(Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 20 de mayo de 2011  
SECRETARIA DE AGRICULTURA, GANADERIA,  DESARROLLO 
RURAL, PESCA Y ALIMENTACION  
NORMA Oficial Mexicana NOM -067-ZOO -2007, Campaña nacional para la prevención y control de la rabia en 
bovinos y especies ganaderas . 
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos. - Secretaría de Agricultura, 
Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación.  
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM -067-ZOO -2007, CAMPAÑA NACIONAL PARA LA PREVENCI ON Y CONTROL DE 
LA RABIA EN BOVINOS Y ESPECIES GANADERAS.  
WOLFGANG RODO LFO GONZALEZ MUÑOZ,  Coordinador General Jurídico de la Secretaría de 
Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación, con fundamento en los artículos 9, 12, 16, 26 
y 35 fracción IV de la Ley Orgánica de la Administración Pública Federal; 1, 6 fracciones I, II, IV, VIII, IX, XV, 
XVI, XVIII y XXI, 54, 55, 56, 58, 63, 64, 65, 66 y 67 de la Ley Federal de Sanidad Animal; 38 fracción II, 40 
fracción II y XI, 41, 43, 44, 45 y 47 de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 28 fracción II y 3 3  del 
Reglamento de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 3, 15 fracciones I, II, XXX y XXXI y 49 del  
Reglamento Interior de la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación, y  
CONSIDERANDO  
Que es atribución de la  Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación, el 
fomentar la producción pecuaria y consecuentemente el diagnóstico, la prevención, control y erradicación de 
enfermedades y plagas, como es el caso de la rabia que afecta a la  ganadería nacional, en su nivel de salud  
y producción;  
Que la rabia es una zoonosis infecto -contagiosa, aguda y mortal que ataca al sistema nervioso central, 
causado por un virus de la familia Rhabdoviridae  y es transmitida por la saliva de animales enfe rmos a los 
bovinos y especies ganaderas como equinos, ovinos, caprinos y porcinos;  
Que el murciélago hematófago o vampiro del género Desmodus rotundus , es el principal transmisor de la 
rabia al ganado bovino y especies ganaderas como equinos, ovinos, capri nos y porcinos y que incide en la 
disminución de la producción de carne y leche y ocasiona la muerte de los animales, lo que repercute 
desfavorablemente en la producción ganadera y como una importante zoonosis;  
Que las condiciones de medio ambiente y geogr áficas en algunos estados del país favorecen la presencia 
de los vampiros del género Desmodus rotundus,  que son reservorios del virus de la rabia;  
Que los casos de rabia en bovinos y especies ganaderas como equinos, ovinos, caprinos y porcinos, se 
han mant enido e incluso incrementado de manera considerable en el país y que su implicación con otros 
vertebrados la convierte en los últimos años en una importante zoonosis;  
Que de acuerdo a los registros epidemiológicos de la Dirección de Campañas Zoosanitarias,  del año 2001 
al mes de octubre de 2010 en nuestro país, la prevalencia de la Rabia Paralítica Bovina se ha incrementado 
de 3.80 por ciento a 5.63 por ciento, lo cual implica, que tan solo en bovinos, 649,596 de estos animales están 
en riesgo de contraer e sta enfermedad, tomando en cuenta que cuando los animales contraen la enfermedad 
de la rabia mueren inevitablemente, en virtud de que no existe cura para ésta, esto mismo contribuye a 
generar la reducción de la producción ganadera asociada a dicha enfermed ad representando pérdidas 
económicas para el sector pecuario;  
Que las pérdidas económicas directas anuales estimadas en la ganadería nacional por la muerte de 
bovinos a causa de esta enfermedad, ascienden aproximadamente a 500 millones de pesos;  
Que de acu erdo al Programa de Acción Específico 2007 -2012, para rabia y otras zoonosis, de la 
Secretaría  de Salud, en el peri odo 2000 -2006, se presentaron 23 casos de rabia humana transmitida por 
fauna silvestre; de éstos, 14 casos (60 por ciento) fueron ocasionados  por agresión de murciélago, 
principalmente en población rural que reside cerca de nichos ecológicos donde prolifera este tipo de fauna. En 
2006 sólo se presentó un caso en el Estado de Guerrero transmitido por murciélago;  
Que los resultados de la caracter ización del virus permitieron identificar que 95.5 por ciento corresponden 
a la variante perro, y el resto a virus de animales silvestres conforme a la siguiente distribución: murciélago 
hematófago, zorro Arizona, murciélago hematófago, zorrillo, murciélag o insectívoro y murciélago hematófago;  
Que en la actualidad la aplicación de vampiricidas es una herramienta para el control de las poblaciones 
de vampiros; y  Viernes 20 de mayo de 2011  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
Que en virtud de los fundamentos y razones antes mencionadas, he tenido a bien expedir la siguien te: 
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM -067-ZOO -2007, CAMPAÑA NACIONAL PARA LA PREVENCI ON  Y 
CONTROL DE LA RABIA EN  BOVINOS Y ESPECIES GANADERAS  
INDICE  
1. Objetivo y campo de aplicación  
2. Referencias  
3. Definiciones y abreviaturas  
4. Disposiciones generales  
5. Fases de la Campaña  
6. Diagnóstico  
7. Muestreo  
8. Vacunas y vacunación  
9. Requisitos mínimos para las vacunas contra la rabia, de virus activo modificado y de virus inactivado  
10. Tratamientos para el control de poblaciones de vampiros  
11. Productos vampirici das 
12. Vigilancia epidemiológica  
13. Movilización de animales  
14. Animales y productos importados  
15. Sanciones  
16. Procedimiento de evaluación de la conformidad  
17. Concordancia con normas internacionales  
18. Bibliografía  
TRANSITORIOS  
Apéndice “A” (Norma tivo) 
Apéndice “B” (Normativo)  
1. Objetivo y campo de aplicación  
1.1. La presente Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en todo el territorio nacional y tiene 
por objeto, establecer las especificaciones zoosanitarias, criterios, estrategias y técnicas operativas para 
diagnosticar, prevenir y controlar la rabia transmitida por vampiros del género Desmodus rotundus  a las 
especies ganaderas en riesgo.  
1.2. La presente Norma Oficial Mexicana aplica a los propietarios de bovinos y especies ganader as en 
riesgo tales como equinos, ovinos, caprinos y porcinos, así como a laboratorios que produzcan y 
comercialicen vacuna antirrábica y productos vampiricidas, laboratorios autorizados en el diagnóstico 
zoosanitario, médicos veterinarios responsables auto rizados, transportistas de ganado y Organismos 
Auxiliares de Sanidad Animal.  
Asimismo, de conformidad con la presente Norma Oficial Mexicana, la Campaña se orienta al diagnóstico, 
prevención y el control de la rabia transmitida por vampiros a los bovinos y  especies ganaderas, mediante la 
vacunación antirrábica del ganado susceptible y el control de las poblaciones de vampiros.  
1.3. La vigilancia de esta Norma Oficial Mexicana corresponde a la Secretaría de Agricultura, Ganadería, 
Desarrollo Rural, Pesca y A limentación; los Gobiernos Estatales; los Organismos Auxiliares de Sanidad 
Animal y los Comités de Fomento y Protección Pecuaria Estatales; y a la Secretaría del Medio Ambiente y 
Recursos Naturales, en el ámbito de sus respectivas atribuciones y circunscri pciones territoriales, de 
conformidad con los acuerdos de coordinación respectivos.  
1.4. La aplicación de las disposiciones previstas en esta Norma Oficial Mexicana, compete a la Dirección 
General de Salud Animal, así como a las Delegaciones Estatales de l a Secretaría de Agricultura, Ganadería, 
Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación, en el ámbito de sus respectivas atribuciones y circunscripciones 
territoriales.  
2. Referencias  
2.1. Para la correcta aplicación de esta Norma Oficial Mexicana, se deben consult ar las siguientes normas 
oficiales mexicanas:  
NOM -011-SSA2 -1993, Para la Prevención y control de la Rabia.  
NOM -046-ZOO -1995, Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica.  
NOM -056-ZOO -1995, Especificaciones técnicas para las pruebas diagnósticas que realic en los 
laboratorios de pruebas aprobados en materia zoosanitaria.  
NOM -059-ECOL -2001, Protección ambiental -Especies nativas de México de flora y fauna silvestres -
Categorías de riesgo y especificaciones para su inclusión, exclusión o cambio -Lista de especies  en riesgo.  
NOM -008-SCFI -2002, Sistema General de Unidades de Medida.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 20 de mayo de 2011  
3. Definiciones y abreviaturas  
Para efectos de esta Norma Oficial Mexicana, se entiende por:  
3.1. Animal sospechoso:  Animal enfermo que presenta signos sugestivos de rabia.  
3.2. Animal c onfirmado:  Caso de rabia comprobado por pruebas de laboratorio.  
3.3. Area endémica:  Sitio geográfico definido, donde se presenta la rabia bovina y en otras especies 
ganaderas en forma habitual.  
3.4. Antígeno:  Sustancia que por sí misma sea capaz de estimul ar una respuesta inmune "in vivo" , así 
como también pueda ser utilizada en la evaluación de la respuesta inmune "in vitro" . 
3.5. Biológico:  Vacuna procedente del cultivo del virus de la rabia, activo modificado o inactivado, que al 
ser aplicada al animal s usceptible confiere inmunidad contra esta enfermedad, de forma tal que los animales 
vacunados no enfermen si son expuestos al virus patógeno contra el cual han sido vacunados.  
3.6. Campaña:  Campaña nacional para la prevención de la rabia en bovinos y espec ies ganaderas.  
3.7. Cepa aprobada:  Virus rábico vacunal o virulento que ha sido autorizado por la Secretaría de 
Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación para ser empleado en la producción de 
vacunas o para las pruebas de desafío, resp ectivamente.  
3.8. Constatación:  Procedimiento mediante el cual se comprueba que los productos cumplen con las 
especificaciones requeridas por las normas oficiales mexicanas.  
3.9. Control:  Conjunto de medidas zoosanitarias que tienen por objeto disminuir la  incidencia o 
prevalencia de la rabia en los animales de un área geográfica determinada.  
3.10. CVS:  Challenge Virus Standar o Virus estándar de confrontación; virus fijo de la rabia que se utiliza 
en las pruebas de desafío.  
3.11. Diagnóstico:  Estudio que s e basa en el análisis que se haga del conjunto de signos clínicos 
observados en los animales que permite descartar o confirmar la sospecha, en este último caso, mediante 
pruebas de laboratorio, del virus de la rabia.  
3.12. Dirección:  Dirección General de S alud Animal.  
3.13. DLR -50 por ciento:  Dosis letal para el ratón al 50 por ciento.  
3.14. Dosis:  Cantidad de producto recomendada por el laboratorio en la etiqueta para ser administrada en 
el animal.  
3.15. Endémica:  Presencia habitual de la rabia en una pobl ación.  
3.16. Especies ganaderas:  Son todos aquellos animales cuyos productos carne y leche son 
aprovechados por el hombre y que consisten en las especies bovina, equina, ovina, caprina y porcina.  
3.17. Fecha de caducidad:  Fecha que designa el término de vi abilidad en que debe aplicarse una vacuna 
antirrábica o un producto vampiricida.  
3.18. Foco rábico:  Lugar donde se manejan, comercializan y/o explotan animales, sus productos y 
subproductos, en el cual se identifica la presencia de uno o más casos de rabia . 
3.19. Georreferenciación:  Sistema basado en el levantamiento de datos geográficos sobre las 
actividades en campaña, en apoyo al proceso de notificación de la rabia para así poder dictar las medidas 
contraepizoóticas a emprender.  
3.20. Herida:  Lesión en p iel o mucosa con solución de continuidad.  
3.21. Infección:  Situación que se presenta cuando el virus de la rabia ha penetrado al organismo de una 
persona o animal.  
3.22. Laboratorio de Pruebas:  Persona física o moral acreditada de acuerdo a lo establecido por la Ley 
Federal sobre Metrología y Normalización y aprobada por la Secretaría para prestar servicios relacionados 
con las pruebas o análisis para determinar la presencia o ausencia de una enfermedad o plaga de los 
animales o para realizar servicios de c onstatación o de contaminantes físicos, microbiológicos y químicos 
conforme a las normas oficiales mexicanas en materia zoosanitaria y expedir informe de resultados.  
3.23. Laboratorio de Control de Calidad:  Laboratorio autorizado por la Secretaría de Agric ultura, 
Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación, que se encarga de la verificación y aprobación del 
cumplimiento de los requisitos mínimos de los productos biológicos, vacunas, antígenos y reactivos, utilizados 
en el diagnóstico y control de la r abia.  
3.24. Laboratorio de Producción de Biológicos:  Laboratorio autorizado por la Secretaría de Agricultura, 
Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación, para la fabricación de las vacunas, antígenos y reactivos 
utilizados en el diagnóstico y contro l de la rabia.  
3.25. Lote:  Es una cantidad específica de cualquier materia prima o producto que haya sido elaborado 
bajo condiciones equivalentes de operación y durante un periodo determinado.  Viernes 20 de mayo de 2011  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
3.26. Medidas zoosanitarias:  Disposiciones para prevenir, contr olar o erradicar la introducción, radicación 
o propagación de una plaga o enfermedad; y de los riesgos provenientes de aditivos, contaminantes, toxinas u 
organismos causantes de enfermedades y daños que afecten a los animales.  
3.27. Muestra:  Encéfalo, cere belo o médula, o parte de los mismos que se relacionan con la rabia, con el 
propósito de ser analizados mediante pruebas de diagnóstico y así identificar la presencia o ausencia del virus 
rábico.  
3.28. Murciélago hematófago o vampiro:  Quiróptero que se ali menta de sangre.  
3.29. NIH:  Prueba mediante la cual se mide el grado de protección conferida por las vacunas antirrábicas 
inactivadas e inoculadas a ratones, los cuales se desafían con el virus de la rabia, esta prueba de potencia fue 
originalmente desarro llada por los National Institutes of Health (NIH), en Bethesda, Estados Unidos de 
América.  
3.30. Número de lote:  Cualquier combinación de letras, números o símbolos, que sirven para la 
identificación de un lote y bajo el cual se amparan todos los documento s referentes a su manufactura  y 
control.  
3.31. pH:  Potencial Hidrógeno.  
3.32. Prevención:  Conjunto de procedimientos sanitarios, destinados a proteger al hombre y animales de 
una infección del virus rábico.  
3.33. Producto liberado:  Es aquel que aprobó sat isfactoriamente las pruebas de control de calidad y que 
está listo para su comercialización.  
3.34. Producto vampiricida:  Producto químico elaborado con anticoagulantes para el control de las 
poblaciones de vampiros.  
3.35. Prueba de potencia:  Análisis que s e realiza para asegurar que un producto biológico es capaz de 
producir una respuesta inmune y proteger, lo cual se expresará en Unidades Internacionales (U.I.)  o 
porcentaje de protección, de acuerdo a lo establecido en los requisitos mínimos de calidad de l producto.  
3.36. Prueba de pureza:  Análisis mediante la cual se verifica que existe en el producto, únicamente el 
microorganismo indicado y que está libre de microorganismos extraños.  
3.37. Prueba de seguridad e inocuidad:  Análisis que se efectúa para ase gurar que un producto no cause 
reacciones desfavorables atribuibles al mismo.  
3.38. Prueba de titulación:  Análisis utilizado para asegurar que un producto contiene la cantidad de 
antígeno de virus rábico o anticuerpos establecidos en los requisitos mínimos . 
3.39. Pruebas de control de calidad:  Es el conjunto de actividades llevadas a cabo en el laboratorio para 
certificar que las características de un producto cumplen con las especificaciones vigentes.  
3.40. Rabia:  Enfermedad infecto -contagiosa, aguda y mor tal, que ataca el sistema nervioso central, 
provocada por un virus del género Lyssavirus  y de la familia Rhabdoviridae,  transmitida al hombre o animales 
por la saliva de algún animal enfermo o material contaminado.  
3.41. Reporte:  Presentación de un informe  sobre la detección de la rabia en un tiempo determinado.  
3.42. Reservorio:  Cualquier animal donde normalmente vive y se multiplica el virus de la rabia y del cual 
depende para su supervivencia, donde se replica de manera que pueda ser transmitido a un hué sped 
susceptible.  
3.43. Secretaría:  Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación.  
3.44. SENASICA:  Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria, órgano 
administrativo desconcentrado de la Secretaría de Ag ricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y 
Alimentación.  
3.45. Vacunación:  Administración de antígenos rábicos en la dosis adecuada con el propósito de inducir 
la producción de anticuerpos contra la rabia a niveles protectores.  
3.46. Vigilancia epidem iológica:  Conjunto de actividades que permiten reunir información indispensable 
para identificar y evaluar la conducta de la rabia, detectar y prever cualquier cambio que pueda ocurrir por 
alteraciones en los factores, condiciones o determinantes con el fi n de recomendar oportunamente, con bases 
científicas, las medidas indicadas para su prevención, control y erradicación.  
3.47. Zona en control:  Area geográfica determinada en la que se operan medidas zoosanitarias 
tendientes a disminuir la incidencia o prev alencia de la rabia, en un periodo y especie animal específicos.  
3.48. Zona libre:  Area geográfica determinada en la cual no se han presentado casos positivos de rabia 
en bovinos y otras especies ganaderas, de acuerdo a lo que la Secretaría disponga en tér minos de sanidad 
aplicables.  
3.49. Zoonosis:  Enfermedades que son transmitidas entre animales y el hombre.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 20 de mayo de 2011  
4. Disposiciones generales  
4.1. La Campaña se orienta al diagnóstico, prevención y el control de la rabia transmitida por vampiros a 
los bovinos y es pecies ganaderas, mediante la vacunación antirrábica del ganado susceptible y el control de 
las poblaciones de vampiros.  
