中华人民共和国国家标准  
 
GB 4689.34—xxxx 
 
 
食品安全国家标准  
食品微生物学检验  双歧杆菌检验 
 
 
（征求意见稿）  
中华人民共和国卫生部    发布 xxxx -xx-xx发布  xxxx -xx-xx实施  GB 4789.34—xxxx  
I 前    言 
    本标准代替 GB/T 4789. 34-2008 《食品卫生微生物学检验  双歧杆菌检验 》。 
本标准与 GB/T 4789. 34-2008相比主要变化如下：  
——修改了标准的中英文名称；  
——修改了培养基和试剂 ； 
——删除了双歧杆菌 的计数方法。  GB 4789.34—xxxx  
1 食品安全国家标准  
食品微生物学检验   双歧杆菌 检验 
1 范围 
本标准规定了食品中 双歧杆菌 （Bifidobacterium  ）的检验方法。  
本标准适用于 食品中双歧杆菌 的检验。  
2  设备和材料  
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他 设备和材料如下：  
2.1  恒温培养箱： 36 ℃±1 ℃ 。 
2.2  气相色谱仪配 FID检测器。  
2.3  冰箱：2 ℃～5 ℃。 
2.4  天平： 感量0.1 g。 
2.5  无菌试管： 18 mm×180 mm 、15 mm×100 mm 。 
2.6  无菌吸管： 1 mL（具0.01 mL刻度）、 10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器（ 200μL～1000μL）
及配套吸头 。 
2.7  无菌锥形瓶： 500 mL、250 mL。 
3   培养基和试剂  
3.1  双歧杆菌 培养基：见附录A.1。 
3.2  PYG培养基：见附录A.2。 
3.3  TPY培养基：见附录A.3。 
3.4  氟化钠：化学纯。  
3.5  碘乙酸钠或碘乙酸钾：化学纯。  
3.6  果糖-6-磷酸盐：化学纯。  
3.7  盐酸羟胺 (Hydroxy Lamine -HCl)：化学纯。  
3.8  三氯乙酸 (TCA)：化学纯。  
3.9  三氯化铁（ FeCl 3·6H 2O）：化学纯。  
3.10  甲醇:分析纯。  GB 4789.34—xxxx  
2 3.11  三氯甲烷：分析纯。  
3.12  硫酸：分析纯。  
3.13  冰乙酸：分析纯。  
3.14  乳酸：分析纯。  
3.15  乙酸标准溶液 : 吸取分析纯冰乙酸 5.7mL,移入100mL容量瓶中 ,加水至刻度 ,标定,标定方法见附  
      录B.1,此溶液浓度约为 1mol/L。 
3.16  乙酸标准使用液 :将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至 0.01mol/L 。 
3.17  乳酸标准溶液 : 吸取分析纯乳酸 8.4mL,移入100mL容量瓶中 ,加水至刻度 ,标定,标定方法见附录  
      B.2，此溶液浓度约为 1mol/L。 
3.18  乳酸标准使用液 : 将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至 0.01mol/L 。 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 GB 4789.34—xxxx  
3 4  检验程序 
双歧杆菌检验程序见图 1。 
 
 
   
 
 
 
图1    双歧杆菌检验程序  
 
 
 厌氧，48 h 
36 ℃±1 ℃ 样品25 g（mL）+225 mL 灭菌生理盐水  
10倍系列稀释  
革兰氏染色，过氧化氢酶试验  
报告 选择2个～3个适当稀释度，各取 0.1mL 
分别加入到 双歧杆菌琼脂平板进行涂布  
 
