(57)【要約】澱粉粒の水懸濁液中の澱粉粒を、０℃以上かつ該澱粉粒の糊化開始温度以下の温度において４−α−グルカノトランスフェラーゼで処理して酵素処理澱粉粒を得る工程を包含する、老化しにくい酵素処理澱粉粒の製造方法。老化しにくい酵素処理澱粉粒であって、該澱粉粒から作製したゲルを４℃にて１４日間保存した後のゲル中の澱粉の老化度が、４℃にて１６時間保存した後の該ゲル中の澱粉の老化度の２００％以下であることを特徴とする、澱粉粒。【特許請求の範囲】
【請求項１】
澱粉粒の水懸濁液中の澱粉粒を、０℃以上かつ該澱粉粒の糊化開始温度以下の温度において４−α−グルカノトランスフェラーゼで処理して酵素処理澱粉粒を得る工程を包含する、老化しにくい酵素処理澱粉粒の製造方法。
【請求項２】
前記４−α−グルカノトランスフェラーゼがＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来アミロマルターゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
老化しにくい酵素処理澱粉粒であって、該澱粉粒から作製したゲルを４℃にて１４日間保存した後のゲル中の澱粉の老化度が、４℃にて１６時間保存した後の該ゲル中の澱粉の老化度の２００％以下であることを特徴とする、澱粉粒。
【請求項４】
前記澱粉粒から作製したゲルを４℃にて１６時間保存した後の該ゲルのヤング率が、該澱粉粒に対応する酵素処理前の未処理澱粉粒から作製したゲルを４℃にて１６時間保存した後のゲルのヤング率に対し９０％以上であることを特徴とする、請求項３記載の澱粉粒。
【請求項５】
請求項１に記載の方法によって製造される、請求項３に記載の澱粉粒。
【請求項６】
請求項３に記載の澱粉粒を使用して製造された澱粉ゲル含有食品。
【請求項７】
澱粉ゲル含有食品の製造方法であって、
食品材料と請求項３に記載の酵素処理澱粉粒と水とを混合して混合物を得る工程；
該混合物を加熱して該混合物中の該酵素処理澱粉粒を糊化する工程；および
該糊化した酵素処理澱粉粒を含む混合物を冷却してゲル化させて澱粉ゲル含有食品を得る工程を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲル状でも老化しにくい性質を有する澱粉粒およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
澱粉を含む材料を加熱調理して得られた食品（例えば、餅、わらび餅など；以下、澱粉ゲル含有食品という）は、しばしば、保存しておくと硬くなって食べられなくなったり、食べにくくなったりする。これは、加熱調理によって形成された澱粉ゲル中の澱粉が、時間の経過とともに老化し、その結果、澱粉ゲルが硬くなり、不透明になることが主な原因である。【０００３】
現代では多種多様な加工食品が流通しており、澱粉ゲル含有食品の加工食品の比率は非常に高い。加工食品は流通過程で数日以上の時間が経過することが多く、また、製造後に長期間保存されることが多い。そのため、流通している間または保存している間に加工食品は加工直後の出来立ての食感を失ってしまうことが多い。【０００４】
食感の劣化は加工食品の商品価値を低下させる。そのため、最悪の場合には、短期間の保存の後にその食品を廃棄せざるを得なくなる。【０００５】
さらに、食品の多様化に伴い、食品に様々な形、物性及びテクスチャーを付与することが求められている。特に、食感と口どけは、食品の重要な物性として注目されている。最近注目されている嚥下困難者用食品及び被介護者用食品の市場においても、食感は重要な機能として検討されている。【０００６】
従来、食品の食感や物性を改良するために、食品の調製の際に様々なゲル化剤が食品素材に添加されている。そのようなゲル化剤の一種として、澱粉が利用されている。天然の澱粉（すなわち、生澱粉）だけでなく、その化学修飾された形態の澱粉（例えば、酢酸澱粉及びリン酸架橋澱粉）もまた、ゲル化剤として利用されている。天然の澱粉は食品調製の後すぐに激しく老化する。特定の官能基付加澱粉（例えばエステル化澱粉及びエーテル化澱粉）は天然の澱粉と比較すると老化しにくいことが知られており、そのため、例えば、改善された老化性を与えるために数多くの食品に用いられている。【０００７】
例えば、エステル化澱粉の一種である酢酸澱粉は、最も一般的に使用される化工澱粉である。この酢酸澱粉に用いられる原料澱粉に結合するアセチル基が増加するほど、得られる酢酸澱粉の糊化温度は低下し、その粘着性が増加する。酢酸澱粉を用いて得られるゲルは、天然の未処理澱粉を用いて得られるゲルよりも老化性および透明性が改善されている。そのため、酢酸澱粉は、焼き鳥のたれ又はみたらしだんごのたれ、冷凍麺の食感改良及び安定化、冷凍卵焼の離水防止などに利用される。しかしながら、酢酸澱粉を用いて製造されたゲルを含む食品についても、以下に述べる理由により、冷蔵庫で長期保存すると食感が悪くなることが問題で、商品として使いものにならなくなるという欠点があった。【０００８】
同様にエステル化澱粉の一種であるリン酸化澱粉を用いて得られる糊液は、天然の澱粉を用いて得られる糊液よりも高い粘性を示す。また、その糊液を冷却してゲル化した場合にも、天然の未処理澱粉を用いて得られるゲルよりも老化性および透明性が改善されている。しかしながら、リン酸化澱粉を用いて製造されたゲルを含む食品も、以下に述べる理由により、冷蔵庫で長期保存すると食感が悪くなることが問題で、商品として使いものにならなくなるという欠点があった。【０００９】
さらに別のエーテル化澱粉の一種にヒドロキシプロピル澱粉がある。天然の未処理澱粉へのヒドロキシプロピル基の結合により、ヒドロキシプロピル澱粉は、天然の未処理澱粉よりも親水性が増大し、糊化温度は低下する。従って、ヒドロキシプロピル澱粉を用いて得られた糊液は、ロングボディーなテクスチャーを有し、さらに、その糊液を冷却してゲル化した場合にも、天然の未処理澱粉を用いて得られるゲルよりも老化性および透明性が改善されている。ヒドロキシプロピル澱粉は、最近では、加工食品の製造に広く利用されるようになってきている。しかしながら、ヒドロキシプロピル澱粉を用いて製造されたゲルを含む食品も、以下に述べる理由により、冷蔵庫で長期保存すると食感が悪くなることが問題で、商品として使いものにならなくなるという欠点があった。【００１０】
また、これらの化工澱粉を用いて得られるゲルの耐老化性を高めるためには、付加する官能基量を増加させることが必須であるが、その場合、澱粉の糊化開始温度の顕著な低下や、澱粉糊液における最高粘度の顕著な上昇、さらにはゲル化力の低下が発生し、澱粉本来の物性と著しくかけ離れてしまう。そのため、食品への利用が制限されてしまう。【００１１】
さらに、このような糊化開始温度の低下や、最高粘度の上昇、ゲル化力を改善する目的で、リン酸架橋やアジピン酸架橋といった化学修飾による架橋処理がある。ところで、上記のその理由というのは、酢酸澱粉、ヒドロキシプロピル澱粉およびそれらをリン酸架橋またはアジピン酸架橋した澱粉のいずれの化工澱粉についても、これらの化工澱粉を用いて得られたゲルを冷蔵庫（例えば、４〜１０℃）で数日間保存すると、ゲル中の澱粉が老化し、その結果、ゲルはもろくなり、弾力性を失い、不透明で硬くなる傾向にある。澱粉ゲル含有食品中の澱粉ゲルも同様に冷却によって澱粉が老化し、澱粉ゲル含有食品がもろくなり、弾力性を失い、その食感が硬くなる。その結果、その澱粉ゲル含有食品の商品価値は激しく低下する。【００１２】
さらに、上記のようなエーテル化澱粉、エステル化澱粉及び架橋澱粉の製造工程は非常に煩雑であり、工程管理が難しく、その上コストアップにつながる。さらに、エーテル化澱粉及びエステル化澱粉は、その構造中に天然の澱粉にはないアセチル基、ヒドロキシプロピル基などが導入されており、その安全性を担保するために加工方法および加工程度に厳密な法的制限があるという問題もある。さらに、化学処理は、安心および安全を求める消費者のニーズに全く適合していないという問題もある。【００１３】
従って、未処理澱粉のゲル形成能を維持したまま、ゲルの状態で冷蔵保存しても老化しにくい澱粉が求められている。さらに、このような澱粉は、化学修飾がされていないかまたはその修飾程度が低い澱粉であることがより好ましい。【００１４】
４−α−グルカノトランスフェラーゼを利用した糖質の開発に関する技術を以下に説明する。特許文献１は、４−α−グルカノトランスフェラーゼの一種であるＤ酵素をアミロースに作用させることにより、環状アミロースを合成し得ることを記載している。特許文献１はまた、Ｄ酵素をアミロペクチンなどの分岐状グルカンに作用させることにより、分岐型環状グルカンを合成し得ることを記載している。【００１５】
しかし、特許文献１の基質として利用されるグルカンは、酵素処理の前に、加熱または有機溶媒により糊化又は溶解したグルカンであり、澱粉粒の形状を維持していない。そのため、この方法では酵素処理された澱粉粒を得ることはできない。【００１６】
特許文献２は、熱可逆性ゲルを形成するための作用剤として、４−α−グルカノトランスフェラーゼと同じ分類の酵素であるα−１，４−α１，４−グルコシルトランスフェラーゼを作用させることにより得られる修飾澱粉の使用を記載する。しかし、特許文献２も、澱粉を糊化させた後に酵素処理するか、または澱粉粒懸濁液に酵素を添加し、糊化開始温度以上（例えばじゃがいも澱粉の糊化開始温度は６０℃前後であり、特許文献２の例４の反応温度は７０℃である）で処理することにより修飾澱粉を調製している。よって、得られた修飾澱粉は澱粉粒の形状を維持しておらず、この方法では、酵素処理された澱粉粒を得ることはできない。実際、澱粉粒懸濁液を用いた場合でさえも、特許文献２の例４に示されるように、α−１，４−α１，４−グルコシルトランスフェラーゼの作用後は粒子構造が完全にみられなくなっており、このことは、修飾澱粉が澱粉粒の形状を維持していないことを意味する。【００１７】
本発明者らが今回発明した酵素処理澱粉粒の調製方法においては、終始、澱粉粒を糊化させず、澱粉粒の状態のままで酵素処理を行うことに特徴がある。酵素処理中に澱粉粒を溶解してしまうと澱粉粒の状態を維持できなくなってしまうので、酵素処理中に澱粉粒を溶解させないことが重要である。【００１８】
このように、本発明者らの酵素処理澱粉粒およびその製造方法は、特許文献１および２に開示される酵素処理澱粉およびその製造方法とは全く異なる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】特開平８−３１１１０３号公報
【特許文献２】特表２００１−５０１６７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、本発明は、老化性の改善された、特に経時的な老化進行の少ない澱粉を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、４−α−グルカノトランスフェラーゼを、澱粉粒が溶解しない条件で澱粉粒に作用させることにより、経時的な老化進行の少ないという優れた特性を有する澱粉粒が得られることを見出し、これに基づいて本発明を完成させた。即ち、澱粉粒が溶解しない条件で４−α−グルカノトランスフェラーゼを澱粉粒に作用させて得た酵素処理澱粉粒を用いて得られたゲルは、長期間低温で放置した場合にも、老化進行は少なく、柔らかな食感を維持できる。【００２２】
本発明の方法においては、澱粉粒が溶解しない条件下で澱粉粒を酵素処理することがポイントである。従来のアミロマルターゼによる酵素処理は、澱粉を糊化した状態で酵素処理している。しかし、従来の方法によって得られる酵素処理澱粉は澱粉粒の形状が崩壊しており、本来澱粉が持つ澱粉粒の膨潤による粘度上昇や、澱粉粒の崩壊による粘度低下といった物性を示さない。また、澱粉粒が崩壊した状態で酵素処理をして得られる物質は、本発明の方法で得られる酵素処理澱粉粒とは全く異なった特性を有しており、老化抑制特性を示さない。本発明の酵素処理澱粉粒は、澱粉粒を維持したまま酵素処理することによって得られ、未処理澱粉とほぼ同等の粒の膨潤及び崩壊を示すことが可能であり、最も驚くべきことには、ゲル化しても老化が抑制されるという効果を示す。本発明の酵素処理澱粉粒の示す老化抑制効果は従来の澱粉（未処理澱粉、化学修飾澱粉及び物理処理澱粉を含む）には全く見られなかったほどに優れている。さらに、本発明の方法は、未処理澱粉、化学修飾澱粉及び物理処理澱粉のみならず、澱粉粒の形状を保持しているどのような任意の澱粉にも適用可能である。【００２３】
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
澱粉粒の水懸濁液中の澱粉粒を、０℃以上かつ該澱粉粒の糊化開始温度以下の温度において４−α−グルカノトランスフェラーゼで処理して酵素処理澱粉粒を得る工程を包含する、老化しにくい酵素処理澱粉粒の製造方法。【００２４】
（項目２）
前記４−α−グルカノトランスフェラーゼがＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来アミロマルターゼである、項目１に記載の方法。【００２５】
（項目３）
老化しにくい酵素処理澱粉粒であって、該澱粉粒から作製したゲルを４℃にて１４日間保存した後のゲル中の澱粉の老化度が、４℃にて１６時間保存した後の該ゲル中の澱粉の老化度の２００％以下であることを特徴とする、澱粉粒。【００２６】
（項目４）
前記澱粉粒から作製したゲルを４℃にて１６時間保存した後の該ゲルのヤング率が、該澱粉粒に対応する酵素処理前の未処理澱粉粒から作製したゲルを４℃にて１６時間保存した後のゲルのヤング率に対し９０％以上であることを特徴とする、請求項３記載の澱粉粒。【００２７】
（項目５）
項目１または２の方法によって製造される、請求項３または４に記載の澱粉粒。【００２８】
（項目６）
項目３〜５のいずれか１項に記載の澱粉粒を使用して製造された澱粉ゲル含有食品。【００２９】
（項目７）
澱粉ゲル含有食品の製造方法であって、
食品材料と項目３〜５のいずれか１項に記載の酵素処理澱粉粒と水とを混合して混合物を得る工程；
該混合物を加熱して該混合物中の該酵素処理澱粉粒を糊化する工程；および
該糊化した酵素処理澱粉粒を含む混合物を冷却してゲル化させて澱粉ゲル含有食品を得る工程を包含する方法。
【発明の効果】
【００３０】
澱粉粒の形状を維持したまま４−α−グルカノトランスフェラーゼを作用させることにより調製された酵素処理澱粉粒は、化学修飾していないにも関わらず、老化性が改善されていることが確認された。【００３１】
化学修飾澱粉に４−α−グルカノトランスフェラーゼを作用させることにより調製された酵素処理澱粉粒は、エーテル化及びエステル化などの化学修飾によって得られる老化性改善効果よりも優れた老化性改善効果を示すことが確認された。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３３】
（１．材料）
（１．１  澱粉粒）
本明細書中では、用語「澱粉粒」とは、結晶構造を有する澱粉分子をいう。澱粉粒は、未処理の澱粉粒であってもよく、未処理の澱粉粒を化学修飾または物理処理することによって得られる澱粉粒であってもよい。食品として分類される酵素処理澱粉粒を使用することが好ましい場合には、使用される澱粉粒は、植物から得られた未処理の澱粉粒である。植物は、アミロプラスト内に澱粉分子を顆粒として（すなわち、大きな結晶として）貯蔵する。この顆粒が澱粉粒と呼ばれる。澱粉粒内では、澱粉分子どうしが水素結合などによって結合している。そのため、澱粉粒はそのままでは水に溶けにくく、消化もされにくい。澱粉粒を水とともに加熱すると膨潤し、分子がほぐれてコロイド状になる。この変化は「糊化」と呼ばれる。澱粉粒の大きさおよび形態は、その澱粉粒が得られた植物によって異なる。例えば、トウモロコシの澱粉粒（コーンスターチ）の平均粒径は約１２μｍ〜約１５μｍであり、他の澱粉粒と比べて小さめで大きさはそろっている。コムギおよびオオムギの澱粉粒は、粒径約２０μｍ〜約４０μｍの大型の澱粉粒と粒径数μｍの小型の澱粉粒の２種の大きさに分かれる。コメではアミロプラスト内に直径数μｍの角ばった澱粉小粒が多数蓄積される複粒構造となる。バレイショの澱粉粒は平均粒径約４０μｍであり、澱粉原料として一般に利用されているものの中では最も大きい。本発明においては、市販されている各種の澱粉粒を使用することが可能である。植物などから澱粉粒を精製するなどの方法により澱粉粒を調製して本発明に使用してもよい。
【００３４】
