈｏ−ｒ（５’−ｇｔｃａａｇｇａｇｔｔｔｔｔｃｔｃｇａｇＴＡＣＣＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＴＧＡＣ−３’：配列番号９）を用いた。アミノトランスフェラーゼ遺伝子内のＮｄｅＩ配列は、プライマー１６１６−ｄｅｌＮｄｅ−ｆ（５’−ＧＧＡＴＴＧＡＡＧＧＡＡＣＡｃＡＴＧＡＡＡＡＡＧＣＡＴＧＣ−３’：配列番号１０）およびプライマー１６１６−ｄｅｌＮｄｅ−ｒ（５’−ＧＣＡＴＧＣＴＴＴＴＴＣＡＴｇＴＧＴＴＣＣＴＴＣＡＡＴＣＣ−３’：配列番号１１）を用いて変換した。ＰＣＲは、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（東洋紡）を用いて以下の条件で行った。【０１０３】
１  ｃｙｃｌｅ        ９４℃、２ｍｉｎ
２５  ｃｙｃｌｅｓ    ９８℃、１０ｓｅｃ
５５℃、１０ｓｅｃ
６８℃、６０ｓｅｃ
１  ｃｙｃｌｅ        ６８℃、６０ｓｅｃ
４℃【０１０４】
得られた約１３００ｂｐのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ、ＸｈｏＩで制限酵素処理し、同様にＮｄｅＩ、ＸｈｏＩで処理したｐＥＴ−２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを抽出し、このプラスミドをｐＥＴ−２２−１６１６ＡＴ−Ｈｉｓと命名した。このプラスミドでは、Ｃ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付与されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ  ＡＪ１６１６由来アミノトランスフェラーゼ（１６１６ＡＴ−Ｈｉｓ）が発現する。【０１０５】
（２）Ｅ．ｃｏｌｉ発現株からの１６１６ＡＴ−Ｈｉｓ精製
構築した発現プラスミドｐＥＴ−２２−１６１６ＡＴ−ＨｉｓをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、形質転換体をアンピシリン１００ｍｇ／ｌを含むＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＴＢ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ）  １６０ｍｌに１白金耳接種し、５００ｍｌ容坂口フラスコを用いて３７℃で１６時間振盪させた。培養終了後、得られた培養液約１０００ｍｌより菌体を遠心分離により集め、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、Ｉｍｉｄｏｚｏｌｅ  ２０ｍＭにて洗浄、懸濁し、４℃で３０分間超音波破砕した。遠心分離により破砕液から菌体残渣を除き、得られた上清を可溶性画分とした。
得られた可溶性画分を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、Ｉｍｉｄｏｚｏｌｅ  ２０ｍＭで平衡化したＨｉｓ−ｔａｇタンパク質精製カラムＨｉｓＰｒｅｐ  ＦＦ  １６／１０（ファルマシア（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）製、ＣＶ＝２０ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、Ｉｍｉｄｏｚｏｌｅ  ２０ｍＭで用いて洗い流した後、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ濃度を２０ｍＭから２５０ｍＭまで直線的に変化させて、３ｍｌ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。
得られた画分を集めて、アミコン  ウルトラ−１５  ３０ｋ（ミリポア）を用いて濃縮した。濃縮液を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭで希釈し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＨｉＬｏａｄ  １６／１０  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＣＶ＝２０ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭで用いて洗い流した後、ＮａＣｌ濃度を１００ｍＭから５００ｍＭまで直線的に変化させて、３ｍｌ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。
各溶出画分について２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性を確認し、２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が認められた画分を集めて、アミコン  ウルトラ−１５  ３０ｋ（ミリポア）を用いて濃縮した。濃縮液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで希釈し、１６１６ＡＴ−Ｈｉｓ溶液とした。【０１０６】
実施例６：１６１６−ＡＴ−Ｈｉｓを用いた２Ｓ，４Ｒ−モナティン合成反応
２Ｓ，４Ｒ−モナティンの定量は、ＨＰＬＣ分析により行った。分析条件は以下に示す通りである。
移動相：２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／アセトニトリル＝１００／５
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ  ２８０ｎｍ
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＭＧＩＩ、４．６×１５０ｍｍ、３μｍ（資生堂）【０１０７】
（１）４Ｒ−ＩＨＯＧからの２Ｓ，４Ｒ−モナティン合成
反応液（４Ｒ−ＩＨＯＧ  ９．５ｍＭ、４Ｓ−ＩＨＯＧ  ０．５ｍＭ、Ｌ−Ａｓｐ  ８０ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １００ｍＭ、ｐＨ８．０）  ０．１ｍｌに、１６１６ＡＴ−Ｈｉｓが０．５ｍｇ含まれるよう調製した１６１６ＡＴ−Ｈｉｓ溶液（実施例５）を加え、２５℃で１２時間反応させた。反応終了後、生成した２Ｓ，４Ｒ−モナティンを定量したところ、８．６ｍＭであった。【０１０８】
（２）インドールピルビン酸（ＩＰＡ）、ピルビン酸（ＰＡ）からの２Ｓ，４Ｒ−モナティン合成
反応液（ＩＰＡ  ５０ｍＭ、ＰＡ  １００ｍＭ、Ｌ−Ａｓｐ  １００ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １００ｍＭ、リン酸カリウム緩衝液  １００ｍＭ、ｐＨ８．０）  ０．１ｍｌに、１６１６ＡＴ−Ｈｉｓが０．５ｍｇ（実施例５の１６１６ＡＴ−Ｈｉｓ溶液を使用）、ＳｐＡｌｄ（アルドラーゼ活性を有する溶液。調製法は、下記にて詳述する。特開２００６−２０４２８５号公報もまた参照）が０．０１ｍｇ、Ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ  Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（シグマ、Ｏ４８７８）が１Ｕ含まれるよう調製し、２５℃で２時間反応させた。反応終了後、生成した２Ｓ，４Ｒ−モナティンを定量したところ、５．０ｍＭであった。【０１０９】
（３）Ｌ−Ｔｒｐからの２Ｓ，４Ｒ−モナティン合成
反応液（Ｌ−Ｔｒｐ  ５０ｍＭ、ＰＡ  １００ｍＭ、Ｌ−Ａｓｐ  ４００ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １００ｍＭ、リン酸カリウム緩衝液  １００ｍＭ、ｐＨ６．５）  １．０ｍｌに、１６１６ＡＴ−Ｈｉｓが５ｍｇ（実施例５の１６１６ＡＴ−Ｈｉｓ溶液を使用）、ＳｐＡｌｄが０．２ｍｇ、ｐＴＢ２株（脱アミノ化酵素を発現し得る菌株。調製法は、下記にて詳述する。ＷＯ２００９／０２８３３８もまた参照）の坂口フラスコ培養液（ＴＢ培地）が０．４ｍｌ、Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ（シグマ、Ｓ８１６０）が２００Ｕ、Ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ  Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（シグマ、Ｏ４８７８）が１０Ｕ含まれるよう調製し、２５℃で１２時間反応させた。反応は試験管を用いて、１４０ｒｐｍで振とうさせ行った。反応終了後、生成した２Ｓ，４Ｒ−モナティンを定量したところ、２２ｍＭであった（４４％の収率）。【０１１０】
ＳｐＡｌｄは以下の方法で調製した。
特開２００６−２０４２８５号公報、実施例５に記載のプラスミドＤＮＡ、ｐｔｒｐＳｐＡＬＤを鋳型にして、ＳｐＡｌｄ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。プライマーは、プライマーＳｐＡｌｄ−ｆ−ＮｄｅＩ（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＧＣＧＣＣＴＣＡＡ−３’：配列番号１２）およびプライマーＳｐＡｌｄ−ｒ−ＨｉｎｄＩＩＩ（５’−ＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＴＡＣＣＣＣＧＣＣＡＧＴＴＣＧＣ−３’：配列番号１３）を用いた。アルドラーゼ遺伝子内のＥ．ｃｏｌｉレアコドン（６Ｌ−ｃｔｃ、１３Ｌ−ｃｔｃ、１８Ｐ−ｃｃｃ、３８Ｐ−ｃｃｃ、５０Ｐ−ｃｃｃ、７７Ｐ−ｃｃｃ、８１Ｐ−ｃｃｃ、８４Ｒ−ｃｇａ）は、それぞれ６Ｌ−ｃｔｇ、１３Ｌ−ｃｔｇ、１８Ｐ−ｃｃｇ、３８Ｐ−ｃｃｇ、５０Ｐ−ｃｃｇ、７７Ｐ−ｃｃｇ、８１Ｐ−ｃｃｇ、８４Ｒ−ｃｇｃに変換した。６Ｌを変換する際には、プライマー６Ｌ−ｆ（５’−ＡＣＣＣＡＧＡＣＧＣＧＣＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣＧ−３’：配列番号１４）およびプライマー６Ｌ−ｒ（５’−ＣＧＧＡＴＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＡＧＧＣＧＣＧＴＣＴＧＧＧＴ−３’：配列番号１５）を用いた。１３Ｌを変換する際には、プライマー１３Ｌ−ｆ（５’−ＡＴＣＡＴＣＣＧＣＧＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＧＧＣＡＡＧＣＣ−３’：配列番号１６）およびプライマー１３Ｌ−ｒ（５’−ＧＧＣＴＴＧＣＣＧＧＣＴＴＣＣＡＧＡＧＣＧＣＧＧＡＴＧＡＴ−３’：配列番号１７）を用いた。１８Ｐを変換する際には、プライマー１８Ｐ−ｆ（５’−ＧＡＡＧＣＣＧＧＣＡＡＧＣＣＧＧＣＴＴＴＣＡＣＣＴＧＣＴＴ−３’：配列番号１８）およびプライマー１８Ｐ−ｒ（５’−ＡＡＧＣＡＧＧＴＧＡＡＡＧＣＣＧＧＣＴＴＧＣＣＧＧＣＴＴＣ−３’：配列番号１９）を用いた。３８Ｐを変換する際には、プライマー３８Ｐ−ｆ（５’−ＣＴＧＡＣＣＧＡＴＧＣＣＣＣＧＴＡＴＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＴ−３’：配列番号２０）およびプライマー３８Ｐ−ｒ（５’−ＡＣＣＡＣＧＣＣＧＴＣＡＴＡＣＧＧＧＧＣＡＴＣＧＧＴＣＡＧ−３’：配列番号２１）を用いた。５０Ｐを変換する際には、プライマー５０Ｐ−ｆ（５’−ＡＴＧＧＡＧＣＡＣＡＡＣＣＣＧＴＡＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧＧＣ−３’：配列番号２２）およびプライマー５０Ｐ−ｒ（５’−ＧＣＣＧＣＧＡＣＡＴＣＧＴＡＣＧＧＧＴＴＧＴＧＣＴＣＣＡＴ−３’：配列番号２３）を用いた。７７Ｐ、８１Ｐ、８４Ｒを変換する際には、プライマー７７Ｐ−８１Ｐ−８４Ｒ−ｆ（５’−ＣＧＧＴＣＧＣＧＣＣＧＴＣＧＧＴＣＡＣＣＣＣＧＡＴＣＧＣＧＣＧＣＡＴＣＣＣＧＧＣＣＡ−３’：配列番号２４）およびプライマー７７Ｐ−８１Ｐ−８４Ｒ−ｒ（５’−ＴＧＧＣＣＧＧＧＡＴＧＣＧＣＧＣＧＡＴＣＧＧＧＧＴＧＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＧＡＣＣＧ−３’：配列番号２５）を用いた。ＰＣＲは、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡）を用いて以下の条件で行った。
１  ｃｙｃｌｅ        ９４℃、２ｍｉｎ
２５  ｃｙｃｌｅｓ    ９４℃、１５ｓｅｃ
５５℃、１５ｓｅｃ
６８℃、６０ｓｅｃ
１  ｃｙｃｌｅ        ６８℃、６０ｓｅｃ
４℃【０１１１】
得られた約９００ｂｐのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理し、同様にＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで処理したｐＳＦＮ  Ｓｍ＿Ａｅｔ（国際公開第２００６／０７５４８６号、実施例１，６，１２）とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを抽出し、このプラスミドをｐＳＦＮ−ＳｐＡｌｄと命名した。【０１１２】
構築したプラスミドｐＳＦＮ−ＳｐＡｌｄを保有する菌株、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＳＦＮ−ＳｐＡｌｄをアンピシリン１００ｍｇ／ｌを含むＬＢ液体培地５０ｍｌに１白金耳接種し、５００ｍｌ容坂口フラスコを用いて３６℃で８時間振盪させた。培養終了後、得られた培養液０．０００６ｍｌをアンピシリン１００ｍｇ／ｌを含むシード液体培地（グルコース  １０ｇ、硫酸アンモニウム  ５ｇ、リン酸二水素カリウム  １．４ｇ、大豆加水分解物  窒素量として  ０．４５ｇ、硫酸マグネシウム七水和物  １ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物  ０．０２ｇ、硫酸マンガン（ＩＩ）五水和物  ０．０２ｇ、チアミン塩酸塩  １ｍｇ、ディスホームＧＤ−１１３Ｋ（日本油脂株式会社）  ０．１ｍｌ、ｐＨ６．３、水で１Ｌにする）３００ｍｌを入れた１０００ｍｌ容ジャーファーメンターに添加し、シード培養を開始した。シード培養は３３℃、通気１／１ｖｖｍ、攪拌７００ｒｐｍ、アンモニアでｐＨを６．３に制御し、グルコースが消費されるまで行った。このようにして得られた培養液１５ｍｌを、アンピシリン  １００ｍｇ／ｌを含むメイン液体培地（グルコース  １５ｇ、硫酸アンモニウム  ５ｇ、リン酸  ３．５ｇ、大豆加水分解物  窒素量として０．４５ｇ、硫酸マグネシウム七水和物  １ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物  ０．０５ｇ、硫酸マンガン（ＩＩ）五水和物  ０．０５ｇ、チアミン塩酸塩  １ｍｇ、ディスホームＧＤ−１１３Ｋ（日本油脂株式会社）  ０．１ｍｌ、ｐＨ６．３、水で０．９５Ｌにする）  ２８５ｍｌを入れた１０００ｍｌ容ジャーファーメンターに添加し、メイン培養を開始した。メイン培養は３６℃、通気１／１ｖｖｍ、アンモニアでｐＨを６．３に制御し、溶存酸素濃度が５％以上になるよう攪拌を７００ｒｐｍ以上で制御した。メイン培地に含まれるグルコースが消費された後、５００ｇ／ｌのグルコース溶液を滴下し、合計５０時間培養を行った。
得られた培養液１００ｍｌから、菌体を遠心分離により集め、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭにて洗浄、懸濁し、４℃で３０分間超音波破砕した。遠心分離により破砕液から菌体残渣を除き、得られた上清を可溶性画分とした。
上記の可溶性画分を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＨｉＬｏａｄ  ２６／１０  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＣＶ＝５３ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで用いて洗い流した後、ＮａＣｌ濃度を０ｍＭから５００ｍＭまで直線的に変化させて、８ｍｌ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。アルドラーゼ活性を有する画分を集めて、硫酸アンモニウム  １Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭとなるよう、硫酸アンモニウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を加えた。【０１１３】
得られた溶液を硫酸アンモニウム  １Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラムＨｉＬｏａｄ  １６／１０  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、ＣＶ＝２０ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかった非吸着タンパク質を硫酸アンモニウム１Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭを用いて洗い流した後、硫酸アンモニウム濃度を１Ｍから０Ｍまで直線的に変化させて、３ｍｌ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。アルドラーゼ活性を有する画分を集めて、アミコン  ウルトラ−１５  １０ｋ（ミリポア）を用いて濃縮した。得られた濃縮液を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで希釈し、ＳｐＡｌｄ溶液とした。アルドラーゼ活性は、ＰＨＯＧを基質としたアルドール分解活性を以下の条件で測定した。
反応条件：りん酸緩衝液（ｐＨ７．０）５０ｍＭ、ＰＨＯＧ  ２ｍＭ、ＮＡＤＨ  ０．２５ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  １６Ｕ／ｍｌ、２５℃、３４０ｎｍの吸光度を測定。【０１１４】
ｐＴＢ２株は以下の方法で調製した。
国際公開第２００９／０２８３３８号、実施例２に記載のｐＴＢ２株をアンピシリン１００ｍｇ／ｌを含むＴＢ液体培地５０ｍｌに１白金耳接種し、５００ｍｌ容坂口フラスコを用いて３７℃で１６時間振盪させた。得られた培養液を、ｐＴＢ２株の坂口フラスコ培養液（ＴＢ培地）とした。【０１１５】
実施例７：２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性菌による２Ｓ，４Ｒ−モナティン合成
（１）細菌による２Ｓ，４Ｒ−モナティン合成
ニュートリエントブロス（ＮＢ）寒天培地、あるいはＣＭ２Ｇ寒天培地（酵母エキス  １０ｇ／ｌ、ポリペプトン  １０ｇ／ｌ、グルコース  ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ、寒天  １５ｇ／ｌ、ｐＨ７．０）に、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＬＡＴ１、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＪ１１５６８、Ｄｉｅｔｚｉａ  ｍａｒｉｓ  ＡＪ２７８８、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ３４４７、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ１３１２７、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ  ｓｕｂｓｐ.  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ  ＮＢＲＣ３９０４、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ  ＮＢＲＣ３０６７、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ１１６３４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＮＢＲＣ１２６６８、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｇｒｉｇｎｏｎｅｎｓｅ  ＡＪ３７３５、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ１５９１、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ３８３９、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ  ＡＪ３９５８、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｏｎｏｃｌｌｏｌｉｓ  ＡＴＣＣ１３６７４、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＩＡＭ１３９０、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＪ１２４６９、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＪ２７７７、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  ＡＪ３０８４、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＪ２７８７、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ４６８３、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＴＣＣ４４５２、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＪ２５５７、Ｃａｒｎｉｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ３２３０、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＮＢＲＣ１２６６７、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ  ＮＢＲＣ３４５８、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＮＢＲＣ１２６６４、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＮＢＲＣ１２０７２、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＡＪ１５９４、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＴＣＣ６４６６、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｎｘａｎｔｈａ  ＮＢＲＣ３９１２、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＴＣＣ４７２０、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＬＭＧ２８３３を塗布し、３０℃で２日間培養した。【０１１６】
得られた菌体を酵素生産培地（酵母エキス  １０ｇ／ｌ、ポリペプトン  １０ｇ／ｌ、グルコース  １ｇ／ｌ、リン酸水素二カリウム  ３ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム  １ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム七水和物  ０．１ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム  ５ｇ／ｌ）  ３ｍｌに一白金耳接種し、試験管で３０℃にて１６時間振とう培養した。培養液２ｍｌより菌体を遠心分離により集め、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭにて洗浄、懸濁し、菌体懸濁液を１ｍｌ調製した。
この菌体懸濁液１ｍｌにガラスビーズ（０．１ｍｍ）を１ｇ添加し、マルチビーズショッカー（安井器械）を用いて菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離し、上清を菌体抽出液とした。
実施例１と同様にして、２Ｓ，４Ｒ−モナティン合成反応および２Ｓ，４Ｒ−モナティンの定量を行ったところ、２Ｓ，４Ｒ−モナティンの生成量は以下の通りであった（表２）。【０１１７】
【表２】
