(57)【要約】  外表面が親水性であって、中空シリンダー内表面が疎水化された内表面疎水化有機ナノチューブであって、下記一般式（１）で表わされる非対称双頭型脂質分子と共に、下記一般式（２）で表されるその誘導体が含まれており、かつ二成分系自己集合により形成されている内表面疎水化有機ナノチューブを提供した。【化１】
2012153576.tif 000036
【化２】
2012153576.tif 000037
式（１）及び式（２）において記号の意味は同一であり、式中、Ｇは１−グルコピラノシル基または２−グルコピラノシル基であり、ｎは１２〜２２の整数である。  特に、前記一般式（１）及び（２）において、ｎ＝１８〜２２の整数、Ｚ１＝Ｚ２＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍは同一もしくは異なる３〜６の整数、Ｘ＝ＯＨ、Ｒが、メトキシ基、エトキシ基、またはベンジルオキシ基の場合の非対称双頭型脂質分子及びそのエステルは、新規物質であり、単独でも、二成分系でも自己集合によりカルボン酸系非対称ナノチューブを形成する。
2012153576.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表わされる非対称双頭型脂質分子と共に、下記一般式（２）で表されるその誘導体が含まれており、かつ二成分系自己集合により形成されている内表面疎水化有機ナノチューブ；
【化１】
2012153576.tif 000027
【化２】
2012153576.tif 000028
式（１）及び式（２）において記号の意味は同一であり、式中、Ｇは１−グルコピラノシル基または２−グルコピラノシル基である。
ｎは１２〜２２の整数である。
【化３】
2012153576.tif 000029
Ｘは、ＹがＧｌｙのときＯＨであり、ＹがｙｌＧのときＨである。
Ｒは、ベンジルオキシカルボニル基、t−ブトキシカルボニル基、９−フルオレニルメトキシカルボニル基、アセチル基、エチルカルボニル基、プロピルカルボニル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、ベンジルオキシ基、または疎水性アミノ酸である。
【請求項２】
前記Ｒが、炭素数１〜４のアルコキシ基のうち、メトキシ基、エトキシ基、もしくはt−ブトキシ基であるか、または疎水性アミノ酸のうち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、もしくはトリプトファンである、請求項１に記載の内表面疎水化有機ナノチューブ。
【請求項３】
前記一般式（１）及び（２）において、式中、ｎ＝１８〜２２の整数、Ｚ1＝Ｚ2＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍは同一もしくは異なる３〜６の整数、Ｘ＝ＯＨ、Ｒが、メトキシ基、エトキシ基、またはベンジルオキシ基であって、それぞれ下記一般式（５）及び一般式（６）で表される非対称双頭型脂質分子から形成されるカルボン酸系非対称ナノチューブであることを特徴とする、請求項１に記載の内表面疎水化有機ナノチューブ；
【化７】
2012153576.tif 000030
（式中、ｎは１８〜２２の整数、ｍは３〜６の整数を表す。）
【化８】
2012153576.tif 000031
（式中、ｎは一般式（１）のｎと同じ意味を表す。ｍは同一もしくは異なる３〜６の整数を表す。Ｒは炭素数１〜４の直鎖状アルキル基を表す）。
【請求項４】
下記一般式（５）又は一般式（６）で表される非対称双頭型脂質分子もしくはその塩又はそのエステル；
【化７】
2012153576.tif 000032
（式中、ｎは１８〜２２の整数、ｍは３〜６の整数を表す。）
【化８】
2012153576.tif 000033
（式中、ｎは一般式（５）のｎと同じ意味を表す。ｍは同一もしくは異なる、３〜６の整数を表す。Ｒは炭素数１〜４の直鎖状アルキル基を表す）。
【請求項５】
請求項４に記載の非対称双頭型脂質分子もしくはその塩、又はそのエステルのいずれかが単独で又は両者が混合された状態で自己集合により形成された、カルボン酸系非対称ナノチューブ。
【請求項６】
水性溶媒中において、一般式（１）で表わされる非対称双頭型脂質分子と共に、一般式（２）で表されるその誘導体を混合し、二成分自己集合させることを特徴とする、請求項１〜３及び５のいずれか１項に記載の内表面疎水化有機ナノチューブの製造方法。
【請求項７】
下記一般式（５）又は（６）で表わされる非対称双頭型脂質分子又はそのエステルを、単独で又は両者を混合してジメチルスルホキシドやジメチルホルムアミドまたは水に分散し、加熱溶解後冷却することを特徴とする、カルボン酸系非対称ナノチューブの製造方法。
【化７】
2012153576.tif 000034
（式中、ｎは１８〜２２の整数、ｍは３〜６の整数を表す。）
【化８】
2012153576.tif 000035
（式中、ｎは一般式（１）のｎと同じ意味を表す。ｍは同一もしくは異なる、３〜６の整数を表す。Ｒは炭素数１〜４の直鎖状アルキル基を表す）。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の内表面疎水化有機ナノチューブを有効成分として含むタンパク質リフォールディング剤。
【請求項９】
変性タンパク質を、請求項１又は２に記載の内表面疎水化有機ナノチューブと共に水性溶媒中において分散させることにより、当該有機ナノチューブ内に包接させることを特徴とする、変性タンパク質のリフォールディング方法。
【請求項１０】
変性タンパク質を、前記非対称双頭型脂質分子とその誘導体とを混合して二成分自己集合させる際の水性媒体中に添加しておくことを特徴とする、請求項９に記載のリフォールディング方法。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載の内表面疎水化有機ナノチューブの疎水性中空シリンダー内に変性タンパク質が包接されている、リフォールディングされた正常タンパク質の放出用組成物。
【請求項１２】
請求項１〜３及び５のいずれか１項に記載の内表面疎水化有機ナノチューブを有効成分として含む疎水性薬剤徐放用カプセル化製剤。
【請求項１３】
疎水性薬剤を、請求項１〜３及び５のいずれか１項に記載の内表面疎水化有機ナノチューブと共に水性溶媒中において分散させることにより、当該有機ナノチューブ内に包接させることを特徴とする、疎水性薬剤のカプセル化方法。
【請求項１４】
疎水性薬剤を、前記非対称双頭型脂質分子とその誘導体とを混合して二成分自己集合させる際の水性媒体中に添加しておくことを特徴とする、請求項１３に記載のカプセル化方法。
【請求項１５】
請求項１〜３及び５のいずれか１項に記載の内表面疎水化有機ナノチューブの疎水性中空シリンダー内に疎水性薬剤が包接されていることを特徴とする、カプセル化された疎水性薬剤組成物。
【請求項１６】
請求項１２に記載の疎水性薬剤徐放用カプセル化製剤が、請求項３又は５に記載のカルボン酸系非対称ナノチューブを有効成分として含むカチオン性薬剤徐放用である、疎水性薬剤徐放用カプセル化製剤。
【請求項１７】
請求項１５に記載の疎水性薬剤組成物が、請求項３又は５に記載のカルボン酸系非対称ナノチューブがカチオン性薬剤を包接し、カチオン性薬剤−非対称ナノチューブ複合体を形成している、カプセル化された疎水性薬剤組成物。
【請求項１８】
請求項３又は５に記載のカルボン酸系非対称ナノチューブがカチオン性薬剤を包接していることを特徴とする、カチオン性薬剤−非対称ナノチューブ複合体。
【請求項１９】
前記請求項１８に記載のカチオン性薬剤−非対称ナノチューブ複合体を有効成分とする、カチオン性薬剤組成物。
【請求項２０】
カチオン性薬剤がアミノ基を有するアントラサイクリン系抗癌剤である、前記請求項１９に記載のカチオン性薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外表面が親水性であって、中空シリンダー部分の内表面が疎水化された中空繊維状ナノチューブ（内表面疎水化有機ナノチューブ）及びその製造方法、並びに当該内表面疎水化有機ナノチューブを用いた変性タンパク質のリフォールディング方法、及び疎水性薬剤のカプセル化方法、徐放方法とその制御に関する。
【背景技術】
【０００２】
的確な分子設計が施された両親媒性分子が水中で自己集合することによって可逆的に形成するチューブ状構造体は、内外表面が親水基で被覆されており、水中へ容易に分散すると共に、その内径５〜１００ｎｍの親水性中空シリンダーには、低分子のみならず、タンパク質（天然状態の）やＤＮＡといった生体高分子、種々のナノ粒子等の親水性ゲストを包接可能である。また、ｐＨ、温度、光、添加剤等の外部刺激に応答して、包接した親水性ゲストの貯蔵と放出の制御が可能であり、特にバイオや医療分野で注目を集めている(非特許文献１)。これらの諸特性を用いることで、薬剤送達用および薬剤徐放用のカプセルやタンパク質などの固定マトリクスおよび保存カプセル等への応用が期待されている（非特許文献２、３）。しかし、従来の大多数の有機ナノチューブは、内外表面が同じ親水部で被覆されているため、薬剤やタンパク質などの材料を有機ナノチューブ内部へ選択的かつ効率的にカプセル化することは困難であった（非特許文献４，５，６）。具体的には、諸材料のカプセル化に際し、有機ナノチューブ内部の水を減圧下での凍結乾燥などで除去した後、材料を分散・溶解させた水溶液を添加し再水和させる（いわゆる毛細管現象）という煩雑な操作が必要とされていた（非特許文献４，５）。
本発明者らは、これまでに疎水部アルキレン鎖の両端に異なる二つの親水基を有する非対称双頭型脂質分子の水中での自己集合により、内外表面がそれぞれの親水基で被覆された単分子膜構造から成る有機ナノチューブ（非対称有機ナノチューブ）の製造技術を開発している（特許文献１、非特許文献１）。最近、２−グルコサミンとオリゴグリシンが長鎖ジカルボン酸の両端にそれぞれアミド結合を介して結合した非対称双頭型脂質分子であり、ドキソルビシンなどアミノ基含有薬剤などを包接して徐々に放出することができ、優れた薬剤カプセルとしての特性を備えた非対称ナノチューブを開発して、特許出願している（特願２０１０−１９４５４４号）。非対称有機ナノチューブの内表面には、親水性ゲストと相互作用可能な官能基を位置特異的に配置できるため、親水性ゲストを選択的且つ効率的に非対称有機ナノチューブの中空シリンダーに包接できる。また外部から刺激を与え、非対称有機ナノチューブ内表面と親水性ゲスト間の相互作用を減ずることで、親水性ゲストのバルク中への放出も制御可能である。例えば、非対称有機ナノチューブ内表面に配置したアミノ基のプロトン化によりカチオン性を帯びた中空シリンダー内には、アニオン性の親水性ゲストとして、低分子、オリゴDNA、二重らせんDNA、タンパク質、ナノ粒子等の選択的且つ効率的包接が可能であった。外部刺激として、溶液中のpHを変化させ、非対称有機ナノチューブ内表面アミノ基の脱プロトン化を行うことで、包接していた親水性ゲストをバルク中へと徐放可能であった。【０００３】
薬剤を簡便かつ効率的にカプセル化し、安定に保持するとともに、ガン細胞など病変部位のタ−ゲット細胞や組織内で持続的に放出できるカプセル化剤の開発が望まれている。特にがん治療において広く用いられるドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ピラルビシンなどのアントラサイクリン系抗癌剤は、毒性、特に心臓毒性が強いため、癌細胞に直接効果的に送達し、かつ持続的な徐放が可能な優れたカプセル化剤が求められていた。また薬剤の投与回数や投与量を抑制し、結果として患者の負担軽減ができる観点から、薬剤徐放速度の制御技術が強く望まれていた。
このような観点から行われた、リポソ−ム系薬剤ナノカプセル（非特許文献7）の場合は、ｐＨ勾配を用い、その後の精製が必要なため、調製が複雑で長時間必要であった。
これに対して、本発明者らの以前に開発した親水性ゲストを中空シリンダー内に包接できる上記非対称ナノチューブ（特願２０１０−１９４５４４号など）は、カルボン酸性内表面を有しているため、ドキソルビシンを含め、アミノ基含有薬剤などに対しては、ナノチューブと薬剤を水中で混合するだけで、簡便かつ効率的に薬剤のカプセル化が可能となり、周囲のｐＨ変化に応じた徐放機能もあるという優れた特性を備えているので、薬剤カプセルとしての応用に極めて有効なものである。
しかしながら、本発明者らが開発した従来の非対称ナノチューブの場合、生理的な条件下で、カプセル化した薬剤の徐放特性を精密に制御する方法論が無いことと共に、チューブ自体の安定性に関しても依然として下記の問題点があり、厳密な徐放制御の課題が解決されたものとはいえなかった。
具体的には、従来のカルボン酸系の非対称双頭型脂質分子群では、生理的条件下で早いものでは２時間放置しただけで、最長でも１２時間近くさらすと、徐々に非対称ナノチューブから別の形態に変化してしまい、薬剤徐放特性が失われるという問題があった。より具体的には１−グルコピラノシル基が長鎖ジカルボン酸の一端でアミド結合を介して結合した脂質分子が形成する非対称ナノチューブ（非特許文献８）は、生理的条件下（例えばＰＢＳバッファー、ｐＨ７.５）で、約４時間後で徐々に外径１２０ｎｍ〜２００ｎｍ程度のマイクロチューブや針状結晶などに変化する。さらには、従来の非対称ナノチューブは、その製造過程において、マイクロチューブやテープ状の集合体が同時に生成してしまうため、遠心分離などによるナノチューブの分離精製工程が必要であった。加えて、室温下または冷蔵での長期保存の際に結晶化しやすく、長期的保存安定性がそれほど高くない問題点もあった。
このようなナノチューブ製造時に分離精製が必要で、ナノチューブ状態が長期保存安定性に欠けるという問題点は、上記カルボン酸系非対称双頭型脂質分子のカルボン酸末端側の領域に、モノおよびジグリシン残基を導入した非対称双頭型脂質分子が開発されたことでかなり解決でき、当該脂質分子により形成される非対称ナノチューブではミリＱ水中で長期保存性も高まった（非特許文献９，１０）。しかしながら、これら非対称ナノチューブにおいても、生理的条件下（ＰＢＳバッファー、ｐＨ７.５）にさらすと、ナノチューブの内径が７ｎｍ前後であったものが５０ｎｍ前後にまで変化するという点に課題が残っていた（実施例５において後述）。
本発明者らの最近開発した非対称有機ナノチューブ（特願２０１０−１９４５４４号)でも、生理的条件下に数時間さらすと、ファイバー状構造に変化してしまう問題点は解決しておらず、生体に薬剤カプセルとして投与する際の徐放性のさらなる向上が必要であり、より厳密な徐放制御が求められる。【０００４】
また、上述のように、病変部に直接薬剤を届けようとするデリバリーシステムで対象となる薬剤は、ドキソルビシンをはじめ抗癌剤などでは、疎水性の高い薬剤が多く、疎水性ゲストを病変部まで運搬し、かつ病変部において徐々に放出することができるカプセル化剤が不可欠である。
従来の疎水性分子を内包させる技術として、シクロデキストリンの１nm前後の空孔に包接可能な疎水性低分子に限っては、シクロデキストリンとの複合体を形成させることで、両親媒性分子による有機ナノチューブの親水性中空シリンダーに包接可能であり、また水中に放出させることもできる（特許文献２）。しかしながら、複合体の調製には煩雑な操作を必要とするだけでなく、その収率は低い。また、当該文献中に記載されている有機ナノチューブは二分子膜構造をとるため内外表面が同一の親水基で覆われているので、シクロデキストリン複合体を中空シリンダー内に選択的に包接することはできず、中空シリンダー内表面とシクロデキストリン複合体との間に特別な相互作用がないので、放出を制御することもできない。
１ｎｍ〜３ｎｍの疎水性低分子を有機ナノチューブの膜壁内に分散して包埋するインターカレート型の有機ナノチューブが開発されており（特許文献３）、有機ナノチューブの形態を維持したまま、脂質分子に対して１０％程度の疎水性低分子の包埋が可能であり、水中に分散させることもできる。しかしながら、膜壁内に包埋された疎水性低分子を放出させるには、有機ナノチューブを添加剤により分解したり、またゲル−液晶相転移温度以上への加熱によって膜壁を流動状態にする必要がある（非特許文献１１）。この場合、疎水性低分子の放出は比較的速く起る。
