中华人民共和国国家标准  
 
 GB/T xxxx—xxxx 
 
 
  
中华人民共和国卫生部    发布 
 
 xxxx—xxxx发布  
 xxxx—xxxx实施  
 食品安全国家标准  
食品中赭曲霉毒素 A的测定 GB/T xxxx—xxxx 
1 前    言 
本标准代替 GB/T 5009.  96-2003《谷物和大豆中赭曲霉毒素 A的测定》、GB/T 2350 2-2009《食品
中赭曲霉毒素 A的测定  免疫亲和层析净化高效液相色谱法 》和GB/T 25220 -2010《粮油检验  粮食中赭
曲霉毒素 A的测定  高效液相色谱法和荧光光度法》 。 
本标准与 GB/T 5009. 96 -2003  、GB/T 2350 2-2009和GB/T 25220 -2010相比，主要变化 如下：  
    ——修改了标准的中文名称，标准中文名称改为 《食品安全国家标准  食品中赭曲霉毒素 A的测定
（理化方法 ）》； 
——按照 GB//T 20001.4 -2001对标准的结构进行了修改 ; 
——新标准内容是由原 GB/T 5009.9 6-2003、GB/T 2350 2-2009和GB/T 25220 -2010中三个方法中的共
五个方法组成， 将GB/T 5009.96 -2003方法作为第一法， GB/T 23502 -2009的方法作为第二法 ，而 GB/T 
25220 -2010里的三种方法分别作为第三法 、第四法和第五法 。 GB/T xxxx—xxxx 
2 食品安全国家标准  
食品中赭曲霉毒素 A的测定  
1 范围  
本标准规定了 食品中赭曲霉毒素 A的测定方法。  
本标准第一法适用于小麦、玉米和大豆中赭曲霉毒素 A的测定，第二法 适用于粮食和粮食制品、
酒类、酱油、醋、酱及酱制品中赭曲霉毒素 A含量的测定 ，第三法 、第四法和第五法适用于小麦、玉
米和稻谷中赭曲霉毒素 A的测定。 
 
