(Primera Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 6 de ju lio de 2009 
SECRETARIA DE AGRICULTURA, GANADERIA, DESARROLLO 
RURAL, PESCA Y ALIMENTACION 
PROYECTO de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-067-ZOO -2007, Campaña nacional para la prevención y 
control de la rabia en bovinos y especies ganaderas . 
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice : Estados Unidos Mexicanos.- Secretaría de Agricult ura, 
Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación. 
WOLFGANG RODOLFO GONZALEZ MUÑOZ, Coordinador Genera l Jurídico de la Secretaría de 
Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y A limentación, a petición del Presidente del Comité 
Consultivo Nacional de Normalización de Protección Zoosanitaria, con fundamento en los artículos 9, 12 , 16, 
26 y 35 fracción IV de la Ley Orgánica de la Admini stración Pública Federal; 1, 6 fracciones I, II, IV , VIII, IX, 
XV, XVI, XVIII y XXI, 54, 55, 56, 58, 63, 64, 65, 6 6 y 67 de la Ley Federal de Sanidad Animal; 38 frac ción II, 40 
fracción II, 41, 43, 44, 45 y 47 de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 28 fracción II y 33 del 
Reglamento de la Ley Federal sobre Metrología y Nor malización; 3, 15 fracciones I, II, XXX y XXXI, fra cción 
XXIX y 49 del Reglamento Interior de la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca  y 
Alimentación, y 
CONSIDERANDO 
Que es atribución de la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación, el 
fomentar la producción pecuaria y consecuentemente el diagnóstico, la prevención, control y erradicaci ón de 
enfermedades y plagas, como es el caso de la rabia que afecta a la ganadería nacional, en su nivel de salud y 
producción; 
Que las pérdidas económicas directas anuales estima das en la ganadería nacional por la muerte de 
bovinos a causa de esta enfermedad son del orden de  los 500 millones de pesos; 
Que la rabia es una zoonosis infecto-contagiosa, ag uda y mortal que ataca al sistema nervioso central,  
causado por un virus de la familia Rhabdoviridae  y es transmitida por la saliva de un animal enferm o a los 
bovinos y especies ganaderas; 
Que el murciélago hematófago o vampiro del género Desmodus rotundus , es el principal transmisor de la 
rabia al ganado bovino y especies ganaderas, que in cide en la disminución de la producción de carne y leche 
y ocasiona la muerte de los animales, lo que reperc ute desfavorablemente en la producción ganadera y c omo 
una importante zoonosis; 
Que las condiciones ecológicas en algunos estados d el país favorecen la presencia de los vampiros del 
género Desmodus rotundus ; que son reservorios del virus de la rabia; 
Que los casos de rabia en bovinos y especies ganade ras, se han mantenido e incluso incrementado de 
manera considerable en el país y que su implicación  con otros vertebrados la convierte en los últimos años en 
una importante zoonosis; 
Que esta enfermedad se controla y previene mediante  acciones conjuntas de los sectores público, social  y 
privado, ofreciendo información educativa al respec to en función de una vigilancia epidemiológica efic az, el 
control de las poblaciones de vampiro, control de f ocos y la vacunación de las especies ganaderas en r iesgo, 
a fin de reducir las importantes pérdidas económica s ocasionadas en la ganadería del país; 
Que es necesario garantizar la aplicación de una ef icaz vacunación contra la rabia a los bovinos  y 
especies ganaderas en riesgo, para inmunizar a ésta s contra esta enfermedad, y 
Que en la actualidad la aplicación de vampiricidas es una herramienta para el control de las poblacion es 
de vampiros, he tenido a bien expedir el siguiente:  
PROYECTO DE NORMA OFICIAL MEXICANA PROY-NOM-067-ZOO -2007, CAMPAÑA NACIONAL  PARA 
LA PREVENCION Y CONTROL DE LA RABIA EN BOVINOS Y ES PECIES GANADERAS 
El presente anteproyecto se publica a efecto de que  los interesados, dentro de los 60 días naturales 
siguientes a la fecha de publicación del mismo, pre senten sus comentarios ante el Comité Consultivo Na cional 
de Normalización de Protección Zoosanitaria, sito e n Municipio Libre número 377, piso 7, ala A, coloni a Santa 
Cruz Atoyac, Delegación Benito Juárez, código posta l 03310, México, D.F.; correo electrónico 
saguilar@senasica.sagarpa.gob.mx 
Durante el plazo mencionado, la manifestación de im pacto regulatorio que sirvió de base para la 
elaboración del anteproyecto de norma, estarán a di sposición del público para su consulta en el domici lio  del 
Comité. Lunes 6 de julio de 2009 DIARIO OFICIAL (Primera Se cción)       
Prefacio 
Unidad Administrativa Responsable de la Elaboración  de este Anteproyecto: 
/uni25CF Dirección General de Salud Animal 
En la elaboración de este Proyecto de Norma Oficial  Mexicana participaron los siguientes organismos  e  
instituciones: 
/uni25CF Organización Panamericana de la Salud/Organización  Mundial de la Salud (OPS-OMS en México) 
/uni25CF Centro Nacional de Investigación Disciplinaria Mic robiología Animal del Instituto Nacional de 
Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias ( INIFAP) 
/uni25CF Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la  Universidad Nacional Autónoma de México 
(UNAM) 
/uni25CF Centro Médico Siglo XXI del Instituto Mexicano del  Seguro Social (IMSS) 
Indice 
1.  Objetivo y campo de aplicación 
2. Referencias 
3.  Definiciones y abreviaturas 
4.  Disposiciones Generales 
5.  Fases de la Campaña 
6.  Diagnóstico 
7.  Muestreo 
8.  Vacunas y Vacunación 
9.  Requisitos mínimos para las vacunas contra la rabi a, de virus activo modificado y de virus inactivado  
10.  Tratamientos para el control de poblaciones de vam piros 
11. Productos Vampiricidas 
12. Vigilancia Epidemiológica 
13. Movilización de animales 
14.  Animales y Productos Importados 
15.  Sanciones 
16.  Procedimiento de Evaluación de la Conformidad 
17. Concordancia con Normas Internacionales 
18.  Bibliografía 
Transitorios 
1. Objetivo y campo de aplicación 
1.1. El objetivo del proyecto de norma es instrumentar u n mecanismo capaz de establecer las 
especificaciones zoosanitarias, criterios, estrateg ias y técnicas operativas para diagnosticar, preven ir y 
controlar la rabia transmitida por vampiros del gén ero Desmodus rotundus  a las especies ganaderas en 
riesgo. 
1.2. El Proyecto de Norma Oficial Mexicana (NOM), aplica  a los propietarios de bovinos y especies 
ganaderas en riesgo tales como equinos, ovinos, cap rinos y porcinos. 
Asimismo, de conformidad con el proyecto de NOM, la  campaña se orienta al diagnóstico, prevención y el  
control de la rabia transmitida por vampiros a los bovinos y especies ganaderas, mediante la vacunació n 
antirrábica del ganado susceptible y el control de las poblaciones de vampiros. 
1.3. La vigilancia de esta Norma corresponde a la Secret aría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, 
Pesca y Alimentación, los gobiernos de los estados y los Comités de Fomento y Protección Pecuaria de l os 
estados, la Secretaría del Medio Ambiente y Recurso s Naturales, en el ámbito de sus respectivas atribu ciones 
y circunscripciones territoriales, de conformidad c on los acuerdos de coordinación respectivos.      (Primera Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 6 de ju lio de 2009 
1.4. La aplicación de las disposiciones previstas en est a Norma, compete a la Dirección General de Salud 
Animal, así como a las delegaciones estatales de la  Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo R ural, 
Pesca y Alimentación, en el ámbito de sus respectiv as atribuciones y circunscripciones territoriales. 
2. Referencias 
2.1. Para la correcta aplicación de esta Norma, se deben  consultar las siguientes normas oficiales 
mexicanas. 
2.2. Modificación a la Norma Oficial Mexicana NOM-011-SS A2-1993, Para la Prevención y control de la 
Rabia” 
2.3. NOM-046-ZOO-1995, Sistema Nacional de Vigilancia Ep idemiológica. 
2.4. NOM-056-ZOO-1995, Especificaciones técnicas para la s pruebas diagnósticas que realicen los 
laboratorios de pruebas aprobados en materia zoosan itaria. 
2.5. NOM-059-ECOL-2001, Protección ambiental-Especies na tivas de México de flora y fauna silvestres-
Categorías de riesgo y especificaciones para su inc lusión, exclusión o cambio Lista de especies en rie sgo. 
2.6. NOM-008-SCFI-1993, Sistema General de Unidades de M edida. 
3. Definiciones y Abreviaturas  
Para los fines de esta Norma, son aplicables las de finiciones siguientes: 
3.1. Animal sospechoso:  Animal enfermo que presenta signos sugestivos de r abia. 
3.2. Animal confirmado:  Caso a rabia comprobado por pruebas de laboratorio . 
3.3. Area endémica:  Sitio geográfico bien definido, donde se presenta la rabia bovina y especies 
ganaderas en forma habitual. 
3.4. Antígeno:  Sustancia que por sí misma sea capaz de estimular una respuesta inmune " in vivo ", así 
como también pueda ser utilizada en la evaluación d e la respuesta inmune " in vitro ". 
3.5. Biológico:  Todo producto de fabricación nacional o importado con regulación correspondiente 
otorgada por la Secretaría de Agricultura, Ganaderí a, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación, a través  de la 
Dirección General de Salud Animal, procedente del c ultivo del virus de la rabia, activo modificado o i nactivado 
u otro, que al ser aplicado al animal susceptible c onfiera inmunidad contra esta enfermedad, de forma tal que 
los animales vacunados no enfermen si son expuestos  al virus patógeno contra el cual han sido vacunado s. 
3.6. Campaña:  Campaña Nacional para la prevención de la rabia en  bovinos y especies ganaderas. 
3.7. Cepa aprobada:  Virus rábico vacunal o virulento que ha sido autor izado por la Secretaría de 
Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y A limentación para ser empleado en la producción de 
vacunas o para las pruebas de desafío, respectivame nte. 
3.8. Constatación: Procedimiento mediante el cual la Secretaría de Agr icultura, Ganadería, Desarrollo 
Rural, Pesca y Alimentación, verifica que el produc to cumple con las especificaciones de calidad prese ntadas 
por el laboratorio productor y/o las normas oficial es mexicanas aplicables. 
3.9. Control:  Conjunto de medidas zoosanitarias que tienen por o bjeto disminuir la incidencia o 
prevalencia de la rabia en los animales de un área geográfica determinada. 
3.10. Control de calidad:  Es el conjunto de actividades llevadas a cabo en e l laboratorio para certificar 
que las características del producto cumplen con la s especificaciones vigentes. 
3.11. CVS:  Virus estándar de confrontación; virus fijo de la rabia que se utiliza en las pruebas  de desafío. 
3.12. Diagnóstico:  Estudio que se basa en el análisis que se haga del  conjunto de signos clínicos 
observados en los animales que permite descartar o confirmar la sospecha, en este último caso, mediant e 
pruebas de laboratorio, del virus de la rabia. 
3.13. Dirección:  Dirección General de Salud Animal. 
3.14. DLR-50%:  Dosis letal para el ratón al 50%. 
3.15. Dosis:  Cantidad de producto recomendada en la etiqueta pa ra ser administrada en el animal. 
3.16. Endémica:  Presencia habitual de la rabia en una población. Lunes 6 de julio de 2009 DIARIO OFICIAL (Primera Se cción)       
3.17. Especies ganaderas:  Son todos aquellos animales cuyos productos carne y leche son 
aprovechados por el hombre y que consisten en las e species bovina, equina, ovina, caprina  y porcina. 
3.18. Fecha de caducidad:  Fecha asignada a una vacuna o vampiricida que desi gna el término del 
periodo en que debe aplicarse. 
3.19. Foco:  Lugar donde se manejan, comercializan y/o explotan  animales, sus productos  y 
subproductos, en el cual se identifica la presencia  de uno o más casos de rabia. 
3.20. Georreferenciación:  Sistema basado en el levantamiento de datos geográ ficos sobre las 
actividades en campaña, en apoyo al proceso de noti ficación de la rabia para así poder dictar  las med idas 
contraepizoóticas a emprender. 
3.21. Herida:  Lesión en piel o mucosa con solución de continuida d. 
3.22. Infección:  Situación que se presenta cuando el virus de la ra bia ha penetrado al organismo de una 
persona o animal. 
3.23. Laboratorio autorizado/aprobado:  Laboratorio reconocido por la Secretaría de Agricu ltura, 
Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación p ara realizar servicios de diagnóstico y constatació n de la 
rabia. 
3.24. Laboratorio de Control de Calidad:  Laboratorio reconocido por la Secretaría de Agricu ltura, 
Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación, que se encarga de la verificación y aprobación del 
cumplimiento de los requisitos mínimos de los produ ctos biológicos, vacunas, antígenos y reactivos, ut ilizados 
en el diagnóstico y control de la rabia. 
3.25. Laboratorio de Producción de Biológicos:  Laboratorio reconocido por la Secretaría de Agricu ltura, 
Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación, para la fabricación de las vacunas, antígenos y rea ctivos 
utilizados en el diagnóstico y control de la rabia.  
3.26. Lote:  Es una cantidad específica de cualquier materia pr ima o producto que haya sido elaborado 
bajo condiciones equivalentes de operación y durant e un periodo determinado 
3.27. Medidas zoosanitarias:  Disposiciones para proteger la salud animal, de la  introducción, radicación 
o propagación de una plaga o enfermedad; de los rie sgos provenientes de aditivos, contaminantes, toxin as u 
organismos causantes de enfermedades y daños. 
3.28. Muestra:  Encéfalo, cerebelo o médula, o parte de los mismos  que se relacionan con la rabia, con el 
propósito de ser analizados mediante pruebas de dia gnóstico y así identificar la presencia  o ausencia  del 
virus rábico. 
3.29. Murciélago hematófago o vampiro:  Quiróptero que se alimenta exclusivamente de sangr e de 
animales domésticos e inclusive del hombre. 
3.30. Número de lote:  Cualquier combinación de letras, números o símbolo s, que sirven para la 
identificación de un lote y bajo el cual se amparan  todos los documentos referentes a su manufactura y  
control. 
3.31. pH:  Potencial Hidrógeno. 
3.32. Potencia:  Prueba de control de calidad para asegurar que un producto biológico es capaz de 
producir una respuesta inmune y proteger, lo cual s e expresará en Unidades Internacionales o porcentaj e de 
protección, de acuerdo a lo establecido en los requ isitos mínimos de calidad del producto. 
3.33. Prevención:  Conjunto de procedimientos sanitarios, destinados a proteger al hombre y animales de 
una infección del virus rábico. 
3.34. Producto liberado:  Es aquel que aprobó satisfactoriamente las pruebas  de control de calidad y que 
está listo para su comercialización. 
3.35. Producto vampiricida:  Producto químico elaborado con anticoagulantes par a el control de las 
poblaciones de vampiros. 
3.36. Pruebas de Control de Calidad:  Es el conjunto de actividades llevadas a cabo en e l laboratorio 
para certificar que las características de un produ cto cumplen con las especificaciones vigentes. 
3.37. Pureza:  Es la prueba mediante la cual se verifica que exis te en el producto, únicamente el 
microorganismo indicado y que está libre de microor ganismos extraños.      (Primera Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 6 de ju lio de 2009 
3.38. Rabia:  Enfermedad infecto-contagiosa, aguda y mortal, que  ataca el sistema nervioso central, 
provocada por un virus del género Lyssavirus  y de la familia Rhabdoviridae . Transmitida al hombre o animales 
por la saliva de algún animal enfermo o material co ntaminado. 
3.39. Reporte:  Presentación de un informe sobre la detección de l a rabia en un tiempo determinado. 
3.40. Reservorio:  Cualquier animal donde normalmente vive y se multi plica el virus de la rabia y del cual 
depende para su supervivencia, donde se replica de manera que pueda ser transmitido a un huésped 
susceptible. 
3.41. Secretaría:  Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo R ural, Pesca y Alimentación. 
3.42. Seguridad e inocuidad:  Prueba de control de calidad para asegurar que un producto no cause 
reacciones desfavorables atribuibles al mismo. 
3.43. SENASICA:  Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria. 
3.44. Titulación:  Prueba de control de calidad para asegurar que un producto contiene la cantidad de 
antígeno de virus rábico o anticuerpos establecidos  en los requisitos mínimos. 
3.45. Vacunación:  Administración de antígenos rábicos en la dosis ad ecuada con el propósito de inducir 
la producción de anticuerpos contra la rabia a nive les protectores. 
3.46. Vigilancia epidemiológica:  Conjunto de actividades que permiten reunir inform ación indispensable 
para identificar y evaluar la conducta de la rabia,  detectar y prever cualquier cambio que pueda ocurr ir por 
alteraciones en los factores, condiciones o determi nantes con el fin de recomendar oportunamente, con bases 
científicas, las medidas indicadas para su prevenci ón, control y erradicación. 
3.47. Zona en control:  Area geográfica determinada en la que se operan me didas zoosanitarias 
tendientes a disminuir la incidencia o prevalencia de la rabia, en un periodo y especie animal específ icos. 
3.48. Zona libre:  Area geográfica determinada en la cual se ha elimi nado o no se han presentado casos 
positivos de rabia en animales específicos, durante  un periodo preciso, de acuerdo a las normas oficia les y las 
medidas zoosanitarias que la Secretaría establezca.  
