Viernes 4 de septiembre de 2009 DIARIO OFICIAL (Seg unda Sección)      
SECRETARIA DE SALUD 
NORMA Oficial Mexicana NOM-244-SSA1-2008, Equipos y  sustancias germicidas para tratamiento doméstico d e 
agua. Requisitos sanitarios. 
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice : Estados Unidos Mexicanos.- Secretaría de Salud. 
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-244-SSA1-2008, EQUIPOS Y  SUSTANCIAS GERMICIDAS PARA TRATAMIENTO 
DOMESTICO DE AGUA. REQUISITOS SANITARIOS. 
MIGUEL ANGEL TOSCANO VELASCO, Comisionado Federal p ara la Protección contra Riesgos 
Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacio nal de Normalización de Regulación y Fomento Sanita rio, 
con fundamento en los artículos 39 fracción XXI de la Ley Orgánica de la Administración Pública Federa l; 4 de 
la Ley Federal de Procedimiento Administrativo; 3 f racción XXIV, 13 apartado A, fracciones I y II, 17 bis 
fracciones II y III, 118 fracción II, 119 fracción II, 194 fracción I, 197, 199, 201, 210 y 214 de la Ley General de 
Salud; 38 fracción II, 40 fracciones I, II, XI y XI I, 41, 43 y 47 fracciones III y IV de la Ley Federa l sobre 
Metrología y Normalización; 28 del Reglamento de la  Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 167 
fracción XI, 214 fracciones IV y V y 227 del Reglam ento de la Ley General de Salud en Materia de Contr ol 
Sanitario de Actividades, Establecimientos, Product os y Servicios; 2. literal C fracción X del Reglame nto 
Interior de la Secretaría de Salud y 3 fracción I i nciso O, fracción II y 10 fracciones IV y VIII del Reglamento de 
la Comisión Federal para la Protección contra Riesg os Sanitarios, y 
CONSIDERANDO 
Que en cumplimiento a lo previsto en el artículo 46  fracción I de la Ley Federal sobre Metrología y 
Normalización, el Subcomité de Salud Ambiental pres entó en el año de 2005 al Comité Consultivo Naciona l de 
Normalización de Regulación y Fomento Sanitario el anteproyecto de Norma Oficial Mexicana. 
Que con fecha 2 de julio de 2008, en cumplimiento d el acuerdo del Comité y lo previsto en el artículo 47 
fracción I de la Ley Federal sobre Metrología y Nor malización, se publicó el Proyecto de Norma Oficial  
Mexicana PROY-NOM-244-SSA1-2005, Equipos y sustanci as germicidas para tratamiento doméstico de 
agua. Requisitos sanitarios, a efecto de que dentro  los sesenta días naturales posteriores a dicha pub licación, 
los interesados presentaran sus comentarios al Comi té Consultivo Nacional de Normalización de Regulaci ón y 
Fomento Sanitario. 
Que con fecha previa, fueron publicadas en el Diari o Oficial de la Federación, las respuestas a los 
comentarios recibidos por el mencionado Comité, en los términos del artículo 47 fracción III de la Ley  Federal 
sobre Metrología y Normalización. 
Que en atención a las anteriores consideraciones, c ontando con la aprobación del Comité Consultivo 
Nacional de Normalización de Regulación y Fomento S anitario, se expide la siguiente: 
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-244-SSA1-2008, EQUIPOS Y  SUSTANCIAS GERMICIDAS PARA 
TRATAMIENTO DOMESTICO DE AGUA. REQUISITOS SANITARIO S 
PREFACIO 
En la elaboración de esta Norma Oficial Mexicana pa rticiparon las unidades administrativas e instituci ones 
siguientes: 
SECRETARIA DE SALUD 
Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios 
Centro Nacional de Vigilancia Epidemiológica y Cont rol de Enfermedades 
COMISION NACIONAL DEL AGUA 
Subdirección General Técnica 
Subdirección General de Infraestructura Hidráulica y Urbana 
INSTITUTO MEXICANO DE TECNOLOGIA DEL AGUA 
Coordinación de Tratamiento y Calidad de Agua 
FEDERACION MEXICANA DE INGENIERIA SANITARIA Y CIENC IAS AMBIENTALES, A.C. 
DIAFRA, S.A. DE C.V. 
INSTAPURA, S.A. DE C.V.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 4 de  septiembre de 2009 
LION BUSSINESS, S.A. DE C.V. 
MERCK DE MEXICO, S.A. DE C.V. 
INDICE 
0.  Introducción 
1.  Objetivo 
2.  Campo de aplicación 
3.  Referencias 
4. Definiciones 
5.  Símbolos y abreviaturas 
6.  Especificaciones 
7. Procedimiento para la evaluación de la conformidad 
8.  Concordancia con normas internacionales y mexicana s 
9.  Bibliografía 
10.  Observancia de la norma 
11.  Vigencia 
 Apéndice Normativo A 
 Apéndice Informativo A 
 Apéndice Informativo B 
0. Introducción 
El objetivo de los programas de abastecimiento de a gua para uso y consumo humano es asegurar que 
toda la población alcance una dotación adecuada de agua de buena calidad. En México, se continúa este 
esfuerzo; sin embargo, no se ha alcanzado la cobert ura total, por lo que un cierto número de usuarios recurre 
a fuentes alternativas y métodos intradomiciliarios  para subsanar deficiencias de la calidad del agua para uso 
o consumo humano. 
Los métodos intradomiciliarios o domésticos para pu rificar el agua de consumo humano, consisten en el 
uso de equipos de tratamiento y aplicación de susta ncias germicidas, orientados fundamentalmente al as pecto 
bacteriológico, considerado como de riesgo inmediat o a la salud y, en casos específicos, a la depuraci ón de 
características físicas y/o químicas. 
1. Objetivo 
Esta Norma Oficial Mexicana establece los requisito s sanitarios y características que deben cumplir lo s 
equipos y sustancias germicidas para tratamiento do méstico de agua. 
2. Campo de aplicación 
Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia oblig atoria en el territorio nacional para las personas 
físicas o morales que se dediquen al proceso e impo rtación de los equipos y sustancias germicidas a qu e se 
refiere esta Norma. 
3. Referencias 
Para la correcta aplicación de esta Norma Oficial M exicana es necesario consultar las siguientes: 
3.1  NOM-008-SCFI-2002. Sistema general de unidades de medida. 
3.2  NOM-092-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Método para  la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa. 
3.3  NOM-110-SSA1-1994. Bienes y servicios. Preparación  y dilución de muestras de alimentos para su 
análisis microbiológico. 
3.4  NOM-112-SSA1-1994. Bienes y servicios. Determinaci ón de bacterias coliformes. Técnica del número 
más probable. 
3.5  Modificación a la NOM-127-SSA1-1994. Salud ambient al. Agua para uso y consumo humano. Límites 
permisibles de calidad y tratamientos a que debe so meterse el agua para su potabilización. 
3.6  NOM-201-SSA1-2002. Productos y servicios. Agua y h ielo para consumo humano, envasados y a 
granel. Especificaciones sanitarias. 