2012050125.tif 000008
【０１１８】
（２）放線菌による２Ｓ，４Ｒ−モナティン合成
ＹＭＰＧ寒天培地（酵母エキス  ３ｇ／ｌ、麦芽エキス  ３ｇ／ｌ、ポリペプトン  ５ｇ／ｌ、グルコース  １０ｇ／ｌ、寒天  １５ｇ／ｌ、ｐＨ７．０）にＮｏｃａｒｄｉａ  ｇｌｏｂｅｒｕｌａ  ＡＴＣＣ２１０２２を塗布し、３０℃で２日間培養した。
得られた菌体をＹＭＰＧ培地（酵母エキス  ３ｇ／ｌ、麦芽エキス  ３ｇ／ｌ、ポリペプトン  ５ｇ／ｌ、グルコース  １０ｇ／ｌ、ｐＨ７．０）  ３ｍｌに一白金耳接種し、試験管で３０℃にて１６時間振とう培養した。培養液２ｍｌより菌体を遠心分離により集め、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭにて洗浄、懸濁し、菌体懸濁液を１ｍｌ調製した。
この菌体懸濁液１ｍｌにガラスビーズ（０．１ｍｍ）を１ｇ添加し、マルチビーズショッカー（安井器械）を用いて菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離し、上清を菌体抽出液とした。
実施例１と同様にして、２Ｓ，４Ｒ−モナティン合成反応および２Ｓ，４Ｒ−モナティンの定量を行ったところ、２Ｓ，４Ｒ−モナティンの生成量は以下の通りであった（表３）。【０１１９】
【表３】
2012050125.tif 000009
【０１２０】
（３）酵母による２Ｓ，４Ｒ−モナティン合成
ＹＰＤ寒天培地（酵母エキス  １０ｇ／ｌ、ポリペプトン  ２０ｇ／ｌ、グルコース  ２０ｇ／ｌ、寒天  １５ｇ／ｌ）にＬｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ  ＣＢＳ２６０５、Ｃａｎｄｉｄａ  ｎｏｒｖｅｇｅｎｓｉｓ  ＮＢＲＣ０９７０、Ｃａｎｄｉｄａ  ｉｎｃｏｎｓｐｉｃｕａ  ＮＢＲＣ０６２１、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｙｐｏｌｙｔｉｃａ  ＮＢＲＣ０７４６を塗布し、３０℃で２日間培養した。
得られた菌体をＹＰＤ培地（酵母エキス  １０ｇ／ｌ、ポリペプトン  ２０ｇ／ｌ、グルコース  ２０ｇ／ｌ）  ３ｍｌに一白金耳接種し、試験管で３０℃にて１６時間振とう培養した。培養液２ｍｌより菌体を遠心分離により集め、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭにて洗浄、懸濁し、菌体懸濁液を１ｍｌ調製した。
この菌体懸濁液１ｍｌにガラスビーズ（０．５ｍｍ）を１ｇ添加し、マルチビーズショッカー（安井器械）を用いて菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離し、上清を菌体抽出液とした。
実施例１と同様にして、２Ｓ，４Ｒ−モナティン合成反応および２Ｓ，４Ｒ−モナティンの定量を行ったところ、２Ｓ，４Ｒ−モナティンの生成量は以下の通りであった（表４）。【０１２１】
【表４】
2012050125.tif 000010
【０１２２】
実施例８：２Ｓ，４Ｒ−モナティンカリウム塩二水和物の製造
還元反応濃縮液１０１．４０ｇ（モナティン３６．６２ｇ、１２５．２８ミリモル含有、（２Ｓ，４Ｒ）：（２Ｒ，４Ｒ）＝３２：６８）にエタノール１４９．００ｇを加えた後、種晶として２Ｒ，４Ｒ−モナティンカリウム塩一水和物０．２５ｇを添加し、５６℃、４時間攪拌し、２Ｒ，４Ｒ−モナティンカリウム塩一水和物の優先晶析を行った。析出した結晶をろ過により分離し（湿結晶３１．２７ｇ）、母液２２５．８０ｇを得た（モナティン２２．４１ｇ、７６．６８ミリモル含有、（２Ｓ，４Ｒ）：（２Ｒ，４Ｒ）＝５３：４７）。この母液を１０℃に冷却した後、５時間攪拌し、２Ｓ，４Ｒ−モナティンカリウム塩二水和物の晶析を行った。析出した結晶をろ過により分離し（湿結晶３２．７４ｇ）、減圧乾燥後、目的とする２Ｓ，４Ｒ−モナティンカリウム塩二水和物９．８８ｇ（１５．６８ミリモル）を得た（ＨＰＬＣ純度：５５．５％）。この粗結晶９．３５ｇを水２５．３７ｇに溶解し、その溶解液にエタノール５８．９９ｇを加え２５℃にて５時間攪拌し、２Ｓ，４Ｒ−モナティンカリウム塩二水和物の精晶析を行った。析出した結晶をろ過により分離し（湿結晶４．４９ｇ）、減圧乾燥後、目的とする２Ｓ，４Ｒ−モナティンカリウム塩二水和物３．７５ｇ（９．６２ミリモル）を得た（ＨＰＬＣ純度：９６．０％）。【０１２３】
なお、得られた結晶（２Ｓ，４Ｒ−モナティンカリウム塩二水和物）の含水量およびカリウム含量は、水分測定法、イオンクロマトグラフィーによるカチオン分析法により解析した。実施した水分測定法、カチオン分析法の詳細を以下に示す。【０１２４】
（水分測定法）
測定装置：平沼水分自動測定装置  ＡＱＶ−２０００  （平沼産業（株）製）
測定条件：滴定液＝Ｈｙｄｒａｎａｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ５Ｋ（Ｒｉｅｄｅｌ  ｄｅ  Ｈａｅｎ社製）【０１２５】
（カチオン分析法）
装置：東ソーＩＣ２００１
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＩＣ−Ｃａｔｉｏｎ（４．６×１５０ｍｍ）
ガードカラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＩＣ−Ｃａｔｉｏｎ（１ｃｍ）
サプレスゲル：ＴＳＫｇｅｌ  ＴＳＫｓｕｐｐｒｅｓｓＩＣ−Ｃ
カラム温度：４０℃
溶離液流量：０．７ｍｌ／ｍｉｎ．
サンプル注入量：３０μｌ
検出：電気伝導度
溶離液組成：２．２ｍＭメタンスルホン酸＋１．０ｍＭ１８−クラウン−６ーエーテル＋０．５ｍＭヒスチジン混合水溶液【０１２６】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ：２．１１（ｄｄ，Ｊ＝１９．０，２７．０Ｈｚ，１Ｈ），２．３９（ｄｄ，Ｊ＝５．０，２７．０Ｈｚ，１Ｈ），３．１４（ｓ，２Ｈ），３．９０（ｄｄ，Ｊ＝５．０，１９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．０６（ｍ，１Ｈ），７．１３（ｍ，１Ｈ），７．１５（ｓ、１Ｈ），７．４０（ｄ，８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６（ｄ，８．５Ｈｚ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ計算値  Ｃ１４Ｈ１６Ｎ２Ｏ５＝２９２．１１
ＥＳＩ−ＭＳ分析値  Ｃ１４Ｈ１６Ｎ２Ｏ５＝２９０．９［Ｍ−Ｈ］−【０１２７】
実施例９：５−ニトロサリチルアルデヒドを用いた異性化反応
２Ｓ，４Ｒ−モナティンカリウム塩二水和物０．１５ｇ（０．３８ミリモル）を７０％エタノール水溶液１０．０ｇに添加し、６０℃にて完全に溶解させた。その溶解液に５‐ニトロサリチルアルデヒド７．６ｍｇ（０．０４５ミリモル）、酢酸７．５μＬ（０．１３ミリモル）を添加し６０℃にて４８時間攪拌した。反応液をＨＰＬＣにて分析し、定量を行ったところ、反応液中の２Ｓ，４Ｒ−モナティンと２Ｒ，４Ｒ−モナティンのモル比は、１：２．１であった。【０１２８】
実施例１０：ピリドキサール塩酸塩を用いた異性化反応
２Ｓ，４Ｒ−モナティンカリウム塩二水和物０．１５ｇ（０．３８ミリモル）を７０％エタノール水溶液１０．０ｇに添加し、６０℃にて完全に溶解させた。その溶解液にピリドキサール塩酸塩９．１ｍｇ（０．０４５ミリモル）、酢酸７．５μＬ（０．１３ミリモル）を添加し６０℃にて４８時間攪拌した。反応液をＨＰＬＣにて分析し、定量を行ったところ、反応液中の２Ｓ，４Ｒ−モナティンと２Ｒ，４Ｒ−モナティンのモル比は、１：１．３であった。【０１２９】
実施例１１：５−リン酸ピリドキサール一水和物を用いた異性化反応
２Ｓ，４Ｒ−モナティンカリウム塩二水和物０．１５ｇ（０．３８ミリモル）を７０％エタノール水溶液１０．０ｇに添加し、６０℃にて完全に溶解させた。その溶解液に５‐リン酸ピリドキサール一水和物１２．８ｍｇ（０．０４８ミリモル）、酢酸７．５μＬ（０．１３ミリモル）を添加し６０℃にて４８時間攪拌した。反応液をＨＰＬＣにて分析し、定量を行ったところ、応液中の２Ｓ，４Ｒ−モナティンと２Ｒ，４Ｒ−モナティンのモル比は、１：１．１であった。【０１３０】
実施例１２：サリチルアルデヒドを用いた異性化反応
２Ｓ，４Ｒ−モナティンカリウム塩二水和物０．１５ｇ（０．３８ミリモル）を７０％エタノール水溶液１０．０ｇに添加し、６０℃にて完全に溶解させた。その溶解液にサリチルアルデヒド５．３ｍｇ（４．６μＬ，０．０４３ミリモル）、酢酸７．５μＬ（０．１３ミリモル）を添加し６０℃にて４８時間攪拌した。反応液をＨＰＬＣにて分析し、定量を行ったところ、反応液中の２Ｓ，４Ｒ−モナティンと２Ｒ，４Ｒ−モナティンのモル比は、１：０．６であった。【０１３１】
実施例１３：３，５−ジクロロサリチルアルデヒドを用いた異性化反応
２Ｓ，４Ｒ−モナティンカリウム塩二水和物０．１５ｇ（０．３８ミリモル）を７０％エタノール水溶液１０．０ｇに添加し、６０℃にて完全に溶解させた。その溶解液に３，５−ジクロロサリチルアルデヒド８．１ｍｇ（０．０４２ミリモル）、酢酸７．５μＬ（０．１３ミリモル）を添加し６０℃にて４８時間攪拌した。反応液をＨＰＬＣにて分析し、定量を行ったところ、反応液中の２Ｓ，４Ｒ−モナティンと２Ｒ，４Ｒ−モナティンのモル比は、１：１．５であった。【０１３２】
実施例１４：２Ｓ，４Ｒ−モナティンカリウム塩二水和物を出発原料とした異性化晶析による２Ｒ，４Ｒ−モナティンカリウム塩一水和物の製造
２Ｓ，４Ｒ−モナティンカリウム塩二水和物を２０％エタノール水溶液に添加し、６０℃にて完全に溶解させる。この溶解液に５−ニトロサリチルアルデヒドを２Ｓ，４Ｒ−モナティンに対して５モル％、酢酸を２Ｓ，４Ｒ−モナティンに対して３０モル％添加し、４８時間攪拌する。この反応液（２Ｓ，４Ｒ−モナティン：２Ｒ，４Ｒ−モナティン＝１：２．１）にエタノール濃度が７０％となるようエタノールを添加した後、種晶として２Ｒ，４Ｒ−モナティンカリウム塩一水和物を反応液中の２Ｒ，４Ｒ−モナティンに対して１％添加し、６０℃、４８時間攪拌し、異性化晶析を行う。析出した結晶をろ過により分離し、減圧乾燥後、目的とする２Ｒ，４Ｒ−モナティンカリウム塩一水和物を得る。【０１３３】
実施例１５：グリオキシル酸を用いた異性化反応
２Ｓ，４Ｒ−モナティンカリウム塩二水和物０．１５ｇ（０．３８ミリモル）を７０％エタノール水溶液１０．０ｇに添加し、６０℃にて完全に溶解させた。その溶解液にグリオキシル酸５．１ｍｇ（０．０６９ミリモル）、酢酸７．５μＬ（０．１３ミリモル）を添加し６０℃にて４８時間攪拌した。反応液をＨＰＬＣにて分析し、定量を行ったところ、反応液中の２Ｓ，４Ｒ−モナティンと２Ｒ，４Ｒ−モナティンのモル比は、１：０．０７であった。【０１３４】
実施例１６：ＡＪ１６１６株由来Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＬＡＴ）の変異体の作製と各種ケト酸に対する比活性測定
（１）部位特異的変異による変異型ＬＡＴ発現プラスミドの作製
部位特異的変異による変異型ＡＪ１６１６株由来ＬＡＴ発現プラスミドの作製は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔのプロトコルに準拠して行った。目的とするヌクレオチド残基の変異（置換）を導入し、かつ２本鎖ＤＮＡの各々の鎖に相補的になるように設計した１セットのＤＮＡプライマーを合成した。作製した変異体と作製に用いたプライマーのヌクレオチド配列をそれぞれ表５、６に示す。ｐＥＴ２２−ＡＪ１６１６ＬＡＴ−Ｈｉｓ（Ｃ）を鋳型とし、以下のＰＣＲ条件で変異型プラスミドを作製した。
１  ｃｙｃｌｅ        ９５℃  １  ｍｉｎ
１８  ｃｙｃｌｅｓ      ９５℃  ３０  ｓｅｃ
５５℃  １  ｍｉｎ
６８℃  ８  ｍｉｎ
ｃｙｃｌｅｓ終了後      ４℃【０１３５】
メチル化ＤＮＡを認識して切断する制限酵素ＤｐｎＩ処理（３７℃、１ｈｒ）によって鋳型ｐＥＴ２２−ＡＪ１６１６ＬＡＴ−Ｈｉｓ（Ｃ）を切断した後に、得られた反応液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換体よりプラスミドを回収してヌクレオチド配列を決定し、目的とするヌクレオチド残基の変異（置換）が導入されていることを確認した。ＩＤ１３６はＳ２５８Ｇ／Ｉ２８９Ａの２重変異体であるが、Ｓ２５８Ｇ変異体プラスミドを作製後に、Ｉ２８９Ａ変異導入用プライマーを用いて同様の操作を繰り返すことにより構築した。また、ＩＤ１８９はＫ３９Ｒ／Ｔ２８８Ｇの２重変異体であるが、ＩＤ１６６（Ｔ２８８Ｇ）変異体プラスミドを作製後に、Ｋ３９Ｒ変異導入用プライマーを用いて同様の操作を繰り返すことにより構築した。ＩＤ２９６はＱ２８７Ｅ／Ｔ２８８Ｇの２重変異体であるが、Ｔ２８８Ｇ変異体プラスミドを作製後に、Ｑ２８７Ｅ／Ｔ２８８Ｇ変異導入用プライマーを用いて同様の操作を繰り返すことにより構築した。【０１３６】
【表５】
2012050125.tif 000011
【０１３７】
【表６】
2012050125.tif 000012
【０１３８】
（２）変異型ＬＡＴの発現および精製
得られた変異型ＡＪ１６１６ＬＡＴ発現プラスミドでＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ＤＥ３）を形質転換し、変異型ＡＪ１６１６ＬＡＴ発現株を作製した。ＬＢ−ａｍｐ（１００ｍｇ／ｌ）プレート上で生育させた変異型ＡＪ１６１６ＬＡＴ発現株、ｐＥＴ２２−ＡＪ１６１６ＬＡＴｍｕｔ−Ｈｉｓ（Ｃ）／Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ＤＥ３）の菌体を、アンピシリン１００ｍｇ／ｌを含むＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＴＢ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ）１００ｍｌに植菌し、３７℃で１６時間、坂口フラスコを用いて振とう培養を行った。培養終了後、得られた培養液より菌体を遠心分離により集め、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  １０ｍＭにて洗浄、懸濁し、超音波破砕を行った。遠心分離により破砕液から菌体残渣を除き、得られた上清を可溶性画分とした。得られた可溶性画分を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  １０ｍＭで平衡化したＨｉｓ−ｔａｇタンパク質精製カラムＨｉｓ  ＴＡＬＯＮ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  ５ｍｌ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  １０ｍＭを用いて洗い流した後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  １５０ｍＭを用いて、５ｍｌ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。得られた画分を集めて、アミコン  ウルトラ−１５  ３０ｋ（ミリポア）を用いて濃縮した。濃縮液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで希釈し、変異型ＡＪ１６１６ＬＡＴ溶液とした。必要に応じて、培養液量、Ｈｉｓ  ＴＡＬＯＮカラムの連結数を増やして精製を行った。【０１３９】
（３）タンパク質の濃度の測定
タンパク質の濃度の測定は、ナカライテスク社のプロテインアッセイＣＢＢ溶液（５倍希釈して使用）を用いて行った。タンパク質の濃度は、０．０５、０．１、０．２５、０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液をスタンダートとして検量線を作成することにより、算出した。【０１４０】
（４）比色法でのＬ−Ａｓｐ／α−ＫＧ、Ｌ−Ａｓｐ／ＰＡ及びＬ−Ａｓｐ／±ＭＨＯＧ活性測定
ＡＪ１６１６ＬＡＴの各種基質に対する活性測定を実施した。アミノ基転移反応のアミノドナー基質としては１００ｍＭ  Ｌ−Ａｓｐを用い、１０ｍＭの各種ケト酸に対する比活性を比色法で測定した。
Ｌ−Ａｓｐ／α−ＫＧ（α-ケトグルタル酸）活性：Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ  １００ｍＭ、α−ＫＧ−２Ｎａ  １０ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  １００ｍＭ、ＮＡＤＨ  ０．２５ｍＭ、ＭＤＨ  ２Ｕ／ｍｌ、２５℃。３４０ｎｍの減少から活性を算出。ＭＤＨはＭａｌｉｃ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｈｅａｒｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。なお、Ｌ−Ａｓｐ／α−ＫＧ活性は、表９において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「α−ＫＧ」に示す。
Ｌ−Ａｓｐ／ＰＡ活性：Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ  １００ｍＭ、ＰＡ−Ｎａ  １０ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  １００ｍＭ、ＮＡＤＨ  ０．２５ｍＭ、ＭＤＨ（上記と同様）  ２Ｕ／ｍｌ、２５℃。３４０ｎｍの減少から活性を算出。なお、Ｌ−Ａｓｐ／ＰＡ活性は、表９において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「ＰＡ」に示す。
Ｌ−Ａｓｐ／（±）−ＭＨＯＧ（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ）活性：Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ  １００ｍＭ、（±）−ＭＨＯＧ  １０ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  １００ｍＭ、ＮＡＤＨ  ０．２５ｍＭ、ＭＤＨ  ２Ｕ／ｍｌ、ＬＤＨ  １０Ｕ／ｍｌ、２５℃。３４０ｎｍの減少から活性を算出。ＬＤＨはＤ−Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ（オリエンタル酵母）を用いた。（±）−ＭＨＯＧに微量に混在しているＰＡを除くため、ＬＤＨを添加した。なお、Ｌ−Ａｓｐ／（±）−ＭＨＯＧ活性は、表９において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「±ＭＨＯＧ」に示す。【０１４１】
（５）Ｌ−Ａｓｐ／４Ｒ−ＩＨＯＧ及びＬ−Ａｓｐ／ＩＰＡ活性測定
目的活性である４Ｒ−ＩＨＯＧからの２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性及びＩＰＡからのＬ−Ｔｒｐ副生活性をそれぞれ測定した。アミノ基転移反応のアミノドナー基質としては１００ｍＭ  Ｌ−Ａｓｐを用い、１０ｍＭの各種ケト酸に対するアミノ基転移反応を行い、生成したアミノ酸量をＵＰＬＣないしＨＰＬＣで定量し、比活性を算出した。
Ｌ−Ａｓｐ／４Ｒ−ＩＨＯＧ活性（１０ｍＭ）：Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ  １００ｍＭ、４Ｒ−ＩＨＯＧ  １０ｍＭ（微量の４Ｓ−ＩＨＯＧ含む）、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  １００ｍＭ、２５℃。ＵＰＬＣ分析を行い、生成した２Ｓ，４Ｒ−モナティン、２Ｓ，４Ｓ−モナティンを定量した。反応停止液は２００ｍＭ  クエン酸Ｎａ溶液（ｐＨ４．５）を用いた。なお、Ｌ−Ａｓｐ／４Ｒ−ＩＨＯＧ活性は、表９において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「４Ｒ−ＩＨＯＧ」に示す。
Ｌ−Ａｓｐ／ＩＰＡ活性：Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ  １００ｍＭ、ＩＰＡ  １０ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  １００ｍＭ（ｐＨは反応液作成後に１Ｎ  ＮａＯＨで８．０に調整）、２５℃。ＵＰＬＣ分析を行い、生成したＴｒｐを定量した。反応停止液は２００ｍＭ  クエン酸Ｎａ溶液（ｐＨ４．５）を用いた。なお、Ｌ−Ａｓｐ／ＩＰＡ活性は、表９において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「ＩＰＡ」に示す。
生成したモナティン及びＴｒｐの定量はＷａｔｅｒｓ社製  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステムを用いて定量した。測定条件を以下に示す。０．２ｍｌで１５分間反応を行ってから反応停止し、反応停止後の反応液を遠心し上清０．２ｍｌ程度をＵＰＬＣ分析に供した。Ｓａｍｐｌｅ−Ｂｌａｎｋが０．０１−０．０５ｍＭの範囲に入る希釈段階で測定した結果を活性値として採用した。【０１４２】
【表７】
2012050125.tif 000013
【０１４３】
２Ｓ，４Ｒ−モナティンを１．１ｍｉｎに、２Ｓ，４Ｓ−モナティンを１．５ｍｉｎに、またＴｒｐを１．３ｍｉｎにそれぞれ分別定量できる。【０１４４】
また、以下の分析条件でＨＰＬＣを用いた定量も併せて実施した。
ＨＰＬＣ条件（モナティン、Ｔｒｐ、ＩＰＡ、ＩＡＡ（インドール酢酸）、ＩＡＤ（インドールアルデヒド）定量用条件）
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＴＹＰＥ  ＭＧＩＩ  ３μｍ  ４．６ｍｍ  ｘ  １５０ｍｍ（資生堂）
カラム温度：４０℃
検出波長：２８０ｎｍ
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
移動層：Ａ：２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／ＣＨ３ＣＮ＝１００／５、Ｂ：ＣＨ３ＣＮ【０１４５】
【表８】
2012050125.tif 000014
【０１４６】
（６）ＡＪ１６１６株ＬＡＴ変異体の各種ケト酸に対する比活性測定結果
作製した変異体を用いて１００ｍＭ  Ｌ−Ａｓｐをアミノドナーとした際の１０ｍＭ  ケト酸に対する比活性測定結果を表９に示す。作製した変異体のいずれにおいても、目的とする４Ｒ−ＩＨＯＧを基質とした２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性の向上が認められた。また、目的活性に対する副反応の相対値に関しても、いずれの変異体においても目的活性（２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性）に対するＬ−Ｔｒｐ副生活性、ＭＨＧ（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ）副生活性、Ｌ−Ａｌａ副生活性の低下が認められた。【０１４７】
【表９】
2012050125.tif 000015
【０１４８】
実施例１７：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９ΔａｓｐＣ株の構築とデアミナーゼ発現ブロスの作製
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９ΔａｓｐＣは、以下の方法で構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＫＤ４６をＬＢ−ａｍｐ（１００ｍｇ／ｌ）プレート上で３０℃、一晩培養した。得られた菌体をＬＢ（Ａｍｐ  １００ｍｇ／ｌ、Ｌ−Ａｒａｂｉｎｏｓｅ  １０ｍＭを含む）５０ｍｌに接種した。これを３０℃で坂口フラスコを用いて振とう培養し、Ｏ．Ｄ．６１０が０．６程度になったところで培養温度を３７℃に変更し、さらに１時間振とう培養を行った。得られた培養液から遠心分離で集菌、１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌで洗浄し、再度遠心分離、集菌した。これを１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌで懸濁しコンピテントセルとした。