第一法 薄层色谱测定法  
2 原理  
用三氯甲烷 -0.l mol/L 磷酸或石油醚－甲醇 /水提取试样中的赭曲霉毒素 A，试样提取液经液－液分
配后，根据其在 365 nm紫外光灯下产生黄绿色荧光，在薄层色谱板上与标准比较测定含量。  
3 试剂和材料  
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 符合 GB/T  6682中规定的一级水。 
3.1  试剂 
3.1.1石油醚（ 60～90 ℃或30～60 ℃）。 
3.1.2  甲醇（CH 3OH）。 
3.1.3  三氯甲烷（ CHCl 3）。 
3.1.4  甲苯（C6H5CH 3）。 
3.1.5  乙酸乙酯 （C4H8O2）。 
3.1.6  甲酸（CH 2O2）。 
3.1.7  冰乙酸（C2H4O2）。 
3.1.8  乙醚（C4H10O）。 
3.1.9  乙腈（CH 3CN）。 
3.1.10  苯（C6H6）。 
3.2 试剂配制    
3.2.1苯-乙腈（ 98:2），98份苯和 2份乙腈混合而成 。 
3.2.2 0.1 mol/L 磷酸 [c（H3PO 4=0.1 mol/L ）]：称取 11.5 g磷酸（85%）加水稀释至 1000 mL。 
3.2.3 2 mol/L盐酸溶液 [c（HCl）=2 mol/L]] ：量取 20 mL盐酸，加水稀释至 120 mL。 
3.2.4 氯化钠 [（NaCl）：纯度≥98%]溶液（ 40 g/L）。 
3.2.5 0.1 mol/L 碳酸氢钠溶液 [c（NaHCO 3）＝0.1 mol/L] ：称取 8.4 g碳酸氢钠，加适量水溶解，并用水
稀释至 1000 mL。 
3.3 标准品   GB/T xxxx—xxxx 
3 赭曲霉毒素 A标准品（以下简称 OA）。 
3.4 标准溶液 配制 
3.4.1  赭曲霉毒素 A标准贮备液 （40 µg/mL）：用苯 -冰乙酸（ 99：1）配成 40 µg/mL赭曲霉毒素 A标
准贮备液，并用紫外分光光度计测定其浓度。浓度的测定参照 GB/T 5009.22 《食品中黄曲霉毒素 B1的
测定》中 3.14条（赭曲霉毒素 A的最大吸收峰波长 333 nm，分子量 403， 克分子消光系数值为 5550） 。
置冰箱中避光保存 ，可使用 3个月。 
3.4.2  赭曲霉毒素 A标准工作液：精密吸取贮备液用苯稀释成 0.5 µg/mL的赭曲霉毒素 A标准溶液，
置冰箱中避光保存 ，可使用 7天。 
3.5 材料 
硅胶 G：薄层层析用。  
4 仪器和设备  
    所有玻璃仪器均需用稀盐酸浸泡，用自来水、蒸馏水冲洗。  
4.1  小型粉碎机。  
4.2  电动振荡器。  
4.3  玻璃板： 5 cm× 20 cm 。 
4.5  薄层涂布器。  
4.5  展开槽：内长 25 cm、宽 6 cm、高 4 cm。 
4.6  紫外光灯： 365 nm。 
4.7  微量注射器： 10 µ L，50 µ L。 
4.8  具0.2 mL尾管的 10 mL小浓缩瓶。  
5 分析步骤  
5.1 试样的制备  
    称取 250 g试样经粉碎并通过 20目筛后备用。   
5.2 提取 
5.2.1 甲法  
    称取约 20 g试样， 精确至 0.001 g， 置于 200 mL具塞锥形瓶中， 加入 100 mL三氯甲烷和 10 mL 0．1 
mol/L磷酸，振荡 30 min后通过快速定性滤纸过滤；取 20 mL滤液置于 250 mL分液漏斗中，加 50 mL 
0.l mol/L 碳酸氢钠溶液振摇 2 min，静置分层后，将三氯甲烷层放入另一个 100 mL分液漏斗中（少量
乳化层，或即使三氯甲烷层全部乳化都可放入分液漏斗中） ，加入 50 mL 0.1 mol/L 碳酸氢钠溶液重复
提取三氯甲烷层，静置分层后弃去三氯甲烷层（如三氯甲烷层仍乳化，弃去，不影响结果） 。碳酸氢钠
水层并入第一个分液漏斗中， 加约 5.5 mL 2 mol/L 盐酸溶液调节 pH 2～3（用 pH试纸测试） ， 加入 25 mL 
三氯甲烷振摇 2 min，静置分层后，放三氯甲烷层于另一 个盛有 100 mL水的 250 mL分液漏斗中，酸
水层再用 10 mL三氯甲烷振摇、提取、静置，将三氯甲烷层并入同一分液漏斗中。振摇、静置分层，
用脱脂棉擦干分液漏斗下端，放三氯甲烷层于一 个75 mL蒸发皿中，将蒸发皿置蒸气浴上通风挥干。
用约 8 mL三氯甲烷分次将蒸发皿中的残渣溶解，转入具尾管的 10 mL浓缩瓶中，置 80 ℃水浴锅上用
蒸汽加热吹氮气（ N2）浓缩至干，加入 0.2 mL苯－乙腈（ 98：2）溶解残渣，摇匀，供薄层色谱点样
