(57)【要約】  下記一般式（Ｉ）で表されることを特徴とする化合物の提供。2012073375.tif 000056  ただし、前記一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２は、置換基を有していてもよいアルキル基を表し、Ｒ３は、下記一般式（ＩＩ）及び下記一般式（ＩＩＩ）いずれかを表し、前記Ｒ１及び前記Ｒ２は、互いに同一であってもよいし、異なっていてもよい。2012073375.tif 000057  ただし、前記一般式（ＩＩ）及び前記一般式（ＩＩＩ）において、Ｘは、水素原子及びハロゲン原子のいずれかを表し、Ｒ４は、メチル基、ジメチル基、及び酸素原子のいずれかを表し、＊は、結合手を表す。
2012073375.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表されることを特徴とする化合物。
【化１】
2012073375.tif 000047
ただし、前記一般式（Ｉ）において、
Ｒ１及びＲ２は、置換基を有していてもよいアルキル基を表し、
Ｒ３は、下記一般式（ＩＩ）及び下記一般式（ＩＩＩ）いずれかを表し、
前記Ｒ１及び前記Ｒ２は、互いに同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【化２】
2012073375.tif 000048
ただし、前記一般式（ＩＩ）及び前記一般式（ＩＩＩ）において、
Ｘは、水素原子及びハロゲン原子のいずれかを表し、
Ｒ４は、メチル基、ジメチル基、及び酸素原子のいずれかを表し、
＊は、結合手を表す。
【請求項２】
一般式（Ｉ）で表される化合物が、下記一般式（ＩＶ）、下記一般式（Ｖ）、及び下記一般式（ＶＩ）のいずれかで表される化合物である請求項１に記載の化合物。
【化３】
2012073375.tif 000049
【化４】
2012073375.tif 000050
【化５】
2012073375.tif 000051
ただし、前記一般式（ＩＶ）、前記一般式（Ｖ）、及び前記一般式（ＶＩ）において、
Ｒ１及びＲ２は、置換基を有していてもよいアルキル基を表し、
Ｘは、水素原子及びハロゲン原子のいずれかを表し、
前記Ｒ１及び前記Ｒ２は、互いに同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【請求項３】
一般式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒ１及びＲ２の少なくともいずれかが、エチル基及びメチル基のいずれかであり、Ｘが、水素原子、フッ素原子、及び塩素原子のいずれかである請求項１から２のいずれかに記載の化合物。
【請求項４】
一般式（Ｉ）で表される化合物が、下記構造式（１）、下記構造式（２）、下記構造式（３）、及び下記構造式（４）のいずれかで表される化合物である請求項１から３のいずれかに記載の化合物。
【化６】
2012073375.tif 000052
【化７】
2012073375.tif 000053
【化８】
2012073375.tif 000054
【化９】
2012073375.tif 000055
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の化合物を含有し、キネシンスピンドルタンパク質の活性を阻害することを特徴とするキネシンスピンドルタンパク質阻害剤。
【請求項６】
請求項５に記載のキネシンスピンドルタンパク質阻害剤を含有し、少なくとも一部にキネシンスピンドルタンパク質が介在する障害を予防乃至治療することを特徴とする医薬組成物。
【請求項７】
少なくとも一部にキネシンスピンドルタンパク質が介在する障害が、細胞増殖性疾患である請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
細胞増殖性疾患が、ガン疾患である請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ガン疾患が、肺ガン、気管支ガン、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、直腸ガン、小腸ガン、甲状腺ガン、食道ガン、口腔ガン、咽頭ガン、喉頭ガン、胃ガン、肝臓ガン、肝内胆管ガン、腎臓ガン、腎盂ガン、膀胱ガン、子宮体ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、結膜ガン、涙腺ガン、眼瞼ガン、多発性骨髄腫、脳腫瘍、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、繊毛性結腸腺腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ性白血病、及び骨髄性白血病から選択される少なくとも１種である請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
更に薬理学的に許容される担体を含む請求項６から９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
更にガンの予防乃至治療に用いられる少なくとも１種の薬剤を含む、請求項６から１０のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項５に記載のキネシンスピンドルタンパク質阻害剤と細胞とを接触させて、該細胞におけるキネシンスピンドルタンパク質の活性を阻害することを特徴とするキネシンスピンドルタンパク質の阻害方法。
【請求項１３】
細胞が、生体内の細胞及び培養細胞のいずれかである請求項１２に記載のキネシンスピンドルタンパク質の阻害方法。
【請求項１４】
キネシンスピンドルタンパク質阻害剤を動物に投与することにより、前記キネシンスピンドルタンパク質と生体内の細胞とを接触させる請求項１３に記載のキネシンスピンドルタンパク質の阻害方法。
【請求項１５】
動物が、非ヒト動物である請求項１４に記載のキネシンスピンドルタンパク質の阻害方法。
【請求項１６】
請求項６から１１のいずれかに記載の医薬組成物を用いて、少なくとも一部にキネシンスピンドルタンパク質が介在する障害を予防乃至治療することを特徴とする予防乃至治療方法。
【請求項１７】
少なくとも一部にキネシンスピンドルタンパク質が介在する障害が、細胞増殖性疾患である請求項１６に記載の予防乃至治療方法。
【請求項１８】
細胞増殖性疾患が、ガン疾患である請求項１７に記載の予防乃至治療方法。
【請求項１９】
ガン疾患が、肺ガン、気管支ガン、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、直腸ガン、小腸ガン、甲状腺ガン、食道ガン、口腔ガン、咽頭ガン、喉頭ガン、胃ガン、肝臓ガン、肝内胆管ガン、腎臓ガン、腎盂ガン、膀胱ガン、子宮体ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、結膜ガン、涙腺ガン、眼瞼ガン、多発性骨髄腫、脳腫瘍、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、繊毛性結腸腺腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ性白血病、及び骨髄性白血病から選択される少なくとも１種である請求項１８に記載の予防乃至治療方法。
【請求項２０】
少なくとも一部にキネシンスピンドルタンパク質が介在する障害の予防乃至治療が、医薬組成物を動物に投与することにより行われる請求項１６から１９のいずれかに記載の予防乃至治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物、前記化合物を含有するキネシンスピンドルタンパク質阻害剤、前記キネシンスピンドルタンパク質阻害剤を含有する医薬組成物、並びに、前記キネシンスピンドルタンパク質阻害剤を用いたキネシンスピンドルタンパク質の阻害方法、及び前記医薬組成物を用いた予防乃至治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キネシンは、アデノシン三リン酸を使用して微小管上を滑走し、細胞小器官及び小胞などを輸送する運動タンパク質であり、細胞分裂や神経軸索輸送等の細胞内物質輸送など、多様な細胞生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている。
現在、約１００種類のキネシン様タンパク質が同定されている。これらは有糸分裂紡錘体の微小管又は染色体と直接相互作用して細胞周期の有糸分裂時期に極めて重要な役割を果たすと考えられている。【０００３】
細胞分裂は、生物が生存し内部環境の恒常性を維持していく上で欠かすことのできない現象である。一方で、この恒常性を維持するために、生体内においてアポトーシスが起こることも重要である。即ち、細胞分裂（増殖）とアポトーシスとがバランスよく行われることで生物の内部環境の恒常性が維持される。
しかし、この細胞分裂とアポトーシスとのバランスが崩れ、細胞分裂が亢進すると、ガン等の細胞増殖性疾患が引き起こされる。【０００４】
そこで、ガン等の細胞増殖性疾患の治療方法として前記キネシンを阻害することが検討されている。ガンの治療に用いられる常套の化学療法剤には、タキサン類及びビンカアルカロイド類がある。タキサン類及びビンカアルカロイド類は、各種の細胞構造に存在する微小管に作用する。これらの薬剤による有糸分裂紡錘体の破壊によってガン細胞の分裂が阻害され、ガン細胞の細胞死が誘発されると推定されている。
しかし、微小管は、ガン細胞だけでなく神経細胞等の正常細胞でも重要な機能を担っている。そのため、これらの常套の化学療法剤は、有糸分裂紡錘体を特異的に標的とするものではなく、手足のしびれ等の神経障害が副作用として問題となっている。【０００５】
前記同定されたキネシン様タンパク質の１つとして、キネシンスピンドルタンパク質（ＫＳＰ、Ｅｇ５、ＫＮＳＬ１、ＴＲＩＰ５、ＫＩＦ１１などと称することもある。）が、有糸分裂紡錘体に局在し、双極有糸分裂紡錘体の形成及び機能に必要であること知られている（非特許文献１参照）。
前記Ｅｇ５は、マウスのニューロン発達に関与していることが知られているが、出生直後ニューロンから消失するので、Ｅｇ５の阻害は常套の化学療法剤にともなう末梢神経障害を起こさないことが示唆されている（非特許文献２参照）。【０００６】
したがって、キネシンスピンドルタンパク質を高効率で阻害することができる低分子の新規化合物、該低分子化合物を含有するキネシンスピンドルタンパク質阻害剤、該キネシンスピンドルタンパク質を含有し、少なくとも一部にキネシンスピンドルタンパク質が介在する障害を予防乃至治療することができ、かつ副作用がなく安全性の高い医薬組成物の提供が望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｎｎｅ  Ｂｌａｎｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｃｅｌｌ，  Ｖｏｌ．８３，  ｐ．１１５９−１１６９
【非特許文献２】Ｌｏｔｆｉ  Ｆｅｒｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  １８（１９），  ｐ．７８２２−７８３５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、キネシンスピンドルタンパク質を高効率で阻害することができる低分子の新規化合物、該低分子の新規化合物を含有するキネシンスピンドルタンパク質阻害剤及びキネシンスピンドルタンパク質の阻害方法、該キネシンスピンドルタンパク質阻害剤を含有し、少なくとも一部にキネシンスピンドルタンパク質が介在する障害を予防乃至治療することができ、かつ副作用がなく安全性の高い医薬組成物、該医薬組成物を用いた治療乃至予防方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
新規化合物は、下記一般式（Ｉ）で表される。
キネシンスピンドルタンパク質阻害剤は、前記化合物を含有し、キネシンスピンドルタンパク質の活性を阻害する。
医薬組成物は、前記キネシンスピンドルタンパク質阻害剤を含有し、少なくとも一部にキネシンスピンドルタンパク質が介在する障害を予防乃至治療する。
キネシンスピンドルタンパク質の阻害方法は、前記キネシンスピンドルタンパク質阻害剤と細胞とを接触させて、該細胞におけるキネシンスピンドルタンパク質の活性を阻害する。