3.7  NOM-213-SSA1-2002. Productos y servicios. Producto s cárnicos procesados. Especificaciones 
sanitarias. Métodos de prueba. Viernes 4 de septiembre de 2009 DIARIO OFICIAL (Seg unda Sección)      
3.8  NOM-230-SSA1-2002. Salud ambiental. Agua para uso y consumo humano, requisitos sanitarios que 
se deben cumplir en los sistemas de abastecimiento públicos y privados durante el manejo del agua. 
Procedimientos sanitarios para el muestreo, publica da en el Diario Oficial de la Federación el 1 de ag osto de 
2003. 
4. Definiciones 
Para efectos de esta Norma aparte de las definicion es dadas en la Ley General de Salud, Ley General de l 
Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente y la Ley de Aguas Nacionales se entiende por: 
4.1  Agua para uso y consumo humano,  al agua que no contiene contaminantes objetables, ya sean 
químicos o agentes infecciosos y que no causa efect os nocivos para la salud. También se denomina como 
agua potable. 
4.2  Bactericida,  a la sustancia o medio, que elimina o destruye a l as bacterias. 
4.3  Bacteriostático,  a la sustancia o medio que tiene la capacidad de i nhibir el crecimiento de bacterias, 
sin eliminarlas o destruirlas. 
4.4  Caducidad, al tiempo que es útil la sustancia germicida conser vando su poder activo. 
4.5  Equipo de tratamiento de agua de tipo doméstico,  al que se instala en punto de uso domiciliario de 
agua para beber o cocinar, con capacidad máxima de 12 litros por minuto con el propósito de retener, e liminar 
o inhibir los microorganismos presentes en ella. 
4.6  Envase primario,  a los elementos del sistema de envase que están en  contacto directo con el insumo. 
4.7  Envase secundario,  a los componentes que forman parte del empaque en el cual se comercializa el 
insumo y no está en contacto directo con él. 
4.8  Germicida,  al agente químico, que destruye microorganismos es pecialmente patógenos, lo que no 
necesariamente incluye la capacidad de destrucción de esporas. 
4.9  Método de prueba,  al procedimiento analítico utilizado en el laborat orio para comprobar que un 
producto satisface las especificaciones que estable ce la norma. 
4.10  Mesófilos aerobios,  bacterias viables que determinan el grado de expos ición del agua a la 
contaminación por microorganismos cuya temperatura óptima de crecimiento se encuentra entre los 20  y 
37° C. 
4.11.  Modelo,  equipo con el mismo principio de actividad bacteri cida. 
4.12  Organismos coliformes termotolerantes, son organismos capaces de formar aeróbicamente 
colonias a 317 ± 0.5 K (44 ± 0.5° C) en un medio de cultivo lactosado selectivo y diferencial, con prod ucción de 
ácido y aldehído dentro de un periodo de 24 horas. 
4.13  Proceso,  el conjunto de actividades relativas a la elaborac ión, fabricación, preparación, 
conservación, acondicionamiento, manipulación, alma cenamiento y expendio de equipos y sustancias 
germicidas. 
5. Símbolos y abreviaturas 
El significado de los símbolos y abreviaturas utili zados en esta Norma es el siguiente: 
5.1  NMP Número más probable. 
5.2  pH Potencial de hidrógeno. 
5.3 UFC Unidades formadoras de colonias. 
6. Especificaciones 
6.1  Las personas físicas o morales que se dediquen al proceso o importación de equipos y sustancias 
germicidas para tratamiento de agua de tipo domésti co, deben tener a disposición de la autoridad sanit aria, un 
informe de resultados de laboratorio sobre prueba d e potabilidad por cada modelo de equipo cada dos añ os o 
cada dos lotes de sustancia en particular, de confo rmidad con el método de prueba para evaluar la efic iencia 
en reducción bacteriana, descrito en el Apéndice No rmativo A de esta Norma. El laboratorio que efectúe  estos 
análisis debe ser acreditado o tercero autorizado p ara el método de prueba de esta Norma. La prueba de  
potabilidad es aceptable, cuando el porcentaje en r educción bacteriana es igual o mayor a 95% para 
organismos mesófilos aerobios e igual o mayor a 99. 99% para organismos coliformes totales. 
6.2  La Secretaría de Salud determinará de acuerdo con el dictamen o solicitud fundamentada 
técnicamente de dependencias, organismos oficiales y empresas privadas, o por queja de un usuario, los  
casos en que un equipo de tratamiento de agua, comp lementariamente a la prueba de eficiencia en reducc ión 
bacteriana, debe ser sometido a pruebas de remoción  de cualquier otro componente que el fabricante señ ale 
que remueve su equipo; así como, cuando el agua tra tada con una sustancia germicida para el tratamient o de       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 4 de  septiembre de 2009 
agua de tipo doméstico, complementariamente a la pr ueba de eficiencia de reducción bacteriana, deba se r 
sometida a análisis de sustancias tóxicas provenien tes de los ingredientes que componen dicha sustanci a. 
6.3  Los equipos para el tratamiento de agua de tipo do méstico deben ostentar una etiqueta con las 
siguientes leyendas: Utilizar con agua de abastecim iento público y véase instructivo anexo. 
6.4  El instructivo o manual de operación del equipo de  tratamiento de agua de tipo doméstico, debe 
contener cuando menos la siguiente información en e spañol: 
6.4.1  Finalidad de uso. 
6.4.2  Instrucciones de operación. 
6.4.3  Condiciones de operación y en su caso, las restric ciones referentes a características de calidad de 
agua a considerar para llevar a cabo el método de p rueba o de verificación sanitaria. 
6.4.4  Procedimiento de mantenimiento. 
6.4.5  Vida útil referida a volumen de agua tratada o a t iempo. 
6.5  La etiqueta de la sustancia germicida, debe conten er cuando menos la siguiente información en 
español: 
6.5.1  Utilizar con agua de abastecimiento público. 
6.5.2  Finalidad de uso. 
6.5.3  Instrucciones de uso. 
6.5.4  Caducidad. 
6.5.5  No. de lote de fabricación. 
6.5.6  La identificación del lote y caducidad se podrá co locar en cualquier parte del envase primario  o 
secundario. 
6.6  Las personas físicas o morales referidas en el pun to 6.1 de este apartado, deben tener a disposición 
de la autoridad sanitaria cuando ésta requiera, la siguiente información: 
6.6.1  Ingredientes activos, formulación de materias prim as, componentes de las sustancias germicidas  y 
partes componentes del equipo. 
6.6.2  País de origen de los ingredientes activos de la s ustancia germicida o, en su caso, indicar si es en su 
totalidad de producción nacional o de importación. 
7. Procedimiento para la evaluación de la conformid ad 
Las personas físicas y morales que se dediquen al p roceso e importación de los equipos y sustancias 
germicidas a que se refiere esta Norma, podrán soli citar a la Comisión Federal para la Protección cont ra 
Riesgos Sanitarios (COFEPRIS) el DICTAMEN SANITARIO  DE EFECTIVIDAD BACTERIOLOGICA DE 
EQUIPOS O SUSTANCIAS GERMICIDAS PARA POTABILIZACION  DE AGUA TIPO DOMESTICO. 
