Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
SEGUNDA SECCION 
PODER EJECUTIVO 
SECRETARIA DE SALUD 
NORMA Oficial Mexicana NOM-243-SSA1-2010,  Productos y servicios. Leche, fórmula láctea, producto lácteo 
combinado y derivados lácteos. Disposiciones y especificaciones sanitarias. Métodos de prueba. 
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.- Secretaría de Salud. 
MIGUEL ANGEL TOSCANO VELASCO, Comisionado Federal para la Protección contra Riesgos 
Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacio nal de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, 
con fundamento en el artículo 39 de la Ley Orgánica de la  Administración Pública Federal; 4 de la Ley Federal 
de Procedimiento Administrativo; 3 fracción XXIV, 13 apartado A fracciones I y II, 17 bis fracción III, 17 bis 2, 
114, 115, fracción VII, 194 fracción I, 19 7, 199, 201, 205, 210, 212, 214, 215 fracción  I, 216 de la Ley General 
de Salud; 3 fracción XI, 38 fracción II, 40 fracciones I, II y XI, 41, 43, 46, 47 fracción IV de la Ley Federal sobre 
Metrología y Normalización; 28 del Reglamento de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 1 fracción I, 4, 8, 13, 15, 25, 30, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 52, 53, 54, 55 y 56 del Reglamento de Control 
Sanitario de Productos y Servicios; 2 inciso C fracción X del Reglamento Interior de la Secretaría de Salud; 3 
fracción I inciso C y fracción II y 10 fracciones IV y VIII del Reglamento de la  Comisión Federal para la 
Protección contra Riesgos Sanitarios, y 
CONSIDERANDO 
Que en cumplimiento a lo previsto en el artículo 46 fracción I de la Ley Federal sobre Metrología y 
Normalización, el Subcomité de Productos y Servicios presentó en el año de 2005 al Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, el anteproyecto de Norma Oficial Mexicana. 
Que con fecha 23 de junio de 2008, en cumplimiento del ac uerdo del Comité y lo previsto en el artículo 47 
fracción I, de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización, se publicó el Proyecto de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-243-SSA1-2005, PRODUCTOS  Y SERVICIOS. LECHE, FORMULA LACTEA, 
PRODUCTO LACTEO COMBINADO Y DERIVADOS LACTEOS. DISPOSICIONES Y ESPECIFICACIONES 
SANITARIAS. METODOS DE PRUEBA en el Diario Oficial de la Federación, a efecto que dentro los sesenta 
días naturales posteriores a dicha publicación, los interesados presentaran sus comentarios al Comité 
Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario. 
Que con fecha previa, fueron publicadas en el Diar io Oficial de la Federación, las respuestas a los 
comentarios recibidos por el mencionado Comité, en los términos del artí culo 47 fracción III de la Ley Federal 
sobre Metrología y Normalización. 
Que en atención a las anteriores consideraciones, contando con la aprobación del Comité Consultivo 
Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, he tenido a bien expedir y ordenar la 
publicación de la siguiente: 
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-243-SSA1-2010. PR ODUCTOS Y SERVICIOS. LECHE, FORMULA 
LACTEA, PRODUCTO LACTEO COMBINADO Y DERIVADOS LACTEOS. DISPOSICIONES Y 
ESPECIFICACIONES SANITARIAS. METODOS DE PRUEBA 
PREFACIO 
En la elaboración de la presente Norma Oficial Mexicana participaron las siguientes unidades 
administrativas, organismos e instituciones: 
SECRETARIA DE SALUD 
Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO 
Programa Universitario de Alimentos 
INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL Escuela Nacional de Ciencias Biológicas 
LICONSA, S.A. DE C.V. 
CONSEJO PARA EL FOMENTO DE LA CALIDAD DE LA LECHE Y SUS DERIVADOS A.C. CAMARA NACIONAL DE LA INDUSTRIA DE TRANSFORMACION 
CAMARA NACIONAL DE INDUSTRIALES DE LA LECHE 
ASOCIACION DE GANADEROS PRODUCTORES DE LECHE PURA, S.A DE C.V. DANONE DE MEXICO, S.A. DE C.V. 
GRUPO CHEN 
UNILEVER DE MEXICO, S DE R.L. DE C.V.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
INDICE 
1. Objetivo y Cam po de Aplicación 
2. Referencias 
3. Definiciones 
4. Clasificación 
5. Símbolos y Abreviaturas 
6. Especificaciones sanitarias 
7. Muestreo 
8. Métodos de prueba 
9. Etiquetado 
10. Concordancia con normas internacionales 
11. Bibliografía 
12. Observancia de la norma 
13. Vigencia 
Apéndice Normativo A. Límites máximos para aditivos alimentarios. 
Apéndice Normativo B. Métodos de Prueba Apéndice Informativo A. Lista de su stancias desinfectantes recomendadas 
Apéndice Informativo B. Procedimiento de limpieza y descontaminación del material de vidrio y área de 
trabajo para la determinación de aflatoxinas. 
1. Objetivo y Campo de Aplicación 
1.1 Esta Norma Oficial Mexicana establece las especif icaciones sanitarias y nutrimentales que debe 
cumplir la leche, fórmula láctea, producto lácteo combinado y los derivados lácteos. 
1.2  Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas 
físicas o morales que se dedican al proceso e import ación de la leche, fórmula láctea, producto lácteo 
combinado y derivados lácteos. 
2. Referencias 
Esta norma se complementa con las siguientes o las que las sustituyan: 
Norma Oficial Mexicana NOM-051-SCFI/SSA1-2010 Es pecificaciones generales  de etiquetado para 
alimentos y bebidas no alcohólicas preenvasados - Información comercial y sanitaria. 
Norma Oficial Mexicana NOM-086-SSA1-1994 Bienes y servicios. Alimentos y bebidas no alcohólicas con 
modificaciones en su composición.  Especificaciones nutrimentales. 
Norma Oficial Mexicana NOM-251-SSA1-2009 Prácticas de higiene para el proceso de alimentos, bebidas 
o suplementos alimenticios. 
Norma Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994 Salud Ambiental, agua para uso y consumo  humano-
Límites permisibles de calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su potabilización. 
Norma Oficial Mexicana NOM-130-SSA1-1995 Bienes y se rvicios. Alimentos envasados en recipientes de 
cierre hermético y sometidos a tratamiento térmico . Disposiciones y especificaciones sanitarias. 
3. Definiciones 
Los términos en los que se definen y clasifican los productos específicos no son denominaciones 
comerciales y su aplicación se relaciona exclusivamente con el control sanitario. 
Para efectos de esta Norma Oficial Mexicana se entiende por.  
3.1 Aditivo o Aditivo para alimentos,  cualquier sustancia permitida que, sin tener propiedades nutritivas, 
se incluya en la formulación de los productos y que act úe como estabilizante, conservador o modificador de 
sus características organolépticas, para favorecer ya sea su estabilidad, conservación, apariencia o 
aceptabilidad. 
3.2 Alimento y bebida no alcohólicas con modificaciones en su composición , al que ha sufrido 
cambios en su composición por adición, disminución o eliminación de uno o más de sus nutrimentos, tales 
como hidratos de carbono, proteínas, lípidos, vitamina s, minerales o fibra; y que forman parte de la dieta 
habitual. 
3.3 Azúcares , a todos los mono y disacáridos presentes en un alimento o bebida no alcohólica. 
3.4 Bases o mezclas para helados,  es la emulsión cuya composición se ajusta al helado, según sea el 
caso, pudiendo presentarse en forma líquida, concentrada o en polvo. 
3.5 Bitácora o registro, al documento controlado que provee evidencia objetiva y auditable de las 
actividades ejecutadas o resultados obtenidos durant e el proceso del producto y su análisis. 
3.6 Buenas prácticas de fabricación,  en particular para el caso de los aditivos se refiere a la cantidad 
mínima indispensable para lograr el efecto deseado. 
3.7 Congelación,  método de conservación físico que se efect úa por medio de equipo especial para lograr 
una reducción de la temperatura de los productos objeto de esta norma en su centro térmico a máximo -18°C 
(255°K). 
3.8 Consumidor,  persona física o moral que adquiere o disfruta como destinatario final productos 
alimenticios y bebidas no alcohólicas preenvasados. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
3.9 Contaminantes, entidades físicas, químicas o biológicas indeseables, que se encuentran en el 
producto, por arriba de los límites permisibles. 
3.10 Crema,  al producto terminado en el que se ha reunido una fracción determinada de grasa y sólidos 
no grasos de la leche, ya sea por reposo, por centri fugación o reconstitución sometida a pasteurización y 
cualquier otro tratamiento térmi co que asegure su inocuidad. 
3.11 Derivados o  productos lácteos, productos obtenidos a partir de la  leche o sus componentes y otros 
ingredientes funcionalmente necesarios para su elabor ación, incluidos los productos con grasa vegetal. 
3.12 Deshidratación,  al tratamiento que consiste en la eliminación de agua de un producto. 
3.13 Dulces a base de leche, a los productos elaborados por tratamiento térmico de la leche y 
edulcorantes, pudiendo ser adicionados de aditivos e ingredientes opcionales. 
3.14 Edulcorante , sustancia que produce la sensación de dul zura, de orígenes naturales o sintéticos. 
3.15 Envasado aséptico, al proceso que reúne las condiciones de  esterilidad comercial para evitar la 
presencia de microorganismos en el producto durante el envasado. 
3.16 Envase, cualquier recipiente, o envoltura en el cual es tá contenido el producto preenvasado para su 
venta al consumidor. 
3.17 Esterilización comercial, al tratamiento térmico aplicado al producto para la destrucción de todos los 
microorganismos viables de importancia en la salud públ ica y aquellos capaces de reproducirse en el alimento 
bajo condiciones normales de almacenamiento y distribución, sin la condición de refrigeración. 
3.18 Etiqueta,  marbete rótulo, inscripción, marca, imagen gráfica u otra forma descriptiva, que se haya 
escrito, impreso, estarcido, marc ado, en relieve o en hueco, grabado,  adherido, precintado o anexado al 
empaque o envase del producto. 
3.19 Fecha de caducidad, a la fecha límite en que se considera que un producto preenvasado 
almacenado en las condiciones establecidas por el fabr icante, mantiene las características sanitarias que 
debe reunir para su consumo. Después de esta fecha no debe comercializarse ni consumirse. 
3.20 Fecha de consumo preferente,  fecha en que, bajo determinadas condiciones de almacenamiento, 
expira el periodo durante el cual el producto pre envasado es comercializable y mantiene las cualidades 
específicas se le atribuyen tácita o explícitamente, per o después de la cual el producto preenvasado puede 
ser consumido. 
3.21 Fórmula láctea, es el producto elaborado a partir de ingredientes propios de la leche, tales como 
caseína, grasa, lactosueros y ag ua para consumo humano. En cantidades de conformidad con lo que 
establece la norma de denominación comercial correspondiente. 
3.22 Función tecnológica , efecto que produce el uso de aditivos en los alimentos y bebidas no 
alcohólicas preenvasados, que proporci ona o intensifica su aroma, color o sabor, y/o mejora su estabilidad y 
conservación, entre otros. Véase aditivo. 
3.23 Helado,  alimento producido mediante la congelación c on o sin agitación de una mezcla pasteurizada 
compuesta por una combinación de ingredientes lácteos pudiendo contener grasas vegetales, frutas, huevo y 
sus derivados, saborizantes, edulcorantes y otros aditi vos; cuando está empalillado se nombrará paleta. 
3.24 Información nutrimental, toda descripción destinada a informar al consumidor sobre las propiedades 
nutrimentales de un alimento o bebida no alcohó lica preenvasado. Comprende dos aspectos: 
a) La declaración nutrimental obligatoria. 
b) La declaración nutrimental complementaria.  
3.25 Ingrediente , cualquier sustancia o producto, incluidos los aditivos, que se emplee, en la fabricación o 
preparación de un alimento o bebida no alcohólica y esté  presente en el producto final, transformado o no.  
3.26 Ingredientes opcionales, a los que se pueden adicionar a los productos tales como: chiles, 
condimentos, especias , frutas, verduras, entre otros. 
3.27 Leche, a la secreción natural de las glándulas mamarias de las vacas sanas o de cualquier otra 
especie animal, excluido el calostro. 
3.28 Leche acidificada , a la obtenida por la acidificación de la leche entera, parcialmente descremada o 
descremada, pasteurizada, co n agentes acidulantes. 
3.29 Leche condensada azucarada,  la que ha sido obtenida mediante la evaporación del agua de la 
leche a través de presión reducida, a la que se le ha agregado sacarosa y/o dextrosa u otro edulcorante 
natural, hasta alcanzar una determinada concent ración de grasa butírica y sólidos totales. 
3.30 Leche evaporada , producto obtenido mediante eliminación parcial del agua de la leche por el calor o 
por cualquier otro procedimiento que permita obtener un  producto con la misma composición y características 
de la leche sin modificación en la proporción entre la caseína y la proteína de la leche. 
3.31 Leche fermentada , a la obtenida por la acidificación de la leche estandarizada entera o 
deshidratada, pasteurizada,  parcialmente descremada, semidescremada o descremada, debido a la acción de 
bacterias lácticas vivas con la consiguiente reducción  del pH, adicionada o no por aditivos, por alimentos e 
ingredientes opcionales. 
3.32 Límite máximo , cantidad establecida de aditivos, micr oorganismos, parásitos, materia extraña, 
plaguicidas, metales pesados y metaloides, entre otros, que no se debe exceder en un alimento, bebida o 
materia prima.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
3.33 Limpieza,  conjunto de procedimientos que tiene por objet o eliminar tierra, residuos, suciedad, polvo, 
grasa u otras sustancias objetables. 
3.34 Lote,  a la cantidad de un producto, elaborado en un mismo ciclo, integrado por unidades 
homogéneas. 
3.35 Mantequilla, al producto obtenido a partir de la grasa de la leche o grasa de la crema, la cual ha sido 
pasteurizada, sometida a maduració n, fermentación o acidificación, batido o amasado, pudiendo ser o no 
adicionada de sal. El contenido de gr asa butírica debe ser mínimo de 80%. 
3.36 Materia extraña, a cualquier sustancia, resto, desecho o material que se presenta en el producto 
pero que no forma parte de la composición normal de éste. 
3.37 Metal pesado, a los elementos químicos que causan efec tos indeseables en el metabolismo aun en 
concentraciones bajas. Su toxicidad depende de la dosis  en que se ingieran, así como su acumulación en el 
organismo. 
3.38 Método de prueba , al procedimiento analítico utilizado par a comprobar que un producto satisface las 
especificaciones que establece la norma. 
3.39 Muestra, al total de unidades de producto provenient es de un lote y que representan las 
características y condiciones del mismo. 
3.40 Pasteurización,  al tratamiento térmico al que se somet en los productos, consistente en una relación 
de temperatura y tiempo que garantice la destrucción de organismos patógenos y la inactivación de algunas 
enzimas de los alimentos. 
3.41 Planta procesadora, al establecimiento dedicado al proceso de pasteurización, ul trapasteurización, 
esterilización, deshidratación,  rehidratación, entre otros procesos de la leche, fórmula láctea y producto lácteo 
combinado. 
3.42 Proceso, al conjunto de actividades relativas a la obt ención, elaboración, fabr icación, preparación, 
conservación, mezclado, acondicionamiento, enva sado, manipulación, transporte, distribución, 
almacenamiento y expendio o suministro al público de los productos objeto de esta norma. 
3.43 Producto a granel, al producto que debe pesarse, medirse, o contarse en presencia del consumidor 
por no encontrarse preenvasado al momento de su venta. 
3.44 Producto lácteo combinado,  el producto elaborado a partir de só lidos lácteos u otros ingredientes 
que no proceden de la leche. En cantidades de confor midad con lo que establece la norma de denominación 
comercial correspondiente. 
3.45 Prueba de este rilidad comercial, a la retención temporal de las muestras representativas de los 
productos bajo condiciones de tiempo y temperatura es tablecidas para verificar la esterilidad comercial del 
producto. 
3.46 Quesos,  productos elaborados de la cuajada de leche estandarizada y pasteurizada de vaca o de 
otras especies animales, con o sin adición de crema,  obtenida de la coagulación de la caseína con cuajo, 
gérmenes lácticos, enzimas apropiadas, ácidos orgánico s comestibles y con o sin tratamiento ulterior, por 
calentamiento, drenada, prensada o no,  con o sin adición de fermentos de maduración, mohos especiales, 
sales fundentes e ingredientes comestibles opcionales , dando lugar a las diferentes variedades de quesos 
pudiendo por su proceso ser: fresco, madurado o procesado. 
3.47 Quesos frescos , aquellos que además de cumplir con la descripción general de queso se 
caracterizan por su alto contenido de humedad, y por no tener corteza o tener corteza muy fina, pudiendo o no 
adicionarles aditivos e ingredientes opcionales. 
3.48 Quesos madurados , aquellos que además de cumplir con la descripción general de queso, se 
caracterizan por ser de pasta dura, semidura o blanda  y pueden tener o no corteza; sometidos a un proceso 
de maduración mediante adición de microorganismos, bajo  condiciones controladas de tiempo, temperatura y 
humedad, para provocar en ellos cambios bioquímicos y físic os característicos del producto del que se trate, 
lo que le permite prolongar su vida de anaquel, los cuales pueden o no requerir condiciones de refrigeración. 
3.49 Quesos procesados , aquellos que además de cumplir con la descripción general de queso se 
caracterizan por ser elaborados con mezclas de quesos, fusión y emulsión con sales fundentes, aditivos para alimentos permitidos e ingredientes opcionales, some tidos a proceso térmico de 70°C durante 30 segundos o 
someterse a cualquier otra combinación equivalente o mayor de tiempo y temperatura, lo que le permite 
prolongar su vida de anaquel.
 
3.50 Quesos de suero, productos obtenidos a partir del suero de leche entera, semidescremada, o 
descremada pasteurizada de vaca, cabra u oveja, el cual es coagulado por calentamiento en medio ácido para 
favorecer la obtención de la cuajada, la que es  salada, drenada, moldeada,  empacada y etiquetada y 
posteriormente refrigerada para su conservación. 
3.51 Refrigeración, al método de conservación físico con el cual se mantienen los productos a una 
temperatura máxima de 7°C (280°K) que se emplea para inhibir el desarrollo de la mayoría de los microorganismos, reducir las reacciones bioquímicas y el deterioro propio de los alimentos. 
3.52 Rehidratación, al procedimiento mediante el cual se rest ituye el agua a los productos deshidratados 
objeto de esta norma. 
3.53 Sorbete,  producto que cumple con la definición de helado, excepto en que su contenido de grasa, 
sólidos no grasos y sólidos totales, son inferiores a los del helado. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
3.54 Suero de leche,  líquido obtenido de la coagulación de la ca seína de la leche, mediante la acción de 
enzimas coagulantes de origen animal, vegetal o microbia no, por la adición de ácidos orgánicos o minerales 
de grado alimentario; acidificación por intercambio iónico  hasta alcanzar el punto isoeléctrico de la caseína. 
3.55 Tratamiento térmico, al método físico que consiste en someter a una fuente de calor suficiente por 
un tiempo apropiado al producto, antes o después de ser envasado con el fin de lograr una estabilidad 
biológica y que garantice la eliminación de microorganismos patógenos. 
3.56 Ultrapasteurización, al proceso al cual es sometido el producto a una adecuada relación de 
temperatura y tiempo, envasado asépticamente para garantizar la esterilidad comercial. 
4. Clasificación 
Los productos objeto de esta norma por su proceso se  clasifican de la siguiente manera, la cual no 
corresponde a una denominación: 
4.1 Leche 
4.1.1 Pasteurizada 
4.1.2 Ultrapasteurizada 
4.1.3 Esterilizada 
4.1.4 Deshidratada 
4.2 Fórmula láctea 
4.2.1 Pasteurizada 
4.2.2 Ultrapasteurizada 
4.2.3 Esterilizada 
4.2.4 Deshidratada 
4.3 Producto lácteo combinado 
4.3.1 Pasteurizado 
4.3.2 Ultrapasteurizado 
4.3.3 Esterilizado 
4.3.4 Deshidratado 
4.4 Quesos  
4.4.1 Frescos  
4.4.1.1 Frescales: Panela, Canasto, Sierra, Rancher o, Fresco, Blanco, Enchilado, Adobado. 
4.4.1.2 De pasta cocida: Oaxaca, Asadero, Mozzarela, Del Morral, Adobera. 
4.4.1.3 Acidificados: Cottage, Crema, Doble crema, Petit Suisse, Nuefchatel. 
4.4.1.4 Quesos de suero: Broccio, Broccotle, Cerrase, Geitmysost, Gyetost, Meje tle, Mysost, Recuit, 
Requesón, Ricotta, Picotón, Schottenezinger, Zinder. 
4.4.2 Madurados 
4.4.2.1 Madurados prensados de pasta dura: Añejo, Parmesano, Cotija, Reggianito. 
4.4.2.2 Madurados prensados: Cheddar, Chester, Chihua hua, Manchego, Brick, Edam, Gouda, Gruyere, 
Emmental, Cheshire, Holandés, Amsterdam, Butterkase, Coulomiers, Dambo, Erom, Friese, Fynbo, Havarti, 
Harzer-Kase, Herrgardsost, Huskallsost, Leidse, Maribo,  Norvergia, Provolone, Port Salut, Romadur, Saint 
Paulin, Samsoe, Svecia, Tilsiter, Bola, Jack. 
4.4.2.3 De maduración con mohos: Azul, Cabrales, Camembert, Roquefort, Danablu, Limburgo, Brie. 
4.4.3 Procesados 
4.4.3.1 Fundidos 
4.4.3.2 Fundidos para untar 
4.4.4  Otros quesos: frescos, madurados y procesados no considerados en los numer ales 4.4.1, 4.4.2 y 
4.4.3, deberán observar lo dis puesto en este ordenamiento. 
4.5 Mantequilla 
4.6 Cremas 
4.6.1 Pasteurizadas 
4.6.2 Ultrapasteurizadas 
4.6.3 Esterilizadas 
4.6.4 Deshidratadas 
4.6.5 Acidificadas 
4.6.6 Fermentadas 
4.6.7 Batidas y para batir 
4.7 Leche condensada azucarada 
4.8 Leche fermentada o acidificada 
4.9 Dulces a base de leche 
4.9.1 Dulces de baja humedad (menos del 12%) o endureci dos: caramelos, chiclosos, jamoncillos, etc. 
4.9.2 Dulces de humedad intermedia (12-20%) que se proc esan mediante evaporación: glorias, cajeta y 
obleas con cajeta, etc.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
4.9.3 Dulces de alta humedad (más de 20%), procesados por coagulación, aireación y procesos 
enzimáticos: flanes, gelatinas, chongos, mousse, arroz con leche, etc. 
4.10 Helados y Sorbetes 
4.10.1 Helados de crema 
4.10.2 Helados de leche 
4.10.3 Helados de grasa vegetal 
4.10.4 Sorbetes 
4.10.5 Bases para helados y sorbetes 
4.11 Otros productos lácteos no considerados, deberán observar lo dispuesto en este ordenamiento. 
5. Símbolos y Abreviaturas 
AFM 1 aflatoxina M 1 
BPF buenas prácticas de fabricación 
cm centímetro 
cm2 centímetro cuadrado 
CI color index conc. 
HACCP concentración 
análisis de peligros y de puntos críticos de control (por su siglas en inglés). 
HPLC cromatografía de líquidos de alta eficacia ºC grados Celsius g gramo x g gravedad (en centrifugado) 
h hora 
= igual 1/d inversa de la dilución kg kilogramo lb libra L litro 
+ más 
m masa ± más-menos Máx. máximo > mayor que 
< 
< 
menor que igual o menor que 
μ micra 
µg microgramo 
µL microlitro 
mg miligramo µm micrómetro mL mililitro min minutos 
mm milímetro 
mM milimolar M molar m/v masa a volumen ng nanogramo nm nanómetro 
N normal 
No. número / por % por ciento pH potencial de hidrógeno 
Pulg pulgada 
rpm revoluciones por minuto seg segundos x signo de multiplicación UF  unidades de fenol  UFC unidades formadoras de colonias 
UI unidades internacionales 
UV ultravioleta v volumen v/v volumen a volumen  Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
Cuando en la presente norma se mencione: 
• Acuerdo, debe entenderse que se trata del Acue rdo por el que se determinan las sustancias 
permitidas como aditivos y coadyuvantes en aliment os, bebidas y suplementos alimenticios, y sus 
modificaciones. 
• Reglamento, debe entenderse que se trata del Reglamento de Control Sanitario de Productos y 
Servicios. 
6. Especificaciones sanitarias 
6.1 Generales  
Los productos objeto de esta norma, además de cumplir con lo establecido en el Reglamento, deben 
ajustarse a las siguientes disposiciones: 
6.1.1 Los establecimientos que se dediquen al proces o e importación de los productos comercializados en 
el Territorio Nacional objeto de esta norma, deben cumplir con lo establecido en la NOM-251-SSA1-2009, señalada en el apartado de referencias. 
6.1.2 Todos los ingredientes que se utilicen para la elaboración de los productos objeto de esta norma, 
deben cumplir con las especificaciones sanitarias establecidas en el Reglamento y las normas oficiales 
mexicanas correspondientes. 
6.1.3 Los productos que se modifiquen en su composició n, deben cumplir con lo establecido en la  NOM-
086-SSA1-1994, señalada en el apartado de referencias. 
6.1.4 Los productos sujetos a tratamiento térmico y enva sados en recipientes de cierre hermético, además 
de cumplir con lo establecido en este ordenamiento,  deben cumplir con la NOM-130-SSA1-1995, señalada en 
el apartado de referencias. 
6.1.5 La leche, que se comercialice para su consumo humano o que se emplee como materia prima para 
la elaboración de productos lácteos debe cumplir con lo siguiente: 
6.1.5.1 No presentar materias extrañas, conser vadores ni sustancias neutralizantes. 
6.1.5.2 No coagular por ebullición. 
6.1.5.3 Presentar prueba de alcohol al 68% negativa (sólo para leche de bovino). 
6.1.5.4 Presentar prueba de inhibidores bacterianos, negativa;  detectados por métodos fisicoquímicos y 
microbiológicos, de conformidad con la tabla 1 del presente ordenamiento. 
Tabla 1.  Inhibidores bacterianos en leche. 
PRODUCTO  Derivados 
Clorados Sales 
cuaternarias 
de amonio Oxidantes Formaldehído Antibióticos 
Pasteurizados Negativo Negativo  Negativo Nega tivo Negativo 
Ultrapasteurizados Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
0Esterilizados Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
 
6.1.5.5 Debe someterse a un tratamiento térmico con un ti empo y temperatura determinados que garantice 
su inocuidad, independientemente del uso que se le dé post eriormente. A excepción de la leche que se utilice 
para la elaboración de quesos que por las característi cas de éstos no pueda ser sometida a tratamiento 
térmico, la cual debe cumplir con lo siguiente: 
6.1.5.5.1 Tener implementado un sistema HACCP para su pr oceso, conforme a lo establecido en el 
Apéndice A de la NOM-251-SSA1-2009, citada en el apartado de referencias. 
6.1.5.6 Los tratamientos térmicos a los que se someta la leche, fórmula láctea o producto lácteo 
combinado para su comercialización, o antes de su uso como materia prima para el caso de la leche, pueden 
ser: ebullición, pasteurización, ultrapasteur ización, esterilizació n o deshidratación. 
Tabla 2.  Temperaturas y tiempos para trat amiento térmico de la leche, fórmula láctea o producto combinado. 
Tratamiento Temperatura y tiempo* 
Pasteurización Lenta 63°C / 30 min. 
Rápida 72°C / 15 seg. 
Ultrapasteurización o 
esterilización 135°C a 149°C / 2 a 8 seg. 
* Puede emplearse alguna otra relación de tiempo-temperatura que sea 
equivalente para la destrucción de los microorganismos patógenos. 
6.1.5.7 El equipo para la pasteurización lenta debe contar , por lo menos, con un sistema para registro 
gráfico o numérico y control de la te mperatura y tiempo del proceso, tina con tapa y sistema de agitación del 
producto, termómetro de mercurio con vástago de acero in oxidable funcionando y calibrado, o su equivalente.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
6.1.5.8 El equipo empleado para la pasteurización rápida debe contar, por lo menos, con un sistema de 
control y registro automático de la temperatura y tiempo del proceso, que no permita el paso del producto 
cuando no se haya alcanzado la temperatura mínima es tablecida, así mismo, un sistema en que el flujo del 
producto cumpla con el tiempo mínimo determinado.  Termómetro de mercurio o su equivalente funcionando y 
calibrado, colocado al final de la “zona de sostenimiento” del equipo, en el que la terminal tenga contacto con 
el producto. 
6.1.5.8.1  La temperatura registrada en el sistema de control y registro del proceso debe ser < 1 °C de la 
temperatura que indique dicho termómetro. 
6.1.5.9 El equipo empleado para la ultrapasteurización o es terilización, debe contar con dispositivos de 
control y registro de temperatura de operación durante el tiempo de producción, que permita comprobar que 
los productos han sido sometidos al tratamiento térmico establecido. 
6.1.5.10 Una vez alcanzada la temperatura, la leche, fó rmula láctea o producto combinado debe enfriarse 
rápidamente a una temperatura de 6°C,  y manejarse a esta temperatura hasta el momento del envasado a 
excepción de productos ultrapasteurizados o esterilizados. 
6.1.5.11 Los productos sometidos a deshidratación deben cumplir con lo siguiente: 
a) Los que se utilicen como materia prima, deben se r pasteurizados previamente a la deshidratación. 
b) No se podrán vender a granel al  consumidor. 
6.1.5.12 Los productos sometidos a rehidratación deben ser pasteurizados, ultrapasteurizados o 
esterilizados, conforme a este ordenamiento. 
6.1.6 Especificaciones físicas y químicas 
6.1.6.1 Prueba de fosfatasa residual. 
Tabla No. 3. Límite máximo de fosfatasa residual.  
Producto Límite máximo de fosfatasa residual 
(UF/g) 
Leche, fórmula láctea o producto lácteo combinado 
pasteurizado*  4 
Quesos frescos, madurados y procesados 12 
Quesos de suero 4 
Helados de crema, de leche o grasa vegetal, sorbetes 
y bases o mezclas para helados 4 
Mantequilla y cremas pasteurizada** 4 
Nota: Se debe considerar que podrán presentar fals os positivos, por lo que esta prueba no puede ser 
concluyente. 
* No aplica para este tipo de productos ultr apasteurizados, esteriliz ados y deshidratados. 
** No aplica para leche condensada azucarada, le che fermentada o acidificada y dulces a base de 
leche 
6.1.6.2 No deben contener materia extraña. 
6.1.7 Especificaciones de contaminantes 
6.1.7.1 La presencia de contaminantes en los productos obje to de esta norma no debe rebasar el límite 
máximo señalado en la siguiente tabla. 
Tabla No. 4.  Límites máximos de contaminantes(1) 
Contaminante Límite máximo 
mg/kg 
Arsénico(2) 0,2 
Plomo 0,1(3) 
0,5(4) 
Mercurio 0,05(3) 
Estaño 250(5) 
Aflatoxina M1 0,5μg/L(3) 
(1) No aplica ningún contaminante a los helados, sorbetes y 
bases o mezclas para helados; (2) No aplica a mantequillas, 
cremas, leche fermentada y acidificada, leche condensada 
azucarada, dulces a base de leche; (3) Límite sólo para leche, 
fórmula láctea y producto lácteo combinado, (4) Límite para 
quesos (5) Aplica sólo para aquellos productos envasados en 
hoja de lata sin barniz. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
6.1.7.2 El productor o fabricante de los productos objet o de esta norma, debe establecer mecanismos de 
control que permitan determinar la presencia y cantidad  de metales pesados y metaloides en las materias 
primas o en el producto en proceso de elaboración o en el producto terminado. Es recomendable establecer 
una periodicidad de verificación de mecanismos de cont rol de al menos 1 vez por año, considerando las 
condiciones del proceso e instalaciones . La información generada debe estar a disposición de la Secretaría de 
Salud, cuando ésta así lo requiera. 
6.1.8 Especificaciones Microbiológicas 
6.1.8.1 Los productos objeto de esta norma no deben exceder los límites de microorganismos señalados a 
continuación: 
Tabla 5.  Límites máximos de contenido micr obiano para leche y derivados lácteos. 
Microorganismo Límite máximo Productos 
Organismos Coliformes totales <100 UFC/g o mL Helados y sorbetes. Quesos de suero  
<50 UFC/g o mL Bases o mezclas para helados. 
<20 UFC/g o mL En punto de venta: Leche, fórmula láctea, producto 
lácteo combinado; pasteurizados.  
<10 UFC/g o mL En planta: Leche, fórmula láctea, producto lácteo combinado; pasteurizados o deshidratados. 
Mantequilla, cremas, leche condensada azucarada, 
leche fermentada o acidificada, dulces a base de leche. 
Staphylococcus aureus <10 UFC/ mL por 
siembra directa Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
pasteurizado . 
<100 UFC/g o mL Mantequilla, cremas, leche condensada azucarada, 
leche fermentada o acidificada, dulces a base de leche. 
Quesos madurados y quesos procesados 
1000 UFC/g Quesos frescos y quesos de suero 
Salmonella spp Ausente en 25g o mL Leche, fórmula láctea, producto lácteo combinado: 
pasteurizados y deshidratados. 
Quesos frescos, madurados  y procesados. Quesos de 
suero. 
Cremas, leche fermentada o acidificada, dulces a base 
de leche*, helados, sorbetes y bases para helados. 
Mantequillas.  
Escherichia coli 100 UFC/g o mL Quesos frescos.  
< 3 NMP/g o mL Leche utilizada como materia prima para la elaboración 
de quesos. 
Leche, fórmula láctea, producto lácteo combinado; 
deshidratados. 
< 10 NMP/g Quesos madurados y procesados. 
Listeria monocytogenes Ausente en 
25g o mL Leche, fórmula láctea, producto lácteo combinado; 
pasteurizados ** 
Quesos. Quesos de suero. Helados, bases para helados y sorbetes. **. 
Vibrio cholerae *** Ausente en 25g Quesos frescos. 
Helados, sorbetes y bases para helados. 
Ausente en 50g Quesos de suero. 
Enterotoxina estafilococcica Negativa Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado; 
deshidratados y la que se emplee como materia prima 
para elaboración de quesos. 
Quesos frescos, madurados y procesados. Helados, sorbetes y bases para helados. 
Toxina botulínica** Negativa Quesos frescos, m adurados y procesados, envasados 
al alto vacío.  
Mohos y levaduras 500 UFC/g o mL Quesos frescos,  madurados*** y quesos de suero. 
100 UFC/g o mL Quesos procesados. 
50 UFC/g o mL Bases o mezclas para helados. 
Mesofílicos aerobios 200,000 UFC/g o mL Helados y sorbetes. 
100,000 UFC/g o mL Bases para helado. 
* Para aquellos que contienen chocolate, cocoa, coco, huevo y semillas. 
** Se determinará únicamente en situaciones de emergenc ia sanitaria, cuando la SSA de acuerdo a los resultados 
microbiológicos detecte su presencia, y ordenará la realización de un plan de trabaj o por parte del fabricante o importador 
para controlar la presencia. 
*** Aquellos productos que para su maduración requieren de hongos, pudieran estar fuera de este límite.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
6.1.9 Aditivos 
6.1.9.1 Unicamente se permiten los aditivos en los lími tes y productos que se señalan en el apéndice 
normativo A de este ordenamiento. 
6.1.10 Control documental del proceso: 
6.1.10.1 Los registros de tratamiento térmico deben ser continuos y contar con la siguiente información: 
Tabla 6. Información mínima de los procedimientos, bitáco ras o registros de las diferentes  etapas del 
proceso. 
DOCUMENTO INFORMACION 
Bitácora o registro de Proceso -  Control de tratamiento térmico. 
• Gráficas de temperatur a y tiempo de tratamiento 
térmico (pasteurización, ultrapasteurización o esterilización, deshidratación), por equipo. 
• Temperatura y tiem po de enfriamiento. 
• Cantidad e identificación del producto 
-  Registro de los hechos no comunes. 
Procedimiento de operaciones de 
limpieza y desinfección de equipos 
para tratamiento térmico. -  Personal encargado de la operación. 
-  Frecuencia -  Vigencia. 
Bitácora o Registro de operaciones de 
limpieza y desinfección de equipo para tratamiento térmico. - Registro de los hechos no comunes.  
Diagrama de proceso -  Etapas de proceso con tiempos y temperaturas de cada 
operación. 
 
6.2 Específicas  
Además de las especificaciones sanitarias generales señaladas en el numeral 6.1 de este ordenamiento; 
se debe cumplir con lo siguiente: 
6.2.1 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
6.2.1.1 Deben contener de 310 a 670 μg equivalentes de retinol/L (1033 a 2233 UI/L), de forma natural o 
por restauración. Y entre 5 a 7,5 μg/L de Vitamina D 3 (200-300 UI/L). 
6.2.1.2 Los productos adicionados con Vitamina A o D 3 no deben contener cantidades superiores a las 
establecidas en este ordenamiento. 
6.2.1.3 Los productos deshidratados deben contener una humedad no mayor al 4%. 
6.2.1.4 Los productos sometidos a ultrapasteurización o esterilización deben cumplir con lo siguiente: 
6.2.1.4.1 Ser envasados asépticamente en envases que cuenten con barreras para proteger el producto 
del oxígeno y la luz, y llenarse en ausencia de aire. 
6.2.1.4.2 El cierre de los envases debe ser hermético y llevar a cabo las pruebas para su control y los 
registros correspondientes. 
6.2.1.4.3 El envase que se emplee, debe someterse a un tratamiento de desinfección. 
6.2.1.4.4 Los agentes desinfectantes deben t ener actividad esporicida, no degradar el material del envase, 
se deben evaporar fácilmente de la superficie del  envase y no deben reaccionar con el producto. 
6.2.1.4.5 Sólo se permite el uso de peróxido de hidrógeno para efectos de desinfección de los envases, 
éste debe emplearse en una concentración de 30 al 50%. 
6.2.1.4.6 Los establecimientos deben destinar un área de incubación para la prueba de esterilidad 
comercial para efectos del control interno de una muestr a representativa de la producción, de la cual se debe 
tomar una submuestra para someterse a análisis microbiológicos. 
6.2.2 Cremas 
6.2.2.1 Las cremas acidificadas y fermentadas deben te ner una acidez titulable de no menos de 0,5% 
expresada como ácido láctico. 
6.2.2.2 Las cremas deshidratadas deben contener una humedad no mayor al 4%. 
6.2.3 Leche fermentada o acidificada. 
6.2.3.1 Las leches fermentadas o acidificadas deben tener una acidez titulable de no menos de 0,5% 
expresada como ácido láctico y su pH debe ser máximo de 4,5. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
6.2.4 Helados, bases para helados y sorbetes 
6.2.4.1 Para la elaboración de helados y sorbetes se permite la incorporación de aire limpio como 
coadyuvante en su elaboración. 
6.2.4.2 No se permite volver a congelar los productos después de haber sido descongelados. 
6.2.4.3 La mezcla para elaborar los helados, bases para  helados y sorbetes debe pasteurizarse de la 
siguiente forma: 
6.2.4.3.1 Deben someterse a una temperatura de 68,5º C durante un tiempo de 30 minutos, o. 
6.2.4.3.2 Serán sometidas a una temperatura de 79,4ºC du rante un tiempo mínimo de 25 segundos, o 
6.2.4.3.3 Someterlas a otra relación de tiempos y temperaturas cuyo efecto sea el mismo. 
6.2.4.3.4 En cualquiera de los casos, una vez alcanzados, respectivamente, las temperaturas y tiempos 
señalados se enfriará bruscamente a 4ºC. 
6.2.4.3.5 Una vez pasteurizadas las mezclas, deben mantenerse a una temperatura máxima de 6ºC antes 
de someterse a congelación. 
7. Muestreo 7.1 El procedimiento de muestreo para los productos objeto de esta norma, debe sujetarse a lo que 
establece la Ley General de Salud, debiendo m antener la muestra en condiciones que eviten su 
contaminación o descomposición. 
8. Métodos de Prueba 
Para la verificación oficial de las especificaciones que se establecen en esta norma, se deben aplicar los 
métodos de prueba señalados en el apéndice normativo B de este ordenamiento. 
9. Etiquetado 
La etiqueta de los productos objeto de esta norma, además de cumplir con lo establecido en el 
Reglamento y la NOM-051-SCFI/SSA1-2010 señalada en el apartado de referencias, debe sujetarse a lo siguiente, sin interferir con las atribuciones de otras dependencias: 
9.1 En la superficie principal de exhibición de los envases de leche, fórmula láctea y producto lácteo 
combinado, debe declararse el tratamiento térmico al qu e fue sometido, así como ot ros tratamientos aplicados 
para asegurar la inocuidad del producto, establecidos  en otros ordenamientos legales correspondientes. 
9.2 En los productos objeto de esta norma que contienen sal yodada, debe declararse como tal en la lista 
de ingredientes. 
9.3 Cuando en la elaboración de los productos objeto de esta norma, se emplee leche que no procede de 
vaca, se debe indicar su origen. 
9.4 Los quesos deben indicar el contenido de grasa butírica. 
9.5 Los productos objeto de esta norma a excepción de los helados, bases para helados y sorbetes deben 
indicar “fecha de caducidad”. 
9.6 Si la identificación del lote corresponde a la fecha de caducidad, se deben  indicar las leyendas: “Lote” 
y “Fecha de caducidad” o sus abreviaturas o sus equivalentes. 
9.7 En la etiqueta de productos pasteurizados y de aquellos que requieren refrigeración para su 
conservación, se debe incluir la siguiente leyend a: "Manténgase en refrigeración" o "Consérvese en 
refrigeración" o cualquier otra equivalente. 
9.8 En el caso de los helados, sorbetes y otros productos que requieren congelación debe figurar la 
leyenda "Manténgase en congelación" o "Consérvese en  congelación" o cualquier otra equivalente. 
9.9 Para productos deshidratados: “Consérvese en un l ugar fresco y seco”, "Una vez preparado el 
producto, manténgase o consérvese en refrigeración" o cualquier otra equivalente. 
9.10 Para dulces a base de leche de humedad baja e intermedia, debe indicarse “Manténgase en lugar 
fresco y seco”, o cualquier otra equivalente. 
9.11 Los productos ultrapasteurizados o esteriliza dos deben de incluir las leyendas “Manténgase o 
consérvese en lugar fresco y seco”. “No requiere refr igeración en tanto no se abra el envase”. “Refrigérese 
después de abrirse” o leyendas equivalentes. 
9.12 Los productos objeto de esta norma que hayan sido modificados en su composición nutrimental, 
deben ostentar junto a la denominación, con el mi smo tipo y tamaño de letra, la modificación que lo 
caracterice. 
9.13 La leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado, adicionados con vitamina D o con vitaminas A 
y D, según corresponda, deben hacer figura r su contenido con las siguientes leyendas: 
9.13.1  "Contiene _______ μg de Vitamina D por L", o 
9.13.2 "Contiene _______ μg de Vitamina D  y _______ μg equivalentes de retinol (Vitamina A)/L".       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
9.13.3  En el espacio en blanco debe figurar el conten ido de dichos nutrimentos, o sus equivalentes por 
100 g, por porción o por envase, si éste contiene sólo una porción. El término entre paréntesis es opcional. 
9.13.4 El texto, “Adicionada con Vitamina D” para los productos adicionados con Vitamina D 3. 
9.13.5  Cuando voluntariamente se señalen dentro de la de claración nutrimental, deben figurar como se 
señala a continuación: 
Tabla 8 
Nutrimento Cantidad por 100 g o por porción o por envase 
Vitamina A μg equivalentes de retinol  
Vitamina D μg 
9.14 Los productos con modificación en su composición deben cumplir con lo señalado en la NOM-086-
SSA1-1994, citada en el apartado de referencias, a exc epción de los indicados en el numeral 9.8.2.1, los 
cuales deben cumplir con lo señalado en este ordenamiento. 
9.15 Cálculo de vitaminas 
9.15.1 Vitamina A 
1 UI de vitamina A es equivalente a 0,3 μg equivalentes de retinol (todos los Retinoles “trans”). 
9.15.2 Vitamina D 3 
1UI de vitamina D 3 es equivalente a 0,025 μg de colecalciferol. 
9.16 Leyendas precautorias  
9.16.1  Los productos que contengan alcohol etílico o be bidas alcohólicas en cantidades superiores al 
0,5%, deben incluir en la superficie principal de exhibici ón de la etiqueta, la siguiente leyenda: “Este producto 
contiene ______% de alcohol. No recomendable para niños”. (En el espacio en blanco citar el contenido de alcohol en %). 
9.17 La cantidad de proteínas que ha de indicarse, debe calcularse utilizando la siguiente fórmula: 
Leche, derivados o productos lácteos y quesos Proteína = contenido total de nitrógeno Kjeldahl X 6.38 
Dulces a base de leche, Helados, Sorbetes: Proteína = contenido total de nitrógeno Kjeldahl X 6.25 
9.18 En el caso de que los productos objeto de esta norma contengan o incluyan productos preenvasados 
como parte de promociones u obsequios, tales como pr oductos de panificación, cereales, chocolate u otros 
alimentos, deben incluir en el envase del producto de promoción u obsequio, cuando menos la siguiente información: lista de ingredientes, identificación del responsable del producto, fecha de caducidad y lote. 
9.19 Cuando en las etiquetas se declaren u ostenten en forma escrita, gráfica o descriptiva que los 
productos, su uso, aplicación, ingredientes o cualquie r otra característica están recomendados, respaldados o 
aceptados por centros de investigación, asociaciones, or ganizaciones, entre otros, los cuales deberán contar 
con reconocimiento nacional o internacional de su experie ncia y estar calificados para dar opinión sobre la 
información declarada. Se deberá contar con el sustento técnico respectivo, el que estará a disposición de la 
Secretaría de Salud en el momento qu e lo solicite. Dichas declaraciones deben sujetarse a lo siguiente: la 
leyenda debe describir claramente la característica referida, estar precedida por el símbolo o nombre del 
organismo y figurar en caracteres claros y fácilmente legibles. 
9.20 Los productos destinados a ser reconstituidos o los contenidos en envases que requieran 
instrucciones de uso o consumo especiales, deben in cluir una descripción escrita o gráfica de las 
instrucciones de uso, empleo o preparación. 
9.21 Los productos envasados en punto de venta, deben ostentar la siguiente información: 
9.21.1 Nombre o denominación del producto. 
9.21.2 Fecha de envasado y, en su caso, fecha de caducidad, señalando el día y el mes y anteponiendo la 
leyenda que corresponda “fecha de envasado _____”, “fecha de caducidad _____”, o leyenda equivalente. 
10. Concordancia con normas internacionales Esta norma es parcialmente equivalente a las siguientes normas: 
10.1 Codex Alimentarius. CODEX STAN 232-2001. Norma Nivel Máximo para la Aflatoxina M 1 en la 
Leche. 
10.2 Codex Alimentarius. CODEX STAN A-9-1976, Re v. 1-2003. Norma del Codex Para Las Natas 
(Cremas) Y Las Natas (Cremas) Preparadas. 
10.3 Codex Alimentarius. CODEX STAN A-6-1978, Rev. 1-1999, enmend ado en 2006. Norma del General 
del Codex para el Queso. 
10.4 Codex Alimentarius. CODEX STAN 221-2001. Norma colectiva para el  Queso No Madurado, Incluido 
el Queso Fresco. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
11. Bibliografía 
11.1 Ley Federal sobre Metrología y Normalización. 
11.2 Reglamento de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización. 
11.3 Ley General de Salud. 
11.4 Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios. 
11.5 Norma Oficial Mexicana NOM-008-SCFI-1994. Sistem a general de unidades de medida. México, D.F. 
11.6 Guía para la redacción, estructuración y present ación de las normas oficiales mexicanas. NORMA-Z-
13/02. 
11.7 Food and Drug Administration. Grade "A" Pasteurize d Milk Ordinance. (2003 Revision). Department of 
Health and Human and Services. U.S.A. 
11.8 Fernández Escartín, E. 2000. "Microbiología e in ocuidad de los Alimentos”. Universidad Autónoma de 
Querétaro. 
11.9 Food and Agriculture Organizatio n of the United Nations. 1994. “S ummary of evaluations performed 
by the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Ad ditives (JECFA)”. ILSI Press, Washington. 
11.10  U.S. Food & Drug Administration . 2001. Center for Food Safety & Apllied Nutrition. Foodborne 
pathogenic microorganisms and natural  toxins handbook. “Bad bug book”. 
11.11  Secretaría de Salud. Dirección General de Contro l Sanitario de Bienes y Servicios. Aplicación de 
Análisis de Riesgos, Identificación y Control de Puntos Críticos en la Industria de la Leche Pasteurizada. 
México 1994. 
11.12  Secretaría de Salud. Dirección General de Contro l Sanitario de Bienes y Servicios. Pasteurización 
de la Leche Controles y Exámenes Curso 302. Traducción de documentos de la FDA. México, 1994. 
11.13  Norma Mexicana NMX-F-703-COFOCALEC-2004, Si stema de producto leche –alimentos- lácteos –
leche y producto lácteo (o alimento lácteo)- fermentad o o acidificado –denominac iones, especificaciones y 
métodos de prueba. 
11.14  Norma Mexicana NMX-F-709-COFOCALEC-2004, Sistema producto leche –alimento- alimento 
lácteo regional- chongos zamoranos y producto lácteo tipo chongos zamoranos –denominaciones, 
especificaciones y métodos de prueba. 
12. Observancia de la norma 12.1 La vigilancia del cumplimiento de la presente no rma corresponde a la Secretaría de Salud, a los 
gobiernos de las entidades federativas, en el  ámbito de sus respectivas competencias. 
13. Vigencia 
13.1 La presente Norma Oficial Mexicana entrará en vigor a los 60 días naturales posteriores a la fecha de 
su publicación en el Diario Oficial de la Federación,  a excepción de los numeral es 6.1.5.5 y 6.1.5.5.1 los 
cuales entrarán en vigor a los 365 días naturales posteriores a la misma fecha. 
Transitorio 
Unico:  Con la entrada en vigor de la presente Norma Oficial Mexicana se cancelan las siguientes normas 
oficiales mexicanas: 
• NOM-035-SSA1-1993, Bienes y servicios. Quesos de suero. Especificaciones sanitarias, publicada en 
el Diario Oficial de la Federación el 30 de enero de 1995. 
• NOM-036-SSA1-1993, Bienes y servicios. Helados de  crema, de leche o grasa vegetal, sorbetes y 
bases o mezclas para helados. Especificaciones sanitarias, publicada en el Diario Oficial de la 
Federación el 10 de marzo de 1995. 
• NOM-121-SSA1-1994, Bienes y servicios. Quesos: frescos, madurados y procesados. 
Especificaciones sanitarias, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 23 de febrero de 1996. 
• NOM-184-SSA1-2002, Productos y servicios. Leche,  fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
Especificaciones sanitarias, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 23 de octubre de 2002 
• NOM-185-SSA1-2002, Productos y servicios. M antequilla, cremas, producto lácteo condensado 
azucarado, productos lácteos ferm entados y acidificados, dulces a base de leche. Especificaciones 
Sanitarias, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 16 de octubre de 2002. 
Sufragio Efectivo. No Reelección. 
México, Distrito Federal, a 25 de junio de 2010.- El Comisionado Federal para la Protección contra 
Riesgos Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, Miguel Angel Toscano Velasco .- Rúbrica.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
APENDICE NORMATIVO A 
A.1 Límites Máximos para Aditivos Alimentarios. 
Aditivo Límite máximo 
mg/kg Observaciones 
Acido acético glacial BPF Quesos frescos y procesados. 
Leche fermentada o acidificada. Helados, sorbetes y bases para helados.  
Acido algínico 10,000 Helados, sorbetes y bases para helados. 
BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Quesos frescos y procesados 
Acido ascórbico * 500 
(expresado como ácido 
ascórbico) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(deshidratados o c on grasa vegetal). 
Crema deshidratada. 
BPF Productos objeto de esta norma saborizados o 
edulcorados. 
Acido benzoico y sus sales 
de sodio, potasio y calcio 1000 Cremas y mantequillas 
Dulces a base de leche. 
50 Leche fermentada o acidificada ** 
Acido cítrico BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
esterilizados saborizados. 
Quesos frescos y procesados Mantequillas 
Para todo tipo de cremas (incluyendo cremas 
acidificadas). 
Leche fermentada o acidificada Dulces a base de leche Helados, sorbetes y bases para helados  
Acido eritórbico BPF Dulces a base de leche. 
Acido fosfórico 9,000 
(total de compuestos de 
fósforo añadidos, calculados como fósforo) Quesos frescos y procesados 
3,000 
(mezclado con otros aditivos 
que tengan la misma función y 
que se listen en este apartado, expresados como sustancias anhidras). Para todo tipo de cremas. 
2,000 
(solo, expresado como 
sustancia anhidra). Para todo tipo de cremas. 
Acido fumárico BPF Leche fermentada o acidificada. 
Acido L (+) tartárico BPF Lec he fermentada o acidificada. 
Acido láctico BPF Quesos frescos y procesados 
Para todo tipo de cremas (incluyendo cremas 
acidificadas) 
Leche fermentada o acidificada Dulces a base de leche Helados, sorbetes y bases para helados. 
Acido D,L-málico BPF Quesos frescos 
Leche fermentada o acidificada Helados, sorbetes y bases para helados. 
Acido propiónico BPF Ques os frescos y procesados. 
Acido sórbico y sus sales de 
sodio, potasio y calcio 3,000 
(sólo o mezclado, expresado 
como ácido sórbico) Quesos frescos, procesados y madurados 
Para todo tipo de cremas 
Mantequillas Bases para helados 
600 Dulces a base de leche. 
250 Leche fermentada y acidificada. ** Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
Adipato acetilado de 
dialmidón 10,000 
(sólo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este 
apartado.) Quesos frescos saborizados (petit) 
Leche fermentada y acidificada. 
BPF Dulces a base de leche. 
Agar 5,000 
(sólo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este apartado.) Para todo tipo de cremas. 
Leche fermentada y acidificada. 
Dulces a base de leche. 
BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Quesos frescos y procesados. 
Alginato de amonio 10,000 Helados, sorbetes y bases para helados. 
8,000 
(sólo o mezclado con otros 
espesantes) Quesos procesados 
BPF Leche fermentada o acidificada. 
Para todo tipo de cremas Dulces a base de leche. 
Alginato de calcio 10,000 Helados, sorbetes y bases para helados. 
2,000 Leche fermentada o acidificada 
BPF Fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Quesos frescos y procesados. Para todo tipo de cremas 
Alginato de potasio 10,000 Helados, sorbetes y bases para helados. 
2,000 Leche fermentada o acidificada. 
BPF Fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Quesos frescos y procesados. Para todo tipo de cremas Leche fermentada o acidificada 
Dulces a base de leche. 
Alginato de propilenglicol 10,000 Helados, sorbetes y bases para helados. 
8,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este apartado.) Quesos frescos y procesados 
5,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este 
apartado.) Crema para batir y crema vegetal. 
Dulces a base de leche. 
1,400 Fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Alginato de sodio 10,000 Helados, sorbetes y bases para helados. 
2,000 Leche fermentada o acidificada. 
BPF Fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Quesos frescos y procesados. Para todo tipo de cremas Leche fermentada o acidificada. 
Almidón acetilado 20,000 
solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este 
apartado.) Leche fermentada o acidificada. 
10,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este apartado.) Quesos frescos saborizados (petit) 
BPF  Dulces a base de leche. 
Quesos frescos y procesados       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
Almidón oxidado 20,000 
solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este 
apartado.) Leche fermentada o acidificada. 
10,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este 
apartado.) Quesos frescos saborizados (petit) y quesos 
procesados. 
BPF Dulces a base de leche. 
Almidones modificados 20,000 
solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este apartado.) Leche fermentada o acidificada 
Helados, sorbetes y bases para helados. 
10,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este apartado.) Quesos frescos saborizados (petit) y quesos 
procesados. 
BPF Dulces a base de leche 
Amarillo ocaso FCF 
Amarillo alimentos 3 
No. C.I. 15985 300 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este 
apartado.) Leche condensada azucarada. 
200 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este 
apartado.) Dulces a base de leche. 
100 Quesos saborizados 
Helados, sorbetes y bases para helados 
35 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o aromatizados). 
12 Leche fermentada o acidificada. 
Ascorbato de calcio* 500 
(expresado como ácido 
ascórbico) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(deshidratados o c on grasa vegetal). 
Ascorbato de potasio* 500 
(expresado como ácido 
ascórbico) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(deshidratados o c on grasa vegetal). 
Ascorbato de sodio * 500 
(expresado como ácido 
ascórbico) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(deshidratados o c on grasa vegetal). 
Crema deshidratada 
Azafrán (Estigmas de 
Crocus sativus  L.) 
Amarillo natural 6 
No. C.I 75100 BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o aromatizados). 
Azorrubina y sus lacas 
Rojo alimentos 3 y sus 
lacas 
No. C.I. 14720 100 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o aromatizados), helados, sorbetes y bases 
para helados 
Quesos frescos saborizados (petit) Leche fermentada o acidificada. 
Azul brillante FCF y sus 
lacas. 
Azul alimentos 2 y sus 
lacas. 
No. C.I. 42090 200 Dulces a base de leche. 
150 Leche fermentada o acidificada. 
Quesos frescos saborizados (petit) 
Crema para batir Helados, sorbetes y bases para helados 
Beta caroteno sintético 
Anaranjado alimentos 5. 
No. C.I. 40800 600 Quesos procesados. 
100 Leche fermentada o acidificada 
35 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o aromatizados). 
25 Quesos madurados. 
Mantequilla. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
Beta-apo-8'-carotenal 
Anaranjado alimentos 6. 
No. C.I. 40820 100 Helados, sorbetes y bases para helados. 
Leche fermentada o acidificada 
35 Quesos madurados y procesados. 
35 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o aromatizados). 
25 Mantequilla 
Butil hidroquinona terciaria 200 Mantequilla (modificada en su composición) 
100 Dulces a base de leche. 
Butil hidroxianisol 200 Mantequilla (modificada en su composición) 
100 Crema deshidratada y crema vegetal deshidratada. 
Dulces a base de leche. 
Butil hidroxitolueno 100 Dulces a base de leche. 
200 Mantequillas  
Cafeína 400 Helados, sorbetes y bases para helados. 
Cantaxantina 
Anaranjado alimentos 8. 
No. C.I. 40850 100 Helados, sorbetes y bases para helados. 
Caramelo Clase I BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o aromatizados) 
Quesos frescos y procesados Quesos saborizados Leche condensada azucarada Leche fermentada o acidificada Dulces a base de leche Helados sorbetes y bases para helados 
Caramelo Clase II 3,200 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o aromatizados). 
150 Leche condensada azucarada 
Leche fermentada o acidificada Dulces a base de leche. 
100 Quesos saborizados 
Helados sorbetes y bases para helado 
Caramelo Clase III 150 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o aromatizados). 
Leche condensada azucarada. 
Leche fermentada o acidificada. 
Dulces a base de leche. 
100 Helados sorbetes y bases para helado 
Quesos saborizados 
Caramelo Clase IV 150 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o aromatizados). 
Leche condensada azucarada. 
Leche fermentada y acidificada. 
Dulces a base de leche. 
100 Helados, sorbetes y bases para helados 
Quesos saborizados 
Carbonato de amonio BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Carbonato de calcio 10,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este 
apartado, expresado como sustancia anhidra). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(deshidratados). 
Crema deshidratada. Leche fermentada o acidificada 
2,000 
(solo, expresado como 
sustancia anhidra). Leche condensada azucarada. 
BPF Quesos frescos, madurados y procesados 
Para todo tipo de cremas 
Carbonato de magnesio BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados).       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
Carbonato de potasio 5,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este 
apartado, expresado como 
sustancia anhidra). Crema deshidratada. 
3,000 
(mezclado con otros aditivos 
que tengan la misma función y que se listen en este apartado, 
expresados como sustancias 
anhidras). Leche condensada azucarada. 
BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Para todo tipo de cremas 
Carbonato de sódio 3,000 
(mezclado con otros aditivos 
que tengan la misma función y 
que se listen en este apartado, expresados como sustancias anhidras). Leche condensada azucarada. 
BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Helados, sorbetes y bases para helados Para todo tipo de cremas. Mantequilla. 
Carbonato hidrogenado de 
amonio BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Carbonato hidrogenado de 
potasio BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Carbonato hidrogenado de 
sodio 2,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este apartado, expresado como 
sustancia anhidra). Mantequilla. 
BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Quesos frescos y procesados 
Dulces a base de leche. 
Carboximetilcelulosa BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o modificados  en su composición). 
Quesos frescos, madurados y procesados. 
Helados, sorbetes y bases para helados. 
Carboximetilcelulosa de 
sodio 10,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este 
apartado) Leche fermentada o acidificada. 
Dulces a base de leche. 
Helados, sorbetes y bases para helados. 
BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o esterilizados). 
Quesos frescos y procesados 
Todo tipo de cremas  
Carotenos naturales 
Anaranjado alimentos 5. 
No. C.I. 75130 100 Leche fermentada o acidificada 
100 Productos objeto de esta norma, excepto: leche, fórmula 
láctea y producto lácteo combinado. 
Helados, sorbetes y bases para helados.  
600 Mantequilla 
Quesos frescos y quesos  madurados (corteza) 
Carragenato de calcio 1,200 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este 
apartado). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o modificados  en su composición). Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
Carragenina 
y sus sales de potasio, 
sodio y amonio 10,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este 
apartado). Helados, sorbetes y bases para helados. 
8,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este 
apartado). Quesos procesados. 
BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Quesos frescos Para todo tipo de cremas Leche fermentada o acidificados (cuajados 
naturalmente), 
Dulces a base de leche Leche condensada azucarada Productos esterilizados. 
Celulosa microcristalina BPF Leches saborizadas, leche fe rmentada o acidificadas. 
Quesos madurados y quesos frescos 
Para todo tipo de cremas. Helados, sorbetes y bases para helados. 
Cera blanca y amarilla de 
abeja BPF Cobertura de quesos. 
Cera de candelilla BPF Cobertura de quesos. 
Cera de carnauba BPF Cobertura de quesos. 
Cera de cascarilla de arroz BPF Cobertura de quesos. 
Cera microcristalina 30,000 Cobertura de quesos. 
Citrato de calcio 3,000 
(mezclado con otros aditivos 
que tengan la misma función y 
que se listen en este apartado, 
expresados como sustancias 
anhidras). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
Fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
2,000 
(solo, expresado como 
sustancia anhidra). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
Fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
BPF Quesos frescos y procesados 
Todo tipo de cremas 
Leche fermentada o acidificada 
Citrato tripotásico 5,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este 
apartado, expresado como 
sustancia anhidra). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(deshidratados). 
Crema deshidratada. 
2,000 
(solo, expresado como 
sustancia anhidra). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
Fórmula láctea y producto lácteo combinado. Todo tipo de cremas Leche condensada azucarada. 
BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
Quesos frescos y procesados Todo tipo de cremas 
Leche condensada azucarada 
Leche fermentada o acidificada       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
Citrato trisódico 5,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este apartado, expresado como sustancia anhidra). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(deshidratados). 
3,000 
(mezclado con otros aditivos 
que tengan la misma función y que se listen en este apartado, expresados como sustancias anhidras). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
Fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
Leche condensada azucarada 
2,000 
(solo, expresado como 
sustancia anhidra). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
Fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
Leche condensada azucarada 
Leche fermentada o acidificada. Dulces a base de leche 
BPF Quesos frescos y procesados. 
Todo tipo de cremas Leche fermentada o acidificada 
Clorofilas 
Verde natural 3 
No. C.I. 75810 BPF Quesos saborizados, pr ocesados y madurados 
Dulces a base de leche  
Cloruro de calcio 1,200 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra). Fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
BPF Quesos frescos, madurados y procesados. 
Dulces a base de leche. 
Leche condensada azucarada 
Todo tipo de cremas 
Cloruro de potasio BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
Dulces a base de leche. 
Complejos cúpricos de 
clorofilas 
Verde natural 3. 
No. C.I. 75810 300 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o aromatizados). 
Curcumina Cúrcuma (Raíz 
de Curcuma longa L.) 
No. C.I. 75300 100 Leche fermentada o acidificada. 
Dulces a base de leche. Quesos frescos y procesados 
50 Helados, sorbetes y bases para helados. 
D-alfa-tocoferol concentrado 300 Dulces a base de leche. 
Helados, sorbetes y bases para helados 
Dextrinas 20,000 Helados, sorbetes y bases para helados. 
Quesos frescos y procesados 
Leche fermentada o acidificada 
Dióxido de azufre 50 Leche fermentada o acidificada. ** 
Dióxido de silicón  amorfo 10,000 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(deshidratados). 
Crema deshidratada. 
Dióxido de titanio 
Pigmento blanco 6. 
No C.I. 77891 BPF Helados, sorbetes y bases para helados. 
Quesos frescos y procesados. Dulces a base de leche. Todo tipo de cremas 
Dl-alfa tocoferol 300 Dulces a base de leche. 
Helados, sorbetes y bases para helados 
Eritrosina 
Rojo alimentos 14 
No. C.I. 45430 2 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o aromatizados). 
27 Leche fermentada o acidificada 
Helados, sorbetes y bases para helados. 
Esteres acéticos de los 
mono y diglicéridos de los 
ácidos grasos. BPF Fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Todo tipo de Crema. 
Quesos frescos y madurados Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
Esteres cítricos de los mono 
y diglicéridos de los ácidos 
grasos BPF Fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Todo tipo de Crema.  
Esteres lácticos de los 
mono y diglicéridos de los 
ácidos grasos 10,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este apartado) Todo tipo de cremas 
BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(modificados en su composición) 
Leches saborizadas 
Fórmula láctea y producto lácteo combinado Leche fermentada o acidificada 
Helados, sorbetes y bases para helados  
Esteres diacetil tartáricos de 
los mono y diglicéridos de 
los ácidos grasos. 1,200 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este apartado) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(modificados en su composición). 
10,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este apartado) Helados, sorbetes y bases para helados. 
BPF Fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
Para todo tipo de cremas. 
Esteres de propilenglicol de 
ácidos grasos 10,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este apartado) Helados, sorbetes y bases para helados. 
Esteres de ácidos grasos y 
sacarosa 10,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este apartado) Helados, sorbetes y bases para helados. 
BPF Fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
Eter apocarotenóico 50 Helados, so rbetes y bases para helados. 
Etil maltol 50 Helados, sorbetes y bases para helados. 
Etilvainillina 1,000 Helados, so rbetes y bases para helados. 
Extracto de annato 
(Extracto de semillas de 
Bixa orellana ). Anaranjado 
natural 4. 
No. C.I. 75120 600 
(calculado como bixina) Quesos procesados. 
60 
(calculado como bixina) Quesos madurados. 
20 
(calculado como bixina) Mantequilla. 
Dulces a base de leche. 
10 
(calculado como bixina) Leche fermentada o acidificada 
0.05 
(calculado como bixina) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o aromatizados). 
Extracto de cochinilla 
(Extracto de Coccus cacti  
L.). 
Rojo natural 4. 
No. C.I. 75470 150 Helados, sorbetes y bases para helados 
100 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o aromatizados). 
50 Leche fermentada o acidificados. 
Dulces a base de leche. Quesos saborizados 
BPF Leche condensada azucarada. 
Fosfato de dialmidón 
acetilado BPF Leche fermentada o acidificada. 
Dulces a base de leche 
Quesos frescos y procesados 
Fosfato de aluminio y sodio 1,000 Dulces a base de leche. 
Quesos procesados 
Fosfato de amonio 1, 000 Dulces a base de leche. 
Fosfato de dialmidón BPF Leche fermentada o acidificada. 
Dulces a base de leche. Quesos frescos y procesados       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
Fosfato de hidroxipropil 
dialmidón 20,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este apartado.) Leche fermentada o acidificada 
BPF Dulces a base de leche. 
Quesos frescos y procesados 
Fosfato hidrogenado de 
magnesio 1,000 Dulces a base de leche. 
Fosfato hidrogenado de 
sodio 9000 
(solo o mezclado, calculado 
como pentóxido de fósforo) Quesos frescos y procesados 
5000 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(deshidratados) 
3000 
(mezclado con otros aditivos 
que tengan la misma función y 
que se listen en este apartado, 
expresados como sustancias 
anhidras) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados) 
2000 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizado) 
1200 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
1000 Dulces a base de leche 
500 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(modificados en su composición) 
150 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(ultrapasteurizados) 
BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados) 
Fosfato de monoalmidón 20,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este apartado.) Leche fermentada o acidificada 
BPF Dulces a base de leche. 
Quesos frescos y procesados 
Fosfato dihidrogenado de 
calcio 9000 Quesos procesados 
Fosfato dihidrogenado de 
potasio 9,000 Quesos procesados 
5,000 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(deshidratados). 
3,000 
(mezclado con otros aditivos 
que tengan la misma función y que se listen en este apartado, 
expresados como sustancias 
anhidras). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
2,000 
(solo, expresado como 
sustancia anhidra). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
1,200 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
1,000 Dulces a base de leche. 
500 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(modificados en su composición). 
150 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(ultrapasteurizados). 
BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
Fosfato dihidrogenado de 
sodio 9000 Quesos procesados 
Fosfato hidrogenado de 
calcio 9,000 
(total de fosfatos, calculados 
como fósforo) Quesos procesados. 
3,000 
(mezclado con otros aditivos 
que tengan la misma función y 
que se listen en este apartado, 
expresados como sustancias 
anhidras). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
2,000 
(solo, expresado como 
sustancia anhidra). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
1,000 Dulces a base de leche. 
Fosfato fosfatado de 
dialmidón 20,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este 
apartado.) Leche fermentada o acidificada. 
BPF Dulces a base de leche. 
Quesos frescos y procesados 
Fosfato hidrogenado 
dipotásico 5,000 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(deshidratados). 
Quesos procesados 
3,000 
(mezclado con otros aditivos 
que tengan la misma función y que se listen en este apartado, expresados como sustancias 
anhidras). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
2,000 
(solo, expresado como 
sustancia anhidra). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
1,200 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
500 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(modificados en su composición). 
150 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(ultrapasteurizados). 
BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Fosfato hidrogenado 
disódico 30,000 
(solo o mezclado, expresado 
como pentóxido de fósforo) Quesos frescos y procesados. 
 
