(57)【要約】  本発明は、遺伝子中のライブラリを保持したまま保存でき、且つ、保存安定性に優れたバイサルファイト反応後のDNAの取得方法の提供、並びに、従来のバイサルファイト法と比較して、より精度よくメチル化シトシンを検出する方法の提供を課題とする。具体的には、「一本鎖DNAを、１）バイサルファイト反応、２）逆転写酵素反応の順に付すことを特徴とする、非メチル化シトシンがウラシルに変換された前記一本鎖DNAに対して相補なDNAの取得方法」、「一本鎖DNAを、１）バイサルファイト反応、２）逆転写酵素反応、３）PCR反応の順に付すことを特徴とする、非メチル化シトシンがウラシルに変換された前記一本鎖DNAに対して相補なDNAの増幅方法」並びに「一本鎖DNAを、１）バイサルファイト反応、２）逆転写酵素反応、３）PCR反応の順に付し、得られたPCRの増幅産物の塩基配列解析を行うことを特徴とする、前記一本鎖DNA中のメチル化シトシンの検出方法」に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖DNAを、１）バイサルファイト反応、２）逆転写酵素反応の順に付すことを特徴とする、非メチル化シトシンがウラシルに変換された前記一本鎖DNAに対して相補なDNAの取得方法。
【請求項２】
一本鎖DNAが、二本鎖DNAをアルカリ処理に付すことにより得たものである請求項１に記載の取得方法。
【請求項３】
一本鎖DNAを、１）バイサルファイト反応、２）逆転写酵素反応、３）PCR反応の順に付すことを特徴とする、非メチル化シトシンがウラシルに変換された前記一本鎖DNAに対して相補なDNAの増幅方法。
【請求項４】
PCR反応が、該反応におけるDNAポリメラーゼとしてα型DNAポリメラーゼを用いてなされるものである、請求項３記載の増幅方法。
【請求項５】
一本鎖DNAが、二本鎖DNAをアルカリ処理に付すことにより得たものである請求項３に記載の増幅方法。
【請求項６】
PCR反応が、該反応におけるDNAポリメラーゼとしてα型DNAポリメラーゼを用いてなされるものであり、且つ、一本鎖DNAが、二本鎖DNAをアルカリ処理に付すことにより得たものである請求項３に記載の増幅方法。
【請求項７】
DNAを含む溶液を、１）バイサルファイト反応、２）逆転写酵素反応、３）PCR反応の順に付し、得られたPCRの増幅産物の塩基配列解析を行うことを特徴とする、前記一本鎖DNA中のメチル化シトシンの検出方法。
【請求項８】
PCR反応が、該反応におけるDNAポリメラーゼとしてα型DNAポリメラーゼを用いてなされるものである、請求項７記載の検出方法。
【請求項９】
一本鎖DNAが、二本鎖DNAをアルカリ処理に付すことにより得たものである請求項７に記載の検出方法。
【請求項１０】
PCR反応が、該反応におけるDNAポリメラーゼとしてα型DNAポリメラーゼを用いてなされるものであり、且つ、一本鎖DNAが、二本鎖DNAをアルカリ処理に付すことにより得たものである請求項７記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイサルファイト反応による非メチル化シトシンのウラシルへの変換を利用した、DNA中のメチル化シトシンの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内におけるゲノムDNAのメチル化は、mRNA発現を抑制するために起こることが知られている。更に、ゲノム上のメチル化のパターンの差異が、発生、分化、癌等の疾患に関係することも報告されており、ゲノムDNAのメチル化を解析することは、病気の原因解明や予防、医薬品の開発、再生医療の研究等において重要な役割を持っている。
一方、DNA塩基配列中のメチル化シトシンを測定する方法としては、メチル化感受性の制限酵素による切断片を比較する方法、バイサルファイト法、methylation-specific PCR法、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いる方法等が知られている。その中でもバイサルファイト法は、低コストで且つハイスループットへの応用もでき、シークエンシングやスクリーニングに有効であるため、一般的な方法として普及してきている。
しかしながら、該バイサルファイト法は、非メチル化シトシンからウラシルへの変換率が高くないため、メチル化シトシンの検出精度が低い等の問題を有していた。そのため、現在、精度の高いバイサルファイト法の開発が望まれていた。
また、バイサルファイト反応を行ったDNAは、非メチル化シトシンがウラシルに変換されるため保存安定性に欠けるものであった。即ち、バイサルファイト反応に付した遺伝子を再度利用しようとしても安定に保存できる期間が数日程度であるため、再利用するためには、通常PCRにより増幅したものを保存しておく必要があった。しかし、PCR反応に付したものは特定のDNAしか増幅されないため、遺伝子中のライブラリを保持したまま保存するには適していなかった。そのため、遺伝子中のライブラリを保持したまま保存でき、且つ、保存安定性に優れたバイサルファイト反応後のDNAの取得方法の開発も望まれていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、遺伝子中のライブラリを保持したまま保存でき、且つ、保存安定性に優れたバイサルファイト反応後のDNAの取得方法の提供、並びに、従来のバイサルファイト法と比較して、より精度よくメチル化シトシンを検出する方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記状況に鑑み、精度の高いバイサルファイト法を開発するために鋭意研究した結果、バイサルファイト反応に付した一本鎖DNAを逆転写酵素反応に付すことにより得られた一本鎖DNAが、ウラシルを含まないため保存安定性に優れるものであることを見出し、本発明を完成するに至った。また、該一本鎖DNAは、PCR反応前の溶液であるため、遺伝子中のライブラリを保持するものでもあった。よって、上記の如く、一本鎖DNAをバイサルファイト反応、逆転写酵素反応に付して得られた一本鎖DNAは、従来法の問題を解決した、保存安定性に優れ且つライブラリを保持するDNAであった。通常DNAを鋳型として逆転写酵素反応に付すことはないため、上記のようにバイサルファイト反応後のDNAを鋳型として逆転写酵素反応に付すことは、本発明者らが初めて行ったことであり、それによりこのような効果が得られることは意外なことであった。
更に、バイサルファイト反応に付した一本鎖DNAを逆転写酵素反応に付して得られた反応産物をPCRに付すことにより、非メチル化シトシンをウラシルに変換した一本鎖DNAを効率よく増幅できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００５】
即ち、本発明は、「一本鎖DNAを、１）バイサルファイト反応、２）逆転写酵素反応の順に付すことを特徴とする、非メチル化シトシンがウラシルに変換された前記一本鎖DNAに対して相補なDNAの取得方法（以下、本発明のウラシル化DNAの相補DNAの取得方法と略記する場合がある）」、「一本鎖DNAを、１）バイサルファイト反応、２）逆転写酵素反応、３）PCR反応の順に付すことを特徴とする、非メチル化シトシンがウラシルに変換された前記一本鎖DNAに対して相補なDNAの増幅方法（以下、本発明のウラシル化DNAの相補DNA増幅方法と略記する場合がある）」並びに「一本鎖DNAを、１）バイサルファイト反応、２）逆転写酵素反応、３）PCR反応の順に付し、得られたPCRの増幅産物の塩基配列解析を行うことを特徴とする、前記一本鎖DNA中のメチル化シトシンの検出方法（以下、本発明のメチル化シトシンの検出方法と略記する場合がある）」に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のウラシル化DNAの相補DNAの取得方法により得られたDNAは、ウラシルを有さないため保存安定性に優れ、且つ、遺伝子中のライブラリを保持したまま保存することができる。また、本発明の方法によれば、ほぼ全ての非メチル化シトシンを効率よくウラシルに変換してDNAを増幅することができる。その結果、メチル化シトシンを高精度に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】各種のPCR増幅産物を電気泳動した結果である。左から順に、実験例１におけるES細胞及びMEF細胞由来のNanog遺伝子、比較例１におけるES細胞由来のNanog遺伝子、比較例２におけるMEF細胞由来のNanog遺伝子、実施例１におけるES細胞由来のNanog遺伝子、実施例２におけるMEF細胞由来のNanog遺伝子を、それぞれ泳動した結果であり、右端は、マーカー［（oneStep Ladder100、0.1-2kbp（ニッポンジーン社製）］を表す。