内外表面が共に疎水基で被覆された有機ナノチューブも開発されてはいるが、疎水性低分子や疎水性ナノ粒子等を吸着するのは内外表面であり、むしろ外表面に主に吸着されるため（特許文献４）、当然のことながら、当該有機ナノチューブは疎水性分子を水中へ分散させることはできない。
このように、外表面は親水性であり内表面のみが疎水化された有機ナノチューブであって、疎水性の中空シリンダー内部が十分なスペースを有し、かつ内表面と疎水性ゲストが直接相互作用可能で、しかも有機ナノチューブの形態を保ったまま疎水性ゲストを放出させることができる有機ナノチューブは未だに実現されておらず各界から切望されていた。このような有機ナノチューブを構築することができれば、疎水性低分子のみならず疎水性高分子、疎水性ナノ構造体を選択的に中空シリンダーに包接し、水中へ分散することが可能であり、従来技術（特許文献２）と異なり、有機ナノチューブ内表面と疎水性ゲストが直接相互作用可能であるため、外部からの刺激でその相互作用を減じることができれば、放出の制御も可能である。また、従来技術（特許文献３）のように有機ナノチューブを分解させたり、膜壁を流動状態にしなくても有機ナノチューブの形態を保ったまま疎水性ゲストを放出させることができる。
そして、本発明者らの最近開発した上述の非対称有機ナノチューブ（特願２０１０−１９４５４４号)でも、ドキソルビシンのような疎水性の高い薬剤の場合など疎水性ゲストの場合には充分な徐放特性が得られない点、及び厳密な徐放制御の観点からは充分なものとはいえなかった。【０００５】
ところで、疎水性分子の包接に関しては、従来から、遺伝子組換えタンパクなどに対する効率の良いリフォールディングについての要望もあった。
すなわち、変性により疎水基が一部露出したタンパク質（変性タンパク質）を包接可能なナノ空間材料の開発が、正常タンパク質の大量調製という観点から、工業的にも切望されている。多孔質無機材料であるβ−ゼオライトは、変性タンパク質の吸着が可能である（非特許文献１２）。変性剤を洗浄後、ポリエチレングリコ−ルや界面活性剤を含む緩衝液を加えると、β−ゼオライトからタンパク質が脱離し、正常な構造へと巻き戻る（リフォールディング）ことが報告されている。また、親水性高分子である多糖に疎水基としてコレステリル基を導入した両親媒性高分子は、水中で自己集合して２０〜３０ｎｍのゲル（ナノゲル）を形成する（非特許文献１３）。ナノゲルの内部空間に変性タンパク質を包接化した後、シクロデキストリンを添加することでナノゲルを崩壊させると、タンパク質の放出と同時にリフォールディングが起こることが報告されている（非特許文献１４）。しかしながら、β−ゼオライト、ナノゲル、どちらの系においても、得られてくるタンパク質溶液には、ポリエチレングリコ−ルや界面活性剤、シクロデキストリン、そしてシクロデキストリンと疎水化多糖の複合高分子が含まれており、それら他成分を除去するための煩雑な分離操作が必要となる。【０００６】
以上の技術的な背景から、上記の全ての課題を解決できる中空シリンダー部分の内表面のみが疎水化された有機ナノチューブ（内表面疎水化有機ナノチューブ）の開発が強く期待されていた。すなわち、疎水性ゲストとして変性タンパク質を選択的且つ効率的に包接可能なだけでなく、リフォールディングを補助する機能を有し、特別な添加剤を加える必要無く正常タンパク質を放出できる内表面疎水化有機ナノチューブの提供が切望されていた。また、疎水性ゲストとしてドキソルビシン等の薬剤を選択的且つ効率的に包接可能なだけでなく、外部環境に応じて薬剤をバルク中へと徐放できる内表面疎水化有機ナノチューブの提供が切望されていた。
特に薬剤徐放制御において、内表面がカルボキシル基で被覆された安定なカルボン酸系の非対称ナノチューブ群における従来からの優れた特性は維持しつつ、かつ生理的条件下（例えばＰＢＳバッファー中、ｐＨ７.５、３５℃）においても長時間に亘り安定なチューブ構造を維持することが可能な非対称ナノチューブを提供すること、及びそのための新規な非対称双頭型脂質分子を提供することが強く期待されていた。すなわち、マイルドな条件で非対称ナノチューブを選択的かつ高収率に製造でき、得られる非対称ナノチューブが長期保存安定性を有すると共に、ドキソルビシンなどのカチオン性薬剤を効率的に高濃度でカプセル化でき、しかも生理的条件下でそのチューブ形態が安定である、という全ての条件を満たすような、徐放制御に優れたナノチューブ状カプセル化物を製造できる非対称双頭型脂質分子の提供が切望されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４１７４７０２号公報
【特許文献２】特開２００９−１３６９７５号公報
【特許文献３】特開２００８−２６４８９７号公報
【特許文献４】特開２０１０−００５７０６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】亀田ら,  高分子論文集  67,  560  (2010).
【非特許文献２】Chia-Chun, C. et al., Advanced Materials, 17,404(2005).
【非特許文献３】Martin, C. et al., Adv. Mater.,18,405(2006).
【非特許文献４】Shimizu, T. et al., Chem. Mater.,16, 2826 (2004).
【非特許文献５】Yui, H. et al., Chem. Lett., 34,232(2005).
【非特許文献６】“環状・筒状超分子新素材の応用技術”、高田十志和  編集、シーエムシー出版、東京、P138-149(2006).
【非特許文献７】O'Brien, M.E., Ann. Oncol., 15,440(2004).
【非特許文献８】Masuda, M. et al., Langmuir, 20, 5969(2004).
【非特許文献９】Lee, S.J., 第５８回高分子討論会予稿集, 発表番号1Pe047 (2009).
【非特許文献１０】Lee, S.J., The 1st FAPS Polymer Congress,Abstract,(Nagoya), Poster No. 22PS2-006b (2009).
【非特許文献１１】Kameta, N. et al., Soft Matter, 7, 85 (2011).
【非特許文献１２】Mizukami, F., Anal. Biochem., 348. 307 (2006).
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【非特許文献１５】Kameta, N., et al., Small, 4, 561 (2008).
【非特許文献１６】Lubineau, A., Carbohydr. Res., 266,211(1995).
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【非特許文献１８】Kameta, N. et al., Chem. Mater.,21,5892(2009).
【非特許文献１９】N.Kameta et al., Langmuir 23, 4634 (2007).
【非特許文献２０】N.Kameta et al., Chem. Lett. 36, 896 (2007).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、外表面が親水性、中空シリンダー部分の内表面のみが疎水化された有機ナノチューブ（内表面疎水化有機ナノチューブ）を提供しようとするものである。また、変性タンパク質を選択的且つ効率的に包接可能なだけでなく、リフォールディングを補助する機能を有し、特別な添加剤を加える必要無く正常タンパク質を放出できる内表面疎水化有機ナノチューブであって、しかも、ドキソルビシンなどの疎水性薬剤を高濃度に包接可能であり、その内表面の疎水性変化や外部刺激に応じて徐放機能を有する内表面疎水化有機ナノチューブ、及び包接化組成物を提供することを目的とする。さらには、生理的条件下で安定なチューブ構造を維持することが可能な、内表面がカルボキシル基とそのエステル又はさらに疎水性アミド誘導体との混合物で被覆された非対称ナノチューブを形成することができる新規な非対称双頭型脂質分子を提供しようとするものである。また、これら非対称双頭型脂質分子を用いることで、ドキソルビシンなどのカチオン性薬剤を効率的に高濃度でカプセル化でき、かつ生理的条件下でチューブ構造を損なうことなく、同薬剤の徐放にすぐれた非対称ナノチューブを形成させることを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、以前疎水部メチレン鎖の両端に親水部として1−グルコピラノシル残基とオリゴグリシン残基を有する非対称双頭型脂質分子とそのオリゴグリシン末端アミノ基に親水性蛍光プロ−ブＡｌｅｘａを連結した誘導体の二成分系自己集合により、外表面が1−グルコピラノシル基、内表面がオリゴグリシンアミノ基とＡｌｅｘａで被覆された非対称有機ナノチューブを形成することを報告した（非特許文献１５）。
今回新たに、下記一般式（１）で表わされる非対称双頭型脂質分子とその誘導体であり末端に疎水性官能基を有する一般式（２）の二成分系自己集合により、内表面のみに疎水性官能基が配置された有機ナノチューブ（内表面疎水化有機ナノチューブ）を形成できることを見出した。
内表面疎水化有機ナノチューブは、一般式（１）のみで形成される有機ナノチューブと比較し、疎水基が露出した変性タンパク質の中空シリンダー内への包接化率、正常タンパク質へのリフォールディング効率共に高いことが明らかとなった。この中空シリンダー内の正常タンパク質は、添加剤を必要とすることなく、ｐＨ刺激によりバルク水中へと放出させることも可能であった（リフォールディング機能）。
また、内表面疎水化有機ナノチューブは、一般式（１）のみで形成される有機ナノチューブと比較し、より多くの疎水性薬剤を包接でき、分散溶媒のｐＨ変化により中空シリンダー内に包接した疎水性薬剤をバルク水中へと放出できることを見出した。驚くべきことに、一般式（１）と一般式（２）の比率を変えて内表面の疎水性を変化させることで、疎水性薬剤の徐放性が制御できることが明らかとなった（疎水性薬剤徐放性制御機能）。【００１１】
さらに、上記の内表面疎水化ナノチューブを構成している一般式（１）で表わされる非対称双頭型脂質分子、およびそのエステルのうち、オクタデカメチレン鎖以上の長さを持つ疎水部アルキル鎖の片端にグルコピラノシル基、もう一端にカルボン酸を有する非対称双頭型脂質分子であって、１又は２残基からなるオリゴグリシンを含む脂質分子（非特許文献９，１０）において、オリゴグリシン残基をさらに３〜６残基にまで増加させた、新規な非対称双頭型脂質分子を合成した。この新規な非対称双頭型脂質分子は、従来の非対称双頭型脂質分子と同様に、自己集合によりカルボン酸系非対称ナノチューブを形成し、しかも、生理的条件下におけるチューブ状構造の安定性が飛躍的に高まることを見出した。具体的には、生理的条件下に３２時間以上放置しても安定なチューブ状構造を維持していた。非対称双頭型脂質分子の末端カルボン酸を、メチルエステルなどのエステルに置換した場合も同様に安定な非対称ナノチューブを形成できることを確認した。
また、上記非対称双頭型脂質分子は、末端に遊離カルボキシル基を有する場合も、エステル基を有する場合も、単独でも混合した場合でも非対称ナノチューブを形成できる。このカルボン酸系非対称ナノチューブは、驚くべきことに薬剤のカプセル化効率も格段に高まり、本発明者らが以前開発したカルボン酸系非対称ナノチューブ（特願２０１０−１９４５４４号）と比較しても、ミリＱ水中でドキソルビシンをカプセル化する際の効率が、ｐＨ６.５、ナノチューブとドキソルビシンの仕込み比が５／１の時に、７５％から９５％以上に改善され、定量的なカプセル化が可能になったばかりでなく（図１８）、生理的条件下での徐放特性も格段に優れていることが明らかとなった（図１９）。
さらに、本非対称ナノチューブは、ｐＨを、弱酸性条件（ｐＨ５.５）とすることで、中性条件（ｐＨ７.４）に較べて２倍以上の速度で放出する特性を有しており、一般的にがん組織は他の正常組織と較べて弱酸性（ｐＨ６.５）側であることからみて、本非対称ナノチューブを抗癌剤用の薬剤カプセルとして用いれば、ガン組織で選択的に薬剤の放出が期待できる。【００１２】
具体的には、本発明は以下の通りである。
〔１〕  下記一般式（１）で表わされる非対称双頭型脂質分子と共に、下記一般式（２）で表されるその誘導体が含まれており、かつ二成分系自己集合により形成されている内表面疎水化有機ナノチューブ；
【化１】
2012153576.tif 000003
【化２】
2012153576.tif 000004
式（１）及び式（２）において記号の意味は同一であり、式中、Ｇは１−グルコピラノシル基または２−グルコピラノシル基である。
ｎは１２〜２２の整数である。
【化３】
2012153576.tif 000005
Ｘは、ＹがＧｌｙのときＯＨであり、ＹがｙｌＧのときＨである。
Ｒは、ベンジルオキシカルボニル基、t−ブトキシカルボニル基、９−フルオレニルメトキシカルボニル基、アセチル基、エチルカルボニル基、プロピルカルボニル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、ベンジルオキシ基、または疎水性アミノ酸である。
〔２〕  前記Ｒが、炭素数１〜４のアルコキシ基のうち、メトキシ基、エトキシ基、もしくはt−ブトキシ基であるか、または疎水性アミノ酸のうち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、もしくはトリプトファンである、〔１〕に記載の内表面疎水化有機ナノチューブ。
〔３〕  前記一般式（１）及び（２）において、式中、ｎ＝１８〜２２の整数、Ｚ１＝Ｚ２＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍは同一もしくは異なる３〜６の整数、Ｘ＝ＯＨ、Ｒが、メトキシ基、エトキシ基、またはベンジルオキシ基であって、それぞれ下記一般式（５）及び一般式（６）で表される非対称双頭型脂質分子から形成されるカルボン酸系非対称ナノチューブであることを特徴とする、〔１〕に記載の内表面疎水化有機ナノチューブ；
【化７】
2012153576.tif 000006
（式中、ｎは１８〜２２の整数、ｍは３〜６の整数を表す。）
【化８】
2012153576.tif 000007
（式中、ｎは一般式（１）のｎと同じ意味を表す。ｍは同一もしくは異なる、３〜６の整数を表す。Ｒは炭素数１〜４の直鎖状アルキル基を表す）。
〔４〕  下記一般式（５）又は一般式（６）で表される非対称双頭型脂質分子もしくはその塩又はそのエステル；
【化７】
2012153576.tif 000008
（式中、ｎは１８〜２２の整数、ｍは３〜６の整数を表す。）
【化８】
2012153576.tif 000009
（式中、ｎは一般式（５）のｎと同じ意味を表す。ｍは同一もしくは異なる、３〜６の整数を表す。Ｒは炭素数１〜４の直鎖状アルキル基を表す）。
〔５〕  前記〔４〕に記載の非対称双頭型脂質分子もしくはその塩、又はそのエステルのいずれかが単独で又は両者が混合された状態で自己集合により形成された、カルボン酸系非対称ナノチューブ。
〔６〕  水性溶媒中において、一般式（１）で表わされる非対称双頭型脂質分子と共に、一般式（２）で表されるその誘導体を混合し、二成分自己集合させることを特徴とする、〔１〕〜〔３〕及び〔５〕のいずれか１項に記載の内表面疎水化有機ナノチューブの製造方法。
〔７〕  下記一般式（５）又は（６）で表わされる非対称双頭型脂質分子又はそのエステルを、単独で又は両者を混合してジメチルスルホキシドやジメチルホルムアミドまたは水に分散し、加熱溶解後冷却することを特徴とする、カルボン酸系非対称ナノチューブの製造方法。