5,000 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(deshidratados). 
3,000 
(mezclado con otros aditivos 
que tengan la misma función y que se listen en este apartado, expresados como sustancias 
anhidras). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
2,000 
(solo, expresado como 
sustancia anhidra). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
1,200 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
1,000 Dulces a base de leche. 
Cremas y cremas para batir 
500 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(modificados en su composición). 
150 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(ultrapasteurizados). 
BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados).       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
Fosfato monomagnésico 1,000 Dulces a base de leche. 
Fosfato tricálcico 9,000 
“límite establecido como 
emulsificante” 
(solo o mezclado, calculado 
como pentóxido de fósforo) Quesos frescos y procesados 
3,000 
(mezclado con otros fosfatos 
que se listen en este apartado, 
expresados como P 2O5). Para todo tipo de cremas. 
Leche condensada azucarada 
2,000 
(solo, expresado como P 2O5). Para todo tipo de cremas. 
Leche condensada azucarada 
1,000 Dulces a base de leche. 
Fosfato trimagnésico 1,000 Dulces a base de leche. 
Fosfato tripotásico 5,000 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(deshidratados). 
Crema deshidratada. 
3,000 
(mezclado con otros aditivos 
que tengan la misma función y 
que se listen en este apartado, 
expresados como sustancias 
anhidras). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
Para todo tipo de cremas. Leche condensada azucarada. 
2,000 
(solo, expresado como 
sustancia anhidra). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
Para todo tipo de cremas. 
Leche condensada azucarada. 
1,000 Dulces a base de leche. 
Fosfato trisódico 9,000 
(solo o mezclado, calculado 
como pentóxido de fósforo) Quesos frescos y procesados. 
5,000 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(deshidratados). 
Crema deshidratada. 
3,000 
(mezclado con otros aditivos 
que tengan la misma función y 
que se listen en este apartado, 
expresados como sustancias anhidras). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
Para todo tipo de cremas. Leche condensada azucarada. 
2,000 
(solo, expresado como 
sustancia anhidra). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
Para todo tipo de cremas. Leche condensada azucarada. 
2,000 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Mantequillas 
1,000 Dulces a base de leche. 
Galato de propilo 90 Dulces a base de leche. 
100 Mantequillas 
Glicerol 10,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este 
apartado.) Helados, sorbetes y bases para helados. 
Gluconato ferroso BPF Helados, so rbetes y bases para helados. 
Glucono delta lactona BPF Todos los quesos 
Leche fermentada o acidificada 
Glutamato monosódico BPF Quesos frescos y procesados 
Goma arábiga 
o acacia 1,200 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este apartado.) Fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Quesos frescos y procesados. Leche fermentada o acidificada. 
Helados, sorbetes y bases para helados 
Para todo tipo de Crema. Dulces a base de leche. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
Goma damar 1,200 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este apartado.) Fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Goma de algarrobo 10,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este 
apartado.) Helados, sorbetes y bases para helados. 
5,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este 
apartado.) Para todo tipo de Crema 
Leche fermentada o acidificada. 
Dulces a base de leche. 
1,200 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este apartado.) Fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Leche fermentada o acidificada. Quesos frescos y procesados. 
Goma gellana 1,200 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este 
apartado.) Fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Goma guar 1,200 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este 
apartado.) Leche esterilizada, fórmula láctea y producto lácteo 
combinado. 
BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Quesos frescos y procesados. Leche fermentada o acidificada. Helados, sorbetes y bases para helados Para todo tipo de Crema Dulces a base de leche. 
Goma karaya 1,200 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este apartado.) Fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Quesos frescos y procesados. Helados, sorbetes y bases para helados 
Goma tara 1,200 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este 
apartado.) Fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Quesos frescos y procesados       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
Goma tragacanto 1,200 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este 
apartado.) Fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Productos lácteos acidificados. 
Goma Xantana 5,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este 
apartado.) Para todo tipo de cremas. 
Leche fermentada o acidificados. 
Dulces a base de leche. Helados, sorbetes y bases para helados 
1,200 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este 
apartado.) Fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Quesos frescos y procesados. Leche fermentada o acidificada. 
Hidróxido de amonio BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Hidróxido de calcio 2,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este 
apartado.) Mantequilla. 
Hidróxido de magnesio BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Hidróxido de potasio BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
2,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este 
apartado.) Mantequilla. 
Hidróxido de sodio BPF Quesos frescos 
Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados) 
Mantequillas (modificadas en su composición) 
Hidroxipropil almidón BPF Leche fermentada o acidificada. 
Dulces a base de leche. 
Quesos frescos y procesados 
Hidroxipropil metil celulosa 10,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este 
apartado.) Helados, sorbetes y bases para helados. 
BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Indigotina y sus lacas. Azul 
alimentos 1 y sus lacas 
No. C.I. 73015 1000 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o aromatizados). 
300 Dulces a base de leche. 
100 Helados, sorbetes y bases para helados 
6 Leche fermentada o acidificada. 
Lactato de calcio BPF Para todo tipo de Crema 
Leche fermentada o acidificada 
Quesos frescos 
Lactato de sodio BPF Para todo tipo de Crema 
Quesos frescos Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
Lecitina 5,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este 
apartado.) Quesos procesados.  
BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados, esterilizados  o deshidratados). 
Mantequilla. 
Dulces a base de leche. Helados, sorbetes y bases para helados 
Cremas esterilizadas  
Maltodextrinas BPF Todos los productos objeto de la norma. 
Metil celulosa 10,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este 
apartado.) Helados, sorbetes y bases para helados. 
Metil etil celulosa 10,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este 
apartado.) Helados, sorbetes y bases para helados. 
Esteres metílico y etílico del 
ácido βapo-8´- carotenóico 
o anaranjado alimentos 7 
(éster etílico) 35 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o aromatizados). 
Mono y diglicéridos 10,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma función y que se listen en este 
apartado.) Helados, sorbetes y bases para helados 
Para todo tipo de Cremas. 
2000 Leche 
Quesos frescos, madurados y procesados. 
Leche fermentada o acidificada 
BPF Dulces a base de leche 
Leches, Fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
Monoestearato de sorbitán 5,000 Quesos frescos 
1,000 Para todo tipo de cremas. 
Helados, sorbetes y bases para helados 
Monoestearato de sorbitán 
polioxietilenado (20) 1,000 Helados, sorbetes y bases para helados. 
Para todo tipo de cremas 
500 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o aromatizaos). 
Monolaurato de sorbitán 
polioxietilenado 1,000 Para todo tipo de cremas. 
Monooleato de sorbitán 
polioxietilenado 1,000 Para todo tipo de cremas. 
Helados, sorbetes y bases para helados 
Pimaricina. 40 
(solo para el tratamiento de la 
superficie o corteza de los 
quesos, ausente a la profundidad de 5 mm) Quesos madurados 
Nisina 12.5 Quesos fresco s, madurados y procesados. 
Nitrato de potasio 50 Quesos madurados. 
Nitrato de sodio 50 Quesos madurados. 
Octenil succinato sódico de 
almidón 10,000 Leche fermentada o acidificada 
BPF Dulces a base de leche. 
Oleorresina de paprika BPF Para todos los productos objeto de esta norma. 
Oxido de magnesio 10,000 Crema deshidratada. 
Palmitato de amonio 100 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(deshidratados o c on grasa vegetal). 
Palmitato de ascorbilo 500 Crema deshidratada. 
200 Dulces a base de leche. 
100 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(deshidratados o c on grasa vegetal).       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
Palmitato de calcio 100 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(deshidratados o c on grasa vegetal). 
Palmitato de potasio 100 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(deshidratados o c on grasa vegetal). 
Palmitato de sodio 100 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(deshidratados o c on grasa vegetal). 
Pectato de amonio BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Pectato de calcio BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Pectato de potasio BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Pectato de sodio BPF Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Pectinas BPF Helados, sorbetes y bases para helados. 
Leche fermentada o acidificada 
Para todo tipo de Cremas. Dulces a base de leche. Quesos frescos y procesados 
Peróxido de hidrógeno BPF Quesos madurados 
Piramicina o natamicina 40 Q uesos frescos y procesados 
Pirofosfato tetrapotásico 9000 Quesos procesados 
Pirofosfato tetrasódico 9000 Quesos procesados 
Pirofosfato dicálcico 9000  Quesos procesados 
Polidextrosa BPF Helados, sorbetes y bases para helados. 
Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado, 
dulces a base de leche, leche saborizada. Todo tipo de cremas. Leche fermentada o acidificada 
Polifosfato de calcio 9,000 Quesos frescos y procesados 
5,000 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(deshidratados). 
3,000 
(mezclado con otros aditivos 
que tengan la misma función y 
que se listen en este apartado, expresados como sustancias 
anhidras). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
2,000 
(solo, expresado como 
sustancia anhidra). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
Polifosfato de potasio 9,000 Quesos frescos y procesados 
5,000 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(deshidratados). 
Crema deshidratada. 
3,000 
(mezclado con otros aditivos 
que tengan la misma función y 
que se listen en este apartado, 
expresados como sustancias anhidras). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
Para todo tipo de cremas. 
2,000 
(solo, expresado como 
sustancia anhidra). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
Para todo tipo de cremas. 
1,200 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
150 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Leche ultrapasteurizada. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
Polifosfato de sodio 9,000 Quesos frescos y procesados 
5,000 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(deshidratados). 
Crema deshidratada. 
3,000 
(mezclado con otros aditivos 
que tengan la misma función y que se listen en este apartado, expresados como sustancias 
anhidras). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
Para todo tipo de cremas. 
2,000 
(solo, expresado como 
sustancia anhidra). Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(esterilizados). 
Para todo tipo de cremas. 
Dulces a base de leche 
1,200 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
150 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Leche ultrapasteurizada. 
Ponceau 4R 
Rojo alimentos 7 
No C.I.16255 150 Leche condensada azucarada 
50 Helados, sorbetes y bases para helados. 
Dulces a base de leche. 
80 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o aromatizados). 
48 Leche fermentada o acidificada. 
Quesos saborizados 
Propionato de calcio BPF 
(sólo para el tratamiento de la 
superficie) Quesos frescos y procesados. 
Propionato de potasio BPF 
(sólo para el tratamiento de la 
superficie) Quesos frescos y procesados. 
Propionato de sodio BPF 
(sólo para el tratamiento de la 
superficie) Quesos frescos y procesados. 
Riboflavina 10 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o aromatizados). 
BPF Quesos frescos, madurados y procesados. 
Riboflavina-5´-fosfato de 
sodio 10 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o aromatizados). 
Rojo Allura AC y sus lacas. 
Rojo alimentos 17 y sus 
lacas. 
No. C.I. 16035 300 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este 
apartado.) Leche condensada azucarada. 
Dulces a base de leche. 
140 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o aromatizados). 
50 Leche fermentada o acidificada. 
Rojo betabel BPF Leche fermentada o acidificada 
Leche condensada azucarada. 
Sales de sodio y potasio de 
complejos cúpricos de 
clorofilinas 
No C.I. 75810 300 Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o aromatizados). 
Sales de sodio, potasio o 
calcio del ácido acético BPF Helados, sorbetes y bases para helados. 
Sales de sodio, potasio o 
calcio del ácido cítrico BPF Helados, sorbetes y bases para helados. 
Sales de sodio, potasio o 
calcio del ácido láctico BPF Helados, sorbetes y bases para helados. 
Sales de sodio, potasio o 
calcio del ácido málico BPF Helados, sorbetes y bases para helados. 
Sales de sodio, potasio o 
calcio del ácido tartárico BPF Helados, sorbetes y bases para helados.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
Silicato de calcio 10,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este apartado.) Crema deshidratada. 
Silicato de magnesio 10,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este 
apartado.) Crema deshidratada. 
Sorbato de potasio 3,000 
(solo o mezclado, expresado 
como ácido sórbico) Quesos frescos, procesados y madurados 
Cremas, mantequillas y bases para helado. 
600 Dulces a base de leche. 
200 Leche fermentada o acidificada. ** 
Sorbato de sodio 3,000 
(solo o mezclado, expresado 
como ácido sórbico) Quesos frescos, procesados y madurados. 
Cremas, mantequillas y bases para helado. 
200 Leche fermentada o acidificada. ** 
Tartrazina y sus lacas. 
Amarillo alimentos 4 y sus 
lacas. 
No. C.I. 19140 300 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este 
apartado.) Leche condensada azucarada. 
200 Dulces a base de leche. 
150 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este apartado.) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o aromatizados). 
100 Helados, sorbetes y bases para helados 
18 Leche fermentada o acidificada. 
Triestearato de sorbitán 
polioxietilenado (20) 10,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este 
apartado.) Helados, sorbetes y bases para helados. 
5,000 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este 
apartado.) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados). 
Para todo tipo de cremas. 
Trifosfato pentapotásico 9000 Quesos procesados 
1100 Para todo tipo de cremas 
120 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Fórmula láctea y producto lácteo combinado 
Trifosfato pentasódico 9000 Quesos procesados 
1,200 
(solo o mezclado, expresado 
como sustancia anhidra) Fórmula láctea y producto lácteo combinado. 
Verde rápido FCF y sus 
lacas. 
Verde alimentos 3 y sus 
lacas. 100 
(solo o mezclado con otros 
aditivos que tengan la misma 
función y que se listen en este apartado.) Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado 
(saborizados o aromatizados). 
* No debe reportarse como nutrimento. 
** Exclusivamente para leche fermentada o acidificada preparados con vegetales. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
A2. Enzimas o cultivos de microorganismos 
A.2.1  Para la elaboración de leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado, sometidos a un proceso 
de trasformación parcial de la lactosa en glucosa y galactosa, se permite emplear las siguientes enzimas: 
Enzima Límite Máximo 
Lactasa derivada del Aspergillus niger  BPF 
Lactasa derivada del Aspergillus oryzae  BPF 
Lactasa derivada del Saccharomyces spp  BPF 
Lactasa derivada del Kluyveromyces fragilis  BPF 
Quimosina B derivada de Kluyveromyces lactis  BPF 
 
Y aquellas mencionadas en el Acuerdo y sus modificaciones 
A.2.2  Para la elaboración de los quesos frescos, madurados y procesados se permite emplear las 
siguientes enzimas para cuajar la leche: 
Enzima Límite Máximo 
Pepsina derivada de estómagos de rumiantes y porcinos BPF 
Quimosina A derivada de la Escherichia coli K12, contiene 
gen de proquimosina A de ternera. BPF 
Quimosina B derivada de Kluyveromyces lactis, contiene 
gen de proquimiosina B de ternera. BPF 
Renina, derivada de Bacillus cereus  BPF 
Endothia parasitica  BPF 
Rhizomucor miehei BPF 
 
Y aquellas mencionadas en el Acuerdo y sus modificaciones 
A.2.3  Para la elaboración de crema, dulces a base de leche, se permite emplear las enzimas listadas en el 
Acuerdo y sus modificaciones, derivadas de las fuent es que ahí se establecen y conforme a las BPF. 
A.3 Saborizantes 
A.3.1  Para la elaboración de los productos objeto de esta norma; se permite emplear los saborizantes 
naturales y sintéticos de acuerdo  a las BPF y de conformidad con lo establecido en el Acuerdo y sus 
modificaciones. 
A.4 Edulcorantes no nutritivos 
A.4.1 Para la elaboración de leche productos edulcorados  y saborizados objeto de esta norma, se permite 
el empleo de edulcorantes no nutritivos de confo rmidad con lo establecido en la NOM-086-SSA11994, citada 
en el apartado de referencias. 
A.5 Conservadores 
A.5.1  Para la elaboración de leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado no se permite el empleo 
de conservadores; a excepción de los productos saboriza dos o aromatizados en los que sólo se permite la 
presencia de ácido sórbico, ácido benzóico o las sale s de sodio o potasio de los ácidos anteriores, como 
efecto de la trasferencia de los ingredientes opcionales. 
A.5.2  Para la elaboración de helados, sorbetes y bases para helados, se permite la presencia de 
conservadores como principio de transferencia de los ingredientes opcionales.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
APENDICE NORMATIVO B 
B. METODOS DE PRUEBA 
Precauciones generales de seguridad. 
El analista debe consultar siempre la información respecto a la exposición y manejo seguro de los 
reactivos químicos especificados en estos métodos, para emplear el equipo de seguridad apropiado como 
bata de laboratorio, guantes de látex,  anteojos de seguridad, mascarilla, etc., y trabajar cuando así se requiera 
bajo campana de extracción. 
Para la aplicación de los siguientes métodos analíticos se debe cumplir con las Buenas Prácticas de 
Laboratorio. 
B.1. Recolección de la muestra 
Utilizar un frasco estéril de vidrio o de plástico provis to de tapón de cierre hermético, libre de fenol. Se 
recomienda el empleo de tapones de hule. Transportar la  muestra en una hielera con refrigerante para lograr 
una temperatura de 2ºC a 7°C; para el caso de producto s congelados deben transportarse en congelación. 
B.2. Preparación de la muestra 
Antes de proceder al estudio fisicoquímico de la le che, homogeneizar la muestra por agitación e inversión 
repetida del recipiente que la contiene. En los casos que se observe la formación de grumos, calentar la 
muestra en baño de agua a temperatura aproximada de 38°C y emplear un agitador con gendarme para 
facilitar el desprendimiento de la crema adherida a la pared del frasco o del tapón. 
Mantener la leche a 20°C al tomar las alícuotas necesarias para los análisis.  
B.3. Determinación de Inhibidores 
B.3.1. Derivados Clorados  (prueba cualitativa). 
B.3.1.1. Principio del método. 
Cuando la muestra es tratada con ácido, se libera el cloro presente, si este cloro se hace reaccionar con 
yoduro de potasio y solución de almidón se desarrolla un color azul cuya intensidad va a depender de la 
cantidad de cloro presente. 
B.3.1.2. Equipo . 
B.3.1.2.1. Baño de agua a 85°C. 
B.3.1.3. Materiales . 
B.3.1.3.1. Tubos de ensaye de  16 x 150 mm, o equivalente.  
B.3.1.3.2. Pipetas graduadas de 10 mL. B.3.1.3.3. Agitadores de vidrio. B.3.1.3.4. Embudos de filtración. 
B.3.1.3.5. Papel filtro. 
B.3.1.3.6. Baño de hielo. 
B.3.1.4. Reactivos. 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico a  menos que se indique otra 
especificación y por agua debe  entenderse agua destilada. 
B.3.1.4.1. Yoduro de potasio (KI). Solución al 7%. 
B.3.1.4.2. Acido clorhídrico (HCl) diluido 1:2. A 100 mL de ácido clorhídrico agregar 200 mL de agua. 
B.3.1.4.3. Solución de almidón (C
6H10O5)n. Suspender 1g de almidón en un poco de agua fría, 
homogeneizar y agregarlo a 100 mL de agua hirviendo, agitar hasta disolución completa, enfriar antes de usar. Utilizar solución recientemente preparada. 
B.3.1.5.  Procedimiento.  
B.3.1.5.1.  En un tubo de ensaye poner 5 mL de leche y agregarle 1,5 mL de solución de yoduro de potasio 
al 7%, agregar 4 mL de HCl diluido y mezclar perfectamente con una varilla de vidrio. Incluir una muestra 
control. 
B.3.1.5.2.  Colocar los tubos en un baño de agua a 85°C y dejar reposar 10 min. Sacar los tubos, enfriarlos 
rápidamente y colocarlos en baño de hielo. Filtrar, reco ger el filtrado en un tubo de en saye. Agregar al filtrado 
0,5 - 1,0 mL de solución de almidón. 
B.3.1.6. Interpretación de resultados. 
La aparición de un color azul grisáceo que va desde el azul hasta el azul morado (de acuerdo con la 
concentración de cloro presente), indica la presencia de  cloro. 
B.3.1.7. Expresión de resultados. 
Prueba positiva o negativa 
 
B.3.2. Sales Cuaternarias de  Amonio (prueba cualitativa). 
B.3.2.1. Principio del método 
Cuando se hace reaccionar el ion cuaternario de am onio en medio alcalino con un indicador (anaranjado 
de metilo) se forma un complejo que es extraído con cloroformo, el cual en medio ácido da un color magenta.  Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.3.2.2. Materiales 
B.3.2.2.1. Matraces Erlenmeyer de 125 mL. 
B.3.2.2.2. Mortero de porcel ana de 10 cm de diámetro. 
B.3.2.2.3. Embudos de filtración. 
B.3.2.2.4. Tubos de ensaye. 
B.3.2.2.5. Pipetas graduadas de 10 mL. B.3.2.3. Reactivos. 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico a  menos que se indique otra 
especificación y por agua debe  entenderse agua destilada. 
B.3.2.3.1. Anaranjado de metilo (C
14H14N3NaO 3S). Solución acuosa al 0,15%. 
B.3.2.3.2. Solución acuosa de hidróxido de sodio (NaOH). Disolver 66,5 g de hidróxido de sodio en 100 mL 
de agua. 
B.3.2.3.3. Cloroformo (CHCl 3). 
B.3.2.3.4. Sulfato de sodio anhidro (Na 2SO 4). 
B.3.2.3.5. Acido cl orhídrico (HCl) 2N. 
B.3.2.3.6.  Cloruro de benzalconio [cloruro de n-alquil-(C 12 a C 18) bencildimetil amonio, con un intervalo de 
peso molecular de 351-380 y conteniendo cadenas de los grupos alquilo con 12 y 16 átomos de carbono], al 
0,06%. Para prepararlo considerar la concen tración inicial del reporte del fabricante. 
B.3.2.4. Procedimiento. B.3.2.4.1. Colocar 25 mL de leche en un matraz Erlenmeyer, agregar 0,5 mL de solución acuosa de 
anaranjado de metilo, 1 mL de solución acuosa de hidróxido de sodio y 20 mL de cloroformo, agitar 3 min. 
B.3.2.4.2. Pasar la emulsión resultante a un mortero al que previamente se le han agregado 50 g de 
sulfato de sodio anhídro, triturar perf ectamente, agregar 20 mL de cloroformo  y filtrar. Al filtrado agregar 5 mL 
de ácido clorhídrico 2 N y agitar. 
B.3.2.4.3. Preparar una solución control de color, coloca ndo en un matraz Erlenmeyer 25 mL de leche y 
0,5 mL de la solución de cloruro de benzalconio al 0,06%. Proceder igual que en la muestra. 
B.3.2.5. Interpretación de resultados. 
Un color magenta cereza en la capa acuosa es una prueba positiva de cantidades mayores de 1 mg/kg de 
sales cuaternarias de amonio. 
B.3.2.6. Expresión de resultados. 
Prueba positiva o negativa. 
 
B.3.3. Oxidante (prueba cualitativa). 
B.3.3.1. Principio del método. 
Está basado en la formación de un compuesto colorido al hacer reaccionar el agente oxidante (peróxido de 
hidrógeno) que contenga la muestra con pentóxido de va nadio en presencia de ácido sulfúrico al 6% (v/v) 
B.3.3.2. Materiales. 
B.3.3.2.1. Tubos de ensaye de 15 mL. B.3.3.2.2. Pipetas gr aduadas de 5 y 10 mL. 
B.3.3.2.3. Probetas de 100 mL. B.3.3.3. Reactivos. 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico a  menos que se indique otra 
especificación y por agua debe  entenderse agua destilada. 
B.3.3.3.1.  Solución de ácido sulfúrico al 6%(v/v) 
En un vaso de precipitados medir 94 mL de agua y lentamente resbalando por las paredes, adicionar 6 mL 
de H
2SO 4 concentrado. 
B.3.3.3.2.  Solución de pentóxido de vanadio (V 2O5). 
Disolver 1 g de pentóxido de vanadio en 100 mL de ácido sulfúrico 6 + 94. 
B.3.3.4. Procedimiento. 
En un tubo de ensaye medir 10 mL de leche y agregarle de 0,5 a 1,0 mL del reactivo de pentóxido de 
vanadio. 
B.3.3.5. Interpretación de Resultados. 
La aparición de un color rosa o rojo, indica la presencia de peróxido de hidrógeno (oxidante). 
B.3.3.6. Expresión de resultados. 
Prueba positiva o negativa. 
 
B.3.4. Determinación de Formaldehído (prueba cualitativa). 
B.3.4.1. Principio del método. 
Se basa en la reacción del formaldehído con la sal disódica del ácido cromotrópico formando una 
coloración de lila a púrpura.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.3.4.2. Equipo . 
B.3.4.2.1 Equipo de de stilación Kjeldahl. 
B.3.4.3. Materiales. 
B.3.4.3.1. Matraz Kjeldahl de 800 mL. 
B.3.4.3.2. Material común de laboratorio. 
B.3.4.4. Reactivos. 
Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por agua se 
entiende agua destilada. 
B.3.4.4.1.  Acido fosfórico (H 3PO 4). 
B.3.4.4.2. Sal disódica del ácido cromotrópico ( C 10H8Na2O8S2). 
B.3.4.4.3.  Acido sulfúrico concentrado (H 2SO 4). 
B.3.4.4.4.  Formaldehído (CH 2O) al 37%, densidad = 1,08 g/L. 
B.3.4.4.5.  Solución de ácido sulfúrico al 72%. Verter 15 0 mL de ácido sulfúrico en 100 mL de agua y 
enfriar. 
B.3.4.4.6.  Solución saturada de sal disódica del ácido cromotrópico. Disolver 500 mg de sal disódica del 
ácido cromotrópico en 100 mL de solución de ácido sulfúrico al 72%. Enfria r a temperatura ambiente. 
B.3.4.4.7.  Solución de formaldehído de 40 mg/L. Tomar 1 mL de formaldehído y aforar a 1 L con agua. 
B.3.4.5. Procedimiento. 
B.3.4.5.1. En el matraz de Kjeldahl tomar 100 mL de leche, adicionar 100 mL de agua y acidificar con 2 mL 
ácido fosfórico adicionando 1 mL de exceso. Destilar 50 mL. 
B.3.4.5.2. En un tubo de ensaye poner 1 mL del destilado y 5 mL de solución saturada de sal disódica del 
ácido cromotrópico, colocarlo en baño maría a ebullici ón durante 15 minutos. Observar durante este periodo 
de calentamiento. 
B.3.4.5.3.  Preparar una solución control de color, colocando en un matraz Kjeldahl, 100 mL de leche y 1 
mL de solución de formaldehído. Proceder como se de scribió en los numerales B.3.4.5.1 y B.3.4.5.2. 
B.3.4.6. Interpretación de resultados. 
La aparición de un color lila hasta púrpura indica la presencia de formaldehído. 
B.3.4.7. Expresión de resultados. 
Prueba positiva o negativa. 
 
B.3.5. Inhibidores Determinados por Prueb as Microbiológicas (residuos de antibióticos). 
B.3.5.1. Principio del método. 
Las substancias inhibidoras del crecimiento bacteriano presentes en la leche, se ponen de manifiesto por 
halos de inhibición medibles, que se forman cuando se im pregnan discos de papel filtro con la muestra y se 
depositan sobre la superficie de una placa de agar inoculado con esporas de B. stearothermophilus . 
B.3.5.2. Equipo. 
B.3.5.2.1. Autoclave. 
B.3.5.2.2. Centr ífuga (de preferencia refrigerada). 
B.3.5.2.3. Balanza gra nataria, de dos platillos, sensibi lidad 0,1 g y capacidad de 1000 g. 
B.3.5.2.4. Balanza de precisión o analítica, turbidímetro o uso de estándares de McFarland 
B.3.5.2.5. Incubadora con termostato que evite variaciones mayores a 1,0ºC. 
B.3.5.2.6. Microscopio óptico. B.3.5.2.7. Nefelómetro de McFarland. B.3.5.2.8. Equipo para ti nción de Gram y esporas. 
B.3.5.3. Materiales. 
B.3.5.3.1. Asa y port aasa bacteriológicas. 
B.3.5.3.2. Cajas Petri de vidrio de 100 X 20 mm c on tapa de porcelana vidriada en la parte exterior o su 
equivalente en plástico, colocando un cojinete de papel filtro en la tapa. 
B.3.5.3.3. Discos de papel de 12,7 mm de diámetro gruesos, de velocidad media y con alta retención (S&S 
740 E o equivalentes en poder de absorción, calidad y pureza). 
B.3.5.3.4. Matraces Erlenmeyer de 250 mL. 
B.3.5.3.5. Micropipeta co n capacidad para medir 90 μL. 
B.3.5.3.6. Pinzas de di sección con punta fina. 
B.3.5.3.7. Port a objetos y puente de tinción. 
B.3.5.3.8. Tubos de cultivo con rosca de 13 X 100 mm. 
B.3.5.3.9. Vernier o medidor de halos B.3.5.3.10. Frascos con tapón de rosca Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.3.5.4. Reactivos. 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico a menos que se indique otra 
especificación y por agua debe  entenderse agua destilada. 
B.3.5.4.1.  Subcultivo de Geo bacillus stearothermophilus  ATCC10149 o Bacillus calidolactis  ATCC 10149. 
B.3.5.4.2.  Agar indicador PM.  
Ingredientes Cantidad (g) 
Extracto de carne 3,0 
Peptona  5,0 
Triptona 1,7 
Soytona 0,3 
Dextrosa 5,25 
Cloruro de sodio 0,5 
K2HPO4 0,25 
Polisorbato 80 0,06 
Púrpura de Bromocresol  0,06 
Agar 15,0 
 
Preparación: 
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada. Ca lentar hasta disolución completa del agar. Ajustar 
el pH, si es necesario. Esterilizar a 121ºC durante 15 min. 
pH final 7,8 + 0,2. Distribuir en plac as como se indica en B.3.5.5.5. 
B.3.5.4.3.  Caldo soya tripticasa (CST) sin dextrosa.  
Ingredientes Cantidad (g) 
Peptona de caseína 17,0 
Peptona de soya 3,0 
Cloruro de sodio 5,0 
Fosfato dipotásico 2,5 
 
Preparación: Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada. Ajustar el pH. Distribuir en frascos en cantidades 
según se requiera. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 min. 
pH final 7,3 + 0,2. 
B.3.5.4.4.  Agar Soya Tripticasa (AST).  
Ingredientes Cantidad (g) 
Peptona de caseína 15,0 
Peptona de soya 5,0 
Cloruro de sodio 5,0 
Agar 15,0 
 
Preparación: Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada. Calentar hasta disolución completa de agar. Ajustar 
el pH, si es necesario. Esterilizar a 121ºC durante 15 min.  Enfriar a 50-60ºC y distribuir a placas de Petri. pH 
final 7,3 + 0,2. 
B.3.5.4.5.  Penicilinasa ( â- lactamasa). Se pueden adquirir discos impregnados, de marca comercial que 
funcionan satisfactoriamente. 
B.3.5.4.6. Penicilina G (sustancia de referencia). 
B.3.5.4.7.  Solución estéril de NaCI al 0,85% (m/v) (SS). 
B.3.5.4.8.  Solución amortiguadora de fosfatos, pH 6. 
B.3.5.5. Procedimiento B.3.5.5.1.  Preparación de la solución de trabajo de Penicilina G de referencia. 
Pesar 30 mg de Penicilina G de referencia, dentro de una atmósfera de humedad relativa menor a 50%. 
Disolver en solución amortiguadora de fosfatos par a obtener una concentración de 100-1000 Unidades 
Internacionales/mL. Almacenar en la oscuridad entre 0-4, 0ºC y usar dentro de los dos días siguientes a su 
preparación.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.3.5.5.2. Preparación del inóculo. 
B.3.5.5.2.1.  Mantener el cultivo de B. stearothermophilus  en medio inclinado de AST, haciendo pases 
semanales. A partir de este cultivo inocular de 3 a 5 placas de AST, incubar a 55ºC -64ºC de 18-24 h. 
Cosechar el cultivo de cada placa con 2-3 mL de SS e inocular 3 matraces conteniendo cada uno 150 mL de 
CST sin dextrosa. Incubar a 55 - 64 + 2ºC. 
B.3.5.5.2.2.  Periódicamente hacer una observación microscópica para determinar el grado de esporulación 
del cultivo (aproximadamente el 80% del cultivo en 72 h,  está en fase esporulada). Centrifugar las células a 
5000 rpm durante 15 min. 
B.3.5.5.2.3.  Decantar el sobrenadante y resuspender las cé lulas en SS. Repetir el lavado, suspender las 
células en 30 mL de SS y almacenar entre 0-4,0ºC. Esta  suspensión puede mantenerse viable durante 6-8 
meses. Verificar su viabilidad mediante cultivo en placas de AST. 
B.3.5.5.3 Solución est ándar de leche. 
Diluir la solución de trabajo de Penicilina G en leche libre de inhibidores para obtener una concentración 
de 0.008 UI/mL. Usar recientemente preparado o almacena r entre 0-4,0ºC durante no más de 2 días, también 
se puede distribuir en pequeños volúmenes y congelar durante un tiempo no mayor a 6 meses. 
B.3.5.5.4. Control Negativo. 
Leche fluida con un contenido de grasa de 0,0% a 3,8%  y sólidos totales menos del 13%. Comprobar la 
ausencia de sustancias inhibidoras (comercialmente disponible). 
B.3.5.5.5. Prepar ación de las placas. 
B.3.5.5.5.1.  Inocular el medio de agar indicador PM, f undido y enfriado a 55-64ºC con una suspensión de 
esporas (B.3.5.5.2.3.), en cantidad suficiente para obtener 1 X 106/mL de medio (cada laboratorio deberá 
ajustar el inóculo dependiendo de la concentración de esporas obtenida). De esta suspensión, pasar 7,0 mL a 
placas de Petri y dejar solidificar sobre una superficie nivelada. 
B.3.5.5.5.2.  Utilizar las placas recientemente preparadas o almacenar entre 0-4,0ºC en bolsas de plástico 
selladas e identificadas con la fecha de preparación. No usar después de 5 días a su preparación. 
B.3.5.5.6. Prueba Preliminar. 
B.3.5.5.6.1.  Agregar 90 µL de la muestra, usando micropi peta, asegurarse de que las puntas estén bien 
colocadas, en posición vertical y en el centro del disco, evitar la introducción de burbujas o colocar sobre la 
superficie de la muestra bien mezclada un disco de pa pel sostenido con las pinzas, hasta que se impregne 
completamente por capilaridad. Eliminar cualquier exceso  de leche, tocar ligeramente la superficie interna de 
la tapa y colocar el disco inmediatamente sobre la pl aca de agar. Asegurar un completo contacto del papel 
filtro con el agar, presionar con las pinzas suavem ente (repetir esta operación con todas las muestras). 
B.3.5.5.6.2.  Colocar un disco control en el centro impregnado con el estándar de leche (0,008 UI/mL de 
Penicilina G). Marcar e identificar los controles y las muestras. Se recomienda no colocar más de 7 discos por 
placa: 6 en la orilla y uno en el centro. 
B.3.5.5.6.3.  Verificar que todos los discos estén uniforme mente absorbidos sin presentar exceso de leche 
y colocados en forma adecuada. Invertir las placas e in cubar a 55-64ºC + 2ºC hasta que se observe una zona 
de inhibición bien definida (16 - 20 mm) alrededor del disco control. 
B.3.5.5.6.4.  Examinar las zonas de inhibición de las muestras y medir los halos con vernier. Las zonas de 
inhibición < 14 mm se leen como negativo, zonas > 14 mm indican la presencia de inhibidores, lo cual deberá 
confirmarse. 
B.3.5.5.7. Prueba  Confirmatoria. 
Calentar las muestras a 82ºC + 2 min. Enfriar rápi damente y continuar como se  indica en B.3.5.5.5. 
Colocar también discos impregnados de penicilinasa (com erciales) o agregar 0,05 mL de penicilinasa a 5 mL 
de muestra e impregnar los discos. 
B.3.5.5.8. Controles 
B.3.5.5.8.1.  Cuando se aplica este método, el analista debe estar seguro de que cualquier grado de 
actividad antimicrobiana detectada, proviene de la muestra y nunca de las condiciones ambientales, del 
equipo o reactivos usados; ni del propio analista. 
B.3.5.5.8.2 . Se requiere, por lo tanto, aplicar las bue nas prácticas de laboratorio y los controles 
adecuados, a lo largo de todo el análisis. 
B.3.5.5.8.3.  El control positivo que contiene solución de referencia de Penicilina G a una concentración de 
0,008 UI/mL debe producir zonas de inhibición clar as y bien definidas de aproximadamente 17-20 mm de 
diámetro. Si éstas no se presentan, la prueba no demuestra la sensibilidad adecuada y deberá repetirse. 
B.3.5.5.8.4.  La sensibilidad de este ensayo es normalment e > 0,008 UI/mL. El control del diluyente, 
siempre  debe dar resultados negativos. 
B.3.5.5.9. Precau ciones al realizar la prueba. 
B.3.5.5.9.1.  Para colocar los discos, utilizar pinzas limpias y flameadas. 
B.3.5.5.9.2.  Tocar con el disco la superficie de las muestras y permitir que el disco se sature por 
capilaridad. Las pinzas deben flamear se y enfriarse entre cada muestra. 
B.3.5.5.9.3.  Tocar la boca del recipiente con el disco, para eliminar el exceso de leche. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.3.5.5.9.4.  Colocar el disco sobre el agar a una distancia de aproximadamente 9 mm de la orilla hacia 
adentro y separados entre cada disco, unos 10 mm como mínimo. Presionar el disco suavemente y 
asegurarse de que hace contacto toda su superficie con el agar. 
B.3.5.5.9.5.  Aplicar el control positivo en el centro de la pl aca y el control negativo en cualquiera de los 
seis lugares de la orilla. 
B.3.5.5.9.6.  Incubar las placas en posición invertida, en u na cámara húmeda, a la temperatura y el tiempo 
indicados en la metodología. 
B.3.5.5.10. Precauciones en el uso de la micropipeta. 
B.3.5.5.10.1.  Homogeneizar la muestra. Fijar la punta a la micropipeta y en posición vertical oprimir el 
émbolo hasta el primer tope. 
B.3.5.5.10.2.  Introducir la punta 1 cm debajo de la superficie de la muestra. Soltar el émbolo y dejar que la 
punta se llene. 
B.3.5.5.10.3.  Si el émbolo se suelta rápidamente, el volumen de leche tomado no será uniforme. Si la 
punta no está llena en forma correcta, después de solt ar el émbolo, descartar y repetir la operación. 
B.3.5.6. Interpretación de los Resultados. 
Las pruebas: preliminar y confirmatoria, p ueden dar lugar a los siguientes resultados: 
B.3.5.6.1.  Ausencia de zonas de inhibición en la prueba preliminar: la prueba es negativa a sustancias 
inhibitorias. 
B.3.5.6.2.  Zonas de inhibición alrededor de discos con muestra sin penicilinasa y ausencia de zonas de 
inhibición alrededor de discos tratados con penicilinasa,  en prueba confirmatoria: la prueba es positiva a 
residuos de â- lactámicos. 
B.3.5.6.3.  Presencia de zonas de inhibición de igual tamaño en ambos discos (tratados y no tratados con 
penicilinasa): prueba positiva a sust ancias inhibidoras diferentes a â-lactámicos. 
B.3.5.6.4.  Presencia de zonas de inhibición de menor tamaño (4 mm) en discos tratados con penicilinasa 
que los no tratados, en prueba confirmatoria: prueba positiva a residuos de â-lactámicos y a otros inhibidores. 
B.3.5.7. Expresión de Resultados. 
Prueba positiva o negativa. 
 
B.4. Determinación de Fosfatasa R esidual en leche, fórmula láctea , producto lácteo combinado y 
derivados lácteos. 
B.4.1. Principio del método. 
La muestra se incuba con fenilfosfato en solución regula dora de hidróxido de bario. Si la fosfatasa activa 
está presente, el fenilfosfato se hidroliza y se forma fenol. 
 