Para lo cual deben realizar su pago de derechos por  la fracción 195-K-3 y presentar ante el Centro Int egral 
de Servicios de la COFEPRIS, el FORMATO DE SOLICITU DES inscrito en el Registro Federal de Trámites y 
Servicios, debidamente requisitado junto con los si guientes anexos: 
a)  Información técnica del producto: instructivo de u so u operación, hoja de seguridad del producto 
formulado o de las sustancias que formen parte del equipo, así como las características de dicho equip o. 
b)  Informe de pruebas de eficiencia bactericida o ger micida del producto, realizadas por la Comisión de 
Control Analítico y Ampliación de Cobertura o por L aboratorios Terceros Autorizados, y conforme a lo 
establecido en esta Norma. 
c)  Etiqueta comercial del producto. 
Los criterios de resolución están en base de: 
1.- El llenado correcto del formato oficial. 
2.- El pago de derechos. 
3.- Cumplimiento de las especificaciones sanitarias es tablecidas en la presente Norma. Viernes 4 de septiembre de 2009 DIARIO OFICIAL (Seg unda Sección)      
La COFEPRIS contará con 15 días hábiles contados a partir de la recepción de la SOLICITUD para emitir 
el dictamen correspondiente, en caso de que al térm ino del plazo ésta no ha respondido, se entenderá q ue la 
solicitud fue resuelta en sentido negativo. 
8. Concordancia con normas internacionales y mexica nas 
Esta Norma Oficial Mexicana no es equivalente a nin guna norma internacional ni mexicana. 
9. Bibliografía 
9.1  Bacteriological Analytical Manual C. 8th. Edition.  Rev. A. Food and Drug Administration. Division of 
Microbiology. 1999. EUA. 
9.2  Methods of Analysis of the Association of Official  Analytical Chemists. 1995. Washington D.C. EUA. 
9.3  Procedimiento Normalizado de Operación CCAyAC-M-15 3 para la Evaluación de Germicidas. 
Laboratorio Nacional de Salud Pública. Gerencia de Investigación y Desarrollo de Pruebas Microbiológic as. 
COFEPRIS. México, D.F. 2005. 
9.4  Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Association. 
20th Ed. Washington D.C. 2001. EUA. 
10. Observancia de la norma 
La vigilancia en el cumplimiento de la presente Nor ma corresponde a la Secretaría de Salud y a los 
gobiernos de las entidades federativas, en sus resp ectivos ámbitos de competencia. 
11. Vigencia 
El presente Norma Oficial Mexicana entrará en vigor  a los 60 días naturales después de su publicación en 
el Diario Oficial de la Federación. 
La presente Norma al entrar en vigor cancela a las siguientes Normas Oficiales Mexicanas: 
/uni25CF NOM-180-SSA1-1998. Salud ambiental. Agua para uso y consumo humano. Equipos de tratamiento 
de tipo doméstico. Requisitos sanitarios, publicada  en el Diario Oficial de la Federación el 30 de 
octubre de 2000. 
/uni25CF NOM-181-SSA1-1998. Salud ambiental. Agua para uso y consumo humano. Requisitos sanitarios 
que deben cumplir las sustancias germicidas para tr atamiento de agua, de tipo doméstico, publicada 
en el Diario Oficial de la Federación el 20 de octu bre de 2000. 
12. Transitorio 
Se tendrá plazo de un año, a partir de la publicaci ón de esta norma en el Diario Oficial de la Federac ión, 
para agotar las existencias de los productos con et iquetas o envases litografiados, que no cumplan con  las 
especificaciones que determina la norma actual. 
Sufragio Efectivo. No Reelección. 
México, D.F., a 17 de junio de 2009.- El Comisionad o Federal y Presidente del Comité Consultivo Nacion al 
de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario,  Miguel Angel Toscano Velasco .- Rúbrica. 
 
APENDICE NORMATIVO A 
METODO DE PRUEBA PARA EVALUAR LA EFICIENCIA EN REDU CCION BACTERIANA 
1. Introducción 
La eficiencia de un equipo en la reducción bacteria na y la eficiencia de una sustancia germicida, está  dada 
por su capacidad para retener, destruir o eliminar la carga microbiana presente en el agua cuando exis te 
alguna contaminación. Esta eficiencia depende del d iseño del equipo, el principio en que esté basada s u 
actividad y la composición química de la sustancia germicida. 
2. Objetivo 
Determinar y demostrar si el equipo o la sustancia cumplen con las propiedades que le son atribuidas p or 
el fabricante, bajo las condiciones de operación de scritas por él mismo. 
3. Método 
Se inocula una fuente de agua con un número conocid o de microorganismos seleccionados para probar la 
eficiencia del equipo o la sustancia germicida. Pos teriormente, el agua se somete al proceso descrito en el 
instructivo del equipo o a la acción de dicha susta ncia germicida, proporcionado por el fabricante.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 4 de  septiembre de 2009 
Se toman muestras del agua de prueba antes y despué s de haberse sometido al tratamiento, de acuerdo 
con la NOM-230-SSA1-2002 citada en el apartado de r eferencias. Se efectúan cuentas microbianas en dich as 
muestras para constatar que se redujo el número de gérmenes en el agua tratada. 
4. Material y equipo 
■ Autoclave con termómetro y manómetro, capaz de alc anzar temperatura de esterilización de 121 ± 
2° C, probado con termómetro de máximas. 
■ Espectrofotómetro con escala de Transmitancia o Ne felómetro de Mc Farland. 
■ Horno para esterilizar a 160-180° C. 
■ Incubadora de aire, con circulación mecánica, para  operar a una temperatura de 35 ± 2° C. 
■ Baño de agua, con circulación mecánica y mezcla de  agua, para operar a una temperatura de  44,5 ± 
0,2° C. 
■ Potenciómetro. 
■ Pipetas serológicas estériles de 1 y 10 mL de capa cidad, con graduación de una décima de su 
volumen total. (Se recomienda contar complementaria mente con pipetas de 2, 5 y 11 mL  de 
capacidad). 
■ Tubos de cultivo de 22 x 175 mm, 20 x 200 mm, 16 x  160 mm y 10 x 100 mm, con tapa metálica o  
de rosca. 
■ Botellas de Roux. 
■ Asa de platino o nicromel. 
■ Contador manual. 
■ Contador de colonias, con fondo oscuro. 
■ Cajas de Petri estériles de 100 X 15 mm. 
■ Mecheros Fisher o Bunsen. 
■ Solución salina estéril al 0,85% (8,5 g de cloruro  de sodio grado analítico en 1000 mL de agua 
destilada o desionizada). 
5. Medios de cultivo 
5.1  Agar nutritivo A. 
- Extracto de carne 3,0 g 
- Peptona 5,0 g 
- Agar libre de sales 15,0 g 
- Agua destilada o desionizada 1000,0 mL 
Poner a ebullición durante tres minutos el extracto  de carne y la peptona (Bacto o equivalente); agreg ar el 
agar y calentar, agitando continuamente hasta disol ver. 
Distribuir en tubos de 10 x 100 mm y esterilizar 20  minutos a 121° C (el medio no debe sufrir 
sobrecalentamiento, lo que se evita por un precalen tamiento del autoclave). 
Utilizar este medio para efectuar los subcultivos. 
5.2.  Agar nutritivo B. 
Preparar del mismo modo que el Agar nutritivo A, de scrito en el punto 5.1, pero agregando 30 g de agar  
libre de sales en lugar de los 15 g especificados e n dicho punto. 