【化７】
2012153576.tif 000010
（式中、ｎは１８〜２２の整数、ｍは３〜６の整数を表す。）
【化８】
2012153576.tif 000011
（式中、ｎは一般式（１）のｎと同じ意味を表す。ｍは同一もしくは異なる、３〜６の整数を表す。Ｒは炭素数１〜４の直鎖状アルキル基を表す）。
〔８〕  前記〔１〕又は〔２〕に記載の内表面疎水化有機ナノチューブを有効成分として含むタンパク質リフォールディング剤。
〔９〕  変性タンパク質を、〔１〕又は〔２〕に記載の内表面疎水化有機ナノチューブと共に水性溶媒中において分散させることにより、当該有機ナノチューブ内に包接させることを特徴とする、変性タンパク質のリフォールディング方法。
〔１０〕  変性タンパク質を、前記非対称双頭型脂質分子とその誘導体とを混合して二成分自己集合させる際の水性媒体中に添加しておくことを特徴とする、〔９〕に記載のリフォールディング方法。
〔１１〕  前記〔１〕又は〔２〕に記載の内表面疎水化有機ナノチューブの疎水性中空シリンダー内に変性タンパク質が包接されている、リフォールディングされた正常タンパク質の放出用組成物。
〔１２〕  前記〔１〕〜〔３〕及び〔５〕のいずれか１項に記載の内表面疎水化有機ナノチューブを有効成分として含む疎水性薬剤徐放用カプセル化製剤。
〔１３〕  疎水性薬剤を、〔１〕〜〔３〕及び〔５〕のいずれか１項に記載の内表面疎水化有機ナノチューブと共に水性溶媒中において分散させることにより、当該有機ナノチューブ内に包接させることを特徴とする、疎水性薬剤のカプセル化方法。
〔１４〕  疎水性薬剤を、前記非対称双頭型脂質分子とその誘導体とを混合して二成分自己集合させる際の水性媒体中に添加しておくことを特徴とする、〔１３〕に記載のカプセル化方法。
〔１５〕  前記〔１〜３〕及び〔５〕のいずれか１項に記載の内表面疎水化有機ナノチューブの疎水性中空シリンダー内に疎水性薬剤が包接されていることを特徴とする、カプセル化された疎水性薬剤組成物。
〔１６〕  前記〔１２〕に記載の疎水性薬剤徐放用カプセル化製剤が、〔３〕又は〔５〕に記載のカルボン酸系非対称ナノチューブを有効成分として含むカチオン性薬剤徐放用である、疎水性薬剤徐放用カプセル化製剤。
〔１７〕  前記〔１５〕に記載の疎水性薬剤組成物が、〔３〕又は〔５〕に記載のカルボン酸系非対称ナノチューブがカチオン性薬剤を包接し、カチオン性薬剤−非対称ナノチューブ複合体を形成している、カプセル化された疎水性薬剤組成物。
〔１８〕  前記〔３〕又は〔５〕に記載のカルボン酸系非対称ナノチューブがカチオン性薬剤を包接していることを特徴とする、カチオン性薬剤−非対称ナノチューブ複合体。
〔１９〕  前記〔１８〕に記載のカチオン性薬剤−非対称ナノチューブ複合体を有効成分とする、カチオン性薬剤組成物。
〔２０〕  カチオン性薬剤がアミノ基を有するアントラサイクリン系抗癌剤である、前記〔１９〕に記載のカチオン性薬剤組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、二成分系自己集合によって、内表面のみが疎水化された有機ナノチューブである「内表面疎水化有機ナノチューブ」を簡便且つ１００％の収率で形成させる手法を確立することができた。疎水性の低分子から高分子までのゲストを対象として制御可能に包接・貯蔵・放出を行うことができ、変性タンパク質の場合は正常タンパク質へのリフォールディング機能も有する。特に、変性タンパク質や抗がん剤であるドキソルビシン等をゲストの対象にできたことは、次世代人工分子シャペロンシステムや次世代ドラッグデリバリ−システムへの応用が期待できる。本発明技術は、バイオや医療分野のみならず、疎水性物質の水分散化とその徐放機能が望まれている化粧品やその他機能性材料分野においても重要である。
また、本発明により、内表面がカルボキシル基、外表面が糖残基で被覆された「カルボン酸系非対称ナノチューブ」において従来困難であった、生理的条件下（ｐＨ７.４、ＰＢＳバッファー中）のような高塩濃度においてもチューブ形態を３０時間以上の長期にわたって保持する非対称ナノチューブを製造することができる。
本発明のカルボン酸系非対称ナノチューブは水、水性溶媒又は有機溶媒のいずれにおいても高い分散性を示す。水性溶媒中に高濃度存在させても結晶化を起こすことなく、長期保存における安定性も非常に高く、５ｍｇ／ｍｌといった比較的高濃度の水分散液で２ヶ月以上安定に保存可能である。また、この非対称ナノチューブを構成する非対称双頭型脂質分子は新規化合物であって、その原料となるβ−Ｄ−グルコピラノシルアミン、長鎖ジカルボン酸及びオリゴグリシン類は安価であり、例えば一般式（１）のうち、Ｇが１−グルコピラノシル基、ｎが１８−２２の整数、Ｚ１が単鎖、ＹがＧｌｙ、ｍ＝３〜６の整数であれば、５段階の穏和な条件での合成反応により製造でき、精製にはカラムクロマトグラフィーを使う必要がなく、全て再沈殿工程で高純度の脂質を得ることができる。同様に上記一般式（１）のエステル誘導体に対応する一般式（２）化合物（Ｇが１−グルコピラノシル基、ｎが１８−２２の整数、Ｚ1とＺ2が単鎖、ＹがＧｌｙ、ｍ＝３〜６の整数、Ｒが炭素数１〜４のアルコキシ基やベンジルオキシ基）では、４段階で同様に合成出来る。このような非対称ナノチューブ形成性脂質分子の合成および精製が簡便であり、非対称ナノチューブも温和な条件で簡単に製造できる点は、薬剤キャリアとしてのカプセルの大量合成および最終的な薬剤組成物の低価格化の点でも重要である。
そして、本発明のカルボン酸系非対称ナノチューブの長期保存安定性や高濃度での良分散性は、抗癌剤治療においてそれぞれ薬剤の安全性の点や患者の負担軽減を図るために経静脈投与する全液量を可能な限り減らす点で必要不可欠である。また本内表面疎水化有機ナノチューブおよびカルボン酸系非対称ナノチューブは外径が僅か１５ｎｍで、自己集合条件を変えることで長さも約１００ｎｍ〜１０μｍまで調節可能である。このためＥＰＲ（Enhanced Permiability and Retation）効果によって、ガン組織へ送達する量を高めることが可能となる。このように、本発明の非対称ナノチューブが備えているこれら安定性や良分散性といった特性は、薬剤キャリアとしての優れた特性の１つである。
また、本発明のカルボン酸系非対称ナノチューブや一部の内表面疎水化ナノチューブは内側が少なくとも部分的にはカルボキシル基に覆われ、中性付近のｐＨでは負の電荷を帯びているので、ドキソルビシンのようなアミノ基を有する薬剤やカチオン性薬剤を混合するだけで、薬剤のカプセル化が可能であるという優れた特性を有する。調製が複雑な従来のリポソーム系の薬剤カプセルは治療時に任意の比率で混合することは不可能であり、あらかじめ薬剤をカプセル化したもののみが市販されていたが、本発明では、薬剤カプセルとしてのナノチューブを医療現場で速やかに調整することや、ナノチューブ分散液と薬剤を治療時に任意の割合で混合することでカプセル化が可能である。上記したように原料の脂質合成やナノチューブの調製が極めて容易なため、安価な薬剤カプセルとして提供することも可能である。  そして
、本発明の非対称ナノチューブは生理的条件下では、その形態を変化させることなく、チューブ両端の空孔からカプセル化された薬剤を徐放することができる。また低ｐＨの環境では、チューブ内表面を被覆するカルボキシル基のイオン化度が減少し、カチオン性の薬剤との静電相互作用が弱められることによって、効率的に薬剤を放出することができる。このため、上記ＥＰＲ効果によるがん組織へのナノチューブの選択的送達に加え、がん組織特有の低ｐＨ環境での効率的な薬剤放出が可能である。さらに、がん細胞内に取り込まれたナノチューブ複合体の場合は、エンドソーム内での低いｐＨ環境による速やかな放出が可能となる。
発明者が以前に報告した非対称双頭型脂質分子（非特許文献９）は、本発明のカルボン酸系非対称双頭型脂質分子とは、構造上ではアルキル鎖長がほぼ同じ（ｎ＝１８）か若干短く（ｎ＝１４、１６）、グリシン残基数が少ない（ｍ＝１又は２）という程度の差異しかないため製造工程もナノチューブへの組織化工程もほぼ一致している上に、得られる非対称ナノチューブの形状でもきわめて類似している。このように類似した非対称ナノチューブであっても従来のものは、生理的条件下に置くと１時間以内で、内径が７ｎｍ程度から５０ｎｍ程度に、外径では１５ｎｍ程度から１００〜１５０ｎｍ程度に速やかに変化するため、包接されたゲストも直ちに放出し、徐放性は持たないし、放出速度の制御も出来なかった。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】化合物−２c（式（２）中、Ｇ＝１−グルコピラノシル基、ｎ＝１８、Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝４、Ｚ２＝単鎖、Ｘ＝メトキシ基）の1Ｈ−ＮＭＲ（重ジメチルスルホキシド、ＤＭＳＯ−ｄ６，Ｄ2Ｏ１滴，６０℃）
【図２】化合物−１ｃ（式（１）中、Ｇ＝１−グルコピラノシル基、ｎ＝１８、Ｚ１＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝４、Ｘ＝ＯＨ）の1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6，Ｄ2Ｏ１滴，６０℃）
【図３】化合物−２ｄ（式（２）中、Ｇ＝１−グルコピラノシル基、ｎ＝１８、Ｚ１＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝４、Ｚ２＝単鎖、Ｒ＝ベンジルオキシ基）の1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6，Ｄ2Ｏ１滴，６０℃）
【図４】化合物−２ｅ（式（２）中、Ｇ＝１−グルコピラノシル基、ｎ＝１８、Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝３、Ｚ２＝ＥＤ、Ｒ＝ベンジルオキシカルボニル基）の1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6，Ｄ２Ｏ１滴，６０℃）
【図５】非対称双頭型脂質分子（式（１）化合物−１ａ、Ｇ＝１−グルコピラノシル基、ｎ＝１６、Ｚ1＝ＥＤ、Ｙ＝ｙｌＧ、ｍ＝３、Ｘ＝Ｈ）と誘導体（式（２）化合物−２ａ、Ｇ＝１−グルコピラノシル基、ｎ＝１６、Ｚ1＝ＥＤ、Ｙ＝ｙｌＧ、ｍ＝３、Ｚ2＝単鎖、Ｒ＝ベンジルオキシカルボニル基）の二成分（混合比、式（１）化合物−１ａ：式（２）化合物−２ａ＝１０：１）系自己集合により形成する内表面疎水化有機ナノチューブの透過型電子顕微鏡像。
【図６】非対称双頭型脂質分子（式（１）化合物−１ｃ、Ｇ＝１−グルコピラノシル基、ｎ＝１８、Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝４、Ｘ＝ＯＨ）と誘導体（式（２）化合物−２ｅ、Ｇ＝１−グルコピラノシル基、ｎ＝１８、Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝３、Ｚ2＝ＥＤ、Ｒ＝ベンジルオキシカルボニル基）の二成分系自己集合により形成する内表面疎水化有機ナノチューブの走査型電子顕微鏡像。  ａ）混合比、式（１）化合物−１ｃ：式（２）化合物−２ｅ＝１０：２  ｂ）混合比、式（１）化合物−１ｃ：式（２）化合物−２ｅ＝１０：１０
【図７】化合物１（上：（式（１）化合物−１ｃ、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１８、Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝４、Ｘ＝ＯＨ）。下：（式（１）化合物−１ｄ、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１８、Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝６、Ｘ＝ＯＨ））のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中での加熱冷却による自己集合で得られた非対称ナノチューブの電子顕微鏡観察像（透過像）。
【図８】非対称双頭型脂質分子（式（２）、化合物−２ｃ：Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝４、Ｚ2＝単鎖、Ｒ＝メトキシ基）のＤＭＳＯ中での加熱冷却による自己集合で得られた非対称ナノチューブの電子顕微鏡観察像（透過像）。
【図９】生理的条件下で３２時間インキュベーションした場合の非対称ナノチューブの安定性の電子顕微鏡観察（透過像）での評価。本願と先行技術の比較。（ａ）「先願ナノチューブＡ」の場合。ほとんどがファイバー状に変化している。（ｂ）「先願ナノチューブＢ」の場合も同様である。（ｃ）「従来ナノチューブＣ」の変化。内径約５０nm、外径約１００〜１５０nmとチューブ径の大きなチューブ構造に変化している。（ｄ）本願中、式（１）化合物−１ｃで製造した非対称ナノチューブの変化。非対称ナノチューブ構造を保持している。
【図１０】変性ＧＦＰの初濃度と有機ナノチューブ（５ｍｇ）に包接された変性ＧＦＰの濃度の関係。図中、●は式（１）化合物−１ａと式（２）化合物−２ａが形成する内表面疎水化有機ナノチューブ。△は式（１）化合物−１ａが形成する内表面疎水化していない有機ナノチューブ
【図１１】有機ナノチューブに包接された変性ＧＦＰのリフォールディング効率。図中、●は式（１）化合物−１ａと式（２）化合物−２ａが形成する内表面疎水化有機ナノチューブ。△は式（１）化合物−１ａが形成する内表面疎水化していない有機ナノチューブ
【図１２】ｐＨ８.２条件下における有機ナノチューブからの正常ＧＦＰの放出。図中、●は式（１）化合物−１ａと式（２）化合物−２ａが形成する内表面疎水化有機ナノチューブ。△は式（１）化合物−１ａが形成する内表面疎水化していない有機ナノチューブ
【図１３】変性ＣＡＢの初濃度と有機ナノチューブ（５.５ｍｇ）に包接された変性ＣＡＢの濃度の関係。図中、●は式（１）化合物−１ａと式（２）化合物−２ｆが形成する内表面疎水化有機ナノチューブ。△は式（１）化合物−１ａが形成する内表面疎水化していない有機ナノチューブ。
【図１４】変性ＣＡＢからリフォールディングした正常ＣＡＢの回収率。図中、●は式（１）化合物−１ａと式（２）化合物−２ｆが形成する内表面疎水化有機ナノチューブからのｐＨ７.８における回収率。△は式（１）化合物−１ａが形成する内表面疎水化していない有機ナノチューブからのｐＨ７.８における回収率。□は有機ナノチューブを用いない希釈法によるｐＨ７における回収率
【図１５】種々の有機ナノチューブ／ゲスト混合比におけるドキソルビシンの内表面疎水化有機ナノチューブの取り込み（ｐＨ６.５）。横軸の比は内表面疎水化有機ナノチューブとゲストの混合比を表す。図中右のテキストは、有機ナノチューブ中の化合物の組成を表す。すなわち上から式（１）化合物−１ｃ（Ｇ＝１−グルコピラノシル基、ｎ＝１８、Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝４、Ｘ＝ＯＨ）；式（１）化合物−１ｃ／式（２）化合物−２ｅ＝１０：２（モル比）；式（１）化合物−１ｃ／式（２）化合物−２ｅ＝１０：４（モル比）；式（１）化合物−１ｃ／式（２）化合物−２ｅ＝１０：１０（モル比）。
【図１６】内表面疎水化有機ナノチューブ／ドキソルビシンカプセル化物からのドキソルビシンの放出（ＰＢＳバッファ−中、ｐＨ７.４）。括弧内は有機ナノチューブの組成（式（１）化合物−１ｃ／式（２）化合物−２ｅの混合モル比）
【図１７】内表面疎水化有機ナノチューブ／ドキソルビシンカプセル化物からのドキソルビシンの放出（ＰＢＳバッファ−中、ｐＨ５.５）。括弧内は有機ナノチューブの組成（式（１）化合物−１ｃ／式（２）化合物−２ｅの混合モル比）。