澱粉粒の状態では澱粉分子どうしが強く結合しているため、酵素が作用しにくい。食品として扱われる酵素処理澱粉粒を得るための特定の実施形態では、本発明で使用される澱粉粒は、植物から単離または精製されているが、酸処理、化学修飾処理および熱処理を受けていないものである。本明細書中では、用語「未処理」の澱粉粒とは、天然で生成される澱粉粒であって、自然状態で共存している他の成分（例えば、タンパク質、脂質など）から澱粉粒を分離するために必要な処理以外の処理が施されていない澱粉粒をいう。したがって、植物などから不純物を除去して澱粉を精製する工程などの、澱粉粒を調製する方法における各工程での処理は、本明細書中においては、澱粉粒の処理には含まれない。澱粉粒としては、通常市販されている澱粉粒であればどのような澱粉粒でも使用され得る。
【００３５】
別の特定の実施形態では、本発明で使用される澱粉粒は、未処理の澱粉粒に対して化学修飾または物理処理を行うことによって処理された澱粉粒であってもよい。化学修飾された澱粉粒の例としては、アセチル化アジピン酸架橋澱粉、アセチル化酸化澱粉、アセチル化リン酸架橋澱粉、オクテニルコハク酸澱粉ナトリウム、酢酸澱粉、酸化澱粉、漂白澱粉、ヒドロキシプロピル化リン酸架橋澱粉、ヒドロキシプロピル澱粉、リン酸架橋澱粉、リン酸化澱粉およびリン酸化モノエステル化リン酸架橋澱粉が挙げられる。「アセチル化アジピン酸架橋澱粉」とは、澱粉を無水酢酸および無水アジピン酸でエステル化して得られたものをいう。「アセチル化酸化澱粉」とは、澱粉を次亜塩素酸ナトリウムで処理した後、無水酢酸でエステル化して得られたものをいう。「アセチル化リン酸架橋澱粉」とは、澱粉をトリメタリン酸ナトリウムまたはオキシ塩化リンおよび無水酢酸または酢酸ビニルでエステル化して得られたものをいう。「オクテニルコハク酸澱粉ナトリウム」とは、澱粉を無水オクテニルコハク酸でエステル化して得られたものをいう。「酢酸澱粉」とは、澱粉を無水酢酸または酢酸ビニルでエステル化して得られたものをいう。「酸化澱粉」とは、澱粉を次亜塩素酸ナトリウムで処理して得られたものであって、厚生労働省告示４８５号記載の純度試験法に準じて試料澱粉中のカルボキシ基（カルボキシル基ともいう）の分析を行った場合にカルボキシ基が１．１％以下であるものをいう。ただし、カルボキシ基の量がこの範囲にあっても「漂白澱粉」は「酸化澱粉」の定義には含まれない。「漂白澱粉」とは、澱粉を次亜塩素酸ナトリウムで処理して得られたものであって、厚生労働省告示４８５号記載の純度試験法に準じて試料澱粉中のカルボキシ基の分析を行った場合にカルボキシ基が０．１％以下であるものであって、厚生労働省告示４８５号記載の酸化澱粉の「確認試験（３）」による試験結果が陰性でかつ粘度等の澱粉の性質に生じた変化が酸化によるものでないことを合理的に説明できるものをいう。カルボキシ基の量が０．１％以下であっても粘度等の澱粉の性質が天然澱粉から変化しているものは酸化澱粉に分類され、日本では食品としては取り扱われず、食品添加物として取り扱われる。「ヒドロキシプロピル化リン酸架橋澱粉」とは、澱粉をトリメタリン酸ナトリウムまたはオキシ塩化リンでエステル化し、酸化プロピレンでエーテル化して得られたものをいう。「ヒドロキシプロピル澱粉」とは、澱粉を酸化プロピレンでエーテル化して得られたものをいう。「リン酸架橋澱粉」とは、澱粉をトリメタリン酸ナトリウムまたはオキシ塩化リンでエステル化して得られたものをいう。「リン酸化澱粉」とは、澱粉をオルトリン酸、そのカリウム塩もしくはナトリウム塩またはトリポリリン酸ナトリウムでエステル化して得られたものをいう。「リン酸モノエステル化リン酸架橋澱粉」とは、澱粉をオルトリン酸、そのカリウム塩もしくはナトリウム塩またはトリポリリン酸ナトリウムでエステル化し、トリメタリン酸ナトリウムまたはオキシ塩化リンでエステル化して得られたものをいう。
【００３６】
物理処理された澱粉粒の種類の例としては、湿熱処理澱粉および熱抑制澱粉が挙げられる。
【００３７】
本発明において使用される澱粉粒は、地上澱粉であっても地下澱粉であってもよい。地下澱粉の例としては、タピオカ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、くず澱粉などが挙げられる。地上澱粉の例としては、小麦澱粉、コーンスターチ（例えば、ハイアミロースコーンスターチ、通常のコーンスターチおよびワキシーコーンスターチ）、米澱粉（例えば、もち米澱粉および粳米澱粉）、豆類澱粉（例えば、緑豆澱粉、エンドウ豆澱粉、小豆澱粉およびソラマメ澱粉）、アマランサス澱粉などが挙げられる。本発明において使用される澱粉粒は、好ましくは馬鈴薯、米、キャッサバ、トウモロコシまたは小麦由来の澱粉である。澱粉粒として未処理の澱粉を使用する場合には、未処理の馬鈴薯澱粉、未処理のタピオカ澱粉、未処理のトウモロコシ澱粉、未処理の小麦澱粉または未処理の米澱粉を使用することが好ましい。澱粉粒として化工澱粉を使用する場合には、馬鈴薯澱粉、タピオカ澱粉、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉または米澱粉の、アセチル化アジピン酸架橋澱粉、アセチル化酸化澱粉、アセチル化リン酸架橋澱粉、オクテニルコハク酸澱粉ナトリウム、酢酸澱粉、酸化澱粉、漂白澱粉、ヒドロキシプロピル化リン酸架橋澱粉、ヒドロキシプロピル澱粉、リン酸架橋澱粉、リン酸化澱粉またはリン酸モノエステル化リン酸架橋澱粉を使用することが好ましい。物理処理澱粉を使用する場合には、馬鈴薯澱粉、タピオカ澱粉、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉または米澱粉の、湿熱処理澱粉または熱抑制澱粉であることが好ましい。
【００３８】
澱粉粒は、一般に、タンパク質、脂質などから分離された、単離された澱粉であることが好ましい。したがって、米由来の澱粉粒を使用する場合には、単離された米澱粉を使用するか、または精白した米粒を粉砕することによってタンパク質が除去された米粉を使用することが好ましい。
【００３９】
本明細書中では用語「米粉」とは、精白した米粒を粉砕したものをいう。「精白」とは、籾殻を除いた米粒を研磨して糠を除去することをいう。精白の程度の指標として精白歩合がある。精白歩合は、｛（精白後の糠の重量）／（籾殻を除いた原料米粒の重量）｝×１００によって計算される。例えば、精白歩合１０％とは、糠の重量が１０％で、得られる精白した米粒の重量が９０％である。本発明で使用される米粉の原料は、ジャポニカ米であってもインディカ米であってもよい。ジャポニカ米が好ましい。米粉の原料は、うるち米であっても糯米であってもよい。米粉の原料は砕米であってもよい。米粉の原料として使用される米粉の精白歩合は、約１０％以上であることが好ましく、約１５％以上であることがさらに好ましく、約２０％以上であることが最も好ましい。精白歩合は約９５％以下であることが好ましく、約９０％以下であることがさらに好ましい。本発明で使用される米粉のタンパク質含量は、通常約１重量％以上であり、例えば、約５重量％以上または約６重量％以上であってもよい。本発明で使用される米粉のタンパク質含量は、約１０重量％以下であることが好ましく、約９重量％以下であることがさらに好ましく、約８重量％以下であることがなおさらに好ましく、約７重量％以下であることが特に好ましく、約６重量％以下であることが最も好ましい。米粉は製造過程で澱粉粒の構造を崩壊させる処理（例えば、加熱処理）が施されていないものである必要がある。米粉は一般に、米粉麺（ライスヌードル、ビーフンなど）、和菓子（羊羹、饅頭、せんべいなど）、洋菓子（クッキー、ケーキなど）、パン、餃子の皮、焼売の皮などに用いられている。
【００４０】
本明細書中では用語「米澱粉」とは、米粒から精製した澱粉をいう。米澱粉は、例えば、原料米をタンパク質除去し、精製することにより製造され得る。米澱粉の一般的な製造方法をより詳細に説明する。例えば、原料米からタンパク質の分離および米粒の軟化のためにアルカリ液による浸漬を行うことで、米タンパク質の５０％程度が除去され、米粒が軟化する。そして、さらにアルカリ液を添加しながら磨砕することで粗澱粉乳が得られる。分級型またはノズル型の遠心分離機を組み合わせて使用してこの粗澱粉乳を（例えば４〜５回）水洗することにより、さらにタンパク質が除去されて精製澱粉乳が得られ得る。こうして得られた精製澱粉乳を塩酸により中和し、水洗し、脱水し、乾燥し、その後精製することにより、タンパク質含量約０．３％以下の精製米澱粉を得ることができる。米澱粉は、その製造過程において澱粉粒の構造を崩壊させる処理（例えば、加熱処理）が施されていないものである必要がある。
【００４１】
米澱粉は多面形の複粒で、その平均粒径は一般に約２〜約５マイクロメートルであり、市販されている澱粉中で最も小さい。このために、製造は困難で収量も少ないために高価なものとなる。
【００４２】
米澱粉は、微粒子であるために、凸凹面に付着することによってその凹凸面を平滑面に変えて滑らかな触感とすることが出来る。そのため、米澱粉は、印画紙用、化粧品用などの工業用や食品の手粉、打ち粉、振りかけ粉などの滑材によく使用される。
【００４３】
澱粉は、その由来によって構造が微妙に異なるため、由来によって物性の特徴が異なる。例えば、未処理の小麦澱粉は、ゲル形成能が高いが、糊液の粘度は低く、糊液は不透明である。未処理のタピオカ澱粉は、ゲル形成能は低いが糊液の粘度は高く、糊液の透明感も高く、さらに老化性は中程度である。未処理のタピオカ澱粉は特に、安価でかつ糊液が透明であるので添加しやすいという利点があるが、ゲル形成能が低いため用途が限定される。また、未処理の天然の小麦澱粉は糊液の粘度が低いために粘度を必要とする用途には使用できなかった。未処理のコーンスターチは、ゲル形成能は高いが、糊液の粘度はやや低く、糊液は不透明であり、老化性が高い。
【００４４】
化学修飾は、未処理の澱粉粒の物性を改変する。例えば、リン酸架橋、アジピン酸架橋などの架橋は、一般に、得られる澱粉粒を使用して形成されるゲルを、未処理の澱粉粒を使用して形成されるゲルよりも硬くし、濁りを増すことが多い。ヒドロキシプロピル化、アセチル化および酸化処理は、一般に、得られる澱粉粒を使用して形成されるゲルを、未処理の澱粉粒を使用して形成されるゲルよりも透明度を向上させ、ゲルを軟らかくすることが多い。オクテニルコハク酸処理は、一般に、得られる澱粉粒を使用して形成されるゲルが油を含むことを可能にすることができる。
【００４５】
物理処理もまた、未処理の澱粉粒の物性を改変する。例えば、湿熱処理は、一般に、得られる澱粉粒を使用して形成されるゲルを、未処理の澱粉粒を使用して形成されるゲルよりも硬くすることが多く、糊液粘度を減少させることが多い。例えば、熱抑制処理は、一般に、得られる澱粉粒を使用して形成されるゲルを、未処理の澱粉粒を使用して形成されるゲルよりも硬くすることが多い。また、ドライ加熱処理時間が長いものは、高架橋澱粉の糊液と同様、低い糊液粘度を示すことが多い。
【００４６】
本発明において使用される澱粉粒は、なるべく不純物を含まないことが好ましい。澱粉粒中の不純物の含有量は、好ましくは約１０重量％以下、より好ましくは約５重量％以下、さらに好ましくは約１重量％以下である。
【００４７】
本発明で使用される澱粉粒のタンパク質含量は、好ましくは約１０重量％以下であり、より好ましくは約８重量％以下であり、さらに好ましくは約６重量％以下であり、特に好ましくは約３重量％以下であり、もっとも好ましくは約１重量％以下である。
【００４８】
（１．２  酵素）
本発明で使用される酵素は４−α−グルカノトランスフェラーゼである。本発明で用いられる４−α−グルカノトランスフェラーゼは、供与体分子の非還元末端のグルコシル基または２個以上のグルコースからなるユニットを、受容体分子の非還元末端に転移する酵素である。従って、４−α−グルカノトランスフェラーゼによる酵素反応は、供与体分子（すなわち、基質）の重合度の不均一化をもたらす。供与体分子が充分に大きい場合、４−α−グルカノトランスフェラーゼは、分子内転移を生じることができ、その結果、環状構造をもつ生成物が得られる。
【００４９】
本発明で用いられる４−α−グルカノトランスフェラーゼは、国際生化学分子生物学連合の定める酵素番号ＥＣ  ２．４．１．２５に分類される酵素である。ＥＣ  ２．４．１．２５に分類される酵素は、アミロマルターゼ、ディスプロポーショネーティングエンザイム、Ｄ−酵素、不均化酵素などとも呼ばれる酵素である（以下、ＭａｌＱとも呼ぶ）。微生物由来の４−α−グルカノトランスフェラーゼはアミロマルターゼと呼ばれ、植物由来の４−α−グルカノトランスフェラーゼはＤ−酵素と呼ばれる。本発明では、グリコーゲンデブランチングエンザイム（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  Ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ）という、４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性とアミロ１，６グルコシダーゼ活性を併せ持つ酵素（ＥＣ  ３．２．１．３３＋ＥＣ  ２．４．１．２５）も利用し得る。４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性は、Ｔｅｒａｄａら（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６５巻，９１０〜９１５頁（１９９９））に基づいて決定され得る。活性を測定する４−α−グルカノトランスフェラーゼの性質に合わせて、測定時の反応温度、反応ｐＨなどを調整し得る。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、アミロマルターゼであってもよく、Ｄ−酵素であってもよい。
【００５０】
本発明においては、反応至適温度が約３０℃以上でかつ約９０℃以下である４−α−グルカノトランスフェラーゼを使用することが好ましい。本明細書中では、「反応至適温度」とは、上述のＭａｌＱ活性の測定を温度のみ変化させて行ったときに、最も活性が高い温度をいう。使用する４−α−グルカノトランスフェラーゼの反応至適温度は、好ましくは約３０℃以上であり、さらに好ましくは約３５℃以上であり、なおさらに好ましくは約４０℃以上であり、特に好ましくは約４５℃以上であり、最も好ましくは約５０℃以上である。使用する４−α−グルカノトランスフェラーゼの反応至適温度は、好ましくは約９０℃以下であり、さらに好ましくは約８５℃以下であり、なおさらに好ましくは約８０℃以下であり、特に好ましくは約７５℃以下であり、最も好ましくは約７０℃以下である。
【００５１】
４−α−グルカノトランスフェラーゼの４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性は、以下の方法によって測定される：
１０％マルトトリオース、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、酵素を含む反応液１２０μｌを５０℃で１０分間インキュベート、その後、１００℃で１０分間加熱して反応を停止する。グルコースオキシダーゼ法によりグルコース量を測定する。４−α−グルカノトランスフェラーゼの単位量は、１分間に１μｍｏｌグルコースを生成する４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性を１単位(Ｕ又はＵｎｉｔ)とする。
【００５２】
本発明の方法においては、４−α−グルカノトランスフェラーゼを澱粉粒に作用させる際の温度において４−α−グルカノトランスフェラーゼが４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性を有することが好ましい。この場合の特定の温度において「４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性を有する」とは、７０℃で１０分間のインキュベーションの代わりにその特定の温度において１０分間のインキュベーションすること以外は上記の４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性の測定と同じ方法で測定を行った場合に４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性が検出されることをいう。この特定の温度での４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性は好ましくは約０．１Ｕ／ｍＬ以上であり、より好ましくは約０．２Ｕ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは約０．５Ｕ／ｍＬ以上であり、特に好ましくは約１Ｕ／ｍＬ以上であり、最も好ましくは約１．５Ｕ／ｍＬ以上である。この特定の温度での４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性は高いほど好ましく、上限は特にないが、例えば、約５，００Ｕ／ｍＬ以下、約２，００Ｕ／ｍＬ以下、約１，００Ｕ／ｍＬ以下、約５０Ｕ／ｍＬ以下、約２５Ｕ／ｍＬ以下などであり得る。
