(57)【要約】本発明は、細菌の増殖を抑制し、且つ、肉芽組織形成又は上皮化を促進する組織再生用材料を提供することを目的とする。本発明は、人工タンパク質ポリマー（Ａ）からなる組織再生用材料であって、（Ａ）が、ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）のうちいずれか１種のアミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）並びに／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、（Ａ）中の（Ｙ）と（Ｙ’）との合計個数が１〜１００個であり、（Ａ）の疎水性度が０．２〜１．２である組織再生用材料である。ポリペプチド鎖（Ｙ’）：（Ｙ）中の１〜１００個のアミノ酸がリシン及び／又はアルギニンで置換されているポリペプチド鎖。
2012111438.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工タンパク質ポリマー（Ａ）からなる組織再生用材料であって、
（Ａ）が、ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）のうちいずれか１種のアミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）並びに／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、
（Ａ）中の（Ｙ）と（Ｙ’）との合計個数が１〜１００個であり、
（Ａ）の疎水性度が０．２〜１．２である組織再生用材料。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：（Ｙ）中の１〜１００個のアミノ酸がリシン及び／又はアルギニンで置換されているポリペプチド鎖。
【請求項２】
人工タンパク質ポリマー（Ａ）が、さらにＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜５０個連続して結合したポリペプチド鎖（Ｓ）を有する請求項１に記載の組織再生用材料。
【請求項３】
人工タンパク質ポリマー（Ａ）１分子中の、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）とアミノ酸配列（Ｘ）及び下記アミノ酸配列（Ｘ’）の合計との配列の数の比率（配列（１）：アミノ酸配列（Ｘ）及び（Ｘ’）の合計）が、１：２〜１：２０である請求項２に記載の組織再生用材料。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）の１〜５個のアミノ酸がリシン及び／又はアルギニンで置換されているアミノ酸配列。
【請求項４】
人工タンパク質ポリマー（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法による分子量が１５〜２００ｋＤａである請求項１〜３のいずれかに記載の組織再生用材料。
【請求項５】
人工タンパク質ポリマー（Ａ）が、アミノ酸配列（Ｘ）がＧＶＧＶＰ配列（３）であるポリペプチド鎖（Ｙ１）中の１個のアミノ酸がリシンで置換されたポリペプチド鎖（Ｙ’１）を有する人工タンパク質ポリマー（Ａ１）である請求項１〜４のいずれかに記載の組織再生用材料。
【請求項６】
人工タンパク質ポリマー（Ａ）が、（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（９）であるポリペプチド鎖（Ｓ１−１）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（８）であるポリペプチド鎖（Ｙ’１）を有する人工タンパク質ポリマー（Ａ１１）である請求項２〜５のいずれかに記載の組織再生用材料。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の組織再生用材料及び水を含有するタンパク質水溶液であって、タンパク質水溶液中の組織再生用材料の含有量が５〜３０重量％、水の含有量が７０〜９５重量％であるタンパク質水溶液。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の組織再生用材料及び水を混合し、４〜６０℃にして組織再生用材料をゲル化させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織再生用材料、これを含むタンパク質水溶液及びこれをゲル化させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
熱傷、採皮創、皮膚剥削創及び外傷性皮膚欠損創等の疾患ないし創傷による患部を保護するために、患部に一時的に適応される創傷被覆材として、従来、ガーゼ及び脱脂綿等が用いられている。これらは、滲出液の吸収が早い反面、細菌に感染しやすく、創面が乾燥してしまうと取り外す際に痛みや出血等を伴うという問題がある。また、創面を乾燥させないために、創傷被覆材と軟膏等を併用することも行われているが、滲出液の吸収が不充分となり、創面が過度に湿った状態になってしまう問題がある。
また、ガーゼ及び脱脂綿等に代わり、創面が広範囲にわたる場合に適用されるものとして、人工材料の被覆膜（シリコーン製ガーゼ、シリコーンゴム、ベロアー状の表面構造を有するナイロン及びポリテトラフルオロエチレン等の合成樹脂シート）が知られている。しかしながら、人工材料の被覆膜は、患部との密着性が悪い、水蒸気透過性が低い、ひび割れしやすい等の種々の問題がある。
また、患部を保護するだけでなく、肉芽組織形成や上皮化を促進する組織再生用材料として、コラーゲンスポンジ（特許文献１）が知られている。コラーゲンスポンジは生体適合性が良いなどの特徴を有するものの、細菌に感染しやすい、細菌が増殖しやすい、滲出液により劣化する、及び材料が入手困難である等の問題がある。細菌に感染しやすいという問題を解決するために、抗菌剤を用いて創傷部を殺菌した後に、生体由来材料の被覆膜を使用することも知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平１０−０８０４３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、創傷部に抗菌剤を使用すると、正常な組織を傷つけてしまい肉芽組織形成や上皮化の遅延が起こる問題がある。
本発明は、細菌の増殖を抑制し、且つ、肉芽組織形成又は上皮化を促進する組織再生用材料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の組織再生用材料は、人工タンパク質ポリマー（Ａ）からなる組織再生用材料であって、（Ａ）が、ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）のうちいずれか１種のアミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）並びに／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、（Ａ）中の（Ｙ）と（Ｙ’）との合計個数が１〜１００個であり、（Ａ）の疎水性度が０．２〜１．２である組織再生用材料である。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：（Ｙ）中の１〜１００個のアミノ酸がリシン及び／又はアルギニンで置換されているポリペプチド鎖。
