中华人民共和国国家标准  
 
GB 5009.139 —201x 
 
  
中华人民共和国卫生部    发布 xxxx -xx-xx发布  
 xxxx -xx-xx实施  
 食品安全国家标准  
饮料中咖啡因的测定  
 GB 5009.139—201x 
I 前    言 
本标准代替 GB/T 5009.139 -2003《饮料中咖啡因的测定》 。 
本标准与 GB/T 5009.139 -2003相比，主要变化如下：  
——将原标准第二法  高效液相色谱法  改为第一法 ； 
——将原标准第一法  紫外分光光度法  改为第二法 ； 
——第一法增加试样分类；  
——第一法修改试样处理条件；  
——第一法修改检出限，增加定量限；  
——第一法修改色谱条件；  
——第二法扩大线性范围；  
——第二法增加结果有效数字 。 
本标准中附录 A为资料性附录 。 
本标准所代替标准的历次版本发布情 况为： 
—— GB/T 5009.139 -2003  GB 5009.139—201x 
1 食品安全国家标准  
饮料中咖啡因的测定  
1 范围 
本标准规定了 可乐型饮料， 咖啡、茶叶及其制品中咖啡因含量的测定方法 —高效液相色谱法和紫
外分光光度法 。 
本标准适用于 可乐型饮料， 咖啡、茶叶及其制 品中咖啡因含量的测定 。 
第一法 高效液相色谱 法 
2 原理 
试样经热水提取、氧化镁净化后，经 C18色谱柱分离，用 紫外检测器检测，外标法定量 。 
3 试剂和材料  
除非另有说明， 本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 
3.1  试剂 
氧化镁（ MgO）。 
     三氯乙酸(CCl 3COOH)。 
   甲醇（CH3OH）：色谱纯 。 
3.2  试剂配制 
     三氯乙酸溶液（ 10g/L）：称取 1g三氯乙酸（ 4.2）于100mL容量瓶中，用水定容至刻度 。 
3.3  标准品 
     咖啡因标准品（ C8H10N4O2，CAS号：58-08-2）：纯度≥99%。 
3.4  标准溶液 配制 
  咖啡因标准储备液（ 2.0mg/mL ）：准确称取咖啡因标准品 20.0mg于10mL容量瓶中，用甲醇溶解
定容。放置于 4℃冰箱可保存半年。 
  咖啡因标准中间液（ 200μg/mL）：准确吸取 5.0mL咖啡因标准储备液（ 4.5.1）于50mL容量瓶中，
用水定容。放置于 4℃冰箱可保存一个月 。    
  咖啡因标准 曲线工作液：分别吸取咖啡因标准中间液（ 4.5.2）0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL、
10.0 mL至10 mL容量瓶中，用水定容。该标准系列浓度分别为 0.00μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、
100μg/mL、200μg/mL。临用现配。  GB 5009.139—201x 
2 4 仪器和设备  
4.1  高效液相色谱仪，带紫外检测器或二极管阵列检测器。  
4.2  天平：感量为 0.1mg。 
4.3  水浴锅。  
4.3  超声波清洗器。  
4.4  0.45 μm微孔水相滤膜。  
5  分析步骤  
5.1  试样制备   
5.1.1可乐型饮料  
5.1.1.1 脱气：试样用超声清洗器在 40℃下超声 5min. 
5.1.1.2 净化：称取5.000g样品，加水定容至 5mL，摇匀， 加入0.5g氧化镁（ 4.1），振摇，静置，取
上清液经微孔滤膜（ 5.4）过滤，备用。  
5.1.2 不含乳的咖啡及茶叶液体制品 ：称取5.000g样品， 加水定容至 5mL， 摇匀，加入0.5g氧化镁 （4.1），
振摇，静置，取上清液经微孔滤膜（ 5.4）过滤， 备用。 
5.1.3 含乳的咖啡及茶 叶液体制品 ：称取1.000g 样品，加入三氯乙酸溶液（ 4.3）摇匀，定容至 10mL，
静置，沉降蛋白，取上清液经微孔滤膜（ 5.4）过滤，备用。  
5.1.4 咖啡、茶叶及其固体制 品：称取1.000g 经粉碎低于 30目的均匀样品于 250mL容量瓶中，加入约
200mL水，沸水浴 30min，不时振摇， 取出流水冷却 1min，加入 5g氧化镁（ 4.1），振摇，再放入沸水
浴20min，取出容量瓶，冷却至室温，加水定容至刻度，摇匀，静置，取上清液经微孔滤膜（ 5.4）过
滤，备用。  
5.2  仪器参考条件  
     色谱柱： C18柱（粒径 5μm,150mm×3.9mm）或同等性能的色谱柱。  
     流动相：甲醇 +水=24+76. 
     流速：1.0mL/min 。 
     检测波长： 272nm。 
     柱温：25℃。 
     进样量： 10μL。 
5.3  标准曲线的制作  
将标准系列工作液分别注入 液相色谱 仪中，测定相应的 峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标 ，
以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。  
5.4   试样溶液的测定  
将试样溶液注入 液相色谱 仪中，以保留时间定性，同时 记录峰面积 ，根据标准曲线得到待测 液中
咖啡因的浓度，平行测定次数不少于两次。  
试样溶液 响应值若超出线性范围，应稀释后再进样分析。  
6  分析结果的表述    GB 5009.139—201x 
3 试样中咖啡因含量按公式（ 1）计算                        
                  
