(57)【要約】  下記式（１）、（２）または（３）で表されることを特徴とする、化合物。【化１】2012091091.tif 000044（上記式（１）、（２）および（３）中、Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ独立して蛍光性を有し、かつエキシトン効果を示す原子団であって、電荷を有さない原子団である。）
2012091091.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）、（２）または（３）で表されることを特徴とする、化合物。
【化１】
2012091091.tif 000036
（上記式（１）、（２）および（３）中、
Ｇは、下記式（３３）で表されるホスホロアミダイト基または水酸基であり、
【化２】
2012091091.tif 000037
Ｂは、塩基骨格を有する原子団であり、
Ｅは、デオキシリボース骨格もしくはリボース骨格を有する原子団またはその誘導体であり、
Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ独立して蛍光性を有し、かつエキシトン効果を示す原子団であって、電荷を有さない原子団であり、Ｚ１１とＺ１２とは、同一であっても異なっていてもよく、
Ｘは、水素原子、酸により脱保護が可能な水酸基の保護基、リン酸基、二リン酸基、または三リン酸基であり、
Ｒ４１はリン酸基の保護基であり、
Ｒ４２およびＲ４３は、それぞれ独立してアルキル基またはアリール基であり、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して主鎖を有するリンカーであり、当該主鎖を構成する原子が置換基を有していてもよく、
Ｒ３は、主鎖を有するリンカーであってもよく、または存在していなくてもよく、当該主鎖を構成する原子は置換基を有していてもよく、
Ｄは、ＣＲ１１、Ｎ、Ｐ、Ｐ＝Ｏ、Ｂ（ホウ素原子）もしくはＳｉＲ１１であってもよく、または存在していなくてもよく、Ｒ１１は、水素原子、アルキル基もしくは任意の置換基であってもよく、
Ｒ３が存在しておらず、かつＤが存在している場合には、ＤはＢに直接結合していてもよく、Ｒ３が存在しており、かつＤが存在していない場合には、Ｒ１およびＲ２はＲ３に直接結合していてもよく、Ｒ３およびＤが存在していない場合には、Ｒ１およびＲ２はＢに直接結合していてもよく、
Ｔは、リン酸架橋であり、当該リン酸架橋中、１つ以上の酸素原子が硫黄原子で置換されていてもよい。）
【請求項２】
上記式（１）および（３）中、下記式（１ａ）で表される原子団が、下記式（４）または（５）で表される原子団であり、
上記式（２）中、下記式（２ａ）で表される原子団が、下記式（６）または（７）で表される原子団であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【化３】
2012091091.tif 000038
【化４】
2012091091.tif 000039
（上記式（４）〜（７）中、
Ａは水素原子、水酸基、アルキル基、または電子吸引基であり、
ＭおよびＪは、それぞれ独立してＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。）
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が有する主鎖は、それぞれ独立して２以上の原子により構成されていることを特徴とする請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
下記式（８）、（９）、（１０）または（１１）で表されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【化５】
2012091091.tif 000040
【化６】
2012091091.tif 000041
（上記式（８）、（９）、（１０）および（１１）中、
ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ独立して正の整数であり、
Ｒ４は、単結合、二重結合もしくは三重結合であるか、または存在していなくてもよい。）
【請求項５】
ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ２であり、Ｒ４は、二重結合であることを特徴とする請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｚ１１およびＺ１２が、それぞれ独立して下記式（１２）、（２８）または（２９）で表される原子団であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【化７】
2012091091.tif 000042
（上記式（１２）、（２８）および（２９）中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立してＯ、Ｓ、ＳｅまたはＴｅであり、
ｎは、０または正の整数であり、
Ｒ２１〜Ｒ３０、Ｒ３２〜Ｒ３４、Ｒ５１〜Ｒ６０は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基またはアミノ基であり、Ｒ２８とＲ２９とは、互いに結合されていてもよく、Ｒ５８とＲ５９とは、互いに結合されていてもよく、
Ｒ３１は、上記式（１）、（２）もしくは（３）中のＲ１もしくはＲ２、または上記式（８）、（９）、（１０）もしくは（１１）中のＮＨに結合する連結基であり、
ｎが２以上の整数である場合には、Ｒ３３は、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、Ｒ３４は、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。）
【請求項７】
上記式（１２）、（２８）および（２９）中、Ｒ３１は、炭素数２以上のポリメチレンカルボニル基であり、カルボニル基部分において上記式（１）、（２）もしくは（３）中のＲ１もしくはＲ２、または上記式（８）、（９）、（１０）もしくは（１１）中のＮＨに結合することを特徴とする請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ４１がシアノエチル基であり、Ｒ４２およびＲ４３がそれぞれイソプロピル基であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物であって、Ｇが上記式（３３）で表されるホスホロアミダイト基である化合物と、オリゴ核酸とを縮合反応させることを特徴とする核酸の製造方法。
【請求項１０】
下記式（２５）、（２６）または（２７）で表される原子団をヌクレオチド部分として含むことを特徴とする核酸。
【化８】
2012091091.tif 000043
（上記式（２５）、（２６）および（２７）中、
Ｂは、塩基骨格を有する原子団であり、
Ｅは、デオキシリボース骨格もしくはリボース骨格を有する原子団またはその誘導体であり、
Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ独立して蛍光性を有し、かつエキシトン効果を示す原子団であって、電荷を有さない原子団であり、Ｚ１１とＺ１２とは、同一であっても異なっていてもよく、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して主鎖を有するリンカーであり、当該主鎖を構成する原子が置換基を有していてもよく、
Ｒ３は、主鎖を有するリンカーであってもよく、または存在していなくてもよく、当該主鎖を構成する原子は置換基を有していてもよく、
Ｄは、ＣＲ１１、Ｎ、Ｐ、Ｐ＝Ｏ、Ｂ（ホウ素原子）もしくはＳｉＲ１１であってもよく、または存在していなくてもよく、Ｒ１１は、水素原子、アルキル基もしくは任意の置換基であってもよく、
Ｒ３が存在しておらず、かつＤが存在している場合には、ＤはＢに直接結合していてもよく、Ｒ３が存在しており、かつＤが存在していない場合には、Ｒ１およびＲ２はＲ３に直接結合していてもよく、Ｒ３およびＤが存在していない場合には、Ｒ１およびＲ２はＢに直接結合していてもよく、
Ｔは、リン酸架橋であり、当該リン酸架橋中、１つ以上の酸素原子が硫黄原子で置換されていてもよい。）
【請求項１１】
請求項９に記載の核酸の製造方法により製造されたことを特徴とする請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を含むことを特徴とする核酸を製造するためのキット。
【請求項１３】
請求項１〜８の何れか1項に記載の化合物であって、式中のＧが上記式（３３）で表されるホスホロアミダイト基である化合物を製造する方法であって、
請求項１〜８の何れか1項に記載の化合物であって、式中のＧが水酸基である化合物を、非プロトン性溶媒中でホスホロアミダイト化する工程を含むことを特徴とする製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エキシトン効果を示す色素を有する化合物および核酸、この化合物を用いた核酸の製造方法ならびに核酸を製造するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を検出する方法として、「エキシトン効果（励起子結合効果）」によって蛍光のｏｎ／ｏｆｆを制御可能なプローブを用いる方法がある。【０００３】
このようにエキシトン効果を利用して核酸を検出するためのプローブとして、特許文献１には、モノヌクレオシドまたはモノヌクレオチドから誘導される構造を有する化合物を含むプローブが記載されている。この化合物には、例えば２分子の蛍光性分子が結合している。このプローブは、ＤＮＡ等と結合していない状態では、構造がひずみ、エキシトンカップリングによる消光が引き起こされることにより蛍光が極めて弱いが、ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズした状態では、構造のひずみが解消・固定化され、強い蛍光発光を示すものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００８／１１１４８５号パンフレット（２００８年９月１８日公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
核酸プローブを製造する方法としては、特許文献１に記載されているように、ヌクレオシドホスホロアミダイト体を用いたホスホロアミダイト法により合成する方法が知られている。特許文献１には、エキシトン効果を利用して核酸を検出するための核酸プローブを製造する方法として、まず蛍光性分子を含まないヌクレオシドホスホロアミダイト体を合成し、これを使用してＤＮＡオリゴマーを作成した後に、蛍光性分子を導入する方法が記載されている。【０００６】
しかし、この方法では、ＤＮＡオリゴマーの合成工程と蛍光性分子を導入するための合成工程との２段階の合成工程が必要であり、それぞれの合成工程についてさらに精製工程が必要である。また、蛍光性分子の導入効率が１００％でない場合には、蛍光性分子が１分子のみ導入された不完全な核酸プローブが作成されてしまう可能性もある。【０００７】
また、従来の方法では、ＤＮＡオリゴマーを合成した後に蛍光性分子を導入するため、ＤＮＡオリゴマーの異なる位置にそれぞれ異なる種類の色素（蛍光性分子）を導入することが困難である。【０００８】
