Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
SEGUNDA SECCION 
PODER EJECUTIVO 
SECRETARIA DE SALUD 
NORMA Oficial Mexicana NOM-242-SSA1- 2009, Productos y servicios. Pro ductos de la pesca frescos, 
refrigerados, congelados y procesados. Especificaciones sanitarias y métodos de prueba. 
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.- Secretaría de Salud. 
MIGUEL ANGEL TOSCANO VELASCO, Comisionado Federal para la Protección contra Riesgos 
Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacio nal de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, 
con fundamento en lo dispuesto por el artículo 39 de la  Ley Orgánica de la Administración Pública Federal; 4 
de la Ley Federal de Procedimiento Administrativo; 3 fracción XXIV, 13 apartado A) fracciones I y II, 17 bis 
fracción III, 194 fracción I, 195,  197, 199, 201,  214 y 215 fracción I de la Ley General de Sa lud; 47 fracción IV 
de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 28 de l Reglamento de la Ley Federal sobre Metrología y 
Normalización; 2 literal C fracción X, 36 y 37 del Reglament o Interior de la Secretaría de Salud; 1 fracción IV, 
4, 8, 15, 80, 91, 92, 93, 97 y 98 del Reglamento de Cont rol Sanitario de Productos y Servicios; 3 fracciones I 
inciso c y II, 10 fracción IV del R eglamento de la Comisi ón Federal para la Prot ección contra  Riesgos 
Sanitarios, tengo a bien ordenar la publicación en el Diario Oficial de la Federación, de la Norma Oficial 
Mexicana NOM-242-SSA1-2009, Productos y servicios.  Productos de la pesca frescos, refrigerados, 
congelados y procesados. Especificacio nes sanitarias y métodos de prueba. 
CONSIDERANDO 
Que en cumplimiento a lo previsto en el artículo 46 fracción I de la Ley Federal sobre Metrología y 
Normalización, el Subcomité de Productos y Servicios presentó en el año del 2005 al Comité Consultivo 
Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sani tario, el anteproyecto de norma oficial mexicana; 
Que con fecha 25 de agosto de 2008, en cumplimiento del  acuerdo del Comité y lo previsto en el artículo 
47 fracción I de la Ley Federal sobre Metrología y Norm alización, se publicó el Proyecto de Norma Oficial 
Mexicana PROY-NOM-242-SSA1-2005, Productos y servicio s. Productos de la pesca frescos, refrigerados, 
congelados y procesados. Especificaciones sanitarias  y métodos de prueba, en el Diario Oficial de la 
Federación, a efecto de que dentro de los sesenta dí as naturales posteriores a dicha publicación, los 
interesados presentaran sus comentarios al Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario; 
Que con fecha previa, fue publicada en el Diario Oficial de la Federación, la respuesta a los comentarios 
recibidos por el menc ionado Comité, en los término s del artículo 47 fr acción III de la Ley Federal sobre 
Metrología y Normalización y 
Que en atención a las anteriores consideraciones, contando con la aprobación del Comité Consultivo 
Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, he tenido a bien ordenar la publicación de la 
Norma Oficial Mexicana NOM-242-SSA1-2009. Productos y servicios. Productos de la pesca frescos, 
refrigerados, congelados y procesados. Especificaciones sanitarias y métodos de prueba. 
PREFACIO 
En la elaboración de la presente Norma partici paron los siguientes organismos e instituciones: 
SECRETARIA DE SALUD 
Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios CAMARA NACIONAL DE LAS INDUSTRIAS PESQUERA Y ACUICOLA 
INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL 
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas PESCADOS INDUSTRIALIZADOS, S.A. DE C.V. 
AHUMADOS NORUEGOS, S.A. DE C.V. 
INDICE 
1. Objetivo y campo de aplicación 
2. Referencias 
3. Definiciones 
4. Símbolos y abreviaturas 
5. Clasificación 
6. Prácticas de higiene y sanidad       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
7. Especificaciones sanitarias 
8. Clasificación de áreas 
9. Muestreo 
10. Métodos de prueba 
11. Etiquetado 
12. Envase y embalaje 
13. Concordancia con normas internacionales y mexicanas 
14. Bibliografía 
15. Observancia de la Norma 
16. Vigencia 
Apéndice Normativo A: Aditivos Apéndice Normativo B: Métodos de prueba 
1. Objetivo y campo de aplicación 
1.1 Esta Norma Oficial Mexicana tiene por objeto establecer los requisitos sanitarios para: las áreas de 
captura de moluscos bivalvos; los establecimientos que procesan productos de la pesca frescos, refrigerados, 
congelados y procesados, incluyendo las embarcaciones de pesca y recolección, así como las 
especificaciones sanitarias que deben cumplir dichos productos.  
1.2 Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el Territorio Nacional para las personas 
físicas o morales que se dediquen a la captura, extrac ción, procesamiento, cons ervación, almacenamiento, 
distribución, transporte, venta o importación de productos de la pesca. 
2. Referencias 
Esta norma se complementa con las siguientes no rmas oficiales mexicanas o las que las sustituyan: 
2.1. Norma Oficial Mexicana NOM-051-SCFI/SSA1-2010. Especificaciones generales de etiquetado para 
alimentos y bebidas no alcohólicas preenvasados – Información comercial y sanitaria. 
2.2. Norma Oficial Mexicana NOM-084-SCFI-1994. Información comercial-especificaciones de información 
comercial y sanitaria para productos de atún y bonita preenvasados. 
2.3. Norma Oficial Mexicana NOM-086-SSA1-1994. Bienes y servicios. Alimentos y bebidas no alcohólicas 
con modificaciones en su composición. Especificaciones nutrimentales. 
2.4. Norma Oficial Mexicana NOM-251-SSA1-2009. Prácti cas de higiene para el proceso de alimentos, 
bebidas o suplementos alimenticios. 
2.5. Norma Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994. Salu d ambiental. Agua para uso y consumo humano-
Límites permisibles de la calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su potabilización. 
2.6. Norma Oficial Mexicana NOM-128-SSA1-1994. Bienes y servicios. Que establece la aplicación de un 
sistema de análisis de riesgos y control de puntos crítico s en la Planta Industrial Procesadora de Productos de 
la Pesca. 
2.7. Norma Oficial Mexicana NOM-130- SSA1-1995. Bienes y servicio s. Alimentos envasados en 
recipientes de cierre hermético y sometidos a tratamient o térmico. Disposiciones y especificaciones sanitarias. 
2.8. Norma Oficial Mexicana NOM-201-SSA1-2002. Produc tos y servicios. Agua y hielo para consumo 
humano, envasados y a granel. Especificaciones sanitarias. 
3. Definiciones 
Para fines de esta Norma Oficial Mexicana, se entiende por: 
3.1 Aditivo o Aditivo para alimentos, cualquier sustancia permitida que, sin tener propiedades nutritivas, 
se incluya en la formulación de los productos y que act úe como estabilizante, conservador o modificador de 
sus características organolépticas, para favorecer ya sea su estabilidad, conservación, apariencia o 
aceptabilidad. 
3.2 Agua de mar limpia, al agua de mar o salobre que no presente contaminación microbiológica, 
sustancias tóxicas o plancton marino tóxico en cantidades tales que puedan afectar la calidad sanitaria de los productos de la pesca. 
3.3 Agua para uso y consumo humano (agua potable) , agua que no contiene contaminantes objetables, 
químicos o agentes infecciosos y  que no causa efectos nocivos para la salud.  
3.4 Ahumado, procedimiento que consiste en someter el alimento al efecto del humo originado en la 
combustión de madera no resinosa y/o extractos con sabor a humo. 
3.5 Ahumado en caliente, someter el producto a temperaturas y periodos suficientes para lograr la 
coagulación térmica de la proteína. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
3.6 Ahumado en frío, someter el producto a temperaturas a las que no muestre señales de coagulación 
térmica de la proteína. 
3.7 Almacenaje húmedo , al almacenamiento temporal de moluscos bivalvos provenientes de áreas de 
cultivo con clasificación aprobada o condicionalmente  aprobada, ya sea en contenedores o flotantes en 
cuerpos naturales de agua o en tanques que c ontengan agua de mar natural o sintética. 
3.8 Area aprobada, zona de producción de moluscos bivalvos, en la cual un estudio sanitario elaborado 
bajo los criterios técnicos establecidos por la autoridad,  así como el monitoreo y las actividades de vigilancia, 
indican que no existe contaminación por materia fecal, microorganismos patógenos, sustancias tóxicas 
nocivas y/o biotoxinas marinas. 
3.9 Area condicionalmente aprobada, zona  de producción de moluscos bivalvos que cumple con los 
criterios para la clasificación apro bada, excepto bajo ciertas condiciones  descritas en un estudio sanitario. 
3.10 Area condicionalmente restringida , al área de producción de moluscos bivalvos que cumple con 
los criterios para la clasificación re stringida excepto bajo ciertas condicione s descritas en un estudio sanitario, 
y de la cual los moluscos bivalvos  extraídos estarán sujetos a un proc eso de tratamiento de reinstalación o 
depuración, tratamiento térmico u otro proceso que elimine organismos patógenos. 
3.11 Area de cultivo, cosecha o producción , a cualquier lugar que sustenta o puede sustentar el 
crecimiento de moluscos bivalvos, por medios naturales o artificiales, y en la cual hay cantidad suficiente para 
su comercialización, incluyendo los sitios de acuacultura e instalaciones relacionadas. 
3.12 Area prohibida, al área donde no está permitido la recolección de moluscos bivalvos, para cualquier 
propósito; excepto para la obtenci ón de semilla para acuacultura. 
3.13 Area restringida, al área de producción de moluscos bivalvos donde la recolección requiere permiso 
de la autoridad, y una vez recolectados los moluscos bi valvos, están sujetos a un proceso de tratamiento de 
reinstalación o depuración, tratamiento térmico u otro proceso que elimine organismos patógenos. 
3.14 Biotoxinas marinas, sustancias de estructura molecular, mecanismos de acción y actividad biológica 
diversa, que pueden clasificarse atendiendo a sus dife rentes efectos toxicológicos. Son generadas por 
especies fitoplanctónicas tóxicas tales como Alexandrium catenella, Gymnodinium catenatum, Pyrodinium 
bahamense en su variedad compressum, Pseudonitzschia pungens, Gonyaulax, spp, Dinophysis spp, Karenia 
brevis, entre otras especies, así como toxinas de origen  natural presentes en algunos peces de interés 
comercial. 
3.15 Buenas prácticas de fabricación (BPF), para el caso de los aditivos se refiere a la cantidad mínima 
indispensable para lograr el efecto deseado. 
3.16 Congelación, al método físico que se efectúa por medio de equipo especial para lograr una 
reducción de la temperatura de los productos que garantice que su centro térmico esté congelado. 
3.17 Depuración,  proceso realizado para la reducción de organismos patógenos que pueden estar 
presentes en los moluscos, mediante la utilización de un ambiente acuático controlado como proceso de 
tratamiento. 
3.18 Distribución, acción de repartir algo (materia prima, produc to, etc.) y de llevarlo al punto o lugar en 
que se ha de utilizar. 
3.19 Embalaje, material que envuelve, contiene y protege los productos preenvasados, para efectos de su 
almacenamiento y transporte. 
3.20 Embarcación menor, a la unidad de pesca que no cuenta con maquinaria de cubierta accionada con 
fuerza electromotriz para el auxilio de las operaciones de pesca, utiliza únicamente hielo para la conservación 
del producto y tiene una autonomía de 3 días. Las emba rcaciones con capacidad hasta 5 toneladas no podrán 
realizar operaciones de pesca por más de 24 horas. 
3.21 Embarcación pesquera , unidad de pesca con motor estacionario y una o más cubiertas con eslora 
superior a los 10.5 m, que pueden tener o no equipo electrónico de navegación y apoyo a la pesca, que le permite tener una autonomía mayor de 3 días, y los sistemas de pesca pueden ser operados con apoyo de 
medios mecánicos. Se puede efect uar la congelación de los productos de la pesca, precedida, en caso 
necesario, de labores de preparación como el sangrado,  descabezado, eviscerado y extracción de las aletas, 
y seguida, si es preciso, del envasado o embalado. 
3.22 Embarcación pesquera de mediana altura, a la unidad de pesca con motor estacionario y una 
cubierta, con eslora de 10 a 27 m; con equipo electrónico de navegación y apoyo a la pesca, que le permite 
tener una autonomía máxima de 25 días, los sistemas  de pesca son operados manualmente o con apoyo de 
medios mecánicos. 
3.23 Enhielado, al método de conservación físico con el cual se mantiene la temperatura interna del 
producto a un máximo de 4°C, con la utilización de hielo potable.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
3.24 Envases herméticamente cerrados, aquellos que se han previsto para proteger el contenido contra 
la entrada de microorganismos. 
3.25 Envase,  cualquier recipiente, o envoltura en el cual es tá contenido el producto preenvasado para su 
venta al consumidor. 
3.26 Esterilización comercial, al tratamiento térmico que libera al producto de formas viables de 
microorganismos patógenos (incluyendo esporas) que af ecten la salud y causantes  de descomposición, así 
como aquellos capaces de desarrollarse en los alimentos sin refrigeración bajo condiciones normales de 
almacenamiento y distribución. 
3.27 Estudio sanitario , el informe escrito, de la evaluación de todos los factores ambientales, incluyendo 
las fuentes de contaminación actuales o potenciales, directas o indire ctas que pudieran alterar la calidad del 
agua en un área de cultivo de moluscos bivalvos. 
3.28 Etiqueta, cualquier rótulo, marbete, inscripción, imagen u otra materia descriptiva o gráfica, escrita, 
impresa, estarcida, marcada, grabada en alto o bajo relieve, adherida, sobrepues ta o fijada al envase del 
producto preenvasado o, cuando no sea posible por las características del producto, al embalaje. 
3.29 Eviscerado, a la acción de retirar las vísceras. 
3.30 Expendio, área o establecimiento donde se exhiben o comercializan los productos objeto de  esta 
norma. 
3.31 Inocuo, al que no causa daño a la salud.  
3.32 Límite máximo, a la cantidad establecida de aditivos, mi croorganismos, parásitos, materia extraña, 
plaguicidas, radionúclidos, biotoxinas, residuos de medi camentos, metales pesados y metaloides, entre otros, 
que no se deben exceder en un alimento, bebida o materia prima. 
3.33 Lote, a la cantidad de producto, elaborado en un mismo ciclo, integrado por unidades homogéneas, e 
identificado con un código específico.  
3.34 Marea roja, evento natural de incremento de la biomasa fitoplanctónica en una región en particular, 
donde la o las especies dominantes son generadoras de biotoxinas marinas. También se denomina 
Florecimiento de Algas Nocivas (FAN). 
3.35 Materia extraña, a la sustancia, resto o desecho orgánico o inorgánico, ajeno al producto, que se 
presenta por contaminación o por malas prácticas de fabricación e higiene del mi smo durante su proceso, 
considerándose entre otros: excretas, pelos de cualqu ier especie, huesos, insectos, vidrio, madera, metal o 
joyería. 
3.36 Metal pesado y metaloide, a los elementos químicos que tienen un peso atómico entre 63 y 208 y 
una gravedad específica mayor de 4,0; que por su na turaleza presenta una gran reactividad y que 
dependiendo de su concentración, forma química o su acumulación en el organismo, pueden causar efectos 
indeseables en el metabolismo. 
3.37 Métodos de prueba, al procedimiento técnico utilizado para la determinación de parámetros o 
características de un producto, proceso o servicio. 
3.38 Molusco bivalvo , todas las especies de moluscos lamelibranquios que se alimentan por filtración, 
que cuentan con dos valvas, ejemplo ostiones, mejillones o almejas. 
3.39 Parásito, al organismo que vive a expensas de otro organismo vivo, provocándole daño. 
3.40 Pasteurización , tratamiento térmico que generalmente se realiza a temperatura por debajo de los 
100°C y se aplica para la destrucción de microorganismos patógenos viables y la inactivación de enzimas. 
3.41 Proceso, al conjunto de actividades relativas a la obt ención, elaboración, fabr icación, preparación, 
conservación, mezclado, acondicionamiento, envasado, manipulación, transporte, distribución, almacenamiento  
y expendio o suministro al público de productos. 
3.42 Producto a granel, al producto que debe pesarse, medirse o contarse en presencia del consumidor 
al momento de su venta. 
3.43 Producto de la pesca, a cualquier producto para consumo humano, derivado en parte o su totalidad 
de los recursos de la flora y fauna acuáticas, s ean peces, crustáceos, moluscos, equinodermos. 
3.44 Producto de la pesca congelado,  a los peces, crustáceos, moluscos, equinodermos, u otros 
animales y vegetales que han sido objeto de un proces o de disminución de temperatura lo suficientemente 
bajo para conservar la calidad sanitaria. 
3.45 Producto de la pesc a fresco refrigerado, es aquel que cumpliendo con las normas microbiológicas 
e higiénicas establecidas no ha sido sometido a proces o alguno de conservación, excepto la refrigeración 
mecánica o el enhielado. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
3.46 Producto de la pesca procesado,  es aquel que ha sido sometido a un proceso tecnológico para su 
conservación y su consumo posterior, a ex cepción de los refrigerados y congelados.  
3.47 Producto preenvasado, al producto que cuando es colocado en un envase de cualquier naturaleza, 
no se encuentra presente el consumidor y la cantidad de producto contenido en él no puede ser alterada, a 
menos que el envase sea abierto o modificado perceptiblemente. 
3.48 Rastreabilidad , la capacidad para seguir el desplazamiento de los productos de la pesca a través de 
una o varias etapas especificadas de su proc eso, conocido también como trazabilidad. 
3.49 Refrigeración, al método físico de conservación con el cual se mantiene la temperatura interna de un 
producto a máximo 4°C. 
3.50 Reinstalación , proceso utilizado para movilizar moluscos biva lvos cosechados en áreas clasificadas 
como restringidas o condicionalmente restringidas, a un área de cosecha clasificada como aprobada o 
condicionalmente aprobada, con el propósito de reducir la presencia de microorganismos patógenos, mismos 
que se determinan mediante el indicador del grupo coliforme (coliformes fecales o E. coli), utilizando la 
permanencia en este ambiente como proceso de tratamiento. 
3.51 Residuos de medicamentos veterinarios , compuestos químicos que pueden encontrarse en la 
materia prima, producto en proceso o producto termin ado, derivados de su aplicació n en la acuicultura, y que 
representa riesgo a la salud humana. 
3.52 Salazón en seco, procedimiento que consiste en mezclar el pescado con sal, azúcar y/u otros 
ingredientes secos aptos para consumo humano, de manera que los líquidos secretados se eliminen. 
3.53 Salmuera, solución de sal en agua, que puede contener azúcar y/u otros ingredientes aptos para 
consumo humano. 
3.54 Sistema PEPS (primeras entradas-pri meras salidas) , serie de operaciones que consiste en 
garantizar la rotación de los productos de acuerdo a su fecha de recepción , su vida útil o vida de anaquel. 
3.55 Subproducto, material generado durante la producción de un producto principal, que se puede 
utilizar como materia prima para otros productos, los cuales pueden ser apto o no para consumo humano. 
3.56 Tratamiento térmico, método físico que consiste en someter a una fuente de calor suficiente por un 
tiempo apropiado al producto, antes o después de ser envasado en recipientes de cierre hermético con el fin 
de lograr una estabilidad biológica. 
3.57 Transporte , al vehículo, remolque o contenedor, elev adores, montacargas, escaleras mecánicas, 
bandas u otros en el se trasladan los productos objeto de esta norma. 
3.58 Veda sanitaria, medida de seguridad consistente en la prohibición temporal o permanente para 
captura, comercialización y consum o de productos de la pesca para consumo humano, con el objeto de 
proteger la salud de la población. 
3.59 Zonas de producción y extracción (captura) de los productos de la pesca, zona geográficamente 
delimitada en la cual la autoridad competente emite un permiso o concesión acuícola, para la explotación 
comercial de determinadas especies acuáticas. 
4. Símbolos y abreviaturas 
4.1 Cuando en esta Norma se haga referencia a los siguientes símbolos y abreviaturas se entiende por: 
Aw actividad de agua 
BPF buenas prácticas de fabricación 
ºC grado Celsius GR grado reactivo 
h hora 
cm centímetro g gramo 
HPLC siglas en inglés de cromatografía de líquidos de alta resolución 
kg kilogramo L litro 
mg miligramo 
mL mililitro ppm partes por millón       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
min minutos 
µg microgramo 
N normalidad mm milímetro NMP número más probable No Número  SO
2 dióxido de azufre 
Ton tonelada pH potencial de hidrógeno P
2O5 pentóxido de fósforo 
PEPS primeras entradas-primeras salidas UFC unidades formadoras de colonias UR unidades ratón V volumen % por ciento ± más menos - menos / por > mayor que > 
mayor o igual que 
< menor que = igual 
 4.2 Cuando en la presente norma se mencione: 
Acuerdo ,  debe entenderse que se trata del Acuerdo por el que se determinan las sustancias 
permitidas como aditivos y coadyuvantes en alimentos, bebidas y suplementos alimenticios. 
Ley, debe entenderse que se trata de la Ley General de Salud. 
Reglamento , debe entenderse que se trata del Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios. 
5. Clasificación Los productos objeto de esta norma por el tratamie nto al que han sido sometidos se clasifican en: 
5.1 Productos de la pesca frescos, refrigerados y congelados; y 
5.2 Productos de la pesca procesados, los que a su vez se clasifican en: 
5.2.1  Productos cocidos refrigerados y congelados. 
5.2.2 Envasados en recipientes de cierre hermético y sometido a tratamiento térmico. 
5.2.2.1 Esterilizados comercialmente. 
5.2.2.2 Pasteurizados. 
5.2.3 Ahumados. 
5.2.4 Salados y secos-salados. 
5.2.5 Semipreparados. 
5.2.6 Crudos o precocidos empanizados o rebozados y congelados. 
5.2.7 Crudos marinados o en salmuera. 
5.2.8 Emulsionados. 
6. Prácticas de higiene y sanidad Los productos objeto de esta norma, deben de cumplir las siguientes especificaciones: 
6.1 En el proceso de los productos objeto de esta norma, se debe cumplir con lo establecido en la  NOM-
251-SSA1-2009, señalada en el apartado de referencias. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
6.2 Todas las materias primas empleadas en la elaboración de los productos deben cumplir con los 
ordenamientos legales aplicables. 
6.3 Control documental del proceso. 
6.3.1 Adicionalmente a lo establecido en otros orde namientos se debe contar con la documentación 
establecida en la tabla No 1 y cumplir con lo siguiente: 
6.3.1.1  Los registros o bitácoras deben estar foliados o numerados, 
6.3.1.2  Contar con documentos que demuestren la veracidad de la información 
6.3.1.3  Conservarse por lo menos durante el tiempo establecido en la NOM-128-SSA1-1994, señalada en 
el apartado de referencias. 
6.3.1.4  Todos los documentos deben contar con los datos que permitan identificar a la persona que 
supervisa. 
Tabla No. 1. Información adicional de las diferentes etapas del proceso. 
REGISTRO DE: INFORMACION 
Recepción de 
materias primas ● Origen (zona de captura o producción,  rastreable por lote de producción, 
cuando aplique). 
● Condiciones de recepción, conser vación y transporte, cuando aplique. 
● El informe de resultados de análisis, además debe incluir: nombre común y 
científico de la ma teria prima, condic iones de toma y transporte de muestra 
(características de la muestra), fecha de análisis. 
Almacenamiento del producto ● Control del Sistema PEPS. 
Area de proceso ● Temperatura del área. 
● Temperatura y tiempo, durante la manipu lación y el procesamiento del producto.
● Determinación de cloro residual en el agua utilizada en el proceso, como 
mínimo una vez al día al inicio del proceso, incluir hora en que se realiza la 
determinación. 
● Informe de resultados de análisis microbiológicos y fisicoquímicos, como mínimo 
semestralmente. 
Distribución de producto terminado ● Condiciones de transporte y comercialización. 
● Control de destino del producto por lotes que garantice su rastreabilidad. 
Control o 
erradicación de 
fauna nociva ● Hojas técnicas de las sustancias. 
Estado de salud del 
personal del área de producción y 
expendio, en su caso ● Tipo de análisis, al menos deben realizarse exudado faríngeo y 
coproparasitoscópico, es recomendable a demás realizar reacciones febriles. 
● Fecha de análisis. 
● Resultados y en su caso seguimiento. 
● Laboratorio responsable. 
Mantenimiento del 
equipo ● Tipo de mantenimiento (preventivo o correctivo). 
 
Lo anterior de conformidad con el trám ite SSA-04-015. Conservación de información sobre el proceso de 
producción y con el SSA-04-022. Conservación de registros de los parámetros de operación en 
establecimientos dedicados al proceso de productos de la pesca y sus derivados. 
6.4 Embarcaciones de pesca y recolección. 
6.4.1  Las embarcaciones pesqueras deben contar al menos con una bodega exclusiva para la 
conservación refrigerada o congelada de los producto s de captura. Las embarcaciones menores deben tener 
contenedores empleados exclus ivamente para almacenar producto.  
6.4.2 Las bodegas deben reunir los siguientes requisitos: 
6.4.2.1 Estar aislada térmicamente;       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
6.4.2.2 Estar revestida interiormente con materiales resi stentes a la corrosión, lisos y de fácil limpieza y 
desinfección. 
6.4.2.3 Las bodegas de almacenamiento de productos de la pesca deben estar separadas de las salas de 
máquinas, de los cuartos de servicio de la tripulaci ón y no podrán ser usados para productos que por su 
naturaleza puedan contaminarlos. 
6.4.2.4  En caso de que los almacenes se utilicen para otro fin el responsable de la embarcación deben 
garantizar que cuenten con los utensilios, procedimient os y productos para la limpieza y desinfección que 
garanticen que los productos de la pesca no puedan contaminarse. 
6.4.2.5 Contar con sistemas que garantic en la conservación del producto. 
6.4.2.6 Cuando se conserven productos de la pesca enhiel ados; deben contar con un sistema de drenaje 
que permita la salida del agua de fusión. 
6.4.3 Las embarcaciones pesqueras menores, deben estibar el  producto en recipientes con suficiente hielo 
que garantice su conservación. Este tipo de embarcaci ones no deben mantener el producto en estas 
condiciones por periodos mayores de veinticuatro horas. 
6.4.4 Las embarcaciones pesqueras que estén provis tas de un sistema de refrigeración no deben 
mantener el producto en estas condiciones por periodos mayores de veinticinco días. 
6.4.5 Las embarcaciones pesqueras de mediana altura y mayores, deben disponer de un sistema de 
abastecimiento de agua potable abundante o de agua de mar limpia. Asimismo, deben contar con un sistema 
de desinfección, con el fin de facilitar el lavado y saneamiento de las áreas de confinación del producto y 
limpieza general del barco, antes de salir del puerto y después de la descarga. 
6.4.6  Las embarcaciones, partes y equipos empleados para la extracción, deben quedar libres de 
pescados, mariscos o fragmentos de éstos, así como  de otras materias orgánicas susceptibles de 
descomposición que puedan contaminar el producto, en su caso se pueden lavar con agua potable o agua de 
mar limpia antes o después de cada operación de pesca o por lo menos una vez al día. 
6.4.7 La cubierta y todo el equipo de cubierta, inm ediatamente después de desca rgar la captura, debe 
limpiarse, desinfectarse y, en su caso, enjuagarse. 
6.4.8 Los productos de la pesca enhielados o refrigerados deben mantenerse a 4ºC como máximo, y a 7°C 
en el caso de los productos vivos; mientras que lo s congelados deben mantenerse a –18ºC como máximo, y 
para los pescados enteros congelados en salmuera y desti nados a la fabricación de conservas, se pueden 
tolerar temperaturas no superiores a –9ºC. 
6.5 Extracción o cosecha de moluscos bivalvos. 
6.5.1 La extracción o cosecha  y manejo de los moluscos bivalvos debe sujetarse a lo siguiente: 
6.5.1.1 Extraerse o cosecharse  de áreas aprobadas, aprobadas cond icionalmente, condicionalmente 
restringidas o restringidas bajo vigilancia sanitaria y libres de marea roja. 
6.5.1.2 Ser inocuos, o en caso de provenir de áreas c ondicionalmente restringidas o restringidas, 
someterse a un proceso de reinstalaci ón, depuración, pasteuriz ación, tratamiento térmico u otro proceso que 
garantice la eliminación de organismos patógenos. Estos procesos deben llevarse a cabo mediante 
lineamientos técnicos sujetos a evaluación por parte de la autoridad. 
6.5.1.3 Lavarse con agua de mar limpia procedente de área aprobada o con agua potable. 
6.5.1.4 Realizar el almacenamiento húmedo en contenedor es o flotadores en cuerpos naturales de agua o 
en tanques que contengan agua de mar natural o sintétic a. Este proceso debe llevarse a cabo de conformidad 
con lineamientos técnicos sujetos a evaluación por parte de la autoridad. 
6.5.1.5 Almacenarse de tal forma que se eviten abrasiones, en bodegas ventiladas y libres de fauna nociva 
o doméstica. 
6.5.1.6 Lavarse, en caso de separación de la concha, con agua potable y manipularse rápidamente, para 
su inmediata refrigeración, congelación o venta. 
6.5.2 Para la depuración de los moluscos bivalvos, se debe observar lo siguiente: 
6.5.2.1 La cantidad de agua que reciban debe ser de mar, limpia, continua y suficiente para el volumen de 
organismos por depurar, el cual no debe ser superior a la capacidad del centro o área de depuración. 
6.5.2.2 El funcionamiento del sistema de depuración debe permitir que los moluscos bivalvos vivos 
vuelvan a alimentarse por filtración, eliminen los residuos contaminantes y se mantengan con vida en 
condiciones adecuadas después de la depuración previa  a envasado, almacenamiento y transporte anteriores 
a la puesta en el mercado. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
6.5.2.3 Los lotes de organismos no se deben mezclar, a menos que los procesadores cuenten con un 
procedimiento de mezclado sujeto a evaluación y vig ilancia por parte de la autoridad sanitaria. 
6.5.2.4  Independientemente del proceso de depuración empl eado, su duración no debe ser inferior a las 
48 h. 
6.5.3  La duración del proceso de reinstalación debe ser al menos de 15 días, y la eficiencia del proceso 
estará sujeta a evaluación por parte de la autoridad sanitaria, en términos de las disposiciones jurídicas 
aplicables. 
6.6 Manejo de producto a bordo. 
6.6.1 El producto capturado, al ser descargado en la cu bierta de las embarcaciones, debe manipularse 
cuidando que no se golpee o dañe y se evite su contaminación.  
6.6.2 En el momento que sea factible y de acuerdo a la  naturaleza del producto, se debe lavar y en su 
caso, extraerle las vísceras, evitando que los desperdicio s entren en contacto con los productos destinados al 
consumo humano. El producto se debe mantener enhielado , en refrigeración o en congelación hasta que sea 
entregado para su procesamiento. 
6.6.3 El producto, una vez libre de vísceras, cabeza o concha, debe lavarse con agua de mar limpia o 
agua potable; en el caso de los pescados, esto debe hacerse hasta que cese el sangrado. 
6.6.4 Para los productos enhielados, la cavidad abdominal del pescado libre de vísceras, debe llenarse 
con hielo y cubrirse con el mismo al estibarlo. El hielo que haya sido previamente utilizado con algún otro 
propósito, no debe ser usado para enfriar el producto. 
6.6.5 Las vísceras, así como los desecho s destinados al consumo animal o al uso industrial no alimentario, 
deben conservarse en condiciones que eviten su de scomposición y separarlos de los de consumo humano. 
6.6.6  La descarga debe realizarse en recipientes limpios y en el menor tiempo posible, cuidando que no 
sea lanzado desde la bodega a la cubierta, a la plataforma del muelle o al medio de transporte.  
6.7 Equipo. 
6.7.1 Todo el equipo empleado para lavar, manipular, transpor tar, enfriar y almacenar los productos de la 
pesca a bordo de las embarcaciones y en los establecimi entos debe ser de material resistente, liso e inocuo, 
que permita su fácil limpieza y desinfección y encontrarse en buen estado de mantenimiento. 
6.7.2  Los recipientes, equipo y utensilios que se empleen en la manipulación, almacenamiento o 
transporte de los productos pesqueros, a bordo de las em barcaciones y en los establecimientos en tierra 
deben por lo menos limpiarse al final de la jornada y desinfectarse al inicio de la jornada y, en su caso, 
enjuagarse con agua potable, o agua de mar limpia.  
6.8 Establecimientos. 
6.8.1  Deben permitir la limpieza y desinfección de las área s, y el flujo lineal y continuo de los productos 
desde su recepción hasta su embarque, así como del área personal y de los materiales, de tal forma que se evite la contaminación del producto en todo momento. 
6.8.2  Los agentes de limpieza y desinfección no deben estar en las áreas de proceso cuando se realice la 
manipulación del producto ni emplearse de forma que provoquen su contaminación o adulteración. 
6.8.3  Las áreas e instalaciones para lavado y/o desi nfección de materias primas, productos, utensilios y 
equipo y para manos del personal deben estar identificadas 
6.8.4  Para las áreas de proceso en donde el producto esté expuesto debe cumplir con lo siguiente: 
6.8.4.1  El área de recepción debe estar cubierta, limpia y ser específica para la actividad. 
6.8.4.2  Las cámaras de refrigeración y congelación deben esta r construidas con materiales resistentes a la 
corrosión, tener acabados lisos, ser de fácil limpieza y desinfección. 
6.8.5  Se debe contar con almacenes específicos para: ingredientes, aditivos y material de empaque. 
6.8.6  Se debe contar con depósito de hielo, cámaras fr igoríficas o almacén para producto refrigerado o 
congelado, según el caso. 
6.8.7  Después de ser lavados y desinfectados, los equi pos y utensilios de trabajo que no se estén 
utilizando, deben estar protegidos de cualquier forma de contaminación. 
6.8.8  Se debe contar con áreas específicas para el la vado y desinfección de botas y mandiles, así como 
para el secado y escurrido de éstos, con los correspondientes accesorios. 
6.8.9  Se debe contar con un área específica de vest idores que cuente con un lugar para guardar los 
objetos personales. 
6.9 Procesamiento de los productos de la pesca.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
6.9.1 Se debe contar con un sistema de potabilización qu e asegure la calidad sanitaria del agua utilizada 
en el proceso. El mantenimient o del mismo es responsabilidad del procesador, de acuerdo a las 
especificaciones establecidas por el fabricante del equipo. 
6.9.2 El hielo que se utilice en la conservación y proceso de los productos objeto de esta norma debe 
cumplir con lo establecido en la NOM-201-SSA1-20 02, señalada en el apartado de referencias. 
6.9.3 La industrialización de los subproductos de la pesca no destinadas a consumo humano debe 
realizarse en áreas separadas físicamente de aquellas en que se elaboren productos destinados al consumo 
humano. 
6.9.4 La temperatura de las cámaras utilizadas para conser var el producto congelado debe garantizar que 
la temperatura en el centro térmico de los productos se mantenga a -18°C o inferior. 
6.9.5  La temperatura de las cámaras utilizadas para conser var el producto refrigerado debe garantizar que 
la temperatura del centro térmico de los productos, se m antenga a 4°C o inferior, y de 7°C o inferior en el caso 
de moluscos bivalvos. 
6.9.6 El producto en el que se sospeche la presencia de parásitos debe ser sujeto a un tratamiento previo 
de congelación a -18°C o menor por un tiempo no inferior a 24 horas. 
6.9.7  La temperatura de las cámaras de refrigeración deben leerse y registrarse por lo menos cada 4 
horas, o deben utilizarse registros continuos y automát icos. Las cámaras utilizadas para congelar y conservar 
el producto a esta temperatura deben contar úni camente con registros c ontinuos y automáticos. 
6.9.8  Durante el lavado de los productos de la pesca, se debe utilizar agua potable fría o agua de mar 
limpia, cuando aplique y disponer de instal aciones adecuadas para la manipulación. 
6.10 Descongelación. 
6.10.1 El método de  descongelación aplicado a los productos no debe representar una fuente de 
contaminación para el mismo. La temperatura interna del producto no debe exceder los 4°C.  
6.10.2 La descongelación se debe efectuar en lu gares cerrados y en condiciones de higiene. 
6.10.3 Cuando se emplee agua como medio de descongelación ésta debe ser potable, y la circulación 
debe ser suficiente para lograr una descongelación uniforme. 
6.11 Manejo de desechos. 
6.11.1 Las embarcaciones pesqueras y los establecimient os deben eliminar sus desechos, de conformidad 
con las disposiciones aplicables. 
6.11.2 Los recipientes para despojos y materiales de desecho, deben ser de material impermeable. 
6.12 Personal.  
6.12.1  La empresa debe asegurarse que al inicio de cada turno, el personal del proceso cuente con el 
equipo de trabajo como son los mandiles, guantes, botas y cofias en condiciones higiénicas, batas, 
cubreboca, pantalón, camisolas, z apatos cerrados, overoles, ropa térmica o cualquier otra indumentaria para 
la realización de sus actividades. 
6.12.2  El personal no podrá usar la indumentaria de tr abajo fuera del establecimiento. Así mismo el 
personal de las áreas sucias no debe ingresar hacia área s limpias para evitar posibles contaminaciones y si 
regresara a áreas de proceso debe tomar las medidas de higiene necesarias. 
6.13 Transporte. 
6.13.1 Los vehículos destinados al transporte de los productos de la pesca deben cumplir con los 
siguientes requisitos sanitarios, según corresponda:  
6.13.1.1 Los acabados del interior de la caja deben ser de material resistente a la corrosión, de fácil 
limpieza y desinfección y encontrarse en buen estado de mantenimiento y en su caso , contar con un sistema 
para el drenaje del agua de deshielo. 
6.13.1.2 Los productos no deben entrar en contacto directo con pisos y paredes. 
6.13.2 El transporte de los productos de la pesca frescos, con duración máxima de 5 horas, puede 
efectuarse en vehículos de caja abie rta o de plataforma siempre y cuando  el producto enhielado se coloque 
dentro de contenedores cerrados que permitan la salida de agua de fusión. 
6.13.3  El enhielado debe hacerse colocando, capas alternas de hielo triturado hasta una altura máxima de 
un metro; la primera y última capas deben ser de hielo. Para el caso de los moluscos bivalvos, el enhielado 
debe garantizar que no se altera dicha condición. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
6.13.4  El transporte de los productos de la pesca con una duración mayor de más de 5 horas de 
transportación, debe contar con sistemas de refrigerac ión o congelación e indicador y registrador de 
temperatura. 
6.13.5  El transporte de los productos de la pesca refrigerados se debe realizar a una temperatura de 4°C 
como máximo y 7°C en caso de los productos vivos. 
6.13.6  El interior de las cajas de los vehículos, los recipientes empleados para el estibado y demás 
superficies que estén en contacto con el producto, deben lavarse con agua potable y desinfectarse antes y 
después de cada viaje. 
6.14 Expendio. 
6.14.1  En las áreas donde se expendan los productos de la pesca frescos refrigerados, no podrán ser 
utilizadas para elaborar productos de la  pesca procesados o alimentos preparados. 
6.14.2  Deben contar con un área específica para almacenar los productos, ya sea enhielado, refrigerado o 
congelado. 
6.14.3  Se debe contar con un área específica para productos no aptos para consumo. 
6.14.4  El hielo que se emplee debe cumplir con lo siguiente: 
6.14.4.1  Ser para consumo humano. 
6.14.4.2  Almacenarse de tal forma que se evite su contaminación. 
6.14.4.3  El que se haya utilizado para conservar los productos no debe ser reutilizado. 
6.14.5  No deben permanecer en esta área productos en envases abiertos o con la envoltura rota. 
6.14.6  La estiba, debe realizarse de manera que se evite el rompimiento y exudación de empaques y 
envolturas. 
6.14.7  Las unidades de refrigeración y congelación, deb en contar con termo-registradores con termómetro 
en lugar visible que permitan monitorear la temperatura. 
6.14.8  El importador, distribuidor y comercializador, ca da uno en el ámbito de su responsabilidad, deben 
observar que se mantengan las condiciones de alma cenamiento establecidas en este ordenamiento. 
6.14.9  Los productos de la pesca que se presenten para su exhibición y venta al público, deben colocarse 
en mostradores de material resistente, con superficie li sa, y de fácil limpieza y desinfección, con inclinación 
necesaria para permitir el escurrimiento del agua de deshiel o. Si la exhibición y venta se realiza en charolas, 
éstas deben ser de material inocuo u otro material anticorrosivo que sea de fácil limpieza y desinfección o 
desechables. 
6.14.10  Durante el pesado del producto, se debe evit ar el contacto directo con las básculas. 
6.14.11  Los utensilios de corte deberán permanecer en  solución desinfectante cuando no se estén 
utilizando. 
6.14.12  Las unidades de refrigeración deben mantenerse  a una temperatura que permita al producto 
permanecer a no más de 4ºC en forma constante. Asimis mo, las unidades de congelación deben mantenerse 
a una temperatura que garantice que los productos manten gan una temperatura de -18ºC en el centro térmico. 
Ambas unidades deben contar con termómetros en lugar visible. 
6.15 Disposiciones específicas. 
6.15.1 Productos cocidos refrigerados y congelados. 
6.15.1.1 Los productos congelados no envasados, inmedi atamente, deben glasearse o empacarse para 
protegerlos contra la deshidratación y la oxidaci ón, durante su permanencia en el almacén frigorífico. 
6.15.1.2 Los productos de la pesca, que se utilicen como materia prima deben conservarse refrigerados o 
congelados, con la excepción de los moluscos bivalvos vivos, que deben manejarse enhielados o con refrigeración mecánica.  
6.15.1.3  La recepción de los productos objeto de este proceso deben ser vivos para langosta, cangrejo o 
jaibas y moluscos bivalvos, y frescos para camarón. 
6.15.1.4  El área de recepción de estos productos podrá contar con estanques para la conservación del 
producto vivo antes de su proceso, los cuales cont arán con equipos para la recirculación de agua de mar 
limpia. 
6.15.1.5  Para el adormecimiento de estos productos se debe emplear agua potable o agua de mar limpia; 
adicionalmente se podrá utiliz ar metabisulfito de sodio. 
6.15.1.6  El área de cocimiento de los productos debe ser independiente del área destinada a la recepción.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
6.15.1.7  Para el cocimiento se debe contar con instalaciones que proporcionen una fuente de 
calentamiento que no esté en contacto  directo con el agua de cocción. En caso de utilizar vapor como fuente 
de calor se debe contar con instalaciones que ev iten que sus residuos contaminen el producto. 
6.15.1.8 La temperatura de cocción de los productos debe se r en su centro térmico de 82° a 93°C, y podrá 
adicionarse hasta 5% de cloruro de sodio. 
6.15.1.9  Una vez concluida la cocción se debe iniciar el enfriamiento del producto cocido en agua fría a 
una temperatura no superior de 4°C por un tiempo sufici ente hasta alcanzar una temperatura inferior a 30°C 
en el centro térmico del mismo. Para el enfriami ento del agua se podrá emplear hielo y/o equipos de 
refrigeración. El agua empleada para enfriamiento no debe reutilizarse. 
6.15.1.10  Seguido del enfriamiento los productos deben someterse a un lavado con agua potable a 
presión con el fin de eliminar los residuos que se acumulen durante la cocción. 
6.15.1.11  Posterior al lavado los productos se deben refrigerar, por un tiempo suficiente para alcanzar una 
temperatura de 4°C en su centro térmico, de esta oper ación se deben llevar registros gráficos de tiempo y 
temperatura. Cuando por exceso de agua se someta el  producto a un escurrimiento o estilado previo a la 
refrigeración, con el fin de eliminar el agua residual, esta operación se debe efect uar en charolas y en un área 
separada de donde se efectúe la cocción y la recepción. El escurrido no debe ser superior a 4 horas y la 
temperatura del área debe per manecer entre 15° y 20°C. 
6.15.1.12 Posterior a la refrigeración se debe realizar el empaque ya sea de manera individual o en forma 
colectiva. El área de empaque debe mantenerse a una temperatura entre 15° y 20°C y en ningún momento el 
producto debe sobrepasar los 4°C en su centro térmico. 
6.15.1.13  Una vez empacado, el producto debe congelarse y conservarse a temperatura de – 18°C o 
inferior, y debe contarse con registro gr áfico de las temperaturas hasta su embarque. 
6.15.1.14  Una vez terminada la cocción y de acuerdo a la naturaleza del producto, se podrá emplear 
equipo de Congelación Rápida Individual (IQF), siem pre y cuando esta operación sea seguida del empaque. 
6.15.2 Productos envasados en recipientes de cierre hermético y sometidos a tratamiento térmico. 
Los productos envasados en recipientes de cierre he rmético sometidos a tratamiento térmico, además de 
cumplir con lo establecido en la Norma Oficial Mexicana NOM-130-SSA1-1995, señalada en el apartado de 
referencias, deben cumplir con lo siguiente: 
6.15.2.1 Pasteurizados. 
6.15.2.1.1 Una vez terminada la etapa de enfriamiento y de acuerdo a la naturaleza del producto, será 
enviado al área de separación de carne y selección, la cual debe ser un área independiente y con temperatura 
medio-ambiental de entre 15° y 20°C. El proceso de separ ación de la carne, limpieza y clasificación no debe 
superar las 4 horas y durante esta fase el produc to no podrá superar una temperatura de 4°C. 
6.15.2.1.2 En el caso de que el producto cocido se refrigere para su posterior seleccionado o pelado, el 
almacenamiento no debe superar las 18 horas hasta su tratamiento térmico posterior. 
6.15.2.1.3  Con el fin de eliminar completamente los restos de caparazón o concha de la carne, 
adicionalmente se podrán inspeccionar con luz negra o luz ultravioleta. 
6.15.2.1.4  Una vez separada la carne y de acuerdo a la naturaleza del producto, se procederá al envasado 
y cerrado en recipientes que estén diseñados para el procesamiento térmico. En el caso de cerrado con 
sistemas de doble cierre se deben efectuar pruebas per iódicas y llevar registros que evalúen la efectividad del 
mismo. 
6.15.2.1.5  Cuando se utilicen materiales para el envasado distintos a los recipientes descritos en el punto 
anterior la empresa debe efectuar pr uebas para la evaluación de los cierres de dichos envases de acuerdo a 
las especificaciones del fabricante. En  todo momento el material utilizado para el envasado del producto debe 
garantizar la impermeabilidad del mismo. 
6.15.2.1.6  El equipo debe contar entre sus componentes c on un sistema para graficar las constantes de 
temperatura y tiempo como mínimo, así como con un te rmómetro de mercurio u otro equivalente que pueda 
ser calibrado y/o certificado. 
6.15.2.1.7  Si se utilizan procedimientos de pasteurización c on sistemas de inmersión en agua caliente, la 
tina con el agua de cocimiento debe ser precalentada de acuerdo a las especificaciones del proceso, asimismo la circulación de agua y la temperatura se debe mantener constante duran te el tiempo del proceso. 
6.15.2.1.8  Una vez pasteurizados los productos deben someterse a enfriamiento con agua potable a una 
temperatura no superior a 4°C. El proceso de enfriamiento concluirá cu ando los productos hayan alcanzado 
una temperatura de 4°C en su centro térmico, y una vez terminado el enfriamiento deben ser sometidos a 
refrigeración. Se deben implementar controles de cinta testigo o tinta termosensible que permitan distinguir un 
producto no pasteurizado de uno pasteurizado. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
6.15.2.1.9  Se deben llevar controles gráficos de la tem peratura de conservación durante la refrigeración de 
los productos pasteurizados hasta su distribución. 
6.15.2.1.10  Los estudios de penetración de calor deben ser revalidados después de que se efectúen 
mantenimientos mayores a los equipos o por lo menos  cada 2 años de la operación continua del equipo. 
6.15.2.2 Esterilizados co mercialmente.  
6.15.2.2.1  Se debe contar con un estudio de penetración  de calor para cada uno de los productos que 
sean sometidos a tratamiento térmico, el cual debe estar sust entado científicamente. 
6.15.2.2.2 No debe existir en una misma carga de la autoclave producto de la pesca envasado en 
recipientes de cierre hermético de distintos tamaños. 
6.15.2.2.3  Durante el manejo del envase se debe cuidar que éste no sufra daño físico y evitar la corrosión. 
6.15.2.2.4  Precocción y otros tratamientos previos. 
6.15.2.2.4.1  Se debe contar con control de parámetros  de tiempo y temperatura por escrito. 
6.15.2.2.4.2  Se debe tener cuidado para evitar que las es pecies susceptibles de desarrollar histamina 
alcancen una temperatura mayor a 4°C, si esto sucede , el tiempo de exposición no debe ser mayor a cuatro 
horas, antes de la precocción. 
6.15.2.2.4.3  Con la excepción de los productos que se envasan aún calientes, el enfriamiento del producto 
precocido debe efectuarse con la mayor rapidez posible, con el fin de evitar la proliferación o producción de 
toxinas, y en condiciones que eviten la contaminación del producto. 
6.15.2.2.5  Los establecimientos deben destinar un área de cuarentena, para el control interno de una 
muestra representativa de los productos con pH > 4,6 con el fin de comprobar que: la manipulación de los 
ingredientes antes del tratamiento, el tratamiento térmico, el enfriamiento y el cierre del envase fueron los 
adecuados. Durante este tiempo se realizarán pruebas de incubación de 30 a 37°C durante 10-14 días, para 
después realizar análisis microbiológicos. 
6.15.3  Ahumados. 
6.15.3.1  Todos los pescados crudos que van a ser ahumados deben conservarse congelados o en su caso 
refrigerados, hasta que vayan a ser procesados. 
6.15.3.2  En el salado en seco, el producto debe regresarse al área de refrigeración o pasarse a la cámara 
de ahumado inmediatamente después de la aplicación de la sal. 
6.15.3.3  Cuando el proceso de ahumado se lleve a cabo con madera, ésta no debe ser resinosa y debe 
estar exenta de polvo y sustancias perjudiciales. No debe emplearse para la producción de humo, madera que 
haya sido pintada, barnizada o que haya sido expuesta a químicos. 
6.15.3.4  Los productos ahumados no deben presentar manchas rojizas o verdosas, de origen micótico o 
microbiano. 
6.15.3.5  El secado después del ahumado debe llevarse a cabo a temperaturas de refrigeración. 
6.15.3.6  El producto ahumado debe mantenerse en refri geración a una temperatura máxima de 4°C o en 
congelación a una temperatura máxima de -18°C. 
6.15.3.7  El pescado sometido al proceso de ahumado en caliente y aquel con sabor a humo, para ser 
empacado, necesita calentarse continuamente a una tem peratura interna de cuando menos 63ºC en todo el 
pescado, por un mínimo de 30 minutos y salarse, para  contener no menos de 3,0 por ciento de sal en base 
húmeda en el producto terminado. En el caso de ser em pacado al vacío en atmósfera modificada y controlada 
necesita ser salado, para contener no menos de 3,5 por ciento de sal en base húmeda en el producto 
terminado. El contenido de sal puede disminuir al 3,0 por ciento, siempre y cuando la temperatura a que se 
someta no sea menor de 82ºC, durante 5 minutos o relación equivalente. 
6.15.3.8  El pescado sometido al proceso de ahumado en frío o aquél con sabor ahumado, que no es 
empacado al vacío, debe ser salado en salmuera o sala do en seco, para contener cuando menos 3,5 por 
ciento de sal en base húmeda en el producto terminado. Sin embargo, cuando dicho pescado contiene no menos de 100 mg/kg de nitrito de sodio debe contener no menos de 3,0 por ciento de sal en base húmeda en 
el producto terminado. Cuando este tipo de producto  se congela inmediatamente después del ahumado y el 
enfriamiento, y permanece en ese estado a lo la rgo de todo el almacenamiento, distribución y 
comercialización subsecuentes, debe contener no meno s de 2,5 por ciento de sal en base húmeda en el 
producto terminado. 
6.15.3.9  El pescado sometido a proceso de ahumado en frío y aquél con sabor a ahumado para ser 
empacado al vacío, con atmósfera m odificada o controlada, debe ser salado en salmuera o salado en seco, 
para contener cuando menos 3,0 por ciento de sal en base húmeda en el producto terminado y no menos de 
100 mg/kg de nitrito de sodio. Si no se utiliza el nitrit o de sodio, el contenido de sal en base húmeda en el 
producto terminado debe ser cuando menos de 3,5 por ciento.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
6.15.3.10 Los límites de contenido de sal citados en lo s puntos 6.15.3.7, 6.15. 3.8 y 6.15.3.9 pueden 
substituirse por cualquier combinación de sal y otros aditivos permitidos que permitan obtener una Aw menor 
a 0,95 en la temperatura de almacenaje. 
6.15.4  Salados y secos-salados. 
6.15.4.1 Generales 
6.15.4.1.1  El producto no debe presentar las siguientes ca racterísticas: manchas rojizas o rosas, tejido 
muscular blando, disgregación de su fibra y olor putrefacto. 
6.15.4.1.2  Deben almacenarse en un lugar seco, protegido contra la contaminación y bien ventilado. 
6.15.4.2  Salado 
6.15.4.2.1  Las salmueras utilizadas en los productos deben  estar preparadas con agua potable y sal grado 
alimentario. 
6.15.4.2.2  Se debe controlar con regularidad la salmuera con un salinómetro y mantener su concentración 
al nivel necesario añadiendo sal sólida. 
6.15.4.2.3  Si el pescado ha de permanecer en salmuera para alcanzar la maduración, la primera debe 
conservarse limpia, eliminando la espuma grasa que se forme. 
6.15.4.3  Salazón en seco 
6.15.4.3.1  Debe efectuarse en una cámara fría a una temperatura inferior de 7°C. 
6.15.4.3.2  En el salado en seco, el producto debe regresarse al área de refrigeración inmediatamente 
después de la aplicación de la sal. 
6.15.4.4  Desalazón 
Cuando sea necesario desalar el producto debe emplearse agua potable, que se cambiará con la 
frecuencia necesaria, hasta alcanzar la concentración deseada. 
6.15.4.5  Secado 
El secado debe prevenir la formación de la toxina de Clostridium botulinum . 
7. Especificaciones sanitarias 
7.1 Los productos objeto de esta norma, deben ajustarse a las siguientes especificaciones: 
7.1.1 Sensoriales. 
7.1.1.1 Productos vivos, frescos, refrigerados y congelad os, deben presentar las siguientes características: 
7.1.1.1.1 Pescados: 
7.1.1.1.1.1  La piel debe estar húmeda y brillante, bien adherida a los tejidos subyacentes; 
7.1.1.1.1.2  La mucosidad, en las especies que la posean, debe ser acuosa y transparente, sin olor que dé 
indicios de descomposición; 
7.1.1.1.1.3  Las branquias deben presentar un color brill ante de rosado al rojo intenso, húmedas y 
brillantes, que no sufre modificación al tacto, con olor  marino salino, suave o neutro, excepto las especies de 
elasmobranquios, como el tiburón o la raya, donde pueden tener un ligero olor amoniacal; 
7.1.1.1.1.4  El abdomen debe ser terso, sin diferencia externa con la línea ventral; al corte, los tejidos 
deben ofrecer resistencia; con el poro anal cerrado; las vísceras de colores vivos y bien diferenciados; las 
paredes interiores brillantes, los vasos sanguíneos llenos y resistentes a la presión digital; y con olor marino 
salino, suave o neutro, excepto las especies de el asmobranquios, como el tiburón o la raya, donde pueden 
tener un ligero olor amoniacal, y 
7.1.1.1.1.5  Los músculos deben presentar elasticidad marcada, firmemente adheridos a los tejidos 
subyacentes y que no se desprendan de ellos al ejercer presión digital; con el color brillante natural 
característico, al primer corte. 
7.1.1.1.2 Crustáceos frescos: 
7.1.1.1.2.1  El exoesqueleto debe estar ligeramente húmedo, brillante y consistente, firmemente adherido 
en sus secciones; 
7.1.1.1.2.2  Los apéndices deben ser resistentes y firmes, firmemente adheridos al cuerpo; 
7.1.1.1.2.3  El olor debe ser marino salino, suave o neutro; 
7.1.1.1.2.4  La piel debe estar lisa, húmeda y brillante, sin manchas rojizas o extrañas a la especie; 
7.1.1.1.2.5  El color debe ser el característico de cada especie, y en algunas ocasiones a la estimulación 
pudiera cambiar; Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
7.1.1.1.2.6  El olor debe ser marino salino, suave o neutro , excepto algunas especies como el calamar, que 
pueden tener un olor ligeramente amoniacal; 
7.1.1.1.2.7  Las ventosas deben estar firmemente adheridas  al cuerpo, enteras y bien definidas, con 
succión, y en el caso del calamar deberá estar presente la rádula; 
7.1.1.1.2.8  En los productos con vísceras, éstas deben estar completas, firmes y bien adheridas; 
7.1.1.1.2.9  Contar con músculos húmedos, bien adheridos a la s valvas y tener aspecto esponjoso, de color 
cenizo claro en los ostiones y amarillento en las almeja s y mejillones, los cuales pueden tener variaciones por 
especie, y 
7.1.1.1.2.10  En los gasterópodos el músculo debe estar firmemente adheridos a la concha, la cual debe 
estar completa y dura. 
7.1.2  Físicas. 
7.1.2.1 Materia extraña. 
Los productos de la pesca frescos, refrigerados y congelados y procesados, deben estar exentos de 
materia extraña. 
7.1.3 Químicas. 
7.1.3.1 Productos frescos, refrigerados y congelados (Parte comestible) 
ESPECIFICACION ESPECIES LIMITE M AXIMO
Nitrógeno amoniacal  Pescados (en músculo) 35 mg/100 g 
Dióxido de azufre Crustáceos 100 mg/kg como SO 2 
pH  Moluscos: 
Carne 
líquido intravalvar  
6,0 – 6,5 
7,0 – 7,25 
Histamina  Peces de las familias: Clupeidae, Scombridae, 
Scombresocidae, Pomatomidae y Coryphaenidae. 
Tales como atún, bonito, macarela y sardinas. 100 mg/kg 
 
