(57)【要約】  本発明は、水混和性有機溶媒中に、リン脂質とコレステロールとの合計濃度が１００〜２００ｗ／ｖ％含有される水混和性有機溶液、容積１に対して、第１水相溶液を容積比３／１〜１２／１で混合し、混合相におけるリン脂質とコレステロールとの合計濃度が１５〜５０ｗ／ｖ％であるエマルジョンを得て、前記エマルジョンを第２水相溶液で外液置換して得られるリポソーム組成物で、前記第１水相溶液よりなるリポソーム膜の内部領域水相と前記第２水相溶液よりなるリポソーム膜の外部領域水相との間にイオン勾配が形成されたリポソーム組成物であり、高封入量で薬物を導入することができるリポソーム組成物と、臨床上十分な有効濃度を維持した持続徐放性を有する、皮下投与等に適したリポソーム製剤とを提供する。
2012133121.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水混和性有機溶媒中に、リン脂質とコレステロールとの合計濃度が１００〜２００ｗ／ｖ％含有される水混和性有機溶液、容積１に対して、第１水相溶液を容積比３／１〜１２／１で混合し、混合相におけるリン脂質とコレステロールとの合計濃度が１５〜５０ｗ／ｖ％であるエマルジョンを得て、前記エマルジョンを第２水相溶液で外液置換して得られるリポソーム組成物で、前記第１水相溶液よりなるリポソーム膜の内部領域水相と前記第２水相溶液よりなるリポソーム膜の外部領域水相との間にイオン勾配が形成されたリポソーム組成物。
【請求項２】
前記イオン勾配は、ｐＨプロトン勾配であり、リポソームの内部領域水相のｐＨがリポソームの外部領域水相のｐＨよりも低いｐＨ勾配をもつ請求項１に記載のリポソーム組成物。
【請求項３】
前記リポソームが、最外径が２．５μｍ以上の平均粒子径と１２重以上の多層膜中に前記内部領域水相を有する請求項１または２に記載のリポソーム組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のリポソーム組成物の内部領域水相にイオン勾配を用いて薬物が導入されたリポソーム製剤であって、該薬物を０．０８（ｍｏｌ）／総脂質（ｍｏｌ）以上でリポソーム内に保持しているリポソーム製剤。
【請求項５】
前記リポソーム製剤が、その内部領域に封入された薬物の血中有効濃度が少なくとも４日以上維持する全身性徐放性を有するか、またはその内部領域に封入された薬物の局所有効濃度が少なくとも４日以上維持する局所性徐放性を有する、請求項４に記載のリポソーム製剤。
【請求項６】
前記薬物が、両親媒性弱塩基性化合物である請求項４または５に記載のリポソーム製剤。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれかに記載の前記リポソーム製剤および２７〜３３ゲージの少なくとも一つのゲージサイズの注射針を含む持続徐放製剤用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬物などの有効成分を含有する持続徐放性リポソーム組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、高齢化社会が進むにつれ、認知症や脳疾患、パーキンソン病などの介護者を必要とする患者さんが増えている。このような患者さんは、薬を飲むこと自体を忘れたり、嚥下困難に伴い薬を飲みこむことが困難だったりと、自分自身で薬を飲むことを管理することが難しく、経口投与以外の投与方法が求められている。また、抗精神病の患者さんなどは、薬が切れてしまうと直ちに症状があらわれて生活に支障をきたすため、薬の効果が切れる前に、１日に何度も投与しなければならず、頻回投与は、患者さんにとって大きな負担となっている。これらのことから、持続徐放製剤は、あらゆる疾患領域において非常に望まれている製剤である。【０００３】
皮下投与製剤もしくは筋肉内投与製剤としてこれまでに検討されている徐放製剤の多くは、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を用いたマイクロスフェアである。例えば、ＰＬＧＡの架橋マトリックス中に抗癌剤リュープロレリンを封入したマイクロカプセル製剤Ｌｅｕｐｒｉｎ（登録商標）がある。これらのＰＬＧＡを用いたマイクロスフェアは、投与後すぐに薬物が放出することが知られており（初期バースト）、直ちに有効濃度以上に血中濃度が上昇するため、副作用が懸念される。また、ＰＬＧＡを用いる場合、薬物を高効率で高濃度に封入することは難しく、一方、臨床では投与可能な投与量に限界があるため、薬物封入量の改善も未だ課題が残る。さらに、ＰＬＧＡを用いる場合、調製工程に有機溶媒を用いるため、製剤からの有機溶媒の除去が必須となり、工業スケールでの製造では困難な場合が多い。加えて、ＰＬＧＡを用いると、加水分解とともに局所的に酸が強まるため、投与部位において炎症が起こることも大きな問題とされている。【０００４】
その他、多層膜リポソームにリモートローディング法によりブピバカインを内封したアプローチもなされているが、該文献では、粒子径と徐放性の関係は追求しておらず、徐放製剤において最適な粒子径の知見は得られていない。また、開示されている徐放時間も、臨床上、十分な持続時間とは言えない（Anesthesiology 101(2004)133-137、International Society for Anaesthetic Pharmacology 110(2004)1018-1023）。さらに、特表２００１−５２２８７０に記載の多胞状リポソーム（ＭＶＬ）は、局所または全身的薬物送達のための脂質ベースの徐放性薬物担体として開発されているが、これに関しても未だ薬物封入量および徐放時間において十分とは言えず、課題が残されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、臨床上、必要とされる薬物量を低容量で投与することができ、さらに有効な薬物血中濃度を長期にわたり安定に持続することのできる持続徐放性を有するリポソーム製剤を得ることができるリポソーム組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、１２重以上の多層膜中に均一の内水相を有し、かつリポソーム（以下、空のリポソームということがある）の内／外水相との間にイオン勾配を形成したリポソーム組成物に、薬剤を封入すれば持続徐放性を有するリポソーム製剤が得られることを知見して本発明に至った。【０００７】
上記課題は以下の本発明によって解決される。