挑取菌落接种于 双歧杆菌 琼脂平板  
接种PYG液体培养基  生化反应  
测定乙酸、乳酸  厌氧，48 h 
36 ℃±1 ℃ 
 
 测定果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶  接种TPY液体培养基  
 
厌氧，72 h 
36 ℃±1 ℃ 
 厌氧，48 h 
36 ℃±1 ℃ GB 4789.34—xxxx  
4 5  操作步骤  
5.1  样品制备  
5.1.1  样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。  
5.1.2  以无菌操作称取 25g（或mL）样品， 置于装有225 mL生理盐水的灭菌锥形瓶内，制成 1:10的
样品匀液。  
5.2  稀释步骤  
5.2.1  用1mL无菌吸管或微量移液器吸取 1:10样品匀液 1.0 mL，沿管壁 缓慢注于装有 9mL生理盐水
的无菌试管中 （注意吸管尖端不要触及稀释液） ， 振摇试管或换用 1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，
制成 1:100的样品匀液。  
5.2.2  另取 1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做 10倍递增样品匀液，每递增稀释
一次，即换用 1次1mL灭菌吸管或吸头。  
5.3  纯培养 
挑取 3个或以上的菌落 接种于 BBL琼脂平板， 厌氧， 36℃±1℃ 培养 48h。 
5.3.1镜检及生化鉴定：  
5.3.1.1  涂片镜检： 双歧杆菌菌体 为革兰氏染色阳性，不抗酸、无芽孢，无动力， 菌体形态多样，呈
短杆状、 纤细杆状或球形，可形成各种分支或分叉形态。  
5.3.1.2  生化鉴定： 选取纯培养平板上的 三个单个 菌落，分别进行生化反应检测， 不同双歧杆菌菌种
主要生化反应见表 1。  
5.4  果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶（ F6PPK）的测定 ,见附录B。 
5.5  气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物 , 见附录B。 
6  报告 
    根据 5.3项镜检及生化反应结果、 5.4项果糖 -6-磷酸盐磷酸酮酶（ F6PPK）阳性结果和 5.5项双歧
杆菌的有机酸代谢产物乙酸与乳酸微摩尔之比大于 1，报告双歧杆菌属的种名 。GB 4789.34—xxxx  
5 表1    双歧杆菌菌 种主要生化反应  
编
号 项目  两歧双歧杆菌   
(B.bifidum ) 婴儿双歧杆菌  
(B.infantis ) 长双歧杆菌
(B.longum ) 青春双歧杆菌
(B.adolescentis ) 动物双歧杆菌
(B.animalis ) 短双歧杆菌  
(B.breve ) 
1 甘  油 － － － － － － 
2 赤癣醇  － － － － － － 
3 D-阿拉伯糖  － － － － － － 
4 L-阿拉伯糖  － － + + + － 
5 D-核  糖 － + － + + + 
6 D-木糖  － + + d + + 
7 L-木糖  － － － － － － 
8 阿东醇  － － － － － － 
9 β-甲基 -D-木糖甙  － － － － － － 
10 D-半乳糖  d + + + d + 
11 D-葡萄糖  + + + + + + 
12 D-果  糖  d + +  d  d + 
13 D-甘露糖  － + + － － － 
14 L-山梨糖  － － － － － － 
15 L-鼠李糖  － － － － － － 
16 卫矛醇  － － － － － － 
17 肌  醇 － － － － － + 
18 甘露醇  － － － － － － 
19 山梨醇  － － － － － － 
20 α-甲基 -D-甘露糖甙  － － － － － － 
21 α-甲基 -D-葡萄糖甙  － － + － － － 
22 N-乙酰 -葡萄糖胺  － － － － － + 
23 苦杏仁甙（扁桃甙）  － － － + + － 
24 熊果甙  － － － － － － 
25 七叶灵  － － + + + － 
 
 
 
 
 GB 4789.34—xxxx  
6 表1    双歧杆菌菌种主要生化反应（续）  
编
号 项目  两歧双歧杆菌   
(B.bifidum ) 婴儿双歧杆菌  
(B.infantis ) 长双歧杆菌
(B.longum ) 青春双歧杆菌
(B.adolescentis ) 动物双歧杆菌
(B.animalis ) 短双歧杆菌  
(B.breve ) 
26 水杨甙（柳醇）  － + － + + － 
27 D-纤维二糖  － + － d － － 
28 D-麦芽糖  － + + + + + 
29 D-乳  糖 + + + + + + 
30 D-蜜二糖  － + + + + + 
31 D-蔗  糖 － + + + + + 
32 D-海藻糖（覃糖）  － － － － － － 
33 菊糖（菊根粉）  － － － － － － 
34 D-松三糖  － － + + － － 
35 D-棉籽糖  － + + + + + 
36 淀  粉 － － － + － － 
37 肝糖（糖原）  － － － － － － 
38 木糖醇  － － － － － － 
39 龙胆二糖  － + － + + + 
40 D-松二糖  － － － － － － 
41 D-来苏糖  － － － － － － 
42 D-塔格糖  － － － － － － 
43 D-岩  糖 － － － － － － 
44 L-岩  糖 － － － － － － 
45 D-阿糖醇  － － － － － － 
46 L-阿糖醇  － － － － － － 
47 葡萄糖酸钠  － － － + － － 
48 2-酮基 -葡萄糖酸钠  － － － － － － 
49 5-酮基 -葡萄糖酸钠  － － － － － － 
注： +表示 90％以上菌株阳性； -表示 90％以上菌株阴性； d表示 11％～ 89％以上菌株阳性。  
 
 
 