本発明は、上記の従来技術が有する問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、エキシトン効果を示す色素を有する核酸の製造を容易に行なうことができる化合物を提供し、ならびに核酸、核酸の製造方法および核酸を製造するためのキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行ない、以下の点を見出すことにより本発明を完成させた。【００１０】
まず、本発明者らは、エキシトン効果を示す色素を有する核酸の製造を容易にするため、色素を有するホスホロアミダイト化合物を用いてオリゴ核酸を合成する方法に着目した。ここで、従来は、エキシトン効果を示す色素として、エキシトン効果の発揮に関わると考えられている電荷（正電荷）を持つ分子を用いるのが一般的である。本発明者らは、このような従来の色素を持つ分子を利用して、核酸の合成を試みたが、合成効率が十分ではない場合があった。【００１１】
また、エキシトン効果を示す色素として上記電荷を持つ分子を用いた場合、当該色素を組み込んだアミダイト体の前駆体（ＯＨ体）が製造できたとしても、この前駆体を効率よくアミダイト化することが出来なかった。【００１２】
そこで、本発明者らは、電荷を有さない色素を用いて、色素を有するホスホロアミダイト化合物を利用して核酸合成を試みたところ、充分な合成効率にて合成できることを見出した。すなわち、このホスホロアミダイト化合物は、ヌクレオシド基質として用いて核酸の合成に供することができることを見出した。また、このホスホロアミダイト化合物を用いて製造した核酸がエキシトン効果を発揮できることを見出した。【００１３】
すなわち、本発明に係る化合物は、下記式（１）、（２）または（３）で表されることを特徴とする。【００１４】
【化１】
2012091091.tif 000003
【００１５】
（上記式（１）、（２）および（３）中、
Ｇは、下記式（３３）で表されるホスホロアミダイト基または水酸基であり、【００１６】
【化２】
2012091091.tif 000004
【００１７】
Ｂは、塩基骨格を有する原子団であり、
Ｅは、デオキシリボース骨格もしくはリボース骨格を有する原子団またはその誘導体であり、
Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ独立して蛍光性を有し、かつエキシトン効果を示す原子団であって、電荷を有さない原子団であり、Ｚ１１とＺ１２とは、同一であっても異なっていてもよく、
Ｘは、水素原子、酸により脱保護が可能な水酸基の保護基、リン酸基、二リン酸基、または三リン酸基であり、
Ｒ４１はリン酸基の保護基であり、
Ｒ４２およびＲ４３は、それぞれ独立してアルキル基またはアリール基であり、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して主鎖を有するリンカーであり、当該主鎖を構成する原子が置換基を有していてもよく、
Ｒ３は、主鎖を有するリンカーであってもよく、または存在していなくてもよく、当該主鎖を構成する原子は置換基を有していてもよく、
Ｄは、ＣＲ１１、Ｎ、Ｐ、Ｐ＝Ｏ、Ｂ（ホウ素原子）もしくはＳｉＲ１１であってもよく、または存在していなくてもよく、Ｒ１１は、水素原子、アルキル基もしくは任意の置換基であってもよく、
Ｒ３が存在しておらず、かつＤが存在している場合には、ＤはＢに直接結合していてもよく、Ｒ３が存在しており、かつＤが存在していない場合には、Ｒ１およびＲ２はＲ３に直接結合していてもよく、Ｒ３およびＤが存在していない場合には、Ｒ１およびＲ２はＢに直接結合していてもよく、
Ｔは、リン酸架橋であり、当該リン酸架橋中、１つ以上の酸素原子が硫黄原子で置換されていてもよい。）
また、本発明に係る化合物は、特に、以下に示すより具体的な例示に限定されないが、上記式（１）および（３）中、下記式（１ａ）で表される原子団が、下記式（４）または（５）で表される原子団であり、上記式（２）中、下記式（２ａ）で表される原子団が、下記式（６）または（７）で表される原子団であることが好ましい。【００１８】
【化３】
2012091091.tif 000005
【００１９】
【化４】
2012091091.tif 000006
【００２０】
（上記式（４）〜（７）中、
Ａは水素原子、水酸基、アルキル基、または電子吸引基であり、
ＭおよびＪは、それぞれ独立してＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。）
また、本発明に係る化合物では、特に、以下に示すより具体的な例示に限定されないが、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が有する主鎖は、それぞれ独立して２以上の原子により構成されていることが好ましい。【００２１】
また、本発明に係る化合物では、特に、以下に示すより具体的な例示に限定されないが、下記式（８）、（９）、（１０）または（１１）で表されることが好ましい。【００２２】
【化５】
2012091091.tif 000007
【００２３】
【化６】
2012091091.tif 000008
【００２４】
（上記式（８）、（９）、（１０）および（１１）中、
ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ独立して正の整数であり、
Ｒ４は、単結合、二重結合もしくは三重結合であるか、または存在していなくてもよい。）
また、本発明に係る化合物では、特に、以下に示すより具体的な例示に限定されないが、ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ２であり、Ｒ４は、二重結合であることが好ましい。【００２５】
また、本発明に係る化合物では、特に、以下に示すより具体的な例示に限定されないが、Ｚ１１およびＺ１２が、それぞれ独立して下記式（１２）、（２８）または（２９）で表される原子団であることが好ましい。【００２６】
【化７】
2012091091.tif 000009
【００２７】
（上記式（１２）、（２８）および（２９）中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立してＯ、Ｓ、ＳｅまたはＴｅであり、
ｎは、０または正の整数であり、
Ｒ２１〜Ｒ３０、Ｒ３２〜Ｒ３４、Ｒ５１〜Ｒ６０は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基またはアミノ基であり、Ｒ２８とＲ２９とは、互いに結合されていてもよく、Ｒ５８とＲ５９とは、互いに結合されていてもよく、
Ｒ３１は、上記式（１）、（２）もしくは（３）中のＲ１もしくはＲ２、または上記式（８）、（９）、（１０）もしくは（１１）中のＮＨに結合する連結基であり、
ｎが２以上の整数である場合には、Ｒ３３は、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、Ｒ３４は、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。）。【００２８】
また、本発明に係る化合物では、特に、以下に示すより具体的な例示に限定されないが、上記式（１２）、（２８）および（２９）中、Ｒ３１は、炭素数２以上のポリメチレンカルボニル基であり、カルボニル基部分において上記式（１）、（２）もしくは（３）中のＲ１もしくはＲ２、または上記式（８）、（９）、（１０）もしくは（１１）中のＮＨに結合することが好ましい。【００２９】
また、本発明に係る化合物では、特に、以下に示すより具体的な例示に限定されないが、Ｒ４１がシアノエチル基であり、Ｒ４２およびＲ４３がそれぞれイソプロピル基であることが好ましい。【００３０】
本発明に係る核酸の製造方法は、上述したいずれかの化合物であって、Ｇが上記式（３３）で表されるホスホロアミダイト基である化合物と、とオリゴ核酸とを縮合反応させることを特徴とする。【００３１】
本発明に係る核酸は、下記式（２５）、（２６）または（２７）で表される原子団をヌクレオチド部分として含むことを特徴とする。【００３２】
【化８】
2012091091.tif 000010
【００３３】
（上記式（２５）、（２６）および（２７）中、
Ｂは、塩基骨格を有する原子団であり、
Ｅは、デオキシリボース骨格もしくはリボース骨格を有する原子団またはその誘導体であり、
Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ独立して蛍光性を有し、かつエキシトン効果を示す原子団であって、電荷を有さない原子団であり、Ｚ１１とＺ１２とは、同一であっても異なっていてもよく、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して主鎖を有するリンカーであり、当該主鎖を構成する原子が置換基を有していてもよく、
Ｒ３は、主鎖を有するリンカーであってもよく、または存在していなくてもよく、当該主鎖を構成する原子は置換基を有していてもよく、
Ｄは、ＣＲ１１、Ｎ、Ｐ、Ｐ＝Ｏ、Ｂ（ホウ素原子）もしくはＳｉＲ１１であってもよく、または存在していなくてもよく、Ｒ１１は、水素原子、アルキル基もしくは任意の置換基であってもよく、
Ｒ３が存在しておらず、かつＤが存在している場合には、ＤはＢに直接結合していてもよく、Ｒ３が存在しており、かつＤが存在していない場合には、Ｒ１およびＲ２はＲ３に直接結合していてもよく、Ｒ３およびＤが存在していない場合には、Ｒ１およびＲ２はＢに直接結合していてもよく、
Ｔは、リン酸架橋であり、当該リン酸架橋中、１つ以上の酸素原子が硫黄原子で置換されていてもよい。）。【００３４】
また、本発明に係る核酸は、特に限定されないが、上述した核酸の製造方法により製造されたことが好ましい。【００３５】
本発明に係る核酸を製造するためのキットは、上述したいずれかの化合物を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００３６】
本発明に係る化合物によれば、エキシトン効果を示す色素を有する核酸プローブの製造を容易に行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明の一実施例におけるＤＮＡプローブのマススペクトルを示す図である。
【図２】本発明の一実施例におけるＤＮＡプローブのＵＶ吸収スペクトルを示す図である。
【図３】本発明の一実施例におけるＤＮＡプローブの蛍光スペクトルを示す図である。
【図４】本発明の他の実施例におけるＤＮＡプローブのＵＶ吸収スペクトルを示す図である。
【図５】本発明の他の実施例におけるＤＮＡプローブの蛍光スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下、本発明の一実施形態について、詳細に説明する。
【００３９】
なお、本明細書において、「ホスホロアミダイト化合物」および「化合物」には、その互変異性体および立体異性体、ならびにその塩などが含まれる。
【００４０】
〔化合物〕
まず、本発明に係る化合物について説明する。
【００４１】
本発明に係る化合物は、エキシトン効果を示す色素（蛍光色素）を含有するホスホロアミダイト化合物（以下、「色素含有ホスホロアミダイト化合物」ともいう。）またはその合成中間体である。本発明に係る化合物は、下記式（１）、（２）または（３）で表される。
【００４２】
【化９】
2012091091.tif 000011
【００４３】
上記式（１）、（２）および（３）中、Ｂは、塩基骨格を有する原子団である。塩基骨格を有する原子団とは、天然核酸塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシル）骨格または人工核酸塩基骨格を有する原子団が挙げられる。