予防乃至治療方法は、前記医薬組成物を用いて、少なくとも一部にキネシンスピンドルタンパク質が介在する障害を予防乃至治療する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、キネシンスピンドルタンパク質を高効率で阻害することができる低分子の新規化合物、該低分子の新規化合物を含有するキネシンスピンドルタンパク質阻害剤及びキネシンスピンドルタンパク質の阻害方法、該キネシンスピンドルタンパク質阻害剤を含有し、少なくとも一部にキネシンスピンドルタンパク質が介在する障害を予防乃至治療することができ、かつ副作用がなく安全性の高い医薬組成物、該医薬組成物を用いた治療乃至予防方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、一般式（Ｉ）で表される化合物の好ましい一例である構造式（１）で表される化合物のプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図２Ａ】図２Ａは、一般式（Ｉ）で表される化合物の好ましい一例である構造式（１）で表される化合物の高速液体クロマトグラフ質量分析における、ＬＣ（液体クロマトグラフィー）（上段）及びＭＳ（質量分析）（下段）のクロマトグラム像である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、一般式（Ｉ）で表される化合物の好ましい一例である構造式（１）で表される化合物の高速液体クロマトグラフ質量分析におけるリテンションタイム３．１４２のピーク成分の質量分析の結果を示した図である。
【図３】図３は、一般式（Ｖ）で表される化合物の好ましい一例である構造式（２）で表される化合物の中間体であるＮ−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）アセトアミドのプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図４】図４は、一般式（Ｖ）で表される化合物の好ましい一例である構造式（２）で表される化合物の中間体である（Ｅ）−３−（３−アセトアミド−６−クロロ−２−フルオロフェニル）アクリル酸のプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図５】図５は、一般式（Ｖ）で表される化合物の好ましい一例である構造式（２）で表される化合物の中間体である３−（３−アセトアミド−２−フルオロフェニル）プロパン酸のプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図６】図６は、一般式（Ｖ）で表される化合物の好ましい一例である構造式（２）で表される化合物の中間体であるＮ−（４−フルオロ−１−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−イル）アセトアミドのプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図７】図７は、一般式（Ｖ）で表される化合物の好ましい一例である構造式（２）で表される化合物の中間体である５−アミノ−４−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−オンのプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図８】図８は、一般式（Ｖ）で表される化合物の好ましい一例である構造式（２）で表される化合物の中間体である５−（ベンジルアミノ）−４−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−オンのプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図９】図９は、一般式（Ｖ）で表される化合物の好ましい一例である構造式（２）で表される化合物のプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図１０】図１０は、一般式（ＶＩ）で表される化合物の好ましい一例である構造式（２）で表される化合物の中間体である［ベンジル−（３−ヒドロキシ−１−Ｈ−インダン−５−イル）−アミノ］酢酸のプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図１１】図１１は、一般式（ＶＩ）で表される化合物の好ましい一例である構造式（３）で表される化合物のプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図１２】図１２は、一般式（ＶＩ）で表される化合物の好ましい一例である構造式（４）で表される化合物のプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（新規化合物）
新規化合物は、下記一般式（Ｉ）で表される。
【化１】
2012073375.tif 000003
ただし、前記一般式（Ｉ）において、
Ｒ１及びＲ２は、置換基を有していてもよいアルキル基を表し、
Ｒ３は、下記一般式（ＩＩ）及び下記一般式（ＩＩＩ）いずれかを表し、
前記Ｒ１及び前記Ｒ２は、互いに同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【化２】
2012073375.tif 000004
ただし、前記一般式（ＩＩ）及び前記一般式（ＩＩＩ）において、
Ｘは、水素原子及びハロゲン原子のいずれかを表し、
Ｒ４は、メチル基、ジメチル基、及び酸素原子のいずれかを表し、
＊は、結合手を表す。
【００１３】
前記一般式（１）で表される化合物は、薬理学的に許容される塩やエステルであってもよく、互変異性体であってもよい。
【００１４】
前記塩としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カルボン酸塩、無機酸塩、アミノ酸塩、スルホン酸塩などが挙げられる。
前記カルボン酸塩としては、例えば、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、トリクロロ酢酸塩、ヒドロキシ酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、安息香酸塩、酪酸塩、マレイン酸塩、プロピオン酸塩、蟻酸塩、リンゴ酸塩などが挙げられる。
前記無機酸塩としては、例えば、ハロゲン化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩などが挙げられる。
前記アミノ酸塩としては、例えば、アルギニン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられる。
前記スルホン酸塩としては、例えば、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩などが挙げられる。
【００１５】
これらの中でも、前記一般式（Ｉ）で表される化合物は、下記一般式（ＩＶ）、下記一般式（Ｖ）、及び下記一般式（ＶＩ）のいずれかで表される化合物であることが好ましい。
【化３】
2012073375.tif 000005
【化４】
2012073375.tif 000006
【化５】
2012073375.tif 000007
ただし、前記一般式（ＩＶ）、前記一般式（Ｖ）、及び前記一般式（ＶＩ）において、
Ｒ１及びＲ２は、置換基を有していてもよいアルキル基を表し、
Ｘは、水素原子及びハロゲン原子のいずれかを表し、
前記Ｒ１及び前記Ｒ２は、互いに同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【００１６】
これらの中でも、前記一般式（Ｉ）〜（ＶＩ）において、Ｒ１及びＲ２の少なくともいずれかが、エチル基及びメチル基のいずれかであることが好ましく、Ｒ１及びＲ２が同一の基であることがより好ましい。
また、前記一般式（Ｉ）〜（ＶＩ）において、Ｘは、水素原子、フッ素原子、及び塩素原子のいずれかであることが好ましい。
【００１７】
＜一般式（ＩＶ）で表される化合物＞
前記一般式（ＩＶ）で表される化合物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、下記構造式（１）で表される化合物が好ましい。
【化６】
2012073375.tif 000008
【００１８】
−物理化学的性状−
前記構造式（１）で表される化合物の物理化学的性状としては、以下のとおりである。
（１）分子式は、Ｃ２４Ｈ２９ＦＮ２Ｏで表される。分子量は、３８０．２３である。
（２）プロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）は、４００ＭＨｚにおいて重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）中で２５℃にて測定した。プロトン核磁気共鳴スペクトルとしては、図１に示す通りである。
（３）高速液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ−ＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ３８１．２（Ｍ＋Ｈ）＋であり、Ｍの計算値は、ｍ／ｚ３８１．２３（Ｃ２４Ｈ３０ＦＮ２Ｏ）である。分析結果を図２Ａに示す。図２Ａにおいて、上段は、ＬＣ（液体クロマトグラフィー）のクロマトグラフ像（縦軸：シグナル強度（ｍＡＵ）、横軸：測定時間（分間）であり、下段は、ＭＳ（質量分析）のクロマトグラフ像（縦軸：シグナル強度、横軸：測定時間（分間））である。また、図２Ｂにリテンションタイム３．１４２のピーク成分の質量分析の結果を示す。
【００１９】
＜＜製造方法＞＞
前記一般式（ＩＶ）で表される化合物の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成による方法などが挙げられる。
以下に、前記構造式（１）で表される化合物を例に挙げ、前記一般式（ＩＶ）で表される化合物の製造方法の一例を説明する。
【００２０】
前記構造式（１）で表される化合物を化学合成により得る方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、出発物質を下記に示す２−フルオロ安息香酸（化合物１）を用い、中間体を経て合成する方法などが挙げられる。
前記出発物質２−フルオロ安息香酸を用いて、前記構造式（１）で表される化合物を製造する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、中間体を１０個経る方法などが挙げられる。
前記中間体としては、例えば、第１に下記化合物２（以下、「中間体１−１」と称することがある。）、第２に下記化合物３（以下、「中間体１−２」と称することがある。）、第３に下記化合物４（以下、「中間体１−３」と称することがある。）、第４に下記化合物５（以下、「中間体１−４」と称することがある。）、第５に下記化合物６（以下、「中間体１−５」と称することがある。）、第６に下記化合物７（以下、「中間体１−６」と称することがある。）、第７に下記化合物８（以下、「中間体１−７」と称することがある。）、第８に下記化合物９（以下、「中間体１−８」と称することがある。）、第９に下記化合物１０（以下、「中間体１−９」と称することがある。）、第１０に下記化合物１１（以下、「中間体１−１０」と称することがある。）などが挙げられる。
前記中間体１−１〜１−１０を得る方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成による方法などが挙げられる。また、化学合成によらず、市販品を用いることもできる。
【００２１】
【化７】
2012073375.tif 000009
【００２２】
前記一般式（ＩＶ）で表される化合物、及び前記中間体１−１〜１−１０を化学合成する際の、反応温度、反応時間、合成方法、及び化合物の使用量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記化学合成に用いる化合物の状態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液体の状態、固体の状態、乾燥した状態、油状物の状態、再結晶化した状態などが挙げられる。
前記中間体を確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プロトン核磁気共鳴分光法、質量分析法、炭素１３核磁気共鳴分光法、赤外分光法、高速液体クロマトグラフィー法等で分析する方法などが挙げられる。
【００２３】
また、前記化学合成により得た生成物は、必要に応じて精製することができる。