（１）水混和性有機溶媒中に、リン脂質とコレステロールとの合計濃度が１００〜２００ｗ／ｖ％含有される水混和性有機溶液、容積１に対して、第１水相溶液を容積比３／１〜１２／１で混合し、混合相におけるリン脂質とコレステロールとの合計濃度が１５〜５０ｗ／ｖ％であるエマルジョンを得て、前記エマルジョンを第２水相溶液で外液置換して得られるリポソーム組成物で、前記第１水相溶液よりなるリポソーム膜の内部領域水相と前記第２水相溶液よりなるリポソーム膜の外部領域水相との間にイオン勾配が形成されたリポソーム組成物。
（２）前記イオン勾配は、ｐＨプロトン勾配であり、リポソームの内部領域水相（以下、内水相ということがある）のｐＨがリポソームの外部領域水相（以下、外水相ということがある）のｐＨよりも低いｐＨ勾配をもつ（１）に記載のリポソーム組成物。
（３）前記リポソームが、最外径が２．５μm以上の平均粒子径と１２重以上の多層膜中に前記内部領域水相を有する（１）または（２）に記載のリポソーム組成物。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のリポソーム組成物の内部領域水相にイオン勾配を用いて薬物が導入されたリポソーム製剤であって、該薬物を０．０８（ｍｏｌ）／総脂質（ｍｏｌ）以上でリポソーム内に保持しているリポソーム製剤。
（５）前記リポソーム製剤が、その内部領域に封入された薬物の血中有効濃度が少なくとも４日以上維持する全身性徐放性を有するか、またはその内部領域に封入された薬物の局所有効濃度が少なくとも４日以上維持する局所性徐放性を有する、（４）に記載のリポソーム製剤。
（６）前記薬物が、両親媒性弱塩基性化合物である（４）または（５）に記載のリポソーム製剤。
（７）上記（４）〜（６）のいずれかに記載の前記リポソーム製剤および２７〜３３ゲージの少なくとも一つのゲージサイズの注射針を含む持続徐放製剤用キット。【０００８】
本発明のリポソーム組成物は、リポソーム組成物中に本発明のリポソーム以外のリポソームを含んでもよく、本発明のリポソーム以外のリポソームは単膜小リポソーム、多小胞リポソーム等がある。本発明のリポソームが前リポソーム中の５０質量％以上であることが好ましく，６０質量％以上であることがより好ましく、８０質量％以上であることがさらに好ましい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のリポソーム組成物は、特定の総脂質濃度のときに薬物を高効率で封入することができ、高い薬物濃度のリポソーム製剤が得られる。また、多層膜中に前記内部領域水相を有する本発明のリポソーム組成物は、薬剤を封入してリポソーム製剤とすると、臨床上、有効な血中濃度を、初期バーストなく長期にわたり安定に持続放出することが可能であり、副作用の懸念も回避され、かつ投与回数も軽減できるため、非常に有用なリポソーム製剤である。さらに、本発明のリポソーム製剤によれば、必要な薬物量を低容量で投与することが可能であり、皮下もしくは筋肉内投与製剤は、一般的に１９〜２１ゲージの太い針で投与しなければならないのに比べて、本発明によるリポソーム製剤は、ゲージ数の高い小径の針でも投与可能であり、患者さんのＱＯＬを大きく向上できる有用なリポソーム製剤である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、調製例２で得られたドネペジルリポソーム製剤の凍結割断レプリカ電子顕微鏡観察写真を示す図である。図１ａは、リポソーム製剤の最外表面に近いところでの分割図。図１ｂは、ほぼ中央での分割図である。
【図２】図２は、平均粒子径と膜枚数（ラメラリティー）の関係を示すグラフである。
【図３】図３は、異なる粒子径を有するリポソーム製剤からの放出特性（硫酸アンモニウムを用いたin vitro放出試験法での測定結果）を示すグラフである。
【図４】図４は、粒子径と薬物放出速度の関係を示すグラフである。
【図５】図５は、ドネペジル単体およびリポソーム製剤の皮下投与における血中塩酸ドネペジル濃度を示すグラフである。
【図６】図６は、筋肉内投与における塩酸ブピバカイン単体およびリポソーム製剤の投与部位における塩酸ブピバカイン残存率（質量％）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のリポソームは、特定の粒子径（リポソーム粒子の最外径）を有する複数の脂質二重層からなり、内部に１つの内水相を有している。本発明のリポソームの平均粒子径は好ましくは２．５μｍ〜１２μｍである。より好ましくは３．７μｍ〜１０μｍであり、さらに好ましくは５μｍ〜１０μｍ、特に好ましくは６μｍ〜１０μｍである。本発明のリポソームは、好ましくは平均粒子径２．５μｍ以上である。本発明のリポソームの粒子径は、粒度分布計（例えば、光散乱回折式粒度分布計、例えばベックマンコールターＬＳ２３０）を用いることにより、平均粒子径（平均最外径）として測定することができる。
【００１２】
本発明のリポソームは壁が脂質二重層から構成されている。一つの脂質二重膜から一つの層構造（ラメラリティ）が構成されているとすると、本発明のリポソームは特定の数の層構造により壁としての外殻が構成されている。特に本発明のリポソームは１２層〜３５層（１２重〜３５重）の層構造（該層構造を有するときの（平均粒子径）は、２．５μｍ〜１２μｍ）を有する。好ましくは１４層〜２７層（１４重〜２７重）の層構造（該層構造を有するときの外径（平均粒子径）は、３．７μｍ〜１０μｍ）を有する。これらの層構造は内側と外側に隣接する層構造がほぼ接触して存在しており、それらの間にはほんの少量の水が存在する。層構造の数は本発明のリポソームの壁を一部破壊するような条件で走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を撮影し、層構造の数を計測することにより求めることができる。
本発明のリポソームは内部に内水相を有する。内水相は最も内側に存在する層構造の内表面の内部領域に構成される。一つの層構造（脂質二重膜）の厚みが約１０ｎｍであり、存在する脂質二重膜の数だけリポソームの壁厚みが生じる。脂質二重膜の層構造が２０層である場合、１０ｎｍの２０層分が内水相の両側に配置されるため、０．４μｍの両壁厚みとなる。２０層からなるリポソームの外径から０．４μｍを引くことにより、内水相の内径が計算できる。本発明のリポソーム組成物および製剤の内水相の内径は、好ましくは２．２μm（平均粒子径２．５μｍで１２層）〜１１．３μｍ（平均粒子径１２μｍで３５層）が例示でき、より好ましくは、３．４μｍ（平均粒子径３．７μｍで１４層）〜９．４μｍ（平均粒子径１０μｍで２７層）である。本発明のリポソームは、例えば、平均粒子径が２．５μｍのときに層構造が１２層である。同様に、例えば、平均粒子径が３．７μｍのときに層構造が１４層である。例えば、平均粒子径が１０μｍのときに層構造が２７層であり、平均粒子径が１２μｍのときに層構造が３５層である。