Si la leche utilizada en la elaboración del producto ha  sido pasteurizada eficient emente, la fosfatasa se 
inactiva y no hay hidrólisis. 
El fenol formado se determina colorimétricamente haci endo reaccionar con 2,6-dibromoquinonacloroimida 
(B.Q.C.), obteniéndose un color azul, cuya in tensidad se mide espe ctrofotométricamente  a 610 nm. 
B.4.2. Equipo. 
B.4.2.1. Baño de agua con contro l de temperatura a 37-40°C. 
B.4.2.2. Parrilla de calentami ento, de control termostático. 
B.4.2.3. Espectrofotóm etro de UV-Visible o fotocolorímetro disp onible para utilizarse a 610 nm con celdas 
de 1 cm de paso óptico. 
B.4.2.4. Balanza analítica con una precisión de 0,1 mg. 
B.4.3. Materiales. 
Todo el material de vidrio utilizado debe someters e a una temperatura entr e 85-90ºC durante una hora. 
B.4.3.1. Tubos de ensaye de 15 x 150 mm. B.4.3.2. Tubos de ensaye co n graduación de 0 a 10 mL. 
B.4.3.3. Pipetas graduadas en  0,1 mL de 1, 5 y 10 mL. 
B.4.3.4. Embudos de filtración, tallo  corto, de 5 cm de diámetro. 
B.4.3.5. Matraces volumétric os de diferentes capacidades. 
B.4.3.6. Papel filtro  Whatman No. 42 o No. 2 o su equivalente. 
B.4.3.7. Perilla de succión B.4.3.8. Material común de laboratorio. 
B.4.4. Reactivos. 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico y libres de fenol a menos que se 
indique otra especificación y por agua debe entenderse agua destilada. 
B.4.41.  Hidróxido de bario octahidratado  [Ba(OH)
2 . 8 H 2O ]. 
B.4.4.2.  Acido bórico (H 3BO 3). 
B.4.4.3.  Metaborato de sodio (NaBO 2).       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.4.4.4.  Cloruro de sodio (NaCl). 
B.4.4.5. Borato de sodio decahidratado (Na 2 B4O7 . 10 H 2O). 
B.4.4.6. Fenilfosfato disódico (Na 2C6H5PO4 )2H2O. Cristales libres de fenol. Conservar en congelación o 
en desecador. 
B.4.4.7.  Alcohol butílico (C 4H10O). Punto de ebullición 116-118°C. 
B.4.4.8. Sulfato de zinc heptahidratado (Zn SO 4 . 7 H 2O). 
B.4.4.9.  Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO 4 . 5 H 2O). 
B.4.4.10.  2,6 Dibromoquinonacloroimida (BQC) C 6H2OBr 2NCl. 
B.4.4.11.  Fenol (C 6H6O). 
B.4.4.12.  Solución reguladora de hidróxido de bario-borato (pH 10,6 ± 0,15 a 25°C). 
Disolver en agua caliente 25 g de hidróxido de bari o octahidratado (fresco, no deteriorado), enfriar  y diluir a 
500 mL. Por separado, disolver 11 g de ácido bórico y diluir a 500 mL. Calentar cada una de las soluciones a 
50°C, mezclarlas, agitar y enfriar aproximadamente a 20°C. Filtrar y conservar el filtrado en recipiente 
perfectamente tapado y en refrigeración. 
Cuando se aplique para leche, fórmula láctea y pr oducto lácteo combinado, pasteurizados descremados, 
sin sabor, diluir 500 mL de este regulador con 500 mL de agua. 
Cuando se aplique para leche, fórmula láctea y produc to lácteo combinado, pasteurizados con sabor, diluir 
esta solución reguladora con un cuarto de su volumen de agua (ejemplo 80 mL de este regulador con 20 mL 
de agua). 
Para leche de cabra esta solución reguladora se prepara pesando 26 g de hidróxido de bario octahidratado 
en lugar de 25 g. 
B.4.4.13. Soluciones reguladoras de trabajo con fenil fosfato disódico . 
B.4.4.13.1. Para leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado pasteurizados. Disolver 0,1 g de fenil fosfato disódico en 100 mL  de una mezcla de 50 mL de la solución reguladora de 
hidróxido de bario-borato (B.4.4.12). En caso de que el fenil fosfato disódico no esté libre de fenol debe ser 
purificado de la siguiente manera: 
Disolver 0,5 g de la sal en 4,5 mL de agua; agregar 0,5 mL de la solución reguladora de hidróxido de bario-
borato (B.4.4.12.) y dos gotas de reactivo B.Q.C. (B.4.4 .18); dejar en reposo 30 min. Al cabo de este tiempo 
agregar 2,5 mL de alcohol butílico y dejar en reposo hast a que se separe el alcohol, con objeto de eliminar el 
color. Eliminar el alcohol con got ero o pipeta Pasteur y descartar. 
Diluir 1 mL de la solución acuosa a 100 mL con el regula dor de substrato (B.4.4.12). Calentar la solución a 
85°C por 2 min, tapar inmediatam ente y guardar en refrigeración . Esta solución madre debe mantenerse en el 
refrigerador durante algunos días. Al emplearse, desarrollar el color y eliminarlo por extracción como se ha 
indicado anteriormente. La solución es estable por un año si se encuentra bien guardada y con mínima 
exposición al aire.  Antes de usar, desarrollar el color y reextraer si es necesario. 
B.4.4.13.2. Para productos con sabor. 
Disolver 0,1 g de fenil fosfato disódico en 100 mL de una mezcla de 80 mL de la solución de hidróxido de 
bario (B.4.4.12.1) y 20 mL de agua, mezclar bien. Conservar en frasco color ámbar y en refrigeración 
B.4.4.13.3.Para helados y sorbetes. 
Disolver 0,1 g de fenil fosfato disódico en 80 mL de solución de borato-hidróxido de bario (B.4.4.12.) y 20 
mL de agua, mezclar bien. Conservar en frasco color ámbar y en refrigeración. 
B.4.4.13.4.  Para sorbetes. 
Disolver 0,1 g de fenil fosfato disódico en 50 mL de solución de borato-hidróxido de bario (B.4.4.12) y 50 
mL de agua, mezclar bien. Conservar en frasco color ámbar y en refrigeración. 
B.4.4.13.5.  Para quesos y cremas pasteurizadas. 
Disolver 0,1 g de fenil fosfato disódico en 50 mL de solución de borato-hidróxido de bario (B.4.4.12) y 50 
mL de agua, mezclar bien. Conservar en frasco color ámbar y en refrigeración. 
B.4.4.13.6. Para mantequillas. Disolver 0,1 g de fenil fosfato disódico en 100 mL de solución de borato-hidróxido de bario (B.4.4.23) y 50 
mL de agua, mezclar bien. Conservar en frasco color ámbar y en refrigeración 
B.4.4.14. Solución reguladora para desa rrollo de color (pH 9,8 ± 0,15 a 25°C). 
Disolver 6 g de metaborato de sodio y 20 g de cloruro de sodio en agua y diluir a un litro. Conservar en 
refrigeración. 
B.4.4.15. Solución reguladora para dilución de colo r. (Para el caso que la muestra haya salido 
fuertemente positiva).  Diluir 100 mL de la solución anterior (B.4.4.14) a un litro con agua. 
B.4.4.16. Solución reguladora patrón para calibrar el potenciómetro (0,00996 M, pH 9,18 a 25°C). 
Disolver 3,80 g de borato de sodio decahidratado en ag ua y diluir a un litro (en ningún caso debe secarse 
esta sal en el horno, antes de emplearse). 
Para evitar contaminación con CO
2 mantener perfectamente tapado el reci piente o protegerlo con un tubo 
de cal sodada. 
Esta solución reguladora debe utilizarse dentro de los 10 min siguientes a su extracción del frasco. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.4.4.17. Reactivo precipitant e de proteínas zinc-cobre. 
B.4.4.17.1. Para leche, fórmula láctea o producto lácteo combinado pasteurizados sin sabor y 
sorbetes. 
Disolver 3 g de sulfato de zinc heptahidratado y 0,6 g de  sulfato de cobre pentahidratado en agua y diluir a 
100 mL. 
B.4.4.17.2. Para leche, fórmula láctea o producto lácteo combinado, pasteurizados con sabor, 
helados y sorbetes. 
Disolver 4,5 g de sulfato de zinc he ptahidratado y 0,1 g de sulfato de co bre pentahidratado en agua y llevar 
a un volumen de 100 mL. 
B.4.4.17.3. Para quesos 
Disolver 6,0 g de sulfato de zinc heptahidratado en agua y diluir a 100 mL. 
B.4.4.17.4. Para crema pasteurizada. 
Disolver 3,0 g de sulfato de zinc he ptahidratado y 0,6 g de sulfato de co bre pentahidratado en agua y llevar 
a un volumen de 100 mL. 
B.4.4.17.5. Para mantequillas. 
Disolver 4,5 g de sulfato de zinc he ptahidratado y 0,1 g de sulfato de co bre pentahidratado en agua y llevar 
a un volumen de 100 mL. En caso de que la mantequilla es té ácida, sustituir esta solución por la preparada en 
B.4.4.17.3. 
B.4.4.18. Solución de 2,6-dibromoquinonacloroimida (B.Q.C.) (C 6H2OBr 2NCl). 
Disolver 40 mg de polvo de BQC en 10 mL de alcohol etílico y conservar esta solución en frasco gotero 
ámbar. Guardar en refrigeración. La solución es estable durante una semana. Desechar si se torna color café. 
Antes de usarse los nuevos frascos de BQC deberán ser comprobados preparando curvas patrón con 
fenol y comparados con los de la solución en buen estado; hacer esta comprobación cuando menos dos 
veces por año. 
B.4.4.19. Solución de sulfato de cobre para patrones al 0,05%. 
Disolver 0,05 g de sulfato de cobre pentahidratado en 100 mL de agua. 
B.4.4.20. Solución de  alcohol butílico. 
Para ajustar su pH, mezclar un litro de éste, con 50 mL  de la solución reguladora para desarrollo de color 
(B.4.4.15). Conservar en frasco de tapón de vidrio esmerilado. 
B.4.4.21. Solución madre de fenol de 1 mg/mL. 
Pesar exactamente 1,0 g de fenol, transferir a un matr az volumétrico de un litro y llevar al volumen con 
agua. Mezclar perfectamente. Esta solución es est able durante varios meses mantenida en refrigeración. 
B.4.4.22. Solución patrón de fenol de 10 μg/mL o 10 unidades/mL (solución de trabajo). 
Diluir 10 mL de la solución madre (B.4.4.21) a un litro con agua y mezclar perfectamente. 
Para preparar soluciones patrón más diluidas, diluir 5, 10, 30 y 50 mL de esta solución en 100 mL para 
que respectivamente conten gan 0,5; 1,0; 3,0 y 5,0 μg o unidades de fenol por mL. Estas soluciones patrón 
mantenidas en refrigeración no se deben emplear después de una semana. 
De manera semejante preparar las soluciones patrón que contengan 20, 30 y 40 unidades por mL. 
Guardar en refrigeración y permitir que esté a la temperatura ambiente en el momento de su uso. 
B.4.4.23. Solución reguladora de borato-hidróxido de bario (18:8 m/v). únicamente para 
mantequillas. 
Disolver en agua caliente 18 g de hidróxido de bario oc tahidratado (fresco, no deteriorado) y diluir a 500 
mL. Por separado, disolver 8 g de ácido bórico en agua ca liente, enfriar y diluir a 500 mL. Calentar cada una 
de las soluciones a 50°C, mezclarlas, agitar y enfriar ap roximadamente a 20°C. Filtra r y conservar el filtrado 
en recipiente perfectamente tapado y en refrigeración. 
B.4.4.24. Solución reguladora de sustra to (para valorar la pasteurización). 
Disolver 0,10 g de fenilfosfato disódico en 100 mL de una mezcla de 50 mL de  la solución reguladora de 
hidróxido de bario-borato (B.4.4.12) en 50 mL de agua. En  caso de no obtener esta sal libre de fenol, debe ser 
purificada como sigue: 
Disolver 0,5 g de la sal en 4,5 mL de agua; agregar 0,5 mL de la solución reguladora de hidróxido de  
bario-borato (B.4.4.12) y do s gotas de reactivo B.Q.C. (B.4.4.18); de jar en reposo 30 min.  Al cabo de este 
tiempo agregar 2,5 mL de alcohol butílico y dejar en reposo hasta que se separe el alcohol, con objeto de 
eliminar el color. Eliminar el alcohol con gotero o pipeta Pasteur. 
Diluir 1 mL de la solución acuosa a 100 mL con el regu lador de sustrato (B.4.4.12.). Calentar la solución a 
85°C por 2 min, tapar inmediatamente y guardar en el re frigerador. Esta solución madre debe mantenerse en 
el refrigerador durante algunos días. Al emplearse, desa rrollar el color y eliminarlo por extracción como se ha 
indicado anteriormente. La solución es estable por un año si se encuentra bien guardada y con mínima 
exposición al aire. Antes de usar, desarrollar el color y reextraer si es necesario.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.4.5. Procedimiento 
B.4.5.1. Preparación de la curva patrón de comparación. B.4.5.1.1.  En series de tubos (de preferencia graduados en 5 y 10 mL), medir volúmenes adecuados de la 
solución patrón de trabajo, a fin de obtener un margen favorable de patrones según las necesidades. Se 
recomienda incluir 0,0 (testigo), 0,5; 5,0; 1,0; 3,0; 10,0; 20,0; 30,0 y 40,0 unidades. 
B.4.5.1.2.  Con objeto de aumentar la intensidad del color azul y la estabilidad de los patrones agregar a 
cada tubo 1 mL de la solución de sulfato de cobre al  0,05% (4.4.19) y a continuación 5 mL de la solución 
reguladora para dilución de color (B.4.4.15). Llevar a un volumen de 10 mL con agua. Agregar 4 gotas de la 
solución B.Q.C. (B.4.4.18.) mezclar y dejar en reposo 30 min, a temperat ura ambiente para desarrollo de 
color. 
B.4.5.1.3.  En caso de emplear el procedimiento de extra cción con alcohol butílico normal, proceder como 
se indica más adelante. 
B.4.5.1.4.  Hacer la lectura de la intensidad del color con un  espectrofotómetro a 610 nanómetros, restar el 
valor que alcanza la lectura del testigo a la de cada una de las soluciones patrones de fenol; finalmente 
construir una curva de calibración la cual debe ajustarse mediante el método de mínimos cuadrados 
(regresión lineal). 
B.4.5.1.5. .Si se pretende efectuar una comparación visual de los patrones, se conservan en refrigeración 
y se prepara una nueva serie cada semana. 
B.4.5.1.6.  Para el caso de la determinación de fosfatasa en leche, fórmula láctea o producto lácteo 
combinado, es fundamental la homogenización antes de des arrollar la técnica. Colocar varios mililitros en un 
tubo de ensaye pequeño, tapar y guardar en el refriger ador; si es necesario el empleo de un conservador 
agregar cloroformo en concentraciones de 1-3 mL por cada 100 mL de leche, fórmula láctea o producto lácteo 
combinado. 
B.4.5.2. Preparación de la Muestra. 
B.4.5.2.1. Leche fórmula láctea o producto lácteo combinado. 
B.4.5.2.1.1.  Medir con pipeta 1 mL de muestra preparada de leche en 2 o 3 tubos (se necesita un tubo 
como testigo y se recomienda preparar dos o más tubos  para determinaciones por duplicado); en caso de la 
leche de cabra emplear 3,0 mL de la muestra. 
B.4.5.2.1.2.  Agregar a cada tubo 10 mL de la solución reguladora de trabajo con fenil fosfato disódico 
(B.4.4.13.1.) o para las determinacio nes cuantitativas en leche cruda; ta par los tubos y mezclar (pH 10,0 ± 
0,15). 
B.4.5.2.1.3.  Calentar el tubo testigo en un baño de agua a ebu llición cubierto durante 1 min (la temperatura 
interna del tubo debe estar entre 85-90°C). Dejar enfriar  a temperatura ambiente y mezclar de nuevo con el 
agitador. 
B.4.5.2.2. Productos saborizados, helados y sorbetes. 
B.4.5.2.2.1.  Pesar 1,0 g de muestra (de preferencia por dup licado), colocar en un tubo (si la muestra es 
pegajosa, pesar en papel encerado de 2,5 x 2,5 cm e inse rtar el papel con la muestra dentro del tubo). De la 
misma forma pesar otra cantidad igua l que servirá de muestra testigo. 
B.4.5.2.2.2.  Calentar el tubo testigo en un baño de agua a ebu llición cubierto durante 1 min (la temperatura 
interna del tubo debe estar entre 85-90°C). Dejar enfriar  a temperatura ambiente y mezclar de nuevo con el 
agitador. 
B.4.5.2.2.3.  Agregar a los tubos con muestra 1 mL de la solución reguladora de trabajo correspondiente 
(B.4.4.13.), mezclar con el agitador de vidrio. A parti r de esta etapa manejar de igual forma el testigo y las 
muestras. 
B.4.5.2.2.4.  Agregar 10 mL de la solución reguladora correspondiente: 
Para productos saborizados (B.4.4.13.2). 
Para helados y sorbetes (B.4.4.13.3). Para sorbetes (B.4.4.13.4). 
B.4.5.2.3. Mantequilla. 
B.4.5.2.3.1.  Pesar 1,0 g de muestra (de preferencia por duplic ado) en piezas de papel encerado de 2,5 
cm, insertar el papel con la muestra dentro de un t ubo de ensaye. De la misma forma pesar otra cantidad de 
muestra que servirá de testigo. 
B.4.5.2.3.2.  Calentar el tubo con la muestra testigo en un baño de agua a ebullición y cubierto, durante un 
minuto (la temperatura interna del tubo debe estar entr e 85 y 90°C), y dejar enfria r a temperatura ambiente. A 
partir de esta etapa manejar de igual manera el testigo y las muestras. 
Agregar a cada tubo 10 mL de la solución reguladora de trabajo (B.4.4.13.6), tapar los tubos y mezclar. 
B.4.5.2.4. Quesos y crema pasteurizada . 
B.4.5.2.4.1.
 Pesar 0,5 g de queso o 1,0 g de crema (de pref erencia por duplicado), colocar en tubo (si la 
muestra es pegajosa, pesar en papel en cerado de 2,5 x 2,5 cm e insertar el papel con la muestra dentro del 
tubo). De la misma forma, pesar otra cantid ad de la muestra que servirá como testigo. 
B.4.5.2.4.2.  Agregar al tubo que contiene la muestra testigo 1 mL de solución reguladora de  borato-
hidróxido de bario. Calentar en un baño a ebullición y cubierto, durante un minuto. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.4.5.2.4.3. Agregar a los tubos con muestra, 10 mL de la solución reguladora de trabajo correspondiente 
(B.4.4.13.7), mezclar con el agitador de vidrio. A parti r de esta etapa manejar de igual forma que el testigo y 
las muestras (excepto para crema vieja o ligeramente agria en donde se agregan 7 mL de la solución 
reguladora de trabajo y 2 mL de agua) para hacer un volumen total de 10 mL. 
B.4.5.2.4.4.  Mezclar (el agitador de vidrio puede quedarse durante la incubación o retirarse en este paso). 
Si se retira, enrollar una pieza de 2,5 x 2,5 cm de pa pel filtro apretado alrededor del agitador y secarlo por 
rotación mientras se retira el tubo. Introducir el papel en el tubo. 
Nota:  La temperatura interna del tubo que contiene la muestra testigo que debe estar entre 85-90°C, es 
controlada con un termómetro sumergido en un tubo de tamaño y volumen igual al de las pruebas. 
B.4.5.3. Determinación de Fosfatasa Residual  (Esta parte del procedimiento es común a todos los 
derivados lácteos). 
B.4.5.3.1.  Inmediatamente después de agregar la solución de substrato, incubar los tubos en baño de 
agua durante una hora a 37-38°C agitando ocasionalmen te durante este tiempo. Trasladar los tubos a un 
recipiente con agua a ebullición durante 1 min. Dejar enfria r los tubos a la temperatura ambiente por inmersión 
en un recipiente de agua fría. 
B.4.5.3.2.  Agregar con una pipeta 1 mL de la solu ción precipitante de proteínas zinc-cobre 
correspondiente (B.4.4.17) a los tubos de la siguiente manera: 
a) Para leche, fórmula láctea o producto lácteo combinado , sin sabor y sorbetes adicionar la solución 
(B.4.4.17.1). 
b) Para leche, fórmula láctea o producto lácteo comb inado, pasteurizados con sabor, helados y sorbetes, 
adicionar la soluci ón (B.4.4.17.2). 
c) Para quesos adicionar la solución (B.4.4.17.3). 
d) Para cremas adicionar la solución (B.4.4.17.4). 
e) Para mantequillas adicionar la solución (B.4.4.17.5). 
B.4.5.3.3.  Mezclar perfectamente el contenido de los tubos.  El pH de la mezcla debe estar entre 9,0-9,1; 
filtrar (empleando embudos de 5 cm de diámetro y papel filtro No. 42 de 9 cm de diámetro o bien el No. 2 o su 
equivalente). Recoger 5 mL del filtrado en un  tubo, de preferencia graduado en 5 y 10 mL. 
B.4.5.3.4.  Agregar 5 mL de solución reguladora para desarrollo de color (B.4.4.14). El pH de la mezcla 
debe estar entre 9,3-9,4. 
B.4.5.3.5  Agregar 4 gotas del reactivo B.Q.C. (B.4.4. 18), mezclar y dejar a temperatura ambiente durante 
30 min para desarrollo de color. En los casos en que se investigue pasteurización deficiente se agregan 2 gotas del reactivo de B.Q.C. 
B.4.5.3.6. Determinar la Intensidad del color azul con cualquiera de los siguientes métodos: 
a) Método espectrofotométrico.  
Leer las intensidades de color del tubo testigo y de la s muestras a 610 nm, restar la lectura del testigo de 
la lectura del tubo de la muestra y convertir el re sultado a unidades de fenol,  utilizando la curva patrón 
(B.4.5.1). 
Ordinariamente se hace innecesaria la extracci ón con alcohol butílico cuando se emplea el 
espectrofotómetro. En los casos en que se emplee la extra cción con este alcohol, purificar el reactivo como se 
señala en la valoración de la pasteurización (B.4.4.13. 1), centrifugar la muestra durante 5 min a fin de romper 
la emulsión y remover el agua suspendida en la c apa alcohólica. Después de ce ntrifugar, con una pipeta 
capilar provista de bulbo de hule, separar todo el alcohol butílico. Filtrar y recoger el filtrado en la celda del 
espectrofotómetro y leer a 610 nm. 
b) Método visual con escala de patrones.  
Comparar los colores de las muestras que dan más de 5 unidades con los tubos de color que contienen 
patrones de fenol (B.4.5.1). 
Para obtener resultados cuantitativos en aquellos casos en que haya variaciones entre 0,5 y 5 unidades de 
color, hacer la extracción con alcohol butílico, agreg ando 5 mL de alcohol e invirtiendo lentamente varias 
veces; centrifugar como se señala en el método anterior, si fuera necesario, para aumentar la claridad de la 
capa alcohólica y comparar el color con los patrones tratados en igual forma. 
En aquellas pruebas en las que durante el desarro llo de color se obtengan resultados fuertemente 
positivos (por ejemplo con 20 unidades o más) y en las cuales no sean suficientes 4 gotas del reactivo de 
B.Q.C. (B.4.4.18) para reaccionar con to do el fenol, hacer diluciones co locando nuevos t ubos con volúmenes 
conocidos que se diluyen a 10 mL con la solución reguladora de dilución de color (B.4.4.15) y agregar 2 o más 
gotas del reactivo B.Q.C. En cada una de estas prue bas diluir el testigo y tratarlo directamente. 
De la misma manera en aquellos casos en los que estas nuevas diluciones produzcan nuevamente 
reacciones fuertemente positivas, todavía será necesario volver a preparar otras diluciones más, hasta que el 
color quede comprendido entre los de la escala o de la curva del espectrofotómetro. 
Para hacer la lectura final, dejar tr anscurrir 30 min a partir  del momento de la adición del reactivo B.Q.C a 
fin de que se desarrolle totalmente su color. Multiplicar las lecturas de las diluciones por el factor de dilución 
por 2 en el caso de haber diluido 5 mL; por 10, para aquella dilución inicial 1+9 mL y por 50, en caso de una 
dilución inicial 1+9 mL, seguida de otra de 2+ 8 mL.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.4.6. Cálculos. 
B.4.6.1. Para leche, fórmula láctea o producto lácteo combinado, pasteurizados u otros productos 
lácteos  donde se mide 1 mL de muestra líquida y se adicionan 11 mL de los reactivos (el volumen total del 
líquido es de 12 mL) y se emplean 5 mL del filtrado. 
U. de Fenol/mL = C x 2,4 
B.4.6.2. Para productos saborizados, helados y sorbetes  donde se pesan 1 g de la muestra y se 
agregan 11 mL de los reactivos (el volumen total del líquido es de 12 mL) y se emplean 5 mL del filtrado. 
U. de Fenol/g = C x 2,2 donde: 
C = concentración de la muestra obtenida de la gr áfica de la curva patrón en unidades fenol/mL. 
2,2 y 2,4 = Factores de dilución. 
B.4.6.3. Para mantequilla y crema  donde se pesa 1 g de la muestra y se adicionan 11 mL de los 
reactivos (el volumen total del líquido es de 12 mL) y se emplean 5 mL del filtrado. 
U. de Fenol/ g = C x 2.4 
B.4.6.4. Para queso  donde se pesa 0,5 g de muestra y se agregan 11 mL de los reactivos (el volumen 
total del líquido es de 12 mL) y se emplean 5 mL del filtrado. 
U. de Fenol/g = C x 4,4 
donde: C = concentración de la muestra obtenida de la gr áfica de la curva patrón en unidades fenol/mL. 
2.2. y 4.4.= Factores de dilución con respecto a los diferentes productos. 
B.4.7. Expresión de resultados . 
Unidades de fenol / mL o g. 
 
B.5. Determinación de Materia Extraña en leche, fó rmula láctea, producto lácteo combinado, dulces 
de leche, helados, mantequilla y cremas. 
B.5.1. Principio del método. 
Los insectos enteros, fragmentos de los mismos, pelos  de roedor o alguna materia extraña se separan de 
la muestra por filtración para su identificación al microscopio. 
B.5.2. Equipo 
B.5.2.1. Balanza analítica con 0,1 mg de sensibilidad. 
B.5.2.2. Equipo de f iltración al vacío. 
B.5.2.3. Microscopio binocular este reoscopio con objetivos que pueden se r de 3, 6, 7 y 10 X, oculares 
apareados de amplio campo visual de 10, 30 y 100 X, respectivamente. 
B.5.2.4. Lámpara para el microsco pio o luz natural equivalente. 
B.5.3. Materiales. 
B.5.3.1. Embudo Büchner. 
B.5.3.2. Matraz Kitazato. B.5.3.3. Vasos de precipitados de 1000 mL 
B.5.3.4. Caja Petri. 
B.5.3.5. Papel de filtra ción rápida para conteo con líneas paralelas de aproximadamente 5 mm de 
separación. 
B.5.3.6. Material común de laboratorio. 
B.5.4. Reactivos. 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico a menos que se indique otra 
especificación y por agua debe  entenderse agua destilada. 
B.5.4.1.  Mezcla de glicerina:etanol 1:3 (v/v) (opcional). 
B.5.5. Procedimiento. 
B.5.5.1. Preparación de la muestra. B.5.5.1.1. Productos líquidos. 
Mezclar bien todo el contenido de la muestra. 
B.5.5.1.2. Productos deshidratados. 
Pesar por duplicado 50 g de leche descremada o 65 g de leche entera y reconstituir ajustando el volumen 
a 500 mL con agua a 40ºC. 
B.5.5.2. Determinación. 
B.5.5.2.1. Filtrar toda la muestra sobre un embudo de succi ón preparado con papel filtro para conteo, 
tratando de vertirlo uniformemente. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.5.5.2.2. Durante la filtración lavar cont inuamente el papel filtro con agua a 80ºC aproximadamente, para 
evitar la acumulación de partículas que tapen los poros del papel. 
B.5.5.2.3. Pasar el papel filtro a una caja Petri y humedecer la con la mezcla glicerina-etanol (opcional). 
Examinar al microscopio utilizando una luz suficientem ente fuerte que muestre los detalles en el papel filtro. 
B.5.5.2.4. Contar con una aguja de disección sobre toda la superficie del papel, línea por línea y explorar 
cada pieza del material dado que algunos fragmentos son irreconocibles a menos que se muevan. 
B.5.6  Expresión de resultados.  
B.5.6.1.  Productos deshidratados. 
Presencia o ausencia de insectos enteros, 
fragmentos de insectos, pelos de roedor y 
cualquier materia extraña que se encuentre en 50 g o 65 g de muestra. 
 
B.5.6.2.  Productos líquidos. 
Presencia o ausencia de insectos enteros, 
fragmentos de insectos, pelos de roedor y 
cualquier materia extraña que se encuentre en la cantidad de mL que contenga el envase 
analizado. 
 
B.6. Determinación de materia extraña  en quesos. Método de filtración. 
B.6.1. Principio del método. 
La materia extraña debe separarse por sedimentación y posteriormente filtrarse para su observación al 
microscopio. 
B.6.2. Equipo 
B.6.2.1. Parrilla de calentam iento con agitación magnética. 
B.6.2.2. Equipo de f iltración al vacío. 
B.6.2.3. Microscopio binocular es tereoscópico con objetivo que pueden ser de 3,6,7 y 10x y oculares 
apareados de amplio campo visual de 10, 30 y 100 x respectivamente. 
B.6.3. Materiales 
B.6.3.1. Cuchillo B.6.3.2. Vaso de precipitados de 2 L 
B.6.3.3. Termómetro graduado de 0°C a 100°C 
B.6.3.4. Embudo Buchner B.6.3.5. Matraz Kitasato de 1 L 
B.6.3.6. Papel filtro W hatman # 1 de diámetro igual al tamaño del embudo 
B.6.3.7 Barra magnética B.6.3.8. Material común de laboratorio 
B.6.4. Reactivos. 
Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por agua se 
entiende agua destilada. 
B.6.4.1. Acido fosfórico 1:40 (H
3PO 4). 
Mezclar un volumen de ácido fosfórico en 40 volúmenes de agua. 
B.6.4..2. Solución de hidróxido de sodio al 5% (Na OH). 
Disolver 5 gramos de hidróxido de sodio en agua y diluir a 100 mL. B.6.4.2. Etanol (C
2H5O) 
B.6.5. Procedimiento. 
B.6.5.1.  Cortar 50 g del producto en cubos, de aproximadamente 6 mm y pasarlos a un vaso de 2 L, 
adicionar de 800 a 1000 mL de solución hirviente de ác ido fosfórico (1:40) y con un agitador magnético, agitar 
continuamente a baja velocidad aproximadamente 20 min.  o hasta que la muestra se haya dispersado. 
B.6.5.2. Filtrar sin permitir que la muestra se acumule en el  papel y para evitar que el filtro se obstruya 
lavar continuamente con porciones de agua casi a ebulli ción. En caso de obstrucción agregar al agua de 
lavado, una solución alcalina diluida (Hidróxido de sodio al 5% o ácido fosfórico 1:40 o alcohol caliente), hasta 
que el filtro quede limpio, entonces adicionar la muestra en suspensión remanente en el vaso y agua. 
Examinar el papel filtro al microscopio. 
B.6.6. Informe de la Prueba. 
Presencia o ausencia de insectos enteros, fragmentos de insectos, pelos  de roedor, excretas o cualquier 
materia extraña en 50 g de producto.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.7. Determinación de Arsénico, Plomo, Mercurio y Estaño. 
B.7.1. Fundamento 
El método de absorción atómica se basa en hacer pasar un haz de luz monocromática de una frecuencia 
tal que puede ser absorbido por el analito que se encu entra presente en forma de vapor atómico. La medida 
de intensidad luminosa antes y después de su paso por el vapor atómico permite determinar el por ciento de 
absorción. 
La cantidad de absorción aumenta con la concentración de átomos en el medio absorbente, es decir, la 
media de la absorción aumenta con la concentración de l elemento de la muestra, ya sea que esté en su 
condición original o sujeta a pretratamiento. 
B.7.2. Materiales B.7.2.1. Matraces Kjeldahl de 500 mL y 800 mL. 
B.7.2.2. Sistema de reflujo con refrigerante. 
B.7.2.3. Crisoles Vycor de 40 a 50 mL de capacidad. 
B.7.2.4. Crisoles de platino de 40 a 50 mL de capacidad. 
B.7.2.5. Matraces Erlenmeyer de diferentes capacidades. 
B.7.2.6. Matraces volumétricos de diferentes capacidades. 
B.7.2.7. Matraces redondos de fondo plano de 50 mL. 
B.7.2.8. Bombas Parr. 
B.7.2.9. Micropipetas o pipetas de Eppendorf de diferentes capacidades. 
B.7.2.10 . Puntas de plástico para micropipetas. 
B.7.2.11. Papel filtro Whatman No. 2. 
B.7.2.12. Perlas de ebullición. 
B.7.2.13.  Varillas de plástico. 
B.7.2.14. Tubos de ensayo graduados de propilen o propileno de 15 mL. 
B.7.2.15.  Recipientes de propilen o propileno. 
B.7.2.16.  Embudos de filtración de diferentes capacidades. 
B.7.2.17.  Material común de laboratorio. 
B.7.2.18.  Todo el material utilizado debe someterse a lavado de acuerdo con las siguientes 
instrucciones:  
B.7.2.18.1.  El jabón que se use debe ser de preferencia neutro. 
B.7.2.18.2.  Enjuagar perfectamente con agua corriente. 
B.7.2.18.3.  Sumergir el material de vidrio o plástico en un recipiente (de preferencia plástico) que contenga 
una solución de ácido nítrico grado RA al 30 %. 
B.7.2.18.4.  Dejarlo tapado y reposando por un lapso de 24 horas. 
B.7.2.18.5. Quitar el exceso de ácido nítrico con varios enjuagues (5 o 6 veces) con agua deionizada. 
B.7.2.18.6.  Dejar escurrir y secar. 
B.7.2.18.7.  Guardar en cuanto esté seco para evitar contaminación por partículas en el aire. 
B.7.3. Equipo B.7.3.1.  Lámparas de cátodo hueco o de descarga sin electrodos para determinar arsénico, cadmio, cobre, 
estaño, fierro, mercurio, plomo y zinc. 
B.7.3.2.  Fuente de radiofrecuencia en caso de usar lámparas de descarga. 
B.7.3.3.  Automuestreador y recirculador de agua. 
B.7.3.4.  Placa de calentamiento con regulador que alcance una temperatura de 400 a 450 ºC. 
B.7.3.5.  Horno de microondas. 
B.7.3.6. Autoclave que alcance 121 ± 5ºC o 15 lb de presión. 
B.7.3.7.  Centrífuga de laboratorio ca paz de mantener 1600 rpm. 
B.7.3.8. Espectrómetro de absorción atómica equipado con los accesorios para flama, horno de grafito, 
generador de hidruros o vapor frío, dependiendo del método a seguir. 
B.7.3.9.  Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg. 
B.7.3.10.  Mufla capaz de mantener una temperatura de 550 ± 10ºC. 
B.7.3.11.  Horno de calentamiento (estufa) con in tervalo de temperatura de 120 ± 5ºC. 
B.7.3.12. Los instrumentos que a continuación se indic an deben estar calibrados y ajustados antes de su 
operación. 
B.7.4. Reactivos B.7.4.1.  Soluciones estándares de referencia certificadas de cada uno de los metales. Agua, debe ser 
destilada deionizada, con un grado máximo de conductividad de 1 µmho/cm a 25ºC. 
B.7.4.2.  Acido nítrico (densidad específica 1,41), grado suprapuro o de alta pureza para el análisis de 
metales o equivalente 
B.7.4.3.  Acido nítrico (densidad específica 1,41), contenido de mercurio muy bajo. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.7.4.4. Acido perclórico (densidad específica 1,67), grado s uprapuro, o de alta pureza para el análisis de 
metales o equivalente 
B.7.4.5. Acido clorhídrico (densidad específica 1,19), grado suprapuro, o de alta pureza para el análisis de 
metales o equivalente 
B.7.4.6.  Acido sulfúrico (densidad específica 1,84), grado s uprapuro, o de alta pureza para el análisis de 
metales o equivalente 
B.7.4.7  Acido sulfúrico 1 N a partir de la solución grado suprapuro, o de alta pureza para el análisis de 
metales o equivalente 
B.7.4.8  Acido nítrico 65% v/v grado RA. 
B.7.4.9  Peróxido de hidrógeno (densidad específica 1,12). 
B.7.4.10  Hidróxido de sodio granalla reactivo RA. 
B.7.4.11  Aire comprimido seco y limpio. 
B.7.4.12  Gases: acetileno, óxido nitroso, arg ón y nitrógeno, grado absorción atómica. 
B.7.4.13  Solución de Nitrato de Magnesio hexahidratado al 7% p/v. Disolver 70 g de Mg(NO 3)2.6H 2O en 
1000 mL de HCl 1N. 
B.7.4.14  Acido clorhídrico 1 N. Diluir 8,3 mL de HCl y llevar a 100 mL de agua. 
B.7.4.15  Acido nítrico al 50% v/v. Diluir 50 mL de HNO 3 al 65% v/v grado suprapuro en 50 mL de agua. 
B.7.4.16  Acido clorhídrico 8 M. Diluir 66,0 mL de HCl y llevar a 100 mL con agua. 
B.7.4.17  Acido clorhídrico 0,5 N. Diluir 4,15 mL de HCl y llevar a 100 mL con agua. 
B.7.4.18  Solución de Yoduro de Potasio al 15% p/v. Disolver 15 g de KI en 100 mL de agua (esta solución 
debe prepararse en el momento de usarse). 
B.7.4.19  Solución de Yoduro de Potasio al 20% p/v. Disolver 20 g de KI en 100 mL de agua (esta solución 
debe prepararse en el momento de usarse). 
B.7.4.20  Solución de Cloruro de Potasio (10 mg/mL de K). Disolver 1,91 g de KCl en agua y diluir a 100 
mL con agua. 
B.7.4.21  Solución de Nitrato de Magnesio al 50% p/v. Disolver 50 g de Mg(NO3)2.6H2O en 100 mL de 
agua. 
B.7.4.22  Solución de ácido clorhídrico al 1,5% p/v. Diluir 1,5 mL de HCl en 100 mL de agua destilada 
deionizada. 
B.7.4.23  Solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 1 g de hidróxido de sodio y diluir a 100 mL con 
agua destilada deionizada. 
B.7.4.24  Solución de borohidruro de sodio al 4% p/v en solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 4 g 
de borohidruro de sodio en 100 mL de una solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Filtrar al vacío. 
B.7.4.25  Solución reductora para mercurio. Mezclar 50 mL de ácido sulfúrico concentrado con 
aproximadamente 300 mL de agua. Enfriar a temperatura ambiente y disolver 15 g de cloruro de sodio, 15 g 
de sulfato o cloruro de hidroxilamina y 25 g de clorur o o sulfato estanoso en solución. Diluir a 500 mL. 
B.7.4.26  Solución de dilución para mercurio. En un matraz de 1 l, conteniendo de 300 a 500 mL de agua 
destilada deionizada, agregar 58 mL de ácido nítrico co ncentrado de muy baja concentración de mercurio y 67 
mL de ácido sulfúrico concentrado.  Diluir al volumen con agua. 
B.7.4.27  Solución de trabajo de As de 1 µg/mL. Diluir 1 mL de la solución patrón de 1000 µg/mL a 1l con 
ácido sulfúrico 1N preparada a partir de la soluci ón grado suprapuro. Preparar fresca cada día. 
B.7.5 Preparación de la Muestra 
B.7.5.1 Digestión por Vía Húmeda para la determinación de Pb. B.7.5.1.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, u na cantidad apropiada de muestra. 
Para la determinación por el método de absorción por flama pesar como máximo 40 g de líquidos, 20 g de 
alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos sólidos o semisólidos. Limite el contenido 
de grasa o aceite a un máximo de 4 g y el total de materia orgánica a 5 g. 
B.7.5.1.2  Añadir 10 mL de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar directamente la 
digestión. 
B.7.5.1.3  Usar matraz de Kjeldhal o matraz conectado al sistema de refrigerantes. 
B.7.5.1.4 Calentar suavemente. 
B.7.5.1.5  Digerir la muestra 3 horas o más tiempo si es necesario (algunas muestras requieren la adición 
de mayor cantidad de ácido nítrico) hasta la aparición de l color traslúcido, si queda ámbar, adicionar peróxido 
de hidrógeno gota a gota con agitación continua (reacción exotérmica). 
B.7.5.1.6  Enfriar. 
B.7.5.1.7  Recuperar, filtrar y llevar a un volumen conocido en matraz volumétrico. Se pueden hacer tantas 
diluciones sean necesarias de acuerdo a la cantidad contenido del metal. 
B.7.5.1.8 . Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión. 
B.7.5.1.9  Leer en el aparato de elección (espectrómetro  de absorción atómica por flama u horno de 
grafito).       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.7.5.2 Digestión por Vía Seca para la determinación de Pb. 
B.7.5.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, u na cantidad apropiada de muestra. 
B.7.5.2.2  Para la determinación por el método de absorci ón por flama pesar como máximo 40 g de jugo o 
bebida, 20 g de alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos sólidos y semisólidos. 
Límite el contenido de grasa o aceite a un máximo de 4 g y el total de materia orgánica a 5g. 
B.7.5.2.3  Añadir 10 mL de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar directamente la 
digestión. En productos con alta concentración de proteí nas adicionar una solución de nitrato de magnesio al 
7,0% p/v y mezclar completamente, llevar a seque dad aproximadamente durante 6 horas en estufa a una 
temperatura de 90 a 95ºC. 
B.7.5.2.4  Colocar la muestra en una mufla y elevar la te mperatura lentamente de 2 a 4ºC por minuto hasta 
350°C. Mantener la temperatura hasta que cesen los humos. 
B.7.5.2.5  Elevar gradualmente la temperatura de 500 a 550º C para evitar que la muestra se incinere y 
mantener esa temperatura dur ante 16 horas o toda la noche. 
B.7.5.2.6  Apagar la mufla y dejar enfriar. 
B.7.5.2.7 Un segundo paso de calcinación puede ser requerido para remover algunos residuos de carbón, 
mediante el siguiente procedimiento: La var las paredes del crisol con 2 mL de ácido nítrico al 50%. Colocar la 
muestra en una placa de calentamient o puesta a 120ºC para remover el exceso de ácido. Colocar la muestra 
en una mufla fría y elevar la temperatura gradualm ente de 500 a 550ºC, manteniéndola por el tiempo 
necesario. Repetir este procedimiento cuantas veces sea necesario hasta que quede libre de carbón 
remanente. 
B.7.5.2.8 Disolver las cenizas completamente en 5 mL de ácido clorhídrico 1N, transferir la muestra 
disuelta a un tubo de propileno o a un matraz de volume n conocido, enjuagar el crisol con dos alícuotas de 5 
mL de ácido clorhídrico 1 N y transferir al mismo tubo  o matraz para obtener un volumen de 15 mL en el 
primero y llevar al aforo en el segundo, tapar y mezclar, si  existe presencia de partículas o materia insoluble, 
filtrar en papel Whatman No. 2, antes  de la determinación. Se pueden hacer tantas diluciones sean necesarias 
de acuerdo a la cantidad contenido del metal. 
B.7.5.2.9 Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión. 
B.7.5.2.10  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica: flama u horno de grafito). 
B.7.5.3 Digestión por Vía Húmeda para la determinación de Sn 
B.7.5.3.1 Proceder igual que en el  punto B.7.5.1.1. 
B.7.5.3.2  No adicionar ácido nítrico si no se lleva cabo la digestión total en el mismo día. 
B.7.5.3.3  Adicionar 30 mL de ácido nítrico concentrado al matraz y calentar suavemente por 15 minutos en 
campana para iniciar la digestión, evitando una excesiva producción de espuma. 
B.7.5.3.4  Hervir suavemente hasta tener un remanente de 3 a 6 mL o hasta que la muestra empiece a 
secarse en el fondo. No dejar que la muestra se calcine. 
B.7.5.3.5  Retirar la muestra del calor. 
B.7.5.3.6  Al mismo tiempo correr dos blancos de reactivos. 
B.7.5.3.7  Adicionar 25 mL de ácido clorhídrico c oncentrado, calentar suavemente durante 
aproximadamente 15 minutos, hasta que todo el cloro se a liberado. Aumentar la temperatura gradualmente 
hasta ebullición. 
B.7.5.3.8  Evaporar hasta obtener de 10 a 15 mL usando un matraz similar con 15 mL de agua como 
patrón de volumen. 
B.7.5.3.9  Adicionar aproximadamente 40 mL de agua. 
B.7.5.3.10  Agitar y pasar a un matraz de 100 mL y enjuagar con 10 mL de agua. 
B.7.5.3.11  Cuando el ácido clorhídrico está presente en la digestión, las muestras se pueden quedar toda 
la noche o por más tiempo. 
B.7.5.3.12  Agregar 1 mL de solución de cloruro de potasio en cada matraz. 
B.7.5.3.13  Enfriar a temperatura ambiente. 
B.7.5.3.14  Diluir con agua y agregar más agua para compensar el volumen de grasa en el matraz. 
B.7.5.3.15  Mezclar perfectamente y filtrar de 30 a 50 mL a través de un papel filtro Whatman No. 2 y 
recoger el filtrado en un recipiente de propileno, polipropileno o polietileno. 
B.7.5.3.16  No filtrar los blancos. Tapar las botellas durante el análisis. Las soluciones son estables por 
varios meses. 
B.7.5.3.17  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión. 
B.7.5.3.18  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica: flama u horno de grafito). 
B.7.5.4 Digestión por Vía Húmeda para la determinación de Hg. 
B.7.5.4.1 Sistem a de Reflujo. 
B.7.5.4.1.1  Pesar como máximo 40g de líquidos, 20g de alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 
10g de alimentos sólidos o semisólidos. Limite el contenido de grasa o aceite a un máximo de 4g y el total de la materia orgánica a 5g Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.7.5.4.1.2  Conectar el matraz al sistema de reflujo y agregar poco a poco la cantidad necesaria de ácido 
nítrico concentrado y calentar durant e media hora o hasta que no se observen cambios en la digestión. 
B.7.5.4.1.3  Dejar enfriar y agregar una mezcla de ácido n ítrico y ácido sulfúrico concentrados (1 + 1). 
B.7.5.4.1.4  Calentar y agregar más ácido nítrico gota a got a sobre las paredes del recipiente, hasta que el 
color obscuro de la solución desaparezca. 
B.7.5.4.1.5  Enfriar. 
B.7.5.4.1.6  Si existe grasa o cera filtrar la solución. Se  pueden hacer tantas diluciones sean necesarias de 
acuerdo a la cantidad contenido del metal. 
B.7.5.4.1.7  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión. 
B.7.5.4.1.8  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica de vapor frío). 
B.7.5.4.2 Sistema Cerrado. 
B.7.5.4.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad  apropiada de muestra, dependiendo el tipo de 
ésta, en el recipiente de digestión. 
B.7.5.4.2.2  Agregar la cantidad necesaria de ácido nítrico concentrado. 
B.7.5.4.2.3  Tapar y sellar perfectamente el recipiente de digestión. 
B.7.5.4.2.4  Si el recipiente de digestión es un matraz Erlenmeyer, colocar éste en una autoclave a 15lb por 
30 minutos. Si se utiliza bomba Parr, calentar en parrilla  controlando la temperatura a un máximo de 300ºC 
por 30 minutos. 
B.7.5.4.2.5  Enfriar a temperatura ambiente. 
B.7.5.4.2.6  En caso de que la digestión no sea completa adicionar peróxido de hidrógeno y repetir la 
digestión. 
B.7.5.4.2.7  Filtrar en caso de que exista grasa o cera y analizar el contenido de Hg. 
B.7.5.4.2.8  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión. 
B.7.5.4.2.9  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica de vapor frío). 
B.7.5.5 Digestión por Vía Húmeda-Seca para la determinación de As. 
B.7.5.5.1  Proceder como en el punto B.7. 4.4.2 hasta que la digestión sea completa y posteriormente 
continuar con los siguientes pasos. 
B.7.5.5.2  Con una pipeta tomar una alícuota de la solución de muestra digerida y colocarla en un crisol 
Vycor 
B.7.5.5.3  Añadir 1 mL de solución de nitrato de magnesio al 7% p/v y calentar en una parrilla a 
temperatura baja, hasta sequedad. 
B.7.5.5.4  Incrementar el calor de la placa a un máximo de 375ºC. 
B.7.5.5.5  Colocar el matraz en la mufla a 450ºC para oxidar cualquier residuo de carbón y descomponer el 
exceso de nitrato de magnesio, por un tiempo mayor o igual a 30 minutos. 
B.7.5.5.6  Enfriar y disolver el residuo en 2,0 mL de ácido clorhídrico 8 M. 
B.7.5.5.7  Añadir 0,1 mL de yoduro de potasio al 20 % p/v para reducir el As(V) a As(III). 
B.7.5.5.8  Dejar reposar por un tiempo mayor a 2 minutos y transferir a un matraz y llevar al aforo con 
agua. 
B.7.5.5.9  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión. 
B.7.5.5.10  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica con adaptación para horno 
de grafito o generador de hidruros). 
B.7.5.6  Digestión por Vía Seca para la determinación de As.  
B.7.5.6.1  Pesar como máximo 40g de líquidos, 20g de alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 
10g de alimentos sólidos o semisólidos. Limite el contenido de grasa o aceite a un máximo de 4g y el total de 
la materia orgánica a 5g 
B.7.5.6.2  Añadir el volumen necesario de nitrato de magnesio al 50% p/v. 
B.7.5.6.3  Homogeneizar con una varilla limpia de plástico extendiendo la mezcla en el crisol. 
B.7.5.6.4  Colocar la muestra en una mufla subiendo gradualmente la temperat ura hasta 300ºC por 2 
horas. Posteriormente subir gradualme nte la temperatura hasta 500ºC por 16 horas o durante toda la noche. 
B.7.5.6.5  Enfriar a temperatura ambiente y humedecer las cenizas con ácido nítrico al 50% v/v. 
B.7.5.6.6  Calentar en parrilla hasta la eliminación del ácido. 
B.7.5.6.7  Llevar los crisoles a una mufla elevando gradualmente la temperatura de 23 a 500ºC, 
manteniendo ésta 30 min hasta evaporación total. 
B.7.5.6.8  Transferir las cenizas del crisol a un matraz aforado usando una porción de 10 mL de ácido 
clorhídrico 0,5 N. 
B.7.5.6.9  Enjuagar los crisoles con 5 mL de agua destilada y transferir al matraz, añadir 1 mL de solución 
de yoduro de potasio al 15% y mezclar. 
B.7.5.6.10  Dejar reposar durante 15 minutos y llevar al aforo. 
B.7.5.6.11  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión. 
B.7.5.6.12  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica con adaptación para horno 
de grafito o generador de hidruros).       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.7.5.7 Digestión para la determinación de As, Pb, Sn, y Hg por horno de microondas. 
B.7.5.7.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, 0,500 g como máximo de muestra, añadir 6 mL de ácido nítrico 
concentrado y 2 mL de agua oxigenada al 30%, cerrar pe rfectamente el envase de reacción y proceder según 
el manual del fabricante. 
B.7.6 Procedimiento 
B.7.6.1 Espectrometría de Ab sorción Atómica por Flama. 
B.7.6.1.1  Calibración. 
B.7.6.1.1.1  Es necesario comprobar que se tiene una calibración inicial y periódica aceptable. 
B.7.6.1.1.2  Se inicia la configuración operacional del in strumento y en el sistema de adquisición de datos. 
Permitir un periodo no menor a 30 minutos para el calentamiento de las lámparas de descarga sin electrodos. 
B.7.6.1.1.3  Se debe verificar la estabilidad del instrumento mediante el análisis de una solución estándar 
20 veces más concentrada que el límite de detección del instrumento (LDI) para el analito, leída un mínimo de 
cinco veces y calculando la desviación estándar resultante, la cual debe ser menor al 5%. 
B.7.6.1.1.4  El instrumento debe calibrarse para el analit o a determinar usando el blanco de calibración y 
los estándares de calibración preparados a 3 o 4 nive les de concentración dentro del intervalo dinámico de 
concentración del analito. 
B.7.6.1.1.5  Ajustar el instrumento a 0 con el blanco de cali bración. Introducir los estándares de calibración 
del analito de menor a mayor concentración y registrar al  menos tres réplicas de la absorbancia de cada uno. 
B.7.6.1.1.6  Elaborar una curva de calibración graficando absorbancia en función de la concentración. Lo 
anterior puede llevarse a cabo en equipos que se programan directamente, en los cuales sólo es necesario 
introducir los estándares y marc ar su concentración teórica. 
B.7.6.1.2 Operación del Instrumento. B.7.6.1.2.1  El desempeño del instrumento se verifica mediante el empleo de blancos de calibración, 
estándares de calibración y una mues tra de control de calidad (MCC). 
B.7.6.1.2.2  Después de que se ha realizado la calibración, se debe verificar que el instrumento trabaje 
adecuadamente para el analito. Para ello se analiza una muestra de control de calidad. Si las mediciones 
varían en ± 10% o más, al valor establecido para la MCC,  el análisis debe interrumpirse y buscar la posible 
causa de error, el instrumento se debe re calibrar y verificar la nueva calibración. 
B.7.6.1.2.3  Para verificar que el instrumento no presenta deriva, por cada 10 análisis se debe analizar el 
blanco de calibración. Si el valor verdadero del analit o difiere ± 10% o más, el instrumento debe recalibrarse. 
Si el error persiste debe identificarse el problema y corre girse. Si la matriz de la muestra es responsable de la 
deriva o afecta la respuesta del analito puede ser necesario trabajar por adiciones estándar. 
B.7.6.1.2.4  La demostración de la operatividad inicial del in strumento se hace estableciendo los límites de 
detección del método (LDM) para el analito y el intervalo de  calibración lineal. Para determinar el LDM se usa 
un blanco de reactivos fortificado con una concentración del analito equivalente de 2 a 5 veces el límite de 
detección estimado. Se hacen al menos 4 réplicas de  lectura de absorbancia del blanco de reactivos 
fortificado procesado a través de todo el método analítico. Los LDM se calculan de acuerdo a: 
LDM= t x s 
t = valor de la "T" de Student a un intervalo de confianza de 99% y una desviación estándar estimada para 
n-1 grados de libertad. t = 3,14 para 7 réplicas. 
s = desviación estándar de las réplicas del análisis. 
El intervalo lineal de calibración se establece a partir de por lo menos 4 estándares de diferente 
concentración, uno de los cuales debe estar próx imo al límite superior del intervalo lineal. 
B.7.6.1.3 Determinación. 
B.7.6.1.3.1 Ajustar el instrumento de absorción atóm ica en las condiciones adecuadas para la 
determinación del analito de acuerdo a las in dicaciones del manual del instrumento. 
B.7.6.1.3.2  Introducir el blanco de reactivos y la muestra a analizar y registrar los valores de absorbancia. 
Se debe analizar al menos un blanco de reactivos con cada grupo de muestras. Los valores obtenidos ponen de manifiesto la calidad de los reactivos usados  y el grado de contaminación del laboratorio. 
B.7.6.1.3.3  En los equipos que pueden programarse, la le ctura obtenida da directamente la concentración 
del elemento en las unidades de concentración utilizadas. 
B.7.6.1.3.4  Se debe analizar al menos un blanco de reacti vos fortificado para cada grupo de muestras. Se 
calcula la exactitud como el por ciento de re cuperación (de acuerdo al  apartado B.7.5.1.2.4). 
B.7.6.1.3.5  Se debe fortificar al menos una muestra por grupo o el 10% de ellas lo que resulte mayor. La 
concentración añadida debe ser de aproximadamente 0,1 unidades de absorbancia. 
B.7.6.1.3.6  Se debe calcular el por ciento de recuperación para el analito, de acuerdo a: 
 CM - C 
R = -------------- x 100 
 CA 
R = % recuperación 
CM = Concentración de la muestra fortificada C = Concentración de la muestra CA = Concentración equivalente de analito añadido a la muestra. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.7.6.1.3.7  Si la recuperación del analito en la muestra fortificada está fuera de l intervalo previamente 
establecido y el blanco de reactivos fortificado está co rrecto, puede existir un problema relacionado con la 
matriz de la muestra. Los datos se deben verificar por el método de las adiciones estándar. 
B.7.6.2 Espectrometría de Absorci ón Atómica por Horno de Grafito. 
B.7.6.2.1 Calibración. 
B.7.6.2.1.1 Proceder de acuerdo a los puntos B.7.5.1 
B.7.6.2.1.2  Elaborar una curva de calibración graficando área de pico o altura máxima contra 
concentración del analito. 
B.7.6.2.1.3  La calibración mediante el uso de una computadora o una calculadora basada en el ajuste 
sobre los datos de concentración respuesta es aceptada. 
Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se  programan directamente, en los cuales sólo es 
necesario introducir los estándares y marcar su concentración teórica. 
B.7.6.2.2 Operación del Instrumento. 
B.7.6.2.2.1 Proceder de acuerdo a B.7.5.1 
B.7.6.2.3 Determinación. 
B.7.6.2.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atóm ica en las condiciones adecuadas para la 
determinación del analito, de acuerdo a las re comendaciones del manual del instrumento. 
El programa de temperaturas para el horno de graf ito puede variar dependiendo de la matriz de la 
muestra. En el caso de existir interferencias no específi cas (absorción molecular o di spersión de la luz), se 
recomienda consultar la bibliografía existente en cuanto  a los métodos disponibles para eliminarlas, así como 
en el caso de interferencias de matriz. 
B.7.6.3 Espectrometría de Absorción Atómica por Generador de Hidruros. 
B.7.6.3.1 Calibración. 
B.7.6.3.1.1  Proceder de acuerdo a los puntos B.7.5.1 
B.7.6.3.1.2  A partir de la solución estándar de As de 1000 mg/l, preparar una solución de As de 1 mg/l en 
ácido clorhídrico de concentración apropiada al méto do. Trazar una curva de calibración de absorbancia 
(máximo de la altura de pico) en función de la concentraci ón del analito para un intervalo de concentración de 
0 a 10 µg/l de As bajo las mismas condiciones de la matriz de la muestra. 
B.7.6.3.2 Operación del Instrumento. 
B.7.6.3.2.1  Proceder de acuerdo a B.7.5.1 
B.7.6.3.3 Determinación 
B.7.6.3.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atóm ica en las condiciones adecuadas para la 
determinación de As: longitud de onda de 193,7 nm y lámpara de descarga sin electrodos. Colocar y ajustar la 
celda de absorción de acuerdo al manual del fabric ante. Ajustar el flujo de gas (nitrógeno o argón). 
B.7.6.3.3.2  Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibración de ácido clorhídrico al 1,5% siguiendo 
las instrucciones del manual del fabricante. 
B.7.6.3.3.3  Optimizar con un estándar de calibración la respuesta del instrumento al analito (por lo general, 
10 mL de una solución de 5 µg/l de As da una absorbancia  de 0,2), ajustando el tiempo de purga I, el tiempo 
de reacción y el tiempo de purga II. 
B.7.6.3.3.4  Tomar un volumen conocido de la muestra dirigida y seguir el mismo procedimiento que con 
los estándares de calibración. 
B.7.6.4 Espectrometría de Absorción Atómica por Vapor Frío. B.7.6.4.1 Calibración. 
B.7.6.4.1.1  Proceder de acuerdo a los puntos B.7.5.1 
B.7.6.4.1.2  A partir de la solución de trabajo de 1 µg/mL preparar estándares de ca libración qu e contengan 
0, 0,2, 0,4, 0,6, 0, 8 y 1,0 µg de Hg a frascos de reacción. A cada frasco agregar 100 mL de la solución de 
dilución y 20 mL de la solución de reducción. Trazar la curva de calibración de absorbancia (altura máxima de 
pico) en función de la concentración del analito. 
B.7.6.4.2 Operación del Instrumento. B.7.6.4.2.1 Proceder de acuerdo a B.7.5.1 
B.7.6.4.3 Determinación. B.7.6.4.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atóm ica en las condiciones adecuadas para la 
determinación de Hg: longitud de onda de 253,6 nm, slit  0,7 nm y lámpara de cátodo hueco. Colocar y ajustar 
la celda de absorción de acuerdo al manual del fabr icante. Ajustar el flujo de gas (nitrógeno o argón). 
B.7.6.4.3.2  Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibración (solución de dilución y de reducción) 
siguiendo las instrucciones del manual del fabricante. 
B.7.6.4.3.3  Optimizar con un estándar de calibración la respuesta del instrumento al analito. 
B.7.6.4.3.4  Tomar 25 mL de la muestra digerida y seguir  el mismo procedimiento que con los estándares 
de calibración.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.7.7 Expresión de Resultados 
B.7.7.1. Método de Cálculo. 
Interpolar los valores de absorbancia o altura de pico de la muestra analizada en la curva de calibración y 
obtener los mg/kg del elemento en la muestra y realizar los cálculos empleando la siguiente fórmula: 
mg/ kg =A x B 
C 
en donde: 
A = Concentración en mg/kg de la muestra a interpolar en la curva de calibración. 
B = Volumen final al que se llevó la muestra (mL). 
C = Peso de la muestra (g) o volumen de la muestra (mL) en el caso de agua. 
En los equipos que pueden programarse, la lectura obtenida da directamente la concentración del 
elemento en mg/kg o µg/kg. 
B.7.8 Informe de la Prueba 
Los resultados se informarán en mg/kg o µg/kg del elemento a determinar. 
B.8. Determinación de AFM1 en leche, fórmula láctea o producto lácteo combinado por columna de 
inmunoafinidad- HPLC. 
B.8.1 Principio del Método. 
La AFM1 es extraída por aplicación de la porción de prueba (leche líquida o leche deshidratada 
reconstituida) a una columna de inmunoafinidad, la cual contiene anticuerpos monoclonales específicos 
ligados a un material de soporte sólido. Así como la  muestra pasa a través de la columna, los anticuerpos 
selectivamente se ligan a la AFM1 presente para formar un complejo antígeno-anticuerpo. Los otros 
componentes de la matriz de la muestra son removidos de la columna con agua destilada. La AFM1 es eluída 
de la columna con acetonitrilo y cuantificada por HPLC en fase reversa con detección de fluorescencia. 
B.8.2  Equipo. 
B.8.2.1 Sistema HPLC, que incluye: 
B.8.2.2 Bomba  
B.8.2.3 Inyector automátic o o manual de muestras.  
B.8.2.4 Columna HPLC C18 de 4.6 x 250 mm, 5 µm de tamaño partícula. 
B.8.2.5 Detector de fluorescencia 
B.8.2.6 Integrador de datos o com putadora personal con el software adecuado para el control del equipo y 
procesamiento de datos  
B.8.2.7 Bomba manual (cuerpo de jeringa de vidrio de 50 mL unida a través de un conector de plástico a 
un suministro de aire) o manifold para extracción por vacío en fase sólida.  
B.8.2.8 Centrífuga a 2000 rpm. 
B.8.2.9 Mezclador tipo vórtex. 
B.8.2.10 Balanza analítica de lectura 0,1 mg. B.8.211 Espectrofotómetro capaz de hacer mediciones de 200 a 400 nm. B.8.2.12 Equipo de filtra ción Millipore o similar. 
B.8.2.13 Sistema de evaporación de muestras multipuesto en baño seco con bomba de vacío. 
B.8.2.14 Extractor en fase sólida o Vaccum manifold B.8.2.15 Bomba de vacío B.8.3. Materiales B.8.3.1 Columnas de inmunoafinidad. Se sugiere ad quirir columnas con una capacidad de carga de no 
menos de 100ng de AFM1. 
B.8.3.2 Tubos de centrífuga. 
B.8.3.3 Vasos de precipitados de 100 mL. 
B.8.3.4 Pipetas volumétricas de 50 mL. B.8.3.5 Pipetas graduadas de 10 mL. B.8.3.6 Auxiliar de macropipeteado. B.8.3.7 Jeringas de vidrio o desechables de 50 mL. B.8.3.8 Micropipetas de 10 a 100 µL; 100 a 1000 µL. y 1 a 5 mL. 
B.8.3.9 Puntas par a micropipeta. 
B.8.3.10 Filtros para solventes  orgánicos de 47 mm de diámetro y poro de 0,45 µm. 
B.8.3.11 Filtros para solvent es acuosos de 47 mm de diámetro y poro de 0,2 µm. 
B.8.3.12 Filtros para muestras  de politetrafluoretileno de 13 mm y poro de 0,45 µm. 
B.8.3.13 Matraces aforados co lor ámbar de 5, 25 y 100 mL. 
B.8.3.14 Jeringas desechables de 5 mL sin aguja. 
B.8.3.15 Frascos vial color ámbar de 5 mL con tapón. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.8.3.16 Matraces Erlenmeyer de 250 mL. 
B.8.3.17 Celdas de cuarzo para espec tofotómetro de 1 cm de paso de luz. 
B.8.3.18 Pipetas Pasteur. 
B.8.3.19 Papel filtro What man No. 4 o equivalente. 
B.8.3.20 Adaptadores o acoples de apil amiento para unir columnas de in munoafinidad (adaptors starcking 
1,3 or 5 mL part Nª 5185-57-94 Agilent o similar) 
B.8.3.21 Embudos 
B.8.4 Reactivos. 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser de grado analítico y por agua debe entenderse 
agua estilada. 
B.8.4.1  Acetonitrilo ( C 2H3N) grado HPLC. 
B.8.4.2 2-Propanol (isopropanol) grado HPLC. 
B.8.4.3 Agua (H 2O) destilada y grado HPLC. 
B.8.4.4 Acido sulfúrico concentrado (H 2SO 4). 
B.8.4.5 Patrón certificado de 50 μg AFM 1 en película. 
B.8.4.6 Tripsina (proteasa pancreática), 2000 FIP-U/g. 
B.8.4.7 Dicromato de potasio (K 2Cr2O7). 
B.8.4.8 Solución de ácido sulfúrico 0,018 N. Disolver 1 mL  de ácido sulfúrico conc entrado y aforar a 2 L 
con agua destilada. 
B.8.4.9 Soluciones patrón de dicromato de potasio. 
B.8.4.9.1 Aproximadamente 0,25 mM. 
Pesar exactamente 78 mg de dicromato de potasio previamente secado en estufa a 100-105°C durante 2 
h, y aforar a 1 L con ác ido sulfúrico 0,018 M. 
B.8.4.9.2 Aproximadamente 0,125 mM. 
Diluir 25 mL de la solución de 0,25 mM a 50 mL con ácido sulfúrico 0,018 M. 
B.8.4.9.3 Aproximadamente 0,0625 mM 
Diluir 25 mL de la solución de 0,125 mM a 50 mL con ácido sulfúrico 0,018 M. 
B.8.4.10 Fase móvil para HPLC. Agua-Acetonitrilo (75:25). F iltrar a través de filtro de membrana de 0,45 μ
m y degasificar. Es recomendable si el sistema cuenta con una bomba binaria o cualquier otra, no se realice la mezcla por medio de ésta, debido a la facilidad con que se generan burbujas 
B.8.4.11 Cloruro de sodio 
B.8.4.12 Fosfato disódico dihidratado 
B.8.4.13 Cloruro de potasio 
B.8.4.14 Hidróxido de sodio 
B.8.4.15 Solución salina amortiguadora de fosfatos para la vado de columna de inmunoafinidad (pesar 8 g 
NaCl, 1,16 g Na2HPO4*2H
2O, 0,2g KH 2PO 4, 0,2g KCl, disolver en 1L de agua destilada y ajustar a pH 7,4 con 
NaOH o HCl 
B.8.5 Procedimiento. B.8.5.1 Preparación de la Muestra . 
B.8.5.1.1 Productos Líquidos. Calentar las muestras de leche entre 35 -37ª C en baño de agua termostaizada y a continuación 
homogenizar suavemente, con barra magnética para dis persas la grasa. Centrifugar un volumen de muestra 
(2000g-15 min) para separar la grasa y eliminar la capa superior. Filtrar la porción restante del tubo con papel 
Whatman Nª 4 (o similar) y transferir 50 mL cuantitat ivamente medidos al reservorio de la columna de 
inmunoafinidad, la cual previamente, se encuentra a temperatura ambiente. 
Para el análisis de productos esterilizados, es recomendable diluir volumen a volumen con agua destilada 
previo calentamiento y filtración o produco preparado. Para el análisis de productos esterilizados, es 
recomendable diluir volumen a volumen con agua des tilada previo al calentamiento y filtración o 
centrifugación. 
B.8.5.1.2 Productos Deshidratados. 
Reconstituir con agua de acuerdo con las instrucciones señaladas en la etiqueta o 130 g del producto 
llevados a 1 L con agua a 50ºC. Disolver y agitar la mues tra a fin de homogeneizarla por completo. Colectar al 
menos 50 mL de la leche preparada. 
Nota: Para el análisis de caseinatos de sodio, calcio  y potasio, es necesario efectuar una hidrólisis 
enzimática de la porción de prueba previo  a la filtración o centrifugación. Para este propósito, proceder de 
igual forma que con los productos deshidratados, pero adicionando 2 g de tripsina a la porción de prueba 
antes de colocar el matraz en el baño de agua por 30 minutos.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.8.5.2 Calibración del Espectrofotómetro: 
B.8.5.2.1 Determinar la absorbancia (A) de las tres soluciones de K 2Cr2O7 0,25, 0,125 y 0,0625 mM en 
ácido sulfúrico, a su máximo de absorción cerca de 350 nm, usando como blanco la solución de ácido 
sulfúrico 0,018 N. 
B.8.5.2.2 Calcular la absorbitividad molar ( ε) de cada concentración con la siguiente fórmula: 
(ε)= A x 1000 
 Conc. (mM) 
B.8.5.2.3 Si los tres valores varían, revisar la técnica o el instrumento, promediar los 3 valores para 
obtener el valor de ( ε). 
B.8.5.2.4 Determinar el factor de corrección (FC) para cada instrumento y celdas en particular, 
sustituyendo en la siguiente ecuación: 
FC= 3160 
       (ε) 
Donde: 3160 = Valor de ( ε) de las soluciones de K 2Cr2O7 
B.8.5.2.5 Si el valor de FC es < 0,95 o > 1,05 revisar el instrumento o técnicas, para determinar o eliminar 
la causa (usar el mismo juego de celdas en la calibración y determinación de la pureza). 
B.8.5.3 Preparación de Soluciones Patrón de AFM1. 
B.8.5.3.1 Solución Patrón de 2 ng/ μL. 
B.8.5.3.1.1 Por medio de una jeringa, introducir aproxima damente 2 mL de acetonitrilo dentro del vial 
sellado que contiene el patrón certificado de AFM1. Agitar vigorosamente durante 1 minuto en mezclador tipo 
vórtex y transferir cuantitativamente a un matraz volumétrico de 25 mL usando pequeñas porciones de 
acetonitrilo. Diluir al volumen con acetonitrilo y mezclar bien. 
B.8.5.3.1.2 Transferir una alícuota de 2-3 mL de esta solución a una celda de cuarzo y registrar el espectro 
ultravioleta entre 330 y 370 nm, usando acetonitrilo en la  celda de referencia. Medir la absorbancia de la 
solución a la longitud de onda de máxima absorción (la cual es cercana a 325 nm). Determinar la 
concentración exacta de esta solución empleando la siguiente ecuación: 
 