ｐＭＷ１１８−ａｔｔＬ−ｃａｔ−ａｔｔＲを鋳型にして、プライマーａｓｐＣ−Ｌ１（５’−ＴＴＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＡＣＣＧＣＣＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＡＣＣＣＧＡＴＴＣＴＧＧＧＣｔｇａａｇｃｃｔｇｃｔｔｔｔｔｔａｔ−３’：配列番号３６）とプライマーａｓｐＣ−Ｒ１（５’−ＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＡＣＡＡＴＣＧＣＴＴＣＧＣＡＣＡＧＣＧＧＡＧＣＣＡＴＧＴＴＡＴＣｃｇｃｔｃａａｇｔｔａｇｔａｔａａａ−３：配列番号３７）を用いてＰＣＲ増幅を行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースから抽出し、ａｓｐＣ遺伝子破壊用ＤＮＡ断片とした。ＰＣＲは、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（東洋紡）を用いて行った。
精製したＤＮＡ断片でコンピテントセルを形質転換し、目的の形質転換体を３７℃、ＬＢ−Ｃｍ（２０ｍｇ／ｌ）プレート上で選択した。形質転換体のａｓｐＣ遺伝子領域にａｔｔＬ−ｃａｔ−ａｔｔＲが挿入されていることをコロニーＰＣＲで確認した。用いたプライマーは、プライマーａｓｐＣ−ｕｐ（５’−ＡＡＣＣＴＣＴＴＧＧＣＡＡＣＧＧＴＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＡＡＣ−３’：配列番号３８）とプライマーａｔｔＬ−１（５’−ＴＡＧＴＧＡＣＣＴＧＴＴＣＧＴＴＧＣ−３’：配列番号３９）、プライマーａｓｐＣ−ｄｏｗｎ（５’−ＧＣＣＴＧＣＧＣＡＡＡＧＴＣＧＴＡＴＧＴＴＴＧＧＴＣＴＧＧＡ−５’：配列番号４０）とプライマーａｔｔＲ−１（５’−ＴＴＡＣＧＴＴＴＣＴＣＧＴＴＣＡＧＣ−３’：配列番号４１）である。ＰＣＲは、Ｚ−ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いた。
得られた形質転換体をＬＢ（Ｃｍ  ２０ｍｇ／ｌ）３ｍｌに接種し、３７℃で６時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離で集菌、１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌで洗浄し、再度遠心分離、集菌した。これを１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌで懸濁しコンピテントセルとした。
ゲノムＤＮＡに挿入されたＣｍ耐性遺伝子配列を除去するため、ｐＭＷ−ｉｎｔｘｉｓ−ｔｓで上記コンピテントセルを形質転換した。目的の形質転換体を３０℃、ＬＢ−ａｍｐ（１００ｍｇ／ｌ）プレート上で選択した。得られた形質転換体を４２℃、ＬＢプレート上で一晩培養し、次に菌体をＬＢ−ａｍｐ（１００ｍｇ／ｌ）プレート、ＬＢ−Ｃｍ（２０ｍｇ／ｌ）プレートにそれぞれストリークし３７℃で培養した。Ａｍｐ、Ｃｍどちらのプレートでも生育しないことを確認し、さらにプライマーａｓｐＣ−ｕｐ（５’−ＡＡＣＣＴＣＴＴＧＧＣＡＡＣＧＧＴＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＡＡＣ−３’：配列番号３８）とプライマーａｓｐＣ−ｄｏｗｎ（５’−ＧＣＣＴＧＣＧＣＡＡＡＧＴＣＧＴＡＴＧＴＴＴＧＧＴＣＴＧＧＡ−５’：配列番号４０）を用いたコロニーＰＣＲによりＣｍ耐性遺伝子の除去を確認した。ＰＣＲは、Ｚ−ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いた。
得られた株をａｓｐＣ欠損株、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９ΔａｓｐＣとした。また、デアミナーゼ発現株ｐＴＢ２／Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９ΔａｓｐＣは、デアミナーゼ発現プラスミドｐＴＢ２でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９ΔａｓｐＣを形質転換し、構築した。本菌株をＬＢ−ａｍｐ（１００ｍｇ／ｌ）プレート上で３７℃、一晩培養した。得られた菌体をＴＢ−ａｍｐ（１００ｍｇ／ｌ）１００ｍｌに植菌、坂口フラスコを用いて３７℃で１６時間振とう培養を行った。得られた培養液をＰｓ＿ａａｄ  ｂｒｏｔｈとして用いた。【０１４９】
実施例１８：オキザロ酢酸デカルボキシラーゼ発現株の構築
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０株由来ＯＡＡ  Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅの遺伝子合成をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に依頼し、ＯＡＡ  Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ遺伝子を含むＤＮＡ断片がｐＵＣ５７に挿入されたプラスミドＤＮＡを得た。コドン使用頻度はＥ．ｃｏｌｉでの発現用に至適化された（配列番号４２、４３を参照）。このプラスミドをＮｄｅＩ、ＸｈｏＩで切断し、ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩで切断したｐＥＴ２２ｂに挿入、得られたプラスミドをｐＥＴ２２−ＰｐＯＤＣ−Ｈｉｓ（Ｃ）と命名した。得られたプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、ＰｐＯＤＣ−Ｈｉｓ（Ｃ）の発現株ｐＥＴ２２−ＰｐＯＤＣ−Ｈｉｓ（Ｃ）／Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を得た。ＬＢ−ａｍｐ（１００ｍｇ／ｌ）プレート上で生育させたＰｐＯＤＣ−Ｈｉｓ（Ｃ）発現株、ｐＥＴ２２−ＰｐＯＤＣ−Ｈｉｓ（Ｃ）／Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）の菌体を、アンピシリン１００ｍｇ／ｌを含むＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＴＢ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ）１００ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、坂口フラスコを用いて振とう培養を行った。培養終了後、得られた培養液より菌体を遠心分離により集め、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  １０ｍＭにて洗浄、懸濁し、超音波破砕を行った。遠心分離により破砕液から菌体残渣を除き、得られた上清を可溶性画分とした。得られた可溶性画分を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  １０ｍＭで平衡化したＨｉｓ−ｔａｇタンパク質精製カラムＨｉｓ  ＴＡＬＯＮ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  ５ｍｌ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  １０ｍＭを用いて洗い流した後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  １５０ｍＭを用いて、５ｍｌ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。得られた画分を集めて、アミコン  ウルトラ−１５  １０ｋ（ミリポア）を用いて濃縮した。濃縮液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで希釈し、ＰｐＯＤＣ溶液とした。
ＯＤＣ活性の測定条件は以下に示す条件で行った。
ＯＡＡ  １０  ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  １００ｍＭ、ＮＡＤＨ  ０．２５ｍＭ、ＬＤＨ  １０Ｕ／ｍｌ、２５℃。３４０ｎｍの減少から活性を算出した。ＬＤＨはＤ−Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ（オリエンタル酵母）を用いた。１  ｍｌスケールで反応、分析を行い測定結果（ＳａｍｐｌｅΔ３４０  ｎｍ／ｍｉｎ）−（ＢｌａｎｋΔ３４０ｎｍ／ｍｉｎ）の値が０．０５−０．１５の範囲に入る希釈段階での活性値を採用した。酵素の希釈にはＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＢＳＡ  ０．０１％を用いた。【０１５０】
実施例１９：Ｌ−Ｔｒｐ  １００ｍＭからの２Ｓ，４Ｒ−モナティンのワンポット合成反応（ＷＴ、ＩＤ１３６、ＩＤ１６６）
精製した変異型ＡＪ１６１６ＬＡＴを用いて、以下の条件で２２時間反応を行った。反応は試験管を用いて１ｍｌで行った。サンプリングは１４、１８、２２時間後に行った。サンプルをＴＥバッファーで希釈し、アミコンウルトラ−０．５ｍＬ  遠心式フィルター１０ｋＤａを用いて限外ろ過、ろ液を分析した。分析にはＨＰＬＣを用いた。【０１５１】
反応条件：Ｌ−Ｔｒｐ  １００ｍＭ、ＰＡ−Ｎａ  ５０ｍＭ、Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ  ３００ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １００ｍＭ、ＫＰＢ  ２０ｍＭ、ｐＨ７．０、Ｐｓ＿ａａｄブロス  ４０％、ＳｐＡｌｄ精製酵素  ０．２ｍｇ／ｍｌ、ＯＡＡ  ＤＣａｓｅ市販酵素１０Ｕ／ｍｌ、変異型ＡＪ１６１６ＬＡＴ精製酵素  ２Ｕ／ｍｌ（ｖｓ  １０ｍＭ  ４Ｒ−ＩＨＯＧ）、ＳＯＤ  市販酵素２００Ｕ／ｍｌ、２５℃、１４０ｒｐｍ。【０１５２】
反応に供した酵素の調製法を下記に示す。
Ｐｓ＿ａａｄブロス：実施例１７に記載の方法に従って調製した。
ＳｐＡｌｄ精製酵素：実施例６に記載の方法に従ってＳｐＡＬＤ発現株のジャー培養を行い、さらに６０℃で１時間の熱処理を行った。得られた熱処理後の培養液１００ｍｌから、菌体を遠心分離により集め、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭにて洗浄、懸濁し、超音波破砕を行った。遠心分離により破砕液から菌体残渣を除き、得られた上清を可溶性画分とした。この可溶性画分が硫酸アンモニウム  １Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭを含むよう、硫酸アンモニウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を添加した。この溶液を硫酸アンモニウム  １Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラムＨｉＬｏａｄ  ２６／１０  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、ＣＶ＝５３ｍｌ）カラムに供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかった非吸着タンパク質を硫酸アンモニウム  １Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭを用いて洗い流した後、硫酸アンモニウム濃度を１Ｍから０Ｍまで直線的に変化させて、８ｍｌ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。活性が検出された画分を集めて、アミコン  ウルトラ−１５  １０ｋ（ミリポア）を用いて濃縮した。得られた濃縮液を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで希釈し、ＳｐＡｌｄ溶液とした。アルドラーゼ活性の測定には、ＰＨＯＧ分解活性測定法を用いた（ＰＨＯＧ  ２ｍＭ、ＫＰＢ  ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ＮＡＤＨ  ０．２５ｍＭ、ＬＤＨ  １６Ｕ／ｍｌ、２５℃、ｐＨ７．０、３４０ｎｍの減少から活性を算出）。ＬＤＨはＤ−Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ（オリエンタル酵母）を用いた。
変異型ＡＪ１６１６ＬＡＴ：ＬＢ−ａｍｐ（１００ｍｇ／ｌ）プレート上で生育させた変異型ＡＪ１６１６ＬＡＴ発現株、ｐＥＴ２２−ＡＪ１６１６ＬＡＴｍｕｔ−Ｈｉｓ（Ｃ）／Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ＤＥ３）の菌体を、アンピシリン１００ｍｇ／ｌを含むＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＴＢ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ）１００ｍｌに植菌し、３７℃で１６時間、坂口フラスコを用いて振とう培養を行った。培養終了後、得られた培養液より菌体を遠心分離により集め、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  １０ｍＭにて洗浄、懸濁し、超音波破砕を行った。遠心分離により破砕液から菌体残渣を除き、得られた上清を可溶性画分とした。得られた可溶性画分を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  １０ｍＭで平衡化したＨｉｓ−ｔａｇタンパク質精製カラムＨｉｓ  ＴＡＬＯＮ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  ５ｍｌ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  １０ｍＭを用いて洗い流した後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  １５０ｍＭを用いて、５ｍｌ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。得られた画分を集めて、アミコン  ウルトラ−１５  ３０ｋ（ミリポア）を用いて濃縮した。濃縮液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで希釈し、変異型ＡＪ１６１６ＬＡＴ溶液とした。必要に応じて、培養液量、Ｈｉｓ  ＴＡＬＯＮカラムの連結数を増やして精製を行った。
ＯＡＡ  ＤＣａｓｅ：Ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ  Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．（Ｓｉｇｍａ）を用いた。酵素量（Ｕ）は、メーカー記載の値を用いた。
ＳＯＤ：Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｌｉｖｅｒ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。酵素量（Ｕ）は、メーカー記載の値を用いた。【０１５３】
ワンポット反応の結果、作製したＩＤ１３６，ＩＤ１６６変異型酵素において、野生株と比較した２Ｓ，４Ｒ−モナティン収率向上効果が認められた（表１０）。【０１５４】
【表１０】
2012050125.tif 000016
【０１５５】
実施例２０：１００ｍＭ  Ｔｒｐからの２Ｓ，４Ｒ−モナティンのワンポット反応（ＩＤ１６６，４００ｍｌスケール）
精製したＡＪ１６１６ＬＡＴ−ＩＤ１６６を用いて、以下の条件で６時間反応を行った。反応は１  Ｌ容Ｓ−ジャーを用いて４００ｍｌで行った。適宜サンプリングを行い、サンプルをＴＥバッファーで希釈し、アミコンウルトラ−０．５ｍＬ  遠心式フィルター  １０ｋＤａを用いて限外ろ過、ろ液を分析した。分析にはＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動を用いた。【０１５６】
反応条件：Ｌ−Ｔｒｐ  １００ｍＭ、ＰＡ−Ｎａ  ５０ｍＭ、Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ  ３００ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、ＫＰＢ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ｐＨ＜７．６（１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）、Ｐｓ＿ａａｄ  ｂｒｏｔｈ  ４０％、ＳｐＡｌｄ  ｂｒｏｔｈ  １０％、ＰｐＯＤＣ  ５Ｕ／ｍｌ、ＡＪ１６１６ＬＡＴ−ＩＤ１６６  ４Ｕ／ｍｌ  （ｖｓ  １０ｍＭ  ４Ｒ−ＩＨＯＧ）、ＳＯＤ  １００Ｕ／ｍｌ、２５℃、５００ｒｐｍ、Ａｉｒ  ２０ｍｌ／ｍｉｎ（１／２０ｖｖｍ）。【０１５７】
Ｐｓ＿ａａｄブロスはｐＴＢ２／Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９ΔａｓｐＣブロスを用いた。ＳｐＡｌｄブロスは実施例１９に記載の熱処理ブロスを用いた。ＰｐＯＤＣは実施例１８に記載の精製酵素を用いた。ＳＯＤはＳｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｌｉｖｅｒ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。【０１５８】
その結果、６時間後に８６ｍＭ  ２Ｓ，４Ｒ−モナティンの蓄積が確認された（図４）。液量補正後に算出された対Ｌ−Ｔｒｐ収率は８９％であった。【０１５９】
実施例２１：１５０ｍＭ  Ｌ−Ｔｒｐからの２Ｓ，４Ｒ−モナティンワンポット反応（ＩＤ１８９，８０ｍｌスケール）
精製したＡＪ１６１６ＬＡＴ−ＩＤ１８９を用いて、以下の条件で２７時間反応を行った。反応は２５０ｍＬ容Ｓ−ジャーを用いて８０ｍｌで行った。適宜サンプリングを行い、サンプルをＴＥバッファーで希釈し、アミコンウルトラ−０．５ｍＬ  遠心式フィルター  １０ｋＤａを用いて限外ろ過、ろ液を分析した。分析にはＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動を用いた。【０１６０】
反応条件：Ｌ−Ｔｒｐ  １５０ｍＭ、ＰＡ−Ｎａ  ５０ｍＭ、Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ  ４００ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、ＫＰＢ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ｐＨ＜７．６（１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）、Ｐｓ＿ａａｄ  ｂｒｏｔｈ  ４０％、ＳｐＡｌｄ  ｂｒｏｔｈ  １０％、ＰｐＯＤＣ  ５Ｕ／ｍｌ、ＡＪ１６１６ＬＡＴ−ＩＤ１８９  ４Ｕ／ｍｌ（ｖｓ  １０ｍＭ  ４Ｒ−ＩＨＯＧ）、ＳＯＤ  １００Ｕ／ｍｌ、２５℃、３８０ｒｐｍ、Ａｉｒ  ４ｍｌ／ｍｉｎ（１／２０ｖｖｍ）。
Ｐｓ＿ａａｄブロスはｐＴＢ２／Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９ΔａｓｐＣブロスを用いた。ＳｐＡｌｄブロスは実施例１９に記載の熱処理ブロスを用いた。ＰｐＯＤＣは実施例１８に記載の精製酵素を用いた。ＳＯＤはＳｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｌｉｖｅｒ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。【０１６１】
その結果、２７時間後に１０５ｍＭ  ２Ｓ，４Ｒ−モナティンの蓄積が確認された（図５）。液量補正後に算出された対Ｌ−Ｔｒｐ収率は７８％であった（図５）。【０１６２】
実施例２２：２Ｓ，４Ｒ−モナティンの単離
実施例２０の酵素反応液４３５．４５ｇ（ロット１０１２１３  Ｊ４）をＵＦ（ＭＷＣＯ：３０００）処理して得られた透過液４３５．６６ｇに、ＺＮ炭２．５９ｇを添加し、室温（約２６℃）で１時間撹拌した。活性炭を桐山濾紙（５Ｃ）で濾過し、得られた濾過液を１Ｌ四つ口フラスコに移液した。そのフラスコを５℃の恒温槽に浸漬し、３５％塩酸でｐＨを３．５になるように中和し、メカニカルスタラーで撹拌した（１２０ｒｐｍ）。種晶を４８ｍｇ添加し、結晶が析出しはじめると溶液ｐＨが上昇するので、目標ｐＨを維持するようにｐＨコントロラーとペリスターポンプを用いて１Ｎ塩酸を逐次添加した。２４時間撹拌して得られたスラリー溶液を濾過し、水１０ｍＬで結晶洗浄を行った後、湿結晶を４０℃で減圧乾燥して２Ｓ，４Ｒ−モナティン  ６．８１ｇを取得した。得られた結晶をＨＰＬＣ及び１Ｈ−ＮＭＲ分析を行いその品質を確認した。【０１６３】
ＨＰＬＣ  ａｒｅａ純度（２１０ｎｍ）：９８．４％
１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ  Ｄ２Ｏ＋Ｋ２ＣＯ３）
２．０８−２．１４（１Ｈ，ｄｄ），２．３５−２．３９（１Ｈ，ｄｄ），３．０９−３．１７（２Ｈ，ｄｄ），３．８５−３．８８（１Ｈ，ｄｄ），７．０４−７．１５（３Ｈ，ｍ），７．３９−７．４１（１Ｈ，ｍ），７．６４−７．６６（１Ｈ，ｄ）【０１６４】
実施例２３：２Ｒ，４Ｒ−モナティンの合成
水  ３．２７ｇに実施例２２で取得した２Ｓ，４Ｒ−モナティン  ３．１０ｇ（１０．４ｍｍｏｌ）及び５０％ＫＯＨ  １．１６５ｇ（１０．４ｍｍｏｌ）を溶解し、更にＥｔＯＨ  １．３ｇ、５−ニトロサリチルアルデヒド０．０８６９ｇ（０．０５２ｍｍｏｌ）及び酢酸０．１８７ｇ（３．１２ｍｍｏｌ）を添加した。２５時間後にＥｔＯＨ  ２０．５ｇ及び種晶（２Ｒ、４Ｒ−モナティン）  １０ｍｇを添加し、更に４６．５時間撹拌した。得られたスラリー溶液を室温まで冷却してから濾過を行い、８５％ＥｔＯＨ水  ４ｇで結晶洗浄を行った後、湿結晶を４０℃で減圧乾燥して粗２Ｒ，４Ｒ−モナティン２．３ｇを取得した。得られた粗２Ｒ，４Ｒ−モナティン  ２．１ｇを水６ｍＬに溶解しＢＡ炭０．２ｇを添加して室温（２５℃前後）で１時間撹拌後、０．４５ｕｍのメンブレンフィルターで処理液を濾過し、その濾過液を６．３８ｇまで減圧濃縮した。４５℃で濃縮液にＥｔＯＨ  １２ｇを滴下し１時間撹拌した。更にＥｔＯＨ  １３．５ｇを１時間で定量滴下し、４５℃で１６時間撹拌後、２５℃まで冷却した。得られたスラリー液を濾過し、８５％ＥｔＯＨ水  ３ｇで結晶洗浄を行った後、湿結晶を４０℃で減圧乾燥して２Ｒ，４Ｒ−モナティン  １．９ｇ（５．４６ｍｍｏｌ）を取得した。得られた結晶、母液、洗液をＨＰＬＣで分析し、収率及び品質解析を実施した。【０１６５】
ＨＰＬＣ  ａｒｅａ純度（２１０ｎｍ）：９９．９％
１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ  Ｄ２Ｏ）
１．９３−２．００（１Ｈ，ｄｄ），２．５７−２．６１（１Ｈ，ｄｄ），２．９９−３．０２（１Ｈ，ｄ），３．１９−３．２２（１Ｈ，ｄ）３．５５−３．５６（１Ｈ，ｄｄ），７．０４−７．１５（３Ｈ，ｍ），７．３９−７．４１（１Ｈ，ｍ），７．６４−７．６６（１Ｈ，ｄ）【０１６６】
【表１１】
2012050125.tif 000017
【０１６７】
実施例２４  １５０ｍＭ  Ｌ−Ｔｒｐからの２Ｓ，４Ｒ−モナティンワンポット反応（ＩＤ２９６，８０ｍｌスケール）
精製したＡＪ１６１６ＬＡＴ−ＩＤ２９６を用いて、以下の条件で５１時間反応を行った。反応は２５０ｍｌ容ジャーを用いて８０ｍｌで行った。適宜サンプリングを行い、サンプルをＴＥバッファーで希釈し、アミコンウルトラ−０．５ｍＬ遠心式フィルター  １０ｋＤａを用いて限外ろ過、ろ液を分析した。分析にはＨＰＬＣを用いた。【０１６８】
反応条件：Ｌ−Ｔｒｐ  １５０ｍＭ、ＰＡ−Ｎａ  ５０ｍＭ、Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ  ４００ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、ＫＰＢ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ｐＨ＜７．６（１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）、Ｐｓ＿ａａｄ  ｂｒｏｔｈ  ４０％、ＳｐＡｌｄ  ｂｒｏｔｈ  １０％、ＰｐＯＤＣ  ５Ｕ／ｍｌ、ＡＪ１６１６ＬＡＴ−ＩＤ２９６  ４Ｕ／ｍｌ（ｖｓ  １０ｍＭ  ４Ｒ−ＩＨＯＧ）、ＳＯＤ  １００Ｕ／ｍｌ、２５℃、３８０ｒｐｍ、Ａｉｒ  ４ｍｌ／ｍｉｎ（１／２０ｖｖｍ）。
Ｐｓ＿ａａｄ  ブロスはｐＴＢ２／Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９ΔａｓｐＣブロスを用いた。ＳｐＡｌｄブロスは実施例１９に記載の熱処理ブロスを用いた。ＰｐＯＤＣは実施例１８に記載の精製酵素を用いた。ＳＯＤはＳｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｌｉｖｅｒ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。【０１６９】