用。  
5.2.2 乙法  GB/T xxxx—xxxx 
4 称取 20 g粉碎并通过 20目筛的试样加于 200 mL具塞锥形瓶中，加 30 mL石油醚和 100 mL甲醇水
（55：45），在瓶塞上抹上一层水盖严防漏。振荡 30 min后，通过快速定性滤纸滤入分液漏斗中，待
下层甲醇水层分清后，取出 20 mL滤液置于 100 mL分液漏斗中，用 pH试纸测试，一般为 pH 5～6。加
入25 mL三氯甲烷振摇 2min，静置分层后放出三氯甲烷层于另一分液漏斗中，再用 10 mL三氯甲烷重
复振摇提取甲醇水层（在用三氯甲烷振摇提取时，如发生乳化现象，可滴加甲醇促使其分层），将三
氯甲烷层合并于同一分液漏斗中，加入 50～100 mL氯化钠溶液（ 3.2.4）（加入量视品种不同而异，
大豆加 100 mL，小麦、玉米则加 50 mL左右），振摇放置（如为大豆试样提取液还须轻轻反复倒转分
液漏斗，使乳化层逐渐上升。如乳化严重可加入少许甲醇），待三氯甲烷层澄清后，用脱脂棉擦干分
液漏斗下端，放三氯甲烷层于 75 mL蒸发皿中（如为大豆 试样须再加入 10 mL三氯甲烷振摇，三氯甲
烷层合并于同一蒸发皿中），将蒸发皿置蒸汽浴上通风挥干。以下操作自 “用约  8mL三氯甲烷分次将
蒸发皿中的残渣溶解 ”起，按甲法操作。  
5.3 测定 
5.3.1薄层板的制备  
称取 4 g硅胶 G，加约 10 mL水于乳钵中研磨至糊状。立即倒入涂布器内制成 5 cm× 20 cm ，厚度
0.3 mm的薄层板三块，在空气中干燥后，在 105～110 ℃活化 1 h， 取出放干燥器中保存。  
5.3.2  点样  
取两块薄层板， 在距薄层板下端 2.5 cm的基线上用微量注射器滴加两个点： 在距板左边缘 1.7 cm
处滴加 OA标准溶液 8 µL（浓度 0.5 µ g/mL） ，在距板左边缘 2.5 cm 处滴加样液 25 µL，然后在第二
块板的样液点上加滴 OA标准溶液 8 µL（浓度 0.5 µ g/mL）点样时，需边滴加边用电吹风吹干，交替
使用冷热风。  
5.3.3 展开  
5.3.3.1   展开剂  
横展剂：乙醚或乙醚 -甲醇 -水（ 94：5：l）。 
纵展剂： a甲苯 -乙酸乙酯 -甲酸 -水（ 6： 3：l.2：0.06）或甲苯 -乙酸乙酯 -甲酸（ 6：3：1.4）; 
         b苯－冰乙酸（ 9：1）。 
5.3.3.2  展开  
    横向展开：在展开槽内倒入 10 m L横展剂，先将薄层板纵展至离原点 2～3 cm，取出通风挥发溶
剂1～2 min后，再将该薄层板靠标准点的长边置于同一展开槽内的溶剂中横展，如横展剂不够，可添
加适量，展至板端过 1 min，取出通风挥发溶剂 2～3 min。 
纵向展开： 在另一展开槽内倒入 10 mL纵展剂， 将经横展后的薄层板纵展至前沿距原点 13～15 cm。
取出通风挥干至板面无酸味（约 5～10 min）。 
5.3.4 观察与评定  
将薄层色谱板置 365 nm波长紫外光灯下观察。  
a.在紫外光灯下将两板相互比较，若第二块板的样液点在 OA标准点的相应处出现最低检出量，
而在第一板相同位置上未出现荧光点， 则试样中的 OA含量在本测定方法的最低检测量 10 µg/kg以下。  
b.如果第一板样液点在与第二板样液点相同位置上出现荧光点则看第二板样液的荧光点是否与滴
加的标准荧光点重叠，再进行以下的定量与确证试验。  
5.3.5 稀释定量  
比较样液中 OA与标准 OA点的荧光强度，估计稀释倍数。  
薄层板经双向展开后，当阳性样品中 OA含量高时， OA的荧光点会被横向拉长、使点变扁，或
分成两个黄绿色荧光点。这是因为在横展过程中原点上 OA的量超过了硅胶的吸附能力，原点上的杂
质和残留溶剂在横展中将 OA点横向拉长了， 这时可根据 OA黄绿色荧光的总强度与标准荧光强度比
较，估计需减少的滴加微升数或所需稀释倍数。经稀释后测定含量时可在样液点的左边基线上滴加二GB/T xxxx—xxxx 
5 个标准点， OA的量可为 4 ng、8 ng。比较样液与两个标准 OA荧光点的荧光强度，概略定量。  
5.3.6 确证试验  
用碳酸氢钠乙醇溶液（在 100 mL水中溶解 6.0 g碳酸氢钠，加 20 mL乙醇）喷洒色谱板，在室温
下干燥，于长波紫外光灯下观察，这时 OA荧光点应由黄绿色变为蓝色，而且荧光强度有所增加，可
使方法检出限达 5 µ g/kg，但概略定量仍按喷洒前所显黄绿色荧光计。  
6 分析结果的表述  
按式（ 1）计算：                               
         
