Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
SEGUNDA SECCION 
PODER EJECUTIVO 
SECRETARIA DE SALUD 
PROYECTO de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-218-SSA 1-2009, Productos y servicios. Bebidas saborizadas 
no alcohólicas, sus congelados, productos concentra dos para prepararlas y bebidas adicionadas con cafe ína. 
Especificaciones y disposiciones sanitarias. 
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice : Estados Unidos Mexicanos.- Secretaría de Salud. 
MIGUEL ANGEL TOSCANO VELASCO, Comisionado Federal p ara la Protección contra Riesgos 
Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacio nal de Normalización de Regulación y Fomento Sanita rio, 
con fundamento en lo dispuesto por el artículo 39 d e la Ley Orgánica de la Administración Pública Fede ral; 4o. 
de la Ley Federal de Procedimiento Administrativo; 3o. fracción XXIV, 13 apartado A, fracciones I y II , 17 bis 
fracciones II y III, 17 Bis 2, 115 fracciones IV y VI, 194 fracción I, 195, 199, 210, 212, 215 fraccio nes II, III, IV y 
216 de la Ley General de Salud; 3 fracción XI, 38 f racción II, 40 fracciones I, XI y XII, 41, 43, 47 f racción I y 52 
de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización;  28 y 33 del Reglamento de la Ley Federal sobre 
Metrología y Normalización; 1 fracción VI, 4, 8, 14 , 15, 25, 30, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 200, 20 1, 202, 
203, 204, 206, 211 y 214  del Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios; 2o. inciso C fracción 
X del Reglamento Interior de la Secretaría de Salud ; 3o. fracción I incisos d y l, y fracción II, 10 f racciones IV y 
VIII del Reglamento de la Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios, tengo a bien 
ordenar la publicación en el Diario Oficial de la F ederación del Proyecto de Norma Oficial Mexicana  P ROY-
NOM-218-SSA1-2009, Productos y servicios. Bebidas s aborizadas no alcohólicas, sus congelados, producto s 
concentrados para prepararlas y bebidas adicionadas  con cafeína. Especificaciones y disposiciones 
sanitarias. 
El presente Proyecto se publica a efecto de que los  interesados, dentro de los siguientes sesenta días  
naturales, contados a partir de la fecha de su publ icación, presenten sus comentarios por escrito y co n el 
sustento técnico suficiente ante el Comité Consulti vo Nacional de Normalización de Regulación y Foment o 
Sanitario, sito en Monterrey número 33, planta baja , colonia Roma, código postal 06700, México, D.F., 
teléfono 50805200, extensión 1333, correo electróni co rfs@cofepris.gob.mx. 
Durante el plazo mencionado, los documentos que sir vieron de base para la elaboración del Proyecto así  
como la Manifestación de Impacto Regulatorio (MIR),  estarán a disposición del público para su consulta  en el 
domicilio del Comité. 
INDICE 
Introducción 
1.  Objetivo y campo de aplicación. 
2.  Referencias. 
3.  Definiciones. 
4.  Símbolos y abreviaturas. 
5.  Disposiciones generales. 
6.  Bebidas saborizadas no alcohólicas y bebidas adici onadas con cafeína. 
7.  Congelados de bebidas saborizadas no alcohólicas. 
8. Productos concentrados para preparar bebidas sabori zadas no alcohólicas. 
9.  Muestreo. 
10.  Métodos de prueba. 
11.  Etiquetado. 
12.  Envase y embalaje. 
13.  Concordancia con normas internacionales y mexicana s. 
14.  Bibliografía. 
15 . Observancia de la norma. 
Apéndice Normativo A. Listado de Aditivos 
Apéndice Normativo B. Métodos de prueba       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
PREFACIO 
En la elaboración de la presente norma participaron  las siguientes Organismos e Instituciones: 
Secretaría de Salud 
Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios 
Secretaría de Salud del Estado de Michoacán 
Secretaría de Salud del Estado de Nuevo León 
Secretaría de Economía 
Procuraduría Federal del Consumidor 
Dirección General de Investigación 
Instituto Politécnico Nacional 
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas 
Universidad Nacional Autónoma de México 
Facultad de Química 
Confederación de Cámaras Industriales de los Estado s Unidos Mexicanos 
Cámara Nacional de la Industria de la Transformació n 
Cámara Nacional de la Industria de Conservas Alimen ticias 
Asociación Nacional de Productores de Refrescos y A guas Carbonatadas, A.C. 
Asociación Nacional de Fabricantes de Productos Aro máticos, A.C. 
Bebidas Sanas, S.A. de C.V. 
Bebidas Energizantes en México A.C. 
Cadbury Bebidas, S.A. de C.V. 
Café Internacional de Córdoba, S.A. de C.V. 
Centro de Capacitación de Calidad Sanitaria S.A. de  C.V. 
Centro de Control Total de Calidades S.A. de C.V. 
Coca Cola de México S.A. de C.V. 
Concentrados Sandy´s S.A. de C.V. 
DULCO S.A. de C.V. 
Embotelladora AGA de México S.A. de C.V. 
GAF Distribuciones Industriales S.A. de C.V. 
Grupo JUMEX 
Helados Siberia S.A. de C.V. 
Innovadora de Esencias, Aromas y sabores S.A. de C. V. 
Jarabes el Manantial S.A. de C.V. 
Jugos del Valle S.A. de C.V. 
KRAFT Foods de México S. de R.L. de C.V. 
Manantiales Peñafiel S.A. de C.V. 
Mead Johnson de México S. de R.L. de C.V. 
Nestle México S.A. de C.V. 
OMNILIFE, S.A. de C.V. 
Paleterías la Michoacana S.A. de C.V. 
Parmalat de México S.A. de C.V. 
Pepsi-Cola Mexicana S.A. de C.V. 
Procesadora de Frutas La Cima S.A. de C.V. 
Procter & Gamble México S. de R.L. de C.V. 
Productora Nacional de Concentrados, S.A. de C.V. 
SABORMEX S.A. de C.V. 
Sabritas, S. de R.L. de C.V. 
Santa Clara Productos Lácteos S.A. de C.V. 
SAROMA S.A. de C.V. 
Super Sopas S.A. de C.V. 
UNILEVER de México S.A. de C.V. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
Introducción 
Las bebidas saborizadas (refrescos, aguas, bebidas para deportistas), sus congelados y polvos para 
prepararlas, y bebidas adicionadas con cafeína, son  altamente consumidos en México, de hecho somos el 
segundo lugar mundial en consumo de refrescos, lo q ue implica una mayor exposición de la población 
mexicana a los diversos peligros asociados a estos productos (microorganismos, aditivos, sustancias 
químicas específicas) por lo cual se debe ejercer u n control sanitario adecuado que minimice los efect os de 
estos agentes en la población, ya sea estableciendo  límites o indicando la información que debe cumpli r el 
etiquetado de estos productos para que el consumido r pueda tomar una decisión responsable. 
1. Objetivo y campo de aplicación 
1.1 Esta norma establece las disposiciones y especifica ciones sanitarias que deben cumplir las bebidas 
saborizadas no alcohólicas (incluye las aguas fresc as, y para deportistas), sus congelados, los produc tos 
concentrados para prepararlas y las bebidas adicion adas con cafeína. 
1.2  Esta norma no aplica a productos que cuenten con u na regulación sanitaria particular, los cuales 
deben ajustarse a las especificaciones sanitarias q ue para cada uno de ellos determine la Secretaría d e 
Salud. 
1.3  Esta norma es de observancia obligatoria en el Ter ritorio Nacional para las personas físicas o morale s 
que se dedican a su proceso o importación. 
2. Referencias 
Esta norma se complementa con las siguientes Normas  Oficiales Mexicanas, sus modificaciones o las que 
las sustituyen: 
2.1  Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA1-2006. Salud am biental. Requisitos sanitarios que debe 
satisfacer el etiquetado de pinturas, tintas, barni ces, lacas y esmaltes 
2.2  Norma Oficial Mexicana NOM-086-SSA1-1994 Bienes y servicios. Alimentos y bebidas no alcohólicas 
con modificaciones en su composición. Especificacio nes nutrimentales. 
2.3  Norma Oficial Mexicana NOM-051-SCFI/SSA1-2010, Esp ecificaciones Generales de Etiquetado para 
Alimentos y Bebidas no alcohólicas preenvasados-inf ormación comercial y sanitaria 
2.4  Modificación a la Norma Oficial Mexicana NOM-127-S SA1-1994 Salud ambiental, agua para uso y 
consumo humano-Límites permisibles de calidad y tra tamientos a que debe someterse el agua para su 
potabilización 
2.5  Norma Oficial Mexicana NOM-130-SSA1-1995 Bienes y servicios. Alimentos envasados en recipientes 
de cierre hermético y sometido a tratamiento térmic o. Disposiciones y especificaciones sanitarias. 
2.6  Norma Oficial Mexicana NOM-201-SSA1-2002 Productos  y servicios. Agua y hielo para consumo 
humano, envasados y a granel. Especificaciones sani tarias. 
2.7  Norma Oficial Mexicana NOM-251-SSA1-2009 Prácticas  de higiene para el proceso de alimentos, 
bebidas o suplementos alimenticios 
3. Definiciones 
Para fines de esta norma se entiende por: 
3.1  Aditivo,  Cualquier substancia permitida que, sin tener prop iedades nutritivas, se incluya en la 
formulación de los productos y que actúe como estab ilizante, conservador o modificador de sus caracter ísticas 
organolépticas, para favorecer ya sea su estabilida d, conservación, apariencia o aceptabilidad. 
3.2  Aguas preparadas o frescas, a las bebidas saborizadas no alcohólicas comerciali zadas a granel, que 
se elaboran a partir de agua para consumo humano, d erivados vegetales o productos concentrados para 
prepararlas, con o sin azúcares e ingredientes opci onales. 
3.3  Bebidas no alcohólicas con modificaciones en su com posición, a las que se les disminuyen, 
eliminan o adicionan uno o más nutrimentos, tales c omo hidratos de carbono, proteínas, lípidos, vitami nas, 
minerales o fibras dietéticas. 
3.4  Bebidas para deportistas,  a las bebidas saborizadas no alcohólicas que son e laboradas por la 
disolución de sales minerales, edulcorantes u otros  ingredientes con el fin de reponer el agua, energí a y 
electrolitos perdidos por el cuerpo humano durante el ejercicio. 
3.5  Bebidas saborizadas no alcohólicas,  a los productos elaborados por la disolución en ag ua para uso 
y consumo humano, de edulcorantes e ingredientes op cionales, adicionados o no de aditivos, que pueden 
estar o no carbonatadas. Incluye las aguas frescas y para deportistas.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
3.6  Bebidas adicionadas con cafeína,  a las bebidas no alcohólicas que son elaboradas po r la disolución 
en agua para consumo humano, de ingredientes opcion ales, con un contenido mayor de 20 mg de cafeína po r 
100 mL de producto. 
3.7  Bitácora o registro, al documento o información electrónica controlada q ue provee evidencia objetiva 
y auditable de las actividades ejecutadas o resulta dos obtenidos durante el proceso del producto y su análisis, 
con la finalidad de asegurar la rastreabilidad del mismo. 
3.8  Buenas prácticas de fabricación (BPF) en el caso de los aditivos se refiere a la cantidad  mínima 
indispensable para lograr el efecto deseado. 
3.9  Coadyuvante de elaboración, a la sustancia o materia, excluidos aparatos, utens ilios y los aditivos, 
que no se utiliza como ingrediente alimenticio por sí misma, y que se emplea intencionalmente en la 
elaboración de materias primas, alimentos o sus ing redientes, para lograr alguna finalidad tecnológica  durante 
el tratamiento o la elaboración, que puede dar luga r a la presencia no intencionada, pero inevitable d e 
residuos o derivados en el producto final. 
3.10  Concentrado, al producto para preparar bebidas no alcohólicas, q ue se elabora a partir de derivados 
vegetales o saborizantes naturales, idénticos a los  naturales o sintético artificiales, adicionado o n o de otros 
aditivos para alimentos y de ingredientes opcionale s. 
3.11  Concentrado de manufactura,  al producto para preparar bebidas no alcohólicas, que se elabora a 
partir de derivados vegetales o saborizantes natura les, idénticos a los naturales o sintéticos artific iales, 
adicionado o no de otros aditivos para alimentos y de ingredientes opcionales y, que no está destinado  para 
su venta al consumidor. 
3.12  Congelado de bebidas no alcohólicas,  al producto elaborado con agua para uso y consumo 
humano, edulcorantes e ingredientes opcionales, adi cionados o no de aditivos para alimentos con o sin 
incorporación de aire y que puede ser moldeado, env asado o empalillado, entre otros. 
3.13  Consumidor,  persona física o moral que adquiere o disfruta com o destinatario final productos 
alimenticios y bebidas no alcohólicas preenvasados 
3.14  Derivados vegetales,  a las materias primas comestibles e inocuas obteni das de las diferentes partes 
de la plantas. Los saborizantes de origen natural s on considerados aditivos. 
3.15  Embalaje, material que envuelve, contiene y protege los produ ctos preenvasados, para efectos de su 
almacenamiento y transporte. 
3.16  Envase múltiple o colectivo,  cualquier recipiente o envoltura en el que se encu entran contenidos 
dos o más variedades iguales o diferentes de produc tos preenvasados, destinados para su venta al 
consumidor en dicha presentación. 
3.17  Envase primario,  recipiente o envoltura que contiene y está en cont acto directo con el producto, 
conservando su integridad física, química y sanitar ia. El envase primario puede estar contenido en un envase 
secundario. 
3.18  Envase secundario,  al que contiene al envase primario de manera indiv idual. 
3.19  Etiqueta,  cualquier rótulo, marbete, inscripción, imagen u o tra materia descriptiva o gráfica, escrita, 
impresa, estarcida, marcada, grabada en alto o bajo  relieve, adherida o sobrepuesta al envase del prod ucto 
preenvasado o, cuando no sea posible por las caract erísticas del producto, al embalaje. 
3.20  Ingrediente compuesto,  a la mezcla previamente elaborada de sustancias y productos, que 
constituye un producto terminado y que se emplea pa ra la fabricación de otro distinto. 
3.21  Ingredientes opcionales,  a los que se pueden adicionar al producto, tales c omo vegetales y sus 
derivados, leche y sus derivados u otros productos aptos para consumo humano. 
3.22  Inocuo, lo que no hace o causa daño a la salud. 
3.23  Límite máximo,  a la cantidad establecida de aditivos, microorgani smos, parásitos, materia extraña, 
plaguicidas, radionúclidos, biotoxinas, residuos de  medicamentos, metales pesados y metaloides, entre otros, 
que no se deben exceder en un alimento, bebida o ma teria prima. 
3.24  Lote,  a la cantidad de un producto, elaborado en un mism o ciclo, integrado por unidades 
homogéneas e identificado con un código específico.  
3.25  Materia extraña,  al material orgánico o inorgánico que se presenta en el producto por contaminación. 
3.26  Metal pesado y metaloide,  a los elementos químicos que tienen un peso atómic o entre 63 y 200 y 
una gravedad específica mayor de 4,0; que por su na turaleza presenta una gran reactividad y que 
dependiendo de la concentración, la forma química o  su acumulación en el organismo pueden ocasionar 
efectos indeseables en el metabolismo. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
3.27  Método de prueba,  al procedimiento analítico utilizado para la deter minación de parámetros o 
características de un producto, proceso o servicio.  
3.28  Prácticas de Higiene , las medidas necesarias para garantizar la inocuid ad de los productos. 
3.29  Plaguicida,  a la sustancia o mezcla de sustancias que se desti na a controlar cualquier plaga, 
incluidos los vectores que transmiten las enfermeda des humanas y de animales, las especies no deseadas  
que causen perjuicio o que interfieran en el proces o de los productos. 
3.30  Proceso, al conjunto de actividades relativas a la obtención , elaboración, fabricación, preparación, 
conservación, mezclado, acondicionamiento, envasado , manipulación, transporte, distribución, 
almacenamiento y expendio o suministro al público d e productos. 
3.31  Productos concentrados para preparar bebidas no alc ohólicas, a los productos obtenidos por la 
mezcla de algunos de los siguientes: azúcares, ingr edientes opcionales y aditivos, que requieren dilui rse o 
disolverse para su consumo. 
3.32  Producto a granel,  al producto que debe pesarse, medirse o contarse e n presencia del consumidor 
por no encontrarse preenvasado al momento de su ven ta. 
3.33  Producto preenvasado, los alimentos y bebidas no alcohólicas, que son col ocados en un envase de 
cualquier naturaleza, en ausencia del consumidor, y  la cantidad de producto contenido en él no puede s er 
alterada, a menos que el envase sea abierto o modif icado perceptiblemente. 
3.34  Tratamiento térmico,  al método físico que consiste en someter a una fue nte de calor suficiente por 
un tiempo apropiado al producto, antes o después de  ser envasado con el fin de lograr una estabilidad 
biológica y que garantice la eliminación de microor ganismos patógenos. 
4. Símbolos y abreviaturas 
Cuando en esta norma se haga referencia a los sigui entes símbolos y abreviaturas se entiende por: 
BPF buenas prácticas de fabricación 
cm centímetro 
g  gramo 
kg  kilogramo 
L   litro 
M masa 
µg microgramos 
mg  miligramo 
mL  mililitro 
n.a. no aplica 
nm  nanómetro 
NMP número más probable 
/ por 
%  por ciento 
UFC unidades formadoras de colonia 
UV  ultravioleta 
pH  potencial de hidrógeno 
v  volumen 
K Kelvin 
° C  grado Celsius 
<  menor 
PEPS primeras entradas, primeras salidas 
v/v relación volumen-volumen       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
Cuando en la presente norma se mencione al: 
/uni25CF Acuerdo de aditivos , debe entenderse que se trata del Acuerdo por el q ue se determinan las 
sustancias permitidas como aditivos y coadyuvantes en alimentos, bebidas y suplementos 
alimenticios, vigente. 
/uni25CF Acuerdo de plantas , debe entenderse que se trata del Acuerdo por el q ue se determinan las plantas 
prohibidas o permitidas para tés, infusiones y acei tes vegetales comestibles, vigente. 
/uni25CF Reglamento , debe entenderse que se trata del Reglamento de Co ntrol Sanitario de Productos y 
Servicios 
/uni25CF Secretaría , debe entenderse que se trata de la Secretaría de Salud. 
5. Disposiciones generales 
5.1  En el proceso de los productos objeto de esta norm a, además de cumplir con lo establecido en el 
Reglamento, deberán ajustarse a las siguientes disp osiciones: 
5.1.1  Los establecimientos que se dediquen al proceso e importación de los productos objeto de esta 
norma, deben aplicar las prácticas de higiene y san idad establecidas en la Norma Oficial Mexicana NOM- 251-
SSA1-2009, Prácticas de higiene para el proceso de alimentos, bebidas o suplementos alimenticios, cita da en 
el apartado de referencias 
5.1.2  Control documental del proceso. Se debe contar con  bitácoras o registros que garanticen los 
requisitos establecidos en la Tabla 1, el diseño y la frecuencia de los registros quedan bajo la respo nsabilidad 
del fabricante y deben: 
5.1.2.1.  Conservarse por lo menos durante una y media veces  la vida de anaquel del producto terminado y 
estar a disposición de la autoridad sanitaria cuand o así lo requiera. 
5.1.2.2.  Contar con fecha e información que permita la iden tificación del encargado de elaborar los 
registros. 
5.1.2.3.  Cuando se elaboren por medios electrónicos deben c ontar con respaldos que aseguren la 
veracidad de la información y un procedimiento para  la prevención de acceso y correcciones no controla das. 
Tabla 1. Información mínima de las bitácoras o regi stros de las diferentes etapas  del proceso y de la s 
buenas prácticas de fabricación. 
REGISTRO DE: INFORMACION 
Materias primas. Proveedor u origen. 
Cuando aplique, condiciones de almacenamiento y 
conservación. 
Rotación, conforme al tipo de proceso. 
Informe del resultado de su análisis, en el que se incluya: 
Nombre, clave o código de la materia prima. 
Lote. 
Parámetro sanitario analizado. 
Fecha de análisis. 
Responsable.  
Producto terminado. Condiciones de almacenamiento y  conservación. 
Cuando aplique, identificación de la cámara, refrig erador o 
congelador. 
Informe del resultado de su análisis, en el que se incluya: 
Nombre clave o código del producto terminado. 
Lote. 
Parámetro sanitario analizado. 
Fecha de análisis. 
Responsable. 
Procedimiento y sus registros de la etapa 
de lavado y desinfección, en su caso. Sustancias usadas. 
Concentraciones. 
Temperaturas y cuando el procedimiento no sea conti nuo, 
tiempo de contacto.  
Proceso. Contar con diagramas de bloque del proceso  de elaboración 
que indique los puntos críticos del proceso. 
Control del tratamiento térmico, cuando aplique 
/uni25CF Registro de temperaturas. 
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5.1.3  Personal 
5.1.3.1  El personal debe estar capacitado para cumplir con  prácticas de higiene y sanidad, e identificar su 
papel y responsabilidad en la protección de las mat erias primas y productos terminados con relación a su 
contaminación o deterioro y la repercusión de su co nsumo en la salud de la población. De esta capacita ción 
debe existir evidencia documental. 
5.1.4  Instalaciones físicas 
5.1.4.1  El área de lavado de los envases debe ser específi ca, localizarse dentro del establecimiento y 
contar con pisos, paredes y techos. En caso de que no exista comunicación directa entre esta área y la  de 
llenado, se deben tomar las medidas necesarias para  evitar la recontaminación de los envases. 
5.1.4.2  El lavado de los útiles de limpieza debe realizars e por separado. 
5.1.5  Materia prima 
5.1.5.1  La materia prima empleada en la elaboración de los  productos objeto de esta norma, debe cumplir 
con lo establecido en el Reglamento y en las Normas  Oficiales Mexicanas correspondientes. 
5.1.5.2  El agua que se utilice en el proceso de los produc tos debe ser para uso y consumo humano, 
conforme a lo establecido en la NOM-127-SSA1-1994 o  NOM-201-SSA1-2002, citadas en el apartado de 
referencias y en caso de ser necesario, se debe con tar con un sistema de potabilización adicional que 
garantice su inocuidad. El mantenimiento del mismo es responsabilidad del particular, de acuerdo con l as 
especificaciones emitidas por el fabricante. 
5.1.5.3  La materia prima de origen vegetal fresca o congel ada, se debe lavar con agua para uso y 
consumo humano, y desinfectar con sustancias inocua s para su uso en alimentos, de conformidad con lo 
siguiente: 
5.1.5.3.1  El agua debe cambiarse con una frecuencia suficien te para prevenir la acumulación de materia 
orgánica y evitar la contaminación cruzada. 
5.1.5.3.2  Debe realizarse el secado o drenaje para eliminar el agua después del lavado. 
5.1.5.3.3  De acuerdo con el desinfectante que se emplee, se debe cumplir estrictamente con las 
instrucciones señaladas por el fabricante en la eti queta y en la hoja o ficha técnica. 
5.1.5.3.4  Deben monitorearse y controlarse los niveles de de sinfectante para garantizar que se mantienen 
en concentraciones eficaces. 
5.1.5.4  En todas las materias primas que requieren fecha d e caducidad debe revisarse ésta, y rechazar 
aquellas que se encuentren vencidas. 
5.2  Disposiciones para establecimientos que elaboran p roductos a granel. 
5.2.1  En los establecimientos en donde se expenden produ ctos objeto de esta norma y otros productos, 
sus áreas o secciones para el almacenamiento y exhi bición deben ser específicas y delimitadas 
5.2.2  Se debe contar como mínimo con una tarja conectada  al sistema de agua potable para el lavado de 
materia prima, enseres y utensilios para el proceso , misma que debe lavarse previo a cada uso. 
5.3  Especificaciones generales 
5.3.1  Los productos sujetos a tratamiento térmico envasa dos en recipientes de cierre hermético, además 
de cumplir con lo establecido en este ordenamiento,  deben cumplir con la NOM-130-SSA1-1995, señalada e n 
el apartado de referencias. 
5.3.2  Contenido de alcohol 
5.3.2.1  El contenido de alcohol etílico en los productos o bjeto de esta norma no debe exceder del 1,99% 
v/v, en el producto terminado. Cuando el primero se  encuentre en el producto terminado por efectos de 
transferencia, no debe exceder el 0,5% en volumen a  20° C. 
5.3.3  Metales pesados y metaloides 
5.3.3.1  El fabricante de los productos objeto de esta norm a, debe establecer mecanismos de control que 
permitan determinar la presencia y cantidad de meta les pesados y metaloides en las materias primas, en  el 
producto en proceso de elaboración o en el producto  terminado. La información generada debe estar a 
disposición de la Secretaría cuando ésta así lo req uiera. 
5.3.4  Especificaciones nutrimentales 
5.3.4.1  Los productos objeto de esta norma que contengan l eche, frutas, cereales, o cualquier otra fuente 
de proteínas, vitaminas o minerales (cuando no sean  por su formulación), pueden adicionar únicamente l os 
nutrimentos listados en la NOM-086-SSA1-1994 citada  en el apartado de referencias       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
5.3.4.2  Los productos restantes, no pueden ser adicionados  de vitaminas liposolubles. 
5.3.5  Los productos objeto de esta norma que empleen com o materia prima derivados vegetales, deben 
sujetarse a lo establecido en el Acuerdo de plantas . 
5.3.6  Los obsequios o promociones que se proporcionen co n los productos objeto de esta norma deben 
ser inocuos, no ceder sustancias tóxicas al product o y, en su caso, cumplir con los ordenamientos jurí dicos 
aplicables. 
5.3.8  Aditivos 
5.3.8.1  En la elaboración de los productos objeto de esta norma, únicamente se permite el empleo de los 
aditivos listados en el Apéndice normativo A. 
5.3.8.2  Los límites establecidos para cada aditivo sólo so n aplicables al uso de dichas sustancias como 
tales, sin considerar su empleo como nutrimentos, p ara proveer de vitaminas y minerales. 
5.3.8.3  Si se utiliza una mezcla de colorantes artificiale s, ésta no debe exceder de 300 mg/kg tomando en 
cuenta el límite máximo de cada colorante. 
5.3.8.4  El límite máximo de la mezcla de emulsificantes, s in incluir a los almidones modificados, es de 10 
g/kg, tomando en cuenta el límite máximo correspond iente a cada sustancia. 
5.3.8.5  En la elaboración de los productos objeto de este apartado se permite el empleo de: 
Saborizantes naturales, sintéticos artificiales y s intéticos idénticos a los naturales, señalados en e l Acuerdo 
de aditivos conforme a las BPF. 
5.3.8.6  En la elaboración de aguas frescas y congelados a granel pueden emplearse los colorantes 
listados en los límites señalados en el Apéndice no rmativo A, de los cuales debe monitorearse y regist rarse la 
concentración en el producto terminado. La presenci a de otros aditivos se deberá únicamente al princip io de 
transferencia, cuando se elaboren a partir de conce ntrados, jarabes o bebidas no alcohólicas preenvasa das. 
5.3.9  Las bebidas de quina no deberán contener más de 0, 001% de quinina o 0,01% de bisulfato de 
quinina o de clorhidrato de quinina. 
5.3.10  Especificaciones físicas 
5.3.10.1  El límite máximo de materia extraña debe ser: 
Tabla 2. Materia extraña 
Materia extraña Con derivados vegetales Sin derivados vegetales 
Bebidas, 
congelados, 
jarabes y 
concentrados Polvos Bebidas, 
congelados, 
jarabes y 
concentrados Polvos 
Pelo 1/100 g 1/50 g 1/250 mL 1/50 g 
Fragmentos de 
Insectos  20/100 g 20/50 g exento 10/50 g 
Fibras 5/100 g 5/50 g 5/100 mL 5/50 g 
Otros exentos exentos exentos exentos 
 
