(57)【要約】  本発明は、薬剤を封入した薬剤カプセルを、効率的かつ高い安全性で、様々な標的細胞や組織に送達し取り込ませることが可能な運搬体、及びそれを用いたドラッグデリバリーシステムを提供する。当該運搬体は、本発明のコレステロール依存性細胞溶解毒素変異体の抗体結合ドメインに細胞または組織特異的抗体が結合しており、また当該変異体のドメイン４を介して、運搬材料となる、薬効成分若しくは生理活性物質を充填したコレステロール含有マイクロカプセルまたは機能性細胞を結合させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（1）抗体結合ドメイン、
（2）コレステロール依存性細胞溶解毒素のドメイン１〜３において、少なくとも２つの任意のアミノ酸残基がCys残基に置換されて、非還元条件下で互いにSS結合を形成してなる改変ドメイン１〜３、及び
（3）コレステロール依存性細胞溶解毒素のドメイン４において、すべてのCys残基がAla、Ser、Gly及びThrから選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されてなる改変ドメイン４を有するコレステロール依存性細胞溶解毒素の変異体であって、
細胞膜またはコレステロール含有リポソーム膜に対して結合性を有し、且つ還元条件下でSS結合が開裂して膜孔形成能を発揮することを特徴とする、コレステロール依存性細胞溶解毒素の変異体。
【請求項２】
コレステロール依存性細胞溶解毒素がスイリシン及びインターメディリシンから選択される少なくとも１種である、請求項１に記載するコレステロール依存性細胞溶解毒素の変異体。
【請求項３】
コレステロール依存性細胞溶解毒素のドメイン１〜３及びドメイン４がいずれもスイリシンに由来するものであるか、またはコレステロール依存性細胞溶解毒素のドメイン１〜３はインターメディリシンに由来し、ドメイン４はスイリシンに由来するものである、請求項１または２に記載するコレステロール依存性細胞溶解毒素の変異体。
【請求項４】
抗体結合ドメインが黄色ブドウ球菌プロテインＡのＺドメイン、またはＧ群レンサ球菌に由来するプロテインＧのＢドメインである請求項１乃至３のいずれかに記載するコレステロール依存性細胞溶解毒素の変異体。
【請求項５】
上記還元条件下が細胞内のグルタチオンによる還元環境である請求項１乃至４のいずれかに記載するコレステロール依存性細胞溶解毒素の変異体。
【請求項６】
細胞内のグルタチオンによる還元環境が１〜１０ｍＭの還元型グルタチオンを含むファゴリソソーム内または細胞質内の環境である請求項５に記載するコレステロール依存性細胞溶解毒素の変異体。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載するコレステロール依存性細胞溶解毒素の変異体に、その抗体結合ドメインを介して、細胞または組織特異的抗体が結合してなる、薬物運搬体。
【請求項８】
細胞または組織特異的抗体が、癌細胞に特異的に発現する蛋白質またはオリゴ糖を特異的に認識する抗体、ウイルス感染細胞の細胞膜上に出現するウイルスタンパク質を特異的に認識する抗体、及び免疫細胞に特異的に発現するCD抗原を特異的に認識する抗体である、請求項７に記載する薬物運搬体。
【請求項９】
請求項７または８に記載する薬物運搬体に、コレステロール依存性細胞溶解毒素の変異体のドメイン４を介して、薬効成分若しくは生理活性物質が充填されたコレステロール含有マイクロカプセルまたは機能性細胞が結合してなる、ドラッグデリバリーシステム。
【請求項１０】
上記機能性細胞が免疫細胞または遺伝子組み換え細胞である、請求項９記載のドラッグデリバリーシステム。
【請求項１１】
上記薬効成分または生理活性物質が、薬効や生理活性を発揮する化合物、ペプチド、タンパク質、核酸、及びドミナントネガティブ効果を有する物質からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項９または１０に記載するドラッグデリバリーシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コレステロール依存性細胞溶解毒素の変異体に関する。また本発明は、当該変異体のドラッグデリバリーシステム（DDS）における薬物運搬体（DDS運搬体）としての用途、及び当該薬物運搬体を用いたDDSに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年は世界的に、癌患者のQOL（Quality of Life）を重視する観点から、癌切除手術、抗癌剤の全身投薬、また放射線照射などの主流的な癌治療法以外に、免疫細胞療法や癌ミサイル療法等が検討されている。そのために癌細胞に特異的かつ効率良く標的化して作用する副作用の少ない治療薬やツールの開発が望まれている。例えばモノクローナル抗体などを癌への標的化分子として用いる標的化技術やそれにリンクさせる抗癌剤の開発についても多くの検討が成されている。しかしながら、実際には、それらの標的化分子を目標の癌細胞に大量に集積させる技術は十分ではなく、さらに改善が必要である。【０００３】
またエイズや肝炎などの多くのウイルス感染症、さらには先天的な遺伝病や遺伝子発現の異常に基づく疾病なども近年大きな問題となっている。これらの疾病の発症抑制や治療に、RNAiの手法による遺伝子発現の抑制や、特定の遺伝子修復を行う遺伝子治療を応用することが、今後の医療において重要な課題となっている。現在はRNAi用の薬剤を送達するためにアテロコラーゲンなどの非特異的なキャリアが使用されているが、遺伝子治療を一般的に実用化するには、対象となる細胞や組織や臓器に選択的に遺伝子発現調節薬剤を送達することが必須となってくる。【０００４】
このような背景において、従来から、抗癌剤のような癌治療薬や遺伝子治療薬を高濃度で封入したリポソームなどを、効率的かつ高い安全性で対象となる細胞や組織に送り届けて疾病を治療するためのドラッグデリバリーシステム（DDS）の構築が求められている。【０００５】
なお、本件発明に類似する技術を開示するものとして、本件出願前に公知となっている文献として、特許文献１、非特許文献１及び２を挙げることができる。【０００６】
しかし、特許文献１は、ヒト細胞膜を特異的に認識するインターメディリシンの細胞膜結合ドメインのＮ末端にCys残基を導入したものにヒト細胞特異的な結合性があることを見出し、この特性を利用してヒト細胞膜結合アダプターとして用いることを提案したものに過ぎない。当該ヒト細胞膜結合アダプターは、種々の物質をヒト細胞膜に結合固定化するうえで有用であるものの、当該物質を細胞内に取り込ませ、細胞内で放出させる機能はない。【０００７】
また非特許文献１は、上記特許文献１記載の技術により細胞膜結合ドメインのＮ末端にCys残基を導入したインターメディリシンのドメイン４に、さらに抗癌胎児性癌抗原（CEA）抗体を連結することで、CEA陽性のヒト甲状腺髄様癌細胞等の癌細胞を標的化することができ、癌治療に応用できること示したものである。この技術は、癌細胞を標的化できるという意味で有用であるものの、上記特許文献１と同様に、抗癌剤などの薬物を細胞内に取り込ませ、細胞内で放出させる効果は期待できない。【０００８】
さらに非特許文献２は、本件発明と同様にコレステロール依存性細胞溶解毒素（cholesterol-dependent cytolysin:CDC）を利用したドラッグデリバリーシステムを開示するものであるが、SS結合の導入による膜孔形成能を制御したCDC変異体（CDC-SS）のＮ末端に肺癌細胞に高親和性を有するペプチド（肺癌標的化ドメイン）を結合させることで、薬物を肺癌細胞に特異的に運搬送達させる技術に過ぎない。つまり、肺癌細胞だけしか特異性がなく、標的可変性がないため汎用性が低いという問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】H.Nagamune et al. (2004) Anticancer Res., Vol.24(5), pp.3367-3372.
【非特許文献２】「癌標的化毒素を用いた癌療法のための効果的DDSの開発」第81回日本生化学会大会発表要旨集（平成20年12月12日）
【非特許文献３】田端厚之ら (2009) 徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部研究報告、No.54, pp.51-56.
【非特許文献４】H.Nagamune et al.(1996) Infect.Immun., Vol.64(8), pp3093-3100.
【非特許文献５】H.Nagamune et al.(2000)J. Clin. Microbiol., Vol.38(1), pp220-226.
【非特許文献６】H.Nagamune et al.(2004) Microbiol. Immunol., Vol.48(9), pp.677-692.
【非特許文献７】K. Ohkura et al. (2004) Anticancer Res., Vol.24(5), pp.3343-3354.
【非特許文献８】K. Sekiya et al. (2007) Microb. Infect., Vol.9(11), pp. 1341-1350.
【非特許文献９】K. Semba et al.(1985) PNAS, Vol.82(19),pp.6497-6501
【非特許文献１０】D.J. Slamon et al.(1987) Science, Vol.235(4785),pp.177-182.
【非特許文献１１】I. Wiest et al.(2010) Anticancer Res., Vol.30(5),pp.1849-1853.
【非特許文献１２】D.X. Zhou et al.(2011) Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol.405(2), pp.325-332
【非特許文献１３】R. Li et al.(2004) Arch. Pathol. Lab. Med., Vol.128(12), pp.1412-1417.
【非特許文献１４】S. Yonezawa and E.Satop (1997) Pathol. Int., Vol.47(12), pp.813-830.