mDVVAX1000
21                          ……………… （1） 
式中：  
X－试样中赭曲霉毒素 A的含量，单位为微克每千克（ µ g/kg）； 
A—薄层板上测得样液点上 OA的量，单位为微克（ µg）； 
D—样液的总稀释倍数；  
V1—苯－乙腈混合液的体积，单位为毫升（ mL）； 
V2—出现最低荧光点时滴加样液的体积，单位为毫升（ mL）； 
m— 苯－乙腈溶解时相当样品的质量，单位为克（ g）。 
 
第二法  免疫亲和层析净化液相色谱法  
7 原理  
    用提取液提取试样中的 赭曲霉毒素 A，经免疫亲和柱净化后，用高效液相色谱紫外检测器测定，
外标法定量。  
8 试剂和材料  
    除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。  
8.1 试剂 
8.1.1 甲醇（CH 3OH）：色谱纯。 
8.1.2  乙腈（CH 3CN）：色谱纯。 
8.1.3  冰乙酸（C2H4O2）：色谱纯。 
8.2 试剂配制  
8.2.1  提取液 1：甲醇 +水（ 80+20），80份甲醇和 20份水混合而成 。 
8.2.2  提取液 2：称取 150 g氯化钠、 20 g碳酸氢钠溶于约 950 mL水中，加水定容至 1 L。 
8.2.3  冲洗液：称取 25 g氯化钠、 5 g碳酸氢钠溶于约 950 mL水中，加水定容至 1 L。 
8.2.4  真菌毒素清洗缓冲液：称取 25.0 g氯化钠、 5.0 g碳酸氢钠溶于水中，加入 0.1 mL吐温 -20，用水
稀释至 1 L。 
8.3  标准品 
OA标准品：纯度 ≥98%。 GB/T xxxx—xxxx 
6 8.4  标准溶液配制  
8.4.1 OA标准储备液（0.1 mg/m L）：准确称取一定量的 OA标准品，用甲醇 -乙腈（ 1:1，v/v）溶解，配
成0.1 mg/m L的标准储备液，在 -20 ℃保存，可使用 3个月。  
8.4.2 OA标准工作液：根据使用需要，准确吸取一定量的 OA储备液，用流动相稀释，分别配成相当于
1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL 、20 ng/mL 、50 ng/mL 的标准工作液， 4 ℃保存，可使用 7天。  
8.5 材料 
8.5.1  OA免疫亲和柱。  
8.5.2 玻璃纤维滤纸：直径 11 cm，孔径 1.5 µ m，无荧光特性。  
9 仪器和设备  
9.1  天平：感量 0.001 g。 
9.2  高效液相色谱仪：配有荧光检测器。  
9.3  均质器：转速大于 10 000 r/min。 
9.4  高速万能粉碎机：转速 10 000 r/min 。 
9.5  玻璃注射器： 10 mL。 
9.6  试验筛： 1 mm孔径。  
9.7  空气压力泵。  
9.8  超声波发生器：功率大于 180 W。 
10 分析步骤  
10.1  试样制备与提取  
10.1.1  粮食和粮食制品：将样品研磨，硬质的粮食等用高速 万能粉碎机磨细并通过试验筛（ 9.6），
不要磨成粉末。称取 20 g（精确到 0.01 g）磨碎的试样于 100 mL容量瓶中，加入 5 g氯化钠，用提取液 1
（8.2.1）定容至刻度 ，混匀，转移至均质杯中，高速搅拌 2 min。定量滤纸过滤，移取 10.0 mL滤液于
50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液 A于干净的容器
中。  
10.1.2  酒类：取脱气酒类试样（含二氧化碳的酒类样品使用前先置于 4 ℃冰箱冷藏 30 min，过滤或超
声脱气） 或其他不 含二氧化碳的酒类试样 20 g（精确到 0.01 g） ， 置于 25 mL容量瓶中， ,加提取液 2（8.2.2）
定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液 B于干净的容器中。  
10.1.3  酱油、醋 、酱及酱制品中： 称取 25 g（精确到 0.01 g）混匀的试样，用提取液 1（8.2.1）定容至
50.0 mL，超声提取 5 min。定量滤纸过滤，移取 10.0 mL滤液于 50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混
匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液 C于干净的容器中。  
10.2 净化   
10.2.1  粮食和粮食制品：将免疫亲和柱连接于玻璃注射器（ 9.5）下，准确移取 10.1中滤液 A 10.0 mL，
注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约 1 滴/S的流速通过免
疫亲和柱，直至空气进入亲 和柱中，依次用 10 mL 真菌毒素清洗缓冲液（ 8.2.4）、 10 mL水先后淋洗
免疫亲和柱，流速约为 1 滴/S～2 滴/S，弃去全部流出液，抽干小柱。  
10.2.2  酒类：将免疫亲和柱连接于玻璃注射器（ 9.5）下，准确移取 10.1中滤液 B 10.0 mL，注入玻璃
注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约 1 滴/S的流速通过免疫亲和柱，
直至空气进入亲和柱中，依次用 10 mL冲洗液（ 8.2.3）、 10 mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速约为 1 滴
/S～2 滴/S，弃去全部流出液，抽干小柱。  GB/T xxxx—xxxx 
7 10.2.3  酱油、醋 、酱及酱制品中： 将免疫亲和柱连接于玻璃注射器（ 9.5）下，准确移取 10.1中滤液 C 
10.0 mL，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约 1 滴/S的流
速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用 10 mL 真菌毒素清洗缓冲液（ 8.2.4）、 10 mL水
先后淋洗免疫亲和柱，流速约为 1 滴/S～2 滴/S，弃去全部流出液，抽干小柱。  
10.3 洗脱 
准确加入 1.0 mL甲醇洗脱， 流速约为 1 滴/S，收集全部洗脱液于干净的玻璃试管中，用甲醇定容
至1 mL，供 HPLC测定。  
10.4 高效液相色谱参考条件  
色谱柱： C18柱， 5 µm，150 mm ×4.6 mm  或相当者；  
流动相：乙腈 +水+冰乙酸（ 99+99+2）；  
流速： 0.9 mL/min ； 
柱温： 35 ℃； 
进样量： 10 µL～100 µL； 
检测波长：激发波长 333 nm，发射波长 477 nm。 
10.5 定量测定  
以OA标准工作液浓度为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线
对试样进行定量，标准工作溶液和试样溶液中 OA的响应值均应在仪器检测线性范围内。在上述色谱条
件下， OA标准品色谱图参见图  A.1。 
10.6 空白试验  
除不加试样外，空白试验应与测定平行进行，并采用相同的分析步骤。  
10.7 平行试验  
按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。  
11 分析结果的表述  
试样中 OA的含量按式（ 2）计算：  
                               
