Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
 
SECRETARIA DE SALUD 
PROYECTO de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-242-SSA 1-2005 , Productos y servicios. Productos de la 
pesca frescos , refrigerados , congelados y procesados. Especificaciones sanitari as y métodos de prueba (Continúa en 
la Segunda Sección) 
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice : Estados Unidos Mexicanos.- Secretaría de Salud. 
PROYECTO DE NORMA OFICIAL MEXICANA PROY-NOM-242-SSA 1-2005, PRODUCTOS Y SERVICIOS. 
PRODUCTOS DE LA PESCA FRESCOS, REFRIGERADOS, CONGEL ADOS Y PROCESADOS. ESPECIFICACIONES 
SANITARIAS Y METODOS DE PRUEBA. 
MIGUEL ANGEL TOSCANO VELASCO, Comisionado Federal p ara la Protección contra Riesgos 
Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacio nal de Normalización de Regulación y Fomento Sanita rio, 
con fundamento en los artículos 4o. de la Ley Feder al de Procedimiento Administrativo; 39 de la Ley Or gánica 
de la Administración Pública Federal; 3 fracción XX IV, 13 apartado A fracciones I y II, 17-bis fracció n III, 17-bis 
2, 194 fracción I, 195, 197, 199, 201, 205, 210, 21 5 fracción I de la Ley General de Salud; 38 fracció n II, 40 
fracciones I, V, XI, XII, 41, 43, 46, 47 fracción I  de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización ; 1o. 
fracción IV, 4, 8, 15, 25, 28, 30, 202, 210 y quint o transitorio del Reglamento de Control Sanitario d e Productos 
y Servicios; 28 y 33 del Reglamento de la Ley Feder al sobre Metrología y Normalización; 2 literal C fr acción X, 
36, 37, 38 del Reglamento Interior de la Secretaría  de Salud, 1, 2, 3 fracción I letra C, fracción II,  10 fracciones 
IV y VIII, 11 fracción II, 12 fracción III del Regl amento de la Comisión Federal para la Protección co ntra 
Riesgos Sanitarios, me permito ordenar la publicaci ón en el Diario Oficial de la Federación del Proyec to de 
Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-242-SSA1-2005, Prod uctos y servicios. Productos de la pesca frescos, 
refrigerados, congelados y procesados. Especificaci ones sanitarias y métodos de prueba. 
El presente Proyecto de Norma Oficial Mexicana se p ublica a efecto de que los interesados, dentro de l os 
siguientes sesenta días naturales, contados a parti r de la fecha de su publicación, presenten sus come ntarios 
por escrito en idioma español y con el sustento téc nico suficiente ante el Comité Consultivo Nacional de 
Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, si to en Monterrey número 33, colonia Roma, Delegación  
Cuauhtémoc, código postal 06700, México, D.F., telé fono 50-80-52-00, fax 55-11-14-99, correo electróni co: 
rfs@salud.gob.mx. 
Durante el plazo mencionado, y de conformidad con l o dispuesto en los artículos 45 y 47 fracción prime ra 
de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización,  la Manifestación de Impacto Regulatorio del presen te 
Proyecto de Norma Oficial Mexicana estará a disposi ción del público, para su consulta en el portal ele ctrónico 
de Manifestaciones de Impacto Regulatorio: www.cofe mir.gob.mx, y los documentos que sirvieron de base 
para la elaboración del proyecto estarán a disposic ión del público para su consulta en el domicilio de l Comité. 
PREFACIO 
En la elaboración de la presente Norma participaron  los siguientes organismos e instituciones: 
SECRETARIA DE SALUD 
Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios 
CAMARA NACIONAL DE LAS INDUSTRIAS PESQUERA Y ACUICO LA 
INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL 
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas 
Pescados Industrializados, S.A. de C.V. 
Ahumados Noruegos, S.A. de C.V. 
INDICE 
1. Objetivo y campo de aplicación 
2. Referencias 
3. Definiciones 
4. Símbolos y abreviaturas 
5. Clasificación 
6. Prácticas de higiene y sanidad       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
7. Especificaciones sanitarias 
8. Clasificación de áreas 
9. Muestreo 
10. Métodos de prueba 
11. Etiquetado 
12. Envase y embalaje 
13. Concordancia con normas internacionales y mexicanas  
14. Bibliografía 
15. Observancia de la Norma 
16. Vigencia 
Apéndice Normativo A: Métodos de prueba 
1. Objetivo y campo de aplicación 
1.1 Esta Norma Oficial Mexicana tiene por objeto establ ecer los requisitos sanitarios para los 
establecimientos que procesan productos de la pesca  frescos, refrigerados, congelados y procesados, 
incluyendo las embarcaciones de pesca y recolección , así como las especificaciones sanitarias que debe n 
cumplir dichos productos. 
1.2 Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia oblig atoria en el Territorio Nacional para las personas 
físicas o morales que se dediquen a la captura, ext racción, procesamiento, conservación, almacenamient o, 
distribución, transporte, venta o importación de pr oductos de la pesca. 
2. Referencias 
Esta Norma se complementa con las siguientes normas  oficiales mexicanas o las que las sustituyan: 
NOM-002-SSA1-1993, Salud ambiental. Bienes y Servic ios. Envases metálicos para alimentos y bebidas. 
Especificaciones de la costura. Requisitos sanitari os. 
NOM-051-SCFI-1994, Especificaciones generales de et iquetado para alimentos y bebidas no alcohólicas 
preenvasados. 
NOM-084-SCFI-1994, Información comercial-Especifica ciones de información comercial y sanitaria para 
productos de atún y bonita preenvasados. 
NOM-086-SSA1-1994, Bienes y Servicios. Alimentos y bebidas no alcohólicas con modificaciones en su 
composición. Especificaciones nutrimentales. 
NOM-120-SSA1-1994, Bienes y servicios. Prácticas de  higiene y sanidad para el proceso de alimentos, 
bebidas no alcohólicas y alcohólicas. 
NOM-127-SSA1-1994, Salud ambiental, Agua para uso y  consumo humano-Límites permisibles de la 
calidad y tratamientos a que debe someterse el agua  para su potabilización. 
NOM-128-SSA1-1994, Bienes y servicios. Que establec e la aplicación de un sistema de análisis de 
riesgos y control de puntos críticos en la Planta I ndustrial Procesadora de Productos de la Pesca. 
NOM-130-SSA1-1995, Bienes y servicios. Alimentos en vasados en recipientes de cierre hermético y 
sometidos a tratamiento térmico. Disposiciones y es pecificaciones sanitarias. 
NOM-201-SSA1-2002, Productos y servicios. Agua y hi elo para consumo humano, envasados y a granel. 
Especificaciones sanitarias. 
3. Definiciones 
Para fines de esta Norma Oficial Mexicana, se entie nde por: 
3.1  Aditivos , a las sustancias que se adicionan directamente a los productos, durante su elaboración para 
proporcionar e intensificar aroma, color o sabor; p ara mejorar su estabilidad o para su conservación, entre 
otras funciones. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
3.2  Agua de mar limpia , al agua de mar o salobre que no presente contamin ación microbiológica, 
sustancias tóxicas o plancton marino tóxico en cant idades tales que puedan afectar la calidad sanitari a de los 
productos de la pesca. 
3.3  Agua limpia , al agua en que la contaminación microbiológica y sustancias tóxicas, no están presentes 
en cantidades tales que puedan afectar la calidad s anitaria de los productos de la pesca. 
3.4 Agua para uso y consumo humano , al agua que no contiene contaminantes objetables,  ya sean 
químicos o agentes infecciosos y que no causa efect os nocivos para la salud. También se denomina como 
agua potable. 
3.5 Ahumado , procedimiento que consiste en someter el alimento  al efecto del humo originado en la 
combustión de madera no resinosa. 
3.6 Ahumado en caliente , someter el producto a temperaturas y periodos suf icientes para lograr la 
coagulación térmica de la proteína. 
3.7 Ahumado en frío , someter el producto a temperaturas a las que no m uestre señales de coagulación 
térmica de la proteína. 
3.8 Almacenaje húmedo , al almacenamiento temporal de moluscos bivalvos pro venientes de áreas de 
cultivo con clasificación aprobada o condicionalmen te aprobada, ya sea en contenedores o flotantes en 
cuerpos naturales de agua o en tanques que contenga n agua de mar natural o sintética. 
3.9 Area aprobada , zona de producción de moluscos bivalvos, en la cu al un estudio sanitario elaborado 
bajo los criterios técnicos establecidos por la aut oridad, así como el monitoreo y las actividades de vigilancia, 
indican que no existe contaminación por materia fec al, microorganismos patógenos, sustancias tóxicas 
nocivas y/o biotoxinas marinas. 
3.10 Area condicionalmente aprobada , zona de producción de moluscos bivalvos que cumpl e con los 
criterios para la clasificación aprobada, excepto b ajo ciertas condiciones descritas en un estudio san itario. 
3.11 Area condicionalmente restringida , al área de producción de moluscos bivalvos que cu mple con 
los criterios para la clasificación restringida exc epto bajo ciertas condiciones descritas en un estud io sanitario, 
y de la cual los moluscos bivalvos extraídos estará n sujetos a un proceso de tratamiento de reinstalac ión o 
depuración, tratamiento térmico u otro proceso que elimine organismos patógenos. 
3.12 Area de cultivo , cosecha o producción , a cualquier lugar que sustenta o puede sustentar el 
crecimiento de moluscos bivalvos, por medios natura les o artificiales, y en la cual hay cantidad sufic iente para 
su comercialización, incluyendo los sitios de acuac ultura e instalaciones relacionadas. 
3.13 Area prohibida , al área donde no está permitido la recolección de  moluscos bivalvos, para cualquier 
propósito; excepto para la obtención de semilla par a acuacultura. 
3.14 Area restringida , al área de producción de moluscos bivalvos donde la recolección requiere permiso 
de la autoridad, y una vez recolectados los molusco s bivalvos, están sujetos a un proceso de tratamien to 
efectivo de reinstalación o depuración, tratamiento  térmico u otro proceso que elimine organismos pató genos. 
3.15 Biotoxinas marinas , sustancias de estructura molecular, mecanismos de  acción y actividad biológica 
diversa, que pueden clasificarse atendiendo a sus d iferentes efectos toxicológicos. Son generadas por 
especies fitoplanctónicas tóxicas tales como Alexandrium catenella, Gymnodinium catenatum, Pyrod inium 
bahamense en su variedad compressum, Pseudonitzschia pungens, Gonyaulax, spp , Dinophysis spp , karenia 
brevis, entre otras. 
3.16 Bitácora o registro , al documento controlado que provee evidencia obje tiva y auditable de las 
actividades ejecutadas o resultados obtenidos duran te el proceso. 
3.17 Buenas prácticas de fabricación (BPF) , para el caso de los aditivos se refiere a la cant idad mínima 
indispensable para lograr el efecto deseado. 
3.18 Coadyuvante de elaboración , a la sustancia o materia, excluidos aparatos, ute nsilios y los aditivos, 
que no se consume como ingrediente alimenticio por sí misma, y se emplea intencionalmente en la 
elaboración de materias primas, alimentos o sus ing redientes, para lograr alguna finalidad tecnológica  durante 
el tratamiento o la elaboración, que puede dar luga r a la presencia no intencionada, pero inevitable, de 
residuos o derivados en el producto final. 
3.19 Congelación , al método físico que se efectúa por medio de equi po especial para lograr una 
reducción de la temperatura de los productos que ga rantice que su centro térmico esté congelado.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
3.20 Consumidor , a la persona física o moral que adquiere o disfru ta como destinatario final los 
productos. No es consumidor, quien adquiera, almace ne o consuma productos con objeto de integrarlos  e n 
procesos de producción, transformación, comercializ ación o prestación de servicios a terceros. 
3.21 Depuración , proceso realizado para la reducción de organismos  patógenos que pueden estar 
presentes en los moluscos, mediante la utilización de un ambiente acuático controlado como proceso de 
tratamiento. 
3.22 Distribución , a la actividad mediante la cual los productos son  trasladados de las zonas centros de 
producción o almacenaje a los establecimientos de v enta. 
3.23 Embalaje , al material que envuelve, contiene o protege debi damente a los envases primarios, 
secundarios, múltiples o colectivos, que facilite y  resiste las operaciones de almacenamiento y transp orte, no 
destinado para su venta al consumidor en dicha pres entación. 
3.24 Embarcación menor , a la unidad de pesca que no cuenta con maquinaria  de cubierta accionada con 
fuerza electromotriz para el auxilio de las operaci ones de pesca, utiliza hielo para la conservación d el producto 
y con una autonomía en tiempo máxima de 3 a 5 días.  
3.25 Embarcación pesquera de altura o mayor , unidad de pesca con motor estacionario y una o ma s 
cubiertas con eslora superior a los 27 m, con equip o electrónico de navegación y apoyo a la pesca, que  le 
permite tener una autonomía mayor de 25 días, los s istemas de pesca son operados con apoyo de medios 
mecánicos. 
3.26 Embarcación pesquera de mediana altura , a la unidad de pesca con motor estacionario y una  
cubierta, con eslora de 10 a 27 m; con equipo elect rónico de navegación y apoyo a la pesca, que le per mite 
tener una autonomía máxima de 25 días, los sistemas  de pesca son operados manualmente o con apoyo de 
medios mecánicos. 
3.27 Enhielado , al método de conservación físico con el cual se m antiene la temperatura interna del 
producto a un máximo de 4° C, con la utilización de hielo potable. 
3.28 Envase colectivo o múltiple , al recipiente o envoltura en el que se encuentran  contenidos dos o 
más variedades de productos de la pesca preenvasado s, destinados para su venta al consumidor en dicha 
presentación. 
3.29 Envases herméticamente cerrados , a los que se han cerrado de tal manera que su con tenido esté 
protegido contra la entrada de microorganismos y co ntaminantes durante el tratamiento térmico y despué s de él. 
3.30 Envase primario , al recipiente destinado a contener un producto y que entra en contacto con el 
mismo. 
3.31 Envase secundario , al que contiene al envase primario de manera indi vidual. 
3.32 Esterilización comercial , al tratamiento térmico que libera al producto de formas viables de 
microorganismos patógenos (incluyendo esporas) que afecten la salud y causantes de descomposición, así  
como aquéllos capaces de desarrollarse en los alime ntos sin refrigeración bajo condiciones normales de  
almacenamiento y distribución. 
3.33 Estudio sanitario , el informe escrito, de la evaluación de todos los  factores ambientales, incluyendo 
las fuentes de contaminación actuales o potenciales , que pudieran alterar la calidad del agua en un ár ea de 
cultivo de moluscos bivalvos. 
3.34 Etiqueta , al marbete, rótulo, inscripción, marca, imagen gr áfica u otra forma descriptiva que se haya 
escrito, impreso, estarcido, marcado, en relieve o en hueco, grabado, adherido, precintado o anexado a l 
empaque o envase del producto. 
3.35 Eviscerado , a la acción de retirar las vísceras. 
3.36 Fecha de caducidad , a la fecha límite en la que se considera que las características sanitarias que 
debe reunir para su consumo un producto, almacenado  bajo las condiciones sugeridas por el fabricante, se 
reducen o eliminan de tal manera que, después de es ta fecha, no debe comercializarse ni consumirse. 
3.37 Fecha de consumo preferente , fecha en que, bajo determinadas condiciones de al macenamiento, 
expira el periodo durante el cual el producto preen vasado es comercializable y mantiene cuantas cualid ades 
específicas se le atribuyen tácita o explícitamente , pero después de la cual el producto preenvasado p uede 
ser consumido, siempre y cuando no exceda la fecha de caducidad. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
3.38 Inocuo , al que no causa daño a la salud. 
3.39 Límite máximo , a la cantidad establecida de aditivos, microorgan ismos, parásitos, materia extraña, 
plaguicidas, radionúclidos, biotoxinas, residuos de  medicamentos, metales pesados y metaloides, entre otros, 
que no se deben exceder en un alimento, bebida o ma teria prima. 
3.40 Lote , a la cantidad de un producto elaborado en un mismo ciclo, integrado por unidades 
homogéneas. 
3.41 Marea roja , evento natural de incremento de la biomasa fitopl anctónica en una región en particular, 
donde la o las especies dominantes son generadoras de biotoxinas marinas. También se denomina 
Florecimiento de Algas Nocivas (FAN). 
3.42 Materia extraña , a la sustancia, resto o desecho orgánico o inorgá nico, ajeno al producto, que se 
presenta por contaminación o por malas prácticas de  fabricación e higiene del mismo durante su proceso , 
considerándose entre otros: excretas, pelos de cual quier especie, huesos, insectos, hidrocarburos. 
3.43 Metal pesado y metaloide , a los elementos químicos que tienen un peso atómi co entre 63 y 208 y 
una gravedad específica mayor de 4,0; que por su na turaleza presenta una gran reactividad y que 
dependiendo de su concentración, forma química o su  acumulación en el organismo, pueden causar efectos  
indeseables en el metabolismo. 
3.44 Métodos de prueba , al procedimiento técnico utilizado para la determ inación de parámetros o 
características de un producto, proceso o servicio.  
3.45 Molusco bivalvo , todas las especies de moluscos lamelibranquios que se alimentan por filtración, 
como ostiones, mejillones o almejas. 
3.46 Parásito , al organismo que vive a expensas de otro organism o vivo, provocándole daño. 
3.47 Pasteurización , al tratamiento físico que consiste en someter al producto a una fuente de calor 
suficiente para eliminar organismos patógenos, segu ido inmediatamente de un drástico descenso de 
temperatura, buscando no alterar sus característica s sensoriales ni nutricionales. 
3.48 Plaguicida , a la sustancia o mezcla de sustancias que se dest ina a controlar cualquier plaga, 
incluidos los vectores que transmiten las enfermeda des humanas y de animales, las especies no deseadas  
que causen perjuicio o que interfieran en el proces o de los productos. 
3.49 Proceso , al conjunto de actividades relativas a la obtenci ón, elaboración, fabricación, preparación, 
conservación, mezclado, acondicionamiento, envasado , manipulación, transporte, distribución, 
almacenamiento y expendio o suministro al público d e productos. 
3.50 Producto a granel , al producto que debe pesarse, medirse o contarse en presencia del consumidor 
al momento de su venta. 
3.51 Producto de la pesca , a cualquier producto para consumo humano, derivad o en parte o su totalidad 
de los recursos de la flora y fauna acuáticas, sean  peces, crustáceos, moluscos, equinodermos u otros 
animales y vegetales. 
3.52 Producto de la pesca congelado , a los peces, crustáceos, moluscos, equinodermos, u otros 
animales y vegetales que han sido objeto de un proc eso de disminución de temperatura lo suficientement e 
bajo para conservar la calidad sanitaria. 
3.53 Producto de la pesca fresco refrigerado , es aquel que cumpliendo con las normas microbioló gicas 
e higiénicas establecidas no ha sido sometido a pro ceso alguno de conservación, excepto la refrigeraci ón 
mecánica o el enhielado. 
3.54 Producto de la pesca procesado , es aquel que ha sido sometido a un proceso tecnol ógico 
adecuado para su conservación y su consumo posterio r, a excepción de los refrigerados y congelados. 
3.55 Producto preenvasado , al producto que cuando es colocado en un envase de cualquier naturaleza, 
no se encuentra presente el consumidor y la cantida d de producto contenido en él no puede ser alterada , a 
menos que el envase sea abierto o modificado percep tiblemente. 
3.56 Rastreabilidad , a la acción de mantener registros de captura, cosec ha, empacado y distribución de 
los productos de la pesca, a efecto de ubicar el pr oducto en cualquier etapa de la cadena productiva. 
3.57 Refrigeración , al método físico de conservación con el cual se m antiene la temperatura interna de un 
producto a máximo 4° C.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
3.58 Residuos de medicamentos veterinarios , compuestos químicos que pueden encontrarse en la 
materia prima, producto en proceso o producto termi nado, derivados de su aplicación en la acuicultura,  y que 
en algunos casos representa riesgo a la salud human a. 
3.59 Salazón en seco , procedimiento que consiste en mezclar el pescado con sal, azúcar y otros 
ingredientes secos aptos para consumo humano, de ma nera que la salmuera resultante se drene. 
3.60 Salmuera , solución de sal en agua, azúcar y otros ingredien tes aptos para consumo humano. 
3.61 Sistema primeras entradas-primeras salidas PEP S , al procedimiento utilizado para desplazar los 
insumos y/o materias primas, de acuerdo con su fech a de entrada o de caducidad, para asegurar su 
adecuada rotación. 
3.62 Subproducto , material generado durante la producción de un produ cto principal, que se puede 
utilizar como materia prima para otros productos, l os cuales pueden ser apto o no para consumo humano.  
3.63 Tratamiento térmico , al método físico que consiste en someter a una fuen te de calor suficiente por 
un tiempo apropiado al producto, antes o después de  ser envasado para garantizar la eliminación de 
microorganismos patógenos. 
3.64 Veda sanitaria , medida de seguridad consistente en la prohibición  temporal o permanente para 
captura, comercialización y consumo de productos de  la pesca para consumo humano, con el objeto de 
proteger la salud de la población. 
3.65 Zonas de producción y extracción (captura) de los productos de la pesca , zona geográficamente 
delimitada en la cual la autoridad competente emite  un permiso o concesión acuícola, para la explotaci ón 
comercial de determinadas especies acuáticas. 
4. Símbolos y abreviaturas 
4.1  Cuando en esta Norma se haga referencia a los sigu ientes símbolos y abreviaturas se entiende por: Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
 
 
4.2  Cuando en la presente Norma se mencione:       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Acuerdo , debe entenderse que se trate del Acuerdo por el q ue se determinan las sustancias permitidas 
como aditivos y coadyuvantes, y sus modificaciones.  
CICOPLAFEST , debe entenderse que se trata de la Comisión Interse cretarial para el Control del Proceso 
y Uso de Plaguicidas, Fertilizantes y Sustancias Tó xicas. 
Reglamento , debe entenderse que se trata del Reglamento de Cont rol Sanitario de Productos y Servicios. 
5. Clasificación 
Los productos objeto de esta norma por el tratamien to al que han sido sometidos se clasifican en: 
5.1  Productos de la pesca frescos, refrigerados y cong elados; y 
5.2  Productos de la pesca procesados los que a su vez se clasifican en: 
5.2.1  Envasados en recipientes de cierre hermético y som etido a tratamiento térmico. 
5.2.2  Esterilizados comercialmente. 
5.2.3  Pasteurizados. 
5.2.4  Ahumados. 
5.2.5  Salados y secos-salados. 
5.2.6  Semipreparados. 
5.2.7  Crudos o precocidos empanizados o rebozados y cong elados. 
5.2.8  Crudos marinados o en salmuera. 
5.2.9  Emulsionados. 
6. Prácticas de higiene y sanidad 
6.1  En el proceso de los productos objeto de esta norm a, se debe cumplir con lo señalado en la  NOM-
120-SSA1-1994, señalada en el apartado de referenci as y las siguientes especificaciones: 
6.2  Todas las materias primas empleadas en la elaborac ión de los productos deben cumplir con los 
ordenamientos legales aplicables. 
6.3  Control documental del proceso. 
6.3.1  Adicionalmente a los registros establecidos en la NOM-128-SSA1-1994, señalada en el apartado de 
referencias, el proceso de los productos debe docum entarse en bitácoras o registros foliados o numerad os 
cuando corresponda, de manera que garantice los req uisitos establecidos en la tabla 1 para los product os de 
la pesca frescos, refrigerados y congelados o proce sados. Los registros o bitácoras, incluyendo los qu e se 
elaboren por medios electrónicos deben: 
a.  Contar con documentos que demuestren la veracidad de la información y un procedimiento para la 
prevención de acceso y correcciones no controladas.  
b.  Conservarse por lo menos durante el tiempo estable cido en la NOM-128-SSA1-1994, señalada en el 
apartado de referencias, para permitir la rastreabi lidad del producto, por lo cual deben estar a dispo sición de la 
autoridad sanitaria cuando así lo requiera. 
c.  El diseño del formato queda bajo la responsabilida d del fabricante. 
Tabla 1.  Información mínima de las bitácoras o registros de  las diferentes etapas del proceso y de las buenas 
prácticas de higiene en los productos de la pesca f rescos refrigerados y congelados o procesados. 
REGISTRO DE: INFORMACION 
Recepción de 
materias primas • Proveedor, cantidad y origen (zona de captura o pro ducción, rastreable por 
lote de producción, cuando aplique). 
• Condiciones de recepción, conservación y transport e, cuando aplique. 
• Control de entrada y salida de materia prima (Sist ema PEPS). 
• Certificado de análisis, cuando aplique. 
• Informe de resultados de análisis, en el que se inc luya: nombre común y 
científico de la materia prima, identificación del lote y fecha de p roceso, 
condiciones de toma y transporte de muestra, paráme tro sanitario analizado, 
fecha de análisis, datos del responsable. 
Almacenamiento del • Cantidad de producto almacenado. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
producto • Identificación de la cámara, refrigerador o congel ador, cuando aplique. 
• Temperaturas de conservación. 
• Control de entrada y salida de producto (Sistema P EPS). 
• Informe de resultados de análisis, en el que se inc luya: nombre común y 
científico del producto, identificación del  lote, fecha de elaboración y 
caducidad, condiciones de toma y transporte de mues tra, parámetro sanitario 
analizado, fecha de análisis, datos del responsable . 
Distribución de 
producto terminado • Condiciones de transporte y comercialización. 
• Control de entrada y salida de producto (Sistema P EPS). 
• Control de destino del producto por lotes que gara ntice su rastreabilidad 
Area de proceso • Temperatura del área. 
• Temperatura y tiempo durante la manipulación y el p rocesamiento del 
producto. 
• Calidad microbiológica del aire. 
• Cloro residual del agua utilizada en el proceso. 
Control o erradicación 
de fauna nociva 1. Por contratación: 
• Fecha y periodicidad. 
• Comprobante del tipo de servicio proporcionado por  la empresa responsable. 
• Técnicas o sustancias usadas. 
• Hojas técnicas de las sustancias 
• Número de licencia de la empresa que aplica. 
• Responsable. 
• Localización de trampas o cebos, en su caso. 
2. Autoaplicación: 
• Fecha. 
• Periodicidad. 
• Nombre y aprobación del responsable técnico. 
• Sustancias usadas y hojas técnicas de las mismas. 
• Concentraciones. 
• Localización de trampas o cebos en su caso. 
Estado de salud del 
personal del área de 
producción y 
expendio, en su caso • Tipo de análisis. 
• Fecha de análisis. 
• Resultados. 
• Laboratorio responsable. 
Limpieza y 
desinfección del 
equipo, utensilios e 
instalaciones • Fecha y hora. 
• Productos usados. 
• Manual de procedimientos.  
• Operador y responsable.  
Mantenimiento del 
equipo • Tipo de mantenimiento (preventivo o correctivo). 
• Operación realizada. 
• Nombre del equipo. 
• Fecha.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
• Responsable. 
 
De conformidad con el trámite SSA-04-015. Conservac ión de información sobre el proceso de producción 
y con el SSA-04-022. Conservación de registros de l os parámetros de operación en establecimientos 
dedicados al proceso de productos de la pesca y sus  derivados. 
6.4  Embarcaciones de pesca y recolección. 
6.4.1  Las embarcaciones pesqueras de mediana altura y ma yores, deben contar al menos con una 
bodega. 
6.4.2  Las bodegas deben reunir los siguientes requisitos : 
6.4.2.1  Estar aislada térmicamente; 
6.4.2.2  Estar revestida interiormente con fibra de vidrio,  plástico u otro material higiénico de superficie l isa 
y resistente a la corrosión; 
6.4.2.3  Estar dividida en compartimentos para almacenar el  producto en condiciones sanitarias; 
6.4.2.4  Contar con sistemas que garanticen la conservación  del producto; 
6.4.2.5  Tener un sistema de drenaje que permita el dren de l agua de deshielo regularmente; 
6.4.3  Las embarcaciones pesqueras menores, deben estibar  el producto muerto en recipientes con 
suficiente hielo que garantice su conservación. Est e tipo de embarcaciones no deben mantener el produc to en 
estas condiciones por periodos mayores de veinticua tro horas. 
6.4.4  Las embarcaciones pesqueras que estén provistas de  un sistema de refrigeración no deben 
mantener el producto en estas condiciones por perio dos mayores de veinticinco días. 
6.4.5  Las embarcaciones pesqueras de mediana altura y ma yores, deben disponer de un sistema de 
abastecimiento de agua potable abundante o de agua de mar limpia. Asimismo, deben contar con un sistem a 
de desinfección, con el fin de facilitar el lavado y saneamiento de las áreas de confinación del produ cto y 
limpieza general del barco, antes de salir del puer to y después de la descarga. 
6.4.6.  Las embarcaciones, partes y equipos empleados para  la extracción, deben quedar libres de 
pescados, mariscos o fragmentos de éstos, así como de otras materias orgánicas susceptibles a 
descomposición que puedan contaminar el producto, e n su caso se pueden lavar con agua potable o agua d e 
mar limpia antes o después de cada operación de pes ca o por lo menos una vez al día. 
6.4.7  La cubierta y todo el equipo de cubierta, inmediat amente después de descargar la captura, debe 
limpiarse, desinfectarse y, en su caso, enjuagarse.  
6.4.8  Los productos de la pesca enhielados o refrigerado s deben mantenerse a 4ºC como máximo, 
mientras que los congelados deben mantenerse a -18º C como máximo, mientras que para los pescados 
enteros congelados en salmuera y destinados a la fa bricación de conservas, se pueden tolerar temperatu ras 
no superiores a -9ºC. 
6.5  Extracción o cosecha de moluscos bivalvos. 
6.5.1  La extracción o cosecha y manejo de los moluscos b ivalvos debe sujetarse a lo siguiente: 
6.5.1.1  Extraerse o cosecharse de áreas aprobadas, aprobad as condicionalmente, condicionalmente 
restringidas o restringidas bajo vigilancia sanitar ia; 
6.5.1.2  Ser inocuos, o en caso de provenir de áreas condic ionalmente restringidas o restringidas, 
someterse a un proceso de reinstalación, depuración , pasteurización, tratamiento térmico u otro proces o que 
garantice la eliminación de organismos patógenos. E stos procesos deberán llevarse a cabo mediante 
lineamientos técnicos sujetos a evaluación por part e de la autoridad. 
6.5.1.3  Lavarse con agua de mar limpia procedente de área aprobada o con agua potable. 
6.5.1.4  Realizar el almacenamiento húmedo en contenedores o flotadores en cuerpos naturales de agua o 
en tanques que contengan agua de mar natural o sint ética. Este proceso deberá llevarse a cabo de 
conformidad con lineamientos técnicos sujetos a eva luación por parte de la autoridad. 
6.5.1.5  Almacenarse de tal forma que se eviten abrasiones,  en bodegas ventiladas y libres de fauna nociva 
o doméstica. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
6.5.1.6  Lavarse, en caso de separación de la concha, con a gua potable y manipularse rápidamente, para 
su inmediata refrigeración, congelación o venta. 
6.5.2  Para la depuración de los moluscos bivalvos, se de be observar lo siguiente: 
6.5.2.1  La cantidad de agua que reciban debe ser de mar, l impia, continua y suficiente para el volumen de 
organismos por depurar, el cual no debe ser superio r a la capacidad del centro o área de depuración; 
6.5.2.2  El funcionamiento del sistema de depuración debe p ermitir que los moluscos bivalvos vivos 
vuelvan a alimentarse por filtración, eliminen los residuos contaminantes y se mantengan con vida en 
condiciones adecuadas después de la depuración prev ia a envasado, almacenamiento y transporte anterior es 
a la puesta en el mercado; 
6.5.2.3  Los lotes de organismos no se deben mezclar, a men os que los procesadores cuenten con un 
procedimiento de mezclado sujeto a evaluación y vig ilancia por parte de la autoridad sanitaria. 
6.6  Manejo de producto a bordo. 
6.6.1  El producto capturado, al ser descargado en la cub ierta de las embarcaciones, debe manipularse 
cuidando que no se golpee o dañe y evitar su contam inación. 
6.6.2  En el momento que sea factible, luego de la captur a, se debe lavar el producto y, en su caso, se le 
pueden extraer las vísceras, evitando que los despe rdicios estén en contacto con los productos destina dos al 
consumo humano. El producto se debe colocar con suf iciente hielo hasta que sea entregado para su 
procesamiento. 
6.6.3  El producto, una vez libre de vísceras, cabeza o c oncha, debe lavarse con agua de mar limpia o 
agua potable; en el caso de los pescados, esto debe  hacerse hasta que cese el sangrado. 
6.6.4  Para los productos enhielados, la cavidad abdomina l del pescado libre de vísceras, debe llenarse 
con hielo y cubrirse con el mismo al estibarlo. El hielo que haya sido previamente utilizado con algún  otro 
propósito, no debe ser usado para enfriar el produc to. 
6.6.5  Las vísceras, así como los desechos destinados al consumo animal o al uso industrial no alimentario, 
deben conservarse en condiciones que eviten su desc omposición y separarlos de los de consumo humano. 
6.6.6  Para que el producto no se dañe, contamine o sufra  calentamiento por acción de la radiación solar, la  
descarga manual debe realizarse en recipientes limp ios, y cuidando que no sea lanzado desde la bodega  a la 
cubierta, a la plataforma del muelle o al medio de transporte. 
6.6.7  El flujo de productos debe ser continuo y sin demo ras, con el fin de mantener la calidad sanitaria de  
los mismos, de acuerdo con las características prop ias del producto y del proceso, así como con su rie sgo 
sanitario. 
6.7  Equipo. 
6.7.1  Todo el equipo empleado para lavar, manipular, tra nsportar, enfriar y almacenar los productos de la 
pesca a bordo de las embarcaciones y en los estable cimientos industriales y comerciales, debe ser cons truido 
con material resistente y no tóxico, que permita su  fácil limpieza y desinfección y diseñado de forma tal que 
evite que el producto sufra magulladuras u otros da ños. 
6.7.2  Los recipientes de múltiples usos, equipo y utensi lios que se empleen en la manipulación, 
almacenamiento o transporte de los productos pesque ros, a bordo de las embarcaciones y en los 
establecimientos en tierra deben limpiarse, desinfe ctarse y, en su caso, enjuagarse con agua potable, o agua 
de mar limpia para el caso de las embarcaciones, al  menos al inicio y al finalizar cada jornada de tra bajo. 
6.7.3  Los transportadores deben estar diseñados para evi tar al producto daños físicos. 
6.7.4  Los detergentes y desinfectantes utilizados para l a limpieza del equipo, deben permanecer 
debidamente etiquetados y resguardados. Asimismo, s e deben emplear exclusivamente para el uso a que 
estén destinados y manejarse con precaución a fin d e evitar contaminación o alteración de los producto s de la 
pesca. 
6.8  Establecimientos. 
6.8.1  Contar con sistemas de saneamiento adecuado o, com o mínimo, con una toma de agua para 
efectuar el aseo de cada ciento cincuenta metros cu adrados de superficie, en las áreas de recepción de  
materia prima y de elaboración; 
6.8.2  De acuerdo a la naturaleza de sus procesos, deberá n cumplir con lo siguiente:       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
6.8.2.1  Contar con un área cerrada para la recepción de ma teria prima 
6.8.2.2  Contar con separaciones físicas entre áreas sucias  y áreas limpias, 
6.8.2.3  Contar con almacenes específicos para: ingrediente s y aditivos, material de empaque, productos 
químicos para limpieza y desinfectantes, y plaguici das. 
6.8.2.4  Contar con depósito de hielo, cámaras frigoríficas  o almacén para producto refrigerado o 
congelado, según el caso; 
6.8.3  El diseño de las instalaciones debe garantizar que  el proceso sea lineal y fluido, evitando retroceso s 
y cruzamientos con los productos en distintas etapa s. 
6.8.4  El sistema de abastecimiento de agua estará provis to de dispositivos para evitar el reflujo. 
6.9  Procesamiento de los productos de la pesca. 
6.9.1  Se debe contar con un sistema de potabilización qu e asegure la calidad sanitaria del agua utilizada 
en el proceso. El mantenimiento del mismo es respon sabilidad del procesador, de acuerdo a las 
especificaciones establecidas por el fabricante del  equipo. 
6.9.2  El hielo que se utilice en la conservación y proce so de los productos objeto de esta norma deben de 
cumplir con lo establecido en la NOM-201-SSA1-2002 señalada en el apartado de referencias. 
6.9.3  Las plantas de procesamiento y distribución, deben  proteger el producto contra la contaminación 
ambiental y evitar la exposición a temperatura ambi ente. 
6.9.4  Cuando se emplee agua de mar o de pozo como elemen to auxiliar de limpieza, se deben suministrar 
por vía distinta a las del agua potable, y sus duct os deben pintarse con colores diferentes para su 
identificación. 
6.9.5  La industrialización de los subproductos de la pes ca no destinadas a consumo humano debe 
realizarse en áreas separadas físicamente de aquell as en que se elaboren productos destinados al consu mo 
humano. 
6.9.6  La empresa deberá asegurarse que al inicio de cada  turno, el personal del proceso cuente con el 
equipo de trabajo como son los mandiles, guantes, b otas y cofias en condiciones higiénicas. 
6.9.7  Los equipos que se utilicen para refrigeración y c ongelación deben estar dotados con dispositivos 
para el control y registro de temperatura, y cumpli r con lo siguiente: 
6.9.7.1  La ubicación debe facilitar la limpieza, mantenimi ento e inspección de los mismos; 
6.9.7.2  Los dispositivos de control de los equipos de refr igeración y congelación deben ser leídos y 
registrados por lo menos una vez durante cada jorna da de trabajo de 8 horas; 
6.9.7.3  En las instalaciones de congelación la temperatura  deberá mantenerse a -18° C, con una variación 
de la temperatura de hasta +5° C durante la limpieza  y descongelación de los difusores (descarche), así  como 
durante las entradas y salidas de productos a las b odegas. 
6.9.7.4 En las instalaciones de refrigeración la temperatur a deberá mantenerse a +4° C, con una tolerancia 
en la variación de la temperatura de hasta +3C dura nte la limpieza y descongelación de los difusores 
(descarche), así como durante las entradas y salida s de productos a las bodegas. 
6.9.8  El tamaño de los congeladores y los conservadores de productos congelados, deben ser acordes 
con la producción prevista por el establecimiento. 
6.9.9  Durante el lavado de los productos de la pesca se debe utilizar agua potable fría, cuando aplique y 
disponer de instalaciones adecuadas para la manipul ación. 
6.9.10  Los productos que no hayan sufrido tratamiento pre vio a bordo de las embarcaciones, deben 
someterse, según la especie, a su clasificación y l avado; en su caso, también se puede efectuar la rem oción 
de vísceras, descabezado o desconchado y colocarse en recipientes limpios, y almacenarse en cámaras de  
refrigeración o congelación. 
6.9.11  Los productos congelados no envasados, inmediatame nte, deben glasearse o empacarse para 
protegerlos contra la deshidratación y la oxidación , durante su permanencia en el almacén frigorífico.  Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
6.9.12  Los productos de la pesca, que se utilicen como ma teria prima que no se manejen vivos deben 
conservarse refrigerados o congelados, con la excep ción de los moluscos bivalvos vivos, que deben 
manejarse enhielados o con refrigeración mecánica. 
6.9.13  El agua y el vapor deben suministrarse a los equip os utilizados en el proceso por medio de tuberías 
que estén debidamente identificadas. 
6.9.14  El vapor utilizado en contacto directo con los pro ductos no debe contener ninguna sustancia que 
origine un riesgo a la salud o que pueda contaminar  el producto. 
6.9.15  El producto en el que se sospeche la presencia de parásitos debe ser sujeto a un tratamiento previo 
de congelación a -18° C o menor por un tiempo no inf erior a 24 horas. 
6.9.16  Todos los pescados que lo requieran deben de ser e viscerados antes del proceso. 
6.9.17  En los procesos donde se utilice sólo la carne de crustáceos o moluscos se debe tener especial 
cuidado en cerciorarse que se hayan eliminado todos  los fragmentos de caparazón. 
6.10  Descongelación. 
6.10.1  Se establecerán límites para el tiempo y la temper atura de descongelación a fin de evitar el 
desarrollo de microorganismos, e histamina (cuando se trate de especies susceptibles a la formación de  esta 
sustancia). 
6.10.2  Cuando se descongele el producto debe hacerse cuid ando de no exceder los límites establecidos. 
6.10.3  La descongelación se debe efectuar en lugares cerr ados y en condiciones de higiene. Cuando se 
emplee agua como medio de descongelación ésta debe ser potable, y la circulación debe ser suficiente p ara 
lograr una descongelación uniforme. 
6.11  Manejo de desechos. 
6.11.1  Las embarcaciones pesqueras y los establecimientos  deben eliminar sus desechos, de conformidad 
con las disposiciones aplicables. 
6.11.2 Se debe reducir al mínimo la acumulación de desecho s sólidos, semisólidos o líquidos para impedir 
la contaminación del producto. 
6.11.3  Los recipientes para despojos y materiales de dese cho, deben ser de material impermeable. 
6.12  Capacitación. 
6.12.1  El personal debe estar capacitado para realizar su s labores y cumplir con las buenas prácticas de 
higiene, así como de su papel y responsabilidad en la protección de las materias primas y productos 
terminados en relación con su contaminación o deter ioro y la repercusión de su consumo en la salud de la 
población. De esta capacitación debe existir eviden cia documental. 
6.13  Transporte. 
6.13.1  Los vehículos destinados al transporte de los prod uctos de la pesca deben cumplir con los 
siguientes requisitos sanitarios, según corresponda : 
6.13.1.1  Tener cámaras aisladas térmicamente y revestidas c on material higiénico; 
6.13.1.2  Disponer de un sistema de refrigeración o congelac ión, según corresponda; 
6.13.1.3  En el exterior del vehículo deben estar colocados los indicadores de la temperatura del interior de 
la caja. 
6.13.1.4  Contar con un sistema para el drenaje del agua de deshielo. 
6.13.1.5  Las paredes, los pisos y los techos deben estar he chos de un material apropiado y resistente a la 
corrosión, con superficies lisas e impermeables. Lo s pisos deben estar dotados de un sistema de drenaj e 
eficaz. 
6.13.1.6  El transporte de los productos de la pesca frescos , con duración máxima de cinco horas, puede 
efectuarse en vehículos sin sistema de refrigeració n, si cuentan con caja cerrada y recubierta con mat erial de 
calidad sanitaria, siempre que estén enhielados. 
6.13.1.7  El enhielado deberá hacerse colocando, capas alter nas de hielo triturado hasta una altura máxima 
de un metro; la primera y última capas deben ser de  hielo.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
6.13.1.8  Realizar el transporte de los productos de la pesc a, lavados y refrigerados a una temperatura de 
4° C como máximo. 
6.13.1.9  Sólo se podrán transportar otros productos cuando no exista riesgo de contaminación. 
6.13.2  Los productos no deben entrar en contacto directo con pisos y paredes. 
6.13.3  En los vehículos, la cámara de conservación, los r ecipientes empleados para el estibado y demás 
superficies que estén en contacto con el producto, deben lavarse con agua potable y desinfectarse ante s y 
después de cada viaje. 
6.13.4  En el transporte marítimo, ferroviario o aéreo de los productos de la pesca objeto de esta norma, se 
deben observar las disposiciones sanitarias de este  ordenamiento. 
6.13.5  Los productos de la pesca, deben contar con docume ntos como registros de recepción y orden de 
embarque, y/o comprobantes de compra y venta, que p ermitan su rastreabilidad. 
6.14  Punto de venta. 
6.14.1  Area de almacén. 
6.14.1.1  No deben permanecer en esta área productos abierto s o con la envoltura rota; 
6.14.1.2  La estiba, debe realizarse de manera que se evite el rompimiento y exudación de empaques y 
envolturas; 
6.14.1.3  Las unidades de refrigeración y congelación, deben  contar con termoregistradores con 
termómetro en lugar visible que permitan monitorear  la temperatura. 
6.14.1.4  El importador, distribuidor y comercializador, cad a uno en el ámbito de su responsabilidad, deben 
observar que se mantengan las condiciones de almace namiento y comercialización del producto, señaladas  
por el fabricante. 
6.14.2  Area de venta. 
6.14.2.1  Los productos de la pesca que se presenten para la  exhibición y venta al público, deben 
colocarse en mostradores de mampostería o de cualqu ier otro material inocuo, resistente, con superfici e lisa, 
impermeable y de color claro, que permita su fácil aseo, con la inclinación necesaria para permitir el  
escurrimiento del agua de deshielo. Si la exhibició n y venta se realiza en charolas, éstas deben ser d e 
material plástico inocuo u otro material anticorros ivo que sea de fácil limpieza y desinfección; 
6.14.2.2  Los productos que se encuentren en esta área, no d eben entrar en contacto directo con las 
básculas; 
6.14.2.3  Los productos que se expendan al público a granel,  deben ser cortados únicamente en presencia 
del consumidor; 
6.14.2.4  Las unidades de corte, deben limpiarse al inicio d e la labor y desinfectarse por lo menos cada 
hora de trabajo, no deben usarse franelas o telas s emejantes para ejecutar la limpieza; 
6.14.2.5  Las unidades de refrigeración deben mantenerse a u na temperatura que permita al producto 
permanecer a no más de 4ºC en forma constante. Asim ismo, las unidades de congelación deben mantenerse 
a una temperatura que garantice que los productos m antengan una temperatura de -18ºC en el centro térm ico. 
Ambas unidades deben contar con termómetros en luga r visible. 
6.14.2.6  El hielo que se emplee en el área de venta debe se r potable y sustituirse cuando menos cada 24 
horas. 
6.14.2.7  Debe existir un área específica para el manejo y d epósito de desechos sólidos. 
6.15  Disposiciones específicas 
6.15.1  Productos envasados en recipientes de cierre hermé tico y sometidos a tratamiento térmico 
6.15.1.1  El tratamiento térmico debe ser capaz de destruir o eliminar bacterias patógenas y a sus esporas. 
6.15.1.2  Durante el transporte, los recipientes metálicos s e deben mantener secos para evitar la corrosión 
u oxidación. 
6.15.1.3  Precocción y otros tratamientos previos. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
I)  Los métodos utilizados para la precocción de los p roductos de la pesca destinados a proceso de 
esterilización comercial deben escogerse de tal for ma que produzca los efectos deseados con un mínimo de 
demora y con la menor manipulación posible. 
II)  Se debe tener cuidado para evitar que las especies  susceptibles de desarrollar histamina alcancen una  
temperatura mayor a 4° C, si esto sucede, el tiempo de exposición no debe ser mayor a cuatro horas, ant es de 
la precocción. 
III)  Con la excepción de los productos que se envasan a ún calientes, el enfriamiento del producto 
precocido debe efectuarse con la mayor rapidez posi ble, con el fin de evitar la proliferación o produc ción de 
toxinas, y en condiciones que eviten la contaminaci ón del producto. 
6.15.1.4  Llenado y cierre hermético. 
I)  Se debe controlar que en el llenado de los recipie ntes se observe la proporción y la distancia respec to al 
cierre que especifique el procedimiento adoptado, d e acuerdo a la capacidad del envase, tratando de ev itar la 
obstrucción de la superficie del cierre con product o. 
II)  Los operarios deben controlar los productos llenad os manualmente, como especies pelágicas 
pequeñas, para verificar que en los bordes o la sup erficie de la tapa del recipiente no queden restos del 
producto que puedan impedir el cierre hermético, ad icionalmente se contará con un plan de muestreo par a 
control de la hermeticidad de los envases. 
III)  La operación de cierre y el procedimiento de ester ilización debe ser efectuada y verificada por perso nal 
calificado, llevando los registros correspondientes . 
IV)  Para definir el tipo de tratamiento térmico requer ido para garantizar la esterilidad comercial, el 
fabricante debe contar con un estudio específico, q ue considere las instalaciones y el equipo con que se 
cuenta. 
V)  Para el tratamiento térmico se podrán utilizar sis temas automatizados de control y registro de 
temperatura, tiempo y presión. Las temperaturas de la autoclave podrán determinarse observando lo 
registrado por el sensor respectivo, con la condici ón de que dicho sensor haya sido calibrado con refe rencia a 
un termómetro de mercurio certificado. 
VI)  Si se elabora en una misma carga de la autoclave p roducto de la pesca envasado en recipientes de 
cierre hermético de distintos tamaños, se debe aseg urar que el proceso del tratamiento utilizado sea s uficiente 
para alcanzar la esterilidad comercial de los recip ientes. 
6.15.1.5  Enfriamiento 
I)  Después del tratamiento térmico el agua que se emp lee a presión para enfriar los productos 
esterilizados comercialmente y envasados en recipie ntes de cierre hermético, debe aplicarse por recirc ulación 
y se comprobará que el nivel de cloro residual en e l agua descargada de cada autoclave se mantenga com o 
mínimo a 0,5 mg/kg. 
II)  Si los productos no se enfrían con agua después de l tratamiento térmico, se deben enfriar rápidamente  
al aire. 
III)  Los recipientes de los productos no deben manipula rse bruscamente o de manera que su superficie, y 
en particular sus costuras, queden expuestas a la c ontaminación. 
6.15.1.6  Control de proceso 
I)  En aquellos casos donde se detecten desviaciones d e los tratamientos programados para un lote o sus 
fracciones, se debe aplicar el tiempo que se indica  en la tabla de compensaciones emitida por la perso na o 
compañía que realizó el estudio de penetración de c alor para el o los productos que en su momento se e stén 
esterilizando. De no contar con dicha tabla de comp ensaciones se debe volver a aplicar el tratamiento térmico 
adecuado para asegurar la esterilidad comercial del  producto o separar la porción del producto para pr oceder 
a realizar el análisis microbiológico correspondien te. En este último caso, el lote en cuestión podrá distribuirse 
después de que se haya determinado que no existe ni ngún riesgo a la salud. 
II)  Con el fin de determinar que la manipulación de lo s ingredientes antes y durante el tratamiento térmi co, 
el enfriamiento y el cierre del envase fueron los a decuados, se deberán realizar pruebas de incubación  a 35° C 
durante 14 días o a 37° C durante 10 días, para desp ués realizar análisis microbiológicos.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Las empresas que lleven a cabo su control del proce so por medio de tratamientos programados, quedarán 
exentas de llevar a cabo análisis microbiológicos, salvo cuando al momento de realizar la inspección d el 
producto incubado detecten un comportamiento anorma l de éste, tal como: apariencia, color, olor, pH, o  
presencia de gas, espuma, abombamiento suave, abomb amiento duro, brincadora y resorte. 
En aquellos casos donde se detecten desviaciones en  los tratamientos programados para un lote o sus 
fracciones se deberá aplicar la acción correctiva r equerida según el punto 6.15.1.6 fracción I, así mi smo se 
tomará una muestra por duplicado para el proceso de  incubación, si durante el análisis del producto ya  
incubado se  encuentran desviaciones en cualquiera de los siguie ntes parámetros: apariencia, color, olor, pH, 
presencia de gas o espuma, abombamiento suave, abom bamiento duro, brincadora y resorte, se procederá a  
realizar análisis microbiológicos. 
La empresa deberá disponer de un mecanismo para ase gurar que todo producto en observación no sea 
enviado a la venta sin que antes se haya determinad o que no existe ningún riesgo potencial para la sal ud. 
6.15.1.7  Si el producto se debe tener fuera de los recipien tes durante un periodo de tiempo prolongado 
antes de ser envasados, debe mantenerse en refriger ación. 
6.15.2  Ahumados 
6.15.2.1  En el salado en seco, el producto debe regresarse al área de refrigeración o pasarse a la cámara 
de ahumado inmediatamente después de la aplicación de la sal. 
6.15.2.2  Cuando el proceso de ahumado se lleve a cabo con m adera, ésta no debe ser resinosa y debe 
estar exenta de polvo y sustancias perjudiciales. N o debe emplearse para la producción de humo, madera  que 
haya sido pintada, barnizada o que haya sido expues ta a químicos. 
6.15.2.3  Los productos ahumados no deben presentar manchas rojizas o verdosas, de origen micótico o 
microbiano. 
6.15.2.4  El secado después del ahumado debe llevarse a cabo  a temperaturas de refrigeración. 
6.15.2.5  El producto ahumado debe mantenerse en refrigeraci ón a una temperatura máxima de 4° C o en 
congelación a una temperatura máxima de -18° C. 
6.15.2.6  El pescado sometido al proceso de ahumado en calie nte y aquel con sabor a humo, para ser 
empacado, necesita calentarse continuamente a una t emperatura interna de cuando menos 63ºC en todo el 
pescado, por un mínimo de 30 minutos y salarse, par a contener no menos de 3,0 por ciento de sal en bas e 
húmeda en el producto terminado. En el caso de ser empacado al vacío en atmósfera modificada y control ada 
necesita ser salado, para contener no menos de 3,5 por ciento de sal en base húmeda en el producto 
terminado. El contenido de sal puede disminuir al 3 ,0 por ciento, siempre y cuando la temperatura a qu e se 
someta no sea menor de 82ºC, durante 5 minutos o re lación equivalente. 
6.15.2.7  El pescado sometido al proceso de ahumado en frío o aquél con sabor ahumado, que no es 
empacado al vacío, debe ser salado en salmuera o sa lado en seco, para contener cuando menos 3,5 por 
ciento de sal en base húmeda en el producto termina do. Sin embargo, cuando dicho pescado contiene no 
menos de 100 mg/kg de nitrito de sodio debe contene r no menos de 3,0 por ciento de sal en base húmeda en 
el producto terminado. 
Cuando este tipo de producto se congela inmediatame nte después del ahumado y el enfriamiento, y 
permanece en ese estado a lo largo de todo el almac enamiento, distribución y comercialización subsecue ntes, 
debe contener no menos de 2,5 por ciento de sal en base húmeda en el producto terminado. 
6.15.2.8  El pescado sometido a proceso de ahumado en frío y  aquél con sabor a ahumado para ser 
empacado al vacío, con atmósfera modificada o contr olada, debe ser salado en salmuera o salado en seco , 
para contener cuando menos 3,0 por ciento de sal en  base húmeda en el producto terminado y no menos de  
100 mg/kg de nitrito de sodio. Si no se utiliza el nitrito de sodio, el contenido de sal en base húmed a en el 
producto terminado debe ser cuando menos de 3,5 por  ciento. 
6.15.2.9  Los límites de contenido de sal citados en los pun tos 6.15.2.6, 6.15.2.7 y 6.15.2.8 pueden 
substituirse por cualquier combinación de sal y otr os aditivos permitidos que permitan obtener una Aw menor 
a 0,95 en la temperatura de almacenaje. 
6.15.3  Salados y secos-salados 
6.15.3.1  Generales. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
I)  Deben almacenarse en un lugar seco, protegido cont ra la contaminación y bien ventilado. 
II)  El producto no debe presentar las siguientes carac terísticas: manchas rojizas o rosas, tejido muscula r 
blando, disgregación de su fibra y olor putrefacto.  
6.15.3.2  Del salado. 
I)  Las salmueras utilizadas en los productos deben es tar preparadas con agua potable. 
II)  Se debe controlar con regularidad la salmuera con un salinómetro y mantener su concentración al nivel  
necesario añadiendo sal sólida. 
III)  Si el pescado ha de permanecer en salmuera para al canzar la maduración, la primera debe 
conservarse limpia, eliminando la espuma grasa que se forme. 
6.15.3.3  Salazón en seco. 
I)  Debe efectuarse en una cámara fría a una temperatu ra inferior de 10° C. 
II)  En el salado en seco, el producto debe regresarse al área de refrigeración inmediatamente después de 
la aplicación de la sal. 
6.15.3.4  Desalazón. 
I)  Cuando sea necesario desalar el producto debe empl earse agua potable, que se cambiará con la 
frecuencia necesaria, hasta alcanzar la concentraci ón deseada. 
6.15.3.5  Secado. 
I)  El secado debe prevenir la formación de la toxina de Clostridium botulinum. 
7. Especificaciones sanitarias 
7.1  Los productos objeto de esta norma, deben ajustars e a las siguientes especificaciones: 
7.1.1  Sensoriales. 
7.1.1.1  Productos frescos, refrigerados y congelados 
I)  Los pescados frescos deben cumplir con las siguien tes características: 
I).1  Las escamas, en las especies que las posean, deben  estar bien unidas entre sí y fuertemente 
adheridas a la piel; 
I).2  La piel debe estar húmeda, bien adherida a los tej idos subyacentes; 
I).3  La mucosidad, en las especies que la posean, debe ser acuosa y transparente; 
I).4  Los ojos deben ocupar toda la cavidad orbitaria, s er transparentes, brillantes y salientes. El iris n o 
debe estar manchado de rojo (sufusión); 
I).5  Los opérculos deben estar rígidos y ofrecer resist encia a su apertura; 
I).6  Las branquias deben presentar un color brillante d e rosado al rojo intenso, húmedas y brillantes, con  
olor característico y suave; 
I).7  El abdomen debe ser terso, sin diferencia externa con la línea ventral; al corte, los tejidos deben 
ofrecer resistencia; con el poro anal cerrado; las vísceras de colores vivos y bien diferenciados; las  paredes 
interiores brillantes, los vasos sanguíneos llenos y resistentes a la presión digital; y con olor cara cterístico y 
suave; 
I).8  Los músculos deben presentar elasticidad marcada, firmemente adheridos a los huesos y que no 
desprendan de ellos al ejercer presión digital; con  el color brillante natural característico, al prim er corte. 
II)  Los crustáceos muertos, frescos, deben presentar l as siguientes características: 
II).1  El exoesqueleto debe estar ligeramente húmedo, bri llante y consistente; 
II).2  El cuerpo debe estar rígido; 
II).3  Los apéndices deben ser resistentes y firmes; 
II).4  El olor debe ser el característico de cada especie . 
III)  Los crustáceos vivos, deben presentar las siguient es características:       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
III).1  El caparazón debe estar húmedo y brillante; 
III).2  La movilidad se debe presentar a la menor excitaci ón. 
IV)  Los moluscos cefalópodos frescos deben presentar l as siguientes características: 
IV).1  La piel debe estar lisa y húmeda, sin manchas sang uinolentas o extrañas a la especie; 
IV).2  Los músculos deben presentar consistencia y elasti cidad; 
IV).3  El color debe ser el característico de cada especi e; 
IV).4  El olor debe ser el característico. 
V)  Los moluscos bivalvos y gasterópodos vivos deben p rovenir de las áreas determinadas en el numeral 
6.5.1.1 y cumplir con las siguientes característica s: 
V).1  Tener valvas cerradas. Cuando presenten valvas abi ertas, éstas deben cerrarse al ser golpeadas 
suavemente. En el interior de las valvas debe haber  agua cristalina. Los moluscos gasterópodos, sumerg idos 
en agua tibia, deben mostrar señales de vida; 
V).2  Presentar el olor característico; 
V).3  Contar con músculos húmedos, bien adheridos a las valvas y tener aspecto esponjoso, de color 
cenizo claro en los ostiones y amarillento en las a lmejas y mejillones; 
7.1.2  Físicas. 
7.1.2.1  Materia extraña. 
I)  Los productos de la pesca frescos, refrigerados y congelados y procesados, deben estar exentos de 
materia extraña. 
7.1.3  Químicas. 
7.1.3.1  Productos frescos, refrigerados y congelados (Part e comestible) 
ESPECIFICACION ESPECIES LIMITE MAXIMO 
Nitrógeno amoniacal  Pescados (en músculo) 35 mg/100 g 
Dióxido de azufre Crustáceos 100 mg/kg como SO 2 
pH de la carne Moluscos 6,0 – 6,5 
Histamina  Peces de las familias: Clupeidae, Scombridae, 
Scombresocidae, Pomatomidae y Coryphaenidae. Tales 
como atún, bonito, macarela y sardinas. 100 mg/kg 
 
7.1.3.2  Productos de la pesca procesados 
ESPECIFICACIONES LIMITE MAXIMO (mg/kg) 
Histamina * 100 
 * Para especies de las familias Scombridae , Clupeidae , Coryphenidae , Scombresocidae y Pomatomidae . 
7.1.4  Fisicoquímicas 
7.1.4.1  Productos de la pesca procesados 
I) Salados y secos-salados 
Especificaciones Límite máximo 
Aw 0,85 
 
7.1.5  Microbiológicas. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
7.1.5.1  Productos frescos, refrigerados y congelados (Part e comestible) 
ESPECIFICACION ESPECIES LIMITE MAXIMO 
Pescados y crustáceos 400 NMP/g 
Moluscos bivalvos 230 NMP/100g de carne y líquido v alvar  Coliformes fecales 
Moluscos cefalópodos y gasterópodos  230 NMP/100g de carne 
Moluscos bivalvos Ausente en 50 g Vibrio cholerae O:1  y no 
O:1 Demás productos de la pesca* Ausente en 50 g 
Salmonella  spp Todas Ausente en 25 g 
Vibrio parahaemolyticus *  Moluscos bivalvos y crustáceos 10 4 UFC/g 
Vibrio vulnificus * Moluscos bivalvos No detectable 
Listeria monocytogenes* Todas Ausente en 25 g 
Clostridium botulinum* Todas (sólo en productos 
preenvasados al vacío) Ausente 
Staphylococcus aureus Todas 1000 UFC/g 
Enterotoxinas 
estafilococcicas * Todas Negativo 
* Bajo situaciones de emergencia sanitaria la Secre taría de Salud sin perjuicio de las atribuciones de  otras 
Dependencias del Ejecutivo Federal, determinará los  casos en los que habrá de identificar la presencia  del patógeno  o la 
toxina. 
 
