(57)【要約】  未分化細胞の未分化状態を維持・向上する新たな未分化状態の制御剤の提供を目的とする。  未分化状態の制御剤として、ＣＣＬ２またはその機能ドメインを含むタンパク質を使用する。前記制御剤の存在下、未分化細胞を培養することによって、前記未分化細胞の未分化状態を維持および／または向上できる。前記未分化細胞は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等があげられ、その由来は、特に制限されず、例えば、ヒトおよびマウス等があげられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＣＬ２、またはその機能ドメインを含むタンパク質を含むことを特徴とする、未分化細胞の未分化状態の制御剤。
【請求項２】
前記ＣＣＬ２、またはその機能ドメインを含むタンパク質が、前記ＣＣＬ２の機能ドメインとして、下記（Ａ１’）、（Ａ２’）、（Ａ３’）、（Ｂ１’）、（Ｂ２’）および（Ｂ３’）のいずれかのポリペプチドを含むタンパク質である、請求項１記載の制御剤。
（Ａ１’）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド
配列番号２：QPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT
（Ａ２’）配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、ＣＣＬ２の機能を有するポリペプチド
（Ａ３’）配列番号２のアミノ酸配列に対する同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、ＣＣＬ２の機能を有するポリペプチド
（Ｂ１’）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド
配列番号４：QPDAVNAPLTCCYSFTSKMIPMSRLESYKRITSSRCPKEAVVFVTKLKREVCADPKKEWVQTYIKNLDRNQMRSEPTTLFKTASALRSSAPLNVKLTRKSEANASTTFSTTTSSTSVGVTSVTVN
（Ｂ２’）配列番号４のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、ＣＣＬ２の機能を有するポリペプチド
（Ｂ３’）配列番号４のアミノ酸配列に対する同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、ＣＣＬ２の機能を有するポリペプチド
【請求項３】
前記ＣＣＬ２、またはその機能ドメインを含むタンパク質が、下記（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ｂ１）、（Ｂ２）および（Ｂ３）のいずれかのタンパク質である、請求項１記載の制御剤。
（Ａ１）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
配列番号１：MKVSAALLCLLLIAATFIPQGLAQPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT
（Ａ２）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、ＣＣＬ２の機能を有するタンパク質
（Ａ３）配列番号１のアミノ酸配列に対する同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、ＣＣＬ２の機能を有するタンパク質
（Ｂ１）配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質
配列番号３：MQVPVMLLGLLFTVAGWSIHVLAQPDAVNAPLTCCYSFTSKMIPMSRLESYKRITSSRCPKEAVVFVTKLKREVCADPKKEWVQTYIKNLDRNQMRSEPTTLFKTASALRSSAPLNVKLTRKSEANASTTFSTTTSSTSVGVTSVTVN
（Ｂ２）配列番号３のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、ＣＣＬ２の機能を有するタンパク質
（Ｂ３）配列番号３のアミノ酸配列に対する同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、ＣＣＬ２の機能を有するタンパク質
【請求項４】
前記未分化細胞が、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、請求項１記載の制御剤。
【請求項５】
さらに、培地を含み、
前記培地が、前記ＣＣＬ２、またはその機能ドメインを含むタンパク質を含み、
未分化細胞の未分化状態の制御用培地である、請求項１記載の制御剤。
【請求項６】
さらに、培養器を含み、
前記ＣＣＬ２タンパク質、またはその機能ドメインを含むタンパク質が、前記培養器に固定されており、
未分化細胞の未分化状態の制御用培養器である、請求項１記載の制御剤。
【請求項７】
ＣＣＬ２、またはその機能ドメインを含むタンパク質を発現する発現ベクターを含むことを特徴とする、未分化細胞の未分化状態の制御剤。
【請求項８】
前記発現ベクターが導入された形質転換体を含む、請求項７記載の制御剤。
【請求項９】
前記形質転換体が、未分化細胞に前記発現ベクターが導入された形質転換体である、請求項８記載の制御剤。
【請求項１０】
請求項１または７記載の未分化細胞の未分化状態の制御剤の存在下、未分化細胞を培養する培養工程を含むことを特徴とする、未分化状態が制御された未分化細胞の製造方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の製造方法に従って未分化細胞を培養することにより、前記未分化細胞の未分化状態を維持および／または向上することを特徴とする、未分化細胞の未分化状態の制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、未分化細胞の未分化状態の制御剤およびその用途に関し、より詳細には、前記未分化状態の制御剤を用いた、未分化状態が制御された未分化細胞の製造方法、および未分化細胞の未分化状態の制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多分化能を有する細胞は、未分化細胞である。前記未分化細胞は、その多分化能から、再生医療等への応用が注目され、研究開発が盛んに行われている。ここで、前記未分化細胞は、未分化状態を維持して培養することが重要である。【０００３】
前記未分化細胞の培養には、一般的に、繊維芽細胞等のフィーダー細胞を使用する方法、いわゆるオンフィーダー培養法が利用されている。この方法は、予めフィーダー細胞を培養しておき、前記フィーダー細胞上に前記未分化細胞を播種する方法である。また、近年では、フィーダー細胞を使用しない培養方法、いわゆるフィーダーフリー培養法も構築されている。前記フィーダーフリー培養法では、例えば、無血清培地が使用されている（特許文献１〜５、非特許文献１〜１４）。【０００４】
しかしながら、これらの公知の培養方法によっても、前記未分化細胞の多分化能および未分化状態を十分に維持できないという問題がある。例えば、マウス由来多能性幹細胞の場合、分化抑制因子として、ＬＩＦ（Leukemia  Inhibitory  Factor：白血病阻害因子）が培地に添加される。しかし、ＬＩＦの添加のみでは十分な多分化能および未分化状態の維持が実現できていない。また、ヒト由来多能性幹細胞については、多分化能ならびに未分化状態を維持および／または向上するための有効な手段が確立されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−１７１６３号公報
【特許文献２】特開２００６−３４５７０２号公報
【特許文献３】特開２００６−２０４２９２号公報
【特許文献４】特開２００９−７２１８６号公報
【特許文献５】特開２０１０−００４７９６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Thomson JA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1995) 92, 7844-7848
【非特許文献２】Thomson JA et al., Science, (1998) 282, 1145-1147
【非特許文献３】Reubinoff BE et al., Nat Biotechnol, (2000)18,399-404.
【非特許文献４】Xu C, et al., Nat Biotechnol (2001) 19, 971-974.
【非特許文献５】Amit M, et al., Biol Reprod  (2004) 70, 837-845.
【非特許文献６】Chambers I. et al., Cell (2003) 113, 643-655.
【非特許文献７】Mitsui K. et al., Cell (2003) 113, 631-642.
【非特許文献８】Ying Q.L. et al., Cell (2003) 115, 281-292.
【非特許文献９】Mitalipova M et al., Stem Cells (2003) 21, 521-526.
【非特許文献１０】Heins N et al., Stem Cells, (2004) 22, 367-376.
【非特許文献１１】Sato N et al.,Nature Medicine、(2004) 10, 55-63.
【非特許文献１２】Beattie GM, et al., Stem Cells (2005) 23, 489-495.
【非特許文献１３】Boiani, M. et al., Nat Rev Mol Cell Biol. (2005)6, 872-884
【非特許文献１４】Totonchi M, et al., Int J Dev Biol. (2010)54, 877-886.
【発明の概要】
【０００７】
そこで、本発明は、未分化細胞の未分化状態を維持および／または向上する新たな未分化状態の制御剤およびその用途の提供を目的とする。
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明の未分化状態の制御剤は、ＣＣＬ２、またはその機能ドメインを含むタンパク質を含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明の未分化状態が制御された未分化細胞の製造方法は、前記本発明の未分化状態の制御剤の存在下、未分化細胞を培養する培養工程を含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明の未分化状態の制御方法は、前記本発明の製造方法に従って未分化細胞を培養することにより、前記未分化細胞の未分化状態を維持および／または向上することを特徴とする。
【００１１】
本発明によれば、ＣＣＬ２またはその機能ドメインを含むタンパク質によって、未分化細胞の未分化状態を維持および／または向上できる。本発明は、例えば、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞等の未分化細胞を、未分化状態を維持および／または向上した状態で培養可能であることから、再生医療等をはじめとする種々の医療やその研究に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の実施例において、ＣＣＬ２を過剰発現させたマウスｉＰＳ細胞における未分化マーカー遺伝子の発現変化率を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施例において、Ｃｃｌ２遺伝子をノックダウンしたマウスｉＰＳ細胞におけるＣｃｌ２遺伝子および未分化マーカー遺伝子の発現変化率を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例において、未分化マーカー遺伝子であるＮａｎｏｇ遺伝子を発現するマウスｉＰＳ細胞に関するフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例において、未分化マーカー遺伝子であるＮａｎｏｇ遺伝子を発現するマウスｉＰＳ細胞に関するフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例において、ＣＣＬ２存在下、マウスｉＰＳ細胞におけるＳＴＡＴ３のリン酸化を示す結果であり、（Ａ）が、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真であり、（Ｂ）が、非リン酸化ＳＴＡＴ３とリン酸化ＳＴＡＴ３との割合を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例において、ＣＣＬ２存在下、マウスｉＰＳ細胞におけるＡＫＴのリン酸化を示す結果であり、（Ａ）が、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真であり、（Ｂ）が、非リン酸化ＡＫＴとリン酸化ＡＫＴとの割合を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例において、ＣＣＬ２存在下、マウスｉＰＳ細胞におけるＥＲＫ1/2のリン酸化を示す結果であり、（Ａ）が、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真であり、（Ｂ）が、非リン酸化ＥＲＫ1/2とリン酸化ＥＲＫ1/2との割合を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の実施例において、未分化マーカー遺伝子であるＮａｎｏｇ遺伝子を発現するマウスｉＰＳ細胞に関するフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の実施例において、ＣＣＬ２存在下、マウスｉＰＳ細胞における未分化マーカー遺伝子であるＴｂｘ３遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明の実施例において、Ｋｌｆ４遺伝子をノックダウンしたマウスｉＰＳ細胞におけるＴｂｘ３遺伝子の発現変化率を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ＣＣＬ２が関与する、未分化状態の維持または向上の推定メカニズムを示す図である。
【図１２】図１２は、本発明の実施例において、ＣＣＬ２を過剰発現させたマウスＥＳ細胞における未分化マーカー遺伝子の発現変化率を示すグラフである。
【図１３】図１３は、本発明の実施例において、ＣＣＬ２添加−ＬＩＦ未添加の条件で培養したマウスｉＰＳ細胞における未分化マーカー遺伝子の発現変化率を示すグラフである。
【図１４】図１４は、本発明の実施例において、ヒトｉＰＳ細胞における未分化マーカー遺伝子の発現変化率を示すグラフである。
【図１５】図１５は、本発明の実施例において、ＣＣＬ２タンパク質存在下、ヒトｉＰＳ細胞におけるＳＴＡＴ３およびＡＫＴのリン酸化を示す結果であり、（Ａ）が、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真であり、（Ｂ）が、非リン酸化ＳＴＡＴ３とリン酸化ＳＴＡＴ３との割合を示すグラフであり、（Ｃ）が、非リン酸化ＡＫＴとリン酸化ＡＫＴとの割合を示すグラフであり、（Ｄ）が、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現に対するＫＬＦ４遺伝子の発現の割合を示すグラフである。
【図１６】図１６は、本発明の実施例において、フィーダー細胞なし、ＣＣＬ２存在下で培養したヒトｉＰＳ細胞の形態を示す写真である。
【図１７】図１７は、本発明の実施例において、ＣＣＬ２存在下で培養したヒトｉＰＳ細胞の経時的な細胞数の変化を示すグラフである。