【図１８】非対称ナノチューブによるドキソルビシンのカプセル化率の先行技術との比較。（ａ）「先願ナノチューブＡ」の場合。（ｂ）本願中、式（１）化合物−１ｃで製造した非対称ナノチューブの場合。(ａ)，(ｂ)いずれもカプセル化はミリＱ水中、ｐＨ調製は塩酸で行い、(ａ)はｐＨ６.５で、(ｂ)はｐＨ５.０と６.５で実施した。図中のｐＨはカプセル化時のｐＨを表す。
【図１９】非対称ナノチューブによるドキソルビシンの放出特性の先行技術との比較。（ａ）「先願ナノチューブＡ」の場合。（ｂ）本願中、式（１）化合物−１ｃで製造した非対称ナノチューブの場合。(ａ)，(ｂ)いずれもカプセル化はナノチューブ／ドキソルビシンのモル比（ＯＮＴ／ＤＯＸ）＝７／１で行った。図中の括弧内は用いたＰＢＳバッファーのｐＨを表す。
【図２０】生理的条件下（ＰＢＳバッファー中）ドキソルビシン放出実験後（３２時間後）の非対称ナノチューブの構造安定性について、電子顕微鏡観察像（透過像）での評価。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１．本発明の内表面疎水化有機ナノチューブについて
（１−１a）本発明の内表面疎水化有機ナノチューブを構成する非対称双頭型脂質分子及びその誘導体
本発明の「内表面疎水化有機ナノチューブ」とは、一般式（１）で表わされる非対称双頭型脂質分子とその誘導体である一般式（２）の二成分系自己集合により形成するナノチューブであり、外表面には官能基Ｇ、内表面にはＸとＲが配置されていることを特徴とする。
【化１】
2012153576.tif 000012
【化２】
2012153576.tif 000013
式中、Ｇは1−グルコピラノシル基または2−グルコピラノシル基であり、Ｄ体でもＬ体でもよいが、入手の容易さからＤ体が好適である。ｎは１２〜２２の任意の整数であるが、原料の入手性から１２〜２０が好ましい。
なお、式（１）及び式（２）において用いている記号が同一の場合、その意味は同一である。
【化３】
2012153576.tif 000014
Ｘは、ＹがＧｌｙのときＯＨであり、ＹがｙｌＧのときＨである。
Ｒはベンジルオキシカルボニル基、t−ブトキシカルボニル基、９−フルオレニルメトキシカルボニル基、アセチル基、エチルカルボニル基、プロピルカルボニル基、炭素数１〜４のアルコキシ基（好ましくは、メトキシ基、エトキシ基、プロピル基、もしくはt−ブトキシ基）、ベンジルオキシ基、または疎水性アミノ酸（好ましくは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、もしくはトリプトファン）のいずれかから選択され、Ｒが疎水性アミノ酸である場合は、Ｚ2とアミド結合を介して結合されることが好ましい。
また、合成のしやすさからは、Ｚ1が単鎖のときは、ＹはＧｌｙであり、Ｚ１がＥＤのとき、ＹはｙｌＧであることが好ましい。
一般式（１）で表わされる非対称双頭型脂質分子とその誘導体である一般式（２）の二成分系自己集合により「内表面疎水化有機ナノチューブ」は、特に後述する内表面疎水性のカルボン酸系非対称ナノチューブを形成させる場合を含め、ナノチューブ状の形態を与える範囲であれば、任意の比率で混合できるが、薬剤のカプセル化や徐放制御、またタンパク質のリフォールディングを調整する目的であれば、一般式（２）の成分を１〜６０％程度、好ましく５〜５０％の割合で混合することが望ましい。
（１−１ｂ）生理条件下で安定なカルボン酸系非対称ナノチューブを構成するための非対称双頭型脂質分子及びその誘導体
本発明においては、生理条件下で安定なカルボン酸系非対称ナノチューブを提供するが、そのための非対称双頭型脂質分子及びその誘導体は、いずれも文献未載の新規化合物であって、前記一般式（１）でＧが１−グルコピラノシルまたは２−グルコピラノシル、ｎ＝１８〜２２の整数、Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝３〜６の整数であり、Ｘ＝ＯＨで表される非対称双頭型脂質分子もしくはその塩、又はそのエステル誘導体と表現できる。
ここで、当該エステル誘導体とは、前記一般式（２）でＧが１−グルコピラノシルまたは２−グルコピラノシル、ｎ＝１８〜２２の整数、Ｚ1＝Ｚ2＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝３〜６の整数であり、Ｒが炭素数１〜４のアルコキシ基のうち、メトキシ基、エトキシ基、またはベンジルオキシ基である、の場合に相当する。
本発明の新規化合物であるカルボン酸系非対称ナノチューブ形成性の脂質分子又はそのエステルの形状は、長鎖カルボン酸の片端にアミド基を介しβ−Ｄ−グルコピラノシルアミン残基が連結し、もう一端にオリゴグリシンのＮ端が縮合した非対称双頭型脂質分子またはそのエステルである。これら脂質分子又はそのエステルは、単独でも両者を適宜混合した場合でも、自己集合によりカルボン酸系非対称ナノチューブを形成することができ、その性質も外表面はいずれも親水性であるが、内表面は、もとの脂質分子及びそのエステル由来の末端カルボキシル基及び／又はそのエステル基が存在しているため、それぞれの官能基の比率によって、内表面の疎水性環境は、きわめて疎水性の高い環境から、かなり親水性の高い環境までの幅広い環境を提供できるカルボン酸系非対称ナノチューブである。
特に、両者を混合した場合に、内表面疎水性のカルボン酸系非対称ナノチューブを形成できるが、その場合ｍは３〜６の整数であれば異なってもよいので、一般式（１）及び（２）を用いて表現すると、
一般式（１）及び（２）の式中、ｎ＝１８〜２２の整数、Ｚ1＝Ｚ2＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍは同一もしくは異なる３〜６の整数、Ｘ＝ＯＨ、Ｒが、メトキシ基、エトキシ基、またはベンジルオキシ基であるカルボン酸系非対称ナノチューブ、と表現できるが、下記一般式（５）及び（６）で表すこともできる。
【化７】
2012153576.tif 000015
（式中、ｎは１８〜２２の整数、ｍは３〜６の整数を表す。）
【化８】
2012153576.tif 000016
（式中、ｎは一般式（１）のｎと同じ意味を表す。ｍは同一もしくは異なる３〜６の整数を表す。Ｒは炭素数１〜４の直鎖状アルキル基を表す）。
後述するように、一般式（５）及び（６）は、いずれも新規化合物であり、それぞれ単独でも、また任意の割合で配合することでも、外表面が１−グルコサミド基で覆われ、かつ、内表面がカルボキシル基又はそのエステルで覆われた状態の新規な「カルボン酸系非対称ナノチューブ」を形成することができる。その際の両者の配合割合に応じて、内表面のカルボキシル基又はそのエステルの存在比率が変化するので、「内表面疎水化有機ナノチューブ」のうちでも、内表面が１００％エステル基に覆われた、きわめて疎水性の高い環境から、１００％カルボキシル基に覆われた、かなり親水性の高い環境までを提供することができる非対称双頭型脂質分子及びそのエステルの組み合わせである。一般には、一般式（１）及び（２）で表される「内表面疎水化有機ナノチューブ」における好適な配合割合が適用され、すなわち、一般式（６）の成分を一般式（５）に対して、１〜６０％程度、好ましく５〜５０％の割合で混合することで、形成される。
しかしながら、「カルボン酸系非対称ナノチューブ」の場合は、種々のイオン特性を有し、疎水性程度も様々な各種薬剤に対応した徐放性制御カプセル化をめざすものであるため、内包される疎水性ゲストの特性に応じて両者の配合割合を調製することが好ましい。具体的には、疎水性がきわめて高いカチオン性薬剤のカプセル化や徐放には内表面の親水性を大きく低下させることが効果的であり、この点から一般式（２）の成分を９９〜２０％程度、好ましくは６０〜３０％程度の割合で混合することが望ましい。一方で、親水性の高いカチオン性薬剤などのカプセル化や徐放には、カルボキシル基の割合が多い方が好適であり、一般式（２）の成分を５０〜１％程度の割合、より好ましくは３０〜５％の割合で混合することが望ましい。
本発明の非対称双頭型脂質分子は外径１５ｎｍ前後、内径約７〜９ｎｍの非対称なナノチューブ構造を、ＤＭＳＯおよび水中での加熱冷却により選択的かつ高純度に製造できる。そのために、本発明の脂質分子のアルキレン鎖の鎖長は１８〜２２の範囲である必要があり、脂質合成時の分散性の良さや精製の容易さからは、偶数であることがより好ましい。またオリゴグリシン残基の数は、３以上、特に３〜６であれば生成されたチューブの生理的条件下での安定性や保存安定性が得られる（図９）。またこの範囲での残基の異なる混合物であってもよい。これは、上述の生理的条件下や保存下での安定性に寄与するものが、オリゴグリシン残基間のポリグリシンII型と呼ばれる多点、協同的な水素結合ネットワークに由来するためである。通常、ポリグリシンなどの高分子に見られる水素結合ネットワークであるが、特にグリシン残基数が３以上であれば効果的なネットワーク形成が出来るためと考えられている。特に３又は４の場合においては、オリゴグリシンの入手のし易さに加えナノチューブ製造時の精製がしやすく本発明の所期の効果が得られる。また、本発明の非対称双頭型脂質分子は、水溶性の制約上許容される塩の状態であってもよい。例えば、ナトリウム塩、アンモニウム塩などが好ましい。
すなわち、本願発明の非対称双頭型脂質分子及びそのエステルは，下記一般式（１）で表すと、
【化１】
2012153576.tif 000017
【化２】
2012153576.tif 000018
上記式(１)及び式（２）の式中、Ｇが１−グルコピラノシルまたは２−グルコピラノシル（但し、合成のしやすさからＧは１−グルコピラノシル基が好ましい。）、ｎ＝１８〜２２の整数、Ｚ１＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝３〜６の整数であり、Ｘ＝ＯＨで表される非対称双頭型脂質分子もしくはその塩。Ｚ２＝単鎖、Ｒが炭素数１〜４のアルコキシ基のうち、メトキシ基、エトキシ基、またはベンジルオキシ基である。）
上記一般式（１）で表される化合物は、水溶性でかつ薬理上許容される塩であってもよく、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩などが好ましい。
また、式（１）及び（２）において、式中、ｎは１８〜２２の任意の整数であるが、原料の入手性から１８〜２０が好ましい。ｍは３〜６、あるいはそれ以上の整数であってよいが、合成上の簡便性から３〜６が望ましい。また市販の化合物の入手しやすさにおいて、３又は４であってもよい。
式（２）のＲは炭素数１〜４の直鎖状アルコキシ基やベンジルオキシ基などが可能であるが、炭素数１〜３の直鎖状アルキル基であって、メチル基又はエチル基が好ましい。
また、カルボン酸系非対称ナノチューブを形成できる非対称双頭型脂質分子又はそのエステルは、下記一般式（５）及び（６）で表すこともできる。
【化７】
2012153576.tif 000019
（式中、ｎは１８〜２２の整数、ｍは３〜６の整数を表す。）
【化８】
2012153576.tif 000020
（式中、ｎは一般式（１）のｎと同じ意味を表す。ｍは同一もしくは異なる３〜６の整数を表す。Ｒは炭素数１〜４の直鎖状アルキル基を表す）。
なお、本明細書中の各一般式において用いられているｎ，ｍ及びＲなどの用語は、特にことわらない限り、同じ用語を用いている場合は全て同じ意味を表す。
【００１６】
（１−２）本発明の非対称双頭型脂質分子及びその誘導体の製造方法
一般式（１）で表わされる非対称双頭型脂質分子は及び一般式（２）で表わされる誘導体は、一般式（３）で表わされる中間体（中間体３）を経由して合成することができる。
【化４】
2012153576.tif 000021
式中、Ｇは１−グルコピラノシル基または２−グルコピラノシル基であり、Ｄ体でもＬ体でもよいが、入手の容易さからＤ体が好適である。また１−グルコピラノシル基の場合の１位のアミノ基は、βとαの両アノマーやその混合物が使えるが、ナノチューブ形成の容易さからβアノマーが好適である。２−グルコピラノシルアミンの場合は、αとβの両アノマーの混合物である。１−グルコピラノシル基の他の水酸基がアセチル化された保護体（２，３，４，６−テトラアセチル−１−グルコピラノシル基）を用いてもよいが、最終的にアセチル基の脱保護が必要となる。アセチル基の脱保護は、メタノール中でナトリウムメトキシドを作用させることで容易に行える（特許文献１、非特許文献８）。ｎは１２〜２２の任意の整数であるが、原料の入手性から１２〜２０が好ましい。
一般式（３）は、下記に示される１−グルコピラノシルアミンまたは２，３，４，６−テトラアセチル−１−グルコピラノシルアミンまたは２−グルコピラノシルアミンとジカルボン酸の間の縮合反応によって合成できる。１−グルコピラノシルアミンや２，３，４，６−テトラアセチル−1−グルコピラノシルアミンはこれまでに報告されている方法で製造出来る（非特許文献８、１６、特許文献１）。ジカルボン酸は塩またはモノエステル（例えばモノメチルエステル、モノエチルエステル、ベンジルエステル）の状態でも用いることができるが、モノエステルの場合には縮合反応後に加水分解が必要となる。この様なモノエステルは非特許文献１７を参考にしてジカルボン酸からジエステルに変換後、加水分解反応を経て合成可能である。エステル加水分解は、メチルエステル等ではアルカリ加水分解で、ベンジルエステルの場合はパラジウムカ−ボンの存在下に接触水素化分解により容易に行える（特許文献１、非特許文献［８］）。また、ジカルボン酸の酸無水物や酸クロライドを用いる場合にも、縮合反応後に水を添加して、上記活性体の加水分解が必要となる。
【化５】
2012153576.tif 000022
縮合反応に用いる縮合剤としては、ペプチド合成に用いられる種々の縮合剤を用いることができる。具体的には、「４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド」（ＤＭＴ−ＭＭ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミドなどを用いることができる。またこのような縮合剤を用いなくても、該当するカルボン酸の酸無水物や酸クロライドを用いることもできる。しかし、水中やメタノール中の反応でも極めて高収率の縮合物を与えるＤＭＴ−ＭＭが望ましい。また同反応は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシドなどを用いることができる。
【００１７】
一般式（３）であらわされる中間体（中間体３）は、メタノールや水含有メタノールなどを用いた加熱・冷却による再沈殿またはシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒として例えば、クロロホルム／メタノール＝２０／１）によって精製することができる。
中間体−３を下記一般式（４）と縮合反応させることで一般式（２）で表わされる誘導体を合成することができる（非特許文献１０、１８）。
【化６】
2012153576.tif 000023
式中、
【化３】
2012153576.tif 000024
Ｒはベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、９−フルオレニルメトキシカルボニル基、アセチル基、エチルカルボニル基、プロピルカルボニル基、炭素数１〜４のアルコキシ基（好ましくは、メトキシ基、エトキシ基、もしくはｔ−ブトキシ基）、ベンジルオキシ基、または疎水性アミノ酸（好ましくは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、もしくはトリプトファン）のいずれかから選択され、Ｒが疎水性アミノ酸である場合は、Ｚ2とアミド結合を介して結合されることが好ましい。
また、合成のしやすさからは、Ｚ１が単鎖のときは、ＹはＧｌｙであり、Ｚ1がＥＤのとき、ＹはｙｌＧであることが好ましい。
一般式（４）でＺ1とＺ2が単鎖の場合は、市販品を用いることができる。一般式（４）でその他の組み合わせの場合は、エチレンジアミンとＮ端にＲを連結したオリゴグリシンとの縮合反応、片一方のＮ端にＲを連結したエチレンジアミンとオリゴグリシンとの縮合反応によって合成できる。