このように製造されたリポソームは好ましい徐放性が得られると共に、均一なリポソーム組成物として製造することが可能となる。
【００１３】
本発明のリポソームは以下の工程によって得られるリポソームで、外部領域水相中に分散して本発明のリポソーム組成物を形成する。
本発明のリポソームは、「水混和性有機溶媒中に、リン脂質とコレステロールとの合計濃度（以下、総脂質濃度と記載することがある。）が１００〜２００ｗ／ｖ％（１００ｍｌ中１００〜２００ｇ）含有される水混和性有機溶液、容積１に対して、第１水相溶液を容積比３／１〜１２／１で混合し、混合相におけるリン脂質とコレステロールとの合計濃度が１５〜５０ｗ／ｖ％（１００ｍｌ中１５〜５０ｇ）であるエマルジョンを得て、前記エマルジョンを第２水相溶液で外液置換して得られるリポソーム。」である。
【００１４】
ここで、「水混和性有機溶媒」とは、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノ−ル等のアルコール類であり、エタノールが好ましい。
「水混和性有機溶液（以下、アルコール溶液ということがある）」とは、アルコール中に、リン脂質とコレステロールとの合計濃度が１００〜２００ｗ／ｖ％（１００ｍｌ中１００〜２００ｇ）で含有される溶液である。
「混合相」とは、水混和性有機溶液、容積１に対して、第１水相溶液を容積比３／１〜１２／１で混合し、得られる混合相であり、総脂質濃度が１５〜５０ｗ／ｖ％（１００ｍｌ中１５〜５０ｇ）である。
「第１水相」とは、内部領域水相または内水相とも呼ばれ、本発明のリポソームの多層膜中に均一に存在する内部領域水相である。
「第２水相」は、外部領域水相または外水相とも呼ばれ、発明のリポソームの多層膜の外部に存在する水相であり、内部領域水相とイオン勾配を形成する水相である。
【００１５】
以下に各成分を説明する。
＜リン脂質＞
本発明のリポソーム組成物の脂質膜の主構成成分の１つであるリン脂質は、生体膜の主要構成成分であり、一般的に、分子内に長鎖アルキル基より構成される疎水性基と、リン酸基より構成される親水性基とをもつ両親媒性物質である。リン脂質としては、ホスファチジルコリン（=レシチン）、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールなどのグリセロリン酸；スフィンゴミエリン（ＳＭ）などのスフィンゴリン脂質；カルジオリピンなどの天然または合成のジホスファチジルリン脂質およびこれらの誘導体；これらの水素添加物たとえば水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、水素添加卵黄ホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリンが好ましい。リン脂質は単一種または複数種の組合せであってもよい。
【００１６】
＜リン脂質以外の添加物＞
本発明のリポソーム組成物の膜脂質には、上記主構成成分とともに他の膜成分を含んでいても良く、たとえば、リン脂質以外の脂質もしくはその誘導体、膜安定化剤、酸化防止剤などを必要に応じて含むことができる。リン脂質以外の脂質とは、分子内に長鎖アルキル基等の疎水性基を有し、リン酸基を分子内に含まない脂質であり、特に限定されないがグリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、コレステロールなどのステロール誘導体およびこれらの水素添加物などの誘導体を挙げることができる。コレステロール誘導体としては、シクロペンタノヒドロフェナントレン環を有するステロール類が挙げられる。これらの中でも、本発明のリポソーム組成物はコレステロールを含むことが好ましい。酸化防止剤としては、たとえばアスコルビン酸、尿酸あるいはトコフェロール同族体すなわちビタミンＥなどが挙げられる。トコフェロールには、α、β、γ、δの4個の異性体が存在するが、本発明ではいずれも使用できる。
本発明では、リン脂質とコレステロールとの合計を総脂質と記載することがある。
【００１７】
なお、本発明のリポソーム組成物は、リン脂質およびコレステロールである総脂質の組成を以下のように選択することによって好適なリポソーム組成物とすることができる。
１）リポソームの脂質膜が、鎖長１６〜１８の飽和脂肪酸のアシル鎖を有するリン脂質のみで構成される。
２）リポソームの脂質膜が、鎖長１４〜１８の飽和脂肪酸のアシル鎖を有するリン脂質
、およびコレステロールを主構成成分として含有する場合、両成分のモル比は８０：２０〜５０：５０である。
３）リポソームの脂質膜が、鎖長１６〜１８の不飽和脂肪酸のアシル鎖を有するリン脂質、およびコレステロールを主構成成分として含有する場合、両成分のモル比は６０：４０〜５０：５０である。
ここで、アシル鎖の鎖長とはアシル鎖の炭素数を意味する。
アシル鎖炭素数１４の飽和脂肪酸は、ミリスチン酸、アシル鎖炭素数１５の飽和脂肪酸は、ペンタデシル酸、アシル鎖炭素数１６の飽和脂肪酸は、パルミチン酸（慣用名：セチル酸、ヘキサデシル酸、体系名：ヘキサデカン酸）、アシル鎖炭素数１７の飽和脂肪酸は、ヘプタデカン酸、アシル鎖炭素数１８の飽和、不飽和脂肪酸は、ステアリン酸（体系名：オクタデカン酸）、オレイン酸、リノール酸、リノレイン酸等が挙げられる。
【００１８】
＜リポソーム内水相（第１水相）溶液＞
本発明において、両親媒性弱塩基性薬物を高効率かつ安定にリポソーム内に封入するために用いられるリポソームの内水相溶液は、前記両親媒性弱塩基性薬物と共にリポソーム内に封入される対イオンの選択が重要となる。本発明のリポソーム組成物は、薬物を高効率で封入し、かつ長期持続徐放性を達成するために、硫酸イオンを含有することが好ましい。硫酸イオンを生じる化合物としては硫酸アンモニウムが一般的であるが、その他、硫酸デキストランやコンドロイチン硫酸などからも選択できる。また、その他の対イオンとしては、水酸化物、燐酸塩、グルクロン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、硝酸塩、シアン酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、臭化物、塩化物、および他の無機または有機アニオン類、またはアニオン性重合体などが挙げられる。
【００１９】
内水相のｐＨについては、リモートローディング法の手法に応じて異なる。例えば、クエン酸を用いる場合、あらかじめ内水相と外水相のｐＨ勾配を形成しておく必要があり、その場合は内水相と外水相のｐＨの差が３以上であることが好ましい。また、硫酸アンモニウムを用いた場合は、化学平衡によってｐＨ勾配が形成されるために特に考慮する必要はない。
【００２０】