【発明の効果】
【０００６】
本願発明の組織再生用材料は、菌増殖抑制作用があり、且つ、肉芽組織形成又は上皮化促進作用に優れているという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】評価１において、実施例１の組織再生用材料を用いた病理標本（ＨＥ染色）の組織断片の写真である。
【図２】評価１において、比較例１の組織再生用材料を用いた病理標本（ＨＥ染色）の組織断片の写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明において、人工タンパク質ポリマー（Ａ）は、動物由来成分を排除するために、人工的に製造されるものであり、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等によって製造できる。有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。有機合成法及び遺伝子組み換え法とも、人工タンパク質ポリマー（Ａ）を作製できるが、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
【０００９】
本発明において、人工タンパク質ポリマー（Ａ）は、ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）のうちいずれか１種のアミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）並びに／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、（Ａ）中の（Ｙ）と（Ｙ’）との合計個数が１〜１００個であり、（Ａ）の疎水性度が０．２〜１．２である人工タンパク質ポリマーである。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：（Ｙ）中の１〜１００個のアミノ酸がリシン及び／又はアルギニンで置換されているポリペプチド鎖。
【００１０】
人工タンパク質ポリマー（Ａ）は、ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）のうちいずれか１種のアミノ酸配列（Ｘ）を有していればいいが、ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群から選ばれる２種以上の（Ｘ）を有していてもいい。２種以上の（Ｘ）を有している場合は、それぞれの種類の（Ｘ）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖を（Ｙ）とする。２種以上の（Ｘ）を有するタンパク質ポリマー（Ａ）として、具体的には、ポリペプチド鎖（Ｙ）が（ＶＰＧＶＧ）ｂ配列、（ＧＶＧＶＰ）ｃ配列、（ＧＰＰ）ｄ配列、（ＧＡＰ）ｅ配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）ｆ配列から選ばれる２種以上の配列である人工タンパク質ポリマー（Ａ）である（なお、ｂ〜ｆは、それぞれ、アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数であり、２〜２００の整数である）。
【００１１】
アミノ酸配列（Ｘ）としては、細胞親和性の観点から、ＶＰＧＶＧ配列（２）又はＧＶＧＶＰ配列（３）が好ましい。つまり、細胞親和性の観点から、（Ａ）が、ポリペプチド鎖（Ｙ）として（ＶＰＧＶＧ）ｂ配列を有するもの又はポリペプチド鎖（Ｙ）として（ＧＶＧＶＰ）ｃ配列を有するものが好ましい。
アミノ酸配列（Ｘ）として、ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群から選ばれる２種以上の配列を有する場合、細胞親和性の観点から、ＧＰＰ配列、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）から選ばれる２種以上の配列であることが好ましく、特に好ましくはＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）である。
【００１２】
また、人工タンパク質ポリマー（Ａ）中にアミノ酸配列（Ｘ）が同種類のポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、上記（Ｘ）の連続する個数は、（Ｙ）ごとに同一でも異なっていてもよい。すなわち、上記ｂ〜ｆが同じポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよく、（Ｘ）の連続する個数ｂ〜ｆが異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもいい。
【００１３】
ポリペプチド鎖（Ｙ）は、アミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連続した（上記ｂ〜ｆが２〜２００）配列であるが、肉芽組織形成を促進させるという観点から、連続する個数は２〜５０個（上記ｂ〜ｆが２〜５０）が好ましく、さらに好ましくは２〜３０個（上記ｂ〜ｆが２〜３０）である。
【００１４】
本発明において、（Ａ）は、アミノ酸配列（Ｘ）中の１〜５個のアミノ酸がリシン及び／又はアルギニンで置換されているアミノ酸配列（Ｘ’）を有するものであってもいい。アミノ酸配列（Ｘ’）において、アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸の置換の数（リシン及び／又はアルギニンで置換される数）は、親水性（水への溶解性）の観点から、１〜４が好ましく、さらに好ましくは１〜３である。
アミノ酸配列（Ｘ’）として、親水性の観点から、ＧＫＧＶＰ配列（１３）、ＧＫＧＫＰ配列（１４）、ＧＫＧＲＰ配列（１５）及びＧＲＧＲＰ配列（１６）から選ばれる１種以上の配列であることが好ましく、さらに好ましくはＧＫＧＶＰ配列（１３）及びＧＫＧＫＰ配列（１４）である。
【００１５】
ポリペプチド鎖（Ｙ’）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）が、一部アミノ酸配列（Ｘ’）に置換され、ポリペプチド（Ｙ）中の１〜１００個のアミノ酸がＫ（リシン）及び／又はＲ（アルギニン）で置換されたものとなったポリペプチド鎖である。ポリペプチド鎖（Ｙ’）であるかどうかは、人工タンパク質ポリマー（Ａ）の配列中の全てのＫ及びＲを、他のアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ又はＨ）に置きかえたときに、ポリペプチド鎖（Ｙ）となるかによって判断する。