En donde: 
A= absorbancia a 350 nm. PM= Peso molecular para AFM
1= 328. 
ε = coeficiente de extinción para AFM1= 19,850. 
FC= Factor de corrección (calculado en B.9.5.2.4). 
B.8.5.3.1.3 Regresar la solución de AFM 1 al frasco original. Almacenar esta solución en el congelador por 
un máximo de 2 años, pero verificar su concentración cada 6 meses. Antes de usar esta solución permitir que 
alcance la temperatura ambiente. Debe mantenerse lejos de la luz directa 
B.8.5.3.2 Solución Patrón de 0,5 μg/mL. 
Medir un volumen apropiado de solución patrón (B.8.5.3.1.) en un matraz volumétrico de 5 mL, dado que 
se transfieran exactamente 500 μg de AFM1. Diluir al volumen con acetonitrilo y mezclar vigorosamente en 
vortex. Esta solución es estable por 2 mese s si es almacenada en refrigeración (4ºC). 
B.8.5.3.3 Soluciones Patrón de Trabajo. 
Preparar una serie de soluciones estándares calibrantes  con el objeto de inyectar masas de aflatoxina M1 
de 0,5, 1,0, 5,0 y 10 ng cada una presente en 50 μL de inyección AFM1. Para ello medir el volumen apropiado 
de solución (B.8.5.3.2) en un vial color ámbar y evaporar, con flujo de nitrógeno. Diluir al volumen necesario 
con fase móvil del inciso 8.4.10. Preparándose en el día de su uso. 
B.8.5.4 Extracción de la AFM1 por medio de Columnas de Inmunoafinidad. 
B.8.5.4.1 Firmemente conectar una columna de inmunoafinidad a la punta de una jeringa de vidrio o 
desechable utilizada como reservorio por medio de acoples y colocar en el extractor de fase sólida (manifold 
de vacío). 
B.8.5.4.2 Medir 50 mL de la muestra en el depósito de la jeringa y pasarla a través de la columna de 
inmunoafinidad a un flujo aproximado de 2-3 mL/min. 
B.8.5.4.3 Lavar la columna con 20 mL de buffer a un flujo aproximado de 2-3 mL/min. Descartar los 
lavados. Pasar de 2-3 mL de aire o suave flujo de nitrógeno para secar el material de empaque. 
B.8.5.4.4 Eluir lentamente la aflatoxina con 4mL de acetonit rilo. Dejar el acetonitrilo en contacto con la 
columna por lo menos 3 minutos para asegurar la completa remoción de la toxina ligada. Esto se logra reflujando el acetonitrilo de dos a tres veces. Colectar el eluido en un vial de 5 mL. 
B.8.5.4.5 Evaporar a sequedad a 40ºC bajo una corriente de nitrógeno. Adicionar al residuo 200 L de fase 
móvil (B.8.4.10). Agitar y filtrar a trav és de un filtro de membrana de 0,45 μm y proceder con la cuantificación 
por HPLC. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.8.5.5 Cuantificación por HPLC. 
B.8.5.5.1 Encender todos los componentes del sistema de cromatografía. 
B.8.5.5.2 Fijar los siguientes parámetros cromatográficos de acuerdo con la s instrucciones de operación 
del equipo: 
Fase móvil: Agua:Acetonitrilo (B.8.4.10). 
Flujo: 0,8 mL/min. 
Volumen de inyección: 50 μL (equivalente a 12,5 mL de producto fluido o 1,25 g de producto 
deshidratado). 
Detector de fluorescencia Excitación: 365 nm. Emisión: 435 nm. 
 
B.8.5.5.3 Purgar las bombas del sistema con cada uno de los componentes de la fase móvil. 
B.8.5.5.4 Correr la fase móvil a través de todo el sistem a a un flujo de 0,8mL/min, hasta obtener una línea 
base estable. 
B.8.5.5.5 Inyectar 50 μL de la solución de trabajo de AFM1 de la mayor concentraci ón (B.8.5.3.2) y ajustar 
los controles del detector de fluorescencia para dar al  menos un 80% de respuesta del registrador. Repetir las 
inyecciones 2-3 veces hasta que las áreas del pico son constantes. La aflatoxina eluye en un tiempo 
aproximado de 11 minutos. 
B.8.5.5.6 El día del análisis, inyectar en secuencia, volúmenes de 50 μL de cada solución patrón de 
trabajo y preparar una curva de calibración graficando  el área del pico contra la concentración de AFM1 
inyectada. Ajustar la curva por método de mínimos cuadrados (Regresión Lineal). 
B.8.5.5.7 Inyectar del mismo modo 50 μL de cada una de las muestras y determinar la cantidad de AFM1 
en la muestra utilizando la ecuación de la recta obtenida en la curva de calibración como sigue: 
Y = m x + b 
En donde: Y = Area del pico correspondiente a la AFM1 en la muestra. 
m = pendiente. 
x = concentración en ng/ μL de AFM1 en la muestra. 
b = ordenada al origen. 
Despejar x, para obtener los ng/ μL de AFM1 en la muestra. 
X= concentración en ng de AFM1 en la muestra. Despejar X, para obtener los ng de AFM1 en la muestra 
B.8.5.5.8 Si el área del pico obtenido para la muestra es mayor que la obtenida para la solución patrón de 
la mayor concentración, preparar una solución adecua da diluyendo con Fase móvil B.8.4.10 y volver a 
inyectar. 
B.8.5.6 Determinación de la Eficiencia  de las Columnas de Inmunoafinidad. 
B.8.5.6.1 Realizar los cálculos necesarios para la fortific ación de una muestra por triplicado, con el punto 
medio de la curva y prosiguiendo como  describe B.8.5.4. 2 a B.8.5.4.5. 
B.8.5.6.2 Eluir la AFM1 con 4 mL de acetonitrilo y evaporar a sequedad a 40ºC con la ayuda de nitrógeno. 
Reconstituir con 1 mL de agua acetonitrilo (7:3). 
B.8.5.6.3 Inyectar 50 μL al sistema HPLC bajo las condiciones  descritas anteriormente. El lote de 
columnas de inmunoafinidad es adecuado si la recuperación de AFM1 es > 80%. 
B.8.6 Cálculos: 
Calcular la concentración de AFM
1 en la porción de prueba, usando las siguientes fórmulas: 
 
Esta fórmula es aplicable sólo cuando ninguna d ilución ha sido efectuada. El factor de dilución 
correspondiente debe ser tomado en cuenta (por ejemplo en  el análisis de productos esterilizados o cuando la 
muestra se sale del intervalo de la curva de calibración). 
B.8.7 Expresión de Resultados. 
μg de AFM1 /L 
B.8.6 Preparación y Dilución de Muestra s para su Análisis Microbiológico. 
B.9.1 Fundamento Se basa en la preparación de diluciones primarias, para obtener una distribución lo más uniforme posible 
de los microorganismos presentes en la porción de muestra. 
B.9.2 Materiales y Equipo       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.9.2.1 Pipetas bacteriológicas para di stribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 1 mL y 2 mL), con tapón de 
algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total. 
B.9.2.2 Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca. 
B.9.2.3 Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca. B.9.2.4 Utensilios esterilizables pa ra la obtención de muestras: cuch illos, pinzas, tijeras, cucharas, 
espátulas, etc. 
B.9.2.5 Todo el material e instru mentos que tengan contacto con la s muestras bajo estudio deberán 
esterilizarse mediante: Horno, durante 2 h a 170 a 175° C o 1 h a 180°C o Autoclave, durante 15 minutos como 
mínimo a 121 ± 1,0°C. 
B.9.2.6 El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las 
especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por esterilización repetida y éste debe 
ser químicamente inerte. 
B.9.2.7 Horno para esterilizar que alcanc e una temperatura mínima de 170°C. 
B.9.2.8 Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas. 
B.9.2.9 Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro 
calibrado con divisiones de 0,1°C y q ue mantenga la temperatura a 45 ± 0,5°C. 
B.9.2.10 Licuadora de una o dos velocidades contro ladas por un reóstato o bien un homogeneizador 
peristáltico (Stomacher). 
B.9.2.11 Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico. 
B.9.2.12 Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g 
B.9.2.13 Vórtex para la agitación de las diluciones. B.9.2.14 Perilla. 
B.9.2.15 Frascos de vidrio con capacidad de 125 a 250 mL. B.9.3 Reactivos 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico. Cuando se indique agua debe 
entenderse como agua destilada. 
B.9.3.1 Solución de Hidróxido de Sodio 1,0 N 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Hidróxido de sodio 4,0 g 
Agua 100 mL 
 
Preparación: Disolver el hidróxido de sodio y llevar a 100 mL con agua. 
B.9.3.2 Soluciones Diluyentes B.9.3.2.1 Solución Reguladora de Fosfatos (solución concentrada). 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Fosfato de sodio monobásico 34,0 g 
Agua 1,0 l 
 
Preparación: Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0N. Llevar 
a un litro con agua. Esterilizar durante 15 minutos a 1 21° ± 1,0°C. Conservar en refrigeración (solución 
concentrada). Tomar 1,25 mL de la solución concentra da y llevar a un litro con agua (solución de trabajo). 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requi era. Esterilizar a 121° ± 1,0°C durante 15 minutos. 
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a los 
iniciales. 
B.9.3.2.2 Agua Peptonada 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Peptona 1,0 g 
Cloruro de sodio 8,5 g 
Agua 1,0 l 
Preparación: Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustar el pH a 7 ± 0,1 con hidróxido de sodio 1,0N. 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera. 
Esterilizar a 121 ± 1,0°C durante 15 minutos. Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la 
solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciale s. Si este diluyente no  es usado inmediatamente, 
almacenar en lugar oscuro a una temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en 
condiciones tales que no alteren su volumen o composición. 
B.9.4 Procedimiento B.9.4.1 Preparación de la Dilución Primaria. B.9.4.1.1 A partir de muestras líquidas: 
Para muestras líquidas no viscosas en las cuales la distribución de microorganismos es homogénea o 
fácilmente homogeneizable por medios mecánicos (agitación, etc.). 
Para muestras congeladas de un alimento originalment e líquido o licuable, fundir por completo en baño de 
agua de 40 a 45°C un tiempo máximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente puede utilizarse 
el Vortex. 
Para la parte líquida de una muestra heterogénea la cual sea considerada sufi cientemente representativa 
de la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales). 
B.9.4.1.1.1 Agitar la muestra manualmente con 25 movi mientos de arriba a abajo en un arco de 30cm 
efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 mL de la  muestra y diluir con 9 mL del diluyente el cual 
debe encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitand o el contacto entre la pipeta y el diluyente. 
Considerar el uso de vórtex para la agitación de los tubos. 
B.9.4.1.1.2 Siempre que la cantidad de muestra lo permi ta, tomar alícuotas mayores, por ejemplo 
volúmenes de 10 u 11 mL, diluidos con 90 o 99 mL, de la misma forma que se describió anteriormente. 
B.9.4.1.2 A partir de muestras sólidas o semisólidas. 
B.9.4.1.2.1 Las muestras sólidas y semisólidas congeladas,  deben descongelarse en refrigeración de 4 a 
8ºC durante 18 horas y no más de 24 horas antes de proceder a su análisis. 
B.9.4.1.2.2 Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plástica 
estériles de tamaño adecuado. 
B.9.4.1.2.3 Adicionar un volumen de 90 a 99 mL del diluyente llevado a una temperatura similar a la de la 
muestra. 
B.9.4.1.2.4 Operar la licuadora o el homogeneizador peri stáltico de 1 a 2 minutos hasta obtener una 
suspensión completa y homogénea según se indique en la técnica correspondiente para cada alimento. Aun en los equipos más lentos, este tiempo no debe exceder de 2,5 minutos. 
B.9.4.1.2.5 Permitir que las partículas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada tomando de 
las capas superiores de la suspensión. Cuando la dilución primaria es muy viscosa o pegajosa, adicionar más diluyente, lo cual debe tomarse en cuenta para las o peraciones subsecuentes o expresión de resultados. El 
homogeneizador peristáltico (Stomacher) puede no ser adecuado para algunos productos (por ejemplo, 
aquellos con partículas agudas o constituyentes que no  se dispersen fácilmente). Debe ser utilizado sólo 
cuando exista evidencia (publicada o por ensayos compar ativos) de que los resultados obtenidos no difieren 
significativamente con aquellos obtenidos con licuadora. 
B.9.4.2 Preparación de las Dilu ciones Decimales Adicionales. 
B.9.4.2.1 Transferir 1 mL o un múltiplo, por ejemplo, 10 u 11 mL de la dilución primaria 1 + 9 (10-1), en 
otro recipiente conteniendo nueve veces el volumen del diluyente estéril a la tem peratura apropiada, evitando 
el contacto entre la pipeta y el diluyente. 
B.9.4.2.2 Mezclar cuidadosamente cada botella de diluyent e siempre de la misma manera que se describe 
en B.9.4.1.1.1. 
B.9.4.2.3 La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, 
dependen del número esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de análisis 
previos y de la información que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado. En ausencia 
total de información, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta. 
B.9.4.2.4 Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas que se hayan 
seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la pipeta. 
B.9.4.2.5 Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de líquido equivalente a su capacidad total, 
escurrir aplicando la punta de la pipeta una sola vez en un área de la caja Petri sin líquido. 
B.9.4.2.6 Mientras se afora el líquido de la  pipeta, la punta de ésta debe apoyarse en el interior del cuello 
del frasco y mantenerla en posición vertical, para lo cual este último debe inclinarse lo necesario. 
En estudios donde se busca la presencia o ausencia de una determinada especie de microorganismos en 
0,1 mL o 0,1 g, no es necesario preparar diluciones mayores. 
El criterio para seleccionar las diluciones a pre parar de acuerdo con el número de microorganismos 
esperado es: 
Para la técnica del número más probable utiliz ar tres tubos: donde sea posible demostrar el 
microorganismo en 10 mL de la dilución más alta.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
Para la técnica de cuenta en placa, considerar aquel las en las que se puedan contar de 25 a 250 colonias 
en un mínimo de una de tres diluciones en el método de cuenta de bacterias aerobias en placa. En el caso de 
otros grupos microbianos, considerar el número especificado de colonias en la Norma Oficial Mexicana 
correspondiente. 
B.9.4.3 Duración del Procedimiento. 
En general, las diluciones de la muestra deben ser pr eparadas inmediatamente antes del análisis y éstas 
deben ser usadas para inocular el medio de cultivo dent ro de los 20 minutos posteriores a su preparación. 
B.10 Método para la Cuenta de Microor ganismos Coliformes Totales en Placa. 
B.10.1  Fundamento del método  
El método permite determinar el número de microorganismos coliformes presentes en una muestra, 
utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis) en el que se desarrollan bacterias a 35°C en 
aproximadamente 24 h, dando como resultado la produ cción de gas y ácidos orgánicos, los cuales viran el 
indicador de pH y precipitan las sales biliares. 
B.10.2  Materiales  
B.10.2.1 Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 11 y 2 mL), con tapón de 
algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total. 
B.10.2.2 Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca. B.10.2.3 Tubos de 16 X 150 mm con tapón de rosca. 
B.10.2.4 Utensilios esterilizables pa ra la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, 
espátulas, etc. 
B.10.2.5 Cajas Petri. B.10.2.6 Todo el material e instrumentos que teng an contacto con las muestras bajo estudio debe 
esterilizarse mediante: Horno, dur ante 2 h a 170 - 175°C, o 1 h a 180°C; o en autoclave, durante 15 minutos 
como mínimo a 121 ± 1,0°C. 
B.10.2.7 El material de vidrio puede sustituirs e por material desechable que cumpla con las 
especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por las esterilizaciones repetidas y éste 
debe ser químicamente inerte. 
B.10.3  Aparatos e instrumentos  
B.10.3.1 Horno para esterilizar que alc ance una temperatura mínima de 170°C. 
B.10.3.2 Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas. 
B.10.3.3 Baño de agua con control de  temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro 
calibrado con divisiones de 0,1° C y q ue mantenga la temperatura a 45 ± 1,0°C. 
B.10.3.4 Licuadora de una o dos velocidades contro ladas por un reóstato o bien un homogeneizador 
peristáltico (Stomacher). 
B.10.3.5 Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico. 
B.10.3.6 Incubadora con termostato que evite variacio nes mayores de ± 1,0° C, provista con termómetro 
calibrado. 
B.10.3.7 Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente 
amplificador. 
B.10.3.8 Registrador mecánico o electrónico. 
B.10.3.9 Microscopio óptico. 
B.10.3.10 Potenciómetro con una escala mí nima de 0,1 unidades de pH a 25 °C. 
B.10.4  Reactivos  
Los reactivos que a continuación se mencionan, deben ser grado analítico y cuando se indique agua debe 
entenderse como agua destilada. 
B.10.4.1  Soluciones Diluyentes  
B.10.4.1.1 Solución Reguladora de Fosfatos (solución concentrada) 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Fosfato monopotásico 34,0 g 
Agua 1,0 l 
 
Preparación: 
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0N. Llevar 
con agua a un litro. Esterilizar a 121± 1,0°C durante 15 minutos. Conservar en refrigeración (solución 
concentrada). 
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a un litro con agua (solución de trabajo). Distribuir en 
porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera. Esteriliz ar durante 15 minutos a 121± 1,0°C. Después de la 
esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.10.4.1.2 Agua Peptonada  
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Peptona 1,0 g 
NaCl 8,5 g 
Agua 1,0 l 
 
Preparación: 
Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustar el  pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1,0 N. Distribuir 
en porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualquier volumen mú ltiplo de nueve según se requiera. Esterilizar durante 
15 minutos a 121 ± 1,0°C. Después de la  esterilización, los volúmenes finales de la solución de trabajo deben 
ser iguales a los iniciales. 
Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 
5°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición. 
B.10.4.2 Medio de Cultivo Agar-r ojo-violeta-bilis-lactosa (RVBA)  
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Peptona 7,0 g 
Extracto de levadura 3,0 g 
Lactosa 10,0 g 
Sales biliares 1,5 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Rojo neutro 0,03 g 
Cristal violeta 0,002 g 
Agar 15,0 g 
Agua 1,0 l 
 
Preparación: 
Mezclar los componentes en el agua y dejar reposa r durante algunos minutos. Mezclar perfectamente y 
ajustar el pH a 7,4 con ácido clorhí drico 0,1N o con hidróxido de sodio 0,1N a 25°C, de forma que después del 
calentamiento se mantenga en este va lor. Calentar con agitación constant e y hervir durante 2 minutos. Enfriar 
inmediatamente el medio en un baño de agua hasta que llegue a 45°C. Evitar el  sobrecalentamiento del 
medio. No debe esterilizarse en autoclave. Usar el me dio dentro de las tres primeras horas después de su 
preparación. En el caso de utilizar medio de cult ivo deshidratado, seguir las instrucciones del fabricante. 
B.10.5 Preparación de la Muestra 
La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo  establecido en el numeral 9 de este apéndice 
normativo. 
B.10.6 Procedimiento  
B.10.6.1  Colocar en cajas Petri por duplicado 1 mL de la m uestra líquida directa o de la dilución primaria, 
utilizando para tal propós ito una pipeta estéril. 
B.10.6.2  Repetir el procedimiento tantas veces como diluci ones decimales se requiera sembrar, utilizando 
una pipeta estéril diferente para cada dilución. 
B.10.6.3  Vertir de 15 a 20 mL del medio RVBA fundido y mant enido a 45 ± 1,0°C en baño de agua. En el 
caso de utilizar cajas de Petri de plástico se vierte de 10 a 15 mL del medio. El tiempo transcurrido entre la 
preparación de la dilución primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20 
minutos. 
B.10.6.4  Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medi o con seis movimientos de derecha a izquierda, 
seis movimientos en el sentido de las manecillas del relo j, seis movimientos en el sentido contrario al de las 
manecillas del reloj y seis de atrás para adelante, so bre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla 
solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fría. 
B.10.6.5  Preparar una caja control con 15 mL de medio para verificar la esterilidad. Incluír un control 
adicional que considere la esterilidad de la solución diluyente adicionando 1 mL directo de esta solución en el mismo medio de cultivo. 
B.10.6.6  Después de que está el medio completamente so lidificado en la caja, verter aproximadamente 4 
mL del medio RVBA a 45 ± 1,0°C en la superficie del medio inoculado. Dejar que solidifique. 
B.10.6.7  Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35°C, durante 24 ± 2 horas. 
B.10.6.8  Después del periodo especificado para la incuba ción, contar las colonias con el contador de 
colonias.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.10.6.9  Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias típicas son de color 
rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un ha lo de precipitación debido a las sales biliares, el 
cual es de color rojo claro o rosa, la morfología colonial  es semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 
0,5 a 2,0 mm. 
B.10.6.10  Para el caso de polvos, inocular 5 placas c on 2 mL de la dilución 1:10, contar las colonias 
encontradas en cada placa y reportar la suma de UFC/g 
B.10.7 Expresión de los Resultados  
B.10.7.1 Cálculo del Método  
B.10.7.1.1 Placas que contienen entre 15 y 150 colonias características. 
Separar las placas que contienen el número ant es mencionado de colonias características en dos 
diluciones consecutivas. Contar las colonias presentes . Calcular el número de coliformes por mililitro o por 
gramo de producto, multiplicando el número de colonias por el inverso de la dilución correspondiente, 
tomando los criterios de la NOM-092-SSA1-1994. Método  para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa. 
B.10.7.1.2 Placas que contienen menos de 15 colonias características. 
Si cada una de las placas tiene menos de 15 colonias  características, reportar el número obtenido seguido 
de la dilución correspondiente. 
B.10.7.1.3 Placas con colonias no características. 
Si en las placas no hay colonias características, repor tar el resultado como: menos de un coliforme por 1/d 
por gramo, en donde d es el factor de dilución. 
B.10.8 Informe de la Prueba  
Informar: UFC/g o mL en placa de agar rojo violeta b ilis, incubados a 35°C durante 24 ± 2 h. En caso de 
emplear diluciones y no observar cr ecimiento, informar utilizando como referencia la dilución más baja 
utilizada, por ejemplo dilución 10-1. En caso de no obse rvar crecimiento en la muestra sin diluir se informa: 
"no desarrollo de co liformes por mL. 
B.11 Determinación de Staphylococcus aureus  
B.11.1 Fundamento  
Este método permite hacer una estimación del contenido de Staphylococcus aureus en alimentos, se 
efectúa directamente en placas de medi o de cultivo selectivo y diferencial,  con la confirmación mediante las 
pruebas de coagulasa y termonucleasa. Este método es a decuado para el análisis de alimentos en los cuales 
se esperen más de 100 células de Staphylococcus aureus por g. 
B.11.2 Materiales y Equipo  
Todos los instrumentos que se utilicen para trabajar  la muestra deben esterilizarse mediante horno, 
durante 2 h de 170-175ºC o como alternativa en autoclave durante 15 min como mínimo a 121ºC ±1. 
B.11.2.1 Cuchillos, pinzas, tijeras, cu charas, espátulas y separador de huevo. 
B.11.2.2 Tubos de cultivo de 16 mm x 150 mm o frasco s de 125 a 250 mL de capacidad, con tapón de 
rosca. 
B.11.2.3 Tubos de cultivo de 10 mm x 75 mm, con tapón de rosca. 
B.11.2.4 Cajas Petri de 90 a 100 mm de diámetro. B.11.2.5 Pipetas bacteriológicas de 1 mL y 10 mL de capacidad graduadas en 0,1 mL y 1 mL 
respectivamente y diámetro de 2 a 3 mm. 
B.11.2.6 Pipetas Pasteur. 
B.11.2.7 Probetas. 
B.11.2.8 Varillas de vidrio de 3,5 mm de diámetro aproximadamente y 20 cm de largo dobladas en ángulo 
recto, o varillas de plástico estériles desechables. 
B.11.2.9 Matraz Erlenmeyer con perlas de vidrio B.11.2.10 Cámara húmeda: consiste en una caja Petri en la cual se coloca una varilla de vidrio en forma 
de "V" rodeada de algodón humedecido con agua. 
B.11.2.11 Horno para esterilizar que alcance 180°C. 
B.11.2.12 Autoclave con termómetro. 
B.11.2.13 Baño de agua con regulado r de temperatura de 35 ± 0,5ºC. 
B.11.2.14 Baño de agua con regulado r de temperatura de 45 ± 0,5ºC. 
B.11.2.15 Balanza con capacidad no mayor de 2,500 g y sensibilidad de 0,1 g. 
B.11.2.16 Incubadora a 35 ± 1ºC. B.11.3  Reactivos  
En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, para su preparación se deben seguir las 
instrucciones impresas en la etiqueta respectiva. 
Cuando se mencione agua debe entenderse que se trata de "agua destilada". 
Los reactivos a emplear en el método objeto de esta norma deben ser grado analítico. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.11.3.1  Soluciones Diluyentes  
B.11.3.1.1 Solución Reguladora de Fosfatos  (Solución concentrada) 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES
Fosfato monopotásico 34,0 g
Agua 1,0 l
 
Preparación 
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1N, aforar 
con agua a 1 l. Esterilizar durante 15 min a 121ºC ±1 , conservar en refrigeración (solución concentrada). 
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a 1 l con agua (solución de trabajo). Distribuir en porciones 
de 99, 90 y 9 mL según se requiera. Esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 min. Después de la esterilización, los 
volúmenes finales y el pH de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales. 
B.11.3.1.2 Agua Peptonada  
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES
Peptona 1,0 g
Cloruro de sodio 8,5 g
Agua 1,0 l
 Preparación 
Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustar el pH a 7,0 con solución de hidróxido de sodio 1N. 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera . Esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 min. Después de 
la esterilización los volúmenes finales y el pH de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales. 
B.11.3.2 Medios de Cultivo  
B.11.3.2.1 Medio de Baird-Parker  
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES
Medio base (11.3.2.2) 95,0 mL
Solución de telurito de potasio (11.3.2.3) 1,0 mL
Emulsión de yema de huevo (11.3.2.4) 5,0 mL
 
Preparación 
Cuando el medio base esté a 45ºC, agregar los demás ingredientes y mezclar. Colocar de 15 a 20 mL del 
medio completo, enfriar y dejar solidificar. Las placas  pueden almacenarse por 48 h a temperatura de 0 a 5ºC. 
B.11.3.2.2 Medio base de Baird-Parker  
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES
Triptona 10,0 g
Extracto de levadura 1,0 g
Extracto de carne 5,0 g
Glicina 12,0 g
Cloruro de litio 5,0 g
Piruvato de sodio 10,0 g
Agar 20,0 g
Agua 1,0 l
 
Preparación 
Disolver los ingredientes o el agar base en agua y cale ntar con agitación constant e y hervir durante 1 min. 
Esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 min. Enfriar y mantener el medio a 45ºC. 
En el caso de usar medio base deshidratado, seguir las indicaciones del fabricante. 
B.11.3.2.3 Solución de Telurito  
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES
Telurito de potasio 1,0 g
Agua 100,0 mL
 Preparación 
Disolver el telurito de potasio en agua y esterilizar. La solución puede ser almacenada por varios meses a 
temperatura de 0 a 5ºC.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.11.3.2.4 Emulsión de Yema de huevo  
Preparación 
Lavar con agua y jabón los huevos frescos que sean necesarios y limpiarlos con una solución de tintura de 
yodo (solución alcohólica al 2%) o sumergirlos en solución de cloruro mercúrico (1:1000). Enjuagar con agua 
estéril y secar con gasa estéril. En campana de flujo laminar o en condiciones asépticas, abrir los huevos y 
vaciarlos en un separador de claras estéril. Transferir las yemas a una probeta hasta un volumen de 60 mL y 
completar a 90 mL con solución salina isotónica. Verter  la emulsión a un matraz Erlenmeyer con perlas de 
vidrio estéril y agitar fuertemente para formar la emulsión.  Filtrar a través de gasa. Las placas deben utilizarse 
dentro de las 48 h siguientes a su preparación. 
B.11.3.2.5 Solución Salina fisiológica  
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Cloruro de sodio 0,85 g 
Agua 100,0 mLl 
 
Preparación 
Disolver el ingrediente en agua y esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 min. 
B.11.3.2.6 Caldo de Infu sión cerebro-corazón (BHI ) 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Infusión de cerebro de ternera 200,0 mL 
Infusión de corazón de res 250,0 mL 
Peptona de gelatina 10,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Fosfato disódico dodecahidratado 2,5 g 
Glucosa 2,0 g 
Agua 1,0 l 
 
Preparación 
Disolver los ingredientes en agua y calentar ligeramente si es necesario. Distribuir y esterilizar durante 15 
min a 121ºC ±1. 
B.11.3.2.7 Acido Desoxirribonucleico helicoidal de timo de ternera.  
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Acido desoxirribonucleico helicoidal 
de timo de ternera o equivalente 0,03 g 
Agar 1,00 g 
Cloruro de calcio anhidro (Solución 
0,01 M) (11.3.2.8) 0,10 mL 
Cloruro de sodio 1,00 g 
Azul de toluidina (Solución 0,1 M) 
(11.3.2.9) 0,30 mL 
Tris-(hidroximetil-aminometano) 
(Tris solución 0,05 M, pH 9) 
(11.3.2.10) 100,00 mL 
 
Preparación 
Disolver los ingredientes, excepto el azul de toluidi na agitando hasta completar la disolución del ácido 
desoxirribonucleico y calentar a ebullición. Agregar el azul de toluidina. Distribuir en frascos pequeños con tapón de hule. No es necesario esterilizar. Este m edio es estable a temperatura ambiente hasta 4 meses y 
funciona perfectamente aun después de fundirlo varias veces. Tomar un porta objetos limpio y agregar 3 mL 
del medio fundido esparciéndolo por la superficie. Cuando el agar solidifique, hacer orificios con la punta de 
una pipeta Pasteur. Conservar en refriger ación para evitar la deshidratación. 
B.11.3.2.8 Solución de Cloruro de calcio anhidro 0,01 M  
Cloruro de calcio PM = 110,99 Disolver 0,1199 g de cloruro de calcio en 100 mL de agua. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.11.3.2.9 Solución de Azul de toluidina 0,1 M  
Disolver 3,05 g de azul de toluidina en 100 mL de agua. 
B.11.3.2.10 Solución Amortiguadora 0,05 M Tris-(hidroximetilaminometano)  
(Tris pH 9) PM = 121,1 Disolver 6,055 g de Tris en 100 mL de agua. 
B.11.3.2.11 Reactivo Biológico: Plasma de conejo  
Emplear plasma de conejo deshidratado o rehidratado si guiendo las instrucciones del fabricante y agregar 
ácido etilendiaminotetracético (EDTA) en solución al 0,1% en plasma rehidrata do. Si se utiliza plasma 
deshidratado diluir con agua estéril en proporción de  1:3. Puede emplearse plasma de conejo liofilizado 
adicionado de EDTA. No debe emplearse sangre citratada. 
B.11.4 Preparación de la Muestra  
La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo  establecido en el numeral 9 de este apéndice 
normativo. 
B.11.5 Procedimiento  
B.11.5.1  Utilizando diferentes pipetas de 1 mL para cada dilución, depositar 0,1 mL sobre la superficie de 
las placas de agar Baird-Parker. 
B.11.5.2  Distribuir el inóculo sobre la superficie del agar con varillas estériles de vidrio en ángulo recto, 
utilizando una para cada dilución. 
B.11.5.3  Mantener las placas en su posición hasta que el inóculo sea absorbido por el agar. 
B.11.5.4  Invertir las placas e incubar de 45 a 48 h a 35ºC. 
B.11.5.5  Seleccionar las placas que tengan entre 15 y 150 colonias típicas de Staphylococcus aureus ; si 
no es posible, seleccionar las placas de las diluciones más altas no obstante tengan más de 150 colonias. 
B.11.5.6  Cuando las placas tengan menos de 15 colonias típicas también pueden ser utilizadas y al 
informe se debe agregar la nota de "valor estimado". 
B.11.5.7  Las colonias típicas son negras, circulares, brilla ntes, convexas, lisas, de diámetro de 1 a 2mm y 
muestran una zona opaca y un halo claro alrededor de la colonia. 
B.11.5.8  Seleccionar las colonias de acuerdo con el siguiente cuadro para realizar las pruebas de 
coagulasa y termonucleasa: 
CUADRO 
NUMERO DE COLONIAS 
SOSPECHOSAS EN PLACA NUMERO DE COLONIAS 
POR PROBAR 
Menos de 50 3 
51 a 100 5 
101 a 150 o más 7 
< 3 Probarlas Todas 
 
B.11.5.9  Seleccionar el número de colonias y sembrar cada una en tubos con 0,5 mL de caldo de infusión 
cerebro-corazón. 
B.11.5.10  Incubar a 35ºC durante 24 h. 
B.11.5.11  Inocular en la misma forma cepas conocidas de Staphylococcus aureus y Staphylococcus 
epidermidis como testigos posi tivo y negativo. 
B.11.5.12  Después del periodo de incubación pasar con una pipeta de 1 mL, 0,3 mL de cada cultivo a otro 
tubo de 10 mm x 75 mm y conservarlo para la prueba de  termonucleasa. El resto del cultivo se usa para la 
prueba de coagulasa. 
B.11.5.13 Prueba de Coagulasa  
B.11.5.13.1  Agregar a los 0,2 mL del cultivo anterior, 0,2 mL de plasma de conejo diluido volumen a 
volumen con solución salina estéril. 
B.11.5.13.2  Incubar en baño de agua de 35 a 37ºC y observar durante 6 h a intervalos de 1 h; si no hay 
formación de coágulo, observar a las 24 h. Considerar positiva la prueba si hay formación de coágulo. 
B.11.5.13.3  Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo se añade una gota de cloruro de 
calcio al 5% a 0,5 mL de plasma reconstituido empleado, formándose un coágulo en 10-15 seg. 
B.11.5.14 Prueba de Termonucleasa  
B.11.5.14.1  Calentar durante 15 min, 0,3 mL de cultivo en caldo de infusión cerebro-corazón en baño de 
agua hirviendo. 
B.11.5.14.2  Pasar una gota de cada cultivo por medio de una pipeta Pasteur a un orificio del medio, 
incluye testigo. 
B.11.5.14.3  Incubar a 35ºC en cámara húmeda de 4 a 24 h. 
B.11.5.14.4  La aparición de un halo color rosa extendido de por lo menos 1 mm alrededor de la 
perforación se califica como positiva.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.11.6 Cálculo 
Hacer el cálculo del contenido de microorganismos en el producto tomando en cuenta el número de 
colonias totales, el número de colonias confirmadas, la dilución y el volumen inoculado (0,1 mL). 
Ejemplo 1: Si la caja tiene 80 colonias en la dilución 1:1000 Se toman 5 colonias para la prueba, de éstas dan 4 positivas, el cálculo es: 
 
Ejemplo 2: 
Si la caja tiene 14 colonias en la dilución 1:10 
Se toman 3 colonias para la prueba, de éstas dan 2 positivas, el cálculo es: 
 
B.11.7 Expresión de los Resultados  
Según ejemplo 1: 
Informar como Staphylococcus aureus 640 000 UFC/g 
Según ejemplo 2: 
Informar como Staphylococcus aureus 930 UFC/g valor estimado 
Si las pruebas confirmativas resultan negativas  en todas las colonias probadas, informar como: 
0 UFC/g en muestras directas -10 UFC/g en muestras de dilución 1:10 -100 UFC/g en muestras de dilución 1:100 En la práctica los resultados pueden variar, esto dependerá del técnico que trabaje el método y el grado de 
confiabilidad del mismo, que en el 95% de los casos es de ± 16% a ± 52%. 
B.12 Determinación de Salmonella spp.  
B.12.1 Fundamento  
La presente técnica para la detección de Salmonella spp. en alimentos, describe un esquema general que 
consiste de 5 pasos básicos: 
Preenriquecimiento, es el paso donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, que 
permite restaurar las células de Salmonella dañadas a una condición fisiológica estable. 
Enriquecimiento selectivo, empleado con el propósito de incrementar las poblaciones de Salmonella spp. e 
inhibir otros organismos presentes en la muestra. 
Selección en medios sólidos, en este paso se utilizan me dios selectivos que restringen el crecimiento de 
otros géneros diferentes a Salmonella spp. y permite el reconocimiento visual de colonias sospechosas. 
Identificación bioquímica, este paso permite la  identificación genérica de los cultivos de Salmonella spp. y 
la eliminación de cultivos sospechosos falsos. 
Serotipificación, es una técnica serológica que pe rmite la identificación específica de un cultivo. 
B.12.2 Materiales y Equipo 
B.12.2.1 Horno para esterilizar que alcance los 180ºC 
B.12.2.2 Incubadora con termostato para evitar variaciones mayores de ± 0,1ºC y termómetro 
B.12.2.3 Autoclave con termómetro o manómetro, probado con termómetro de máximas 
B.12.2.4 Baño maría con termostato y termómetro 
B.12.2.5 Balanza granataria con sensibilidad de 0, 1 g, o Balanza de precisión o analítica 
B.12.2.6 Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato, con vasos esterilizables (vidrio o 
aluminio) 
B.12.2.7 Mecheros Bunsen o Fisher 
B.12.2.8 Potenciómetro 
B.12.2.9 Matraces Erlenmeyer de 500 mL 
B.12.2.10 Recipientes de boca ancha, de capacidad apropiada para contener las muestras simples y 
compuestas 
B.12.2.11 Angulos de vidrio 
B.12.2.12 Cucharas, bisturíes, cuchillos y pinzas 
B.12.2.13 Tubos de ensaye de 16 x 150 mm y de 20 x 100 mm 
B.12.2.14 Tubos para serología de 10 x 75 mm o de 13 x 100 mm 
B.12.2.15 Pipetas bacteriológicas de 10,0 y 5,0 mL, graduad as en 0,1 mL y protegidas con tapón de 
algodón 
B.12.2.16 Pipetas de 1 mL , con graduaciones de 0,01 mL. 
B.12.2.17 Cajas de petri estériles de vidrio o desechables 
B.12.2.18 Rejillas para tubos de ensaye Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.12.2.19 Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de diámetro 
B.12.2.20 Papel pH (intervalo de 6-8) con graduaciones máximas de 0,4 unidades de pH para cambios de 
color 
B.12.2.21 Todo el material que tenga contacto con las muestras bajo estudio debe esterilizarse mediante: 
Horno, durante 2 horas a 170-175ºC o autoclave, durante 15 min como mínimo a 121ºC ± 1ºC 
B.12.2.22 Perilla 
B.12.2.23 Vórtex 
B.12.2.24 Estomacher (opcional) 
B.12.3 Reactivos 
En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, se deben seguir las instrucciones 
impresas en la etiqueta respectiva para su preparación. 
Las sustancias químicas usadas para preparar los medios de cultivo y los reactivos deben ser grado 
analítico. 
B.12.3.1 Medios de Pre-enriquecimiento 
B.12.3.1.1 Agua de Peptona tamponada 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Peptona 10,0 g 
Cloruro sódico 5,0 g 
Fosfato sódico dibásico 3,5 g 
Fosfato potásico monobásico 1,5 g 
Agua 1,0 l 
 
Preparación 
Disolver los componentes en agua, calentando si es nec esario. Ajustar el pH, si es necesario, después de 
la esterilización a 7,0. Distribuir en recipientes de vidrio  esterilizables con la capacidad necesaria para obtener 
las porciones necesarias para la prueba. Esterilizar por 20 min a 121 ± 1ºC. 
B.12.3.1.2 Cal do Lactosado 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Extracto de carne 3,0 g 
Peptona 5,0 g 
Lactosa 5,0 g 
Agua destilada 
pH final: 6,9 ± 0,2 1,0 l 
 
Preparación 
Disolver los ingredientes en agua, calentando a 65º C. Distribuir en porciones de 225 mL, en frascos de 
500 mL. Esterilizar durante 15 min a 121ºC ± 1ºC. 
B.12.3.2 Caldo de Enriquecimiento 
B.12.3.2.1 Caldo Se lenito-cistina 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Triptona o polipeptona 5,00 g 
Lactosa 4,00 g 
Fosfato disódico 10,00 g 
Selenito ácido de sodio 4,00 g 
L-cistina 0,01 g 
Agua destilada 
pH final: 7,0 ± 0,2 a 25ºC 1,00 l 
 
Preparación 
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estéril y distribuir en volúmenes de 10 y 225 mL en 
recipientes estériles, según se requiera. El caldo así preparado es transparente. De preferencia usarlo el 
mismo día de su preparación. Si se desea conservar el medio por varios días, puede exponerse al calor en 
autoclave por 5 min a 110ºC ± 1ºC,  tomando entonces un color salmón.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.12.3.2.2 Caldo Tetrationato 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Proteosa peptona o triptona 5,0 g 
Sales biliares 1,0 g 
Carbonato de calcio 10,0 g 
Tiosulfato de sodio pentahidratado 30,0 g 
Agua destilada 
pH final: 7,0 ± 0,1 1,0 l 
 
Preparación 
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estéril. Distribuir, agitando constantemente, en 
porciones de 10 y 225 mL, en recipientes estériles. Guar dar en refrigeración. Antes de usar el medio, agregar 
2 mL de una solución yodo-yoduro y 1 mL de solución de verde brillante al 0,1% por cada 100 mL de caldo. El 
medio una vez adicionado de yodo no debe calentarse y debe usarse el mismo día de su preparación 
B.12.3.2.3 Vassiliadis-Rappaport 
Solución A 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Triptona 5,0 g 
Cloruro de sodio 8,0 g 
Fosfato de potasio dihidrogenado 1,6 g 
Agua destilada 1,0 l 
 
Disolver los componentes en agua por calentamiento cercano a 70ºC. 
Solución B 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Cloruro de magnesio hexahidratado 400,0 g 
Agua destilada 1,0 l 
 
Disolver el cloruro de magnesio en agua. Como esta sal es muy higroscópica es conveniente disolver el 
contenido entero de cloruro de magnesio desde un recipiente recientemente abierto de tal modo que la 
concentración de la solución sea de 0,4 g/mL. Cons ervar en frasco ámbar a temperatura ambiente. 
Solución C 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Oxalato de verde de malaquita 0,4 g 
Agua destilada 100,0 mL 
 
Disolver el oxalato de verde de malaquita en agua. Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente. 
Medio completo 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
solución A 1000 mL 
solución B 100 mL 
solución C 10 mL 
 
Preparación 
Adicionar 1000 mL de la solución A, 100 mL de la solución B y 10 mL de la solución C. Ajustar el pH si es 
necesario, de tal manera que después de la esterilizaci ón sea de 5,2. Distribuir ante s de usar dentro de tubos 
en cantidades de 10 mL. Almacenar en refrigeración. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.12.3.2.4 Caldo de  Soya tripticasa 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Tripticasa o triptosa 17,0 g 
Fitona 3,0 g 
Glucosa 2,5 g 
Cloruro de sodio 2,5 g 
Agua destilada 
pH final: 7,3 ± 0,2 1,0 l 
 
Preparación 
Disolver los ingredientes en 1 litro de agua destilada, ca lentando lentamente hasta su disolución completa. 
Distribuir porciones de 225 mL dentro de matraces de 500 mL y esterilizar en autoclave durante 15 min a 
121ºC ± 1ºC. 
B.12.3.2.5 Leche descremada reconstituida Suspender 100 g de leche descremada en polvo en un litro de agua destilada. Agitar circularmente hasta 
disolución. Distribuir en volúmenes de 225 mL en matrac es Erlenmeyer de 500 mL. Esterilizar a 121ºC ± 1ºC 
por 15 min. El volumen final debe corregirse para mantener 225 mL. 
B.12.3.2.6 Caldo Soya tripticasa estéril adicionado con sulfito de potasio 
Adicionar al caldo soya tripticasa 5 g de sulfito de potasio por cada 1000 mL de medio, quedando una 
concentración final de sulfito de potasio del 0,5%. Adic ionar el sulfito de potasio antes de esterilizar en 
autoclave en la forma habitual. 
B.12.3.3 Medios de Aislamiento B.12.3.3.1 Agar verde brillante (VB) 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Extracto de levadura 3,0000 g 
Polipeptona (Proteosa peptona No. 3) 10,0000 g 
Cloruro de sodio 5,0000 g 
Lactosa 10,0000 g 
Sacarosa 10,0000 g 
Rojo de fenol 0,0800 g 
Agar 20,0000 g 
Verde brillante 0,0125 g 
Agua destilada 
pH final: 6,9 ± 0,2 1,0000 l 
 
