(57)【要約】  本発明は、Ｘ線ＣＴや蛍光イメージング等において利用可能で、かつ発光強度の高い画像診断用シリカナノ粒子とその製造方法を提供する。また、当該画像診断用シリカナノ粒子を用いた生体物質標識剤を提供する。本発明の画像診断用シリカナノ粒子は、有機蛍光色素と金属錯体とを内包した画像診断用シリカナノ粒子であって、当該シリカナノ粒子の構成分子に対し、当該金属錯体の配位子が共有結合していることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機蛍光色素と金属錯体とを内包した画像診断用シリカナノ粒子であって、当該有機蛍光色素と金属錯体のそれぞれが、有機分子を介して、シリカナノ粒子の骨格に連結していることを特徴とする画像診断用シリカナノ粒子。
【請求項２】
前記有機分子が、シリル基を有する有機分子であることを特徴とする請求項１に記載の画像診断用シリカナノ粒子。
【請求項３】
前記有機分子が、同一分子内にアミノ基と、加水分解性置換基で置換されたシリル基を有する分子であることを特徴とする請求項１または２に記載の画像診断用シリカナノ粒子。
【請求項４】
前記有機分子と前記金属錯体の配位子が共有結合を介して連結していることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の画像診断用シリカナノ粒子。
【請求項５】
前記共有結合として、アミド結合を含むことを特徴とする請求項４に記載の画像診断用シリカナノ粒子。
【請求項６】
前記金属錯体が、ガドリニウム錯体であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の画像診断用シリカナノ粒子。
【請求項７】
少なくとも、下記工程（ａ）、工程（ｂ）及び工程（ｃ）を経由して有機蛍光色素と金属錯体とを内包した画像診断用シリカナノ粒子を製造することを特徴とする画像診断用シリカナノ粒子の製造方法。
工程（ａ）：同一分子内にアミノ基と、加水分解性置換基で置換されたシリル基とを有する有機分子と、当該アミノ基と反応する官能基を有する有機蛍光色素とを反応させる工程、
工程（ｂ）同一分子内にアミノ基と、加水分解性置換基で置換されたシリル基とを有する有機分子と、当該アミノ基と反応する官能基を有するガドリニウム錯体とを反応させる工程、
工程（ｃ）：前記工程（ａ）及び工程（ｂ）で得られた反応生成物を含ケイ素アルコキシドと混合し、塩基性条件下で加水分解反応を行う工程。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の画像診断用シリカナノ粒子と分子標識物質とが、有機分子を介して結合されていることを特徴とする生体物質標識剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｘ線ＣＴや蛍光イメージング等において利用可能な、有機蛍光色素と金属錯体を内包した画像診断用シリカナノ粒子、その製造方法、及び当該画像診断用シリカナノ粒子を用いた生体物質標識剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの診断・治療は、画像診断とそれに続く組織診断によって行われる。Ｘ線コンピュータ断層撮影（Ｘ−ｒａｙ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ；以下「Ｘ線ＣＴ」と略す。）や磁気共鳴イメージング（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ；以下「ＭＲＩ」と略す。）で病変を発見したのち、超音波診断装置などで病変を確認しつつ外科的に病変部の組織を採取する。その際に、Ｘ線ＣＴやＭＲＩと、超音波診断装置とではモダリティーが異なるため、切除範囲の決定が困難となる場合がある。【０００３】
すなわち、一つの方法で検出できた病変を同時に生検に利用可能なイメージングでも観察可能とすることで生検の精度を飛躍的に向上させ、偽陰性による誤診を防ぐことが可能となると考えられる。【０００４】
Ｘ線ＣＴやＭＲＩは、解剖学的情報を得ることができる。Ｘ線ＣＴは、正常組織と腫瘍組織とのＸ線吸収の差異の検出に基づく。Ｘ線ＣＴ用標識剤としては、ヨウ素原子、金原子、ガドリニウム原子などを含む分子が用いられている。【０００５】
また一方、ＭＲＩは、ＭＲＩ造影剤に近接した組織でのＴ1（スピン−格子緩和時間）及びＴ2（スピン−スピン緩和時間）の差異の検出に基づく。ＭＲＩ造影剤としては、ガドリニウムイオンを含め常磁性イオンが用いられている。例えば特許文献１にはシリカナノ粒子の表面にガドリニウム錯体を結合させたＭＲＩ造影剤が開示されている。【０００６】
蛍光イメージングは、患者を電離放射線に曝さないので、診断モダリティーとしての受容度が常に高い。蛍光イメージングは、正常組織と腫瘍組織からの蛍光の差異の検出に基づく。蛍光標識剤は、励起光とは波長の異なる蛍光を発する有機蛍光色素物質が優れている。【０００７】
これまでに幾つかのＸ線ＣＴやＭＲＩと、蛍光イメージング両方に対応した生体物質標識剤が知られているものの、蛍光イメージング成分として有機色素を用いている（例えば特許文献２参照）。しかしながら、より超早期での微小な病変の検出を行うには、有機色素単独での蛍光強度では弱く、より高蛍光強度を有する蛍光物質が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００９−５１４９０５号公報
【特許文献２】特表２００６−５１１４７３号公報
【特許文献３】国際公開第２００７／０７４７２２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記問題・状況にかんがみてなされたものであり、その解決課題は、Ｘ線ＣＴや蛍光イメージング等において利用可能で、かつ発光強度の高い画像診断用シリカナノ粒子とその製造方法を提供することである。また、当該画像診断用シリカナノ粒子を用いた生体物質標識剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。【００１１】
１．有機蛍光色素と金属錯体とを内包した画像診断用シリカナノ粒子であって、当該有機蛍光色素と金属錯体のそれぞれが、有機分子を介して、シリカナノ粒子の骨格に連結していることを特徴とする画像診断用シリカナノ粒子。【００１２】
２．前記有機分子が、シリル基を有する有機分子であることを特徴とする前記第１項に記載の画像診断用シリカナノ粒子。【００１３】
３．前記有機分子が、同一分子内にアミノ基と、加水分解性置換基で置換されたシリル基を有する分子であることを特徴とする前記第１項又は第２項に記載の画像診断用シリカナノ粒子。【００１４】
４．前記有機分子と前記金属錯体の配位子が共有結合を介して連結していることを特徴とする前記第１項から第３項までのいずれか一項に記載の画像診断用シリカナノ粒子。【００１５】
５．前記共有結合として、アミド結合を含むことを特徴とする前記第４項に記載の画像診断用シリカナノ粒子。【００１６】
６．前記金属錯体が、ガドリニウム錯体であることを特徴とする前記第１項から第５項までのいずれか一項に記載の画像診断用シリカナノ粒子。【００１７】
７．少なくとも、下記工程（ａ）、工程（ｂ）及び工程（ｃ）を経由して有機蛍光色素と金属錯体とを内包した画像診断用シリカナノ粒子を製造することを特徴とする画像診断用シリカナノ粒子の製造方法。
工程（ａ）：同一分子内にアミノ基と、加水分解性置換基で置換されたシリル基とを有する有機分子と、当該アミノ基と反応する官能基を有する有機蛍光色素とを反応させる工程、
工程（ｂ）同一分子内にアミノ基と、加水分解性置換基で置換されたシリル基とを有する有機分子と、当該アミノ基と反応する官能基を有するガドリニウム錯体とを反応させる工程、