その結果、３９時間後に１１３ｍＭ  ２Ｓ，４Ｒ−モナティン蓄積が確認された（図６）。液量補正後に算出された対Ｌ−Ｔｒｐ収率は８６％であった（図６）。【０１７０】
実施例２５：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＪ３９７６由来アミノトランスフェラーゼの精製
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＪ３９７６の可溶性画分から、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成するアミノトランスフェラーゼの精製を以下の通り行った。Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １００ｍＭ、４Ｒ−ＩＨＯＧ  １０ｍＭ（微量の４Ｓ−ＩＨＯＧ含む）、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  １００ｍＭ、２５℃で反応を行い、生成した２Ｓ，４Ｒ−モナティンをＵＰＬＣ分析で定量した。
【表１２−１】
2012050125.tif 000018
【０１７１】
（１）可溶性画分の調製
ＬＢ寒天培地にＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＪ３９７６を塗布し、３０℃で２日間培養した。
得られた菌体を酵素生産培地（酵母エキス  １０ｇ／ｌ、トリプトン  １０ｇ／ｌ、グルコース  １ｇ／ｌ、リン酸水素二カリウム  ３ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム  １ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム七水和物  ０．１ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム  ５ｇ／ｌ）１６０ｍｌに一白金耳接種し、５００ｍｌ容坂口フラスコで３０℃にて２０時間振とう培養した。得られた培養液約１９２０ｍｌより菌体を遠心分離により集め、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭにて洗浄、懸濁し、４℃で３０分間超音波破砕した。遠心分離により破砕液から菌体残渣を除き、得られた上清を可溶性画分とした。【０１７２】
（２）陰イオン交換クロマトグラフィー
上記の可溶性画分を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＨｉＬｏａｄ  ２６／１０  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＣＶ＝５３ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで洗い流した後、ＮａＣｌ濃度を０ｍＭから５００ｍＭまで直線的に変化させて、２ｍｌ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。各溶出画分について２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性を検出したところ、約２５０ｍＭ  ＮａＣｌ相当の画分に２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が認められた。【０１７３】
（３）疎水性クロマトグラフィー
２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が検出された画分を集めて、硫酸アンモニウム  １．０Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ（ｐＨ７．６）となるよう、硫酸アンモニウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を添加した。この溶液を硫酸アンモニウム  １．０Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ（ｐＨ７．６）で平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラムＨｉＬｏａｄ  １６／１０  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、ＣＶ＝２０ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかった非吸着タンパク質を硫酸アンモニウム１．０Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭを用いて洗い流した後、硫酸アンモニウム濃度を１．０Ｍから０Ｍまで直線的に変化させて、３ｍｌ／ｍｉｎの流速で２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成酵素を溶出させた。得られた各溶出画分について２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性を測定したところ、約０．９Ｍ硫酸アンモニウム相当の画分に２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が認められた。【０１７４】
（４）ゲル濾過クロマトグラフィー
２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が検出された画分を集めて、アミコン  ウルトラ−１５  １０ｋ（ミリポア）を用いて濃縮した。得られた濃縮液を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭで希釈した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭで平衡化されたゲルろ過カラムＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｇ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＣＶ＝１２０ｍｌ）に供し、１ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出した。この操作により分子量約１００ｋＤａと見積もられる位置で２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が確認された。【０１７５】
（５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、活性画分には４７ｋＤａ付近にバンドが１本認められた。このバンドを、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成するアミノトランスフェラーゼの候補としてＮ末端アミノ酸配列解析に供した。【０１７６】
実施例２６：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＪ３９７６由来アミノトランスフェラーゼのＮ末端アミノ酸配列決定
実施例２５で得られた精製酵素溶液をＮ末端アミノ酸配列解析に供したところ、ＡＦＬＡＤＩＬＳＲＶＫＰＳＡＴＩＡＶＴＱ（配列番号４４）のＮ末端アミノ酸配列が得られた。Ｎ末端アミノ酸配列は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｔｒ．Ｃ５８由来アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＡＫ８７９４０）と高い相同性を示した。【０１７７】
実施例２７：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＪ３９７６由来アミノトランスフェラーゼ遺伝子のクローニング
実施例２５と同様の方法でＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＪ３９７６を培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、ゲノムＤＮＡを抽出した。
得られたゲノムＤＮＡを鋳型にして、アミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。プライマーは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｔｒ．Ｃ５８のゲノムＤＮＡ配列を参考にして、アミノトランスフェラーゼ遺伝子の上流１００ｂｐと、下流１００ｂｐのＤＮＡ配列から設計した、プライマーＡｇ−ｕ１００−ｆ（５’−ｃｔｇｇｔｇｃａｇａｔａａｇｃｃｇｇｃｔｔｔｔｇａｃｃ−３’：配列番号４５）およびプライマーＡｇ−ｄ１００−ｒ（５’−ｃｃａｃｃｔｔｃａｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｇｔｔｔｃｔｃｇ−３’：配列番号４６）を用いた。ＰＣＲは、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（東洋紡）を用いて以下の条件で行った。
１  ｃｙｃｌｅ      ９４℃、２ｍｉｎ
２５  ｃｙｃｌｅｓ    ９８℃、１０ｓｅｃ
５５℃、１０ｓｅｃ
６８℃、６０ｓｅｃ
１  ｃｙｃｌｅ      ６８℃、６０ｓｅｃ
４℃【０１７８】
増幅した約１４００ｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｔｒ．Ｃ５８由来アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（Ａｔｕ２１９６）と相同性の高い、１２０３ｂｐのＯＲＦを含む塩基配列が明らかとなった（配列番号４７、４８）。相同性はＤＮＡ配列で９２％、アミノ酸配列で９７％であった。
実施例２６で得られたＮ末端アミノ酸配列とも一致したため、２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性を有するアミノトランスフェラーゼの遺伝子を取得できたと考えられた。【０１７９】
実施例２８：Ｅ．ｃｏｌｉでのＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＪ３９７６由来アミノトランスフェラーゼ発現
（１）Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＪ３９７６由来アミノトランスフェラーゼ発現プラスミドの構築
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＪ３９７６のゲノムＤＮＡを鋳型にして、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＪ３９７６由来アミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。プライマーは、プライマー３９７６ＡＴ−Ｎｄｅ−ｆ（５’−ｇｇａａｔｔｃｃａｔＡＴＧＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＣＣＧＡＣＡＴＴＣＴＣＴ−３’：配列番号４９）およびプライマー３９７６−ｘｈｏ−ｒ（５’−ａｃｔｃｃｇｃｔｃｇａｇＡＣＧＧＣＡＡＴＣＧＧＣＧＣＡＧＡＡＡＣＧＣＴＧＡ−３’：配列番号５０）を用いた。ＰＣＲは、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（東洋紡）を用いて以下の条件で行った。
１  ｃｙｃｌｅ      ９４℃、２ｍｉｎ
２５  ｃｙｃｌｅｓ    ９８℃、１０ｓｅｃ
５５℃、１０ｓｅｃ
６８℃、６０ｓｅｃ
１  ｃｙｃｌｅ      ６８℃、６０ｓｅｃ
４℃【０１８０】
得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ、ＸｈｏＩで制限酵素処理し、同様にＮｄｅＩ、ＸｈｏＩで処理したｐＥＴ−２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを抽出し、このプラスミドをｐＥＴ−２２−３９７６ＡＴ−Ｈｉｓと命名した。このプラスミドでは、Ｃ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付与されたＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＪ３９７６由来アミノトランスフェラーゼ（３９７６ＡＴ−Ｈｉｓ）が発現する。【０１８１】
（２）Ｅ．ｃｏｌｉ発現株からの３９７６ＡＴ−Ｈｉｓ精製
構築した発現プラスミドｐＥＴ−２２−３９７６ＡＴ−ＨｉｓをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、形質転換体をアンピシリン１００ｍｇ／ｌを含むＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＴＢ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ）  １６０ｍｌに白金耳接種し、５００ｍｌ容坂口フラスコを用いて３７℃で１６時間振盪させた。培養終了後、得られた培養液約１０００ｍｌより菌体を遠心分離により集め、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、Ｉｍｉｄｏｚｏｌｅ  ２０ｍＭにて洗浄、懸濁し、４℃で３０分間超音波破砕した。遠心分離により破砕液から菌体残渣を除き、得られた上清を可溶性画分とした。
得られた可溶性画分を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、Ｉｍｉｄｏｚｏｌｅ  ２０ｍＭで平衡化したＨｉｓ−ｔａｇタンパク質精製カラムＨｉｓＰｒｅｐ  ＦＦ  １６／１０（ファルマシア（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）製、ＣＶ＝２０ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、Ｉｍｉｄｏｚｏｌｅ  ２０ｍＭで用いて洗い流した後、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ濃度を２０ｍＭから２５０ｍＭまで直線的に変化させて、３ｍｌ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。
得られた画分を集めて、アミコン  ウルトラ−１５  ３０ｋ（ミリポア）を用いて濃縮した。濃縮液を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで希釈し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＨｉＬｏａｄ  １６／１０  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＣＶ＝２０ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで用いて洗い流した後、ＮａＣｌ濃度を０ｍＭから５００ｍＭまで直線的に変化させて、３ｍｌ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。
各溶出画分について２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性を確認し、２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が認められた画分を集めて、アミコン  ウルトラ−１５  ３０ｋ（ミリポア）を用いて濃縮した。濃縮液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで希釈し、３９７６ＡＴ−Ｈｉｓ溶液とした。【０１８２】
実施例２９：ＡＪ３９７６ＬＡＴの各種ケト酸に対する比活性測定結果
（１）比色法でのＬ−Ａｓｐ／α−ＫＧ、Ｌ−Ａｓｐ／ＰＡ、およびＬ−Ａｓｐ／（±）−ＭＨＯＧ活性測定
ＡＪ３９７６ＬＡＴの各種基質に対する活性測定を実施した。アミノ基転移反応のアミノドナー基質としては１００ｍＭ  Ｌ−Ａｓｐを用い、１０ｍＭの各種ケト酸に対する比活性を比色法で測定した。
Ｌ−Ａｓｐ／α−ＫＧ活性：Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １００ｍＭ、α−ＫＧ−２Ｎａ  １０ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００ｍＭ、ＮＡＤＨ  ０．２５ｍＭ、ＭＤＨ  ２Ｕ／ｍｌ、２５℃。３４０ｎｍの減少から活性を算出。ＭＤＨはＭａｌｉｃ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｈｅａｒｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。なお、Ｌ−Ａｓｐ／α−ＫＧ活性は、表１３において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「α−ＫＧ」に示す。
Ｌ−Ａｓｐ／ＰＡ活性：Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １００ｍＭ、ＰＡ−Ｎａ  １０ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００ｍＭ、ＮＡＤＨ  ０．２５ｍＭ、ＭＤＨ（上記と同様）２Ｕ／ｍｌ、２５℃。３４０ｎｍの減少から活性を算出。なお、Ｌ−Ａｓｐ／ＰＡ活性は、表１３において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「ＰＡ」に示す。
Ｌ−Ａｓｐ／（±）−ＭＨＯＧ活性：Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １００ｍＭ、（±）−ＭＨＯＧ  １０ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００ｍＭ、ＮＡＤＨ  ０．２５ｍＭ、ＭＤＨ（上記と同様）２Ｕ／ｍｌ、ＬＤＨ  １０Ｕ／ｍｌ、２５℃。３４０ｎｍの減少から活性を算出。ＬＤＨはＤ−Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ（オリエンタル酵母）を用いた。（±）−ＭＨＯＧに微量に混在しているＰＡを除くため、ＬＤＨを添加した。なお、Ｌ−Ａｓｐ／（±）−ＭＨＯＧ活性は、表１３において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「±ＭＨＯＧ」に示す。【０１８３】
（２）Ｌ−Ａｓｐ／４Ｒ−ＩＨＯＧ、Ｌ−Ａｓｐ／（±）−ＩＨＯＧ、及びＬ−Ａｓｐ／ＩＰＡ活性測定
目的活性である４Ｒ−ＩＨＯＧからの２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性、（±）−ＩＨＯＧからの２Ｓ，４Ｒ−モナティン及び２Ｓ，４Ｓ−モナティン生成活性、及びＩＰＡからのＬ−Ｔｒｐ副生活性をそれぞれ測定した。アミノ基転移反応のアミノドナー基質としては１００ｍＭ  Ｌ−Ａｓｐを用い、１０ｍＭの各種ケト酸に対するアミノ基転移反応を行い、生成したアミノ酸量をＵＰＬＣで定量し、比活性を算出した。
Ｌ−Ａｓｐ／４Ｒ−ＩＨＯＧ活性：Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １００ｍＭ、４Ｒ−ＩＨＯＧ  １０ｍＭ（微量の４Ｓ−ＩＨＯＧ含む）、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  １００ｍＭ、２５℃。ＵＰＬＣ分析を行い、生成した２Ｓ，４Ｒ−モナティン、２Ｓ，４Ｓ−モナティンを定量した。反応停止液は２００ｍＭ  クエン酸Ｎａ溶液（ｐＨ４．５）を用いた。なお、Ｌ−Ａｓｐ／４Ｒ−ＩＨＯＧ活性は、表１３において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「４Ｒ−ＩＨＯＧ」に示す。
Ｌ−Ａｓｐ／（±）−ＩＨＯＧ活性：Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １００ｍＭ、（±）−ＩＨＯＧ  １０ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  １００ｍＭ、２５℃。ＵＰＬＣ分析を行い、生成した２Ｓ，４Ｒ−モナティン、２Ｓ，４Ｓ−モナティンを定量した。反応停止液は２００ｍＭ  クエン酸Ｎａ溶液（ｐＨ４．５）を用いた。なお、Ｌ−Ａｓｐ／４Ｒ−ＩＨＯＧ活性は、表１３において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「±ＩＨＯＧ」に示す。
Ｌ−Ａｓｐ／ＩＰＡ活性：Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １００ｍＭ、ＩＰＡ  １０ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  １００ｍＭ（ｐＨは反応液作成後に１Ｎ  ＮａＯＨで８．０に調整）、２５℃。ＵＰＬＣ分析を行い、生成したＴｒｐを定量した。反応停止液は２００ｍＭ  クエン酸Ｎａ溶液（ｐＨ４．５）を用いた。なお、Ｌ−Ａｓｐ／ＩＰＡ活性は、表１３において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「ＩＰＡ」に示す。
生成したモナティン及びＴｒｐの定量はＷａｔｅｒｓ社製  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステムを用いて定量した。測定条件を以下に示す。０．２ｍｌで１５分間反応を行ってから反応停止し、反応停止後の反応液を遠心し上清０．２ｍｌ程度をＵＰＬＣ分析に供した。【０１８４】
【表１２−２】
2012050125.tif 000019
【０１８５】
２Ｓ，４Ｒ−モナティンを１．１ｍｉｎに、２Ｓ，４Ｓ−モナティンを１．５ｍｉｎに、またＴｒｐを１．３ｍｉｎにそれぞれ分別定量できる。【０１８６】
（３）ＡＪ３９７６ＬＡＴの各種ケト酸に対する比活性測定結果
３９７６−ＡＴ−Ｈｉｓを用いて１００ｍＭ  Ｌ−Ａｓｐをアミノドナーとした際の１０ｍＭ  ケト酸に対する比活性測定結果を表１３に示す。【０１８７】
【表１３】
2012050125.tif 000020
【０１８８】
実施例３０：ｐＥＴ−２２−３９７６ＡＴ−Ｈｉｓ／Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を用いた２Ｓ，４Ｒ−モナティン合成反応
実施例２８で作製したｐＥＴ−２２−３９７６ＡＴ−Ｈｉｓ／Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）をアンピシリン１００ｍｇ／ｌを含むＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＴＢ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ）３ｍｌに白金耳接種し、試験管を用いて３７℃で１６時間振盪させた。培養終了後、得られた培養液１ｍｌより菌体を遠心分離により集め、１  ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （Ｎｏｖａｇｅｎ）に懸濁した。得られた懸濁液を室温にて１５分間静置して溶菌させ、遠心分離により菌体残渣を除き、得られた上清を可溶性画分とした。
得られた可溶性画分を用いて４Ｒ−ＩＨＯＧからの２Ｓ，４Ｒ−モナティン合成反応を行った。反応液〔Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １００ｍＭ、４Ｒ−ＩＨＯＧ  １０ｍＭ（微量の４Ｓ−ＩＨＯＧ含む）、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １００ｍＭ、ｐＨ８．０〕  ０．１ｍｌに、上記の可溶性画分が０．０５ｍｌ含まれるように加え、２５℃で１時間反応させた。反応終了後、生成した２Ｓ，４Ｒ−モナティンを定量したところ、０．８４ｍＭであった。２Ｓ，４Ｒ−モナティンの定量は、ＵＰＬＣ分析により行った。分析条件は実施例２９と同様である。【０１８９】
実施例３１：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＡＪ１２４６９由来アミノトランスフェラーゼの精製
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＡＪ１２４６９の可溶性画分から、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成するアミノトランスフェラーゼの精製を以下の通り行った。実施例２５と同様にして、２Ｓ，４Ｒ−モナティン合成反応および２Ｓ，４Ｒ−モナティンの定量を行った。【０１９０】