4.2. La responsabilidad de operar la Campaña es responsabilidad de los Organismos Auxiliares de 
Sanidad Animal, autorizados por la Secr etaría, se podrá concertar con los Gobiernos Federal y Estatales, la 
implementación de estrategias de operación orientadas a mantener y mejorar la condición zoosanitaria de la 
Campaña contra la rabia bovina.  
4.3. La Secretaría, por medio del SENASICA, veri ficará el cumplimiento de las Normas Oficiales 
Mexicanas observando lo dispuesto en la Ley Federal de Sanidad Animal; de igual manera, será aplicable lo 
dispuesto en materia de evaluación de la conformidad, en lo referente a fabricación, importación, expor tación, 
almacenaje, transportación, comercialización y uso de las vacunas antirrábicas citadas en esta Norma Oficial 
Mexicana, así como en los productos vampiricidas.  
5. Fases de la Campaña  
5.1. Para efectos de esta Campaña se reconocen las zonas: a) zona de control y b) zona libre, las cuales 
deben ser consideradas a nivel municipal, regional o estatal.  
5.2. Las vertientes estratégicas de la Campaña serán el diagnóstico, la capacitación de personal, la 
vacunación antirrábica del ganado y el control de las poblaciones de vampiros.  
5.3. La Secretaría, realizará el reconocimiento oficial de las fases, bajo el cumplimiento de las siguientes 
medidas zoosanitarias:  
a) La zona de control debe de contar con las siguientes medidas zoosanitarias:  
● Control de las pob laciones de vampiros, por la realización de actividades conforme a los numerales 
10 y 11 de esta Norma Oficial Mexicana y la georreferenciación de estas actividades.  
● Vacunación de las especies ganaderas susceptibles conforme al numeral 8 de esta Norma Of icial 
Mexicana y la georreferenciación de estas actividades.  
● Control de los focos rábicos conforme a lo dispuesto a los numerales 8, 10, 12 y 13 de esta Norma 
Oficial Mexicana y la georreferenciación de estas actividades.  
● Contar con un sistema de muest reo, y monitoreo de los lugares donde habitan los vampiros y la 
georreferenciación de estos lugares.  
● Contar con un sistema de muestreo y monitoreo, basado en el diagnóstico de laboratorio para 
realizar la vigilancia epidemiológica de la rabia bovina y es pecies ganaderas.  
Por otra parte, la zona de control deberá contar con las siguientes actividades como son:  
● Promoción y difusión de la Campaña las cuales se deben llevar a cabo por las instituciones 
involucradas, en el ámbito de sus respectivas atribucio nes y circunscripciones territoriales, de 
conformidad con los acuerdos de coordinación respectivos.  
● Capacitación de personal operativo y productores, mediante la programación y realización de cursos 
y talleres sobre la prevención de la rabia y el control  de las poblaciones de vampiros.  
b) La zona libre debe contar con las siguientes medidas zoosanitarias:  
● Ausencia del virus rábico en la población de bovinos y otras especies ganaderas susceptibles, tales 
como equinos, ovinos, caprinos y porcinos.  
● Ausen cia de vampiros del género Desmodus rotundus , en el área o región ya sea por razones 
ecológicas o por acciones de la Campaña, comprobada mediante inspección oficial.  
● Control de los focos rábicos conforme a lo dispuesto a los numerales 8, 10, 12 y 13 de e sta Norma 
Oficial Mexicana y la georreferenciación de estas actividades.  
● Control de la movilización de animales conforme al numeral 13 de esta Norma Oficial Mexicana.  
● Contar con un sistema de muestreo y monitoreo, basado en el diagnóstico de laboratori o para 
realizar la vigilancia epidemiológica de la rabia bovina y especies ganaderas.  
6. Diagnóstico  
6.1. Las pruebas para la detección del virus rábico en bovinos y especies ganaderas, se deben realizar de 
acuerdo a lo descrito en la NOM -056-ZOO -1995, Esp ecificaciones técnicas para las pruebas diagnósticas que 
realicen los laboratorios de pruebas aprobados en materia zoosanitaria; y en la Parte 2, Sección 2.2, capítulo 
2.2.5 del Manual de Pruebas Diagnósticas y Vacunas para los animales terrestres de la Or ganización Mundial 
de Sanidad Animal. Ver Apéndice “B” (Normativo).  Viernes 20 de mayo de 2011  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
7. Muestreo  
7.1. Toma y envío de muestras a laboratorio.  
7.1.1.  La muestra para el diagnóstico de rabia en laboratorio, es el encéfalo y médula de bovinos y 
especies ganaderas, que hayan m uerto con signos nerviosos característicos de la enfermedad, así como los 
murciélagos hematófagos capturados durante los operativos, para poder determinar la presencia del virus de 
la rabia.  
7.1.2.  La toma de muestra deberá realizarse conforme a lo descrit o en el Apéndice “A” (Normativo) de la 
presente Norma Oficial Mexicana.  
7.1.3.  Registrar la información geográfica (georreferenciación) sobre la colecta de muestras para el 
diagnóstico de rabia.  
8. Vacunas y vacunación  
8.1. Las vacunas antirrábicas que se utilicen en la Campaña deben ser las elaboradas con virus activo 
modificado y las elaboradas con virus inactivado, estas mismas deben contar con el reconocimiento oficial de 
la Secretaría. Su aplicación se realizará conforme a la vía de administración y do sis indicada por el laboratorio 
fabricante, el manejo de la vacuna deberá realizarse por un Médico Veterinario Zootecnista.  
8.2. La vacunación antirrábica de las especies ganaderas, será obligatoria en el área enzootica y en 
aquellos lugares donde se prese nten casos clínicos y/o confirmados por laboratorio, se deben realizar las 
acciones de manera focal y perifocal en un radio mínimo de 10 kilómetros del foco inicial.  
8.3. Para garantizar una buena práctica de inmunización antirrábica en los animales, se de ben conservar 
todas las vacunas antirrábicas en refrigeración de 2 a 8 grados centígrados desde su compra y hasta la 
aplicación en los animales, siguiendo las recomendaciones del laboratorio productor.  
8.4. El esquema de vacunación antirrábica para los bov inos y especies ganaderas mayores de un año, se 
realizará en el área endémica de rabia y cuando las acciones de Campaña se encuentren en la zona.  
8.5. El esquema de vacunación antirrábica para los bovinos y especies ganaderas menores de un año, se 
debe rea lizar en el área endémica de rabia y consistirá en la aplicación de la primera dosis de vacuna 
antirrábica a partir del mes de edad y la aplicación de sus refuerzos cuando cumplan la edad de tres y seis 
meses, respectivamente.  
8.6. En el caso de tratarse d e la revacunación antirrábica anual de los bovinos y especies ganaderas en el 
área endémica de rabia, ésta se debe realizar conforme a lo dispuesto en los numerales 8.4 y 8.5 de esta 
Norma Oficial Mexicana.  
8.7. Para el control de un foco de rabia en el ga nado bovino y otras especies ganaderas, se deben aplicar 
vacunas antirrábicas de tipo virus activo modificado y/o de tipo virus inactivado, además de realizar 
actividades de control del transmisor referidas en los numerales 10 y 11 de esta Norma Oficial Me xicana, 
cuando así proceda.  
9. Requisitos mínimos para las vacunas contra la rabia, de virus activo modificado y de virus 
inactivado  
9.1. Características del producto. Elaborado con una cepa aprobada de virus de rabia, activo modificado 
liofilizado o inact ivado y presentado en forma líquida o liofilizada.  
9.2. Medios de producción. Cultivos celulares primarios o a partir de líneas celulares o embrión de pollo.  
9.3. Requisitos de pruebas. Por cada lote de producto terminado antes de que salga al mercado, el 
elaborador y/o titular del registro debe realizar las siguientes pruebas:  
9.3.1.  Pruebas de pureza. Esta prueba consiste en demostrar que el producto vacunal está libre de 
cualquier contaminante y que contiene únicamente el microorganismo que se indica.  
9.3.1.1.  El análisis bacteriológico, usando medios para gérmenes aerobios y anaerobios, debe comprobar 
que el producto está exento de cualquier contaminación bacteriana.  
9.3.1.2.  Se deben realizar las pruebas necesarias, a fin de demostrar que el producto es tá libre de hongos 
y levaduras.  
9.3.1.3.  Se deben realizar las pruebas que se requieran para demostrar que el producto está libre de 
micoplasmas.  
9.3.1.4.  Se deben realizar las pruebas necesarias, a fin de demostrar que el producto está libre de virus 
contaminantes.  
9.3.2.  Prueba de inactivación viral para vacunas inactivadas. La suspensión viral inactivada debe 
someterse a esta prueba, para la cual se debe utilizar:  
a) 10 ratones sanos y susceptibles a la rabia, de la misma cepa o estirpe, de 21 días de ed ad y de 12 a 16 
gramos de peso.  
b) Una camada de por lo menos 8 ratones lactantes sanos y susceptibles a la rabia, de 3 a 5 días de edad.  
c) Por lo menos 2 conejos sanos y susceptibles a la rabia, de 1.5 a 2.5 kilogramos de peso.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 20 de mayo de 2011  
Estos animales deben ser i noculados con la suspensión viral en estudio, por vía intracerebral; los ratones 
de 21 días con 0.03 mililitros, los ratones lactantes con 0.02 mililitros y los conejos con 0.25 mililitros, todos los 
animales deben ser observados diariamente durante 28 día s post -inoculación. Se deben colectar los cerebros 
de los animales que mueran entre los días 5 y 28, post -inoculación y se tratará de detectar la presencia o 
ausencia del virus, mediante la inyección de 5 ratones por vía intracerebral, con el material proc edente de 
cada cerebro, debiéndose observar durante 30 días. Para la confirmación de la presencia o ausencia del virus 
de la rabia, se debe realizar la prueba de anticuerpos fluorescentes, basado a lo estipulado en el numeral 6 de 
esta Norma Oficial Mexica na. 
Si se confirma la presencia del virus, el lote es insatisfactorio.  
9.3.3.  Prueba de seguridad e inocuidad para las vacunas inactivadas. Esta prueba debe realizarse en 
ratones y en cobayos.  
En caso de que la vacuna deba reconstituirse, se hará utilizand o el diluyente que la acompaña, de acuerdo 
a las indicaciones del laboratorio productor.  
9.3.3.1.  Prueba en ratones adultos. Se debe utilizar 10 ratones de 21 días de edad de 12 a 16 gramos de 
peso, sanos y susceptibles a la rabia, cada uno de los cuales s e debe inocular con 0.5 mililitros de la vacuna 
en estudio por vía intraperitoneal y serán observados diariamente durante 21 días post -inoculación. Para que 
la prueba se considere satisfactoria, todos los animales deben permanecer sanos, sin signos de enfe rmedad 
durante el periodo de prueba.  
9.3.3.2.  Prueba en cobayos. Se deben utilizar 2 cobayos de 250 a 300 gramos de peso, sanos y 
susceptibles a la rabia, los cuales deben ser inoculados por vía intraperitoneal con 2 mililitros del producto  y 
deben ser ob servados diariamente durante 21 días post -inoculación.  
La prueba se debe considerar satisfactoria cuando los cobayos permanezcan sanos, sin signos ni 
reacciones indeseables atribuibles al producto durante el periodo de observación.  
9.3.4.  Prueba de segurid ad e inocuidad para las vacunas de virus activo modificado. Esta prueba debe 
realizarse en ratones y cobayos.  
La vacuna debe ser reconstituida con el diluyente que la acompaña, según indicaciones del laboratorio 
productor.  
9.3.4.1.  Prueba en ratones adulto s. Se deben utilizar 10 ratones de 21 días de edad de 12 a 16 gramos de 
peso, sanos y susceptibles a la rabia, cada uno se inoculará con 0.5 mililitros de la vacuna, por vía 
intraperitoneal y serán observados diariamente durante 21 días post -inoculación.  
La prueba se debe considerar satisfactoria, si en el periodo de observación sobrevive por lo menos el 80 
por ciento de los ratones, sin presentar reacciones desfavorables atribuibles al producto, siempre y cuando se 
demuestre que los que murieron (menos del  20 por ciento) fueron a causa de la cepa vacunal de rabia y no a 
causa de otros agentes infecciosos ajenos al producto.  
9.3.4.2.  Prueba en cobayos. Se deben utilizar 2 cobayos de 250 a 300 gramos de peso, sanos y 
susceptibles a la rabia, los cuales deben ser inoculados por vía intramuscular, en el músculo gastrocnemio, 
con 2 mililitros del producto y deben ser observados diariamente durante 21 días post -inoculación.  
La prueba se debe considerar satisfactoria cuando los cobayos permanezcan sanos, sin signos , ni 
reacciones indeseables atribuibles al producto durante el periodo de observación.  
9.3.5.  Prueba de seguridad e inocuidad para el trámite de regulación de los productos nuevos y para la 
semilla de trabajo y/o cuando se requiera. Esta debe realizarse en  cada una de las especies animales que el 
producto recomiende en la etiqueta.  
Se deben utilizar 10 animales sanos y susceptibles a la rabia, de cada especie a ser probada (negativos a 
anticuerpos antirrábicos a la dilución 1 en 2 ante la prueba de seroneut ralización).  
Cinco animales deben ser inoculados por vía intramuscular, cada uno con el equivalente a 10 dosis del 
producto y cada uno de los otros 5 debe ser inoculado también por vía intramuscular, infiltrando el inóculo en 
un nervio mayor con el equival ente a 10 dosis del producto.  
Todos los animales deben ser observados diariamente durante 90 días, tiempo durante el cual deben 
permanecer sanos, sin signos de enfermedad.  
Si alguno de los animales presenta signos de enfermedad o se demuestra el virus de l a rabia en su 
sistema nervioso central, el producto o la semilla se deben considerar insatisfactorios.  
9.4. Prueba de titulación para productos de virus activo modificado. Para esta prueba se deben utilizar 
ratones blancos. Todos de la misma cepa o estirpe , sanos y susceptibles a la rabia, de 21 días de edad y de 
12 a 16 gramos de peso.  
Dos frascos de la vacuna de un mismo lote deben ser reconstituidos con el diluyente que los acompaña; 
media dosis será extraída de cada frasco para completar la dosis total,  que será considerada como la dilución 
10 a la cero.  Viernes 20 de mayo de 2011  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
Se deben realizar diluciones decimales desde 10 a la cero a 10 a la menos cero de la vacuna con una 
solución tampón fosfatada (conteniendo 2 mililitros de suero de caballo, libre de anticuerpos contra la  rabia, o 
albúmina de bovino al 0.4 por ciento), con un pH de 7.2 más o menos 0.3 o con el diluyente recomendado por 
el productor.  
Con cada dilución se deben inocular 10 ratones de 21 días de edad de 12 a 16 gramos de peso, por vía 
intracerebral, cada uno con 0.03 mililitros, empezando la dilución más alta de 10 a la menos cero, después 
con 10 a la menos 5, 10 a la menos 4 y así sucesivamente.  
Los ratones deben observarse diariamente durante 14 días post -inoculación y se deben registrar las 
muertes y los si gnos de parálisis y espasmos que se observen en los ratones, esto a partir del quinto día post -
inoculación. Los ratones que mueran dentro de los primeros 4 días post -inoculación deben ser descartados.  
Para que la prueba sea válida, por lo menos el 80 por c iento de los ratones inoculados con cada dilución, 
deben sobrevivir, a partir del cuarto día post -inoculación.  
Con los ratones que mueran a partir del quinto día, se deben calcular los resultados por el método de 
Reed and Muench o de Spearmen -Karber, expre sados como la dosis letal 50 por ciento para el ratón  (DLR -
50 por ciento). Los ratones que mueran o presenten signos atribuibles a rabia, se les deben hacer pruebas de 
Inmunofluorescencia a partir del cerebro, por lo menos un animal por dilución.  
Todos lo s lotes de vacuna elaborados deben demostrar un título mínimo de 10 a la 3.3 Dosis Letal Ratón 
50 por ciento por cada 0.03 mililitros al inicio y durante el periodo de vigencia.  
9.5. Pruebas de potencia.  
9.5.1.  Pruebas de potencia para vacunas de virus act ivo modificado. Para esta prueba se deben utilizar 15 
cobayos de la misma cepa o estirpe, sanos y susceptibles a la rabia, con un peso mínimo de 350 gramos 
elegidos al azar, 10 cobayos deben constituir el lote de prueba y los otros 5 el lote testigo.  
Dos f rascos de la vacuna del mismo lote deben ser reconstituidos por el diluyente que los acompaña.  
La mitad de la dosis recomendada por el laboratorio productor debe ser extraída de cada frasco, para 
completar una dosis total. Posteriormente se debe agregar el  diluyente antes mencionado, hasta completar 
una dilución de 1 en 10.  
Cada uno de los cobayos del lote de prueba debe ser inoculados con 0.25 mililitros de la vacuna 
previamente diluida, en el músculo gastrocnemio, en la cara interna de la pierna, tan cerc a del nervio como 
sea posible.  
Tres semanas después de la inoculación, los cobayos vacunados y los testigos deben ser desafiados con 
el virus CVS de rabia, con 0.5 mililitros de la dilución anterior a la que en una titulación previa haya matado al 
100 por ciento de los cobayos, utilizando diluciones dobles, por vía intramuscular, en la extremidad opuesta a 
la empleada para la vacunación.  
Todos los cobayos deben ser observados diariamente durante 14 días post -desafío, las muertes que 
ocurran entre el primero  o cuarto día posterior al desafío deben ser descartadas.  
La prueba se debe considerar satisfactoria cuando por lo menos 8 de los 10 cobayos vacunados 
sobrevivan sin manifestar signos de rabia y cuando por lo menos el 80 por ciento de los testigos mueran o  
presenten signos de rabia en el periodo de observación.  
9.5.2.  Prueba de potencia para vacunas inactivadas. Esta debe realizarse por la técnica del NIH (Técnica 
del Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos de América).  