【００５３】
４−α−グルカノトランスフェラーゼは、微生物および植物に存在する。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する微生物の例としては、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓなどが挙げられる。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する植物の例としては、馬鈴薯、サツマイモ、ヤマイモ、キャッサバなどの芋類、トウモロコシ、イネ、コムギ、大麦などの穀類、えんどう豆、大豆などの豆類、ホウレンソウなどが挙げられる。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、市販のものであっても、当該分野で公知の方法によりこれらの生物から調製されてもよく、またはこれらの生物の４−α−グルカノトランスフェラーゼ遺伝子を用いて遺伝子組換え法により調製されてもよい。当該分野で公知の任意の４−α−グルカノトランスフェラーゼが使用され得る。
【００５４】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓのＴａｑ  ＭａｌＱ（Ｔａｑ  ＭａｌＱは、アミロマルターゼであり、４−α−グルカノトランスフェラーゼの一種である）をコードする塩基配列を配列番号１に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号２に示す。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑ  ＭａｌＱをコードする塩基配列のクローニング方法は、Ｔｅｒａｄａら（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６５巻，９１０〜９１５頁（１９９９）に記載される。
【００５５】
本明細書中では、酵素がある生物に「由来する」とは、その生物から直接単離したことのみを意味するのではなく、その生物が持っている酵素のアミノ酸配列またはそれをコードする塩基配列に基づいて同じアミノ酸配列を有する酵素を別の生物で作製することも意味する。例えば、ある生物から入手したある酵素をコードする遺伝子を大腸菌に導入して、その大腸菌からその酵素を単離する場合も、その酵素はその生物に「由来する」という。
【００５６】
多数の４−α−グルカノトランスフェラーゼが公知であり、従って、多数の４−α−グルカノトランスフェラーゼアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列が公知である。当該分野においては、天然の配列とはわずかに異なる配列を有する改変体が天然に存在し得ることも公知である。本発明の方法においては、配列番号２に例示した配列を有する４−α−グルカノトランスフェラーゼ以外にも、４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性を有する限り、このような、天然に存在する４−α−グルカノトランスフェラーゼ改変体および天然の４−α−グルカノトランスフェラーゼに対して人工的に変異を導入して得られる改変体も用い得る。改変体４−α−グルカノトランスフェラーゼは、改変を導入する前の４−α−グルカノトランスフェラーゼと同等以上の活性を有することが好ましい。例えば、本発明で用いられる４−α−グルカノトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、ある実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列（すなわち、対照アミノ酸配列）と同一、すなわち、１００％同一であってもよく、別の実施形態では、このアミノ酸配列は、対照アミノ酸配列と比較してある一定の数までアミノ酸が変化していてもよい。このような変化は、少なくとも１個（好ましくは１または数個；上限は特にないが、例えば、約５０個以下、約４０個以下、約３０個以下、約２０個以下、約１０個以下など）のアミノ酸の欠失、置換（保存的置換および非保存的置換を含む）または挿入からなる群より選択され得る。この変化は対照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置で生じてもよく、またはこれら末端以外のどの位置で生じてもよい。アミノ酸残基の変化は、１残基ずつ点在していてもよく、数残基連続していてもよい。当業者は、４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性を有する目的の改変体を容易に選択することができる。あるいは、目的の酵素をコードする遺伝子を直接化学合成してもよい。そのような化学合成の方法は、当該分野において周知である。
【００５７】
特定の実施形態では、本発明で使用される４−α−グルカノトランスフェラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列に対して好ましくは約５０％以上、より好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、なおいっそう好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性を有する。本発明で使用される４−α−グルカノトランスフェラーゼは、特に好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列に対して約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性を有する。
【００５８】
本明細書において（例えば、アミノ酸配列、塩基配列など）配列の「同一性」とは、２つの配列の間で同一のアミノ酸（塩基配列を比較する場合は塩基）の出現する程度をいう。一般に、同一性は、２つのアミノ酸または塩基の配列を比較して、付加または欠失を含み得る最適な様式で整列されたこれら２つの配列を比較することによって決定され得る。
【００５９】
しかし、本明細書では配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ  Ｖｅｒ．４．０（株式会社ゼネティックス）のマキシマムマッチングを用いて算出される。このプログラムは、解析対象となる配列データに対して、比較対照となる配列データを置き換えおよび欠損を考慮しながら、配列間で一致するアミノ酸対が最大になるように並べ替え、その際、一致（Ｍａｔｃｈｅｓ）、不一致（Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ）、ギャップ（Ｇａｐｓ）についてそれぞれ得点を与え合計を算出して最小となるアライメントを出力しその際の同一性を算出する（参考文献：Ｔａｋｅｉｓｈｉ，Ｋ．，およびＧｏｔｏｈ，Ｏ．１９８４．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｍｏｎｇ  Ｖａｒｉｏｕｓ  ４．５  Ｓ  ＲＮＡ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９２：１１７３−１１７７）。本明細書では配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ  Ｖｅｒ．４．０のマキシマムマッチングをＭａｔｃｈｅｓ＝−１；Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ＝１；Ｇａｐｓ＝１；＊Ｎ＋＝２の条件で用いて算出される。
【００６０】
４−α−グルカノトランスフェラーゼをコードする塩基配列の改変は、当該分野で周知の方法を用いて、例えば、部位特異的変異誘発法、変異原を用いた変異誘発法（対象遺伝子を亜硝酸塩などの変異剤で処理すること、または紫外線処理を行うこと）、エラープローンＰＣＲを行うことなどによって行われ得る。目的の変異を得やすい点から、部位特異的変異誘発を用いることが好ましい。部位特異的変異誘発を用いれば、目的とする部位で目的とする改変を導入することができるからである。あるいは、目的とする配列をもつ核酸分子を直接合成してもよい。そのような化学合成の方法は、当該分野において周知である。部位特異的変異誘発の手法は、例えば、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．６４８７−６５００（１９８２）に記載される。
【００６１】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、基質など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【００６２】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として実質的に同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において実質的に等価なタンパク質）を生じさせ得ることは、当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【００６３】
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換が挙げられるがこれらに限定されない：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。
【００６４】
本発明の方法において使用する酵素は、上記の目的の酵素を産生する天然の微生物から単離されてもよい。例えば、最初に、目的の酵素を産生する微生物を適切な培地（例えば、Ｌブロス（１％  Ｂａｃｔｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ．，ＵＳＡ）、０．５％  Ｂａｃｔｏ−Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３））中に接種し、振盪させながら適切な温度（例えば、約３０℃〜約４０℃）で一晩培養する。次いで、この培養液を遠心分離して、微生物を沈殿させ、培養上清を得る。得られた培養上清をＵＦ膜で濃縮し、目的の酵素液とする。さらなる精製を必要とする場合、必要に応じて、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅなどを用いたイオン交換クロマトグラフィーによる分画、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲ（ファルマシア社製）などを用いたゲルフィルトレーションクロマトグラフィーによる分画、Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー社製）などを用いた疎水クロマトグラフィーによる分画を組み合わせて使用することにより、精製された目的の酵素を含有する溶液を得ることができる。
【００６５】
あるいは、本発明の方法において使用する４−α−グルカノトランスフェラーゼは、目的の４−α−グルカノトランスフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸分子を適切な宿主細胞に導入して酵素を発現させ、この発現された４−α−グルカノトランスフェラーゼをこの宿主細胞またはその培養液から精製することによって入手され得る。
【００６６】
天然の４−α−グルカノトランスフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸分子（遺伝子ともいう）は、上記のようにして得た精製４−α−グルカノトランスフェラーゼをトリプシン処理し、得られるトリプシン処理断片をＨＰＬＣにより分離し、分離されたいずれかのペプチド断片のＮ末端のアミノ酸配列を、ペプチドシークエンサーにより同定し、次いで、同定したアミノ酸配列をもとに作製した合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて、適切なゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、入手され得る。オリゴヌクレオチドプローブおよびＤＮＡライブラリーを調製するための、ならびに核酸のハイブリダイゼーションによりそれらをスクリーニングするための基本的な戦略は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第ＩおよびＩＩ  巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編  １９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編  １９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編  １９８４）を参照のこと。
【００６７】
あるいは、既知の４−α−グルカノトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列に対する相同性を利用して、例えば、この塩基配列の少なくとも一部を含む核酸プローブを用いたハイブリダイゼーションによって、この４−α−グルカノトランスフェラーゼを有する生物種とは別の生物種をスクリーニングして、この別の生物種が有する４−α−グルカノトランスフェラーゼ遺伝子を含む核酸分子を獲得することもできる。このような方法は当該分野で公知である。
【００６８】
あるいは、種々の４−α−グルカノトランスフェラーゼのアミノ酸配列において保存された領域に対応する縮重プライマーを作製して、ＰＣＲによって４−α−グルカノトランスフェラーゼの塩基配列を獲得することも可能である。このような方法は当該分野で公知である。
【００６９】
ゲノムライブラリーをスクリーニングして４−α−グルカノトランスフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸分子を得る場合、得られた核酸分子は、当業者に周知の方法を用いてサブクローニングされ得る。例えば、目的の塩基配列を含むλファージと、適切な大腸菌と、適切なヘルパーファージとを混合することにより、容易に目的の塩基配列を含有するプラスミドを得ることができる。その後、このプラスミドを含有する溶液を用いて、適切な大腸菌を形質転換して形質転換体を得ることにより、目的の塩基配列をサブクローニングし得る。得られた形質転換体を培養して、例えばアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを得、このプラスミドを解析することにより目的の塩基配列を決定し得る。プラスミドの塩基配列を決定する方法は、当業者に周知である。別の方法として、目的の塩基配列の一部を基に合成されたプライマーを用い、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓなどのゲノムＤＮＡなどを鋳型に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて直接４−α−グルカノトランスフェラーゼ遺伝子を増幅することもできる。
【００７０】
あるいは、４−α−グルカノトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、公知の塩基配列に基づいて化学合成されてもよい。
【００７１】
本発明の方法で用いられる４−α−グルカノトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列は、対照アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（すなわち、対照塩基配列）と比較してある一定の数まで変化していてもよい。このような変化は、少なくとも１個のヌクレオチドの欠失、トランジションおよびトランスバージョンを含む置換、または挿入からなる群より選択され得る。この変化は対照塩基配列の５’末端もしくは３’末端の位置で生じてもよく、またはこれら末端以外のどの位置で生じてもよい。塩基の変化は、１塩基ずつ点在していてもよく、数塩基連続していてもよい。