【非特許文献１５】E. Lacunza et al.(2010) Cancer Genet. Cytogenet.,Vol.201(2), pp.102-120.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記医療業界並びに社会における要望を解決することを目的とするものであり、薬剤を封入した薬剤カプセルを、効率的かつ高い安全性で、標的細胞や組織に送達することが可能な運搬体（薬物運搬体）、及びそれを用いたドラッグデリバリーシステム（DDS）を提供することを課題とする。より好ましくは、癌治療や遺伝子治療において、効率的かつ高い安全性とともに汎用性のある運搬体（薬物運搬体）、及びそれを用いたドラッグデリバリーシステム（DDS）を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決すべく、鋭意検討を重ねていたところ、細胞膜またはコレステロール（CHL）を含有する膜に特異的に結合して膜孔(穴)を形成するコレステロール依存性細胞溶解毒素(以下、単に「CDC」ともいう)に着目し、これを下記（1）〜（3）のように改変し、当該CDC変異体のＮ末端領域の抗体結合ドメインに細胞特異的抗体または組織特異的抗体を結合させて調製した、抗体結合CDC変異体によれば、任意の薬剤を封入したCHL含有リポソーム等を結合させることができ、その結果、当該薬剤含有リポソームを抗体が認識結合する標的部位に選択的且つ効率良く安全に送達することができること、また当該標的部位で的確に薬剤の機能を発揮させることができることを見出し、当該抗体結合CDC変異体が薬物運搬体として有効に機能することを確認した。【００１２】
（1）CDCのＮ末端側に、抗体結合性タンパク質の抗体結合ドメインを結合する。【００１３】
図１において、抗体結合ドメインは符号Ｚで、またCDCは符号１〜４で示されている。図１に示すように、抗体結合ドメイン（Z）を、ドメイン１〜４からなるCDCのドメイン１のＮ末端側に結合させる。
（2）CDCの膜結合に関係するドメイン４（図１中、符号４）について、その安定性を確保するために、ドメイン４のCys残基を他の安定化アミノ酸（例えば、Ala残基等）に置換する。
（3）CDCの自己会合と膜貫通（膜孔形成）に関係するドメイン１〜３（図１中、符号１〜３）について、その任意の少なくとも２箇所をCysに変異してSS結合を形成させる。【００１４】
上記（1）〜（3）のように改変されたCDC変異体（以下、「Z-CDC-SS」ともいう）には、前述するように、そのＮ末端領域の抗体結合ドメイン(Z)に、抗原特異性の異なる細胞特異的なまたは組織特異的な抗体（IgG）を結合させることができるとともに、ドメイン４を介して、薬剤を封入したCHL含有リポソーム等（図１中、符号Ｍで示す）を結合させることができる。このため、例えば、Ｎ末端領域の抗体結合ドメイン(Z)に、癌細胞に特異的に発現するタンパク質を選択的に認識する抗体を結合させ、ドメイン４に抗癌剤を封入したCHL含有リポソームを結合させることで、当該癌細胞や癌組織を標的部位として、そこに特異的に抗癌剤（抗癌剤を封入したCHL含有リポソーム）を運搬することができる。さらにCDC変異体は、そのドメイン１〜３がSS結合により架橋化されており、還元環境下でのみSS結合が開裂してCDCの膜貫通（膜孔形成）機能が発揮されるようになっている（例えば、図２の下段図参照）。具体的には、例えば、上記標的部位（癌細胞や癌組織）に運搬された抗癌剤（抗癌剤を封入したCHL含有リポソーム）は、エンドサイトーシスにより当該癌細胞内に取り込まれ、細胞内の還元型グルタチオンなどによる還元環境に晒されて初めて、抗癌剤を封入したリポソーム膜に孔が開き、内部の抗癌剤が細胞内に放出されて抗癌活性を発揮することができる（ファゴリソソーム内での膜孔形成と内容物放出）（図３参照）。【００１５】
このように、本発明のCDC変異体（Z-CDC-SS）は、Ｎ末端領域の抗体結合ドメイン(Z)に様々な特異性を示す抗体を連結することができるため、癌やウイルス感染細胞などを含む多種多様な細胞をターゲットとした汎用のDDS運搬体として、DDSに広く応用可能である。また、CDC変異体（Z-CDC-SS）に細胞若しくは組織特異的な抗体を結合させた本発明のDDS運搬体（抗体結合CDC変異体）によれば、抗体の標的細胞に薬物（薬物を封入したCHL含有リポソーム）に選択的に到達させることができるだけでなく、到達後に細胞内に取り込まれることにより、CDC変異体のSS結合が還元的に開裂して薬物を封入したCHL含有リポソームに穴が空き、標的細胞内に薬物を放出させることができるため、標的細胞に対して選択的且つ効率よく薬効を発揮させることができる。このため、他の細胞への影響が少なく、また少量で、安全かつ有効な治療効果を得ることができる。【００１６】
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであって、下記の実施形態を包含するもの
である。【００１７】
（Ｉ）コレステロール依存性細胞溶解毒素の変異体（CDC変異体）
（I-1）（1）抗体結合ドメイン、
（2）コレステロール依存性細胞溶解毒素（CDC）のドメイン１〜３において、少なくとも２つの任意のアミノ酸残基がCys残基に置換されて、非還元条件下で互いにSS結合を形成してなる改変ドメイン１〜３、及び
（3）CDCのドメイン４において、すべてのCys残基がAla、Ser、Gly及びThrからなる群から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されてなる改変ドメイン４
を有するCDCの変異体であって、
細胞膜またはコレステロール含有リポソーム膜に対して結合性を有し、且つ還元条件下でSS結合が開裂して膜孔形成能を発揮することを特徴とする、CDC変異体。【００１８】
（I-2）CDCがスイリシン（SLY）及びインターメディリシン（ILY）から選択される少なくとも１種である、（I-1）に記載するCDC変異体。【００１９】
（I-3）CDCのドメイン１〜３及びドメイン４がいずれもスイリシン（SLY）に由来するものであるか、またはCDCのドメイン１〜３はインターメディリシン（ILY）に由来し、ドメイン４はスイリシン（SLY）に由来するものである、（I-1）または（I-2）に記載するCDC変異体。【００２０】
（I-4）抗体結合ドメインが、黄色ブドウ球菌プロテインＡのＺドメイン、またはＧ群レンサ球菌種に由来するプロテインＧのＢドメインである（I-1）乃至(I-3)のいずれかに記載するCDC変異体。【００２１】
（I-5）上記還元条件下が細胞内のグルタチオンによる還元環境である（I-1）乃至(I-4)のいずれかに記載するCDC変異体。【００２２】
（I-6）細胞内のグルタチオンによる還元環境が、１〜１０ｍＭ、または２〜５ｍＭ等の数ｍＭオーダーの還元型グルタチオンを含むファゴリソソーム内または細胞質内の環境である（I-5）記載のCDC変異体。【００２３】
（II）薬物運搬体
（II-1）（I-1）乃至（I-6）のいずれかに記載するCDC変異体に、その抗体結合ドメインを介して、細胞または組織に特異的な抗体が結合してなる、薬物運搬体。
（II-2）細胞または組織特異的抗体が、癌細胞に特異的に発現する蛋白質やオリゴ糖などの抗原を特異的に認識する抗体、ウイルス感染細胞の細胞膜上に出現するウイルスタンパク質を特異的に認識する抗体、または免疫細胞に発現するCD抗原を特異的に認識する抗体である（II-1）に記載する、薬物運搬体。【００２４】
（III）ドラッグデリバリーシステム
（III-1）（I-1）乃至（I-6）のいずれかに記載するCDC変異体に、そのドメイン４を介して、薬効成分または生理活性物質が充填されたコレステロール含有マイクロカプセル、または免疫細胞若しくは遺伝子組み換え細胞等の機能性細胞が結合されてなり、且つ抗体結合ドメインを介して、細胞または組織特異的抗体が結合してなる、ドラッグデリバリーシステム。【００２５】
（III-2）細胞または組織特異的抗体が、癌細胞に特異的に発現する蛋白質やオリゴ糖などの抗原を認識する抗体、ウイルス感染細胞の細胞膜上に出現するウイルス蛋白質を認識する抗体、または免疫細胞に発現するCD抗原を認識する抗体である（III-1）に記載するドラッグデリバリーシステム。【００２６】
なお、当該ドラッグデリバリーシステムは、上記(II-1)または（II-2）に記載する薬物運搬体に、CDC変異体のドメイン４を介して、薬物が充填されたコレステロール含有マイクロカプセル、または免疫細胞若しくは遺伝子組み換え細胞等の機能性細胞が結合されてなるものでもある。【００２７】
（III-3）薬効成分または生理活性物質が、薬効や生理活性を発揮する化合物、ペプチド、タンパク質（抗体を含む）、核酸（生理活性ペプチドやタンパク質をコードする遺伝子やこれを含むベクター、DNA/RNAハイブリッド若しくはキメラポリヌクレオチド、siRNA、アンチセンス核酸[RNA,DNA,PNA,これらの複合物を含む]、ドミナントネガティブ効果を有する物質）からなる群から選択される少なくとも１つである（III-1）または（III-2）に記載するドラッグデリバリーシステム。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、薬効成分若しくは生理活性物質が充填されたコレステロール含有マイクロカプセルまたは免疫細胞若しくは遺伝子組み換え細胞等の細胞を、所望の標的細胞に選択的に効率よく送達し、且つ当該送達部で作用させることのできるドラッグデリバリーシステム（DDS）を提供することができる。【００２９】
従来開発していた類似のCDC変異体では肺癌細胞への標的化ができるだけで、用途が極めて限られていた（非特許文献３）。しかしそれに比べ、本発明のCDC変異体は、DDSに使用する薬物運搬体を製造するための分子ツールとして遙かに有用である。つまり、本発明のCDC変異体は、目的とする標的細胞に応じて、自由に所望の抗体を選択し結合することができるため、当該目的の標的細胞に指向性の高い種々の薬物運搬体を製造することができる。このため、本発明のCDC変異体によれば、疾患の種類や部位など、目的に応じて様々な抗体を用いることで、所望の細胞指向性を有する薬物運搬体、言い換えれば様々な疾病の治療に応用可能な薬物運搬体を製造することができる。この意味で、本発明のCDC変異体は、標的細胞に指向性の高い所望の薬物運搬体を製造するのに有用な汎用性の高い材料として用いることができる。【００３０】