9.5.2.1.  Prueba de potencia  del NIH. Los lotes comerciales deben probarse mediante la prueba del NIH. 
Para esta prueba se deben utilizar ratones blancos de la misma cepa o estirpe sanas y susceptibles a la rabia, 
del mismo sexo, de 21 días de edad y con un peso de 12 a 16 gramos de peso y se requiere del empleo de 
una vacuna de referencia aprobada por la Secretaría.  
Para la vacuna de prueba y la de referencia se debe seguir el mismo procedimiento.  
Con solución salina tamponada de fosfatos pH 7.6, se deben realizar diluciones quíntupl es seriadas de la 
vacuna (desde 1 en 5 hasta 1 en 625).  
Con cada dilución deben vacunarse 16 ratones, cada uno con 0.5 mililitros por vía intraperitoneal; se debe 
comenzar por la dilución mayor y se debe terminar con la menor. Al momento del desafío, se re alizará la 
titulación del CVS, en 6 ratones por dilución, empleando la previa a la que contenga 50 Dosis Letal Ratón al 
momento del desafío.  
La vacunación debe repetirse una semana después. Todos los ratones vacunados, así como los testigos 
deben ser desaf iados por vía intracerebral a los 7 días después de la segunda vacunación; cada uno con 12 a 
50 Dosis Letal Ratón 50 por ciento de Challenge Virus Standar, contenidas en 0.03 mililitros y se deben 
observar diariamente durante 21 días post -desafío, registra ndo la morbilidad y mortalidad.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 20 de mayo de 2011  
Se deben registrar aquellos que mueran a partir del quinto día posdesafío manifestando signos de rabia 
tales como parálisis y espasmos, asimismo, se deben registrar aquellos que después de presentar signos de 
rabia sobreviva n al periodo de prueba. Los muertos antes del quinto día posdesafío serán descartados.  
La prueba debe considerarse válida cuando la titulación del virus de confrontación (Challenge Virus 
Standar) tenga una concentración de 12 a 50 Dosis Letal Ratón 50 por ciento, en 0.03 mililitros.  
Se debe calcular el punto final de protección de las vacunas por el método de Reed and Muench o el de 
Spearman -Karber y se debe expresar como la Dosis Protectora (DP) 50 por ciento, tanto de la vacuna de 
referencia como la de pr ueba.  
La potencia de la vacuna de prueba debe ser expresada en Unidades Internacionales por mililitro (U.I. por 
mililitros) y calculada con la siguiente fórmula:  
Potencia de la vacuna 
de prueba  = Dosis Protectora 50 por ciento de la 
vacuna de prueba  
X Potencia de la vacuna de 
referencia en Unidades 
Internacionales/mililitros  Dosis Protectora 50 por ciento de la 
vacuna de referencia  
 
La prueba debe considerarse satisfactoria cuando la potencia relativa de la vacuna que está siendo 
probada tenga un valo r mínimo de 2 Unidades Internacionales por dosis.  
9.5.3.  Prueba de potencia para el trámite de regulación de los productos nuevos, para la semilla de trabajo 
y/o cuando se requiera. Debe realizarse en las especies animales que el producto recomienda en la etiqueta; 
el protocolo de prueba que se debe seguir debe estar previamente autorizado por la autoridad competente.  
Para que los resultados sean satisfactorios, el producto debe proteger por lo menos al 80 por ciento de los 
vacunados con una sola dosis, al ser desafiados al término del periodo de protección indicado por el 
laboratorio productor y deben morir por lo menos el 80 por ciento de los testigos, después de ser observados 
durante 90 días.  
Para efectos de comprobación, el elaborador y/o titular del re gistro debe asegurar todos los requisitos 
señalados durante el periodo de vigencia que ofrezca, por cada lote del producto, a partir de la fecha de 
elaboración.  
Para muestra de retención, en vacunas de virus activo modificado el título mínimo aceptable deb e ser de 
10 a la 3.3 Dosis Letal Ratón 50 por ciento en 0.03 mililitros, durante 3 meses más a la fecha de caducidad 
indicada en la etiqueta.  
Para vacunas inactivadas el valor mínimo será de 2 Unidades Internacionales por dosis, durante 3 meses 
más a la fe cha de caducidad indicada en la etiqueta.  
9.6. Prueba de vacío para vacunas liofilizadas. Esta prueba debe realizarse en un cuarto oscuro, 
empleando el aparato de Tessler que es el generador de alta frecuencia, el cual debe aplicarse a cada frasco 
de vacun a liofilizada a una distancia de no más de 5 milímetros de la retapa de aluminio. Existirá vacío si la 
descarga eléctrica ilumina el interior del frasco de la vacuna.  
Al término del proceso de liofilización se puede sellar también con gas inerte, para lo c ual, en este caso, 
no se realizará la prueba de vacío.  
9.7. Prueba de humedad para vacunas liofilizadas. Esta prueba consiste en determinar el porcentaje de 
humedad que tiene la vacuna liofilizada, que debe ser igual o menor del 4 por ciento, se puede dete rminar por 
los métodos de Abderhalden, Karl Fischer o Termogravimétrico.  
9.8. Prueba de pH.  
9.8.1.  Para vacunas de virus activo modificado. La vacuna reconstituida debe mostrar un pH entre 6.9  y 
7.4 el cual debe ser comprobado con un potenciómetro previam ente calibrado.  
9.8.2.  Para vacunas de virus inactivado. Deben mostrar un pH entre 7.2 y 8.2.  
10. Tratamientos para el control de poblaciones de vampiros  
10.1.  Las capturas para el control de vampiros se realizarán por personal oficial de la Secretaría o 
personal capacitado para tal fin, el cual será supervisado por el personal oficial de la Secretaría.  
10.2.  En las zonas de fase de control, además de lo indicado en los numerales 8 y 9, se realizarán 
operativos para el control de las poblaciones de vampiros  indicados en los numerales 10 y 11 de esta Norma 
Oficial Mexicana.  Viernes 20 de mayo de 2011  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
10.3.  En cada operativo para el control de vampiros, sea este municipal, regional o estatal, debe diseñarse 
una estrategia y un programa de acciones, considerando e indicando la dimensión del área, las barreras 
naturales, la población bovina y especies ganaderas, la incidencia de mordeduras, así como la población 
estimada de vampiros.  
10.4.  En cada operativo de control de vampiros en cualquiera de sus niveles, se debe registrar la cantidad 
de vampiros capturados y tratados, así como los enviados para diagnóstico de rabia. Asimismo se debe 
registrar, el número de bovinos y especies ganaderas tratadas conforme a lo establecido en el numeral 10.5  y 
los resultados obtenidos en este ámbito.  
10.5. En los operativos para el control de vampiros, se deben utilizar únicamente los tratamientos descritos 
en los numerales 10.5.1., 10.5.2. y 10.5.3., sin causar daños ni trastornos en las poblaciones benéficas de 
murciélagos.  
10.5.1.  Previa identificación taxonómica de los murciélagos hematófagos capturados, en corral o refugio 
por personal capacitado se procederá al tratamiento tópico con pomada vampiricida. Esta técnica sólo debe 
ser empleada por personal oficial y/o personal entrenado en las técnicas de control, además de estar 
vacunado previamente contra la rabia.  
10.5.2.  Tratamiento tópico con pomada vampiricida elaborada a base de anticoagulantes orales aplicado 
en las heridas ocasionadas por la mordedura de los vampiros en los bovinos y especies ganad eras. Esta 
técnica podrá ponerla en práctica cualquier persona, siguiendo las indicaciones establecidas en el producto.  
10.5.3.  Tratamiento sistémico del ganado con vampiricida elaborado a base de anticoagulantes de uso 
sistémico. Esta técnica puede utiliz arla cualquier persona.  
10.6.  El control de vampiros se llevará a cabo con recursos de la Secretaría, los Gobiernos Estatales, 
Gobiernos Municipales, Grupos Organizados, Comités de Fomento y Protección Pecuaria, Uniones 
Ganaderas Regionales y aquellos que los productores tengan destinados para su efecto.  
10.7.  Registrar la información georreferenciada sobre las actividades de control de vampiros.  
11. Productos vampiricidas  
11.1.  Los productos vampiricidas que se utilicen en la Campaña deben ser los elaborad os con sustancias 
anticoagulantes. Sus vehículos, dosificación, así como el mismo vampiricida deben contar con el registro 
oficial de la Secretaría. Su aplicación se realizará conforme a la vía de administración y dosis indicada por el 
laboratorio fabrican te. 
11.2.  Para el control de poblaciones de murciélagos hematófagos, no deben utilizarse productos 
vampiricidas o sustancias que no cuenten con el registro oficial de la Secretaría.  
12. Vigilancia epidemiológica  
12.1.  En el caso de focos de rabia en una ex plotación o de un resultado positivo a rabia por laboratorio, es 
obligación tanto del propietario de los animales, Organismos Auxiliares de Sanidad Animal, Comités de 
Fomento y Protección Pecuaria, Médicos Veterinarios Zootecnistas, así como el público en general según 
corresponda, notificarlo de forma inmediata a la Secretaría y cuando ocurra exposición directa a alguna 
persona se deberá notificar a las autoridades del Sector Salud.  
12.2.  En las zonas en control y libres de rabia, es responsabilidad de los  Gobiernos Federal y Estatal, así 
como de poseedores o productores de ganado bovino y otras especies ganaderas, laboratorios autorizados en 
el diagnóstico zoosanitario, médicos veterinarios responsables autorizados, transportistas de ganado, 
Organismos Aux iliares de Sanidad Animal; así como del público en general según corresponda, la notificación 
inmediata de morbilidad, mortalidad, sospecha o confirmación de rabia en los animales.  
12.3.  La vigilancia epidemiológica de la rabia en el área endémica del país , debe reportarse de la manera 
siguiente:  
● Notificación inmediata de casos o sospecha de rabia en bovinos y especies ganaderas a las 
Delegaciones Estatales de la Secretaría, Comités de Fomento y Protección Pecuaria, Gobiernos Estatales, 
Gobiernos Municipales, laboratorios de diagnóstico autorizad os en materia zoosanitaria o a la Dirección 
General de Salud Animal, con domicilio u bicado en la avenida Cuauhtémoc número 1230 , colonia Santa Cruz 
Atoyac, Delegación Benito Juárez, código postal 03110, México , Distrito Federal, teléfono (55) 59 05 1000 , 
extensión 51092.  
● Las Delegaciones Estatales de la Secretaría, los Gobiernos Estatales, Comités de Fomento y Protección 
Pecuaria, Gobiernos Municipales, laboratorios de diagnóstico, la Dirección de Epidemiología y Análisis de 
Riesgo, deben enviar a la Campaña, la informac ión geográfica (georreferenciación) sobre las actividades de 
vacunación y control de vampiros, así como la correspondiente a los focos de rabia bovina.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 20 de mayo de 2011  
● Realización del diagnóstico de rabia conforme a lo referido en el numeral 6 de esta Norma Oficial 
Mexi cana.  
● El seguimiento epidemiológico de los casos en bovinos y especies ganaderas, se debe realizar de 
acuerdo a lo referido en los numerales 6, 7, 8, 9, 10 y 11 de esta Norma Oficial Mexicana.  
● El cierre de los casos se debe efectuar cuando ya no exista n bovinos y especies ganaderas con 
evidencias de rabia o sospechas de la enfermedad como efecto de las acciones indicadas en los numerales 6, 
7, 8, 9, 10 y 11 de esta Norma Oficial Mexicana.  
12.4.  En cada una de las medidas zoosanitarias aplicadas en la vi gilancia epidemiológica, es necesario 
contar con la participación de las instituciones involucradas en la Campaña, mismas que deben actuar en su 
oportunidad y de manera coordinada, para la obtención y envío de la información zoosanitaria.  
13. Movilización de animales  
13.1.  Las especificaciones contenidas en este numeral se aplican para el ganado bovino y especies 
ganaderas que se pretenda movilizar, para lo cual se debe comprobar mediante una constancia expedida por 
un Médico Veterinario Zootecnista Respons able Autorizado en el área de rumiantes, que los animales fueron 
vacunados mínimo 30 días antes de la movilización; asimismo, la movilización no podrá ser realizada cuando 
el animal tenga hasta 12 meses de la última vacunación. Adicional al certificado de vacunación se debe contar 
con el Certificado Zoosanitario correspondiente.  
13.2. En la zona libre.  Los bovinos y especies ganaderas que se encuentren en zonas colindantes a la 
endémica, se mantendrá una vigilancia epidemiológica activa de acuerdo a las cir cunstancias y periodicidad, a 
través de las Delegaciones Estatales de la Secretaría, quienes informarán a los productores a través de las 
instancias correspondientes.  
13.3. En la zona en control.  Es obligatoria la vacunación antirrábica de los bovinos y es pecies ganaderas, 
además de realizar los operativos de control de vampiros, los cuales se deben dar a conocer en cada región a 
través de las Delegaciones Estatales de la Secretaría, quienes informarán a los productores mediante las 
instancias correspondien tes. 
13.4.  Todos los animales originarios de zonas libres de rabia pueden movilizarse sin ninguna restricción a 
zonas libres; en el caso que el destino de los animales sea a un Estado, zona o región en control, y se 
pretende que estos animales se establezc an en zonas de riesgo, deben estar vacunados contra la rabia, 
mínimo 30 días antes de la movilización; asimismo, la movilización no podrá ser realizada cuando el animal 
tenga más de 12 meses de la última vacunación.  
13.5.  Los bovinos y especies ganaderas o riginarias de zonas en control podrán movilizarse en el territorio 
nacional siempre y cuando comprueben la vacunación antirrábica de los animales, 30 días antes de la 
movilización e igualmente, ésta no podrá ser realizada cuando el animal tenga más de 12 m eses de la última 
vacunación, además de contar con el Certificado Zoosanitario correspondiente.  
13.6.  No se deben movilizar bovinos y/o especies ganaderas con signos nerviosos y/o sugestivos o 
sospechosos a rabia.  
14. Animales y productos importados  
14.1.  La importación de bovinos y especies ganaderas que provengan de países enzoóticos de rabia de 
acuerdo a los reportes de la Organización Mundial de Sanidad Animal, tendrán que demostrar la vacunación 
antirrábica de los animales mínimo 30 días antes de la im portación e igualmente, é sta no puede ser realizada 
cuando el animal tenga más de 12 meses de la última vacunación a su importación, de acuerdo a lo 
estipulado en el numeral 8 y 13 de esta Norma Oficial Mexicana.  
14.2.  Los productos biológicos (vacunas) y vampiricidas importados deben cumplir con todos los requisitos 
establecidos en esta Norma Oficial Mexicana.  
14.3.  Las vacunas importadas para su uso en bovinos y especies ganaderas, deben provenir de una 
empresa elaboradora con registro oficial del país de  origen y cumplir con todos los requisitos establecidos en 
esta Norma Oficial Mexicana y las disposiciones correspondientes.  
14.4.  Sólo pueden importarse productos que se estén comercializando libremente en el país de origen, lo 
cual debe ser avalado con e l certificado de libre venta o su equivalente.  Viernes 20 de mayo de 2011  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
15. Sanciones  
15.1.  El incumplimiento de las disposiciones contenidas en esta Norma Oficial Mexicana, será sancionado 
conforme a lo establecido en la Ley Federal de Sanidad Animal y la Ley Federal sobre Metrol ogía  y 
Normalización.  
15.2.  Las personas que teniendo conocimiento de la presencia o sospecha de rabia y que no lo notifiquen, 
serán sancionadas por la autoridad competente conforme a lo dispuesto en la Ley Federal de Sanidad Animal.  
16. Procedimiento de evaluación de la conformidad  
Para efecto de la presente regulación, la evaluación de la conformidad será realizada por la Secretaría a 
través de la expedición de dictámenes, informe de resultados y certificados zoosanitarios, por sí misma  o 
mediante perso nas morales acreditadas y, en su caso, aprobadas para ello.  
Los dictámenes serán elaborados por el Médico Veterinario Oficial o Médico Veterinario Responsable 
Autorizado o las unidades de verificación aprobadas, en los cuales se presentan los resultados ob tenidos de 
la verificación realizada.  
Mediante el informe de resultados se presentarán los resultados obtenidos de las pruebas y/o análisis 
realizados por un laboratorio oficial o aprobado, así como otra información relevante derivada de los mismos.  
El cer tificado zoosanitario debe ser expedido por la Secretaría o por un Organismo de Certificación 
Aprobado para constatar el cumplimiento de la presente Norma Oficial Mexicana. Tratándose de animales 
será signado por un Médico Veterinario Oficial o por un Médi co Veterinario Tercero Especialista Autorizado.  
El certificado zoosanitario constata el cumplimiento de la presente Norma Oficial Mexicana o parte  de la 
misma.  
17. Concordancia con normas internacionales  
No se tiene concordancia con normas internacionales  al momento de su elaboración.  
18. Bibliografía  
1. Baer G.M. (1991). The Natural History of Rabies, Second Edition. CRC Press, Boca Raton, Florida, 
USA.  
2. Council of Europe (1997). Vaccinum rabie inactivatum ad usum veterinarium. Inactivated Rabies 
Vaccin e for Veterinary Use. European Pharmacopoeia, Third Edition. Monograph 0451. Editions of 
the Council of Europe, Strasbourg, France.  
3. Flores, C.R. La rabia en las diferentes especies sus transmisores y su control. 1a. edición, Editado 
por INIFAP SARH (Ago sto de 1998).  
4. Flores, C.R. Prevención de la Rabia Paralítica Bovina y el control de los murciélagos vampiros. 1a. 
Edición Mayo 1996. Editado por INIFAP -SAGAR -PAIPEME. (1996).  
5. Flores, C.R. Técnicas, substancias y estrategias para el control de murciél agos vampiros. 1a. 
Edición, Marzo 2003, México, D.F. ISBN 970 -92109 -1-2 Impreso por Laboratorios Bayer de México.  