（１）可溶性画分の調製
ＬＢ寒天培地にＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＡＪ１２４６９を塗布し、３０℃で２日間培養した。
得られた菌体を酵素生産培地（酵母エキス  １０ｇ／ｌ、トリプトン  １０ｇ／ｌ、グルコース  １ｇ／ｌ、リン酸水素二カリウム  ３ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム  １ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム七水和物  ０．１ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム  ５ｇ／ｌ）１６０ｍｌに一白金耳接種し、５００ｍｌ容坂口フラスコで３０℃にて１６時間振とう培養した。得られた培養液約１９２０ｍｌより菌体を遠心分離により集め、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭにて洗浄、懸濁し、４℃で３０分間超音波破砕した。遠心分離により破砕液から菌体残渣を除き、得られた上清を可溶性画分とした。【０１９１】
（２）陰イオン交換クロマトグラフィー
上記の可溶性画分を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＨｉＬｏａｄ  ２６／１０  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＣＶ＝５３ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで洗い流した後、ＮａＣｌ濃度を０ｍＭから５００ｍＭまで直線的に変化させて、８ｍｌ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。各溶出画分について２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性を検出したところ、約２００ｍＭ  ＮａＣｌ相当の画分に２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が認められた。【０１９２】
（３）疎水性クロマトグラフィー
２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が検出された画分を集めて、硫酸アンモニウム  １．５Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ（ｐＨ７．６）となるよう、硫酸アンモニウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を添加した。この溶液を硫酸アンモニウム  １．５Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ（ｐＨ７．６）で平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラムＨｉＬｏａｄ  １６／１０  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、ＣＶ＝２０ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかった非吸着タンパク質を硫酸アンモニウム１．５Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭを用いて洗い流した後、硫酸アンモニウム濃度を１．５Ｍから０Ｍまで直線的に変化させて、３ｍｌ／ｍｉｎの流速で２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成酵素を溶出させた。得られた各溶出画分について２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性を測定したところ、約０．８Ｍ硫酸アンモニウム相当の画分に２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が認められた。【０１９３】
（４）ゲル濾過クロマトグラフィー
２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が検出された画分を集めて、アミコン  ウルトラ−１５  １０ｋ（ミリポア）を用いて濃縮した。得られた濃縮液を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭで希釈した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭで平衡化されたゲルろ過カラムＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｇ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＣＶ＝１２０ｍｌ）に供し、１ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出した。この操作により分子量約１００ｋＤａと見積もられる位置で２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が確認された。【０１９４】
（５）陰イオン交換クロマトグラフィー
２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が検出された画分を集めて、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＭｏｎｏ  Ｑ  ５／５（ファルマシア（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）製、ＣＶ＝１ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで洗い流した後、ＮａＣｌ濃度を０ｍＭから５００ｍＭまで直線的に変化させて、０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。各溶出画分について２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性を検出したところ、約３００ｍＭ  ＮａＣｌ相当の画分に２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が認められた。【０１９５】
（６）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、活性画分には４７ｋＤａ付近にバンドが認められた。このバンドを、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成するアミノトランスフェラーゼの候補としてＮ末端アミノ酸配列解析に供した。【０１９６】
実施例３２：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＡＪ１２４６９由来アミノトランスフェラーゼのＮ末端アミノ酸配列決定
実施例３１で得られた精製酵素溶液をＮ末端アミノ酸配列解析に供したところ、ＡＦＬＡＤＩＬＳＲＶＫＰＳＡＴＩＡＶＴＱ（配列番号５１）のＮ末端アミノ酸配列が得られた。Ｎ末端アミノ酸配列は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｔｒ．Ｃ５８由来アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＡＫ８７９４０）と高い相同性を示した。【０１９７】
実施例３３：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＡＪ１２４６９由来アミノトランスフェラーゼ遺伝子のクローニング
実施例３１と同様の方法でＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＪ３９７６を培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、ゲノムＤＮＡを抽出した。
得られたゲノムＤＮＡを鋳型にして、アミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。プライマーは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｔｒ．Ｃ５８のゲノムＤＮＡ配列を参考にして、アミノトランスフェラーゼ遺伝子の上流１００ｂｐと、下流１００ｂｐのＤＮＡ配列から設計した、プライマーＡｇ−ｕ１００−ｆ（５’−ｃｔｇｇｔｇｃａｇａｔａａｇｃｃｇｇｃｔｔｔｔｇａｃｃ−３’：配列番号４５）およびプライマーＡｇ−ｄ１００−ｒ（５’−ｃｃａｃｃｔｔｃａｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｇｔｔｔｃｔｃｇ−３’：配列番号４６）を用いた。ＰＣＲは、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（東洋紡）を用いて以下の条件で行った。
１  ｃｙｃｌｅ      ９４℃、２ｍｉｎ
２５  ｃｙｃｌｅｓ    ９８℃、１０ｓｅｃ
５５℃、１０ｓｅｃ
６８℃、６０ｓｅｃ
１  ｃｙｃｌｅ      ６８℃、６０ｓｅｃ
４℃【０１９８】
増幅した約１４００ｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｔｒ．Ｃ５８由来アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（Ａｔｕ２１９６）と相同性の高い、１２０３ｂｐのＯＲＦを含む塩基配列が明らかとなった（配列番号５２、５３）。相同性はＤＮＡ配列で９７％、アミノ酸配列で９９％であった。
実施例３２で得られたＮ末端アミノ酸配列とも一致したため、２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性を有するアミノトランスフェラーゼの遺伝子を取得できたと考えられた。【０１９９】
実施例３４：Ｅ．ｃｏｌｉでのＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＡＪ１２４６９由来アミノトランスフェラーゼ発現
（１）Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＡＪ１２４６９由来アミノトランスフェラーゼ発現プラスミドの構築
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＡＪ１２４６９のゲノムＤＮＡを鋳型にして、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＡＪ１２４６９由来アミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。プライマーは、プライマー１２４６９ＡＴ−Ｎｄｅ−ｆ（５’−ｇｇａａｔｔｃｃａｔＡＴＧＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＣＣＧＡＣＡＴＴＣＴＣＴ−３’：配列番号５４）およびプライマー１２４６９−ｘｈｏ−ｒ（５’−ａｃｔｃｃｇｃｔｃｇａｇＧＣＧＧＣＡＡＴＣＧＧＣＧＣＡＧＡＡＡＣＧＣＴＧＡ−３’：配列番号５５）を用いた。ＰＣＲは、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（東洋紡）を用いて以下の条件で行った。
１  ｃｙｃｌｅ      ９４℃、２ｍｉｎ
２５  ｃｙｃｌｅｓ    ９８℃、１０ｓｅｃ
５５℃、１０ｓｅｃ
６８℃、６０ｓｅｃ
１  ｃｙｃｌｅ      ６８℃、６０ｓｅｃ
４℃【０２００】
得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ、ＸｈｏＩで制限酵素処理し、同様にＮｄｅＩ、ＸｈｏＩで処理したｐＥＴ−２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを抽出し、このプラスミドをｐＥＴ−２２−１２４６９ＡＴ−Ｈｉｓと命名した。このプラスミドでは、Ｃ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付与されたＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＪ１２４６９由来アミノトランスフェラーゼ（１２４６９ＡＴ−Ｈｉｓ）が発現する。【０２０１】
（２）Ｅ．ｃｏｌｉ発現株からの１２４６９ＡＴ−Ｈｉｓ精製
構築した発現プラスミドｐＥＴ−２２−１２４６９ＡＴ−ＨｉｓをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、形質転換体をアンピシリン１００ｍｇ／ｌを含むＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＴＢ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ）  １６０ｍｌに白金耳接種し、５００ｍｌ容坂口フラスコを用いて３７℃で１６時間振盪させた。培養終了後、得られた培養液約１０００ｍｌより菌体を遠心分離により集め、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、Ｉｍｉｄｏｚｏｌｅ  ２０ｍＭにて洗浄、懸濁し、４℃で３０分間超音波破砕した。遠心分離により破砕液から菌体残渣を除き、得られた上清を可溶性画分とした。
得られた可溶性画分を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、Ｉｍｉｄｏｚｏｌｅ  ２０ｍＭで平衡化したＨｉｓ−ｔａｇタンパク質精製カラムＨｉｓＰｒｅｐ  ＦＦ  １６／１０（ファルマシア（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）製、ＣＶ＝２０ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、Ｉｍｉｄｏｚｏｌｅ  ２０ｍＭで用いて洗い流した後、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ濃度を２０ｍＭから２５０ｍＭまで直線的に変化させて、３ｍｌ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。
得られた画分を集めて、アミコン  ウルトラ−１５  ３０ｋ（ミリポア）を用いて濃縮した。濃縮液を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）２０ｍＭで希釈し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＨｉＬｏａｄ  １６／１０  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＣＶ＝２０ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）２０ｍＭで用いて洗い流した後、ＮａＣｌ濃度を０ｍＭから５００ｍＭまで直線的に変化させて、３ｍｌ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。
各溶出画分について２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性を確認し、２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が認められた画分を集めて、アミコン  ウルトラ−１５  ３０ｋ（ミリポア）を用いて濃縮した。濃縮液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで希釈し、１２４６９ＡＴ−Ｈｉｓ溶液とした。【０２０２】
実施例３５：ＡＪ１２４６９ＬＡＴの各種ケト酸に対する比活性測定結果
（１）比色法でのＬ−Ａｓｐ／α−ＫＧ、Ｌ−Ａｓｐ／ＰＡ、およびＬ−Ａｓｐ／（±）−ＭＨＯＧ活性測定
ＡＪ１２４６９ＬＡＴの各種基質に対する活性測定を実施した。アミノ基転移反応のアミノドナー基質としては１００ｍＭ  Ｌ−Ａｓｐを用い、１０ｍＭの各種ケト酸に対する比活性を比色法で測定した。
Ｌ−Ａｓｐ／α−ＫＧ活性：Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １００ｍＭ、α−ＫＧ−２Ｎａ  １０ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００ｍＭ、ＮＡＤＨ  ０．２５ｍＭ、ＭＤＨ  ２Ｕ／ｍｌ、２５℃。３４０ｎｍの減少から活性を算出。ＭＤＨはＭａｌｉｃ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｈｅａｒｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。なお、Ｌ−Ａｓｐ／α−ＫＧ活性は、表１５において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「α−ＫＧ」に示す。
Ｌ−Ａｓｐ／ＰＡ活性：Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １００ｍＭ、ＰＡ−Ｎａ  １０ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００ｍＭ、ＮＡＤＨ  ０．２５ｍＭ、ＭＤＨ（上記と同様）２Ｕ／ｍｌ、２５℃。３４０ｎｍの減少から活性を算出。なお、Ｌ−Ａｓｐ／ＰＡ活性は、表１５において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「ＰＡ」に示す。
Ｌ−Ａｓｐ／（±）−ＭＨＯＧ活性：Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １００ｍＭ、（±）−ＭＨＯＧ  １０ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００ｍＭ、ＮＡＤＨ  ０．２５ｍＭ、ＭＤＨ（上記と同様）  ２Ｕ／ｍｌ、ＬＤＨ  １０Ｕ／ｍｌ、２５℃。３４０ｎｍの減少から活性を算出。ＬＤＨはＤ−Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ（オリエンタル酵母）を用いた。（±）−ＭＨＯＧに微量に混在しているＰＡを除くため、ＬＤＨを添加した。なお、Ｌ−Ａｓｐ／（±）−ＭＨＯＧ活性は、表１５において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「±ＭＨＯＧ」に示す。【０２０３】
（２）Ｌ−Ａｓｐ／４Ｒ−ＩＨＯＧ、Ｌ−Ａｓｐ／（±）−ＩＨＯＧ、及びＬ−Ａｓｐ／ＩＰＡ活性測定
目的活性である４Ｒ−ＩＨＯＧからの２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性、（±）−ＩＨＯＧからの２Ｓ，４Ｒ−モナティン及び２Ｓ，４Ｓ−モナティン生成活性、及びＩＰＡからのＬ−Ｔｒｐ副生活性をそれぞれ測定した。アミノ基転移反応のアミノドナー基質としては１００ｍＭ  Ｌ−Ａｓｐを用い、１０ｍＭの各種ケト酸に対するアミノ基転移反応を行い、生成したアミノ酸量をＵＰＬＣで定量し、比活性を算出した。
Ｌ−Ａｓｐ／４Ｒ−ＩＨＯＧ活性：Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １００ｍＭ、４Ｒ−ＩＨＯＧ  １０ｍＭ（微量の４Ｓ−ＩＨＯＧ含む）、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  １００ｍＭ、２５℃。ＵＰＬＣ分析を行い、生成した２Ｓ，４Ｒ−モナティン、２Ｓ，４Ｓ−モナティンを定量した。反応停止液は２００ｍＭ  クエン酸Ｎａ溶液（ｐＨ４．５）を用いた。なお、Ｌ−Ａｓｐ／４Ｒ−ＩＨＯＧ活性は、表１５において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「４Ｒ−ＩＨＯＧ」に示す。
Ｌ−Ａｓｐ／（±）−ＩＨＯＧ活性：Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １００ｍＭ、（±）−ＩＨＯＧ  １０ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  １００ｍＭ、２５℃。ＵＰＬＣ分析を行い、生成した２Ｓ，４Ｒ−モナティン、２Ｓ，４Ｓ−モナティンを定量した。反応停止液は２００ｍＭ  クエン酸Ｎａ溶液（ｐＨ４．５）を用いた。なお、Ｌ−Ａｓｐ／（±）−ＩＨＯＧ活性は、表１３において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「±ＩＨＯＧ」に示す。
Ｌ−Ａｓｐ／ＩＰＡ活性：Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １００ｍＭ、ＩＰＡ  １０ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  １００ｍＭ（ｐＨは反応液作成後に１Ｎ  ＮａＯＨで８．０に調整）、２５℃。ＵＰＬＣ分析を行い、生成したＴｒｐを定量した。反応停止液は２００ｍＭ  クエン酸Ｎａ溶液（ｐＨ４．５）を用いた。なお、Ｌ−Ａｓｐ／ＩＰＡ活性は、表１５において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「ＩＰＡ」に示す。
生成したモナティン及びＴｒｐの定量はＷａｔｅｒｓ社製  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステムを用いて定量した。測定条件を以下に示す。０．２ｍｌで１５分間反応を行ってから反応停止し、反応停止後の反応液を遠心し上清０．２ｍｌ程度をＵＰＬＣ分析に供した。【０２０４】
【表１４】
2012050125.tif 000021
【０２０５】
２Ｓ，４Ｒ−モナティンを１．１ｍｉｎに、２Ｓ，４Ｓ−モナティンを１．５ｍｉｎに、またＴｒｐを１．３ｍｉｎにそれぞれ分別定量できる。【０２０６】
（３）ＡＪ１２４６９ＬＡＴの各種ケト酸に対する比活性測定結果
１２４６９−ＡＴ−Ｈｉｓを用いて１００ｍＭ  Ｌ−Ａｓｐをアミノドナーとした際の１０ｍＭ  ケト酸に対する比活性測定結果を表１５に示す。【０２０７】
【表１５】
2012050125.tif 000022
【０２０８】
実施例３６：ｐＥＴ−２２−１２４６９ＡＴ−Ｈｉｓ／Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を用いた２Ｓ，４Ｒ−モナティン合成反応
実施例３４で作製したｐＥＴ−２２−１２４６９ＡＴ−Ｈｉｓ／Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）をアンピシリン１００ｍｇ／ｌを含むＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＴＢ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ）３ｍｌに白金耳接種し、試験管を用いて３７℃で１６時間振盪させた。培養終了後、得られた培養液１ｍｌより菌体を遠心分離により集め、１ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に懸濁した。得られた懸濁液を室温にて１５分間静置して溶菌させ、遠心分離により菌体残渣を除き、得られた上清を可溶性画分とした。
得られた可溶性画分を用いて４Ｒ−ＩＨＯＧからの２Ｓ，４Ｒ−モナティン合成反応を行った。反応液〔Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １００ｍＭ、４Ｒ−ＩＨＯＧ  １０ｍＭ（微量の４Ｓ−ＩＨＯＧ含む）、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １００ｍＭ、ｐＨ８．０〕  ０．１ｍｌに、上記の可溶性画分が０．０５ｍｌ含まれるように加え、２５℃で１時間反応させた。反応終了後、生成した２Ｓ，４Ｒ−モナティンを定量したところ、０．８７ｍＭであった。２Ｓ，４Ｒ−モナティンの定量は、ＵＰＬＣ分析により行った。分析条件は実施例２９と同様である。【０２０９】
実施例３７：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＪ１４４４由来アミノトランスフェラーゼの精製
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＪ１４４４の可溶性画分から、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成するアミノトランスフェラーゼの精製を以下の通り行った。実施例２５と同様にして、２Ｓ，４Ｒ−モナティン合成反応および２Ｓ，４Ｒ−モナティンの定量を行った。【０２１０】