6. Bebidas saborizadas no alcohólicas y bebidas adi cionadas con cafeína 
6.1  Clasificación 
Las bebidas saborizadas no alcohólicas por su prese ntación se clasifican en: 
6.1.1  Preenvasadas, y 
6.1.2  A granel Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
6.2  Disposiciones sanitarias 
6.2.1  Además de lo señalado en el punto 5.1, las empresa s productoras de bebidas saborizadas no 
alcohólicas preenvasadas y las bebidas adicionadas con cafeína deben cumplir con lo siguiente: 
6.2.1.1  Cuando se utilicen envases retornables, éstos debe n ser sometidos a un proceso de desinfección 
interna y de lavado externo con soluciones desinfec tantes, enjuagados con agua apta para consumo human o  
y escurridos de manera que no queden residuos de lo s desinfectantes. 
6.2.1.2  Para el caso de envases no retornables vacíos, ést os deben almacenarse en condiciones 
higiénicas, protegidos de polvo y de materia extrañ a. Previo a su llenado, deben ser sometidos a un pr oceso 
que garantice la inocuidad del producto terminado. 
6.2.1.3  Los tapones, tapas o corcholatas deben ser nuevos y de materiales no tóxicos. 
6.2.1.4  Los tapones, tapas o corcholatas deben ser manteni dos desde su producción, transporte y manejo 
en condiciones higiénicas libres de polvo y de mate ria extraña. En caso de que no sea así, deben 
desinfectarse con soluciones que no modifiquen, rea ccionen o alteren las características de éstos, evi tando la 
contaminación por arrastre. 
6.3  Especificaciones Microbiológicas 
6.3.1  Las bebidas saborizadas no alcohólicas y las bebid as adicionadas con cafeína no deben sobrepasar 
los siguientes límites: 
Tabla 3. Especificaciones microbiológicas 
Microorganismos Bebidas no 
Alcohólicas 
Preenvasadas Bebidas no alcohólicas a granel 
Sin 
derivados 
vegetales Con derivados vegetales 
Con 
tratamiento 
térmico Sin 
tratamiento 
térmico 
Mesófilos aerobios UFC/g o mL 50 n.a. n.a. n.a. 
Coliformes totales NMP/mL o g 10 10 50 n.a. 
Coliformes fecales NMP/mL o g n.a. n.a. n.a. < 3 
Salmonella  sp en 25 mL o g  ausente * ausente ausente ausente 
E. coli NMP/g o mL n.a. n.a. n.a. < 3 ** 
V. cholerae  O1 en 50 g o mL  ausente * ausente * ausente * ausente * 
Enterotoxina estafilocóccica negativa* negativa* ne gativa* negativa* 
* Sólo en casos de contingencia sanitaria. 
* * Confirmar la presencia de E. coli  por el método del NMP cuando el parámetro de colif ormes fecales 
esté fuera de las especificaciones. 
6.4  Las bebidas adicionadas con cafeína no deben conte ner más de 33mg de cafeína/100mL de producto. 
6.5  Las bebidas para deportistas deben contener, por l o menos sodio e hidratos de carbono, en las 
siguientes concentraciones: 
6.5.1  Sodio entre 230 y 575 mg/L 
6.5.2  Hidratos de carbono máximo 80 g/L 
7. Productos congelados 
7.1  Clasificación 
Los productos objeto de este capítulo se clasifican  en: 
7.1.1  Preenvasados y 
7.1.2  A granel       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
7.2  Disposiciones sanitarias 
7.2.1  Además de lo señalado en el punto 5.1 las empresas  productoras de congelados de bebidas 
saborizadas no alcohólicas deben cumplir con lo sig uiente: 
7.2.1.1  En todo momento se debe evitar que la salmuera ent re en contacto con el producto terminado. 
7.2.1.2  El agua que se utilice durante el desmolde de los productos debe ser para uso y consumo humano. 
7.2.1.3  No se permite colocar hielo en contacto directo co n el producto terminado, a menos que éste se 
encuentre preenvasado, de tal forma que evite su co ntaminación. 
7.2.1.4  La cámara de congelación y congeladores o neveras deben mantenerse a una temperatura de  -
l2° C o menos, con termómetro visible o dispositivos  de registro de temperaturas funcionando y en buen 
estado; permitir el flujo de aire entre los product os. 
7.2.1.5  Los congelados de bebidas saborizadas no alcohólic as adicionadas con cafeína deben de cumplir 
con los límites establecidos en el numeral 6.4 
7.3  Especificaciones Microbiológicas 
7.3.1  Los congelados de bebidas saborizadas no alcohólic as no deben sobrepasar los siguientes límites: 
Tabla 4. Especificaciones microbiológicas para los congelados  de las bebidas saborizadas no 
alcohólicas 
Microorganismos Congelados de 
bebidas 
saborizadas no 
alcohólicas 
preenvasados Congelados de bebidas saborizadas no 
alcohólicas a granel 
Sin derivados 
vegetales Con derivados vegetales 
Con 
tratamiento 
térmico Sin 
tratamiento 
térmico 
Coliformes totales NMP/mL o g 10 10 50 n.a. 
Coliformes fecales NMP/mL o g n.a. n.a. n.a. <3 
Salmonella sp./25 mL o g  ausente* ausente ausente ausente 
E. coli NMP/mL o g  n.a. n.a. n.a. <3 ** 
V. cholerae  O1 /50 mL o g  ausente * ausente * ausente * ausente * 
Enterotoxina estafilocóccica negativa *** negativa *** negativa *** negativa *** 
* Sólo en casos de contingencia sanitaria. 
**Confirmar la presencia de E. Coli  por el método de NMP cuando el parámetro de colifo rmes fecales esté 
fuera de especificaciones. 
***Sólo en productos adicionados con leche y sus de rivados y en casos de contingencia sanitaria. 
8. Productos concentrados para preparar bebidas sab orizadas no alcohólicas 
8.1  Clasificación 
Los productos objeto de este capítulo, por su proce so se clasifican en: 
8.1.1  Jarabes o Concentrados 
8.1.1.1 Con tratamiento térmico 
8.1.1.2  Sin tratamiento térmico 
8.1.2  Concentrados de manufactura, y 
8.1.3  Polvos Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
8.2  Disposiciones sanitarias 
8.2.1  Además de lo señalado en el punto 5.1 las empresas  productoras de concentrados para preparar 
bebidas saborizadas no alcohólicas deben cumplir co n lo siguiente: 
8.2.1.1  Las empresas productoras de concentrados de manufa ctura para el control documental del 
proceso deben aplicar lo señalado en la siguiente t abla: 
Tabla 5. Contenido mínimo de las bitácoras o regist ros de las diferentes etapas  del proceso y de las 
buenas prácticas de fabricación 
Tipo de registro Datos 
Análisis del agua de proceso, cuando aplique Result ados 
Fecha de análisis 
Laboratorio responsable 
Análisis de materia prima Certificado de calidad 
Análisis del producto terminado Certificado de cali dad 
Almacenamiento del producto terminado Temperaturas de conservación del producto, cuando 
aplique. 
Identificación de la cámara o refrigerador 
Fecha 
Responsable 
Sistema PEPS 
Almacenamiento de Materias primas Temperaturas de c onservación, cuando aplique. 
Fecha 
Responsable 
Sistema PEPS 
Control de tratamiento térmico, cuando aplique 
 Registro de temperaturas 
Fecha 
Responsable  
 
