(57)【要約】  動物細胞の培養に好適に用い得る動物細胞培養キット、動物細胞の培養方法、動物細胞の選択培養方法及び細胞分化方法を提供する。本発明に係る動物細胞培養キットは、親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基を所定の割合で表面に有する培養器と、無血清培地と、を備える。動物細胞培養キットは、特定の動物細胞の接着・増殖に適した官能基を表面に有する培養器を備えるため、無血清培地でも動物細胞の増殖の促進が可能である。
2012137830.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基を所定の割合で表面に有する培養器と、無血清培地と、を備える、
ことを特徴とする動物細胞培養キット。
【請求項２】
前記培養器が前記官能基を所定の割合で表面に有する自己組織化単分子膜を備える、
ことを特徴とする請求項１に記載の動物細胞培養キット。
【請求項３】
前記親水性官能基が水酸基、アミノ基又はカルボキシル基であり、前記疎水性官能基がアルキル基である、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の動物細胞培養キット。
【請求項４】
水酸基：カルボキシル基を１００：０〜２０：８０の割合で有し、ヒト骨髄間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
【請求項５】
アミノ基：水酸基を４０：６０、カルボキシル基：メチル基を１００：０〜８０：２０、アミノ基：メチル基を２０：８０〜８０：２０、アミノ基：カルボキシル基を４０：６０〜２０：８０、或いは、水酸基：メチル基を１００：０〜８０：２０の割合で有し、不均質な細胞集団において初代のラット間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
【請求項６】
水酸基：カルボキシル基を１００：０〜４０：６０の割合で有し、ヒト滑膜由来間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
【請求項７】
水酸基：カルボキシル基を１００：０〜６０：４０の割合で有し、ヒト歯髄由来間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
【請求項８】
水酸基：カルボキシル基を１００：０〜４０：６０、或いは、水酸基：メチル基を８０：２０〜２０：８０の割合で有し、ヒト線維芽細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
【請求項９】
水酸基：カルボキシル基を１００：０〜０：１００、或いは、水酸基：メチル基を８０：２０〜２０：８０の割合で有し、ラット骨芽細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
【請求項１０】
水酸基：カルボキシル基を１００：０〜０：１００、或いは、カルボキシル基：メチル基を１００：０〜８０：２０の割合で有し、ラット骨髄間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
【請求項１１】
水酸基：カルボキシル基を１００：０〜４０：６０の割合で有し、ヒト初代間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
【請求項１２】
水酸基：カルボキシル基を１００：０〜４０：６０の割合で有し、ヒト間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
【請求項１３】
親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基を所定の割合で表面に有する培養器と、無血清培地とを用い、
所定の動物細胞の接着及び増殖を促進させる、
ことを特徴とする動物細胞の培養方法。
【請求項１４】
親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基を所定の割合で表面に有する培養器と、無血清培地とを用い、
不均質な細胞集団から選択的に所定の動物細胞の接着及び増殖を促進させる、
ことを特徴とする動物細胞の選択培養方法。
【請求項１５】
血清含有培地と、アミノ基：水酸基を１００：０〜２０：８０、水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０、カルボキシル基：メチル基を１００：０〜６０：４０、アミノ基：メチル基を８０：２０〜２０：８０、或いは、アミノ基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０の割合で表面に有する培養器とを用いて、ヒト間葉系幹細胞、ヒト線維芽細胞又はラット間葉系幹細胞の増殖を促進させる、
ことを特徴とする動物細胞の培養方法。
【請求項１６】
親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基を所定の割合で表面に有する培養器と、無血清の分化誘導培地とを用い、ヒト骨髄間葉系幹細胞を培養して前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を軟骨細胞又は骨細胞に分化させる、
ことを特徴とする細胞分化方法。
【請求項１７】
水酸基：カルボキシル基を１００：０〜２０：８０の割合で有する前記培養器と、無血清の軟骨分化誘導培地とを用い、前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化させる、
ことを特徴とする請求項１６に記載の細胞分化方法。
【請求項１８】
水酸基：カルボキシル基を１００：０〜２０：８０の割合で有する前記培養器と、無血清の骨形成分化誘導培地とを用い、前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を骨細胞に分化させる、
ことを特徴とする請求項１６に記載の細胞分化方法。
【請求項１９】
親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基を所定の割合で表面に有する培養器と脂肪分化誘導培地とを用いてヒト骨髄間葉系幹細胞を培養し、前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を脂肪細胞に分化させる、
ことを特徴とする細胞分化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞培養キット、動物細胞の培養方法、動物細胞の選択培養方法及び細胞分化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞の培養では、プラズマ照射などで様々なイオン基が導入された組織培養用ポリスチレン培養皿が広く用いられている。しかし、イオン基導入によるイオン化の程度は一定ではなく、表面組成が化学的に規定されていない。このような通常の組織培養用ポリスチレン培養皿でも、不死化した株細胞はよく増殖する場合が多い。【０００３】
一方で、組織から分離された初代動物細胞は、不均質な細胞集団であるため、あるいは培養系に馴化していないため、増殖速度が低いことが多い。このため、組織培養用ポリスチレン培養皿を用いた場合では、動物細胞を用いた基礎研究、再生医療、バイオ医薬品などの開発が困難である。また、組織培養用ポリスチレン培養皿では、成長因子やサイトカインが添加されても、目的細胞を選択的に増殖させ難い。あるいは不均質な細胞集団から目的細胞以外の混入細胞を除去できない。そのため再生医療あるいはバイオ医薬などの研究開発が困難である。【０００４】
上記の通常の組織培養ポリスチレン培養皿の欠点を補うため、コート剤として、フィブロネクチンやコラーゲンなどの接着因子、接着因子の部分ペプチド、ポリリジン、基底膜などの細胞外基質が使用されている。これらのコート剤は、高価であり、また、培養の効果は限られた細胞に限定的であった。【０００５】
また、一般的に、動物細胞の培養には、高濃度の血清が添加された血清含有培養液が用いられる。しかし、血清は天然成分であるため、血清含有培養液では、成分不確定、ロット間のバラツキ、病原体混入リスク、免疫反応リスクなどの欠点がある。このため、血清含有培養液を用いた場合、細胞増殖（分化）にバラツキが生じやすい。これらの欠点を克服するため、無血清培養液が開発されつつある。しかし、無血清培養液には血清中の接着因子が含有されていないため、通常の組織培養用ポリスチレン培養皿で培養しようとすると、細胞が接着／増殖しにくいという問題がある。【０００６】
更には、近年、ＮＨ２基やＣＯＯＨ基を添加したプラスチック培養皿も販売されているが、細胞増殖への影響は十分には明らかになっていない。また、一部の研究では、培養皿表面に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を備える培養皿について検討されている。ＳＡＭを構成する官能基３種類の組み合わせ（ＣＨ３／ＯＨ，ＣＨ３／ＣＯＯＨ，ＣＨ３／ＮＨ２）及び配合比を変えて、２−１０％牛胎児血清存在下で、癌細胞や株化（不死化）細胞の接着に及ぼす影響が検討されている（非特許文献１）。【０００７】
また、２種類の官能基の組み合わせが癌細胞や株化（不死化）細胞の短期間の増殖に及ぼす影響が検討されている（非特許文献２）。【０００８】
また、ＲＧＤペプチドのＳＡＭへの血管内皮細胞の接着について報じられている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ａｒｉｍａ  Ｙ，Ｉｗａｔａ  Ｈ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２８：３０７４−３０８２，２００７
【非特許文献２】Ｆｕｓｅ  Ｙ，  Ｈｉｒａｔａ  Ｉ，  Ｋｕｒｉｈａｒａ  Ｈ，  Ｏｋａｚａｋｉ  Ｍ  ；「Ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｎ  ｍｉｘｅｄ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｒａｔｉｏｓ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｇｒｏｕｐｓ．」；Ｄｅｎｔ  Ｍａｔｅｒ  Ｊ．  ２００７  ２６（６）：８１４−８１９．
【非特許文献３】Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １９９８，  １２０：６５４８−６５５５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、非特許文献１及び非特許文献２では、通常の組織培養用ポリスチレン培養皿以上に増殖を促進する官能基配合や不死化株細胞以外についての細胞（初代細胞、幹細胞など）の言及はない。細胞接着を極端に抑制する官能基が存在するのは予想の範囲内である。また、非特許文献３について、ＲＧＤペプチドが細胞接着を促進するのは当然である。つまり、従来、細胞接着に及ぼす官能基配合の基礎研究があったが、官能基配合ＳＡＭにより、通常培養皿と比較してより高レベルに細胞の増殖をもたらすという産業的な発想や研究および実験結果はなかった。【００１１】
また、これまでのＳＡＭの研究では血清が用いられていたが、血清タンパク質はＳＡＭへ接着して、細胞との相互作用に干渉する。したがって、化学的規定化下で培養器表面の官能基配合を至適化できなかった。【００１２】
本発明は、上記事項に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、動物細胞の培養に好適に用い得る動物細胞培養キット、動物細胞の培養方法、動物細胞の選択培養方法及び細胞分化方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の第１の観点に係る動物細胞培養キットは、
親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基を所定の割合で表面に有する培養器と、無血清培地と、を備える、
ことを特徴とする。【００１４】
また、前記培養器が前記官能基を所定の割合で表面に有する自己組織化単分子膜を備えていてもよい。【００１５】
また、前記親水性官能基が水酸基、アミノ基又はカルボキシル基であり、前記疎水性官能基がアルキル基であることが好ましい。【００１６】
また、水酸基：カルボキシル基を１００：０〜２０：８０の割合で有し、ヒト骨髄間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。【００１７】
また、アミノ基：水酸基を４０：６０、カルボキシル基：メチル基を１００：０〜８０：２０、アミノ基：メチル基を２０：８０〜８０：２０、アミノ基：カルボキシル基を４０：６０〜２０：８０、或いは、水酸基：メチル基を１００：０〜８０：２０の割合で有し、不均質な細胞集団において初代のラット間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。【００１８】
また、水酸基：カルボキシル基を１００：０〜４０：６０の割合で有し、ヒト滑膜由来間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。【００１９】
また、水酸基：カルボキシル基を１００：０〜６０：４０の割合で有し、ヒト歯髄由来間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。【００２０】