Distribuir 20 mL del medio en cada botella de Roux o tubos de 22 x 175 mm. 
Utilizar este medio para preparar el cultivo de ref erencia. 
6. Microorganismo de prueba 
Cepa de Escherichia coli  ATCC 11229 
7. Preparación del cultivo de referencia 
Tomar una asada de la cepa de Escherichia coli  y sembrar en una botella de Roux con Agar nutritiv o B; 
incubar de 20 a 24 horas a una temperatura de 35 ± 2° C, hacer por lo menos tres siembras. 
8. Preparación del subcultivo Viernes 4 de septiembre de 2009 DIARIO OFICIAL (Seg unda Sección)      
Tomar una asada de cada cultivo de referencia y res embrar en tubos independientes con Agar nutritivo A ; 
incubar 20-24 horas a una temperatura de 35 ± 2° C. 
9. Preparación de la suspensión de Escherichia coli  
9.1.  A partir del subcultivo en tubo ya desarrollado, a dicionar 5 mL de solución salina al 0,85% estéril y  
agitar suavemente en forma manual, rotando vertical mente el tubo entre las dos manos, para obtener una  
suspensión bacteriana, la cual se transfiere a un t ubo estéril. 
9.2.  Determinación de la concentración de organismos me sófilos aerobios en la suspensión de Escherichia  
coli , utilizando uno de los dos métodos que se presenta n en los puntos 9.2.1 y 9.2.2. 
9.2.1  Método espectrofotométrico. 
Determinar la concentración de bacterias en UFC/mL,  utilizando la Tabla 1. 
Tabla 1 
370 420 490 530 550 580 650 LONGITUD DE ONDA EN nm 
% TRANSMITANCIA CON FILTROS UFC/mL x 10 9 
7,0 4,0 6,0 6,0 6,0 7,0 8,0 13,0 
8,0 5,0 7,0 7,0 7,0 8,0 9,0 11,5 
9,0 6,0 8,0 8,0 8,0 9,0 10,0 10,2 
10,0 7,0 9,0 9,0 9,0 10,0 11,0 8,6 
11,0 8,0 10,0 10,0 10,0 12,0 13,0 7,7 
13,0 9,0 12,0 12,0 12,0 13,0 15,0 6,7 
Nota.  La calibración del aparato debe realizarse con sol ución salina estéril. 
 
9.2.2  Método nefelométrico. 
Determinar la concentración de bacterias en UFC/mL,  utilizando la Tabla 2. 
Tabla 2 
Solución de BaCI 2 al 10% ml Solución de H 2SO 4 al 1,0% ml Escala de Mc Farland UFC 
millones/ml 
0,1 9,9 4,0 300 
0,2 9,8 3,7 600 
0,3 9,7 3,5 900 
0,4 9,6 3,4 1 200 
0,5 9,5 3,3 1 500 
0,6 9,4 3,2 1 800 
0,7 9,3 3,15 2 100 
0,8 9,2 3,10 2 400 
0,9 9,1 3,04 2 700 
1,0 9,0 3,00 3 000 
 
9.3 Diluir la suspensión bacteriana con solución salin a estéril al 0,85%, a la transmitancia o turbiedad 
elegida, de acuerdo con la concentración de bacteri as establecida en el punto 10.2. 
10. Preparación de agua de prueba 
10.1  El agua de prueba se debe preparar con agua del si stema de abastecimiento público, ajustada o que 
cumpla con los límites permisibles de la Modificaci ón a la NOM-127-SSA1-1994, en los parámetros  que 
incidan o afecten la eficiencia del equipo de trata miento, conforme al contenido de su instructivo, 
proporcionado por el fabricante o distribuidor al l aboratorio acreditado que efectúe la prueba. 
10.2  Preparar para el caso de los equipos un volumen de  100 litros y para el caso de las sustancias 
germicidas un litro de agua de prueba, libre de bac tericidas y bacteriostáticos, para operar el equipo  
inoculando el volumen de suspensión de Escherichia coli  requerido, para alcanzar una carga total de bacter ias 
(organismos mesófilos aerobios) de 5 000 a 10 000 U FC/mL y una concentración de organismos coliformes 
totales mayor o igual a 1600 NMP/100 mL o UFC/100 m L. 
10.3  Determinar para el agua de prueba la concentración  real de organismos mesófilos aerobios en 
UFC/mL de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana NOM -092-SSA1-1994 y la concentración real de 
organismos coliformes totales de acuerdo con la Nor ma Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994 o con los 
métodos alternativos presentados en los Apéndices I nformativos A y B.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 4 de  septiembre de 2009 
11. Desarrollo de la prueba para los equipos 
11.1  Instalar el equipo y operarlo con agua de prueba, de acuerdo con el instructivo del fabricante  o 
distribuidor. 
11.2  Alimentar el equipo con agua de prueba. 
11.3  Después de 10 minutos de operar el equipo, tomar t res muestras de agua de prueba sin tratar y a 
continuación tres muestras de agua tratada; determi nar la concentración de organismos mesófilos aerobi os en 
UFC/mL de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana NOM -092-SSA1-1994 y la concentración de organismos 
coliformes totales de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994 o con los métodos 
alternativos presentados en los Apéndices Informati vos A y B. 
12. Desarrollo de la prueba para las sustancias ger micidas 
12.1  Agregar la sustancia germicida al agua de prueba, de acuerdo con las instrucciones del fabricante o 
distribuidor, especificadas en la etiqueta o instru ctivo. 
12.2  Después de transcurrido el tiempo de contacto espe cificado en la etiqueta o instructivo, tomar tres 
muestras de agua de prueba sin tratar y a continuac ión, tres muestras de agua tratada; determinar la 
concentración de organismos mesófilos aerobios en U FC/mL de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana 
NOM-092-SSA1-1994 y la concentración de organismos coliformes totales de acuerdo con la Norma Oficial 
Mexicana NOM-112-SSA1-1994 o con los métodos altern ativos presentados en los Apéndices Informativos  A  
y B. 
13. Cálculos 
Con los resultados de cuenta de organismos mesófilo s aerobios y la concentración de organismos 
coliformes totales en agua de prueba sin tratar y t ratada (media aritmética), calcular los porcentajes  en la 
reducción bacteriana de acuerdo con las fórmulas es pecificadas en los puntos 12.1 y 12.2. 
13.1  Porcentaje en reducción bacteriana de organismos m esófilos aerobios: 
 
En donde: 
% RBMA.- Porcentaje en reducción bacteriana de orga nismos mesófilos aerobios. 
(organismos mesófilos aerobios) APST.- Cuenta de or ganismos mesófilos aerobios en UFC/mL de agua 
de prueba sin tratar. 
(organismos mesófilos aerobios) APT.- Cuenta de org anismos mesófilos aerobios en UFC/mL de agua de 
prueba tratada. 
13.2  Porcentaje en reducción bacteriana de organismos c oliformes totales. 
 
En donde: 
% RBCT. Porcentaje en reducción bacteriana de organ ismos coliformes totales. 
(coliformes totales) APST.- Cuenta de organismos co liformes totales en NMP/100 mL o UFC/100 mL de 
agua de prueba sin tratar. 