（１）可溶性画分の調製
ＬＢ寒天培地にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＪ１４４４を塗布し、３０℃で２日間培養した。
得られた菌体を酵素生産培地（酵母エキス  １０ｇ／ｌ、トリプトン  １０ｇ／ｌ、グルコース  １ｇ／ｌ、リン酸水素二カリウム  ３ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム  １ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム七水和物  ０．１ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム  ５ｇ／ｌ）１６０ｍｌに一白金耳接種し、５００ｍｌ容坂口フラスコで３０℃にて１６時間振とう培養した。得られた培養液約１７６０ｍｌより菌体を遠心分離により集め、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭにて洗浄、懸濁してガラスビーズを加え、マルチビーズショッカー（安井器械）にて菌体を破砕した。遠心分離により破砕液から菌体残渣を除き、得られた上清を可溶性画分とした。【０２１１】
（２）硫安沈殿
上記の可溶性画分に硫酸アンモニウム９０％（ｗ／ｗ）を含むよう、硫酸アンモニウムを添加し、遠心分離により硫安沈殿を得た。【０２１２】
（３）疎水性クロマトグラフィー
上記の硫安沈殿を、硫酸アンモニウム  １．０Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ（ｐＨ７．６）に懸濁した。この溶液を硫酸アンモニウム  １．０Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ（ｐＨ７．６）で平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラムＨｉＬｏａｄ  ２６／１０  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、ＣＶ＝５３ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかった非吸着タンパク質を硫酸アンモニウム  １．０Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭを用いて洗い流した後、硫酸アンモニウム濃度を１．０Ｍから０Ｍまで直線的に変化させて、３ｍｌ／ｍｉｎの流速で２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成酵素を溶出させた。得られた各溶出画分について２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性を測定したところ、約０．２Ｍ硫酸アンモニウム相当の画分に２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が認められた。【０２１３】
（４）陰イオン交換クロマトグラフィー
２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が検出された画分を集めて、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで一晩透析した。得られた溶液を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＨｉＬｏａｄ  １６／１０  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＣＶ＝２０ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで洗い流した後、ＮａＣｌ濃度を０ｍＭから５００ｍＭまで直線的に変化させて、２．２５ｍｌ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。各溶出画分について２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性を検出したところ、約４００ｍＭ  ＮａＣｌ相当の画分に２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が認められた。【０２１４】
（５）ゲル濾過クロマトグラフィー
２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が検出された画分を集めて、アミコン  ウルトラ−１５  １０ｋ（ミリポア）を用いて濃縮した。得られた濃縮液を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭで希釈した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭで平衡化されたゲルろ過カラムＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＣＶ＝１２０ｍｌ）に供し、１．２ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出した。この操作により分子量約８５ｋＤａと見積もられる位置で２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が確認された。【０２１５】
（６）陰イオン交換クロマトグラフィー
２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が検出された画分を集めて、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＭｏｎｏ  Ｑ  ５／５（ファルマシア（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）製、ＣＶ＝１ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで洗い流した後、ＮａＣｌ濃度を０ｍＭから５００ｍＭまで直線的に変化させて、１ｍｌ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。各溶出画分について２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性を検出したところ、約４００ｍＭ  ＮａＣｌ相当の画分に２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が認められた。【０２１６】
（７）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、活性画分には４３ｋＤａ付近にバンドが認められた。このバンドを、２Ｓ，４Ｒ−モナティンを生成するアミノトランスフェラーゼの候補としてＮ末端アミノ酸配列解析に供した。【０２１７】
実施例３８：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＪ１４４４由来アミノトランスフェラーゼのＮ末端アミノ酸配列決定
実施例３７で得られた精製酵素溶液をＮ末端アミノ酸配列解析に供したところ、ＭＳＸＩＡＱＸＩＬＤＱ（配列番号１１２）のＮ末端アミノ酸配列が得られた。Ｎ末端アミノ酸配列は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｒｉａｔｕｍ  ＡＴＣＣ６９４０由来アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＺＰ＿０３９３５５１６）やＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＤＳＭ２０３０６由来アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＺＰ＿０６８３８５１５）と高い相同性を示した。【０２１８】
実施例３９：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＪ１４４４由来アミノトランスフェラーゼ遺伝子のクローニング
実施例３７と同様の方法でＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＪ１４４４を培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、ゲノムＤＮＡを抽出した。
得られたゲノムＤＮＡを鋳型にして、アミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。プライマーは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＤＳＭ２０３０６のゲノムＤＮＡ配列を参考にして、アミノトランスフェラーゼ遺伝子の下流５０ｂｐのＤＮＡ配列から設計した、プライマーＣｏ−ｄ５０−ｒ（５’−ｃｔｔｃｃｔｔｇｇａａｃａａｇｔｃｇａｇｇａａｇａｃ−３’：配列番号５６）、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｒｉａｔｕｍ  ＡＴＣＣ６９４０由来アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＺＰ＿０３９３５５１６）とＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＤＳＭ２０３０６由来アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＺＰ＿０６８３８５１５）のゲノムＤＮＡ配列で相同性の高い部分配列を参考にして設計した、プライマーＣｏ−８００−ｆ（５’−ｇｃｔａｔｃｇｃａｃａａｔｔｃｃａｃｃｇｃａｃｃｔｔ−３’：配列番号５７）を用いた。ＰＣＲは、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（東洋紡）を用いて以下の条件で行った。
１  ｃｙｃｌｅ      ９４℃、２ｍｉｎ
２５  ｃｙｃｌｅｓ    ９８℃、１０ｓｅｃ
５５℃、１０ｓｅｃ
６８℃、６０ｓｅｃ
１  ｃｙｃｌｅ      ６８℃、６０ｓｅｃ
４℃【０２１９】
増幅した約４００ｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、その配列を基にしてプライマーＣｏ−８９０−ｒ（５’−ａｃａｔｃｇｔｔａａｇｃａａｇｃｇａａｃｃａｃｃａｇ−３’：配列番号５８）、およびプライマーＣｏ−１０６０−ｒ（５’−ｇａａａｇａｃａａｇｃｇａａｔｇｔｇｇｔｇｃｔｃｇ−３’：配列番号５９）を設計し、ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（東洋紡）を用いて以下の条件で行った。
１  ｃｙｃｌｅ      ９４℃、２ｍｉｎ
２５  ｃｙｃｌｅｓ    ９８℃、１０ｓｅｃ
５５℃、１０ｓｅｃ
６８℃、６０ｓｅｃ
１  ｃｙｃｌｅ      ６８℃、６０ｓｅｃ
４℃【０２２０】
その結果、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＤＳＭ２０３０６由来アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＭＰＲＥＦ０２８１＿０２４８０）と相同性の高い、１１３４ｂｐのＯＲＦを含む塩基配列が明らかとなった（配列番号６０、６１）。相同性はＤＮＡ配列で７６％、アミノ酸配列で８２％であった。
実施例３８で得られたＮ末端アミノ酸配列とも一致したため、２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性を有するアミノトランスフェラーゼの遺伝子を取得できたと考えられた。【０２２１】
実施例４０：Ｅ．ｃｏｌｉでのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＪ１４４４由来アミノトランスフェラーゼ発現
（１）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＪ１４４４由来アミノトランスフェラーゼ発現プラスミドの構築
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＪ１４４４のゲノムＤＮＡを鋳型にして、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＪ１４４４由来アミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。プライマーは、プライマー１４４４ＡＴ−Ｎｄｅ−ｆ（５’−ｇｇａａｔｔｃｃａｔＡＴＧＡＧＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＡＣＧＣＡＴＣＣ−３’：配列番号６２）およびプライマー１４４４−ｘｈｏ−ｒ（５’−ａｃｔｃｃｇｃｔｃｇａｇＧＧＡＣＴＴＴＴＣＧＡＡＧＴＡＴＴＧＧＣＧＡＡＴＧ−３’：配列番号６３）を用いた。ＰＣＲは、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（東洋紡）を用いて以下の条件で行った。
１  ｃｙｃｌｅ      ９４℃、２ｍｉｎ
２５  ｃｙｃｌｅｓ    ９８℃、１０ｓｅｃ
５５℃、１０ｓｅｃ
６８℃、６０ｓｅｃ
１  ｃｙｃｌｅ      ６８℃、６０ｓｅｃ
４℃【０２２２】
得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ、ＸｈｏＩで制限酵素処理し、同様にＮｄｅＩ、ＸｈｏＩで処理したｐＥＴ−２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを抽出し、このプラスミドをｐＥＴ−２２−１４４４ＡＴ−Ｈｉｓと命名した。このプラスミドでは、Ｃ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付与されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＪ１４４４由来アミノトランスフェラーゼ（１４４４ＡＴ−Ｈｉｓ）が発現する。【０２２３】
（２）Ｅ．ｃｏｌｉ発現株からの１４４４ＡＴ−Ｈｉｓ精製
構築した発現プラスミドｐＥＴ−２２−１４４４ＡＴ−ＨｉｓをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、形質転換体をアンピシリン１００ｍｇ／ｌを含むＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＴＢ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ）  １６０ｍｌに白金耳接種し、５００ｍｌ容坂口フラスコを用いて３７℃で１６時間振盪させた。培養終了後、得られた培養液約１０００ｍｌより菌体を遠心分離により集め、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｉｍｉｄｏｚｏｌｅ  １０ｍＭにて洗浄、懸濁し、４℃で３０分間超音波破砕した。遠心分離により破砕液から菌体残渣を除き、得られた上清を可溶性画分とした。
得られた可溶性画分を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｉｍｉｄｏｚｏｌｅ  １０ｍＭで平衡化したＨｉｓ−ｔａｇタンパク質精製カラムＨｉｓ  ＴＡＬＯＮ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  ５ｍｌ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｉｍｉｄｏｚｏｌｅ  １０ｍＭで用いて洗い流した後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｉｍｉｄｏｚｏｌｅ  １５０ｍＭを用いて５ｍｌ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。
得られた画分を集めて、アミコン  ウルトラ−１５  ３０ｋ（ミリポア）を用いて濃縮した。濃縮液を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）２０ｍＭで希釈し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＨｉＬｏａｄ  １６／１０  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＣＶ＝２０ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）２０ｍＭで用いて洗い流した後、ＮａＣｌ濃度を０ｍＭから５００ｍＭまで直線的に変化させて、３ｍｌ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。
各溶出画分について２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性を確認し、２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性が認められた画分を集めて、アミコン  ウルトラ−１５  ３０ｋ（ミリポア）を用いて濃縮した。濃縮液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで希釈し、１４４４ＡＴ−Ｈｉｓ溶液とした。【０２２４】
実施例４１：ＡＪ１４４４ＬＡＴの各種ケト酸に対する比活性測定結果
（１）比色法でのＬ−Ａｓｐ／α−ＫＧ、Ｌ−Ａｓｐ／ＰＡ、Ｌ−Ａｓｐ／（±）−ＭＨＯＧ、Ｌ−Ｇｌｕ／ＰＡ、およびＬ−Ｇｌｕ／±ＭＨＯＧ活性測定
ＡＪ１４４４ＬＡＴの各種基質に対する活性測定を実施した。アミノ基転移反応のアミノドナー基質としては１００ｍＭ  Ｌ−ＡｓｐまたはＬ−Ｇｌｕを用い、１０ｍＭの各種ケト酸に対する比活性を比色法で測定した。
Ｌ−Ａｓｐ／α−ＫＧ活性：Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １００ｍＭ、α−ＫＧ−２Ｎａ  １０ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００ｍＭ、ＮＡＤＨ  ０．２５ｍＭ、ＭＤＨ  ２Ｕ／ｍｌ、２５℃。３４０ｎｍの減少から活性を算出。ＭＤＨはＭａｌｉｃ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｈｅａｒｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。なお、Ｌ−Ａｓｐ／α−ＫＧ活性は、表１７において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「α−ＫＧ」に示す。
Ｌ−Ａｓｐ／ＰＡ活性：Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １００ｍＭ、ＰＡ−Ｎａ  １０ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００ｍＭ、ＮＡＤＨ  ０．２５ｍＭ、ＭＤＨ（上記と同様）２Ｕ／ｍｌ、２５℃。３４０ｎｍの減少から活性を算出。なお、Ｌ−Ａｓｐ／ＰＡ活性は、表１７において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「ＰＡ」に示す。
Ｌ−Ａｓｐ／（±）−ＭＨＯＧ活性：Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １００ｍＭ、（±）−ＭＨＯＧ  １０ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００ｍＭ、ＮＡＤＨ  ０．２５ｍＭ、ＭＤＨ（上記と同様）２Ｕ／ｍｌ、ＬＤＨ  １０Ｕ／ｍｌ、２５℃。３４０ｎｍの減少から活性を算出。ＬＤＨはＤ−Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ（オリエンタル酵母）を用いた。（±）−ＭＨＯＧに微量に混在しているＰＡを除くため、ＬＤＨを添加した。なお、Ｌ−Ａｓｐ／（±）−ＭＨＯＧ活性は、表１７において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「±ＭＨＯＧ」に示す。
Ｌ−Ｇｌｕ／ＰＡ活性：Ｌ−Ｇｌｕ−Ｎａ  １００ｍＭ、ＰＡ  １０ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  １００ｍＭ、ＮＨ４Ｃｌ  １００ｍＭ、ＮＡＤＨ  ０．２５ｍＭ、ＧＤＨ  １０Ｕ／ｍｌ、２５℃。３４０ｎｍの減少から活性を算出。ＧＤＨはＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｌｉｖｅｒ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。なお、Ｌ−Ｇｌｕ／ＰＡ活性は、表１７において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「ＰＡ」に示す。
Ｌ−Ｇｌｕ／（±）−ＭＨＯＧ活性：Ｌ−Ｇｌｕ−Ｎａ  １００ｍＭ、（±）−ＭＨＯＧ  １０ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  １００ｍＭ、ＮＨ４Ｃｌ  １００ｍＭ、ＮＡＤＨ  ０．２５ｍＭ、ＧＤＨ  １０Ｕ／ｍｌ、２５℃。３４０ｎｍの減少から活性を算出。なお、Ｌ−Ｇｌｕ／（±）−ＭＨＯＧ活性は、表１７において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「±ＭＨＯＧ」に示す。【０２２５】
（２）Ｌ−Ａｓｐ／４Ｒ−ＩＨＯＧ、Ｌ−Ａｓｐ／（±）−ＩＨＯＧ、Ｌ−Ａｓｐ／ＩＰＡ、Ｌ−Ｇｌｕ／４Ｒ−ＩＨＯＧ、およびＬ−Ｇｌｕ／ＩＰＡ活性測定
目的活性である４Ｒ−ＩＨＯＧからの２Ｓ，４Ｒ−モナティン生成活性、（±）−ＩＨＯＧからの２Ｓ，４Ｒ−モナティン及び２Ｓ，４Ｓ−モナティン生成活性、及びＩＰＡからのＬ−Ｔｒｐ副生活性をそれぞれ測定した。アミノ基転移反応のアミノドナー基質としては１００ｍＭ  Ｌ−ＡｓｐまたはＬ−Ｇｌｕを用い、１０ｍＭの各種ケト酸に対するアミノ基転移反応を行い、生成したアミノ酸量をＵＰＬＣで定量し、比活性を算出した。
Ｌ−Ａｓｐ／４Ｒ−ＩＨＯＧ活性：Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １００ｍＭ、４Ｒ−ＩＨＯＧ  １０ｍＭ（微量の４Ｓ−ＩＨＯＧ含む）、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  １００ｍＭ、２５℃。ＵＰＬＣ分析を行い、生成した２Ｓ，４Ｒ−モナティン、２Ｓ，４Ｓ−モナティンを定量した。反応停止液は２００ｍＭ  クエン酸Ｎａ溶液（ｐＨ４．５）を用いた。なお、Ｌ−Ａｓｐ／４Ｒ−ＩＨＯＧ活性は、表１７において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「４Ｒ−ＩＨＯＧ」に示す。
Ｌ−Ａｓｐ／（±）−ＩＨＯＧ活性：Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １００ｍＭ、（±）−ＩＨＯＧ  １０ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  １００ｍＭ、２５℃。ＵＰＬＣ分析を行い、生成した２Ｓ，４Ｒ−モナティン、２Ｓ，４Ｓ−モナティンを定量した。反応停止液は２００ｍＭ  クエン酸Ｎａ溶液（ｐＨ４．５）を用いた。なお、Ｌ−Ａｓｐ／（±）−ＩＨＯＧ活性は、表１７において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「±ＩＨＯＧ」に示す。
Ｌ−Ａｓｐ／ＩＰＡ活性：Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １００ｍＭ、ＩＰＡ  １０ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  １００ｍＭ（ｐＨは反応液作成後に１Ｎ  ＮａＯＨで８．０に調整）、２５℃。ＵＰＬＣ分析を行い、生成したＴｒｐを定量した。反応停止液は２００ｍＭ  クエン酸Ｎａ溶液（ｐＨ４．５）を用いた。なお、Ｌ−Ａｓｐ／ＩＰＡ活性は、表１７において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「ＩＰＡ」に示す。
Ｌ−Ｇｌｕ／４Ｒ−ＩＨＯＧ活性：Ｌ−Ｇｌｕ−Ｎａ  １００ｍＭ、４Ｒ−ＩＨＯＧ  １０ｍＭ（微量の４Ｓ−ＩＨＯＧ含む）、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  １００ｍＭ、２５℃。ＵＰＬＣ分析を行い、生成した２Ｓ，４Ｒ−モナティン、２Ｓ，４Ｓ−モナティンを定量した。反応停止液は２００ｍＭ  クエン酸Ｎａ溶液（ｐＨ４．５）を用いた。なお、Ｌ−Ｇｌｕ／４Ｒ−ＩＨＯＧ活性は、表１７において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「４Ｒ−ＩＨＯＧ」に示す。