また、水酸基：カルボキシル基を１００：０〜４０：６０、或いは、水酸基：メチル基を８０：２０〜２０：８０の割合で有し、ヒト線維芽細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。【００２１】
また、水酸基：カルボキシル基を１００：０〜０：１００、或いは、水酸基：メチル基を８０：２０〜２０：８０の割合で有し、ラット骨芽細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。【００２２】
また、水酸基：カルボキシル基を１００：０〜０：１００、或いは、カルボキシル基：メチル基を１００：０〜８０：２０の割合で有し、ラット骨髄間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。【００２３】
また、水酸基：カルボキシル基を１００：０〜４０：６０の割合で有し、ヒト初代間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。【００２４】
また、水酸基：カルボキシル基を１００：０〜４０：６０の割合で有し、ヒト間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。【００２５】
本発明の第２の観点に係る動物細胞の培養方法は、
親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基を所定の割合で表面に有する培養器と、無血清培地とを用い、
所定の動物細胞の接着及び増殖を促進させる、
ことを特徴とする。【００２６】
本発明の第３の観点に係る動物細胞の選択培養方法は、
親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基を所定の割合で表面に有する培養器と、無血清培地とを用い、
不均質な細胞集団から選択的に所定の動物細胞の接着及び増殖を促進させる、
ことを特徴とする。【００２７】
本発明の第４の観点に係る動物細胞の培養方法は、
血清含有培地と、アミノ基：水酸基を１００：０〜２０：８０、水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０、カルボキシル基：メチル基を１００：０〜６０：４０、アミノ基：メチル基を８０：２０〜２０：８０、或いは、アミノ基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０の割合で表面に有する培養器とを用いて、ヒト間葉系幹細胞、ヒト線維芽細胞又はラット間葉系幹細胞の増殖を促進させる、
ことを特徴とする。【００２８】
本発明の第５の観点に係る細胞分化方法は、
親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基を所定の割合で表面に有する培養器と、無血清の分化誘導培地とを用い、ヒト骨髄間葉系幹細胞を培養して前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を軟骨細胞又は骨細胞に分化させる、
ことを特徴とする。【００２９】
また、水酸基：カルボキシル基を１００：０〜２０：８０の割合で有する前記培養器と、無血清の軟骨分化誘導培地とを用い、前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化させてもよい。【００３０】
また、水酸基：カルボキシル基を１００：０〜２０：８０の割合で有する前記培養器と、無血清の骨形成分化誘導培地とを用い、前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を骨細胞に分化させてもよい。【００３１】
本発明の第６の観点に係る細胞分化方法は、
親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基を所定の割合で表面に有する培養器と脂肪分化誘導培地とを用いてヒト骨髄間葉系幹細胞を培養し、前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を脂肪細胞に分化させる、
ことを特徴とする。
【発明の効果】
【００３２】
本発明に係る動物細胞培養キットは、特定の動物細胞の接着・増殖に適した官能基を表面に有する培養器を備えるため、無血清培地でも動物細胞の増殖の促進が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】（Ａ）はアルカンチオールの模式図、（Ｂ）はＳＡＭの模式図である。
【図２】実施例において、（Ａ）はアルカンチオール（ＮＨ２−ＳＨ及びＯＨ−ＳＨ）の配合比に対する作製したＳＡＭ表面の官能基の組成を示すグラフ、（Ｂ）はアルカンチオール（ＯＨ−ＳＨ及びＣＯＯＨ−ＳＨ）の配合比に対する作製したＳＡＭ表面の官能基の組成を示すグラフ、（Ｃ）はアルカンチオール（ＣＯＯＨ−ＳＨ及びＣＨ３−ＳＨ）の配合比に対する作製したＳＡＭ表面の官能基の組成を示すグラフ、（Ｄ）はアルカンチオール（ＣＨ３−ＳＨ及びＮＨ２−ＳＨ）の配合比に対する作製したＳＡＭ表面の官能基の組成を示すグラフである。
【図３】（Ａ）は実験１における４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図、（Ｂ）は実験２における４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図、（Ｃ）は実験３における４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図である。
【図４】実験１における４日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ６）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ８）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ１９）の写真である。
【図５】実験２における４日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＳＡＭ（Ａ１）、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ８）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ１４）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ２０）の写真である。
【図６】実験３における４日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＳＡＭ（Ａ１）、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ７）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ１６）の写真である。
【図７】実験４における４日間培養後の細胞数測定結果を示す図である。
【図８】実験４における４日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ｂ５）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ｂ８）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ｂ１３）の写真である。
【図９】（Ａ）は実験５における４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図、（Ｂ）は実験６における４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図である。
【図１０】実験５における４日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ１）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ１５）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ２１）の写真である。
【図１１】実験１における４日間培養後のＤＮＡ定量結果を示す図である。
【図１２】実験５における４日間培養後のＤＮＡ定量結果を示す図である。
【図１３】（Ａ）は実験１における通常培養皿及びＳＡＭ（Ａ８）と、実験５の通常培養皿及びＳＡＭ（Ａ５）の４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図、（Ｂ）は実験１における通常培養皿及びＳＡＭ（Ａ８）と、実験５の通常培養皿及びＳＡＭ（Ａ５）の４日間培養後のＤＮＡ定量結果を示す図である。
【図１４】（Ａ）は実験１１−１における７日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図、（Ｂ）は実験１１−２における８日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図、（Ｃ）は実験１２における８日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図、（Ｄ）は実験１３における７日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図である。
【図１５】実験１１−１における７日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ６）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ１１）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ１５）、（Ｅ）はＳＡＭ（Ａ２５）の写真である。
【図１６】実験１１−２における８日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ４）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ１１）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ１８）、（Ｅ）はＳＡＭ（Ａ２５）の写真である。
【図１７】実験１２における８日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ１４）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ１７）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ２５）の写真である。
【図１８】実験１３における７日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ６）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ９）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ１１）、（Ｅ）はＳＡＭ（Ａ１９）、（Ｆ）はＳＡＭ（Ａ２８）の写真である。
【図１９】（Ａ）は実験２１における４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図、（Ｂ）は実験２２における１４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図である。
【図２０】実験２１における４日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＳＡＭ（Ａ１）、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ８）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ１６）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ１８）の写真である。
【図２１】実験２２で１４日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ８）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ１０）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ２２）の写真である。
【図２２】実験２３における４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図である。
【図２３】実験２３における４日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＳＡＭ（Ａ１）、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ７）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ１６）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ１８）の写真である。
【図２４】（Ａ）は実験３１における４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図、（Ｂ）は実験３２における４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図である。