3.49. Zoonosis:  Enfermedades que afectan a distintos vertebrados, incluido el hombre. 
4. Disposiciones Generales  
4.1. La Campaña se orienta al diagnóstico, prevención y el control de la rabia transmitida por vampiros a 
los bovinos y especies ganaderas, mediante la vacun ación antirrábica del ganado susceptible  y el cont rol de 
las poblaciones de vampiros. 
4.2. La responsabilidad de operar los programas estatale s de la Campaña, debe compartirse y concertarse 
entre el Gobierno Federal, los gobiernos estatales,  los productores y propietarios de ganado, los médi cos 
veterinarios zootecnistas y otros profesionistas re lacionados con el problema, las empresas vinculadas  a la 
producción comercialización de vacunas y productos vampiricidas, comerciantes y transportistas de gana do 
bovino y especies ganaderas, con las instancias cor respondientes, así como otras que determine la 
Secretaría, quienes deben participar activamente en  dichos programas. 
4.3. La SECRETARIA por medio del SENASICA, supervisará e l cumplimiento de las normas en lo 
referente a fabricación, importación, exportación, almacenaje, transportación, comercialización y uso de las 
vacunas antirrábicas para cada una de las especies afectadas, así como los productos vampiricidas. 
5. Fases de la Campaña 
5.1. Para efectos de esta Campaña se reconocen las zonas : a)  zona de control y b)  zona libre, las cuales 
deben ser consideradas a nivel municipal, regional o estatal. 
5.2. Las vertientes estratégicas de la Campaña serán el diagnóstico, la capacitación de personal,  la 
vacunación antirrábica del ganado y el control de l as poblaciones de vampiros. 
5.3. La SECRETARIA, realizará el reconocimiento oficial de las fases, bajo el cumplimiento de las 
siguientes medidas zoosanitarias: 
5.4. La zona de control debe de contar con actividades d e: 
/uni25CF Promoción y difusión de la Campaña las cuales se d eben llevar a cabo por las instituciones 
involucradas, en el ámbito de sus respectivas atrib uciones y circunscripciones territoriales, de 
conformidad con los acuerdos de coordinación respec tivos. Lunes 6 de julio de 2009 DIARIO OFICIAL (Primera Se cción)       
/uni25CF Capacitación de personal operativo y productores, mediante la programación de cursos y talleres 
sobre la prevención de la rabia y el control de las  poblaciones de vampiros. 
/uni25CF Control de las poblaciones de vampiros, por la rea lización de actividades conforme a los puntos  10 y  
11 de esta Norma y la georreferenciación de estas a ctividades. 
/uni25CF Vacunación de las especies ganaderas susceptibles conforme al punto 8 de esta Norma y la 
georreferenciación de estas actividades. 
/uni25CF Control de los focos rábicos conforme a lo dispues to a los puntos 8, 10, 12 y 13 de esta Norma y  la 
georreferenciación de estas actividades. 
/uni25CF Contar con un sistema de muestreo, y monitoreo de los lugares donde habitan los vampiros y la 
georreferenciación de estos lugares. 
/uni25CF Contar con un sistema de muestreo y monitoreo, bas ado en el diagnóstico de laboratorio para 
realizar la vigilancia epidemiológica de la rabia b ovina y especies ganaderas. 
5.5. La zona libre debe demostrar lo siguiente: 
/uni25CF Ausencia del virus rábico en la población suscepti ble. 
/uni25CF Ausencia de vampiros del género Desmodus rotundus , en el área o región ya sea por razones 
ecológicas o por acciones de la campaña, comprobada  mediante inspección oficial. 
/uni25CF Control de los focos rábicos conforme a lo dispues to a los puntos 8, 10, 12 y 13 de esta Norma y la 
georreferenciación de estas actividades 
/uni25CF Control de la movilización de animales conforme al  punto 13 de esta Norma. 
/uni25CF Contar con un sistema de muestreo y monitoreo, bas ado en el diagnóstico de laboratorio para 
realizar la vigilancia epidemiológica de la rabia b ovina y especies ganaderas. 
6. Diagnóstico 
6.1. Las pruebas para la detección del virus rábico en b ovinos y especies ganaderas, se deben realizar de 
acuerdo a lo descrito en la Parte 2, Sección 2.2, c apítulo 2.2.5 del Manual de Pruebas Diagnósticas y vacunas 
para los animales terrestres de la Organización Mun dial de Sanidad Animal (OIE). (Ver Apéndice “B” 
Normativo). 
7. Muestreo  
7.1 Toma y envío de muestras a laboratorio 
7.1.1. La muestra ideal para el diagnóstico de rabia en la boratorio es el encéfalo y médula  de bovinos y 
especies ganaderas sospechosas que muestren signos nerviosos característicos de la enfermedad. 
7.1.2. La toma de muestra deberá realizarse conforme a lo descrito en el Apéndice “A” (Normativo)  de la 
presente Norma. 
7.1.3. Registrar la información geográfica (georreferencia ción) sobre la colecta de muestras para el 
diagnóstico de rabia. 
8. Vacunas y Vacunación 
8.1. Las vacunas antirrábicas que se utilicen en la Camp aña deben ser las elaboradas con virus activo 
modificado y las elaboradas con virus inactivado, e stas mismas deben contar con el reconocimiento ofic ial de 
la Secretaría. Su aplicación se realizará conforme a la vía de administración y dosis indicada por el laboratorio 
fabricante. 
8.2. La vacunación antirrábica en las especies ganaderas  en la área endémica, será obligatoria en 
aquellos lugares donde se presenten casos clínicos y/o confirmados por laboratorio y se deben realizar  las 
acciones de manera focal y perifocal en un radio mí nimo de 10 km del foco inicial. 
8.3. Para garantizar una buena práctica de inmunización antirrábica en los animales, se deben conservar 
todas las vacunas antirrábicas en refrigeración y/o  en recipientes con bolsas congelantes o hielo sufi ciente 
desde su compra y hasta la aplicación en los animal es, siguiendo las recomendaciones de laboratorio 
productor.      (Primera Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 6 de ju lio de 2009 
8.4. El esquema de vacunación antirrábica para los bovin os y especies ganaderas mayores de un año, se 
realizará en el área endémica de rabia y cuando las  acciones de campaña se encuentren en  la zona. 
8.5. El esquema de vacunación antirrábica para los bovin os y especies ganaderas menores de un año, se 
debe realizar en el área endémica de rabia y consis tirá en la aplicación de la primera dosis de vacuna  
antirrábica a partir del mes de edad y la aplicació n de sus refuerzos cuando cumplan la edad de tres y  seis 
meses, respectivamente. 
8.6. En el caso de tratarse de la revacunación antirrábi ca anual de los bovinos y especies ganaderas en el 
área endémica de rabia, ésta se debe realizar confo rme a lo dispuesto en los puntos  8.4 y 8.5 de esta  Norma. 
8.7. Para el control de un foco de rabia en el ganado bo vino y otras especies ganaderas, se deben aplicar 
vacunas antirrábicas de tipo virus activo modificad o y/o de tipo virus inactivado, además de realizar 
actividades de control del transmisor referidas en los puntos 10 y 11 de esta Norma, cuando así proced a. 
9. Requisitos mínimos para las vacunas contra la ra bia, de virus activo modificado y de virus 
inactivado 
9.1. Características del producto. Elaborado con una cep a aprobada de virus de rabia, activo modificado 
liofilizado o inactivado y presentado en forma líqu ida o liofilizada. 
9.2. Medios de producción. Cultivos celulares primarios o a partir de líneas celulares o embrión  de pollo.  
9.3. Requisitos de pruebas. Por cada lote de producto te rminado antes de que salga al mercado, el 
elaborador y/o titular del registro debe realizar l as siguientes pruebas: 
9.3.1. Pruebas de pureza. Esta prueba consiste en demostra r que el producto vacunal está libre de 
cualquier contaminante y que contiene únicamente el  microorganismo que se indica. 
9.3.1.1. El análisis bacteriológico, usando medios para gérm enes aerobios y anaerobios, debe comprobar 
que el producto está exento de cualquier contaminac ión bacteriana. 
9.3.1.2. Se deben realizar las pruebas necesarias, a fin de demostrar que el producto está libre de hongos 
y levaduras. 
9.3.1.3. Se deben realizar las pruebas que se requieran para  demostrar que el producto está libre de 
micoplasmas. 
9.3.1.4. Se deben realizar las pruebas necesarias, a fin de demostrar que el producto está libre de virus 
contaminantes. 
9.3.2. Prueba de inactivación viral para vacunas inactivad as. La suspensión viral inactivada debe 
someterse a esta prueba, para la cual se debe utili zar: 
a)  10 ratones sanos y susceptibles a la rabia, de la misma cepa o estirpe, de 21 días de edad y de  12 a  
16 gr de peso. 
b)  Una camada de por lo menos ocho ratones lactantes sanos y susceptibles a la rabia, de tres a cinco 
días de edad. 
c)  Por lo menos dos conejos sanos y susceptibles a la  rabia, de 1.5 a 2.5 kg de peso. 
Estos animales deben ser inoculados con la suspensi ón viral en estudio, por vía intracerebral; los rat ones 
de 21 días con 0.03 ml, los ratones lactantes con 0 .02 ml, y los conejos con 0.25 ml, todos los animal es deben 
ser observados diariamente durante 28 días postinoc ulación. Se deben colectar los cerebros de los anim ales 
que mueran entre los días cinco y 28, postinoculaci ón y se tratará de detectar la presencia o ausencia  del 
virus, mediante la inyección de cinco ratones por v ía intracerebral, con el material procedente de cad a 
cerebro, debiéndose observar durante 30 días. Para la confirmación de la presencia o ausencia  del vir us de la 
rabia, se debe realizar la prueba de anticuerpos fl uorescentes, basado a lo estipulado en el capítulo 6 de esta 
Norma. 
Si se confirma la presencia del virus, el lote es i nsatisfactorio. 
9.3.3. Prueba de seguridad o inocuidad para las vacunas in activadas. Esta prueba debe realizarse en 
ratones y en cobayos. 
En caso de que la vacuna deba reconstituirse, se ha rá utilizando el diluyente que la acompaña, de acue rdo 
a las indicaciones del laboratorio productor. 
9.3.3.1. Prueba en ratones adultos. Se debe utilizar 10 rato nes de 21 días de edad de 12 a 16 gr de peso, 
sanos y susceptibles a la rabia, cada uno de los cu ales se debe inocular con 0.5 ml de la vacuna en es tudio Lunes 6 de julio de 2009 DIARIO OFICIAL (Primera Se cción)       
por vía intraperitoneal y serán observados diariame nte durante 21 días post-inoculación. Para que la p rueba 
se considere satisfactoria, todos los animales debe n permanecer sanos, sin signos de enfermedad durant e el 
periodo de prueba. 
9.3.3.2. Prueba en cobayos. Se deben utilizar 2 cobayos de 2 50 a 300 gr de peso, sanos y susceptibles a 
la rabia, los cuales deben ser inoculados por vía i ntraperitoneal con 2 ml del producto y deben ser ob servados 
diariamente durante 21 días post-inoculación. 
La prueba se debe considerar satisfactoria cuando l os cobayos permanezcan sanos, sin signos ni 
reacciones indeseables atribuibles al producto dura nte el periodo (de observación) 
9.3.4. Prueba de seguridad o inocuidad para las vacunas de  virus activo modificado. Esta prueba debe 
realizarse en ratones y cobayos. 
La vacuna debe ser reconstituida con el diluyente q ue la acompaña, según indicaciones del laboratorio 
productor. 
9.3.4.1. Prueba en ratones adultos. Se deben utilizar 10 rat ones de 21 días de edad de 12 a 16 gr de peso, 
sanos y susceptibles a la rabia, cada uno se inocul ará con 0.5 ml de la vacuna, por vía intraperitonea l y serán 
observados diariamente durante 21 días post-inocula ción. 
La prueba se debe considerar satisfactoria, si en e l periodo de observación sobrevive por lo menos el 80% 
de los ratones, sin presentar reacciones desfavorab les atribuibles al producto, siempre y cuando se de muestre 
que los que murieron (<20%). fueron a causa de la c epa vacunal de rabia y no a causa de otros agentes 
infecciosos ajenos al producto. 
9.3.4.2. Prueba en cobayos. Se deben utilizar 2 cobayos de 2 50 a 300 gr de peso, sanos y susceptibles a 
la rabia, los cuales deben ser inoculados por vía i ntramuscular, en el músculo gastrocnemio, con 2 ml del 
producto y deben ser observados diariamente durante  21 días post-inoculación. 
La prueba se debe considerar satisfactoria cuando l os cobayos permanezcan sanos, sin signos, ni 
reacciones indeseables atribuibles al producto dura nte el periodo de observación. 
9.3.5. Prueba de seguridad o inocuidad para el trámite de regulación de los productos nuevos y para la 
semilla de trabajo y/o cuando se requiera. Esta deb e realizarse en cada una de las especies animales q ue el 
producto recomiende en la etiqueta. 
Se deben utilizar 10 animales sanos y susceptibles a la rabia, de cada especie a ser probada (negativo s a 
anticuerpos antirrábicos a la dilución 1:2 ante la prueba de seroneutralización). 
Cinco animales deben ser inoculados por vía intramu scular, cada uno con el equivalente a 10 dosis del 
producto y cada uno de los otros cinco debe ser ino culado también por vía intramuscular, infiltrando e l inóculo 
en un nervio mayor con el equivalente a 10 dosis de l producto. 
Todos los animales deben ser observados diariamente  durante 90 días, tiempo durante el cual deben 
permanecer sanos, sin signos de enfermedad. 
Si alguno de los animales presenta signos de enferm edad o se demuestra el virus de la rabia en su 
sistema nervioso central, el producto o la semilla se deben considerar insatisfactorios. 
9.4. Prueba de titulación para productos de virus activo  modificado. Para esta prueba se deben utilizar 
ratones blancos. Todos de la misma cepa o estirpe, sanos y susceptibles a la rabia, de 21 días de edad  y de 
12 a 16 gr de peso. 
Dos frascos de la vacuna de un mismo lote deben ser  reconstituidos con el diluyente que los acompaña; 
media dosis será extraída de cada frasco para compl etar la dosis total, que será considerada como la d ilución 
10 0. 
Se deben realizar diluciones decimales desde10 0 a 10 -6 de la vacuna con una solución tampón fosfatada 
(conteniendo 2% ml de suero de caballo, libre de an ticuerpos contra la rabia, o albúmina de bovino al 0.4%), 
con un pH de 7.2 ± 0.3 o con el diluyente recomenda do por el productor. 
Con cada dilución se deben inocular 10 ratones de 2 1 días de edad de 12 a 16 gr de peso, por vía 
intracerebral, cada uno con 0.03 ml, empezando la d ilución más alta de 10 -6, después con 10 -5, 10 -4 y así 
sucesivamente.      (Primera Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 6 de ju lio de 2009 
Los ratones deben observarse diariamente durante 14  días post-inoculación y se deben registrar las 
muertes y los signos de parálisis y espasmos que se  observen en los ratones, esto a partir del quinto día post-
inoculación. Los ratones que mueran dentro de los p rimeros cuatro días post-inoculación deben  ser 
descartados. 
Para que la prueba sea válida, por lo menos el 80% de los ratones inoculados con cada dilución, deben 
sobrevivir, a partir del cuarto día post-inoculació n. 
Con los ratones que mueran a partir de quinto día, se deben calcular los resultados por el método de R eed 
and Muench o de Spearmen-Karber, expresados como la  dosis letal 50% para el ratón (DLR-50%) Los 
ratones que mueran o presenten signos atribuibles a  rabia, se les deben hacer pruebas de 
inmunofluorescencia a partir del cerebro, por lo me nos un animal por dilución. 
La vacuna probada debe tener un título mínimo de 10 3.3  DLR 50% por cada 0.03 ml al inicio y durante el 
periodo de vigencia. 
9.5. Pruebas de potencia.  
9.5.1. Pruebas de potencia para vacunas de virus activo mo dificado. Para esta prueba se deben utilizar 15 
cobayos de la misma cepa o estirpe, sanos y suscept ibles a la rabia, con un peso mínimo de 350 gr eleg idos 
al azar, 10 cobayos deben constituir el lote de pru eba y los otros 5 el lote testigo. 
Dos frascos de la vacuna del mismo lote deben ser r econstituidos por el diluyente que los acompaña. 
La mitad de la dosis recomendada por el laboratorio  productor debe ser extraída de cada frasco, para 
completar una dosis total. Posteriormente se debe a gregar el diluyente antes mencionado, hasta complet ar 
una dilución de 1:10. 
Cada uno de los cobayos del lote de prueba debe ser  inoculados con 0.25 ml de la vacuna previamente 
diluida, en el músculo gastrocnemio, en la cara int erna de la pierna, tan cerca del nervio como sea po sible. 
Tres semanas después de la inoculación, los cobayos  vacunados y los testigos deben ser desafiados con 
el virus CVS de rabia, con 0.5 ml de la dilución an terior a la que en una titulación previa haya matad o al 100% 
de los cobayos, utilizando diluciones dobles, por v ía intramuscular, en la extremidad opuesta a la emp leada 
para la vacunación. 
Todos los cobayos deben ser observados diariamente durante 14 días post-desafío, las muertes que 
ocurran entre el primero o cuarto día posterior al desafío deben ser descartadas. 