Preparación Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar a ebullición, hasta disolución completa. 
Ajustar el pH. Esterilizar en autoclave por 15 min a 121ºC ± 1ºC. El sobrecalentam iento del medio disminuye 
su selectividad. Enfriar el medio a 50ºC y distribuirlo  en cajas de petri estériles. El aspecto del medio es 
obscuro, de color marrón. 
B.12.3.3.2 Agar con sulfito de bismuto 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Extracto de carne de res 5,000 g 
Mezcla de peptonas 10,000 g 
Glucosa 5,000 g 
Fosfato disódico (anhidro) 5,000 g 
Sulfato ferroso (anhidro) 0,300 g 
Sulfito de bismuto 8,000 g 
Verde brillante 0,025 g 
Agar 20,000 g 
Agua destilada 
pH final: 7,6 ± 0,2 1,000 l 
Preparación 
Suspender los ingredientes en un litro de agua. Ca lentar hasta su disolución completa, agitando 
frecuentemente. Ajustar el pH. Enfriar a 45ºC y verter en cajas de petri estériles, distribuyendo de manera 
homogénea el precipitado propio del medio. El aspecto de las placas es opaco, de color verde pálido y deben 
usarse el mismo día de su preparación. Si la colo ración es parda, no deben utilizarse. El medio no debe 
esterilizarse en autoclave; el sobrecalentamiento afecta su selectividad.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.12.3.3.3 Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES
Xilosa 3,75 g
L-lisina 5,00 g
Lactosa 7,50 g
Sacarosa 7,50 g
Cloruro de sodio 5,00 g
Extracto de levadura 3,00 g
Rojo de fenol 0,08 g
Agar 15,00 g
Desoxicolato de sodio 2,50 g
Citrato férrico-amónico 0,80 g
Tiosulfato de sodio 6,80 g
Agua destilada
pH final: 6,9 ± 0,2 1,00 l
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en un litro de agua des tilada, y calentar en baño de agua a 55ºC, agitando 
frecuentemente, hasta disolución completa. Ajustar el pH. Enfriar a 50ºC y verter en cajas de petri estériles. 
No se esterilice. El sobrecalentamiento produce un a precipitación; la reactividad del medio puede ser 
satisfactoria, pero las colonias suelen ser muy pequeñas. El aspecto del medio es claro y de color rojo brillante. 
B.12.3.3.4 Agar para Salmonella  y Shigella  (SS) 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES
Extracto de carne 5,000 g
Polipeptona 5,000 g
Lactosa 10,000 g
Sales biliares 8,500 g
Citrato de sodio dihidratado 8,500 g
Tiosulfato de sodio pentahidratado 8,500 g
Citrato férrico 1,000 g
Agar 13,500 g
Rojo neutro 0,025 g
Verde brillante 0,330 mg
Agua destilada
pH final: 7,0 ± 0,2 1,000 l
Preparación 
Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada  estéril y calentar a ebullición hasta disolución 
completa. Ajustar el pH. No esterilizar en autoclave. Enfriar a 50ºC y distribuir en cajas de petri estériles en 
condiciones asépticas. El aspecto del me dio fundido es claro y de color rosado. 
Nota: La polipeptona se puede sustituir por 2,5 g de peptona de caseína y 2,5 g de peptona de carne. 
B.12.3.3.5 Agar Entérico Hektoen 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES
Proteosa peptona 12,000 g
Extracto de levadura 3,000 g
Lactosa 12,000 g
Sacarosa 12,000 g
Salicina 2,000 g
Sales biliares 9,000 g
Cloruro de sodio 5,000 g
Tiosulfato de sodio 5,000 g
Citrato amónico férrico 1,500 g
Azul de bromotimol 0,064 g
Fuscina ácida 0,100 g
Agar 13,500 g
Agua 
pH final: 7,5 ± 0,2 1,000 l
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir c on agitación hasta completa disolución del agar. No 
sobrecalentar. Dejar enfriar a 55-60ºC y distribuir en  cajas de petri estériles en condiciones asépticas. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.12.3.4 Medios para  Pruebas Bioquímicas 
B.12.3.4.1  Agar de tres azúcares y hierro (TSI) 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Peptona de carne 1,0 g 
Peptona de caseína 1,0 g 
Cloruro de sodio 0,5 g 
Lactosa 1,0 g 
Sacarosa 1,0 g 
Glucosa 0,1 g 
Agar 1,3 g 
Rojo de fenol 2,5 mg 
Sulfato ferroso amónico pentahidratado 20,0 mg 
Tiosulfato de sodio 20,0 mg 
Agua destilada 
pH final: 7,3 ± 0,2 100,0 mL 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en 100 mL de agua destila da. Calentar a ebullición, agitando ocasionalmente, 
hasta disolución completa. Enfriar a 60ºC y ajustar el pH. Distribuir en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 min. Inclinar  los tubos de manera que el medio de cultivo en el 
fondo alcance una altura de 3 cm y una profundidad de 4 cm. El medio es de color rojo. 
Nota: Las peptonas se pueden sustituir por 2 g de polipeptona. 
B.12.3.4.2 Agar de Hierro y Lisina (LIA) 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Peptona de gelatina 0,5 g 
Extracto de levadura 0,3 g 
Glucosa 0,1 g 
L-lisina 1,0 g 
Citrato férrico-amónico 50,0 mg 
Tiosulfato de sodio anhidro 4,0 mg 
Púrpura de bromocresol 2,0 mg 
Agar 1,5 g 
Agua destilada 
pH final: 6,7 ± 0,2 100,0 mL 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en el agua destilada y mezc lar bien, calentar hasta ebullición con agitación 
frecuente hasta conseguir la disolución completa. Ajustar el pH. Distribuir en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm, con tapón de rosca. Esterilizar en autoclave  a 121ºC ± 1ºC durante 12 min. Dejar que los tubos 
se enfríen en posición inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 4 cm y una superficie 
inclinada de 2 cm. El medio ya preparado es de color púrpura. 
B.12.3.4.3 Agar Nutritivo 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Extracto de carne 3,0 g 
Peptona 5,0 g 
Agar 15,0 g 
Agua destilada 
pH final: 6,8 ± 0,2 1,0 l 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en agua. Dejar reposar de 5 a 10 min. Calentar a ebullición hasta disolución 
completa. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm, en cantidades  de 1/3 de su volumen. Esterilizar a 121ºC ± 1ºC 
por 15 min. Inclinar los tubos antes que el agar solidifique.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.12.3.4.4. Medio de SIM (par a Sulfuro, Indol y Movilidad) 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Extracto de carne 3,000 g 
Peptona 30,000 g 
Hierro peptonizado 0,200 g 
Tiosulfato de sodio 0,025 g 
Agua destilada 
pH final: 7,3 ± 0,2 1,000 l 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta 
lograr una disolución completa. Enfriar a 50ºC y ajustar el pH. Distribuir el medio en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en aut oclave a 121ºC ± 1ºC durante 15 min. Se dejan enfriar los tubos en 
posición vertical. 
B.12.3.4.5 Agar Citrato de Simmons 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Fosfato de amonio 1,00 g 
Fosfato dipotásico 1,00 g 
Cloruro de sodio 5,00 g 
Citrato de sodio 2,00 g 
Sulfato de magnesio 0,20 g 
Azul de bromotimol 0,08 g 
Agar 15,00 g 
Agua destilada 
pH final: 6,8 ± 0,2 1,00 l 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta 
lograr una disolución completa. Ajustar el pH. Distribuir el medio en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 
mm y esterilizar en autoclave a 121ºC ± 1ºC durante 15 mi n. Dejar enfriar los tubos en posición inclinada. 
B.12.3.4.6 Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer) 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Peptona 7,0 g 
Dextrosa 5,0 g 
Difosfato de potasio 5,0 g 
Agua destilada 
pH final: 6,9 ± 0,2 1,0 l 
Preparación 
Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta 
lograr una disolución completa. Ajustar el pH. Distribuir el medio en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 
mm y esterilizar en autoclave a 121ºC ± 1ºC durante 15 min. 
B.12.3.4.7 Caldo Manitol 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Extracto de carne 1,000 g 
Proteosa peptona 10,000 g 
Cloruro de sodio 5,000 g 
Rojo de fenol 0,018 g 
Manitol 10,000 g 
Agua 
pH final: 7,4 ± 0,2 1,000 l 
Preparación 
Suspender 26 g del medio deshidratado en un litro de agua, mezclar y ajustar el pH. Distribuir en 
volúmenes de 2 a 3 mL en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 min. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.12.3.4.8 Caldo Malonato 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES
Extracto de levadura 1,000 g
Sulfato de amonio 2,000 g
Fosfato dipotásico 0,600 g
Fosfato monopotásico 0,400 g
Cloruro de sodio 2,000 g
Malonato 3,000 g
Glucosa 0,250 g
Azul de bromotimol 0,025 g
Agua 
pH final: 6,7 ± 0,2 1,000 l
 
Preparación Suspender los ingredientes en agua, mezclar y ajustar el pH. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm en 
cantidades de 3 mL. Esterilizar en aut oclave a 121ºC ± 1ºC durante 15 min. 
B.12.3.4.9 Caldo Urea 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES
Urea 20,00 g
Extracto de levadura 0,10 g
Fosfato monopotásico 9,10 g
Fosfato disódico 9,50 g
Rojo de fenol 0,01 g
Agua 
pH final: 6,8 ± 0,2 1,00 l
 
Preparación 
Disolver los ingredientes en agua destilada. NO CA LENTAR. Esterilizar por filtración a través de 
membrana 0,45 µm o en autoclave de 5 a 8 lb de pres ión durante 15 min. Distribui r asépticamente de 1,5 a 3 
mL en tubos estériles de 13 x 100 mm. 
B.12.3.4.10 Caldo de Urea Rápido 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES
Urea 20,000 g
Extracto de levadura 0,100 g
Fosfato monopotásico 0,091 g
Fosfato disódico 0,095 g
Rojo de fenol 0,010 g
Agua 
pH final: 6,8 ± 0,2 1,000 l
 
Preparación 
Disolver los ingredientes en agua destilada. NO CA LENTAR. Esterilizar por filtración a través de 
membrana 0,45 µm. Distribuir asépticamente de 1, 5 a 3 mL en tubos estériles de 13 x 100 mm. 
B.12.3.4.11 Caldo Infusión Cerebro Corazón 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES
Infusión cerebro corazón 200,0 g
Infusión de corazón de res 250,0 g
Proteosa peptona 10,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Fosfato disódico dodecahidratado 2,5 g
Dextrosa 2,0 g
Agua destilada
pH final: 7,4 ± 0,2 1,0 l
 
Preparación 
Disolver los ingredientes en agua destilada, calentar suavemente. Distribuir y es terilizar a 121ºC ± 1ºC 
durante 15 min.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.12.3.5 Soluciones 
B.12.3.5.1 Solución Verde Brillante al 0,1% (1:1000) 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Verde brillante 0,1 g 
Agua destilada estéril 100,0 mL 
 
Disolver 0,1 g de verde brillante en agua des tilada estéril hasta completar 100 mL. 
B.12.3.5.2 Solución de Yodo-yoduro 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Cristales de yodo 6,0 g 
Yoduro de potasio 6,0 g 
Agua destilada 100,0 mL 
 
Disolver los cristales y el yoduro de potasio en agua destilada hasta completar 100 mL. Conservar en 
frasco ámbar. 
B.12.3.5.3 Solución Salina al 0,85% 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Cloruro de sodio 0,85 g 
Agua destilada 100,00 mL 
 
Disolver el cloruro de sodio en el agua y esterilizar a 121°C ± 1°C durante 15 min. 
B.12.3.5.4 Solución Salina formalizada 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Solución de formaldehído (36-38%) 6,0 mL 
Cloruro de sodio 8,5 g 
Agua destilada 1,0 l 
 
Disolver 8,5 g de cloruro de sodio en 1 litro de agua destilada. Esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 min. 
Enfriar a temperatura ambiente. Adicionar 6 mL de la solución de formaldehído. No esterilizar después de la 
adición de formaldehído. 
B.12.3.5.5 Reactivo de Kovac 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
p-dimetil-aminobenzaldehído 5,0 g 5,0 g 
Alcohol amílico 75,0 mL 75,0 mL 
Acido clorhídrico concentrado 25,0 mL 25,0 mL 
 
Disolver el p-dimetil-aminobenzaldehído en el alcohol  amílico y después agregar el ácido clorhídrico 
lentamente. Conservar en frasco ámbar en refrigeración. 
B.12.3.5.6 Solución de Alfa-naftol al 5% 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Alfa-naftol 5,0 g 
Alcohol 100,0 mL 
 
Disolver 5 g de alfa-naftol en alcohol hasta completar 100 mL. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.12.3.5.7 Solución de Rojo de metilo 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Rojo de metilo 0,10 g 
Alcohol etílico 300,00 mL 
Agua destilada c.b.p. 500,00 mL 
 
Disolver el rojo de metilo en el alcohol etílico y adicionar agua hasta completar 500 mL. B.12.3.5.8 Solución de Hidróxido de potasio al 40% 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Hidróxido de potasio 40,0 g 
Agua destilada 100,0 mL 
 
Disolver 40 g de hidróxido de potasio en agua hasta completar 100,0 mL. B.12.3.5.9 Solución de Gelatinasa al 5% 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Gelatinasa 5,0 g 
Agua 100,0 mL 
 
Disolver 5 g de gelatinasa en 100 mL de agua destilada. NO CALENTAR. B.12.3.6 Antisueros Antisuero polivalente somático (O) 
Antisuero polivalente flagelar (H) 
Antisuero Vi 
B.12.4 Procedimiento 
B.12.4.1 Preparación de los alim entos para el aislamiento de Salmonella.  
Los siguientes métodos se basan en el análisis de 25 g de la muestra analítica en una proporción de 1:9 
de muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse si empre que se mantenga la misma proporción. Se 
recomienda una muestra de 25 g o más. 
B.12.4.1.1 Procedimiento general pa ra la preparación de muestras. 
Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso esté ril de licuadora o en bolsa estéril para trabajar en 
homogeneizador peristáltico (stomacher). Adicionar  225 mL del medio de preenriquecimiento estéril 
(generalmente caldo lactosado, a menos que se indiqu e otro) y licuar si es necesario durante un min. 
Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con tapón de rosca 
y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien y determinar el 
pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6,8 ± 0,2 con hidróxido de sodio 1N o ácido 
clorhídrico 1N estériles. Mezclar y cubrir el recipi ente enroscando suavemente la tapa. Incubar 24 ± 2 h a 
35ºC. Continuar como se indica en B.12.4.1.2. 
B.12.4.1.2 Procedimiento específico para la preparación de muestra según el producto. B.12.4.1.2.1 Leche en polvo, entera, semidescremada o descremada. 
Seguir el procedimiento general para el pesado de la muestra y adicionarla lentamente a un matraz 
Erlenmeyer con 1 lt de agua estéril, 2 mL al 1% de verde brillante, procurando que el polvo quede en la 
superficie del líquido y se hidrate suavemente. De esta solución se toman 225 mL para disolver la muestra. 
Dejar la mezcla en reposo por 60 min, e incubar como se indica en B.12.4.1.1. 
B.12.4.1.2.2 Queso 
Proceder igual que en B.12.4. 1.1 utilizando agua de peptona tamponada como medio de 
preenriquecimiento. 
B.12.4.1.2.3 Productos procesados té rmicamente y productos secos. 
Se sigue el procedimiento señalado en B.12.4.1.1 hasta la homogeneización. Si la muestra es en polvo o 
molida, el licuado puede omitirse. Después de reposar, mezclar bien y ajustar el pH como se indica en el 
procedimiento general. Para emulsionar las grasas, adicionar hasta un máximo de 2,25 mL de Tergitol 
aniónico 7 estéril (121ºC ± 1ºC/15 min) y mezclar bien. Pu ede utilizarse Triton X-100 es téril. Usar la cantidad 
necesaria de estos detergentes utilizando el volumen mínimo para que se inicie la formación de espuma. 
Puede ser, para el Triton X-100 de 2 a 3 gotas. La c antidad de los mismos dependerá en gran medida de la 
composición del alimento. Los detergentes no serán necesarios en los productos glandulares en polvo. 
Incubar las muestras como se indica en B.12.4.1.1       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.12.4.1.2.4 Productos crudos o altamente contaminados. 
Pesar porciones de 25 g de producto en dos vasos para licuadora. Si la muestra es en polvo o molida, el 
licuado puede omitirse y el producto puede pesarse di rectamente en matraces Erlenmeyer estériles de 500 
mL. Adicionar 225 mL de caldo selenito cistina o 225 mL  de caldo tetrationato (sin verde brillante) a cada 
muestra analítica. Licuar por dos min y pasar asépticamente a matraces Erlenmeyer de 500 mL. Dejar reposar 
y ajustar el pH como se indica en B.12.4.1.1. Adicio nar 2,25 mL de solución de verde brillante 0,1% y 4,5 mL 
de solución yodo-yoduro a la muestra que se enriquecer á con caldo tetrationato. Homogeneizar e incubar. 
Continuar como se indica en B.12.4.2.1. 
B.12.4.1.2.5 Dulces y dulces cubiertos 
Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un va so para licuadora agregando 225 mL de leche 
descremada reconstituida. Licuar por dos min. Maneja r igual que en B.12.4.1.1 hasta después de ajustar el 
pH. Adicionar 0,45 mL de la solución verde brillante al  0,1% y mezclar bien. Incubar como se indica en 
B.12.4.1.1. 
B.12.4.2 Aislamiento de Salmonella spp. 
B.12.4.2.1 Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matr aces con los cultivos de preenriquecimiento y 
agitar suavemente, transferir respectivamente 1 mL  de la mezcla a un tubo que contenga 10 mL de caldo 
tetrationato y a otro con 10 mL de caldo selenito cistina.  Como alternativa, en sust itución del caldo tetrationato 
puede emplearse el medio Vassiliadis-Rappaport. 
B.12.4.2.2 Incubar de 18 a 24 h a 35ºC o, para alimentos f uertemente contaminados a 42ºC por el mismo 
periodo. Estriar los productos que fueron direct amente enriquecidos en medios selectivos. 
B.12.4.2.3 Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar 
verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios selectivos adicionales (agar entérico 
Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS). Efectuar el mismo procedimiento para el caldo tetrationato. 
Incubar las placas 24 ± 2 h a 35ºC. 
B.12.4.2.4 Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella, de acuerdo 
con las siguientes características: 
Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser tr ansparentes con o sin centro negro. En algunos casos 
las colonias pueden aparecer completamente negras. 
Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las 
bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas. 
Agar entérico Hektoen: colonias verdes o azulver des con o sin centro negro. En algunos casos las 
colonias pueden aparecer completamente negras. 
Agar Sulfito de Bismuto: las colonias típicas de Salmonella pueden ser cafés, grises o negras; con o sin 
brillo metálico. Generalmente el medio circundante (halo) es café, tornándose posteriormente negro. 
Algunas cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscuro. Si las placas no muestran 
colonias típicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales. 
Agar SS: colonias translúcidas, oc asionalmente opacas. Algunas colonias  dan centro negro. Las colonias 
fermentadoras de la lactosa son rojas. 
B.12.4.3 Identifi cación Bioquímica 
B.12.4.3.1 Seleccionar al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien 
aisladas. Tocar levemente el centro de cada colonia e i nocular dos tubos, uno con agar triple azúcar hierro 
(TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), por estría en la  superficie inclinada y por punción en el fondo. Incubar 
por 24 ± 2 h a 35ºC. Almacenar en refrigeración de 5 a 8ºC las placas con medios selectivos por si es 
necesario retomar más colonias. 
B.12.4.3.2 Observar el crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente positivas para Salmonella 
las colonias que den las siguientes reacciones: 
B.12.4.3.2.1 Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentación de la 
glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo más intenso que el medio original debido a la no fermentación de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayoría de los casos se observa coloración negra a lo largo de la punción debido a la producción de ácido sulfihídrico. 
B.12.4.3.2.2 Agar LIA, se observa intensificación del colo r púrpura en todo el tubo por la descarboxilación 
de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos  que produzcan claramente color amarillo en el fondo del 
agar. La mayoría de las cepas de Salmonella producen ácido sulfihídrico en este medio con ennegrecimiento 
a lo largo de la punción. 
B.12.4.3.2.3 Retener todos los cultivos que mues tren las reacciones características de 
Salmonella en los 
medios TSI y LIA para las pruebas adic ionales, indicadas en B.12.4.3.3. 
B.12.4.3.3 Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella spp. pero que present an reacciones en LIA 
típicos, deben trabajarse como cultivos presuntivos positi vos, ya que en estos casos, el medio LIA permitirá 
detectar S. arizonae y cepas atípicas de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los 
cultivos que muestren reacciones atípicas en ambos medios. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.12.4.3.4 Continuar el análisis a partir de los tubos de TSI con reacciones típicas. Si el cultivo presenta 
reacciones atípicas en este medio, tomar colonias adic ionales de las placas de donde se obtuvo el cultivo 
atípico anterior y sembrar las pruebas bioquímicas nuevamente. 
B.12.4.3.5 Continuar la identificación bioquímica y serológica a partir de los cultivos recuperados de TSI. 
Se recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analítica seleccionando colonias procedentes de ambos medios de enriquecimiento. 
B.12.4.3.6 Prueba de Ureasa B.12.4.3.6.1 Prueba de Ureasa (convencional).  Con un asa estéril, tomar crecimiento del cultivo 
presumiblemente positivo de  cada tubo de medio TSI e inocular tubo s de caldo urea. Utilizar un control de 
medio para comparar el vire púrpura de las reacciones pos itivas con el color del medio original. Incubar 24 ± 2 
h a 35ºC.  
B.12.4.3.6.2 Prueba de Ureasa (rápida).  Tomar dos asadas de crecimient o del cultivo presumiblemente 
positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea (rápida). Incubar 2 h a 37 ± 0,5ºC en baño 
de agua. Descartar todos los cultivos que den ureasa posi tiva. Retener los cultivos que den la prueba negativa 
(sin cambio de co lor del medio). 
B.12.4.4 Identifi cación Serológica 
B.12.4.4.1 Ensayo de los Antígenos somáticos de Salmonella (Antisuero polivalente O) 
B.12.4.4.1.1 Colocar con un asa dos gotas separadas de solución salina estéril sobre un portaobjetos o en 
dos secciones de una placa para aglutinación. Suspender  en cada una de las gotas, una porción del cultivo 
desarrollado en TSI. 
B.12.4.4.1.2 Agregar a una de ellas una gota del antisuero polivalente somático (O) y mezclar con el canto 
del asa o empleando aplicadores de madera. 
B.12.4.4.1.3 Agitar inclinando la lámina hacia atrás y hacia adelante durante aproximadamente un min. 
Observar bajo buena iluminación sobre un fondo oscuro. 
B.12.4.4.1.4 Considerar cualquier grado de aglutinación como  positiva. La prueba positiva resulta cuando 
se presenta aglutinación en la gota con el cultivo y el antisuero y no aglutinación en la gota que contiene el 
cultivo y la solución salina . Si se observa aglutinación en ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe 
continuar con las pruebas bioquímicas complementarias. 
B.12.4.4.2 Cuando la aglutinación es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el subgrupo 
empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los más frecuentes). 
B.12.4.4.2.1 Si la aglutinación con el antisuero O es negativa , utilizar antisuero Vi y efectuar la prueba. Si 
hay aglutinación con Vi calentar el cultivo a ebullición y repetir la aglutinación con el antisuero polivalente O. 
B.12.4.4.2.2 Si no se cuenta con los sueros grupoespecíficos, solicitar la tipificación de la cepa  al 
Laboratorio de Enterobacterias del Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia de la Secretaría de Salud o al 
Laboratorio Nacional de Salud Pública. 
B.12.4.4.3 Si se requiere, practicar el ensayo de los antígenos flagelares de Salmonella (Antisuero 
polivalente H). 
B.12.4.4.3.1 Inocular el crecimiento del tubo de TSI en agar infusión de cerebro corazón e incubar de 4 a 6 
h a 35ºC hasta que se observe crecimient o (para ensayo en el mismo día), o bien, en caldo soya tripticaseina 
e incubar por 24 ± 2 h a 35ºC (para ensayo al día siguiente). Adicionar 2,5 mL de solución salina formalizada a 5 mL del cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazón (BHI). 
B.12.4.4.3.2 Colocar 0,5 mL del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para serología  (13 
x 100 mm aproximadamente). Adicionar 0,5 mL del cultivo fo rmalizado. Preparar un control de solución salina 
mezclando 0,5 mL de solución salina formalizada con 0,5 mL del antígeno formalizado. Incubar las mezclas en baño de agua a 48-50ºC. Observar a intervalos de 15  min por espacio de una h. Una prueba positiva es 
cuando se observa aglutinación en la mezcla de prueba pero no en el control. Debe interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas  muestre aglutinación. Cuando ambas mezclas se 
aglutinan, se considera la prueba inespecífica. 
B.12.4.5 Pruebas Bioquí micas Complementarias 
Cuando las pruebas serológicas o bioquímicas iniciales, dan resultados atípicos o no concluyentes, 
realizar las pruebas que se describen a continuación: 
B.12.4.5.1 Inocular los cultivos positivos provenientes  de TSI y LIA en: medio SIM, agar citrato de 
Simmons, caldo manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para confirmar la presencia de la especie S. 
arizonae . 
B.12.4.5.2 Interpretar los camb ios en los medios inoculados conforme lo siguiente: 
B.12.4.5.2.1 Agar Ci trato de Simmons 
Inocular por estría el tubo. Incubar 96 ± 2 h a 35 ± 2ºC. 
Prueba positiva: crecimiento acompañado de un cambio de color de verde a azul. 
Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.12.4.5.2.2 Medio SIM 
Inocular por punción. Incubar 24 h a 35 ± 2ºC. Movilidad. Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la punción y en el seno del medio de cultivo. 
Prueba negativa: crecimiento a lo la rgo de la punción exclusivamente. 
Producción de ácido sulfihídrico. Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la punción que puede extenderse a todo el 
medio. 
Prueba negativa: ausencia de color negro. 
Producción de indol. 
Adicionar al tubo con medio SIM que presente crec imiento, de 0,2 a 0,3 mL de reactivo de Kovac. 
Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color rojo. Prueba negativa: sin cambio de color. B.12.4.5.2.3 Caldo RM-VP 
Inocular un tubo con el medio. 
Incubar 48 ± 2 h a 35 ± 2ºC para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM. 
B.12.4.5.2.4 Prueba de Voges-Proskauer (VP) Transferir a un tubo un mL del cultivo de 48 h. Adicionar  0,6 mL de solución de alfa naftol. Adicionar 0,2 
mL de solución de hidróxido de potasio 40%. Adicionar al gunos cristales de creatinina (opcional). Interpretar 
los resultados después de incubar 2 h a 35 ± 2ºC o 4 h a temperatura ambiente. 
Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo. 
Prueba negativa: sin cambio de color. Reincubar el resto del medio RM-VP 48 h más a 35 ± 2ºC. B.12.4.5.2.5 Prueba de Rojo de metilo (RM) Adicionar al medio de cultivo de 96 h de incubación de  dos a tres gotas de solución de rojo de metilo. 
Interpretar los resultados inmediatamente. 
Prueba positiva: desarrollo de color rojo. Prueba negativa: desarrollo de color amarillo. B.12.4.5.2.6 Caldo Malonato Inocular un tubo conteniendo el medi o. Incubar 40 ± 2 h a 35 ± 2ºC. 
Prueba positiva: desarrollo de color azul. 
Prueba negativa: sin cambio de color. B.12.4.5.2.7 Ca ldo Manitol 
Inocular un tubo conteniendo el medi o. Incubar 24 ± 2 h a 35 ± 2ºC. 
Prueba positiva: desarrollo de color amarillo. Prueba negativa: sin cambio de color. 
B.12.4.5.3 Consultar los resultados obtenidos en el  cuadro 2 para la identificación de los géneros 
de las bacterias  investigadas.  
Nota: los sistemas bioquímicos comerciales validados pueden ser usados como alternativa para las 
pruebas bioquímicas convencionales. 
B.12.4.6 Cálculo y Expresión de Resultados 
B.12.4.6.1 Interpretación de reacciones bioquímicas y serológicas. 
CUADRO 1 
Reacciones bioquímicas Reacciones serológi cas Interpretación 
Típica Antígeno O Vi o H positivo Cepas consideradas como 
Salmonella spp. 
Típica Todas las reacciones negativas  
Típica No probada Puede ser Salmonella spp. 
Reacciones atípicas Antígeno O, Vi o H positivo  
Reacciones atípicas Todas las reacciones negativas No debe ser considerada 
Salmonella spp. 
 
Nota: Ver imagen 1 al final del método. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.12.4.6.2 Reacci ones Bioquímicas y Serológicas de Salmonella  spp. 
CUADRO 2 
Prueba o sustrato Positivo Negativo Reacción 
Glucosa (TSI) amarillo rojo + 
Lisina descarboxilasa(LIA) púrpura amarillo + 
H2S (TSI y LIA) negro no negro + 
Ureasa rojo-púrpura no hay cambio de color - 
Caldo de lisina descarboxilasa púrpura amarillo + 
Caldo dulcitol rojo de fenol amarillo o gas no hay cambio de color 
ni gas + b 
Caldo KCN crecimiento no hay crecimiento - 
Caldo malonato azul no hay cambio 
de color - c 
Prueba de indol superficie color violeta superficie color amarillo - 
Prueba del antígeno flagelar aglutinación no hay aglutinación + 
Prueba del antígeno 
somático aglutinación no hay aglutinación + 
Caldo lactosa rojo fenol amarillo o gas no hay cambio de color ni 
gas - c 
Caldo sacarosa rojo fenol amarillo o gas no hay cambio de color ni 
gas - 
Prueba Voges- Proskauer de rosa a rojo no hay cambio de color - 
Prueba rojo de metilo rojo difuso amarillo difuso + 
Citrato de Simmons crecimiento color azul no hay crecimiento, no hay 
cambio de color v 
 
a +, 90% o más positivos en 1 o 2 días; -, 90% o más negativas en 1 o 2 días;v, variable. 
b La mayoría de los cultivos S. arizonae son negativos. 
c La mayoría de los cultivos S. arizonae son positivos. 
 
IMAGEN 1 . Diagrama de Flujo para la determinación de Salmonella  spp.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.12.4.7 Informe de Resultados 
Informar: Presencia o Ausencia de Salmonella en __________ g o ____________ mL de muestra. 
B.13 Determinación de Listeria monocytogenes . 
B.13.1 Fundamento 
El método para detectar la presencia de L. monocytogenes  se basa en el aislamiento y la diferenciación de 
especies de Listeria  spp., principalmente por la fermentación de carbohidratos y la actividad hemolítica de los 
miembros de este género. 
B.13.2 Materiales y Equipo 
B.13.2.1 Aceite de inmersión 
B.13.2.2 Asas bacteriológicas 
B.13.2.3 Cajas Petri 
B.13.2.4 Cubreobjetos 
B.13.2.5 Matraces Erlenmeyer de 500 mL 
B.13.2.6 Lámpara de luz blanca 
B.13.2.7 Lápiz graso o marcador 
B.13.2.8 Lupa de bajo aumento 
B.13.2.9 Pipetas volumétricas de 25, 10 y 1,0 mL 
B.13.2.10 Portaobjetos escavado 
B.13.2.11 Portaasas 
B.13.2.12 Tubos de 16 x 125 mm 
B.13.2.13 Tubos de 13 x 100 mm u otros con tapón de rosca 
B.13.2.14 Sistema de filtración con membranas  con un tamaño de poro de 0,45 µm 
B.13.2.15 Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C. 
B.13.2.16 Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas. 
B.13.2.17 Baño de agua con control de temperatura y ci rculación mecánica, provista con termómetro 
calibrado con divisiones de 0,1°C y q ue mantenga la temperatura a 45 ± 0,5°C. 
B.13.2.18 Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador 
peristáltico (Stomacher). 
B.13.2.18 Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador 
peristáltico. 
B.13.2.20 Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g. 
B.13.2.21 Incubadoras con termostato que evite variaciones  mayores de ± 1,0ºC, provista con termómetro 
calibrado. 
B.13.2.22 Microscopio de contraste de fases con objetivo de inmersión en aceite (100 X) o microscopio de 
campo oscuro. 
B.13.3 Reactivos 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico. 
Cuando se indica agua, debe entenderse que se trata de agua destilada. 
B.13.3.1 Acido acético 5 N 
B.13.3.2 Acido clorhídrico 1 M 
B.13.3.3 Acido sulfanílico (cristales) 
B.13.3.4 Alfa-naftilamina 
B.13.3.5 Alfa-naftol 5% en etanol absoluto  
B.13.3.6 Etanol absoluto 
B.13.3.7 Granalla de zinc 
B.13.3.8 Hidróxido de sodio 1 M 
B.13.3.9 Lactamato de glicil-glicina (anhídrido de glicina) 
B.13.3.10 Regulador de fosfatos glicerinado con pH 9,0 ± 0,2 
B.13.3.11 Sangre de carnero desfibrinada 
B.13.3.12 Solución al 3% de peróxido de hidrógeno 
B.13.3.13 Solución salina fisiológica 0,85% estéril  
B.13.3.14 Sueros comerciales para tipificación de Listeria spp  
B.13.3.15 Sulfato de cadmio al 20%  
B.13.3.16 Zinc pulverizado  
B.13.3.17 Reactivos para Tinción de Gram B.13.3.17.1  Alcohol-acetona 
Ingredientes Cantidad 
Etanol (95%)  700,0 mL 
Acetona  300,0 mL 
Mezclar ambos líquidos. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.13.3.17.2 Cristal Violeta 
Solución A 
Ingredientes Cantidad 
Cristal violeta 2,0 g 
Etanol (95%) 20,0 mL 
Disolver el cristal violeta en el etanol. 
Solución B 
Ingredientes Cantidad 
Oxalato de amonio 0,8 g 
Agua 80,0 mL 
Disolver el oxalato de amonio en el agua. 
Después de preparar las soluciones A y B, verter  una en la otra y agitar hasta que se mezclen 
perfectamente. 
B.13.3.17.3 Solución de Yodo 
Ingredientes Cantidad 
Yodo 1,0 g 
Yoduro de potasio 2,0 g 
Agua  300,0 mL 
 
Triturar finamente el yodo y el  yoduro de potasio en un mortero, de ser posible en una campana de 
extracción. Añadir una pequeña cantidad de agua para lavar el material, agregar el resto del agua y agitar. 
Nota: ¡Evitar el contacto de los reactivos con la piel! 
B.13.3.17.4 Solución de Safranina 
Ingredientes Cantidad 
Safranina 0,25 g 
Etanol (95%) 10,00 mL 
Agua 100,00 mL 
 
Disolver la safranina en el etanol, mezclar, agregar el agua y volver a agitar. Filtrar la solución con papel 
filtro. 
B.13.3.18 Reactivos para la Determinación de Nitritos 
B.13.3.18.1 Reactivo A 
Ingredientes Cantidad 
Alfa-naftilamina  0,5 g 
Acido acético 5N  100,0 mL 
 
B.13.3.18.2 Reactivo B 
Ingredientes Cantidad 
Acido sulfanílico  1,0 g 
Acido acético 5N  125,0 mL 
 
B.13.3.18.3 Reactivo C 
Ingredientes Cantidad 
  
Acido acético 5N  200,0 mL 
 
B.13.3.18.4 Solución de Sulfato de cadmio al 20% 
Colocar granallas de zinc en solución de sulfato de cadm io al 20% de 4 a 6 h. Disolver el precipitado de 
cadmio, adicionando ácido clorhídrico 1N. 
B.13.4 Medios de Cultivo 
A continuación se presentan las fórmulas y los proc edimientos para preparar los medios empleados en 
este análisis microbiológico. En caso de disponer de fórmulas comerciales deshidratadas se deben seguir las 
instrucciones del fabricante para su preparación.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.13.4.1 Caldo soya tripticaseína con 0,6 % de extracto de levadura (CSTEL) 
Ingredientes Cantidad 
Caldo soya tripticaseína 30,0 g 
Extracto de levadura  6,0 g 
Agua  1000,0 mL 
 
Agitar hasta disolver los ingredientes. Esterilizar a 121 ± 1ºC durante 15 min. El pH final de la solución 
debe ser 7,3 ± 0,2. 
B.13.4.2 Caldo de Enriquecimiento (EB) pH 7,3 
Un litro de caldo soya tripticaseína con extracto de levadura (CSTEL) debe contener los siguientes 
suplementos: 
Suplementos Cantidad 
Clorhidrato de acriflavina  15,0 mg 
Acido nalidíxico (sal sódica)  40,0 mg 
Cicloheximida  50,0 mg 
Acido pirúvico (sal sódica) 
solución al 10 % (p/v) * 11,1 mL 
 
* Utilizar solamente cuando se sospeche que las células de Listeria estén dañadas. (Ver el punto B.13.6.1) 
Preparar los suplementos de acriflavina y nalidíxico a partir de una solución al 0,5 % (p/v) con agua. El 
suplemento de cicloheximida prepararlo como una solu ción al 1,0 % (p/v) en una solución al 40 % (v/v) de 
etanol en agua. Esterilizar por filtra ción los suplementos. Agregar en condiciones asépticas los suplementos al 
medio CSTEL previamente esterilizado,  justo antes de su uso. Para la  preparación de un litro del medio 
CSTEL se debe partir de las soluciones anteriores,  agregando las siguientes cantidades: 3,0 mL de 
acriflavina, 8,0 mL de ácido nalidíxico y 5,0 mL de solución de cicloheximida. 
Precaución: ¡La cicloheximida es una sustancia química altamente tóxica, durante su manejo deben 
emplearse guantes, lentes de protección y lavars e las manos inmediatamente después de usarla! 
B.13.4.3 Medio de Cloruro de litio feniletanol -moxolactam (LMP) 
Ingredientes Cantidad 
Agar fenil etanol 35,5 g 
Glicina anhídra 10,0 g 
Cloruro de litio 5,0 g 
Solución de moxolactam al 1 % en 
amortiguador de fosfatos pH 6,0 2,0 mL 
Agua  1000,0 mL 
 
Esterilizar el medio (sin moxolactam) en autoclave  a 121 ± 1ºC durante 15 min. Enfriar de 48 a 50ºC y 
agregar la solución de moxolactam previamente esteriliz ada por filtración. Distribuir volúmenes de 12 a 15 mL 
del medio en cajas de Petri estériles. Las placas delgadas facilitan la observación de las colonias. 
B.13.4.4 Medio Oxford 
B.13.4.4.1 Medio Base Oxford (OXA) 
Ingredientes Cantidad 
Base de agar Columbia 39,0 g 
Esculina 1,0 g 
Citrato férrico amónico 0,5 g 
Cloruro de litio 15,0 g 
Agua 1000,0 mL 
 
Agregar los ingredientes a un litro de agua y llevar  a ebullición hasta disolución completa. Esterilizar en 
autoclave a 121 ± 1ºC durante 15 min. Enfriar a 50ºC el  medio base y en condiciones asépticas agregar los 
suplementos. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
Un litro de medio Oxford debe contener los siguientes suplementos: 
Suplementos Cantidad 
Cicloheximida 400 mg 
Sulfato de colistina 20 mg 
Acriflavina 5 mg 
Cefotetán 2 mg 
Fosfomicina 10 mg 
 
Disolver la cicloheximida, el sulfato de colestina, acriflavina, cefotetán y la fosfomicina en 10 mL de una 
mezcla 1:1 de etanol: agua. Esterilizar por filtración ante s de agregar al medio base. Mezclar y vaciar en cajas 
Petri estériles. Las placas del medio Oxford se pueden almacenar como máximo dos semanas. 
B.13.4.5 Agar Soya tripticaseína con 0, 6% de extracto de levadura (ASTEL) 
Ingredientes Cantidad 
Agar soya tripticaseína 40,0 g 
Extracto de levadura 6,0 g 
Agua 1000,0 mL 
 
Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el agar. Esterilizar a 121 ± 1ºC durante 15 min. pH final 7,3 ± 
0,2. 
B.13.4.6 Agar Sangre de carnero 
Ingredientes Cantidad 
Base de agar sangre 95,0 mL 
Sangre de carnero desfibrinada 5,0 mL 
 
Preparar el agar base de acuerdo a las instrucciones  del fabricante. Enfriar a 45 ± 2ºC y agregar 
asépticamente la sangre de carnero, la cual previa mente se debe encontrar a temperatura ambiente (20 - 
25°C). Homogeneizar el medio y verter en las cajas Petri estériles de 12 a 15 mL para la prueba de CAMP y 
de 15 a 20 mL para la prueba de hemólisis. 
B.13.4.7 Caldo Nitratos 
Ingredientes Cantidad 
Nitrato de potasio 1,0 g 
Cloruro de sodio 0,5 g 
Peptona 2,0 g 
Agua 1000,0 mL 
 
Agregar los ingredientes a un litro de agua, agitar hasta disolución completa. Verter en tubos de 13 x 100 
mm con tapón de rosca. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C durante 15 min. 
B.13.4.8 Medios para la  Prueba de Movilidad 
B.13.4.8.1 Medio de SIM 
Ingredientes Cantidad 
Peptona de caseína 20,0 g 
Peptona de carne 6,1 g 
Sulfato de fierro y amonio 0,2 g 
Tiosulfato de sodio 0,2 g 
Agar 3,5 g 
Agua 1000,0 mL 
 
Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el agar. Envasar en porciones de 4 mL en tubos de 13 x 100 
mm. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C durante 15 min. pH final 7,3 ± 0,2.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.13.4.8.2 Medio MTM 
Ingredientes Cantidad 
Extracto de carne 3,0 g 
Peptona 10,0 g 
Cloruro de sodio (NaCl) 5,0 g 
Agar 4,0 g 
Agua 1000,0 mL 
 
Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el agar. Envasar en porciones de 4 mL en tubos de 13 x 100 
mm. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1ºC durante 15 min. pH final 7,4 ± 0,2. 
B.13.4.9 Caldo Púrpura para fermentación de carbohidratos 
Ingredientes Cantidad 
Proteosa peptona No. 3 10,00 g 
Cloruro de sodio 5,00 g 
Extracto de carne 1,00 g 
Púrpura de bromocresol 0,02 g 
Agua 1000,00 mL 
 
Calentar si es necesario para disolver los ingredi entes. Esterilizar en autoclave durante 15 min. A 121 ± 
1°C pH final 6,8 ± 0,2. Agregar la solución del carbohidr ato, previamente esterilizada,  por filtración en cantidad 
suficiente para obtener una concentración final de 0,5 %. 
Nota: Los sistemas bioquímicos comerciales validados pueden usarse como alternativa para las pruebas 
bioquímicas convencionales. 
B.13.5 Preparación de la Muestra 
Para la preparación de la muestra seguir con lo establecido en el numeral 9 de este apéndice. 
B.13.6 Procedimiento 
Este método debe realizarlo un microbiólogo experi mentado, en un ambiente controlado, aislado de áreas 
de producción de alimentos. Se debe tener especial cuida do en la disposición de aquellos materiales y equipo 
que hayan estado en contacto con alimentos sospechosos, antes de desecharlos o volver a utilizarlos. Esta 
técnica por ningún motivo debe aplicarla personal inmunocomprometido ya sea por enfermedad o por el uso 
de medicamentos, mujeres embarazadas o personas de edad avanzada. 
B.13.6.1 Procedimiento de Enriquecimiento 
Tomar una muestra representativa del alimento, tanto de la superficie externa como del interior Colocar 25 
mL o 25 g de la muestra en un recipiente cont eniendo 225 mL de medio de enriquecimiento (EB), 
homogeneizar e incubar por 48 h a 30ºC. En el caso de muestras en donde se sospecha que tienen células de 
Listeria spp dañadas, se recomienda la incubación en un caldo de enriquecimiento que contenga piruvato  de 
sodio al 0,1 % (p/v) incubado a 30°C por 6 h sin suplementos. Después de las 6 h de incubación los 
suplementos deben agregarse y continuar la incubación a 30ºC hasta un total de 48 h. 
B.13.6.1.1 Aislamiento 
Después de 24 y 48 h de incubación en el medio EB, resembrar en los medios LMP y OXA. Incubar las 
placas del medio LMP a 30ºC por 24 a 48 h y las de medio OXA a 35ºC por el mismo periodo. Observar el 
crecimiento en las placas del medio LMP con luz blanc a en un ángulo de 45º (iluminación de Henry), a simple 
vista o con la ayuda de una lupa. En este medio ge neralmente aparecen las colonias de color blanco o azul 
iridiscentes. En el medio OXA las colonias de Listeria son negras, con halo negro. Algunas colonias pueden 
aparecer con un tono café oscuro que se define mejor a los siete días de incubación. Seleccionar cinco o más 
colonias típicas del medio de OXA o LMP y pasar a pl acas de medio ASTEL. Este paso es importante debido 
a que las colonias aparentemente aisladas en los m edios OXA y LMP pueden estar contaminadas con flora 
competitiva parcialmente inhibida, invisible a simple vista. Debido a que puede estar presente más de una 
especie de Listeria en la muestra, deben identificarse como mínimo cinco colonias. 
B.13.6.2 Identificación 
Se deben utilizar cepas de referencia positivas y negativas para cada una de las pruebas. Seleccionar 
colonias típicas y sembrar en medio ASTEL. Incubar a 35ºC por 24 h. Estos cultivos pueden mantenerse a 
4ºC y utilizarse como inóculo para re alizar las pruebas de identificación. 
B.13.6.2.1 Prueba de Movilidad en Fresco 
Hacer preparaciones en fresco (en gota suspendida o entre porta y cubreobjetos) utilizando solución salina 
al 0,85%. La suspensión debe ser densa y emulsificars e completamente, y observar con objetivo de inmersión 
en un microscopio de contraste de fase o microscopio de campo oscuro. Las células de Listeria spp  son 
bacilos cortos con movilidad rotatoria o como si brincaran. Los bacilos con movimientos rápidos no son 
Listeria spp . Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.13.6.2.2 Prueba de Catalasa 
Emulsificar un cultivo puro, con una gota de solución de peróxido al 3%. La formación inmediata de 
burbujas indica que la prueba es positiva. Las especies de Listeria son catalasa positivo. Precauciones, la 
emulsión debe realizarse con un asa de plástico o palillo  de madera estéril evitando el contacto del metal con 
el reactivo. Si las colonias provienen de agar base con sangre. Cualquier contaminación de eritrocitos puede 
dar pruebas falsas positivas! 
B.13.6.2.3 Tinción de Gram Hacer una tinción de Gram de cultivos de 16 a 24 h. Todas las especies de Listeria son bacilos cortos 
Grampositivo; sin embargo en cultiv os viejos pueden presentarse como formas cocoides. ¡En extensiones 
delgadas se observan de color pálido y pueden confundirse con Bacteroides spp . 
B.13.6.2.4 Prueba de Hemólisis Dibujar una cuadrícula de 20 a 25 espacios en el fondo de la placa de agar sangre de carnero al 5%. 
Inocular por picadura un cuadro por ca da cultivo. Incubar por 48 h a 35ºC. Al inocular, observar la reacción 
hemolítica en las placas. L. monocytogenes y L. seeligeri producen una zona ligeramente clara alrededor del 
punto de picadura. Confirmar las reacciones dudosas con la prueba de CAMP. 
B.13.6.2.5 Prueba de Reducción de Nitratos 
Inocular los tubos conteniendo caldo nitratos, incubar a 35ºC por 5 días. Para la lectura se debe agregar 
0,2 mL del reactivo A y 0,2 mL del reactivo B, un color ro jo indica una prueba positiva (presencia de nitritos). 
Si esta coloración no se observa, adicionar zinc en polvo. El desarrollo de color rojo después de una hora confirma una prueba negativa (presencia de nitratos). En fo rma alternativa adicionar al cultivo en caldo nitratos 
0,2 mL del reactivo B y 0,2 mL del reactivo C. Un color naranja indica una prueba positiva (presencia de 
nitritos). Si esta coloración no se observa, adicionar 0,2 mL del reactivo de cadmio, el desarrollo de un color 
naranja confirma una prueba negativa (presencia de nitrat os). Este procedimiento alternativo elimina el uso del 
alfa - naftilamina, que es carcinogénica. 
B.13.6.2.6 Prueba de Movilidad en Agar Inocular el medio SIM o MTM, inc ubar por 7 días a temperatura ambient e (20-25ºC), observar diariamente. 
Las especies de Listeria son móviles, dando un crecimiento típico en forma de paraguas. 
B.13.6.2.7 Prueba de Ut ilización de Carbohidratos 
Inocular tubos de caldo púrpura para fermentación de ca rbohidratos al 0,5 %: dextr osa, esculina, maltosa, 
ramnosa, manitol y xilosa. Incubar 7 días a 35ºC. Una coloración amarill a indica una prueba positiva. Todas 
las especies de Listeria dan positivas las pruebas para dextrosa, e sculina y maltosa. Consultar el cuadro 1 
para reacciones con ramnosa, xilosa y manitol. Si la pigmentación prematura del aislamiento en el medio OXA 
no deja lugar a duda, el ensayo de esculina puede omitirse. 
B.13.6.2.8 Prueba de Cristie-Atkins -Munch-Peterson  (CAMP) 
Para la prueba de CAMP se emplean las siguientes cepas de colección de S. aureus y R. equi: 
Staphylococcus aureus  Rhodococcus equi 
ATCC 49444 ATCC 6339 
NCTC 7428 NCTC 1621 
ATCC 25923  
CIP 5710  
 
Las cepas empleadas en la prueba de CAMP pueden obtenerse de diversas colecciones nacionales e 
internacionales. En una placa de agar sangre de carnero sembrar una estría de la cepa de S. aureus y, 
paralelamente una de R. equi, separadas lo suficiente para que entre éstas se puedan estriar 
perpendicularmente las cepas sospechosas de Listeria , sin que lleguen a tocarse (aproximadamente 5 mm de 
separación). Después de 24 y 48 h de incubación a 35°C  observar el sinergismo entre las hemolisinas de S. 
aureus, R . equi y Listeria que se manifiesta como una zona hemolítica más intensa. 
La hemólisis de L. monocytogenes y L. seeligeri se incrementa cerca de la estría de S. aureus , y la 
hemólisis de L. ivanovii se aumenta cerca de la estría de R. equi. Las especies restante s no son hemolíticas 
en esta prueba.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
Prueba de CAMP para Listeria monocytogenes : 
Diseño de la inoculación en placas de agar sangre de  carnero. Las líneas hor izontales representan las 
estrías de la inoculación de cinco cepas. Las líneas  verticales representan las estrías de inoculación de S. 
aureus (S) y R. equi (R). Las líneas sombreadas indican el incremento de hemólisis en esas regiones. 
Cuadro 1. Diferenciación de las Especies de Listeria 
Especies Hemolítico 
(beta) a Reducción 
nitratos Producción de 
ácidos de CAMP 
M R X S.a R.e 
L. monocytogenes  + - - + - + - 
L. ivanovii  + - - - + - + 
L. innocua - - - bV - - - 
L. welshimeri - - - bV + - - 
L. seeligeri + - - - + +1 - 
L. grayi c - bV + bV - - - 
 
a  Sangre de carnero desfibrinada bV  Variable 
L. grayi incluye ahora las cepas de la especie L. murrayi reductoras de nitratos y ramnosa variable 
M  Manitol 
R  Ramnosa 
X  Xilosa 
S.a  Staphylococcus aureus 
R.e  Rhodococcus equi 
1  Puede haber reacciones débilmente positivas, particularmente a las 48 horas de incubación. 
B.13.6.3 Serología 
La determinación de los tipos serológicos de Listeria se aplica cuando las consideraciones 
epidemiológicas sean cruciales. Inocul ar en caldo de triptosa por 24 h a 35º C. Transferir a dos tubos de agar 
inclinado de triptosa e incubar 24 h a 35ºC. Para realizar la prueba se pueden utilizar sueros comerciales, 
siguiendo las instrucciones del fabricante. 
Cuadro 2. Serología de las especies de Listeria 
Especies  Serotipo 
L. monocytogenes  1/2A, 1/2B, 1/2C 
3A, 3B, 3C 
4A, 4AB, 4B 
4C, 4D, 4E, "7" 
L. ivanovii 5 
L. innocua 
L .welshimeri 4AB, 6A, 6B, Una 
6A, 6B 
L.seeligeri 1/2B, 4C, 4D, 6B, Una 
 
B.13.7 Expresión de Resultados 
Comparar los resultados obtenidos con el cuadro 1 y determinar el género y especie de las cepas 
aisladas. La correspondencia de resultados con el cuadro anterior indica la presencia del género Listeria . 
El único miembro del género Listeria de importancia para esta norma es Listeria monocytogenes . 
B.13.8 Informe de la Prueba 
Cuando los resultados sean positivos para L. monocytogenes informar la presencia en 25 g o 25 mL de 
muestra. Y si los resultados son negativos  informar ausencia en 25 g o 25 mL de muestra.  
B.14 Determinación de Vibrio cholerae  
B.14.1 Material y Equipo 
B.14.1.1 Licuadora y vasos de licuadora estériles. 
B.14.1.2 Frascos de vidrio de boca ancha tipo tarro de 500 mL de capacidad con tapa de rosca. 
B.14.1.3 Varilla de vidrio de 3mm de diámetro y 20cm de largo, con un doblez terminal en ángulo recto de 
4cm. 
B.14.1.4 Balanza granataria de 2000 g de capacidad y 0,2 g de sensibilidad. 
B.14.1.5 Balanza analítica de 120 g de capacidad y 5 mg de sensibilidad. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.14.1.6 Incubadoras de 39-40ºC. 
B.14.1.7 Baño de agua de 42 ± 0,2ºC y 35-37ºC. 
B.14.1.8 Cucharas estériles u otros instrumentos aprop iados para transferir muestras de alimentos. 
B.14.1.9 Cajas Petri estériles de 15 x 100 mm de plástico. 
B.14.1.10 Pipetas estériles de 1 mL con graduación de 0,01mL, de 5 y 10 mL con graduación de 0,1mL. 
B.14.1.11 Asas bacteriológicas de 3 mm de diámetro de nicromel o platino. 
B.14.1.12 Tubos de cultivo o de ensayo de 16 x 150 mm y 20 x 150 mm. 
B.14.1.13 Tubos para bioquímicas o ensaye de 10 x 75 mm o 13 x 100 mm. 
B.14.1.14 Tijeras y pinzas estériles. 
B.14.115 Lámpara (para observar reacciones serológicas). 
B.14.1.16 Mecheros. 
B.14.1.17 Papel pH (rango 1-14) con un máximo de graduación de 0,4 unidades de pH por cambio de 
color. 
B.14.1.18 Potenciómetro. 
B.14.1.19 Bolsas de polietileno de 28 x 37 cm con tapa resellable. 
B.14.1.20 Aparato de filtración y membranas de 0,45 micras. 
B.14.2 Medios de Cultivo 
B.14.2.1 Agua Peptonada Alcalina (APW) 
FORMULA 
Peptona  10 g 
Cloruro de sodio  10 g 
Agua destilada  1 000 mL  
 
Disolver los ingredientes. Ajustar el pH de tal forma que después de esterilizar éste sea de 
8,5±0,2.Esterilizar en autoclave 10 minutos a 121ºC. 
B.14.2.2 Agar Tiosulfato, Citrato,  Sales Biliares y Sacarosa (TCBS) 
FORMULA 
Extracto de levadura  5g 
Proteosa peptona  10 g 
Sacarosa  20 g 
Tiosulfato de sodio.5H2O  10 g 
Citrato de sodio.2H2O  10 g 
Sales biliares 3 g 
Bilis de buey 5 g 
Cloruro de sodio 10 g 
Citrato férrico 1 g 
Azul de bromotimol 40 mg 
Azul de timol 40 mg 
Agar 15 g 
Agua destilada  1 000 mL  
 
Preparar en un matraz por lo menos tres veces más gr ande que el volumen requerido de medio. Adicionar 
los ingredientes en agua destilada tibia y calentar c on agitación constante hasta ebullición e inmediatamente 
retirar del calor. No esterilizar. Enfriar a 50ºC y coloca r en cajas de Petri. Dejar secar las placas de 37-45ºC 
antes de usar. 
B.14.2.3 Agar modificado con Celobio sa, Polimixina B y Colistina (mCPC) 
Solución 1: 
FORMULA 
Peptona  10 g 
Extracto de carne  5 g 
Cloruro de sodio  20 g 
Solución Stock de colorante1 000  1 mL  
Agar  15 g 
Agua destilada  900 mL  
 
Ajustar el pH a 7,6. Hierva hasta que se disuelva el agar. Esterilizar por autoclave 15 minutos a 121ºC. 
Enfríe de 48-55ºC.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
Solución stock de colorantes 1 000 X: 
FORMULA 
Azul de bromotimol  4 g 
Rojo de cresol  4 g 
Etanol al 95%  100 mL  
 
Para obtener un color firme del medio usar una solución colorante stock en lugar de estar pesando 
repetidamente los colores en polvo. Disuelva el colorante en etanol hasta obtener una solución al 4% 
(peso/volumen). Agregue 1 mL de esta solución a cada litro de agar mCPC, la cual tendrá al final 40 mg de 
azul de bromotimol y 40 mg de rojo cresol por litro. 
Solución 2: 
FORMULA 
Celobiosa  10 g 
Colistina  400 000 UI  
Polimixina B  100 000 UI  
Agua destilada  100 mL  
 
Disuelva la celobiosa por calentami ento en agua destilada. Enfríe y agregue los antibióticos. Esterilice por 
filtración, agregue la solución 2 a la solución 1 mezcle y distribuya en cajas Petri. 
B.14.2.4 Agar T1N1 (Agar Triptona y Sal) 
FORMULA 
Triptona o tripticasa  10 g 
Cloruro de sodio  10 g 
Agar 20 g 
Agua destilada mL  1 000  
 
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolución del  agar, si lo desea inclinado, distribuya en tubos. 
Esterilice en autoclave 15 minutos a 121ºC. Deje solidificar  los tubos inclinados, para placas enfríe el medio de 
45-50ºC y distribuya en cajas Petri estériles. 
B.14.2.5 Agar Gelatina (GA) 
FORMULA 
Peptona  4 g 
Extracto de levadura  1 g 
Gelatina  15 g 
Agar  15 g 
Agua destilada  1000 mL  
 
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolución de  la gelatina y el agar, ajuste el pH a 7,2 ± 0.2. 
Esterilice en autoclave 15 minutos a 121ºC. Enfríe de 45-50ºC y distribuya en cajas Petri estériles. 
B.14.2.6 Agar Gelatina con Sal (GS) 
Preparar agar gelatina (GA), pero adicionando 30 g de cloruro de sodio por cada litro. Suspenda los 
ingredientes y hierva hasta disolver la gelatina y el agar. Ajuste el pH de 7,2 ± 0,2.  Esterilice en autoclave 15 
minutos a 121ºC. Enfríe de 45-50ºC, coloque en cajas Petri. Si es necesario para inhibir la diseminación de 
Vibrio spp tal como V. alginolyticus, use de 25-30 g de agar por litro. 
B.14.2.7 Caldo Glucosa de Hugh-Leifson 
FORMULA 
Peptona  2 g 
Extracto de levadura  0,5 g  
Cloruro de sodio  20 g 
Dextrosa  10 g 
Púrpura de bromocresol  0,015 g  
Agar 3 g 
Agua destilada  1 000 mL  
 
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolver el  agar. Ajuste el pH a 7,4 ± 0,2. Coloque en tubos y 
esterilice en autoclave 15 minutos a 121ºC. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.14.2.8 Medio Base de Descarboxilasa (Arginina, Lisina y Ornitina) 
FORMULA 
BASE 
Peptona  5 g 
Extracto de levadura  3 g 
Dextrosa (D-glucosa)  1 g 
Púrpura de bromocresol  0.02 g  
Agua destilada  1 000 mL  
 
Para caldo de arginina, lisina y ornitina, adicione 5 g de  L-aminoácido a 1 litro de base. Como control, use 
base sin suplemento (aminoácido). Para Vibrio spp halofílicos, adicionar 15 g de cloruro de sodio por litro. 
Ajuste el pH de tal manera que después de la esterili zación sea de 6,5 ± 0,2. Distribuya en tubos y esterilice 
en autoclave 10 minutos a 121ºC. 
B.14.2.9 Caldo Triptona y Caldos Triptona Sal T1N0,T1N1,T1N3, T1N6,T1N8 y T1N10 
FORMULA 
Triptona o tripticasa  10 g 
Cloruro de sodio  0,10,30,60,80 o 100 g  
Agua destilada  1 000 mL  
 
Disuelva los ingredientes en agua destilada, para T1N0 no agregue cloruro de sodio, para T1N1 use 10g 
de cloruro de sodio (1% w/v concentración de cloruro de sodio); así respectivamente. Para T1N3 usar 30g de 
NaCl por litro (3% w/v concentración de cloruro de sodio). Distribuya en tubos de tapón de rosca de 16 x 150 
mm, tape los tubos. Esterilice en autoclave durante 15 minutos a 121ºC. Ajuste el pH a 7,2 ± 0,2. 
B.14.2.10 Caldo Soya Tripticasa (TSB) 
FORMULA 
Peptona de tripticasa 
(Triptona)  17 g 
Peptona de fitona 
(Soytona)  3 g 
Cloruro de sodio 5 g 
Fosfato dipotásico 2,5 g 
Dextrosa 2,5 g 
Agua destilada  1 000 mL  
 