【図２５】実験３１における４日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ７）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ２２）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ２６）の写真である。
【図２６】実験３３における４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図である。
【図２７】実験３３における４日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ６）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ１４）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ２５）の写真である。
【図２８】（Ａ）は実験４１における４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図、（Ｂ）は実験４２における４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図である。
【図２９】（Ａ）は実験４１における４日間培養後のＤＮＡ定量結果を示す図、（Ｂ）は実験４２における４日間培養後のＤＮＡ定量結果を示す図である。
【図３０】実験４１における４日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ６）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ１１）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ１４）、（Ｅ）はＳＡＭ（Ａ２５）、（Ｆ）はＳＡＭ（Ａ２８）の写真である。
【図３１】実験４２における４日間培養後の細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ７）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ１１）、（Ｄ）はＳＡＭ（Ａ１６）、（Ｅ）はＳＡＭ（Ａ２４）、（Ｆ）はＳＡＭ（Ａ２８）の写真である。
【図３２】実験５１における１４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図である。
【図３３】実験５１における１４日間培養した細胞の写真であり、（Ａ）はＣｏｎｔｒｏｌ、（Ｂ）はＳＡＭ（Ａ７）、（Ｃ）はＳＡＭ（Ａ８）の写真である。
【図３４】実験５２における１４日間培養後のＭＴＴ試験結果を示す図である。
【図３５】実験６１において、ＳＡＭ（Ａ１）にて培養した細胞の写真であり、（Ａ）は１０倍拡大写真、（Ｂ）は４０倍拡大写真である。
【図３６】実験６２において、ＳＡＭ（Ａ６）にて培養した細胞の写真であり、（Ａ）は１０倍拡大写真、（Ｂ）は４０倍拡大写真である。
【図３７】実験６３において、ＳＡＭ（Ａ８）にて培養した細胞の写真であり、（Ａ）は１０倍拡大写真、（Ｂ）は４０倍拡大写真である。
【図３８】実験６４において、ＳＡＭ（Ａ１１）にて培養した細胞の写真であり、（Ａ）は１０倍拡大写真、（Ｂ）は４０倍拡大写真である。
【図３９】トルイジンブルー染色した通常培養皿で培養した細胞の写真である。
【図４０】トルイジンブルー染色したＳＡＭ（Ａ８）で培養した細胞の写真である。
【図４１】ＧＡＧ産生量の測定結果を示すグラフである。
【図４２】通常培養皿で培養しオイルレッド０染色した細胞の写真である。
【図４３】ＳＡＭ（Ａ８）で培養しオイルレッド０染色した細胞の写真である。
【図４４】ＧＰＤＨ量の測定結果を示すグラフである。
【図４５】ＡＬＰ活性の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本実施の形態に係る動物細胞培養キット、動物細胞の培養方法、動物細胞の選択培養方法及び細胞分化方法について説明する。本実施の形態に係る動物細胞培養キットは、培養器及び無血清培地から構成される。
【００３５】
培養器は表面に親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基を所定の割合で有する。より具体的には、培養器は表面に自己組織単分子膜（Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ）（以下、ＳＡＭと記す）を有する。ＳＡＭは、親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から１種以上の官能基が所定の割合で表面に露出した形態である。この場合、一つのＳＡＭが、異なる２種以上の親水性官能基又は疎水性官能基を有していてもよく、その両方を有していてもよい。親水性官能基として、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、ニトロ基等を例示され、疎水性官能基としてはメチル基、エチル基、プロピル基等のアルキル基、フェニル基、シクロヘキシル基、シクロペンチル基、フルオロ基などが例示される。親水性官能基は正電荷官能基又は負電荷官能基であってもよく、例えば、アミノ基はプロトンによりＮＨ３＋に、カルボキシル基は脱プロトンによりＣＯＯ−となっていてもよい。
【００３６】
ＳＡＭは以下のようにして作製され得る。エタノール等の溶媒にアルカンチオールを溶解し、アルカンチオール溶液を調製する。アルカンチオールは、図１（Ａ）の模式図に示すように、直鎖状のアルキル鎖の一方の末端にチオール基（−ＳＨ）を有し、他方の末端にメチル基（−ＣＨ３）、水酸基（−ＯＨ）、アミノ基（−ＮＨ２）又はカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を有している。アルキル鎖の炭素数について特に制限はないが、５〜２０である。
【００３７】
調製したアルカンチオール溶液に金蒸着基板等を浸漬する等により、金蒸着基板にアルカンチオールを結合させる。図１（Ｂ）に模式的に示すように、金蒸着基板上にＳＡＭが形成される。アルカンチオールのチオール基は金と特異的に結合し、さらにアルキル鎖間のファンデルワールス力によって分子同士が高密度・高配向な構造となるため、表面に官能基が露出した単分子膜が金蒸着基板上に形成する。この金蒸着基板を、ポリスチレン製培養皿等に設置することで培養器が得られる。または、金修飾した培養皿等を用い、直接アルカンチオールを結合させてもよい。
【００３８】
上記の各種アルカンチオールを１種又は複数種組み合わせてアルカンチオール溶液を調製し用いることで、様々な官能基を表面に有するＳＡＭが得られる。ＳＡＭの表面組成は、用いるアルカンチオール溶液の組成とほぼ同様の組成になる。したがって、増殖させる動物細胞に応じ、上記４種の官能基を有するアルカンチオールを所定の割合で溶媒に溶解させたアルカンチオールを調製しＳＡＭを形成することにより、その動物細胞の増殖に適した培養器が得られる。
【００３９】
無血清培地は、血清を含有していない培地であり、未知の要因が少ない。このため、血清含有培地に比べ、一定の性能が得られる、培地からの精製及び後続のプロセスが容易、細胞機能の正確な評価が容易、生理的反応性の制御が容易等の利点を有する。
【００４０】
一方で、無血清培地は血清を含有していないため、血清中の接着因子（基質接着性細胞）がほぼない。細胞増殖の過程では、まず、接着因子が培養皿等に接着し、接着因子を介して細胞が接着し増殖するものと考えられる。したがって、無血清培地には、この接着因子がほとんど存在していないため、細胞の接着、増殖が生じにくい。
【００４１】
しかしながら、本実施の形態に係る動物細胞培養キットでは、種々の官能基が所定の割合で露出した形態のＳＡＭを有する培養器を備えており、培養器の表面組成を所定の動物細胞の接着、伸展、増殖に適した表面組成とすることが可能である。したがって、無血清培地においても、所定の動物細胞の接着・伸展・増殖を促進することができる。更には、複数系統の細胞に分化できる能力を有する間葉系幹細胞等の幹細胞では、細胞分化も促進され得る。
【００４２】
無血清培地として、一般的に使用されている基本培地、例えば、塩類、アミノ酸、糖、ビタミン及びその他の微量必須栄養素を混合した等浸透圧性ｐＨ平衡溶液等を組み合わせることができ、基本培地に各種添加剤が含有された培地でもよい。例えば、好適な無血清培地として、ＳＴＫ１（商品名）、ＳＴＫ２（商品名）、ＳＴＫ３（商品名）（いずれもＤＳファーマバイオメディカル社製）等が挙げられる。
【００４３】
また、本動物細胞培養キットでは、以上の事から、不均質な細胞集団（例えば、骨髄液中の細胞集団）から、目的とする特定の動物細胞の接着・増殖に適したＳＡＭと無血清培地とを組み合わせることで、特定の動物細胞を選択的に接着・増殖させることが可能である。
【００４４】
また、上記では金蒸着基板にＳＡＭを形成し、これを培養皿に設置した培養器について説明したが、金蒸着基板のほか、金泊や金コロイドを用いてＳＡＭを形成させた基板であってもよく、金のほか、アルミニウム、チタン、白金、銀等の金属等の基板であってもよい。更には、酸化アルミニウム、酸化ケイ素、酸化チタン等の無機金属酸化物やガラス等のセラミックの基板を用い表面にＳＡＭが形成されていてもよい。
【００４５】
また、培養皿に応じた形状に加工された上記基板を用い、その表面にＳＡＭを形成させて得られたＳＡＭ形成基板を培養皿に積層して培養器を得ることができる。
【００４６】
また、金蒸着基板等の基板を備えず、培養皿そのものが上記の素材から形成された形態や、培養皿表面が上記の素材で修飾された形態であり、培養皿表面に直接ＳＡＭが形成された培養器でもよい。
【００４７】
また、上記では、培養器として培養皿を例にとって説明したが、動物細胞の培養が可能なものであれば培養皿に限られることはない。また、アルカンチオールを用いてＳＡＭを形成することなく、上述した官能基が表面に直接的に付加された形態であってもよい。例えば、移植用生体材料などの表面に上記の官能基が付加された形態であってもよい。更には、ガラスなどへのシランカップリング法やチタン表面の加工、或いは、各種生体材料ポリマーなどへ直接的に官能基が付加された形態であってもよい。
【００４８】
以下、実施例に基づいて種々の動物細胞の増殖に適するＳＡＭ組成について説明する。
【実施例】
【００４９】
種々の表面組成のＳＡＭを作製し、種々の動物細胞及び培地を組み合わせ、動物細胞の接着・増殖に作用するＳＡＭの表面組成の影響について検証した。
（ＳＡＭの作製）
まず、以下のようにして金蒸着基板上にＳＡＭを作製した。【００５０】
１−ｄｏｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌ（以下、ＣＨ３−ＳＨと記す）は和光純薬株式会社製を用いた。１１−ｍｅｒｃａｐｔｏ−１−ｕｎｄｅｃａｎｏｌ（以下、ＯＨ−ＳＨと記す），１１−ｍｅｒｃａｐｔｏ−１−ｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（以下、ＣＯＯＨ−ＳＨと記す），１１−ａｍｉｎｏ−１−ｕｎｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌ（以下、ＮＨ２−ＳＨと記す）はシグマアルドリッチ株式会社製を用いた。【００５１】
金蒸着基板をＰｉｒａｎｈａ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（濃硫酸：３０％過酸化水素水＝７：３）を用いて表面を洗浄した。窒素ガスで脱酸素化したエタノールに、アルカンチオール（ＣＨ３−ＳＨ、ＯＨ−ＳＨ，ＣＯＯＨ−ＳＨ，ＮＨ２−ＳＨ）を表１に示すように様々な組み合わせ・割合で、合計１ｍｍｏｌ／Ｌになるように溶解し、アルカンチオール溶液を調製した。
【表１】
2012137830.tif 000003
【００５２】
調製したアルカンチオール溶液に、金蒸着基板を２４時間浸漬して、種々のＳＡＭ（以下、それぞれＳＡＭ（Ａ１）〜ＳＡＭ（Ａ２８）と記す）を金蒸着基板上に作製した。作製したＳＡＭは、実験に用いるまで２−プロパノール中に保存しておいた。【００５３】
（ＳＡＭの表面組成解析）
作製したＳＡＭ（Ａ１）〜（Ａ２０）の表面元素組成をＸ−ｒａｙ  ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｏｒｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＸＰＳ  ＡＸＩＳ−ＨＳ，Ｋｒａｔｏｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）を用いて求めた。測定は１０−７Ｐａ以下の圧力下で行った。Ａｌ−Ｋａｐｈａ単色Ｘ線は、加速電圧が１５ｋＶ，フィラメント電流が１０ｍＡの条件で試料表面に照射し、光電子脱離角度が９０度の条件における炭素と酸素の元素組成比を測定した。【００５４】
図２（Ａ）にアルカンチオール溶液中のＮＨ２−ＳＨとＯＨ−ＳＨとの配合割合に対する作製したＳＡＭ表面の官能基の割合、図２（Ｂ）にアルカンチオール溶液中のＯＨ−ＳＨとＣＯＯＨ−ＳＨとの配合割合に対する作製したＳＡＭ表面の官能基の割合、図２（Ｃ）にアルカンチオール溶液中のＣＯＯＨ−ＳＨとＣＨ３−ＳＨとの配合割合に対する作製したＳＡＭ表面の官能基の割合、図２（Ｄ）にアルカンチオール溶液中のＣＨ３−ＳＨとＮＨ２−ＳＨとの配合割合に対する作製したＳＡＭ表面の官能基の割合をそれぞれ示す。【００５５】