【図１８】図１８は、本発明の実施例において、ヒトｉＰＳ細胞から作製したＥＢの自発的分化誘導培養後の形態を示す写真であり、（Ａ）は、ＣＣＬ２存在下で培養したヒトｉＰＳ細胞から得たＥＢの自発的分化誘導結果であり、（Ｂ）は、ＣＣＬ２非存在下で培養したヒトｉＰＳ細胞から得たＥＢの自発的分化誘導結果である。
【図１９】図１９は、本発明の実施例において、ヒトｉＰＳ細胞から作製したＥＢの培養後の形態を示す写真であり、（Ａ）は、ＣＣＬ２非存在下で培養したヒトｉＰＳ細胞から得たＥＢの結果であり、（Ｂ）は、ＣＣＬ２存在下で培養したヒトｉＰＳ細胞から得たＥＢの結果である。
【図２０】図２０は、本発明の実施例において、ヒトｉＰＳ細胞から作製したＥＢの自発的分化誘導培養後の形態を示す写真であり、（Ａ）は、ＣＣＬ２添加／ＬＩＦ未添加／ｂＦＧＦ未添加、（Ｂ）は、ＣＣＬ２添加／ＬＩＦ添加／ｂＦＧＦ未添加の結果を示す。
【図２１】図２１は、本発明の実施例において、フィーダーフリー条件下で培養したヒトｉＰＳ細胞における未分化マーカー遺伝子の発現変化率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明について、以下に、第１の形態および第２の形態をあげて説明する。本発明は、これらの形態に限定されるものではない。
【００１４】
第１の形態
（１）第１の制御剤
本発明の第１の制御剤は、前述のように、未分化細胞の未分化状態の制御剤であって、ＣＣＬ２またはその機能ドメインを含むタンパク質を含むことを特徴とする。本発明の第１の制御剤は、未分化細胞の未分化状態を維持および／または向上させる。本発明の第１の制御剤は、例えば、未分化状態の維持剤または未分化状態の向上剤ということもでき、「維持・向上剤」と表わすこともできる。
【００１５】
本発明において、「未分化状態の維持」は、例えば、未分化細胞に対して、前記制御剤の非存在下における未分化状態（分化の階層性hierarchy）を維持させることを意味する。本発明において、「未分化状態の向上」は、未分化細胞に対して、その未分化状態（前記階層性）を、前記制御剤の非存在下での状態よりも、より未分化の状態に移行させること、すなわち脱分化を促進することを意味し、未分化能の向上ともいう（以下、同様）。
【００１６】
また、本発明の制御剤によれば、例えば、前記未分化細胞の接着および／または増殖を促進することも可能である。このため、本発明の制御剤は、例えば、未分化細胞の接着および／または増殖促進剤ということもできる。本発明の未分化細胞の接着および／または増殖促進剤は、ＣＣＬ２またはその機能ドメインを含むタンパク質を含むことを特徴とし、以下に示す本発明の制御剤の記載を引用できる。また、本発明の未分化細胞の未分化状態の制御方法は、例えば、未分化細胞の接着および／または増殖促進方法ということもできる。本発明の未分化細胞の接着および／または増殖促進方法は、後述する本発明の未分化細胞の未分化状態の制御方法と同様の構成であり、それらの記載を引用できる。
【００１７】
ＣＣＬ２は、Ｃ−Ｃモチーフ  ケモカイン２（Ｃ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ２）であり、ＣＸＣファミリーに分類されるタンパク質である。本発明において、ＣＣＬ２は、ＣＣＬ２の機能を有するタンパク質を意味し、ＣＣＬ２の機能ドメインは、ＣＣＬ２において、ＣＣＬ２の機能に寄与するドメインを意味する。前記ＣＣＬ２の機能ドメインを含むタンパク質を、以下、「ＣＣＬ２様タンパク質」という。
【００１８】
本発明において、ＣＣＬ２の機能は、未分化細胞の未分化状態を維持する機能および／または向上する機能を意味する。ＣＣＬ２の機能は、例えば、単球等の走化性を誘因する機能ともいえる。
【００１９】
本発明の制御剤は、例えば、前記ＣＣＬ２および前記ＣＣＬ２様タンパク質の一方を含んでもよいし、両方を含んでもよい。本発明の制御剤は、例えば、有効成分として、前記ＣＣＬ２のみを含んでもよいし、前記ＣＣＬ様タンパク質のみを含んでもよいし、前記ＣＣＬ２と前記ＣＣＬ２様タンパク質の両方を含んでもよい。
【００２０】
前記ＣＣＬ２の種類は、特に制限されない。前記ＣＣＬ２の由来は、特に制限されず、例えば、哺乳類があげられる。前記哺乳類は、ヒトまたは非ヒト哺乳類があげられる。前記非ヒト哺乳類は、例えば、サル等の霊長類、マウス、ニワトリ、馬、ラット、ブタ、ウサギ等があげられる。前記ＣＣＬ２は、例えば、天然物でもよいし、人工的に合成した合成物でもよい。前記合成物の合成方法は、特に制限されず、例えば、遺伝子工学的な手法があげられ、具体例としては、細胞を用いたタンパク質合成、細胞を使用しない無細胞タンパク質合成等があげられる。前記ＣＣＬ２は、例えば、天然のＣＣＬ２でもよいし、前記天然ＣＣＬ２の改変タンパク質でもよい。後者の改変タンパク質は、例えば、前記天然ＣＣＬ２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質でもよく、１もしくは数個のアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列からなるタンパク質でもよい。このようなタンパク質は、前記ＣＣＬ２の機能を有する限り、本発明におけるＣＣＬ２に含まれる。
【００２１】
本発明は、前記ＣＣＬ２と同様に、ＣＣＬ２の機能ドメインを含むタンパク質（前記ＣＣＬ２様タンパク質）を使用できる。この場合、前記ＣＣＬ２様タンパク質は、例えば、前記ＣＣＬ２の機能ドメインが、その機能を奏すればよく、その他の条件は、何ら制限されない。具体的には、前記ＣＣＬ２様タンパク質は、その他の条件として、例えば、前記機能ドメイン以外の配列等は、何ら制限されない。前記ＣＣＬ２様タンパク質は、例えば、前記機能ドメインのポリペプチドからなるタンパク質でもよいし、前記機能ドメインのポリペプチドを含むタンパク質でもよい。
【００２２】
以下に、前記ＣＣＬ１およびその機能ドメインのアミノ酸配列の例を示すが、本発明は、これらの例示には制限されない。
【００２３】
前記ＣＣＬ２または前記ＣＣＬ２様タンパク質は、例えば、下記（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ｂ１）、（Ｂ２）および（Ｂ３）のいずれかのタンパク質である。
（Ａ１）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
配列番号１：MKVSAALLCLLLIAATFIPQGLAQPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT
（Ａ２）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、ＣＣＬ２の機能を有するタンパク質
（Ａ３）配列番号１のアミノ酸配列に対する同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、ＣＣＬ２の機能を有するタンパク質
（Ｂ１）配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質
配列番号３：MQVPVMLLGLLFTVAGWSIHVLAQPDAVNAPLTCCYSFTSKMIPMSRLESYKRITSSRCPKEAVVFVTKLKREVCADPKKEWVQTYIKNLDRNQMRSEPTTLFKTASALRSSAPLNVKLTRKSEANASTTFSTTTSSTSVGVTSVTVN
（Ｂ２）配列番号３のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、ＣＣＬ２の機能を有するタンパク質
（Ｂ３）配列番号３のアミノ酸配列に対する同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、ＣＣＬ２の機能を有するタンパク質
【００２４】
前記（Ａ１）は、ヒトのＣＣＬ２である。配列番号１のアミノ酸配列は、前記ＣＣＬ２の全長アミノ酸配列であり、例えば、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．Ｐ１３５００に登録されている。配列番号１のアミノ酸配列において、例えば、２４番〜９９番の領域が、前記ＣＣＬ２の機能ドメインである。
【００２５】
前記（Ａ２）において、前記欠失等のアミノ酸の個数は、特に制限されず、例えば、１個または数個であり、好ましくは１個〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは、１〜３個、特に好ましくは１個または２個である。
【００２６】
前記（Ａ３）において、前記同一性は、特に制限されず、例えば、８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、算出できる（以下、同様）。
【００２７】
前記（Ｂ１）は、マウスのＣＣＬ２である。配列番号３のアミノ酸配列は、前記ＣＣＬ２の全長アミノ酸配列であり、例えば、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．Ｐ１０１４８またはＮＰ＿０３５４６３．１に登録されている。配列番号３のアミノ酸配列において、例えば、２４番〜１４８番の領域が、前記ＣＣＬ２の機能ドメインである。
【００２８】
前記（Ｂ２）において、前記欠失等のアミノ酸の個数は、特に制限されず、例えば、１個または数個であり、好ましくは１個〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは、１〜３個、特に好ましくは１個または２個である。
【００２９】
前記（Ｂ３）において、前記同一性は、特に制限されず、例えば、８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
【００３０】
前記ＣＣＬ２または前記ＣＣＬ２様タンパク質は、例えば、ＣＣＬ２の機能ドメインとして、下記（Ａ１’）、（Ａ２’）、（Ａ３’）、（Ｂ１’）、（Ｂ２’）および（Ｂ３’）のいずれかのポリペプチドを有するタンパク質である。
（Ａ１’）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド
配列番号２：QPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT
（Ａ２’）配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、ＣＣＬ２の機能を有するポリペプチド
（Ａ３’）配列番号２のアミノ酸配列に対する同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、ＣＣＬ２の機能を有するポリペプチド
（Ｂ１’）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド
配列番号４：QPDAVNAPLTCCYSFTSKMIPMSRLESYKRITSSRCPKEAVVFVTKLKREVCADPKKEWVQTYIKNLDRNQMRSEPTTLFKTASALRSSAPLNVKLTRKSEANASTTFSTTTSSTSVGVTSVTVN
（Ｂ２’）配列番号４のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、ＣＣＬ２の機能を有するポリペプチド
（Ｂ３’）配列番号４のアミノ酸配列に対する同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、ＣＣＬ２の機能を有するポリペプチド
【００３１】
前記（Ａ１’）は、ヒトのＣＣＬ２の機能ドメインである。配列番号２のアミノ酸配列は、例えば、前記配列番号１のアミノ酸配列において、２４番〜９９番の領域に該当する。
【００３２】
前記（Ａ２’）において、前記欠失等のアミノ酸の個数は、特に制限されず、例えば、１個または数個であり、好ましくは１個〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは、１〜３個、特に好ましくは１個または２個である。
【００３３】
前記（Ａ３’）において、前記同一性は、特に制限されず、例えば、８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
【００３４】
前記（Ｂ１’）は、マウスのＣＣＬ２の機能ドメインであり、配列番号４のアミノ酸配列は、例えば、配列番号３のアミノ酸配列において、例えば、２４番〜１４８番の領域に該当する。
【００３５】
前記（Ｂ２’）において、前記欠失等のアミノ酸の個数は、特に制限されず、例えば、１個または数個であり、好ましくは１個〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは、１〜３個、特に好ましくは１個または２個である。
【００３６】
前記（Ｂ３’）において、前記同一性は、特に制限されず、例えば、８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
【００３７】
本発明の制御剤を適用する対象は、特に制限されない。本発明において、未分化細胞の分化段階、すなわち、階層性（hierarchy）は、特に制限されず、完全に分化する以前の細胞があげられる。前記未分化細胞は、例えば、未分化マーカー遺伝子を発現している細胞である。細胞の未分化状態は、例えば、未分化マーカー遺伝子を指標として決定できる。前記未分化マーカー遺伝子は、例えば、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、Ｔｂｘ３、Ｒｅｘ１、Ｓｔｅｌｌａ等があげられる。これらの遺伝子は、例えば、より未分化な状態にあるブラストシスト状態（Naive  Pluripotent  State）を示すマーカー遺伝子である。前記未分化細胞は、例えば、自己複製能および多分化能を有する未分化状態にある細胞と言うこともできる。
【００３８】
前記未分化細胞は、例えば、胚または生体の組織に由来する細胞でもよいし、人工的に作成された未分化な細胞でもよい。より未分化な状態の前記未分化細胞は、例えば、胚性幹細胞（Embryonic  Stem  cells：ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（Embryonic  Germ  cells：ＥＧ細胞）があげられる。より分化が進行した状態の前記未分化細胞は、例えば、体性幹細胞（成体幹細胞ともいう）があげられる。前記体性幹細胞は、例えば、成体多能性幹細胞（成体多能性前駆細胞ともいう：multipotent  adult  progenitor  cells）、造血幹細胞、血管内皮幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、膵幹細胞、肝幹細胞等があげられる。前記未分化細胞は、例えば、始原生殖細胞があげられる。前記未分化細胞は、この他に、例えば、胚性腫瘍細胞（Embryonal  Carcinoma  cells：ＥＣ細胞）等があげられる。また、人工的な未分化細胞として、例えば、核移植ＥＳ細胞（nuclear  transfer  Embryonic  Stem  cells：ｎｔＥＳ細胞）等があげられる。また、前記人工的な未分化細胞として、例えば、遺伝子導入および化合物処理等によって多分化能を付与した細胞である人工多能性幹細胞（Induced  pluripotent  stem  cells：ｉＰＳ細胞）を使用できる（例えば、国際公開第２００７／０６９６６６号パンフレット、特開２０１０−２７３６８０号公報、特開２０１０−２８４０８８号公報、特開２０１１−５０３７９号公報、特開２０１１−４６７４号公報）。
【００３９】
前記未分化細胞の由来は、特に制限されず、例えば、哺乳類由来の細胞があげられる。前記哺乳類は、ヒトまたは非ヒト哺乳類があげられる。前記非ヒト哺乳類は、例えば、サル等の霊長類、マウス、ニワトリ、馬、ラット、ブタ、ウサギ等があげられる。
【００４０】
