中华人民共和国国家标准  
 
GB xxxx—xxxx 
 
  
中华人民共和国卫生部    发布 xxxx -xx-xx发布  
 xxxx -xx-xx实施  
 食品安全国家标准  
鲜河豚鱼中河豚毒素的测定  
 GB xxxx—xxxx  
I 前    言 
本标准代替 GB/T5009.206 -2007《鲜河豚鱼中河豚毒素的测定 》。 
本标准与 GB/T5009.206 -2007相比，主要变化 如下：  
——增加了对规范性引用文件的说明；  
——修改了试剂 和材料； 
——修改了仪器和设备 ； 
——修改了分析步骤；  
——修改了分析结果的表述 。 
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1 食品安全国家标准  
鲜河豚鱼中河豚毒素的测定  
1 范围  
本标准规定了 鲜河豚鱼中河豚毒素（ tetrodotoxin ）的测定方法。  
本标准适用于 鲜河豚鱼中 河豚毒素 的测定。  
2 原理  
样品中的河豚毒素经提取、脱脂 后，与定量的特异性酶标抗体反应，多余的游离酶标抗体则与酶
标板内的包被抗原结合，加入底物后显色，与标准曲线比较来测定 河豚毒素 含量。 
3 试剂和材料  
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的二级以上水。  
3.1 试剂  
3.1.1 辣根过氧化物酶标记的 抗河豚毒素单克隆抗体： 杂交瘤技术生产并经纯化的抗 河豚毒素 单克隆
抗体，用辣根过氧化物酶（ HRP）标记， -18℃~-80℃保存，冷冻干燥后的酶标抗体可 室温、 4℃
或-20℃保存。 
3.1.2 人工抗原： 河豚毒素 -载体蛋白连接物 ，-18℃~-80℃保存，冷冻干燥后的酶标抗体可 室温、 4℃
或-20℃保存。 
3.1.3 乙酸（CH 3COOH）。  
3.1.4 乙酸钠（ CH 3COONa）。 
3.1.5 乙醚（CH 3OCH 3）。 
3.1.6 氢氧化钠（ NaOH）。  
3.1.7 磷酸二氢钾（ KH 2PO 4）。 
3.1.8 十二水合 磷酸氢二钠（ Na2HPO 4· 12H 2O）。 
3.1.9 氯化钠（ NaCl）。 
3.1.10  氯化钾（ KCl）。 
3.1.11  碳酸钠（ Na2CO 3）。 
3.1.12  碳酸氢钠（ NaHCO 3）。 
3.1.13  牛血清白蛋白（ BSA）：纯度≥98%。 
3.1.14  吐温 -20（Tween -20）。 GB xxxx—xxxx  
2 3.1.15  柠檬酸（ C6H8O7·H2O）。 
3.1.16  3, 3, 5, 5 -四甲基联苯胺（ TMB）（C16H20N2）。 
3.1.17  N，N-二甲基甲酰胺 （DMF）（C3H7NO）。 
3.1.18  过氧化氢（ H2O2）：2~8℃避光保存。 
3.1.19  硫酸（ H2SO 4）：浓度 98%。 
 