 GB 4789.34—xxxx  
7 附录 A 
培养基 
A.1   双歧杆菌琼脂培养基  
A.1.1  成分 
蛋白胨  15.0 g  
酵母浸膏  2.0 g  
葡萄糖  20.0 g  
可溶性淀粉  0.5 g  
氯化钠  5.0 g  
西红柿浸 出液  400.0 mL 
吐温 80 1.0 mL  
肝粉  0.3 g 
琼脂粉  15.0～20.0 g  
加蒸馏水至  1 000.0 mL 
A.1.2  制法 
A.1.2.1半胱氨酸盐溶液的配置： 称取半胱氨酸 0.5 g，加入 1.0 mL盐酸，使 半胱氨酸全部溶解，配制
成半胱氨酸盐溶液。  
A.1.2.2西红柿浸出液的制备： 将新鲜的西红柿洗净后称重切碎，加等量的蒸馏水在 100℃水浴中加热，
搅拌 90min，然后用纱布过滤，校正 pH7.0，将浸出液分装后， 121℃高压灭菌 15 min～20 min。 
A.1.2.3制法：将A.1.1所有成分加入蒸馏水中， 加热溶解 , 然后加入 半胱氨酸盐溶液， 校正 pH 6.8± 0.2 。
分装后 121℃高压灭菌 15 min～20 min。临用时加热熔化琼脂，冷至 50℃时使用。  
A.2  PYG 液体培养基  
A.2.1  成分 
蛋白胨             10.0 g  
葡萄糖  2.5 g  
酵母粉  5.0 g  
半胱氨酸 -HCl                          0.25 g  
盐溶液  20.0 mL   
维生素 K1溶液  0.5 mL  
氯化血红素溶液 5mg/mL  2.5 m L 
加蒸馏水至  500.0 mL 
A.2.2  制法 
A.2.2.1盐溶液的配制： 称取无水氯化钙 0.2 g，硫酸镁 0.2 g，磷酸氢二钾 1.0 g，磷酸二氢钾 1.0 g，碳
酸氢钠 10.0 g，氯化钠 2.0 g，加蒸馏水至 1000 mL。 
A.2.2.2氯化血红素溶液（ 5mg/mL）的配制： 称取氯化血红素 0.5 g溶于 1mol/L氢氧化钠 1.0 mL中，
加蒸馏水至 1000mL，121℃高压灭菌 15 min～20 min。 
A.2.2.3维生素K1溶液的配制： 称取维生素 K11.0 g，加无水乙醇 99 mL，过滤除菌，冷藏保存。  
A.2.2.4制法：除氯化血红素溶液和维生素 K1溶液外， A.2.1其余成分加入蒸馏水中，加热溶解，校正
pH6.0，加入中性红溶液。分装后 121℃高压灭菌 15 min～20 min。临用时加热熔化琼脂，加入氯化血
红素溶液和维生素 K1溶液，冷至 50℃使用。  
 GB 4789.34—xxxx  
8 A.3   TPY液体培养基 
A.3.1  成分 
水解酪蛋白  10.0 g  
植物胨  5.0 g  
酵母粉  2.0 g  
葡萄糖  5.0 g  
磷酸氢二钾（ K2HPO 4· 7H 2O） 2.0 g  
氯化镁（ MgCl 2· 6H 2O） 0.5 g 
硫酸锌（ ZnSO 4· 7H 2O） 0.25 g  
氯化钙（ CaCl 2） 0.15 g  
氯化铁（ FeCl 3） 0.1 mg  
吐温 -80 1.0 mL  
加蒸馏水至  1 000.0 mL 
A.3.2  制法： 
A.3.2.1 半胱氨酸盐溶液的配置： 称取半胱氨酸 0.5 g，加入 1.0 mL盐酸，使 半胱氨酸全部溶解，配制
成半胱氨酸盐溶液。  
A.3.2 .2 制法：将A.3.1成分加热溶解，然后加入 半胱氨酸盐溶液， 校正 pH6.5± 0.1 ，分装后 121℃高
压灭菌 15min～20 min。GB 4789.34—xxxx  
9 附录 B 
果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶与 双歧杆菌的有机酸代谢产物检测方法  
B.1  果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶（ F6PPK）测定 
B.1.1  试剂 
（1）0.05mol/L 磷酸盐缓冲液 pH6.5+500mg/L 半胱氨酸 -HCl。 
（2）6mg/mL氟化钠 +10mg/mL 碘乙酸钠或钾  
（3）果糖 -6-磷酸盐（钠盐， 70%-98%纯度） 80mg/mL 水溶液。  
（4）盐酸羟胺 (Hydroxy Lamine -HCl) 139mg/mL 水溶液，使用时以 NaOH中和至 pH6.5。 
（5）15g/100mL 三氯乙酸 (TCA) 水溶液。  
（6）4mol/L HCl 。 
（7）0.5 g/100mL FeCl 3· 6H 2O溶于 0.1mol/L HCl 中。  
B.1.2  检测步骤  