7.1.5.2  Productos de la pesca procesados 
I) Estériles comercialmente 
ESPECIFICACIONES LIMITE MAXIMO 
Termófilos anaerobios esporulados  Negativo 
Mesófilos anaerobios esporulados  Negativo 
Termófilos aerobios esporulados  Negativo 
Mesófilos aerobios esporulados  Negativo 
Toxina botulínica* Ausente en todo el contenido del  envase 
Enterotoxina estafilocóccica* Ausente en todo el co ntenido del envase 
* Bajo situaciones de emergencia sanitaria la Secre taría de Salud, sin perjuicio de las atribuciones d e otras 
dependencias del Ejecutivo Federal, determinará los  casos para identificar la presencia de esta toxina . 
II) Pasteurizados y envasados en recipientes de cie rre hermético. 
ESPECIFICACIONES LIMITE MAXIMO 
Salmonella spp Ausente en 25 g 
Enterotoxina estafilocóccica * Negativo 
Coliformes fecales ‹ 3 NMP/g 
Listeria monocytogenes *  Ausente en 25 g 
Clostridium botulinum * Ausente       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Vibrio cholerae O:1* Ausente en 50 g 
* Bajo situaciones de emergencia sanitaria la Secre taría de Salud, sin perjuicio de las atribuciones d e otras 
dependencias del Ejecutivo Federal, determinará los  casos para identificar la presencia del patógeno o  la toxina. 
 
III) Ahumados 
ESPECIFICACIONES LIMITE MAXIMO 
Coliformes fecales  < 230 NMP/g 
Salmonella spp   Ausente en 25 g 
Enterotoxina estafilocóccica *  Negativo 
Listeria monocytogenes *  Ausente en 25 g 
Clostridium botulinum *  Ausente 
Vibrio cholerae O:1*  Ausente en 50 g 
* Bajo situaciones de emergencia sanitaria la Secre taría de Salud, sin perjuicio de las atribuciones d e otras 
Dependencias del Ejecutivo Federal, determinará los  casos para identificar la presencia del patógeno o  la toxina. 
 
IV) Salados y secos-salados 
Especificaciones Límite máximo 
Enterotoxina estafilocóccica* Negativo 
Salmonella spp Ausente en 25 g 
* Bajo situaciones de emergencia sanitaria la Secre taría de Salud, sin perjuicio de las atribuciones d e otras 
Dependencias del Ejecutivo Federal, determinará los  casos para identificar la presencia de esta toxina . 
 
V) Semipreparados 
Producto Enterotoxina 
estafilocóccica * Salmonella spp  
 Coliformes fecales 
 Vibrio cholerae 
O:1 * 
Crudos o 
precocidos, 
empanizados o 
rebozados 
(capeados), 
empanadas y  
congelados Negativo Ausente en 25 g ‹ 230 NMP/g 
 Ausente en 50 g 
Crudos, 
marinados o en  
salmuera Negativo Ausente en 25 g ‹ 230 NMP/g Ausente en 50 g 
 
* Bajo situaciones de emergencia sanitaria la Secre taría de Salud, sin perjuicio de las atribuciones d e otras 
Dependencias del Ejecutivo Federal, determinará los  casos para identificar la presencia del patógeno o  la toxina. 
VI) Emulsionados 
Especificaciones Límite máximo 
Enterotoxina estafilocóccica *  Negativo 
Salmonella spp   Ausente en 25 g 
Coliformes fecales  < 230 NMP/g 
* Bajo situaciones de emergencia sanitaria la Secre taría de Salud, sin perjuicio de las atribuciones d e otras 
Dependencias del Ejecutivo Federal, determinará los  casos para identificar la presencia de la toxina. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
 
7.1.6  Parásitos. 
7.1.6.1  Durante su producción y antes del despacho al cons umo humano, los pescados deben ser 
sometidos a un examen a contraluz para detectar par ásitos visibles. 
7.1.6.2  Los pescados no deben exceder los siguientes límit es: 
ESPECIFICACION LIMITE MAXIMO 
Parásitos del género G nathostoma y Paragonimus (Sólo en 
peces de agua dulce o salobre)  Ausente 
Parásitos con cápsula >3 mm de diámetro 2/kg de uni dad de muestra 
Parásitos no encapsulados > 10 mm de longitud 1/kg de unidad de muestra 
 
7.1.7  Biotoxinas marinas. 
ESPECIFICACION ESPECIES LIMITE MAXIMO 
Toxina amnésica de moluscos (Acido domoico)* Molusc os 20 µg/g en carne 
Toxina neurotóxica de moluscos (Brevitoxina) Molusc os Negativa 
Toxina paralizante de moluscos (Saxitoxina) Molusco s 80 µg/100 g de carne 
Toxina diarreica de Moluscos (Bioensayo en ratón)* Moluscos Negativa 
* Bajo situaciones de emergencia sanitaria la Secre taría de Salud sin perjuicio de las atribuciones de  otras 
Dependencias del Ejecutivo Federal, determinará los  casos en los que habrá de identificar la presencia  de la toxina. 
 
7.1.8 Metales pesados. 
7.1.8.1 Productos frescos, refrigerados y congelados (parte  comestible) 
ESPECIFICACION ESPECIES LIMITE MAXIMO 
Arsénico total  Crustáceos y Moluscos bivalvos 80 m g/kg 
Cadmio (Cd) Moluscos 
Otras especies 1,0 mg/kg 
0,5 mg/kg 
Mercurio (como Hg) Todas 
Pescados como atún, marlín, mero, y bonito 
Otras especies 0,5 mg/kg 
1,0 mgkg 
0,5 mg/kg 
Pescados y crustáceos 0,5 mg/kg Plomo (Pb) 
Moluscos 1 mg/kg 
(Continúa en la Segunda Sección) 
 
 
 
 
 
 
       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
 
SEGUNDA SECCION 
PODER EJECUTIVO 
SECRETARIA DE SALUD 
PROYECTO de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-242-SSA 1-2005 , Productos y servicios. Productos de la 
pesca frescos , refrigerados , congelados y procesados. Especificaciones sanitari as y métodos de prueba (Continúa de 
la Primera Sección) 
(Viene de la página 83 de la Primera Sección) 
7.1.8.2  Productos de la pesca procesados 
ESPECIFICACIONES LIMITE MAXIMO (mg/kg) 
Cadmio (Cd)  0,5 
Mercurio (Hg) 0,5 
Plomo (Pb) 1,0 
Estaño (Sn)* 100,0 
* Unicamente para los productos enlatados 
 
7.1.9  Plaguicidas. 
7.1.9.1  El proveedor de las materias primas, las unidades de transporte y los establecimientos en donde 
se procesen o comercialicen los productos objeto de  esta Norma, cada uno en el ámbito de su 
responsabilidad, sólo podrán utilizar plaguicidas a utorizados por la Secretaría en el marco de coordin ación de 
la CICOPLAFEST. 
7.1.10  Residuos de medicamentos veterinarios. 
7.1.10.1  Los productos objeto de esta Norma deben cumplir c on las especificaciones establecidas para 
medicamentos veterinarios conforme a los ordenamien tos aplicables. 
7.1.11  Aditivos para alimentos 
7.1.11.1 En los productos de la pesca frescos, refrigerados y congelados sólo se permite emplear los 
aditivos enlistados a continuación, los cuales no d eben pasar de los límites indicados. 
ADITIVO ESPECIES LIMITE MAXIMO (mg/kg) 
Ascorbato de potasio; 
Ascorbato de sodio;  Pescados y crustáceos 1000 * 
Acido cítrico  Crustáceos BPF 
Etilendiamino tetracetato disódico (EDTA)  Crustáce os 250 
Fosfato tricálcico  Pescados 5000 **  
Metabisulfito de sodio; 
Metabisulfito de potasio; Crustáceos 100 
Polifosfato tetrapotásico;  Pescados 5000  **  
Pirofosfato tetrasódico; Pescados 5000 ** 
Polifosfato de sodio; Pescados 5000 ** 
Fosfato monopotásico; Pescados 5000 ** 
Fosfato monosódico; Pescados 5000 ** 
Sulfito de sodio; 
Sulfito de potasio; Crustáceos 100 Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Trifosfato pentapotásico; Pescados 5000 ** 
Trifosfato pentasódico; Pescados 5000 ** 
* Expresado como ácido ascórbico. 
** Expresado como P 2O5 solos o combinados. 
7.1.11.2 En los productos de la pesca procesados sólo se per mite emplear los aditivos enlistados a 
continuación, los cuales no deben pasar de los lími tes indicados: 
I)  En la elaboración de los productos esterilizados c omercialmente y envasados en recipientes de cierre 
hermético, únicamente se permite el empleo de los s iguientes aditivos: 
Aditivo PRODUCTO LIMITE MAXIMO 
Pescados 20 g/kg solos o mezclados Acetato de almidón 
Atún y bonita 20 g/kg solos o mezclados 
Pescados  BPF Acido acético glacial 
Atún y bonita  BPF 
Pescados  20 g/kg solos o mezclados Acido algínico 
Atún y bonita  20 g/kg solos o mezclados 
Cangrejo  BPF 
Pescados  BPF Acido cítrico 
Atún y bonita  BPF 
Cangrejo  10 g/kg solos o mezclado 
expresados como P 2O5 Acido fosfórico 
Camarones  850 mg/kg de producto final 
Pescados  BPF Acido láctico 
Atún y bonita  BPF 
Pescados  60 g/kg solos o mezclados Adipato acetilado de dialmidón  
Atún y bonita  60 g/kg solos o mezclados 
Pescados  20 g/kg solos o mezclados Agar 
Atún y bonita  20 g/kg solos o mezclados 
Pescados  20 g/kg solos o mezclados Alginato de amonio 
Atún y bonita 20 g/kg solos o mezclados 
Pescados  20 g/kg solos o mezclados Alginato de calcio 
Atún y bonita  20 g/kg solos o mezclados 
Pescados  20 g/kg solos o mezclados Alginato de potasio 
Atún y bonita  20 g/kg solos o mezclados 
Pescados  20 g/kg solos o mezclados Alginato de sodio 
Atún y bonita  20 g/kg solos o mezclados 
Pescados  20 g/kg solos o mezclados Almidón hidroxipropilado 
Atún y bonita  20 g/kg solos o mezclados 
Pescados  2,5 g/kg Carboximetilcelulosa sódica 
Atún y bonita  2,5 g/kg       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Pescados  20 g/kg solos o mezclados Carragenina 
Atún y bonita  20 g/kg solos o mezclados 
Pescados  60 g/kg solos o mezclados Dialmidón glicerol 
Atún y bonita  60 g/kg solos o mezclados 
Pescados  60 g/kg solos o mezclados Dialmidón glicerol 
hidroxipropilado Atún y bonita  60 g/kg solos o mezclados 
Cangrejo  250 mg/kg Etilendiamino tetracetato 
disódico-cálcico Camarones final 250 mg/kg de producto 
Pescados  60 g/kg solos o mezclados Fosfato de dialmidón 
Atún y bonita  60 g/kg solos o mezclados 
Pescados  60 g/kg solos o mezclados Fosfato acetilado de dialmidón  
Atún y bonita  60 g/kg solos o mezclados 
Pescados  60 g/kg solos o mezclados Fosfato de hidroxipropil dialmidón 
Atún y bonita  60 g/kg solos o mezclados 
Pescados  60 g/kg solos o mezclados Fosfato de monoalmidón 
Atún y bonita  60 g/kg solos o mezclados 
Pescados  60 g/kg solos o mezclados Glicerol de dialmidón acetilado 
Atún y bonita  60 g/kg solos o mezclados 
Glutamato monosódico Cangrejo  500 mg/kg 
Pescados  20 g/kg solos o mezclados Goma de algarrobo 
Atún y bonita  20 g/kg solos o mezclados 
Pescados  20 g/kg solos o mezclados Goma guar 
Atún y bonita  20 g/kg solos o mezclados 
Pescados  20 g/kg solos o mezclados Goma tragacanto 
Atún y bonita  20 g/kg solos o mezclados 
Pescados  20 g/kg solos o mezclados Goma xantano 
Atún y bonita  20 g/kg solos o mezclados 
L- glutamato monosódico  500 mg/kg 
Pectinas y las siguientes sales: Pescados  2,5 g/kg  
Pectato de amonio, de calcio, 
de potasio o de sodio Atún y bonita 
 2,5 g/kg 
 
Cangrejo  10 g/kg solos o mezclados 
expresados como P 2O5 Pirofosfato disódico 
Pirofosfato tetrasódico 
Atún y bonita  10 g/kg expresados como P 2O5 
combinados, expresados como 
P2O5 
Sulfato doble de aluminio y potasio    Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Tartrazina Camarones 
 30 mg/kg de producto final, solos 
o mezclados 
Amarillo ocaso FCF Camarones  30 mg/kg de producto final, solos 
o mezclados 
II) En los productos de la pesca ahumados se permite el  uso de los siguientes conservadores, dentro de 
los límites señalados a continuación: 
ADITIVO LIMITE MAXIMO 
Nitrito y nitrato de sodio (expresados como nitrito  de 
sodio) 156 mg/kg 
Sorbato de potasio 0,1% 
 
III)  En la elaboración de los productos de la pesca sal ados y secos-salados, únicamente se permite el 
empleo de los siguientes aditivos: 
ADITIVO PRODUCTO LIMITE MAXIMO 
Acido sórbico; y las siguientes 
sales: 
Sorbato de calcio, 
Sorbato de potasio, 
Sorbato de sodio Pescado salad o y pescado seco y 
salado 
 200 mg/kg del producto final solos 
o mezclados, expresados como 
ácido sórbico. 
 
 
IV)  En la elaboración de los productos de la pesca sem ipreparados: crudos o precocidos, empanizados o 
rebozados y congelados, únicamente se permite el em pleo de los siguientes aditivos: 
ADITIVO PRODUCTO LIMITE MAXIMO 
Acetato de almidón En el rebozado o empanado BPF 
Acido ascórbico o sus sales de 
sodio o de potasio En filetes y carne de pescado 
picada BPF 
Acido cítrico o sus sales de sodio o 
potasio Carne de pescado picada 
En el rebozado o empanado BPF 
Acido láctico En el rebozado o empanado BPF 
Acido L-glutámico En el rebozado o empanado BPF 
Adipato acetilado de dialmidón  En el rebozado o em panado BPF 
Alginato de calcio En filetes y carne de p escado 
picada BPF 
Alginato de sodio En el rebozado o empanado BPF 
Almidón hidroxipropilado. En el rebozado o empanado  BPF 
Almidón oxidado En el rebozado o empanado BPF 
Almidones tratados con ácidos En el rebozado o empa nado BPF 
Almidones tratados con álcalis En el rebozado o emp anado BPF 
Beta caroteno sintético En el rebozado o empanado 1 00 mg/kg, solos o en 
combinación       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Beta-apo-8´-carotenal En el rebozado o empanado 100  mg/kg, solos o en 
combinación 
Carbonato de amonio En el rebozado o empanado BPF 
Carbonato de potasio En el rebozado o empanado BPF 
Carbonato de sodio En el rebozado o empanado BPF 
Carbonato de amonio hidrogenado  En el rebozado o empanado BPF 
Carbonato de potasio hidrogenado  En el rebozado o empanado BPF 
Carbonato de sodio hidrogenado  En el rebozado o em panado BPF* 
Carboximetilcelulosa de sodio  Carne de pescado pic ada 
En el rebozado o empanado BPF 
Carragenina Carne de pescado picada 
En el rebozado o empanado BPF 
Color Caramelo clase I En el rebozado o empanado BP F 
Extracto de annato (extracto 
De semillas de Bixa orellana ) En el rebozado o empanado 20 mg/kg expresada como b ixina 
Fosfato de aluminio y sodio En el rebozado o empana do 1g/kg, solos o en combinación, 
expresados como P 2O5 
Fosfato de dialmidón En el rebozado o empanado BPF 
Fosfato acetilado de dialmidón  En el rebozado o em panado BPF 
Fosfato de dialmidón fosfatado En el rebozado o emp anado BPF 
Fosfato de hidroxipropil dialmidón  En el rebozado o empanado BPF 
Fosfato de monoalmidón En el rebozado o empanado BP F 
Fosfato de calcio dihidrogenado En el rebozado o em panado 1g/kg, solos o en combinación, 
expresados como P 2O5 
Fosfato de potasio dihidrogenado  En filetes y carne de pescado 
picada 10 g/kg solos o mezclados 
expresados como P 2O5 (con 
inclusión de los fosfatos naturales)  
Fosfato de sodio dihidrogenado En filetes y carne d e pescado 
picada 10 g/kg solos o mezclados 
expresados como P 2O5 
(con inclusión de los fosfatos 
naturales) 
Fosfato de calcio hidrogenado  En el rebozado o emp anado 1g/kg, solos o en combinación, 
expresados como P 2O5 
Glutamato monopotásico En el rebozado o empanado BP F 
Goma de algarrobo Carne de pescado picada 
En el rebozado o 
empanado BPF 
Goma guar Carne de pescado picada 
En el rebozado o empanado BPF 
Goma xantano Carne de pescado picada 
En el rebozado o empanado BPF Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Hidroxipropil metil celulosa En el rebozado o empan ado BPF 
Hidroxipropil celulosa En el rebozado o empanado BP F 
Lecitina En el rebozado o empanado BPF 
Metil celulosa Carne de pescado picada 
En el rebozado o empanado BPF 
Metil etil celulosa En el rebozado o empanado BPF 
Mono y diglicéridos En el rebozado o empanado BPF 
Oleorresina de paprika En el rebozado o empanado BP F 
Palmitato de ascorbilo En filetes y carne de pescado 
picada 1g/kg, expresados como ácido 
cítrico, solo o en combinación con 
ácido ascórbico. 
Pectinas Carne de pescado picada 
En el rebozado o empanado BPF 
Pirofosfato disódico En el rebozado o empanado 1g/k g, solos o en combinación, 
expresados como P 2O5 
Pirofosfato tetrapotásico En filetes y carne de pescado 
picada 10 g/kg solos o mezclados 
expresados como P 2O5 (con 
inclusión de los fosfatos naturales)  
Pirofosfato tetrasódico En filetes y carne de pescado 
picada 10 g/kg solos o mezclados 
expresados como P 2O5 (con 
inclusión de los fosfatos naturales)  
Polifosfato de sodio En filetes y carne de pescado 
picada 10 g/kg solos o mezclados 
expresados como P 2O5 (con 
inclusión de los fosfatos naturales)  
Trifosfato pentapotásico En filetes y carne de pescado 
picada 10 g/kg solos o mezclados 
expresados como P 2O5 (con 
inclusión de los fosfatos naturales)  
Trifosfato pentasódico En filetes y carne de pescado 
picada 10 g/kg solos o mezclados 
expresados como P 2O5 (con 
inclusión de los fosfatos naturales)  
 
V)  En la elaboración de los productos de la pesca emu lsionados, únicamente se permite el empleo de los 
siguientes aditivos: 
ADITIVO LIMITE MAXIMO 
Acetato de almidón  BPF 
Acido algínico  BPF 
Acido ascórbico y su sal de sodio  BPF 
Acido cítrico  BPF 
Acido eritórbico  BPF 
Acido L-glutámico  BPF 
Acido sórbico y sus sales de sodio y potasio 1 g/kg  la suma de los conservadores no podrá ser 
mayor a 1 g/kg 
Adipato acetilado de dialmidón  BPF 
Agar BPF       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Alginato de amonio BPF 
Alginato de calcio BPF 
Alginato de potasio BPF 
Alginato de sodio BPF 
Almidón hidroxipropilado BPF 
Carragenina BPF 
Dialmidón glicerol Hidroxipropilado 60 g/kg solos o  mezclados 
Etilendiamino tetracetato disódico cálcico 75 mg/kg  en producto final 
Fosfato de dialmidón BPF 
Fosfato acetilado de dialmidón  BPF 
Fosfato de hidroxipropil dialmidón  BPF 
Fosfato de monoalmidón BPF 
Glicerol de dialmidón acetilado 60 g/kg solos o mez clados 
Glutamato monosódico BPF 
Goma de algarrobo BPF 
Goma guar BPF 
Goma tragacanto BPF 
Goma xantano BPF 
Nitratos o nitritos de sodio o potasio 0,15 g/kg ex presados como nitritos 
Pirofosfato disódico 5 g/kg solos o mezclados expre sados como P 2O5 
Pirofosfato tetrasódico 5 g/kg solos o mezclados, e xpresados como P 2O5 
Rojo allura AC y sus lacas 100 mg/kg de producto final 
Mezcla de tocoferoles concentrados 0,05 g/kg 
 
7.1.12  Nutrimentales. 
Los productos que hayan sido modificados en su comp osición deben sujetarse a lo establecido en la 
NOM-086-SSA1-1994, señalada en el apartado de refer encias. 
8. Clasificación de áreas 
8.1  Para efectos de esta Norma las áreas se clasifican  de la siguiente manera, la cual debe demostrarse 
mediante estudios sanitarios: 
8.1.1  Area aprobada. 
8.1.1.1  Aquélla que cumple con las especificaciones siguie ntes: 
MICROORGANISMOS LIMITE MAXIMO 
Bacterias coliformes fecales La mediana o el promed i o geométrico del NMP del agua no excede 
de 14 NMP/100 ml y no más del 10% de las muestras e xcede de  43 
NMP/100ml para la prueba de dilución decimal de 5 t ubos con 3 
diluciones o 49 NMP/100 ml para la prueba de diluci ón decimal de 3 
tubos.  
 
8.1.1.2  El área aprobada no debe encontrarse bajo los caso s mencionados en los numerales 8.1.5.1.1, 
8.1.5.1.2., 8.1.5.1.3 y 8.1.5.1.4. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
8.1.2  Area aprobada condicionalmente. 
8.1.2.1  Aquella que cumple con los siguientes criterios: 
I)  Las áreas de producción que están sujetas a contam inación microbiológica intermitente, son las que se  
pueden clasificar como aprobadas condicionalmente, esta alternativa se puede utilizar cuando existe in terés 
sobre un área que esté afectada por eventos de cont aminación predecibles en tiempo y la cosecha de 
moluscos bivalvos sea destinada a venta directa en determinadas épocas del año. Así también, la calida d 
sanitaria del área puede estar afectada por poblaci ones estacionales, fuentes de contaminación no punt uales 
o por el uso esporádico de muelles o de puertos. 
8.1.2.2  Por lo anterior, el área debe estar sujeta a un pr ograma de manejo que contenga los siguientes 
puntos: 
I)  Evaluación de fuentes potenciales de contaminación  en términos de sus efectos en el agua y en el área . 
II)  Monitoreo rutinario. 
III)  Disponibilidad de instalaciones y condiciones de o peración para el tratamiento de aguas residuales 
descargadas directa o indirectamente por el efluent e en el área. 
IV)  Condiciones para la apertura o clausura. Esta área  está sujeta a reaperturas o clausuras, las cuales 
están determinadas por los resultados de los anális is bacteriológicos establecidos para un área aproba da y 
prohibida respectivamente. 
8.1.3  Area restringida. 
8.1.3.1  Aquella que cumple con las especificaciones siguie ntes: 
MICROORGANISMOS LIMITE MAXIMO 
Bacterias coliformes fecales La mediana o el promedio geométrico del NMP del agu a, no excede 
de 88 NMP/100 ml y no más del 10% de las muestras e xcede de 260 
NMP/100ml para la prueba de dilución decimal de 5 t ubos o 300 
NMP/100 ml para la prueba de dilución decimal de 3 tubos.  
 
8.1.3.2  El área restringida no debe encontrarse bajo los c asos mencionados en los numerales 8.1.5.1.1, 
8.1.5.1.2. , 8.1.5.1.3 y 8.1.5.1.4. 
8.1.3.3  Los moluscos cosechados en áreas restringidas debe n ser reinstalados o depurados o sometidos a 
un tratamiento térmico u otro proceso que elimine o rganismos patógenos. 
8.1.4  Area condicionalmente restringida 
8.1.4.1  Aquella que cumple con: 
I)  Las especificaciones de área restringida cuando se  encuentra en condición abierta. 
II)  Las condiciones establecidas para área prohibida c uando está en condición cerrada. 
8.1.4.2  Los moluscos bivalvos provenientes de esta área de ben reinstalarse o depurarse o ser sometidos a 
un tratamiento térmico u otro proceso que elimine o rganismos patógenos. 
8.1.5  Area prohibida. 
8.1.5.1  Aquella en la cual la calidad del agua rebase los límites máximos establecidos para el área 
restringida y en los siguientes casos: 
I)  Que estén contaminadas con aguas residuales, domés ticas, municipales, industriales, agrícolas, de 
embarcaciones, plataformas u otras instalaciones la custres o marinas; 
II)  Que estén afectadas por derrames de materiales que  contengan sustancias tóxicas como 
consecuencias de contingencias; 
III)  Que estén afectadas con residuos de material radia ctivo; 
IV)  Que estén afectadas por marea roja o biotoxinas na turales, diferentes a las presentes en marea roja, y       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
V)  Que estén sujetas a veda sanitaria o que estén con taminadas por otras fuentes no contempladas en 
esta Norma. 
9. Muestreo 
9.1  El procedimiento de muestreo para los productos ob jeto de esta norma, debe sujetarse a lo que 
establece la Ley General de Salud y otras disposici ones que al efecto se emitan. 
10. Métodos de prueba 
10.1  Para la verificación oficial de las especificacion es sanitarias que se establecen en esta norma se 
deben aplicar los métodos de prueba señalados en el  apéndice normativo A. 
11. Etiquetado 
La información sanitaria que debe figurar en la eti queta de los productos preenvasados objeto de esta 
norma, además de cumplir con las NOM-051-SCFI-1994 o NOM-084-SCFI-1994, señaladas en el apartado de 
referencias, según corresponda, debe sujetarse a lo  siguiente: 
11.1  Generales 
11.1.1  Los productos destinados a ser comercializados en el mercado nacional, deben ostentar una 
etiqueta con la información a que se refiere esta n orma en idioma español, independientemente de que 
también pueda estar en otros idiomas, en cuyo caso los caracteres deben ser al menos iguales en tamaño , 
proporcionalidad tipográfica y colores idénticos o similares a aquellos en los que se presente la info rmación en 
otros idiomas. 
11.1.2  Las etiquetas que ostenten los productos preenvasa dos deben fijarse de manera tal que 
permanezcan disponibles hasta el momento de su uso y consumo bajo condiciones normales de manejo, y 
deben aplicarse por presentación individual, envase  múltiple o colectivo, según corresponda, con carac teres 
claros, visibles, indelebles y en colores contrasta ntes, fáciles de leer por el consumidor en circunst ancias 
normales de compra. 
11.1.3  Cuando en las etiquetas se declaren u ostenten de forma escrita, gráfica o descriptiva, que los 
productos, su aplicación, ingredientes o cualquier otra característica, están recomendados, respaldado s o 
aceptados por centros de investigación, asociacione s, entre otros, éstos deben contar con reconocimien to 
nacional o internacional de su experiencia y estar calificados para dar opinión sobre la información d eclarada. 
Deben contar con el sustento técnico respectivo, qu e debe estar a disposición de la Secretaría en el m omento 
que lo solicite, dichas declaraciones deben sujetar se a lo siguiente: 
11.1.3.1  La leyenda debe describir claramente la caracterís tica referida; 
11.1.3.2  Estar precedida por el símbolo o nombre del organi smo; y 
11.1.3.3  Figurar con caracteres claros y fácilmente legible s. 
11.2  Específicas. 
11.2.1  El nombre o la denominación del producto preenvasa do debe corresponder con lo establecido en 
los ordenamientos legales específicos. A falta de e llos, debe identificarse con el nombre de uso común  o en 
su defecto por su composición y naturaleza del prod ucto. 
11.2.2  Cuando el producto haya sufrido alguna modificació n en su composición nutrimental, la 
denominación debe corresponder a la establecida en la NOM-086-SSA1-1995, señalada en el apartado de 
referencias. 
11.2.3  En el caso de que el producto haya sido objeto de tratamiento térmico, esta condición puede 
señalarse en cualquier parte de la etiqueta. Si el producto ha sido sujeto a otro tipo de tratamiento se puede 
indicar el nombre de éste. 
11.2.4  Lista de ingredientes. 
11.2.4.1  En la etiqueta de los productos debe figurar la li sta de ingredientes, la cual puede eximirse 
cuando se trate de productos de un solo ingrediente . 
11.2.4.2  La lista de ingredientes debe ir encabezada o prec edida por el término “ingredientes:”. 
11.2.4.3  Los ingredientes deben presentarse por orden cuant itativo decreciente (m/m). 
11.2.4.4  Cuando se trate de un ingrediente compuesto y éste  constituya el 25% o más, debe ir 
acompañado de una lista entre paréntesis de sus ing redientes constitutivos por orden cuantitativo decr eciente 
(m/m). Cuando constituya menos de ese porcentaje se  debe declarar el ingrediente compuesto, los aditiv os Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
que desempeñan una función tecnológica en la elabor ación del producto y aquellos ingredientes o aditiv os 
que se asocien a reacciones alérgicas. 
11.2.4.5  Se debe indicar en la lista de ingredientes el agu a añadida por orden de predominio, excepto 
cuando ésta forme parte de un ingrediente compuesto  y declarado como tal en la lista y la que se utili ce en los 
procesos de cocción y reconstitución. No es necesar io declarar el agua u otros ingredientes volátiles que se 
evaporan durante la fabricación. 
11.2.4.6  En la lista de ingredientes debe emplearse el nomb re específico de los mismos, para el caso de 
las especies de los productos de la pesca empleadas , debe declararse el nombre común y el nombre 
científico de la especie de manera que no induzca a l consumidor a engaños, excepto los incluidos en la   
NOM-084-SCFI-1994, señalada en el apartado de refer encias. 
11.2.4.7  Los aditivos empleados en la elaboración de los pr oductos objeto de esta norma, deben 
reportarse con el nombre común o los sinónimos esta blecidos en el Acuerdo y sus modificaciones, a 
excepción de los saborizantes y las enzimas, los cu ales pueden figurar con la denominación genérica. 
11.2.4.8  Coadyuvantes de elaboración y transferencia de adi tivos. 
I)  Debe ser incluido en la lista de ingredientes todo  aditivo que haya sido empleado en los ingredientes  de 
los productos objeto de esta norma y que se transfi era a estos últimos en cantidad notable o suficient e para 
desempeñar en ellos una función tecnológica. 
II)  Están exentos de declararse en la lista de ingredi entes, los aditivos transferidos a los productos ob jeto 
de esta norma que no cumplen una función tecnológic a en el producto terminado, así como los coadyuvant es 
de elaboración, excepto aquellos que puedan provoca r reacciones alérgicas o de intolerancia. 
11.2.5  Identificación del responsable del proceso. 
11.2.5.1  Para los productos preenvasados nacionales objeto de esta norma, debe indicarse en la etiqueta 
el nombre o razón social y domicilio (calle, número , colonia, código postal, ciudad y estado, según 
corresponda) del productor o empresa responsable de  la fabricación. 
11.2.5.2  Tratándose de productos importados debe figurar en  la etiqueta, el nombre o la razón social y el 
domicilio del importador (calle, número, colonia, c ódigo postal, ciudad y estado, según corresponda), o bien 
incorporarse al producto, en el Territorio Nacional , después del despacho aduanero y antes de la 
comercialización. La información sobre el fabricant e debe ser proporcionada por el importador a la aut oridad 
competente, a solicitud de ésta. 
11.2.5.3  Cuando varios establecimientos participen en la el aboración, fabricación, preparación, mezclado, 
acondicionamiento o envasado de un producto, debe h acerse constar en la etiqueta la leyenda “Hecho par a:” 
o una equivalente, además del domicilio del estable cimiento donde se llevó a cabo la última etapa de l a 
fabricación. 
11.2.6  Identificación de la clave del lote. 
11.2.6.1  Cada unidad de venta debe llevar grabada o marcada  de cualquier modo, pero de forma 
indeleble, la identificación del lote al que perten ece, la cual debe permitir la rastreabilidad del pr oducto y estar 
relacionada con la fecha de elaboración. Dicha clav e puede colocarse en cualquier parte del envase el cual no 
debe ser alterado u ocultarse en forma alguna. 
11.2.6.2  Cuando se identifique en formato de fecha, debe an teponerse la palabra “Lote” o “Lot”. 
11.2.6.3  Si la identificación del lote corresponde a la fec ha de caducidad, se debe anteponer la leyenda: 
“Lote y fecha de caducidad”. 
11.2.7  Fecha de caducidad o de consumo preferente. 
11.2.7.1  Los productos de la pesca, deben presentar la fech a de caducidad o de consumo preferente, 
incorporada por el fabricante, con excepción de aqu ellos que son estériles comercialmente la cual debe  ser 
identificada como tal y puede figurar en cualquier parte del envase, misma que no puede ser alterada u  oculta 
en ningún caso y bajo ninguna circunstancia. Para l a fecha de caducidad se permite el uso de la abrevi atura 
“CAD.”. Para el caso de la fecha de consumo prefere nte se permiten las siguientes abreviaturas: Cons A nt … 
o Cons Antes … o Cons Pref Antes … o Cons Pref Ant … 
11.2.7.2  Los productos refrigerados deben presentar la fech a de caducidad señalando al menos día y mes. 
11.2.7.3  Los productos congelados, deben presentar la fecha  de caducidad o de consumo preferente 
señalando cuando menos mes y año.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
11.2.8  Leyendas de conservación. 
11.2.8.1  Los productos de la pesca refrigerados, deben incl uir el texto “Manténgase en refrigeración a 
máximo 4º C u otras análogas. 
11.2.8.2  Los productos congelados deben incluir el texto “C onsérvese en congelación a una temperatura 
máxima de - 18º C” y “una vez descongelado, no debe  volverse a congelar” u otras análogas. 
11.2.9  Información adicional obligatoria. 
11.2.9.1  En el caso de los moluscos bivalvos frescos, refri gerados o congelados, debe figurar en la 
etiqueta la fecha de extracción, área de producción , número de certificado de exportación e importació n del 
producto cuando proceda, día, mes y año de elaborac ión. 
11.2.10  Leyendas precautorias o de advertencia. 
11.2.10.1  Las leyendas precautorias deben hacer referencia a l ingrediente u origen del ingrediente que, 
basado en información científica reconocida, se aso cie a riesgos relacionados con la intolerancia dige stiva, 
alergias, enfermedades metabólicas o toxicidad. 
11.2.11 Instrucciones de uso. 
11.2.11.1  Cuando por el tipo de producto se requieran instru cciones de uso, éstas deben indicarse en la 
etiqueta, incluido descongelamiento, si es el caso,  para asegurar una correcta utilización del product o. 
11.2.11.2  Para los productos crudos o precocidos, la etiquet a debe contener una leyenda que refiera al 
consumo del producto cocido o frito. 
11.2.12  Información nutrimental. 
11.2.12.1  La declaración nutrimental en la etiqueta de los p roductos de la pesca es voluntaria. Sólo es 
obligatoria cuando se realice la declaración de alg una propiedad nutrimental. 
11.2.12.2  Cuando se incluya la declaración nutrimental, es o bligatorio declarar lo siguiente: 
I)  Contenido energético; 
II)  Las cantidades de proteínas, hidratos de carbono d isponibles (carbohidratos) y lípidos (grasas); 
III)  La cantidad de sodio; 
IV)  La cantidad de cualquier otro nutrimento acerca de l cual se haga una declaración de propiedades, y; 
V)  La declaración de propiedades nutrimentales cuanti tativa o cualitativamente de algunos nutrimentos o 
ingredientes en la etiqueta, regulados por los orde namientos legales aplicables. 
11.2.12.3  Presentación de la información nutrimental. 
I)  La declaración nutrimental debe hacerse en las uni dades métricas que correspondan. 
II)  La declaración debe hacerse por 100 gramos o por p orción o por envase, si éste contiene sólo una 
porción. 
III)  La declaración sobre el contenido energético debe expresarse en kJ o kcal. 
IV)  La declaración sobre la cantidad de proteínas, hid ratos de carbono (o carbohidratos) y lípidos (o 
grasas). 
V)  La declaración sobre el contenido de sodio debe ex presarse en mg o g. 
VI)  Cuando la declaración numérica sobre vitaminas, mi nerales se haga en porcentaje de la ingestión 
diaria recomendada (IDR), debe emplearse únicamente  la tabla de recomendaciones ponderadas establecida  
en el Apéndice Normativo B de la NOM- 086-SSA1-1994 , señalada en el apartado de referencias. 
VII)  Los valores de composición bromatológica que figur en en la declaración de nutrimentos del producto, 
deben ser valores medios ponderados derivados de an álisis, bases de datos o tablas reconocidas 
internacionalmente. 
VIII)  Información nutrimental complementaria. 
VIII).1  Se puede incluir información nutrimental complemen taria, la cual en ningún caso debe sustituir la 
declaración de los nutrimentos del apartado 11.2.10 .2 y debe cumplir con lo siguiente: 
a)  La declaración de uno de los siguientes nutrimento s, no requiere declaración de uno de los otros y só lo 
se realiza si se tiene asignado una IDR y el conten ido de la porción esté por arriba del 5% de la IDR:  
Proteína (%IDR), vitamina A (%IDR), vitamina E (%ID R), vitamina C (%IDR), vitamina B1(tiamina) (%IDR),  
vitamina B2 (riboflavina) (%IDR), vitamina B6 (piri doxina) (%IDR), vitamina B12 (cobalamina) (%IDR), á cido 
fólico (folacina) (%IDR), niacina (ácido nicotínico ) (%IDR), calcio (%IDR), fósforo (%IDR), magnesio ( %IDR), 
hierro (%IDR), zinc (%IDR), yodo (%IDR). Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
b)  Todos o ninguno de los siguientes: 
Grasa poliinsaturada ___g; grasa monoinsaturada ___ g; grasa saturada ___g; colesterol ___mg. 
(En el espacio en blanco debe indicarse la cantidad  del componente o nutrimento). 
c)  La declaración de uno de los siguientes no requier e la declaración de los otros: 
Azúcar ___g; almidón ___g; fibra dietética ___g. (E n el espacio en blanco debe indicarse la cantidad d el 
componente o nutrimento). 
d)  Al expresar los tipos de constituyentes de las líp idos (grasas) y de los hidratos de carbono 
(carbohidratos) referidos en b) y c) respectivament e, se debe anteponer el texto “del cual... o de las  cuales, 
según corresponda”. 
e)  Número de porciones por presentación. 
IX)  Cálculos de nutrimentos. 
IX).1  Cálculos de energía. 
La cantidad de energía que se indique, debe calcula rse utilizando los siguientes factores de conversió n: 
Carbohidratos (hidratos de carbono) 17 kJ o 4 kcal/ g 
Proteínas 17 kJ o 4 kcal/g 
Grasas (lípidos) 38 kJ o 9 kcal/g 
IX).2  Cálculo de proteínas. 
La cantidad de proteínas que se indique, debe calcu larse utilizando la siguiente ecuación: 
Proteína = Contenido total de nitrógeno Kjeldahl x 6,25 
11.2.13  Declaraciones que no se deben utilizar. 
11.2.13.1  Declaración de propiedades que no pueden comprobar se. 
11.2.13.2  Declaraciones que impliquen que una dieta recomend able con alimentos o bebidas no 
alcohólicas ordinarias no puede suministrar cantida des suficientes de todos los nutrimentos. 
11.2.13.3  Declaraciones que indiquen que el producto ha adqu irido un valor nutrimental especial o superior 
gracias a la adición de nutrimentos, tales como vit aminas, minerales y proteínas. 
11.2.13.4  Declaraciones que indiquen que por sus característ icas o por la adición de nutrimentos al 
producto, éste cubre las necesidades nutrimentales de la población o sustituye alguna comida. 
11.2.13.5  Declaraciones, figuras, gráficos u otras que compa ren o relacionen los productos sin procesar o 
sus nutrimentos con un producto procesado preenvasa do, incluyendo superlativos. 
11.2.13.6  Declaraciones de propiedades terapéuticas, prevent ivas o rehabilitatorias de alguna enfermedad 
o trastorno fisiológico. 
11.2.13.7  Declaraciones de propiedades que pueden suscitar d udas sobre la inocuidad de los productos 
similares o causar, infundir, propiciar o explotar el miedo al consumidor. 
11.2.14  Envases múltiples o colectivos. 
11.2.14.1  Cuando los productos objeto de este ordenamiento s e encuentren en un envase múltiple o 
colectivo para su venta al consumidor, éste debe co ntar con la información a que se refiere la present e Norma 
Oficial Mexicana, en tanto que los envases individu ales podrán ostentar en sus etiquetas la misma info rmación 
o sólo la indicación de lote, fecha de caducidad cu ando corresponda; además de la leyenda “No etiqueta do 
para su venta individual”. 
11.2.14.2  Cuando el envase esté cubierto por una envoltura, debe figurar en ésta toda la información 
necesaria, excepto en los casos en que la etiqueta aplicada al envase pueda leerse fácilmente a través  de la 
envoltura exterior. 
11.2.15  Promociones u obsequios. 
11.2.15.1  En el caso de que los productos objeto de esta nor ma contengan o incluyan productos 
preenvasados como parte de promociones u obsequios,  tales como salsas, aderezos, etc., deben incluir e n el 
envase del producto de promoción u obsequio, cuando  menos la siguiente información: lista de ingredien tes, 
identificación del responsable del proceso, lote y fecha de caducidad, cuando aplique. 
11.2.16  Especificaciones para productos a granel. 
11.2.16.1  Los productos envasados en punto de venta, así com o los que se manejan en contenedores o 
para el transporte de los mismos, deben presentar e n etiqueta adherida, cuando menos los datos de los 
numerales 11.2.1, 11.2.3, 11.2.4, 11.2.5, 11.2.6, 1 1.2.7 y 11.2.8 de esta norma. 
12. Envase y embalaje       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
12.1 Los productos objeto de esta norma se deben envasar  con materiales inocuos y resistentes a 
distintas etapas del proceso, de tal manera que no alteren las características físicas, químicas y sen soriales 
de estos últimos. 
12.2  Las superficies interiores de los envases no deben  reaccionar con el contenido. 
12.3  Se debe usar material resistente que ofrezca la pr otección adecuada a los envases para impedir su 
deterioro exterior, a la vez que facilite su manipu lación, almacenamiento y distribución. 
13. Concordancia con normas internacionales y mexic anas 
13.1  Esta norma es parcialmente equivalente a las sigui entes normas internacionales: 
13.1.1  Codex Alimentarius. ALINORM 01/18. Apéndice V. Ant eproyecto de Código Internacional 
Recomendado de Prácticas para el Pescado y los Prod uctos Pesqueros. 
13.1.2  Codex Alimentarius. ALINORM 01/18. Apéndice III. A nteproyecto de enmienda a la norma de 
sardinas y productos análogos en conserva. 
13.1.3  Codex Alimentarius. ALINORM 01/18. Apéndice VI. An teproyecto de norma para el arenque del 
Atlántico salado y el espadín salado. 
13.1.4  Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apéndice VII. P royecto de norma revisada para barritas, 
porciones y filetes de pescado empanados o rebozado s congelados rápidamente. 
13.1.5  Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apéndice IX. Pr oyecto de norma revisada para la carne de 
cangrejo en conserva. 
13.1.6  Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apéndice X. Pro yecto de norma revisada para pescados en 
conserva. 
13.1.7  Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apéndice XI. Pr oyecto de norma revisada para el salmón en 
conserva. 
13.1.8  Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apéndice XII. P royecto de norma revisada para las sardinas 
y productos análogos en conserva. 
13.1.9  Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apéndice XIII. Proyecto de norma revisada para los 
camarones en conserva. 
13.1.10  Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apéndice XIV. P royecto de norma revisada para el atún y el 
bonito en conserva. 
13.1.11  Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apéndice XV. Pr oyecto de norma revisada para pescado 
salado y pescado seco salado de la familia gadidae.  
13.2  Esta norma no es equivalente con normas mexicanas.  
14. Bibliografía 
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14.2  NOM-008-SCFI-1993. Sistema General de Unidades de Medida. México, D.F. 1993 
14.3  NOM-Z-13. Guía para la Redacción, Estructuración y  Presentación de las Normas Oficiales 
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14.4  Reglamento de la Ley Federal sobre Metrología y No rmalización. México, D.F. 1999 
14.5 "Directrices para emitir aseguramiento de calidad d e productos de la pesca". México, D.F. 1992 
14.6  Acuerdo por el que se determinan las sustancias pe rmitidas como aditivos y coadyuvantes. Diario 
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14.7  Epidemiología. Sistema Nacional de Vigilancia Epid emiológica. Núm. 3 Vol. 19. México, D.F. 2002 
14.8  Ley General de Salud. México, D.F. 1984 
14.9  "Manual de Técnicas y Procedimientos para Análisis  Microbiológico y Alimentos Enlatados". 
Laboratorio Nacional de Salud Pública. México, D.F.  1989 
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14.11  Reglamento de la Comisión Federal para la Protecci ón contra Riesgos Sanitarios. Diario Oficial de la 
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14.12  Modelo de Ordenanza del Programa Mexicano de Molus cos Bivalvos. Secretaría de Salud México, 
D.F. 2003. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
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and Sea Food Guide 7108.07 U.S.A. 
14.26  Servicio Nacional de Pesca (SERNAPESCA). Estándare s de calidad para productos marinos. 
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14.27  Codex Alimentarius. 1981. Proyecto de norma revisa da para los camarones en conserva. CODEX 
Stan 37-1981. Roma, Italia. 
14.28  Codex Alimentarius. 1981. Proyecto de norma revisa da para la carne de cangrejo en conserva. 
Codex Stan 90-1981. Roma, Italia. 
14.29  Comisión del Codex Alimentarius. 1981. Proyecto de  Norma Revisada para las Sardinas y 
Productos Análogos en Conserva. CODEX STAN 94-1981.  Roma, Italia. 
14.30  Codex Alimentarius. 1981. Proyecto de norma revisa da para pescados en conserva. Codex Stan 
119-1981. Roma, Italia. 
14.31  Codex Alimentarius. 1981. Proyecto de norma revisa da el salmón en conserva. Codex Stan 3-1981. 
Roma, Italia. 
14.32  Codex Alimentarius. 1981. Proyecto de norma revisa da para del atún y el bonito en conserva. Codex 
Stan 70-1981. Roma, Italia. 
14.33  Comisión del Codex Alimentarius. 1992. Codex Alime ntarius: "Texto abreviado" Roma, Italia. 
14.34  Comisión del Codex Alimentarius. 1989. Norma del C odex para Pescados y Productos Pesqueros 
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14.56  Wright JL, et al. 1990. Chemistry, biology, and to xicology of domoic acid and its isomers. Can Dis 
Wkly Rep sep;16 suppl 1E:21-6. 
15. Observancia de la norma 
La vigilancia del cumplimiento de la presente Norma  corresponde a la Secretaría de Salud, a los gobier nos 
de las entidades federativas, en el ámbito de sus r espectivas competencias. 
Con la entrada en vigor de la presente Norma Oficia l Mexicana se cancelan las siguientes normas: 
• NOM-027-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos d e la pesca. Pescados frescos refrigerados y 
congelados. Especificaciones sanitarias, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 3 de marzo  
de 1995. 
• NOM-028-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos d e la pesca. Pescados en conserva. 
Especificaciones sanitarias, publicada en el Diario  Oficial de la Federación el 3 de marzo de 1995. 
• NOM-029-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos d e la pesca. Crustáceos frescos refrigerados y 
congelados. Especificaciones sanitarias, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 27 de 
febrero de 1995. 
• NOM-030-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos d e la pesca. Crustáceos en conserva. 
Especificaciones sanitarias, publicada en el Diario  Oficial de la Federación el 31 de enero de 1995. 
• NOM-031-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos d e la pesca. Moluscos bivalvos frescos 
refrigerados y congelados. Especificaciones sanitar ias, publicada en el Diario Oficial de la Federació n 
el 6 de marzo de 1995. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
• NOM-032-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos d e la pesca. Moluscos bivalvos en conserva. 
Especificaciones sanitarias, publicada en el Diario  Oficial de la Federación el 6 de marzo de 1995. 
• NOM-129-SSA1-1995. Bienes y Servicios. Productos d e la pesca: secos-salados, ahumados, 
moluscos cefalópodos y gasterópodos, frescos-refrig erados y congelados. Disposiciones y 
especificaciones sanitarias, publicada en el Diario  Oficial de la Federación el 10 de diciembre de 
1997. 
16. Vigencia 
La presente Norma entrará en vigor a los noventa dí as siguientes de su publicación en el Diario Oficia l de 
la Federación. 
Atentamente 
México, D.F., a 28 de abril de 2008.- El Presidente  del Comité Consultivo Nacional de Normalización de  
Regulación y Fomento Sanitario, Miguel Angel Toscano Velasco .- Rúbrica. 
APENDICE NORMATIVO A 
1. Precauciones generales de seguridad 
1.1  El analista debe consultar siempre la información respecto a la exposición y manejo seguro de los 
reactivos químicos especificados en estos métodos, para emplear el equipo de seguridad apropiado como 
bata de laboratorio, guantes de látex, anteojos de seguridad, mascarilla, etc. y trabajar cuando así s e requiera 
bajo campana de extracción. 
1.2  Para la aplicación de los siguientes métodos analí ticos se debe cumplir con las Buenas Prácticas de 
Laboratorio. 
1. Determinación de materia extraña en pescado (enl atado) y productos de la pesca frescos 
refrigerados y congelados. 
1.1  Principio del método. 
La materia extraña se separa por flotación y poster iormente se filtra para su observación al microscop io. 
1.2  Equipo. 
1.2.1  Balanza granataria con una precisión de 0,1 g 
1.2.2  Microscopio binocular estereoscópico con objetivos  que pueden ser de 3, 6, 7 y 10 X y oculares 
apareados de amplio campo visual de 10, 30 y 100 X respectivamente. 
1.2.3  Equipo de filtración al vacío. 
1.2.4  Lámpara para el microscopio o luz natural equivale nte. 
1.2.5  Parrilla de calentamiento con agitación magnética.  
1.3  Materiales. 
1.3.1  Percolador de 2 L. 
1.3.2  Matraz de 1,5 L. 
1.3.3  Embudo Buchner. 
1.3.4  Vaso de precipitado de 600 mL. 
1.3.5  Papel de filtración rápida rayado para conteo con líneas paralelas de aproximadamente 5 mm de 
separación. 
1.3.6  Material de uso común en el laboratorio. 
1.4  Reactivos. 
1.4.1  Todos los reactivos deben ser grado analítico a me nos que se indique otra especificación y por agua 
se entiende agua destilada. 
1.4.2  Isopropanol (C 3H8O) 
1.4.3  Acido clorhídrico (HCl) 
1.4.4  Aceite mineral. Aceite de parafina, blanco y liger o. Con un peso específico de 0,840-0,860 (25ºC)       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
1.4.5  Solución detergente al 5% 
1.5  Procedimiento. 
1.5.1  Pesar 225 g de muestra y transferir a un matraz de  1,5 L. Romper los grumos con espátula. En el 
caso de productos enlatados, lavar la lata completa mente con pequeñas cantidades de isopropanol y 
adicionar estos lavados al matraz. 
1.5.2  Añadir 50 mL de HCl y llevar a un volumen de 800 m L con agua. Agitar magnéticamente y llevar a 
ebullición durante 20 minutos (si el producto forma  espuma adicionar agua ocasionalmente) 
1.5.3  Adicionar 50 mL de aceite mineral y agitar magnéti camente durante 5 minutos manteniendo  la 
ebullición. 
1.5.4  Transferir al percolador el cual previamente conti ene aproximadamente 250 mL de agua. Mantener el 
matraz de 1,5 L para llenar el percolador con agua durante los ciclos de rellenado. 
1.5.5  Llenar el percolador con agua caliente (55-70ºC) a  unos 3 cm de la parte superior. Dejar en reposo 
durante 3 minutos y drenar el contenido a aproximad amente 3 cm de la parte más baja de la capa de acei te (si 
existen grandes cantidades de sólidos suspendidos, dejar más tiempo en reposo para permitir la separac ión 
del aceite) 
1.5.6  Repetir el drenado y las etapas de rellenado a int ervalos de 3 minutos hasta que la fase acuosa esté 
clara. Finalmente drenar el percolador lentamente a  un volumen mínimo de fase acuosa sin perder la  fa se 
oleosa. 
1.5.7  Drenar la fase oleosa a un matraz de 600 mL. Lavar  el percolador con agua caliente, con solución 
detergente al 5%, agua e isopropanol en secuencia, usando aproximadamente 50 mL por cada lavado. 
1.5.8  Colectar los lavados en el matraz de 600 mL. Filtr ar a través del papel y observar al microscopio. 
1.5.9  Informe de la prueba. 
2. Bioensayo para toxina paralizante en moluscos bi valvos. 
2.1  Materiales 
2.1.1  Ratones machos albinos, sanos, cepa Webster Suiza,  con un peso de 19 a 21 gramos. Los animales 
que pesan de 17 a 19 y de 21 a 23 gramos también pu eden ser utilizados en ausencia de animales con el 
intervalo de peso deseado. No reutilizar ratones so brevivientes. 
2.1.2  Reactivos 
2.1.2.1  Solución patrón de saxitoxina de100 µg/mL. 
2.1.2.2  Solución de referencia de saxitoxina de 1 µg/mL 
2.1.2.3  Medir 1 mL de solución patrón en un matraz volumét rico de 100 mL, y llevar al volumen con agua 
destilada acidificada con HCl (pH=3). Esta solución  es estable por varias semanas si se almacena a 3 o  4° C y 
el pH está entre 2,0 y 4,0. 
2.1.2.4  Soluciones de ácido clorhídrico 0,5 N y 0,18 N. 
2.2  Procedimiento 
2.2.1  Precaución: Usar guantes de hule, cuando se manipu len materiales que puedan contener toxina 
paralizante de los moluscos. 
2.2.2  Acondicionamiento del bioensayo. 
2.2.3  Diluir alícuotas de 10 mL de la solución de refere ncia con 10, 15, 20, 25 y 30 mL de agua, 
respectivamente. Posteriormente inyectar 1 mL de ca da dilución por vía intraperitoneal a unos cuantos ratones 
de prueba. 
2.2.4  La mediana del tiempo de muerte debe estar entre 5  y 7 minutos. El pH de las diluciones debe estar 
entre 2 y 4 y en ningún caso debe ser mayor a 4,5. 
2.2.5  Probar diluciones adicionales con incrementos de 1  mL de agua destilada. Por ejemplo, si la alícuota 
de 10 mL diluidos con 25 mL de agua mata a los rato nes en 5 a 7 minutos, preparar soluciones 10 + 24 y  10 + 
26. 
2.2.6  Inyectar a un grupo de 10 ratones con 2 diluciones  (de preferencia 3), que estén dentro del tiempo 
entre 5 a 7 minutos. Aplicar dosis de 1 mL por vía intraperitoneal a cada ratón. 
2.2.7  Registrar el tiempo de inyección y de muerte lo má s aproximado posible a intervalos de 5 segundos. 
Si se registran 7 segundos, redondear a 5 segundos.  Si se registran 8 segundos redondear a 10 segundos . El 
tiempo de muerte es el tiempo transcurrido entre el  término de la inyección y el último jadeo del rató n. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
2.2.8  Pesar y anotar el peso de los 10 ratones, aproxima ndo hasta 0,5 gramos e inyectar cada uno con 1 
mL de 2 o 3 diluciones de preferencia que provoquen  la muerte en una mediana de tiempo de 5 a 7 minuto s. 
2.2.9  Anotar los tiempos de muerte. Si más ratones de un  grupo de 10 sobrevive a la inyección de una 
dilución en particular de la solución de referencia , repetir la inyección en un nuevo grupo de 10 rato nes. 
2.2.10  Antes de proceder a realizar la prueba con el segu ndo grupo, investigar las variables del 
procedimiento que pudieron haber provocado los resu ltados iniciales, tales como filtración, derrame de  la 
mezcla inyectada en el ratón o el no haber inyectad o el volumen completo de la solución patrón. 
2.2.11  Cálculo del factor de corrección (FC) 
2.2.12  Determinar la mediana del tiempo de muerte para ca da grupo de 10 ratones usados con cada 
dilución. Descartar los resultados para cada grupo de 10 ratones que den una mediana de muerte menor d e 5 
o mayor de 7 minutos. Si cualquier grupo de 10 rato nes produce una mediana de tiempo de muerte en el 
intervalo de tiempo mencionado, incluir todos los g rupos de 10 ratones usados para que los cálculos de  la 
dilución subsecuente o algunas muertes estén en el intervalo deseado. 
2.2.13  Usar los tiempos de muerte por cada ratón y para c ada grupo, en el cual la mediana de tiempo de 
muerte quede entre 5 y 7 minutos. Determinar las Un idades Ratón correspondientes a partir de la tabla de 
Sommer's. 
2.2.14  Con el peso de cada ratón se determina el factor d e corrección en la tabla de correcciones de 
pesos de ratones. Multiplicar las Unidades Ratón po r el factor de conversión del peso para determinar los 
valores para las Unidades Ratón corregidas por mL d e las diluciones seleccionadas. Dividir los µg de 
toxina/mL calculados en las diluciones seleccionada s por las URC asociadas y así obtener el factor  de  
conversión. 
2.2.15  Calcular el promedio de FC individuales. El valor resultante es útil para verificar los ensayos de 
rutina. Este valor representa los microgramos de ve neno equivalentes a una UR. 
2.2.16  Los valores individuales del FC obtenidos en el la boratorio, pueden variar significativamente si no 
existe un control absoluto de la técnica. Por lo re gular el uso de patrones de referencia o patrones 
secundarios, depende del volumen de ejecución del t rabajo de ensayo. 
2.3  Uso de patrones en el ensayo de rutina de Moluscos  Bivalvos. 
2.3.1  Verificar los valores del FC periódicamente como s igue: si los moluscos son analizados menos de 
una vez a la semana, determinar el valor del FC cad a día que el ensayo sea ejecutado. Para ello inocul ar 5 
ratones con una dilución apropiada de la solución p atrón. Si los ensayos se realizan durante varios dí as a la 
semana, verificar solamente una vez por semana la d ilución cuya mediana de tiempo de muerte este entre  5-7 
minutos. El FC así determinando debe quedar dentro de ±20% el FC estándar predeterminado. 
2.3.2  Si los resultados no concuerdan, verificar el FC s obre una base de 10 ratones formado por la adición 
de 5 ratones inoculados con la misma dilución de so lución patrón de saxitoxina e incluir los resultado s a los  5 
ratones originales. 
2.3.3  Inocular un segundo grupo de 10 ratones. El promed io de valores del FC obtenidos de los 6 grupos 
de 10 ratones representa un nuevo valor de FC. 
2.3.4  Repetir la verificación de los valores de FC de ma nera que los resultados sean consistentes dentro 
del ±20%. Si se encuentran grandes variaciones, inv estigar la posibilidad de controlar y reconocer otr as 
variables que afectan al método antes de proceder c on los análisis de rutina. 
2.4  Preparación de la muestra 
2.4.1  Almejas, ostiones y mejillones. 
2.4.1.1  Lavar los moluscos bivalvos con agua potable retir ando la arena y cualquier material extraño. 
Desconchar la carne con cuidado, sin lesionar el cu erpo del molusco. Colectar aproximadamente 150 g de  
carne sobre un tamiz del número 10 y dejar escurrir  durante 5 minutos. Descartar las conchas, moler la  carne 
en una mezcladora o licuadora hasta su homogenizaci ón. 
2.4.2  Escalopas. 
2.4.2.1  Separar la porción comestible (músculo aductor) y solamente aplicar la prueba a esta porción. 
Drenar y moler como se describió anteriormente 
2.4.3  Extracción de la saxitoxina. 
2.4.3.1  Pesar 100 gramos de carne homogenizada en un vaso de precipitados tarado. 
2.4.3.2  Agregar 100 mL de solución de ácido clorhídrico 0, 18 N, agitar y verificar el pH, el cual debe estar 
entre 2 y 4, y de preferencia 3.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
2.4.3.3  Calentar la mezcla, hervir 5 minutos y dejar enfri ar a temperatura ambiente. Ajustar la mezcla 
enfriada a un pH 2,0-4,0 (nunca mayor a 4,5) 
2.4.3.4  Verificar el pH con indicador universal BDH, azul de fenol, papel rojo congo o con un 
potenciómetro. Para bajar el pH, agregar solución d e HCl 5 N por goteo, agitando constantemente para e vitar 
la destrucción de la toxina. 
2.4.3.5  Transferir la mezcla a una probeta graduada y dilu ir a 200 mL. Regresar la mezcla a un vaso de 
precipitados, agitar para homogeneizar y dejar repo sar hasta que una parte del sobrenadante sea transl úcido 
y pueda encontrarse libre de partículas sólidas cap aces de "tapar" una aguja hipodérmica del número 26 . 
2.4.3.6 Si es necesario centrifugar el sobrenadante 5 minut os a 3000 rpm o filtrar por papel. Filtrar sólo la 
cantidad de líquido necesario para el bioensayo. 
2.5  Prueba de bioensayo en ratón 
2.5.1  Pesar 3 ratones, anotando el peso para cada muestr a que va a ser analizada. Inyectar por vía 
intraperitoneal a cada ratón l mL de extracto centr ifugado. Este es el punto crítico del bioensayo. Si  las 
inyecciones no se hacen directamente en la cavidad peritoneal el tiempo de muerte no es reproducible. 
2.5.2  Descartar cualquier ratón en donde se pierda o se filtre más de una gota de extracto. Activar el 
cronómetro en el momento de la inyección y mantener  la observación cuidadosamente, hasta el tiempo de 
muerte, que se manifiesta por el último jadeo del a nimal. 
2.5.3  Registrar el momento de la muerte de cada ratón. S i la mediana de tiempo de muerte es de 5 
minutos, diluir el extracto con HCl 0,01 N, e inyec tar otro lote de ratones hasta obtener los tiempos de muerte 
entre 5 y 7 minutos. Si la mediana del tiempo de mu erte con el extracto no diluido es mayor a 7 minuto s, el 
dato puede ser utilizado para determinar la toxicid ad de la muestra. 
2.5.4  Determinar la UR/mL de extracto que corresponde a los tiempos de muerte observados de la tabla 
de corrección de pesos de ratones. 
2.5.5  Calcular las URC, multiplicando las UR correspondi entes al tiempo de muerte de cada ratón por el 
factor de corrección del peso obtenido en la tabla de corrección de pesos de ratones. 
2.6  Expresión de resultados. 
2.6.1  Cálculos 
µg saxitoxina/100g carne de molusco = Mediana URC/m L x FC x FD x 200 
En donde: 
FC = Factor de conversión 
FD = Factor de dilución 
Tabla de corrección de pesos de ratones. 
PESO DEL RATON(G) UNIDADES RATON  
10 0,50 
10,5 0,53 
11 0,56 
11,5 0,59 
12 0,62 
12,5 0,65 
13 0,675 
13,5 0,70 
14 0,73 
14,5 0,76 
15 0,785 
15,5 0,81 
16 0,84 
16,5 0,86 
17 0,88 
17,5 0,905 Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
18 0,93 
18,5 0,95 
19 0,97 
19,5 0,985 
20 1,000 
20,5 1,015 
21 1,03 
21,5 1,04 
22 1,05 
22,5 1,06 
23 1,07 
 