【図２】各種のPCR増幅産物を電気泳動した結果である。各種のPCR増幅産物を電気泳動した結果である。左から順に、実験例１におけるES細胞及びMEF細胞由来のRex1遺伝子、比較例１におけるES細胞由来のRex1遺伝子、比較例２におけるMEF細胞由来のRex1遺伝子、実施例１におけるES細胞由来のRex1遺伝子、実施例２におけるMEF細胞由来のRex1遺伝子を、それぞれ泳動した結果であり、右端は、マーカー［（oneStep Ladder100、0.1-2kbp（ニッポンジーン社製）］を表す。
【図３】左から、実施例１におけるES細胞由来のCD133遺伝子の泳動結果を、実施例２におけるMEF細胞由来のCD133遺伝子の泳動結果であり、右端はマーカー［（oneStep Ladder100、0.1-2kbp（ニッポンジーン社製）］を表す。
【図４】Normalは、既知のNanog遺伝子の塩基配列（塩基配列13、GeneBank Accession No. AC131715）を、ESは、本発明のメチル化シトシンの検出方法により得たES細胞由来Nanog遺伝子の塩基配列（塩基配列14）を、MEFは、本発明のメチル化シトシンの検出方法により得たES細胞由来Nanog遺伝子の塩基配列（塩基配列15）を、それぞれ表す。
【図５】Normalは、既知のRex1遺伝子の塩基配列（塩基配列16、GeneBank Accession No. AC127575）を、ESは、本発明のメチル化シトシンの検出方法により得たES細胞由来Rex1遺伝子の塩基配列（塩基配列17）を、MEFは、本発明のメチル化シトシンの検出方法により得たES細胞由来Rex1遺伝子の塩基配列（塩基配列18）を、それぞれ表す。
【図６】Normalは、既知のCD133遺伝子の塩基配列（塩基配列19、GeneBank Accession No. AC103621）を、ESは、本発明のメチル化シトシンの検出方法により得たES細胞由来CD133遺伝子の塩基配列（塩基配列20）を、MEFは、本発明のメチル化シトシンの検出方法により得たES細胞由来CD133遺伝子の塩基配列（塩基配列21）を、それぞれ表す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明に係る一本鎖DNAとしては、メチル化シトシンを含有する一本鎖DNAが好ましく、メチル化シトシンの含有率が高いプロモーター領域を有するものが好ましい。該一本鎖DNAとしては、未知配列であっても既知配列であってもよいが、未知配列の場合、バイサルファイト反応に付す前の一本鎖DNAについて塩基配列解析をする必要があるため、既知の配列の方が好ましい。該一本鎖DNAの塩基数は、通常50〜300塩基であり、80〜300塩基が好ましく、100〜200塩基がより好ましい。
【０００９】
本発明に係る一本鎖DNAは、例えばラボマニュアル遺伝子工学（丸善）、遺伝子工学ハンドブック（羊土社）等に記載のアルカリSDS法等公知のDNA抽出方法に従って、或いは、市販のゲノムDNAの抽出キットを用いて、細胞、微生物、ウィルス等から抽出することにより得られる。尚、抽出されたDNAが二本鎖の場合には、自体公知の一本鎖化処理により一本鎖DNAを得ることができる。
【００１０】
該一本鎖化処理としては、通常この分野で用いられる、DNAを一本鎖化する処理であれば特に限定はされないが、例えば通常80〜100℃で、好ましくは80〜90℃で通常30秒〜10分、好ましくは1〜3分間加熱することによりなされる熱処理や例えばDNAをアルカリに接触させることによりなされるアルカリ処理等が挙げられる。上記のうち、アルカリ処理は、次工程へ移行する際に一本鎖DNAが二本鎖に戻る可能性が低いため、好ましい。該アルカリ処理としては、具体的には例えばアルカリ又はその水溶液を、本発明に係る一本鎖DNA又は本発明に係る一本鎖DNAを含む溶液に添加して溶液を通常pH10〜14、好ましくは12〜14のアルカリ性にすることによりなされる。該アルカリとしては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、水酸化バリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等のアルカリ土類金属水酸化物、炭酸ナトリウム等のアルカリ金属の炭酸塩、アンモニア、アミン類が挙げられるが、中でも水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物が好ましく、これらの中でも水酸化ナトリウムが特に好ましい。該アルカリ処理は、より具体的には、一本鎖DNAを含む溶液１μＬに対して0.5〜3mol/Lのアルカリ水溶液を通常0.1〜１μＬ、好ましくは０．１〜０．５μＬ添加し、通常5〜60分間、好ましくは5〜30分間、通常25〜70℃、好ましくは30〜50℃で加温することによりなされる。
【００１１】
［非メチル化シトシンがウラシルに変換された一本鎖DNAに対して相補なDNAの取得方法（本発明のウラシル化DNAの相補DNAの取得方法）］
本発明のウラシル化DNAの相補DNAの取得方法は、一本鎖DNAを、１）バイサルファイト反応、２）逆転写酵素反応の順に付すことによりなされ、該方法により、非メチル化シトシンがウラシルに変換された前記一本鎖DNAに対して相補なDNAを容易に取得することができる。
【００１２】
上記バイサルファイト反応としては、メチル化シトシンはそのままで非メチル化シトシンのみをウラシルに変換する、通常この分野で用いられるバイサルファイト反応であれば何れでもよい。具体的には、例えば一本鎖DNAを、要すればスカベンジャーの存在下で、亜硫酸塩組成物と反応させた後、加水分解させ、更に、アルカリ存在下で脱スルホン酸化させることによりなされる。
【００１３】
上記バイサルファイト反応に一本鎖DNAを供する場合には、一本鎖DNAを溶解した溶液で供するのが通常であるが、該溶液としては、例えばpH6〜8の、MES、HEPES等のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、滅菌水等に溶解したもの等が挙げられ、中でも滅菌水に溶解したものが好ましい。該溶液中の一本鎖DNA量は特に限定はされないが、通常溶液1〜１０μＬ中に10〜100ngである。
【００１４】
上記バイサルファイト反応中の一本鎖DNAと亜硫酸塩組成物の反応における、亜硫酸塩としては、例えば亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸アンモニウム等が挙げられ、亜硫酸水素ナトリウムが好ましい。その使用量は、通常一本鎖DNA 50ng〜500ngを含む1〜５００μＬの溶液に対して反応液中の終濃度が1〜6mol/Lとなるように添加される。上記スカベンジャーとしては、例えば、ハイドロキノン等のハイドロキノン化合物等が挙げられる。該スカベンジャーは、通常一本鎖DNA500ng〜５μｇを含む１〜５００μＬの溶液に対して終濃度が1〜5mmol/Lとなるように添加されればよい。該一本鎖DNAと亜硫酸塩との反応は、通常30〜70℃、好ましくは40〜60℃、より好ましくは50〜60℃で、通常40分〜24時間、好ましくは1時間〜20時間、より好ましくは4時間〜16時間反応させることによりなされる。
【００１５】