（Ｙ’）において、（Ｙ）中の置換されるアミノ酸の数は、水への溶解性の観点から、１〜７０個が好ましく、さらに好ましくは１〜３０個である。
【００１６】
人工タンパク質ポリマー（Ａ）中に、（Ｘ）の種類及び／又は連続する個数が異なる（Ｙ）を有している場合は、それぞれを１個として数え、（Ｙ）の個数はその合計である。（Ｙ’）も同様である。
【００１７】
人工タンパク質ポリマー（Ａ）は、（Ａ）１分子中にポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を合計１〜１００個有するが、肉芽組織形成を促進させるという観点から、１〜８０個が好ましく、特に好ましくは１〜６０個である。
【００１８】
本発明において、（Ａ）の疎水性度は０．２〜１．２であり、（Ａ）の溶解性及びゲル化する観点から、０．３〜１．１が好ましく、さらに好ましくは０．４〜１．０であり、特に好ましくは０．５〜１．０である。
（Ａ）の疎水性度は、（Ａ）分子の疎水性の度合いを示すものであり、（Ａ）分子を構成するそれぞれのアミノ酸の数（Ｍα）、それぞれのアミノ酸の疎水性度（Ｎα）及び（Ａ）１分子中のアミノ酸の総数を、下記数式に当てはめることにより算出することができる。なお、それぞれのアミノ酸の疎水性度は、非特許文献（レ−ニンジャ−の新生化学  上，ｐ．３４６−３４７）に下記の数値が記載されている。
疎水性度＝Σ（Ｍα×Ｎα）／（ＭＴ）
Ｍα：（Ａ）１分子中のそれぞれのアミノ酸の数
Ｎα：各アミノ酸の疎水性度
ＭＴ：（Ａ）１分子中のアミノ酸の総数
Ａ（アラニン）：１．８
Ｒ（アルギニン）：−４．５
Ｎ（アスパラギン）：−３．５
Ｄ（アスパラギン酸）：−３．５
Ｃ（システイン）：２．５
Ｑ（グルタミン）：−３．５
Ｅ（グルタミン酸）：−３．５
Ｇ（グリシン）：−０．４
Ｈ（ヒスチジン）：−３．２
Ｉ（イソロイシン）：４．５
Ｌ（ロイシン）：３．８
Ｋ（リシン）：−３．９
Ｍ（メチオニン）：１．９
Ｆ（フェニルアラニン）：２．８
Ｐ（プロリン）：−１．６
Ｓ（セリン）：−０．８
Ｔ（トレオニン）：−０．７
Ｗ（トリプトファン）：−０．９
Ｙ（チロシン）：−１．３
Ｖ（バリン）：４．２
例えば、（Ａ）が（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（８）である場合、（Ａ）の疎水性度＝｛１６（Ｇの数）×（−０．４）＋１５（Ｖの数）×４．２＋８（Ｐの数）×（−１．６）＋１（Ｋの数）×（−３．９）｝／４０（アミノ酸の総数）＝１．００である。
【００１９】
本発明においては、人工タンパク質ポリマー（Ａ）が上記ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を有していることで、細胞親和性が高く、肉芽組織形成及び上皮化促進効果が優れた組織再生用材料となる。また、上記ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、且つ（Ａ）の疎水性度が上記範囲内であることにより、組織再生用材料である人工タンパク質ポリマー（Ａ）を水に溶解することができ、また、この水溶液をゲル化することができる。さらに、この水溶液がゲル化することで、組織再生用材料として用いた際に、組織再生用材料が創傷部に密着し、細菌の増殖を抑制することができる。
【００２０】
本発明において、人工タンパク質ポリマー（Ａ）は、さらにＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有していてもいい。（Ａ）がＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有している場合、（Ａ）がゲル化する観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜１００個連続して結合したポリペプチド鎖（Ｓ）を有していることが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｓ）において、配列（１）が連続する数は、ゲル化する観点から、２〜１００個が好ましく、より好ましくは２〜５０個であり、さらに好ましくは３〜４０個であり、特に好ましくは４〜３０個である。
（Ａ）において、ポリペプチド鎖（Ｓ）を有する際、（Ａ）１分子中に（Ｓ）を１つ有すればよいが、ゲル化する観点から、１〜２０個が好ましく、さらに好ましくは３〜１０個である。
【００２１】
人工タンパク質ポリマー（Ａ）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）及びポリペプチド鎖（Ｓ）を合計２個以上有する場合は、ポリペプチド鎖とポリペプチド鎖との間に、介在アミノ酸配列（Ｚ）を有していてもいい。（Ｚ）は、アミノ酸１個、アミノ酸配列（Ｘ）１個又はアミノ酸が２個以上結合したペプチド配列である。（Ｚ）を構成するアミノ酸の数は、細胞親和性の観点から、１〜３０個が好ましく、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個である。（Ｚ）として、具体的には、ＶＡＡＧＹ配列（５）、ＧＡＡＧＹ配列（６）及びＬＧＰ配列等が挙げられる。
【００２２】
人工タンパク質ポリマー（Ａ）中の両末端の各ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）及びポリペプチド鎖（Ｓ）のＮ及び／又はＣ末端には、末端アミノ酸配列（Ｔ）を有していてもいい。（Ｔ）は、アミノ酸１個、アミノ酸配列（Ｘ）１個又はアミノ酸が２個以上結合したペプチド配列である。（Ｔ）を構成するアミノ酸の数は、細胞親和性の観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜５０個、特に好ましくは１〜４０個である。（Ｔ）として、具体的には、ＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭ配列（７）等が挙げられる。
【００２３】
人工タンパク質ポリマー（Ａ）は、上記（Ｔ）以外に、発現させた（Ａ）の精製または検出を容易にするために、（Ａ）のＮ及び／又はＣ末端に特殊なアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド（以下これらを「精製タグ」と称する）を有してもいい。精製タグとしては、アフィニティー精製用のタグが利用される。そのような精製タグとしては、ポリヒスチジンからなる６×Ｈｉｓタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＡＵ１タグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＤＤＤＤＫタグ、Ｓタグ、ＣｒｕｚＴａｇ０９ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ２２ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ４１ＴＭ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｈａ．１１タグ及びＫＴ３タグ等がある。