7.1.3.2  Productos de la pesca procesados  
ESPECIFICACION LIMITE M AXIMO (mg/kg) 
Histamina * 100 
* Para especies de las familias Scombridae , Clupeidae , Coryphenidae , Scombresocidae y Pomatomidae . 
7.1.4 Fisicoquímicas. 
7.1.4.1 Productos de la pesca procesados  
7.1.4.1.1 Salados y secos-salados 
ESPECIFICACIONES LIMITE M AXIMO (mg/kg) 
Aw 0,85 
Humedad 40 % 
Cloruro de sodio 20 % 
 
7.1.5 Microbiológicas. 
7.1.5.1 Productos frescos, refrigerados y congelados (Parte comestible) 
ESPECIFICACION ESPECIES LIMITE M AXIMO
Coliformes fecales y/o E. 
coli Pescados y crustáceos 400 NMP/g 
Moluscos bivalvos 230 NMP/100 g de carne 
y líquido valvar 
Moluscos cefalópodos y gasterópodos 230 NMP/100 g de carne
Vibrio cholerae O:1 y  no 
O:1 Moluscos bivalvos Ausente en 50 g 
Demás productos de la pesca* Ausente en 50 g       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
Salmonella  spp Todas Ausente en 25 g 
Vibrio parahaemolyticus * Moluscos bivalvos y crustáceos 10 4 NMP/g 
Vibrio vulnificus * Moluscos bivalvos Ausente en 50 g 
Listeria monocytogenes* Todas Ausente en 25 g 
Clostridium botulinum* Todas (sólo en productos preenvasados al vacío) Ausente 
Staphylococcus aureus Todas 1000 UFC/g 
Enterotoxinas 
estafilococcicas * Todas Negativo 
* Bajo situaciones de emergencia sanitaria la Secretaría  de Salud sin perjuicio de las atribuciones de otras 
Dependencias del Ejecutivo Federal, determinará los casos en los que habrá de identificar la presencia del patógeno o la toxina. 
7.1.5.2 Productos de la pesca procesados 
7.1.5.2.1 Esterilizados comercialmente 
ESPECIFICACION LIMITE M AXIMO 
Termófilos anaerobios esporulados  Negativo 
Mesófilos anaerobios esporulados  Negativo 
Termófilos aerobios esporulados  Negativo 
Mesófilos aerobios es porulados  Negativo 
Toxina botulínica* Ausente en todo el contenido del envase 
Enterotoxina estafilocóccica* Ausente en todo el contenido del envase 
* Bajo situaciones de emergencia sanitaria la Secretaría  de Salud, sin perjuicio de las atribuciones de otras 
dependencias del Ejecutivo Federal, determinará los caso s para identificar la presencia de esta toxina. 
7.1.5.2.2 Pasteurizados  
ESPECIFICACIONES LIMITE M AXIMO 
Salmonella spp Ausente en 25 g 
Enterotoxina estafilocóccica * Negativo 
Coliformes fecales y/o E. coli  < 10 UFC/g 
Listeria monocytogenes *  Ausente en 25 g 
Clostridium botulinum * Ausente 
Vibrio cholerae O:1 y no O:1*  Ausente en 50 g 
Vibrio parahemolitycus* Negativo 
* Bajo situaciones de emergencia sanitaria la Secretaría  de Salud, sin perjuicio de las atribuciones de otras 
dependencias del Ejecutivo Federal, determinará los casos para identificar la presencia del patógeno o la 
toxina. 
7.1.5.2.3 Ahumados 
ESPECIFICACIONES LIMITE M AXIMO 
Coliformes fecales  < 230 NMP/g 
Salmonella spp  Ausente en 25 g 
Enterotoxina estafilocó ccica *  Negativo 
Listeria monocytogenes *  Ausente en 25 g 
Clostridium botulinum *  Ausente 
Vibrio cholerae O:1*  Ausente en 50 g 
* Bajo situaciones de emergencia sanitaria la Secretaría  de Salud, sin perjuicio de las atribuciones de otras 
Dependencias del Ejecutivo Federal, determinará los casos para identificar la presencia del patógeno o la toxina. 
7.1.5.2.4 Salados y secos-salados 
ESPECIFICACION LIMITE M AXIMO 
Enterotoxina estafilo cóccica* Negativo 
Salmonella spp Ausente en 25 g 
* Bajo situaciones de emergencia sanitaria la Secretaría  de Salud, sin perjuicio de las atribuciones de otras 
Dependencias del Ejecutivo Federal, determinará los caso s para identificar la presencia de esta toxina. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
7.1.5.2.5 Semipreparados 
Producto  Enterotoxina 
estafilocóccica* Salmonella spp
 Coliformes 
fecales Vibrio cholerae O:1 
y no O:1 
toxigénico* 
Crudos o precoci dos, empanizados o 
rebozados (capeados), empanadas y 
congelados Negativo Ausente en 25 g < 230 NMP/g Ausente en 50 g 
Crudos, marinados o en salmuera Negativo Ausente en 25 g < 230 NMP/g Ausente en 50 g 
* Bajo situaciones de emergencia sanitaria la Secretaría  de Salud, sin perjuicio de las atribuciones de otras 
Dependencias del Ejecutivo Federal, determinará los casos para identificar la presencia del patógeno o la 
toxina. 
7.1.5.2.6 Emulsionados  
ESPECIFICACION LIMITE MAXIMO 
Enterotoxina estafilo cóccica * Negativo 
Salmonella spp Ausente en 25 g 
Coliformes fecales < 230 NMP/g 
* Bajo situaciones de emergencia sanitaria la Secretaría  de Salud, sin perjuicio de las atribuciones de otras 
Dependencias del Ejecutivo Federal, determinará los ca sos para identificar la presencia de la toxina. 
7.1.6 Parásitos. 
7.1.6.1 Durante su producción y antes del despacho al consumo humano, los pescados deben ser 
sometidos a un examen a contraluz para detectar parásitos visibles. 
7.1.6.2 Los pescados no deben exceder los siguientes límites: 
ESPECIFICACION LIMITE MAXIMO 
Parásitos del género G nathostoma y Paragonimus (Sólo 
en peces de agua dulce o salobre)  Ausente  
Parásitos con cápsula >3 mm de diámetro 2/kg de unidad de muestra 
Parásitos no encapsulados > 10 mm de longitud 1/kg de unidad de muestra 
 
7.1.7 Biotoxinas marinas. 
ESPECIFICACION ESPECIES LIMITE MAXIMO 
Toxina amnésica de moluscos (Acido domoico)* Moluscos 20 mg/kg en carne 
Toxina neurotóxica de moluscos (Brevitoxina) Moluscos 20 UR /100 g 
Toxina paralizante de moluscos (Saxitoxina) Moluscos 800 μg/kg de carne 
Toxina diarreíca de Moluscos (Bioensayo en ratón)* Moluscos 160 μg/kg 
Toxina ciguatera (Ciguatoxina )  Peces de zonas tropicales 
y subtropicales 2,5 UR / 100g 
* Bajo situaciones de emergencia sanitaria la Secretaría  de Salud sin perjuicio de las atribuciones de otras 
Dependencias del Ejecutivo Federal, determinará los caso s en los que habrá de identificar la presencia de la 
toxina. 
7.1.8 Metales pesados. 
7.1.8.1 Productos frescos, refrigerados y congelados (parte comestible) 
ESPECIFICACION ESPECIES LIMITE MAXIMO 
Arsénico total Crustáceos y Moluscos bivalvos 80 mg/kg 
Cadmio (Cd) Moluscos 
Otras 2,0 mg/kg 
0,5 mg/kg 
Metilmercurio Pescados como at ún, marlín, mero, y bonito 
Otras 1,0 mgkg 
0, 5 mg/kg 
Plomo (Pb) Pescados y crustáceos 0,5 mg/kg 
 Moluscos 1 mg/kg 
       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
7.1.8.2 Productos de la pesca procesados 
ESPECIFICACION LIMITE MAXIMO (mg/kg) 
Cadmio (Cd) 0,5 
Metilmercurio 1,0 pescados como atún, marlín, mero, y bonito 
0,5 otras 
Plomo (Pb) 1,0 
Estaño (Sn)* 100,0 
* Unicamente para los productos enlatados. 
7.1.9 Residuos de medicamentos veterinarios. 
Los productos objeto de esta Norma deben cumplir con las especificaciones establecidas para 
medicamentos veterinarios conforme a los ordenami entos aplicables, considerando que en los productos no 
debe detectarse residuos de cloran fenicol, nitrofuranos y sulfas. 
7.1.10 Aditivos para alimentos. 
Unicamente se permite el empleo de los aditivos en lo s niveles y productos establecidos en el apéndice 
normativo A de esta norma. 
8. Clasificación de áreas 
8.1 Para efectos de esta Norma las áreas se clasifican de la siguiente manera, la cual debe demostrarse 
mediante estudios sanitarios: 
8.1.1 Area aprobada. 
8.1.1.1 Aquélla que cumple con las especificaciones siguientes: 
MICROORGANISMOS LIMITE MAXIMO 
Bacterias coliformes fecales La mediana o el promedio geométrico del NMP del agua, no excede de 
14 NMP/100 mL y no mas del 10% de las muestras excede de 43 NMP/100mL para la prueba de dilución decimal de 5 tubos. El promedio 
geométrico deberá realizarse mediante un muestreo anual de 30 
muestras de cada uno de los puntos de monitoreo.  
 
8.1.1.2 El área aprobada no debe encontrarse bajo los ca sos mencionados en los incisos del 8.1.5.1.1 al 
8.1.5.1.4 del nu meral 8.1.5.1. 
8.1.1.3  Para mantener el estatus de área aprobada, se debe realizar un monitoreo regular anual de agua y 
producto. 
8.1.2 Area aprobada condicionalmente. 
8.1.2.1 Aquélla que cumple con el siguiente criterio: 
Las áreas de producción que están sujetas a contaminación microbiológica intermitente, son las que se 
pueden clasificar como aprobadas condicionalmente, esta  alternativa se puede utilizar cuando existe interés 
sobre un área que esté afectada por eventos de c ontaminación predecibles en tiempo y la cosecha de 
moluscos bivalvos sea destinada a venta directa en determinadas épocas del año. Así también, la calidad 
sanitaria del área puede estar afectada por poblaciones  estacionales, fuentes de contaminación no puntuales 
o por el uso esporádico de muelles o de puertos. 
8.1.2.2 Por lo anterior, el área debe estar sujeta a un programa de manejo que contenga los siguientes 
puntos: 
8.1.2.2.1  Evaluación de fuentes potenciales de contaminación en términos de sus efectos en el agua y en 
el área. 
8.1.2.2.2  Monitoreo rutinario de agua de mar y de producto. 
8.1.2.2.3  Disponibilidad de instalaciones y condicio nes de operación para el tratamiento de aguas 
residuales descargadas directa o indi rectamente por el efluente en el área. 
8.1.2.2.4  Condiciones para la apertura o clausura. Esta área está sujeta a reaperturas o clausuras, las 
cuales están determinadas por los resultados de los a nálisis bacteriológicos establecidos para un área 
aprobada y prohibida respectivamente. 
8.1.3 Area restringida. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
8.1.3.1 Aquélla que cumple con las especificaciones siguientes: 
MICROORGANISMOS LIMITE MAXIMO 
Bacterias coliformes fecales La mediana o el promedio geométrico del NMP del agua, no excede 
de 88 NMP/100 mL y no mas del 10% de las muestras excede de 
260 NMP/100mL para la prueba de dilución decimal de 5 tubos. El promedio geométrico deberá realizarse mediante un muestreo anual 
de 30 muestras de cada uno de los puntos de monitoreo. 
 
8.1.3.2 El área restringida no debe encontrarse bajo los ca sos mencionados en los incisos del 8.1.5.1.1 al 
8.1.5.1.4 del nu meral 8.1.5.1. 
8.1.3.3 Los moluscos cosechados en áreas restringidas deben ser reinstalados o depurados o sometidos a 
un tratamiento térmico u otro proces o que elimine organismos patógenos. 
8.1.4  Area condicionalmente restringida.  
8.1.4.1  Aquella que cumple con: 
8.1.4.1.1 Las especificaciones de área restringida cu ando se encuentra en condición abierta. 
8.1.4.1.2 Las condiciones establecidas para área pr ohibida cuando está en condición cerrada. 
8.1.4.2  Los moluscos bivalvos provenientes de esta área deben reinstalarse o depurarse o ser sometidos a 
un tratamiento térmico u otro proces o que elimine organismos patógenos.  
8.1.5 Area prohibida. 
8.1.5.1 Aquella en la cual la calidad del agua rebase los límites máximos establecidos para el área 
restringida y en los siguientes casos: 
8.1.5.1.1  Que estén contaminadas con aguas residuales, dom ésticas, municipales, industriales, agrícolas, 
de embarcaciones, plataformas u otras instalaciones lacustres o marinas; 
8.1.5.1.2  Que estén afectadas por derrames de material es que contengan sustancias tóxicas como 
consecuencias de contingencias; 
8.1.5.1.3  Que estén afectadas con residuos de material radiactivo; 
8.1.5.1.4  Que estén afectadas por marea roja o biotoxinas naturales, diferentes a las presentes en  marea 
roja; 
8.1.5.1.5  Que estén sujetas a veda sanitaria o que estén contaminadas por otras f uentes no contempladas 
en esta Norma, y 
8.1.5.1.6  Que no cuente con un estudio sanitario como el señalado en el numeral 3.27. 
8.2 Las áreas de cosecha clasificadas como aproba das, condicionalmente aprobadas, condicionalmente 
restringidas y restringidas deberán c ontar con un programa de monitoreo de fitoplancton y biotoxinas marinas. 
A partir de los resultados de éste podrá establecerse la aplicación de la veda sanitaria. 
9. Muestreo 
El procedimiento de muestreo para los productos objeto de esta norma, debe sujetarse a lo que establece 
la Ley General de Salud y las disposiciones jurídicas aplicables. 
10. Métodos de prueba 
Para la verificación oficial de las especificaciones sanitarias que se establecen en esta norma se deben 
aplicar los métodos de prueba señalados en el Apéndice Normativo B. 
11. Etiquetado La información sanitaria que debe figurar en la etiqueta de los productos preenvasados objeto de esta 
norma, además de cumplir con la NO M-051-SCFI/SSA1-2010, señalada en el  apartado de referencias, según 
corresponda, debe sujetarse a lo siguiente: 
11.1 Cuando el producto haya sufrido alguna modificaci ón en su composición nutrimental, la denominación 
debe corresponder a la establecida en la NOM-086-SSA1- 1994, señalada en el apartado de referencias. 
11.2 En la lista de ingredientes debe emplearse el nombre específico de los mismos, para el caso de las 
especies de los productos de la pesca empleadas, debe decl ararse el nombre común y el nombre científico de 
la especie de manera que no induzca al consumidor a engaños. Sin interferir con lo establecido en las 
regulaciones de otras Dependencias excepto los incl uidos en la NOM-084-SCFI-1994, señalada en el 
apartado de referencias.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
11.3 Si la identificación del lote corresponde a la fecha de caducidad, se debe anteponer la leyenda: “Lote 
y fecha de caducidad”. 
11.4 Los productos refrigerados deben presentar la fecha de caducidad. 
11.5 Los productos congelados, deben presentar la fecha de caducidad o de consumo preferente. 
11.6 En el caso de los moluscos bivalvos frescos, refrigerados o congelados, debe figurar en la etiqueta la 
fecha de extracción, área de producción, número de certificado de exportación e importación del producto 
cuando proceda, día, mes y año de elaboración. 
11.7 Leyendas de conservación. 
11.7.1 Los productos de la pesca refrigerados, deben incluir el texto “Manténgase en refrigeración a 
máximo 4ºC” u otra análoga. 
11.7.2 Los productos congelados deben incluir el texto “Consérvese en congelación a una temperatura 
máxima de - 18ºC” y “una vez descongelado, no debe volverse a congelar” u otras análogas. 
11.7.3 Para los productos crudos o precocidos, la etiq ueta debe contener una leyenda que refiera al 
consumo del producto cocido, como: “El consumo crudo o poco cocido de productos de la pesca, puede 
incrementar el riesgo de adquirir una enf ermedad alimentaria” o leyenda análoga. 
11.8 En el caso de que los productos objeto de esta norma contengan o incluyan productos preenvasados 
como parte de promociones u obsequios, tales como salsas, aderezos, etc., se debe incluir en el envase del 
producto de promoción u obsequio, cuando menos la sigu iente información: lista de ingredientes, identificación 
del responsable del proceso, lote y fecha de caducidad, cuando aplique.  
11.9 Especificaciones para productos a granel. 
11.9.1 Los productos envasados en punto de venta, deb en presentar en etiqueta adherida, cuando menos 
la siguiente información: 
11.9.1.1  Nombre o denominación del producto. 
11.9.1.2  Fecha de envasado o de caducidad. 
11.9.1.3  Leyendas de conservación. 
12. Envase y embalaje 
12.1 Los productos objeto de esta norma se deben en vasar con materiales inocuos y resistentes a 
distintas etapas del proceso, de tal manera que no alteren las características físicas, químicas y sensoriales 
de estos últimos. 
12.2 Las superficies interiores de los envases  no deben reaccionar con el contenido. 
12.3 Para su embalaje se debe usar material resistente que ofrezca la protección adecuada a los envases 
para impedir su deterioro exterior, a la vez que faci lite su manipulación, almacenamiento y distribución. 
13. Concordancia con normas internacionales Esta norma es parcialmente equivalente con las siguientes normas internacionales: 
13.1 Codex Alimentarius. ALINORM 01/18. Apéndice  V. Anteproyecto de Código Internacional 
Recomendado de Prácticas para el Pescado y los Productos Pesqueros. 
13.2 Codex Alimentarius. ALINORM 01/18. Apéndice III. Anteproyecto de enmienda a la norma de 
sardinas y productos análogos en conserva. 
13.3 Codex Alimentarius. ALINORM 01/18. Apéndice V I. Anteproyecto de norma para el arenque del 
Atlántico salado y el espadín salado. 
13.4 Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apéndice VII. Proyecto de norma revisada para barritas, 
porciones y filetes de pescado empanados  o rebozados congelados rápidamente. 
13.5 Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apéndice IX. Proyecto de norma revisada para la carne de 
cangrejo en conserva. 
13.6 Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apéndice X. Proyecto de norma revisada para pescados en 
conserva. 
13.7 Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apéndice XI. Proyecto de norma revisada para el salmón en 
conserva. 
13.8 Codex Alimentarius. ALINOR M 95/18. Apéndice XII. Proyecto de norma revisada para las sardinas y 
productos análogos en conserva. 
13.9 Codex Alimentarius. ALINORM 95/18 . Apéndice XIII. Proyecto de no rma revisada para  los camarones 
en conserva. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
13.10 Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apéndice XIV.  Proyecto de norma revisada para el atún y el 
bonito en conserva. 
13.11 Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apéndice XV. Proyecto de norma revisada para pescado 
salado y pescado seco salado de la familia gadidae. 
14. Bibliografía 14.1 Ley Federal sobre Metrología y Normalización. México, D. F. 
14.2 Ley General de Salud. México, D. F. 
14.3 Reglamento de la Ley Federal sobre Metr ología y Normalización. México, D. F. 
14.4 Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios. México, D. F. 
14.5 Reglamento de la Comisión Federal para la Prote cción contra Riesgos Sanitarios. México, D. F. 
14.6 NOM-Z-13-1997. Guía para la Redacción, Estructuración y Presentación de las Normas Oficiales 
Mexicanas. 
14.7 Administración de Alimentos y Drogas de los Es tados Unidos (FDA), 1998. Guía de Peligros y 
Controles de Pescados y de Productos Pesqueros del FDA, E.U.A. 
14.8 AOAC. 1995. Official Methods of Analysis. 16th Ed ition. U.S.A. 
14.9 Australia New Zealand Food Authority. Stan dard 1.4.1 Subscribe to Food Standards Code. 
Contaminants and Natural Toxicants. 
14.10 Canadian Food Inspection Agency. 20/07/93. Gener al fresh & frozen finfish product standard, 
chapter 3, 5, standard 3. 
14.11  Comunidades Europeas, 28.9.2001. Decisión de la Comisión de 27 de septiembre de 2001, relativa 
a determinadas medidas de protección con respecto a determinados productos de la pesca y de la acuicultura 
destinados al consumo humano y originarios de Indonesia. Diario Oficial de las Comunidades Europeas 
(2001/705/CE). 
14.12 Code of Federal Regulations. 1991. Regulations governing processed fishery products and U.S. 
standards for grades of fishery products. Revi sed as October 1. Washington D.C. U.S.A. 
14.13  Code of Federal Regulations. 1990. "Fish and Shellf ish. Washington D.C. Revised as of April 1. 
14.14 Codex Alimentarius. 1981. Proyecto de norma revisada para los camarones en conserva. CODEX 
Stan 37-1981. Roma, Italia. 
14.15 Codex Alimentarius. 1981. Proyecto de norma revi sada para la carne de cangrejo en conserva. 
Codex Stan 90-1981. Roma, Italia. 
14.16  Comisión del Codex Alimentarius. 1981. Proyecto de Norma Revisada para las Sardinas y 
Productos Análogos en Conserva. CODEX STAN 94-1981. Roma, Italia. 
14.17  Codex Alimentarius. 1981. Proyecto de norma revisada para pescados en conserva. Codex Stan 
119-1981. Roma, Italia. 
14.18 Codex Alimentarius. 1981. Proyecto de norma re visada el salmón en conserva. Codex Stan 3-1981. 
Roma, Italia. 
14.19  Codex Alimentarius. 1981. Proyecto de norma revi sada para del atún y el bonito en conserva. Codex 
Stan 70-1981. Roma, Italia. 
14.20 Comisión del Codex Alimentarius. 1989. Norma del Codex para Pescados y Productos Pesqueros 
STAN.94 Roma, Italia. Miércoles 20 de agosto de 2003 DIARIO OFICIAL 75. 
14.21  Comisión del Codex Alimentarius. Informe de la 29a. reunión del Comité del Codex sobre pescado y 
productos pesqueros. Trondheim, Noruega, 18-23 de febrero de 2008.14.35 Food and Agriculture 
Organization of the Nations. 1989. Food Safety Regulations Applied to Fish by Major Importing Countries. Roma, Italia. 
14.22  Comisión del Codex Alimentarius. Informe de la 29a. reunión del Comité del Codex sobre pescado y 
productos pesqueros. Trondheim, Noruega, 18-23 de febrero de 2008. 
14.23  Directiva por la que se fijan las normas sanitarias  aplicables a la producción y a la puesta en el 
mercado de los productos pesqueros. (91/493/CEE). 
14.24  Directrices para emitir aseguramiento de cali dad de productos de la pesca. México, D.F. 1992. 
14.25 Directrices del Codex para la evaluación sensorial de pescados y los mariscos en laboratorio 
CAC/GL 31-1999 
14.26  Epidemiología. Sistema Nacional de Vigilancia Epid emiológica. Núm. 3 Vol. 19. México, D.F. 2002.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
14.27  Food and Agriculture Organization. 1989. Food Safety Regulations Applied to Fish by Major 
Importing Countries. 
14.28  Food and Agriculture Organization FAO/OMS Comité  del Codex Alimentarius 1998. Documento de 
posición sobre el arsénico. La Haya, Holanda. 
14.29 Food and Agriculture Organization. 1989. "Food Safety Regulations Applied to Fish by Major 
Importing Countries". 
14.30  Food and Drug Administration EDRO. 1984. Compliance Guidelines Branch, DFRG Chapter 8-Fish 
and Sea Food Guide 7108.07 U.S.A. 
14.31  Food and Agriculture Organization of the Nations. 1989. Food Safety Regulations Applied to Fish by 
Major Importing Coun tries. Roma, Italia. 
14.32  Guía Técnica del Programa Mexicano de Moluscos Bivalvos. Secretaría de Salud. México,  D.F. 
2009. 
14.33  Industria de Conservas de Productos de la Pesca. Guía para la aplicación del Sistema de Análisis 
de Riesgos y Control de Puntos Críticos (ARCPC). Se ries agroalimentarias. Cuadernos de Calidad. pp.  88-
100. AECI e IICA. 1999. 
14.34 Manual de Técnicas y Procedimientos para A nálisis Microbiológico y Alimentos Enlatados. 
Laboratorio Nacional de Salud Pública. México, D.F. 1989. 
14.35  Normas y métodos de productos de la pesca de la agencia de inspección de alimentos de Canadá y 
de Estados Unidos de América como los estándares  grados de frescura camarón fresco y congelado. 
indicadores de evaluación sensorial de productos de la pesca. 
14.36 Programa conjunto FAO/OMS sobre normas alimentarias. Comisión  del Codex Alimentarius. Informe 
de la 24a. Reunión del Comité del Codex sobre Pescado y Productos Pesqueros. 
14.37  Reglamento (CE) No. 178/2002 (por el que se establecen los principios y los requisitos generales de 
la legislación alimentaría, se crea la Autoridad Euro pea de Seguridad Alimentaria y se fijan procedimientos 
relativos a la seguridad alimentaria) 
14.38  Reglamento (CE) No. 852/2004 del Parlamento Europeo y del Consejo de 29 de abril de 2004 
relativo a la higiene de los productos alimenticios. 
14.39  Reglamento (CE) No. 853/2004 del Parlamento Europeo y del Consejo de 29 de abril de 2004 por el 
que se establecen normas específicas de higiene de los alimentos de origen animal. 
14.40  Reglamento /CE) No 854/2004 del Parlamento Eu ropeo y del Consejo de 29 de abril de 2004, por el 
que se establecen normas específicas para la organización de controles oficiales de los productos de origen 
animal destinados al consumo humano. 
14.41  Reglamento (CE) 2406/96 del Consejo por el que se establecen normas comunes para 
determinados productos pesqueros. 
14.42 Servicio Nacional de Pesca (SERNAPESCA). Estándares de calidad para productos marinos. 
República de Chile. 
14.43  Andrés Silvestre Alejandro. 1996. Toxicología de los Alimentos. Editorial Hemisferio Sur.  pp. 111-
152. 
14.44  Andrew R. Et al. 2000. Incidence of foodborne pathogens on European fish. Food Control 12 (2001) 
67-71. 
14.45  Badui D.S. 1988. Diccionario de Tecnología de los Alimentos. Ed. Alambra Mexicana. 
14.46 Brown, L.D. & R. Dorn. 1977. "Fis h and Shellfish and Human Health". 
14.47  Brownsell, V.L. y col. 1993. Deterioro y Conservaci ón de los Alimentos. En la Ciencia aplicada en el 
estudio de los Alimentos. Ed. Diana. México, D.F. 
14.48  Fernández, E. 2000. Microbiología e inocuidad de los alimentos. Universidad Autónoma de 
Querétaro, México. 
14.49 Food and Drug Administration. 2007 National Shellf ish Sanitation Program. Guide for the control of 
moluscan shellfish. Revision. U.S.A. 
14.50  Hersom A.C. à Hullonded. 1969. Canned Foods 2nd Ed. J & Churchill Ltd. London. 
14.51 Kietzwann/Priebe/Reichsteien. 1974.  "Inspección Veterinaria de Pescados. Ed. Acribia. Zaragoza, 
España. 
14.52 Lamothe-Argumedo, R. 1997. Hospederos definitivo s, intermediarios y paraténicos de Gnathostoma 
en Veracruz y Oaxaca, México. Cuad. Méx. Zool. 3(1) 22-28, 1997. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
14.53  Lamothe-Argumedo, R. et al. 1998. Estado actual de  la gnastostomiasis en México, Anales Inst. Biol. 
Univ. Nac. Autón. México, Ser. Zool. 69 (1): 23-27. 
14.54  Leuger, A. et al. 1999. Marine Toxins. Wien Med. Wochenschr 151 (5-6): 122-5. 
14.55 Lipp EK. 1997. The role of seafood in foodborne in th e United States of Americ a. Rev. Sci Tech Aug: 
16(2): 620-40. 
14.56  Ministerio de Salud. 1986. Disposiciones sanita rias sobre productos de la pesca. República de 
Colombia. 
14.57 Rodríguez, A. M. 2001. Gnatosto miasis. Presentación de un caso. Rev. Cent. Dermatol Pascua Vol. 
10, Núm. 1, Ene-Abr 2001 pp. 15-17. 
14.58  Ruiz Dur Fernández. 1978. "Recursos Pesqueros de las Costas de México". Ed. Limusa México, 
D.F. 
14.59 Sierra-Beltran, AP et al. 1998. An overview of de marine food poisoning in México. Toxicon Nov.; 
36(11): 1493-502. 
14.60 Torres Vitela, R. 1999. Agentes patógenos transmitidos  por alimentos. Vol. 1 Editor Universidad de 
Guadalajara. 
14.61   Wright JL, et al. 1990. Chemistry, biology, and toxicology of domoic acid and its isomers. Can Dis 
Wkly Rep sep;16 suppl 1E:21-6. 
14.62  Los criterios para la verificación de la vent a de productos pesqueros, de Subsecretaría de 
Regulación y Fomento Sanitario de la Dirección General  de Control Sanitario de Bienes y Servicios. 
15. Observancia de la norma 
La vigilancia del cumplimiento de la presente Norma corresponde a la Secretaría de Salud y a los 
gobiernos de las Entidades Federativas, en el ámbito de sus respectivas competencias. 
16. Vigencia 
La presente Norma entrará en vigor a los noventa días  naturales contados a partir de la fecha de su 
publicación en el Diario Oficial de la Federación. 
Transitorio 
Unico.- Con la entrada en vigor de la presente Norma Oficial Mexicana cancela las siguientes normas: 
● Norma Oficial Mexicana NOM-027-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos de la pesca. Pescados 
frescos refrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias, publicada en el Diario Oficial de la 
Federación el 3 de marzo de 1995. 
● Norma Oficial Mexicana NOM-028-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos de la pesca. Pescados 
en conserva. Especificaciones sanitarias, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 3 de 
marzo de 1995. 
● Norma Oficial Mexicana NOM-029-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos de la pesca. 
Crustáceos frescos refrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias, publicada en el Diario 
Oficial de la Federación el 27 de febrero de 1995. 
● Norma Oficial Mexicana NOM-030-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos de la pesca. 
Crustáceos en conserva. Especificaciones sanitarias, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 31 de enero de 1995. 
● Norma Oficial Mexicana NOM-031-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos de la pesca. Moluscos 
bivalvos frescos refrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias, publicada en el Diario Oficial 
de la Federación el 6 de marzo de 1995. 
● Norma Oficial Mexicana NOM-032-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos de la pesca. Moluscos 
bivalvos en conserva. Especificaciones sanitarias, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 6 
de marzo de 1995. 
● Norma Oficial Mexicana NOM-129-SSA1-1995. Bienes y Servicios. Productos de la pesca: secos-
salados, ahumados, moluscos cefalópodos y gasterópodos, frescos-refrigerados y congelados. Disposiciones y especificaciones sanitarias, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 10 de 
diciembre de 1997. 
Sufragio Efectivo. No Reelección. 
México, D.F., a 3 de noviembre de 2010.- El Comisionado Federal para la Protección contra Riesgos 
Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacio nal de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, 
Miguel Angel Toscano Velasco .- Rúbrica.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
APENDICE NORMATIVO A 
ADITIVOS PERMITIDOS 
Se podrán emplear los aditivos enlistados a continuac ión en los productos y concentraciones establecidas, 
según corresponda al producto en cuestión. 
A.1. Productos de la pesca fresco s, refrigerados  y congelados 
ADITIVO PRODUCTO LIMITE MAXIMO 
(mg/kg) 
Ascorbato de potasio 
Ascorbato de sodio Pescados y crustáceos 1000 * 
Acido cítrico  Crustáceos BPF 
Etilendiamino tetracetato disódico 
(EDTA)  Crustáceos 250 
Fosfato tricálcico  Pescados 5000 ** 
Metabisulfito de sodio 
Metabisulfito de potasio Crustáceos 100 
Polifosfato tetrapotásico Pescados 5000 ** 
Pirofosfato tetrasódico Pescados 5000 ** 
Polifosfato de sodio Pescados 5000 ** 
Fosfato monopotásico Pescados 5000 ** 
Fosfato monosódico Pescados 5000 ** 
Sulfito de sodio 
Sulfito de potasio Crustáceos 100 
Trifosfato pentapotásico Pescados 5000 ** 
Trifosfato pentasódico Pescados 5000 ** 
*Expresado como ácido ascórbico. 
**Expresado como P2O5  solos o combinados. 
A.2. Productos de la pesca procesados 
ADITIVO PRODUCTO LIMITE MAXIMO (mg/kg) 
Acetato de almidón Pescados 20 g/kg solos o mezclados 
Atún y bonita 20 g/kg solos o mezclados 
Acido acético glacial Pescados BPF 
Atún y bonita BPF 
Acido algínico Pescados 20 g/kg solos o mezclados 
Atún y bonita 20 g/kg solos o mezclados 
Acido cítrico Cangrejo BPF 
Pescados BPF 
Atún y bonita BPF 
Acido fosfórico Cangrejo 10 g/kg solos o mezclado 
expresados como P 2O5 
Camarones 850 mg/kg de producto final 
Acido láctico Pescados BPF 
Atún y bonita BPF Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Adipato acetilado de dialmidón  Pescados 60 g/kg solos o mezclados
Atún y bonita 60 g/kg solos o mezclados
Agar Pescados 20 g/kg solos o mezclados
Atún y bonita 20 g/kg solos o mezclados
Alginato de amonio Pescados 20 g/kg solos o mezclados
Atún y bonita 20 g/kg solos o mezclados
Alginato de calcio Pescados 20 g/kg solos o mezclados
Atún y bonita 20 g/kg solos o mezclados
Alginato de potasio Pescados 20 g/kg solos o mezclados
Atún y bonita 20 g/kg solos o mezclados
Alginato de sodio Pescados 20 g/kg solos o mezclados
Atún y bonita 20 g/kg solos o mezclados
Almidón hidroxipropilado Pescados 20 g/kg solos o mezclados
Atún y bonita 20 g/kg solos o mezclados
Almidón blanqueado Atún y bonita BPF 
Butilhidroxitolueno Atún y bonita 100 ppm 
Carboximetilcelulosa sódica Pescados 2,5 g/kg 
Atún y bonita 2,5 g/kg 
Carragenina Pescados 20 g/kg solos o mezclados
Atún y bonita 20 g/kg solos o mezclados
Dialmidón glicerol Pescados 60 g/kg solos o mezclados
Atún y bonita 60 g/kg solos o mezclados
Dialmidón glicerol 
hidroxipropilado Pescados 60 g/kg solos o mezclados
Atún y bonita 60 g/kg solos o mezclados
Etilendiamino tetracetato 
disódico-cálcico Cangrejo 250 mg/kg 
Camarones final 250 mg/kg de producto
Fosfato de dialmidón Pescados 60 g/kg solos o mezclados
Atún y bonita 60 g/kg solos o mezclados
Fosfato acetilado de dialmidón  Pescados 60 g/kg solos o mezclados
Atún y bonita 60 g/kg solos o mezclados
Fosfato de hidroxipropil dialmidón Pescados 60 g/kg solos o mezclados
Atún y bonita 60 g/kg solos o mezclados
Fosfato de monoalmidón Pescados 60 g/kg solos o mezclados
Atún y bonita 60 g/kg solos o mezclados
Glicerol de dialmidón acetilado Pescados 60 g/kg solos o mezclados
Atún y bonita 60 g/kg solos o mezclados
Glutamato monosódico Cangrejo 500 mg/kg 
Goma de algarrobo Pescados 20 g/kg solos o mezclados
Atún y bonita 20 g/kg solos o mezclados
Goma guar Pescados 20 g/kg solos o mezclados
Atún y bonita 20 g/kg solos o mezclados
Goma tragacanto Pescados 20 g/kg solos o mezclados
Atún y bonita 20 g/kg solos o mezclados
Goma xantano Pescados 20 g/kg solos o mezclados
Atún y bonita 20 g/kg solos o mezclados      (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
Lactato de sodio Embutidos, esterilizados 
comercialmente; 
Atún y bonita esterilizados 
comercialmente y en recipientes 
de cierre hermético y sometidos 
a tratamiento térmico. 
Pescados envasados en 
recipientes de cierre hermético 
y sometidos a tratamiento 
térmico. BPF 
Pectinas y las siguientes sales: 
Pectato de amonio, de calcio, de 
potasio o de sodio Pescados Atún y bonita 2,5 g/kg 
Pirofosfato disódico 
Pirofosfato tetrasódico Cangrejo Atún y bonita 10 g/kg expresados como P 2O5 
o mezclados 
Tartrazina Camarones 30 mg/kg de producto final, solos 
o mezclados 
Amarillo ocaso FCF Camarones 30 mg/kg de producto final, solos 
o mezclados 
 
A.3. Productos de la pesca ahumados 
ADITIVO LIMITE MAXIMO 
Bicarbonato de sodio BPF 
Butilhidroxianisol 100 ppm 
Dióxido de silicio amorfo BPF 
Eritorbato de sodio BPF 
Nitrito y nitrato de sodio (expresados como nitrito de sodio) 156 mg/kg 
Sorbato de potasio 0,1% 
 
A.4. Productos de la pesca salados y secos-salados 
ADITIVO PRODUCTO LIMITE MAXIMO 
Acido sórbico; y las siguientes 
sales: 
Sorbato de sodio, potasio y calcio Pescado salado y pescado seco y 
salado 
 200 mg/kg del producto final solos 
o mezclados, expresados como 
ácido sórbico. 
 
A.5. Productos de la pesca semipreparados: crudos o precocidos, empanizados o rebozados y 
congelados 
ADITIVO PRODUCTO LIMITE MAXIMO 
Acetato de almidón En el rebozado o empanado BPF 
Acido ascórbico o sus sales de sodio o de potasio En filetes y carne de pescado 
picada BPF 
Acido cítrico o sus sales de sodio o 
potasio Carne de pescado picada 
En el rebozado o empanado BPF 
Acido láctico En el rebozado o empanado BPF 
Acido L-glutámico En el rebozado o empanado BPF 
Adipato acetilado de dialmidón  En el rebozado o empanado BPF 
Alginato de calcio 
 En filetes y carne de pescado 
picada BPF 
 Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Alginato de sodio En el rebozado o empanado BPF 
Almidón hidroxipropilado. En el rebozado o empanado BPF 
Almidón oxidado En el rebozado o empanado BPF 
Almidones tratados con ácidos En el rebozado o empanado BPF 
Almidones tratados con álcalis En el rebozado o empanado BPF 
Ascorbato de potasio Embutidos, semipreparados, 
crudos o precocidos 
empanizados o rebozados y 
congelados, crudos marinados o en salmuera, emulsionados, 
modificados en su composición, 
y envasados en recipientes de cierre hermético y sometidos a tratamiento térmico. BPF 
Ascorbato de calcio Embutidos, semipreparados, 
crudos o precocidos 
empanizados o rebozados y 
congelados, crudos marinados o en salmuera, emulsionados, 
modificados en su composición, 
y envasados en recipientes de cierre hermético y sometidos a tratamiento térmico. BPF 
Beta caroteno sintético En el rebozado o empanado 100 mg/kg, solos o en 
combinación 
Beta-apo-8´-carotenal En el rebozado o empanado 100 mg/kg, solos o en 
combinación 
Carbonato de amonio En el rebozado o empanado BPF 
Carbonato de potasio En el rebozado o empanado BPF 
Carbonato de sodio En el rebozado o empanado BPF 
Carbonato de amonio hidrogenado  En el rebozado o empanado BPF 
Carbonato de potasio hidrogenado  En el rebozado o empanado BPF 
Carbonato de sodio hidrogenado  En el rebozado o empanado BPF* 
Carboximetilcelulosa de sodio  Carne de pescado picada 
En el rebozado o empanado BPF 
 
Carragenina Carne de pescado picada 
En el rebozado o empanado BPF 
 
Color Caramelo clase I En el rebozado o empanado BPF 
Extracto de annato (extracto De semillas de Bixa orellana ) En el rebozado o empanado 20 mg/kg expresada como bixina 
Fosfato de aluminio y sodio En el rebozado o empanado 1g/kg, solos o en combinación, 
expresados como P 2O5 
Fosfato de dialmidón En el rebozado o empanado BPF 
Fosfato acetilado de dialmidón  En el rebozado o empanado BPF 
Fosfato de dialmidón fosfatado En el rebozado o empanado BPF 
Fosfato de hidroxipropil dialmidón  En el rebozado o empanado BPF 
Fosfato de monoalmidón En el rebozado o empanado BPF 
Fosfato de calcio dihidrogenado En el rebozado o empanado 1g/kg, solos o en combinación, 
expresados como P 2O5       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
Fosfato de potasio dihidrogenado  En filetes y carne de pescado 
picada 10 g/kg solos o mezclados 
expresados como P 2O5 (con 
inclusión de los fosfatos 
naturales) 
Fosfato de sodio dihidrogenado En filetes y carne de pescado 
picada 10 g/kg solos o mezclados 
expresados como P 2O5 
(con inclusión de los fosfatos 
naturales) 
Fosfato de calcio hidrogenado  En el rebozado o empanado 1g/kg, solos o en combinación, 
expresados como P 2O5 
Glutamato monopotásico En el rebozado o empanado BPF 
Goma de algarrobo Carne de pescado picada 
En el rebozado o empanado BPF 
 
Goma guar Carne de pescado picada 
En el rebozado o empanado BPF 
 
Goma xantano Carne de pescado picada 
En el rebozado o empanado BPF 
 
Hidroxipropil metil celulosa En el rebozado o empanado BPF 
Hidroxipropil celulosa En el rebozado o empanado BPF 
Lecitina En el rebozado o empanado BPF 
Metil celulosa Carne de pescado picada 
En el rebozado o empanado BPF 
 
Metil etil celulosa En el rebozado o empanado BPF 
Mono y diglicéridos En el rebozado o empanado BPF 
Palmitato de ascorbilo En filetes y carne de pescado 
picada 1g/kg, expresados como ácido 
cítrico, solo o en combinación con 
ácido ascórbico. 
Pectinas Carne de pescado picada 
En el rebozado o empanado BPF 
 
Pirofosfato disódico En el rebozado o empanado 1g/kg, solos o en combinación, 
expresados como P 2O5 
Pirofosfato tetrapotásico En filetes y carne de pescado 
picada 10 g/kg solos o mezclados 
expresados como P 2O5 (con 
inclusión de los fosfatos 
naturales) 
Pirofosfato tetrasódico En filetes y carne de pescado 
picada 10 g/kg solos o mezclados 
expresados como P 2O5 (con 
inclusión de los fosfatos 
naturales) 
Polifosfato de sodio En filetes y carne de pescado 
picada 10 g/kg solos o mezclados 
expresados como P 2O5 (con 
inclusión de los fosfatos 
naturales) 
Trifosfato pentapotásico En filetes y carne de pescado 
picada 10 g/kg solos o mezclados 
expresados como P 2O5 (con 
inclusión de los fosfatos 
naturales) 
Trifosfato pentasódico En filetes y carne de pescado 
picada 10 g/kg solos o mezclados 
expresados como P 2O5 (con 
inclusión de los fosfatos 
naturales) Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
 
A.6. Productos de la pesca emulsionados 
ADITIVO LIMITE MAXIMO 
Acetato de almidón  BPF 
Acido algínico  BPF 
Acido ascórbico y su sal de sodio  BPF 
Acido cítrico  BPF 
Acido eritórbico  BPF 
Acido L-glutámico  BPF 
Acido sórbico y sus sales de sodio y potasio 1 g/kg la suma de los conservadores no podrá ser 
mayor a 1 g/kg 
Adipato acetilado de dialmidón  BPF 
Agar BPF 
Alginato de amonio BPF 
Alginato de calcio BPF 
Alginato de potasio BPF 
Alginato de sodio BPF 
Almidón hidroxipropilado BPF 
Ascorbato de potasio BPF 
Ascorbato de calcio BPF 
Carragenina BPF 
Dialmidón glicerol Hidroxipropilado 60 g/kg solos o mezclados 
Etilendiamino tetracetato disódico cálcico 75 mg/kg en producto final 
Fosfato de dialmidón BPF 
Fosfato acetilado de dialmidón  BPF 
Fosfato de hidroxipropil dialmidón  BPF 
Fosfato de monoalmidón BPF 
Glicerol de dialmidón acetilado 60 g/kg solos o mezclados 
Glutamato monosódico BPF 
Goma de algarrobo BPF 
Goma guar BPF 
Goma tragacanto BPF 
Goma xantano BPF 
Nitratos o nitritos de sodio o potasio 0,15 g/kg expresados como nitritos 
Pirofosfato disódico 5 g/kg solos o mezclados expresados como P 2O5 
Pirofosfato tetrasódico 5 g/kg solos o mezclados, expresados como P 2O5 
Rojo allura AC y sus lacas 100 mg/kg de producto final 
Mezcla de tocoferoles concentrados 0,05 g/kg 
 