【００７２】
塩基の変化は、そのコード配列において、ノンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト変異を生じ得、このような変化をした後の塩基配列によりコードされる酵素に変化をもたらし得る。
【００７３】
４−α−グルカノトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列としてはまた、天然の４−α−グルカノトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して同一ではないが相同性のある配列もまた使用され得る。４−α−グルカノトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して相同性を有するそのような塩基配列としては、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ  Ｖｅｒ．４．０のマキシマムマッチングにおいて、上記の条件で用いて比較した場合に、比較対象の配列に対して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の同一性を有する塩基配列が挙げられるがそれらに限定されない。
【００７４】
天然で公知の４−α−グルカノトランスフェラーゼをコードする塩基配列（例えば、配列番号１）の相補配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる４−α−グルカノトランスフェラーゼは、４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性を有する限り、本発明の方法において使用され得る。天然で公知の４−α−グルカノトランスフェラーゼをコードする塩基配列の相補配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子に対して改変を行って得られる改変塩基配列を含む核酸分子によってコードされる４−α−グルカノトランスフェラーゼもまた、老化が抑制された澱粉を生産する能力を有する限り、本発明の方法において使用され得る。当業者は、所望の４−α−グルカノトランスフェラーゼ遺伝子を容易に選択することができる。
【００７５】
本明細書中で使用する用語「ストリンジェントな条件」とは、特異的な配列にはハイブリダイズするが、非特異的な配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件の設定は、当業者に周知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載される。「ストリンジェントな条件」は、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液（０．２％  ＢＳＡ、０．２％  Ｆｉｃｏｌｌ  ４００および０．２％ポリビニルピロリドン）、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での６５℃でのハイブリダイゼーション、およびその後の０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）での６５℃条件下での洗浄である。それゆえ、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、具体的には、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液（０．２％  ＢＳＡ、０．２％  Ｆｉｃｏｌｌ  ４００および０．２％ポリビニルピロリドン）、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄するという条件を用いることにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。
【００７６】
本発明の方法で用いられる４−α−グルカノトランスフェラーゼを製造するために用いられる核酸分子は、天然の４−α−グルカノトランスフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸分子に対して保存的に改変された核酸分子であってもよい。「天然の４−α−グルカノトランスフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸分子に対して保存的に改変された核酸分子」とは、天然の４−α−グルカノトランスフェラーゼのアミノ酸配列と同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸分子をいう。「天然の４−α−グルカノトランスフェラーゼのアミノ酸配列と本質的に同一のアミノ酸配列」とは、天然の４−α−グルカノトランスフェラーゼと本質的に同じ４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性を有するアミノ酸配列をいう。遺伝コードの縮重のため、機能的に同一な多数の塩基配列が任意の所定のアミノ酸配列をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、ＧＣＡコドンによってアラニンが特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたアラニンを変更することなく、ＧＣＣ、ＧＣＧまたはＧＣＵに変更され得る。同様に、複数のコドンによってコードされ得るアミノ酸に関しては、コドンによってそのアミノ酸が特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされた特定のアミノ酸を変更することなく、そのアミノ酸をコードする任意の別のコドンに変更され得る。このような塩基配列の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての塩基配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を包含する。サイレント変異は、コードするアミノ酸が変化しない「サイレント置換」と、そもそも核酸がアミノ酸をコードしない場合（例えば、イントロン部分での変異、他の非翻訳領域での変異など）を包含する。ある核酸がアミノ酸をコードする場合、サイレント変異は、サイレント置換と同義である。本明細書において「サイレント置換」とは、塩基配列において、あるアミノ酸をコードする塩基配列を、同じアミノ酸をコードする別の塩基配列に置換することをいう。遺伝コード上の縮重という現象に基づき、あるアミノ酸をコードする塩基配列が複数ある場合（例えば、グリシンなど）、このようなサイレント置換が可能である。したがって、サイレント置換により生成した塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、もとのポリペプチドと同じアミノ酸配列を有する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンをコードする唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンをコードする唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。
【００７７】
本発明で用いられる４−α−グルカノトランスフェラーゼをコードする塩基配列は、発現のために導入される生物におけるコドンの使用頻度にあわせて変更され得る。コドン使用頻度は、その生物において高度に発現される遺伝子での使用頻度を反映する。例えば、大腸菌において発現させることを意図する場合、公開されたコドン使用頻度表（例えば、Ｓｈａｒｐら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６  第１７号，８２０７頁（１９８８））に従って大腸菌での発現のために最適にすることができる。
【００７８】
上記のようにして改変された塩基配列を含む核酸分子を用いて、発現ベクターが作製され得る。特定の核酸配列を用いて発現ベクターを作製する方法は、当業者に周知である。
【００７９】
本明細書において使用される「作動可能に連結された（る）」とは、所望の塩基配列が、発現（すなわち、作動）をもたらす転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【００８０】
改変した核酸配列を、上記調節エレメントに作動可能に連結するために、酵素遺伝子を加工すべき場合がある。例えば、プロモーターとコード領域との間が長すぎて転写効率の低下が予想される場合、またはリボゾーム結合部位と翻訳開始コドンとの間隔が適切でない場合などである。加工の手段としては、制限酵素による消化、Ｂａｌ３１、ＥｘｏＩＩＩなどのエキソヌクレアーゼによる消化、あるいはＭ１３などの一本鎖ＤＮＡまたはＰＣＲを使用した部位特異的変異の導入が挙げられる。
【００８１】
次いで、上記のようにして作製された発現ベクターを細胞に導入して目的の４−α−グルカノトランスフェラーゼが発現される。
【００８２】
本明細書において４−α−グルカノトランスフェラーゼの「発現」とは、その４−α−グルカノトランスフェラーゼをコードする塩基配列が、インビボまたはインビトロで転写および翻訳されて、コードされる４−α−グルカノトランスフェラーゼが生産されることをいう。
【００８３】
発現ベクターを導入する細胞（宿主ともいう）としては、原核生物および真核生物が挙げられる。発現ベクターを導入する細胞は、目的の酵素の発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。例えばこのような細胞の例としては、細菌、真菌などの微生物が挙げられる。より好ましい細胞の例としては、中温性微生物（例えば、酵母、カビ、大腸菌、枯草菌）が挙げられる。細胞は、微生物細胞であってもよいが、植物、動物などの細胞であってもよい。用いる細胞によっては、４−α−グルカノトランスフェラーゼは、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
【００８４】
本発明の方法において、発現ベクターを細胞に導入する技術は、当該分野で公知の任意の技術であり得る。このような技術の例としては、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、繁用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。
【００８５】
本発明の方法において使用される４−α−グルカノトランスフェラーゼの量は、反応開始時の懸濁液中の澱粉粒（すなわち、基質）に対して、好ましくは約０．１Ｕ／ｇ基質以上であり、より好ましくは約０．５Ｕ／ｇ基質以上であり、最も好ましくは約１Ｕ／ｇ基質以上である。本発明の方法において使用される４−α−グルカノトランスフェラーゼの量は、反応開始時の懸濁液中の澱粉粒に対して、代表的には約１００，０００Ｕ／ｇ基質以下であり、好ましくは約５０，０００Ｕ／ｇ基質以下であり、さらに好ましくは約１０，０００Ｕ／ｇ基質以下である。４−α−グルカノトランスフェラーゼの使用量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、目的の酵素処理澱粉粒の収率が低下する場合がある。
【００８６】
本発明の澱粉粒を製造する場合には、本発明によって得られる効果を阻害しない限り、他の酵素を組み合わせて使用してもよい。このような酵素の例としては、ブランチングエンザイム、澱粉分解酵素などが挙げられる。
【００８７】
（１．３  他の材料）
本発明の酵素処理澱粉粒の製造においては、４−α−グルカノトランスフェラーゼの作用を妨害しない限り、酵素処理において通常用いられる任意の材料が用いられ得る。このような他の材料の例としては、塩、緩衝剤などが挙げられる。一般的に、各酵素に適切な特定の塩を添加することにより酵素反応の速度が飛躍的に向上することが公知であるので、そのような特定の塩を添加することが好ましい。このような各酵素に適切な塩を添加することにより、処理時間の短縮が可能である。
【００８８】
（２．酵素処理澱粉粒の製造方法）
澱粉粒の水懸濁液中の澱粉粒を、０℃以上かつこの澱粉粒の糊化開始温度以下の温度で４−α−グルカノトランスフェラーゼによって処理して酵素処理澱粉粒を得る工程を包含する方法によって、老化しにくい酵素処理澱粉粒が製造される。詳細について以下で説明する。
【００８９】
（２．１  反応液（懸濁液）の調製）
本発明の製造方法では、例えば、澱粉粒と、４−α−グルカノトランスフェラーゼと、それを溶かしている溶媒とを主な材料として用いる。これらの材料は通常、反応開始時に全て添加されるが、反応の途中でこれらのうちの任意の材料を追加してもよい。本発明の製造方法に用いる溶媒は、使用される酵素の酵素活性を損なわない溶媒であれば任意の溶媒であり得る。代表的な溶媒は、水（例えば、イオン交換水、精製水、水道水など）である。溶媒は、酵素を調製する際に酵素に付随して得られる細胞破砕液のうちの水分であってもよい。
【００９０】
本発明の製造方法においては、まず、反応液を調製する。反応液は、例えば、適切な溶媒に、澱粉粒と４−α−グルカノトランスフェラーゼとを添加することにより調製され得る。例えば、澱粉粒を溶媒（例えば、水または緩衝液）に懸濁させて澱粉粒懸濁液を作製した後に４−α−グルカノトランスフェラーゼを添加してもよい。あるいは、反応液は、澱粉粒を含む懸濁液と４−α−グルカノトランスフェラーゼを含む溶液とを混合することによって調製してもよい。この反応液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、ｐＨを調整する目的で任意の緩衝剤を加えてもよい。
【００９１】
反応液のｐＨは、使用する酵素が活性を発揮し得るｐＨであれば任意に設定され得る。反応液のｐＨは、使用する酵素の至適ｐＨ付近であることが好ましい。反応液のｐＨは、代表的には約２以上であり、好ましくは約３以上であり、さらに好ましくは約４以上であり、特に好ましくは約５以上であり、特に好ましくは約６以上であり、最も好ましくは約７以上である。反応液のｐＨは、代表的には約１３以下であり、好ましくは約１２以下であり、さらに好ましくは約１１以下であり、特に好ましくは約１０以下であり、特に好ましくは約９以下であり、最も好ましくは約８以下である。１つの実施形態では、反応液のｐＨは、代表的には、使用する酵素の至適ｐＨの±３以内であり、好ましくは至適ｐＨの±２以内であり、さらに好ましくは至適ｐＨの±１以内であり、最も好ましくは至適ｐＨの±０．５以内である。
【００９２】
反応液中の澱粉粒の量は、酵素反応が可能な量である限り、任意に設定され得る。反応液中の澱粉粒の量は、好ましくは約５重量％以上であり、より好ましくは約１０重量％以上であり、さらに好ましくは約２０重量％以上であり、最も好ましくは約３０重量％以上である。反応液中の澱粉粒の量は、好ましくは約６０重量％以下であり、より好ましくは約５０重量％以下であり、さらに好ましくは約４０重量％以下であり、最も好ましくは約３５重量％以下である。
【００９３】
反応液中の４−α−グルカノトランスフェラーゼ（すなわち、酵素）の量は、酵素反応が可能な量である限り、任意に設定され得る。酵素の量は、合理的な時間内に反応を行うに充分な量であることが好ましい。酵素量が多いほど反応に要する時間は短くなり、酵素量が少ないほど反応に要する時間は長くなる。酵素量が多すぎると、コストが非常に高くなり、さらに、酵素が凝集して沈澱物を形成する場合もあるので、適切に設定することが好ましい。
【００９４】
反応液中の４−α−グルカノトランスフェラーゼの量は、澱粉粒乾燥重量に対して、好ましくは約０．０１重量％以上であり、より好ましくは約０．０５重量％以上であり、さらに好ましくは約０．１重量％以上である。反応液中の酵素の量は、澱粉粒乾燥重量に対して、好ましくは約１０重量％以下であり、より好ましくは約５重量％以下であり、さらに好ましくは約１重量％以下である。反応液中の酵素の量は、酵素反応が進行するのに充分な量であればよいので、酵素の活性（ユニット数）について詳細に検討する必要はない。