前記精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、順層系又は逆層系充填剤を使用したカラム、ｐｒｅｐ−ＴＬＣ（分取ＴＬＣ）、ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣ（分取ＨＰＬＣ）などの方法を用いることができる。
【００２４】
＜一般式（Ｖ）で表される化合物＞
前記一般式（Ｖ）で表される化合物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、下記構造式（２）で表される化合物が好ましい。
【化８】
2012073375.tif 000010
【００２５】
−物理化学的性状−
前記構造式（２）で表される化合物の物理化学的性状としては、以下のとおりである。
（１）分子式は、Ｃ２２Ｈ２５ＦＮ２Ｏ２で表される。分子量は、３６８．４４である。
（２）プロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）は、４００ＭＨｚにおいて重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）中で２５℃にて測定した。プロトン核磁気共鳴スペクトルとしては、図９に示す通りである。
【００２６】
＜＜製造方法＞＞
前記一般式（Ｖ）で表される化合物の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成による方法などが挙げられる。
以下に、前記構造式（２）で表される化合物を例に挙げ、前記一般式（Ｖ）で表される化合物の製造方法の一例を説明する。
【００２７】
前記構造式（２）で表される化合物を化学合成による得る方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、出発物質として下記４−クロロ−２−フルオロアニリンを用い、中間体を経て製造する方法などが挙げられる。
前記４−クロロ−２−フルオロアニリンを用いて、前記構造式（２）で表される化合物を製造する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下記に示すように、中間体を８つ経る方法などが挙げられる。
【００２８】
前記中間体としては、例えば、第１にＮ−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）アセトアミド（以下、「中間体２−１」と称することがある。）、第２にＮ−（４−クロロ−２−フルオロ−３−ホルミルフェニル）アセトアミド（以下、「中間体２−２」と称することがある。）、第３に（Ｅ）−エチル−３−（３−アセトアミド−６−クロロ−２−フルオロフェニル）アクリレート（以下、「中間体２−３」と称することがある。）、第４に（Ｅ）−３−（３−アセトアミド−６−クロロ−２−フルオロフェニル）アクリル酸（以下、「中間体２−４」と称することがある。）、第５に３−（３−アセトアミド−２−フルオロフェニル）プロパン酸（以下、「中間体２−５」と称することがある。）、第６にＮ−（４−フルオロ−１−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−イル）アセトアミド（以下、「中間体２−６」と称することがある。）、第７に５−アミノ−４−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−オン（以下、「中間体２−７」と称することがある。）、第８に５−（ベンジルアミノ）−４−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−オン（以下、「中間体２−８」と称することがある。）などが挙げられる。
前記中間体２−１〜２−８を得る方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成による方法などが挙げられる。また、市販品を用いてもよい。
【００２９】
【化９】
2012073375.tif 000011
【００３０】
前記一般式（Ｖ）で表される化合物、及び前記中間体２−１〜２−８を化学合成する際の、反応温度、反応時間、合成方法、及び化合物の使用量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記化学合成に用いる各化合物の状態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液体の状態、固体の状態、乾燥した状態、油状物の状態、再結晶化した状態などが挙げられる。
【００３１】
前記中間体を確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プロトン核磁気共鳴分光法、質量分析法、炭素１３核磁気共鳴分光法、赤外分光法、高速液体クロマトグラフィー法等で分析する方法などが挙げられる。
【００３２】
また、前記化学合成により得た生成物は、必要に応じて精製することができる。
前記精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、順層系又は逆層系充填剤を使用したカラム、ｐｒｅｐ−ＴＬＣ、ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣなどの方法を用いることができる。
【００３３】
＜一般式（ＶＩ）で表される化合物＞
前記一般式（ＶＩ）で表される化合物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、下記構造式（３）及び下記構造式（４）のいずれかで表される化合物が好ましい。
【化１０】
2012073375.tif 000012
【化１１】
2012073375.tif 000013
【００３４】
−物理化学的性状−
前記構造式（３）で表される化合物の物理化学的性状としては、以下のとおりである。
（１）分子式は、Ｃ２３Ｈ２８Ｎ２Ｏで表される。分子量は、３４８．４８である。
（２）プロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）は、４００ＭＨｚにおいて重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）中で２５℃にて測定した。プロトン核磁気共鳴スペクトルとしては、図１１に示す通りである。
【００３５】
前記構造式（４）で表される化合物の物理化学的性状としては、以下のとおりである。
（１）分子式は、Ｃ２１Ｈ２４Ｎ２Ｏで表される。分子量は、３２０．４３である。
（２）プロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）は、４００ＭＨｚにおいて重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）中で２５℃にて測定した。プロトン核磁気共鳴スペクトルとしては、図１２に示す通りである。
【００３６】
＜＜製造方法＞＞
前記一般式（ＶＩ）で表される化合物の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成による方法などが挙げられる。
以下に、前記構造式（３）及び前記構造式（４）で表される化合物を例に挙げ、前記一般式（ＶＩ）で表される化合物の製造方法の一例を説明する。
【００３７】
前記構造式（３）及び前記構造式（４）で表される化合物を化学合成による得る方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、出発物質として下記ブロモベンゼンを用い、中間体を経て製造する方法などが挙げられる。
前記ブロモベンゼンを用いて、前記構造式（３）及び前記構造式（４）で表される化合物を製造する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下記に示すように、中間体を１０個経る方法などが挙げられる。
【００３８】
前記中間体としては、例えば、第１にフェニルリチウム（以下、「中間体３−１」と称することがある。）、第２に３−フェニルブタン酸（以下、「中間体３−２」と称することがある。）、第３に３−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−オン（以下、「中間体３−３」と称することがある。）、第４に３−メチル−６−ニトロ−２，３−ジヒドロ−１−Ｈ−インデン−１−オン（以下、「中間体３−４」と称することがある。）、第５に６−アミノ−３−メチル−２，３−ジヒドロ−１−Ｈ−インデン−１−オン（以下、「中間体３−５」と称することがある。）、第６にＮ−（１−メチル−３−オキソ−インダン−５−イル）ベンズアミド（以下、「中間体３−６」と称することがある。）、第７に［ベンジル−（１−メチル−３−オキソ−インダン−５−イル）−アミノ]酢酸エチルエステル（以下、「中間体３−７」と称することがある。）、第８に［ベンジル−（３−ヒドロキシ−１−メチル−インダン−５−イル）−アミノ］酢酸エチルエステル（以下、「中間体３−８」と称することがある。）、第９に［ベンジル−（３−ヒドロキシ−１−Ｈ−インダン−５−イル）−アミノ］酢酸エチルエステル（以下、「中間体３−９」と称することがある。）、第１０に［ベンジル−（３−ヒドロキシ−１−Ｈ−インダン−５−イル）−アミノ］酢酸エチルエステル（以下、「中間体３−１０」と称することがある。）などが挙げられる。
前記中間体３−１〜３−１０を得る方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成による方法などが挙げられる。また、市販品を用いてもよい。
【化１２】
2012073375.tif 000014
【００３９】
前記一般式（ＶＩ）で表される化合物、及び前記中間体３−１〜３−１０を化学合成する際の、反応温度、反応時間、合成方法、及び化合物の使用量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記化学合成に用いる各化合物の状態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液体の状態、固体の状態、乾燥した状態、油状物の状態、再結晶化した状態などが挙げられる。
【００４０】
前記中間体を確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プロトン核磁気共鳴分光法、質量分析法、炭素１３核磁気共鳴分光法、赤外分光法、高速液体クロマトグラフィー法等で分析する方法などが挙げられる。
【００４１】
また、前記化学合成により得た生成物は、必要に応じて精製することができる。
前記精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、順層系又は逆層系充填剤を使用したカラム、ｐｒｅｐ−ＴＬＣ、ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣなどの方法を用いることができる。
【００４２】
（キネシンスピンドルタンパク質阻害剤）
キネシンスピンドルタンパク質阻害剤は、前記一般式（Ｉ）で表される化合物を含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
【００４３】
＜一般式（Ｉ）で表される化合物＞
前記キネシンスピンドルタンパク質阻害剤中の前記一般式（Ｉ）で表される化合物は、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記キネシンスピンドルタンパク質阻害剤における前記一般式（Ｉ）で表される化合物の含有量としては、キネシンスピンドルタンパク質の活性を阻害することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記キネシンスピンドルタンパク質阻害剤は、前記一般式（Ｉ）で表される化合物そのものであってもよい。
【００４４】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、薬理学的に許容される担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬理学的に許容される担体などが挙げられる。
【００４５】
＜剤型＞
前記キネシンスピンドルタンパク質阻害剤の剤型としては、特に制限はなく、例えば、固形剤、半固形剤、液剤などが挙げられる。
【００４６】
−固形剤−
前記固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内容剤として用いられる場合、例えば、錠剤、チュアブル錠、発泡錠、口腔内崩壊錠、トローチ剤、ドロップ剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、ドライシロップ剤、浸剤などが挙げられる。