図２（Ａ）を見ると、アルカンチオール溶液中の水酸基に対するアミノ基の割合が高くなるにつれ、水酸基に対するアミノ基の割合が高い表面最外層を有するＳＡＭが得られている。図２（Ｂ）、図２（Ｃ）、図２（Ｄ）を見ると、他の官能基を末端に有するアルカンチオール溶液を混合した場合においても同じ傾向である。このように、配合するアルカンチオールの混合比に応じて、ＳＡＭ表面の官能基の組成を調節することが可能であることがわかる。【００５６】
以上のようにして作製したＳＡＭを用い、以下の実験にて動物細胞の培養を行った。【００５７】
また、一部の実験では、表２に示す混合比のアルカンチオール溶液を調製し、上記同様に各種ＳＡＭを作製して（以下、ＳＡＭ（Ｂ１）〜（Ｂ１３）と記す）実験に用いた。【００５８】
【表２】
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【００５９】
（使用培養液）
無血清培養液としてＳＴＫ１（商品名）及びＳＴＫ２（商品名）（いずれもＤＳファーマバイオメディカル社製）を用いた。なお、ＳＴＫ１及びＳＴＫ２には、ヒト血清アルブミン、トランスフェリン、数種類の成長因子の蛋白質が含有されているが、未知物質は一切含有されていない無血清培養液である。【００６０】
また、一部の実験では、参考例として、１０％牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）（以下、ＦＢＳと記す）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ  ＵＴ，ＵＳＡ）１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ’Ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）（以下、血清培養液Ａ、或いは、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳと記す）を使用した。【００６１】
また、一部の実験では、組織培養用培養皿（ポリスチレンのプラズマ処理あり）の２４ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（２４  Ｗｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  直径１６ｍｍ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）（以下、通常培養皿或いはＣｏｎｔｒｏｌと記す）を使用した。【００６２】
（実験１〜６）
ＳＡＭ表面の官能基の組み合わせが、ヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈ−ＢＭ  ＭＳＣ）の接着・増殖に及ぼす影響について検証した。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）を適宜ＭＳＣと称する。【００６３】
（使用細胞）
ヒト骨髄間葉系幹細胞（２株：Ｒ−４４，Ｒ−８１）は五十嵐らの方法（Ｉｇａｒａｓｈｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ，２００７）で腸骨から分離した。血清培養液Ａにて、３日毎に培養液交換しながら、３７℃で５％ＣＯ２条件下にて培養した。そして、実験には４−７代目の細胞を使用した。細胞がほぼコンフルエントになるまで増殖した後、トリプシンとＥＤＴＡと５分間インキュベートすることにより細胞を分散した。
そして１０％ＦＢＳ含有培養液にて酵素反応を停止して、細胞を無血清のＤＭＥＭで３回洗浄した。その後、無血清培養液（ＳＴＫ１又はＳＴＫ２）あるいは血清培養液Ａに細胞を分散させ、ＳＡＭ上に播種した。【００６４】
（ＳＡＭ上での細胞培養）
保存しておいたＳＡＭ基板（直径約１５ｍｍ）をＰＢＳ（リン酸緩衝生理的食塩水）で３回洗浄後、２４Ｗｅｌｌ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｌａｔｅ（浮遊培養用培養皿、プラズマ処置なし、直径約１６ｍｍ、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ社）に設置した。【００６５】
予め培養しておいたヒト骨髄間葉系幹細胞を回収後、２０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で１培養系あたり０．５ｍＬの細胞懸濁液を播種した。【００６６】
実験に用いたヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈ−ＢＭ  ＭＳＣ）、培養液及びＳＡＭの組み合わせを表３に示す。【００６７】
【表３】
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【００６８】
（評価手法）
細胞を培養後、細胞の状態／形態を位相顕微鏡下で観察して、接着／進展細胞（Ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ，Ａ）と浮遊細胞あるいは弱く接着した球形の細胞（Ｆｌｏａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ，Ｆ）に区分した。【００６９】
細胞増殖の評価は、ＷＳＴアッセイによるＭＴＴ試験（色素：ＷＳＴ−８（２−（２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）、測定吸光度：４５０ｎｍ）にて測定した。【００７０】
細胞数は、ＷＳＴ-８を用いたＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（Ｗａｋｏ）、あるいはコールターカウンター（コールター社）にて測定した。【００７１】
一部の実験では、ＤＮＡをＰｉｃｏＧｒｅｅｎＤｓＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ｍｏｌｏｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）にて測定した。【００７２】
（結果）
実験１，２，３の４日間培養後のＭＴＴ試験結果をそれぞれ図３（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）に、４日間培養後の写真をそれぞれ図４、図５、図６に示している。【００７３】
ヒト骨髄間葉系幹細胞（Ｒ４４、Ｒ８１株）は、ドナーの違い、植継ぎ回数（４から７回）に関わらず、ＳＡＭ（Ａ５）〜（Ａ１１）に高レベルで接着し、ＳＡＭ（Ａ１２）〜（Ａ１３）にも低レベルで接着したが、他の組成のＳＡＭ（Ａ１）〜（Ａ４）、（Ａ１４）〜（Ａ２８）にはほとんど接着しなかった。【００７４】
そして、これらの細胞は、ドナー、継代数に関わらず、ＳＡＭ（Ａ６）〜（Ａ８）（ＯＨ＝１００からＯＨ：ＣＯＯＨ＝６０：４０までの配合）でよく増殖し、ＳＡＭ（Ａ９）、ＳＡＭ（Ａ１６）でも増殖したが、他のＳＡＭ組成では増殖しなかった。なお、細胞増殖はＳＡＭ（Ａ７）（ＯＨ：ＣＯＯＨ＝８０：２０）あるいはＳＡＭ（Ａ８）（ＯＨ：ＣＯＯＨ＝６０：４０）で最大であった。【００７５】
次に、ヒト骨髄間葉系幹細胞が接着したＳＡＭ組成（ＯＨ：ＣＯＯＨ）の官能基の割合をより細かくして作製したＳＡＭ（Ｂ１）〜（Ｂ１３）を用いて行った実験４の細胞数測定結果を図７に示すとともに、培養した細胞の写真を図８に示す。なお本実験では、コールターカウンターにて細胞数を直接測定した。【００７６】
ＳＡＭ（Ｂ５）〜ＳＡＭ（Ｂ１１）（ＯＨ：ＣＯＯＨ＝６５：３５〜３０：７０）で、Ｃｏｎｔｒｏｌに比べて細胞が増殖していることがわかる。そして、ＳＡＭ（Ｂ５）（ＯＨ：ＣＯＯＨ＝６５：３５）でヒト骨髄間葉系幹細胞の増殖が最大となった。【００７７】
（血清存在下でのＳＡＭの影響）
図９（Ａ）、（Ｂ）は、血清培養液Ａを用いて行った実験５，６の４日間培養後のＭＴＴ試験結果であり、また、図１０は実験５の４日間培養後の写真であるが、ヒト骨髄間葉系幹細胞（Ｒ４４株）はすべてのＳＡＭ組成（Ａ１）〜（Ａ２８）に接着した。血清中の接着因子の存在により、細胞がＳＡＭ組成の影響を受けにくく、全てのＳＡＭに接着したものと考えられる。なお、ＳＡＭ組成によって増殖の程度は異なっており、ＳＡＭ（Ａ１）から（Ａ５），ＳＡＭ（Ａ１０）〜（Ａ１２），ＳＡＭ（Ａ１７）〜（Ａ２４）上で顕著に増殖している。【００７８】
注目すべきことに、無血清培養液中での増殖を促進したＳＡＭ（Ａ６）〜（Ａ９）は、血清培養液Ａ中での増殖を抑制している。なんらかの血清蛋白質がＳＡＭ（Ａ６）〜（Ａ８）に接着して、増殖を妨害したものと考えられる。【００７９】
また無血清培養液中での接着および増殖を抑制した多くのＳＡＭ組成が、血清培養液Ａ中での増殖を促進した。血清中の接着因子や増殖促進因子がこれらのＳＡＭ組成に結合したと考えられる。つまり、血清存在下と無血清では、細胞の接着／増殖に及ぼすＳＡＭ組成の影響が本質的に異なることが判明した。【００８０】
なお、一部の実験（実験１、５）では、ＤＮＡ定量でも増殖を評価した。図１１、図１２に実験１、実験５の４日間培養後のＤＮＡ定量結果をそれぞれ示す。ＭＴＴ試験結果とＤＮＡ定量結果は一致した。【００８１】
また、実験１の通常培養皿及びＳＡＭ（Ａ８）と、実験５の通常培養皿及びＳＡＭ（Ａ５）の４日間培養後のＭＴＴ試験結果を図１３（Ａ）に、ＤＮＡ定量結果を図１３（Ｂ）にそれぞれ示しているが、無血清培養液中では、ＳＡＭ（Ａ８）上で、通常培養皿に比較して細胞数とＤＮＡが培養４日目で２〜３倍に増加していることがわかる。【００８２】
以上の実験結果から、表面の水酸基：カルボキシル基の割合が１００：０〜０：１００、好ましくは、８０：２０〜２０：８０、より好ましくは７０：３０〜６０：４０のＳＡＭと、無血清培養液（ＳＴＫ２）とを組み合わせることで、無血清培養液中でも、ヒト骨髄間葉系幹細胞の接着・増殖を促進させられることがわかる。【００８３】
（実験１１〜１３）
ラット初代間葉系幹細胞（ｒａｔ−ｐｒｉｍａｒｙ  ＭＳＣ）の接着・増殖に及ぼすＳＡＭ表面の官能基配合の影響について検証した。【００８４】
骨髄液には造血系細胞、血管系細胞、間質細胞、間葉系幹細胞などが存在する。すなわち不均質な細胞集団である。骨髄間葉系幹細胞は、骨髄中の培養皿に接着・進展する線維芽細胞様細胞として分離される。しかし通常培養皿では、均質な骨髄間葉系幹細胞を得ることが困難である。そこで、本実験では、ラット骨髄液を直接各種のＳＡＭ培養皿に播種して、間葉系幹細胞（線維芽細胞様細胞）の接着と増殖に及ぼすＳＡＭ組成の影響を検討した。【００８５】
５匹の生後５週目の雄性Ｗｉｓｔａｒラットの左右の大腿骨と脛骨から分離した骨髄液を無血清のａｌｐｈａ  ＭＥＭにて稀釈して計２５ｍｌ（骨髄稀釈液）とした。【００８６】
そして各種ＳＡＭ基板を装着した培養皿に、骨髄稀釈液を０．０６ｍＬ／１６ｍｍ  ｗｅｌｌで播種し、さらにＳＴＫ１、血清培養液Ａ、又は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含有するαＭＥＭ（以下、αＭＥＭ＋１０％ＦＢＳと記す）を追加して培養液の総量を０．５ｍｌ／ｗｅｌｌとした。【００８７】
培養液は３日後より３日毎に交換して７〜８日間培養した。【００８８】
なお、２代目以降のラット骨髄間葉系幹細胞を得るためには、３ｍｌの骨髄稀釈液を１００ｍｍ組織培養用培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種して、８日間培養して、その後サブコンフルエントになった培養系からトリプシンとＥＤＴＡにて分散した細胞を、２０００／ｃｍ２の細胞密度で、各種のＳＡＭ基板に播種した。【００８９】
細胞の形態観察と細胞数の評価方法は実験１〜６と同様である。また、用いた細胞、培養液、ＳＡＭの組み合わせを表４に示す。【００９０】
【表４】
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【００９１】
（結果）
実験１１では７日間培養、及び、８日間培養を行いそれぞれについて評価を行った。以下では、実験１１の７日間培養について実験１１−１、８日間培養について実験１１−２と記す。実験１１−１の７日間培養後のＭＴＴ試験結果を図１４（Ａ）に、実験１１−２の８日間培養後のＭＴＴ試験結果を図１４（Ｂ）に、実験１２の８日間培養後のＭＴＴ試験結果を図１４（Ｃ）に、実験１３の７日間培養後のＭＴＴ試験結果を図１４（Ｄ）に示す。また、実験１１−１の７日間培養後の写真を図１５に、実験１１−２の８日間培養後の写真を図１６に、実験１２の８日間培養後の写真を図１７に、実験１３の７日間培養後のＭＴＴ試験結果を図１８に示す。【００９２】
無血清培養液ＳＴＫ１存在下で、ラット骨髄の線維芽細胞様細胞（間葉系幹細胞を含む）は、異なるグループとして、ＳＡＭ（Ａ４），（Ａ６），（Ａ１１），（Ａ１２），（Ａ１７）〜（Ａ２０），（Ａ２３）〜（Ａ２５）上で増殖した。しかも培養７〜８日目では、通常培養皿に比較して７〜１１倍もの細胞数が得られた。ＳＡＭ接着性の違いを利用して、骨髄の線維芽細胞様細胞（間葉系幹細胞）の分画が可能である。【００９３】
なお、血清培養液Ａ或いはαＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ存在下でも、いくつかのＳＡＭで、通常培養皿以上の増殖の亢進が観察された。血清存在下と無血清条件下では、ラット骨髄線維芽細胞様細胞（間葉系幹細胞）の増殖のパターンは異なっていることがわかる。【００９４】
以上の実験結果から、表面のアミノ基：水酸基が４０：６０、カルボキシル基：メチル基が１００：０〜８０：２０、アミノ基：メチル基が２０：８０〜８０：２０、アミノ基：カルボキシル基が４０：６０〜２０：８０、或いは、水酸基：メチル基が１００：０〜８０：２０のＳＡＭと、無血清培養液（ＳＴＫ１）とを組み合わせることで、無血清培養液中でも、初代のラット骨髄間葉系幹細胞の接着・増殖を促進させられることがわかる。【００９５】
