(57)【要約】  動脈−静脈ループを備え、毛細血管網を構築させた血管床を作製し、その血管床上へ細胞シートを積層し、培地を生体外で灌流することで細胞シート内に血管網を構築させることを特徴とする細胞シート積層化物の製造方法。この製造方法によれば、細胞シート内に血管網を構築させられ、その細胞シートを積層化すれば厚みのある細胞シート積層化物を簡便に作製することができるようになる。このような厚みのある細胞シート積層化物は生体内組織様のものとして、さまざまな組織の再生医療や、薬剤等の評価に有用なものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動脈−静脈ループを備え、毛細血管網が構築された血管床上に細胞シートを積層し、培地を生体外で灌流することで得られる毛細血管網を構築したことを特徴とする細胞シート積層化物。
【請求項２】
血管床が生体組織片である、請求項１の細胞シート積層化物。
【請求項３】
生体組織片が皮弁である、請求項２記載の細胞シート積層化物。
【請求項４】
生体組織片が筋肉由来のものである、請求項２、３のいずれか１項記載の細胞シート積層化物。
【請求項５】
血管床が、生体適合性基材により区切られた領域内に動脈−静脈ループを内包し、区切られた領域内にゲルを充填し、生体内に留置することで毛細血管網を構築させたものである、請求項１記載の細胞シート積層化物。
【請求項６】
ゲルが生分解性ポリマー及び／または細胞からなる、請求項５記載の細胞シート積層化物。
【請求項７】
培地が、血管新生促進に関与するサイトカイン含んだものである、請求項１〜６のいずれか１項記載の細胞シート積層化物。
【請求項８】
細胞シートが、０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力が弱い温度域で細胞を培養し、その後、培養液をポリマーの水和力が強い状態となる温度に変化させることで培養した細胞をシート状で剥離させたものである、請求項１〜７のいずれか１項記載の細胞シート積層化物。
【請求項９】
０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーがポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）である、請求項１〜８のいずれか１項記載の細胞シート積層化物。
【請求項１０】
細胞シートが積層化された回数が４以上である、請求項９記載の細胞シート積層化物。
【請求項１１】
細胞が、心臓組織、肝組織、腎組織、副腎組織、皮膚組織、粘膜組織をそれぞれ構成する細胞であって、それぞれの組織において、いずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したものである、請求項１〜１０のいずれか１項記載の細胞シート積層化物。
【請求項１２】
血管内皮細胞が含まれる、請求項１１記載の細胞シート積層化物。
【請求項１３】
得られた細胞シート積層化物を生体内へ移植することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項記載の細胞シート積層化物の利用方法。
【請求項１４】
心筋組織へ移植し、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される少なくとも1種の心臓の疾患または障害の治療を目的とする、請求項１３記載の細胞シート積層化物の利用方法。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか１項記載の細胞シート積層化物を利用した薬剤の評価方法。
【請求項１６】
細胞シート積層化物を構成する細胞にレポーター遺伝子が導入された請求項１５記載の薬剤の評価方法。
【請求項１７】
レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である請求項１６記載の薬剤の評価方法。
【請求項１８】
評価する薬剤が心臓疾患に関与する薬剤である請求子１７記載の薬剤の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、生物、創薬、薬学等の分野において有用な細胞シート積層化物の製造方法、それより得られる血管網を有する細胞シート積層化物及びその利用方法に関するものである。本出願は、２０１０年９月１４日に提出された日本出願（特願２０１０−２２５２００）を基礎とする優先権主張出願である。
【背景技術】
【０００２】
今日、動物細胞培養技術が著しく進歩し、動物細胞を対象とした研究開発もさまざまな分野に広がって実施されるようになってきた。対象となる動物細胞の使われ方も、開発当初の細胞そのものを製品化したり、その産生物を製品化したりするだけでなく、今や細胞やその細胞表層蛋白質を分析することで有効な医薬品を設計したり、患者本人の細胞を生体外で再生したり、或いはその機能を高めたりしてから生体内へ戻し治療する等ということも実施されつつある。現在、動物細胞を培養する技術、並びに評価、解析、利用する技術は、研究者が注目している一分野である。ところで、ヒト細胞を含め動物細胞の多くは付着依存性のものである。すなわち、動物細胞を生体外で培養しようとするときは、それらを一度、基材表面に付着させる必要性がある。そして、培養した細胞をばらばらに剥離させず、その基材表面上で培養した形態を保持したまま剥離させる必要性も出てきている。【０００３】
特に患者本人の細胞を生体外で再生する技術について言えば、近年、治療困難となった臓器を他人の臓器と置き換えようとする臓器移植が一般化してきた。対象となる臓器も皮膚、角膜、腎臓、肝臓、心臓等と実に多様で、また、術後の経過も格段に良くなり、医療の一技術としてすでに確立されつつある。一例として角膜移植をあげると、約５０年前に日本にもアイバンクが設立され移植活動が始められた。しかしながら、未だにドナー数が少なく、国内だけでも角膜移植の必要な患者が年間約２万人いるのに対し、実際に移植治療が行える患者は約１／１０の２０００人程度でしかないといわれている。角膜移植というほぼ確立された技術があるにもかかわらず、ドナー不足という問題のため、次なる医療技術が求められているのが現状である。このような背景のもと、患者本人の正常な細胞を所望の大きさまで培養し移植しようとする技術が開発された。【０００４】
特開平０２−２１１８６５号公報（特許文献１）には、水に対する上限若しくは下限臨界溶解温度が０〜８０℃であるポリマーで基材表面を被覆した細胞培養支持体上にて、細胞を上限臨界溶解温度以下または下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下にすることにより酵素処理なくして培養細胞を剥離させる新規な細胞培養法が示されている。また、特開平０５−１９２１３８号公報（特許文献２）には、この温度応答性細胞培養基材を利用して皮膚細胞を上限臨界溶解温度以下或いは下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上或いは下限臨界溶解温度以下にすることにより培養皮膚細胞を低損傷で剥離させることが記載されている。温度応答性細胞培養基材を利用することにより、従来の培養技術に対しさまざまな新規な展開をはかれるようになってきた。さらに、再表０２−００８３８７号公報（特許文献３）では温度応答性ポリマーで基材表面を被覆した細胞培養支持体上で心筋組織の細胞を培養し、心筋様細胞シートを得、その後、培養液温度を上限臨界溶解温度以上又は下限臨界溶解温度以下とし、培養した重層化細胞シートをポリマー膜に密着させ、そのままポリマー膜と共に剥離させること、及びそれを所定の方法で３次元構造化させることにより、構造欠陥の少ない、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの心筋様組織として幾つかの機能を備えた細胞シート、及び３次元構造が構築されることを見いだした。しかしながら、上述した従来技術では心筋様細胞シートの積層化は無限に行えるものではなく、３層程度が限界であり、簡便に多数回積層化できる技術が強く望まれていた。【０００５】
以上のような問題点を解決するため、ＦＡＳＥＢ．Ｊ．，２０（６），７０８−７１０（２００６）（非特許文献１）では生体内で細胞シートを積層化することが試みられ、１ｍｍ厚の心筋シート積層化物の得られたことが示されている。その中で、厚みのある細胞シート積層化物を得るためには、積層化された各細胞もしくは各細胞シートへ栄養や酸素が供給されることが必須であることが分かったが、ＦＡＳＥＢ．Ｊ．，２０（６），７０８−７１０（２００６）（非特許文献１）の方法では、生体内へ細胞シートを繰り返して移植する必要があり、その都度、移植部位を開口しなくてはならず、被移植側に大きな負担を強いる方法であり、この課題を解決するような、簡便に多数回積層化できる技術が強く望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平０２−２１１８６５号公報
【特許文献２】特開平０５−１９２１３８号公報