また本発明のCDC変異体に上記所望の抗体を結合させてなる本発明の薬物運搬体（抗体結合CDC変異体）は細胞膜またはコレステロールに結合性を有するため、細胞またはコレステロール含有リポソームの中に封入した薬物を、所望の標的細胞に特異的且つ効果的に運搬し送達することができる。当該薬物運搬体を利用した本発明のドラッグデリバリーシステム（DDS）によれば、薬物を担持した薬物運搬体（抗体結合CDC変異体）が体液中を移動し抗体の標的細胞に到達すると、エンドサイトーシスにより当該細胞内に取り込まれ、そうすると、CDC変異体のSS結合が還元的に開裂して薬物を封入した細胞またはリポソームの膜に穴が空いて、当該細胞内に薬物を放出させることができる。このため、他の細胞や組織に影響を与えることなく、標的細胞に対して選択的且つ効率よく、有効に薬効を発揮させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明のCDC変異体をDDS運搬体（薬物運搬体）とするドラッグデリバリーシステム（DDS）の模式図を示す。図に示すDDS中、ＡとＢの領域から形成されるCDC変異体（Z-CDC-SS）が薬物運搬体に相当し、当該薬物運搬体（CDC変異体）のアンカー部位（ドメイン４）に結合してなる符号Ｍで示すＣ領域が、当該薬物運搬体によって標的部位に運搬される「運搬対象」である。DDS中、Ａ領域（符号Ｚ）は、抗原特異性の異なる種々の抗体（IgG）を結合することのできる抗体結合ドメイン（「ターゲティング部」ともいう）；Ｂ領域は、CDCの改変ドメイン１〜４からなり（CDC-SS）、CHL含有リポソーム膜または細胞膜に結合するアンカー部位（ドメイン４）と、還元条件下でSS結合が開裂すると膜孔形成能を発揮する膜孔形成部位を備えている（「アンカー及び膜孔形成部」ともいう）。また、DDS中、符号Ｃで示される領域は、薬物運搬体（CDC変異体）のアンカー部位（ドメイン４）に結合してなる「運搬対象」である。運搬対象の例としては、抗癌剤、細菌毒素、または遺伝子治療剤などを封入したリポソーム；並びに活性化を誘導したＮＫ細胞、マクロファージ、またはＴｃ細胞等を例示することができる。
【図２】野生型CDC（上段）とCDC変異体（Z-CDC-SS）（下段）について、細胞膜への結合、会合体形成、及び膜貫入（膜孔形成）を対比した模式図である（但し、模式図中、CDC変異体の「Zドメイン」の記載は省略している）。野生型CDCは、細胞膜に結合すると、ドメイン１〜３の立体構造が変化して膜貫入（膜孔形成）を起こして毒素活性を示すのに対して、CDC変異体（Z-CDC-SS）は、細胞膜に結合しても、非還元条件下ではSS結合が開裂せずドメイン１〜３の立体構造が維持されるため膜貫入（膜孔形成）を起さない。還元条件下になって初めてSS結合が開裂して、ドメイン１〜３の立体構造が変化して膜貫入（膜孔形成）を生じ毒素活性を示す。つまり、この図は、CDC変異体（Z-CDC-SS）によると、CDCの毒素活性の発現を、還元／非還元の有無でコントロールすることができることを示している。
【図３】本発明のドラッグデリバリーシステム（DDS）を利用した治療方法を示す模式図である。
【図４】ＡはCDCの一つであるスイリシン（Suilysin：SLY）の立体構造、Ｂはインターメディリシン（ILY）の立体構造を示す。
【図５】実施例１で作製した本発明のCDC変異体（Z-CDC-SS）に相当する２つの例を示す。Ａは、Ｎ末端側から、Hisタグを有する黄色ブドウ球菌プロテインＡのＺドメイン、SLYの改変ドメイン１、２及び３、並びにSLYの改変ドメイン４を有するCDC変異体（Z-SLY-SS（C/A））のアミノ酸配列を示す。Ｂは、Ｎ末端側から、Hisタグを有する黄色ブドウ球菌プロテインＡのＺドメイン、ILYの改変ドメイン１、２及び３、並びにSLYの改変ドメイン４を有するCDC変異体（Z-cSLY-SS（C/A））のアミノ酸配列を示す。図中、二重線下線領域は精製用のHisタグ領域；両矢印の下線（←→）領域（58a.a.）は、黄色ブドウ球菌（S.aureus）のプロテインＡ由来Ｚドメイン；箱矢印で挟まれた領域が、各CDCの毒素領域；黒矢頭（▲）はSS結合導入のために導入したCys残基；白矢頭（△）は分子の安定化のために、Cys残基をAla残基に置換した箇所；をそれぞれ意味する。
【図６】実施例１で作製した本発明のCDC変異体（Z-SLY-SS（C/A）、Z-cSLY-SS（C/A））の精製標品を電気泳動（SDS-PAGE）にかけてCBB染色して、純度を確認した結果を示す。図中、ＡはZ-SLY-SS（C/A）（分子量：59.7kDa）の結果、ＢはZ-cSLY-SS（C/A）（分子量：62.5kDa）の結果を示す。
【図７】実施例１で作製した本発明のCDC変異体（Z-SLY-SS（C/A）、Z-cSLY-SS（C/A））について、還元条件下及び非還元条件下での膜孔形成能を、溶血活性から評価した結果を示す（実施例２）。図中、ＡはZ-SLY-SS（C/A）の結果、ＢはZ-cSLY-SS（C/A）の結果を示す。各図において、―●―は、10mM DTTによる還元条件下でのCDC変異体の溶血活性（％）、―□―は、非還元条件下でのCDC変異体の溶血活性（％）を示す。横軸は、各CDC変異体の濃度（ng/ml）を意味する。
【図８】実施例１で作製した本発明のCDC変異体（Z-SLY-SS（C/A）、Z-cSLY-SS（C/A））について、ヒト血清由来IgG（Human IgG）、ウサギ血清由来IgG（Rabbit IgG）に対する結合性を評価した結果を示す。図中、ＡはZ-SLY-SS（C/A）の結果、ＢはZ-cSLY-SS（C/A）の結果を示す（実施例３）。各図において、―●―は、本発明のCDC変異体（Z-SLY-SS（C/A）、Z-cSLY-SS（C/A））のIgGへの結合性、―□―は、本発明のCDC変異体のN末端領域のZドメインに代えて抗体結合性を有しない20アミノ酸残基からなるペプチドを結合してなるCDC変異体（LTBP-SLY-SS（C/A）、LTBP-cSLY-SS（C/A））のIgGへの結合性を示す。縦軸は、IgGへの結合性をELISAアッセイで評価した吸光度（415nm）を示す。また、横軸は、各CDC変異体の濃度（μg/ml）を意味する。
【図９】図９Ａは抗CEA抗体−[Z-cSLY-SS(C/A)]−ウラニン封入リポソームで細胞を処理した結果を、図９Ｂはウラニン封入リポソームで細胞を処理した結果を示す（実施例４）。各図において、１は位相差顕微鏡で観察した細胞の画像、２は倒立型蛍光顕微鏡で観察したウラニン蛍光像、Merge（Ａのみ）は、１と２の画像を重ねたものである。黒矢印は、CEA陽性ヒト大腸癌細胞（Lovo細胞）、白矢印はヒト正常線維芽細胞（NB1RGB細胞）を示す。
【図１０】実施例５において、「5-FU担持-抗体結合CDC変異体」（１群：「＋HepG2,＋αCEA/Zcdc(ss)LIPO」を懸濁したPBS）、「5-FU担持-CDC変異体」（２群：「＋HepG2,＋Zcdc(ss)LIPO」を懸濁したPBS）、またはPBS（３群：「＋HepG2（control）」）を腹腔内投与した担癌ヌードマウス、並びにPBSを腹腔内投与した健常ヌードマウス（４群：「−HepG2（control）」）の生存率を経時的に測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
（Ｉ）コレステロール依存性細胞溶解毒素の変異体
本発明が対象とするコレステロール依存性細胞溶解毒素の変異体（CDC変異体）は、下記（1）〜（3）に示す領域を有するCDC変異体であって、細胞膜またはコレステロール含有リポソーム膜に対して結合性を有し、且つ還元条件下でSS結合が開裂して膜孔形成能を発揮することを特徴とする。
【００３３】
（1）抗体結合ドメイン、
（2）CDCのドメイン１〜３において、少なくとも２つの任意のアミノ酸残基がCys残基に置換されて、非還元条件下で互いにSS結合を形成してなる改変ドメイン１〜３、及び
（3）CDCのドメイン４において、すべてのCys残基が、Ala、Ser、Gly及びThrからなる群から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されてなる改変ドメイン４。
【００３４】
本発明においてCDC変異体の作製対象となるコレステロール依存性細胞溶解毒素（CDC）は、人間やそれ以外の哺乳類等の動物の細胞膜に結合する能力と当該結合した細胞膜に孔を形成する膜孔形成能を有し、その結果、細胞を死滅させる細菌由来の毒素である。制限されないものの、具体的には、豚レンサ球菌（Streptococcus suis）に由来するスイリシン（Suilysin：以下、「SLY」という）、アンギノーサス連鎖球菌の一種であるStreptococcus intermediusに由来するインターメディリシン（以下、単に「ILY」という）、Ａ群溶血性レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）に由来するストレプトリシンO（Streptolysin O：以下「SLO」という）、Streptococcus canisに由来するケイニリシン、Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilisに由来するイクイシミリシン、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）に由来するニューモリシン（以下、単に「PLY」という）、ウエルシュ菌（Clostridium perfringens）に由来するパーフリンゴリシンO、破傷風菌（Clostridium tetani）に由来するテタノリシンO、Streptococcus mitisに由来する三種のCDC:ミチリシン（以下、単に「MLY」という）/Streptococcus mitis由来ヒト血小板凝集因子（以下、単に「Sm-hPAF」という）/レクチノリシン（以下、単に「LLY」という）、Streptococcus pseudopneumoniaeに由来するシュードニューモリシン、Gardnerella vaginalisに由来するバジノリシン（以下、単に「VLY」という）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）に由来するリステリオリシンO、Listeria seeligeriに由来するセリゲリオリシンO、Listeria ivanoviiに由来するイバノリシンO、Bacillus alveiに由来するアルベオリシンO、炭疽菌（Bacilllus anthracis）に由来するアンスラリシンO、Arcanobacterium pyogenesに由来するピオリシンOなどを挙げることができる。好ましくは、SLY及びILY、より好ましくはSLYである。特にSLYは、他のCDC（例えば、ILY、Sm-hPAF、PLY、MLY、SLO、VLY）よりも大腸菌を用いた発現系での発現量が格段に多く（1Lの培養スケールでグラム単位に近い収量がある）、その変異体の発現量も多いため、安価に工業的生産が可能であるという利点がある。また、CDCとしてILYを用いる場合は、そのドメイン４を、コレステロールを直接認識して結合することのできる他のCDC（例えばSLY等）のドメイン４に置換して用いることが好ましい。一方、ILYのドメイン１〜３によれば、SLYのドメイン１〜３よりも弱い還元条件下でSS結合が開裂する、開裂性の高い改変ドメイン１〜３を調製することができる。その意味で、ILYは、本発明のCDC変異体の作製対象のCDCとして有効に利用することができる。