fmVccX 10001000 ) (0 1  ………………………………… （2） 
式中：  
X— 试样中 OA的含量，单位为微克每千克（ µ g/kg）；  
c1—试样溶液中 OA的浓度，单位为纳克每毫升（ ng/mL）；  
c0—空白试样 溶液中 OA的浓度，单位为纳克每毫升（ ng/mL）；  
V—甲醇洗脱液体积，单位为毫升（ mL）；  
m—试样的质量，单位为克（ g）；  
f—稀释倍数。  
检测结果以两次测定值的算数平均值表示。计算结果表示到小数点后 1位。  
 
第三法  免疫亲和柱净化 高效液相色谱法  
12  原理  GB/T xxxx—xxxx 
8     试样中的赭曲霉毒素 A用乙腈 +水提取后，利用抗体与其相应抗原之间的专一性免疫亲和反应，  
以含有赭曲霉毒素 A特异性抗体的免疫亲和层析柱净化提取液，用配有荧光检测器的高效液相色谱仪  
测定，外标法定量。  
13 试剂和材料  
    除非另有说明，本方法所用试 剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的二级水。  
13.1   试剂 
13.1.1 乙腈（CH3CN）：色谱纯。  
13.1.2   甲醇（CH3OH）：色谱纯。  
13.1.3   氯化钠（ NaCl）。 
13. 1.4   冰醋酸（C2H4O 2）。 
13. 1.5   吐温 -20。 
13. 1.6   碳酸氢钠  （NaHCO3 ）。 
13. 1.7   磷酸氢二钠 （Na2HPO4 ）。 
13. 1.8   磷酸二氢钾 （KH2PO4）。 
13. 1.9   氯化钾（KCl）。 
13. 1.10  浓盐酸（HCl）。 
13.2 试剂配制    
13.2.1 提取液：乙腈 +水=60+40。 
13.2.2 磷酸盐缓冲溶液 （PBS）：8.0 g氯化钠、 1.2 g磷酸氢二钠、 0.2 g磷酸二氢钾和 0.2 g氯化钾溶解于
约990 mL水中 ,用浓盐酸调节 pH至7.0。用水稀释至 1 L。 
13.2.3  淋洗缓冲液： 25 g氯化钠、 5 g碳酸氢钠溶于水中，加人 0.1 mL吐温 -20，用水稀释至 1 L。 
13.2.4  流动相：96 mL乙腈、 102 mL水和 2 mL冰醋酸混合，用0.2 μm滤膜过滤并脱气。  
13. 3 标准品    
赭曲霉毒素  A（Ochratoxin A ，OTA）标准品 :纯度≥99%。 
13.4 标准溶液 配制 
13.4.1 OA标准储备液 （0.1 mg/mL ）：准确称取适量的 OA标准品，用甲醇配制成 0.100 mg/mL的OA标准
储备液，避光保存于 4 ℃冰箱备用。  
13.4.2 OA标准工作溶液 :准确移取适量的 OA标准储备液 （13.4.1）,用甲醇稀释成质量浓度分别为 1 
ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL的系列标准工作溶液。  
14 仪器和设备  
14.1  天平：感量 0.001  g。 
14.2  高速均质器：约 22 000 r/min ，或相当的设备。  
14.3  槽纹折叠滤纸。  
14.4  玻璃纤维滤纸。  
14.5  滤膜： 0.2 μm孔径， 25 nm直径的聚砜膜或相当者 。 
14.6  OA免疫亲和柱 ：对OA的最大吸附容量可达 100 ng，对于甲醇 +PBS=1+10 溶液中含有 5 ng OA的
回收率不小于 85%。 
14.7  玻璃注射器： 10 mL。 
14.8  空气压力泵 。 GB/T xxxx—xxxx 
9 14.9  高效液相色谱仪：带荧光检测器。  
14.10 微量进样器： 20 μL。 
14.11 氮吹仪。  
15  分析步骤  
15.1  提取 
称取试样 50 g（精确到 1 mg）于均质器搅拌杯 中，加入 5.0 g氯化钠和100 mL提取液（ 13.2.1）。将
搅拌杯状语 均质器上，于22 000 r/min 高速搅拌 3 min。提取液经槽纹折叠 滤纸过滤 于干净的烧杯中，准
确移取 10.0 mL滤液于 50 mL容量瓶中，用 磷酸盐缓冲液（ 13.2.2）稀释至 至刻度，混匀，用玻璃纤维
滤纸过滤 ，备用。 
15.2  净化   
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器 （14.7）下端，准确移取 10.0 mL样品提取液（ 15.1），注入玻璃
注射器中 ，将空气压 力泵（14.8）与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约 1 滴/S～2 滴/S的流速
缓慢通过免疫亲和柱，至 有空气进入 免疫亲和柱时停止加压。用上述方法，以 10 mL淋洗缓冲液
（13.12.3）、 10 mL水先后淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液， 再用 1.5 mL甲醇以上述方法洗脱 OA，
收集全部洗脱液于玻璃试管中，在 45 ℃下以氮吹仪（ 14.11）用氮气吹干 。用液相流动相（ 13.2.4）溶
解残渣并定容到 200 μL（V），即为试样提取净化液，供高效液相色谱测定时使用。  
注：对于 OA含量较高的样品，可将 提取液进行适当稀释，以保证 OA的含量不超过免疫亲和柱的吸附容量。由于
不同厂商提供的亲和柱操作程序可能有所区别，实际操作时，请参照免疫亲和柱厂商提供的操作说明和程序操作。  
15.3 高效液相色谱参考条件  
a) 色谱柱： C18柱， 5 µm，150 mm× 4.6  mm 或性能相当者；  
b) 流动相：乙腈 +水+冰乙酸（ 96+102+2）；  
c) 流速： 1.0 mL/min； 
d) 检测波长：激发波长 333 nm，发射波长 460 nm； 
e) 柱温：室温 ； 
f) 进样量： 20 µ L。 
15.4 定量测定  
参考上述色谱条件，调节高效液相色谱仪工作参数，使 OA与杂质完全分离。用微量进样器（ 14.10）
分别吸取等体积的 OA标准工作溶液 （13.16.2）和试样提取净化液 （15.2）分别进样分析 ，测定响应值
（峰高或峰面积 ），以标准工作液的浓度与相应的峰面积绘制标准曲线 ，以试样提取净化液 OA的峰面
积在标准曲线上求得相应的 OA的浓度（c），OA标准品色谱图参见图  A.2。 
15.5  空白试验  
除不加试样外，按 21.1～21.4步骤进行提取、净化、测定，求得空白试液中 OA的浓度（ c0）。  
15.6  平行试验  
每个试样进行两次平行试验， 取两次测定的算术平均值作为测定结 果。  
16 分析结果的表述  
试样中 OA的含量按式（ 3）计算：  GB/T xxxx—xxxx 
10                                
0
1()
1000c c V fXm   ……………………………… （3） 
式中：  
X1— 试样中 OA的含量， 单位为微克每千克（ µ g/kg）； 
c—最终定容 试样提取净化液 中OA的浓度，单位为纳克每毫升（ ng/mL）； 
c0—空白试样中最终定容溶液中 OA的浓度，单位为纳克每毫升（ ng/mL）； 
V—试样测定液最终定容 体积，单位为毫升（ mL）； 
m—试样质量，单位为 克（ g）； 
f—稀释倍数。  
 