挑取 BBL琼脂平板上纯培养的双歧杆菌接种到 TPY液体培养基 , 厌氧， 36℃±1℃ 培养 72h± 3h。
从10mL TPY 培养液于3000r／min离心 5min，弃上清液， 细胞用上述试剂（ 1）洗涤 2次，然后悬浮
于1.0mL试剂（ 1）中。将盛有细胞悬液的容器置于一冰浴内，用超声波处理 20min，以破碎细胞。然
后在超声波处理物中加入试剂（ 2）和试剂（ 3）各 0.25mL，置于 37℃保温 30 min。保温后在溶液中
入1.5mL试剂（ 4），置室 温5 min。加入试剂（ 5）和试剂（ 6）各 1mL，置室温5 min。然后加入 1mL
试剂（ 7）观察溶液颜色。  
B.1.3  结果判定： 经以上程序测定如显红褐色或红紫色，则果糖 -6-磷酸盐磷酸酮酶为阳性，否则为
阴性。 
B.2气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物  
B.2.1  双歧杆菌培养液制备  
挑取BBL琼脂平板上纯培养的双歧杆菌接种于 PYG液体培养基， 同时用未接种菌的 PYG液体培养基做
空白对照，厌氧， 36℃±1℃ 培养48h。 
B.2.2  标准液的配 制 
B.2.2.1 乙酸标准溶液： 准确吸取乙酸 5.70mL 加水稀释至 100.0mL， 摇匀， 进行标定， 配成约 1.0 mol/L
的乙酸标准溶液。标定方法为： 准确称取乙酸 3 g，加水 15 mL，酚酞指示液 2滴，用 1 mol/mL 氢氧
化钠溶液滴定，并将滴定结果用空白试验校正。 1mL 1 mol/mL 氢氧化钠溶液相当于 60.05mg 的乙酸。  
B.2.2.2 乙酸使用液： 将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至 20.0 mmol/L 。 
B.2.2.3 乳酸标准溶液： 准确吸取含量为 85%～90%的乳酸 0.84 mL，加水稀释至 100.0mL，摇匀，配
成1.0 mol/L 的乳酸标准溶液。标定方法为：准确称取乳酸 1 g，加水 50 mL，加入 1 mol/mL 氢氧化钠滴
定液 25 mL，煮沸 5min，加入酚酞指示液 2滴，同时用 0.5 mol/mL 用1 mol/mL 硫酸滴定液滴定，并将滴
定结果用空白试验校正。 1mL 1 mol/mL 氢氧化钠溶液相当于 90.08mg的乳酸。  
B.2.2.4 乳酸使用液： 将乳酸标准溶液用水稀释至 20.0 mmol/L 。 
B.2.3   方法 
B.2.3.1乙酸的处理  
取双歧杆菌 培养液 2.0mL～3.0mL放入 10mL离心管中，加入 0.2mL 50 ％（v/v）硫酸溶液，混匀，
加入 2.0mL丙酮，混匀后加过量氯化钠，剧烈振摇 1min，再加入 2.0mL乙醚，振摇 1min后，于 3000r
／min离心 5min，将上清液转入另一试管中，下层溶液用 2.0mL丙酮和 2.0mL乙醚重复提取 2次，合GB 4789.34—xxxx  
10 并有机相，于 40℃水浴中用氮气吹至少量溶液存在，用丙酮定容至 1.0 mL，混匀后备用。同样操作步
骤处理乙酸标准和空白培养液。  
B.2.3.2乳酸的处理  
取双歧杆菌 培养液 2.0mL～3.0mL放入 10mL比色管中， 100℃水浴 10min，加入0.2mL 50% （v/v）
硫酸溶液，混匀，加入 1.0mL甲醇，于 58℃水浴 30min后加水 1.0mL，加三氯甲烷 1.0mL，振摇 3min，
3000r/min 离心 5min，取三氯甲烷层分析。同样操作步骤处理乳酸标准和空白培养液。  
B.2.3.3气相色谱条件  
色谱柱： 长 2m， 内径 4mm的玻璃柱， 填装涂有 20％DNP +7％Tween60 的chromosorbw  HP （80～
100目） ；柱温： 110℃；汽化室： 150℃；检测器： 150℃；载气： （ N2）50ml/min ；进样量 1.0µ l；外
标法峰面积定量。  
 
 
乳酸标准                                         乙酸标准  
B.2.4  结果计算 :  
                          
 C ÁA -A

标空样X  
    式中： 
X——样品培养液中乙酸或乳酸的含量，单位为微摩尔每毫升（ mol/mL）； 
A样——样品培养液中乙酸或乳酸的峰面积；  
A空——空白培养液中乙酸或乳酸的峰面积；  
A标——乙酸标准或乳酸标准的峰面积；  
C——乙酸标准或乳酸标准的浓 度，单位为微摩尔每毫升（ mol/mL）。 
B.2.5  允许差：相对相差≤ 15%。 
B.2.6  结果判定： 如果乙酸(mol/mL)与乳酸(mol/mL)比值大于 1，可判定为是 双歧杆菌的有机酸代
谢产物。