上記バイサルファイト反応中の加水分解は、通常この分野でなされている方法であれば特に限定はされないが、通常30〜70℃、好ましくは40〜60℃で、通常40分〜24時間、好ましくは1時間〜20時間、より好ましくは4時間〜16時間加熱することによりなされる。尚、該加水分解処理は、上記一本鎖DNAと亜硫酸塩の反応と同時に進めてもよい。
【００１６】
尚、上記加水分解を行った一本鎖DNAについては、脱スルホン酸化処理をする前に、精製処理に付すのが好ましい。該精製処理は、バイサルファイト反応において用いられる高濃度の亜硫酸塩等を取り除くことを目的としてなされるものであり、通常この分野で行われるDNAの精製方法に準じてなされればよい。具体的には、例えば一本鎖DNA又は一本鎖DNAを含む溶液に、グアニジン塩酸塩、ヨウ化ナトリウム等のカオトロピック剤を添加し、それを、HPLC法等により分離精製する方法や、例えばフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合溶液による抽出精製、アルコール沈殿法、シリカゲルを充填したカラムによる精製、フィルターろ過法等が挙げられ、中でもアルコール沈殿法が好ましい。該アルコール沈殿法としては、具体的には以下のようになされる。
【００１７】
即ち、加水分解後の一本鎖DNAを含む溶液１０μＬに対して、通常アルコール40〜1１０μＬ、緩衝液30〜100μLを添加し、遠心分離を行う。遠心分離後、上清を除去しアルコールで洗浄することにより、目的の一本鎖DNAを分離精製することができる。上記アルコール及び緩衝液添加の際、分離後の上清の除去を容易にするために、一本鎖DNAを含む溶液１０μＬに対して0.1〜１μＬのエタチンメイトやグリコーゲンを添加してもよい。上記アルコールとしては、エタノール、イソプロパノール、ブタノール等が挙げられるが、イソプロパノールが特に好ましい。本発明に係るバイサルファイト反応においては、理由は不明であるが、イソプロパノールを用いると、目的の一本鎖DNAのみを効率よく沈殿させることができ、効率よく反応を進めることが可能となる。上記緩衝液としては、例えばMES、HEPES等のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液等が挙げられ、中でも、MES、HEPES等のグッド緩衝液、トリス緩衝液等が好ましく、トリス緩衝液が特に好ましい。これら緩衝液のpHは、通常7〜８、好ましくは7〜7.5であり、緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常0.1〜5 mol/L、好ましくは0.1〜2 mol/Lの範囲である。上記遠心分離は、通常この分野でなされる態様であれば特に限定されないが、通常10,000〜22,000gで10〜30分間なされる。
【００１８】
上記バイサルファイト反応中の脱スルホン酸化反応としては、上記一本鎖化処理の項のアルカリ処理と同じ方法が挙げられ、その好ましい態様も同じものが挙げられる。
【００１９】
逆転写酵素反応は、通常この分野において、逆転写酵素が有する逆転写酵素活性（逆転写反応活性：RNA依存性DNAポリメラーゼ活性）を利用して一本鎖RNAを鋳型として相補鎖DNAを合成するために用いられる。しかしながら、本発明においては、逆転写酵素が有するDNA依存性DNAポリメラーゼ活性を利用して一本鎖DNAを鋳型として相補鎖DNAを合成するために用いられる。即ち、本発明における逆転写酵素反応としては、鋳型として一本鎖RNAの代わりに一本鎖DNAを用いる以外は、通常この分野で用いられている自体公知の一本鎖RNAを鋳型として相補鎖DNAを合成する方法に準じて行えばよく、上記本発明に係るバイサルファイト反応を行った一本鎖DNA（以下、バイサルファイト反応後DNAと略記する場合がある）を逆転写酵素反応に付せばよく、市販のキットを用いて行うこともできる。具体的には例えば、バイサルファイト反応後DNAの核酸量１μgに、逆転写酵素を通常50〜500 Units、好ましくは100〜400 Units、逆転写酵素反応用プライマーを通常0.1〜1μg、好ましくは0.5〜1μg、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTPs）をそれぞれ通常1〜50nmol、好ましくは1〜20nmol添加し、トリス塩酸緩衝液、HEPES、MOPS等の緩衝液（pH7〜8.5）中で、好ましくはトリス緩衝液、HEPES等の緩衝液（pH8〜8.5）中で、通常35〜50℃、好ましくは40〜50℃で通常30〜90分間、好ましくは30〜60分間反応させる。これにより、バイサルファイト反応後DNAに対して相補な一本鎖DNAを得ることができる。尚、逆転写酵素反応用プライマーがランダムプライマーの場合には、上記反応を行う前にアニーリング反応を進める必要がある。そのため、ランダムプライマーを用いて反応させる場合には、バイサルファイト反応後DNAに、逆転写酵素、ランダムプライマー、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTPs）を上記量添加した後、通常20〜40℃、好ましくは20〜30℃で5〜30分間、好ましくは10〜20分間アニーリング反応を行い、その後、上記温度で上記時間逆転写酵素反応させることによりなされる。
【００２０】
尚、上記逆転写酵素反応においては、反応後加熱処理又は反応停止液を加えることにより反応を停止させるのが好ましい。該加熱処理は、通常65〜100℃、好ましくは65〜70℃で、通常15〜60分、好ましくは15〜30分行われる。また、反応停止液としては、例えばEDTA等が挙げられ、その使用量は最終濃度として通常10〜100mmol/L、好ましくは40〜60mmol/Lとなるように添加される。
【００２１】
また、上記逆転写酵素反応においては、通常このような逆転写酵素反応時に用いられている、DTT(ジチオスレイトール)等の還元剤、塩化カリウム、塩化マグネシウム等の試薬を添加してもよく、これら試薬の濃度及び使用量は通常この分野で用いられている範囲から適宜選択される。
【００２２】
上記逆転写酵素反応時の逆転写酵素としては、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有するものであれば特に限定されないが、例えばMoloney Murine Leukemia Virus(M-MLV) 逆転写酵素、Avian myeloblastosis virus(AMV)逆転写酵素、M-MLV逆転写酵素(RNaseHマイナス)等が挙げられ、中でもM-MLV逆転写酵素(RNaseHマイナス)が好ましい。
【００２３】
逆転写酵素反応用プライマーは、鋳型となるバイサルファイト反応後DNAに対してアニーリングし得、DNA鎖伸長の起点となるものであればよい。逆転写酵素反応用プライマーのヌクレオチド数は、通常6〜12mer、好ましくは6〜10mer、より好ましくは6〜9 merである。尚、本発明に係る一本鎖DNAが未知の場合には、このランダムプライマーを用いるのが好ましい。
【００２４】
上記dNTPsは、通常この分野で用いられる４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）の混合物であれば特に限定はされない。
【００２５】
本発明のウラシル化DNAの相補DNAの取得方法の好ましい例を以下に説明する。
即ち、例えば、DNA抽出キット等を用いて細胞等からDNAを抽出し、DNA 1μｇを例えば滅菌水3〜5μLに溶解してDNAを含む溶液を準備する。得られたDNAが二本鎖DNAの場合には、DNAを含む溶液3〜5μLに例えば1〜3mol/Lの水酸化ナトリウム等1〜5μLを添加し、30〜50℃で10〜30分間反応させ、DNAを一本鎖化する。
【００２６】