Suspenda los ingredientes en agua destilada y caliente hasta disolución. Distribuya 225 mLen matraces de 
500 mL o tubos. Esterilice en autoclave durante 15 minu tos a 121ºC. El pH final debe ser de 7,2 ± 0,2. 
B.14.2.11 Agar Soya Tripticasa (TSA) 
FORMULA 
Peptona tripticasa (Triptona)  15 g 
Peptona de fitona (Soytona)  5 g 
Cloruro de sodio  5 g 
Agar  15 g 
Agua destilada  1 000 mL  
 
Suspenda los ingredientes en agua destilada y hierva  durante un minuto hasta disolución del agar. Para 
Vibrio spp halofílicos, agregar 15 g de cloruro de sodio. Distribuya dentro de tubos o matraces. Esterilice en 
autoclave durante 15 minutos a 121ºC. Deje solidifi car los tubos inclinados o deje enfriar de 45-50ºC y 
distribuya en cajas Petri. El pH final debe ser de 7,3 ± 0,2.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.14.2.12 Agar de Hierro Kligler (KIA) 
FORMULA 
Peptona polipeptona  20 g 
Lactosa  20 g 
Dextrosa  1 g 
Cloruro de sodio  5 g 
Citrato férrico amoniacal  0,5 g  
Tiosulfato de sodio 0,5 g 
Rojo de fenol 0,025 g 
Agar 15,0 g 
Agua destilada 1 000 mL  
 
Suspender los ingredientes y hervir hasta disolu ción del agar. Distribuir en tubos de tapón de rosca. 
Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121ºC. Dejar solidificar los tubos inclinados. Ajustar el pH de 7,4 
± 0,2. 
B.14.2.13 Agar Arginina Glucosa Inclinado (AGS) 
FORMULA 
Peptona  5 g 
Extracto de levadura  3 g 
Triptona 10 g 
Cloruro de sodio 20 g 
Glucosa 1 g 
L-Arginina(hidrocloruro) 5 g 
Citrato férrico amónico 0,5 g 
Tiosulfato de sodio 0,3 g 
Púrpura de bromocresol 0,2 g 
Agar 13,5 g 
Agua destilada 1 000 mL  
 
Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir ha sta disolución del agar, y distribuir en cantidades 
de 5 mL a tubos de 13 x 100 mm. Ajustar el pH de 6,8 a 7,0. Esterilizar en autoc lave de 10 a 12 minutos a 
121ºC. Deje solidificar el medio inclinado. 
B.14.2.14 Agar Triple Azúcar y Hierro (TSI) 
FORMULA 
Polipeptona  20 g 
Cloruro de sodio  5 g 
Lactosa  10 g 
Sacarosa  10 g 
Glucosa  1 g 
Sulfato ferroso amónico  0,2 g  
Tiosulfato de sodio  0,2 g  
Rojo de fenol 0,025 g 
Agar 13 g 
Agua destilada  1 000 mL  
 
Disolver los ingredientes en agua destilada. Mezclar bien y calentar a ebullició n, agitando ocasionalmente 
hasta completa disolución. Enfriar a 60ºC y ajuste el pH de 7,3 ± 0,1. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.14.2.15 Agar de Hierro y Lisina (LIA) 
FORMULA 
Peptona o gelisato 5,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Glucosa 1,0 g
L-Lisina 10,0 g
Citrato férrico amónico 0,5 g
Tiosulfato de sodio 0,04 g
Púrpura de bromocresol 0,02 g
Agar 15,0 g 
Agua destilada 1 000 mL
 
Disolver los ingredientes en el agua destilada y me zclar bien; calentar hasta ebullición con agitación 
frecuente hasta conseguir la disolución completa. Ester ilizar en autoclave 12 minutos a 121ºC. Enfriar de 50-
60ºC y ajustar el pH de 6,7 ± 0,1.  Distribuir en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm. Los tubos se 
enfrían en posición inclinada, de tal modo que se obteng an columnas de medio de 3 cm y una parte inclinada 
de 2 cm. 
B.14.2.16 Caldo Rojo de Metilo y Vogues Proskauer(RM-VP) 
FORMULA 
Peptona  7 g 
Glucosa  5 g 
Fosfato dipotásico  5 g 
Agua destilada  1 000 mL  
 
Disolver los ingredientes en 800 mL de agua tibia. Para Vibrio  spp halofílicos, agregar 15 g más de cloruro 
de sodio (para una concentración final del 2%). Filtrar, enfriar a 20ºC y diluir a 1 litro. Distribuya en tubos. 
Esterilizar en autoclaves durante 12 - 15 minuto s a 121ºC. Ajustar el pH de 6,9 +/- 0,2. 
B.14.2.17 Medio para Prueba de Movilidad (semisólida) 
FORMULA 
Peptona  10 g 
Extracto de carne  3 g 
Cloruro de sodio  5 g 
Agar  4 g 
Agua destilada 1 000 mL  
 
Calentar con agitación y hervir de 1 a 2 minutos hasta  disolución del agar. Para Vibrio spp halofílicos 
agregar 15 g más de cloruro de sodio (para una concentración final del 2%). Distribuir en tubos con tapón de 
rosca. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121ºC. Ajustar el pH de 7,4 ± 0,2. 
B.14.3 Soluciones y Reactivos 
B.14.3.1 Prueba de rojo de metilo. Reactivo 
FORMULA 
Rojo de metilo  0,1 g  
Alcohol etílico  300 mL  
Agua destilada  200 mL  
 
Disolver el rojo de metilo en el alcohol y diluir con el  agua destilada, para llevar a cabo la prueba, añadir 5 
gotas de la solución a 5 mL del cultivo problema. Resu ltados: Un color rojo demuestra un pH menor a 4,5 y la 
prueba es Positiva. Un color amarillo se reporta como prueba Negativa. 
B.14.3.2 Prueba de Vogues-Proskauer. 
Esta prueba es para comprobar la presencia del diacetilo. 
Reactivo 
FORMULA 
Alfa naftol  5 g 
Alcohol etílico absoluto  100 mL  
 
Añadir 0,6 mL de la solución de alfa naftol y 0,2 mL de una solución acuosa al 40% de KOH a 1 mL de 
cultivo. Resultados: El desarrollo de una coloración roja en 15 minutos constituye una reacción Positiva.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.14.3.3 Prueba de oxidasa. 
Reactivo 
FORMULA 
N,N,N,N-Tetrametil-p-Fenilendiamino  0,5 g  
Agua destilada  100 mL  
 
Conservar en frasco oscuro a 5-10°C. El reactivo se conserva durante 14 días. Sembrar en un tubo de 
base de gelosa para sangre. Incubar 18 horas a 35ºC. Agregar 0,3 mL de reactivo. Resultado: La reacción 
positiva se observa por la producción de un color azul en un minuto. 
B.14.3.4 Reacción de indol. Reactivo de Kovac 
FORMULA 
P-dimetilaminobenzaldehído  5.0 g  
Alcohol amílico o alcohol isoamílico  750 mL  
Acido clorhídrico concentrado 25 mL  
 
Disolver el p-dimetilaminobenzaldehído en el alcohol amílico y agregar el ácido clorhídrico lentamente, 
gota a gota y agitando. Debe conservarse en frasco ámba r con tapón esmerilado; el color del reactivo va del 
amarillo al café claro. Se debe conservar a 4ºC. 
B.14.4 Procedimiento Sembrar un tubo con 5 mL de caldo triptona. Incubar 48 horas a 35ºC. Agregar de 0,2 a 0,3 mL del 
reactivo. El desarrollo de un color intenso constituye una prueba Positiva para indol. Toma de muestra La 
toma de muestra para análisis microbiológicos se deb erá hacer en condiciones asépticas y en recipientes 
estériles. 
B.14.4.1 Preparación de la Muestra Para la preparación de la muestra seguir con lo establecido en el numeral 9 de este apéndice. Para helados o bases o mezclas para helados y para los quesos, se deben preparar las siguientes 
diluciones 10
-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 y 10-6. Tomar 25 gramos de helado o bases o mezclas para helados o 
queso previamente molido e introducirlos en un vaso estéril de licuadora de 500 mL de capacidad que 
contenga 225 mL de agua peptonada alcalina (APW) y homogeneizar por 2 minutos a la máxima velocidad. Esta es la dilución 1:10. De ésta preparar la dilu ción, 1:100, 1:1000, 1:10000,  1:100000 y 1:1000000, en 9 o 
90 mL de agua peptonada alcalina. Incubar las seis diluciones entre 35ºC - 37ºC. 
B.14.4.2 Resembrar Después de la incubación, y sin agitar, transferir el inóculo de la película (crecimiento superficial) con un 
asa de 3-5 mm de diámetro a una placa por lo menos, de cada uno de los medios de cultivo selectivos: Agar 
con tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa (TC BS) o al agar modificado con celobiosa, polimixina B y 
colistina (mCPC), la polimixina inhibe al biotipo Clásic o de V. cholerae. Incubar el agar TCBS durante 18 a 24 
horas de 35-37ºC y el agar mCPC durante 18 a 24 horas de 39-40ºC. 
B.14.5 Morfología Colonial. 
Examinar las placas a fin de determinar si se present an las características coloni ales que a continuación 
se describen, seleccionar por lo menos 3 colonias sos pechosas de cada placa y aplicarlas con estría cruzada 
para aislar en agar T1N1 o en agar soya tripticasa con sal (al 2% de concentración de NaCl) e incubar durante 
12-18 horas a 35-37°C. Es necesario hacer un cultivo en  un medio no selectivo a fin de garantizar la pureza 
de las colonias, antes de las pruebas bioquímicas, se pu ede inocular a los agares gelatina (GA) y gelatina sal 
(GS) en el segundo día. Los resultados  serán confiables si las placas de  aislamiento muestran colonias puras. 
a.- Agar TCBS.  
Las colonias de V. cholerae  (El Tor y Clásico) son grandes, lisas, am arillas (positivas para la fermentación 
de la sacarosa) y ligeramente achatadas, con el centro opaco y los bordes translúcidos. 
Nota: Las especies de vibrio no producen colonias pequeñas de color crema en agar TCBS. Las colonias 
de V. mimicus , que están estrechamente relacionadas con la especie anterior, son verdes (sacarosa 
negativas). La mayoría de las demás especies de vibrio crecen en agar TCBS y producen colonias amarillas y 
verdes. 
b.- Agar mCPC . 
Las colonias de V. cholerae  El Tor son púrpuras (negativas para la  fermentación de la celobiosa). El V. 
vulnificus  produce colonias amarillas achatadas, con el centro opaco y los bordes translúcidos. La mayoría de 
las demás especies de V ibrio spp. no crecen fácilmente en agar mCPC. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.14.6 Diferenciación. 
Diferenciación de los vibrios sospechosos de los microorganismos que no son vibrios. a.- TSI,KIA y agar inclinado de Arginina y Glucosa (AGS).  
Inocular las colonias individuales en medios de cultiv o TSI (Agar de Triple Azúcar y Hierro), KIA (Agar de 
Hierro Kliger) y AGS, picar y estriar en el agar inclin ado. Incubar los tubos inoculados, con el tapón no muy 
apretado, durante 18 a 24 horas de 35-37ºC. Se recomie ndan estos medios porque las reacciones permiten 
efectuar una diferenciación presunt iva entre la mayoría de las especies de vibrio, Aeromonas, Plesiomonas 
shigella y otras bacterias. 
b.- Caldo triptona al 3% de NaCl (T1N3).  
Inocular las colonias en los caldos T1N0 y T1 N3 e incubar durante 18 a 24 horas de 35-37ºC. El V. 
cholerae  y el V. mimicus  crecerán en T1N0 y T1N3. Algunas especies de bacterias que no son vibrios y que 
presentan reacciones similares a las de V. cholerae  en medios de TSI y LIA no crecen en T1N3. La mayoría 
de las especies de Vibrio  spp, incluyen algunos V. cholerae  No. 01, crecerán en T1N3 únicamente de la 
familia Vibrionaceae  crece solamente en T1N3. Una alternativa c onsiste en usar agar gelatina (GA) y agar 
gelatina con 3% de NaCl (GS) para determinar la tolerancia  de los cultivos puros a la sal. Dividir las placas en 
ocho sectores, inocular una línea rect a en el centro de un sector de las placas, tanto de GA como de GS con 
cada cultivo puro. Incubar durante 18 a 24 horas de 35-37ºC. V . cholerae  y el V. mimicus  crecerán. El Vibrio 
spp haloflico crecerá en ambas placas, porque ellos no requ ieren de sal. Sólo en la placa con GS. Para leer la 
reacción de la gelatinasa sostener la placa sobre una superficie negra, observará un halo opaco alrededor de 
la colonia de los microorganismos gelatinasa positivos. 
c.- Caldo glucosa de Hugh-Leifson.  
Inocular colonias individuales en tubos duplicados con caldo de glucosa de Hugh-Leifson. Recubrir un tubo 
con una capa de aceite mineral estéril o vapor líqui do (50% de petrolato y 50% de parafina) unos dos 
centímetros de grueso. Incubar ambos tubos duran te 18 a 24 horas de 35-37ºC. Las especies de Vibrio  spp 
utilizan la glucosa tanto para la oxidación como par a la fermentación. Las especies de pseudomonas, que 
comúnmente se aíslan del pescado y los mariscos co n métodos de enriquecimiento que se usan para las 
especies de vibrio, utilizan la glucosa sólo para la oxidación. 
d.- Prueba de Oxidasa.  
Realizar la prueba de oxidasa con cultivos puros de agar soya tripticasa (2% de NaCl) u otro medio que no 
contenga carbohidratos fermentables. Un método fácil consiste en colocar un círculo de papel filtro en una 
caja de Petri y humedecerlo con algunas gotas de reac tivo de oxidasa. Con un palito aplicador de madera, un 
mondadientes o una asa de platino estéril, sacar un poco de  cultivo de la placa y tocar el papel humedecido, si 
hay microorganismos oxidasa positivos, el papel se to rnará púrpura oscura o azul en pocos segundos. Las 
especies patógenas de Vibrio spp. son oxidasa positivas (excepto el V. metschnnikovii ). 
B.14.7 Identificación y Confirmación de V.chloreae  01, V.cholerae  NO 01 y V. mimicus . 
a.- Leer los resultados de las prueba bioquímicas de TSI, KIA, AGS, T1N0 y T1N3 o GA y GS, y caldo 
glucosa de Hugh-Leifson.  
b.- Hacer una tinción de Gram a un cultivo de 18 a 24 horas en caldo o agar.  
Nota: Los cultivos puros que se someterán a las demás pruebas serológicas y bioquímicas para el V. 
cholerae  son sacarosa positivos (amarillo) en agar TCBS y sacarosa negativos (verdes) en el caso de V. 
mimicus  o son celobiosa negativos (verde-púrpura) en agar mCPC, crecen en caldo T1N0 o en placas con 
GA; presentan reacciones características en TSI, KIA y AGS. Son gelatina y oxi dasa positivos, son bacilos 
curvos gram negativos y producen ácido a partir de la glucosa, tanto en la oxidación como en la fermentación, 
en el caldo de cultivo de Hugh-Leifson. 
c.- Pruebas Bioquímicas.  
Las reacciones bioquímicas para identificación de V. cholerae  y otras especies bacterianas afines figuran 
en el cuadro anexo. La fórmula para todos los medios bioquímicos deberá contener por lo menos un 2% de NaCl. En vez de medios convencionales se pueden usar  tiras AP120E, con 2% de NaCl como diluyente. Para 
el V. cholerae  se puede usar solución salina fisiológica (0,85% de NaCl) como diluyente. 
d.- Prueba Serológica de Aglutinación . 
Usar antisuero de diagnóstico del grupo 01 y del subgrupo Inaba (factores AC) y Ogawa (Factores AB) 
para el antígeno del serotipo 01. Usar cultivos de 16 a 24 horas producidos en TSA. Incluir cultivos positivos y 
negativos, y los controles salinos para cada antisue ro usado. Seguir las instrucciones del antisuero. 
Como es posible que los antígenos de los antisueros es tén relacionados entre sí, hay que realizar pruebas 
bioquímicas para confirmar que el cultivo puro sea de V. cholerae  01 o No. 01. 
Nota: Anticuerpos monoclonales están disponibles, per o el anti-B y anti-C reaccionan opuestamente con 
bacterias de otras especies. Uso de anticuerpos policlonales y/o monoclonales será para el antígeno del 
complejo 01       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
1.- Los cultivos que aglutinan con el antisuero del grupo 01 , pero no en solución salina fisiológica simple, 
son de V. cholerae  del grupo 01 si las reacciones bioquímicas confirman que el cultivo puro es de V. cholerae . 
Los cultivos que se aglutinan con este antisuero para  grupos específicos pueden ser clasificados según el 
subtipo con anticuerpos Inaba y Ogawa. 
- Los cultivos que aglutinan con el suero polivalente (grupo 01) y con los antisueros Inaba y Ogawa, tienen 
los 3 factores (A, B y C) y son del serotipo Hikojima. 
- Los cultivos que aglutinan con el antisuero polival ente, pero no aglutinan con antisueros Inaba y Ogawa, 
no se pueden tipificar con estos antisueros. 
2.- Los cultivos de V. cholerae  cuya identidad se haya confirmado con métodos bioquímicos y que no 
aglutinen con el antisuero del grupo 01 son V. cholerae  0:1. El suero para la clasificación de V. cholerae  No 
0:1 según el tipo se puede obtener de R.J. Siebeling. 
3.- Los cultivos que se aglutinan en el antisuero del gr upo 01 y en solución salina, no se pueden clasificar 
según el tipo. Sin embargo, si se usa un medio más ri co, como en TSA o agar infusión cerebro corazón (BHI), 
se puede eliminar esta autoaglutinación. 
e. Características mínimas para la identificación de V. cholerae . 
Las características que permiten suponer la presencia de V. cholerae  como mínimo son las siguientes: 
1.- Morfología. 
Bacilo o bacilo encorvado, no esporogénico y gram negativo. 
2.- Aspecto en TSI. 
Estría ácido, picadura ácido, gas negativo y H 2S negativo. 
3.- Prueba de Hugh-Leifson. 
Fermentación de la glucosa y oxidación positiva. 
4.- Citocromo-oxidasa positivo. 
5.- Prueba de la dihidrolasa arginina: negativo. 
6.- Prueba de la lisinadescarboxilasa: positivo. 
7.- Prueba de VP: Positivo El Tor, negativo Clásico y V. mimicus . 
8.- Crecimiento a 42º C: positivo. 
9.- Prueba de halofilia con NaCl. 
0%: positivo, 3%: positivo, 6%: usua lmente negativo. Algunas cepas de V. cholerae  NO 01 se desarrollan 
a 0% de NaCl. 
10.- Fermentación de la sacarosa: positivo para V. cholerae  (negativo para V. mimicus ). 
11.- Prueba de ONPG: positivo. 
12.- Fermentación de la arabinosa: negativo. 
13.- 0/129 sensitiva: sensible  para 10 y 150 µg 0/129 
B.14.8 Reacciones 
REACCIONES DE ALGUNOS Vibrio  spp. EN AGAR KIA, TSI Y AGS. 
Microorganismos KIA TSI AGS 
Estría Picadura Estría Pi cadura Estría Picadura 
V.cholerae K A A(K)* A K a 
V.mimicus K A K(A)* A K A 
V.parahaemolyticus K A K A K A 
V.alginolyticus K A A A K A 
V.vulnificus K o A A K(A)* A K A 
Aeromonas .hidrophyla K o A A K o A A K K 
Plesiomonas shigelloides K o A A K o A A N N 
* = Raramente 
K = Alcalino A = Acido 
a = Ligeramente ácido 
N = Neutro 
Ninguna de las especies enumeradas produce sulfuro de  hidrógeno en medios KIA, TSI o AGS, ni una 
cantidad perceptible de gas a partir de glucosa en  medios KIA, TSI o AGS. Algunas especies de Aeromonas  
spp. Pueden producir gas a partir de glucosa en estos medios. 
B.15 Determinación de Enterotoxina Estafilocóccica, por el método de Elisa. 
B.15.1 Principio del Método. Este método se basa en un inmunoensayo visual el cual proporciona una prueba rápida (4 h), sensible (1,0 
ng o más por mL o g), y específica para la identificac ión de las enterotoxinas A-E estafilocóccicas. Sin 
embargo, con esta prueba no se identifican los sero tipos de enterotoxina, en forma individual. La prueba de 
Elisa se realiza en configuración de “sandwich”. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.15.2 Materiales y Equipo 
B.15.2.1 Algodón absorbente. 
B.15.2.2 Micropipetas de 50-200 μL y 5-20 μL. 
B.15.2.3 Puntas de plástico para micropipeta. 
B.15.2.4 Plástico para envolver o sellar recipientes de plástico. 
B.15.2.5 Papel pH (intervalo 0-14). 
B.15.2.6 Frascos de plástico de 500 mL. 
B.15.2.7 Jeringas de plástico de 25 mL. 
B.15.2.8 Tubos para centrífuga. 
B.15.2.9 Tubos de polipropileno de 12 x 75 mm.  
B.15.2.10 Polietilen glicol (PEG, peso molecular de 15,000-20,000). 
B.15.2.11 Tubo de diálisis (12,000-14,000 peso molecular exclusión). 
B.15.2.12 Vasos de precipitados de 250 mL. 
B.15.2.13 Filtros tipo jeringa  (para filtrar los alimentos ). Preparar jeringas de plástico desechables (0,25 
mL) e insertar suficiente cantidad de algodón absorbe nte, para hacer un empaque de 0,5 cm. Pasar 5,0 mL de 
agua destilada, presionar con el émbolo para asegurarse de formar un paquete firme. Preparar 
inmediatamente antes de filtrar los ex tractos de alimento, para tratar con el aditivo provisto con el equipo. 
B.15.2.14 Placa de 48 o 96 pozos recubiertos con el grupo de antisueros *. 
B.15.2.15 Soporte para sostener la placa *. 
B.15.2.16 Instructivo del método *. 
B.15.2.17 Comparador de color *. 
B.15.2.18 Hoja de resultados *. 
B.15.2.19 Materiales suministrados por el fabricante. 
B.15.2.20 Equipo TECRA TM. 
B.15.2.21 Incubadora a 35-37°C. 
B.15.2.22 Omnimixer, licuadora (o equivalente) para la preparación de los extractos de alimentos. 
B.15.2.23 Centrífuga a 1000 -3000 x g. 
B.15.2.24 Agitador de microplacas (opcional). 
B.15.2.25 Lector de microplacas (opcional). 
B.15.2.26 Balanza. 
B.15.3 Reactivos. 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico a menos que se indique otra 
especificación y por agua debe  entenderse agua destilada. 
B.15.3.1 Solución amortiguadora Tris 0,25 M (30,28 g TRIS/L, pH 8,0). 
B.15.3.2 Solución de hidróxido de sodio 1,0 N (NaOH). 
B.15.3.3  Acido clorhídrico (HCl). 
B.15.3.4  Agua destilada o deionizada. 
B.15.3.5  Hipoclorito de sodio. 
B.15.3.6  BHI con 0,7% de agar (m/v). 
B.15.3.7  Solución de lavado. Contiene: 1,5 g de tris(hid roximetil) aminometano (Tris), 6g de NaCl, 2,0 g 
polioxietilen sorbitan monolaurato (Tween 20), y 0,001 g de timerosal en 25,0 mL de H 2O * 
B.15.3.8  Aditivo para la muestra. Es una solución que co ntiene: 2 g de Tween 20 y 0,001 g de timerosal en 
6,0 mL de H 2O *. 
B.15.3.9  Control positivo: Diluir 25 μL de control positivo concentrado (toxina estafilocóccica tipo B, 0,1 g 
Na2B4O7, 0,1 g de NaCl y 0,001 g de timerosal en 4,0 mL de H 2O), en 2,5 de sol. de la vado (B.15.4.2.1) *. 
B.15.3.10  Control negativo. Contiene: 0, 0072 g de Tris, 0,1 g de NaCl, 0,001 g de timerosal y 0,01 g de 
Tween 20 en 6,0 mL de H 2O *. 
B.15.3.11  Diluyente del Conjuga do. Contiene: 0,2 g Na 2B4O7, 0,1 g de NaCl, 0,1 g de gelatina, y 0,001 g 
de timerosal en 13,5 mL de H 2O *. 
B.15.3.12  Conjugado liofilizado. Un frasco que contiene antisuero polivalente (A-E) liofilizado, conjugado; 
0,003g de Na 2B4O7, 0,002 g de CaCl 2, y 0,0001 g de timerosal. Para su uso, agregar al frasco 13 mL del 
diluyente (B.15.3.11) *. 
B.15.3.13  Diluyente del Substrato. Cada 26 mL de H 2O contienen 0,2 g de ác ido acético y 0,01 g de 
H2O2*. 
B.15.3.14  Substrato.  Un frasco de liofilizado que contiene; 0,01 g de 2,2´-di-azino(sulfonato de 3-etil 
benzotiazolin), 0,01 g de EDTA, y 0,1 g de NaH 2PO 4. Para su uso, agregar al frasco 26 mL del diluyente 
(B.15.3.13) *.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.15.3.15  Solución para detener la reacción (solución stop). Cada 6,0 mL contie nen; 1,5 g de NaF en 6,0 
mL de agua *. 
* Reactivos suministrados por el fabricante 
B.15.4  Procedimiento. 
B.15.4.1 Preparación de las Muestras. 
B.15.4.1.1 Productos Fluidos y Productos Deshidratados . 
Pesar 25 g de leche deshidratada y agregar 125 mL de solución Tris 0,25 M pH 8.0 (B.15.3.1). Continuar 
como se indica para leche fluida. En muestras de 5,0 mL , verificar que el pH esté en un intervalo de 7,0-8,0. 
Agregar 50 μL de aditivo (B.15.3.8). En el caso de extrac tos más claros, ajustar el pH a 4,0 con HCl 
concentrado. Para muestras de leche de 50 mL, verificar que el pH esté en un intervalo de 7,0-8,0. Agregar 50 
μL de aditivo (B.15.3.8). Cent rifugar la muestra 10 min a 1000-3000 x g. Decantar el extracto y pasar 5,0 mL 
aproximadamente, a través de una jeringa empacada con algodón absorbente hum edecido previamente, y 
recibir en un tubo de polipropileno. Ajustar nuevament e el pH a 7,0-8,0 (usar papel pH). Agregar 50 μL de 
aditivo (B.15.3.8) y mezclar. 
B.15.4.1.2 Ingredientes Deshidratados. Agregar 125 mL de solución Tris 0,25 M pH 8,0 a 25 g de muestra, homogeneizar en licuadora (a 
velocidad alta), durante 3 min. Centrifugar la m uestra 10 min a 1000-3000 x g y recoger el extracto 
(sobrenadante). Quitar el émbolo de la jeringa de plásti co que contiene el empaque de algodón absorbente 
humedecido previamente y con cuidado, pasar el extracto a través del empaque y recibir el eluido. Tomar 5,0 
mL de eluido y ajustar el pH a 7,0-8,0. Agregar 50 μL de aditivo, y mezclar. 
B.15.4.1.3 Quesos. 
Agregar 50 mL de agua a 25 g de muestra y homogeneizar en licuadora durante 3 min a velocidad alta. 
Ajustar, con HCl concentrado, a pH 4 (usar papel pH). Centrifugar la muestra durant e 10 min a 1000-3000 x g. 
Quitar el émbolo de la jeringa de plástico que contiene el empaque de algodón absorbente humedecido 
previamente, y pasar 5 mL del extracto a la jeringa. Inse rtar el émbolo y con cuidado pasar el extracto a través 
del empaque y recibir el eluido. Tomar 5 mL del eluido, y agregar solución de NaOH para ajustar a pH 7,0-8,0; 
agregar 50 μL de aditivo, y mezclar. 
B.15.4.1.4 Otros Alimentos. 
Agregar 50 mL de solución Tris 0,25 M pH 8,0 a 25 g de muestra, y homogeneizar en licuadora durante 3 
min a velocidad alta. Centrifugar la muestra durante 10 min a 1000-3000 x g. Quitar el émbolo de la jeringa de 
plástico que contiene el empaque de algodón absorbe nte humedecido previament e, y pasar 5,0 mL de 
extracto a la jeringa, insertar el émbolo y con cuidado presionar el émbolo y recoger el eluido. Tomar 5 mL del 
eluido, ajustar a pH 7,0-8,0, si es necesario; agregar 50 μL de aditivo, y mezclar. 
Nota 1: Preparar los extractos de alimentos inmediat amente antes de realizar la prueba. 
Precauciones Generales: 
En caso de alimentos crudos fermentados, procesados o enlatados, con evidentes defectos; o de cultivos 
fluidos obtenidos en el laboratorio, que pudieran dar  como resultado el crecimiento de microorganismos 
productores de peroxidasa, es necesario, antes de hacer la determinación de toxina, verificar si los extractos 
de alimentos o preparados a partir del cultivo en el la boratorio, contienen peroxidasa, debido a que esta 
enzima podría interferir con la interpretación de los resultados. 
Para determinar la presencia de peroxidasa, agregar 50 μL del substrato (B.15.3.14.), en una placa de 
microtitulación sin tratar (no contie ne anticuerpos para la enterotoxina es tafilocóccica). Dejar en reposo 10 
min. Si el color cambia a azul o azulverdoso, indica que la muestra contiene peroxidasa intrínseca; la cual 
debe inactivarse. Si la muestra permanece incolora (o con el  color original), realizar el análisis de enterotoxina. 
Para inactivar la peroxidasa intrínseca, preparar una solución al 30% (m/v) de azida de sodio y agregar 1 mL 
de esta solución a 4 mL de muestra (la concentración fi nal de la azida de sodio es de 6% (m/v). Mezclar y 
agregar un poco de aditivo ( B.15.3.8 ), dejar en reposo 1-2 min a tem peratura del laboratorio (20-25ºC). 
Repetir la prueba para determinar presencia de peroxidasa,  como se describió anteriormente. Si la reacción 
es incolora o presenta el color original, continuar con la prueba. 
Nota 2: Para alimentos crudos (ejemplo: verduras), seguir las precauciones generales señaladas 
anteriormente. 
B.15.4.2 Preparación de Reactivos . 
B.15.4.2.1 Reconstitu ción de la Solución de Lavado. 
Diluir, en un frasco de reactivos la solución concentrada (como lo indique el fabricante), con agua destilada 
o deionizada, para obtener 2 L. Utiliz ar esta "solución de lavado" para lavar los pozos y diluir el control 
positivo. Es recomendable el uso de pizeta. Almacenar a 4°C, cuando no se use. 
B.15.4.2.2 Preparación del Conjugado . 
Agregar el diluyente del conjugado y rehidratar a temperatura del laboratorio. Mezclar  suavemente. Esta 
preparación es el "Conjugado reconstituido". 
B.15.4.2.3 Preparación del Substrato. 
Disolver el substrato con el diluyente (B.15.3.13), asegurarse que el contenido se haya disuelto 
completamente. Dejar a la temperatura del laboratorio (20-25°C), antes de su uso. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B. 15.4.2.4 Precau ciones generales: 
 Observar la fecha de caducidad del equipo adquirido. Es la última fecha en la cual el producto debe 
utilizarse. Preparar todos los reactivos con cuidado y anotar  la fecha de reconstitución, en la etiqueta externa 
de la caja. Usar los reactivos dentro de los 65 días a la fecha anotada en la etiquet a. Refrigerar todos los 
componentes (2-8°C) cuando no estén en uso. NO CONGELAR.  
 El equipo de inmunoensayo visual está preparado para utilizarse como una unidad integral; por tanto, no 
se deben mezclar los componentes de diferentes lotes. 
 Utilizar puntas nuevas para cada mu estra de alimento. Evitar la cont aminación cruzada al llenar los 
pozos. Si se usan propipetas de plástico para distribu ir el conjugado y el substrato, se deben mantener 
siempre por separado. Asegurarse de no confundir las tapas de los reactivos. 
 Usar controles positivos y negativos en cada prueba. 
 Preparar recipientes con solución al 2% de hipocl orito de sodio para desechar todas las muestras y 
materiales que contengan toxina. 
 Mantener los pozos removibles que no se usen dent ro del paquete y volver a sellar con cinta, después 
de cada uso. 
B.15.4.3 Determinación de la Enterotoxina. 
B.15.4.3.1 Preparación de los pozos. Tomar del paquete el número necesario de pozos; un o para cada muestra, uno para control positivo y uno 
para control negativo. Si se requiere, pueden utilizar se pozos adicionales (control positivo y negativo en 
alimento). 
B.15.4.3.2 Prelavado . 
Con la ayuda de una pizeta llenar cada pozo con solución de lavado y dejar en reposo durante 10 minutos 
a la temperatura de laboratorio (20-25ºC). Vaciar los po zos por inversión rápida del soporte (placa); eliminar 
completamente todo residuo de líquido, golpeando varias  veces, firmemente hacia abajo la placa, sobre una 
toalla de papel absorbente. 
B.15.4.3.3 Colocación de las Muestras . 
Pasar alícuotas de 200 μL de los controles y muestras (extract os de alimento o de cultivos) dentro de 
pozos individuales. Registrar la posición de cada muestra en la hoja de registro específica. Golpear 
suavemente la placa para asegurarse de la distribuci ón homogénea y del contacto de las muestras con las 
paredes de los pozos; el uso de un agitador de microp lacas durante 30 segundos, es opcional. Cubrir los 
pozos con una película plástica, estirable, autoadherible  o sello especial de microplacas; para evitar la 
evaporación. Incubar 2 hrs. a 35-37°C. 
B.15.4.3.4 Segundo Lavado. 
Presionar firmemente los pozos en la placa e invertir rápidamente. Vaciar el contenido de los pozos en el 
recipiente de desecho (con hipoclorito de sodio al 2%). Eliminar el residuo de líquido golpeando 
enérgicamente, varias veces la placa invertida, sobre una toalla de papel absorbente; llenar completamente 
los pozos con solución de lavado, y repetir el lavado en la misma forma, de 2 a 3 veces más y finalmente 
vaciar los pozos. 
Nota 3: El lavado profundo de los pozos es un paso crítico y asegurará una clara interpretación de los 
resultados. 
B.15.4.3.5 Adición de Conjugado. 
Agregar 200 μL del conjugado reconstituido (enzima) a cada poz o. Volver a cubrir la placa e incubar 1 h a 
temperatura de laboratorio (20-25°C). Vaciar las placas  y lavar profundamente, 5 veces, como se describió 
anteriormente (B.16.4.3.4). 
B.15.4.3.6 Adición del Substrato. 
Agregar, a cada pozo, 200 μL del substrato reconstituido. Dejar a temperatura del laboratorio (20-25°C) 
durante 30 min, como mínimo, hasta que el control posit ivo alcance la máxima absorbancia (mayor a 1,0) o al 
color más intenso que el número 4 del comparador de color. El desarrollo de color tiende a concentrarse 
alrededor de las orillas de los pozos. Para obtener resu ltados más precisos, golpee con suavidad los extremos 
de la placa, con el propósito de que el contenido de los pozos se mezcle bien antes de la lectura. Agregar a 
cada pozo 20 μL de solución stop; golpear con suavidad, para mezclar los contenidos. 
B.15.4.3.7 Determinar los Result ados visualmente o mediante un Lector de Microtitulación. 
B.15.5 Interpretación de los Resultados:  
B.15.5.1  Colocar la placa que sostiene los pozos sobre un fondo blanco. Comparar el color de cada pozo 
con el comparador de color. El control positivo de toxina (y el control positivo de alimento, si se usó) deben dar 
un color verde intenso, lo que indica que todos los re activos han funcionado. Si el control negativo es 
significativamente más oscuro que el representado en comparador de color, significa que hubo, 
probablemente, un lavado inadecuado y la prueba debe repetirse. 
B.15.5.2 La muestra se considera positiva,  si cumple los siguientes criterios: 
• El control negativo está dentro del intervalo de co lor negativo, representado en el comparador de color, y 
• Las muestras presentan un color verde o azul más o scuro que el intervalo negativo representado en el 
comparador de color.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.15.5.3 La prueba de enterotoxina se considera negativa , si se cumplen los siguientes criterios: 
• El control negativo está dentro del intervalo de co lor negativo, representado en el comparador de color, y 
• La muestra es incolora o tiene el color dentro del  intervalo negativo, repr esentado en el comparador de 
color. 
B.15.6 Expresión de Resultados. 
Prueba positiva o negativa para enterotoxina estafilocóccica 
 
Cuando se obtengan resultados positivos, éstos t endrán que ser confirmados por el método de doble 
difusión en gel en laminilla, establecido en el numeral 11 de este apéndice. 
B.16. Método para la Cuenta de  Bacterias Aerobias en Placa. 
B.16.1 Introducción Cuando se requiere investigar el contenido de mi croorganismos viables en un alimento, la técnica 
comúnmente utilizada es la cuenta en placa. En realidad  esta técnica no pretende poner en evidencia todos 
los microorganismos presentes. La variedad de espec ies y tipos diferenciables por sus necesidades 
nutricionales, temperatura requerida para su crecimient o, oxígeno disponible, etc., hacen que el número de 
colonias contadas constituyan una estimación de la cifra realmente presente y la misma refleja si el manejo 
sanitario del producto ha sido el adecuado. 
Por otra parte el recuento de termofílicos, psicrofí licos y psicotróficos es importante para predecir la 
estabilidad del producto bajo diferentes condiciones de almacenamiento. 
Para obtener resultados reproducibles y por lo tanto si gnificativos, es de suma importancia seguir fielmente 
y controlar cuidadosamente las condiciones. 
Esta técnica puede aplicarse para la estimación de microorganismos viables en una amplia variedad de 
alimentos. 
B.16.2 Fundamento El fundamento de la técnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio de elección 
después de un cierto tiempo y temperatura de incubaci ón, presuponiendo que cada colonia proviene de un 
microorganismo de la muestra bajo estudio. El método admite numerosas fuentes de variación, algunas de 
ellas controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores. 
B.16.3 Reactivos Los reactivos que a continuación se mencionan, deben ser grado analítico. Cuando se indique agua, debe entenderse agua destilada, con pH cercano a la neutralidad. B.16.4 Medio de Cultivo. B.16.4.1 Agar Triptona-Extracto de Levadura (agar para cuenta estándar).  
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de levadura  2,5 g  
Triptona  5,0 g  
Dextrosa  1,0 g 
Agar  15,0 g  
Agua  1,0 l 
 
Preparación del Medio de Cultivo. Suspender los componentes del medio deshidratado en  un litro de agua. Hervir hasta total disolución. 
Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables  de capacidad no mayor de 500 mL, cantidades de 
aproximadamente la mitad del volumen del mismo. Esteri lizar en autoclave a 121 ± 1,0ºC, durante 15 minutos. 
El pH final del medio debe ser 7,0 ± 0,2 a 25ºC. 
Si el medio de cultivo es utilizado inmediatamente, enfriar a 45ºC ± 1, 0 ºC en baño de agua y mantenerlo a 
esta temperatura hasta antes de su uso. El medio no debe de fundirse más de una vez. 
En caso de medios deshidratados seguir las instrucciones del fabricante. El medio de cultivo anterior es el de uso más generalizado. Para algunos alimentos en particular se 
requerirá de un medio de cultivo especial que se debe indicar al describir la técnica para ese alimento. 
B.16.5 Materiales  
Todo el material que tenga contacto con las mues tras o los microorganismos debe estar estéril. 
Se requiere, los materiales mencionados numeral 9, Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos 
para su Análisis Microbiológico. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.16.6 Aparatos e Instrumentos 
B.16.6.1 Incubadora con termostato que evite variaci ones mayores de ± 1,0ºC, provista con termómetro 
calibrado. 
B.16.6.2 Contador de colonias de campo obscuro, c on luz adecuada, placa de cristal cuadrículada y lente 
amplificador. 
B.16.6.3 Registrador mecánico o electrónico. 
B.16.6.4 Microscopio óptico. 
B.16.6.5 Baño de agua con o sin circulación mecánica, provista con termómetro calibrado con divisiones 
de hasta 1,0 °C y que mantenga la temperatura a 45 ± 1,0 °C. 
B.16.7 Preparación de la Muestra 
Para la preparación de la muestra seguir numeral 9, Preparación y dilución de muestras de alimentos para 
su análisis microbiológico. 
B.16.8 Procedimiento 
B.16.8.1 Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación; la adición de 
medio de cultivo y homogenización, se puedan realizar cómoda y libremente. Marcar las cajas en sus tapas 
con los datos pertinentes previamente a su inoculación y correr por duplicado. 
B.16.8.2 Después de inocular las diluciones de las mues tras preparadas según en B.5.1 Preparación y 
dilución de muestras de alimentos para su análisis micr obiológico, en las cajas Petri, agregar de 12 a 15 mL 
del medio preparado, mezclarlo mediante 6 movimient os de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las 
manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta 
lograr una completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las 
cajas. Dejar solidificar. 
B.16.8.3 Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de 
esterilidad. 
B.16.8.4 El tiempo transcurrido desde el momento en que la  muestra se incorpora al diluyente hasta que 
finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos. 
B.16.8.5 Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia  abajo) por el tiempo y la temperatura que se 
requieran, según el tipo de alimento y microorg anismo de que se trate, véase el cuadro 1. 
CUADRO 1 
Grupo bacteriano Temperatura  Tiempo de incubación 
Termofílicos aerobios 55 ± 2ºC  48 ± 2 h 
Mesofílicos aerobios 35 ± 2ºC  48 ± 2 h 
Psicrotróficos 20 ± 2ºC  3 - 5 días 
Psicrofílicos  5 ± 2ºC  7 - 10 días 
 
B.16.8.6 En la lectura seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250 UFC, para disminuir el 
error en la cuenta. 
B.16.8.7 Contar todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas (excepto las de mohos y 
levaduras), incluyendo las colonias puntiformes. Hacer us o del microscopio para resolver los casos en los que 
no se pueden distinguir las colonias de las pequeñas partículas de alimento. 
B.16.9 Expresión de Resultados B.16.9.1 Cálculo del Método . 
i) Después de la incubación, contar las placas que se encuentren en el intervalo de 25 a 250 colonias, 
usando el contador de colonias y el registrador. Las pl acas de al menos una de tres diluciones deben estar en 
el intervalo de 25 a 250. Cuando sólo una dilución está en  el intervalo apropiado, véase el cuadro 2, ejemplo 
1. Calcular la cuenta promedio por gramo o mililitro de dicha dilución y reportar. 
ii) Cuando dos diluciones están en el intervalo apropi ado, determinar la cuenta promedio dada por cada 
dilución antes de promediar la cuenta de las dos diluciones para obtener la cuenta en placa por gramo o mililitro, véase el cuadro 2, ejemplo 2. 
iii) Con el fin de uniformar los criterios para el reporte de las cuentas en ensayos donde las placas 
presenten situaciones no contempladas en los ejem plos anteriores, se presentan las siguientes guías: 
iv) Placas con menos de 25 colonias.- Cuando las placas corridas para la menor dilución muestran 
cuentas de menos de 25 colonias, contar el número de colonias presentes en dicha dilución, promediar el 
número de colonias y multiplicar por el factor de diluci ón para obtener el valor estimado de cuenta en placa. 
Aclarar en su informe esta situación agregando la leye nda "valor estimado", véas e el cuadro 2, ejemplo 3. 
v) Placas con más de 250 colonias.- Cuando el número de colonias por placa exceda de 250, contar las 
colonias en aquellas porciones de la placa que sean repr esentativas de la distribuci ón de colonias. Contar por 
ejemplo, una cuarta parte o una mitad del área de la  caja y multiplicar el valor obtenido por 4 o 2, 
respectivamente. Si solamente pueden contarse algunos  cuadros, considerar que el fondo de una caja Petri 
de 100 mm de diámetro contiene 65 cuadros de la cu adrícula del contador. Aclarar en el informe esta 
situación agregando la leyenda "valor estimado", véase el cuadro 2, ejemplo 4.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
vi) Colonias extendidas.- Las colonias extendidas  pueden presentarse en las siguientes formas: 
vii) Cadenas de colonias no separadas claramente entre sí, que parecen ser causadas por la 
desintegración de un cúmulo de bacterias. 
viii) Colonias que se desarrollan en película entre el agar y el fondo de la caja. 
ix) Colonias que se desarrollan en película en la orilla de la caja sobre la superficie del agar. 
x) Colonias de crecimiento extendido y en algunas oc asiones acompañadas de inhi bición del crecimiento, 
que en conjunto exceden el 50% de la caja o represión de l crecimiento que por sí mismo excede el 25% de la 
superficie de la caja. 
xi) Cuando es necesario contar en cajas que contien en colonias extendidas que no están incluidas en 
punto x) del numeral B.4.2.7.1 , contar cualquiera de los tipos vii), viii) o ix) del numeral B.4.2.7.1 , como 
provenientes de una sola fuente. En el caso de las colo nias del tipo vii) del numer al B.4.2.7.1, si la caja 
contiene una sola cadena, contar como una sola coloni a, si la caja contiene varias cadenas que parecen 
originarse de fuentes separadas, contar cada cadena como  colonia individual. No contar cada colonia de la 
cadena individualmente. Las colonias del tipo vii) y ix) del numeral B.4.2.7.1,  generalmente se observan como 
crecimiento diferenciable de otras colonias y se cuent an como tales. Los crecimientos tipo x) del numeral 
B.4.2.7.1,  reportarlos como crecimiento extendido. En caso de que una dilución se encuentre dentro del rango 
y otra dilución presente colonias de crecimiento extendid o, reportar la dilución en la que se pueden contar las 
colonias, véase el cuadro 2, ejemplo 5 
xii) Placas sin colonias.- Cuando las placas de todas las diluciones no muestran colonias, reportar la 
cuenta en placa como menor que una vez el valor de la dilución más baja usada, véase el cuadro 2, ejemplo 
6. 
xiii) Placas corridas por duplicado, una con crecimient o dentro del intervalo adecuado y otra con más de 
250 colonias.- Cuando una placa tiene entre 25 y 250 colonias y su duplicado más de 250 colonias, contar 
ambas placas incluyendo la que está fuera del interval o para determinar la cuenta en pl aca, véase el cuadro 2, 
ejemplo 7. 
xiv) Placas corridas por duplicado, una placa de cada dilución dentro del intervalo de 25 a 250 colonias.- 
Cuando una placa dentro de diferentes diluciones c ontiene el número de colonias especificadas en el 
intervalo, contar el número de colonias de las cuatro placas para calcular la cuenta en placa, véase el cuadro 
2, ejemplo 8. 
xv) Placas corridas por duplicado, ambas placas de u na dilución dentro del intervalo de 25 a 250 y sólo 
una de la otra dilución dentro del mismo. Contar la s cuatro cajas incluyendo aquélla con menos de 25 o más 
de 250 colonias, para calcular la cuenta en placa, véase el cuadro 2, ejemplo 9. 
xvi) Después de contabilizar las colonias en las placas seleccionadas, multiplicar por la inversa de la 
dilución para obtener el número de UFC por mililitro o gramo de la muestra. Redondear la cifra obtenida en la 
cuenta de manera que sólo aparezcan dos dígitos significati vos al inicio de esta cifra. Para redondear, elevar 
el segundo dígito al número inmediato superior cuando el  tercer dígito de la derecha sea cinco o mayor (por 
ejemplo: 128 redondear a 130). Si el tercer dígito es cuat ro o menos, reemplazar el tercer dígito con cero y el 
segundo dígito mantenerlo igual (Por ejemplo: 2417 a 2400): 
B.16.10 Informe de la Prueba 
Reportar como: Unidades formadoras de colonias, ___ UFC/g o mL, de bacterias aerobias en placa en 
agar triptona extracto de levadura o agar para cuenta estándar, incubadas ________ horas a _______ ºC. 
CUADRO 2 
Cálculo de los valores de la cuenta en placa  (ensayos por duplicado) 
Ejemplo  Colonias contadas  UFC/ g o mL 
número 1:100 1:1,000 1:10,000  
1 >250 178 16 180,000 
 >250 190 17  
2 >250 220 25 250,000 
3 18 2 0 1,600 
 14 0 0  
4 >250 >250 512 5,000,000 
 >250 >250 495  
5 >250 235 Crecimiento extendido  
6 0 0 0 <100 
7 >250 240 24 250,000 
 >250 268 19  
8 >250 216 23 280,000 
 >250 262 42  
9 >250 215 20 23,000 
 >250 235 26  
 >250 275 32 270,000 
 >250 225 26  Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.17 Método para la Cuenta de Mohos y Levaduras en Alimento. 
B.17.1 Fundamento 
El método se basa en inocular una cantidad conoc ida de muestra de prueba en un medio selectivo 
específico, acidificado a un pH 3,5 e incubado a una temperatura de 25 ± 1°C, dando como resultado el 
crecimiento de colonias características para este tipo de microorganismos. 
B.17.2 Reactivos y materiales B.17.2.1 Reactivos  
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser de grado analítico y cuando se indique agua 
debe entenderse como agua destilada. 
i) Medios de cultivo.  
Agar papa - dextrosa, comercialmente disponible en forma deshidratada. 
Preparación del medio de cultivo. Seguir instrucciones del fabricante y después de esteriliz ar, enfriar en baño de agua a 45 ± 1°C, acidificar 
a un pH de 3,5 ± 0,1 con ácido tartárico estéril al 10% (aproximadamente 1,4 mL de ácido tartárico por 100 mL 
de medio). Después de adicionar la solución, mezclar y medir el pH con potenciómetro. Dejar solidificar una porción del medio. Hacer esto en cada lote de medio preparado. A fin de preservar las propiedades 
gelificantes del medio, no calentar desp ués de agregar el ácido tartárico. 
B.17.2.1.1 Soluciones.  
i) Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada)  
Fórmula 
Ingredientes Cantidades  
Fosfato de potasio monobásico 34,0 g 
Agua  1,0 l 
 
Preparación: 
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con hidróxido de sodio 1 N. Llevar a 1,0 l de agua. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Conserva r en refrigeración (solución concentrada). 
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y ll evar a 1,0 l con agua (solución de trabajo). 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera. 
Esterilizar a 121 ± 1°C durante 15 minutos. ii) Solución estéril de ácido tartárico al 10%  
Fórmula 
Ingredientes Cantidades  
Acido tartárico 10 g 
Agua destilada  100, mL  
 
Preparación: 
Disolver el ácido en el agua y esterilizar a 121 ± 1,0 °C por 15 minutos o por  filtración a través de 
membrana de 0,45 μm. 
B.17.2.2 Materiales.  
B.17.2.2.1 Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL(o si es necesario de 1 mL y 2 mL), con tapón 
de algodón. Pueden utilizarse pipetas graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total. 
B.17.2.2.2 Cajas Petri. 
B.17.2.2.3 Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca. 
B.17.2.2.4 Tubos de 16 x 15 0 mm con tapón de rosca. 
B.17.2.2.5 Utensilios esterilizables  para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, 
espátulas, etc. 
B.17.2.2.6 Todo el material e inst rumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio, deben 
esterilizarse mediante: 
Horno, durante 2 h de 170 a 175°C o por 1h a 180°C o autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 
± 1,0°C.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.17.2.3 Aparatos e Instrumentos 
B.17.2.3.1 Horno para esterilizar que alca nce una temperatura mínima de 170°C. 
B.17.2.3.2 Incubadora con termostat o que pueda ser mantenido a 25 ± 1,0°C provista con termómetro 
calibrado. 
B.17.2.3.3 Autoclave que alcance una temperatura mínima de 121 ± 1,0°C. 
B.17.2.3.4 Baño de agua co n control de temperatura y circulació n mecánica, provista con termómetro 
calibrado con divisiones de 0,1°C y q ue mantenga la temperatura a 45 ± 1,0°C. 
B.17.2.3.5 Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente 
amplificador. 
B.17.2.3.6 Registrador mecánico o electrónico. B.17.2.3.7 Microscopio óptico. 
B.17.2.3.8 Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25 °C. 
B.17.3 Preparación de la Muestra La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo señalado en el numeral B.4.1 (Procedimiento para 
la preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico) de este apéndice 
normativo 
B.17.3.1 Procedimiento 
B.17.3.1.1 Colocar por duplicado en cajas Petri 1 mL de la mues tra líquida directa o de la dilución primaria, 
utilizando para tal propós ito una pipeta estéril. 
B.17.3.1.2 Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, 
utilizando una pipeta estéril diferente para cada dilución. 
B.17.3.1.3 Verter de 15 a 20 mL de agar papa dextrosa acidific ado, fundido y mantenido a 45 ± 1 °C en un 
baño de agua. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que es 
vertido el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos. 
B.17.3.1.4 Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el 
sentido de las manecillas del reloj, seis en el sent ido contrario y seis de atrás para adelante, sobre una 
superficie lisa. Permitir que la mezcla se solidifique de jando las cajas Petri reposar sobre una superficie 
horizontal fría. 
B.17.31.5 Preparar una caja control con 15 mL de medio, para verificar la esterilidad. 
B.17.3.1.6 Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25 ± 1°C. 
B.17.3.1.7 Contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación. Después de 5 días, 
seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna parte de la caja muestra 
crecimiento extendido de mohos o si es difícil contar colo nias bien aisladas, considerar los conteos de 4 días 
de incubación y aun de 3 días. En este caso, informar el periodo de incubación de 3 o 4 días en los resultados del análisis. 
B.17.3.1.8 Si es necesario, cuando la morfología colonial no sea suficiente, examinar microscópicamente 
para distinguir las colonias de levaduras y mohos de las bacterias. 
B.17.4 Expresión de Resultados 
Cálculo del Método 
Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el informe. Multiplicar por el inverso de la dilución, tomando en consideración los criterios del numeral B.4.2 de este 
apéndice (Método para la cuenta de bacterias aerobia s en placa), para la expresión de resultados. 
B.17.5 Informe de la Prueba Informar: 
Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de mohos en agar papa – dextrosa 
acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 5 días. 
Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de levaduras en agar papadextrosa 
acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 5 días. 
B.18. Estimación de la Densidad Microbiana por la  Técnica del Número Mas Probable de Bacterias 
Coliformes, Coliformes fecales y Escherichia coli,  por la Técnica de Diluciones en Tubo Múltiple. 
Este método es aplicable a cualquier grupo bacteriano de interés sanitario, especialmente en productos 
que se encuentran en bajas concentraciones de microorgani smos (10 por gramo o mL). Ejemplo: Leche, agua, 
alimentos; que por su consistencia pueden interferir c on la exactitud de la cuenta de Unidades Formadoras de 
Colonias (U.F.C.). 
B.18.1  Fundamento.  
Se basa en la dilución de la muestra en tubos múltiples, de tal forma que todos los tubos de la menor 
dilución sean positivos y todos los tubos de la dilución más alta sean negativos. El resultado positivo se 
demuestra por la presencia de gas o crecimiento microbiano. 
Para obtener el Número Más Probable (NMP) en los result ados se aplica la teoría de la probabilidad, lo 
cual tiene como condición lo siguiente: 
- Una distribución aleatoria de las bacterias que existen en la muestra. - Las bacterias se encuentran como entidades no agrupadas. - Los microorganismos presentes en la muestra cr ecerán en el medio, cuando son incubados y se 
mantengan en las condiciones adecuadas para su desarrollo. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
Si se espera una cuenta microbiana alta, la muestra deberá diluirse para dar cumplimiento a las 
condiciones. La forma más común de realizar esta prueba es mediante diluciones decimales y usando un 
inóculo en series de 3, 5 o 10 tubos en serie. A medida qu e el número de tubos inoculados para cada dilución 
aumentan se reducen los límites de confianza. 
B.18.2 Equipo, Materiales y Reactivos.  
No aplica. 
B.18.3 Procedimientos . 
B.18.3.1 Uso de tablas de NMP con 95% de límite de confianza.  
Las tablas 1-3 presentan la esti mación estadística de los valores del NMP que corresponden al 95% de 
límite de confianza cuando se utiliz an 3, 5 y 10 tubos. Otras combinac iones de resultados positivos y 
negativos no encontrados en estas tablas, tienen muy baja probabilidad de que se presenten. Si los resultados 
no están incluidos en las tablas,  se deberá repetir la prueba a partir de la muestra original . Si no es 
posible, el NMP se puede obtener (para las combinaciones de 3 y 5 tubos) de las tablas 4 y 5; también se puede aplicar una ecuación (véase punto B. 2) para obtener el NMP aproximado. 
El intervalo del 95% de confianza se interpreta como sigue: si el analista supone que el número real de 
microorganismos cae dentro de los límites, entonces se asume que será correcto el 95% de las veces. El valor 
del NMP tabulado representa un intervalo y no un valor absoluto. 
Cuando se preparan más de 3 diluciones de una muestra, el NMP deberá determinarse a partir de tres 
diluciones consecutivas (usando tablas 1-3). Primero,  para todas las diluciones que tengan todos los tubos 
positivos, seleccionar la dilución mayor. Después usar la s 2 siguientes diluciones mayores (A y B en las tablas 
6 y 7). Cuando en ninguna de las diluciones probadas h ubiera crecimiento en todos los tubos, seleccionar (si 
es posible) las primeras tres diluciones consecutiv as (volumen de muestra) para que la dilución media 
contenga resultados positivos  (C de tablas 6 y 7). 
Con frecuencia es necesario el NMP desde el inicio  con volúmenes diferentes de los enlistados en las 
tablas 1-5. Si el volumen de muestra es mayor que 0, 01 g multiplicar el NMP enlistado en la tabla por 10. El 
resultado de una determinación de 5 tubos que dé 3 tubos positivos en 0,01 g; 2 tubos positivos en 0,001 g y 1 
tubo positivo en 0,0001 g (3-2-1) leer en la tabla No. 2 como 17 y multiplicar por 10 para así obtener 170 como 
el NMP actual por gramo de muestra. De igual forma si la cantidad más grande utilizada para la tabla de 
referencia es 1 g en lugar de 0,1 g, dividir el NMP derivado de la tabla entre 10. Por ejemplo el resultado de la 
determinación del NMP en 3 tubos para Salmonella spp que dé 3 tubos positivos en 1 g; 1 tubo positivo en 0,1 
g y ningún positivo en 0,01 g (3-1-0) leer en la tabla No. 1 como 43 y dividir entre 10, lo que da 4,3 como el NMP presuntivo por gramo de muestra. 
Un método alternativo para obtener el número más probable es usando la siguiente fórmula: 
(NMP/g de la tabla - 100) X factor de dilución del tubo de enmedio = NMP/g Para calcular el NMP/100 g multiplicar por 100. 
B.18.3.2  Cálculo Aproximado del NMP y 95% de límite de confianza.  
Debido a la inherente complejidad para calcular los lí mites de confianza del NMP lo más común es el uso 
de tablas. Generalmente estas tablas están limitadas al  uso de 3, 5 y 10 tubos por dilución, incluso usando un 
método aceptado, pueden pres entarse datos irregulares o accidentes de laboratorio que causan pérdida de 1 
o más tubos de dilución. En este caso una serie de dilu ciones de por ejemplo: 5, 4,4 puede dar una lectura de 
5-2-0. Para estos casos se puede aplicar una fórmula sencilla, la cual no corresponde exactamente con los 
resultados obtenidos teóricamente; sin embargo, las desviaciones generalmente son pequeñas, esta fórmula 
no debe ser aplicada para fines de regulación. La fórmula no restringe el número de tubos o las diluciones y puede aplicarse para todo tipo de pruebas. El cálculo aproximado está dado por la siguiente ecuación: NMP/g 
= P/(N T)
1/2 
Donde: P es el número de tubos positivos, N es la  cantidad total de muestra (g) en todos los tubos 
negativos y T es la cantidad tota l de muestra (g) en todos los tubos. 
Por ejemplo, considerando que se tuvieran serie de diluciones al doble: 
MUESTRA (g) No. DE TUBOS No. DE TUBOS POSITIVOS 
8 
4 
2 
1 
0,5 
0,25 5 
5 
5 
5 
5 5 5 
4 
2 
0 
1 0       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
El número de tubos positivos es: P = (5 + 4 + 2+ 1) = 12; N = (8x0) + (4x1) + (2x3) + (1x5) + (0,5x4) + 
(0,25x5) = 18,25; y T = 5 (8+4+2+1+0,5+0,25) = 78,75 
NPM/g = 12/(18,25 x 78,75)1/2 = 0,32/g o 32/100 g 
Los límites de confianza del 95% estimado, pueden obtenerse del antilogaritmo de base 10 con la 
siguiente ecuación: 
log (NMP/g) 1,08 (log a)/n) 1/2 
Donde: a es el radio de dilución y n es el número de tubos por dilución. Esta expresión asume que el radio 
de dilución es diferente de 1:10 (por ejemplo 1:2). Para diluciones de 1:10, la cantidad por restar o sumar 
deberá ser de 1,14(n)½ para la mejor estimación. Si el número de tubos por dilución (n i) es desigual (por 
ejemplo: un accidente de laboratorio) para la dilución k reemplazar n por la expresión n H (media armónica) por 
el número de tubos por dilución (n i). 
La media armónica se define como: 
nH = k / (1/ n i ) 
k es el número de diluciones. Por ejemplo: Suponiendo que el resultado de 3 diluciones en n i fuera 5-4-4. 
Por lo tanto n H = 3/ (1/5) + (1/4) + (1/4) ½ = 3/0,70 = 4,3i 
Para el ejemplo anterior el NMP con n = 5 y un lími te de confianza aproximado de 95% será el siguiente: 
log 0,32 (1,08) (log 2)/5) ½ 
-0,495 0,265 
Entonces el límite inferior es el antilogaritmo (-0 -76) = 0.17/g o 17/100 g y el límite inferior es el 
antilogaritmo (-0,23) = 0,59/g o 59/100  g. Cuando se compara con las tablas el NMP podría ser 0,31/g con 
límites de confianza de 0,16/g y 0,57/g. 
Tabla No. 1 Selección del NMP con un límite de confianza de 95% para la prueba de fermentación 
utilizando 3 tubos: con porciones de 0,1,  0,01 y 0,001 g (mL) de muestra. 
No. de tubos positivos  95% de límite de confianza 
0,1 0,01 0,001 NMP/g (mL)b Inferior Superior 
0 0 0 3 - - 
0 1 0 3+ 1 17 
1 0 0 4 1 21 
1 0 1 7+ 2 27 
1 1 0 7 2 28 
1 2 0 11+ 4 35 
2 0 0 9 2 38 
2 0 1 14+ 5 48 
2 1 0 15 5 50 
2 1 1 20+ 7 60 
2 2 0 21 8 62 
3 0 0 23 9 130 
3 0 1 39 10 180 
3 1 0 43 10 210 
3 1 1 75 20 280 
3 2 0 93 30 380 
3 2 1 150 50 500 
3 2 2 210+ 80 640 
3 3 0 240 90 1400 
3 3 1 460 100 2400 
3 3 2 1100 300 4800 
3 3 3 1100 - - 
a Los resultados normales, obtenidos en un 95% de las pruebas no están seguidos por un símbolo más 
(+). Menos del 4% de los resultados de las pruebas  obtenidos están marcados por un símbolo más (+). 
Combinaciones de tubos positivos no encontrados en esta tabla se presentan en menos del 1% de las 
pruebas y si se presentaran con mayor frecuencia indican un error de técnica o que el valor del número más 
probable se encuentra en el límite. El NMP de combi naciones que no aparecen en la tabla, se puede obtener 
por extrapolación a la combinación cercana más elevada. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por  100 para expresarlos como NMP/100 g (mL). Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
Tabla No. 2 Selección del NMP con un límite de confianza de 95% para la prueba de fermentación 
utilizando 5 tubos: con porciones de 0, 1, 0,01 y 0,001 g (mL) de muestraa. 
No. de tubos positivos 95% de límite de confianza
0,1 0,01 0,001 NMP/g (mL)bInferio r Superio r
   