【００９５】
（２．２  酵素反応）
本発明の調製方法は、澱粉粒の水懸濁液（すなわち、反応液）中で澱粉粒と４−α−グルカノトランスフェラーゼとを接触させ、糊化開始温度以下で酵素反応を進行させることが特徴である。本発明の方法においては、澱粉粒を糊化させずに、澱粉粒を維持したまま酵素反応を進め、得られた酵素処理澱粉粒を回収することが重要である。澱粉粒と４−α−グルカノトランスフェラーゼとが同じ反応液中に存在して接触することにより、４−α−グルカノトランスフェラーゼは澱粉粒に作用し、酵素反応が進行する。このとき、反応液を加熱しても加熱しなくてもよい。
【００９６】
反応液の調製時および反応時のこの反応液の温度は、０℃以上でかつ澱粉の糊化開始温度以下である。澱粉の糊化開始温度は、使用する澱粉粒を得た植物、その植物の収穫時期、その植物の栽培地などによって異なり得る。一般に、通常のトウモロコシ澱粉の糊化開始温度は約７０．７℃であり、ワキシーコーンスターチ（モチトウモロコシ）の糊化開始温度は約６７．５℃であり、コメ澱粉の糊化開始温度は約７３．５℃であり、馬鈴薯澱粉の糊化開始温度は約６２．６℃であり、タピオカ澱粉の糊化開始温度は約６８．４℃であり、そして緑豆澱粉の糊化開始温度は約７１．０℃である。
【００９７】
澱粉の糊化開始温度は、アミログラフによって測定され得る。糊化開始温度の測定方法については、「澱粉科学の事典」の１９４頁〜１９７頁に記載される。
【００９８】
この反応液の温度は、使用する澱粉粒に適切になるように変更し得るが、例えば、約０℃以上であり、好ましくは約１０℃以上であり、さらに好ましくは約１５℃以上であり、特に好ましくは約２０℃以上であり、最も好ましくは約２５℃以上である。この反応液の温度は、使用する澱粉粒に適切になるように変更し得るが、例えば、約６７．５℃以下であり、好ましくは約６０℃以下であり、さらに好ましくは約５０℃以下であり、特に好ましくは約４０℃以下であり、最も好ましくは約３５℃以下である。
【００９９】
本発明の方法においては、酵素処理澱粉粒の製造の全過程を通して澱粉粒が完全に糊化することがないようにしなければならない。好ましくは、糊化が全く生じないように製造を行う。
【０１００】
反応時間は、反応温度、澱粉粒に対する酵素量などを考慮して、任意に設定することができる。反応時間は、好ましくは約１時間以上であり、例えば、約２時間以上、約３時間以上、約６時間以上、約１２時間以上などであり得る。反応時間に特に上限はないが、好ましくは約７２時間以下、より好ましくは約４８時間以下、さらにより好ましくは約３６時間以下、特に好ましくは約２４時間以下、最も好ましくは約２０時間以下である。
【０１０１】
（２．３  後処理）
酵素処理を行った澱粉粒は、用途によってはそのまま使用することも可能であるが、酵素処理された澱粉粒を洗浄し、脱水することによって、使用した酵素および酵素分解により溶出した糖質が除去されることが好ましい。酵素処理された澱粉粒の洗浄および脱水は、当該分野で公知の任意の方法によって行われ得る。澱粉粒の洗浄および脱水は澱粉調製の常法であり、一般的に行われている。さらに、脱水後の澱粉を乾燥して、目的とする酵素処理澱粉粒を得ることが好ましい。脱水後の澱粉粒の乾燥は、当該分野で公知の任意の方法によって行われ得る。
【０１０２】
（２．４  化学修飾）
酵素処理を行った澱粉粒は、所望により化学修飾され得る。酵素処理に使用した澱粉粒が未処理の澱粉粒または物理処理した澱粉粒の場合だけでなく、何らかの化工澱粉の澱粉粒を使用した場合にも、その化工澱粉に施された種類の化学修飾とは異なる種類の化学修飾を施すことができる。化学修飾の例としては、アセチル化、アジピン酸架橋、酸化、漂白、リン酸架橋、オクテニルコハク酸処理、ヒドロキシプロピル化、リン酸化およびリン酸モノエステル化が挙げられる。これらの化学修飾の方法は当該分野で周知である。これらの化学修飾は、日本国の食品衛生法で許容される範囲内であれば任意の程度まで行われ得る。日本では、化学修飾された加工澱粉が食品添加物として認められるためには、厚生労働省告示４８５号記載の純度試験法に準じて試料澱粉中の各種化学物質の分析を行って、下記の基準を満たすことが必須である：
（ａ）アセチル化アジピン酸架橋デンプン：アジピン酸基が０．１３５％以下であってかつアセチル基が２．５％以下であること；
（ｂ）アセチル化酸化デンプン：アセチル基が２．５％以下であってかつカルボキシ基が１．３％以下であること；
（ｃ）アセチル化リン酸架橋デンプン：アセチル基が２．５％以下であってかつリンがＰとして０．１４％以下であること；
（ｄ）オクテニルコハク酸デンプンナトリウム：オクテニルコハク酸基が３．０％以下であること；
（ｅ）酢酸デンプン：アセチル基が２．５％以下であること；
（ｆ）酸化デンプン：カルボキシ基が１．１％以下であること；
（ｇ）ヒドロキシプロピル化リン酸架橋澱粉：ヒドロキシプロピル基が７．０％以下であってかつリンがＰとして０．１４％以下であること；
（ｈ）ヒドロキシプロピルデンプン：ヒドロキシプロピル基が７．０％以下であること；
（ｉ）リン酸架橋澱粉：リンがＰとして０．５％以下であること；
（ｊ）リン酸化デンプン：リンがＰとして０．５％以下であること；
（ｋ）リン酸モノエステル化リン酸架橋デンプン：リンがＰとして０．５％以下であること；
（ｌ）漂白デンプン；カルボキシ基が０．１％以下であり、厚生労働省告示４８５号記載の酸化澱粉の「確認試験（３）」による試験結果が陰性で、かつ、粘度等の澱粉の性質に生じた変化が酸化によるものでないことを合理的に説明できること。日本以外の国についてはその国で許容される範囲内であれば任意の程度の化学処理が行われ得る。化学修飾は何種類か組み合わせて使用することができる。
【０１０３】
（２．５  物理処理）
酵素処理を行った澱粉粒は、所望により物理処理され得る。酵素処理に使用した澱粉粒が未処理の澱粉粒または化工澱粉の場合だけでなく、何らかの物理処理をした澱粉粒を使用した場合にも、その物理処理とは異なる種類の物理処理を施すことができる。物理処理の例としては、湿熱処理および熱抑制処理が挙げられる。
【０１０４】
「湿熱処理」とは、澱粉を糊化させない程度の低水分状態で、密閉容器内で相対湿度約１００％の条件下で約９５〜約１２５℃に加熱することをいう。「澱粉を糊化させない程度の低水分状態」は、例えば水分含量約５０％以下を示す。澱粉を糊化させない程度の低水分状態は、例えば水分含量約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下または約２０％以下であってもよい。湿熱処理の加熱時間は、湿熱処理の方法によって変化し得る。例えば、特開平６−１４５２０３号公報に記載の方法に従って湿熱処理される場合、まず約０〜５００トール（約０〜６６．６６１ｋＰａ）に減圧し、その後加圧蒸気を導入して約１００℃〜約１５０℃にて約２分〜約１２０分間保持することにより加熱処理される。湿熱処理は、種々の文献に記載されており、当該分野で公知の任意の湿熱処理方法に従って行われ得る。湿熱処理は例えば、特開平６−１４５２０３号公報、特開平４−１３０１０２号公報および月刊フードケミカル  ２０１０−２（Ｐ．３７−４２）等に記載されている。湿熱処理の温度、時間などは目的とする澱粉およびその物性によって適切に設定され得る。
【０１０５】
「熱抑制処理」とは、極めて低水分に乾燥した澱粉粒を、ドライ加熱処理することにより澱粉粒の結晶構造を強化することをいう。「極めて低水分に乾燥した澱粉粒」とは、水分含量が約１％未満の澱粉粒をいう。熱抑制処理される澱粉粒の水分含量は好ましくは約０％である。澱粉粒を極めて低水分に乾燥する方法は、例えば、特開２００８−２２３０３２号公報に記載され、例えば、澱粉粒のｐＨを７．０以上のｐＨに調整してから、水分含量が約１％未満になるまで脱水する方法であり得る。この低水分に乾燥する場合のｐＨは好ましくはｐＨ７以上であり、より好ましくはｐＨ８より大きく、好ましくはｐＨ７．５〜１０．５であり、より好ましくはｐＨ８〜９．５である。脱水は熱的脱水であってもよく、非熱的脱水であってもよい。ドライ加熱処理の際には、澱粉を抑制するのに充分な時間にわたって充分な温度で熱処理する。好ましくは、澱粉を非凝集性にするのに充分な時間にわたって充分な温度で熱処理する。熱抑制処理のための好ましい加熱温度は、約１００℃よりも高い。熱処理温度は好ましくは約２００℃以下である。熱抑制処理のための加熱温度は、より好ましくは約１２０℃〜約１８０℃であり、特に好ましくは約１４０℃〜約１６０℃であり、最も好ましくは約１６０℃である。抑制のレベルはｐＨ、加熱温度および加熱時間に依存する。ｐＨが高いほど、より高度に抑制された澱粉が得られる。熱処理温度が高いほど、より高度に抑制された澱粉が得られる。熱処理時間が長いほど、より高度に抑制された澱粉が得られる。熱抑制処理のための熱処理時間は、例えば約３時間以上であり得、好ましくは約２０時間以下である。熱抑制処理は、種々の文献に記載されており、当該分野で公知の任意の熱抑制処理方法に従って行われ得る。熱抑制処理は、例えば、米国特許第６，２２１，４２０号公報、国際公開第９５／０４０８２号パンフレットおよび特開２００８−２２３０３２号公報に記載されている。熱抑制処理の温度、時間などは目的とする澱粉およびその物性によって適切に設定され得る。物理処理は当該分野で周知の方法に従って実施され得る。
【０１０６】
湿熱処理澱粉の例としては、例えば、三和澱粉工業株式会社製の「デリカスター・シリーズ」、「ナチュラスター・シリーズ」、「アミロジェル」および日本食品化工株式会社製の「ロードスター」が挙げられる。熱抑制澱粉の例としては、例えば、ナショナルスターチ社製「ノベーション・シリーズ」が挙げられる。
【０１０７】
（３．本発明の酵素処理澱粉粒の特性）
本発明の酵素処理澱粉粒は、老化しにくい特徴を有する。特定の実施形態では、本発明の酵素処理澱粉粒は、澱粉粒の水懸濁液中の澱粉粒を、０℃以上かつこの澱粉粒の糊化開始温度以下の温度で４−α−グルカノトランスフェラーゼによって処理して酵素処理澱粉粒を得る工程を包含する方法によって得られた酵素処理澱粉である。
【０１０８】
（３．１  老化）
本明細書中の用語「澱粉の老化」とは、通常、澱粉糊液を低温に放置した場合に、澱粉分子の直鎖分子が再結晶化し、凝集化することにより硬いゲルを形成し、その後さらに澱粉分子の再結晶化および凝集化が進む現象を指す。
【０１０９】
糊液を低温に放置した最初の１日程度の間の老化、すなわち、初期の短期間の老化は、ゲル形成に伴って必然的に生じる現象であり、その老化およびゲル形成に伴い、食品等に求められる所望の物性が達成される。ここで、所望のゲルが形成された後も、澱粉の老化の現象はさらに進行する。そのため、長期間が経過すると、ゲルは当初の所望の物性からかけ離れた物性になり、硬く、食感に劣るものになってしまう。本発明の澱粉粒は、初期の短期間のゲル化および老化により所望の物性を示すようになった後、長期間が経過してもその適切な所望の物性を維持することができる。例えば、本発明の澱粉粒を使ってゲルを作製し、それを用いて食品を製造すれば、ゲルを作製する際に適切なレベルの老化が生じ、そのゲルを用いて食品を製造して長期間保存する際にその所望のレベルの物性が維持される。
【０１１０】
通常の未処理澱粉では、この老化は、低温での放置時間の増加によりさらに進行し、ゲル強度の増加をもたらす。しかし、経時的な老化進行によるゲル強度の増加は、ゲルの脆さを増加させ、澱粉ゲルは「硬くて脆い」物性へと進行する。
【０１１１】
老化度の分析および評価方法の詳細としては、実施例に記載される方法を一般的に使用することができる。
【０１１２】
本発明の酵素処理澱粉粒は、従来の未処理澱粉、化学修飾澱粉および物理処理澱粉と比較して老化が進行しにくい。本発明の酵素処理澱粉粒を用いて澱粉ゲルを作製し、ゲル中の澱粉の老化度を測定した場合、４℃にて１４日間保存した後のゲル中の澱粉の老化度は、４℃にて１６時間保存した後の該ゲル中の澱粉の老化度（４℃にて１４日間保存した後のゲル中の澱粉の老化度と４℃にて１６時間保存した後の該ゲル中の澱粉の老化度との比を「老化度の変化率」ともいう）の例えば約３００％以下であることが好ましく、約２５０％以下であることがより好ましく、約２００％以下であることが特に好ましく、約１５０％以下であることが最も好ましい。老化度の変化率の下限は特に限定されないが、１つの実施形態では約１００％以上であり、別の実施形態では約１２０％以上である。老化度の変化率が約１００％未満になることは一般的にはないが、何らかの原因により若干１００％を下回ることもあり得る。そのような場合があり得ることを考慮すると、１４日間保存後の老化度は、１６時間保存後の老化度の約７０％以上、約８０％以上または約９０％以上であることが、初期の物性を維持する点から好ましい。
【０１１３】
４℃にて１６時間保存した場合と比較して老化度の変化率が約２００％を超えて進行すると、食品の物性が変わり、硬くて脆い物性を呈するようになる。食品の流通の観点からも、老化度は、一日でも長く、少なくとも１４日間変化しないことが重要である。なぜなら、現在のチルド製品（例えば麺類など）の賞味期限は一般に２週間程度であり、それ以上の期間保存できることが望まれているからである。
【０１１４】
ゲル中の澱粉の老化の進行は、澱粉ゲルのヤング率の変化によっても測定することができる。ゲルを５℃で１６時間保存した後のゲルのヤング率に対する、５℃で１４日間保存した後のゲルのヤング率の変化率（すなわち、ヤング率の変化率（％）＝{(１４日後のヤング率)／（１６時間後のヤング率)}×１００）は、好ましくは約１４０％以下であり、より好ましくは約１３０％以下であり、さらに好ましくは約１２０％以下であり、最も好ましくは約１１０％以下であり；通常、約９０％以上であり、好ましくは約１００％以上である。
【０１１５】
本発明の酵素処理澱粉粒を用いて作製されたゲルは、４℃にて２週間以上保存した場合に、作製翌日と比較して少し老化するがその程度は極めて小さく、食感、硬さ、しなやかさなどは殆ど変化しない。一方、天然の未処理澱粉粒、化学修飾澱粉粒または物理処理澱粉粒を用いて作製されたゲルは、４℃にて保存した場合、翌日と比較し、保存時間に比例し老化が進行し、食感、硬さが大幅に変化し、特に脆さが増す。
【０１１６】
（３．２  粘度）
澱粉粒は、通常、所定以上の水と共に加熱すると、澱粉粒が膨潤し、透明度の増大、及び粘度上昇という糊化現象を起こすことはよく知られている。そして、さらに加熱を続けることにより、澱粉粒は崩壊する。これら一連の事象にともなう粘度変化を測定するために、いくつかの方法があるが、ブラベンダー社のアミログラフが実用的で広く使用されている。アミログラフは、対象物を所定の速度で加熱し、温度と対象物の粘度との関係を記録するものである。すなわち、加熱とともに澱粉粒は膨潤し、それに伴ってアミログラフでは粘度の発現および粘度の増大が観察される。やがて、澱粉粒の膨潤が最大になる時に粘度もピークに達する。この粘度を最高粘度という。さらに加熱を続けると、澱粉粒は崩壊し、澱粉粒の崩壊とともに粘度も低下していく。この粘度低下の度合いをブレイクダウンという。このアミログラフでの粘度曲線は澱粉の起源および製法によって異なり、澱粉の特徴を示す測定法である。
【０１１７】
アミログラフでの測定は、例えば以下のように行われる。所定量の酵素処理澱粉粒（例えば、乾物換算で小麦澱粉は８．５重量％濃度、コーンスターチは７．０重量％濃度、タピオカ澱粉は６．０重量％濃度）となるように、４５０ｍｌの水で澱粉粒懸濁液を調製し、試料容器に投入後、それらを回転させながら５０℃まで加温する。その後１．５℃／ｍｉｎで９５℃まで昇温し、９５℃で１５分間保持する。続いて１．５℃／ｍｉｎで冷却する。アミログラフはブラベンダー社製のＶＩＳＣＯＧＲＡＰＨ−Ｅを用い、試料容器の回転数は７５ｒｐｍとし、測定カートリッジは７００ｃｍｇとして測定する。この時、粘度がピークに達した時の粘度を最高粘度とし、そして、この最高粘度と９５℃にて１５分間保持した時の粘度の差をブレイクダウンとする。この差をブレイクダウン粘度ともいう。最高粘度と９５℃にて１５分間保持した時の粘度の差が１００ＢＵ未満の場合、その澱粉は「ブレイクダウンを有さない」という。
【０１１８】
（３．３  ゲル形成能）
一般に天然の澱粉から作製した澱粉糊液は所定濃度以上になると、冷却することにより澱粉ゲルを形成することがよく知られている。この澱粉ゲルの物性は粘度同様、澱粉の起源および製法によって異なる。そのため、各種澱粉は、そのゲル物性の特徴を考慮した上で、様々な食品に使用されている。