また、本発明のリポソーム組成物の調製において、脂質を含む水混和性溶媒よりなる水混和性有機溶液の容積１に対して、第１水相溶液を容積比３／１〜１２／１で混合する。第１水相（内水相）溶液は、水混和性有機溶液の容積１に対して、体積比として３〜９が好ましく、３〜５．６がさらに好ましい。
【００２１】
＜リポソーム外水相（第２水相）溶液＞
外水相は、内水相溶液より前記イオン勾配を形成するためのイオン濃度が低い水溶液が用いられ、具体的にはＨＥＰＥＳ溶液やＮａＣｌ溶液、グルコースやショ糖などの糖類水溶液が用いられる。外水相のｐＨについては緩衝剤によって調整されていることが望ましく、脂質の分解および生体内投与時のｐＨ格差を考慮してｐＨ５．５から８．５の範囲で調整されることが好適であり、より好ましくはｐＨ６．０〜７．５の範囲である。リポソームの内水相と外水相の浸透圧については、両者の浸透圧差でリポソームが破壊されることのない範囲の浸透圧で調整されていればよく、特に限定はされないが、リポソームの物理的安定性を考慮するとこの浸透圧差は少ないほど望ましい。
【００２２】
＜リポソーム製剤＞
本発明のリポソーム組成物にリモートローディング法を用いて薬物が封入され、本発明のリポソーム製剤が得られる。
【００２３】
＜リモートローディング法＞
リモートローディング法とは、薬物が内封されていない空リポソームを製造し、リポソーム外液に薬物を加えることによりリポソームに薬物を導入する方法である。リモートローディング法では、外液に加えられた薬物が能動的にリポソームへと移行し、リポソームへと取り込まれる。このドライビングフォースとしては、溶解度勾配、イオン勾配、ｐＨ勾配などが用いられ、例えばリポソーム膜を隔てて形成されるイオン勾配を用いて薬物をリポソーム内部に導入する方法が一般的であり、例えば、Ｎａ+／Ｋ+濃度勾配に対するリモートローディング法により予め形成されているリポソーム中に薬物を添加する技術がある（特許第２８４７０６５号公報参照）。
【００２４】
イオン勾配によるリモートローディング法においてはプロトン濃度勾配が最も一般的に用いられており、例えばクエン酸を用いてリポソーム膜の内部領域水相（内水相）のｐＨが外部領域水相（外水相）のｐＨよりも低いｐＨ勾配を形成する態様とすることができる。また、ｐＨ勾配は、アンモニウムイオン濃度勾配および／またはプロトン化しうるアミノ基を有する有機化合物の濃度勾配などにより形成することができる（特許第２６５９１３６号公報参照）。また近年では、イオノファをリポソーム膜に導入することによりリモートローディングを行う方法も開示されている。（米国特許４，８８５，１７２、米国特許５，０５９，４２１、米国特許５，１７１，５７８、米国特許５，８３７，２８２、の各公報参照）。
【００２５】
＜封入される薬物＞
本発明のリポソーム製剤における保持薬物は、イオン勾配法でリポソーム内に保持可能であればよく特に限定されないが、両親媒性弱塩基であることが好ましい。また、効果の面からは局所投与において持続徐放性が望まれる薬物が好ましく、特に脳血管障害、パーキンソン病、抗精神病、認知症等の治療薬や、鎮痛薬であることが好ましい。これらの薬物としては、ドネペジル、リスペリドン、リバスチグミン、ガランタミン、フィソスチグミン、ヘプチルフィソスチグミン、フェンセリン、トリセリン、シムセリン、チアトルセリン、チアシムセリン、ネオスチグミン、フペルジン、タクリン、メトリフォネート、ミノサイクリン、塩酸ファスジル、ニモジン、モルヒネ、ブピバカイン、ロビバカイン、レボブピバカイン、トラマドール、リドカインなどが挙げられる。その他、ドーパミン、Ｌ−ＤＯＰＡ、セロトニン、エピネフリン、コデイン、メペリジン、メタドン、モルフィン、アトロピン、デシクロミン、メチキセン、プロパンテリン、イミプラミン、アミトリプチリン、ドキセピン、デシプラミン、キニジン、プロプラノロール、クロルプロマジン、プロメタジン、ペルフェナジンなどが挙げられる。
【００２６】
＜投与方法＞
本発明のリポソーム製剤の投与方法は特に制限されないが、非経口的、かつ局所的に投与することが好ましい。たとえば、皮下、筋肉内、腹腔内、髄腔内、硬膜外、脳室内を選択することができ、症状により適宜投与方法を選択することができる。より好適な投与方法は、皮下もしくは筋肉内投与であり、具体的な投与方法としては、リポソーム製剤をシリンジで投与することや、スプレー式デバイスによって噴霧することができる。また、カテーテルを体内、たとえば管腔内、たとえば血管内に挿入して病巣部位にもっていき、当該カテーテルを通して局所的に投与することも可能である。
本発明のリポソーム製剤は、その内部領域に封入された薬物の血中有効濃度が少なくとも４日以上維持する全身性徐放性を有する。本発明のリポソーム製剤はその内部領域に封入された薬物の局所有効濃度が少なくとも４日以上維持する局所性徐放性を有する。本発明のリポソーム製剤は、投与後、３日以上、好ましくは４日以上、より好ましくは５日以上、さらに好ましくは７日以上の徐放性を有する。
ここで、血中濃度とは、血管から血液を採取し、血漿中の薬物濃度を例えば以下の実施例で説明する、高速液体クロマトグラフィーにて定量した濃度をいう。
局所濃度とは、組織、臓器等の特定の部位を採取し、その部位のホモジネートから得られた上清における薬物濃度を測定した値をいう。有効濃度とは病態や薬物の種類によって決定され、治療に有効であると考えられる最小の濃度をいう。
【００２７】
本発明の持続徐放製剤用キットは、上記の本発明のリポソーム製剤および２７〜３３ゲージの少なくとも一つのゲージサイズの注射針を含む。注射針の本数は単数でも複数でもよく、注射針のサイズは、１種類でも２種類以上の組合せでもよい。本発明のリポソーム製剤は２７ゲージ、３０ゲージ、３３ゲージのなどの細い針でも投与可能であり、投与される患者の負担が少ない。また、投与されるリポソーム製剤の徐放性も高いので本発明の持続徐放性剤用キットの有用性が高い。
【実施例】
【００２８】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
各例で調製された薬物封入リポソームの各濃度および粒子径は、以下のように求めた。
リン脂質濃度（ｍｇ／ｍＬ）：高速液体クロマトグラフィーまたはリン脂質定量を用いて定量されるリポソーム懸濁液中でのリン脂質濃度。
コレステロール濃度（ｍｇ／ｍＬ）：高速液体クロマトグラフィーを用いて定量されるリポソーム懸濁液中でのコレステロール濃度。
総脂質濃度（ｍｏｌ／Ｌ）：上記リン脂質濃度およびコレステロール濃度の合計である膜構成成分としての総脂質の合計モル濃度（ｍＭ）。【００２９】
＜薬物濃度（ｍｇ／ｍＬ）＞