2.6.2  Tabla de Sommer's. 
Tiempo de muerte: relación unidades ratón para toxi na paralizante de moluscos. (ácida) 
TIEMPO DE MUERTE* UNIDADES RATON TIEMPO DE MUERTE U NIDADES RATON  
1:00 100 5:00 1,92 
10 66,2 05 1,89 
15 38,3 10 1,86 
20 26,4 15 1,83 
25 20,7 20 1,80 
30 16,5 30 1,74 
35 13,9 40 1,69 
40 11,9 45 1,67 
45 10,4 50 1,64 
50 9,33 6:00 1,60 
55 8,42 15 1,54 
2:00 7,67 30 1,48 
05 7,04 45 1,43 
10 6,52 7:00 1,39 
15 6,06 15 1,35 
20 5,66 30 1,31 
25 5,32 45 1,28 
30 5,00 8:00 1,25 
35 4,73 15 1,22 
40 4,48 30 1,20 
45 4,26 45 1,18 
50 4,06 9:00 1,16 
55 4,88 30 1,13 
3:00 3,70 10:00 1,11 
05 3,57 30 1,09 
10 3,43 11:00 1,075 
15 3,31 30 1,06 
20 3,19 12:00 1,05 
25 3,08 13 1,03 
30 2,98 14 1,015 
35 2,88 15 1,000 
40 2,79 16 0,99 
45 2,71 17 0,98 
50 2,63 18 0,972       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
55 2,56 19 0,965 
4:00 2,50 20 1,96 
05 2,44 21 0,954 
10 2,38 22 0,948 
15 2,32 23 0,942 
20 2,26 24 0,937 
25 2,21 25 0,934 
30 2,16 30 0,917 
35 2,12 40 0,898 
40 2,08 60 0,875 
45 2,04 50 2,00 
 1,96 55 2,22 
*Minutos: segundos 
2.6.3  Informe de la prueba 
µg saxitoxina/100g carne de molusco 
 
3. Determinación de ácido domoico por cromatografía  de líquidos (HPLC) 
3.1  Principio del método. 
El ácido domoico es extraído del tejido homogenizad o por ebullición en HCl 0,1 N durante 5 minutos. La  
mezcla es enfriada y centrifugada, una alícuota del  sobrenadante es diluida, filtrada y analizada por HPLC 
isocrática y detección ultravioleta a 242 nm. 
3.2  Equipo. 
3.2.1  Sistema de cromatógrafo de líquidos: 
3.2.1.1  Sistema de gasificador por Helio, membrana de vací o o ultrasonido. 
3.2.1.2  Sistema de bombas capaz de desarrollar un flujo de  0.5 a 1,5 mL/min. 
3.2.1.3  Inyector manual o automático, compatible para inye ctar 20 uL de muestra. 
3.2.1.4  Detector de ultravioleta de longitud de onda varia ble a 242 nm. 
3.2.1.5  Sistema de datos: graficador, integrador o computa dora compatible con la salida de voltaje  del 
detector. 
3.2.2  Centrífuga capaz de desarrollar 3000 rpm usando tu bos de 100 mL. 
3.3  Materiales. 
3.3.1 Columna HPLC de 15 cm de longitud x 4,6 mm de diáme tro interno, empacada con octadecilsilanos 
(C18) de tamaño de partícula de 5 µm. 
3.3.2  Filtros de membrana para muestras, de 3 cm de diám etro y tamaño de poro de 0,45 µm. 
3.3.3  Jeringas de vidrio o desechables de 5 mL. 
3.3.4  Tubos para centrífuga de 100 mL. 
3.3.5  Matraces volumétricos de 50 y 100 mL. 
3.4  Reactivos. 
3.4.1  Todos los reactivos deben ser grado analítico a me nos que se indique otra especificación y por agua 
se entiende agua desionizada. 
3.4.2  Agua grado HPLC (H 2O) 
3.4.3  Acetonitrilo grado HPLC (C 2H3N). 
3.4.4  Acido fosfórico (H 3PO 4) Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
3.4.5  Solución de HCl 0,1 N 
3.5  Fase móvil. 
3.5.1  Adicionar 2 mL de solución acuosa de H 3PO 4 a 873 mL de agua desionizada. Mezclar y verificar e l 
pH a aproximadamente 2,5. Adicionar 125 mL de aceto nitrilo, mezclar y degasificar. 
3.5.2  Solución patrón de ácido domoico 1,09 ng/ µL. 
3.5.3  Esta solución está disponible comercialmente. Refr igerar cuando no se use. Llevar a temperatura 
ambiente antes de su uso. 
3.6  Procedimiento. 
3.6.1  Preparación de las muestras. 
3.6.2  Limpiar completamente el exterior del molusco con agua fresca. Abrir por corte los músculos 
aductores. Enjuagar el interior con agua fresca par a eliminar la tierra u otro material extraño. Quita r la carne 
de la concha separando los músculos aductores y la conexión del tejido en las valvas (charnela). No us ar 
calor o anestésicos antes de abrir la concha, y no cortar o dañar el cuerpo del molusco en este estado . 
3.6.3  Colectar aproximadamente de 100-159 g de carne en un plato de vidrio. Tan pronto como sea 
posible, transferir la carne a un tamiz del No. 10 y dejar drenar por espacio de 5 minutos. Descartar los 
drenados. Moler en un procesador de alimentos caser o hasta obtener una mezcla homogénea. 
3.6.4  Pesar exactamente 50 g de la muestra homogenizada en un matraz de 250 mL. Adicionar 50 mL de 
solución de HCl 0,1 N y agitar completamente. Rápid amente calentar la mezcla a ebullición  (en 
aproximadamente 10 minutos) y continuar el calentam iento vigoroso, con agitación, por exactamente  5 
minutos. 
3.6.5  Transferir inmediatamente el matraz y su contenido  a un baño de hielo y dejar enfriar a temperatura 
ambiente (aproximadamente 10 minutos). 
3.6.6  Llevar la mezcla enfriada a un matraz volumétrico de 100 mL y diluir al volumen con solución de HCl 
0,1 N. Mezclar. Transferir una alicuota de 50 mL a un tubo de centrífuga. Centrifugar a 3000 rpm duran te 5 
minutos. 
3.6.7  Transferir con pipeta volumétrica de 1-5 mL del so brenadante clarificado a un matraz volumétrico de 
50 mL (el volumen transferido depende de la concent ración de ácido domoico esperada). Diluir al volume n con 
agua y mezclar. 
3.6.8  Filtrar un alícuota de 1-2 mL del sobrenadante dil uido a través del filtro para muestras y colectar e n 
un frasco vial. 
3.7  Acondicionamiento del equipo. 
3.7.1  Fijar los parámetros cromatográficos requeridos en  el método de acuerdo con el manual  de 
operación. 
3.7.2  Bombear fase móvil a través del sistema del cromat ógrafo hasta la obtención de una línea  base 
estable. 
3.7.3  Realizar un análisis preeliminar de la solución de  ácido domoico y ajustar la concentración del 
acetonitrilo en la fase móvil a fin de obtener un t iempo de retención aproximado para el ácido domoico  de 8 
min. 
3.8  Determinación. 
3.8.1  Inyectar varias réplicas 20 µL de solución patrón de ácido domoico hasta que la altura o área de los 
picos de 3 inyecciones consecutivas no varíen en má s del 3%. 
3.8.2  Inyectar 20 µL de las muestras. 
3.9  Expresión de resultados. 
3.9.1 Cálculos. 
µg Acido domoico/g = (R/R ′) x (W ′/W) 
donde:       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
R= Area o altura promedio del pico de la muestra. 
R′= Area o altura promedio del pico de la solución es tándar de ácido domoico. 
W= Peso de la muestra inyectada (mg) 
W′= Peso de la solución estándar de ácido domoico iny ectada (ng) 
3.10  Informe de la prueba. 
 µg de ácido domoico/g  
 
4. Determinación de histamina por cromatografía en capa fina (TLC) 
4.1  Principio del método. 
Se basa en la hidrólisis ácida de las proteínas dej ando libres a los aminoácidos. La histamina es extr aída 
con n-butanol y el extracto es analizado por cromat ografía en capa fina comparando con una curva de 
histamina. 
4.2  Equipo. 
4.2.1  Cámara cromatográfica. 
4.2.2  Atomizador de 50 mL para cromatografía. 
4.3  Materiales. 
4.3.1  Embudos de separación de 125 mL. 
4.3.2  Embudo de Buchner. 
4.3.3  Matraz Kitazato de 500 mL. 
4.3.4  Cromatofolios AL de sílica gel 60 F 254 (para crom atografía en capa fina de 0,2 mm de espesor). 
4.3.5  Microjeringa ajustable de 0-200 µL. 
4.3.6  Material común de laboratorio. 
4.4  Reactivos. 
4.4.1  Todos los reactivos deben ser de grado analítico a  menos que se indique otra especificación y por 
agua se entiende agua destilada. 
4.4.2  Diclorhidrato de histamina (C 5H11Cl2 N3) 
4.4.3  n-Butanol (C 4H10 O) 
4.4.4  Acido clorhídrico (HCl) 
4.4.5  Hidróxido de calcio (Ca(OH) 2) 
4.4.6  Etanol (C 2H5OH) 
4.4.7  Hidróxido de amonio (NH 4OH) 
4.4.8  Acetona (C3H 6O) 
4.4.9  Cloruro de sodio (NaCl) 
4.4.10  Solución de HCl 1N 
4.4.10.1  Medir 479,8 mL de HCl y llevar a 1 L con agua. 
4.4.11  Solución de ninhidrina al 1% (1 mg ninhidrina/mL) 
4.4.11.1  Pesar 1 g de ninhidrina y disolver en 100 mL de ac etona 
4.4.12  Solución patrón de histamina de 5 µg/ µL. 
4.4.12.1  Mezclar 30,17 mg de diclorhidrato de histamina (eq uivalente a 10 mg de histamina), 20 mL de  n-
butanol y 7,0 g de cloruro de sodio con 20 mL de ag ua destilada. Agitar durante 5 minutos. Adicionar 2 ,5 g de 
hidróxido de calcio y agitar durante 2 minutos. Fil trar en embudo Buchner y pasar a un embudo de separ ación. 
Dejar reposar y separar la capa de butanol. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
4.5  Procedimiento. 
4.5.1  Preparación de la curva patrón. 
4.5.2  A partir de la solución patrón de histamina prepar ar las siguientes diluciones de acuerdo con la tabl a 
siguiente: 
No. DE TUBO SOLUCION PATRON DE HISTAMINA (ML)  VOLUMEN FINAL DE 
N-BUTANOL µG HISTAMINA/ µL.  
1 2,20 0,0 5,0 
2 2,52 2,8 4,5 
3 2,88 3,6 4,0 
4 3,29 4,7 3,5 
5 3,35 6,7 2,5 
6 4,00 10,0 2,0 
7 5,61 18,7 1,5 
8 6,66 33,3 1,0 
9 10,00 100,0 0,5 
4.5.3  Agitar y dejar reposar para permitir la separación . 
4.6  Preparación de la muestra. 
4.6.1  Mezclar 50 g de muestra molida en 100 ml de ácido clorhídrico 1 N por 5 minutos. 
4.6.2  Filtrar por succión a través de un embudo Buchner con papel filtro grueso. 
4.6.3  Tomar una alicuota de 20 mL (4 mL del extracto + 1 6 mL de agua). Adicionar 20 mL de n-butanol. 
Agregar 7 g de NaCl y agitar durante 5 minutos. 
4.6.4  Agregar 2,5 g de Ca(OH)2. Agitar durante 2 minutos . Filtrar por succión a través de un embudo 
Buchner con papel filtro grueso. 
4.6.5  Separar la capa de butanol. 
4.6.6  Determinación. 
4.6.7  Tomar alícuotas de 10 µL de cada una de las soluciones de la curva patrón y muestras y colocarlas 
en una placa de sílica gel. 
4.6.8  Desarrollo de la TLC. 
4.6.9  Poner una mezcla de etanol: hidróxido de amonio: a gua (90:6:10) en la cámara para cromatografía y 
dejar saturar. 
4.6.10  Meter la placa y dejar eluir hasta que el frente d el solvente haya alcanzado los 5 cm. Sacar de la 
cámara y dejar secar al aire durante 30 min. Aplica r la solución de ninhidrina al 1% por aspersión y c alentar a 
100ºC en estufa durante 2 minutos. 
4.7  Estimación del nivel de histamina. 
4.7.1  Comparar las muestras con las soluciones patrón de  histamina en el intervalo de 5-50 mg (25 a 250 mg 
de histamina). 
4.7.2  La cantidad de histamina en la muestra se estima c omparando visualmente el desplazamiento de las 
manchas de la muestra contra el desplazamiento de l os patrones de histamina. 
4.7.3  Para determinar el contenido de histamina en la mu estra es suficiente que una de las manchas de 
muestra tenga un desplazamiento igual al de por lo menos uno de los patrones. 
4.8  Expresión de resultados. 
4.8.1  Cálculos. 
4.8.1.1  Si una de las manchas de las muestras entre 5 y 50  mg equivale al intervalo de 0,5 a 5 µg de los 
patrones, la cantidad de histamina para 50 g de mue stra se calcula como sigue: 
mg de histamina = 10 E 
donde:       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
E = µg de histamina estimados en la muestra entre 0,5 y 5 µg 
10= µL de muestra colocados en la placa. 
Si una mancha de la muestra del intervalo de 25 a 2 50 mg corresponde al intervalo para el patrón de 0, 5 a 
5 mg, la cantidad de histamina para 50 g de muestra  se calcula como sigue: 
mg de histamina = 50 E 
donde: 
E = µg de histamina estimados en la muestra entre 0,5 y 5 µg 
50= µL de muestra colocados en la placa. 
4.8.1.3  Si el valor obtenido en las muestras analizadas re sulta ser mayor de 15 mg/100 g debe analizarse 
nuevamente haciendo la dilución correspondiente con  butanol. 
4.9  Informe de la prueba. 
 mg de histamina/kg  
5. Determinación de sulfitos en alimentos. Método o ptimizado de Monier-Williams. 
5.1  Principio del método. 
El método mide sulfitos libres más porciones reprod ucibles de sulfitos ligados, tales como productos 
carbonílicos, en alimentos. La muestra es calentada  con ácido clorhídrico (HCl) en reflujo para conver tir el 
sulfato a SO 2 (sulfitos). El nitrógeno introducido a la solución arrastra el SO 2 a través del condensador 
enfriado por agua y pasa a una solución del H 2O2 al 3% donde el SO 2 se oxida a ácido sulfúrico (H 2SO 4). El 
contenido de sulfito es directamente relacionado al  H 2SO 4 generado, el cual es determinado por titulación con  
hidróxido de sodio (NaOH) estandarizado. Aplicable para la determinación de ≥ 10 ppm de sulfitos en 
alimentos. Aplicable en presencia de otros compuest os volátiles de azufre, no aplicable a cebollas sec as, 
puerros y calabazas. 
5.2  Equipo. 
5.2.1  Aparato de Destilación (nota: En este método la pr esión dentro del aparato está limitada a la presión  
propia de la solución de H 2 O2 al 3% encima del extremo del burbujeador. Mantener la presión baja para evitar 
la pérdida del SO 2 a través del goteo). 
Usar una película delgada de vaselina en las superf icies que sellan en todas las juntas, excepto en la  junta 
entre el matraz y el embudo de separación. Poner pi nza en cada junta para asegurar que sellen 
completamente. Ensamblar el aparato según se muestr a en la figura siguiente: 
 
G 
E A) Adaptador de entrada 
B) Embudo de separación 
C) Matraz de fondo redondo 
D) Entrada de gas 
E) Condensador 
F) Burbujeador 
G)  Probeta  
C B G A 
F D 
 
5.2.2  Bureta de 10 mL con tubo de sobrellenado y conexio nes para tubo Ascarita o el equivalente para 
permitir mantener una atmósfera libre de CO 2 sobre el hidróxido de sodio 0,01N estandarizado. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
5.3  Reactivos. 
Todos los reactivos deben ser grado analítico a men os que se indique otra especificación y por agua se  
entiende agua desionizada. 
5.3.1  Acido clorhídrico (HCl) acuoso 4N. Para cada análi sis, preparar 90 mL de esta solución mezclando 
30 mL de HCl y 60 mL de agua desionizada. 
5.3.2  Indicador de rojo de metilo. Disolver 250 mg de ro jo de metilo en 100 mL de etanol. 
5.3.3  Titulante estandarizado. Hidróxido de sodio (NaOH)  0,010N Estandarizar la solución con estándar de 
ftalato ácido de potasio. 
5.3.4  Solución de peróxido de hidrógeno al 3% (H 2 O2). 
Para cada análisis, diluir 3 mL de H 2 O2 al 30% con 30 mL de agua desionizada. Justo antes d e usarse, 
agregar 3 gotas de indicador de rojo de metilo y ti tular con hidróxido de sodio (NaOH) 0,010N a un pun to final 
amarillo, si el punto final excedió, descartar la s olución. 
5.3.5  Nitrógeno de alta pureza. Usar un regulador para m antener el flujo de 200 mL/min. Para evitar 
oxígeno en el nitrógeno se usa una trampa tipo crom atografía de gases. 
5.4  Preparación de la muestra. 
a)  Sólidos. Transferir 50g de alimento o la cantidad que contenga de 500 a 1500 µg de SO 2, a un 
procesador de alimentos o licuadora. Agregar 100 mL  de etanol - agua (5+95 v/v) y mezclar. Licuar sólo  hasta 
que el alimento pueda pasar por la junta 24/40 del matraz. 
b)  Líquidos. Mezclar 50g de muestra, o la cantidad qu e contenga de 500 a 1500 µg de SO 2 con 100 mL de 
la mezcla etanol – agua. 
Nota: Llevar a cabo la preparación de la muestra y el análisis tan rápido como sea posible para evitar  la 
pérdida de formas lábiles de sulfito. 
5.5  Preparación del sistema. 
5.5.1  Usando el aparato ensamblado y el matraz puesto en  la manta de calentamiento, agregar 400 mL de 
agua al matraz. Cerrar la llave del embudo de separ ación y agregar 90 mL de HCl 4N. Empezar con el flu jo de 
nitrógeno. Iniciar el flujo en el refrigerante. Col ocar el recipiente con 30 mL de H 2O2, el cual ha sido titulado a 
punto final amarillo con NaOH 0,010N. Después de 15  min, el aparato y el agua estarán completamente 
desoxigenadas y la porción de muestras debe ser int roducida al sistema. 
5.5.2  Remover el embudo de separación y cuantitativament e transferir la muestra al matraz. Limpiar la 
junta y rápidamente aplicar grasa de silicón y regr esarlo a su lugar. 
5.5.3  El flujo de nitrógeno a través de la solución de H2O2 al 3% se reanuda tan pronto como se coloca el 
embudo en la junta del matraz. Examinar cada junta para asegurar que esté sellado. Usar un bulbo con 
válvula para aplicar presión sobre el HCl. Abrir la  llave y dejar pasar el HCl al matraz. Continuar so steniendo la 
válvula para mantener la suficiente presión sobre l a solución de ácido para forzarla a pasar. Cerrar l a llave 
antes de que los últimos 2-3 mL drenen para evitar que el SO 2 escape hacia el embudo de separación. 
5.5.4  Calentar la manta al calentamiento y regular para calentar lo suficiente, obteniendo de 80 a 90 
gotas/min del condensador. 
5.5.5  Dejar 1 h 45 min y remover el vaso. 
5.6  Determinación. 
Inmediatamente titular el contenido del vaso o prob eta con hidróxido de sodio 0,010N a punto final ama rillo 
y que persista ≥ 20 segundos. 
5.7  Expresión de resultados. 
5.7.1  Cálculos. 
Calcular el contenido de sulfitos, como sigue: 
µg SO 2,/g  = 32,03 x VB x N x 1000  
peso de muestra 
donde:       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
32,03 = peso milequivalente del SO 2 
VB = Volumen (Ml) del NaOH 
N = Normalidad del NaOH 
1000 = Factor para convertir milequivalentes a micr oequivalentes 
Peso de muestra: cantidad de muestra que se introdu jo al matraz 
6. Determinación de sulfitos por gravimetría (opcio nal). 
6.1  Después de la titulación, llevar el contenido del recipiente a un vaso de 400 mL agregar 4 gotas de H Cl 
1N y un exceso de solución de BaCl 2 al 10% y dejar reposar toda la noche. 
6.2  Lavar el precipitado por decantación 3 veces con a gua caliente a través de un Gooch previamente 
pesado. Lavar con 20 mL de alcohol etílico y 20 mL de éter. Secar a 105°  - 110° C. 
6.3  Determinar el blanco de reactivos para la titulaci ón y para el método gravimétrico y considerarlo en el 
cálculo de los resultados. 
6.4  Preparación del Aparato de Filtración 
6.4.1  Unir el receptáculo con un filtro de fibra de vidr io. 
6.4.2  Colocar lo anterior en el matraz kitasato. 
6.4.3  Lavar el filtro con 10 mL de agua caliente, desion izada y después con 10 mL de etanol usando vacío. 
6.4.4  Quitar el filtro y secarlo a 110° C durante 12 hora s o más. Transferir a desecador para enfriar a 
temperatura ambiente. Pesar (Wb). 
6.4.5  Colocar el filtro en el receptáculo de vidrio. 
6.5  Precipitado de BaSO 4 
6.5.1  Pasar el precipitado por el filtro. Lavar con agua  para asegurar que todo ha sido filtrado. 
6.5.2  Pasar 10 mL de etanol a través del precipitado y f iltrar con vacío. 
6.5.3  Remover el filtro y secar en estufa a 110° C durant e toda la noche. 
6.5.4  Transferir a desecador, enfriar y pesar (Wp). 
6.6  Expresión de resultados. 
6.6.1  Cálculos. 
Calcular el contenido de sulfitos como sigue: 
µg SO 2,/g  = [(Wp – Wb) x 274,46 ] 
  g muestra 
Donde: 
Wp = Peso de papel filtro con el precipitado de BaS O 4 a peso constante 
Wb = Peso de papel filtro preparado y puesto a peso  constante 
6.7  Ensayos de Recuperación. 
6.7.1  Para familiarizarse y eficientizar el método antes  de realizar la rutina, analizar porciones de muest ra 
que contengan cantidades conocidas de sulfitos. 
6.7.2  Realizar los análisis de manera que se omita cualq uier pérdida de sulfitos por oxidación o reacción 
con los componentes en el alimento. 
6.7.3  Debido a que los sulfitos son reactivos con el air e y con algunas matrices alimenticias y dado que 
carecen de estabilidad, se debe fortificar con fuen tes estables de sulfitos, no sulfito de sodio o sal es similares. 
6.7.4  El hidroximetil sulfonato de sodio (HMS), el cual es estructuralmente similar a algunas formas 
combinadas de sulfitos en alimentos, es útil para p reparar porciones de prueba fortificada. 
6.7.5  Para el análisis, transferir 50g de muestra de ali mento libre de sulfitos al matraz. Agregar una 
alicuota de solución de la sal sódica de hidroximet il sulfonato. Analizar inmediatamente. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
6.7.6  Recuperaciones de > 80% del HMS con matrices alimenticias de 10 ppm so n recomendables para 
asegurar una adecuada exactitud analítica. 
6.8  Informe de las pruebas. 
 
 
7. Determinación de pH. 
7.1  Fundamento. 
Es la medida de la diferencia de potenciales entre un electrodo de vidrio y otro de referencia que se 
genera en una muestra, medido con un potenciómetro.  La fuerza electromotriz producida por el sistema d e 
electrodos es proporcional al pH de la muestra prob lema. 
7.2  Materiales y Equipo. 
7.2.1  Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg. 
7.2.2  Molino mecánico para carnes con placa perforada co n agujeros de un diámetro no mayor de 4mm. 
7.2.3  Potenciómetro graduado en unidades de pH de 0,1 o menos y que permita efectuar lecturas con una 
exactitud entre 0,05 unidades y provista de un sist ema de corrección de temperaturas (en caso de no te nerlo, 
las lecturas deben tomarse en un rango de temperatu ras de 20±2° C). 
7.2.4  Electrodos de referencia. 
7.2.5  Electrodo de vidrio o sistema de electrodo combina do. 
7.2.6  Material común de laboratorio. 
7.2.7  Algodón. 
7.3  Reactivos. 
Todos los reactivos deben ser de grado analítico y cuando se mencione agua debe ser destilada. 
7.3.1  Etanol al 95% (v/v) C 2H6O 
7.3.2  Eter etílico saturado con agua C 4H10 O 
7.3.3  Soluciones patrón. 
7.3.4  Para calibrar el potenciómetro se pueden usar las siguientes soluciones de referencia: 
7.3.4.1  Soluciones patrón con pH 4,0 a 20° C. 
7.3.4.2  Pesar con exactitud 10,211g de potasio hidrógeno f talato (KHC 6H4 (COO) 2) previamente secado a 
125° C hasta peso constante, disolver en agua y llev ar al volumen de 1000 ml. 
7.3.4.3  El pH de esta solución a 10° C es de 4,01. 
7.3.4.4  Solución patrón con pH 5,45 a 20° C. 
7.3.4.5  Mezclar 500 ml de solución 0,2N de ácido cítrico ( C 6H8O7) en agua con 375 ml de solución de 
hidróxido de sodio (NaOH) en agua. El pH de esta so lución a 10° C es de 5,42 y a 30° C es de 5,48. 
7.3.4.6  Solución patrón con pH 6,88 a 20° C. 
7.3.4.7  Pesar con exactitud 3,402g de potasio dihidrógeno ortofostato (KH 2PO 4) y 3,549g de disodio 
hidrógeno ortofosfato (Na 2HPO 4), disolver en agua y llevar al volumen a 1 l. 
7.3.4.8  El pH de esta solución es 6,92 a 10° C y 6,85 a 30° C. 
7.3.4.9  En el caso de disponer de producto comercial segui r las indicaciones del fabricante. 
7.4  Procedimiento: 
Se describen dos procedimientos: 
7.4.1  Para productos que pueden ser homogeneizados. 
7.4.2  Para productos que no pueden ser homogeneizados.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
7.4.3  Preparación de la muestra. 
7.4.3.1  Homogeneizar la muestra y pasarla dos veces a trav és de un molino y después mezclarla 
perfectamente. 
7.4.3.2  En el caso de muestras muy secas para poder homege neizarlas adicionar una cantidad de agua 
igual a la masa de muestra tomada para la determina ción y mezclarlas perfectamente. 
7.4.3.3  Tomar una cantidad de muestra suficiente para que los electrodos puedan sumergirse. 
7.4.4  Calibración del potenciómetro. 
7.4.5  Calibrar el potenciómetro y usar solución patrón d e un pH conocido exactamente y lo más cerca 
posible del pH que se va a determinar. 
7.4.6  Si el procedimiento no tiene un sistema de correcc ión de temperatura, la temperatura de la solución 
patrón debe estar dentro del rango de 20±2° C. 
7.5  Medición. 
7.5.1  Introducir los electrodos en la muestra y fijar el  sistema de corrección de temperatura a la 
temperatura de la muestra, en caso de que no lo ten ga, la temperatura de la muestra debe estar dentro del 
rango de 20±2° C. 
7.5.2  Efectuar la medición usando el procedimiento descr ito en el manual del aparato. 
7.5.3  Leer el pH directamente en la escala del instrumen to, hasta alcanzar un valor estable. 
7.5.4  Llevar a cabo 3 lecturas de la misma muestra. 
7.6  Limpieza de los electrodos. 
Limpiar los electrodos con trozos de algodón mojado s con éter etílico y etanol sucesivamente, finalmen te 
lavarlos con agua y guardarlos de acuerdo con las i nstrucciones del fabricante. 
7.7  Expresión de los resultados. 
Tomar como resultado la media aritmética de los val ores de las tres lecturas siempre y cuando la 
diferencia entre los valores extremos resultantes n o sea mayor de 0,15 unidades de pH. 
7.8  Procedimiento para productos que no puedan homogen eizarse. 
7.8.1  Tomar una porción de muestra suficiente que permit a tomar medidas de pH en varios puntos de la 
misma. 
7.8.2  Medición. 
Si la muestra tiene consistencia firme, hacer un ag ujero para cada determinación de manera que el 
electrodo pueda ser introducido cuidadosamente para  no quebrarlo. 
7.8.3  Efectuar las lecturas como se describió anteriorme nte. 
Si se considera importante conocer las diferencias entre los valores del pH tomados en diferentes punt os 
de la muestra, el número de determinaciones estará en función de la naturaleza y el tamaño de la muest ra. 
El lavado de los electrodos debe hacerse como se de scribió en el punto 10.10.6 
7.8.4  Expresión de resultados. 
Tomar como resultado la media aritmética de los val ores obtenidos en el mismo punto de la muestra 
siempre y cuando la variación no sea mayor a 0,15 u nidades de pH. 
Reportar que el promedio de pH para cada punto al m ás cercano a 0,1 unidades de pH. 
7.9  Precauciones. 
Determinar el pH de la muestra inmediatamente cuand o sea posible o almacenarla de tal manera que el 
cambio de pH se restrinja al mínimo. 
Durante las mediciones el aparato debe estar proteg ido de cambios de corriente eléctrica externa. 
8. Nitrógeno amoniacal (NVT). 
8.1  Fundamento. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
La muestra se destila bajo condiciones establecidas  en presencia de óxido de magnesio recibiendo las 
bases volátiles en un ácido débil de donde son titu ladas. 
8.2  Material y equipo. 
8.2.1  Bureta de 10 ml graduada en 0,01 
8.2.2  Matraz de Kjeldahl de 800ml 
8.2.3  Matraz Erlenmeyer de 500ml 
8.2.4  Probeta 
8.2.5  Cuerpos de ebullición 
8.2.6  Equipo de destilación macro Kjeldahl 
8.2.7  Balanza analítica con sensibilidad de 0,1mg 
8.2.8  Agua destilada 
8.3  Reactivos. 
8.3.1  Acido bórico H 3BO 3 al 2% grado reactivo, pesar 20g y diluir con agua d estilada a 1 litro. 
8.3.2  Acido sulfúrico o clorhídrico 0,1N valorado 
8.3.3  Rojo de metilo 
8.3.4  Azul de metileno 
8.3.5  Etanol 
8.3.6  Oxido de magnesio grado reactivo 
8.3.7  Antiespumante preparación de silicones o alcohol o ctílico. 
8.3.8  Preparación del reactivo de Wesslow. 
8.3.8.1  En una mezcla 60:40 de etanol-agua, agregar rojo d e metilo hasta llegar al 0,2%. 
8.3.8.2  Preparar una dilución de azul de metileno al 0,2% en agua destilada. 
8.3.8.3  Mezclar dos partes de la solución de rojo de metil o con una parte de azul de metileno. 
8.4  Preparación de la muestra. 
8.4.1  Para prevenir la pérdida de agua durante la prepar ación y subsecuente manejo no se deben usar 
muestras pequeñas (la cantidad mínima aceptable es de 500g). 
8.4.2  Guardar el material molido en recipientes de vidri o o similares con tapas herméticas que lo protejan 
del aire y del agua. 
8.4.3  Pasar la muestra rápidamente tres veces a través d e un molino de alimentos con placas de 
aproximadamente 3mm de abertura. 
8.4.4  Mezclar perfectamente después de cada molienda y c omenzar todas las determinaciones lo más 
rápido posible, si ocurriera cualquier demora, cong elar la muestra para inhibir la descomposición (-2 a -4° C). 
8.5  Procedimiento. 
8.5.1  Pesar 10g de muestra preparada como se indica en e l punto 2.4 transferirla cuantitativamente a un 
matraz de Kjeldahl 800ml. 
8.5.2  Agregar 2g de óxido de magnesio, 300 ml de agua de stilada y los cuerpos de ebullición (en caso 
necesario, agregar algún agente antiespumante). 
8.5.3  Disgregar perfectamente la muestra, por medio de m ovimientos circulares. Recibir el destilado en un 
matraz Erlenmeyer de 500ml conteniendo 25ml de ácid o bórico y unas gotas del indicador de Wesslow (la 
parte terminal del tubo debe estar dentro del ácido ). 
8.5.4  Conectar el matraz de Kjeldahl al equipo de destil ación y calentar de manera que hierva 
exactamente durante un periodo de 10 min, mantener la temperatura exactamente durante 25 min. 
8.5.6  Lavar el refrigerante con agua destilada y titular  con ácido sulfúrico o clorhídrico. 
8.5.7  Titular la solución destilada utilizando el ácido clorhídrico o sulfúrico.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
8.5.8  Simultáneamente, determinar un blanco. 
Nota: Antes de realizar la determinación definir lo s tiempos y temperaturas con una prueba. 
8.6  Cálculos. 
 