6. Jiménez, R.A. 2005. Manual para la Toma de Muestras para el Diagnóstico de Rabia en Bovinos.  
7. Jiménez, R.A. 2006. Manual Técnico sobre Té cnicas para el control de poblaciones de vampiros  
(Desmodus rotundus ). 1a. edición. Impreso por Laboratorios Bayer de México.  
8. Manual Operativo para el control de la Rabia Paralítica Bovina. México, D.F., SAGARPA, 2002.  
9. Manual of Standards for Diagnos tic Test and Vaccines, OIE. 5a. Edición, París Francia 2004.  
10. Organización Mundial de la Salud. 8o. Informe del Comité de expertos de la OMS sobre rabia. Serie 
de Informes Técnicos No. 824, 1992.  
11. Rexford, D.L. Manual de campo para el control de murc iélagos vampiros y la rabia. Bat Conservation 
International. Austin, Texas, July 31, 1998.  
12. World Health Organization (1996). Laboratory Techniques in Rabies, Fourth Edition, Meslin F. -X., 
Kaplan M.M. & Koprowski H., Eds. WHO, Geneva, Switzerland.  
TRANS ITORIOS  
PRIMERO. - La presente Norma Oficial Mexicana entrará en vigor a los 180 días posteriores a su 
publicación en el Diario Oficial de la Federación.  
SEGUNDO. - Se cancela la Norma Oficial Mexicana NOM -035-ZOO -1996, Requisitos mínimos para las 
vacunas, a ntígenos y reactivos empleados en la prevención y control de la rabia en las especies domésticas.  
Ciudad de México, Distrito Federal, a veintiséis de abril de dos mil once. - El Coordinador General Jurídico, 
Wolfgang Rodolfo Gonz ález Muñoz .- Rúbrica.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 20 de mayo de 2011  
Apéndi ce “A” (Normativo)  
Toma y Envío de Muestras al Laboratorio para Diagnóstico de Rabia  
La recolección de muestras de animales sospechosos de rabia o de aquellos animales que muestren 
signos de alguna enfermedad nerviosa y sus condiciones de su envío al labor atorio son la parte de trabajo de 
campo más importante, ya que de esto depende disponer de un resultado de laboratorio rápido y confiable.  
La recolección será efectuada por un Médico Veterinario Zootecnista o personal entrenado para esta 
actividad que cuen te con el equipo de protección necesario y que haya recibido el esquema de vacunación 
previo a la exposición.  
Para la manipulación de muestras sospechosas de rabia, de las cuales se pretende hacer el diagnóstico 
en laboratorio, se requiere de un cuidado es pecial para que las muestras lleguen al laboratorio en las 
condiciones óptimas y así obtener los resultados con mayor exactitud.  
Para el diagnóstico de rabia, las muestras son las de tipo nervioso como el encéfalo y la médula; estos 
órganos son donde se co ncentra la mayor cantidad de virus rábico.  
Para enviar el cerebro, se emplea glicerol al 50 por ciento en solución salina neutra o simplemente en 
condiciones de refrigeración.  
En el caso de que se encuentre el animal en el laboratorio de diagnóstico, la ne cropsia de éste deberá 
efectuarse en una habitación exclusivamente con este propósito, además de contemplarse todas las 
precauciones necesarias para la toma y envío de muestras y éstas van desde la vacunación del personal 
antes de la exposición, el uso obl igatorio de lentes protectores para los ojos, bata u overol, guantes de hule 
grueso hasta la utilización de cubrebocas; con el fin de evitar la exposición al virus a las personas encargadas 
de la extracción de muestras.  
El equipo e instrumental para la ext racción de las muestras de encéfalo y médula, para diagnóstico de 
rabia es indispensable y debe ser exclusivo para ello, mismo que consiste en:  
● Bata u overol  
● Lentes protectores para los ojos  
● Guantes de hule grueso  
● Careta o mascarillas con protecció n 
● Cubrebocas  
● Segueta o sierra de carnicero  
● Cuchillo  
● Tijeras para cirugía  
● Pinzas  
Para el envío de las muestras de encéfalo y médula, a laboratorio para el diagnóstico de rabia  se requiere 
de: 
● Bolsas de plástico suficientes (de preferencia con ci erre hermético, tipo zip)  
● 1 o 2 frascos de plástico de boca ancha con cierre hermético de un volumen de 1 y medio litros  
● Hielo en cantidad suficiente o Glicerina fosfatada al 50 por ciento  
● Hielera con refrigerante  
El procedimiento para la extracción de las muestras de encéfalo y médula, para diagnóstico de rabia es 
indispensable y debe ser exclusivo para ello, mismo que consiste en:  
1. Retirar la piel del cráneo y efectuar los siguientes cortes con segueta o sierra de carnicero para el corte 
de los hu esos.  
2. El primer corte de hueso es transversal y posterior a las cuencas oculares, las cuales sirven para sujetar 
la cabeza y como puntos de referencia.  
3. Hacer dos cortes, uno en cada hueso parietal, tomando como punto de referencia la comisura externa  
del ojo y la porción lateral del agujero magno exactamente encima de los cóndilos del occipital, procurando 
evitar cortar la masa encefálica.  
4. Al desprender la bóveda craneana dejamos al descubierto el encéfalo.  
5. Cortar con las tijeras las meninges qu e cubren la superficie del encéfalo y que se caracteriza por ser 
muy duras en los bovinos.  
6. Extraer con sumo cuidado el encéfalo.  
7. Cada encéfalo se pone en una bolsa de plástico y se deposita dentro de la hielera, misma que contiene 
refrigerantes o hie lo en cantidad suficiente, para asegurar su óptimo traslado y conservación hasta el 
laboratorio.  
8. Por cada muestra, debe elaborarse y anexarse una hoja con la información completa y detallada  (SIVE 
1). 
9. Una vez hecho todo lo anterior se procede el env ío del tejido dentro de las primeras 24 horas, después 
de su extracción manteniéndolo en refrigeración de 2 a 8 grados centígrados. De no ser así, sumergirlo en 
una solución de glicerol al 50 por ciento preparada con agua y remitirlo al laboratorio autoriz ado para el 
diagnóstico de rabia más cercano.  Viernes 20 de mayo de 2011  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
Apéndice “B” (Normativo)  
Manual de Pruebas Diagnósticas y Vacunas para Animales Terrestres  
PARTE 2; SECCION 2.2; CAPITULO 2.2.5  
RABIA  
Resumen  
La rabia es una importante zoonosis para la cual las técnicas de dia gnóstico se han tenido que 
estandarizar internacionalmente. Debido a que no hay lesiones patognomónicas de la enfermedad, el 
diagnóstico de la rabia debe hacerse solamente en el laboratorio. Las técnicas de laboratorio conducen 
preferentemente con tejido d el sistema nervioso central (CNS) removido del cráneo. Un compuesto de 
muestras del CNS debe ser probado y el tallo cerebral es el componente más importante de la muestra.  
Identificación del agente:  La identificación del agente preferentemente se realiza u tilizando la prueba de 
anticuerpos fluorescentes (FAT por sus siglas en inglés). Una gota de inmunoglobulina purificada previamente 
conjugado con isotiocianato de fluoresceína es añadida en acetona.  
La identificación del agente se hace preferentemente usan do la prueba de anticuerpos fluorescentes 
(FAT). Una gota de inmunoglobulina purificada conjugada previamente con isotiocianato de fluoresceína se 
agrega a un frotis de tejido del cerebro fijado acetona -fijo, es preferible hacerlo de varias partes del cere bro, 
incluyendo el hipocampo, el cerebelo y la médula oblongada. Para una gran cantidad de muestras, como en el 
caso de vigilancia epidemiológica, la técnica inmunoenzimática puede proporcionar los resultados rápidos 
(inmunodiagnóstico rápido de la enzima de la rabia [RREID]). El FAT proporciona un diagnóstico confiable 
entre el 98 -100 por ciento de los casos para todos los genotipos si se utiliza un potente conjugado, mientras 
que RREID detecta solamente el virus del genotipo 1.  
Las células nerviosas infec tadas han demostrado por pruebas histológicas y estos procedimientos revelan 
agregados del material viral (Corpúsculos de Negri) en el citoplasma de las neuronas. Sin embargo, la 
sensibilidad de la técnica histológica es mucho menor al de los métodos inmun ológicos, especialmente si 
éstos han sufrido cierta autolisis del espécimen. Consecuentemente, las técnicas histológicas no pueden ser 
recomendadas por mucho tiempo.  
Una simple prueba negativa en el material fresco no elimina la posibilidad de infección, l as pruebas de 
inoculación, u otras pruebas, se deben realizar simultáneamente. Ratones lactantes o de 3 a 4 semanas de 
edad serán inoculados intracerebralmente con una serie de diversos tejidos del Sistema Nervioso Central, 
incluyendo el tallo cerebral y d espués se mantienen bajo observación por 28 días. Cualquier ratón que muera 
entre los 5 y 28 días, la causa de la muerte deberá ser confirmada por el FAT. Sucesivamente, una capa de 
cultivo celular susceptible se inoculará con el mismo material utilizado e n los ratones. La inmunofluorescencia 
(FAT) realizada después de una incubación apropiada demostrará la presencia o la ausencia del antígeno 
viral. Donde sea posible aislar el virus en cultivos celulares, deberá remplazarse por la inoculación en ratones.  
La identificación del agente puede ser suplementada en laboratorios especializados mediante la 
identificación de cualquier variante de cepa del virus a través del uso de anticuerpos monoclonales, pruebas 
de ácido nucleico específicas, o por la prueba de Rea cción en Cadena de la Polimerasa (PCR) seguido por la 
secuenciación de Aido Desoxirribonucleico (ADN) de áreas genómicas. Tales técnicas pueden distinguir entre 
el virus de campo y cepas vacunales, y posiblemente identificar geográficamente el origen de la s cepas de 
campo. Estas pruebas son muy sensibles y deberán ser utilizadas por el personal entrenado y en laboratorios 
especializados.  
Pruebas serológicas:  Los análisis de neutralización del virus (VN) en cultivos celulares son de las 
pruebas ordenadas par a el comercio internacional. Alternativamente, el uso puede hacerse de una prueba que 
es conocida a correlacionar con ésta, notablemente un análisis de inmunoabsorción enzima -ligado usando el 
anticuerpo de la proteína G o la prueba de neutralización en rat ones. Los resultados se expresan en Unidades 
Internacionales o unidades equivalentes relativas para un antisuero estándar internacional.  
Requerimientos para las vacunas y biológicos para el diagnóstico:  Las vacunas antirrábicas para su 
uso en animales cont ienen virus vivo atenuado para la especie objetivo (tales como ola FLURY de bajo 
pasaje, Flury de alto pasaje, SAD/Street Alabama Dufferin o Kelev), de virus inactivado por medios químicos o 
físicos o vacunas recombinantes. El virus es cultivado en tejido del Sistema Nervioso Central de animales 
recién nacidos, en huevos embrionados, o en cultivos celulares.  
Las vacunas antirrábicas se liofilizan generalmente, pero las vacunas de virus inactivado con un 
coadyuvante y pueden ser almacenadas en forma líquida.  
Antes de registrar el desarrollo de nuevas vacunas, debe determinarse la duración de la inmunidad que 
resulta de su uso en animales vacunados para cada especie objetivo.  
Para las vacunas de virus vivo, deberá establecerse el contenido mínimo viral que res ultará en una 
respuesta inmunológica adecuada.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 20 de mayo de 2011  
La potencia de las vacunas de virus inactivado es establecido y controlado mediante la vacunación en 
ratones seguido por desafío intracerebral utilizando pruebas formuladas por el Departamento de Agricultura d e 
los Estados Unidos en los Estados Unidos o por la Farmacopea Europea, en otra parte. Los productos finales 
de ambos tipos de vacuna están sujetos a pruebas de inocuidad y ausencia de toxicidad.  
Para vacunas vivas que estén preparadas para la vacunación o ral en animales silvestres (o domésticos), 
deberán demostrar la seguridad y eficacia en los animales objeto y la seguridad en especies no objeto.  
A. Introducción  
La rabia es causada por un virus neurotrópico del género Lyssavirus  de la familia Rhabdovirida e, y se 
transmite a todos los mamíferos. Como también se transmite al ser humano por inoculación o por inhalación 
del virus, todo el material sospechoso de infección debe manejarse bajo condiciones apropiadas de seguridad 
especificadas por la Organización Mundial de la Salud (OMS) (37).  
Puede distinguirse siete líneas genéticas distintas del género Lyssavirus  mediante pruebas de protección 
cruzada y por análisis de biología molecular (5, 14, 21), a saber el virus de la rabia clásica (RABV, genotipo 1, 
serot ipo 1), el virus Lagos bat (LBV, genotipo 2, serotipo 2), Virus Mokola (MOKV, genotipo 3, serotipo 3), y 
virus Duvenhage (DUUV, genotipo 4, serotipo 4). Los lyssavirus de murciélagos europeos (EBLV), subdividido 
en dos biotipos (EBLV1, genotype 5 and EBLV2 , genotipo 6) y el lyssavirus de murciélagos australianos 
(ABLV, genotipo 7), recientemente aislado en Australia (24), también son miembros del género de los 
Lyssavirus genus , pero aún no se han clasificado en serotipos. Los virus de los serotipos 2 -4, los  EBLV y el 
ABLV son conocidos virus relacionados con la rabia. El uso de anticuerpos monoclonales están dirigidos 
contra los antígenos víricos de la nucleocápside o la glicoproteína, o la secuenciación de fragmentos 
genómicos determinados ha hecho posible la definición de numerosos subtipos dentro de cada serotipo. Los 
lyssavirus causan una enfermedad clínica indistinguible de la rabia clásica. Los sitios antiénicos conservados 
en la nucleocápside permiten el reconocimiento de todos los lyssavirus con recie ntes preparaciones 
comerciales de conjugados de anticuerpos antirrábicos usados para el diagnóstico con muestras de cerebro. 
Los sitios antigénicos conservados en la superficie de la glicoproteína de RABV, DUUV, EBLV and ABLV, 
permiten la neutralización cr uzada y la inmunidad cruzada mediante la vacunación antirrábica. Existe poca o 
nula protección cruzada contra MOKVo LBV por vacunación antirrábica y la mayoría de los antisueros no 
neutralizan estos lyssavirus.  
El personal que trabaja con material sospecho so debe estar vacunado contra los lyssavirus y otros 
patógenos que pueden estar presentes en las muestras a diagnosticar. El laboratorio debe cumplir con la 
normativa nacional de biocontención y de bioseguridad para proteger al personal del contacto con lo s 
patógenos; también debe cumplir con especificaciones de seguridad humana en el laboratorio de 
microbiología.  
La OMS recomienda la inmunización preventiva del personal expuesto. El protocolo de inmunización 
incluye tres inyecciones en los días 0, 7, y 28.  La evaluación serológica de la inmunización se realice de 1 a 3 
semanas después de la última inyección y se comprueba cada 6 meses en el caso de trabajadores de 
laboratorio o cada 2 años en otro personal. Debe suministrarse un refuerzo cuando el título de sciende por 
debajo de 0.5 Unidades Internacionales por mililitro. En ausen cia de control serológico, el ré gimen de 
vacunación debe consistir en una vacunación de refuerzo inicial después de 1 año y continuando cada 1  a 3 
años.  
Como no existen signos clíni cos o lesion es evidentes post-mortem  que puedan considerarse 
patognomónicas en animales domésticos o silvestres, el diagnóstico de la rabia depende en pruebas de 
laboratorio. La evidencia serológica de infección es raramente útil debido a la seroconversión  tardía y a la 
elevada tasa de mortalidad de las especies hospedadoras, aunque tales datos pueden usarse en algunos 
análisis epidemiológicos.  
1. Identificación del agente  
La observación clínica puede conducir solamente a una sospecha de rabia porque los si gnos de la 
enfermedad no son característicos y puede variar grandemente de un animal a otro (36). La única manera de 
realizar un diagnóstico de rabia confiable es la identificación del virus o parte de sus componentes específicos 
mediante pruebas de labora torio.  
Como el virus de la rabia es inactivado rápidamente, las muestras a diagnosticar deberán enviarse al 
laboratorio en refrigeración y por los medios más rápidos disponibles. Las condiciones del envío deben ser 
considerados para ser parte de la “cadena  de diagnóstico de la rabia”.  
Pueden utilizarse varias técnicas de laboratorio, mismas que han sido detalladas y estandardizadas en la 
cuarta edición de Técnicas de Laboratorio para la Rabia de la Organización Mundial de la Salud (OMS's 
Laboratory Techniqu es in Rabies) (37). Los métodos varían en su eficacia, especificidad y confiabilidad. Se 
aplican generalmente al tejido cerebral, pero pueden también ser aplicados aunque con menos eficacia a 
otros órganos (e.g. glándulas salivales). En el cerebro, el viru s de la rabia es particularmente abundante en el 
tálamo, el Puente de Varolio y la médula. El hipocampo (cuerno de Ammon), el cerebelo y diferentes partes Viernes 20 de mayo de 2011  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
del cerebro se han reportado negativos en 3.9 - 11.1 por ciento de los cerebros positivos. La estruct ura de la 
elección es el tálamo y esto fue positivo en todos los casos. Se recomienda que una serie de tejidos cerebro 
sean incluidos la corteza el tallo cerebral debe ser colectado y probado (12). Para alcanzar estas partes del 
cerebro, es necesario remov er el órgano completo después de haber abierto el cráneo en un cuarto de 
necropsias. Bajo algunas condiciones (como en el campo o cuando se realizan muestreos grandes para 
estudios epidemiológicos), puede emplearse un método de muestreo simplificado a trav és del agujero occipital 
(11), o a través de la cavidad orbital (26).  
a) Envío de muestras  
Durante el envío de material sospechoso para diagnóstico (cabezas de animales, cerebro u otros tejidos), 
no debe existir ningún riesgo de contaminación al hombre: lo s cerebros deben colocarse en un envase rígido y 
hermético (las cabezas de animales serán envueltas en material absorbente) como se señala en el Apéndice 
“A” (Normativo).  