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ−１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ）  （ｉｉ−１）グルタチオン
（ｉ−２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）  （ｉｉ−２）アミロース
（ｉ−３）ＨＱタグ  （ｉｉ−３）ニッケル
（ｉ−４）Ｍｙｃタグ  （ｉｉ−４）抗Ｍｙｃ抗体
（ｉ−５）ＨＡタグ  （ｉｉ−５）抗ＨＡ抗体
（ｉ−６）ＦＬＡＧタグ  （ｉｉ−６）抗ＦＬＡＧ抗体
（ｉ−７）６×Ｈｉｓタグ  （ｉｉ−７）ニッケル又はコバルト
前記精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおける人工タンパク質ポリマー（Ａ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。
【００２４】
人工タンパク質ポリマー（Ａ）１分子中のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量（重量％）は、肉芽組織形成を促進させるという観点から、（Ａ）の分子量を基準として１０〜８０重量％が好ましく、さらに好ましくは１５〜７５重量％である。
【００２５】
人工タンパク質ポリマー（Ａ）中のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求めることができる。
＜アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の含有量の測定法＞
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法から２種類以上を用いて、人工タンパク質ポリマー（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、人工タンパク質ポリマー（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量を測定する。
アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量（％）＝［｛アミノ酸配列（Ｘ）の分子量｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝＋｛アミノ酸配列（Ｘ’）の分子量｝×｛アミノ酸配列（Ｘ’）の数｝］／｛（Ａ）の分子量｝×１００
【００２６】
タンパク質ポリマー（Ａ）１分子中の、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）とアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）との配列の数の比率（ＧＡＧＡＧＳ配列（１）：アミノ酸配列（Ｘ）及び（Ｘ’）の合計）は、ゲル化する観点から、１：２〜１：２０が好ましく、さらに好ましくは１：２〜１：１０である。
【００２７】
人工タンパク質ポリマー（Ａ）の分子量は、菌増殖抑制の観点から、１５〜２００ｋＤａが好ましく、さらに好ましくは１５〜１００ｋＤａである。
なお、人工タンパク質ポリマー（Ａ）の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、測定サンプルを分離し、泳動距離を標準物質と比較する方法によって求められる。
【００２８】
人工タンパク質ポリマー（Ａ）は、上記のポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を有していることにより、（Ａ）を後述するタンパク質水溶液（Ｂ）とした際に、熱等の刺激により（Ｂ）の流動性が低くなるものがある。人工タンパク質ポリマー（Ａ）１分子中のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量（重量％）が多ければ、（Ａ）が刺激により流動性が低くなる可能性が高くなり、（Ｘ）及び（Ｘ’）の合計含有量が５０重量％以上であれば非常に高い。
また、疎水性度が低すぎると、親水性が高くなりゲル化せず、また疎水性度が高すぎると、水に溶解してタンパク質水溶液とすることができない。
また、（Ａ）がポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、疎水性度が０．２〜１．２であればゲル化するが、（Ａ）がＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有していると、（Ａ）のゲル化能がさらに高くなる。特に、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）とアミノ酸配列（Ｘ）及び（Ｘ’）との比が１：２〜１：２０であることで、さらに高くなる。
熱等の刺激により（Ｂ）がゲル化し、流動性が低くなれば、（Ｂ）を患部に投与した際に流出しにくくなり、また菌増殖抑制の効果が高くなる。
【００２９】
上記刺激として熱を加えた場合、後述するタンパク質水溶液（Ｂ）の温度としては、人工タンパク質ポリマー（Ａ）の熱安定性の観点から、２５〜８０℃が好ましく、さらに好ましくは２５〜５０℃、特に好ましくは３０〜４０℃である。
【００３０】
好ましい人工タンパク質ポリマー（Ａ）の一部を以下に例示する。
（１）アミノ酸配列（Ｘ）がＧＶＧＶＰ配列（３）の人工タンパク質ポリマー
（１−１）ＧＶＧＶＰ配列（３）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）中の１個のアミノ酸がＫ（リシン）で置換されたポリペプチド鎖（Ｙ’１）を有する人工タンパク質ポリマー（Ａ１）であり、さらに好ましくは、（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（８）であるポリペプチド鎖（Ｙ’１１）及び（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（９）であるポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を有する人工タンパク質ポリマー（Ａ１１）、ポリペプチド鎖（Ｙ’１１）及び（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１０）であるポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を有する人工タンパク質ポリマー（Ａ１２）、並びにポリペプチド鎖（Ｙ’１１）、ポリペプチド鎖（Ｓ１−１）及びポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を有する人工タンパク質ポリマー（Ａ１３）である。