El resultado se expresa en mgN/100g 
En donde: 
v1 = ml de ácido sulfúrico 0,1N requeridos en la ti tulación de la muestra.  
v2 = ml de ácido sulfúrico 0,1N requeridos en la ti tulación del blanco. 
N = Normalidad del ácido sulfúrico o clorhídrico. 
PM = Peso de la muestra. 
14 = Miliequivalente de Nitrógeno. 
9. Método de prueba para la determinación de cadmio , arsénico , plomo , estaño , cobre , fierro , zinc y 
mercurio en alimentos , agua potable y agua purificada por espectrometría de absorción atómica. 
9.1  Fundamento 
El método de absorción atómica se basa en hacer pas ar un haz de luz monocromática de una frecuencia 
tal que puede ser absorbido por el analito que se e ncuentra presente en forma de vapor atómico. La med ida 
de la intensidad luminosa antes y después de su pas o por el vapor atómico permite determinar el porcie nto de 
absorción. La cantidad de absorción aumenta con la concentración de los átomos en el medio absorbente,  es 
decir, la medida de la absorción aumenta con la con centración del elemento en la muestra, ya sea que e sté en 
su condición original o sujeta a pretratamiento. 
9.2  Reactivos y materiales 
9.2.1  Reactivos 
/square4 Soluciones estándares de referencia certificadas d e cada uno de los metales. 
/square4 Agua, debe ser destilada deionizada, con un grado máximo de conductividad de 1 µmho/cm a 25ºC. 
/square4 Acido nítrico (densidad específica 1,41), grado su prapuro. 
/square4 Acido nítrico (densidad específica 1,41), contenid o de mercurio muy bajo. 
/square4 Acido perclórico (densidad específica 1,67), grado  suprapuro. 
/square4 Acido clorhídrico (densidad específica 1,19), grad o suprapuro. 
/square4 Acido sulfúrico (densidad específica 1,84), grado suprapuro. 
/square4 Acido sulfúrico 1 N a partir de la solución grado suprapuro. 
/square4 Acido nítrico 65% v/v grado RA. 
/square4 Peróxido de hidrógeno (densidad específica 1,12). 
/square4 Hidróxido de sodio granalla reactivo RA. 
/square4 Aire comprimido seco y limpio. 
/square4 Gases: acetileno, óxido nitroso, argón y nitrógeno , grado absorción atómica. 
/square4 Solución de Nitrato de Magnesio hexahidratado al 7 % p/v. Disolver 70 g de Mg(NO3)2.6H2O en 1000 
ml de HCl 1 N. 
/square4 Acido clorhídrico 1 N. Diluir 8,3 ml de HCl y llev ar a 100 ml de agua. 
/square4 Acido nítrico al 50% v/v. Diluir 50 ml de HNO3 al 65% v/v grado suprapuro en 50 ml de agua. 
/square4 Acido clorhídrico 8 M. Diluir 66,0 ml de HCl y lle var a 100 ml con agua. 
/square4 Acido clorhídrico 0,5 N. Diluir 4,15 ml de HCl y l levar a 100 ml con agua. 
/square4 Solución de Yoduro de Potasio al 15% p/v. Disolver  15 g de KI en 100 ml de agua (esta solución 
debe prepararse en el momento de usarse). Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
/square4 Solución de Yoduro de Potasio al 20% p/v. Disolver  20 g de KI en 100 ml de agua (esta solución 
debe prepararse en el momento de usarse). 
/square4 Solución de Cloruro de Potasio (10 mg/ml de K). Di solver 1,91 g de KCl en agua y diluir a 100 ml  con  
agua. 
/square4 Solución de Nitrato de Magnesio al 50% p/v. Disolv er 50 g de Mg(NO3)2.6H2O en 100 ml de agua. 
/square4 Solución de ácido clorhídrico al 1,5% p/v. Diluir 1,5 ml de HCl en 100 ml de agua destilada 
deionizada. 
/square4 Solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 1 g de hidróxido de sodio y diluir a 100 ml con agua 
destilada deionizada. 
/square4 Solución de borohidruro de sodio al 4% p/v en solu ción de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 4 g de 
borohidruro de sodio en 100 ml de una solución de h idróxido de sodio al 1% p/v. Filtrar al vacío. 
/square4 Solución reductora para mercurio. Mezclar 50 ml de  ácido sulfúrico concentrado con 
aproximadamente 300 ml de agua. Enfriar a temperatu ra ambiente y disolver 15 g de cloruro de 
sodio, 15 g de sulfato o cloruro de hidroxilamina y  25 g de cloruro o sulfato estanoso en solución. 
Diluir a 500 ml. 
/square4 Solución de dilución para mercurio. En un matraz d e 1 l, conteniendo de 300 a 500 ml de agua 
destilada deionizada, agregar 58 ml de ácido nítric o concentrado de muy baja concentración de 
mercurio y 67 ml de ácido sulfúrico concentrado. Di luir al volumen con agua. 
/square4 Solución de trabajo de As de 1 µg/ml. Diluir 1 ml de la solución patrón de 1000 µg/ml a 1 l con ácido  
sulfúrico 1N preparada a partir de la solución grad o suprapuro. Preparar fresca cada día. 
9.2.2  Materiales 
/square4 Matraces Kjeldahl de 500 ml y 800 ml. 
/square4 Sistema de reflujo con refrigerante. 
/square4 Crisoles Vycor de 40 a 50 ml de capacidad. 
/square4 Crisoles de platino de 40 a 50 ml de capacidad. 
/square4 Matraces Erlenmeyer de diferentes capacidades. 
/square4 Matraces volumétricos de diferentes capacidades. 
/square4 Matraces redondos de fondo plano de 50 ml. 
/square4 Bombas Parr. 
/square4 Micropipetas o pipetas de Eppendorf de diferentes capacidades. 
/square4 Puntas de plástico para micropipetas. 
/square4 Papel filtro Whatman No. 2. 
/square4 Perlas de ebullición. 
/square4 Varillas de plástico. 
/square4 Tubos de ensayo graduados de propilen o propileno de 15 ml. 
/square4 Recipientes de propilen o propileno. 
/square4 Embudos de filtración de diferentes capacidades. 
/square4 Material común de laboratorio. 
Todo el material utilizado debe someterse a lavado de acuerdo con las siguientes instrucciones: 
o El jabón que se use debe ser de preferencia neutr o. 
o Enjuagar perfectamente con agua corriente. 
o Sumergir el material de vidrio o plástico en un r ecipiente (de preferencia plástico) que contenga un a 
solución de ácido nítrico grado RA al 30%. 
o Dejarlo tapado y reposando por un lapso de 24 hor as. 
o Quitar el exceso de ácido nítrico con varios enju agues (5 o 6 veces) con agua deionizada.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
o Dejar escurrir y secar. 
o Guardar en cuanto esté seco para evitar contamina ción por partículas en el aire. 
9.3  Aparatos e instrumentos 
9.3.1  Aparatos 
/square4 Lámparas de cátodo hueco o de descarga sin electro dos para determinar arsénico, cadmio, cobre, 
estaño, fierro, mercurio, plomo y zinc. 
/square4 Fuente de radiofrecuencia en caso de usar lámparas  de descarga. 
/square4 Automuestreador y recirculador de agua. 
/square4 Placa de calentamiento con regulador que alcance u na temperatura de 400 a 450ºC. 
/square4 Horno de microondas. 
/square4 Autoclave que alcance 121 ± 5ºC o 15 lb de presión . 
/square4 Centrífuga de laboratorio capaz de mantener 1600 r pm. 
9.3.2 Instrumentos 
Los instrumentos que a continuación se indican debe n estar calibrados y ajustados antes de su operació n. 
/square4 Espectrómetro de absorción atómica equipado con lo s accesorios para flama, horno de grafito, 
generador de hidruros o vapor frío, dependiendo del  método a seguir. 
/square4 Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg. 
/square4 Mufla capaz de mantener una temperatura de 550 ± 1 0ºC. 
/square4 Horno de calentamiento (estufa) con intervalo de t emperatura de 120 ± 5ºC. 
9.4 Preparación de la muestra 
9.4.1  Digestión para la determinación de Cd, Cu, Fe, Pb y Zn. 
9.4.1.1  Digestión por vía húmeda. 
9.4.1.1.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad apro piada de muestra. 
Para la determinación por el método de absorción po r flama pesar como máximo 40 g de jugo o bebida, 20  
g de alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos sólidos o semisólidos. Limite e l 
contenido de grasa o aceite a un máximo de 4 g y el  total de materia orgánica a 5 g. 
9.4.1.1.2  Añadir 10 ml de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar directamente  la 
digestión. 
9.4.1.1.3  Usar matraz de Kjeldhal o matraz conectado al sist ema de refrigerantes. 
9.4.1.1.4  Calentar suavemente. 
9.4.1.1.5  Digerir la muestra 3 horas o más tiempo si es nece sario (algunas muestras requieren la adición 
de mayor cantidad de ácido nítrico) hasta la aparic ión del color traslúcido, si queda ámbar, adicionar  peróxido 
de hidrógeno gota a gota con agitación continua (re acción exotérmica). 
9.4.1.1.6  Enfriar. 
9.4.1.1.7  Recuperar, filtrar y llevar a un volumen conocido en matraz volumétrico. 
9.4.1.1.8  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificad a por cada serie de digestión. 
9.4.1.1.9  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de a bsorción atómica por flama u horno  de 
grafito). 
9.4.1.2  Digestión por vía seca. 
9.4.1.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad apro piada de muestra. 
Para la determinación por el método de absorción po r flama pesar como máximo 40 g de jugo o bebida, 20  
g de alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos sólidos y semisólidos. Limite e l 
contenido de grasa o aceite a un máximo de 4 g y el  total de materia orgánica a 5 g. 
9.4.1.2.2  Añadir 10 ml de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar directamente la 
digestión. En productos con alta concentración de p roteínas adicionar una solución de nitrato de magne sio al Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
7,0% p/v y mezclar completamente, llevar a sequedad  aproximadamente durante 6 horas en estufa a una 
temperatura de 90 a 95ºC. 
9.4.1.2.3  Colocar la muestra en una mufla y elevar la temper atura lentamente de 2 a 4ºC por minuto hasta 
350° C. Mantener la temperatura hasta que cesen los humos. 
9.4.1.2.4  Elevar gradualmente la temperatura de 500 a 550ºC para evitar que la muestra se incinere  y 
mantener esa temperatura durante 16 horas o toda la  noche. 
9.4.1.2.5  Apagar la mufla y dejar enfriar. 
9.4.1.2.6  Un segundo paso de calcinación puede ser requerido  para remover algunos residuos de carbón, 
mediante el siguiente procedimiento: 
Lavar las paredes del crisol con 2 ml de ácido nítr ico al 50%. Colocar la muestra en una placa de 
calentamiento puesta a 120ºC para remover el exceso  de ácido. Colocar la muestra en una mufla fría y e levar 
la temperatura gradualmente de 500 a 550ºC, manteni éndola por el tiempo necesario. Repetir este 
procedimiento cuantas veces sea necesario hasta que  quede libre de carbón remanente. 
9.4.1.2.7  Disolver las cenizas completamente en 5 ml de ácid o clorhídrico 1N, transferir la muestra disuelta 
a un tubo de propileno o a un matraz de volumen con ocido, enjuagar el crisol con dos alícuotas de 5 ml  de 
ácido clorhídrico 1 N y transferir al mismo tubo o matraz para obtener un volumen de 15 ml en el prime ro y 
llevar al aforo en el segundo, tapar y mezclar, si existe presencia de partículas o materia insoluble,  filtrar en 
papel Whatman No. 2, antes de la determinación. 
9.4.1.2.8  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificad a por cada serie de digestión. 
9.4.1.2.9  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de a bsorción atómica: flama u horno de grafito). 
9.4.2  Digestión por vía húmeda para la determinación de Sn. 
9.4.2.1  Proceder igual que en el punto 9.4.1.1.1. 
9.4.2.2  No adicionar ácido nítrico si no se lleva cabo la digestión total en el mismo día. 
9.4.2.3  Adicionar 30 ml de ácido nítrico concentrado al ma traz y calentar suavemente por 15 minutos en 
campana para iniciar la digestión, evitando una exc esiva producción de espuma. 
9.4.2.4  Hervir suavemente hasta tener un remanente de 3 a 6 ml o hasta que la muestra empiece a 
secarse en el fondo. No dejar que la muestra se cal cine. 
9.4.2.5  Retirar la muestra del calor. 
9.4.2.6  Al mismo tiempo correr dos blancos de reactivos. 
9.4.2.7  Adicionar 25 ml de ácido clorhídrico concentrado, calentar suavemente durante aproximadamente 
15 minutos, hasta que todo el cloro sea liberado. A umentar la temperatura gradualmente hasta ebullició n. 
9.4.2.8  Evaporar hasta obtener de 10 a 15 ml, usando un ma traz similar con 15 ml de agua como patrón 
de volumen. 
9.4.2.9  Adicionar aproximadamente 40 ml de agua. 
9.4.2.10  Agitar y pasar a un matraz de 100 ml y enjuagar co n 10 ml de agua. 
9.4.2.11  Cuando el ácido clorhídrico está presente en la di gestión, las muestras se pueden quedar toda la 
noche o por más tiempo. 
9.4.2.12  Agregar 1 ml de solución de cloruro de potasio en cada matraz. 
9.4.2.13  Enfriar a temperatura ambiente. 
9.4.2.14  Diluir con agua y agregar más agua para compensar el volumen de grasa en el matraz. 
9.4.2.15  Mezclar perfectamente y filtrar de 30 a 50 ml a tr avés de un papel filtro Whatman No. 2 y recoger 
el filtrado en un recipiente de propileno, poliprop ileno o polietileno. 
9.4.2.16  No filtrar los blancos. Tapar las botellas durante  el análisis. Las soluciones son estables por vario s 
meses. 
9.4.2.17  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificad a por cada serie de digestión. 
9.4.2.18  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de a bsorción atómica: flama u horno de grafito).       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
9.4.3  Digestión por vía húmeda para la determinación de Hg. 
9.4.3.1  Sistema de reflujo. 
9.4.3.1.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad aprop iada de muestra, dependiendo el tipo de ésta, 
en un matraz de digestión y adicionar perlas de ebu llición. 
9.4.3.1.2  Conectar el matraz al sistema de reflujo y agregar  poco a poco la cantidad necesaria de ácido 
nítrico concentrado y calentar durante media hora o  hasta que no se observen cambios en la digestión. 
9.4.3.1.3  Dejar enfriar y agregar una mezcla de ácido nítric o y ácido sulfúrico concentrados (1 + 1). 
9.4.3.1.4  Calentar y agregar más ácido nítrico gota a gota s obre las paredes del recipiente, hasta que el 
color obscuro de la solución desaparezca. 
9.4.3.1.5  Enfriar. 
9.4.3.1.6 Si existe grasa o cera filtrar la solución. 
9.4.3.1.7 Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada  por cada serie de digestión. 
9.4.3.1.8  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de a bsorción atómica de vapor frío). 
9.4.3.2  Sistema cerrado. 
9.4.3.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad aprop iada de muestra, dependiendo el tipo de ésta, 
en el recipiente de digestión. 
9.4.3.2.2  Agregar la cantidad necesaria de ácido nítrico con centrado. 
9.4.3.2.3  Tapar y sellar perfectamente el recipiente de dige stión. 
9.4.3.2.4  Si el recipiente de digestión es un matraz Erlenme yer, colocar éste en una autoclave a 15 lb por 
30 minutos. Si se utiliza bomba Parr, calentar en p arrilla controlando la temperatura a un máximo de 3 00ºC 
por 30 minutos. 
9.4.3.2.5  Enfriar a temperatura ambiente. 
9.4.3.2.6  En caso de que la digestión no sea completa adicio nar peróxido de hidrógeno y repetir  la 
digestión. 
9.4.3.2.7  Filtrar en caso de que exista grasa o cera y anali zar el contenido de Hg. 
9.4.3.2.8  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificad a por cada serie de digestión. 
9.4.3.2.9  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de a bsorción atómica de vapor frío). 
9.4.4  Digestión para la determinación de As. 
9.4.4.1  Digestión por vía húmeda-seca. 
9.4.4.1.1  Proceder como en el punto 9.4.3.2 hasta que la dig estión sea completa y posteriormente 
continuar con los siguientes pasos. 
9.4.4.1.2  Con una pipeta tomar una alícuota de la solución d e muestra digerida y colocarla en un crisol 
Vycor o vaso de precipitados. 
9.4.4.1.3  Añadir 1 ml de solución de nitrato de magnesio al 7% p/v y calentar en una parrilla a temperatura 
baja, hasta sequedad. 
9.4.4.1.4  Incrementar  el calor de la placa a un máximo de 375ºC.  
9.4.4.1.5  Colocar el matraz en la mufla a 450ºC para oxidar cualquier residuo de carbón y descomponer el 
exceso de nitrato de magnesio, por un tiempo mayor o igual a 30 minutos. 
9.4.4.1.6  Enfriar y disolver el residuo en 2,0 ml de ácido c lorhídrico 8 M. 
9.4.4.1.7  Añadir 0,1 ml de yoduro de potasio al 20% p/v para  reducir el As(V) a As(III). 
9.4.4.1.8  Dejar reposar por un tiempo mayor a 2 minutos y tr ansferir a un matraz y llevar al aforo con agua. 
9.4.4.1.9 Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada  por cada serie de digestión. 
9.4.4.1.10  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de a bsorción atómica con adaptación para horno 
de grafito o generador de hidruros). 
9.4.4.2  Digestión por vía seca. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
9.4.4.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad neces aria de muestra en un crisol Vycor  o de 
platino. 
9.4.4.2.2 Añadir el volumen necesario de nitrato de magnesio al 50% p/v. 
9.4.4.2.3  Homogeneizar con una varilla limpia de plástico ex tendiendo la mezcla en el crisol. 
9.4.4.2.4  Colocar la muestra en una mufla subiendo gradualme nte la temperatura hasta 300ºC por 2 horas. 
Posteriormente subir gradualmente la temperatura ha sta 500ºC por 16 horas o durante toda la noche. 
9.4.4.2.5  Enfriar a temperatura ambiente y humedecer las cen izas con ácido nítrico al 50% v/v. 
9.4.4.2.6  Calentar en parrilla hasta la eliminación del ácid o. 
9.4.4.2.7 Llevar los crisoles a una mufla elevando gradualmen te la temperatura de 23 a 500ºC, 
manteniendo ésta 30 min hasta evaporación total. 
9.4.4.2.8 Transferir las cenizas del crisol a un matraz afora do usando una porción de 10 ml de ácido 
clorhídrico 0,5 N. 
9.4.4.2.9  Enjuagar los crisoles con 5 ml de agua destilada y  transferir al matraz, añadir 1 ml de solución de 
yoduro de potasio al 15% y mezclar. 
9.4.4.2.10  Dejar reposar durante 15 minutos y llevar al aforo . 
9.4.4.2.11  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificad a por cada serie de digestión. 
9.4.4.2.12  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de a bsorción atómica con adaptación para horno 
de grafito o generador de hidruros). 
9.4.5  Digestión para la determinación de Cd, As, Pb, Sn,  Cu, Fe, Zn y Hg por horno de microondas. 
Pesar con precisión de ± 0,1 mg, 0,500 g como máxim o de muestra, añadir 6 ml de ácido nítrico 
concentrado y 2 ml de agua oxigenada al 30%, cerrar  perfectamente el envase de reacción y proceder seg ún 
el manual del fabricante. 
9.5  Procedimiento 
9.5.1  Espectrometría de absorción atómica por flama. 
9.5.1.1  Calibración. Es necesario comprobar que se tiene u na calibración inicial y periódica aceptable. 
9.5.1.1.1  Se inicia la configuración operacional del instrum ento y en el sistema de adquisición de datos. 
Permitir un periodo no menor a 30 minutos para el c alentamiento de las lámparas de descarga sin electr odos. 
9.5.1.1.2  Se debe verificar la estabilidad del instrumento m ediante el análisis de una solución estándar 20 
veces más concentrada que el límite de detección de l instrumento (LDI) para el analito, leída un mínim o de 
cinco veces y calculando la desviación estándar res ultante, la cual debe ser menor al 5%. 
9.5.1.1.3  El instrumento debe calibrarse para el analito a d eterminar usando el blanco de calibración y los 
estándares de calibración preparados a 3 o 4 nivele s de concentración dentro del intervalo dinámico de  
concentración del analito. 
9.5.1.1.4  Ajustar el instrumento a 0 con el blanco de calibr ación. Introducir los estándares de calibración 
del analito de menor a mayor concentración y regist rar al menos tres réplicas de la absorbancia de cad a uno. 
9.5.1.1.5  Elaborar una curva de calibración graficando absor bancia en función de la concentración. 
Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se  programan directamente, en los cuales sólo es 
necesario introducir los estándares y marcar su con centración teórica. 
9.5.1.2  Operación del instrumento. 
El desempeño del instrumento se verifica mediante e l empleo de blancos de calibración, estándares de 
calibración y una muestra de control de calidad (MC C). 
9.5.1.2.1  Después de que se ha realizado la calibración, se debe verificar que el instrumento trabaje 
adecuadamente para el analito. Para ello se analiza  una muestra de control de calidad. Si las medicion es 
varían en ± 10% o más, al valor establecido para la  MCC, el análisis debe interrumpirse y buscar la po sible 
causa de error, el instrumento se debe recalibrar y  verificar la nueva calibración. 
9.5.1.2.2  Para verificar que el instrumento no presenta deri va, por cada 10 análisis se debe analizar el 
blanco de calibración. Si el valor verdadero del an alito difiere ± 10% o más, el instrumento debe reca librarse. 
Si el error persiste debe identificarse el problema  y corregirse.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Si la matriz de la muestra es responsable de la der iva o afecta la respuesta del analito puede ser 
necesario trabajar por adiciones estándar. 
9.5.1.2.3  La demostración de la operatividad inicial del ins trumento se hace estableciendo los límites de 
detección del método (LDM) para el analito y el int ervalo de calibración lineal. Para determinar el LD M se usa 
un blanco de reactivos fortificado con una concentr ación del analito equivalente de 2 a 5 veces el lím ite de 
detección estimado. Se hacen al menos 4 réplicas de  lectura de absorbancia del blanco de reactivos 
fortificado procesado a través de todo el método an alítico. Los LDM se calculan de acuerdo a: 
LDM= t x s 
t = valor de la "T" de Student a un intervalo de co nfianza de 99% y una desviación estándar estimada p ara 
n-1 grados de libertad. t = 3,14 para 7 réplicas. 
s = desviación estándar de las réplicas del análisi s. 
El intervalo lineal de calibración se establece a p artir de por lo menos 4 estándares de diferente 
concentración, uno de los cuales debe estar próximo  al límite superior del intervalo lineal. 
9.5.1.3  Determinación 
9.5.1.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómica en las  condiciones adecuadas para la determinación 
del analito de acuerdo a las indicaciones del manua l del instrumento. 
9.5.1.3.2  Introducir el blanco de reactivos y la muestra a a nalizar y registrar los valores de absorbancia. Se 
debe analizar al menos un blanco de reactivos con c ada grupo de muestras. Los valores obtenidos ponen de 
manifiesto la calidad de los reactivos usados y el grado de contaminación del laboratorio. 
9.5.1.3.3  En los equipos que pueden programarse, la lectura obtenida da directamente la concentración 
del elemento en las unidades de concentración utili zadas. 
9.5.1.3.4  Se debe analizar al menos un blanco de reactivos f ortificado para cada grupo de muestras. Se 
calcula la exactitud como el porciento de recuperac ión (de acuerdo al apartado 9.5.1.3.6). 
9.5.1.3.5  Se debe fortificar al menos una muestra por grupo o el 10% de ellas lo que resulte mayor. La 
concentración añadida debe ser de aproximadamente 0 ,1 unidades de absorbancia. 
9.5.1.3.6  Se debe calcular el porciento de recuperación para  el analito, de acuerdo a: 
CM - C 
R = -------------- x 100 
CA 
R = % recuperación 
CM = Concentración de la muestra fortificada 
C = Concentración de la muestra 
CA = Concentración equivalente de analito añadido a  la muestra. 
Si la recuperación del analito en la muestra fortif icada está fuera del intervalo previamente establec ido y el 
blanco de reactivos fortificado está correcto, pued e existir un problema relacionado con la matriz de la 
muestra. Los datos se deben verificar por el método  de las adiciones estándar. 
9.5.2  Espectrometría de absorción atómica por horno de g rafito. 
9.5.2.1  Calibración. 
9.5.2.1.1  Proceder de acuerdo a los puntos 9.5.1.1.1 a 9.5.1 .1.4 
9.5.2.1.2  Elaborar una curva de calibración graficando área de pico o altura máxima contra concentración 
del analito. 
La calibración mediante el uso de una computadora o  una calculadora basada en el ajuste sobre los dato s 
de concentración respuesta es aceptada. 
Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se  programan directamente, en los cuales sólo es 
necesario introducir los estándares y marcar su con centración teórica. 
9.5.2.2  Operación del instrumento. 
9.5.2.2.1  Proceder de acuerdo a 9.5.1.2.1 a 9.5.1.2.3 Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
9.5.2.3  Determinación. 
9.5.2.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómica en las  condiciones adecuadas para la determinación 
del analito, de acuerdo a las recomendaciones del m anual del instrumento. 
El programa de temperaturas para el horno de grafit o puede variar dependiendo de la matriz de la 
muestra. En el caso de existir interferencias no es pecíficas (absorción molecular o dispersión de la l uz), se 
recomienda consultar la bibliografía existente en c uanto a los métodos disponibles para eliminarlas, a sí como 
en el caso de interferencias de matriz. 
9.5.3  Espectrometría de absorción atómica por generador de hidruros. 
9.5.3.1  Calibración. 
9.5.3.1.1  Proceder de acuerdo a los puntos 9.5.1.1.1 a 9.5.1 .1.4 
9.5.3.1.2  A partir de la solución estándar de As de 1000 mg/ l, preparar una solución de As de 1 mg/l en 
ácido clorhídrico de concentración apropiada al mét odo. Trazar una curva de calibración de absorbancia  
(máximo de la altura de pico) en función de la conc entración del analito para un intervalo de concentr ación de 
0 a 10 µg/l de As bajo las mismas condiciones de la  matriz de la muestra. 
9.5.3.2  Operación del instrumento. 
9.5.3.2.1  Proceder de acuerdo a los puntos 9.5.1.2.1 a 9.5.1 .2.3 
9.5.3.3  Determinación. 
9.5.3.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómica en las  condiciones adecuadas para la determinación 
de As: longitud de onda de 193,7 nm y lámpara de de scarga sin electrodos. Colocar y ajustar la celda d e 
absorción de acuerdo al manual del fabricante. Ajus tar el flujo de gas (nitrógeno o argón). 
9.5.3.3.2  Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibr ación de ácido clorhídrico al 1,5% siguiendo las 
instrucciones del manual del fabricante. 
9.5.3.3.3  Optimizar con un estándar de calibración la respue sta del instrumento al analito (por lo general, 
10 ml de una solución de 5 µg/l de As da una absorb ancia de 0,2), ajustando el tiempo de purga I, el t iempo 
de reacción y el tiempo de purga II. 
9.5.3.3.4  Tomar un volumen conocido de la muestra dirigida y  seguir el mismo procedimiento que con los 
estándares de calibración. 
9.5.4  Espectrometría de absorción atómica por vapor frío . 
9.5.4.1  Calibración. 
9.5.4.1.1  Proceder igual que en los puntos 9.5.1.1.1 a 9.5.1 .1.4. 
9.5.4.1.2  A partir de la solución de trabajo de 1 µg/ml prep arar estándares de calibración que contengan 0, 
0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1,0 µg de Hg a frascos de reac ción. A cada frasco agregar 100 ml de la solución d e dilución 
y 20 ml de la solución de reducción. Trazar la curv a de calibración de absorbancia (altura máxima de p ico) en 
función de la concentración del analito. 
9.5.4.2  Operación del instrumento. 
9.5.4.2.1  Proceder de acuerdo a los puntos 9.5.1.2.1 a 9.5.1 .2.3. 
9.5.4.3  Determinación. 
9.5.4.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómica en las  condiciones adecuadas para la determinación 
de Hg: longitud de onda de 253,6 nm, slit 0,7 nm y lámpara de cátodo hueco. Colocar y ajustar la celda  de 
absorción de acuerdo al manual del fabricante. Ajus tar el flujo de gas (nitrógeno o argón). 
9.5.4.3.2  Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibr ación (solución de dilución y de reducción) 
siguiendo las instrucciones del manual del fabrican te. 
9.5.4.3.3  Optimizar con un estándar de calibración la respue sta del instrumento al analito. 
9.5.4.3.4  Tomar 25 ml de la muestra digerida y seguir el mis mo procedimiento que con los estándares  de 
calibración. 
9.6  Expresión de resultados 
9.6.1  Método de cálculo.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Interpolar los valores de absorbancia o altura de p ico de la muestra analizada en la curva de calibrac ión y 
obtener los mg/kg del elemento en la muestra y real izar los cálculos empleando la siguiente fórmula: 
               A x B 
mg/ kg = -------- 
              C 
en donde: 
A = Concentración en mg/kg de la muestra a interpol ar en la curva de calibración. 
B = Volumen final al que se llevó la muestra (ml). 
C = Peso de la muestra (g) o volumen de la muestra (ml) en el caso de agua. 
En los equipos que pueden programarse, la lectura o btenida da directamente la concentración del 
elemento en mg/kg o µg/kg. 
9.7  Informe de la prueba 
Los resultados se informarán en mg/kg o µg/kg del e lemento a determinar. 
10. Preparación y dilución de muestras de alimentos  para su análisis microbiológico. 
10.1  Fundamento 
Se basa en la preparación de diluciones primarias, para obtener una distribución lo más uniforme posib le 
de los microorganismos presentes en la porción de m uestra. 
10.2  Reactivos y materiales 
10.2.1  Reactivos 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben  ser grado analítico. Cuando se indique agua debe 
entenderse como agua destilada. 
10.2.1.1  Preparación de reactivos 
10.2.1.1.1  Solución de hidróxido de sodio 1,0 N 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Hidróxido de sodio 4,0 g 
Agua 100,0 ml 
 
Preparación:  Disolver el hidróxido de sodio y llevar a 100 ml c on agua. 
10.2.1.1.2  Soluciones diluyentes 
10.2.1.1.2.1 Solución reguladora de fosfatos (solución concentra da). 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Fosfato de Sodio monobásico 34,0 g 
Agua 1,0 l 
 
Preparación:  Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el  pH a 7,2 con solución de hidróxido de 
sodio 1,0 N. Llevar a un litro con agua. Esteriliza r durante 15 minutos a 121°  ± 1,0° C. Conservar en 
refrigeración (solución concentrada). Tomar 1,25 ml  de la solución concentrada y llevar a un litro con  agua 
(solución de trabajo). Distribuir en porciones de 9 9, 90 y 9 ml según se requiera. Esterilizar a 121°  ± 1,0° C 
durante 15 minutos. Después de la esterilización, e l pH y los volúmenes finales de la solución de trab ajo 
deberán ser iguales a los iniciales. 
10.2.1.1.2.2 Agua peptonada 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Peptona 1,0 g 
Cloruro de sodio 8,5 g 
Agua 1,0 l 
 
Preparación:  Disolver los componentes en un litro de agua. Ajus tar el pH a 7 ± O,1 con hidróxido de sodio 
1,0 N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o e n cualquier volumen múltiplo de nueve según se requ iera. 
Esterilizar a 121 ± 1,0° C durante 15 minutos. Despu és de la esterilización, el pH y los volúmenes fina les de la 
solución de trabajo deberán ser iguales a los inici ales. Si este diluyente no es usado inmediatamente,  
almacenar en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5° C por un tiempo no mayor de un mes, en 
condiciones tales que no alteren su volumen o compo sición. 
10.2.2  Materiales 
• Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 ml (o si es necesario de 1 ml y 2 ml), con tapón de 
algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúme nes iguales a una décima de su volumen total. 
• Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca. 
• Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca. 
• Utensilios esterilizables para la obtención de mue stras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas,  
espátulas, etc. 
• Todo el material e instrumentos que tengan contact o con las muestras bajo estudio deberán 
esterilizarse mediante: 
• Horno, durante 2 h a 170 a 175° C o 1 h a 180° C o A utoclave, durante 15 minutos como mínimo  a 
121 ± 1,0° C. 
• El material de vidrio puede sustituirse por materi al desechable que cumpla con las especificaciones 
deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por esterilización repetida y éste debe ser 
químicamente inerte. 
10.3 Aparatos e instrumentos 
• Horno para esterilizar que alcance una temperatura  mínima de 170° C.  
• Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada co n termómetro de máximas y mínimas. 
• Baño de agua con control de temperatura y circulac ión mecánica, provista con termómetro calibrado 
con divisiones de 0,1° C y que mantenga la temperatu ra a 45 ± 0,5° C. 
• Licuadora de una o dos velocidades controladas por  un reóstato o bien un homogeneizador 
peristáltico (Stomacher). 
• Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bol sas estériles para homogeneizador peristáltico. 
• Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g. 
10.4 Procedimiento 
10.4.1  Preparación de la dilución primaria. 
10.4.1.1  A partir de muestras líquidas: 
Para muestras líquidas no viscosas (agua, leche, re frescos, etc.) en las cuales la distribución de 
microorganismos es homogénea o fácilmente homogenei zable por medios mecánicos (agitación, etc.) 
Para muestras congeladas de un alimento originalmen te líquido o licuable, fundir por completo en baño de 
agua de 40 a 45° C un tiempo máximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente. 
Para la parte líquida de una muestra heterogénea la  cual sea considerada suficientemente representativ a 
de la muestra total (Por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales). 
10.4.1.1.1  Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos d e arriba a abajo en un arco de 30 cm 
efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 ml d e la muestra y diluir con 9 ml del diluyente el cua l debe 
encontrarse a una temperatura similar a ésta, evita ndo el contacto entre la pipeta y el diluyente. 
10.4.1.1.2  Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tom ar alícuotas mayores, por ejemplo 
volúmenes de 10 u 11 ml, diluidos con 90 o 99 ml, d e la misma forma que se describió anteriormente.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
10.4.1.2  A partir de muestras sólidas o semisólidas. 
Las muestras sólidas y semisólidas congeladas, debe n descongelarse en refrigeración de 4 a 8° C durante  
18 horas y no más de 24 horas antes de proceder a s u análisis. 
10.4.1.2.1  Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plástica 
estériles de tamaño adecuado. 
10.4.1.2.2  Adicionar un volumen de 90 a 99 ml del diluyente l levado a una temperatura similar a la de  la 
muestra. 
10.4.1.2.3  Operar la licuadora o el homogeneizador peristálti co de 1 a 2 minutos hasta obtener una 
suspensión completa y homogénea según se indique en  la técnica correspondiente para cada alimento. Aun  
en los equipos más lentos, este tiempo no debe exce der de 2,5 minutos. 
10.4.1.2.4  Permitir que las partículas grandes se sedimenten,  y transferir la cantidad deseada tomando de 
las capas superiores de la suspensión. 
Cuando la dilución primaria es muy viscosa o pegajo sa, adicionar más diluyente, lo cual debe tomarse e n 
cuenta para las operaciones subsecuentes o expresió n de resultados. 
El homogeneizador peristáltico (Stomacher) puede no  ser adecuado para algunos productos (por ejemplo, 
aquéllos con partículas agudas o constituyentes que  no se dispersen fácilmente). Debe ser utilizado só lo 
cuando exista evidencia (publicada o por ensayos co mparativos) de que los resultados obtenidos no difi eren 
significativamente con aquéllos obtenidos con licua dora. 
10.4.2  Preparación de las diluciones decimales adicionale s. 
10.4.2.1  Transferir 1 ml o un múltiplo, por ejemplo, 10 u 1 1 ml de la dilución primaria 1 + 9 (10 -1), en otro 
recipiente conteniendo nueve veces el volumen del d iluyente estéril a la temperatura apropiada, evitan do el 
contacto entre la pipeta y el diluyente. 
10.4.2.2  Mezclar cuidadosamente cada botella de diluyente s iempre de la misma manera que se describe 
en 10.1.1.1. 
10.4.2.3  La selección de las diluciones que se vayan a prep arar y de aquellas que se van a inocular, 
dependen del número esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de análisis 
previos y de la información que se obtenga del pers onal de inspección que la haya colectado. En ausenc ia 
total de información, trabajar con las diluciones d e la primera a la sexta. 
10.4.2.4  Utilizar pipetas diferentes para cada dilución ino culando simultáneamente las cajas que se hayan 
seleccionado. El volumen que se transfiera nunca de be ser menor al 10% de la capacidad total de la pip eta. 
10.4.2.5  Si la pipeta es terminal y se transfiere un volume n de líquido equivalente a su capacidad total, 
escurrir aplicando la punta de la pipeta una sola v ez en un área de la caja Petri sin líquido. 
10.4.2.6  Mientras se afora el líquido de la pipeta, la punt a de ésta debe apoyarse en el interior del cuello 
del frasco y mantenerla en posición vertical, para lo cual este último debe inclinarse lo necesario. 
En estudios donde se busca la presencia o ausencia de una determinada especie de microorganismos en 
0,1 ml o 0,1 g, no es necesario preparar diluciones  mayores. 
El criterio para seleccionar las diluciones a prepa rar de acuerdo con el número de microorganismos 
esperado es: 
Para la técnica del número más probable utilizar tr es tubos: donde sea posible demostrar el 
microorganismo en 10 ml de la dilución más alta. 
Para la técnica de cuenta en placa, considerar aqué llas en las que se puedan contar de 25 a 250 coloni as 
en un mínimo de una de tres diluciones en el método  de cuenta de bacterias aerobias en placa. En el ca so de 
otros grupos microbianos, considerar el número espe cificado de colonias en la Norma Oficial Mexicana 
correspondiente. 
10.4.3  Duración del procedimiento. 
En general, las diluciones de la muestra deben ser preparadas inmediatamente antes del análisis y ésta s 
deben ser usadas para inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos posteriores a su preparaci ón. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
11. Determinación de bacterias coliformes. Técnica del número más probable. 
11.1  Fundamento 
El método se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a 35 ± 1° C durante 2 4 
a 48 horas, resultando una producción de ácidos y g as el cual se manifiesta en las campanas  de 
fermentación. 
11.2  Reactivos y materiales 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben  ser grado analítico. Cuando se indique agua debe 
entenderse como agua destilada con pH cercano a la neutralidad. 
11.2.1  Reactivos 
11.2.1.1  Soluciones diluyentes 
11.2.1.1.1  Solución reguladora de fosfatos (solución concentr ada) 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Fosfato monopotásico 34,0 g 
Agua 1,0 l 
 
Preparación:  Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el  pH a 7,2 con solución de hidróxido de 
sodio 1N. Llevar a un litro con agua. Esterilizar d urante 15 minutos a 121 ± 1,0° C. Conservar en refri geración 
(solución concentrada). Tomar 1,25 ml de la solució n concentrada y llevar a un litro con agua. Distrib uir en 
porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera. Ester ilizar durante 15 minutos a 121 ± 1° C. Después de l a 
esterilización, el pH y los volúmenes finales de la  solución de trabajo deben ser iguales a los inicia les. 
11.2.1.1.2.  Agua peptonada 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 1,0 g 
Cloruro de sodio 8,5 g 
Agua 1,0 l 
 
Preparación:  Disolver los componentes en un litro de agua. Ajus tar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio  1 
N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cu alquier volumen múltiplo de nueve según se requiera . 
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0° C. Despu és de la esterilización los volúmenes finales de la  solución 
de trabajo deben ser iguales a los iniciales. Si es te diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar 
obscuro a una temperatura entre 0 a 5° C por un tiem po no mayor de un mes, en condiciones tales que no 
alteren su volumen o composición. 
11.2.1.2  Medios de cultivo. 
Caldo lactosado (medio de enriquecimiento para agua  potable y hielo). 
Caldo lauril sulfato triptosa (medio de enriquecimi ento selectivo). 
Caldo lactosa bilis verde brillante (medio de confi rmación). 
En el caso del análisis de agua potable y hielo pue de utilizarse caldo lactosado o caldo lauril sulfat o 
triptosa con púrpura de bromocresol (concentración 0,01 g/l de medio), como alternativa al uso de camp anas 
de fermentación. Los tubos positivos se manifiestan  por el vire del indicador a color amarillo. 
11.2.1.2.1  Caldo lactosado       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Ingrediente Medio de concentración 
1,5 Medio de concentración sencilla 
Extracto de carne 4,5 g 3,0 g 
Peptona de gelatina 7,5 g 5,0 g 
Lactosa 7,5 g 5,0 g 
Agua destilada  1000,0 ml 1000,0 ml 
 
Disolver los ingredientes en 1 l de agua, calentand o si es necesario o el medio completo deshidratado,  
siguiendo las instrucciones del fabricante. Ajustar  el pH final de tal manera que después de la esteri lización 
éste sea de 6,9 ± 0,2 a 25° C. Distribuir en volúmen es de 10 ml en tubos con dimensiones de 16 x 160 mm  el 
medio de concentración sencilla y de 20 ml en tubos  de 20 x 200 mm el medio de concentración 1,5, cada  
tubo debe tener campana de fermentación. Esteriliza r en autoclave por 15 minutos a 121 ± 1,0° C. Enfria r 
rápidamente para evitar una exposición excesiva al calor. El aspecto del caldo es claro y de color bei ge. Se 
puede utilizar una concentración doble del medio de  cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 ml del caldo  
preparado, cuando se agreguen 10 ml de la muestra. 
11.2.1.2.2 Caldo lauril sulfato triptosa. 
Ingrediente Medio de concentración 
1,5 Medio de concentración 
sencilla 
Triptosa 30,0 g 20,0 g 
Lactosa 7,5 g 5,0 g 
Fosfato dipotásico  4,125 g 2,75 g 
Fosfato monopotásico 4,125 g 2,75 g 
Cloruro de sodio  7,50 g 5,0 g 
Lauril sulfato de sodio  0,15 g 0,1 g 
Agua destilada  1000,0 ml 1000,0 ml 
Disolver los componentes en 1 l de agua, calentando  si es necesario o el medio de cultivo completo 
deshidratado, siguiendo las instrucciones del fabri cante. Ajustar el pH de tal manera que después de l a 
esterilización éste sea de 6,8 ± 0,2 a 25° C. Distri buir en volúmenes de 10 ml en tubos con dimensiones  de 16 
x 160 mm el medio de concentración sencilla y de 20  ml en tubos de 20 x 200 mm el medio de concentraci ón 
1,5, cada tubo debe tener campana de fermentación. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ± 1,0 ° C. 
Se recomienda almacenar el medio una vez preparado.  Las campanas de fermentación no deben de contener 
burbujas de aire después de la esterilización. Se p uede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, 
en cuyo caso se emplearán 10 ml de caldo preparado,  cuando se agreguen 10 ml de muestra. 
11.2.1.2.3  Lactosa bilis verde brillante 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 10,0 g 
Lactosa 10,0 g 
Sales biliares 20,0 g 
Verde brillante 0,0133 g 
Agua 1,0 l 
 
Disolver los componentes o el medio completo deshid ratado en agua, calentar si es necesario. Ajustar e l 
pH, de tal manera que después de la esterilización éste sea de 7,2 a 25° C. Distribuir el medio en cant idades 
de 10 ml en tubos de 16 X 160 mm conteniendo campan a de fermentación. Esterilizar en autoclave por 15 
minutos a 121 ± 1,0° C. Las campanas de fermentación  no deben contener burbujas de aire después de la 
esterilización. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
11.2.2  Materiales 
/square4 Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 ml (o si es necesario de 11 y 2 ml), con tapón de 
algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúme nes iguales a una décima de su volumen total. 
/square4 Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca. 
/square4 Utensilios esterilizables para la obtención de mue stras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátu las, etc. 
/square4 Tubos de cultivo 20 x 200 mm y de 16 x 160 mm con tapones metálicos o de rosca. 
/square4 Campanas de fermentación (tubos de Durham). 
/square4 Pipetas bacteriológicas graduadas de 10 y 1 ml 
/square4 Gradillas. 
/square4 Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de diámetro 
/square4 Todo el material que tenga contacto con las muestr as bajo estudio debe esterilizarse mediante: 
/square4 Horno, durante 2 horas a 170 a 175° C o 1 h a 180° C  o autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 
121 ± 1,0° C. 
/square4 El material de vidrio puede sustituirse por materi al desechable que cumpla con las especificaciones 
deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por las esterilizaciones repetidas y éste debe 
ser químicamente inerte. 
11.3  Aparatos e instrumentos 
/square4 Horno para esterilizar que alcance una temperatura  mínima de 170° C. 
/square4 Incubadora con termostato que evite variaciones ma yores de ± 1,0° C, provista con termómetro 
calibrado. 
/square4 Termómetro de máximas y mínimas. 
/square4 Autoclave que alcance una temperatura mínima de 12 1 ± 1,0° C. 
/square4 Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidade s de pH a 25° C. 
11.4 Preparación de la muestra 
Las muestras deben prepararse y diluirse, siempre q ue sea posible, de acuerdo al Método de Preparación  
y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisi s Microbiológico. 
11.5  Procedimiento 
11.5.1  Para alimentos. 
Preparar suficiente número de diluciones para asegu rar que todos los tubos correspondientes a la últim a 
dilución rindan un resultado negativo. 
11.5.1.1  Prueba presuntiva 
11.5.1.1.1  Inoculación. Tomar tres tubos de medio de enriquec imiento de mayor concentración. Usar una 
pipeta estéril para tranferir a cada tubo 10 ml de la muestra si es líquida o 10 ml de la dilución pri maria inicial, 
en el caso de otros productos. 
11.5.1.1.1.1  Tomar tres tubos de concentración sencilla del med io selectivo de enriquecimiento. Usar una 
pipeta estéril para transferir a cada uno de estos tubos 1 ml de la muestra si es líquida o 1 ml de la  dilución 
primaria en el caso de otros productos. 
11.5.1.1.1.2  Para las diluciones subsecuentes, continuar como s e indica en el párrafo anterior, usando una 
pipeta diferente para cada dilución. Mezclar suavem ente el inóculo con el medio. 
11.5.2.1.2  Incubación. Incubar los tubos a 35 ± 0,5° C por 24 ± 2 horas y observar si hay formación de gas, 
en caso contrario prolongar la incubación hasta 48 ± 2 horas 
11.5.1.2  Prueba confirmativa 
De cada tubo que muestre formación de gas, tomar un a asada y sembrar en un número igual de tubos con 
medio de confirmación. Incubar a 35 ± 0,5° C por 24 ± 2 horas o si la formación de gas no se observa en  este 
tiempo, prolongar la incubación por 48 ± 2 horas.        (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
En esta Norma Oficial Mexicana se considera una com binación de tres tubos por cada dilución de la seri e. 
Para algunos productos y siempre que se requiera un a mayor precisión en los resultados, será necesario  
inocular una serie de cinco o diez tubos. 
11.6  EXPRESION DE LOS RESULTADOS. 
Tomar la serie de tubos de la prueba confirmativa q ue dé formación de gas después del periodo de 
incubación requerido y buscar el NMP en los cuadros  correspondientes. 
El cuadro 3 muestra algunos ejemplos que se pueden presentar. 
Ejemplos: 
Ejemplo 1. Cuando sólo una dilución muestra tres tu bos positivos, elegir ésta y las diluciones mayores  
posteriores. 
Ejemplo 2. Cuando más de una dilución muestra tres tubos positivos y la última da menos de tres, elegi r 
esta última y las dos diluciones anteriores más baj as. 
Ejemplo 3. Cuando en ninguna dilución hay tres tubo s positivos y éstos se encuentran en más de tres 
diluciones, seleccionar las dos diluciones mayores positivas y la siguiente. 
Ejemplos 4 y 5. Cuando los tubos positivos sólo se encuentran en la muestra sin diluir (10 ml o 1 g) y  en la 
primera dilución (1 ml o 10 -1), seleccionar las tres primeras diluciones para el  cálculo del número más 
probable. 
En cada caso se obtiene un número de tres cifras, l o cual es representado en los cuadros 4 al 7, según  
corresponda. En la columna que indica el número de tubos positivos se busca el índice del NMP. 
La técnica de NMP puede admitir gran cantidad de va riaciones. Los resultados obtenidos con esta técnic a 
deben ser utilizados con precaución. Los límites de  confianza están representados en los cuadros 4 al 7. Por 
ejemplo, para una muestra sólida con un NMP de 70 c oliformes por gramo, los límites de confianza en el  95% 
de los casos variarán de 10 a 230 coliformes por gr amo (ejemplo 3 del cuadro 3) y en un producto con 2 4 de 
NMP de coliformes por gramo, los límites de confian za son de 3,6 a 130 coliformes por gramo (ejemplo 2  
cuadro 3). 
 
 Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
CUADRO 4. Indice del NMP y límites de confianza 95%  para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados varios números de tubos . (Diluciones 10 , 1 ,0 y 0 ,1g) 
 3 TUBOS POR DILUCION 5 TUBOS POR DILUCION 
95% Límites de confianza 95% Límites de confianza Combinación 
de positivos Indice del 
NMP por g bajo alto Indice del 
NMP por g bajo alto 
0-0-0 < 0,03 <0,005 <0,09 <0,02 <0,005 <0,07 
0-0-1 0,03 <0,005 <0,09 0,02 <0,005 0,07 
0-1-0 0,03 <0,005 0,13 0,02 <0,005 0,07 
0-2-0 --- --- --- 0,04 <0,005 0,11 
1-0-0 0,04 <0,005 0,20 0,02 <0,005 0,07 
1-0-1 0,07 0,01 0,21 0,04 <0,005 0,11 
1-1-0 0,07 0,01 0,23 0,04 <0,005 0,11 
1-1-1 0,11 0,03 0,36 0,06 <0,005 0,15 
1-2-0 0,11 0,03 0,36 0,06 <0,005 0,15 
2-0-0 0,09 0,01 0,36 0,05 <0,005 0,13 
2-0-1 0,14 0,03 0,37 0,07 0,01 0,17 
2-1-0 0,15 0,03 0,44 0,07 0,01 0,17 
2-1-1 0,20 0,07 0,89 0,09 0,02 0,21 
2-2-0 0,21 0,04 0,47 0,09 0,02 0,21 
2-2-1 0,28 0,10 1,50 ---- --- --- 
2-3-0 --- --- --- 0,12 0,03 0,28 
3-0-0 0,23 0,04 1,20 0,08 0,01 0,19 
3-0-1 0,39 0,07 1,3 0,11 0,02 0,25 
3-0-2 0,64 0,15 3,80 --- --- --- 
3-1-0 0,43 0,07 2,1 0,11 0,02 0,25 
3-1-1 0,75 0,14 2,3 0,14 0,04 0,34 
3-1-2 1,20 0,30 3,8 --- --- --- 
3-2-0 0,93 0,15 3,80 0,14 0,04 0,34 
3-2-1 1,50 0,30 4,40 0,17 0,05 0,46 
3-2-2 2,10 0,35 4,70 -- -- -- 
3-3-0 2,40 0,36 13,0 -- -- -- 
3-3-1 4,60 0,71 24,0 -- -- -- 
3-3-2 11,0 1,50 48,0 -- -- -- 
3-3-3 >11.0 >1,50 >48.0 -- -- -- 
4-0-0 -- --- --- 0,13 0,03 0,31 
4-0-1 -- --- --- 0,17 0,05 0,46 
4-1-0 -- --- --- 0,17 0,05 0,46 
4-1-1 -- -- --- 0,21 0,07 0,63 
4-1-2 -- -- --- 0,26 0,09 0,78 
4-2-0 -- -- --- 0,22 0,07 0,67 
4-2-1 -- --- --- 0,26 0,09 0,78 
4-3-0 -- --- --- 0,27 0,09 0,80 
4-3-1 -- --- --- 0,33 0,11 0,93 
4-4-0 -- --- --- 0,34 0,12 0,93 
5-0-0 -- --- --- 0,23 0,07 0,70       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
5-0-1 -- --- --- 0,31 0,11 0,89 
5-0-2 -- --- --- 0,43 0,15 1,14 
5-1-0 -- --- --- 0,33 0,11 0,93 
5-1-1 -- --- ---- 0,46 0,16 1,2 
5-1-2 -- --- --- 0,63 0,21 1,5 
5-2-0 -- --- --- 0,49 0,17 1,3 
5-2-1 -- --- --- 0,70 0,23 1,70 
5-2-2 -- --- --- 0,94 0,28 2,2 
5-3-0 -- --- --- 0,79 0,25 1,9 
5-3-1 -- --- --- 1,10 0,31 2,5 
5-3-2 -- --- --- 1,4 0,37 3,4 
5-3-3 -- --- --- 1,80 0,44 5,0 
5-4-0 -- --- --- 1,30 0,35 3,0 
5-4-1 -- --- --- 1,70 0,43 4,9 
5-4-2 -- --- --- 2,20 0,57 7,0 
5-4-3 -- --- --- 2,80 0,90 8,5 
5-4-4 -- --- --- 3,50 1,20 10,0 
5-5-0 --- --- --- 2,40 0,68 7,5 
5-5-1 --- --- --- 3,50 1,60 10,0 
5-5-2 --- --- --- 5,40 1,80 14,0 
5-5-3 ---- --- --- 9,20 3,0 32,0 
5-5-4 --- --- --- 16,09 6,40 58,0 
5-5-5 ---- --- --- --- --- --- 
CUADRO 5 Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados varios números de tubos . (Diluciones 1 ,0, 0 ,1 y 0 ,01g) 
 3 TUBOS POR DILUCION 5 TUBOS POR DILUCION 
95% Límites de confianza 95% Límites de confianza Combinación 
de positivos Indice del 
NMP por g bajo alto Indice del 
NMP por g bajo alto 
0-0-0 <0,3 <0,05 <0,9 <0,2 <0,05 <0,7 
0-0-1 0,3 <0,05 <0,9 0,2 <0,05 0,7 
0-1-0 0,3 <0,05 1,3 0,2 <0,05 0,7 
0-2-0 --- --- --- 0,4 <0,05 0,11 
1-0-0 0,4 <0,05 2,0 0,2 <0,05 0,7 
1-0-1 0,7 0,1 2,0 0,4 <0,05 1,1 
1-1-0 0,7 0,1 2,3 0,4 <0,05 1,1 
1-1-1 1,1 0,3 3,6 0,6 <0,05 1,5 
1-2-0 1,1 0,3 3,6 0,6 <0,05 1,5 
2-0-0 0,9 0,1 3,6 0,5 <0,05 1,3 
2-0-1 1,4 0,3 3,7 0,7 0,1 1,7 
2-1-0 1,5 0,3 4,4 0,7 0,1 1,7 
2-1-1 2,0 0,7 8,9 0,9 0,2 2,1 
2-2-0 2,1 0,4 4,7 0,9 0,2 2,1 
2-2-1 2,8 1,0 15,0 --- --- --- 
2-3-0 --- --- --- 1,2 0,3 2,8 
3-0-0 2,3 0,4 12,0 0,8 0,1 1,9 Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
3-0-1 3,9 0,7 13,0 1,1 0,2 2,5 
3-0-2 6,4 1,5 38,0 -- -- -- 
3-1-0 4,3 0,7 21,0 1,1 0,2 2,5 
3-1-1 7,5 1,4 23,0 1,4 0,4 3,4 
3-1-2 12,0 3,0 38,0 -- -- -- 
3-2-0 9,3 1,5 38,0 1,4 0,4 3,4 
3-2-1 15,0 3,0 44,0 1,7 0,5 4,6 
3-2-2 21,0 3,5 47,0 -- -- -- 
3-3-0 24,0 3,6 130,0 -- -- -- 
3-3-1 46,0 7,1 240,0 -- -- -- 
3-3-2 110,0 15,0 480,0 -- -- -- 
3-3-3 >110,0 >15,0 >480,0 -- -- -- 
4-0-0 -- --- --- 1,3 0,3 3,1 
4-0-1 -- --- --- 1,7 0,5 4,6 
4-1-0 -- --- --- 1,7 0,5 4,6 
4-1-1 -- --- --- 2,1 0,7 6,3 
4-1-2 -- --- --- 2,6 0,9 7,8 
4-2-0 -- --- --- 2,2 0,7 6,7 
4-2-1 -- --- --- 2,6 0,9 7,8 
4-3-0 -- --- --- 2,7 0,9 8,0 
4-3-1 -- --- --- 3,3 1,1 9,3 
4-4-0 -- --- --- 3,4 1,2 3, 
5-0-0 -- --- --- 2,3 0,7 7,0 
5-0-1 -- --- --- 3,1 1,1 8,9 
5-0-2 -- --- --- 4,3 1,5 11,4 
5-1-0 -- --- --- 3,3 1,1 9,3 
5-1-1 -- --- --- 4,6 1,6 12,0 
5-1-2 -- --- --- 6,3 2,1 15,0 
5-2-0 -- --- --- 4,9 1,7 13,0 
5-2-1 -- --- --- 7,0 2,3 17,0 
5-2-2 -- --- --- 9,4 2,8 22,0 
5-3-0 -- --- --- 7,9 2,5 19,0 
5-3-1 -- --- --- 11,0 3,1 25,0 
5-3-2 -- --- --- 14,0 3,7 34,0 
5-3-3 -- --- --- 18,0 4,4 50,0 
5-4-0 -- --- --- 13,0 3,5 30,0 
5-4-1 -- --- --- 17,0 4,3 49,0 
5-4-2 -- --- --- 22,0 5,7 70,0 
5-4-3 -- --- --- 28,0 9,0 85,0 
5-4-4 -- --- --- 35,0 12,0 100,0 
5-5-0 -- --- --- 24,0 6,8 75,0 
5-5-1 -- --- --- 35,0 12,0 100,0 
5-5-2 -- --- --- 54,0 18,0 140,0 
5-5-3 -- --- --- 92,0 30,0 320,0 
5-5-4 -- --- --- 161,0 64,0 580,0 
5-5-5 -- --- --- >161,0 >64,0 >580,0       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
 
CUADRO 6. Indice del NMP y límites de confianza 95%  para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados varios números de tubos . (Diluciones 0 ,1, 0 ,001 y 0 ,0001 g) 
 3 TUBOS POR DILUCION 5 TUBOS POR DILUCION 
95% Límites de confianza 95% Límites de confianza Combinación 
de positivos Indice del 
NMP por g bajo Alto Indice del 
NMP por g bajo alto 
0-0-0 <3 <0,5 <9 <2 <0,5 <7 
0-0-1 3 <0,5 <9 2 <0,5 7 
0-1-0 3 <0,5 13 2 <0,5 7 
0-2-0 --- --- --- 4 <0,5 11 
1-0-0 4 <0,5 20 2 <0,5 7 
1-0-1 7 1 21 4 <0,5 11 
1-1-0 7 1 23 4 <0,5 11 
1-1-1 11 3 36 6 <0,5 15 
1-2-0 11 3 36 6 <0,5 15 
2-0-0 9 1 36 5 <0,5 13 
2-0-1 14 3 37 7 1,0 17 
2-1-0 15 3 44 7 1,0 17 
2-1-1 20 7 89 9 2 21 
2-2-0 21 4 47 9 2 21 
2-2-1 28 10 150 --- --- --- 
2-3-0 --- --- --- 12 3 28 
3-0-0 23 4 120 8 1 19 
3-0-1 39 7 13,0 11 2 25 
3-0-2 64 15 380 -- -- -- 
3-1-0 43 7 210 11 2 25 
3-1-1 75 14 230 14 4 34 
3-1-2 120 30 380 -- -- -- 
3-2-0 93 15 380 14 4 34 
3-2-1 150 30 440 17 5 46 
3-2-2 210 35 470 -- -- -- 
3-3-0 240 36 130,0 -- -- -- 
3-3-1 460 71 240,0 -- -- -- 
3-3-2 1100 150 480,0 -- -- -- 
3-3-3 >1100 >150 >480,0 -- -- -- 
4-0-0 -- --- --- 13 3 31 
4-0-1 -- --- --- 17 5 46 
4-1-0 -- --- --- 17 5 46 
4-1-1 -- --- --- 21 7 63 
4-1-2 -- --- --- 26 9 78 
4-2-0 -- --- --- 22 7 67 
4-2-1 -- --- --- 26 9 78 
4-3-0 -- --- --- 27 9 80 
4-3-1 -- --- --- 33 11 93 
4-4-0 -- --- --- 34 12 93 
5-0-0 -- --- --- 23 7 7 Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
5-0-1 -- --- --- 31 11 89 
5-0-2 -- --- --- 43 15 114 
5-1-0 -- --- --- 33 11 93 
5-1-1 -- --- --- 46 16 120 
5-1-2 -- --- --- 63 21 150 
5-2-0 -- --- --- 49 17 130 
5-2-1 -- --- --- 70 23 170 
5-2-2 -- --- --- 94 28 220 
5-3-0 -- --- --- 79 25 190 
5-3-1 -- --- --- 110 31 250 
5-3-2 -- --- --- 140 37 340 
5-3-3 -- --- --- 180 44 500 
5-4-0 -- --- --- 130 35 300 
5-4-1 -- --- --- 170 43 490 
5-4-2 -- --- --- 220 57 700 
5-4-3 -- --- --- 280 90 850 
5-4-4 -- --- --- 350 120 1000 
5-5-0 -- --- --- 240 68 750 
5-5-1 -- --- --- 350 120 1000 
5-5-2 -- --- --- 540 180 1400 
5-5-3 -- --- --- 920 300 3200 
5-5-4 -- --- --- 1600 640 5800 
5-5-5 -- --- --- >1600 >640 >5800 
CUADRO 7 Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados varios números de tubos . (Diluciones 0 ,01 , 0 ,001 y 0 ,0001 g) 
 3 TUBOS POR DILUCION 5 TUBOS POR DILUCION 
95% Límites de confianza 95% Límites de confianza Combinación 
de positivos Indice del 
NMP por g bajo Alto Indice del 
NMP por g bajo alto 
0-0-0 <30 <5 <90 <20 <5 <70 
0-0-1 30 <5 <90 20 <5 70 
0-1-0 30 <5 130 20 <5 70 
0-2-0 --- --- --- 40 <5 110 
1-0-0 40 <5 200 20 <5 70 
1-0-1 70 10 210 40 <5 110 
1-1-0 70 10 230 40 <5 110 
1-1-1 110 30 360 60 <5 150 
1-2-0 110 30 360 60 <5 150 
2-0-0 90 10 360 50 <5 130 
2-0-1 140 30 370 70 10 170 
2-1-0 150 30 440 70 10 170 
2-1-1 200 70 890 90 20 210 
2-2-0 210 40 470 90 20 210 
2-2-1 280 100 1500 --- --- --- 
2-3-0 --- --- --- 120 30 280 
3-0-0 230 40 1200 80 10 190       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
3-0-1 390 70 1300 110 20 250 
3-0-2 640 150 3800 -- -- -- 
3-1-0 430 70 2100 110 20 250 
3-1-1 750 140 2300 140 40 340 
3-1-2 1200 300 3800 -- -- -- 
3-2-0 930 150 3800 140 40 340 
3-2-1 1500 300 4400 170 50 460 
3-2-2 2100 350 4700 -- -- -- 
3-3-0 2400 360 13000 -- -- -- 
3-3-1 4600 710 24000 -- -- -- 
3-3-2 11000 1500 48000 -- -- -- 
3-3-3 >11000 >1500 >48000 -- -- -- 
4-0-0 -- --- --- 130 30 310 
4-0-1 -- --- --- 170 50 460 
4-1-0 -- --- --- 170 50 460 
4-1-1 -- --- --- 210 70 630 
4-1-2 -- --- --- 260 90 780 
4-2-0 -- --- --- 220 70 670 
4-2-1 -- --- --- 260 90 780 
4-3-0 -- --- --- 270 90 800 
4-3-1 -- --- --- 330 110 930 
4-4-0 -- --- --- 340 120 930 
5-0-0 -- --- --- 230 70 700 
5-0-1 -- --- --- 310 110 890 
5-0-2 -- --- --- 430 150 1140 
5-1-0 -- --- --- 330 110 930 
5-1-1 -- --- --- 460 160 1200 
5-1-2 -- --- --- 630 210 1500 
5-2-0 -- --- --- 490 170 1300 
5-2-1 -- --- --- 700 230 1700 
5-2-2 -- --- --- 940 280 2200 
5-3-0 -- --- --- 790 250 1900 
5-3-1 -- --- --- 1100 310 2500 
5-3-2 -- --- --- 1400 370 3400 
5-3-3 -- --- --- 1800 440 5000 
5-4-0 -- --- --- 1300 350 3000 
5-4-1 -- --- --- 1700 430 4900 
5-4-2 -- --- --- 2200 570 7000 
5-4-3 -- --- --- 2800 900 8500 
5-4-4 -- --- --- 3500 1200 10000 
5-5-0 -- --- --- 2400 680 7500 
5-5-1 -- --- --- 3500 1200 10000 
5-5-2 -- --- --- 5400 1800 14000 
5-5-3 -- --- --- 9200 3000 32000 
5-5-4 -- --- --- 16000 6400 58000 Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
5-5-5 -- --- --- >16000 >6400 >58000 
 