Cuando no sea posible enviar las muestras en refrigeración, otras técnicas de conserv ación pueden 
usarse. La elección de conservación está estrechamente ligada a las pruebas de diagnóstico utilizadas:  
● La formalina inactiva el virus de la rabia, por lo que no puede utilizarse pruebas del aislamiento y el 
diagnóstico depende del uso de pru ebas modificadas y con menos sensibilidad como son la de 
inmunofluorescencia directa (FAT), inmunohistoquímica o histológica (33, 37);  
● La infecciosidad a temperatura ambiente puede extenderse por varios días si el material del cerebro se 
mantiene en una mezcla tamponada de glicerol al 50 por ciento y solución salina fosfatada (PBS). La mezcla 
Glicerol/Solución de Fosfatos Buferada retarda la acción bacteriana y por lo tanto la protege contra los efectos 
químicos y biológicos de la putrefacción. Esta no pr otege contra la declinación del título debido a las 
condiciones térmicas y por lo tanto como el virus de la rabia es termolábil, el título del virus declinará durante 
su almacenaje en Glicerol/ Solución de Fosfatos Buferada. Bajo condiciones de transporte normal en las 
zonas tropicales, esta protección puede ser eficaz por cuestión de días. Por lo tanto, siempre que sea posible 
mantener las muestras en Glicerol/ Solución de Fosfatos Buferada deben mantenerse refrigeradas. Como el 
virus no se inactiva por el  Glicerol/ Solución de Fosfatos Buferada, todas las pruebas de laboratorio pueden 
utilizarse en estas muestras.  
b) Colecta de muestras  
Usualmente el cerebro es colectado seguido de abrir el cráneo en una sala de necropsias y las muestras 
apropiadas son tom adas. Este paso puede ser peligroso si los técnicos de laboratorio no se encuentran 
entrenados, o están bajo condiciones de campo. En tales casos, existen dos métodos de colecta de muestras 
de cerebro sin la necesidad de abrir el cráneo:  
● Ruta del Agujero  Occipital para la toma de muestra de cerebro  
Se introduce un popote de beber de 5 milímetros (11) o una pipeta plástica disponible de 2 mililitros (16) 
en el agujero occipital en la dirección de un ojo. Puede tomarse muestras de bulbo raquídeo, de la base  del 
cerebelo, del hipocampo, de la corteza y de la médula oblongada. La Encefalopatía Espongiforme de los 
Bóvidos (BSE) debe considerarse en el diagnóstico diferencial de la mayoría del ganado que es considerado 
“sospechoso a rabia”. El muestreo de tejido  cerebral para ambas enfermedades puede hacerse mediante el 
uso de una “cucharada de cerebro o herramienta” desarrollada para el muestreo del tejido para BSE y con 
mejor efectividad que con el uso de un popote o pipeta. Las muestras resultantes son relativ amente fácilmente 
de reconocer como el área de cerebro muestreada.  
● Ruta Retro -orbital para la toma de muestra de cerebro  
En esta  técnica (26), se utiliza un tro car para hacer un agujero en la pared posterior de la cuenca del ojo y 
se introduce una pipeta de plástico a través de este agujero. Las partes del cerebro muest readas son las 
mismas que en la técnica anterior, pero se toman en la dirección opuesta.  
c) Pruebas de rutina en el laboratorio  
El diagnóstico de laboratorio puede desarrollarse usando tres tipos de procedimientos.  
● Identificación histológica de lesiones celulares características  
Los corpúsculos de Negri corresponden a una acumulación de proteínas virales, pero las técnicas clásicas 
de tinción sólo detectan una afinidad de estas estructuras para tinciones acidofílicas. Las pruebas 
inmunohistoquímicas son l as únicas pruebas histológicas específicas para la rabia.  
Un frotis de tejido sin fijar, puede ser teñido por el método de Seller’s, el diagnóstico es después obtenido 
en una hora aproximadamente. Generalmente, las pruebas histológicas, como la prueba de M ann, se realizan 
en material fijado después de su inclusión en parafina y el resultado de la prueba se obtiene en un lapso de 3 
días. Estas técnicas tienen la ventaja que el equipo del laboratorio necesario para realizarlas es barato y se 
evita cualquier n ecesidad para mantener las muestras frías después de ser fijadas. Cualquiera que sea el 
método de tinción usado, la evidencia de la infección es proporcionada por la presencia de cuerpos 
acidofílicos intracitoplásmicos. Estos métodos histológicos, especial mente el método de Seller’s, no pueden 
recomendarse porque tienen una sensibilidad baja y deben descartados.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 20 de mayo de 2011  
● Identificación inmunoquímica del antígeno del virus de la rabia  
i) Prueba de anticuerpos fluorescentes (Inmunofluorescencia FAT)  
La prueba amplia mente utilizada para el diagnóstico de la rabia es la inmunofluorescencia, misma que es 
recomendada por la Organización Mundial de la Salud y la Organización Mundial de Sanidad Animal. Esta 
prueba puede utilizarse directamente en un frotis y también puede usarse para confirmar la presencia del 
antígeno del virus de la rabia en cultivos celulares o en tejido de cerebro de ratones que hayan sido 
inoculados para el diagnóstico. La inmunofluorescencia da resultados confiables en especímenes frescos con 
unas poc as horas en más de 95 -99 por ciento de los casos. La sensibilidad de la inmunofluorescencia 
depe nde de la muestra (grado de auto lisis y cómo fue muestreado el cerebro, vea la sección B.1.) (1, 9), en el 
tipo de lyssavirus y en la habilidad del personal de diagnóstico. La sensibilidad puede ser baja en muestras de 
animales vacunados debido a la localización del antígeno que se confina al tallo cerebral. Para el diagnóstico 
directo de la rabia, los frotis se preparan de una muestra compuesta del tejido cerebr al que incluya el tallo 
cerebral, se fijan en acetona fría de alto grado y después se tiñen con una gota del conjugado específico. Los 
conjugados fluorescentes antirrábicos pueden prepararse en el laboratorio. Aquellos disponibles 
comercialmente son conjug ados policlonales específicos al virus completo o específico a la proteína de la 
nucleocapside del virus, o pueden estar preparados con una mezcla de diversos anticuerpos monoclonales. 
En la inmunofluorescencia, los agregados específicos de la proteína del  nucleocapside son identificados por 
su fluorescencia. La especificidad y la sensibilidad de estos conjugados antirrábicos fluorescentes deben 
comprobarse para las variantes de los virus localmente predominantes antes de ser utilizados.  
La inmunofluorescen cia puede aplicarse a muestras conservadas en glicerol. Si la muestra ha sido 
conservada en una solución de formalina, la inmunofluorescencia puede ser utilizada solamente después que 
el espécimen se ha tratado con una enzima proteolítica (6, 7, 32, 33). S in embargo, la inmunofluorescencia en 
muestras fijas en formalina y digeridas son siempre menos confiable y más incómodas que cuando éstas se 
realizan en tejido fresco.  
ii) Pruebas inmunoquímicas  
El anticuerpo puede ser conjugado con una enzima como la per oxidasa en vez del isotiocianato de 
fluoresceína (FITC). Este conjugado puede usarse para el diagnóstico directo con la misma sensibilidad que la 
inmunofluorescencia (22), pero atención debe tenerse cuidado del riesgo de resultados falso positivos no 
espec íficos. Este riesgo es reducido considerablemente por el entrenamiento cuidadoso de los técnicos. 
También debe enfatizarse que esta técnica necesita un paso de incubación más que la inmunofluorescencia.  
El conjugado con peroxidasa puede usarse en secciones  de tejido fijado en formalina para las pruebas 
immunohistoquímicas.  
Una variación de la prueba inmunoquímica es un enzimoinmunoensayo que detecta antígeno de rabia. 
Esta prueba rápida del immunodiagnóstico de la enzima de la rabia (RREID) está disponible comercialmente 
(28). Los rangos de correlación entre la inmunofluorescencia y el RREID se extienden entre el 96 por ciento y 
el 99 por ciento (8, 15). La versión “rutinaria” de esta prueba no es sensible a los virus de rabia relacionados 
ya que RREID detec ta solamente lyssavirus del genotipo 1.  
● Detección de replicación del virus de la rabia después de la inoculación  
Estas pruebas detectan la infecciosidad de una suspensión de tejido en cultivos celulares o en animales 
de laboratorio. Estas deben ser utilizadas si la inmunofluorescencia da un re sultado incierto o cuando ésta es 
negativa en el caso de exposición humana conocida.  
i) Prueba de inoculación en ratones  
Se inoculan intracerebralmente de 5 a 10 a ratones de 3 a 4 semanas de edad (12 -14 gramos de peso), o 
una camada de ratones de 2 días d e nacidos. Es recomendable, aunque no estrictamente esencial, el uso de 
ratones libres de patógeno específico (SPF). El inóculo es el sobrenadante clarificado de un 20 por ciento 
(peso/volumen) homogéneo del material del cerebro (corteza, cuerno de Ammon, cerebelo, médula 
oblongada) en una solución isotónica bufferada conteniendo antibióticos. Para reducir el dolor en los animales, 
los ratones deben ser anestesiados cuando sean inoculados. Los ratones jóvenes adulto serán observados 
diariamente por 28 días y cada ratón que muera será examinado para rabia usando inmunofluorescencia 
directa. Para las cepas de calle de rabia en zorros, las muertes debido a la rabia generalmente comienzan  9 
días post -inoculación. Para resultados más rápidos en ratones recién na cidos, es posible revisar un ratón 
bebé por inmunofluorescencia directa en los días 5, 7, 9 y 11 post -inoculación.  
Esta prueba in-vivo es demasiado costosa, particularmente si se utilizan los ratones libres de patógenos 
específicos y debe evitarse en lo po sible. No da resultados rápidos (comparados con las pruebas de 
inoculación in-vitro), pero cuando la prueba es positiva, una gran cantidad de virus puede ser aislada de un 
solo cerebro de ratón con el propósito de identificación de la cepa. Otra ventaja de  esta prueba de baja 
tecnología es que puede fácilmente ponerse en práctica y ser aplicada en situaciones donde no está 
disponible habilidades e instalaciones para otras pruebas (por ejemplo cultivos celulares).  Viernes 20 de mayo de 2011  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
ii) Prueba de cultivos celulares  
Para el dia gnóstico rutinario de rabia se usan las líneas de células de Neuroblastoma, por ejemplo  CCL-
131 en la American Type Culture Collection (ATCC: American Type Culture Collection, 10801 University 
Boulevard, Manassas, Virginia 20110 -2209, United States of Ame rica). Las células se cultivan en el medio 
Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 5 por ciento de suero fetal bovino y se incuban a 36 grados 
centígrados con 5 por ciento de bióxido de carbono. Esta sensibilidad ha sido comparada en células del riñón 
del hámster neonato (BHK -21) (29). Esta línea celular es la adecuada para los aislamientos de cepas de la 
calle sin ningún paso de adaptación, pero debe ser analizada, antes de su empleo, para comprobar su 
susceptibilidad a las variantes de virus predominante s localmente. La presencia del virus de la rabia en las 
células es revelada por inmunofluorescencia. El resultado de la prueba se obtiene por lo menos 18 horas 
después (un ciclo de replicación de virus en las células); generalmente la incubación se prolong a por 48 horas 
(10) y en algunos laboratorios hasta 4 días.  
Esta prueba es tan sensible como la prueba de inoculación en ratones. Una vez que la unidad de cultivo 
celular existe en el laboratorio, esta prueba deberá sustituir la prueba de inoculación en ra tones de esta 
manera se evita el uso de animales vivos, es menos costosa y da resultados más rápidos.  
A menudo es recomendable realizar más de un tipo de prueba en cada muestra, por lo menos cuando 
existe una exposición en humanos.  
d) Otras pruebas de iden tificación  
Las pruebas anteriores pueden completarse en laboratorios especializados (como los laboratorios de 
referencia de la Organización Mundial de Sanidad Animal o de la Organización Mundial de la Salud) usando 
anticuerpos monoclonales, pruebas de ácid o nucle ico, o de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), 
seguida por secuenciación de Acido Desoxirribonucleico (ADN) de áreas genómicas para tipificar el virus (16). 
Esto permite que se haga una distinción entre el virus vacunal y una cepa de virus de campo y posiblemente 
el origen geográfico de esta última.  
2. Pruebas serológicas  
Las pruebas serológicas son raramente utilizadas en la vigilancia epidemiológica, debido a la tardía 
seroconversión y al bajo porcentaje de animales que sobreviven a la enferm edad y por lo tanto que tienen 
anticuerpos post -infección. La inmunización oral en los reservorios de la rabia es el método de elección para 
el control en la fauna silvestre. Para las investigaciones de seguimiento en campañas de vacunación oral, las 
prueb as de neutralización del virus (VN) en cultivos celulares son las preferidas. Sin embargo, si una pobre 
calidad en los sueros son sometidos a la prueba VN los cultivos celulares son sensibles a la citotoxicidad, la 
cual podría conducir a resultados falso p ositivos. Para tales muestras, el uso de un ELISA indirecta con placas 
revestidas de glicoproteína de la rabia, han demostrado ser tan sensibles y específicas como la prueba del VN 
en células (19).  
a) Prueba de neutralización del virus en cultivo celular: Prueba de neutralización del virus por 
anticuerpos fluorescentes (una prueba prescrita para el comercio internacional)  
El principio de la prueba de Neutralización del Virus por Anticuerpos Fluorescentes (FAVN) (18) es la 
neutralización in vitr o de una cant idad constante del virus de la rabia ('Challenge Virus Standard' adaptada a 
cultivos celulares) antes de inocular las células susceptibles al virus de la rabia: células de BHK -21 C13.  
El título del suero es la dilución en la cual 100 por ciento del virus e s neutralizada en 50 por ciento de los 
pozos. Este título es expresado en Unidades Internacionales/mililitro comparándolo con la dilución 
neutralizante de un suero estándar bajo las mismas condiciones experimentales (suero de la OIE de origen 
canino o está ndar de la OMS para inmunoglobulina [humana] No. 2 o ambas). Puede ser usado un control 
interno calibrado contra el control internacional.  
Este método de microplaca utiliza placas de 96 pozos y es una adaptación de la técnica de Smith et al. 
(30), modifica do por Zalan et al. (38) y por Perrin et al. (27). Varias publicaciones (17, 18) han demostrado que 
la prueba de FAVN y la Prueba Rápida de Inhibición de Focos Fluorescentes (RFFIT) dan resultados 
equivalentes.  
● Equipo esencial  
Incubador humedecido a 37 grados centígrados con 5 por ciento de bióxido de carbono; incubador seco a 
37 grados centígrados; gabinete de biocontención; microscopio de fluorescencia apropiado para fluorescencia 
con FITC y equipado con ocul ar x10 y objetivo x10. El aumento global del microscopio varía entre x100 y x125 
debido al aumento adicional de algunos sistemas de epi -fluorescencia.  
● Reactivos y biológicos  
Solución tamponada solución de fosfatos tamponada, pH 7.2, sin Ca2+ y Mg2+, alma cenada a 4 grados 
centígrados;  
Tripsina con etilen diamino tetra acético (EDTA);  
Acetona de alto grado al 80 por ciento (diluida con agua desionizada), almacenada a 4 grados 
centígrados;       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 20 de mayo de 2011  
Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) más 10 por ciento de su ero bovino inactivado por calor;  
Conjugado antirrábico con FITC;  
Células: BHK -21 C13 (ATCC CCL -10); 
Virus: Cepa CVS -11 (ATCC VR 959), la cual está disponible en el ATCC o en el laboratorio de referencia 
de la Organización Mundial de Sanidad Animal para la rabia, Nancy, Francia. Los frascos se almacenan a 
menos 80 grados centígrados;  
Inmunoglobulina antirrábica (humana) estandarizada de la OMS No. 2, 30 Unidades Internacionales por 
ampolleta (National Institute for Biological Standards and Control NIBSC), Bl anche Lane, South Mimms, 
Potters Bar, Hertfordshire EN6 3QG, United Kingdom (reconstituido con 5 mililitros de agua estéril desionizada 
o destilada, almacenados a menos 20 grados centígrados, y diluidos a 0.5 Unidades Internacionales por 
mililitro con agua  desionizada antes de usarse), o preferentemente suero estándar de la OIE de origen canino 
(Laboratorio de Referencia de rabia, Nancy, Francia de la OIE almacenado a menos 20 grados centígrados y 
diluido a 0.5 Unidades Internacionales por mililitro con agu a desionizada estéril o agua destilada según al 
título del lote). Es aconsejable que para el control interno rutinario, los laboratorios utilicen un suero positivo o 
un conjunto de sueros de origen canino que hayan sido calibrados con el Suero Estándar Int ernacional de la 
Organización Mundial de Sanidad Animal;  
Suero control: Conjunto de 10 sueros caninos liofilizados, se almacena a 4 grados centígrados, y se 
reconstituye con 0.5 mililitro de agua estéril desionizada o de agua destilada.  