La prueba se debe considerar satisfactoria cuando p or lo menos 8 de los 10 cobayos vacunados 
sobrevivan sin manifestar signos de rabia y cuando por lo menos el 80% de los testigos mueran o presen ten 
signos de rabia en el periodo de observación. 
9.5.2. Prueba de potencia para vacunas inactivadas. Esta d ebe realizarse por la técnica del NIH (Técnica 
del Instituto Nacional de Salud de los Estados Unid os de América). 
9.5.2.1. Prueba de potencia del NIH. Los lotes comerciales d eben probarse mediante la prueba del NIH. 
Para esta prueba se deben utilizar ratones blancos de la misma cepa o estirpe sanos y susceptibles a l a rabia, 
del mismo sexo, de 21 días de edad y con un peso de  12 a 16 gr de peso y se requiere del empleo de una  
vacuna de referencia aprobada por la Secretaría. 
Para la vacuna de prueba y la de referencia se debe  seguir el mismo procedimiento. 
Con solución salina tamponada de fosfatos pH 7.6, s e deben realizar diluciones quintuples seriadas de la 
vacuna (desde 1:5 hasta 1:625) 
Con cada dilución deben vacunarse 16 ratones, cada uno con 0.5 ml por vía intraperitoneal; se debe 
comenzar por la dilución mayor y se debe terminar c on la menor. Al momento del desafío, se realizará l a 
titilación del CVS, en 6 ratones por dilución, empl eando la previa a la que contenga 50 DLR al momento   del 
desafío. 
La vacunación debe repetirse una semana después. To dos los ratones vacunados, así como los testigos 
deben ser desafiados por vía intracerebral a los 7 días después de la segunda vacunación; cada uno con  12 a 
50 DLR 50% de CVS, contenidas en 0.03 ml y se deben  observar diariamente durante 21 días post-desafío,  
registrando la morbilidad y mortalidad. 
Se deben registrar aquellos que mueran a partir del  quinto día posdesafío manifestando signos de rabia  
tales como parálisis y espasmos, asimismo, se deben  registrar aquellos que después de presentar signos  de 
rabia sobrevivan al periodo de prueba. Los muertos antes del quinto día posdesafío serán descartados. Lunes 6 de julio de 2009 DIARIO OFICIAL (Primera Se cción)       
La prueba debe considerarse válida cuando la titula ción del virus de confrontación (CVS) tenga una 
concentración de 12 a 50 DLR 50%, en 0.03 ml 
Se debe calcular el punto final de protección de la s vacunas por el método de Reed and Muench o el de 
Spearman-Karber y se debe expresar como la dosis pr otectora (DP) 50%, tanto de la vacuna de referencia  
como la de prueba. 
La potencia de la vacuna de prueba debe ser expresa da en Unidades Internacionales por mililitro (U.I.  por 
ml) y calculada con la siguiente fórmula: 
Potencia de la vacuna 
de prueba = DP50% de la vacuna de prueba X Potencia de la vacuna de 
referencia en UI/ml  DP 50% de la vacuna de referencia   
 
La prueba debe considerarse satisfactoria cuando la  potencia relativa de la vacuna que está siendo 
probada tenga un valor mínimo de 2 U.I. por dosis. 
9.5.3. Prueba de potencia para el trámite de regulación de  los productos nuevos, para la semilla de trabajo 
y/o cuando se requiera.- Debe realizarse en las esp ecies animales que el producto recomienda en la eti queta; 
el protocolo de prueba que se debe seguir debe esta r previamente autorizado por la autoridad competent e. 
Para que los resultados sean satisfactorios, el pro ducto debe proteger por lo menos al 80% de los 
vacunados con una sola dosis, al ser desafiados al término del periodo de protección indicado por el 
laboratorio productor y deben morir por lo menos el  80% de los testigos, después de ser observados dur ante 
90 días. 
Para efectos de comprobación, el elaborador y/o tit ular del registro debe asegurar todos los requisito s 
señalados durante el periodo de vigencia que ofrezc a, por cada lote del producto, a partir de la fecha   de 
elaboración. 
Para muestra de retención, en vacunas de virus acti vo modificado el título mínimo aceptable debe ser d e 
10 3.3 DLR 50% en 0.03 ml, durante 3 meses más a la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. 
Para vacunas inactivadas el valor mínimo será de 2 U.I. por dosis, durante tres meses más a la fecha d e 
caducidad indicada en la etiqueta. 
9.6. Prueba de vacío para vacunas liofilizadas- Esta pru eba debe realizarse en un cuarto oscuro, 
empleando el aparato de Tessler que es el generador  de alta frecuencia, el cual debe aplicarse a cada frasco 
de vacuna liofilizada a una distancia de no más de 5 mm de la retapa de aluminio. Existirá vacío si la  descarga 
eléctrica ilumina el interior del frasco de la vacu na. 
Al término del proceso de liofilización se puede se llar también con gas inerte, para lo cual, en este caso, 
no se realizará la prueba de vacío. 
9.7. Prueba de humedad para vacunas liofilizadas. Esta p rueba consiste en determinar el porcentaje de 
humedad que tiene la vacuna liofilizada, que debe s er igual o menor del 4%, se puede determinar por lo s 
métodos de Abderhalden, Karl Fischer o Termogravimé trico. 
9.8. Prueba de pH. 
9.8.1. Para vacunas de virus activo modificado. La vacuna reconstituida debe mostrar un  pH entre 6.9 y 
7.4 el cual debe ser comprobado con un potenciómetr o previamente calibrado. 
9.8.2. Para vacunas de virus inactivado. Deben mostrar un pH entre 7.2 y 8.2. 
10. Tratamientos para el control de poblaciones de vampiros 
10.1. Las capturas para el control de vampiros se realiza rán por personal oficial de la Secretaría o 
personal capacitado para tal fin, el cual será supe rvisado por el personal oficial de la Secretaría. 
10.2. En las zonas de fase de control, además de lo indic ado en los puntos 8 y 9, se realizarán operativos 
para el control de las poblaciones de vampiros indi cados en los puntos 10 y 11 de esta Norma. 
10.3. En cada operativo para el control de vampiros, sea este comunitario, municipal, regional o estatal, 
debe diseñarse una estrategia y un programa de acci ones, considerando e indicando la dimensión del áre a, 
las barreras naturales, la población bovina y espec ies ganaderas, la incidencia de mordeduras, así com o la 
población estimada de vampiros.      (Primera Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 6 de ju lio de 2009 
10.4. En cada operativo de control de vampiros en cualqui era de sus niveles, se debe registrar la cantidad 
de vampiros capturados y tratados, así como los env iados para diagnóstico de rabia. Asimismo se debe 
registrar, el número de bovinos y especies ganadera s tratadas conforme a lo establecido en el punto 10 .5 y 
los resultados obtenidos en este ámbito. 
10.5. En los operativos para el control de vampiros, se d eben utilizar únicamente los tratamientos descritos  
en los puntos 10.5.1., 10.5.2. y 10.5.3., sin causa r daños ni trastornos en las poblaciones benéficas de 
murciélagos. 
10.5.1. Tratamiento tópico con pomada vampiricida elaborada  a base de anticoagulantes orales, en 
vampiros capturados con redes ya sea en corral o re fugio. Esta técnica sólo debe ser empleada por pers onal 
oficial y/o personal entrenado en las técnicas de c ontrol, además de estar vacunado previamente contra  la 
rabia. 
10.5.2. Tratamiento tópico con pomada vampiricida elaborada  a base de anticoagulantes orales aplicado 
en las heridas ocasionadas por la mordedura de los vampiros en los bovinos y especies ganaderas. Esta 
técnica podrá ponerla en práctica cualquier persona , siguiendo las indicaciones establecidas en el pro ducto. 
10.5.3. Tratamiento sistémico del ganado con vampiricida el aborado a base de anticoagulantes de uso 
sistémico. Esta técnica puede utilizarla cualquier persona. 
10.6. El control de vampiros se llevará a cabo con recurs os de la Secretaría, los Gobiernos de los Estados, 
Municipios, Grupos Organizados, Comités de Fomento y Protección Pecuaria, Uniones Ganaderas Regionales  
y aquellos que los productores tengan destinados pa ra su efecto. 
10.7. Registrar la información geográfica (georreferencia ción) sobre las actividades de control de 
vampiros. 
11. Productos Vampiricidas 
11.1. Los productos vampiricidas que se utilicen en la Ca mpaña deben ser los elaborados con sustancias 
anticoagulantes. Sus vehículos, dosificación, así c omo el mismo vampiricida deben contar con el 
reconocimiento oficial de la Secretaría. Su aplicac ión se realizará conforme a la vía de administració n y dosis 
indicada por el laboratorio fabricante. 
11.2. Para el control de poblaciones de murciélagos hemat ófagos, no deben utilizarse productos 
vampiricidas o sustancias que no cuenten con el rec onocimiento oficial de la Secretaría. 
12. Vigilancia Epidemiológica 
12.1. En el caso de focos de rabia en una explotación o d e un resultado positivo a rabia por laboratorio, es  
obligación tanto del propietario de los animales, m édico veterinario aprobado, así como del público en  general 
según corresponda, el notificarlo de forma inmediat a a la Secretaría. 
12.2. En las zonas de control y libres de rabia, es respo nsabilidad de los gobiernos federal y estatal, así 
como de poseedores o productores de ganado bovino y  otras especies ganaderas, médicos veterinarios, 
responsable de la explotación o del laboratorio; as í como del público en general según corresponda la 
notificación inmediata de morbilidad, mortalidad, s ospecha o confirmación de rabia en los animales. 
12.3. La vigilancia epidemiológica de la rabia en el área  endémica del país, debe reportarse de la manera 
siguiente: 
/uni25CF Notificación inmediata de los casos o sospechas de  rabia en bovinos y especies ganaderas a la 
Delegación de la SECRETARIA en los estados, Comités  de Fomento y Protección Pecuaria, 
Gobiernos de los estados, Presidencias municipales,  laboratorios de diagnóstico, Dirección de 
Vigilancia Epizootiológica (DIVE) y/o la Campaña. 
/uni25CF Las Delegaciones estatales, los estados, Comités d e Fomento y Protección Pecuaria, Gobiernos de 
los estados, Presidencias municipales, laboratorios  de diagnóstico, Dirección de Vigilancia 
Epidemiológica (DIVE), deben enviar a la Campaña, l a información geográfica (georreferenciación) 
sobre las actividades de vacunación y control de va mpiros, así como la correspondiente a los focos 
de rabia bovina. 
/uni25CF Realización del diagnóstico de rabia conforme a lo  referido en el punto 6 de esta Norma. 
/uni25CF El Seguimiento epidemiológico de los casos en bovi nos y especies ganaderas, se debe realizar de 
acuerdo a lo referido en los puntos 6, 7, 8, 9, 10 y 11 de esta Norma. Lunes 6 de julio de 2009 DIARIO OFICIAL (Primera Se cción)       
/uni25CF El Cierre de los casos se debe efectuar cuando ya no existan bovinos y especies ganaderas con 
evidencias de rabia o sospechas de la enfermedad co mo efecto de las acciones indicadas en los 
puntos 6, 7, 8, 9, 10 y 11 de esta Norma. 
12.4. En cada una de las medidas zoosanitarias aplicadas en la vigilancia epidemiológica, es necesario 
contar con la participación de las instituciones in volucradas en la Campaña, mismas que deben actuar e n su 
oportunidad y de manera coordinada, para la obtenci ón y envío de la información zoosanitaria. 
13. Movilización de Animales 
13.1. Las especificaciones contenidas en este capítulo se  aplican para el ganado bovino y especies 
ganaderas, para su movilización se debe comprobar q ue los animales fueron vacunados 30 días antes de l a 
movilización e igualmente, ésta no podrá ser realiz ada cuando el animal tenga más de 6 meses de la últ ima 
vacunación. Adicionalmente debe contar con el Certi ficado Zoosanitario correspondiente. 
13.2. En la zona libre.-  Los bovinos y especies ganaderas que se encuentren  en zonas colindantes a la 
endémica, se mantendrá una vigilancia epidemiológic a activa de acuerdo a las circunstancias y periodic idad, a 
través de las Delegaciones, quienes informarán a lo s productores a través de las instancias correspond ientes. 
13.3. En la zona en control.-  Es obligatoria la vacunación antirrábica de los bo vinos y especies 
ganaderas, además de realizar los operativos de con trol de vampiros, los cuales se deben dar a conocer  en 
cada región a través de las Delegaciones, quienes i nformarán a los productores mediante las instancias  
correspondientes. 
13.4. Todos los animales originarios de zonas libres de r abia pueden movilizarse sin ninguna restricción a 
zonas libres; en el caso que el destino de los anim ales sea un estado, zona o región en control, éstos  deben 
estar vacunados contra la rabia, 30 días antes de l a movilización e igualmente, ésta no podrá ser real izada 
cuando el animal tenga más de 6 meses de la última vacunación conforme a los puntos 8.4 y 8.5 de esta 
norma. 
13.5. Los bovinos y especies ganaderas originarias de zon as en control podrán movilizarse en el territorio 
nacional siempre y cuando comprueben la vacunación antirrábica de los animales, 30 días antes de la 
movilización e igualmente, ésta no podrá ser realiz ada cuando el animal tenga más de 6 meses de la últ ima 
vacunación, además de contar con el Certificado Zoo sanitario correspondiente. 
13.6. No se deben movilizar bovinos y/o especies ganadera s con signos nerviosos y/o sugestivos o 
sospechosos a rabia. 
14. Animales y Productos Importados 
14.1. La importación de bovinos y especies ganaderas que provengan de países endémicos de rabia, 
tendrán que demostrar la vacunación antirrábica de los animales 30 días antes de la movilización e 
igualmente, ésta no puede ser realizada cuando el a nimal tenga más de 6 meses de la última vacunación a su 
importación y de acuerdo a lo estipulado en el punt o 8 y 13 de esta Norma. 
14.2. Los productos biológicos (vacunas) y vampiricidas i mportados deben cumplir con todos los requisitos 
establecidos en esta Norma. 
14.3. Las vacunas importadas para su uso en bovinos y esp ecies ganaderas, deben provenir de una 
empresa elaboradora con registro Federal o Nacional , de su país de origen y cumplir con todos los requ isitos 
establecidos en esta Norma y con las disposiciones correspondientes, según sea la especie y el caso. 
14.4. Sólo pueden importarse productos que se estén comer cializando libremente en el país de origen, lo 
cual debe ser avalado con el certificado de libre v enta o su equivalente. 
15. Sanciones 
15.1. El incumplimiento de las disposiciones contenidas e n esta Norma, será sancionado conforme a lo 
establecido en la Ley Federal de Sanidad Animal y l a Ley Federal sobre Metrología y Normalización. 
15.2. Las personas que teniendo conocimiento de la presen cia o sospecha de rabia y que no lo notifiquen 
serán sancionadas conforme a lo dispuesto en el art ículo 254 fracción II del Código Penal para el Dist rito 
Federal en Materia del Fuero Común y para toda la R epública en Materia del Fuero Común. 
16. Procedimiento de Evaluación de la Conformidad 
Para efecto de la presente regulación, la evaluació n de la conformidad será realizada por la Secretarí a a 
través de la expedición de dictámenes, informe de r esultados y certificados zoosanitarios, por sí mism a o 
mediante personas físicas o morales acreditadas y, en su caso, aprobadas para ello.      (Primera Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 6 de ju lio de 2009 
Los dictámenes serán elaborados por el médico veter inario oficial o las unidades de verificación 
acreditadas y, en su caso, aprobadas, en los cuales  se presentan los resultados obtenidos de la verifi cación 
realizada. 
Mediante el informe de resultados se presentarán lo s resultados obtenidos de las pruebas y/o análisis 
realizados por un laboratorio oficial o aprobado, a sí como otra información relevante derivada de los mismos. 
El certificado zoosanitario debe ser expedido por l a Secretaría o por quienes estén acreditados o 
aprobados para constatar el cumplimiento de la pres ente Norma Oficial Mexicana. Tratándose de animales  
será signado por un médico veterinario de la Secret aría o por un médico veterinario aprobado o acredit ado. 
El certificado zoosanitario constata el cumplimient o de la presente Norma o parte de la misma. 
17. Concordancia con Normas Internacionales  
No se tiene concordancia con normas internacionales  al momento de su elaboración. 
18. Bibliografía 
1.  Baer G.M. (1991). The Natural History of Rabies, S econd Edition. CRC Press, Boca Raton, Florida, 
USA. 
2.  Council of Europe (1997). Vaccinum rabie inactivat um ad usum veterinarium. Inactivated Rabies 
Vaccine for Veterinary Use. European Pharmacopoeia,  Third Edition. Monograph 0451. Editions of 
the Council of Europe, Strasbourg, France. 
3.  Flores, C.R. La rabia en las diferentes especies s us transmisores y su control. 1a. edición, Editado 
por INIFAP SARH (Agosto de 1998). 
4.  Flores, C.R. Prevención de la Rabia Paralítica Bov ina y el control de los murciélagos vampiros.  1a. 
Edición Mayo 1996. Editado por INIFAP-SAGAR-PAIPEME . (1996). 
5.  Flores, C.R. Técnicas, substancias y estrategias p ara el control de murciélagos vampiros.  1a. 
Edición, Marzo 2003, México, D.F. ISBN 970-92109-1- 2 Impreso por Laboratorios Bayer  de México. 