前記固形剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、坐剤、パップ剤、プラスター剤などが挙げられる。
【００４７】
−半固形剤−
前記半固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、舐剤、チューインガム剤、ホイップ剤、ゼリー剤などが挙げられる。
前記半固形剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ムース剤、インヘラー剤、ナザールジェル剤などが挙げられる。
【００４８】
−液剤−
前記液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、シロップ剤、ドリンク剤、懸濁剤、酒精剤などが挙げられる。
前記液剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、液剤、点眼剤、エアゾール剤、噴霧剤などが挙げられる。
【００４９】
（キネシンスピンドルタンパク質の阻害方法）
キネシンスピンドルタンパク質の活性は、前記キネシンスピンドルタンパク質阻害剤と細胞とを接触させることにより阻害することができる。
【００５０】
＜キネシンスピンドルタンパク質阻害剤＞
前記キネシンスピンドルタンパク質阻害剤の使用量としては、前記細胞におけるキネシンスピンドルタンパク質の活性を阻害することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記キネシンスピンドルタンパク質阻害剤は、１種単独で使用してもよく、他のキネシンスピンドルタンパク質阻害剤と併用してもよい。
【００５１】
＜細胞＞
前記細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、生体内の細胞、培養細胞などが挙げられる。
【００５２】
−生体内の細胞−
前記キネシンスピンドルタンパク質阻害剤と、前記生体内の細胞とを接触させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記キネシンスピンドルタンパク質阻害剤を動物等の投与対象に投与する方法などが挙げられる。
前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられる。
【００５３】
前記投与方法としては、特に制限はなく、キネシンスピンドルタンパク質の活性を阻害したい部位などに応じて適宜選択することができ、例えば、局所投与法、径腸投与法、非経口投与法などが挙げられる。
前記局所投与法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、皮膚上投与法、吸入投与法、注投与法、結膜上への点眼、経鼻投与法、膣内投与法などが挙げられる。
前記径腸投与法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与法、径管栄養法、注腸投与法などが挙げられる。
前記非経口投与法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、径静脈投与法、径動脈投与法、筋肉内投与法、心臓内投与法、皮下投与法、骨内投与法、皮内投与法、くも膜下投与法、腹腔内投与法、膀胱内投与法、径皮投与法、径粘膜投与法、吸入投与法、硬膜外投与法、硝子体内投与法などが挙げられる。
【００５４】
前記キネシンスピンドルタンパク質阻害剤の投与量としては、特に制限はなく投与対象となる個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
【００５５】
−培養細胞−
前記培養細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記培養細胞は、公知の培養細胞株であってもよく、動物から採取した初代培養細胞、又は前記初代培養細胞を継代培養した細胞であってもよい。
前記培養細胞の細胞数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５６】
前記キネシンスピンドルタンパク質阻害剤と、前記培養細胞とを接触させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記キネシンスピンドルタンパク質阻害剤を、前記培養細胞を培養中の培地に添加する方法などが挙げられる。
前記キネシンスピンドルタンパク質阻害剤の添加量としては、特に制限はなく、培養細胞の細胞数などに応じて適宜選択することができる。
【００５７】
（医薬組成物、予防乃至治療方法）
医薬組成物は、前記キネシンスピンドルタンパク質阻害剤を含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
前記医薬組成物を用いることにより、少なくとも一部にキネシンスピンドルタンパク質が介在する障害を予防乃至治療することができる。
【００５８】
＜医薬組成物＞
＜＜キネシンスピンドルタンパク質阻害剤＞＞
前記医薬組成物における、前記キネシンスピンドルタンパク質阻害剤の含有量としては、前記障害を予防乃至治療することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記キネシンスピンドルタンパク質阻害剤は、１種単独で含有されていてもよく、２種以上が含有されていてもよい。また、前記医薬組成物は、前記キネシンスピンドルタンパク質阻害剤そのものであってもよい。
【００５９】
＜＜その他の成分＞＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬理学的に許容される担体、他の成分を有効成分とする薬剤などが挙げられる。
前記医薬組成物中の、その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６０】
−薬理学的に許容される担体−
前記薬理学的に許容される担体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、清涼剤、殺菌剤、保存剤、粘結剤、増粘剤、固着剤、結合剤、着色剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等調化剤、溶剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、結晶析出防止剤、消泡剤、物性向上剤、防腐剤などが挙げられる。
【００６１】
前記粘結剤、増粘剤、固着剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、澱粉、デキストリン、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、プルラン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、グアーガム、ローカストビーンガム、アラビアゴム、キサンタンガム、ゼラチン、カゼイン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、エチレン・プロピレンブロックポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００６２】
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００６３】
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
【００６４】
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。
【００６５】
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００６６】
前記等張化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。
【００６７】
−他の成分を有効成分とする薬剤−
前記他の成分を有効成分とする薬剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ガンの治療乃至予防に用いられる薬剤が好ましい。
前記ガンの治療乃至予防に用いられる薬剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）、アクチノマイシンＤ、アクラルビシン、アザシチジン、アスパラギナーゼ、アセグラトン、アナストロゾール、アミノグルテチミド、アムサクリン、アレムツズマブ、アロプリノール、アントラサイクリン、アンドロゲン、アンドロゲン  ビカルタミド、抗アンドロゲン、イブリツモマブ、イホスファミド、イマチニブ、イリノテカン、インターフェロン、インターフェロンアルファ、インターロイキン−２、ウベニメクス、エキセメスタン、エストラムスチン、エストロゲン、エトポシド、エノシタビン、エピルビシン、オキサリプラチン、オクトレオチド、カルボコン、カルボプラチン、カルムスチン、カルモフール、クラドリビン、クラリスロマイシン、クレスチン（ＰＳＫ）、クロラムブシル、ケトコナゾール、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、ゴセレリン、サリドマイド、シクロホスファミド、シスプラチン、シゾフィラン、シタラビン、シプロヘプタジン、ジノスタチンスチマラマー、ストレプトゾシン、スラミン、ソブゾキサン、タモキシフェン、タルグレチン、ダウノルビシン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、チオグアニン、チオテパ、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、テニポシド、デキサメタゾン、デニロイキンジフチトクス、トポテカン、トラスツズマブ、トリプトレリン、トレチノイン、トレミフェン、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、ドセタキセル、ニムスチン、ネオカルチノスタチン、ネダプラチン、バルルビシン、パクリタキセル、ヒドロキシウレア、ヒドロキシカルバミド、ビカルタミド、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、ピシバニール、ピラルビシン、ファドロゾール、フルオロウラシル、フルタミド、フルダラビン、フルベストラント、フロクスウリジン、ブスルファン、ブレオマイシン、プリカマイシン、プレドニゾン、プロカルバジン、プロカルバジン、ペプロマイシン、ペメトレキセド、ペントスタチン、ポルフィマーナトリウム、マイトマイシン、ミトキサントロン、ミトタン、メクロレタミン、メスナ、メチセルジド、メトトレキサート、メドロキシプロゲステロン、メラシン、メルカプトプリン、メルファラン、ラニムスチン、リツキシマブ、リュープロライド、レトロゾール、レバミゾール、レンチナン、ロイコボリン、ロムスチン、三酸化ヒ酸、酢酸メゲストロール、放射性ヨウ素−１３１、放射性リン等を有効成分とする薬剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００６８】
＜＜使用＞＞
前記医薬組成物は、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。また、医薬組成物は、他の成分を有効性分とする医薬と併せて使用されてもよく、他の成分を有効成分とする医薬に配合された状態で使用されてもよい。
【００６９】
＜＜キネシンスピンドルタンパク質が介在する障害＞＞
前記障害としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、細胞増殖性疾患であることが好ましく、ガン疾患であることがより好ましい。
前記ガン疾患としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、肺ガン、気管支ガン、前立腺ガン、乳ガン、膵臓ガン、結腸ガン、直腸ガン、小腸ガン、甲状腺ガン、食道ガン、口腔ガン、咽頭ガン、喉頭ガン、胃ガン、肝臓ガン、肝内胆管ガン、腎臓ガン、腎盂ガン、膀胱ガン、子宮体ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、結膜ガン、涙腺ガン、眼瞼ガン、多発性骨髄腫、脳腫瘍、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、繊毛性結腸腺腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ性白血病、骨髄性白血病などが挙げられる。