【特許文献３】再表０２−００８３８７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＦＡＳＥＢ．Ｊ．，２０（６），７０８−７１０（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上述したような細胞シートの積層化に関する問題点を解決することを意図してなされたものである。すなわち、本発明は、従来技術と全く異なった発想に基づいて創作した新規な細胞シート積層化物の製造方法、それより得られる血管網を有する細胞シート積層化物及びその利用方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、動脈−静脈ループを備え、毛細血管網を構築させた血管床を作製し、その血管床上へ細胞シートを積層し、生体外で培地を灌流することで細胞シート内に血管網を構築することが出来、簡便に細胞シートを厚く積層化できることを見出した。また、それにより得られた血管網付き細胞シート積層化物を利用し、生体外において薬剤の生体組織に対する効果を評価ができることを見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。【００１０】
すなわち、本発明は、動脈−静脈ループを備え、毛細血管網を構築させた血管床を作製し、その血管床上へ細胞シートを積層し、生体内の組織片に対し生体外で培地を灌流することで細胞シート内に血管網を構築させることを特徴とする細胞シート積層化物の製造方法を提供するものである。さらに、本発明はそれより得られた細胞シート積層化物を提供するものである。さらに本発明は、その細胞シート積層化物を利用する方法を提供するものである。本発明は、血管床を利用して厚さをもった細胞シート積層化物を生体外において作製することができるという世界に類のない新規な発想による細胞構造物を使ってはじめて実現する極めて重要な発明と考えている。なお、本発明において、細胞シート積層化物を細胞シート積層体、重層化細胞シート積層体と表現することがあるが、いずれも細胞シートを複数枚積層して得られるものを示しており、これらの表現の違いにより何ら制限が加えられるものではない。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に示される製造方法であれば、細胞シート内に血管網を構築させられ、その細胞シートを積層化すれば厚みのある細胞シート積層化物を簡便に作製することができるようになる。このような厚みのある細胞シート積層化物は生体内組織様のものとして移植することが可能となり、さまざまな組織の再生医療に有用なものになると期待される。また、血管床を利用して得られた血管網付き細胞シート積層化物を利用することで、生体外において薬剤の生体組織に対する効果を簡便に評価ができるようになる。このような評価系は、実験動物の代替となるばかりでなく、動物の個体差に依存しない安定的なデータが得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１の血管床作製時の概要を示す図である。
【図２】実施例１で得られた血管床へ培地を灌流させたときのようすを示す図である。
【図３】実施例１で使用した血管床へ循環した培地の概要を示す図である。
【図４】実施例１の細胞シート積層化物内の血管網のようすを示す図である。
【図５】実施例１の細胞シート積層化物内の血管網のようすを示す図である。
【図６】実施例２の細胞シート積層化物の活性を示す図である。
【図７】実施例３の細胞シート積層化物をさらに重ねたときのようすを示す図である。
【図８】実施例４の細胞シート積層化物の血管新生を促進するサイトカインを探索した結果を示す図である。ラットから血液を採取し、血清中に含まれるサイトカイン濃度をELISA法にて測定した。
【図９】実施例５の血管床作製時の概念図を示す図である。
【図１０】実施例４で作製した血管床内に新たに形成された毛細血管を示した図である。矢印で挟まれた領域が新たに新生された毛細血管である。
【図１１】実施例４で作製した細胞シート積層化物の機能を確かめるために生体内へ再移植した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、厚みのある細胞シート積層化物を簡便に作製することを目的としている。そのためには、上述したように細胞シート積層化物中に血管網が構築されることが求められる。その血管網を簡便に構築させるために、本発明では動脈及び静脈を備え血流のあった生体組織片を採取し、生体外で培地を灌流することで血管床とし、その血管床上へ細胞シートを積層することで細胞シート内に血管網を構築させることを特徴としている。
【００１４】
血管床とは、生体組織、臓器で見られる構造であり、毛細血管とその周辺の組織を合わせた構造をいう。血管床は、血管床内に無数に張り巡らされた毛細血管の薄い壁を介し、生体組織内の酸素、ブドウ糖、その他の栄養素を交換する機能を果たしている。二酸化炭素のような老廃物は血管床の毛細血管内へ滲出する。生体組織において組織液が比較的一定に保たれているのは、毛細血管での物質交換が存在するからである。本発明においては、細胞シート内に効率的に毛細血管網を構築させ、栄養素や酸素等を供給するために血管床を利用した。
【００１５】
本発明において利用する血管床は動脈及び静脈を備え血流のあった生体組織片、皮弁、または動脈及び静脈を備えた人工血管床であればいずれでも良く、特に限定される訳ではない。例えば、生体組織片として、筋肉、腸間膜、大網等がすでに血管網が高度に構築されており好都合である。その中で、筋肉は生体組織上、栄養や酸素が十分に供給される部位であり、すなわち血管網がより一層高度に構築されておりさらに好都合である。本発明では、これらの組織片、皮弁、また動脈及び静脈を備えた人工血管床に対し、さらに血管網を構築させても良い。その方法は特に限定されるものではないが、例えば、組織片、皮弁に対し、一部の血管を閉じ血管網をさらに構築し血流が循環するまで生体内で処理を行う方法、その際に無菌的な容器内にその組織片、皮弁を閉じ込め、生体と動静脈だけで繋がっている状態を作製し、血管網がさらに構築し血流が循環するまで生体内で処理を行う方法、ＶＥＧＦやＦＧＦ等の血管新生を促進するサイトカインを投与する方法等が挙げられる。本発明で用いられる血管床の動物種の由来は、特に制約されるものではないが、例えば、ヒト、或いはラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、チンパンジーあるいはそれらの免疫不全動物等が挙げられるが、本発明の細胞シート積層化物をヒトの治療に用いる場合はヒト、ブタ、サル、チンパンジー由来の血管床を用いる方が望ましい。
【００１６】
動脈―静脈ループとは、動脈と静脈が繋がり、血液、培地などの液体成分を一箇所又は複数箇所の血管から流入させた際、流入させた血管以外の一箇所又は複数箇所の血管から液体成分が流出するような流路が構築された血管流路のことをいう。動脈―静脈ループの長さについては特に限定されるものではないが、血管床の大きさにより適宜決められる。動脈と静脈とをつなぐ方法についても特に限定されるものではないが、動脈と静脈との間に毛細血管網を構築させて良く、切断された動脈の一端と切断された静脈の一端を吻合して作製してもよい。動脈と静脈との間に毛細血管網を構築する方法についても特に限定するものではないが、例えば、動脈と静脈がそれぞれ繋がっている生体組織片を電気メス等で切離し、生体組織片と動脈と静脈がそれぞれ１本ずつ繋がった状態を作り出し、その状態を維持したまま、一週間程度、生体内に留置する方法が挙げられる。その結果、動脈と静脈との間に毛細血管の短絡(動静脈ループ)が起こり、動脈から毛細血管網を介して静脈へ戻る流路が構築される。
【００１７】
本発明における人工血管床とは、毛細血管網が構築され、毛細血管網の間をゲル及び／または細胞により充填された血管床様構造物のことをいう。生体組織由来の血管床は、毛細血管を構成する細胞の他、組織由来の様々な細胞が含まれている。そのため、生体組織由来の血管床上で細胞シート積層化物を灌流培養する際、血管床由来の細胞代謝物も細胞シート積層体に混入する場合がある。混入する細胞代謝物は、血管床上の細胞シートの維持培養にとって好ましい場合や、細胞シート内の血管網形成を促進し、好ましい場合もある。その一方、混入する細胞代謝物は、細胞シートを構成する細胞の種類によっては、維持培養に悪影響を及ぼす場合や、積層化した細胞シートの使用用途（例えば、移植に利用、又は細胞シートの活性を評価する場合）によっては好ましくない場合もある。生体由来の血管床、又は人工血管床を選択するかは、目的に応じて選択すればよく、特に限定するものではない。
【００１８】
動脈及び静脈を備えた人工血管床を作製する方法は特に限定される訳ではないが、例えば、無菌的な容器内により区切られた領域内に生体内の動脈と静脈を吻合した動脈―静脈ループを内包し、区切られた領域内にゲルを充填し、生体内に留置することで毛細血管網を構築させる方法が挙げられる。人工血管床を作製する容器としては、生体適合性基材であれば特に限定されるものではなく、医療用器具等の分野において一般的な素材を用いることができる。具体例としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリウレタン、ポリウレア、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリ(メタ)アクリル酸、ポリ(メタ)アクリル酸誘導体、ポリアクリロニトリル、ポリ(メタ)アクリルアミド、ポリ(メタ)アクリルアミド誘導体、ポリスルホン、ポリカーボネート、セルロース、セルロース誘導体、ポリシリコーン、ガラス、セラミック、金属等が挙げられる。これらの素材は単独で用いられていても、組み合わせて用いられていてもよい。人工血管床のサイズは、作製する細胞シート積層化物、移植する細胞シート積層化物、人工血管床を作製する生体組織の部位等により適宜最適化することができ、特に限定されるものではない。