8.2.1.2  Las características y especificaciones sanitarias de los concentrados de manufactura, utilizados 
como materia prima para la elaboración de bebidas s aborizadas no alcohólicas deben garantizar la inocu idad 
de estas últimas, a fin de cumplir con las especifi caciones sanitarias establecidas en esta norma y de más 
disposiciones aplicables. 
8.2.1.3  Los concentrados de manufactura utilizados como ma teria prima, deben contar con un certificado 
de calidad que incluya, entre otros, los siguientes  datos: nombre o clave o código del producto, ident ificación 
del responsable de proceso, número de lote, leyenda s de conservación y la declaración de ingredientes 
misma información que debe ser declarada en la etiq ueta, a excepción de los ingredientes. Cuando se 
requiera utilizar una clave o código para referirse  al nombre del producto o a los ingredientes, la pe rsona física 
o moral, licenciatario o causahabiente, propietaria  de la marca debe contar con la documentación que 
respalde la identificación de los mismos, la cual d ebe estar a disposición de la Secretaría cuando ést a lo 
requiera. 
8.3  Especificaciones Físicas y Químicas 
8.3.1  Los polvos para preparar bebidas saborizadas no al cohólicas no deben exceder de 5% de humedad. 
8.3.2  El límite máximo de dióxido de azufre (SO 2) en concentrados y jarabes de uva es de 10 mg/kg. 
8.4  Especificaciones Microbiológicas 
8.4.1  Los jarabes o concentrados para preparar bebidas s aborizadas no alcohólicas no deben pasar de los 
siguientes límites:       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
Tabla 6. Especificaciones microbiológicas en jarabe s y concentrados  para preparar bebidas 
saborizadas no alcohólicas. 
Microorganismo Con tratamiento 
térmico Sin tratamiento térmico. 
Sin derivados 
vegetales Con derivados 
vegetales 
Coliformes totales UFC/ g o mL <10 10 n.a. 
Coliformes fecales NMP/ g o mL n.a. n.a. <3 
Salmonella  sp. / 25 g o mL ausente* ausente* ausente 
E. coli  NMP/mL o g n.a. n.a. <3** 
Enterotoxina estafilocóccica negativa * negativa * negativa * 
* En caso de contingencia sanitaria. 
** Confirmar la presencia de E. coli  por el método de NMP cuando el parámetro de colifo rmes fecales esté 
fuera de especificaciones. 
8.4.2  Los polvos para preparar bebidas saborizadas no al cohólicas no deben pasar de los siguientes 
límites: 
Tabla 7. Especificaciones microbiológicas en polvos  para preparar  bebidas saborizadas no 
alcohólicas. 
Microorganismos Límite máximo 
Mesofílicos aerobios UFC/g 5000* 
Coliformes totales NMP/g < 10 
Escherichia coli NMP/g < 3 ** 
Salmonella  sp. en 25 g  ausente** 
*Para aquellos que contengan cacao o leche el límit e máximo es de 7000 UFC/g 
**En aquellos productos que contengan cacao, huevo o leche (incluyendo sus derivados) 
9. Muestreo 
El procedimiento de muestreo para los productos obj eto de esta norma, debe sujetarse a lo que establec e 
la Ley General de Salud y otras disposiciones juríd icas aplicables. 
10. Métodos de prueba 
Para la verificación oficial de las especificacione s sanitarias que se establecen en esta norma, se de ben 
aplicar los métodos de prueba establecidos en el Ap éndice normativo B. 
11. Etiquetado 
Las etiquetas o envases de los productos preenvasad os  objeto de esta norma, además de cumplir con lo 
establecido en el Reglamento y en la NOM-051-SCFI-1 994, señalada en el apartado de referencias, deben 
cumplir con lo siguiente: 
11.1  Requisitos generales 
11.1.1  Los productos que hayan sido modificados en su com posición, deben cumplir con la NOM-086-
SSA1-1994, señalada en el apartado de referencias. 
11.1.2  Cuando en las etiquetas se declaren u ostenten de forma escrita, gráfica o descriptiva, que los 
productos, su aplicación, ingredientes o cualquier otra característica, están recomendados, respaldado s o 
aceptados por centros de investigación, asociacione s, entre otros, estas Instituciones deben contar co n 
reconocimiento nacional o internacional por su expe riencia y estar calificados para dar opinión sobre la 
información declarada. Se deberá contar con el sust ento técnico respectivo, el que estará a disposició n de la 
Secretaría en el momento que lo solicite. Dichas de claraciones deben sujetarse a lo siguiente: 
11.1.2.1  La leyenda debe describir claramente la caracterís tica referida, estar precedida por el símbolo o 
nombre del organismo y figurar con caracteres claro s y fácilmente legibles. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
11.1.3  El nombre o la denominación del producto preenvasa do debe corresponder con la establecida en 
los ordenamientos legales específicos. Cuando se tr ate de productos con modificaciones en su composici ón 
referentes a menor contenido de sodio, grasa, grasa  saturada, colesterol, calorías o adicionados deben  
ostentar las denominaciones establecidas en la NOM- 086-SSA1-1994, señalada en el apartado de 
referencias. 
11.1.4  En el caso de que el producto haya sido objeto de tratamiento térmico, para asegurar la inocuidad 
del producto, esta condición debe señalarse en cual quier parte de la etiqueta. Si el producto ha sido sujeto a 
otro tipo de tratamiento se puede indicar el nombre  de éste. 
11.2  Lista de ingredientes 
11.2.1  En los productos con cafeína debe declararse en la  lista de ingredientes la cafeína, el o los 
ingredientes base o la mezcla de éstos, seguido del  contenido exacto de cafeína expresado en mg/100 mL , 
que debe corresponder al total ya sea por el sabori zante, el o los ingredientes base o la mezcla de és tos. 
11.3  Identificación del responsable del producto 
11.3.1  Cuando en un establecimiento diferente al de la pe rsona física o moral, al licenciatario o 
causahabiente, propietario de la marca, participe e n el proceso de los productos, debe figurar en la e tiqueta la 
leyenda “HECHO PARA…” o alguna equivalente, seguido del nombre o domicilio (calle, número, colonia, 
código postal, ciudad y estado) del responsable del  producto, asimismo el lote debe permitir la identi ficación 
del o los establecimientos que intervienen en el pr oceso. 
11.4  Instrucciones de uso 
11.4.1  Cuando por el tipo de producto se requieran instru cciones de uso, éstas deben indicarse en la 
etiqueta. 
11.4.2  Para los productos objeto de esta norma que por di seño del envase requieran instrucciones de uso 
o consumo especiales, deben incluir una descripción  escrita o gráfica de las instrucciones de empleo o  
preparación. 
11.4.3  Los productos destinados a ser reconstituidos debe n incluir una descripción escrita o gráfica de las 
instrucciones de empleo o preparación. 
11.4.4  Los jarabes o concentrados, cuando aplique, deben ostentar la leyenda: “Agítese antes de su 
consumo” o cualquier otra equivalente. 
11.5  Leyendas de conservación. 
11.5.1  Cuando sea necesario, se debe incluir la leyenda r elativa a la conservación del producto. 
11.5.2  Para los congelados de bebidas no alcohólicas pree nvasados: “Manténgase en congelación” o 
“Consérvese en congelación” o cualquier otra equiva lente. 
11.5.3  Para los polvos: "Consérvese en un lugar fresco y seco” o cualquier otra equivalente. 
11.5.4  Para los jarabes o concentrados: “Refrigérese desp ués de abrirse” o “Manténgase en congelación” 
o cualquier otra equivalente. 
11.6  Etiquetado nutrimental. 
11.6.1  Las bebidas para deportistas deben contener la inf ormación nutrimental, de conformidad con lo que 
se establece en la NOM-051-SCFI-1994, señalada en e l apartado de referencias y adicionalmente deben 
incluir los electrolitos y minerales que aporten. 
11.6.2  Quedan exceptuados de incluir la información nutri mental los concentrados de manufactura. 
11.7  Leyendas precautorias 
11.7.1  En productos que contienen quinina debe indicarse la presencia de la misma, ya sea que se utilice 
la palabra “quinina” en la denominación del product o o empleando una leyenda por separado, las cuales 
deben escribirse con caracteres mayores a la de los  ingredientes. 
11.7.2  En productos que contienen alcohol etílico en cant idades superiores al 0,50% en volumen, en el 
producto terminado, deben incluir en la superficie principal de exhibición de la etiqueta, las siguien tes 
leyendas: “Este producto contiene __ % de alcohol” y “No recomendable para niños”. En el espacio en bl anco 
citar la cantidad correspondiente. 
11.7.3  En congelados, cuando corresponda, deben incluirse  la(s) leyenda(s) que se refieran al siguiente 
aspecto: 
- Que para protección de la salud, deben lavarse la s manos y el envase del producto antes de consumirl o.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
11.7.4  Las bebidas adicionadas con cafeína, deben incluir  las siguientes leyendas: “No consumir más  de 
_______ unidades al día” (en el espacio en blanco i ndicar la cantidad correspondiente, dependiendo de la 
concentración de cafeína, en ningún caso la ingesta  máxima recomendada de bebidas adicionadas con 
cafeína debe exceder de 165 mg de cafeína por día),  “No se recomienda su consumo por: niños menores de  
12 años, ni para personas sensibles a la cafeína” y  “No mezclar o consumir junto con bebidas alcohólic as”. 
11.8  Especificaciones para productos a granel 
11.8.1  Durante el expendio de las aguas frescas y congela dos a granel y en caso de que contengan 
alcohol etílico, deben indicar mediante carteles, l a leyenda precautoria indicada en el punto 11.7.2 e n un lugar 
visible o en el listado de precios y sabores. 
11.8.2  Durante el expendio de las aguas frescas y congela dos a granel y en caso de que contengan 
cafeína o quinina, deben indicar por cualquier medi o que el producto contiene dichos ingredientes. 
12. Envase y embalaje 
12.1  Los productos objeto de esta norma se deben envasa r en recipientes elaborados con materiales 
inocuos y resistentes a distintas etapas del proces o, de tal manera que no reaccionen con el producto o 
alteren las características físicas, químicas y sen soriales de este último. 
12.2  Se debe usar material resistente que ofrezca la pr otección adecuada a los envases para impedir su 
deterioro exterior, a la vez que faciliten su manip ulación, almacenamiento y distribución. 
12.3  Debe garantizarse la inocuidad de las tintas emple adas en la etiqueta cuando por las características 
del producto y el envase primario, se presente el r iesgo de ingerirlas; según lo que establece la NOM- 003-
SSA1-2006, señalada en el apartado de referencias. 
13. Concordancia con normas internacionales y mexic anas 
Esta norma no es equivalente con ninguna norma inte rnacional y es parcialmente equivalente a las 
siguientes normas mexicanas: 
13.1  NMX-F-466-1984, Alimentos-Bebidas no alcohólicas-N aranjadas. Secretaría de Comercio y Fomento 
Industrial. Dirección General de Normas. 
13.2  NMX-F-439-1983, Alimentos-Bebidas no alcohólicas-B ebidas y refrescos Clasificación y definiciones. 
Secretaría de Comercio y Fomento Industrial. Direcc ión General de Normas. 
14. Bibliografía 
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14.2  Reglamento de la Ley Federal sobre Metrología y No rmalización. 
14.3  Ley General de Salud. 
14.4  Reglamento de la Ley General de Salud en Materia d e Control Sanitario de Actividades, 
Establecimientos, Productos y Servicios. 
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Toxicológicos y de Identidad y Pureza de los Aditiv os Alimentarios. 
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712 Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
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14.81  Winick, M. 1994. Ejercicios. En Enciclopedia Colum bia de Nutrición pp. 168-181. 
15. Vigencia 
La presente norma oficial mexicana entrará en vigor  a los 60 días naturales posteriores a su publicaci ón en 
el Diario Oficial de la Federación. 
16. Observancia de la norma 
16.1  La vigilancia en el cumplimiento de la presente no rma corresponde a la Secretaría de Salud y a los 
gobiernos de las entidades federativas, en sus resp ectivos ámbitos de competencia. 
Sufragio Efectivo. No Reelección. 
México, D.F., a 22 de octubre de 2010.- El Comision ado Federal para la Protección contra Riesgos 
Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacio nal de Normalización de Regulación y Fomento Sanita rio, 
Miguel Angel Toscano Velasco .- Rúbrica. 
Apéndice normativo A. Listado de aditivos 
Aditivo Productos Límite máximo en el 
producto listo para 
consumo mg/L 
Aceite vegetal bromado 1 Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados 15 
Acetato isobutirato de sacarosa Bebidas y congelado s 500 
Acido acético glacial Bebidas y congelados BPF 
Acido algínico Bebidas y congelados BPF 
Acido ascórbico (expresado como ácido 
ascórbico) Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados BPF 
Acido benzoico 3 (expresado como ácido 
benzoico) Bebidas, congelados, jarabes y 
concentrados 600 
Acido cítrico Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados BPF 
Acido D-L-tartárico Bebidas, congelados, polvos, ja rabes 
y concentrados BPF 
Acido eritórbico (expresado como ácido 
eritórbico) Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados BPF       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
Acido fosfórico Bebidas, congelados, polvos, jarabe s 
y concentrados 700 
Acido fumárico Bebidas, congelados, polvos, jarabes  
y concentrados BPF 
Acido L (+ ) – tartárico  Bebidas, congelados, polv os, jarabes 
y concentrados 2000 
Acido láctico Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados BPF 
Acido D,L- málico Bebidas, congelados, polvos, jara bes 
y concentrados BPF 
Acido sórbico 3 (expresado como ácido 
sórbico ) Bebidas, congelados, jarabes y 
concentrados 1000 
Acido tánico Bebidas, congelados y polvos, jarabes 
y concentrados 300 
Adipato acetilado de dialmidón Bebidas y congelados  BPF 
Agar Bebidas y congelados BPF 
Alginato de amonio Bebidas, congelados, polvos, jar abes 
y concentrados BPF 
Alginato de calcio Bebidas, congelados, polvos, jar abes 
y concentrados BPF 
Alginato de potasio Bebidas, congelados, polvos, ja rabes 
y concentrados BPF 
Alginato de propilenglicol Bebidas, congelados, pol vos, jarabes 
y concentrados 500 
Alginato de sodio Bebidas, congelados, polvos, jara bes 
y concentrados BPF 
Almidón acetilado Bebidas, congelados, jarabes y 
concentrados BPF 
Almidón hidroxipropilado 
Hidroxipropil de almidón  Bebidas, congelados, jarabes y 
concentrados BPF 
Almidón oxidado Bebidas, congelados, jarabes y 
concentrados BPF 
Aluminosilicato de potasio Polvos BPF 
Aluminosilicato de sodio Polvos BPF 
Amarillo ocaso FCF y sus lacas Amarillo 
alimentos 3 y sus lacas No. C.I. 15895 Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados 100 
Antocianinas Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados 2000 
Ascorbato de calcio (expresado como 
ácido ascórbico) Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados BPF 
Ascorbato de potasio (expresado como 
ácido ascórbico) Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados BPF 
Ascorbato de sodio (expresado como 
ácido ascórbico) Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados BPF 
Azorrubina y sus lacas 
Rojo alimentos 3 y sus lacas 
Carmoisina 
No. C.I. 14720 Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados 100 Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
Azul brillante FCF y sus lacas 
Azul alimentos 2 y sus lacas 
No. C.I. 42090 Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados 100 
Benzoato de potasio 3 (expresado como 
ácido benzoico) Bebidas, congelados, jarabes y 
concentrados 600 
Benzoato de sodio 3 (expresado como 
ácido benzoico)  Bebidas, congelados, jarabes y 
concentrados 600 
Beta-apo-8’-carotenal 
Anaranjado alimentos 6 
No. C.I. 40820 Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados 100 
Butilhidroxianisol 2 Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados 1000 
Butilhidroxitolueno 2 Bebidas y congelados 1000 
Cantaxantina 
Anaranjado alimentos 8 
No. C.I. 40850 Congelados 100 
Carbonato de amonio Polvos BPF 
Carbonato hidrogenado de amonio  Polvos BPF 
Carbonato de calcio Polvos BPF 
Carbonato de magnesio Bebidas, congelados y polvos BPF 
Carbonato de potasio Bebidas, congelados y polvos B PF 
Carbonato de sodio Bebidas, congelados y polvos BPF  
Carbonato hidrogenado de sodio  Bebidas, congelados  y polvos BPF 
Carboximetilcelulosa de sodio Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados BPF 
Carotenos naturales 
Anaranjado alimentos 5 
No. C.I. 75130 Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados BPF 
Carragenina Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados BPF 
Celulosa microcristalina Bebidas, congelados, polvo s, jarabes 
y concentrados BPF 
Citrato de isopropilo 2 Bebidas y congelados 100 
Citrato tripotásico Bebidas, congelados y polvos BP F 
Citrato trisódico Bebidas, congelados y polvos BPF 
Clorofilas 
Verde natural 3 
No. C.I. 75810 Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados BPF 
Cloruro de magnesio Bebidas y congelados BPF 
Cloruro de potasio Bebidas y congelados BPF 
Color caramelo Clase I y II Bebidas, congelados, po lvos, jarabes 
y concentrados BPF 
Color caramelo Clase III y IV Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados 800 
Curcumina 
No. C.I. 75300 Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados BPF 
d-alfa- tocoferol concentrado Bebidas y congelados 20 
Dialmidón glicerol acetilado Bebidas y congelados B PF       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
Dioctil sulfosuccinato de sodio Bebidas, congelados  y polvos 10 
Dióxido de silicón amorfo Polvos BPF 
dl–alfa-tocoferol Bebidas, congelados y polvos 20 
Dióxido de titanio 
Pigmento blanco 6 
No. C.I. 77891 Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados BPF 
Eritorbato de sodio (expresado como 
ácido eritórbico) Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados BPF 
Eritrosina 
Rojo alimentos 14 
No. C.I. 45430 Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados 100 
Estearato de polioxietileno (40) Bebidas y congelad os 500 
Estearoil 2 lactilato de calcio Bebidas, congelados , polvos 2000 
Estearoil 2 lactilato de sodio Bebidas, congelados,  polvos 2000 
Ester de glicerol de madera rosina Bebidas, congela dos y polvos 150 
Ester de glicerol de goma rosina Bebidas, congelado s y polvos 150 
Esteres de glicerol de ácidos grasos y 
ácido diacetil tartárico Bebidas, congelados, jarabes y 
concentrados 1000 
Esteres de poliglicerol de ácidos grasos Bebidas y congelados 300 
Esteres de poliglicerol del ácido ricinoléico 
interésterificado Bebidas y congelados 300 
Esteres de propilenglicol de ácidos grasos  Bebidas y congelados 150 
Esteres de ácidos grasos y sacarosa Bebidas y conge lados 1000 
Etilendiamino tetracetato disódico  Bebidas y conge lados 33 
Etilendiamino tetracetato cálcico disódico  Bebidas  y congelados 33 
Etilendiamino tetracetato tetrasódico  Bebidas y co ngelados 33 
Extracto de annato (Extracto de semillas 
de Bixa orellana ) 
Anaranjado natural 4 
No. C.I. 75120 Bebidas, congelados y polvos. 50 
Extracto de cempazuchitl ( Tagetes  erecta 
L.) Jarabes y concentrados BPF 
Extracto de cochinilla 
Extracto de Coccus cacti L 
No. C.I. 75470 Bebidas, congelados y polvos BPF 
Extracto de tegumento de uva  Bebidas y congelados 2000 
Fosfato de dialmidón acetilado Bebidas, congelados,  jarabes y 
concentrados BPF 
Fosfato de dialmidón Bebidas y congelados, jarabes y 
concentrados BPF 
Fosfato de hidroxipropil dialmidón  Bebidas, congel ados, jarabes y 
concentrados BPF Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
Fosfato fosfatado de dialmidón Bebidas, congelados,  jarabes y 
concentrados BPF 
Fosfato de monoalmidón Bebidas, congelados, jarabes  y 
concentrados BPF 
Fosfato dihidrogenado de calcio Bebidas, congelados  500 
Fosfato dihidrogenado de sodio Bebidas, congelados 500 
Fosfato hidrogenado disódico Bebidas y congelados 5 00 
Fosfato tricálcico Bebidas, congelados y polvos 700  
Fosfato tripotásico Bebidas y congelados 700 
Fosfato trisódico Bebidas y congelados 700 
Galato de propilo 2 Bebidas y congelados 100 
Glucono delta lactona Polvos BPF 
Goma arábiga Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados BPF 
Goma damar Bebidas, congelados, y polvos BPF 
Goma de algarrobo Bebidas, congelados, polvos, jara bes 
y concentrados BPF 
Goma ghatti Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados BPF 
Goma guar Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados BPF 
Goma tragacanto Bebidas, congelados, jarabes y 
concentrados BPF 
Goma xantana Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados BPF 
Hidróxido de magnesio Bebidas y congelados BPF 
p-hidroxibenzoato de metilo Bebidas y congelados 10 00 
Indigotina y sus lacas 
Azul alimentos 1 y sus lacas 
No. C.I. 73015 Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados 100 
L (+) Tartrato de potasio  Bebidas y congelados 300  
L (+) Tartrato de sodio Bebidas y congelados 300 
Lactato de calcio Bebidas y congelados BPF 
Lactato de sodio Bebidas y congelados BPF 
Lecitina Bebidas, congelados y polvos BPF 
Metil celulosa Bebidas y congelados BPF 
Monoestearato de glicerilo Bebidas, congelados y po lvos BPF 
Monoestearato de sorbitán Bebidas, congelados y pol vos 500 
Monoestearato de sorbitán 
polioxietilenado (20) Bebidas y congelados 500 
Monolaurato de sorbitán polioxietilenado 
(20) Bebidas y congelados 100       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
Monooletato de sorbitán polioxietilenado 
(20) Bebidas y congelados 500 
Oleorresina de paprika Bebidas, congelados, polvos,  jarabes 
y concentrados BPF 
Oxiestearina Bebidas y congelados BPF 
Pectinas 3 Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados BPF 
Polidimetilsiloxano Bebidas, congelados, jarabes y 
concentrados 10 
Polifosfato de potasio Bebidas, congelados, y polvo s 1000 
Polifosfato de sodio  Bebidas, congelados, y polvos  1000 
Ponceau 4R 
Rojo alimentos 7 No. C.I. 16255 Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados 50 
p- hidroxibenzoato de propilo Bebidas, congelados 100 0 
Propionato de sodio Bebidas, congelados, polvos, ja rabes 
y concentrados BPF 
Resina de guayaco Bebidas, congelados 1000 
Riboflavina Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados 50 
Riboflavina- 5’- fosfato de sodio Bebidas, congelad os, polvos, jarabes 
y concentrados 50 
Rojo allura AC y sus lacas 
Rojo alimentos 17 y sus lacas 
No. C.I. 16035 Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados 300 
Rojo betabel Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados BPF 
Silicato de calcio Polvos BPF 
Sorbato de potasio 3 (expresado como 
ácido sórbico) Bebidas, congelados, jarabes y 
concentrados 1000 
Sorbato de sodio 3 (expresado como ácido 
sórbico) Bebidas, congelados, jarabes y 
concentrados 1000 
Tartracina y sus lacas 
Amarillo alimentos 4 y sus lacas 
No. C.I. 19140 Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados 100 
Tocoferoles concentrados (mezcla) Bebidas, congelad os y polvos BPF 
Triestearato de sorbitán polioxietilenado 
(20) Congelados 500 
Verde rápido FCF y sus lacas 
Verde alimentos 3 y sus lacas 
No. C.I. 42053 Bebidas, congelados, polvos, jarabes 
y concentrados 100 
 