【００７０】
＜予防乃至治療方法＞
前記少なくとも一部にキネシンスピンドルタンパク質が介在する障害を予防乃至治療する方法としては、前記医薬組成物を用いる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
例えば、前記障害の発症前又は発症後の投与対象に前記医薬組成物を投与する方法などが挙げられる。
【００７１】
前記投与量、投与対象、投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記投与対象となる動物種としては、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられる。
前記投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記キネシンスピンドルタンパク質阻害剤の投与方法と同様の方法などが挙げられる。
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
【実施例】
【００７２】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら制限されるものではない。【００７３】
（製造例１：構造式（１）で表される化合物の合成）
＜化合物２の合成＞
下記反応式で示すとおり、２−フルオロ安息香酸（１０ｇ、７１ｍｍｏｌ）と塩化チオニル（ＳＯＣｌ２；９ｍＬ）混合液を４０度で３０分反応し溶媒を留去し精製することなく次行程に使用した。
【化１３】
2012073375.tif 000015
【００７４】
＜化合物３の合成＞
下記反応式で示すとおり、化合物２の粗生成物を塩化メチレン５０ｍｌに溶かし氷冷下塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ３；１３ｇ、９．７ｍｍｏｌ）及び塩化ナトリウム（ＮａＣｌ；６ｇ、１０ｍｍｏｌ）を加え、攪拌下エチレンガスを２時間導入した。反応液に１００ｇの氷を加え濾過を３０ｍｌのエーテルで３回抽出し１００ｍｌの飽和食塩水で洗った。無水硫酸ナトリウムで乾燥し濾液を濃縮しｎーヘキサンと酢酸エチルを用いて１００ｇのシリカゲルカラムで精製すると目的化合物３を得た（２．５ｇ、収率：２３％）。
【化１４】
2012073375.tif 000016
【００７５】
＜化合物４の合成＞
下記反応式で示すとおり、化合物３（１９ｇ、１２７ｍｍｏｌ）、及びトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ；１４ｇ、１３８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ；１００ｍＬ）混合液に、氷冷下ｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシラン（ＴＢＳＣｌ）（２１ｇ、１４０ｍｍｏｌ）を加えた。次に、混合液を１時間還流下で攪拌した。反応液を濃縮し残渣を得た後、該残渣をエーテル（１５０ｍＬ）に溶解させた。得られた濾液を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮することにより化合物４の粗生成物を得た。該粗生成物は、精製は行わずに次工程に使用した。
【化１５】
2012073375.tif 000017
＜化合物５の合成＞
下記反応式で示すとおり、化合物４の粗生成物（３２ｇをアセトニトリル（２５０ｍＬ）に溶かし、ヨウ化メチル（ＭｅＩ；４４ｇ、３１０ｍｍｏｌ）及びリチウムヘキサメチルジシラジド（ＬｉＨＭＤＳ；ｇ、３１０ｍｍｏｌ）の２９％のテトラハイドロフラン溶液（２００ｍＬ）を加え、２時間還流した。この反応液に氷水２００ｍｌを加え１００ｍＬの酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機相を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮することにより化合物５の粗生成物を得た。該粗生成物は、精製は行わずに次工程に使用した。
【化１６】
2012073375.tif 000018
【００７６】
＜化合物６の合成＞
下記反応式で示すとおり、化合物５の粗生成物（２０．４ｇ、７７ｍｍｏｌ）のテトラハイドロフラン（２５０ｍＬ）混合液に、セシウムフロライド（１０ｇ、６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間攪拌した。テトラハイドロフランを減圧で１００ｍｌまで濃縮し１００ｍＬの酢酸エチルと氷水１００ｍｌを加えて酢酸１００ｍｌで３回抽出した。合わせた有機相を、飽和食塩水１００ｍｌで洗い無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮することにより化合物６を得た（１２ｇ、収率：５３％）。
【化１７】
2012073375.tif 000019
【００７７】
＜化合物７の合成＞
下記反応式で示すとおり、化合物６（１２ｇ、６７ｍｍｏｌ）に、硝酸カリウム（ＫＮＯ３；８ｇ、８１ｍｍｏｌ）の硫酸（２０ｍＬ）混合液を添加し、氷冷下１時間、更に室温２時間攪拌した。この反応液に２００ｍＬの氷水を加え酢酸エチル１００ｍｌで３回抽出した。合わせた有機相を、飽和食塩水で洗い無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮することにより化合物７ａ（５ｇ、収率：３３％）及び７ｂ（４ｇ、収率：２７％）を得た。
【化１８】
2012073375.tif 000020
【００７８】
＜化合物８の合成＞
下記反応式で示すとおり、化合物７ａ（５ｇ、２２ｍｍｏｌ）及び水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４；１ｇ、２６ｍｍｏｌ）のエタノール（５０ｍＬ）混合液を、室温１時間攪拌した。この混合液に水１００ｍｌを加え１００ｍＬの酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機相を、飽和食塩水１００ｍｌで洗い無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮することにより化合物８の粗生成物を得た。該粗生成物は、精製は行わずに次工程に使用した。
【化１９】
2012073375.tif 000021
【００７９】
＜化合物９の合成＞
下記反応式で示すとおり、化合物８（３ｇ、１３ｍｍｏｌ）及びｐ−トリスルホン酸触媒（ＴｓＯＨ（ｃａｔ）；２００ｍｇ）をトルエン３０ｍｌに溶かし３時間還流した。この反応液のトルエンを濃縮後水３０ｍｌを加えて３０ｍＬの酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機相を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮することにより化合物９を得た（２．５ｇ、収率：９０％）。
【化２０】
2012073375.tif 000022
【００８０】
＜化合物１０の合成＞
下記反応式で示すとおり、化合物９（２．５ｇ、１２ｍｍｏｌ）と塩化スズ（ＳｎＣｌ２；５．７ｇ、３０ｍｍｏｌ）に、塩酸（ＨＣｌ；１５．５ｍＬ）及びを室温にて添加し、その後６０度で２時間攪拌した。この反応液に氷水５０ｍＬを加え酢酸エチル３０ｍｌで３回抽出した。合わせた有機相を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮することにより化合物１０を得た（１．５ｇ、収率：７１％）。
【化２１】
2012073375.tif 000023
【００８１】
＜化合物１１の合成＞
下記反応式で示すとおり、化合物１０（５００ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）のジメチルフォルムアミド（７ｍＬ）混合液にトリエチルアミン３００ｍｇ（３０ｍＭ）とヨウ素酢酸ジエチルアミド（６４０ｍｇ、３０ｍｍｏｌ）を加え４０度で２時間攪拌した。この反応液に２０ｍｌの氷水を加え３０ｍＬの酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機相を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮することにより化合物１１を得た（１４０ｍｇ、収率：１７％）。
【化２２】
2012073375.tif 000024
【００８２】
＜構造式（１）で表される化合物の合成＞
下記反応式で示すとおり、化合物１１（１４０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（５ｍＬ）混合液にトリエチルアミン５０ｍｇ（０．５ｍＭ）とベンジルブロマイド８０ｍｇ（０．５ｍＭ）を加え６０度で２時間加熱した。この反応液に２０ｍｌの水を加え５ｍＬの酢酸エチルで３回抽出し溶媒を蒸去後、ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社製）で精製して生成物を得た（１５ｍｇ、収率：８．２％）。
【化２３】
2012073375.tif 000025
【００８３】
前記構造式（１）で表される化合物のプロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）は、４００ＭＨｚにおいて重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）中で２５℃にて測定した。プロトン核磁気共鳴スペクトルを図１に示す。
また、前記構造式（１）で表される化合物の高速液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ−ＭＳ：正イオンモード）による、実験値は、ｍ／ｚ３８１．２（Ｍ＋Ｈ）＋であり、Ｍの計算値は、ｍ／ｚ３８１．２３（Ｃ２４Ｈ３０ＦＮ２Ｏ）であった。分析結果を図２Ａに示す。図２Ａにおいて、上段は、ＬＣ（液体クロマトグラフィー）のクロマトグラフ像（縦軸：シグナル強度（ｍＡＵ）、横軸：測定時間（分間）であり、下段は、ＭＳ（質量分析）のクロマトグラフ像（縦軸：シグナル強度、横軸：測定時間（分間））である。また、図２Ｂにリテンションタイム３．１４２のピーク成分の質量分析の結果を示す。【００８４】
（製造例２：構造式（２）で表される化合物の合成）
＜Ｎ−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）アセトアミドの調製＞
下記反応式で示すとおり、４−クロロ−２−フルオロアニリン（２ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）の酢酸（２ｍＬ）混合液に、無水酢酸（Ａｃ２Ｏ；１．７ｍＬ）を数回に分けて室温（約２５℃）にて添加した。得られた反応混合液を２時間攪拌した。反応終了後、混合液をろ過し粗生成物を得た。次に、前記粗生成物をヘキサンで洗浄することにより、Ｎ−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）アセトアミドを得た（２．４ｇ、収率：９４％）。
このＮ−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）アセトアミドのプロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）は、４００ＭＨｚにおいて重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）中で２５℃にて測定した。プロトン核磁気共鳴スペクトルを図３に示す。
【化２４】
2012073375.tif 000026
【００８５】
＜Ｎ−（４−クロロ−２−フルオロ−３−ホルミルフェニル）アセトアミドの調製＞
下記反応式で示すとおり、Ｎ−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）アセトアミド（３０ｇ、０．１６ｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ；３００ｍＬ）溶液に、−７８℃でｎ−ブチルリチウム（ｎ−ＢｕＬｉ）のヘキサン溶液（１６６ｍＬ、０．３５ｍｏｌ）を数回に分けて添加した。得られた反応混合液を１時間攪拌した。次に、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；１０．５ｍＬ、０．１８ｍｏｌ）を−７８℃で混合液に添加し、更に０．５時間攪拌した。飽和塩化アンモニウムで反応を停止させた。有機相を分離し、乾燥させ、濃縮することにより粗生成物を得た後、該粗生成物を精製せずに次工程に使用した。