【００１９】
人工血管床に充填するゲルは特に限定されないが、得られた細胞シート積層化物を生体内へ移植治療に利用することを目的とした場合は、生分解性ポリマーからなるゲルが好都合である。また、その場合、生分解性ポリマー部が生体内で消失し、本発明の細胞シート積層化物が生体と血管を通して繋がることとなる。そのような生分解性ポリマーの種類は特に限定されないが、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、多糖類、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、キチン、キトサン等の単独、もしくは２種以上の混合物が挙げられる。
【００２０】
人工血管床に充填するゲルに細胞を混ぜても良い。ゲルに混合させる細胞は生体組織から直接採取した細胞、直接採取し培養系等で分化させた細胞、或いは細胞株が挙げられるがその種類は、何ら制約されるものではない。例えば、心筋組織の再生、或いは心筋機能を評価する方法を目的とした場合、使用する細胞としては心筋細胞、心筋芽細胞、筋芽細胞、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。肝組織の再生、肝組織を模擬した人工肝臓の作製、或いは肝組織の機能を評価する方法等を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、肝実質細胞、類洞内皮細胞、クッパー細胞、星細胞、ピット細胞、胆管上皮細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。腎組織の再生、腎組織を模擬した人工腎臓の作製、或いは腎機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、腎細胞、顆粒細胞、集合管上皮細胞、壁側上皮細胞、足細胞、メサンギウム細胞、平滑筋細胞、尿細管細胞、間在細胞、糸球体細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。副腎組織の再生、副腎を模擬した人工副腎の作製、或いは副腎機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、副腎髄質細胞、副腎皮質細胞、球状層細胞、束状層細胞、網上層細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。皮膚の再生、或いは皮膚機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、表皮角化細胞、メラノサイト、立毛筋細胞、毛包細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。粘膜組織の再生、或いは粘膜組織の機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、粘膜を構成する組織から採取される細胞を使用すればよい。粘膜の種類としては、頬側粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、嗅上皮、口腔粘膜、子宮粘膜などが挙げられる。粘膜組織から採取される細胞のうち、いずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。
【００２１】
上記の細胞の含有比率についても特に限定されるものではない。その際、人工血管床内に血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞等が混合されていると、人工血管床内の血管網の構築が効率良く行われ、好都合である。
【００２２】
人工血管床に充填するゲルに、あらかじめ、血管新生を促進する血管増殖因子等を混合させておくことで、血管網を構築させてもよい。人工血管床に血管誘導を施す方法も特に限定されるものではないが、例えば、ゲルに直接血管増殖因子を混合させる方法、血管増殖因子であるＦＧＦをミクロスフィアに包埋し、このミクロスフィアをゲルと混合し、長時間ミクロスフェアからＦＧＦが放出される方法などが挙げられる。
【００２３】
血管床中で灌流される培地の流速は特に限定されるものではなく、血管床内の流路が破壊されない程度の流速を最大の流速とし、灌流された培地が血管床内へ浸み出し、培地が血管床表面へ到達できる流速を最小の流速とすれば良い。その数値としては流路のサイズや血管床の性質、大きさ、細胞シートのサイズ等の因子が大きく影響するため、具体的に示すことはできない。
【００２４】
本発明は、こうして得られた血管網を有する生体組織片、皮弁、又は動脈及び静脈を備えた人工血管床を生体外へ分離して生体外の灌流培養装置に設置し、血管床の上に生着した細胞シートへ血管網を構築させようとするものである。その際、血管床内を循環させるものは培地、血液、血清等と特に限定されるものではないが、取り扱いが簡便なものとしては培地が挙げられる。その培地の種類についても、培養する細胞の種類に応じて、定法に従い適宜選択すればよく、特に限定されるものではないが、血管床上で培養される細胞シートを構成する細胞に適したものが好ましい。例えば、心筋細胞からなる細胞シートを血管床上で積層化するならば心筋細胞を培養するＭ１９９培地などが好適である。本発明の細胞シートに使用される細胞の種類は特に限定されるものではなく、得られた細胞シート積層化物を使って移植したい部位の細胞、又は評価を行いたい臓器由来若しくは組織由来の細胞を使用すれば良い。例えば、心筋組織の再生、或いは心筋機能を評価する方法を目的とした場合、使用する細胞としては心筋細胞、心筋芽細胞、筋芽細胞、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。肝組織の再生、肝組織を模擬した人工肝臓の作製、或いは肝組織の機能を評価する方法等を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、肝実質細胞、類洞内皮細胞、クッパー細胞、星細胞、ピット細胞、胆管上皮細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。腎組織の再生、腎組織を模擬した人工腎臓の作製、或いは腎機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、腎細胞、顆粒細胞、集合管上皮細胞、壁側上皮細胞、足細胞、メサンギウム細胞、平滑筋細胞、尿細管細胞、間在細胞、糸球体細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。副腎組織の再生、副腎を模擬した人工副腎の作製、或いは副腎機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、副腎髄質細胞、副腎皮質細胞、球状層細胞、束状層細胞、網上層細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。皮膚の再生、或いは皮膚機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、表皮角化細胞、メラノサイト、立毛筋細胞、毛包細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。粘膜組織の再生、或いは粘膜組織の機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、粘膜を構成する組織から採取される細胞を使用すればよい。粘膜の種類としては、頬側粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、嗅上皮、口腔粘膜、子宮粘膜などが挙げられる。粘膜組織から採取される細胞のうち、いずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。
【００２５】
上記の細胞の含有比率についても特に限定されるものではない。その際、細胞シート内に血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞等が混合されていると、人工血管床内の血管網の構築が効率良く行われ、好都合である。
【００２６】
本発明で用いられる細胞は、生体組織から直接採取した細胞、直接採取し培養系等で分化させた細胞、或いは細胞株が挙げられるがその種類は、何ら制約されるものではない。これらの細胞の由来は特に制約されるものではないが、例えば、ヒト、或いはラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、チンパンジーあるいはそれらの免疫不全動物等が挙げられるが、本発明の細胞シート積層化物をヒトの治療に用いる場合はヒト、ブタ、サル、チンパンジー由来の細胞を用いる方が望ましい。
【００２７】