【００４４】
Ｂは、下記式（１４）で表される骨格を有するピリミジン塩基もしくは下記式（１５）で表される骨格を有するプリン塩基、またはこれらの誘導体であることが好ましい。
【００４５】
【化１０】
2012091091.tif 000012
【００４６】
上記式（１４）中、１位のＮ原子は、上記式（１）〜（３）中のＥと結合している共有結合を有しており、１位のＮ原子以外の原子のいずれか１つは、色素（Ｚ１１またはＺ１２）につながるリンカー（すなわち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３またはＤ）と結合（共有結合）していてもよい。なかでも、５位の原子がリンカーと結合していることが好ましい。
【００４７】
上記式（１４）中、６員環を構成する原子のうち、少なくとも１つの炭素原子は、Ｎ、ＳまたはＯ原子で置換されていてもよく、少なくとも１つの窒素原子はＣ、ＳまたはＯ原子で置換されていてもよく、当該Ｎ、Ｃ、ＳまたはＯ原子は、電荷、水素原子または置換基を有していてもよい。
【００４８】
上記式（１５）中、９位のＮ原子は、上記式（１）〜（３）中のＥと結合している共有結合を有しており、９位のＮ原子以外の原子のいずれか１つは、色素（Ｚ１１またはＺ１２）につながるリンカー（すなわち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３またはＤ）と結合（共有結合）していてもよい。なかでも、８位の原子がリンカーと結合していることが好ましい。
【００４９】
上記式（１５）中、５員環および６員環を構成する原子、好ましくは５員環を構成する原子のうち、少なくとも１つの炭素原子は、Ｎ、ＳまたはＯ原子で置換されていてもよく、少なくとも１つの窒素原子はＣ、ＳまたはＯ原子で置換されていてもよく、当該Ｎ、Ｃ、ＳまたはＯ原子は、電荷、水素原子または置換基を有していてもよい。
【００５０】
上記式（１）、（２）および（３）中、Ｅは、デオキシリボース骨格もしくはリボース骨格を有する原子団またはその誘導体である。Ｅは、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、または修飾ＲＮＡの主鎖構造を有する原子団であれば、合成が容易であるため好ましい。
【００５１】
例えば、上記式（１）および（３）中、下記式（１ａ）で表される原子団は、下記式（４）または（５）で表される原子団であることが好ましい。
【００５２】
【化１１】
2012091091.tif 000013
【００５３】
上記式（４）〜（５）中、Ａは、水素原子、水酸基、アルキル基、アルコキシ基または電子吸引基である。アルキル基またはアルコキシ基としては、メトキシ基等が挙げられる。また、電子吸引基としては、ハロゲン等が挙げられる。ＭおよびＪは、それぞれ独立してＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。
【００５４】
また、例えば、上記式（２）中、下記式（２ａ）で表される原子団は、下記式（６）または（７）で表される原子団であることが好ましい。
【００５５】
【化１２】
2012091091.tif 000014
【００５６】
上記式（６）〜（７）中、Ａは、水素原子、水酸基、アルキル基、アルコキシ基または電子吸引基である。アルキル基またはアルコキシ基としては、メトキシ基等が挙げられる。また、電子吸引基としては、ハロゲン等が挙げられる。ＭおよびＪは、それぞれ独立してＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。
【００５７】
上記式（１）、（２）および（３）中、Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ独立して蛍光性を有する原子団（以下、「色素」ともいう。）であり、かつ、エキシトン効果を示す原子団である。また、Ｚ１１およびＺ１２は、電荷を有さない原子団である。Ｚ１１とＺ１２とは、同一であっても異なっていてもよい。
【００５８】
ここで、「エキシトン効果（エキシトンカップリング）」（励起子結合効果ともよばれる。）とは、Ｚ１１とＺ１２とが互いに並行に集合し、または、Ｚ１１もしくはＺ１２と他の原子団とが並行に集合し、Ｈ会合体（Ｈ−ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を形成することにより生じるものである。「エキシトン効果を示す」とは、エキシトン効果が生じていないときには蛍光発光し、エキシトン効果が生じているときには消光することをいう。エキシトン効果は、Ｚ１１およびＺ１２で表される原子団の励起状態が、Ｈ会合体を形成することによりＤａｖｙｄｏｖ  ｓｐｌｉｔｔｉｎｇにより２つのエネルギーレベルに分裂し、上位エネルギーレベルに励起した後、下位エネルギーレベルに内部変換（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）し、発光が熱的に禁制されることにより生じると考えられる。ただし、これらの説明は、本発明を何ら限定するものではない。
【００５９】
また、「電荷を有さない」とは、少なくとも非プロトン性溶媒中において電荷（正電荷または負電荷）を有さないことをさす。換言すれば、Ｚ１１およびＺ１２で表される原子団内の双極子モーメントが小さいことをいう。なお、Ｚ１１およびＺ１２で表される原子団は、非プロトン性溶媒中において電荷を有さないものであればよく、プロトン性溶媒中においては分極して電荷を帯びるものであってもよい。ここで、非プロトン性溶媒とは、例えばアセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等をさし、プロトン性溶媒とは、水等をさす。
【００６０】
Ｚ１１およびＺ１２は、例えば、それぞれ独立して下記式（１２）で表される原子団であってもよい。
【００６１】
【化１３】
2012091091.tif 000015
【００６２】
上記式（１２）中、Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、ＳｅまたはＴｅであり、ＯまたはＳであることが好ましい。
【００６３】
上記式（１２）中、ｎは、０または正の整数である。このｎは５以下であることが好ましく、一例では０〜２の整数であり、好ましくは０または１である。
【００６４】
上記式（１２）中、Ｒ２１〜Ｒ３０、Ｒ３２〜Ｒ３４は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基またはアミノ基である。低級アルキル基としては、例えば炭素数１〜６の直鎖または分岐アルキル基であってもよい。また、低級アルコキシ基としては、例えば炭素数１〜６の直鎖または分岐アルコキシ基であってもよい。
【００６５】
Ｒ２８とＲ２９とは、互いに結合されていてもよい。すなわち、Ｒ２８とＲ２９とは、互いに結合されて環状構造を構成していてもよく、環状構造としては、例えばアリール基等が挙げられる。また、この環状構造またはアリール基は、置換基を有していてもよい。
【００６６】
上記式（１２）中、Ｒ３１は、上記式（１）、（２）もしくは（３）中のＲ１もしくはＲ２、または下記式（８）、（９）、（１０）もしくは（１１）中のＮＨに結合する連結基である。Ｒ３１は、原子数２以上の主鎖を有することが好ましい。また、この主鎖を構成する原子数の上限は、特に限定されないが、好ましくは１００以下であり、より好ましくは５０以下であり、さらに好ましくは３０以下であり、特に好ましくは１０以下である。
【００６７】
また、Ｒ３１は、炭素数２以上のポリメチレンカルボニル基であることが好ましく、このうちカルボニル基部分において上記式（１）、（２）もしくは（３）中のＲ１もしくはＲ２、または下記式（８）、（９）、（１０）もしくは（１１）中のＮＨに結合することが好ましい。
【００６８】
上記式（１２）中、ｎが２以上の整数である場合には、複数のＲ３３は、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、複数のＲ３４は、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。
【００６９】
Ｚ１１およびＺ１２としては、例えば下記式（１７）〜（２０）で表される色素等が挙げられる。
【００７０】
【化１４】
2012091091.tif 000016
【００７１】
上記式（１７）〜（２０）中、Ｒ３１は、上記式（１２）中において例示したものと同じものを用いることができる。
【００７２】
また、Ｚ１１およびＺ１２は、例えば、それぞれ独立して下記式（２８）または（２９）で表される原子団であってもよい。
【００７３】
【化１５】
2012091091.tif 000017
【００７４】
上記式（２８）および（２９）中、Ｒ２１〜Ｒ３４、Ｘ１およびｎとしては、上記式（１２）中において例示したものと同じものを用いることができる。
【００７５】
上記式（２８）中、Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、ＳｅまたはＴｅであり、ＯまたはＳであることが好ましい。なお、Ｘ１とＸ２とは、同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００７６】
上記式（２８）および（２９）中、Ｒ５１〜Ｒ６０は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基またはアミノ基である。低級アルキル基としては、例えば炭素数１〜６の直鎖または分岐アルキル基であってもよい。また、低級アルコキシ基としては、例えば炭素数１〜６の直鎖または分岐アルコキシ基であってもよい。
【００７７】
Ｒ５８とＲ５９とは、互いに結合されていてもよい。すなわち、Ｒ５８とＲ５９とは、互いに結合されて環状構造を構成していてもよく、環状構造としては、例えばアリール基等が挙げられる。また、この環状構造またはアリール基は、置換基を有していてもよい。
【００７８】
Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ独立して上記式（１２）、（２８）または（２９）のいずれかで表される原子団であってもよい。
【００７９】
上記式（１）、（２）および（３）中、Ｘは、水素原子、酸により脱保護が可能な水酸基の保護基、リン酸基、二リン酸基、または三リン酸基である。酸により脱保護が可能な水酸基の保護基としては、たとえばジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ基）などが挙げられる。
【００８０】
上記式（１）、（２）および（３）中、Ｇは、下記式（３３）で表されるホスホロアミダイト基または水酸基である。
【００８１】
【化１６】
2012091091.tif 000018
【００８２】
上記式（３３）中、Ｒ４１はリン酸基の保護基であり、例えば、シアノアルキル基等が挙げられる。なかでも、シアノエチル基が好ましい。
【００８３】
上記式（３３）中、Ｒ４２およびＲ４３は、それぞれ独立してアルキル基またはアリール基である。アルキル基としては、例えば、炭素数１〜６のアルキル基等が挙げられ、なかでもイソプロピル基が好ましい。アリール基としては、例えば、炭素数６〜１０のアリール基等が挙げられ、なかでもフェニル基が好ましい。
【００８４】