（１）塩酸ドネペジル濃度（ｍｇ／ｍＬ）：製剤の総脂質濃度が約２０〜３０ｍｇ／ｍＬとなるようにＲＯ水（逆浸透膜浄水）でリポソーム組成物を希釈した後、これをさらにメタノールで２０倍希釈してリポソームを崩壊した。この溶液について、３１５ｎｍでの吸光度を、紫外可視吸光光度計を用いて高速液体クロマトグラフィーにて定量される製剤中塩酸ドネペジル濃度である。
（２）塩酸ブピバカイン濃度（ｍｇ／ｍＬ）：製剤の総脂質濃度が約２０〜３０ｍｇ／ｍＬとなるようにＲＯ水（逆浸透膜浄水）でリポソーム組成物を希釈した後、これをさらにメタノールで２０倍希釈してリポソームを崩壊した。この溶液について、２６３ｎｍでの吸光度を、紫外可視吸光光度計を用いて高速液体クロマトグラフィーにて定量される製剤中塩酸ブピバカイン濃度である。
（３）塩酸ロピバカイン濃度（ｍｇ／ｍＬ）：製剤の総脂質濃度が約２０〜３０ｍｇ／ｍＬとなるようにＲＯ水（逆浸透膜浄水）でリポソーム組成物を希釈した後、これをさらにメタノールで２０倍希釈してリポソームを崩壊した。この溶液について、２６３ｎｍでの吸光度を、紫外可視吸光光度計を用いて高速液体クロマトグラフィーにて定量される製剤中塩酸ロピバカイン濃度。
（４）薬剤担持量（薬物／総脂質のモル比）：リポソームに内封された塩酸ドネペジル濃度または塩酸ブピバカイン濃度または塩酸ロピバカイン濃度を上記総脂質濃度に対する上記薬剤濃度の比から、薬剤／総脂質のモル比で示す。
（５）血漿中塩酸ドネペジル濃度（ｍｇ／ｍＬ）：採取した血漿を処理し、最終的に遠心分離にて得られた上清を、励起波長（Ｅｘ）３２２ｎｍ、検出波長（Ｅｍ）３８５ｎｍでの蛍光を、蛍光光度計を用いて高速液体クロマトグラフィーにて定量して血漿中の塩酸ドネペジル濃度を測定した。
（６）組織中塩酸ブピバカイン濃度（ｍｇ／ｍＬ）：採取した組織を処理し、最終的に遠心分離にて得られた上清を、２１０ｎｍでの吸光度を、紫外可視吸光光度計を用いて高速液体クロマトグラフィーにて定量し組織中の塩酸ブピバカイン濃度を測定した。
（７）平均粒子径（μｍ）：光散乱回折式粒度分布計ベックマンコールターＬＳ２３０で測定した平均粒子径である。【００３０】
以下に使用した各成分の略称および分子量を示す。
ＨＳＰＣ：水素添加大豆フォスファチジルコリン（分子量７９０、リポイド（Lipoid）社製ＳＰＣ３）
Ｃｈｏｌ：コレステロール（分子量３８８．６６、Ｓｏｌｖａｙ社製）
ＤＮＰ：塩酸ドネペジル（以下、ＤＮＰということがある。）（分子量４１５．９５、ＵＩＮＡＮ  ＣＨＥＮＧＨＵＩ−ＳＨＵＡＮＦＤＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｉｔｄ）
塩酸ブピバカイン（分子量３２４．８９、ＪＩＮＡＮ  ＣＨＥＮＧＨＵＩ−ＳＨＵＡＮＧＤＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｉｔｄ）
塩酸ロピバカイン（分子量３１０．８８、ＪＩＮＡＮ  ＣＨＥＮＧＨＵＩ−ＳＨＵＡＮＧＤＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｉｔｄ）【００３１】
＜異なる調整条件で得られたリポソーム組成物への薬物封入量の比較＞
（調製例１〜３）
エタノール中の脂質濃度が１５０ｗ／ｖ％、２００ｗ／ｖ％で、リポソームを調製し、ｐＨ勾配で薬物を導入しリポソーム製剤を調製した。
（１）空リポソームの調製
表１に示すようにＨＳＰＣおよびＣｈｏｌを秤量し、無水エタノール中の脂質濃度が１５０ｗ／ｖ％または２００ｗ／ｖ％となるように無水エタノールを添加後、約７０℃で加温溶解した。引き続き、溶解した脂質エタノール溶液の容積１に対して、第１水相である内水相溶液（１５０ｍＭ硫酸アンモニウム水溶液）が容積比４／１または３／１（ｖ／ｖ）となるように加え、約１０分間、一定の回転速度で加温撹拌することで空リポソームを調製した。加温終了後のリポソームは速やかに氷冷した。
（２）ｐＨ勾配形成
氷冷後の空リポソームを、遠心機を用いて外液置換を行い、リポソーム内水相側／外水相側にｐＨ勾配を形成させた。リポソームを約１０倍量の外水相溶液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ／０．９％塩化ナトリウム（ｐＨ７．５））で分散し、３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離することでリポソームを沈殿させた。その後、上清を除き、引き続き、ｐＨ７．５の２０ｍＭＨＥＰＥＳ／０．９％塩化ナトリウムを添加し分散し、同様に遠心分離した。これを３回繰り返えした後ｐＨ７．５の２０ｍＭＨＥＰＥＳ／０．９％塩化ナトリウムを再分散し、ｐＨ勾配を形成した。
（３）ｐＨ勾配による薬物導入
ｐＨ勾配形成後のリポソームのＨＳＰＣおよびコレステロールを定量し、総脂質濃度を求めた。算出した総脂質濃度をもとに、塩酸ドネペジル（ＤＮＰ，分子量４１５．９５）／総脂質（ｍｏｌ／ｍｏｌ）比が０.１６となるように塩酸ドネペジル量を計算し、必要量のＤＮＰを秤量後、ＲＯ水により２０ｍｇ／ｍＬのＤＮＰ溶液（薬物溶液）を調製した。
６５℃で加温したリポソーム溶液に、あらかじめ６５℃で加温したＤＮＰ溶液を所定量添加後、引き続き、６５℃で６０分間、加温攪拌することで薬物導入を行った。薬物導入後のリポソームは速やかに氷冷した。
（４）未封入薬物除去
薬物導入後、リポソームに外水相溶液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ／０．９％塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．５））を添加し分散させて、３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離することでリポソームを沈殿させた。その後上清を除き、引き続き、２０ｍＭＨＥＰＥＳ／０．９％塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．５）を添加し分散させ、同様に遠心分離した。これを３回繰り返すことで未封入薬物除去を行った。【００３２】
上記、本発明による製造法で得られた調製例１〜３のリポソーム製剤について、空リポソームを調製する時のエタノール中の脂質濃度、内水相／脂質を含むエタノール溶液の体積比、薬剤担持量（薬剤／総脂質モル比）および粒子径を表２に示す。表２に示したエタノール溶液中脂質濃度、内水相／エタノール溶液の体積比で調製されるとき、薬剤／総脂質モル比が０．０８ｍｏｌ／ｍｏｌ以上の高い薬剤担持量を得られることが明らかとなった。【００３３】