(coliformes totales) APT.- Cuenta de organismos col iformes totales en NMP/100 mL o UFC/100 mL  de 
agua de prueba tratada. 
14. Reporte 
Prueba de potabilidad aceptable, si el porcentaje e n reducción bacteriana es igual o mayor a 95% para 
organismos mesófilos aerobios e igual o mayor a 99, 99% para organismos coliformes totales. 
APENDICE INFORMATIVO A 
DETERMINACION DE ORGANISMOS COLIFORMES TOTALES Y Escherichia coli . METODO DEL 
SUSTRATO CROMOGENICO (ver Nota 1 a pie de página) 
                                                           
1 Aprobado por el Committee of Standard Methods, 1992 .  Viernes 4 de septiembre de 2009 DIARIO OFICIAL (Seg unda Sección)      
1. Introducción 
La determinación de organismos coliformes por medio  del sustrato cromogénico, se fundamenta en el uso 
de sustratos cromogénicos hidrolizables para la det ección de enzimas de bacterias coliformes. Cuando s e 
utiliza esta técnica, el grupo se define como todas  las bacterias que poseen la enzima ß-D-galactosida sa y 
son capaces de romper el sustrato cromogénico, dand o como resultado una liberación del cromógeno. A 
diferencia del método de fermentación de lactosa qu e permite el crecimiento de muchos organismos aerób icos 
y elimina o suprime algunos no-coliformes con inhib idores químicos, esta técnica provee nutrientes que  son 
más selectivos y específicos para el crecimiento de  coliformes. La prueba puede usarse tanto en tubos 
múltiples como en formato presencia-ausencia (muest ras individuales de 100 mL). La obtención de result ados 
válidos requiere la aplicación estricta de los proc edimientos de control de calidad. 
2. Principio 
El sustrato cromogénico tal como el orto-nitrofenil -ß-D galactopiranósido (ONPG) u otro equivalente, e s 
empleado para detectar la enzima ß-D-galactosidasa,  la cual es producida por bacterias coliformes tota les. La 
enzima ß-D-galactosidasa hidroliza al sustrato y pr ovoca un cambio de color, el cual indica y sustenta  una 
prueba positiva después de 24 a 28 horas sin proced imientos adicionales. Las bacterias no coliformes, tales 
como las especies del género Aeromonas  y Pseudomonas , que producen pequeñas cantidades de la enzima 
ß-D-galactosidasa, son suprimidas y no pueden produ cir una respuesta positiva durante las 28 horas a m enos 
de que más de 1X10 4 unidades formadoras de colonias (UFC) por mL estén  presentes. 
3. Aplicaciones 
La prueba de coliformes con sustrato cromogénico se  recomienda para el análisis de muestras de agua 
potable, agua purificada o agua limpia proveniente de cualquier fuente. 
Las muestras de agua que contienen materiales húmic os o de otro tipo pueden estar coloreadas. Si hay 
color de fondo, se comparan los tubos inoculados co n un tubo de control conteniendo únicamente muestra  de 
agua. Ciertas aguas con alto contenido de sales de calcio pueden causar precipitación, pero ésta no de be 
afectar la reacción. 
La prueba del sustrato cromogénico no se usa para v erificar siembras presuntivas de coliformes o colon ias 
de filtración con membrana porque el sustrato puede  ser sobrecargado por el inóculo pesado de  ß-D-
galactosidasa débil producido por no-coliformes, ca usando resultados falsos positivos. 
En lo que se refiere a Escherichia Coli , un sustrato fluorogénico como el 4-metilumbelifer il-ß-D-glucorónido 
(MUG) es utilizado para detectar la enzima ß-glucor onidasa, la cual es producida por E. Coli . La enzima  ß-
glucoronidasa hidroliza el sustrato, produciendo fl uorescencia cuando el líquido es expuesto a la luz 
ultravioleta de onda larga (366 nm). La presencia d e fluorescencia indica una respuesta positiva para E. coli . 
Algunas Shigella spp  también pueden producir una respuesta positiva. De bido a que Shigella spp  son 
reconocidas como patógenas humanas, no están consid eradas como perjudiciales para probar la calidad 
sanitaria del agua. 
4. Formulación del sustrato 
Las formulaciones del sustrato se presentan comerci almente en tubos para el procedimiento de tubos 
múltiples o en recipientes para muestras de 100 mL para la determinación de presencia/ausencia. Tambié n 
son aprovechables porciones prepesadas del reactivo  para mezclar y dosificar en tubos múltiples para 
pruebas de 10 mL u otros recipientes para muestras de 100 mL. Se debe evitar la exposición prolongada del 
sustrato a la luz directa del sol. 
La formulación en polvo contiene los siguientes com puestos anhidros (por litro de sustrato preparado)  (ver 
Nota 2 a pie de página). 
Sulfato de amonio (NH 4)2SO 4 5,00 g 
Sulfato de manganeso, MnSO 4 0,0005 g 
Sulfato de zinc, ZnSO 4 0,0005 g 
Sulfato de magnesio, MgSO 4 0,10 g 
Cloruro de sodio, NaCl 10,0 g 
Cloruro de calcio, CaCl 2 0,05 g 
Sulfito de sodio, Na 2SO 3 0,04 g 
                                                           
2 Alternativamente se pueden utilizar productos con dife rentes formulaciones, debidamente acreditados.        (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 4 de  septiembre de 2009 
Amfotericina B 0,001 g 
O-Nitrofenil-ß-D-galactopiranósido 0,50 g 
4-Metilumbeliferil-ß-D-glucorónido 0,075 g 
Solanio (ver Nota 3 a pie de página) 0,50 g 
Buffer Hepes de sal de sodio 5,3 g 
Buffer Hepes de ac, orgánicos (ver Nota 4 a pie de página) 6,9 g 
5. Procedimiento 
5.1  Procedimiento de tubos múltiples. Seleccione el nú mero apropiado de tubos por muestra con medio 
predosificado para la prueba de tubos múltiples y r otule. Siga las instrucciones del fabricante para p reparar la 
serie de diluciones. Asépticamente, adicione 10 mL de muestra a cada tubo, tape herméticamente y agite  
vigorosamente para disolver. La mezcla resultante e s incolora. Algunas partículas pueden resultar inso lubles 
durante la prueba, esto no afectará su desarrollo. 
El procedimiento también puede ser desarrollado con  la adición de cantidades apropiadas del sustrato 
reactivo a la muestra, mezclando vigorosamente y do sificando en cinco o diez tubos estériles. Incube a  
35±0,5° C por 24 horas. 
5.2  Procedimiento de presencia/ausencia. Adicione asép ticamente sustrato enzimático prepesado  a 100 
mL de muestra en un vaso, estéril, transparente, no  fluorescente de borosilicato o en una botella o re cipiente 
equivalente. Opcionalmente adicionar 100 mL. de mue stra al sustrato enzimático en un recipiente provis to por 
el fabricante. Tape asépticamente y mezcle vigorosa mente para disolver. Incube a 35+0,5° C  por 24 hora s. 