上記式（１）、（２）および（３）中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して主鎖を有するリンカーである。Ｒ１およびＲ２が有する主鎖を構成する原子は、置換基を有していてもよい。また、Ｒ３は、主鎖を有するリンカーであってもよいが、存在していなくてもよい。Ｒ３が主鎖を有する場合には、この主鎖を構成する原子は、置換基を有していてもよい。
【００８５】
Ｒ１およびＲ２が有する主鎖、ならびにＲ３が主鎖を有する場合にはＲ３が有する主鎖、を構成する原子の数（主鎖原子数）は、それぞれ独立して正の整数である。Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の主鎖原子数は、それぞれ独立して２以上の整数であることが好ましい。また、この主鎖原子数の上限は、特に限定されないが、好ましくは１００以下であり、より好ましくは３０以下であり、さらに好ましくは１０以下である。
【００８６】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が有する主鎖は、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＰおよびＳｉの少なくとも１つを含んでいてもよく、また、単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合およびチオエステル結合の少なくとも１つを含んでいてもよい。また、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、互いに同一であっても異なっていてもよい。
【００８７】
上記式（１）、（２）および（３）中、Ｄは、ＣＲ１１、Ｎ、Ｐ、Ｐ＝Ｏ、Ｂ（ホウ素原子）もしくはＳｉＲ１１であってもよく、Ｒ１１は、水素原子、アルキル基もしくは任意の置換基であってもよい。また、Ｄは、存在していなくてもよい。
【００８８】
上記式（１）、（２）および（３）中、Ｒ３が存在しておらず、かつＤが存在している場合には、ＤはＢに直接結合していてもよい。また、Ｒ３が存在しており、かつＤが存在していない場合には、Ｒ１およびＲ２はＲ３に直接結合していてもよい。また、Ｒ３およびＤが存在していない場合には、Ｒ１およびＲ２はＢに直接結合していてもよい。
【００８９】
上記式（１）、（２）および（３）中、Ｔは、リン酸架橋である。このリン酸架橋中、１つ以上の酸素原子が硫黄原子で置換されていてもよい。
【００９０】
また、本発明に係る化合物は、下記式（８）、（９）、（１０）または（１１）で表される化合物であることが好ましい。
【００９１】
【化１７】
2012091091.tif 000019
【００９２】
【化１８】
2012091091.tif 000020
【００９３】
上記式（８）、（９）、（１０）および（１１）中、ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ独立して正の整数である。ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ独立して２以上の整数であることが好ましい。また、ｌ、ｍおよびｎの上限は、特に限定されないが、好ましくは１００以下であり、より好ましくは３０以下であり、さらに好ましくは１０以下である。なお、ここで、ｌ、ｍおよびｎの上限は、５以下または４以下でもありえる。
【００９４】
上記式（８）中、Ｒ４は、単結合、二重結合もしくは三重結合であるか、または存在していなくてもよい。なかでも、二重結合であることが好ましい。
【００９５】
上記式（８）、（９）、（１０）および（１１）中、Ｂ、Ｅ、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｘ、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、およびＴとしては、上記式（１）〜（３）中において例示したものと同じものを用いることができる。
【００９６】
本発明に係る化合物は、例えば下記式（１６）で表される化合物であることが好ましい。
【００９７】
【化１９】
2012091091.tif 000021
【００９８】
上記式（１６）中、Ｘ、Ｇ、Ｚ１１、Ｚ１２としては、上記式（１）〜（３）中において例示したものと同じものを用いることができる。また、上記式（１６）中、Ａとしては、上記式（４）〜（７）中において例示したものと同じものを用いることができる。
【００９９】
本発明に係る化合物であって、Ｇが水酸基である化合物は、ホスホロアミダイト体を合成する合成中間体として用いることができる。
【０１００】
本発明に係る化合物であって、Ｇが上記式（３３）で表されるホスホロアミダイト基である化合物（以下、「本発明に係るホスホロアミダイト化合物」ともいう。）は、ホスホロアミダイト法による核酸合成に供するヌクレオシド基質として用いることができる。本発明に係るホスホロアミダイト化合物を用いて合成された核酸は、例えば、プライマー、核酸を検出するための核酸プローブ、標識物質等として好適に利用され得る。すなわち、本発明に係る化合物は、核酸の標識化試薬（核酸ラベル化試薬）として用いることができる。
【０１０１】
〔ホスホロアミダイト化合物の製造方法〕
本発明に係るホスホロアミダイト化合物は、種々の経路にて製造することができる。以下に、本発明に係るホスホロアミダイト化合物を製造するいくつかの経路の例について説明するが、本発明は、特にこれに限定されるものではない。
【０１０２】
例えば、本発明に係るホスホロアミダイト化合物は、ヌクレオシドのＤＭＴｒ体に、Ｒ１、Ｒ２、ＤおよびＲ３等からなるリンカーを付加した後、色素であるＺ１１およびＺ１２を付加し、その後これをアミダイト化することによって製造してもよい（式（１）〜（３）を参照）。また、ヌクレオシドのＤＭＴｒ体に、Ｒ１、Ｒ２、ＤおよびＲ３等からなるリンカーを予め付加したＺ１１およびＺ１２を付加した後、これをアミダイト化してもよい（式（１）〜（３）を参照）。
【０１０３】
例えば、本発明に係るホスホロアミダイト化合物は、下記式（２１）、（２２）または（２３）で表される合成中間体を合成した後、これをアミダイト化することによって、製造することができる。
【０１０４】
【化２０】
2012091091.tif 000022
【０１０５】
上記式（２１）、（２２）および（２３）中、Ｂ、Ｅ、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、ＤおよびＴとしては、上記式（１）〜（３）中において例示したものと同じものを用いることができる。
【０１０６】
本発明においては、Ｚ１１およびＺ１２が非プロトン性溶媒中において電荷を有さない色素であるため、上記式（２１）、（２２）または（２３）で表される合成中間体におけるＺ１１およびＺ１２は、非プロトン性溶媒中において電荷を有さない。したがって、これらの合成中間体を非プロトン性溶媒中においてアミダイト化することが容易であり、本発明に係るホスホロアミダイト化合物を容易に製造することができる。なお、アミダイト化に際して溶媒として用いる非プロトン性溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等である。
【０１０７】
〔核酸〕
次に、本発明に係る核酸について説明する。
【０１０８】
ここで、本明細書中「核酸」とは、ポリヌクレオチドを意味し、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが含まれる。また、核酸には、オリゴ核酸が含まれる。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。また、本明細書中「オリゴ核酸」とは、オリゴヌクレオチドを意味し、１つ以上のヌクレオチドにより構成されていればよい。
【０１０９】
本発明に係る核酸の長さは、特に限定されないが、例えば１０ｂｐ以上１０ｋｂ以下であることが好ましく、１０ｂｐ以上１ｋｂ以下であることがより好ましい。また、本発明に係る核酸は、オリゴ核酸であってもよく、その長さは、特に限定されないが、例えば１０ｂｐ以上１００ｂｐ以下であることが好ましく、１０ｂｐ以上５０ｂｐ以下であることがより好ましく、１０ｂｐ以上３０ｂｐ以下であることがさらに好ましい。
【０１１０】
本発明に係る核酸は、下記式（２５）、（２６）または（２７）で表される原子団をヌクレオチド部分として含む。
【０１１１】
【化２１】
2012091091.tif 000023
【０１１２】
上記式（２５）、（２６）および（２７）中、Ｂ、Ｅ、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、ＤおよびＴとしては、上記式（１）〜（３）中において例示したものと同じものを用いることができる。
【０１１３】
本発明に係る核酸は、上記式（２５）または（２６）で表される原子団を、ヌクレオチド部分として少なくとも１つ含んでいればよいが、２つ以上含んでいてもよい。これにより、本発明に係る核酸は、色素を２個有するヌクレオチド部分を１つ含むか、色素を１個有するヌクレオチド部分を連続して２つ含む構成となる。
【０１１４】
また、本発明に係る核酸は、上記式（２７）で表される原子団を、ヌクレオチド部分として、エキシトン効果を示す構造を有する他の原子団とともに含むことが好ましい。この他の原子団とは、例えばＺ１１およびＺ１２として例示したもののいずれかを有する原子団であってもよい。また、核酸は、上記式（２７）で表される原子団を、ヌクレオチド部分として、少なくとも２つ含んでいることが好ましい。これらの２つの原子団は、核酸中に連続して配置されてもよいし、数個の他の色素を含まないヌクレオチドを挟んで配置されてもよいが、それぞれが有する色素が互いに集合してエキシトン効果を示すように配置されることが好ましい。
【０１１５】
また、本発明に係る核酸は、本発明に係るホスホロアミダイト化合物を用いて製造されたものであることが好ましい。本発明に係るホスホロアミダイト化合物を用いて製造される核酸は、このホスホロアミダイト化合物におけるホスホロアミダイト基以外の部分（以下、「色素含有ヌクレオシド」ともいう。）を構成要素として含む。
【０１１６】
すなわち、本発明に係る核酸は、エキシトン効果を示す色素を含有しており、このエキシトン効果を利用して、検出対象の核酸を検出するためのプローブ（核酸プローブ）として好適に用いることができる。また、本発明に係る核酸は、このようなプローブの一部を構成するものであってもよい。このような核酸プローブを用いれば、本発明に係る核酸が有する色素による、蛍光発光と、エキシトン効果による消光とを観察することにより、検出対象の核酸を容易に検出することができる。
【０１１７】
また、本発明に係る核酸は、含有する色素の蛍光発光を利用した標識物質としても好適に用いることができる。例えば、組織の染色等に用いる標識物質であってもよい。さらに、本発明に係る核酸は、プライマー、例えばＰＣＲ用のプライマーとしても好適に用いることができる。
【０１１８】
以上のように、本発明に係る核酸は、研究、臨床、診断、試験管内遺伝子検出、生体内遺伝子検出などに用いるためのプライマー、プローブ、標識物質等であってもよい。
【０１１９】
本発明に係るホスホロアミダイト化合物を用いて核酸を合成する場合、本発明に係るホスホロアミダイト化合物のうち、上記式（１）または（２）で表される、色素を２つ有する化合物は、核酸の合成に、少なくとも１分子用いればよい。これにより、核酸は、色素を２個有するヌクレオシドを１分子含むか、色素を１個有するヌクレオシドを連続して２分子含む。
【０１２０】