0 0 0 2 - - 
0 0 1 2+ 1 10
0 1 0 2 1 10
1 0 0 2 1 11
1 0 1 4+ 1 15
1 1 0 4 1 15
1 2 0 6+ 2 18
2 0 0 4 1 17
2 0 1 7+ 2 20
2 1 0 7 2 21
2 1 1 9+ 3 25
2 2 0 9 3 25
3 0 0 8 3 24
3 0 1 11 4 29
3 1 0 11 4 30
3 1 1 14+ 6 35
3 2 0 14 6 35
3 2 1 17+ 7 40
3 3 0 17+ 7 41
4 0 0 13 5 38
4 0 1 17 7 45
4 1 0 17 7 46
4 1 1 21 9 55
4 2 0 22 9 56
4 2 1 26+ 12 65
4 3 0 27 12 67
4 3 1 33+ 15 77
4 4 0 34+ 16 80
5 0 0 23 9 68
5 0 1 31 13 110
5 1 0 33 14 120
5 1 1 46 20 150
5 1 2 63+ 22 180
5 2 0 49 21 170
5 2 1 70 30 210
5 2 2 94+ 40 250
5 3 0 79 30 250
5 3 1 110 40 300
5 3 2 140 60 360
5 4 0 130 50 390
5 4 1 170 70 480
5 4 2 220 100 580
5 4 3 280+ 120 690
5 4 4 350+ 160 820
5 5 0 240 100 940
5 5 1 350 100 1300
5 5 2 540 220 2000
5 5 3 920 300 2900
5 5 4 1600 600 5300
5 5 5 1600 - - 
a Los resultados normales, obtenidos en un 95% de las pruebas, no están seguidos por un símbolo 
más(+). Menos del 4% de los resultados de las pru ebas obtenidos están marcados por un símbolo más (+). 
Combinaciones de tubos positivos no encontrados en esta tabla se presentan en menos del 1% de las 
pruebas y si se presentaran con mayor frecuencia indican un error de técnica o que el valor del número más 
probable se encuentra en el límite. El NMP de combinaciones que no aparecen en la tabla, se pueden obtener 
por extrapolación a la combinación cercana más elevada. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por  100 para expresarlos como NMP/100 g (mL).       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
Tabla No. 3 Selección del NMP con un límite de confianza de 95% para la prueba de fermentación 
utilizando 10 tubos: con porciones de 0,1, 0,01 y 0,001 g (mL) de muestraa. 
No. de tubos positivos  95% de límite de confianza 
0,1 0,01 0,001 NMP/g (mL)b Inferior Superior 
0 0 0 1 - - 
0 0 1 1+ 1 5 
0 1 0 1 1 5 
0 2 0 2+ 1 7 
1 0 0 1 1 5 
1 0 1 2+ 1 7 
1 1 0 2 1 7 
1 2 0 3+ 1 8 
2 0 0 2 1 7 
2 0 1 3+ 1 9 
2 1 0 3 1 9 
2 1 1 4+ 1 10 
2 2 0 4 2 10 
2 3 0 5+ 2 12 
3 0 0 3 1 9 
3 0 1 4 2 11 
3 1 0 4 2 11 
3 1 1 5+ 2 13 
3 2 0 5 2 13 
3 2 1 6+ 3 14 
3 3 0 6+ 3 14 
4 0 0 4 2 12 
4 0 1 6 2 13 
4 1 0 6 2 14 
4 1 1 7 3 15 
4 2 0 7 3 15 
4 2 1 8 4 17 
4 3 0 8 4 17 
4 4 0 9+ 5 19 
5 0 0 6 2 15 
5 0 1 7 3 16 
5 1 0 7 3 17 
5 1 1 9 4 18 
5 2 0 9 4 18 
5 2 1 10+ 5 20 
5 3 0 10 5 20 
5 3 1 11+ 6 22 
5 4 0 11+ 6 22 
6 0 0 8 3 18 
6 0 1 9 4 20 
6 1 0 9 4 20 
6 1 1 11 5 22 
6 2 0 11 5 22 
6 2 1 12 6 24 
6 3 0 12 6 25 
6 3 1 14+ 7 27 
6 4 0 14+ 7 27 
6 5 0 15+ 8 29 
7 0 0 10 5 22 
7 0 1 12 6 24 
7 0 2 13+ 7 27 
7 1 0 12 6 25 Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
7 1 1 13 7 27 
7 1 2 15+ 8 30 
7 2 0 13 7 27 
7 2 1 15 8 30 
7 2 2 17+ 9 32 
7 3 0 15 8 30 
7 3 1 17 9 33 
7 4 0 17 9 33 
7 4 1 19+ 10 36 
7 5 0 19+ 10 36 
8 0 0 13 6 28 
8 0 1 15 7 31 
8 0 2 17+ 8 34 
8 1 0 15 7 31 
8 1 1 17 9 34 
8 1 2 19+ 10 37 
8 2 0 17 9 35 
8 2 1 19 10 38 
8 2 2 21+ 12 42 
8 3 0 19 10 39 
8 3 1 21 12 42 
8 3 2 24+ 13 46 
8 4 0 22 12 43 
8 4 1 24 13 46 
8 5 0 24 13 47 
8 5 1 27+ 15 51 
8 6 0 27+ 15 52 
9 0 0 17 8 37 
9 0 1 19 10 41 
9 0 2 22+ 11 46 
9 1 0 19 10 42 
9 1 1 22 11 47 
9 1 2 25+ 13 52 
9 2 0 22 12 47 
9 2 1 25 13 53 
9 2 2 28+ 15 58 
9 3 0 25 13 54 
9 3 1 29 15 60 
9 3 2 32+ 18 66 
9 4 0 29 16 61 
9 4 1 33 18 67 
9 4 2 37+ 20 74 
9 5 0 33 18 69 
9 5 1 37 20 76 
9 5 2 42+ 23 83 
9 6 0 38 21 77 
9 6 1 43+ 24 85 
9 7 0 44+ 24 87 
10 0 0 23 12 58 
10 0 1 27 14 67 
10 0 2 31+ 16 77 
10 1 0 27 14 69 
10 1 1 32 17 79 
10 1 2 38 20 92 
10 2 0 33 17 83       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
10 2 1 39 20 96 
10 2 2 50 20 110 
10 2 3 50+ 30 120 
10 3 0 40 20 100 
10 3 1 50 20 120 
10 3 2 60+ 30 130 
10 3 3 70+ 30 150 
10 4 0 50 30 120 
10 4 1 60 30 140 
10 4 2 70 30 160 
10 4 3 80+ 40 170 
10 5 0 60 30 150 
10 5 1 70 40 170 
10 5 2 90 40 190 
10 5 3 100 50 210 
10 6 0 80 40 180 
10 6 1 90 50 200 
10 6 2 110 50 230 
10 6 3 120 60 250 
10 6 4 140+ 70 270 
10 7 0 100 50 220 
10 7 1 120 60 250 
10 7 2 140 70 280 
10 7 3 150 80 310 
10 7 4 170+ 90 340 
10 8 0 130 60 280 
10 8 1 150 80 320 
10 8 2 170 90 360 
10 8 3 200 100 400 
10 8 4 220 120 440 
10 8 5 250+ 140 480 
10 9 0 170 90 380 
10 9 1 200 100 430 
10 9 2 230 120 490 
10 9 3 260 140 560 
10 9 4 300 160 640 
10 9 5 350 180 720 
10 9 6 400+ 210 820 
10 10 0 240 120 610 
10 10 1 290 150 750 
10 10 2 350 170 910 
10 10 3 400 200 1100 
10 10 4 500 300 1400 
10 10 5 700 300 1700 
10 10 6 900 400 2100 
10 10 7 1120 600 2700 
10 10 8 1160 800 3700 
10 10 9 2300 1100 6000 
10 10 10 2300 - - 
a Los resultados normales, obtenidos en un 95% de la s pruebas, no están seguidos por un símbolo más 
(+). Menos del 4% de los resultados de las pruebas  obtenidos están marcados por un símbolo más(+). 
Combinaciones de tubos positivos no encontrados en esta tabla se presentan en menos del 1% de las 
pruebas y si se presentaran con mayor frecuencia indican un error de  técnica o que el valor del número más 
probable se encuentra en el límite. El NMP de combinaciones que no aparecen en la tabla, se pueden obtener 
por extrapolación a la combinación cercana más elevada. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por  100 para expresarlos como NMP/100 g (mL). Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
Tabla No. 4 Número más probable (NMP) para 1g de muestra cuando se usan 3 tubos con 
porciones de 0,1, 0,01 y 0,001g. 
Tubos Positivos Tubos Positivos Tubos Positivos Tubos Positivos 
0,1 0,01 0,001 NMP 0,1 0,01 0,001 NMP 0,1 0,01 0,001 NMP 0,1 0,01 0,001 NMP
0  0  0  3  1  0  0  3 , 6 2009 , 1 30  0  2 3
0  0  1  3  1  0  1  7 , 2 2011 4 30  1  3 9
0  0  2  6  1  0  2  1 1 2022 0 30  2  6 4
0  0  3  9  1  0  3  1 5 2032 6 30  3  9 5
0  1  0  3  1  1  0  7 , 3 2101 5 31  0  4 3
0  1  1   6 , 1  1  1  1  1 1 2112 0 31  1  7 5
0  1  2   9 , 2  1  1  2  1 5 2122 7 31  2  1 2 0
0  1  3  1 2  1  1  3  1 9 2133 4 31  3  1 6 0
0  2  0   6 , 2  1  2  0  1 1 2202 1 32  0  9 3
0  2  1   9 , 3  1  2  1  1 5 2212 8 32  1  1 5 0
0  2  2  1 2  1  2  2  2 0 2223 5 32  2  2 1 0
0  2  3  1 6  1  2  3  2 4 2234 2 32  3  2 9 0
0  3  0   9 , 4  1  3  0  1 6 2302 9 33  0  2 4 0
0  3  1  1 3  1  3  1  2 0 2313 6 33  1  4 6 0
0  3  2  1 6  1  3  2  2 4 2324 4 33  2  1100
0  3  3  1 9  1  3  3  2 9 2335 3 33  3  1100
 
Tabla No. 5 Número más probable (NMP) para 100 mL de muestra cuando se usan 5 porciones en 
cada una de 3 diluciones con series geométricas.  
No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos 
10  1  0,1 10  1  0,1 10  1  0,1 10  1  0,1 10  1  0,1 10  1  0,1 
mL mL mL N 
M 
P mL mL mL N 
M 
P mL mL mL N 
M 
P mL mL mL N 
M 
P mL mL mL N 
M 
P mL mL mL N  M 
P 
0 0 0  1 0 0 2 2 0 0 4,5 3 0 0 7,8 4 0 0 13 5 0 0 23 
0 0 1 1,8 1 0 1 4 2 0 1 6,8 3 0 1 11 4 0 1 17 5 0 1 31 
0 0 2 3,6 1 0 2 6 2 0 2 9,1 3 0 2 13 4 0 2 21 5 0 2 43 
0 0 3 5,4 1 0 3 8 2 0 3 12 3 0 3 16 4 0 3 25 5 0 3 58 
0 0 4 7,2 1 0 4 10 2 0 4 14 3 0 4 20 4 0 4 30 5 0 4 76 
0 0 5 9,0 1 0 5 12 2 0 5 16 3 0 5 23 4 0 5 36 5 0 5 95 
0 1 0 1,8 1 1 0 4 2 1 0 6,8 3 1 0 11 4 1 0 17 5 1 0 33 
0 1 1 3,6 1 1 1 6,1 2 1 1 9,2 3 1 1 14 4 1 1 21 5 1 1 46 
0 1 2 5,5 1 1 2 8,1 2 1 2 12 3 1 2 17 4 1 2 26 5 1 2 64 
0 1 3 7,3 1 1 3 10 2 1 3 14 3 1 3 20 4 1 3 31 5 1 3 84 
0 1 4 9,1 1 1 4 12 2 1 4 17 3 1 4 23 4 1 4 35 5 1 4 110 
0 1 5 11 1 1 5 14 2 1 5 19 3 1 5 27 4 1 5 42 5 1 5 130 
0 2 0 3,7 1 2 0 6,1 2 2 0 9,3 3 2 0 14 4 2 0 22 5 2 0 49 
0 2 1 5,5 1 2 1 8,2 2 2 1 12 3 2 1 17 4 2 1 26 5 2 1 70 
0 2 2 7,4 1 2 2 10 2 2 2 14 3 2 2 20 4 2 2 32 5 2 2 95 
0 2 3 9,2 1 2 3 12 2 2 3 17 3 2 3 24 4 2 3 38 5 2 3 120 
0 2 4 11 1 2 4 15 2 2 4 19 3 2 4 27 4 2 4 44 5 2 4 150 
0 2 5 13 1 2 5 17 2 2 5 22 3 2 5 31 4 2 5 50 5 2 5 180 
0 3 0 5,6 1 3 0 8,3 2 3 0 12 3 3 0 17 4 3 0 27 5 3 0 79 
0 3 1 7,4 1 3 1 10 2 3 1 14 3 3 1 21 4 3 1 33 5 3 1 110 
0 3 2 9,3 1 3 2 13 2 3 2 17 3 3 2 24 4 3 2 39 5 3 2 140 
0 3 3 11 1 3 3 15 2 3 3 20 3 3 3 28 4 3 3 45 5 3 3 180 
0 3 4 13 1 3 4 17 2 3 4 22 3 3 4 31 4 3 4 52 5 3 4 210 
0 3 5 15 1 3 5 19 2 3 5 25 3 3 5 35 4 3 5 59 5 3 5 250 
0 4 0 7,5 1 4 0 11 2 4 0 15 3 4 0 21 4 4 0 34 5 4 0 130 
0 4 1 9,4 1 4 1 13 2 4 1 17 3 4 1 24 4 4 1 40 5 4 1 170 
0 4 2 11 1 4 2 15 2 4 2 20 3 4 2 28 4 4 2 47 5 4 2 220 
0 4 3 13 1 4 3 17 2 4 3 23 3 4 3 32 4 4 3 54 5 4 3 280 
0 4 4 15 1 4 4 19 2 4 4 25 3 4 4 36 4 4 4 62 5 4 4 350 
0 4 5 17 1 4 5 22 2 4 5 28 3 4 5 40 4 4 5 69 5 4 5 430 
0 5 0 9,4 1 5 0 13 2 5 0 17 3 5 0 25 4 5 0 41 5 5 0 240 
0 5 1 11 1 5 1 15 2 5 1 20 3 5 1 29 4 5 1 48 5 5 1 350 
0 5 2 13 1 5 2 17 2 5 2 23 3 5 2 32 4 5 2 56 5 5 2 540 
0 5 3 15 1 5 3 19 2 5 3 26 3 5 3 37 4 5 3 64 5 5 3 920 
0 5 4 17 1 5 4 22 2 5 4 29 3 5 4 41 4 5 4 72 5 5 4 1600 
0 5 5 19 1 5 5 24 2 5 5 32 3 5 5 45 4 5 5 81           (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
Tabla No. 6 Ejemplos para determinar el NMP estimado en series de tres tubos con 1g (mL) de 
muestra por tubo. 
 Cantidad de muestra (g o mL)aValores positivos 
reportados NMP estimado/g o mLb 
Ejemplo 0,10 ,001 0,001 0,0001 0,00001   
A 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3 3-2-0 930 
B 3/3 3/3 3/3 2/3 0/3 3-2-0 9300 
C 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3 0-1-0 30 
D 3/3 3/3 2/3 1/3 1/3 3-2-2 2100 
E 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3-3-3 110000 
        
a Numerador/denominador = número de tubos positivos/número de tubos inoculados. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por  100 para expresarlos como NMP/100 g (mL). 
Tabla No. 7 Ejemplos para determinar el NMP estimado en series de 5 tubos con 1 g (mL) de 
muestra por tubo. 
 Cantidad de muestra (g o mL)aValores positivos NMP estimado/g o mLb 
Ejemplo 0,1, 0,01 0,001 0,0001 0,00001 reportados  
A 5/5 5/5 2/5 0/5 0/5 5-2-0 490 
B 5/5 5/5 5/5 2/5 0/5 5-2-0 4900 
C 0/5 0/5 1/5 0/5 0/5 0-1-0 20 
D 5/5 5/5 3/5 1/5 1/5 5-2-2 1400 
E 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5-5-5 160000 
a Numerador/denominador = número de tubos positivos/número de tubos inoculados. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por  100 para expresarlos como NMP/100 g (mL). 
B.18.3.3  Determinación de Bacterias Colif ormes, Coliformes fecales y Escherichia coli  por la 
Técnica de Diluciones en Tubo  Múltiple.  
B.18.3.3.1 Fundamento  
Este método se basa en la propiedad de los micr oorganismos coliformes para producir gas a partir de 
glucosa y fermentación de lactosa dentro de las 48 horas  de incubación a 35 0,5°C (coliformes) y 44,50,2°C 
(coliformes fecales y E. coli ). 
B.18.3.3.2  Equipo y Materiales 
Además de los mencionados en el método Preparación y dilución de muestras de alimentos para análisis 
microbiológico, lo siguiente: 
- Baño de agua con agitación continua cubierto y c on termostato que evite variaciones mayores a 0,1°C. 
- Termómetro calibrado y verificado 1/10 
- Tubos de cultivo de 20x200 y de 16x160 mm con tapón de rosca - Campanas de fermentación (tubos de Durham) 
- Gradillas 
- Asas bacteriológicas de 3 mm de diámetro - Lámpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. 
- Lentes protectores. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.18.3.3.3  Medios de Cultivo 
Caldo Lauril 
Ingredientes: 
Bacto triptosa 20,0 g 
Bacto lactosa 5,0 g 
Fosfato potásico,  dibásico 2,75 g 
Fosfato potásico, monobásico 2,75 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Lauril sulfato de sodio 0,1 g 
Agua destilada 1000,0 mL 
pH final: 6,8 0,2 a 25°C. 
Preparación: 
1. Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada. 
2. Ajustar el pH. 3. Distribuir en tubos de ensaye con campanas de Durham. 
4. Adicionar 10 mL de medio para cada tubo. 
5. Esterilizar en autoclave  durante 15 minutos a 121C. 
6. Antes de abrir el autoclave, dejar bajar la temperatura a 75C para que no queden burbujas en las 
campanas de Durham. 
Preparación de Caldo Lauril Triptosa 
INOCULO 
(mL) CANTIDAD DE MEDIO 
POR TUBO (mL) VOLUMEN DE MEDIO 
MAS INOCULO (mL) CALDO LAURIL 
TRIPTOSA REQUERIDO 
g/L 
1 10 o más 11 o más 35,6 
10 10 20 71,2 
10 20 30 53,4 
20 10 30 106,8 
100 50 150 106,8 
100 35 135 137,1 
100 20 120 213,6 
 
Caldo EC ( E. coli .) 
Ingredientes:  
Bacto triptosa 20,0 g 
Bacto lactosa 5,0 g 
Bacto sales biliares No. 3 1,5 g 
Fosfato dipotásico 4,0 g 
Fosfato monopotásico 1,5 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Agua destilada 1000,0 mL 
pH final: 6,9 0,2 a 25°C. 
Preparación: 
1. Disolver los ingredientes en un litro de agua desti lada y calentar ligeramente para que se disuelva por 
completo. 
2. Ajustar el pH. 
3. Distribuir en tubos de ensaye con campanas de Durham. 4. Adicionar 10 mL de medio para cada tubo. 
5. Esterilizar en autoclave  durante 15 minutos a 121°C. 
6. Antes de abrir el autoclave, dejar bajar la tem peratura a 75°C para evitar que queden burbujas en las 
campanas de Durham.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
Agar McConkey 
Ingredientes:  
Proteasa peptona o polipeptona 3,0 g 
Peptona o gelizante 17,0 g 
Lactosa 10,0 g 
Sales biliares No. 3 1,5 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Rojo neutro 0,03 g 
Cristal violeta 0,001 g 
Agar 13,5 g 
Agua destilada 1000,0 mL 
pH final: 7,1 0,2 a 25°C 
Preparación: 
1. Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada. 
2. Calentar hasta ebullición para disolver por completo. 
3. Ajustar el pH. 
4. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. 
5. Enfriar a 50-60°C y vaciar en cajas Petri. 
Agar Eosina Azul de Metileno de Levin (EMB-L) 
Ingredientes:  
Peptona 10,0 g 
Lactosa 10,0 g 
K2HPO 4 2,0 g 
Eosina Y 0,4 g 
Azul de metileno 0,065 g 
Agua destilada 1000 mL 
pH final: 7,1 0,2 
1. Disolver la peptona, el fosfat o y el agar en un litro de agua. 
2. Calentar hasta ebullición para la disolución completa. 
3. Distribuir en porciones de 100 o 200 mL y esterilizar a no más de 121°C por 15 minutos. 
4. Fundir antes de su uso y adicionar a cada porción de 100 mL: 
a) 5 mL de solución de lactosa al 20% 
b) 2 mL de solución acuosa de eosina al 2% 
c) 4,3 mL de solución acuosa de azul de metileno al 0,15%. 
Cuando se use el producto deshidratado, disolver todo s los ingredientes de acuerdo con las instrucciones 
del fabricante. 
Caldo Triptona al 1% (triptofano) 
Ingredientes:  
Triptona o tripticasa 10 g 
Agua destilada 1000 mL 
pH final: 6,9 0,2 
1. Disolver los ingredientes 
2. Distribuir en porciones de 5 mL en tubos  de ensaye de 16 x 125 o 16 x 150 mm. 
3. Esterilizar a 121°C por 15 minutos. 
Caldo MR-VP 
Medio 1 
Ingredientes:   
Peptona tamponada 7 g 
Glucosa 5 g 
K2HPO 4 5 g 
Agua destilada 1000 mL 
pH final: 6,9 0,2 
1. Disolver los ingredientes con cale ntamiento suave si es necesario. 
2. Distribuir en volúmenes de 10 mL en tubos de ensaye de 16x150 mm. 
3. Esterilizar a 121°C por 15 minutos. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
Caldo Citrato de Koser 
Ingredientes:  
NaNH 4HPO 4 •4H 2O 1,5 g 
KH2PO 4 (monobásico) 1,0 g 
MgSO 4 •7H 2O 0,2 g 
Citrato de sodio •2H 2O 3,0 g 
Agua destilada 1000 mL 
pH final: 6,7 0,2. 
1. Distribuir preferentemente en tubos de ensaye con tapa de rosca. 
2. Esterilizar a 121°C por 15 minutos. 
Esta formulación se recomienda en los Métodos de Análisis Oficial de AOAC y en los Métodos Estándares 
para el Análisis de Agua y Aguas de Desecho (APHA). Este difiere de la composición del medio deshidratado 
disponible comercialmente y es recomendable su uso. 
B.18.3.3.4 Reactivos 
Reactivo de Kovacs 
Ingredientes:  
p-imetilaminobenzaldehído 5 g 
Alcohol amílico (normal) 75 mL 
HCI concentrado 25 mL 
 
1. Disolver el p-Dimetilaminobenzal dehído en alcohol amílico normal. 
2. Adicionar lentamente el  HCl. Almacenar a 4°C. 
Para la prueba de indol 
1. Adicionar 0,2-0,3 mL del reactivo a 5 mL del cultivo de bacteria en caldo triptona. 
Se considera una prueba positiva cuando desarrolla un color rojo en la superficie del tubo. 
Reactivo de Voges-Proskauer (VP) Solución 1 
Ingredientes:  
alfa-naftol 5 g 
Alcohol absoluto 100 g 
 
Solución 2 
Ingredientes:  
Hidróxido de potasio 40 g 
Agua destilada para llevar a 100 mL 
 
B.18.3.3.4.1 Prueba de Voges-Proskauer (VP). 
1. Transferir 1 mL del cultivo a probar con 48 horas de incubación a un tubo de ensaye. 
2. Adicionar 0,6 mL de la solución 1 y 0,2 mL de la solución 2. 
3. Agitar después de la adición de cada solución. 
4. Para intensificar y acelerar la reacción adicionar unos cuantos cristales de creatina y mezclar. 
5. Dejar a temperatura ambiente. 
6. Leer resultados después de 4 horas de adicionar los reactivos. 
El desarrollo de una coloración rosa es una prueba positiva. B.18.3.3.4.2 Reactivos para la coloración de Gram Cristal violeta 
Solución A  
Cristal violeta (colorante 90%) 2 g 
Etanol 95% 20 mL 
 
Solución B 
Ingredientes:  
Oxalato de amonio 0,8 g 
Agua destilada 80 mL       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.18.3.3.4.3 Indicador rojo de metilo (R44) 
1. Mezclar la solución A y B. Almacenar por 24 horas 2. Filtrar a través de un papel filtro áspero. 
B.18.3.3.4.4 lodo de Gram 
Ingredientes:   
lodo 1g 
Ioduro de potasio (Kl) 2 g 
Agua destilada 300 mL 
 
1. Colocar el Kl en un mortero. 
2. Adicionar el yodo. 
3. Triturar con el pistilo por 5-10 segundos. 
4. Adicionar 1 mL de agua y triturar 
5. Adicionar 5 mL de agua y triturar 
6. Adicionar 10 mL de agua y triturar 
7. Vaciar esta solución en una botella de reactivo. 
8. Enjuagar el mortero y el pistilo con la ca ntidad de agua necesaria para completar 300 mL. 
B.18.3.3.4.5 Colorante de contr aste (solución concentrada)  
Ingredientes:  
Safranina O 2,5 g 
Etanol al 95% 100 mL 
 
Solución de trabajo : Adicionar 10 mL de la solución concentrada a 90 mL de agua destilada. 
B.18.3.3.4.6 Procedimiento pa ra la tinción de Gram: 
1. Fijar con calor moderado los frotis de la muestra a teñir. 2. Adicionar la solución de cristal violeta al frotis. 
3. Dejar actuar por un minuto. 
4. Lavar con agua corriente y escurrir. 5. Aplicar la solución de yodo por un minuto. 6. Lavar con agua corriente y escurrir. 7. Decolorar con etanol al 95% hasta que la coloración azul deje de fluir (aproximadamente 30 segundos). 
8. Inmediatamente después enjuagar con agua corriente 
9. Escurrir. 
10. Aplicar el colorante de contra ste (safranina) por 30 segundos. 
11. Enjuagar, escurrir y secar al aire. Examinar al microscopio. Medio EC-MUG 
Preparar el caldo EC y adicionar 50 mg de 4-metilumb elliferyl-beta-D-glucurónido (MUG) por litro antes de 
esterilizar (121°C por 15 minutos). El cal do EC-MUG está comercialmente disponible. 
B.18.3.3.4.7 Procedimiento  
B.18.3.3.4.8 Agua y hielo  
B.18.3.3.4.9 Prueba presuntiva  
B.18.3.3.3.4.10  Agitar la muestra y transferir volúmenes de 10 mL a cada uno de 5 tubos con 20 mL de 
caldo lauril sulfato triptosa de doble concentración, 5 tubos con 1 mL y 5 tubos con 0,1 mL de caldo lauril 
sulfato triptosa de concentración sencilla o las siguientes  porciones: 10 tubos con 10 mL de muestra; 5 tubos 
con 20 mL de muestra o una porción de 100 mL; consultar la tabla del inciso 2 en la preparación del “caldo 
lauril triptosa” para la concentración de caldo lauril tr iptosa requerido. Los tubos deben contener una campana 
de fermentación (Durham). 
B.18.3.3.4.11  Incubar los tubos a 35 0,5°C. Examinar los t ubos a las 24 horas y observar si hay formación 
de gas; si la formación de gas no se observa, incubar 24 horas más. 
B.18.3.3.4.12  Prueba confirmativa  
B.18.3.3.4.13  De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una asada y sembrar en un número 
igual de tubos con medio de confirmación, para la dete rminación de bacterias coliformes referirse al método 
de Determinación de bacterias coliformes. Técnica del Número más probable, para la determinación de 
bacterias coliformes fecales, sembrar en caldo EC . Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli  
como control positivo y una de Enterobacter  aerogenes  como control negativo e incubar con las muestras. 
B.18.3.3.4.14 Para la determinación de coliformes fecales incubar los tubos a 44,5 0,2°C en baño de agua 
con agitación durante 24 horas, observar si hay formac ión de gas; si la formación de gas no se observa, 
continuar la incubación 24 horas más, hacer la lectura.  Utilizar estos resultados para calcular el número más 
probable (NMP) de coliformes fecales. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.18.3.3.5 Prueba confirmativa para Escherichia coli  (por identificación bioquímica) 
B.18.3.3.5.1 Tomar una asada de cada uno de los tubos posit ivos y sembrar por estría cruzada en agar 
EMB-L para su aislamiento. 
B.18.3.3.5.2 Incubar las placas invertidas a 35°C por 18-24 horas. 
B.18.3.3.5.3 Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfología colonial: Colonias con 
centro negro, planas con o sin brillo metálico y sembrarl as en agar cuenta estándar para realizar las pruebas 
de morfología microscópica y pruebas bioquímicas . Incubar las placas a 35°C por 18-24 horas. 
B.18.3.3.5.4 Si no hay colonias con morfología típica, probar una o más colonias lo más parecido E. coli  de 
cada placa. 
B.18.3.3.5.5 Hacer un frotis y teñirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos cortos o 
cocobacilos Gram-negativos. 
B.18.3.3.6 Pruebas Bioquí micas Indol, Rojo de metilo, V oges Proskauer, Citrato (IMViC).  
a. Producción de indol Inocular un tubo en caldo triptona e incubarlo a 35°C por 24 2 horas. Adicionar 0,2-0,3 mL de reactivo de 
Kovacs. La presencia de una coloración en la superfi cie del tubo se considera una prueba positiva. 
b. Voges-Proskauer (VP) Inocular un tubo con caldo MR-VP e incubar a 35°C por 48 2 horas. Transferir 1 mL a un tubo de 13X100 
mm. Adicionar 0,6 mL de solución de alfa naftol y 0,2 mL de hidróxido de potasio al 40% y agitar. Se considera 
una prueba positiva cuando se desarrolla un color rosa. 
c. Rojo de metilo Inocular un tubo adicional con caldo MR-VP e incubar a 35°C por 48 2 horas. Adicionar 5 gotas de 
solución de rojo de metilo. Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color 
amarillo es una prueba negativa. 
d. Citrato Inocular un tubo con caldo citrato de Koser un inóculo ligero para evitar turbiedad en el tubo. Incubar a 
35°C por 96 horas. El desarrollo del cultivo que se obser va con la turbiedad del medio, se considera una 
prueba positiva. 
e. Interpretación de resultados Todos los cultivos que: 1. Fermenten la lactosa con producción de gas dentro de las 48 horas a 35°C; 2. 
Sean bacilos o cocobacilos Gram negativos no esporulados  y 3. Se obtenga las siguientes combinaciones 
para el IMVIC: 
Biotipo 1--, o Biotipo 2 ---, son consideradas como E. coli. Calcular el NMP de E. coli  basada en la 
proporción de los tubos positivos de caldo EC. 
B.18.3.3.7 Prueba Confirmativa para Escherichia  coli (por el método de EC-MUG)  
Fundamento. Alrededor del 94% de las cepas de E. coli  incluso las cepas no productoras de gas producen la enzima 
beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato es pecífico 4-metilu mbelliferyl-beta-D -glucurónido (MUG) 
en 4-metilumbelliferona (MU), que al ser expuesto a una f uente de luz ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) 
produce una fluorescencia azul, fácil de observar. Cuando el MUG es incorporado al caldo EC se puede 
identificar E. coli . 
B.18.3.3.8 Seguir lo indicado para Prueba Presuntiva B.18.3.3.9 Prueba Confirmativa  
De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una asada y sembrar en un número igual de tubos con 
medio de confirmación EC-MUG. Inocular dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli  como control 
positivo y K. pneumoniae  como control negativo. Incubar a estos tubos con uno adicional de caldo EC-MUG 
sin inocular a 44,5 0,5°C en baño de agua con los tubos  de las muestras durante 24 horas, observar si hay 
formación de gas; si la formación de gas no se observa continuar la incubación 24 horas más. Irradiar los 
tubos con una fuente de luz UV, observar fluorescencia y hacer la lectura. Utiliz ar estos resultados para 
calcular el número má s probable (NMP) de E. coli . 
B.18.3.3.10 Alimentos  
B.18.3.3.10.1 Prueba Presuntiva.  
B.18.3.3.10.2 Preparar la muestra como se indica en el método Preparación y dilución de muestras de 
alimentos para análisis microbiológico; y de acuerdo con el  tipo de producto, utilizar las diluciones apropiadas, 
según se indica en el procedimiento de la densidad microbiana por la técnica del número más probable. 
Utilizar como medio de enriquecimiento caldo la uril triptosa y continuar como anteriormente  
B.18.3.3.10.3 Prueba Confirmativa.  Continuar como anteriormente 
B.18.3.3.10.4 Prueba Confirmatoria.  
Confirmar la presencia de Escherichia coli  en por lo menos el 10% de las pruebas con resultados positivos 
a coliformes fecales por cultivo en placas de agar McConkey a partir de los tubos que demostraron la 
presencia de gas en la prueba confirmativa. Incubar la s placas a 35 0,5°C durante 24 2 horas, observar las 
colonias típicas fermentadoras de color rojo rodeadas de un halo opaco de precipitación de sales biliares. 
Seleccionar 1 o más colonias aisladas y pasar a tubos de fermentación con caldo lauril triptosa, continuar como se indica anteriormente. Hacer tinción de Gram para observación de la morfología de las colonias.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.18.3.3.11  Interpretación de Resultados.  
La formación de gas en el tubo de fermentación secund ario dentro de las 48 3 horas y la demostración de 
bacilos Gram (-) no esporulados confir ma un resultado positivo de la prueba demostrándose la presencia del 
grupo coliforme. 
B.18.3.3.12 Cálculos  
Calcular la densidad microbiana en número más probable conforme al procedimiento señalado 
anteriormente, para estimar la població n de bacterias coliformes y bacterias coliformes fecales de acuerdo con 
las diluciones empleadas y expresar en NMP/g o mL para alimentos y NMP/100 mL para agua. En el caso de 
usar volúmenes de 20 mL de muestras de agua en 5 tu bos o 10 mL de muestras de agua en 10 tubos, utilizar 
las siguientes tablas: 
TABLA 1. Indice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados 
positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con 20 mL de muestra de agua o hielo. 
No. de Tubos  95% de Límite de Confianza (aproximado) 
Positivos NMP/100 mL Inferior Superior 
0 1,1 0 3,0 
1 1,1 0,05 6,3 
2 2,6 0,3 9,6 
3 4,6 0,8 14,7 
4 8,0 1,7 26,4 
5 8,0 4,0 Infinito 
 
TABLA 2. Indice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados 
positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con 10 mL de muestra de agua o hielo. 
No. de Tubos  Positivos NMP/100 mL 95% de Límite de Confianza (aproximado) 
Inferior Superior 
0 1,1 0,0 3,0 
1 1,1 0,03 5,9 
2 2,2 0,26 8,1 
3 3,6 0,69 10,6 
4 5,1 1,3 13,4 
5 6,9 2,1 16,8 
6 9,2 3,1 21,1 
7 12,0 4,3 27,1 
8 16,1 5,9 36,8 
9 23,0 8,1 59,5 
10 23,0 13,5 Infinito 
 
B.19 Determinación de Humedad en leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado, sometidos 
a deshidratación. 
B.19.1 Principio del Método.  
Este método se basa en la pérdida de peso debido a la evaporación del agua bajo condiciones 
establecidas. 
B.19.2 Equipo.  
B.19.2.1  Balanza analítica con sensibilidad de 0, 1 mg. 
B.19.2.2  Estufa eléctrica con regulador de temperatura a 100 – 102º C. 
B.19.3 Materiales.  
B.19.3.1 Desecador de vidrio con sílica gel con indicador de humedad u otro desecante activo. 
B.19.3.2 Cápsulas de vidrio, acero inoxidable, níquel o al uminio de 50 a 90 mm de diámetro y de 12 a 25 
mm de altura provistos de tapa que cierre herméticamente. 
B.19.3.3 Pinzas metálicas especiales para las cápsulas. 
B.19.4 Procedimiento. 
B.19.4.1 Preparación de la Muestra.  
B.19.4.1.1  Cuando se tome la muestra operar tan rápido como sea posible. Evitar la absorción de 
humedad del medio ambiente durante la preparación de la  muestra. Mezclar el producto transfiriéndolo a un 
frasco seco y bien tapado con capacidad aproximada al doble del tamaño de la muestra. Mezclar cuidadosamente agitando e invirtiendo repetidamente. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.19.4.1.2  Sólo para muestras que presentan grumos o te rrones, tamizar la muestra a través de una malla 
número 20 y si es necesario frotar el material  a través de la malla y golpear vigorosamente. 
B.19.4.2 Preparación de las Cápsulas.  
Secar las cápsulas destapadas en una estufa controlada a 100-102ºC por una hora. Taparlas e 
introducirlas en un desecador y dejarlas enfriar a te mperatura ambiente. Pesarl as con una precisión de 0,1 
mg. 
B.19.4.3 Secado de las Muestras.  
En las cápsulas previamente secadas y pesadas, pe sar con exactitud y distribuir homogéneamente de 1 a 
3 g de muestra. Secar en estufa (100-102ºC) du rante 4 horas consecutivas, dejando las cápsulas 
descubiertas, pero manteniendo las tapas correspondien tes identificadas cerca de ellas. Al término del 
periodo, cubrir las cápsulas con sus respectivas tapas e introducirlas en el desecador. Enfriar a temperatura 
ambiente y pesar. 
B.19.5 Cálculos.  
 
En donde: 
mo = masa en gramos de la cápsula y la tapa. 
m1 = masa en gramos de la cápsula y tapa con la muestra antes de secar. 
m2 = masa en gramos de la cápsula y la tapa con la muestra después de secar. 
B.19.6  Expresión de Resultados. 
% Humedad 
 