1 Indice de yodo = 16,0; Acidos grasos libres (como ácido oleico) = 2,5% 
2 Cantidad máxima referida al peso total de los acei tes esenciales. 
3 La mezcla no debe exceder de 600 mg/L tomando en cu enta el límite máximo de cada aditivo. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
APENDICE NORMATIVO B. 
METODOS DE PRUEBA 
B 1. DETERMINACION DE CAFEINA EN BEBIDAS NO ALCOHOL ICAS. 
B 1.1  Principio del método. 
La cafeína es extraída de la muestra con cloroformo  y determinada espectrométricamente a una longitud 
de onda de 276 nm. 
B 1.2  Equipo. 
B 1.2.1  Espectrómetro de UV-Visible disponible para utiliz arse a 276 nm. 
B 1.2.2  Balanza analítica con una precisión de 0,1 mg. 
B 1.3 Materiales. 
B 1.3.1  Matraces volumétricos de 100 mL. 
B 1.3.2  Probetas de 100 mL. 
B 1.3.3  Vasos de precipitados de 250 mL. 
B 1.3.4  Embudos de separación de 125 mL. 
B 1.3.5  Pipetas graduadas de 1 y 10 mL. 
B 1.4  Reactivos. 
Todos los reactivos deben ser grado analítico a men os que se indique otra especificación y por agua se  
entiende agua destilada. 
B 1.4.1 Sulfito de sodio anhidro (Na 2SO 3) 
B 1.4.2  Tiocianato de potasio (KSCN). 
B 1.4.3  Acido fosfórico (H 3PO 4). 
B 1.4.4  Hidróxido de sodio (NaOH). 
B 1.4.5  Cloroformo (CHCl 3). 
B 1.4.6  Cafeína (C 8H10 N4O2) 
B 1.4.7  Permanganato de potasio (KMnO 4). 
B 1.4.8  Solución reductora. 
Disolver 5 g de Na 2SO 3 y 5 g de KSCN en agua y llevar a un volumen de 100  mL. 
B 1.4.9  Solución diluida de ácido fosfórico. 
Diluir 15 mL de H 3PO 4 con 85 mL de agua. 
B 1.4.10  Solución de hidróxido de sodio. 
Disolver 25 g de NaOH en 75 mL de agua. 
B 1.4.11  Solución patrón de cafeína de 1 mg/mL. 
Disolver exactamente 100 mg de cafeína en cloroform o y llevar a un volumen de 100 mL con el mismo 
solvente. 
B 1.4.12  Solución de permanganato de potasio al 1,5%. 
Pesar 1,5 g de KMnO 4 y disolver en 100 mL de agua. 
B 1.5  Procedimiento. 
B 1.5.1  Preparación de la curva patrón.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
B 1.5.1.1  Medir los siguientes volúmenes de solución patrón de cafeína, de acuerdo con la Tabla número 1 
y llevar a un volumen de 100 mL con cloroformo. 
Tabla No. 1 
Matraz mL solución patrón de cafeína mg cafeína/100  mL 
1 0,00 Blanco 
2 0,10 0,10 
3 0,25 0,25 
4 0,50 0,50 
5 1,00 1,00 
6 1,50 1,50 
7 2,00 2,00 
 