その後、得られた一本鎖DNAを含む溶液4〜8μLに、例えば2〜3mol/Lの亜硫酸水素ナトリウム30〜50μL、要すれば20〜50mmol/Lのヒドロキノン3〜5μLを添加して、80〜90℃で60〜100分間加熱する。該条件で反応させることにより、一本鎖DNA中のシトシンをスルホン酸化すると同時にスルホン酸化されたシトシンを加水分解することができる。次いで、1mol/L トリス緩衝液（pH7.5〜8.0）及びイソプロパノールを、40：60〜60:40、好ましくは40：60〜50:50の割合でそれぞれ加水分解後の溶液の5〜10倍量添加し、加水分解後の一本鎖DNAを沈殿させる。この際、エタチンメイトを1〜3μL添加するとDNA沈殿の確認が容易となる。その後、10,000〜20,000gで10〜20分間遠心分離し、上清を取り除き、得られたDNAをエタノールで洗浄する。これにより、加水分解後の一本鎖DNAを抽出精製することができる。更に、得られた一本鎖DNA 1μgを例えば滅菌水30〜40μLに溶解し、該溶液に、1〜3mol/Lの水酸化ナトリウム5〜20μLを添加し、30〜40℃で20〜60分間反応させ、脱スルホン酸化する。その後、要すれば、市販のキット等を用いて低分子量のDNAを取り除き精製する。これにより、バイサルファイト反応が完了し、非メチル化シトシンが効率よくウラシルに変換された一本鎖DNAが得られる。
【００２７】
次いで、バイサルファイト反応により得られた一本鎖DNA 1μgを含む溶液5〜１０μＬに、例えば1〜3μg/μLの5〜15merのランダムプライマー1〜2μL、100〜400Unitsの逆転写酵素1〜2μL、1〜3mmol/Lの４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTPs）の混合溶液5〜１０μＬを添加し、通常20〜40℃で通常10〜20分間アニーリング反応をさせ、その後、37〜50℃で通常30〜60分間反応させて伸長反応を行うことにより、逆転写酵素反応を行う。反応後、得られた一本鎖DNAを例えば市販のキット等を用いて低分子量のDNAを取り除き精製する。
以上の操作により、非メチル化シトシンがウラシル化された一本鎖DNAに対して相補なDNA（以下、ウラシル化DNAの相補DNAと略記する場合がある）を取得することができる。
【００２８】
［非メチル化シトシンがウラシル化されたDNAに対して相補なDNAの増幅方法（本発明のウラシル化DNAの相補DNA増幅方法）］
本発明のウラシル化DNAの相補DNA増幅方法は、一本鎖DNAを、１）バイサルファイト反応、２）逆転写酵素反応、３）PCR反応の順に付すことにより、非メチル化シトシンがウラシルに変換された前記一本鎖DNAに対して相補なDNAを効率よく増幅することができる。
【００２９】
上記バイサルファイト反応及び逆転写酵素反応については、上記本発明のウラシル化DNAの相補DNAの取得方法の項で記載した方法と同じものが挙げられ、好ましい条件等も同じである。
【００３０】
本発明のウラシル化DNAの相補DNA増幅方法における、PCR反応は、自体公知の方法例えばNucleic Acids Research,1991,Vol.19,3749、BioTechniques, 1994, Vol.16, 1134-1137に記載の方法に準じて行えばよいが、具体的には以下のようになされる。即ち、鋳型となる上記逆転写酵素反応により得られた一本鎖DNA（以下、逆転写酵素反応後DNAと略記する場合がある）の核酸量1〜100ngに、２種のプライマーをそれぞれ通常0.1〜100pmol、好ましくは0.1〜50pmol、DNAポリメラーゼを通常1〜10 Units、好ましくは2.5〜5Units、並びに４種類の混合デオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTPs）を通常0.01〜20μmol、好ましくは、0.01〜10μmol添加し、トライシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液中で、例えば(1)93〜98℃、1〜10分→(2)93〜98℃、10〜30秒→(3)50〜60℃、10〜30秒→(4)68〜72℃、30秒〜5分間を１サイクルとして20〜40サイクル行うことにより、バイサルファイト反応後DNAに相補なDNAを増幅して得ることができる。上記PCR反応においては、反応後、通常この分野で用いられている精製方法、例えばフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合溶液による抽出、アルコール沈殿、カラム精製、フィルターろ過等の方法により得られたDNAを精製するのが好ましい。また、上記精製の後、目的の塩基対(bp)を有するDNAを抽出するのがより好ましい。該抽出方法としては、自体公知の方法、例えばアガロースゲル電気泳動を用いる方法、液体クロマトグラフィー法を用いる方法や増補版ラボマニュアル遺伝子工学,1990,27-28に記載のポリアクリルアミドゲル等の電気泳動を用いた方法等が挙げられる。また、上記の如きPCR反応により得た本発明に係る二本鎖DNAについては、目的のDNAをより多く得るため、更にPCR反応に付してもよい。
【００３１】
上記PCR反応における２種のプライマーとしては、鋳型である、逆転写酵素反応後DNAの一部を含むもの及び逆転写酵素反応後DNAの相補鎖の一部を含むものであり、そのヌクレオチド数は通常12〜40、好ましくは15〜35、より好ましくは18〜30である。
【００３２】
上記PCR反応におけるDNAポリメラーゼとしては、通常この分野で用いられるDNAポリメラーゼであれば何れでもよいが、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有するものが好ましく、具体的には、例えばPfu DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ等のα型DNAポリメラーゼが好ましく、中でもKOD DNAポリメラーゼが特に好ましい。このような3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いることにより、正確にバイサルファイト反応後DNAに相補なDNAを増幅することが可能となり、その結果、精度の高いメチル化シトシンの検出が可能となる。
【００３３】
上記dNTPsは、通常この分野で用いられる４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）の混合物であれば特に限定はされない。
【００３４】
本発明のウラシル化DNAの相補DNA増幅方法の好ましい例を以下に説明する。
【００３５】
即ち、まず、本発明のウラシル化DNAの相補DNAの取得方法の項で記載したように、一本鎖DNAを、バイサルファイト反応、逆転写酵素反応の順に付して、ウラシル化DNAの相補DNAを得る。その後、得られたDNAをPCR反応に付す。即ち、逆転写酵素反応により得られた一本鎖DNA 100ng〜1μgを含む溶液1〜3μLに、1〜10μmol/Lの増幅対象となるDNAの上流用のプライマー5〜１０μＬと1〜10μmol/Lの増幅対象となるDNAの下流用プライマー5〜１０μＬ、1〜5mmol/Lの４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTPs）の混合溶液5〜１０μＬ、並びに、1〜5UnitsのKOD DNAポリメラーゼ20〜30μLを添加して、例えば93〜98℃、1〜10分→93〜98℃、10〜30秒→50〜60℃、10〜30秒→68〜72℃、68〜72℃、30秒〜5分間を１サイクルとして20〜40サイクル行う。これにより、非メチル化シトシンがウラシルに変換されたDNAに対して相補なDNAが増幅される。その後、該二本鎖DNAを例えばアガロースゲル又は未変性ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行い、目的の鎖長のDNAを抽出する。尚、必要に応じて、得られたDNAを、例えばフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合溶液による抽出等で精製してもよい。以上の操作により、ウラシル化DNAの相補DNAを増幅することができる。
【００３６】