【化２５】
2012073375.tif 000027
【００８６】
＜（Ｅ）−エチル−３−（３−アセトアミド−６−クロロ−２−フルオロフェニル）アクリレートの調製＞
Ｎ−（４−クロロ−２−フルオロ−３−ホルミルフェニル）アセトアミドとエチル−２−（ジエトキシホスホリル）アセテート（３７．６ｇ、０．１７ｍｏｌ）とを含有するトルエン（５００ｍＬ）溶液に、水酸化ナトリウム（５．３ｇ、０．２２ｍｏｌ）を０℃で添加した。得られた溶液を室温（２５℃）にて２時間攪拌した。飽和塩化アンモニウムで反応を停止させ、３００ｍＬの酢酸エチルで３回抽出した。有機相を分離し、乾燥させ、濃縮することにより粗生成物を得た後、該粗生成物を精製せずに次工程に使用した。
【化２６】
2012073375.tif 000028
【００８７】
＜（Ｅ）−３−（３−アセトアミド−６−クロロ−２−フルオロフェニル）アクリル酸の調製＞
（Ｅ）−エチル−３−（３−アセトアミド−６−クロロ−２−フルオロフェニル）アクリレートと、メタノール（１５０ｍＬ）／テトラヒドロフラン（ＴＨＦ；１５０ｍＬ）混合溶液との混合液に、水酸化リチウム水溶液（１１．３ｇ、１５０ｍＬ、０．２７ｍｏｌ）を室温（２５℃）にて添加し、次に得られた溶液を２時間攪拌した。混合液を３０ｍＬの酢酸エチルで３回抽出した。水相のｐＨを塩化水素（１Ｍ）で１〜２に調整し、３０ｍＬの酢酸エチルで３回抽出した。
有機相を乾燥させ濃縮することにより、純粋な生成物である（Ｅ）−３−（３−アセトアミド−６−クロロ−２−フルオロフェニル）アクリル酸を得た（１５ｇ、収率：３７％）。なお、前記収率は、前記３ステップを経た収率である。
この（Ｅ）−３−（３−アセトアミド−６−クロロ−２−フルオロフェニル）アクリル酸のプロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）は、４００ＭＨｚにおいて重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）中で２５℃にて測定した。プロトン核磁気共鳴スペクトルを図４に示す。
【化２７】
2012073375.tif 000029
【００８８】
＜３−（３−アセトアミド−２−フルオロフェニル）プロパン酸の調製＞
下記反応式で示すとおり、（Ｅ）−３−（３−アセトアミド−６−クロロ−２−フルオロフェニル）アクリル酸（１５ｇ、０．０５８ｍｏｌ）、パラジウム炭素（Ｐｄ／Ｃ；１．５ｇ、５．８ｍｍｏｌ）、メタノール（１００ｍＬ）、及びトリエチルアミン（６．４ｇ、０．０６ｍｏｌ）の混合液を５０℃、１気圧（Ｈ２）の条件下で一晩攪拌した。混合液をろ過し濃縮することにより３−（３−アセトアミド−２−フルオロフェニル）プロパン酸を黄色固体として得た（１０ｇ、収率：７３％）。
この３−（３−アセトアミド−２−フルオロフェニル）プロパン酸のプロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）は、４００ＭＨｚにおいて重メタノール（ＭｅＯＤ）中で２５℃にて測定した。プロトン核磁気共鳴スペクトルを図５に示す。
【化２８】
2012073375.tif 000030
【００８９】
＜Ｎ−（４−フルオロ−１−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−イル）アセトアミドの調製＞
下記反応式で示すとおり、３−（３−アセトアミド−２−フルオロフェニル）プロパン酸（１０ｇ、０．０４ｍｍｏｌ）のポリリン酸溶液（ＰＰＡ；２０ｍＬ）溶液を１２０℃で２時間攪拌した。得られた混合液を４Ｎ水酸化ナトリウムで処理してｐＨを１０〜１２に調整し、１００ｍＬの酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮することによりＮ−（４−フルオロ−１−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−イル）アセトアミドを黄色固体として得た（３．０ｇ、収率：３８％）。
このＮ−（４−フルオロ−１−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−イル）アセトアミドのプロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）は、４００ＭＨｚにおいて重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）中で２５℃にて測定した。プロトン核磁気共鳴スペクトルを図６に示す。
【化２９】
2012073375.tif 000031
【００９０】
＜５−アミノ−４−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−オンの調製＞
下記反応式で示すとおり、Ｎ−（４−フルオロ−１−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−イル）アセトアミド（３ｇ、０．０１ｍｍｏｌ）の濃硫酸（２０ｍＬ）溶液を８０℃で０．５時間攪拌した。得られた混合液を４Ｎ水酸化ナトリウムで処理してｐＨを１０〜１２に調整し、１００ｍＬの酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮することにより５−アミノ−４−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−オンを得た（２．３ｇ、収率：９６％）。
この５−アミノ−４−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−オンのプロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）は、４００ＭＨｚにおいて重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）中で２５℃にて測定した。プロトン核磁気共鳴スペクトルを図７に示す。
【化３０】
2012073375.tif 000032
【００９１】
＜５−（ベンジルアミノ）−４−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−オンの調製＞
下記反応式で示すとおり、５−アミノ−４−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−オン（２．３ｇ、１４ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（Ｃｓ２ＣＯ３；１２ｇ、２８ｍｍｏｌ）、及び臭化ベンジル（０．１７ｇ、７２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ；２０ｍＬ）混合液を４８時間還流下で攪拌した。混合液を濃縮し残渣を得た後、該残渣を水（２０ｍＬ）に溶解させた。得られた溶液を２０ｍＬの酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮することにより粗生成物を得た後、該粗生成物をｐｒｅ−ＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ社製）で精製することにより、５−（ベンジルアミノ）−４−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−オンを黄色固体として得た（３７０ｍｇ、収率：１０％）。
この５−（ベンジルアミノ）−４−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−オンのプロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）は、４００ＭＨｚにおいて重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）中で２５℃にて測定した。プロトン核磁気共鳴スペクトルを図８に示す。
【化３１】
2012073375.tif 000033
【００９２】
＜構造式（２）で表される化合物の調製＞
下記反応式で示すとおり、５−（ベンジルアミノ）−４−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−オン（３７０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）及び炭酸セシウム（Ｃｓ２ＣＯ３；９４０ｍｇ、３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ；２０ｍＬ）混合液に、Ｎ，Ｎ−ジエチル−２−ヨードアセトアミド（７２３ｍｇ、３ｍｍｏｌ）を室温にて滴下した。次に、混合液を４８時間還流した。続いて混合液をろ過し、ろ液を濃縮することにより粗生成物を得た後、該粗生成物をｐｒｅ−ＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ社製）で精製することにより、構造式（２）で表される２−（ベンジル（４−フルオロ−１−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−イル）アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミドを黄色固体として得た（５ｍｇ、収率：１％）。
この２−（ベンジル（４−フルオロ−１−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−イル）アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミドのプロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）は、４００ＭＨｚにおいて重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）中で２５℃にて測定した。プロトン核磁気共鳴スペクトルを図９に示す。
【化３２】
2012073375.tif 000034
【００９３】
（製造例３：構造式（３）及び構造式（４）で表される化合物の合成）
＜３−フェニルブタン酸の調製＞
下記反応式で示すとおり、ブロモベンゼン（１６６ｇ、１．０７ｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ；５００ｍＬ）混合液に、ｎ−ブチルリチウム（ｎ−ＢｕＬｉ；４２８ｍＬ、１．０７ｍｏｌ）を−７８℃〜−６５℃で滴下し、次いで、−７８℃で０．５時間攪拌した。次に、（Ｅ）−２−ブテン酸（４６ｇ、０．５３ｍｏｌ）を前記混合液に滴下した。反応終了後、混合液を塩酸で処理してｐＨを１．０に調整し、続いて５００ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）で２回抽出した。合わせた有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ濃縮することにより粗生成物を得た後、該粗生成物をカラムクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ社製のシリカゲル３００ｇ）で精製し、３−フェニルブタン酸を黄色液体として得た（５２ｇ、収率：６０％）。
【化３３】
2012073375.tif 000035
【００９４】
＜３−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−オンの調製＞
下記反応式で示すとおり、３−フェニルブタン酸（３０ｇ、０．１８ｍｏｌ）の塩化チオニル（ＳＯＣｌ２；１００ｍＬ）混合液を２時間加熱還流した後、該塩化チオニルを除去した。トルエン（２００ｍＬ）と塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ３；２４ｇ、０．１８ｍｏｌ）を混合液に０℃で添加し、反応混合液を０℃で０．５時間攪拌し、次いで加熱還流した。反応終了後、混合液を氷水で処理し、続いて２００ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）で２回抽出した。合わせた有機相を水（１００ｍＬ）と飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ濃縮することにより粗生成物を得た後、該粗生成物をゲルカラムクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ社のシリカゲル１００ｇ）にてペンタン（ＰＥ）：酢酸エチル（２０：１（体積比））で溶出させて精製することにより、３−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−オンを褐色油状物として得た（１６ｇ、収率：６０％）。