B 1.5.1.2  Determinar la absorbancia de cada una de las soluc iones patrón a 276 nm. 
B 1.5.1.3  Elaborar una gráfica de la lectura de absorbancia para cada una de las soluciones patrón en 
función de su concentración (en mg/100mL). Ajustar la curva mediante regresión lineal (método de mínim os 
cuadrados). Lo anterior, puede llevarse a cabo en e quipos que se programan directamente en los cuales sólo 
es necesario leer los estándares y marcar su concen tración teórica. 
B 1.5.2  Preparación de la muestra. 
B 1.5.2.1  Eliminar el gas de la muestra por agitación o con ultrasonido. 
B 1.5.2.2  Medir 10 mL de muestra en un embudo de separación de 125 mL, adicionar 5 mL de solución de 
permanganato de potasio al 1,5% y mezclar. 
B 1.5.2.3  Después de exactamente 5 minutos, añadir 10 mL de la solución reductora y mezclar. 
B 1.5.2.4  Adicionar 1 mL de solución diluida de ácido fosfór ico, mezclar, añadir 1 mL de solución de 
hidróxido de  sodio y mezclar. 
B 1.5.2.5  Extraer con 50 mL de cloroformo durante un minuto.  Dejar separar las fases y drenar la fase 
inferior filtrando a través de papel filtro. Colect ar en un matraz volumétrico de 100 mL. 
B 1.5.2.6  Añadir de 2-3 mL de cloroformo al embudo de separa ción y drenar a través del papel. 
B 1.5.2.7  Lavar el papel con 2-3 mL de cloroformo. Extraer n uevamente con 40 mL de cloroformo filtrando 
y lavando el papel filtro como se describió anterio rmente y diluir al volumen con cloroformo. 
B 1.5.2.8  Determinar la absorbancia a 270 nm. 
B 1.6  Cálculos 
De la ecuación de la recta obtenida. 
y = mx + b 
Donde: 
y = Absorbancia obtenida en la muestra ya procesada . 
m = Pendiente (coeficiente de absortividad). 
x = mg cafeína/100 mL en la muestra. 
b = Ordenada al origen. 
Despejar “ x”  y obtener directamente los mg de cafeína/100 mL de  bebida. 
mg cafeína/100 mL = mg de cafeína/100 mL obtenidos de la curva X 100 X F.D. 
 10 
Donde: 
F.D. = Factor de dilución. 
B 1.7  Expresión de resultados. 
mg cafeína/100 mL. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 2  DETERMINACION DE MATERIA EXTRAÑA. 
B 2.1  Principio del método. 
La materia extraña se separa de la muestra mediante  flotación o sedimentación de acuerdo a la naturale za 
del producto y posteriormente se filtra para su ide ntificación al microscopio. 
B 2.2   Equipo. 
B 2.2.1  Balanza granataria con una precisión de 0.1 g. 
B 2.2.2  Equipo de filtración al vacío. 
B 2.2.3  Microscopio binocular estereoscópico con objetivos  que pueden ser de 3, 6, 7 y 10X y oculares 
apareados de amplio campo visual de 10, 30 y 100X, respectivamente. 
B 2.2.4  Lámpara para el microscopio o luz natural equivale nte. 
B 2.2.5  Parrilla de calentamiento con agitación magnética.  
B 2.3 Materiales. 
B 2.3.1  Matraz trampa de Wildman, formado por un matraz Er lenmeyer de 1 o 2 L, provisto de una varilla 
metálica con un tapón de émbolo de hule en un extre mo. 
B 2.3.2  Embudo de Hirsch o Buchner para filtración al vací o. 
B 2.3.3  Caja de Petri. 
B 2.3.4  Papel de filtración rápida del número 8 rayado par a conteo o rayado a lápiz con líneas paralelas de 
aproximadamente 5 mm de separación. 
B 2.3.5  Aguja de disección. 
B 2.3.6  Material de uso común en el laboratorio. 
B 2.4  Reactivos. 
Todos los reactivos deben ser grado analítico a men os que se indique otra especificación y por agua se  
entiende agua destilada. 
B 2.4.1  Heptano (C 7H16 ). 
B 2.4.2  Acido clorhídrico (HCl) de 36,5 a 38,0% de pureza.  
B 2.4.3  Aceite mineral. Aceite de parafina, blanco y liger o. Con un peso específico de 0,840-0,860 (24ºC). 
B 2.4.4  Glicerina (C 3H8O3) 
B 2.4.5  Mezcla de glicerina: etanol 1:3 (v/v). 
B 2.4.6  Mezclar un volumen de glicerina con 3 volúmenes de  etanol. 
B 2.5  Procedimiento. 
B 2.5.1 Determinación de materia extraña en bebidas no alco hólicas embotelladas o en lata. 
B 2.5.1.1  Homogeneizar bien la muestra y filtrar 250 mL sobr e un embudo de succión, preparado con 
papel filtro para conteo, tratando de verterlo unif ormemente. 
B 2.5.1.2  Colocar el filtro con residuo en una caja de Petri , y humedecerla con la mezcla de glicerina/ 
etanol (opcional). Examinar al microscopio utilizan do una luz suficientemente fuerte para que muestre los 
detalles en el papel filtro. 
B 2.5.1.3  Contar explorando con una aguja de disección sobre  toda la superficie del papel, línea por línea, 
y explorar cada pieza del material, porque algunos fragmentos son irreconocibles a menos que se muevan . 
B 2.5.2 Determinación de materia extraña en concentrados, j arabes y aguas frescas preparadas. 
B 2.5.2.1  Homogeneizar bien la muestra. En el caso de concen trados y jarabes reconstituir la muestra 
siguiendo las instrucciones de la etiqueta. 
B 2.5.2.2  En un matraz trampa de Wildman medir 250 mL de mue stra, adicionar 15 mL de aceite mineral y 
agregar agitando vigorosamente suficiente cantidad de agua caliente (70ºC), hasta que la capa de aceit e 
llegue al cuello del matraz. Dejar reposar 30 minut os. 
B 2.5.2.3 Girar suavemente la varilla de metal, para atrapar la capa de aceite, levantándolo e 
introduciéndolo lo más que se pueda en el cuello de l matraz.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
B 2.5.2.4  Mantener el émbolo en su lugar y decantar el líqui do que está sobre él a un embudo de succión 
preparado con un filtro para conteo, tratando de ve rterlo uniformemente. 
B 2.5.2.5  Colocar el filtro con residuo en una caja de Petri , y humedecerla con la mezcla de glicerinaetanol 
(opcional). Examinar al microscopio utilizando una luz suficientemente fuerte para que muestre los det alles en 
el papel filtro. 
B 2.5.2.6  Contar explorando con una aguja de disección sobre  toda la superficie del papel, línea por línea, 
y explorar cada pieza del material, porque algunos fragmentos son irreconocibles a menos que se muevan . 
B 2.5.2.7  En caso de que la muestra contenga tejidos de frut as emplear el siguiente procedimiento: 
B 2.5.2.7.1  Pesar en un vaso 100 g de la muestra y adicionar 2 00 mL de agua caliente (Aprox. a 50ºC). 
Transferir al matraz trampa, adicionar 10 mL de áci do clorhídrico y hervir por 3 minutos. 
B 2.5.2.7.2  Enfriar a temperatura ambiente, adicionar 25 mL de  heptano y agitar perfectamente. Bajar la 
varilla de metal y el tapón émbolo de hule, añadir el agua necesaria para que la capa de heptano suba al 
cuello del matraz. 
B 2.5.2.7.3  Dejar reposar por 15 minutos. Girar suavemente la varilla de metal, para remover el sedimento 
fino que se acumuló en la superficie del tapón émbo lo. 
B 2.5.2.7.4  Atrapar la capa de heptano levantándolo e introduc iéndolo lo más que se pueda en el cuello 
del matraz. Mantener el émbolo en su lugar y decant ar el líquido que está sobre él a un embudo de succ ión 
preparado con un papel filtro para conteo, tratando  de verterlo vigorosamente. 
B 2.5.2.7.5 Añadir nuevamente 25 mL de heptano al matraz trampa  para hacer una segunda extracción 
heptano sobre el embudo de succión, lavar la varill a y el cuello del matraz con heptano y verterlo sob re el 
mismo embudo. 
B 2.5.2.7.6  Examinar al microscopio utilizando una luz suficie ntemente fuerte para que muestre los 
detalles en el papel filtro. Contar explorando con una aguja de disección sobre toda la superficie del  papel, 
línea por línea, voletear y explorar cada pieza del  material, porque algunos fragmentos son irreconoci bles a 
menos que se muevan. No contar material dudoso. 
B 2.5.3  Determinación de materia extraña en polvos para pr eparar bebidas. 
B 2.5.3.1  Homogeneizar la muestra. Pesar en un vaso 50 g de muestra y adicionar de 400-500 mL de 
agua agitar bien hasta que toda la muestra se disue lva y aplicar el mismo procedimiento seguido en B 2 .5.1 
B 2.6  Expresión de resultados. 
Presencia o ausencia de insectos enteros, fragmento s de insectos, pelos de roedor, excretas o cualquie r 
materia extraña encontrada en 50 g, 100 g o 250 mL de producto, según corresponda. 
 
B 3 DETERMINACION DE QUININA EN BEBIDAS CARBONATADAS. 
B 3.1  Principio del método. 
La quinina es determinada espectrométricamente en m edio ácido a una longitud de onda de 347.5 nm. 
B 3.2  Equipo. 
B 3.2.1  Espectrómetro de UV-Visible disponible para utiliz arse a 347.5 nm. 
B 3.2.2  Balanza analítica con una precisión de 0.1 mg. 
B 3.2.3  Agitador magnético. 
B 3.3  Materiales. 
B 3.3.1  Matraces volumétricos de 100 mL. 
B 3.3.2  Probetas de 100 mL. 
B 3.3.3  Vasos de precipitados de 250 mL. 
B 3.4  Reactivos. 
Todos los reactivos deben ser grado analítico a men os que se indique otra especificación y por agua se  
entiende agua destilada. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 3.4.1  Quinina (C 20 H24 N2O2). Secada a 100ºC durante 3 horas. 
B 3.4.2  Acido clorhídrico concentrado (HCl). 
B 3.4.3  Solución de ácido clorhídrico 0,5 N. 
B 3.4.4  Solución patrón de quinina de 1 mg/mL. Pesar exact amente 100 mg de quinina en un matraz 
volumétrico de 100 mL. Adicionar 20 mL de ácido clo rhídrico 0,5 N y llevar al volumen con agua. Mezcla r. 
B 3.5  Procedimiento. 
B 3.5.1  Preparación de la curva patrón. 
B 3.5.1.1  Medir los siguientes volúmenes de solución patrón de quinina, de acuerdo con la Tabla No. 2, en 
matraces volumétricos de 100 mL. 
Tabla No.2 
Matraz mL solución patrón de quinina mg quinina/ L 
1 0,00 Blanco 
2 0,50 5,0 
3 1,00 10,0 
4 2,00 20,0 
5 3,00 30,0 
6 4,00 40,0 
7 5,00 50,0 
8 6,00 60,0 
 
B 3.5.1.2  Adicionar a cada matraz 20 mL de ácido clorhídrico  0.5 N. Llevar al volumen con agua y mezclar. 
B 3.5.1.3  Determinar la absorbancia de cada las soluciones p atrón a 347,5 nm. 
B 3.5.1.4  Elaborar una gráfica de la lectura de absorbancia para cada una de las soluciones estándar en 
función de su concentración (en mg/L). Ajustar la c urva mediante regresión lineal (método de mínimos 
cuadrados). Lo anterior, puede llevarse a cabo en e quipos que se programan directamente, en los cuales  sólo 
es necesario leer los estándares y marcar su concen tración teórica. 
B 3.5.2  Preparación de la muestra. 
B 3.5.2.1  Vaciar el contenido de la botella o lata en un vas o de precipitados. Agitar magnéticamente hasta 
eliminar el gas. 
B 3.5.2.2  Medir 50 mL de la muestra degasificada en un matra z volumétrico de 100 mL y adicionar 20 mL 
de ácido clorhídrico 0,5 N y llevar al volumen con agua. Mezclar. 
B 3.5.2.3  Determinar la absorbancia a 347,5 nm. 
B 3.6 Cálculos. 
De la ecuación de la recta obtenida. 
y = mx + b 
Donde: 
y = Absorbancia obtenida en la muestra ya procesada . 
m = Pendiente (coeficiente de absortividad). 
x = mg quinina/L en la muestra. 
b = Ordenada al origen. 
Despejar “ x”  y obtener directamente de la curva los mg de quini na/L. 
Para obtener la cantidad de quinina en la muestra a plicar la siguiente ecuación: 
mg quinina/L = mg quinina/L obtenidos de la curva e stándar X 100 X F.D. 50 
Donde: 
F.D. = Factor de dilución. 
B 3.7  Expresión de resultados. 
mg quinina / L.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
B 4 DETERMINACION DE SULFITOS EN ALIMENTOS. METODO OPTIMIZADO DE MONIER-
WILLIAMS. 
B 4.1  Principio del método. 
El método mide sulfitos libres más porciones reprod ucibles de sulfitos ligados, tales como productos 
carbonílicos, en alimentos. La muestra es calentada  con ácido clorhídrico (HCl) en reflujo para conver tir el 
sulfato a SO 2 (sulfitos). El nitrógeno introducido a la solución  arrastra el SO 2 a través del condensador 
enfriado por agua y pasa a una solución del H 2O2 al 3% donde el SO 2 se oxida a ácido sulfúrico (H 2SO 4). El 
contenido de sulfito es directamente relacionado al  H 2SO 4 generado, el cual es determinado por titulación co n 
hidróxido de sodio (NaOH) estandarizado. 
Aplicable para la determinación de ≥ 10 ppm de sulfitos en alimentos. Aplicable en pres encia de otros 
compuestos volátiles de azufre, no aplicable a cebo llas secas, puerros y calabazas. 
B 4.2  Equipo. 
B 4.2.1  Aparato de Destilación (nota: En este método la pr esión dentro del aparato está limitada a la 
presión propia de la solución de H 2O2 al 3% encima del extremo del burbujeador, mantener  la presión baja 
para evitar la pérdida del SO 2 a través del goteo). Usar una película delgada de vaselina en las superficies 
que sellan en todas las juntas, excepto en la junta  entre el matraz y el embudo de separación. Poner p inza en 
cada junta para asegurar que sellen completamente. 
 