6. Interpretación 
Después de 24 horas de incubación examine si existe  cambio de color en los tubos o recipientes. Cuando  
el sustrato es orto-nitrofenil-ß-D-galactopiranósid o (ONPG) es hidrolizado por la enzima de la bacteri a para 
producir ortonitrofenol amarillo; algunos sustratos  usados en otras formulaciones pueden producir resp uestas 
de diferente color. La respuesta cromogénica descri ta es una reacción positiva para coliformes totales . Si el 
cambio de color no es uniforme en todo el tubo, mez cle por inversión antes de la lectura. Comparar cad a tubo 
nuevamente con el comparador de color disponible de  la fuente comercial del sustrato. Si la intensidad  del 
color es mayor o igual a la del comparador, los col iformes totales están presentes. 
Las muestras son negativas para coliformes totales si no se observa color. Si la respuesta cromogénica  es 
cuestionable después de 24 horas, incube 4 horas má s. Si se intensifica el cromógeno, la muestra es po sitiva 
para coliformes totales; si no sucede esto, la mues tra es negativa. 
Incidir luz ultravioleta para la presencia de E. coli , la muestra será positiva si se observa fluorescen cia en 
las celdas positivas para coliformes totales. 
7. Reporte 
Si se desarrolló el procedimiento de NMP, calcular el valor de NMP del número de tubos o celdas 
positivos, de acuerdo con las tablas de número más probable, correspondientes al sistema utilizado. Si  se 
utiliza el procedimiento de presencia/ausencia, rep ortar resultados de coliformes totales presentes a ausentes 
en 100 mL de muestra. 
8. Control de calidad 
Pruebe cada lote de sustrato comercial desarrolland o la prueba por inoculación con tres bacterias de 
control; Escherichia coli , otra coliforme total diferente a E. coli  (por ejemplo Enterobacter cloacae ) y una no 
coliforme. Evite el uso de inóculos pesados. Si se usan Pseudomonas  como el no coliforme representativo, 
seleccione una especie no fluorescente. Incube esto s controles a 35 ± 0,5° C por 24 horas. Lea y regist re  los 
resultados. 
9. Bibliografía 
Edberg. S.C., M.J. Allen, D.B. Smith & the National  Collaborative Study, 1988. National field evaluati on of a 
defined substrate method for the simultaneous enume ration of total coliforms and Escherichia coli  from 
drinking water: Comparison with the standard multip le tube fermentation method. Appl. Environ. Microbi ol. 
54:1595. 
Edberg, S.C. & M.M. Edberg, 1988. A defined substra te technology for the enumeration of microbial 
indicators of environmental pollution. Yale J. Biol . Med. 61:389. 
Covert, T.C., L.C. Shadix, E.W. Rice, J.R. Haines &  R.W. Frey Berg, 1989. Evaluation of the autoanalys is 
Colilert test for detection and enumeration of tota l coliforms. Appl. Environ. Microbiol. 55:2443. 
                                                           
3 Solanio es una mezcla de diversos químicos incluyendo anti bióticos. Es propiedad de Environetics, Branford, Conn.  
4 N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-ácido etano sulfónico.  Viernes 4 de septiembre de 2009 DIARIO OFICIAL (Seg unda Sección)      
Edberg, S.C. & D.B. Smith, 1989. Absence of associa tion between total heterotrophic and total coliform  
bacteria from a public water supply. Appl. Environ.  Microbiol 55:380. 
Edberg S.C., M.J. Allen, D.B. Smith & the National Collaborative Study, 1989. National field evaluatio n of a 
defined substrate method for the simultaneous detec tion of total coliforms and Escherichia coli  from drinking 
water: Comparison with presence-absence techniques.  Appl. Environ. Microbiol. 55:1003. 
Edberg S.C., M.J. Allen, D.B. Smith & N.J. Kaiz, 19 90. Enumeration of total coliforms and Escherichia coli  
from source water by the defined substrate technolo gy. Appl. Environ. Microbiol. 56:366. 
Edberg S.C., M.J. Allen, D.B. Smith, 1991. Defined substrate technology method for rapid and specific 
simultaneous enumeration of total coliforms and Escherichia coli  from water: Collaborative study. J. Assoc. 
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Edberg, S.C., F. Ludwig & D.B. Smith, 1991. The Col ilert System for total coliforms and Escherichia coli . 
American Water Works Research Foundation, Denver, C o. 
APENDICE INFORMATIVO B 
DETERMINACION DE BACTERIAS COLIFORMES TOTALES Y COL IFORMES FECALES-METODO DE  
FILTRACION POR MEMBRANA 
1. Fundamento 
Este método se basa en la filtración de una muestra  para concentrar células viables sobre la superfici e de 
una membrana y transferirlas a un medio de cultivo apropiado, para posteriormente contar el número  de  
unidades formadoras de colonias (UFC) desarrolladas  después de la incubación. 
2. Material 
• Autoclave con termómetro y manómetro, capaz de alc anzar temperatura de esterilización de  121 ± 
2° C, probado con termómetro de máximas. 
• Material para envolver esterilizable (papel kraft,  bolsas de polímero resistentes al calor, otros). 
• Membranas para filtración estériles con poro de 0, 45 milimicras y cojinetes absorbentes de 47 mm  de 
diámetro. 
• Sistema de filtración. 
• Sistema de luz ultravioleta para esterilización de  las unidades de filtración. 
• Bomba de vacío (20-27 pulgadas Hg), tubería y adit amentos herméticos para mantener el vacío. 
• Matraz Kitazato. 
• Cajas Petri desechables o de vidrio estériles de 5 0 x 90 mm. 
• Marcador indeleble o equivalente. 
• Pinzas de acero inoxidable. 
• Propipeta de 50 mL de capacidad. 
• Botellas de borosilicato con capacidad de 150 mL y  tapa de rosca. 
• Pipetas serológicas de 1, 2, 5, 10 y 25 mL de capa cidad, estériles y protegidas con tapón de algodón.  
• Utensilios estériles como: cucharas, cucharones, p icahielos, destapadores, abrelatas, entre otros. 
• Microscopio estereoscópico, óptico o equivalente. 
• Incubadora de aire, con circulación mecánica, para  operar a una temperatura de 35 ± 2° C. 
• Contador mecánico o manual de Tally. 
• Recipientes estériles para muestras (frascos, bote llas, jarras, bolsas, otros). 
• Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g. 
• Portaasa y asa bacteriológica. 
• Portaobjetos. 
3. Reactivos y medios de cultivo 
3.1  Agar cuenta estándar 
Preparar de acuerdo con las instrucciones del fabri cante o por ingredientes: 
El pH final debe ser de 7.0 ± 0,2 después de esteri lizar a 121ºC durante 15 minutos. 