また、本発明に係るホスホロアミダイト化合物のうち、上記式（３）で表される、色素を１個有する化合物は、エキシトン効果を示す原子団を有する他の化合物とともに、核酸の合成に用いられることが好ましい。この他の化合物とは、例えばＺ１１およびＺ１２として例示したもののいずれかを有する化合物であってもよい。また、核酸は、上述した色素を１個有する化合物を、少なくとも２分子用いて合成されてもよい。
【０１２１】
ここで、本発明に係る核酸が、検出対象の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）を検出する核酸プローブである場合に、この検出対象の核酸を検出する原理について、説明する。上述したように、この核酸プローブは、エキシトン効果を示す色素を少なくとも２個含んでいる。この核酸プローブが一本鎖状態のときには、これらの色素は、互いに会合することで、励起子結合効果を生じさせて消光する。一方、この核酸プローブが、検出対象の核酸と結合した二本鎖状態のときには、これらの色素は、この二本鎖の核酸にインターカレーションまたはグルーヴバインディングしてエキシトンカップリングが解消され、蛍光発光が起こる。この蛍光発光を検出することにより、核酸を検出することができる。
【０１２２】
なお、本発明に係る核酸は、本発明に係るホスホロアミダイト化合物由来のヌクレオシド（色素含有ヌクレオシド）を含む領域を、少なくとも２個有していてもよい。１つの核酸におけるこれらの領域は、ある領域に含まれる色素含有ヌクレオシドが有する色素が、他の領域に含まれる色素含有ヌクレオシドが有する色素との間でエキシトン効果を示さないように構成されていることが好ましい。また、それぞれの領域に含まれる色素含有ヌクレオシドが有する色素は、互いに異なる波長の蛍光を発光するものであることが好ましい。
【０１２３】
これにより、本発明に係る核酸は、複数の異なる色素を有するため、核酸プローブとして用いる場合には、それぞれの色素の発光および消光を同時に観察することによって、この核酸プローブのどの領域が検出対象の核酸と結合しているかを検出することができる。すなわち、この核酸プローブの一部のみが検出対象の核酸と例えば二本鎖を形成している場合に、核酸プローブ中のどの配列が二本鎖を形成しているか等を検出することが可能となる。
【０１２４】
例えば、赤色色素を有する色素含有ヌクレオシドと、青色色素を有する色素含有ヌクレオシドとを、それぞれ核酸プローブの離れた領域に導入してもよい。この核酸プローブを用いて核酸を検出した際に、例えば青色のみが発光した場合には、青色色素を有する色素含有ヌクレオシドを導入した領域は、検出対象の核酸とハイブリダイズしているが、赤色色素を有する色素含有ヌクレオシドを導入した領域は、検出対象の核酸とハイブリダイズしていないことが分かる。
【０１２５】
このように、本発明では、上述した方法によって、１つの核酸に複数の異なる色素を導入することができる。そのため、本発明を用いれば、多様な核酸構造を検出できる核酸プローブを製造することができる。例えば、この核酸プローブは、癌に関係する遺伝子の転座、ＲＮＡのスプライシング位置等の調査に用いることができ、様々な病気の診断、原因解明などに好適に利用することができる。
【０１２６】
なお、本発明に係る核酸を相補鎖とのハイブリダイゼーション検出用のプローブとして用いる場合、より強い蛍光強度を得るという観点では、ｐＨが１０．５以下の環境で用いられることが好ましく、ｐＨが９以下の環境がより好ましく、ｐＨが８以下の環境がさらに好ましい。なお、何れの条件でもハイブリダイズしていないプローブからのバックグラウンドノイズは充分に低く抑えられている。
【０１２７】
〔核酸の製造方法〕
次に、本発明に係る核酸の製造方法について説明する。
【０１２８】
本発明に係る核酸の製造方法は、上述した本発明に係るホスホロアミダイト化合物とオリゴ核酸とを縮合反応させる、色素含有ヌクレオシド付加工程（付加工程）を含む。この色素含有ヌクレオシド付加工程により、蛍光性を有し、かつエキシトン効果を示す原子団を有するヌクレオシド（色素含有ヌクレオシド）を、オリゴ核酸に付加させることができる。
【０１２９】
色素含有ヌクレオシド付加工程は、本発明に係るホスホロアミダイト化合物、すなわち色素含有ホスホロアミダイト化合物を、ホスホロアミダイト法によりオリゴ核酸におけるヌクレオチドの５’−水酸基と縮合反応させる工程である。これにより、色素含有ヌクレオシドがオリゴ核酸に付加され、色素含有ヌクレオシドを含むオリゴ核酸が合成される。
【０１３０】
色素含有ヌクレオシド付加工程では、色素含有ホスホロアミダイト化合物とオリゴ核酸とを、室温において２〜２０分反応させることが好ましい。その他の反応条件については、ホスホロアミダイト法において用いる通常の条件を好適に用いることができる。
【０１３１】
なお、本発明に係る核酸の製造方法は、色素含有ヌクレオシド付加工程の前に、本発明に係る化合物であって、Ｇが水酸基である化合物をアミダイト化してホスホロアミダイト化合物を得る工程を含んでいてもよい。
【０１３２】
本発明は、上述した色素含有ヌクレオシド付加工程を、公知の核酸製造方法に組み込んだものであってもよい。ここで、公知の核酸製造方法とは、例えば、通常のヌクレオシド基質をホスホロアミダイト法によりオリゴ核酸に付加させるヌクレオシド付加工程と、ヌクレオシド付加工程により合成されたオリゴ核酸を脱保護する脱保護工程と、脱保護工程により脱保護されたオリゴ核酸を精製する精製工程とを含むセットを、所定の回数にて繰り返す方法である。本発明に係る核酸の製造方法は、この公知の核酸製造方法において、少なくともある１つのセットにおけるヌクレオシド付加工程を、上述した色素含有ヌクレオシド付加工程に置き換えたものであってもよい。
【０１３３】
また、本発明は、公知の核酸製造方法において、複数のセットにおけるヌクレオシド付加工程のそれぞれを、色素含有ヌクレオシド付加工程に置き換えたものであってもよい。これにより、本発明に係る化合物由来の色素含有ヌクレオシドを複数含む核酸を製造することができる。なお、この複数のセットは、連続して実施されるセットであってもよいし、他の１つ以上のセットを挟んで実施されるセットであってもよい。これにより、本発明に係る化合物由来の色素含有ヌクレオシドを含む領域を、少なくとも２個有している核酸を製造することができる。
【０１３４】
また、本発明に係る製造方法が、複数の色素含有ヌクレオシド付加工程を含む場合には、それぞれの色素含有ヌクレオシド付加工程は、互いに異なる色素を有するホスホロアミダイト化合物を用いるものであってもよい。これにより、１つの核酸に複数の異なる色素を導入することができ、すなわち複数の異なる色素を有する核酸を製造することができる。
【０１３５】
これらの色素含有ヌクレオシド付加工程、ヌクレオシド付加工程、脱保護工程、および精製工程は、公知の方法、条件、装置などにより行なうことができ、例えば公知の自動核酸合成装置を用いて行なってもよい。したがって、本発明に係る核酸の製造方法には、公知の核酸合成装置等を使用することができる。
【０１３６】
以上のように、本発明に係る製造方法を使用して、色素含有ヌクレオシドを含む核酸、すなわち本発明に係る核酸を製造することができる。
【０１３７】
また、本発明は、ＤＮＡオリゴマーの合成と色素を導入するための合成との２段階の合成工程を必要としないため、エキシトン効果を示す色素を有する核酸を容易に製造することができる。さらに、予め色素が導入されているヌクレオシドをＤＮＡ合成に用いるため、所望の数の色素が導入されていない不完全な核酸が合成されるおそれを回避することができる。
【０１３８】
〔核酸を製造するためのキット〕
本発明に係る核酸を製造するためのキットは、上述した本発明に係る化合物を含むものである。これにより、本発明に係るホスホロアミダイト化合物、すなわち色素含有ホスホロアミダイト化合物を用いて、上述した核酸の製造方法を行なうことにより、核酸を容易に製造することができる。
【０１３９】
なお、本発明に係るキットは、それぞれ異なる種類の色素を含有する、複数種類の色素含有ホスホロアミダイト化合物を含んでいてもよい。また、色素を含まない各種のヌクレオシドをさらに含んでいてもよい。これらのヌクレオシドは、核酸の合成に好適に用いることができる態様、例えばホスホロアミダイト体として含まれていることが好ましい。また、本発明に係るキットは、核酸を合成する装置、核酸合成に用いる試薬、製造した核酸を用いて核酸を検出するための検出用試薬、キットの取扱い説明書（キットを用いて核酸を製造する具体的な手法を記載）などをさらに含んでいてもよい。
【０１４０】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１４１】
以下の実施例において、試薬、溶媒等は、一般に市販されているものを使用した。１Ｈおよび１３ＣＮＭＲスペクトルは、ＪＥＯＬ（日本電子株式会社）のＪＮＭ−α４００（商品名）により測定した。カップリング定数（Ｊ値）は、ヘルツ（Ｈｚ）で表している。ケミカルシフトは、ｐｐｍで表し、内部標準には、ジメチルスルホキシド（δ＝２．４８  ｉｎ  １ＨＮＭＲ，δ＝３９．５  ｉｎ  １３ＣＮＭＲ）及びメタノール（δ＝３．３０  ｉｎ  １ＨＮＭＲ，δ＝４９．０  ｉｎ  １３ＣＮＭＲ）を用いた。ＥＳＩマススペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ社のＢｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  ＡＰＥＣ−ＩＩ（商品名）を用いて測定した。【０１４２】
〔実施例１：蛍光色素の合成〕
下記反応式（Ａ）〜（Ｄ）により、下記式（２４）で表される蛍光色素（蛍光性を有する原子団）のＮＨＳ活性体を合成した。用いた具体的な方法を以下に示す。【０１４３】
【化２２】
2012091091.tif 000024
【０１４４】
（１−１：1-(2-Carboxyethyl)quinolinium bromideの合成）【０１４５】
【化２３】
2012091091.tif 000025
【０１４６】
キノリン（Ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）（１１．８ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）と３−ｂｒｏｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（１５．３ｇ、１００ｍｍｏｌ）とを、１５０℃にて１０分間加熱および撹拌した。これに５００ｍＬのジクロロメタンを加え、生じた固体を砕いて粉末状にし、１時間撹拌した。白色沈殿をろ過した後、ジクロロメタンで洗浄し、減圧下にて乾燥させ、目的の化合物として２０．７ｇ（７３．７ｍｍｏｌ、７４％）の白色粉末を得た。当該目的の化合物の測定データは以下に示す。【０１４７】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：１２．６９（ｂｒ，１Ｈ），９．６２（ｄｄ，Ｊ＝５．９，１．５Ｈｚ，１Ｈ），９．３３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），８．６３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），８．５０（ｄｄ，Ｊ＝８．３，１．５Ｈｚ，１Ｈ），８．２８−８．２４（ｍ，１Ｈ），８．２０（ｄｄ，Ｊ＝８．３，５．９Ｈｚ，１Ｈ），８．０６−８．０２（ｍ，１Ｈ），５．２７（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），３．０９（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）；