中間体−３にＮ−ベンジルオキシ−１，２−ジアミノエタンを縮合した後、脱保護を行い、再度、Ｎ端にＲが連結したオリゴグリシンと縮合反応を行うことでも誘導体を合成できる（非特許文献１８、１９）。
縮合反応に用いる縮合剤としては、ＤＭＴ−ＭＭ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミドなどを用いることができる。水中やメタノール中の反応でも極めて高収率の縮合物を与えるＤＭＴ−ＭＭが望ましい。また同反応は、メタノール、エタノール、イソプロパノ−ル、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシドなどを用いることができる。
誘導体は、メタノールや水含有メタノールなどを用いた加熱・冷却による再沈殿によって精製することができる。元素分析、赤外吸収スペクトル、Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより同定することができる。
一般式（１）で表わされる非対称双頭型脂質分子は、Ｚ2が単鎖でありＲがベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、９−フルオレニルメトキシカルボニル基、メトキシ基、エトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ベンジルオキシ基の誘導体（一般式（２））において、Ｒは縮合反応における末端カルボン酸の保護基として働いているので、通常の保護基除去法を適用してＲを除去することによって合成することができる。誘導体からのベンジルオキシカルボニル基またはベンジルオキシ基の除去は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、あるいはメタノール、メタノール／水中などでのパラジウム炭素を触媒とした接触水素化還元によって行うことができる。誘導体からのt−ブトキシカルボニル基の除去は、塩酸／有機溶媒、トリフルオロ酢酸等による酸処理によって行うことができる。誘導体からの９−フルオレニルメトキシカルボニル基の除去は、ピペリジン、モルホリン、ジエチルアミン等の塩基処理によって行うことができる。誘導体からのメトキシ基、エトキシ基、ｔ−ブトキシ基の除去は、メタノール／水混合溶媒中での酸またはアルカリを用いる加水分解反応によって行うことができる。
Ｒの除去反応は定量的に進行するため、高純度の非対称双頭型脂質分子が得られるが、必要に応じてメタノールやエタノール、ＤＭＦなどで加熱冷却による精製を行ってもよい。
なお、以上のようにして合成される上記式（１）及び式（２）中、ｎ＝１８〜２２の整数、Ｚ1＝Ｚ２＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝３〜６の整数、Ｘ＝ＯＨ、Ｚ2＝単鎖、Ｒが炭素数１〜４のメトキシ基、エトキシ基、またはベンジルオキシ基である場合（式（５）及び式（６）など）は、本発明の「カルボン酸系非対称ナノチューブ」を形成できる新規化合物である。
【００１８】
（１−３）内表面疎水化有機ナノチューブおよびカルボン酸系非対称ナノチューブの製造法
本発明における「内表面疎水化有機ナノチューブ」のうちでも、「カルボン酸系非対称ナノチューブ」は、新規な非対称双頭型脂質分子及びそのエステルにより形成されるため、「非対称ナノチューブ」としても新規であるため、特に「カルボン酸系非対称ナノチューブ」と呼ぶことがある。以下、必要に応じて、一般的な「内表面疎水化有機ナノチューブ」の場合と分けて、「カルボン酸系非対称ナノチューブ」の場合を詳細に説明する。
（ア）加熱溶解・冷却法
内表面疎水化有機ナノチューブの場合：一般式（１）で表わされる非対称双頭型脂質分子（０.５ｍｇ〜５ｍｇ）とそれに対して１〜６０ｍｏｌ％の一般式（２）で表わされる誘導体を８０〜１００℃に加熱することで１ｍｌ純水中（ミリＱ水など）に完全に溶解し、その後冷却（０.１℃〜１０℃毎分）することで内表面疎水化有機ナノチューブが得られる。内表面疎水化有機ナノチューブの形成は、電子顕微鏡観察によって確認できる。分散液を電子顕微鏡用のグリッドに滴下し、内部を電子線不透過な染色剤で染色することで、外径が約１５ｎｍ、内径が約８〜１０ｎｍ、長さが１００ｎｍ〜２μｍといった内表面疎水化有機ナノチューブのサイズや中空シリンダーを確認することができる。
本発明の内表面疎水化有機ナノチューブは構造安定性が高いので、凍結乾燥処理あるいは超音波処理などの物理的擾乱にも耐えられる。これらの物理的擾乱処理によって、収率良く軸比の短い、かつ良分散性の内表面疎水化有機ナノチューブに変換することが可能である。
一般式（１）で表わされる非対称双頭型脂質分子や一般式（２）で表わされる誘導体の水への溶解度が低い場合は、ジメチルスルホキシドやジメチルホルムアミド中で上記と同様に加熱、冷却により、内表面疎水化有機ナノチューブを分散液として得る。これを吸引濾過後、水に再分散することですることで水分散液も得られる。用いる溶媒は溶解性の点からジメチルスルホキシドがより好適である。ジメチルホルムアミドやジメチルスルホキシド中で製造した場合は、室温での減圧濃縮、ろ過、凍結乾燥、また膜透析によってこれらの溶媒を除去することで非対称ナノチューブを得ることができる。また溶解性が向上するので、５ｍｇ/ｍＬ以上の濃度での製造にも適している。
生体に投与することが目的の薬剤をカプセル化する場合には、薬剤を水又は水性溶媒に溶解又は分散させて用いるので、非対称ナノチューブ製造時に水又は水性溶媒を用いた場合には、薬剤をカプセル化する際に、溶媒除去工程を経ずにそのまま薬剤のカプセル化工程に供することができるので好ましい。
【００１９】
カルボン酸系非対称ナノチューブの場合：一般式（１）で表わされる非対称双頭型脂質分子や一般式（２）で表わされる誘導体のうちで、一般式（５）及び（６）で表される非対称脂質分子及びそのエステルを混合した場合も内表面疎水化有機ナノチューブが形成できるが、当該非対称脂質分子及びそのエステルは、一成分のみでも、同様の製造方法により、非対称ナノチューブを形成し単離できる。特に疎水部アルキル鎖長（ｎ）が１８〜２２である場合には、ジメチルスルホキシドやジメチルホルムアミド中などの方が、加熱時の溶解性が良好なため、結果として高濃度での製造が可能になる点で望ましい。また、カルボキシル基をナトリウムやカリウム、リチウム、アンモニウムなどの塩にすることにより、同様に水中、加熱時の溶解性が向上し、５ｍｇ/ｍＬ以上の高濃度での製造がより効率的になる。
いずれの非対称ナノチューブの場合も外表面が１−グルコサミド基で覆われ、かつ、内表面がカルボキシル基又はそのエステルで覆われた状態となっているので、特に両者をあわせて「カルボン酸系非対称ナノチューブ」ということもある。つまり、「カルボン酸系非対称ナノチューブ」という場合、内表面のカルボキシル基又はそのエステルの存在比率によって、内表面疎水化有機ナノチューブとはいっても、内表面が１００％エステル基に覆われた、きわめて疎水性の高い環境から、１００％カルボキシル基に覆われた、かなり親水性の高い環境までを提供することができる。
本発明の内表面疎水化有機ナノチューブやカルボン酸系非対称ナノチューブは、チューブ内にカチオン性の物質、アミノ基を有する物質、カチオン性の疎水性物質など（あわせて「カチオン性薬剤」ということもある。）を包接し、徐々にチューブ外に放出することができる。
【００２０】
（イ）ｐＨ調整法
一般式（１）で表わされる非対称双頭型脂質分子を室温で等モルから２等量程度の水酸化ナトリウム水溶液または塩酸水溶液に分散・溶解し、そこに一般式（２）で表わされる誘導体を添加、加熱により誘導体も溶解する。室温まで冷却し、塩酸等の酸溶液または水酸化ナトリウムのアルカリ溶液を等モルから２等量程度添加することで、同様に内表面疎水化有機ナノチューブを得ることができる。上記水酸化物水溶液としては、水酸化ナトリウム以外にもリチウム、カリウム、ルビジウム、セシウムなどの水酸化物水溶液も用いることができるし、アンモニアの使用も可能である。また上記酸溶液としては塩酸以外にもリン酸、ギ酸、酢酸、クエン酸、アスコルビン酸、硫酸等を用いることができる。
このｐＨ調整法を適用する場合も、超音波処理、凍結乾燥などで軸比の短い内表面疎水化有機ナノチューブに変換可能であり、そのサイズはいずれもほぼ同じである。特に後者では、再水和時の添加する水の量によって良分散な状態のまま脂質分子濃度を１０ｍｇ／ｍｌ程度まで上げることができる。またそれ以上（例えば５０ｍｇ／ｍｌ）に濃度を上げることも可能であるが、ゲル状に変化する。
【００２１】
（１−４）本発明の内表面疎水化有機ナノチューブおよびカルボン酸系非対称ナノチューブの安定性
こうして得られた内表面疎水化有機ナノチューブは、カルボン酸系非対称ナノチューブの場合を含め、その分散液は、そのまま室温あるいは冷蔵庫で上記のいずれの濃度で冷蔵保存しても約６ヶ月以上、沈殿を与えることなく良好な分散液として保存可能である。さらに分散液を凍結乾燥すれば１年以上の室温保存が可能で、ミリＱ水等を添加して再水和すると同様の分散液を得ることができる。
【００２２】
（１−５）本発明の内表面疎水化有機ナノチューブおよびカルボン酸系非対称ナノチューブの構造
チューブ状構造であることの確認は、ネガティブ染色後の電子顕微鏡観察によってチューブ内空間を可視化することで可能となる。すなわち、チューブの内空間に電子線を透過させない染色剤を毛細管現象によって導入し、電子顕微鏡観察による透過像を得ると、染色剤が分布するチューブ内空間が暗い像を与え、チューブの壁は電子線が透過しやすい有機物で出来ているため、薄いコントラストを与える。これによって確認可能である。
得られたナノチューブの内径、膜厚が均一であり、そのナノチューブ以外の自己集合形態が観察されなければ、非対称双頭型脂質分子と誘導体の二成分が均一に混合していることを強く示唆している。
【００２３】
内表面疎水化有機ナノチューブの場合、ナノチューブ内表面に疎水基が配置されていることは、赤外分光スペクトルによって確認することができる。一般式（１）で表わされる非対称双頭型脂質分子は、オリゴグリシン部位のポリグリシンII型と呼ばれる分子間多点水素結合網により平行にパッキングし、単分子膜ナノチューブを形成する。これにより、ナノチューブの内外表面はそれぞれグルコピラノシル基、オリゴグリシンのカルボキシル基またはアミノ基で被覆される。非対称双頭型脂質分子と一般式（２）で表わされる誘導体との間に、同様に分子間多点水素結合網が形成されれば、それら二成分から成るナノチューブの内表面には、非対称双頭型脂質分子由来のオリゴグリシンのカルボキシル基またはアミノ基、そして誘導体由来の疎水基が配置される。ポリグリシンII型の分子間多点水素結合網形成は、赤外分光スペクトルにおいてＣＨ変角振動（１４２０ｃｍ-1）と骨格振動（１０２６ｃｍ-1）の明確なピ−クの出現によって明らかとなる（非特許文献２０）。またオリゴメチレン鎖の副格子構造を反映するＣＨ２はさみ振動吸収帯、ＣＨ2横揺れ振動吸収帯において三斜晶系平行型を示す１本のピ−クがそれぞれ１４６５ｃｍ-1、７１９ｃｍ-1に観察されれば、非対称双頭型脂質分子と誘導体が平行に並んで分子パッキングしていることを示している。
また非対称内外表面構造（すなわちチューブ内表面にカルボキシル基や種々の疎水性官能基が、また外表面にグルコピラノシル基を配列するように配向する構造）の確認は、ナノチューブの粉末Ｘ線回折パタ−ンから得られるナノチューブの膜厚の周期ｄと分子モデルから推定される分子長Ｌの関係から推測できる。すなわち非対称双頭型脂質分子が非対称内外表面構造のナノチューブを形成しているときは、ナノチューブの膜周期ｄと分子長Ｌがほぼ同じか、あるいはｄが若干小さくなること（Ｌ≧ｄ）が知られている（非特許文献８、１９）。そこで、以下のようにｄとＬを比較検討した結果、いずれの場合にも上記の関係を満たすことが明らかとなり（表１）、本発明の有機ナノチューブは非対称内外表面構造であることがわかった。
【００２４】
Ｘ線回折測定より得られる内表面疎水化有機ナノチューブおよびカルボン酸系非対称ナノチューブの膜周期ｄとその構成脂質分子の分子モデルから得られる分子長Ｌの関係を、下記（表１）として示す。
表中の内表面疎水化有機ナノチューブとしては、下記実施例２によって化合物−１ｃと化合物−２ｅ（混合モル比＝１／１）から得たものを用い、分子長Ｌは化合物−１ｃ（４.９ｎｍ）と化合物−２ｅ（５.６ｎｍ）の平均値を示す。同様にカルボン酸系非対称ナノチューブとして、非対称双頭型脂質分子（化合物−１ｃ）を元に実施例３によって形成されたカルボン酸系非対称ナノチューブについて、以下のようにｄとＬを比較検討した結果、上記の関係（Ｌ≧ｄ）を満たすことが明らかとなった（表１）。
以上から、本発明の有機ナノチューブは全て非対称ナノチューブであることがわかった。
【表１】
2012153576.tif 000025
一般に、分子の鎖長のみが異なる一連の脂質群では、自己集合で得られるナノチューブ構造がほぼ同じ形態やサイズ（内径、外径、壁厚）を有する場合は、分子の配列様式も同様であることも知られている（非特許文献８）。したがって、ｎ＝１８よりも長い疎水鎖のｎ＝１９，２０，２１，２２の場合も同様の非対称ナノチューブ構造を形成していることが示唆される。
【００２５】
２．変性タンパク質に対するリフォールディング機能
（２−１）対象となる変性タンパク質
本発明の内表面疎水化有機ナノチューブは、その中空シリンダー内に包接した変性タンパク質を、立体構造的に安定な本来の構造にリフォールディングすることができる。具体的に対象となる変性タンパク質としては、酵素（酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、異性化酵素、リガーゼ）、信号伝達タンパク質、核酸結合タンパク質、受容体タンパク質、エネルギー変換タンパク質、蛍光タンパク質等が、塩酸グアニジンや尿素、界面活性剤、有機溶媒、濃厚塩、pH、そして熱によって変性したものが挙げられる。大腸菌宿主などを用いた組換えタンパク質の大量調製過程で生じる不溶性のタンパク質凝集体（インクルージョンボディ）に対しても適用できるが、その際には、６ｍｏｌ／Ｌ塩酸グアニジンや８ｍｏｌ／Ｌ尿素によってあらかじめ可溶化させておくことが好ましい。
【００２６】
（２−２）変性タンパク質の包接化方法
（ア）内表面疎水化有機ナノチューブ形成時の包接化法
変性タンパク質の水溶液に一般式（１）で表わされる非対称双頭型脂質分子とその誘導体である一般式（２）が均一に混合した水溶液を添加する。この時、変性剤の濃度が１ｍｏｌ／Ｌ程度に希釈されるよう、一般式（１）と（２）の水溶液を添加することが望ましい。変性タンパク質共存下、ｐＨ調製法により二成分系自己集合を行い、内表面疎水化有機ナノチューブを形成させる。遠心分離操作により、変性タンパク質を包接した内表面疎水化有機ナノチューブを沈降させ、上澄み液中に含まれる未包接の変性タンパク質を除去する。純水を加え、遠心分離を行った後、上澄み液を取り除く操作を数回繰り返し、内表面疎水化有機ナノチューブの外表面に吸着した変性タンパク質も除去する。回収された未包接の変性タンパク質の濃度を分光分析（紫外吸収法、ビシンコニン酸法、ブラッドフォード法、ローリー法、ビューレット法等）によって算出し、変性タンパク質の初濃度から差し引くことによって包接化率が求められる。
【００２７】
（イ）内表面疎水化有機ナノチューブ形成後の包接化法
６ｍｏｌ／Ｌ塩酸グアニジンや８ｍｏｌＬ-１尿素等の変性剤で可溶化させた変性タンパク質の水溶液（ｍｇ／ｍｌオーダー）に（１−３）の製造法で調製した内表面疎水化有機ナノチューブの分散水溶液（ｍｇ／ｍｌオーダー）を添加する。この時、変性剤の濃度が１ｍｏｌ／Ｌ程度に希釈されるよう、内表面疎水化有機ナノチューブの分散水溶液を添加することが望ましい。未包接の変性タンパク質の除去、及び内表面疎水化有機ナノチューブに包接された変性タンパク質の濃度計算は、（２−２）（ア）と同様に行える。
【００２８】
（２−３）変性タンパク質のリフォールディングと放出