APENDICE NORMATIVO B 
B.1 Precauciones generales de seguridad. 
B.1.1  El analista debe consultar siempre la información respecto a la exposición y manejo seguro de los 
reactivos químicos especificados en estos métodos, para emplear el equipo de seguridad apropiado como 
bata de laboratorio, guantes de látex, anteojos de segu ridad, mascarilla, etc. y trabajar cuando así se requiera 
bajo campana de extracción. 
B.1.2  Para la aplicación de los siguientes métodos analíticos se debe cumplir con las Buenas Prácticas de 
Laboratorio.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.2 DETERMINACION DE MATERIA EXTRAÑA EN PESCADO (ENLATADO) Y PRODUCTOS DE LA 
PESCA FRESCOS REFRIGERADOS Y CONGELADOS. 
B.2.1 Principio del método. La materia extraña se separa por flotación y posteriorment e se filtra para su observación al microscopio. 
B.2.2 Equipo. B.2.2.1  Balanza granataria con una precisión de 0,1 g 
B.2.2  Microscopio binocular estereoscópico con objeti vos que pueden ser de 3, 6, 7 y 10 X y oculares 
apareados de amplio campo visual de 10, 30 y 100 X respectivamente. 
B.2.2.3  Equipo de filtración al vacío. 
B.2.2.4  Lámpara para el microscopio o luz natural equivalente. 
B.2.2.5  Parrilla de calentamiento con agitación magnética. 
B.2.3  Materiales. 
B.2.3.1  Percolador de 2 L. 
B.2.3.2  Matraz de 1,5 L 
B.2.3.3  Embudo Buchner. 
B.2.3.4  Vaso de precipitado de 600 mL. 
B.2.3.5  Papel de filtración rápida rayado para conteo c on líneas paralelas de aproximadamente 5 mm de 
separación. 
B.2.3.6  Material de uso común en el laboratorio. 
B.2.4 Reactivos. 
B.2.4.1  Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por 
agua se entiende agua destilada. 
B.2.4.2  Isopropanol (C
3H8O) 
B.2.4.3  Acido clorhídrico (HCl) 
B.2.4.4 Aceite mineral. Aceite de parafina, blanco y liger o. Con un peso específico de 0,840-0,860 (25 ºC) 
B.2.4.5  Solución detergente al 5% 
B.2.5 Procedimiento. 
B.2.5.1  Pesar 225 g de muestra y transferir a un matraz de 1,5 L. Romper los grumos con espátula. En el 
caso de productos enlatados, lavar la lata comple tamente con pequeñas cantidades de isopropanol y 
adicionar estos lavados al matraz. 
B.2.5.2  Añadir 50 mL de HCl y llevar a un volumen de 8 00 mL con agua. Agitar m agnéticamente y llevar a 
ebullición durante 20 minutos (si el producto forma espuma adicionar agua ocasionalmente) 
B.2.5.3  Adicionar 50 mL de aceite mineral y agitar magnéticamente durante 5 minutos manteniendo la 
ebullición. 
B.2.5.4  Transferir al percolador el cual previamente contiene aproximadamente 250 mL de agua. Mantener 
el matraz de 1,5 L para llenar el percolador con agua durante los ciclos de rellenado. 
B.2.5.5  Llenar el percolador con agua caliente (55-70ºC) a unos 3 cm de la parte superior. Dejar en reposo 
durante 3 minutos y drenar el contenido a aproximadamente 3 cm de la parte más baja de la capa de aceite  
(si existen grandes cantidades de sólidos suspendi dos, dejar más tiempo en reposo para permitir la 
separación del aceite) 
B.2.5.6  Repetir el drenado y las etapas de rellenado a in tervalos de 3 minutos hasta que la fase acuosa 
esté clara. Finalmente drenar el percolador lentam ente a un volumen mínimo de fase acuosa sin perder la 
fase oleosa. 
B.2.5.7  Drenar la fase oleosa a un matraz de 600 mL. La var el percolador con agua caliente, con solución 
detergente al 5%, agua e isopropanol en secuencia , usando aproximadamente 50 mL por cada lavado. 
B.2.5.8  Colectar los lavados en el matraz de 600 mL. Filt rar a través del papel y observar al microscopio. 
B.2.5.9  Informe de la prueba. 
B.3. BIOENSAYO PARA TOXINA PARALIZANTE EN MOLUSCOS BIVALVOS. B.3.1 Materiales 
B.3.1.1  Ratones machos albinos, sanos, cepa Webste r Suiza, con un peso de 19 a 21 gramos. Los 
animales que pesan de 17 a 19 y de 21 a 23 gramos también pueden ser utilizados en ausencia de animales con el intervalo de peso deseado. No reutilizar ratones sobrevivientes. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
B.3.1.2 Reactivos 
B.3.1.2.1  Solución patrón de saxitoxina de100 µg/mL. 
B.3.1.2.2  Solución de referencia de saxitoxina de1 µg/mL 
B.3.1.2.3  Medir 1 mL de solución patrón en un matraz volumétrico de 100 mL, y llevar al volumen con 
agua destilada acidificada con HCl (pH=3). Esta solución es estable por varias semanas si se almacena a 3 o 4 °C y el pH está entre 2,0 y 4,0. 
B.3.1.2.4  Soluciones de ácido clorhídrico 0,5 N y 0,18 N. 
B.3.2 Procedimiento B.3.2.1  Precaución: Usar guantes de hule, cuando se ma nipulen materiales que puedan contener toxina 
paralizante de los moluscos. 
B.3.2.2  Acondicionamiento del bioensayo. 
B.3.2.3  Diluir alícuotas de 10 mL de la solución de  referencia con 10, 15, 20, 25 y 30 mL de agua, 
respectivamente. Posteriormente inyectar 1 mL de cada  dilución por vía intraperitoneal a unos cuantos ratones 
de prueba. 
B.3.2.4  La mediana del tiempo de muerte debe estar entre 5 y 7 minutos. El pH de las diluciones debe 
estar entre 2 y 4 y en ningún caso debe ser mayor a 4,5. 
B.3.2.5  Probar diluciones adicionales con incrementos de 1 mL de agua destilada. Por ejemplo, si la 
alícuota de 10 mL diluidos con 25 mL de agua mata a lo s ratones en 5 a 7 minutos, preparar soluciones  10 + 
24 y 10 + 26. 
B.3.2.6  Inyectar a un grupo de 10 ratones con 2 diluciones (de preferencia 3), que estén dentro del tiempo 
entre 5 a 7 minutos. Aplicar dosis de 1 mL por vía intraperitoneal a cada ratón. 
B.3.2.7  Registrar el tiempo de inyección y de muerte lo más aproximado posible a intervalos de 5 
segundos. Si se registran 7 segundos, redondear a 5 se gundos. Si se registran 8 segundos redondear a 10 
segundos. El tiempo de muerte es el tiempo transcurrido entre el término de la inyección y el último jadeo  del ratón. 
B.3.2.8  Pesar y anotar el peso de los 10 ratones, aprox imando hasta 0,5 gramos e inyectar cada uno con 
1 mL de 2 o 3 diluciones de preferencia que provoque n la muerte en una mediana de tiempo de 5 a 7 minutos. 
B.3.2.9  Anotar los tiempos de muerte. Si más ratones de un grupo de 10 sobrevive a la inyección de una 
dilución en particular de la solución de referencia, repetir la inyección en un nuevo grupo de 10 ratones. 
B.3.2.10  Antes de proceder a realizar la prueba con el segundo grupo, investigar las variables del 
procedimiento que pudieron haber provoc ado los resultados iniciales, tales como filtración, derrame de la 
mezcla inyectada en el ratón o el no haber inyectado el volumen completo de la solución patrón. 
B.3.2.11  Cálculo del factor de corrección (FC) 
B.3.2.12  Determinar la mediana del tiempo de muerte para cada grupo de 10 ratones usados con cada 
dilución. Descartar los resultados para cada grupo de 10 ratones que den una mediana de muerte menor de 5 
o mayor de 7 minutos. Si cualquier grupo de 10 ratones produce una mediana de tiempo de muerte en el intervalo de tiempo mencionado, incluir todos los grupos de 10 ratones usados para que los cálculos de la dilución subsecuente o algunas muertes estén en el intervalo deseado. 
B.3.2.13  Usar los tiempos de muerte por cada ratón y para cada grupo, en el cual la mediana de tiempo de 
muerte quede entre 5 y 7 minutos. Determinar las Unid ades Ratón correspondientes a partir de la tabla de 
Sommer's. 
B.3.2.14  Con el peso de cada ratón se determina el factor de corrección en la tabla de correcciones de 
pesos de ratones. Multiplicar las Unidades Ratón por el  factor de conversión del peso para determinar los 
valores para las Unidades Ratón corregidas por mL de las diluciones seleccionadas. Dividir los µg de toxina/mL calculados en las diluciones seleccionadas  por las URC asociadas y así obtener el factor de 
conversión. 
B.3.2.15  Calcular el promedio de FC individuales. El valor resultante es útil para verificar los ensayos de 
rutina. Este valor representa los microgr amos de veneno equivalentes a una UR. 
B.3.2.16  Los valores individuales del FC obtenidos en el la boratorio, pueden variar significativamente si no 
existe un control absoluto de la técnica. Por lo regular el uso de patrones de referencia o patrones 
secundarios, depende del volumen de ejecución del trabajo de ensayo. 
B.3.3 Uso de patrones en el ensayo de rutina de Moluscos Bivalvos. B.3.3.1  Verificar los valores del FC periódicamente como sigue: si los moluscos son analizados menos de 
una vez a la semana, determinar el valor del FC cada dí a que el ensayo sea ejecutado. Para ello inocular 5 
ratones con una dilución apropiada de la solución patrón. Si los ensayos se realizan durante varios días a la 
semana, verificar solamente una vez por semana la dilución cuya mediana de tiempo de muerte esté entre 5-7 minutos. El FC así determinando debe quedar dentro de ±20% el FC estándar predeterminado.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.2.3.2  Si los resultados no concuerdan, verificar el FC sobre una base de 10 ratones formado por la 
adición de 5 ratones inoculados con la misma dilución de solución patrón de saxitoxina e incluir los resultados a los 5 ratones originales. 
B.3.3.3  Inocular un segundo grupo de 10 ratones. El pr omedio de valores del FC obtenidos de los 6 
grupos de 10 ratones representa un nuevo valor de FC. 
B.3.3.4  Repetir la verificación de los valores de FC de manera que los resultados sean consistentes dentro 
del ±20%. Si se encuentran grandes variaciones, inve stigar la posibilidad de controlar y reconocer otras 
variables que afectan al método antes de proceder con los análisis de rutina. 
B.3.4 Preparación de la muestra B.3.4.1  Almejas, ostiones y mejillones. 
B.3.4.1.1  Lavar los moluscos bivalvos con agua potable retirando la arena y cualquier material extraño. 
Desconchar la carne con cuidado, sin lesionar el cuerpo del molusco. Colectar aproximadamente 150 g de 
carne sobre un tamiz del número 10 y dejar escurrir durante 5 minutos. Descartar las conchas, moler la carne en una mezcladora o licuadora hasta su homogenización. 
B.3.4.2 Escalopas. 
B.3.4.2.1  Separar la porción comestible (músculo aductor)  y solamente aplicar la prueba a esta porción. 
Drenar y moler como se describió anteriormente 
B.3.4.3  Extracción de la saxitoxina. 
B.3.4.3.1  Pesar 100 gramos de carne homogenizada en un vaso de precipitados tarado. 
B.3.4.3.2  Agregar 100 mL de solución de ácido clorhídrico 0,18 N, agitar y verificar el pH, el cual debe 
estar entre 2 y 4, y de preferencia 3. 
B.3.4.3.3  Calentar la mezcla, hervir 5 minutos y dejar enf riar a temperatura ambiente. Ajustar la mezcla 
enfriada a un pH 2,0-4,0 (nunca mayor a 4,5) 
B.3.4.3.4  Verificar el pH con indicador universal BDH, azul de fenol, papel rojo congo o con un 
potenciometro. Para bajar el pH, agregar solución de HCl 5 N por goteo, agitando constantemente para evitar 
la destrucción de la toxina. 
B.3.4.3.5  Transferir la mezcla a una probeta graduada y diluir a 200 mL. Regresar la mezcla a un vaso de 
precipitados, agitar para homogenizar y dejar reposar hasta que una parte del sobrenadante sea translúcido y 
pueda encontrarse libre de partículas sólidas capaces  de "tapar" una aguja hipodérmica del número 26. 
B.3.4.3.6  Si es necesario centrifugar el sobrenadante 5 mi nutos a 3000 rpm o filtrar por papel. Filtrar solo 
la cantidad de líquido necesario para el bioensayo. 
B.3.5 Prueba de bioensayo en ratón 
B.3.5.1  Pesar 3 ratones, anotando el peso para cada muestra que va a ser analizada. Inyectar por vía 
intraperitoneal a cada ratón l mL de extracto centrifuga do. Este es el punto crítico del bioensayo. Si las 
inyecciones no se hacen directamente en la cavidad peritoneal el tiempo de muerte no es reproducible. 
B.3.5.2  Descartar cualquier ratón en donde se pierda o se filtre más de una gota de extracto. Activar el 
cronómetro en el momento de la inyección y mantener  la observación cuidadosamente, hasta el tiempo de 
muerte, que se manifiesta por el último jadeo del animal. 
B.3.5.3  Registrar el momento de la muerte de cada ratón. Si la mediana de tiempo de muerte es de 5 
minutos, diluir el extracto con HCl 0, 01 N, e inyectar otro lote de ratones hasta obtener los tiempos de muerte 
entre 5 y 7 minutos. Si la mediana del tiempo de muerte  con el extracto no diluido es mayor a 7 minutos, el 
dato puede ser utilizado para determinar  la toxicidad de la muestra. 
B.3.5.4  Determinar la UR/mL de extracto que corresponde a los tiempos de muerte observados de la tabla 
de corrección de pesos de ratones. 
B.3.5.5 Calcular las URC, multiplicando las UR correspondientes al tiempo de muerte de cada ratón por el 
factor de corrección del peso obtenido en la tabla de corrección de pesos de ratones. 
B.3.6 Expresión de resultados. B.3.6.1  Cálculos 
µg saxitoxina/100g carne de molusco = Mediana URC/mL x FC x FD x 200 
En donde: FC = Factor de conversión FD = Factor de dilución Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Tabla de corrección de pesos de ratones. 
PESO DEL RATON(G) UNIDADES RATON 
10 0,50 
10,5 0,53 
11 0,56 
11,5 0,59 
12 0,62 
12,5 0,65 
13 0,675 
13,5 0,70 
14 0,73 
14,5 0,76 
15 0,785 
15,5 0,81 
16 0,84 
16,5 0,86 
17 0,88 
17,5 0,905 
18 0,93 
18,5 0,95 
19 0,97 
19,5 0,985 
20 1,000 
20,5 1,015 
21 1,03 
21,5 1,04 
22 1,05 
22,5 1,06 
23 1,07 
 
B.3.6.2  Tabla de Sommer's. 
Tiempo de muerte: relación unidades ratón para toxina paralizante de moluscos. (ácida) 
TIEMPO DE MUERTE* UNIDADES RATON TIEMPO DE MUERTE UNIDADES RATON 
1:00 100 5:00 1,92 
10 66,2 05 1,89 
15 38,3 10 1,86 
20 26,4 15 1,83 
25 20,7 20 1,80 
30 16,5 30 1,74 
35 13,9 40 1,69 
40 11,9 45 1,67 
45 10,4 50 1,64 
50 9,33 6:00 1,60 
55 8,42 15 1,54 
2:00 7,67 30 1,48 
05 7,04 45 1,43 
10 6,52 7:00 1,39 
15 6,06 15 1,35 
20 5,66 30 1,31 
25 5,32 45 1,28       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
TIEMPO DE MUERTE* UNIDADES RATON TIEMPO DE MUERTE UNIDADES RATON 
30 5,00 8:00 1,25 
35 4,73 15 1,22 
40 4,48 30 1,20 
45 4,26 45 1,18 
50 4,06 9:00 1,16 
55 4,88 30 1,13 
3:00 3,70 10:00 1,11 
05 3,57 30 1,09 
10 3,43 11:00 1,075 
15 3,31 30 1,06 
20 3,19 12:00 1,05 
25 3,08 13 1,03 
30 2,98 14 1,015 
35 2,88 15 1,000 
40 2,79 16 0,99 
45 2,71 17 0,98 
50 2,63 18 0,972 
55 2,56 19 0,965 
4:00 2,50 20 1,96 
05 2,44 21 0,954 
10 2,38 22 0,948 
15 2,32 23 0,942 
20 2,26 24 0,937 
25 2,21 25 0,934 
30 2,16 30 0,917 
35 2,12 40 0,898 
40 2,08 60 0,875 
45 2,04 50 2,00 
 1,96 55 2,22 
*Minutos: segundos 
B.3.6.3 Informe de la prueba 
µg saxitoxina/100g carne de molusco 
 
B.4. DETERMINACION DE ACIDO DOMOICO POR CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS (HPLC) 
B.4.1  Principio del método. 
El ácido domoico es extraído del tejido homogenizado por ebullición en HCl 0,1 N durante 5 minutos. La 
mezcla es enfriada y centrifugada, una alícuota del s obrenadante es diluida, f iltrada y analizada por HPLC 
isocrática y detección ultravioleta a 242 nm.  
B.4.2  Equipo. 
B.4.2.1  Sistema de cromatógrafo de líquidos: 
B.4.2.1.1  Sistema de gasificador por Helio,  membrana de vacío o ultrasonido. 
B.4.2.1.2  Sistema de bombas capaz de desarrollar un flujo de 0.5 a 1,5 mL/min. 
B.4.2.1.3  Inyector manual o automático, compatible para inyectar 20 uL de muestra. 
B.4.2.1.4  Detector de ultravioleta de longitud de onda variable a 242 nm. 
B.4.2.1.5  Sistema de datos: graficador, integrador o comp utadora compatible con la salida de voltaje del 
detector. 
B.4.2.2 Centrífuga capaz de desarrollar 3000 rpm usando tubos de 100 mL. 
B.4.3  Materiales. 
B.4.3.1  Columna HPLC de 15 cm de longitud x 4,6 mm de diámetro interno, empacada con 
octadecilsilanos (C18) de tamaño de partícula de 5 μm. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
B.4.3.2  Filtros de membrana para muestras, de 3 cm de diámetro y tamaño de poro de 0,45 μm. 
B.4.3.3  Jeringas de vidrio o desechables de 5 mL. 
B.4.3.4  Tubos para centrífuga de 100 mL. 
B.4.3.5  Matraces volumétricos de 50 y 100 mL. 
B.4.4  Reactivos. 
B.4.4.1  Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por 
agua se entiende agua desionizada. 
B.4.4.2  Agua grado HPLC (H 2O) 
B.4.4.3  Acetonitrilo grado HPLC (C 2H3N). 
B.4.4.4  Acido fosfórico ( H 3PO4) 
B.4.4.5  Solución de HCl 0,1 N 
B.4.5 Fase móvil. B.4.5.1  Adicionar 2 mL de solución acuosa de H
3PO4 a 873 mL de agua desionizada. Mezclar y verificar el 
pH a aproximadamente 2,5. Adicionar 125 mL de acetonitrilo, mezclar y degasificar. 
B.4.5.2  Solución patrón de ácido domoico 1,09 ng/ μL. 
B.4.5.3  Esta solución está disponible comercialmente. Refrigerar cuando no se use. Llevar a temperatura 
ambiente antes de su uso. 
B.4.6  Procedimiento. 
B.4.6.1  Preparación de las muestras. 
B.4.6.2 Limpiar completamente el exterior del molusco con agua fresca. Abrir por corte los músculos 
aductores. Enjuagar el interior con agua fresca para elimi nar la tierra u otro material extraño. Quitar la carne 
de la concha separando los músculos aductores y la conexión del tejido en las valvas (charnela). No usar 
calor o anestésicos antes de abrir la concha, y no cortar o dañar el cuerpo del molusco en este estado. 
B.4.6.3  Colectar aproximadamente de 100-159 g de ca rne en un plato de vidrio. Tan pronto como sea 
posible, transferir la carne a un tamiz del No. 10 y dejar drenar por espacio de 5 minutos. Descartar los 
drenados. Moler en un procesador de alimentos casero hasta obtener una mezcla homogénea. 
B.4.6.4  Pesar exactamente 50 g de la muestra homogenizada en un matraz de 250 mL. Adicionar 50 mL 
de solución de HCl 0,1 N y agitar completamente. Rápidamente calentar la mezcla a ebullición (en 
aproximadamente 10 minutos) y continuar el calentam iento vigoroso, con agitación, por exactamente 5 
minutos. 
B.4.6.5  Transferir inmediatamente el matraz y su contenido a un baño de hielo y dejar enfriar a 
temperatura ambiente (apr oximadamente 10 minutos). 
B.4.6.6  Llevar la mezcla enfriada a un matraz volumétrico de 100 mL y diluir al volumen con solución de 
HCl 0,1 N. Mezclar. Transferir una alícuota de 50 mL a un tubo de centrífuga. Centrifugar a 3000 rpm durante 
5 minutos. 
B.4.6.7  Transferir con pipeta volumétrica de 1-5 mL del sobrenadante clarificado a un matraz volumétrico 
de 50 mL (el volumen transferido depende de la concentración de ácido domoico esperada). Diluir al volumen con agua y mezclar. 
B.4.6.8  Filtrar un alícuota de 1-2 mL del sobrenadante dilui do a través del filtro par a muestras y colectar en 
un frasco vial. 
B.4.7  Acondicionamiento del equipo.  
B.4.7.1  Fijar los parámetros cromatográf icos requeridos en el método de acuerdo con el manual de 
operación. 
B.4.7.2  Bombear fase móvil a través del sistema del cr omatógrafo hasta la obtención de una línea base 
estable. 
B.4.7.3  Realizar un análisis preeliminar de la solución de ácido domoico y ajustar la concentración del 
acetonitrilo en la fase móvil a fin de obtener un tiem po de retención aproximado para el ácido domoico  de 8 
min. 
B.4.8  Determinación. 
B.4.8.1 Inyectar varias réplicas 20 
μL de solución patrón de ácido domoico hasta que la altura o área de 
los picos de 3 inyecciones consecutivas no varíen en más del 3%. 
B.4.8.2  Inyectar 20 μL de las muestras.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.4.9  Expresión de resultados. 
B.4.9.1  Cálculos. 
μg Acido domoico/g = (R/R ′) x (W′/W) 
donde: 
R= Area o altura promedio del pico de la muestra. 
R′= Area o altura promedio del pico de la solución estándar de ácido domoico. 
W= Peso de la muestra inyectada (mg) 
W′= Peso de la solución estándar de ácido domoico inyectada (ng) 
B.4.10  Informe de la prueba. 
μg de ácido domoico/g  
 
B.5. DETERMINACION DE HISTAMINA POR CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA (TLC) 
B.5.1  Principio del método. 
Se basa en la hidrólisis ácida de las proteínas dejan do libres a los aminoácidos. La histamina es extraída 
con n-butanol y el extracto es analizado por cromat ografía en capa fina comparando con una curva de 
histamina. 
B.5.2 Equipo. 
B.5.2.1  Cámara cromatográfica. 
B.5.2.2  Atomizador de 50 mL para cromatografía. 
B.5.3 Materiales . 
B.5.3.1  Embudos de separación de 125 mL. 
B.5.3.2  Embudo de Buchner. 
B.5.3.3  Matraz Kitaza to de 500 mL. 
B.5.3.4  Cromatofolios AL de sílica gel 60 F 254 (para cr omatografía en capa fina de 0,2 mm de espesor). 
B.5.3.5  Microjeringa ajustable de 0-200 μL. 
B.5.3.6  Material común de laboratorio. 
B.5.4  Reactivos. 
B.5.4.1  Todos los reactivos deben ser de grado analítico a menos que se indique otra especificación y por 
agua se entiende agua destilada. 
B.5.4.2  Diclorhidrato de histamina (C 5H11Cl2N3) 
B.5.4.3  n-Butanol (C 4H10O) 
B.5.4.4  Acido clorhídrico (HCl) 
B.5.4.5  Hidróxido de calcio (Ca(OH) 2) 
B.5.4.6  Etanol (C 2H5OH) 
B.5.4.7  Hidróxido de amonio (NH 4OH) 
B.5.4.8  Acetona (C3H 6O) 
B.5.4.9  Cloruro de sodio (NaCl) 
B.5.4.10 Solución de HCl 1N 
B.5.4.10.1  Medir 479,8 mL de HCl y llevar a 1 L con agua. 
B.5.4.11  Solución de ninhidrina al 1% (1 mg ninhidrina/mL) 
B.5.4.11.1  Pesar 1 g de ninhidrina y disolver en 100 mL de acetona 
B.5.4.12  Solución patrón de histamina de 5 μg/μL. 
B.5.4.12.1  Mezclar 30,17 mg de diclorhidrato de histamin a (equivalente a 10 mg de histamina), 20 mL de 
n-butanol y 7,0 g de cloruro de sodio con 20 mL de a gua destilada. Agitar durante 5 minutos. Adicionar 2,5 g 
de hidróxido de calcio y agitar durante 2 minutos. Filtrar en embudo Buchner y pasar a un embudo de 
separación. Dejar reposar y separar la capa de butanol. 
B.5.5  Procedimiento. 
B.5.5.1  Preparación de la curva patrón. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
B.5.5.2  A partir de la solución patrón de histamina preparar las siguientes diluciones de acuerdo con la 
tabla siguiente: 
No. DE TUBO SOLUCION  PATRON DE HISTAMINA 
(ML) VOLUMEN FINAL DE 
N-BUTANOL μG HISTAMINA/ μL. 
1 2,20 0,0 5,0 
2 2,52 2,8 4,5 
3 2,88 3,6 4,0 
4 3,29 4,7 3,5 
5 3,35 6,7 2,5 
6 4,00 10,0 2,0 
7 5,61 18,7 1,5 
8 6,66 33,3 1,0 
9 10,00 100,0 0,5 
 
B.5.5.3  Agitar y dejar reposar para permitir la separación. 
B.5.6  Preparación de la muestra. 
B.5.6.1  Mezclar 50 g de muestra molida en 100 ml de ácido clorhídrico 1 N por 5 minutos. 
B.5.6.2  Filtrar por succión a través de un em budo Buchner con papel filtro grueso. 
B.5.6.3  Tomar una alícuota de 20 mL (4 mL del extracto + 16 mL de agua). Adicionar 20 mL de n-butanol. 
Agregar 7 g de NaCl y agitar durante 5 minutos. 
B.5.6.4  Agregar 2,5 g de Ca(OH)2. Agitar durante 2 mi nutos. Filtrar por succión a través de un embudo 
Buchner con papel filtro grueso. 
B.5.6.5  Separar la capa de butanol. 
B.5.6.6  Determinación. 
B.5.6.7  Tomar alícuotas de 10 μL de cada una de las soluciones de la curva patrón y muestras y 
colocarlas en una placa de sílica gel. 
B.5.6.8  Desarrollo de la TLC. 
B.5.6.9  Poner una mezcla de etanol: hidróxido de amonio: agua (90:6:10) en la cámara para cromatografía 
y dejar saturar. 
B.5.6.10  Meter la placa y dejar eluir hasta que el frente del solvente haya alcanzado los 5 cm. Sacar de la 
cámara y dejar secar al aire durante 30 min. Aplicar la solución de ninhidrina al 1% por aspersión y calentar a 100 ºC en estufa durante 2 minutos. 
B.5.7  Estimación del nivel de histamina.  
B.5.7.1  Comparar las muestras con las soluciones patrón  de histamina en el intervalo de 5-50 mg  (25 a 
250 mg de histamina). 
B.5.7.2  La cantidad de histamina en la muestra se esti ma comparando visualmente el desplazamiento de 
las manchas de la muestra contra el desp lazamiento de los patrones de histamina. 
B.5.7.3  Para determinar el contenido de histamina en la muestra es suficiente que una de las manchas de 
muestra tenga un desplazamiento igual al  de por lo menos uno de los patrones. 
B.5.8  Expresión de resultados. 
B.5.8.1  Cálculos. 
B.5.8.1.1  Si una de las manchas de las muestras entre 5 y 50 mg equivale al intervalo de 0,5 a 5 
μg de los 
patrones, la cantidad de histamina para 50 g de muestra se calcula como sigue: 
mg de histamina = 10 E 
donde: 
E = μg de histamina estimados en la muestra entre 0,5 y 5 μg 
10= μL de muestra colocados en la placa. 
Si una mancha de la muestra del intervalo de 25 a 25 0 mg corresponde al intervalo para el patrón de 0,5 a 
5 mg, la cantidad de histamina para 50 g de muestra se calcula como sigue: 
mg de histamina = 50 E 
donde: 
E = μg de histamina estimados en la muestra entre 0,5 y 5 μg 
50= μL de muestra colocados en la placa.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.5.8.1.3  Si el valor obtenido en las muestras analizadas resulta ser mayor de 15 mg/100 g debe 
analizarse nuevamente haciendo la dilución correspondiente con butanol. 
B.5.9 Informe de la prueba. 
mg de histamina/kg  
 
B.6. DETERMINACION DE SULFITOS EN ALIMENTOS. METODO OPTIMIZADO DE MONIER-
WILLIAMS. 
B.6.1  Principio del método.  
El método mide sulfitos libres más porciones repr oducibles de sulfitos ligados, tales como productos 
carbonílicos, en alimentos. La muestra es calentada co n ácido clorhídrico (HCl) en reflujo para convertir el 
sulfato a SO 2 (sulfitos). El nitrógeno introducido a la solución arrastra el SO 2 a través del condensador 
enfriado por agua y pasa a una solución del H 2O2 al 3% donde el SO 2 se oxida a ácido sulfúrico (H 2SO4).  El 
contenido de sulfito es directamente relacionado al H 2SO4 generado, el cual es determinado por titulación con 
hidróxido de sodio (NaOH) estandarizado.  Aplicable para la determinación de ≥ 10 ppm de sulfitos en 
alimentos. Aplicable en presencia de otros compuest os volátiles de azufre, no aplicable a cebollas secas, 
puerros y calabazas. 
B.6.2 Equipo. 
B.6.2.1  Aparato de Destilación (nota: En este método la presión dentro del aparato está limitada a la 
presión propia de la solución de H 2 O2 al 3% encima del extremo del burbujeador. Mantener la presión baja 
para evitar la pérdida del SO 2 a través del goteo). 
Usar una película delgada de vaselina en las superficies que sellan en todas las juntas, excepto en la junta 
entre el matraz y el embudo de separación. Poner pinza en cada junta para asegurar que sellen 
completamente. Ensamblar el aparato según se muestra en la figura siguiente: 
 
 
B.6.2.2  Bureta de 10 mL con tubo de sobrellenado y conexiones para tubo Ascarita o el equivalente para 
permitir mantener una atmósfera libre de CO 2 sobre el hidróxido de sodio 0,01N estandarizado. 
B.6.3 Reactivos. Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por agua se 
entiende agua desionizada. 
B.6.3.1  Acido clorhídrico (HCl) acuoso 4N. Para cada análisis, preparar 90 mL de esta solución mezclando 
30 mL de HCl y 60 mL de agua desionizada. 
B.6.3.2  Indicador de rojo de metilo. Disolver 250 mg de rojo de metilo en 100 mL de etanol. 
B.6.3.3  Titulante estandarizado. Hidróxido de sodio (NaOH)  0,010N Estandarizar la solución con estándar 
de ftalato ácido de potasio. 
B.6.3.4  Solución de peróxido de hidrógeno al 3% (H
2 O2). 
Para cada análisis, diluir 3 mL de H 2 O2 al 30% con 30 mL de agua desionizada. Justo antes de usarse, 
agregar 3 gotas de indicador de rojo de metilo y titular con hidróxido de sodio (NaOH) 0,010N a un punto final 
amarillo, si el punto final excedió, descartar la solución. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
B.6.3.5  Nitrógeno de alta pureza. Usar un regulador para mantener el flujo de 200 mL/min. Para evitar 
oxígeno en el nitrógeno se usa una trampa tipo cromatografía de gases. 
B.6.4 Preparación de la muestra. 
a) Sólidos. Transferir 50g de alimento o la cantidad que contenga de 500 a 1500 μg de SO 2, a un 
procesador de alimentos o licuadora. Agregar 100 mL de et anol-agua (5+95 v/v) y mezclar. Licuar sólo hasta 
que el alimento pueda pasar por la junta 24/40 del matraz. 
b) Líquidos. Mezclar 50g de muestra, o la cantidad que contenga de 500 a 1500 μg de SO 2 con 100 mL de 
la mezcla etanol-agua. 
Nota: Llevar a cabo la preparación de la muestra y el an álisis tan rápido como sea posible para evitar la 
pérdida de formas lábiles de sulfito. 
B.6.5 Preparaci ón del sistema. 
B.6.5.1  Usando el aparato ensamblado y el matraz pues to en la manta de calentamiento, agregar 400 mL 
de agua al matraz. Cerrar la llave del embudo de separación y agregar 90 mL de HCl 4N. Empezar con el flujo de nitrógeno. Iniciar el flujo en el refrigerante. Colocar el recipiente con 30 mL de H
2O2, el cual ha sido titulado 
a punto final amarillo con NaOH 0,010N. Después de 15  min, el aparato y el agua estarán completamente 
desoxigenadas y la porción de muestras debe ser introducida al sistema. 
B.6.5.2  Remover el embudo de separación y cuantitativament e transferir la muestra al matraz. Limpiar la 
junta y rápidamente aplicar grasa de silicón y regresarlo a su lugar. 
B.6.5.3  El flujo de nitrógeno a través de la solución de H 2O2 al 3% se reanuda tan pronto como se coloca 
el embudo en la junta del matraz. Examinar cada junta para asegurar que esté sellado. Usar un bulbo con 
válvula para aplicar presión sobre el HCl. Abrir la llave y dejar pasar el HCl al matraz. Continuar sosteniendo la 
válvula para mantener la suficiente pr esión sobre la solución de ácido para forzarla a pasar. Cerrar la llave 
antes de que los últimos 2-3 mL drenen para evitar que el SO 2 escape hacia el embudo de separación. 
B.6.5.4 Calentar la manta al calentamiento y regular para calentar lo suficiente, obteniendo de 80 a  90 
gotas/min del condensador. 
B.6.5.5 Dejar 1 h 45 min y remover el vaso. 
B.6.6  Determinación. 
Inmediatamente titular el contenido del vaso o probeta c on hidróxido de sodio 0,010N a punto final amarillo 
y que persista ≥ 20 segundos. 
B.6.7  Expresión de resultados . 
B.6.7.1  Cálculos. 
Calcular el contenido de sulfitos, como sigue: 
μg SO 2,/g = 32,03 x VB x N x 1000 
peso de muestra 
donde: 
32,03 = peso milequivalente del SO 2 
VB = Volumen (Ml) del NaOH 
N = Normalidad del NaOH 1000 = Factor para convertir milequivalentes a microequivalentes Peso de muestra: cantidad de muestra que se introdujo al matraz 
B.7. DETERMINACION DE SULFITOS POR GRAVIMETRIA (OPCIONAL). B.7.1  Después de la titulación, llevar el contenido del recipiente a un vaso de 400 mL agregar 4 gotas de 
HCl 1N y un exceso de solución de BaCl
2 al 10% y dejar reposar toda la noche. 
B.7.2 Lavar el precipitado por decantación 3 veces con agua caliente a través de un Gooch previamente 
pesado. Lavar con 20 mL de alcohol etílico y 20 mL de éter. Secar a 105° - 110°C. 
B.7.3  Determinar el blanco de reactivos para la titulación  y para el método gravimétrico y considerarlo en 
el cálculo de los resultados. 
B.7.4 Preparación del Aparato de Filtración 
B.7.4.1 Unir el receptáculo con un filtro de fibra de vidrio. 
B.7.4.2 Colocar lo anterior en el matraz kitasato. 
B.7.4.3  Lavar el filtro con 10 mL de agua caliente, de sionizada y después con 10 mL de etanol  usando 
vacío.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.7.4.4  Quitar el filtro y secarlo a 110°C durante 12 horas o más. Transferir a desecador para enfriar a 
temperatura ambiente. Pesar (Wb). 
B.7.4.5  Colocar el filtro en el receptáculo de vidrio. 
B.7.5  Precipitado de BaSO 4 
B.7.5.1  Pasar el precipitado por el filtro. Lavar c on agua para asegurar que todo ha sido filtrado. 
B.7.5.2  Pasar 10 mL de etanol a través del precipitado y filtrar con vacío. 
B.7.5.3  Remover el filtro y secar en estufa a 110°C durante toda la noche. 
B.7.5.4  Transferir a desecador, enfriar y pesar (Wp). 
B.7.6  Expresión de resultados.  
B.7.6.1  Cálculos. 
Calcular el contenido de sulfitos como sigue: 
μg SO 2,/g = [(Wp – Wb) x 274,46 ] 
g muestra 
Donde: 
Wp = Peso de papel filtro con el precipitado de BaSO 4 a peso constante 
Wb = Peso de papel filtro preparado y puesto a peso constante 
B.7.7  Ensayos de Recuperación. 
B.7.7.1  Para familiarizarse y eficientizar el método antes de realizar la rutina, analizar porciones de 
muestra que contengan canti dades conocidas de sulfitos. 
B.7.7.2  Realizar los análisis de manera que se omita cual quier pérdida de sulfitos por oxidación o reacción 
con los componentes en el alimento. 
B.7.7.3  Debido a que los sulfitos son reactivos con el ai re y con algunas matrices alimenticias y dado que 
carecen de estabilidad, se debe fortific ar con fuentes estables de sulfitos, no sulfito de sodio o sales similares. 
B.7.7.4  El hidroximetil sulfonato de sodio (HMS), el c ual es estructuralmente similar a algunas formas 
combinadas de sulfitos en alimentos, es útil para preparar porciones de prueba fortificada. 
B.7.7.5  Para el análisis, transferir 50g de muestra de al imento libre de sulfitos al matraz. Agregar una 
alícuota de solución de la sal sódica de hidr oximetil sulfonato. Ana lizar inmediatamente. 
B.7.7.6  Recuperaciones de > 80% del HMS con matrices alimenticias de 10 ppm son recomendables para 
asegurar una adecuada exactitud analítica. 
B.7.8 Informe de las pruebas. 
μg SO 2,/g 
 
B.8. DETERMINACION DE pH. 
B.8.1  Fundamento. 
Es la medida de la diferencia de potenciales entre un  electrodo de vidrio y otro de referencia que se 
genera en una muestra, medido con un potenciómetro. La fuerza electromot riz producida por el sistema de 
electrodos es proporcional al pH de la muestra problema. 
B.8.2  Materiales y Equipo. 
B.8.2.1  Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg. 
B.8.2.2  Molino mecánico para carnes con placa perforada con agujeros de un diámetro no mayor de 4mm. 
B.8.2.3 Potenciómetro graduado en unidades de pH de 0, 1 o menos y que permita efectuar lecturas con 
una exactitud entre 0,05 unidades y provista de un sist ema de corrección de temperaturas (en caso de no 
tenerlo, las lecturas deben tomarse en un rango de temperaturas de 20±2°C). 
B.8.2.4  Electrodos de referencia. 
B.8.2.5  Electrodo de vidrio o sistema de electrodo combinado. 
B.8.2.6  Material común de laboratorio. 
B.8.2.7  Algodón. 
B.8.3  Reactivos. 
Todos los reactivos deben ser de grado analítico y cuando se mencione agua debe ser destilada. 
B.8.3.1  Etanol al 95% (v/v) C 2H6O 
B.8.3.2  Eter etílico saturado con agua C 4H10O Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
B.8.3.3  Soluciones patrón. 
B.8.3.4  Para calibrar el potenciómetro se pueden usar las siguientes soluciones de referencia: 
B.8.3.4.1  Soluciones patrón con pH 4,0 a 20°C. 
B.8.3.4.2  Pesar con exactitud 10,211g de potasio hidrógeno ftalato (KHC 6H4 (COO) 2) previamente secado 
a 125°C hasta peso constante, disolver en agua y llevar al volumen de 1000 ml. 
B.8.3.4.3  El pH de esta solución a 10°C es de 4,01. 
B.8.3.4.4  Solución patrón con pH 5,45 a 20°C. 
B.8.3.4.5  Mezclar 500 ml de solución 0,2N de ácido cítrico (C 6H8O7) en agua con 375 ml de solución de 
hidróxido de sodio (NaOH) en agua. El pH de esta solución a 10°C es de 5,42 y a 30°C es de 5,48. 
B.8.3.4.6  Solución patrón con pH 6,88 a 20°C. 
B.8.3.4.7  Pesar con exactitud 3,402g de potasio dihidrógeno ortofostato (KH 2PO4) y 3,549g de disodio 
hidrógeno ortofosfato (Na 2HPO 4), disolver en agua y llevar al volumen a 1 l. 
B.8.3.4.8  El pH de esta solución es 6,92 a 10°C y 6,85 a 30°C. 
B.8.3.4.9  En el caso de disponer de producto comercial seguir las indicaciones del fabricante. 
B.8.4  Procedimiento: 
Se describen dos procedimientos: B.8.4.1  Para productos que pueden ser homogeneizados. 
B.8.4.2  Para productos que no pueden ser homogeneizados. 
B.8.4.3  Preparación de la muestra. 
B.8.4.3.1  Homogeneizar la muestra y pasarla dos veces a través de un molino y después mezclarla 
perfectamente. 
B.8.4.3.2  En el caso de muestras muy secas para poder homegeneizarlas adicionar una cantidad de agua 
igual a la masa de muestra tomada para la determinación y mezclarlas perfectamente. 
B.8.4.3.3  Tomar una cantidad de muestra suficiente para que los electrodos puedan sumergirse. 
B.8.4.4  Calibración del potenciómetro. 
B.8.4.5  Calibrar el potenciómetro y usar solución patrón de un pH conocido exactamente y lo más cerca 
posible del pH que se va a determinar. 
B.8.4.6  Si el procedimiento no tiene un sistema de co rrección de temperatura, la temperatura de la 
solución patrón debe estar dentro del rango de 20±2°C. 
B.8.5  Medición. 
B.8.5.1  Introducir los electrodos en la muestra y fijar el sistema de corrección de temperatura a la 
temperatura de la muestra, en caso de que no lo teng a, la temperatura de la muestra debe estar dentro del 
rango de 20±2°C. 
B.8.5.2  Efectuar la medición usando el procedimi ento descrito en el manual del aparato. 
B.8.5.3  Leer el pH directamente en la escala del instrumento, hasta alcanzar un valor estable. 
B.8.5.4  Llevar a cabo 3 lecturas de la misma muestra. 
B.8.6  Limpieza de los electrodos. 
Limpiar los electrodos con trozos de algodón mojados con éter etílico y etanol sucesivamente, finalmente 
lavarlos con agua y guardarlos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 
B.8.7  Expresión de los resultados. 
Tomar como resultado la media aritmética de los valores de las tres lecturas siempre y cuando la 
diferencia entre los valores extremos resultantes no sea mayor de 0,15 unidades de pH. 
B.8.8  Procedimiento para productos que no puedan homogeneizarse. 
B.8.8.1  Tomar una porción de muestra suficiente que permita tomar medidas de pH en varios puntos de la 
misma. 
B.8.8.2  Medición. 
Si la muestra tiene consistencia firme, hacer un agujero para cada determinación de manera que el 
electrodo pueda ser introducido cuidadosamente para no quebrarlo. 
B.8.8.3  Efectuar las lecturas como se describió anteriormente. 
Si se considera importante conocer las diferencias entre  los valores del pH tomados en diferentes puntos 
de la muestra, el número de determinaciones estará en función de la naturaleza y el tamaño de la muestra.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
El lavado de los electrodos debe hacerse como se describió en el punto 11.10.6 
B.8.8.4  Expresión de resultados.  
Tomar como resultado la media aritmética de los valores obtenidos en el mismo punto de la muestra 
siempre y cuando la variación no sea mayor a 0,15 unidades de pH. 
Reportar que el promedio de pH para cada punto al más cercano a 0,1 unidades de pH. B.8.9 Precauciones. 
Determinar el pH de la muestra inmediatamente cuando sea posible o almacenarla de tal manera que el 
cambio de pH se restrinja al mínimo. 
Durante las mediciones el aparato debe estar prot egido de cambios de corriente eléctrica externa. 
B.9. NITROGENO AMONIACAL (NVT). B.9.1  Fundamento. 
La muestra se destila bajo condiciones establecidas en presencia de óxido de magnesio recibiendo las 
bases volátiles en un ácido débil de donde son tituladas. 
B.9.2  Material y equipo. 
B.9.2.1  Bureta de 10 ml graduada en 0,01 
B.9.2.2  Matraz de Kjeldahl de 800ml 
B.9.2.3  Matraz Erlenmeyer de 500ml 
B.9.2.4 Probeta 
B.9.2.5  Cuerpos de ebullición 
B.9.2.6  Equipo de destilación macro Kjeldahl 
B.9.2.7  Balanza analítica con sensibilidad de 0,1mg 
B.9.2.8  Agua destilada 
B.9.3  Reactivos.  
B.9.3.1  Acido bórico H
3BO3 al 2% grado reactivo, pesar 20g y diluir con agua destilada a 1 litro. 
B.9.3.2  Acido sulfúrico o clorhídrico 0,1N valorado 
B.9.3.3  Rojo de metilo 
B.9.3.4  Azul de metileno 
B.9.3.5  Etanol 
B.9.3.6  Oxido de magnesio grado reactivo 
B.9.3.7  Antiespumante preparación de silicones o alcohol octílico. 
B.9.3.8  Preparación del reactivo de Wesslow. 
B.9.3.8.1  En una mezcla 60:40 de etanol-agua, agregar rojo de metilo hasta llegar al 0,2%. 
B.9.3.8.2  Preparar una dilución de azul de metileno al 0,2% en agua destilada. 
B.9.3.8.3  Mezclar dos partes de la solución de rojo de metilo con una parte de azul de metileno. 
B.9.4  Preparación de la muestra. 
B.9.4.1  Para prevenir la pérdida de agua durante la preparación y subsecuente manejo no se deben usar 
muestras pequeñas (la cantidad mínima aceptable es de 500g). 
B.9.4.2  Guardar el material molido en recipientes de vidrio o similares con tapas herméticas que lo 
protejan del aire y del agua. 
B.9.4.3  Pasar la muestra rápidamente tres veces a través de un molino de alimentos con placas de 
aproximadamente 3mm de abertura. 
B.9.4.4  Mezclar perfectamente después de cada molienda y comenzar todas las determinaciones lo más 
rápido posible, si ocurriera cualquier demora, congelar la muestra para inhibir la descomposición (-2 a -4°C). 
B.9.5 Procedimiento. B.9.5.1  Pesar 10g de muestra preparada como se indica en el punto 2.4 transferirla cuantitativamente a un 
matraz de Kjeldahl 800ml. 
B.9.5.2  Agregar 2g de óxido de magnesio, 300 ml de agua destilada y los cuerpos de ebullición (en caso 
necesario, agregar algún agente antiespumante). 
B.9.5.3  Disgregar perfectamente la muestra, por medio de movimientos circulares. Recibir el destilado en 
un matraz Erlenmeyer de 500ml conteniendo 25ml de ácid o bórico y unas gotas del indicador de Wesslow  (la 
parte terminal del tubo debe estar dentro del ácido). Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
B.9.5.4  Conectar el matraz de Kjeldahl al equipo de destilación y calentar de manera que hierva 
exactamente durante un periodo de 10 min, mantener la temperat ura exactamente durante 25 min. 
B.9.5.6  Lavar el refrigerante con agua destilada y ti tular con ácido sulfúrico o clorhídrico. 
B.9.5.7  Titular la solución destilada utilizan do el ácido clorhídrico o sulfúrico. 
B.9.5.8  Simultáneamente, determinar un blanco. 
Nota: Antes de realizar la determinación defin ir los tiempos y temperaturas con una prueba. 
B.9.6  Cálculos. 
 
