中华人民共和国国家标准  
 
GB 4789.13xxxx—xxxx 
 
 
食品安全 国家标准  
食品微生物学检验  产气荚膜梭菌 检验 
 
 
（征求意见稿）  
 
中华人民共和国卫生部    发布 xxxx -xx-xx发布  xxxx -xx-xx实施  带格式的: 字体: (默认) 黑体,
(中文) 黑体, 四号
带格式的: 字体: (默认) 黑体,
(中文) 黑体, 四号GB 4789.13—xxxx  
I 前    言 
本标准代替 GB/T 4789.13 —2003《食品卫生微生物学检验  产气荚膜梭菌检验》 。 
本标准与 GB/T 4789.13 —2003相比主要变化如下：  
——修改了标准的中英文名称；  
——修改了样品制备过程；  
——将选择性计数琼脂由亚硫酸盐 -多粘菌素 -磺胺嘧啶琼脂 （SPS）改为胰胨 -亚硫酸盐 -环丝氨  
酸（ TSC）琼脂； 
——修改了活菌计数培养部分；  
——将卵磷脂分解试验改为乳糖 -明胶试验；  
——修改了菌数计算部分。  
——增加了附录 A。 GB 4789.13—xxxx  
1 
 食品安全国家标准  
食品微生物学检验   产气荚膜梭菌 检验 
1 范围 
本标准规定了食品中 产气荚膜梭菌（ Clostridium perfringens ）的检验方法 。 
本标准适用于 食品和食物中毒样品 中产气荚膜梭菌的 检验。  
2  设备和材料  
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：  
2.1  恒温培养箱： 36 ℃± 1 ℃。 
2.2  冰箱： 2 ℃～5℃。 
2.3  恒温水浴箱： 50℃±1 ℃，46℃±0.5℃。 
2.4  天平：感量 0.1 g。 
2.5  均质器。  
2.6  显微镜： 10×～ 100×。 
2.7  无菌吸管： 1 mL（具 0.01 mL刻度） 、 10 mL（具 0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头 。 
2.8  无菌试管： 16mm 18mm×160mm 180mm。 
2.9  无菌培养皿：直径 90 mm。 
2.10  pH计或 pH比色管或精密 pH试纸。  
2.11  厌氧培养装置 。 
3  培养基和试剂  
3.1  胰胨-亚硫酸盐 -环丝氨酸（ TSC）琼脂： 见附录 A中A.1。 
3.2  液体硫乙醇酸盐培养基（ FTG）：见附录 A中A.2。 
3.3  缓冲动力 -硝酸盐培养基： 见附录 A中A.3。 
3.4  乳糖-明胶培养基： 见附录 A中A.4。 
3.5  含铁牛乳 培养基： 见附录 A中A.5。 
3.6  0.1%蛋白胨水： 见附录 A中A.6。 GB 4789.13—xxxx  
2 
 3.7  革兰氏染色液： 见附录 A中A.7。 
3.8  硝酸盐还原试剂： 见附录 A中A.8。 
3.9  缓冲甘油 -氯化钠溶液 ：见附录 A中A.9。 
4  检验程序  
产气荚膜梭菌检验程序见图 1。 
 
图1 产气荚膜梭菌 检验程序  
5  操作步骤  
5.1  样品制备  
5.1.1  样品采集后应尽快检验，若不能及时检验，可在 2℃～5℃保存；如 8h内不能进行检验，应以
无菌操作称取 25g（mL）样品加入等量缓冲甘油 -氯化钠溶液（液体样品应加双料） ，并 尽快于 -60℃低
温冰箱中冷冻保存 或加干冰保存。  
5.1.2  以无菌操作称取 25g（mL）样品放入含有 225 mL 0.1% 蛋白胨水（如为 5.1.1中冷冻保存样品，检   样 
25g(mL)检样 +225 mL0.1% 蛋白胨水  
均质、稀释  
10-1～10-6稀释液各 1mL + TSC 琼脂混合  
厌氧培养， 36℃± 1℃、 20h～24h，黑色菌落计数  
黑色菌落计数  
任选黑色菌落 10CFU 5个，分别接种 FTG培
养基  
确证试验  
镜检形态  乳糖 -明胶  动力 -硝酸盐  牛奶发酵  
 