本発明の制御剤における前記ＣＣＬ２および前記ＣＣＬ２様タンパク質の由来と、前記未分化細胞の由来は、例えば、同じでもよいし、異なってもよい。両者が同じ場合、例えば、哺乳類が好ましく、また、霊長類またはげっ歯類であることが好ましく、ヒトまたはマウスが好ましい。
【００４１】
本発明の制御剤において、前記ＣＣＬ２およびＣＣＬ２様タンパク質は、前記ＣＣＬ２の機能を奏する限りにおいて、さらに、他のペプチドが結合してもよい。前記他のペプチドにおけるアミノ酸残基の数および種類は、特に制限されない。
【００４２】
本発明の制御剤は、前記ＣＣＬ２および／または前記ＣＣＬ２様タンパク質の他に、さらにその他の成分を含んでもよい。前記他の成分は、特に制限されず、例えば、後述する培地に含まれる成分等があげられる。
【００４３】
本発明の制御剤は、例えば、本発明の制御剤の非存在下における前記未分化細胞の分化の階層性を維持できることから、分化の階層性の維持剤ともいえる。また、前記未分化細胞は、一般に、未分化のブラストシスト（Naive  Pluriponent  State）から、より分化したエピブラスト（Primed  Pluriponent  State）に階層が進む。このため、本発明の制御剤は、例えば、ブラストシスト状態の維持剤、エピブラスト化の抑制剤ともいえる。また、本発明の制御剤によれば、例えば、特にヒト由来の未分化細胞について、エピブラストからブラストシストへの脱分化の進行を促進できる。このため、本発明の制御剤は、例えば、分化の階層性の向上剤または脱分化促進剤ともいえる。
【００４４】
本発明の制御剤の形態は、特に制限されない。前記本発明の制御剤は、例えば、後述するように、さらに培地を含む、前記未分化細胞の未分化状態の制御用培地の形態でもよいし、さらに、培養器を含み、予め、前記ＣＣＬ２または前記ＣＣＬ２様タンパク質が固定化された、前記未分化細胞の未分化状態の制御用培養器の形態でもよい。後者の場合、例えば、培養の度に培地に前記制御剤を添加する必要がなく、前記ＣＣＬ２または前記ＣＣＬ２様タンパク質を安定に維持できる。また、前記培養器に前記ＣＣＬ２または前記ＣＣＬ２様タンパク質を固定化することで、例えば、培養対象の細胞に足場を提供できる。前記培養器は、特に制限されず、例えば、フラスコ、ディッシュ、ウェルプレート等があげられる。前記ＣＣＬ２および前記ＣＣＬ２様タンパク質の固定化方法は、特に制限されず、前記ＣＣＬ２および前記ＣＣＬ２様タンパク質の前記機能が維持されていればよく、公知の方法を任意に採用できる。前記固定化の方法は、例えば、Nature  Methods  Vol.5,  No.7,  2008,  p.645-650等を参照できる。
【００４５】
本発明の制御剤の使用方法は、例えば、後述する、本発明の未分化細胞の未分化状態の制御用培地において説明する。
【００４６】
（２）第１の未分化細胞の未分化状態の制御用培地
本発明の第１の未分化細胞の未分化状態の制御用培地は、前述のように、前記未分化細胞を培養するための培地であって、前記本発明の制御剤の一態様である。
【００４７】
本発明の培地は、前記本発明の制御剤を含んでいればよく、その他の構成および条件は、何ら制限されない。本発明の培地は、例えば、前記制御剤を含む基本培地があげられ、前記基本培地に前記制御剤を添加することで調製できる。
【００４８】
本発明の培地において、前記制御剤の含有量は、特に制限されない。前記制御剤が有効成分として前記ＣＣＬ２含む場合、前記培地における前記ＣＣＬ２濃度は、下限が、例えば、５００ｎｇ／ｍＬであり、好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは２０００ｎｇ／ｍＬであり、特に好ましくは２５００ｎｇ／ｍＬである。前記培地における前記ＣＣＬ２濃度は、上限が、例えば、１００００ｎｇ／ｍＬであり、好ましくは８０００ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは５０００ｎｇ／ｍＬであり、特に好ましくは２５００ｎｇ／ｍＬである。前記培地における前記ＣＣＬ２濃度の範囲は、例えば、５００ｎｇ／ｍＬ〜１００００ｎｇ／ｍＬの範囲であり、好ましくは１０００ｎｇ／ｍＬ〜８０００ｎｇ／ｍＬの範囲であり、特に好ましくは２０００ｎｇ／ｍＬ〜５０００ｎｇ／ｍＬの範囲である。前記制御剤が有効成分として前記ＣＣＬ２様タンパク質を含む場合、前記培地における前記ＣＣＬ２様タンパク質の濃度は、特に制限されず、例えば、前述したＣＣＬ２の添加濃度と同様であり、また、前記ＣＣＬ２の添加濃度から前記機能ドメインの量に基づいて換算可能である。
【００４９】
本発明の培地は、例えば、さらに、他の分化抑制因子を含んでもよい。前記分化抑制因子は、例えば、ＬＩＦ（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）、ｂＦＧＦ、ＮＯＤＡＬ、ＧＳＫ／ＭＥＫ阻害剤等があげられる。前記ＬＩＦは、例えば、マウス由来細胞用の培地に使用することが好ましく、前記ｂＦＧＦおよびＮＯＤＡＬは、ヒト由来細胞用の培地に使用することが好ましい。前記分化抑制因子の由来は、特に制限されず、例えば、培養する未分化細胞の由来と同じでもよいし、異なってもよい。前記未分化細胞が、マウスおよびラット等のげっ歯類由来の細胞の場合、例えば、前記分化抑制因子として、ＬＩＦが使用できる。前記分化抑制因子は、例えば、天然由来でもよいし、形質転換等により人工的に調製したものでもよい。
【００５０】
従来、げっ歯類由来の未分化細胞の培養は、一般的に、分化抑制因子としてＬＩＦが培地に添加される。これに対して、本発明の培地は、例えば、ＬＩＦ未添加でも、前記ＣＣＬ２および／または前記ＣＣＬ２様タンパク質によって、前記未分化細胞の未分化状態を維持および／または向上できる。また、本発明の培地は、例えば、さらにＬＩＦを含んでもよい。本発明の培地が、さらにＬＩＦを含む場合、例えば、前記未分化細胞の未分化状態を、より一層維持および／または向上できる。
【００５１】
本発明の培地が、さらに前記他の分化抑制因子を含む場合、前記分化抑制因子の含有量は、特に制限されない。前記分化抑制因子がＬＩＦの場合、前記培地における前記ＬＩＦ濃度は、下限が、例えば、２５ｕｎｉｔ／ｍＬであり、好ましくは５０ｕｎｉｔ／ｍＬであり、より好ましくは１００ｕｎｉｔ／ｍＬであり、特に好ましくは２００ｕｎｉｔ／ｍＬである。前記培地における前記ＬＩＦ濃度は、上限が、例えば、１０００ｕｎｉｔ／ｍＬであり、好ましくは８００ｕｎｉｔ／ｍＬであり、より好ましくは５００ｕｎｉｔ／ｍＬであり、特に好ましくは３００ｕｎｉｔ／ｍＬである。前記培地における前記ＬＩＦ濃度の範囲は、例えば、２５ｕｎｉｔ／ｍＬ〜１０００ｕｎｉｔ／ｍＬの範囲であり、好ましくは５０ｕｎｉｔ／ｍＬ〜８００ｕｎｉｔ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは１００ｕｎｉｔ／ｍＬ〜５００ｕｎｉｔ／ｍＬの範囲であり、特に好ましくは２００ｕｎｉｔ／ｍＬ〜３００ｕｎｉｔ／ｍＬの範囲である。前記ＬＩＦのｕｎｉｔは、例えば、ＥＳ細胞の分化抑制に必要とするのが１０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬとした場合に、１０００分の１量を１ｕｎｉｔとする。
【００５２】
本発明の培地が、前記ＬＩＦを含む場合、前記ＣＣＬ２および／または前記ＣＣＬ２様タンパク質と、前記ＬＩＦとの添加比は、特に制限されない。前記培地において、例えば、前記ＣＣＬ２および／または前記ＣＣＬ２様タンパク質１ｎｇに対して、前記ＬＩＦが０．１ｕｎｉｔ／ｍＬ〜２ｕｎｉｔ／ｍＬの範囲であることが好ましく、より好ましくは０．１ｕｎｉｔ／ｍＬ〜１．５ｕｎｉｔ／ｍＬの範囲であり、さらに好ましくは０．１ｕｎｉｔ／ｍＬ〜１ｕｎｉｔ／ｍＬの範囲であり、特に好ましくは０．１ｕｎｉｔ／ｍＬ〜０．５ｕｎｉｔ／ｍＬの範囲である。
【００５３】
本発明の培地は、例えば、さらに、増殖因子を含んでもよい。前記増殖因子は、例えば、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）、形質転換増殖因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ：ＴＧＦβ）等があげられる。前記増殖因子の由来は、特に制限されず、例えば、培養する未分化細胞の由来と同じでもよいし、異なってもよい。前記未分化細胞が、ヒト由来の細胞の場合、例えば、前記増殖因子として、ｂＦＧＦが使用できる。前記増殖因子は、例えば、天然由来でもよいし、形質転換等により人工的に調製したものでもよい。
【００５４】
本発明の培地が、さらに前記増殖因子を含む場合、前記増殖因子の含有量は、特に制限されない。前記増殖因子がｂＦＧＦの場合、前記培地における前記ｂＦＧＦ濃度は、下限が、例えば、４ｎｇ／ｍＬであり、好ましくは５ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは８ｎｇ／ｍＬであり、特に好ましくは１０ｎｇ／ｍＬである。前記培地における前記ｂＦＧＦ濃度は、上限が、例えば、２０ｎｇ／ｍＬであり、好ましくは１７ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは１５ｎｇ／ｍＬであり、特に好ましくは１０ｎｇ／ｍＬである。前記培地における前記ｂＦＧＦ濃度の範囲は、例えば、４ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬの範囲であり、好ましくは５ｎｇ／ｍＬ〜１７ｎｇ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは８ｎｇ／ｍＬ〜１５ｎｇ／ｍＬの範囲であり、特に好ましくは約４ｎｇ／ｍＬまたは約１０ｎｇ／ｍＬである。
【００５５】
本発明の培地が、前記ｂＦＧＦを含む場合、前記ＣＣＬ２および／または前記ＣＣＬ２様タンパク質と、前記ｂＦＧＦとの添加比は、特に制限されない。前記培地において、例えば、前記ＣＣＬ２および／または前記ＣＣＬ２様タンパク質１ｎｇに対して、前記ｂＦＧＦが、例えば、０．０１６ｎｇ／ｍＬ〜０．０４ｎｇ／ｍＬ、または、０．０２ｎｇ／ｍＬ〜０．０４ｎｇ／ｍＬの範囲であることが好ましく、より好ましくは０．０１６ｎｇ／ｍＬ〜０．０３４ｎｇ／ｍＬの範囲であり、さらに好ましくは０．０１６ｎｇ／ｍＬ〜０．０３ｎｇ／ｍＬの範囲であり、特に好ましくは約０．０２ｎｇ／ｍＬである。
【００５６】
本発明の培地は、例えば、前記ＣＣＬ２および／または前記ＣＣＬ２様タンパク質を基本培地に添加することで調製できる。前記基本培地は、特に制限されず、例えば、培養に必要な成分および増殖に必要な成分等が含まれていればよく、培養する未分化細胞の種類に応じて適宜設定できる。前記基本培地は、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｏｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）、ノックアウトＤＭＥＭ（ＮＯ  ＤＭＥＭ）等があげられる。また、前記基本培地は、例えば、公知のオンフィーダー培地、フィーダーフリー培地等が使用できる。前記基本培地において、ＬＩＦ等の前記他の分化抑制因子の添加の有無、ｂＦＧＦ等の前記増殖因子の添加の有無は、特に制限されず、前述の通りである。前記基本培地は、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清；必須アミノ酸；非必須アミノ酸等の増殖補助因子；ヌクレオシド；β−メルカプトエタノール等を含んでもよい。
【００５７】
本発明の培地のｐＨは、特に制限されず、例えば、培養する未分化細胞の種類に応じて適宜設定できる。前記培地のｐＨは、例えば、６〜７であり、好ましくは６．５〜７であり、より好ましくは６．８〜７である。
【００５８】
本発明の培地は、例えば、フィーダー細胞を使用する培養（以下、「オンフィーダー培養」という）のための培地（以下、「オンフィーダー培地」という）でもよいし、フィーダー細胞を使用しない培養（以下、「フィーダーフリー培養」という）のための培地（以下、「フィーダーフリー培地」という）でもよい。本発明において、前記基本培地は、例えば、オンフィーダー培養およびフィーダーフリー培養の種類、および、培養対象の細胞の種類等によって適宜選択できる。前記基本培地について、以下に例示するが、本発明は、これには制限されない。
【００５９】
オンフィーダー培地において、マウス未分化細胞を培養する場合、前記基本培地は、例えば、血清添加培地または無血清培地（血清無添加培地）が使用でき、好ましくは前記血清添加培地である。前記血清の種類は、特に制限されず、ＦＢＳ等が使用できる。オンフィーダー培地において、ヒト未分化細胞を培養する場合、前記基本培地は、例えば、無血清培地が好ましい。
【００６０】
フィーダーフリー培地において、マウス未分化細胞を培養する場合、前記基本培地は、例えば、前記血清添加培地が好ましい。前記血清の種類は、特に制限されず、ＦＢＳ等が使用できる。フィーダーフリー培地において、ヒト未分化細胞を培養する場合、前記基本培地は、例えば、無血清培地が好ましい。
【００６１】
本発明の培地の使用方法は、例えば、後述する本発明の製造方法において説明する。
【００６２】
（３）第１の未分化状態が制御された未分化細胞の製造方法
本発明の第１の未分化状態が制御された未分化細胞の製造方法は、前記本発明の未分化状態の制御剤の存在下、未分化細胞を培養する培養工程を含むことを特徴とする。
【００６３】
本発明の製造方法は、前記本発明の制御剤の存在下で未分化細胞を培養すればよく、その他の工程および条件は、何ら制限されない。本発明の製造方法は、前記培養工程が、前記制御剤を含む前記本発明の未分化細胞の未分化状態の制御用培地を使用して、前記未分化細胞を培養する工程であることが好ましい。
【００６４】
本発明の製造方法において、前記制御剤によって提供される前記ＣＣＬ２または前記ＣＣＬ２様タンパク質の由来と、培養する未分化細胞の由来は、例えば、同じでもよいし、異なってもよい。前記ＣＣＬ２または前記ＣＣＬ２様タンパク質の由来と、前記未分化細胞の由来は、同じであることが好ましく、より好ましくは、共に哺乳類動物であり、さらに好ましくは、共に同じ哺乳類動物である。具体例として、ヒト由来の未分化細胞を培養する場合、ヒト由来の前記ＣＣＬ２および／または前記ＣＣＬ２様タンパク質を使用することが好ましく、マウス由来の未分化細胞を培養する場合、マウス由来の前記ＣＣＬ２および／または前記ＣＣＬ２様タンパク質を使用することが好ましい。
【００６５】
培養する前記未分化細胞の種類は、特に制限されず、前述のような種々の細胞が使用できる。前記未分化細胞の調製方法は、特に制限されず、公知の方法により採取され、調製できる。
【００６６】
本発明の製造方法における培養は、例えば、オンフィーダー培養でもよいし、フィーダーフリー培養でもよい。本発明の制御剤の存在下で培養することによって、例えば、オンフィーダー培養およびフィーダーフリー培養のいずれにおいても、前記未分化細胞の未分化状態を効果的に維持および／または向上できる。
【００６７】
本発明の製造方法が、オンフィーダー培養の場合、前記フィーダー細胞は、特に制限されず、公知のフィーダー細胞が使用できる。前記フィーダー細胞は、一般に、目的の細胞を増殖させる際、培養条件を調整するために使用する他の細胞を意味する。前記フィーダー細胞の種類は、特に制限されず、例えば、培養する未分化細胞の種類に応じて適宜決定できる。前記フィーダー細胞は、例えば、繊維芽細胞、ＳＮＬ細胞等があげられ、また、胎児由来の細胞であることが好ましい。前記フィーダー細胞の由来と、前記未分化細胞の由来は、例えば、同じでも異なってもよい。両者が同じ場合、例えば、哺乳類が好ましく、また、霊長類またはげっ歯類であることが好ましく、ヒトまたはマウスであることが好ましい。
【００６８】
本発明の製造方法において、培養条件は、特に制限されず、培養する前記未分化細胞の種類に応じて、適宜設定できる。前記培養におけるＯ２分圧は、例えば、１〜２１％が好ましく、ＣＯ２分圧は、例えば、５〜６％が好ましい。培養温度は、例えば、３６〜３７℃が好ましい。