工程（ｃ）：前記工程（ａ）及び工程（ｂ）で得られた反応生成物を含ケイ素アルコキシドと混合し、塩基性条件下で加水分解反応を行う工程。【００１８】
８．前記第１項から第６項までのいずれか一項に記載の画像診断用シリカナノ粒子と分子標識物質とが、有機分子を介して結合されていることを特徴とする生体物質標識剤。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の上記手段により、Ｘ線ＣＴや蛍光イメージング等において利用可能で、かつ発光強度の高い画像診断用シリカナノ粒子とその製造方法を提供することができる。また、当該画像診断用シリカナノ粒子を用いた生体物質標識剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の画像診断用シリカナノ粒子は、有機蛍光色素と金属錯体とを内包した画像診断用シリカナノ粒子であって、当該有機蛍光色素と金属錯体のそれぞれが、有機分子を介して、シリカナノ粒子の骨格に連結していることを特徴とする。この特徴は、請求項１から請求項８までの請求項に係る発明に共通する技術的特徴である。
【００２１】
本発明の実施態様としては、本発明の効果発現の観点から、前記有機分子が、シリル基を有する有機分子であることが好ましい。さらに、当該有機分子が、同一分子内にアミノ基と、加水分解性置換基で置換されたシリル基を有する分子であることが好ましい。
【００２２】
本発明においては、前記有機分子と前記金属錯体の配位子が共有結合を介して連結していることが好ましい。また、当該共有結合として、アミド結合を含むことが好ましい。さらに、前記金属錯体が、ガドリニウム錯体であることが好ましい。
【００２３】
本発明の画像診断用シリカナノ粒子の製造方法としては、少なくとも前記工程（ａ）〜（ｃ）を経由して有機蛍光色素と金属錯体とを内包した画像診断用シリカナノ粒子を製造する態様の製造方法であることが好ましい。
【００２４】
本発明の画像診断用シリカナノ粒子は、当該画像診断用シリカナノ粒子と分子標識物質とが、有機分子を介して結合されている態様の生体物質標識剤に好適に用いることができる。
【００２５】
以下、本発明とその構成要素、及び本発明を実施するための形態・態様について詳細な説明をする。なお、本明細書において、「〜」は、その前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用する。
【００２６】
〔画像診断用シリカナノ粒子の概要〕
本発明の画像診断用シリカナノ粒子は、有機蛍光色素と金属錯体とを内包した画像診断用シリカナノ粒子であって、当該有機蛍光色素と金属錯体のそれぞれが、有機分子を介して、シリカナノ粒子の骨格に連結していることを特徴とする。
【００２７】
ここで、本明細書において、「有機分子」なる語は、他の物質と結合可能な部位を複数有する有機分子をいい、特に、リンカーとして機能しうる有機分子を意味する。
なお、「シリカナノ粒子の骨格」とは、ナノサイズ（平均粒径３０〜８００ｎｍ）の二酸化ケイ素結晶粒子を構成する酸素原子とケイ素原子との結合からなる骨組みをいう。
【００２８】
以下、画像診断用シリカナノ粒子の構成要素について詳細な説明をする。
【００２９】
〔有機蛍光色素の内包〕
本発明の画像診断用シリカナノ粒子は、有機蛍光色素を内包した画像診断用シリカナノ粒子であって、当該有機蛍光色素が、有機分子を介して、シリカナノ粒子の骨格に連結していることを特徴とする。
【００３０】
有機蛍光色素をシリカナノ粒子に内包させる方法としては、シリカナノ粒子において、前記有機分子と有機蛍光色素とを共有結合、イオン結合、水素結合などを介して結びつける方法が挙げられる。
【００３１】
本発明においては、化学的安定性の観点から、当該有機分子と有機蛍光色素とが共有結合していることが好ましい。当該有機分子が有機蛍光色素と結合していないと、水分散液として保存しているうちに、徐々に当該有機蛍光色素が漏洩するおそれがあり、生体物質標識剤への応用上好ましくない。
【００３２】
本発明の画像診断用シリカナノ粒子に用いられる有機蛍光色素としては、２００〜７００ｎｍの範囲内の波長の紫外〜近赤外光により励起されたときに、４００〜９００ｎｍの範囲内の波長の可視〜近赤外光の発光を示す態様の有機蛍光色素であることが好ましい。
【００３３】
有機蛍光色素としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（インビトロジェン社製）系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、ＮＢＤ系色素分子、ピレン系色素分子、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ系色素分子、シアニン系色素分子等を挙げることができる。
【００３４】
具体的には、５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２′，４，４′，５′，７，７′−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２′，４，７，７′−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４′，５′−ジクロロ−２′，７′−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン  ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ，ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等を挙げることができる。これらを単独でも用いても、複数種組み合わせて用いてもよい。
【００３５】
有機蛍光色素をシリカナノ粒子に内包させるための有機分子として、シリル基を有する種々の有機化合物を用いることができる。例えば、反応性官能基と少なくとも一種の加水分解性置換基で置換されたシリル基を有する有機分子、すなわち、同一分子内に反応性置換基と、少なくとも一種の加水分解性置換基で置換されたシリル基とを有する有機分子を用いることができる。
ここで、「シリル基」は、後述する「シリカナノ粒子の骨格」との結合に供される基であり、本発明においては、このシリル基として、加水分解性置換基で置換されたシリル基が好ましく用いられる。ここで、「加水分解性置換基で置換されたシリル基」は、水分の存在により加水分解してシラノールを生じさせるような置換基を有するシリル基をいい、例えば、トリメトキシシリル基、トリエトキシシリル基、メチルジメトキシシリル基などのアルコキシシリル基が挙げられる。シリル基として「加水分解性置換基で置換されたシリル基」を用いると、有機分子と、後述する「シリカナノ粒子の骨格」との結合を容易に形成することが可能になるとともに、そのような結合の形成反応を制御しやすくもなるので、有利である。
【００３６】
したがって、有機蛍光色素をシリカナノ粒子に内包させる方法、すなわち、有機蛍光色素を、後述する「シリカナノ粒子の骨格」と結びつける方法は、特に限定されるものではない。ただ、好ましい方法として、加水分解性置換基で置換されたシリル基を有する有機分子と、反応性官能基と反応しうる官能基をもつ有機蛍光色素との反応を利用することができる。この反応は、より具体的には、反応性官能基と少なくとも一種の加水分解性置換基で置換されたシリル基を有する有機分子と、当該反応性官能基と反応しうる官能基をもつ有機蛍光色素との反応として行うことができる。
【００３７】
一方、本明細書において、「反応性官能基」は、他の物質との結合を形成可能な官能基であり、通常の場合、他の物質との結合を形成可能な、上記「シリル基」とは異なる官能基である。