6.  Jiménez, R.A. 2005. Manual para la Toma de Muestra s para el Diagnóstico de Rabia en Bovinos. 
7.  Jiménez, R.A. 2006. Manual Técnico sobre Técnicas para el control de poblaciones de vampiros 
(Desmodus rotundus) . 1a. edición. Impreso por Laboratorios Bayer de Mé xico. 
8. Manual Operativo para el control de la Rabia Paralí tica Bovina. México, D.F., SAGARPA, 2002. 
9.  OIE. Manual of Standards for Diagnostic Test and V accines, 5a. Edición, París Francia 2004. 
10.  Organización Mundial de la Salud. 8o. Informe del Comité de expertos de la OMS sobre rabia. Serie 
de Informes Técnicos No. 824, 1992. 
11.  Rexford, D.L. Manual de campo para el control de m urciélagos vampiros y la rabia. Bat Conservation 
International. Austin, Texas, July 31, 1998. 
12. World Health Organization (1996). Laboratory Techni ques in Rabies, Fourth Edition, Meslin F.-X., 
Kaplan M.M. & Koprowski H., Eds. WHO, Geneva, Switz erland. 
TRANSITORIO 
PRIMERO.- La presente Norma entrará en vigor a los 60 días po steriores a su publicación en el Diario 
Oficial de la Federación. 
SEGUNDO.-  Se cancela la Norma Oficial Mexicana NOM-035-ZOO-1 996, Requisitos mínimos para las 
vacunas, antígenos y reactivos empleados en la prev ención y control de la rabia en las especies domést icas. 
México, D.F., a 12 de junio de 2009.- El Coordinado r General Jurídico, Wolfgang Rodolfo González 
Muñoz .- Rúbrica. 
Apéndice “A” (Normativo) Lunes 6 de julio de 2009 DIARIO OFICIAL (Primera Se cción)       
Toma y Envío de Muestras al Laboratorio para Diagnó stico de Rabia 
La recolección de muestras de animales sospechosos de rabia, o de aquellos animales que muestren 
signos de enfermedad nerviosa y de las condiciones en su envío al laboratorio y es la parte del trabaj o en 
campo más importante, ya que de esto depende el pod er disponer de un resultado de laboratorio rápido  y 
confiable. 
Para la manipulación de muestras sospechosas de rab ia, de las cuales se pretende hacer el diagnóstico 
en laboratorio, se requiere de un cuidado especial para que las muestras lleguen al laboratorio en las  
condiciones óptimas y así obtener los resultados co n mayor exactitud. 
Para el diagnóstico de rabia, las muestras ideales son las de tipo nervioso como el encéfalo y la médu la; 
estos órganos son donde se concentra la mayor canti dad de virus rábico. 
Para enviar el cerebro, se emplea glicerol al 50% e n solución salina neutra o simplemente en condicion es 
de refrigeración. 
En el caso de que se encuentre el animal en el labo ratorio de diagnóstico, la necropsia de éste deberá  
efectuarse en una habitación exclusivamente con est e propósito, además de contemplarse todas las 
precauciones necesarias para la toma y envío de mue stras y éstas van desde la vacunación del personal 
antes de la exposición, el uso obligatorio de lente s protectores para los ojos, bata u overol, guantes  de hule 
grueso hasta la utilización de cubrebocas; con el f in de evitar la exposición al virus a las personas encargadas 
de la extracción de muestras. 
El equipo e instrumental para la extracción de las muestras de encéfalo y médula, para diagnóstico de 
rabia es indispensable y debe ser exclusivo para el lo, mismo que consiste en: 
/uni25CF Bata u overol 
/uni25CF Lentes protectores para los ojos 
/uni25CF Guantes de hule grueso 
/uni25CF Careta o mascarillas con protección 
/uni25CF Cubrebocas 
/uni25CF Segueta o sierra de carnicero 
/uni25CF Cuchillo 
/uni25CF Tijeras para cirugía 
/uni25CF Pinzas. 
Para el envío de las muestras de encéfalo y médula,  a laboratorio para el diagnóstico de rabia se  req uiere 
de: 
/uni25CF Bolsas de plástico suficientes (de preferencia con  cierre hermético, tipo zip) 
/uni25CF 1 ó 2 frascos de plástico de boca ancha con cierre  hermético de un volumen de 1 ½ litros. 
/uni25CF Hielo en cantidad suficiente; o 
/uni25CF Glicerina fosfatada al 50% 
/uni25CF Hielera con refrigerante. 
El procedimiento para la extracción de las muestras  de encéfalo y médula, para diagnóstico de rabia es  
indispensable y debe ser exclusivo para ello, mismo  que consiste en: 
1.  Retirar la piel del cráneo y efectuar los siguient es cortes con segueta o sierra de carnicero para el  
corte de los huesos. 
2.  El primer corte de hueso es transversal y posterio r a las cuencas oculares, las cuales sirven para 
sujetar la cabeza y como puntos de referencia. 
3. Hacer dos cortes, uno en cada hueso pariental, toma ndo como punto de referencia la comisura 
externa del ojo y la porción lateral del agujero ma gno exactamente encima de los cóndilos del 
occipital, procurando evitar cortar la masa encefál ica. 
4.  Al desprender la bóveda craneana dejamos al descub ierto el encéfalo. 
5.  Cortar con las tijeras las meninges que cubren la superficie del encéfalo y que se caracteriza por se r 
muy duras en los bovinos. 
6.  Extraer con sumo cuidado el encéfalo. 
7.  Cada encéfalo se pone en una bolsa de plástico y s e deposita dentro de la hielera, misma que 
contiene refrigerantes o hielo en cantidad suficien te, para asegurar su óptimo traslado y conservación  
hasta el laboratorio. 
8.  Por cada muestra, debe elaborarse y anexarse una h oja con la información completa y detallada 
(SIVE 1). 
9.  Una vez hecho todo lo anterior se procede a su env ío al laboratorio más cercano lo más pronto 
posible. 
Apéndice “B” (Normativo) 
Manual de Pruebas Diagnósticas y Vacunas para Anima les Terrestres      (Primera Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 6 de ju lio de 2009 
PARTE 2; SECCION 2.2; CAPITULO 2.2.5 
RABIA  
Resumen 
La rabia es una importante zoonosis para la cual la s técnicas de diagnóstico se han tenido que 
estandarizar internacionalmente. Debido a que no ha y lesiones patognomónicas de la enfermedad, el 
diagnóstico de la rabia debe hacerse solamente en e l laboratorio. Las técnicas de laboratorio conducen  
preferentemente con tejido del sistema nervioso cen tral (CNS) removido del cráneo. Un compuesto de 
muestras del CNS debe ser probado y el tallo cerebr al es el componente más importante de la muestra. 
Identificación del agente:  La identificación del agente preferentemente se re aliza utilizando la prueba de 
anticuerpos fluorescentes (FAT por sus siglas en in glés). Una gota de inmunoglobulina purificada previ amente 
conjugado con isotiocianato de fluoresceína es añad ida en acetona 
La identificación del agente se hace preferentement e usando la prueba de anticuerpos fluorescentes 
(FAT). Una gota de inmunoglobulina purificada conju gada previamente con isotiocianato de fluoresceína se 
agrega a un frotis de tejido del cerebro fijado ace tona-fijo, es preferible hacerlo de varias partes d el cerebro, 
incluyendo el hipocampo, el cerebelo y la médula ob longada. Para una gran cantidad de muestras, como e n el 
caso de vigilancia epidemiológica, la técnica inmun oenzimática puede proporcionar los resultados rápid os 
(inmunodiagnóstico rápido de la enzima de la rabia [RREID]). El FAT proporciona un diagnóstico confiab le 
entre el 98-100% de los casos para todos los genoti pos si se utiliza un potente conjugado, mientras qu e 
RREID detecta solamente el virus del genotipo 1. 
Las células nerviosas infectadas han demostrado por  pruebas histológicas y estos procedimientos revela n 
agregados del material viral (Corpúsculos de Negri)  en el citoplasma de las neuronas. Sin embargo, la 
sensibilidad de la técnica histológica es mucho men or al de los métodos inmunológicos, especialmente s i 
estos han sufrido cierta autolisis del espécimen. C onsecuentemente, las técnicas histológicas no puede n ser 
recomendadas por mucho tiempo. 
Una simple prueba negativa en el material fresco no  elimina la posibilidad de infección, las pruebas d e 
inoculación, u otras pruebas, se deben realizarse s imultáneamente. Ratones lactantes o de 3 a 4 semana s de 
edad serán inoculados intracerebralmente con una se rie de diversos tejidos del CNS, incluyendo el tall o 
cerebral y después se mantienen bajo observación po r 28 días. Cualquier ratón que muera entre los 5 y 28 
días, la causa de la muerte deberá ser confirmada p or el FAT. Sucesivamente, una capa de cultivo celul ar 
susceptible se inoculará con el mismo material util izado en los ratones. La inmunofluorescencia (FAT) 
realizada después de una incubación apropiada demos trará la presencia o la ausencia del antígeno viral . 
Donde sea posible aislar el virus en cultivos celul ares, deberá remplazarse por la inoculación en rato nes. 
La identificación del agente puede ser suplementada  en laboratorios especializados mediante la 
identificación de cualquier variante de cepa del vi rus a través del uso de anticuerpos monoclonales, p ruebas 
de ácido nucleico específicas, o por la prueba de R eacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) seguido po r la 
secuenciación de ADN de áreas genómicas. Tales técn icas pueden distinguir entre el virus de campo y ce pas 
vacunales, y posiblemente identificar geográficamen te el origen de las cepas de campo. Estas pruebas s on 
muy sensibles y deberán ser utilizadas por el perso nal entrenado y en laboratorios especializados. 
Pruebas serológicas:  Los análisis de neutralización del virus (VN) en c ultivos celulares son de las 
pruebas ordenadas para el comercio internacional. A lternativamente, el uso puede hacerse de una prueba  que 
es conocida a correlacionar con ésta, notablemente un análisis de inmunoabsorción enzima-ligado usando  el 
anticuerpo de la proteína de G o la prueba de neutr alización en ratones. Los resultados se expresan en  
Unidades Internacionales o unidades equivalentes re lativas para un antisuero estándar internacional. 
Requerimientos para las vacunas y biológicos para e l diagnóstico:  Las vacunas antirrábicas para su 
uso en animales contienen virus vivo atenuado para la especie objetivo (tales como ola FLURY de bajo 
pasaje, Flury de alto pasaje, SAD/Street Alabama Du fferin o Kelev), de virus inactivado por medios quí micos o 
físicos o vacunas recombinantes. El virus es cultiv ado en tejido del CNS de animales recién nacidos, e n 
huevos embrionados, o en cultivos celulares. 
Las vacunas antirrábicas se liofilizan generalmente , pero las vacunas de virus inactivado con un 
coadyuvante y pueden ser almacenadas en forma líqui da. 
Antes de registrar el desarrollo de nuevas vacunas,  debe determinarse la duración de la inmunidad que 
resulta de su uso en animales vacunados para cada e specie objetivo. Lunes 6 de julio de 2009 DIARIO OFICIAL (Primera Se cción)       
Para las vacunas de virus vivo, deberá establecerse  el contenido mínimo viral que resultará en una 
respuesta inmunológica adecuada. 
La potencia de las vacunas de virus inactivado es e stablecido y controlado mediante la vacunación en 
ratones seguido por desafío intracerebral utilizand o pruebas formuladas por el Departamento de Agricul tura de 
los Estados Unidos en los Estados Unidos o por la F armacopea Europea, en otra parte. Los productos fin ales 
de ambos tipos de vacuna están sujetos a pruebas de  inocuidad y ausencia de toxicidad. 
Para vacunas vivas que estén preparadas para la vac unación oral en animales silvestres (o domésticos),  
deberán demostrar la seguridad y eficacia en los an imales objeto y la seguridad en especies no objeto.  
A. Introducción  
La rabia es causada por un virus neurotrópico del g énero Lyssavirus  de la familia Rhabdoviridae, y se 
transmite a todos los mamíferos. Como también se tr ansmite al ser humano por inoculación o por inhalac ión 
del virus, todo el material sospechoso de infección  debe manejarse bajo condiciones apropiadas de segu ridad 
especificadas por la Organización Mundial de la Sal ud (OMS) (37). 
Puede distinguirse siete líneas genéticas distintas  del género Lyssavirus  mediante pruebas de protección 
cruzada y por análisis de biología molecular (5, 14 , 21), a saber el virus de la rabia clásica (RABV, genotipo 1, 
serotipo 1), el virus Lagos bat (LBV, genotipo 2, s erotipo 2), Virus Mokola (MOKV, genotipo 3, serotip o 3), y 
virus Duvenhage (DUUV, genotipo 4, serotipo 4). Los  lyssavirus de murciélagos europeos (EBLV), subdivi dido 
en dos biotipos (EBLV1, genotype 5 and EBLV2, genot ipo 6) y el lyssavirus de murciélagos australianos 
(ABLV, genotipo 7), recientemente aislado en Austra lia (24), también son miembros del género de los 
Lyssavirus genus, pero aún no se han clasificado en  serotipos. Los virus de los serotipos 2-4, los EBL V y el 
ABLV son conocidos virus relacionados con la rabia.  El uso de anticuerpos monoclonales (MAbs) están 
dirigidos contra los antígenos víricos de la nucleo cápside o la glicoproteína, o la secuenciación de f ragmentos 
genómicos determinados ha hecho posible la definici ón de numerosos subtipos dentro de cada serotipo. L os 
Lyssaviruses causan una enfermedad clínica indistin guible de la rabia clásica. Los sitios antiénicos 
conservados en la nucleocápside permiten el reconoc imiento de todos los lyssavirus con recientes 
preparaciones comerciales de conjugados de anticuer pos antirrábicos usados para el diagnóstico con 
muestras de cerebro. Los sitios antigénicos conserv ados en la superficie de la glicoproteína de RABV, DUUV, 
EBLV and ABLV, permiten la neutralización cruzada y  la inmunidad cruzada mediante la vacunación 
antirrábica. Existe poca o nula protección cruzada contra MOKVo LBV por vacunación antirrábica y la ma yoría 
de los antisueros no neutralizan estos lyssaviruses . 
El personal que trabaja con material sospechoso deb e estar vacunado contra los lyssaviruses y otros 
patógenos que pueden estar presentes en las muestra s a diagnosticar. El laboratorio debe cumplir con l a 
normativa nacional de biocontención y de biosegurid ad para proteger al personal del contacto con los 
patógenos; también debe cumplir con las directrices  señaladas en el capítulo I.1.6. Seguridad humana e n el 
laboratorio de Microbiología. 
La OMS recomienda la inmunización preventiva del pe rsonal expuesto. El protocolo de inmunización 
incluye tres inyecciones en los días 0, 7, y 28. La  evaluación serológica de la inmunización se realic e de 1 a 3 
semanas después de la última inyección y se comprue ba cada 6 meses en el caso de trabajadores de 
laboratorio o cada 2 años en otro personal. Debe su ministrarse un refuerzo cuando el título desciende por 
debajo de 0.5 Unidades Internacionales por mililitr o UI/ml. En ausencia de control serológico, el regi men de 
vacunación debe consistir en una vacunación de refu erzo inicial después de 1 año y continuando cada 1 a 3 
años. 
Como no existen signos clínicos o lesions evidentes  post-mortem que puedan considerarse 
patognomónicas en animales domésticos o silvestres,  el diagnóstico de la rabia depende en pruebas de 
laboratorio. La evidencia serológica de infección e s raramente útil debido a la seroconversión tardía y a la 
elevada tasa de mortalidad de las especies hospedad oras, aunque tales datos pueden usarse en algunos 
análisis epidemiológicos. 
1. Identificación del agente 
La observación clínica puede conducir solamente a u na sospecha de rabia porque los signos de la 
enfermedad no son característicos y puede variar gr andemente de un animal a otro (36). La única manera  de 
realizar un diagnóstico de rabia confiable es la id entificación del virus o parte de sus componentes e specíficos 
mediante pruebas de laboratorio.      (Primera Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 6 de ju lio de 2009 
Como el virus de la rabia es inactivado rápidamente , las muestras a diagnosticar deberán enviarse al 
laboratorio en refrigeración y por los medios más r ápidos disponibles. Las condiciones del envío deben  ser 
considerados para ser parte de la “cadena de diagnó stico de la rabia”. 
Pueden utilizarse varias técnicas de laboratorio, m ismas que han sido detalladas y estandardizadas en la 
4ta edición de Técnicas de Laboratorio para la Rabi a de la Organización Mundial de la Salud (OMS's 
Laboratory Techniques in Rabies) (37). Los métodos varían en su eficacia, especificidad y confiabilida d. Se 
aplican generalmente al tejido cerebral, pero puede n también ser aplicados aunque con menos eficacia a  
otros órganos (e.g. glándulas salivales). En el cer ebro, el virus de la rabia es particularmente abund ante en el 
tálamo, el Puente de Varolio y la médula. El hipoca mpo (cuerno de Ammon), el cerebelo y diferentes par tes 
del cerebro se han reportado negativos en 3.9 - 11. 1% de los cerebros positivos. La estructura de la e lección 
es el tálamo y esto fue positivo en todos los casos . Se recomienda que una serie de tejidos cerebro se an 
incluidos la corteza el tallo cerebral debe ser col ectado y probado (12). Para alcanzar estas partes d el cerebro, 
es necesario remover el órgano completo después de haber abierto el cráneo en un cuarto de necropsias.  