11.7  Informe de la prueba 
Informar "Número más probable (NMP) de coliformes p or gramo o mililitro de muestra". 
En caso de muestras de agua informar NMP/100 ml. 
12. Método para la cuenta de microorganismos colifo rmes totales en placa. 
12.1  Fundamento 
El método permite determinar el número de microorga nismos coliformes presentes en una muestra, 
utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bi lis) en el que se desarrollan bacterias a 35° C en 
aproximadamente 24 h, dando como resultado la produ cción de gas y ácidos orgánicos, los cuales viran e l 
indicador de pH y precipitan las sales biliares. 
12.2  Reactivos y materiales 
12.2.1  Reactivos 
Los reactivos que a continuación se mencionan, debe n ser grado analítico y cuando se indique agua debe  
entenderse como agua destilada. 
12.2.1.1  Soluciones diluyentes 
12.2.1.1.1  Solución reguladora de fosfatos (solución concentr ada) 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Fosfato monopotásico 34,0 g 
Agua 1,0 l 
 
Preparación:  Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el  pH a 7,2 con solución de hidróxido de 
sodio 1,0 N. Llevar con agua a un litro. Esteriliza r a 121± 1,0° C durante 15 minutos. Conservar en 
refrigeración (solución concentrada). Tomar 1,25 ml  de la solución concentrada y llevar a un litro con  agua 
(solución de trabajo). Distribuir en porciones de 9 9, 90 y 9 ml según se requiera. Esterilizar durante  15 minutos 
a 121± 1,0° C. Después de la esterilización, el pH y  los volúmenes finales de la solución de trabajo de ben ser 
iguales a los iniciales. 
12.2.1.1.2  Agua Peptonada  
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 1,0 g 
NaCl 8,5 g 
Agua 1,0 l 
 
Preparación:  Disolver los componentes en un litro de agua. Ajus tar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1,0 
N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cu alquier volumen múltiplo de nueve según se requiera . 
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0° C. Despu és de la esterilización, los volúmenes finales de l a 
solución de trabajo deben ser iguales a los inicial es. Si este diluyente no es usado inmediatamente, a lmacenar 
en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5° C po r un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tale s 
que no alteren su volumen o composición. 
12.2.1.2  Medio de Cultivo 
Agar-rojo- violeta-bilis-lactosa (RVBA) 
FORMULA       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 7,0 g 
Extracto de levadura 3,0 g 
Lactosa 10,0 g 
Sales biliares 1,5 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Rojo neutro 0,03 g 
Cristal violeta 0,002 g 
Agar 15,0 g 
Agua 1,0 l 
 
Preparación:  Mezclar los componentes en el agua y dejar reposar  durante algunos minutos. Mezclar 
perfectamente y ajustar el pH a 7,4 con ácido clorh ídrico 0,1N o con hidróxido de sodio 0,1N a 25° C, d e forma 
que después del calentamiento se mantenga en este v alor. Calentar con agitación constante y hervir dur ante 2 
minutos. Enfriar inmediatamente el medio en un baño  de agua hasta que llegue a 45° C. Evitar el 
sobrecalentamiento del medio. No debe esterilizarse  en autoclave. Usar el medio dentro de las tres pri meras 
horas después de su preparación. En el caso de util izar medio de cultivo deshidratado, seguir las 
instrucciones del fabricante. 
12.2.2  Materiales 
/square4 Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 ml (o si es necesario de 11 y 2 ml), con tapón de 
algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúme nes iguales a una décima de su volumen total. 
/square4 Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca. 
/square4 Tubos de 16 X 150 mm con tapón de rosca. 
/square4 Utensilios esterilizables para la obtención de mue stras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátu las, 
etc. 
/square4 Cajas Petri. 
/square4 Todo el material e instrumentos que tengan contact o con las muestras bajo estudio debe esterilizarse 
mediante: 
/square4 Horno, durante 2 h a 170 - 175° C, o 1 h a 180° C; o  en autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 
121 ± 1,0° C. 
/square4 El material de vidrio puede sustituirse por materi al desechable que cumpla con las especificaciones 
deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por las esterilizaciones repetidas y éste debe 
ser químicamente inerte. 
12.3 Aparatos e instrumentos 
/square4 Horno para esterilizar que alcance una temperatura  mínima 
/square4 de 170° C. 
/square4 Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada co n termómetro de máximas y mínimas. 
/square4 Baño de agua con control de temperatura y circulac ión mecánica, provista con termómetro calibrado 
con divisiones de 0,1°  C y que mantenga la temperat ura a 45 ± 1,0° C. 
/square4 Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bol sas estériles para homogeneizador peristáltico. 
/square4 Incubadora con termostato que evite variaciones ma yores de ± 1,0° C, provista con termómetro 
calibrado. 
/square4 Contador de colonias de campo oscuro, con luz adec uada, placa de cristal cuadriculada y lente 
amplificador. 
/square4 Registrador mecánico o electrónico. 
/square4 Microscopio óptico. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
/square4 Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidade s de pH a 25° C. 
12.4  Preparación de la muestra 
La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en el método de Preparación y Diluci ón 
de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiol ógico. 
12.5  Procedimiento 
12.5.1  Colocar en cajas Petri por duplicado 1 ml de la mu estra líquida directa o de la dilución primaria, 
utilizando para tal propósito una pipeta estéril. 
12.5.2  Repetir el procedimiento tantas veces como dilucio nes decimales se requiera sembrar, utilizando 
una pipeta estéril diferente para cada dilución. 
12.5.3  Verter de 15 a 20 ml del medio RVBA fundido y mant enido a 45 ± 1,0° C en baño de agua. En el 
caso de utilizar cajas de Petri de plástico se vier te de 10 a 15 ml del medio. El tiempo transcurrido entre la 
preparación de la dilución primaria y el momento en  que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder  de  20 
minutos. 
12.5.4  Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio con  seis movimientos de derecha a izquierda, seis 
movimientos en el sentido de las manecillas del rel oj, seis movimientos en el sentido contrario al de las 
manecillas del reloj y seis de atrás para adelante,  sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que  la mezcla 
solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre u na superficie horizontal fría. 
12.5.5  Preparar una caja control con 15 ml de medio para verificar la esterilidad. 
12.5.6  Después de que está el medio completamente solidif icado en la caja, verter aproximadamente 4 ml 
del medio RVBA a 45 ± 1,0° C en la superficie del me dio inoculado. Dejar que solidifique. 
12.5.7  Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35° C, durante 24 ± 2 horas. 
12.5.8  Después del periodo especificado para la incubació n, contar las colonias con el contador de 
colonias. 
12.5.9  Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 15 0 colonias. Las colonias típicas son de color rojo 
oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un h alo de precipitación debido a las sales biliares, e l cual 
es de color rojo claro o rosa, la morfología coloni al es semejante a lentes biconvexos con un diámetro  de 0,5 a 
2,0 mm. 
12.6  Expresión de los resultados 
12.6.1  Cálculo del Método 
12.6.1.1  Placas que contienen entre 15 y 150 colonias carac terísticas. 
Separar las placas que contienen el número antes me ncionado de colonias características en dos 
diluciones consecutivas. Contar las colonias presen tes. Calcular el número de coliformes por mililitro  o por 
gramo de producto, multiplicando el número de colon ias por el inverso de la dilución correspondiente, 
tomando los criterios del método para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa. 
12.6.1.2  Placas que contienen menos de 15 colonias caracter ísticas. 
Si cada una de las placas tiene menos de 15 colonia s características, reportar el número obtenido segu ido 
de la dilución correspondiente. 
12.6.1.3  Placas con colonias no características. 
Si en las placas no hay colonias características, r eportar el resultado como: menos de un coliforme po r 1/d 
por gramo, en donde d es el factor de dilución. 
12.7  Informe de la prueba 
Informar: UFC/g o ml en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35° C durante 24 ± 2 h. 
En caso de emplear diluciones y no observar crecimi ento, informar utilizando como referencia la diluci ón 
más baja utilizada, por ejemplo dilución 10 -1. 
En caso de no observar crecimiento en la muestra si n diluir se informa: "no desarrollo de coliformes p or 
ml". 
13. Método para la determinación de salmonella  en alimentos. 
13.1  Fundamento       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
La presente técnica para la detección de  Salmonella  en alimentos, describe un esquema general que 
consiste de 5 pasos básicos: 
13.1.1  Preenriquecimiento, es el paso donde la muestra es  enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, 
que permite restaurar las células de  Salmonella  dañadas a una condición fisiológica estable. 
13.1.2  Enriquecimiento selectivo, empleado con el propósi to de incrementar las poblaciones de Salmonella  
e inhibir otros organismos presentes en la muestra.  
13.1.3  Selección en medios sólidos, en este paso se utili zan medios selectivos que restringen el 
crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella  y permite el reconocimiento visual de colonias 
sospechosas. 
13.1.4  Identificación bioquímica, este paso permite la id entificación génerica de los cultivos de Salmonella  
y la eliminación de cultivos sospechosos falsos. 
13.1.5  Serotipificación, es una técnica serológica que pe rmite la identificación específica de un cultivo. 
13.2  Reactivos y materiales 
En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshi dratadas, se deben seguir las instrucciones 
impresas en la etiqueta respectiva para su preparac ión. 
Las sustancias químicas usadas para preparar los me dios de cultivo y los reactivos deben ser grado 
analítico. 
13.2.1  Reactivos 
13.2.1.1  Medios de pre-enriquecimiento 
13.2.1.1.1  Agua de peptona tamponada 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 10,0 g 
Cloruro sódico 5,0 g 
Fosfato sódico dibásico 3,5 g 
Fosfato potásico monobásico  1,5 g 
Agua 1,0 l 
Preparación:  Disolver los componentes en agua, calentando si es  necesario. Ajustar el pH, si es 
necesario, después de la esterilización a 7,0. Dist ribuir en recipientes de vidrio esterilizables con la capacidad 
necesaria para obtener las porciones necesarias par a la prueba. Esterilizar por 20 min a 121 ± 1° C 
13.2.1.1.2  Caldo lactosado 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 3,0 g 
Peptona 5,0 g 
Lactosa 5,0 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final: 6,9 ± 0,2 
Preparación:  Disolver los ingredientes en agua, calentando a 65 ° C. Distribuir en porciones de 225 ml, en 
frascos de 500 ml. Esterilizar durante 15 min a 121 ° C ± 1° C 
13.2.1.2  Caldo de enriquecimiento 
13.2.1.2.1  Caldo selenito-cistina 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Triptona o polipeptona 5,00 g 
Lactosa 4,00 g 
Fosfato disódico 10,00 g 
Selenito ácido de sodio 4,00 g 
L-cistina 0,01 g 
Agua destilada 1,00 l 
pH final: 7,0 ± 0,2 a 25° C 
Preparación:  Disolver los ingredientes en un litro de agua dest ilada estéril y distribuir en volúmenes de 10 
y 225 ml en recipientes estériles, según se requier a. El caldo así preparado es transparente. De prefe rencia 
usarlo el mismo día de su preparación. Si se desea conservar el medio por varios días, puede exponerse  al 
calor en autoclave por 5 min a 110° C ± 1° C, tomando  entonces un color salmón. 
13.2.1.2.2  Caldo tetrationato 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Proteosa peptona o tristona 5,0 g 
Sales biliares 1,0 g 
Carbonato de calcio 10,0 g 
Tiosulfato de sodio 
pentahidratado 30,0 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final: 7,0 ± 0,1 
Preparación:  Disolver los ingredientes en un litro de agua dest ilada estéril. Distribuir, agitando 
constantemente, en porciones de 10 y 225 ml, en rec ipientes estériles. Guardar en refrigeración. Antes  de 
usar el medio, agregar 2 ml de una solución yodo-yo duro y 1 ml de solución de verde brillante al 0,1% por 
cada 100 ml de caldo. El medio una vez adicionado d e yodo no debe calentarse y debe usarse el mismo dí a 
de su preparación. 
13.2.1.2.3  Vassiliadis-Rappaport 
Solución A 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Tristona 5,0 g 
Cloruro de sodio 8,0 g 
Fosfato de potasio 
dihidrogenado 1,6 g 
Agua destilada 1,0 l 
 
Disolver los componentes en agua por calentamiento cercano a 70° C 
Solución B 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Cloruro de magnesio 
hexahidratado 400,0 g 
Agua destilada 1,0 l 
       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Disolver el cloruro de magnesio en agua. Como esta sal es muy higroscópica es conveniente disolver el 
contenido entero de cloruro de magnesio desde un re cipiente recientemente abierto de tal modo que la 
concentración de la solución sea de 0,4 g/ml. Conse rvar en frasco ámbar a temperatura ambiente 
Solución C 
Ingredientes Cantidades 
Oxalato de verde de malaquita 0,4 g 
Agua destilada 100,0 ml 
 
Disolver el oxalato de verde de malaquita en agua. Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente 
Medio completo 
Ingredientes Cantidades 
solución A 1 000 ml 
solución B 100 ml 
solución C 10 ml 
 
Preparación: Adicionar 1 000 ml de la solución A, 1 00 ml de la solución B y 10 ml de la solución C. Aj ustar 
el pH si es necesario, de tal manera que después de  la esterilización sea de 5,2. Distribuir antes de usar 
dentro de tubos en cantidades de 10 ml. Almacenar e n refrigeración. 
13.2.1.2.4  Caldo de Soya Tripticasa 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Tripticasa o triptosa 17,0 g 
Fitona 3,0 g 
Glucosa 2,5 g 
Cloruro de sodio 2,5 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final: 7,3 ± 0,2 
Preparación:  Disolver los ingredientes en 1 litro de agua desti lada, calentando lentamente hasta su 
disolución completa. Distribuir porciones de 225 ml  dentro de matraces de 500 ml y esterilizar en auto clave 
durante 15 min a 121° C ± 1° C. 
13.2.1.2.5  Leche descremada reconstituida 
Suspender 100 g de leche descremada en polvo en un litro de agua destilada. Agitar circularmente hasta  
disolución. Distribuir en volúmenes de 225 ml en ma traces Erlenmeyer de 500 ml. Esterilizar a 121° C ± 1° C 
por 15 min. El volumen final debe corregirse para m antener 225 ml. 
13.2.1.2.6  Caldo soya tripticasa estéril adicionado con sulfi to de potasio. 
Adicionar al caldo soya tripticasa 5 g de sulfito d e potasio por cada 1000 ml de medio, quedando una 
concentración final de sulfito de potasio del 0,5%.  Adicionar el sulfito de potasio antes de esteriliz ar en 
autoclave en la forma habitual. 
13.2.1.3  Medios de Aislamiento 
13.2.1.3.1  Agar verde brillante (VB) 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de levadura 3,0000g 
Polipeptona (Proteosa peptona 10,0000g Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
No. 3) 
Cloruro de sodio 5,0000g 
Lactosa 10,0000g 
Sacarosa 10,0000g 
Rojo de fenol 0,0800g 
Agar 20,0000g 
Verde brillante 0,0125g 
Agua destilada 1,0000l 
pH final: 6,9 ± 0,2 
Preparación:  Suspender los ingredientes en un litro de agua des tilada y calentar a ebullición, hasta 
disolución completa. Ajustar el pH. Esterilizar en autoclave por 15 min a 121° C ± 1° C. El sobrecalenta miento 
del medio disminuye su selectividad. Enfriar el med io a 50° C y distribuirlo en cajas de petri estérile s. El 
aspecto del medio es obscuro, de color marrón. 
13.2.1.3.2  Agar con sulfito de bismuto 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne de res 5,000g 
Mezcla de peptonas 10,000g 
Glucosa 5,000g 
Fosfato disódico (anhidro) 5,000g 
Sulfato ferroso (anhidro) 0,300g 
Sulfito de bismuto 8,000g 
Verde brillante 0,025g 
Agar 20,000g 
Agua destilada 1,000l 
pH final: 7,6 ± 0,2 
Preparación:  Suspender los ingredientes en un litro de agua. Ca lentar hasta su disolución completa, 
agitando frecuentemente. Ajustar el pH. Enfriar a 4 5° C y verter en cajas de petri estériles, distribuy endo de 
manera homogénea el precipitado propio del medio. E l aspecto de las placas es opaco, de color verde pá lido 
y deben usarse el mismo día de su preparación. Si l a coloración es parda, no deben utilizarse. El medi o no 
debe esterilizarse en autoclave; el sobrecalentamie nto afecta su selectividad. 
13.2.1.3.3  Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) 
FORMULA  
Ingredientes Cantidades 
Xilosa 3,75g 
L-lisina 5,00g 
Lactosa 7,50g 
Sacarosa 7,50g 
Cloruro de sodio 5,00g 
Extracto de levadura 3,00g 
Rojo de fenol 0,08g       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Agar 15,00g 
Desoxicolato de sodio 2,50g 
Citrato férrico-amónico  0,80g 
Tiosulfato de sodio 6,80g 
Agua destilada 1,00l 
pH final: 6,9 ± 0,2 
Preparación:  Suspender los ingredientes en un litro de agua des tilada, y calentar en baño de agua a 
55° C, agitando frecuentemente, hasta disolución com pleta. Ajustar el pH. Enfriar a 50° C y verter en ca jas de 
petri estériles. No se esterilice. El sobrecalentam iento produce una precipitación; la reactividad del  medio 
puede ser satisfactoria, pero las colonias suelen s er muy pequeñas. El aspecto del medio es claro y de  color 
rojo brillante. 
13.2.1.3.4 Agar para Salmonella y Shigella (SS) 
FORMULA  
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 5,000g 
Polipeptona * 5,000g 
Lactosa 10,000g 
Sales biliares 8,500g 
Citrato de sodio dihidratado 8,500g 
Tiosulfato de sodio pentahidratado 8,500g 
Citrato férrico 1,000g 
Agar 13,500g 
Rojo neutro 0,025g 
Verde brillante 0,330mg 
Agua destilada 1,000l 
pH final: 7,0 ± 0,2 
* La polipeptona se puede sustituir por 2,5 g de pe ptona de caseína y 2,5 g de peptona de carne. 
Preparación:  Suspender los ingredientes en un litro de agua des tilada estéril y calentar a ebullición hasta 
disolución completa. Ajustar el pH. No esterilizar en autoclave. Enfriar a 50° C y distribuir en cajas de petri 
estériles en condiciones asépticas. El aspecto del medio fundido es claro y de color rosado. 
13.2.1.3.5 Agar entérico Hektoen 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Proteosa peptona 12,000g 
Extracto de levadura 3,000g 
Lactosa 12,000g 
Sacarosa 12,000g 
Salicina 2,000g 
Sales biliares 9,000g 
Cloruro de sodio 5,000g 
Tiosulfato de sodio 5,000g Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Citrato amónico férrico  1,500g 
Azul de bromotimol 0,064g 
Fuscina ácida 0,100g 
Agar 13,500g 
Agua 1,000l 
pH final: 7,5 ± 0,2 
Preparación:  Suspender los ingredientes en agua destilada, herv ir con agitación hasta completa 
disolución del agar. No sobrecalentar. Dejar enfria r a 55 - 60° C y distribuir en cajas de petri estéri les en 
condiciones asépticas. 
13.2.1.4 Medios para pruebas bioquímicas 
13.2.1.4.1  Agar de tres azúcares y hierro (TSI) 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Peptona de carne * 1,0g 
Peptona de caseína * 1,0g 
Cloruro de sodio 0,5g 
Lactosa 1,0g 
Sacarosa 1,0g 
Glucosa 0,1g 
Agar 1,3g 
Rojo de fenol 2,5mg 
Sulfato ferroso amónico-
Pentahidratado 20,0mg 
Tiosulfato de sodio 20,0mg 
Agua destilada 100,0ml 
pH final: 7,3 ± 0,2 
* Estas peptonas se pueden sustituir por 2 g de pol ipeptona. 
Preparación:  Suspender los ingredientes en 100 ml de agua desti lada. Calentar a ebullición, agitando 
ocasionalmente, hasta disolución completa. Enfriar a 60° C y ajustar el pH. Distribuir en volúmenes de 3 ml en 
tubos de 13 x 100 mm y esterilizar a 121° C ± 1° C du rante 15 min. Inclinar los tubos de manera que el m edio 
de cultivo en el fondo alcance una altura de 3 cm y  una profundidad de 4 cm. El medio es de color rojo . 
13.2.1.4.2  Agar de hierro y lisina (LIA) 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Peptona de gelatina 0,5g 
Extracto de levadura 0,3g 
Glucosa 0,1g 
L-lisina 1,0g 
Citrato férrico-amónico 50,0mg 
Tiosulfato de sodio anhidro 4,0mg 
Púrpura de bromocresol 2,0mg       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Agar 1,5g 
Agua destilada 100,0ml 
pH final: 6,7 ± 0,2 
Preparación:  Suspender los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien, calentar hasta ebullición 
con agitación frecuente hasta conseguir la disoluci ón completa. Ajustar el pH. Distribuir en volúmenes  de 3 ml 
en tubos de 13 x 100 mm, con tapón de rosca. Esteri lizar en autoclave a 121° C ± 1° C durante 12 min. De jar 
que los tubos se enfríen en posición inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 4 cm y 
una superficie inclinada de 2 cm. 
El medio ya preparado es de color púrpura. 
13.2.1.4.3  Agar nutritivo 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 3,0g 
Peptona 5,0g 
Agar 15,0g 
Agua destilada 1,0l 
pH final: 6,8 ± 0,2 
Preparación: Suspender los ingredientes en agua. Dejar reposar d e 5 a 10 min. Calentar a ebullición 
hasta disolución completa. Distribuir en tubos de 1 3 x 100 mm, en cantidades de 1/3 de su volumen. 
Esterilizar a 121° C ± 1° C por 15 min. Inclinar los tubos antes que el agar solidifique. 
13.2.1.4.4 Medio de SIM (para Sulfuro, Indol y Movilidad) 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 3,000g 
Peptona 30,000g 
Hierro peatonizado 0,200g 
Tiosulfato de sodio 0,025g 
Agua destilada 1,000l 
pH final: 7,3 ± 0,2 
Preparación: Suspender los ingredientes en el agua destilada, ca lentar a ebullición agitando 
frecuentemente hasta lograr una disolución completa . Enfriar a 50° C y ajustar el pH. Distribuir el med io en 
volúmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm y esteril izar en autoclave a 121° C ± 1° C durante 15 min. Se 
dejan enfriar los tubos en posición vertical. 
13.2.1.4.5  Agar citrato de Simmons  
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Fosfato de amonio 1,00g 
Fosfato dipotásico 1,00g 
Cloruro de sodio 5,00g 
Citrato de sodio 2,00g 
Sulfato de magnesio 0,20g 
Azul de bromotimol 0,08g 
Agar 15,00g Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Agua destilada 1,00l 
pH final: 6,8 ± 0,2 
Preparación: Suspender los ingredientes en el agua destilada, ca lentar a ebullición agitando 
frecuentemente hasta lograr una disolución completa . Ajustar el pH. Distribuir el medio en volúmenes d e 3 ml 
en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121° C ± 1° C durante 15 min. Dejar enfriar los tub os en 
posición inclinada. 
13.2.1.4.6  Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer) 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 7,0g 
Dextrosa 5,0g 
Difosfato de potasio 5,0g 
Agua destilada 1,0l 
pH final: 6,9 ± 0,2 
Preparación:  Suspender los ingredientes en el agua destilada, c alentar a ebullición agitando 
frecuentemente hasta lograr una disolución completa . Ajustar el pH. Distribuir el medio en volúmenes d e 3 ml 
en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121° C ± 1° C durante 15 min. 
13.2.1.4.7  Caldo manitol 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 1,000g 
Proteosa peptona 10,000g 
Cloruro de sodio 5,000g 
Rojo de fenol 0,018g 
Manitol 10,000g 
Agua 1,000 l 
pH final: 7,4 ± 0,2 
Preparación:  Suspender 26 g del medio deshidratado en un litro de agua, mezclar y ajustar el pH. 
Distribuir en volúmenes de 2 a 3 ml en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar a 121° C ± 1° C durante 15 min 
13.2.1.4.8  Caldo malonato 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades  
Extracto de levadura 1,000g 
Sulfato de amonio 2,000g 
Fosfato dipotásico 0,600g 
Fosfato monopotásico 0,400g 
Cloruro de sodio 2,000g 
Malonato 3,000g 
Glucosa 0,250g 
Azul de bromotimol 0,025g 
Agua 1,000l       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
pH final: 6,7 ± 0,2 
Preparación:  Suspender los ingredientes en agua, mezclar y ajus tar el pH. Distribuir en tubos de 13 x 100 
mm en cantidades de 3 ml. Esterilizar en autoclave a 121° C ± 1° C durante 15 min. 
13.2.1.4.9  Caldo Urea 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Urea 20,00g 
Extracto de levadura 0,10g 
Fosfato monopotásico 9,10g 
Fosfato disódico 9,50g 
Rojo de fenol 0,01g 
Agua 1,00l 
pH final: 6,8 ± 0,2 
Preparación:  Disolver los ingredientes en agua destilada. NO CA LENTAR. Esterilizar por filtración a 
través de membrana 0,45 µm o en autoclave de 5 a 8 lb de presión durante 15 min. Distribuir asépticame nte 
de 1,5 a 3 ml en tubos estériles de 13 x 100 mm. 
13.2.1.4.10  Caldo de urea rápido 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Urea 20,000g 
Extracto de levadura 0,100g 
Fosfato monopotásico 0,091g 
Fosfato disódico 0,095g 
Rojo de fenol 0,010g 
Agua 1,000l 
pH final: 6,8 ± 0,2 
Preparación:  Disolver los ingredientes en agua destilada. NO CA LENTAR. Esterilizar por filtración a 
través de membrana 0,45 µm. Distribuir asépticament e de 1,5 a 3 ml en tubos estériles de 13 x 100 mm. 
13.2.1.4.11  Caldo infusión cerebro corazón  
FORMULA 
Ingredientes Cantidades  
Infusión cerebro corazón 200,0g 
Infusión de corazón de res 250,0g 
Proteosa peptona 10,0g 
Cloruro de sodio 5,0g 
Fosfato disódico dodecahidratado 2,5g 
Dextrosa 2,0g 
Agua destilada 1,0l 
pH final: 7,4 ± 0,2 Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Preparación:  Disolver los ingredientes en agua destilada, calen tar suavemente. Distribuir y esterilizar a 
121° C ± 1° C durante 15 min. 
13.2.1.5  Soluciones 
13.2.1.5.1  Solución verde brillante al 0,1% (1:1000) 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Verde brillante 0,1g 
Agua destilada estéril 100,0 ml 
 
Disolver 0,1 g de verde brillante en agua destilada  estéril hasta completar 100 ml. 
13.2.1.5.2  Solución de yodo-yoduro 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Cristales de yodo 6,0g 
Yoduro de potasio 6,0g 
Agua destilada 100,0 ml 
 
Disolver los cristales y el yoduro de potasio en ag ua destilada hasta completar 100 ml. 
Conservar en frasco ámbar 
13.2.1.5.3  Solución salina al 0,85% 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Cloruro de sodio 0,85g 
Agua destilada 100,00ml 
 
Disolver el cloruro de sodio en el agua y esteriliz ar a 121° C ± 1 ° C durante 15 min. 
13.2.1.5.4  Solución salina formalizada 
FORMULA  
Ingredientes Cantidades 
Solución de formaldehído (36-38%) 6,0ml 
Cloruro de sodio 8,5g 
Agua destilada 1,0l 
 
Disolver 8,5 g de cloruro de sodio en 1 litro de ag ua destilada. Esterilizar a 121° C ± 1° C durante 15 min. 
Enfriar a temperatura ambiente. Adicionar 6 ml de l a solución de formaldehído. No esterilizar después de la 
adición de formaldehído. 
13.2.1.5.5  Reactivo de Kovac 
FORMULA       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Ingredientes Cantidades 
p-dimetil-aminobenzaldehído 5,0g 
Alcohol amílico 75,0ml 
Acido clorhídrico concentrado 25,0ml 
 
Disolver el p-dimetil-aminobenzaldehído en el alcoh ol amílico y después agregar el ácido clorhídrico 
lentamente. Conservar en frasco ámbar en refrigerac ión. 
13.2.1.5.6  Solución de alfa-naftol al 5% 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Alfa-naftol 5,0g 
Alcohol 100,0 ml 
 
Disolver 5 g de alfa-naftol en alcohol hasta comple tar 100 ml. 
13.2.1.5.7  Solución de rojo de metilo 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Rojo de metilo 0,10g 
Alcohol etílico 300,00ml 
agua destilada c.b.p 500,00ml 
 
Disolver el rojo de metilo en el alcohol etílico y adicionar agua hasta completar 500 ml. 
13.2.1.5.8  Solución de hidróxido de potasio al 40% 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Hidróxido de potasio 40,0g 
Agua destilada 100,0 ml 
 
Disolver 40 g de hidróxido de potasio en agua hasta  completar 100 ml. 
13.2.1.5.9  Solución de gelatinasa al 5% 
FORMULA 
Ingredientes Cantidades 
Gelatinasa 5,0g 
Agua 100,0 ml 
 
Disolver 5 g de gelatinasa en 100 ml de agua destil ada. NO CALENTAR. 
13.2.1.6 Antisueros 
/square4 Antisuero polivalente somático (O) 
/square4 Antisuero polivalente flagelar (H) 
/square4 Antisuero Vi Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
13.2.2  Material 
/square4 Matraces Erlenmeyer de 500 ml 
/square4 Recipientes de boca ancha, de capacidad apropiada para contener las muestras simples y 
compuestas 
/square4 Angulos de vidrio 
/square4 Cucharas, bisturís, cuchillos y pinzas 
/square4 Tubos de ensaye de 16 x 150 mm y de 20 x 100 mm 
/square4 Tubos para serología de 10 x 75 mm o de 13 x 100 m m 
/square4 Pipetas bacteriológicas de 10,0 y 5,0 ml, graduada s en 0,1 ml y protegidas con tapón de algodón. 
/square4 Pipetas de 1 ml, con graduaciones de 0,01 ml 
/square4 Cajas de Petri estériles de vidrio o desechables 
/square4 Rejillas para tubos de ensaye 
/square4 Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de diámetro 
/square4 Papel pH (intervalo de 6-8) con graduaciones máxim as de 0,4 unidades de pH para cambios de color 
Todo el material que tenga contacto con las muestra s bajo estudio debe esterilizarse mediante: 
Horno, durante 2 horas a 170-175° C o autoclave, dur ante 15 min como mínimo a 121° C ± 1° C 
13.3 Equipo 
/square4 Horno para esterilizar que alcance los 180° C 
/square4 Incubadora con termostato para evitar variaciones mayores de ± 0,1° C y termómetro. 
/square4 Autoclave con termómetro o manómetro, probado con termómetro de máximas. 
/square4 Baño maría con termostato y termómetro. 
/square4 Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g 
/square4 Licuadora de una o dos velocidades controladas por  un reóstato, con vasos esterilizables (vidrio o 
aluminio). 
/square4 Mecheros Bunsen o Fisher 
/square4 Potenciómetro 
13.4  Procedimiento 
13.4.1  Preparación de los alimentos para el aislamiento d e Salmonella 
Los siguientes métodos se basan en el análisis de 2 5 g de la muestra analítica en una proporción de 1: 9 
de muestra/ caldo. Esta cantidad puede variarse sie mpre que se mantenga la misma proporción. Se 
recomienda una muestra de 25 g o más. 
13.4.1.1  Procedimiento general para la preparación de muest ras 
Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso e stéril de licuadora o en bolsa estéril para trabaja r en 
homogeneizador peristáltico (stomacher). Adicionar 225 ml del medio de preenriquecimiento estéril 
(generalmente caldo lactosado, a menos que se indiq ue otro) y licuar si es necesario durante un min. 
Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con tapón de ro sca 
y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente c on la tapa bien enroscada. Mezclar bien y determina r el 
pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesari o, a un pH 6,8 ± 0,2 con hidróxido de sodio 1N o ác ido 
clorhídrico 1N estériles. Mezclar y cubrir el recip iente enroscando suavemente la tapa. 
Incubar 24 ± 2 h a 35° C. Continuar como se indica e n 13.4.2.1 
13.4.1.2  Procedimiento específico para la preparación 
13.4.1.2.1  Productos que contienen huevo en su formulación (p astas para sopa, rollos chinos, etc.); 
ensaladas preparadas (jamón, huevos, pollo, atún, p avo); frutas frescas, congeladas o secas; crustáceo s 
(camarones, cangrejos, jaibas, langostinos, langost as) y pescado.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Preferentemente no descongelar la muestra antes de su análisis, si esto es necesario, utilizar caldo 
lactosado como medio de preenriquecimiento, licuar dos min. Continuar después de la incubación como en  
13.4.2.1 
13.4.1.2.2  Carnes, sustitutos de carnes, derivados cárnicos, sustancias de origen animal, productos 
glandulares y harinas (pescado, carne y hueso). 
13.4.1.2.2.1  Productos procesados térmicamente y productos seco s. Se sigue el procedimiento señalado 
en 12.4.1.1 hasta la homogenización. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse. De spués 
de reposar, mezclar bien y ajustar el pH como se in dica en el procedimiento general. Para emulsionar l as 
grasas, agregar los detergentes en las mismas propo rciones y con las mismas recomendaciones que para e l 
coco. La cantidad de los mismos dependerá en gran m edida de la composición del alimento. Los detergent es 
no serán necesarios en los productos glandulares en  polvo. Incubar las muestras como se indica en 13.4 .1.1. 
13.4.1.2.2.2  Productos crudos o altamente contaminados. Pesar p orciones de 25 g de producto en dos 
vasos para licuadora. Si la muestra es en polvo o m olida, el licuado puede omitirse y el producto pued e 
pesarse directamente en matraces Erlenmeyer estéril es de 500 ml. Adicionar 225 ml de caldo selenito ci stina 
o 225 ml de caldo tetrationato (sin verde brillante ) a cada muestra analítica. Licuar por dos min y pa sar 
asépticamente a matraces Erlenmeyer de 500 ml. Deja r reposar y ajustar el pH como se indica en 13.4.1. 1 
Adicionar 2,25 ml de solución de verde brillante 0, 1% y 4,5 ml de solución yodo-yoduro a la muestra qu e 
se enriquecerá con caldo tetrationato. Homogenizar e incubar. Continuar como se indica en 12.4.2.1 
13.4.2  Aislamiento de  Salmonella  
13.4.2.1  Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matrace s con los cultivos de preenriquecimiento y 
agitar suavemente, transferir respectivamente 1 ml de la mezcla a un tubo que contenga 10 ml de caldo 
tetrationato y a otro con 10 ml de caldo selenito c istina. Como alternativa, en sustitución del caldo tetrationato 
puede emplearse el medio Vassiliadis-Rappaport. 
13.4.2.2  Incubar de 18 a 24 h a 35° C o, para alimentos fuer temente contaminados a 42° C por el mismo 
periodo. Estriar los productos que fueron directame nte enriquecidos en medios selectivos. 
13.4.2.3  Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estri ar en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar 
verde brillante (VB) y una tercera caja con cualqui era de los medios selectivos adicionales (agar enté rico 
Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS). 
Efectuar el mismo procedimiento para el caldo tetra tionato. 
Incubar las placas 24 ± 2 h a 35° C. 
13.4.2.4  Examinar las placas para investigar la presencia d e colonias típicas de Salmonella,  de acuerdo 
con las siguientes características: 
Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser tra nsparentes con o sin centro negro. En algunos casos  
las colonias pueden aparecer completamente negras. 
Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser tran sparentes rodeadas por medio enrojecido; las 
bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas. 
Agar entérico Hektoen: colonias verdes o azulverdes  con o sin centro negro. En algunos casos las 
colonias pueden aparecer completamente negras. 
Agar Sulfito de Bismuto: las colonias típicas de  Salmonella  pueden ser cafés, grises o negras; con o sin 
brillo metálico. Generalmente el medio circundante (halo) es café, tornándose posteriormente negro. Al gunas 
cepas producen colonias verdes sin la formación del  halo oscuro. Si las placas no muestran colonias tí picas o 
no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales . 
Agar SS: colonias translúcidas, ocasionalmente opac as. Algunas colonias dan centro negro. Las colonias  
fermentadoras de la lactosa son rojas. 
13.4.3  Identificación bioquímica 
13.4.3.1  Seleccionar al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien 
aisladas. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Tocar levemente el centro de cada colonia e inocula r dos tubos, uno con agar triple azúcar hierro (TSI ) y 
otro con agar hierro lisina (LIA), por estría en la  superficie inclinada y por punción en el fondo.  
Incubar por 24 ± 2 h a 35° C. 
Almacenar en refrigeración de 5 a 8° C las placas co n medios selectivos por sí es necesario retomar más  
colonias. 
13.4.3.2  Observar el crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente positivas para Salmonella  las 
colonias que den las siguientes reacciones: 
13.4.3.2.1  Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del  indicador debido a la fermentación de la 
glucosa; en la superficie del medio se observa un c olor rojo más intenso que el medio original debido a la no 
fermentación de la lactosa ni de la sacarosa. En la  mayoría de los casos se observa coloración negra a  lo 
largo de la punción debido a la producción de ácido  sulfihídrico. 
13.4.3.2.2  Agar LIA, se observa intensificación del color púr pura en todo el tubo por la descarboxilación de 
la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos q ue produzcan claramente color amarillo en el fondo del agar. 
La mayoría de las cepas de Salmonella  producen ácido sulfihídrico en este medio con enne grecimiento a lo 
largo de la punción. 
13.4.3.2.3  Retener todos los cultivos que muestren las reacci ones características de Salmonella  en los 
medios TSI y LIA para las pruebas adicionales, indi cadas en 13.4.3.3 
13.4.3.3  Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella  pero que presentan reacciones en LIA típicos, 
deben trabajarse como cultivos presuntivos positivo s, ya que en estos casos, el medio LIA permitirá de tectar  
S. arizonae  y cepas atípicas de Salmonella  que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamen te los cultivos 
que muestren reacciones atípicas en ambos medios. 
13.4.3.4  Continuar el análisis a partir de los tubos de TSI  con reacciones típicas. Si el cultivo presenta 
reacciones atípicas en este medio, tomar colonias a dicionales de las placas de donde se obtuvo el cult ivo 
atípico anterior y sembrar las pruebas bioquímicas nuevamente. 
13.4.3.5  Continuar la identificación bioquímica y serológic a a partir de los cultivos recuperados de TSI. Se 
recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analítica seleccionando colonias procedentes  de 
ambos medios de enriquecimiento. 
13.4.3.6  Prueba de ureasa 
13.4.3.6.1  Prueba de ureasa (convencional). Con una asa estér il, tomar crecimiento del cultivo 
presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea. Utilizar un control  de 
medio para comparar el vire púrpura de las reaccion es positivas con el color del medio original. Incub ar  24 ± 
2 h a 35° C. 
13.4.3.6.2  Prueba de ureasa (rápida). Tomar dos asadas de cre cimiento del cultivo presumiblemente 
positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos  de caldo urea (rápida). Incubar 2 h a 37 ± 0,5° C e n baño 
de agua. 
Descartar todos los cultivos que den ureasa positiv a. Retener los cultivos que den la prueba negativa (sin 
cambio de color del medio). 
13.4.4  Identificación serológica 
13.4.4.1  Ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella  (Antisuero polivalente O). 
13.4.4.1.1  Colocar con una asa dos gotas separadas de solució n salina estéril sobre un portaobjetos o en 
dos secciones de una placa para aglutinación. Suspe nder en cada una de las gotas, una porción del cult ivo 
desarrollado en TSI. 
13.4.4.1.2  Agregar a una de ellas una gota del antisuero poli valente somático (O) y mezclar con el canto 
del asa o empleando aplicadores de madera. 
13.4.4.1.3  Agitar inclinando la lámina hacia atrás y hacia ad elante durante aproximadamente un min. 
Observar bajo buena iluminación sobre un fondo oscu ro. 
13.4.4.1.4  Considerar cualquier grado de aglutinación como po sitiva.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
La prueba positiva resulta cuando se presenta aglut inación en la gota con el cultivo y el antisuero y no 
aglutinación en la gota que contiene el cultivo y l a solución salina. 
Si se observa aglutinación en ambas gotas, la prueb a no es definitiva y se debe continuar con las prue bas 
bioquímicas complementarias. 
13.4.4.2  Cuando la aglutinación es positiva con el suero po livalente O, puede determinarse el subgrupo 
empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los más frecuen tes). 
13.4.4.2.1  Si la aglutinación con el antisuero O es negativa,  utilizar antisuero Vi y efectuar la prueba. Si 
hay aglutinación con Vi calentar el cultivo a ebull ición y repetir la aglutinación con el antisuero po livalente O. 
13.4.4.2.2  Si no se cuenta con los sueros grupoespecíficos, s olicitar la tipificación de la cepa al Laboratorio 
de Enterobacterias del Centro Nacional de Diagnósti co y Referencia de la Secretaría de Salud o al Labo ratorio 
Nacional de Salud Pública. 
13.4.4.3  Si se requiere, practicar el ensayo de los antígen os flagelares de Salmonella  (Antisuero 
polivalente H). 
13.4.4.3.1  Inocular el crecimiento del tubo de TSI en agar in fusión de cerebro corazón e incubar de 4 a 6 h 
a 35° C hasta que se observe crecimiento (para ensay o en el mismo día), o bien, en caldo soya tripticas eina e 
incubar por 24 ± 2 h a 35° C (para ensayo al día sig uiente). Adicionar 2,5 ml de solución salina formal izada  a 5 
ml del cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebr o corazón (BHI). 
13.4.4.3.2  Colocar 0,5 ml del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para serología  (13 x 
100 mm aproximadamente). Adicionar 0,5 ml del culti vo formalizado. Preparar un control de solución sal ina 
mezclando 0,5 ml de solución salina formalizada con  0,5 ml del antígeno formalizado. Incubar las mezcl as en 
baño de agua a 48- 50° C. Observar a intervalos de 1 5 min por espacio de una h. Una prueba positiva es 
cuando se observa aglutinación en la mezcla de prue ba pero no en el control. Debe interpretarse como 
negativa una prueba en la que ninguna de las mezcla s muestre aglutinación. Cuando ambas mezclas se 
aglutinan, se considera la prueba inespecífica. 
13.4.5  Pruebas bioquímicas complementarias 
Cuando las pruebas serológicas o bioquímicas inicia les, dan resultados atípicos o no concluyentes, 
realizar las pruebas que se describen a continuació n: 
13.4.5.1  Inocular los cultivos positivos provenientes de TS I y LIA en: medio SIM, agar citrato de Simmons, 
caldo manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato pa ra confirmar la presencia de la especie S. arizonae.  
13.4.5.2  Interpretar los cambios en los medios inoculados c onforme lo siguiente: 
13.4.5.2.1  Agar citrato Simmons 
Inocular por estría el tubo 
Incubar 96 ± 2 h a 35 ± 2° C 
Prueba positiva: crecimiento acompañado de un cambi o de color de verde a azul. 
Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin camb io de color. 
13.4.5.2.2  Medio SIM 
Inocular por punción 
Incubar 24 h a 35 ± 2° C 
Movilidad 
Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la punci ón y en el seno del medio de cultivo. 
Prueba negativa: crecimiento a lo largo de la punci ón exclusivamente. 
Producción de ácido sulfihídrico 
Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la punción que puede extenderse a todo  el  
medio. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Prueba negativa: ausencia de color negro. 
Producción de indol 
Adicionar al tubo con medio SIM que presente crecim iento, de 0,2 a 0,3 ml de reactivo de Kovac. 
Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color r ojo. 
Prueba negativa: sin cambio de color. 
13.4.5.2.3  Caldo RM-VP 
Inocular un tubo con el medio 
Incubar 48 ± 2 h a 35 ± 2° C para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM 
13.4.5.2.3.1  Prueba de Voges-Proskauer (VP) 
Transferir a un tubo un ml del cultivo de 48 h 
Adicionar 0,6 ml de solución de alfa naftol 
Adicionar 0,2 ml de solución de hidróxido de potasi o 40% 
Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional )  
Interpretar los resultados después de incubar 2 h a  35 ± 2° C o 4 h a temperatura ambiente 
Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo 
Prueba negativa: sin cambio de color 
Reincubar el resto del medio RM-VP 48 h más a 35 ± 2° C 
13.4.5.2.3.2  Prueba de rojo de metilo (RM) 
Adicionar al medio de cultivo de 96 h de incubación  de dos a tres gotas de solución de rojo de metilo 
Interpretar los resultados inmediatamente 
Prueba positiva: desarrollo de color rojo 
Prueba negativa: desarrollo de color amarillo 
13.4.5.2.4  Caldo malonato 
Inocular un tubo conteniendo el medio 
Incubar 40 ± 2 h a 35 ± 2° C 
Prueba positiva: desarrollo de color azul 
Prueba negativa: sin cambio de color 
13.4.5.2.5  Caldo manitol 
Inocular un tubo conteniendo el medio 
Incubar 24 ± 2 h a 35 ± 2° C 
Prueba positiva: desarrollo de color amarillo 
Prueba negativa: sin cambio de color 
13.4.5.3  Consultar los resultados obtenidos en el cuadro 2 para la identificación de los géneros de las 
bacterias investigadas. 
Nota:  Los sistemas bioquímicos comerciales validados pue den ser usados como alternativa para las 
pruebas bioquímicas convencionales. 
13.5  Cálculo y expresión de resultados 
13.5.1  Interpretación de reacciones bioquímicas y serológ icas. 
CUADRO 1 
REACCIONES 
BIOQUIMICAS REACCIONES SEROLOGICAS INTERPRETACION       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Típica Antígeno O, Vi o H positivo  Cepas considera das como Salmonella   
Típica Todas las reacciones negativas  
Típica No probada  Puede ser Salmonella  
Reacciones 
atípicas Antígeno O, Vi o H positivo   
Reacciones 
atípicas Todas las reacciones negativas No debe ser consider ada Salmonella  
 
13.5.2  Reacciones bioquímicas y serológicas de Salmonella  
CUADRO 2 
PRUEBA O SUSTRATO POSITIVO NEGATIVO REACCION  
Glucosa (TSI)  amarillo rojo + 
Lisina descarboxilasa(LIA) púrpura amarillo + 
H2S (TSI y LIA)  negro no negro + 
Ureasa rojo-púrpura no hay cambio de color - 
Caldo de lisina descarboxilasa púrpura amarillo + 
Caldo dulcitol rojo de fenol  ³ amarillo o gas no h ay ³ cambio de color, ni gas +b 
Caldo KCN  crecimiento no hay crecimiento - 
Caldo malonato  azul no hay cambio de color - 
Prueba de indol  superficie color violeta superfici e color amarillo - 
Prueba del antígeno flagelar aglutinación no hay ag lutinación + 
Prueba del antígeno somático aglutinación no hay ag lutinación + 
Caldo lactosa rojo fenol  amarillo o gas no hay cam bio de color, ni gas - 
Caldo sacarosa rojo fenol amarillo o gas no hay cam bio de color, ni gas - 
Prueba Voges- Proskauer de rosa a rojo no hay cambi o de color - 
Prueba rojo de metilo rojo difuso amarillo difuso +  
Citrato de Simmons  crecimiento color azul no hay c recimiento no hay 
cambio de color v 
a +, 90% o más positivos en 1 o 2 días; -, 90% o más  negativas en 1 o 2 días; v, variable. 
b La mayoría de los cultivos S. arizonae  son negativos. 
c La mayoría de los cultivos S. arizonae  son positivos. 
13.5.3  Informe de Resultados 
Informar: presencia o ausencia de Salmonella  en ___________ g o _______________ ml de muestra. 
14. Método para la determinación de staphylococcus aureus  en alimentos 
14.1  Fundamento 
Este método permite hacer una estimación del conten ido de Staphylococcus aureus en alimentos, se 
efectúa directamente en placas de medio de cultivo selectivo y diferencial, con la confirmación median te las 
pruebas de coagulasa y termonucleasa. Este método e s adecuado para el análisis de alimentos en los cua les 
se esperen más de 100 células de Staphylococcus aureus  por g. 
14.2  Reactivos y materiales 
En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshi dratadas, para su preparación se deben seguir las 
instrucciones impresas en la etiqueta respectiva. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Cuando se mencione agua debe entenderse que se trat a de "agua destilada". 
Los reactivos a emplear en el método objeto de esta  norma deben ser grado analítico. 
14.2.1  Reactivos 
14.2.1.1  Soluciones diluyentes 
14.2.1.1.1  Solución reguladora de fosfatos (Solución concentr ada) 
FORMULA 
Ingredientes Cantidad 
Fosfato monopotásico 34,0 g 
Agua  1,0 l 
 
Preparación:  Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el  pH a 7,2 con solución de hidróxido de 
sodio 1 N, aforar con agua a 1 l. Esterilizar duran te 15 min a 121ºC ±1, conservar en refrigeración (s olución 
concentrada). Tomar 1,25 ml de la solución concentr ada y llevar a 1 l con agua (solución de trabajo). Distribuir 
en porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera. Es terilizar a 121ºC ±1 durante 15 min. Después de la 
esterilización, los volúmenes finales y el pH de la  solución de trabajo deben ser iguales a los inicia les. 
14.2.1.1.2  Agua peptonada 
FORMULA 
Ingredientes Cantidad 
Peptona 1,0 g 
Cloruro de sodio 8,5 g 
Agua  1,0 l 
 
Preparación:  Disolver los componentes en un litro de agua. Ajus tar el pH a 7,0 con solución de hidróxido 
de sodio 1N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera. Esterilizar a 121ºC ±1 durant e 15 min. 
Después de la esterilización los volúmenes finales y el pH de la solución de trabajo deben ser iguales   a los 
iniciales. 
14.2.1.2  Medios de cultivo 
14.2.1.2.1  Medio de Baird-Parker 
FORMULA 
Ingredientes Cantidad 
Medio base (6.1.2.1.1) 95,0 ml 
Solución de telurito de potasio (6.1.2.1.2) 1,0 ml 
Emulsión de yema de huevo (6.1.2.1.3) 5,0 ml 
 
Preparación:  Cuando el medio base esté a 45ºC, agregar los demá s ingredientes y mezclar. Colocar de 
15 a 20 ml del medio completo, enfriar y dejar soli dificar. Las placas pueden almacenarse por 48 h a 
temperatura de 0 a 5ºC. 
14.2.1.2.1.1.  Medio base de Baird-Parker 
FORMULA 
Ingredientes Cantidad 
Triptona  10,0 g 
Extracto de levadura  1,0 g 
Extracto de carne 5,0 g       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Glicina 12,0 g 
Cloruro de litio 5,0 g 
Piruvato de sodio  10,0 g 
Agar  20,0 g 
Agua  1,0 l 
 
Preparación:  Disolver los ingredientes o el agar base en agua y  calentar con agitación constante y hervir 
durante 1 min. Esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 mi n. Enfriar y mantener el medio a 45ºC. 
14.2.1.2.1.2 Solución de telurito 
FORMULA  
Ingredientes Cantidad 
Telurito de potasio 1,0 g 
Agua 100,0 ml 
 