El resultado se expresa en mgN/100g 
En donde: 
v1 = ml de ácido sulfúrico 0,1N requeridos en la titulación de la muestra.  
v2 = ml de ácido sulfúrico 0,1N requeridos en la titulación del blanco. N = Normalidad del ácido sulfúrico o clorhídrico. 
PM = Peso de la muestra. 
14 = Miliequivalente de Nitrógeno. 
B.10.  METODO DE PRUEBA PARA LA DETERMINACION DE CADMIO, ARSENICO, PLOMO, 
ESTAÑO, COBRE, FIERRO, ZINC Y MERCURIO EN ALIMENTOS, AGUA POTABLE Y AGUA 
PURIFICADA POR ESPECTROMETRIA DE ABSORCION ATOMICA. 
B.10.1 Fundamento  
El método de absorción atómica se basa en hacer pasar un haz de luz monocromática de una frecuencia 
tal que puede ser absorbido por el analito que se encu entra presente en forma de vapor atómico. La medida 
de la intensidad luminosa antes y después de su paso por  el vapor atómico permite determinar el porciento de 
absorción. La cantidad de absorción aumenta con la conc entración de los átomos en el  medio absorbente, es 
decir, la medida de la absorción aumenta con la concentración del elemento en la muestra, ya sea que esté en 
su condición original o sujeta a pretratamiento. 
B.10.2 Reactivos y materiales B.10.2.1  Reactivos 
B.10.2.1.1 Soluciones estándares de referencia certificadas de cada uno de los metales. 
B.10.2.1.2  Agua, debe ser destilada deionizada, con un grado máximo de conductividad de 1 µmho/cm  a 
25ºC. 
B.10.2.1.3  Acido nítrico (densidad específica 1,41), grado suprapuro. 
B.10.2.1.4  Acido nítrico (densidad específica 1,41), contenido de mercurio muy bajo. 
B.10.2.1.5  Acido perclórico (densidad específica 1,67), grado suprapuro. 
B.10.2.1.6  Acido clorhídrico (densidad específica 1,19), grado suprapuro. 
B.10.2.1.7  Acido sulfúrico (densidad espec ífica 1,84), grado suprapuro. 
B.10.2.1.8  Acido sulfúrico 1 N a partir de la solución grado suprapuro. 
B.10.2.1.9  Acido nítrico 65% v/v grado RA. 
B.10.2.1.10  Peróxido de hidrógeno (densidad específica 1,12). 
B.10.2.1.11  Hidróxido de sodio granalla reactivo RA. 
B.10.2.1.12  Aire comprimido seco y limpio. 
B.10.2.1.13  Gases: acetileno, óxido nitroso, ar gón y nitrógeno, grado absorción atómica. 
Solución de Nitrato de Magnesio hexahidratado al 7% p/v. Disolver 70 g de Mg(NO3)2.6H2O en 1000 ml 
de HCl 1 N. 
B.10.2.1.14  Acido clorhídrico 1 N. Diluir 8,3 ml de HCl y llevar a 100 ml de agua. 
B.10.2.1.15  Acido nítrico al 50% v/v. Diluir 50 ml de HNO 3 al 65% v/v grado suprapuro en 50 ml de agua.  
B.10.2.1.16  Acido clorhídrico 8 M. Diluir 66,0 ml de HCl y llevar a 100 ml con agua. 
B.10.2.1.17  Acido clorhídrico 0,5 N. Diluir 4,15 ml de HCl y llevar a 100 ml con agua. 
B.10.2.1.18  Solución de Yoduro de Potasio al 15% p/v. Disolver 15 g de KI en 100 ml de agua (esta 
solución debe prepararse en el momento de usarse).       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.10.2.1.19  Solución de Yoduro de Potasio al 20% p/v. Disolver 20 g de KI en 100 ml de agua  (esta 
solución debe prepararse en el momento de usarse). 
B.10.2.1.20  Solución de Cloruro de Potasio (10 mg/ml de K). Disolver 1,91 g de KCl en agua y diluir a  100 
ml con agua. 
B.10.2.1.21  Solución de Nitrato de Magnesio al 50% p/v. Disolver 50 g de Mg(NO3)2.6H2O en 100 ml de 
agua. 
B.10.2.1.22  Solución de ácido clorhídrico al 1,5% p/v.  Diluir 1,5 ml de HCl en 100 ml de agua destilada 
deionizada. 
B.10.2.1.23  Solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 1 g de hidróxido de sodio y diluir a 100 ml con 
agua destilada deionizada. 
B.10.2.1.24  Solución de borohidruro de sodio al 4% p/v en solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 
4 g de borohidruro de sodio en 100 ml de una solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Filtrar al vacío. 
B.10.2.1.25  Solución reductora para mercurio. Mezclar 50 ml de ácido sulfúrico concentrado con 
aproximadamente 300 ml de agua. Enfriar a temperatura ambiente y disolver 15 g de cloruro de sodio, 15 g de 
sulfato o cloruro de hidroxilamina y 25 g de clorur o o sulfato estanoso en solución. Diluir a 500 ml. 
B.10.2.1.26  Solución de dilución para mercurio. En un matraz de 1 l, conteniendo de 300 a 500 ml de agua 
destilada deionizada, agregar 58 ml de ácido nítrico concentrado de muy baja concentración de mercurio  y 67 
ml de ácido sulfúrico concentrado. Diluir al volumen con agua. 
B.10.2.1.27  Solución de trabajo de As de 1 µg/ml. Diluir 1 ml de la solución patrón de 1000 µg/ml a 1 l con 
ácido sulfúrico 1N preparada a partir de la soluci ón grado suprapuro. Preparar fresca cada día. 
B.10.2.2  Materiales 
B.10.2.2.1  Matraces Kjeldahl de 500 ml y 800 ml. 
B.10.2.2.2  Sistema de reflujo con refrigerante. 
B.10.2.2.3  Crisoles Vycor de 40 a 50 ml de capacidad. 
B.10.2.2.4  Crisoles de platino de 40 a 50 ml de capacidad. 
B.10.2.2.5  Matraces Erlenmeyer de diferentes capacidades. 
B.10.2.2.6  Matraces volumétricos de diferentes capacidades. 
B.10.2.2.7  Matraces redondos de fondo plano de 50 ml. 
B.10.2.2.8  Bombas Parr. 
B.10.2.2.9  Micropipetas o pipetas de Eppendorf de diferentes capacidades. 
B.10.2.2.10  Puntas de plástico para micropipetas. 
B.10.2.2.11  Papel filtro Whatman No. 2. 
B.10.2.2.12  Perlas de ebullición. 
B.10.2.2.13  Varillas de plástico. 
B.10.2.2.14  Tubos de ensayo graduados de propilen o propileno de 15 ml. 
B.10.2.2.15  Recipientes de propilen o propileno. 
B.10.2.2.16  Embudos de filtración de diferentes capacidades. 
B.10.2.2.17  Material común de laboratorio.  
B.10.2.2.18  Todo el material utilizado debe someterse a lavado de acuerdo con las siguientes 
instrucciones: 
o El jabón que se use debe ser de preferencia neutro. 
o Enjuagar perfectamente con agua corriente. 
o Sumergir el material de vidrio o plástico en un recipiente (de preferencia plástico) que 
contenga una solución de ácido nítrico grado RA al 30 %. 
o Dejarlo tapado y reposando por un lapso de 24 horas. o Quitar el exceso de ácido nítrico con varios enjuagues (5 o 6 veces) con agua 
deionizada. 
o Dejar escurrir y secar. o Guardar en cuanto esté seco para evitar  contaminación por partículas en el aire. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
B.10.3 Aparatos e instrumentos 
B.10.3.1  Aparatos 
B.10.3.1.1  Lámparas de cátodo hueco o de descarga sin electrodos para determinar arsénico, cadmio, 
cobre, estaño, fierro, mercurio, plomo y zinc. 
B.10.3.1.2  Fuente de radiofrecuencia en caso de usar lámparas de descarga.  
B.10.3.1.3  Automuestreador y recirculador de agua. 
B.10.3.1.4  Placa de calentamiento con regulador que alcance una temperatura de 400 a 450 ºC. 
B.10.3.1.5  Horno de microondas. 
B.10.3.1.6  Autoclave que alcance 121 ± 5ºC o 15 lb de presión. 
B.10.3.1.7  Centrífuga de laboratorio capaz de mantener 1600 rpm. 
B.10.3.2 Instrumentos Los instrumentos que a continuación se indican deben estar calibrados y ajustados antes de su operación. 
B.10.3.2.1  Espectrómetro de absorción atómica equipado con lo s accesorios para flama, horno de grafito, 
generador de hidruros o vapor frío, dependiendo del método a seguir. 
B.10.3.2.2  Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg. 
B.10.3.2.3  Mufla capaz de mantener una temperatura de 550 ± 10ºC. 
B.10.3.2.4  Horno de calentamiento (estufa) con in tervalo de temperatura de 120 ± 5ºC. 
B.10.4 Preparación de la muestra 
B.10.4.1  Digestión para la determinación de Cd, Cu, Fe, Pb y Zn. 
B.10.4.1.1  Digestión por vía húmeda. 
B.10.4.1.1.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad apropiada de muestra. 
Para la determinación por el método de absorción por flama pesar como máximo 40 g de jugo o bebida,  
20 g de alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos sólidos o semisólidos. Limite el 
contenido de grasa o aceite a un máximo de 4 g y el total de materia orgánica a 5 g. 
B.10.4.1.1.2  Añadir 10 ml de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar directamente 
la digestión. 
B.10.4.1.1.3  Usar matraz de Kjeldhal o matraz conectado al sistema de refrigerantes. 
B.10.4.1.1.4  Calentar suavemente. 
B.10.4.1.1.5  Digerir la muestra 3 horas o más tiempo si es  necesario (algunas muestras requieren la 
adición de mayor cantidad de ácido nítrico) hasta la apar ición del color traslúcido, si queda ámbar, adicionar 
peróxido de hidrógeno gota a gota con agit ación continua (reacción exotérmica). 
B.10.4.1.1.6  Enfriar. 
B.10.4.1.1.7  Recuperar, filtrar y llevar a un volumen conocido en matraz volumétrico. 
B.10.4.1.1.8  Correr un blanco de reactivos y muestra fo rtificada por cada serie de digestión. 
B.10.4.1.1.9  Leer en el aparato de elección (espectrómetro  de absorción atómica por flama u horno  de 
grafito). 
B.10.4.1.2  Digestión por vía seca. 
B.10.4.1.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad apropiada de muestra. 
Para la determinación por el método de absorción por flama pesar como máximo 40 g de jugo o bebida,  
20 g de alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos sólidos y semisólidos. Limite el 
contenido de grasa o aceite a un máximo de 4 g y el total de materia orgánica a 5 g. 
B.10.4.1.2.2  Añadir 10 ml de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar directamente 
la digestión. En productos con alta concentración de pr oteínas adicionar una solución de nitrato de magnesio 
al 7,0% p/v y mezclar completamente, llevar a se quedad aproximadamente durante 6 horas en estufa a una 
temperatura de 90 a 95ºC. 
B.10.4.1.2.3  Colocar la muestra en una mufla y elevar la temperatura lentamente de 2 a 4ºC por minuto 
hasta 350°C. Mantener la tem peratura hasta que cesen los humos. 
B.10.4.1.2.4  Elevar gradualmente la temperatura de 500 a 550º C para evitar que la muestra se incinere y 
mantener esa temperatura dur ante 16 horas o toda la noche. 
B.10.4.1.2.5  Apagar la mufla y dejar enfriar.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.10.4.1.2.6  Un segundo paso de calcinación puede ser requerido para remover algunos residuos de 
carbón, mediante el siguiente procedimiento: 
Lavar las paredes del crisol con 2 ml de ácido n ítrico al 50%. Colocar la muestra en una placa de 
calentamiento puesta a 120ºC para remover el exceso de ácido. Colocar la muestra en una mufla fría y elevar 
la temperatura gradualmente de 500 a 550ºC, manten iéndola por el tiempo necesario. Repetir este 
procedimiento cuantas veces sea necesario hasta que quede libre de carbón remanente. 
B.10.4.1.2.7  Disolver las cenizas completamente en 5 ml de ácido clorhídrico 1N, transferir la muestra 
disuelta a un tubo de propileno o a un matraz de volume n conocido, enjuagar el crisol con dos alícuotas de 5 
ml de ácido clorhídrico 1 N y transferir al mismo tubo o matraz para obtener un volumen de 15 ml en el 
primero y llevar al aforo en el segundo, tapar y mezclar, si  existe presencia de partículas o materia insoluble, 
filtrar en papel Whatman No. 2,  antes de la determinación. 
B.10.4.1.2.8  Correr un blanco de reactivos y muestra fo rtificada por cada serie de digestión. 
B.10.4.1.2.9  Leer en el aparato de elección (espectróm etro de absorción atómica: flama u horno de 
grafito). 
B.10.4.2  Digestión por vía húmeda para la determinación de Sn. 
B.10.4.2.1  Proceder igual que en el punto B.10 .4.1.1.1. 
B.10.4.2.2  No adicionar ácido nítrico si no se lleva cabo la digestión total en el mismo día. 
B.10.4.2.3  Adicionar 30 ml de ácido nítrico concentrado al matraz y calentar suavemente por 15 minutos 
en campana para iniciar la digestión, evitando una excesiva producción de espuma. 
B.10.4.2.4  Hervir suavemente hasta tener un remanente de 3 a 6 ml o hasta que la muestra empiece a 
secarse en el fondo. No dejar que la muestra se calcine. 
B.10.4.2.5  Retirar la muestra del calor. 
B.10.4.2.6  Al mismo tiempo correr dos blancos de reactivos. 
B.10.4.2.7  Adicionar 25 ml de ácido clorhídrico c oncentrado, calentar suavemente durante 
aproximadamente 15 minutos, hasta que todo el cloro se a liberado. Aumentar la temperatura gradualmente 
hasta ebullición. 
B.10.4.2.8  Evaporar hasta obtener de 10 a 15 ml, usando  un matraz similar con 15 ml de agua como 
patrón de volumen. 
B.10.4.2.9  Adicionar aproximadamente 40 ml de agua. 
B.10.4.2.10  Agitar y pasar a un matraz de 100 ml y enjuagar con 10 ml de agua. 
B.10.4.2.11  Cuando el ácido clorhídrico está presente en la digestión, las muestras se pueden quedar toda 
la noche o por más tiempo. 
B.10.4.2.12  Agregar 1 ml de solución de cloruro de potasio en cada matraz. 
B.10.4.2.13  Enfriar a temperatura ambiente. 
B.10.4.2.14  Diluir con agua y agregar más agua para compensar el volumen de grasa en el matraz. 
B.10.4.2.15  Mezclar perfectamente y filtrar de 30 a 50 ml a través de un papel filtro Whatman No. 2 y 
recoger el filtrado en un recipiente de propileno, polipropileno o polietileno. 
B.10.4.2.16  No filtrar los blancos. Tapar las botellas durante el análisis. Las soluciones son estables por 
varios meses. 
B.10.4.2.17  Correr un blanco de reactivos y muestra fo rtificada por cada serie de digestión. 
B.10.4.2.18  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica: flama u horno de grafito). 
B.10.4.3  Digestión por vía húmeda para la determinación de Hg. 
B.10.4.3.1  Sistema de reflujo. 
B.10.4.3.1.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad  apropiada de muestra, dependiendo el tipo de 
ésta, en un matraz de digestión y adicionar perlas de ebullición. 
B.10.4.3.1.2  Conectar el matraz al sistema de reflujo y agregar poco a poco la cantidad necesaria de ácido 
nítrico concentrado y calentar durant e media hora o hasta que no se observen cambios en la digestión. 
B.10.4.3.1.3  Dejar enfriar y agregar una mezcla de ácido nítrico y ácido sulfúrico concentrados (1 + 1). 
B.10.4.3.1.4  Calentar y agregar más ácido nítrico gota a go ta sobre las paredes del recipiente, hasta que 
el color obscuro de la solución desaparezca. 
B.10.4.3.1.5  Enfriar. 
B.10.4.3.1.6  Si existe grasa o cera filtrar la solución. 
B.10.4.3.1.7  Correr un blanco de reactivos y muestra fo rtificada por cada serie de digestión. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
B.10.4.3.1.8  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica de vapor frío). 
B.10.4.3.2  Sistema cerrado. 
B.10.4.3.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad  apropiada de muestra, dependiendo el tipo de 
ésta, en el recipiente de digestión. 
B.10.4.3.2.2  Agregar la cantidad necesaria de ácido nítrico concentrado. 
B.10.4.3.2.3  Tapar y sellar perfectamente el recipiente de digestión. 
B.10.4.3.2.4  Si el recipiente de digestión es un matraz Erlenmeyer, colocar éste en una autoclave a 15 lb 
por 30 minutos. Si se utiliza bomba Parr, calentar en parrilla controlando la temperatura a un máximo de 
300ºC por 30 minutos. 
B.10.4.3.2.5  Enfriar a temperatura ambiente. 
B.10.4.3.2.6  En caso de que la digestión no sea completa adicionar peróxido de hidrógeno y repetir la 
digestión. 
B.10.4.3.2.7  Filtrar en caso de que exista grasa o cera y analizar el contenido de Hg. 
B.10.4.3.2.8  Correr un blanco de reactivos y muestra fo rtificada por cada serie de digestión. 
B.10.4.3.2.9  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica de vapor frío). 
B.10.4.4  Digestión para la determinación de As. 
B.10.4.4.1  Digestión por vía húmeda-seca. 
B.10.4.4.1.1  Proceder como en el punto B.10.4.3.2 hasta que la digestión sea completa y posteriormente 
continuar con los siguientes pasos. 
B.10.4.4.1.2  Con una pipeta tomar una alícuota de la solución de muestra digerida y colocarla en un crisol 
Vycor o vaso de precipitados. 
B.10.4.4.1.3  Añadir 1 ml de solución de nitrato de magnesio al 7% p/v y calentar en una parrilla a 
temperatura baja, hasta sequedad. 
B.10.4.4.1.4  Incrementar el calor de la placa a un máximo de 375ºC. 
B.10.4.4.1.5  Colocar el matraz en la mufla a 450ºC para oxidar cualquier residuo de carbón y 
descomponer el exceso de nitrato de magnesio, por un tiempo mayor o igual a 30 minutos. 
B.10.4.4.1.6 Enfriar y disolver el residuo en 2,0 ml de ácido clorhídrico 8 M. 
B.10.4.4.1.7 Añadir 0,1 ml de yoduro de potasio al 20% p/v para reducir el As(V) a As(III). 
B.10.4.4.1.8  Dejar reposar por un tiempo mayor a 2 minutos y transferir a un matraz y llevar al aforo con 
agua. 
B.10.4.4.1.9  Correr un blanco de reactivos y muestra fo rtificada por cada serie de digestión. 
B.10.4.4.1.10  Leer en el aparato de elección (espectrómet ro de absorción atómica con adaptación para 
horno de grafito o generador de hidruros). 
B.10.4.4.2  Digestión por vía seca. 
B.10.4.4.2 .1 Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad necesaria de muestra en un crisol Vycor o de 
platino. 
B.10.4.4.2.2  Añadir el volumen necesario de nitrato de magnesio al 50% p/v. 
B.10.4.4.2.3  Homogeneizar con una varilla limpia de plástico extendiendo la mezcla en el crisol. 
B.10.4.4.2.4  Colocar la muestra en una mufla subiendo gr adualmente la temperatura hasta 300ºC por 2 
horas. Posteriormente subir gradualme nte la temperatura hasta 500ºC por 16 horas o durante toda la noche. 
B.10.4.4.2.5 Enfriar a temperatura ambiente y humedecer la s cenizas con ácido nítrico al 50% v/v. 
B.10.4.4.2.6  Calentar en parrilla hasta la eliminación del ácido. 
B.10.4.4.2.7  Llevar los crisoles a una mufla elevando  gradualmente la temperatura de 23 a 500ºC, 
manteniendo ésta 30 min hasta evaporación total. 
B.10.4.4.2.8 Transferir las cenizas del crisol a un matraz aforado usando una porción de 10 ml de ácido 
clorhídrico 0,5 N. 
B.10.4.4.2.9  Enjuagar los crisoles con 5 ml de agua destilada y transferir al matraz, añadir 1 ml de solución 
de yoduro de potasio al 15% y mezclar. 
B.10.4.4.2.10  Dejar reposar durante 15 minutos y llevar al aforo. 
B.10.4.4.2.11  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión. 
B.10.4.4.2.12 Leer en el aparato de elección (espectrómet ro de absorción atómica con adaptación para 
horno de grafito o generador de hidruros).       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.10.4.5  Digestión para la determinación de Cd, As, Pb, Sn, Cu, Fe, Zn y Hg por horno de microondas. 
Pesar con precisión de ± 0,1 mg, 0,500 g como máximo de muestra, añadir 6 ml de ácido nítrico 
concentrado y 2 ml de agua oxigenada al 30%, cerrar per fectamente el envase de reacción y proceder según 
el manual del fabricante. 
B.10.5 Procedimiento 
B.10.5.1  Espectrometría de absorción atómica por flama. 
B.10.5.1.1  Calibración. Es necesario comprobar que se tiene una calibración inicial y periódica aceptable. 
B.10.5.1.1.1  Se inicia la configuración operacional del inst rumento y en el sistema de adquisición de datos. 
Permitir un periodo no menor a 30 minutos para el calentamiento de las lámparas de descarga sin electrodos. 
B.10.5.1.1.2  Se debe verificar la estabilidad del instrument o mediante el análisis de una solución estándar 
20 veces más concentrada que el límite de detección del instrumento (LDI) para el analito, leída un mínimo de 
cinco veces y calculando la desviación estándar resultante, la cual debe ser menor al 5%. 
B.10.5.1.1.3  El instrumento debe calibrarse para el analit o a determinar usando el blanco de calibración y 
los estándares de calibración preparados a 3 o 4 nive les de concentración dentro del intervalo dinámico de 
concentración del analito. 
B.10.5.1.1.4  Ajustar el instrumento a 0 con el blanco de calibración. Introducir los estándares de 
calibración del analito de menor a mayor concentración y re gistrar al menos tres réplicas de la absorbancia de 
cada uno. 
B.10.5.1.1.5  Elaborar una curva de calibración graficando absorbancia en función de la concentración. 
Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se  programan directamente, en los cuales sólo es 
necesario introducir los estándares y marcar su concentración teórica. 
B.10.5.1.2  Operación del instrumento. 
El desempeño del instrumento se verifica mediante el  empleo de blancos de calibración, estándares de 
calibración y una muestra de control de calidad (MCC). 
B.10.5.1.2.1  Después de que se ha realizado la calibración, se debe verificar que el instrumento trabaje 
adecuadamente para el analito. Para ello se analiza una muestra de control de calidad. Si las mediciones 
varían en ± 10% o más, al valor establecido para la MCC,  el análisis debe interrumpirse y buscar la posible 
causa de error, el instrumento se debe re calibrar y verificar la nueva calibración. 
B.10.5.1.2.2  Para verificar que el instrumento no presenta deriva, por cada 10 análisis se debe analizar el 
blanco de calibración. Si el valor verdadero del analit o difiere ± 10% o más, el instrumento debe recalibrarse. 
Si el error persiste debe identificarse el problema y corregirse. 
Si la matriz de la muestra es responsable de la deriva o afecta la respuesta del analito puede ser 
necesario trabajar por adiciones estándar. 
B.10.5.1.2.3  La demostración de la operatividad inicial del  instrumento se hace estableciendo los límites 
de detección del método (LDM) para el analito y el intervalo de calibración lineal. Para determinar el LDM se usa un blanco de reactivos fortificado con una concentraci ón del analito equivalente de 2 a 5 veces el límite de 
detección estimado. Se hacen al menos 4 réplicas de  lectura de absorbancia del blanco de reactivos 
fortificado procesado a través de todo el método analítico. Los LDM se calculan de acuerdo a: 
LDM= t x s 
t = valor de la "T" de Student a un intervalo de confianza de 99% y una desviación estándar estimada para 
n-1 grados de libertad. t = 3,14 para 7 réplicas. 
s = desviación estándar de las réplicas del análisis. El intervalo lineal de calibración se establece a partir de por lo menos 4 estándares de diferente 
concentración, uno de los cuales debe estar próx imo al límite superior del intervalo lineal. 
B.10.5.1.3  Determinación 
B.10.5.1.3.1 Ajustar el instrumento de absorción atómic a en las condiciones adecuadas para la 
determinación del analito de acuerdo a las in dicaciones del manual del instrumento. 
B.10.5.1.3.2 Introducir el blanco de reactivos y la muestra a analizar y registrar los valores de absorbancia. 
Se debe analizar al menos un blanco de reactivos con cada grupo de muestras. Los valores obtenidos ponen 
de manifiesto la calidad de los reactivos usados  y el grado de contaminación del laboratorio. 
B.10.5.1.3.3 En los equipos que pueden programarse, la lectura obtenida da directamente la 
concentración del elemento en las unidades de concentración utilizadas. 
B.10.5.1.3.4 Se debe analizar al menos un blanco de reactivos fortificado para cada grupo de muestras. 
Se calcula la exactitud como el porciento de recuperación (de acuerdo al apartado B.10.5.1.3.6). Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
B.10.5.1.3.5 Se debe fortificar al menos una muestra por grupo o el 10% de ellas lo que resulte mayor. La 
concentración añadida debe ser de aproximadamente 0,1 unidades de absorbancia. 
B.10.5.1.3.6 Se debe calcular el porciento de recuperación para el analito, de acuerdo a: 
CM - C 
R = -------------- x 100 
CA 
R = % recuperación CM = Concentración de la muestra fortificada 
C = Concentración de la muestra 
CA = Concentración equivalente de analito añadido a la muestra. 
Si la recuperación del analito en la muestra fortificada está fuera del intervalo previamente establecido y el 
blanco de reactivos fortificado está correcto, puede existir un problema relacionado con la matriz de la 
muestra. Los datos se deben verificar por el método de las adiciones estándar. 
B.10.5.2  Espectrometría de absorción at ómica por horno de grafito. 
B.10.5.2.1  Calibración. 
B.10.5.2.1.1  Proceder de acuerdo a los punt os B.10.5.1.1.1 a B.10.5.1.1.4 
B.10.5.2.1.2  Elaborar una curva de calibración graficando área de pico o altura máxima contra 
concentración del analito. 
La calibración mediante el uso de una computadora o una calculadora basada en el ajuste sobre los datos 
de concentración respuesta es aceptada. 
Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se  programan directamente, en los cuales sólo es 
necesario introducir los estándares y marcar su concentración teórica. 
B.10.5.2.2  Operación del instrumento. 
B.10.5.2.2.1  Proceder de acuerdo a B.10.5.1.2.1 a B.10.5.1.2.3 
B.10.5.2.3  Determinación. 
B.10.5.2.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómic a en las condiciones adecuadas para la 
determinación del analito, de acuerdo a las re comendaciones del manual del instrumento. 
El programa de temperaturas para el horno de graf ito puede variar dependiendo de la matriz de la 
muestra. En el caso de existir interferencias no específi cas (absorción molecular o di spersión de la luz), se 
recomienda consultar la bibliografía existente en cuanto  a los métodos disponibles para eliminarlas, así como 
en el caso de interferencias de matriz. 
B.10.5.3  Espectrometría de absorción atóm ica por generador de hidruros. 
B.10.5.3.1  Calibración. 
B.10.5.3.1.1  Proceder de acuerdo a los punt os B.10.5.1.1.1 a B.10.5.1.1.4 
B.10.5.3.1.2  A partir de la solución estándar de As de 1000 mg/l, preparar una solución de As de 1 mg/l en 
ácido clorhídrico de concentración apropiada al méto do. Trazar una curva de calibración de absorbancia 
(máximo de la altura de pico) en función de la concen tración del analito para un intervalo de concentración  de 
0 a 10 µg/l de As bajo las mismas condiciones de la matriz de la muestra. 
B.10.5.3.2  Operación del instrumento. 
B.10.5.3.2.1  Proceder de acuerdo a los punt os B.10.5.1.2.1 a B.10.5.1.2.3 
B.10.5.3.3  Determinación. 
B.10.5.3.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómic a en las condiciones adecuadas para la 
determinación de As: longitud de onda de 193,7 nm y lámpara de descarga sin electrodos. Colocar y ajustar la 
celda de absorción de acuerdo al manual del fabric ante. Ajustar el flujo de gas (nitrógeno o argón). 
B.10.5.3.3.2  Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibración de ácido clorhídrico al 1,5% siguiendo 
las instrucciones del manual del fabricante. 
B.10.5.3.3.3  Optimizar con un estándar de calibración la respuesta del instrumento al analito  (por lo 
general, 10 ml de una solución de 5 µg/l de As da una absorbancia de 0,2), ajustando el tiempo de purga I, el 
tiempo de reacción y el tiempo de purga II. 
B.10.5.3.3.4  Tomar un volumen conocido de la muestra dirigida y seguir el mismo procedimiento que con 
los estándares de calibración. 
B.10.5.4  Espectrometría de absorción atómica por vapor frío.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.10.5.4.1  Calibración. 
B.10.5.4.1.1  Proceder igual que en los punt os B.10.5.1.1.1 a B.10.5.1.1.4. 
B.10.5.4.1.2  A partir de la solución de trabajo de 1 µg/m l preparar estándares de calibración que 
contengan 0, 0,2, 0, 4, 0,6, 0,8 y 1,0 µg de Hg a frascos de re acción. A cada frasco agregar 100 ml de la 
solución de dilución y 20 ml de la solución de reducción. Trazar la curva de calibración de absorbancia (altura 
máxima de pico) en función de la concentración del analito. 
B.10.5.4.2  Operación del instrumento. 
B.10.5.4.2.1  Proceder de acuerdo a los punt os B.10.5.1.2.1 a B.10.5.1.2.3. 
B.10.5.4.3  Determinación. 
B.10.5.4.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómic a en las condiciones adecuadas para la 
determinación de Hg: longitud de onda de 253,6 nm, slit  0,7 nm y lámpara de cátodo hueco. Colocar y ajustar 
la celda de absorción de acuerdo al manual del fabr icante. Ajustar el flujo de gas (nitrógeno o argón). 
B.10.5.4.3.2  Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibración (solución de dilución y de reducción) 
siguiendo las instrucciones del manual del fabricante. 
B.10.5.4.3.3  Optimizar con un estándar de calibración la respuesta del instrumento al analito. 
B.10.5.4.3.4  Tomar 25 ml de la muestra digerida y seguir el mismo procedimiento que con los estándares 
de calibración. 
B.10.6 Expresión de resultados 
B.10.6.1 Método de cálculo. 
Interpolar los valores de absorbancia o altura de pico de la muestra analizada en la curva de calibración y 
obtener los mg/kg del elemento en la muestra y realizar los cálculos empleando la siguiente fórmula: 
A x B 
mg/ kg = -------- 
C 
en donde: 
A = Concentración en mg/kg de la muestra a interpolar en la curva de calibración. B = Volumen final al que se llevó la muestra (ml). 
C = Peso de la muestra (g) o volumen de la muestra (ml) en el caso de agua. 
En los equipos que pueden programarse, la lectura obtenida da directamente la concentración del 
elemento en mg/kg o µg/kg. 
B.10.7 Informe de la prueba 
Los resultados se informarán en mg/kg o µg/kg del elemento a determinar. 
B.11.  PREPARACION Y DILUCION DE MUESTRAS DE ALIMENTOS PARA SU ANALISIS 
MICROBIOLOGICO. 
B.11.1 Fundamento Se basa en la preparación de diluciones primarias, para obtener una distribución lo más uniforme posible 
de los microorganismos presentes en la porción de muestra. 
B.11.2 Reactivos y materiales B.11.2.1  Reactivos 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico. Cuando se indique agua debe 
entenderse como agua destilada. 
B.11.2.1.1  Preparación de reactivos 
B.11.2.1.1.1  Solución de hidróxido de sodio 1,0 N 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades Hidróxido de sodio 4,0 g 
Agua 100,0 ml 
 Preparación : Disolver el hidróxido de sodio y llevar a 100 ml con agua. 
B.11.2.1.1.2  Soluciones diluyentes Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
B.11.2.1.1.2.1  Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada). 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Fosfato de Sodio monobásico 34,0 g 
Agua 1,0 l 
 
Preparación : Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de 
sodio 1,0 N. Llevar a un litro c on agua. Esterilizar durante 15 minutos  a 121° ± 1,0 °C. Conservar en 
refrigeración (solución concentrada). Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y llevar a un litro con agua 
(solución de trabajo). Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera. Esterilizar a 121° ± 1,0 °C 
durante 15 minutos. Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo 
deberán ser iguales a los iniciales. 
B.11.2.1.1.2.2  Agua peptonada 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 1,0 g 
Cloruro de sodio 8,5 g 
Agua 1,0 l 
 
Preparación:  Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustar el pH a 7 ± O,1 con hidróxido de sodio 
1,0 N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera. 
Esterilizar a 121 ± 1,0 °C durante 15 minutos. Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la 
solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciale s. Si este diluyente no  es usado inmediatamente, 
almacenar en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en 
condiciones tales que no alteren su volumen o composición. 
B.11.2.2  Materiales 
B.11.2.2.1  Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 ml (o si es necesario de 1 ml y 2 ml), con tapón de 
algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total. 
B.11.2.2.2  Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca.  
B.11.2.2.3  Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca. 
B.11.2.2.4  Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, 
espátulas, etc. 
B.11.2.2.5  Todo el material e instrumentos que tengan  contacto con las muestras bajo estudio deberán 
esterilizarse mediante: 
Horno, durante 2 h a 170 a 175°C o 1 h a 180 °C o Au toclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 
1,0 °C. 
B.11.2.2.6  El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las 
especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por esterilización repetida y éste debe 
ser químicamente inerte. 
B.11.3 Aparatos e instrumentos 
B.11.3.1 Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.  
B.11.3.2 Autoclave con termómetro y manómetro, calib rada con termómetro de máximas y mínimas. 
B.11.3.3  Baño de agua con control de temperatura y ci rculación mecánica, provista con termómetro 
calibrado con divisiones de 0,1°C y que mantenga la temperatura a 45 ± 0,5°C.  
B.11.3.4  Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador 
peristáltico (Stomacher).  
B.11.3.5  Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico. 
B.11.3.6  Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g. 
B.11.4 Procedimiento 
B.11.4.1  Preparación de la dilución primaria. 
B.11.4.1.1  A partir de muestras líquidas:       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
Para muestras líquidas no viscosas (agua, leche, refresco s, etc.) en las cuales la distribución de 
microorganismos es homogénea o fácilmente homoge neizable por medios mecánicos (agitación, etc.) 
Para muestras congeladas de un alimento originalment e líquido o licuable, fundir por completo en baño de 
agua de 40 a 45°C un tiempo máximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente. 
Para la parte líquida de una muestra heterogénea la cual sea considerada sufi cientemente representativa 
de la muestra total (Por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales). 
B.11.4.1.1.1  Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm 
efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 ml de la m uestra y diluir con 9 ml del diluyente el cual debe 
encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente. 
B.11.4.1.1.2  Siempre que la cantidad de muestra lo pe rmita, tomar alícuotas mayores, por ejemplo 
volúmenes de 10 u 11 ml, diluídos con 90 o 99 ml, de la misma forma que se describió anteriormente 
B.11.4.1.2  A partir de muestras sólidas o semisólidas. 
Las muestras sólidas y semisólidas congeladas, deben  descongelarse en refrigeración de 4 a 8°C durante 
18 horas y no más de 24 horas antes de proceder a su análisis. 
B.11.4.1.2.1  Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plástica 
estériles de tamaño adecuado. 
B.11.4.1.2.2  Adicionar un volumen de 90 a 99 ml del diluyente llevado a una temperatura similar a la de la 
muestra. 
B.11.4.1.2.3  Operar la licuadora o el homogeneizador per istáltico de 1 a 2 minut os hasta obtener una 
suspensión completa y homogénea según se indique en la técnica correspondiente para cada alimento. Aún 
en los equipos más lentos, este tiempo no debe exceder de 2,5 minutos. 
B.11.4.1.2.4  Permitir que las partículas grandes se sediment en, y transferir la cantidad deseada tomando 
de las capas superiores de la suspensión. 
Cuando la dilución primaria es muy viscosa o pegajosa, adicionar más diluyente, lo cual debe tomarse en 
cuenta para las operaciones subsecue ntes o expresión de resultados. 
El homogeneizador peristáltico (Stomacher) puede no ser adecuado para algunos productos (por ejemplo, 
aquellos con partículas agudas o constituyentes que no  se dispersen fácilmente). Debe ser utilizado sólo 
cuando exista evidencia (publicada o por ensayos compar ativos) de que los resultados obtenidos no difieren 
significativamente con aquellos obtenidos con licuadora. 
B.11.4.2  Preparación de las diluciones decimales adicionales. 
B.11.4.2.1  Transferir 1 ml o un múltiplo, por ejemplo, 10 u 11 ml de la dilución primaria 1 + 9 (10 -1), en otro 
recipiente conteniendo nueve veces el volumen del diluye nte estéril a la temperatur a apropiada, evitando el 
contacto entre la pipeta y el diluyente. 
B.11.4.2.2  Mezclar cuidadosamente cada botella de dilu yente siempre de la misma manera que se 
describe en B.11.4.1.1.1. 
B.11.4.2.3  La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, 
dependen del número esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de análisis 
previos y de la información que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado. En ausencia 
total de información, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta. 
B.11.4.2.4  Utilizar pipetas diferentes para cada dilu ción inoculando simultáneamente las cajas que se 
hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la pipeta. 
B.11.4.2.5  Si la pipeta es terminal y se transfiere un vo lumen de líquido equivalente a su capacidad total, 
escurrir aplicando la punta de la pipeta una sola vez en un área de la caja Petri sin líquido. 
B.11.4.2.6  Mientras se afora el líquido de la pipeta, la punt a de ésta debe apoyarse en el interior del cuello 
del frasco y mantenerla en posición vertical, para lo cual este último debe inclinarse lo necesario. 
En estudios donde se busca la presencia o ausencia de una determinada especie de microorganismos en 
0,1 ml o 0,1 g, no es necesario preparar diluciones mayores. 
El criterio para seleccionar las diluciones a pre parar de acuerdo con el número de microorganismos 
esperado es: 
Para la técnica del número más probable utiliz ar tres tubos: donde sea posible demostrar el 
microorganismo en 10 ml de la dilución más alta. 
Para la técnica de cuenta en placa, considerar aquel las en las que se puedan contar de 25 a 250 colonias 
en un mínimo de una de tres diluciones en el método de cuenta de bacterias aerobias en placa. En el caso de 
otros grupos microbianos, considerar el número especificado de colonias en la Norma Oficial Mexicana 
correspondiente. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
B.11.4.3  Duración del procedimiento. 
En general, las diluciones de la muestra deben ser pr eparadas inmediatamente antes del análisis y éstas 
deben ser usadas para inocular el medio de cultivo dent ro de los 20 minutos posteriores a su preparación. 
B.12. DETERMINACION DE BACTERIAS COLIFORMES. TECNICA DEL NUMERO MAS PROBABLE. 
B.12.1  Fundamento 
El método se basa en que las bacterias coliformes,  fermentan la lactosa incubadas a 35 ± 1° C durante 24 
a 48 horas, resultando una producción de ácidos y gas el cual se manifiesta en las campanas de 
fermentación. 
B.12.2 Reactivos y materiales 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico. Cuando se indique agua debe 
entenderse como agua destilada con pH cercano a la neutralidad. 
B.12.2.1  Reactivos 
B.12.2.1.1  Soluciones diluyentes 
B.12.2.1.1.1  Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada) 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Fosfato monopotásico 34,0 g Agua 1,0 l 
 
Preparación : Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de 
sodio 1N. Llevar a un litro con agua. Esterilizar durante  15 minutos a 121 ± 1,0 °C. Conservar en refrigeración 
(solución concentrada). Tomar 1,25 ml de la solución co ncentrada y llevar a un litro  con agua. Distribuir en 
porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera. Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1 °C. Después de la 
esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales. 
B.12.2.1.1.2.  Agua peptonada 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades Peptona 1,0 g 
Cloruro de sodio 8,5 g 
Agua 1,0 l 
 Preparación: Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio  1 
N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cu alquier volumen múltiplo de nueve según se requiera. 
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0 °C. Después de la esterilización los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales. Si este diluyente no es usad o inmediatamente, almacenar 
en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5°C po r un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales 
que no alteren su volumen o composición. 
B.12.2.1.2  Medios de cultivo. 
Caldo lactosado (medio de enriquecimiento para agua potable y hielo). 
Caldo lauril sulfato triptosa (medio de enriquecimiento selectivo). 
Caldo lactosa bilis verde brillante (medio de confirmación). 
En el caso del análisis de agua potable y hielo pue de utilizarse caldo lactosado o caldo lauril sulfato 
triptosa con púrpura de bromocresol (concentración 0, 01 g/l de medio), como alternativa al uso de campanas 
de fermentación. Los tubos positivos se manifiestan por el vire del indicador a color amarillo. 
B.12.2.1.2.1  Caldo lactosado 
Ingrediente Medio de concentración 
1,5 Medio de concentración sencilla 
Extracto de carne 4,5 g 3,0 g 
Peptona de gelatina 7,5 g 5,0 g Lactosa 7,5 g 5,0 g 
Agua destilada  1000,0 ml 1000,0 ml 
       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
Disolver los ingredientes en 1 l de agua, calentando si  es necesario o el medio completo deshidratado, 
siguiendo las instrucciones del fabricante. Ajustar el pH final de tal manera que después de la esterilización 
éste sea de 6,9 ± 0,2 a 25°C. Distribuir en volúmenes  de 10 ml en tubos con dimensiones de 16 x 160 mm el 
medio de concentración sencilla y de 20 ml en tubos de 20 x 200 mm el medio de concentración 1,5, cada tubo debe tener campana de fermentación. Esterilizar  en autoclave por 15 minutos a 121 ± 1,0 °C. Enfriar 
rápidamente para evitar una exposición excesiva al calo r. El aspecto del caldo es claro y de color beige. Se 
puede utilizar una concentración doble del medio de cult ivo, en cuyo caso se emplearán 10 ml del caldo 
preparado, cuando se agreguen 10 ml de la muestra. 
B.12.2.1.2.2  Caldo lauril sulfato triptosa. 
Ingrediente Medio de concentración 1,5 Medio de concentración 
sencilla 
Triptosa 30,0 g 20,0 g Lactosa 7,5 g 5,0 g 
Fosfato dipotásico  4,125 g 2,75 g 
Fosfato monopotásico 4,125 g 2,75 g Cloruro de sodio  7,50 g 5,0 g 
Lauril sulfato de sodio  0,15 g 0,1 g 
Agua destilada  1000,0 ml 1000,0 ml 
 Disolver los componentes en 1 l de agua, calentando si es necesario o el medio de cultivo completo 
deshidratado, siguiendo las instrucci ones del fabricante. Ajustar el pH de tal manera que después de la 
esterilización éste sea de 6,8 ± 0,2 a 25°C. Distribuir en volúmenes de 10 ml en tubos con dimensiones de  16 
x 160 mm el medio de concentración sencilla y de 20 ml  en tubos de 20 x 200 mm el medio de concentración 
1,5, cada tubo debe tener campana de fermentación. Es terilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ± 1,0°C. 
Se recomienda almacenar el medio una vez preparado.  Las campanas de fermentación no deben de contener 
burbujas de aire después de la esterilización. Se pued e utilizar una concentración doble del medio de cultivo, 
en cuyo caso se emplearán 10 ml de caldo preparado, cuando se agreguen 10 ml de muestra. 
B.12.2.1.2.3  Lactosa bilis verde brillante 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 10,0 g Lactosa 10,0 g 
Sales biliares 20,0 g 
Verde brillante 0,0133 g Agua 1,0 l 
 
Disolver los componentes o el medio completo deshidrat ado en agua, calentar si es necesario. Ajustar el 
pH, de tal manera que después de la esterilización éste sea de 7,2 a 25°C. Distribuir el medio en cantidades de 10 ml en tubos de 16 X 160 mm conteniendo campana de fermentación. Esterilizar en autoclave por  15 minutos a 121 ± 1,0°C. Las campa nas de fermentación no deben contener burbujas de aire después de la 
esterilización. 
B.12.2.2  Materiales 
 Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 ml  (o si es necesario de 11 y 2 ml), con tapón de 
algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total. 
 Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca. 
 Utensilios esterilizables para la obtención de muestras : cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, 
etc. 
 Tubos de cultivo 20 x 200 mm y de 16 x 160 mm con tapones metálicos o de rosca. 
 Campanas de fermentación (tubos de Durham). 
 Pipetas bacteriológicas graduadas de 10 y 1 ml 
 Gradillas. 
 Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de diámetro Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
 Todo el material que tenga contacto con las m uestras bajo estudio debe esterilizarse mediante: 
 Horno, durante 2 horas a 170 a 175°C o 1 h a 180° C o autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 
121 ± 1,0°C. 
 El material de vidrio puede sustituirse por materi al desechable que cumpla con las especificaciones 
deseadas. No debe usarse material de vidrio daña do por las esterilizaciones repetidas y éste debe 
ser químicamente inerte. 
B.12.3 Aparatos e instrumentos  Horno para esterilizar que alcanc e una temperatura mínima de 170 °C. 
 Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1,0°C, provista con termómetro 
calibrado. 
 Termómetro de máximas y mínimas. 
 Autoclave que alcance una temperatura mínima de 121 ± 1,0°C. 
 Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25°C. 
B.12.4 Preparación de la muestra 
Las muestras deben prepararse y diluirse, siempre qu e sea posible, de acuerdo al Método de Preparación 
y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico. 
B.12.5 Procedimiento B.12.5.1  Para alimentos. 
Preparar suficiente número de diluciones para asegurar  que todos los tubos correspondientes a la última 
dilución rindan un resultado negativo. 
B.12.5.1.1  Prueba presuntiva 
B.12.5.1.1.1  Inoculación. Tomar tres tubos de medio de enriquecimiento de mayor concentración. Usar 
una pipeta estéril para transferir a cada tubo 10 ml de la muestra si es líquida o 10 ml de la dilución primaria 
inicial, en el caso de otros productos. 
B.12.5.1.1.1.1  Tomar tres tubos de concentración sencilla del medio selectivo de enriquecimiento. Usar 
una pipeta estéril para transferir a cada uno de estos tu bos 1 ml de la muestra si es líquida o 1 ml de la 
dilución primaria en el caso de otros productos. 
B.12.5.1.1.1.2  Para las diluciones subsecuentes, continuar como se indica en el párrafo anterior, usando 
una pipeta diferente para cada dilución. Mezclar suavemente el inóculo con el medio. 
B.12.5.2.1.2  Incubación. Incubar los tubos a 35 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas y observar si hay formación de 
gas, en caso contrario prolongar la incubación hasta 48 ± 2 horas 
B.12.5.1.2  Prueba confirmativa 
De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una asada y sembrar en un número igual de tubos con 
medio de confirmación. Incubar a 35 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas o si la formación de gas no se observa en este 
tiempo, prolongar la incubación por 48 ± 2 horas. 
En esta Norma Oficial Mexicana se considera una combinación de tres tubos por cada dilución de la serie. 
Para algunos productos y siempre que se requiera un a mayor precisión en los resultados, será necesario 
inocular una serie de cinco o diez tubos. 
B.12.6 EXPRESION DE LOS RESULTADOS. Tomar la serie de tubos de la prueba confirmativa que dé formación de gas después del período de 
incubación requerido y buscar el NMP en los cuadros correspondientes. 
El cuadro 3 muestra algunos ejemplos que se pueden presentar. 
Ejemplos: 
Ejemplo 1. Cuando sólo una dilución muestra tres t ubos positivos, elegir ésta y las diluciones mayores 
posteriores. 
Ejemplo 2. Cuando más de una dilución muestra tres tu bos positivos y la última da menos de tres, elegir 
esta última y las dos diluciones anteriores más bajas. 
Ejemplo 3. Cuando en ninguna dilución hay tres tubos positivos y éstos se encuentran en más de tres 
diluciones, seleccionar las dos dilucion es mayores positivas y la siguiente. 
Ejemplos 4 y 5. Cuando los tubos positivos sólo se encu entran en la muestra sin diluir (10 ml o 1 g) y en la 
primera dilución (1 ml o 10-1), seleccionar las tres primeras diluciones para el cálculo del número más 
probable.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
En cada caso se obtiene un número de tres cifras, lo cual es representado en los cuadros 4 al 7, según 
corresponda. En la columna que indica el número de tubos positivos se busca el índice del NMP. 
La técnica de NMP puede admitir gran cantidad de variac iones. Los resultados obtenidos con esta técnica 
deben ser utilizados con precaución. Los límites de confi anza están representados en los cuadros 4 al 7. Por 
ejemplo, para una muestra sólida con un NMP de 70 colif ormes por gramo, los límites de confianza en el 95% 
de los casos variarán de 10 a 230 coliformes por gramo (ejemplo 3 del cuadro 3) y en un producto con 24 de NMP de coliformes por gramo, los límites de confianz a son de 3,6 a 130 coliformes por gramo (ejemplo 2 
cuadro 3). 
 
CUADRO 4. Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados varios números de tubos. (Diluciones 10, 1,0 y 0,1g) 
 3 TUBOS POR DILUCION 5 TUBOS POR DILUCION 
Combinación 
de positivos Indice del NMP 
por g 95% Límites de confianza Indice del NMP 
por g 95% Límites de confianza 
bajo alto bajo alto 
0-0-0 < 0,03 <0,005 <0,09 <0,02 <0,005 <0,07 
0-0-1 0,03 <0,005 <0,09 0,02 <0,005 0,07 
0-1-0 0,03 <0,005 0,13 0,02 <0,005 0,07 
0-2-0 --- --- --- 0,04 <0,005 0,11 
1-0-0 0,04 <0,005 0,20 0,02 <0,005 0,07 
1-0-1 0,07 0,01 0,21 0,04 <0,005 0,11 
1-1-0 0,07 0,01 0,23 0,04 <0,005 0,11 
1-1-1 0,11 0,03 0,36 0,06 <0,005 0,15 
1-2-0 0,11 0,03 0,36 0,06 <0,005 0,15 
2-0-0 0,09 0,01 0,36 0,05 <0,005 0,13 
2-0-1 0,14 0,03 0,37 0,07 0,01 0,17 
2-1-0 0,15 0,03 0,44 0,07 0,01 0,17 
2-1-1 0,20 0,07 0,89 0,09 0,02 0,21 
2-2-0 0,21 0,04 0,47 0,09 0,02 0,21 
2-2-1 0,28 0,10 1,50 ---- --- --- 
2-3-0 --- --- --- 0,12 0,03 0,28 
3-0-0 0,23 0,04 1,20 0,08 0,01 0,19 
3-0-1 0,39 0,07 1,3 0,11 0,02 0,25 
3-0-2 0,64 0,15 3,80 --- --- --- 
3-1-0 0,43 0,07 2,1 0,11 0,02 0,25 
3-1-1 0,75 0,14 2,3 0,14 0,04 0,34 Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
3-1-2 1,20 0,30 3,8 --- --- --- 
3-2-0 0,93 0,15 3,80 0,14 0,04 0,34 
3-2-1 1,50 0,30 4,40 0,17 0,05 0,46 
3-2-2 2,10 0,35 4,70 -- -- -- 
3-3-0 2,40 0,36 13,0 -- -- -- 
3-3-1 4,60 0,71 24,0 -- -- -- 
3-3-2 11,0 1,50 48,0 -- -- -- 
3-3-3 >11.0 >1,50 >48.0 -- -- -- 
4-0-0 -- --- --- 0,13 0,03 0,31 
4-0-1 -- --- --- 0,17 0,05 0,46 
4-1-0 -- --- --- 0,17 0,05 0,46 
4-1-1 -- -- --- 0,21 0,07 0,63 
4-1-2 -- -- --- 0,26 0,09 0,78 
4-2-0 -- -- --- 0,22 0,07 0,67 
4-2-1 -- --- --- 0,26 0,09 0,78 
4-3-0 -- --- --- 0,27 0,09 0,80 
4-3-1 -- --- --- 0,33 0,11 0,93 
4-4-0 -- --- --- 0,34 0,12 0,93 
5-0-0 -- --- --- 0,23 0,07 0,70 
5-0-1 -- --- --- 0,31 0,11 0,89 
5-0-2 -- --- --- 0,43 0,15 1,14 
5-1-0 -- --- --- 0,33 0,11 0,93 
5-1-1 -- --- ---- 0,46 0,16 1,2 
5-1-2 -- --- --- 0,63 0,21 1,5 
5-2-0 -- --- --- 0,49 0,17 1,3 
5-2-1 -- --- --- 0,70 0,23 1,70 
5-2-2 -- --- --- 0,94 0,28 2,2 
5-3-0 -- --- --- 0,79 0,25 1,9 
5-3-1 -- --- --- 1,10 0,31 2,5 
5-3-2 -- --- --- 1,4 0,37 3,4 
5-3-3 -- --- --- 1,80 0,44 5,0 
5-4-0 -- --- --- 1,30 0,35 3,0 
5-4-1 -- --- --- 1,70 0,43 4,9 
5-4-2 -- --- --- 2,20 0,57 7,0 
5-4-3 -- --- --- 2,80 0,90 8,5 
5-4-4 -- --- --- 3,50 1,20 10,0 
5-5-0 --- --- --- 2,40 0,68 7,5 
5-5-1 --- --- --- 3,50 1,60 10,0 
5-5-2 --- --- --- 5,40 1,80 14,0 
5-5-3 ---- --- --- 9,20 3,0 32,0 
5-5-4 --- --- --- 16,09 6,40 58,0 
5-5-5 ---- --- --- --- --- --- 
 
CUADRO 5. Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados varios números de tubos. (Diluciones 1,0, 0,1 y 0,01g) 
 3 TUBOS POR DILUCION 5 TUBOS POR DILUCION 
Combinación de 
positivos Indice del 
NMP por g 95% Límites de confianza Indice del NMP 
por g 95% Límites de confianza 
bajo alto bajo alto 
0-0-0 <0,3 <0,05 <0,9 <0,2 <0,05 <0,7 
0-0-1 0,3 <0,05 <0,9 0,2 <0,05 0,7 
0-1-0 0,3 <0,05 1,3 0,2 <0,05 0,7 
0-2-0 --- --- --- 0,4 <0,05 0,11 
1-0-0 0,4 <0,05 2,0 0,2 <0,05 0,7 
1-0-1 0,7 0,1 2,0 0,4 <0,05 1,1 
1-1-0 0,7 0,1 2,3 0,4 <0,05 1,1 
1-1-1 1,1 0,3 3,6 0,6 <0,05 1,5       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
1-2-0 1,1 0,3 3,6 0,6 <0,05 1,5 
2-0-0 0,9 0,1 3,6 0,5 <0,05 1,3 
2-0-1 1,4 0,3 3,7 0,7 0,1 1,7 
2-1-0 1,5 0,3 4,4 0,7 0,1 1,7 
2-1-1 2,0 0,7 8,9 0,9 0,2 2,1 
2-2-0 2,1 0,4 4,7 0,9 0,2 2,1 
2-2-1 2,8 1,0 15,0 --- --- --- 
2-3-0 --- --- --- 1,2 0,3 2,8 
3-0-0 2,3 0,4 12,0 0,8 0,1 1,9 
3-0-1 3,9 0,7 13,0 1,1 0,2 2,5 
3-0-2 6,4 1,5 38,0 -- -- -- 
3-1-0 4,3 0,7 21,0 1,1 0,2 2,5 
3-1-1 7,5 1,4 23,0 1,4 0,4 3,4 
3-1-2 12,0 3,0 38,0 -- -- -- 
3-2-0 9,3 1,5 38,0 1,4 0,4 3,4 
3-2-1 15,0 3,0 44,0 1,7 0,5 4,6 
3-2-2 21,0 3,5 47,0 -- -- -- 
3-3-0 24,0 3,6 130,0 -- -- -- 
3-3-1 46,0 7,1 240,0 -- -- -- 
3-3-2 110,0 15,0 480,0 -- -- -- 
3-3-3 >110,0 >15,0 >480,0 -- -- -- 
4-0-0 -- --- --- 1,3 0,3 3,1 
4-0-1 -- --- --- 1,7 0,5 4,6 
4-1-0 -- --- --- 1,7 0,5 4,6 
4-1-1 -- --- --- 2,1 0,7 6,3 
4-1-2 -- --- --- 2,6 0,9 7,8 
4-2-0 -- --- --- 2,2 0,7 6,7 
4-2-1 -- --- --- 2,6 0,9 7,8 
4-3-0 -- --- --- 2,7 0,9 8,0 
4-3-1 -- --- --- 3,3 1,1 9,3 
4-4-0 -- --- --- 3,4 1,2 3, 
5-0-0 -- --- --- 2,3 0,7 7,0 
5-0-1 -- --- --- 3,1 1,1 8,9 
5-0-2 -- --- --- 4,3 1,5 11,4 
5-1-0 -- --- --- 3,3 1,1 9,3 
5-1-1 -- --- --- 4,6 1,6 12,0 
5-1-2 -- --- --- 6,3 2,1 15,0 
5-2-0 -- --- --- 4,9 1,7 13,0 
5-2-1 -- --- --- 7,0 2,3 17,0 
5-2-2 -- --- --- 9,4 2,8 22,0 
5-3-0 -- --- --- 7,9 2,5 19,0 
5-3-1 -- --- --- 11,0 3,1 25,0 
5-3-2 -- --- --- 14,0 3,7 34,0 
5-3-3 -- --- --- 18,0 4,4 50,0 
5-4-0 -- --- --- 13,0 3,5 30,0 
5-4-1 -- --- --- 17,0 4,3 49,0 
5-4-2 -- --- --- 22,0 5,7 70,0 
5-4-3 -- --- --- 28,0 9,0 85,0 
5-4-4 -- --- --- 35,0 12,0 100,0 
5-5-0 -- --- --- 24,0 6,8 75,0 
5-5-1 -- --- --- 35,0 12,0 100,0 
5-5-2 -- --- --- 54,0 18,0 140,0 
5-5-3 -- --- --- 92,0 30,0 320,0 
5-5-4 -- --- --- 161,0 64,0 580,0 
5-5-5 -- --- --- >161,0 >64,0 >580,0 
 Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
CUADRO 6. Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados va rios números de t ubos. (Diluciones 0,1, 0,001 y 0,0001 g) 
 3 TUBOS POR DILUCION 5 TUBOS POR DILUCION 
Combinación 
de positivos Indice del 
NMP por g 95% Límites de confianza Indice del NMP 
por g 95% Límites de confianza 
bajo Alto bajo alto 
0-0-0 <3 <0,5 <9 <2 <0,5 <7 
0-0-1 3 <0,5 <9 2 <0,5 7 
0-1-0 3 <0,5 13 2 <0,5 7 
0-2-0 --- --- --- 4 <0,5 11 
1-0-0 4 <0,5 20 2 <0,5 7 
1-0-1 7 1 21 4 <0,5 11 
1-1-0 7 1 23 4 <0,5 11 
1-1-1 11 3 36 6 <0,5 15 
1-2-0 11 3 36 6 <0,5 15 
2-0-0 9 1 36 5 <0,5 13 
2-0-1 14 3 37 7 1,0 17 
2-1-0 15 3 44 7 1,0 17 
2-1-1 20 7 89 9 2 21 
2-2-0 21 4 47 9 2 21 
2-2-1 28 10 150 --- --- --- 
2-3-0 --- --- --- 12 3 28 
3-0-0 23 4 120 8 1 19 
3-0-1 39 7 13,0 11 2 25 
3-0-2 64 15 380 -- -- -- 
3-1-0 43 7 210 11 2 25 
3-1-1 75 14 230 14 4 34 
3-1-2 120 30 380 -- -- -- 
3-2-0 93 15 380 14 4 34 
3-2-1 150 30 440 17 5 46 
3-2-2 210 35 470 -- -- -- 
3-3-0 240 36 130,0 -- -- -- 
3-3-1 460 71 240,0 -- -- -- 
3-3-2 1100 150 480,0 -- -- -- 
3-3-3 >1100 >150 >480,0 -- -- -- 
4-0-0 -- --- --- 13 3 31 
4-0-1 -- --- --- 17 5 46 
4-1-0 -- --- --- 17 5 46 
4-1-1 -- --- --- 21 7 63 
4-1-2 -- --- --- 26 9 78 
4-2-0 -- --- --- 22 7 67 
4-2-1 -- --- --- 26 9 78 
4-3-0 -- --- --- 27 9 80 
4-3-1 -- --- --- 33 11 93 
4-4-0 -- --- --- 34 12 93 
5-0-0 -- --- --- 23 7 7 
5-0-1 -- --- --- 31 11 89 
5-0-2 -- --- --- 43 15 114 
5-1-0 -- --- --- 33 11 93 
5-1-1 -- --- --- 46 16 120 
5-1-2 -- --- --- 63 21 150 
5-2-0 -- --- --- 49 17 130 
5-2-1 -- --- --- 70 23 170 
5-2-2 -- --- --- 94 28 220 
5-3-0 -- --- --- 79 25 190 
5-3-1 -- --- --- 110 31 250       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
5-3-2 -- --- --- 140 37 340 
5-3-3 -- --- --- 180 44 500 
5-4-0 -- --- --- 130 35 300 
5-4-1 -- --- --- 170 43 490 
5-4-2 -- --- --- 220 57 700 
5-4-3 -- --- --- 280 90 850 
5-4-4 -- --- --- 350 120 1000 
5-5-0 -- --- --- 240 68 750 
5-5-1 -- --- --- 350 120 1000 
5-5-2 -- --- --- 540 180 1400 
5-5-3 -- --- --- 920 300 3200 
5-5-4 -- --- --- 1600 640 5800 
5-5-5 -- --- --- >1600 >640 >5800 
 