（実験２１〜２３）
各種組織由来の間葉系幹細胞の接着と増殖に及ぼすＳＡＭ表面の官能基配合の影響について検証した。【００９６】
ヒト滑膜由来間葉系幹細胞（ヒトの変形性関節症由来の間葉系幹細胞、滑膜線維芽細胞とも呼ばれる（２株）（ｈ−ｓｙｎｏｖｉａｌ  ＭＳＣ（Ｓ６−Ｐ２）、ｈ−ｓｙｎｏｖｉａｌ  ＭＳＣ））は、Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．から入手した。【００９７】
ヒト歯髄間葉系幹細胞（１株）（ｈ−Ｄｅｎｔａｌ  ｐｕｌｐ  ＭＳＣ）は、抜歯した智歯の歯髄組織細片より遊走、成長する細胞集団として分離した（Ｏｄｏｎｔｂｌａｓｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｐｕｌｐ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｌａｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ．  Ｍ．−Ｌ．Ｃｏｕｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．２０００）。【００９８】
これらの細胞は血清培養液Ａにて、３日毎に培養液交換しながら、３７℃で５％ＣＯ２条件下にて培養した。植継ぎのためには、サブコンフルエントになった培養系をトリプシンとＥＤＴＡと５分間インキュベートした。そして１０％ＦＢＳ含有培養液にて酵素反応を停止して、その後遠心して細胞を無血清のＤＭＥＭで３回洗浄した。そしてＳＴＫ２あるいはＳＴＫ１で懸濁した細胞をＳＡＭ培養皿に実験２１、２３では２０００／ｃｍ２、実験２２では５００／ｃｍ２の細胞密度で播種して、４−１４日間培養した。【００９９】
細胞の形態観察と細胞数の評価方法は実験１〜６と同様である。また、用いた細胞、培養液、ＳＡＭの組み合わせを表５に示す。【０１００】
【表５】
2012137830.tif 000007
【０１０１】
（結果）
実験２１のＭＴＴ試験結果を図１９（Ａ）に、実験２２のＭＴＴ試験結果を図１９（Ｂ）にそれぞれ示すとともに、実験２１の４日間培養後の写真を図２０に、実験２２の１４日間培養後の写真を図２１にそれぞれ示す。【０１０２】
ヒト滑膜由来間葉系幹細胞（２代目）は、ドナーの違い、無血清培養液（ＳＴＫ２あるいはＳＴＫ１）の種類の違いに関わらず、ＳＡＭ（Ａ６）〜（Ａ９）によく接着し、ＳＡＭ（Ａ１０），（Ａ１１）にも接着したが、他の組成のＳＡＭには接着しなかった。【０１０３】
そして、これらの細胞は、ＳＡＭ（Ａ６）〜（Ａ８）、（ＯＨ＝１００からＯＨ：ＣＯＯＨ＝６０：４０の配合比）でよく増殖し、ＳＡＭ（Ａ９）でも増殖したが、他の組成では増殖しなかった。【０１０４】
なお最大の細胞増殖はＳＡＭ（Ａ７）（ＯＨ：ＣＯＯＨ＝８０：２０）あるいはＳＡＭ（Ａ８）（ＯＨ：ＣＯＯＨ＝６０：４０）で観察された。そして、図１９（Ｂ）に示すように、通常培養皿よりも７倍の細胞数が得られた。この結果は、ヒト骨髄間葉系幹細胞の増殖を促進するＳＡＭ組成とほぼ一致した。【０１０５】
したがって、表面の水酸基：カルボキシル基の割合が１００：０〜４０：６０、好ましくは、８０：２０〜６０：４０のＳＡＭと、無血清培養液（ＳＴＫ２あるいはＳＴＫ１）とを組み合わせることで、無血清培養液中でも、ヒト滑膜由来間葉系幹細胞の接着・増殖を促進させられることがわかる。【０１０６】
また、実験２３の４日間培養後のＭＴＴ試験結果を図２２に、写真を図２３に示す。ヒト歯髄由来間葉系幹細胞（５代目）の増殖を促進するＳＡＭ組成も、ヒト骨髄およびヒト滑膜由来間葉系幹細胞とほとんど共通していた。したがって、表面の水酸基：カルボキシル基の割合が１００：０〜６０：４０のＳＡＭと、無血清培養液（ＳＴＫ２）とを組み合わせることで、無血清培地中でも、ヒト歯髄由来間葉系幹細胞の接着・増殖を促進させられることがわかる。【０１０７】
（実験３１〜３３）
ヒト線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）およびラット骨芽細胞（ｒａｔ−Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）の接着と増殖に及ぼす培養皿表面の官能基配合の影響について検証した。【０１０８】
ヒト皮膚線維芽細胞はクラボー社（大阪）から購入して、上記のように血清培養液Ａにて維持した。【０１０９】
ラット頭蓋骨由来骨芽細胞は、吉子らの方法（Ａ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＰＰＡＲｇａｍｍａ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ  ｆａｔｅ  ｔｏ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｃａｌｖａｒｉａ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｏｄｅｌ．  Ｙｏｓｈｉｋｏ  Ｙ，Ｏｉｚｕｍｉ  Ｋ，Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｔ，Ｍｉｎａｍｉｚａｋｉ  Ｔ，Ｔａｎｎｅ  Ｋ，Ｍａｅｄａ  Ｎ，Ａｕｂｉｎ  ＪＥ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１０  ５（７）：ｅ１１７８２．）で分離した。【０１１０】
すなわち胎生２１日の雄性Ｗｉｓｔａｒラット頭蓋冠を経時的にコラゲナーゼで消化し、細胞を５分画し、最初の分画（線維芽細胞分画）を除く４分画を別々に１０％ＦＢＳ含有ａｌｐｈａ  ＭＥＭにて培養した。翌日、これらの分画をプールし、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）を添加した同培養液で培養した。これらの細胞はほぼコンフルエントまで増殖した後で、上記のようにトリプシンとＥＤＴＡにて植継いだ。【０１１１】
細胞の形態観察と細胞数の評価方法は実験１〜６と同様である。また、用いた細胞、培養液、ＳＡＭの組み合わせを表６に示す。なお、これらの細胞は培養皿に２０００／ｃｍ２の細胞密度で播種して培養した。【０１１２】
【表６】
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【０１１３】
（結果）
実験３１のＭＴＴ試験結果を図２４（Ａ）に、実験３２のＭＴＴ試験結果を図２４（Ｂ）にそれぞれ示すとともに、実験３１の４日間培養後の写真を図２５に示す。【０１１４】
図２４（Ａ）を見ると、無血清培養液（ＳＴＫ２）存在下で、ヒト線維芽細胞は、ＳＡＭ（Ａ６）〜（Ａ９）とＳＡＭ（Ａ２５）〜ＳＡＭ（Ａ２８）によく接着した。そして、ＳＡＭ（Ａ６）〜ＳＡＭ（Ａ７）、（ＯＨ＝１００からＯＨ：ＣＯＯＨ＝８０：２０）およびＳＡＭ（Ａ２５）〜ＳＡＭ（Ａ２６）（ＯＨ：ＣＨ３＝８０：２０からＯＨ：ＣＨ３＝６０：４０）で最もよく増殖した。【０１１５】
これらのＳＡＭ組成上では、４日以内に、通常培養皿より２倍以上の細胞数が得られた。なお、ＳＡＭ（Ａ８）とＳＡＭ（Ａ２７）〜（Ａ２８）でも中レベルに増殖したが、他の組成では増殖しなかった。無血清培養液で、ヒト線維芽細胞が増殖するＳＡＭ組成は、ヒト間葉系幹細胞が増殖するＳＡＭ組成は部分的に重複していたが、パターンは異なっていた。【０１１６】
以上のことから、表面の水酸基：カルボキシル基の割合が１００：０〜４０：６０、或いは、水酸基：メチル基の割合が８０：２０〜２０：８０、好ましくは、水酸基：カルボキシル基の割合が１００：０〜８０：２０、或いは、水酸基：メチル基の割合が８０：２０〜６０：４０のＳＡＭと、無血清培養液（ＳＴＫ２）とを組み合わせることで、無血清培養液中でも、ヒト線維芽細胞の接着・増殖を促進させ得ることがわかる。【０１１７】
なお、血清培養液Ａにて培養すると、ヒト線維芽細胞は、ＳＡＭ（Ａ６），（Ａ１４）〜（Ａ１６）、（Ａ２５）、（Ａ２６）以外の配合では接着増殖した。とくにＳＡＭ（Ａ１）〜（Ａ５），（Ａ８），（Ａ１７），（Ａ２０）〜（Ａ２４）ではよく接着して通常培養皿以上に増殖した。また血清培養液Ａを使用すると、各種ＳＡＭ上でのヒト線維芽細胞の増殖パターンはヒト骨髄間葉系幹細胞とラット骨髄間葉系幹細胞と類似していた。つまり血清存在下では、細胞の種類や動物種を区別することができなかった。【０１１８】
また、ラット骨芽細胞を用いた実験３３の４日間培養後のＭＴＴ試験結果を図２６に、写真を図２７に示す。ラット骨芽細胞は、無血清培養液（ＳＴＫ２）存在下で、ＳＡＭ（Ａ６）〜（Ａ１２）とＳＡＭ（Ａ２５）〜（Ａ２８）に接着よくした。そして、すべてのＳＡＭ組成で通常培養皿以上の細胞増殖が観察された。特にＳＡＭ（Ａ６）〜（Ａ７）、ＳＡＭ（Ａ１０）〜（Ａ１１）およびＳＡＭ（Ａ２５）〜（Ａ２８）（ＯＨ：ＣＨ３＝８０：２０からＯＨ：ＣＨ３＝２０：８０）で最もよく増殖した。無血清培養液で、骨芽細胞が増殖するＳＡＭ組成は、間葉系幹細胞あるいは線維芽細胞のパターンとは異なっていた。【０１１９】
以上の結果から、表面の水酸基：カルボキシル基の割合が１００：０〜０：１００、カルボキシル基：メチル基の割合が８０：２０、或いは、水酸基：メチル基の割合が８０：２０〜２０：８０のＳＡＭと、無血清培養液（ＳＴＫ２）とを組み合わせることで、無血清培養液中でも、ラット骨芽細胞の接着・増殖を促進させ得ることがわかる。【０１２０】
（実験４１〜４２）
ラット骨髄間葉系幹細胞（ｒａｔ−ＢＭ  ＭＳＣ）の接着と増殖に及ぼす培養皿表面の官能基配合の影響について検証した。【０１２１】
ラット骨髄間葉系幹細胞は、実験１１〜１３と同様の手法で分離、培養して用いた。【０１２２】
細胞の形態観察と細胞数の評価方法は実験１〜６と同様である。また、用いた細胞、培養液、ＳＡＭの組み合わせを表７に示す。【０１２３】
【表７】
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【０１２４】
（結果）
実験４１及び実験４２の４日間培養後のＭＴＴ試験結果を図２８（Ａ）、（Ｂ）に、実験４１及び実験４２の４日間培養後のＤＮＡ定量結果を図２９（Ａ）、（Ｂ）に、実験４１及び実験４２の４日間培養後の写真を図３０、図３１にそれぞれ示す。【０１２５】
ＭＴＴ試験結果とＤＮＡ定量結果とはほぼ同じ傾向であることがわかり、無血清培養液（ＳＴＫ２）存在下では、ＳＡＭ（Ａ６）〜（Ａ１１）でラット骨髄間葉系幹細胞の顕著な増殖が見られる。表面の水酸基：カルボキシル基の割合が１００：０〜０：１００、カルボキシル基：メチル基の割合が１００：０〜８０：２０のＳＡＭと、無血清培養液（ＳＴＫ２）とを組み合わせることで、無血清培地中でも、ラット骨髄間葉系幹細胞の接着・増殖を促進させ得ることがわかる。なお、図２８中の２ｈ−４ｄａｙｓは播種２時間後および４日後での細胞接着の状態を接着が多いもの（Ａ）、非接着細胞が多いもの（Ｆ）を示している。つまりＳＡＭによっては初期接着を促進したものの長期的な接着あるいは増殖を維持しなかったもの、初期接着のみならず増殖を促進したものなどが存在した。ＳＡＭは接着のみならず増殖にも影響することが示された。【０１２６】
（実験５１、５２）
ヒト初代間葉系幹細胞（ｈ−ｐｒｉｍａｒｙ  ＭＳＣ）の接着と増殖に及ぼす培養皿表面の官能基配合の影響について検証した。【０１２７】
ヒト初代骨髄間葉系幹細胞は、広島大学倫理委員会の許可のもとで、腸骨の骨髄液から得た（Ｋｕｂｏ  Ｈ，  Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｍ，  Ｔａｙａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ  ２００９，１４：４０７−４２４）。【０１２８】
ヒト骨髄の単核球画分（Ｒ８２株）をＳＴＫ１培地で稀釈して、各１６ｍｍ培養皿に有核細胞７万個／ｃｍ２の細胞密度になるように０．５ｍＬの細胞浮遊液を播種して、播種３日後に０．２５ｍＬのＳＴＫ１を追加した。そして３日毎に０．５ｍＬのＳＴＫ１にて培地交換した。そして播種から１４日目に細胞の写真撮影をしてから、培養液にＷＳＴ−８試薬を追加し、ＭＴＴ  ａｓｓａｙを行った。また、ヒト骨髄液（Ｒ８３株）をそのまま用いた以外は上記と同様にして播種し、ＭＴＴ  ａｓｓａｙを行った。【０１２９】
細胞の形態観察と細胞数の評価方法は実験１〜６と同様である。また、用いた細胞、培養液、ＳＡＭの組み合わせを表８に示す。【０１３０】
【表８】
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【０１３１】
（結果）
実験５１のＭＴＴ試験結果を図３２に、培養後の写真を図３３にそれぞれ示す。無血清培養液（ＳＴＫ１）存在下では、ＳＡＭ（Ａ６）〜（Ａ１１）でヒト初代間葉系幹細胞の顕著な増殖が見られる。表面の水酸基：カルボキシル基の割合が１００：０〜４０：６０のＳＡＭと、無血清培養液（ＳＴＫ１）とを組み合わせることで、無血清培養液中でも、ヒト初代間葉系幹細胞の接着・増殖を促進させ得ることがわかる。【０１３２】
また、実験５２のＭＴＴ試験結果を図３４に示す。骨髄液を培養した場合、コントロールではほとんど増殖が見られなかったが、ＳＡＭ（Ａ６）〜（Ａ９）では、顕著に増殖した。【０１３３】
また、実験１〜４におけるヒト骨髄間葉系幹細胞の結果、実験２１、２２におけるヒト滑膜由来間葉系幹細胞の結果、実験２３におけるヒト歯髄間葉系幹細胞の結果を見ると、いずれも同様の傾向を示しており、ＳＡＭ（Ａ６）〜（Ａ８）で細胞の増殖が見られる。このことから、ＳＡＭ組成が水酸基：カルボキシル基が１００：０〜６０：４０の割合であれば、他の組織、例えば、脂肪由来、臍帯由来、胎盤由来、羊膜由来、骨膜由来など、ヒト間葉系幹細胞の接着、増殖にも適用可能である。【０１３４】