Bajo algunas condiciones (como en el campo o cuando  se realizan muestreos grandes para estudios 
epidemiológicos), puede emplearse un método de mues treo simplificado a través del agujero occipital (1 1), o a 
través de la cavidad orbital (26). 
a)   Envío de muestras 
 Durante el envío de material sospechoso para diagn óstico (cabezas de animales, cerebro u otros 
tejidos), no debe existir ningún riesgo de contamin ación al hombre: los cerebros deben colocarse en 
un envase rígido y hermético (las cabezas de animal es serán envueltas en material absorbente) 
como se señala en la Asociación Internacional para el Transporte Aéreo (IATA). Estas regulaciones 
se resumen en el capítulo I.1.1. Métodos de muestre o. 
 Cuando no sea posible enviar las muestras en refri geración, otras técnicas de conservación pueden 
usarse. La elección de conservación está estrechame nte ligada a las pruebas de diagnóstico 
utilizadas: 
/uni25CF La formalina inactiva el virus de la rabia, por lo  que no puede utilizarse pruebas del aislamiento y 
el diagnóstico depende del uso de pruebas modificad as y con menos sensibilidad como son la 
de inmunofluorescencia directa (FAT), inmunohistoqu ímica o histológica (33, 37); 
/uni25CF La infecciosidad a temperatura ambiente puede exte nderse por varios días si el material del 
cerebro se mantiene en una mezcla tamponada de glic erol al 50% y solución salina fosfatada 
(PBS). La mezcla Glicerol/PBS retarda la acción bac teriana y por lo tanto la protege contra los 
efectos químicos y biológicos de la putrefacción. E sta no protege contra la declinación del título 
debido a las condiciones térmicas y por lo tanto co mo el virus de la rabia es termolábil, el título 
del virus declinará durante su almacenaje en Glicer ol/PBS. Bajo condiciones de transporte 
normal en las zonas tropicales, esta protección pue de ser eficaz por cuestión de días. Por lo 
tanto, siempre que sea posible mantener las muestra s en Glicerol/PBS deben mantenerse 
refrigeradas. Como el virus no se inactivada por el  Glicerol/PBS, todas las pruebas de laboratorio 
pueden utilizarse en estas muestras. 
b)   Colecta de muestras 
 Usualmente el cerebro es colectado seguido de abri r el cráneo en una sala de necropsias y las 
muestras apropiadas son tomadas. Este paso puede se r peligroso si los técnicos de laboratorio no se 
encuentran entrenados, o están bajo condiciones de campo. En tales casos, existen dos métodos de 
colecta de muestras de cerebro sin la necesidad de abrir el cráneo: 
/uni25CF Ruta del Agujero Occipital para la toma de muestra de cerebro 
 Se introduce un popote de beber de 5 milímetros (1 1) o una pipeta plástica disponible de 2 ml (16) en  
el agujero occipital en la dirección de un ojo. Pue de tomarse muestras de Bulbo raquídeo, de la base 
del cerebelo, del hipocampo, de la corteza y de la médula oblongada. La Encefalopatía Espongiforme 
de los bóvidos (BSE) debe considerarse en el diagnó stico diferencial de la mayoría del ganado que 
es considerado “sospechoso a rabia”. El muestreo de  tejido cerebral para ambas enfermedades 
puede hacerse mediante el uso de una “cucharada de cerebro o herramienta” desarrollada para el 
muestreo del tejido para BSE y con mejor efectivida d que con el uso de un popote o pipeta. Las 
muestras resultantes son relativamente fácilmente d e reconocer como el área de cerebro 
muestreada. Lunes 6 de julio de 2009 DIARIO OFICIAL (Primera Se cción)       
/uni25CF Ruta Retro-orbital para la toma de muestra de cereb ro 
 En esta técnica (26), se utiliza un trócar para ha cer un agujero en la pared posterior de la cuenca d el 
ojo y se introduce una pipeta de plástico a través de este agujero. Las partes del cerebro 
muestreadas son las mismas que en la técnica anteri or, pero se toman en la dirección opuesta. 
c)  Pruebas de Rutina en el laboratorio 
 El diagnóstico de laboratorio puede desarrollarse usando tres tipos de procedimientos. 
/uni25CF Identificación histológica de lesiones celulares ca racterísticas  
 Los corpúsculos de Negri corresponden a una acumul ación de proteínas virales, pero las técnicas 
clásicas de tinción sólo detectan una afinidad de e stas estructuras para tinciones acidofílicas. Las 
Pruebas Inmunohistoquímicas son las únicas pruebas histológicas específicas para la rabia. 
 Un frotis de tejido sin fijar, puede ser teñido po r el método de Seller’s, el diagnóstico es después 
obtenido en una 1 hora aproximadamente. Generalment e, las pruebas histológicas, como la prueba 
de Mann, se realizan en material fijado después de su inclusión en parafina y el resultado de la 
prueba se obtiene en un lapso de 3 días. Estas técn icas tienen la ventaja que el equipo del 
laboratorio necesario para realizarlas es barato y se evita cualquier necesidad para mantener las 
muestras frías después de ser fijadas. Cualquiera q ue sea el método de tinción usado, la evidencia 
de la infección es proporcionada por la presencia d e cuerpos acidofílicos intracitoplásmicos. Estos 
métodos histológicos, especialmente el método de Se ller’s, no pueden recomendarse porque tienen 
una sensibilidad baja y deben descartados. 
/uni25CF Identificación inmunoquímica del antígeno del virus  de la rabia 
i) Prueba de Anticuerpos fluorescentes (Inmunofluoresc encia FAT) 
 La prueba ampliamente utilizada para el diagnóstic o de la rabia es la inmunofluorescencia, 
misma que es recomendada por la OMS y la OIE. Esta prueba puede utilizarse directamente en 
un frotis y también puede usarse para confirmar la presencia del antígeno del virus de la rabia en 
cultivos celulares o en tejido de cerebro de ratone s que hayan sido inoculados para el 
diagnóstico. La inmunofluorescencia da resultados c onfiables en especímenes frescos con unas 
pocas horas en más de 95-99% de los casos. La sensi bilidad de la inmunofluorescencia 
depende de la muestra (grado de autólisis y cómo fu e muestreado el cerebro, vea la sección 
B.1.) (1, 9), en el tipo de lyssavirus y en la habi lidad del personal de diagnóstico. La sensibilidad 
puede ser baja en muestras de animales vacunados de bido a la localización del antígeno que se 
confina al tallo cerebral. Para el diagnóstico dire cto de la rabia, los frotis se preparan de una 
muestra compuesta del tejido cerebral que incluya e l tallo cerebral, se fijan en acetona fría de 
alto grado y después se tiñen con una gota del conj ugado específico. Los conjugados 
fluorescentes antirrábicos pueden prepararse en el laboratorio. Aquellos disponibles 
comercialmente son conjugados policlonales específi cos al virus completo o específico a la 
proteína de la nucleocapside del virus, o pueden es tar preparados con una mezcla de diversos 
anticuerpos monoclonales (MAbs). En la inmunofluore scencia, los agregados específicos de la 
proteína del nucleocapside son identificados por su  fluorescencia. La especificidad y la 
sensibilidad de estos conjugados antirrábicos fluor escentes deben comprobarse para las 
variantes de los virus localmente predominantes ant es de ser utilizados. 
 La inmunofluorescencia puede aplicarse a muestras conservadas en glicerol. Si la muestra ha 
sido conservada en una solución de formalina, la in munofluorescencia puede ser utilizada 
solamente después que el espécimen se ha tratado co n una enzima proteolítica (6, 7, 32, 33). 
Sin embargo, la inmunofluorescencia en muestras fij as en formalina y digeridas son siempre 
menos confiable y más incómodas que cuando éstas se  realizan en tejido fresco. 
ii) Pruebas inmunoquímicas 
 El anticuerpo puede ser conjugado con una enzima c omo la peroxidasa en vez del isotiocianato 
de fluoresceína (FITC). Este conjugado puede usarse  para el diagnóstico directo con la misma 
sensibilidad que la inmunofluorescencia (22), pero atención debe tenerse cuidado del riesgo de 
resultados falso positivos no específicos. Este rie sgo es reducido considerablemente por el 
entrenamiento cuidadoso de los técnicos. También de be enfatizarse que esta técnica necesita 
un paso de incubación más que la inmunofluorescenci a.      (Primera Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 6 de ju lio de 2009 
 El conjugado con peroxidasa puede usarse en seccio nes de tejido fijado en formalina para las 
pruebas immunohistoquímicas. 
 Una variación de la prueba inmunoquímica es un enz imoinmunoensayo (ELISA) que detecta 
antígeno de rabia. Esta prueba rápida del immunodia gnóstico de la enzima de la rabia (RREID) 
está disponible comercialmente (28). Los rangos de correlación entre la inmunofluorescencia y el 
RREID se extiende entre el 96% y el 99% (8, 15). La  versión “rutinaria” de esta prueba no es 
sensible a los virus de rabia relacionados ya que R REID detecta solamente lyssaviruses del 
genotipo 1. 
 Detección de replicación del virus de la rabia desp ués de la inoculación 
 Estas pruebas detectan la infecciosidad de una sus pensión de tejido en cultivos celulares o en 
animales de laboratorio. Estas deben ser utilizadas  si la inmunofluorescencia da un resultado incierto  
o cuando ésta es negativa en el caso de exposición humana conocida. 
i) Prueba de inoculación en ratones 
 Se inoculan intracerebralmente de cinco a diez a r atones de tres a cuatro semanas de edad  (12-
14 g), o una camada de ratones de 2 días de nacidos . Es recomendable, aunque no 
estrictamente esencial, el uso de ratones libres de  patógeno específico (SPF). El inóculo es el 
sobrenadante clarificado de un 20% (peso/volumen) h omogéneo del material del cerebro 
(corteza, cuerno de Ammon, cerebelo, médula oblonga da) en una solución isotónica bufferada 
conteniendo antibióticos. Para reducir el dolor en los animales, los ratones deben ser 
anestesiados cuando sean inoculados. Los ratones jó venes adulto serán observados 
diariamente por 28 días y cada ratón que muera será  examinado para rabia usando FAT. Para 
las cepas de calle de rabia en zorros, las muertes debido a la rabia generalmente comienzan 9 
días post inoculación. Para resultados más rápidos en ratones recién nacidos, es posible revisar 
un ratón bebé por FAT en los días 5, 7, 9 y 11 post -inoculación. 
 Esta prueba in-vivo  es demasiado costosa, particularmente si se utiliz an los ratones SPF y debe 
evitarse en lo posible. No da resultados rápidos (c omparados con las pruebas de inoculación  in-
vitro ), pero cuando la prueba es positiva, una gran cant idad de virus puede ser aislada de un 
solo cerebro de ratón con el propósito de identific ación de la cepa. Otra ventaja de esta prueba 
de baja tecnología es que puede fácilmente ponerse en práctica y ser aplicada en situaciones 
donde no está disponible habilidades e instalacione s para otras pruebas (por ejemplo cultivos 
celulares). 
ii) Prueba de cultivos celulares 
 Para el diagnóstico rutinario de rabia se usan las  líneas de células de Neuroblastoma, por 
ejemplo CCL-131 en la American Type Culture Collect ion (ATCC: American Type Culture 
Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, V irginia 20110-2209, United States of 
America). Las células se cultivan en el medio Eagle  modificado por Dulbecco (DMEM) con 5% 
de suero fetal bovino (FCS) y se incuban a 36° C con  5% de CO 2. Esta sensibilidad ha sido 
comparada en células del riñón del hámster neonato (BHK-21) (29). Esta línea celular es la 
adecuada para los aislamientos de cepas de la calle  sin ningún paso de adaptación, pero debe 
ser analizada, antes de su empleo, para comprobar s u susceptibilidad a las variantes de virus 
predominantes localmente. La presencia del virus de  la rabia en las células es revelada por 
inmunofluorescencia. El resultado de la prueba se o btiene por lo menos 18 horas después (un 
ciclo de replicación de virus en las células); gene ralmente la incubación se prolonga por 48 horas 
(10) y en algunos laboratorios hasta cuatro días. 
 Esta prueba es tan sensible como la prueba de inoc ulación en ratones. Una vez que la unidad de 
cultivo celular existe en el laboratorio, esta prue ba deberá sustituir la prueba de inoculación en 
ratones de esta manera se evita el uso de animales vivos, es menos costosa y da resultados 
más rápidos. 
 A menudo es recomendable realizar más de un tipo d e prueba en cada muestra, por lo menos 
cuando existe una exposición en humanos. Lunes 6 de julio de 2009 DIARIO OFICIAL (Primera Se cción)       
d) Otras pruebas de identificación 
 Las pruebas anteriores pueden completarse en labor atorios especializados (como los laboratorios de 
referencia de la OIE o de la OMS) usando anticuerpo s monoclonales, pruebas de ácido nucléico, o 
de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), segui da por secuenciación de DNA de áreas 
genómicas para tipificar el virus (16). Esto permit e que se haga una distinción entre el virus vacunal  y 
una cepa de virus de campo y posiblemente el origen  geográfico de esta última. 
2. Pruebas serológicas 
 Las pruebas serológicas son raramente utilizadas e n la vigilancia epidemiológica, debido a la tardía 
seroconversión y al bajo porcentaje de animales que  sobreviven a la enfermedad y por lo tanto que 
tienen anticuerpos post-infección. La inmunización oral en los reservorios de la rabia es el método de  
elección para el control en la fauna silvestre. Par a las investigaciones de seguimiento en campañas 
de vacunación oral, las pruebas de neutralización d el virus (VN) en cultivos celulares son las 
preferidas. Sin embargo, si una pobre calidad en lo s sueros son sometidos a la prueba VN los 
cultivos celulares son sensibles a la citotoxicidad , la cual podría conducir a resultados falso positi vos. 
Para tales muestras, el uso de un ELISA indirecta c on placas revestidas de glicoproteína de la rabia, 
han demostrado ser tan sensibles y específicas como  la prueba del VN en células (19). 
a) Prueba de neutralización del virus en cultivo ce lular: Prueba de neutralización del virus 
por anticuerpos fluorescentes (una prueba prescrita  para el comercio internacional) 
 El principio de la prueba de Neutralización del Vi rus por Anticuerpos Fluorescentes (FAVN) (18) 
es la neutralización in vitro  de una cantidad constante del virus de la rabia (' Challenge Virus 
Standard' [CVS] adaptada a cultivos celulares) ante s de inocular las células susceptibles al virus 
de la rabia: células de BHK-21 C13. 
 El título del suero es la dilusión en la cual 100%  del virus es neutralizada en 50% de los pozos. 
Este título es expresado en UI/ml comparándolo con la dilusión neutralizante de un suero 
estándar bajo las mismas condiciones experimentales  (suero de la OIE de origen canino o 
estándar de la OMS para inmunoglobulina [humana] No . 2 o ambas). Puede ser usado un control 
interno calibrado contra el control internacional. 
 Este método de microplaca utiliza placas de 96 poz os y es una adaptación de la técnica de 
Smith et al. (30), modificado por Zalan et al. (38)  y por Perrin et al. (27). Varias publicaciones 
(17, 18) han demostrado que la prueba de FAVN y la Prueba Rápida de Inhibición de Focos 
Fluorescentes (RFFIT) dan resultados equivalentes. 
/uni25CF Equipo esencial 
 Incubador humedecido a 37° C con 5% CO 2; incubador seco a 37° C; gabinete de biocontención;  
microscopio de fluorescencia apropiado para fluores cencia con FITC y equipado con ocular x10 
y objetivo x10. El aumento global del microscopio v aría entre x100 y x125 debido al aumento 
adicional de algunos sistemas de epi-fluorescencia.  
/uni25CF Reactivos y biológicos 
 Solución tamponada PBS, pH 7.2, sin Ca 2+  y Mg 2+ , almacenada a 4° C; 
 Tripsina con etilen diamino tetra acético (EDTA); 
 Acetona de alto grado al 80% (diluida con agua des ionizada), almacenada a 4° C; 
 Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) + 10 % de FCS inactivado por calor; 
 Conjugado antirrábico con FITC; 
 Células:  BHK-21 C13 (ATCC CCL-10); 
 Virus:  Cepa CVS-11 (ATCC VR 959), la cual está disponible  en el ATCC o en el laboratorio de 
referencia de la OIE para la rabia, Nancy, Francia.  Los frascos se almacenan a -80° C; 
 Inmunoglobulina antirrábica (humana) estandarizada  de la OMS No. 2, 30 UI por ampolleta (National 
Institute for Biological Standards and Control (NIB SC), Blanche Lane, South Mimms, Potters Bar, 
Hertfordshire EN6 3QG, United Kingdom) (reconstitui do con 5 ml de agua estéril desionizada o 
destilada, almacenados a -20° C, y diluidos a 0.5 UI /ml con agua desionizada antes de usarse),  o 
preferentemente suero estándar de la OIE de origen canino (Laboratorio de Referencia de rabia,      (Primera Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 6 de ju lio de 2009 
Nancy, Francia de la OIE almacenado a -20° C y dilui do a 0.5 UI/ml con agua desionizada estéril o 
agua destilada según al título del lote). Es aconse jable que para el control interno rutinario, los 
laboratorios utilicen un suero positivo o un conjun to de sueros de origen canino que se hayan sido 
calibrados con el Suero Estándar Internacional de l a OIE; 
 Suero control: Conjunto de diez sueros caninos lio filizados, se almacena a 4° C, y se reconstituye con  
0.5 ml de agua estéril desionizada o de agua destil ada. 
