化妆品用化学原料体外 3T3 中性红摄取 
光毒性试验方法 （征求意见稿） 
 
一、范围 本方法规定了3T3中性红摄取光毒性试验的范围、规范
性引用文件、术语和定义、试验原理、试验材料与试剂、试验步骤、结果判定标准。 
本方法适用于化妆品用化学原料潜在光毒性的检测。 二、规范性引用文件 下列文件中的条款通过本方法的引用而成为本方法的
条款。注明日期的引用文件，其后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本方法，但是，鼓励使用单位对修订部分的引用进行研究， 并提出意见。 研究是否可使用这些文件的最新版本。 未注明日期的引用文件， 其最新版本适用于本方法。 
经济合作与发展组织（OECD）guidelines for the 
testing of chemicals: 3T3 NRU phototoxicity test. NO. 432  
三、术语和定义 下列术语和定义适用于本方法。 （一）光毒性  （Phototoxicity） 皮肤一次接触化学物质后， 继而暴露于紫外线照射下所
引发的一种皮肤毒性反应。 
（二）细胞活性  （cell viability） 测量某一细胞群总活性的参数 （如细胞溶酶体摄取活性
染料中性红） ， 其数值取决于测定的终点和试验所用的设计方案，并与细胞总数和/或细胞活力相关。 
（三）相对细胞活性  （relative cell viability） 通过与溶剂 （阴性） 对照组的相关性来表达的细胞活性，
对照组除了未经受试化学物质处理外， 整个试验过程与试验
组一样（或+Irr或-Irr）。 
（四）光刺激因子  （photo irritation factor; PIF） 在无细胞毒性的UV/vis照射下，受试物分别在无光照
(-Irr)和有光照(+Irr)条件下获得两组平行有效的细胞毒性浓度(IC50 )，通过比较IC50的值得到的因子。 
（五）半数抑制浓度  （IC50）  使细胞活性下降50%的受试化学物质的浓度。 （六）平均光效应  （mean photo effect; MPE） 在无细胞毒性的UV/vis照射下，受试物分别在无光照
(一Irr)和有光照(+ Irr)条件下获得两组浓度反应曲线， 通过数
学分析导出的数值。 
（七）预测模型  （prediction model） 将毒性试验结果转换为预测毒性潜力的算法。 在本方法
中，PIF和MPE可用于把体外3T3中性红摄取光毒性试验的结果转换为对光毒性潜力的预测。 
四、试验原理 中性红是一种弱的阳离子染料， 极易以非离子扩散的方
式穿透细胞膜并在细胞溶酶体内聚集。 在某些化学物质和外
界条件作用下， 可引起细胞表面或溶酶体膜敏感性的改变而
导致溶酶体脆性增高等不可逆变化， 从而导致细胞吸收中性
红的能力下降。通过测定3T3成纤维细胞经化学物质和紫外线照射联合作用后细胞吸收中性红能力的变化来判断该化学物质是否具有光毒性。 
五、试验材料与试剂 （一）细胞株 Balb/c 3 T3 成纤维细胞。要求：来源清晰，代数明确
（<100代）。 
（二）培养基 高糖D M E M培养基，小牛血清（1 0 %），氨酰胺
（4mmol/L），抗生素（青霉素和链霉素，浓度分别为100IU/mL）。 
（三）溶剂的选择 在测定前， 应首先评价受试物的溶解度， 以选择最佳溶
剂体系， 即受试物原液是用磷酸盐缓冲液 （EBSS或PBS） 、还是用有机溶剂配制。 
能溶于水且浓度达1000 μg/mL的受试物可溶于预先加
温（37℃）灭菌的EBSS或PBS。水中溶解度有限的受试物
（<1000 μg /mL） 可用二甲基亚砜 （DMSO） 或乙醇 （ETOH）
溶解。使用DMSO或ETOH作为溶剂时，其终浓度不得超过总体积的1％（v/v），阴性对照组和受试物组溶剂的体积比例应相同。 
（四）受试物的配制 在+UVA试验和-UVA试验中， 用溶剂将受试物原液使用
某一常数稀释因子 (如3√10＝3.16)稀释成8个浓度， 尽量覆