［本発明のメチル化シトシンの検出方法］
本発明のメチル化シトシンの検出方法は、一本鎖DNAを、１）バイサルファイト反応、２）逆転写酵素反応、３）PCR反応の順に付し、得られたPCRの増幅産物の塩基配列解析を行うことによりなされる。
【００３７】
本発明のメチル化シトシンの検出方法における、バイサルファイト反応、逆転写酵素反応、PCR反応については、上記本発明のウラシル化DNAの相補DNAの取得方法および本発明のウラシル化DNAの相補DNA増幅方法の項で説明した方法と同じであり、好ましい条件等も同じである。
【００３８】
上記塩基配列解析としては、通常この分野でなされている塩基配列解析方法であれば特に限定されず、例えば、ラボマニュアル遺伝子工学、遺伝子工学ハンドブック等に記載の蛍光ダイターミネーター法、サンガー法等の常法に従ってなされればよい。具体的には、例えば本発明の増幅法により得られた、ウラシル化DNAの相補DNAをベクターに組み込み、得られた組換えベクターをコンピテントセルに形質転換し、該コンピテントセルを培養し、そこからウラシル化DNAの相補DNAを含むプラスミドを抽出し、該プラスミドを用いて例えばシークエンサー等で解読することによりなされる。このようにして得た塩基配列とバイサルファイト反応に付していない通常のDNAの塩基配列を比較することにより、メチル化シトシンを検出することができる。即ち、本発明に係るバイサルファイト反応ではメチル化シトシン以外のシトシンは全てウラシルに変換されるため、得られた塩基配列においてウラシルに変換されていないシトシンを見つけ出すことによってメチル化シトシンを検出することができる。
【００３９】
上記ウラシル化DNAの相補DNAをベクターに組み込む方法としては、具体的には、例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド等のベクター並びにウラシル化DNAの相補DNAをT4DNAポリメラーゼ等で平滑末端化した後、ウラシル化DNAの相補DNAを、T4DNAリガーゼを用いてベクターに挿入する方法や、ウラシル化DNAの相補DNAにアデニン（A）を付加し、該アデニンが付加されたウラシル化DNAの相補DNAを、T4DNAリガーゼを用いてチミン塩基が付加されているベクターに組み込むTAクローニング法等が挙げられる。中でも、挿入するDNAとベクター両者を制限酵素により切断する必要がなく簡便なTAクローニング法が好ましい。
【００４０】
該TAクローニング法としては具体的には例えば以下の如くなされる。即ち、PCR反応後のウラシル化DNAの相補DNA 100ngに対してTaq DNAポリメラーゼ1〜5 Unitsを添加し、55〜75℃で10〜30分間反応させ、ウラシル化DNAの相補DNAの3'末端にアデニンを付加させる。尚、該反応の際、ウラシル化DNAの相補DNA1μｇに対してdATP0.01〜20nmolを反応液中に添加してもよいが、PCR反応溶液にTaq DNAポリメラーゼを添加することにより、この添加ステップを省くことができる。また、アデニンが付加されたウラシル化DNAの相補DNAについては、合成反応後、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合溶液による抽出、アルコール沈殿、カラム精製、フィルターろ過等の方法により得られたDNAを精製するのが好ましい。次いで、アデニンが付加されたウラシル化DNAの相補DNA10〜100ngに対して、チミン塩基が付加されている大腸菌形質転換用ベクター及びT4 DNAリガーゼ300〜3000 Unitsを付与して10〜40℃で30〜90分間反応させことにより、ウラシル化DNAの相補DNAを組み込んだ組換えベクターを得ることができる。
【００４１】
上記組換えベクターのコンピテントセルへの形質転換方法としては、例えば35〜45℃で20〜90秒加熱するヒート・ショック法や1.5〜2.5kVの電気パルスをかけるエレクトロポレーション法等が挙げられるが、エレクトロポレーション法がより好ましい。ここで用いられるコンピテントセルとしては、通常用いられる大腸菌や枯草菌等であれば何れでも用いることができ、その使用量は通常用いられる範囲内で適宜設定されればよい。
【００４２】
上記コンピテントセルの培養は、例えばアンピシリンを30〜150μg/ml含むＬＢ寒天培地やアンピシリンを30〜150μg/ml含むＭ９寒天培地等の培地上で30〜40℃で12〜20時間培養することによりなされる。尚、上記培地としては、微生物がの栄養源となる炭素源、窒素源、無機塩類や生育因子としての酵母エキス等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行えるものであれば、天然培地、合成培地などのいずれを用いてもよい。該炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。該窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、トリプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
【００４３】
培養したコンピテントセルからウラシル化DNAの相補DNAを含むプラスミドを抽出する方法としては、例えば、先ず、コロニーPCR法により、コロニー中のウラシル化DNAの相補DNAを含むプラスミド由来のDNAを増幅する。その後、目的のプラスミドがコロニー中で増幅しているかを例えば電気泳動法により確認し、目的のプラスミドの挿入が確認されたコロニーから目的のプラスミドを抽出することによりなされればよい。
【００４４】
該コロニーPCR法としては、例えば以下の如くなされる。即ち、培養したコロニーに、目的の塩基配列検出のための2種のPCRプライマーそれぞれ通常0.1〜100pmol、好ましくは0.1〜50pmol、４種類の混合デオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTPs）通常0.01〜20nmol、好ましくは、0.01〜10nmol、並びにDNAポリメラーゼ通常1〜10Units、好ましくは1〜5Units添加し、トライシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液中で、例えば(1)93〜98℃、1〜10分→(2)93〜98℃、10〜30秒→(3)50〜60℃、10〜30秒→(4)68〜72℃、30秒〜5分間を１サイクルとして25〜40サイクルの反応を行うことによりなされる。上記2種のプライマーとしては、目的のDNAを増幅できるように設計されたもの、即ち、ウラシル化DNAの全部又は一部を含むもの及びウラシル化DNAの相補DNAの全部又は一部を含むもの、又は、挿入されているウラシル化DNAの相補DNAの両端に位置するベクター由来の配列等が挙げられるが、ウラシル化DNAの相補DNAの両端に位置するベクター由来の配列が好ましい。即ち、本発明の方法においては、非メチル化シトシンがウラシル化され、該ウラシルは逆転写酵素反応の時にチミンとして読まれるため、シトシンが全て非メチル化シトシンであった場合、ウラシル化DNAの相補DNAは３塩基から構成されることとなる。そのため、効率よくPCR反応反応をするためには、４塩基で構成することができる、ウラシル化DNAの相補DNAの両端に位置するベクター由来の配列が好ましい。上記プライマーのヌクレオチド数は通常12〜30、好ましくは15〜25、より好ましくは18〜22である。上記DNAポリメラーゼとしては例えば通常この分野で用いられるDNAポリメラーゼであれば何れでもよいが、具体的には、例えばTaq DNA ポリメラーゼ、Tth DNA ポリメラーゼ、KOD DNA ポリメラーゼ等が挙げられ、中でもTaq DNA ポリメラーゼ、KOD DNA ポリメラーゼ等が好ましい。
【００４５】
上記コロニーPCR反応後になされる電気泳動法としては、通常この分野で用いられる、移動度により塩基数を求めることができるゲル電気泳動法であればいずれでもよいが、アガロースゲル電気泳動法が好ましい。尚、該電気泳動法における泳動条件については公知の方法に準じて適宜設定されればよい。