CUADRO 7. Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados va rios números de tubos. (Diluciones 0,01, 0,001 y 0,0001 g) 
 3 TUBOS POR DILUCION 5 TUBOS POR DILUCION 
Combinación 
de positivos Indice del 
NMP por g 95% Límites de confianza Indice del NMP 
por g 95% Límites de confianza 
bajo Alto bajo alto 
0-0-0 <30 <5 <90 <20 <5 <70 
0-0-1 30 <5 <90 20 <5 70 
0-1-0 30 <5 130 20 <5 70 
0-2-0 --- --- --- 40 <5 110 
1-0-0 40 <5 200 20 <5 70 
1-0-1 70 10 210 40 <5 110 
1-1-0 70 10 230 40 <5 110 
1-1-1 110 30 360 60 <5 150 
1-2-0 110 30 360 60 <5 150 
2-0-0 90 10 360 50 <5 130 
2-0-1 140 30 370 70 10 170 
2-1-0 150 30 440 70 10 170 
2-1-1 200 70 890 90 20 210 
2-2-0 210 40 470 90 20 210 
2-2-1 280 100 1500 --- --- --- 
2-3-0 --- --- --- 120 30 280 
3-0-0 230 40 1200 80 10 190 
3-0-1 390 70 1300 110 20 250 
3-0-2 640 150 3800 -- -- -- 
3-1-0 430 70 2100 110 20 250 
3-1-1 750 140 2300 140 40 340 
3-1-2 1200 300 3800 -- -- -- 
3-2-0 930 150 3800 140 40 340 
3-2-1 1500 300 4400 170 50 460 
3-2-2 2100 350 4700 -- -- -- 
3-3-0 2400 360 13000 -- -- -- 
3-3-1 4600 710 24000 -- -- -- 
3-3-2 11000 1500 48000 -- -- -- 
3-3-3 >11000 >1500 >48000 -- -- -- 
4-0-0 -- --- --- 130 30 310 
4-0-1 -- --- --- 170 50 460 
4-1-0 -- --- --- 170 50 460 
4-1-1 -- --- --- 210 70 630 
4-1-2 -- --- --- 260 90 780 
4-2-0 -- --- --- 220 70 670 
4-2-1 -- --- --- 260 90 780 Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
4-3-0 -- --- --- 270 90 800 
4-3-1 -- --- --- 330 110 930 
4-4-0 -- --- --- 340 120 930 
5-0-0 -- --- --- 230 70 700 
5-0-1 -- --- --- 310 110 890 
5-0-2 -- --- --- 430 150 1140 
5-1-0 -- --- --- 330 110 930 
5-1-1 -- --- --- 460 160 1200 
5-1-2 -- --- --- 630 210 1500 
5-2-0 -- --- --- 490 170 1300 
5-2-1 -- --- --- 700 230 1700 
5-2-2 -- --- --- 940 280 2200 
5-3-0 -- --- --- 790 250 1900 
5-3-1 -- --- --- 1100 310 2500 
5-3-2 -- --- --- 1400 370 3400 
5-3-3 -- --- --- 1800 440 5000 
5-4-0 -- --- --- 1300 350 3000 
5-4-1 -- --- --- 1700 430 4900 
5-4-2 -- --- --- 2200 570 7000 
5-4-3 -- --- --- 2800 900 8500 
5-4-4 -- --- --- 3500 1200 10000 
5-5-0 -- --- --- 2400 680 7500 
5-5-1 -- --- --- 3500 1200 10000 
5-5-2 -- --- --- 5400 1800 14000 
5-5-3 -- --- --- 9200 3000 32000 
5-5-4 -- --- --- 16000 6400 58000 
5-5-5 -- --- --- >16000 >6400 >58000 
 
B.12.7 Informe de la prueba 
Informar "Número más probable (NMP) de coliformes por gramo o mililitro de muestra". 
En caso de muestras de agua informar NMP/100 ml. 
B.13. METODO PARA LA CUENTA DE MICROOR GANISMOS COLIFORMES TOTALES EN PLACA. 
B.13.1 Fundamento El método permite determinar el número de microorganismos coliformes presentes en una muestra, 
utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis) en el que se desarrollan bacterias a 35°C en aproximadamente 24 h, dando como resultado la produ cción de gas y ácidos orgánicos, los cuales viran el 
indicador de pH y precipitan las sales biliares. 
B.13.2 Reactivos y materiales 
B.13.2.1  Reactivos 
Los reactivos que a continuación se mencionan, deben ser grado analítico y cuando se indique agua debe 
entenderse como agua destilada. 
B.13.2.1.1  Soluciones diluyentes 
B.13.2.1.1.1  Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada) 
FORMUL
A 
Ingredientes Cantidades
Fosfato monopotásico 34,0 g Agua 1,0 l 
 
Preparación : Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de 
sodio 1,0 N. Llevar con agua a un litro. Esterilizar a 121± 1,0°C du rante 15 minutos. Conservar en 
refrigeración (solución concentrada). Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y llevar a un litro con agua 
(solución de trabajo). Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera. Esterilizar durante 15 minutos a 121± 1,0°C. Después de la ester ilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser 
iguales a los iniciales.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.13.2.1.1.2  Agua Peptonada  
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 1,0 g NaCl 8,5 g 
Agua 1,0 l 
 
Preparación:  Disolver los componentes en un litro de agua. Ajus tar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio  1,0 
N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cu alquier volumen múltiplo de nueve según se requiera. 
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0°C. Después de la esterilización, los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales. Si este diluyente no es usad o inmediatamente, almacenar 
en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5°C po r un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales 
que no alteren su volumen o composición. 
B.13.2.1.2  Medio de Cultivo 
Agar-rojo- violeta-bilis-lactosa (RVBA) 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 7,0 g Extracto de levadura 3,0 g 
Lactosa 10,0 g 
Sales biliares 1,5 g Cloruro de sodio 5,0 g 
Rojo neutro 0,03 g 
Cristal violeta 0,002 g Agar 15,0 g 
Agua 1,0 l 
 
Preparación:  Mezclar los componentes en el agua y deja r reposar durante algunos minutos. Mezclar 
perfectamente y ajustar el pH a 7,4 con ácido clorhídric o 0,1N o con hidróxido de sodio 0,1N a 25°C, de forma 
que después del calentamiento se mantenga en este valor.  Calentar con agitación constante y hervir durante 2 
minutos. Enfriar inmediatamente el medio en un ba ño de agua hasta que llegue a 45°C. Evitar el 
sobrecalentamiento del medio. No debe esterilizarse en aut oclave. Usar el medio dentro de las tres primeras 
horas después de su preparación. En el caso de ut ilizar medio de cultivo deshidratado, seguir las 
instrucciones del fabricante. 
B.13.2.2 Materiales 
 Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 ml  (o si es necesario de 11 y 2 ml), con tapón de 
algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total. 
 Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca. 
 Tubos de 16 X 150 mm con tapón de rosca. 
 Utensilios esterilizables para la obtención de mu estras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas,  
espátulas, etc. 
 Cajas Petri. 
 Todo el material e instrumentos que tengan contacto  con las muestras bajo estudio debe esterilizarse 
mediante: 
 Horno, durante 2 h a 170 - 175°C, o 1 h a 180°C; o en autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 
121 ± 1,0°C. 
 El material de vidrio puede sustituirse por materi al desechable que cumpla con las especificaciones 
deseadas. No debe usarse material de vidrio daña do por las esterilizaciones repetidas y éste debe 
ser químicamente inerte. 
B.13.3 Aparatos e instrumentos 
 Horno para esterilizar que al cance una temperatura mínima 
 de 170°C. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
 Autoclave con termómetro y manómetro, calib rada con termómetro de máximas y mínimas. 
 Baño de agua con control de temperatura y circul ación mecánica, provista con termómetro calibrado 
con divisiones de 0,1° C y que mant enga la temperatura a 45 ± 1,0°C. 
 Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico. 
 Incubadora con termostato que evite variaciones ma yores de ± 1,0° C, provista con termómetro 
calibrado. 
 Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente 
amplificador. 
 Registrador mecánico o electrónico. 
 Microscopio óptico. 
 Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25 °C. 
B.13.4 Preparación de la muestra 
La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en el método de Preparación y Dilución 
de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico. 
B.13.5 Procedimiento B.13.5.1  Colocar en cajas Petri por duplicado 1 ml de la muestra líquida directa o de la dilución primaria, 
utilizando para tal propós ito una pipeta estéril. 
B.13.5.2  Repetir el procedimiento tantas veces como diluci ones decimales se requiera sembrar, utilizando 
una pipeta estéril diferente para cada dilución. 
B.13.5.3  Verter de 15 a 20 ml del medio RVBA fundido y mant enido a 45 ± 1,0°C en baño de agua. En el 
caso de utilizar cajas de Petri de plástico se vierte de 10 a 15 ml del medio. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20 
minutos. 
B.13.5.4  Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medi o con seis movimientos de derecha a izquierda, 
seis movimientos en el sentido de las manecillas del relo j, seis movimientos en el sentido contrario al de las 
manecillas del reloj y seis de atrás para adelante, so bre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla 
solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fría. 
B.13.5.5  Preparar una caja control con 15 ml de medio para verificar la esterilidad. 
B.13.5.6 Después de que está el medio completamente solidificado en la caja, verter aproximadamente  4 
ml del medio RVBA a 45 ± 1,0°C en la superficie del medio inoculado. Dejar que solidifique. 
B.13.5.7  Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35°C, durante 24 ± 2 horas. 
B.13.5.8  Después del período especificado para la incuba ción, contar las colonias con el contador de 
colonias. 
B.13.5.9  Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias típicas son de color 
rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un ha lo de precipitación debido a las sales biliares, el 
cual es de color rojo claro o rosa, la morfología colonial  es semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 
0,5 a 2,0 mm. 
B.13.6 Expresión de los resultados B.13.6.1 Cálculo del Método 
B.13.6.1.1  Placas que contienen entre 15 y 150 colonias características. 
Separar las placas que contienen el número ant es mencionado de colonias características en dos 
diluciones consecutivas. Contar las colonias presentes . Calcular el número de coliformes por mililitro o por 
gramo de producto, multiplicando el número de colonias por el inverso de la dilución correspondiente, 
tomando los criterios del método para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa. 
B.13.6.1.2  Placas que contienen menos de 15 colonias características. 
Si cada una de las placas tiene menos de 15 colonias  características, reportar el número obtenido seguido 
de la dilución correspondiente. 
B.13.6.1.3  Placas con colonias no características. 
Si en las placas no hay colonias características, repor tar el resultado como: menos de un coliforme por 1/d 
por gramo, en donde d es el factor de dilución. 
B.13.7 Informe de la prueba Informar: UFC/g o ml en placa de agar rojo viol eta bilis, incubados a 35°C durante 24 ± 2 h.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
En caso de emplear diluciones y no observar crecimient o, informar utilizando como referencia la dilución 
más baja utilizada, por ejemplo dilución 10-1. 
En caso de no observar crecimiento en la muestra sin diluir se informa: "no desarrollo de coliformes  por 
ml". 
B.14. METODO PARA LA DETERMINACION DE Salmonella  EN ALIMENTOS. 
B.14.1 Fundamento La presente técnica para la detección de  Salmonella  en alimentos, describe un esquema general que 
consiste de 5 pasos básicos: 
B.14.1.1  Preenriquecimiento, es el paso donde la mues tra es enriquecida en un medio nutritivo no 
selectivo, que permite restaurar las células de  Salmonella  dañadas a una condición fisiológica estable. 
B.14.1.2  Enriquecimiento selectivo, empleado con el propósito de incrementar las poblaciones de 
Salmonella  e inhibir otros organismos presentes en la muestra. 
B.14.1.3  Selección en medios sólidos, en este paso se utilizan medios selectivos que restringen el 
crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella  y permite el reconocimiento visual de colonias 
sospechosas. 
B.14.1.4  Identificación bioquímica, este paso permite la identificación génerica de los cultivos de 
Salmonella  y la eliminación de cultivos sospechosos falsos. 
B.14.1.5  Serotipificación, es una técnica serológica que permite la identificación específica de un cultivo. 
B.14.2 Reactivos y materiales En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, se deben seguir las instrucciones 
impresas en la etiqueta respectiva para su preparación. 
Las sustancias químicas usadas para preparar los medios de cultivo y los reactivos deben ser grado 
analítico. 
B.14.2.1 Reactivos B.14.2.1.1 Medios de pre-enriquecimiento 
B.14.2.1.1.1  Agua de peptona tamponada 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades Peptona 10,0 g Cloruro sódico 5,0 g Fosfato sódico dibásico 3,5 g Fosfato potásico monobásico 1,5 g 
Agua 1,0 l 
 Preparación:  Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario. Ajustar el pH, si es 
necesario, después de la esterilización a 7,0. Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables con la capacidad 
necesaria para obtener las porciones necesarias par a la prueba. Esterilizar por 20 min a 121 ± 1°C 
B.14.2.1.1.2  Caldo lactosado 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades Extracto de carne 3,0 g Peptona 5,0 g Lactosa 5,0 g Agua destilada 1,0 l 
pH final: 6,9 ± 0,2 Preparación: Disolver los ingredientes en agua, calentando a 65°C. Distribuir en porciones de 225 ml, en 
frascos de 500 ml.. Esterilizar durante 15 min a 121°C ± 1°C Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
B.14.2.1.2 Caldo de  enriquecimiento 
B.14.2.1.2.1  Caldo selenito-cistina 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades Triptona o polipeptona 5,00 g 
Lactosa 4,00 g 
Fosfato disódico 10,00 g Selenito ácido de sodio 4,00 g 
L-cistina 0,01 g 
Agua destilada 1,00 l 
pH final: 7,0 ± 0,2 a 25°C Preparación : Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estéril y distribuir en volúmenes de 10 
y 225 ml en recipientes estériles, según se requiera. El  caldo así preparado es tr ansparente. De preferencia 
usarlo el mismo día de su preparación. Si se desea c onservar el medio por varios días, puede exponerse al 
calor en autoclave por 5 min a 110°C ± 1°C, tomando entonces un color salmón. 
B.14.2.1.2.2  Caldo tetrationato 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Proteosa peptona o tristona 5,0 g 
Sales biliares 1,0 g 
Carbonato de calcio 10,0 g 
Tiosulfato de sodio pentahidratado 30,0 g Agua destilada 1,0 l 
pH final: 7,0 ± 0,1 
Preparación:  Disolver los ingredientes en un litro de agua  destilada estéril. Distribuir, agitando 
constantemente, en porciones de 10 y 225 ml, en recipiente s estériles. Guardar en refrigeración. Antes de  
usar el medio, agregar 2 ml de una solución yodo-yoduro y 1 ml de solución de verde brillante al 0,1% por cada 100 ml de caldo. El medio una vez adicionado de yodo no debe calentarse y debe usarse el mismo día 
de su preparación. 
B.14.2.1.2.3  Vassiliadis-Rappaport 
Solución A 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Tristona 5,0 g 
Cloruro de sodio 8,0 g Fosfato de potasio dihidrogenado 1,6 g 
Agua destilada 1,0 l 
 Disolver los componentes en agua por calentamiento cercano a 70°C 
Solución B 
FORMULA 
Ingredientes  Cantidades 
Cloruro de magnesio 
hexahidratado 400,0 g 
Agua destilada 1,0 l 
 Disolver el cloruro de magnesio en agua. Como esta sal es muy higroscópica es conveniente disolver el 
contenido entero de cloruro de magnesio desde un recipiente recientemente abierto de tal modo que la 
concentración de la solución sea de 0,4 g/ml. Cons ervar en frasco ámbar a temperatura ambiente.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
Solución C 
Ingredientes Cantidades 
Oxalato de verde de malaquita 0,4g 
Agua destilada 100,0 ml 
 
Disolver el oxalato de verde de malaquita en agua. Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente. 
Medio completo 
Ingredientes Cantidades 
solución A 1 000 ml 
solución B 100 ml 
solución C 10 ml 
 
Preparación:  Adicionar 1 000 ml de la solución A, 100 ml de la solución B y 10 ml de la solución C. Ajustar 
el pH si es necesario, de tal manera que después de la esterilización sea de 5,2. Distribuir antes de usar 
dentro de tubos en cantidades de 10 ml. Almacenar en refrigeración. 
B.14.2.1.2.4  Caldo de Soya Tripticasa 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Tripticasa o triptosa 17,0 g Fitona 3,0 g Glucosa 2,5 g Cloruro de sodio 2,5 g Agua destilada 1,0 l 
pH final: 7,3 ± 0,2 Preparación:  Disolver los ingredientes en 1 litro de ag ua destilada, calentando lentamente hasta su 
disolución completa. Distribuir porciones de 225 ml dent ro de matraces de 500 ml y esterilizar en autoclave 
durante 15 min a 121°C ± 1°C. 
B.14.2.1.2.5  Leche descremada reconstituida 
Suspender 100 g de leche descremada en polvo en un litro de agua destilada. Agitar circularmente hasta 
disolución. Distribuir en volúmenes de 225 ml en matraces  Erlenmeyer de 500 ml. Esterilizar a 121 °C ± 1°C 
por 15 min. El volumen final debe corregirse para mantener 225 ml. 
B.14.2.1.2.6  Caldo soya tripticasa estéril adicionado con sulfito de potasio. 
Adicionar al caldo soya tripticasa 5 g de sulf ito de potasio por cada 1000 ml de medio, quedando una 
concentración final de sulfito de potasio del 0,5%. Adic ionar el sulfito de potasio antes de esterilizar en 
autoclave en la forma habitual. 
B.14.2.1.3 Medios de Aislamiento B.14.2.1.3.1  Agar verde brillante (VB) 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades Extracto de levadura 3,0000g Polipeptona (Proteosa peptona No. 3) 10,0000g Cloruro de sodio 5,0000g Lactosa 10,0000g Sacarosa 10,0000g Rojo de fenol 0,0800g Agar 20,0000g Verde brillante 0,0125g Agua destilada 1,0000l 
pH final: 6,9 ± 0,2 Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Preparación:  Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar a ebullición, hasta 
disolución completa. Ajustar el pH. Esterilizar en autoc lave por 15 min a 121°C ± 1°C. El sobrecalentamiento 
del medio disminuye su selectividad. Enfriar el medio a 50°C y distribuirlo en cajas de petri estériles. El 
aspecto del medio es obscuro, de color marrón. 
B.14.2.1.3.2  Agar con sulfito de bismuto 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades Extracto de carne de res 5,000g 
Mezcla de peptonas 10,000g 
Glucosa 5,000g Fosfato disódico (anhidro) 5,000g 
Sulfato ferroso (anhidro) 0,300g 
Sulfito de bismuto 8,000g Verde brillante 0,025g 
Agar 20,000g 
Agua destilada 1,000l 
pH final: 7,6 ± 0,2 
Preparación:  Suspender los ingredientes en un litro de agua. Calentar hasta su disolución completa, 
agitando frecuentemente. Ajustar el pH. Enfriar a 45°C y verter en cajas de petri estériles, distribuyendo de 
manera homogénea el precipitado propio del medio. El as pecto de las placas es opaco, de color verde pálido 
y deben usarse el mismo día de su preparación. Si la  coloración es parda, no deben utilizarse. El medio no 
debe esterilizarse en autoclave; el sobrecalentamiento afecta su selectividad. 
B.14.2.1.3.3  Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Xilosa 3,75g 
L-lisina 5,00g Lactosa 7,50g 
Sacarosa 7,50g 
Cloruro de sodio 5,00g Extracto de levadura 3,00g 
Rojo de fenol 0,08g 
Agar 15,00g Desoxicolato de sodio 2,50g 
Citrato férrico-amónico 0,80g 
Tiosulfato de sodio 6,80g Agua destilada 1,00l 
pH final: 6,9 ± 0,2 
Preparación:  Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada, y calentar en baño de agua a 
55°C, agitando frecuentemente,  hasta disolución completa. Ajustar el pH. Enfriar a 50°C y verter en cajas de 
petri estériles. No se esterilice. El sobrecalentami ento produce una precipitación; la reactividad del medio 
puede ser satisfactoria, pero las colonias suelen ser muy pequeñas. El aspecto del medio es claro y de color rojo brillante. 
B.14.2.1.3.4  Agar para Salmonella y Shigella (SS) 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 5,000g Polipeptona * 5,000g 
Lactosa 10,000g 
Sales biliares 8,500g Citrato de sodio dihidratado 8,500g       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
Tiosulfato de sodio pentahidratado 8,500g 
Citrato férrico 1,000g 
Agar 13,500g 
Rojo neutro 0,025g Verde brillante 0,330mg 
Agua destilada 1,000l 
pH final: 7,0 ± 0,2 * La polipeptona se puede sustituir por 2,5 g de peptona de caseína y 2,5 g de peptona de carne. 
Preparación:  Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada estéril y calentar a ebullición hasta 
disolución completa. Ajustar el pH. No esterilizar en aut oclave. Enfriar a 50°C y distribuir en cajas de petri 
estériles en condiciones asépticas. El aspecto del medio fundido es claro y de color rosado. 
B.14.2.1.3.5  Agar entérico Hektoen 
FORMULA 
Ingredientes CantidadesProteosa peptona 12,000g 
Extracto de levadura 3,000g 
Lactosa 12,000g Sacarosa 12,000g 
Salicina 2,000g 
Sales biliares 9,000g Cloruro de sodio 5,000g 
Tiosulfato de sodio 5,000g 
Citrato amónico férrico 1,500g Azul de bromotimol 0,064g 
Fuscina ácida 0,100g 
Agar 13,500g Agua 1,000l 
pH final: 7,5 ± 0,2 
Preparación:  Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir con agitación hasta completa 
disolución del agar. No sobrecalentar. Dejar enfriar a 55 - 60 °C y distribuir en cajas de petri estériles en 
condiciones asépticas. 
B.14.2.1.4 Medios para pruebas bioquímicas 
B.14.2.1.4.1  Agar de tres azúcares y hierro (TSI) 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades
Peptona de carne * 1,0g Peptona de caseína * 1,0g 
Cloruro de sodio 0,5g 
Lactosa 1,0g Sacarosa 1,0g 
Glucosa 0,1g 
Agar 1,3g Rojo de fenol 2,5mg 
Sulfato ferroso amónico- Pentahidratado 20,0mg 
Tiosulfato de sodio 20,0mg Agua destilada 100,0ml 
pH final: 7,3 ± 0,2 
* Estas peptonas se pueden sustituir por 2 g de polipeptona. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Preparación:  Suspender los ingredientes en 100 ml de agua destilada. Calentar a ebullición, agitando 
ocasionalmente, hasta disolución completa. Enfriar a 60°C y ajustar el pH. Distribuir en volúmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar a 121°C ± 1°C durant e 15 min. Inclinar los tubos de manera que el medio 
de cultivo en el fondo alcance una altura de 3 cm y una profundidad de 4 cm. El medio es de color rojo. 
B.14.2.1.4.2  Agar de hierro y lisina (LIA) 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades Peptona de gelatina 0,5g 
Extracto de levadura 0,3g 
Glucosa 0,1g L-lisina 1,0g 
Citrato férrico-amónico 50,0mg 
Tiosulfato de sodio anhidro 4,0mg Púrpura de bromocresol 2,0mg 
Agar 1,5g 
Agua destilada 100,0ml 
pH final: 6,7 ± 0,2 
Preparación:  Suspender los ingredientes en el agua destila da y mezclar bien, calentar hasta ebullición 
con agitación frecuente hasta conseguir la disolución co mpleta. Ajustar el pH. Distribuir en volúmenes de 3 ml 
en tubos de 13 x 100 mm, con tapón de rosca. Ester ilizar en autoclave a 121°C ± 1°C durante 12 min. Dejar 
que los tubos se enfríen en posición inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 4 cm y una superficie inclinada de 2 cm. 
El medio ya preparado es de color púrpura. B.14.2.1.4.3  Agar nutritivo 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades Extracto de carne 3,0g 
Peptona 5,0g 
Agar 15,0g Agua destilada 1,0l 
pH final: 6,8 ± 0,2 
Preparación:  Suspender los ingredientes en agua. Dejar reposar de 5 a 10 min. Calentar a ebullición 
hasta disolución completa. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm, en cantidades de 1/3 de su volumen. 
Esterilizar a 121°C ± 1°C por 15 min. Incli nar los tubos antes que el agar solidifique. 
B.14.2.1.4.4  Medio de SIM (para Sulfuro, Indol y Movilidad) 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades Extracto de carne 3,000g 
Peptona 30,000g 
Hierro peatonizado 0,200g Tiosulfato de sodio 0,025g 
Agua destilada 1,000l 
pH final: 7,3 ± 0,2 Preparación:  Suspender los ingredientes en el ag ua destilada, calentar a ebullición agitando 
frecuentemente hasta lograr una disolución completa. Enfriar a 50°C y ajustar el pH. Distribuir el medio en volúmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm y esteriliz ar en autoclave a 121°C ± 1°C durante 15 min. Se 
dejan enfriar los tubos en posición vertical.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.14.2.1.4.5  Agar citrato de Simmons  
FORMULA 
Ingredientes Cantidades
Fosfato de amonio 1,00g Fosfato dipotásico 1,00g 
Cloruro de sodio 5,00g 
Citrato de sodio 2,00g Sulfato de magnesio 0,20g 
Azul de bromotimol 0,08g 
Agar 15,00g Agua destilada 1,00l 
pH final: 6,8 ± 0,2 
Preparación : Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando 
frecuentemente hasta lograr una disolución completa. Ajustar el pH. Distribuir el medio en volúmenes de 3 ml 
en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121° C ± 1°C durante 15 min. Dejar enfriar los tubos en 
posición inclinada. 
B.14.2.1.4.6  Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer) 
FORMULA 
Ingredientes CantidadesPeptona 7,0g 
Dextrosa 5,0g 
Difosfato de potasio 5,0g Agua destilada 1,0l 
pH final: 6,9 ± 0,2 
Preparación:  Suspender los ingredientes en el ag ua destilada, calentar a ebullición agitando 
frecuentemente hasta lograr una disolución completa. Ajustar el pH. Distribuir el medio en volúmenes de 3 ml 
en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121°C ± 1°C durante 15 min. 
B.14.2.1.4.7  Caldo manitol 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades
Extracto de carne 1,000g 
Proteosa peptona 10,000g Cloruro de sodio 5,000g 
Rojo de fenol 0,018g 
Manitol 10,000g Agua 1,000 l 
pH final: 7,4 ± 0,2 
Preparación: Suspender 26 g del medio deshidratado en un litro de agua, mezclar y ajustar el pH. 
Distribuir en volúmenes de 2 a 3 ml en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar a 121°C ± 1°C durante 15 min 
B.14.2.1.4.8  Caldo malonato 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades
Extracto de levadura 1,000g Sulfato de amonio 2,000g 
Fosfato dipotásico 0,600g 
Fosfato monopotásico 0,400g Cloruro de sodio 2,000g 
Malonato 3,000g 
Glucosa 0,250g Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Azul de bromotimol 0,025g 
Agua 1,000l 
pH final: 6,7 ± 0,2 
Preparación:  Suspender los ingredientes en agua, mezclar y ajustar el pH. Distribuir en tubos de 13 x  
100 mm en cantidades de 3 ml. Esterilizar en autoclave a 121°C ± 1°C durante 15 min. 
B.14.2.1.4.9  Caldo Urea 
FORMULA 
Ingredientes CantidadesUrea 20,00g Extracto de levadura 0,10g Fosfato monopotásico 9,10g Fosfato disódico 9,50g Rojo de fenol 0,01g Agua 1,00l 
pH final: 6,8 ± 0,2 Preparación:  Disolver los ingredientes en agua destilada. NO CALENTAR. Esterilizar por filtración a 
través de membrana 0,45 µm o en autoclave de 5 a 8 lb de presión durante 15 min. Distribuir asépticamente 
de 1,5 a 3 ml en tubos estériles de 13 x 100 mm. 
B.14.2.1.4.10  Caldo de urea rápido 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades
Urea 20,000g 
Extracto de levadura 0,100g 
Fosfato monopotásico 0,091g 
Fosfato disódico 0,095g 
Rojo de fenol 0,010g 
Agua 1,000l 
pH final: 6,8 ± 0,2 
Preparación:  Disolver los ingredientes en agua destilada. NO CALENTAR. Esterilizar por filtración a 
través de membrana 0,45 µm. Distribuir asépticamente de 1,5 a 3 ml en tubos estériles de 13 x 100 mm. 
B.14.2.1.4.11  Caldo infusión cerebro corazón  
FORMULA 
Ingredientes CantidadesInfusión cerebro corazón 200,0g Infusión de corazón de res 250,0g Proteosa peptona 10,0g Cloruro de sodio 5,0g Fosfato disódico dodecahidratado 2,5g Dextrosa 2,0g Agua destilada 1,0l 
pH final: 7,4 ± 0,2 Preparación:  Disolver los ingredientes en agua destilada, ca lentar suavemente. Distribuir y esterilizar a 
121°C ± 1°C durante 15 min. 
B.14.2.1.5 Soluciones B.14.2.1.5.1  Solución verde brillante al 0,1% (1:1000) 
FORMULA 
Ingredientes CantidadesVerde brillante 0,1g Agua destilada estéril 100,0 ml 
 Disolver 0,1 g de verde brillante en agua des tilada estéril hasta completar 100 ml.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.14.2.1.5.2  Solución de yodo-yoduro 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades
Cristales de yodo 6,0g Yoduro de potasio 6,0g 
Agua destilada 100,0 ml 
 Disolver los cristales y el yoduro de potasio en agua destilada hasta completar 100 ml. 
Conservar en frasco ámbar 
B.14.2.1.5.3  Solución salina al 0,85% 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades
Cloruro de sodio 0,85g Agua destilada 100,00ml 
 
Disolver el cloruro de sodio en el agua y esterilizar a 121°C ± 1 °C durante 15 min. B.14.2.1.5.4  Solución salina formalizada 
FORMULA 
Ingredientes CantidadesSolución de formaldehído (36-38%) 6,0ml 
Cloruro de sodio 8,5g 
Agua destilada 1,0l 
 
Disolver 8,5 g de cloruro de sodio en 1 litro de agua destilada. Esterilizar a 121°C ± 1°C durante 15 min. 
Enfriar a temperatura ambiente. Adicionar 6 ml de la so lución de formaldehído. No esterilizar después de la 
adición de formaldehído. 
B.14.2.1.5.5  Reactivo de Kovac 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades
p-dimetil-aminobenzaldehido 5,0g Alcohol amílico 75,0ml 
Acido clorhídrico concentrado 25,0ml 
 Disolver el p-dimetil-aminobenzaldehído en el alcohol  amílico y después agregar el ácido clorhídrico 
lentamente. Conservar en frasco ámbar en refrigeración. 
B.14.2.1.5.6  Solución de alfa-naftol al 5% 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades
Alfa-naftol 5,0g 
Alcohol 100,0 ml 
 
Disolver 5 g de alfa-naftol en alcohol hasta completar 100 ml. 
B.14.2.1.5.7  Solución de rojo de metilo 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades
Rojo de metilo 0,10g Alcohol etílico 300,00ml 
agua destilada c.b.p 500,00ml 
 Disolver el rojo de metilo en el alcohol etílico y adicionar agua hasta completar 500 ml. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
B.14.2.1.5.8  Solución de hidróxido de potasio al 40% 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Hidróxido de potasio 40,0g Agua destilada 100,0 ml 
 
Disolver 40 g de hidróxido de potasio en agua hasta completar 100 ml. B.14.2.1.5.9  Solución de gelatinasa al 5% 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades Gelatinasa 5,0g 
Agua 100,0 ml 
 Disolver 5 g de gelatinasa en 100 ml de agua destilada. NO CALENTAR. 
B. 14.2.1.6 Antisueros 
 Antisuero polivalente somático (O) 
 Antisuero polivalente flagelar (H) 
 Antisuero Vi 
B.14.2.2 Material  Matraces Erlenmeyer de 500 ml 
 Recipientes de boca ancha, de capacidad apropiada para contener las muestras simples y 
compuestas 
 Angulos de vidrio 
 Cucharas, bisturíes, cuchillos y pinzas 
 Tubos de ensaye de 16 x 150 mm y de 20 x 100 mm 
 Tubos para serología de 10 x 75 mm o de 13 x 100 mm 
 Pipetas bacteriológicas de 10,0 y 5,0 ml, graduadas  en 0,1 ml y protegidas con tapón de algodón. 
 Pipetas de 1 ml, con graduaciones de 0,01 ml 
 Cajas de Petri estériles de vidrio o desechables 
 Rejillas para tubos de ensaye 
 Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de diámetro 
 Papel pH (intervalo de 6-8) con graduaciones máximas de 0,4 unidades de pH para cambios de color 
Todo el material que tenga contacto con las mues tras bajo estudio debe esterilizarse mediante: 
Horno, durante 2 horas a 170-175°C o autoclave, durante 15 min como mínimo a 121°C ± 1°C 
B.14.3 Equipo  Horno para esterilizar que alcance los 180 °C 
 Incubadora con termostato para evitar va riaciones mayores de ± 0,1°C y termómetro. 
 Autoclave con termómetro o manómetro, probado con termómetro de máximas. 
 Baño maría con termostato y termómetro. 
 Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g 
 Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato, con vasos esterilizables (vidrio o 
aluminio). 
 Mecheros Bunsen o Fisher 
 Potenciómetro 
B.14.4 Procedimiento B.14.4.1  Preparación de los alimentos para el aislamiento de Salmonella 
Los siguientes métodos se basan en el análisis de 25 g de la muestra analítica en una proporción de 1:9 
de muestra/ caldo. Esta cantidad  puede variarse siempre que se mantenga la misma proporción. Se 
recomienda una muestra de 25 g o más.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.14.4.1.1  Procedimiento general para la preparación de muestras 
Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso esté ril de licuadora o en bolsa estéril para trabajar en 
homogeneizador peristáltico (stomacher). Adicionar  225 ml del medio de preenriquecimiento estéril 
(generalmente caldo lactosado, a menos que se indiqu e otro) y licuar si es necesario durante un min. 
Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien y determinar el 
pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6,8 ± 0,2 con hidróxido de sodio 1N o ácido 
clorhídrico 1N estériles. Mezclar y cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa. 
Incubar 24 ± 2 h a 35 °C. Continuar como se indica en B.14.4.2.1 B.14.4.1.2  Procedimiento específico para la preparación 
B.14.4.1.2.1  Productos que contienen huevo en su formulación (pastas para sopa, rollos chinos, etc.); 
ensaladas preparadas (jamón, huevos, pollo, atún, pavo ); frutas frescas, congeladas o secas; crustáceos 
(camarones, cangrejos, jaibas, langostinos, langostas) y pescado. 
Preferentemente no descongelar la muestra antes de su análisis, si esto es necesario, utilizar caldo 
lactosado como medio de preenriquecimiento, licuar dos min. Continuar después de la incubación como en 
B.14.4.2.1 
B.14.4.1.2.2  Carnes, sustitutos de carnes, derivados cárn icos, sustancias de origen animal, productos 
glandulares y harinas (pescado, carne y hueso). 
B.14.4.1.2.2.1  Productos procesados térmicamente y prod uctos secos. Se sigue el procedimiento 
señalado en A.13.4.1.1 hasta la homogenización. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede 
omitirse. Después de reposar, mezclar bien y ajustar el pH como se indica en el procedimiento general. Para 
emulsionar las grasas, agregar los detergentes en las mismas proporciones y con las mismas recomendaciones que para el coco. La cantidad de los mismos dependerá en gran medida de la composición del alimento. Los detergentes no serán necesarios en  los productos glandulares en polvo. Incubar las 
muestras como se indica en B.14.4.1.1. 
B.14.4.1.2.2.2  Productos crudos o altamente contaminados. Pesar porciones de 25 g de producto en dos 
vasos para licuadora. Si la muestra es en polvo o moli da, el licuado puede omitirse y el producto puede 
pesarse directamente en matraces Erlenmeyer estériles de 500 ml. Adicionar 225 ml de caldo selenito cistina o 225 ml de caldo tetrationato (sin verde brillante) a cada muestra analítica. Licuar por dos min y pasar 
asépticamente a matraces Erlenmeyer de 500 ml. Dejar repo sar y ajustar el pH como se indica en B.14.4.1.1 
Adicionar 2,25 ml de solución de verde brillante 0,1% y 4,5 ml de solución yodo-yoduro a la muestra que 
se enriquecerá con caldo tetrationato. Homogenizar e incubar. Continuar como se indica en B.13.4.2.1  
B.14.4.2  Aislamiento de  Salmonella  
B.14.4.2.1  Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matr aces con los cultivos de preenriquecimiento y 
agitar suavemente, transferir respectivamente 1 ml de la mezcla a un tubo que contenga 10 ml de caldo 
tetrationato y a otro con 10 ml de caldo selenito cistina.  Como alternativa, en sustitución del caldo tetrationato 
puede emplearse el medio Vassiliadis-Rappaport. 
B.14.4.2.2  Incubar de 18 a 24 h a 35°C o, para alimentos  fuertemente contaminados a 42°C por el mismo 
período. Estriar los productos que fueron dire ctamente enriquecidos en medios selectivos. 
B.14.4.2.3  Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar 
verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios selectivos adicionales (agar entérico 
Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS). 
Efectuar el mismo procedimient o para el caldo tetrationato. 
Incubar las placas 24 ± 2 h a 35°C. B.14.4.2.4  Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella,  de acuerdo 
con las siguientes características: 
Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser tr ansparentes con o sin centro negro. En algunos casos 
las colonias pueden aparecer completamente negras. 
Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las 
bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas. 
Agar entérico Hektoen: colonias verdes o azulver des con o sin centro negro. En algunos casos las 
colonias pueden aparecer completamente negras. 
Agar Sulfito de Bismuto: las colonias típicas de  Salmonella  pueden ser cafés, grises o negras; con o sin 
brillo metálico. Generalmente el medi o circundante (halo) es café, torn ándose posteriormente negro. Algunas 
cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscuro. Si las placas no muestran colonias típicas o 
no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales. 
Agar SS: colonias translúcidas, oc asionalmente opacas. Algunas colonias  dan centro negro. Las colonias 
fermentadoras de la lactosa son rojas. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
B.14.4.3  Identificación  bioquímica 
B.14.4.3.1  Seleccionar al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien 
aisladas. 
Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular dos tubos, uno con agar triple azúcar hierro (TSI) y 
otro con agar hierro lisina (LIA), por estría en la  superficie inclinada y por punción en el fondo. 
Incubar por 24 ± 2 h a 35°C. 
Almacenar en refrigeración de 5 a 8 °C las placas con medios selectivos por sí es necesario retomar más 
colonias. 
B.14.4.3.2  Observar el crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente positivas para Salmonella  
las colonias que den las siguientes reacciones: 
B.14.4.3.2.1  Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentación de la 
glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo más intenso que el medio original debido a la no 
fermentación de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayoría de los casos se observa coloración negra a lo 
largo de la punción debido a la producción de ácido sulfihídrico. 
B.14.4.3.2.2  Agar LIA, se observa intensificación del colo r púrpura en todo el tubo por la descarboxilación 
de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos  que produzcan claramente color amarillo en el fondo del 
agar. La mayoría de las cepas de Salmonella  producen ácido sulfihídrico en este medio con ennegrecimiento 
a lo largo de la punción. 
B.14.4.3.2.3  Retener todos los cultivos que mues tren las reacciones características de Salmonella  en los 
medios TSI y LIA para las pruebas ad icionales, indicadas en B.14.4.3.3 
B.14.4.3.3  Los cultivos con TSI que no parecen de Salmone lla pero que presentan reacciones en LIA 
típicos, deben trabajarse como cultivos presuntivos positi vos, ya que en estos casos, el medio LIA permitirá 
detectar  S. arizonae  y cepas atípicas de Salmonella  que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los 
cultivos que muestren reacciones atípicas en ambos medios. 
B.14.4.3.4  Continuar el análisis a partir de los tubos de TS I con reacciones típicas. Si el cultivo presenta 
reacciones atípicas en este medio, tomar colonias adic ionales de las placas de donde se obtuvo el cultivo 
atípico anterior y sembrar las pruebas bioquímicas nuevamente. 
B.14.4.3.5  Continuar la identificación bioquímica y serológica a partir de los cultivos recuperados de TSI. 
Se recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analítica seleccionando colonias procedentes de 
ambos medios de enriquecimiento. 
B.14.4.3.6  Prueba de ureasa 
B.14.4.3.6.1  Prueba de ureasa (convencional). Con una as a estéril, tomar crecimiento del cultivo 
presumiblemente positivo de  cada tubo de medio TSI e inocular tubo s de caldo urea. Utilizar un control de 
medio para comparar el vire púrpura de las reacciones positivas con el color del medio original. Incubar  24 ± 
2 h a 35 °C. 
B.14.4.3.6.2  Prueba de ureasa (rápida). Tomar dos asadas de crecimiento del cult ivo presumiblemente 
positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea (rápida) . Incubar 2 h a 37 ± 0,5°C en baño 
de agua. 
Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Retener los cultivos que den la prueba negativa (sin 
cambio de color del medio). 
B.14.4.4  Identificación  serológica 
B.14.4.4.1  Ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella  (Antisuero polivalente O). 
B.14.4.4.1.1  Colocar con una asa dos gotas separadas de solución salina estéril sobre un portaobjetos o 
en dos secciones de una placa para aglutinación. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo 
desarrollado en TSI. 
B.14.4.4.1.2  Agregar a una de ellas una gota del antisuero polivalente somático (O) y mezclar con el canto 
del asa o empleando aplicadores de madera. 
B.14.4.4.1.3  Agitar inclinando la lámina hacia atrás y hacia adelante durante aproximadamente un min. 
Observar bajo buena iluminación sobre un fondo oscuro. 
B.14.4.4.1.4  Considerar cualquier grado de aglutinación como positiva. 
La prueba positiva resulta cuando se presenta aglutinac ión en la gota con el cultivo y el antisuero y no 
aglutinación en la gota que contiene el cultivo y la solución salina. 
Si se observa aglutinación en ambas gotas, la prueba no  es definitiva y se debe continuar con las pruebas 
bioquímicas complementarias.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.14.4.4.2  Cuando la aglutinación es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el subgrupo 
empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los más frecuentes). 
B.14.4.4.2.1  Si la aglutinación con el antisuero O es negativa , utilizar antisuero Vi y efectuar la prueba. Si 
hay aglutinación con Vi calentar el cultivo a ebullición y repetir la aglutinación con el antisuero polivalente O. 
B.14.4.4.2.2  Si no se cuenta con los sueros grupoespecíficos, solicitar la tipificación de la cepa al 
Laboratorio de Enterobacterias del Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia de la Secretaría de Salud o al 
Laboratorio Nacional de Salud Pública. 
B.14.4.4.3  Si se requiere, practicar el ensayo de los antígenos flagelares de Salmonella  (Antisuero 
polivalente H). 
B.14.4.4.3.1  Inocular el crecimiento del tubo de TSI en agar infusión de cerebro corazón e incubar de 4  a 
6 h a 35 °C hasta que se observe crecimiento (par a ensayo en el mismo día), o bien, en caldo soya 
tripticaseina e incubar por 24 ± 2 h a 35°C (para ensayo al día siguiente). Adicionar 2,5 ml de solución salina 
formalizada a 5 ml del cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazón (BHI). 
B.14.4.4.3.2  Colocar 0,5 ml del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para serología (13 x 
100 mm aproximadamente). Adicionar 0,5 ml del cultiv o formalizado. Preparar un control de solución salina 
mezclando 0,5 ml de solución salina formalizada con 0,5 ml del antígeno formalizado. Incubar las mezclas en baño de agua a 48- 50°C. Observar a intervalos de 15 min por espacio de una h. Una prueba positiva es 
cuando se observa aglutinación en la mezcla de prueba pero no en el control. Debe interpretarse como 
negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas  muestre aglutinación. Cuando ambas mezclas se 
aglutinan, se considera la prueba inespecífica. 
B.14.4.5  Pruebas bioquímicas complementarias 
Cuando las pruebas serológicas o bioquímicas iniciales, dan resultados atípicos o no concluyentes, 
realizar las pruebas que se describen a continuación: 
B.14.4.5.1  Inocular los cultivos positivos provenientes  de TSI y LIA en: medio SIM, agar citrato de 
Simmons, caldo manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para confirmar la presencia de la especie  S. 
arizonae.  
B.14.4.5.2  Interpretar los ca mbios en los medios inoculados conforme lo siguiente: 
B.14.4.5.2.1  Agar citrato Simmons 
Inocular por estría el tubo 
Incubar 96 ± 2 h a 35 ± 2°C 
Prueba positiva: crecimiento acompañado de un cambio de color de verde a azul. 
Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color. 
B.14.4.5.2.2  Medio SIM 
Inocular por punción Incubar 24 h a 35 ± 2°C 
Movilidad 
Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la punción y en el seno del medio de cultivo. 
Prueba negativa: crecimiento a lo la rgo de la punción exclusivamente. 
Producción de ácido sulfihídrico 
Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la punción que puede extenderse a todo  el 
medio. 
Prueba negativa: ausencia de color negro. 
Producción de indol Adicionar al tubo con medio SIM que presente crec imiento, de 0,2 a 0,3 ml de reactivo de Kovac. 
Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color rojo. 
Prueba negativa: sin cambio de color. B.14.4.5.2.3  Caldo RM-VP 
Inocular un tubo con el medio 
Incubar 48 ± 2 h a 35 ± 2°C para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM B.14.4.5.2.3.1  Prueba de Voges-Proskauer (VP) 
Transferir a un tubo un ml del cultivo de 48 h 
Adicionar 0,6 ml de solución de alfa naftol Adicionar 0,2 ml de solución de hidróxido de potasio 40% 
Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional)  
Interpretar los resultados después de incubar 2 h a 35 ± 2°C o 4 h a temperatura ambiente Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo 
Prueba negativa: sin cambio de color 
Reincubar el resto del medio RM-VP 48 h más a 35 ± 2°C 
B.14.4.5.2.3.2  Prueba de rojo de metilo (RM) 
Adicionar al medio de cultivo de 96 h de incubación de dos a tres gotas de solución de rojo de metilo 
Interpretar los resultados inmediatamente 
Prueba positiva: desarrollo de color rojo Prueba negativa: desarrollo de color amarillo 
B.14.4.5.2.4  Caldo malonato 
Inocular un tubo conteniendo el medio Incubar 40 ± 2 h a 35 ± 2°C 
Prueba positiva: desarrollo de color azul 
Prueba negativa: sin cambio de color B.14.4.5.2.5  Caldo manitol 
Inocular un tubo conteniendo el medio 
Incubar 24 ± 2 h a 35 ± 2°C Prueba positiva: desarrollo de color amarillo 
Prueba negativa: sin cambio de color 
B.14.4.5.3  Consultar los resultados obtenidos en el cuadro 2 para la identificación de los géneros de las 
bacterias investigadas. 
Nota : Los sistemas bioquímicos comerciales validados pueden ser usados como alternativa para las 
pruebas bioquímicas convencionales. 
B.14.5 Cálculo y expresión de resultados 
B.14.5.1  Interpretación de reacciones  bioquímicas y serológicas. 
CUADRO 1 
REACCIONES 
BIOQUIMICAS REACCIONES SEROLOGICAS INTERPRETACION 
Típica  Antígeno O, Vi o H positivo  Cepas consideradas como Salmonella  
Típica Todas las reacciones negativas  
Típica No probada Puede ser Salmonella  
Reacciones 
atípicas Antígeno O, Vi o H positivo  
Reacciones 
atípicas Todas las reacciones negativas No debe ser considerada Salmonella  
 
B.14.5.2  Reacciones bioquímicas y serológicas de Salmonella 
CUADRO 2 
PRUEBA O SUSTRATO POSITIVO NEGATIVO REACCIO
N 
Glucosa (TSI)  amarillo  rojo + 
Lisina descarboxilasa(LIA) púrpura amarillo + 
H2S (TSI y LIA)  negro no negro + 
Ureasa rojo-púrpura no hay cambio de color - 
Caldo de lisina descarboxilasa púrpura amarillo + 
Caldo dulcitol rojo de fenol  ³ amarillo o gas no hay ³ cambio de color, ni gas +b 
Caldo KCN  crecimiento no hay crecimiento - 
Caldo malonato  azul no hay cambio de color - 
Prueba de indol  superficie color violeta superficie color amarillo - 
Prueba del antígeno flagelar aglutinación no hay aglutinación + 
Prueba del antígeno somático aglutinación no hay aglutinación + 
Caldo lactosa rojo fenol  amarillo o gas no hay cambio de color, ni gas -       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
Caldo sacarosa rojo fenol amarillo o gas no hay cambio de color, ni gas - 
Prueba Voges- Proskauer de rosa a rojo no hay cambio de color - 
Prueba rojo de metilo rojo difuso amarillo difuso + 
Citrato de Simmons  crecimiento color azul no hay crecimiento no hay 
cambio de color v 
a +, 90 % o más positivos en 1 o 2 días; -, 90 % o más negativas en 1 o 2 días; v, variable. 
b La mayoría de los cultivos  S. arizonae son negativos. 
c La mayoría de los cultivos  S. arizonae son positivos. 
B.14.5.3  Informe de Resultados  
Informar: presencia o ausencia de Salmonella en ___________ g o _______________ ml de muestra. 
B.15. METODO PARA LA DETERMINACION DE Staphylococcus aureus  EN ALIMENTOS. 
B.15.1  Fundamento 
Este método permite hacer una estimación del contenido de Staphylococcus aureus en alimentos, se 
efectúa directamente en placas de medi o de cultivo selectivo y diferencial,  con la confirmación mediante las 
pruebas de coagulasa y termonucleasa. Este método es a decuado para el análisis de alimentos en los cuales 
se esperen más de 100 células de Staphylococcus aureus  por g. 
B.15.2 Reactivos y materiales 
En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, para su preparación se deben seguir las 
instrucciones impresas en la etiqueta respectiva. 
Cuando se mencione agua debe entenderse que se trata de "agua destilada". 
Los reactivos a emplear en el método objeto de esta norma deben ser grado analítico. B.15.2.1  Reactivos 
B.15.2.1.1  Soluciones diluyentes 
B.15.2.1.1.1  Solución reguladora de fosfatos (Solución concentrada) 
FORMULA 
Ingredientes Cantidad 
Fosfato monopotásico 34,0 g 
Agua  1,0 l 
 
Preparación:  Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de 
sodio 1 N, aforar con agua a 1 l. Esterilizar durante 15  min a 121ºC ±1, conservar en refrigeración (solución 
concentrada). Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y llevar a 1 l con agua (solución de trabajo). Distribuir 
en porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera. Este rilizar a 121ºC ±1 durante 15 min. Después de la 
esterilización, los volúmenes finales y el pH de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales. 
B.15.2.1.1.2  Agua peptonada 
FORMULA 
Ingredientes Cantidad 
Peptona 1,0 g 
Cloruro de sodio 8,5 g Agua  1,0 l 
 
Preparación:  Disolver los componentes en un litro de agua. Aj ustar el pH a 7,0 con solución de hidróxido 
de sodio 1N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera. Esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 min. 
Después de la esterilización los volúmenes finales y el pH de la solución de trabajo deben ser iguales a los 
iniciales. 
B.15.2.1.2  Medios de cultivo 
B.15.2.1.2.1  Medio de Baird-Parker 
FORMULA 
Ingredientes Cantidad 
Medio base (6.1.2.1.1) 95,0 ml Solución de telurito de po tasio (6.1.2.1.2) 1,0 ml 
Emulsión de yema de huevo (6.1.2.1.3) 5,0 ml 
 
Preparación:  Cuando el medio base esté a 45ºC, agregar los demás ingredientes y mezclar. Colocar de 
15 a 20 ml del medio completo, enfriar y dejar solidificar. Las placas pueden almacenarse por 48 h a temperatura de 0 a 5ºC. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
B.15.2.1.2.1.1.  Medio base de Baird-Parker 
FORMULA 
Ingredientes Cantidad 
Triptona  10,0 g Extracto de levadura  1,0 g 
Extracto de carne 5,0 g 
Glicina 12,0 g Cloruro de litio 5,0 g 
Piruvato de sodio  10,0 g 
Agar  20,0 g Agua  1,0 l 
 
Preparación:  Disolver los ingredientes o el agar base en agu a y calentar con agitac ión constante y hervir 
durante 1 min. Esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 min. Enfriar y mantener el medio a 45ºC. 
B.15.2.1.2.1.2  Solución de telurito 
FORMULA 
Ingredientes Cantidad 
Telurito de potasio 1,0 g Agua 100,0 ml 
 
Preparación:  Disolver el telurito de potasio en agua y esterilizar. La solución puede ser almacenada por 
varios meses a temperatura de 0 a 5ºC. 
B.15.2.1.2.1.3  Emulsión de yema de huevo 
Preparación. Lavar con agua y jabón los huevos fresco s que sean necesarios y limpiarlos con una 
solución de tintura de yodo (solución alcohólica al  2%) o sumergirlos en solución de cloruro mercúrico 
(1:1000). Enjuagar con agua estéril y secar con gasa es téril. En campana de flujo laminar o en condiciones 
asépticas, abrir los huevos y vaciarlos en un separador de claras estéril. Transferir las yemas a una probeta 
hasta un volumen de 60 ml y completar a 90 ml con solución salina isotónica. Verter la emulsión a un matraz Erlenmeyer con perlas de vidrio estéril y agitar fuerteme nte para formar la emulsión. Filtrar a través de gasa. 
Las placas deben utilizarse dentro de las 48 h siguientes a su preparación. 
B.15.2.1.2.1.4  Solución salina isotónica 
FORMULA 
Ingredientes  Cantidad 
Cloruro de sodio  0,85 g 
Agua  100,0 ml 
 
Preparación: Disolver el ingrediente en agua y esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 min. 
B.15.2.1.2.2  Caldo de infusión cerebro-corazón (BHI) 
FORMULA 
Ingredientes Cantidad 
Infusión de cerebro de ternera  200,0 ml Infusión de corazón de res 250,0 ml 
Peptona de gelatina  10,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g Fosfato disódico dodecahidratado  2,5 g 
Glucosa  2,0 g 
Agua  1,0 l 
 