【０１１９】
本発明の酵素処理は、未処理澱粉の持つゲル形成能をほとんどまたは全く損なわない。そのため、本発明の酵素処理澱粉粒は、未処理澱粉粒同様に良好なゲル形成能を示す。一方、エステル化澱粉およびエーテル化澱粉は、冷蔵保存してもゲルを形成できないかまたはゲルが極端に柔らかくなるという欠点がある。
【０１２０】
澱粉のゲル形成能を確認する方法はいくつか実用化されているが、その１つにレオメータを用いてゲルの粘度を測定する方法がある。レオメータによるゲルの粘度の測定は、例えば、澱粉粒懸濁液をケーシングに充填し、加熱後、例えば１６時間（例えば、約５℃で）冷蔵保存し、室温（例えば、約２５℃）に戻した後、レオメータでそのゲルの粘度を測定することにより行われ得る。具体的な測定方法および測定条件は実施例に記載される。
処理が澱粉ゲル形成能に与える影響は、処理の有無によるヤング率の変化率（％）を一つの指標として評価することができる。この変化率は、処理の有無によるヤング率の変化率（％）＝{(処理澱粉のヤング率）／（未処理澱粉のヤング率）｝×１００）によって計算される。
【０１２１】
本発明の酵素処理澱粉粒では、処理の有無によるヤング率の変化率は好ましくは約９０％以上であり、より好ましくは約９２％以上であり、さらに好ましくは約９５％以上である。本発明の酵素処理澱粉粒では、処理の有無によるヤング率の変化率は好ましくは約３００％以下であり、より好ましくは約２００％以下であり、さらに好ましくは約１６０％以下である。
【０１２２】
なお、ここで、処理が澱粉ゲル形成能に与える影響を調べる際に使用される未処理澱粉は、酵素処理澱粉と同じ植物由来の未処理澱粉であるべきである。本明細書中では、「酵素処理澱粉粒に対応する酵素処理前の未処理澱粉粒」とは、該酵素処理を施していないこと以外は全く同じ未処理澱粉粒をいう。本明細書中の他の箇所に記載したとおり、未処理澱粉粒は、澱粉粒を精製するための処理以外には、酵素処理も化学処理も物理処理も施されていない。例えば、酵素処理された小麦澱粉粒に対応する酵素処理前の未処理澱粉粒は、該酵素処理を行っていないこと以外はこの酵素処理小麦澱粉粒と同じ未処理小麦澱粉粒であり；酵素処理されたタピオカ澱粉粒に対応する酵素処理前の未処理澱粉粒は、該酵素処理を行っていないこと以外はこの酵素処理タピオカ澱粉粒と同じ未処理タピオカ澱粉粒であり；酵素処理された馬鈴薯澱粉粒に対応する酵素処理前の未処理澱粉粒は、該酵素処理を行っていないこと以外はこの酵素処理馬鈴薯澱粉粒と同じ未処理馬鈴薯澱粉粒であり；酵素処理された米澱粉粒に対応する酵素処理前の未処理澱粉粒は、該酵素処理を行っていないこと以外はこの酵素処理米澱粉粒と同じ未処理米澱粉粒であり；そして、酵素処理されたコーン澱粉粒に対応する酵素処理前の未処理澱粉粒は、該酵素処理を行っていないこと以外はこの酵素処理コーン澱粉粒と同じ未処理コーン澱粉粒である。
【０１２３】
（４．本発明の食品）
特定の実施形態では、本発明の食品は、食品材料と本発明の酵素処理澱粉粒と水とを混合して混合物を得る工程；該混合物を加熱して該混合物中の該酵素処理澱粉粒を糊化する工程；および該糊化した酵素処理澱粉粒を含む混合物を冷却してゲル化させて澱粉ゲル含有食品を得る工程を包含する方法によって製造された食品である。
【０１２４】
別の特定の実施形態では、本発明の食品は、本発明の酵素処理澱粉粒から作製された加熱調理済みの澱粉ゲル含有食品である。別の特定の実施形態では、本発明の澱粉ゲル含有食品は、食品材料と該酵素処理澱粉粒とを混合した後に加熱することを含む方法によって製造された食品である。
【０１２５】
本明細書中で、澱粉ゲル含有食品とは、澱粉ゲルを含有する食品をいう。澱粉ゲルを含有していれば、その食品が全体としてゲルの形態である必要はない。例えば、カスタードプディングなどのゲル状食品、くず餅、ういろうなどのゲル状和菓子などは食品全体がゲルを形成している。ホイップクリーム、アイスクリームなどの油脂含有食品、ミートソースなどのソース類は食品全体としてはゲル状ではないが、微小な澱粉ゲルを含有しているため、本発明の澱粉ゲル含有食品に含まれる。また、ベーカリー類、洋菓子類なども、製造工程中に一旦ゲルを形成し、焼成などにより、水分が減少した澱粉ゲルを含有しているため、本発明の澱粉ゲル含有食品に含まれる。
【０１２６】
特定の実施形態では、本発明の食品は、酵素処理澱粉粒を使用して調製され得る。本発明の方法によって製造された酵素処理澱粉粒は、従来の澱粉と同様の用途に利用され得る。本発明の酵素処理澱粉粒を食品に利用することにより、食品の物性および食感が改変される。本発明の酵素処理澱粉粒は、従来澱粉を利用して調製されているほとんど全ての飲食用組成物または食品添加物用組成物に使用することが可能である。本発明の食品においては、酵素処理澱粉粒によって得られる優れた効果（すなわち、老化抑制効果）を妨害しない限り、目的とする組成物および食品において通常用いられる任意の材料が用いられ得る。好ましい実施形態では、本発明の澱粉粒は、本発明の食品中でゲルを形成している。
【０１２７】
本発明の酵素処理澱粉粒は、高水分系の食品に利用した場合、低温で数日間冷却した後でもボディを維持し、自然な弾力を維持し、且つ適度な口溶け感を維持する。高水分系の食品とは、摂食時の状態で可食部１００ｇあたりの水分量が４０ｇよりも多い食品をいう。高水分系の食品の例としては、例えば、和菓子類、油脂含有食品、ゲル状食品、魚肉および畜肉加工食品、たれおよびソース類、麺類などが挙げられる。
【０１２８】
本発明の酵素処理澱粉粒は、低水分系の食品に利用した場合、口解けの良い、滑らかな食感を維持することが可能である。低水分系の食品とは、摂食時の状態で可食部１００ｇあたりの水分量が４０ｇ以下の食品をいう。低水分系の食品の例としては、例えば、ベーカリー類、洋菓子類、フライ食品、ゼリーキャンデー類などが挙げられる。
【０１２９】
このように、高水分系の食品と低水分系の食品とは、可食部１００ｇあたりの水分量が４０ｇよりも高いかまたは４０ｇ以下であるかによって分類される。ただし、可食部１００ｇあたりの水分量が４０ｇ付近（３５〜５０ｇ）の食品に関しては、同じ水分量であっても、形態により、相反する物性を示す場合がある。また、フライ食品などの場合、中身の具材を除いた、衣部分に対する水分量で判断する。
【０１３０】
種々の食品の可食部１００ｇあたりの水分量を以下に例示する（五訂増補日本食品標準成分表より；カッコ内が水分量）：
（１）ベーカリー類：食パン（３８．０ｇ）、ハードビスケット（２．６ｇ）、パイ生地（３２．０ｇ）、衛生ボーロ（４．５ｇ）；
（２）和菓子類：ういろう（５４．５ｇ）、くずまんじゅう（４５．０ｇ）、大福餅（４１．５ｇ）；
（３）洋菓子類：スポンジケーキ（３２．０ｇ）、カステラ（２５．６ｇ）、ホットケーキ（４０．０ｇ）；
（４）油脂含有食品：ホイップクリーム（乳脂肪タイプ、４２．１ｇ）、ホイップクリーム（植物性脂肪タイプ、４１．２ｇ）、アイスクリーム類（アイスミルク：６５．６ｇ、ラクトアイス：６０．４ｇ）；
（５）ゲル状食品：カスタードプディング（７４．１ｇ）；
（６）魚肉、畜肉加工食品：す巻かまぼこ（７５．８ｇ）、焼きぬきかまぼこ（７２．８ｇ）、ウィンナー（５３．０ｇ）；
（７）たれ、ソース類：ウスターソース（６１．７ｇ）、ミートソース（７８．８ｇ）、サウザンアイランドドレッシング（４４．１ｇ）；および
（８）ゼリーキャンデー類：ゼリーキャンデー（１６ｇ）、ゼリービーンズ（９．５ｇ）。
【０１３１】
このような食品に本発明の酵素処理澱粉粒を使用することにより、従来の澱粉を使用した場合と比較して、澱粉の老化が改善され、その結果、例えば以下の物性が改善される：
（１）ベーカリー類において、ソフトな食感が従来よりも長期にわたって維持される。ベーカリー類の例としては、パン、クッキー、ビスケット、ピザ生地、パイ生地、アイスクリームのコーンカップ、モナカの皮、シュークリームの皮などが挙げられる。
【０１３２】
（２）和菓子類において、適度な硬さ、脆さ、且つ、適度な粘弾性、もちっとした食感が従来よりも長期にわたって維持される。和菓子類の例としては、くず餅、ういろう、饅頭などが挙げられる。
【０１３３】
（３）洋菓子類において、焼成後の食感が従来よりも長期にわたって維持される。洋菓子類の例としては、スポンジケーキ、シフォンケーキ、カステラ、マドレーヌ、フィナンシェ、パウンドケーキ、ロールケーキなどが挙げられる。
【０１３４】
（４）油脂含有食品において、適度なボディ感、保形性を有しつつ、且つ、口溶け良好で滑らかな食感が従来よりも長期にわたって維持される。油脂含有食品の例としては、カスタードクリーム、フラワーペースト、フィリング、ホイップクリーム、アイスクリーム類（例えば、アイスミルク、ラクトアイス）などが挙げられる。
【０１３５】
（５）ゲル状食品において、もちっとして、ぷるっとした良好な弾力を有しつつ、口溶けも良好で滑らかな食感が従来よりも長期にわたって維持される。ゲル状食品の例としては、ゼリー、プリン、ムース、ヨーグルト、ごま豆腐などが挙げられる。
【０１３６】
（６）魚肉および畜肉加工食品において、良好な歯ごたえを持つ弾力が従来よりも長期にわたって維持され、かつ経時的な変化も少ない効果を付与する。魚肉および畜肉加工食品の例としては、蒲鉾、ソーセージなどが挙げられる。
【０１３７】
（７）たれおよびソース類において、良好なボディ感、保形性を有し、食品へののりが良く滴り落ちにくく、且つ、粘りや糸曳き感も小さく、滑らかな食感が従来よりも長期にわたって維持される。たれおよびソース類の例としては、蒲焼きのたれ、みたらし団子のたれ、フルーツソース、ホワイトソース、ドレッシングなどが挙げられる。
【０１３８】
（８）フライ食品において、サクッとした軽い食感が従来よりも長期にわたって維持される。フライ食品の例としては、天ぷら、エビフライなどが挙げられる。
【０１３９】
（９）麺類において、歯ごたえに富むモチモチとした食感が従来よりも長期にわたって維持される。麺類の例としては、うどん、そうめん、冷麦、中華麺、そば、マカロニ、スパゲティーなどが挙げられる。
【０１４０】
（１０)ゼリーキャンデー類において、適度な弾力を有しつつ、口溶けも良好で滑らかな食感が従来よりも長期にわたって維持される。ゼリーキャンデー類の例としては、ゼリーキャンデー、ゼリービーンズなどが挙げられる。
【０１４１】
本発明の食品において、本発明の酵素処理澱粉粒は、従来その食品に用いられる澱粉量と同量で使用することができる。一部を従来の澱粉を使用し、残りを本発明の酵素処理澱粉粒に置換してもよい。本発明の酵素処理澱粉粒は、好ましくは通常の澱粉使用量の約５０重量％以上であり、より好ましくは約６０重量％以上であり、さらに好ましくは約７０重量％以上であり、ことに好ましくは約８０重量％以上であり、特に好ましくは約９０重量％以上であり、最も好ましくは１００重量％である。すなわち、本発明の酵素処理澱粉粒で従来の澱粉の全量を置換することが最も好ましい。
【０１４２】
（５．澱粉ゲル含有食品の製造方法）
特定の実施形態では、本発明の澱粉ゲル含有食品の製造方法は、澱粉粒の水懸濁液中で澱粉粒を０℃以上でかつその澱粉粒の糊化開始温度以下の温度において酵素で処理して酵素処理澱粉粒を得る工程；食品材料と該酵素処理澱粉粒と水とを混合して混合物を得る工程；該混合物を加熱して該混合物中の該酵素処理澱粉粒を糊化する工程；および該糊化した酵素処理澱粉粒を含む混合物を冷却してゲル化させて澱粉ゲル含有食品を得る工程を包含する。従来の食品製造においては、食品製造過程で澱粉粒に酵素処理を施して使用することはない。
【０１４３】
澱粉粒の水懸濁液中で澱粉粒を０℃以上でかつその澱粉粒の糊化開始温度以下の温度において酵素で処理して酵素処理澱粉粒を得る工程は、上記「２．２  酵素反応」において詳述した通りに行われ得る。上述のように、この澱粉粒は、未処理澱粉、物理処理澱粉または化学修飾澱粉の澱粉粒であり得る。食品として扱われる酵素処理澱粉粒を得ることが好ましい場合には、原料として使用される澱粉粒は未処理澱粉、物理処理澱粉または漂白澱粉の澱粉粒であり、この澱粉粒を使用して澱粉ゲル含有食品を得るまでのいずれの段階においても、この澱粉粒は化学修飾がされない。特定の実施形態では、原料として使用される澱粉粒は未処理澱粉または物理処理澱粉の澱粉粒であり、酵素処理により得られた酵素処理澱粉粒を化学修飾する工程をさらに包含し、この化学修飾した酵素処理澱粉粒を食品材料および水と混合する。別の特定の実施形態では、原料として使用される澱粉粒は未処理澱粉または化学修飾澱粉の澱粉粒であり、酵素処理により得られた酵素処理澱粉粒を物理処理する工程をさらに包含し、この物理処理した酵素処理澱粉粒を食品材料および水と混合する。
【０１４４】
次いで、食品材料とこの酵素処理澱粉粒と水とを混合して混合物が得られる。食品材料と酵素処理澱粉粒と水との混合方法およびその混合比率は、目的の食品の通常の製造方法での混合方法および混合比率に従って行われ得る。
【０１４５】
次いで、この混合物を加熱してこの混合物中のこの酵素処理澱粉粒が糊化される。この加熱は、加熱調理であり得る。加熱は、目的の食品の通常の製造方法での加熱調理と同じ条件で行われ得る。
【０１４６】
次いで、この糊化した酵素処理澱粉粒を含む混合物を冷却してゲル化させて澱粉ゲル含有食品が得られる。冷却は、加熱後の混合物を室温に放置することによって行われてもよく、冷蔵庫などで冷却することによって行われてもよい。
【０１４７】
本発明の酵素処理澱粉粒を使用する実施形態では、本発明の食品は、酵素処理澱粉粒を使用すること以外は、通常の澱粉を使用する場合と同様の方法で製造することができる。本発明の澱粉含有食品の製造方法は、食品材料に酵素処理澱粉粒を添加して混合する工程；および該混合物を加熱調理する工程を包含する。
【０１４８】
本発明の酵素処理澱粉粒は、従来の未処理澱粉に比べて澱粉が老化しにくいゲルを形成する。そのため、本発明の酵素処理澱粉粒を食品材料に添加して混合し、その混合物を加熱調理することによりこの酵素処理澱粉粒は糊化し、その後冷却することによりゲルを形成する。そのため、得られる加熱調理物は従来の未処理澱粉を使用した加熱調理物よりも優れた物性（例えば、優れたボディ感、自然な弾力、良好な口溶け、滑らかな食感、もちっとした食感、ふわっとした食感など）を維持する。本明細書中では、食品は、飲料であってもよい。
【０１４９】
本明細書中では、「加熱調理」とは、食品材料と澱粉粒との混合物を加熱することをいう。好ましくは、加熱調理は、澱粉粒の崩壊温度以上で加熱することであり得る。例えば、食品材料と澱粉粒との混合物は、約７０℃以上、約８０℃以上、約９０℃以上、または約９５℃以上で加熱され得る。好ましくは、加熱調理は、食品素材と澱粉粒との過度の変性を引き起こさない温度で行われる。例えば、食品材料と澱粉粒との混合物は、約２００℃以下、約１５０℃以下、約１３０℃以下、または約１１０℃以下で加熱され得る。加熱調理の時間は、目的とする食品の通常の調理時間で調理され得る。
【０１５０】
加熱調理は、好ましくはある程度の水分の存在下で行われる。澱粉粒は、通常、所定以上の水の存在下で加熱されると膨潤し、透明度が増大し、粘度が上昇する。食品素材が必要以上の水分を含む場合、食品素材と澱粉粒との混合物に水を添加する必要はないが、食品素材の水分が少ない場合、食品素材と澱粉粒との混合物に水を添加することが好ましい。なお、無糖のくず湯のような、水と澱粉粒以外の食品素材を含まない食品の場合には、水を食品素材とみなす。
【０１５１】
加熱調理は、目的とする食品の製造方法の一部であり得る。例えば、ゼリーなどのゲル状食品の場合、加熱調理した後で例えば約５〜１０℃の温度で冷却され得る。
【０１５２】
（６．配列の説明）
配列番号１：Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑ  ＭａｌＱをコードする塩基配列；
配列番号２：Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑ  ＭａｌＱのアミノ酸配列；
配列番号３：Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５の天然のブランチングエンザイムをコードする塩基配列；
配列番号４：Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５の天然のブランチングエンザイムのアミノ酸配列。
【実施例】
【０１５３】