本発明において「有機蛍光色素をシリカナノ粒子に内包させるための有機分子」を構成する反応性官能基は、上述の「シリル基」が後述する「シリカナノ粒子の骨格」と結合する能力を失わない条件下で、有機蛍光色素との結合を可能とするものであることが好ましく、特に、加水分解を生じさせる条件を用いることなく、有機蛍光色素との結合を可能とするものであることがより好ましい。このような反応性官能基としては、アミノ基、メルカプト基、マレイミド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基など活性エステル基があげられる。中でも安定性や反応性からアミノ基が好ましい。
【００３８】
アミノ基と少なくとも一種の加水分解性置換基で置換されたシリル基を有する分子は、特に限定されるものではないが、一般に、シランカップリング剤と呼ばれている各種化合物を挙げることができる。具体的には、３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシランなどを挙げることができる。
【００３９】
一方、前記反応性官能基と反応しうる官能基をもつ有機蛍光色素としては、アミノ基、メルカプト基、マレイミド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、カルボキシル基、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基などの活性エステル基をもつものがあげられる。
【００４０】
なかでも、上述したようにアミノ基を用いた場合、有機蛍光色素もアミノ基と反応する官能基イソシアネート基、イソチオシアネート基、カルボキシル基、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基などの活性エステル基が好適である。
【００４１】
なお、本明細書において、「活性エステル基」とは、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基をいう。実際的には、「活性エステル基」とは、エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基であり、活性エステル基は、アミノ基、チオール基、またはヒドロキシル等の基に対する反応性を有する。
【００４２】
本発明においては、このような有機分子と有機蛍光色素との反応を、前記「反応性官能基」および「反応性官能基と反応しうる官能基」自体が有する反応性に基づいて行ってもよいし、あるいは、これらの基を活性化させるために、必要により反応を促進させる添加剤、触媒などを用いてもよい。例えば、前記有機分子が「反応性官能基」としてアミノ基を有し、前記有機蛍光色素が「反応性官能基と反応しうる官能基」としてカルボキシル基を有する場合、例えば、ＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）のようなカルボジイミドなどの縮合剤を用いてもよい。
【００４３】
また、用いられる有機溶媒としては、シリル基上の加水分解性基との反応性がないものであればよく、例えば、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどを挙げることができる。
【００４４】
反応温度は特に限定されるものではないが、−２０〜５０℃の間で行うことができる。
【００４５】
反応時間は、１時間以上５０時間以下であることが好ましい、１時間以上とすることで反応が完結し、収率が向上する点で好ましく、５０時間以下とすることで、反応が進行しすぎて不溶物が形成することを防止できる点で好ましい。
【００４６】
反応終了後は、精製することなく次工程へ用いてもよい。必要に応じて、常法により再結晶、カラムクロマトグラフィーなどによる精製を行ってもよい。
【００４７】
〔金属錯体の内包〕
本発明の画像診断用シリカナノ粒子は、金属錯体を内包した画像診断用シリカナノ粒子であって、当該金属錯体のそれぞれが、有機分子を介して、シリカナノ粒子の骨格に連結していることを特徴とする。
【００４８】
金属錯体をシリカナノ粒子に内包させる方法としては、シリカナノ粒子において、前記有機分子と有機蛍光色素とを共有結合、イオン結合、水素結合などを介して結びつける方法が挙げられる。すなわち、本発明に係る画像診断用シリカナノ粒子において、金属錯体と有機分子とを結びつける結合として、共有結合、イオン結合、水素結合などが挙げられる。
【００４９】
当該金属錯体が有機分子と共有結合していないときには、水分散液として保存しているうちに、徐々に当該金属錯体が漏洩するおそれがあり、生体物質標識剤への応用上好ましくない場合がある。したがって、本発明では、金属錯体と有機分子とが共有結合によって結びついていることが好ましい。このとき、金属錯体と有機分子との結合は、通常、金属錯体の配位子と有機分子が共有結合を介して連結している態様で行われる。
【００５０】
当該共有結合としては、ケトン結合、エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、エーテル結合、イミノ結合などがあげられるが、加水分解安定性の高さなどの観点からアミド結合が好ましい。
【００５１】
金属錯体として、ランタノイド錯体、鉄錯体、金錯体など種々の金属錯体が挙げられるものの、これらに、限定されるものではない。ただ、ＭＲＩへの利用可能な常磁性イオンであるランタノイド錯体、なかでもガドリニウム錯体がＸ線吸収能も高く好ましい。
【００５２】
金属錯体をシリカナノ粒子に内包させるための有機分子として、上述した「有機蛍光色素をシリカナノ粒子に内包させるために用いられる有機分子」と同様のものを用いることができる。すなわち、シリル基を有する種々の有機化合物を用いることができ、例えば、反応性官能基と少なくとも一種の加水分解性置換基で置換されたシリル基を有する有機分子を用いることができる。ここで、「加水分解性置換基で置換されたシリル基」として、上述した「有機蛍光色素をシリカナノ粒子に内包させるために用いられる有機分子」で用いうる「加水分解性置換基で置換されたシリル基」と同様のものを用いることができる。
なお、金属錯体をシリカナノ粒子に内包させるための有機分子は、有機蛍光色素をシリカナノ粒子に内包させるために用いられる有機分子と同一のものであっても良く、あるいは、異なっていても良い。
金属錯体を有機分子と共有結合させ内包させる方法、すなわち、金属錯体を、後述する「シリカナノ粒子の骨格」と結びつける方法は、特に限定されるものではない。ただ、好ましい方法として、反応性官能基と少なくとも一種の加水分解性置換基で置換されたシリル基を有する有機分子と、当該反応性官能基と反応しうる官能基をもつ金属錯体との反応を用いることができる。
【００５３】
本発明において「金属錯体をシリカナノ粒子に内包させるための有機分子」を構成する反応性官能基は、上述の「シリル基」が後述する「シリカナノ粒子の骨格」と結合する能力を失わない条件下で、金属錯体との結合を可能とするものであることが好ましい。このような反応性官能基としては、アミノ基、メルカプト基、マレイミド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基など活性エステル基があげられる。中でも安定性や反応性からアミド結合をつくるアミノ基が好ましい。
【００５４】
アミノ基と少なくとも一種の加水分解性置換基で置換されたシリル基を有する分子は、特に限定されるものではないが、一般に、シランカップリング剤と呼ばれている各種化合物を挙げることができる。具体的には、３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシランなどを挙げることができる。