図１は、本願実施例において調製例２で製造された、薬物導入後のリポソーム製剤の断面を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した写真である。図１ａにおいて示されるリポソーム製剤は、リポソーム製剤の最外表面に近いところで分割されている。図１ｂにおいて示されるリポソーム製剤は、ほぼ中央で分割されている。電子顕微鏡観察の結果、本発明によるリポソーム製剤は図１に示すように、複数層の脂質二重膜で形成された外膜を有する1つの均質な内水相を有する構造であることが分かる。また、電子顕微鏡の写真を肉眼でみて多重性の高い部分（層構造を有する部分）の脂質二重膜の膜枚数（層構造、ラメラリティー）を計測した結果、一組の脂質二重層が一つの層構造だとすると、本発明で得られる平均粒子径６μｍのリポソーム製剤におけるラメラリティーは、およそ２０であった。また、平均粒子径２．５μｍではおよそ１２であった。一方、本発明で得られる製剤の長期持続的な徐放性能を示す好ましい平均粒子径は３μｍ付近以上である。従って、リポソーム製剤のラメラリティーが１２以上（より好ましくは１２〜２７）で、好ましい徐放性が得られると推測される。
尚、本実施例で測定した平均粒子径６μｍのリポソーム製剤は、３μｍ以下および１０μｍ以上のリポソーム製剤がそれぞれ約１０％未満ずつ（体積もしくは個数）存在し、かつ４μｍ〜７μｍのリポソーム製剤が約５０％以上存在するリポソーム製剤である。【００３４】
【表１】
2012133121.tif 000003
【００３５】
（調製例４〜５）
空リポソームを調製するときのリポソーム懸濁液の回転速度を調節することで粒子径をコントロールし、その他は調製例２と同様にしてＤＮＰ内封リポソーム製剤を調製した。その結果、表２に示すように、３．７μｍおよび１２．２μｍの異なる平均粒子径を有するリポソーム製剤を得た。また、調製例１〜３と同様に、良好な封入効率で高い薬物担持量のリポソーム製剤が得られた。【００３６】
【表２】
2012133121.tif 000004
【００３７】
（比較例１）
＜エタノール中脂質濃度が１００ｗ／ｖ％のときに調製されるリポソーム＞
表３に示すようにＨＳＰＣおよびＣｈｏｌを秤量し、エタノール中脂質濃度が１００ｗ／ｖ％となるように１ｍＬの無水エタノールを添加後、約７０℃で加温溶解した。引き続き、溶解した脂質エタノール溶液の容量１に対して、内水相溶液（１５０ｍＭ硫酸アンモニウム溶液）９／１となるように第１水相である内水相を９ｍＬ加え、約１０分間、一定の回転速度で加温撹拌しリポソームを調製した。混合相における総脂質濃度は１０ｗ／ｖ％であった。加温終了後の空リポソームは速やかに氷冷した。その後のｐＨ勾配形成、薬物導入、未封入薬物除去は調整例１〜３と同様な方法で行い、薬物を封入したリポソーム製剤を得た。【００３８】
上記、比較例１のリポソーム組成物の空リポソーム調製時におけるエタノール中総脂質濃度、内水相／エタノール溶液の容積比を表４に示す。また、得られたリポソーム組成物の薬剤担持量（薬剤／総脂質モル比）、および粒子径を表４に示す。その結果、調製例１〜３と同等な平均粒子径が得られたにもかかわらず、混合相（内水相溶液＋アルコール溶液）における総脂質濃度が低いと、薬剤封入量が低下することが明らかとなった（表４）。以上のことから、空リポソーム調製時のエタノール中脂質濃度、内水相／エタノール溶液の容積比がリポソームの構造に影響を与え、その結果、薬剤封入量に影響を及ぼすと考えられる。【００３９】
【表３】
2012133121.tif 000005
【００４０】
【表４】
2012133121.tif 000006
【００４１】
＜エクストルージョン法による塩酸ドネペジルリポソーム製剤の調製＞
（比較例２〜３）
ＨＳＰＣおよびＣｈｏｌをそれぞれ０．７１ｇ、０．２９ｇ秤量し、無水エタノール１ｍＬを添加して加温溶解した。得られた脂質エタノール溶液１ｍＬに、約７０℃に加温した硫酸アンモニウム溶液（内水相）９ｍＬを添加し、加温しながら超音波装置にて攪拌して粗リポソーム懸濁液を調製した。この粗リポソーム懸濁液を、約７０℃に加温したエクストルーダー（The Extruder T.10、Lipexbiomembranes Inc.）に取り付けたフィルター（Whatman社）を、孔径０．４μｍを５回、または孔径２μｍを５回順次通し、粒径３００ｎｍ付近の空リポソームを調製した。加温終了後の空リポソームは、速やかに氷冷した。氷冷後、外水相溶液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ／０．９％塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．５）で充分に置換したゲルろ過を用いて外液置換を行い、ｐＨ勾配を形成した。その後、薬物／総脂質（mol/mol）=０．１６となるように所定量のＤＮＰ溶液を添加し、６５℃で６０分間、加温攪拌することで薬物導入を行った。薬物導入後のリポソームは速やかに氷冷し、その後、２０ｍＭＨＥＰＥＳ／０．９％塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．５）で充分に置換したゲルろ過を用いて未封入薬物除去を行った。
表４に、比較例２および３で調製したリポソーム組成物の薬剤担持量および粒子径を示す。その結果、比較的薬剤担持量の高いものが得られた。【００４２】
＜異なる粒子径におけるin vitro放出特性の検討＞
本実施例において、調製例２、４、５および比較例２、３で調製したリポソーム組成物からの薬物放出特性について、硫酸アンモニウムを用いたin vitro評価系で検証した。
７．５ｍＭとなるように硫酸アンモニウムを秤量し、リン酸緩衝液を加えて放出試験液（ｐＨ７．４、３００ｍＯｓｍｏｌの７．５ｍＭ硫酸アンモニウム／リン酸緩衝液）を調製した。調製例２、４、５および比較例２、３で調製したリポソーム組成物を上記放出試験液で１０倍希釈し、３７℃で所定時間、加温した。加温開始後、０、１、２、５、８、１０、１５、３０分で試料を取り出し、直ちに停止液を加え氷冷し、放出を停止した。放出したＤＮＰの定量は、上記に述べた薬物濃度の定量法に従い高速液体クロマトグラフにて実施した。【００４３】
その結果、図３に示すように、リポソームからのＤＮＰ（塩酸ドネペジル）の放出は、粒子径が小さいほど速いことが明らかとなった。また、図３のデータをもとに、初期の放出のプロットにおいてそれぞれ傾きを算出し、各平均粒子径における放出速度を算出した。その結果を図４に示す。１２．２μｍのときの放出速度は２３（μｇ／（ｍＬ・ｍｉｎ））、６μｍのとき３７（μｇ／（ｍＬ・ｍｉｎ））、３．７μｍのとき５１（μｇ／（ｍＬ・ｍｉｎ））、１．２μｍのとき１１０（μｇ／（ｍＬ・ｍｉｎ））であった。