 
B 4.2.2  Ensamblar el aparato según se muestra en la figura  siguiente: 
B 4.2.3  Bureta de 10 mL con tubo de sobrellenado y conexio nes para tubo Ascarita o el equivalente para 
permitir mantener una atmósfera libre de CO 2 sobre el hidróxido de sodio 0,01N estandarizado. 
B 4.3 Reactivos.  
Todos los reactivos deben ser grado analítico a men os que se indique otra especificación y por agua se  
entiende agua desionizada. 
B 4.3.1  Acido clorhídrico (HCl) acuoso 4N. Para cada análi sis, preparar 90 mL de esta solución mezclando 
30 mL de HCl y 60 mL de agua desionizada. 
B 4.3.2  Indicador de rojo de metilo. Disolver 250 mg de ro jo de metilo en 100 mL de etanol. 
B 4.3.3  Titulante estandarizado. Hidróxido de sodio (NaOH)  0,010N Estandarizar la solución con estándar 
de ftalato ácido de potasio. 
B 4.3.4  Solución de peróxido de hidrógeno al 3% (H 2 O2). Para cada análisis, diluir 3 mL de H 2O2 al 30% 
con 30 mL de agua desionizada. Justo antes de usars e, agregar 3 gotas de indicador de rojo de metilo y  titular 
con hidróxido de sodio (NaOH) 0,010N a un punto fin al amarillo, si el punto final excedió, descartar l a solución. 
B 4.3.5  Nitrógeno de alta pureza. Usar un regulador para m antener el flujo de 200 mL/min. Para evitar 
oxígeno en el nitrógeno se usa una trampa tipo crom atografía de gases. 
B 4.4 Preparación de la muestra.  
B 4.4.1  Sólidos. 
Transferir 50g de alimento o la cantidad que conten ga de 500 a 1500 µg de SO 2, a un procesador de 
alimentos o licuadora. Agregar 100 mL de etanol-agu a (5+95 v/v) y mezclar. Licuar sólo hasta que el al imento 
pueda pasar por la junta 24/40 del matraz. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 4.4.2  Líquidos. 
Mezclar 50g de muestra, o la cantidad que contenga de 500 a 1500 µg de SO 2 con 100 mL de la mezcla 
etanol-agua. 
Nota: Llevar a cabo la preparación de la muestra y el análisis tan rápido como sea posible para evitar  la 
pérdida de formas lábiles de sulfito. 
B 4.5 Preparación del sistema.  
B 4.5.1  Usando el aparato ensamblado y el matraz puesto en  la manta de calentamiento, agregar 400 mL 
de agua al matraz. 
B 4.5.2  Cerrar la llave del embudo de separación y agregar  90 mL de HCl 4N. 
B 4.5.3  Empezar con el flujo de nitrógeno. Iniciar el fluj o en el refrigerante. 
B 4.5.4  Colocar el recipiente con 30 mL de H 2O2, el cual ha sido titulado a punto final amarillo c on NaOH 
0,010N. 
B 4.5.5  Después de 15 min, el aparato y el agua estarán co mpletamente desoxigenadas y la porción de 
muestras debe ser introducida al sistema. 
B 4.5.6  Remover el embudo de separación y cuantitativament e transferir la muestra al matraz. 
B 4.5.7  Limpiar la junta y rápidamente aplicar grasa de si licón y regresarlo a su lugar. 
B 4.5.8  El flujo de nitrógeno a través de la solución de H 2O2 al 3% se reanuda tan pronto como se coloca 
el embudo en la junta del matraz. Examinar cada jun ta para asegurar que esté sellado. Usar un bulbo co n 
válvula para aplicar presión sobre el HCl. Abrir la  llave y dejar pasar el HCl al matraz. Continuar so steniendo la 
válvula para mantener la suficiente presión sobre l a solución de ácido para forzarla a pasar. Cerrar l a llave 
antes de que los últimos 2-3 mL drenen para evitar que el SO 2 escape hacia el embudo de separación. 
B 4.5.9  Calentar la manta al calentamiento y regular para calentar lo suficiente, obteniendo de 80 a 90 
gotas/min del condensador. 
B 4.5.10 Dejar 1 h 45 min y remover el vaso. 
B 4.6  Procedimiento 
Inmediatamente titular el contenido del vaso o prob eta con hidróxido de sodio 0,010N a punto final ama rillo 
y que persista ≥ 20 segundos. 
B 4.7  Cálculos. 
Calcular el contenido de sulfitos, como sigue: 
µg SO 2,/g = 32,03 x VB x N x 1000  
 peso de muestra 
Donde: 
32,03 = peso milequivalente del SO 2 
VB = Volumen (ML) del NaOH 
N = Normalidad del NaOH 
1000 = Factor para convertir milequivalentes a micr oequivalentes 
Peso de muestra: cantidad de muestra que se introdu jo al matraz 
B 5 DETERMINACION DE SULFITOS POR GRAVIMETRIA (OPCI ONAL). 
B 5.1  Después de la titulación, llevar el contenido del recipiente a un vaso de 400 mL agregar 4 gotas de 
HCl 1N y un exceso de solución de BaCl 2 al 10% y dejar reposar toda la noche. 
B 5.2 Lavar el precipitado por decantación 3 veces con ag ua caliente a través de un Gooch previamente 
pesado. Lavar con 20 mL de alcohol etílico y 20 mL de éter y secar a 105° -110° C. 
B 5.3  Determinar el blanco de reactivos para la titulaci ón y para el método gravimétrico y considerarlo en 
el cálculo de los resultados. 
B 5.4  Preparación del Aparato de Filtración 
B 5.4.1 Unir el receptáculo con un filtro de fibra de vidri o. 
B 5.4.2 Colocar lo anterior en el matraz kitasato. 
B 5.4.3  Lavar el filtro con 10 mL de agua caliente, desion izada y después con 10 mL de etanol usando 
vacío.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
B 5.4.4  Quitar el filtro y secarlo a 110° C durante 12 hora s o más. Transferir a desecador para enfriar a 
temperatura ambiente. Pesar (Wb). 
B 5.4.5  Colocar el filtro en el receptáculo de vidrio. 
B 5.5  Precipitado de BaSO 4 
B 5.5.1  Pasar el precipitado por el filtro. Lavar con agua  para asegurar que todo ha sido filtrado. 
B 5.5.2  Pasar 10 mL de etanol a través del precipitado y f iltrar con vacío. 
B 5.5.3  Remover el filtro y secar en estufa a 110° C durant e toda la noche. 
B 5.5.4  Transferir a desecador, enfriar y pesar (Wp). 
B 5.6 Cálculos. 
Calcular el contenido de sulfitos como sigue: 
µg SO 2,/g = [(Wp – Wb) x 274,46 ] 
g muestra 
Donde: 
Wp = Peso de papel filtro con el precipitado de BaS O 4 a peso constante 
Wb = Peso de papel filtro preparado y puesto a peso  constante 
B 5.7 Ensayos de Recuperación. 
B 5.7.1  Para familiarizarse y eficientizar el método antes  de realizar la rutina, analizar porciones de 
muestra que contengan cantidades conocidas de sulfi tos. 
B 5.7.2  Realizar los análisis de manera que se omita cualq uier pérdida de sulfitos por oxidación o reacción 
con los componentes en el alimento. 
B 5.7.3  Debido a que los sulfitos son reactivos con el air e y con algunas matrices alimenticias y dado que 
carecen de estabilidad, se debe fortificar con fuen tes estables de sulfitos, no sulfito de sodio o sal es similares. 
B 5.7.4  El hidroximetil sulfonato de sodio (HMS), el cual es estructuralmente similar a algunas formas 
combinadas de sulfitos en alimentos, es útil para p reparar porciones de prueba fortificada. 
B 5.7.5  Para el análisis, transferir 50g de muestra de ali mento libre de sulfitos al matraz. Agregar una 
alícuota de solución de la sal sódica de hidroximet il sulfonato. Analizar inmediatamente. 
B 5.7.6  Recuperaciones de > 80% del HMS con matrices alimenticias de 10 ppm so n recomendables para 
asegurar una adecuada exactitud analítica. 
B 5.8  Informe de las pruebas. 
µg SO 2,/g  
 
B 6 DETERMINACION DE SODIO (Na) POR ESPECTROFOTOMET RIA DE ABSORCION ATOMICA 
CON ADITAMENTO DE FLAMA 
B 6.1 Fundamento 
La muestra se somete a una digestión ácida con ácid o nítrico concentrado para que el analito liberado sea 
cuantificado por espectrofotometría de absorción at ómica. 
B 6.2 Reactivos 
B 6.2.1  Acido nítrico (HNO 3) concentrado grado suprapuro 
B 6.2.2  Acido nítrico (HNO 3) concentrado G.R. 
B 6.2.3  Estándar certificado de Na de 1000 µg/mL 
B 6.2.4  Agua deionizada 
B 6.3  Materiales 
B 6.3.1  Sistema de reflujo 
B 6.3.2  Material común de laboratorio 
B 6.3.3  Papel filtro No. 1 
B 6.4  Equipo 
B 6.4.1  Balanza analítica con una sensibilidad de 0.1 mg Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 6.4.2  Espectrofotómetro de absorción atómica con aditame nto de flama 
B 6.4.3  Parrilla de calentamiento 
B 6.4.4  Lámpara de cátodo hueco de sodio 
B 6.5  Preparación de la muestra para ensayo 
B 6.5.1 Productos sólidos 
Tomar una cantidad representativa de la muestra a a nalizar. Si es necesario moler el producto mediante  
un molino o un mortero. Evitar cualquier contaminac ión durante esta manipulación. Mezclar bien. 
B 6.5.2  Productos líquidos 
Mezclar bien el producto antes de abrir el recipien te. A continuación transvertir a un recipiente de v idrio o 
de plástico descontaminado. Guardar en el refrigera dor (4° C). Mezclar bien antes del uso. 
B 6.5.3  Descontaminación del material 
En una cubeta de polietileno (volumen aproximado de  15L) introducir 10L de mezcla ácido nítrico/agua 
(1:1). En este baño descontaminar durante una noche  todos los matraces aforados, tapones, recipientes de 
polietileno o de polipropileno, así como todo el ma terial de vidrio necesario. Enjuagar con agua desti lada. 
Secar. 
B 6.6 Procedimiento 
B 6.6.1  Se pesa de 1,0 a 2,0 g de muestra en un matraz de fondo plano de 250 mL con boca esmerilada, 
se le añaden 10 mL de HNO 3 grado suprapuro y se digieren por calentamiento en  un sistema de reflujo 
durante 2 h o hasta digestión completa. 
B 6.6.2  La muestra se enfría y se filtra a través de papel  filtro No. 1 y se recibe en un matraz aforado de 
100 mL. 
B 6.6.3  Se lava tres veces el matraz de la digestión con t res porciones de 10 mL de agua deionizada y los 
lavados se filtran y se reciben en el matraz aforad o, se lleva a volumen con agua deionizada. 
B 6.6.4  Ajustar el espectrofotómetro de acuerdo a las reco mendaciones del fabricante usando un estándar 
certificado. 
B 6.6.5  Se leen las muestras y se anotan los resultados ob tenidos en µg/mL, de acuerdo a lo siguiente: 
B 6.6.5.1  Longitud de onda: 589,6 nm 
B 6.6.5.2  Llama: aire-acetileno, oxidante 
Nota: Se recomienda meter una muestra añadida para valorarla y hacer un blanco de reactivos para cada 
serie de digestiones. 
B 6.6.6  Cálculo 
mg/kg Na+ = (A-B) x C  
D 
En donde: 
A = µg/mL de Na+ en la muestra 
B = µg/mL de Na+ en el blanco 
C = mL de aforo de la muestra 
D = peso de la muestra en g tomada para el análisis  
B 6.6.6.1  Sensibilidad del método: 0,15 µg/mL para 1% de absorción. 
B 7 ANALISIS MICROBIOLOGICO DE PRODUCTOS OBJETO DE ESTA NORMA 
B 7.1 Procedimiento para la preparación y dilución de mue stras de alimentos para su análisis 
microbiológico. 
B 7.1.1  Fundamento 
La dilución primaria tiene por objeto obtener una d istribución lo más uniforme posible de los 
microorganismos contenidos en la muestra destinada para el análisis. La preparación de diluciones deci males 
adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo  reducir el número de microorganismos por unidad de  
volumen, para permitir, después de la incubación, l a observación de la prueba en el caso de tubos o ma traces 
y la cuenta de colonias en el caso de placas. 
B 7.1.2  Reactivos 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben  ser grado analítico. Cuando se indique agua debe 
entenderse como agua destilada.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
B 7.1.2.1  Preparación de reactivos 
B 7.1.2.1.1  Solución de hidróxido de sodio 1,0 N 
Ingredientes Cantidades 
Hidróxido de sodio 4,0 g 
Agua 100 mL 
 