【００４６】
上記コロニー部からプラスミドを取り出す方法としては、例えばラボマニュアル遺伝子工学（丸善）、遺伝子工学ハンドブック（羊土社）等に記載の、振とう培養の後、アルカリSDS法等公知のプラスミド抽出方法によりプラスミドを抽出すればよい。尚、プラスミド抽出は、市販のキットを用いて行ってもよい。上記振とう培養における培地は、寒天を用いずに溶液とした以外は、コンピテントセルの培養の項に記載された培地と同じものを用いることができ、好ましい培養時間、培養温度についてもコンピテントセルの項で記載した範囲と同じである。
【００４７】
本発明のメチル化シトシンの検出方法の好ましい例を以下に説明する。
【００４８】
即ち、まず、本発明のウラシル化DNAの相補DNAの取得方法および本発明のウラシル化DNAの相補DNA増幅方法の項で記載したように、一本鎖DNAを、バイサルファイト反応、逆転写酵素反応、PCR反応の順に付して、ウラシル化DNAの相補DNAを得る。該ウラシル化DNAの相補DNA 100ng〜1μｇを含む溶液5〜１０μＬに1〜5 UnitsのTaq DNAポリメラーゼ0.5〜１μＬを添加して55〜75℃で10〜30分間反応させ、ウラシル化DNAの相補DNAの3'末端にアデニンを付加させる。尚、アデニンが付加された、ウラシル化DNAの相補DNAについては、合成反応後、精製操作に付すのが好ましい。次いで、アデニンが付加された、ウラシル化DNAの相補DNA10〜100ngを含む1〜5μLの滅菌水等に、チミン塩基が付加されている10〜100ngの大腸菌形質転換用ベクター1〜3μL及び300〜3000 UnitsのT4 DNAリガーゼ1〜3μLを付与して10〜20℃で30〜240分間反応させ、ウラシル化DNAの相補DNAを組み込んだ組換えベクターを得る。その後、得られた組換えベクター10〜100ngをコンピテントセル108〜109細胞に添加し、1.5〜2.5kVの電気パルスをかけて形質転換を行う。更に、例えばアンピシリン30〜150μg/ml、トリプトンを1% (w/v)、酵母エキスを0.5% (w/v)、塩化ナトリウムを1% (w/v)含む寒天培地上で30〜40℃で12〜20時間培養する。次いで、得られた培養物をコロニーPCRに付す。具体的には、コロニーを溶解した滅菌水1〜１０μＬに、目的のDNAを増幅できるように設計された1〜10μmol/Lの2種のPCRプライマーそれぞれ1〜5μL、1〜5mmol/Lの４種類の混合デオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTPs）通常1〜5μL、並びに1〜5UnitsのTaq DNAポリメラーゼ0.5〜１μＬを添加し、トライシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液中で、例えば(1)93〜98℃、1〜10分→(2)93〜98℃、10〜30秒→(3)50〜60℃、10〜30秒→(4)68〜72℃、30秒〜5分間を１サイクルとして30〜40サイクルの反応を行うことによりなされる。その後、アガロースゲル電気泳動法にて、コロニー中の目的のDNAの存在を確認し、確認できたコロニーを採取する。採取したコロニーを、LB培地で振とう培養した後、培養液から例えば市販のプラスミド抽出キット等を用いて目的のDNAを取り出し、シークエンサー等によりDNAの塩基配列を解読する。得られた塩基配列と、バイサルファイト反応に付さない通常の塩基配列とを比較し、解読したDNAの塩基配列中からウラシル化されていないシトシンを探し出すことにより、メチル化シトシンを検出することができる。
【００４９】
以下に実験例、実施例、比較例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例等により何等限定されるものではない。
【実施例】
【００５０】
実験例１  マウスゲノムDNAの抽出
1×106のマウス胚性幹細胞 (embryonic stem cell : ES細胞)及び胎児繊維芽細胞 (Mouse Embryonic Fibloblast : MEF細胞)よりQuickGene SP kit DNA tissue（富士フィルム(株)製）を使用して、現品説明書に従ってゲノムDNAを抽出した。【００５１】
その後、ES細胞由来の、Nanog遺伝子及びRex１遺伝子、並びに、MEF細胞由来の、Nanog遺伝子及びRex１遺伝子の存在の確認を行った。【００５２】
即ち、得られたES細胞及びMEF細胞由来の精製マウスゲノムDNA各10ngに全量が33.5μLとなるように滅菌水を添加した。これら溶液を各２種類ずつ準備し、マウスNanog遺伝子及びRex１遺伝子のプロモーター領域のPCR増幅を行った。即ち、上記滅菌水に、10×Gene Taq Universal Buffer（(株)ニッポンジーン製）を5μL、dNTPs 混合溶液 (2.5mmol/each) （(株)ニッポンジーン製）を5μL、Gene Taq NT（(株)ニッポンジーン製）を0.5μL加えたものに、5μmol/LのNanog遺伝子用のPCRプライマーForward溶液及びReverse溶液それぞれ3μL［Forward：5' CTGTGAATTCACAGGGCTGGTGGG 3'（塩基配列１）］、Reverse: 5' CAACCAAATCAGCCTATCTGAAGGCC 3' （塩基配列２）］、若しくは、5μmol/LのRex１遺伝子用のPCRプライマーForward溶液及びReverse溶液それぞれ3μL［Forward: 5'GGGTCACCTGAAGGGCCAGGGGCC 3' （塩基配列３）、Reverse: 5' CTTGGACCCCTCCCTTTTTAGATGG 3' （塩基配列４）］を加え、全量50μLとして、95℃で2分、95℃で20秒、68℃で30秒を１サイクルとして30サイクルのPCR反応を行った。その後、得られた各PCR増幅産物を1.5%アガロースゲルを用いて電気泳動し、ES細胞由来の、Nanog遺伝子及びRex１遺伝子、並びに、MEF細胞由来の、Nanog遺伝子及びRex１遺伝子の存在を確認した。【００５３】
Nanog遺伝子の結果を図1に、Rex１遺伝子の結果を図2にそれぞれ示す。該結果より、ES細胞、MEF細胞何れについてもNanog遺伝子及びRex１遺伝子の存在を確認をすることができた。【００５４】
実施例１  本発明の方法による、ES細胞由来Nanog遺伝子、ES細胞由来Rex１遺伝子及びES細胞由来CD133遺伝子中の非メチル化シトシンのウラシル化
（１）ゲノムDNAのアルカリ処理による一本鎖化
実験例１で得られたES細胞由来のゲノムDNA 1μgをチューブに取り、該チューブを、Nanog遺伝子用、Rex１遺伝子用及びCD133遺伝子用として３本準備した。これらのそれぞれに滅菌水を添加して4.5μLに調製した後、1mol/L水酸化ナトリウム（和光純薬工業(株)製）2μLを加え、全量6.5μLとして37℃で20分間インキュベートを行い、ゲノムDNAそれぞれを一本鎖化した。【００５５】
（２）バイサルファイト反応
３本のチューブ中の一本鎖化したゲノムDNAを含む溶液6.5μLそれぞれに、30mmol/Lヒドロキノン（和光純薬工業(株)製）を3.5μL、2.5mol/L亜硫酸水素ナトリウム（和光純薬工業(株)製）40μLを加え、全量を50μLとして、55℃で16時間インキュベートを行った。その後、1mol/Lトリス緩衝液(pH7.5)（(株)ニッポンジーン製）350μL、エタ沈メイト（(株)ニッポンジーン製）１μＬ、イソプロパノール（和光純薬工業(株)製）400μをそれぞれ加え、18800×gで10分間遠心分離した。その後、上清を除き75%のエタノール（和光純薬工業(株)製）にて洗浄後、全量が35μLとなるように滅菌水を添加した。