【００５５】
一方、前記反応性官能基と反応しうる官能基をもつ金属錯体としては、アミノ基、メルカプト基、マレイミド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基など活性エステル基をもつものがあげられる。なかでも上述したようにアミノ基を用いた場合、金属錯体もアミノ基と反応する官能基イソシアネート基、イソチオシアネート基、カルボキシル基、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基などの活性エステル基等が挙げられる。これらのうち、アミド基を形成するカルボキシル基や、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基などの活性エステル基が好適である。
【００５６】
カルボキシル基をもつ錯体、すなわち、カルボキシル基を有する金属錯体の具体例としては、１、４、７、１０−テトラアザシクロドデカン−１、４，７、１０−四酢酸ガドリニウム錯体（以下Ｇｄ−ＤＯＴＡと略す）、ジエチレントリアミン五酢酸ガドリニウム錯体（以下「Ｇｄ−ＤＴＰＡ」と略す。）などを挙げることができる。
【００５７】
本発明においては、このような有機分子と金属錯体との反応を、前記「反応性官能基」および「反応性官能基と反応しうる官能基」自体が有する反応性に基づいて行ってもよいし、あるいは、これらの基を活性化させるために、必要により、反応を促進させる添加剤、触媒などを用いてもよい。例えば、前記有機分子が「反応性官能基」としてアミノ基を有し、前記金属錯体が「反応性官能基と反応しうる官能基」としてカルボキシル基を有する場合、例えば、ＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）のようなカルボジイミドなどの縮合剤を用いてもよい。
【００５８】
また、用いられる有機溶媒としては、シリル基上の加水分解性基との反応性がないものであればよく、例えば、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどを挙げることができる。
【００５９】
反応温度は特に限定されるものではないが、−２０〜５０℃の間で行うことができる。
【００６０】
反応時間は、１時間以上５０時間以下であることが好ましい、１時間以上とすることで反応が完結する点で好ましく、５０時間以下とすることで、反応が進行しすぎて不溶物が形成することを防止できる点で好ましい。
【００６１】
反応終了後は、精製することなく次工程へ用いてもよい。必要に応じて、常法により再結晶、カラムクロマトグラフィーなどによる精製を行ってもよい。
【００６２】
〔シリカナノ粒子の骨格およびその製造方法、並びに画像診断用シリカナノ粒子の粒径〕
本発明の画像診断用シリカナノ粒子は、有機蛍光色素と金属錯体とを内包した画像診断用シリカナノ粒子であって、当該有機蛍光色素と金属錯体のそれぞれが、有機分子を介して、シリカナノ粒子の骨格に連結していることを特徴とする。
ここで、本発明において、「シリカナノ粒子の骨格」は、マトリクス部分として、画像診断用シリカナノ粒子の構造を支持する役割を有する。
【００６３】
有機蛍光色素等を内包していないシリカナノ粒子、すなわち、「シリカナノ粒子の骨格」自体は、従来公知の種々の製造方法で製造することができるが、例えば、ジャーナル・オブ・コロイドサイエンス  ２６巻、６２ページ（１９６８年）に記載されている、アンモニア水などを用いたアルカリ性条件下でテトラエトキシシランなどの含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解を行う「ストーバー法」と呼ばれる方法により製造することが好ましい。
あるいは、「画像診断用シリカナノ粒子の製造方法」の項で後述するように、上記有機分子を導入した有機蛍光色素および金属錯体存在下でこのような含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解を行うことによっても、「シリカナノ粒子の骨格」を好適に形成することができる。この場合、「シリカナノ粒子の骨格」の形成と、「シリカナノ粒子の骨格」への有機蛍光色素および金属錯体の内包を同時に行うことができるので有利である。
本発明の画像診断用シリカナノ粒子において、上記有機蛍光色素および金属錯体は、有機分子を介して、上記「シリカナノ粒子の骨格」の表面または内部に内包された状態で存在している。
【００６４】
本発明の画像診断用シリカナノ粒子自体の粒径は、添加する水、エタノール、アルカリ量などについて公知の反応条件を適用することで自在に調整でき、平均粒径３０〜８００ｎｍ程度にできる。また、粒径のばらつきを示す変動係数は２０％以下とすることができる。
【００６５】
なお、本発明において、平均粒径とは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径を粒径として求めた。本明細書においては、１０００個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。変動係数も、１０００個の粒子の粒径分布から算出した値とした。
【００６６】
〔画像診断用シリカナノ粒子の製造方法〕
本発明の画像診断用シリカナノ粒子の製造方法は、少なくとも、下記工程（ａ）、工程（ｂ）及び工程（ｃ）を経由して有機蛍光色素と金属錯体とを内包した画像診断用シリカナノ粒子を製造することを特徴とする。
工程（ａ）：同一分子内にアミノ基と、加水分解性置換基で置換されたシリル基とを有する有機分子と、当該アミノ基と反応する官能基を有する有機蛍光色素とを反応させる工程、
工程（ｂ）同一分子内にアミノ基と、加水分解性置換基で置換されたシリル基とを有する有機分子と、当該アミノ基と反応する官能基を有するガドリニウム錯体とを反応させる工程、
工程（ｃ）：前記工程（ａ）及び工程（ｂ）で得られた反応生成物を含ケイ素アルコキシドと混合し、塩基性条件下で加水分解反応を行う工程。
【００６７】
本発明の有機蛍光色素及び金属錯体を共内包した画像診断用シリカナノ粒子は、公知の方法、例えば、非特許文献（ラングミュア  ８巻、２９２１ページ（１９９２年））に記載されている方法を参考にすることができる。
【００６８】
本発明の画像診断用シリカナノ粒子の製造方法を、更に詳しく説明するならば、下記工程（１）〜（５）を経由して有機蛍光色素と金属錯体とを内包した画像診断用シリカナノ粒子を製造することが好ましい。
【００６９】
工程（１）：同一分子内にアミノ基と、少なくとも一種の加水分解性置換基で置換されたシリル基を有する分子と、当該アミノ基と反応する官能基を有する有機蛍光色素とを反応させる。
【００７０】
工程（２）：同一分子内にアミノ基と、少なくとも一種の加水分解性置換基で置換されたシリル基を有する分子と、当該アミノ基と反応する官能基を有するガドリニウム錯体とを反応させる。
【００７１】
工程（３）工程（１）及び工程（２）で得られたものを、テトラエトキシシランなどの含ケイ素アルコキシド化合物を混合する。
【００７２】
工程（４）：エタノールなどの有機溶媒、水及び塩基を混合し、反応を進行させる。
【００７３】
工程（５）：反応混合物から生成した有機蛍光色素及び金属錯体を内包した画像診断用シリカナノ粒子を、ろ過又は遠心分離により回収する。
【００７４】
ここで、工程（１）が上記工程（ａ）に、工程（２）が上記工程（ｂ）に、工程（３）〜（５）が上記工程（ｃ）にそれぞれ対応する。
そして、上記工程（１）〜（５）を経ることによって得られる本願発明の画像診断用シリカナノ粒子に対して、下記工程（６）をさらに行い、生体物質標識剤を製造することもできる：