Preparación:  Disolver el telurito de potasio en agua y esterili zar. La solución puede ser almacenada por 
varios meses a temperatura de 0 a 5ºC. 
14.2.1.2.1.3  Emulsión de yema de huevo 
Preparación.  Lavar con agua y jabón los huevos frescos que sean  necesarios y limpiarlos con una 
solución de tintura de yodo (solución alcohólica al  2%) o sumergirlos en solución de cloruro mercúrico  
(1:1000). Enjuagar con agua estéril y secar con gas a estéril. En campana de flujo laminar o en condici ones 
asépticas, abrir los huevos y vaciarlos en un separ ador de claras estéril. Transferir las yemas a una probeta 
hasta un volumen de 60 ml y completar a 90 ml con s olución salina isotónica. Verter la emulsión a un m atraz 
Erlenmeyer con perlas de vidrio estéril y agitar fu ertemente para formar la emulsión. Filtrar a través  de gasa. 
Las placas deben utilizarse dentro de las 48 h sigu ientes a su preparación. 
14.2.1.2.1.4  Solución salina isotónica 
FORMULA 
Ingredientes Cantidad 
Cloruro de sodio  0,85 g 
Agua  100,0 ml 
 
Preparación:  Disolver el ingrediente en agua y esterilizar a 12 1ºC ±1 durante 15 min. 
14.2.1.2.2  Caldo de infusión cerebro-corazón (BHI) 
FORMULA 
Ingredientes Cantidad 
Infusión de cerebro de ternera  200,0 ml 
Infusión de corazón de res 250,0 ml 
Peptona de gelatina  10,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Fosfato disódico dodecahidratado  2,5 g 
Glucosa  2,0 g 
Agua  1,0 l 
 
Preparación:  Disolver los ingredientes en agua y calentar liger amente si es necesario. Distribuir y 
esterilizar durante 15 min a 121ºC ±1. 
14.2.1.2.3  Acido desoxirribonucleico helicoidal de timo de te rnera. 
FORMULA 
Ingredientes Cantidad 
Acido desoxirribonucleico helicoi- dal de timo de ternera o 
equivalente 0,03 g 
Agar  1,00 g 
Cloruro de calcio anhidro (Solución 0,01 M) (6.1.2. 3.1)  0,10 ml 
Cloruro de sodio  1,00 g 
Azul de toluidina (Solución 0,1 M) (6.1.2.3.2)  0,3 0 ml 
Tris-(hidroximetil- aminometano) (Tris solución 0,05 M, pH 9) 
(6.1.2.3.3)  100,00 ml 
 
Preparación:  Disolver los ingredientes, excepto el azul de tolu idina agitando hasta completar la disolución 
del ácido desoxirribonucleico y calentar a ebullici ón. Agregar el azul de toluidina. Distribuir en fra scos 
pequeños con tapón de hule. No es necesario esteril izar. Este medio es estable a temperatura ambiente hasta 
4 meses y funciona perfectamente aun después de fun dirlo varias veces. Tomar un porta objetos limpio y  
agregar 3 ml del medio fundido esparciéndolo por la  superficie. Cuando el agar solidifique, hacer orif icios con 
la punta de una pipeta Pasteur. Conservar en refrig eración para evitar la deshidratación. 
14.2.1.2.3.1  Solución de cloruro de calcio anhidro 0,01 M 
Cloruro de calcio PM = 110,99 
Disolver 0,1199 g de cloruro de calcio en 100 ml de  agua. 
14.2.1.2.3.2  Solución de azul de toluidina 0,1 M 
Disolver 3,05 g de azul de toluidina en 100 ml de a gua. 
14.2.1.2.3.3  Solución amortiguadora 0,05 M Tris-(hidroximetilam inometano) 
(Tris pH 9) PM = 121,1 
Disolver 6,055 g de Tris en 100 ml de agua. 
14.2.1.3  Reactivo biológico: 
Plasma de conejo 
Emplear plasma de conejo deshidratado o rehidratado  siguiendo las instrucciones del fabricante y agreg ar 
ácido etilendiaminotetracético (EDTA) en solución a l 0,1% en plasma rehidratado. Si se utiliza plasma 
deshidratado diluir con agua estéril en proporción de 1:3. Puede emplearse plasma de conejo liofilizad o 
adicionado de EDTA. No debe emplearse sangre citrat ada. 
14.2.2  Materiales 
Todos los instrumentos que se utilicen para trabaja r la muestra deben esterilizarse mediante horno, 
durante 2 h de 170-175ºC o como alternativa en auto clave durante 15 min como mínimo a 121ºC ±1. 
/square4 Cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas y separador de huevo. 
/square4 Tubos de cultivo de 16 mm x 150 mm o frascos de 12 5 a 250 ml de capacidad. 
/square4 Tubos de cultivo de 10 mm x 75 mm.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
/square4 Cajas Petri de 90 a 100 mm de diámetro. 
/square4 Pipetas bacteriológicas de 1 ml y 10 ml de capacid ad graduadas en 0,1 ml y 1 ml respectivamente y 
diámetro de 2 a 3 mm. 
/square4 Pipetas Pasteur. 
/square4 Probetas. 
/square4 Varillas de vidrio de 3,5 mm de diámetro aproximad amente y 20 cm de largo dobladas en ángulo 
recto. 
/square4 Matraz Erlenmeyer con perlas de vidrio 
/square4 Cámara húmeda: consiste en una caja Petri en la cu al se coloca una varilla de vidrio en forma de "V" 
rodeada de algodón humedecido con agua. 
14.3  Aparatos 
/square4 Horno para esterilizar que alcance 180° C. 
/square4 Autoclave con termómetro. 
/square4 Baño de agua con regulador de temperatura de 35 ± 0,5ºC. 
/square4 Baño de agua con regulador de temperatura de 45 ± 0,5ºC. 
/square4 Balanza con capacidad no mayor de 2,500 g y sensib ilidad de 0,1 g. 
/square4 Incubadora a 35 ± 1ºC. 
14.4 Preparación de la muestra 
La preparación de la muestra se debe realizar de ac uerdo a lo establecido en el método Preparación y 
Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico. 
14.5  Procedimiento 
14.5.1  Utilizando diferentes pipetas de 1 ml para cada di lución, depositar 0,1 ml sobre la superficie de las  
placas de agar Baird-Parker. 
14.5.2  Distribuir el inóculo sobre la superficie del agar  con varillas estériles de vidrio en ángulo recto, 
utilizando una para cada dilución. 
14.5.3  Mantener las placas en su posición hasta que el in óculo sea absorbido por el agar. 
14.5.4  Invertir las placas e incubar de 45 a 48 h a 35ºC.  
14.5.5  Seleccionar las placas que tengan entre 15 y 150 c olonias típicas de Staphylococcus aureus ; si no 
es posible, seleccionar las placas de las dilucione s más altas no obstante tengan más de 150 colonias.  
14.5.6  Cuando las placas tengan menos de 15 colonias típi cas también pueden ser utilizadas y al informe 
se debe agregar la nota de "valor estimado". 
14.5.7  Las colonias típicas son negras, circulares, brill antes, convexas, lisas, de diámetro de 1 a 2 mm y 
muestran una zona opaca y un halo claro alrededor d e la colonia. 
14.5.8  Seleccionar las colonias de acuerdo con el siguien te cuadro para realizar las pruebas de coagulasa 
y termonucleasa: 
NUMERO DE COLONIAS NUMERO DE COLONIAS 
SOSPECHOSAS EN PLACA POR 
PROBAR 
Menos de 50 3 Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
51 a 100 5 
101 a 150 o más 7 
 
14.5.9  Seleccionar el número de colonias y sembrar cada u na en tubos con 0,5 ml de caldo de infusión 
cerebro-corazón. 
14.5.10  Incubar a 35ºC durante 24 h. 
14.5.11  Inocular en la misma forma cepas conocidas de Staphylococcus aureus y Staphylococcus 
epidermidis  como testigos positivo y negativo. 
14.5.12  Después del periodo de incubación pasar con una pi peta de 1 ml, 0,3 ml de cada cultivo a otro 
tubo de 10 mm x 75 mm y conservarlo para la prueba de termonucleasa. El resto del cultivo se usa para la 
prueba de coagulasa. 
14.5.13  Prueba de coagulasa 
14.5.13.1  Agregar a los 0,2 ml del cultivo anterior, 0,2 ml de plasma de conejo diluido volumen a volumen 
con solución salina estéril. 
14.5.13.2  Incubar en baño de agua de 35 a 37ºC y observar du rante 6 h a intervalos de 1 h; si no hay 
formación de coágulo, observar a las 24 h. Consider ar positiva la prueba si hay formación de coágulo. 
Para comprobar la coagulabilidad del plasma de cone jo se añade una gota de cloruro de calcio al 5%  a 
0,5 ml de plasma reconstituido empleado, formándose  un coágulo en 10-15 seg. 
14.5.14  Prueba de termonucleasa 
14.5.14.1  Calentar durante 15 min, 0,3 ml de cultivo en cald o de infusión cerebro-corazón en baño de  
agua hirviendo. 
14.5.14.2  Pasar una gota de cada cultivo por medio de una pi peta Pasteur a un orificio del medio,  incluye 
testigo. 
14.5.14.3  Incubar a 35ºC en cámara húmeda de 4 a 24 h. 
14.5.14.4  La aparición de un halo color rosa extendido de po r lo menos 1 mm alrededor de la perforación 
se califica como positiva. 
14.6  Cálculo y expresión de resultados 
14.6.1  Cálculo 
Hacer el cálculo del contenido de microorganismos e n el producto tomando en cuenta el número de 
colonias totales, el número de colonias confirmadas , la dilución y el volumen inoculado (0,1 ml). 
Ejemplo 1: 
Si la caja tiene 80 colonias en la dilución 1:1000 
Se toman 5 colonias para la prueba, de éstas dan 4 positivas, el cálculo es: 
80 x 4  = 64 x 1000 x 10 = 640 000 
5 
Ejemplo 2: 
Si la caja tiene 14 colonias en la dilución 1:10 
Se toman 3 colonias para la prueba, de éstas dan 2 positivas, el cálculo es: 
14 x 2 = 9,3 x 10 x 10 = 930 
3 
14.6.2  Expresión de los resultados: 
Según ejemplo 1: 
Informar como Staphylococcus aureus  640 000 UFC/g 
Según ejemplo 2: 
Informar como Staphylococcus aureus  930 UFC/g valor estimado 
Si las pruebas confirmativas resultan negativas en todas las colonias probadas, informar como:       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
0 UFC/g en muestras directas 
-10 UFC/g en muestras de dilución 1:10 
-100 UFC/g en muestras de dilución 1:100 
En la práctica los resultados pueden variar, esto d ependerá del técnico que trabaje el método y el gra do de 
confiabilidad del mismo, que en el 95% de los casos  es de ± 16% a ± 52%. 
15. Método de prueba microbiológico para alimentos.  Determinación de L. monocytogenes . 
15.1  Fundamento 
El método para detectar la presencia de Listeria . monocytogenes se basa en el aislamiento y la 
diferenciación de especies de Listeria  spp., principalmente por la fermentación de carboh idratos y la actividad 
hemolítica de los miembros de este género. 
15.2  Reactivos 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben  ser grado analítico. 
Cuando se indica agua, debe entenderse que se trata  de agua destilada. 
/square4 Acido acético 5 N 
/square4 Acido clorhídrico 1 M 
/square4 Acido sulfanílico (cristales) 
/square4 Alfa-naftilamina 
/square4 Alfa-naftol 5% en etanol absoluto 
/square4 Etanol absoluto 
/square4 Granalla de zinc 
/square4 Hidróxido de sodio 1 M 
/square4 Lactamato de glicil-glicina (anhídrido de glicina)  
/square4 Regulador de fosfatos glicerinado con pH 9,0 ± 0,2  
/square4 Sangre de carnero desfibrinada 
/square4 Solución al 3% de peróxido de hidrógeno 
/square4 Solución salina fisiológica 0,85% estéril 
/square4 Sueros comerciales para tipificación de Listeria  spp 
/square4 Sulfato de cadmio al 20% 
/square4 Zinc pulverizado 
15.2.1  Reactivos para Tinción de Gram 
15.2.1.1  Alcohol-acetona 
Ingredientes Cantidad 
Etanol (95%) 700,0 ml 
Acetona 300,0 ml 
Mezclar ambos líquidos. 
15.2.1.2  Cristal violeta 
Solución A 
Ingredientes Cantidad 
Cristal violeta 2,0 g 
Etanol (95%) 20,0 ml Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Disolver el cristal violeta en el etanol. 
Solución B 
Ingredientes Cantidad 
Oxalato de amonio 0,8 g 
Agua 80,0 ml 
 
Disolver el oxalato de amonio en el agua. Después d e preparar las soluciones A y B, verter una en la o tra 
y agitar hasta que se mezclen perfectamente. 
15.2.1.3  Solución de Yodo 
Ingredientes Cantidad 
Yodo 1,0 g 
Yoduro de potasio 2,0 g 
Agua 300,0 ml 
 
Triturar finamente el yodo y el yoduro de potasio e n un mortero, de ser posible en una campana de 
extracción. Añadir una pequeña cantidad de agua par a lavar el material, agregar el resto del agua y ag itar. 
Nota: ¡Evitar el contacto de los reactivos con la p iel! 
15.2.1.4 Solución de Safranina 
Ingredientes Cantidad 
Safranina 0,25 g 
Etanol (95%) 10,00 ml 
Agua 100,00 ml 
 
Disolver la safranina en el etanol, mezclar, agrega r el agua y volver a agitar. Filtrar la solución co n papel 
filtro. 
15.2.2  Reactivos para la determinación de nitritos 
15.2.2.1  Reactivo A 
Ingredientes Cantidad 
Alfa-naftilamina 0,5 g 
Acido acético 5N 100,0 ml 
 
15.2.2.2  Reactivo B 
Ingredientes Cantidad 
Acido sulfanílico 1,0 g 
Acido acético 5N 125,0 ml 
 
15.2.2.3  Reactivo C 
Ingredientes Cantidad 
Alfa-naftol 1,0 g 
Acido acético 5N 200,0 ml 
15.2.2.4  Solución de sulfato de cadmio al 20% 
Colocar granallas de zinc en solución de sulfato de  cadmio al 20% de 4 a 6 h. Disolver el precipitado de 
cadmio, adicionando ácido clorhídrico 1N. 
15.3  Medios de cultivo       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
A continuación se presentan las fórmulas y los proc edimientos para preparar los medios empleados en 
este análisis microbiológico. En caso de disponer d e fórmulas comerciales deshidratadas se deben segui r las 
instrucciones del fabricante para su preparación. 
15.3.1  Caldo soya tripticaseína con 0,6 % de extracto de levadura (CSTEL) 
Ingredientes Cantidad 
Caldo soya tripticaseína 30,0 g 
Extracto de levadura 6,0 g 
Agua 1000,0 ml 
 
Agitar hasta disolver los ingredientes. Esterilizar  a 121 ± 1ºC durante 15 min. El pH final de la solu ción 
debe ser 7,3 ± 0,2. 
15.3.2  Caldo de enriquecimiento (EB) pH 7,3 
Un litro de caldo soya tripticaseína con extracto d e levadura (CSTEL) debe contener los siguientes 
suplementos: 
Suplementos Cantidad 
Clorhidrato de acriflavina 15,0 mg 
Acido nalidíxico (sal sódica) 40,0 mg 
Cicloheximida 50,0 mg 
Acido pirúvico (sal sódica) Solución al 
10 % (p/v) * 11,1 ml 
 
Preparar los suplementos de acriflavina y nalidíxic o a partir de una solución al 0,5 % (p/v) con agua.  
El suplemento de cicloheximida prepararlo como una solución al 1,0 % (p/v) en una solución al 40 % (v/ v) 
de etanol en agua. Esterilizar por filtración los s uplementos. Agregar en condiciones asépticas los 
suplementos al medio CSTEL previamente esterilizado , justo antes de su uso. Para la preparación de un litro 
del medio CSTEL se debe partir de las soluciones an teriores, agregando las siguientes cantidades: 3,0 ml de 
acriflavina, 8,0 ml de ácido nalidíxico y 5,0 ml de  solución de cicloheximida. Precaución: ¡La ciclohe ximida es 
una sustancia química altamente tóxica, durante su manejo deben emplearse guantes, lentes de protecció n y 
lavarse las manos inmediatamente después de usarla!  
15.3.3  Medio de cloruro de litio feniletanol-moxolactam ( LMP) 
Ingredientes Cantidad 
Agar fenil etanol 35,5 g 
Glicina anhídra 10,0 g 
Cloruro de litio 5,0 g 
Solución de moxolactam al 1 % en amortiguador de 
fosfatos pH 6,0 2,0 ml 
Agua 1000,0 ml 
 
Esterilizar el medio (sin moxolactam) en autoclave a 121 ± 1ºC durante 15 min. Enfriar de 48 a 50ºC y 
agregar la solución de moxolactam previamente ester ilizada por filtración. Distribuir volúmenes de 12 a 15 ml 
del medio en cajas de Petri estériles. Las placas d elgadas facilitan la observación de las colonias. 
15.3.4  Medio Oxford 
15.3.4.1  Medio base Oxford (OXA) 
Ingredientes Cantidad 
Base de agar Columbia 39,0 g Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Esculina 1,0 g 
Citrato férrico amónico 0,5 g 
Cloruro de litio 15,0 g 
Agua 1000,0 ml 
 
Agregar los ingredientes a un litro de agua y lleva r a ebullición hasta disolución completa. Esteriliz ar en 
autoclave a 121 ± 1ºC durante 15 min. Enfriar a 50º C el medio base y en condiciones asépticas agregar los 
suplementos. Un litro de medio Oxford debe contener  los siguientes suplementos: 
Suplementos Cantidad 
Cicloheximida 400 mg 
Sulfato de colistina 20 mg 
Acriflavina 5 mg 
Cefotetán 2 mg 
Fosfomicina 10 mg 
 
Disolver la cicloheximida, el sulfato de colestina,  acriflavina, cefotetán y la fosfomicina en 10 ml d e una 
mezcla 1:1 de etanol: agua. Esterilizar por filtrac ión antes de agregar al medio base. Mezclar y vacia r en cajas 
Petri estériles. Las placas del medio Oxford se pue den almacenar como máximo dos semanas. 
15.3.5  Agar soya tripticaseína con 0,6% de extracto de le vadura (ASTEL) 
Ingredientes Cantidad 
Agar soya tripticaseína 40,0 g 
Extracto de levadura 6,0 g 
Agua 1000,0 ml 
 
Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el ag ar. Esterilizar a 121 ± 1ºC durante 15 min. pH fina l 7,3 ± 
0,2. 
15.3.6  Agar sangre de carnero 
Ingredientes Cantidad 
Base de agar sangre 95,0 ml 
Sangre de carnero desfibrinada 5,0 ml 
 
Preparar el agar base de acuerdo a las instruccione s del fabricante. Enfriar a 45 ± 2ºC y agregar 
asépticamente la sangre de carnero, la cual previam ente se debe encontrar a temperatura ambiente  (20 - 
25° C). Homogeneizar el medio y verter en las cajas Petri estériles de 12 a 15 ml para la prueba de CAM P y de 
15 a 20 ml para la prueba de hemólisis. 
15.3.7  Caldo nitratos 
Ingredientes Cantidad 
Nitrato de potasio 1,0 g 
Cloruro de sodio 0,5 g 
Peptona 2,0 g 
Agua 1000,0 ml 
 
Agregar los ingredientes a un litro de agua, agitar  hasta disolución completa. Verter en tubos de 13 x  100 
mm con tapón de rosca. Esterilizar en autoclave a 1 21 ± 1° C durante 15 min. 
15.3.8  Medios para la prueba de movilidad 
15.3.8.1  Medio de SIM 
Ingredientes Cantidad       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Peptona de caseína 20,0 g 
Peptona de carne 6,1 g 
Sulfato de fierro y amonio 0,2 g 
Tiosulfato de sodio 0,2 g 
Agar 3,5 g 
Agua 1000,0 ml 
 
Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el ag ar. Envasar en porciones de 4 ml en tubos de 13 x 1 00 
mm. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1° C durante 15  min. pH final 7,3 ± 0,2. 
15.3.8.2  Medio MTM 
Ingredientes Cantidad 
Extracto de carne 3,0 g 
Peptona 10,0 g 
Cloruro de sodio (NaCl) 5,0 g 
Agar 4,0 g 
Agua 1000,0 ml 
 
Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el ag ar. Envasar en porciones de 4 ml en tubos de 13 x 1 00 
mm. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1ºC durante 15  min. pH final 7,4 ± 0,2. 
15.3.9  Caldo púrpura para fermentación de carbohidratos 
Ingredientes Cantidad 
Proteosa peptona No. 3 10,00 g 
Cloruro de sodio 5,00 g 
Extracto de carne 1,00 g 
Púrpura de bromocresol  0,02 g 
Agua 1000,00 ml 
 
Calentar si es necesario para disolver los ingredie ntes. Esterilizar en autoclave durante 15 min.  A 1 21 ± 
1° C pH final 6,8 ± 0,2. Agregar la solución del car bohidrato, previamente esterilizada, por filtración  en cantidad 
suficiente para obtener una concentración final de 0,5 %. 
Nota:  Los sistemas bioquímicos comerciales validados pue den usarse como alternativa para las pruebas 
bioquímicas convencionales. 
15.4  Materiales 
/square4 Aceite de inmersión 
/square4 Asas bacteriológicas 
/square4 Cajas Petri 
/square4 Cubreobjetos 
/square4 Matraces Erlenmeyer de 500 ml 
/square4 Lámpara de luz blanca 
/square4 Lápiz graso o marcador 
/square4 Lupa de bajo aumento 
/square4 Pipetas volumétricas de 25, 10 y 1,0 ml Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
/square4 Portaobjetos escabado 
/square4 Portaasas 
/square4 Tubos de 16 x 125 mm 
/square4 Tubos de 13 x 100 mm u otros con tapón de rosca 
/square4 Sistema de filtración con membranas con un tamaño de poro de 0,45 µm 
15.5  Aparatos e instrumentos 
Se requiere además de lo mencionado en el método de  Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos 
para su Análisis Microbiológico, lo siguiente: 
/square4 Incubadoras con termostato que evite variaciones m ayores de ± 1,0ºC, provista con termómetro 
calibrado. 
/square4 Microscopio de contraste de fases con objetivo de inmersión en aceite (100 X) o microscopio de 
campo oscuro. 
15.6  Preparación de la muestra 
Para la preparación de la muestra seguir lo mencion ado en el método Preparación y Dilución de muestras  
de Alimentos para su Análisis Microbiológico. 
15.7  Procedimiento 
Este método debe realizarlo un microbiólogo experim entado, en un ambiente controlado, aislado de áreas  
de producción de alimentos. Se debe tener especial cuidado en la disposición de aquellos materiales y equipo 
que hayan estado en contacto con alimentos sospecho sos, antes de desecharlos o volver a utilizarlos. E sta 
técnica por ningún motivo debe aplicarla personal i nmunocomprometido ya sea por enfermedad o por el us o 
de medicamentos, mujeres embarazadas o personas de edad avanzada. 
15.7.1  Procedimiento de enriquecimiento 
Tomar una muestra representativa del alimento, tant o de la superficie externa como del interior. Coloc ar  
25 ml o 25 g de la muestra en un recipiente conteni endo 225 ml de medio de enriquecimiento (EB), 
homogeneizar e incubar por 48 h a 30ºC. En el caso de muestras en donde se sospecha que tienen células  de 
Listeria  spp dañadas, se recomienda la incubación en un cal do de enriquecimiento que contenga piruvato  de 
sodio al 0,1 % (p/v) incubado a 30° C por 6 h sin su plementos. Después de las 6 h de incubación los 
suplementos deben agregarse y continuar la incubaci ón a 30ºC hasta un total de 48 h. 
15.7.1.1  Aislamiento 
Después de 24 y 48 h de incubación en el medio EB, resembrar en los medios LMP y OXA. Incubar las 
placas del medio LMP a 30ºC por 24 a 48 h y las de medio OXA a 35ºC por el mismo periodo. Observar el 
crecimiento en las placas del medio LMP con luz bla nca en un ángulo de 45º (iluminación de Henry), a s imple 
vista o con la ayuda de una lupa. En este medio gen eralmente aparecen las colonias de color blanco o a zul 
iridiscentes. Ver la figura 1. En el medio OXA las colonias de Listeria son negras, con halo negro. Algunas 
colonias pueden aparecer con un tono café oscuro qu e se define mejor a los siete días de incubación. 
Seleccionar cinco o más colonias típicas del medio de OXA o LMP y pasar a placas de medio 
ASTEL. Este paso es importante debido a que las col onias aparentemente aisladas en los medios OXA 
y LMP pueden estar contaminadas con flora competiti va parcialmente inhibida, invisible a simple vista.  
Debido a que puede estar presente más de una especi e de Listeria en la muestra, deben identificarse 
como mínimo cinco colonias.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
 
15.7.2  Identificación 
Se deben utilizar cepas de referencia positivas y n egativas para cada una de las pruebas. Seleccionar 
colonias típicas y sembrar en medio ASTEL. Incubar a 35ºC por 24 h. Estos cultivos pueden mantenerse a  
4ºC y utilizarse como inóculo para realizar las pru ebas de identificación. 
15.7.2.1  Prueba de movilidad en fresco 
Hacer preparaciones en fresco (en gota suspendida o  entre porta y cubreobjetos) utilizando solución sa lina 
al 0,85%. La suspensión debe ser densa y emulsifica rse completamente, y observar con objetivo de inmer sión 
en un microscopio de contraste de fase o microscopi o de campo oscuro. Las células de Listeria  spp son 
bacilos cortos con movilidad rotatoria o como si br incaran. Los bacilos con movimientos rápidos no son  
Listeria  spp. 
15.7.2.2  Prueba de catalasa 
Emulsificar un cultivo puro, con una gota de soluci ón de peróxido al 3%. La formación inmediata de 
burbujas indica que la prueba es positiva. Las espe cies de Listeria  son catalasa positivo. 
¡Precauciones, la emulsión debe realizarse con una asa de plástico o palillo de madera estéril evitand o el 
contacto del metal con el reactivo. Si las colonias  provienen de agar base con sangre. Cualquier 
contaminación de eritrocitos puede dar pruebas fals as positivas! 
15.7.2.3  Tinción de Gram 
Hacer una tinción de Gram de cultivos de 16 a 24 h.  Todas las especies de Listeria  son bacilos cortos 
Grampositivo; sin embargo en cultivos viejos pueden  presentarse como formas cocoides. En extensiones 
delgadas se observan de color pálido y pueden confu ndirse con Bacteroides spp. 
15.7.2.4  Prueba de hemólisis 
Dibujar una cuadrícula de 20 a 25 espacios en el fo ndo de la placa de agar sangre de carnero al 5%. 
Inocular por picadura un cuadro por cada cultivo. I ncubar por 48 h a 35ºC. Al inocular, observar la re acción 
hemolítica en las placas. L. monocytogenes  y L. seeligeri  producen una zona ligeramente clara alrededor del 
punto de picadura. Confirmar las reacciones dudosas  con la prueba de CAMP. 
15.7.2.5  Prueba de reducción de nitratos 
Inocular los tubos conteniendo caldo nitratos, incu bar a 35ºC por 5 días. Para la lectura se debe agre gar 
0,2 ml del reactivo A y 0,2 ml del reactivo B, un c olor rojo indica una prueba positiva (presencia de nitritos). Si 
esta coloración no se observa, adicionar zinc en po lvo. El desarrollo de color rojo después de una hor a 
confirma una prueba negativa (presencia de nitratos ). En forma alternativa adicionar al cultivo en cal do nitratos 
0,2 ml del reactivo B y 0,2 ml del reactivo C. Un c olor naranja indica una prueba positiva (presencia de 
nitritos). Si esta coloración no se observa, adicio nar 0,2 ml del reactivo de cadmio, el desarrollo de  un color 
naranja confirma una prueba negativa (presencia de nitratos). Este procedimiento alternativo elimina e l uso del 
alfa - naftilamina, que es carcinogénica. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
15.7.2.6  Prueba de movilidad en agar 
Inocular el medio SIM o MTM, incubar por 7 días a t emperatura ambiente (20-25ºC), observar diariamente . 
Las especies de Listeria  son móviles, dando un crecimiento típico en forma de paraguas. 
15.7.2.7  Prueba de utilización de carbohidratos 
Inocular tubos de caldo púrpura para fermentación d e carbohidratos al 0,5 %: dextrosa, esculina, malto sa, 
ramnosa, manitol y xilosa. Incubar 7 días a 35ºC. U na coloración amarilla indica una prueba positiva. Todas 
las especies de Listeria  dan positivas las pruebas para dextrosa, esculina y maltosa. Consultar el cuadro 1 
para reacciones con ramnosa, xilosa y manitol. Si l a pigmentación prematura del aislamiento en el medi o OXA 
no deja lugar a duda, el ensayo de esculina puede o mitirse. 
15.7.2.8  Prueba de Cristie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP) 
Para la prueba de CAMP se emplean las siguientes ce pas de colección de S. aureus  y R. equi:  
Staphylococcus aureus  Rhodococcus equi 
ATCC 49444 ATCC 6339 
NCTC 7428 NCTC 1621 
ATCC 25923 
CIP 5710 
Las cepas empleadas en la prueba de CAMP pueden obt enerse de diversas colecciones nacionales e 
internacionales. 
En una placa de agar sangre de carnero sembrar una estría de la cepa de S. aureus  y, paralelamente una 
de R. equi , separadas lo suficiente para que entre éstas se p uedan estriar perpendicularmente las cepas 
sospechosas de Listeria , sin que lleguen a tocarse (aproximadamente 5 mm d e separación). Después de 24 y 
48 h de incubación a 35° C observar el sinergismo en tre las hemolisinas de S. aureus , R. equi  y Listeria  que se 
manifiesta como una zona hemolítica más intensa. 
La figura 2 muestra la disposición de las estrías d e los cultivos en una placa para la prueba de CAMP.  La 
hemólisis de L. monocytogenes  y L. seeligeri  se incrementa cerca de la estría de S. aureus,  y la hemólisis de 
L. ivanovii  se aumenta cerca de la estría de R. equi . Las especies restantes no son hemolíticas en esta  
prueba. 
 
 
Prueba de CAMP para Listeria monocytogenes : 
Diseño de la inoculación en placas de agar sangre d e carnero. Las líneas horizontales representan las 
estrías de la inoculación de cinco cepas. Las línea s verticales representan las estrías de inoculación  de  S. 
aureus  (S) y R. equi  (R). Las líneas sombreadas indican el incremento d e hemólisis en esas regiones.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Cuadro 1. Diferenciación de las Especies de Listeria 
ESPECIES HEMOLITICO(BETA) A REDUCCION 
NITRATOS PRODUCCION DE 
ACIDOS CAMPO 
   M R X S.a R.e 
L. monocytogenes + - - + - + - 
L. ivanovii + - - - + - + 
L. innocua - - - bV - - - 
L. welshimeri - - - bV + - - 
L. seeligeri + - - - + +1 - 
L. grayic - bV + bV - - - 
a Sangre de carnero desfibrinada 
bV Variable 
L. grayi incluye ahora las cepas de la especie L. m urrayi reductoras de nitratos y ramnosa variable 
M Manitol 
R Ramnosa 
X Xilosa 
S.a Staphylococcus aureus  
R.e Rhodococcus equi  
15.7.3  Serología 
La determinación de los tipos serológicos de Listeria  se aplica cuando las consideraciones 
epidemiológicas sean cruciales. Inocular en caldo d e triptosa por 24 h a 35ºC. Transferir a dos tubos de agar 
inclinado de triptosa e incubar 24 h a 35ºC. Para r ealizar la prueba se pueden utilizar sueros comerci ales, 
siguiendo las instrucciones del fabricante. 
Cuadro 2. Serología de las especies de Listeria  
ESPECIES SEROTIPO 
L. monocytogenes 1/2A, 1/2B, 1/2C 
 3A, 3B, 3C 
 4A, 4AB, 4B 
 4C, 4D, 4E, "7" 
L. ivanovii 5 
L. innocua 4AB, 6A, 6B, Un a 
L. welshimeri 6A, 6B 
L. seeligeri 1/2B, 4C, 4D, 6B, Un a 
 
15.8  Expresión de resultados 
Comparar los resultados obtenidos con el cuadro 1 y  determinar el género y especie de las cepas 
aisladas. La correspondencia de resultados con el c uadro anterior indica la presencia del género Listeria.  
El único miembro del género Listeria de importancia para esta norma es Listeria monocytogenes. 
15.9  Informe de la prueba 
Cuando los resultados sean positivos para L. monocytogenes  informar la presencia en 25 g o 25 ml de 
muestra. Y si los resultados son negativos informar  ausencia en 25 g o 25 ml de muestra. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
16. De la estimación de la densidad microbiana por la técnica del número más probable. 
Determinación de bacterias coliformes , coliformes fecales y Escherichia coli por la técnica de 
diluciones en tubo múltiple. 
Este método es aplicable a cualquier grupo bacteria no de interés sanitario, especialmente en productos  
que se encuentran en bajas concentraciones de micro organismos (10 por gramo o ml). Ejemplo: Leche, agu a, 
alimentos; que por su consistencia pueden interferi r con la exactitud de la cuenta de Unidades Formado ras de 
Colonias (U.F.C.). 
16.1  Fundamento. 
Se basa en la dilución de la muestra en tubos múlti ples, de tal forma que todos los tubos de la menor 
dilución sean positivos y todos los tubos de la dil ución más alta sean negativos. El resultado positiv o se 
demuestra por la presencia de gas o crecimiento mic robiano. 
Para obtener el Número Más Probable (NMP) en los re sultados se aplica la teoría de la probabilidad, lo  
cual tiene como condición lo siguiente: 
- Una distribución aleatoria de las bacterias que e xisten en la muestra. 
- Las bacterias se encuentran como entidades no agr upadas. 
- Los microorganismos presentes en la muestra crece rán en el medio, cuando son incubados y se 
mantengan en las condiciones adecuadas para su desa rrollo. 
Si se espera una cuenta microbiana alta, la muestra  deberá diluirse para dar cumplimiento a las 
condiciones. La forma más común de realizar esta pr ueba es mediante diluciones decimales y usando un 
inóculo en series de 3, 5 o 10 tubos en serie. A me dida que el número de tubos inoculados para cada di lución 
aumentan se reducen los límites de confianza. 
16.2  Equipo, materiales y reactivos. 
No aplica. 
16.3  Procedimientos. 
16.3.1  Uso de tablas de NMP con 95% de límite de confianz a. 
Las tablas 1-3 presentan la estimación estadística de los valores del NMP que corresponden al 95% de 
límite de confianza cuando se utilizan 3, 5 y 10 tu bos. Otras combinaciones de resultados positivos y 
negativos no encontrados en estas tablas, tienen mu y baja probabilidad de que se presenten. Si los res ultados 
no están incluidos en las tablas, se deberá repetir  la prueba a partir de la muestra original. Si no e s posible, el 
NMP se puede obtener (para las combinaciones de 3 y  5 tubos) de las tablas 4 y 5; también se puede apl icar 
una ecuación (véase punto B.2) para obtener el NMP aproximado. 
El intervalo del 95% de confianza se interpreta com o sigue: si el analista supone que el número real d e 
microorganismos cae dentro de los límites, entonces  se asume que será correcto el 95% de las veces. El  valor 
del NMP tabulado representa un intervalo y no un va lor absoluto. 
Cuando se preparan más de 3 diluciones de una muest ra, el NMP deberá determinarse a partir de tres 
diluciones consecutivas (usando tablas 1-3). Primer o, para todas las diluciones que tengan todos los t ubos 
positivos, seleccionar la dilución mayor. Después u sar las 2 siguientes diluciones mayores (A y B en l as tablas 
6 y 7). Cuando en ninguna de las diluciones probada s hubiera crecimiento en todos los tubos, seleccion ar (si 
es posible) las primeras tres diluciones consecutiv as (volumen de muestra) para que la dilución media 
contenga resultados positivos (C de tablas 6 y 7). 
Con frecuencia es necesario el NMP desde el inicio con volúmenes diferentes de los enlistados en las 
tablas 1-5. Si el volumen de muestra es mayor que 0 ,01 g multiplicar el NMP enlistado en la tabla por 10. El 
resultado de una determinación de 5 tubos que dé 3 tubos positivos en 0,01 g; 2 tubos positivos en 0,0 01 g y 1 
tubo positivo en 0,0001 g (3-2-1) leer en la tabla No. 2 como 17 y multiplicar por 10 para así obtener  170 como 
el NMP actual por gramo de muestra. De igual forma si la cantidad más grande utilizada para la tabla d e 
referencia es 1 g en lugar de 0,1 g, dividir el NMP  derivado de la tabla entre 10. Por ejemplo el resu ltado de la 
determinación del NMP en 3 tubos para Salmonella spp  que dé 3 tubos positivos en 1 g; 1 tubo positivo en   
0,1 g y ningún positivo en 0,01 g (3-1-0) leer en l a tabla No. 1 como 43 y dividir entre 10, lo que da  4,3 como el 
NMP presuntivo por gramo de muestra.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Un método alternativo para obtener el número más pr obable es usando la siguiente fórmula: 
(NMP/g de la tabla - 100) X factor de dilución del tubo de enmedio = NMP/g 
Para calcular el NMP/100 g multiplicar por 100. 
16.3.2  Cálculo aproximado del NMP y 95% de límite de conf ianza. 
Debido a la inherente complejidad para calcular los  límites de confianza del NMP lo más común es el us o 
de tablas. Generalmente estas tablas están limitada s al uso de 3, 5 y 10 tubos por dilución, incluso u sando un 
método aceptado, pueden presentarse datos irregular es o accidentes de laboratorio que causan pérdida d e 1 
o más tubos de dilución. En este caso una serie de diluciones de por ejemplo: 5,4,4 puede dar una lect ura de 
5-2-0. Para estos casos se puede aplicar una fórmul a sencilla, la cual no corresponde exactamente con los 
resultados obtenidos teóricamente; sin embargo, las  desviaciones generalmente son pequeñas, esta fórmu la 
no debe ser aplicada para fines de regulación. La f órmula no restringe el número de tubos o las diluci ones y 
puede aplicarse para todo tipo de pruebas. El cálcu lo aproximado está dado por la siguiente ecuación: NMP/g 
= P/(N T )1/2  
Donde: P es el número de tubos positivos, N es la c antidad total de muestra (g) en todos los tubos 
negativos y T  es la cantidad total de muestra (g) en todos los t ubos. 
Por ejemplo, considerando que se tuvieran serie de diluciones al doble: 
MUESTRA (G) No. DE TUBOS No. DE TUBOS POSITIVOS 
8 
4 
2 
1 
0,5 
0,25 5 
5 
5 
5 
5 
5 5 
4 
2 
0 
1 
0 
 
El número de tubos positivos es: P = (5 + 4 + 2+ 1)  = 12; N  = (8x0) + (4x1) + (2x3) + (1x5) + (0,5x4) + 
(0,25x5) = 18,25; y T  = 5 (8+4+2+1+0,5+0,25) = 78,75 
NPM/g = 12/(18,25 x 78,75) 1/2  = 0,32/g o 32/100 g 
Los límites de confianza del 95% estimados, pueden obtenerse del antilogaritmo de base 10 con la 
siguiente ecuación: 
log (NMP/g) 1,08 (log a)/n)  1/2  
Donde: a es el radio de dilución y n es el número d e tubos por dilución. Esta expresión asume que el r adio 
de dilución es diferente de 1:10 (por ejemplo 1:2).  Para diluciones de 1:10, la cantidad por restar o sumar 
deberá ser de 1,14(n) ½ para la mejor estimación. Si el número de tubos por  dilución (n i) es desigual (por 
ejemplo: un accidente de laboratorio) para la diluc ión k reemplazar n por la expresión n H (media armónica) por 
el número de tubos por dilución (n i). 
La media armónica se define como: 
nH = k / (1/ n i) 
k es el número de diluciones. Por ejemplo: Suponien do que el resultado de 3 diluciones en n i fuera 5-4-4. 
Por lo tanto n H = 3/  (1/5) + (1/4) + (1/4)  ½  = 3/0,70 = 4,3 i 
Para el ejemplo anterior el NMP con n = 5 y un lími te de confianza aproximado de 95% será el siguiente : 
log 0,32 (1,08) (log 2)/5)  ½  
-0,495  0,265 
Entonces el límite inferior es el antilogaritmo (-0 -76) = 0.17/g o 17/100 g y el límite inferior es el  
antilogaritmo (-0,23) = 0,59/g o 59/100 g. Cuando s e compara con las tablas el NMP podría ser 0,31/g c on 
límites de confianza de 0,16/g y 0,57/g. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Tabla No. 1 Selección del NMP con un límite de conf ianza de 95% para  la prueba de fermentación 
utilizando 3 tubos: con porciones de 0 ,1, 0 ,01 y 0 ,001 g (ml) de muestra 
No. de tubos positivos    95% de límite de confianza  
0,1 0,01 0,001 NMP/g (ml) b Inferior Superior 
0 0 0 3 - - 
0 1 0 3+ 1 17 
1 0 0 4 1 21 
1 0 1 7+ 2 27 
1 1 0 7 2 28 
1 2 0 11+ 4 35 
2 0 0 9 2 38 
2 0 1 14+ 5 48 
2 1 0 15 5 50 
2 1 1 20+ 7 60 
2 2 0 21 8 62 
3 0 0 23 9 130 
3 0 1 39 10 180 
3 1 0 43 10 210 
3 1 1 75 20 280 
3 2 0 93 30 380 
3 2 1 150 50 500 
3 2 2 210+ 80 640 
3 3 0 240 90 1400 
3 3 1 460 100 2400 
3 3 2 1100 300 4800 
3 3 3 1100 - - 
a Los resultados normales, obtenidos en un 95% de las  pruebas no están seguidos por un símbolo más (+). Menos del 
4% de los resultados de las pruebas obtenidos están  marcados por un símbolo más (+). Combinaciones de tubos positivos 
no encontrados en esta tabla se presentan en menos del 1% de las pruebas y si se presentaran con mayor  frecuencia 
indican un error de técnica o que el valor del núme ro más probable se encuentra en el límite. El NMP d e combinaciones que 
no aparecen en la tabla, se puede obtener por extra polación a la combinación cercana más elevada. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (ml) por 100  para expresarlos como NMP/100 g (ml).       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Tabla No. 2 Selección del NMP con un límite de conf ianza de 95% para  la prueba de fermentación 
utilizando 5 tubos: con porciones de 0 ,1, 0 ,01 y 0 ,001 g (ml) de muestra a 
No. de tubos positivos    95% de límite de confianza  
0,1 0,01 0,001 NMP/g (ml) b Inferior Superior 
      
0 0 0 2 - - 
0 0 1 2+ 1 10 
0 1 0 2 1 10 
1 0 0 2 1 11 
1 0 1 4+ 1 15 
1 1 0 4 1 15 
1 2 0 6+ 2 18 
2 0 0 4 1 17 
2 0 1 7+ 2 20 
2 1 0 7 2 21 
2 1 1 9+ 3 25 
2 2 0 9 3 25 
3 0 0 8 3 24 
3 0 1 11 4 29 
3 1 0 11 4 30 
3 1 1 14+ 6 35 
3 2 0 14 6 35 
3 2 1 17+ 7 40 
3 3 0 17+ 7 41 
4 0 0 13 5 38 
4 0 1 17 7 45 
4 1 0 17 7 46 
4 1 1 21 9 55 
4 2 0 22 9 56 
4 2 1 26+ 12 65 
4 3 0 27 12 67 
4 3 1 33+ 15 77 
4 4 0 34+ 16 80 
5 0 0 23 9 68 
5 0 1 31 13 110 
5 1 0 33 14 120 
5 1 1 46 20 150 
5 1 2 63+ 22 180 
5 2 0 49 21 170 
5 2 1 70 30 210 
5 2 2 94+ 40 250 
5 3 0 79 30 250 
5 3 1 110 40 300 
5 3 2 140 60 360 
5 4 0 130 50 390 
5 4 1 170 70 480 
5 4 2 220 100 580 
5 4 3 280+ 120 690 
5 4 4 350+ 160 820 
5 5 0 240 100 940 
5 5 1 350 100 1300 
5 5 2 540 220 2000 
5 5 3 920 300 2900 
5 5 4 1600 600 5300 
5 5 5 1600 - - 
a Los resultados normales, obtenidos en un 95% de la s pruebas, no están seguidos por un símbolo más(+).  Menos del 
4% de los resultados de las pruebas obtenidos están  marcados por un símbolo más (+). Combinaciones de tubos positivos 
no encontrados en esta tabla se presentan en menos del 1% de las pruebas y si se presentaran con mayor  frecuencia 
indican un error de técnica o que el valor del núme ro más probable se encuentra en el límite. El NMP d e combinaciones que 
no aparecen en la tabla, se pueden obtener por extr apolación a la combinación cercana más elevada. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (ml) por 100  para expresarlos como NMP/100 g (ml). Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Tabla No. 3 Selección del NMP con un límite de conf ianza de 95% para  la prueba de fermentación 
utilizando 10 tubos: con porciones de 0 ,1, 0 ,01 y 0 ,001 g (ml) de muestra a 
No. de tubos positivos    95% de límite de confianza  
0,1 0,01 0,001 NMP/g (ml) b Inferior Superior 
0 0 0 1 - - 
0 0 1 1+ 1 5 
0 1 0 1 1 5 
0 2 0 2+ 1 7 
1 0 0 1 1 5 
1 0 1 2+ 1 7 
1 1 0 2 1 7 
1 2 0 3+ 1 8 
2 0 0 2 1 7 
2 0 1 3+ 1 9 
2 1 0 3 1 9 
2 1 1 4+ 1 10 
2 2 0 4 2 10 
2 3 0 5+ 2 12 
3 0 0 3 1 9 
3 0 1 4 2 11 
3 1 0 4 2 11 
3 1 1 5+ 2 13 
3 2 0 5 2 13 
3 2 1 6+ 3 14 
3 3 0 6+ 3 14 
4 0 0 4 2 12 
4 0 1 6 2 13 
4 1 0 6 2 14 
4 1 1 7 3 15 
4 2 0 7 3 15 
4 2 1 8 4 17 
4 3 0 8 4 17 
4 4 0 9+ 5 19 
5 0 0 6 2 15 
5 0 1 7 3 16 
5 1 0 7 3 17 
5 1 1 9 4 18 
5 2 0 9 4 18 
5 2 1 10+ 5 20 
5 3 0 10 5 20 
5 3 1 11+ 6 22 
5 4 0 11+ 6 22 
6 0 0 8 3 18 
6 0 1 9 4 20 
6 1 0 9 4 20 
6 1 1 11 5 22 
6 2 0 11 5 22 
6 2 1 12 6 24 
6 3 0 12 6 25 
6 3 1 14+ 7 27 
6 4 0 14+ 7 27 
6 5 0 15+ 8 29 
7 0 0 10 5 22 
7 0 1 12 6 24 
7 0 2 13+ 7 27       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
7 1 0 12 6 25 
7 1 1 13 7 27 
7 1 2 15+ 8 30 
7 2 0 13 7 27 
7 2 1 15 8 30 
7 2 2 17+ 9 32 
7 3 0 15 8 30 
7 3 1 17 9 33 
7 4 0 17 9 33 
7 4 1 19+ 10 36 
7 5 0 19+ 10 36 
8 0 0 13 6 28 
8 0 1 15 7 31 
8 0 2 17+ 8 34 
8 1 0 15 7 31 
8 1 1 17 9 34 
8 1 2 19+ 10 37 
8 2 0 17 9 35 
8 2 1 19 10 38 
8 2 2 21+ 12 42 
8 3 0 19 10 39 
8 3 1 21 12 42 
8 3 2 24+ 13 46 
8 4 0 22 12 43 
8 4 1 24 13 46 
8 5 0 24 13 47 
8 5 1 27+ 15 51 
8 6 0 27+ 15 52 
9 0 0 17 8 37 
9 0 1 19 10 41 
9 0 2 22+ 11 46 
9 1 0 19 10 42 
9 1 1 22 11 47 
9 1 2 25+ 13 52 
9 2 0 22 12 47 
9 2 1 25 13 53 
9 2 2 28+ 15 58 
9 3 0 25 13 54 
9 3 1 29 15 60 
9 3 2 32+ 18 66 
9 4 0 29 16 61 
9 4 1 33 18 67 
9 4 2 37+ 20 74 
9 5 0 33 18 69 
9 5 1 37 20 76 
9 5 2 42+ 23 83 
9 6 0 38 21 77 
9 6 1 43+ 24 85 
9 7 0 44+ 24 87 
10 0 0 23 12 58 
10 0 1 27 14 67 
10 0 2 31+ 16 77 
10 1 0 27 14 69 
10 1 1 32 17 79 
10 1 2 38 20 92 Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
10 2 0 33 17 83 
10 2 1 39 20 96 
10 2 2 50 20 110 
10 2 3 50+ 30 120 
10 3 0 40 20 100 
10 3 1 50 20 120 
10 3 2 60+ 30 130 
10 3 3 70+ 30 150 
10 4 0 50 30 120 
10 4 1 60 30 140 
10 4 2 70 30 160 
10 4 3 80+ 40 170 
10 5 0 60 30 150 
10 5 1 70 40 170 
10 5 2 90 40 190 
10 5 3 100 50 210 
10 6 0 80 40 180 
10 6 1 90 50 200 
10 6 2 110 50 230 
10 6 3 120 60 250 
10 6 4 140+ 70 270 
10 7 0 100 50 220 
10 7 1 120 60 250 
10 7 2 140 70 280 
10 7 3 150 80 310 
10 7 4 170+ 90 340 
10 8 0 130 60 280 
10 8 1 150 80 320 
10 8 2 170 90 360 
10 8 3 200 100 400 
10 8 4 220 120 440 
10 8 5 250+ 140 480 
10 9 0 170 90 380 
10 9 1 200 100 430 
10 9 2 230 120 490 
10 9 3 260 140 560 
10 9 4 300 160 640 
10 9 5 350 180 720 
10 9 6 400+ 210 820 
10 10 0 240 120 610 
10 10 1 290 150 750 
10 10 2 350 170 910 
10 10 3 400 200 1100 
10 10 4 500 300 1400 
10 10 5 700 300 1700 
10 10 6 900 400 2100 
10 10 7 1120 600 2700 
10 10 8 1160 800 3700 
10 10 9 2300 1100 6000 
10 10 10 2300 - - 
a Los resultados normales, obtenidos en un 95% de las  pruebas, no están seguidos por un símbolo más (+).  Menos del 
4% de los resultados de las pruebas obtenidos están  marcados por un símbolo más(+). Combinaciones de t ubos positivos 
no encontrados en esta tabla se presentan en menos del 1% de las pruebas y si se presentaran con mayor  frecuencia 
indican un error de técnica o que el valor del núme ro más probable se encuentra en el límite. El NMP d e combinaciones que 
no aparecen en la tabla, se pueden obtener por extr apolación a la combinación cercana más elevada. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (ml) por 100  para expresarlos como NMP/100 g (ml).       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Tabla No. 4 Número más probable (NMP) para 1g de mu estra cuando se usan 3 tubos con porciones de 
0,1, 0 ,01 y 0 ,001g 
Tubos Positivos  Tubos Positivos  Tubos Positivos  Tubos Positivos   
0,1  0,01  0,001  NMP  0,1  0,01  0,001  NMP  0,1 0,01  0,001  NMP 0,1 0,01  0,001  NMP 
0 0 0 3 1 0 0 3,6 2 0 0 9,1 3 0 0 23 
0 0 1 3 1 0 1 7,2 2 0 1 14 3 0 1 39 
0 0 2 6 1 0 2 11 2 0 2 20 3 0 2 64 
0 0 3 9 1 0 3 15 2 0 3 26 3 0 3 95 
0 1 0 3 1 1 0 7,3 2 1 0 15 3 1 0 43 
0 1 1 6,1 1 1 1 11 2 1 1 20 3 1 1 75 
0 1 2 9,2 1 1 2 15 2 1 2 27 3 1 2 120 
0 1 3 12 1 1 3 19 2 1 3 34 3 1 3 160 
0 2 0 6,2 1 2 0 11 2 2 0 21 3 2 0 93 
0 2 1 9,3 1 2 1 15 2 2 1 28 3 2 1 150 
0 2 2 12 1 2 2 20 2 2 2 35 3 2 2 210 
0 2 3 16 1 2 3 24 2 2 3 42 3 2 3 290 
0 3 0 9,4 1 3 0 16 2 3 0 29 3 3 0 240 
0 3 1 13 1 3 1 20 2 3 1 36 3 3 1 460 
0 3 2 16 1 3 2 24 2 3 2 44 3 3 2 1100 
0 3 3 19 1 3 3 29 2 3 3 53 3 3 3 1100 
 