次いで、３本のチューブ中のゲノムDNAを含む溶液35μLそれぞれに1mol/L水酸化ナトリウム（和光純薬工業(株)製）15μLを加え、全量を50μLとして37℃で20分間インキュベートを行い、脱スルホン酸化反応を行った。その後、10mol/L酢酸アンモニウム（(株)ニッポンジーン製）12μL、エタノール（和光純薬工業(株)製）125μLをそれぞれ加え、18800×gで10分間遠心分離した。続いて、上清を除き75%のエタノール（和光純薬工業(株)製）で洗浄後、滅菌水で50μLに調製した。その後、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）を使用して、現品説明書に従って低分子DNAの除去を行った。更に、除去操作後の溶液にエタ沈メイト（(株)ニッポンジーン製）１μＬ、3mol/L酢酸ナトリウム（(株)ニッポンジーン製）5μL、エタノール（和光純薬工業(株)製）125μLをそれぞれ加え、18800×gで10分間遠心分離した。最後に、上清を除き75%のエタノール（和光純薬工業(株)製）で洗浄後、全量が6μLとなるように滅菌水を添加した。【００５６】
（３）逆転写酵素反応
バイサルファイト反応後の３本のチューブ中のゲノムDNAを含む溶液 6μLそれぞれに、ランダムプライマー(6mer、1μg/μL)（タカラバイオ(株)製）１μＬ加え、全量を7μLとして90℃で1分間インキュベートした後、直ちに氷冷を行い、熱変性を行った。その後、5×buffer（東洋紡(株)製） 4μL、2.5mmol/L dNTPs 混合溶液（(株)ニッポンジーン製） 8μL、ReverTra Ace（東洋紡(株)製） １μＬをそれぞれ加え、全量を20μLとして25℃で10分間インキュベートした後、42℃で30分間インキュベートを行い、逆転写酵素による伸長反応を行った。次いで、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）を使用して、現品説明書に従って低分子DNAの除去を行った。その後、低分子DNA除去操作後の溶液にエタ沈メイト（(株)ニッポンジーン製）１μＬ、3mol/L酢酸ナトリウム（(株)ニッポンジーン製）5μL、エタノール（和光純薬工業(株)製）125μLをそれぞれ加え、18800×gで10分間遠心分離した。更に、上清を除き75%のエタノール（和光純薬工業(株)製）にて洗浄後、全量が１０μＬとなるように滅菌水を添加した。【００５７】
（４）PCR反応
逆転写酵素反応を行った、３本のチューブ中のゲノムDNAを含む溶液１μＬにそれぞれ、滅菌水 7μL、 2×PCR Buffer for KOD FX（東洋紡(株)製） 25μL、2mmol/L dNTPs 混合溶液（東洋紡(株)製） １０μＬ、及びKOD FX（東洋紡(株)製） １μＬを加えたものに、5μmol/LのNanog遺伝子用のPCRプライマーForward溶液及びReverse溶液それぞれ3μL［Forward：5'TTGTGAATTTATAGGGTTGGTGGG 3' （塩基配列５）、Reverse: 5'CAACCAAATCAACCTATCTAAAAACC 3' （塩基配列６）］、5μmol/LのRex１遺伝子用のPCRプライマーForward溶液及びReverse溶液それぞれ3μL［Forward: 5' GGGTTATTTGAAGGGTTAGGGGTT 3' （塩基配列７）、Reverse: 5' CTTAAACCCCTCCCTTTTTAAATAA 3'（塩基配列８）］、又は5μmol/LのCD133遺伝子用のPCRプライマーForward溶液及びReverse溶液それぞれ3μL［Forward: 5' GTTTTTTAAATTATTGAGTTTTGTGGAG 3' （塩基配列９）、Reverse: 5' CACCACAAAAATAATTAAATAAAAACCC 3' （塩基配列１０）］を加え、全量を50μLとして94℃で2分→98℃で10秒→55℃で20秒→68℃で30秒を1サイクルとして35サイクルのPCR反応を行った。その後、得られたPCR増幅産物を1.5%のアガロースゲルを用いた電気泳動で分画し、目的のDNAが増幅されているかを確認した。【００５８】
ES細胞由来Nanog遺伝子の泳動結果を図1に、ES細胞由来Rex１遺伝子の泳動結果を図2に、ES細胞由来CD133遺伝子の泳動結果を図3にそれぞれ示す。【００５９】
（５）PCR増幅産物のクローニング及び塩基配列解析
電気泳動で増幅を確認した３種のPCR反応後の溶液9μLそれぞれに10×A-attachment Mix（東洋紡(株)製）１μＬを加え、全量を１０μＬとして60℃で30分間インキュベートを行い、PCR増幅産物の3'末端にアデニンを付加させた。次いで、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）を使用して、現品説明書に従って低分子DNAの除去を行った。その後、低分子DNA除去処理後の溶液にエタ沈メイト（(株)ニッポンジーン製）１μＬ、3mol/L酢酸ナトリウム（(株)ニッポンジーン製）5μL、エタノール（和光純薬工業(株)製）125μLをそれぞれ加え、18800×gで10分間遠心分離した。更に、上清を除き75%のエタノール（和光純薬工業(株)製）にて洗浄後、全量が3μLとなるように滅菌水を添加した。【００６０】
３種類の、アデニンを付加したPCR増幅産物を含む溶液3μLそれぞれに、pGEM-T Easy Vector(Promega社製)１μＬ及びDNA Ligation Kit（タカラバイオ(株)製）4μLを加え、全量8μLとして16℃で60分間インキュベートを行い、PCR増幅産物をベクターに挿入した。次いで、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）を使用して、ベクターの精製を行った。その後、精製処理溶液にエタ沈メイト（(株)ニッポンジーン製）１μＬ、3mol/L酢酸ナトリウム（(株)ニッポンジーン製）5μL、エタノール（和光純薬工業(株)製）125μLをそれぞれ加え、18800×gで10分間遠心分離した。更に、上清を除き75%のエタノール（和光純薬工業(株)製）で洗浄後、全量が2μLとなるように滅菌水を添加した。【００６１】
３種類の、ベクターに挿入したPCR増幅産物を含む溶液１μＬそれぞれに大腸菌40μL（XL10 Gold、ストラタジーン社製、109cell）を添加した後、エレクトロポレーション法により形質転換を行った。次いで、形質転換させた大腸菌をLB寒天培地にて37℃で一晩培養した。培養された大腸菌のコロニーからその一部を釣菌して滅菌水5.9μLに溶解し、該滅菌水に、10×Gene Taq Universal Buffer（(株)ニッポンジーン製）１μＬ、dNTPs 混合溶液 (各2.5mmol) （(株)ニッポンジーン製）１μＬ、Gene Taq NT（(株)ニッポンジーン製）0.１μＬ、並びに、5μmol/LのpGEM-T Easy Vector(Promega社製)由来配列の２種のプライマー各１μＬ［5'CCAGTCACGACGTTGTAAAACG 3' （塩基配列11）及び5' CACACAGGAAACAGCTATGACC 3'（塩基配列12）、挿入断片の鎖長＋250bpになるように設計)をそれぞれ加え、全量を１０μＬとして、95℃で2分、95℃で20秒、60℃で20秒、72℃で30秒を１サイクルとして30サイクルのコロニーPCR反応を行った。その後、得られた各コロニーPCR増幅産物を1.5%アガロースゲルを用いた電気泳動で分画し、ベクターが挿入されたコロニーであるかどうかを確認した。ベクターの挿入が確認されたコロニーを用いて、LB培地にて37℃で一晩振とう培養した。その後、得られた培養液を用いて、QuickGene Plasmid kit SII（富士フイルム(株)製）にてプラスミド抽出を行った。【００６２】
得られたプラスミド3種について、pGEM-T Easy Vector(Promega社製)由来配列のプライマー[5' CACACAGGAAACAGCTATGACC 3' （塩基配列12）]によりApplied Biosystems 3730xl DNA Analyzer（ライフテクノロジーズジャパン社）にて塩基配列の解読を行った。【００６３】