【００６９】
（４）第１の未分化状態の制御方法
本発明の第１の未分化状態の制御方法は、前記未分化細胞の未分化状態の制御方法であって、前記本発明の第１の製造方法に従って未分化細胞を培養する工程を含むことを特徴とする。前記本発明の第１の製造方法にしたがって未分化細胞を培養することにより、前記未分化細胞の未分化状態を維持および／または向上できる。
【００７０】
本発明の制御方法は、前記本発明の第１の製造方法に従って未分化細胞を培養すればよく、その他の工程および条件は、何ら制限されない。本発明の制御方法は、例えば、前記本発明の第１の製造方法の説明を引用できる。
【００７１】
本発明の制御方法は、例えば、本発明の制御剤の非存在下における、前記未分化細胞の分化の階層性を維持できることから、分化の階層性の維持方法ともいえる。また、前記未分化細胞は、一般に、ブラストシストからエピブラストに階層が進む。このため、本発明の制御方法は、例えば、ブラストシスト状態の維持方法、エピブラスト化の抑制方法ともいえる。また、本発明の制御方法によれば、例えば、特にヒト由来の未分化細胞について、エピブラストからブラストシストへの脱分化の進行を促進できる。このため、本発明の制御方法は、例えば、分化の階層性の向上方法または脱分化促進方法ともいえる。
【００７２】
前記本発明の製造方法または前記本発明の制御方法により、未分化状態が維持および／または向上された未分化細胞は、例えば、所望の時点で、分化誘導を行うことにより、目的の細胞に分化させることができる。分化誘導の方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。前記方法は、例えば、ＥＢ（Embryonic  Body）の形成後、ゼラチンコートディッシュにおいて、血清入り培地で培養し、自発的分化を誘導する自発的分化誘導法方法等があげられる。前記分化誘導を行う際は、例えば、前記ＣＣＬ２または前記ＣＣＬ２様タンパク質の非存在下で、前記未分化細胞を培養することが好ましい。
【００７３】
第２の形態
（１）第２の制御剤
つぎに、本発明の第２の制御剤は、未分化細胞の未分化状態を制御する制御剤であって、前記ＣＣＬ２またはその機能ドメインを含むタンパク質（前記ＣＣＬ２様タンパク質）を発現する発現ベクターを含むことを特徴とする。本発明の第２の制御剤によれば、前記ＣＣＬ２または前記ＣＣＬ２様タンパク質を発現できるため、例えば、この発現産物を前記未分化細胞の培養に使用することによって、前記未分化細胞の未分化状態を維持および／または向上できる。
【００７４】
また、本発明の制御剤によれば、例えば、さらに、前記未分化細胞の未分化状態を維持および／または向上しつつ、細胞接着および／または増殖を促進することも可能である。このため、本発明の制御剤は、例えば、未分化細胞の接着および／または増殖促進剤ということもできる。本発明の未分化細胞の接着および／または増殖促進剤は、前記発現ベクターを含むことを特徴とし、以下に示す本発明の制御剤の記載を引用できる。また、本発明の未分化細胞の未分化状態の制御方法は、例えば、未分化細胞の接着および／または増殖促進方法ということもできる。本発明の未分化細胞の接着および／または増殖促進方法は、後述する本発明の未分化細胞の未分化状態の制御方法と同様の構成であり、それらの記載を引用できる。
【００７５】
前記発現ベクターは、前記ＣＣＬ２のコード配列および前記ＣＣＬ２様タンパク質のコード配列の少なくとも一方が、ベクターに、発現可能に挿入されていればよい。具体的には、前記発現ベクターは、例えば、前記発現ベクターを導入する細胞内で、前記ＣＣＬ２または前記ＣＣＬ２様タンパク質が発現可能であればよい。前記発現ベクターは、例えば、前記ＣＣＬ２のコード配列のみが挿入されてもよいし、前記ＣＣＬ２様タンパク質のコード配列のみが挿入されてもよいし、両方が挿入されてもよい。
【００７６】
前記ＣＣＬ２のコード配列および前記ＣＣＬ２様タンパク質のコード配列は、特に制限されない。前記コード配列は、例えば、前述のアミノ酸配列から対応するコドンに置き換えることで設計可能である。以下に、前記ＣＣＬ２および前記ＣＣＬ２様タンパク質のコードＤＮＡ配列の例を示すが、本発明は、これには制限されない。
【００７７】
前記ＣＣＬ２または前記ＣＣＬ２様タンパク質のコード配列は、例えば、下記（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ａ４）、（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）および（ｂ４）のいずれかのポリヌクレオチドからなるＤＮＡである。また、前記ポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドからなるＤＮＡでもよい。
（ａ１）配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチド
配列番号５
atgaaagtctctgccgcccttctgtgcctgctgctcatagcagccaccttcattccccaagggctcgctcagccagatgcaatcaatgccccagtcacctgctgttataacttcaccaataggaagatctcagtgcagaggctcgcgagctatagaagaatcaccagcagcaagtgtcccaaagaagctgtgatcttcaagaccattgtggccaaggagatctgtgctgaccccaagcagaagtgggttcaggattccatggaccacctggacaagcaaacccaaactccgaagacttga
（ａ２）配列番号５の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＣＣＬ２の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ａ３）配列番号５の塩基配列に対する同一性が８０％以上の塩基配列からなり、ＣＣＬ２の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ａ４）配列番号５の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、ＣＣＬ２の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ１）配列番号６の塩基配列からなるポリヌクレオチド
配列番号６
atgcaggtccctgtcatgcttctgggcctgctgttcacagttgccggctggagcatccacgtgttggctcagccagatgcagttaacgccccactcacctgctgctactcattcaccagcaagatgatcccaatgagtaggctggagagctacaagaggatcaccagcagcaggtgtcccaaagaagctgtagtttttgtcaccaagctcaagagagaggtctgtgctgaccccaagaaggaatgggtccagacatacattaaaaacctggatcggaaccaaatgagatcagaacctacaactttatttaaaactgcatctgccctaaggtcttcagcacctttgaatgtgaagttgacccgtaaatctgaagctaatgcatccactaccttttccacaaccacctcaagcacttctgtaggagtgaccagtgtgacagtgaactag
（ｂ２）配列番号６の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＣＣＬ２の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ３）配列番号６の塩基配列に対する同一性が８０％以上の塩基配列からなり、ＣＣＬ２の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ４）配列番号６の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、ＣＣＬ２の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００７８】
前記（ａ１）は、ヒトのＣＣＬ２のコード配列である。配列番号５の塩基配列は、前記ＣＣＬ２の全長コード配列（ＯＲＦ）であり、例えば、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．Ｐ１３５００に登録されている。
【００７９】
前記（ａ２）において、前記欠失等の塩基の個数は、特に制限されず、例えば、１個または数個であり、好ましくは１個〜６個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個または２個である。
【００８０】
前記（ａ３）において、前記同一性は、特に制限されず、例えば、８０％以上であり、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、算出できる（以下、同様）。
【００８１】
前記（ａ４）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」は、例えば、０．７〜１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６０〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５〜６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。なお、１×ＳＳＣは、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムからなる。ストリンジェンシーの選択のため、例えば、洗浄工程における塩濃度や温度を適宜最適化できる。また、当業者であれば、ストリンジェンシーを上げるために、例えば、ホルムアミドやＳＤＳ等を添加することも技術常識である（以下、同様）。
【００８２】
前記（ｂ１）は、マウスのＣＣＬ２のコード配列である。配列番号６の塩基配列は、前記ＣＣＬ２の全長コード配列（ＯＲＦ）であり、例えば、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．Ｐ１０１４８またはＮＭ＿０１１３３３．３に登録されている。
【００８３】
前記（ｂ２）において、前記欠失等の塩基の個数は、特に制限されず、例えば、１個または数個であり、好ましくは１個〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは、１〜３個、特に好ましくは１個または２個である。
【００８４】
前記（ｂ３）において、前記同一性は、特に制限されず、例えば、８０％以上であり、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
【００８５】
前記コード配列が挿入される前記ベクター（以下、「基本ベクター」ともいう）は、特に制限されず、例えば、前記発現ベクターを導入する細胞の種類に応じて、適宜設定できる。前記基本ベクターは、例えば、非ウイルスベクターおよびウイルスベクターがあげられる。前記非ウイルスベクターは、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター等があげられる。前記ウイルスベクターは、例えば、レトロウイルスベクター、ＤＮＡウイルスベクター、ＲＮＡウイルスベクター等があげられる。前記レトロウイルスベクターは、例えば、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のレンチウイルスベクター等があげられる。前記ＤＮＡウイルスベクターは、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶベクター；ａｄｅｎｏ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ボックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シンビスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ＳＶ４０等があげられる。前記ＲＮＡウイルスベクターは、例えば、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のレンチウイルスベクター等があげられる。
【００８６】
前記発現ベクターは、例えば、さらに、前記コード配列の発現を調節する調節配列を含んでもよい。前記調節配列は、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス−４０（ＳＶ−４０）、筋βアクチンプロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）等の構成プロモーター、チミジンキナーゼプロモーター等の組織特異的プロモーター、成長ホルモン調節性プロモーター等の調節性プロモーター、ｌａｃオペロン配列の制御下にあるプロモーター、亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーター等の誘導性プロモーターがあげられる。前記調節配列は、公知の方法に基づいて、前記コード配列の発現を機能的に調節できる部位に配置すればよい。この他に、例えば、エンハンサー配列、ポリアデニル化シグナル、複製起点配列（ｏｒｉ）等を含んでもよい。
【００８７】
前記発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。
【００８８】
本発明の第２の制御剤は、例えば、前記発現ベクターが導入された形質転換体でもよい。前記宿主は、特に制限されない。前記形質転換体は、例えば、前記未分化細胞以外の宿主に前記発現ベクターが導入された形質転換体でもよいし、目的の前記未分化細胞を宿主とし、これに前記発現ベクターが導入された形質転換体（形質転換未分化細胞）でもよい。
【００８９】
前者の形質転換体によれば、前記ＣＣＬ２または前記ＣＣＬ２様タンパク質を発現できる。前記形質転換体を使用する場合、例えば、前記形質転換体と前記未分化細胞との共培養によって、前記未分化細胞の未分化状態を維持・向上できる。また、例えば、前記形質転換体の培養により発現した前記ＣＣＬ２または前記ＣＣＬ２様タンパク質の存在下で、目的の未分化細胞の培養することによって、前記未分化細胞の未分化状態を維持・向上できる。前記発現ベクターを導入する宿主は、特に制限されず、例えば、前記発現ベクターの種類に応じて適宜設定できる。
【００９０】
また、後者の形質転換体によれば、前記未分化細胞内で前記ＣＣＬ２または前記ＣＣＬ２様タンパク質を発現できる。前記形質転換体を使用する場合、例えば、前記形質転換体を培養することによって、前記未分化細胞の未分化状態を維持・向上できる。
【００９１】
前記宿主に対する前記発現ベクターの導入方法は、特に制限されず、例えば、宿主の種類に応じて適宜設定できる。前記導入方法は、例えば、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、遺伝子銃による導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法等があげられる。前記リポソームは、例えば、リポフェクタミンおよびカチオニックリポソーム等があげられ、前記導入補助剤は、例えば、アテロコラーゲン、ナノ粒子およびポリマー等があげられる。
【００９２】
（２）第２の未分化状態が制御された未分化細胞の製造方法
本発明の第２の未分化状態が制御された未分化細胞の製造方法は、前記第２の制御剤を使用する方法である。前記制御剤として、前述のような、例えば、前記未分化細胞以外の宿主に前記発現ベクターが導入された形質転換体を使用する方法、および、目的の前記未分化細胞に前記発現ベクターが導入された形質転換体（形質転換未分化細胞）を使用する方法があげられる。