【００３５】
なお、これらのCDC、特にILY及びSLOの構造及び機能については、本発明者らによって既に発表されているので、これを参考にすることができる（非特許文献１、３〜８など参照）。
【００３６】
上記CDCのうちSm-hPAFとLLYはＮ末端にさらに追加ドメインを１つ有するものの、上記CDCはいずれも自己会合と膜貫通に関わるドメイン１〜３と、細胞膜との結合に関わるドメイン４（細胞膜結合ドメイン）の４つのドメインを有している。SLY成熟体の全長のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列をそれぞれ配列番号１及び２に、またその立体構造を図４のＡに示す。ここで、配列番号１に示すSLYのアミノ酸配列において、アミノ酸番号１-358番目の領域がドメイン１〜３：及びアミノ酸番号359-467番目の領域がドメイン４に相当する。
【００３７】
またILY成熟体の全長のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列をそれぞれ配列番号３及び４に、またその立体構造を図４のＢに示す。ここで、配列番号３に示すILYのアミノ酸配列において、アミノ酸番号１-385番目の領域がドメイン１〜３：及びアミノ酸番号386-499番目の領域がドメイン４に相当する。
【００３８】
本発明のCDC変異体は、非還元条件下でドメイン１〜３の立体構造が維持され、かつ固定されていることが好ましく、そのために、上記（2）に記載するように、当該ドメイン１〜３において、少なくとも２つの任意のアミノ酸残基がCys残基に置換されて、非還元条件下で互いにSS結合を形成している。Cys残基で置換されるアミノ酸残基の位置は、上記するようにSS結合を形成することで、非還元条件下ではドメイン１〜３の立体構造が維持され、かつ膜孔形成に伴う構造変化が阻害される位置であって、またCDCのドメイン４が有する膜結合性、及び還元条件下でのドメイン１〜３が有する膜孔形成能を損なわないものであれば、特に制限されない。好ましくは、ドメイン１〜３のいずれか一つのドメインに位置する任意の位置のアミノ酸残基と他のドメインに位置する任意の位置のアミノ酸残基がそれぞれCys残基に置換され、非還元条件下で、当該Cys残基同士がSS結合することにより、ドメイン１〜３の異なるドメイン同士が連結して立体構造が維持されてなる形態である。
【００３９】
Cys残基で置換されるアミノ酸残基の領域として、より具体的には下記に示す領域を例示することができる。
【００４０】
（１）ドメイン２とドメイン３の立体的に近接する領域にあるドメイン２及びドメイン３の各１アミノ酸残基を各々Cys 残基に変異させてSS 結合を導入する。例えばILY（配列番号３）の場合、ドメイン２のHis48-Glu51の領域内、Gln76-Thr82の領域内、またはIle369-Val380の領域内の1アミノ酸残基をCys残基で置換し、またドメイン３のGln181-Asp193の領域内またはVal208-Glu212の領域内の1アミノ酸残基をCys残基で置換してSS結合を形成させる。SLY（配列番号１）の場合では、ドメイン２のAsn20-Glu23の領域内、Lys48- Ser54の領域内、またはIle342-Ser353の領域内の1アミノ酸残基をCys残基で置換し、またドメイン３のTyr154-Ser166の領域内またはVal181-Glu185の領域内の1アミノ酸残基をCys残基で置換してSS結合を形成させる。
【００４１】
（２）ドメイン３に２つある膜貫入ループ形成部位がドメイン１と立体的に近接する領域の、前者及び後者の各１アミノ酸残基を各々Cys 残基に変異させてSS 結合を導入する。たとえばILY（配列番号３）の場合、ドメイン１のLeu85-Asp92の領域内、Leu108-Leu111の領域内、またはSer346-Ile354の領域内の1アミノ酸残基をCys残基で置換し、またドメイン３のPhe190-Gly198の領域内またはVal316-Gly322の領域内の1アミノ酸残基をCys残基で置換してSS結合を形成させる。SLY（配列番号１）の場合では、ドメイン１のIle57-Ala64の領域内、Leu80-Asn83の領域内、またはGly319-Ile327の領域内の1アミノ酸残基をCys残基で置換し、またドメイン３のPhe163-Ala171の領域内またはIle289-Gly295の領域内の1アミノ酸残基をCysで置換してSS結合を形成させる。
【００４２】
（３）ドメイン３に２つある膜貫入ループ形成部位がドメイン３の立体構造変化の少ない部位と立体的に近接する領域の、前者及び後者の各１アミノ酸残基を各々Cys 残基に変異させてSS 結合を導入する。たとえばILY（配列番号３）の場合、ドメイン３のIle332-Gly342の領域内の1アミノ酸残基をCys残基で置換し、またドメイン３のIle288-Lys293の領域内またはLeu307-Ile312の領域内の1アミノ酸残基をCys残基で置換してSS結合を形成させる。SLY（配列番号１）の場合では、ドメイン３のIle305-Gly315の領域内の1アミノ酸残基をCys残基で置換し、またドメイン３のPhe261-Lys266の領域内またはLeu280-Phe285の領域内の1アミノ酸残基をCys残基で置換してSS結合を形成させる。
【００４３】
（４）ドメイン３に２つある膜貫入ループ形成部位が相互に立体的に近接する領域の、各膜貫入ループ形成部位の１アミノ酸残基を各々Cys 残基に変異させてSS 結合を導入する。たとえばILY（配列番号３）の場合、ドメイン３のArg269-Lys293の領域内、Thr313-Val315の領域内、またはAla324-Val327の領域内の1アミノ酸残基をCys残基で置換し、ドメイン３のLys213-Gln222の領域内またはVal197-Val203の領域内の1アミノ酸残基をCys残基で置換してSS結合を形成させる。SLY（配列番号１）の場合では、ドメイン３のArg242-Lys266の領域内、Ser286-Tyr288の領域内またはAla297-Val300の領域内の1アミノ酸残基をCys残基で置換し、ドメイン３のLys186-Gln195の領域内またはIle170-Ile176の領域内の1アミノ酸残基をCys残基で置換してSS結合を形成させる。
【００４４】
（５）ドメイン３に２つある膜貫入ループ形成部位の、どちらか一方あるいは両方の内部に、立体構造変化によるループ伸展ができなくなるよう２箇所のアミノ酸残基を各々Cys 残基に変異させてSS 結合を導入する。たとえばILY（配列番号３）の場合、ドメイン３のIle288-Leu297の領域内とIle332-Gln340の領域内の各1アミノ酸残基を各々Cys残基で置換してSS結合を形成させるか、あるいはGln181-Phe190の領域内とGlu176-Ser179の領域内の各1アミノ酸残基を各々Cys残基で置換してSS結合を形成させる。SLY（配列番号１）の場合では、ドメイン３のPhe261-Ile270の領域内とIle305-Glu313の領域内の各1アミノ酸残基を各々Cys残基で置換してSS結合を形成させるか、あるいはTyr154-Phe163の領域内とAsp149-Met152の領域内の各1アミノ酸残基を各々Cys残基で置換してSS結合を形成させる。
【００４５】
より好ましくは、（１）の態様であり、図４Ａ及びＢの立体構造に示すように互いに隣接するドメイン２と３が、各ドメインにおいて置換された位置のCys残基間で、非還元条件下でSS結合が形成されることにより連結してなる形態である。
【００４６】
SS結合を形成する箇所は、１箇所以上であればよく、１箇所に限られないが、好ましくは１〜２箇所、より好ましくは１箇所である。
【００４７】
ドメイン１〜３の領域で形成されたSS結合は、非還元条件では安定に形成されているが、還元条件下では開裂する。かかる還元条件としては、細胞内のグルタチオンによる還元環境を挙げることができる。具体的には、例えば１〜１０ｍＭ、または２〜５ｍＭ等といった数ｍＭオーダーの還元型グルタチオンを含むファゴリソソーム内や細胞質内の環境を挙げることができる。
【００４８】
かかる還元条件に晒されると、ドメイン１〜３領域で形成されたSS結合が開裂して立体構造の拘束が解除されるため、立体構造が変化することで、ドメイン１〜３が本来有する膜孔形成能を発揮するようになる。
【００４９】
このように本発明のCDC変異体は、上記ドメイン１〜３領域で形成させたSS結合を、還元条件／非還元条件を利用することで、当該ドメイン１〜３の膜孔形成能をON／OFF制御するものである。このため、膜孔形成能のON／OFFに関係しないCDCのドメイン４領域は、上記（3）に記載するように、全てのCys残基がAla、Ser、Gly、及びThrからなる群から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されることにより、還元条件／非還元条件に関わらず安定化されていることが好ましい。これらAla、Ser、Gly、及びThrは、Cysに近い構造や類似する物性を持ち、自然酸化を受けにくいことを共通の特徴とするアミノ酸であり、任意に選択することができる。
【００５０】
例えば、SLYのドメイン４に位置する426番目のCys残基（配列番号１に示すアミノ酸配列中、426番目のCys残基）は、Ala残基で置換されていることが好ましい。
【００５１】
また本発明のCDC変異体において、抗体結合ドメインとは、抗原特異性の異なる抗体（IgG）を結合することができるドメインであり、具体的には、黄色ブドウ球菌プロテインＡの抗体結合性領域であるＺドメインを例示することができる。当該Ｚドメインのアミノ酸配列を配列番号６に示す。また、抗体結合ドメインとして、当該Ｚドメイン以外に、Ｇ群レンサ球菌種に由来するプロテインＧの抗体結合領域であるＢドメイン、その他のレンサ球菌種に由来する類似抗体結合タンパク質の抗体結合領域などを用いることもできる。
【００５２】
なお、抗体結合ドメインは、その抗体（IgG）結合性を損なわないことを限度に、その抗原性低下を図るためにアミノ酸置換を加えたり、精製の便宜のために、Ｎ末端側にHisタグ、FLAGタグ、mycタグ、抗原エピトープタグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼタグ、マルトース結合タンパク質タグ等のタグを有していても良い。かかるタグの一例として、配列番号１１に示すアミノ酸配列を有するヘキサHisタグを例示することができるが、これに限定されるものではない。
【００５３】