1000
1000cVXm  …………………………………… （1） 
式中： 
X——试样中咖啡因的含量， 单位为毫克每公斤（ mg/kg）； 
c——  试样溶液中咖啡因的质量浓度，单位为微克每毫升 （μg/mL）； 
V——被测试样总体积，单位为毫升（ mL）； 
m——称取试样的质量，单位为克（ g）。 
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果 保留三位有效数字 。 
7 精密度 
可乐型饮料： 在重复性条件下获得的两次独立测定结果 的绝对差值不得超过算术平均值的 5 %；
咖啡、茶叶及其制品： 在重复性条件下获得的两次独立测定结果 的绝对差值不得超过算术平均值的
10 %。 
8 其他 
本方法线性范围 为220ng/mL至439μg/mL。检出限：以3倍基线噪音信号确定检出限 0.7ng；可乐、
不含乳的 咖啡及茶叶液体制品 检出限为 0.07mg/kg ，定量限为 0.2mg/ kg；以含乳咖啡及茶 叶液体制品取
样量 1g，确定检出限为 0.7mg/ kg，定量限为 2.0mg/L；以咖啡、茶叶及其固体制 品取样量 1g，确定检出
限为 18mg/kg，定量限为 54mg/kg。 
 
第二法 紫外分光光度法  
9  原理 
试样经热水提取、净化后，因 咖啡因的三氯甲烷溶液在 276.5nm波长下有最大吸收，其吸收值 的
大小与咖啡因浓度成正比，从而可进行定量。  
10  试剂和材料  
除非另有说明， 本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的三级水。 
10.1  试剂 
无水硫酸钠（ Na2SO4）。 
    三氯甲烷 (CHCl 3)：使用前重新蒸馏。  
    高锰酸钾 (KMnO 4)。 
    无水亚硫酸钠（ Na2SO3）。 GB 5009.139—201x 
4     硫氰酸钾（ KSCN）。 
    磷酸(H3PO4)。 
    氢氧化钠 (NaOH)。 
    醋酸锌（ Zn(CH 3COO) 2·2H2O）。 
    亚铁氰化钾（ K4Fe(CN) 6·3H2O）。 
10.2 试剂配制  
高锰酸钾溶液 (15g/L)：称取1.5g高锰酸钾，用水溶解并稀释至 100mL。 
亚硫酸钠和硫氰酸钾混合溶液 ：称取10g无水亚硫酸钠，用水溶解并稀释至 100mL。另取10g硫氰酸
钾，用水溶解并稀释至 100mL，然后二者均匀混合。  
磷酸溶液 (15%)：吸取15mL磷酸置于 100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。  
氢氧化钠溶液 (200g/L) ：称取20g氢氧化钠，用水溶解，冷却后稀释至 100mL。 
醋酸锌溶液 (200g/L) ：称取20g醋酸锌加入 3mL冰乙酸，加水溶解并稀释至 100mL。 
    亚铁氰化钾溶液 (100g/L) ：称取10g亚铁氰化钾用水溶解并稀释至 100mL。 
10.3 标准品    
    咖啡因标准品（ C8H10N4O2，CAS号：58-08-2）：纯度≥99%。 
10.4 标准溶液配制  
    咖啡因标准储备液 （0.5mg/mL ）：根据咖啡因标准品的含量用重蒸三氯甲烷配制成每毫升相当于
0.5mg咖啡因的溶液，置于 4℃冰箱中保存。  
11  仪器 
紫外分光光度计。  
12  分析步骤  
12.1 试样的处理   
12.1.1  可乐型饮料： 在 250mL的分液漏斗中， 准确移入 10.0g～20.0g经超声脱气后的均匀可乐型饮料
试样，加入 5mL高锰酸钾溶液 （11.11），摇匀，静置 5min，加入混合溶液 （11.12）10mL，摇匀，加入
磷酸溶液 （11.13）1mL，摇匀，加入 氢氧化钠溶液 （11.14）1mL，摇匀，加入 50mL重蒸三氯甲烷。振
摇100次，静止分层。收集三氯甲烷。水层再加入 40mL重蒸三氯甲烷，振摇 100次，静置分层。合并二
次三氯甲烷萃取液，并用重蒸三氯甲烷定容至 100mL，摇匀，备用 。 
12.1.2  咖啡、茶叶及其固体 制品：在100mL烧杯中称取经粉碎成低于 30目的均匀试样 0.5g～2.0g，加
入80mL沸水， 加盖， 摇匀， 浸泡 2h， 然后将浸出液全部移入 100mL容量瓶中， 加入 2mL醋酸锌溶液 （11.15），
摇匀，加入2mL 亚铁氰化钾溶液 （11.16），摇匀，用水定容至 100mL，摇匀，静置沉淀，过滤。取滤
液5.0mL～20.0mL按13.1.1操作进行，制备成 100mL三氯甲烷溶液，备用。  GB 5009.139—201x 
5 12.1.3  咖啡或茶叶的液体制品 ：在100mL容量瓶中准确移入 10.0g～20.0g均匀试样，加入 2mL醋酸锌
溶液（11.15），摇匀，加入 2mL 亚铁氰化钾溶液 （11.16），摇匀，用水定容至 100mL，摇匀，静置沉
淀，过滤。取滤液 5.0mL～20.0mL按13.1.1操作进行，制备成 100mL三氯甲烷 溶液，备用。  
12.2  标准曲线的绘制  
从0.5mg/mL 的咖啡因标准储备液中，用重蒸三氯甲烷配制成浓度分别为 0、5、10、15、20、30μ
g/mL标准系列，以 0μg/mL作参比管，调节零点，用 1cm比色杯于 276.5nm下测量吸光度，作吸光度 -咖
啡因浓度的标准曲线或求出直线回归方程。  
12.3  测定 
在25mL具塞试管中，加入 5g无水硫酸钠，倒入 20mL试样的三氯甲烷制备液，摇匀，静置。将澄清
的三氯甲烷 制备液用1cm比色杯于 276.5nm测出其吸光度，根据标准曲线（直线回归方程）求出样品的
吸光度相当 于咖啡因的浓度 c（μg/mL）。同时用重蒸三氯甲烷作试剂空白。  
13  结果计算  
试样中咖啡因含量按 下列公式计算：  
                           