盖相关浓度范围，避免包含无细胞毒性和／或100％细胞毒性的浓度。 显示少于三种有细胞毒性浓度的试验应该重复试
验，如果有可能，使用更小的稀释因子。 
根据受试物的溶解度，建议最大浓度为1000 μg/ mL。 
受试物必须在使用前新鲜配制。 如果可能出现快速光衰
减现象，有必要在红光下准备。 
每次实验应设空白对照、 溶剂对照和阳性对照。 加样示
意图见附录B。 
（五）中性红（Neutral Red，NR） 化学名为3-氨基一7一二甲氨基一2一甲基吩嗦盐酸盐
(3-amino-7-dime-2-thylamino-2-methylphenazine hydrochloride〕,CAS编号:553-24-20或国家药品标准物质，编号：100460。 
（六）中性红溶液 1．中性红原液 称取0.4g中性红染料，溶于100mL蒸馏水。 （在室温条
件下可保存2个月） 
2．中性红使用液 将在79mLDMEM培养液中加入1mL中性红原液，即为
使用液。中性红终浓度为50 μg/mL。 
（七）中性红解吸附溶液 将蒸馏水、乙醇、乙酸按49:50:1比例配制。（现用现
配，储存不超过1小时） 
六、 试验步骤 （一） 加100 μL培养基于96孔组织培养板的外围孔 （空
白对照），在其余孔中加入100 μL密度为1 ×105 个细胞/mL
的细胞悬液（即 1 ×104细胞/孔）。每次试验制备两个板，
包括相同的受试物浓度系列、 溶剂对照、 空白对照和阳性对照，一个板用于确定细胞毒性（+Irr），另一个板用于确定光毒性（-Irr）。 （二）培养细胞24小时（5%CO 2，37℃）直至它们形
成半融合单层细胞。该培养过程允许细胞恢复和粘连。 
（三）去除培养液，用150 μL EBSS或PBS冲洗两次。
加入100μL含适当浓度受试物或溶剂的缓冲液到孔中。 培养
细胞1小时（5%CO 2， 37℃）。 
（四） 在室温下将其中一个板进行光照 （ +Irr ） 暴露，
以1.7 mW/cm2光强度 （即5J/ cm2） 透过96孔板盖照射细胞
50分钟；同时将另一个平板无光照（-Irr）置于暗盒内50分钟。 
（五）去除受试溶液，用150 μL 磷酸盐缓冲液（EBSS
或PBS）冲洗两次。加入100 μL培养液，培养过夜（18～22
小时，37℃）。 
（六） 在相差显微镜下检查细胞， 记录受试物细胞毒性
所致细胞形态学的改变，用于排除试验误差。 
（七）中性红吸收（NRU）测量 细胞吸收中性红进入溶酶体和活细胞体内空泡， 可用作
细胞数量和活性的定量指标。 
1． 用150 μL预温的EBSS或PBS冲洗细胞两次。 轻柔拍
打平板，去除冲洗溶液。加入100 μL 含50μg/mL中性红的
培养液，在37℃，5%CO
2和湿度适宜的环境下培养细胞3
小时。 2．去除中性红培养液，用150 μL EBSS或PBS冲洗细
胞一次。 
3．轻轻倒出并吸干全部EBSS或PBS。 4．准确加入150 μL 中性红解吸附溶液。 
5．在微量滴定平板振荡器上快速震荡微量滴定平板10
分钟，直至中性红从细胞内被提取 出来，并形成均匀溶液。  
6．用酶标仪测定溶液在540nm波长处的光密度。用空
白孔作为参考对照。 
七、结果评判标准 （一）确定以光刺激因子（PIF值）为基础的预测模型 1．通过分析在有光照（+Irr）和无光照（-Irr）两种情
况下获得的细胞毒性浓度反应曲线，确定能抑制50％细胞活性的受试物浓度（IC50），按下列公式计算光刺激因子（PIF）。 
IC50（-Irr） 
PIF＝
IC50（+Irr） 
评判标准：PIF≤2：预测“无光毒性”；PIF≥5：预测“有
光毒性”。PIF介于2～5之间，需重新进行实验再行判定。 
2．如果受试物在光照 （+Irr） 时有细胞毒性， 无光照 （-Irr）
时无细胞毒性，>PIF细胞毒性试验所使用的浓度已达最高受试浓度（Cmax）时，可按照下列公式计算>PIF： 