（２−２）の未包接変性タンパク質を除去するための水洗浄過程で、変性剤も併せて除去されるが、変性剤の濃度は最終的に０.０１ｍｏｌ／Ｌ以下にすることが好ましい。変性タンパク質を中空シリンダー内に包接した内表面疎水化有機ナノチューブをｐＨ、塩濃度が調製された水溶液に再分散させ、変性タンパク質のリフォールディングを行う。ｐＨはリン酸バッファーやグッドバッファー等を用い中性付近に調製するのが良いが、タンパク質の等電点から少し外れたｐＨにすることでタンパク質同士の会合を抑制する場合もある。ジスルフィド結合を持つタンパク質の場合には、酸化還元反応を行うため、ｐＨ８程度の弱アルカリ性にする必要がある。塩は、アルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩を用いるのが望ましい。
当該有機ナノチューブ内表面には、誘導体（一般式（２））由来の疎水性官能基の他に、非対称双頭型脂質分子（一般式（１））由来のグリシン残基が配置されている。そのグリシン残基の末端カルボキシル基またはアミノ基は、pHに依存してプロトン解離、プロトン付加するため、中空シリンダー内がアニオン性、カチオン性となる。リフォールディングした正常タンパク質も等電点以外では、ｐＨに依存して表面電荷がアニオン性、カチオン性となる。内表面疎水化有機ナノチューブの内表面の電荷と正常タンパク質の表面電荷が反対の場合、静電相互作用が働き、正常タンパク質は中空シリンダー内に保持される。ｐＨ調製により、静電相互作用を減ずるまたは消失させることで、特別な添加剤を必要とせず、正常タンパク質をバルク水中へと放出可能である。
【００２９】
３．疎水性薬剤のカプセル化、徐放制御
（３−１）対象となる疎水性薬剤
本内表面疎水化有機ナノチューブにカプセル化が可能な疎水性薬剤としては、チューブ内表面とは逆の電荷を有し、かつ疎水性の官能基を有する薬剤が上げられる。これは、疎水性薬剤中のイオン性官能基と内表面疎水化有機ナノチューブのイオン性官能基の静電引力とともに、チューブの疎水性内表面と薬剤中の疎水部との疎水性相互作用によって効率的に薬剤をカプセル化することが出来るからである。
例えば、一般式（１）で表わされる非対称双頭型脂質分子のうち内表面が負にイオン化できるカルボン酸系脂質と一般式（２）で表わされる疎水基を有する誘導体の組み合わせで得られる内表面疎水化有機ナノチューブ（アニオン性疎水化ナノチューブ）にはアミノ基を有する抗悪性腫瘍剤であるドキソルビシン、同様にアミノ基を有するカチオン性の疎水性薬剤である、アミロリド（抗利尿剤）、モルヒネ、プロカインアミド（抗不整脈薬）、キニジン（抗不整脈薬）、ラニチジン（Ｈ2ブロッカー）、テトラサイクリン系抗生物質、バンコマイシン、クラリスロマイシンなどの薬剤の包接が可能である。また疎水性ナノチューブを製造する際、一般式（２）で表わされる疎水基を有する誘導体の比率を高くすることで、内表面の疎水性をより高くすることができる。これによりカチオン性薬剤のうちでもより疎水性の高い薬剤、または疎水性薬剤（例えば、イブプロフェンやビタミンＥ）のカプセル化が優位となる。このようにして包接させるゲストのカチオン性、及び疎水性の度合いを勘案しながら、両者の配合割合を設定できるので、ゲストにとって最適な非対称ナノチューブを提供できる。
逆に内表面が正にイオン化できるアミン系脂質と疎水基を有する脂質などの組み合わせで得られる内表面疎水化有機ナノチューブ（カチオン性疎水化ナノチューブ）には、カルボン酸を有するインドメタシンなどの薬剤がカプセル化可能である。
また本発明のカルボン酸系非対称ナノチューブは、その内側がカルボキシル基で被覆されているため、中に好ましく包接される薬剤は、カルボキシル基とイオン結合可能なアミノ基などのカチオン性の官能基を有する化合物が好ましく、安定なカチオン性薬剤−非対称ナノチューブ複合体を形成する。また、チューブ内が負の電荷に満たされた環境となっているため、特にイオン結合可能な官能基を有している化合物でなくても、物質全体が正の電荷を帯びたカチオン性物質であって、サイズが０.１〜５ｎｍ程度の物質であれば包接可能であり、このようなカチオン性物質を包接した非対称ナノチューブもカチオン性物質−非対称ナノチューブ複合体を形成しているといえる。
カチオン性薬剤−非対称ナノチューブ複合体を形成する具体的なカチオン性薬剤としては、上記のドキソルビシンに加え、イダルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ピラルビシンなどのアントラサイクリン系抗癌剤やその他のアミノ基やピリジンを有する薬剤が特に好ましく用いられる。また、シスプラチン、ネダプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンなどの薬剤も、チューブ内表面のカルボキシル基と相互作用する点から好ましい。
当然のことながら、本発明の非対称ナノチューブは、このような医薬品としての薬理作用を有する薬剤のみならず、化粧品用、食品用などのカチオン性の乳化剤、分散剤、安定剤、保湿剤等各種添加剤に対しても適用可能である。
【００３０】
（３−２）疎水性薬剤のカプセル化（包接化）方法
疎水性薬剤のうち水に可溶なもののカプセル化には、内表面疎水化有機ナノチューブを水に分散し、そこに疎水性薬剤を添加、撹拌することでカプセル化が可能となる。例えばカプセル化したいカチオン性物質を純水（ミリＱ水）に０.１ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように溶解又は懸濁したものと、本発明の非対称ナノチューブ分散液（濃度０.１ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬ）とを等量混合し、１０分〜２４時間程度室温で放置する。そのことで、３０〜９５％程度のカプセル化率を達成できるため、例えば抗癌剤用組成物として用いる場合など、有効量を含有させるための組成物総量を低く抑えることができる。
疎水性薬剤のうち水に難溶なものは、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、アルコ−ルなど、カプセル化する薬剤を可溶にしつつ、チューブ構造を破壊しない有機溶媒の利用（混合系あるいは純品）が必要となる。またナノチューブは温度によっても溶解性が変化するので、ナノチューブを壊さない温度を選択することも重要である。このようにして薬剤が溶解しており、かつナノチューブも形態を保っていられる様な状態で混合したのち、それを１０分から２４時間ほど静置することでカプセル化が可能となる。
カプセル化されなかった物質は、上記混合溶液を２００ｎｍの多孔質膜でろ過することによって、効率よく取り除くことができる。これによって、カチオン性物質をカプセル化したチューブのみを固体として単離することができるので、これを任意の濃度でミリＱ水に再分散させることで濃度を調整することも可能である。またカチオン性物質をカプセル化したチューブを凍結乾燥して得た固体を同様に任意の濃度でミリＱ水に分散させることでも濃度を調整することができる。
薬剤のカプセル化率は、上記の手法でカプセル化した後、ナノチューブを濾別し、これをミリＱ水に再分散して得られた溶液の薬剤固有のＵＶ吸収を測定することで、定量することができる。例えばドキソルビシンの場合、ドキソルビシン溶液２００μL（それぞれミリＱ水１ｍＬあたりに２.０ｍｇ〜０.５０ｍｇの任意の量で溶解したもの）とナノチューブ分散液（２００μＬ、５ｍｇ／ｍL）を混合し、３０分室温で放置した。これより２００μLを取り、２００nmの多孔質膜でろ過し、さらにミリＱ水（４００μＬ）で洗浄した。濾別された固体（ナノチューブ）はろ紙ごと２００μＬのミリＱ水に再分散した。ドキソルビシンのＵＶ吸収（４８０ｎｍ）によって、ろ過前の溶液とろ過後の溶液の吸収を比較して、カプセル化率を求めた。
水溶液系でのアニオン性疎水化ナノチューブを用いたカプセル化において、疎水性部位を持つ一般式（２）で表わされる誘導体の比率の増加は、薬剤のカプセル化率を向上させる。特にナノチューブに対して、カプセル化される薬剤の量が多い場合には、疎水成分の添加により、カルボン酸系非対称ナノチューブに較べると約１０％程度のカプセル化率の向上が見られることが分かる。
【００３１】
（３−３）疎水性薬剤の徐放制御
内表面疎水化ナノチューブからの疎水性薬剤の徐放については、水系、有機溶媒などの種々の溶媒中で可能である。ナノチューブと薬剤との静電引力を維持し、薬剤をより長時間徐放するためには、媒体の塩濃度をなるべく抑制することが望ましい。非対称双頭型脂質分子とその誘導体の混合比を変えることでも、カプセル化された薬剤の徐放特性を制御することができる。
またカルボキシル基を内表面にもつ内表面疎水化有機ナノチューブおよびカルボン酸系非対称ナノチューブのいずれにおいてもｐＨ変化などの外部の刺激に応じ、チューブ内表面を被覆するカルボキシル基のイオン化状態の変化によって、条件選択的かつ効率的に薬剤を放出することができる。具体的には、ミリＱ水の分散液にバッファー溶液を加えｐＨ値を４〜６程度とすることで、内表面のカルボキシル基がプロトン化するため、放出の加速が可能である。またｐＨを７〜８程度にすることでも徐放することが可能である。
【００３２】
また、本発明の内表面疎水化有機ナノチューブおよびカルボン酸系非対称ナノチューブとして、超音波処理などにより長さを５０ｎｍ〜５００ｎｍ程度にまでサイズダウンしたナノチューブを用いることで、ＥＰＲ（Enhanced Permiability and Retation）効果により、ターゲットとなるガン細胞、組織へ送達する量を高めることが期待出来る。
ナノチューブからの薬剤放出量は、チューブ分散液を透析膜チューブ（分画分子量１２００〜２００００程度）の内水相に密閉し、膜を通過して外水相に放出された薬剤をＵＶなどの分光分析によって計測することで定量的に計測可能である。
例えば、ドキソルビシンを内包化した非対称ナノチューブ（ナノチューブ／ドキソルビシン＝８／１）のＰＢＳバッファー中（ｐＨ７.４）の場合は、これを透析膜（分画分子量１４０００）に密閉し、同様にＰＢＳバッファー中（ｐＨ７.４）の外水相に入れて撹拌しながら外水相のドキソルビシンの放出量をＵＶ吸収によってモニターした。
【００３３】
４．カプセル化された薬剤組成物
（４−１）薬剤組成物について
本発明の内表面疎水化有機ナノチューブおよびカルボン酸系非対称ナノチューブは、上述のように薬剤キャリアとして優れた特性を有しているため、治療用の薬剤を有効量含む非対称ナノチューブ複合体を有効成分として、薬理学的に許容される担体と共に薬剤組成物とすることができる。なお、薬剤組成物とは、例えば抗癌剤など癌の予防、治療又は処置のための医薬組成物を含む。また、水性環境中に徐々に薬剤を放出させたい場合などにも有効であることから、この薬剤組成物としては、化粧品用、食品用として配合されるカチオン性薬剤組成物も包含される。
本発明のカプセル内の薬剤として典型的な薬剤は、上述のドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ピラルビシンなどのアントラサイクリン系抗癌剤やその他のアミノ基を有する薬剤である。その他、シスプラチン、ネダプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンなどのカチオン性薬剤も同様に用いることができる。なお、本発明の非対称ナノチューブの内表面がカルボン酸エステル基に覆われている場合、あるいはカルボン酸基とそのエステルの混合物、又はカルボン酸基と疎水性アミド基の混合物に覆われている場合は、カチオン性薬剤のうちでもより疎水性の高い薬剤、または疎水性薬剤（例えば、イブプロフェンやビタミンＥ）をカプセル化させた薬剤組成物とする場合に、より有効である。
ここで、薬学的に許容される担体とは、希釈剤又は賦形剤、例えば、水又は生理的許容される緩衝液を含む。
本発明の薬剤組成物は、錠剤などの経口投与も可能であるが、静脈経由若しくは直接患部への注射、外用剤などの非経口的に投与することもできる。
本発明の薬剤組成物を患者に投与する際の投与量は、用いる薬剤の種類、医療対象の患者の年齢、体重及び病状、投与経路などに従い適宜決めることができるが、典型的には、１回の投与当たりの薬剤の有効量としては、１μｇ〜１ｇ、好ましくは１００μｇ〜１０ｍｇの範囲である。
【００３４】
（４−２）薬剤組成物の機能について
本発明の内表面疎水化有機ナノチューブおよびカルボン酸系非対称ナノチューブによる薬剤カプセル化物は、中性付近での徐々に放出することができる徐放作用と、酸性条件での加速された薬剤放出効果、さらには内表面疎水化有機チューブでは、チューブ内表面の疎水性の制御による徐放制御という３つの効果が期待できる。すなわち、癌細胞の場合、若干酸性状態のがん組織付近での選択的な薬剤放出効果と共に、がん細胞内部での速やかな薬剤放出による高い抗癌活性の発現、さらには必要に応じて徐放速度を制御することでさらに毒性に由来する副作用を抑制しかつ薬効を向上させるという三つの効果が期待できる。
なお、本発明で「細胞」というとき、典型的にはヒトを含む哺乳動物細胞を指す。インビトロでの培養細胞であってもよいが、薬剤治療用の場合、生体を構成する組織、臓器内の細胞や、血液など体液中の血球細胞やリンパ球細胞などの免疫細胞、及び各種の癌細胞が対象となる。
【００３５】
（４−３）薬剤組成物のin Vitro下での細胞毒性評価について
毒性評価では、ＨｅＬａ細胞を用い、種々の非対称ナノチューブにドキソルビシンをカプセル化させたものを添加、培養し、その細胞数を評価することで見積もることが出来る。同様にして、ドキソルビシンそのものとの比較、またナノチューブ自体の評価も可能となる。
【実施例】
【００３６】
次に本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって何ら限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。【００３７】
（参考例１）１−β−Ｄ−グルコピラノシルアミンの製造
Ｄ−グルコ−ス（１.８g，１０ｍｍｏｌ）、重炭酸アンモニウム（０.８g，１０ｍｍｏｌ）、アンモニア水（２８％，５５ｍｌ）をナスフラスコに入れ、４１℃で４８時間撹拌した。反応液を減圧濃縮後、凍結乾燥し、目的とする１−β−Ｄ−グルコピラノシルアミンを固体として得た。【００３８】
（参考例２）一般式（３）で表される中間体３（Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１８）の製造
エイコサン二酸モノメチルエステル（７４６ｍｇ，２.１ｍｍｏｌ）をメタノール３３ｍｌ、酢酸エチル１７ｍｌに溶解し、ＤＭＴ−ＭＭ（４０５ｍｇ，１.４７ｍｍｏｌ）、１−β−Ｄ−グルコピラノシルアミン（２５０ｍｇ，１.４ｍｍｏｌ）を添加後、室温で４.５時間撹拌した。反応液をろ過し、目的とする中間体３のメチルエステルを白色の固体として得た。中間体３のメチルエステル（２５７ｍｇ，０.５ｍｍｏｌ）をメタノール／水溶媒に分散させ、水酸化ナトリウム水溶液（１ｍｏｌ／Ｌ，０.９ｍｌ）を６０℃で添加して加水分解を行った。塩酸を添加してｐＨを４に調整し、不溶の白色固体を濾別することで目的とする中間体３（１７１ｍｇ，２４％）を白色固体として得た。【００３９】
（製造例１）非対称双頭型脂質分子（式（１）化合物−１ａ、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１６、Ｚ1＝ＥＤ、Ｙ＝ｙｌＧ、ｍ＝３、Ｘ＝Ｈ）の合成
一般式（１）で表される非対称双頭型脂質分子のうち、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１６，Ｚ1＝ＥＤ、Ｙ＝ｙｌＧ、ｍ＝３、Ｘ＝Ｈ）の場合の脂質分子（化合物−１ａ）は、非特許文献18の方法に従った合成した。1Ｈ−ＮＭＲ、ＩＲ、元素分析によって化合物−１aであることを確認した。【００４０】
（製造例２）非対称双頭型脂質分子（式（１）化合物−１b、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１８、Ｚ1＝ＥＤ、Ｙ＝ｙｌＧ、ｍ＝３、Ｘ＝Ｈ）の合成