【００９３】
前者の形質転換体を使用する場合、本発明の製造方法は、例えば、前記形質転換体の培養後、または、前記形質転換体の培養と同時に、未分化細胞を培養する工程を含むことを特徴とする。前述のように、前記形質転換体は、前記ＣＣＬ２または前記ＣＣＬ２様タンパク質を発現できる。このため、前記形質転換体の培養後、または、前記形質転換体の培養と同時に、前記未分化細胞を培養することで、発現された前記ＣＣＬ２または前記ＣＣＬ２様タンパク質により、前記未分化細胞の未分化状態を維持および／または向上できる。
【００９４】
本発明において、前記形質転換体の培養と前記未分化細胞の培養は、同じ培地で行われることが好ましい。
【００９５】
後者の形質転換体を使用する場合、本発明の製造方法は、例えば、前記発現ベクターが導入された前記形質転換未分化細胞を培養する工程を含むことを特徴とする。前述のように、前記形質転換体は、未分化細胞内で前記ＣＣＬ２または前記ＣＣＬ２様タンパク質を発現できる。このため、前記形質転換未分化細胞を培養することで、発現された前記ＣＣＬ２または前記ＣＣＬ２様タンパク質により、前記未分化細胞の未分化状態を維持および／または向上できる。
【００９６】
上述したいずれの場合も、前記未分化細胞は、前記本発明の制御剤により提供される前記ＣＣＬ２および／または前記ＣＣＬ２様タンパク質の存在下で培養されるため、前記未分化細胞の未分化状態を維持および／または向上できる。
【００９７】
本発明の第２の製造方法は、前記培養工程を含んでいればよく、その他の条件は、特に制限されず、例えば、前記本発明の第１の製造方法の工程および条件を引用できる。
【００９８】
（３）第２の未分化状態の制御方法
本発明の第２の未分化状態の制御方法は、前記未分化細胞の未分化状態の制御方法であって、前記本発明の第２の製造方法に従って未分化細胞を培養することにより、前記未分化細胞の未分化状態を維持および／または向上することを特徴とする。
【００９９】
本発明の制御方法は、前記本発明の第２の製造方法に従って未分化細胞を培養すればよく、その他の工程および条件は、何ら制限されない。本発明の制御方法は、例えば、前記本発明の第１の製造方法、前記第２の製造方法および前記本発明の第１の未分化状態の制御方法の説明を引用できる。
【実施例】
【０１００】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記の実施例により制限されない。【０１０１】
（ｉＰＳ細胞）
マウスｉＰＳ細胞は、ｉＰＳ−ＭＥＦ−Ｎｇ−２０Ｄ−１７（Takahashi  K,  Okita  K,  Nakagawa  M,  et  al.  Induction  of  pluripotent  stem  cells  from  fibroblast  cultures.  Nat  Protoc  2007:  2:3081-3089.）を、理研バイオリソースセンター（http://www.brc.riken.go.jp/inf/en/index.shtml、#APS0001）から入手した。ヒトｉＰＳ細胞は、２０１Ｂ７（Takahashi  K  et  al.,  Cell  (2007)  131,  861-872）を、理研バイオリソースセンター（http://www.brc.riken.go.jp/inf/en/index.shtml、HPS0063）から入手した。【０１０２】
（ＥＳ細胞）
マウスＥＳ細胞は、RF8  derived  from  129  SV  Jae  strainを、理研バイオリソースセンター（http://www.brc.riken.go.jp/inf/en/index.shtml、＃AES0121）から入手した。【０１０３】
（フィーダー条件の培養）
フィーダー条件下、マイトマイシンＣ（シグマアルドリッチ社）で処理したフィーダー細胞ＳＮＬ７６／７（European  Collection  of  Cell  Cultures、ＥＣＡＣＣ、＃０７０３２８０１）上で、マウスｉＰＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞を培養した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２とした。培地は、１５％  ＦＢＳ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＥＡＡおよび０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを含むＤＭＥＭ培地（高濃度グルコース含有、ピルビン酸ナトリウム非含有）を使用した。【０１０４】
（フィーダーフリー条件の培養）
培地は、１５％  ＦＢＳ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＥＡＡおよび０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノールを含むＤＭＥＭ培地（高濃度グルコース含有、ピルビン酸ナトリウム非含有）に、ＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）を添加したものを使用した。ＬＩＦは、前記培地における最終濃度が１０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬとなるように添加した。そして、フィーダーフリー条件で、前記培地によりマウスｉＰＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞を培養した。マウスｉＰＳ細胞は、２〜３日ごとに、０．２５％  トリプシンで剥離し、継代培養した。また、ヒトｉＰＳ細胞は、６−７日ごとに、ＥＳ／ｉＰＳ細胞剥離液およびＣＴＫ溶液で剥離し、継代培養した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２とした。【０１０５】
（定量ＲＴ−ＰＣＲ）
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（商品名、タカラバイオ社）、ＡＢＩ  ７５００  Ｆａｓｔ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（商品名、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社）およびＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（商品名、タカラバイオ社）を、各プロトコールに従って使用した。ＰＣＲは、９４℃で５秒および６２．５℃で２０秒を１サイクルとして、４０サイクル行った。各遺伝子の発現量は、前記遺伝子のｍＲＮＡの相対量を、２−ΔΔＣＴ  ｍｅｔｈｏｄ（Thomse   R,  Solvsten  CA,  Linnet  TE,  et  al.  Analysis  of  qPCR  data  by  converting  exponentially  related  Ct  values  into  linearly  related  X0  values.  J  Bioinform  Comput  Biol  2010:  8:885-900.）を使用し、Ｇａｐｄｈ  ｍＲＮＡに正規化することで算出した。【０１０６】
（プライマー）
前記未分化マーカー遺伝子の定量ＲＴ−ＰＣＲ等には、以下のプライマーを使用した。以下、Ｆは、フォワードプライマー、Ｒは、リバースプライマーを示す。
m-Gapdh_F（配列番号  ９）    gaagcccatcaccatcttcc
m-Gapdh_R（配列番号１０）    gatgacccttttggctccac
m-c-Myc_F（配列番号１１）    tagtgctgcatgaggagacacc
m-c-Myc_R（配列番号１２）    tttgcctcttctccacagacac
m-Dax1_F（配列番号１３）      tatctgaaagggaccgtgctc
m-Dax1_R（配列番号１４）      atccggatgtgctcagtaagg
m-Klf4_F（配列番号１５）      ctttcctgccagaccagatg
m-Klf4_R（配列番号１６）      ttcttcccctctttggcttg
m-Nanog  1  F（配列番号１７）    aagtactcagcctccagca
m-Nanog  1  R（配列番号１８）    gtgctgagcccttctgaatc
m-Oct3/4_F（配列番号１９）      agtttgccaagctgctgaag
m-Oct3/4_R（配列番号２０）      tcttaaggctgagctgcaagg
m-Sox2_F（配列番号２１）    tgaacgccttcatggtatgg
m-Sox2_R（配列番号２２）    ttgtgcatcttggggttctc
m-Utf1_F（配列番号２３）    agtcgttgaataccgcgttg
m-Utf1_R（配列番号２４）    agaaacggtttggtcgaagg
m-Tbx3  1  F（配列番号２５）    cagctcacactgcagtccat
m-Tbx3  1  R（配列番号２６）    tggagacagcaggagaggat
Cxcl1  F（配列番号２７）    gctgggattcacctcaagaa
Cxcl1  R（配列番号２８）    aagggagcttcagggtcaag
Dcn  F（配列番号２９）    tctccaggaacttcgtgtcc
Dcn  R（配列番号３０）    ctccgttttcaatcccagag
Ccl2  F（配列番号３１）      cccaatgagtaggctggaga
Ccl2  R（配列番号３２）      tctggacccattccttcttg
Btc  F （配列番号３３）        gcacaggtaccacccctaga
Btc  R（配列番号３４）        gccccaaagtagcctttctc
Gsto2  F（配列番号３５）    gtaaggtcccgcctttaagc
Gsto2  R（配列番号３６）    cgccgaagaaggtagtgttc
Mmp13  F（配列番号３７）    gccctgatgtttcccatcta
Mmp13  R（配列番号３８）    ttttgggatgcttagggttg
EG545886  F（配列番号３９）    acccaggtctcaggttcaga
EG545886  R（配列番号４０）    tgctgttgctgttcctgttc
Ltbp3  F（配列番号４１）    ctgcttccaggacacattgc
Ltbp3  R（配列番号４２）    tgtgggcacttgtgacactt
Ltbp1  F（配列番号４３）    ggaagtttcctgtgtgtctgc
Ltbp1  R（配列番号４４）    cggccatccctacacatatc
Areg  F（配列番号４５）      catgcactgccaagtttcag
Areg  R（配列番号４６）      ccacaccgttcaccaaagta
Ecm1  F（配列番号４７）      ggagactccgagttgaccac
Ecm1  R（配列番号４８）      ggccagtcttcctcgtacac
Ccl9  F（配列番号４９）      cagtctgaaggcacagcaag
Ccl9  R（配列番号５０）      ccactggtgggaaaataacc
Ccl7  F（配列番号５１）      tgtccctgggaagctgttat
Ccl7  R（配列番号５２）      ctttggagttggggttttca
Plau  F（配列番号５３）      gcctgctgtccttcagaaac
Plau  R（配列番号５４）      caaactgccttaggccaatc
Msln  F（配列番号５５）      agcacaatgtgagcatggac
Msln  R（配列番号５６）      acggacagggcttttatcct
Traf1  F（配列番号５７）    gatggctcaggcaagaagac
Traf1  R（配列番号５８）    agcatgctctcggttgttct
Cav1  F（配列番号５９）      gcacaccaaggagattgacc
Cav1  R（配列番号６０）      tcccttctggttctgcaatc
Lhfp  F（配列番号６１）      tcggaactcatctccaggac
Lhfp  R（配列番号６２）      gccagagatgtagccacaag
D12ertd647e  F（配列番号６３）    tattgctaatgggggtggag
D12ertd647e  R（配列番号６４）    cagagcccacgatgacagta
Col4a5  F（配列番号６５）    gggggaaccaggcagtataa
Col4a5  R（配列番号６６）    taaacctggtggtcctggag
Igfbp7  F（配列番号６７）    ggaaaatctggccattcaga
Igfbp7  R（配列番号６８）    tgcgtggcactcatactctc
Ltbp2  F（配列番号６９）      agggagcagacagagcagag
Ltbp2  R（配列番号７０）      ctttgtcagggagggtctca
Serpina3g  F（配列番号７１）    cattgatggtgctggtgaac
Serpina3g  R（配列番号７２）    tcatggacacaatcacagacc
Ppbp  F（配列番号７３）    gcgctgcagatgtacgaata
Ppbp  R（配列番号７４）    ccattcttcagtgtggctata
S100a4  F（配列番号７５）    ttgtgtccaccttccacaaa
S100a4  R（配列番号７６）    tggaatgcagcttcatctgt
Serpinb2  F（配列番号７７）    caccacagggggattatttg
Serpinb2  R（配列番号７８）    aggaagtccactgcttctgg
Tcn  F（配列番号７９）    accagacatccaccaccatt
Tcn  R（配列番号８０）    tcaggtgcaggcaaatagg
Gm566（Bcl2l15）  F（配列番号８１）    cagatgaaccatgctcagga
Gm566（Bcl2l15）  R（配列番号８２）    ctgtcctccaatggttaccg
m-Zfp42_F（配列番号８３）      acgagtggcagtttcttcttggga
m-Zfp42_R（配列番号８４）      tatgactcacttccagggggcact
m-Cripto_F（配列番号８５）    atggacgcaactgtgaacatgatgttcgca
m-Cripto_R（配列番号８６）    ctttgaggtcctggtccatcacgtgaccat
m-Ecat1_F（配列番号８７）      tgtggggccctgaaaggcgagctgagat
m-Ecat1_R（配列番号８８）      atgggccgccatacgacgacgctcaact
m-Esg1_F（配列番号８９）    gaagtctggttccttggcaggatg
m-Esg1_R（配列番号９０）    actcgatacactggcctagc
m-Eras_F（配列番号９１）    actgcccctcatcagactgctact
m-Eras_R（配列番号９２）    cactgccttgtactcgggtagctg
m-Fgf4_F（配列番号９３）    cgtggtgagcatcttcggagtgg
m-Fgf4_R（配列番号９４）    ccttcttggtccgcccgttctta【０１０７】