工程（６）：工程（５）で得られた有機蛍光色素及び金属錯体を内包した画像診断用シリカナノ粒子を分子標識物質と結合させ、生体物質標識剤を得る。
なお、生体物質標識剤およびその製造方法についての詳細は、後述する「生体物質標識剤」の項で述べる。
【００７５】
なお、上記工程（３）で用いられる含ケイ素アルコキシド化合物としては、テトラエトキシシラン、テトラメトキシシランといったテトラアルコキシドシラン、メチルトリメトキシシラン、メチルエトキシシラン、フェニルトリエトキシシランなどのトリアルコキシシランなどを挙げることができる。また有機官能基を有する含ケイ素アルコキシド化合物を挙げることができる。具体的にはメルカプトプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシランなどがあげられる。
【００７６】
含ケイ素アルコキシド化合物は、上記の一種又は二種以上を併用することもできる。
【００７７】
含ケイ素アルコキシド化合物と工程（１）で得られる有機蛍光色素結合分子の混合比に制限はないが、最終的に得られるシリカナノ粒子中に１×１０-6ｍｏｌ／Ｌ以上１×１０-2ｍｏｌ／Ｌ以下になるように混合することが好ましい。濃度を１×１０-6ｍｏｌ／Ｌ以上とすることで十分な蛍光が得られる。また１×１０-2ｍｏｌ／Ｌ以下とすることで、シリカ内で均一に分散できる点で好ましい。
【００７８】
含ケイ素アルコキシド化合物と工程（２）で得られるガドリニウム錯体結合分子の混合比に制限はないが、最終的に得られるシリカナノ粒子中に１×１０-6ｍｏｌ／Ｌ以上１×１０-2ｍｏｌ／Ｌ以下になるように混合することが好ましい。濃度を１×１０-6ｍｏｌ／Ｌ以上とすることで十分なＸ線ＣＴ又はＭＲＩコントラストが得られる。また１×１０-2ｍｏｌ／Ｌ以下とすることで、シリカ内で均一に分散できる点で好ましい。
【００７９】
工程（４）で用いられる有機溶媒として、通常の含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応で用いられるものであればよく、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどが用いられる。一種又は二種以上の混合としてもよい。
【００８０】
また、工程（４）で用いられる塩基としては、通常の含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応で用いられるものであればよく、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどを用いることができ、それぞれ水溶液として用いてもよい。
【００８１】
含ケイ素アルコキシド化合物としてテトラエトキシシラン、有機溶媒としてエタノール、塩基としてアンモニア水を用いた場合のそれぞれの仕込みモル比を以下に挙げる。
【００８２】
テトラエトキシシランを１ｍｏｌとした場合、エタノールをａ  ｍｏｌ、水をｒ  ｍｏｌ、アンモニアをｂ  ｍｏｌとすると、ａは２０以上４００以下、ｒは１０以上２００以下、ｂは１０以上４０以下で混合する。具体的には、ジャーナル・オブ・コロイドサイエンス  ２６巻、６２ページ（１９６８年）に記載されている条件を適用することができる。
【００８３】
工程（４）において、反応温度は通常の含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応で適用される条件でよく、室温から５０℃の間で行うことができる。
【００８４】
工程（４）における反応時間は、通常の含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応で適用される条件でよく、１時間以上５０時間以下であることが好ましい。１時間以上とすることで反応が完結する点で好ましく、５０時間以下とすることで反応が進行しすぎて、不溶物が形成することを防止できる点で好ましい。
【００８５】
工程（５）における反応混合物から生成した有機蛍光色素及び金属錯体を内包した画像診断用シリカナノ粒子の回収方法は、通常ナノ粒子の回収で行われるろ過、又は遠心分離などを用いることができる。回収した有機蛍光色素及び金属錯体を内包した画像診断用シリカナノ粒子は必要に応じて、未反応原料などを除くため、有機溶媒又は水による洗浄をしてもよい。
【００８６】
〔生体物質標識剤〕
本発明に係る生体物質標識剤は、有機分子修飾された有機蛍光色素及び金属錯体を内包した上述の画像診断用シリカナノ粒子と、当該画像診断用シリカナノ粒子に結合した分子標識物質とを含む。
本発明の生体物質標識剤は、分子標識物質が他の分子を介することなく直接画像診断用シリカナノ粒子に結合した態様の生体物質標識剤であることを妨げるものではない。ただ、本発明の生体物質標識剤は、上記画像診断用シリカナノ粒子と分子標識物質とが有機分子により結合されている態様であることが好ましい。すなわち、本発明の生体物質標識剤の好適な態様において、上記画像診断用シリカナノ粒子と分子標識物質とが、有機分子を介して結合されている。上記結合の態様としては、特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。
なお、本発明の生体物質標識剤において、上記画像診断用シリカナノ粒子と結合した有機分子と、分子標識物質とは、直接結合していても良いし、あるいは、第２のリンカー化合物を介して結合していても良い。
【００８７】
本発明に係る生体物質標識剤は、分子標識物質が目的とする生体物質と特異的に結合及び／又は反応することにより、生体物質の標識が可能となる。すなわち、本発明に係る生体物質標識剤は、生体物質を標識する用途に好適に用いることができる。本発明に係る生体物質標識剤は、蛍光及びＸ線吸収の両方のモダリティーによる標識化を可能とするものであり、特に、イムノアッセイなどの各種アッセイ法において高感度な検出を可能とする。
【００８８】
分子標識物質
本発明において、分子標識物質は、標識対象とする生体物質と特異的に結合及び／又は反応することのできる物質である限り特に限定されるものではない。本発明で用いうる分子標識物質の例として、ヌクレオチド鎖、タンパク質、抗体等が挙げられる。
【００８９】
画像診断用シリカナノ粒子と分子標識物質とを結合する有機分子
本発明において、画像診断用シリカナノ粒子と分子標識物質とを結合するために用いうる有機分子は、画像診断用シリカナノ粒子と結合可能な部位と、分子標識物質と直接的にまたは間接的に結合可能な部位とを有する有機分子である限り特に限定されるものではない。ただ、本発明では、有機蛍光色素及び金属錯体を内包した画像診断用シリカナノ粒子の表面に結合し、分子標識物質とも結合しうる有機分子として、例えば、無機物と有機物を結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端に、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基などの官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物と結合する。具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシランなどがあげられる。
【００９０】
また、後述する生体物質標識剤として用いる場合、生体物質との非特異的吸着を抑制するためポリエチレングリコール鎖をもつシランカップリング剤（例えば、Ｇｅｌｅｓｔ社製ＰＥＧ−ｓｉｌａｎｅ  ｎｏ．ＳＩＭ６４９２．７）を用いることができる。
【００９１】
シランカップリング剤を用いる場合、二種以上を併用してもよい。