一般式（１）で表される非対称双頭型脂質分子のうち、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１８，Ｚ1＝ＥＤ、Ｙ＝ｙｌＧ、ｍ＝３、Ｘ＝Ｈ）の場合の脂質分子（化合物−１ｂ）は、原料としてエイコサン二酸用い、製造例１の方法に従った合成した。1Ｈ−ＮＭＲ、ＩＲによって化合物−１ｂであることを確認した。
１Ｈ−ＮＭＲ(DMSO-d6とD2O１滴、400MHz)  1.23(s,  28H,  -CH2-),  1.47(m,  4H,  -CH2-),  2.07(m,  4H,  -CH2C=O),  3.08(m,  3H,  H-2,  H-4,  H-5),  3.09(m,  4H,  NH-CH2C=O),  3.18(t,  1H,  H-3),  3.62(m,  4H,  -NH-CH2-,  -CH2-NH2),  3.68(d,  2H,  H-6a,  H-6b),  3.85(s,  2H,  -NH-CH2-),  4.68(t,  1H,  H-1),  7.95(m,  2H,  NH),  8.32(m,  2H,  NH)【００４１】
（製造例３）誘導体（式（２）化合物−２a、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１６、Ｚ1＝ＥＤ、Ｙ＝ｙｌＧ、ｍ＝３、Ｚ2＝単鎖、Ｒ＝ベンジルオキシカルボニル基）の合成
一般式（２）で表される誘導体のうち、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１６、Ｚ1＝ＥＤ、Ｙ＝ｙｌＧ、ｍ＝３、Ｚ2＝単鎖、Ｒ＝ベンジルオキシカルボニル基）の場合の誘導体（化合物−２a）は、化合物−１aの前駆体であることから、化合物−１aの合成過程で得た。1Ｈ−ＮＭＲによって化合物−２aであることを確認した。
１Ｈ−ＮＭＲ(DMSO-d6とD2O１滴、400MHz)  1.24(s,  24H,  −CH2−),  1.47(m,  4H,  -CH2-),  2.04(m,  4H,  -CH2C=O),  3.05(m,  3H,  H-2,  H-3,  H-5),  3.08(m,  4H,  N-CH2-CH2-N),  3.16(m,  1H,  H-4),  3.40  (m,  2H,  H-6),  3.63  (m,  2H,  H-6),  3.65(d,  2H,  N-CH2C=O),  3.67(d,  2H,  N-CH2C=O),  3.75(d,  2H,  N-CH2C=O),  4.69(t,  1H,  H-1),  5.03(s,  2H,  -CH2-Phe),  7.35(m,  5H,  Phe),  7.50(t,  1H,  NH),  7.81(d,  2H,  NH),  8.12(t,  1H,  NH),  8.16(t,  1H,  NH),  8.61(d,  1H,  NH)【００４２】
（製造例４）誘導体（式（２）化合物−２ｃ、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１８，Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝４、Ｚ2＝単鎖、Ｒ＝メトキシ基）の合成
一般式（２）で表される誘導体のうち、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝４、Ｚ2＝単鎖、Ｒ＝メトキシ基の場合の誘導体（化合物−２ｃ）は、特許文献１あるいは非特許文献8によって得た中間体３を原料として用い、ＤＭＦ（２０ｍｌ）中、この中間体３（２００ｍｇ、０.４ｍｍｏｌ）にテトラグリシンメチルエステル（１１５ｍｇ、０.４４ｍｍｏｌ）およびＤＭＴ−ＭＭを添加し、室温で２時間撹拌することによって合成した。反応液を減圧濃縮後、メタノール中で再沈殿、吸引ろ過することにより白色固体として化合物−２ｃを得た。1Ｈ−ＮＭＲによって化合物−２cであることを確認した（図１）。
１Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d6とD2O１滴、400MHz）  1.23(s,28H,-CH2-),  1.47(m,4H,-CH2-),  2.07(m,4H,-CH2C=O),  3.08(m,3H,H-2,H-4,H-5),  3.09(m,4H,NH-CH2C=O),  3.18(t,1H,  H-3),  3.62(m,  4H,-NH-CH2-,  -CH2-NH2),  3.68(d,2H,H-6a,H-6b),  3.85(s,2H,  -NH-CH2-),  4.68(t,1H,H-1),  7.95(m,2H,NH),  8.32(m,2H,NH).【００４３】
（製造例５）非対称双頭型脂質分子（式（１）化合物−１c、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１８、Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝４、Ｘ＝ＯＨ）の合成
一般式（１）で表される非対称双頭型脂質分子のうち、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１８、Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝４、Ｘ＝ＯＨの場合の脂質分子（化合物−１ｃ）は、製造例４で得た誘導体（式（２）化合物−２ｃ）から調製した。誘導体（式（２）化合物−２ｃ、２５０ｍｇ，０.３４ｍｍｏｌ）をエタノール／水（１：１体積比、２５ｍｌ）に溶解し、１規定のＮａＯＨ水溶液を（０.３８ｍｌ）添加。溶液を９０℃で１０分撹拌することで加水分解を行った後、１規定のＨＣｌ水溶液を（０.４ｍｌ）添加して、ｐＨ４付近になるように中和し、沈殿した固体をろ過、乾燥することで化合物−１cを得た（２１５ｍｇ，収率８５％）。1Ｈ−ＮＭＲによって化合物−１cであることを確認した（図２）。
１Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d6とD2O１滴、400MHz）  1.23(s,28H,-CH2-),  1.47(m,4H,-CH2-),  2.07(m,4H,-CH2C=O),  3.08(m,3H,H-2,H-4,H-5),  3.09(m,4H,NH-CH2C=O),  3.18(t,1H,H-3),  3.62(m,4H,-NH-CH2-,-CH2-NH2),  3.68(d,2H,H-6a,H-6b),  3.85(s,2H,-NH-CH2-),  4.68(t,1H,H-1),  7.95(m,2H,NH),  8.32(m,  2H,NH)【００４４】
（製造例６）誘導体（式（２）化合物−２d、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１８、Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝４、Ｚ2＝単鎖、Ｒ＝ベンジルオキシ基）の合成
一般式（２）で表される誘導体のうち、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１８、Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝４、Ｚ2＝単鎖、Ｒ＝ベンジルオキシ基の場合、上述の製造例４に記載した方法によって得た中間体−３を原料として用い、ＤＭＦ（１０ｍｌ）中、この中間体−３（１００ｍｇ，０.２ｍｍｏｌ）にテトラグリシンベンジルエステル（８０ｍｇ，０.２４ｍｍｏｌ）およびＤＭＴ−ＭＭを添加し、室温で２時間撹拌することで合成した。反応液を減圧濃縮後、メタノール中で再沈殿、吸引ろ過することにより白色固体として化合物２d（１５０ｍｇ，０.１８ｍｍｏｌ，収率９０％）を得た。1Ｈ−ＮＭＲによって化合物−２dであることを確認した（図３）。
１Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d6とD2O１滴、400MHz）  1.23(s,28H,-CH2-),  1.47(m,4H,-CH2-),  2.07(m,4H,-CH2C=O),  3.08(m,3H,H-2,H-4,H-5),  3.09(m,4H,NH-CH2C=O),  3.18(t,1H,H-3),  3.62(m,4H,-NH-CH2-,-CH2-NH2),  3.68(d,2H,H-6a,H-6b),  3.85(s,2H,-NH-CH2-),  4.68(t,1H,H-1),  7.95(m,2H,NH),  8.32(m,  2H,NH).【００４５】
（製造例７）誘導体（式（２）化合物−２e、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１８、Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝３、Ｚ2＝ＥＤ、Ｒ＝ベンジルオキシカルボニル）の合成
一般式（２）で表される誘導体のうち、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１８、Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝３、Ｚ2＝ＥＤ、Ｒ＝ベンジルオキシカルボニル基の場合、誘導体（式（２）化合物−２e）との一部となる一般式（４）（Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝３、Ｚ2＝ＥＤ、Ｒ＝ベンジルオキシカルボニル）の合成を行った。Ｂｏｃ−Ｎ−トリグリシン（２ｇ、６.９ｍｍｏｌ）を無水メタノール（５０ｍｌ）に溶解し、モノＮ−ベンジルオキシカルボニルエチレンジアミン塩酸塩（１.７ｇ、７.２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１.１ｍｌ）およびＤＭＴ−ＭＭを添加し、室温で３時間撹拌した。反応液を減圧濃縮後（２０ｍｌまで）、これを４規定の塩酸−酢酸エチル溶液（２０ｍｌ）を４℃で添加、撹拌することで、沈殿物として一般式（４）（Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝３、Ｚ2＝ＥＤ、Ｒ＝ベンジルオキシカルボニル）の塩酸塩を得た（２.４ｇ，８７％）。上述の製造例４に記載した方法によって得た中間体−３を原料として用い、ＤＭＦ（２０ｍｌ）中、この中間体−３（２００ｍｇ，０.４ｍｍｏｌ）と一般式（４）（Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝３、Ｚ2＝ＥＤ、Ｒ＝ベンジルオキシカルボニル）（１７５ｍｇ，０.４４ｍｍｏｌ）およびＤＭＴ−ＭＭとトリエチルアミンを添加し、室温で２時間撹拌した。反応液を減圧濃縮後、メタノール中で再沈殿、吸引ろ過することにより白色固体として化合物−２e（３１０ｍｇ、０.３６ｍｍｏｌ、収率９０％）を得た。1Ｈ−ＮＭＲによって化合物−２eであることを確認した（図４）。
１Ｈ−ＮＭＲ（DMSO−d6とD2O１滴,400MHz）  1.23(s,28H,-CH2-),  1.47(m,4H,-CH2-),  2.07(m,4H,-CH2C=O),  3.08(m,3H,H-2,H-4,H-5),  3.09(m,4H,NH-CH2C=O),  3.18(t,1H,H-3),  3.62(m,4H,-NH-CH2-,-CH2-NH2),  3.68(d,2H,H-6a,H-6b),  3.85(s,2H,-NH-CH2-),  4.68(t,1H,H-1),  7.95(m,2H,NH),  8.32(m,2H,NH).【００４６】
（製造例８）誘導体（式（２）化合物−２ｆ、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１６、Ｚ1＝ＥＤ、Ｙ＝ｙｌＧ、ｍ＝３、Ｚ2＝単鎖、Ｒ＝ｔ−ブトシキカルボニル基）の合成
一般式（２）で表される誘導体のうち、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１６、Ｚ1＝ＥＤ、Ｙ＝ｙｌＧ、ｍ＝３、Ｚ2＝単鎖、Ｒ＝ｔ−ブトシキカルボニル基）の場合の誘導体（化合物−２ｆ）は、ｔ−ブトシキカルボニルグリシルグリシルグリシンスクシニミジルエステルを用いて、化合物−２ａの合成法に従い得た。1Ｈ−ＮＭＲによって化合物−２ｆであることを確認した。
１Ｈ−ＮＭＲ(DMSO-d6とD2O１滴, 60oC, 400MHz) 4.69 (t, 1H, H-1), 3.75 (d, 2H, NCH2C=O), 3.67 (s, 2H, NCH2C=O), 3.65 (d, 2H, NCH2C=O), 3.63 (m, 1H, H-6), 3.40 (m, 1H, H-6), 3.16 (m, 1H, H-4), 3.08 (m, 4H, NCH2CH2N), 3.05 (m, 3H, H-2, H-3, H-5), 2.04 (m, 4H, CH2C=O), 1.47 (m, 4H, CH2), 1.38 (s ,9H, CH3), 1.24 (m, 24H, CH2)【００４７】
（実施例１）非対称双頭型脂質分子（化合物−１a）と誘導体（化合物−２a）の二成分系自己集合による内側表面が疎水化された有機ナノチューブの製造
非対称双頭型脂質分子（式（１）化合物−１ａ、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１６、Ｚ1＝ＥＤ、Ｙ＝ｙｌＧ、ｍ＝３、Ｘ＝Ｈ；５ｍｇ,７.３μｍｏｌ）の塩酸塩と誘導体（式（２）化合物−２a、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１６、Ｚ1＝ＥＤ、Ｙ＝ｙｌＧ、ｍ＝３、Ｚ2＝単鎖、Ｒ＝ベンジルオキシカルボニル基；０.６ｍｇ，０.７３μｍｏｌ）をｐＨ５の水５ｍｌに加熱溶解後、室温まで冷却した。化合物−１ａと化合物−２ａが均一に混合した水溶液に水酸化ナトリウムを添加し、室温下ｐＨ９に調製した。リンタングステン酸でネガティブ染色後、透過型電子顕微鏡観察により、内径約１０ｎｍ、膜厚約３ｎｍのナノチューブ構造であることを確認した（図５）。【００４８】
（実施例２）非対称双頭型脂質分子（化合物−１ｃ）と誘導体（化合物−２ｅ）の二成分系自己集合による内表面が疎水化された有機ナノチューブの製造
非対称双頭型脂質分子１ｃ（式（１）化合物−１ｃ、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１８、Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝４、Ｘ＝ＯＨ）および誘導体２ｅ（式（２）化合物−２ｅ、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１８、Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝３、Ｚ2＝ＥＤ、Ｒ＝ベンジルオキシカルボニル基）を所定の割合（約１０：１〜１０：１０程度）でＤＭＳＯ中で混合し、その後７０℃で加熱溶解後、室温に冷却することで、二成分系自己集合を行った。これに水（ＤＭＳＯの９倍体積）を加えてろ過（２００ｎｍ）によりナノチューブを単離し、水を添加する（５ｍｇ／ｍｌ）とほぼ透明なナノチューブ分散液を得た。誘導体２ｅ単独では針状結晶として沈殿するが、上述の混合物では良分散のほぼ透明な分散液を与える。またこの分散液の電子顕微鏡観察により、内径が約７ｎｍ前後のナノチューブ状構造体のみを集合形態として与える（図６）ことから、二成分系自己集合により均一な分子分散状態としてナノチューブを与えることがわかった。【００４９】