具体的には、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（９）のポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を１２個及びＧＶＧＶＰ配列（３）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１１）中のＶ（バリン）のうち１個がＫ（リシン）に置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（８）（Ｙ’１１）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１０）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）１個が化学結合した構造を有する分子質量が約８０ｋＤａの配列（１１）の人工タンパク質ポリマー（ＳＥＬＰ８Ｋポリマー、疎水性度０．６１８）；ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１０）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（８）のポリペプチド鎖（Ｙ’１１）をそれぞれ１７個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約８２ｋＤａの配列（１２）の人工タンパク質ポリマー（ＳＥＬＰ０Ｋポリマー、疎水性度０．７１８）等である。
（１−２）ＧＶＧＶＰ配列（３）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ２）を有する人工タンパク質ポリマー（Ａ２）であり、さらに好ましくは、ＧＶＧＶＰ配列（３）が２個連続したポリペプチド鎖（Ｙ２１）及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）が６個連続したポリペプチド鎖（Ｓ２−１）を有する人工タンパク質ポリマー（Ａ２１）であり、具体的には、ポリペプチド鎖（Ｙ２１）とポリペプチド鎖（Ｓ２−１）が結合したアミノ酸ブロック（Ｌ−１）が２９個繰り返し化学結合した構造を有する分子質量が約９３ｋＤａの配列（１８）の人工タンパク質ポリマー（ＳＬＰ４．１ポリマー、疎水性度０．４７）である。
（１−３）ＧＶＧＶＰ配列（３）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）中の２個のアミノ酸がＫ（リシン）で置換されたポリペプチド鎖（Ｙ’３）を有する人工タンパク質ポリマー（Ａ３）であり、さらに好ましくは、ＧＫＧＶＰ配列（１３）が２個連続したポリペプチド鎖（Ｙ’３１）、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が６個結合したポリペプチド鎖（Ｓ２−１）及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）が１０個結合したポリペプチド鎖（Ｓ２−２）を有する人工タンパク質ポリマー（Ａ３１）である。
具体的には、ポリペプチド鎖（Ｓ２−１）にポリペプチド鎖（Ｙ’３１）が結合し、さらにポリペプチド鎖（Ｓ２−２）が結合したアミノ酸ブロック（Ｌ−２）が１０個繰り返し化学結合した構造を有する分子質量が約７３ｋＤａの配列（２６）の人工タンパク質ポリマー（ＳＬＰ４．２ポリマー、疎水性度０．２）等である。
【００３１】
（２）アミノ酸配列（Ｘ）がＶＰＧＶＧ配列（２）の人工タンパク質ポリマー
（２−１）ＶＰＧＶＧ配列（２）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ４）を有する人工タンパク質ポリマー（Ａ４）であり、具体的には、ＶＰＧＶＧ配列（２）が１６０個連続したポリペプチド鎖（Ｙ４１）を有する分子質量が約６５ｋＤａの配列（２１）の人工タンパク質ポリマー（ＥＬＰ１、疎水性度１．２）である。
（２−２）ＶＰＧＶＧ配列（２）が４個連続したポリペプチド鎖（Ｙ５−１）及びＶＰＧＶＧ配列（２）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ５−２）を有する人工タンパク質ポリマー（Ａ５）であり、さらに好ましくは、ＶＰＧＶＧ配列（２）が４個連続したポリペプチド鎖（Ｙ５−１）、ＶＰＧＶＧ配列（２）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ５−２）及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有する人工タンパク質ポリマー（Ａ５１）であり、具体的には、ポリペプチド鎖（Ｙ５−１）にＧＡＧＡＧＳ配列（１）が結合し、さらにポリペプチド鎖（Ｙ５−２）が結合したアミノ酸ブロック（Ｌ−３）が４０個繰り返し化学結合した構造を有する分子質量が約２２０ｋＤａの配列（１７）の人工タンパク質ポリマー（ＥＬＰ１．１ポリマー、疎水性度１．１２）である。
【００３２】
本発明の組織再生用材料は、上記人工タンパク質ポリマー（Ａ）からなるものである。組織再生用材料の患部への適用方法としては、下記の方法が挙げられる。
（１）本発明の組織再生用材料及び水を所定量含む後述するタンパク質水溶液（Ｂ）を４〜２５℃で作製する。（Ｂ）は必要により無機塩及び／又はリン酸（塩）を含んでもよい。また、（Ｂ）は必要により患部に投与する直前に温めてもよい。
（２）患部に（Ｂ）を投与する。
（３）投与後、（Ｂ）が患部から流出しないように、適当なドレッシングで被覆する。
【００３３】
タンパク質水溶液（Ｂ）中の各成分の量は、後述する本発明のタンパク質水溶液（Ｂ）と同様であり、好ましい範囲も同様である。
また、（Ｂ）を温める温度として、好ましい温度は、後述する本発明の（Ａ）をゲル化させる方法と同様である。
【００３４】
患部への投与方法としては、患部を被覆できれば特に制限はないが、肉芽組織形成及び上皮化促進の観点から、患部の欠損部分を埋めるように注入することが好ましい。
【００３５】
上記（３）で使用するドレッシングの材質としては、特に限定されないが、ポリウレタン、シリコーン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリエチレン、エチレン酢酸ビニル共重合体及びナイロン等が挙げられる。
ドレッシングの形状としては、（Ｂ）を投与後に、（Ｂ）が患部から流出しないように被覆できれば制限なく使用できるが、フィルム状が好ましい。
【００３６】
本発明の組織再生用材料は、動物由来の血清等が含まれていないので、抗原性が低いと推察される。また、人工タンパク質ポリマー（Ａ）は生物由来配列を有するので、生体適合性が高いと推察される。さらに、人工タンパク質ポリマー（Ａ）は大腸菌等の細菌により、安価に大量生産できるので、組織再生用材料を容易に入手できる。
【００３７】
本発明のタンパク質水溶液（Ｂ）は、組織再生用材料及び水を含有するタンパク質水溶液であって、タンパク質水溶液中の組織再生用材料の含有量が５〜３０重量％、水の含有量が７０〜９５量％であるタンパク質水溶液である。