/uni25CF Producción de CVS (Challenge Virus Standar) 
i) Cultivo celular:  Las células BHK-21 C13 (ATCC CCL-10) son usadas pa ra producir el virus 
CVS (ATCC VR 959 CVS-11) se tripsinizan durante la fase rápida de crecimiento, es decir, 
cuando las células están en fase exponencial de cre cimiento. Si la confluencia de la capa es 
completa, un nuevo pasaje debe hecerse. Las células  en suspensión no deben agregarse; se 
usan 2 x 10 7 células por cada frasco de cultivo de 75 cm 2. Se colectan las células con un 
volumen de 20 a 30 ml de medio de cultivo con 10% d e FCS inactivado por calor. 
ii) Infección de las células:  La multiplicidad de infección (número de partícula s infecciosas por 
célula) es ajustada entre 0.1 y 0.5. La botella de cristal que contiene la suspensión de 
virus/células es incubada por 60 minutos a 35.5 y 3 7° C. El contenido de la botella se agita 
suavemente cada 10 a 15 minutos. 
iii) Crecimiento del virus:  La suspensión de virus/células centrifugada a 800 g  por 15 minutos y el 
precipitado se resuspende en el medio de cultivo me zclado con 10% de FCS inactivado por 
calor. El virus es cosechado 2 días después. 
iv) Cosecha y almacenaje:  El sobrenadante es centrifugado a 800 g por 15 min utos a 4° C. Si se 
han utilizado varios frascos, los diversos sobrenad antes centrifugados son mezclados y después 
repartidos en alícuotas y se congelan a -80° C. El t ítulo infectivo de la cosecha se establece por 
lo menos 3 días después de la congelación. 
/uni25CF Titulación del virus en TCID50 (Dosis infectiva de l 50% en cultivo de tejidos) 
 Este método de titulación utiliza células BHK-21 C 13 (ATCC CCL-10) en placas del microtitulación. 
 Diversos pasos en este procedimiento pueden ser ad aptados según los requisitos de seguridad y a 
las prácticas de funcionamiento del laboratorio, pe ro lo siguiente no debe ser cambiado: 
/uni25CF Inoculación de una capa de células de 24 horas, 
/uni25CF Dilusiones decimales preparadas con 0.9 ml de diluy ente y 0.1 ml de suspensión del virus, 
/uni25CF seis réplicas de 50 µl por dilusión, 
/uni25CF Incubación por 72 horas, 
/uni25CF lectura cualitativa (es decir si el pozo es positiv o o negativo), 
/uni25CF En cada sesión de titulación, se titula un vial de un lote control de virus y este título es integrado  
en una tarjeta control para validar el proceso de t itulación, 
/uni25CF El cálculo por el método gráfico del neoprobit o po r el método de Spearman-Kärber. 
i) Suspensión celular:  El día anterior a la titulación, se prepara una su spensión de células que 
contengan 10 5 células/ml en medio de cultivo celular que conteng a 10% de FCS inactivado por 
calor y es distribuida en la placa de microtitulaci ón de 96 pozos, con 200 µl por pozo. Las placas 
son después incubadas por 24 horas a 35.5°  C - 37° C  con 5% de CO 2. 
ii) Dilusión del virus:  Las dilusiones seriadas son realizadas en tubos de  5 ml usando un medio de 
cultivo celular sin FCS como diluyente. Se preparan  dilusiones de 10 -1 a 10 -12  (0.9 ml de 
diluyente con 0.1 ml de la dilusión anterior). 
iii) Infección de las células:  El medio de las placas del microtitulación es dese chado usando un 
sistema de aspirado. Se distribuye en cada pozo 50 µl de cada dilusión de virus. Se usan seis 
réplicas por cada dilusión. La placa de microtitula ción es después incubada por 1 hora a 35.5 - 
37° C con 5% de CO 2. Después se añaden 200 µl de medio de cultivo con 5% de FCS. 
iv) Incubación:  Incubar por 3 días a 35.5 - 37° C en 5% de CO 2 Lunes 6 de julio de 2009 DIARIO OFICIAL (Primera Se cción)       
v) La tinción y cálculo del título:  Se tiñen las células usando inmunofluorescencia, c omo se 
detalla a continuación. La lectura es cualitativa, cada pozo que muestre fluorescencia específica 
es considerado como positivo. El cálculo del título  se hace usando: 
/uni25CF El método gráfico de neoprobit (2) o, 
/uni25CF La fórmula de Spearman-Kärber: 
log 10  (dilución a punto final) =  
x0 = ( (log 10  de la dilución más baja con todos los pozos positi vos) 
d = log10 del paso de la dilución, uno en este caso 
ni = número de réplicas, seis en este caso 
ri = número de pozos positivos 
 
Fig. 1. Utilización propuesta de las microplacas para la pr ueba de neutralización del virus por anticuerpos 
fluorescentes. Los pozos a los cuales se les debe a ñadir sueros sin diluirse llenan con los “50 µl” in dicados. 
Los pozos a los que se les debe añadir 50 µl de dil ución de virus estandar de desafío se muestran en 
sombeado. Las diluciones se expresan en log 10 . 
 
 
      (Primera Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 6 de ju lio de 2009 
/uni25CF Procedimiento de la Prueba  
i)  Las microplacas son usan según el modelo indicado en la figura 1. La placa No. 1 se usa para la 
titulación de CVS (filas 1 a la 4), y para los cont roles se emplean los sueros caninos control.  La 
placa No. 2 y las siguientes se usan para los suero s que se van a probar. 
ii) El medio se agrega a los pozos como sigue: placa 1,  filas 1 a la 4 y pozos A9 a A12: agregue 
150 µl por pozo; placa 2 y siguientes, filas 6 y 12 : agregue 200 µl por pozo; el resto de los pozos: 
agregue 100 µl. 
iii)  Los sueros a probarse son inactivados por calor du rante 30 minutos a 56° C. Como se indica en 
la figura 1, se agregan 50 µl de cada suero sin dil uido a los cuatro pozos adyacentes. 
iv)  Las dilusiones de sueros se lleva a cabo en las mi croplacas de la siguiente manera: 
 El suero de la OIE, el suero de OMS, el control in terno y el suero canino control: con una pipeta 
multicanal de 50-200 µl, mezcle los primeros pozos de la dilusión succionando dentro y fuera por 
lo menos ocho veces, transfiera 50 µl de una fila a  la siguiente, hasta alcanzar la última. 
Descarte 50 µl de la última fila. 
 Los sueros problemas (todas las placas): como se s eñaló antes, transfiera sucesivamente 50 µl 
de una fila a la siguiente hasta las filas 5 y 11 ( dil. 10 -2.39 ). Con una pipeta multicanal transfiera 
de 5 a 50 µl, transfiera 10 µl de las filas 5 y 11 a las filas 6 y 12 respectivamente (de dil. 10 -2.39  a 
dil. 10 -4.23 ). Usando una pipeta multicanal ajustada a 100 µl, mezcle las filas 6 y 12 y deseche 
180 µl. Después agregue a estas filas 70 µl de medi o. Este paso final no lleva por sí mismo a 
mayor rendimiento de la prueba. Para lograr o super ar la dilución final recomendada pueden 
usarse procedimientos alternativos. Esto puede requ erir modificaciones en la distribución de la 
placa. 
/uni25CF Adición del Virus Estándar de Desafío (CVS)  
i) El stock de CVS es guardado en microtubos de 1 ml a  -80° C. Un tubo se descongelada 
rápidamente bajo el chorro de agua corriente y se c oloca en hielo. 
ii)  Se prepara una dilusión de este tubo para obtener 100 TCID 50  en 50 µl. De esta dilusión se 
agregan 50 µl de suero a cada pozo (véase la figura  1). Para la titulación del virus se añaden 50 
µl a los pozos H1 a H4 (placa 1). Después, transfie ra 50 µl de una fila a la otra fila (placa 1, 
líneas 1-4). Deseche los 50 µl de la última fila (p laca 1, pozos A1 a A4). No agregue ningún virus 
a los pozos A9 a A12 de la placa 1 (controles). 
iii) Incube las microplacas a 37° C en una incubadora húm eda con 5% de CO 2 por 1 hora. 
iv)  Adición de células:  Tripsinizar un cultivo subconfluente de células BH K-21 de 3 días de edad. 
Resuspenda las células para obtener una suspensión de 4 x 10 5 células/ml en DMEM 
suplementada con 10% de FCS e inactivada por calor Agregue 50 µl de la suspensión de células 
a cada pozo. 
v)  Incube las microplacas por 48 horas a 37° C en una incubadora húmeda con 5% de CO 2. 
/uni25CF Fijación y tinción 
i)  Después de 48 horas del período de incubación, el medio es desechado y las microplacas se 
lavan una vez con PBS, pH 7.2, y una vez en acetona  al 80%. Las microplacas son después 
fijadas en acetona al 80% a temperatura ambiente po r 30 minutos (sin tapa) y se secan a 
temperatura ambiente por lo menos 1 hora. 
ii)  Agregue a cada pozo 50 µl de la dilución de trabaj o del conjugado antirrábico con FITC, 
suavemente agite las microplacas e incúbelas a 37° C  por 30 minutos. Deseche el conjugado 
fluorescente y lave las microplacas un par de veces  con PBS. El exceso de PBS es retirado 
invirtiendo las microplacas en papel absorbente. Lunes 6 de julio de 2009 DIARIO OFICIAL (Primera Se cción)       
/uni25CF Lectura e interpretación de resultados 
i)  Se observa la superficie total de cada pozo. La le ctura de evaluación es cualitativa (más o 
menos): si no hay fluorescencia en las células se a signa un signo (–) para el pozo (registro 
negativo); si existe fluorescencia en las células ( una célula o más), se asigna un (+) al pozo 
(registro positivo). 
ii)  Se leen primero los controles. Para las células co ntrol, la titulación de CVS, el suero control y los  
sueros estándares (Suero estándar de la OMS y/o sue ro estándar de la OIE), los títulos son 
calculados acorde al método gráfico de neoprobit (2 ) o el método de Spearman-Kärber. 
iii)  Los resultados de la titulación de CVS (TCID 50 ), del suero control (D 50  [dosis media]) y del 
positivo estándar (D 50 ) se reportan en una tarjeta de control para cada c aso. Los resultados de 
control de la prueba actual se compara con los resu ltados de las pruebas control de pruebas 
anteriores usando el mismo lote de control. La prue ba se valida si los valores obtenidos para los 
tres controles en la prueba actual no son estadísti camente diferentes de la media de todos los 
valores obtenidos en las pruebas anteriores según e sta técnica. 
iv)  El resultado de la prueba corresponde al virus no neutralizado después de la incubación con el 
suero de referencia o con el suero problema. Estos títulos son calculados con el método gráfico 
neoprobit (2) o con la fórmula de Spearman-Kärber ( 37). La comparación del título medido en los 
sueros probados con el del suero positivo estándar de título neutralizante conocido permite 
determinar el título neutralizante de los sueros pr oblema en UI/ml. 
b) La Prueba Rápida de Inhibición de Focos Fluoresc entes (RFFIT) para determinar la 
neutralización del virus de la rabia por anticuerpo s (rabies virus-neutralising antibody) 
(Prueba prescrita para comercio internacional) 
/uni25CF Procedimiento estandarizado (por OMS Laboratory Te chniques in Rabies, 1996; [ref. 37]) 
/uni25CF Preparación de la suspension de virus de inóculo 
i)  Tripsinizar un cultivo de células de neuroblastoma  de ratón (MNA) de 3 días de edad en un 
frasco de 150 ml (disponible Rabies Laboratory, Div ision of Viral and Rickettsial Diseases, 
Centres for Disease Control and Prevention, Atlanta , Georgia, USA). Estas células prefieren un 
medio ácido suplementado con vitaminas (34). Puede obtenerse una línea celular similar (CCL-
131) por petición del ATCC. 
ii)  Resuspender 3 x 10 7 de células en un tubo cónico de centrífuga de 50 m l en 2.7 ml de medio 
mínimo esencial de Eagle suplementado con 10% de su ero fetal bovino (EMEM-10). 
iii) Utilizando procedimientos estándares de seguridad c ontra la rabia, agrege 1 x 10 7 unidades 
infecciosas del virus de la rabia CVS-11 (ATCC, VR9 59) y mezcle con el vórtex una vez. Incube 
las células y el virus por 15 minutos a 37° C; somet er una vez más las células al vórtex. 
iv)  Agregue 10 ml EMEM-10, mezclar con vórtex y centri fuge las células a 500 g por 10 minutos. 
v)  Deseche el sobrenadante. Resuspenda las células en  30 ml de medio de cultivo y transfiéralas a 
un frasco de 150 ml. 
vi)  Agite suavemente el frasco para mezclar la suspens ión de células y después preparare tres 
portaobjetos con cámara para cultivo de tejidos con  8 pozos, midiendo con una pipeta 0.2 ml de 
la suspensión celular en un pozo de cada portaobjet os. 
vii)  Incube el frasco y los portaobjetos a 37° C en una incubadora humedecida con 0.5% de CO 2.  El 
frasco debe incubarse como un cultivo cerrado (apre tar la tapa). 
viii) A las 20, 40 y 64 horas después de la infección, fi je con acetona y tiña un portaobjetos usando 
por la técnica de inmunofluorescencia (23) para det erminar la infecciosidad del virus.  El 
sobrenadante debe ser cosechado 24 horas después de  que las células alcanzan 100% de 
infecciosidad (típicamente 40 horas después de la i nfección). 
ix)  Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrifuga dora de 50 ml y centrifuge a 4000 g por 10 
minutos. 
x)  Distribuya el sobrenadante en alícuotas de 0.5 ml y almacénelas a -70° C.      (Primera Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 6 de ju lio de 2009 
/uni25CF Titulación de la suspensión viral de inóculo 
i)  Descongele una alícuota del virus inóculo y prepar e diluciones decimales (a partir la 10 -1 a 10 -8) 
en EMEM-10. 
ii)  Distribuya 0.1 ml de cada dilusión del virus en un  pozo del portaobjetos con cámara para cultivo 
de tejidos. Agregue a cada pozo 0.2 ml de células M NA suspendidas en EMEM-10 (la 
concentración de las células 5 x 10 4 por 0.2 ml). 
iii) Mezcle las células y el virus oscilando suavemente el portaobjetos, después incubese a 37° C en 
una incubadora humedecida con 0.5% de CO 2 por 40 horas. 
iv)  Fije con acetona y tiña el portaobjetos por la téc nica de inmunofluorescencia. La evidencia de la 
infección del virus debe observarse en la dilución del virus 10 -6, indicando una existencia de 
virus de al menos 1 x 10 6 unidades infecciosas por 0.1 ml. Prepare suficient e virus inóculo para 
que no sea necesario frecuentes pasajes seriados de l virus. 
/uni25CF Preparación de la suspension de virus stock 
i)  Infecte 3 x 10 7 de células de MNA con 1 x 10 7 unidades infecciosas de la preparación del virus 
inóculo (véase arriba). 
ii)  Coseche el sobrenadante 24 horas después de que la s células alcancen el 100% de 
infecciosidad (típicamente 40 horas después de la i nfección). 
iii)  Distribuya el sobrenadante en alícuotas de 0.5 ml y almacénelo a -70° C. 
/uni25CF Titulación de la suspensión viral stock 
i)  Descongele una alícuota del virus inóculo y utilic e esto para preparar dilusiones decimales (de 
10 -1 a 10 -6) en EMEM-10. 
ii) Distribuya 0.1 ml de cada dilusión del virus en un pozo de un portaobjeto con cámara para 
cultivo de tejidos con ocho pozos. Agregue a cada p ozo 0.2 ml de células MNA suspendidas en 
EMEM-10 (la concentración de células 1 x 10 5 por 0.2 ml). 
iii)  Mezcle las células y la suspensión del virus agita ndo suavemente el portaobjetos, entonces 
incube a 37° C en una incubadora humedecida con 0.5%  CO 2 por 20 horas. 
iv)  Fije con acetona y tiña el portaobjetos por la téc nica de inmunofluorescencia. 
 Cada pozo del portaobjeto con cámara para cultivo de tejidos con ocho pozos contiene 25-50 
campos microscópicos distintos cuando se observa en  la ampliación x160-200. Una unidad de virus 
para el RFFIT es determinada como la dilusión en la  cual el 50% de los campos microscópicos 
observados contienen unos o más focos de células in fectadas (la dosis de foco-formación, FFD50). 
La suspensión stock de virus debe contener al menos  1 x 10 4 FFD50 por 0.1 ml (es decir el pozo de 
células infectadas con la dilución 10 -4 debe contener al menos un foco de células infectad as en 50% 
de los campos microscópicos observados). Una suspen sión stock de virus con este título puede 
después diluirse a 10 -2.3  para obtener un virus de desafío 50 FFD 50 . 