（実験６１〜６７）
続いて、ヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈ−ＢＭ  ＭＳＣ）の培養皿表面への接着、伸展性等について検証した。【０１３５】
予め培養しておいたヒト骨髄間葉系幹細胞をＳＴＫ２に分散させ、１６ｍｍ培養皿に４０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し培養した。また、参考例として、共焦点ガラスシャーレとＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ或いはＳＴＫ２との組み合わせで上記同様に培養した。用いた培養液と培養皿との組み合わせを表９に示す。【０１３６】
【表９】
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【０１３７】
培養を開始して３時間後及び２４時間後に、それぞれについて、一次抗体及び二次抗体を添加して染色し、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ−１０００Ｄ、株式会社オリンパス製）にて観察し、ヒト骨髄間葉系幹細胞の培養皿への接着や伸展等を評価した。用いた一次抗体は、Actin Cytoskeleton / Focal Adhesion Staining Kit（Merck MILLIPORE社製）、二次抗体は、GOAT ANTI-MOUSE IgG (H&L) FLUORESCEIN CONJUGATED（タカラバイオ株式会社製）である。【０１３８】
図３５〜図３８に、ＳＡＭ（Ａ１）、（Ａ６）、（Ａ８）、（Ａ１１）の写真を示す。また、それぞれの観察の結果、糸状突起、葉状突起、接着斑及びストレスファイバーの有無、並びに、細胞の大きさ及び形状の評価を表１０に示す。評価は以下の指標にて行った。
ｄ：脱着或いは浮遊細胞
Ｓ：小細胞
Ｌ：大細胞
Ｒ：丸まって伸展していない形状
Ｆ：扁平し伸展した形状
−：存在していない
±：存否の判断不能
＋：存在している
＋＋：多く存在している【０１３９】
【表１０】
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【０１４０】
共焦点用ガラスシャーレに関し、血清を含有するＦＢＳ培地（実験６６）では、接着因子を有するので、糸状突起等の存在が見られ、細胞が伸展し大きくなっているが、無血清培地であるＳＴＫ２（実験６７）では、細胞がガラスシャーレに接着せず、糸状突起等の存在がなく細胞の伸展等も見られなかった。【０１４１】
一方、実験６２、６３のＳＡＭ（Ａ６）、（Ａ８）では、接着因子を有さない無血清培地であるＳＴＫ２であっても、糸状突起等が多く存在し、細胞が伸展し大きくなっている。細胞とＳＡＭ（Ａ６）、（Ａ８）との相互作用が活発であり、細胞がＳＡＭ表面に良好に接着するとともに伸展も促進され、これにより細胞の増殖も促進され得ることがわかる。【０１４２】
（実験７１）
続いて、ＳＡＭ（Ａ８）を用い、ヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈ−ＢＭ  ＭＳＣ）の軟骨細胞、脂肪細胞および骨細胞への分化について検証した【０１４３】
予め培養しておいたヒト骨髄間葉系幹細胞を回収後、１６ｍｍ培養皿に４０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し培養した。なお、培養液としてＳＴＫ２を用いた。【０１４４】
ヒト骨髄間葉系幹細胞がコンフルエントに達するまで増殖した後、軟骨細胞、脂肪細胞、骨細胞へ分化させるべく培養液をそれぞれＳＴＫ２、脂肪分化誘導培地、ＳＴＫ３に交換して培養した。脂肪分化誘導培地として、1% Antibiotic-Antimycotic，10% FBS，2mM L-glutamine，10-6MDex，0.2mMindomethacin（Wako Pure Chemical Industries, Ltd），0.01mg/ml insulin（WakoPureChemical Industries, Ltd），0.5mM 3-isobutyl-1-methylxanthine（Wako PureChemicalIndustries, Ltd）を添加したDMEMを用いた。また、それぞれについて、参考例としてＳＡＭ（Ａ８）の代わりに通常培養皿（Ｃｏｎｔｒｏｌ）を用いて上記同様に細胞を培養した。なお、いずれの実験においても、３検体ずつ行った。【０１４５】
（軟骨細胞への分化の検証）
培地をＳＴＫ２に交換後、顕微鏡で経時的に観察し、培養皿への細胞の接着状態を観察した。また、トルイジンブルー染色（Toluidine blue staining）を行い、軟骨細胞に分化しているか否かを検証した。【０１４６】
図３９に、通常培養皿で培養した細胞を染色した写真、図４０に、ＳＡＭ（Ａ８）で培養した細胞を染色した写真をそれぞれ示す。また、表１１に接着状態及びトルイジンブルー染色で染色された細胞の量について示す。【０１４７】
【表１１】
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【０１４８】
通常培養皿では、培地交換して６日後に細胞が培養皿から脱離した。一方、ＳＡＭ（Ａ８）では、細胞が培養皿に接着した状態を保っていた。このため、トルイジンブルー染色は、ＳＡＭ（Ａ８）では培地交換して２９日目、一方の通常培養皿では培地交換して６日後に細胞が培養皿から脱離したため、６日後に行ったものである。トルイジンブルー染色の結果、ＳＡＭ（Ａ８）では、多くの細胞が染色されており、軟骨細胞に分化していることがわかる。【０１４９】
更に、軟骨が形成された際に産生されるグリコサミノグリカン（ｇｌｙｏｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｕｃａｎ：ＧＡＧ）の産生量を測定し、軟骨細胞への分化が促進されているかについて検証した。その結果を図４１に示す。なお、ＳＡＭ（Ａ８）及び通常培養皿ともに、培地交換して２８日目に、培養皿あたりのＧＡＧ産生量を測定した。【０１５０】
通常培養皿では、ＧＡＧは約６０ｎｇ／ｃｕｌｔｕｒｅであったが、ＳＡＭ（Ａ８）では、約１６０ｎｇ／ｃｕｌｔｕｒｅであり、通常培養皿に比べて３倍近くＧＡＧが産生されていた。【０１５１】
これらの結果から、ＳＡＭ（Ａ８）でヒト骨髄間葉系幹細胞を培養すると、軟骨細胞への分化が促進されることがわかった。【０１５２】
（脂肪細胞への分化の検証）
脂肪分化誘導培地に交換した後、共焦点レーザー顕微鏡で観察し、培養皿への細胞の接着状態を観察するとともに、オイルレッドＯ（Oil red O staining）染色により、軟骨細胞に分化しているか否かを検証した。図４２に、通常培養皿にて培養した細胞を染色した写真、図４３に、ＳＡＭ（Ａ８）にて培養した細胞を染色した写真をそれぞれ示す。また、表１２に染色された細胞の量を目視で観察した結果を示す。【０１５３】
【表１２】
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【０１５４】
ＳＡＭ（Ａ８）にて培養した場合、通常培養皿にて培養した場合に比べ、多くの細胞が染色されていることがわかる。【０１５５】
また、脂肪細胞にて発現するＧＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）量を測定した。その結果を図４４に示す。通常培養皿に比べ、ＳＡＭ（Ａ８）ではＧＰＤＨ量が多いことがわかる。これらの結果から、ヒト骨髄間葉系幹細胞が脂肪細胞に分化していることが分かった。【０１５６】
（骨細胞への分化の検証）
ＳＴＫ３に交換した後、骨細胞に発現するＡＬＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）活性を測定した。なお、本実験では、通常培養皿とＳＴＫ３とを組み合わせた参考例のほか、他の参考例として、通常培養皿とＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳとの組み合わせ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）についても行った。【０１５７】
ＡＬＰ活性測定の結果を図４５に示す。通常培養皿に比べ、ＳＡＭ（Ａ８）ではＡＬＰ活性が高いことがわかる。この結果から、ヒト骨髄間葉系幹細胞が骨細胞に分化していることが分かった。【０１５８】
なお、細胞分化は、幹細胞が培養器等に接着、増殖するとともに、適切な分化誘導培地を用いれば生じ得る。それゆえ、実験１〜４にて、ヒト骨髄間葉系幹細胞の接着及び増殖が良好であったＳＡＭ（Ａ６）〜ＳＡＭ（Ａ１０）、即ち、水酸基：カルボキシル基を１００：０〜２０：８０の割合で表面に有する培養器についても、実験７１同様、ヒト骨髄間葉系幹細胞を分化させ得る。すなわち、軟骨分化誘導培地を用いてヒト骨髄間葉系幹細胞を培養すれば軟骨細胞へと分化させ得る。また、骨形成誘導培地を用いればヒト骨髄間葉系幹細胞を骨細胞へと分化させ得る。また、脂肪分化誘導培地を用いればヒト骨髄間葉系幹細胞を脂肪細胞へと分化させ得る。ここで、軟骨分化誘導培地及び骨形成誘導培地については、無血清の培地であっても細胞分化させ得る。無血清の軟骨分化誘導培地及び骨形成誘導培地はそれぞれ制限されるものではなく、一例として上述したＳＴＫ２及びＳＴＫ３がそれぞれ挙げられる。そして、本発明に係る培養器と分化誘導培地を用いて細胞分化させると、通常の培養皿を用いた場合に比べて、多くの細胞が分化しており、本発明に係る培養器を用いた培養方法は細胞の増殖だけでなく、細胞分化に対しても優れていることがわかる。【０１５９】
なお、本発明は、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な実施形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。【０１６０】
本出願は、２０１１年４月５日に出願された日本国特許出願２０１１−０８４１１９号に基づく。本明細書中に、日本国特許出願２０１１−０８４１１９号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１６１】
本発明に係る動物細胞培養キットでは、接着因子が含有されていない無血清培地でも、特定の動物細胞の接着・増殖を促進できるので、再生医療やバイオ医薬などの研究開発に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３４】
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【図４１】
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【図４４】
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【図４５】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2012137830.tif 000034
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４２】
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【図４３】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年5月17日(2013.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
直鎖状アルキル鎖の一方の末端にチオール基を有するとともに他方の末端に親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から選択される官能基を有するアルカンチオールから形成された自己組織化単分子膜を有する培養器と、無血清培地と、を備え、
前記自己組織化単分子膜は、異なる前記官能基を有する２種の前記アルカンチオールから形成され、前記アルカンチオールのチオール基が前記培養器或いは前記培養器に配置される基板に結合し、前記直鎖状アルキル鎖のファンデルワールス力によって前記アルカンチオール同士が凝集することにより表面に２種の前記官能基が所定の割合で露出しており、
動物細胞の接着及び増殖を促進させる、
ことを特徴とする動物細胞培養キット。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
前記親水性官能基が水酸基、アミノ基又はカルボキシル基であり、前記疎水性官能基がアルキル基である、
ことを特徴とする請求項１に記載の動物細胞培養キット。
【請求項４】
水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０の割合で有し、ヒト骨髄間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
【請求項５】
アミノ基：水酸基を４０：６０、カルボキシル基：メチル基を８０：２０、アミノ基：メチル基を２０：８０〜８０：２０、アミノ基：カルボキシル基を４０：６０〜２０：８０、或いは、水酸基：メチル基を８０：２０の割合で有し、不均質な細胞集団において初代のラット間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
【請求項６】