タンパク質水溶液（Ｂ）中の組織再生用材料の含有量（重量％）は、創傷治癒の観点から、タンパク質水溶液（Ｂ）の重量を基準として１０〜３０重量％が好ましく、さらに好ましくは１５〜３０重量％である。
【００３８】
タンパク質水溶液（Ｂ）中の水としては、滅菌されたものであれば特に限定するものではなく、滅菌方法としては、０．２μｍ以下の孔径を持つ精密ろ過膜を通した水、限外ろ過膜を通した水、逆浸透膜を通した水及びオートクレーブで１２１℃において２０分加熱して過熱滅菌したイオン交換水等が挙げられる。
タンパク質水溶液（Ｂ）中の水の含有量（重量％）はタンパク質ポリマー溶解性の観点から、タンパク質水溶液（Ｂ）の重量を基準として７０〜９０重量％が好ましく、さらに好ましくは７０〜８５重量％である。
【００３９】
タンパク質水溶液（Ｂ）中には、上記組織再生用材料及び水以外に無機塩及びリン酸（塩）を含んでもいい。
無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム及び炭酸水素マグネシウム等が挙げられる。リン酸塩は無機塩に含まない。
タンパク質水溶液（Ｂ）中の塩の含有量（重量％）は、人間の体液と同等にするという観点から、タンパク質水溶液（Ｂ）の重量を基準として０．５〜１．３重量％が好ましく、さらに好ましくは０．７〜１．１重量％、特に好ましくは０．８５〜０．９５重量％である。
【００４０】
リン酸（塩）は、リン酸及び／又はリン酸塩を意味する。
タンパク質水溶液（Ｂ）中のリン酸（塩）としては、リン酸及びリン酸塩が挙げられる。
塩としては、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられ、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等が挙げられる。
タンパク質水溶液（Ｂ）中のリン酸（塩）の含有量（重量％）は、創傷治癒の観点から、タンパク質水溶液（Ｂ）の重量を基準として０．１０〜０．３０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１２〜０．２８重量％、特に好ましくは０．１４〜０．２６重量％である。
【００４１】
タンパク質水溶液（Ｂ）のｐＨは、組織親和性の観点から、５〜９が好ましく、さらに好ましくは６〜８である。
【００４２】
本発明のタンパク質水溶液は、菌増殖抑制作用があり、かつ、肉芽組織形成作用や上皮化促進作用に優れている上記組織再生用材料を含んでいるので、熱傷、採皮創、皮膚剥削創及び外傷性皮膚欠損創等の疾患ないし創傷による患部の肉芽組織形成や上皮化の促進に有効であり、創傷部の被覆材や充填材として利用できる。
【００４３】
本発明の組織再生用材料をゲル化させる方法は、組織再生用材料及び水を混合して組織再生用材料をゲル化させる方法である。
組織再生用材料は水と混合してタンパク質水溶液（Ｂ）とすることにより、室温（４〜２５℃）でも流動性が低くなりゲル化するが、短時間でゲル化させる観点から、タンパク質水溶液（Ｂ）を２５℃を超えて８０℃以下の温度に温めてもいい。８０℃以下であると、組織再生用材料の機能を低下させずにゲル化させることができ、また、ゲル化までの時間が適度である。
また、タンパク質水溶液（Ｂ）の温度は、組織再生用材料の熱安定性及びハンドリング性の観点から、４〜８０℃が好ましく、より好ましくは４〜６０℃、さらに好ましくは２５〜５０℃、特に好ましくは３０〜４０℃である。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００４５】
＜製造例１＞
○ＳＥＬＰ８Ｋポリマーの生産
特許第４０８８３４１号公報の実施例記載の方法に準じて、ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５を作製した。
作製したプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションし、ＳＥＬＰ８Ｋ生産株を得た。以下、このＳＥＬＰ８Ｋ生産株を用いてＳＥＬＰ８Ｋポリマーを生産する方法を示す。
３０℃で生育させたＳＥＬＰ８Ｋ生産株の一夜培養液を使用して、２５０ｍｌフラスコ中のＬＢ培地５０ｍｌに接種した。カナマイシンを最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように加え、該培養液を３０℃で攪拌しながら（２００ｒｐｍ）インキュベートした。培養液がＯＤ６００＝０．８（吸光度計ＵＶ１７００：島津製作所製を使用）となった時に、４０ｍｌを４２℃に前もって温めたフラスコに移し、同じ温度で約２時間インキュベートした。該培養体を氷上で冷却し、培養液のＯＤ６００を測定した。大腸菌を遠心分離で集めた。集菌した大腸菌からタンパク質ポリマーを取り出すために、超音波破砕（４℃、３０秒×１０回）をして溶菌した。
この大腸菌により産生されたタンパク質ポリマーを、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した後、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜にトランスファーした。その後、一次抗体に抗ラビットＳＥＬＰ８Ｋ抗体、２次抗体に抗ラビットＩｇＧ−ＨＲＰ標識抗体（ＧＥヘルスケア社製）を用いたウエスタンブロット分析を行なった。該生成物の見かけ分子量は約８０ｋＤａであった。よってＳＥＬＰ８Ｋ生産株は、見かけ分子質量８０，０００の抗ラビットＳＥＬＰ８Ｋ抗体反応性を有するＳＥＬＰ８Ｋポリマーを生成したことが分かった。【００４６】
○ＳＥＬＰ８Ｋポリマー精製
上記で得たＳＥＬＰ８Ｋポリマーを、菌体溶解、遠心分離による不溶性細片の除去、及びアフィニティークロマトグラフィーにより大腸菌バイオマスから精製した。このようにして、分子量が約８０ｋＤａの人工タンパク質ポリマーであるＳＥＬＰ８Ｋポリマー（Ａ−１）を得た。実施例１においては、このＳＥＬＰ８Ｋポリマー（Ａ−１）を組織再生用材料として用いた。【００４７】
○ＳＥＬＰ８Ｋポリマーの同定
得られたＳＥＬＰ８Ｋポリマー（Ａ−１）を下記の手順で同定した。
抗ラビットＳＥＬＰ８Ｋ抗体及びＣ末端配列の６×Ｈｉｓタグに対する抗ラビット６×Ｈｉｓ抗体（Ｒｏｌａｎｄ社製）を用いたウエスタンブロットにより分析した。見かけ分子質量８０，０００のタンパク質バンドが、各抗体に抗体反応性を示した。また得られたタンパク質をアミノ分析供した結果、該生成物が、グリシン（４３．７％），アラニン（１２．３％），セリン（５．３％），プロリン（１１．７％）及びバリン（２１．２％）に富むものであった。また、該生成物はリシンを１．５％含んでいた。下記の表１は、精製された生成物の組成と、合成遺伝子配列から推測された予測理論組成との相関関係を示す。