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：１７１．４，１５０．７，１４７．７，１３７．３，１３５．７，１３０．８，１２９．８，１２９．６，１２１．９，１１８．９，５３．２，３３．３。【０１４８】
（１−２：4-{[3-(4-Carboxybutyl)benzothiazol-2-ylidene]methyl}-1-(2-carboxyethyl)quinolinium bromideの合成）【０１４９】
【化２４】
2012091091.tif 000026
【０１５０】
3-(4-Carboxybutyl)-2-methylbenzothiazolium bromide（１７．０ｇ、５１．５ｍｍｏｌ）と、1-(2-Carboxyethyl)quinolinium bromide（１４．５ｇ、５１．５ｍｍｏｌ）とを、３００ｍＬのジクロロメタンに懸濁させた。この懸濁液に、トリエチルアミン（７２ｍＬ、５１５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１６時間撹拌した。次に、溶媒を減圧留去し、５００ｍＬのアセトンを加えた。生じた沈殿をろ過し、アセトンで洗浄した後、減圧下で乾燥させた。【０１５１】
得られた粉末を、５００ｍＭの蒸留水にて洗浄し、沈殿をろ過し、さらに蒸留水で洗浄した後に減圧下で乾燥させた。この粉末を、５００ｍＬのアセトニトリルで同様に洗浄し、減圧下で乾燥させ、目的の化合物として８．３１ｇ（１５．７ｍｍｏｌ、３０％）の赤色粉末を得た。当該目的の化合物の測定データは以下に示す。【０１５２】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：８．５３（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），８．４２（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），７．９１−７．８８（ｍ，１Ｈ），７．７９（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．７１（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５５−７．５２（ｍ，１Ｈ），７．３４−７．３０（ｍ，２Ｈ），６．８０（ｓ，１Ｈ），４．７５（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），４．４８（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），２．８１（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），２．４１（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．９７−１．９１（ｍ，２Ｈ），１．８７−１．８１（ｍ，２Ｈ）；
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：１７８．０，１７６．４，１６１．１，１５０．７，１４５．６，１４１．２，１３８．５，１３４．４，１２９．４，１２８．２，１２６．６，１２６．０，１２５．８，１２５．７，１２３．７，１１８．７，１１３．７，１０９．５，８８．８，５３．２，４７．３，３７．２，３５．１，２７．７，２３．５。【０１５３】
（１−３：4-{[3-(4-Carboxybutyl)benzothiaazol-2-ylidene]methyl}quinolineの合成）【０１５４】
【化２５】
2012091091.tif 000027
【０１５５】
4-{[3-(4-Carboxybutyl)benzothiazol-2-ylidene]methyl}-1-(2-carboxyethyl)quinolinium bromide （６．１５ｇ、１１．６ｍｍｏｌ）と、O-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate （１３．２ｇ、３４．８ｍｍｏｌ）とを、６０ｍＬのＤＭＦに懸濁した。この懸濁液に、トリエチルアミン（９．７ｍＬ、６９．７ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１６時間撹拌した。次に、この反応溶液に１０ｍＬの蒸留水を加えた後、さらに３０分間撹拌した。この反応溶液に、５００ｍＬの蒸留水と１５ｍＬの酢酸とを加え、生じた沈殿をろ過し、蒸留水で洗浄し、減圧下で乾燥させた。【０１５６】
得られた赤色粉末に３００ｍＬのメタノールを加え、よく混合した。次に、沈殿をろ過し、減圧下で乾燥させた。その後得られた赤色粉末に、３００ｍＬのジクロロメタンを加え、よく混合し、上澄み液をデカンテーションによって捨てた。その後、３００ｍＬのアセトンを加え、生じた沈殿をろ過し、減圧下で乾燥させ、目的の化合物として２．２４ｇ（５．９５ｍｍｏｌ、５１％）の赤色粉末を得た。当該目的の化合物の測定データは以下に示す。【０１５７】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：１２．１８（ｂｒ，１Ｈ），８．６５（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），８．５１（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｄｄ，Ｊ＝８．３，１．０Ｈｚ，１Ｈ），７．８３−７．７９（ｍ，２Ｈ），７．６６−７．６２（ｍ，１Ｈ），７．５１−７．４１（ｍ，３Ｈ），７．２３−７．２０（ｍ，１Ｈ），６．６８（ｓ，１Ｈ），４．４１（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），２．３２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．８３−１．７７（ｍ，２Ｈ），１．７３−１．８１（ｍ，２Ｈ）；
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：１７４．２，１５３．５，１４５．８，１４４．９，１４２．６，１４０．５，１３０．８，１２７．４，１２６．１，１２４．７，１２４．２４，１２４．１９，１２３．０，１２２．８，１２２．２，１１１．０，１１０．６，８５．８，４４．６，３３．２，２５．８，２１．７。【０１５８】
（１−４：4-{[3-(4-Succinimidoxycarbonylbutyl) -2(3H)-benzothiazolylidene]methyl}quinolineの合成）【０１５９】
【化２６】
2012091091.tif 000028
【０１６０】
4-{[3-(4-carboxybutyl)-2(3H)-benzothiazolylidene]methyl}quiniline（７５５ｍｇ、ＦＷ３７６．４７）と、N-hydroxy succinimide（４６２ｍｇ、ＦＷ１１５．０９）と、N,N-Diisopropyl carbodiimide（５０６ｍｇ、ＦＷ１２６．２０）とに、ＤＭＦ（１２ｍｌ）を加え、２５℃で一晩撹拌した。これに塩化メチレンと水とをそれぞれ５０ｍｌずつ加えて、分液した。有機相を、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、ろ過した。ろ液をエバポレーションにより濃縮し、ジエチルエーテルを加えた。沈殿をろ過した後、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥させた。乾燥した沈殿をクロロホルムで洗浄した後、乾燥させた。目的の化合物として、２２７ｍｇ（ＦＷ４７３．５４、収率２４％）の赤色粉末を得た。当該目的の化合物の測定データは以下に示す。【０１６１】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：８．６８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），８．６０（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），８．０２（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），７．９１（ｍ，２Ｈ），７．７４（ｍ，２Ｈ），７．６０（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），６．８９（ｓ，１Ｈ），４．６３（ｍ，２Ｈ），２．８３（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），２．７７（ｓ，４Ｈ），１．８９（ｍ，４Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：１７０．２，１６９．０，１５８．３，１４９．０，１４０．８，１４０．０，１３７．８，１３２．７，１２８．１，１２６．９，１２５．０，１２４．２，１２３．６，１２３．３，１２２．８，１２０．６，１１２．７，１０８．４，８７．２，４５．０，２９．８，２５．８，２５．４，２１．５；
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２６Ｈ２４Ｎ３Ｏ４Ｓ（［Ｍ＋Ｈ］＋）４７４．１５；ｆｏｕｎｄ，４７４，１２。【０１６２】
〔実施例２：ホスホロアミダイト体の合成〕
次に、下記反応式（Ｅ）〜（Ｇ）により、蛍光色素を有するヌクレオシドのホスホロアミダイト体（色素含有ホスホロアミダイト化合物）を合成した。用いた具体的な方法を以下に示す。【０１６３】
（２−１：5'-O-DMTr-5-(2-[2-{N,N-bis(2-aminoethyl)}aminoethyl]carbamoyl-(E)-vinyl)-2'-deoxyuridineの合成）
まず、下記反応式（Ｅ）により、ヌクレオシドのＤＭＴｒ体において、アミノ基の脱保護を行なった。【０１６４】
【化２７】
2012091091.tif 000029
【０１６５】