本発明に利用される細胞は特に限定するものではないが、例えば細胞を試薬、タンパク質、遺伝子等の少なくとも１つ以上の方法によって蛍光染色及び/または色素染色したものでも良い。レポーター遺伝子が導入されている細胞を利用した際、レポーター遺伝子が発現して作られるレポータータンパクによる蛍光、又はレポータータンパクが特異的な基質と反応する際に放出する蛍光を検出すれば、細胞シート又は細胞シート積層体の活性を知ることができる。利用されるレポーター遺伝子、又はレポータータンパク質は特に限定されないが、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ＤｓＲｅＤ、β−グルクロニダーゼ、ＬａｃＺ、カエデ、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ等が挙げられる。細胞へ遺伝子を導入する方法は定法に従えば良く、特に限定されないが、例えば、リポフェクション法、ウイルスベクター法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。また、これらの遺伝子導入法を利用して、レポーター遺伝子が宿主ゲノム内に導入された遺伝子導入動物（トランスジェニック  アニマル）由来の細胞を利用しても良い。レポーター遺伝子の発現を調節するプロモーター配列についても特に限定されるものではなく、レポーター遺伝子発現の検出目的に応じ、適宜選択すればよい。
【００２８】
本発明における細胞シートは、０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力が弱い温度域で細胞を培養し、その後、培養液をポリマーの水和力が強い状態となる温度に変化させることで培養した細胞をシート状に剥離させることで得られる。その際、細胞は０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力の弱い温度域で培養される。その温度とは通常、細胞を培養する温度である３７℃が好ましい。本発明に用いる温度応答性高分子はホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このような高分子としては、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体が挙げられ、コポリマーの場合は、これらの中で任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。その際、培養、剥離されるものが細胞であることから、分離が５℃〜５０℃の範囲で行われるため、温度応答性ポリマーとしては、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド（同５６℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３２℃）などが挙げられる。本発明に用いられる共重合のためのモノマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリアクリル酸及びその塩、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなどの含水ポリマーなどが挙げられるが、特に制約されるものではない。
【００２９】
本発明で用いられる、上述の各ポリマーの基材表面への被覆方法は、特に制限されないが、例えば、基材と上記モノマーまたはポリマーを、電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理、有機重合反応のいずれかにより、または塗布、混練等の物理的吸着等により行うことができる。培養基材表面への温度応答性ポリマーの被覆量は、１．１〜２．３μｇ／ｃｍ２の範囲が良く、好ましくは１．４〜１．９μｇ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは１．５〜１．８μｇ／ｃｍ２である。１．１μｇ／ｃｍ２より少ない被覆量のとき、刺激を与えても当該ポリマー上の細胞は剥離し難く、作業効率が著しく悪くなり好ましくない。逆に２．３μｇ／ｃｍ２以上であると、その領域に細胞が付着し難く、細胞を十分に付着させることが困難となる。このような場合、温度応答性ポリマー被覆層の上にさらに細胞接着性タンパク質を被覆すれば、基材表面の温度応答性ポリマー被覆量は２．３μｇ／ｃｍ２以上であっても良く、その際の温度応答性ポリマーの被覆量は９．０μｇ／ｃｍ２以下が良く、好ましくは８．０μｇ／ｃｍ２以下が良く、７．０μｇ／ｃｍ２以下が好都合である。温度応答性ポリマーの被覆量が９．０μｇ／ｃｍ２以上であると温度応答性ポリマー被覆層の上にさらに細胞接着性タンパク質を被覆しても細胞が付着し難くなり好ましくない。そのような細胞接着性タンパク質の種類は何ら限定されるものではないが、例えば、コラーゲン、ラミニン、ラミニン５、フィブロネクチン、マトリゲル等の単独、もしくは２種以上の混合物が挙げられる。また、これらの細胞接着性タンパク質の被覆方法は常法に従えば良く、通常、細胞接着性タンパク質の水溶液を基材表面に塗布し、その後その水溶液を除去しリンスする方法がとられている。本発明は、温度応答性培養皿を利用したなるべく細胞シートそのものを利用しようとする技術である。従って、温度応答性ポリマー層上の細胞接着性タンパク質の被覆量が極度に多くなっては好ましくない。温度応答性ポリマーの被覆量、並びに細胞接着性タンパク質の被覆量の測定は常法に従えば良く、例えばＦＴ−ＩＲ−ＡＴＲを用いて細胞付着部を直接測る方法、あらかじめラベル化したポリマーを同様な方法で固定化し細胞付着部に固定化されたラベル化ポリマー量より推測する方法などが挙げられるがいずれの方法を用いても良い。
【００３０】
本発明の方法において、培養時に播種する細胞数は使用細胞の動物種によって異なるが、一般的に０．４×１０６〜２．５×１０６個／ｃｍ２が良く、好ましくは０．５×１０６〜２．１×１０６個／ｃｍ２が良く、さらに好ましくは０．６×１０６〜１．７×１０６個／ｃｍ２が良い。播種濃度が０．４×１０６個／ｃｍ２以下の場合、一般に細胞の増殖が悪く、得られる細胞シートの機能の発現程度が悪化し、本発明を実施する点において好ましくない。本発明においては、培養した細胞シートを温度応答性基材から剥離回収するには、培養された細胞の付着した培養基材の温度を培養基材上の被覆ポリマーの上限臨界溶解温度以上若しくは下限臨界溶解温度以下にすることによって剥離させることができる。その際、培養液中において行うことも、その他の等張液中において行うことも可能であり、目的に合わせて選択することができる。細胞をより早く、より高効率に剥離、回収する目的で、基材を軽くたたいたり、ゆらしたりする方法、更にはピペットを用いて培地を撹拌する方法等を単独で、あるいは併用して用いてもよい。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知のウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。
【００３１】
以上のことを温度応答性ポリマーとしてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を例にとり説明する。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は３１℃に下限臨界溶解温度を有するポリマーとして知られ、遊離状態であれば、水中で３１℃以上の温度で脱水和を起こしポリマー鎖が凝集し、白濁する。逆に３１℃以下の温度ではポリマー鎖は水和し、水に溶解した状態となる。本発明では、このポリマーがシャーレなどの基材表面に被覆、固定されたものである。したがって、３１℃以上の温度であれば、基材表面のポリマーも同じように脱水和するが、ポリマー鎖が基材表面に被覆、固定されているため、基材表面が疎水性を示すようになる。逆に、３１℃以下の温度では、基材表面のポリマーは水和するが、ポリマー鎖が基材表面に被覆、固定されているため、基材表面が親水性を示すようになる。このときの疎水的な表面は細胞が付着、増殖できる適度な表面であり、また、親水的な表面は細胞が付着できないほどの表面となり、培養中の細胞、もしくは細胞シートも冷却するだけで剥離させられることになる。
【００３２】
被覆を施される基材としては、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の化合物を初めとして、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外のポリマー化合物、セラミックス類など全て用いることができる。
【００３３】
本発明における培養基材の形状は特に制約されるものではないが、例えばディッシュ、マルチプレート、フラスコ、多孔膜上で培養するセルインサートのような形態のもの、或いは平膜状のものなどが挙げられる。被覆を施される基材としては、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の化合物を初めとして、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外の高分子化合物、セラミックス類などが挙げられる。
【００３４】