以上説明した本発明のCDC変異体は、(1)Ｎ末端にタグを有していてよい抗体結合ドメイン（以下、これを略称「Z」ともいう）、(2)CDCのドメイン１〜３の任意のアミノ酸残基がCys残基に置換されることによって、非還元条件下でSS結合を形成してなる改質ドメイン１〜３、及び(3)CDCのドメイン４の全Cys残基がAla、Ser、Gly及びThrからなる群から選択されるいずれかのアミノ酸残基（これらを総称して、アミノ酸の一文字表記に代えて「X」と標記する）に置換されてなる改質ドメイン４を有するため、便宜上「Z-CDC-SS(C/X)」（例えば、CDCがSLYの場合は「Z-SLY-SS(C/X)」、SLOの場合は「Z-SLO-SS(C/X)」など）と標記する。
【００５４】
なお、本発明のCDC変異体は、これら(1)、(2)、及び(3)ドメインの各ドメインをＮ末側から順に有しているものであり、本発明の機能を有する限り、これらのドメインがこの順序で直接連結されているものであってもよいし、また各ドメインの間に任意に１若しくは複数個のアミノ酸残基を有するものであってもよい。
【００５５】
Z-SLY-SS(C/X)の一例として、後述する実施例１で作製するZ-SLY-SS(C/A)（配列番号７、図５Ａ）を例に挙げることができる。当該Z-SLY-SS(C/A)のアミノ酸配列中、アミノ酸番号１〜９及び１０〜６７の領域がそれぞれヘキサＨｉｓタグ、及び黄色ブドウ球菌プロテインＡの抗体結合性領域（Ｚドメイン）に相当し、これらが抗体結合ドメインとして機能する。またZ-SLY-SS(C/A)のアミノ酸配列中、アミノ酸番号７０〜４２７及び４２８〜５３６の領域がそれぞれSLYのドメイン１〜３及びドメイン４に相当する。なお、上記抗体結合ドメインにおいて、ヘキサＨｉｓタグ領域（配列番号７中、アミノ酸番号１〜９の領域）は任意であり、黄色ブドウ球菌プロテインＡの抗体結合性領域（Ｚドメイン）（配列番号７中、アミノ酸番号１０〜６７の領域）だけでも抗体結合ドメインとして機能する。
【００５６】
かかるZ-CDC-SS(C/X)は、ドメイン１〜３領域とドメイン４が、いずれも同種のCDCに由来するものであってもよいが、異なるCDCに由来するものあってもよい。同種のCDCに由来するCDC変異体（Z-CDC-SS(C/X)）として、好ましくはドメイン１〜３領域とドメイン４が、いずれもSLYに由来するものであるCDC変異体（これを「Z-SLY-SS(C/X)」という。）を挙げることができる。また異種のCDCに由来するキメラCDC変異体（Z-cCDC-SS(C/X)）として、好ましくはドメイン１〜３領域がILYに由来し、ドメイン４がSLYに由来するものであるキメラCDC変異体（これを「Z-cSLY-SS(C/X)」という。）を挙げることができる。
【００５７】
Z-cSLY-SS(C/X)の一例として、後述する実施例１で作製するZ-cSLY-SS(C/A)（配列番号８、図５Ｂ）を例に挙げることができる。当該Z-cSLY-SS(C/A)のアミノ酸配列中、アミノ酸番号１〜９及び１０〜６７の領域がそれぞれヘキサＨｉｓタグ、及び黄色ブドウ球菌プロテインＡの抗体結合性領域（Ｚドメイン）に相当し、これらが抗体結合ドメインとして機能する。またZ-cSLY-SS(C/A)のアミノ酸配列中、アミノ酸番号７０〜４５４の領域がILYのドメイン１〜３に、またアミノ酸番号４５５〜５６３の領域がSLYのドメイン４に相当する。なお、上記抗体結合ドメインにおいて、ヘキサＨｉｓタグ領域（配列番号８中、アミノ酸番号１〜９）は任意であり、黄色ブドウ球菌プロテインＡの抗体結合性領域（Ｚドメイン）（配列番号８中、アミノ酸番号１０〜６７）だけでも抗体結合ドメインとして機能する。
【００５８】
（II）薬物運搬体
本発明の薬物運搬体は、Ｎ末端領域に抗体結合ドメインを有する上記本発明のCDC変異体（Z-CDC-SS(C/X)）に、その抗体結合ドメインを介して、細胞特異的抗体または組織特異的抗体が結合してなることを特徴とする。
【００５９】
細胞特異的抗体または組織特異的抗体としては、例えば、癌細胞または癌組織に特異的あるいは過剰量発現する蛋白質やオリゴ糖構造などの抗原を特異的に認識することのできる抗体、ウイルス感染細胞の細胞膜上に特異的に出現するウイルスタンパク質（抗原）を特異的に認識することのできる抗体、また免疫細胞の細胞表面に特異的に発現する各種のCD抗原などを特異的に認識することのできる抗体を挙げることができる。
【００６０】
好ましくは、癌細胞または癌組織に特異的に発現する抗原を認識するヒト型抗体である。ここでヒト型抗体としては、ヒト以外の動物型抗体の可変領域遺伝子をヒト型IgGの定常領域遺伝子とハイブリッドさせた抗体や、ヒト型抗体遺伝子を発現するトランスジェニック動物などで誘導し作製した抗体などを挙げることができる。
【００６１】
癌細胞または癌組織に特異的に発現する抗原としては、癌胎児性抗原（CEA）；並びに、例えば乳癌、唾液腺癌または卵巣癌などで発現しているHER2（非特許文献８及び９）；膵臓癌、胆道癌、喉頭癌、胃がんまたは大腸癌などで発現しているシアリルルイスＡ（CA19-9）（非特許文献１０）；胆管細胞癌などで発現しているHCA（非特許文献１１及び１２）；膵臓癌や乳癌などで発現しているMUC-1（非特許文献１３及び１４）などを例示することができる。
【００６２】
また、ウイルス感染細胞の細胞膜上に特異的に発現するウイルスタンパク質（抗原）としては、ＨＩＶやＣ型肝炎ウイルスなどのエンベロープウイルスのエンベロープタンパク質を挙げることができる。
【００６３】
本発明の薬物運搬体は、そのＣ末端側に、細胞膜またはコレステロールに結合性を有するCDC変異体のドメイン４（改変ドメイン４）を有しているため、当該ドメイン４に対して、細胞またはコレステロール（CHL）を含有するマイクロカプセルを結合させることができる。結合させる細胞としては、制限されないが、例えば細胞性医薬品として活性化した免疫細胞や所望な遺伝子を組み込んだ細胞を挙げることができる。またCHL含有マイクロカプセルとして、制限されないが、例えば所望の薬物を封入したマイクロカプセルを挙げることができる。ドメイン４を介してこれらの細胞やCHL含有マイクロカプセルを結合させた本発明の薬物運搬体によれば、標的細胞や組織に、所望な活性や遺伝子を有する細胞や薬物を運搬することができ、当該細胞や組織で、その細胞や薬物の機能を発揮させることができる。すなわち、本発明の薬物運搬体は、後述するドラッグデリバリーシステム（DDS）のツールである薬物運搬体として有用である。
【００６４】
例えば、癌細胞または癌組織に特異的に発現する蛋白質などの抗原を特異的に認識し結合する抗体を、抗体結合ドメインに結合させた本発明の薬物運搬体は、癌細胞または癌組織に指向性であり、これによれば、癌細胞または癌組織に対して選択的に致死性の抗癌剤を送達して死滅させたり、または癌細胞または癌組織に対して選択的に遺伝子治療剤を送達し、これを細胞内に取り込ませることにより、癌に関わるmRNA発現を抑制することができる。
【００６５】
また、ウイルス感染細胞の細胞膜上に特異的に発現するウイルスタンパク質を特異的に認識し結合する抗体を、抗体結合ドメインを介して結合させた本発明の薬物運搬体は、ウイルス感染細胞に指向性であり、これによれば、ウイルス感染細胞に対して選択的に致死性の薬剤を送達して死滅させたり、またはウイルス感染細胞に選択的に遺伝子治療剤を送達し、これを細胞内に取り込ませてウイルスタンパク質のmRNA発現を抑制したり、またゲノムに入ったウイルス遺伝子を破壊または不活性化することができる。
【００６６】
また免疫細胞の細胞表面に特異的に発現する各種のCD抗原を特異的に認識し結合する抗体を、抗体結合ドメインを介して結合させた本発明の薬物運搬体は、免疫細胞指向性であり、これによれば、各種の免疫細胞に対して選択的に所望の薬剤や遺伝子治療剤を送達することができる。
【００６７】
（III）ドラッグデリバリーシステム（DDS）
前述するように、本発明のDDSは、上記本発明の薬物運搬体を利用したものであり、当該薬物運搬体のCDC変異体のドメイン４に、薬効成分または生理活性物質（以下、これらを総称して単に「薬物」という）を封入したコレステロール含有マイクロカプセルや、または各種の有用な機能を有する細胞（機能性細胞）を結合させてなるものである。
【００６８】
コレステロール含有マイクロカプセルとしては、膜の構成成分としてコレステロールを含有するものであればよく、特に制限されないが、コレステロール含有リポソームを好適に例示することができる。CDC変異体のドメイン４が、マイクロカプセルに含まれているコレステロールを認識して結合するうえで、マイクロカプセル中に含まれるコレステロールの濃度としては、３０重量％以上が好ましい。制限はされないが、例えば３０〜６０重量％、より好ましくは４０〜５０重量％を例示することができる。
【００６９】
コレステロール含有マイクロカプセルに封入する薬物としては、特に制限はされないものの、生体内で抗癌作用、抗炎症作用、抗血管新生作用、抗菌作用、抗ウイルス作用、アポトーシス誘導作用、遺伝子発現抑制作用、遺伝子発現誘導作用などの薬効や生理活性を発揮する化合物、ペプチド、タンパク質（抗体を含む）、核酸（生理活性ペプチドやタンパク質をコードする遺伝子やこれを含むベクター、DNA/RNAハイブリッド若しくはキメラポリヌクレオチド、siRNA、アンチセンス核酸[RNA,DNA,PNA,これらの複合物を含む]、ドミナントネガティブ効果を有する物質）を例示することができる。
【００７０】
これらの薬物は、薬学上許容される担体や添加剤とともにコレステロール含有マイクロカプセルに封入されていてもよい。
【００７１】
上記機能性細胞としては、免疫活性が向上されてなる免疫細胞（ＮＫ細胞、マクロファージ等）、上記各種の化合物、ペプチド、タンパク質、あるいは核酸が導入されてなる細胞を例示することができる。
【００７２】
本発明のドラッグデリバリーシステムは、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、たとえば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる。
【００７３】
たとえば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。当該注射剤には点滴剤も含まれる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であることができる。好ましくは、非経口投与形態である。
【００７４】
本発明は、本発明のドラッグデリバリーシステムが、前記薬物を封入したマイクロカプセルや機能性細胞の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。ここで、有効量とは、対象疾患の発症を低減し、症状を軽減し、または進行を防止する量であり、好ましくは、対象疾患の発症を予防し、または対象疾患を治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。