この結果より、粒子径が小さくなるに従い、放出速度が大きくなることが明らかとなった。特に、平均粒子径が１．２μｍでは放出速度が著しく速くなった。このことから、１．２μｍ以下では短時間で薬物が放出し、持続性が得られないことが推測される。これはおそらく、粒子径が小さくなるにつれて脂質膜の膜枚数（層状構造の厚さ）が減少し、薬物がリポソームの外側に拡散しやすくなるため、放出が加速すると考えられる。また、粒子径が小さいほど脂質膜の曲率が大きくなり、それに伴い脂質膜のパッキング性が弱まり薬物が脂質膜を透過しやすくなることも要因の一つとして考えられる。
以上の結果より、放出速度が著しく加速し、持続性が期待できない平均粒子径は、１．２μｍ以下であり、長期持続性には１．２μｍより大きい平均粒子径を有することが重要であることが明らかとなった。
以上のことから、比較例２および３で得られたリポソーム組成物は、薬剤の封入量は高いが、放出が調製例２、４、５と比較して著しく速いため、ｉｎ  ｖｉｖｏでの３日以上の長期持続放出は困難だと推測される。一方、調製例２、４、５はｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出試験において経時的な放出プロファイルを示し、特に粒子径が大きいほど放出速度が遅くなることが明らかとなった。【００４４】
＜ＤＮＰリポソームの薬物動態＞
調製例２および比較例２、３で調製したドネペジルリポソーム製剤およびドネペジル単体の薬物動態試験を行った。本発明による製造法で調製したリポソーム組成物は、高い薬物封入量を得ることができるため、低容量で高濃度の薬物を投与することが可能である。そのため、調製例２で調製したドネペジルリポソーム製剤については、塩酸ドネペジル量として５０ｍｇ／ｋｇをラット背部皮下に投与した。一方、比較例２および３で調製したリポソーム製剤については、製剤の薬物濃度に対する投与可能な容量に限界があるため、塩酸ドネペジル量としてそれぞれ５ｍｇ／ｋｇと２５ｍｇ／ｋｇをラット背部皮下に投与した。さらに、比較としてドネペジル単体を５ｍｇ／ｋｇでラット背部皮下に投与した。塩酸ドネペジル単体、比較例２、３、調整例２の投与量を表５に示す。【００４５】
【表５】
2012133121.tif 000007
【００４６】
ドネペジル単体については、投与後、０．５、１、５、１０、３０、１２０、４８０、１４４０、２８８０分経過後に尾静脈より採血した。一方、リポソーム製剤については、投与後、０．５、１、３、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６、２６４、２８８、３１２、３３６時間経過後に尾静脈より採血し、遠心分離（６，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）して血漿を分取した。得られた血漿を処理し、励起波長（Ｅｘ）３２２ｎｍ、検出波長（Ｅｍ）３８５ｎｍでの蛍光強度を高速液体クロマトグラフィーにて定量し、各血漿中の塩酸ドネペジル濃度を求めた。その結果を図５に示す。【００４７】
図５に示すように、塩酸ドネペジル単体を皮下投与したときの血中塩酸ドネペジル濃度は、投与後０．５時間で最大血中濃度を示し、その後、急激に減少した。４８時間後は既に検出限界以下であった。比較例２で調製したリポソーム製剤は、ドネペジル単体に比べて初期バーストがなく、４８時間まで持続徐放が認められたが、投与後８時間で最大血中濃度を示し、それ以降は急激に減少し、投与後４８時間で既に１０ｎｇ／ｍｌを下回った。また、比較例３で調製したリポソーム製剤についても、投与後４日までは比較的高い血中濃度を維持したが、その後、急激に低下した。これらの製剤は、粒子径が０．３μｍおよび１．２μｍと比較的小さいため、大きな粒子径と比べてリポソーム製剤からの薬物放出特性が速い。これに加えて、投与部位においてリポソームが拡散しやすく、リンパや血中に移行し、リポソームとしての消失も速い可能性が考えられる。これらの要因から、期待される持続徐放性が得られないと推測される。【００４８】
一方、本発明による調製例２で得られたリポソーム製剤は、初期バーストもなく、顕著な徐放時間の延長が認められ、１４日間にわたる持続徐放性を得ることができた。これは、ｐＨ勾配により内水相で薬物が強固に保持されるのに加えて、粒子径が大きくなるほど、脂質二重膜の膜枚数が増加し、層状構造が厚くなるため、薬物の脂質膜透過性が抑制され、その結果、長期的な持続徐放性を達成できたと考えられる。【００４９】
本実施例で得られた血中薬物濃度は、臨床上、十分な有効濃度を示すものである。初期バーストもなく、１４日間にわたり有効濃度を安定に持続できたことは、副作用の懸念も取り除かれ、患者さんのＱＯＬを向上でき、非常に有効な徐放能を有する製剤を見出すことができた。
以上のことから、本発明により調製されたリポソーム組成物は、複数層の脂質二重膜で形成された外膜を有する１つの内水相を有し、かつｐＨ勾配法によって十分な薬物量を内水相に強固に保持することで、薬物を高濃度に封入することができる。また、本発明のリポソーム組成物に薬物を封入した本発明のリポソーム製剤は、長期的な持続徐放能を発揮する優れた持続徐放製剤であることが明らかとなった。【００５０】
＜本発明による塩酸ブピバカインリポソーム製剤の調製＞
（調製例６〜１３）
表６に示すようにＨＳＰＣおよびＣｈｏｌを秤量し、無水エタノール中の脂質濃度がそれぞれ２００、１５０、１００w/v%となるように無水エタノールを添加後、約７０℃で加温溶解した。引き続き、溶解した脂質エタノール溶液に対して内水相溶液（ｐＨ２．５クエン酸溶液）が３／１、４／１、５．６／１、９／１（ｖ／ｖ）となるように加え、約１０分間、一定の回転速度で加温撹拌することでリポソームを調製した。加温終了後のリポソームは速やかに氷冷した。調製条件におけるエタノール、内水相および脂質濃度の関係を表７に示す。
その後、ｐＨ６．５のクエン酸溶液を用いて遠心機により外液置換を行い、リポソーム内／外にｐＨ勾配を形成させた。
その後、薬物導入を調製例１〜３と同様に行った。薬物として塩酸ブピバカイン（ＢＰＶ，分子量３２４．８９）を用いた。必要量の塩酸ブピバカイン（ＢＰＶ）を秤量後、ＲＯ水により１０ｍｇ／ｍＬのＢＰＶ溶液（薬物溶液）を調製し、６５℃で６０分間、加温攪拌することで薬物導入を行った。薬物導入後のリポソームは速やかに氷冷した。引き続き、ｐＨ６．５クエン酸溶液を用いて、調製例１〜３と同様な操作で未封入薬物除去を行った。得られた塩酸ブピバカインリポソームについて、薬物封入量として塩酸ブピバカイン／総脂質（ｍｏｌ/ｍｏｌ）を表８に示す。【００５１】
その結果、表２、７に示すように、エタノール中脂質濃度が１００〜２００ｗ／ｖ％であり、かつ該エタノール溶液に対する内水相（ｐＨ２．５クエン酸溶液）比率が３／１、４／１、５．６／１、９／１（ｖ／ｖ）で加えられ、さらにエタノール溶液および内水相（混合相）の総体積における脂質濃度が１５〜５０ｗ／ｖ％のときに、表８に示すように、非常に高い薬物封入量が得られた。【００５２】