/uni25CF Suero de Referencia  
 Debe incluirse un suero de referencia estándar nac ional o internacional diluido a una potencia de 2.0  
UI/ml en cada prueba. El suero de referencia usado en los Centros para el Control y Prevención de 
Enfermedades, es el primer estándar internacional d e inmunoglobulina antirrábica (35), y puede 
obtenerse del NIBSC. El suero de referencia debe ma ntenerse en alícuotas congeladas en 
cantidades suficientes para 1 semana de pruebas. Ta mbién debe prepararse por el laboratorio e 
incluirse en cada prueba un suero positivo estándar  de control diluido a una potencia de 0.1 UI/ml y 
un suero negativo estándar. Lunes 6 de julio de 2009 DIARIO OFICIAL (Primera Se cción)       
/uni25CF Sueros problema 
 Antes de probarse, las muestras del suero deben ca lentarse a 56° C por 30 minutos para inactivar el 
complemento. Si el suero está congelado, éste debe recalentarse después de descongelarse. Las 
dilusiones seriadas de los sueros problema pueden s er preparadas en un portaobjetos con cámara 
para cultivo de tejidos de ocho pozos. El análisis de las diluciones 1/5 y 1/50 es suficiente para una  
evaluación rutinaria de eficacia vacunal y pueden h acerse como sigue: 
i)  Prepare una dilución 1/2.5 agregando 0.1 ml de sue ro inactivado y 0.15 ml de EMEM-10 a uno 
de los portaobjetos. Mezcle suavemente oscilando la  lámina portaobjetos. 
ii) Transfiera 0.05 ml de la dilución 1/2.5 a un segund o pozo conteniendo 0.45 ml de EMEM-10. 
Deseche todos excepto 0.1 ml del pozo que contiene la dilución 1/2.5. 
iii)  Mezcle el segundo pozo y deseche todo excepto 0.1 ml. 
iv)  Agregue 0.1 ml de la preparación del virus del des afío (que contiene 32-100 FFD 50 ) a todas las 
diluciones del suero. 
v)  Mezcle e incube a 35°  C en una incubadora humedeci da con 0.5% CO 2 por 90 minutos. 
/uni25CF Adición de células 
i)  Durante el período de incubación, tripsinice un cu ltivo de células MNA de 3-5-días. 
ii)  Resuspenda las células en EMEM-10 a una concentrac ión final de 1 x 10 5 células por 0.2 ml. 
iii)  Distribuya 0.2 ml de la suspensión de células en c ada pozo del portaobjetos e incube a 35° C en 
una incubadora humedecida con 0.5% CO 2 por 20 horas más. 
/uni25CF Fijación con acetona y tinción por inmunofluorescen cia 
i)  Después de 20 horas, saque los portaobjetos de la incubadora y deseche el medio virtiéndolo 
sobre una solución virucida. 
ii)  Lave los portaobjetos una vez en PBS y después fíj elas por 10 minutos a temperatura ambiente 
en acetona fría (- 20° C). 
iii)  Deje secar los portaobjetos por 10 minutos antes d e agregar el suero de conjugado antirrábico 
con FITC. El conjugado puede ser preparado en EMEM- 10 o PBS; no hay necesidad de 
adsorber el conjugado con papel o células. La dilus ión del conjugado debe determinarse por 
titulación. Los portaobjetos deben teñirse durante 20-30 minutos a 37°  C y después lavar con 
PBS y agua destilada, respectivamente. 
iv) Observe los portaobjetos en un microscopio de fluor escencia. 
/uni25CF Cálculo de los títulos de virus neutralizado por an ticuerpos 
 El virus residual es detectado usando un microscop io estándar de fluorescencia. El título de 
neutralización a punto final del suero se define co mo el factor de dilución de la dilución más alta de l 
suero en la cual el 50% de los campos microscópicos  observados contienen una o más células 
infectadas (es decir una reducción del 97% del viru s inoculado). Este valor puede obtenerse por 
interpolación matemática. Alternativamente, un 100%  de título neutralizado puede ser determinado 
registrando la dilución más alta del suero en la cu al el 100% del inóculo del desafío se neutraliza y no 
hay células infectadas en los campos observados. Po r ambos métodos de titulación, el título de 
anticuerpos en el suero problema (en UI/ml) puede s er obtenido por la comparación con el título de la 
referencia nacional incluida en cada prueba. Debe o bservarse que es también válido realizar la 
prueba RFFIT usando las células BHK-21 en vez de la s células del neuroblastoma. Para tal fin se ha 
publicado un protocolo modificado (37). 
c) Neutralización viral en ratones 
 El principio de esta prueba es la neutralización in vitro  de una cantidad constante de virus rábico (50 
LD 50  [dosis letal al 50%] por 0.03 ml de cepa CVS) vari ando las cantidades del suero a ser titulado 
durante un paso de incubación de 90 minutos a 37° C.  La mezcla de virus/suero (0.03 ml) es 
inoculado en el cerebro de ratones de 3 semanas de edad. El título del suero es la dilución final del 
suero en la mezcla del virus/suero que protege al 5 0% de los ratones (la mortalidad es 100% en 
ausencia de neutralización). Este título puede expr esarse en UI comparándolo con la dilución que 
neutralizante de un suero estándar bajo mismas cond iciones experimentales.      (Primera Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 6 de ju lio de 2009 
 Para realizar la prueba, descongele una ampolleta de virus de CVS y prepare una suspensión que 
contenga 100 LD 50 /0.03 ml (considere que será diluida dos veces por la adición del mismo volumen 
del suero antes de ser inyectado). La cantidad de v irus usada realmente durante la prueba (límites 
permitidos: 30-300 LD 50 /0.03 ml) es comprobado titulando cuatro diluciones  de la preparación viral, 
cada una de las cuales se inocularán en cinco raton es. Los sueros de prueba se calientan a 56° C por 
30 minutos para inactivar cualquier complemento. 
 Se debe incluir un suero estándar para comprobar l as condiciones de titulación. La diferencia máxima 
permitida entre su capacidad neutralizante esperada  y la medida durante la titulación es 10 0.5.  La 
dilución más grande no debe neutralizar el virus. E l diluyente es el mismo que se usa para la 
preparación viral. 
 A cada dilución de suero se agrega un volumen igua l de la preparación viral conteniendo 100 
LD 50 /0.03 ml. Las mezclas se incuban en un baño de agua  a 37° C por 90 minutos y después se 
colocan en hielo para reducir la inactivación del v irus debido a la temperatura. La reacción es 
detenida por la inmersión en hielo. Durante la inoc ulación, los tubos que no se utilizan 
inmediatamente se guardan en 4° C. 
 Para cada dilución, se inoculan cinco ratones intr acerebralmente con 0.03 ml de la mezcla del 
suero/virus. La mortalidad es registrada durante 21  días después de la inoculación, aunque las 
muertes que ocurren durante los primeros 4 días son  observadas como inespecíficas (debido al 
choque, a la infección, etc.). El título de suero p uede ser calculado en UI por la comparación con un 
suero estándar internacional. 
d) Enzimoinmunoensayo ELISA 
 Esta prueba de ELISA indirecta permite la detecció n cualitativa de los anticuerpos de rabia en 
muestras individuales de suero canino y de gato des pués de la vacunación. De acuerdo con las 
recomendaciones de la OMS (36), 0.5 UI por ml de an ticuerpos antirrábicos es la medida mínima de 
título de anticuerpos considerado para representar un nivel de inmunidad que correlaciona con la 
capacidad de proteger contra una infección de la ra bia. Aunque la ELISA indirecta tiene una 
sensibilidad más baja que el FAVN o el RFFIT, puede  utilizarse como prueba de investigación rápida 
(aproximadamente 4 horas), y que no requiere el man ejo del virus vivo de la rabia, para determinar si 
los perros y los gatos vacunados han seroconvertido . Debido a la baja sensibilidad de la prueba, los 
resultados negativos deben confirmarse por FAVN o R FFIT.  
 La reacción está compuesta por tres pasos: 
1. Cada muestra de sueros problema es colocada en un p ozo de una placa de microtítulo cubierta 
primero con los antígenos inactivados del virus de la rabia. Los anticuerpos presentes en la 
muestra se unen a los antígenos virales en la super ficie del plástico. 
2.  Después del lavado, se agrega el conjugado de la p roteína A/peroxidase, éste se une a las 
inmunoglobulinas (anticuerpos) previamente capturad as, formando un complejo: (antígeno de la 
rabia AG)-(anticuerpo antirrábico Ab)-(proteína A/p eroxidasa). 
3.  El exceso de conjugado es eliminado por lavado. La  enzima unida al complejo es revelada por la 
adición de un substrato que se transforma en un pro ducto coloreado. Después de detener la 
reacción, se miden las densidades ópticas. 
/uni25CF Preparación del antígeno  
 La Cepa de virus rábico G5, 52 Wistar (derivada de  la cepa Pasteur) se obtiene en células NIL2 con 
pocos pasajes, originadas en cultivos celulares de embrión del hámster. La cosecha del virus es 
clarificado para eliminar restos celulares por filt ración en gel y la suspensión del virus se inactiva  con 
betapropiolactone. Para la reacción en placas se ut iliza un stock de antígeno de 4.1 µg/ml. Lunes 6 de julio de 2009 DIARIO OFICIAL (Primera Se cción)       
/uni25CF Reactivos  
 (Available from Synbiotics Europe S.A.S., 2 rue Al exander Fleming, 69367 Lyon Cedex 07, France.) 
 Microplaca con seis filas de 16 pozos sensibilizad os con antígenos de la rabia. Se deben usar en las 
4 semanas después de abrir la bolsa, la cual debe e star cerrada después de cada uso; 
 Conjugado (CJ): Proteína A/peroxidasa (concentrado  x 10). Diluir diez veces con el diluyente del 
conjugado (CD) y utilizarlas en el plazo de 24 hora s seguidas a la dilución; 
 Sustrato de peroxidasa tamponado (PS); 3,3', 5,5'- Tetrametilbenzidina; 
 Suero control negativo (N), Suero Libre de Patógen os Específicos diluidos en Stabilzyme, un 
estabilizador comercial proporcionado por Surmodics  Inc., MN 55344-3523 USA; 
 Suero control positivo (P), Suero hiperinmune de c aninos vacunados diluidos en Stabilzyme, un 
estabilizador comercial proporcionado por Surmodics  Inc., MN 55344-3523 USA; 
 Diluente de la muestra (SD), PBS tamponado, pH 7.8 , incluyendo 0.28% de caseina (peso/volumen), 
(volumen/volumen) Tritón X100 al 0.055%; 
 PEG al 0.55% (peso/volumen) SDS al 0.056% (peso/vo lumen) PVP al 1% (peso/volumen), Tetronic 
al 0.42% (peso/volumen) y Suero bovino inactivado p or calor al 1% (volumen/volumen); 
 Solución de lavado (W), Tris/NaCl tamponado, pH 7. 5, incluyendo Tween 20 al 1%; 
 Diluente del conjugado (CD), Tris tamponado, pH 8;  
 Solución de detención (S), Solución de Acido Sulfú rico 4 N + tiomersal al 0.02% (w/v). 
 Los reactivos diluidos deben ser almacenados a 5° C  ± 3° C. Coloque todos los reactivos a 
temperatura del laboratorio por lo menos 1 hora ant es de usarse. 
/uni25CF Muestras 
 La reacción se realiza con sueros individuales ina ctivados por calor (30 minutos a 56° C) diluidos a 
1/100. Es necesario probar las diluciones apropiada s del suero estándar de referencia de la OIE que 
contiene 6.7 UI/ml (disponible en el laboratorio de  referencia de la OIE para rabia, Nancy, Francia. 
 Las muestras de suero deben mantenerse a 5° C ± 3° C . Para conservación prolongada, las muestras 
de suero deberán congelarse a -20° C. 
/uni25CF Pasos preliminares de predilución 
 Seguir estrictamente el procedimiento indicado a c ontinuación. Utilizar controles negativos y positiv os 
por duplicado en cada prueba y/o para cada placa. 
i)  Fijar cuidadosamente la identificación y distribuc ión de los controles y las muestras utilizando el 
protocolo que se señala más abajo. 
ii)  Prepare los sueros problema. Las diluciones se rea lizan con el diluyente de muestras (SD) de 
modo siguiente: Las muestras primero se prediluyen a 1/10 en una microplaca en blanco (10 µl 
de muestra en 90 µl de SD). 
iii)  Para la titulación del suero, debe hacerse un conj unto de seis diluciones del Suero Estándar de 
la OIE en un tubo o en una microplaca en blanco con  la dilución inicial 1/10, luego 1/30, 1/100, 
1/300, 1/1000 hasta la dilución final 1/3000. Estas  diluciones del suero Estándar ede la OIE 
deben incluirse en cada prueba y/o microplaca con u na dilución inicial de 1/10, 1/30, 1/100, 
1/300, 1/1000 y 1/3000.      (Primera Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 6 de ju lio de 2009 
 Se recomienda el siguiente esquema para preparar l as diluciones apropiadas: 
Dilución OIE  Preparación  
1/10 10 µl de Suero Estándar Internacional de la OI E + 90 µl de diluyente de la muestra 
1/30 10 µl de Suero Estándar Internacional de la OI E + 290 µl de diluyente de la muestra 
1/100 10 µl de la dilución 1/10 + 90 µl de diluyent e de la muestra 
1/300 10 µl de la dilución 1/30 + 90 µl de diluyent e de la muestra 
1/1000 10 µl de la dilución 1/100 + 90 µl de diluye nte de la muestra 
1/3000 10 µl de la dilución 1/300 + 90 µl de diluye nte de la muestra 
Este rango de diluciones del Suero Estándar de la O IE debe estar presente en todas las placas. 
/uni25CF Procedimiento de la prueba  
i)  Distribución del control: Deposite 90 µl de diluen te de muestra y añada 10 µl del control negativo 
en los pozos A1 y A2, y en los pozos B1 y B2. Añada  10 µl del control positivo. 
ii)  Distribución de muestras y diluciones del suero es tándar de la OIE: Deposite 90 µl de diluyente 
muestra, añada 10 µl de la predilución de la muestr a 1/10 o de cada una de las diluciones de 
1/10 a 1/3000 en todos los pozos y mezcle cuidadosa mente. 
 Las diluciones de la muestra y del suero estándar de la OIE deben probarse por duplicado. Se 
recomienda la siguiente distribución (reporte final  de las diluciones probadas): 
Cuantificación de anticuerpos (dilución final)  
 1 2 3 4 
A N 1/10 N 1/10 S1 1/100 S1 1/100 
B P 1/10 P 1/10 S2 1/100 S2 1/100 
C OIE 1/100 OIE 1/100 S3 1/100 S3 1/100 
D OIE 1/300 OIE 1/300 S4 1/100 S4 1/100 
E OIE 1/1000 OIE 1/1000 S5 1/100 S5 1/100 
F OIE 1/3000 OIE 1/3000 S6 1/100 S6 1/100 
G OIE 1/10000 OIE 1/10000 S7 1/100 S7 1/100 
H OIE 1/30000 OIE 1/30000 S8 1/100 S8 1/100 
 
 Deben colocarse siempre las filas marcadas sobre e l soporte de modo que se pueda utilizar 
tanto el lavador como el lector. Los pozos se cubre n con cinta adhesiva cortada a la longitud 
necesaria en función del número de filas utilizadas . Mezclar por agitación manual suave o 
mediante un agitador de placas. 
iii) Incubar las placas de microtitulación durante 1 hor a ± 5 minutos a 37° C ± 3° C. 
iv) Dilución del reactivo: 
 Lavado Tampón: Diluir la solución de lavado concen trada (W) a 1/10 con agua destilada o 
desmineralizada. 
 Conjugado: Diluir el concentrado (CJ) a 1/10 con e l diluyente del conjugado (CD); se necesitan 2 
ml para una fila, es decir 20 µl de CJ en 1.88 ml d e CD. 
v) Con cuidado remueva la cinta adhesiva y lave cuatro  veces. 
vi) Añada 100 µl de conjugado diluido a todos los pozos  y cúbralos con una tira nueva de cinta 
adhesiva. Lunes 6 de julio de 2009 DIARIO OFICIAL (Primera Se cción)       
vii) Incube el conjugado por 1 hora ± 5 minutos a 37° C ±  3° C. 
viii) Con cuidado remueva la cinta adhesiva y lave cuatro  veces. 
ix) Añada 100 µl de sustrato de peroxidasa tamponado a cada pozo (PS). No cubra con cinta 
adhesiva en esta fase. Mezcle suavemente la placa p or agitación manual o mediante un agitador 
de placas para asegurar una correcta homogeinizació n. 
x) Incube por 30 ± 5 minutos a temperatura del laborat orio (20° C ± 5° C), y protegida de la luz. 
xi) Añada a cada pozo 50 µl de solución de parade (S). Mezcle suavemente la placa por agitación 
manual o mediante un agitador de placas. Asegúrese que no haya burbujas de los pozos. Seque 
cuidadosamente el fondo de los pozos. 
xii) Mida la densidad óptica (OD) bicromáticamente a 450  y 630 nm o monocromáticamente a 450 
nm (en el espectro amarillo). 