本発明における細胞シートは培養時にディスパーゼ、トリプシン等で代表される蛋白質分解酵素による損傷を受けていないものである。そのため、基材から剥離された細胞シートは接着性蛋白質を有し、細胞をシート状に剥離させた際には細胞−細胞間のデスモソーム構造がある程度保持されたものとなる。このことにより、血管床上へ載せたとき良好に接着することができ、効率良く生着することができるようになる。一般に蛋白質分解酵素であるディスパーゼに関しては、細胞−細胞間のデスモソーム構造については１０〜４０％保持した状態で剥離させることができることで知られているが、細胞−基材間の基底膜様蛋白質等を殆ど破壊してしまうため、得られる細胞シートは強度の弱いものとなる。これに対して、本発明の細胞シートは、デスモソーム構造、基底膜様蛋白質共に６０％以上残存された状態のものであり、上述したような種々の効果を得ることができるものである。
【００３５】
本発明における細胞シートの積層体を作製する方法についても特に限定されるものではないが、例えば、培養細胞をシート状で剥離させ、必要に応じ培養細胞移動治具を用いて培養細胞シート同士を積層化させることで得られる。その際、培地の温度は、培養基材表面に被覆された前記ポリマーが上限臨界溶解温度を有する場合はその温度以下、また前記ポリマーが下限臨界溶解温度を有する場合はその温度以上であれば特に制限されない。しかし、培養細胞が増殖しないような低温域、あるいは培養細胞が死滅するような高温域における培養が不適切であることは言うまでもない。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知のウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。また、必要に応じ、細胞シートを移動させるための治具を利用しても良い。そのような治具としては、剥離した細胞シートを捕捉できるものであれば材質、形状共に何ら限定されるものではないが、それらの材質としては、通常、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、シリコン、ポリビニルアルコール、ウレタン、セルロース及びその誘導体、キチン、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、フィブリングルー等の材料を膜状、多孔膜状、不織布状、織布状として細胞シートに接触させて使用される。
【００３６】
かくして本発明により、厚みのある細胞シート積層化物が得られる。本発明のように血管網を構築させなかった場合、積層化された細胞シートが生存し続けるためには３層程度の積層しかできなかった。本発明によれば細胞シートを４層以上積層化することができるようになる。その際、積層化方法は特に限定されないが、一度に細胞シートを積層化するよりも、３層以下の細胞シートを複数回に分けて積層化する方が好ましい。また、その積層化時期は血管床と繋がる血管網が十分に構築されたときとする方が好ましい。その積層化回数は、細胞シート積層化物が使用される目的に適宜合わせれば良く特に問われないが、好ましくは５層以上、より好ましくは１０層以上、さらに好ましくは１５層以上が良い。細胞シート積層化物の厚みが増せば、本発明の効果を顕著に受けられ、また移植先においても大量の細胞を移植できることとなり好都合である。また、本発明では２枚の細胞シート積層化物の天上面同士を重ね合わせることで、細胞シート積層化物の上面側及び下面側双方に流路を有した構造体を得ることができ、その流路を生体側と繋ぐことで効率良く細胞シート積層物内に栄養、酸素を導入することもできるようになる。
【００３７】
細胞シート積層化物内、及び細胞シート積層化物と血管床との間に毛細血管網の構築を促進させる方法として、血管床に灌流させる培養液、又は血管床全体を浸す培養液、若しくはその両方の培養液中に、血管新生を促進する因子を添加する方法が挙げられる。ここで添加する因子としては、血管新生を誘導する因子であれば良く、特に限定するものではない。例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、アンギオポエチン、トランスフォーミング増殖因子-β（ＴＧＦ−β）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、ＭＭＰ、又は上述した因子のファミリータンパク等が挙げられる。培養液に添加する血管新生を促進する因子としては、上述の中から一つを選んでも良く、二以上を組み合わせても良い。培養液に添加する血管新生を促進する因子の濃度は、細胞シートに含まれる細胞の種類、数、細胞シートの大きさ、血管床の種類他、様々な因子が大きく影響するため、適宜最適化すればよく、ここでは具体的に示すことはできない。なお、本願明細書中において「培養液」と「培地」という用語は同じ意味を表す。
【００３８】
ＶＥＧＦとは血管内皮細胞増殖因子と呼ばれ、一般に血管内皮細胞表面にある血管内皮細胞増殖因子受容体 (ＶＥＧＦＲ) にリガンドとして結合する糖タンパクである。増殖、遊走、分化を刺激したり、プラスミノーゲンアクチベーターやコラゲナーゼといったプロテアーゼ活性、およびコラーゲンゲルの中での血管様構造形成の、いわゆる血管新生の全てのステップを促進し、ｉｎ  ｖｉｖｏでも血管新生を促進する因子として知られる。ＶＥＧＦは微小血管の血管透過性を亢進させたりする働きをもつが、その他単球・マクロファージの活性化にも関与する。本発明の場合、培養液に添加する濃度としては、１ｐｇ／ｍＬ以上が良く、好ましくは１０ｐｇ／ｍＬ以上、最も好ましくは２０ｐｇ／ｍＬ以上である。
【００３９】
ＨＧＦとは肝細胞増殖因子と呼ばれ、一般的に線維芽細胞、マクロファージ、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞などから産生され、主に上皮系細胞の増殖や機能を制御するパラクリン因子としての作用が特徴である因子である。ＨＧＦは肝実質細胞ばかりでなく、血管内皮細胞では遊走能の促進、管腔形成などの形態形成誘導作用、抗アポトーシス作用、血管新生作用および免疫応答調節作用なども有する。本発明の場合、培養液に添加する濃度としては、１５ｎｇ／ｍＬ以上が良く、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ以上、最も好ましくは２５ｎｇ／ｍＬ以上である。
【００４０】
ＦＧＦとは線維芽細胞成長因子と呼ばれ、線維芽細胞をはじめとするさまざまな細胞に対して増殖活性や分化誘導など多彩な作用を示す多機能性細胞間シグナル因子である。現在までに構造上の類似性からヒトにおいて23種類からなるファミリーを形成している。中でも、bFGF（塩基性線維芽細胞増殖因子）は、心筋の虚血部位に注射することによる冠血管新生療法にも用いられることで知られており、心臓の血管新生が促進されることが示されている。本発明の場合、培養液に添加する濃度としては、ｂＦＧＦを１０ｎｇ／ｍＬ以上添加するのが良く、好ましくは１５ｎｇ／ｍＬ以上、最も好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ以上である。
【００４１】
ＰＤＧＦとは血小板由来成長因子と呼ばれ、間葉系細胞（線維芽細胞、平滑筋細胞、グリア細胞等）の遊走および増殖などの調節に関与する他、胎児の成長や血管新生にも関与している増殖因子である。主に巨核球によって産生されるほか、血小板のα顆粒中にも含まれる。ＰＤＧＦは上皮細胞や内皮細胞など様々な細胞によって産生される。ＰＤＧＦにはＰＤＧＦ−Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの少なくとも4種類が存在するが、Ａ鎖およびＢ鎖はジスルフィド結合を形成することによりホモあるいはヘテロ2量体構造をとり3種類のアイソフォーム（ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＡＢ、ＢＢ）を有している。当業者において、ＰＤＧＦ−ＡＡはＰＤＧＦ−aa、ＰＤＧＦ−ＡＢはＰＤＧＦ−aｂ、ＰＤＧＦ−ＢＢはＰＤＧＦ−ｂｂと表現される場合もあり、これらの表現の違いにより、何ら制限を加えられるものではない。本発明の場合、培養液に添加する濃度としては、ＰＤＧＦ−ＢＢを４ｎｇ／ｍＬ以上が良く、好ましくは５ｎｇ／ｍＬ以上、最も好ましくは７ｎｇ／ｍＬ以上である。
【００４２】
ＩＧＦとはインスリン様成長因子と呼ばれ、インスリンと配列が高度に類似したポリペプチドである。ＩＧＦ−２は初期の発生に要求される第一の成長因子であると考えられるのに対し、ＩＧＦ−１の発現は後の段階で見られる。インスリン様成長因子1（ＩＧＦ−１）は主に肝臓で成長ホルモン（ＧＨ）による刺激の結果分泌される。人体の殆どの細胞、特に筋肉、骨、肝臓、腎臓、神経、皮膚及び肺の細胞はＩＧＦ−１の影響を受ける。ＩＧＦ−１によって血管新生が促進することも知られている。本発明の場合、培養液に添加するＩＧＦ−１の濃度としては、６００ｎｇ／ｍＬ以上が良く、好ましくは８００ｎｇ／ｍＬ以上、最も好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬ以上である。
【００４３】
本発明で得られた細胞シート積層化物を生体内の所定部位に移植することができる。その方法は特に問われないが、本発明の細胞シート積層化物に設けられた流路と生体側の血管を繋げる方法、細胞シート積層化物表面を生体へ付着させる方法等が挙げられ、その際、移植部位にあらかじめ血管誘導を施していても良く特に限定されるものではない。ここで、血管誘導を施す方法も特に限定されるものではないが、例えば、血管増殖因子であるＦＧＦをミクロスフィアに包埋し、このミクロスフィアの組成、大きさ、注入範囲を変えながら生体に８〜１０日間作用させる方法、ポリエチレンテレフタレートメッシュを任意の大きさに切り、袋状のものを作製し、そのバッグの内側に、高濃度アガロース溶液に溶解させたＦＧＦを入れ、８〜１０日間後、そのバッグを除去することにより、血管誘導された空間を作製する方法などが挙げられる。