>PIF＝Cmax（-Irr）/ IC50（+Irr） 评判标准为： 如果只获得一个 “>PIF ”，那么任何>PIF >1
的值都能提示“有潜在光毒性”。 
3．受试物在最高浓度时仍未显示任何细胞毒性， 用“PIF
＝*1”表示，提示“无潜在光毒性”。 
（二）确定以平均光效应（MPE值）为基础的预测模
型 
平均光效应（MPE）通过在浓度网格上比较有光照
（+Irr）和无光照（-Irr）两种情况下获得的细胞毒性浓度反应曲线（i＝1， ….，N），染毒浓度范围在有光照（+Irr）
和无光照（-Irr）试验共有的浓度范围内选择。浓度ci的光效应（PEi）等于浓度效应（CEi）和反应效应（REi）的乘积。使用专门的软件 “PHOTO32 ”求得平均光效应（MPE），
建立以平均光效应 （MPE） 为基础的预测模型。 通过将MPE与临界阈值MPEc比较，预测化学物潜在光毒性的预测模型。 
阈值MPEc＝0.1 评判标准： 如果MPE≤0.1：预测无潜在光毒性； 如果MPE≥0.15：预测有潜在光毒性。 如果MPE介于0.1～0.15之间，需重新进行实验再行判
定。 附录 A   
NRU PT试验流程图 
 
时间  步骤  
0小时  接种 96孔平板： 1×104个细胞 //孔培养  
（37℃、 5%CO 2、24h） 
24小时  去除培养液，用 EBSS/PBS 冲洗两次  
24小时  分别用 100μL 8种不同浓度的受试化学物处理细胞，培养细胞
1h （37℃、 5%CO 2 ） 
25小时  光毒性：室温下暴露于有光照（ +Irr）（1.7mW/cm2）50分钟（即
5J/cm2） 
细胞毒性：室温下将另一个平板置于黑暗环境 50分钟  
25小时 50分钟  去除受试液，用 EBSS或PBS冲洗两次，再用培养液培养细胞
（37℃、 5%CO 2、18～22h过夜）  
48小时  显微镜下观察细胞形态学改变 ；去除培养液，加入 100μL含
50μg/mL中性红培养液培养（ 37℃、 5%CO 2、3h） 
51小时  去除中性红培养液，用 150μL EBSS 或PBS冲洗一次，加入
150μL中性红解吸附溶液  
51小时  震荡平板 10分钟  
51小时 10分钟  检测在 540nm波长下细胞对中性红的吸收情况 （反映细胞活性）
 
         
 附录B  
96孔板加样示意图 
1．建议使用如下式样 96孔板。如使用软件 NRU-PIT 进行数据分析，则必须按
以下所示，准确设计 96孔板的加样。  
2．鉴于在平板四周外围孔可能发生蒸发作用， 建议将四边这些孔作为空白对照，
以纠正可能出现的塑胶材料对中性红吸收所造成的结果干扰。  
3．96孔的加样示例如下：  
 
b b b b b b b b b b b b 
b UC C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 UC b 
b UC C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 UC b 
b UC C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 UC b 
b UC C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 UC b 
b UC C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 UC b 
b UC C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 UC b 
b b b b b b b b b b b b 
注：①  UC为未接受处理的对照孔（平均活性设为 100％）； 
② C1－C8为8个浓度梯度的受试化学物（ C1－C8为从低浓度向高浓度
依次排列） ； 
③ b为空白对照（不含有细胞，但用 NR培养液和 NR解吸附溶液处理） 。