Preparación: 
Disolver el hidróxido de sodio y llevar a 100 mL co n agua. 
B 7.1.2.1.2  Solución reguladora de fosfatos (solución concentr ada). 
Ingredientes Cantidades 
Fosfato de sodio monobásico 34,0 g 
Agua 1,0 L 
 
Preparación: 
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0 N. 
Llevar a un litro con agua. 
Esterilizar durante 15 minutos a 121°  ± 1,0° C. 
Conservar en refrigeración (solución concentrada). 
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a  un litro con agua (solución de trabajo). 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se r equiera. 
Esterilizar a 121°  ± 1,0° C durante 15 minutos. 
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes  finales de la solución de trabajo deberán ser igua les a 
los iniciales. 
B 7.1.2.1.3  Agua peptonada 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 1,0 g 
Cloruro de sodio 8,5 g 
Agua 1,0 L 
 
Preparación: 
Disolver los componentes en un litro de agua. 
Ajustar el pH a 7 ± 0,1 con hidróxido de sodio 1,0 N. 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualq uier volumen múltiplo de nueve según se requiera. 
Esterilizar a 121 ± 1,0° C durante 15 minutos. 
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes  finales de la solución de trabajo deberán ser igua les a 
los iniciales. 
Si este diluyente no es usado inmediatamente, almac enar en lugar oscuro a una temperatura entre 0 a 5° C 
por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones ta les que no alteren su volumen o composición. 
B 7.1.3 Materiales 
B 7.1.3.1  Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 1 mL y 2 mL), con tapón 
de algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en vol úmenes iguales a una décima de su volumen total. 
B 7.1.3.2  Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca. 
B 7.1.3.3  Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca. 
B 7.1.3.4  Utensilios esterilizables para la obtención de mue stras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, 
espátulas, etc. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 7.1.3.5  Todo el material e instrumentos que tengan contact o con las muestras bajo estudio deberán 
esterilizarse mediante: Horno, durante 2 h a 170 a 175° C o 1 h a 180° C o en autoclave, durante 15 minu tos 
como mínimo a 121 ± 1,0° C. 
B 7.1.3.6  El material de vidrio puede sustituirse por materi al desechable que cumpla con las 
especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por esterilización repetida y éste  debe 
ser químicamente inerte. 
B 7.1.4 Aparatos e instrumentos 
B 7.1.4.1  Horno para esterilizar que alcance una temperatura  mínima de 170° C. 
B 7.1.4.2  Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada co n termómetro de máximas y mínimas. 
B 7.1.4.3  Baño de agua con control de temperatura y circulac ión mecánica, provista con termómetro 
calibrado con divisiones de 0,1° C y que mantenga la  temperatura a 45 ± 0,5° C. 
B 7.1.4.4 Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador 
peristáltico (Stomacher). 
B 7.1.4.5  Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bol sas estériles para homogeneizador peristáltico. 
B 7.1.4.6  Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g. 
B 7.1.5  Procedimiento 
B 7.1.5.1 Preparación de la dilución primaria. 
B 7.1.5.1.1 Para muestras congeladas de un alimento originalmen te líquido o licuable, fundir por completo 
en baño de agua de 40 a 45° C un tiempo máximo de 15  minutos y homogeneizar agitando vigorosamente. 
B 7.1.5.1.2 Para la parte líquida de una muestra heterogénea la  cual sea considerada suficientemente 
representativa de la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales). 
B 7.1.5.1.2.1  Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos d e arriba a abajo en un arco de 30 cm 
efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 mL d e la muestra y diluir con 9 mL del diluyente el cua l 
debe encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente . 
B 7.1.5.1.2.2  Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tom ar alícuotas mayores, por ejemplo 
volúmenes de 10 u 11 mL, diluidos con 90 o 99 mL, d e la misma forma que se describió anteriormente 
B 7.1.5.1.3 A partir de muestras sólidas o semisólidas. 
Las muestras sólidas y semisólidas congeladas, debe n descongelarse en refrigeración de 4 a 8ºC durante  
8 horas y no más de 24 horas antes de proceder a su  análisis. 
B 7.1.5.1.3.1  Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plástica 
estériles de tamaño adecuado. 
B 7.1.5.1.3.2  Adicionar un volumen de 90 a 99 mL del diluyente l levado a una temperatura similar a la de 
la muestra. 
B 7.1.5.1.3.3  Operar la licuadora o el homogeneizador peristálti co de 1 a 2 minutos hasta obtener una 
suspensión completa y homogénea según se indique en  la técnica correspondiente para cada alimento. Aun  
en los equipos más lentos, este tiempo no debe exce der de 2,5 minutos. 
B 7.1.5.1.3.4  Permitir que las partículas grandes se sedimenten,  y transferir la cantidad deseada tomando 
de las capas superiores de la suspensión. 
B 7.1.5.1.3.5  Cuando la dilución primaria es muy viscosa o pegaj osa, adicionar más diluyente, lo cual debe 
tomarse en cuenta para las operaciones subsecuentes  o expresión de resultados. 
B 7.1.5.1.3.6  El homogeneizador peristáltico (Stomacher) puede n o ser adecuado para algunos productos 
(por ejemplo, aquellos con partículas agudas o cons tituyentes que no se dispersen fácilmente). Debe se r 
utilizado sólo cuando exista evidencia (publicada o  por ensayos comparativos) de que los resultados 
obtenidos no difieren significativamente con aquell os obtenidos con licuadora. 
B 7.1.5.2 Preparación de las diluciones decimales adicionales . 
B 7.1.5.2.1 Transferir 1 mL o un múltiplo, por ejemplo, 10 u 11  mL de la dilución primaria 1 + 9 (10 -1), en 
otro recipiente conteniendo nueve veces el volumen del diluyente estéril a la temperatura apropiada, e vitando 
el contacto entre la pipeta y el diluyente. 
B 7.1.5.2.2 Mezclar cuidadosamente cada botella de diluyente si empre de la misma manera que se 
describe en el punto B 7.1.5.1.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
B 7.1.5.2.3 La selección de las diluciones que se vayan a prepa rar y de aquellas que se van a inocular, 
dependen del número esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de análisis 
previos y de la información que se obtenga del pers onal de inspección que la haya colectado. En ausenc ia 
total de información, trabajar con las diluciones d e la primera a la sexta. 
B 7.1.5.2.4 Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoc ulando simultáneamente las cajas que se 
hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nu nca debe ser menor al 10% de la capacidad total de  la 
pipeta. 
B 7.1.5.2.5 Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen  de líquido equivalente a su capacidad total, 
escurrir aplicando la punta de la pipeta una sola v ez en una área de la caja Petri sin líquido. 
B 7.1.5.2.6 Mientras se afora el líquido de la pipeta, la punta  de ésta debe apoyarse en el interior del cuello 
del frasco y mantenerla en posición vertical, para lo cual este último debe inclinarse lo necesario. 
B 7.1.5.2.7 En estudios donde se busca la presencia o ausencia de una determinada especie de 
microorganismos en 0,1 mL o 0,1 g, no es necesario preparar diluciones mayores. 
B 7.1.5.2.8 El criterio para seleccionar las diluciones a prepa rar de acuerdo con el número de 
microorganismos esperado es: 
B 7.1.5.2.8.1  Para la técnica del número más probable utilizar t res tubos: donde sea posible demostrar el 
microorganismo en 10 mL de la dilución más alta. 
B 7.1.5.2.8.2  Para la técnica de cuenta en placa, considerar aqu ellas en las que se puedan contar de 25 a 
250 colonias en un mínimo de una de tres diluciones  en el método de cuenta de bacterias aerobias en pl aca. 
En el caso de otros grupos microbianos, considerar el número especificado de colonias en la Norma Ofic ial 
Mexicana correspondiente. 
B 7.1.6  Duración del procedimiento. 
En general, las diluciones de la muestra deben ser preparadas inmediatamente antes del análisis y ésta s 
deben ser usadas para inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos posteriores a su preparaci ón. 
B 7.2 Método para la cuenta de bacterias aerobias en plac a. 
B 7.2.1  Fundamento 
El fundamento de la técnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio de elecció n 
después de un cierto tiempo y temperatura de incuba ción, presuponiendo que cada colonia proviene de un  
microorganismo de la muestra bajo estudio. El métod o admite numerosas fuentes de variación, algunas de  
ellas controlables, pero sujetas a la influencia de  varios factores. 
B 7.2.2  Reactivos 
Los reactivos que a continuación se mencionan, debe n ser grado analítico. 
Cuando se indique agua, debe entenderse agua destil ada, con pH cercano a la neutralidad. 
B 7.2.3  Medios de Cultivo. 
B 7.2.3.1  Agar Triptona-Extracto de Levadura (agar para cuen ta estándar). 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de levadura 2,5 g 
Triptona 5,0 g 
Dextrosa 1,0 g 
Agar 15,0 g 
Agua 1,0 L 
 
Preparación del medio de cultivo. 
Suspender los componentes del medio deshidratado en  un litro de agua. Hervir hasta total disolución. 
Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables de capacidad no mayor de 500 mL, cantidades de 
aproximadamente la mitad del volumen del mismo. Est erilizar en autoclave a 121 ± 1,0ºC, durante 15 min utos. 
El pH final del medio debe ser 7,0 ± 0,2 a 25ºC. 
Si el medio de cultivo es utilizado inmediatamente,  enfriar a 45ºC ± 1,0ºC en baño de agua y mantenerl o a 
esta temperatura hasta antes de su uso. El medio no  debe de fundirse más de una vez. 
En caso de medios deshidratados seguir las instrucc iones del fabricante. 
El medio de cultivo anterior es el de uso más gener alizado. Para algunos alimentos en particular se 
requerirá de un medio de cultivo especial que se de be indicar al describir la técnica para ese aliment o. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 7.2.4  Materiales 
Todo el material que tenga contacto con las muestra s o los microorganismos debe estar estéril. Se 
requieren, los materiales mencionados en el apartad o B 7.1 
B 7.2.5  Aparatos e instrumentos 
Se requiere, además de los mencionados en B.7.1, lo s siguientes: 
B 7.2.5.1  Incubadora con termostato que evite variaciones ma yores de ± 1,0ºC, provista con termómetro 
calibrado. 
B 7.2.5.2  Contador de colonias de campo obscuro, con luz ade cuada, placa de cristal cuadriculada y lente 
amplificador. 
B 7.2.5.3  Registrador mecánico o electrónico. 
B 7.2.5.4  Microscopio óptico. 
B 7.2.5.5  Baño de agua con o sin circulación mecánica, provi sta con termómetro calibrado con divisiones 
de hasta 1,0° C y que mantenga la temperatura a 45 ±  1,0° C. 
B 7.2.6 Preparación de la muestra 
Para la preparación de la muestra seguir el numeral  B 7.1. 
B 7.2.7  Procedimiento 
B 7.2.7.1  Distribuir las cajas estériles en la mesa de traba jo de manera que la inoculación; la adición de 
medio de cultivo y homogeneización, se puedan reali zar cómoda y libremente. Marcar las cajas en sus ta pas 
con los datos pertinentes previamente a su inoculac ión y correr por duplicado. 
B 7.2.7.2  Después de inocular las diluciones de las muestras  preparadas según en B 7.1 en las cajas 
Petri, agregar de 12 a 15 mL del medio preparado, m ezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquie rda, 
6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en s entido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una  superficie 
lisa y horizontal hasta lograr una completa incorpo ración del inóculo en el medio; cuidar que el medio  no moje 
la cubierta de las cajas. Dejar solidificar. 
B 7.2.7.3  Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medi o y diluyente preparado como testigo de 
esterilidad. 
B 7.2.7.4  El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que 
finalmente se adiciona el medio de cultivo a las ca jas, no debe exceder de 20 minutos. 
B 7.2.7.5  Incubar las cajas en posición invertida (la tapa h acia abajo) por el tiempo y la temperatura que se 
requieran, según el tipo de alimento y microorganis mo de que se trate, véase el cuadro 1. 
CUADRO 1 
Grupo bacteriano Temperatura Tiempo de incubación 
Termofílicos aerobios 55 ± 2ºC 48 ± 2 h 
Mesofílicos aerobios 35 ± 2ºC 48 ± 2 h 
Psicrotróficos 20 ± 2ºC 3 - 5 días 
Psicrofílicos 5 ± 2ºC 7 - 10 días 
 