【表６】
2012133121.tif 000008
【００５３】
【表７】
2012133121.tif 000009
【００５４】
【表８】
2012133121.tif 000010
【００５５】
（調製例１４〜１７）
内水相として１５０ｍＭ硫酸アンモニウムを用いたこと以外については、調製例６〜９と同様に塩酸ブピバカインリポソームを調製した。表９に示すようにＨＳＰＣおよびＣｈｏｌを秤量し、無水エタノール中の脂質濃度がそれぞれ２００w/v%となるように無水エタノールを添加後、約７０℃で加温溶解した。引き続き、内水相として１５０ｍＭ硫酸アンモニウムを用い、溶解した脂質エタノール溶液に対して内水相溶液（１５０ｍＭ硫酸アンモニウム）が３／１、４／１、５．６／１、９／１（ｖ／ｖ）となるように加え、約１０分間、一定の回転速度で加温撹拌することで空リポソームを調製した。加温終了後のリポソームは速やかに氷冷した。
その後、調製例６〜９と同様に、ｐＨ勾配形成、塩酸ブピバカイン導入、未封入薬物除去を行い、塩酸ブピバカインリポソーム製剤を得た。その結果を表２に示す。内水相に硫酸アンモニウムを用いた場合も、ｐＨ２．５クエン酸溶液と同様に高い薬物封入量が得られた。【００５６】
【表９】
2012133121.tif 000011
【００５７】
（比較例４〜７）
表１０に示すようにＨＳＰＣおよびＣｈｏｌを秤量し、無水エタノール中の脂質濃度がそれぞれ２００、１５０、１００w/v%となるように無水エタノールを添加後、約７０℃で加温溶解した。引き続き、溶解した脂質エタノール溶液に対する内水相（ｐＨ２．５クエン酸溶液）比率が１．５／１、２／１、９／１（ｖ／ｖ）となるように加え、約１０分間、一定の回転速度で加温撹拌することでリポソームを調製した。加温終了後のリポソームは速やかに氷冷した。
その後、ｐＨ６．５のクエン酸溶液を用いて外液置換を行い、リポソーム内／外水相にｐＨ勾配を形成させた。引き続き、塩酸ブピバカインを用いて薬物導入を行った。
その後、ｐＨ６．５クエン酸溶液を用いて未封入薬物除去を行い、リポソーム製剤を得た。得られたリポソーム製剤について、塩酸ブピバカイン封入量を表４および表８に示す。
その結果、エタノール中脂質濃度が１００〜２００ｗ／ｖ％で、かつ脂質エタノール溶液に対する内水相（ｐＨ２．５クエン酸溶液）の容積比が２／１以下のとき、薬物封入量がやや低下し、かつ未封入の薬物量（製剤中塩酸ブピバカイン量に対する外液中塩酸ブピバカイン量）が、６〜９％と比較的高かった。このことから、上記のリポソームの調製条件では、十分な量の薬物が内水相に安定に保持されないことが示唆された。【００５８】
【表１０】
2012133121.tif 000012
【００５９】
＜塩酸ブピバカインリポソーム製剤の薬物動態＞
調製例１６で調製した塩酸ブピバカインリポソーム製剤および塩酸ブピバカイン単体の薬物動態試験を行った。投与量は、塩酸ブピバカイン量として表１１に示す容量でラット背部皮下に投与した。塩酸ブピバカインリポソーム組成物は、投与後、１、２４、７２、１２０、１６８時間経過後に、一方、塩酸ブピバカイン単体は、投与後、０．５、４、２４時間経過後、投与部位の背部皮下組織を採取しホモジネイト処理を行った。引き続きホモジネイト溶液を処理し、得られた試料溶液を高速液体クロマトグラフィーにて定量し、投与部位の背部皮下組織に残存する塩酸ブピバカイン量を求めた。その結果を図６に示す。塩酸ブピバカイン単体の投与部位残存率は、投与後４時間で１％を下回った。このことから、塩酸ブピバカイン単体は数時間で投与部位から消失することが明らかとなった。一方、塩酸ブピバカインリポソーム製剤は、経過時間に依存した投与部位からの持続的な消失プロファイルが得られ、投与後、３日目で約１０％、５日目で約５％、７日目において約３％の塩酸ブピバカインが残存していた。これらのことから、投与したリポソームは、投与部位で持続的に塩酸ブピバカインを放出することが明らかとなった。
以上のことから、本発明で得られた塩酸ブピバカインリポソーム製剤は、長期徐放能を有していることが明らかとなった。【００６０】
【表１１】
2012133121.tif 000013
【００６１】
＜本発明による塩酸ロピバカインリポソームの調製＞
（調製例１８）
薬物として塩酸ロピバカインを用いる他は調製例１５と同様にリポソーム組成物を作製し、塩酸ロピバカインリポソームを得た。
その結果、表１に示すように、薬物に塩酸ロピバカインを用いた場合も同様にｐＨ勾配法で導入でき、高い薬物封入量が得られた。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの放出性も、塩酸ドネペジルリポソーム製剤および塩酸ブピバカインリポソーム製剤と同等な放出プロファイルを示した。【００６２】
＜本発明のリポソーム製剤を投与するための注射針の大きさの確認＞
本発明のリポソーム製剤が、どの程度の針の細さまで投与可能かを検討した。
調製例１６で調製した本発明の塩酸ブピバカインを含有するリポソーム製剤を用いて、異なるゲージを有する注射針により、製剤を吸う工程と、押し出す工程を行った。その結果、２７ゲージ、３０ゲージ、３３ゲージの非常に細い注射針を用いても、いずれも本発明のリポソーム製剤を容易に吸うことができ、かつ押し出すことが可能であった。【００６３】
＜比較実験＞
上記の比較実験として、リスパダール・コンスタ（ヤンセンファーマ）を用いて細い注射針での投与が可能か検討した。リスパダール・コンスタは、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）からなるマイクロスフェアである。抗精神病薬の持続注射剤であり、２０Ｇの注射針がついたキット製品である。マイクロスフェアの平均粒子径は２５〜１５０μｍである。これらを２７〜３３ゲージの注射針を用いて吸う作業を行った結果、吸う工程については、いずれの針でも吸うことができなかった。また押し出す工程について、１９〜２１ゲージの太い注射針のみ投与する際に用いることが可能であり、２７ゲージ、３０ゲージ、３３ゲージの細い注射針では押し出すことはできなかった。これは、マイクロスフェアの粒子サイズが大きいため、細い針では投与できないためと考えられる。
以上のことから、通常、リポソームなどのマイクロスフェアは１９〜２１ゲージの針で投与するのが限界であったが、本発明によるリポソーム製剤は２７ゲージ、３０ゲージ、３３ゲージのなどの細い針でも投与可能であることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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