【００４４】
ヒトに対し、本発明の細胞シート積層体を利用すれば、移植された細胞シート積層体はヒトの生体内で機能を長期間発現することとなる。そして、剥離された細胞シート積層体の大きさや形状、もしくは両者で機能の発現量を制御できる。このような細胞シート積層体は、例えば構成する細胞として、心筋細胞、心筋芽細胞、筋芽細胞、間葉系幹細胞のような心臓組織を構成する細胞とすれば、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される疾患または障害を伴う各疾患の治療を目的に使用することができる。また、例えば、肝実質細胞、類洞内皮細胞、クッパー細胞、星細胞、ピット細胞、胆管上皮細胞、間葉系幹細胞のような肝組織を構成する細胞とすれば、肝酵素欠損症、血友病、凝固異常症、肝不全症、劇症肝炎、肝硬変、肝切除患者の治療、感染症等の治療もしくは、肝機能の補佐を目的に使用することができる。また、例えば、腎細胞、顆粒細胞、集合管上皮細胞、壁側上皮細胞、足細胞、メサンギウム細胞、平滑筋細胞、尿細管細胞、間在細胞、糸球体細胞のような腎組織を構成する細胞とすれば、腎機能障害、腎不全、糸球体腎炎の治療、感染症等の治療もしくは、腎機能の補佐を目的に使用することができる。また、例えば、使用する細胞としては、副腎髄質細胞、副腎皮質細胞、球状層細胞、束状層細胞、網上層細胞のような副腎組織を構成する細胞とすれば、副腎皮質不全、副腎皮質機能低下症、クッシング症候群、アルドステロン症、副腎低形成症、副腎酵素欠損症の治療、感染症等の治療もしくは、副腎機能の補佐を目的に使用することができる。また、例えば、使用する細胞としては、表皮角化細胞、メラノサイト、立毛筋細胞、毛包細胞のような表皮組織を構成する細胞とすれば、皮膚移植、毛髪移植を目的に使用することができる。また、例えば、頬側粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、嗅上皮、口腔粘膜、子宮粘膜などの組織から採取される粘膜を構成する細胞とすれば、粘膜疾患の治療、感染症の治療を目的に使用することができる。これらは、使用する細胞種によって適宜、移植先が特定され、特に限定されるものではない。
【００４５】
本発明の血管床上に積層化した細胞シート積層化物を利用することにより、薬剤の効果についての評価を行うことが可能となる。例えば、血管床上に積層化する細胞シートを構成する細胞として、心筋細胞、心筋芽細胞、筋芽細胞、間葉系幹細胞のような心臓組織を構成する細胞とすれば、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される疾患または障害を伴う各疾患の治療を目的に使用される薬剤等の効果を評価することができる。また、例えば、肝実質細胞、類洞内皮細胞、クッパー細胞、星細胞、ピット細胞、胆管上皮細胞、間葉系幹細胞のような肝組織を構成する細胞とすれば、肝酵素欠損症、血友病、凝固異常症、肝不全症、劇症肝炎、肝硬変、肝切除患者の治療、感染症等の治療を目的に使用することができる薬剤等の評価を行うことができる。また、例えば、腎細胞、顆粒細胞、集合管上皮細胞、壁側上皮細胞、足細胞、メサンギウム細胞、平滑筋細胞、尿細管細胞、間在細胞、糸球体細胞のような腎組織を構成する細胞とすれば、腎機能障害、腎不全、糸球体腎炎の治療、感染症等の治療を目的に使用することができる薬剤等の評価を行うことができる。また、例えば、使用する細胞としては、副腎髄質細胞、副腎皮質細胞、球状層細胞、束状層細胞、網上層細胞のような副腎組織を構成する細胞とすれば、副腎皮質不全、副腎皮質機能低下症、クッシング症候群、アルドステロン症、副腎低形成症、副腎酵素欠損症の治療、感染症等の治療を目的に使用することができる薬剤等の評価を行うことができる。また、例えば、使用する細胞としては、表皮角化細胞、メラノサイト、立毛筋細胞、毛包細胞のような皮膚組織を構成する細胞とすれば、皮膚移植、毛髪移植、毛髪再生を目的に使用することができる薬剤等の評価を行うことができる。また、例えば、頬側粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、嗅上皮、口腔粘膜、子宮粘膜などの組織から採取されるような粘膜を構成する細胞とすれば、粘膜疾患の治療、感染症を目的に使用することができる薬剤等の評価を行うことができる。
【００４６】
本発明の血管床に積層化した細胞シート積層化物を利用した生体外における薬剤等の評価方法については、特に限定されるものではないが、例えば、積層化された細胞シートを構成する細胞に導入されたレポーター遺伝子の発現を検出する方法が挙げられる。レポーター遺伝子としても特に限定するものではないが、例えば、レポーター遺伝子として恒常的にルシフェラーゼ遺伝子が発現する細胞の利用が挙げられる。灌流培地にルシフェラーゼタンパクの基質であるルシフェリンを加えることで発光させることができる。細胞シート内に流入する基質量は、細胞シート内に構築された毛細血管網の量に比例する。蛍光強度を測定することにより、細胞シート内における毛細血管網の構築度合いを比較するができる。また、細胞内のＡＴＰ量に比例して、ルシフェラーゼタンパクによる発光も変化する。つまり、発光量を比較することで、細胞の代謝を比較することができる。この原理を利用して、血管床上の細胞シート積層化物に、任意の薬剤等を添加した培地を灌流させ、その後に基質を灌流させることで、細胞シート積層化物に対する薬剤の効果を評価することも可能である。検出される発光量の変化により、細胞の代謝に与える薬剤等の評価を行うことが可能である。このほか、任意の薬剤を添加した培地を灌流培養させた後、培地に溶出するサイトカインやその他のタンパク質、細胞代謝物を検出することにより、細胞シート積層化物に対する薬剤等の効果を評価すること、細胞が生ずる電気的信号を検出することができる。
【００４７】
本発明の血管床に積層化した細胞シート積層化物を利用した生体外における薬剤等の評価方法を用いれば、これまで動物又はヒトに投与しなければ評価できなかった薬剤等の効果を、生体外においても評価できるようになる。また、任意の組織を模擬した細胞シート積層化物を利用するため、他の組織による影響を殆ど受けることなく、薬剤効果を安定的かつ簡便に評価することが可能となる。本発明により新規薬剤等の開発に利用されることが期待される。
【００４８】
動物に対し、本発明の細胞シート及び細胞シート積層体が移植されれば、医薬品評価用動物となる。そして、剥離された細胞シート積層体の大きさや形状で機能の発現量を制御できる。ここで使用される動物はラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ブタ、ヤギ、サル、チンパンジーあるいはそれらの免疫不全動物等が挙げられるが特に限定されるものではない。このような移植動物は、例えば、被検物質をこの動物に投与し、当該被検物質の心機能への影響を判定する心機能評価システム等を目的に使用されるが、特に限定されるものではない。
【実施例】
【００４９】
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００５０】
移植積層化心筋組織内への血管新生を促進させる手段として、ラットの大腿部の表皮を切開し、大腿動静脈を含む四頭筋骨格筋組織を電気メスにより１．５ｃｍ×２．０ｃｍ角で切離し、大腿動静脈のみが１．５ｃｍ×２．０ｃｍ角の四頭筋骨格筋組織と繋がった状態を作り出し、その状態を維持したまま、切開した表皮のみを縫合した。１．５ｃｍ×２．０ｃｍ角に切離した四頭筋骨格筋組織を一週間生体内に留置することで、毛細血管の短絡(動静脈ループ)を起こさせ、動脈から静脈へ戻る血管網を有する臓器様の血管床を作製した（図１）。動静脈ループが起こった血管床をラットの大腿部から完全に切離し、大腿動脈、大腿静脈それぞれを、培地を灌流させるチューブと繋ぎ、培地を血管床内に循環させることができる組織灌流バイオリアクターを作製した（図２）。
血管床バイオリアクターの作製と並行し、心筋細胞シートの作製を行った。心筋細胞は生後0日のSD系ラットの心臓から単離培養した心筋細胞を使用した。仔ラットから心臓摘出後、組織主要構成要素であるコラーゲンを分解する酵素であるコラゲナーゼ TypeII（Worthington社製）を用い心筋細胞を単離した。単離した心筋細胞を320×104  cell/dishの濃度で温度応答性培養皿（φ35 mm、 Dish Upcell Type-E（ Cell Seed社製））に播種した。4日後、心筋細胞が培養皿表面でコンフルエント状態になったところで20℃に温度を降下させることでシート状の心筋細胞群を回収した。このシートを３枚重層化し心筋細胞シートとしてバイオリアクターに接続した血管床上へ移植したところ、細胞シート積層化物を血管床上で培養することができた（図２）。【００５１】
（血管床内及び血管床上の細胞シート積層化物内の毛細血管網を成熟する方法の探索）