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。なお、実施例において、粘度の測定は、ブラベンダー社のアミログラフで測定し、ゲル物性についてはレオテック社のレオメータで測定した。実施例および比較例においては、以下の分析及び評価方法に従って、各澱粉の物性および各澱粉から作製したゲルの物性を測定した。【０１５４】
１．分析及び評価方法：
１．１  老化度の分析及び評価：
β−アミラーゼ・プルラナーゼ法（ＢＡＰ法）を用いて澱粉ゲル中の澱粉の老化度を調査した。詳細には、５％澱粉粒懸濁液を沸騰浴中で２０分間加熱し、室温にて１時間放冷後、４℃にて保存した。４℃での保存１６時間後、及び１４日後のゲル中の澱粉の老化度をＢＡＰ法にて測定した。ＢＡＰ法については、学会出版センター発行「生物化学実験法１９  澱粉・関連糖質実験法」（Ｐ．１９０〜１９１）に準じて実施し、４℃での保存１６時間後の老化度値を１００とした場合の、１４日後の変化率を算出した。【０１５５】
【数１】
2012111326.tif 000002
【０１５６】
変化率が大きいほど、老化の進行速度が速いことを示す。【０１５７】
１．２  ゲル形成能の分析：
（１）ゲル形成能に対する処理の影響の確認：
未処理澱粉粒またはその未処理澱粉を酵素処理または化学修飾することにより得た澱粉粒を乾物換算で２０重量％濃度となるように水に添加して混合し、澱粉粒懸濁液を作製し、折幅４５ｍｍのクレハロンケーシングに充填する。これを９０℃まで１℃／ｍｉｎで昇温し、３０分間９０℃で保持する。その後、２０℃の恒温水槽にて３０分間放冷し、続いて冷蔵庫にて５℃まで冷却した。冷却後、５℃で１６時間冷蔵保存し、その後室温（約２５℃）で４時間放置して室温に戻した後に、レオテック社製レオメータ（ＲＴ−２０１０Ｊ−ＣＷ）で測定した。レオメータの測定条件は、試験項目として破断試験を選択し、試料の高さを２５ｍｍとし、粘性２８用球Φ５（直径５ｍｍ、面積１９．６３５ｍｍ２）のアダプターを用い、試料の移動速度（破断速度）を６ｃｍ／ｍｉｎとした。この時、澱粉ゲルの硬さをヤング率（ｄｙｎ／ｃｍ２）で評価した。【０１５８】
未処理澱粉粒を使用して作製したゲルのヤング率と、その未処理澱粉粒と同じ未処理澱粉粒に対して化学修飾、酵素処理などの特定の処理をすることによって得た澱粉粒を使用して作製したゲルのヤング率とを比較することにより、この処理がゲル強度に与える影響を確認することができる。【０１５９】
【数２】
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【０１６０】
処理の有無によるヤング率の変化率が１１０％以上であれば、処理後の澱粉粒を使用したゲルの硬さは未処理澱粉を使用したゲルに比べて有意に増していること、すなわち、その処理によってゲル形成能が有意に向上したことを示す。処理の有無によるヤング率の変化率が９０〜１１０％であれば、処理後の澱粉粒を使用したゲルの硬さは未処理澱粉を使用したゲルとほぼ同等であり、その処理はゲル形成能にあまり影響を与えないことを示す。処理の有無によるヤング率の変化率が９０％以下である場合、処理後の澱粉粒を使用したゲルは未処理澱粉を使用したゲルに比べ有意に柔らかくなっていることを示し、すなわち、その処理によってゲル形成能が有意に低下したことを示す。処理後の澱粉粒がゲルを形成しなければ、その処理によって澱粉粒のゲル形成能が失われることを示す。【０１６１】
（２）ヤング率による老化の進行度の確認：
澱粉粒を乾物換算で２０重量％濃度となるように水に添加して混合し、澱粉粒懸濁液を作製し、折幅４５ｍｍのクレハロンケーシングに充填する。これを９０℃まで１℃／ｍｉｎで昇温し、３０分間９０℃で保持する。その後、２０℃の恒温水槽にて３０分間放冷し、続いて冷蔵庫にて５℃まで冷却した。冷却後、５℃で１６時間または１４日間冷蔵保存し、その後室温（約２５℃）で４時間放置して室温に戻した後に、レオテック社製レオメータ（ＲＴ−２０１０Ｊ−ＣＷ）で測定した。レオメータの測定条件は、試験項目として破断試験を選択し、試料の高さを２５ｍｍとし、粘性２８用球Φ５（直径５ｍｍ、面積１９．６３５ｍｍ２）のアダプターを用い、試料の移動速度（破断速度）を６ｃｍ／ｍｉｎとした。この時、澱粉ゲルの硬さをヤング率（ｄｙｎ／ｃｍ２）で評価し、以下の式により、ヤング率の変化率を求めた。【０１６２】
【数３】
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【０１６３】
時間経過によるヤング率の変化率が１００％以上であれば、ゲルは硬さと脆さを増していることを示し、その変化率が大きいほど、老化が進行していることを示す。例えば、麺類の保存において、時間の経過とともに老化が進行すると、ヤング率が上昇し、ボソボソした食感になることが当該技術分野で公知であり、確認されている。【０１６４】
１．３  粘度の測定：
アミログラフを使用して粘度を以下の方法で測定した。所定量の酵素処理澱粉粒（例えば、乾物換算で小麦澱粉は８．５重量％濃度、コーンスターチは７．０重量％濃度、タピオカ澱粉は６．０重量％濃度）となるように、４５０ｍｌの水で澱粉粒懸濁液を調製し、試料容器に投入後、それらを回転させながら５０℃まで加温した。その後１．５℃／ｍｉｎで９５℃まで昇温し、９５℃で１５分間保持した。続いて１．５℃／ｍｉｎで冷却した。アミログラフはブラベンダー社製のＶＩＳＣＯＧＲＡＰＨ−Ｅであり、試料容器の回転数は７５ｒｐｍであり、測定カートリッジは７００ｃｍｇである条件で測定した。ここで、粘度がピークに達した時の粘度を最高粘度とし、そして、この最高粘度と９５℃にて１５分間保持した時の粘度の差をブレイクダウンとした。この差をブレイクダウン粘度ともいう。【０１６５】
１．４  ゲルの食感
各澱粉粒についてゲル特性測定のためにゲルを作製してから１日後の食感も調べた。食感は熟練者によって官能評価した。非常に硬く、脆さが感じられる場合や、逆に弾力感に乏しく柔らかすぎる場合、またはゲルを形成できない場合を「不良」とし、弾力のある食感の場合には「良好」とした。【０１６６】
（製造例１：Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来アミロマルターゼ（ＴａｑＭａｌＱ）の組換え生産）
Ｔｅｒａｄａら（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、６５巻、９１０−９１５（１９９９））に示されたプラスミドｐＦＧＱ８を保持する大腸菌ＭＣ１０６１株より、同文献に示された方法により配列番号２のアミノ酸配列を有するＴａｑＭａｌＱを含む酵素液を得た。【０１６７】
（製造例２：Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５由来ブランチングエンザイム（ＡｑＢＥ）の製造）
特開２００８−９５１１７の製造例１に記載された組換えプラスミドｐＡＱＢＥ１を保持する大腸菌ＴＧ−１株より、同特許文献に示された方法により配列番号４のアミノ酸配列を有するＡｑＢＥを含む酵素液を得た。【０１６８】
（比較例１）
未処理の小麦澱粉（タンパク質含量  ０．２重量％）を比較例１のサンプルとして使用した。上記「１．分析及び評価方法」に記載の方法に従って、未処理の小麦澱粉から作製したゲル中の澱粉の老化度をＢＡＰ法にて分析し、ヤング率をレオメータにて分析し、そして食感を官能評価した。【０１６９】
（実施例１：アミロマルターゼで処理した澱粉粒の製造）
比較例１で使用したのと同じロットの未処理の小麦澱粉４００ｇにイオン交換水９００ｇを加え、澱粉粒懸濁液を調製した。澱粉粒懸濁液のｐＨをｐＨ７．０に調整した後、製造例１で製造したアミロマルターゼ酵素液（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来；至適ｐＨ７．５）を５ｍｌ（８００ｕｎｉｔｓ）添加し、５５℃で１８時間撹拌し、酵素反応を行った。反応終了後、反応液を遠心濾過し、沈殿物を送風乾燥することにより、酵素処理澱粉粒を回収した。上記「１．分析及び評価方法」に記載の方法に従って、得られた酵素処理澱粉粒から作製したゲル中の澱粉の老化度をＢＡＰ法にて分析し、ヤング率をレオメータにて分析し、そして食感を官能評価した。【０１７０】
（実施例２：アミロマルターゼおよびブランチングエンザイムで処理した澱粉粒の製造）
比較例１で使用したのと同じロットの未処理の小麦澱粉４００ｇにイオン交換水９００ｇを加え、澱粉粒懸濁液を調製した。澱粉粒懸濁液のｐＨをｐＨ７．０に調整した後、製造例１で製造したアミロマルターゼ酵素液（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来；至適ｐＨ７．５）を５ｍｌ（８００ｕｎｉｔｓ）と、製造例２で製造したブランチングエンザイム酵素液（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ由来；至適ｐＨ７．５）を１ｍｌ（６０，０００ｕｎｉｔｓ）とを添加し、５５℃で１８時間撹拌し、酵素反応を行った。反応終了後、反応液を遠心濾過し、沈殿物を送風乾燥することにより、酵素処理澱粉粒を回収した。上記「１．分析及び評価方法」に記載の方法に従って、得られた酵素処理澱粉粒から作製したゲル中の澱粉の老化度をＢＡＰ法にて分析し、ヤング率をレオメータにて分析し、そして食感を官能評価した。【０１７１】
（比較例２：リン酸架橋澱粉粒の製造）
未処理の天然タピオカ澱粉（タンパク質含量  ０．１重量％）５００ｇに、６．７％（ｗ／ｗ）硫酸ナトリウム水溶液７５０ｇを加え、澱粉粒懸濁液を調製した。澱粉粒懸濁液のｐＨをｐＨ１１．０に調整した後、オキシ塩化リン１０μｌを添加し、３０℃で１時間撹拌し、反応を行った。１時間後、反応液のｐＨを６．０に調整し、反応を停止させた。反応終了後、反応液を遠心濾過し、沈殿物を送風乾燥することにより、リン酸架橋澱粉粒を回収した。上記「１．分析及び評価方法」に記載の方法に従って、得られたリン酸架橋澱粉粒から作製したゲル中の澱粉の老化度をＢＡＰ法にて分析した。【０１７２】
（実施例３：アミロマルターゼで処理したリン酸架橋澱粉粒の製造）
比較例２で調製したリン酸架橋澱粉粒４００ｇにイオン交換水９００ｇを加え、澱粉粒懸濁液を調製した。澱粉粒懸濁液のｐＨをｐＨ７．０に調整した後、製造例１で製造したアミロマルターゼ酵素液（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来；至適ｐＨ７．５）を５ｍｌ（８００ｕｎｉｔｓ）添加し、５０℃で１８時間撹拌し、酵素反応を行った。反応終了後、反応液を遠心濾過し、沈殿物を送風乾燥することにより、酵素処理澱粉粒を回収した。上記「１．分析及び評価方法」に記載の方法に従って、得られた酵素処理澱粉粒から作製したゲル中の澱粉の老化度をＢＡＰ法にて分析した。【０１７３】
（実施例４：アミロマルターゼで処理した澱粉粒の製造）
未処理の馬鈴薯澱粉（タンパク質含量  ０．１重量％）４００ｇにイオン交換水９００ｇを加え、澱粉粒懸濁液を調製した。澱粉粒懸濁液のｐＨをｐＨ７．０に調整した後、製造例１で製造したアミロマルターゼ酵素液（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来；至適ｐＨ７．５）を５ｍｌ（８００ｕｎｉｔｓ）添加し、５０℃で１８時間撹拌し、酵素反応を行った。反応終了後、反応液を遠心濾過し、沈殿物を送風乾燥することにより、酵素処理澱粉粒を回収した。上記「１．分析及び評価方法」に記載の方法に従って、得られた酵素処理澱粉粒の粘度特性をアミログラフにて分析し、ゲル中の澱粉の老化度をＢＡＰ法にて分析した。【０１７４】
（比較例３：糊化後にアミロマルターゼで処理した澱粉の製造）
実施例４で使用したのと同じロットの未処理の馬鈴薯澱粉３００ｇにイオン交換水２７００ｇを加え、澱粉粒懸濁液を調製した。澱粉粒懸濁液を１３０℃で１５分間加熱し、糊化させた。得られた糊液中では澱粉が溶解しており、澱粉粒は存在しなかった。得られた糊液を、７０℃に冷却し、糊液のｐＨをｐＨ７．０に調整した後、製造例１で製造したアミロマルターゼ酵素液（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来；至適ｐＨ７．５）を５ｍｌ（８００ｕｎｉｔｓ）添加し、７０℃で１８時間撹拌し、酵素反応を行った。反応終了後、４℃にて白いゲルが形成するまで（４０時間）冷却した。このゲルを、水で洗浄し、濾過し、次いで残渣を２５％エタノールで洗浄し、濾過し、次いで残渣を５０％エタノールで洗浄し、濾過し、次いで残渣を７５％エタノールで洗浄し、濾過し、次いで残渣を９９．５％エタノールにより洗浄し、濾過し、次いで残渣を送風乾燥し、酵素処理澱粉を回収した。上記「１．分析及び評価方法」に記載の方法に従って、得られた酵素処理澱粉の粘度特性をアミログラフにて分析した。【０１７５】
（比較例４：糊化開始温度より高い温度にてアミロマルターゼで処理した澱粉の製造）
実施例４で使用したのと同じロットの未処理の馬鈴薯澱粉３００ｇにイオン交換水５７００ｇを加え、澱粉粒懸濁液を調製した。澱粉粒懸濁液のｐＨをｐＨ７．０に調整した後、製造例１で製造したアミロマルターゼ酵素液（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来；至適ｐＨ７．５）を５ｍｌ（８００ｕｎｉｔｓ）添加し、７０℃で１８時間撹拌し、酵素反応を行った。反応終了後、顕微鏡にて、澱粉粒が見られないことを確認し、その後４℃にて白いゲルが形成するまで（４０時間）冷却した。このゲルを、水で洗浄し、濾過し、次いで残渣を２５％エタノールで洗浄し、濾過し、次いで残渣を５０％エタノールで洗浄し、濾過し、次いで残渣を７５％エタノールで洗浄し、濾過し、次いで残渣を９９．５％エタノールにより洗浄し、濾過し、次いで残渣を送風乾燥し、酵素処理澱粉を回収した。上記「１．分析及び評価方法」に記載の方法に従って、得られた酵素処理澱粉の粘度特性をアミログラフにて分析した。【０１７６】
（比較例５：酢酸澱粉粒の製造）
比較例１で使用したのと同じロットの未処理の天然小麦澱粉５００ｇに、６．７％（ｗ／ｗ）硫酸ナトリウム水溶液７５０ｇを加え、澱粉粒懸濁液を調製した。澱粉粒懸濁液のｐＨをｐＨ８．５に調整した後、酢酸ビニルモノマー７．３６ｇを添加し、３０℃で４０分間撹拌し、反応を行った。４０分後、反応液のｐＨをｐＨ６．０に調整し、反応を停止させた。反応終了後、反応液を遠心濾過し、沈殿物を送風乾燥することにより、酢酸澱粉粒を回収した。得られた酢酸澱粉粒から作製したゲルのヤング率を、上記「１．分析及び評価方法」に記載の方法に従って、レオメータにて分析した。【０１７７】
（比較例６）
比較例２で使用したのと同じロットの未処理のタピオカ澱粉を比較例６のサンプルとして使用した。上記「１．分析及び評価方法」に記載の方法に従って、未処理のタピオカ澱粉から作製したゲル中の澱粉の老化度をＢＡＰ法にて分析した。【０１７８】
（比較例７）
実施例４で使用したのと同じロットの未処理の馬鈴薯澱粉を比較例７のサンプルとして使用した。上記「１．分析及び評価方法」に記載の方法に従って、未処理の馬鈴薯澱粉から作製したゲル中の澱粉の老化度をＢＡＰ法にて分析した。【０１７９】
（実施例５：アミロマルターゼで処理した澱粉粒の製造）
日本産の精白されたうるち米（ジャポニカ米、精白歩合２０％）を原料米とし、十分な水洗後、一晩水に浸漬を行った後、水を除去し、浸漬後の米の見かけの体積と同じ体積の加水を行い、従来技術に従って磨砕および篩別を行った。その後、従来技術に従って脱水および乾燥し、タンパク質含量５．５重量％の未処理の米粉を得た。得られた未処理の米粉４００ｇにイオン交換水９００ｇを加え、澱粉粒懸濁液を調製した。澱粉粒懸濁液のｐＨをｐＨ７．０に調整した後、製造例１で製造したアミロマルターゼ酵素液（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来；至適ｐＨ７．５）を５ｍｌ（８００ｕｎｉｔｓ）添加し、５５℃で１８時間撹拌し、酵素反応を行った。反応終了後、反応液を遠心濾過し、沈殿物を送風乾燥することにより、酵素処理澱粉粒を回収した。上記「１．分析及び評価方法」に記載の方法に従って、得られた酵素処理澱粉粒から作製したゲル中の澱粉の老化度をＢＡＰ法にて分析した。【０１８０】
（比較例８）
実施例５で使用したのと同じロットの未処理の米粉を比較例８のサンプルとして使用した。上記「１．分析及び評価方法」に記載の方法に従って、未処理の米粉から作製したゲル中の澱粉の老化度をＢＡＰ法にて分析した。【０１８１】
（実施例６：アミロマルターゼで処理した澱粉粒の製造）