また、本発明に係る画像診断用シリカナノ粒子と分子標的物質との間の結合として、必要により、上記有機分子と分子標的物質との間に、第２のリンカー化合物をさらに介在させることもできる。このような第２のリンカー化合物は、画像診断用シリカナノ粒子と分子標的物質との間に一定の距離を確保するスペーサーとして機能するものであっても良く、あるいは、画像診断用シリカナノ粒子に導入された有機分子と分子標的物質とが結合するためのアダプターとして機能するものであっても良い。
この第２のリンカー化合物は、画像診断用シリカナノ粒子に導入された上記有機分子と直接結合しうる部位と、分子標的物質と結合しうる部位とを有するものであれば、特に限定されるものではない。
例えば、画像診断用シリカナノ粒子に導入された有機分子がアミノ基を有する場合、この第２のリンカー化合物における上記有機分子と直接結合しうる部位として、カルボキシル基などが挙げられ、分子標的物質と結合しうる部位として、マレイミド基など、メルカプト基と選択的に反応しうる官能基が挙げられる。この第２のリンカー化合物の具体例として、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）などが挙げられる。
【００９２】
生体物質標識剤の製造方法
本発明に係る生体物質標識剤は、上述した画像診断用シリカナノ粒子と、分子標識物質と有機分子を介して結合させて得られる。
ここで、本発明に係る生体物質標識剤の製造方法は、画像診断用シリカナノ粒子に有機分子を導入する工程を経てから、分子標識物質を当該有機分子と結合させる工程を経るものであっても良いし、分子標識物質を予め有機分子で修飾して有機分子修飾分子標識物質を形成する工程を経てから、画像診断用シリカナノ粒子に当該有機分子修飾分子標識物質を導入する工程を経るものであっても良い。ただ、後処理の容易さ等の観点から、画像診断用シリカナノ粒子に有機分子を導入する工程を経てから、分子標識物質を当該有機分子と結合させる工程を経ることによって、本発明に係る生体物質標識剤を製造することが好ましい。
本発明に係る生体物質標識剤の好適な製造方法として、具体的には、
(i) まず、有機蛍光色素及び金属錯体を内包した画像診断用シリカナノ粒子と、
適当な反応性官能基（例えば、アミノプロピル基）を有するシランカップリング剤と
を反応させることにより、反応性官能基を画像診断用シリカナノ粒子に導入して、官能基修飾画像診断用シリカナノ粒子を得る工程と、
(ii) 上記工程 (i) により得られた官能基修飾画像診断用シリカナノ粒子と、
当該反応性官能基と結合形成可能な官能基（例えば、カルボキシル基）を有する分子標識物質（例えば、抗体）と
を反応させて、官能基修飾画像診断用シリカナノ粒子と分子標識物質との間に結合を生じさせることにより、生体物質標識剤を得る工程
を含むものが挙げられる。
ここで、上記工程 (ii) に代えて、
(ii') 上記工程 (i) により得られた官能基修飾画像診断用シリカナノ粒子と、
当該反応性官能基と結合形成可能な官能基（例えば、カルボキシル基およびその活性エステル）と、第２の反応性官能基（例えば、マレイミド基）とを有する上記第２のリンカー化合物（例えば、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＭＣ）と
を反応させて、当該第２の反応性官能基を画像診断用シリカナノ粒子に導入して、第２の官能基修飾画像診断用シリカナノ粒子を得る工程と、
(iii') 上記工程 (ii') により得られた第２の官能基修飾画像診断用シリカナノ粒子と、
当該第２の反応性官能基と結合形成可能な官能基（例えば、チオール基）を有する分子標識物質（例えば、抗体）と
を反応させて、当該第２の官能基修飾画像診断用シリカナノ粒子と分子標識物質との間に結合を生じさせることにより、生体物質標識剤を得る工程
からなる２つの工程を行っても良い。
【００９３】
有機蛍光色素及び金属錯体を内包した画像診断用シリカナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知の手法を用いることができる。例えば、得られた有機蛍光色素及び金属錯体を内包した画像診断用シリカナノ粒子を純水中に分散させ、アミノプロピルトリエトキシシランを添加し、室温で１２時間反応させる。反応終了後、遠心分離又はろ過により表面がアミノプロピル基で修飾された画像診断用シリカナノ粒子を得ることができる。
【００９４】
また、上記工程 (ii) の具体例として、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した画像診断用シリカナノ粒子のアミノ基と抗体中のカルボキシル基とを反応させることで、アミド結合を介し抗体を画像診断用シリカナノ粒子と結合させることができる。必要に応じＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）のような縮合剤を用いることもできる。
【００９５】
また、上記工程 (ii')および(iii') に記載したように、必要により、有機分子修飾された画像診断用シリカナノ粒子と直接結合しうる部位と、分子標的物質と結合しうる部位とを有するリンカー化合物、すなわち、上記第２のリンカー化合物を用いることができる。具体例として、アミノ基と選択的に反応する部位とメルカプト基と選択的に反応する部位の両方をもつｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いると、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した画像診断用シリカナノ粒子のアミノ基と、抗体中のメルカプト基を結合させることで、抗体結合した画像診断用シリカナノ粒子ができる。
【実施例】
【００９６】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例において「部」あるいは「％」の表示を用いるが、特に断りがない限り「質量部」あるいは「質量％」を表す。【００９７】
合成例１：有機蛍光色素ＴＡＭＲＡ及びガドリニウム錯体Ｇｄ−ＤＴＰＡを内包した画像診断用シリカナノ粒子１の作製
下記工程（１）〜（６）の方法により、画像診断用シリカナノ粒子１を作製した。【００９８】
工程（１）：有機蛍光色素ＴＡＭＲＡ（以下「ＴＡＭＲＡ」と称す。）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製５（６）−ＴＡＭＲＡ−ＮＨＳ，ＳＥ）２．６ｍｇ（０．００４８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド０．８ｍｌに溶解させたところに、氷冷下、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製）１μｌ（０．００４８ｍｍｏｌ）を添加し、３０分間撹拌した。【００９９】
工程（２）：ジエチレントリアミン五酢酸ガドリニウム錯体（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）２．６ｍｇ（０．００４８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（以下「ＤＭＦ」と略す。）０．８ｍｌに溶解させたところに、１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）０．７ｍｇ（０．００４８ｍｍｏｌ）ついで３−アミノプロピルトリエトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製）１μｌ（０．００４８ｍｍｏｌ）と添加し、３０分間撹拌した。【０１００】
工程（３）：工程（１）及び工程（２）で得られたＤＭＦ溶液とテトラエトキシシラン４０μｌを混合した。【０１０１】