Preparación:  Disolver los ingredientes en agua y calentar  ligeramente si es necesario. Distribuir y 
esterilizar durante 15 min a 121ºC ±1.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.15.2.1.2.3  Acido desoxirribonucleico helicoidal de timo de ternera. 
FORMULA 
Ingredientes Cantidad 
Acido desoxirribonucleico helicoi-dal de timo de ternera o equivalente 0,03 g 
Agar  1,00 g 
Cloruro de calcio anhidro (Solución 0,01 M) (A.7.1.2.3.1)  0,10 ml Cloruro de sodio  1,00 g Azul de toluidina (Solución 0,1 M) (6.1.2.3.2)  0,30 ml Tris-(hidroximetil-aminometano) (T ris solución 0,05 M, pH 9) 
(A.7.1.2.3.3)  100,00 ml 
 
Preparación : Disolver los ingredientes, excepto el azul de toluidina agitando hasta completar la disolución 
del ácido desoxirribonucleico y calentar a ebullición. Agregar el azul de toluidina. Distribuir en frascos pequeños con tapón de hule. No es necesario esterilizar. Este medio es estable a temperatura ambiente hasta 
4 meses y funciona perfectamente aun después de fundi rlo varias veces. Tomar un porta objetos limpio y 
agregar 3 ml del medio fundido esparciéndolo por la superf icie. Cuando el agar solidifique, hacer orificios con 
la punta de una pipeta Pasteur. Conservar en refrigeración para evitar la deshidratación. 
B.15.2.1.2.3.1  Solución de cloruro de calcio anhidro 0,01 M 
Cloruro de calcio PM = 110,99 Disolver 0,1199 g de cloruro de calcio en 100 ml de agua. B.15.2.1.2.3.2  Solución de azul de toluidina 0,1 M 
Disolver 3,05 g de azul de toluidina en 100 ml de agua. 
B.15.2.1.2.3.3  Solución amortiguadora 0,05 M Tris-(hidroximetilaminometano) 
(Tris pH 9) PM = 121,1 Disolver 6,055 g de Tris en 100 ml de agua. B.15.2.1.3 Reactivo biológico: 
Plasma de conejo Emplear plasma de conejo deshidratado o rehidratado si guiendo las instrucciones del fabricante y agregar 
ácido etilendiaminotetracético (EDTA) en solución al 0,1% en plasma rehidrata do. Si se utiliza plasma 
deshidratado diluir con agua estéril en proporción de  1:3. Puede emplearse plasma de conejo liofilizado 
adicionado de EDTA. No debe emplearse sangre citratada. 
B.15.2.2  Materiales 
Todos los instrumentos que se utilicen para trabajar  la muestra deben esterilizarse mediante horno, 
durante 2 h de 170-175ºC o como alternativa en autoclave durante 15 min como mínimo a 121ºC ±1. 
 Cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas y separador de huevo. 
 Tubos de cultivo de 16 mm x 150 mm o frascos de 125 a 250 ml de capacidad. 
 Tubos de cultivo de 10 mm x 75 mm. 
 Cajas Petri de 90 a 100 mm de diámetro. 
 Pipetas bacteriológicas de 1 ml y 10 ml de capacid ad graduadas en 0,1 ml y 1 ml respectivamente y 
diámetro de 2 a 3 mm. 
 Pipetas Pasteur. 
 Probetas. 
 Varillas de vidrio de 3,5 mm de diámetro aproximadamente y 20 cm de largo dobladas en ángulo 
recto. 
 Matraz Erlenmeyer con perlas de vidrio 
 Cámara húmeda: consiste en una caja Petri en la cual se coloca una varilla de vidrio en forma de "V" 
rodeada de algodón humedecido con agua. 
B.15.3 Aparatos  Horno para esterilizar que alcance 180°C. 
 Autoclave con termómetro. 
 Baño de agua con regulador de temperatura de 35 ± 0,5ºC. 
 Baño de agua con regulador de temperatura de 45 ± 0,5ºC. 
 Balanza con capacidad no mayor de 2,500 g y sensibilidad de 0,1 g. 
 Incubadora a 35 ± 1ºC. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
B.15.4 Preparación de la muestra 
La preparación de la muestra se debe realizar de acuerdo a lo establecido en el método Preparación y 
Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico. 
B.15.5 Procedimiento 
B.15.5.1  Utilizando diferentes pipetas de 1 ml para cada dilución, depositar 0,1 ml sobre la superficie de 
las placas de agar Baird-Parker. 
B.15.5.2  Distribuir el inóculo sobre la superficie del agar con varillas estériles de vidrio en ángulo recto, 
utilizando una para cada dilución. 
B.15.5.3  Mantener las placas en su posición hasta que el inóculo sea absorbido por el agar. 
B.15.5.4  Invertir las placas e incubar de 45 a 48 h a 35ºC. 
B.15.5.5  Seleccionar las placas que tengan entre 15 y 150 colonias típicas de Staphylococcus aureus ; si 
no es posible, seleccionar las placas de las diluciones más altas no obstante tengan más de 150 colonias. 
B.15.5.6  Cuando las placas tengan menos de 15 colonias típicas también pueden ser utilizadas y al 
informe se debe agregar la nota de "valor estimado". 
B.15.5.7  Las colonias típicas son negras, circulares, br illantes, convexas, lisas, de diámetro de 1 a 2 mm y 
muestran una zona opaca y un halo claro alrededor de la colonia. 
B.15.5.8  Seleccionar las colonias de acuerdo con el siguiente cuadro para realizar las pruebas de 
coagulasa y termonucleasa: 
NUMERO DE COLONIAS NUMERO DE COLONIAS 
SOSPECHOSAS EN PLACA 
POR PROBAR 
Menos de 50 3 
51 a 100 5 
101 a 150 o más 7 
 
B.15.5.9  Seleccionar el número de colonias y sembrar cada una en tubos con 0,5 ml de caldo de infusión 
cerebro-corazón. 
B.15.5.10  Incubar a 35ºC durante 24 h. 
B.15.5.11  Inocular en la misma forma cepas conocidas de Staphylococcus aureus y Staphylococcus 
epidermidis como testigos positivo y negativo. 
B.15.5.12  Después del periodo de incubación pasar con u na pipeta de 1 ml, 0,3 ml de cada cultivo a otro 
tubo de 10 mm x 75 mm y conservarlo para la prueba de  termonucleasa. El resto del cultivo se usa para la 
prueba de coagulasa. 
B.15.5.13  Prueba de coagulasa 
B.15.5.13.1  Agregar a los 0,2 ml del cultivo anterior, 0,2 ml de plasma de conejo diluido volumen a 
volumen con solución salina estéril. 
B.15.5.13.2 Incubar en baño de agua de 35 a 37ºC y observar durante 6 h a intervalos de 1 h; si no hay 
formación de coágulo, observar a las 24 h. Considerar positiva la prueba si hay formación de coágulo.  
Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo se añade una gota de cloruro de calcio al 5% a  
0,5 ml de plasma reconstituido empleado, formándose un coágulo en 10-15 seg. 
B.15.5.14  Prueba de termonucleasa 
B.15.5.14.1  Calentar durante 15 min, 0,3 ml  de cultivo en caldo de infusión cerebro-corazón en baño de 
agua hirviendo. 
B.15.5.14.2  Pasar una gota de cada cultivo por medio de una pipeta Pasteur a un orificio del medio, 
incluye testigo. 
B.15.5.14.3  Incubar a 35ºC en cámara húmeda de 4 a 24 h. 
B.15.5.14.4  La aparición de un halo color rosa extendido de por lo menos 1 mm alrededor de la 
perforación se califica como positiva. 
B.15.6 Cálculo y expresión de resultados B.15.6.1  Cálculo 
Hacer el cálculo del contenido de microorganismos en el producto tomando en cuenta el número de 
colonias totales, el número de colonias confirmadas, la dilución y el volumen inoculado (0,1 ml).       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
Ejemplo 1: 
Si la caja tiene 80 colonias en la dilución 1:1000 
Se toman 5 colonias para la prueba, de éstas dan 4 positivas, el cálculo es: 
80 x 4 = 64 x 1000 x 10 = 640 000 
    5 
Ejemplo 2: 
Si la caja tiene 14 colonias en la dilución 1:10 Se toman 3 colonias para la prueba, de éstas dan 2 positivas, el cálculo es: 
14 x 2 = 9,3 x 10 x 10 = 930 
    3 
B.15.6.2  Expresión de los resultados: 
Según ejemplo 1: 
Informar como Staphylococcus aureus  640 000 UFC/g 
Según ejemplo 2: 
Informar como Staphylococcus aureus 930 UFC/g valor estimado 
Si las pruebas confirmativas resultan negativas  en todas las colonias probadas, informar como: 
0 UFC/g en muestras directas 
-10 UFC/g en muestras de dilución 1:10 
-100 UFC/g en muestras de dilución 1:100 En la práctica los resultados pueden variar, esto dependerá del técnico que trabaje el método y el grado de 
confiabilidad del mismo, que en el 95% de los casos es de ± 16% a ± 52%. 
B.16. METODO DE PRUEBA MICROBIOLOGICO PARA ALIMENTOS. DETERMINACION  DE L. 
monocytogenes . 
B.16.1  Fundamento 
El método para detectar la presencia de Listeria  monocytogenes se basa en el aislamiento y la 
diferenciación de especies de Listeria  spp., principalmente por la fermentación de carbohidratos y la actividad 
hemolítica de los miembros de este género. 
B.16.2  Reactivos 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico. 
Cuando se indica agua, debe entenderse que se trata de agua destilada. 
 Acido acético 5 N 
 Acido clorhídrico 1 M 
 Acido sulfanílico (cristales) 
 Alfa-naftilamina 
 Alfa-naftol 5% en etanol absoluto 
 Etanol absoluto 
 Granalla de zinc 
 Hidróxido de sodio 1 M 
 Lactamato de glicil-glicina (anhídrido de glicina) 
 Regulador de fosfatos glicerinado con pH 9,0 ± 0,2 
 Sangre de carnero desfibrinada 
 Solución al 3% de peróxido de hidrógeno 
 Solución salina fisiológica 0,85% estéril 
 Sueros comerciales para tipificación de Listeria spp 
 Sulfato de cadmio al 20% 
 Zinc pulverizado 
B.16.2.1  Reactivos para Tinción de Gram 
B.16.2.1.1  Alcohol-acetona 
Ingredientes Cantidad
Etanol (95%) 700,0 ml 
Acetona 300,0 ml 
Mezclar ambos líquidos. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
B.16.2.1.2  Cristal violeta 
Solución A 
Ingredientes Cantidad 
Cristal violeta 2,0 g Etanol (95%) 20,0 ml 
Disolver el cristal violeta en el etanol. 
Solución B 
Ingredientes Cantidad 
Oxalato de amonio 0,8 g 
Agua 80,0 ml 
 
Disolver el oxalato de amonio en el agua. Después de pr eparar las soluciones A y B, verter una en la otra 
y agitar hasta que se mezclen perfectamente. 
B.16.2.1.3  Solución de Yodo 
Ingredientes Cantidad 
Yodo 1,0 g Yoduro de potasio 2,0 g 
Agua 300,0 ml 
 Triturar finamente el yodo y el  yoduro de potasio en un mortero, de ser posible en una campana de 
extracción. Añadir una pequeña cantidad de agua para lavar el material, agregar el resto del agua y agitar. 
Nota: ¡Evitar el contacto de los reactivos con la piel! B.16.2.1.4  Solución de Safranina 
Ingredientes Cantidad 
Safranina 0,25 g Etanol (95%) 10,00 ml 
Agua 100,00 ml 
 Disolver la safranina en el etanol, mezclar, agregar el agua y volver a agitar. Filtrar la solución con papel 
filtro. 
B.16.2.2  Reactivos para la determinación de nitritos 
B.16.2.2.1  Reactivo A 
Ingredientes Cantidad 
Alfa-naftilamina 0,5 g Acido acético 5N 100,0 ml 
 
B.16.2.2.2  Reactivo B 
Ingredientes Cantidad 
Acido sulfanílico 1,0 g 
Acido acético 5N 125,0 ml 
 
B.16.2.2.3  Reactivo C 
Ingredientes Cantidad 
Alfa-naftol 1,0 g 
Acido acético 5N 200,0 ml 
 B.16.2.2.4  Solución de sulfato de cadmio al 20% 
Colocar granallas de zinc en solución de sulfato de cadm io al 20% de 4 a 6 h. Disolver el precipitado de 
cadmio, adicionando ácido clorhídrico 1N.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.16.3  Medios de cultivo 
A continuación se presentan las fórmulas y los proc edimientos para preparar los medios empleados en 
este análisis microbiológico. En caso de disponer de fórmulas comerciales deshidratadas se deben seguir las 
instrucciones del fabricante para su preparación. 
B.16.3.1  Caldo soya tripticaseína con 0,6 % de extracto de levadura (CSTEL) 
Ingredientes Cantidad 
Caldo soya tripticaseína 30,0 g 
Extracto de levadura 6,0 g 
Agua 1000,0 ml 
 Agitar hasta disolver los ingredientes. Esterilizar a 121 ± 1ºC durante 15 min. El pH final de la solución 
debe ser 7,3 ± 0,2. 
B.16.3.2  Caldo de enriquecimiento (EB) pH 7,3 
Un litro de caldo soya tripticaseína con extracto de levadura (CSTEL) debe contener los siguientes 
suplementos: 
Suplementos Cantidad 
Clorhidrato de acriflavina 15,0 mg Acido nalidíxico (sal sódica) 40,0 mg 
Cicloheximida 50,0 mg 
Acido pirúvico (sal sódica) Solución 
al 10 % (p/v) * 11,1 ml 
 
Preparar los suplementos de acriflavina y nalidíxico a partir de una solución al 0,5 % (p/v) con agua. 
El suplemento de cicloheximida prepararlo como una solución al 1,0 % (p/v) en una solución al 40 % (v/v) 
de etanol en agua. Esterilizar por filtración los suplementos. Agregar en condiciones asépticas los 
suplementos al medio CSTEL previament e esterilizado, justo antes de su uso. Para la preparación de un litro 
del medio CSTEL se debe partir de las soluciones anterio res, agregando las siguientes  cantidades: 3,0 ml de 
acriflavina, 8,0 ml de ácido nalidíxico y 5,0 ml de soluci ón de cicloheximida. Precaución: ¡La cicloheximida es 
una sustancia química altamente tóxica, durante su ma nejo deben emplearse guantes, lentes de protección y 
lavarse las manos inmediatamente después de usarla! 
B.16.3.3  Medio de cloruro de litio feniletanol-moxolactam (LMP) 
Ingredientes Cantidad 
Agar fenil etanol 35,5 g Glicina anhídra 10,0 g 
Cloruro de litio 5,0 g 
Solución de moxolactam al 1 % en amor tiguador de fosfatos pH 6,0 2,0 ml 
Agua 1000,0 ml 
 
Esterilizar el medio (sin moxolactam) en autoclave  a 121 ± 1ºC durante 15 min. Enfriar de 48 a 50ºC y 
agregar la solución de moxolactam previamente esteriliz ada por filtración. Distribuir volúmenes de 12 a 15 ml 
del medio en cajas de Petri estériles. Las placas delgadas facilitan la observación de las colonias. 
B.16.3.4  Medio Oxford 
B.16.3.4.1  Medio base Oxford (OXA) 
Ingredientes Cantidad 
Base de agar Columbia 39,0 g 
Esculina 1,0 g 
Citrato férrico amónico 0,5 g Cloruro de litio 15,0 g 
Agua 1000,0 ml 
 Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Agregar los ingredientes a un litro de agua y llevar  a ebullición hasta disolución completa. Esterilizar en 
autoclave a 121 ± 1ºC durante 15 min. Enfriar a 50ºC el  medio base y en condiciones asépticas agregar los 
suplementos. Un litro de medio Oxford debe contener los siguientes suplementos: 
Suplementos Cantidad
Cicloheximida 400 mg Sulfato de colistina 20 mg Acriflavina 5 mg Cefotetán 2 mg Fosfomicina 10 mg 
 
Disolver la cicloheximida, el sulfato de colestina, acri flavina, cefotetán y la fosfomicina en 10 ml de una 
mezcla 1:1 de etanol: agua. Esterilizar por filtración ante s de agregar al medio base. Mezclar y vaciar en cajas 
Petri estériles. Las placas del medio Oxford se pueden almacenar como máximo dos semanas. 
B.16.3.5  Agar soya tripticaseína con 0,6% de extracto de levadura (ASTEL) 
Ingredientes Cantidad
Agar soya tripticaseína 40,0 g Extracto de levadura 6,0 g Agua 1000,0 ml 
 
Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el agar. Es terilizar a 121 ± 1ºC durante 15 min. pH final  7,3 ± 
0,2. 
B.16.3.6  Agar sangre de carnero 
Ingredientes Cantidad
Base de agar sangre 95,0 ml Sangre de carnero desfibrinada 5,0 ml 
 
Preparar el agar base de acuerdo a las instrucciones  del fabricante. Enfriar a 45 ± 2ºC y agregar 
asépticamente la sangre de carnero, la cual previa mente se debe encontrar a temperatura ambiente (20 - 
25°C). Homogeneizar el medio y verter en las cajas Petri estériles de 12 a 15 ml para la prueba de CAMP y de 15 a 20 ml para la prueba de hemólisis. 
B.16.3.7  Caldo nitratos 
Ingredientes Cantidad
Nitrato de potasio 1,0 g Cloruro de sodio 0,5 g Peptona 2,0 g Agua 1000,0 ml 
 
Agregar los ingredientes a un litro de agua, agitar hast a disolución completa. Verter en tubos de 13 x  100 
mm con tapón de rosca. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C durante 15 min. 
B.16.3.8  Medios para la prueba de movilidad 
B.16.3.8.1  Medio de SIM 
Ingredientes Cantidad
Peptona de caseína 20,0 g Peptona de carne 6,1 g Sulfato de fierro y amonio 0,2 g Tiosulfato de sodio 0,2 g Agar 3,5 g Agua 1000,0 ml 
 
Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el agar. Envasar en porciones de 4 ml en tubos de 13 x  100 
mm. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C durante 15 min. pH final 7,3 ± 0,2.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.16.3.8.2  Medio MTM 
Ingredientes Cantidad 
Extracto de carne 3,0 g 
Peptona 10,0 g Cloruro de sodio (NaCl) 5,0 g Agar 4,0 g 
Agua 1000,0 ml 
 
Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el agar. Envasar en porciones de 4 ml en tubos de 13 x  100 
mm. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1ºC durante 15 min. pH final 7,4 ± 0,2. 
B.16.3.9  Caldo púrpura para fermentación de carbohidratos 
Ingredientes Cantidad 
Proteosa peptona No. 3 10,00 g 
Cloruro de sodio 5,00 g Extracto de carne 1,00 g Púrpura de bromocresol 0,02 g 
Agua 1000,00 ml 
 
Calentar si es necesario para disolver los ingredient es. Esterilizar en autoclave durante 15 min.  a 121 ± 
1°C pH final 6,8 ± 0,2. Agregar la solución del carbohidr ato, previamente esterilizada,  por filtración en cantidad 
suficiente para obtener una concentración final de 0,5 %. 
Nota:  Los sistemas bioquímicos comerciales validados pueden usarse como alternativa para las pruebas 
bioquímicas convencionales. 
B.16.4  Materiales 
 Aceite de inmersión 
 Asas bacteriológicas 
 Cajas Petri 
 Cubreobjetos 
 Matraces Erlenmeyer de 500 ml 
 Lámpara de luz blanca 
 Lápiz graso o marcador 
 Lupa de bajo aumento 
 Pipetas volumétricas de 25, 10 y 1,0 ml 
 Portaobjetos escabado 
 Portaasas 
 Tubos de 16 x 125 mm 
 Tubos de 13 x 100 mm u otros con tapón de rosca 
 Sistema de filtración con membranas con un tamaño de poro de 0,45 µm 
B.16.5 Aparatos e instrumentos 
Se requiere además de lo mencionado en el mét odo de Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos 
para su Análisis Microbiológico, lo siguiente: 
 Incubadoras con termostato que evite variaciones  mayores de ± 1,0ºC, provista con termómetro 
calibrado. 
 Microscopio de contraste de fases con objetivo de inmersión en aceite (100 X) o microscopio de 
campo oscuro. 
B.16.6  Preparación de la muestra 
Para la preparación de la muestra seguir lo mencionado en el método Preparación y Dilución de muestras 
de Alimentos para su Análisis Microbiológico. 
B.16.7  Procedimiento 
Este método debe realizarlo un microbiólogo experi mentado, en un ambiente controlado, aislado de áreas 
de producción de alimentos. Se debe tener especial cuida do en la disposición de aquellos materiales y equipo 
que hayan estado en contacto con alimentos sospechosos, antes de desecharlos o volver a utilizarlos. Esta 
técnica por ningún motivo debe aplicarla personal inmunocomprometido ya sea por enfermedad o por el uso de medicamentos, mujeres embarazadas o personas de edad avanzada. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
B.16.7.1  Procedimiento de enriquecimiento 
Tomar una muestra representativa del a limento, tanto de la superficie externa como del interior. Colocar  
25 ml o 25 g de la muestra en un recipiente conteniendo 225 ml de medio de enriquecimiento (EB), 
homogeneizar e incubar por 48 h a 30ºC. En el caso de muestras en donde se sospecha que tienen células de 
Listeria  spp dañadas, se recomienda la incubación en un caldo de enriquecimiento que contenga piruvato de 
sodio al 0,1 % (p/v) incubado a 30°C por 6 h sin suplementos. Después de las 6 h de incubación los suplementos deben agregarse y continuar la incubación a 30ºC hasta un total de 48 h. 
B.16.7.1.1  Aislamiento 
Después de 24 y 48 h de incubación en el medio EB, resembrar en los medios LMP y OXA. Incubar las 
placas del medio LMP a 30ºC por 24 a 48 h y las de medio OXA a 35ºC por el mismo periodo. Observar el crecimiento en las placas del medio LMP con luz blanc a en un ángulo de 45º (iluminación de Henry), a simple 
vista o con la ayuda de una lupa. En este medio ge neralmente aparecen las colonias de color blanco o azul 
iridiscentes. Ver la figura 1. En el medio OXA las colonias de Listeria son negras, con halo negro. Algunas 
colonias pueden aparecer con un tono café oscuro que se define mejor a los siete días de incubación. 
Seleccionar cinco o más colonias típicas del medio de OXA o LMP y pasar a placas de medio ASTEL. Este 
paso es importante debido a que las colonias aparentemen te aisladas en los medios OXA y LMP pueden estar 
contaminadas con flora compet itiva parcialmente inhibida, invisible a simple vista. 
Debido a que puede estar presente más de una especie de Listeria en la muestra, deben identificarse 
como mínimo cinco colonias. 
 
B.16.7.2  Identificación 
Se deben utilizar cepas de referencia positivas y negativas para cada una de las pruebas. Seleccionar 
colonias típicas y sembrar en medio ASTEL. Incubar a 35ºC por 24 h. Estos cultivos pueden mantenerse a 
4ºC y utilizarse como inóculo para re alizar las pruebas de identificación. 
B.16.7.2.1  Prueba de movilidad en fresco 
Hacer preparaciones en fresco (en gota suspendida o entre porta y cubreobjetos) utilizando solución salina 
al 0,85%. La suspensión debe ser densa y emulsificars e completamente, y observar con objetivo de inmersión 
en un microscopio de contraste de fase o microscopio de campo oscuro. Las células de Listeria  spp son 
bacilos cortos con movilidad rotatoria o como si brincaran. Los bacilos con movimientos rápidos no son 
Listeria  spp. 
B.16.7.2.2  Prueba de catalasa 
Emulsificar un cultivo puro, con una gota de solución de peróxido al 3%. La formación inmediata de 
burbujas indica que la prueba es positiva. Las especies de Listeria  son catalasa positivo. 
¡Precauciones, la emulsión debe realizarse con una asa de plástico o palillo de madera estéril evitando el 
contacto del metal con el reactivo. Si las colo nias provienen de agar base con sangre. Cualquier 
contaminación de eritrocitos pued e dar pruebas falsas positivas! 
B.16.7.2.3  Tinción de Gram 
Hacer una tinción de Gram de cultivos de 16 a 24 h. Todas las especies de Listeria  son bacilos cortos 
Grampositivo; sin embargo en cultiv os viejos pueden presentarse como formas cocoides. En extensiones 
delgadas se observan de color pálido y pueden confundirse con Bacteroides spp.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.16.7.2.4  Prueba de hemólisis 
Dibujar una cuadrícula de 20 a 25 espacios en el fondo de la placa de agar sangre de carnero al 5%. 
Inocular por picadura un cuadro por ca da cultivo. Incubar por 48 h a 35ºC. Al inocular, observar la reacción 
hemolítica en las placas. L. monocytogenes  y L. seeligeri  producen una zona ligeramente clara alrededor del 
punto de picadura. Confirmar las reacciones dudosas con la prueba de CAMP. 
B.16.7.2.5  Prueba de reducción de nitratos 
Inocular los tubos conteniendo caldo nitratos, incubar a 35ºC por 5 días. Para la lectura se debe agregar 
0,2 ml del reactivo A y 0,2 ml del reactivo B, un color rojo  indica una prueba positiva (presencia de nitritos). Si 
esta coloración no se observa, adicionar zinc en polvo. El desarrollo de color rojo después de una hora 
confirma una prueba negativa (presencia de nitratos). En fo rma alternativa adicionar al cultivo en caldo nitratos 
0,2 ml del reactivo B y 0,2 ml del reactivo C. Un color naranja indica una prueba positiva (presencia de 
nitritos). Si esta coloración no se observa, adicionar  0,2 ml del reactivo de cadmio, el desarrollo de un color 
naranja confirma una prueba negativa (presencia de nitrat os). Este procedimiento alternativo elimina el uso del 
alfa-naftilamina, que es carcinogénica. 
B.16.7.2.6  Prueba de movilidad en agar 
Inocular el medio SIM o MTM, inc ubar por 7 días a temperatura ambient e (20-25ºC), observar diariamente. 
Las especies de Listeria  son móviles, dando un crecimiento típico en forma de paraguas. 
B.16.7.2.7  Prueba de utilización de carbohidratos 
Inocular tubos de caldo púrpura para fermentación de ca rbohidratos al 0,5 %: dextr osa, esculina, maltosa, 
ramnosa, manitol y xilosa. Incubar 7 días a 35ºC. Una coloración amarill a indica una prueba positiva. Todas 
las especies de Listeria  dan positivas las pruebas para dextrosa, esculina y maltosa. Consultar el cuadro 1 
para reacciones con ramnosa, xilosa y manitol. Si la pigmentación prematura del aislamiento en el medio OXA 
no deja lugar a duda, el ensayo de esculina puede omitirse. 
B.16.7.2.8  Prueba de Cristie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP) 
Para la prueba de CAMP se emplean las siguientes cepas de colección de S. aureus  y R. equi:  
Staphylococcus aureus  Rhodococcus equi 
ATCC 49444 ATCC 6339 
NCTC 7428 NCTC 1621 
ATCC 25923 
CIP 5710 
Las cepas empleadas en la prueba de CAMP pueden obtenerse de diversas colecciones nacionales e 
internacionales. 
En una placa de agar sangre de carnero sembrar una estría de la cepa de S. aureus  y, paralelamente una 
de R. equi, separadas lo suficiente para que entre éstas se puedan estriar perpendicularmente las cepas 
sospechosas de Listeria , sin que lleguen a tocarse (aproximadamente 5 mm de separación). Después de 24 y 
48 h de incubación a 35°C observar el sinergismo entre la s hemolisinas de S. aureus, R. equi y Listeria que se 
manifiesta como una zona hemolítica más intensa. 
La figura 2 muestra la disposición de las estrías de lo s cultivos en una placa para la prueba de CAMP. La 
hemólisis de L. monocytogenes  y L. seeligeri  se incrementa cerca de la estría de S. aureus,  y la hemólisis de 
L. ivanovii  se aumenta cerca de la estría de R. equi. Las especies restantes no son hemolíticas en esta 
prueba. 
 
Prueba de CAMP para Listeria monocytogenes : 
Diseño de la inoculación en placas de agar sangre de  carnero. Las líneas hor izontales representan las 
estrías de la inoculación de cinco cepas. Las líneas verticales representan las estrías de inoculación de  S. 
aureus  (S) y R. equi (R). Las líneas sombreadas indican el incremento de hemólisis en esas regiones. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Cuadro 1. Diferenciación de las Especies de Listeria 
ESPECIES HEMOLITICO(BETA)A REDUCCION 
NITRATOS PRODUCCION DE 
ACIDOS CAMPO 
   M R X S.a R.e 
L. monocytogenes + - - + - + - 
L. ivanovii + - - - + - + 
L. innocua - - - bV - - - 
L. welshimeri - - - bV + - - 
L. seeligeri + - - - + +1 - 
L. grayic - bV + bV - - - 
a Sangre de carnero desfibrinada 
bV Variable 
L. grayi incluye ahora las cepas de la especie L. murrayi reductoras de nitratos y ramnosa variable 
M Manitol R Ramnosa 
X Xilosa 
S.a Staphylococcus aureus R.e Rhodococcus equi 
B.16.7.3  Serología 
La determinación de los tipos serológicos de Listeria se aplica cuando las consideraciones 
epidemiológicas sean cruciales. Inocul ar en caldo de triptosa por 24 h a 35º C. Transferir a dos tubos de agar 
inclinado de triptosa e incubar 24 h a 35ºC. Para realizar la prueba se pueden utilizar sueros comerciales, 
siguiendo las instrucciones del fabricante. 
Cuadro 2.  Serología de las especies de Listeria  
ESPECIES SEROTIPO 
L. monocytogenes 1/2A, 1/2B, 1/2C 
 3A, 3B, 3C 
 4A, 4AB, 4B 
 4C, 4D, 4E, "7" 
L. ivanovii 5 
L. innocua 4AB, 6A, 6B, Un a 
L. welshimeri 6A, 6B 
L. seeligeri 1/2B, 4C, 4D, 6B, Un a 
 
B.16.8  Expresión de resultados 
Comparar los resultados obtenidos con el cuadro 1 y determinar el género y especie de las cepas 
aisladas. La correspondencia de resultados con el cuadro anterior indica la presencia del género Listeria.  
El único miembro del género Listeria de importancia para esta norma es Listeria monocytogenes. 
B.16.9 Informe de la prueba 
Cuando los resultados sean positivos para L. monocytogenes  informar la presencia en 25 g o 25 ml de 
muestra. Y si los resultados son negativos  informar ausencia en 25 g o 25 ml de muestra. 
B.17. DE LA ESTIMACION DE LA DENSIDAD MICROBIANA POR LA TECNICA DEL NUMERO MAS 
PROBABLE. DETERMINACION DE BACTERIAS COLIFORMES, COLIFORMES FECALES Y Escherichia 
coli POR LA TECNICA DE DILUCIONES EN TUBO MULTIPLE. 
Este método es aplicable a cualquier grupo bacteriano de interés sanitario, especialmente en productos 
que se encuentran en bajas concentraciones de microorg anismos (10 por gramo o ml). Ejemplo: Leche, agua, 
alimentos; que por su consistencia pueden interferir c on la exactitud de la cuenta de Unidades Formadoras de 
Colonias (U.F.C.). 
B.17.1 Fundamento. 
Se basa en la dilución de la muestra en tubos múltiples, de tal forma que todos los tubos de la menor 
dilución sean positivos y todos los tubos de la dilución más alta sean negativos. El resultado positivo se 
demuestra por la presencia de gas o crecimiento microbiano. 
Para obtener el Número Más Probable (NMP) en los result ados se aplica la teoría de la probabilidad, lo 
cual tiene como condición lo siguiente:       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
- Una distribución aleatoria de las bacterias que existen en la muestra. 
- Las bacterias se encuentran como entidades no agrupadas. 
- Los microorganismos presentes en la muestra cr ecerán en el medio, cuando son incubados y se 
mantengan en las condiciones adecuadas para su desarrollo. 
Si se espera una cuenta microbiana alta, la muestra deberá diluirse para dar cumplimiento a las 
condiciones. La forma más común de realizar esta prueba es mediante diluciones decimales y usando un 
inóculo en series de 3, 5 o 10 tubos en serie. A medida qu e el número de tubos inoculados para cada dilución 
aumentan se reducen los límites de confianza. 
B.17.2 Equipo, materiales y reactivos . 
No aplica. B.17.3 Procedimientos. 
B.17.3.1 Uso de tablas de NMP con 95% de límite de confianza. 
Las tablas 1-3 presentan la esti mación estadística de los valores del NMP que corresponden al 95% de 
límite de confianza cuando se utiliz an 3, 5 y 10 tubos. Otras combinac iones de resultados positivos y 
negativos no encontrados en estas tablas, tienen muy baja probabilidad de que se presenten. Si los resultados 
no están incluidos en las tablas, se  deberá repetir la prueba a partir de la muestra original. Si no es posible, 
el NMP se puede obtener (para las combinaciones de 3 y 5 tubos) de las tablas 4 y 5; también se puede 
aplicar una ecuación (véase punto B. 2) para obtener el NMP aproximado. 
El intervalo del 95% de confianza se interpreta como sigue: si el analista supone que el número real de 
microorganismos cae dentro de los límites, entonces se asume que será correcto el 95% de las veces. El valor 
del NMP tabulado representa un intervalo y no un valor absoluto. 
Cuando se preparan más de 3 diluciones de una muestra, el NMP deberá determinarse a partir de tres 
diluciones consecutivas (usando tablas 1-3). Primero,  para todas las diluciones que tengan todos los tubos 
positivos, seleccionar la dilución mayor. Después usar la s 2 siguientes diluciones mayores (A y B en las tablas 
6 y 7). Cuando en ninguna de las diluciones probadas hu biera crecimiento en todos los tubos, seleccionar  (si 
es posible) las primeras tres diluciones consecutiv as (volumen de muestra) para que la dilución media 
contenga resultados positivos  (C de tablas 6 y 7). 
Con frecuencia es necesario el NMP desde el inicio  con volúmenes diferentes de los enlistados en las 
tablas 1-5. Si el volumen de muestra es mayor que 0, 01 g multiplicar el NMP enlistado en la tabla por 10. El 
resultado de una determinación de 5 tubos que dé 3 tubos positivos en 0,01 g; 2 tubos positivos en 0,001 g y 1 
tubo positivo en 0,0001 g (3-2-1) leer en la tabla No. 2 como 17 y multiplicar por 10 para así obtener 170 como 
el NMP actual por gramo de muestra. De igual forma si la cantidad más grande utilizada para la tabla de 
referencia es 1 g en lugar de 0,1 g, dividir el NMP derivado de la tabla entre 10. Por ejemplo el resultado de la 
determinación del NMP en 3 tubos para Salmonella spp que dé 3 tubos positivos en 1 g; 1 tubo positivo en  
0,1 g y ningún positivo en 0,01 g (3-1-0) leer en la tabla No. 1 como 43 y dividir entre 10, lo que da 4,3 como el 
NMP presuntivo por gramo de muestra. 
Un método alternativo para obtener el número más probable es usando la siguiente fórmula: (NMP/g de la tabla - 100) X factor de dilución del tubo de enmedio = NMP/g 
Para calcular el NMP/100 g multiplicar por 100. 
B.17.3.2  Cálculo aproximado del NMP y 95% de límite de confianza. 
Debido a la inherente complejidad para calcular los lí mites de confianza del NMP lo más común es el uso 
de tablas. Generalmente estas tablas están limitadas al  uso de 3, 5 y 10 tubos por dilución, incluso usando un 
método aceptado, pueden pres entarse datos irregulares o accidentes de laboratorio que causan pérdida de 1 
o más tubos de dilución. En este caso una serie de dilu ciones de por ejemplo: 5, 4,4 puede dar una lectura de 
5-2-0. Para estos casos se puede aplicar una fórmula sencilla, la cual no corresponde exactamente con los 
resultados obtenidos teóricamente; sin embargo, las desviaciones generalmente son pequeñas, esta fórmula 
no debe ser aplicada para fines de regulación. La fórmula no restringe el número de tubos o las diluciones y 
puede aplicarse para todo tipo de pruebas. El cálculo aproximado está dado por la siguiente ecuación:  NMP/g 
= P/(N T)
1/2 
Donde: P es el número de tubos positivos, N es la  cantidad total de muestra (g) en todos los tubos 
negativos y T es la cantidad tota l de muestra (g) en todos los tubos. 
Por ejemplo, considerando que se tuvieran serie de diluciones al doble: 
MUESTRA (G) NO. DE TUBOS NO. DE TUBOS POSITIVOS 
8 
4 
2 
1 
0,5 0,25 5 
5 
5 
5 
5 5 5 
4 
2 
0 
1 0 
 Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
El número de tubos positivos es: P = (5 + 4 + 2 + 1) = 12; N = (8x0) + (4x1) + (2x3) + (1x5) + (0,5x4) + 
(0,25x5) = 18,25; y T = 5 (8+4+2+1+0,5+0,25) = 78,75 
NPM/g = 12/(18,25 x 78,75)1/2 = 0,32/g o 32/100 g 
Los límites de confianza del 95% estimados, puede n obtenerse del antilogaritmo de base 10 con la 
siguiente ecuación: 
log (NMP/g) 1,08 (log a)/n) 1/2 
Donde: a es el radio de dilución y n es el número de tubos por dilución. Esta expresión asume que el radio 
de dilución es diferente de 1:10 (por ejemplo 1:2). Para diluciones de 1:10, la cantidad por restar o sumar 
deberá ser de 1,14(n)½ para la mejor estimación. Si el número de tubos por dilución (n i) es desigual  (por 
ejemplo: un accidente de laboratorio) para la dilución k reemplazar n por la expresión n H (media armónica) por 
el número de tubos por dilución (n i). 
La media armónica se define como: n
H = k / (1/ n i ) 
k es el número de diluciones. Por ejemplo: Suponiendo que el resultado de 3 diluciones en n i fuera 5-4-4. 
Por lo tanto n H = 3/ (1/5) + (1/4) + (1/4) ½ = 3/0,70 = 4,3i 
Para el ejemplo anterior el NMP con n = 5 y un lími te de confianza aproximado de 95% será el siguiente: 
log 0,32 (1,08) (log 2)/5) ½ 
-0,495 0,265 
Entonces el límite inferior es el antilogaritmo (-0 -76) = 0.17/g o 17/100 g y el límite inferior es el 
antilogaritmo (-0,23) = 0,59/g o 59/100  g. Cuando se compara con las tablas el NMP podría ser 0,31/g con 
límites de confianza de 0,16/g y 0,57/g. 
Tabla No. 1 Selección del NMP con un límite de confianza de 95% para  la prueba de fermentación 
utilizando 3 tubos: con porciones de 0,1,  0,01 y 0,001 g (ml) de muestra. 
No. de tubos positivos  95% de límite de confianza 
0,1 0,01 0,001 NMP/g (ml)b Inferior Superior 
0 0 0 3 - - 
0 1 0 3+ 1 17 
1 0 0 4 1 21 
1 0 1 7+ 2 27 
1 1 0 7 2 28 
1 2 0 11+ 4 35 
2 0 0 9 2 38 
2 0 1 14+ 5 48 
2 1 0 15 5 50 
2 1 1 20+ 7 60 
2 2 0 21 8 62 
3 0 0 23 9 130 
3 0 1 39 10 180 
3 1 0 43 10 210 
3 1 1 75 20 280 
3 2 0 93 30 380 
3 2 1 150 50 500 
3 2 2 210+ 80 640 
3 3 0 240 90 1400 
3 3 1 460 100 2400 
3 3 2 1100 300 4800 
3 3 3 1100 - - 
a Los resultados normales, obtenidos en un 95% de las pruebas no están seguidos por un símbolo más (+). Menos del 
4% de los resultados de las pruebas obtenidos están marcados por un símbolo más (+). Comb inaciones de tubos positivos 
no encontrados en esta tabla se presentan  en menos del 1% de las pruebas y si se presentaran con mayor frecuencia 
indican un error de técnica o que el valor del número más prob able se encuentra en el límite. El NMP de combinaciones que 
no aparecen en la tabla, se puede obtener por extr apolación a la combinac ión cercana más elevada. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (ml) por 100 para expresarlos como NMP/100 g (ml).       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
Tabla No. 2 Selección del NMP con un límite de confianza de 95% para la prueba de fermentación 
utilizando 5 tubos: con porciones de 0, 1, 0,01 y 0,001 g (ml) de muestraa. 
No. de tubos positivos 95% de límite de confianza
0,1 0,01 0,001 NMP/g (ml) b Inferio r Superio r
    
0 0 0 2 - - 
0 0 1 2+ 1 10 
0 1 0 2 1 10 
1 0 0 2 1 11 
1 0 1 4+ 1 15 
1 1 0 4 1 15 
1 2 0 6+ 2 18 
2 0 0 4 1 17 
2 0 1 7+ 2 20 
2 1 0 7 2 21 
2 1 1 9+ 3 25 
2 2 0 9 3 25 
3 0 0 8 3 24 
3 0 1 11 4 29 
3 1 0 11 4 30 
3 1 1 14+ 6 35 
3 2 0 14 6 35 
3 2 1 17+ 7 40 
3 3 0 17+ 7 41 
4 0 0 13 5 38 
4 0 1 17 7 45 
4 1 0 17 7 46 
4 1 1 21 9 55 
4 2 0 22 9 56 
4 2 1 26+ 12 65 
4 3 0 27 12 67 
4 3 1 33+ 15 77 
4 4 0 34+ 16 80 
5 0 0 23 9 68 
5 0 1 31 13 110 
5 1 0 33 14 120 
5 1 1 46 20 150 
5 1 2 63+ 22 180 
5 2 0 49 21 170 
5 2 1 70 30 210 
5 2 2 94+ 40 250 
5 3 0 79 30 250 
5 3 1 110 40 300 
5 3 2 140 60 360 
5 4 0 130 50 390 
5 4 1 170 70 480 
5 4 2 220 100 580 
5 4 3 280+ 120 690 
5 4 4 350+ 160 820 
5 5 0 240 100 940 
5 5 1 350 100 1300 
5 5 2 540 220 2000 
5 5 3 920 300 2900 
5 5 4 1600 600 5300 
5 5 5 1600 - - 
a Los resultados normales, obtenidos en un 95% de las pruebas , no están seguidos por un símbolo más(+). Menos del 
4% de los resultados de las pruebas obtenidos están marcados por un símbolo más (+). Comb inaciones de tubos positivos 
no encontrados en esta tabla se presentan  en menos del 1% de las pruebas y si se presentaran con mayor frecuencia 
indican un error de técnica o que el valor del número más prob able se encuentra en el límite. El NMP de combinaciones que 
no aparecen en la tabla, se pueden obtener por extr apolación a la combinac ión cercana más elevada. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (ml) por 100 para expresarlos como NMP/100 g (ml). Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
 
Tabla No. 3 Selección del NMP con un límite de confianza de 95% para  la prueba de fermentación 
utilizando 10 tubos: con porciones de 0,1, 0,01 y 0,001 g (ml) de muestra a. 
No. de tubos positivos  95% de límite de confianza 
0,1 0,01 0,001 NMP/g (ml) b Inferior Superior 
0 0 0 1 - - 
0 0 1 1+ 1 5 
0 1 0 1 1 5 
0 2 0 2+ 1 7 
1 0 0 1 1 5 
1 0 1 2+ 1 7 
1 1 0 2 1 7 
1 2 0 3+ 1 8 
2 0 0 2 1 7 
2 0 1 3+ 1 9 
2 1 0 3 1 9 
2 1 1 4+ 1 10 
2 2 0 4 2 10 
2 3 0 5+ 2 12 
3 0 0 3 1 9 
3 0 1 4 2 11 
3 1 0 4 2 11 
3 1 1 5+ 2 13 
3 2 0 5 2 13 
3 2 1 6+ 3 14 
3 3 0 6+ 3 14 
4 0 0 4 2 12 
4 0 1 6 2 13 
4 1 0 6 2 14 
4 1 1 7 3 15 
4 2 0 7 3 15 
4 2 1 8 4 17 
4 3 0 8 4 17 
4 4 0 9+ 5 19 
5 0 0 6 2 15 
5 0 1 7 3 16 
5 1 0 7 3 17 
5 1 1 9 4 18 
5 2 0 9 4 18 
5 2 1 10+ 5 20 
5 3 0 10 5 20 
5 3 1 11+ 6 22 
5 4 0 11+ 6 22 
6 0 0 8 3 18 
6 0 1 9 4 20 
6 1 0 9 4 20 
6 1 1 11 5 22 
6 2 0 11 5 22 
6 2 1 12 6 24 
6 3 0 12 6 25 
6 3 1 14+ 7 27 
6 4 0 14+ 7 27 
6 5 0 15+ 8 29 
7 0 0 10 5 22 
7 0 1 12 6 24 
7 0 2 13+ 7 27       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
7 1 0 12 6 25 
7 1 1 13 7 27 
7 1 2 15+ 8 30 
7 2 0 13 7 27 
7 2 1 15 8 30 
7 2 2 17+ 9 32 
7 3 0 15 8 30 
7 3 1 17 9 33 
7 4 0 17 9 33 
7 4 1 19+ 10 36 
7 5 0 19+ 10 36 
8 0 0 13 6 28 
8 0 1 15 7 31 
8 0 2 17+ 8 34 
8 1 0 15 7 31 
8 1 1 17 9 34 
8 1 2 19+ 10 37 
8 2 0 17 9 35 
8 2 1 19 10 38 
8 2 2 21+ 12 42 
8 3 0 19 10 39 
8 3 1 21 12 42 
8 3 2 24+ 13 46 
8 4 0 22 12 43 
8 4 1 24 13 46 
8 5 0 24 13 47 
8 5 1 27+ 15 51 
8 6 0 27+ 15 52 
9 0 0 17 8 37 
9 0 1 19 10 41 
9 0 2 22+ 11 46 
9 1 0 19 10 42 
9 1 1 22 11 47 
9 1 2 25+ 13 52 
9 2 0 22 12 47 
9 2 1 25 13 53 
9 2 2 28+ 15 58 
9 3 0 25 13 54 
9 3 1 29 15 60 
9 3 2 32+ 18 66 
9 4 0 29 16 61 
9 4 1 33 18 67 
9 4 2 37+ 20 74 
9 5 0 33 18 69 
9 5 1 37 20 76 
9 5 2 42+ 23 83 
9 6 0 38 21 77 
9 6 1 43+ 24 85 
9 7 0 44+ 24 87 
10 0 0 23 12 58 
10 0 1 27 14 67 
10 0 2 31+ 16 77 
10 1 0 27 14 69 
10 1 1 32 17 79 
10 1 2 38 20 92 Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
10 2 0 33 17 83 
10 2 1 39 20 96 
10 2 2 50 20 110 
10 2 3 50+ 30 120 
10 3 0 40 20 100 
10 3 1 50 20 120 
10 3 2 60+ 30 130 
10 3 3 70+ 30 150 
10 4 0 50 30 120 
10 4 1 60 30 140 
10 4 2 70 30 160 
10 4 3 80+ 40 170 
10 5 0 60 30 150 
10 5 1 70 40 170 
10 5 2 90 40 190 
10 5 3 100 50 210 
10 6 0 80 40 180 
10 6 1 90 50 200 
10 6 2 110 50 230 
10 6 3 120 60 250 
10 6 4 140+ 70 270 
10 7 0 100 50 220 
10 7 1 120 60 250 
10 7 2 140 70 280 
10 7 3 150 80 310 
10 7 4 170+ 90 340 
10 8 0 130 60 280 
10 8 1 150 80 320 
10 8 2 170 90 360 
10 8 3 200 100 400 
10 8 4 220 120 440 
10 8 5 250+ 140 480 
10 9 0 170 90 380 
10 9 1 200 100 430 
10 9 2 230 120 490 
10 9 3 260 140 560 
10 9 4 300 160 640 
10 9 5 350 180 720 
10 9 6 400+ 210 820 
10 10 0 240 120 610 
10 10 1 290 150 750 
10 10 2 350 170 910 
10 10 3 400 200 1100 
10 10 4 500 300 1400 
10 10 5 700 300 1700 
10 10 6 900 400 2100 
10 10 7 1120 600 2700 
10 10 8 1160 800 3700 
10 10 9 2300 1100 6000 
10 10 10 2300 - - 
a Los resultados normales, obtenidos en un 95% de las pruebas, no están seguidos por un sím bolo más (+). Menos del 
4% de los resultados de las pruebas obtenidos están marcados por un símbolo más(+). Combinaciones de tubos positivos 
no encontrados en esta tabla se presentan  en menos del 1% de las pruebas y si se presentaran con mayor frecuencia 
indican un error de  técnica o que el valor del número más probable se enc uentra en el límite. El NMP de combinaciones que 
no aparecen en la tabla, se pueden obtener por extr apolación a la combinac ión cercana más elevada. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (ml) por 100 para expresarlos como NMP/100 g (ml).       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
 
Tabla No. 4 Número más probable (NMP) para 1g de muestra cuando se usan 3 tubos  con porciones 
de 0,1, 0,01 y 0,001g. 
Tubos Positivos Tubos Positivos Tubos Positivos Tubos Positivos  
0,1 0,01 0,001 NMP 0,1 0,01 0,001 NMP 0,1 0,01 0,001 NMP 0,1 0,01 0,001 NMP 
0 0 0 3 1 0 0 3,6 2 0 0 9,1 3 0 0 23 
0 0 1 3 1 0 1 7,2 2 0 1 14 3 0 1 39 
0 0 2 6 1 0 2 11 2 0 2 20 3 0 2 64 
0 0 3 9 1 0 3 15 2 0 3 26 3 0 3 95 
0 1 0 3 1 1 0 7,3 2 1 0 15 3 1 0 43 
0 1 1  6,1 1 1 1 11 2 1 1 20 3 1 1 75 
0 1 2  9,2 1 1 2 15 2 1 2 27 3 1 2 120 
0 1 3 12 1 1 3 19 2 1 3 34 3 1 3 160 
0 2 0  6,2 1 2 0 11 2 2 0 21 3 2 0 93 
0 2 1  9,3 1 2 1 15 2 2 1 28 3 2 1 150 
0 2 2 12 1 2 2 20 2 2 2 35 3 2 2 210 
0 2 3 16 1 2 3 24 2 2 3 42 3 2 3 290 
0 3 0  9,4 1 3 0 16 2 3 0 29 3 3 0 240 
0 3 1 13 1 3 1 20 2 3 1 36 3 3 1 460 
0 3 2 16 1 3 2 24 2 3 2 44 3 3 2 1100 
0 3 3 19 1 3 3 29 2 3 3 53 3 3 3 1100 
 
Tabla No. 5 Número más probable (NMP) para 100 ml de muestra cuando se  usan 5 porciones en 
cada una de 3 diluciones con series geométricas . 
No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos 
10 1 0,1 10 1 0,1 10 1 0,1 10 1 0,1 10 1 0,1 10 1 0,1 
ml ml ml N 
M 
P ml ml ml N 
M 
P ml ml ml N 
M 
P m
l ml ml N 
M 
P ml ml ml N 
M 
P ml ml ml N M 
P 
0 0 0   1 0 0 2 2 0 0 4,5 3 0 0 7,8 4 0 0 13 5 0 0 23 
0 0 1 1,8 1 0 1 4 2 0 1 6,8 3 0 1 11 4 0 1 17 5 0 1 31 
0 0 2 3,6 1 0 2 6 2 0 2 9,1 3 0 2 13 4 0 2 21 5 0 2 43 
0 0 3 5,4 1 0 3 8 2 0 3 12 3 0 3 16 4 0 3 25 5 0 3 58 
0 0 4 7,2 1 0 4 10 2 0 4 14 3 0 4 20 4 0 4 30 5 0 4 76 
0 0 5 9,0 1 0 5 12 2 0 5 16 3 0 5 23 4 0 5 36 5 0 5 95 
0 1 0 1,8 1 1 0 4 2 1 0 6,8 3 1 0 11 4 1 0 17 5 1 0 33 
0 1 1 3,6 1 1 1 6,1 2 1 1 9,2 3 1 1 14 4 1 1 21 5 1 1 46 
0 1 2 5,5 1 1 2 8,1 2 1 2 12 3 1 2 17 4 1 2 26 5 1 2 64 
0 1 3 7,3 1 1 3 10 2 1 3 14 3 1 3 20 4 1 3 31 5 1 3 84 
0 1 4 9,1 1 1 4 12 2 1 4 17 3 1 4 23 4 1 4 35 5 1 4 110 
0 1 5 11 1 1 5 14 2 1 5 19 3 1 5 27 4 1 5 42 5 1 5 130 
0 2 0 3,7 1 2 0 6,1 2 2 0 9,3 3 2 0 14 4 2 0 22 5 2 0 49 
0 2 1 5,5 1 2 1 8,2 2 2 1 12 3 2 1 17 4 2 1 26 5 2 1 70 
0 2 2 7,4 1 2 2 10 2 2 2 14 3 2 2 20 4 2 2 32 5 2 2 95 
0 2 3 9,2 1 2 3 12 2 2 3 17 3 2 3 24 4 2 3 38 5 2 3 120 
0 2 4 11 1 2 4 15 2 2 4 19 3 2 4 27 4 2 4 44 5 2 4 150 
0 2 5 13 1 2 5 17 2 2 5 22 3 2 5 31 4 2 5 50 5 2 5 180 
0 3 0 5,6 1 3 0 8,3 2 3 0 12 3 3 0 17 4 3 0 27 5 3 0 79 
0 3 1 7,4 1 3 1 10 2 3 1 14 3 3 1 21 4 3 1 33 5 3 1 110 
0 3 2 9,3 1 3 2 13 2 3 2 17 3 3 2 24 4 3 2 39 5 3 2 140 
0 3 3 11 1 3 3 15 2 3 3 20 3 3 3 28 4 3 3 45 5 3 3 180 Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
0 3 4 13 1 3 4 17 2 3 4 22 3 3 4 31 4 3 4 52 5 3 4 210 
0 3 5 15 1 3 5 19 2 3 5 25 3 3 5 35 4 3 5 59 5 3 5 250 
0 4 0 7,5 1 4 0 11 2 4 0 15 3 4 0 21 4 4 0 34 5 4 0 130 
0 4 1 9,4 1 4 1 13 2 4 1 17 3 4 1 24 4 4 1 40 5 4 1 170 
0 4 2 11 1 4 2 15 2 4 2 20 3 4 2 28 4 4 2 47 5 4 2 220 
0 4 3 13 1 4 3 17 2 4 3 23 3 4 3 32 4 4 3 54 5 4 3 280 
0 4 4 15 1 4 4 19 2 4 4 25 3 4 4 36 4 4 4 62 5 4 4 350 
0 4 5 17 1 4 5 22 2 4 5 28 3 4 5 40 4 4 5 69 5 4 5 430 
0 5 0 9,4 1 5 0 13 2 5 0 17 3 5 0 25 4 5 0 41 5 5 0 240 
0 5 1 11 1 5 1 15 2 5 1 20 3 5 1 29 4 5 1 48 5 5 1 350 
0 5 2 13 1 5 2 17 2 5 2 23 3 5 2 32 4 5 2 56 5 5 2 540 
0 5 3 15 1 5 3 19 2 5 3 26 3 5 3 37 4 5 3 64 5 5 3 920 
0 5 4 17 1 5 4 22 2 5 4 29 3 5 4 41 4 5 4 72 5 5 4 1600 
0 5 5 19 1 5 5 24 2 5 5 32 3 5 5 45 4 5 5 81         
 