【００７５】
本発明において投与するドラッグデリバリーシステムの具体的な用量は、処置を要する対象に関する種々の条件、たとえば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。投与頻度は、用いる薬物あるいは機能性細胞の性状や、上記のような対象の条件によって異なるが、たとえば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎など）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎など）であってもよい。
【００７６】
本発明のドラッグデリバリーシステムが対象とする被験者は、任意の生物個体であり、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトである。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、疾患の処置が企図される場合には、典型的には同疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。
【００７７】
なお、本発明が対象とするドラッグデリバリーシステムには、下記の態様のドラッグデリバリーシステムが含まれる。
【００７８】
（1）様々な癌細胞に特異的な細胞表面マーカー分子に対する抗体を連結させたCDS変異体（Z-CDC-SS（C/X））を、抗癌剤や癌細胞死誘導蛋白質/毒素（抗癌性薬剤）などを封入したリポソームに結合し、これを癌患者の血中や局所の癌組織に導入し、特異的に抗癌性薬剤を癌細胞に送達して効率的に治療を行うためのドラッグデリバリーシステム。
【００７９】
（2）ウイルス感染細胞でウイルス抗原を細胞膜に発現する細胞を標的とし、感染したウイルスの遺伝子発現を選択的に抑制するRNAi薬剤やウイルスゲノムを特異的に破壊あるいは不活性化するDNAやRNA断片及びそれらをコードしたベクターなどを封入したリポソームに、そのウイルス抗原特異的な抗体を連結した本発明のCDS変異体（Z-CDC-SS（C/X））を結合させ，感染患者の血中に導入してウイルス発現を効果的に抑制するためのドラッグデリバリーシステム。
【００８０】
（3）特定の原因蛋白質を発現することで疾病を発症した組織/臓器を構成する細胞を標的とし，その原因蛋白質遺伝子の発現を選択的に抑制するRNAi薬剤を封入したリポソームにその組織/臓器特異的な抗原を認識する抗体を連結したCDC変異体を結合させ，患者の血中や組織/臓器の局所に導入してその疾病を効果的に治療するためのドラッグデリバリーシステム。
【００８１】
（4）特定の原因蛋白質遺伝子が破損してそれが発現しないことによって疾病を発症した組織/臓器を構成する細胞を標的とし、その原因蛋白質の異常遺伝子を正常な遺伝子と置換するための遺伝子断片や正常なその原因蛋白質の発現ベクターなどの遺伝子治療剤を封入したリポソームにその組織/臓器特異的な抗原を認識する抗体を連結したCDC変異体を結合させ，患者の血中や組織/臓器の局所に導入して遺伝子修復あるいは遺伝子相補を行い，その疾病を効果的に治療するためのドラッグデリバリーシステム。
【００８２】
（5）特定の抗原を細胞表面に発現する細胞を標的として，特定の遺伝子を発現あるいは抑制するためのベクタープラスミド，遺伝子DNA断片，RNAi用のsiRNA，ペプチドや蛋白質，小分子性の薬剤などを封入したリポソームにその細胞表面抗原に対する抗体を連結したCDC変異体を結合させ，その細胞に作用させて封入物質を効果的に細胞内に導入するドラッグデリバリーシステム。
【実施例】
【００８３】
実施例１  CDC変異体（Z-CDC-SS）発現系の作製：
（１）CDC変異体の説明
コレステロール依存性細胞溶解毒素(以下、単に「CDC」という。)であるスイリシン（Suilysin：以下、単に「SLY」という。）とインターメディリシン（以下、単に「ILY」という）を対象として、下記の変異体を作製した。なお、SLYは、豚レンサ球菌（Streptococcus suis）が有するCDC であり、sly遺伝子によってコードされ、チオールにより活性化あるいは失活から保護される52kDaの膜孔形成タンパク質である。その成熟体全長のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。またILYは、アンギノーサス連鎖球菌の一種であるStreptococcus intermediusが持つCDC であり、ily遺伝子によってコードされる55kDaの膜孔形成タンパク質である。その成熟体全長のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列をそれぞれ配列番号３及び４に示す。これらSLY及びILYは、いずれも自己会合と膜貫通に関わるドメイン１〜３と細胞膜の結合に関わるドメイン４（細胞膜結合ドメイン）の４つのドメインを有している。【００８４】
（1-1）Z-SLY-SS（C/A）（図５Ａ、配列番号７）の説明
SLYのドメイン４に位置するCys残基（配列番号１：426番目）をAlaに置換（Cys426Ala）して安定性を向上させ、さらにドメイン２に位置するGly残基（配列番号１：22番目）とドメイン３に位置するSer残基（配列番号１：157番目）のそれぞれをCysに点変異（Gly22Cys、Ser157Cys）してSS結合を導入することで、ドメイン１〜３の立体構造変化を拘束して、SS結合を開裂する還元環境でのみ毒素活性が発揮できるように改良した（SLY-SS（C/A)の作製）。SLY-SS（C/A)の全長のアミノ酸配列を配列番号５に示す。【００８５】
そのＮ末端側にStaphylococcus aureusのプロテインＡの抗体結合ドメインであるＺドメイン（配列番号６）を融合した（Z-SLY-SS（C/A)の作製）。Z-SLY-SS（C/A)の全長のアミノ酸配列を図５のＡ、及び配列番号７に示す。【００８６】
（1-2）Z-cSLY-SS（C/A）（図５Ｂ、配列番号８）の説明
ILYのドメイン２にあるGly残基（配列番号３：50番目）とドメイン３にあるSer残基（配列番号３：184番目）のそれぞれをCysに点変異（Gly50Cys、Ser184Cys）してSS結合を導入することで、ILYのドメイン１〜３の立体構造変化を拘束して、SS結合を開裂する還元環境でのみ毒素活性が発揮できるように改良した（ILY-SSの作製）。【００８７】
（1-1）で説明したSLY-SS（C/A）のドメイン１〜３領域（配列番号５のアミノ酸番号１〜358の領域）を、上記で作製したILY-SSのドメイン１〜３領域で置換し、ILY-SSのドメイン１〜３領域とSLY-SS（C/A)のドメイン４を有するキメラCDC変異体（ 以下、これを「cSLY-SS(C/A)」という。)を作製した。次いで、そのＮ末端側にStaphylococcus aureusのプロテインＡの抗体結合ドメインであるＺドメイン（配列番号６）を融合した（Z-cSLY-SS（C/A)の作製）。Z-cSLY-SS（C/A)の全長のアミノ酸配列を図５のＢ、及び配列番号８に
示す。【００８８】
以下にこれらのCDC変異体（Z-SLY-SS（C/A)、Z-cSLY-SS（C/A)）の作製方法の詳細を説明する。【００８９】
（２）CDC変異体の作製方法
（2-1）Z-SLY-SS（C/A)の作製
Staphylococcus aureus IFO12732株の精製ゲノムDNAを鋳型とし、プロテインＡ内の抗体結合性を示すＺドメイン部分の遺伝子を次のプライマーセットを用いてPCR（98℃で10秒，55℃で5秒，72℃で15秒を35サイクル後，72℃で5分）で増幅した。【００９０】
＜プライマーセット＞
5'-GATAACAAATTCAACAAAGAACAAC-3'  ：配列番号９
5'-GCCTGCAGCTAGCAAGCTTTTGGTGCTTGTGCATC-3'  ：配列番号１０。【００９１】
次いで得られた増幅断片をPstIで切断して、pQE-1（Qiagen登録商標）プラスミドのPvuIIとPstI部位の間にDNA Ligation Kit (TaKaRa)を用いて16℃にて2時間連結反応を行い、ヘキサHisタグ（MKHHHHHHQ：配列番号１１）のC末端側に融合発現するようクローニングした。【００９２】
次に、Ｚドメイン遺伝子(配列番号１２)の3’末端側遺伝子端にBamHI部位を付加するため、このプラスミドを鋳型として、下記のプライマーセットを用いてPCR（98℃で10秒，55℃で5秒，72℃で15秒を35サイクル後，72℃で5分）で増幅し、得られた増幅断片をBamHIで切断した（Ｚドメイン遺伝子PCR断片のBamHI切断物の調製）。【００９３】
＜プライマーセット＞
5'-GATAACAAATTCAACAAAGAACAAC-3'  ：配列番号９
5'-GCGGATCCAGCTTTTGGTGCTTGTGC-3'  ：配列番号１３。【００９４】
予めpQE-1のBamHI/PstI部位にSLY-SS(C/A)遺伝子を挿入して作成していた発現プラスミドからBamHIとPstIで挿入部を切り出し精製し、これと前記のＺドメイン遺伝子PCR断片のBamHI切断物との連結反応を16℃にて2時間行い、この連結反応液を鋳型として、下記のプライマーセットを用いてPCR（98℃で10秒，55℃で5秒，72℃で15秒を35サイクル後，72℃で5分）増幅した。【００９５】
＜プライマーセット＞
5'-GATAACAAATTCAACAAAGAACAAC-3'  ：配列番号９
5'-CGCTGCAGTTACTCTATCACCTC-3'    ：配列番号１４。【００９６】
得られた断片をPstIで処理し、pQE-1ベクターをPvuIIとPstIで切断した箇所に挿入し連結した。これを用いてEscherichia coli DH5αZ1株（University of HeidelbergのBernd Bukau博士より恵与）を形質転換し、Ｎ末端側にＺドメインを融合したCDC変異体（Z-SLY-SS(C/A)）の発現株を得た。【００９７】
Z-SLY-SS(C/A)のアミノ酸配列（図５Ａ；配列番号７）をコードするZ-SLY-SS(C/A)発現系大腸菌をLB培地で大量（2L）に培養し、遠心分離して集菌した後、超音波破砕を行って菌体からCDC変異体（Z-SLY-SS(C/A)）の粗分画を得た。HisTrapHPカラムを装着したAKTAprime plus（GE healthcare）を用いてキレート親和性クロマトグラフィーにより、この粗分画からCDC変異体（Z-SLY-SS(C/A)）を精製し、その主分画をPBSに透析して精製標品（分子量：59.7kDa）を得た。この標品について、SDS-PAGE後にCBB染色することで純度を確認した（図６Ａ）。使用するまで-80℃にて凍結保存した。【００９８】