工程（４）：エタノール４０ｍｌ及び１４％アンモニア水１０ｍｌを混合した。【０１０２】
工程（５）：工程（４）で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（３）で作製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。【０１０３】
工程（６）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。【０１０４】
得られた画像診断用シリカナノ粒子１の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ；日立社製Ｓ−８００型）観察を行ったところ、平均粒径１１０ｎｍ、変動係数は１２％であった。なお、当該観察は、１０００個の粒子について断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径を粒径として求め、１０００個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。また、変動係数も、１０００個の粒子の粒径分布から算出した値とした。【０１０５】
合成例２：Ｃｙ５及びＧｄ−ＤＯＴＡを内包した画像診断用シリカナノ粒子２の合成
有機蛍光色素としてＣｙ５Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）ガドリニウム錯体としてＧｄ−ＤＯＴＡ（Ｇｕｅｒｂｅｔ社製ＤＯＴＡＲＥＭ登録商標）を用いた他は合成例１と同様の手順により画像診断用シリカナノ粒子２を合成した。【０１０６】
得られた画像診断用シリカナノ粒子２のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１００ｎｍ、変動係数は１０％であった。【０１０７】
合成例３：ＴＡＭＲＡ／Ｇｄ−ＤＴＰＡを内包した画像診断用シリカナノ粒子３の合成
Ｇｄ−ＤＴＰＡをシリカナノ粒子と共有結合する工程を行わずに下記工程（１）〜（６）の方法により、画像診断用シリカナノ粒子３を作製した。【０１０８】
工程（１）：ＴＡＭＲＡのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製５（６）−ＴＡＭＲＡ−ＮＨＳ，ＳＥ）２．６ｍｇ（０．００４８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド０．８ｍｌに溶解させたところに、氷冷下３−アミノプロピルトリエトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製）１μｌ（０．００４８ｍｍｏｌ）添加し、３０分間撹拌した。【０１０９】
工程（２）：ジエチレントリアミン五酢酸ガドリニウム錯体（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）２．６ｍｇ（０．００４８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド０．８ｍｌに溶解させた。【０１１０】
工程（３）：工程（１）及び工程（２）で得られたＤＭＦ溶液とテトラエトキシシラン４０μｌを混合した。【０１１１】
工程（４）：エタノール４０ｍｌ、１４％アンモニア水１０ｍｌを混合した。【０１１２】
工程（５）：工程（４）で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（３）で作製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。【０１１３】
工程（６）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。【０１１４】
得られた画像診断用シリカナノ粒子３の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ；日立社製Ｓ−８００型）観察を行ったところ、平均粒径１０５ｎｍ、変動係数は１２％であった。【０１１５】
合成例４：ＴＡＭＲＡを内包した画像診断用シリカナノ粒子４の合成
下記工程（１）〜（５）の方法により、有機蛍光色素のみ内包した画像診断用シリカナノ粒子４を作製した。【０１１６】
工程（１）：ＴＡＭＲＡのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製５（６）−ＴＡＭＲＡ−ＮＨＳ，ＳＥ）２．６ｍｇ（０．００４８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド０．８ｍｌに溶解させたところに、氷冷下３−アミノプロピルトリエトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製）１μｌ（０．００４８ｍｍｏｌ）添加し、３０分間撹拌した。【０１１７】
工程（２）：工程（１）で得られたＤＭＦ溶液とテトラエトキシシラン４０μｌを混合した。【０１１８】
工程（３）：エタノール４０ｍｌ、１４％アンモニア水１０ｍｌを混合した。【０１１９】
工程（４）：工程（４）で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（２）で作製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。【０１２０】
工程（５）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。【０１２１】
得られた画像診断用シリカナノ粒子４の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ；日立社製Ｓ−８００型）観察を行ったところ、平均粒径１１０ｎｍ、変動係数は１０％であった。【０１２２】
合成例５：Ｇｄ−ＤＴＰＡを内包した画像診断用シリカナノ粒子５の合成
下記工程（１）〜（５）の方法により、ガドリニウム錯体のみをシリカ粒子に共有結合により内包した画像診断用シリカナノ粒子５を作製した。【０１２３】
工程（１）：ジエチレントリアミン五酢酸ガドリニウム錯体（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）２．６ｍｇ（０．００４８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド０．８ｍｌに溶解させたところに、１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）０．７ｍｇ（０．００４８ｍｍｏｌ）ついで３−アミノプロピルトリエトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製）１μｌ（０．００４８ｍｍｏｌ）と添加し、３０分間撹拌した。【０１２４】
工程（２）：工程（１）で得られたＤＭＦ溶液とテトラエトキシシラン４０μｌを混合した。【０１２５】
工程（３）：エタノール４０ｍｌ、１４％アンモニア水１０ｍｌを混合した。【０１２６】
工程（４）：工程（４）で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（２）で作製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。【０１２７】
工程（５）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。【０１２８】
得られた画像診断用シリカナノ粒子５の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ；日立社製Ｓ−８００型）観察を行ったところ、平均粒径１０２ｎｍ、変動係数は１１％であった。【０１２９】