3.2  Agar ENDO LES 
3.2.1  Ingredientes Cantidad (g) 
Extracto de levadura 1,2 
Casitona o tripticasa 3,7 
Tiopeptona o tiotona 3,7       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 4 de  septiembre de 2009 
Triptosa 7,5 
Lactosa 9,4 
Fosfato ácido de potasio - K 2HPO 4 3,3 
Fosfato de potasio - K 3PO 4  1,0 
Cloruro de sodio - NaCI 3,7 
Desoxicolato de sodio 0,1 
Lauril sulfato de sodio 0,05 
Sulfito de sodio - Na 2SO 3  1,6 
Fucsina básica 0,8 
Agar 15,0 
Agua grado reactivo 1000,0 ml 
3.2.2  Preparación 
Rehidratar el medio en un litro de agua que conteng a 20 mL de etanol al 95%, no desnaturalizado (lo cu al 
reduce el crecimiento y el tamaño de la colonia). L levar hasta ebullición para disolver el agar, retir ar del calor y 
enfriar a 45-50ºC. No esterilizar en autoclave. El pH final debe ser 7,0 ± 0,2. Distribuir en cantidad es de 5 a 7 
mL en cajas de Petri de 60 mm de vidrio o plástico.  Si se utilizan placas de otro tamaño, ajustar la c antidad de 
medio. No exponer las placas a la luz directa del s ol. Almacenar en la oscuridad de 4 a 8ºC, preferibl emente 
en bolsas de plástico selladas u otros recipientes para reducir la pérdida de humedad. Descartar el me dio que 
no se utilizó después de 2 semanas. 
3.3  Medio ENDO 
3.3.1  Ingredientes Cantidad (g) 
Triptosa o polipeptona 10,0 
Tiopeptona o tiotona 5,0 
Casitona o tripticasa 5,0 
Extracto de levadura 1,5 
Lactosa 12,5 
Cloruro de sodio - NaCI 5,0 
Fosfato ácido dipotásico - K 2HPO 4 4,375 
Fosfato dihidrógeno potásico - KH 2PO 4 1,375 
Lauril sulfato de sodio 0,05 
Desoxicolato de sodio 0,10 
Sulfito de sodio - Na 2SO 3  2,1 
Fuscina básica 1,05 
Agar (opcional) 15,0 
Agua grado reactivo 1000,0 mL 
3.3.1  Rehidratar el medio en un litro de agua que conten ga 20 mL de etanol al 95%. Calentar hasta 
ebullición para disolver el agar, retirar del calor  y enfriar entre 45-50ºC. Distribuir en cantidades de 5 a 7 mL a 
cajas de Petri desechables o de vidrio de 60 mm de diámetro. No esterilizar en autoclave. El pH final debe ser 
de 7,1-7,3. 
Almacenar el medio (Caldo o Agar) en la oscuridad d e 4 a 8ºC y descarte cualquier caldo de medio sin 
usar después de 96 horas y el agar sin usar después  de 2 semanas. 
Medio líquido: 2 mL por placa, sin agar; se puede u sar un cojinete absorbente si está certificado, lib re de 
sulfito u otro agente tóxico a una concentración qu e pueda inhibir el desarrollo bacteriano. 
4. Procedimiento 
Generalmente, el enriquecimiento del medio de culti vo puede mejorar la valoración de la calidad del ag ua 
para beber. Sin embargo, este paso puede eliminarse  en el análisis de rutina de este tipo de agua ya q ue 
varios estudios mostraron que se obtienen resultado s adecuados por la técnica simple de filtración por  
membrana en un solo paso. Sin embargo, se recomiend a que, en lo posible, se verifiquen todas las muest ras 
de agua que den resultados positivos. 
4.1  Selección del tamaño de muestra Viernes 4 de septiembre de 2009 DIARIO OFICIAL (Seg unda Sección)      
El tamaño de muestra lo determina la densidad bacte riana, lo cual en muestras de agua para beber estar á 
limitado sólo por el grado de turbiedad o por el cr ecimiento de bacterias no coliformes sobre el medio . 
El volumen de muestra sugerida para prueba de colif ormes totales y coliformes fecales por esta técnica  es 
de 100 ml. 
4.2  Filtración de la muestra 
Utilizando pinzas estériles, colocar una membrana e stéril (cuadriculado hacia arriba) sobre el portafi ltro 
poroso. Cuidadosamente coloque el embudo sobre el r eceptáculo y asegúrelo en su lugar. Filtre la muest ra 
bajo vacío parcial, con el filtro aún en su lugar, enjuague el embudo mediante la filtración de tres p orciones de 
20 a 30 mL de solución buffer estéril. Una vez comp lementado el enjuague final y que el proceso de fil tración 
haya concluido, quitar el embudo e inmediatamente d espués retire la membrana con pinzas estériles y 
colóquela sobre el medio selectivo con un movimient o circular a fin de evitar la entrada de aire. Mete r un 
control de 100 mL de solución buffer estéril cada 1 0 muestras para estudiar una posible contaminación 
cruzada o buffer contaminado. Incubar el control ba jo las mismas condiciones de la muestra. 
Usar unidades de filtración estériles al principio de cada serie de filtraciones, como precaución míni ma 
para prevenir contaminación accidental. Una serie d e filtraciones se considera cuando hay un intervalo  de 
interrupción de 30 minutos o más entre cada filtrac ión de muestras. Después de tales interrupciones, t ratar 
cualquier muestra como una serie de filtración y es terilizar toda la unidad de filtración en uso. Desc ontaminar 
este equipo entre filtraciones sucesivas, ya sea po r medio de luz ultravioleta (UV) o esterilizando 
apropiadamente en autoclave de acuerdo con las cara cterísticas del equipo. No exponer la preparación d e 
cultivo con el filtro de membrana al rango de radia ción UV que pueda salir de la cabina de esterilizac ión. Se 
recomienda protegerse los ojos, pueden usarse lente s de seguridad o de vidrio prescritos para la adecu ada 
protección contra la luz UV de la columna de esteri lización. Limpie el tubo de UV regularmente y chequ e 
periódicamente su efectividad para asegurar que hay a un 99,99% de muerte bacteriana en 2 minutos  de 
exposición. 
4.3  Técnica de enriquecimiento 
Colocar un cojinete absorbente en una caja de Petri  estéril y pipetear 1,8 a 2,0 mL de caldo lauril tr iptosa 
para saturar el cojinete. Cuidadosamente remueva cu alquier exceso de líquido del cojinete. Asépticamen te 
colocar sobre el cojinete una membrana a través de la cual se haya filtrado una muestra de agua, incub ar  la 
membrana sin invertir la caja durante 15 a 20 horas  a 35 ± 0,5ºC en una atmósfera de 90% de  humedad 
relativa. 
Si se usa el medio de agar base tipo ENDO, remover el enriquecimiento de la incubadora, separar la 
membrana del cojinete con el enriquecimiento y colo car sobre la superficie del agar. La colocación inc orrecta 
de la membrana a su vez se pone de manifiesto, porq ue partes de la membrana no se tiñen, lo cual indic a 
entrada de aire. Donde suceda esto, cuidadosamente vuelva a colocar la membrana sobre la superficie de  
agar. Si se usa medio líquido, colocar un cojinete estéril nuevo en el fondo de la caja y saturar con 1,8  a 2,0 
mL de medio M-ENDO; separar la membrana del cojinet e con el enriquecimiento y colocar sobre la superfi cie 
del M-ENDO, con las precauciones antes descritas. D escartar el cojinete de enriquecimiento utilizado. 
A continuación, con el medio ya sea agar o líquido (con cojinete), invertir las placas e incubar de 20  a 22 
horas a 35 ± 0,5ºC. 