水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜４０：６０の割合で有し、ヒト滑膜由来間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
【請求項７】
水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜６０：４０の割合で有し、ヒト歯髄由来間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
【請求項８】
水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜４０：６０、或いは、水酸基：メチル基を８０：２０〜２０：８０の割合で有し、ヒト線維芽細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
【請求項９】
水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０、或いは、水酸基：メチル基を８０：２０〜２０：８０の割合で有し、ラット骨芽細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
【請求項１０】
水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０、或いは、カルボキシル基：メチル基を８０：２０の割合で有し、ラット骨髄間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
【請求項１１】
水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜４０：６０の割合で有し、ヒト初代間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
【請求項１２】
水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜４０：６０の割合で有し、ヒト間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項３に記載の動物細胞培養キット。
【請求項１３】
直鎖状アルキル鎖の一方の末端にチオール基を有するとともに他方の末端に親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から選択される官能基を有するアルカンチオールから形成された自己組織化単分子膜を有する培養器と、無血清培地とを用い、
前記自己組織化単分子膜は、異なる前記官能基を有する２種の前記アルカンチオールから形成され、前記アルカンチオールのチオール基が前記培養器或いは前記培養器に配置される基板に結合し、前記直鎖状アルキル鎖のファンデルワールス力によって前記アルカンチオール同士が凝集することにより表面に２種の前記官能基が所定の割合で露出しており、
所定の動物細胞の接着及び増殖を促進させる、
ことを特徴とする動物細胞の培養方法。
【請求項１４】
直鎖状アルキル鎖の一方の末端にチオール基を有するとともに他方の末端に親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から選択される官能基を有するアルカンチオールから形成された自己組織化単分子膜を有する培養器と、無血清培地とを用い、
前記自己組織化単分子膜は、異なる前記官能基を有する２種の前記アルカンチオールから形成され、前記アルカンチオールのチオール基が前記培養器或いは前記培養器に配置される基板に結合し、前記直鎖状アルキル鎖のファンデルワールス力によって前記アルカンチオール同士が凝集することにより表面に２種の前記官能基が所定の割合で露出しており、
不均質な細胞集団から選択的に所定の動物細胞の接着及び増殖を促進させる、
ことを特徴とする動物細胞の選択培養方法。
【請求項１５】
血清含有培地と、直鎖状アルキル鎖の一方の末端にチオール基を有するとともに他方の末端にアミノ基、水酸基又はカルボキシル基を有するアルカンチオールから形成された自己組織化単分子膜を有する培養器とを用い、
前記自己組織化単分子膜は、異なる官能基を有する２種の前記アルカンチオールから形成され、前記アルカンチオールのチオール基が前記培養器或いは前記培養器に配置される基板に結合し、前記直鎖状アルキル鎖のファンデルワールス力によって前記アルカンチオール同士が凝集することにより表面に２種の前記官能基が所定の割合で露出しており、
アミノ基：水酸基を８０：２０〜２０：８０、水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０、或いは、アミノ基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０の割合で表面に有し、
ヒト間葉系幹細胞、ヒト線維芽細胞又はラット間葉系幹細胞の増殖を促進させる、
ことを特徴とする動物細胞の培養方法。
【請求項１６】
直鎖状アルキル鎖の一方の末端にチオール基を有するとともに他方の末端に親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から選択される官能基を有するアルカンチオールから形成された自己組織化単分子膜を有する培養器と、無血清の分化誘導培地とを用い、
前記自己組織化単分子膜は、異なる前記官能基を有する２種の前記アルカンチオールから形成され、前記アルカンチオールのチオール基が前記培養器或いは前記培養器に配置される基板に結合し、前記直鎖状アルキル鎖のファンデルワールス力によって前記アルカンチオール同士が凝集することにより表面に２種の前記官能基が所定の割合で露出しており、
ヒト骨髄間葉系幹細胞を培養して前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を軟骨細胞又は骨細胞に分化させる、
ことを特徴とする細胞分化方法。
【請求項１７】
水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０の割合で有する前記培養器と、無血清の軟骨分化誘導培地とを用い、前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化させる、
ことを特徴とする請求項１６に記載の細胞分化方法。
【請求項１８】
水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０の割合で有する前記培養器と、無血清の骨形成分化誘導培地とを用い、前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を骨細胞に分化させる、
ことを特徴とする請求項１６に記載の細胞分化方法。
【請求項１９】
直鎖状アルキル鎖の一方の末端にチオール基を有するとともに他方の末端に親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から選択される官能基を有するアルカンチオールから形成された自己組織化単分子膜を有する培養器と脂肪分化誘導培地とを用い、
前記自己組織化単分子膜は、異なる前記官能基を有する２種の前記アルカンチオールから形成され、前記アルカンチオールのチオール基が前記培養器或いは前記培養器に配置される基板に結合し、前記直鎖状アルキル鎖のファンデルワールス力によって前記アルカンチオール同士が凝集することにより表面に２種の前記官能基が所定の割合で露出しており、
ヒト骨髄間葉系幹細胞を培養し、前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を脂肪細胞に分化させる、
ことを特徴とする細胞分化方法。
【手続補正書】
【提出日】平成25年9月20日(2013.9.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
直鎖状アルキル鎖の一方の末端に表面活性基を有するとともに他方の末端に親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から選択される官能基を有するアルカンから形成された自己組織化単分子膜を有する培養器と、無血清培地と、を備え、
前記自己組織化単分子膜は、異なる前記官能基を有する２種の前記アルカンから形成され、前記アルカンの表面活性基が前記培養器或いは前記培養器に配置される基板に結合し、前記直鎖状アルキル鎖のファンデルワールス力によって前記アルカン同士が凝集することにより表面に２種の前記官能基が所定の割合で露出しており、
動物細胞の接着及び増殖を促進させる、
ことを特徴とする動物細胞培養キット。
【請求項２】
前記親水性官能基が水酸基、アミノ基又はカルボキシル基であり、前記疎水性官能基がアルキル基である、
ことを特徴とする請求項１に記載の動物細胞培養キット。
【請求項３】
水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０の割合で有し、ヒト骨髄間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項２に記載の動物細胞培養キット。
【請求項４】
アミノ基：水酸基を４０：６０、カルボキシル基：メチル基を８０：２０、アミノ基：メチル基を２０：８０〜８０：２０、アミノ基：カルボキシル基を４０：６０〜２０：８０、或いは、水酸基：メチル基を８０：２０の割合で有し、不均質な細胞集団において初代のラット間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項２に記載の動物細胞培養キット。
【請求項５】
水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜４０：６０の割合で有し、ヒト滑膜由来間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項２に記載の動物細胞培養キット。
【請求項６】
水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜６０：４０の割合で有し、ヒト歯髄由来間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項２に記載の動物細胞培養キット。
【請求項７】
水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜４０：６０、或いは、水酸基：メチル基を８０：２０〜２０：８０の割合で有し、ヒト線維芽細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項２に記載の動物細胞培養キット。
【請求項８】
水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０、或いは、水酸基：メチル基を８０：２０〜２０：８０の割合で有し、ラット骨芽細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項２に記載の動物細胞培養キット。
【請求項９】
水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０、或いは、カルボキシル基：メチル基を８０：２０の割合で有し、ラット骨髄間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項２に記載の動物細胞培養キット。
【請求項１０】
水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜４０：６０の割合で有し、ヒト初代間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項２に記載の動物細胞培養キット。
【請求項１１】
水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜４０：６０の割合で有し、ヒト間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する、
ことを特徴とする請求項２に記載の動物細胞培養キット。
【請求項１２】
直鎖状アルキル鎖の一方の末端に表面活性基を有するとともに他方の末端に親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から選択される官能基を有するアルカンから形成された自己組織化単分子膜を有する培養器と、無血清培地とを用い、
前記自己組織化単分子膜は、異なる前記官能基を有する２種の前記アルカンから形成され、前記アルカンの表面活性基が前記培養器或いは前記培養器に配置される基板に結合し、前記直鎖状アルキル鎖のファンデルワールス力によって前記アルカン同士が凝集することにより表面に２種の前記官能基が所定の割合で露出しており、
所定の動物細胞の接着及び増殖を促進させる、
ことを特徴とする動物細胞の培養方法。
【請求項１３】
直鎖状アルキル鎖の一方の末端に表面活性基を有するとともに他方の末端に親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から選択される官能基を有するアルカンから形成された自己組織化単分子膜を有する培養器と、無血清培地とを用い、
前記自己組織化単分子膜は、異なる前記官能基を有する２種の前記アルカンから形成され、前記アルカンの表面活性基が前記培養器或いは前記培養器に配置される基板に結合し、前記直鎖状アルキル鎖のファンデルワールス力によって前記アルカン同士が凝集することにより表面に２種の前記官能基が所定の割合で露出しており、
不均質な細胞集団から選択的に所定の動物細胞の接着及び増殖を促進させる、
ことを特徴とする動物細胞の選択培養方法。
【請求項１４】