【化３４】
2012073375.tif 000036
【００９５】
＜３−メチル−６−ニトロ−２，３−ジヒドロ−１−Ｈ−インデン−１−オンの調製＞
下記反応式で示すとおり、３−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−オン（９．０ｇ、０．０６ｍｏｌ）の硫酸（Ｈ２ＳＯ４；４０ｍＬ）混合液に、硝酸カリウム（ＫＮＯ２；６．２ｇ、０．０６ｍｏｌ）の硫酸（３０ｍＬ）溶液を０℃で滴下した。次に、該混合液を反応が終了するまで０℃で攪拌した。この反応により得られた混合液を氷水に添加し、ろ過した。ケーキを水で洗浄し１００ｇのシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ社製）にてペンタン（ＰＥ）：酢酸エチル（１０：１（体積比））で溶出させて精製することにより、３−メチル−６−ニトロ−２，３−ジヒドロ−１−Ｈ−インデン−１−オンを黄色固体として得た（８ｇ、収率：６９％）。
【化３５】
2012073375.tif 000037
【００９６】
＜６−アミノ−３−メチル−２，３−ジヒドロ−１−Ｈ−インデン−１−オンの調製＞
下記反応式で示すとおり、３−メチル−６−ニトロ−２，３−ジヒドロ−１−Ｈ−インデン−１−オン（５．０ｇ、０．０２６ｍｏｌ）、塩酸（ＨＣｌ；９０ｍＬ）及び水（Ｈ２Ｏ；３０ｍＬ）の混合液に、塩化スズ（ＳｎＣｌ２；２６．５ｇ、０．１１７ｍｏｌ）を室温にて添加し、反応混合液を４０℃で０．５時間攪拌した。反応終了後、混合液を飽和、無水炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３；３００ｍＬ）で処理し、続いて１００ｍＬのジクロロメタンで３回抽出した。合わせた有機相を濃縮することにより、６−アミノ−３−メチル−２，３−ジヒドロ−１−Ｈ−インデン−１−オンを得た（３．８ｇ、収率：９２％）。
【化３６】
2012073375.tif 000038
【００９７】
＜Ｎ−（１−メチル−３−オキソ−インダン−５−イル）ベンズアミドの調製＞
下記反応式で示すとおり、３−メチル−６−ニトロ−２，３−ジヒドロ−１−Ｈ−インデン−１−オン（７ｇ、０．０４３ｍｏｌ）及びトリエチルアミン（９．６ｇ、０．０９５ｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ；１００ｍＬ）混合液に、塩化ベンゾイル（ＰｈＣＯＣｌ；６．７ｇ、０．０４３ｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ；２０ｍＬ）溶液を０℃で添加し、反応混合液を２時間攪拌した。反応終了後、混合液を水（５０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム（５０ｍＬ）、及び飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、濃縮することにより粗生成物を得た後、該粗生成物を５０ｇのシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ社製）にてペンタン（ＰＥ）：酢酸エチル（１０：１（体積比））で溶出させて精製し、所望の生成物であるＮ−（１−メチル−３−オキソ−インダン−５−イル）ベンズアミドを黄色固体として得た（１０ｇ、収率：８７％）。
【化３７】
2012073375.tif 000039
【００９８】
＜［ベンジル−（１−メチル−３−オキソ−インダン−５−イル）−アミノ]酢酸エチルエステルの調製＞
下記反応式で示すとおり、Ｎ−（１−メチル−３−オキソ−インダン−５−イル）ベンズアミド（１０ｇ、０．０３７ｍｏｌ）及び無水炭酸カリウム（１０．４ｇ、０．０７５ｍｏｌ）のアセトニトリル（１５０ｍＬ）混合液に、ブロモ酢酸エチル（ＢｒＣＨ２ＣＯＯＥｔ；７．５ｇ、０．０４５ｍｏｌ）のアセトニトリル（２０ｍＬ）溶液を添加し、反応混合液を５時間還流した。反応終了後、混合液をろ過し、ろ液を濃縮することにより粗生成物として［ベンジル−（１−メチル−３−オキソ−インダン−５−イル）−アミノ］酢酸エチルエステルを黄色固体として得た（８ｇ、収率：６３％）。
【化３８】
2012073375.tif 000040
【００９９】
＜［ベンジル−（３−ヒドロキシ−１−メチル−インダン−５−イル）−アミノ］酢酸エチルエステルの調製＞
下記反応式で示すとおり、［ベンジル−（１−メチル−３−オキソ−インダン−５−イル）−アミノ］酢酸エチルエステル（４ｇ、０．０１１ｍｏｌ）とテトラヒドロフラン（ＴＨＦ；５０ｍＬ）との溶液に、ボラン（ＢＨ３）のメチルスルフィド（Ｍｅ２Ｓ；１．４ｍＬ、０．０１４ｍｏｌ）混合液を添加し、反応混合液を２時間還流した。ＢＨ３のＭｅ２Ｓ（１．４ｍＬ、０．０１４ｍｏｌ）混合液は、残留反応物が消失するまで数回に分けて添加した。メタノール（１０ｍＬ）にて０℃で反応を停止させた。得られた混合液を室温まで加温し０．５時間攪拌した。混合液を濃縮して粗生成物を得た後、該粗生成物を３０ｇのシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ社製）にてペンタン（ＰＥ）：酢酸エチル（５：１（体積比））で溶出させて精製し、所望の生成物である［ベンジル−（３−ヒドロキシ−１−メチル−インダン−５−イル）−アミノ］酢酸エチルエステルを得た（１．４ｇ、収率：３２％）。
【化３９】
2012073375.tif 000041
【０１００】
＜［ベンジル−（３−ヒドロキシ−１−Ｈ−インダン−５−イル）−アミノ］酢酸エチルエステルの調製＞
下記反応式で示すとおり、［ベンジル−（３−ヒドロキシ−１−メチル−インダン−５−イル）−アミノ］酢酸エチルエステル（２ｇ、５．９ｍｍｏｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸−水和物（Ｐ−ＴｓＯＨ．２Ｈ２Ｏ；０．１２ｇ、０．６ｍｍｏｌ）のトルエン（５０ｍＬ）混合液を２時間還流した。反応終了後、混合液を炭酸水素ナトリウムで処理し、続いて２０ｍＬの酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機相を、水（２０ｍＬ）と飽和食塩水（２０ｍＬ）とで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮することにより粗生成物として［ベンジル−（３−ヒドロキシ−１−Ｈ−インダン−５−イル）−アミノ］酢酸エチルエステルを得た（１．５ｇ、収率：７７％）。該粗生成物をｐｒｅｐ−ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社製）で精製し純粋な生成物を得た。
【化４０】
2012073375.tif 000042
【０１０１】
＜［ベンジル−（３−ヒドロキシ−１−Ｈ−インダン−５−イル）−アミノ］酢酸の調製＞
下記反応式で示すとおり、［ベンジル−（３−ヒドロキシ−１−Ｈ−インダン−５−イル）−アミノ］酢酸エチルエステル（０．５ｇ、０．００１６ｍｏｌ）、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ；０．１３ｇ、０．００３ｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ；７ｍＬ）、水（３ｍＬ）、及びメタノール（３ｍＬ）の混合液を、反応が終了するまで室温にて攪拌した。得られた混合液を塩酸で処理してｐＨを６．０に調整し、続いて３０ｍＬのジクロロメタンで抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水（２５ｍＬ）で洗浄し硫酸マグネシウムで乾燥させ濃縮することにより粗生成物として［ベンジル−（３−ヒドロキシ−１−Ｈ−インダン−５−イル）−アミノ］酢酸を得た（０．３２ｇ、７０％）。該粗生成物は、更なる精製は行わずに次工程に使用した。
この［ベンジル−（３−ヒドロキシ−１−Ｈ−インダン−５−イル）−アミノ］酢酸のプロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）は、４００ＭＨｚにおいて重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）中で２５℃にて測定した。プロトン核磁気共鳴スペクトルを図１０に示す。
【化４１】
2012073375.tif 000043
【０１０２】
＜構造式（３）で表される化合物及び構造式（４）で表される化合物の調製＞
下記反応式で示すとおり、［ベンジル−（３−ヒドロキシ−１−Ｈ−インダン−５−イル）−アミノ］酢酸（０．２ｇ、０．７ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．３８ｇ、１ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、トリエチルアミン（ＮＥｔ３；０．５ｇ、５ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン（１０ｍＬ）の混合液に、アミン（３．５ｍｍｏｌ）を２０℃で１時間添加した。次に、混合液を２０ｍＬの水で３回洗浄し、ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社製）で精製して生成物として、構造式（３）で表される化合物（４２ｍｇ、収率：１９％）及び構造式（４）で表される化合物（３５ｍｇ、収率：１４％）を得た。
なお、同様に、下記構造式（５）で表される化合物（５５ｍｇ、収率：２４％）及び下記構造式（６）で表される化合物（３９ｍｇ、収率：１７％）も得られたが、後述する実施例１では、構造式（３）で表される化合物及び構造式（４）で表される化合物を用いて試験を行った。
この構造式（３）で表される化合物及び構造式（４）で表される化合物のプロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）は、４００ＭＨｚにおいて重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）中で２５℃にて測定した。構造式（３）で表される化合物のプロトン核磁気共鳴スペクトルを図１１に、構造式（４）で表される化合物のプロトン核磁気共鳴スペクトルを図１２に示す。
【化４２】
2012073375.tif 000044
【０１０３】
（実施例１）
前記構造式（１）〜（４）で表される化合物のそれぞれのキネシンスピンドルタンパク質阻害活性を、Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｂ．  Ｃｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９９，  ２７１，  ｐ．２９−３５及びＫｅｉｔｈ  Ｗ．  Ｒｉｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，  ２００８，  ４６９，  ｐ．２２０−２３１に記載の方法を参照し、以下の方法で測定した。【０１０４】
＜キネシンスピンドルタンパク質の調製＞
−キネシンスピンドルタンパク質の発現−
ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）（インビトロジェン株式会社製）をＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地を用いて３７℃、２００ｒｐｍの条件で、１晩培養した。この培養物を２ＬのＬＢ培地に添加し６００ｎｍにおけるＯＤを０．０１とした。次いで、３７℃、２００ｒｐｍの条件で、６００ｎｍにおけるＯＤが０．４となる細胞密度になるまで培養した。
キネシンスピンドルタンパク質の発現は、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加することにより誘導し、ＩＰＴＧによる誘導開始から３時間後に、４℃、７，０００ｇで１５分間遠心分離を行うことにより細胞を回収した。このリコンビナントキネシンスピンドルタンパク質を発現する細胞は、１ｇ／パックとして、使用時まで−８０℃で保存した。【０１０５】