 
报告  GB 4789.13—xxxx  
3 
 室温解冻后，加入 200mL 0.1% 蛋白胨水）的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质 1 min～2min；或
置于盛有 225mL0.1% 蛋白胨水的均质杯中， 8 000 r/min ～10 000 r/min 均质 1min～2min，作为 1：10
稀释液。  
5.1.3  以上述 1：10稀释液按 1 mL加0.1%蛋白胨水 9mL制备 10-2～10-6的系列稀释液。  
5.2  活菌计数 培养 
5.2.1  吸取各稀释液 1 mL加入灭菌平皿内 ，每个稀释度做两个平行 。每个平皿倾注 冷却至 50℃的
TSC琼脂（可放置于 50± 1 ℃恒温水浴箱中保温 ）15mL，缓慢旋转平皿，使稀释液和琼脂充分混匀。
吸取各稀释液 1 mL分别放入两个灭菌平皿内。每个平皿倾注约 50℃的TSC琼脂 15mL，缓慢旋转平
皿，使稀释液和琼脂充分混匀。  
5.2.2  上述琼脂平板凝固后，再加 10mL冷却至 50℃的TSC琼脂（可放置于 50± 1 ℃恒温水浴 箱中
保温）均匀覆盖平板表层。 上述琼脂平板凝固后，再加 10mLTSC 琼脂覆盖平板表层。  
5.2.3  待琼脂凝固后，正置于厌氧培养装置内，于 36℃± 1℃培养 20h～24 h。 
5.2.4  典型的产气荚膜梭菌在 TSC琼脂平板上为 黑色菌落。 选取菌落数在 20 CFU～200 CFU的平板，
计数黑色菌落数 。 
5.3  确证试验  
5.3.1  从单个平板上任选5个（小于 5个全选） 黑色菌落， 由平板上任选 10CFU黑色菌落， 分别接
种到 FTG培养基，于 36℃±1℃培养 18h～24h。 
5.3.2  用上述培养液涂片， 革兰氏 染色镜检 观察其纯度 。 产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗短的 梭状芽胞
杆菌。 
5.3.3  取生长旺盛的 FTG培养液 1mL接种于含铁牛乳培养基，在 46℃± 0.5℃水浴中培养 2h后，每
小时观察一次有无 “暴烈发酵”现象，该现象的特点是乳凝结物破碎后快速 形成海绵样物质，通常 会上
升到培养基表面。 5h内不发酵者为阴性。产气荚膜梭菌发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈 “暴烈
发酵”现象，但培养基不变黑。  
5.3.4  用接种环（针）取 FTG培养液穿刺接种缓冲动力 -硝酸盐培养基，于 36℃±1℃培养 24h。在透
射光下检查细菌沿穿刺线的生长 情况，判定有无动力。有动力的菌株沿穿刺线呈扩散生长，无动力的
菌株只沿穿刺线生长。然后滴加 0.5mL试剂甲和 0.2mL试剂乙以检查亚硝酸盐的存在。 15min内出现
红色者，表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐；如果不出现颜色变化，则加少许锌粉，放置 10min，出现红
色者，表明该菌株不能还原硝酸盐。产气荚膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。  
5.3.5  用接种环（针）取 FTG培养液穿刺接种乳糖 -明胶培养基，于 36℃±1℃培养 24h，观察结果。
如发现产气和培养基由红变黄，表明乳糖被发酵并产酸。将试管于 5℃左右放置 1h，检查明胶液化情
况。如果培养基是固态，于 36℃±1℃再培养 24h，重复检查明胶是否液化。产气荚膜梭菌能发酵乳糖，
使明胶液化。   
6  结果与报告  
6.1  典型菌落计数  
选取典型菌落数在 20CFU～200CFU之间的平板，计数典 型菌落数。如果：  
a) 最低稀释度平板的 典型菌落数均小于 20CFU，计数该稀释度平板上的典型菌落；  
b）某一稀释度平板的典型菌落数均大于 200CFU，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应 计数该
稀释度平板上的典型菌落；  
c）某一稀释度平板的典型菌落数均大于 200CFU，且下一稀释度平板上有 典型菌落，但其平板上GB 4789.13—xxxx  
4 
 的典型菌落数不在 20CFU～200CFU之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落；  
6.2  结果计算  
以上计数结果按 公式（1）计算： 
 