ラットの血清中に含まれる血管新生を促進するサイトカインを探索するため、ラットの心臓に穿刺して採血を行い、ＥＬＩＳＡ法にて検出を試みた（n=3）。その結果、ラット血清中には１６ｐｇ／ｍＬのｂＦＧＦが存在することが確認された（図４Ａ）。そこで、組織灌流バイオリアクターにて灌流させる培地にｂＦＧＦを添加することとした。【００５２】
灌流液として、血清中に存在する濃度の１０００倍量である16ng/mLのbFGF添加心筋細胞用培養液を選択し、培養を行った（図３、４）。血管床上に細胞シート積層化物を移植して７２時間培養後、血管新生及び管腔構造を確かめるため、培地の代わりに墨汁を還流させて黒く染色される領域を確認した（図４Ｂ）その結果、bFGFを添加して培養した細胞シートは、bFGF非添加にて灌流培養を行った細胞シート積層化物に比べ、血管床内及び細胞シート積層化物内に黒く染色された領域が広範囲に見られた。この結果より、培地にbFGFを添加すると、血管床及び細胞シート積層化物内に管腔形成を伴った毛細血管網が構築されることが明らかとなった（図４Ｂ）。【００５３】
心筋細胞シートと血管床の間にも毛細血管を介した繋がりが形成されたかどうかについて詳細に確認するため、組織灌流バイオリアクターを用いて３０μL/minの流速において墨汁または血液の灌流を行った。その結果、血管床上に移植した心筋細胞シートの一部が墨（図５上段）または血液（図５下段）で強く染まった（図５）。また、H.E染色およびAzan染色における組織切片の観察においても血管床上の心筋細胞シート内部に墨が流入したことが明らかとなった（図５）。さらにCD31と心筋トロポニンT抗体を用いた免疫組織染色により、墨または赤血球が流入した周辺部には血管内皮細胞が管状の構造を形成していることが分かり、血管を介して栄養や酸素が供給されていることが明らかとなった（図５）。つまり、ＦＡＳＥＢ．Ｊ．，２０（６），７０８−７１０（２００６）（非特許文献１）で試みられたような生体内で細胞シートの積層化を行わなくても、in vitro条件下においても、心筋細胞シート内への血管誘導が可能であることが明らかとなった。
【実施例２】
【００５４】
（血管床上の心筋細胞シート積層体を利用した薬剤効果の測定方法）
血管床上に積層化した細胞シートは、ルシフェラーゼ遺伝子が導入されたトランスジェニックラットの生後０日の心臓から単離した細胞を使用した。実施例１と同様の方法で、血管床上に細胞シートを積層化し、ＦＧＦを添加（16ng/mL）、非添加にて灌流培養を行い、７２時間後、培地の代わりにルシフェラーゼタンパクの基質であるルシフェリンを含んだ培地を灌流し、イメージアナライザにて蛍光強度を測定した（図６）。蛍光強度はシュードカラーで表現されており、暖色であるほど蛍光強度が強いことを示す（図６Ａ、Ｃ）。基質およびＡＴＰ濃度に依存して蛍光し、蛍光が強い程、細胞活性が高い事を示す。蛍光強度をグラフ化したものが図６Ｂ及びＤである。ＦＧＦを添加して灌流培養を行うと、非添加で灌流培養したものに比べて、蛍光強度が強い傾向が見られた。このことから、ＦＧＦを添加して灌流培養した細胞シート積層化物は、非添加で灌流培養したものよりも成熟した血管網が誘導され、細胞シートに流入する培地の量が増加し、高い細胞活性を示すことが明らかとなった。【００５５】
ルシフェラーゼイメージング法を用いて心筋細胞シート積層化物に対する薬剤の評価を試みた。ルシフェラーゼによる蛍光強度は、前述のように細胞活性と細胞シートへ流入するルシフェリン濃度に依存する。積層化した心筋シート積層化物は、血管床上においても拍動が維持されているため、拍動するに合わせて、細胞シート積層化物内の毛細血管は収縮、弛緩する。そのため、収縮時には、灌流する培地の量が一時的に減少する。ルシフェラーゼイメージング法により、蛍光強度を経時的に観察した結果、蛍光強度が増減することが明らかとなった。かかる発見を利用し、心筋細胞に影響を与える薬剤の効果を測定した。薬剤としてはβブロッカーを使用した。βブロッカーとは、交感神経のアドレナリン受容体のうち、β受容体のみに遮断作用を示す薬剤であり、臨床的には降圧薬や労作性狭心症患者の狭心症状予防、不整脈（心房細動、洞性頻脈、期外収縮時の心拍数低下）、心不全患者の心機能改善や突然死亡、心筋梗塞など循環器疾患に対して用いられる。βブロッカーを灌流培地に添加したものと、非添加の培地を用い、実施例１で示した方法により作製した細胞シート積層化物の灌流培地として培養して７２時間培養した。その後、ルシフェリンを添加した培地を灌流させて、ルシフェラーゼイメージング法により、経時的に蛍光強度の変化を観察した。その結果、コントロールの薬剤を加えた心筋細胞シートの拍動の強度、発光回数、発光間隔にはほとんど影響を及ぼさなかったが、βブロッカーを添加した培地で灌流培養を行った心筋細胞シート積層化物では、蛍光強度の低下、発光回数の減少、発光間隔の遅延が見られた。このことから、本発明により、心筋細胞シート積層化物を利用することにより、in Vitroにおいて、心筋機能に影響を及ぼす薬剤の影響を簡便かつ定量的に評価できることが明らかとなった。
【実施例３】
【００５６】
（心筋細胞シートを肥厚化させる方法の探索）
得られた血管網を構築させた細胞シート層の上へさらに３層の心筋細胞シートを生着させ、さらに６日間培養を行った。その結果、灌流液速度を30μL/min、50μL/minのいずれの場合においても、後から載せた細胞シートが生存し、細胞シート内に血管網が構築されていることが分かった（図７）。しかし、30μL/minで灌流培養した細胞シートは、１回目に積層した領域の染色が弱く、50μL/minで灌流培養した時の方が、１回目、２回目共に積層した領域の染色が強いため、厚い細胞シート積層化物を構築する際は、灌流液の流速を速める方が良いことが明らかとなった。これらの結果より血管新生の場として血管床を利用することにより、心筋シート積層化物の内部に毛細血管網を構築する手法を確立できた。
【実施例４】
【００５７】
（細胞シート積層化物内の血管新生を促進するサイトカインの探索）
実施例１より、血管床を利用した灌流バイオリアクターによる細胞シートを積層化させる方法において、灌流させる培養液にbFGFを添加することにより、心筋細胞シート内、及び血管床と細胞シートとの間の毛細血管形成が促進されることが明らかとなった。実施例１では、ラットからの採血方法として心臓への穿刺法を用いた。そのため、穿刺により刺激が加わり、炎症反応等が誘導され、血中サイトカイン濃度に影響を与えた可能性も考えられる。そこで、より刺激が誘導されない採血方法として、断頭採血法を採用し、採血をおこなった。【００５８】
血清中に含まれる血管形成促進に関与するサイトカイン濃度をELISA法にて測定した（図８）。その結果、心臓穿刺法で検出できなかった血管新生に関与するVEGF（22±23pg/ml）の他、bFGF（21±9pg/ml）、HGF（33500±15218pg/ml）、PDGF-bb（7345±2976pg/ml）、IGF-1（1065565±384348pg/ml）が含まれていることが判明し、これらのサイトカインが恒常的に血管新生を促進していることが予測された。【００５９】
そこで、実施例１と同様、血管床に心筋細胞シートを移植し、図２に示す組織灌流バイオリアクターを用いて、VEGFを22pg/ml、bFGFを21pg/ml、HGFを33500pg/ml、PDGF-bbを7345pg/ml、IGF-1を1065565pg/ml、それぞれの量を含む、又は含まない心筋細胞培養液を用い、50μL/minの流速で72時間灌流培養を行った。その結果、VEGF、bFGF、HGF、PDGF-bb、IGF-1それぞれを添加した培養液で灌流培養を行った場合、サイトカインを添加しない培養液と比較して、細胞シート内及び血管床と細胞シートとの間に毛細血管形成が促進されることが明らかとなった。
【実施例５】
【００６０】
（シリコンチャンバー内に動静脈ループを形成した人工血管床、及びそれを利用した細胞シート積層化物の作製方法）
生体外にて細胞シート積層化物を作製する血管床として、シリコンチャンバーを利用した人工血管床を作製した（図９）。【００６１】
ラットの表皮を切開し、大腿動脈と大腿静脈のみを生体組織から剥離した。大腿動脈及び大腿静脈を切断し、大腿動脈と大腿静脈の切断面同士を吻合し、動脈−静脈ループ（Ａ−Ｖループ）を作製した。縦１．５ｃｍ、横１．５ｃｍ、厚さ３mmのシリコン製の容器で、０．１ｍｍ厚のシリコン膜で覆われたシリコンチャンバー内に、生体内の動脈と静脈を吻合して作製した動静脈ループを挿入し、その周りを、２％アテロコラーゲン、１０６個の血管内皮細胞および線維芽細胞の混合物で充填した。その後、切開した表皮を縫合し、動静脈ループを内包したシリコンチャンバーを生体内に２週間留置した（図９）。その結果、シリコンチャンバー内の動静脈ループから毛細血管網が新生された（図１０）。図１０は、シリコンチャンバーを利用して作製した血管床の動脈側から、培養液の代わりに墨汁を灌流させた組織切片を示している。黒色領域が血管領域を示す。矢印で挟まれた領域は、静脈部分より新生した血管を示している。【００６２】
２週間後、再びラットの大腿部を切開し、シリコンチャンバー内に繋がった大腿動脈および大腿静脈を切断し、シリコンチャンバーで作製した人工血管床を生体から切離した。、シリコンチャンバーの０．１ｍｍ厚で覆われた一面を除去し、図２で示す生体組織片からなる血管床の代わりに、シリコンチャンバー内に繋がった大腿動脈と大腿静脈をバイオリアクターの培地を循環させるチューブと結合した。シリコンチャンバーで作製した人工血管床上に細胞シートを積層化し、実施例１と同様に灌流培養を行った。その結果、生体組織の血管床を利用して作製した細胞シート積層化物と同様、細胞シート内及び血管床と細胞シートとの間に毛細血管が形成され、厚みをもった細胞シート積層化物を作製することができた。