/uni25CF Cuantificación de anticuerpos: Expresión e Interpre tación de resultados  
 Cálculo del título usando la curva de regresión 
i) Calcular el valor medio de la OD para cada muestra problema y cada dilución del suero  de la 
OIE. 
ii) Calcular el valor del logaritmo natural ( ln ) de cada OD media y el valor ln de la concentració n de 
anticuerpos rábicos para cada dilución de la OIE (a  partir 6.7 a 0.0223 UI/ml, sin considerar el 
factor de dilución 1/100 de la prueba). 
iii) Trace el ln  de la (OD) (en ordenadas eje Y) en función del ln  (concentración de anticuerpos 
antirrábicos) (en abcisas eje X) para obtener la cu rva de referencia para el suero estándar  de la 
OIE. 
iv) Utilizando todos los resultados individuales obteni dos de las diluciones estándar del suero de la 
OIE, realice una regresión lineal entre las concent raciones In  de la concentración de anticuerpos 
antirrábicos (expresadas en unidades ELISA/ml) y el  ln  de la (OD), para establecer el 
correspondiente modelo matemático: 
 In de la concentración de anticuerpos antirrábicos = a  + b x In  OD 
v) Para cada muestra probada, calcule el valor promedi o de la OD y después la concentración de 
anticuerpos antirrábicos de la muestra expresada co mo “unidades equivalentes por ml” (EU/ml), 
a partir del modelo establecido: 
 Concentración de anticuerpos antirrábicos de la mu estra (EU/ml) = e (a + b x ln  OD)  
/uni25CF Validación de la Prueba. 
 Los resultados de cada prueba corrida (o para cada  placa) son válidos: 
/uni25CF Si la densida óptica obtenida con el control posit ivo (OD P) es mayor que o igual a 0.300, y 
/uni25CF Si la densidad óptica obtenida con el control nega tivo (OD N) es menor que 0.50 x OD P. 
/uni25CF El coeficiente de correlación entre In  ODs y ln  la concentración de anticuerpos antirrábicos para 
el suero estándar de la OIE Standard Serum es mayor  que 0.95. 
Ejemplos. 
 Control positivo:  __ 
 OD pozo B 1 = 0.610 OD pozo B 2 = 0.690 –> OD P = 0.650 
 Control negativo:   __ 
 OD pozo A 1 = 0.190 OD pozo A 2 = 0.210 –> OD N = 0.200 
    __      (Primera Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 6 de ju lio de 2009 
Muestra 1: 
 OD pozo 1 = 1.790 OD pozo 2 = 1.750 –> OD = 1.770 
Muestra 2: OD pozo 1 = 0.350 OD pozo 2 = 0.390 –> O D = 0.370 
 Validación de la prueba 
 OD P = 0.650 > 0.300 and OD N = 0.200 < 0.50 x 0.6 50 = 0.325, de esta forma la prueba es válida. 
/uni25CF Resultados e interpretación (Titulación cuantitativ a de anticuerpos).  
Si el título calculado es >  0.6, se considera que el animal presenta sero-conv ersión después de  la 
vacunación. 
Si el título calculado es < 0.6, se considera que e l animal no presenta un nivel suficiente de anticue rpos. 
Como la prueba de ELISA es una prueba de ensayo, un a prueba confirmatoria por FAVN o RFFIT deberá 
realizarse en las muestras de suero que muestren un  título < 0.6. 
C. Requerimiento para las Vacunas y los materiales de Diagnóstico 
Las vacunas antirrábicas preparadas de la cepa orig inal 1885 de Pasteur y sus cepas derivadas (virus 
Pasteur, virus de desafío estándar (Challenge), Ptm an-Moore, entre otras) y de las cepas aisladas 
recientemente (Flury, Street Alabama Duffering [SAD ], Vnukovo y Kelev), protegen contra todas las cepa s del 
genotipo 1 aisladas hasta la fecha. Las vacunas con vencionales contra el virus de la rabia pueden no 
suministrar una adecuada protección cruzada contra otros Lyssavirus; no existe protección contra el vi rus 
Mogola (31). Los principios que rigen la preparació n de vacunas inactivadas contra la rabia son idénti cos para 
las que se usan en humanos o en animales, aunque en  las vacunas para uso en animales se puede añadir u n 
adyuvante. 
En los animales, las vacunas vivas también son efic aces por rita oral y se pueden distribuir en cebos para 
inmunizar animales salvajes (o domésticos). También  resultan eficaces las vacunas vivas recombinantes (por 
ejemplo, glicoproteína recombinante del virus de la  rabia expresada en poxvirus) (25). 
Las normas para la producción de vacunas veterinari as se indican en el Capítulo I. 1.7. Principios de 
producción de vacunas veterinarias. Las directrices  dadas aquí y en el Capítulo I.1.7. son de carácter  general 
y pueden suplementarse con requisitos nacionales y regionales. 
Se aplican diferentes estándares a las vacunas vete rinarias con virus vivos modificados por pases en 
animales, huevos o cultivos celulares, para reducir  su virulencia en el animal, que a las vacunas prep aradas 
con virus inactivados. Ambos tipos de vacunas tiene n sus ventajas e inconvenientes (5), pero los dos t ipos 
pueden utilizarse para inmunizar animales por perio dos de entre 1 y 3 años. En algunos países no se ac eptan 
las vacunas con virus atenuados. No son adecuados p ara proteger animales no vacunados previamente que 
se hayan expuesto a la infección (13). La eficacia de un tratamiento con vacuna sola después de la exp osición 
solamente se ha demostrado en humanos, pero incluso  en estos casos se recomienda administrar 
adicionalmente inmunoglobulina antirrábica. 
Toda manipulación del virus durante la producción y  ensayo de las vacunas debe adaptarse a las estrict as 
precauciones de seguridad especificadas por la OMS (36, 37), la OIE (Capítulo I.1.6) y las directrices  y 
normas nacionales. 
1. Control de los inóculos. 
a)  Característica del inóculo. 
 Cualquier cepa perteneciente a la cepa del serotip o 1 que demuestre proteger contra los virus 
naturales de la rabia (que se encuentren actualment e en el país donde se va a usar la vacuna). La 
cepa de virus utilizada debe tener propiedades biol ógicas (patogenicidad) y antigénicas 
(caracterizadas por anticuerpos monoclonales) conoc idas. Si es empleada como vacuna viva, el 
inóculo primario de virus no debe causar rabia clín ica. Deben probarse al menos en dos animales 
(preferentemente cinco o seis por grupo) de cada un a de las especies a las que va dirigida la vacuna 
y si fuera possible de cualquier especie que pueda estar en contacto con la vacuna o con animales 
vacunados. Esto se realiza inoculando en un nervio importante o en sus inmediaciones una dosis 
diez veces superior al título vírico contenido en u na dosis del producto final propuesto. Los animales  
deben observarse por lo menos durante 90 días para cualquier efecto que se pueda atribuir al inóculo 
primario. Lunes 6 de julio de 2009 DIARIO OFICIAL (Primera Se cción)       
b)  Método de cultivo. 
 Debe prepararse y mantenerse a -70° C, o a temperat ura inferior, un stock de células primarias del 
virus de inóculo, cuyos subcultivos se utilizarán p ara la producción de vacuna. La multiplicación  del  
virus se comprueba por titulación durante el crecim iento del virus de inóculo. 
c)  Validación como vacuna. 
 Antes que una vacuna sea autorizada, deben estable cerse evidencias de su eficacia mediante 
inoculaciones de desafío en los animales vacunados y en animales control de cada especie 
determinada. La prueba de desafío debe realizarse d espués de la vacunción, al final del periodo en 
que el fabricante manifiesta que se mantiene la inm unidad. La cinética de producción de anticuerpos 
debe determinarse también para establecer la correl ación entre el título de anticuerpos y la 
resistencia al desafío. 
 La eficacia de la vacuna producida se determina po r estudios con cada especie a la que va dirigida, 
vacunada como se recomendó. La protección al final del periodo de inmunidad es monitoreada por la 
medición de anticuerpos neutralizantes específicos y por el desafío con virus de la rabia. Las 
condiciones experimentales de este desafío deben re flejar las condiciones naturales de la infección, 
aunque desde un punto de vista práctico, puede resu ltar más fácil obtener un 100% de mortalidad en 
los animales control con una cepa de virus de rabia  conocida que con una aislada localmente. En los 
animales vacunados con vacunas inactivadas, el porc entaje de seroconversión y el nivel medio de 
anticuerpos permiten un buen pronóstico de sobreviv encia al desafío. 
 Debe establecerse la correlación entre potencia, l a especie en cuestión y el valor antigénico 
determinado en ratones (ver Sección C.4.c. más adel ante). 
 Para efectos de autorizar una vacuna, se deben rea lizar pruebas de seguridad en la especie a la  que 
va dirigida. En el caso de las vacunas con virus vi vos (incluyendo las vacunas recombinantes) que se 
utilizan en campañas de vacunación oral, las prueba s de seguridad también deben ser realizadas en 
aquellas otras especies que viven en las áreas de v acunación y que podrían estar expuestas a la 
vacuna (5). 
 La estabilidad de la vacuna se determina probando lotes después de un almacenamiento prolongado, 
usualmente 1 a 2 años. En ocasiones se utiliza un p rocedimiento de envejecimiento acelerado 
manteniendo la vacuna a 37° C durante 1 semana. El t iempo de validez o vencimiento manifestado 
por el fabricante se comprueba por la autoridad nac ional. En general es de 12 a 18 meses para las 
vacunas líquidas y posiblemente de 24 meses para la s liofilizadas. 
2.  Método de producción. 
 Cualquiera que sea el método adoptado, se debe pre star una especial atención a la calidad del 
sustrato. Tanto los animals como los huevos deben s er de origen SPF y los cultivos celulares, tales 
como la línea celuar BHK, deben cumplir con los est ándares internacionales de esterilidad  e 
inocuidad. 
a)  En animales. 
 El virus es inoculado intracerebralmente y cuando el animal muere en las fases terminales de la rabia  
se retira el tejido nervioso. El virus se inactiva por métodos físicos, como irradiación con luz 
ultravioleta o químicos como la adición de fenol o betapropiolactona. Las vacunas deben prepararse 
en animales jóvenes (ratones, corderos, entre otros ) para obtener gran rendimiento vírico y reducir el  
contenido de mielina en la vacuna y otros efectos a dversos asociados. En algunos casos el virus no 
se inactiva por completo, como por ejemplo en las v acunas de tipo Fermi tratadas con fenol, pero 
tales vacunas no se recomiendan más. 
b)  En huevos. 
 Se inocula una cepa de virus adaptada a huevos, en  huevos embrionados de pollo SPF, los cuales 
se incubarán a 38° C por 5 o 6 días. El virus se rec oge en forma de tejidos embrionados infecciosos y 
normalmente se liofiliza y se usa como una vacuna v iva. Ejemplos de estas vacunas son las que 
contiene el Flury de bajo pasaje en huevo (LEP) o l a cepa variante y la más deseable la de alto 
pasaje en huevo (HEP), la cual es más segura para e species animales como el gato.      (Primera Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 6 de ju lio de 2009 
c)  En cultivos celulares. 
 Los cultivos celulares son infectados con cepas de  virus de la rabia adaptadas al cultivo celular y s e 
incuban a 35 o 36° C. Estos pueden ser usados como v acunas de virus vivo (como las vacunas Flury 
y SAD) o como vacunas inactivadas después de la adi ción de fenol (vacuna Semple) o cualquier otro 
compuesto, como la betapropiolactona. 
 Los cultivos celulares pueden utilizarse para obte ner virus vectores (por ejemplo poxvirus) que lleve n 
el gen que codifica la expresión de la glicoproteín a del virus de la rabia (25). 
 Durante la producción se controla la multiplicació n de los virus en uno de los sustratos antes 
mencionados y se recoge el virus al tiempo más apro piado, usualmente de 4 a 6 días después de la 
inoculación en los animales, los huevos o cultivos celulares. El virus obtenido se suspende en una 
solución tamponada a una dilución que provoque una antigenicidad óptima. Si se requiere, la 
suspensión se inactiva o liofiliza. Se recomienda u n adyuvante para vacunas con virus inactivados, 
así como para otros antígenos de la vacuna que pued an incorporarse a vacunas polivalentes. 
3. Control del Proceso. 
 Este consiste en el seguimiento del crecimiento vi ral para obtener un título óptimo y asegurar la 
ausencia de contaminación microbiana indeseable. 
 En las vacunas con virus vivo, debe establecerse l a cinética del crecimiento viral para asegurar un 
título final de virus que se correlacione con la pr otección deseable de las especies concretas. 
 En vacunas con virus inactivados, deben evaluarse las propiedades inmunogénicas del producto final 
por técnicas in vitro  (por ejemplo ELISA, inmunodifusión en agar de gel,  pruebas de unión-anticuerpo 
o tinción de células infectadas). Estas estimacione s indicarán el mejor tiempo para recoger los virus 
de los cultivos celulares. 
4. Control de lotes. 
a)  Esterilidad. 
 Las pruebas de esterilidad y ausencia de contamina ción de materiales biológicos, se encuentran 
en el Capítulo I.1.5. 
b)  Inocuidad. 
 Las pruebas de inocuidad de los lotes de vacunas c on virus inactivados se llevan a cabo 
mediante inoculación en cultivos celulares o intrac erebralmente en ratones para detectar virus 
viables. Para vacunas antirrábicas vivas, debe real izarse una prueba de seguridad adecuada 
para cada lote de vacuna en la especie hospedadora concreta. Por lo menos tres y 
preferentemente cinco o seis animales de cada espec ie hospedadora en cuestión deben recibir 
una dosis equivalente a diez veces la dosis de camp o recomendada por la ruta normal de 
administración. Los animales deben ser observados d urante 90 días para detectar reacciones 
atribuibles a la vacuna. 
c)  Potencia. 
 La cantidad de virus presente en vacunas vivas ate nuadas y en las recombinantes se determina 
por titulación. Una vez establecida una correlación  entre la actividad de la vacuna en la especie 
a la que va dirigida y los títulos virales, las tit ulaciones representan unos indicadores fiables de l a 
eficacia de la vacuna. Esto se realiza usando culti vos celulares o por inoculación intracerebral de 
ratones lactantes (en ratones sólo es posible con u nos cuantos virus atenuados). Las vacunas 
recombinantes deben controlarse para la expresión d e la proteína de la rabia hasta asegurar que 
la estabilidad de la expresión se mantiene en el pr oceso de producción. El título del vector puede 
usarse entonces como un indicador fiable de la efic acia de la vacuna. 
 Para las vacunas con virus inactivados, la correla ción entre la potencia en la especie a la que 
van dirigidas y el valor antigénico estimado en rat ones representa un indicador fiable de la 
actividad de la vacuna. En los Estados Unidos la po tencia de la vacuna se establece por  la 
prueba de NIH (Nacional Instututes of Health). En o tras partes tiene gran aceptación  la prueba 
de la Farmacopea Europea. Lunes 6 de julio de 2009 DIARIO OFICIAL (Primera Se cción)       
 De acuerdo a la Farmacopea Europea (20) se inocula n grupos de al menos 10 ratones de 3 a 4 
semanas de edad, con dosis decrecientes únicas de v acuna o con dosis separadas por 1 
semana, según la prueba del HIH (37). Se compara un  número suficiente de diluciones para 
determinar la dilución a la que el 50% de los raton es se protegen contra una inoculación 
intracerebral de desafío 14 días después (20, 37). 
 Para la calibración de estándares nacionales exist e una vacuna internacional estándar de la 
OMS (ver nota 2 a pie de página), de modo que los r esultados de la prueba de antigenicidad se 
pueden expresar en Unidades Internacionales (UI). L a prueba no es válida a menos que: 
i)  Tanto para la vacuna examinada y la preparación est ándar, la PD 50  (dosis de protección al 
50%) se encuentre entre la mayor y la menor dosis d ada a los ratones. 
ii)   La titulación de la suspension del virus de desaf ío muestre que 0.03 ml de la suspensión 
contenía 10 LD 50 . La dosis de desafío debe estar entre 12 a 50 LD 50  para una  prueba 
válida. 
iii)   El intervalo de confianza (p=0.95) para la prueba  no debe ser menor de 25% ni superior al 
400% de la potencia estimada: el análisis estadísti co debe mostrar una notable pendiente 
sin desviaciones importantes de la linealidad o par alelismo de las líneas dosis-respuesta. 
 La vacuna supera la prueba si la potencia estimada  es superior a 1 UI por dosis o la potencia 
demostrada en la prueba de duración de la inmunidad  para autorizar el producto es la dosis 
prescrita más pequeña. 
 También se puede utilizar una prueba simplificada a efectos de anticipar qué vacunas es 
probable que tengan un valor antigénico >  1 UI por dosis (4). Esta prueba se emplea como 
prueba de investigación aproximada para reducir el número de ratones utilizados en las pruebas 
de control de la potencia de la vacuna. 
d)  Duración de la inmunidad. 
 La duración de la inmunidad debe ser establecida p or el producto autorizado, en la especie a la 
que va dirigida, con un protocolo de vacunación def inido. Después de esto, no se prueba cada 
lote (ver anteriormente Sección C.4.c.). 
e)  Estabilidad. 
 Debe comprobarse por pruebas adecuadas el vencimie nto (la caducidad) que se establece. 
Estos experimentos incluyen pruebas biológicas y de  estabilidad físico-química y deben 
realizarse sobre un número suficiente de lotes de v acuna mantenidos en las condiciones 
recomendadas. 
 La termoestabilidad de las vacunas con virus vivos  en forma líquida suele ser baja. En las 
vacunas liofilizadas con virus inactivados la estab ilidad suele garantizarse por 2 años a 4° C. 
f)  Conservadores. 
 Las vacunas con virus inactivados pueden tener con servantes (formalina, mertiolato).  La 
naturaleza y cantidad de dichos conservadores debe cumplir las normas de control nacionales. 
5.  Pruebas sobre el producto final. 
a)  Inocuidad. 
 Ver Sección C.4.b. 
b)  Potencia. 
 Ver Sección C.4.c. 
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