…………………………………    (1) 
式中： 
T ——样品中产气荚膜梭菌 的菌落数；  
A ——单个平板上典型菌落数；  
B ——单个平板上经确证试验为产气荚膜梭菌的菌落数；  
C ——单个平板上用于确证试验的菌落数；  
n1  ——第一稀释度（低稀释倍数） 经确证试验有产气荚膜梭菌的 平板个数；  
n2  ——第二稀释度（高稀释倍数） 经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个 数； 
d ——稀释因子（第一稀释度） 。  
6.3  报告 
根据TSC琼脂平板上 产气荚膜梭菌的典型菌落数 ，按照 6.2中公式计算， 报告每 g（mL）样品中
产气荚膜梭 菌数，报告单位以 CFU/ g（mL）表示；如 T值为 0，则以小于 1乘以最低稀释倍数报告。  
 
根据黑色菌落的计数（ 5.2.4）和确证试验的结果（ 5.3） ，计算并报告每 g（mL）样品中产气荚膜
梭菌数，报告单位以 CFU/ g（mL）表示。  
例如： 10-4稀释液的平板黑色菌落数为 100CFU，而供做确证试验的 10CFU菌落中有 7CFU被确
证为产气荚膜梭菌，则每 g（mL）样品中产气荚膜梭菌数为：  
100× 0.7× 104=7× 105 
dn nCBA
T)1.0 () (
2 1
带格式的: 居中GB 4789.13—xxxx  
5 
  