【実施例６】
【００６３】
（細胞シート積層化物の機能確認のための生体への再移植）
血管床を利用して作製した心筋細胞シート積層化物が、移植した際においても機能的であるかどうかをラットに再移植して確かめた（図１１）。【００６４】
実施例１で作製した、心筋細胞シートを積層化した血管床と繋がった左大腿動脈を左内頚動脈と吻合、血管床の左大腿静脈を左外頸静脈に吻合した。その結果、細胞シート積層化物にも血液が正しく流入することを確認した。また、心筋細胞シートの拍動が維持されることも確認され、該方法により作製する細胞シート積層化物が、移植の際も機能を維持したままであることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明に示される製造方法であれば、細胞シート内に血管網を構築させられ、その細胞シートを積層化すれば厚みのある細胞シート積層化物を簡便に作製することができるようになる。このような厚みのある細胞シート積層化物は生体内組織様のものとして、さまざまな組織の再生医療に有用なものであると同時に、治療を目的とする薬剤の効果を評価するのに有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年12月21日(2012.12.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管床、及び該血管床上に細胞シートを積層し、培地を生体外で灌流することで該細胞シート内に毛細血管網が誘導された細胞シートからなる細胞シート積層化物であって、該血管床は、生体組織から取り出した動脈及び静脈を含む生体組織材料であって、該生体組織材料内に該動脈及び静脈から派生した動脈−静脈ループを備えた毛細血管網が構築された血管床である、細胞シート積層化物。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
生体組織が皮弁由来である、請求項１記載の細胞シート積層化物。
【請求項４】
生体組織が筋肉由来である、請求項１記載の細胞シート積層化物。
【請求項５】
血管床が、生体適合性基材により区切られた領域内に、生体組織から取り出した動脈及び静脈を内包し、該区切られた領域内にゲルを充填し、生体内に留置することにより、該動脈及び静脈から派生した動脈−静脈ループを備えた毛細血管網をゲル内に構築させることによって得られる、該動脈及び静脈と該毛細血管網とを含む血管床である、請求項１記載の細胞シート積層化物。
【請求項６】
ゲルが生分解性ポリマー及び／または細胞からなる、請求項５記載の細胞シート積層化物。
【請求項７】
培地が、血管新生促進に関与するサイトカインを含んだものである、請求項１、及び３〜６のいずれか１項記載の細胞シート積層化物。
【請求項８】
細胞シートが、０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力が弱い温度域で細胞を培養し、その後、培養液をポリマーの水和力が強い状態となる温度に変化させることで培養した細胞をシート状で剥離させたものである、請求項１、及び３〜７のいずれか１項記載の細胞シート積層化物。
【請求項９】
０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーがポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）である、請求項１、及び３〜８のいずれか１項記載の細胞シート積層化物。
【請求項１０】
細胞シートが積層化された回数が４以上である、請求項９記載の細胞シート積層化物。
【請求項１１】
細胞が、心臓組織、肝組織、腎組織、副腎組織、皮膚組織、粘膜組織をそれぞれ構成する細胞であって、それぞれの組織において、いずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したものである、請求項１、及び３〜１０のいずれか１項記載の細胞シート積層化物。
【請求項１２】
血管内皮細胞が含まれる、請求項１１記載の細胞シート積層化物。
【請求項１３】
得られた細胞シート積層化物を生体内へ移植することを特徴とする、請求項１、及び３〜１２のいずれか１項記載の細胞シート積層化物の利用方法。
【請求項１４】
心筋組織へ移植し、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される少なくとも１種の心臓の疾患または障害の治療を目的とする、請求項１３記載の細胞シート積層化物の利用方法。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか１項記載の細胞シート積層化物を利用した薬剤の評価方法。
【請求項１６】
細胞シート積層化物を構成する細胞にレポーター遺伝子が導入された請求項１５記載の薬剤の評価方法。
【請求項１７】
レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である請求項１６記載の薬剤の評価方法。
【請求項１８】
評価する薬剤が心臓疾患に関与する薬剤である請求項１７記載の薬剤の評価方法。
【手続補正書】
【提出日】平成25年5月29日(2013.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管床、及び該血管床上に細胞シートを積層し、培地を生体外で灌流することで該細胞シート内に毛細血管網が誘導された細胞シートからなる細胞シート積層化物であって、該血管床は、生体組織から取り出した動脈及び静脈を含む生体組織材料であって、該生体組織材料内に該動脈及び静脈から派生した動脈−静脈ループを備えた毛細血管網が構築された血管床である、細胞シート積層化物。
【請求項２】
生体組織が皮弁由来である、請求項１記載の細胞シート積層化物。
【請求項３】
生体組織が筋肉由来である、請求項１記載の細胞シート積層化物。
【請求項４】
血管床が、生体適合性基材により区切られた領域内に、生体組織から取り出した動脈及び静脈を内包し、該区切られた領域内にゲルを充填し、生体内に留置することにより、該動脈及び静脈から派生した動脈−静脈ループを備えた毛細血管網をゲル内に構築させることによって得られる、該動脈及び静脈と該毛細血管網とを含む血管床である、請求項１記載の細胞シート積層化物。
【請求項５】
ゲルが生分解性ポリマー及び／または細胞からなる、請求項４記載の細胞シート積層化物。
【請求項６】
培地が、血管新生促進に関与するサイトカインを含んだものである、請求項１〜５のいずれか１項記載の細胞シート積層化物。
【請求項７】
細胞シートが、０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力が弱い温度域で細胞を培養し、その後、培養液をポリマーの水和力が強い状態となる温度に変化させることで培養した細胞をシート状で剥離させたものである、請求項１〜６のいずれか１項記載の細胞シート積層化物。
【請求項８】
０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーがポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）である、請求項１〜７のいずれか１項記載の細胞シート積層化物。
【請求項９】
細胞シートが積層化された回数が４以上である、請求項８記載の細胞シート積層化物。
【請求項１０】
細胞が、心臓組織、肝組織、腎組織、副腎組織、皮膚組織、粘膜組織をそれぞれ構成する細胞であって、それぞれの組織において、いずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したものである、請求項１〜９のいずれか１項記載の細胞シート積層化物。
【請求項１１】
血管内皮細胞が含まれる、請求項１０記載の細胞シート積層化物。
【請求項１２】
得られた細胞シート積層化物をヒトを除く動物の生体内へ移植することを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項記載の細胞シート積層化物の利用方法。
【請求項１３】
ヒトを除く動物の心筋組織へ移植し、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される少なくとも１種の心臓の疾患または障害の治療を目的とする、請求項１２記載の細胞シート積層化物の利用方法。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか１項記載の細胞シート積層化物を利用した薬剤の評価方法。
【請求項１５】
細胞シート積層化物を構成する細胞にレポーター遺伝子が導入された請求項１４記載の薬剤の評価方法。
【請求項１６】
レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である請求項１５記載の薬剤の評価方法。
【請求項１７】
評価する薬剤が心臓疾患に関与する薬剤である請求項１６記載の薬剤の評価方法。
【国際調査報告】
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