第四法 免疫亲和柱层析净化荧光光度法  
17 原理  
    试样中的赭曲霉毒素 A用乙腈 +水提取后，利用抗体与其相应抗原之间的专一性免疫亲和反应，以
含有赭曲霉毒素 A特异性抗体的免疫亲和层析柱净化提取液，用荧光光度计进行 测定。  
18  试剂和材料  
    除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为重蒸水。  
18.1  试剂 
18.1.1   乙腈（CH 3CN）：色谱纯。  
18.1.2  甲醇（CH 3OH）：色谱纯。  
18.1.3  氯化钠（NaCl）。 
18.1.4  吐温 -20。 
18.1.5  碳酸氢钠 （NaHCO 3）。 
18.1.6  硫酸奎宁。  
18.1.7  浓硫酸（ H2SO 4）。 
18.1.8  氢氧化钠（ NaOH）。 
18.2  试剂配制     
18.2.1 提取液：乙腈 +水=60+40。 
18.2.2 淋洗缓冲液： 25 g氯化钠、 5 g碳酸氢钠溶于水中，加人 0.1 mL吐温 -20，用水稀释至 1 L。 
18.2.3 0.05 mol/L 硫酸溶液：量取 2.8 mL浓硫酸，缓慢加入适量水中，冷却定容至 1 000 mL 。 
18.2.4  0.1 mol/L 氢氧化钠溶液：称取 0.40 g氢氧化钠，缓慢加入适量水中，冷却 后定容至 100 mL。 
18.2.5  甲醇 -氢氧化钠溶液：甲醇 +氢氧化钠 =50+50。 
18.3  标准溶液的制备  
18.3.1 准确称取适量的 OA标准品，用甲醇 -氢氧化钠溶液（ 18.2.4）溶解并定容， 配制成 5 mg/mL和10 
mg/mL OA标准溶液。 
18.3.2 荧光光度计标定溶液：准确称取一定量的硫酸奎宁，用硫酸溶液（ 18.2.3）溶解并稀释至 100 mL。
分别用 5 mg/mL和10 mg/ mL OA标准溶液（ 18.3.1）确定相当于该浓度荧光强度的硫酸奎宁溶液浓度，并GB/T xxxx—xxxx 
11 用该浓度的硫酸奎宁溶液标定 荧光光度计（配制时可参考： 1.625 mg/mL 硫酸奎宁的荧光强度约相当于 1 
mg/mL OA，具体根据实际情况定） 。此标定溶液浓度一经确定，可在该荧光计上反复使用。  
19   仪器和设备  
19.1  荧光光度计 ：激发波长 360 nm、发射波长 440 nm。 
19.2  高速均质器：约 22 000 r/min ，或性能相当的设备。  
19.3  槽纹折叠滤纸 ：无荧光特性 。 
19.4  玻璃纤维滤纸 ：直径 11 cm，孔径 1.5 μm，无荧光特性 。 
19.5  滤膜： 0.2 μm孔径， 25 nm直径的聚砜膜或相当者 。 
19.6  OA免疫亲和柱：对 OA的最大吸附容量可达 100 ng，对于甲醇 +PBS=1+10 溶液中含有 5 ng OA的
回收率不小于 85%。 
19.7  玻璃注射器： 10 mL。 
19.8  空气压力泵。  
20   分析步骤  
20.1  提取 
同15.1。 
20.2  净化  
同21.2操作至淋洗步骤结束。准确吸取 1 mL甲醇以 1 滴/s～2 滴/s的流速洗脱 OA，收集全部洗脱
液于玻璃试管中。  
20.3  荧光光度计标定  
在激发波长 360 nm、发射波长 440 nm条件下，以 0.05 mol/L 硫酸溶液为 空白，调节荧光光度计的
读数值为零，再分别以不同浓度硫酸奎宁标定溶液（ 18.15）调节荧光光度计的读数值分别为 5和10。 
20.4  测定 
在甲醇洗脱液（ 18.13）中加入 1 mL 0.1 mol/L NaOH 溶液（ 18.12），总体积为 V’（2 mL），混匀
后立即置于荧光光度计中，读取溶液的荧光强度，此读数即为试样测定液中 OA的浓度（ c）。  
20.5  空白试验   
除不加试样外，按 20.1～20.4步骤进行提取、净化、测定， 求得空白试液中 OA的浓度（ c0）。  
20.6  平行试验  
每个试样进行两次平行试验， 取两次测定的算术平均值作为测定结果。  
21   分析结果的表述  
试样中OA的含量按式（ 4）计算：  
                               
20 ( ) 'c c V fXm    ……………………………… （4） 
式中：  
X2— 试样中 OA的含量， 单位为微克每千克（ µ g/kg）； 
c—最终定容 试样提取净化液中 OA的浓度，单位为纳克每毫升（ ng/mL）； GB/T xxxx—xxxx 
12 c0—空白试样中最终定容溶液中 OA的浓度，单位为纳克每毫升（ ng/mL）； 
V’—试样测定液最终定容体积， 单位为毫升（ mL）； 
m—试样质量，单位为 克（ g）； 
f—稀释倍数。  
 