Ｌ−Ｇｌｕ／ＩＰＡ活性：Ｌ−Ｇｌｕ−Ｎａ  １００ｍＭ、ＩＰＡ  １０ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）  １００ｍＭ（ｐＨは反応液作成後に１Ｎ  ＮａＯＨで８．０に調整）、２５℃。ＵＰＬＣ分析を行い、生成したＴｒｐを定量した。反応停止液は２００ｍＭ  クエン酸Ｎａ溶液（ｐＨ４．５）を用いた。なお、Ｌ−Ｇｌｕ／ＩＰＡ活性は、表１７において、アミノトランスフェラーゼ活性の項目「ＩＰＡ」に示す。【０２２６】
生成したモナティン及びＴｒｐの定量はＷａｔｅｒｓ社製  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステムを用いて定量した。測定条件を以下に示す。０．２ｍｌで１５分間反応を行ってから反応停止し、反応停止後の反応液を遠心し上清０．２ｍｌ程度をＵＰＬＣ分析に供した。【０２２７】
【表１６】
2012050125.tif 000023
【０２２８】
２Ｓ，４Ｒ−モナティンを１．１ｍｉｎに、２Ｓ，４Ｓ−モナティンを１．５ｍｉｎに、またＴｒｐを１．３ｍｉｎにそれぞれ分別定量できる。【０２２９】
（３）ＡＪ１４４４ＬＡＴの各種ケト酸に対する比活性測定結果
１４４４−ＡＴ−Ｈｉｓを用いて１００ｍＭ  Ｌ−Ａｓｐをアミノドナーとした際の１０ｍＭ  ケト酸に対する比活性測定結果を表１７に示す。【０２３０】
【表１７】
2012050125.tif 000024
【０２３１】
実施例４２：ｐＥＴ−２２−１４４４ＡＴ−Ｈｉｓ／Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を用いた２Ｓ，４Ｒ−モナティン合成反応
実施例４０で作製したｐＥＴ−２２−１４４４ＡＴ−Ｈｉｓ／Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）をアンピシリン１００ｍｇ／ｌを含むＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＴＢ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ）３ｍｌに白金耳接種し、試験管を用いて３７℃で１６時間振盪させた。培養終了後、得られた培養液１ｍｌより菌体を遠心分離により集め、１ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に懸濁した。得られた懸濁液を室温にて１５分間静置して溶菌させ、遠心分離により菌体残渣を除き、得られた上清を可溶性画分とした。
得られた可溶性画分を用いて４Ｒ−ＩＨＯＧからの２Ｓ，４Ｒ−モナティン合成反応を行った。反応液〔Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １００ｍＭ、４Ｒ−ＩＨＯＧ  １０ｍＭ（微量の４Ｓ−ＩＨＯＧ含む）、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １００ｍＭ、ｐＨ８．０〕  ０．１ｍｌに、上記の可溶性画分が０．０５ｍｌ含まれるように加え、２５℃で１５分間反応させた。反応終了後、生成した２Ｓ，４Ｒ−モナティンを定量したところ、０．１３ｍＭであった。２Ｓ，４Ｒ−モナティンの定量は、ＵＰＬＣ分析により行った。分析条件は実施例２９と同様である。【０２３２】
実施例４３：Ｌ−Ｔｒｐ  ２０ｍＭからの２Ｓ，４Ｒ−モナティンのワンポット合成反応（ＡＪ３９７６ＬＡＴ、ＡＪ１２４６９ＬＡＴ、ＡＪ１４４４ＬＡＴ）
精製した３９７６ＡＴ−Ｈｉｓ、１２４６９ＡＴ−Ｈｉｓ、および１４４４ＡＴ−Ｈｉｓを用いて、以下の条件で１２時間反応を行った。反応は試験管を用いて１ｍｌで行った。適宜サンプリングを行い、サンプルをＴＥバッファーで希釈し、アミコンウルトラ−０．５ｍＬ  遠心式フィルター１０ｋＤａ（ミリポア）を用いて限外ろ過、ろ液を分析した。分析にはＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動を用いた。【０２３３】
反応条件：Ｌ−Ｔｒｐ  ２０ｍＭ、ＰＡ−Ｎａ  ４０ｍＭ、Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １６０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １００ｍＭ、ＫＰＢ  ２０ｍＭ、ｐＨ７．０、Ｐｓ＿ａａｄブロス  ２０％、ＳｐＡｌｄ精製酵素  ３０Ｕ／ｍｌ、ＯＡＡ  ＤＣａｓｅ市販酵素１０Ｕ／ｍｌ、ＬＡＴ精製酵素  ２Ｕ／ｍｌ（ｖｓ  １０ｍＭ  ４Ｒ−ＩＨＯＧ）、ＳＯＤ市販酵素２００Ｕ／ｍｌ、２５℃、１２０ｒｐｍ。【０２３４】
反応に供した酵素の調製法を下記に示す。
Ｐｓ＿ａａｄブロス：実施例１７に記載の方法に従って調製した。
ＳｐＡｌｄ精製酵素：実施例１９に記載の方法に従って調整した。
ＡＪ３９７６ＬＡＴ、ＡＪ１２４６９ＬＡＴ、ＡＪ１４４４ＬＡＴ：実施例２８、３４、４０に記載の方法に従って調製した。  
ＯＡＡ  ＤＣａｓｅ：Ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ  Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．（Ｓｉｇｍａ）を用いた。酵素量（Ｕ）は、メーカー記載の値を用いた。
ＳＯＤ：Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｌｉｖｅｒ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。酵素量（Ｕ）は、メーカー記載の値を用いた。【０２３５】
ワンポット反応の結果、ＡＪ３９７６ＬＡＴ、ＡＪ１２４６９ＬＡＴ、ＡＪ１４４４ＬＡＴにおいて、それぞれ４時間後に２Ｓ，４Ｒ−モナティンが１２ｍＭ、１１ｍＭ、１３ｍＭ生成し、対Ｌ−Ｔｒｐ収率はそれぞれ５８％、５３％、６４％であった。【０２３６】
実施例４４：５０ｍＭ  Ｔｒｐからの２Ｓ，４Ｒ−モナティンのワンポット合成反応（ＡＪ３９７６、８０ｍｌスケール）
精製した３９７６ＡＴ−Ｈｉｓを用いて、以下の条件で１２時間反応を行った。反応は２５０ｍｌ容ミニジャーを用いて８０ｍｌで行った。適宜サンプリングを行い、サンプルをＴＥバッファーで希釈し、アミコンウルトラ−０．５ｍＬ  遠心式フィルター  １０ｋＤａ（ミリポア）を用いて限外ろ過、ろ液を分析した。分析にはＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動を用いた。【０２３７】
反応条件：Ｌ−Ｔｒｐ  ５０ｍＭ、ＰＡ−Ｎａ  ５０ｍＭ、Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  ２００ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  １００ｍＭ、ＫＰＢ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＧＤ１１３Ｋ  ０．００２５％、ｐＨ＜７．６（１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）、Ｐｓ＿ａａｄ  ｂｒｏｔｈ  ２０％、ＳｐＡｌｄ精製酵素  ３０Ｕ／ｍｌ、ＯＡＡ  ＤＣａｓｅ市販酵素  １０Ｕ／ｍｌ、ＬＡＴ精製酵素  ２Ｕ／ｍｌ（ｖｓ  １０ｍＭ  ４Ｒ−ＩＨＯＧ）、ＳＯＤ市販酵素  ２００Ｕ／ｍｌ、２５℃、３５０−４００ｒｐｍ、Ａｉｒ  ８ｍｌ／ｍｉｎ（１／１０ｖｖｍ）。【０２３８】
反応に供した酵素の調製法を下記に示す。
Ｐｓ＿ａａｄブロス：実施例１７に記載の方法に従って調製した。
ＳｐＡｌｄ精製酵素：実施例１９に記載の方法に従って調整した。
ＡＪ３９７６ＬＡＴ：実施例２８に記載の方法に従って調製した。  
ＯＡＡ  ＤＣａｓｅ：Ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ  Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．（Ｓｉｇｍａ）を用いた。酵素量（Ｕ）は、メーカー記載の値を用いた。
ＳＯＤ：Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｌｉｖｅｒ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。酵素量（Ｕ）は、メーカー記載の値を用いた。【０２３９】
ワンポット反応の結果、８時間後に２７ｍＭ  ２Ｓ，４Ｒ−モナティンの蓄積が確認された。液量補正後に算出された対Ｌ−Ｔｒｐ収率は５６％であった。【０２４０】
実施例４５：Ｅ．ｃｏｌｉでのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ選抜アミノトランスフェラーゼの発現
（１）ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ選抜アミノトランスフェラーゼ発現プラスミドの構築
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏから選抜した各種アミノトランスフェラーゼの遺伝子配列の５’末端にＮｄｅＩ認識配列を、３’末端にＸｈｏＩ認識配列を付与したＤＮＡ配列を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社のＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ  Ｃｏｄｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓに供し、Ｅ．  ｃｏｌｉでの遺伝子発現効率が最適化された合成ＤＮＡを得た。アミノトランスフェラーゼの種類は以下の通りである。
Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  Ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ  ＤＳＭ  １１３００由来Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｄｇｅ，ＡＢＦ４５２４４）（配列番号６４、６５）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  Ｒ由来Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃｇｌ，ＢＡＦ５３２７６）（配列番号６６、６７）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ２７由来Ｌｙｓｎ，Ａｌｐｈａ−Ａｍｉｎｏａｄｉｐａｔｅ  Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＴｔＨＢ，ＡＡＳ８０３９１）（配列番号６８、６９）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  Ｍａｒｉｔｉｍａ由来Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ｐｕｔａｔｉｖｅ（Ｔｍａ１，ＡＡＤ３６２０７）（配列番号７０、７１）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  Ｏｔ３由来Ｈｕｍａｎ  Ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ  Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ＩＩ  Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ（ＰｈｏＨ，１Ｘ０Ｍ）（配列番号７２、７３）、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  Ｌａｐｉｄｅｕｍ由来Ａｓｐａｒｔａｔｅ  Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｐｌａ，ＢＡＢ８６２９０）（配列番号７４、７５）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来Ａｓｐａｒｔａｔｅ  Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｔｔｈ，ＢＡＤ６９８６９）（配列番号７６、７７）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  Ｏｔ３由来Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰｈｏＡ，１ＤＪＵ）（配列番号７８、７９）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来Ｍｊ０６８４（Ｍｊａ，ＡＡＢ９８６７９）（配列番号８０、８１）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  Ｍａｒｉｔｉｍａ由来Ａｓｐａｒｔａｔｅ  Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｔｍａ２，ＡＡＤ３６７６４）（配列番号８２、８３）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来Ａｓｐａｒｔａｔｅ  Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｓｃｅ，ＣＡＹ８１２６５）（配列番号８４、８５）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ由来Ａｓｐａｒｔａｔｅ  Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｅｒｅ，ＡＣＲ７４３５０）（配列番号８６、８７）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ＳＡＦＲ−０３２由来Ａｓｐａｒｔａｔｅ  Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｂｐｕ，ＡＢＶ６２７８３）（配列番号８８、８９）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ  ＤＳＭ  ２５２２由来Ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ，  ＧｎｔＲ  ｆａｍｉｌｙ（Ｂｃｅ，ＡＤＵ３０６１６）（配列番号９０、９１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ（ｓｔｒａｉｎ  ＹＭ−２）由来Ａｓｐａｒｔａｔｅ  Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｓｐＣ（Ｂｓｐ，ＡＡＡ２２２５０）（配列番号９２、９３）、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ  １０２１由来Ａｓｐａｒｔａｔｅ  Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａａｔＢ（ＳｍｅＢ，ＣＡＣ４７８７０）（配列番号９４、９５）、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ  ｓｔｒ．Ｄｅｌｔａ  Ｈ由来Ｂｒａｎｃｈｅｄ−ｃｈａｉｎ  ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｍｔｈ，ＡＡＢ８５９０７）（配列番号９６、９７）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ由来Ａｓｐａｒｔａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｌｂａ，ＡＡＶ４３５０７）（配列番号９８、９９）、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ  １０２１由来Ａｓｐａｒｔａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａａｔＡ（ＳｍｅＡ，ＣＡＣ４６９０４）（配列番号１００、１０１）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ  ＯＴ３由来Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｓｅｒｉｎｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰｈｏＳ，ＢＡＡ３０４１３）（配列番号１０２、１０３）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  ＭＢ４由来ＰＬＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ（Ｔｔｅ，ＡＡＭ２４４３６）（配列番号１０４、１０５）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ  Ｈ１０由来Ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ，  ＧｎｔＲ  ｆａｍｉｌｙ（Ｃｃｅ，ＡＣＬ７５１０１）（配列番号１０６、１０７）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＰＲ４由来Ａｓｐａｒｔａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ＡｓｐＴ（Ｒｅｒ，ＢＡＨ３１０７０）（配列番号１０８、１０９）、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ  ｄｅｇｒａｄａｎｓ  ２−４０由来Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ（Ｓｄｅ，ＡＢＤ８２５４５）（配列番号１１０、１１１）。【０２４１】
【表１８】
2012050125.tif 000025
【０２４２】
合成ＤＮＡをそれぞれＮｄｅＩ、ＸｈｏＩで制限酵素処理し、同様にＮｄｅＩ、ＸｈｏＩで処理したｐＥＴ−２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを抽出した。これらのプラスミドをｐＥＴ−２２−ＡＴ−Ｈｉｓと命名した。これらのプラスミドでは、Ｃ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付与された各種アミノトランスフェラーゼ（ＡＴ−Ｈｉｓ）が発現する。【０２４３】
（２）Ｅ．ｃｏｌｉ発現株からのＡＴ−Ｈｉｓ精製
構築した各種発現プラスミドｐＥＴ−２２−ＡＴ−ＨｉｓをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、形質転換体をアンピシリン１００ｍｇ／ｌを含むＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＴＢ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ）  １００ｍｌに白金耳接種し、５００ｍｌ容坂口フラスコを用いて１６時間振盪させた。振盪温度は、Ｌｂａは２５℃、Ｄｇｅ、Ｐｌａ、Ｔｔｈ、Ｔｍａ２、Ｓｃｅ、Ｅｒｅ、Ｂｐｕ、Ｂｃｅ、Ｂｓｐ、ＳｍｅＡ、ＰｈｏＳ、Ｒｅｒ、Ｓｄｅは３０℃、Ｃｇｌ、ＴｔＨＢ、ＰｈｏＨ、ＰｈｏＡ、ＳｍｅＢ、Ｔｔｅ、Ｃｃｅは３７℃、Ｔｍａ１、Ｍｊａ、Ｍｔｈは４２℃で行った。培養終了後、得られた培養液より菌体を遠心分離により集め、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  １０ｍＭにて洗浄、懸濁し、超音波破砕を行った。遠心分離により破砕液から菌体残渣を除き、得られた上清を可溶性画分とした。
得られた可溶性画分を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  １０ｍＭで平衡化したＨｉｓ−ｔａｇタンパク質精製カラムＨｉｓ  ＴＡＬＯＮ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  ５ｍｌ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  １０ｍＭを用いて洗い流した後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  １５０ｍＭを用いて、５ｍｌ／ｍｉｎの流速で吸着したタンパク質の溶出を行った。得られた画分を集めて、アミコン  ウルトラ−１５  １０ｋ（ミリポア）を用いて濃縮した。濃縮液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）  ２０ｍＭで希釈し、各種ＬＡＴ溶液とした。必要に応じて、培養液量、Ｈｉｓ  ＴＡＬＯＮカラムの連結数を増やして精製を行った。【０２４４】
実施例４６：Ｌ−Ｔｒｐ  ２０ｍＭからの２Ｓ，４Ｒ−モナティンのワンポット合成反応
精製した各種ＡＴ−Ｈｉｓを用いて、以下の条件で１５時間反応を行った。反応は試験管を用いて１ｍｌで行った。反応終了後にサンプルをＴＥバッファーで希釈し、アミコンウルトラ−０．５ｍＬ  遠心式フィルター１０ｋＤａ（ミリポア）を用いて限外ろ過、ろ液を分析した。分析にはＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動を用いた。【０２４５】
反応条件：Ｌ−Ｔｒｐ  ２０ｍＭ、ＰＡ−Ｎａ  ４０ｍＭ、Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １６０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １００ｍＭ、ＫＰＢ  ２０ｍＭ、ｐＨ７．０、Ｐｓ＿ａａｄブロス  ２０％、ＳｐＡｌｄ精製酵素  ３０Ｕ／ｍｌ、ＯＡＡ  ＤＣａｓｅ市販酵素１０Ｕ／ｍｌ、ＬＡＴ精製酵素  １ｍｇ／ｍｌ、ＳＯＤ市販酵素２００Ｕ／ｍｌ、２５℃、１２０ｒｐｍ。【０２４６】
反応に供した酵素の調製法を下記に示す。
Ｐｓ＿ａａｄブロス：実施例１７に記載の方法に従って調製した。
ＳｐＡｌｄ精製酵素：実施例１９に記載の方法に従って調整した。
各種ＬＡＴ：実施例４５に記載の方法に従って調製した。
ＯＡＡ  ＤＣａｓｅ：Ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ  Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．（Ｓｉｇｍａ）を用いた。酵素量（Ｕ）は、メーカー記載の値を用いた。
ＳＯＤ：Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｌｉｖｅｒ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。酵素量（Ｕ）は、メーカー記載の値を用いた。【０２４７】
ワンポット反応の結果を表１９に示す。Ｔｔｈ、Ｂｐｕ、ＳｍｅＡ、Ｓｄｅにおいて、それぞれ２Ｓ，４Ｒ−モナティンが１１ｍＭ、１６ｍＭ、６ｍＭ、８ｍＭ生成し、対Ｌ−Ｔｒｐ収率はそれぞれ５５％、７８％、２８％、４２％であった。【０２４８】
【表１９】
2012050125.tif 000026
【０２４９】
実施例４７：Ｌ−Ｔｒｐ  ２０ｍＭからの２Ｓ，４Ｒ−モナティンのワンポット合成反応（Ｔｔｈ、Ｂｐｕ、ＳｍｅＡ、Ｓｄｅ）
精製した各種ＡＴ−Ｈｉｓを用いて、以下の条件で１５時間反応を行った。反応は試験管を用いて１ｍｌで行った。反応終了後にサンプルをＴＥバッファーで希釈し、アミコンウルトラ−０．５ｍＬ  遠心式フィルター１０ｋＤａ（ミリポア）を用いて限外ろ過、ろ液を分析した。分析にはＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動を用いた。【０２５０】
反応条件：Ｌ−Ｔｒｐ  ２０ｍＭ、ＰＡ−Ｎａ  ４０ｍＭ、Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ−１ａｑ  １６０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １００ｍＭ、ＫＰＢ  ２０ｍＭ、ｐＨ７．０、Ｐｓ＿ａａｄブロス  ２０％、ＳｐＡｌｄ精製酵素  ３０Ｕ／ｍｌ、ＯＡＡ  ＤＣａｓｅ市販酵素１０Ｕ／ｍｌ、ＬＡＴ精製酵素  ３ｍｇ／ｍｌ（Ｔｔｈは１２ｍｇ／ｍｌ、Ｂｐｕは１ｍｇ／ｍｌ）、ＳＯＤ市販酵素２００Ｕ／ｍｌ、２５℃、１２０ｒｐｍ。【０２５１】