0
1( ) 100 1000
1000ccXm  …………………………………… （1） 
 
   
0
2( ) 100 100 1000
1000ccXVm    …………………………………… （2） 
 
式中： 
X1——可乐型饮料中咖啡因含量 ，单位为毫克每千克（mg/kg）； 
X2 ——咖啡、茶叶及其 制品中咖啡因含量，单位为毫克每 千克（mg/k g）； 
C——试样吸光 度相当于咖啡因浓度，单位为微克每毫升（ μg/mL）； 
C0——试剂空白吸光度相当于咖啡因浓度，单位为微克每毫升（ μg/mL）； 
m——称取试样的质量，单位为克（ g）； 
V——移取试样处理后水溶液的体积，单位为毫升（ mL）。 
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果 保留三位有效数字 。 
14  精密度 
可乐型饮料：在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 5%；咖
啡、茶叶及其制品：在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 15%。 
15  其他 
检出限：可乐型饮料为 3mg/kg；咖啡、茶叶及其固体制品为 50mg/kg；咖啡、茶叶的液体制品为
5mg/kg。（本方法线型范围 为0.0-30.0μg/mL,定量限：可乐型饮料为 9mg/kg；咖啡、茶叶及其固体制
品为150mg/kg；咖啡、茶叶的液体制品为 15mg/kg）。  
 
 GB 5009.139—201x 
6 附录A 
（资料性附录）  
咖啡因色谱图  
A.1咖啡因标准溶液的色谱图  
             
AU
0.000.020.040.060.08
分钟1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00咖啡因  - 6.263
咖啡因标准色谱图 A.1 
A.2可乐样品的色谱图  
AU
0.000.050.100.150.200.25
分钟1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00咖啡因  - 6.383
可乐样品的色谱图 A.2 
A.3茶饮料样品的色谱图  
AU
0.000.050.100.150.200.25
分钟1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00咖啡因  - 6.382
 
茶饮料样品的色谱图 A.3 GB 5009.139—201x 
7 A.4咖啡奶样品的色谱图  
AU
0.000.020.040.060.080.100.120.14
分钟1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00咖啡因  - 6.242
 
咖啡奶样品的色谱图 A.4 
 
A.5茶叶样品的色谱图  
AU
0.000.020.040.060.08
分钟1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00咖啡因  - 6.368
 
茶叶样品的色谱图 A.5 
A.6咖啡样品的色谱图  
AU
0.0000.0100.0200.0300.0400.0500.0600.070
分钟1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00咖啡因  - 6.382
 
咖啡样品的色谱图 A.6