Tabla No. 5 Número más probable (NMP) para 100 ml d e muestra cuando se usan 5 porciones en cada 
una de 3 diluciones con series geométricas 
No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos 
10 1 0,1 10 1 0,1 10 1 0,1 10 1 0,1 10 1 0,1 10 1 0 ,1 
ml  ml ml N 
M 
P ml  ml ml N 
M 
P ml  ml ml N 
M 
P ml  ml ml N 
M 
P ml ml ml N 
M 
P ml  ml ml N M  
P 
0 0 0   1 0 0 2 2 0 0 4,5  3 0 0 7,8  4 0 0 13 5 0 0 23 
0 0 1 1,8  1 0 1 4 2 0 1 6,8  3 0 1 11 4 0 1 17 5 0 1 31 
0 0 2 3,6  1 0 2 6 2 0 2 9,1  3 0 2 13 4 0 2 21 5 0 2 43 
0 0 3 5,4  1 0 3 8 2 0 3 12 3 0 3 16 4 0 3 25 5 0 3 58 
0 0 4 7,2  1 0 4 10 2 0 4 14 3 0 4 20 4 0 4 30 5 0 4 76 
0 0 5 9,0  1 0 5 12 2 0 5 16 3 0 5 23 4 0 5 36 5 0 5 95 
0 1 0 1,8  1 1 0 4 2 1 0 6,8  3 1 0 11 4 1 0 17 5 1 0 33 
0 1 1 3,6  1 1 1 6,1  2 1 1 9,2  3 1 1 14 4 1 1 21 5 1 1 46 
0 1 2 5,5  1 1 2 8,1  2 1 2 12 3 1 2 17 4 1 2 26 5 1 2 64 
0 1 3 7,3  1 1 3 10 2 1 3 14 3 1 3 20 4 1 3 31 5 1 3 84 
0 1 4 9,1  1 1 4 12 2 1 4 17 3 1 4 23 4 1 4 35 5 1 4 110 
0 1 5 11 1 1 5 14 2 1 5 19 3 1 5 27 4 1 5 42 5 1 5 130 Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
0 2 0 3,7  1 2 0 6,1  2 2 0 9,3  3 2 0 14 4 2 0 22 5 2 0 49 
0 2 1 5,5  1 2 1 8,2  2 2 1 12 3 2 1 17 4 2 1 26 5 2 1 70 
0 2 2 7,4  1 2 2 10 2 2 2 14 3 2 2 20 4 2 2 32 5 2 2 95 
0 2 3 9,2  1 2 3 12 2 2 3 17 3 2 3 24 4 2 3 38 5 2 3 120 
0 2 4 11 1 2 4 15 2 2 4 19 3 2 4 27 4 2 4 44 5 2 4 150 
0 2 5 13 1 2 5 17 2 2 5 22 3 2 5 31 4 2 5 50 5 2 5 180 
0 3 0 5,6  1 3 0 8,3  2 3 0 12 3 3 0 17 4 3 0 27 5 3 0 79 
0 3 1 7,4  1 3 1 10 2 3 1 14 3 3 1 21 4 3 1 33 5 3 1 110 
0 3 2 9,3  1 3 2 13 2 3 2 17 3 3 2 24 4 3 2 39 5 3 2 140 
0 3 3 11 1 3 3 15 2 3 3 20 3 3 3 28 4 3 3 45 5 3 3 180 
0 3 4 13 1 3 4 17 2 3 4 22 3 3 4 31 4 3 4 52 5 3 4 210 
0 3 5 15 1 3 5 19 2 3 5 25 3 3 5 35 4 3 5 59 5 3 5 250 
0 4 0 7,5  1 4 0 11 2 4 0 15 3 4 0 21 4 4 0 34 5 4 0 130 
0 4 1 9,4  1 4 1 13 2 4 1 17 3 4 1 24 4 4 1 40 5 4 1 170 
0 4 2 11 1 4 2 15 2 4 2 20 3 4 2 28 4 4 2 47 5 4 2 220 
0 4 3 13 1 4 3 17 2 4 3 23 3 4 3 32 4 4 3 54 5 4 3 280 
0 4 4 15 1 4 4 19 2 4 4 25 3 4 4 36 4 4 4 62 5 4 4 350 
0 4 5 17 1 4 5 22 2 4 5 28 3 4 5 40 4 4 5 69 5 4 5 430 
0 5 0 9,4  1 5 0 13 2 5 0 17 3 5 0 25 4 5 0 41 5 5 0 240 
0 5 1 11 1 5 1 15 2 5 1 20 3 5 1 29 4 5 1 48 5 5 1 350 
0 5 2 13 1 5 2 17 2 5 2 23 3 5 2 32 4 5 2 56 5 5 2 540 
0 5 3 15 1 5 3 19 2 5 3 26 3 5 3 37 4 5 3 64 5 5 3 920 
0 5 4 17 1 5 4 22 2 5 4 29 3 5 4 41 4 5 4 72 5 5 4 1600  
0 5 5 19 1 5 5 24 2 5 5 32 3 5 5 45 4 5 5 81         
 
Tabla No. 6 Ejemplos para determinar el NMP estimad o en series de tres tubos con 1g (ml) de muestra 
por tubo 
  Cantidad de muestra (g o ml) a Valores positivos 
reportados NMP estimado/g o ml b 
Ejemplo 0,10 ,001 0,001 0,0001 0,00001    
A 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3 3-2-0 930 
B 3/3 3/3 3/3 2/3 0/3 3-2-0 9300 
C 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3 0-1-0 30 
D 3/3 3/3 2/3 1/3 1/3 3-2-2 2100 
E 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3-3-3 110000 
                
a Numerador/denominador = número de tubos positivos/n úmero de tubos inoculados. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (ml) por 100  para expresarlos como NMP/100 g (ml).       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Tabla No. 7 Ejemplos para determinar el NMP estimad o en series de 5 tubos con 1 g (ml) de muestra 
por tubo 
  Cantidad de muestra (g o ml) a Valores 
positivos  NMP estimado/g o ml b 
Ejemplo 0,1, 0,01 0,001 0,0001 0,00001 reportados   
A 5/5 5/5 2/5 0/5 0/5 5-2-0 490 
B 5/5 5/5 5/5 2/5 0/5 5-2-0 4900 
C 0/5 0/5 1/5 0/5 0/5 0-1-0 20 
D 5/5 5/5 3/5 1/5 1/5 5-2-2 1400 
E 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5-5-5 160000 
a 
Numerador/denominador = número de tubos positivos/n úmero de tubos inoculados. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (ml) por 100  para expresarlos como NMP/100 g (ml). 
16.3.3  Determinación de bacterias coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli  por la técnica de 
diluciones en tubo múltiple. 
16.3.3.1  Fundamento 
Este método se basa en la propiedad de los microorg anismos coliformes para producir gas a partir de 
glucosa y fermentación de lactosa dentro de las 48 horas de incubación a 35 0,5° C (coliformes) y 44,50 ,2° C 
(coliformes fecales y E. coli ). 
16.3.3.2  Equipo y materiales 
/square4 Además de los mencionados en el método Preparación  y dilución de muestras de alimentos para 
análisis microbiológico, lo siguiente: 
/square4 Baño de agua con agitación continua cubierto y con  termostato que evite variaciones mayores a 
0,1° C. 
/square4 Termómetro calibrado y verificado 1/10 
/square4 Tubos de cultivo de 20x200 y de 16x160 mm con tapó n de rosca 
/square4 Campanas de fermentación (tubos de Durham) 
/square4 Gradillas 
/square4 Asas bacteriológicas de 3 mm de diámetro 
/square4 Lámpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 w atts. 
/square4 Lentes protectores. 
/square4 Medios de cultivo 
Caldo lauril 
Ingredientes: 
Bacto triptosa 20,0 g 
Bacto lactosa 5,0 g 
Fosfato potásico, 
dibásico 2,75 g 
Fosfato potásico, 
monobásico 2,75 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Lauril sulfato de sodio 0,1 g 
Agua destilada 1000,0 ml 
pH final: 6,8 0,2 a 25° C. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Preparación:  Disolver los ingredientes en un litro de agua dest ilada. Ajustar el pH. Distribuir en tubos de 
ensaye con campanas de Durham. Adicionar 10 ml de m edio para cada tubo. Esterilizar en autoclave duran te 
15 minutos a 121° C. Antes de abrir el autoclave, de jar bajar la temperatura a 75° C para que no queden 
burbujas en las campanas de Durham. 
Preparación de caldo lauril triptosa 
INOCULO 
(ml) CANTIDAD DE MEDIO 
POR TUBO (ml) VOLUMEN DE MEDIO 
MAS INOCULO (ml) CALDO LAURIL TRIPTOSA 
REQUERIDO g/L 
1 10 o más 11 o más 35,6 
10 10 20 71,2 
10 20 30 53,4 
20 10 30 106,8 
100 50 150 106,8 
100 35 135 137,1 
100 20 120 213,6 
 
Caldo EC ( E. coli .) 
Ingredientes:   
Bacto triptosa 20,0 g 
Bacto lactosa 5,0 g 
Bacto sales biliares No. 3 1,5 g 
Fosfato dipotásico 4,0 g 
Fosfato monopotásico 1,5 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Agua destilada 1000,0 ml 
 pH final: 6,9 0,2 a 25° C. 
Preparación:  Disolver los ingredientes en un litro de agua dest ilada y calentar ligeramente para que se 
disuelva por completo. Ajustar el pH. Distribuir en  tubos de ensaye con campanas de Durham. Adicionar 10 ml 
de medio para cada tubo. Esterilizar en autoclave d urante 15 minutos a 121° C. Antes de abrir el autocl ave, 
dejar bajar la temperatura a 75° C para evitar que q ueden burbujas en las campanas de Durham. 
Agar McConkey 
Ingredientes:    
Proteasa peptona o polipeptona  3,0 g 
Peptona o gelizante 17,0 g 
Lactosa 10,0 g 
Sales biliares No. 3 1,5 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Rojo neutro 0,03 g 
Cristal violeta 0,001 g 
Agar 13,5 g 
Agua destilada 1000,0 ml 
pH final: 7,1 0,2 a 25° C 
Preparación:  Disolver los ingredientes en un litro de agua dest ilada. Calentar hasta ebullición para 
disolver por completo. Ajustar el pH. Esterilizar a  121° C durante 15 minutos. Enfriar a 50-60° C y vaci ar en 
cajas Petri.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Agar eosina azul de metileno de Levin (EMB-L) 
Ingredientes:   
Peptona 10,0 g 
Lactosa 10,0 g 
K2HPO 4 2,0 g 
Eosina Y 0,4 g 
Azul de metileno 0,065 g 
Agua destilada 1000 ml 
pH final: 7,1 0,2 
Preparación:  Disolver la peptona, el fosfato y el agar en un li tro de agua. Calentar hasta ebullición para la 
disolución completa. Distribuir en porciones de 100  o 200 ml y esterilizar a no más de 121° C por 15 mi nutos. 
Fundir antes de su uso y adicionar a cada porción d e 100 ml. 
a)  5 ml de solución de lactosa al 20% 
b)  2 ml de solución acuosa de eosina al 2% 
c)  4,3 ml de solución acuosa de azul de metileno al 0 ,15%. 
Cuando se use el producto deshidratado, disolver to dos los ingredientes de acuerdo con las instruccion es 
del fabricante. 
Caldo triptona al 1% (triptofano) 
Ingredientes:   
Triptona o tripticasa 10 g 
Agua destilada 1000 ml 
pH final: 6,9 0,2 
Preparación:  Disolver los ingredientes. Distribuir en porciones  de 5 ml en tubos de ensaye de 16 x 125 o 
16 x 150 mm. Esterilizar a 121° C por 15 minutos. 
Caldo MR-VP 
Medio 1 
Ingredientes:  
Peptona tamponada 7 g 
Glucosa 5 g 
K2HPO 4 5 g 
Agua destilada 1000 ml 
pH final: 6,9 0,2 
Preparación:  Disolver los ingredientes con calentamiento suave si es necesario. Distribuir en volúmenes 
de 10 ml en tubos de ensaye de 16x150 mm. Esteriliz ar a 121° C por 15 minutos. 
Caldo citrato de Koser 
Ingredientes:  
NaNH 4HPO 4 •4H 2O 1,5 g 
KH 2PO 4 (monobásico) 1,0 g 
MgSO 4 •7H 2O 0,2 g 
Citrato de sodio •2H 2O 3,0 g 
Agua destilada 1000 ml 
pH final: 6,7 0,2. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Preparación:  Distribuir preferentemente en tubos de ensaye con tapa de rosca. Esterilizar a 121° C por 15 
minutos. Esta formulación se recomienda en los Méto dos de Análisis Oficial de AOAC y en los Métodos 
Estándares para el Análisis de Agua y Aguas de Dese cho (APHA). Este difiere de la composición del medi o 
deshidratado disponible comercialmente y es recomen dable su uso. 
Reactivos 
Reactivo de Kovacs 
Ingredientes:   
p-imetilaminobenzaldehído 5 g 
Alcohol amílico (normal) 75 ml 
HCI concentrado 25 ml 
 
Preparación:  Disolver el p-Dimetilaminobenzaldehído en alcohol amílico normal. Adicionar lentamente el 
HCl. Almacenar a 4° C. 
Para la prueba de indol 
1. Adicionar 0,2-0,3 ml del reactivo a 5 ml del cul tivo de bacteria en caldo triptona. 
Se considera una prueba positiva cuando desarrolla un color rojo en la superficie del tubo. 
Reactivo de Voges-Proskauer (VP) 
Solución 1 
Ingredientes:   
alfa-naftol 5 g 
Alcohol absoluto 100 g 
 
Solución 2 
Ingredientes:    
Hidróxido de potasio  40 g 
Agua destilada para llevar a 
100 ml 
 
Prueba de Voges-Proskauer (VP). 
1.  Transferir 1 ml del cultivo a probar con 48 horas de incubación a un tubo de ensaye. 
2.  Adicionar 0,6 ml de la solución 1 y 0,2 ml de la s olución 2. 
3.  Agitar después de la adición de cada solución. 
4.  Para intensificar y acelerar la reacción adicionar  unos cuantos cristales de creatina y mezclar. 
5.  Dejar a temperatura ambiente. 
6.  Leer resultados después de 4 horas de adicionar lo s reactivos. 
El desarrollo de una coloración rosa es una prueba positiva. 
Reactivos para la coloración de Gram 
Cristal violeta 
Solución A 
Cristal violeta (colorante 90%) 2 g 
Etanol 95% 20 ml       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Solución B 
Oxalato de amonio 0,8 g 
Agua destilada 80 ml 
 
Indicador rojo de metilo (R44) 
1.  Mezclar la solución A y B. Almacenar por 24 horas 
2.  Filtrar a través de un papel filtro áspero. 
lodo de Gram 
Ingredientes:    
lodo 1 g 
Ioduro de potasio (Kl) 2 g 
Agua destilada 300 ml 
 
1.  Colocar el Kl en un mortero. 
2.  Adicionar el yodo. 
3.  Triturar con el pistilo por 5-10 segundos. 
4. Adicionar 1 ml de agua y triturar. 
5.  Adicionar 5 ml de agua y triturar. 
6. Adicionar 10 ml de agua y triturar. 
7.  Vaciar esta solución en una botella de reactivo. 
8.  Enjuagar el mortero y el pistilo con la cantidad d e agua necesaria para completar 300 ml. 
Colorante de contraste (solución concentrada)  
Ingredientes:    
Safranina O 2,5 g 
Etanol al 95% 100 ml 
 
Solución de trabajo: Adicionar 10 ml de la solución  concentrada a 90 ml de agua destilada. 
Procedimiento para la tinción de Gram 
1.  Fijar con calor moderado los frotis de la muestra a teñir. 
2.  Adicionar la solución de cristal violeta al frotis . 
3.  Dejar actuar por un minuto. 
4.  Lavar con agua corriente y escurrir. 
5.  Aplicar la solución de yodo por un minuto. 
6.  Lavar con agua corriente y escurrir. 
7.  Decolorar con etanol al 95% hasta que la coloració n azul deje de fluir (aproximadamente 30 segundos).  
8.  Inmediatamente después enjuagar con agua corriente . 
9.  Escurrir. 
10.  Aplicar el colorante de contraste (safranina) por 30 segundos. 
11.  Enjuagar, escurrir y secar al aire. Examinar al mi croscopio. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Medio EC-MUG 
Preparar el caldo EC y adicionar 50 mg de 4-metilum belliferyl-beta-D-glucurónido (MUG) por litro antes  de 
esterilizar (121° C por 15 minutos). El caldo EC-MUG  está comercialmente disponible. 
16.3.3.3  Procedimiento 
16.3.3.3.1  Alimentos 
16.3.3.3.1.1  Prueba presuntiva. 
16.3.3.3.1.1.1  Preparar la muestra como se indica en el método Pr eparación y dilución de muestras de 
alimentos para análisis microbiológico; y de acuerd o con el tipo de producto, utilizar las diluciones apropiadas, 
según se indica en el procedimiento de la densidad microbiana por la técnica del número más probable. 
Utilizar como medio de enriquecimiento caldo lauril  triptosa y continuar como en el punto 16.3.3.3.1.1 .2. 
16.3.3.3.1.2  Prueba confirmativa. Continuar como en el punto 16 .3.3.3.1.2 
16.3.3.3.3  Prueba confirmatoria. 
Confirmar la presencia de Escherichia coli  en por lo menos el 10% de las pruebas con resultad os positivos 
a coliformes fecales por cultivo en placas de agar McConkey a partir de los tubos que demostraron la 
presencia de gas en la prueba confirmativa. Incubar  las placas a 35±0,5° C durante 24±2 horas, observar  las 
colonias típicas fermentadoras de color rojo rodead as de un halo opaco de precipitación de sales bilia res. 
Seleccionar 1 o más colonias aisladas y pasar a tub os de fermentación con caldo lauril triptosa, conti nuar 
como se indica en el punto 16.3.3.3.1.1 Hacer tinci ón de Gram para observación de la morfología de  la s 
colonias. 
16.3.3.3.3.1  Interpretación de resultados. 
La formación de gas en el tubo de fermentación secu ndario dentro de las 48±3 horas y la demostración d e 
bacilos Gram (-) no esporulados confirma un resulta do positivo de la prueba demostrándose la presencia  del 
grupo coliforme. 
16.3.3.3.4  Cálculos 
Calcular la densidad microbiana en número más proba ble conforme al procedimiento señalado 
anteriormente, para estimar la población de bacteri as coliformes y bacterias coliformes fecales de acu erdo con 
las diluciones empleadas y expresar en NMP/g o ml p ara alimentos y NMP/100 ml para agua. En el caso de  
usar volúmenes de 20 ml de muestras de agua en 5 tu bos o 10 ml de muestras de agua en 10 tubos, utiliz ar 
las siguientes tablas: 
TABLA 1. Indice del NMP con 95% de límite de confia nza para varias combinaciones de resultados 
positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con 20  ml de muestra de agua o hielo. 
95% DE LIMITE DE CONFIANZA 
(APROXIMADO) No. DE TUBOS 
POSITIVOS NMP/100 ML 
Inferior Superior 
0 1,1 0 3,0 
1 1,1 0,05 6,3 
2 2,6 0,3 9,6 
3 4,6 0,8 14,7 
4 8,0 1,7 26,4 
5 8,0 4,0 Infinito       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
TABLA 2. Indice del NMP con 95% de límite de confia nza para varias combinaciones de resultados 
positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con 1 0 ml de muestra de agua o hielo. 
95% de Límite de Confianza 
(aproximado) No. de Tubos 
Positivos NMP/100 ml 
Inferior Superior 
0 1,1 0,0 3,0 
1 1,1 0,03 5,9 
2 2,2 0,26 8,1 
3 3,6 0,69 10,6 
4 5,1 1,3 13,4 
5 6,9 2,1 16,8 
6 9,2 3,1 21,1 
7 12,0 4,3 27,1 
8 16,1 5,9 36,8 
9 23,0 8,1 59,5 
10 23,0 13,5 Infinito 
 
17. Preparación de la muestra para la determinación  de Vibrio cholerae. 
Las submuestras de pescado ahumado en filete deben analizarse individualmente. 
17.1  Incubación de las muestras a 35-37° C. 
De cada submuestra tomar 25 g, cortar en piezas peq ueñas e introducirlas en un vaso de licuadora de 50 0 
ml de capacidad que contenga 225 ml de agua peptona da alcalina (APW) y homogeneizar por 2 min a la 
máxima velocidad. Esta es la dilución 1:10. De esta  dilución preparar la dilución 1:100 y 1:1000, en 9  o 90 ml 
de agua peptonada alcalina. 
Incubar las tres diluciones de 35 a 37° C. 
17.2  Incubación de las muestras de 35-37° C y 42° C. 
Si se van a incubar los enriquecimientos a dos temp eraturas para una muestra, homogeneizar una porción  
de 50 g de cada submuestra en 450 ml de agua pepton ada alcalina (APW). Esto hace la dilución 1:10. Ver ter 
250 ml (g) de la dilución 1:10 a un segundo recipie nte estéril. Prepare dos series de diluciones de 1: 100 y 
1:1000. Por lo tanto tenemos dos series de 3 diluci ones. Incubar una serie de 35 a 37° C y la otra a 42 ° C. 
Proseguir con el paso de resiembra marcado en la NO M-031-SSA1-1993, Productos de la pesca. Moluscos 
bivalvos frescos-refrigerados y congelados. Especif icaciones sanitarias. 
18. Técnicas y procedimientos para la investigación  de Vibrio cholerae  
18.1  Material y equipo 
/square4 Licuadora y vasos de licuadora estériles. 
/square4 Frascos de vidrio de boca ancha tipo tarro de 500 ml de capacidad con tapa de rosca. 
/square4 Varilla de vidrio de 3 mm de diámetro y 20 cm de l argo, con un doblez terminal en ángulo recto de 4 
cm. 
/square4 Balanza granataria de 2000 g de capacidad y 0,2 g de sensibilidad. 
/square4 Balanza analítica de 120 g de capacidad y 5 mg de sensibilidad. 
/square4 Incubadoras de 39-40° C. 
/square4 Baño de agua de 42 ± 0,2° C y 35-37° C. 
/square4 Cucharas estériles u otros instrumentos apropiados  para transferir muestras de alimentos. 
/square4 Cajas Petri estériles de 15 x 100 mm de plástico. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
/square4 Pipetas estériles de 1 ml con graduación de 0,01 m l, de 5 y 10 ml con graduación de 0,1 ml. 
/square4 Asas bacteriológicas de 3 mm de diámetro de nicrom el o platino. 
/square4 Tubos de cultivo o de ensayo de 16 x 150 mm y 20 x  150 mm. 
/square4 Tubos para bioquímicas o ensaye de 10 x 75 mm o 13  x 100 mm. 
/square4 Tijeras y pinzas estériles. 
/square4 Lámpara (para observar reacciones serológicas). 
/square4 Mecheros. 
/square4 Papel pH (rango 1-14) con un máximo de graduación de 0,4 unidades de pH por cambio de color. 
/square4 Potenciómetro. 
/square4 Bolsas de polietileno de 28 x 37 cm con tapa resel lable. 
/square4 Aparato de filtración y membranas de 0,45 micras. 
18.1.1  Medios de cultivo 
Agua Peptonada Alcalina (APW) 
FORMULA 
Peptona 10 g 
Cloruro de Sodio 10 g 
Agua destilada 1 000 ml 
 
Disolver los ingredientes. Ajustar el pH de tal for ma que después de esterilizar éste sea de 8,5 ± 0,2 . 
Esterilizar en autoclave 10 minutos a 121° C. 
Agar Tiosulfato , Citrato , Sales Biliares y Sacarosa (TCBS) 
FORMULA 
Extracto de levadura 5 g 
Proteosa peptona 10 g 
Sacarosa 20 g 
Tiosulfato de sodio.5H 2O 10 g 
Citrato de sodio.2H 2O 10 g 
Sales biliares 3 g 
Bilis de buey 5 g 
Cloruro de sodio 10 g 
Citrato férrico 1 g 
Azul de bromotimol 40 mg 
Azul de timol 40 mg 
Agar 15 g 
Agua destilada 1 000 ml 
 
Preparar en un matraz por lo menos tres veces más g rande que el volumen requerido de medio. Adicionar 
los ingredientes en agua destilada tibia y calentar  con agitación constante hasta ebullición e inmedia tamente 
retirar del calor. No esterilizar. Enfriar a 50° C y  colocar en cajas de Petri. Dejar secar las placas de 37-45° C 
antes de usar.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Agar modificado con Celobiosa , Polimixina B y Colistina (mCPC) 
SOLUCION 1 FORMULA 
Peptona 10 g 
Extracto de carne 5 g 
Cloruro de sodio 20 g 
Solución Stock de colorante  1 
000 1 ml 
Agar 15 g 
Agua destilada 900 ml  
 
Ajustar el pH a 7,6. Hierva hasta que se disuelva e l Agar. Esterilizar por autoclave 15 minutos a 121° C. 
Enfríe de 48-55° C. 
SOLUCION STOCK DE COLORANTES 1 000 X: 
FORMULA 
Azul de Bromotimol 4 g 
Rojo de cresol 4 g 
Etanol al 95% 100 ml 
 
Para obtener un color firme del medio usar una solu ción colorante stock en lugar de estar pesando 
repetidamente los colores en polvo. Disuelva el col orante en etanol hasta obtener una solución al 4% 
(peso/volumen). Agregue 1 ml de esta solución a cad a litro de agar mCPC, la cual tendrá al final 40 mg  de 
Azul de Bromotimol y 40 mg de Rojo Cresol por litro . 
SOLUCION 2: FORMULA 
Celobiosa 10 g 
Colistina 400 000 Ul 
Polimixina B 100 000 UI 
Agua destilada 100 ml 
 
Disuelva la celobiosa por calentamiento en agua des tilada. Enfríe y agregue los antibióticos. Esterili ce por 
filtración, agregue la solución 2 a la solución 1 m ezcle y distribuya en cajas Petri. 
Agar T 1N1 (Agar Triptona y Sal) 
FORMULA 
Triptona o tripticasa  10 g 
Cloruro de sodio 10 g 
Agar 20 g 
Agua destilada 1 000 ml 
 
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolución  del agar, si lo desea inclinado, distribuya en tub os. 
Esterilice en autoclave 15 minutos a 121° C. Deje so lidificar los tubos inclinados, para placas enfríe el medio 
de 45-50° C y distribuya en cajas Petri estériles. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Agar Gelatina (GA) 
FORMULA 
Peptona 4 g 
Extracto de levadura 1 g 
Gelatina 15 g 
Agar 15 g 
Agua destilada 1 000 ml 
 
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolución  de la gelatina y el agar, ajuste el pH a 7,2 ± 0.2 . 
Esterilice en autoclave 15 minutos a 121° C. Enfríe de 45-50° C y distribuya en cajas Petri estériles. 
Agar Gelatina con Sal (GS) 
Preparar agar gelatina (GA), pero adicionando 30 g de Cloruro de Sodio por cada litro. Suspenda los 
ingredientes y hierva hasta disolver la gelatina y el agar. Ajuste el pH de 7,2 ± 0,2. Esterilice en a utoclave 15 
minutos a 121° C. Enfríe de 45-50° C, coloque en caja s Petri. Si es necesario para inhibir la diseminaci ón de 
Vibrio spp  tal como V. alginolyticus , use de 25-30 g de agar por litro. 
Caldo Glucosa de Hugh-Leifson 
FORMULA 
Peptona 2 g 
Extracto de levadura 0,5 g 
Cloruro de Sodio 20 g 
Dextrosa 10 g 
Púrpura de Bromocresol 0,015 g 
Agar 3 g 
Agua destilada 1 000 ml 
 
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolver e l agar. Ajuste el pH a 7,4 ± 0,2. Coloque en tubos y 
esterilice en autoclave 15 minutos a 121° C. 
Medio Base de Descarboxilasa (Arginina , Lisina y Ornitina) 
FORMULA BASE 
Peptona 5 g 
Extracto de levadura 3 g 
Dextrosa (D-glucosa) 1 g 
Púrpura de 
Bromocresol 0.02 g 
Agua destilada 1 000 ml 
 
Para caldo de Arginina, Lisina y Ornitina, adicione  5 g de L-aminoácido a 1 litro de base. Como contro l, 
use base sin suplemento (aminoácido). Para Vibrio spp  halofílicos, adicionar 15 g de Cloruro de Sodio po r 
litro. Ajuste el pH de tal manera que después de la  esterilización sea de 6,5 ± 0,2. Distribuya en tub os y 
esterilice en autoclave 10 minutos a 121° C.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Caldo Triptona y Caldos Triptona Sal T 1N0,T1N1,T1N3 y T1N6,T1N8 y T 1N10  
FORMULA 
Triptona o Tripticasa 10 g 
Cloruro de Sodio 0, 10, 30, 60, 80, o 100 g 
Agua destilada 1 000 ml 
 
Disuelva los ingredientes en agua destilada, para T1N0 no agregue Cloruro de sodio, para T 1N1 use 10 g 
de Cloruro de sodio (1% w/v concentración de clorur o de sodio); así respectivamente. Para T 1N3 usar 30 g de 
NaCl por litro (3% w/v concentración de cloruro de sodio) Distribuya en tubos de tapón de rosca de 16 x 150 
mm, tape los tubos. Esterilice en autoclave durante  15 minutos a 121° C. Ajuste el pH a 7,2 ± 0,2. 
Caldo Soya Tripticasa (TSB) 
FORMULA 
Peptona de Tripticasa (Triptona) 17 g 
Peptona de fitona (Soytona) 3 g 
Cloruro de Sodio 5 g 
Fosfato dipotásico 2,5 g 
Dextrosa 2,5 g 
Agua destilada 1 000 ml 
 
Suspenda los ingredientes en agua destilada y calie nte hasta disolución. Distribuya 225 ml en matraces  de 
500 ml o tubos. Esterilice en autoclave durante 15 minutos a 121° C. El pH final debe ser de 7,2 ± 0,2.  
Agar Soya Tripticasa (TSA) 
FORMULA 
Peptona tripticasa (Triptona) 15 g 
Peptona de fitona (Soytona) 5 g 
Cloruro de Sodio 5 g 
Agar 15 g 
Agua destilada 1 000 ml 
 
Suspenda los ingredientes en agua destilada y hierv a durante un minuto hasta disolución del agar. Para  
Vibrio spp  halofílicos, agregar 15 g de Cloruro de Sodio. Dis tribuya dentro de tubos o matraces. Esterilice en 
autoclave durante 15 minutos a 121° C. Deje solidifi car los tubos inclinados o deje enfriar de 45-50° C y 
distribuya en cajas Petri. El pH final debe ser de 7,3 ± 0,2. 
Agar de Hierro Kligler (KIA) 
FORMULA 
Peptona polipeptona 20 g 
Lactosa 20 g 
Dextrosa 1 g 
Cloruro de Sodio 5 g 
Citrato férrico 
amoniacal 0,5 g 
Tiosulfato de sodio 0,5 g 
Rojo de fenol 0,025 g 
Agar 15,0 g 
Agua destilada 1 000 ml 
 
Suspender los ingredientes y hervir hasta disolució n del agar. Distribuir en tubos de tapón de rosca. 
Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121° C . Dejar solidificar los tubos inclinados. Ajustar e l pH de  7,4 
± 0,2. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Agar Arginina Glucosa Inclinado (AGS) 
FORMULA 
Peptona 5 g 
Extracto de levadura 3 g 
Tristona 10 g 
Cloruro de Sodio 20 g 
Glucosa 1 g 
L-Arginina (hidrocloruro) 5 g 
Citrato férrico amónico 0,5 g 
Tiosulfato de Sodio 0,3 g 
Púrpura de Bromocresol 0,2 g 
Agar 13,5 g 
Agua destilada 1 000 ml 
 
Suspender los ingredientes en agua destilada, hervi r hasta disolución del agar, y distribuir en cantid ades 
de 5 ml a tubos de 13 x 100 mm. Ajustar el pH de 6, 8 a 7,0. Esterilizar en autoclave de 10 a 12 minuto s a 
121° C. Deje solidificar el medio inclinado. 
Agar Triple Azúcar y Hierro (TSI) 
FORMULA 
Polipeptona 20 g 
Cloruro de Sodio 5 g 
Lactosa 10 g 
Sacarosa 10 g 
Glucosa 1 g  
Sulfato ferroso amónico 0,2 g 
Tiosulfato de Sodio 0,2 g 
Rojo de fenol 0,025 g 
Agar 13 g 
Agua destilada 1 000 ml 
 
Disolver los ingredientes en agua destilada. Mezcla r bien y calentar a ebullición, agitando ocasionalm ente 
hasta completa disolución. Enfriar a 60° C y ajuste el pH de 7,3 ± 0,1. 
Agar de Hierro y Lisina (LIA) 
FORMULA 
Peptona o gelisato 5,0 g 
Extracto de levadura 3,0 g 
Glucosa 1,0 g 
L-Lisina 10,0 g 
Citrato férrico amónico 0,5 g 
Tiosulfato de sodio 0,04 g 
Púrpura de bromocresol  0,02 g 
Agar 15,0 g 
Agua destilada 1 000 g       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Disolver los ingredientes en el agua destilada y me zclar bien; calentar hasta ebullición con agitación  
frecuente hasta conseguir la disolución completa. E sterilizar en autoclave 12 minutos a 121° C. Enfríar  de 50-
60° C y ajustar el pH de 6,7 ± 0,1. Distribuir en vo lúmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm. Los tubos se 
enfrían en posición inclinada, de tal modo que se o btengan columnas de medio de 3 cm y una parte incli nada 
de 2 cm. 
Caldo Rojo de Metilo y Vogues Proskauer(RM-VP) 
FORMULA 
Peptona 7 g 
Glucosa 5 g 
Fosfato dipotásico 5 g 
Agua destilada 1 000 ml 
 
Disolver los ingredientes en 800 ml de agua tibia. Para Vibrio spp  halofílicos, agregar 15 g más de Cloruro 
de Sodio (para una concentración final del 2%). Fil trar, enfríar a 20° C y diluir a 1 litro. Distribuya  en tubos. 
Esterilizar en autoclaves durante 12 - 15 minutos a  121° C. Ajustar el pH de 6,9 +/- 0,2. 
Medio para prueba de movilidad (Semisólida) 
FORMULA 
Peptona 10 g 
Extracto de carne 3 g 
Cloruro de Sodio 5 g 
Agar 4 g 
Agua destilada 1 000 ml 
 
Calentar con agitación y hervir de 1 a 2 minutos ha sta disolución del agar. Para Vibrio spp  halofílicos 
agregar 15 g más de Cloruro de Sodio (para una conc entración final del 2%). Distribuir en tubos con ta pón de 
rosca. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121° C.  Ajustar el pH de 7,4 ± 0,2. 
18.1.2  Soluciones y reactivos 
Prueba de Rojo de Metilo. 
Reactivo. Fórmula 
Rojo de metilo 0,1 g 
Alcohol etílico 300 ml 
Agua destilada 200 ml 
 
Disolver el Rojo de Metilo en el alcohol y diluir c on el agua destilada, para llevar a cabo la prueba,  añadir 5 
gotas de la solución a 5 ml del cultivo problema. 
Resultados: Un color rojo demuestra un pH menor a 4 ,5 y la prueba es Positiva. Un color amarillo se 
reporta como prueba Negativa. 
Prueba de Vogues-Proskauer. 
Esta prueba es para comprobar la presencia del Diac etilo. 
Reactivo. Fórmula 
Alfa Naftol 5 g 
Alcohol Etílico absoluto 100 ml 
 
Añadir 0,6 ml de la solución de Alfa Naftol y 0,2 m l de una solución acuosa al 40% de KOH a 1 ml de 
cultivo. 
Resultados: El desarrollo de una coloración roja en  15 minutos constituye una reacción POSITIVA. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Prueba de Oxidasa. 
Reactivo 
FORMULA 
N,N,N,N-Tetrametil-p-Fenilendiamino 0,5 g 
Agua destilada 100 ml 
 
Conservar en frasco oscuro a 5-10° C. El reactivo se  conserva durante 14 días. Sembrar en un tubo de 
base de gelosa para sangre. Incubar 18 horas a 35° C . Agregar 0,3 ml de reactivo. 
Resultado: La reacción positiva se observa por la p roducción de un color azul en un minuto. 
Reacción de Indol. 
REACTIVO DE KOVAC 
FORMULA 
p-dimetilaminobenzaldehído 5.0 g 
Alcohol amílico o alcohol isoamílico 750 ml 
Acido clorhídrico concentrado 25 ml 
 
Disolver el p-dimetilaminobenzaldehído en el alcoho l amílico y agregar el ácido clorhídrico lentamente , 
gota a gota y agitando. Debe conservarse en frasco ámbar con tapón esmerilado; el color del reactivo v a del 
amarillo al café claro. Se debe conservar a 4° C. 
18.1.3  Procedimiento: 
Sembrar un tubo con 5 ml de caldo triptona. Incubar  48 horas a 35° C. Agregar de 0,2 a 0,3 ml del react ivo. 
El desarrollo de un color intenso, constituye una p rueba Positiva para indol. 
18.1.4  Toma de muestra 
La toma de muestra para análisis microbiológicos, s e deberá hacer en condiciones asépticas y en 
recipientes estériles. 
18.1.4.1  Preparación de la muestra 
Las muestras de moluscos bivalvos deberán analizars e en su composición básica de líquido y carne. Para  
moluscos bivalvos desconchar de 10 a 12 piezas gran des, incluir el líquido. Verter 50 g en 450 ml de a gua 
peptonada alcalina (APW), licue para homogeneizar d urante 2 minutos a alta velocidad. Esta es la diluc ión 
1:10. Colocar 250 g de esta dilución en un segundo recipiente estéril. Preparar dos series de dilucion es 1:100 
y 1:1000. En este momento deberá tener dos series d e tres diluciones. Incubar una serie a 35-37° C y la  otra a 
42° C. 
18.1.4.1.1  Resembrar 
Después de la incubación, y sin agitar, transferir el inóculo de la película (crecimiento superficial)  con un 
asa de 3-5 mm de diámetro a una placa por lo menos,  de cada uno de los medios de cultivo selectivos: A gar 
con tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa (TCBS) o al agar modificado con celobiosa, polimixi na B y 
colistina (mCPC), la polimixina inhibe al biotipo C lásico de V. cholerae . Incubar el agar TCBS durante 18 a 24 
horas de 35-37° C y el agar mCPC durante 18 a 24 hor as de 39-40° C. 
18.1.4.2  Morfología colonial. 
Examinar las placas a fin de determinar si se prese ntan las características coloniales que a continuac ión 
se describen, seleccionar por lo menos 3 colonias s ospechosas de cada placa y aplicarlas con estría cr uzada 
para aislar en agar T 1N1 o en agar soya tripticasa con sal (al 2% de concen tración de NaCl) e incubar durante 
12-18 horas a 35-37° C. Es necesario hacer un cultiv o en un medio no selectivo a fin de garantizar la p ureza 
de las colonias, antes de las pruebas bioquímicas, se puede inocular a los agares gelatina (GA) y gela tina sal 
(GS) en el segundo día. Los resultados serán confia bles si las placas de aislamiento muestran colonias  puras.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
a.- Agar TCBS . Las colonias de V. cholerae  (El Tor y Clásico) son grandes, lisas, amarillas ( positivas para 
la fermentación de la sacarosa) y ligeramente achat adas, con el centro opaco y los bordes translúcidos . 
Nota:  Las especies de Vibrio  no producen colonias pequeñas de color crema en ag ar TCBS. Las colonias 
de V. mimicus , que están estrechamente relacionadas con la espec ie anterior, son verdes (sacarosa 
negativas). La mayoría de las demás especies de Vibrio  crecen en agar TCBS y producen colonias amarillas y 
verdes. 
b.- Agar mCPC.  Las colonias de V. cholerae  El Tor son púrpuras (negativas para la fermentació n de la 
celobiosa). El V. vulnificus  produce colonias amarillas achatadas, con el centr o opaco y los bordes 
translúcidos. La mayoría de las demás especies de Vibrio  no crecen fácilmente en agar mCPC. 
18.1.4.3  Diferenciación. 
Diferenciación de los vibrios sospechosos de los mi croorganismos que no son vibrios. 
a.- TSI,KIA y agar inclinado de Arginina y Glucosa (AG S). Inocular las colonias individuales en medios de  
cultivo TSI (Agar de Triple Azúcar y Hierro), KIA ( Agar de Hierro Kliger) y AGS, picar y estriar en el  agar 
inclinado. Incubar los tubos inoculados, con el tap ón no muy apretado, durante 18 a 24 horas de 35-37° C. Se 
recomiendan estos medios porque las reacciones perm iten efectuar una diferenciación presuntiva entre l a 
mayoría de las especies de Vibrio , Aeromonas , Plesiomonas,  Shigella  y otras bacterias. 
b.- Caldo triptona al 3% de NaCl (T 1N3). Inocular las colonias en los caldos T 1N0 y T 1N3 e incubar durante 
18 a 24 horas de 35-37° C. El V. cholerae  y el V. mimicus  crecerán en T 1N0 y T 1N3. Algunas especies de 
bacterias que no son vibrios y que presentan reacci ones similares a las de V. cholerae  en medios de TSI y LIA 
no crecen en T 1N3. La mayoría de las especies Vibrio  spp, incluyen algunos V. cholerae  No. 01, crecerán en 
T1N3 únicamente de la familia Vibrionaceae crece solame nte en T 1N3. 
Una alternativa consiste en usar agar gelatina (GA)  y agar gelatina con 3% de NaCl (GS) para determina r 
la tolerancia de los cultivos puros a la sal. Divid ir las placas en ocho sectores, inocular una línea recta en el 
centro de un sector de las placas, tanto de GA como  de GS con cada cultivo puro. Incubar durante 18 a 24 
horas de 35 - 37° C. El V. cholerae  y el V. mimicus  crecerán. El Vibrio spp  halofílico crecerá en ambas placas, 
porque ellos no requieren de sal. Sólo en la placa con GS. Para leer la reacción de la gelatinasa sost ener la 
placa sobre una superficie negra, observará un halo  opaco alrededor de la colonia de los microorganism os 
gelatinasa positivos. 
c.- Caldo glucosa de Hugh-Leifson. 
Inocular colonias individuales en tubos duplicados con caldo de glucosa de Hugh-Leifson. Recubrir un t ubo 
con una capa de aceite mineral estéril o vapor líqu ido (50% de petrolato y 50% de parafina) unos dos 
centímetros de grueso. Incubar ambos tubos durante 18 a 24 horas de 35-37° C. Las especies de Vibrio spp  
utilizan la glucosa tanto para la oxidación como pa ra la fermentación. Las especies de Pseudomonas, qu e 
comúnmente se aíslan del pescado y los mariscos con  métodos de enriquecimiento que se usan para las 
especies de Vibrio , utilizan la glucosa sólo para la oxidación. 
d.- Prueba de oxidasa. 
Realizar la prueba de oxidasa con cultivos puros de  agar soya tripticasa (2% de NaCl) u otro medio que  no 
contenga carbohidratos fermentables. Un método fáci l consiste en colocar un círculo de papel filtro en  una 
caja de Petri y humedecerlo con algunas gotas de re activo de oxidasa. Con un palito aplicador de mader a, un 
mondadientes o una asa de platino estéril, sacar un  poco de cultivo de la placa y tocar el papel humed ecido, si 
hay microorganismos oxidasa positivos, el papel se tornará púrpura oscura o azul en pocos segundos. La s 
especies patógenas de Vibrio  son oxidasa positivas (excepto el V. metschnnikovii ). 
18.2 Identificación y Confirmación de V. cholerae  01, V.cholerae  NO 01 y V. mimicus . 
a.- Leer los resultados de las pruebas bioquímicas de T SI, KIA, AGS, T 1N0 y T 1N3 o GA Y GS, y caldo 
glucosa de Hugh-Leifson. 
b.- Hacer una tinción de Gram a un cultivo de 18 a 24 horas en caldo o agar. 
Nota:  Los cultivos puros que se someterán a las demás pr uebas serológicas y bioquímicas para el V.  
cholerae  son sacarosa positivos (amarillo) en agar TCBS y s acarosa negativos (verdes) en el caso de V. 
mimicus  o son celobiosa negativos (verde-púrpura) en agar mCPC, crecen en caldo T 1N0 o en placas con GA; 
presentan reacciones características en TSI, KIA y AGS. Son gelatina y oxidasa positivos, son bacilos curvos 
gram negativos y producen ácido a partir de la gluc osa, tanto en la oxidación como en la fermentación,  en el 
caldo de cultivo de Hugh-Leifson.  Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
c.- Pruebas bioquímicas. 
Las reacciones bioquímicas para identificación de V. cholerae  y otras especies bacterianas afines figuran 
en el cuadro anexo. La fórmula para todos los medio s bioquímicos deberá contener por lo menos un 2% de  
NaCl. En vez de medios convencionales se pueden usa r tiras AP120E, con 2% de NaCl como diluyente. Para  
el V. cholerae  se puede usar solución salina fisiológica (0,85% d e NaCl) como diluyente. 
d.- Prueba serológica de aglutinación. 
Usar antisuero de diagnóstico del grupo 01 y del su bgrupo Inaba (factores AC) y Ogawa (Factores AB) 
para el antígeno del serotipo 01. Usar cultivos de 16 a 24 horas producidos en TSA. Incluir cultivos p ositivos y 
negativos, y los controles salinos para cada antisu ero usado. Seguir las instrucciones del antisuero. Como es 
posible que los antígenos de los antisueros estén r elacionados entre sí, hay que realizar pruebas bioq uímicas 
para confirmar que el cultivo puro sea de V. cholerae  01 o No. 01. 
Nota:  Anticuerpos monoclonales están disponibles, pero e l anti-B y anti-C reaccionan opuestamente con 
bacterias de otras especies. Uso de anticuerpos pol iclonales y/o monoclonales será para el antígeno de l 
complejo 01 
1.- Los cultivos que aglutinan con el antisuero del gr upo 01, pero no en solución salina fisiológica simp le, 
son de V. cholerae  del grupo 01 si las reacciones bioquímicas confirm an que el cultivo puro es de V. cholerae . 
Los cultivos que se aglutinan con este antisuero pa ra grupos específicos pueden ser clasificados según  el 
subtipo con anticuerpos Inaba y Ogawa. 
/square4 Los cultivos que aglutinan con el suero polivalent e (grupo 01) y con los antisueros Inaba y Ogawa, 
tienen los 3 factores (A,B y C) y son del serotipo Hikojima. 
/square4 Los cultivos que aglutinan con el antisuero poliva lente pero no aglutinan con antisueros Inaba y 
Ogawa, no se pueden tipificar con estos antisueros.  
2.- Los cultivos de V. cholerae  cuya identidad se haya confirmado con métodos bioq uímicos y que no 
aglutinen con el antisuero del grupo 01 son V. cholerae  0:1. El suero para la clasificación de V. cholerae  No 
0:1 según el tipo se puede obtener de R.J. Siebelin g. 
3.- Los cultivos que se aglutinan en el antisuero del grupo 01 y en solución salina, no se pueden clasifi car 
según el tipo. Sin embargo, si se usa un medio más rico, como en TSA o agar infusión cerebro corazón ( BHI), 
se puede eliminar esta autoaglutinación. 
e.  Características mínimas para la identificación de V. cholerae . 
Las características que permiten suponer la presenc ia de V. cholerae  como mínimo son las siguientes: 
1.- Morfología. 
Bacilo o bacilo encorvado, esporogénico y gram nega tivo. 
2.- Aspecto en TSI. 
Estría ácido, picadura ácido, gas negativo y H 2S negativo. 
3.- Prueba de Hugh-Leifson. 
Fermentación de la glucosa y oxidación positiva. 
4.- Citocromo-oxidasa positivo. 
5.- Prueba de la Dihidrolasa arginina: negativo. 
6.- Prueba de la Lisinadescarboxilasa: positivo. 
7.- Prueba de VP: Positivo El Tor, negativo Clásico y V. mimicus . 
8.- Crecimiento a 42° C: positivo. 
9.- Prueba de halofilia con NaCl. 0%: positivo, 3%: po sitivo, 6%: usualmente negativo. Algunas cepas de 
V. cholerae  NO 01 se desarrollan a 0% de NaCl. 
10.- Fermentación de la sacarosa: positivo para V. cholerae  (negativo para V. mimicus ). 
11.- Prueba de ONPG: positivo. 
12.- Fermentación de la arabinosa: negativo. 
13.- 0/129 sensitiva: sensible para 10 y 150 µg 0/129       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
REACCIONES DE ALGUNOS Vibrio EN AGAR KIA, TSI Y AGS . 
MICROORGANISMOS  KIA 
 ESTRIA PICADURA  TSI 
 ESTRIA PICADURA  AGS 
 ESTRIA PICADURA  
V. cholerae K A A(K)* A K a 
V. mimicus K A K(A)* A K A 
V .parahemolyticus K A K A K A 
V. alginolyticus K A A A K A 
V. vulnificus K o A A K(A)* A K A 
V. hidrophyla K o A A K o A A K K 
V. shigelloides K o A A K o A A N N 
* = Raramente 
K = Alcalino 
A = Acido 
a = Ligeramente ácido 
N = Neutro 
Ninguna de las especies de Vibrio  enumeradas produce sulfuro de hidrógeno en medios KIA, TSI o AGS, 
ni una cantidad perceptible de gas a partir de gluc osa en medios KIA, TSI o AGS. Algunas especies de 
Aeromonas  pueden producir gas a partir de glucosa en estos m edios. 
19. Determinación de Clostridium botulinum  y sus toxinas en alimentos y muestras clínicas 
19.1  Fundamento 
Demostrar la presencia de toxina botulínica por iny ección a ratones con extractos de alimentos o muest ras 
clínicas y observar el efecto letal. Comprobar con el antisuero específico la neutralización de la tox ina. La 
determinación de C botulinum  se basa en el cultivo de muestras de alimentos y c línicas en condiciones de 
anaerobiosis en medios específicos y la subsecuente  demostración de la toxina. 
19.2  Toma y manejo de muestras 
19.2.1  Alimentos 
Las muestras pueden tomarse de sobrantes de los ali mentos sospechosos o de recipientes cerrados. 
Cuando están involucrados alimentos comerciales, es  importante observar la etiqueta, número de lote de l 
fabricante, o cualquier dato relevante que pueda id entificar el origen de la muestra. 
19.2.2  Clínicas 
Las muestras clínicas para el análisis incluyen: ma teria fecal, aproximadamente 10 g, contenido gástri co 
(ajustar aproximadamente a pH 6 con hidróxido de so dio 0,1) y suero (colectado de 20 ml de sangre ANTE S 
DE ADMINISTRAR LA ANTITOXINA). Cuando se sospecha d e botulismo infantil es importante analizar las 
heces. Si fuera necesario, las manchas o partes sól idas de los pañales. 
19.3  Envío de muestras 
19.3.1  Para un envío seguro, el interior de los empaques deben contener: 
(I)  Un primer recipiente impermeable al agua. 
(II)  Un segundo recipiente impermeable al agua. 
(III)  Material absorbente (por ejemplo unicel) entre los  dos contenedores, suficiente para 
absorber el contenido entero del primer recipiente.  
19.3.2  De preferencia enviar el material en refrigeración  en paquetes que contengan recipientes con gel 
congelado. Para una máxima preservación de la toxin a el recipiente secundario debe empacarse en una ca ja 
de unicel con recipientes de gel congelado. Sin emb argo, si se sospecha retraso en el envío, el materi al debe 
congelarse y empacarse con hielo seco. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
19.4  Material y equipo 
/square4 0,1 N NaOH o NaHCO3 saturado para limpiar posibles  derrames. 
/square4 Flujo laminar 
/square4 Propipeta o bulbo 
/square4 Lentes de seguridad 
/square4 Guantes de cirujano 
/square4 Tubos de centrífuga de 40 ml de capacidad 
/square4 Centrífuga refrigerada con capacidad de 15 000 x g  
/square4 Jeringas desechables de 19 x 15. 
/square4 Filtros desechables de 0,45  m. 
/square4 Vortex 
/square4 Licuadora 
/square4 Solución de tetraciclina al 0,2% 
/square4 Potenciómetro 
/square4 Incubadora 30º, 35ºC 
/square4 Balanza 
/square4 Equipo para tinción de Gram 
/square4 Tubos de ensayo de 13 x 100 mm 
/square4 Antisuero monovalente A,B,E y F 
/square4 Antisuero trivalente ABE 
/square4 Jeringas para tuberculina 
/square4 Ratones de preferencia hembras de 20 a 30 g cepa C FI o NIH 
/square4 Solución reguladora de fosfatos con gelatina 
/square4 Tripsina al 1% p/v 
/square4 Tripsina al 1,4% 
/square4 Medio carne cocida (CMM) 
/square4 Caldo tripticasa peptona glucosa extracto de levad ura (TPGY). 
/square4 Caldo tripticasa peptona glucosa extracto de levad ura (TPGYT) con tripsina 
/square4 Agar aislamiento Clostridium  botulinum  (CBI) 
/square4 Agar hígado de ternera yema de huevo 
/square4 Agar esporulación de Eklund 
/square4 Baño de agua (75-100ºC) 
/square4 Etanol al 50% o absoluto 
/square4 Jarras y sistema de anaerobiosis 
19.5 Preparación de medios de cultivo 
19.5.1  Medio de la carne cocida (CMM). 
FORMULA 
Corazón de res 454 g 
Proteosa peptona  20 g 
Bactodextrosa 2 g 
Cloruro de sodio  5 g 
Extracto de corazón de res 1000 ml       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Picar el corazón de res, sumergir en agua y calenta r hasta ebullición durante 1 h. Enfriar, ajustar el  pH a 
7,0, y hervir 10 minutos. Filtrar a través de musel ina y presionar para drenar el exceso de líquido de  la carne. 
Guardar la carne cocida. Agregar los ingredientes a l filtrado y ajustar a pH 7,0, agregar agua hasta h acer 1000 
ml. Filtrar a través de papel filtro poroso. Se pue de conservar el caldo y la carne en congelación por  separado. 
Agregar el corazón cocido y picado a tubos de ensay e de 18 x 150 mm o 20 x 150 mm a una altura de 1,2 a 
2,5 cm del tubo y adicionar de 10 a 12 ml del caldo . Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121ºC. Si e ste medio 
se almacena por más de 12 h después de su preparaci ón, debe calentarse a ebullición por 10 minutos y 
enfriar antes de su uso. 
19.5.2  Caldo tripticasa peptona glucosa extracto de levad ura (TPGY). 
FORMULA 
Tripticasa  50 g 
Peptona  5 g 
Glucosa  4 g 
Extracto de levadura  20 g 
Tioglicolato de sodio  1 g 
Agua destilada  1000 ml 
 
Disolver los ingredientes en agua caliente, enfriar  y ajustar a pH 7,2. Distribuir en volúmenes de 2 m l en 
tubos de 20 x 150 mm con tapón de rosca. Esteriliza r por vapor fluente, enfriar a la temperatura y alm acenar a 
4ºC hasta 6 semanas. Si se almacena más de 12 h tra tarlos con calor como se indica en 4.5.1. Agregar 1 ,5 ml 
de solución de tripsina al 1,4% por cada tubo con 2 1 ml del medio TPGY. Mezclar muy suavemente. Este 
medio no se puede almacenar. 
19.5.3  Caldo tripticasa peptona glucosa extracto de levad ura adicionado con tripsina (TPGYT). 
FORMULA 
Tripticasa  50 g 
Peptona  5 g 
Glucosa 4 g 
Extracto de levadura  20 g 
Tioglicolato de sodio  1 g 
Agua destilada 1000 ml 
 