−キネシンスピンドルタンパク質の精製−
リコンビナントキネシンスピンドルタンパク質を発現するウェット細胞２ｇを氷冷したタンパク質抽出バッファー（下記に組成を示す。）５０ｍＬに懸濁した。マイクロフルイダイザー（ＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＺＥＲ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社製）を用いて、４℃にて１５，０００ｐｓｉの圧力で細胞を３回処理し溶解させた。次いで、高機能高速冷却遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ａｖａｎｔｉ  Ｊ−２６ＸＰ、ベックマンコールター社製）を用いて、４℃にて２０，０００×ｇで３０分間遠心分離を行った後、上清を回収し、続いて該上清を０．４５μＭフィルターでろ過した。【０１０６】
ろ液を１ｍＬ  ＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社製）に充填した。Ａ２８０がベースラインに達するまで、このカラムに、Ｈｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（下記に組成を示す。）とＨｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ（下記に組成を示す。）（Ｈｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ：Ｈｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ＝９５：５（体積比））を流した。Ｈｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂを、Ｈｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒ  Ａに対して０体積％〜５０体積％のリニアグラジエントで流してリコンビナントキネシンスピンドルタンパク質を溶出させた。
キネシンスピンドルタンパク質のピークは、２５体積％のＢｕｆｆｅｒ  Ｂ（２５０ｍＭイミダゾール）で観測された。この粗キネシンスピンドルタンパク質画分（４ｍＬ）を透析チューブ（Ｔｉｎｇ  Ｋｅ  Ｈｏｎｇ  Ｄａ（中国製））に入れ、４℃で、５００ｍＬのＩＥＸ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（下記に組成を示す。）で透析した。この透析は２回行った。【０１０７】
次いで、更なる精製をイオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィーにて行った。キネシンスピンドルタンパク質の画分を１ｍＬ  ＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＳＰＸＬカラム（ＧＥヘルスケア社製）に充填した。Ａ２８０がベースラインに達するまで、このカラムにＩＥＸ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａを流し、続いてｐＨ６．８のＩＥＸ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ及びＩＥＸ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ（下記に組成を示す。）を用いて塩化ナトリウムの濃度について０Ｍ〜１Ｍのリニアグラジエントで流した。
キネシンスピンドルタンパク質は、塩化ナトリウムの濃度が約４００ｍＭのときに溶出され、この画分を透析により保存用バッファー（下記に組成を示す。）に移した。透析の方法は、１回目の精製と同様の方法で行った。【０１０８】
最終的に精製したキネシンスピンドルタンパク質の濃度を、紫外吸収法により測定した。精製したキネシンスピンドルタンパク質の濃度は１．５μＭであった。これを１００μＬ／チューブ（総量１．４５ｍＬ）に分けて使用時まで−８０℃で保存した。【０１０９】
［タンパク質抽出バッファーの組成］
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（４−（２−ハイドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルフォン酸）（ｐＨ８．０）
２ｍＭ  塩化マグネシウム
２５０ｍＭ  塩化ナトリウム
１０質量％  グリセロール
０．１質量％  ＮＰ−４０（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル）
１ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）
１ｍＭ  フェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）
０．５ｍＭ  ＡＴＰ−Ｍｇ
１０ｍＭ  イミダゾール
２ｍＭ  Ｂｅｎｚｉｍｉｄｉｎｅ
［Ｈｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒ  Ａの組成］
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）
２ｍＭ  塩化マグネシウム
２５０ｍＭ  塩化ナトリウム
１０質量％  グリセロール
［Ｈｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂの組成］
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）
２ｍＭ  塩化マグネシウム
２５０ｍＭ  塩化ナトリウム
１０質量％  グリセロール
１Ｍ  イミダゾール
［ＩＥＸ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａの組成］
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）
１ｍＭ  塩化マグネシウム
１ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）
１０質量％  グリセロール
［ＩＥＸ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂの組成］
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）
１ｍＭ  塩化マグネシウム
１ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）
１０質量％  グリセロール
１Ｍ  塩化ナトリウム
［保存用バッファー］
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）
１ｍＭ  塩化マグネシウム
１ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）
１０質量％  グリセロール【０１１０】
＜キネシンスピンドルタンパク質阻害活性の測定＞
−構造式（１）〜（４）で表される化合物の調製−
前記構造式（１）〜（４）で表される化合物は、それぞれ１００質量％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）中に１００倍濃度（１００×）で調製した。次いで、１００質量％ＤＭＳＯで０．００１ｍＭ、０．００３．ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．０３ｍＭ、０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、１ｍＭ、３ｍＭ、１０ｍＭ、３０ｍＭとなるように希釈した。【０１１１】
−キネシンスピンドルタンパク質阻害活性の測定方法−
下記表１に示す反応液を調製した。即ち、水２８．５μＬと、前記精製したキネシンスピンドルタンパク質（１．５μＭ）１μＬと、１０×反応バッファー（１５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ（１，４−ピペラジンジエタンスルフォン酸）（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ（グリコールエーテルジアミン四酢酸））５μＬと、５×微小管溶液（３３０μｇ／ｍＬ微小管、１５ｍＭ  ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０μＭタキソール）１０μＬと、前記調製した１００×化合物（構造式（１）で表される化合物、構造式（２）で表される化合物、構造式（３）で表される化合物、又は構造式（４）で表される化合物）０．５μＬとを混合して４５μＬの反応液を調製し、３７℃で１０分間インキュベートした後、１０×ＡＴＰ溶液（１０ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０））５μＬを添加して反応を開始させ、直ちに３７℃で２０分間インキュベートした。なお、前記反応液５０μＬ中の終濃度は、１９ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１．２ｍＭ塩化マグネシウム、２μＭタキソール、６６μｇ／ｍＬ微小管、３０ｎＭキネシンスピンドルタンパク質、１ｍＭ  ＡＴＰとなる。
また、ハイコントロールは、前記反応液において、１００×化合物に代えて１００質量％ＤＭＳＯのみを用いたこと以外は、前記反応液と同様の方法で調製し、同様の方法で反応させた。
また、ローコントロールは、前記反応液において、キネシンスピンドルタンパク質１μＬに代えて水１μＬを添加したこと以外は、前記反応液と同様の方法で調製し、同様の方法で反応させた。【０１１２】
【表１】
2012073375.tif 000045
【０１１３】
反応後、１５０μＬのＱｕｅｎｃｈ  Ｃバッファー（下記に組成を示す。）を添加して反応を停止させて、続いて室温で５分間インキュベートした。５２５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダ（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）で測定した。
［Ｑｕｅｎｃｈ  Ｃの組成］
１００μＬのＱｕｅｎｃｈ  Ａ（１ｍｇ／ｍＬキナルジンレッド（ＱＲ）、０．１４質量％ＰＶＡ）と５０μＬのＱｕｅｎｃｈ  Ｂ（１．１５Ｍ硫酸、１２．３ｍＭ七モリブデン酸アンモニウム）とを混合した。なお、Ｑｕｅｎｃｈ  Ｃバッファーは、試験前に用時調製したものを用いた。【０１１４】
キネシンスピンドルタンパク質は、ＡＴＰをＡＤＰとＰｉ（リン酸）に分解する。分解して生成されたＰｉは、キナルジンレッド（ＱＲ）及び七モリブデン酸アンモニウムと結合して複合体を形成する。このため、５２５ｎｍにおける吸光度を測定することによりＰｉの生成量を測定することができる。したがって、前記ハイコントロールの５２５ｎｍにおける吸光度の値（Ｐｉの生成量）を１００としたとき、該ハイコントロールの吸光度の値と、前記化合物を添加した試験区の吸光度の値とを比較することで、キネシンスピンドルタンパク質の活性が阻害されているか否かを判断することができる。
即ち、キネシンスピンドルタンパク質の活性阻害率は、以下の計算式より算出することができる。前記各化合物の濃度と、キネシンスピンドルタンパク質活性の阻害率との関係を下記表２に示す。
阻害率（％）＝（Ｓ−Ｌ）／（Ｈ−Ｌ）×１００
上記計算式において、「Ｓ」は、前記構造式（１）で表される化合物、前記構造式（２）で表される化合物、前記構造式（３）で表される化合物、又は前記構造式（４）で表される化合物を添加した反応液で試験した吸光度の値、「Ｌ」は、ローコントロールの吸光度の値、「Ｈ」は、ハイコントロールの吸光度の値を表わす。【０１１５】
【表２】
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【０１１６】
表２の結果より、前記構造式（１）で表される化合物、前記構造式（２）で表される化合物、前記構造式（３）で表される化合物、及び前記構造式（４）で表される化合物は、それぞれ好適にキネシンスピンドルタンパク質の活性を阻害できることがわかった。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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