第五法  离子交换固相萃取柱净化高效液相色谱法  
22  原理  
    试样中的 OA用碱性甲醇 +水提取后， 提取液经离子交换固相萃取柱净化、洗脱后，用配有荧光检测
器的液相色谱仪进行测定，标准曲线法 定量。  
23  试剂和材料  
    除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的二级水 要求。 
23.1  试剂 
23.1.1  乙腈（CH 3CN）：色谱纯。  
23.1.2 甲醇（CH 3OH）：色谱纯。  
23.1.3 冰醋酸（C2H4O2）。 
23.1.4 石油醚（ 60 ℃～90 ℃）。 
23.1.5 甲酸（ CH 2O2）。 
23.1.6 三氯甲烷 （CHCl 3）。 
23.2 试剂配制    
23.2.1  0.1 mol/L氢氧化钾溶液。  
23.2.2  0.1 mol/L磷酸溶液。  
23.2.3  提取液：氢氧化钾溶液 （23.8）+甲醇 +水=2+60+38 。 
23.2.4  淋洗液：氢氧化钾溶液 （23.8）+乙腈 +水=3+50+47 。 
23.2.5  洗脱液：甲醇 +乙腈 +甲酸 +水=40+50+5+5。 
23.2.6  流动相： 取45 mL乙腈加 54 mL水和 1 mL冰醋酸混合 ，过0.45μm的滤膜并脱气。  
23.3 标准品  
  赭曲霉毒素  A（Ochratoxin A ，OTA）标准品 :纯度≥99%。 
23.4 标准溶液配制  
23.4.1 OA标准储备溶液 ：准确称取 l mg OA标准品（23.3）,用甲醇溶解并定  
容至 25 mL，配制成 40μg/mL的标准储备液 ，避光保存于 4 ℃冰箱备用。  
23.4.2 OA标准工作溶液 :准确移取适量 OA标准储备液 （23.4.1），用甲醇稀释配制成 0.4μg/mL的工作液。  
24  仪器和设备  
24.1  旋风式谷物粉碎机。  
24.2  振荡器。  
24.3  高效液相色谱仪 ：带荧光检测器。  
24.4  快速定性滤纸。  GB/T xxxx—xxxx 
13 24.5  针头式过滤器 ：0.45μm孔径，13 mm直径的醋酸纤维素膜或性能相当者。  
24.6  固相萃取柱 ：PAX阴离子交换混合反相固相萃取柱 ，120 mg/3  mL。 
24.7  色谱柱：长250 mm，内径 4.6 mm，填料直径 5μm C18柱或性能相当者。  
24.8  保护柱：长20 mm，内径 4.6 mm，填料直径 5μm C18柱或性能相当者。  
24.9   一次性塑料注射器 ：5 mL。 
24.10  氮吹仪。  
24.11  旋转蒸发仪 ：带水浴。  
24.12  20目筛。  
24.13  滤膜：0.45μm孔径，25 mm直径的醋酸纤维素膜或性能相当者。  
25  操作步骤  
25.1 试样制备  
玉米、稻谷 （糙米）、小麦、小麦粉、大豆等粮食均用旋风式谷物粉碎机 （24.1）将样品粉碎 ，用
20目筛筛理 ，筛下物装瓶备用。  
25.2 提取  
25.2.1 玉米  
称取试样 10 g（精确至 0.01 g），加人三氯甲烷 50 mL（V3）和5 mL 0.1 mol/L的磷酸溶液 （23.2.2），
于振荡器 （24.2）上振荡提取 3 min~5 min，提取液用滤纸 （24.4）过滤，取下层滤液 10mL放入100mL
平底烧瓶中 ，于水浴中 40 ℃用旋转蒸发仪 （24.11）旋转蒸发至接近干涸 ，用20 mL石油醚溶解残渣 ，
加入 10 mL提取液（23.2.3），再用振荡器振荡提取 3 min~5 min，静置分层后取下层溶液 ，用滤纸过滤 ，
取滤液 5 mL（V4）进行固相萃取。  
25.2.2 稻谷（糙米）、小麦、小麦粉、大豆  
称取试样 10 g（精确至 0.01 g），加人提取液 50 mL（V3）（23.2.3），于振荡器 （24.2）振荡提取 3 min~  
5 min，用滤纸（24.4）过滤，取滤液 10 mL放人 100 mL平底烧瓶中 ，加人 20 mL石油醚，振荡器振荡提
取3 min~5  min，静置分层后取下层溶液 ，用滤纸过滤 ，取滤液 5 mL（V4）进行固相萃取净化。  
25.3 固相萃取净化  
用5 mL甲醇冲洗 PAX固相萃取柱 （24.6），再用 3 mL提取液（23.2.3）润洗。然后将 5 mL样品提取
液（25.2）加人柱子中 ，调节流速以 1 滴/s~2 滴/s的速度通过柱子 ，再以同样的流速用 3 mL淋洗液（23.2.4）
洗柱，然后用 1.2 mL蒸馏水快速冲洗柱子 ，用空气或氮气吹尽柱子中的液体。最后用 4 mL~5  mL洗脱液
（23.2.5）脱OA并收集洗脱液于玻璃试管中 ，于45 ℃下在氮吹仪 （24.10）上用氮气吹干溶剂。用流动
相溶解残渣并定容到 1.0 mL（V2）（或者洗脱液收集于一个 50 mL的平底烧瓶中 ，于40 ℃以下水浴 中，
10 min内旋转蒸发至干 ，用1.0 mL流动相溶解残留物 ），经针头式过滤器 （24.5）过滤后备用。  
25.4 高效液相色谱参考条件  
a) 色谱柱： C18柱， 5 µ m，150 mm× 4.6 mm 或性能相当者；  
b) 保护柱：C18柱， 5 µ m，20 mm× 4.6 mm 或性能相当者；  
c) 流动相：乙腈 +水+冰乙酸（ 45+54+1）；  
d) 流速： 1.0 mL/min； 
e) 荧光检测器 ：激发波长 333 nm，发射波长 460 nm； 
f) 柱温： 30 ℃； 
g) 进样量： 25 µL。 
25.5 测定  GB/T xxxx—xxxx 
14 参考上述色谱条件，调节高效液相色谱仪工作参数，使 OA与杂质完全分离。 用流动相将 OA标准工
作溶液配制浓度分别为 0.4 ng/mL、0.8 ng/mL、1.6 ng/mL、3.2 ng/mL、8 ng/mL、16 ng/mL、32 ng/mL
标准工作溶液系列，分别吸收 25μL不同浓度的标准工 作液和试样提取净化液 （V1），进行分析。 以各
标准溶液中OA的浓度与相应的峰面积 （或峰高）作 标准曲线 。以试样 OA的峰面积在标准曲线上求得 试
样提取净化液中 OA的质量（mx）， OA标准品色谱图参见图  A.3。 
25.6 空白试验  
除不加试样外，按 25.2～25.5步骤进行提取、净化、测定，求得空白试液中 OA的质量（m0）。  
25.7 平行试验  
每个试样进行两次平行试验， 取两次测定的算术平均值作为测定结果。  
26   分析结果的表述  
试样中 OA的含量按式（ 5）计算：  
                               
0 2 3
3
14( ) 1000xm m V VXV m V     ……………………………… （5） 
式中：  
X3— 试样中 OA的含量， 单位为微克每千克（ µ g/kg）； 
mx—从标准曲线上获得的 OA的质量，单位为纳克（ ng）； 
m0—空白溶液中OA的质量，单位为纳克（ ng）； 
V1—试样提取净化液的进样 体积，单位为微升（μL）； 
V2—试样提取液最终定容体积， 单位为毫升（ mL）； 
V3—试样总提取液 体积，单位为毫升（ mL）； 
V4—用于固相萃取的样品提取液 体积，单位为毫升（ mL）； 
m—试样质量，单位为 克（ g）； 
 