反応に供した酵素の調製法を下記に示す。
Ｐｓ＿ａａｄブロス：実施例１７に記載の方法に従って調製した。
ＳｐＡｌｄ精製酵素：実施例１９に記載の方法に従って調整した。
各種ＬＡＴ：実施例４５に記載の方法に従って調製した。
ＯＡＡ  ＤＣａｓｅ：Ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ  Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．（Ｓｉｇｍａ）を用いた。酵素量（Ｕ）は、メーカー記載の値を用いた。
ＳＯＤ：Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｌｉｖｅｒ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。酵素量（Ｕ）は、メーカー記載の値を用いた。【０２５２】
ワンポット反応の結果を表２０に示す。Ｔｔｈ、Ｂｐｕ、ＳｍｅＡ、Ｓｄｅにおいて、それぞれ２Ｓ，４Ｒ−モナティンが１８  ｍＭ、１７  ｍＭ、１１  ｍＭ、１２ｍＭ生成し、対Ｌ−Ｔｒｐ収率はそれぞれ９２％、８７％、５４％、６１％であった。【０２５３】
【表２０】
2012050125.tif 000027
【０２５４】
実施例４８：Ｌ−Ｔｒｐ  １００ｍＭからの２Ｓ，４Ｒ−モナティンのワンポット合成反応（Ｔｔｈ、Ｂｐｕ、ＳｍｅＡ、Ｓｄｅ）
Ｔｔｈ、Ｂｐｕ、ＳｍｅＡ、Ｓｄｅの精製したＡＴ−Ｈｉｓを用いて、以下の条件で１８時間反応を行った。反応は試験管を用いて１ｍｌで行った。反応終了後にサンプルをＴＥバッファーで希釈し、アミコンウルトラ−０．５ｍＬ  遠心式フィルター１０ｋＤａ（ミリポア）を用いて限外ろ過、ろ液を分析した。分析にはＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動を用いた。【０２５５】
反応条件：Ｌ−Ｔｒｐ  １００ｍＭ、ＰＡ−Ｎａ  ５０ｍＭ、Ｌ−Ａｓｐ−Ｎａ  ３００ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ＰＬＰ  ５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １００ｍＭ、ＫＰＢ  ２０ｍＭ、ｐＨ７．０、Ｐｓ＿ａａｄブロス  ４０％、ＳｐＡｌｄ精製酵素  ６０Ｕ／ｍｌ、ＯＡＡ  ＤＣａｓｅ市販酵素１０Ｕ／ｍｌ、ＬＡＴ精製酵素  ３ｍｇ／ｍｌ（Ｔｔｈは１２ｍｇ／ｍｌ）、ＳＯＤ市販酵素２００Ｕ／ｍｌ、２５℃、１５０ｒｐｍ。【０２５６】
反応に供した酵素の調製法を下記に示す。
Ｐｓ＿ａａｄブロス：実施例１７に記載の方法に従って調製した。
ＳｐＡｌｄ精製酵素：実施例１９に記載の方法に従って調整した。
各種ＬＡＴ：実施例４５に記載の方法に従って調製した。
ＯＡＡ  ＤＣａｓｅ：Ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ  Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．（Ｓｉｇｍａ）を用いた。酵素量（Ｕ）は、メーカー記載の値を用いた。
ＳＯＤ：Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｌｉｖｅｒ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。酵素量（Ｕ）は、メーカー記載の値を用いた。【０２５７】
ワンポット反応の結果を表２１に示す。Ｔｔｈ、Ｂｐｕ、ＳｍｅＡ、Ｓｄｅにおいて、それぞれ２Ｓ，４Ｒ−モナティンが７２ｍＭ、４６ｍＭ、６．４ｍＭ、２０ｍＭ生成し、対Ｌ−Ｔｒｐ収率はそれぞれ７２％、４６％、６．４％、２０％であった。【０２５８】
【表２１】
2012050125.tif 000028
【０２５９】
（微生物の情報）
本明細書中に記載される、受託番号で特定された微生物は、その受託番号を参照することにより、所定の受託機関から入手可能である。表２２に記載される微生物は、ブダペスト条約上の国際寄託機関である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に下記の日付で寄託され、下記の受託番号が付されている。なお、表２２に記載されるように、これらの微生物は、異なる名称が従来付されていたが、再同定の結果、現在は以下のとおり分類されている。【０２６０】
【表２２】
2012050125.tif 000029
【０２６１】
また、表２３に記載される微生物は、異なる名称が従来付されていたが、再同定の結果、現在は以下のとおり分類されている。なお、菌株Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＡＪ１３１２７は、受託番号ＦＥＲＭ−ＢＰ５５６８により特定される公知の菌株と同一である。【０２６２】
【表２３】
2012050125.tif 000030
【産業上の利用可能性】
【０２６３】
以上のように、本発明の方法は、甘味料として使用できるモナティンの製造のために有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０２６４】
配列番号１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号２：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号３：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子（塩基番号２３１〜１５３８）、ならびにその上流および下流領域のヌクレオチド配列
配列番号４：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ由来のアミノトランスフェラーゼ断片のアミノ酸配列
配列番号５：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ由来のアミノトランスフェラーゼ断片のアミノ酸配列
配列番号６：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを増幅するためのフォワードプライマー（Ｂｐ−ｕ２００−ｆ）
配列番号７：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを増幅するためのリバースプライマー（Ｂｐ−ｄ２００−ｒ）
配列番号８：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを増幅するためのフォワードプライマー（１６１６ＡＴ−Ｎｄｅ−ｆ）
配列番号９：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを増幅するためのリバースプライマー（１６１６−ｘｈｏ−ｒ）
配列番号１０：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子上に見出される、ＮｄｅＩにより認識されるＤＮＡ配列を変換するためのフォワードプライマー（１６１６−ｄｅｌＮｄｅ−ｆ）
配列番号１１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子上に見出される、ＮｄｅＩにより認識されるＤＮＡ配列を変換するためのリバースプライマー（１６１６−ｄｅｌＮｄｅ−ｒ）
配列番号１２：ＳｐＡｌｄ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを増幅するためのフォワードプライマー（ＳｐＡｌｄ−ｆ−ＮｄｅＩ）
配列番号１３：ＳｐＡｌｄ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを増幅するためのリバースプライマー（ＳｐＡｌｄ−ｒ−ＨｉｎｄＩＩＩ）
配列番号１４：ＳｐＡｌｄ遺伝子内のレアコドン６Ｌを変換するためのフォワードプライマー（６Ｌ−ｆ）
配列番号１５：ＳｐＡｌｄ遺伝子内のレアコドン６Ｌを変換するためのリバースプライマー（６Ｌ−ｒ）
配列番号１６：ＳｐＡｌｄ遺伝子内のレアコドン１３Ｌを変換するためのフォワードプライマー（１３Ｌ−ｆ）
配列番号１７：ＳｐＡｌｄ遺伝子内のレアコドン１３Ｌを変換するためのリバースプライマー（１３Ｌ−ｒ）
配列番号１８：ＳｐＡｌｄ遺伝子内のレアコドン１８Ｐを変換するためのフォワードプライマー（１８Ｐ−ｆ）
配列番号１９：ＳｐＡｌｄ遺伝子内のレアコドン１８Ｐを変換するためのリバースプライマー（１８Ｐ−ｒ）
配列番号２０：ＳｐＡｌｄ遺伝子内のレアコドン３８Ｐを変換するためのフォワードプライマー（３８Ｐ−ｆ）
配列番号２１：ＳｐＡｌｄ遺伝子内のレアコドン３８Ｐを変換するためのリバースプライマー（３８Ｐ−ｒ）
配列番号２２：ＳｐＡｌｄ遺伝子内のレアコドン５０Ｐを変換するためのフォワードプライマー（５０Ｐ−ｆ）
配列番号２３：ＳｐＡｌｄ遺伝子内のレアコドン５０Ｐを変換するためのリバースプライマー（５０Ｐ−ｒ）
配列番号２４：ＳｐＡｌｄ遺伝子内のレアコドン７７Ｐ、８１Ｐおよび８４Ｒを変換するためのフォワードプライマー（７７Ｐ−８１Ｐ−８４Ｒ−ｆ）
配列番号２５：ＳｐＡｌｄ遺伝子内のレアコドン７７Ｐ、８１Ｐおよび８４Ｒを変換するためのリバースプライマー（７７Ｐ−８１Ｐ−８４Ｒ−ｒ）
配列番号２６：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ  ＡＪ１６１６由来のアミノトランスフェラーゼ変異体Ｋ３９Ｒを調製するためのフォワードプライマー（Ｋ３９Ｒ＿ＦＷ）
配列番号２７：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ  ＡＪ１６１６由来のアミノトランスフェラーゼ変異体Ｋ３９Ｒを調製するためのリバースプライマー（Ｋ３９Ｒ＿ＲＶ）
配列番号２８：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ  ＡＪ１６１６由来のアミノトランスフェラーゼ変異体Ｓ２５８Ｇを調製するためのフォワードプライマー（Ｓ２５８Ｇ＿ＦＷ）
配列番号２９：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ  ＡＪ１６１６由来のアミノトランスフェラーゼ変異体Ｓ２５８Ｇを調製するためのリバースプライマー（Ｓ２５８Ｇ＿ＲＶ）
配列番号３０：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ  ＡＪ１６１６由来のアミノトランスフェラーゼ変異体Ｔ２８８Ｇを調製するためのフォワードプライマー（Ｔ２８８Ｇ＿ＦＷ）
配列番号３１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ  ＡＪ１６１６由来のアミノトランスフェラーゼ変異体Ｔ２８８Ｇを調製するためのリバースプライマー（Ｔ２８８Ｇ＿ＲＶ）
配列番号３２：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ  ＡＪ１６１６由来のアミノトランスフェラーゼ変異体Ｉ２８９Ａを調製するためのフォワードプライマー（Ｉ２８９Ａ＿ＦＷ）
配列番号３３：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ  ＡＪ１６１６由来のアミノトランスフェラーゼ変異体Ｉ２８９Ａを調製するためのリバースプライマー（Ｉ２８９Ａ＿ＲＶ）
配列番号３４：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ  ＡＪ１６１６由来のアミノトランスフェラーゼ変異体Ｑ２８７Ｅ／Ｔ２８８Ｇを調製するためのフォワードプライマー（Ｑ２８７Ｅ／Ｔ２８８Ｇ＿ＦＷ）
配列番号３５：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ  ＡＪ１６１６由来のアミノトランスフェラーゼ変異体Ｑ２８７Ｅ／Ｔ２８８Ｇを調製するためのリバースプライマー（Ｑ２８７Ｅ／Ｔ２８８Ｇ＿ＲＶ）
配列番号３６：ａｓｐＣ遺伝子を破壊するためのＤＮＡフラグメントを調製するためのプライマー（ａｓｐＣ−Ｌ１）
配列番号３７：ａｓｐＣ遺伝子を破壊するためのＤＮＡフラグメントを調製するためのプライマー（ａｓｐＣ−Ｒ１）
配列番号３８：ａｓｐＣ遺伝子領域内のａｔｔＬ−ｃａｔ−ａｔｔＲの挿入を確認するためのプライマー（ａｓｐＣ−ｕｐ）
配列番号３９：ａｓｐＣ遺伝子領域内のａｔｔＬ−ｃａｔ−ａｔｔＲの挿入を確認するためのプライマー（ａｔｔＬ−１）
配列番号４０：ａｓｐＣ遺伝子領域内のａｔｔＬ−ｃａｔ−ａｔｔＲの挿入を確認するためのプライマー（ａｓｐＣ−ｄｏｗｎ）
配列番号４１：ａｓｐＣ遺伝子領域内のａｔｔＬ−ｃａｔ−ａｔｔＲの挿入を確認するためのプライマー（ａｔｔＲ−１）
配列番号４２：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来のオキザロ酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号４３：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来のオキザロ酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子のアミノ酸配列
配列番号４４：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ由来のアミノトランスフェラーゼ断片のアミノ酸配列
配列番号４５：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｔｒ．Ｃ５８由来のゲノムＤＮＡ配列に基づいて設計されたフォワードプライマー（Ａｇ−ｕ１００−ｆ）
配列番号４６：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｔｒ．Ｃ５８由来のゲノムＤＮＡ配列に基づいて設計されたリバースプライマー（Ａｇ−ｄ１００−ｒ）
配列番号４７：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号４８：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号４９：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを増幅するためのフォワードプライマー（３９７６ＡＴ−Ｎｄｅ−ｆ）
配列番号５０：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを増幅するためのリバースプライマー（３９７６−ｘｈｏ−ｒ）
配列番号５１：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．由来のアミノトランスフェラーゼ断片のアミノ酸配列
配列番号５２：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号５３：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号５４：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを増幅するためのフォワードプライマー（１２４６９ＡＴ−Ｎｄｅ−ｆ）
配列番号５５：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを増幅するためのリバースプライマー（１２４６９−ｘｈｏ−ｒ）
配列番号５６：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＤＳＭ２０３０６由来のゲノムＤＮＡ配列に基づいて設計されたフォワードプライマー（Ｃｏ−ｄ５０−ｒ）
配列番号５７：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｒｉａｔｕｍ  ＡＴＣＣ６９４０由来のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＺＰ＿０３９３５５１６）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＤＳＭ２０３０６由来のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼに対応するゲノムＤＮＡ配列の間の相同領域に基づいて設計されたリバースプライマー
配列番号５８：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを増幅するためのフォワードプライマー（Ｃｏ−８９０−ｒ）
配列番号５９：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを増幅するためのリバースプライマー（Ｃｏ−１０６０−ｒ）
配列番号６０：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号６１：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号６２：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを増幅するためのフォワードプライマー（１４４４ＡＴ−Ｎｄｅ−ｆ）
配列番号６３：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを増幅するためのリバースプライマー（１４４４−ｘｈｏ−ｒ）
配列番号６４：Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号６５：Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号６６：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号６７：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号６８：Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号６９：Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号７０：Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号７１：Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号７２：Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号７３：Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号７４：Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｌａｐｉｄｅｕｍ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号７５：Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｌａｐｉｄｅｕｍ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号７６：Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号７７：Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号７８：Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号７９：Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号８０：Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号８１：Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号８２：Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号８３：Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号８４：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号８５：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号８６：Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号８７：Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号８８：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号８９：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号９０：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号９１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号９２：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号９３：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号９４：Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号９５：Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号９６：Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号９７：Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号９８：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号９９：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号１００：Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号１０１：Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号１０２：Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号１０３：Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号１０４：Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号１０５：Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号１０６：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号１０７：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号１０８：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号１０９：Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号１１０：Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ  ｄｅｇｒａｄａｎｓ由来のアミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号１１１：Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ  ｄｅｇｒａｄａｎｓ由来のアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列
配列番号１１２：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ由来のアミノトランスフェラーゼ断片のアミノ酸配列
【図１】
2012050125.tif 000031
【図２】
2012050125.tif 000032
【図３】
2012050125.tif 000033
【図４】
2012050125.tif 000034
【図５】
2012050125.tif 000035
【図６】
2012050125.tif 000036
【配列表】
2012050125000001.app
【国際調査報告】
2012050125.tif 000037
2012050125.tif 000038
2012050125.tif 000039
2012050125.tif 000040