3.2 溶液配制  
3.2.1 乙酸盐缓冲液 （0.2mol/L，pH4.0） 
3.2.1.1  乙酸溶液 （10%）：取乙酸 10mL，用水定容至 100mL。 
3.2.1.2  乙酸盐缓冲液 （0.2mol/L，pH4.0）：称取乙酸钠 16.4g，加 950mL水溶解，再用 10%乙酸溶
液调 pH值至 4.0后，用水定容至 1000mL。 
3.2.2 磷酸盐缓冲液 （PBS）（0.01mol/L ，pH7.4）：分别称取 KH 2PO 4 0.2g、Na2HPO 4· 12H 2O 2.9g、
NaCl  8.0g、KCl 0.2g，加水溶解并定容至 1000mL。 
3.2.3 乙酸溶液 （0.1%）：取1mL乙酸，加 水定容至 1000 mL。 
3.2.4 氢氧化钠溶液（ 1mol/L）：称取 NaOH  40.0g，加水溶解并定容至 1000mL。 
3.2.5 包被缓冲液（ 0.05mol/L ，pH9.6碳酸盐缓冲液） ：分别称取 Na2CO 31.6g、NaHCO 32.9g，加水
溶解并定容至 1000mL。 
3.2.6 封闭液：称取 BSA 2.0g，加 PBS溶解并定容至 1000mL，2~8℃保存。  
3.2.7 抗体稀释液 ：称取 BSA1.0g，加 PBS溶解并定容至 1000mL，2~8℃保存。 
3.2.8 磷酸盐 -吐温缓冲液 （PBS-T）（0.01mol/L ，pH7.4）：取0.5mL吐温 -20，加 PBS溶解并定容
至1000mL。 
3.2.9 底物缓冲液  
3.2.9.1  柠檬酸溶液（ 0.1mol/L）：称取柠檬酸 21.0g，加水溶解并定容至 1000mL。 
3.2.9.2  磷酸氢二钠溶液（ 0.2 mol/L ）：称取 Na2HPO 4· 12H 2O 71.6 g，加水溶解并定容至 1000mL。 
3.2.9.3  底物缓冲液：取柠檬酸溶液 24.3mL、磷酸氢二钠溶液 25.7mL，加水定容至 100mL，现用现
配。 
3.2.10  底物溶液  
3.2.10.1  TMB储存液：称取 0.2gTMB ，加 N, N -二甲基甲酰胺溶解并定容至 20mL，2~8℃避光保存 ； 
3.2.10.2  取75µ LTMB 储存液、 10mL底物缓冲液和 10µ LH 2O2混合而成 ，现用现配 。 GB xxxx—xxxx  
3 3.2.11  终止液（ 2mol/L硫酸溶液） ：取108.5 mL 98%的浓硫酸， 沿玻棒缓慢加至盛有 500.0 mL水的
玻璃容器中 ，边加边搅拌，直到混合均匀；将 烧杯中的溶液加入到 1000mL容量瓶中，并用水
洗烧杯 3次，将水均加入容量瓶中后，定容至 1000mL。 
 
3.3 河豚毒素标准 品（C11H17N2O8）：纯度 ≥98%，2~8℃保存。 
3.4 标准溶液 配制  
3.4.1 河豚毒素 贮备液（ 1.0m g/mL）：精确称取河豚毒素 标准品，用乙酸盐缓 冲液定容至 河豚毒素
浓度为 1.0mg /mL，2~8℃保存。  
3.4.2 河豚毒素 中间液（ 5µ g/mL）：用乙酸盐缓冲液将 0.5mL河豚毒素 贮备液定容至 100mL，2~8℃
保存。  
3.4.3 河豚毒素标准曲线工作液：分别吸取河豚毒素中间液 0.005mL、0.01mL于500mL容量瓶中，
用0.01mol/L ，pH7.4 PBS 定容至刻度 ；分别吸取河豚毒素中间液 0.01mL、0.02mL、0.1mL、
0.2m 1、0.5mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL、10.0mL、20.0mL、50.0mL于100mL容量瓶中，用
0.01mo l/L，pH7.4 PBS 定容至刻度 ；工作曲线工作液的浓度从低到高依次为 0.05、0.10、0.50、
1.00、5.00、10.00、25.00、50.00、100.00、250.00、500.00、1000.00、2500.00 µ g/L，2~8℃保
存。  
 
3.5 材料  
3.5.1 酶标微孔板 ：平底。 
 
4 仪器和设备  
4.1 电子天平：感量 分别为0.01g、0.0001g。 
4.2 离心机：转速 ≥8000 转/min。 
4.3 酶标仪（可测定 450nm吸收波长） 。 
4.4 恒温培养箱： 36℃±1℃。 
 