● Producción de CVS  (Challenge Virus Standar)  
i) Cultivo celular:  Las células BHK -21 C13 (ATCC CCL -10) son usadas para producir el virus CVS (ATCC 
VR 959 CVS -11) se tripsinizan durante la fase rápida de crecimiento, es decir, cuando las células están en 
fase exponencial de c recimiento. Si la confluencia de la capa es c ompleta, un nuevo pasaje debe ha cerse. Las 
células en suspensión no deben agregarse; se usan 2 x 107 células por ca da frasco de cultivo de 75 
centímetros cú bicos. Se colectan las células con un volumen de 20 a 3 0 mililitros de medio de cultivo con 10 
por ciento de suero fetal bovino inactivado por calor.  
ii) Infección de las células:  La multiplicidad de infección (número de partículas infecciosas por célula) es 
ajustada entre 0.1 y 0.5. La botella de cristal que contiene la suspensión de virus/células es incubada por 60 
minutos a 35.5 y 37 grados centígrados. El contenido de la botella se agita suavemente cada 10 a 15 minutos.  
iii) Crecimiento del virus:  La suspensión de virus/células centrifugada a 800 gravedades  por 15 minutos 
y el precipitado se resuspende en el medio de cultivo mezclado con 10 por ciento de suero fetal bovino 
inactivado por calor. El virus es cosechado 2 días después.  
iv) Cosecha y almacenaje:  El sobrenadante es centrifugado a 800 gravedades po r 15 minutos a 4 grados 
centígrados. Si se han utilizado varios frascos, los diversos sobrenadantes centrifugados son mezclados y 
después repartidos en alícuotas y se congelan a menos 80 grados centígrados. El título infectivo de la 
cosecha se establece po r lo menos 3 días después de la congelación.  
● Titulación del virus en TCID50 (Dosis infectiva del 50 por ciento en cultivo de tejidos)  
Este método de titulación utiliza células BHK -21 C13 (ATCC CCL -10) en placas de microtitulación.  
Diversos pasos en este procedimiento pueden ser adaptados según los requisitos de seguridad y a las 
prácticas de funcionamiento del laboratorio, pero lo siguiente no debe ser cambiado:  
● Inoculación de una capa de células de 24 horas;  
● Dilusiones decimales preparadas con 0.9 mi lilitros de diluyente y 0.1 mililitros de suspensión del virus;  
● Seis réplicas de 50 microlitros por dilución;  
● Incubación por 72 horas;  
● Lectura cualitativa (es decir si el pozo es positivo o negativo);  
● En cada sesión de titulación, se titula un vial  de un lote control de virus y este título es integrado en una 
tarjeta control para validar el proceso de titulación;  
● El cálculo por el método gráfico del neoprobit o por el método de Spearman -Kärber.  
i) Suspensión celular:  El día anterior a la titulació n, se prepara una suspensión de células que contengan 
105 células por mililitro en medio de cultivo celular que contenga 10 por ciento de suero fetal bovino inactivado 
por calor y es distribuida en la placa de microtitulación de 96 pozos, con 200 microlitr os por pozo. Las placas 
son después incubadas por 24 horas de 35.5 a 37 grados centígrados con 5 por ciento de bióxido de carbono.  
ii) Dilución del virus:  Las diluciones seriadas son realizadas en tubos de 5 mililitro s usando un medio de 
cultivo celular si n suero fetal bovino como diluyente. Se preparan diluciones de 10-1 a 10-12 (0.9 mililitro de 
diluyente con 0.1 mililitro de la dilución anterior).  
iii) Infección de las células:  El medio de las placas de microtitulación es desechado usando un sistema 
de aspirado. Se distribuye en cada pozo 50 microlitros de cada dilución de virus. Se usan 6 réplicas por cada 
dilución. La placa de microtitulación es después incubada por 1 hora a 35.5 – 37 grados centígrados con 5 por 
ciento de bióxido de carbono. Después se  añaden 200 microlitros de medio de cultivo con 5 por ciento de 
suero fetal bovino.  Viernes 20 de mayo de 2011  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
iv) Incubación:  Incubar por 3 días a 35.5 – 37 grados centígrados en 5 por ciento de bióxido de carbono.  
v) La tinción y cálculo del título:  Se tiñen las células usando inm unofluorescencia, como se detalla a 
continuación. La lectura es cualitativa, cada pozo que muestre fluorescencia específica es considerado como 
positivo. El cálculo del título se hace usando:  
● El método gráfico de neoprobit (2); o  
● La fórmula de Spearman -Kärber:  
logaritmo10 (dilución a punto final) = 
  
x0 = ( Logaritmo10 de la dilución más baja con todos los pozos positivos)  
d = Logaritmo 10 del paso de la dilución, 1 en este caso  
ni = número  de réplicas, 6 en este caso  
ri = número de pozos positivos  
Fig. 1.  Utilización propuesta de las microplacas para la prueba de neutralización del virus por anticuerpos 
fluorescentes. Los pozos a los cuales se les debe añadir sueros sin diluirse llenan con los “50 microlitros” 
indicados. Los pozos a los que se les debe añadir 50 micro litros de dilución de virus está ndar de desafío se 
muestran en sombreado. Las diluciones se expresan en logaritmo base 10.  
      (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 20 de mayo de 2011  
● Procedimiento de la prueba  
i) Las microplacas se usan según el modelo indicado en la figura 1. La placa No. 1 se usa para la titulación 
de CVS (filas 1 a la 4), y para los controles se emplean los sueros caninos control. La placa No. 2 y las 
siguientes s e usan para los sueros que se van a probar.  
ii) El medio se agrega a los pozos como sigue: placa 1, filas 1 a la 4 y pozos A9 a A12: agregue 150 
microlitros por pozo; placa 2 y siguientes, filas 6 y 12: agregue 200 microlitros por pozo; el resto de los poz os: 
agregue 100 microlitros.  
iii) Los sueros a probarse son inactivados por calor durante 30 minutos a 56 grados centígrados. Como se 
indica en la figura 1, se agregan 50 microlitros de cada suero sin diluido a los 4 pozos adyacentes.  
iv) Las diluciones de  sueros se lleva a cabo en las microplacas de la siguiente manera:  
El suero de la Organización Mundial de Sanidad Animal, el suero de OMS, el control interno y el suero 
canino control: con una pipeta multicanal de 50 -200 microlitros, mezcle los primeros po zos de la dilución 
succionando dentro y fuera por lo menos 8 veces, transfiera 50 microlitros de una fila a la siguiente, hasta 
alcanzar la última. Descarte 50 microlitros de la última fila.  
Los sueros problemas (todas las placas): como se señaló antes, tr ansfiera sucesivamente 50 microlitros 
de una fila a la siguiente hasta las filas 5 y 11 (dilución. 10 -2.39). Con una pipeta multicanal transfiera de 5 a 
50 microlitros, transfiera 10 microlitros de las filas 5 y 11 a las filas 6 y 12 respectivamente (de di lución 10 -2.39 
a dilución 10 -4.23). Usando una pipeta multicanal ajustada a 100 microlitros, mezcle las filas 6 y 12 y deseche 
180 microlitros. Después agregue a estas filas 70 microlitros de medio. Este paso final no lleva por sí mismo a 
mayor rendimiento  de la prueba. Para lograr o superar la dilución final recomendada pueden usarse 
procedimientos alternativos. Esto puede requerir modificaciones en la distribución de la placa.  
● Adición del Virus Estándar de Desafío (CVS)  
i) El stock de CVS es guardado en  microtubos de 1 mililitro a menos 80 grados centígrados. Un tubo se 
descongela rápidamente bajo el chorro de agua corriente y se coloca en hielo.  
ii) Se prepara una dilución de este tubo para obtener 100 Dosis Infectantes Tejido de Cultivos al 50 por 
ciento en 50 mililitro s. De esta dilución se agregan 50 microlitros de suero a cada pozo (véase la figura 1). 
Para la titulación del virus se añaden 50 microlitros a los pozos H1 a H4 (placa 1). Después, transfiera 50 
microlitros de una fila a la otra fila (pl aca 1, líneas 1 -4). Deseche los 50 microlitros de la última fila (placa 1, 
pozos A1 a A4). No agregue ningún virus a los pozos A9 a A12 de la placa 1 (controles).  
iii) Incube las microplacas a 37 grados centígrados en una incubadora húmeda con 5 por ciento  de bióxido 
de carbono por 1 hora.  
iv) Adición de células: Tripsinizar un cultivo subconfluente de células BHK -21 de 3 días de edad. 
Resuspenda las células para obtener una suspensión de 4 por 105 células por mililitro en DMEM 
suplementada con 10 por cient o de suero fetal bovino e inactivada por calor. Agregue 50 microlitros de la 
suspensión de células a cada pozo.  
v) Incube las microplacas por 48 horas a 37 grados centígrados en una incubadora húmeda con 5 por 
ciento de bióxido de carbono.  
● Fijación y tin ción 
i) Después de 48 horas del per iodo de incubación, el medio es desechado y las microplacas se lavan una 
vez con solución de fosfatos buferada, pH 7.2, y una vez en acetona al 80 por ciento. Las microplacas son 
después fijadas en acetona al 80 por cient o a temperatura ambiente por 30 minutos (sin tapa) y se secan a 
temperatura ambiente por lo menos 1 hora.  
ii) Agregue a cada pozo 50 microlitros de la dilución de trabajo del conjugado antirrábico con FITC, 
suavemente agite las microplacas e incúbelas a 37  grados centígrados por 30 minutos. Deseche el conjugado 
fluorescente y lave las microplacas un par de veces con solución de fosfatos amortiguada. El exceso de 
solución de fosfatos amortiguada es retirado invirtiendo las microplacas en papel absorbente.  
● Lectura e interpretación de resultados  
i) Se observa la superficie total de cada pozo. La lectura de evaluación es cualitativa (más o menos): si no 
hay fluorescencia en las células se asigna un signo ( –) para el pozo (registro negativo); si existe fluoresc encia 
en las células (una célula o más), se asigna un (+) al pozo (registro positivo).  
ii) Se leen primero los controles. Para las células control, la titulación de CVS, el suero control y los sueros 
estándares (Suero estándar de la OMS y/o suero estándar de la Organización Mundial de Sanidad Animal), 
los títulos son calculados acorde al método gráfico de neoprobit (2) o el método de Spearman -Kärber.  
iii) Los resultados de la titulación de CVS (TCID 50), del suero control (D 50 dosis media) y del positivo 
estándar (Dosis 50) se reportan en una tarjeta de control para cada caso. Los resultados de control de la 
prueba actual se comparan con los resultados de las pruebas control de pruebas anteriores usando el mismo 
lote de control. La prueba se valida si los valo res obtenidos para los tres controles en la prueba actual no son 
estadísticamente diferentes de la media de todos los valores obtenidos en las pruebas anteriores según  esta 
técnica.  Viernes 20 de mayo de 2011  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
iv) El resultado de la prueba corresponde al virus no neutralizado despué s de la incubación con el suero 
de referencia o con el suero problema. Estos títulos son calculados con el método gráfico neoprobit (2) o con 
la fórmula de Spearman -Kärber (37). La comparación del título medido en los sueros probados con el del 
suero posit ivo estándar de título neutralizante conocido permite determinar el título neutralizante de los sueros 
problema en Unidades Internacionales por mililitro.  
b) La Prueba Rápida de Inhibición de Focos Fluorescentes (RFFIT) para determinar la 
neutralización de l virus de la rabia por anticuerpos (rabies virus -neutralising antibody)  (Prueba 
prescrita para comercio internacional)  
● Procedimiento estandarizado (por OMS Laboratory Techniques in Rabies, 1996; [ref. 37])  
● Preparación de la suspensió n de virus de inóculo  
i) Tripsinizar un cultivo de células de neuroblastoma de ratón (MNA) de 3 días de edad en un frasco de 
150 mililitro  (disponible Rabies Laboratory, Division of Viral and Rickettsial Diseases, Centres for Disease 
Control and Prevention, Atlanta, Georgia, USA). Estas células prefieren un medio ácido suplementado con 
vitaminas (34). Puede obtenerse una línea celular simila r (CCL -131) por petición del ATCC.  
ii) Resuspender 3 x 10 7 de células en un tubo cónico de centrífuga de 50 mililitros en 2.7 mililitros de 
medio mínimo esencial de Eagle suplementado con 10 por ciento de suero fetal bovino (EMEM -10). 
iii) Utilizando proce dimientos estándares de seguridad contra la rabia, agregue 1 x 10 7 unidades 
infecciosas del virus de la rabia CVS -11 (ATCC, VR959) y mezcle con el vórtex una vez. Incube las células y 
el virus por 15 minutos a 37 grados centígrados; someter una vez más las  células al vórtex.  
iv) Agregue 10 mililitros EMEM -10, mezclar con vórtex y centrifuge las células a 500 gravedades por  10 
minutos.  
v) Deseche el sobrenadante. Resuspenda las células en 30 mililitros de medio de cultivo y transfiéralas a 
un frasco de 150 mililitros.  
vi) Agite suavemente el frasco para mezclar la suspensión de células y después preparare 3 portaobjetos 
con cámara para cultivo de tejidos con 8 pozos, midiendo con una pipeta 0.2 mililitros de la suspensión celular 
en un pozo de cada portaobje tos. 
vii) Incube el frasco y los portaobjetos a 37 grados centígrados en una incubadora humedecida con 0.5 
por ciento de bióxido de carbono. El frasco debe incubarse como un cultivo cerrado (apretar la tapa).  
viii) A las 20, 40 y 64 horas después de la inf ección, fije con acetona y tiña un portaobjetos usando por la 
técnica de inmunofluorescencia (23) para determinar la infecciosidad del virus. El sobrenadante debe ser 
cosechado 24 horas después de que las células alcanzan 100 por ciento de infecciosidad (t ípicamente 40 
horas después de la infección).  
ix) Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrifugadora de 50 mililitros y centrifuge a 4000 gravedades 
por 10 minutos.  
x) Distribuya el sobrenadante en alícuotas de 0.5 mililitros y almacénelas a menos 70 g rados centígrados.  
● Titulación de la suspensión viral de inóculo  
i) Descongele una alícuota del virus inóculo y prepare diluciones decimales (a partir de 10 -1 a 10 -8) en 
EMEM -10. 
ii) Distribuya 0.1 mililitros de cada dilución del virus en un pozo del port aobjetos con cámara para cultivo 
de tejidos. Agregue a cada pozo 0.2 mililitros de células MNA suspendidas en EMEM -10 (la concentración de 
las células 5 x 10 4 por 0.2 mililitros).  
iii) Mezcle las células y el virus oscilando suavemente el portaobjetos, des pués incú bese a 37 grados 
centígrados en una incubadora humedecida con 0.5 por ciento de bióxido de carbono por 40 horas.  
iv) Fije con acetona y tiña el portaobjetos por la técnica de inmunofluorescencia. La evidencia de la 
infección del virus debe observa rse en la dilución del virus 10 -6, indicando una existencia de virus de al menos 
1 x 10 6 unidades infecciosas por 0.1 mililitros. Prepare suficiente virus inóculo para que no sea necesario 
frecuentes pasajes seriados del virus.  
● Preparación de la suspensi ón de virus stock  
i) Infecte 3 x 10 7 de células de MNA con 1 x 10 7 unidades infecciosas de la preparación del virus inóculo 
(véase arriba).  
ii) Coseche el sobrenadante 24 horas después de que las células alcancen el 100 por ciento de 
infecciosidad (típicam ente 40 horas después de la infección).  
iii) Distribuya el sobrenadante en alícuotas de 0.5 mililitros y almacénelo a menos 70 grados centígrados.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 20 de mayo de 2011  
● Titulación de la suspensión viral stock  
i) Descongele una alícuota del virus inóculo y utilice esto para preparar diluciones decimales (de 10 -1 a  
10-6) en EMEM -10. 
ii) Distribuya 0.1 mililitros de cada dilución del virus en un pozo de un portaobjeto con  cámara para cultivo 
de tejidos con ocho pozos. Agregue a cada pozo 0.2 mililitros de células MNA suspendidas en EMEM -10  (la 
concentración de células 1 x 10 5 por 0.2 mililitros).  
iii) Mezcle las células y la suspensión del virus agitando suavemente el por taobjetos, entonces incube a 37 
grados centígrados en una incubadora humedecida con 0.5 por ciento de bióxido de carbono por 20 horas.  
iv) Fije con acetona y tiña el portaobjetos por la técnica de inmunofluorescencia.  
Cada pozo del portaobjeto con cámara p ara cultivo de tejidos con ocho pozos contiene 25 -50 campos 
microscópicos distintos cuando se observa en la ampliación x160 -200. Una unidad de virus para el RFFIT es 
determinada como la dilución en la cual el 50 por ciento de los campos microscópicos obser vados contienen 
unos o más focos de células infectadas (la dosis de foco -formación, FFD50). La suspensión stock de virus 
debe contener al menos 1 x 10 4 FFD50 por 0.1 mililitros (es decir el pozo de células infectadas con la dilución 
10-4 debe contener al m enos un foco de células infectadas en 50 por ciento de los campos microscópicos 
observados). Una suspensión stock de virus con este título puede después diluirse a 10 -2.3 para obtener un 
virus de desafío 50 FFD 50. 
● Suero de referencia  
Debe incluirse un su ero de referencia estándar nacional o internacional diluido a una potencia de  2.0 
Unidades Internacionales por mililitro en cada prueba. El suero de referencia usado en los Centros para el 
Control y Prevención de Enfermedades, es el primer estándar intern acional de inmunoglobulina antirrábica 
(35), y puede obtenerse del NIBSC. El suero de referencia debe mantenerse en alícuotas congeladas en 
cantidades suficientes para 1 semana de pruebas. También debe prepararse por el laboratorio e incluirse en 
cada prue ba un suero positivo estándar de control diluido a una potencia de 0.1 Unidades Internacionales por 
mililitro y un suero negativo estándar.  