［実施例１］
本例では、マウスｉＰＳ細胞について、ＣＣＬ２タンパク質を過剰発現させ、未分化マーカー遺伝子の発現に対する影響を確認した。【０１０８】
（１）ＣＣＬ２の過剰発現による未分化マーカー遺伝子の発現への影響
以下に示すように、マウスｉＰＳ細胞においてＣＣＬ２を過剰発現させ、未分化マーカー遺伝子の発現量を確認した。未分化マーカー遺伝子は、Ｅｃａｔ１遺伝子、Ｃｒｉｐｔｏ遺伝子、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｚｆｐ４２遺伝子、Ｅｓｇ１遺伝子、Ｅｒａｓ遺伝子、Ｆｇｆ４遺伝子、Ｄａｘ１遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃＭｙｃ遺伝子、Ｔｂｘ３遺伝子およびＥｅｄ遺伝子とした。【０１０９】
ＣＣＬ２を過剰発現するＣｃｌ２発現ベクターを構築した。発現させる前記ＣＣＬ２は、配列番号３の全長アミノ酸配列からなるマウス由来のタンパク質とした。まず、Gateway  Technology（Invitrogen社）を使用して、ｐＥＮＴＥＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに、前記ＣＣＬ２をコードする全長ｃＤＮＡ（配列番号６）をクローニングした。クローニングした配列を確認した後、Gateway  LR  Clonase  II  Enzyme  Mix（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して、ＥＦ−α１プロモーターを含むｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、前記全長ｃＤＮＡを挿入し、Ｃｃｌ２発現ベクターを構築した。前記Ｃｃｌ２発現ベクターは、Endotoxin  free  Plasmid  maxi  prep  kit（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して、そのプロトコールにしたがって精製した。
配列番号３（NP_035463.1）148  aa
MQVPVMLLGLLFTVAGWSIHVLAQPDAVNAPLTCCYSFTSKMIPMSRLESYKRITSSRCPKEAVVFVTKLKREVCADPKKEWVQTYIKNLDRNQMRSEPTTLFKTASALRSSAPLNVKLTRKSEANASTTFSTTTSSTSVGVTSVTVN
配列番号６（NM_011333.3）447  nt
ATGCAGGTCCCTGTCATGCTTCTGGGCCTGCTGTTCACAGTTGCCGGCTGGAGCATCCACGTGTTGGCTCAGCCAGATGCAGTTAACGCCCCACTCACCTGCTGCTACTCATTCACCAGCAAGATGATCCCAATGAGTAGGCTGGAGAGCTACAAGAGGATCACCAGCAGCAGGTGTCCCAAAGAAGCTGTAGTTTTTGTCACCAAGCTCAAGAGAGAGGTCTGTGCTGACCCCAAGAAGGAATGGGTCCAGACATACATTAAAAACCTGGATCGGAACCAAATGAGATCAGAACCTACAACTTTATTTAAAACTGCATCTGCCCTAAGGTCTTCAGCACCTTTGAATGTGAAGTTGACCCGTAAATCTGAAGCTAATGCATCCACTACCTTTTCCACAACCACCTCAAGCACTTCTGTAGGAGTGACCAGTGTGACAGTGAACTAG【０１１０】
つぎに、前記フィーダーフリー条件下で培養した前記マウスｉＰＳ細胞を、１２穴ディッシュに３×１０５細胞／ウェルとなるように播種した。前記ディッシュに添加する培地の量は、１ウェルあたり１ｍＬとした。そして、１ウェルあたり、Lipofectamine  2000（Invitrogen社）１６μＬおよび前記Ｃｃｌ２発現ベクター４．８μｇを使用して、前記マウスｉＰＳ細胞に前記Ｃｃｌ２発現ベクターを導入した。このマウスｉＰＳ細胞を、さらに、フィーダーフリー条件下で２４時間培養した後、トータルＲＮＡを抽出し、未分化マーカー遺伝子の発現量を確認した。前記未分化マーカー遺伝子の発現は、前述のプライマーを用いて、定量ＲＴ−ＰＣＲにより確認した。また、ネガティブコントロールとして、前記発現ベクターを導入しない以外は、同様にして培養した前記マウスｉＰＳ細胞についても、同様に発現量を確認した。そして、ネガティブコントロールに対する発現量の変化率を算出した。【０１１１】
これらの結果を図１示す。図１は、ＣＣＬ２を過剰発現させたマウスｉＰＳ細胞における未分化マーカー遺伝子の発現変化率を示すグラフである。縦軸は、変化率（倍）を示し、横軸には、対象となる前記未分化マーカー遺伝子を示す。【０１１２】
図１に示すように、ＣＣＬ２をマウスｉＰＳ細胞内で過剰発現することによって、未分化マーカー遺伝子であるＮａｎｏｇ遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、およびＴｂｘ３遺伝子の発現が、顕著に増加した。【０１１３】
（２）Ｃｃｌ２遺伝子のノックダウンによる未分化マーカー遺伝子の発現への影響
以下に示すように、マウスｉＰＳ細胞においてＣｃｌ２遺伝子をノックダウンさせ、未分化マーカー遺伝子の発現量を確認した。前記未分化マーカー遺伝子は、Ｋｌｆ４遺伝子およびＴｂｘ３遺伝子とした。【０１１４】
前記Ｃｃｌ２遺伝子のノックダウンは、ステルス  ｓｉＲＮＡ（Invitrogen社）を使用して以下のように行った。まず、フィーダーフリー条件下で培養した前記マウスｉＰＳ細胞を、１２穴ディッシュに、６×１０４細胞／ウェルとなるように播種した。前記ディッシュに添加する培地の量は、１ウェルあたり１ｍＬとした。２４時間培養後、１ウェルあたりLipofectamine  2000（Invitrogen社）１６μＬおよびステルスｓｉＲＮＡ（商品名CCL2  Stealth  RNAi（登録商標）  ｓｉＲＮＡ、Invitrogen社）を添加し、それらのプロトコールに従って、前記マウスｉＰＳ細胞にステルスｓｉＲＮＡを導入した。前記ステルスｓｉＲＮＡにおけるＣｃｌ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡの配列は、配列番号７とした。
ＣＡＵＵＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＡＵＧＡＵＣＣＣＡＡＵ（配列番号７）
前記ステルスｓｉＲＮＡは、１ウェルあたり、最終濃度が２０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加した。そして、導入から２４時間後、トータルＲＮＡを抽出し、前記マウスｉＰＳ細胞における未分化マーカー遺伝子およびＣｃｌ２遺伝子の発現量を、定量ＲＴ−ＰＣＲにより確認した。【０１１５】
また、ネガティブコントロールとして、ステルスｓｉＲＮＡ（商品名Stealth  RNAi（登録商標）  Negative  Control  Medium  GC、Duplex-catalog  number  12935-300、Invitrogen社)を使用した以外は、同様にして、前記マウスｉＰＳ細胞への導入を行い、未分化マーカー遺伝子の発現を測定した（ｎ＝３）。そして、ネガティブコントロールに対する発現量の変化率を算出した。【０１１６】
これらの結果を図２示す。図２は、Ｃｃｌ２遺伝子をノックダウンしたマウスｉＰＳ細胞におけるＣｃｌ２遺伝子および未分化マーカー遺伝子の発現変化率を示すグラフである。縦軸は、ネガティブコントロールに対する発現量の変化率（倍）を示し、横軸には、Ｃｃｌ２遺伝子および前記未分化マーカー遺伝子を示す。各遺伝子の結果において、白抜きのバーは、Ｃｃｌ２遺伝子をノックダウンしたマウスｉＰＳ細胞の結果、黒塗りのバーは、Ｃｃｌ２遺伝子をノックダウンしていないマウスｉＰＳ細胞（コントロール）の結果を示す。【０１１７】
図２に示すように、Ｃｃｌ２遺伝子をノックダウンすることによって、未分化マーカー遺伝子の発現が著しく低下した。【０１１８】
［実施例２］
本例では、フィーダーフリー条件下、ＣＣＬ２の存在下でマウスｉＰＳ細胞を培養し、ＣＣＬ２による未分化能の向上を確認した。【０１１９】
（１）ＣＣＬ２の添加による未分化能の向上
実施例は、前記ＬＩＦおよびマウス組換えＣＣＬ２（ＭＣＰ−１、＃４７９−ＪＥ−０１０、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した前記ＤＭＥＭ培地を使用した。前記培地において、ＬＩＦの最終濃度は、２５ｕｎｉｔ／ｍＬ、前記組換えＣＣＬ２濃度は、５００ｎｇ／ｍＬとした。１２穴ディッシュに添加する培地の量は、１ウェルあたり１ｍＬとした。一方、比較例は、ＬＩＦを添加し、前記ＣＣＬ２が未添加である前記ＤＭＥＭ培地を使用した。ＬＩＦの最終濃度は、２５ｕｎｉｔ／ｍＬとした。【０１２０】
フィーダーフリー条件下で培養した前記マウスｉＰＳ細胞を、前記実施例および前記比較例の培地で培養した。前記マウスｉＰＳ細胞は、１２穴ディッシュに、６×１０４細胞／ウェルとなるように播種した。培養から２４時間後、フローサイトメトリー解析により、多分化能を有する細胞集団として、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰポジティブの細胞集団を確認した。【０１２１】
フローサイトメトリー解析は、以下のように行った。前述のようにして、前記マウスｉＰＳ細胞を培養した後、前記ウェルから細胞を採取し、２５ｕｎｉｔ／ｍＬのＬＩＦを添加したＥＳ培地に再度懸濁した。前記ＥＳ培地は、１５％  ＦＢＳ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＥＡＡおよび０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプロエタノールを含むＤＭＥＭ培地（高濃度グルコース含有、ピルビン酸ナトリウム非含有）を使用した。そして、この細胞の懸濁液を、フローサイトメーター（商品名ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（登録商標）  ＩＩ、ベクトンディッキンソン社）に供し、そのプロトコールに従って、解析した。この際、多分化能を有する集団、すなわち未分化の細胞集団として、ＦＩＴＣ−Ａ＞１０４で区切ったＮａｎｏｇ−ＧＦＰ陽性領域をモニターし、未加工のデータを、プログラム（ＦｌｏｗＪｏ、ｖｅｒ．７）により解析し、密度プロットとしてプロットした。前記ｉＰＳ細胞は、Ｎａｎｏｇ遺伝子のプロモーター領域にＧＦＰタンパクを組み込んである改変マウスのＭＥＦから作製されている。このため、前記Ｎａｎｏｇ遺伝子が発現している場合は、前記Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰポジティブであり、前記ＧＦＰが産出され、そのＧＦＰが、ＦＡＣＳによって検出される。【０１２２】
これらの結果を、図３に示す。図３は、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。図３において、（Ａ）は、比較例の培地を使用した結果であり、（Ｂ）は、実施例の培地を使用した結果である。図３において、縦軸は、細胞数である。【０１２３】
図３（Ａ）に示すように、比較例の培地で培養した場合、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ陽性のマウスｉＰＳ細胞は、３７.６％であるのに対し、実施例の培地で培養した場合、前記組換えＣＣＬ２の添加によって、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ陽性のマウスｉＰＳ細胞は、６７．３％に増加した。この結果から、前記組換えＣＣＬ２の添加によって、マウスｉＰＳ細胞の分化がより抑制された、つまり、未分化能が向上したことがわかる。【０１２４】
（２）ＬＩＦ濃度に対するＣＣＬ２の効果
前記（１）に示す実施例および比較例の培地について、ＬＩＦ濃度を２５、５０、１００、５００、１０００ｕｎｉｔ／ｍＬとした以外は、前記（１）と同様にして、前記マウスｉＰＳ細胞の培養を行い、フローサイトメトリー解析を行った。【０１２５】
これらの結果を、図４に示す。図４は、ＦＡＣＳ解析の結果を示すグラフである。図４において、縦軸は、全細胞においてＮａｎｏｇ−ＧＦＰ陽性のマウスｉＰＳ細胞が占める割合（％）を示す。白抜きのバーは、ＣＣＬ２を添加した実施例の結果であり、黒塗りのバーは、ＣＣＬ２未添加の比較例の結果である。【０１２６】
図４に示すように、さらに前記ＣＣＬ２を添加することによって、ＬＩＦの濃度にかかわらず、分化が抑制され、Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ陽性のマウスｉＰＳ細胞が占める割合が増加した。この結果から、ＣＣＬ２の添加によって、マウスｉＰＳ細胞の分化がより抑制された、つまり、未分化能が向上されたことがわかる。【０１２７】
［実施例３］
本例では、ＣＣＬ２によるＫｌｆ４遺伝子の発現促進のメカニズムを解析した。【０１２８】
ＣＣＬ２の過剰発現による、Ｊａｋ／Ｓｔａｔ３経路におけるＳＴＡＴ３タンパク質のリン酸化の促進を確認した。【０１２９】
前記実施例１と同様にして、前記Ｃｃｌ２発現ベクターを導入した前記マウスｉＰＳ細胞を、２４時間培養した。培養後、前記マウスｉＰＳ細胞をＰＢＳで洗浄し、mammalian  m−PER  lysis  buffer  １００μＬに懸濁した。前記懸濁液を、２６ゲージニードルに１０分間通すことで、前記細胞をホモジナイズし、１３，０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離して上清を回収した。前記上清について、Pierce（登録商標）  BCA  Protein  assay（商品名、Thermo  Scientific社）を用いて、タンパク質濃度を測定した。つぎに、前記上清について、ウエスタンブロッティングにより目的タンパク質の検出を行った。具体的には、まず、前記上清（総タンパク質量１０μｇ）を、４〜１２％  Bis-Tris  Novex  Gel  electrophoresisに供し、ニトロセルロースメンブレンにブロットした。そして、前記メンブレンを、検出目的のタンパク質に対する一次抗体とインキュベートし、前記メンブレンを洗浄した後、前記メンブレンを、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼで標識した標識化二次抗体とインキュベートし、発色試薬（商品名ＥＣＬ  ｐｌｕｓ、GE  Healthcare社）使用して、発色反応を行った。そして、前記メンブレンについて、Fuji  LAS-3000  luminescent  image  analyzerを使用して、発光を検出した。【０１３０】
前記一次抗体として、前記リン酸化ＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３）には、抗リン酸化ＳＴＡＴ３抗体（抗ｐＳＴＡＴ３抗体、ＣＳＴ社、＃９１４５）、ＳＴＡＴ３タンパク質には、抗ＳＴＡＴ３抗体（ＣＳＴ社製、＃９１３２）、発現コントロールのＧＡＰＤＨには、抗ＧＡＰＤＨ抗体（Santa  Cruz  Biotechnology  Inc社、＃２５７７８）を使用した。前記標識化二次抗体は、抗体として、前記一次抗体の種類に応じて、抗ウサギＩｇＧ（Cell  Signaling社、anti-rabbit  IgG  HPR-linked  antibody（＃7074））または抗マウスＩｇＧ（Cell  Signaling社、anti-mouse  IgG  HPR-linked  antibody（＃7076））を使用した。なお、抗リン酸化ＳＴＡＴ３抗体は、ストリッピング試薬（商品名1x  ReBlot（登録商標）  Plus  Strong  Antibody  Stripping  Solution、Millipore社製）を用いて、前記メンブレンを室温で１５分間インキュベートすることにより、前記メンブレンから解離させた。そして、非リン酸化ＳＴＡＴ３に対するリン酸化ＳＴＡＴ３の割合（ｐＳＴＡＴ３／ＳＴＡＴ３）を求めた。【０１３１】