5'-O-DMTr-5-(2-[2-{N,N-bis(2-trifluoroacetamidoethyl)}aminoethyl]carbamoyl-(E)-vinyl)-2'-deoxyuridine（５００ｍｇ、ＦＷ９２０．８５）を、アンモニア水（２８％）１０ｍｌとメタノール１０ｍｌとを混ぜた溶液に加え、２５℃で終夜撹拌した。この反応液は、エバポレーションにより濃縮し、少量のアセトンに溶解させ、ジエチルエーテルを加えた。生じた沈殿をろ過して分離し、その沈殿物をジエチルエーテルで洗浄した後、乾燥させた。目的の化合物として２７３ｍｇ（ＦＷ７２８．８３、収率６９％）の白色粉末を得た。当該目的の化合物の測定データは以下に示す。【０１６６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：７．９７（ｓ，１Ｈ），７．４３（ｍ，２Ｈ），７．３３−７．２７（ｍ，６Ｈ），７．２０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０２（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，２Ｈ），６．８６（ｔｄ，Ｊ＝２．２，６．９Ｈｚ，４Ｈ），６．２０（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），４．４０（ｑ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０８（ｄｄ，Ｊ＝３．５，７．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７６（ｓ，６Ｈ），３．３９−３．２７（ｍ，４Ｈ），３．０３（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，４Ｈ），２．８１（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，４Ｈ），２．６５（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），２．４７−２．３３（ｍ，２Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：１６９．３，１６３．７，１６０．２，１５１．０，１４６．１，１４３．４，１３７．１，１３７．０，１３４．６，１３１．３，１３１．２，１２９．３，１２８．９，１２８．０，１２２．４，１１４．３，１１０．８，８８．２，８８．０，７２．７，６５．０，５５．８，５４．５，５２．８，４１．８，３８．５，３８．４；
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３９Ｈ４９Ｎ６Ｏ８（［Ｍ＋Ｈ］＋），７２９．３６；ｆｏｕｎｄ，７２９．３１１４。【０１６７】
（２−２：Double dye-labeled nucleosideの合成）
次に、下記反応式（Ｆ）により、蛍光色素を有するヌクレオシドのＤＭＴｒ体を合成した。【０１６８】
【化２８】
2012091091.tif 000030
【０１６９】
5'-O-DMTr-5-(2-[2-{N,N-bis(2-aminoethyl)}aminoethyl]carbamoyl-(E)-vinyl)-2'-deoxyuridine（232mg、FW728.83）と、4-{[3-(4-Succinimidoxycarbonylbutyl) -2(3H)-benzothiazolylidene]methyl}quinoline（色素のＮＨＳ活性体）（３３１ｍｇ、ＦＷ４７３．５４）とに、ピリジン１３ｍｌを加え、２５℃で一晩撹拌した。エバポレーションにより溶媒を蒸発させ、シリカゲルカラムを用いて精製した（５％ＭｅＯＨ、１％Ｅｔ３Ｎ／ＣＨ２Ｃｌ２）。エバポレーションにより溶媒を蒸発させ、少量のアセトンに溶解させた後、ジエチルエーテルを加えた。生成した橙色粉末をろ過し、エーテルにて洗浄した後乾燥させ、目的の化合物として８３ｍｇ（ＦＷ１４４５．７５、収率１８％）を得た。当該目的の化合物の測定データは以下に示す。【０１７０】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ８３Ｈ８５Ｎ１０Ｏ１０Ｓ２（［Ｍ＋Ｈ］＋）１４４５．５９；ｆｏｕｎｄ，１４４５．４９。【０１７１】
（２−３：アミダイト合成）
次に、下記反応式（Ｇ）により、上記２−２で合成したＤＭＴｒ体を非プロトン性溶媒中においてアミダイト化し、色素含有ホスホロアミダイト化合物を合成した。【０１７２】
【化２９】
2012091091.tif 000031
【０１７３】
２１２ｍｇのＤＭＴｒ体（上記反応式（Ｇ）の左側の化合物）（ＦＷ１４４５．７５，０．１４７ｍｍｏｌ）、２１ｍｇの１Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｅ（ＦＷ７０．０５，０．３０ｍｍｏｌ）、４ｍＬのアセトニトリル、および２ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を混合し、これに２４０μＬのアミダイト化剤（ＦＷ３０１．４１，ｄ＝０．９４９，０．７５ｍｍｏｌ）を加えた。その３０分後に、重曹水と酢酸エチルとの混合溶液を加え、分液した。有機相を塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後、溶媒を留去した。【０１７４】
得られたホスホロアミダイト体は、ＤＭＦ：アセトニトリル＝１：１の溶媒を用いて０．１Ｍ溶液とし、フィルターに通した後、実施例３におけるＤＮＡ合成に用いた。【０１７５】
〔実施例３：ＤＮＡプローブ〕
実施例２で合成した色素含有ホスホロアミダイト化合物を用いて、蛍光色素を有するヌクレオシドを含むＤＮＡプローブ（核酸）を合成した。具体的な方法について、以下に説明する。【０１７６】
（３−１．ＤＮＡ合成）
ＤＮＡ合成機（Applied Biosystems社の392 DNA/RNA synthesizer（商品名））を用い、固相合成法にしたがってＤＮＡプローブ５’−ｄ（ＴＴＴＴＴＴＮＴＴＴＴＴＴ）−３’（Ｎは、蛍光色素を有するヌクレオシド）を合成した。蛍光色素を有するヌクレオシド（Ｎ）を導入する際の反応時間を１５分とし、蛍光色素を有さないヌクレオシド（Ｔ）を導入する際の反応時間を２分とした。これ以外の条件については、通常のホスホロアミダイト法において用いる条件を用いた。固相担体からの切り出しは、通常用いられる方法（２８％アンモニア水を用いる方法）により行なった。また、脱保護は、２５℃、終夜（１６時間）にて行なった。【０１７７】
（３−２．ＤＮＡプローブの精製）
次に、合成したＤＮＡプローブを、逆相ＨＰＬＣ（ギルソン社の装置Gilson Chromatograph, Model 305（商品名））により精製した。カラムには、ＣＨＥＭＣＯＢＯＮＤ  ５−ＯＤＳ−Ｈカラム（商品名、１０×１５０ｍｍ）を使用した。溶媒には、５−５５％ＣＨ３ＣＮ／１００ｍＭのＴＥＡＡ  ｂｕｆｆｅｒ  １００ｍＭ（ｐＨ７．０）を用い、４０分の勾配にて３ｍＬ／分の流速で流した。ＵＶ検出器Ｍｏｄｅｌ  １１８（商品名）により、２６０ｎｍのＵＶ吸収をモニターすることによってＤＮＡプローブを検出した。【０１７８】
精製したＤＮＡプローブは、ＥＳＩ法を用いたマススペクトル測定により同定された。図１は、本発明の一実施例におけるＤＮＡプローブのマススペクトルを示す図である。本実施例におけるＤＮＡプローブ５’−ｄ（ＴＴＴＴＴＴＮＴＴＴＴＴＴ）−３’（分子式Ｃ１８２Ｈ２２２Ｎ３４Ｏ９２Ｓ２Ｐ１２）の分子量は、計算値が４７９３．７であり、実測値が４７９３．２であった。【０１７９】
以上のように、蛍光色素を有するヌクレオシドのホスホロアミダイト体を用いることにより、蛍光色素を含むＤＮＡプローブを容易に合成することができた。すなわち、ＤＮＡプローブを合成する際には、ヌクレオシドを導入するためにヌクレオシド付加工程、脱保護工程および精製工程により構成されるセットが繰り返されるが、そのうちの１セットを本発明に係る化合物を用いて行なうことにより、蛍光色素を含むＤＮＡプローブを容易に製造できることが示された。【０１８０】
以上のように、本発明に係る化合物は、既に蛍光色素を含んでおり、ＤＮＡ合成後に蛍光色素を別途導入する必要がない。したがって、本発明によれば、容易かつ低労力にてＤＮＡプローブを製造することが可能であることが示された。【０１８１】
〔実施例４：ＤＮＡプローブを用いたＵＶ吸収スペクトル測定および蛍光スペクトル測定〕
実施例３によって合成されたＤＮＡプローブを用いて、ＵＶ吸収スペクトル測定および蛍光スペクトル測定を行なった。ＵＶ吸収スペクトル測定には、株式会社島津製のＳｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ−２５５０（商品名）分光光度計を用い、蛍光スペクトル測定には、ＲＦ−５３００ＰＣ（商品名）蛍光分光光度計を用いた。【０１８２】
まず、ＤＮＡプローブ５’−ｄ（ＴＴＴＴＴＴＮＴＴＴＴＴＴ）−３’について、ＵＶ吸収測定により濃度を決定した（２６０ｎｍにおけるモル吸光定数ε＝１０５，９００とし、Ｎ＝Ｔと近似した）。【０１８３】
ＵＶ吸収スペクトル測定および蛍光スペクトル測定には、ＤＮＡストランド濃度０．４μＭ、リン酸バッファー５０ｍＭ（ｐＨ７．０）、ＮａＣｌ１００ｍＭの試料を用いた。また、試料中に、ＤＮＡプローブの相補鎖５’−ｄ（ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ）−３’を、０μＭ（すなわち、ＤＮＡプローブのみ。図中、結果をａにて示す）または０．４μＭ（図中、結果をｂにて示す）となるように加えた。蛍光スペクトル測定においては、４８８ｎｍ（１．５ｎｍ幅）の光を励起光として用いた。【０１８４】
これらの測定の結果を図２および図３に示す。図２は、本発明の一実施例におけるＤＮＡプローブのＵＶ吸収スペクトルを示す図であり、図３は、本発明の一実施例におけるＤＮＡプローブの蛍光スペクトルを示す図である。【０１８５】
図２および図３に示すように、ＤＮＡプローブは、相補鎖ＤＮＡと結合することによって蛍光発光することが示された。したがって、本実施例のＤＮＡプローブは、明確な蛍光発光スイッチング機能を備えていることが示された。【０１８６】
〔実施例５〕
実施例３と同様の方法および条件により、ＤＮＡプローブ５’−ｄ（ＴＡＣＣＡＧＮＣＡＣＣＡＴ）−３’（Ｎは、蛍光色素を有するヌクレオシド）を合成し、その後精製した。次に、このＤＮＡプローブを用いて、実施例４と同様の方法および条件により、ＵＶ吸収スペクトル測定および蛍光スペクトル測定を行なった。【０１８７】
これらの測定の結果を図４および図５に示す。図４は、本発明の他の実施例におけるＤＮＡプローブのＵＶ吸収スペクトルを示す図であり、図５は、本発明の他の実施例におけるＤＮＡプローブの蛍光スペクトルを示す図である。なお、図４および図５では、試料中にＤＮＡプローブの相補鎖を加えなかった場合の結果をｃ、相補鎖を加えた場合の結果をｄにて示す。【０１８８】
図４および図５に示すように、ＤＮＡプローブは、相補鎖ＤＮＡと結合することによって蛍光発光することが示された。したがって、本実施例のＤＮＡプローブは、明確な蛍光発光スイッチング機能を備えていることが示された。【０１８９】
〔実施例６：蛍光色素を有するヌクレオシドのＤＭＴｒ体の合成〕
下記反応式（Ｈ）〜（Ｊ）により、下記式（３２）で表される、蛍光色素を有するヌクレオシドのＤＭＴｒ体を合成した。具体的には、ヌクレオシドのＮＨＳ活性体のＤＭＴｒ体と、蛍光色素とをそれぞれ合成した後、蛍光色素を有するヌクレオシドのＤＭＴｒ体を合成した。用いた具体的な方法を以下に示す。【０１９０】
【化３０】
2012091091.tif 000032
【０１９１】
（６−１：5’-O-DMTr 5-(2-Succinimidoxycarbonyl-(E)-vinyl)-2’-deoxyuridineの合成）
まず、ヌクレオシドのＮＨＳ活性体を合成した。【０１９２】
(E)-5-(2-carbxyvinyl)-2’-deoxyuridine（１０ｇ，ＦＷ２９８．２５）とN -hydroxy succinimide（７．７ｇ，ＦＷ１１５．０９）とN,N -Diisopropyl carbodiimide（８．５ｇ，ＦＷ１２６．２０）とに、ＤＭＦ（６０ｍｌ）を加えて、２５℃で４時間撹拌した。酢酸（９３．８ｍｌ）を加え、ジクロロメタン（３００ｍｌ）と水（３００ｍｌ）との混合溶液を激しく撹拌した中に滴下した。生じた沈殿をろ過し、超純水で洗浄し、乾燥した。【０１９３】
次に、下記式（３０）で表される、ヌクレオシドのＮＨＳ活性体のＤＭＴｒ体を合成した。【０１９４】