未処理のコーンスターチ（タンパク質含量  ０．１重量％）４００ｇにイオン交換水９００ｇを加え、澱粉粒懸濁液を調製した。澱粉粒懸濁液のｐＨをｐＨ７．０に調整した後、製造例１で製造したアミロマルターゼ酵素液（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来；至適ｐＨ７．５）を５ｍｌ（８００ｕｎｉｔｓ）添加し、５５℃で１８時間撹拌し、酵素反応を行った。反応終了後、反応液を遠心濾過し、沈殿物を送風乾燥することにより、酵素処理澱粉粒を回収した。上記「１．分析及び評価方法」に記載の方法に従って、得られた酵素処理澱粉粒から作製したゲル中の澱粉の老化度をＢＡＰ法にて分析した。【０１８２】
（比較例９）
実施例６で使用したのと同じロットの未処理のコーンスターチを比較例９のサンプルとして使用した。上記「１．分析及び評価方法」に記載の方法に従って、未処理のコーンスターチから作製したゲル中の澱粉の老化度をＢＡＰ法にて分析した。【０１８３】
（実施例７：アミロマルターゼで処理した澱粉粒の製造）
比較例２で使用したのと同じロットの未処理の天然タピオカ澱粉４００ｇにイオン交換水９００ｇを加え、澱粉粒懸濁液を調製した。澱粉粒懸濁液のｐＨをｐＨ７．０に調整した後、製造例１で製造したアミロマルターゼ酵素液（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来；至適ｐＨ７．５）を５ｍｌ（８００ｕｎｉｔｓ）添加し、５５℃で１８時間撹拌し、酵素反応を行った。反応終了後、反応液を遠心濾過し、沈殿物を送風乾燥することにより、酵素処理澱粉粒を回収した。上記「１．分析及び評価方法」に記載の方法に従って、得られた酵素処理澱粉粒から作製したゲル中の澱粉の老化度をＢＡＰ法にて、ヤング率をレオメータにて分析した。【０１８４】
（比較例１０：酢酸澱粉粒の製造）
比較例２で使用したのと同じロットの未処理の天然タピオカ澱粉５００ｇに、６．７％（ｗ／ｗ）硫酸ナトリウム水溶液７５０ｇを加え、澱粉粒懸濁液を調製した。澱粉粒懸濁液のｐＨをｐＨ８．５に調整した後、酢酸ビニルモノマー７．３６ｇを添加し、３０℃で４０分間撹拌し、反応を行った。４０分後、反応液のｐＨをｐＨ６．０に調整し、反応を停止させた。反応終了後、反応液を遠心濾過し、沈殿物を送風乾燥することにより、酢酸澱粉粒を回収した。上記「１．分析及び評価方法」に記載の方法に従って、得られた酢酸澱粉粒から作製したゲルのヤング率をレオメータにて分析した。【０１８５】
（比較例１１：ヒドロキシプロピル澱粉粒の製造）
比較例２で使用したのと同じロットの未処理の天然のタピオカ澱粉５００ｇに、１１％（ｗ／ｗ）硫酸ナトリウム水溶液７８５ｇを加え、澱粉懸濁液を調製した。懸濁液のｐＨをｐＨ１１．０に調整した後、プロピレンオキサイド２４ｇを添加し、４２℃で１６時間撹拌することにより反応を行った。１６時間後、懸濁液のｐＨを６．０に調整し、反応を停止させた。反応終了後、遠心濾過、送風乾燥し、ヒドロキシプロピル澱粉を回収した。上記「１．分析及び評価方法」に記載の方法に従って、得られたヒドロキシプロピル澱粉粒から作製したゲルのヤング率をレオメータにて分析した。【０１８６】
【表１】
2012111326.tif 000005
【０１８７】
得られた澱粉粒（または澱粉粉末）から作製したゲルについての物性測定結果を以下の表２〜表７および表９〜表１０に示し、各種馬鈴薯澱粉の粘度特性への糊化の影響を表８に示す。【０１８８】
【表２】
2012111326.tif 000006
【０１８９】
比較例１の酵素処理しなかった澱粉粒に比べ、酵素処理した澱粉粒の方が、ゲルにして保存した場合の経時的な老化度の変化が格段に少ないことが確認された。【０１９０】
【表３】
2012111326.tif 000007
【０１９１】
比較例５の澱粉粒を使用して作製したゲルは、未処理澱粉を使用して作製したゲルに比べ、非常に柔らかく、実用に値しないものであったが、実施例１または２の澱粉粒を使用して作製したゲルは未処理澱粉を使用して作製したゲルと同等の硬さを示した。このように、アセチル化によって澱粉のゲル形成能が非常に損なわれ、その程度は到底実用に値しないことが確認された。【０１９２】
【表４】
2012111326.tif 000008
【０１９３】
実施例１または２の澱粉粒を使用して作製したゲルについては、保存一日後の食感は、適度な硬さを持ち、弾力感があったが、比較例１の澱粉粒を使用して作製したゲルの食感は非常に硬く、サクさを感じ、脆かった。また、比較例５の澱粉粒を使用して作製したゲルの食感は軟らかく、弾力が感じられなかった。【０１９４】
比較例１または比較例５の澱粉粒を使用して作製したゲルでは４℃で１４日間保存することによりヤング率が上昇したことから、ゲル中の澱粉の老化が進行していることが確認された。一方、実施例１および２の澱粉粒を使用して作製したゲルでは、４℃で１４日間保存した後もヤング率の変化が少ないことから、澱粉の老化が抑制されていることが確認された。【０１９５】
【表５】
2012111326.tif 000009
【０１９６】
比較例10または11の澱粉粒を使用してはゲルを形成できなかったが、実施例７、または比較例２の澱粉粒を使用して作製されたゲルは未処理澱粉粒を使用して作製されたゲルに比べ非常に硬くなっていた。【０１９７】
【表６】
2012111326.tif 000010
比較例６及び２の酵素処理していない澱粉粒に比べ、酵素処理した澱粉粒（実施例３および７）の方が、ゲルにして保存した場合の経時的な老化度の変化が格段に少ないことが確認された。【０１９８】
【表７】
2012111326.tif 000011
【０１９９】
比較例７の酵素処理していない澱粉粒に比べ、酵素処理した澱粉粒の方が、ゲルにして保存した場合の経時的な老化度の変化が格段に少ないことが確認された。【０２００】
【表８】
2012111326.tif 000012
【０２０１】
本願実施例４の酵素処理した澱粉粒は比較例７の未処理の馬鈴薯澱粉と同様に高い最高粘度を示すのに対し、比較例３〜４の澱粉粒が消失している酵素処理澱粉は、粘度が極めて低かった。このように、酵素処理前または酵素処理中に澱粉粒が糊化して消失すると、粘度の高い澱粉粒を得られないことが確認された。【０２０２】
【表９】
2012111326.tif 000013
【０２０３】
比較例８の酵素処理していない澱粉粒に比べ、酵素処理した澱粉粒（実施例５）の方が、ゲルにして保存した場合の経時的な老化度の変化が格段に少ないことが確認された。【０２０４】
【表１０】
2012111326.tif 000014
【０２０５】
比較例９の酵素処理していない澱粉粒に比べ、酵素処理した澱粉粒（実施例６）の方が、ゲルにして保存した場合の経時的な老化度の変化が格段に少ないことが確認された。【０２０６】
（試作例）
次に、本発明を試作例により詳しく説明するが、本発明はこれらの試作例によって限定されるものではない。また、特に記載のない限り、「部」とは「質量部」を意味するものとする。【０２０７】
（試作例１：クッキーの調製）
ミキサーに、下記表１１に掲げる処方の内の無塩バター及びショートニングを加えよく混ぜ合わせる。この混合物に更に、上白糖及び食塩を加えよく混ぜ合わせた後、予め水に溶解した炭酸水素アンモニウムを加えよく混ぜ合わせる。最後に、予め混合した薄力粉及び澱粉及び重曹（炭酸水素ナトリウム）の粉体混合物を加え、生地の塊（ドウ）が形成されるまでよく混ぜ合わせる。生地の塊（ドウ）を麺棒で薄く伸ばし、型抜きをして、オーブンにて２００℃下で１５分間焼成し、クッキーを調製した。【０２０８】
【表１１】
2012111326.tif 000015
【０２０９】
得られたクッキーについて、翌日及び７日後の食感を、評価した。結果、翌日は、試作比較例１及び２のクッキーでは、ガリガリした食感を感じたが、試作例１のクッキーは口どけよく、サクさが感じられた。７日後のクッキーでは、試作比較例１のクッキー及び試作比較例２のクッキーは、硬さが増し、さらにボソボソした食感になっていたが、試作例１のクッキーは、翌日と同様の口解けのよさを維持していた。【０２１０】
（試作例２：スポンジケーキの調製）
下記表１２に掲げる処方にてオールインミックス法により生地比重を０．４５に調整した。生地３５０ｇを６号型に流し込み、１６０℃（上）、１７０℃（下）のオーブンで５５分間焼成してスポンジケーキを調製した。【０２１１】
【表１２】
2012111326.tif 000016
【０２１２】
得られたスポンジケーキについて、翌日及び３日後の食感を評価した。翌日の結果では、全サンプルのスポンジケーキで、ソフトでふわっとした良好な食感を感じられたが、３日後には、試作比較例３及び試作比較例４のスポンジケーキは、パサついた食感を強く感じたが、試作例２のスポンジケーキは、ふわっと感を維持していた。【０２１３】
（試作例３：ロールケーキの調製）
下記表１３に掲げる処方にてオールインミックス法により生地比重を０．４５に調整した。生地３５０ｇを天板に流し込み、１７０℃（上）、１８０℃（下）のオーブンで１５分間焼成してケーキ生地を得た。これを網に載せて室温程度まで放熱させ、巻いてロールケーキを調製した。【０２１４】
【表１３】
2012111326.tif 000017
【０２１５】
得られたロールケーキを４℃で冷蔵保管し、翌日及び３日後の食感を評価した。翌日の結果では、全サンプルのロールケーキで、ソフトな食感が感じられ、特に試作例３のロールケーキは、膨らみが大きかった。３日後には、試作比較例５及び試作比較例６のロールケーキは、クチャついた食感を感じるものであったが、試作例３のロールケーキは、ふわっとしたソフト感を維持しており、膨らみも維持していた。【０２１６】
（試作例４：くず餅の調製）
下記表１４に掲げる処方の内、いずれかの澱粉と上白糖の混合物を水に加え、木べらでよく混ぜ合わせ上白糖を溶かす。木べらで掻き混ぜながら、粘度が出て糊状になり、かつ、透明感のある状態になるまで加熱する。型に流し入れ、氷浴にて急冷し、くず餅を調製した。【０２１７】
【表１４】
2012111326.tif 000018
【０２１８】
得られたくず餅を４℃で冷蔵保管し、翌日及び３日後の食感を評価した。翌日の食感については、試作比較例７のくず餅は、ねちゃつきを感じる食感であり、また、試作比較例８のくず餅は、軟らかい食感であった。一方、試作例４のくず餅は、適度な硬さと粘弾性を持っていた。３日後の食感については、試作比較例７、８のくず餅は共に、弾力感が低下し、脆さが感じられたが、試作例４のくず餅は、弾力のある食感を維持し、食感の変化を感じられなかった。【０２１９】
（試作例５：茹うどんの調製）
下記表１５に掲げる処方に準じ、いずれかの澱粉、中力小麦粉を下記の割合で混合した粉末混合物に、食塩１部を水４０部に溶解した捏ね水を加え、真空ミキサーで１２分間混練した。その後製麺機を用いて複合及び圧延を行い麺帯とし、切り歯８番を用いて裁断し生うどんを得た。得られた生うどんを沸騰水中で１４分間茹でた後、水洗、冷却し酸浸漬させて４℃で保管した。【０２２０】
【表１５】
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【０２２１】
得られた茹うどんを、４℃で冷蔵保管し、翌日及び５日後の食感を評価した。なお、評価は、沸騰水中で３分間茹でた後、熱いスープに入れ食感を評価した。【０２２２】
翌日の食感は、試作比較例９の茹でうどんは、若干弾力に乏しかったが、つるみを感じられた。試作比較例１０の茹でうどんは、剛的な硬さを感じられた。一方、試作例５の茹でうどんは歯ごたえに富むモチモチとした食感が感じられた。５日後の評価では、試作比較例９、１０の茹でうどんは共に、脆さが強くなり、老化を感じられたが、試作例５の茹でうどんはモチモチ感を維持できていた。【０２２３】
（試作例６：ゼリーキャンデーの調製）
下記表１６に掲げる処方に準じ、砂糖、水飴、いずれかの澱粉と水を下記の割合で撹拌混合しながら、ブリックス（Ｂｘ）７５まで加熱溶解した。得られた溶液を鋳型に充填し、常温で２４時間放置した。固化を確認後、鋳型から取り出し、ゼリーキャンデーを得た。
【表１６】
2012111326.tif 000020
【０２２４】
得られたゼリーキャンデーについて、翌日及び室温保存１４日後の食感を評価した。翌日の食感は、試作比較例１１、１２のゼリーキャンデーは共に、弾力感が強く感じられ、一方、試作例６のゼリーキャンデーは、適度な粘弾性と、且つ口解け感を感じられた。１４日後の食感は、試作比較例１１、１２のゼリーキャンデーは共にサクさが強く感じられ、老化が進行している感じを受けたが、試作例６のゼリーキャンデーは、適度な弾力感を維持していた。【０２２５】
（試作例７：パンの調製）
下記表１７に掲げる処方により、ホームベーカリー（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ  ＳＤ−ＢＨ１０３）を用いて食パンを調製した。
【表１７】
2012111326.tif 000021
【０２２６】
得られた食パンについて、翌日及び室温保存３日後の食感を評価した。翌日の結果では、試作比較例１３の食パンは、パサパサした食感であり、一方、試作例７の食パンは軽い食感が感じられた。３日後には、試作比較例１３の食パンは、ガリガリした硬い食感となったが、試作例７の食パンは、軽い食感を維持していた。【０２２７】
（試作例８：フラワーペーストの調製）
下記表１８に掲げる処方に準じ、全ての材料を鍋に入れ、Ｂｘ．４２．５まで撹拌しながら加熱し、フラワーペーストを調製した。
【表１８】
2012111326.tif 000022
【０２２８】
得られたフラワーペーストをカップに充填し４℃保管し、翌日及び７日後の食感を評価した。【０２２９】
翌日の食感は、試作比較例１４のフラワーペーストについては、硬さが感じられ、試作比較例１５のフラワーペーストについては、モチ様の硬さを感じられた。一方、試作例８のフラワーペーストは口解けの良いクリーム感が感じられた。５日後の評価では、試作比較例１４、１５のフラワーペーストは共に、脆さが強くなり、特に試作比較例１５のフラワーペーストは、著しい離水が確認され、老化を感じられたが、試作例８のフラワーペーストは口解けの良いクリーム感を維持できていた。【０２３０】
以下の比較例１２および実施例８で使用した米澱粉は、シグマアルドリッチ社製の米澱粉である。シグマアルドリッチ社製の米澱粉は、イネ由来である。【０２３１】
（比較例１２）
未処理の米澱粉（シグマアルドリッチ製）（タンパク質含量  ０．４重量％）を比較例１２のサンプルとして使用した。上記「１．分析及び評価方法」に記載の方法に従って、未処理の米澱粉から作製したゲル中の澱粉の老化度をＢＡＰ法にて分析した。【０２３２】
（実施例８）
比較例１２で使用したのと同じロットの米澱粉（シグマアルドリッチ社製）４００ｇにイオン交換水９００ｇを加え、澱粉粒懸濁液を調製した。澱粉粒懸濁液をｐＨ  ７．０に調整した後、製造例１で製造したアミロマルターゼ酵素液（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来；至適ｐＨ７．５）を５ｍｌ（８００  ｕｎｉｔｓ）添加し、５５℃で１８時間撹拌し、酵素反応を行った。反応終了後、反応液を遠心濾過し、沈殿物を送風乾燥することにより酵素処理澱粉粒を回収した。上記「１．分析及び評価方法」に記載の方法に従って、得られた酵素処理澱粉粒から作製したゲル中の澱粉の老化度をＢＡＰ法にて分析した。【０２３３】
【表１９】
2012111326.tif 000023
【０２３４】
【表２０】
2012111326.tif 000024
比較例１２の酵素処理をしていない澱粉粒に比べ、酵素処理した澱粉粒（実施例８）の方が、ゲルにして保存した場合の経時的な老化度の変化が格段に少ないことが確認された。【０２３５】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０２３６】
本発明により、老化しにくい特性を持った酵素処理澱粉粒が提供される。本発明の酵素処理澱粉粒を利用して澱粉ゲル含有食品を製造することにより、従来よりも長期にわたって日持ちする食品が得られる。このような澱粉ゲル含有食品は、従来よりも長期にわたって柔らかい食感を保持する。また、このような澱粉ゲル含有食品がゼリー、わらび餅などの透明な食品である場合、低温で長期間保存しても柔らかい食感が保たれ、さらに透明感も維持される。
【配列表】
2012111326000001.app
【国際調査報告】
2012111326.tif 000025
2012111326.tif 000026