B.20. Determinación de Clostridium botulinum  y sus Toxinas en Alimentos y Muestras Clínicas 
B.20.1 Fundamento  
Demostrar la presencia de toxina botulínica por inyecci ón a ratones con extractos de alimentos o muestras 
clínicas y observar el efecto letal. Comprobar con el antisuero específico la neutralización de la toxina. La 
determinación de C botulinum  se basa en el cultivo de muestras de alimentos y clínicas en condiciones de 
anaerobiosis en medios específicos y la subsecuente demostración de la toxina. 
20.2 Toma y manejo de muestras 
B.20.2. Alimentos  
Las muestras pueden tomarse de sobrantes de los alimentos sospechosos o de recipientes cerrados. 
Cuando están involucrados alimentos comerciales, es  importante observar la etiqueta, número de lote del 
fabricante, o cualquier dato relevante que p ueda identificar el origen de la muestra. 
B.20.2.2  Clínicas  
Las muestras clínicas para el análisis incluyen: mate ria fecal, aproximadamente 10 g, contenido gástrico 
(ajustar aproximadamente a pH 6 con hidróxido de sodi o 0,1) y suero (colectado de 20 mL de sangre ANTES 
DE ADMINISTRAR LA ANTITOXINA). C uando se sospecha de botulismo inf antil es importante analizar las 
heces. Si fuera necesario, las manchas o partes sólidas de los pañales. 
B.20.3 Envío de muestras  
B.20.3.1  Para un envío seguro, el interior de los empaques deben contener: 
(i) Un primer recipiente impermeable al agua. 
(ii) Un segundo recipiente impermeable al agua. (iii) Material absorbente (por ejemplo unicel) entre los dos contenedores, suficiente para absorber el 
contenido entero del primer recipiente. 
B.20.3.2  De preferencia enviar el material en refrigeración en paquetes que contengan recipientes con gel 
congelado. Para una máxima preservación de la toxi na el recipiente secundario debe empacarse en una caja 
de unicel con recipientes de gel congelado. Sin embargo,  si se sospecha retraso en el envío, el material debe 
congelarse y empacarse con hielo seco. 
B.20.4  Materiales, Equipo y Reactivos 
B.20.4.1 Flujo laminar 
B.20.4.2 Propipeta o bulbo B.20.4.3 Lentes de seguridad 
B.20.4.4 Guantes de cirujano 
B.20.4.5 Tubos de centríf uga de 40 mL de capacidad 
B.20.4.6 Centrífuga refrigerada  con capacidad de 15 000 x g 
B.20.4.7 Jeringas desechables de 19 x 15.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.20.4.8 Filtros desechables de 0,45  m. 
B.20.4.9 Vortex B.20.4.10 Licuadora 
B.20.4.11 Potenciómetro 
B.20.4.12 Incubadora 30º, 35ºC B.20.4.13 Balanza B.20.4.14 Tubos de ensayo de 13 x 100 mm B.20.4.15 Jeringas para tuberculina B.20.4.16 Equipo para tinción de Gram 
B.20.4.17 Ratones de preferencia he mbras de 20 a 30 g cepa CFI o NIH 
B.20.4.18 Antisuero trivalente ABE B.20.4.19 Antisuero monovalente A,B,E y F B.20.4.20 Tripsina al 1% p/v B.20.4.21 Tripsina al 1,4% 
B.20.4.22 Solución reguladora de fosfatos con gelatina 
B.20.4.23 Solución de tetraciclina al 0,2% B.20.4.24 0,1 N NaOH o NaHCO3 satur ado para limpiar pos ibles derrames. 
B.20.4.25 Tripsina al 1% p/v B.20.4.26 Tripsina al 1,4% B.20.4.27 Medio carne cocida (CMM) 
B.20.4.28 Caldo tripticasa peptona gluc osa extracto de levadura (TPGY). 
B.20.4.29 Caldo tripticasa peptona glucosa ex tracto de levadura (TPGYT) con tripsina 
B.20.4.30 Agar aislamiento Clostridium  botulinum  (CBI) 
B.20.4.31 Agar hígado de ternera yema de huevo B.20.4.32 Agar esporulación de Eklund 
B.20.4.33 Baño de agua (75-100ºC) 
B.20.4.34 Etanol al 50% o absoluto B.20.4.35 Jarras y sistema de anaerobiosis 
B.20.5 Preparación de Medios de Cultivo  
B.20.5.1  Medio de la Carne cocida (CMM).  
FORMULA 
Corazón de res 454 g 
Proteosa peptona 20 g Bactodextrosa 2 g Cloruro de sodio 5 g Extracto de corazón de res 1000 mL 
Picar el corazón de res, sumergir en agua y calentar ha sta ebullición durante 1 h. Enfriar, ajustar el pH a 
7,0, y hervir 10 minutos. Filtrar a tr avés de muselina y presionar para drenar el exceso de líquido de la carne. 
Guardar la carne cocida. Agregar los ingredientes al filt rado y ajustar a pH 7,0, agregar agua hasta hacer 1000 
mL. Filtrar a través de papel filtro poroso. Se puede conservar el caldo y la carne en congelación por 
separado. Agregar el corazón cocido y picado a tubos de ensaye de 18 x 150 mm o 20 x 150 mm a una altura 
de 1,2 a 2,5 cm del tubo y adicionar de 10 a 12 mL del ca ldo. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121ºC. Si 
este medio se almacena por más de 12 h después de su preparación, debe calentarse a ebullición por 10 
minutos y enfriar antes de su uso. 
B.20.5.2  Caldo Tripticasa Peptona Glucosa Extracto de Levadura (TPGY).  
FORMULA 
Tripticasa 50 g 
Peptona 5 g Glucosa 4 g Extracto de levadura 20 g Tioglicolato de sodio 1 g 
Agua destilada 1000 mL 
Disolver los ingredientes en agua calie nte, enfriar y ajustar a pH 7,2. Di stribuir en volúmenes de 21 mL en 
tubos de 20 x 150 mm con tapón de rosca. Esterilizar a 121 ±1ºC/15 min, enfriar a la temperatura ambiente y 
almacenar a 4ºC hasta 6 semanas. Si se almacena más de 12 h, tratarlos con calor como se indica en 
B.19.9.1. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.20.5.3  Caldo Tripticasa Peptona Glucosa Extracto de Levadura adicionado con Tripsina (TPGYT).  
FORMULA Tripticasa 50 g 
Peptona 5 g 
Glucosa 4 g 
Extracto de levadura 20 g 
Tioglicolato de sodio 1 g 
Agua destilada 1000 mL 
Disolver los ingredientes en agua calie nte, enfriar y ajustar a pH 7,2. Di stribuir en volúmenes de 21 mL en 
tubos de 20 x 150 mm con tapón de rosca. Esterilizar a 121±1ºC/15 min, enfriar a la temperatura ambiente, y 
almacenar a 4ºC hasta 6 semanas. Si se almacena más de 12 h tratarlo con calor como se indica en B.20.9.1. 
Agregar 1,5 mL de solución de tripsina al 1,4% por cada tubo con 21 mL del medio TPGY. Mezclar muy 
suavemente. Este medio no se puede almacenar. 
B.20.5.4  Agar Hígado de Ternera Yema de huevo.  
a) Agar Hígado de ternera. 
FORMULA 
Infusión de hígado 50 g Infusión de ternera 500 g Proteosa peptona 20 g Neopeptona 1,3 g 
Triptona 1,3 g 
Dextrosa 5,0 g Almidón soluble 10,0 g Caseína isoeléctrica 2,0 g Cloruro de sodio 5,0 g 
Nitrato de sodio 2,0 g 
Gelatina 20,0 g Agar 15,0 g Agua destilada 1000 mL Calentar con agitación constante hasta dilución comple ta. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121ºC, 
pH final 7,3  0,2. Agregar por cada 500 mL del medio base fundido 40 mL de la suspensión salina de yema 
de huevo. Mezclar y vaciar a cajas de Petri estériles de 15 x 100 mm (aproximadamente 15 – 20 mL). Secar 
las placas a temperatura del laboratorio  por 2 días o a 35ºC por 24 horas. Verificar esterilidad de las placas. 
Almacenar en refrigeración. 
b) Emulsión al 50% de Yema de huevo. 
Lavar los huevos con un cepillo suave y dejar escurrir. Sumergirlos por 1 hora en solución de cloruro 
mercúrico al 0,1%, escurrir. Sumergir  en una solución de etanol al 70% y dejar durante 30 minutos, escurrir. 
Abrir los huevos en condiciones asépticas y descartar las claras. Colocar las yemas en un recipiente estéril y 
mezclar con igual volumen de solución salina fisiológica (0,85%) estéril. Guardar en refrigeración hasta su 
uso. 
B.20.5.5 Agar para Asilamiento de C. botulinum  (CBI).  
El agar CBI es una modificación del medio agar McClung Toabe para el aislamiento selectivo y diferencial 
de C. botulinum , el cual puede aislarse de los cultivos toxi génicos de CMM, provenientes de muestras de 
heces, líquido gástrico o alimentos. El me dio de agar CBI contiene: Cicloserina 250 μg/ mL, sulfametoxazol 76 
μg/ mL y trimetroprim 4 μg/ mL en la base del medio agar McClung Toabe yema de huevo. 
Agar McClung Toabe 
FORMULA 
Proteosa peptona 40 g 
Bacto dextrosa 2 g Fosfato de sodio dibásico 5 g Fosfato de potasio monobásico 1 g Cloruro de sodio 2 g 
Sufato de magnesio 0,1 g 
Agar 25 g Agua destilada 1000 mL pH final 7,6 +0,2 a 25ºC 
Extracto de levadura 5 g Suspensión de yema de huevo 100 mL       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
SOLUCION DE ANTIBIOTICOS 
Cicloserina 250 mg o 25 mL de una solución al 1,0% 
Sufametoxasol 76 mg o 4 mL de una solución al 1,9% 
Disolver el sulfametoxazol en solución 2 N de NaOH. 
Lactato de Trimetroprim 4 mg o 4 mL de una solución al 0,1% por cada 100 mL de medio base 
Esterilizar por filtración. 
Preparación: 
Agregar el extracto de levadura y los ingredientes del agar McClug Toabe a un matraz de 2 L con 900 mL 
de agua destilada, mezclar y calentar hasta disolución. Ajustar a pH 7,5. Esterilizar 15 minutos a 121ºC en 
autoclave. Enfriar a 55ºC en baño de agua y en condiciones asépticas agregar 100 mL de la suspensión al 
50% de yema de huevo. Agregar los volúmenes necesario s para conservar la concentración de antibióticos 
por litro de medio base. Mezclar y distribuir en cajas de Petri estériles de 15 x 100 mm aproximadamente 15-
20 mL por placa. Dejar solidificar y colocar en bolsas de plástico. Guardar en refrigeración hasta su uso. Estas 
placas pueden almacenarse hasta 1 mes aproximadamente. 
B.20.5.6 Agar para Esporulación de Eklund.  
FORMULA Tripticasa 4 g 
Peptona 1 g 
Glucosa 0,1 g 
Extracto de levadura 1 g 
Agar 4 g 
Agua destilada 200 mL 
Disolver los ingredientes en agua caliente, excepto el ag ar, ajustar a pH 7,8, agregar el agar. Esterilizar a 
121±1ºC/15 min. y enfriar a 50ºC. Agregar 2 mL de solu ción al 10% de clorhidrato de cisteína, esterilizada por 
filtración; 12 mL de emulsión de yema de huevo y 2 mL  de sangre citratada de bovino o borrego. Preparar las 
placas. Este medio es particularmente adecuado para la esporulación de C. botulinum  del grupo II. 
B.20.6  Diluyentes y Reactivos  
B.20.6.1  Solución Amortiguadora de Fosfatos con Gelatina  
FORMULA 
Gelatina 2 g 
Na2HPO4 4 g 
Agua destilada 1000 mL 
Ajustar a pH 6,2 con solución de ácido clorhídrico 4N . Distribuir en frascos con tapón de rosca, esterilizar 
por vapor, enfriar a la temperat ura ambiente y almacenar a 4ºC. 
B.20.6.2 Solución de Tetraciclina al 0,2%.  
Disolver 50 mg en 25 mL del diluyente fosfato de gelati na, mantener a 4ºC hasta 4 días. Si se requiere 
almacenar por más tiempo, congelar en pequeñas porciones. Evitar la recongelación. 
B.20.6.3 Solución de Tripsina (1:250).  
a) Solución al 1% Disolver 200 mg en 20 mL de agua destilada. No almacenar. 
b) Solución al 1,4%. 
Disolver 280 mg en 20 mL del diluyente fosfato de gelatina, filtrar a través de membrana de 0,45  m. Usar 
vacío para obtener efecto parcial  de deareación del filtrado. 
B.20.6.4  Antisueros  
A, B, E; A, B; A, B, E, C*, D*, F. Investigación de sospecha de botulismo en animales. 
B.20.7 Procedimiento  
B.20.7.1 Examen Microscópico de los Alimentos Sospechosos  
Este examen no es esencial para la detección de C. botulinum , pero facilita la selección de los alimentos 
sospechosos para el análisis. Preparar frotis directos y hacer tinción de Gram. Si el alimento contiene exceso 
de grasa, sumergir los portaobjetos fijados al calor por 1-2 minutos en xilol antes de teñir. 
B.20.7.2 Preparación del Material para el Análisis de las Toxinas.  
B.20.7.2.1  Alimentos Líquidos:  
Centrifugar aproximadamente 20 mL a 15000 x g durante 20 minutos. Decantar cuidadosamente el 
sobrenadante o extraer con una jeringa desechable de 19  x 25 mm. Cubrir el tubo y conservar a 4ºC para 
hacer el cultivo del sedimento posterior mente. Repetir la centrifugación, si  el sobrenadante aún no está claro. 
Esterilizar el sobrenadante por filtra ción a través de la membrana de 0,45 μ
m adaptada a una jeringa 
desechable. Ocasionalmente puede requer irse una prefiltración durante el pr oceso de filtración. El propósito 
de la esterilización es prevenir una infección y a su vez una muerte inespecífica de los ratones inoculados. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.20.7.2.2 Alimentos Semilíquidos:  
Colocar 10-15 g en tubos de centrífuga de 40 mL, agregar igual volumen de solución reguladora de 
fosfatos con gelatina y homogenizar en vortex. 
Centrifugar y proceder  como en B.20.7.2.1. 
B.20.7.2.3 Alimentos Sólidos:  
Colocar 10-20 g en un vaso de licuadora o mortero. Ag regar suficiente solución reguladora de fosfatos con 
gelatina para obtener cuando menos 10 mL de sobrenad ante después de la centrifugación. La dilución del 
alimento deberá estar entre 1:1 a 1:3.  Licuar a velocidad alta por 1-2 minutos. Los vasos de licuadora deberán 
cerrarse herméticamente para prevenir la formación de aer osoles. Centrifugar y proceder como en B.20.7.2.1, 
B.20.7.2.2 y B.20.7.2.3. 
B.20.7.2.4 Alimentos Enlatados:  
Lavar y secar la superficie de la lata. Cubrir la ta pa con etanol al 96%, dejar  por 2 minutos; decantar y 
flamear el alcohol residual. Colocar la lata en una bolsa de plástico para prevenir la dispersión de aerosoles  y 
abrir con un abrelatas estéril. Proceder co mo en B.20.7.2.1, B.20. 7.2.2 y B.20.7.2.3. 
B.20.7.2.5 Suero  
Idealmente debe obtenerse 10 mL de suero. El suero usado sirve sólo  antes del tratamiento con el 
antisuero. Si está turbio, centrifugar a 15,000 x g durante 20 minutos, dec antar el sobrenadante. 
B.20.7.2.6 Heces  
Colocar 10 g en un tubo de centrífuga de 40 mL de capa cidad, agregar suficiente cantidad de solución 
reguladora de fosfatos con gelatina para obtener al menos 10 mL de sobrenadante después de la 
centrifugación. Mezclar en vortex durante 2-3 minutos. Conservar la mezcla a 4ºC por 2 h. Homogeneizar en 
vortex. Centrifugar y proceder como en B.20.7.2.7. La muestras líquidas, enemas y el contenido intestinal se 
pueden centrifugar directamente con poco o sin la adició n de la solución reguladora de fosfatos con gelatina. 
Ocasionalmente, los sobrenadantes de muestras clínic as no se pueden filtrar, en estos casos, agregar 1 
mL de una solución al 0,2% de tetraciclina por cada 9 mL del sobrenadante. 
B.20.7.2.8  Contenido Gástrico  
Medir el pH y ajustar, si es necesario, a 5,5-6,5 con una solución 1N de NaOH. Evitar que el valor de pH 
sea mayor a 7,0. Centrifugar y proceder como en B.20.7.2.1. 
B.20.7.2.9 Otras Muestras Clínicas.  
Tratar las muestras semilíquidas y só lidas como en B.20.7.2.2 y B.20.7.2.3 
B.20.8  Análisis de las toxinas  
B.20.8.1 Procedimiento General  (se aplica cuando no se sospecha de alguna toxina en particular). 
B.20.8.1.1  Si se dispone de suficiente material, distribuir el filtrado en volúmenes de 1,2 mL dentro de 6 
tubos de ensaye de 13 x 100 mm, marcados del 1-6. A los tubos marcados 2-5, agregar 0,12 mL de los 
siguientes antisueros: monovalente A, B o E y trivalente  ABE. Mezclar en vortex y dejar reposar a temperatura 
ambiente por 45 minutos. 
B.20.8.1.2  Al tubo 6, agregar 0,12 mL de una solución de tripsina al 1%. Incubar a 35ºC por 60 minutos. El 
tubo 1 no se adiciona. Ver tabla No. 2. 
B.20.8.1.3  Si el volumen de material es insuficiente para co mpletar la prueba, se puede omitir el tubo  No. 
6. 
B.20.8.1.4  Inyectar dos ratones (20-30 g) intraperitonealme nte por tubo, con los volúmenes siguientes: 0,5 
mL del tubo 1,0 y 0,55 mL de los tubos 2-6. Observ ar a los ratones por 72 h. Los síntomas típicos de 
botulismo son: pelo erizado, estrec hamiento de cintura, dificultad para respirar, parálisis de los miembros 
posteriores y parálisis general antes de la muerte. Si  estos síntomas se presentan después de 72 h, observar 
a los animales por otras 24 h hasta completar un total de 4 días. 
B.20.8.1.5  Si mueren 1 o 2 ratones repetir la inyección. U na muestra se considera positiva para la toxina si 
2/2 o > o = 2/4 ratones mueren, si se  presenta la muerte de los animales  dentro de las 2 primeras horas se 
pueden considerar que son debidas a otras causas diferentes a toxina botulínica. 
B.20.8.1.6  Si solamente mueren los ratones inoculados con las muestras tratadas con tripsina, indica la 
presencia de toxina de grupo II y continuar como se indica en el punto B.20.8.3. 
B.20.8.1.7  Si no se neutralizara la toxina con los antisueros A, B y E, indica 
a) la presencia de toxinas no relacionadas en es pecial cuando se presentan síntomas atípicos; 
b) Cantidad insuficiente de antisuero en presencia de altos niveles de toxina (difícil en caso de muestras 
clínicas y en la mayoría de los alimentos tóxicos; o 
c) incluido un serotipo no común. Si la muestra probada produce síntomas típicos de botulismo y sin 
embargo no es neutralizada con los antisueros, proceder de la forma siguiente: 
i) En casos de muy alta toxicidad, diluir la muestra 1: 10 con solución amortiguadora de fosfatos gelatina y 
repetir la prueba de neutralización. 
ii) Incluir el antisuero F en la prueba de neutralización. 
B.20.8.2  Muestras Sospechosas de contener Toxina Grupo V (A o B).  
Proceder como se indica anteriormente omitiendo el tubo No. 6.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.20.8.3 Muestras Sospechosas de contener Toxina Grupo II (B o E).  
Distribuir en cada uno de los tubos marcados del 1 al 4,  1,2 mL del filtrado. A cada tubo agregar 0,12 mL 
de una solución de tripsina al 1%, incubar a 35ºC por 60 minutos. A los tubos marcados del 2 al 4 agregar 0,12 mL de uno de los siguientes antisueros monoval ente B o E y trivalente A, B y E. Mezclar y continuar 
como se indica anteriormente  Inyectar 0,5 mL del tubo No. 1 y 0,6 mL de los tubos 2 al 4. 
Si no hubiese material disponible suficiente, omitir  los tubos con los antisueros monovalentes B y E. 
B.20.8.4 Determinación de la Dosis Letal en ratón (DLR)  
Si se quiere titular la toxina, hacer diluciones decim ales de los sobrenadantes tratados, y no tratados con 
tripsina, generalmente se hacen hasta 1:1000 dependiendo del nivel de toxina esperado, pero nunca excediendo 1:10000. Inyectar 2 ratones por dilución. La recíproca de la dilución más alta que causa la muerte 
multiplicada por 2, es la DLR. Ejemplo: si la muerte ocurre a una dilución de 1:100 pero no de 1:1000, el nivel 
de toxina es de 200 a 2000 DLR por mL. 
B.20.9  Identificación de Clostridium  botulinum . 
B.20.9.1 Quitar el exceso de aire disuelto en los tubos preparados con medio caldo carne cocida (CMM) y 
caldo glucosa peptona tripticasa extracto de levadur a (TPGY), mediante calentamiento en baño de agua a 
ebullición por 10 minutos y enfriar antes de usarlos. Asegur arse de que las tapas de los tubos estén flojas al 
hacer este proceso. 
B.20.9.2  Agregar a los tubos de TPGY 1,5 mL de una solución de tripsina al 1,4% y mezclar suavemente y 
marcar con una T (TPGYT). A los tubos de CMM marcar los con 1 y 2; y 3 y 4 a los tubos con TPGYT. Ver 
tabla No. 3. 
B.20.9.3  Cualquier tipo de muestra incluyendo los sedimentos, pueden servir como inóculo; éstos además 
tienen la ventaja de que no contienen inhibidores potenciales, los cuales se han eliminado junto con el 
sobrenadante, de aquí que los sedimentos pueden c ontener grandes cantidades de microorganismos por 
unidad de volumen. 
B.20.9.4  Colocar aproximadamente 1 g de inóculo a cada uno de los tubos 1 a 3, calentar el tubo No. 2 en 
baño de agua a 75ºC por 20 minutos para seleccionar esporas resistentes al calor. 
B.20.9.5  Para seleccionar esporas sensibles o resisten tes al calor, suspender aproximadamente 1 g del 
inóculo en un volumen de 10 a 20 mL de solución de etanol al 50%, o mezclar el inóculo, cuando la muestra 
es líquida 1:1 con etanol absoluto o de 96%. Mantener las suspens iones o mezclas a temperatura ambiente 
por 60 minutos, centrifugar a 14000 x g durante 15 mi nutos, y pasar el sedimento al tubo No. 4. 
B.20.9.6 Incubar los tubos a 35ºC por 24 horas y a 30ºC  por 4 días. Centrifugar aproximadamente 10 mL 
de cultivo a 15000 x g durante 20 minutos. Esterilizar el sobrenadante por filtración a través de membranas de 
0,45 μ m, con ayuda de una jeringa desechable. Diluir el filtrado 1:5 con solución am ortiguadora de fosfatos 
con gelatina. Continuar como se indica en B.20.6.1 para el ensayo de toxina pero omitiendo el tubo No. 6. 
B.20.9.7  Si fuera necesario neutralizar con antisuero tipo F,  el cual es relativamente débil, determinar la 
toxicidad y diluir con solución amortiguadora de fosf atos de gelatina el sobrenada nte a aproximadamente 10 
DLR/mL. Mezclar volúmenes de 1,25 mL con 0,25 mL de ant isuero F. Inyectar 0,5 mL sin antisuero y 0,6 mL 
con antisuero. 
B.20.10 Aislamiento de Clostridium  botulinum  a partir de Cultivos Toxigénicos.  
B.20.10.1  El aislamiento de cepas productoras de botulismo, se facilita si se dan todas las condiciones 
para la producción de toxina. Si los cultivos de los tubos Nos. 2 o 4 son toxigénicos, uno de éstos debe seleccionarse. Sembrar directamente en agar hígado de ternera yema de huevo o en agar para el aislamiento de Clostridium  botulinum  (CBI), en estos medios no se ha obser vado un enmascaramiento por microflora 
atípica. En el caso de que predominara flora atípica combinada con la presencia de algunas esporas de C. 
botulinum
, el inóculo debe hacerse previo tratamiento c on etanol. En el caso de ausencia de esporas, 
reincubar los tubos de enriquecimiento o pasar al medio de esporulación (Eklund). 
B.20.10.2 Aislamiento de C. botulinum  de Cultivos con Presencia Moderada de Microorganismos 
Atípicos.  
B.20.10.2.1  Hacer una tinción de Gram de los cultivos tóxico s. Si los cultivos 2 y 4 son tóxicos, pueden 
excluirse los tubos 1 y 3. Seleccionar los cultivos sobre las siguientes bases: 
i) Bacilos gram positivos atípicos. 
ii) Número de bacilos gram positivos con esporas. Si en la tinción se observa un mínimo de 10% de bacilos 
gram positivos, inocular una asada en agar hígado de ternera-yema de huevo y en agar CBI. Incubar en 
anaerobiosis a 30ºC por 48 horas. 
NOTA: Es importante tomar en cuenta que cultivos viejos de C. botulinum  pueden aparecer como Gram 
negativos. 
B.20.10.2.2  Seleccionar 5 colonias bien aisladas sobre el agar hígado de ternera yema de huevo que 
presenten un halo opaco indicativo de lipolisis y pasar las a caldo TPGY. Seleccionar otras 5 colonias del 
medio agar para el aislamiento de C. botulinum  rodeadas de un halo opaco con brillo aperlado y pasar a caldo 
TPGY. Incubar a 30ºC durante 5 días. Hacer pruebas para  determinar las toxinas como se indica en B.4.6, 
inocular por duplicado los cultivos toxigénicos en agar hígado de ternera yema de huevo, incubar una placa en anaerobiosis y otra en aerobiosis para asegurar pureza.  Nota: Es necesario inocular un gran número de 
colonias, debido a que C. botulinum  puede enmascararse por otros clostr idia que presentan características 
coloniales similares. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.20.10.3 Aislamiento de C. botulinum  de Cultivos con Grandes Cantidades de Microorganismos 
Atípicos.  
B.20.10.3.1  Si en la tinción de Gram se observan bacilos gram positivos con esporas, mezclar 2 mL del 
cultivo, con 2 mL de etanol al 96%, y dejar a temp eratura ambiente por 60 minutos. Inocular una asada en 
agar hígado de ternera yema de huevo y en agar aislamiento de C. botulinum , y continuar como se indica  en 
B.20.10.1 
B.20.10.3.2  Si no se presenta esporulación en el medio de enriquecimiento, reincubar por otra semana a 
30ºC o extender 0,1 mL del cultivo en agar de esporulació n de Eklund, e incubar las placas en anaerobiosis a 
30ºC hasta que las esporas estén presentes en cantidades significativas (generalmente se requieren de 5 a 10 
días. Suspender una asada del cultivo en aproximadamen te 2 mL de etanol al 50%, dejar a temperatura 
ambiente por 60 minutos, e inocular en agar hígado de te rnera yema de huevo y en agar CBI. Continuar como 
se indica en B.20.10.1. 
TABLA No. 1 ALGUNAS CARACTERISTICAS DE C. BOTULINUM  GRUPOS I Y II 
GRUPO CRECIMIENTO 
POR ABAJO DE 10ºC TEMPERATURA 
PARA 
CRECIMIENTO Y 
PRODUCCION 
DE TOXINA     
I A,B, Fb + + - 30 - 37ºC 
II Bc,E,F b  + - + 26 - 30ºC 
* Algunas cepas de los tipos A y B pueden presentar subtipos A-B, A-F. B-A.  B-F, cada una produce una 
toxina en mayor cantidad (representada por la primera letra del subtipo). 
b No común 
c No común en Norteamérica 
TABLA No. 2 PRUEBA DE NEUTRALIZACION Y TOXICIDAD EN RATON 
TUBO No. Volumen de muestra 
(mL) Antisuero Volumen del 
Antisuero ( mL) Volumen iunoculado  ( 
mL) 
1 1,2 - - 0,5 
2 1,2 AntiA 0,12 0,55 
3 1,2 AntiB 0,12 0,55 
4 1,2 AntiE 0,12 0,55 
5 1,2 Anti A,B,E 0,12 0,55 
6 1,2 Tripsina 0,12 0,55 
 
TABLA No 3 ENRIQUECIMIENTO 
TUBO No. MEDIO TRATAMIENTO 
1 CMM NINGUNO 
2 CMM CALOR 
3 TPGYT NINGUNO 
4 TPGYT ALCOHOL 
 B.21. Determinación de Acidez en Cremas y Productos Lácteos Fermentados y Acidificados 
B.21.1  Principio del Método . 
La acidez se mide con base a una titulación alcalimét rica con NaOH 0.1 N utilizando fenolftaleína como 
indicador. 
B.21.2  Equipo. 
B.21.2.1 Potenciómetro (opcional) 
B.21.2.2 Balanza analítica con una precisión de 0,1 mg. 
B.21.2.3 Agitador magnético 
B.21.3 Materiales.  
B.21.3.1 Probeta graduada de 100 mL. B.21.3.2 Pipeta volumétrica de 9 mL (estándar para crema). B.21.3.3 Matraz Erlenmeyer de 125 mL B.21.3.4 Bureta de 25 o 50 mL graduada en 0.1 mL. B.21.3.5 Barra magnética (opcional).       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.21.4  Reactivos. 
Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por agua se 
entiende agua destilada recientemente hervida. 
B.21.4.1  Solución de hidróxido de sodio (NaOH) 0.1 N valorada. 
B.21.4.2 Solución indicadora de fenolftaleína (C 29H14O4) al 1%. 
B.21.5 Procedimiento . 
B.21.5.1  Medir 9 mL (si se emplea la pipeta estándar  de crema) o pesar 18 g de muestra perfectamente 
mezclada en un matraz Erlenmeyer o una cápsula de porc elana. Si la muestra es medida volumétricamente, 
enjuagar la pipeta con veces su volumen de agua y adicionar los enjuagues al matraz o cápsula y mezclar 
bien. 
B.21.5.2 Si la muestra es pesada, añadir 2 veces el peso de la misma en agua y mezclar bien. 
B.21.5.3 Adicionar 0.5 mL de indicador de fenolftaleína y titular con solución de hidróxido de sodio 0.1 N 
hasta la aparición de un color rosa permanente por lo menos 30 segundos (se recomienda emplear siempre 
una cantidad constante de indicador ya que su c oncentración puede influir en los resultados). 
B.21.5.4  Si la muestra es obscura o colorida, será necesario después de agregar agua, titular con ayuda 
de un potenciómetro a un pH de 8.3.  
B.21.5. Cálculos %Acidez (expresada como ácido láctico) = (VxNx9)/M 
donde: 
V = mL de NaOH 0.1 N gastados en la titulación. 
N = Normalidad de la solución de NaOH 
M = Volumen o peso de la muestra. B.21.7 Expresión de resultados.  
 
% Acidez titulable expresada como ácido láctico 
 
B.22. Determinación de Vitamina A por Cromatografía Líquida  de Alta Resolución (HPLC en fase 
reversa).  
B.22.1 Principio del método.  
Los lípidos son ésteres que en presencia de un álcali cáustico se hidrolizan liberando el material 
insaponificable, el cual es extraído con un disolvente or gánico. Posteriormente la vitamina A contenida en este 
material, es cuantificada por medio de Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución. 
B.22.2 Equipo.  
B.22.2.1.  Sistema de HPLC que incluye:  
B.22.2.1.1 Bomba binaria LC. ( se puede cont ar con una trinaria o cuaternaria) 
B.22.2.1.2 Inyector  automático o manual de muestras. 
B.22.2.1.3 Detector es pectrofotométrico de longitud de onda variable UV-Visible LC. 
B.22.2.1.4 Integrador computarizado LC. 
B.22.2.1.5 Columna Octadecil ODS (20), tamaño de partíc ula 5, longitud 250 mm x diámetro interno  4,6 
mm. 
B.22.2.1.6 Balanza analítica, con ca pacidad de 160 g, lectura 0,1 mg. 
B.22.2.1.7 Placas de agitac ión con calentamiento. 
B.22.2.1.8 Cilindro para gas comp rimido de nitrógeno pureza 95%. 
B.22.2.1.9 Cilindro para gas comp rimido de helio pureza 95%. 
B.22.2.1.10 Evaporador rotatorio con elevador rápido y baño maría. 
B.22.2.1.11 Equipo de filt ración para la preparación de la fase móvil. 
B.22.2.1.12 Cronómet ro o reloj. 
B.22.3 Materiales. 
B.22.3.1 Matraces volumétricos actínicos o de color marrón con tapón de vidrio o teflón de 50 y 100 mL. 
B.22.3.2 Matraces actínicos o de color marr ón de fondo plano, cuello corto de 250 mL. 
B.22.3.3 Matraces, en forma de pera actínicos o de co lor marrón, de cuello corto y boca esmerilada de 500 
mL (que embone en el rotavapor). Si no se contaran c on estos, se pueden utilizar matraces de fondo plano. 
B.22.3.4 Matraces volumétricos actínicos o de color marrón de 10 mL. 
B.22.3.5 Vasos de precipitados de 500 mL. 
B.22.3.6 Embudo de separación cónico, actínicos o de color marrón, con llave de teflón 500 mL. 
B.22.3.7 Embudo tallo co rto diámetro 12 cm. 
B.22.3.8 Tapones de teflón huecos hexagonales o actínicos o de color marrón. 
B.22.3.9 Refrigerante con macho y hembra, manguito 300 mL, de 50 cm de longitud aproximadamente. 
B.22.3.10 Manguera de látex. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
B.22.3.11 Papel filtro mediano No. 1 con diámetro de 18,5 cm., O también se podrán utilizar diámetros de 
11 y 12.5 cm 
B.22.3.12 Pipetas volumétricas con marca de 5 y 4 mL. 
B.22.3.13 Jeringa de vidrio sin aguja desechable de 10  mL. Se pueden utilizar jeringas plásticas sin aguja 
desechables de 10 mL. 
B.22.3.14 Filtros para jeringa (a crodiscos para HPLC) de 0,45 μm de tamaño de poro y diámetro de 25 
mm, para solventes orgánicos y fase móvil. 
B.22.3.15 Membranas de filtración de fluoruro de poli vinilideno, utilizada para fases móviles (solventes 
orgánicos y acuosos), cuyos extractables sean de abso rción en UV, u otro filtro para fines similares. 
B.22.3.16 Magnetos para placa de agitación. 
B.22.4 Reactivos. B.22.4.1 Los reactivos que a continuación se menc ionan deben ser grado analítico y por agua debe 
entenderse agua destilada. 
B.22.4.2 Estándar de retinol (vitamina A) cristalizada (C
20H30O) all trans RETINOL con certificado de 
pureza. 
B.22.4.3 Hidróxido de potas io en lentejas (KOH). 
B.22.4.4 Alcohol etílico absoluto (C 2H5OH). 
B.22.4.5 Eter de petróleo inte rvalo de ebullición 40 - 60°C. 
B.22.4.6 Fenolftaleína en solución etanólica al 1%, indicador ( C 20H14O4). 
B.22.4.7 Metanol grado HPLC (CH 3OH). 
B.22.4.8 Agua destilada filtr ada, grado HPLC (sólo para la preparación de fase móvil). 
B.22.4.9 Agua destilada que se  utilizará en los lavados del saponificado (verificar que el valor de pH no 
sea mayor de 6,0). 
B.22.4.10 Sulfato de sodio anhidro (Na 2SO 4). 
B.22.4.11 Acido ascórbico (C 6H8O6). 
B.22.4.12 Fase móvil metanol: agua (95:5) para HPLC. Pasar agua destilada a través de una membrana de f iltración para soluciones acuosas. Pasar metanol a 
través de una membrana de filtración para solvent es orgánicos. Posteriormente mezclar 50 mL de agua 
destilada en 950 mL de metanol (fase móvil). Degasifica r la fase móvil pasando una ligera corriente de gas 
helio o por ultrasonido 15 minutos a temperatura ambien te. Si el equipo cuenta con desgasificador integrado, 
permitir que la mezcla la realice el mismo. 
B.22.4.12 Soluciones Patrón de Vitamina A.  Siempre y cuando se garantice la estabilidad de la misma,  
a través de un controlado en un Gráfico de Factor de Respuesta. 
B.22.4.12.1 Solución Concentrada  (150 μg equivalentes de retinol). 
Justo antes de emplearse, pesar 15 mg de retinol crista lizado (A - OH) y registrar el peso exacto. Colocar 
el estándar pesado en un matraz volumétrico de 100 mL. Disolver con metanol y llevar al volumen. 
B.22.4.12.2 Solución Intermedia  (15 μg equivalentes de retinol). 
Diluir 5 mL de la solución concentrada a 50 mL con el mismo metanol para obtener una solución de 
aproximadamente 50 UI/mL. 
B.22.4.12.3 Solución de Trabajo  (6 μg equivalentes de retinol). 
Añadir 4 mL de la solución estándar intermedia al matraz marcado como estándar y adicionar los reactivos 
al igual que al blanco y muestra como se indica en el apartado de saponificación. Esta solución tendrá 
aproximadamente 20 UI/mL de vitamina A, al final del proceso de recuperación, en el matraz volumétrico  de 
10 mL. 
Nota 1 : Si el certificado de % de pureza en el estándar es  inferior al 85% no debe prepararse la solución 
patrón, siendo necesario un nuevo estándar de otro  lote con una pureza superior a la antes indicada. 
Nota 2:  La vitamina A-OH (A-alcohol) se oxida con gran rapidez y es muy sensible a la luz. Al abrir una 
ampolleta nueva de vitamina A-cristalizada, pesar la cantidad de estándar requerida y guardar la ampolleta 
bajo atmósfera de nitrógeno o en condiciones similares. 
B.22.5 Procedimiento  
Nota 3:  La vitamina A es sensible a la luz. Utilizar mate rial actínico o de color marrón o bien, proteger el 
material con papel aluminio. Por otra parte, efect uar las evaporaciones con rotavapor a una temperatura 
máxima de 40ºC. Evaporar a sequedad y romper el vacío e inmediatamente introducir nitrógeno al sistema o 
al matraz, para evaporar los últimos mililitros mediante una corriente de nitrógeno. 
B.22.5.1 Toma de Muestra.  
En el caso de productos deshidratados, reconstituir con agua, de acuerdo con las instrucciones señaladas 
en la etiqueta o 130 g del producto llevados a 1 L con agua. Disolver y agitar la muestra a fin de 
homogeneizarla por completo. 
Medir de preferencia por duplicado una canti dad de muestra tal, que contenga de 30 a 90 μg equivalentes 
de retinol (100 a 300 UI de vitamina A) o la cantidad correspondiente a lo declarado en la etiqueta de la 
muestra. En caso de no contar con esta inform ación no es conveniente realizar el análisis.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.22.5.2 Saponificación.  
B.22.5.2.1  Marcar 4 matraces actínicos de cuello cort o y esmerilado con fondo plano de 250 mL (cuando 
la muestra se trabaje por duplicado) de la si guiente manera: blanco, estándar y muestra. 
B.22.5.2.2  Añadir los siguientes reactivos a cada uno de los matraces antes mencionados: 7 g de 
hidróxido de potasio y a continuación añadir 60 mL de alcohol absoluto. Mezclar para disolver. Agregar 0,5 g 
de ácido ascórbico así como una barra magnética. Adic ionar una ligera corriente de nitrógeno a cada uno de 
los matraces. 
B.22.5.2.3  Montar un sistema de reflujo y calentar durant e 30 minutos en placas de calentamiento o baño 
de agua en ebullición con agitación constante. 
Nota 4:  Durante la saponificación, asegurar una buena agitación del medio de reacción. 
B.22.5.3  Extracción del Insaponificable.  
B.22.5.3.1 Una vez concluido el tiempo de saponificación, enjuagar con máximo 30 mL de agua destilada 
(evitar el exceso de agua para prevenir la formación de emulsiones) por las paredes internas del refrigerante 
sin quitar el matraz del saponificado. Enfriar el  matraz aun instalado al refrigerante sumergiéndolo 
parcialmente en un vaso de precipitados que contenga a gua fría, lo anterior con la finalidad de llevarlo a 
temperatura ambiente, evitando enfriarlo demasiado. Tr asvasar la suspensión a un embudo de separación de 
500 mL. 
B.22.5.3.2 Enseguida enjuagar el matraz con 100 mL de éter de petróleo que se añaden al embudo de 
separación. Extraer la vitamina A ag itando ligeramente. Dejar separar las fa ses. Vaciar la fase acuosa a otro 
embudo de 500 mL. Recoger la fase orgánica a un tercer embudo de separación de 500 mL. Repetir la 
operación dos veces más, enjuagando el matraz c on dos porciones de 100 mL de éter cada una. 
B.22.5.3.3 Efectuar esta extracción 3 veces en total (un lavado de 50 mL y 2 lavados de 100 mL). Hacer 
las agitaciones con mucho cuidado para evitar emulsiones. 
B.22.5.3.4 Lavar la solución orgánica con porciones de 100 mL de agua adicionándola por las paredes del 
embudo, agitando suavemente, hasta que el agua del lavado ya no dé reacción colorida con la fenolftaleína. 
Después del último lavado, esperar de 15 a 30 minutos antes de vaciar la fase acuosa y volver a revisar con el 
indicador que no exista reacción colorida. 
B.22.5.3.5 Filtrar la solución lavada en continuo a través  de un filtro que contiene aproximadamente 10 g 
de sulfato de sodio anhidro y recoger el filtrado en un matraz de pera de 500 mL, sin dejar secar el filtro. Al 
final enjuagar el sulfato de sodio contenido en  el filtro con 50 mL de éter de petróleo. 
B.22.5.3.6 Evaporar el disolvente en un rotavapor a 40ºC y dejar un remanente de aproximadamente 6 
mL. Tratar de reducir esta cantidad del disolvente a un volumen de 2 mL aproximadamente mediante una 
corriente de nitrógeno. 
B.22.5.3.7 Disolver el remanente obtenido con 3 mL de la fase móvil y recolectar cuantitativamente la 
solución con una jeringa de vidrio. Filtrar la solución a través de un filtro acrodisco de 0,45 µm a un matraz 
actínico de 10 mL. Lavar el matraz pera con porciones de 2 mL de fase móvil y repetir el mismo procedimiento 
hasta llegar al aforo del matraz. Hacer lo mismo para ca da filtro de blanco, estándar y probar por duplicado. 
Nota 5:  Se recomienda acondicionar el acrodisco de 0,45 μm con metanol antes de utilizarlo en la filtración 
del recuperado. 
B.22.5.4 Condicion es Cromatográficas.  
B.22.5.4.1  Fijar los siguientes parámetros de acuerdo c on las instrucciones de operación del cromatógrafo. 
Columna Octadecil ODS (20), tamaño de partícula 5 μm, longitud 250 mm x diámetro interno 4,6 mm. 
Loop de inyección: 20 μL. 
Fase móvil: metanol: agua 95:5. 
Flujo: 1 mL/min. 
Detector: Longitud de onda ajustada a 325 nm. 
Registrador: 5 mm/min. B.22.5.5  Determinación de Vitamina A.  
Inyectar dos veces los siguientes analitos: primero 20 μL del blanco, después 20 μL de la solución 
estándar para HPLC (20 UI/mL aprox.) y por último 20 μL de la muestra (del saponificado). 
B.22.5.5.1 En el cromatograma, identificar el pico y tiempo de retención de la vitamina A correspondiente 
al estándar. Con estos datos, identificar el pico y tiempo de retención de la vitamina A contenida en la 
muestra. 
B.22.5.5.2 Calcular el área o la altura del pico de la solución patrón y de las muestras en los 
cromatogramas obtenidos. 
B.22.6 Cálculos. 
El contenido de vitamina A, expresado en Unidades  Internacionales por L de producto es igual a: 
 Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
En donde: 
m = toma de ensayo en g o mL. 
hP = altura del pico de la muestra, en mm. 
hS = altura del pico de la solución estándar final, en mm. 
C = concentración de la solución estándar fina l inyectada, en UI/mL para la vitamina A. 
V = volumen de solución estándar final, en el cual ha sido diluido el remanente antes de la cromatografía. 
Los resultados deben reportarse como μg equivalentes de retinol. 
B.22.7 Expresión de Resultados.  
μg equivalentes de retinol/ L 
1 UI = 0,3 μg equivalentes de retinol (todos los retinoles trans) 
 
B.23 Determinación de Vitamina D 3 – HPLC 
B.23.1 Fundamento  
Saponificación alcalina de la muestra; extracción con éter de compuestos insaponificables; evaporación 
del éter; solución del residuo seco en hexano e inyección de una alícuota en columna preparativa de HPLC 
(fase normal, Sílice). Colección del el uato que contiene la fracción de vitamina D; evaporación de esta fracción 
a sequedad, disolución en la fase móvil de HPLC (Analíti ca, Acetonitrilo: Cloruro de metileno: Isopropanol), 
inyección en HPLC (fase reversa C18) y determinación de la vitamina D con el pico máximo a 264 nm por 
calibración del estándar externo. 
B.23.2 Preparación de la muestra. 
En el caso de productos deshidratados reconstituir con agua, de acuerdo con las instrucciones señaladas 
en la etiqueta o 130 g de producto llevado a 1 L c on agua. Disolver y agitar la muestra a fin de 
homogeneizarla por completo. Medir de preferencia por  duplicado una cantidad de muestra que contenga de 
0,5 a 1 g de vitamina D 3 (20 a 40 UI). 
B.23.3  Material  
B.23.3.1 Instalación HPLC isocrática 
B.23.3.2 Uno o dos registradores B.23.3.3 Balanza analítica, con c apacidad de 160 g, lectura 0,1 mg 
B.23.3.4 Balanza de precisión, con capacidad de 1600 g, lectura 0,01 g 
B.23.3.5 Estufa de laboratorio (para productos con almidón) 
B.23.3.6 Baño de agua con agitad ores magnéticos, 4 plazas 
B.23.3.7 Evaporador rotatorio con elevador rápido y baño B.23.3.8 Matraces aforados, vidrio marr ón, tapón de vidrio de 5, 50 y 100 mL 
B.23.3.9 Matraz de fondo plano, cuel lo corto, vidrio marrón de 250 mL 
B.23.3.10 Matraces, en forma de pera, vidrio marrón de 10 y 500 mL B.23.3.11 Embudo de separación cónico, vidrio marrón, con llave de 500 mL B.23.3.12 Embudo, vidrio ma rrón, diámetro 12 cm 
B.23.3.13 Tapones huecos hexagonales, vidrio marrón 
B.23.3.14 Refrigerante con macho y hembra, manguito 300 mm B.23.3.15 Alargadera para introducción de gas B.23.3.16 Filtro plisado medi ano con diámetro de 18,5 cm 
B.23.3.17 Pipeta aforada, con una marca de 2 mL 
B.23.3.18 Jeringuillas de 1 y 5 mL 
B.23.3.19 Aguja para jeringuillas 
B.23.3.20 Cilindro para gas comprimido, nitrógeno B.23.3.21 Monodetentor para gas comprimido, N2 B.23.3.22 Filtro de 0, 45 µ de diámetro 
B.23.3.23 2 Columnas de 5 µ, 4,6 X 250 B.23.3.24 Aparato de filtración 
B.23.3.25 Filtro 0,5 µ B.23.4  Reactivos  
B.23.4.1 Colecalciferol, vitamina D3, cristalizada para fines bioquímicos (C
27H44O) 
B.23.4.2 Hidróxido de potasio en lentejas para análisis (KOH) 
B.23.4.3 Alcohol etílico absoluto, para análisis (C 2H5OH) 
B.23.4.4 Hidroquinona (C 6H4(OH) 2) 
B.23.4.5 Eter de petróleo para análisis  intervalo de ebullición 40 -60°C 
B.23.4.6 Fenolftaleína en solución etanólica al 1%, indicador (C 6H4OH) 2COC 6H4CO) 
B.23.4.7 Diastasa (para productos de almidón)       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
B.23.4.7 2-propanol (CH 3)2CHOH 
B.23.4.8 n-hexano CH3(CH 2)4CH 3 
B.23.4.9 Acetonitrilo (CH 3CN) 
B.23.4.10 Diclorometano (CH 2Cl12) 
B.23.4.11 Sulfato de sodio a nhídro para análisis (Na 2SO 4) 
B.23.4.12 Nitrógeno (N 2) 
B.23.4.13 Acido ascórbico (C 6H8O6) 
B.23.4.14 Fase Móvil para HPLC Preparativa , 2-propanol al 1% en n-hexano 
Degasificar el n-hexano bajo presión reducida y pasar  a través un filtro. Mezclar 100 mL de diclorometano 
con 900 mL de acetonitrilo degasificado. 
B.23.4.15  Fase Móvil Analítica , diclorometano: acetonitriloisopropano (10: 89: 1) para HPLC analítica 
Degasificar 1 l de acetonitrilo bajo presión reducida y pasar a través de un filtro. Mezclar 100 mL de 
diclorometano con 890 mL de acetonitr ilo degasificado y 10 mL de 2-propanol. 
Nota: La proporción diclorometano/acetonit rilo debe adaptarse de modo que la vitamina D3 dé un tiempo 
de retención de aproximadamente 8-9 min. Sin embargo no debería rebasar 20:100. 
B.23.4.16  Fase Móvil para lavar la Columna Preparativa , 2-propanol al 10% en n-hexano 
Mezclar 100 mL de 2-propanol con 900 mL de n-hexano degasificado. 
B.23.4.17  Solución Patrón de Vitamina D3 para HPLC preparativa  
En un matraz aforado de 100 mL, pesar exactamente 50,0  mg de colecalciferol (D3) cristalizado, disolver 
en n-hexano y llevar al volumen con el mism o disolvente (= solución de 20,000 U.I./ mL). 
Diluir esta solución 1000 veces con el mismo disolvente para obtener u na solución de 20 U.I./ mL . Esta 
solución permanece estable de 3 a 4 semanas a +4°C. 
B.23.4.18  Solución Patrón de Vitamina D3 para HPLC Analítica  
Evaporar 2 mL de solución patrón de 20 U.I./ mL (B.20.4.4) y tomar el residuo en 2 mL de fase móvil 
(B.20.4.2). 
B.23.5  Procedimiento  
Notas:  La vitamina D3 es sensible a la luz. Utilizar material de vidrio marrón o proteger el material 
corriente con papel aluminio. 
Efectuar todas las evaporaciones de disolventes bajo presión reducida a una temperatura máxima de 
40°C. No se debe evaporar a sequedad. Romper el va cío introduciendo nitrógeno en el  sistema. Evaporar los 
últimos mL mediante una corriente de nitrógeno. 
Al final de la jornada, lavar la columna preparativa durante 15 min con 2-propanol al 10% en n-hexano 
(B.20.4.3) con un caudal de 2 mL /min. 
B.23.5.1  Toma de Ensayo  
Mezclar o moler la muestra a fin de homogeneizarla por completo. Pesar, con una precisión de 10 mg, una 
toma de ensayo que contenga 20-40 U.I. de vitamina D3. 
B.23.5.1.1  Productos con Almidón:  
En un matraz redondo de fondo plano de 250 mL con cuello esmerilado, mezclar la toma de ensayo con 
10% de su peso de diastasa. Añadir máximo 30 mL de  agua destilada a 45-50°C. Mezclar bien para obtener 
una suspensión homogénea. Eliminar el aire del matraz mediante nitrógeno, tapar y colocar el matraz durante 
30 min en una estufa a 45°C. 
B.23.5.1.2  Productos sin Almidón:  
En un matraz redondo de fondo plano de 250 mL con cuello esmerilado, mezclar la toma de ensayo con 
máximo 30 mL de agua destilada a 45-50°C. 
B.23.5.2 Saponificación  
Añadir 7 g de hidróxido de potasio grado analítico en  el matraz (B.23.5.1.1 o B.23.5.1.2), y mezclar para 
disolver. 
A continuación añadir 60 mL de alcohol absoluto y 0,5 g de ácido ascórbico o hidroquinona. 
Montar sobre el matraz una alargadera para introduc ción de un gas refrigerante. Introducir una ligera 
corriente de gas nitrógeno, y calentar durante 30 mi n a 70°C en un baño de agua ebulliendo provisto de 
agitadores magnéticos. 
Nota:  Durante la saponificación, asegurar una buena agitación del medio de reacción. 
B.23.5.3 Extracción del Insaponificable  
Una vez terminada la saponificación, enfriar el matraz  a temperatura ambiente y transvasar la suspensión 
a un embudo de separación de 500 mL. 
Enjuagar con máximo 30 mL de agua fría en 3 porciones de 10 mL que se añaden al contenido del 
embudo de separación. Evitar un exceso de agua, ya que favorece la formación de emulsiones. 
En seguida enjuagar el matraz con 50 mL de éter de petróleo (rango de 40-60°C) en varias porciones que 
se añaden al embudo de separación. Extraer la vitamina  D3 agitando ligeramente. Dejar separar las fases. 
Vaciar la fase acuosa a otro embudo de separación de 500 mL. Recojer la fase orgánica en un tercer 
embudo de separación de 500 mL. Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
Efectuar esta extracción 5 veces en total. Hacien do las agitaciones con mucho cuidado para evitar 
emulsiones. 
Lavar la solución orgánica con porciones de 100 mL de agua adicionándola por las paredes del embudo, 
sin agitar, hasta que el agua de lavado ya no dé reacción coloreada con fenolftaleína. Después del último 
lavado, esperar al menos 15 min antes de vaciar la fase acuosa. 
Filtrar la solución lavada en continuo a través de un filt ro que contiene aproximadamente 5 g de sulfato de 
sodio anhídro o en un papel separador de fases tipo 1 PS, y recoger el filtrado en un matraz en forma de pera 
de 500 mL , sin dejar secar el filtro. Y al final enjuagar el filtro con 50 mL de éter de petróleo. 
Evaporar el disolvente bajo presión reducida en un rotavapor a 40°C, y eliminar los últimos mililitros 
mediante una corriente de nitrógeno. 
Transvasar el residuo cuantitativamente a un matraz  aforado de 5 mL, mediante pequeñas porciones de 
fase móvil (B.20.4.1) llevar al volumen y filtrar la so lución inmediatamente a través de un filtro de 0,45 µ de 
tamaño de poro y adecuado para solventes orgánicos, po r ejemplo Acrodisc - CR o equivalente; recoger el 
filtrado en un matraz en forma de per a. El filtrado debe ser límpido. 
La solución está lista para la cromatografía. 
B.23.5.4 Cromatografía Preparativa 
Condiciones: 
Columna Spherisorb Si, 5 mcm, 4,6 X 250 mm 
Loop de inyección 500 µl 
Fase móvil 1% 2-propanol en n-hexano (B.2.3.1) 
Caudal 1-3 mL/min (el tiempo de retención de la vitamina D3 debe ser de 
aproximadamente 5 min 
Detector espectrofotómetro, longitud de onda variable, ajustada a 264 nm (o 
eventualmente espectrofotómetro de longitud de onda fija a 254 nm, 
únicamente utilizable para la etapa pr eparativa), 0,05 AUFS para el patrón y 
0,5 AUFS para el extracto de muestra 
Registrador 10 mm/min 
 
Inyectar primero 500 µl de solución patrón de vitami na D3 (B.20.4.4) y determinar el tiempo de retención: 
debe ser aproximadamente 5 min. Inyectar a continuación la solución de la muestra obtenida bajo el numeral 
B.20.5.3 y recoger la fracción que contiene la vita mina D3 en un matraz en forma de pera de 10 mL. 
Comenzando a recoger aproximadamente 1 min antes de la elución de la vitamina D3 y parar 
aproximadamente 1 min después de la elución de la vitamina D3. 
B.23.5.5 Cromatografía Analítica  
Evaporar a seco la fracción recogida bajo 20.5.4, mediante una ligera corriente de nitrógeno. 
Enfriar el matraz a fin de evitar errores de volumen a una evaporación eventual de disolvente; luego tomar 
el residuo en 300 µl de fase móvil (B.20.4.2), agitar ligeramente para disolver bien el residuo. 
Condiciones: 
Columna Spherisorb ODS, 5 mcm, 4,6 X 250 mm 
Loop de inyección 100 µl 
Fase móvil 10% diclorometano, 89% acetonitrilo y 1% de 2-propanol 
Caudal 2 mL/min 
Detector espectrofotómetro, longitud de onda variable, ajustada a 264 nm; 0,01 
AUFS 
Registrador 10 mm/min 
 Inyectar primero 100 µl de solución patrón (B.20.4. 5) y determinar el tiempo de retención: debe ser 
aproximadamente 8-9 min (adaptar la proporción de di clorometano/acetonitrilo si es necesario). Luego 
inyectar 100 µl de la fracción obtenida bajo B.20.5.4. 
B.23.6  Cálculo, Expresión e Interpretación de los Resultados  
B.23.6.1 Evaluación  
Identificar el pico de la vitamina D3 en el cromat ograma de la muestra mediante el tiempo de retención 
definido por cromatografía de la solución patrón. M edir la altura de los picos obtenidos durante la 
cromatografía de la solución patrón y de la solución muestra. 
El contenido en vitamina D3, expresado en Unidades Internacionales por 100 g de producto, es igual a: 
h
p x C x V o x V 2 x 100 
Hs x m x V 1       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
En donde: 
m = toma de ensayo, en gramos 
hp = altura del pico de la muestra, en mm 
hs = altura del pico de la solución patrón, en mm 
C = concentración de la soluci ón patrón inyectada, en U.I./ mL 
Vo = volumen en el cual ha sido diluido el residuo antes de la cromatografía preparativa (20.5.3) (en 
general 5 mL= matraz aforado) 
V1 = volumen del extracto inyectado en la columna prep arativa (en general 0,500 mL=volumen del loop de 
inyección) 
V2 = volumen en el cual ha sido diluida la fracción después de la cromatografía preparativa (en general 
0,300 mL) 
Nota:  es superfluo un factor de corrección para la isom erización de la vitamina D3, en previtamina D3, ya 
que este fenómeno es despreciable en las condiciones de saponificación aplicadas. 
B.23.6.2 Límite de Detección de Acuerdo a la Sensibilidad del Equipo.  
Aproximadamente: 20 U.I./100 g 
B.23.6.3 Repetibilidad  
La diferencia entre dos resultados individuales obt enidos con la misma muestra para ensayo, en las 
mismas condiciones (analista, aparato, laboratorio) en un corto intervalo de tiempo, no debe exceder 10% de 
la media entre ambos resultados. 
Cuando las vitaminas han sido añadidas por mezcla en seco, la repetibilidad está fuertemente influida por 
el grado de homogeneidad del producto. 
APENDICE INFORMATIVO A 
A. LISTA DE SUSTANCIAS DESINFECTANTES RECOMENDADAS 
No. Solución acuosa de: Concentración máx.  del ingrediente 
activo Condiciones  de empleo 
1 Hipoclorito cálcico, sódico o potásico, 
con o sin bromuro cálcico, sódico o 
potásico. 200 mg/kg de halógeno calculado en cloro. Escurrir después del 
tratamiento. 
No precisa aclarado final 
2 Acido di y tricloroisocianúrico, o sales 
potásicas o sódicas de estos ácido 
con o sin bromuro potásico, cálcico o 
sódico. 100 mg/kg de halógeno calculado en cloro. Como en 1 
3 Yoduro potásico, p-
toluensulfocloramida sódica y lauril 
sulfato sódico. 25 mg/kg de yodo valorable; el nivel de los 
componentes no debe superar el mínimo 
preciso para obtener el  efecto funcional 
deseado. Como en 1 
4 yodo butoxi-monoéter de etilenglicol + 
butoximono-éter de propilenglicol+ 
butoximonoéter de polialquilenglicol, 
teniendo un punto de niebla de 90-
100ºC. en solución al 0.5% y un peso 
molecular medio de 3,300 y 
monobutiléter de etilenglicol. 
Monoetil-éter de dietilenglicol se 
puede adicionar como componente 
opcional. 25 mg/kg de yodo. Los adyuvantes 
utilizados con el yodo no deben de superar 
la cantidad mínima necesaria para obtener 
el efecto funcional deseado. Como en 1 
5 Yodo, ácido hidroyódico alfa- (p-
monofenil-W-hidroxipolil (oxietileno) 
(peso molecular medio 748) y/o 
polioxietilen-polioxipropileno tipo 
copolimerización en bloque (peso 
molecular medio mínimo 1,90). 
Alcohol isopropílico se puede 
adicionar como componente opcional.Como en 4 Como en 1 
6 Yodo, yoduro de sodio, 
dioctilsulfosuccinato de sodio y 
polioxietilen-polioxipropileno tipo 
copolimerización en bloque (peso 
molecular medio mínimo 1,900). Como en 4 Como en 1 
7 Acido dodecilbencenosulfónico, 
polioxietilen-polioxipropileno, tipo 
copolimerización en bloque (peso 
molecular medio mínimo 2,800). 400 mg/kg de ácido dodecil-benceno-
sulfónico y 80 mg/kg de polioxietilen-
polioxipropileno, tipo copolimerización en 
bloque (peso molecular medio mínimo 
2,800). Estas soluciones se 
emplean en la limpieza de 
equipo y utensilios, así 
como en botellas y 
envases para leche; no 
precisan aclarado final.* Lunes 27 de septiembre de 2010 DIARIO  OFICIAL (Segunda Sección)      
8 Yodo, butoxi-monoéter de etilen 
glicol+butoxi-monoéter de 
propilenglicol+butoximono-éter de 
polialquilenglicol, con un peso 
molecular medio mínimo de 2,400, y 
alfa-lauril-W-hidroxipoli (oxietileno) 
con un promedio de 8-9 moles de 
óxido de etileno y un peso molecular 
medio de 400. Como en 4 Estas soluciones se 
emplean en la limpieza del 
equipo y utensilios, así 
como de envases de leche 
y otras bebidas. Como 
aclarado preliminar se 
puede utilizar agua a la 
que se ha añadido esta 
solución. No se debe 
emplear en el enjuagado 
final. * 
9 Cloruro de n-alquil-(C 12 a C 18) 
bencildimetil-amonio, con un 
promedio de peso molecular de 351-
380 y conteniendo principalmente 
cadenas de los grupos alquilo con 12 
a 16 átomos de carbono, con o sin 
grupos alquilo de 8 a 10 átomos de 
carbono, en una proporción máxima 
de 1% respecto a los de 12-16. Se 
puede añadir como componente 
opcional alcohol isopropílico. 200 mg/kg de compuestos de amonio 
cuaternario activos. Como en 1 
10 Tricloromelamina y lauril sulfato 
sódico o ácido dodecilbenceno 
sulfónico. Tricloromelamina, en cantidad no superior a 
la necesaria para producir 200 mg/kg de 
cloro y lauril sulfato sódico, a un nivel que 
no exceda del mínimo requerido para que 
se presente el efecto funcional deseado o, 
ácido dodecilbenceno sulfónico en 
proporción no superior a 4000 mg/kg Estas soluciones se 
emplean en la limpieza de 
envases para bebidas, 
excepto leche, así como en 
la higienización del equipo 
y utensilios y otros 
materiales, que puedan 
contactar con alimentos. 
No precisan aclarado 
final.* 
11 Volúmenes iguales de cloruro de n-
alquil (C 12 a C 18) bencildimetilamonio 
y cloruro de n-alquil (C 12 a C 18) 
dimetilbencilamonio, con un peso 
molecular medio de 384. 200 mg/kg de compuestos de amonio 
cuaternarios activos. Estas soluciones se 
utilizan en el tratamiento 
de equipo y utensilios, así 
como las superficies que 
contactan los alimentos, en 
establecimientos de 
comidas públicas. No 
precisan aclarado final.* 
12 Sal sódica del ácido oleico 
sulfonatado, polioxietileno-
polioxipropileno tipo copolimerización 
en bloque, con un peso molecular 
medio de 2,000 y con 27 a 31 moles 
de polioxipropileno. 200 mg/kg de ácido sulfonatado, sal sódica.Esta solución se utiliza 
para botellas u otros 
envases de vidrio para 
leche, así como para el 
equipo y utensilios 
empleados en la 
elaboración de alimentos. 
Los artículos tratados con 
esta solución se deben 
escurrir durante 15 min 
antes de ponerlos en 
contacto con los alimentos. 
No precisa aclarado final. * 
13 Yodo y alquil (C 12 - C15) monoéter de 
etilen y propilenglicol+ monoéter de 
polialquilenglicol, con un punto de 
niebla de 70-77ºC en solución acuosa 
al 1% y con un peso molecular medio 
de 807. Como en 4 Como en 1 
14 Yodo, butoxi-monoéter de etilen y 
propilenglicol+butoximonoéter de 
polialquilenglicol, con un punto de 
niebla de 90-100ºC, en solución 
acuosa al 0,5% y con un peso 
molecular medio de 3,300 y 
polioxietileno-polioxipropileno, tipo 
copolimerización en bloque, con un 
peso molecular medio mínimo de 
2,000. Como en 4 Como en 1 
15 Hipoclorito de litio 290 mg/kg de cloro y 30 mg/kg de litio. Como en 1       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 27 de septiembre de 2010 
16 Cantidades iguales de cloruro de n-
alquil (C 12-C18) bencil-dimetil-amonio 
y cloruro de n-alquil (C 12 a C 14)-
dimetil-(etil-bencil)-amonio (con 
pesos moleculares medios de 377-
384). De forma opcional se puede 
adicionar etilen-diaminote-tracetato 
tetrasódico y/o α-(p-nonil-fenol)-w-
hidroxipoli (oxietileno con un 
contenido de 11 moles. 200 mg/kg de compuestos de amonio 
cuaternario activo. Como en 1 
17 Cloruro de di-n-alquil (C 8 - C10)-
dimetilamonio y alcohol isopropílico, 
con un peso molecular medio de 332-
361 150 mg/kg de compuestos de amonio 
cuaternario activo. Como en 1 
18 Cloruro de n-alquil (C 12 -C18) bencil-
dimetil-amonio, metaborato sódico, α-
terpinol y α- [ p-(1,1,3,3 tetrametil-
butil)fenil]-w-hidroxipoli (oxietileno), 
producido con 1 mol de fenol y  4-14 
moles de óxido de etileno 200 mg/kg de compuestos de amonio 
cuaternario activos y 66 mg/kg de α- 
[(1,1,3,3 tetrametil-butil)fenil] w-hidroxipoli 
(oxietileno). Como en 1 
19 Di-cloro-iso-cianurato sódico y etilen-
diamino-tetracetato tetrasódico. 100 mg/kg de cloro. Como en 11 
20 o-fenil-fenol, o-bencil-p-cloro fenol, p-
amilfenol, sulfato de α-alquil- (C 12 a 
C15)-w- hidroxipoli- (oxietileno) y sodio 
con un contenido medio de 
polioxietileno de 1 mol, sales 
potásicas de ácidos grasos de aceite 
de coco y alcohol isopropílico o 
hexilenglicol. 800 mg/kg de fenoles activos totales, que 
comprenden 400 mg/kg de o-fenil-fenol 320 
mg/kg de o-bencil-p-clorofenol y 80 mg/kg 
de p-amifenol terciario. Unicamente para 
aplicaciones de un solo 
uso. 
21 Dodecil-benceno-sulfonato sódico. Entre 25 y 430 mg/kg del producto. Como en 1 
*En otros países, entre los que no se incluyen Estado s Unidos, es obligatorio el aclarado final con agua 
después de aplicar la solución desinfectante. 
Los fabricantes podrán emplear otras sustancias para  la limpieza y desinfección de equipo, siempre y 
cuando se asegure que los productos obtenidos son inocuos para el consumidor. 
 
APENDICE INFORMATIVO B 
B.1 PROCEDIMIENTO DE LIMPIEZA Y DESCONTAMI NACION DEL MATERIAL DE VIDRIO Y AREA DE 
TRABAJO PARA LA DETERMINACION DE AFLATOXINAS 
B.1 Objetivo 
Por la naturaleza y potenciabilidades tóxicas de las af latoxinas es importante establecer directrices para la 
descontaminación del área de trabajo, material y equipo utilizados, así como los procedimientos a seguir para 
neutralizar derrames y remanentes de extractos de las muestras. 
El trabajo de limpieza y descontaminación será re alizado por personal capacitado y que cuente con equipo 
protector como una bata, guantes im permeables y lentes protectores. 
B.2 Descontaminación del Material de Laboratorio 
Todo el material de vidrio del laboratorio que haya sido utilizado durante el análisis debe sumergirse en 
una solución de hipoclorito, el cual se prepara diluyendo una parte de solución comercial de hipoclorito de sodio o clarasol (con una concentración entre 5 y 6%) con 10 partes de agua, por ejemplo mezclar 100 mL de 
blanqueador comercial con 1000 mL de agua. 
Después del tratamiento, el material debe enjuagar se abundantemente con agua corriente seguido de 
agua destilada, secar por escurrimiento o en estufa de 90-100°C. 
B.3 Descontaminación del Area de Trabajo 
La superficie de las mesas de trabajo y las paredes en las que pudiera haberse contaminado de leche con 
aflatoxinas, deben limpiarse con una toalla desechable impregnada en solución de hipoclorito de sodio o solución blanqueadora comercial después de cada sesión. 
B.4 Descontaminación de Material Desechable Todo el material desechable como son las columnas y placas deben sumergirse durante un mínimo de 5 
min en una solución de hipoclorito de sodio utilizando un a parte de blanqueador comercial y diez partes de 
agua. La solución descontaminadora ya usada debe elimin arse por el drenaje y los materiales desechables 
tratados deben empacarse en una bolsa de plástico sellada para colocarse en el depósito de desechos. 
B.5 Tratamiento de Derrames 
Los derrames de soluciones de aflatoxinas deben tratarse inmediatamente con hipoclorito de sodio o 
blanqueador doméstico y vertirlo directamente del envas e, recoger los líquidos con un papel absorbente, el 
cual también se colocará en una bolsa de plástico. 
B.6 Tratamiento de Remanentes de Extracto de Muestras 
Una vez que se ha separado una alícuota del extracto de la muestra es frecuente que permanezca un 
remanente del mismo. Estos restos de extractos deben tr atarse con una cantidad de blanqueador equivalente 
a la unidad del volumen del residuo a tratar. Los líquidos  resultantes se deben acumular en un recipiente para 
desechos líquidos y eliminarse en un lugar de stinado especialmente para este propósito. 
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