附录A 
      培养基和试剂  
A.1  胰胨-亚硫酸盐 -环丝氨酸（ TSC）琼脂 
A.1.1  基础成分  
胰胨 15.0 g 
大豆胨  5.0 g 
酵母粉   5.0 g 
焦亚硫酸钠  1.0 g 
柠檬酸铁铵  1.0 g 
琼脂  15.0 g 
蒸馏水  900.0 mL 
pH 7. 6± 0.2 
A.1.2  D-环丝氨酸溶液  
    溶解 1gD-环丝氨酸于 200mL蒸馏水，膜过滤除菌后，于 4℃冷藏保存备用。  
A.1.3  制法 
    将基础成分加热煮沸至完全溶解，调节 pH，分装到 500mL烧瓶中，每瓶 250mL，121℃高压灭菌
15min，于 50 ℃±1℃保温备用。临用前每 250mL基础溶液中加入 20mL D -环丝氨酸溶液，混匀，倾注
平皿。 
A.2 液体硫乙醇酸盐培养基（ FTG）.0  
A.2.1  成分 
胰蛋白胨  15.0 g 
L-胱氨酸                           0.5g 
酵母粉 5.0 g 
葡萄糖 5.0 g 
氯化钠 2.5g 
硫乙醇酸钠  0.5g  
刃天青 0.001g  
琼脂 0.75g  
蒸馏水 1 000.0 mL 
pH 7. 1± 0.2 
A.2.2  制法 
将以上成分加热煮沸至完全溶解，冷却后调节 pH，分装试管，每管 10mL，121℃高压灭菌 15min。
临用前煮沸或流动蒸汽加热 15min，迅速冷却至接种温度。  
A.3 缓冲动力 -硝酸盐培养基  
A.3.1  成分 
蛋白胨  5.0 g 
牛肉粉  3.0 g 
硝酸钾  5.0 g 带格式的: 正文, 缩进: 首行缩进:
 3 字符
带格式表格
带格式表格
带格式表格GB 4789.13—xxxx  
6 
 磷酸氢二钠  2.5g 
半乳糖  5.0 g 
甘油  5.0 mL  
琼脂 3.0 g 
蒸馏水  1 000.0 mL 
pH 7.3± 0.2  
A.3.2  制法 
将以上成分加热煮沸至完全溶解，调节 pH，分装试管，每管 10mL，121℃高压灭菌 15min。如果
当天不用，置 4 ℃左右冷藏保存。临用前煮沸或流动蒸汽加热 15min，迅速冷却至接种温度。  
A.4 乳糖-明胶培养基  
A.4.1  成分 
蛋白胨  15.0 g 
酵母粉  10.0 g 
乳糖  10.0 g 
酚红  0.05g  
明胶  120.0 g 
蒸馏水  1 000.0 mL 
pH 7.5± 0.2  
A.4.2  制法 
加热溶解蛋白胨、酵母粉和明胶 于1000 mL 蒸馏水中，调节 pH，加入乳糖和酚红。分装试管，
每管 10mL，121℃高压灭菌 10min。如果当天不用，置 4 ℃左右冷藏保存。临用前煮沸或流动蒸汽加
热15min，迅速冷却至接种温度。  
A.5 含铁牛乳培养基  
A.5.1   成分 
新鲜全脂牛奶  1 000.0 mL 
硫酸亚铁 (FeSO 4· 7H 2O)  1.0 g 
蒸馏水  50.0 mL 
A.5.2   制法 
将硫酸亚铁溶于蒸馏水中，不断搅拌，缓慢加入 1000mL牛奶中，混匀。分装大试管，每管 10mL，
118℃高压灭菌 12min。本培养基必须新鲜配制。  
A.6 0.1% 蛋白胨水  
A.6.1  成分 
蛋白胨  1.0 g 
蒸馏水  1 000.0  mL 
pH 7.0± 0.2 
A.6.2  制法 
加热溶解，调节 pH，121℃高压灭菌 15min。 
A.7 革兰氏染色液  
A.7.1  结晶紫染色液  
A.7.1.1 成分 带格式表格
带格式表格
带格式表格GB 4789.13—xxxx  
7 
 结晶紫  1.0g  
95%乙醇  20.0 mL  
1%草酸铵水溶液  80.0 mL 
A.7.1.2 制法 
将结晶紫完全溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。  
A.7.2  革兰氏碘液  
A.7.2.1 成分 
碘 1.0 g  
碘化钾  2.0 g  
蒸馏水  300.0  mL 
A.7.2.2 制法 
将碘与碘化钾先混合，加入蒸馏水少许振摇，待完全溶解后，再加入蒸馏水至 300 mL。 
A.7.3  沙黄复染液  
A.7.3.1 成分 
沙黄  0.25 g  
95%乙醇  10.0 mL  
蒸馏水  90.0 mL 
A.7.3.2 制法 
将沙黄溶解于 95%乙醇中，然后用蒸馏水稀释。  
A.7.4  染色方法   
a） 涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染色 1min，水洗。  
b） 滴加革兰氏碘液，作用 1min，水洗。  
c） 滴加 95%乙醇脱色约 15s～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。  
d） 滴加沙黄复染 液，复染 1min，水洗、待干、镜检。  
A.8 硝酸盐还原试剂  
A.8.1 甲液（对氨基苯磺酸溶液）  
在1 000mL5mol/L 乙酸中溶解 8g对氨基苯磺酸。  
A.8.2 乙液（
-萘酚乙酸溶液 ） 
在1 000mL5mol/L 乙酸中溶解 5g 
 -萘酚。 
A.9 缓冲甘油 -氯化钠溶液  
A.9.1    成分 
甘油  100.0 mL 
氯化钠  4.2 g 
磷酸氢二钾（无水）  12.4 g 
磷酸二氢钾（无水）   4.0 g 
蒸馏水  900.0 mL 
 pH7.2 ± 0.1 
A.9.2    制法 
将以上成分加热至完全溶解，调节 pH，121℃高压灭菌 15min。配制双料缓冲甘油溶液时，用甘油
200mL和蒸馏水 800 mL。 
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