また、ネガティブコントロールとして、前記Ｃｃｌ２発現ベクターを未導入のマウスｉＰＳ細胞を使用した以外は、同様にして、培養およびウエスタンブロッティングを行った。そして、ネガティブコントロールのｐＳＴＡＴ３／ＳＴＡＴ３を「１」として、相対値を算出した。【０１３２】
これらの結果を図５に示す。図５において、（Ａ）は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図５（Ａ）において、ＮＣは、ネガティブコントロールの結果であり、Ｃｃｌ２は、前記Ｃｃｌ２発現ベクターを導入したマウスｉＰＳ細胞の結果である。図５において、（Ｂ）は、非リン酸化ＳＴＡＴ３に対するリン酸化ＳＴＡＴ３の割合（ｐＳＴＡＴ３／ＳＴＡＴ３）の相対値を示すグラフである。【０１３３】
図５（Ａ）および（Ｂ）に示すように、ＣＣＬ２を過剰発現させることで、非リン酸化ＳＴＡＴ３よりもリン酸化されたｐＳＴＡＴ３の割合が増加していた。つまり、ＣＣＬ２の過剰発現により、ＳＴＡＴ３のリン酸化が促進されていることがわかる。これらの結果から、ＣＣＬ２は、ＳＴＡＴ３のリン酸化を介して、Ｋｌｆ４遺伝子の発現を促進していると推測される。【０１３４】
［実施例４］
本例では、ＣＣＬ２によるＴｂｘ３遺伝子の発現促進のメカニズムを解析した。前記実施例１（２）において、ＣＣＬ２が、Ｋｌｆ４遺伝子だけでなくＴｂｘ３遺伝子の発現をも促進することが確認された。そこで、ＣＣＬ２によるＫｌｆ４遺伝子の発現促進が、直接、Ｔｂｘ３遺伝子の発現を制御している可能性を確認した。【０１３５】
（１）ＰＩ３Ｋ経路およびＭＡＰＫ経路のリン酸化に対するＣＣＬ２の影響
Ｔｂｘ３遺伝子は、ＰＩ３Ｋ経路の活性化によるＡＫＴのリン酸化を介して、または、ＭＡＰＫ経路の抑制を介して、発現が促進されることが報告されている。そこで、ＣＣＬ２による、ＰＩ３Ｋ経路におけるＡＫＴのリン酸化の促進およびＭＡＰＫ経路におけるＥＲＫ1/2のリン酸化の促進を確認した。【０１３６】
前記実施例３（２）と同様にして、前記Ｃｃｌ２発現ベクターを導入した前記マウスｉＰＳ細胞の培養およびウエスタンブロッティングによる目的タンパク質の検出を行った。なお、前記一次抗体は、リン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）に対して、抗ｐＡＫＴ抗体（ＣＳＴ社製、＃９２７２）、非リン酸化ＡＫＴに対して、抗ＡＫＴ抗体（ＣＳＴ社製、＃９２７１）、リン酸化ＥＲＫ1/2（ｐＥＲＫ1/2）に対して、抗ｐＥＲＫ1/2抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、＃Ｖ８０３１）、ＥＲＫ1/2に対して、抗ＥＲＫ1/2抗体（ＣＳＴ社製、＃９１０２）を使用した。これらの一次抗体を使用した以外は、前記実施例３（２）と同様にウエスタンブロッティングを行った。【０１３７】
これらの結果を図６および図７に示す。図６は、ＡＫＴのリン酸化への影響を示す結果であり、図７は、ＥＲＫ1/2のリン酸化への影響を示す結果である。図６および図７において、（Ａ）は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図６（Ａ）および図７（Ａ）において、ＮＣは、ネガティブコントロールの結果であり、Ｃｃｌ２は、前記Ｃｃｌ２発現ベクターを導入したマウスｉＰＳ細胞の結果である。図６および図７において、（Ｂ）は、非リン酸化タンパク質に対するリン酸化タンパク質の割合（ｐＡＫＴ／ＡＫＴ、またはｐＥＲＫ1/2／ＥＲＫ1/2）を示すグラフである。【０１３８】
図６（Ａ）および（Ｂ）に示すように、ＣＣＬ２を過剰発現させたが、ＡＫＴおよびＥＲＫ1/2のリン酸化は、促進されなかった。これは、ＣＣＬ２による分化の抑制に、ＡＫＴのリン酸化およびＥＲＫ1/2のリン酸化が関与していないことを示唆するといえる。以上の結果から、ＣＣＬ２による未分化能の向上には、ＰＩ３Ｋ経路およびＭＡＰＫ経路は、関与していないと解される。【０１３９】
（２）ＰＩ３Ｋ経路に対するＣＣＬ２の影響
前記（１）において、ＣＣＬ２による未分化能の向上に、ＰＩ３Ｋ経路が関与していないことが示唆された。そこで、ＰＩ３Ｋ経路を阻害した場合における、ＣＣＬ２による未分化能への影響を確認した。【０１４０】
ネガティブコントロールの培地として、前記ＬＩＦを添加した前記ＤＭＥＭ培地を使用した。前記培地において、ＬＩＦの最終濃度は、２５ｕｎｉｔ／ｍＬとした。比較例の培地として、前記ＬＩＦおよびＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２（プロメガ社）を含む前記ＤＭＥＭ培地を使用した。前記培地において、ＬＩＦの最終濃度は、２５ｕｎｉｔ／ｍＬ、前記阻害剤濃度は、５ｎｇ／ｍＬとした。実施例の培地として、前記ＬＩＦおよび前記組換えＣＣＬ２を添加した前記ＤＭＥＭ培地、ならびに、前記ＬＩＦ、前記組換えＣＣＬ２および前記ＰＩ３Ｋ阻害剤を含む前記ＤＭＥＭ培地を使用した。前記培地において、ＬＩＦの最終濃度は、２５ｕｎｉｔ／ｍＬ、前記組換えＣＣＬ２濃度は、５００ｎｇ／ｍＬ、前記阻害剤濃度は、５ｎｇ／ｍＬとした。【０１４１】
これらの各培地を使用した以外は、実施例２（２）と同様にして、マウスｉＰＳ細胞の培養およびフローサイトメトリー解析を行った。これらの結果を、図８に示す。図８は、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフであり、縦軸は、全細胞においてＮａｎｏｇ−ＧＦＰ陽性のマウスｉＰＳ細胞が占める割合（％）を示す。【０１４２】
図８の比較例に示すように、前記培地（ＣＣＬ２未添加）に前記ＰＩ３Ｋ阻害剤を添加することによって、多分化能を有する未分化の細胞数が、著しく減少した。この結果から、ＣＣＬ２の非存在下の場合、未分化細胞の未分化能の維持には、ＰＩ３Ｋ経路の活性化が必須であることがわかる。しかしながら、図８の実施例に示すように、培地に、さらに前記組換えＣＣＬ２を添加することで、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤が原因となる前記細胞数の減少が解消されるだけでなく、さらに増加することがわかった。【０１４３】
また、前記マウスｉＰＳ細胞の培養後、前記実施例１（１）と同様にして、Ｔｂｘ３遺伝子の発現量を確認した。そして、前記ネガティブコントロールに対する発現量の変化率を算出した。これらの結果を図９に示す。図９は、Ｔｂｘ３遺伝子の発現量の変化率を示すグラフである。縦軸は、変化率（倍）を示す。図９の比較例に示すように、培地に前記ＰＩ３Ｋ阻害剤を添加することによって、Ｔｂｘ３遺伝子の発現量は、著しく減少した。しかしながら、図９の実施例に示すように、培地に、さらに前記組換えＣＣＬ２を添加することで、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤が原因となる前記Ｔｂｘ３遺伝子の発現量の減少が解消されるだけでなく、さらに増加することがわかった。【０１４４】
（３）Ｋｌｆ４遺伝子のノックダウンによるＴｂｘ３遺伝子の発現への影響
前記（１）および（２）の結果から、ＣＣＬ２によるＫｌｆ４遺伝子の発現促進を介して、Ｔｂｘ３遺伝子の発現が促進されていることが示唆された。そこで、Ｋｌｆ４遺伝子のノックダウンによる、Ｔｂｘ３遺伝子の発現への影響を確認した。【０１４５】
前記Ｋｌｆ４遺伝子のノックダウンは、ステルス  ｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）として、商品名ＣＣＬ２  Ｓｔｅａｌｔｈ  ＲＮＡｉ（登録商標）  ｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用した以外は、前記実施例１（２）に示すノックダウンの方法に従って行った。前記ステルスｓｉＲＮＡにおけるＫｌｆ４遺伝子に対するｓｉＲＮＡの配列は、配列番号８とした。
ＣＡＡＧＵＵＵＧＵＧＣＵＧＡＡＧＧＣＧＵＣＵＣＵＧ（配列番号８）
そして、前記実施例１（２）と同様にして、前記マウスｉＰＳ細胞に前記ステルスｓｉＲＮＡを導入し、２４時間後、トータルＲＮＡを抽出し、前記マウスｉＰＳ細胞におけるＴｂｘ３遺伝子の発現量を、定量ＲＴ−ＰＣＲにより確認した。【０１４６】
これらの結果を図１０に示す。図１０は、Ｋｌｆ４遺伝子をノックダウンしたマウスｉＰＳ細胞におけるＴｂｘ３遺伝子の発現変化率を示すグラフである。縦軸は、ネガティブコントロールに対する発現量の変化率（倍）を示し、横軸には、Ｔｂｘ３遺伝子を示す。各遺伝子の結果において、白抜きのバーは、Ｋｌｆ４遺伝子をノックダウンしたマウスｉＰＳ細胞の結果、黒塗りのバーは、Ｋｌｆ４遺伝子をノックダウンしていないマウスｉＰＳ細胞（コントロール）の結果を示す。【０１４７】
図１０に示すように、Ｋｌｆ４遺伝子のノックダウンにより、Ｔｂｘ３遺伝子の発現が著しく低下することが確認された。【０１４８】
また、データベース（ＭＰｒｏｍＤＢ）におけるＫｌｆ４  ＣｈＩＰのデータから、Ｔｂｘ３遺伝子のプロモーター領域への、Ｋｌｆ４遺伝子の結合が確認された。【０１４９】
以上の結果から、ＣＣＬ２によって、ＳＴＡＴ３のリン酸化が促進され、これによりＫｌｆ４遺伝子の発現が促進されること、Ｋｌｆ４遺伝子の発現促進により、Ｔｂｘ３遺伝子が発現促進されていることが示唆された。これらの結果に基づくと、ＣＣＬ２によって、新たに、図１１に示す経路が促進され、未分化細胞の未分化状態が維持（分化が抑制）されていると解される。なお、本発明は、これらの推定メカニズムに限定されるものではない。【０１５０】
［実施例５］
本例では、マウスＥＳ細胞について、ＣＣＬ２を過剰発現させ、未分化マーカー遺伝子の発現に対する影響を確認した。【０１５１】
マウスｉＰＳ細胞に代えてＥＳ細胞を使用した以外は、前記実施例１（１）と同様にして、ＣＣＬ２を過剰発現させ、未分化マーカー遺伝子の発現を測定した。また、ネガティブコントロールとして、前記Ｃｃｌ２発現ベクターを導入しない以外は、同様にして培養した前記マウスＥＳ細胞についても、同様に発現量を確認した。そして、ネガティブコントロールに対する発現量の変化率を算出した。【０１５２】
これらの結果を図１２示す。図１２は、ＣＣＬ２を過剰発現させたマウスＥＳ細胞における未分化マーカー遺伝子の発現変化率を示すグラフである。縦軸は、変化率（倍）を示し、横軸には、対象となる前記未分化マーカー遺伝子を示す。各未分化マーカー遺伝子の結果において、白抜きのバーが、ＣＣＬ２を過剰発現させたマウスＥＳ細胞の結果であり、黒塗りバーは、ネガティブコントロールの結果である。前者（白抜きバー）は、培地におけるＬＩＦ濃度１０００ｕｎｉｔ／ｍＬ、ＣＣＬ２濃度５００ｎｇ／ｍＬであり、後者（黒塗りバー）は、培地におけるＬＩＦ濃度１０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、ＣＣＬ２  ０ｎｇ／ｍＬである。【０１５３】
図１２に示すように、前記実施例１におけるマウスｉＰＳ細胞と同様に、ＣＣＬ２の添加により、未分化マーカー遺伝子であるＫｌｆ４遺伝子、Ｔｂｘ３遺伝子の発現が著しく増加した。この結果から、マウスＥＳ細胞についても、ＣＣＬ２により未分化能を向上できることがわかった。【０１５４】
［実施例６］
本例では、マウスｉＰＳ細胞について、フィーダーフリーの条件下でＣＣＬ２を添加し、未分化マーカー遺伝子の発現に対する影響を確認した。【０１５５】
実施例は、ＬＩＦ未添加とし、前記組換えＣＣＬ２を添加した前記ＤＭＥＭ培地を使用した。前記培地において、前記組換えＣＣＬ２濃度は、２５００ｎｇ/ｍＬとした。比較例は、前記組換えＣＣＬ２を未添加とし、ＬＩＦを添加した前記ＤＭＥＭ培地を使用した。前記培地において、前記ＬＩＦの最終濃度は、１０００ｕｎｉｔ／ｍＬとした。１２穴ディッシュに添加する培地の量は、１ウェルあたり１ｍＬとした。【０１５６】
フィーダーフリー条件下で培養した前記マウスｉＰＳ細胞を、前記実施例および前記比較例の培地で培養した。前記マウスｉＰＳ細胞は、１２穴ディッシュに、６×１０４細胞／ウェルとなるように播種した。培養から２４時間後、実施例１（１）と同様にして、未分化マーカー遺伝子の発現量を確認した。ＬＩＦ添加の結果に対する発現量の変化率を算出した。【０１５７】
これらの結果を図１３に示す。図１３は、ＣＣＬ２添加−ＬＩＦ未添加の条件で培養したマウスｉＰＳ細胞における未分化マーカー遺伝子の発現変化率を示すグラフである。縦軸は、変化率（倍）を示し、横軸には、実施例の結果（白抜きバー）、および比較例の結果（黒塗りバー）を示す。【０１５８】
図１３に示すように、フィーダーフリー条件下での培養において必須とされているＬＩＦが未添加であっても、ＣＣＬ２の添加によって、未分化マーカー遺伝子の発現が著しく増加した。この結果から、ＣＣＬ２によれば、例えば、分化抑制剤として、ＬＩＦとの併用も可能であり、また、単独での使用が可能であるといえる。【０１５９】
［実施例７］
本例では、フィーダー条件下、ヒトｉＰＳ細胞について、ＣＣＬ２の存在下で培養を行い、ＣＣＬ２による未分化マーカー遺伝子の発現に対する影響を確認した。【０１６０】
未分化細胞は、ヒトｉＰＳ細胞を使用し、ＣＣＬ２は、ヒト組換えＣＣＬ２（１３７−１３０１１、ＷＡＫＯ社、配列番号１）を使用した。培地は、ヒト幹細胞用培地（商品名霊長類ＥＳ培地、リプロセル社）を使用し、ＬＩＦを未添加とし、前記ＣＣＬ２を添加した。前記培地における前記ＣＣＬ２の濃度は、５００ｎｇ／ｍＬとした。前述のフィーダー条件にしたがって、前記培地を使用し、ＬＩＦを産生する前記フィーダー細胞ＳＮＬ７６／７上で、前記ヒトｉＰＳ細胞を培養した。そして、培養から６日後に、前記フィーダー細胞を除去し、培養した前記ヒトｉＰＳ細胞から、トータルＲＮＡを回収し、未分化マーカー遺伝子の定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。【０１６１】
また、ネガティブコントロールは、前記ＣＣＬ２に代えて、５ｎｇ／ｍＬとなるようにｂＦＧＦ（ヒト由来、ＷＡＫＯ社）を添加した以外は、同様にして、フィーダー条件下で培養を行い、未分化マーカー遺伝子の定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。そして、前記比較例の発現量を１として、これに対する相対値を、発現量の変化率として算出した。【０１６２】
これらの結果を図１４に示す。図１４は、前記ＣＣＬ２の存在下で培養したヒトｉＰＳ細胞における未分化マーカー遺伝子の発現変化率を示すグラフである。縦軸は、変化率（倍）を示し、横軸には、対象となる前記未分化マーカー遺伝子を示す。白抜きのバーが、実施例の結果（ＣＣＬ２）であり、黒塗りのバーが、ネガティブコントロールの結果（ＮＣ）である。【０１６３】
図１４に示すように、前記ヒト組換えＣＣＬ２の存在下でヒトｉＰＳ細胞を培養することによって、未分化マーカー遺伝子であるＮＡＮＯＧ遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＳＴＥＬＬＡ遺伝子およびＲＥＸ１遺伝子の発現が、著しく増加した（約２倍）。これらの未分化マーカー遺伝子は、ブラストシスト状態（Naive  PluripotentState）を示すマーカー遺伝子であることから、ヒトｉＰＳ細胞が、エピブラスト状態からブラストシスト状態に脱分化しているといえる。【０１６４】
［実施例８］
本例では、ヒトｉＰＳ細胞について、ＣＣＬ２によるＫｌｆ４遺伝子の発現促進のメカニズムを解析した。【０１６５】
（１）ＪａＫ／Ｓｔａｔ３経路のリン酸化に対するＣＣＬ２の影響
ＣＣＬ２による、Ｊａｋ／Ｓｔａｔ３経路におけるＳＴＡＴ３のリン酸化の促進を確認した。【０１６６】