Disolver los ingredientes en agua caliente, enfriar  y ajustar a pH 7,2. Distribuir en volúmenes de 2 m l en 
tubos de 20 x 150 mm con tapón de rosca. Esteriliza r por vapor fluente, enfriar a la temperatura y alm acenar a 
4ºC hasta 6 semanas. Si se almacena más de 12 h tra tarlos con calor como se indica en 4.5.1. Agregar 1 ,5 ml 
de solución de tripsina al 1,4% por cada tubo con 2 1 ml del medio TPGY. Mezclar muy suavemente. Este 
medio no se puede almacenar. 
19.5.4  Agar hígado de ternera yema de huevo. 
a)  Agar hígado de ternera. 
FORMULA 
Infusión de hígado 50 g 
Infusión de ternera 500 g 
Proteosa peptona  20 g 
Neopeptona  1,3 g 
Triptona 1,3 g 
Dextrosa 5,0 g 
Almidón soluble 10,0 g 
Caseína isoeléctrica 2,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Nitrato de sodio 2,0 g 
Gelatina 20,0 g 
Agar  15,0 g 
Agua destilada  1000 ml Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Calentar con agitación constante hasta dilución com pleta. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 12 1ºC, 
pH final 7,3 +  0,2. Agregar por cada 500 ml del medio base fundid o 40 ml de la suspensión salina de yema de 
huevo. Mezclar y vaciar a cajas de Petri estériles de 15 x 100 mm (aproximadamente 15 - 20 ml). Secar las 
placas a temperatura del laboratorio por 2 días o a  35ºC por 24 horas. Verificar esterilidad de las pl acas. 
Almacenar en refrigeración. 
b)  Emulsión al 50% de yema de huevo. 
Lavar los huevos con un cepillo suave y dejar escur rir. Sumergirlos por 1 hora en solución de cloruro 
mercúrico al 0,1%, escurrir. Sumergir en una soluci ón de etanol al 70% y dejar durante 30 minutos, esc urrir. 
Abrir los huevos en condiciones asépticas y descart ar las claras. Colocar las yemas en un recipiente e stéril y 
mezclar con igual volumen de solución salina fisiol ógica (0,85%) estéril. Guardar en refrigeración has ta su 
uso. 
19.5.5  Agar para asilamiento de C. botulinum  (CBI). 
El agar CBI es una modificación del medio agar McCl ung Toabe para el aislamiento selectivo y diferenci al 
de C. botulinum , el cual puede aislarse de los cultivos toxigénico s de CMM, provenientes de muestras de 
heces, líquido gástrico o alimentos. El medio de ag ar CBI contiene: Cicloserina 250  g/ml, sulfametoxazol 76 
 g/ml y trimetroprim 4  g/ml en la base del medio agar McClung Toabe yema de huevo. 
Agar McClung Toabe 
FORMULA 
Proteosa peptona  40 g 
Bacto dextrosa   2 g 
Fosfato de sodio dibásico   1 g 
Fosfato de potasio monobásico    1 g 
Cloruro de sodio   2 g 
Sufato de magnesio 0,1 g 
Agar  25 g 
Agua destilada  1000 ml 
pH final 7,6  0,2 a 25ºC 
Extracto de levadura  5 g 
Suspensión de yema de huevo  100 ml 
 
SOLUCION DE ANTIBIOTICOS 
/square4 Cicloserina 250 mg o 25 ml de una solución al 0,1%  
/square4 Sufametoxasol 76 mg o 4 ml de una solución al 1,9% . Disolver el sulfametoxazol en solución 2 N de 
NaOH. 
/square4 Lactato deTrimetroprim 4 mg o 4 ml de una solución  al 0,1% por cada 100 ml de medio base. 
Esterilizar por filtración. 
Preparación:  Agregar el extracto de levadura y los ingredientes  del agar McClug Toabe a un matraz de 2 
L con 900 ml de agua destilada, mezclar y calentar hasta disolución. Ajustar a pH 7,5. Esterilizar 15 minutos a 
121ºC en autoclave. Enfriar a 55ºC en baño de agua y en condiciones asépticas agregar 100 ml de la 
suspensión al 50% de yema de huevo. Agregar los vol úmenes necesarios para conservar la concentración d e 
antibióticos por litro de medio base. Mezclar y dis tribuir en cajas de Petri estériles de 15 x 100 mm 
aproximadamente 15-20 ml por placa. Dejar solidific ar y colocar en bolsas de plástico. Guardar en 
refrigeración hasta su uso. Estas placas pueden alm acenarse hasta 1 mes aproximadamente. 
19.5.6  Agar para esporulación de Eklund. 
FORMULA 
Tripticasa  4 g 
Peptona  1 g 
Glucosa  0,1 g 
Extracto de levadura   1 g 
Agar  4 g 
Agua destilada  200 ml       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Disolver los ingredientes en agua caliente, excepto  el agar, ajustar a pH 7,8, agregar el agar. Esteri lizar 
por vapor y enfriar a 50ºC. Agregar 2 ml de solució n al 10% de clorhidrato de cisteína, esterilizada p or 
filtración; 12 ml de emulsión de yema de huevo y 2 ml de sangre citratada de bovino o borrego. Prepara r las 
placas. Este medio es particularmente adecuado para  la esporulación de C. botulinum  del grupo II. 
19.6  Diluyentes y reactivos 
19.6.1  Solución amortiguadora de fosfatos con gelatina 
FORMULA 
Gelatina  2 g 
Na2HPO4  4 g 
Agua destilada  1000 ml 
 
Ajustar a pH 6,2 con solución de ácido clorhídrico 4N. Distribuir en frascos con tapón de rosca, ester ilizar 
por vapor, enfriar a la temperatura ambiente y alma cenar a 4ºC. 
19.6.2  Solución de tetraciclina al 0,2%. 
Disolver 50 mg en 25 ml del diluyente fosfato de ge latina, mantener a 4ºC hasta 4 días. Si se requiere  
almacenar por más tiempo, congelar en pequeñas porc iones. Evitar la recongelación. 
19.6.3  Solución de tripsina (1:250). 
a)  Solución al 1% 
Disolver 200 mg en 20 ml de agua destilada. No alma cenar. 
b) Solución al 1,4%. 
Disolver 280 mg en 20 ml del diluyente fosfato de g elatina, filtrar a través de membrana de 0,45  m. Usar 
vacío para obtener efecto parcial de deareación del  filtrado. 
19.6.4  Antisueros 
A, B, E; A, B; A, B, E, C*, D*, F. 
Investigación de sospecha de botulismo en animales.  
19.7  Procedimiento 
19.7.1  Examen microscópico de los alimentos sospechosos 
Este examen no es esencial para la detección de C. botulinum , pero facilita la selección de los alimentos 
sospechosos para el análisis. Preparar frotis direc tos y hacer tinción de Gram. Si el alimento contien e exceso 
de grasa, sumergir los portaobjetos fijados al calo r por 1-2 minutos en xilol antes de teñir. 
19.7.2  Preparación del material para el análisis de las t oxinas. 
19.7.2.1  Alimentos líquidos 
Centrifugar aproximadamente 20 ml a 15000 x g duran te 20 minutos. Decantar cuidadosamente el 
sobrenadante o extraer con una jeringa desechable d e 19 x 25 mm. Cubrir el tubo y conservar a 4ºC para  
hacer el cultivo del sedimento posteriormente. Repe tir la centrifugación, si el sobrenadante aún no es tá claro. 
Esterilizar el sobrenadante por filtración a través  de la membrana de 0,45  m adaptada a una jeringa 
desechable. Ocasionalmente puede requerirse una pre filtración durante el proceso de filtración. El pro pósito 
de la esterilización es prevenir una infección y a su vez una muerte inespecífica de los ratones inocu lados. 
19.7.2.2  Alimentos semilíquidos 
Colocar 10-15 g en tubos de centrífuga de 40 ml, ag regar igual volumen de solución reguladora de fosfa tos 
con gelatina y homogenizar en vortex. 
Centrifugar y proceder como en 19.7.2.1. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
19.7.2.3  Alimentos sólidos 
Colocar 10-20 g en un vaso de licuadora o mortero. Agregar suficiente solución reguladora de fosfatos con 
gelatina para obtener cuando menos 10 ml de sobrena dante después de la centrifugación. La dilución del  
alimento deberá estar entre 1:1 a 1:3. Licuar a vel ocidad alta por 1-2 minutos. Los vasos de licuadora  deberán 
cerrarse herméticamente para prevenir la formación de aerosoles. Centrifugar y proceder como en 19.7.2 .1, 
19.7.2.2 y 19.7.2.3. 
19.7.2.4  Alimentos enlatados 
Lavar y secar la superficie de la lata. Cubrir la t apa con etanol al 96%, dejar por 2 minutos; decanta r y 
flamear el alcohol residual. Colocar la lata en una  bolsa de plástico para prevenir la dispersión de a erosoles y 
abrir con un abrelatas estéril. Proceder como en 19 .7.2.1, 19.7.2.2 y 19.7.2.3. 
19.7.2.5  Suero 
Idealmente debe obtenerse 10 ml de suero. El suero usado sirve sólo antes del tratamiento con el 
antisuero. Si está turbio, centrifugar a 15,000 x g  durante 20 minutos, decantar el sobrenadante. 
19.7.2.6  Heces 
Colocar 10 g en un tubo de centrífuga de 40 ml de c apacidad, agregar suficiente cantidad de solución 
reguladora de fosfatos con gelatina para obtener al  menos 10 ml de sobrenadante después de la 
centrifugación. Mezclar en vortex durante 2-3 minut os. Conservar la mezcla a 4ºC por 2 h. Homogeneizar  en 
vortex. Centrifugar y proceder como en 19.7.2.1. La s muestras líquidas, enemas y el contenido intestin al se 
pueden centrifugar directamente con poco o sin la a dición de la solución reguladora de fosfatos con ge latina. 
Ocasionalmente, los sobrenadantes de muestras clíni cas no se pueden filtrar, en estos casos, agregar 1  ml de 
una solución al 0,2% de tetraciclina por cada 9 ml del sobrenadante. 
19.7.2.7  Contenido gástrico 
Medir el pH y ajustar, si es necesario, a 5,5-6,5 c on una solución 1N de NaOH. Evitar que el valor de pH 
sea mayor a 7,0. Centrifugar y proceder como en 19. 7.2.1. 
19.7.2.8  Otras muestras clínicas. 
Tratar las muestras semilíquidas y sólidas como en 19.7.2.2 y 19.7.2.3 
19.8  Análisis de las toxinas 
19.8.1  Procedimiento general (se aplica cuando no se sosp echa de alguna toxina en particular). 
19.8.1.1  Si se dispone de suficiente material, distribuir e l filtrado en volúmenes de 1,2 ml dentro de 6 tubos  
de ensaye de 13 x 100 mm, marcados del 1-6. A los t ubos marcados 2-5, agregar 0,12 ml de los siguiente s 
antisueros: monovalente A, B o E y trivalente ABE. Mezclar en vortex y dejar reposar a temperatura amb iente 
por 45 minutos. 
19.8.1.2  Al tubo 6, agregar 0,12 ml de una solución de trip sina al 1%. Incubar a 35ºC por 60 minutos. El 
tubo 1 no se adiciona. Ver tabla No. 2. 
19.8.1.3  Si el volumen de material es insuficiente para com pletar la prueba, se puede omitir el tubo No. 6. 
19.8.1.4  Inyectar dos ratones (20-30 g) intraperitonealment e por tubo, con los volúmenes siguientes:  0,5 
ml del tubo 1,0 y 0,55 ml de los tubos 2-6. Observa r a los ratones por 72 h. Los síntomas típicos de b otulismo 
son: pelo erizado, estrechamiento de cintura, dific ultad para respirar, parálisis de los miembros post eriores y 
parálisis general antes de la muerte. Si estos sínt omas se presentan después de 72 h, observar a los 
animales por otras 24 h hasta completar un total de  4 días. 
19.8.1.5  Si mueren 1 o 2 ratones repetir la inyección. Una muestra se considera positiva para la toxina si 
2/2 o  o = 2/4 ratones mueren, si se presenta la muerte d e los animales dentro de las 2 primeras horas se 
pueden considerar que son debidas a otras causas di ferentes a toxina botulínica. 
19.8.1.6  Si solamente mueren los ratones inoculados con las  muestras tratadas con tripsina, indica la 
presencia de toxina de grupo II y continuar como se  indica en el punto 19.8.3.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
19.8.1.7  Si no se neutralizara la toxina con los antisueros  A, B y E, indica 
a)  La presencia de toxinas no relacionadas en especia l cuando se presentan síntomas atípicos; 
b)  Cantidad insuficiente de antisuero en presencia de  altos niveles de toxina (difícil en caso de muestr as 
clínicas y en la mayoría de los alimentos tóxicos; o 
c)  Incluido un serotipo no común. Si la muestra proba da produce síntomas típicos de botulismo y sin 
embargo no es neutralizada con los antisueros, proc eder de la forma siguiente: 
I)  En casos de muy alta toxicidad, diluir la muestra 1:10 con solución amortiguadora de fosfatos gelatin a y 
repetir la prueba de neutralización. 
II)  Incluir el antisuero F en la prueba de neutralizac ión. 
19.8.2  Muestras sospechosas de contener toxina grupo V (A  o B). 
Proceder como se indica en 4.8.1 omitiendo el tubo No. 6. 
19.8.3  Muestras sospechosas de contener toxina grupo II ( B o E). 
Distribuir en cada uno de los tubos marcados del 1 al 4, 1,2 ml del filtrado. A cada tubo agregar 0,12  ml de 
una solución de tripsina al 1%, incubar a 35ºC por 60 minutos. A los tubos marcados del 2 al 4 agregar  0,12 ml 
de uno de los siguientes antisueros monovalente B o  E y trivalente A, B y E. Mezclar y continuar como se 
indica en 4.8.1 Inyectar 0,5 ml del tubo No. 1 y 0, 6 ml de los tubos 2 al 4. 
Si no hubiese material disponible suficiente, omiti r los tubos con los antisueros monovalentes B y E. 
19.8.4  Determinación de la dosis letal en ratón (DLR) 
Si se quiere titular la toxina, hacer diluciones de cimales de los sobrenadantes tratados, y no tratado s con 
tripsina, generalmente se hacen hasta 1:1000 depend iendo del nivel de toxina esperado, pero nunca 
excediendo 1:10000. Inyectar 2 ratones por dilución . La recíproca de la dilución más alta que causa la  muerte 
multiplicada por 2, es la DLR. Ejemplo: si la muert e ocurre a una dilución de 1:100 pero no de 1:1000,  el nivel 
de toxina es de 200 a 2000 DLR por ml. 
19.9  Identificación de Clostridium  botulinum . 
19.9.1  Quitar el exceso de aire disuelto en los tubos pre parados con medio caldo carne cocida (CMM) y 
caldo glucosa peptona tripticasa extracto de levadu ra (TPGY), mediante calentamiento en baño de agua a  
ebullición por 10 minutos y enfriar antes de usarlo s. Asegurarse de que las tapas de los tubos estén f lojas al 
hacer este proceso. 
19.9.2  Agregar a los tubos de TPGY 1,5 ml de una solución  de tripsina al 1,4% y mezclar suavemente y 
marcar con una T (TPGYT). A los tubos de CMM marcar los con 1 y 2; y 3 y 4 a los tubos con TPGYT. Ver 
tabla No. 3. 
19.9.3  Cualquier tipo de muestra incluyendo los sedimento s, pueden servir como inóculo; éstos además 
tienen la ventaja de que no contienen inhibidores p otenciales, los cuales se han eliminado junto con e l 
sobrenadante, de aquí que los sedimentos pueden con tener grandes cantidades de microorganismos por 
unidad de volumen. 
19.9.4  Colocar aproximadamente 1 g de inóculo a cada uno de los tubos 1 a 3, calentar el tubo No. 2 en 
baño de agua a 75ºC por 20 minutos para seleccionar  esporas resistentes al calor. 
19.9.5  Para seleccionar esporas sensibles o resistentes a l calor, suspender aproximadamente 1 g del 
inóculo en un volumen de 10 a 20 ml de solución de etanol al 50%, o mezclar el inóculo, cuando la mues tra es 
líquida 1:1 con etanol absoluto o de 96%. Mantener las suspensiones o mezclas a temperatura ambiente p or 
60 minutos, centrifugar a 14000 x g durante 15 minu tos, y pasar el sedimento al tubo No. 4. 
19.9.6  Incubar los tubos a 35ºC por 24 horas y a 30ºC por  4 días. Centrifugar aproximadamente 10 ml de 
cultivo a 15000 x g durante 20 minutos. Esterilizar  el sobrenadante por filtración a través de membran as de 
0,45  m, con ayuda de una jeringa desechable. Diluir el filtrado 1:5 con solución amortiguadora de fosfatos  
con gelatina. Continuar como se indica en 17.6.1 pa ra el ensayo de toxina pero omitiendo el tubo No. 6 . 
19.9.7  Si fuera necesario neutralizar con antisuero tipo F, el cual es relativamente débil, determinar la 
toxicidad y diluir con solución amortiguadora de fo sfatos de gelatina el sobrenadante a aproximadament e 10 
DLR/ml. Mezclar volúmenes de 1,25 ml con 0,25 ml de  antisuero F. Inyectar 0,5 ml sin antisuero y 0,6 m l con 
antisuero. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
19.10  Aislamiento de Clostridium  botulinum  a partir de cultivos toxigénicos. 
19.10.1  El aislamiento de cepas productoras de botulismo, se facilita si se dan todas las condiciones para 
la producción de toxina. Si los cultivos de los tub os números 2 o 4 son toxigénicos, uno de éstos debe  
seleccionarse. Sembrar directamente en agar hígado de ternera yema de huevo o en agar para el aislamie nto 
de Clostridium  botulinum  (CBI), en estos medios no se ha observado un enmas caramiento por microflora 
atípica. En el caso de que predominara flora atípic a combinada con la presencia de algunas esporas de C. 
botulinum , el inóculo debe hacerse previo tratamiento con et anol. En el caso de ausencia de esporas, 
reincubar los tubos de enriquecimiento o pasar al m edio de esporulación (Eklund). 
19.10.2  Aislamiento de C. botulinum  de cultivos con presencia moderada de microorganis mos atípicos. 
19.10.2.1  Hacer una tinción de Gram de los cultivos tóxicos.  Si los cultivos 2 y 4 son tóxicos, pueden 
excluirse los tubos 1 y 3. Seleccionar los cultivos  sobre las siguientes bases: 
i)  Bacilos gram positivos atípicos. 
ii)  Número de bacilos gram positivos con esporas. Si e n la tinción se observa un mínimo de 10% de 
bacilos gram positivos, inocular una asada en agar hígado de ternera-yema de huevo y en agar CBI. Incu bar 
en anaerobiosis a 30ºC por 48 horas. 
Nota:  Es importante tomar en cuenta que cultivos viejos de C. botulinum  pueden aparecer como Gram 
negativos. 
19.10.2.2  Seleccionar 5 colonias bien aisladas sobre el agar  hígado de ternera yema de huevo que 
presenten un halo opaco indicativo de lipolisis y p asarlas a caldo TPGY. Seleccionar otras 5 colonias del 
medio agar para el aislamiento de C.  botulinum  rodeadas de un halo opaco con brillo aperlado y pa sar a caldo 
TPGY. Incubar a 30ºC durante 5 días. Hacer pruebas para determinar las toxinas como se indica en 4.6, 
inocular por duplicado los cultivos toxigénicos en agar hígado de ternera yema de huevo, incubar una p laca en 
anaerobiosis y otra en aerobiosis para asegurar pur eza. Nota: Es necesario inocular un gran número de 
colonias, debido a que C.  botulinum  puede enmascararse por otros clostridia que presen tan características 
coloniales similares. 
19.10.3  Aislamiento de C. botulinum  de cultivos con grandes cantidades de microorganis mos atípicos. 
19.10.3.1  Si en la tinción de Gram se observan bacilos gram positivos con esporas, mezclar 2 ml del 
cultivo, con 2 ml de etanol al 96%, y dejar a tempe ratura ambiente por 60 minutos. Inocular una asada en agar 
hígado de ternera yema de huevo y en agar aislamien to de C. botulinum , y continuar como se indica en 
4.10.1. 
19.10.3.2  Si no se presenta esporulación en el medio de enri quecimiento, reincubar por otra semana a 
30ºC o extender 0,1 ml del cultivo en agar de espor ulación de Eklund, e incubar las placas en anaerobi osis  a 
30ºC hasta que las esporas estén presentes en canti dades significativas (generalmente se requieren de 5 a 10 
días. Suspender una asada del cultivo en aproximada mente 2 ml de etanol al 50%, dejar a temperatura 
ambiente por 60 minutos, e inocular en agar hígado de ternera yema de huevo y en agar CBI. Continuar c omo 
se indica en 19.10.1. 
TABLA No. 1 ALGUNAS CARACTERISTICAS DE C. BOTULINUM  GRUPOS I Y II 
GRUPO  CRECIMIENTO 
POR ABAJO DE 10ºC TEMPERATURA PARA CRECIMIENTO 
Y PRODUCCION DE TOXINA 
I A,B, Fb +  + - 30 - 37ºC 
II Bc,E,F b  + - + 26 - 30ºC 
* Algunas cepas de los tipos A y B pueden presentar  subtipos A-B, A-F. B-A. B-F, cada una produce una toxina en 
mayor cantidad (representada por la primera letra d el subtipo). 
b No común 
c No común en Norteamérica       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
TABLA No. 2 PRUEBA DE NEUTRALIZACION Y TOXICIDAD EN  RATON 
TUBO 
No. VOLUMEN DE 
MUESTRA (ML) ANTISUERO VOLUMEN DEL 
ANTISUERO (ML) VOLUMEN IUNOCULADO 
(ML) 
1 1,2 - - 0,5 
2 1,2 AntiA 0,12 0,55 
3 1,2 AntiB 0,12 0,55 
4 1,2 AntiE 0,12 0,55 
5 1,2 Anti A,B,E 0,12 0,55 
6 1,2 Tripsina 0,12 0,55 
 
TABLA No. 3 ENRIQUECIMIENTO 
TUBO No. MEDIO TRATAMIENTO 
1 CMM NINGUNO 
2 CMM CALOR 
3 TPGYT NINGUNO 
4 TPGYT ALCOHOL 
 
20. De las recomendaciones para el tratamiento de c ongelación 
20.1  Para los productos de la pesca con sospecha de con tener parásitos y que se destine para ahumar en 
frío debe ser sometido a un tratamiento previo, con forme a los tiempos y temperaturas que se recomiend an a 
continuación: 
TEMPERATURA  TIEMPO 
-20ºC 7 días 
-35ºC  15 h 
 
21. Método de prueba para el análisis microbiológic o de alimentos envasados herméticamente. 
esterilizados comercialmente 
21.1 Fundamento 
21.1.1  Examen microbiológico de latas no alteradas 
Este examen tiene por objeto determinar la presenci a de microorganismos viables latentes, que resistie ron 
el tratamiento térmico debidamente aplicado y que e n determinadas circunstancias pudieran desarrollars e, 
produciendo alteraciones en el alimento y represent ando un riesgo para el consumidor. 
Los envasados, aun los bien procesados, pueden cont ener esporas de bacilos termofílicos, las cuales so n 
muy resistentes al calor, pero no se desarrollan en  las condiciones normales de almacenamiento y no 
producen problemas de descomposición del producto n i representan un peligro para el consumidor. 
La prueba de esterilidad comercial, puede efectuars e por la observación y análisis del contenido del 
producto, su apariencia, color, olor, pH y examen m icroscópico. 
Estas observaciones se hacen después de la incubaci ón de las latas y siempre comparándolas con otras 
no incubadas. 
Si es necesario efectuar el cultivo o si el product o después de incubarse presenta cualquier cambio, y a 
sea en apariencia, olor, color, pH, o bien presenci a de gas o espuma, proceder como se indica en 5.1 o  5.2, 
dependiendo del pH del alimento. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
21.1.2  Examen microbiológico de latas alteradas 
Este análisis tiene por objeto determinar el origen  de la alteración, la cual puede ser causada por 
microorganismos que sobreviven al tratamiento térmi co o por la introducción de éstos después del 
tratamiento, por defectos de las cerraduras o por g olpes que lesionen el envase. Conociendo la natural eza  
del alimento y su tratamiento, es posible predecir el tipo de organismo responsable de la alteración. 
Numerosas investigaciones han demostrado que el tip o de alteraciones guarda relación con el grado de 
acidez del alimento procesado, por lo que éstos se dividen en dos grandes grupos: 
21.1.2.1  Alimentos de baja acidez, con pH > 4,6, entre los que se encuentran productos cárnicos, lácteos, 
marinos, algunos vegetales, guisados, sopas, etcéte ra. 
21.1.2.2  Alimentos ácidos, con pH <  4,6, entre los que se encuentran tomates, frutas, jugos de cítricos, 
encurtidos, entre otros. 
21.2  Reactivos y materiales 
A continuación se presentan las fórmulas y los proc edimientos para preparar los medios y reactivos 
empleados en el análisis microbiológico de los prod uctos envasados herméticamente y sometidos a 
esterilización comercial. En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas equivalentes, se  
deben seguir las instrucciones del fabricante. 
21.2.1  Medios de cultivo y soluciones 
21.2.1.1  Caldo glucosa púrpura de bromocresol (CGPB) 
FORMULA 
Glucosa  100 g 
Extracto de carne  30 g 
Peptona (P. Ej. caseína)  50 g 
Púrpura de bromocresol  20 ml 
(1 6% en etanol) 
Agua destilada  1 0000 ml 
pH final = 7,0 ± 0,2 
Disolver los ingredientes en el agua, ajustar el pH  y envasar en tubos de 22 x 175 mm, en volúmenes de  
12 a 15 ml. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1° C po r 15 min. 
21.2.1.2  Caldo de hígado picado o caldo carne cocida (CH o CCC) 
FORMULA 
Hígado o carne magra de res  500,0 g 
Agua destilada  800,0 ml 
Peptona  10,0 g 
Fosfato dipotásico  1,0 g 
Almidón soluble  1,0 g 
pH final = 7,0 ± 0,2 
Poner el hígado o la carne picada en agua, calentar  a ebullición y dejar a fuego lento durante una hor a. 
Enfriar, retirar la capa de grasa, ajustar el pH y hervir otros 10 min. Filtrar a través de gasa o man ta de cielo, 
presionando para quitar el exceso de líquido. Enfri ar y agregar al caldo la peptona, el fosfato y el a lmidón 
soluble. Ajustar el pH y llevar el volumen del cald o a 1 000 ml con agua destilada. Filtrar a través d e papel 
filtro grueso; en este paso el caldo y la carne pue den guardarse en refrigeración, si el medio no pued e 
terminarse el mismo día. Envasar en tubos de 22 x 1 75 mm volúmenes de 10 a 12 ml de caldo y depositar 
suficiente hígado o carne picada para que ocupe una  altura de 1,25 cm del fondo del tubo. Esterilizar a 121 ± 
1° C por 15 min.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
21.2.1.3  Caldo extracto de malta 
FORMULA 
Extracto de malta  6,0 g 
Maltosa  1,5 g 
Glucosa  6,0 g 
Extracto de levadura  1,0 g 
Agua destilada  1 000,0 ml 
pH final = 4,7 ± 0,2 
Disolver los ingredientes con agitación constante. Ajustar el pH a 4,7 ± 0,2, envasar en tubos de 22 x  175 
mm en volúmenes de 12-15 ml. Esterilizar en autocla ve a 121 ± 1° C por 15 min. Exponer al calor el meno r 
tiempo posible. 
21.2.1.4  Caldo ácido 
FORMULA 
Proteosa peptona  5,0 g 
Extracto de levadura  5,0 g 
Glucosa  5,0 g 
Fosfato dipotásico  4,0 g 
Agua destilada  1 000,0 ml 
pH final = 5,0 ± 0,2 
Disolver los ingredientes en 1 l de agua y envasar en tubos de 22 x 175 mm en volúmenes de 12 a 15 ml.  
Esterilizar en autoclave a 121 ± 1° C por 15 min. 
21.2.1.5  Agar papa dextrosa o dextrosa Sabouraud 
21.2.1.5.1  Agar papa dextrosa 
FORMULA 
Infusión de papa  200,0 ml 
Glucosa  20,0 g 
Agar  15,0 g 
Agua destilada  1 000,0 ml 
pH final = 3,5 
Lavar, pelar y rebanar papas de tamaño mediano (250  g). Hervir durante 30 min en 290 ml de agua 
destilada. Filtrar varias veces a través de gasa y algodón. En esta infusión, disolver los demás ingre dientes. 
Añadir agua destilada hasta completar el volumen (1 000 ml). Calentar a ebullición, hasta la disolución  total de 
los ingredientes. Ajustar el pH a 5,6 ± 0,2. Distri buir en volúmenes de 100 ml y esterilizar en autocl ave a 121 ± 
1° C. Enfriar a 45 - 48° C y acidificar a pH 3,5 con solución estéril de ácido tartárico al 10% (aproxim adamente 
1,4 ml de ácido por cada 100 ml de medio). Una vez que se ha agregado el ácido tartárico, no se vuelve  a 
calentar el medio. 
21.2.1.5.2 Agar dextrosa Sabouraud 
FORMULA 
Polipeptona o neopeptona  10,0 g 
Dextrosa  40,0 g 
Agar  15,0 g 
Agua destilada  1 000,0 ml 
pH final = 5,6 ± 0,2 Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
Calentar hasta disolución completa. Esterilizar en autoclave a 118 - 121° C por 15 min, no exceder de 1 21 
± 1° C. 
21.2.1.6  Agar hígado de ternera 
FORMULA 
Infusión de hígado  50,0 g 
Infusión de ternera  500,0 g 
Proteosa peptona  20,0 g 
Neopeptona  1,3 g 
Triptona  1,3 g 
Glucosa  5,0 g 
Almidón soluble  10,0 g 
Caseína isoeléctrica  5,0 g 
Cloruro de sodio  5,0 g 
Nitrato de sodio  2,0 g 
Grenetina  20,0 g 
Agar  15,0 g 
Agua destilada  1 000,0 ml 
pH final = 7,3 ± 0,2 
Mezclar los ingredientes con agua destilada y calen tar a ebullición hasta su disolución total. Ajustar  el pH y 
esterilizar a 121 ± 1° C por 15 min. 
21.2.1.7  Agar nutritivo 
FORMULA 
Extracto de carne  3,0 g 
Peptona  5,0 g 
Agar  15,0 g 
Agua destilada  1 000,0 ml 
pH final = 7,3 ± 0,2 
Suspender los ingredientes en agua destilada y diso lverlos por ebullición. Ajustar el pH. Distribuirlo  en 
volúmenes adecuados en matraces o botellas y esteri lizar a 121 ± 1° C por 15 min. 
21.2.1.8  Solución estéril de ácido tartárico al 10% 
Disolver 10,0 g de Acido tartárico y llevar a 100 m l con agua destilada. Esterilizar en autoclave a 12 1 ± 1° C. 
21.2.1.9  Colorante de azul de metileno 
Solución A Azul de metileno (pureza no < 90%) 0,3 g  Etanol (95%) 90,0 ml 
Solución B Solución 0,01% de hidróxido de 100,0 ml potasio 
Mezclar A y B 
21.2.1.10  Colorante de cristal violeta 
Cristal violeta (pureza no < 90%) 2,0 g 
Etanol (95%) 20,0 ml 
Agua destilada 80,0 ml       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
21.2.1.11  Colorante de Gram 
Solución A Cristal violeta (pureza no < 90%) 2,0 g Etanol (95%) 20,0 ml 
Solución B Oxalato de amonio 0,8 g Agua destilada 8 0,0 ml 
Mezclar solución A y B dejar reposar 24 h al abrigo  de la luz, filtrar por papel filtro grueso. 
Solución de yodo para Gram 
Yodo (cristales) 1,0 g 
Yoduro de potasio 2,0 g 
Agua destilada 300,0 ml 
Mezclar el Yodo y el Yoduro de potasio en un morter o y triturar hasta fino polvo. Agregar 1 ml de agua  y 
mezclar, agregar 5 ml de agua y mezclar, agregar 10  ml de agua y mezclar. Vaciar esta solución a un fr asco 
reactivo, lavar el mortero y el pistilo con suficie nte agua hasta completar los 300 ml. 
21.2.2  Materiales 
/square4 Mecheros de Bunsen o Fischer. 
/square4 Abrelatas sanitarios. 
/square4 Pinzas, espátulas y cucharas. 
/square4 Charolas. 
/square4 Pipetas serológicas de 10 ml con tapón de algodón.  
/square4 Pipetas despuntadas o tubos de 8 mm de diámetro co n tapón de algodón. 
/square4 Propipeta o bulbo para pipeta. 
/square4 Tubos de cultivo de 18 x 150 o de 22 x 175 mm. 
/square4 Embudos grandes de tallo corto. 
/square4 Portaobjetos. 
/square4 Cajas de Petri estériles. 
/square4 Punzón para latas. 
/square4 Asa de platino o nicromel en porta-asas. 
/square4 Cepillo para lavar las latas. 
/square4 Toallas o gasas estériles. 
/square4 Solución de yodo al 4% (en etanol al 70%). 
/square4 Sistema de anaerobiosis. 
/square4 Varillas de vidrio de 20 cm de longitud y 3 mm de grueso, dobladas en ángulo recto de 5 cm en uno 
de sus extremos. 
/square4 Azul de metileno, cristal violeta o equipo para ti nción de Gram. 
21.3  Aparatos e instrumentos 
/square4 Autoclave con termómetro o manómetro. 
/square4 Horno para esterilizar a 180° C. 
/square4 Incubadoras con termómetro y termostato que evite variaciones > de 0,1° C. 
/square4 Potenciómetro de escala expandida. 
/square4 Microscopio compuesto. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
21.4 Preparación de las muestras 
21.4.1  Llevar un registro en el laboratorio en donde se a noten: 
21.4.1.1  El número de lote (o señalar si éste no existe o e stá incompleto) 
21.4.1.2  Todos los datos importantes para la identificación  del producto que aparezcan en la etiqueta; 
identificar la muestra en forma indeleble, antes de  remover la etiqueta. Conservar el envase y la etiq ueta. 
21.4.1.3  Los defectos físicos que se observen en el envase como abolladuras, golpes que lo deformen, 
oxidación, derrames, defectos aparentes de las cerr aduras, abombamiento, etcétera. 
Según su apariencia externa clasificarlas como sigu e: 
21.4.2  Latas 
21.4.2.1  Latas planas o normales. 
21.4.2.2  Abombamiento ligero (Flipper), Grado I. Unicamente  uno de los extremos de la lata se encuentra 
ligeramente abombado, pero puede comprimirse fácilm ente. 
21.4.2.3  Abombamiento elástico (Springer), Grado II. Uno de  los extremos se encuentra abombado; al 
presionarle el extremo opuesto se abulta. 
21.4.2.4  Hinchazón (Soft swell), Grado III. Ambos extremos se encuentran abombados, pero pueden 
comprimirse o ceden ligeramente a la presión. 
21.4.2.5  Hinchazón (Hard swell), Grado IV. Ambos extremos s e encuentran abombados y no pueden 
comprimirse: la lata puede reventar. 
21.4.3  Frascos de vidrio 
21.4.3.1  Tapa normal 
21.4.3.2  Tapa abombada 
21.4.4  Incubación de los envases 
21.4.4.1  Incubación de productos en envases de apariencia n ormal. 
La prueba más confiable para determinar la esterili dad comercial es la incubación del producto a 
temperaturas apropiadas y por un tiempo suficiente para que cualquier microorganismo que se encuentre 
pueda desarrollarse bajo las condiciones del produc to envasado, dando origen a manifestaciones ya sea en el 
envase o en el producto. Incubar de 30 a 35° C por 1 0 a 14 días. 
Observar diariamente los envases. La manifestación de crecimiento es la hinchazón en diferentes grados  y 
en los envases de vidrio se pueden observar los cam bios en el alimento o la formación de burbujas. En cuanto 
se detecte hinchazón en el producto o cualquier otr a desviación suspender la incubación. 
Al final del periodo de incubación, abrir las latas  para descubrir descomposición ácida (flat sour), p or 
cambios en el color, olor, consistencia y pH del al imento. Preparar extensiones, teñirlas con azul de metileno o 
tinción de Gram y observarlas microscópicamente. El  hallazgo de cualquier anormalidad indica que el 
producto no está comercialmente estéril y se debe p roceder como para los envases alterados. 
21.4.4.2  Incubación de envases sospechosos o alterados 
Analizar de inmediato una o varias unidades de la m uestra e incubar el resto de las latas que no prese nten 
alteración evidente o con abombamiento de grado I d e 30 a 35° C por 10 a 14 días. 
Los envases con abombamiento muy evidente no deben incubarse. Aquellas que se clasifiquen como 
grado III o IV de no analizarse en el momento, debe rán refrigerarse. 
21.4.5  Apertura de las latas o envases 
21.4.5.1  Area de trabajo 
Se debe trabajar preferentemente en un gabinete de flujo laminar que proporcione un ambiente ultra-
limpio, clase 100* 
La desinfección de la superficie de trabajo se pued e hacer con alcohol o sales cuaternarias de amonio a la 
concentración recomendada por el fabricante. Poster iormente se debe poner a trabajar el flujo, 30 min antes 
de efectuar el trabajo.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Para controlar la eficacia del flujo, se deben pone r como testigos cajas con medio de cultivo abiertas , a los 
lados y al centro del área de trabajo, durante todo  el tiempo que dure la operación. 
Si no se tiene el equipo necesario, se puede utiliz ar un cuarto o cubículo perfectamente limpio, lavad o con 
agua y jabón, desinfectándolo con un agente bacteri cida apropiado. En este caso se trabajará entre dos  
mecheros Bunsen. 
21.4.5.2  Personal 
El personal debe trabajar con bata limpia. Si tiene  el pelo largo, debe usar turbante. El uso de masca rillas 
quirúrgicas es opcional. El personal enfermo con gr ipe o cualquier otro problema infeccioso no debe in tervenir 
en el análisis. 
21.4.6  Preparación de latas o envases normales 
Lavar el envase con un cepillo, usando agua calient e y jabón; enjuagar y dejar secar. 
Remojar con un sanitizante durante 10 a 15 min, la tapa contraria a donde está grabado el lote. Escurr ir el 
líquido y secar con la flama de un mechero. 
Destapar con un abridor de latas sanitario estéril.  
En las latas de cierre de anillo o dispositivos abr e fácil, abrir por la cara opuesta. 
* El equipo debe proveer un ambiente libre de partí culas de 0,3 micras con una eficiencia del 99,99% e n 
un flujo de 100 pies3/min. 
21.4.6.1  Frascos de vidrio 
Lavar la tapa del frasco y sumergirlo durante 15 mi n en una solución sanitizante, de manera que quede 
cubierta la tapa; esta solución puede ser cloro 100  mg/kg. Colocar un algodón estéril en torno a la ta pa y con 
un punzón estéril hacer un orificio en el centro, a  fin de que se pierda el vacío y pueda abrirse con facilidad. 
Abrir el frasco sin contaminar los bordes del mismo . 
21.4.7  Preparación de latas o envases alterados 
Lavar el envase con un cepillo, con agua caliente y  jabón; enjuagar y secar. Si la lata está muy infla da, 
mantener en el refrigerador antes de abrirla. Limpi ar y sanitizar la tapa con una solución de cloro 10 0 mg/kg o 
yodo al 2% en alcohol al 70%; limpiar con una gasa estéril. 
En latas muy infladas de pH muy ácido, es necesario  hacer una prueba para hidrógeno, con objeto de 
conocer si el gas se debe a la acción del ácido sob re el metal. 
Para ello, practicar una pequeña puntura en el cent ro de la tapa y recibir el gas en un tubo de ensayo  
invertido; inmediatamente ponerlo sobre la flama. U na pequeña explosión indica la presencia de hidróge no. 
No debe flamearse directamente el orificio de la la ta. 
Para abrir latas infladas, colocar un embudo invert ido con un algodón estéril sobre la tapa y picar co n un 
picahielo estéril, hasta desalojar el gas antes de abrir la lata. 
21.5  Procedimiento 
Abrir la lata entre dos mecheros Bunsen o en el gab inete de flujo laminar vertical. Tomar porciones ta nto 
del contenido sólido como del líquido; si es posibl e, homogeneizar. Utilizando utensilios adecuados a la 
naturaleza del producto (espátulas, pinzas, tubos d e vidrio, pipetas, etcétera) transferir aproximadam ente 2 g 
o 2 ml del producto a los tubos con el medio que se  va a utilizar, dependiendo del pH del alimento. 
Conservar una muestra en un frasco estéril, para cu alquier aclaración o para efectuar pruebas biológic as. 
Hacer una extensión en un portaobjetos del contenid o de la lata, ya que muchas veces los gérmenes 
causantes del deterioro mueren durante el almacenam iento y sólo el examen microscópico puede dar una 
idea de los microorganismos involucrados en la desc omposición. Preparar las extensiones mediante una a sa 
de platino. Si el alimento es sólido o muy espeso, agregar una pequeña cantidad de agua estéril. Si es  muy 
grasoso, depositar sobre la extensión una pequeña c antidad de xilol con posterioridad a su fijación po r calor. 
Una vez tomada la muestra, anotar el estado del ali mento: su olor, cambios en su color, consistencia, 
etcétera. No debe probarse. Determinar el pH y vaci ar el contenido de la lata. Observar su interior, a notando 
el estado del barniz, la presencia de manchas, defe ctos del frasco o de la tapa, etcétera. Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
21.5.1  Examen de alimentos envasados de baja acidez (pH >  a 4,6) 
Inocular aproximadamente 2 g o 2 ml, en cada uno de  4 tubos con caldo hígado, previamente calentado a 
100° C para expulsar el oxígeno disuelto, y enfriar rápidamente. 
Inocular asimismo, 4 tubos de caldo púrpura de brom ocresol. 
Incubar según el siguiente esquema: 
MEDIO DE CULTIVO TUBOS TEMPERATURA TIEMPO INVESTIGA CION 
Caldo hígado o CCC 2 35° C 96 h/120 h Mesofílicos an aerobios 
Caldo hígado o CCC 2 55° C 24 h/72 h Termofílicos an aerobios 
Caldo púrpura de bromocresol 2 35° C 96 h/120 h Meso fílicos aerobios 
Caldo púrpura de bromocresol 2 55° C 24 h/48 h Termo fílicos aerobios 
 
Transferir los alimentos líquidos por medio de una pipeta, utilizando un bulbo o propipeta. ¡Precaució n! 
Tener ciudado al manipular el producto, incluso cua ndo provenga de envases aparentemente normales. ¡La  
Toxina botulínica puede estar presente! Observar lo s tubos diariamente, hasta el término del tiempo de  
incubación si no hay crecimiento en todos los tubos , descartar e informar como NEGATIVO. 
Cuadro 1 DIAGRAMA DEL PROCEDIMIENTO DE CULTIVO PARA  ALIMENTOS ENLATADOS DE BAJA 
ACIDEZ (> 4 ,6). 
CULTIVO ORIGINAL  TEMPERATURA  SUBCULTIVO   CULTIVO PURO  IDENTIFICACION  
CH o CCC 
y 
CGPB  
35° C 
96/120 h AN o AHT 
Aeróbico 
 
AN o AHT 
Anaeróbico Crecimiento 
  
 
Crecimiento Frotis 
CH o CCC 
 
Frotis 
CH o CCC Tinción de Gram 
Anaeróbico 
AN o AHT 
Tinción de Gram 
Aeróbico 
AN o AHT 
CH o CCC 
y 
CGPB  
55° C 
24/72 h AN o AHT 
Aeróbico 
 
AN o AHT 
Anaeróbico Crecimiento 
 
 
Crecimiento Frotis 
CH o CCC 
 
Frotis 
CH o CCC Tinción de Gram 
Anaeróbico 
 
Tinción de Gram 
Aeróbico 
AN o AHT 
CH = Caldo Hígado de Ternera AN = Agar Nutritivo 
CCC = Caldo Carne Cocida AHT = Agar Hígado de Terne ra 
CGPB = Caldo Púrpura de Bromocresol 
 
DIAGRAMA DEL PROCEDIMIENTO DE CULTIVO PARA ALIMENTO S ENLATADOS ACIDOS (   4 ,6). 
CULTIVO 
ORIGINAL TEMPERATURA SUBCULTIVO  CULTIVO 
PURO IDENTIFICACION  
 
CA,CEM  
30° C 
96/120 h AN, ADS o ADP  
Aeróbico 
AN, ADS o ADP  
Anaeróbico Crecimiento 
 
Crecimiento Frotis 
CA, CEM 
Frotis 
CA, CEM Tinción de Gram 
Anaeróbico 
AN, ADS o ADP 
Tinción de Gram 
Aeróbico 
AN, ADS o ADP 
CA  
55° C 
24/72 h AN 
Aeróbico 
 
AN 
Anaeróbico Crecimiento 
 
 
Crecimiento Frotis 
CA 
 
Frotis 
CA Tinción de Gram 
Anaeróbico 
AN 
Tinción de Gram 
Aeróbico 
AN 
CA = Caldo Acido AN = Agar Nutritivo 
CEM = Caldo Extracto de Malta ADS = Agar Dextrosa S abouraud 
ADP = Agar Papa Dextrosa       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
Si hay crecimiento, hacer frotis y teñir-resembrar a placas de agar hígado de ternera (sin yema de hue vo) 
o agar nutritivo. Incubar a 35° C y 55° C una placa e n aerobiosis y anaeróbico (ver cuadro 1) continuar la 
incubación a 35° C de caldo de hígado (CH) o caldo c arne cocida (CCC) hasta un máximo de 5 días y guard ar 
para determinación de toxina (cuando proceda). 
Observar los agares y seleccionar un número represe ntativo de los diferentes tipos de colonias y 
resembrar a CH y CCC a la temperatura y las condici ones según se especifica en el cuadro 1 (a 35° C por  
96/120h y 55° C por 24/72h). 
Expulsar el oxígeno inmediatamente antes de utiliza r el CH que se va a incubar en anaerobiosis. Manten er 
viables los cultivos puros aislados. Hacer tinción de Gram. 
21.5.1.1  Cuando se presente crecimiento microbiano durante las pruebas para esterilidad comercial en un 
enlatado y no haya evidencia de descomposición del alimento, efectuar la confirmación de la siguiente forma: 
21.5.1.1.1  Obtener cultivos puros de la cepa o cepas encontra das. 
21.5.1.1.2  Seleccionar otro envase del mismo producto y el mi smo lote que el anterior. 
21.5.1.1.3  En condiciones asépticas, practicar una pequeña pe rforación en el extremo de la lata o cerca 
del cierre. 
21.5.1.1.4  Inocular el producto con la cepa por abajo de la s uperficie. 
21.5.1.1.5  Flamear el orificio para crear vacío y sellar asép ticamente con soldadura o un material similar. 
21.5.1.1.6  Después de inocular, incubar a 30-35° C durante 10 días. 
21.5.1.1.7  Abrir el enlatado y examinar el producto. 
El aspecto del producto debe ser igual al que se ob servó en el envase de donde se obtuvo el cultivo. S i en 
el primer enlatado el producto fue de apariencia no rmal, pero se obtuvo crecimiento y en el segundo, 
inoculado con la flora microbiana aislada del prime ro, se encuentra el producto alterado (gas, consist encia 
diferente, olor, etcétera), debe considerarse que e l primer enlatado era comercialmente estéril y que el 
crecimiento fue el resultado de un procedimiento de ficiente por el laboratorio. Si se encuentra flora mixta 
únicamente en el CGPB, hacer informe de los tipos m orfológicos. Si hay flora mixta en CH/CCC entre la cual 
se incluyan bacilos, hacer prueba toxina. Si se obs ervan únicamente bacilos Gram positivo o Gram varia ble 
típicos del género Bacillus  o Clostridium  investigar presencia de esporas. En algunos casos las células 
vegetativas envejecidas pueden dar la apariencia de  Gram negativo y debe considerarse como si fuera Gr am 
positivo. Determinar la presencia de toxina. Esta p rueba la podrá realizar un laboratorio oficialmente  
acreditado por las autoridades correspondientes. 
21.5.2  Examen microbiológico de alimentos envasados de ac idez alta (pH <  4,6) 
Inocular 2 g o 2 ml de alimento en 4 tubos de caldo  ácido y 2 tubos de caldo extracto de malta. 
Incubar según el esquema: 
MEDIO DE CULTIVO TUBOS TEMPERATURA TIEMPO INVESTIGA CION 
Caldo ácido 2  30° C 96 h Lactobacilos, hongos y lev aduras 
Caldo ácido 2 55° C 48 h Termofílicos de descomposic ión ácida 
Caldo extracto de malta 2 30° C 96 h Lactobacilos, h ongos y levaduras 
 
21.6  Expresión de resultados 
21.6.1  Envases normales 
Conviene extremar los cuidados al efectuar los ensa yos, seleccionar las muestras e interpretar los 
resultados de las pruebas para demostrar la esteril idad comercial, ya que cualquier error basado en fa llas de 
manipulación o interpretación, puede originar la de strucción de un lote comercialmente estéril, como Lunes 25 de agosto de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Sección)      
contaminado. Al incubar el enlatado o al recibirse la lata, la presencia de hinchazón, principalmente cuando es 
muy acentuada, indica contaminación microbiana. Est as condiciones deben ser confirmadas demostrando la  
presencia de un gran número de microorganismos en l as extensiones preparadas directamente a partir del  
alimento, descubriendo cambios en el aspecto del pr oducto (consistencia, olor, coloración anormal) o 
variaciones en el pH, en comparación siempre con un  producto normal. Los cultivos se practican por 
duplicado, cuando hay contaminación, en ambos tubos  se debe hallar una flora similar a la encontrada e n las 
extensiones de la muestra original. Encontrar sólo uno de los tubos de cultivo positivo y otro negativ o, puede 
indicar una contaminación por manipulación en el la boratorio, a menos que se compruebe que existe el m ismo 
tipo de flora que en la extensión de la muestra ori ginal. 
A veces existe alguna dificultad en diferenciar par tículas del alimento de microorganismos. Otras vece s las 
levaduras o lactobacilos participan en la producció n del alimento, como sucede en algunos productos 
obtenidos por fermentación. En estos casos, aunque ya no sean viables, los microorganismos pueden 
aparecer en la extensión, y sólo la experiencia y e l conocimiento de los procesos permite interpretar 
correctamente los resultados. 
21.6.2  Envases alterados, con pH > de 4,6 
21.6.2.1  Presencia de mesofílicos aerobios 
La flora presente en este caso, puede estar constit uida por bacilos o ser mixta. 
21.6.2.1.1  Presencia de bacilos esporulados 
Generalmente consiste en esporas termorresistentes de diferentes especies de bacilos. Regularmente el 
alimento no presenta alteraciones, ya que las espor as no pueden desarrollarse en condiciones de 
anaerobiosis; sin embargo, se han encontrado altera ciones producidas por bacilos con esporas resistent es 
(Bacillus  mesentericus  y Bacillus subtilis ), en alimentos de acidez media, con tratamiento té rmico adecuado, 
pero con vacío incompleto. También se ha encontrado  Bacillus ß nigrificans , en conservas de betabeles con 
ennegrecimiento del producto. 
21.6.2.1.2  Presencia de flora mixta 
La presencia de flora mixta se debe generalmente a la penetración de gérmenes, con posterioridad al 
proceso térmico, actuando como vehículo el agua de enfriamiento. La flora que se observa puede ser muy  
variada. 
La penetración de los gérmenes se debe a defectos e n las cerraduras, que permiten el paso de los 
microorganismos. Las latas generalmente se encuentr an infladas y pueden mostrar defectos o derrames. 
El pH y el aspecto del producto varían. 
21.6.2.2  Presencia de mesofílicos anaerobios 
Consiste de anaerobios del género Clostridium , entre los que se encuentran C. sporogenes , C.  putrificans, 
C. hystoliticum, C. bifermentans, C. perfringens  y C. botulinum ; este último es el de mayor importancia 
sanitaria, por producir una toxina muy potente. Las  latas pueden estar parcialmente infladas y el prod ucto 
parcialmente digerido; el olor es pútrido. El pH au menta. En este caso, es necesario practicar la prue ba en 
animales, tanto del producto como del filtrado del cultivo, para investigar la presencia de la toxina.  Esta prueba 
la podrá realizar un laboratorio oficialmente acred itado por las autoridades correspondientes. 
21.6.2.3  Presencia de termofílicos aerobios 
Consta de bacilos termofílicos estrictos o facultat ivos, que poseen esporas muy resistentes al calor 
(especie tipo B. stearothermophilus , causante de la descomposición ácida flat sour). L as latas son planas, sin 
alteración y con marcado aumento de la acidez del p roducto; puede haber olor anormal o enturbiamiento del 
líquido.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 25 de agosto de 2008 
21.6.2.4  Termofílicos anaerobios 
Pertenecen también al género Clostridium , con esporas muy resistentes al calor. 
La especie tipo C. thermosaccharolyticum,  es un anaerobio estricto no productor de sulfhídri co; las latas se 
encuentran infladas. 
Otro tipo de descomposición poco común, puede ser c ausada por C. nigrificans, que produce sulfhídrico 
con ennegrecimiento del producto. 
21.6.3  Interpretación de resultados en alimentos de acide z alta 
21.6.3.1  Presencia de mesofílicos aerobios 
21.6.3.1.1  Presencia de Lactobacillus . La descomposición por bacterias acidúricas no for madoras de 
esporas, puede deberse a varias especies del género  Lactobacillus . Se han aislado L. lycoperci, L. 
pentoaceticus, L. menitipolum  y L. pleofructi . 
21.6.3.1.2  Presencia de levaduras. El hallazgo de levaduras i ndica falta de procesamiento. Las latas 
contaminadas generalmente se presentan muy hinchada s y el olor del producto es característico de levad ura 
(olor ácido). Entre las levaduras se han aislado es poras del género Torula. 
21.6.3.1.3  Presencia de hongos. Otro tipo de descomposición p uede ser causada por hongos como 
Byssochlamys fulva , que forma esporas muy resistentes al calor. Se ha n encontrado también algunas cepas 
de Penicillium; en estos casos generalmente las lat as se encuentran planas, sin alteración y el hongo crece en 
la superficie del producto. 
21.6.3.2  Mesofílicos anaerobios 
Clostridium pasteurianum  causa una descomposición poco frecuente, en que la s latas se encuentran 
infladas y con olor butírico. Si se sospecha este t ipo de contaminación, sembrar un tubo con medio o c aldo 
ácido en anaerobiosis a 35° C. 
21.6.3.3  Termofílicos aerobios 
La descomposición por termofílicos aerobios produce  el tipo flat-sour, o sea la descomposición ácida. Las 
latas se encuentran planas y se observan cambios en  el vacío; entre los gérmenes causantes está B. 
coagulans , que es el responsable de la descomposición de pro ductos derivados del jitomate y de la 
producción de grumos de leche evaporada. 
21.6.3.4  Termofílicos anaerobios 
La descomposición por termofílicos anaerobios es po co frecuente en productos ácidos. La producen 
anaerobios butíricos. 
En productos de acidez muy alta, con pH inferior a 3,7, como col agria, encurtidos, etcétera, la 
descomposición puede deberse a las bacterias ya señ aladas, pero generalmente la acidez inhibe el desar rollo 
de gérmenes. En muchos casos, la hinchazón de la la ta se debe a causas químicas, por formación de 
hidrógeno. 
21.6.4  Observaciones generales 
Algunas veces se pueden encontrar cultivos negativo s, procedentes de latas anormales, o de latas 
normales con productos descompuestos. Esto puede de berse a que la alteración ocurrió antes del 
procesamiento térmico del enlatado y han muerto los  microorganismos que la originaron, o bien a que en  un 
producto contaminado, los gérmenes murieron al agot arse el oxígeno o los nutrientes. 
En estos casos, un examen microscópico del producto  puede ayudar al diagnóstico. 
22. Procedimiento al Trasluz para la detección de p arásitos. 
22.1  Para detectar los parásitos se coloca una muestra sobre una lámina acrílica de 5 mm de espesor, de 
45% de traslucidez y una fuente luminosa de 1500 lu x a una distancia de 30 cm por encima de la lámina.  
22.2  La infestación parasítica podrá detectarse mediant e este procedimiento al trasluz, por examen visual.