【化３１】
2012091091.tif 000033
【０１９５】
得られた沈殿（２ｇ，ＦＷ３９５．３２）とＤＭＴｒＣｌ（１．９ｇ，ＦＷ２２８．８３）とにピリジン（ｐｙｒｉｄｉｎｅ）（２０ｍｌ）を加え、２５℃で終夜撹拌した。塩化ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。エバポレーションで溶媒を留去し、シリカゲルカラムで分離した（２−１０％ＭｅＯＨ，１％Ｅｔ３Ｎ／ＣＨ２Ｃｌ２）。目的化合物を含むフラクションの溶媒をエバポレーションで留去した。少量のジクロロメタンに溶解し、ヘキサンを加え、沈殿をろ過し、ヘキサンにより洗浄し、乾燥した。目的化合物１．６ｇ（ＦＷ６９７．６９，収率４６％）を白色粉末として得た。当該目的化合物の測定データは以下に示す。【０１９６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：８．０７（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．２８（ｍ，６Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），７．１１（ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，１Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝１５．７Ｈｚ，１Ｈ），６．８５（ｍ，４Ｈ），６．２１（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），４．４６（ｑ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，１Ｈ），４．１１（ｄｄ，Ｊ＝６．６，３．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），３．６６（ｓ，２Ｈ），３．３７（ｓ，２Ｈ），２．６５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），２．５４（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），２．４５（ｄｄｄ，Ｊ＝１３．８，６．３，３．２Ｈｚ，１Ｈ），２．３８ｐｐｍ（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ）。【０１９７】
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：１７４．４，１７１．９，１６６．８，１６３．４，１６０．２３，１６０．２１，１５０．９，１４５．９，１４５．５，１３６．９，１３６．６，１３１．３，１３１．２，１２９．２，１２８．９，１２８．１，１１４．２７，１１４．２５，１１０．０，８８．３７，８８．０６，７２．７１，６４．９６，５５．７７，５２．２９，４７．７３，４２．０３，２９．８４，２８．３６，２６．５０，９．３７ｐｐｍ。【０１９８】
（６−２：N,N-bis({[3-(4-valeryl)benzoxazol-2-ylidene]methyl}quioline))-2-amidoethyl)ethylamineの合成）
次に、下記式（３１）で表される蛍光色素を合成した。【０１９９】
【化３２】
2012091091.tif 000034
【０２００】
4-{[3-(4-Carboxybutyl)benzoxazol-2-ylidene]methyl}quinoline（１．９ｇ，ＦＷ３７６．４７）とＰｙＢＯＰ（５．２ｇ，ＦＷ５２０．３９）とに、ＤＭＦ（１０ｍｌ）を加えて、２５℃で３０分撹拌した。反応溶液をトリス（２−アミノエチル）アミン（３１４ｍｇ，ＦＷ１４６．２３）のＤＭＦ（１０ｍｌ）溶液に滴下し、２５℃で終夜撹拌した。溶媒をエバポレーションで留去し、シリカゲルカラムで分離した（７−２０％ＭｅＯＨ，１％Ｅｔ３Ｎ／ＣＨ２Ｃｌ２）。目的化合物を含むフラクションの溶媒をエバポレーションで留去した。少量のメタノールに溶解し、ジエチルエーテルを加え、沈殿をろ過し、乾燥した。目的化合物５９３ｍｇ（ＦＷ８６３．１５，収率２８％）を橙色粉末として得た。当該目的化合物の測定データは以下に示す。【０２０１】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：８．７２（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ），８．３５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．９２（ｄｄ，Ｊ＝８．３，１．２Ｈｚ，２Ｈ），７．８４（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），７．６９（ｍ，２Ｈ），７．６１（ｄｄ，Ｊ＝７．７，１．１Ｈｚ，２Ｈ），７．５５（ｍ，２Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，２Ｈ），７．３０（ｍ，２Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．０３（ｔｄ，Ｊ＝７．６，０．９０Ｈｚ，２Ｈ），６．４４（ｓ，２Ｈ），４．１７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，４Ｈ），３．０５（ｄｄ，Ｊ＝１２．５，６．６Ｈｚ，４Ｈ），２．７３（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），２．３８（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，４Ｈ），２．１７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，４Ｈ），１．７０ｐｐｍ（ｍ，８Ｈ）。【０２０２】
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：１７２．１，１４９．７，１４８．５，１４８．１，１４２．５，１４１．２，１２９．３，１２９．０，１２６．９，１２５．４，１２５．３，１２３．９，１２２．４，１２１．９，１２１．４，１１３．２，１０９．５，８４．４，５４．９，５３．６，４３．９，３７．０，３６．７，３５．０，２５．５，２２．７，７．４ｐｐｍ。【０２０３】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ５０Ｈ５４Ｎ８Ｏ２Ｓ２（［Ｍ＋Ｈ］＋）８６３．３９，ｆｏｕｎｄ  ８６３．３９０７。【０２０４】
（６−３：5’-O-DMTr-5-(2-[2-{N,N-bis({[3-(4-valeryl)benzoxazol-2-ylidene]methyl}quioline)-2-amidoethyl)aminoethyl]carbomoyl-(E)-vinyl)-2-deoxyuridineの合成）
次に、下記式（３２）で表される、蛍光色素を有するヌクレオシドのＤＭＴｒ体を合成した。【０２０５】
【化３３】
2012091091.tif 000035
【０２０６】
5’-O-DMTr 5-(2-Succinimidoxycarbonyl-(E)-vinyl)-2’-deoxyuridine（５００ｍｇ，ＦＷ６９７．６９）とN,N-bis({[3-(4-valeryl)benzoxazol-2-ylidene]methyl}quioline))-2-amidoethyl)ethylamine（６２１ｍｇ，ＦＷ８６３．１５）とに、ＤＭＦ（１０ｍｌ）を加え、２５℃で２時間撹拌した。反応溶液にＤＭＡＰ（８．８ｍｇ，ＦＷ１２２．１７）を添加し、２５℃で終夜撹拌した。溶媒はエバポレーションで留去し、シリカゲルカラムで分離した（７−１５％ＭｅＯＨ，１％Ｅｔ３Ｎ／ＣＨ２Ｃｌ２）。少量のメタノールに溶解し、ジエチルエーテルを加え、沈殿をろ過し、乾燥した。粉末を水で洗浄し、ろ過し、乾燥した。目的化合物２５６ｍｇ（ＦＷ１４４５．７５，収率２５％）を橙色粉末として得た。当該目的化合物の測定データは以下に示す。【０２０７】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：８．５７（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），８．４８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．８１（ｍ，９Ｈ），７．５８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．４５−７．１５（ｍ，１６Ｈ），７．０８（ｓ，２Ｈ），６．８５（ｄｄ，Ｊ＝８．９，６．０Ｈｚ，４Ｈ），６．６４（ｓ，２Ｈ），６．１１（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），５．２８（ｓ，１Ｈ），４．３５（ｍ，４Ｈ），４．２０（ｍ，１Ｈ），３．８７（ｄｄ，Ｊ＝９．５，４．２Ｈｚ，１Ｈ），３．６９（ｓ，３Ｈ），６．６８（ｓ，３Ｈ），３．１９−３．０６（ｍ，１０Ｈ），２．４４（ｍ，４Ｈ），２．２６（ｑｕｉ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），２．１７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，４Ｈ），１．７１ｐｐｍ（ｍ，８Ｈ）。【０２０８】
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：１７２．０，１６５．７，１６１．７，１５８．０，１５４．４，１４９．２，１４６．３，１４４．８，１４３．９，１４２．７，１４１．５，１４０．４，１３５．５５，１３５．４６，１３２．３，１３１．１，１２９．６，１２７．８，１２７．６，１２７．５，１２６．６，１２６．２，１２４．４，１２３．９，１２３．８，１２３．１，１２３．０，１２２．４，１２１．８，１１３．２，１１１．３，１１０．１，１０９．３，８６．０，８５．６，８４．７，７０．２，６３．９，５５．０，５４．９，５３．４，５３．２，４４．８，３４．８，２５．９，２２．５ｐｐｍ。【０２０９】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ８３Ｈ８５Ｎ１０Ｏ１０Ｓ２（［Ｍ＋Ｈ］＋）１４４５．５９，ｆｏｕｎｄ１４４５．５９３０１。【０２１０】
以上の方法を用いることにより、より高い合成効率を得ることができる。この方法により合成した蛍光色素を有するヌクレオシドのＤＭＴｒ体は、実施例２の２−３に記載した方法を用いてアミダイト化することによって、色素含有ホスホロアミダイト化合物とすることができる。
【産業上の利用可能性】
【０２１１】
本発明は、エキシトン効果を示す色素を有する核酸の製造を容易に行なうことができるので、プライマー、検出対象を効果的に検出できるプローブ、標識物質等およびこれらの製造に好適に利用することができる。したがって、本発明は、研究用、臨床用、診断用、試験管内遺伝子検出用、生体内遺伝子検出用などの幅広い用途のための核酸およびその製造に好適に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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