Nanog遺伝子の解読結果を図4に、Rex１遺伝子の解読結果を図5に、CD133遺伝子の解読結果を図6にそれぞれ示す。【００６４】
実施例１においては、ES細胞より抽出したゲノムDNAを用いて、本発明の方法により、DNA中の非メチル化シトシンのウラシル化及びウラシル化されたDNAを鋳型とするDNAの増幅を試みた。具体的には、幹細胞マーカーであるNanog遺伝子、Rex1遺伝子およびCD133遺伝子の各プロモーター領域中のDNAにおける非メチル化シトシンをウラシル化し、ウラシル化後のDNAを鋳型としたDNAの増幅を行った。その結果、図１〜３の結果から、本発明の方法により、ES細胞中の各遺伝子が増幅されていることが判った。【００６５】
バイサルファイト反応後のDNAは高チミン含量となるため、高アデニン含量PCRプライマーを使用すると非特異的増幅産物が形成されやすくなり、目的の増幅産物を得ることが難しくなる。実際、後に示す従来法による比較例１及び２においては、十分な量のPCR増幅産物を得る事ができていない。一方、本願発明の方法においては、図１〜３から明らかなように、十分な量のPCR増幅産物を得る事ができている。特に、CD133のプロモーター領域のPCR増幅では、60.7%のアデニン含量PCRプライマーを使用しており、厳しい条件でのPCR増幅であったが、十分な量のPCR増幅産物を得る事ができている。これは、本発明の方法においては、バイサルファイト反応後に逆転写酵素反応、α型DNAポリメラーゼによるPCR増幅反応を行っており、これらの反応を連続して行った結果、PCR増幅効率が向上していると考えられる。特に、PCR増幅用のDNAポリメラーゼとしてα型DNAポリメラーゼを使用しているため、その校正活性によりバイサルファイト反応後のDNAが精度よく増幅されていると考えられる。よって、図１〜３の結果より、本発明の方法によるPCR増幅効率は良好であり、その許容範囲が広いことが判る。【００６６】
また、図４〜６の結果から明らかなように、Nanog遺伝子、Rex1遺伝子およびCD133遺伝子何れのシトシンもウラシルに変換されたことが判った（解読結果上ではウラシルはチミンとして表記）。幹細胞であるES細胞のプロモーター領域のシトシンは通常メチル化されていないため、該結果より、本発明の方法によれば全てのシトシンがウラシルに変換されており、高精度にシトシンをウラシルに変換できることが示された。【００６７】
実施例２  本発明の方法による、MEF細胞由来Nanog遺伝子、MEF細胞由来Rex１遺伝子及びMEF細胞由来CD133遺伝子中の非メチル化シトシンのウラシル化
ゲノムDNAとして、実験例１で得られたES細胞由来のゲノムDNAを用いる代わりに、実験例１で得られたMEF細胞由来のゲノムDNAを用いた以外は、実施例１(1)〜(4)と同様に実験を行った。即ち、MEF細胞由来のゲノムDNAを用いて、実施例1記載の方法に従って、アルカリ処理、バイサルファイト反応、逆転写酵素反応、PCR反応を行い、該PCRの増幅産物を1.5％のアガロースゲルを用いた電気泳動で分画し、目的のDNAが増幅されているかを確認した。【００６８】
Nanog遺伝子の泳動結果を図1に、Rex１遺伝子の泳動結果を図2に、CD133遺伝子の泳動結果を図3にそれぞれ示す。【００６９】
電気泳動で確認できた上記PCR反応の各増幅産物を、実施例１の(5)と同様の方法により、pGEM-T Easy Vector(Promega社製)とライゲーション反応を行い、大腸菌の形質転換後、プラスミドを採取して塩基配列の解読を行った。MEF細胞由来Nanog遺伝子の解読結果を図4に、MEF細胞由来Rex１遺伝子の解読結果を図5に、MEF細胞由来CD133遺伝子の解読結果を図6にそれぞれ示す。【００７０】
実施例２においては、MEF細胞より抽出したゲノムDNAを用いて、本発明の方法により、DNA中の非メチル化シトシンのウラシル化及びウラシル化されたDNAを鋳型とするDNAの増幅を試みた。具体的には、幹細胞マーカーであるNanog遺伝子、Rex1遺伝子およびCD133遺伝子の各プロモーター領域中のDNAにおける非メチル化シトシンをウラシル化し、ウラシル化後のDNAを鋳型としたDNAの増幅を行った。その結果、実施例１のES細胞由来のDNAを用いた結果と同様に、本発明の方法により、MEF細胞中の各遺伝子を増幅できていることが確認された。【００７１】
また、図４〜６の結果から明らかなように、CpG ジヌクレオチド以外の全シトシンがウラシルに変換されたことが判った。変換されていないCpGジヌクレオチドにおけるシトシンはメチル化されているものと推測された。これは、MEF細胞等の分化した細胞においてはプロモーター領域のCpGジヌクレオチドでシトシンがメチル化されるという多くの報告と一致するものである。よって、該結果と、上記ES細胞より抽出したゲノムDNAを用いた実施例１の結果より、本発明の方法によれば精度よく非メチル化シトシンのみをウラシルに変換できることが判った。【００７２】
比較例１  従来法による、ES細胞由来Nanog遺伝子又はES細胞由来Rex１遺伝子中の非メチル化シトシンのウラシル化
実施例１(2)のバイサルファイト反応により得られた、ES細胞由来Nanog遺伝子又はES細胞由来Rex１遺伝子含有溶液 １μＬそれぞれに、滅菌水 32.5μL、10×Gene Taq Universal Buffer（(株)ニッポンジーン製） 5μL、dNTPs 混合溶液 (2.5mmol/each) （(株)ニッポンジーン製） 5μL、Gene Taq NT（(株)ニッポンジーン製） 0.5μL、並びに、5μmol/LのNanog遺伝子用のPCRプライマーForward溶液およびReverse溶液各3μL［Forward：5'TTGTGAATTTATAGGGTTGGTGGG 3' （塩基配列５）、Reverse: 5'CAACCAAATCAACCTATCTAAAAACC 3' （塩基配列６）］、若しくは、5μmol/LのRex１遺伝子用のPCRプライマーForward溶液およびReverse溶液各3μL［Forward:5' GGGTTATTTGAAGGGTTAGGGGTT 3'（塩基配列７）、Reverse: 5'CTTAAACCCCTCCCTTTTTAAATAA 3' （塩基配列８）］を加え、全量を50μLとして95℃で2分→95℃で20秒→55℃で20秒→72℃で30秒を1サイクルとして35サイクルのPCR反応を行った。その後、得られたPCR増幅産物を1.5%のアガロースゲルを用いた電気泳動で分画し、目的のDNAが増幅されているかを確認した。【００７３】
Nanog遺伝子の泳動結果を図1に、Rex１遺伝子の泳動結果を図2にそれぞれ示す。【００７４】
該結果より、従来法では、十分な量の増幅産物が得られていないことが判った。即ち、バイサルファイト反応後にTaq DNAポリメラーゼ等のポリメラーゼを用いてPCR反応を行う従来法では、十分な量の増幅産物が得られないことが判った。【００７５】
比較例２  従来法による、MEF細胞由来Nanog遺伝子又はMEF細胞由来Rex１遺伝子中の非メチル化シトシンのウラシル化
ES細胞由来Nanog遺伝子及びES細胞由来Rex１遺伝子含有溶液の代わりに、実施例２(2)のバイサルファイト反応により得られた、MEF細胞由来Nanog遺伝子及びMEF細胞由来Rex１遺伝子含有溶液を用いた以外は、比較例１と同様の方法によりPCR反応を行った。その後、得られたPCR増幅産物を1.5%のアガロースゲルを用いた電気泳動で分画し、目的のDNAが増幅されているかを確認した。【００７６】
Nanog遺伝子の泳動結果を図1に、Rex１遺伝子の泳動結果を図2にそれぞれ示す。【００７７】
該結果より、従来法では、十分な量の増幅産物が得られていないことが判った。即ち、MEF細胞由来のDNAを用いた場合であっても、比較例１と同様に、従来法では十分な量の増幅産物が得られないことが判った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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