得られたシリカナノ粒子の１ｎＭＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）分散液をそれぞれ調製し、蛍光分光光度計Ｆ−７０００（商品名、日立ハイテクノロジーズ社製）を用いて、励起光波長を、ＴＡＭＲＡを内包した場合は５８０ｎｍ、Ｃｙ５を内包した場合は６３３ｎｍとし、蛍光強度を測定した。作製した画像診断用シリカナノ粒子１の５８０ｎｍでの蛍光強度を１００としたときの相対値として評価した。評価結果を表１に示す。【０１３０】
また、Ｘ線吸収能は、得られたシリカナノ粒子の１ｎＭＰＢＳ分散液をプラスチックチューブにいれ、加速電圧７０ｋＶのＸ線を照射し、透過したＸ線量を、フラットパネル検出器ＰａｘＳｃａｎ登録商標１３１３Ｒ（商品名：バリアン社製）を用いて測定した。試料のない部分の測定値を１００としたときの相対値として評価した。評価結果を表１に示す。表１において、「Ｘ線吸収」の欄に示した値が小さいほど、透過したＸ線量が少なく、Ｘ線吸収能が優れていることを意味する。【０１３１】
【表１】
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【０１３２】
表１に示した結果から明らかなように、本発明の画像診断用シリカナノ粒子１及び２は、蛍光、Ｘ線吸収どちらのモダリティーによっても検出されることがわかる。またガドリニウム錯体が共有結合で内包されていない粒子３は、Ｘ線吸収率が低下した。このことはガドリニウム錯体が共有結合で粒子の骨格と結合されていないため、容易にシリカ粒子から漏えいしてしまい、洗浄により除去されたためと考えられる。有機蛍光色素のみを内包した粒子４は、Ｘ線吸収では検出ができず、蛍光による検出のみが可能であった。また、ガドリニウム錯体のみを内包した粒子５は、蛍光による検出はできなかったが、Ｘ線吸収による検出のみが可能であった。このように有機蛍光色素、ガドリニウム錯体どちらか一方しか内包していない粒子では、複数モダリティーによる検出ができず、本発明の効果が得られない。【０１３３】
《生体物質標識剤》
有機蛍光色素及び金属錯体の両方を内包した画像診断用シリカナノ粒子１及び２を用いて、下記に示す方法により分子修飾シリカナノ粒子Ａ及びＢを各々調製し、更にこれを用いて生体物質標識剤１及び２を調製して、生体物質標識剤の長期保存性を評価した。【０１３４】
〔分子修飾シリカナノ粒子Ａの調製〕
（分子修飾シリカナノ粒子Ａ：ＴＡＭＲＡ／Ｇｄ−ＤＴＰＡを内包した画像診断用シリカナノ粒子へのアミノ基修飾）
画像診断用シリカナノ粒子１  １ｍｇを純水５ｍｌに分散させた。アミノプロピルトリエトキシシラン水分散液１００μｌを添加し、室温で１２時間撹拌した。【０１３５】
反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄をさらに行った。その結果、分子修飾シリカナノ粒子Ａが得られた。【０１３６】
得られたアミノ基修飾したシリカナノ粒子ＡのＦＴ−ＩＲ測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾できたことを確認できた。【０１３７】
〔分子修飾シリカナノ粒子Ｂの調製〕
（分子修飾シリカナノ粒子Ｂ：Ｃｙ５／Ｇｄ−ＤＯＴＡを内包した画像診断用シリカナノ粒子へのアミノ基修飾）
画像診断用シリカナノ粒子２について、分子修飾シリカナノ粒子Ａの調製と同様の手順によりアミノ基修飾を行った。その結果、分子修飾シリカナノ粒子Ｂが得られた。【０１３８】
得られたアミノ基修飾したシリカ被覆テトラメチルローダミンを内包した画像診断用シリカナノ粒子、すなわち、分子修飾シリカナノ粒子ＢのＦＴ−ＩＲ測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾できたことを確認できた。【０１３９】
〔生体物質標識剤１の調製〕
（生体物質標識剤１：アミノ基修飾ＴＡＭＲＡ／Ｇｄ−ＤＴＰＡを内包した画像診断用シリカナノ粒子への抗体結合体）
上記「分子修飾シリカナノ粒子Ａの調製」で得られたアミノ基修飾ＴＡＭＲＡ／Ｇｄ−ＤＴＰＡを内包した画像診断用シリカナノ粒子、すなわち、上記分子修飾シリカナノ粒子Ａ０．５ｍｇを純水０．５ｍｌに分散させたもの０．１ｍｌをＤＭＳＯ２ｍｌに添加した。そこへ、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）をいれ１時間反応させた。過剰のｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣなどを遠心分離により除去する、一方で、抗ｈＣＧ抗体を１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元処理を行い、ゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去した。【０１４０】
ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ処理したＴＡＭＲＡ／Ｇｄ−ＤＴＰＡを内包した画像診断用シリカナノ粒子と、ＤＴＴ処理した抗ｈＣＧ抗体を混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。ゲルろ過カラムにより未反応物を除去し、抗ｈＣＧ抗体が結合したＴＡＭＲＡ／Ｇｄ−ＤＴＰＡを内包した画像診断用シリカナノ粒子（生体物質標識剤１）を得た。【０１４１】
〔生体物質標識剤２の調製〕
（生体物質標識剤２：アミノ基修飾Ｃｙ５／Ｇｄ−ＤＯＴＡを内包した画像診断用シリカナノ粒子への抗体結合体）
上記「分子修飾シリカナノ粒子Ｂの調製」で得られたアミノ基修飾Ｃｙ５／Ｇｄ−ＤＯＴＡを内包した画像診断用シリカナノ粒子、すなわち、上記分子修飾シリカナノ粒子Ｂについて、生体物質標識剤１の調製と同様の手順で、抗ｈＣＧ抗体が結合したＣｙ５／Ｇｄ−ＤＯＴＡを内包した画像診断用シリカナノ粒子（生体物質標識剤２）を得た。【０１４２】
生体物質標識剤１及び２を用いたイムノアッセイを下記の手順で行った。
１）マイクロプレート上ウェル内にアンチ−ｈαサブニットを固定化した。
２）抗原であるｈＣＧを各ウェルに濃度を変えて入れた。
３）過剰のｈＣＧを洗浄により除去後、各ウェルに生体物質標識剤分散液を入れた。
４）過剰の生体物質標識剤を洗浄により除去した。
５）マイクロプレートリーダー  フルオロスキャンアセントＦＬ（商品名：サーモフィッシャー社製）により各ウェルの蛍光強度を測定した。
６）マイクロプレートにＸ線を照射し、各ウェルのＸ線吸収率を測定した。【０１４３】
生体標識剤１についてｈＣＧ抗体濃度が１ｎｇ／ｍｌの時の蛍光強度を１００としたときの、各ｈＣＧ抗体濃度で測定した蛍光強度を表２に、及びｈＣＧ抗体濃度が１ｎｇ／ｍｌの時のＸ線吸収率を１０としたときの、各ｈＣＧ抗体濃度で測定したＸ線吸収率を表３に示す。【０１４４】
【表２】
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【０１４５】
【表３】
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【０１４６】
本発明の生体物質標識剤を用いたところ、蛍光及びＸ線吸収のどちらのモダリティーを用いた場合でも抗原濃度に応じて蛍光強度の上昇及びＸ線吸収率の低下がみられた。【０１４７】
すなわち、本発明で得られた生体物質標識剤は、抗原認識能を損なっていないことが言える。すなわち、この結果により、本発明により複数のモダリティーにより高感度検出が可能な生体物質標識剤を提供することができることが分かる。
【国際調査報告】
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