● Sueros problema  
Antes de probarse, las muestras del suero deben calentarse a 56 grados centígrados por 30 minutos para 
inactivar el complemento. Si el suero está congelado, éste debe recalentarse después de descongelarse. Las 
diluciones seriadas de los sueros problema pueden ser preparadas en un portaobjetos con cámara para 
cultivo de tejidos de 8 pozos. El análisis d e las diluciones 1 en 5 y 1 en 50 es suficiente para una evaluación 
rutinaria de eficacia vacunal y pueden hacerse como sigue:  
i) Prepare una dilución 1 en 2.5 agregando 0.1 mililitros de suero inactivado y 0.15 mililitros de EMEM -10 a 
uno de los portaobje tos. Mezcle suavemente oscilando la lámina portaobjetos.  
ii) Transfiera 0.05 mililitros de la dilución 1 en 2.5 a un segundo pozo conteniendo 0.45 mililitros de  
EMEM -10. Deseche todos excepto 0.1 mililitros del pozo que contiene la dilución 1 en 2.5.  
iii) Mezcle el segundo pozo y deseche todo excepto 0.1 mililitros.  
iv) Agregue 0.1 mililitros de la preparación del virus del desafío (que contiene 32 -100 FFD 50) a todas las 
diluciones del suero.  
v) Mezcle e incube a 35 grados centígrados en una incubadora hum edecida con 0.5 por ciento de bióxido 
de carbono por 90 minutos.  
● Adición de células  
i) Durante el peri odo de incubación, tripsí nice un cultivo de células MNA de 3 -5-días.  
ii) Resuspenda las células en EMEM -10 a una concentración final de 1 x 10 5 células por 0.2 mililitros.  
iii) Distribuya 0.2 mililitros de la suspensión de células en cada pozo del portaobjetos e incube a 35 grados 
centígrados en una incubadora humedecida con 0.5 ciento de bióxido de carbono por 20 horas más.  
● Fijación con acetona y tinci ón por inmunofluorescencia  
i) Después de 20 horas, saque los portaobjetos de la incubadora y deseche el medio virtiéndolo sobre una 
solución virucida.  
ii) Lave los portaobjetos una vez en PBS y después fíjelas por 10 minutos a temperatura ambiente en 
aceto na fría (menos 20 grados centígrados).  
iii) Deje secar los portaobjetos por 10 minutos antes de agregar el suero de conjugado antirrábico con 
FITC. El conjugado puede ser preparado en EMEM -10 o PBS; no hay necesidad de adsorber el conjugado 
con papel o cél ulas. La dilución del conjugado debe determinarse por titulación. Los portaobjetos deben 
teñirse durante 20 -30 minutos a 37 grados centígrados y después lavar con PBS y agua destilada, 
respectivamente.  
iv) Observe los portaobjetos en un microscopio de fluo rescencia.  Viernes 20 de mayo de 2011  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
● Cálculo de los títulos de virus neutralizado por anticuerpos  
El virus residual es detectado usando un microscopio estándar de fluorescencia. El título de neutralización 
a punto final del suero se define como el factor de dilución de la dilución más alta del suero en la cual el 50 por 
ciento de los campos microscópicos observados contienen una o más células infectadas (es decir una 
reducción del 97 por ciento del virus inoculado). Este valor puede obtenerse por interpolación matemática. 
Alternativamente, u n 100 por ciento de título neutralizado puede ser determinado registrando la dilución más 
alta del suero en la cual el 100 por ciento del inóculo del desafío se neutraliza y no hay células infectadas en 
los campos observados. Por ambos métodos de titulació n, el título de anticuerpos en el suero problema  (en 
Unidades Internacionales por mililitro) puede ser obtenido por la comparación con el título de la referencia 
nacional incluida en cada prueba. Debe observarse que es también válido realizar la prueba RF FIT usando  
las células BHK -21 en vez de las células del neuroblastoma. Para tal fin se ha publicado un protocolo 
modificado (37).  
c) Neutralización viral en ratones  
El principio de esta prueba es la neutralización in vitro  de una cantidad constante de vir us rábico  (50 LD 50 
[dosis letal al 50 por ciento] por 0.03 mililitros de cepa CVS) variando las cantidades del suero a ser titulado 
durante un paso de incubación de 90 minutos a 37 grados centígrados. La mezcla de virus/suero  (0.03 
mililitros) es inoculado  en el cerebro de ratones de 3 semanas de edad. El título del suero es la dilución final 
del suero en la mezcla del virus/suero que protege al 50 por ciento de los ratones (la mortalidad es 100 por 
ciento en ausencia de neutralización). Este título puede e xpresarse en Unidades Internacionales, 
comparándolo con la dilución que neutraliza un suero estándar bajo mismas condiciones experimentales.  
Para realizar la prueba, descongele una ampolleta de virus de CVS y prepare una suspensión que 
contenga 100 LD 50/0.03 mililitros (considere que será diluida 2 veces por la adición del mismo volumen del 
suero antes de ser inyectado). La cantidad de virus usada realmente durante la prueba (límites permitidos:  
30-300 LD 50/0.03 mililitros) es comprobado titulando 4 diluci ones de la preparación viral, cada una de las 
cuales se inocularán en 5 ratones. Los sueros de prueba se calientan a 56 grados centígrados por 30 minutos 
para inactivar cualquier complemento.  
Se debe incluir un suero estándar para comprobar las condiciones  de titulación. La diferencia máxima 
permitida entre su capacidad neutralizante esperada y la medida durante la titulación es 100.5. La dilución más 
grande no debe neutralizar el virus. El diluyente es el mismo que se usa para la preparación viral.  
A cada dilución de suero se agrega un volumen igual de la preparación viral conteniendo 100 LD 50/0.03 
mililitros. Las mezclas se incuban en un baño de agua a 37 grados centígrados por 90 minutos y después se 
colocan en hielo para reducir la inactivación del virus  debido a la temperatura. La reacción es detenida por la 
inmersión en hielo. Durante la inoculación, los tubos que no se utilizan inmediatamente se guardan en  4 
grados centígrados.  
Para cada dilución, se inoculan 5 ratones intracerebralmente con 0.03 mili litros de la mezcla del 
suero/virus. La mortalidad es registrada durante 21 días después de la inoculación, aunque las muertes que 
ocurren durante los primeros 4 días son observadas como inespecíficas (debido al choque, a la infección, 
etc.). El título de suero puede ser calculado en Unidades Internacionales por la comparación con un suero 
estándar internacional.  
d) Enzimoinmunoensayo ELISA  
Esta prueba de ELISA indirecta permite la detección cualitativa de los anticuerpos de rabia en muestras 
individuales d e suero canino y de gato después de la vacunación. De acuerdo con las recomendaciones de la 
OMS (36), 0.5 Unidades Internacionales por mililitro de anticuerpos antirrábicos es la medida mínima de título 
de anticuerpos considerado para representar un nivel de inmunidad que correlaciona con la capacidad de 
proteger contra una infección de la rabia. Aunque la ELISA indirecta tiene una sensibilidad más baja que el 
FAVN o el RFFIT, puede utilizarse como prueba de investigación rápida (aproximadamente 4 horas), y  que no 
requiere el manejo del virus vivo de la rabia, para determinar si los perros y los gatos vacunados han 
seroconvertido. Debido a la baja sensibilidad de la prueba, los resultados negativos deben confirmarse por 
FAVN o RFFIT.  
La reacción está compues ta por tres pasos:  
1. Cada muestra de sueros problema es colocada en un pozo de una placa de microtítulo cubierta primero 
con los antígenos inactivados del virus de la rabia. Los anticuerpos presentes en la muestra se unen a los 
antígenos virales en la sup erficie del plástico.  
2. Después del lavado, se agrega el conjugado de la proteína A/peroxidase, éste se une a las 
inmunoglobulinas (anticuerpos) previamente capturadas, formando un complejo: (antígeno de la rabia AG) -
(anticuerpo antirrábico Ab) -(proteína A/peroxidasa).  
3. El exceso de conjugado es eliminado por lavado. La enzima unida al complejo es revelada por la adición 
de un substrato que se transforma en un producto coloreado. Después de detener la reacción, se miden las 
densidades ópticas.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 20 de mayo de 2011  
● Preparación del antígeno  
La Cepa de virus rábico G5, 52 Wistar (derivada de la cepa Pasteur) se obtiene en células NIL2 con pocos 
pasajes, originadas en cultivos celulares de embrión del hámster. La cosecha del virus es clarificado para 
eliminar restos c elulares por filtración en gel y la suspensión del virus se inactiva con betapropiolactone. Para 
la reacción en placas se utiliza un stock de antígeno de 4.1 microgramos por mililitro.  
● Reactivos  
(Available from Synbiotics Europe S.A.S., 2 rue Alexander F leming, 69367 Lyon Cedex 07, France.)  
Microplaca con 6 filas de 16 pozos sensibilizados con antígenos de la rabia. Se deben usar en las 4 
semanas después de abrir la bolsa, la cual debe estar cerrada después de cada uso;  
Conjugado (CJ): Proteína A/peroxida sa (concentrado x 10). Diluir 10 veces con el diluyente del conjugado 
(CD) y utilizarlas en el plazo de 24 horas seguidas a la dilución;  
Sustrato de peroxidasa tamponado (PS); 3,3', 5,5' -Tetrametilbenzidina;  
Suero control negativo (N), Suero Libre de Patóg enos Específicos diluidos en Stabilzyme, un estabilizador 
comercial proporcionado por Surmodics Inc., MN 55344 -3523 USA;  
Suero control positivo (P), Suero hiperinmune de caninos vacunados diluidos en Stabilzyme, un 
estabilizador comercial proporcionado por  Surmodics Inc., MN 55344 -3523 USA;  
Diluente de la muestra (SD), PBS tamponado, pH 7.8, inc luyendo 0.28 por ciento de caseí na 
(peso/volumen), (volumen/volumen) Tritón X100 al 0.055 por ciento;  
PEG al 0.55 por ciento (peso/volumen) SDS al 0.056 por ciento ( peso/volumen) PVP al 1 por ciento 
(peso/volumen), Tetronic al 0.42 por ciento (peso/volumen) y Suero bovino inactivado por calor al 1 por ciento 
(volumen/volumen);  
Solución de lavado (W), Tris/NaCl tamponado, pH 7.5, incluyendo Tween 20 al 1 por ciento;  
Diluente del conjugado (CD), Tris tamponado, pH 8;  
Solución de detención (S), Solución de Acido Sulfúrico 4 N + tiomersal al 0.02 por ciento (peso/volumen).  
Los reactivos diluidos deben ser almacenados a 5 grados centígrados más o menos a 3 grados 
centígrado s. Coloque todos los reactivos a temperatura del laboratorio por lo menos 1 hora antes de usarse.  
● Muestras  
La reacción se realiza con sueros individuales inactivados por calor (30 minutos a 56 grados centígrados) 
diluidos a 1 en 100. Es necesario probar las diluciones apropiadas del suero estándar de referencia de la 
Organización Mundial de Sanidad Animal que contiene 6.7 Unidades Internacionales por mililitro (disponible 
en el laboratorio de referencia de la Organización Mundial de Sanidad Animal para ra bia, Nancy, Francia).  
Las muestras de suero deben mantenerse de 5 grados centígrados a más o menos 3 grados centígrados. 
Para conservación prolongada, las muestras de suero deberán congelarse a menos 20 grados centígrados.  
● Pasos preliminares de predilución  
Seguir estrictamente el procedimiento indicado a continuación. Utilizar controles negativos y positivos por 
duplicado en cada prueba y/o para cada placa.  
i) Fijar cuidadosamente la identificación y distribución de los co ntroles y las muestras utilizando el 
protocolo que se señala más abajo.  
ii) Prepare los sueros problema. Las diluciones se realizan con el diluyente de muestras (SD) de modo 
siguiente: Las muestras primero se prediluyen a 1 en 10 en una microplaca en blanc o (10 microlitros de 
muestra en 90 microlitros de SD).  
iii) Para la titulación del suero, debe hacerse un conjunto de 6 diluciones del Suero Estándar de la 
Organización Mundial de Sanidad Animal en un tubo o en una microplaca en blanco con la dilución inic ial 1 en 
10, luego 1 en 30, 1 en 100, 1 en 300, 1 en 1000 hasta la dilución final 1 en 3000. Estas diluciones del suero 
Estándar de la Organización Mundial de Sanidad Animal deben incluirse en cada prueba y/o microplaca con 
una dilución inicial de 1 en 10,  luego 1 en 30, 1 en 100, 1 en 300, 1 en 1000 hasta la dilución final 1 en 3000.  
Se recomienda el siguiente esquema para preparar las diluciones apropiadas:  
Dilución OIE  Preparación  
1 en 10  10 microlitros de Suero Estándar Internacional de la Organización  Mundial de Sanidad 
Animal + 90 microlitros de diluyente de la muestra  
1 en 30  10 microlitros de Suero Estándar Internacional de la Organización Mundial de Sanidad 
Animal + 290 microlitros de diluyente de la muestra  
1 en100  10 microlitros de la dilución 1/10 + 90 microlitros de diluyente de la muestra  
1 en 300  10 microlitros de la dilución 1/30 + 90 microlitros de diluyente de la muestra  
1 en 1000  10 microlitros de la dilución 1/100 + 90 microlitros de diluyente de la muestra  
1 en 3000  10 microlitros d e la dilución 1/300 + 90 microlitros de diluyente de la muestra  
 
Este rango de diluciones del Suero Estándar de la Organización Mundial de Sanidad Animal debe estar 
presente en todas las placas.  Viernes 20 de mayo de 2011  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
● Procedimiento de la prueba  
i) Distribución del control: De posite 90 microlitros de dilu yente de muestra y añada 10 microlitros del 
control negativo en los pozos A1 y A2, y en los pozos B1 y B2. Añada 10 microlitros del control positivo.  
ii) Distribución de muestras y diluciones del suero estándar de la Organizaci ón Mundial de Sanidad 
Animal: Deposite 90 microlitros de diluyente muestra, añada 10 microlitros de la predilución de la muestra 1 en 
10 o de cada una de las diluciones de 1 en 10 a 1 en 3000 en todos los pozos y mezcle cuidadosamente.  
Las diluciones de la  muestra y del suero estándar de la Organización Mundial de Sanidad Animal deben 
probarse por duplicado. Se recomienda la siguiente distribución (reporte final de las diluciones probadas):  
Cuantificación de anticuerpos (dilución final)  
 1 2 3 4 
A N 1 en 1 0 N 1 en 10  S1 1 en 100  S1 1 en 100  
B P 1 en 10  P 1 en 10  S2 1 en 100  S2 1 en 100  
C Organización Mundial de 
Sanidad Animal  
1 en 100  Organización Mundial de 
Sanidad Animal  
1 en 100  S3 1 en 100  S3 1 en 100  
D Organización Mundial de 
Sanidad Animal  
1 en 300  Organización Mundial de 
Sanidad Animal  
1 en 300  S4 1 en 100  S4 1 en 100  
E Organización Mundial de 
Sanidad Animal  
1 en 1000  Organización Mundial de 
Sanidad Animal  
1 en 1000  S5 1 en 100  S5 1 en 100  
F Organización Mundial de 
Sanidad Animal  
1 en 3000  Organi zación Mundial de 
Sanidad Animal  
1 en 3000  S6 1 en 100  S6 1 en 100  
G Organización Mundial de 
Sanidad Animal  
1 en 10000  Organización Mundial de 
Sanidad Animal  
1 en 10000  S7 1 en 100  S7 1 en 100  
H Organización Mundial de 
Sanidad Animal  
1 en 30000  Organizac ión Mundial de 
Sanidad Animal  
1 en 30000  S8 1 en 100  S8 1 en 100  
 
Deben colocarse siempre las filas marcadas sobre el soporte de modo que se pueda utilizar tanto el 
lavador como el lector. Los pozos se cubren con cinta adhesiva cortada a la longitud neces aria en función del 
número de filas utilizadas. Mezclar por agitación manual suave o mediante un agitador de placas.  
iii) Incubar las placas de microtitulación durante 1 hora más o menos 5 minutos a 37 grados centígrados y 
a más o menos 3 grados centígrado s. 
iv) Dilución del reactivo:  
Lavado Tampón: Diluir la solución de lavado concentrada (W) a 1 en 10 con agua destilada o 
desmineralizada.  
Conjugado: Diluir el concentrado (CJ) a 1 en 10 con el diluyente del conjugado (CD); se necesitan 2 
mililitros para un a fila, es decir 20 microlitros de CJ en 1.88 mililitros de CD.  
v) Con cuidado remueva la cinta adhesiva y lave 4 veces.  
vi) Añada 100 microlitros de conjugado diluido a todos los pozos y cúbralos con una tira nueva de cinta 
adhesiva.  
vii) Incube el conjug ado por 1 hora más o menos 5 minutos a 37 grados centígrados, más o menos  a 3 
grados centígrados.  
viii) Con cuidado remueva la cinta adhesiva y lave 4 veces.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 20 de mayo de 2011  
ix) Añada 100 microlitros de sustrato de peroxidasa tamponado a cada pozo (PS). No cubra con cinta  
adhesiva en esta fase. Mezcle suavemente la placa por agitación manual o mediante un agitador de placas 
para asegurar una correcta homogeinización.  
x) Incube por 30 más o menos 5 minutos a temperatura del laboratorio (20 grados centígrados, más o 
menos 5 grados centígrados), y protegida de la luz.  
xi) Añada a cada pozo 50 microlitros de solución de parada (S). Mezcle suavemente la placa por agitación 
manual o mediante un agitador de placas. Asegúrese que no haya burbujas de los pozos. Seque 
cuidadosamente el fondo de los pozos.  
xii) Mida la densidad óptica (OD) b icromáticamente a 450 y 630 nanó metros  o monocromáticamente a 450 
nanó metros (en el espectro amarillo).  