したがって、ＳＥＬＰ８Ｋポリマー（Ａ−１）がＧＶＧＶＰ配列（３）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）であり、（Ｙ）中のＶのうち１個がＫに置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（８）（Ｙ’１１）を１３個及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（９）のポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を１２個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１０）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）が化学結合した配列（１１）の人工タンパク質ポリマーであることを確認した。【００４８】
【表１】
2012111438.tif 000003
【００４９】
＜製造例２＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＳＥＬＰ０ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３６４」を用いる以外は同様にして、分子質量が約８２ｋＤａの配列（１２）の人工タンパク質ポリマー（Ａ−２）を得た。【００５０】
＜製造例３＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＥＬＰ１．１をコードしたプラスミドｐＰＴ０１０２−１」を用いる以外は同様にして、分子質量が約２２０ｋＤａの配列（１７）の人工タンパク質ポリマー（Ａ−３）を得た。【００５１】
＜製造例４＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＳＬＰ４．１をコードしたｐＳＹ１３９８−１」を用いる以外は同様にして、分子質量が約９３ｋＤａの配列（１８）の人工タンパク質ポリマー（Ａ−４）を得た。【００５２】
＜製造例５＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＥＬＰ１をコードしたプラスミドｐＰＴ０１０２」を用いる以外は同様にして、分子質量が約６５ｋＤａの配列（２１）の人工タンパク質ポリマー（Ａ−５）を得た。【００５３】
＜製造例６＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＳＬＰ４．２をコードしたｐＳＹ１３９８−２」を用いる以外は同様にして、分子質量が約７３ｋＤａの配列（２３）の人工タンパク質ポリマー（Ａ−６）を得た。【００５４】
＜製造例７＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＳＬＰ４をコードしたｐＳＹ１３９８」を用いる以外は同様にして、分子質量が約７０ｋＤａの配列（１９）の人工タンパク質ポリマー（Ａ’−１）を得た。【００５５】
＜製造例８＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＣＬＰ３．７をコードしたｐＰＴ０３１２」を用いる以外は同様にして、分子質量が約６６ｋＤａの配列（２０）の人工タンパク質ポリマー（Ａ’−２）を得た。【００５６】
＜製造例９＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＤＣＰ２をコードしたプラスミドｐＰＴ０１６１」を用いる以外は同様にして、分子質量が約８０ｋＤａの配列（２２）の人工タンパク質ポリマー（Ａ’−３）を得た。【００５７】
＜製造例１０＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＥＬＰ１．２をコードしたプラスミドｐＰＴ０１０２−２」を用いる以外は同様にして、分子質量が約３７ｋＤａの配列（２４）の人工タンパク質ポリマー（Ａ’−４）を得た。【００５８】
＜ゲル化の可否の測定＞
プラスティックチューブ容器中に、製造例１〜１０で得た人工タンパク質ポリマー（Ａ−１）〜（Ａ−６）及び（Ａ’−１）〜（Ａ’−４）２０ｍｇを、８０μＬの４℃のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）にそれぞれ溶解し、タンパク質水溶液（Ｂ１）〜（Ｂ１０）を作製した。このタンパク質水溶液を３７℃で静置し、２時間後及び４時間後にゲル化したかを確認した。ゲル化したかの確認は、タンパク質水溶液が入ったプラスティックチューブ容器を転倒し、溶液が垂れない場合はゲル化しているとし、溶液が垂れる場合はゲル化しないと判断した。結果を表２に示す。なお、表中、タンパク質水溶液がゲル化したものを○、ゲル化しなかったものを×とした。【００５９】
【表２】
2012111438.tif 000004
【００６０】
表２の結果から、ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、疎水性度が０．２〜１．２である人工タンパク質ポリマー（Ａ−１）〜（Ａ−６）は、４時間後にはゲル化することが分かる。特に、人工タンパク質ポリマー（Ａ−１）を含むタンパク質水溶液（Ｂ１）及び人工タンパク質ポリマー（Ａ−２）を含むタンパク質水溶液（Ｂ２）は、２時間後にはゲル化しており、創傷部をより早く被覆・封鎖するのに有効であることが分かる。
一方、ポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｙ’）をいずれも有しない人工タンパク質ポリマー（Ａ’−１）及び（Ａ’−２）、並びに、疎水性度が０．２〜１．２の範囲外である人工タンパク質ポリマー（Ａ’−３）及び（Ａ’−４）は、ゲル化しないことが分かる。【００６１】
製造例１及び２で得た人工タンパク質ポリマー（Ａ−１）及び（Ａ−２）を、それぞれ下記表３の濃度に調整し、タンパク質水溶液（Ｂ１−１）〜（Ｂ１−５）及び（Ｂ２−１）〜（Ｂ２−４）を作製した。それぞれのタンパク質水溶液について、２５℃、３７℃及び５０℃で静置し、ゲル化するまでの時間を測定した。結果を表３に示す。【００６２】
【表３】
2012111438.tif 000005
【００６３】
表３の結果から、タンパク質濃度が高ければゲル化時間は短くなり、また、加温温度が高ければゲル化時間が短くなることが分かる。【００６４】
＜実施例１＞
○タンパク質水溶液の作製
組織再生用材料であるＳＥＬＰ８Ｋポリマー（Ａ−１）２００ｍｇを８００μＬの４℃のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解し、ＳＥＬＰ８Ｋポリマー（Ａ−１）の２０重量％水溶液（Ｂ−１）を作製した。【００６５】
＜比較例１＞
人工真皮として用いられているコラーゲンスポンジ（Ｂ’−１）（グンゼ株式会社製）を用いた。【００６６】
＜評価１＞
（糖尿病マウスを用いたＩＶ度褥瘡モデルでの治療実験）
遺伝的糖尿病マウス♀（日本クレア社製）８週齢を麻酔下で除毛し、大腿第三転子部の皮膚を圧迫（４００ｇ／８ｍｍ×２時間×４）し、褥瘡（直径８ｍｍ）を作製した。圧迫終了後５日目に壊死組織を除去し、ＳＥＬＰ８Ｋポリマー（Ａ−１）の２０重量％水溶液（Ｂ−１）５６μｌを注入し、ポリウレタンフィルムを貼付した。２時間後、（Ｂ−１）はゲル化していた。その後、創傷部の上にガーゼをあてて、シルキーテックス（アルケア社製）で固定した。治療期間１４日目に検体を擬死させ、創傷部を含む皮膚を採取し、病理標本（ＨＥ染色）を作製した。