Tabla No. 6 Ejemplos para determinar el NMP estimado en series de tres tubos  con 1g (ml) de muestra 
por tubo. 
  Cantidad de muestra (g o ml) a Valores positivos 
reportados NMP estimado/g o ml b 
Ejemplo 0,10 ,001 0,001 0,0001 0,00001   
A 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3 3-2-0 930 
B 3/3 3/3 3/3 2/3 0/3 3-2-0 9300 
C 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3 0-1-0 30 
D 3/3 3/3 2/3 1/3 1/3 3-2-2 2100 
E 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3-3-3 110000 
                
a Numerador/denominador = número de tubos positivos/número de tubos inoculados. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (ml) por 100 para expresarlos como NMP/100 g (ml). 
Tabla No. 7 Ejemplos para determinar el NMP estimado en series de 5 tubos  con 1 g (ml) de muestra 
por tubo. 
  Cantidad de muestra (g o ml) a Valores positivos NMP estimado/g o ml b 
Ejemplo 0,1, 0,01 0,001 0,0001 0,00001 reportados   
A 5/5 5/5 2/5 0/5 0/5 5-2-0 490 
B 5/5 5/5 5/5 2/5 0/5 5-2-0 4900 
C 0/5 0/5 1/5 0/5 0/5 0-1-0 20 
D 5/5 5/5 3/5 1/5 1/5 5-2-2 1400 
E 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5-5-5 160000 
a Numerador/denominador = número de tubos positivos/número de tubos inoculados. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (ml) por 100 para expresarlos como NMP/100 g (ml). 
B.17.3.3  Determinación de bacterias coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli  por la técnica 
de diluciones en tubo múltiple. 
B.17.3.3.1 Fundamento Este método se basa en la propiedad de los micr oorganismos coliformes para producir gas a partir de 
glucosa y fermentación de lactosa dentro de las 48 horas  de incubación a 35 0,5°C (coliformes) y 44,50,2°C 
(coliformes fecales y E. coli ). 
B.17.3.3.2  Equipo y materiales  
 Además de los mencionados en el método Preparac ión y dilución de muestras de alimentos para 
análisis microbiológico, lo siguiente: 
 Baño de agua con agitación continua cubierto y con termostato que evite variaciones mayores  a 
0,1°C.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
 Termómetro calibrado y verificado 1/10 
 Tubos de cultivo de 20x200 y de 16x160 mm con tapón de rosca 
 Campanas de fermentación (tubos de Durham) 
 Gradillas 
 Asas bacteriológicas de 3 mm de diámetro 
 Lámpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. 
 Lentes protectores. 
 Medios de cultivo 
 Caldo lauril 
Ingredientes: 
Bacto triptosa 20,0 g 
Bacto lactosa 5,0 g 
Fosfato potásico,  dibásico 2,75 g 
Fosfato potásico, monobásico 2,75 g 
Cloruro de sodio 5,0 g Lauril sulfato de sodio 0,1 g Agua destilada 1000,0 ml 
pH final: 6,8 0,2 a 25°C. 
Preparación:  Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada. Ajustar el pH. Distribuir en tubos de 
ensaye con campanas de Durham. Adicionar 10 ml de medi o para cada tubo. Esteriliz ar en autoclave durante 
15 minutos a 121C. Antes de abrir el autoclave, dejar bajar la temperatura a 75C para que no queden burbujas en las campanas de Durham. 
Preparación de caldo lauril triptosa 
INOCULO (ml) CANTIDAD DE MEDIO 
POR TUBO (ml) VOLUMEN DE MEDIO 
MAS INOCULO (ml) CALDO LAURIL TRIPTOSA 
REQUERIDO g/L 
1 10 o más 11 o más 35,6 
10 10 20 71,2 
10 20 30 53,4 
20 10 30 106,8 
100 50 150 106,8 
100 35 135 137,1 
100 20 120 213,6 
 
Caldo EC ( E. coli .) 
Ingredientes:    
Bacto triptosa 20,0 g 
Bacto lactosa 5,0 g 
Bacto sales biliares No. 3 1,5 g 
Fosfato dipotásico 4,0 g Fosfato monopotásico 1,5 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Agua destilada 1000,0 ml 
 pH final: 6,9 0,2 a 25°C. 
Preparación:  Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar ligeramente para que se 
disuelva por completo. Ajustar el pH. Distribuir en tubos de ensaye con campanas de Durham. Adicionar 10 ml 
de medio para cada tubo. Esterilizar en autoclave durant e 15 minutos a 121°C. Antes de abrir el autoclave, 
dejar bajar la temperatura a 75°C para evitar que queden burbujas en las campanas de Durham. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Agar McConkey 
Ingredientes:    
Proteasa peptona o polipeptona 3,0 g Peptona o gelizante 17,0 g Lactosa 10,0 g Sales biliares No. 3 1,5 g Cloruro de sodio 5,0 g Rojo neutro 0,03 g 
Cristal violeta 0,001 g 
Agar 13,5 g Agua destilada 1000,0 ml 
pH final: 7,1 0,2 a 25°C 
Preparación:  Disolver los ingredientes en un litro de agua  destilada. Calentar hasta ebullición para 
disolver por completo. Ajustar el pH. Esterilizar a 1 21°C durante 15 minutos. Enfriar a 50-60°C y vaciar en 
cajas Petri. 
Agar eosina azul de metileno de Levin (EMB-L) 
Ingredientes:   Peptona 10,0 g 
Lactosa 10,0 g 
K
2HPO 4 2,0 g 
Eosina Y 0,4 g 
Azul de metileno 0,065 g 
Agua destilada 1000 ml 
pH final: 7,1 0,2 Preparación:  Disolver la peptona, el fosfato y el agar en un litro de agua. Calentar hasta ebullición para la 
disolución completa. Distribuir en porciones de 100 o 200 ml y esterilizar a no más de 121°C por 15 minutos. 
Fundir antes de su uso y adicionar a cada porción de 100 ml. 
a) 5 ml de solución de lactosa al 20% b) 2 ml de solución acuosa de eosina al 2% 
c) 4,3 ml de solución acuosa de azul de metileno al 0,15%. 
Cuando se use el producto deshidratado, disolver todo s los ingredientes de acuerdo con las instrucciones 
del fabricante. 
Caldo triptona al  1% (triptofano) 
Ingredientes:    
Triptona o tripticasa 10 g Agua destilada 1000 ml 
pH final: 6,9 0,2 
Preparación:  Disolver los ingredientes. Distribuir en porciones  de 5 ml en tubos de ensaye de 16 x 125 o 
16 x 150 mm. Esterilizar a 121°C por 15 minutos. 
Caldo MR-VP 
Medio 1 
Ingredientes:   Peptona tamponada 7 g 
Glucosa 5 g 
K
2HPO 4 5 g 
Agua destilada 1000 ml 
pH final: 6,9 0,2 
Preparación:  Disolver los ingredientes con calentamiento s uave si es necesario. Distribuir en volúmenes 
de 10 ml en tubos de ensaye de 16x150 mm. Esterilizar a 121°C por 15 minutos.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
Caldo citrato de Koser 
Ingredientes:   
NaNH 4HPO 4 •4H 2O 1,5 g 
KH2PO4 (monobásico) 1,0 g 
MgSO 4 •7H2O 0,2 g 
Citrato de sodio •2H 2O 3,0 g 
Agua destilada 1000 ml 
pH final: 6,7 0,2. 
Preparación:  Distribuir preferentemente en tubos de ensaye con tapa de rosca. Esterilizar a 121°C por 15 
minutos. Esta formulación se recomienda en los Méto dos de Análisis Oficial de AOAC y en los Métodos 
Estándares para el Análisis de Agua y Aguas de Dese cho (APHA). Este difiere de la composición del medio 
deshidratado disponible comercialmente y es recomendable su uso. 
Reactivos 
Reactivo de Kovacs 
Ingredientes:   
p-imetilaminobenzaldehído 5 g 
Alcohol amílico (normal) 75 ml 
HCI concentrado 25 ml 
 
Preparación:  Disolver el p-Dimetilaminobenzaldehído en alco hol amílico normal. Adicionar lentamente el 
HCl. Almacenar a 4°C. 
Para la prueba de indol 
1. Adicionar 0,2-0,3 ml del reactivo a 5 ml del cultivo de bacteria en caldo triptona. 
Se considera una prueba positiva cuando desarrolla un color rojo en la superficie del tubo. 
Reactivo de Voges-Proskauer (VP) 
Solución 1 
Ingredientes:   
alfa-naftol 5 g 
Alcohol absoluto 100 g 
 
Solución 2 
Ingredientes:    
Hidróxido de potasio 40 g 
Agua destilada para llevar a 100 ml 
 
Prueba de Voges-Proskauer (VP). 
1. Transferir 1 ml del cultivo a probar con 48 horas de incubación a un tubo de ensaye. 
2. Adicionar 0,6 ml de la solución 1 y 0,2 ml de la solución 2. 
3. Agitar después de la adición de cada solución. 
4. Para intensificar y acelerar la reacción adicionar unos cuantos cristales de creatina y mezclar. 
5. Dejar a temperatura ambiente. 
6. Leer resultados después de 4 horas de adicionar los reactivos. 
El desarrollo de una coloración rosa es una prueba positiva. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Reactivos para la coloración de Gram 
Cristal violeta 
Solución A   
Cristal violeta (colorante 90%) 2 g 
Etanol 95% 20 ml 
 Solución B 
Oxalato de amonio 0,8 g 
Agua destilada 80 ml 
 
Indicador rojo de metilo (R44) 
1. Mezclar la solución A y B. Almacenar por 24 horas 2. Filtrar a través de un papel filtro áspero. 
lodo de Gram 
Ingredientes:    lodo 1g 
Ioduro de potasio (Kl) 2 g 
Agua destilada 300 ml 
 
1. Colocar el Kl en un mortero. 
2. Adicionar el yodo. 3. Triturar con el pistilo por 5-10 segundos. 
4. Adicionar 1 ml de agua y triturar 
5. Adicionar 5 ml de agua y triturar 6. Adicionar 10 ml de agua y triturar 
7. Vaciar esta solución en una botella de reactivo. 
8. Enjuagar el mortero y el pistilo con la ca ntidad de agua necesaria para completar 300 ml. 
Colorante de contraste (solución concentrada)  
Ingredientes:    
Safranina O 2,5 g Etanol al 95% 100 ml 
 
Solución de trabajo: Adicionar 10 ml de la solución concentrada a 90 ml de agua destilada. Procedimiento para la tinción de Gram 
1. Fijar con calor moderado los frotis de la muestra a teñir. 
2. Adicionar la solución de cristal violeta al frotis. 3. Dejar actuar por un minuto. 
4. Lavar con agua corriente y escurrir. 
5. Aplicar la solución de yodo por un minuto. 6. Lavar con agua corriente y escurrir. 
7. Decolorar con etanol al 95% hasta que la coloración azul deje de fluir (aproximadamente 30 segundos). 
8. Inmediatamente después enjuagar con agua corriente 9. Escurrir.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
10. Aplicar el colorante de contra ste (safranina) por 30 segundos. 
11. Enjuagar, escurrir y secar al aire. Examinar al microscopio. 
Medio EC-MUG 
Preparar el caldo EC y adicionar 50 mg de 4-metilumb elliferyl-beta-D-glucurónido (MUG) por litro antes de 
esterilizar (121°C por 15 minutos). El cal do EC-MUG está comercialmente disponible. 
B.17.3.3.3  Procedimiento 
B.17.3.3.3.1 Alimentos 
B.17.3.3.3.1.1 Prueba presuntiva. 
B.17.3.3.3.1.1.1 Preparar la muestra como se indica en el método Preparación y dilución de muestras de 
alimentos para análisis microbiológico; y de acuerdo con el  tipo de producto, utilizar las diluciones apropiadas, 
según se indica en el procedimiento de la densidad microbiana por la técnica del número más probable. 
Utilizar como medio de enriquecimiento caldo lauril trip tosa y continuar como en el punto B.17. 3.3.3.1.1.2 
B.17.3.3.3.1.2 Prueba confirmativa. Continuar co mo en el punto B.17.3.3.3.1.2 
B.17.3.3.3.3 Prueba confirmatoria. 
Confirmar la presencia de Escherichia coli  en por lo menos el 10% de las pruebas con resultados positivos 
a coliformes fecales por cultivo en placas de agar McConkey a partir de los tubos que demostraron la presencia de gas en la prueba confirmativa. Incubar las placas a 35±0,5°C durante 24±2 horas, observar las 
colonias típicas fermentadoras de color rojo rodeadas de un halo opaco de precipitación de sales biliares. 
Seleccionar 1 o más colonias aisladas y pasar a tubos de fermentación con caldo lauril triptosa, continuar como se indica en el punto B.16.3. 3.3.1.1 Hacer tinción de Gram para obs ervación de la morfología de las 
colonias. 
B.17.3.3.3.3.1 Interpre tación de resultados.  
La formación de gas en el tubo de fermentación secundario dentro de las 48±3 horas y la demostración de 
bacilos Gram (-) no esporulados confir ma un resultado positivo de la prueba demostrándose la presencia del 
grupo coliforme. 
B.17.3.3.3.4 Cálculos 
Calcular la densidad microbiana en número más probable conforme al procedimiento señalado 
anteriormente, para estimar la població n de bacterias coliformes y bacterias coliformes fecales de acuerdo con 
las diluciones empleadas y expresar en NMP/g o ml par a alimentos y NMP/100 ml para agua. En el caso de 
usar volúmenes de 20 ml de muestras de agua en 5 tubos  o 10 ml de muestras de agua en 10 tubos, utilizar 
las siguientes tablas: 
TABLA 1. Indice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados 
positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con 20 ml de muestra de agua o hielo. 
NO. DE TUBOS 
Positivos NMP/100 ml 95% DE LIMITE DE CONFIANZA (APROXIMADO) 
Inferior Superior 
0 1,1 0 3,0 
1 1,1 0,05 6,3 
2 2,6 0,3 9,6 
3 4,6 0,8 14,7 
4 8,0 1,7 26,4 
5 8,0 4,0 Infinito 
 Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
TABLA 2. Indice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados 
positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con 10 ml de muestra de agua o hielo. 
No. de Tubos 
Positivos NMP/100 ml 95% de Límite de Confianza (aproximado) 
  Inferior Superior 
0 1,1 0,0 3,0 
1 1,1 0,03 5,9 
2 2,2 0,26 8,1 
3 3,6 0,69 10,6 
4 5,1 1,3 13,4 
5 6,9 2,1 16,8 
6 9,2 3,1 21,1 
7 12,0 4,3 27,1 
8 16,1 5,9 36,8 
9 23,0 8,1 59,5 
10 23,0 13,5 Infinito 
 
B.18. PREPARACION DE LA MUESTRA PARA LA DETERMINACION DE VIBRIO CHOLERAE. 
Las submuestras de pescado ahumado en filete deben analizarse individualmente. 
B.18.1  Incubación de las muestras a 35-37°C. 
De cada submuestra tomar 25 g, cortar en piezas pequeñas e introducirlas en un vaso de licuadora de  
500 ml de capacidad que contenga 225 ml de agua peptonada alcalina (APW) y homogeneizar por 2 min a la máxima velocidad. Esta es la dilución 1:10. De esta di lución preparar la dilución 1:100 y 1:1000, en 9 o 90 ml 
de agua peptonada alcalina. 
Incubar las tres diluciones de 35 a 37°C. 
B.18.2  Incubación de las muestras de 35-37°C y 42°C. 
Si se van a incubar los enriquecimientos a dos tem peraturas para una muestra, homogeneizar una porción 
de 50 g de cada submuestra en 450 ml de agua peptonada alcalina (APW). Esto hace la dilución 1:10. Verter 
250 ml (g) de la dilución 1:10 a un segundo recipiente estéril. Prepare dos series de diluciones de 1:100 y 
1:1000. Por lo tanto tenemos dos series de 3 diluciones . Incubar una serie de 35 a 37°C y la otra a 42°C. 
Proseguir con el paso de resiembra marcado en la NOM-031-SSA1-1993. Productos de la pesca. Moluscos bivalvos frescos-refrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias. 
B.19. TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS  PARA LA INVESTIGACION DE VIBRIO CHOLERAE  
B.19.1 Material y equipo 
 Licuadora y vasos de licuadora estériles. 
 Frascos de vidrio de boca ancha tipo tarro de 500 ml de capacidad con tapa de rosca. 
 Varilla de vidrio de 3 mm de diámetro y 20 cm de largo, con un doblez terminal en ángulo recto de  4 
cm. 
 Balanza granataria de 2000 g de capacidad y 0,2 g de sensibilidad. 
 Balanza analítica de 120 g de capacidad y 5 mg de sensibilidad. 
 Incubadoras de 39-40°C. 
 Baño de agua de 42 ± 0,2°C y 35-37°C. 
 Cucharas estériles u otros instrumentos apro piados para transferir muestras de alimentos. 
 Cajas Petri estériles de 15 x 100 mm de plástico. 
 Pipetas estériles de 1 ml con graduación de 0,01 ml, de 5 y 10 ml con graduación de 0,1 ml. 
 Asas bacteriológicas de 3 mm de diámetro de nicromel o platino. 
 Tubos de cultivo o de ensayo de 16 x 150 mm y 20 x 150 mm. 
 Tubos para bioquímicas o ensaye de 10 x 75 mm o 13 x 100 mm.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
 Tijeras y pinzas estériles. 
 Lámpara (para observar reacciones serológicas). 
 Mecheros. 
 Papel pH (rango 1-14) con un máximo de graduación de 0,4 unidades de pH por cambio de color. 
 Potenciómetro. 
 Bolsas de polietileno de 28 x 37 cm con tapa resellable. 
 Aparato de filtración y membranas de 0,45 micras. 
B.19.1.1 Medios de cultivo Agua Peptonada Alcalina (APW) FORMULA 
Peptona. 10 g Cloruro de Sodio 10 g Agua destilada 1 000 ml 
 
Disolver los ingredientes. Ajustar el pH de tal forma  que después de esterilizar  éste sea de 8,5± 0,2. 
Esterilizar en autoclave 10 minutos a 121°C. 
Agar Tiosulfato, Citrato, Sa les Biliares y S acarosa (TCBS) 
FORMULA  
Extracto de levadura 5 g Proteosa peptona 10 g Sacarosa 20 g Tiosulfato de sodio.5H
2O 10 g 
Citrato de sodio.2H2O 10 g 
Sales biliares 3 g Bilis de buey 5 g Cloruro de sodio 10 g Citrato férrico 1 g Azul de bromotimol 40 mg Azul de timol 40 mg Agar 15 g Agua destilada 1 000 ml 
 
Preparar en un matraz por lo menos tres veces más gr ande que el volumen requerido de medio. Adicionar 
los ingredientes en agua destilada tibia y calentar c on agitación constante hasta ebullición e inmediatamente 
retirar del calor. No esterilizar. Enfriar a 50°C y colo car en cajas de Petri. Dejar secar las placas de 37-45°C 
antes de usar. 
Agar modificado con Celobiosa, Polimixina B y Colistina (mCPC) 
SOLUCION 1 FORMULA 
Peptona 10 g Extracto de carne 5 g Cloruro de sodio 20 g Solución Stock de colorante 1 000 1 ml Agar 15 g Agua destilada 900 ml 
 
Ajustar el pH a 7,6. Hierva hasta que se disuelva el  Agar. Esterilizar por autoclave 15 minutos a 121°C. 
Enfríe de 48-55°C. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
SOLUCION STOCK DE COLORANTES 1 000 X : 
FORMULA 
Azul de Bromotimol 4 g 
Rojo de cresol 4 g Etanol al 95% 100 ml 
 
Para obtener un color firme del medio usar una solución colorante stock en lugar de estar pesando 
repetidamente los colores en polvo. Disuelva el colorante en etanol hasta obtener una solución al 4% (peso/volumen). Agregue 1 ml de esta solución a cada litro de agar mCPC, la cual tendrá al final 40 mg de 
Azul de Bromotimol y 40 mg de Rojo Cresol por litro. 
SOLUCION 2: FORMULA 
Celobiosa 10 g 
Colistina 400 000 Ul 
Polimixina B 100 000 UI 
Agua destilada 100 ml 
 
Disuelva la celobiosa por calentami ento en agua destilada. Enfríe y agregue los antibióticos. Esterilice por 
filtración, agregue la solución 2 a la solución 1 mezcle y distribuya en cajas Petri. 
Agar T
1N1 (Agar Triptona y Sal) 
FORMULA  
Triptona o tripticasa 10 g 
Cloruro de sodio 10 g Agar 20 g Agua destilada 1 000 ml 
 
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolución del  agar, si lo desea inclinado, distribuya en tubos. 
Esterilice en autoclave 15 minutos a 121°C. Deje solidi ficar los tubos inclinados, para placas enfríe el medio 
de 45-50°C y distribuya en cajas Petri estériles. 
Agar Gelatina (GA) 
FORMULA  
Peptona 4 g 
Extracto de levadura 1 g 
Gelatina 15 g Agar 15 g Agua destilada 1 000 ml 
 
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolución de  la gelatina y el agar, ajuste el pH a 7,2 ± 0.2. 
Esterilice en autoclave 15 minutos a 121°C. Enfríe de 45-50°C y distribuya en cajas Petri estériles. 
Agar Gelatina con Sal (GS) 
Preparar agar gelatina (GA), pero adicionando 30 g de Cloruro de Sodio por cada litro. Suspenda los 
ingredientes y hierva hasta disolver la  gelatina y el agar. Ajuste el pH de 7,2 ± 0,2. Esterilice en autoclave  15 
minutos a 121°C. Enfríe de 45-50°C, coloque en cajas Petr i. Si es necesario para inhibir la diseminación de 
Vibrio spp  tal como V. alginolyticus , use de 25-30 g de agar por litro. 
Caldo Glucosa de Hugh-Leifson FORMULA  
Peptona 2 g 
Extracto de levadura 0,5 g Cloruro de Sodio 20 g Dextrosa 10 g Púrpura de Bromocresol 0,015 g Agar 3 g 
Agua destilada 1 000 ml 
 
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolver el  agar. Ajuste el pH a 7,4 ± 0,2. Coloque en tubos y 
esterilice en autoclave 15 minutos a 121°C.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
Medio Base de Descarboxilasa (Arginina, Lisina y Ornitina) 
FORMULA BASE 
Peptona 5 g 
Extracto de levadura 3 g 
Dextrosa (D-glucosa) 1 g 
Púrpura de Bromocresol 0.02 g 
Agua destilada 1 000 ml 
 
Para caldo de Arginina, Lisina y Ornitina, adicione 5 g de L-aminoácido a 1 litro de base. Como control, 
use base sin suplemento (aminoácido). Para Vibrio s pp halofílicos, adicionar 15 g de Cloruro de Sodio por 
litro. Ajuste el pH de tal manera que después de la esterilización sea de 6,5 ± 0,2. Distribuya en tubos y 
esterilice en autoclave 10 minutos a 121°C. 
Caldo Triptona y Caldos Triptona Sal T1N0,T1N1,T1N3 y T1N6,T1N8 y T1N10 
FORMULA  
Triptona o Tripticasa 10 g 
Cloruro de Sodio 0,10,30,60,80, o 100 g 
Agua destilada 1 000 ml 
 
Disuelva los ingredientes en agua destilada, para T 1N0 no agregue Cloruro de sodio, para T1N1 use 10 g 
de Cloruro desodio (1% w/v concentración de cloruro de sodio); así respectivamente. Para T1N3 usar 30 g  de 
NaCl por litro (3% w/v concentració n de cloruro de sodio) Distribuya en tubos de tapón de rosca de  16 x 150 
mm, tape los tubos. Esterilice en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Ajuste el pH a 7,2 ± 0,2. 
Caldo Soya Tripticasa (TSB) 
FORMULA  
Peptona de Tripticasa (Triptona) 17 g 
Peptona de fitona (Soytona) 3 g 
Cloruro de Sodio 5 g 
Fosfato dipotásico 2,5 g 
Dextrosa 2,5 g 
Agua destilada 1 000 ml 
 
Suspenda los ingredientes en agua destilada y caliente hasta disolución. Distribuya 225 ml en matraces de 
500 ml o tubos. Esterilice en autoclave durante 15 minu tos a 121°C. El pH final debe ser de 7,2 ± 0,2. 
Agar Soya Tripticasa (TSA) 
FORMULA  
Peptona tripticasa (Triptona) 15 g 
Peptona de fitona (Soytona) 5 g 
Cloruro de Sodio 5 g 
Agar 15 g 
Agua destilada 1 000 ml 
 
Suspenda los ingredientes en agua destilada y hierva  durante un minuto hasta disolución del agar. Para 
Vibrio spp  halofílicos, agregar 15 g de Cloruro de Sodio. Dist ribuya dentro de tubos o matraces. Esterilice en 
autoclave durante 15 minutos a 121°C.  Deje solidificar los tubos inclinados o deje enfríar de 45-50°C y 
distribuya en cajas Petri. El pH final debe ser de 7,3 ± 0,2. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Agar de Hierro Kligler (KIA) 
FORMULA  
Peptona polipeptona 20 g Lactosa 20 g Dextrosa 1 g Cloruro de Sodio 5 g Citrato férrico amoniacal 0,5 g Tiosulfato de sodio 0,5 g Rojo de fenol 0,025 g Agar 15,0 g Agua destilada 1 000 ml 
 
Suspender los ingredientes y hervir hasta disolu ción del agar. Distribuir en tubos de tapón de rosca. 
Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Dejar solidificar los tubos inclinados. Ajustar el pH  de 7,4 
± 0,2. 
Agar Arginina Glucosa Inclinado (AGS) FORMULA  
Peptona 5 g Extracto de levadura 3 g Tristona 10 g Cloruro de Sodio 20 g Glucosa 1 g L-Arginina. (hidrocloruro) 5 g Citrato férrico amónico 0,5 g Tiosulfato de Sodio 0,3 g Púrpura de Bromocresol 0,2 g Agar 13,5 g Agua destilada 1 000 ml 
 
Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir ha sta disolución del agar, y distribuir en cantidades 
de 5 ml a tubos de 13 x 100 mm. Ajustar el pH de 6,8 a 7,0. Esterilizar en autoclave de 10 a 12 minutos a 
121°C. Deje solidificar el medio inclinado. 
Agar Triple Azúcar y Hierro (TSI) FORMULA  
Polipeptona 20 g Cloruro de Sodio 5 g Lactosa 10 g Sacarosa 10 g Glucosa 1 g  Sulfato ferroso amónico 0,2 g Tiosulfato de Sodio 0,2 g Rojo de fenol 0,025 g Agar 13 g Agua destilada 1 000 ml 
 
Disolver los ingredientes en agua destilada. Mezclar bien y calentar a ebullició n, agitando ocasionalmente 
hasta completa disolución. Enfríar a 60°C y ajuste el pH de 7,3 ± 0,1.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
Agar de Hierro y Lisina (LIA) 
FORMULA  
Peptona o gelisato 5,0 g Extracto de levadura 3,0 g Glucosa 1,0 g L-Lisina 10,0 g Citrato férrico amónico 0,5 g Tiosulfato de sodio 0,04 g Púrpura de bromocresol 0,02 g Agar 15,0 g Agua destilada 1 000 g 
 Disolver los ingredientes en el agua destilada y me zclar bien; calentar hasta ebullición con agitación 
frecuente hasta conseguir la disolución completa. Esteriliz ar en autoclave 12 minutos a 121°C. Enfríar de  50-
60°C y ajustar el pH de 6,7 ± 0,1. Distribuir en vo lúmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm. Los tubos se 
enfrían en posición inclinada, de tal modo que se obteng an columnas de medio de 3 cm y una parte inclinada 
de 2 cm. 
Caldo Rojo de Metilo y Vogues Proskauer(RM-VP) FORMULA  
Peptona 7 g Glucosa 5 g Fosfato dipotásico 5 g Agua destilada 1 000 ml 
 Disolver los ingredientes en 800 ml de agua tibia. Para Vibrio spp  halofílicos, agregar 15 g más de Cloruro 
de Sodio (para una concentración final del 2%). Filtrar, enfríar a 20°C y diluir a 1 litro. Distribuya en tubos. 
Esterilizar en autoclaves durante 12 - 15 minuto s a 121°C. Ajustar el pH de 6,9 ± 0,2. 
Medio para prue ba de movilidad (Semisólida) 
FORMULA  
Peptona 10 g Extracto de carne 3 g Cloruro de Sodio 5 g Agar 4 g Agua destilada 1 000 ml 
 Calentar con agitación y hervir de 1 a 2 minutos hasta disolución del agar. Para Vibrio spp  halofílicos 
agregar 15 g más de Cloruro de Sodio (para una concent ración final del 2%). Distribuir en tubos con tapón de 
rosca. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121°C. Ajustar el pH de 7,4 ± 0,2. 
B.19.1.2  Soluciones y reactivos 
Prueba de Rojo de Metilo. Reactivo. Fórmula 
Rojo de metilo 0,1 g Alcohol etílico 300 ml Agua destilada 200 ml 
 Disolver el Rojo de Metilo en el alcohol y diluir con el  agua destilada, para llevar a cabo la prueba, añadir 5 
gotas de la solución a 5 ml del cultivo problema. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Resultados: Un color rojo demuestra un pH menor a 4,5 y la prueba es Positiva. Un color amarillo se 
reporta como prueba Negativa. 
Prueba de Vogues-Proskauer. 
Esta prueba es para comprobar la presencia del Diacetilo. Reactivo. Fórmula 
Alfa Naftol 5 g 
Alcohol Etílico absoluto 100 ml 
 
Añadir 0,6 ml de la solución de Alfa Naftol y 0,2 ml de una solución acuosa al 40% de KOH a 1 ml de 
cultivo. 
Resultados: El desarrollo de una coloración roja en 15 minutos constituye una reacción POSITIVA. 
Prueba de Oxidasa. 
Reactivo FORMULA  
N,N,N,N-Tetrametil-p-Fenilendiamino 0,5 g 
Agua destilada 100 ml 
 
Conservar en frasco oscuro a 5-10°C. El reactivo se conserva durante 14 días. Sembrar en un tubo de 
base de gelosa para sangre. Incubar 18 horas a 35°C. Agregar 0,3 ml de reactivo. 
Resultado: La reacción positiva se observa por la producción de un color azul en un minuto. 
Reacción de Indol. 
REACTIVO DE KOVAC FORMULA  
p-dimetilaminobenzaldehído 5.0 g 
Alcohol amílico.o alcohol isoamílico 750 ml Acido clorhídrico concentrado 25 ml 
 
Disolver el p-dimetilaminobenzaldehído en el alcohol amílico y agregar el ácido clorhídrico lentamente, 
gota a gota y agitando. Debe conservarse en frasco ámba r con tapón esmerilado; el color del reactivo va del 
amarillo al café claro. Se debe conservar a 4°C. 
B.19.1.3 Procedimiento: Sembrar un tubo con 5 ml de caldo triptona. Incubar 48 horas a 35°C. Agregar de 0,2 a 0,3 ml del reactivo. 
El desarrollo de un color intenso, constituye una prueba Positiva para indol. 
B.19.1.4  Toma de muestra 
La toma de muestra para análisis microbiológicos,  se deberá hacer en condiciones asépticas y en 
recipientes estériles. 
B.19.1.4.1  Preparación de la muestra 
Las muestras de moluscos bivalvos deberán analizarse en su composición básica de líquido y carne. Para 
moluscos bivalvos desconchar de 10 a 12 piezas grandes, incluir el líquido. Verter 50 g en 450 ml de agua 
peptonada alcalina (APW), licúe para homogeneizar durante 2 minutos a alta velocidad. Esta es la dilución 1:10. Colocar 250 g de esta dilución en un segundo reci piente estéril. Preparar dos series de diluciones 1:100 
y 1:1000. En este momento deberá tener dos series de tr es diluciones. Incubar una serie a 35-37°C y la otra a 
42°C. 
B.19.1.4.1.1  Resembrar 
Después de la incubación, y sin agitar, transferir el inóculo de la película (crecimiento superficial) con un 
asa de 3-5 mm de diámetro a una placa por lo menos, de cada uno de los medios de cultivo selectivos: Agar 
con tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa (TC BS) o al agar modificado con celobiosa, polimixina B y 
colistina (mCPC), la polimixina inhibe al biotipo Clásico de V. cholerae . Incubar el agar TCBS durante 18 a 24 
horas de 35-37°C y el agar mCPC durante 18 a 24 horas de 39-40°C.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.19.1.4.2  Morfología colonial. 
Examinar las placas a fin de determinar si se present an las características coloni ales que a continuación 
se describen, seleccionar por lo menos 3 colonias sospechosas de cada placa y aplicarlas con estria cruzada para aislar en agar T
1N1 o en agar soya tripticasa con sal (al 2% de concentración de NaCl) e incubar durante 
12-18 horas a 35-37°C. Es necesario hacer un cultivo en  un medio no selectivo a fin de garantizar la pureza 
de las colonias, antes de las pruebas bioquímicas, se pu ede inocular a los agares gelatina (GA) y gelatina sal 
(GS) en el segundo día. Los resultados  serán confiables si las placas de  aislamiento muestran colonias puras. 
a.- Agar TCBS.  Las colonias de V. cholerae  (El Tor y Clásico) son grandes, lisas, amarillas (positivas para 
la fermentación de la sacarosa) y ligeramente achata das, con el centro opaco y los bordes translúcidos. 
Nota: Las especies de Vibrio  no producen colonias pequeñas de color crema en agar TCBS. Las colonias 
de V. mimicus , que están estrechamente relacionadas con la especie anterior, son verdes (sacarosa 
negativas). La mayoría de las demás especies de Vibrio  crecen en agar TCBS y producen colonias amarillas y 
verdes. 
b.- Agar mCPC.  Las colonias de V. cholerae  El Tor son púrpuras (negativas para la fermentación de la 
celobiosa). El V. vulnificus  produce colonias amarillas achata das, con el centro opaco y los bordes 
translúcidos. La mayoría de las demás especies de Vibrio  no crecen fácilmente en agar mCPC. 
B.19.1.4.3  Diferenciación. 
Diferenciación de los vibrios sospechosos de los microorganismos que no son vibrios. 
a.- TSI, KIA y agar inclinado de Arginina y Glucosa (AGS ). Inocular las colonias individuales en medios de 
cultivo TSI (Agar de Triple Azúcar y Hierro), KIA (Agar de Hierro Kliger) y AGS, picar y estriar en el agar 
inclinado. Incubar los tubos inoculados, con el tapón no muy apretado, durante 18 a 24 horas de 35-37°C. Se recomiendan estos medios porque las reacciones permi ten efectuar una diferencia ción presuntiva entre la 
mayoría de las especies de Vibrio , Aeromonas , Plesiomonas,  Shigella  y otras bacterias. 
b.- Caldo triptona al 3% de NaCl (T
1N3). Inocular las colonias en los caldos T1N0 y T1N3 e incubar durante 
18 a 24 horas de 35-37°C. El V. cholerae  y el V. mimicus  crecerán en T1N0 y T1N3. Algunas especies de 
bacterias que no son vibrios y que presentan reacciones similares a las de V. cholerae  en medios de TSI y LIA 
no crecen en T1N3. La mayoría de las especies Vibrio  spp, incluyen algunos V. cholerae  No. 01, crecerán en 
T1N3 unicamente de la familia Vibrionaceae crece solamente en T1N3. 
Una alternativa consiste en usar agar gelatina (GA)  y agar gelatina con 3% de NaCl (GS) para determinar 
la tolerancia de los cultivos puros a la sal. Dividir las placas en ocho sectores, inocular una línea recta en el 
centro de un sector de las placas, tanto de GA como de GS con cada cultivo puro. Incubar durante 18 a 24 
horas de 35-37°C. El V. cholerae  y el V. mimicus  crecerán. El Vibrio spp  halofílico crecerá en ambas placas, 
porque ellos no requieren de sal. Sólo en la placa con GS. Para leer la reacción de la gelatinasa sostener la 
placa sobre una superficie negra, observará un halo opaco alrededor de la colonia de los microorganismos 
gelatinasa positivos. 
c.- Caldo glucosa de Hugh-Leifson. 
Inocular colonias individuales en tubos duplicados con caldo de glucosa de Hugh-Leifson. Recubrir un tubo 
con una capa de aceite mineral estéril o vapor líqui do (50% de petrolato y 50% de parafina) unos dos 
centímetros de grueso. Incubar ambos tubos dur ante 18 a 24 horas de 35-37°C. Las especies de Vibrio spp  
utilizan la glucosa tanto para la oxidación como para la fermentación. Las especies de Pseudomonas, que 
comúnmente se aíslan del pescado y los mariscos co n métodos de enriquecimiento que se usan para las 
especies de Vibrio , utilizan la glucosa sólo para la oxidación. 
d.- Prueba de oxidasa. 
Realizar la prueba de oxidasa con cultivos puros de agar soya tripticasa (2% de NaCl) u otro medio que no 
contenga carbohidratos fermentables. Un método fácil consiste en colocar un círculo de papel filtro en una 
caja de Petri y humedecerlo con algunas gotas de reac tivo de oxidasa. Con un palito aplicador de madera, un 
mondadientes o una asa de platino estéril, sacar un poco de  cultivo de la placa y tocar el papel humedecido, si 
hay microorganismos oxidasa positivos, el papel se to rnará púrpura oscura o azul en pocos segundos. Las 
especies patógenas de Vibrio  son oxidasa positivas (excepto el V. metschnnikovii ). 
B.19.2  Identificación y Confirmación de V. cholerae  01, V.cholerae  NO 01 y V. mimicus . 
a.- Leer los resultados de las prueba bioquímicas de TSI, KIA, AGS, T1N0 y T1N3 o GA y GS, y caldo 
glucosa de Hugh-Leifson. 
b.- Hacer una tinción de Gram a un cultivo de 18 a 24 horas en caldo o agar. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Nota: Los cultivos puros que se someterán a las demás  pruebas serológicas y bioquímicas para el  V. 
cholerae  son sacarosa positivos (amarillo) en agar TCBS y sacarosa negativos (verdes) en el caso de V. 
mimicus  o son celobiosa negativos (verde-púrpura) en agar mCPC, crecen en caldo T1N0 o en placas con GA; 
presentan reacciones características en TSI, KIA y AGS.  Son gelatina y oxidasa positivos, son bacilos curvos 
gram negativos y producen ácido a partir de la glucosa,  tanto en la oxidación como en la fermentación, en el 
caldo de cultivo de Hugh-Leifson. 
c.- Pruebas bioquímicas. Las reacciones bioquímicas para identificación de V. cholerae  y otras especies bacterianas afines figuran 
en el cuadro anexo. La fórmula para todos los medios bioquímicos deberá contener por lo menos un 2% de NaCl. En vez de medios convencionales se pueden usar tiras AP120E, con 2% de NaC1 como diluyente. Para 
el V. cholerae  se puede usar solución salina fisiológica (0,85% de NaC1) como diluyente. 
d.- Prueba serológica de aglutinación. 
Usar antisuero de diagnóstico del grupo 01 y del subgrupo Inaba (factores AC) y Ogawa (Factores AB) 
para el antígeno del serotipo 01. Usar cultivos de 16 a 24 horas producidos en TSA. Incluir cultivos positivos y 
negativos, y los controles salinos para cada antisuero us ado. Seguir las instrucciones del antisuero. Como es 
posible que los antígenos de los antisueros estén relacionados entre sí, hay que realizar pruebas bioquímicas 
para confirmar que el cultivo puro sea de V. cholerae  01 o No. 01. 
Nota: Anticuerpos monoclonales están disponibles, pero el anti-B y anti-C r eaccionan opuestamente con 
bacterias de otras especies. Uso de anticuerpos policlonales y/o monoclonales será para el antígeno del 
complejo 01 
1.- Los cultivos que aglutinan con el antisuero del grupo 01, pero no en solución salina fisiológica simple, 
son de V. cholerae  del grupo 01 si las reacciones bioquímicas confirman que el cultivo puro es de V. cholerae . 
Los cultivos que se aglutinan con este antisuero para  grupos específicos pueden ser clasificados según el 
subtipo con anticuerpos Inaba y Ogawa. 
 Los cultivos que aglutinan con el suero polivalent e (grupo 01) y con los antisueros Inaba y Ogawa, 
tienen los 3 factores (A, B y C) y son del serotipo Hikojima. 
 Los cultivos que aglutinan con el antisuero poliv alente pero no aglutinan con antisueros Inaba y 
Ogawa, no se pueden tipificar con estos antisueros. 
2.- Los cultivos de V. cholerae  cuya identidad se haya confirmado con métodos bioquímicos y que no 
aglutinen con el antisuero del grupo 01 son V. cholerae  0:1. El suero para la clasificación de V. cholerae  No 
0:1 según el tipo se puede obtener de R.J. Siebeling. 
3.- Los cultivos que se aglutinan en el antisuero del grupo 01 y en solución salina, no se pueden clasificar 
según el tipo. Sin embargo, si se usa un medio más ri co, como en TSA o agar infusión cerebro corazón (BHI), 
se puede eliminar esta autoaglutinación. 
e. Características mínimas para la identificación de V. cholerae . 
Las características que permiten suponer la presencia de V. cholerae  como mínimo son las siguientes: 
1.- Morfología. 
Bacilo o bacilo encorvado, es porogénico y gram negativo. 
2.- Aspecto en TSI. Estria ácido, picadura ácido, gas negativo y H
2S negativo. 
3.- Prueba de Hugh-Leifson. 
Fermentación de la glucosa y oxidación positiva. 4.- Citocromo-oxidasa positivo. 
5.- Prueba de la Dihidrolasa arginina: negativo. 
6.- Prueba de la Lisinadescarboxilasa: positivo. 7.- Prueba de VP: Positivo El Tor, negativo Clásico y V. mimicus . 
8.- Crecimiento a 42°C: positivo. 
9.- Prueba de halofilia con NaCl. 0% : positivo, 3% : positivo, 6%: usual mente negativo. Algunas cepas de 
V. cholerae  NO 01 se desarrollan a 0% de NaCl. 
10.- Fermentación de la sacarosa: positivo para V. cholerae  (negativo para V. mimicus ). 
11.- Prueba de ONPG: positivo. 
12.- Fermentación de la  arabinosa: negativo. 
13.- 0/129 sensitiva: sensib le para 10 y 150 µg 0/129       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
REACCIONES DE ALGUNOS Vibrio  EN AGAR KIA, TSI Y AGS. 
MICROORGANISMOS KIA 
ESTRIA PICADURA TSI 
ESTRIA PICADURA AGS 
ESTRIA PICADURA 
V. cholerae K A A(K)* A K a 
V. mimicus K A K(A)* A K A 
V .parahemolyticus K A K A K A 
V. alginolyticus K A A A K A 
V. vulnificus K o A A K(A)* A K A 
V. hidrophyla K o A A K o A A K K 
V. shigelloides K o A A K o A A N N 
* = Raramente 
K = Alcalino A = Acido 
a = Ligeramente ácido 
N = Neutro 
Ninguna de las especies de Vibrio  enumeradas produce sulfuro de hidrógeno en medios KIA, TSI o AGS, 
ni una cantidad perceptible de gas a partir de glucos a en medios KIA, TSI o AG S. Algunas especies de 
Aeromonas  pueden producir gas a partir de glucosa en estos medios. 
B.20. DETERMINACION DE CLOSTRIDIUM BOTULINUM  Y SUS TOXINAS EN ALIMENTOS Y 
MUESTRAS CLINICAS 
B.20.1  Fundamento 
Demostrar la presencia de toxina botulínica por inyecci ón a ratones con extractos de alimentos o muestras 
clínicas y observar el efecto letal. Comprobar con el antisuero específico la neutralización de la toxina. La 
determinación de C botulinum  se basa en el cultivo de muestras de alimentos y clínicas en condiciones de 
anaerobiosis en medios específicos y la subsecuente demostración de la toxina. 
B.20.2 Toma y manejo de muestras 
B.20.2.1  Alimentos 
Las muestras pueden tomarse de sobrantes de los alimentos sospechosos o de recipientes cerrados. 
Cuando están involucrados alimentos comerciales, es  importante observar la etiqueta, número de lote del 
fabricante, o cualquier dato relevante que p ueda identificar el origen de la muestra. 
B.20.2.2  Clínicas 
Las muestras clínicas para el análisis incluyen: mate ria fecal, aproximadamente 10 g, contenido gástrico 
(ajustar aproximadamente a pH 6 con hidróxido de sodi o 0,1) y suero (colectado de 20 ml de sangre ANTES 
DE ADMINISTRAR LA ANTITOXINA). C uando se sospecha de botulismo inf antil es importante analizar las 
heces. Si fuera necesario, las manchas o partes sólidas de los pañales. 
B.20.3 Envío de muestras 
B.20.3.1  Para un envío seguro, el interior de los empaques deben contener: 
(I) Un primer recipiente impermeable al agua. 
(II) Un segundo recipiente impermeable al agua. 
(III) Material absorbente (por ejemplo unicel) entre los dos contenedores, suficiente para 
absorber el contenido entero del primer recipiente. 
B.20.3.2  De preferencia enviar el material en refrigeración en paquetes que contengan recipientes con gel 
congelado. Para una máxima preservación de la toxi na el recipiente secundario debe empacarse en una caja 
de unicel con recipientes de gel congelado. Sin embargo,  si se sospecha retraso en el envío, el material debe 
congelarse y empacarse con hielo seco. 
B.20.4 Material y equipo 
 0,1 N NaOH o NaHCO3 saturado para limpiar posibles derrames. 
 Flujo laminar 
 Propipeta o bulbo Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
 Lentes de seguridad 
 Guantes de cirujano 
 Tubos de centrífuga de 40 ml de capacidad 
 Centrífuga refrigerada con capacidad de 15 000 x g 
 Jeringas desechables de 19 x 15. 
 Filtros desechables de 0,45 m. 
 Vortex 
 Licuadora 
 Solución de tetraciclina al 0,2% 
 Potenciómetro 
 Incubadora 30º, 35ºC 
 Balanza 
 Equipo para tinción de Gram 
 Tubos de ensayo de 13 x 100 mm 
 Antisuero monovalente A, B, E y F 
 Antisuero trivalente ABE 
 Jeringas para tuberculina 
 Ratones de preferencia hembras de 20 a 30 g cepa CFI o NIH 
 Solución reguladora de fosfatos con gelatina 
 Tripsina al 1% p/v 
 Tripsina al 1,4% 
 Medio carne cocida (CMM) 
 Caldo tripticasa peptona glucosa extracto de levadura (TPGY). 
 Caldo tripticasa peptona glucosa extracto de levadura (TPGYT) con tripsina 
 Agar aislamiento Clostridium  botulinum  (CBI) 
 Agar hígado de ternera yema de huevo 
 Agar esporulación de Eklund 
 Baño de agua (75-100ºC) 
 Etanol al 50% o absoluto 
 Jarras y sistema de anaerobiosis 
B.20.5 Preparación de medios de cultivo B.20.5.1 Medio de la carne cocida (CMM). 
FORMULA 
Corazón de res 454 g Proteosa peptona  20 g 
Bactodextrosa 2 g 
Cloruro de sodio  5 g Extracto de corazón de res 1000 ml 
 
Picar el corazón de res, sumergir en agua y calentar ha sta ebullición durante 1 h. Enfriar, ajustar el pH a 
7,0, y hervir 10 minutos. Filtrar a tr avés de muselina y presionar para drenar el exceso de líquido de la carne. 
Guardar la carne cocida. Agregar los ingredientes al filtrado y ajustar a pH 7,0,  agregar agua hasta hacer  
1000 ml. Filtrar a través de papel filtro poroso. Se puede conservar el caldo y la carne en congelación por separado. Agregar el corazón cocido y picado a tubos de ensaye de 18 x 150 mm o 20 x 150 mm a una altura 
de 1,2 a 2,5 cm del tubo y adicionar de 10 a 12 ml del cal do. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121ºC. Si 
este medio se almacena por más de 12 h después de su preparación, debe calentarse a ebullición por 10 
minutos y enfriar antes de su uso.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.20.5.2 Caldo tripticasa peptona gluc osa extracto de levadura (TPGY). 
FORMULA  
Tripticasa  50 g 
Peptona  5 g 
Glucosa  4 g Extracto de levadura  20 g Tioglicolato de sodio  1 g Agua destilada  1000 ml 
 
Disolver los ingredientes en agua cali ente, enfriar y ajustar a pH 7,2. Distribuir en volúmenes de 2 ml en 
tubos de 20 x 150 mm con tapón de rosca. Esterilizar por v apor fluente, enfriar a la temperatura y almacenar a 
4ºC hasta 6 semanas. Si se almacena más de 12 h tratarlo s con calor como se indica en 4.5.1. Agregar 1,5 ml 
de solución de tripsina al 1,4% por cada tubo con 21 ml del medio TPGY. Mezclar muy suavemente. Este 
medio no se puede almacenar. 
B.20.5.3  Caldo tripticasa peptona glucosa extracto de levadura adicionado con tripsina (TPGYT). 
FORMULA  
Tripticasa  50 g Peptona  5 g Glucosa 4 g Extracto de levadura 20 g Tioglicolato de sodio 1 g 
Agua destilada 1000 ml 
 Disolver los ingredientes en agua cali ente, enfriar y ajustar a pH 7,2. Distribuir en volúmenes de 2 ml en 
tubos de 20 x 150 mm con tapón de rosca. Esterilizar por v apor fluente, enfriar a la temperatura y almacenar a 
4ºC hasta 6 semanas. Si se almacena más de 12 h tratarlo s con calor como se indica en B.5.5.1. Agregar  1,5 
ml de solución de tripsina al 1,4% por cada tubo con 21 ml del medio TPGY. Mezclar muy suavemente. Este medio no se puede almacenar. 
B.20.5.4  Agar hígado de ternera yema de huevo. 
a) Agar hígado de ternera. 
FORMULA  
Infusión de hígado 50 g Infusión de ternera 500 g 
Proteosa peptona  20 g 
Neopeptona  1,3 g Triptona 1,3 g Dextrosa 5,0 g Almidón soluble 10,0 g Caseína isoeléctrica 2,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Nitrato de sodio 2,0 g Gelatina 20,0 g Agar  15,0 g Agua destilada  1000 ml 
 
Calentar con agitación constante hasta dilución comple ta. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a  121ºC, 
pH final 7,3 + 0,2. Agregar por cada 500 ml del medio base fundido 40 ml de la suspensión salina de yema de 
huevo. Mezclar y vaciar a cajas de Petri estériles de 15 x 100 mm (aproximadamente 15 - 20 ml). Secar las 
placas a temperatura del laboratorio por 2 días o a 35ºC por 24 horas. Verificar esterilidad de las placas. 
Almacenar en refrigeración. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
b) Emulsión al 50% de yema de huevo. 
Lavar los huevos con un cepillo suave y dejar escurrir. Sumergirlos por 1 hora en solución de cloruro 
mercúrico al 0,1%, escurrir. Sumergir  en una solución de etanol al 70% y dejar durante 30 minutos, escurrir. 
Abrir los huevos en condiciones asépticas y descartar las claras. Colocar las yemas en un recipiente estéril y 
mezclar con igual volumen de solución salina fisiológica (0,85%) estéril. Guardar en refrigeración hasta su 
uso. 
B.20.5.5  Agar para asilamiento de C. botulinum  (CBI). 
El agar CBI es una modificación del medio agar McClung Toabe para el aislamiento selectivo y diferencial 
de C. botulinum , el cual puede aislarse de los cultivos toxi génicos de CMM, provenientes de muestras de 
heces, líquido gástrico o alimentos. El medi o de agar CBI contiene: Cicloserina 250  g/ml, sulfametoxazol 76 
 g/ml y trimetroprim 4  g/ml en la base del medio agar McClung Toabe yema de huevo. 
Agar McClung Toabe 
FORMULA  
Proteosa peptona  40 g 
Bacto dextrosa  2 g Fosfato de sodio dibásico  1 g 
Fosfato de potasio monobásico  1 g 
Cloruro de sodio  2 g Sufato de magnesio  0,1 g 
Agar  25 g 
Agua destilada  1000 ml pH final 7,6 0,2 a 25ºC 
Extracto de levadura  5 g 
Suspensión de yema de huevo  100 ml 
 