血清含有培地と、直鎖状アルキル鎖の一方の末端に表面活性基を有するとともに他方の末端にアミノ基、水酸基又はカルボキシル基を有するアルカンから形成された自己組織化単分子膜を有する培養器とを用い、
前記自己組織化単分子膜は、異なる官能基を有する２種の前記アルカンから形成され、前記アルカンの表面活性基が前記培養器或いは前記培養器に配置される基板に結合し、前記直鎖状アルキル鎖のファンデルワールス力によって前記アルカン同士が凝集することにより表面に２種の前記官能基が所定の割合で露出しており、
アミノ基：水酸基を８０：２０〜２０：８０、水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０、或いは、アミノ基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０の割合で表面に有し、
ヒト間葉系幹細胞、ヒト線維芽細胞又はラット間葉系幹細胞の増殖を促進させる、
ことを特徴とする動物細胞の培養方法。
【請求項１５】
直鎖状アルキル鎖の一方の末端に表面活性基を有するとともに他方の末端に親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から選択される官能基を有するアルカンから形成された自己組織化単分子膜を有する培養器と、無血清の分化誘導培地とを用い、
前記自己組織化単分子膜は、異なる前記官能基を有する２種の前記アルカンから形成され、前記アルカンの表面活性基が前記培養器或いは前記培養器に配置される基板に結合し、前記直鎖状アルキル鎖のファンデルワールス力によって前記アルカン同士が凝集することにより表面に２種の前記官能基が所定の割合で露出しており、
ヒト骨髄間葉系幹細胞を培養して前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を軟骨細胞又は骨細胞に分化させる、
ことを特徴とする細胞分化方法。
【請求項１６】
水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０の割合で有する前記培養器と、無血清の軟骨分化誘導培地とを用い、前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化させる、
ことを特徴とする請求項１５に記載の細胞分化方法。
【請求項１７】
水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０の割合で有する前記培養器と、無血清の骨形成分化誘導培地とを用い、前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を骨細胞に分化させる、
ことを特徴とする請求項１５に記載の細胞分化方法。
【請求項１８】
直鎖状アルキル鎖の一方の末端に表面活性基を有するとともに他方の末端に親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から選択される官能基を有するアルカンから形成された自己組織化単分子膜を有する培養器と脂肪分化誘導培地とを用い、
前記自己組織化単分子膜は、異なる前記官能基を有する２種の前記アルカンから形成され、前記アルカンの表面活性基が前記培養器或いは前記培養器に配置される基板に結合し、前記直鎖状アルキル鎖のファンデルワールス力によって前記アルカン同士が凝集することにより表面に２種の前記官能基が所定の割合で露出しており、
ヒト骨髄間葉系幹細胞を培養し、前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を脂肪細胞に分化させる、
ことを特徴とする細胞分化方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明の第１の観点に係る動物細胞培養キットは、
直鎖状アルキル鎖の一方の末端に表面活性基を有するとともに他方の末端に親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から選択される官能基を有するアルカンから形成された自己組織化単分子膜を有する培養器と、無血清培地と、を備え、
前記自己組織化単分子膜は、異なる前記官能基を有する２種の前記アルカンから形成され、前記アルカンの表面活性基が前記培養器或いは前記培養器に配置される基板に結合し、前記直鎖状アルキル鎖のファンデルワールス力によって前記アルカン同士が凝集することにより表面に２種の前記官能基が所定の割合で露出しており、
動物細胞の接着及び増殖を促進させる、
ことを特徴とする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
また、水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０の割合で有し、ヒト骨髄間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
また、アミノ基：水酸基を４０：６０、カルボキシル基：メチル基を８０：２０、アミノ基：メチル基を２０：８０〜８０：２０、アミノ基：カルボキシル基を４０：６０〜２０：８０、或いは、水酸基：メチル基を８０：２０の割合で有し、不均質な細胞集団において初代のラット間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
また、水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜４０：６０の割合で有し、ヒト滑膜由来間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
また、水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜６０：４０の割合で有し、ヒト歯髄由来間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
また、水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜４０：６０、或いは、水酸基：メチル基を８０：２０〜２０：８０の割合で有し、ヒト線維芽細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
また、水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０、或いは、水酸基：メチル基を８０：２０〜２０：８０の割合で有し、ラット骨芽細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
また、水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０、或いは、カルボキシル基：メチル基を８０：２０の割合で有し、ラット骨髄間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
また、水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜４０：６０の割合で有し、ヒト初代間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
また、水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜４０：６０の割合で有し、ヒト間葉系幹細胞の接着及び増殖を促進する形態でもよい。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本発明の第２の観点に係る動物細胞の培養方法は、
直鎖状アルキル鎖の一方の末端に表面活性基を有するとともに他方の末端に親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から選択される官能基を有するアルカンから形成された自己組織化単分子膜を有する培養器と、無血清培地とを用い、
前記自己組織化単分子膜は、異なる前記官能基を有する２種の前記アルカンから形成され、前記アルカンの表面活性基が前記培養器或いは前記培養器に配置される基板に結合し、前記直鎖状アルキル鎖のファンデルワールス力によって前記アルカン同士が凝集することにより表面に２種の前記官能基が所定の割合で露出しており、
所定の動物細胞の接着及び増殖を促進させる、
ことを特徴とする。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
本発明の第３の観点に係る動物細胞の選択培養方法は、
直鎖状アルキル鎖の一方の末端に表面活性基を有するとともに他方の末端に親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から選択される官能基を有するアルカンから形成された自己組織化単分子膜を有する培養器と、無血清培地とを用い、
前記自己組織化単分子膜は、異なる前記官能基を有する２種の前記アルカンから形成され、前記アルカンの表面活性基が前記培養器或いは前記培養器に配置される基板に結合し、前記直鎖状アルキル鎖のファンデルワールス力によって前記アルカン同士が凝集することにより表面に２種の前記官能基が所定の割合で露出しており、
不均質な細胞集団から選択的に所定の動物細胞の接着及び増殖を促進させる、
ことを特徴とする。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
本発明の第４の観点に係る動物細胞の培養方法は、
血清含有培地と、直鎖状アルキル鎖の一方の末端に表面活性基を有するとともに他方の末端にアミノ基、水酸基又はカルボキシル基を有するアルカンから形成された自己組織化単分子膜を有する培養器とを用い、
前記自己組織化単分子膜は、異なる官能基を有する２種の前記アルカンから形成され、前記アルカンの表面活性基が前記培養器或いは前記培養器に配置される基板に結合し、前記直鎖状アルキル鎖のファンデルワールス力によって前記アルカン同士が凝集することにより表面に２種の前記官能基が所定の割合で露出しており、
アミノ基：水酸基を８０：２０〜２０：８０、水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０、或いは、アミノ基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０の割合で表面に有し、
ヒト間葉系幹細胞、ヒト線維芽細胞又はラット間葉系幹細胞の増殖を促進させる、
ことを特徴とする。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
本発明の第５の観点に係る細胞分化方法は、
直鎖状アルキル鎖の一方の末端に表面活性基を有するとともに他方の末端に親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から選択される官能基を有するアルカンから形成された自己組織化単分子膜を有する培養器と、無血清の分化誘導培地とを用い、
前記自己組織化単分子膜は、異なる前記官能基を有する２種の前記アルカンから形成され、前記アルカンの表面活性基が前記培養器或いは前記培養器に配置される基板に結合し、前記直鎖状アルキル鎖のファンデルワールス力によって前記アルカン同士が凝集することにより表面に２種の前記官能基が所定の割合で露出しており、
ヒト骨髄間葉系幹細胞を培養して前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を軟骨細胞又は骨細胞に分化させる、
ことを特徴とする。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
また、水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０の割合で有する前記培養器と、無血清の軟骨分化誘導培地とを用い、前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化させてもよい。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
また、水酸基：カルボキシル基を８０：２０〜２０：８０の割合で有する前記培養器と、無血清の骨形成分化誘導培地とを用い、前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を骨細胞に分化させてもよい。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
本発明の第６の観点に係る細胞分化方法は、
直鎖状アルキル鎖の一方の末端に表面活性基を有するとともに他方の末端に親水性官能基及び疎水性官能基からなる群から選択される官能基を有するアルカンから形成された自己組織化単分子膜を有する培養器と脂肪分化誘導培地とを用い、
前記自己組織化単分子膜は、異なる前記官能基を有する２種の前記アルカンから形成され、前記アルカンの表面活性基が前記培養器或いは前記培養器に配置される基板に結合し、前記直鎖状アルキル鎖のファンデルワールス力によって前記アルカン同士が凝集することにより表面に２種の前記官能基が所定の割合で露出しており、
ヒト骨髄間葉系幹細胞を培養し、前記ヒト骨髄間葉系幹細胞を脂肪細胞に分化させる、
ことを特徴とする。
【国際調査報告】
2012137830.tif 000060
2012137830.tif 000061
2012137830.tif 000062
2012137830.tif 000063
2012137830.tif 000064
2012137830.tif 000065
2012137830.tif 000066
2012137830.tif 000067