 
5 分析步骤  
5.1 试样制备  
5.1.1 样品采集及运输  GB xxxx—xxxx  
4 现场采集样品后立即 加冰，并在 0℃~4℃下存放，于48h内运至实验室进行检验。如果 48h内无法
检验，应在采集后尽快 在低于 -18℃的条件下 进行冷冻，并保 持冷冻状态运输至检验实验室。  
5.1.2 取样  
对冷藏样品或冷冻后解冻的样品，用水清洗鱼体表面的污物，滤纸吸干鱼体表面的水分后， 根据
检测需要分解鱼体，分解后的 各部分组织 分开存放， 用水洗去血污，滤纸吸干表面的水分后称重。  
5.1.3 样品提取  
5.1.3.1  将待测河豚样品组织用剪刀剪碎， 按照 1g组织中加入 0.1%乙酸溶液 5mL的比例加入溶液 后，
磨成均匀糊状。  
5.1.3.2  取25mL样品糊（相当于 5g河豚组织 ）于烧杯中，置温控磁力搅 拌器上边加热边搅拌，达
100℃时持续 10min后取下，冷却至室温后， 8000r/min 离心 15min，用快速定性滤纸 过滤于
125mL分液漏斗中。  
5.1.3.3  用20mL  0.1%乙酸溶液分次 冲洗滤纸上的组织 残渣，洗液合并于原烧杯中，置温控磁力搅拌
器上边加热边搅拌，达 100℃时持续 3min后取下， 8000r/min 离心 15min后，用快速定性滤
纸过滤，滤液合并于 6.1.3.2分液漏斗中。  
5.1.3.4  在5.1.3.2分液漏斗的 溶液中加入等体积乙醚振摇脱脂，静置分层后，放出水层至另一分液漏
斗中，并用等体积乙醚再重复脱脂一次，将水层放入 100mL烧杯中，通风去除其中残存的乙
醚。  
5.1.3.5  将5.1.3.4的提取液用 1mol/L氢氧化钠溶液调 pH至6.5~7.0后，转移至 50mL容量瓶并 用PBS
定容后，立即用于检测，该液每毫升相当于 0.1g河豚组织样品。  
5.1.3.6  当天不能检测的提取液去除残存的乙醚后，密封后 -20℃以下冷冻保存，在检测前调节 pH并
定容至 50mL立即检测。  
5.2 样品测定  
5.2.1 包被酶标微孔板  
用河豚毒素 -载体连接物包被酶标板， 120µ L/孔， 4℃静置 12h。 
5.2.2 抗体抗原反应  
将辣根过氧化物酶标记的 抗河豚毒素 单克隆抗体稀释后分别：  
5.2.2.1  与等体积不同浓度的河豚毒素 标准溶液在 2mL试管内混合后， 4℃静置 12h或37℃温育 2h
备用。此液用于制作 河豚毒素 标准抑制曲线。  GB xxxx—xxxx  
5 5.2.2.2  与等体积样品提取液在 2mL试管内混合后， 4℃静置 12h或37℃温育 2h备用。此液用于测
定样品中 河豚毒素 含量。  
5.2.3 封闭  
已包被的酶标板用 PBS-T洗3次，每次浸泡 3min后，加封闭液封闭， 200µ L/孔，置 37℃温育 2h。 
5.2.4 测定  
封闭后的酶标板用 PBS-T洗3次，每次 3min后，加抗原抗体反应液（在酶标板的适当孔位加抗体稀
释液代替抗体 作为空白对照，加 PBS代替河豚毒素标准溶液作为阴性对照 ）， 100µ L/孔，置 37℃温育
2h，酶标板洗 5次，每次 3min后，加新配制的底物溶液， 100µ L/孔， 37℃温育 10min后，加入终止液终
止显色反应， 50µ L/孔，于波长 450nm处测定吸光度值 （OD值）。 
5.3 标准曲线的制 作 
以标准溶液 OD值与阴性对照 OD值的比值为纵坐标（即标准品 OD比），所对应标准溶液浓度
（ng/mL）的对数值为横坐标，制作标准曲线。  
5.4 试样溶液的测定  
根据样品 OD值与阴性对照 OD值的比值（即样品 OD比），可从曲线上得到对应点的横坐标，即为
测定液中 河豚毒素 浓度的对数值，求得反对数即为测定液中 河豚毒素 浓度 C（µ g/L），平行测定次数
不少于两次。  
6 分析结果的表述  
试样中河豚毒素 的含量按公式 （1）计算：  
                               
mVDCX  …………………………………… （1） 
式中：  
X——试样中河豚毒素 的含量，单位为 微克 /千克（g/kg）； 
C ——试样测定液中 河豚毒素 浓度，单位为纳克 /毫升（ µ g/L）； 
D ——样品提取液的稀释倍数；  
V ——样品提取液定容体积，单位为毫升（ mL）； 
m ——样品质量，单位为 千克（ kg）。 
以重复性条件下获得的 两次独立测定结果的算术平均值表示 ，最后结果保留整数 。 
 
7 其他  
方法检出限为0.1µg/L，相当于样品中 1µg/kg的河豚毒素 。（本方法线 性范围为5µg/L~500µg/L）。