（2-2）Z-cSLY-SS（C/A）の作製
pQE-1ベクターのBamHI/PstI部位に、S. intermedius UNS46株（Bart’s and The London School of Medicine and DentistryのRobert A. Whiley博士より恵与）のily遺伝子から作成したILY-SSをクローニングしたプラスミドを鋳型とし、下記のプライマーセットを用いてPCRを行い、一端にBamHI認識切断部位を、また他端にSLYのドメイン４のN末端側の5アミノ酸残基をコードする15塩基を有するILY-SSのドメイン１〜３の遺伝子領域を増幅した。【００９９】
＜プライマーセット＞
5'-CGGGATCCGAAACACCTACCAAACC-3'：配列番号１５
5'-CAATGTCAATGCACTATCTTTATAGGATGTTAC-3'：配列番号１６。【０１００】
次に、予め作製しておいた、pQE-1のBamHI/PstI部位にSLY-SS(C/A)遺伝子を挿入してなる発現プラスミドを鋳型とし、下記のプライマーセットを用いてPCRを行い、一端にILYのドメイン1〜３のC末端側の5アミノ酸残基をコードする15塩基と、他端にPstI認識切断部位を有するSLY-SS(C/A)のドメイン４の遺伝子領域を増幅した。【０１０１】
＜プライマーセット＞
5'-ACATCCTATAAAGATAGTGCATTGACATTG-3'：配列番号１７
5'-CGCTGCAGTTACTCTATCACCTC-3'：配列番号１４。【０１０２】
この２つの増幅断片をアガロースゲル電気泳動で切り出し精製し、それを混合して下記に示すプライマーセットを用いて融合PCRを行い、末端にBamHIとPstIの認識切断部位を持ったILY-SSのドメイン１−３領域とSLY-SS(C/A)のドメイン４領域を融合したキメラCDC変異体（cSLY-SS（C/A））の遺伝子を得た。【０１０３】
＜プライマーセット＞
5'-CGGGATCCGAAACACCTACCAAACC-3'：配列番号１５
5'-CGCTGCAGTTACTCTATCACCTC-3'：配列番号１４。【０１０４】
次いでキメラCDC変異体（cSLY-SS（C/A））遺伝子断片をBamHIとPstIで切断し、このcSLY-SS（C/A）遺伝子断片を、先に調製したZ-SLY-SS(C/A)発現プラスミドのBamHI/PstI部位に置換することで挿入し，このプラスミドで大腸菌を形質転換させてキメラCDC変異体（Z-cSLY-SS（C/A））の発現系を樹立した。  【０１０５】
キメラCDC変異体（Z-cSLY-SS（C/A））のアミノ酸配列（図５Ｂ；配列番号８）をコードするZ-cSLY-SS(C/A)発現系大腸菌をLB培地で大量（2L）に培養し、遠心分離して集菌した後、超音波破砕を行って菌体からキメラCDC変異体（Z-cSLY-SS(C/A)）の粗分画を得た。HisTrapHPカラムを装着したAKTAprime plus（GE healthcare）を用いてキレート親和性クロマトグラフィーにより、この粗分画から精製を行い、その主分画をPBSに透析して精製標品（分子量：62.5kDa）を得た。この標品について、SDS-PAGE後にCBB染色することにより、その純度を確認した（図６Ｂ）。使用するまで-80℃にて凍結保存した。【０１０６】
実施例２  CDC変異体（Z-CDC-SS）の機能評価  −  Z-CDC-SSの膜孔形成活性：  
実施例１で作製したCDC変異体（Z-SLY-SS（C/A)、Z-cSLY-SS（C/A)）の膜孔形成活性を、ヒト赤血球に対する溶血活性を測定することで評価した。【０１０７】
健常人ボランティアから得た血液を遠心して調製した赤血球を、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄した後、赤血球を25％含むPBS懸濁液とした。反応液（PBS）中での赤血球濃度が0.5％になるようにその赤血球懸濁液を加え、そこにそれぞれのCDC変異体を加えて37℃で1時間反応させた。その際、分子内SS結合の開裂時と未開裂時における溶血活性の違いを見るために、10mMのジチオスレイトール（DTT）共存条件下（還元条件下）とDTT非共存条件下（非還元条件下）の２通りの条件下で実験を行った。その後、遠心し、得られた上清を96穴マイクロプレートウエルに200μl分注して、その540nmの吸光度をマイクロプレートリーダー（Bio-Rad Model550）で測定した。PBSで赤血球を処理したときの測定値を溶血活性０％（陰性コントロール）、精製水で赤血球を処理したときの測定値を溶血活性100％（陽性コントロール）として、各CDC変異体の溶血活性、つまり膜孔形成活性を算出した。【０１０８】
Z-SLY-SS(C/A)及びZ-cSLY-SS(C/A)が、それぞれ、DTT共存条件下（還元条件下：―●―）及びDTT非共存条件下（非還元条件下：―□―）で示す溶血活性を図７のＡ及びＢに示す。【０１０９】
図７に示すように、実施例１で作製した２種類のCDC変異体（Z-SLY-SS（C/A）、Z-cSLY-SS（C/A））は、分子内のSS結合の開裂が起こらない非還元条件下では全く溶血活性（膜孔形成活性）を示さず、SS結合が開裂する還元条件下でのみ溶血活性（膜孔形成活性）を示した。しかも、50％溶血活性を示す各毒素濃度は、Z-SLY-SS(C/A)変異体は1.7ng/ml、Z-cSLY-SS(C/A)変異体は12.4ng/mlであり、このことからいずれのCDC変異体も極めて低い濃度で膜孔を形成することが判明した。【０１１０】
以上のことから、本発明のCDC変異体は、SS結合を開裂する還元条件によって、細胞膜またはコレステロールを含む膜に選択的に膜孔を形成して、内部に含む物質を放出（溶出）できることが確認された。    【０１１１】
実施例３  CDC変異体（Z-CDC-SS）の機能評価  −  Z-CDC-SSの抗体結合活性：  
Ｚドメインを持つCDC変異体（Z-SLY-SS(C/A)及びZ-cSLY-SS(C/A)）のIgG結合活性を、次のようにして評価した。【０１１２】
まず、96穴のマイクロプレート（ELISAプレート，IWAKI）の各穴に、健常人ボランティアの正常血清またはウサギの正常血清から精製したIgGを1μgずつ乾燥固定し、1％ウシ血清アルブミンを含むPBS（ブロッキング液）で30分ブロッキングした。次いで、ブロッキング液で調製した各CDC変異体（Z-SLY-SS(C/A)、Z-cSLY-SS(C/A)）、または抗体と親和性を持たない20アミノ酸残基（配列番号１８）からなるLTBPペプチドで、各CDC変異体（Z-SLY-SS(C/A)、Z-cSLY-SS(C/A)）のＺドメイン（配列番号６）を置換したＺドメイン欠失体（LTBP-SLY-SS(C/A)、LTBP-cSLY-SS(C/A)）の各希釈列と1時間反応させてPBSで6回洗浄後、抗SLYマウス単クローン抗体（精製SLYを抗原に用い、Balb/cマウスにて自作したIgG1抗体であり、SLYのドメイン４をエピトープとする）を含むハイブリドーマ培養液と1時間反応させた。PBSで6回洗浄を行った後、ブロッキング液で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識化-抗マウスIgGヤギ抗体（Kirkegaard & Perry Laboratories社から入手）と1時間反応させた。反応後、再び、PBSで6回洗浄を行った。最後に、各穴に2 mMの2,2’-アジノ-ジ-(3-エチル-ベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)(ABTS)と0.002％過酸化水素を含む50mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)からなるHRP基質液を分注して、一定時間反応させた後に、415nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。【０１１３】
結果を図８に示す。図８のＡの左図及び右図は、Ｚドメインを有するZ-SLY-SS(C/A)（―●―）とＺドメインを欠失したLTBP-SLY-SS(C/A)（―□―）について、それぞれヒトIgG及びウサギIgGとの結合活性を示した結果を示す。図８のＢの左図及び右図は、Ｚドメインを有するZ-cSLY-SS(C/A)（―●―）とＺドメインを欠失したLTBP-cSLY-SS(C/A)（―□―）について、それぞれヒトIgG及びウサギIgGとの結合活性を示した結果を示す。【０１１４】
これから分かるように、Ｚドメインを有する本発明のCDC変異体（Z-SLY-SS(C/A) 及びZ-cSLY-SS(C/A)）はいずれも濃度依存的にIgG結合活性を示したが、それらからＺドメインを除去したＺドメイン欠失体（LTBP-SLY-SS(C/A)及びLTBP-cSLY-SS(C/A)）はいずれもIgG結合活性が消失していた。このことから、実施例１で作製した本発明のCDC変異体（Z-SLY-SS(C/A)及びZ-cSLY-SS(C/A)）は、そのＺドメインを介してウサギやヒトの抗体（IgG）に結合する活性を保持していることが確認された。【０１１５】
実施例４  Z-cSLY-SS(C/A)と抗CEA抗体を用いたCEA陽性癌細胞へのリポソームの標的化：
（１）薬剤封入リポソーム（模擬リポソーム）の作製
ドラッグデリバリーシステム（DDS）の可視化モデルを構築するために、標的部位に送達する薬剤封入リポソーム（模擬リポソーム）として、10mMの蛍光色素ウラニン（フルオレセインNa）を封入した1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン(以下、「DPPC」という)/コレステロール（1:1）リポソームを調製した。【０１１６】
具体的には、定法により、DPPCとコレステロールを１：１（重量比）の割合でクロロホルムに溶解してナス型フラスコに減圧コートし乾燥させたところに、10mMウラニンを含むPBSを加えて超音波水槽中で60℃にて超音波処理してベジクルを作成した。これを液体窒素と60℃恒温槽を使って凍結融解を5回繰り返し、さらにMini-extruder（Avanti）を用いて孔径100nmのメンブランフィルターに21回通液し、ULMリポソームを作成した。【０１１７】
これをSephadexG50ゲルろ過カラムに通して、未封入のウラニンを含まないウラニン封入リポソーム分画を回収した。また必要に応じて、超遠心処理で濃縮を行い、4℃で保存して使用した。【０１１８】