 GB/T xxxx—xxxx 
15 附  录 A 
    （资料性附录）  
赭曲霉毒素 A标准品的色谱图  
 
 
图 A.1第二法中 赭曲霉毒素 A标准品的液相色谱图  
 
图 A.2第三法中赭曲霉毒素 A标准品的液相色谱图  
 
图 A.3第五法中离子交换固相萃取柱净化高效液相法色谱条件下赭曲霉毒素 A标准品的色谱图  GB/T xxxx—xxxx 
16 附  录 B 
（资料性附录）  
实验室间测试结果  
表B.1为2008年组织的 5个实验室参与的免疫亲和层析净化净化高效液相色谱法实验室间测试统 计
结果,样品为添加了赭曲霉毒素 A标准品的小麦、稻谷和玉米。  
表B.1 免疫亲和层析净化高效液相色谱法测试结果的统计分析  
 
表B.2为2O08年组织的有 6个实验室参与的免疫亲和柱层析净化荧光光度法实验室间测试统计结果 ,
样品为添加了赭曲霉毒素 A标准品的小麦、稻谷和玉米。  
表B.2 免疫亲和柱层析净化荧光光度法测试结果的统计分析  
 项目 玉米 小麦 稻谷 
参加实验室的数量  5 5 5 5 5 5 5 5 5 
样品的数量  1 1 1 1 1 1 1 1 1 
去除离群值后的测试实验室数量  5 5 5 5 5 5 5 5 5 
所有可接受结果的数量  15 15 15 15 15 15 15 15 15 
平均值/（μg/kg） 0.850 4.408 8.843 0.773 3.995 8.108 0.813 4.353 8.885 
重复性的标准偏差， Sr/（μg/kg） 0.046 0.444 0.952 0.055 0.355 0.623 0.046 0.378 1.179 
重复性的变异系数 /% 5.4 10.1 10.8 7.2 8.9 7.7 5.6 8.7 13.3 
重复性限值， r/（μg/kg） 0.13 1.257 2.693 0.157 1.006 1.763 0.129 1.070 3.338 
再现性标准偏差， SR/（μg/kg） 0.135 0.636 1.307 0.072 0.361 0.702 0.109 0.518 1.440 
再现性的变异系数 /% 15.9 14.4 14.8 9.3 9.0 8.7 13.4 11.9 16.2 
再现性限值， R/（μg/kg） 0.383 1.799 3.699 0.204 1.023 1.985 0.309 1.465 4.075 
回收率/% 85.0 88.2 88.4 77.3 79.9 81.1 81.3 87.1 88.9 
项目 玉米 小麦 稻谷 
参加实验室的 数量 6 6 6 6 6 6 6 6 6 
样品的数量  1 1 1 1 1 1 1 1 1 
去除离群值后的测试实验室数量  6 6 6 6 6 6 6 6 6 
所有可接受结果的数量  18 18 18 18 18 18 18 18 18 
平均值/（μg/kg） 0.763 4.022 7.733 0.799 3.917 7.694 0.769 4.194 8.111 
重复性的标准偏差， Sr/（μg/kg） 0.065 0.614 0.898 0.183 0.608 0.733 0.056 0.651 1.222 
重复性的变异系数 /% 8.5 15.3 11.6 22.9 15.5 9.5 7.2 15.5 15.1 
重复性限值， r/（μg/kg） 0.184 1.738 2.542 0.518 1.721 2.075 0.158 1.843 3.457 
再现性标准偏差， SR/（μg/kg） 0.065 0.614 0.898 0.183 0.608 0.733 0.056 0.651 1.222 
再现性的变异系数 /% 8.5 15.3 11.6 22.9 15.5 9.5 7.2 15.5 15.1 
再现性限值， R/（μg/kg） 0.184 1.738 2.542 0.518 1.721 2.075 0.158 1.843 3.457 
回收率/% 76.3 80.4 77.3 79.9 78.3 76.9 76.9 83.9 81.1 GB/T xxxx—xxxx 
17 表B.3为2008年组织的有 5个实验室参与的离子交换固相萃取柱净化高效液相色谱法实验室间测试
统计结果 ,样品为添加了赭曲霉毒素 A标准品的小麦、稻谷和玉米。  
表 B.3 离子交换固相萃取柱净化高效液相色谱法测试结果的统计分析  
 
 
 
 
 
 项目 玉米 小麦 稻谷 
参加实验室 的数量 5 5 5 5 5 5 5 5 5 
样品的数量  1 1 1 1 1 1 1 1 1 
去除离群值后的测试实验室数量  4 5 5 4 5 5 4 5 5 
所有可接受结果的数量  12 15 15 12 15 15 12 15 15 
平均值/（μg/kg） 0.909 4.206 8.678 0.861 4.679 9.224 0.926 4.680 9.177 
重复性的标准偏差， Sr/（μg/kg） 0.034 0.180 0.183 0.031 0.120 0.256 0.048 0.245 0.287 
重复性的变异系数 /% 3.8 4.3 2.1 3.6 2.6 2.8 5.2 5.2 3.1 
重复性限值， r/（μg/kg） 0.097 0.509 0.517 0.089 0.340 0.725 0.135 0.693 0.813 
再现性标准偏差， SR/（μg/kg） 0.143 0.693 0.873 0.133 0.418 1.021 0.095 0.400 1.403 
再现性的变异系数 /% 15.7 16.5 10.1 15.4 8.9 11.1 10.3 8.6 15.3 
再现性限值， R/（μg/kg） 0.403 1.962 2.472 0.375 1.184 2.890 0.270 1.133 3.969 
回收率/% 90.9 84.1 86.8 86.1 93.6 92.2 92.6 93.6 91.8