SOLUCION DE ANTIBIOTICOS 
 Cicloserina 250 mg o 25 ml de una solución al 0,1% 
 Sufametoxasol 76 mg o 4 ml de una solución al 1,9%. Disolver el sulfametoxazol en solución 2 N de 
NaOH. 
 Lactato deTrimetroprim 4 mg o 4 ml de una solución al 0,1% por cada 100 ml de medio base. 
Esterilizar por filtración. 
Preparación: Agregar el extracto de levadura y los ingredientes del agar McClug Toabe a un matraz de 2 
L con 900 ml de agua destilada, mezclar y calentar hasta disolución. Ajustar a pH 7,5. Esterilizar 15 minutos a 
121ºC en autoclave. Enfriar a 55ºC en baño de agua y en condiciones asépticas agregar 100 ml de la 
suspensión al 50% de yema de huevo. Agregar los volú menes necesarios para conservar la concentración de 
antibióticos por litro de medio base. Mezclar y dist ribuir en cajas de Petri estériles de 15 x 100 mm 
aproximadamente 15-20 ml por placa. Dejar solidificar y colocar en bolsas de plástico. Guardar en 
refrigeración hasta su uso. Estas placas pu eden almacenarse hasta 1 mes aproximadamente. 
B.20.5.6  Agar para esporulación de Eklund.  
FORMULA  
Tripticasa  4 g 
Peptona  1 g 
Glucosa  0,1 g Extracto de levadura  1 g 
Agar  4 g 
Agua destilada  200 ml 
 
Disolver los ingredientes en agua calient e, excepto el agar, ajustar a pH 7,8, agregar el agar. Esterilizar 
por vapor y enfriar a 50ºC. Agregar 2 ml de solución al 10% de clorhidrato de cisteína, esterilizada por 
filtración; 12 ml de emulsión de yema de huevo y 2 ml  de sangre citratada de bovino o borrego. Preparar las 
placas. Este medio es particularmente adecuado para la esporulación de C. botulinum  del grupo II.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.20.6  Diluyentes y reactivos 
B.20.6.1  Solución amortiguadora de fosfatos con gelatina  
FORMULA 
Gelatina  2 g Na2HPO4  4 g 
Agua destilada  1000 ml 
 Ajustar a pH 6,2 con solución de ácido clorhídrico 4N . Distribuir en frascos con tapón de rosca, esterilizar 
por vapor, enfriar a la temperat ura ambiente y almacenar a 4ºC. 
B.20.6.2  Solución de tetraciclina al 0,2%. 
Disolver 50 mg en 25 ml del diluyente fosfato de gela tina, mantener a 4ºC hasta 4 días. Si se requiere 
almacenar por más tiempo, congelar en pequeñas porciones. Evitar la recongelación. 
B.20.6.3  Solución de tripsina (1:250). 
a) Solución al 1% 
Disolver 200 mg en 20 ml de agua destilada. No almacenar. 
b) Solución al 1,4%. 
Disolver 280 mg en 20 ml del diluyente fosfato de gela tina, filtrar a través de membrana de 0,45 m. Usar 
vacío para obtener efecto parcial  de deareación del filtrado. 
B.20.6.4  Antisueros 
A, B, E; A, B; A, B, E, C*, D*, F. 
Investigación de sospecha de botulismo en animales. 
B.20.7  Procedimiento 
B.20.7.1  Examen microscópico de los alimentos sospechosos 
Este examen no es esencial para la detección de C. botulinum , pero facilita la selección de los alimentos 
sospechosos para el análisis. Preparar frotis directos y hacer tinción de Gram. Si el alimento contiene exceso 
de grasa, sumergir los portaobjetos fijados al calor por 1-2 minutos en xilol antes de teñir. 
B.20.7.2  Preparación del material para el análisis de las toxinas. 
B.20.7.2.1  Alimentos líquidos 
Centrifugar aproximadamente 20 ml a 15000 x g dur ante 20 minutos. Decantar cuidadosamente el 
sobrenadante o extraer con una jeringa desechable de 19  x 25 mm. Cubrir el tubo y conservar a 4ºC para 
hacer el cultivo del sedimento posterior mente. Repetir la centrifugación, si  el sobrenadante aún no está claro. 
Esterilizar el sobrenadante por filtra ción a través de la membrana de 0,45  m adaptada a una jeringa 
desechable. Ocasionalmente puede requer irse una prefiltración durante el pr oceso de filtración. El propósito 
de la esterilización es prevenir una infección y a su vez una muerte inespecífica de los ratones inoculados. 
B.20.7.2.2 Alimentos semilíquidos 
Colocar 10-15 g en tubos de centrífuga de 40 ml, agregar igual volumen de solución reguladora de fosfatos 
con gelatina y homogenizar en vortex. 
Centrifugar y proceder  como en B.20.7.2.1. 
B.20.7.2.3  Alimentos sólidos 
Colocar 10-20 g en un vaso de licuadora o mortero. Ag regar suficiente solución reguladora de fosfatos con 
gelatina para obtener cuando menos 10 ml de sobren adante después de la centrifugación. La dilución del 
alimento deberá estar entre 1:1 a 1:3.  Licuar a velocidad alta por 1-2 minutos. Los vasos de licuadora deberán 
cerrarse herméticamente para prevenir la formación de aer osoles. Centrifugar y proceder como en B.20.7.2.1, 
B.20.7.2.2 y B.20.7.2.3. 
B.20.7.2.4 Alimentos enlatados 
Lavar y secar la superficie de la lata. Cubrir la ta pa con etanol al 96%, dejar  por 2 minutos; decantar y 
flamear el alcohol residual. Colocar la lata en una bolsa de plástico para prevenir la dispersión de aerosoles y 
abrir con un abrelatas estéril. Proceder co mo en B.20.7.2.1, B.20. 7.2.2 y B.20.7.2.3. 
B.20.7.2.5  Suero 
Idealmente debe obtenerse 10 ml de suero. El suero usado sirve sólo  antes del tratamiento con el 
antisuero. Si está turbio, centrifugar a 15,000 x g durante 20 minutos, dec antar el sobrenadante. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
B.20.7.2.6 Heces 
Colocar 10 g en un tubo de centrífuga de 40 ml de ca pacidad, agregar suficiente cantidad de solución 
reguladora de fosfatos con gelatina para obtener  al menos 10 ml de sobrenadante después de la 
centrifugación. Mezclar en vortex durante 2-3 minutos. Conservar la mezcla a 4ºC por 2 h. Homogeneizar en 
vortex. Centrifugar y proceder como en 19.7.2.1. Las m uestras líquidas, enemas y el contenido intestinal se 
pueden centrifugar directamente con poco o sin la adició n de la solución reguladora de fosfatos con gelatina. 
Ocasionalmente, los sobrenadantes de muestras clínicas no  se pueden filtrar, en estos casos, agregar 1 ml de 
una solución al 0,2% de tetraciclina por cada 9 ml del sobrenadante. 
B.20.7.2.7  Contenido gástrico 
Medir el pH y ajustar, si es necesario, a 5,5-6,5 con una solución 1N de NaOH. Evitar que el valor de pH 
sea mayor a 7,0. Centrifugar y proceder como en B.19.7.2.1. 
B.20.7.2.8  Otras muestras clínicas. 
Tratar las muestras semilíquidas y só lidas como en B.20.7.2.2 y B.20.7.2.3 
B.20.8  Análisis de las toxinas 
B.20.8.1  Procedimiento general (se aplica cuando no se  sospecha de alguna toxina en particular). 
B.20.8.1.1  Si se dispone de suficiente material, distribuir el filtrado en volúmenes de 1,2 ml dentro de 6 
tubos de ensaye de 13 x 100 mm, marcados del 1-6.  A los tubos marcados 2-5, agregar 0,12 ml de los 
siguientes antisueros: monovalente A, B o E y trivalente  ABE. Mezclar en vortex y dejar reposar a temperatura 
ambiente por 45 minutos. 
B.20.8.1.2  Al tubo 6, agregar 0,12 ml de una solución de tripsina al 1%. Incubar a 35ºC por 60 minutos.  El 
tubo 1 no se adiciona. Ver tabla No. 2. 
B.20.8.1.3  Si el volumen de material es insuficiente para co mpletar la prueba, se puede omitir el tubo  No. 
6. 
B.20.8.1.4  Inyectar dos ratones (20-30 g) intraperitonealmente por tubo, con los volúmenes siguientes:  0,5 
ml del tubo 1,0 y 0,55 ml de los tubos 2-6. Observar a los ratones por 72 h. Los sí ntomas típicos de botulismo 
son: pelo erizado, estrechamiento de cintura, dificultad para respirar, parálisis de los miembros posteriores y 
parálisis general antes de la muerte. Si estos sínt omas se presentan después de 72 h, observar a los 
animales por otras 24 h hasta completar un total de 4 días. 
B.20.8.1.5 Si mueren 1 o 2 ratones repetir la inyección. Una muestra se considera positiva para la toxina si 
2/2 o ? o = 2/4 ratones mueren, si se presenta la muer te de los animales dentro de las 2 primeras horas se 
pueden considerar que son debidas a otras causas diferentes a toxina botulínica. 
B.20.8.1.6  Si solamente mueren los ratones inoculados con las muestras tratadas con tripsina, indica la 
presencia de toxina de grupo II y continuar como se indica en el punto B.19.8.3. 
B.20.8.1.7  Si no se neutralizara la toxina con los antisueros A, B y E, indica 
a) la presencia de toxinas no relacionadas en es pecial cuando se presentan síntomas atípicos; 
b) Cantidad insuficiente de antisuero en presencia de altos niveles de toxina (difícil en caso de muestras 
clínicas y en la mayoría de los alimentos tóxicos; o 
c) incluido un serotipo no común. Si la muestra probada produce síntomas típicos de botulismo y sin 
embargo no es neutralizada con los antisueros, proceder de la forma siguiente: 
I) En casos de muy alta toxicidad, diluir la m uestra 1:10 con solución amortiguadora de fosfatos 
gelatina y repetir la prueba de neutralización. 
II) Incluir el antisuero F en la prueba de neutralización. 
B.20.8.2  Muestras sospechosas de contener toxina grupo V (A o B). 
Proceder como se indica en 4.8.1 omitiendo el tubo No. 6. B.20.8.3 Muestras sospechosas de contener toxina grupo II (B o E). 
Distribuir en cada uno de los tubos marcados del 1 al 4,  1,2 ml del filtrado. A cada tubo agregar 0,12 ml de 
una solución de tripsina al 1%, incubar a 35ºC por 60 mi nutos. A los tubos marcados del 2 al 4 agregar 0,12 ml 
de uno de los siguientes antisueros monovalente B o E y trivalente A, B y E. Mezclar y continuar como se 
indica en 4.8.1 Inyectar 0,5 ml del tubo No. 1 y 0,6 ml de los tubos 2 al 4. 
Si no hubiese material disponible suficiente, omitir  los tubos con los antisueros monovalentes B y E. 
B.20.8.4  Determinación de la dosis letal en ratón (DLR) 
Si se quiere titular la toxina, hacer diluciones decim ales de los sobrenadantes tratados, y no tratados con 
tripsina, generalmente se hacen hasta 1:1000 dependiendo del nivel de toxina esperado, pero nunca 
excediendo 1:10000. Inyectar 2 ratones por dilución. La recíproca de la dilución más alta que causa la muerte 
multiplicada por 2, es la DLR. Ejemplo: si la muerte ocurre a una dilución de 1:100 pero no de 1:1000, el nivel 
de toxina es de 200 a 2000 DLR por ml.        (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.20.9  Identificación de Clostridium  botulinum . 
B.20.9.1  Quitar el exceso de aire disuelto en los tubos preparados con medio caldo carne cocida (CMM) y 
caldo glucosa peptona tripticasa extracto de levadur a (TPGY), mediante calentamiento en baño de agua a 
ebullición por 10 minutos y enfriar antes de usarlos. Asegur arse de que las tapas de los tubos estén flojas al 
hacer este proceso. 
B.20.9.2  Agregar a los tubos de TPGY 1,5 ml de una solución de tripsina al 1,4% y mezclar suavemente y 
marcar con una T (TPGYT). A los tubos de CMM marcar los con 1 y 2; y 3 y 4 a los tubos con TPGYT.  Ver 
tabla No. 3. 
B.20.9.3 Cualquier tipo de muestra incluyendo los sedimentos, pueden servir como inóculo; éstos además 
tienen la ventaja de que no contienen inhibidores potenciales, los cuales se han eliminado junto con el sobrenadante, de aquí que los sedimentos pueden c ontener grandes cantidades de microorganismos por 
unidad de volumen.  
B.20.9.4  Colocar aproximadamente 1 g de inóculo a cada uno de los tubos 1 a 3, calentar el tubo No. 2 en 
baño de agua a 75ºC por 20 minutos para seleccionar esporas resistentes al calor. 
B.20.9.5  Para seleccionar esporas sensibles o resisten tes al calor, suspender aproximadamente 1 g del 
inóculo en un volumen de 10 a 20 ml de solución de etanol al 50%, o mezclar el inóculo, cuando la muestra es 
líquida 1:1 con etanol absoluto o de 96%. Mantener las suspensiones o mezclas a temperatura ambiente por 
60 minutos, centrifugar a 14000 x g durante 15 mi nutos, y pasar el sedimento al tubo No. 4. 
B.20.9.6  Incubar los tubos a 35ºC por 24 horas y a 30ºC por 4 días. Centrifugar aproximadamente 10 ml 
de cultivo a 15000 x g durante 20 minutos. Esterilizar el sobrenadante por filtración a través de membranas de 
0,45  m, con ayuda de una jeringa desechable. Diluir el filtrado 1:5 con solución amortiguadora de fosfatos 
con gelatina. Continuar como se indica en B.17.6.1 para el ensayo de toxina pero omitiendo el tubo No. 6. 
B.20.9.7  Si fuera necesario neutralizar con antisuero tipo F,  el cual es relativamente débil, determinar la 
toxicidad y diluir con solución amortiguadora de fosfatos  de gelatina el sobrenadante a aproximadamente  10 
DLR/ml. Mezclar volúmenes de 1,25 ml con 0,25 ml de ant isuero F. Inyectar 0,5 ml sin antisuero y 0,6 ml con 
antisuero.  
B.20.10  Aislamiento de Clostridium  botulinum  a partir de cultivos toxigénicos. 
B.20.10.1  El aislamiento de cepas productoras de botulismo, se facilita si se dan todas las condiciones 
para la producción de toxina. Si los cultivos de los tubos Nos. 2 o 4 son toxigénicos, uno de éstos debe 
seleccionarse. Sembrar directamente en agar hígado de ternera yema de huevo o en agar para el aislamiento 
de Clostridium  botulinum  (CBI), en estos medios no se ha obser vado un enmascaramiento por microflora 
atípica. En el caso de que predominara flora atípica combinada con la presencia de algunas esporas de  C. 
botulinum , el inóculo debe hacerse previo tratamiento c on etanol. En el caso de ausencia de esporas, 
reincubar los tubos de enriquecimiento o pasar al medio de esporulación (Eklund). 
B.20.10.2 Aislamiento de C. botulinum  de cultivos con presencia moderada de microorganismos atípicos. 
B.20.10.2.1  Hacer una tinción de Gram de los cultivos tóxico s. Si los cultivos 2 y 4 son tóxicos, pueden 
excluirse los tubos 1 y 3. Seleccionar los cultivos sobre las siguientes bases: 
i) Bacilos gram positivos atípicos. 
ii) Número de bacilos gram positivos con esporas. Si en la tinción se observa un mínimo de 10% de 
bacilos gram positivos, inocular una asada en agar híga do de ternera-yema de huevo y en agar CBI. Incubar 
en anaerobiosis a 30ºC por 48 horas. 
Nota: Es importante tomar en c uenta que cultivos viejos de 
C. botulinum  pueden aparecer como Gram 
negativos. 
B.20.10.2.2 Seleccionar 5 colonias bien aisladas sobre el agar hígado de ternera yema de huevo que 
presenten un halo opaco indicativo de lipolisis y pasar las a caldo TPGY. Seleccionar otras 5 colonias del 
medio agar para el aislamiento de C. botulinum  rodeadas de un halo opaco con brillo aperlado y pasar a caldo 
TPGY. Incubar a 30ºC durante 5 días. Hacer pruebas para determinar las toxinas como se indica en 4.6, 
inocular por duplicado los cultivos toxigénicos en agar hígado de ternera yema de huevo, incubar una placa en 
anaerobiosis y otra en aerobiosis para asegurar pureza.  Nota: Es necesario inocular un gran número de 
colonias, debido a que C. botulinum  puede enmascararse por otros clostr idia que presentan características 
coloniales similares. 
B.20.10.3  Aislamiento de C. botulinum  de cultivos con grandes cantidades de microorganismos atípicos. 
B.20.10.3.1  Si en la tinción de Gram se observan bacilos gram positivos con esporas, mezclar 2 ml del 
cultivo, con 2 ml de etanol al 96%, y dejar a temperat ura ambiente por 60 minutos. Inocular una asada en agar 
hígado de ternera yema de huevo y en agar aislamiento de C. botulinum , y continuar como se indica en 
B.6.10.1. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
B.20.10.3.2  Si no se presenta esporulación en el medio de enriquecimiento, reincubar por otra semana a 
30ºC o extender 0,1 ml del cultivo en agar de esporula ción de Eklund, e incubar las placas en anaerobiosis a 
30ºC hasta que las esporas estén presentes en cantidades significativas (generalmente se requieren de 5 a 10 
días). Suspender una asada del cu ltivo en aproximadamente 2 ml de etano l al 50%, dejar a temperatura 
ambiente por 60 minutos, e inocular en agar hígado de te rnera yema de huevo y en agar CBI. Continuar como 
se indica en B.20.10.1. 
TABLA No. 1 ALGUNAS CARACTERISTICAS DE C. BOTULINUM  GRUPOS I Y II 
GRUPO CRECIMIENTO 
POR ABAJO DE 10ºC TEMPERATURA PARA CRECIMIENTO 
Y PRODUCCION DE TOXINA 
I A, B, Fb + + - 30 - 37ºC 
II Bc, E, F b  + - + 26 - 30ºC 
* Algunas cepas de los tipos A y B pueden presentar subtipos A-B, A-F. B-A.  B-F, cada una produce una 
toxina en mayor cantidad (representada por la primera letra del subtipo). 
b No común 
c No común en Norteamérica 
TABLA No. 2 PRUEBA DE NEUTRALIZACION Y TOXICIDAD EN RATON 
TUBO 
NO. VOLUMEN DE 
MUESTRA (ML) ANTISUERO VOLUMEN DEL 
ANTISUERO (ML) VOLUMEN IUNOCULADO 
(ML) 
1 1,2 - - 0,5 
2 1,2 AntiA 0,12 0,55 
3 1,2 AntiB 0,12 0,55 
4 1,2 AntiE 0,12 0,55 
5 1,2 Anti A, B, E 0,12 0,55 
6 1,2 Tripsina 0,12 0,55 
 
TABLA No 3 ENRIQUECIMIENTO 
TUBO NO. MEDIO TRATAMIENTO 
1 CMM NINGUNO 
2 CMM CALOR 
3 TPGYT NINGUNO 
4 TPGYT ALCOHOL 
 
B.21. DE LAS RECOMENDACIONES PARA EL TRATAMIENTO DE CONGELACION B.21.1  Para los productos de la pesca con sospecha de contener parásitos y que se destine para ahumar 
en frío debe ser sometido a un tratamiento previo, confor me a los tiempos y temperaturas que se recomiendan 
a continuación: 
TEMPERATURA TIEMPO 
-20ºC 7 días 
-35ºC  15 h 
 
B.22. METODO DE PRUEBA PARA EL ANALIS IS MICROBIOLOGICO DE ALIMENTOS ENVASADOS 
HERMETICAMENTE. ESTERILIZADOS COMERCIALMENTE 
B.22.1 Fundamento B.22.1.1 Examen microbiológico de latas no alteradas 
Este examen tiene por objeto determinar la presencia de microorganismos viables latentes, que resistieron 
el tratamiento  térmico debidamente aplicado y que en determina das circunstancias pudieran desarrollarse, 
produciendo alteraciones en el alimento y representando un riesgo para el consumidor.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
Los envasados, aun los bien procesados, pueden contener esporas de bacilos termofílicos, las cuales son 
muy resistentes al calor, pero no se desarrollan en las condiciones normales de almacenamiento y no producen problemas de descomposición del producto ni representan un peligro para el consumidor. 
La prueba de esterilidad comercial,  puede efectuarse por la observa ción y análisis del contenido del 
producto, su apariencia, color, olor, pH y examen microscópico. 
Estas observaciones se hacen después de la incubac ión de las latas y siempre comparándolas con otras 
no incubadas. 
Si es necesario efectuar el cultivo o si el producto  después de incubarse presenta cualquier cambio, ya 
sea en apariencia, olor, color, pH, o bien presencia de gas  o espuma, proceder como se indica en 5.1 o 5.2, 
dependiendo del pH del alimento. 
B.22.1.2  Examen microbiológico de latas alteradas 
Este análisis tiene por objeto determinar el origen de la alteración, la cual puede ser causada por 
microorganismos que sobreviven al tratamiento térmi co o por la introducción de éstos después del 
tratamiento, por defectos de las cerradur as o por golpes que lesionen el envase. Conociendo la naturaleza del 
alimento y su tratamiento, es posible predecir el tipo de organismo responsable de la alteración. 
Numerosas investigaciones han demostrado que el tipo de alteraciones guarda relación con el grado de 
acidez del alimento procesado, por lo que éstos se dividen en dos grandes grupos: 
B.22.1.2.1  Alimentos de baja acidez, con pH > 4,6, en tre los que se encuentran productos cárnicos, 
lácteos, marinos, algunos vegetales, guisados, sopas, etcétera. 
B.22.1.2.2  Alimentos ácidos, con pH < 4, 6, entre los que se  encuentran tomates, fr utas, jugos de cítricos, 
encurtidos, entre otros. 
B.22.2 Reactivos y materiales 
A continuación se presentan las fórmulas y los proced imientos para preparar los medios y reactivos 
empleados en el análisis microbiológico de los pr oductos envasados herméticamente y sometidos a 
esterilización comercial. En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas equivalentes, se 
deben seguir las instrucciones del fabricante. 
B.22.2.1  Medios de cultivo y soluciones  
B.2.2.1.1 Caldo glucosa púrpura de bromocresol (CGPB) FORMULA 
Glucosa  100 g Extracto de carne  30 g Peptona (P. Ej. caseína)  50 g Púrpura de bromocresol  20 ml (1 6% en etanol) Agua destilada  1 0000 ml 
pH final = 7,0 ± 0,2 
Disolver los ingredientes en el agua, ajustar el pH y envasar en tubos de 22 x 175 mm, en volúmenes de 
12 a 15 ml. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C por 15 min. 
B.21.2.1.2  Caldo de hígado picado o caldo carne cocida (CH o CCC) 
FORMULA 
Hígado o carne magra de res  500,0 g Agua destilada  800,0 ml Peptona  10,0 g Fosfato dipotásico  1,0 g Almidón soluble  1,0 g 
pH final = 7,0 ± 0,2 
Poner el hígado o la carne picada en agua, calent ar a ebullición y dejar a fuego lento durante una hora. 
Enfriar, retirar la capa de grasa, ajustar el pH y hervi r otros 10 min. Filtrar a trav és de gasa o manta de cielo, 
presionando para quitar el exceso de líquido. Enfriar y agregar al caldo la  peptona, el fosfato y el almidón 
soluble. Ajustar el pH y llevar el volumen del caldo a 1 000 ml con agua destilada. Filtrar a través de papel 
filtro grueso; en este paso el caldo y la carne pue den guardarse en refrigeración, si el medio no puede 
terminarse el mismo día. Envasar en tubos de 22 x 175 mm volúmenes de 10 a 12 ml de caldo y depositar suficiente hígado o carne picada para que ocupe una altura de 1,25 cm del fondo del tubo. Esterilizar a 121  ± 
1°C por 15 min. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
B.22.2.1.3 Caldo extracto de malta 
FORMULA 
Extracto de malta  6,0 g 
Maltosa  1,5 g 
Glucosa  6,0 g 
Extracto de levadura  1,0 g 
Agua destilada  1 000,0 ml 
pH final = 4,7 ± 0,2 
Disolver los ingredientes con agitación constante. Ajustar el pH a 4,7 ±  0,2, envasar en tubos de  22 x 175 
mm en volúmenes de 12-15 ml. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C por 15 min. Exponer al calor el menor 
tiempo posible. 
B.22.2.1.4  Caldo ácido 
FORMULA 
Proteosa peptona  5,0 g 
Extracto de levadura  5,0 g 
Glucosa  5,0 g 
Fosfato dipotásico  4,0 g 
Agua destilada  1 000,0 ml 
pH final = 5,0 ± 0,2 
Disolver los ingredientes en 1 l de agua y envasar en tubos de 22 x 175 mm en volúmenes de 12 a 15 ml. 
Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C por 15 min. 
B.22.2.1.5  Agar papa dextrosa o dextrosa Sabouraud 
B.22.2.1.5.1 Agar papa dextrosa 
FORMULA 
Infusión de papa  200,0 ml 
Glucosa  20,0 g 
Agar  15,0 g 
Agua destilada  1 000,0 ml 
pH final = 3,5 
Lavar, pelar y rebanar papas de tamaño mediano (250 g). Hervir durante 30 min en 290 ml de agua 
destilada. Filtrar varias veces a través de gasa y algodón . En esta infusión, disolver los demás ingredientes. 
Añadir agua destilada hasta completar el volumen (1000 ml ). Calentar a ebullición, hasta la disolución total de 
los ingredientes. Ajustar el pH a 5,6 ± 0,2. Distribuir en volúmenes de 100 ml y esterilizar en autoclave a 121 ± 
1°C. Enfriar a 45 - 48°C y acidificar a pH 3,5 con soluci ón estéril de ácido tartárico al 10% (aproximadamente 
1,4 ml de ácido por cada 100 ml de medio). Una vez que se ha agregado el ácido tartárico, no se vuelve a 
calentar el medio. 
B.22.2.1.5.2  Agar dextrosa Sabouraud  
FORMULA 
Polipeptona o neopeptona  10,0 g 
Dextrosa  40,0 g 
Agar  15,0 g 
Agua destilada  1 000,0 ml 
pH final = 5,6 ± 0,2 
Calentar hasta disolución completa. Esterilizar en autoclave a 118 - 121°C por 15 min, no exceder  de 121 
± 1°C.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.22.2.1.6  Agar hígado de ternera  
FORMULA 
Infusión de hígado  50,0 g 
Infusión de ternera  500,0 g Proteosa peptona  20,0 g 
Neopeptona  1,3 g 
Triptona  1,3 g Glucosa  5,0 g 
Almidón soluble  10,0 g 
Caseína isoeléctrica  5,0 g Cloruro de sodio  5,0 g 
Nitrato de sodio  2,0 g 
Grenetina  20,0 g Agar  15,0 g 
Agua destilada  1 000,0 ml 
pH final = 7,3 ± 0,2 Mezclar los ingredientes con agua destilada y calentar a eb ullición hasta su disolución total. Ajustar el pH y 
esterilizar a 121 ± 1°C por 15 min. 
B.22.2.1.7  Agar nutritivo  
FORMULA 
Extracto de carne  3,0 g Peptona  5,0 g 
Agar  15,0 g 
Agua destilada  1 000,0 ml 
pH final = 7,3 ± 0,2 
Suspender los ingredientes en agua destilada y disolver los por ebullición. Ajustar el pH. Distribuirlo en 
volúmenes adecuados en matraces o botellas y esterilizar a 121 ± 1°C por 15 min. 
B.22.2.1.8  Solución estéril de ácido tartárico al 10% 
Disolver 10,0 g de Acido tartárico y llevar a 100 ml con agua destilada. Esterilizar en autoclave a 121 ± 
1°C. 
B.22.2.1.9  Colorante de azul de metileno 
Solución A Azul de metileno (pureza no < 90%) 0,3 g Etanol (95%) 90,0 ml 
Solución B Solución 0,01% de hidróxido de 100,0 ml potasio 
Mezclar A y B B.22.2.1.10 Colorante de cristal violeta  
Cristal violeta (pureza no < 90%) 2,0 g 
Etanol (95%) 20,0 ml Agua destilada 80,0 ml 
B.22.2.1.11  Colorante de Gram  
Solución A Cristal violeta (pureza no < 90%) 2,0 g Etanol (95%) 20,0 ml 
Solución B Oxalato de amonio 0,8 g Agua destilada 80,0 ml 
Mezclar solución A y B dejar reposar 24 h al abrig o de la luz, filtrar por  papel filtro grueso. 
Solución de yodo para Gram Yodo (cristales) 1,0 g 
Yoduro de potasio 2,0 g 
Agua destilada 300,0 ml Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Mezclar el Yodo y el Yoduro de potasio en un mortero y tr iturar hasta fino polvo. Agregar 1 ml de agua y 
mezclar, agregar 5 ml de agua y mezclar, agregar 10 ml de agua y mezclar. Vaciar esta solución a un frasco 
reactivo, lavar el mortero y el pistilo c on suficiente agua hasta completar los 300 ml. 
B.22.2.2  Materiales  
 Mecheros de Bunsen o Fischer. 
 Abrelatas sanitarios. 
 Pinzas, espátulas y cucharas. 
 Charolas. 
 Pipetas serológicas de 10 ml con tapón de algodón. 
 Pipetas despuntadas o tubos de 8 mm de diámetro con tapón de algodón. 
 Propipeta o bulbo para pipeta. 
 Tubos de cultivo de 18 x 150 o de 22 x 175 mm. 
 Embudos grandes de tallo corto. 
 Portaobjetos. 
 Cajas de Petri estériles. 
 Punzón para latas. 
 Asa de platino o nicromel en porta-asas. 
 Cepillo para lavar las latas. 
 Toallas o gasas estériles. 
 Solución de yodo al 4% (en etanol al 70%). 
 Sistema de anaerobiosis. 
 Varillas de vidrio de 20 cm de longitud y 3 mm de grueso, dobladas en ángulo recto de 5 cm en uno 
de sus extremos. 
 Azul de metileno, cristal violeta o equipo para tinción de Gram. 
B.22.3 Aparatos e instrumentos  Autoclave con termómetro o manómetro. 
 Horno para esterilizar a 180°C. 
 Incubadoras con termómetro y termostat o que evite variaciones > de 0,1°C. 
 Potenciómetro de escala expandida. 
 Microscopio compuesto. 
B.22.4 Preparación de las muestras B.22.4.1  Llevar un registro en el laboratorio en donde se anoten: 
B.22.4.1.1  El número de lo te (o señalar si éste no existe o está incompleto) 
B.22.4.1.2  Todos los datos importantes para la identifica ción del producto que aparezcan en la etiqueta; 
identificar la muestra en forma indeleble, antes de  remover la etiqueta. Conserva r el envase y la etiqueta. 
B.22.4.1.3  Los defectos físicos que se observen en el envas e como abolladuras, golpes que lo deformen, 
oxidación, derrames, defectos aparentes de las cerraduras, abombamiento, etcétera. 
Según su apariencia externa clasificarlas como sigue: 
B.22.4.2  Latas 
B.22.4.2.1  Latas planas o normales. 
B.22.4.2.2  Abombamiento ligero (Flipper), Grado I. Unicamente uno de los extremos de la lata se 
encuentra ligeramente abombado, pero puede comprimirse fácilmente. 
B.22.4.2.3  Abombamiento elástico (Springer), Grado II. Un o de los extremos se encuentra abombado; al 
presionarle el extremo opuesto se abulta. 
B.22.4.2.4  Hinchazón (Soft swell), Grado III. Ambos ex tremos se encuentran abombados, pero pueden 
comprimirse o ceden ligeramente a la presión. 
B.22.4.2.5  Hinchazón (Hard swell), Grado IV. Ambos extr emos se encuentran abombados y no pueden 
comprimirse: la lata puede reventar.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.22.4.3  Frascos de vidrio 
B.22.4.3.1 Tapa normal 
B.22.4.3.2  Tapa abombada 
B.22.4.4  Incubación de los envases 
B.22.4.4.1  Incubación de productos en envases de apariencia normal. 
La prueba más confiable para determinar la esterilid ad comercial es la incubación del producto a 
temperaturas apropiadas y por un tiempo suficiente para que cualquier microorganismo que se encuentre 
pueda desarrollarse bajo las condiciones del producto envasado, dando origen a manifestaciones ya sea en el 
envase o en el producto. Incubar de 30 a 35°C por 10 a 14 días. 
Observar diariamente los envases. La manifestación de crecimiento es la hinchazón en diferentes grados y 
en los envases de vidrio se pueden observar los cambios en el alimento o la formación de burbujas.  En 
cuanto se detecte hinchazón en el producto o cual quier otra desviación suspender la incubación. 
Al final del periodo de incubación, abrir las latas para descubrir descomposición ácida (flat sour), por 
cambios en el color, olor, consistencia y pH del alimen to. Preparar extensiones, teñirlas con azul de metileno o 
tinción de Gram y observarlas microscópicamente. El hallazgo de cualquier anormalidad indica que el producto no está comercialmente estéril y se debe proceder como para los envases alterados. 
B.22.4.4.2 Incubación de envases sospechosos o alterados 
Analizar de inmediato una o varias unidades de la muestra e incubar el resto de las latas que no presenten 
alteración evidente o con abombamiento de grado I de 30 a 35°C por 10 a 14 días. 
Los envases con abombamiento muy evidente no deben incubarse.  Aquellas que se clasifiquen como 
grado III o IV de no analizarse en el momento, deberán refrigerarse. 
B.22.4.5  Apertura de las latas o envases 
B.22.4.5.1 Area de trabajo 
Se debe trabajar preferentemente en un gabinete de fl ujo laminar que proporcione un ambiente ultra-
limpio, clase 100* 
La desinfección de la superficie de trabajo se puede hacer con alcohol o sales cuaternarias de amonio a la 
concentración recomendada por el fabr icante. Posteriormente se debe poner a trabajar el flujo, 30 min antes 
de efectuar el trabajo. 
Para controlar la eficacia del flujo, se deben poner co mo testigos cajas con medio de cultivo abiertas, a los 
lados y al centro del área de trabajo, durante todo el tiempo que dure la operación. 
Si no se tiene el equipo necesario, se puede utilizar un cuarto o cubículo perfe ctamente limpio, lavado con 
agua y jabón, desinfectándolo con un agente bacterici da apropiado. En este caso se trabajará entre dos 
mecheros Bunsen. 
B.22.4.5.2 Personal 
El personal debe trabajar con bata limpia. Si tiene el pe lo largo, debe usar turbante. El uso de mascarillas 
quirúrgicas es opcional. El personal enfermo con gripe o cualquier otro problema infeccioso no debe intervenir 
en el análisis. 
B.22.4.6  Preparación de latas o envases  normales 
Lavar el envase con un cepillo, usando agua caliente y jabón; enjuagar y dejar secar. 
Remojar con un sanitizante durante 10 a 15 min, la t apa contraria a donde está grabado el lote. Escurrir el 
líquido y secar con la flama de un mechero. 
Destapar con un abridor de latas sanitario estéril. 
En las latas de cierre de anillo o dispositiv os abre fácil, abrir por la cara opuesta. 
* El equipo debe proveer un ambiente libre de partículas  de 0,3 micras con una eficiencia del 99,99% en 
un flujo de 100 pies3/min. 
B.22.4.6.1 Frascos de vidrio 
Lavar la tapa del frasco y sumergirlo durante 15 min en una solución sanitizante, de manera que quede 
cubierta la tapa; esta solución puede ser cloro 100 mg/kg. Colocar un algodón estéril en torno a la tapa y con 
un punzón estéril hacer un orificio en el centro, a fin de que se pierda el vacío y pueda abrirse con facilidad. 
Abrir el frasco sin contaminar los bordes del mismo. 
B.22.4.7 Preparación de latas o envases alterados 
Lavar el envase con un cepillo, con agua caliente y jab ón; enjuagar y secar. Si la lata está muy inflada, 
mantener en el refrigerador antes de abrirla. Limpiar y sanitizar la tapa con una solución de cloro 100 mg/kg o yodo al 2% en alcohol al 70%; limpiar con una gasa estéril. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
En latas muy infladas de pH muy ácido, es necesario hacer una prueba para hidrógeno, con objeto de 
conocer si el gas se debe a la acción del ácido sobre el metal. 
Para ello, practicar una pequeña puntura en el centro de la tapa y recibir el gas en un tubo de ensayo 
invertido; inmediatamente ponerlo s obre la flama. Una pequeña explosión indica la presencia de hidrógeno. 
No debe flamearse directamente el orificio de la lata. 
Para abrir latas infladas, colocar un embudo invertido con un algodón estéril  sobre la tapa y picar con un 
picahielo estéril, hasta desalojar el gas antes de abrir la lata. 
B.22.5 Procedimiento 
Abrir la lata entre dos mecheros Bunsen o en el gabinete de flujo laminar vertical. Tomar porciones tanto 
del contenido sólido como del líquido; si es posib le, homogeneizar. Utilizando utensilios adecuados a la 
naturaleza del producto (espátulas, pinzas, tubos de vidr io, pipetas, etcétera) transferir aproximadamente 2 g 
o 2 ml del producto a los tubos con el medio que se va a utilizar, dependiendo del pH del alimento. 
Conservar una muestra en un frasco estéril, para cu alquier aclaración o para efectuar pruebas biológicas. 
Hacer una extensión en un portaobjetos del contenido de la lata, ya que muchas veces los gérmenes 
causantes del deterioro mueren durante el almacenami ento y sólo el examen microscópico puede dar una 
idea de los microorganismos involucrados en la desco mposición. Preparar las extensiones mediante una asa 
de platino. Si el alimento es sólid o o muy espeso, agregar una pequeña cantidad de agua estéril. Si es muy 
grasoso, depositar sobre la extensión una pequeña cant idad de xilol con posterioridad a su fijación por calor. 
Una vez tomada la muestra, anotar el estado del aliment o: su olor, cambios en su color, consistencia, 
etcétera. No debe probarse. Determinar el pH y vaciar el  contenido de la lata. Observar su interior, anotando 
el estado del barniz, la presencia de mancha s, defectos del frasco o de la tapa, etcétera. 
B.22.5.1 Examen de alimentos envasados de baja acidez (pH > a 4,6) 
Inocular aproximadamente 2 g o 2 ml, en cada uno de 4 tubos con caldo hígado, previamente calentado a 
100°C para expulsar el oxígeno disuelto, y enfriar rápidamente. 
Inocular asimismo, 4 tubos de caldo púrpura de bromocresol. 
Incubar según el siguiente esquema: 
MEDIO DE CULTIVO TUBOS TEMPERATURA TIEMPO INVESTIGACION 
Caldo hígado o CCC 2 35°C 96 h/120 h Mesofílicos anaerobios 
Caldo hígado o CCC 2 55°C 24 h/72 h Termofílicos anaerobios 
Caldo púrpura de bromocresol 2 35°C 96 h/120 h Mesofílicos aerobios 
Caldo púrpura de bromocresol 2 55° C 24 h/48 h Termofílicos aerobios 
 
Transferir los alimentos líquidos por medio de una pi peta, utilizando un bulbo o propipeta. ¡Precaución! 
Tener ciudado al manipular el producto, incluso cuando provenga de envases aparentemente normales. ¡La 
Toxina botulínica puede estar presente! Observar los tubos diariamente, hasta el término del tiempo de 
incubación si no hay crecimiento en todos los tubos, descartar e informar como NEGATIVO. 
Cuadro 1 DIAGRAMA DEL PROCEDIMIENTO DE  CULTIVO PARA ALIMENTOS ENLATADOS DE 
BAJA ACIDEZ (> 4,6). 
CULTIVO ORIGINAL TEMPERATURA SUBCULTIVO  CULTIVO PURO IDENTIFICACION 
CH o CCC 
y CGPB  
35°C 96/120 h AN o AHT 
Aeróbico  AN o AHT Anaeróbico Crecimiento 
 Crecimiento Frotis 
CH o CCC  Frotis CH o CCC Tinción de Gram 
Anaeróbico AN o AHT Tinción de Gram Aeróbico AN o AHT 
CH o CCC y CGPB  
55°C 24/72 h AN o AHT 
Aeróbico  AN o AHT Anaeróbico Crecimiento 
 Crecimiento Frotis 
CH o CCC  Frotis CH o CCC Tinción de Gram 
Anaeróbico  Tinción de Gram Aeróbico AN o AHT 
CH = Caldo Hígado de Ternera AN = Agar Nutritivo 
CCC = Caldo Carne Cocida AHT = Agar Hígado de Ternera CGPB = Caldo Púrpura de Bromocresol       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
DIAGRAMA DEL PROCEDIMIENTO DE CULTIVO PA RA ALIMENTOS ENLATADOS ACIDOS (4,6). 
CULTIVO ORIGINAL TEMPERATURA SUBCULTIVO  CULTIVO PURO IDENTIFICACION 
 
CA, CEM  
30°C 
96/120 h AN, ADS o ADP 
Aeróbico 
 AN, ADS o ADP Anaeróbico Crecimiento 
 
Crecimiento Frotis 
CA, CEM 
 Frotis CA, CEM Tinción de Gram 
Anaeróbico 
AN, ADS o ADP Tinción de Gram Aeróbico AN, ADS o ADP 
CA  
55°C 24/72 h AN 
Aeróbico  AN 
Anaeróbico Crecimiento 
 Crecimiento Frotis 
CA  Frotis 
CA Tinción de Gram 
Anaeróbico AN Tinción de Gram 
Aeróbico 
AN 
CA = Caldo Acido AN = Agar Nutritivo 
CEM = Caldo Extracto de Malta ADS = Agar Dextrosa Sabouraud 
ADP = Agar Papa Dextrosa Si hay crecimiento, hacer frotis y teñir-resembrar a placas de agar hígado de ternera (sin yema de huevo) 
o agar nutritivo. Incubar a 35°C y 55°C una placa en aerobiosis y anaeróbico (ver cuadro 1) continuar la 
incubación a 35°C de caldo de hígado (CH) o caldo carne cocida (CCC) hasta un máximo de 5 días y guardar 
para determinación de toxina (cuando proceda). 
Observar los agares y seleccionar un número representativo de los diferentes tipos de colonias y 
resembrar a CH y CCC a la temperatura y las condici ones según se especifica en el cuadro 1 (a 35°C por 
96/120h y 55°C por 24/72h). 
Expulsar el oxígeno inmediatamente ant es de utilizar el CH que se va a incubar en anaerobiosis. Mantener 
viables los cultivos puros aislados. Hacer tinción de Gram. 
B.22.5.1.1  Cuando se presente crecimiento microbiano durante las pruebas para esterilidad comercial en 
un enlatado y no haya evidencia de descomposición del a limento, efectuar la confirmación de la siguiente 
forma: 
B.22.5.1.1.1 Obtener cultivos puros de la cepa o cepas encontradas. 
B.22.5.1.1.2 Seleccionar otro envase del mismo producto y el mismo lote que el anterior. 
B.22.5.1.1.3  En condiciones asépticas, practicar una pequeña perforación en el extremo de la lata o cerca 
del cierre. 
A.22.5.1.1.4 Inocular el producto con la cepa por abajo de la superficie. 
B.22.5.1.1.5  Flamear el orificio para crear vacío y sellar as épticamente con soldadura o un material similar. 
B.22.5.1.1.6  Después de inocular, incubar a 30-35°C durante 10 días. 
B.22.5.1.1.7  Abrir el enlatado y examinar el producto. 
El aspecto del producto debe ser igual al que se obse rvó en el envase de donde se obtuvo el cultivo. Si en 
el primer enlatado el producto fue de apariencia norma l, pero se obtuvo crecimiento y en el segundo, 
inoculado con la flora microbiana aislada del primero, se encuentra el producto alterado (gas, consistencia 
diferente, olor, etcétera), debe considerarse que el primer enlatado era comercialmente estéril y que el 
crecimiento fue el resultado de un pr ocedimiento deficiente por el laborato rio. Si se encuentra flora mixta 
únicamente en el CGPB, hacer informe de los tipos morfol ógicos. Si hay flora mixta en CH/CCC entre la cual 
se incluyan bacilos, hacer prueba toxina. Si se obser van únicamente bacilos Gram positivo o Gram variable 
típicos del género Bacillus  o Clostridium  investigar presencia de espora s. En algunos ca sos las células 
vegetativas envejecidas pueden dar la apariencia de Gr am negativo y debe considerarse como si fuera Gram 
positivo. Determinar la presencia de toxina. Esta prueba la podrá realizar un laboratorio oficialmente 
acreditado por las autoridades correspondientes. Jueves 10 de febrero de 2011 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
B.22.5.2 Examen microbiológico de alimentos envasados de acidez alta (pH < 4,6) 
Inocular 2 g o 2 ml de alimento en 4 tubos de cald o ácido y 2 tubos de caldo extracto de malta. 
Incubar según el esquema: 
MEDIO DE CULTIVO TUBOS TEMPERATURA TIEMPO INVESTIGACION 
Caldo ácido 2  30°C 96 h Lactobacilos, hongos y levaduras 
Caldo ácido 2 55°C 48 h Termofí licos de descomposición ácida 
Caldo extracto de malta 2 30°C 96 h Lactobacilos, hongos y levaduras 
 
B.22.6 Expresión de resultados B.22.6.1  Envases normales 
Conviene extremar los cuidados al efectuar los ensayos, seleccionar las muestras e interpretar los 
resultados de las pruebas para demostrar la esterilidad comercial, ya que cualquier error basado en fallas de 
manipulación o interpretación, puede originar la de strucción de un lote comercialmente estéril, como 
contaminado. Al incubar el enlatado o al recibirse la la ta, la presencia de hinchazón, principalmente cuando es 
muy acentuada, indica contaminación microbiana. Esta s condiciones deben ser confirmadas demostrando la 
presencia de un gran número de microorganismos en las extensiones preparadas directamente a partir del 
alimento, descubriendo cambios en el aspecto del producto (consistencia, olor, coloración anormal) o variaciones en el pH, en comparación siempre con un  producto normal. Los cultivos se practican por 
duplicado, cuando hay contaminación, en ambos tubos se  debe hallar una flora similar a la encontrada en las 
extensiones de la muestra original. Encontrar sólo uno de  los tubos de cultivo positivo y otro negativo, puede 
indicar una contaminación por manipulación en el laboratorio, a menos que se compruebe que existe el mismo tipo de flora que en la extensión de la muestra original. 
A veces existe alguna dificultad en diferenciar partículas del alimento de microorganismos. Otras veces las 
levaduras o lactobacilos participan en la producción del alimento, como sucede en algunos productos 
obtenidos por fermentación. En estos casos, aunq ue ya no sean viables, los microorganismos pueden 
aparecer en la extensión, y sólo la experiencia y el conocimiento de los procesos permite interpretar correctamente los resultados. 
B.A.22.6.2 Envases alterados, con pH > de 4,6 
B.22.6.2.1  Presencia de mesofílicos aerobios 
La flora presente en este caso, puede estar constituida por bacilos o ser mixta. 
B.22.6.2.1.1 Presencia de bacilos esporulados 
Generalmente consiste en esporas te rmorresistentes de diferentes especies de bacilos. Regularmente el 
alimento no presenta alteraciones, ya que las esporas no pueden desarrollarse en condiciones de anaerobiosis; sin embargo, se han encontrado alteraci ones producidas por bacilos con esporas resistentes 
(Bacillus  mesentericus  y Bacillus subtilis ), en alimentos de acidez media, con tratamiento térmico adecuado, 
pero con vacío incompleto. También se ha encontrado Bacillus ß nigrificans , en conservas de betabeles con 
ennegrecimiento del producto. 
B.22.6.2.1.2 Presencia de flora mixta 
La presencia de flora mixta se debe generalmente a la penetración de gérmenes, con posterioridad al 
proceso térmico, actuando como vehículo el agua de enf riamiento. La flora que se observa puede ser muy 
variada. 
La penetración de los gérmenes se debe a defectos en las cerraduras, que permiten el paso de los 
microorganismos. Las latas generalmente se encuentra n infladas y pueden mostrar defectos o derrames. 
El pH y el aspecto del producto varían. B.22.6.2.2 Presencia de mesofílicos anaerobios 
Consiste de anaerobios del género Clostridium , entre los que se encuentran C. sporogenes , C. putrificans, 
C. hystoliticum, C. bifermentans, C. perfringens  y C. botulinum ; este último es el de mayor importancia 
sanitaria, por producir una toxina muy potente. Las latas pueden estar parcialmente infladas y el producto 
parcialmente digerido; el olor es pút rido. El pH aumenta. En este caso, es necesario practicar la prueba en 
animales, tanto del producto como del f iltrado del cultivo, para investigar la  presencia de la toxina. Esta prueba 
la podrá realizar un laboratorio  oficialmente acreditado por las autoridades correspondientes.       (Segunda Sección) DIARIO OF ICIAL Jueves 10 de febrero de 2011 
B.22.6.2.3 Presencia de termofílicos aerobios 
Consta de bacilos termofílicos estrictos o facultat ivos, que poseen esporas muy resistentes al calor 
(especie tipo B. stearothermophilus , causante de la descomposición ácida flat sour). Las latas son planas, sin 
alteración y con marcado aumento de la acidez del producto; puede haber olor anormal o enturbiamiento del 
líquido. 
B.22.6.2.4 Termofílicos anaerobios 
Pertenecen también al género Clostridium , con esporas muy resistentes al calor. 
La especie tipo C. thermosaccharolyticum,  es un anaerobio estricto no productor de sulfhídrico; las latas se 
encuentran infladas. 
Otro tipo de descomposición poco común, puede ser caus ada por C. nigrificans, que produce sulfhídrico 
con ennegrecimiento del producto. 
B.22.6.3  Interpretación de resultados en alimentos de acidez alta 
B.22.6.3.1 Presencia de mesofílicos aerobios 
B.22.6.3.1.1 Presencia de Lactobacillus . La descomposición por bacterias acidúricas no formadoras de 
esporas, puede deberse a varias especies del género Lactobacillus . Se han aislado L. lycoperci,  L. 
pentoaceticus, L. menitipolum  y L. pleofructi . 
B.22.6.3.1.2 Presencia de levaduras. El hallazgo de levaduras indica falta de procesamiento. Las latas 
contaminadas generalmente se presentan muy hinchadas y el olor del producto es característico de levadura 
(olor ácido). Entre las levaduras se han aislado esporas del género Torula. 
B.22.6.3.1.3 Presencia de hongos. Otro tipo de descomposición puede ser causada por hongos como 
Byssochlamys fulva , que forma esporas muy resistentes al calor. Se han encontrado también algunas cepas 
de Penicillium; en estos casos generalmente las latas se encuentran planas, sin alteración y el hongo crece en 
la superficie del producto. 
B.22.6.3.2  Mesofílicos anaerobios 
Clostridium pasteurianum  causa una descomposición poco frecuente, en que las latas se encuentran 
infladas y con olor butírico. Si se sospecha este tipo  de contaminación, sembrar un tubo con medio o caldo 
ácido en anaerobiosis a 35°C. 
B.22.6.3.3 Termofílicos aerobios 
La descomposición por termofílicos aerobios produce el tipo flat-sour, o sea la descomposición ácida. Las 
latas se encuentran planas y se observan cambios en el vacío; entre los gér menes causantes está  B. 
coagulans , que es el responsable de la descomposición de productos derivados del jitomate y de la 
producción de grumos de leche evaporada. 
B.22.6.3.4 Termofílicos anaerobios 
La descomposición por termofílicos anaerobios es  poco frecuente en productos ácidos. La producen 
anaerobios butíricos. 
En productos de acidez muy alta, con pH inferior a 3, 7, como col agria, encurtidos, etcétera, la 
descomposición puede deberse a las bacterias ya señaladas, pero generalmente la acidez inhibe el desarrollo 
de gérmenes. En muchos casos, la hinchazón de la lata se debe a causas químicas, por formación de 
hidrógeno. 
B.22.6.4 Observaciones generales 
Algunas veces se pueden encontrar cultivos negativ os, procedentes de latas anormales, o de latas 
normales con productos descompuestos. Esto puede deberse a que la alteración ocurrió antes del 
procesamiento térmico del enlatado y han muerto los mi croorganismos que la originaron, o bien a que en un 
producto contaminado, los gérmenes murieron al agotarse el oxígeno o los nutrientes. 
En estos casos, un examen microscópico del producto puede ayudar al diagnóstico. 
B.23. PROCEDIMIENTO AL TRASLUZ PA RA LA DETECCION DE PARASITOS. 
B.23.1 Para detectar los parásitos se coloca una muestr a sobre una lámina acrílica de 5 mm de espesor, 
de 45% de traslúcidez y una fuente luminosa de 1500 lu x a una distancia de 30 cm por encima de la lámina. 
B.23.2  La infestación parasítica podrá detectarse mediant e este procedimiento al trasluz, por examen 
visual. 
____________________