● Cuantificación de anticuerpos: Expresión e Interpretación de resultados  
Cálculo del título usando la curva de regresión.  
i) Calcular el valor medio de la OD para cada muestra problema y cada dilución del suero de la OIE.  
ii) Calcular el valor del logarit mo natural ( ln) de cada Densidad Optica (OD) media y el valor ln de  la 
concentración de anticuerpos rábicos para cada dilución de la Organización Mundial de Sanidad Animal  (a 
partir de 6.7 a 0.0223 Unidades Internacionales/mililitros, sin considerar el f actor de dilución 1 en 100  de la 
prueba).  
iii) Trace el ln de la Densidad Optica (OD) (en coordenadas eje Y) en función del ln (concentración de 
anticuerpos antirrábicos) (en ab scisas eje X) para obtener la curva de referencia para el suero estándar de la  
Organización Mundial de Sanidad Animal.  
iv) Utilizando todos los resultados individuales obtenidos de las diluciones estándar del suero de  la 
Organización Mundial de Sanidad Animal, realice una regresión lineal entre las concentraciones In de la 
concentr ación de anticuerpos antirrábicos (expresadas en unidades ELISA/mililitros) y el ln de la Densidad 
Optica (OD), para establecer el correspondiente modelo matemático:  
In de la concentración de anticuerpos antirrábicos = a + b x In OD 
v) Para cada muestra pr obada, calcule el valor promedio de la Densidad Optica (OD) y después la 
concentración de anticuerpos antirrábicos de la muestra expresada como “unidades equivalentes por mililitros” 
(UE/mililitros), a partir del modelo establecido:  
Concentración de anticu erpos antirrábicos de la muestra (UE/mililitros) = e (a + b x ln OD).  
● Validación de la prueba  
Los resultados de cada prueba corrida (o para cada placa) son válidos:  
● Si la densida d óptica obtenida con el control positivo Densidad Optica Positiva (OD P) es mayor que o 
igual a 0.300;  
● Si la densidad óptica obtenida con el control negativo Densidad Optica Negativa (OD N) es menor que 
0.50 x OD P; y  
● El coeficiente de correlación entre In ODs e ln la concentración de anticuerpos antirrábicos para el suero 
estándar de la Organización Mundial de Sanidad Animal Standard Serum e s mayor que 0.95.  
Ejemplos  
 Control positivo:  __ 
 OD pozo B 1 = 0.610  OD pozo B 2 = 0.690  –> OD P = 0.650  
 Contro l negativo:  __ 
 OD pozo A 1 = 0.190  OD pozo A 2 = 0.210  –> OD N = 0.200  
Muestra 1:  
 OD pozo 1 = 1.790  OD pozo 2 = 1.750  –> OD = 1.770  
Muestra 2:   
 OD pozo 1 = 0.350  OD pozo 2 = 0.390  –> OD = 0.370  
Validación de la prueba.  
OD P igual a 0.650 o mayor que 0.300 y OD N = 0.200 < 0.50 x 0.650 = 0.325, de esta forma la prueba  es 
válida.  Viernes 20 de mayo de 2011  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
● Resultados e interpretación (Titulación cuantitativa de anticuerpos)  
Si el título calculado es mayor o igual a 0.6, se considera que el animal presenta seroconversión después 
de la vacunación.  
Si el título calculado es menor a 0.6, se considera que el an imal no presenta un nivel suficiente de 
anticuerpos. Como la prueba de ELISA es una prueba de ensayo, una prueba confirmatoria por FAVN o 
RFFIT deberá realizarse en las muestras de suero que muestren un título menor a 0.6.  
C. Requerimiento para las vacunas  y los materiales de diagnóstico  
Las vacunas antirrábicas preparadas de la cepa original 1885 de Pasteur y sus cepas derivadas (virus 
Pasteur, virus de desafío estándar (Challenge), Ptman -Moore, entre otras) y de las cepas aisladas 
recientemente (Flury, St reet Alabama Duffering [SAD], Vnukovo y Kelev), protegen contra todas las cepas del 
genotipo 1 aisladas hasta la fecha. Las vacunas convencionales contra el virus de la rabia pueden no 
suministrar una adecuada protección cruzada contra otros lyssavirus; no  existe protección contra el virus 
Mogola (31). Los principios que rigen la preparación de vacunas inactivadas contra la rabia son idénticos para 
las que se usan en humanos o en animales, aunque en las vacunas para uso en animales se puede añadir un 
adyuva nte. 
En los animales, las vacunas vivas también son eficaces por rita oral y se pueden distribuir en cebos para 
inmunizar animales salvajes (o domésticos). También resultan eficaces las vacunas vivas recombinantes  (por 
ejemplo, glicoproteína recombinante del virus de la rabia expresada en poxvirus) (25).  
Las normas para la producción de vacunas veterinarias deben ajustarse a las directrices de la 
Organización Mundial de Sanidad Animal y pueden suplementarse con requisitos nacionales y regionales.  
Se aplica n diferentes estándares a las vacunas veterinarias con virus vivos modificados por pases en 
animales, huevos o cultivos celulares, para reducir su virulencia en el animal, que a las vacunas preparadas 
con virus inactivados. Ambos tipos de vacunas tienen su s ventajas e inconvenientes (5), pero los dos tipos 
pueden utilizarse para inmunizar animales por periodos de entre 1 y 3 años. En algunos países no se aceptan 
las vacunas con virus atenuados. No son adecuados para proteger animales no vacunados previament e que 
se hayan expuesto a la infección (13). La eficacia de un tratamiento con vacuna sola después de la exposición 
solamente se ha demostrado en humanos, pero incluso en estos casos se recomienda administrar 
adicionalmente inmunoglobulina antirrábica.  
Toda manipulación del virus durante la producción y ensayo de las vacunas, debe adaptarse a las estrictas 
precauciones de seguridad especificadas por la Organización Mundial de la Salud (36, 37), la Organización 
Mundial de Sanidad Animal y las directrices y n ormas nacionales.  
1. Control de los inóculos  
a) Característica del inóculo  
Cualquier cepa perteneciente a la cepa del serotipo 1 que demuestre proteger contra los virus naturales de 
la rabia (que se encuentren actualmente en el país donde se va a usar la v acuna). La cepa de virus utilizada 
debe tener propiedades biológicas (patogenicidad) y antigénicas (caracterizadas por anticuerpos 
monoclonales) conocidas. Si es empleada como vacuna viva, el inóculo primario de virus no debe causar 
rabia clínica. Deben pr obarse al menos en 2 animales (preferentemente 5 o 6 por grupo) de cada una de las 
especies a las que va dirigida la vacuna y si fuera posible de cualquier especie que pueda estar en contacto 
con la vacuna o con animales vacunados. Esto se realiza inoculan do en un nervio importante o en sus 
inmediaciones una dosis 10 veces superior al título vírico contenido en una dosis del producto final propuesto. 
Los animales deben observarse por lo menos durante 90 días para cualquier efecto que se pueda atribuir al 
inóculo primario.  
b) Método de cultivo  
Debe prepararse y mantenerse a menos 70 grados centígrados, o a temperatura inferior, un stock de 
células primarias del virus de inóculo, cuyos subcultivos se utilizarán para la producción de vacuna. La 
multiplicación d el virus se comprueba por titulación durante el crecimiento del virus de inóculo.  
c) Validación como vacuna  
Antes que una vacuna sea autorizada, deben establecerse evidencias de su eficacia mediante 
inoculaciones de desafío en los animales vacunados y en a nimales control de cada especie determinada. La 
prueba de desafío debe realizarse después de la vacun ación, al final del periodo en que el fabricante 
manifiesta que se mantiene la inmunidad. La cinética de producción de anticuerpos debe determinarse 
tambié n para establecer la correlación entre el título de anticuerpos y la resistencia al desafío.  
La eficacia de la vacuna producida se determina por estudios con cada especie a la que va dirigida, 
vacunada como se recomendó. La protección al final del periodo de inmunidad es monitoreada por la 
medición de anticuerpos neutralizantes específicos y por el desafío con virus de la rabia. Las condiciones 
experimentales de este desafío deben reflejar las condiciones naturales de la infección, aunque desde un      (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 20 de mayo de 2011  
punto de vista práctico, puede resultar más fácil obtener un 100 por ciento de mortalidad en los animales 
control con una cepa de virus de rabia conocida que con una aislada localmente. En los animales vacunados 
con vacunas inactivadas, el porcentaje de seroconvers ión y el nivel medio de anticuerpos permiten un buen 
pronóstico de sobrevivencia al desafío.  
Debe establecerse la correlación entre potencia, la especie en cuestión y el valor antigénico determinado 
en ratones (ver Sección 4. c) más adelante).  
Para efectos  de autorizar una vacuna, se deben realizar pruebas de seguridad en la especie a la que va 
dirigida. En el caso de las vacunas con virus vivos (incluyendo las vacunas recombinantes) que se utilizan en 
campañas de vacunación oral, las pruebas de seguridad t ambién deben ser realizadas en aquellas otras 
especies que viven en las áreas de vacunación y que podrían estar expuestas a la vacuna (5).  
La estabilidad de la vacuna se determina probando lotes después de un almacenamiento prolongado, 
usualmente de 1 a 2 años. En ocasiones se utiliza un procedimiento de envejecimiento acelerado 
manteniendo la vacuna a 37 grados centígrados durante 1 semana. El tiempo de validez o vencimiento 
manifestado por el fabricante se comprueba por la autoridad nacional. En general e s de 12 a 18 meses para 
las vacunas líquidas y posiblemente de 24 meses para las liofilizadas.  
2. Método de producción  
Cualquiera que sea el método adoptado, se debe prestar una especial atención a la calidad del sustrato. 
Tanto los animal es como los huevo s deben ser de origen Libre de Patógenos Especí ficos y los cultivos 
celulares, tales como la línea celular BHK, deben cumplir con los estándares internacionales de esterilidad  e 
inocuidad.  
a) En animales  
El virus es inoculado intracerebralmente y cuando e l animal muere en las fases terminales de la rabia se 
retira el tejido nervioso. El virus se inactiva por métodos físicos, como irradiación con luz ultravioleta o 
químicos como la adición de fenol o betapropiolactona. Las vacunas deben prepararse en animal es jóvenes 
(ratones, corderos, entre otros) para obtener gran rendimiento vírico y reducir el contenido de mielina en la 
vacuna y otros efectos adversos asociados. En algunos cas os el virus no se inactiva por completo, como por 
ejemplo en las vacunas de tipo Fermi tratadas con fenol, pero tales vacunas no se recomiendan más.  
b) En huevos  
Se inocula una cepa de virus adaptada a huevos, en huevos embrionados de pollo SPF, los cuales  se 
incubarán a 38 grados centígrados por 5 o 6 días. El virus se recoge en forma de tejidos embrionados 
infecciosos y normalmente se liofiliza y se usa como una vacuna viva. Ejemplos de estas vacunas son las que 
contiene el Flury de bajo pasaje en huevo ( Low Egg Passage, LEP) o la cepa variante y la más deseable la de 
alto pasaje en huevo (High Egg Passage,  HEP), la cual es más segura para especies animales como el gato.  
c) En cultivos celulares  
Los cultivos celulares son infectados con cepas de virus de l a rabia adaptadas al cultivo celular y se 
incuban a 35 o 36 grados centígrados. Estos pueden ser usados como vacunas de virus vivo (como las 
vacunas Flury y SAD) o como vacunas inactivadas después de la adición de fenol (vacuna Semple) o 
cualquier otro com puesto, como la betapropiolactona.  
Los cultivos celulares pueden utilizarse para obtener virus vectores (por ejemplo poxvirus) que lleven el 
gen que codifica la expresión de la glicoproteína del virus de la rabia (25).  
Durante la producción se controla la multiplicación de los virus en uno de los sustratos antes mencionados 
y se recoge el virus al tiempo más apropiado, usualmente de 4 a 6 días después de la inoculación en los 
animales, los huevos o cultivos celulares. El virus obtenido se suspende en una so lución tamponada a una 
dilución que provoque una antigenicidad óptima. Si se requiere, la suspensión se inactiva o liofiliza. Se 
recomienda un adyuvante para vacunas con virus inactivados, así como para otros antígenos de la vacuna 
que puedan incorporarse a vacunas polivalentes.  
3. Control del proceso  
Este consiste en el seguimiento del crecimiento viral para obtener un título óptimo y asegurar la ausencia 
de contaminación microbiana indeseable.  
En las vacunas con virus vivo, debe establecerse la cinética d el crecimiento viral para asegurar un título 
final de virus que se correlacione con la protección deseable de las especies concretas.  
En vacunas con virus inactivados, deben evaluarse las propiedades inmunogénicas del producto final por 
técnicas in vitro  (por ejemplo ELISA, inmunodifusión en agar de gel, pruebas de unión -anticuerpo o tinción de 
células infectadas). Estas estimaciones indicarán el mejor tiempo para recoger los virus de los cultivos 
celulares.  Viernes 20 de mayo de 2011  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
4. Control de lotes  
a) Esterilidad  
Las pruebas de  esterilidad y ausencia de contaminación de materiales biológicos, son las especificadas 
por la Organización Mundial de Sanidad Animal.  
b) Inocuidad  
Las pruebas de inocuidad de los lotes de vacunas con virus inactivados se llevan a cabo mediante 
inoculació n en cultivos celulares o intracerebralmente en ratones para detectar virus viables. Para vacunas 
antirrábicas vivas, debe realizarse una prueba de seguridad adecuada para cada lote de vacuna en la especie 
hospedadora concreta. Por lo menos 3 y preferentem ente 5 o 6 animales de cada especie hospedadora en 
cuestión deben recibir una dosis equivalente a 10 veces la dosis de campo recomendada por la ruta normal de 
administración. Los animales deben ser observados durante 90 días para detectar reacciones atribu ibles  a la 
vacuna.  
c) Potencia  
La cantidad de virus presente en vacunas vivas atenuadas y en las recombinantes se determina por 
titulación. Una vez establecida una correlación entre la actividad de la vacuna en la especie a la que va 
dirigida y los título s virales, las titulaciones representan unos indicadores fiables de la eficacia de la vacuna. 
Esto se realiza usando cultivos celulares o por inoculación intracerebral de ratones lactantes (en ratones sólo 
es posible con unos cuantos virus atenuados). Las vacunas recombinantes deben controlarse para la 
expresión de la proteína de la rabia hasta asegurar que la estabilidad de la expresión se mantiene en el 
proceso de producción. El título del vector puede usarse entonces como un indicador fiable de la eficac ia  de 
la vacuna.  
Para las vacunas con virus inactivados, la correlación entre la potencia en la especie a la que van dirigidas 
y el valor antigénico estimado en ratones representa un indicador fiable de la actividad de la vacuna. En los 
Estados Unidos la potencia de la vacuna se establece por la prueba de NIH (Nacional Instututes of Health). En 
otras partes tiene gran aceptación la prueba de la Farmacopea Europea.  
De acuerdo a la Farmacopea Europea (20) se inoculan grupos de al menos 10 ratones de 3 a 4 se manas 
de edad, con dosis decrecientes únicas de vacuna o con dosis separadas por 1 semana, según la prueba del 
NIH (37). Se compara un número suficiente de diluciones para determinar la dilución a la que el 50 por ciento 
de los ratones se protegen contra u na inoculación intracerebral de desafío 14 días después (20, 37).  
Para la calibración de estándares nacionales existe una vacuna internacional estándar de la Organización 
Mundial de la Salud, de modo que los resultados de la prueba de antigenicidad se pued en expresar en 
Unidades Internacionales (UI). La prueba no es válida a menos que:  
i) Tanto para la vacuna examinada y la preparación estándar, la PD 50 (dosis de protección al 50 por 
ciento) se encuentre entre la mayor y la menor dosis dada a los ratones.  
ii) La titulación de la suspensió n del virus de desafío muestre que 0.03 mililitros de la suspensión contenía 
10 Dosis Letales 50. La dosis de desafío debe estar entre 12 a 50 Dosis Letales 50 para una prueba válida.  
iii) El intervalo de confianza (p=0.95) pa ra la prueba no debe ser menor de 25 por ciento ni superior al 400 
por ciento de la potencia estimada: el análisis estadístico debe mostrar una notable pendiente sin 
desviaciones importantes de la linealidad o paralelismo de las líneas dosis -respuesta.  
La vacuna supera la prueba si la potencia estimada es superior a 1 Unidad Internacional por dosis o la 
potencia demostrada en la prueba de duración de la inmunidad para autorizar el producto es la dosis prescrita 
más pequeña.  
También se puede utilizar una pru eba simplificada a efectos de anticipar qué vacunas es probable que 
tengan un valor antigénico mayor o igual a 1 Unidad Internacional por dosis (4). Esta prueba se emplea como 
prueba de investigación aproximada para reducir el número de ratones utilizados en las pruebas de control de 
la potencia de la vacuna.  
d) Duración de la inmunidad  
La duración de la inmunidad debe ser establecida por el producto autorizado, en la especie a la que va 
dirigida, con un protocolo de vacunación definido. Después de esto, no  se prueba cada lote (ver Sección 4. c) 
anterior).  
e) Estabilidad  
Debe comprobarse por pruebas adecuadas el vencimiento (la caducidad) que se establece. Estos 
experimentos incluyen pruebas biológicas y de estabilidad físico -química y deben realizarse sobre  un número 
suficiente de lotes de vacuna mantenidos en las condiciones recomendadas.  
La termoestabilidad de las vacunas con virus vivos en forma líquida suele ser baja. En las vacunas 
liofilizadas con virus inactivados la estabilidad suele garantizarse por  2 años a 4 grados centígrados.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 20 de mayo de 2011  
f) Conservadores  
Las vacunas con virus inactivados pueden tener conservantes (formalina, mertiolato). La naturaleza  y 
cantidad de dichos conservadores debe cumplir las normas de control nacionales.  
5. Pruebas sobre el produ cto final  
a) Inocuidad  
Ver Sección C. 4 b).  
b) Potencia  
Ver Sección C. 4 c).  
Referencias  
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Microbiol. Infect. Dis., 5, 369 -376. 
2. Aubert M.F.A. (1982). Une  méthode simple de calcul des titres des suspensions virales, vaccinales 
ou séroneutralisantes: la méthode graphique. (A simple method for calculating titres of virus, vaccine 
or serum -neutralising suspensions: the graphic method.) Rev. sci. tech. Off. int . Epiz., 1, 828 -833. 
3. Aubert M.F.A. (1992). Practical significance of rabies antibodies in cats and dogs. Rev. sci. tech. Off. 
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