斯くして調製したウラニン封入リポソーム分画と本発明のCDC変異体（Z-SLY-SS(C/A)またはZ-cSLY-SS(C/A)）との結合性を確認するため、一定量の各CDC変異体（Z-SLY-SS(C/A)、Z-cSLY-SS(C/A)）と上記ウラニン封入リポソームとを反応させた後、超遠心分離して、回収した上清中の溶血活性を測定した。また陽性コントロールとして、一定量の各CDC変異体（Z-SLY-SS(C/A)、Z-cSLY-SS(C/A)）に上記ウラニン封入リポソームを添加しないで反応させた後、超遠心分離して、回収した上清中の溶血活性を測定した。なお、溶血活性の測定は、実施例２に記載する方法に従って、10mMのDTT還元条件下で行った。【０１１９】
その結果、ウラニン封入リポソームを反応させた後、回収した上清中の溶血活性は、ウラニン封入リポソームを反応させないで回収した上清の溶血活性の１％未満であり、このことから、本発明のCDC変異体（Z-SLY-SS(C/A)、Z-cSLY-SS(C/A)）はいずれもその99％以上がウラニン封入リポソームと結合することが判明した。【０１２０】
（２）ドラッグデリバリーシステムの作製とその評価
上記ウラニン封入リポソームを薬剤封入リポソーム（模擬リポソーム）として用いて、ドラッグデリバリーシステムを作製した。【０１２１】
具体的にはウラニン封入リポソーム分画と各CDC変異体（Z-SLY-SS(C/A)、Z-cSLY-SS(C/A)）を、リポソーム中のDPPCに対するモル比が400:1（DPPC:CDC変異体）となる割合で混合し、25℃にて30分間反応させ、CDC変異体とウラニン封入リポソームとを結合させた。これを癌胎児性抗原であるCEAに対する抗体（抗CEAウサギIgG抗体（ABBIOTEC社））（以下、「抗CEA抗体」という）と反応させ、洗浄した後、上清を10％ウシ胎児血清含有DMEM培地に置換し、同濃度になるように再懸濁して、抗CEA抗体を結合したドラッグデリバリーシステムを作製した（抗CEA抗体−[Z-SLY-SS(C/A)]−ウラニン封入リポソーム、抗CEA抗体−[Z-cSLY-SS(C/A)]−ウラニン封入リポソーム）。【０１２２】
これを、コラーゲンコートしたカバーグラス上で、CEAを発現しているCEA陽性ヒト大腸癌細胞（Lovo細胞）と、対照細胞としてヒト正常線維芽細胞（NB1RGB細胞）とを混合培養した細胞の上に加えて、37℃で炭酸ガス培養器中にて2時間反応させた。なお，コントロールとして、Z-SLY-SS(C/A)とZ-cSLY-SS(C/A)のいずれも結合させていないリポソーム分画（ウラニン封入リポソーム分画）を同濃度になるよう調製したものも、同様に反応させて、以下の操作を行った。【０１２３】
反応後、上清を取り除いて血清を含まないDMEM培地で3回洗浄し、倒立型蛍光顕微鏡IX71（Olympus）で観察した。【０１２４】
代表例として、抗CEA抗体−[Z-cSLY-SS(C/A)]−ウラニン封入リポソームとコントロールについて得られた結果を図９に示す。図９Ａは抗CEA抗体−[Z-cSLY-SS(C/A)]−ウラニン封入リポソームで細胞を処理した結果を、図９Ｂはウラニン封入リポソームで細胞を処理した結果を示す。各図において、１は位相差顕微鏡で観察した細胞の画像、２は倒立型蛍光顕微鏡で観察したウラニン蛍光像、Merge（Ａのみ）は、１と２の画像を重ねたものである。黒矢印は、CEA陽性ヒト大腸癌細胞（Lovo細胞）、白矢印はヒト正常線維芽細胞（NB1RGB細胞）を示す。【０１２５】
この図からわかるように、抗CEA抗体−[Z-cSLY-SS(C/A)]−ウラニン封入リポソームは、正常細胞とCEA陽性細胞（Lovo細胞）が混在する中でも、CEA陽性細胞を標的にして特異的に結合する様相が観察された。また、細胞表面にリポソームが留まっている細胞もあるが、一部の細胞においては細胞内に、ウラニンの蛍光色素が取り込まれ、拡散している像が見られた。一方、CDC変異体を結合していないリポソームは、どちらの細胞（正常細胞とCEA陽性細胞（Lovo細胞））に対してもほとんど親和性を示さず、洗浄操作で容易に除去されることが確認された。  【０１２６】
このことから、実施例１で作製した本発明のCDC変異体（Z-SLY-SS(C/A)、Z-cSLY-SS(C/A)）を運搬体とするドラッグデリバリーシステムによれば、目的の薬物を封入したリポソームを、ターゲティング部に結合させた抗体の特異性に基づいて標的細胞に送達することができ、且つ、当該標的細胞に到達後、当該標的細胞内にリポソーム内の薬物を取り込ませ、薬物を作用させることができることが確認された。【０１２７】
以上のことから、実施例１で作製した本発明のCDC変異体（Z-SLY-SS(C/A)、Z-cSLY-SS(C/A)）は抗体を結合させることで、薬物などの所望の物質を封入した直径10nmから300nmサイズのコレステロール含有リポソーム、好ましくは30nmから100nmサイズのリポソームを、標的細胞に送達し、且つ当該細胞に取り込ませることができるDDS運搬体（薬物運搬体）として有用であることが確認された。【０１２８】
実施例５  担癌ヌードマウスに対するDDS送達及び抗癌作用の評価
１．薬剤封入リポソームの調製
送達する薬剤として5mMの5-フルオロウラシル（5-FU）を用い、また、リポソーム密封性を評価するための可視化剤として、10mMの蛍光色素ウラニン（フルオレセインNa）を用いて、Dipalmitoylphosphatidylcholine（DPPC）/コレステロール（1:1）リポソームをバンガム法で調製した。【０１２９】
具体的には、定法により，10μmolのDPPCと10μmolのコレステロールをクロロホルムに溶解してナス型フラスコに減圧コートし乾燥させたところに、5mMの5-FUと10mMのウラニンを含む1mlのリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）を加えて超音波水槽中で60℃にて超音波処理してベジクルを作成した。これを液体窒素と60℃恒温槽を使って凍結融解を5回繰り返し、さらにMini-extruder（Aventi）を用いて100nmメンブランフィルターを通してULMリポソームを作成した。これをSephadexG50ゲルろ過カラムに通して、未封入のウラニンを含まないウラニン封入リポソーム分画を回収した。斯くして調製したリポソームを薬剤（5-FU）封入リポソームとして、下記の実験に使用した。【０１３０】
なお、使用時のリポソームのリン脂質濃度を、リン脂質定量キット（リン脂質C-テストワコー）を用いて測定したところ、リポソームのリン脂質濃度は25μMであった。【０１３１】
２．DDS（薬剤担持−抗体結合CDC変異体）の調製
上記で調製した5-FU含有リポソーム（75nmolのDPPC相当）を、36μgのCDC変異体（Z-cSLY-SS(C/A)）と、25℃にて１時間処理して結合させた。次いで、これを10 mMのコレステロール含有PBSで処理して，含まれる可能性がある未結合のZ-cSLY-SS(C/A)のコレステロール結合ドメインをマスクする中和処理を施した。また、これに36μgの抗-癌胎児性抗原（CEA）抗体(IgG)を反応させ、CDC変異体に抗体を連結し、薬剤として5-FUを担持した抗体結合CDC変異体（5-FU担持-抗体結合CDC変異体）を調製した。これをDDSとして、下記の動物実験に使用した。【０１３２】
また比較実験用に、上記で調製した5-FU含有リポソーム（75nmolのDPPC相当）を、36μgのCDC変異体（Z-cSLY-SS(C/A)）と25℃にて１時間処理して結合させて、抗体を結合させていない「5-FU担持-CDC変異体」を作製し、下記の動物実験に使用した。【０１３３】
３  担癌ヌードマウスへのDDS投与と抗癌作用の評価
ヌードマウスとしてBalb/cSlc-nu/nuマウス（雄，11週齢）を使用し、ランダムに４群（各群５匹）に分別した。これらの群のうち、１〜３群のマウスの腹腔内に、1.0x106個のCEA陽性のヒト肝癌細胞HepG2をペニシリン/ストレプトマイシン含有DMEM培地1mlに懸濁したものを移植した。その翌日に、各群のマウスに下記のPBS懸濁液またはPBSを腹腔内投与した。
（１）１群：上記で調製した「5-FU担持-抗体結合CDC変異体」をPBSに懸濁させたPBS懸濁液0.1ml（図１０中では、+HepG2, +αCEA/Zcdc(ss)LIPOと表示）
（２）２群：上記で調製した「5-FU担持-CDC変異体」をPBSに懸濁させたPBS懸濁液0.1ml（図１０中では、+HepG2, +Zcdc(ss)LIPOと表示）
（３）３群：PBS  0.1ml（図１０中では、+HepG2と表示）。
を腹腔内投与した。【０１３４】
なお、４群のマウスは、コントロール群として、ヒト肝癌細胞HepG2を移植せず、他群のマウスに上記PBS懸濁液またはPBSを投与する際に、同時にPBS  0.1mlのみを投与した（図１０中では、-HepG2 (control)と表示）。【０１３５】
当該PBS懸濁液またはPBS投与（初回投与）の30日後に、各群のマウスに同様のPBS懸濁液またはPBSを腹腔内投与した。但し、この際、１群及び２群に投与した「5-FU担持-抗体結合CDC変異体」及び「5-FU担持-CDC変異体」は、いずれも初回で投与したリポソーム量（5-FU量）は同じだが、CDC変異体（Z-cSLY-SS(C/A)）及び抗CEA抗体(IgG)量はいずれも2/3量に減量させたものである。【０１３６】
その後、各群のマウスを個別に体重測定と状況観察を行いつつ，その生死を観察した。【０１３７】
図１０に、各群の生存率を経時的に示す。この結果から、DDS処理しなかった担癌マウス（３群）の100日目の生存率は２０％であったのに対して、「5-FU担持-CDC変異体」を投与した担癌マウス（２群）の100日目の生存率は４０％、「5-FU担持-抗体結合CDC変異体」を投与した担癌マウス（１群）の100日目の生存率は８０％と、本件発明のDDSを投与することで、生存率が格段に上がることが確認された。これから、本件発明のDDS（薬物担持-抗体結合CDC変異体）は、標的細胞に選択的に移行送達され、当該部位で有効に薬効を発揮していると考えられる。【０１３８】
つまり、本発明のCDC変異体は、所望の抗体及び薬物を結合させることで、所望の標的細胞に当該薬物を選択的且つ効果的に運搬し、当該細胞内で効果的に薬効を発揮することができることが確認された。
【配列表フリーテキスト】
【０１３９】
配列番号７は、Z-SLY-SS(C/X)の一例として、実施例１で作製したZ-SLY-SS(C/A)（図５Ａ）のアミノ酸配列を示す。配列番号８は、Z-cSLY-SS(C/X)の一例として、実施例１で作製したZ-cSLY-SS(C/A)（図５Ｂ）のアミノ酸配列を示す。配列番号９、１０及び１３〜１７はプライマーの塩基配列、配列番号１１はヘキサHisタグのアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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