前記実施例８と同様にして、フィーダー条件下、ヒトｉＰＳ細胞を培養し、培養から６日後に、前記フィーダー細胞を除去した。そして、培養後の前記ヒトｉＰＳ細胞について、前記実施例３と同様にして、洗浄、懸濁、ホモジナイズ、遠心分離を行い、細胞抽出液である上清を回収した。そして、前記上清を使用した以外は、前記実施例３と同様にして、ウエスタンブロッティングにより目的タンパク質の検出を行った。また、ネガティブコントロールとして、前記ＣＣＬ２に代えてｂＦＧＦを添加した以外は、同様にして処理を行い、目的タンパク質の検出を行った。【０１６７】
そして、非リン酸化ＳＴＡＴ３に対するリン酸化ＳＴＡＴ３の割合（ｐＳＴＡＴ３／ＳＴＡＴ３）を求め、ネガティブコントロールのｐＳＴＡＴ３／ＳＴＡＴ３を「１」として、相対値を算出した。【０１６８】
これらの結果を図１５に示す。図１５において、（Ａ）は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図１５（Ａ）において、ＮＣは、ネガティブコントロールの結果であり、ＣＣＬ２は、前記マウス組換えＣＣＬ２を添加した結果である。図１５において、（Ｂ）は、非リン酸化ＳＴＡＴ３に対するリン酸化ＳＴＡＴ３の割合（ｐＳＴＡＴ３／ＳＴＡＴ３）の相対値を示すグラフである。【０１６９】
図１５（Ａ）および（Ｂ）に示すように、前記ＣＣＬ２を添加することで、非リン酸化ＳＴＡＴ３タンパク質よりもリン酸化されたｐＳＴＡＴ３の割合が、ネガティブコントロールの約７．５倍に増加していた。つまり、前記ＣＣＬ２の共存により、ＳＴＡＴ３のリン酸化が促進されていることがわかる。これらの結果から、ＣＣＬ２は、ＳＴＡＴ３のリン酸化を介して、Ｋｌｆ４遺伝子の発現を促進していると推測される。【０１７０】
（２）ＰＩ３Ｋ経路のリン酸化に対するＣＣＬ２の影響
ＰＩ３Ｋ経路の活性化は、ＡＫＴのリン酸化が指標となる。そこで、ＰＩ３Ｋ経路におけるＡＫＴのリン酸化の促進を確認した。【０１７１】
前記（１）で調製した上清について、前記実施例４と同様にして、目的タンパク質の検出を行った。また、ネガティブコントロールとして、前記ＣＣＬ２に代えてｂＦＧＦを添加した以外は、同様にして処理を行い、目的タンパク質の検出を行った。【０１７２】
そして、非リン酸化ＡＫＴに対するリン酸化ＡＫＴの割合（ｐ−ＡＫＴ／ＡＫＴ）を求め、ネガティブコントロールのｐ−ＡＫＴ／ＡＫＴを「１」として、相対値を算出した。また、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現に対するＫＬＦ４遺伝子の発現の割合（ＫＬＦ４／ＧＡＰＤＨ）を求め、ネガティブコントロールのＫＬＦ４／ＧＡＰＤＨを「１」として、相対値を算出した。【０１７３】
これらの結果を図１５（Ｃ）に示す。図１５（Ｃ）は、非リン酸化ＡＫＴに対するリン酸化ＡＫＴの割合（ｐＡＫＴ／ＡＫＴ）の相対値を示すグラフである。また、ウエスタンブロッティングの結果は、前記図１５（Ａ）にあわせて示す。図１５（Ｃ）に示すように、前記ＣＣＬ２を添加したが、ＡＫＴのリン酸化は、促進されなかった。これは、ＣＣＬ２による分化の抑制に、ＡＫＴのリン酸化が関与していないことを示唆するといえる。【０１７４】
また、ＧＡＰＤＨに対するＫＬＦ４の割合（ＫＬＦ４／ＧＡＰＤＨ）を求め、ネガティブコントロールのＫＬＦ４／ＧＡＰＤＨを「１」として、相対値を算出した。これらの結果を図１５（Ｄ）に示す。図１５（Ｄ）は、ＧＡＰＤＨに対するＫＬＦ４の割合（ＫＬＦ４／ＧＡＰＤＨ）の相対値を示すグラフである。また、ウエスタンブロッティングの結果は、前記図１５（Ａ）にあわせて示す。図１５（Ｄ）に示すように、ＫＬＦ４の発現量は、ＧＡＰＤＨの発現量で標準化し、比較した結果、ネガティブコントロールよりも約１．７倍の発現が確認された。【０１７５】
（３）Ｊａｋ／Ｓｔａｔ３Ｐ経路およびＰＩ３経路の阻害による影響
前記（１）において、ＣＣＬ２による未分化能の向上に、Ｊａｋ／Ｓｔａｔ３Ｐ経路が関与し、ＰＩ３Ｋ経路が関与していないことが示唆された。そこで、これらの経路を阻害した場合における、ＣＣＬ２による未分化能への影響を確認した。【０１７６】
ＪＡＫ阻害剤として、ＪＡＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｉ（Ｍｅｒｋ社）を使用し、ＰＩ３Ｋとして、実施例４と同じＬＹ２９４００２を使用した。培地に、前記ＣＣＬ２の他に、さらに前記ＪＡＫ阻害剤またはＰＩ３Ｋ阻害剤を添加した以外は、前記（１）と同様にして、フィーダー条件下、ヒトｉＰＳ細胞を６日間培養した。前記培地における前記Ｊａｋ阻害剤または前記ＰＩ３Ｋ阻害剤の濃度は、それぞれ１０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬとした。【０１７７】
また、コントロールとして、前記ＣＣＬ２に代えてｂＦＧＦを添加し、前記阻害剤に代えてＤＭＳＯ（５ｎｇ／ｍＬ）を添加した培地、前記ＣＣＬ２に代えてｂＦＧＦ（５ｎｇ／ｍＬ）を添加し、前記阻害剤を添加した培地をそれぞれ用いて、同様に細胞培養を行った。【０１７８】
これらの結果を、図１６に示す。図１６は、６日間培養したヒトｉＰＳ細胞の位走査顕微鏡写真である。図１６において、左レーンは、ｂＦＧＦ添加（＋）／ＣＣＬ２未添加（−）の結果であり、右レーンは、ｂＦＧＦ未添加（−）／ＣＣＬ２添加（＋）の結果を示し、上から、阻害剤未添加（ＤＭＳＯ添加）、ＪＡＫ阻害剤添加、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤添加の結果である。【０１７９】
阻害剤未添加（ＤＭＳＯ添加）、ｂＦＧＦ（＋）／ＣＣＬ２（−）の条件では、大部分は未分化能を維持していたが、一部に分化した細胞がみられた。これに対して、阻害剤未添加（ＤＭＳＯ添加）、ｂＦＧＦ（−）／ＣＣＬ２（＋）の条件では、前者と比較して、分化している細胞はほとんどみられなかった。一方、Ｊａｋ阻害剤を添加した場合、ｂＦＧＦ（＋）／ＣＣＬ２（−）の条件およびｂＦＧＦ（−）／ＣＣＬ２（＋）の条件のいずれにおいても、全ての細胞が分化して、死細胞が多く確認された。また、ＰＩ３Ｋ阻害剤を添加した場合、ｂＦＧＦ（＋）／ＣＣＬ２（−）の条件では、細胞は、ほぼ全て分化して、死細胞が多く確認されたが、ｂＦＧＦ（−）／ＣＣＬ２（＋）の条件では、未分化能を維持した細胞が多く確認された。このことからも、ＣＣＬ２は、Ｊａｋ／Ｓｔａｔ３経路を介して、未分化能を維持または向上していることが示唆された。【０１８０】
［実施例９］
本例では、ヒトｉＰＳ細胞について、ＣＣＬ２による細胞接着および増殖能への影響を確認した。【０１８１】
前記実施例８と同様にして、フィーダー条件下、ヒトｉＰＳ細胞を培養し、４８時間ごとに細胞数を測定した。前記ＣＣＬ２に代えてｂＦＧＦを添加したネガティブコントロールも同様とした。これらの結果を図１７に示す。図１７は、ヒトｉＰＳ細胞の経時的な細胞数変化を示すグラフであり、縦軸は、細胞数（１０４細胞／ｍＬ）、横軸は、培養時間（ｈｒ）を示す。ＣＣＬ２（＋）は、ｂＦＧＦ（−）／ＣＣＬ２（＋）の結果であり、ＣＣＬ２（−）は、ｂＦＧＦ（＋）／ＣＣＬ２（−）の結果である。【０１８２】
図１７に示すように、ＣＣＬ２を添加した場合、ＣＣＬ２未添加と比較して、４８時間の時点で、接着細胞数が多いため、細胞数が多く、１４４時間（６日目）では、さらに増殖能が向上していることがわかった。未分化細胞が、ブラストシスト状態（Naive  Pluripotent  State）にあると、細胞増殖能が向上すると考えられる。このため、本実施例の結果から、ＣＣＬ２によって、ヒトｉＰＳ細胞の未分化状態が、エピブラスト状態からブラストシスト状態に脱分化されたことがわかる。【０１８３】
［実施例１０］
本例では、ヒトｉＰＳ細胞について、ＣＣＬ２による分化誘導効率を確認した。【０１８４】
（１）ＥＳ細胞様形態の観察
前記実施例７と同様にして、フィーダー条件下、ヒトｉＰＳ細胞を６日間培養した後、ＥＢ（Embryonic  Body）を作製した。ＥＢの形成は、ｉＰＳ細胞の分化を誘導する自発的分化誘導法方法として知られている。具体的には、まず、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２、ＷＡＫＯ社）を１０μｌ／ｍＬとなるように、ヒトｉＰＳ細胞を培養中の前記培養液に添加し、３７℃、ＣＯ２  ５％の条件下、１時間培養した。つぎに、培養に使用したフィーダー細胞を、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞用剥離液（ＣＴＫ溶液）で剥離し、ヒトｉＰＳ細胞を回収した。そして、１ｘ１０６個のヒトｉＰＳ細胞を、超低接着培養容器に播種し、ＥＢ作成用培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＳＲ、Ｌ−グルタミン、ＮＥＡＡ(非必須アミノ酸(ＧＩＢＣＯ)、２−ＭＥ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）で６日間培養した。前記培地は、２日ごとに交換した。【０１８５】
つぎに、自発的分化誘導を行った。具体的には、作製したＥＢを１つずつゼラチンコートディッシュに撒き、２０％ＦＢＳを含む培地（ＤＭＥＭ）で１４日間培養し、顕微鏡観察した。前記培地は、２日ごとに交換した。この結果を、図１８に示す。図１８は、プレーティングから３日目の細胞の形態を示す写真であり、（Ａ）が前記マウス組換えＣＣＬ２を添加した結果、（Ｂ）が前記ｂＦＧＦを添加した結果である。【０１８６】
図１８に示すように、プレーティングから３日目において、前記ＣＣＬ２存在下で培養したヒトｉＰＳ細胞から作製したＥＢは、ＥＳ細胞様形態を示した。これに対して、ｂＦＧＦ存在下で培養したヒトｉＰＳ細胞から作製したＥＢは、３日目においてすでに分化が進み、上皮細胞様形態を示した。【０１８７】
（２）心筋細胞への分化の確認
一般的に、前記（１）で用いた自発的分化誘導法は、心筋細胞に分化されやすいとい報告がある。そこで、前記（１）のプレーティングから１０日目の細胞について、心筋細胞への分化を確認した。【０１８８】
前記細胞は、その形態を、顕微鏡で確認し、また、心筋細胞のマーカーであるTropomyosinで免疫染色を行った。また、前記ＣＣＬ２およびＬＩＦに代えて、ｂＦＧＦ（５ｎｇ／ｍＬ）を添加した培地を用い、同様にして、細胞の培養、形態の観察および染色を行った。【０１８９】
この結果を図１９に示す。図１９は、ＥＢのプレーティングから１０日目の細胞の形態を示す写真であり、（Ａ）は、ＣＣＬ２未添加（−）／ｂＦＧＦ添加（＋）、（Ｂ）は、ＣＣＬ２添加（＋）／ＬＩＦ（＋）添加の結果を示す。また、図１９（Ａ）（Ｂ）において、左側が、細胞の形態を示す写真であり、右側が染色した細胞の写真である。染色された部位は、図１９の白黒写真において、薄いグレーで表わされる。【０１９０】
図１９（Ａ）に示すように、前記ＣＣＬ２未添加でありｂＦＧＦ存在下で培養したヒトｉＰＳ細胞から作製したＥＢは、心筋細胞様形態を示す細胞もあるが、多くが、上皮細胞様の細胞であり、それらはTropomyosinで染色されなかった。これに対して、図１９（Ｂ）に示すように、前記ＣＣＬ２およびＬＩＦ共存下で培養したヒトｉＰＳ細胞から作製したＥＢは、１０日間の培養によって、部分が心筋細胞様形態を示し、Tripomyosinで細胞全体が赤く染色された。この結果から、ＣＣＬ２によって、ＥＢは、より心筋細胞に分化しやすい細胞になっているといえる。【０１９１】
［実施例１１］
本例では、ヒトｉＰＳ細胞について、ＬＩＦの存在下、フィーダーフリー培地での培養が可能か否かを確認した。具体的には、前記実施例９において、ＣＣＬ２により、ヒトｉＰＳ細胞における未分化能が、Ｊａｋ／Ｓｔａｔ３を介して上昇していることが確認された。そこで、ＣＣＬ２をＬＩＦと共存させることで、フィーダー細胞なしで培養可能かどうかを確認した。【０１９２】
未分化細胞は、前記実施例７と同じヒトｉＰＳ細胞を使用した。ＣＣＬ２は、実施例２（１）の前記マウス組換えＣＣＬ２を使用した。フィーダーフリー培地として、前記実施例８のヒト幹細胞用培地に、前記ＣＣＬ２、ＬＩＦおよびｂＦＧＦを、それぞれ添加または未添加としたもの３種類を使用した。具体的には、ＣＣＬ２未添加（−）／ＬＩＦ未添加(−)／ｂＦＧＦ添加（＋）の培地、ＣＣＬ２添加（＋）／ＬＩＦ未添加(−)／ｂＦＧＦ未添加（−）の培地、ＣＣＬ２添加（＋）／ＬＩＦ添加（＋）／ｂＦＧＦ未添加（−）の培地を使用した。前記培地において、ＬＩＦ濃度は、５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、前記ＣＣＬ２濃度は、５００ｎｇ／ｍＬ、前記ｂＦＧＦ濃度は、５ｎｇ／ｍＬとした。そして、前記ヒトｉＰＳ細胞を、前記培地を用いて６日間培養して、ＥＢを作製した。そして、作製したＥＢを１つずつゼラチンコートディッシュに撒き、２０％ＦＢＳを含む培地（ＤＭＥＭ）で５日間培養した。そして、培養後の細胞を顕微鏡観察した。【０１９３】
これらの結果を、図２０に示す。図２０は、ＥＢのプレーティングから５日目の細胞の形態を示す写真であり、（Ａ）は、ＣＣＬ２添加（＋）／ＬＩＦ未添加(−)／ｂＦＧＦ未添加（−）、（Ｂ）、ＣＣＬ２添加（＋）／ＬＩＦ添加（＋）／ｂＦＧＦ未添加（−）の結果を示す。【０１９４】
ＣＣＬ２未添加（−）／ＬＩＦ未添加（−）／ｂＦＧＦ添加（＋）の場合、細胞の接着は確認されなかった（図示せず）。これに対して、ＣＣＬ２添加（＋）／ＬＩＦ添加（＋）／ｂＦＧＦ未添加（−）の場合（Ｂ）、細胞の接着が確認され、５日間の培養により、図に示すようなコロニー成長が確認された。また、ＣＣＬ２添加（＋）／ＬＩＦ未添加（−）／ｂＦＧＦ未添加（−）の場合も、接着が確認された（Ａ）。【０１９５】
［実施例１２］
接着した細胞の細胞形態は、通常のヒトｉＰＳ細胞の形態と異なっている。そこで、本例では、実際に、ヒトｉＰＳ細胞から、未分化能が保たれた細胞が増殖しているのかを確認した。【０１９６】
具体的には、ｂＦＧＦ添加、前記ＣＣＬ２未添加のフィーダー条件下、および、ｂＦＧＦ未添加、前記ＣＣＬ２およびＬＩＦ添加のフィーダーフリー条件下で、ヒトｉＰＳ細胞を培養し、トータルＲＮＡを抽出して、ｑＲＴ−ＰＣＲで未分化マーカー遺伝子の発現を確認した。前記フィーダー条件下の培養は、前記実施例８と同様に行い、前記フィーダーフリー条件下の培養は、前記実施例１２と同様に行った。そして、フィーダー条件下の発現量を１として、これに対する相対値を、フィーダーフリー条件下の発現量の変化率として算出した。【０１９７】
これらの結果を、図２１に示す。図２１は、前記ヒトｉＰＳ細胞における未分化マーカー遺伝子の発現変化率を示すグラフである。縦軸は、変化率（倍）を示し、横軸には、対象となる前記未分化マーカー遺伝子を示す。白抜きのバーが、フィーダーフリー条件下の結果であり、黒塗りのバーが、フィーダー条件下の結果である。その結果、フィーダーフリー条件下においても、フィーダー条件下と同程度の発現を示した。【０１９８】
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。【０１９９】
この出願は、２０１１年３月３１日に出願された日本出願特願２０１１−０７７４７３を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。また、本明細書において引用する全ての特許、特許出願、刊行物の開示の全てをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０２００】
以上のように、本発明によれば、ＣＣＬ２またはその機能ドメインを含むタンパク質によって、未分化細胞の未分化状態を維持および／または向上できる。本発明は、例えば、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞等の未分化細胞を、未分化状態を維持および／または向上した状態で培養可能であることから、再生医療等をはじめとする種々の医療やその研究に極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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