（実施例３）  非対称双頭型脂質分子（式（１）化合物−１c、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１８、Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝４、Ｘ＝ＯＨ）の自己集合による非対称ナノチューブの形成
まず、前記製造例５において製造された、本発明の非対称双頭型脂質分子、化合物−１ｃを用いて、以下の分散液の加熱による溶解、その後の冷却による方法において、溶媒に水およびジメチルスルホキシドを用いた場合を以下に示す。
水中での製造の場合は本発明の非対称双頭型脂質分子（０.５ｍｇ〜５ｍｇ）を１ミリリットルの純水（ミリＱ水など）に分散し、８０〜１００℃に加熱溶解後、冷却（０.１℃〜１０℃毎分）することで非対称ナノチューブが得られる。得られた非対称ナノチューブの形態、大きさなどは、分散液を電子顕微鏡用のグリッドに滴下し、内部を電子線不透過な染色剤で染色することで、確認することができる。この様にして外径が約１５ｎｍ、内径が約７〜９ｎｍ、長さが、２００ｎｍ〜３００ｎｍの非対称ナノチューブを得ることができた（図７上）。
ジメチルスルホキシド（１ｍＬ）中に非対称双頭型脂質分子（０.５ｍｇ〜５０ｍｇ）を分散し、８０〜１２０℃に加熱溶解後、冷却（０.１℃〜１０℃毎分）することで同様にチューブが得られる。チューブ長約５〜１０μｍ程度の長いナノチューブが得られる。
同様に化合物−１ｄ（式（１）中、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１８、Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝６、Ｘ＝ＯＨ）においても上記と同様の工程によって同様のサイズを持つ非対称ナノチューブを得ること画出来る（図７下）。【００５０】
（実施例４）  非対称双頭型脂質分子（式（２）、化合物−２ｃ：Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝４、Ｚ2＝単鎖、Ｒ＝メトキシ基）の自己集合による非対称ナノチューブの形成
前記製造例４において製造された、本発明の非対称双頭型脂質分子の、化合物―２ｃを用いた非対称ナノチューブの製造方法を示す。
ジメチルスルホキシド（１ミリリットル）中に非対称双頭型脂質分子（０.５ｍｇ〜５０ｍｇ）を分散し、８０〜１２０℃に加熱溶解後、冷却（０.１℃〜１０℃毎分）することで外径が約１５ｎｍ、内径が約７〜９ｎｍの非対称ナノチューブが得られる（図８）【００５１】
（実施例５）  生理的条件下でのチューブ構造の安定性評価
図９に、生理的条件下（ｐＨ７.４のＰＢＳバッファー中に分散し３２時間インキュベーション後）での種々の非対称ナノチューブ構造の安定性を検討した結果を示す。比較のために、先行技術として特許出願（特願２０１０−１９４５４４号）中の２種類の非対称ナノチューブ（「先願ナノチューブＡ（一般式１において、Ｇが２−グルコピラノシルアミンに置換され、ｎ＝１２、Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝４に相当）」、「先願ナノチューブＢ（一般式１において、Ｇが２−グルコピラノシルアミンに置換され、ｎ＝１４、Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝４に相当）」）及び非特許文献9で製造した非対称ナノチューブ「従来ナノチューブＣ（一般式１において、Ｇが１−グルコピラノシルアミンに置換され、ｎ＝１６、Ｚ1＝単鎖、Ｙ＝Ｇｌｙ、ｍ＝２に相当））」）を用いた。これらの「先願ナノチューブＡ，Ｂ」及び「従来ナノチューブＣ」は、いずれの場合にもほとんどがファイバー状に変化してしまう（図９ａ〜ｃ）。この場合、内径約５０ｎｍ、外径約１００〜１５０ｎｍとチューブ径の大きなチューブ構造に変化している。
一方、本願、実施例３で得た非対称ナノチューブでは、この様な変化は示さず（図９ｄ）、水中で作成したナノチューブのサイズを保持しており、生理学的条件下でも高い構造安定性を有することを示している。なお図示してはいないが、同様に実施例４で得た非対称ナノチューブ、および実施例２で得た疎水化非対称ナノチューブも上記の生理的条件下での安定性を検討し、形態変化を示さなかったことから、同様の安定性をもつことが判っている。【００５２】
（実施例６）タンパク質リフォールディング機能
６ｍｏｌ／Ｌ塩酸グアニジンまたは８ｍｏｌ／Ｌ尿素によって化学変性させた緑色蛍光タンパク質（GFP，０.５〜５０μg/μL）共存下で実施例１と同様に式（１）−１ａと式（２）−２ａの二成分系自己集合を行っても同サイズ次元を有する内表面疎水化有機ナノチューブが形成した。遠心分離によって内表面疎水化有機ナノチューブを沈降させ、中空シリンダー内に包接されなかったＧＦＰを含む上澄み液を除去した。水を加え遠心分離を行い、上澄みを除去する操作を数回繰り返した。内表面疎水化有機ナノチューブが包接した変性ＧＦＰの量は、式（１）−１ａの単一成分自己集合によって形成する有機ナノチューブが包接可能な変性ＧＦＰの量よりも二倍程度多いことが明らかとなった（図１０）。これは、内表面疎水化有機ナノチューブの方が、疎水基が一部露出した構造をとっている変性ＧＦＰと強く相互作用するためである。塩酸グアニジンまたは尿素の濃度を０.０１ｍｏｌ／Ｌ程度まで減少させると、有機ナノチューブの中空シリンダー内で変性ＧＦＰのリフォールディングが起こることが分かった。内表面疎水化有機ナノチューブを用いた場合のリフォールディング効率は、通常の希釈法で行った場合よりも著しく高いだけでなく、内表面を疎水化していない有機ナノチューブを用いた場合のそれよりも二倍程度高いという結果であった（図１１）。リフォールディングした正常ＧＦＰはｐＨ７付近でアニオン性であり、プロトン化した有機ナノチューブ内表面アミノ基との静電相互作用により長期間にわたって中空シリンダー内に安定に保持すること可能であった。一方、ｐＨ８付近では有機ナノチューブ内表面アミノ基の脱プロトン化により、静電相互作用が消失し、正常ＧＦＰはバルク水中へと放出されることが分かった（図１２）。内表面疎水化有機ナノチューブからの正常ＧＦＰの放出速度は、内表面を疎水化していない有機ナノチューブのそれよりも速いことが分かった。遠心分離操作によって、正常ＧＦＰのみを簡便に回収できることが明らかとなった。【００５３】
（実施例７）タンパク質リフォールディング機能２
非対称双頭型脂質分子（式（１）化合物−１ａ、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１６、Ｚ1＝ＥＤ、Ｙ＝ｙｌＧ、ｍ＝３、Ｘ＝Ｈ；５ｍｇ，７.３μｍｏｌ）の塩酸塩と誘導体（式（２）化合物−２ｆ、Ｇ＝１−β−Ｄ−グルコピラノシル基、ｎ＝１６、Ｚ1＝ＥＤ、Ｙ＝ｙｌＧ、ｍ＝３、Ｚ2＝単鎖、Ｒ＝ｔ-ブトキシカルボニル基；０.５４ｍｇ，０.６９μｍｏｌ）をｐＨ５の水１ｍｌに加熱溶解後、室温まで冷却した。６ｍｏｌ／Ｌ塩酸グアニジンによって化学変性させた炭酸脱水酵素（CAB，５〜５０μg）を添加後、水酸化ナトリウムを用い、室温下ｐＨ７に調製した。リンタングステン酸でネガティブ染色後、透過型電子顕微鏡観察により、内径約１０ｎｍ、膜厚約３ｎｍのナノチューブが生成したことを確認した。遠心分離によって内表面疎水化有機ナノチューブを沈降させ、中空シリンダー内に包接されなかったＣＡＢを含む上澄み液を除去した。水を加え遠心分離を行い、上澄みを除去する操作を数回繰り返した。内表面疎水化有機ナノチューブが包接した変性ＣＡＢの量は、式（１）−１ａの単一成分自己集合によって形成する有機ナノチューブが包接可能な変性ＣＡＢの量よりも二倍程度多いことが明らかとなった（図１３）。これは、内表面疎水化有機ナノチューブの方が、疎水基が一部露出した構造をとっている変性ＣＡＢと強く相互作用するためである。塩酸グアニジンまたは尿素の濃度を１ｍｍｏｌ／Ｌ程度まで減少させると、有機ナノチューブの中空シリンダー内で変性ＣＡＢのリフォールディングが起こることが分かった。ｐＨ７.８条件下、有機ナノチューブからＣＡＢをバルク水中へと放出させた。リフォールディングした正常ＣＡＢの回収率は、変性ＣＡＢを単純に希釈してリフォールディングさせた場合（希釈法）よりも著しく高く、また、内表面疎水化有機ナノチューブを用いた場合の回収率は、内表面を疎水化していない有機ナノチューブを用いた場合のそれよりも１.５倍高いという結果であった（図１４）。【００５４】
（実施例８）カチオン性薬剤のカプセル化および徐放性制御機能
（ドキソルビシン／ナノチューブ中の脂質のモル比＝１／８、ドキソルビシンの量は２３９μｇ／５００μＬ）
実施例２の方法で得られた化合物−１ｃと化合物−２ｅの二成分系自己集合による内表面が疎水化された有機ナノチューブのミリＱ水への分散液（１.９１ｍｇ／ｍＬ，０.５ｍＬ，ｐＨ６.５に調製）にドキソルビシン水溶液を添加し、そのカプセル化能を検討した結果、化合物−１ｃ単体から得られたナノチューブとほぼ同等か若干高い包接能力を示した（図１５）。
続いて包接されたドキソルビシンのナノチューブからの放出を評価した。すなわちドキソルビシンをカプセル化したナノチューブ（ドキソルビシン／ナノチューブ中の脂質のモル比＝１／８、ドキソルビシンの量は２３９μｇ/５００μＬ）を透析チューブに密封し、外水相としてＨＥＰＥＳ−salineバッファ−（２０ｍＭ，ＨＥＰＥＳ；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ,ｐＨ７.４か５.５に調製、２０ｍｌ）を用い、撹拌（２００ｒｐｍ）しながら、外水相に漏れ出してくるドキソルビシンの量を分光光度計で定量した。その結果、ナノチューブ内表面の疎水性官能基の割合によって放出速度が大きく変化することが分かった（図１６）。また分散媒のｐＨが７.４から５.５に低下すると放出速度が増大することが分かった（図１６と図１７の比較）。これは、がん組織が若干酸性に変化することが知られているので、がん組織における選択的な放出を促進する優れた特性となる。【００５５】
（実施例９）薬剤内包化実験
上記実施例３で化合物１−ｃより製造した非対称性ナノチューブ、および上記「先願ナノチューブＡ」を用いてドキソルビシンの内包化を以下の実験によりおこなった。
ドキソルビシン溶液２００μＬ（それぞれ２，１，０.７１４，０.６２５，０.５５５，０.５ｍｇ／ｍＬのミリＱ水に溶解したもの）と上記のそれぞれの非対称ナノチューブの分散液（２００μＬ、５ｍｇ／ｍＬ）を混合し、３０分室温で放置した。２００μＬを取り、多孔質膜（２００ｎｍ）でろ過し、さらにミリＱ水で洗浄した（４００μＬ）。固体はミリＱ水（２００μＬ）に再分散した。ドキソルビシンのＵＶ吸収（４８０ｎｍ）によって、ろ過前の溶液とろ過後の溶液の吸収を比較して、カプセル化率を求めた。図１８ａには先行技術として特許出願（特願２０１０−１９４５４４号）中の非対称ナノチューブ（先願ナノチューブＡ）の場合、図１８ｂに本願実施例３で製造した非対称ナノチューブのカプセル化率を示した。
その結果、本願の場合、ナノチューブ／ドキソルビシンのモル比（ＯＮＴ／ＤＯＸ）＝５／１〜１１／１では、９５％以上がカプセル化されていることから、混合するだけで高いカプセル化率を示すことが示された（図１８ｂ）。また「先願ナノチューブＡ」でも同様に混合することでドキソルビシンのカプセル化を確認しているが、ＯＮＴ／ＤＯＸ＝５／１では本願よりも２０％も低い７５％のカプセル化率であった（図１８ａ）。また９５％以上のカプセル化を達成するにはＯＮＴ／ＤＯＸ＝７／１以上のチューブが必要であった。以上より本願の非対称ナノチューブの方がドキソルビシンのカプセル化率が高いことがわかった。またカプセル化後もナノチューブの形態は変化していないことを別途、電子顕微鏡観察によって確認している。【００５６】
（実施例１０）薬剤放出実験
次に、前記（実施例９）で記述したドキソルビシンを内包化した先行技術および本願より得た二種類の非対称性ナノチューブからのドキソルビシンの放出実験を、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７.４とｐＨ５.５）中での透析法によって行った。その結果を図１９ａおよびｂにそれぞれ示した。図１９ｂの様に、本願の非対称ナノチューブにおいて中性付近（ｐＨ７.４）では、１２〜１３時間後に全内包化量の５０％が放出され、３２時間たっても放出量は全体の７０％にとどまっているのに対して、弱酸性状態（ｐＨ５.５）では、約５時間で約５０％を放出し、２５時間ではほぼ全量放出してしまうことがわかった。一方、図１９ａの様に上記「先願ナノチューブＡ」を用いた場合では、ｐＨ７.４では、約４時間で５０％のドキソルビシンが放出されてしまう。すなわち放出速度は本願では１／３に減少しており、優れた徐放性をもつことがわかった。これは、図９に示した通り、生理的条件下、３２時間後では本願のナノチューブがそのチューブ構造を維持しているのに対し、「先願ナノチューブＡ」は、同時間後にはファイバー状に変化してしまうことに起因していると考えられる。さらに図２０に示す様に、本願のナノチューブは本薬剤放出の実験後もチューブ構造を維持していることが明かとなっている。以上、ナノチューブの生理的条件下でのチューブ形態の安定性が薬剤の徐放性に極めて重要であることが示唆された。
弱酸性下のｐＨ５.５でも同様、先行技術に較べて本願のナノチューブの方が徐放性に優れていることが示唆された。この弱酸性下では、中性付近と比較して薬剤放出の加速がみられる。これは、非対称ナノチューブ内表面を覆うカルボキシル基から生じたカルボキシラートのプロトン化が刺激となって抗癌剤の放出を加速できることを示している。この低ｐＨ条件で抗癌剤放出が加速される点は、一般に、ガン組織および細胞は、正常細胞に比べて酸性（低ｐＨ）であるという特性を有するから、ガン組織での選択的な薬剤放出が期待でき、ナノチューブを薬剤カプセルとして利用することの有効性は極めて高いと考えられる。【００５７】
（実施例１１）カチオン性薬剤のin Vitro評価
薬剤組成物のin Vitro下での細胞毒性評価について
前記実施例８で得たドキソルビシンをカプセル化した種々の非対称ナノチューブの細胞毒性を以下の様に評価した。すなわちカプセル化細胞用培地としてウシ胎児血清（１０％）を添加したＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）を用い、９６穴プレート上でＨｅＬａ細胞（各１×１０4個）と実施例８で得たドキソルビシンをカプセル化した種々のナノチューブを、各ドキソルビシンの濃度が同一になるように添加し、３７℃、５％ＣＯ2下で２４時間培養した。このドキソルビシンの濃度を０．０１〜２０μｇ／ｍＬで実施した。また用いたカプセル化体でのドキソルビシンとチューブの割合は、モル比で化合物１／Ｄｏｘ＝７とした。対照実験としてドキソルビシンでも同様に調べた。培養後、上清を除去、細胞をＰＢＳバッファー（ｐＨ７.４）で洗浄した。その後の細胞生存率をＷＳＴ−８アッセイで調べて、半数阻害濃度（ＩＣ50）を算出した。また実施例３で化合物１−ｃより得た非対称ナノチューブ自体の細胞毒性も同様に調べた（表２）。
【表２】
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ドキソルビシン（Ｄｏｘ）、ドキソルビシンカプセル化非対称ナノチューブ、非対称ナノチューブの半数阻害濃度ＩＣ50（μグラム／ミリＬ）。
まず非対称ナノチューブ自体では、ＩＣ50が約０.５ｍｇ／ｍＬであることから、細胞毒性も非常に低く、生体に比較的安全な化合物であることが示唆された。またドキソルビシンカプセル化非対称ナノチューブの毒性は、ドキソルビシンそのものに較べて低減されていることがわかる。特に、徐放性に優れた疎水化非対称ナノチューブではＩＣ50が約９〜１０倍になっていることから、大幅な毒性低減効果をもつことが判った。この様に非対称ナノチューブ、中でも疎水化非対称ナノチューブでの優れた副作用抑制効果が明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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