（Ｂ−１）に変えて、コラーゲンスポンジ（Ｂ’−１）を、直径８ｍｍに加工したものをナイロン糸で創傷部に固定し、同様に病理標本を作製した。
病理標本は、（Ｂ−１）又は（Ｂ’−１）を使用したものをそれぞれ９個作製した。
作製した病理標本用いて、組織学的検査を実施した。検査項目は、以下のとおりである。評価結果は表４に示す。【００６７】
（検査項目１）表皮の再生
表皮の再生を、以下の５段階の評価基準で評価し、点数化した。評価結果の点数は、９個の病理標本の平均点である。なお、点数が高いほど、より上皮化が促進されており、組織再生用材料の上皮化促進作用が優れていることを示している。
１点：欠損部に対して全く表皮が再生していない状態
２点：欠損部の全面積中の表皮の再生面積率が０％より大きく２５％未満
３点：欠損部の全面積中の表皮の再生面積率が２５％以上５０％未満
４点：欠損部の全面積中の表皮の再生面積率が５０％以上７５％未満
５点：欠損部の全面積中の表皮の再生面積率が７５％以上【００６８】
（検査項目２）肉芽組織の形成
未熟な毛細血管と繊維芽細胞が一体となった良好な肉芽組織を肉芽組織とみなした。ガス嚢胞やコレステリン血漿を含む肉芽組織は、肉芽組織ではないものとみなした。肉芽組織の形成を、以下の５段階の評価基準で評価し、点数化した。評価結果の点数は、９個の病理標本の平均点である。なお、点数が高いほど、より肉芽組織形成が促進されており、組織再生用材料の肉芽組織形成促進作用が優れていることを示している。
１点：欠損部に対して全く肉芽組織が形成していない状態
２点：欠損部の全面積中の肉芽組織形成面積率が０％より大きく２５％未満
３点：欠損部の全面積中の肉芽組織形成面積率が２５％以上５０％未満
４点：欠損部の全面積中の肉芽組織形成面積率が５０％以上７５％未満
５点：欠損部の全面積中の肉芽組織形成面積率が７５％以上【００６９】
（検査項目３）細菌コロニー
組織切片（ＨＥ染色）の紫色の塊（細菌コロニー）の数や大きさから、５段階の評価基準で評価し、点数化した。評価結果の点数は、９個の病理標本の平均点である。なお、点数が低いほど、細菌増殖性が低く、組織再生用材料が細菌増殖を抑制できていることを示している。
１点：細菌コロニーが全くない
２点：細菌コロニーが欠損部の一部にあり、数が少ない且つ大きさが小さい
３点：細菌コロニーが欠損部の一部にあり、数が多い又は大きさが大きい
４点：細菌コロニーが欠損部の一部にあり、数が多い且つ大きさが大きい
５点：細菌コロニーが欠損部全体に存在している【００７０】
（検査項目４）ガス嚢胞
ガス産生菌が作り出すガス嚢胞の分布から、ガス産生菌の感染率について、５段階の評価基準で評価し、点数化した。評価結果の点数は、９個の病理標本の平均点である。なお、点数が低いほど、細菌感染率が低く、組織再生用材料が細菌に感染しにくいものであることを示している。
１点：欠損部に対して全くガス嚢胞が分布していない状態
２点：欠損部の全面積中のガス嚢胞感染率が０％より大きく２５％未満
３点：欠損部の全面積中のガス嚢胞感染率が２５％以上５０％未満
４点：欠損部の全面積中のガス嚢胞感染率が５０％以上７５％未満
５点：欠損部の全面積中のガス嚢胞感染率が７５％以上【００７１】
【表４】
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【００７２】
＜評価２＞
（糖尿病マウスを用いたＩＶ度褥瘡モデルでの菌感染性試験）
評価１と同様の方法でＩＶ度褥瘡モデルを作製し、同様の方法で（Ｂ−１）又は（Ｂ’−１）を創傷部に投与又は固定した。（Ｂ−１）を投与したものを７個、（Ｂ’−１）を投与したものを６個作製した。治療期間７日目に検体を擬死させ、創傷部を含む皮膚を採取した。採取した皮膚を滅菌した生理食塩水中で細かく裁断し懸濁した。適宜希釈した懸濁液を普通寒天培地に塗布して、３７℃で１２時間培養した。培養後の寒天プレート上に得られたコロニー数を測定した。（Ｂ−１）の評価結果は７個の平均、（Ｂ’−１）の評価結果は６個の平均である。評価結果は表５に示す。【００７３】
【表５】
2012111438.tif 000007
【００７４】
＜評価３＞
（健常モルモットを用いた全層欠損層モデルでの治療試験）
健常モルモット♀  ｓｔｄ  Ｈａｒｔｌｅｙ（日本エスエルシー社製）７週齢を麻酔下で除毛し、消毒したモルモット背部皮膚に脂肪層が完全に露出した創面１０×１０ｍｍの全層皮膚欠損創を作製し、止血、乾燥した後、ＳＥＬＰ８Ｋポリマー（Ａ−１）の２０重量％水溶液（Ｂ−１）を注入し、ポリウレタンフィルムを貼付した。その後、各創傷部の上にガーゼをのせて、ナイロン糸で創傷部周囲と固定した。治療期間５、１０日目に検体を擬死させ、創傷部を含む皮膚を採取し、病理標本（ＨＥ染色）を作製した。治療期間５日目の病理標本を１０個、治療期間１０日目の病理標本を１１個作製した。
（Ｂ−１）に変えてコラーゲンスポンジ（Ｂ’−１）を、直径８ｍｍに加工したものをナイロン糸で創傷部に固定し、同様に病理標本を作製した。治療期間５日目の病理標本を６個、治療期間１０日目の病理標本を１２個作製した。
作製した治療期間５日目の病理標本用いて、パニキュラス（筋様膜）からの肉芽組織高をマイクロルーラーを使用して測定した。（Ｂ−１）の評価結果は１０個の平均、（Ｂ’−１）の評価結果は６個の平均である。評価結果は表６に示す。また、治療期間１０日目の病理標本用いて、正常組織から伸長した上皮化長をマイクロルーラーを使用して測定した。（Ｂ−１）の評価結果は１１個の平均、（Ｂ’−１）の評価結果は１２個の平均である。評価結果は表７に示す。【００７５】
【表６】
2012111438.tif 000008
【００７６】
【表７】
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【００７７】
評価１（表４中の検査項目１及び２）及び評価３（表６〜７）の結果から、ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有する実施例１の組織再生用材料は、比較例１のコラーゲンスポンジと比較して、肉芽組織形成と上皮化促進作用が共に優れていることが分かる。また、評価１（表４中の検査項目３及び４）及び評価２（表５）の結果から、実施例１の組織再生用材料は、菌増殖抑制作用が極めて優れていることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明の組織再生用材料は、菌増殖抑制作用、肉芽組織形成及び上皮化促進作用に優れている。したがって、熱傷、採皮創、皮膚剥削創及び外傷性皮膚欠損創等の疾患ないし創傷による患部を保護する創傷被覆材としてだけでなく、肉芽組織形成や上皮化を促進する組織再生用材料として有効である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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