4.4  Técnica alternativa directa en paso simple 
Si se usa medio de agar base, colocar la membrana d espués de filtrar la muestra de agua, directamente 
sobre el agar como se describió anteriormente en el  apartado 4.3 e incubar durante 24 ± 2 horas a 35 ±  0,5ºC. 
Si se usa medio líquido, colocar un cojinete sobre la placa y saturar con 1,8 a 2,0 mL de medio M-ENDO . 
Colocar la membrana después de filtrar la muestra d e agua, directamente sobre el cojinete; invierta la  caja e 
incube durante 24 ± 2 horas a 35 ± 0,5ºC. 
4.5  Conteo: para determinar la cuenta de colonias sobr e el filtro de membrana, usar un microscopio 
binocular de disección de bajo poder (10 a 15 aumen tos) u otro aparato óptico similar, con lámpara 
fluorescente de luz blanca perpendicular, tanto com o sea posible al plano del filtro. 
Las colonias típicas de coliformes totales tienen c olor rojo oscuro con brillo metálico. El área brill ante 
puede variar de tamaño, con brillo en la parte supe rior de la colonia o hasta cubrir su superficie tot al, las 
colonias atípicas de coliformes pueden ser rojo osc uro o nucleadas sin brillo. Las colonias que no ten gan brillo 
pueden ser rosas, rojas, blancas o incoloras y se c onsideran no coliformes. No existe correlación entr e la 
cuenta de colonias (coliformes o no coliformes) sob re el medio tipo ENDO y el número total de bacteria s 
presentes en la muestra original. Sin embargo, una cuenta alta de bacterias no coliformes puede interf erir con 
el máximo desarrollo de coliformes. La refrigeració n de los cultivos (después de 22 horas de incubació n) con       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 4 de  septiembre de 2009 
alta densidad de colonias no coliformes de 0,5 a 1 hora antes de contar, puede prevenir la dispersión y puede 
ayudar a discernir el brillo metálico. La incubació n anaeróbica a 35ºC por 24 horas de algunas muestra s de 
agua subterránea, pueden suprimir el desarrollo de colonias de no coliformes, pero debe ser cuidadosam ente 
evaluada para asegurar no perder la recuperación de  los coliformes. 
Las muestras de agua tratada, efluente o residual, puede incluir bacterias estresadas que crecen 
relativamente lento y producen un máximo brillo de 22 a 24 horas. Los organismos de fuentes no tratada s 
pueden producir brillo de las 16 a 18 horas y el br illo puede, subsecuentemente, disminuir después de 24 a  
30 horas. 
4.6  Verificación de los coliformes 
Ocasionalmente, las colonias de no coliformes apare cen como colonias típicas con brillo. Las colonias 
atípicas (rojo oscuro, nucleadas sin brillo metálic o) ocasionalmente pueden ser coliformes. Es recomen dable 
verificar ambos tipos de colonias, mediante una pru eba de fermentación de lactosa o por el uso de 
procedimientos alternativos, que involucren ambos u na prueba rápida (4 horas) o por reacciones bioquím icas 
típicas o un sistema multiprueba para especies. 
4.6.1  Fermentación de la lactosa. 
Verificar colonias típicas y atípicas incluidas en la cuenta directa; probar un mínimo de cinco de tal es 
colonias, por transferencia del crecimiento de cada  colonia en caldo lauril triptosa, incubar a 35 ± 0 ,5ºC 
durante 48 horas. 
La formación de gas en caldo lauril triptosa y su c onformación en caldo lactosa con verde brillante de ntro 
de las 48 horas verifica a la colonia probada como coliforme. 
4.6.2  Verificación alternativa de coliformes. 
Aplicar este procedimiento alternativo de verificac ión de coliformes para colonias aisladas sobre el f iltro de 
membrana. Si no hay colonias aisladas o si la separ ación entre las colonias es de menos de 2 mm, estri ar el 
crecimiento a medio M-ENDO para asegurar la pureza del cultivo y transferir al tubo de fermentación. 
4.6.2.1  Prueba rápida. 
Una verificación rápida de las colonias es la prueb a de citocromo oxidasa (CO) y beta-galactoxidasa 
(ONPG). La reacción de los coliformes es de CO nega tiva y ONPG positiva con 4 horas de incubación del 
tubo de cultivo o procedimiento de microprueba. 
4.6.2.2  Sistema multiprueba comercial. 
Verificar las colonias por estrías para su purifica ción, seleccionar colonias perfectamente aisladas e  
inocular dentro de un sistema multiprueba para ente robacterias que incluya reacciones de fermentación de 
lactosa, CO y ONPG. 
5. Cálculos 
Cálculo de la densidad de coliformes. 
Hacer el conteo, usando filtros de membrana con 20 a 80 colonias de coliformes y no más de 200 colonia s 
para cualquier tipo de colonia según la siguiente e cuación: 
 
5.1  Agua para consumo humano (considerando las especif icaciones establecidas en la Modificación de la 
NOM-127-SSA1-1994). 
Con agua de buena calidad, la presencia general de coliformes es mínima. Por lo tanto, se deben contar  
todas las colonias de coliformes (cajas con 20 a 80  colonias) y usar la fórmula dada anteriormente par a 
obtener la densidad de coliformes. 
Si existe un crecimiento confluente, que es un desa rrollo que cubre el área de filtración completa de la 
membrana o una porción y las colonias no están bien  distribuidas, reportar los resultados como “crecim iento 
confluente con (sin) coliformes” y solicite un nuev o muestreo del mismo sitio. Si el número total de c olonias 
bacterianas, coliformes o no coliformes excede las 200 por membrana o si las colonias no son suficient emente 
distinguibles una de la otra para asegurar el conte o, reporte los resultados como “Demasiado numerosas  para 
contar” (DNPC). La presencia de coliformes en tales  cultivos, se verifica mediante la colocación del f iltro de 
membrana completo dentro de un tubo estéril con cal do bilis verde brillante. Como alternativa arrastre  la 
superficie completa del cultivo de la membrana con un asa estéril o con un hisopo de algodón estéril e  inocule 
a un tubo de caldo lactosado y a otro de caldo bili s verde brillante. Viernes 4 de septiembre de 2009 DIARIO OFICIAL (Seg unda Sección)      
Si se produce gas de este cultivo dentro de las 48 ± 3 horas a 35 ± 0,5ºC, se concluye la presencia  d e 
coliformes. 
Se recomienda reportar “Crecimiento confluente” o “ Demasiado numerosas para contar” con al menos una 
colonia de coliformes detectable (verificada) como una muestra positiva de coliforme total. No se reco mienda 
reportar únicamente “Crecimiento confluente” o “Dem asiado numerosas para contar”. 
Cuando no se detectan coliformes, habiendo utilizad o volúmenes de muestra pequeños, se requiere una 
nueva muestra y seleccionar volúmenes más apropiado s para la filtración por membrana. Normalmente se 
requieren volúmenes de 25, 50 o 100 mL para agua de stinada al consumo humano. 
Para reducir interferencia de sobrecrecimiento, en lugar de filtrar 100 mL, filtre porciones de 50 mL a 
través de dos diferentes membranas, porciones de 25  mL a través de cuatro diferentes membranas, y así 
sucesivamente. La cuenta de coliformes totales obse rvadas sobre todas las membranas se suma y se repor ta 
el número total en 100 mL. 
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