B 7.2.7.6  En la lectura seleccionar aquellas placas donde ap arezcan entre 25 a 250 UFC, para disminuir el 
error en la cuenta. 
B 7.2.7.7  Contar todas las colonias desarrolladas en las pla cas seleccionadas (excepto las de mohos y 
levaduras), incluyendo las colonias puntiformes. Ha cer uso del microscopio para resolver los casos en los que 
no se pueden distinguir las colonias de las pequeña s partículas de alimento.  
B 7.2.8 Cálculos del método. 
B 7.2.8.1 Después de la incubación, contar las placas que se encuentren en el intervalo de 25 a 250 
colonias, usando el contador de colonias y el regis trador. Las placas de al menos una de tres dilucion es deben 
estar en el intervalo de 25 a 250. Cuando sólo una dilución está en el intervalo apropiado, véase el c uadro 2, 
ejemplo 1. Calcular la cuenta promedio por gramo o mililitro de dicha dilución y reportar. 
B 7.2.8.2 Cuando dos diluciones están en el intervalo apropia do, determinar la cuenta promedio dada por 
cada dilución antes de promediar la cuenta de las d os diluciones para obtener la cuenta en placa por g ramo o 
mililitro, véase el cuadro 2, ejemplo 2.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
B 7.2.8.3 Con el fin de uniformar los criterios para el repor te de las cuentas en ensayos donde las placas 
presenten situaciones no contempladas en los ejempl os anteriores, se presentan las siguientes guías: 
B 7.2.8.4 Placas con menos de 25 colonias.- Cuando las placas  corridas para la menor dilución muestran 
cuentas de menos de 25 colonias, contar el número d e colonias presentes en dicha dilución, promediar e l 
número de colonias y multiplicar por el factor de d ilución para obtener el valor estimado de cuenta en  placa. 
Aclarar en su informe esta situación agregando la l eyenda "valor estimado", véase el cuadro 2, ejemplo  3. 
B 7.2.8.5 Placas con más de 250 colonias.- Cuando el número d e colonias por placa exceda de 250, 
contar las colonias en aquellas porciones de la pla ca que sean representativas de la distribución de c olonias. 
Contar por ejemplo, una cuarta parte o una mitad de l área de la caja y multiplicar el valor obtenido p or 4 o 2, 
respectivamente. Si solamente pueden contarse algun os cuadros, considerar que el fondo de una caja Pet ri 
de 100 mm de diámetro contiene 65 cuadros de la cua drícula del contador. Aclarar en el informe esta 
situación agregando la leyenda "valor estimado", vé ase el cuadro 2, ejemplo 4. 
B 7.2.8.6 Colonias extendidas.- Las colonias extendidas puede n presentarse en las siguientes formas: 
B 7.2.8.6.1  Cadenas de colonias no separadas claramente entre sí, que parecen ser causadas por la 
desintegración de un cúmulo de bacterias. 
B 7.2.8.6.2  Colonias que se desarrollan en película entre el a gar y el fondo de la caja. 
B 7.2.8.6.3 Colonias que se desarrollan en película en la orill a de la caja sobre la superficie del agar. 
B 7.2.8.6.4  Colonias de crecimiento extendido y en algunas oca siones acompañadas de inhibición del 
crecimiento, que en conjunto exceden el 50% de la c aja o represión del crecimiento que por sí mismo ex cede 
el 25% de la superficie de la caja. 
B 7.2.8.6.5 Cuando es necesario contar en cajas que contienen c olonias extendidas que no están 
incluidas en el numeral B 7.2.8.6.4, contar cualqui era de los demás tipos especificados en el numeral B 
7.2.8.6.4, como provenientes de una sola fuente. 
B 7.2.8.6.6 En el caso de las colonias de las que se habla en e l primer guión, del numeral B 7.2.8.6.1, si la 
caja contiene una sola cadena, contar como una sola  colonia, si la caja contiene varias cadenas que pa recen 
originarse de fuentes separadas, contar cada cadena  como colonia individual. No contar cada colonia de  la 
cadena individualmente. 
B 7.2.8.6.7 Las colonias mencionadas en el primer y tercer guió n, generalmente se observan como 
crecimiento diferenciable de otras colonias y se cu entan como tales. Los crecimientos mencionados en e l 
cuarto apartado, reportarlos como crecimiento exten dido. En caso de que una dilución se encuentre dent ro del 
rango y otra dilución presente colonias de crecimie nto extendido, reportar la dilución en la que se pu eden 
contar las colonias, véase el cuadro 2, ejemplo 5 
B 7.2.8.7 Placas sin colonias.- Cuando las placas de todas la s diluciones no muestran colonias, reportar la 
cuenta en placa como menor que una vez el valor de la dilución más baja usada, véase el cuadro 2,  eje mplo 
6. 
B 7.2.8.8 Placas corridas por duplicado, una con crecimiento dentro del intervalo adecuado y otra con más 
de 250 colonias.- Cuando una placa tiene entre 25 y  250 colonias y su duplicado más de 250 colonias, c ontar 
ambas placas incluyendo la que está fuera del inter valo para determinar la cuenta en placa, véase el c uadro 2, 
ejemplo 7. 
B 7.2.8.9 Placas corridas por duplicado, una placa de cada di lución dentro del intervalo de 25 a 250 
colonias.- Cuando una placa dentro de diferentes di luciones contiene el número de colonias especificad as en 
el intervalo, contar el número de colonias de las c uatro placas para calcular la cuenta en placa, véas e el 
cuadro 2, ejemplo 8. 
B 7.2.8.10 Placas corridas por duplicado, ambas placas de una dilución dentro del intervalo de 25 a 250 y 
sólo una de la otra dilución dentro del mismo. Cont ar las cuatro en placa, véase el cuadro 2, ejemplo 9. 
B 7.2.8.11 Después de contabilizar las colonias en las placas seleccionadas, multiplicar por la inversa de 
la dilución para obtener el número de UFC por milil itro o gramo de la muestra. Redondear la cifra obte nida en 
la cuenta de manera que sólo aparezcan dos dígitos significativos al inicio de esta cifra. Para redond ear, 
elevar el segundo dígito al número inmediato superi or cuando el tercer dígito de la derecha sea cinco o mayor 
(por ejemplo: 128 redondear a 130). Si el tercer dí gito es cuatro o menos, reemplazar el tercer dígito  con cero 
y el segundo dígito mantenerlo igual (Por ejemplo: 2417 a 2400). 
B 7.2.9 Informe de la prueba 
Reportar como: Unidades formadoras de colonias, ___  UFC/g o mL, de bacterias aerobias en placa en 
agar triptona extracto de levadura o agar para cuen ta estándar, incubadas ________ horas a _______ ºC.  Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
CUADRO 2 
Cálculo de los valores de la cuenta en placa (ensay os por duplicado) 
Ejemplo  Colonias contadas  UFC/ g o mL 
Número 1:100 1:1,000 1:10,000  
1 >250 178 16 180,000 
 >250 190 17  
2 >250 220 25 250,000 
3 18 2 0 1,600 
 14 0 0  
4 >250 >250 512 5,000,000 
 >250 >250 495  
5 >250 235 Crecimiento extendido  
6 0 0 0 <100 
7 >250 240 24 250,000 
 >250 268 19  
8 >250 216 23 280,000 
 >250 262 42  
9 >250 215 20 23,000 
 >250 235 26  
 >250 275 32 270,000 
 >250 225 26  
 
B 7.3 Método para la cuenta de microorganismos coliformes  totales en placa. 
B 7.3.1 Fundamento 
El método permite determinar el número de microorga nismos coliformes presentes en una muestra, 
utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bi lis) en el que se desarrollan bacterias a 35° C en 
aproximadamente 24 h, dando como resultado la produ cción de gas y ácidos orgánicos, los cuales viran e l 
indicador de pH y precipitan las sales biliares. 
B 7.3.2 Reactivos 
Los reactivos que a continuación se mencionan, debe n ser grado analítico y cuando se indique agua debe  
entenderse como agua destilada. 
B 7.3.2.1  Soluciones diluyentes 
Solución reguladora de fosfatos (solución concentra da) 
Ingredientes Cantidades 
Fosfato monopotásico 34,0 g 
Agua 1,0 l 
 
Preparación 
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0 N. 
Llevar con agua a un litro. 
Esterilizar a 121± 1,0° C durante 15 minutos. Conser var en refrigeración (solución concentrada). 
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a  un litro con agua (solución de trabajo). 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se r equiera. 
Esterilizar durante 15 minutos a 121± 1,0° C. 
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes  finales de la solución de trabajo deben ser iguale s a 
los iniciales.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
Agua peptonada 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 1,0 
NaCl 8,5 g 
Agua 1,0 l 
 
Preparación: 
Disolver los componentes en un litro de agua. 
Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1,0 N. 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualq uier volumen múltiplo de nueve según se requiera. 
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0° C. 
Después de la esterilización, los volúmenes finales  de la solución de trabajo deben ser iguales  a los  
iniciales. 
Si este diluyente no es usado inmediatamente, almac enar en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 
5° C por un tiempo no mayor de un mes, en condicione s tales que no alteren su volumen o composición. 
B 7.3.2.2  Medio de cultivo 
Agar-rojo- violeta-bilis -lactosa (RVBA) 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 7,0 g 
Extracto de levadura 3,0 g 
Lactosa 10,0 g 
Sales biliares 1,5 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Rojo neutro 0,03 g 
Cristal violeta 0,002 g 
Agar 15,0 g 
agua 1,0 l 
 
Preparación: 
Mezclar los componentes en el agua y dejar reposar durante algunos minutos. 
Mezclar perfectamente y ajustar el pH a 7,4 con áci do clorhídrico 0,1N o con hidróxido de sodio 0,1N a  
25° C, de forma que después del calentamiento se man tenga en este valor. 
Calentar con agitación constante y hervir durante 2  minutos. 
Enfriar inmediatamente el medio en un baño de agua hasta que llegue a 45° C. 
Evitar el sobrecalentamiento del medio. 
No debe esterilizarse en autoclave. 
Usar el medio dentro de las tres primeras horas des pués de su preparación. 
En el caso de utilizar medio de cultivo deshidratad o, seguir las instrucciones del fabricante. 
B 7.3.3  Materiales 
B 7.3.3.1  Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 11 y 2 mL), con tapón  de 
algodón. 
B 7.3.3.2  Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes igua les a una décima de su volumen total. 
B 7.3.3.3  Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca. 
B 7.3.3.4  Tubos de 16 X 150 mm con tapón de rosca. 
B 7.3.3.5  Utensilios esterilizables para la obtención de mue stras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, 
espátulas, etc. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 7.3.3.6  Cajas Petri. 
B 7.3.3.7  Todo el material e instrumentos que tengan contact o con las muestras bajo estudio debe 
esterilizarse mediante: 
B 7.3.3.8  Horno, durante 2 h a 170 - 175° C, o 1 h a 180° C; o  en autoclave, durante 15 minutos como 
mínimo a 121 ± 1,0° C. 
B 7.3.3.9  El material de vidrio puede sustituirse por materi al desechable que cumpla con las 
especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por las esterilizaciones repetidas  y éste 
debe ser químicamente inerte. 
B 7.3.4  Aparatos e instrumentos 
B 7.3.4.1  Horno para esterilizar que alcance una temperatura  mínima de 170° C. 
B 7.3.4.2  Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada co n termómetro de máximas y mínimas. 
B 7.3.4.3  Baño de agua con control de temperatura y circulac ión mecánica, provista con termómetro 
calibrado con divisiones de 0,1° C y que mantenga la  temperatura a 45 ± 1,0° C. 
B 7.3.4.4  Licuadora de una o dos velocidades controladas por  un reóstato o bien un homogeneizador 
peristáltico (Stomacher). 
B 7.3.4.5  Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bol sas estériles para homogeneizador peristáltico. 
B 7.3.4.6  Incubadora con termostato que evite variaciones ma yores de ± 1,0° C, provista con termómetro 
calibrado. 
B 7.3.4.7  Contador de colonias de campo oscuro, con luz adec uada, placa de cristal cuadriculada  y lente 
amplificador. 
B 7.3.4.8  Registrador mecánico o electrónico. 
B 7.3.4.9  Microscopio óptico. 
B 7.3.4.10  Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidade s de pH a 25° C. 
B 7.3.5 Preparación de la muestra 
La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la sección B 7.1 “Preparación y 
dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.” 
B 7.3.6 Procedimiento 
B 7.3.6.1 Colocar en cajas Petri por duplicado 1 mL de la mue stra líquida directa o de la dilución primaria, 
utilizando para tal propósito una pipeta estéril. 
B 7.3.6.2 Repetir el procedimiento tantas veces como dilucion es decimales se requiera sembrar, utilizando 
una pipeta estéril diferente para cada dilución. 
B 7.3.6.3 Vertir de 15 a 20 mL del medio RVBA fundido y mante nido a 45 ± 1,0° C en baño de agua. En el 
caso de utilizar cajas de Petri de plástico se vier te de 10 a 15 mL del medio. El tiempo transcurrido entre la 
preparación de la dilución primaria y el momento en  que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder  de 20 
minutos. 
B 7.3.6.4 Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, 
seis movimientos en el sentido de las manecillas de l reloj, seis movimientos en el sentido contrario a l de las 
manecillas del reloj y seis de atrás para adelante,  sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que  la mezcla 
solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre u na superficie horizontal fría. 
B 7.3.6.5 Preparar una caja control con 15 mL de medio para v erificar la esterilidad. 
B 7.3.6.6 Después de que está el medio completamente solidifi cado en la caja, verter aproximadamente 4 
mL del medio RVBA a 45 ± 1,0° C en la superficie del  medio inoculado. Dejar que solidifique. 
B 7.3.6.7 Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a  35° C, durante 24 ± 2 horas. 
B 7.3.6.8 Después del periodo especificado para la incubación , contar las colonias con el contador de 
colonias. 
B 7.3.6.9 Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150  colonias. Las colonias típicas son de color 
rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de  un halo de precipitación debido a las sales biliar es, el 
cual es de color rojo claro o rosa, la morfología c olonial es semejante a lentes biconvexos con un diá metro de 
0,5 a 2,0 mm.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
B 7.3.7 Cálculos del método 
B 7.3.7.1 Placas que contienen entre 15 y 150 colonias caract erísticas. 
Separar las placas que contienen el número antes me ncionado de colonias características en dos 
diluciones consecutivas. Contar las colonias presen tes. Calcular el número de coliformes por mililitro  o por 
gramo de producto, multiplicando el número de colon ias por el inverso de la dilución correspondiente, 
tomando los criterios del punto B 7.2.8.1  “Método para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Pla ca.” 
B 7.3.7.2 Placas que contienen menos de 15 colonias caracterí sticas. 
Si cada una de las placas tiene menos de 15 colonia s características, reportar el número obtenido segu ido 
de la dilución correspondiente. 
B 7.3.7.3 Placas con colonias no características. 
Si en las placas no hay colonias características, r eportar el resultado como: menos de un coliforme po r 1/d 
por gramo, en donde d es el factor de dilución. 
B 7.3.8 Informe de la prueba 
Informar: UFC/g o mL en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35° C durante 24 ± 2h. En caso de  
emplear diluciones y no observar crecimiento, infor mar utilizando como referencia la dilución más baja  
utilizada, por ejemplo dilución 10-1. En caso de no  observar crecimiento en la muestra sin diluir se i nforma: 
"no desarrollo de coliformes por mL". 
B 7.4 Método para la determinación de Salmonella spp. en alimentos.  
B 7.4.1  Fundamento 
La presente técnica para la detección de Salmonella spp . en alimentos, describe un esquema general que 
consiste de 5 pasos básicos: 
B 7.4.1.1  Preenriquecimiento, es el paso donde la muestra es  enriquecida en un medio nutritivo no 
selectivo, que permite restaurar las células de Salmonella spp . dañadas a una condición fisiológica estable. 
B 7.4.1.2  Enriquecimiento selectivo, empleado con el propósi to de incrementar las poblaciones de 
Salmonella spp.  e inhibir otros organismos presentes en la muestra.  
B 7.4.1.3  Selección en medios sólidos, en este paso se utili zan medios selectivos que restringen el 
crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella spp.  y permite el reconocimiento visual de colonias 
sospechosas. 
B 7.4.1.4  Identificación bioquímica, este paso permite la id entificación genérica de los cultivos de 
Salmonella spp. y la eliminación de cultivos sospechosos falso s. 
B 7.4.1.5  Serotipificación, es una técnica serológica que pe rmite la identificación específica de un cultivo. 
B 7.4.2  Reactivos  
En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshi dratadas, se deben seguir las instrucciones 
impresas en la etiqueta respectiva para su preparac ión. 
Las sustancias químicas usadas para preparar los me dios de cultivo y los reactivos deben ser  grado 
analítico. 
B 7.4.2.1  Medios de pre-enriquecimiento 
B 7.4.2.1.1  Agua de peptona tamponada 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 10,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Fosfato sódico dibásico 3,5 g 
Fosfato potásico monobásico 1,5 g 
Agua 1,0 L 
 
Preparación 
Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario. 
Ajustar el pH, si es necesario, después de la ester ilización a 7,0. 
Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables con la capacidad necesaria para obtener las porcion es 
necesarias para la prueba. 
Esterilizar por 20 min a 121 ± 1ºC. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 7.4.2.1.2  Caldo lactosado 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 3,0 g 
Peptona 5,0 g 
Lactosa 5,0 g 
Agua destilada 1,0 g 
pH final 6,9 +  0,2 
 
Preparación 
Disolver los ingredientes en agua, calentando a 65º C. 
Distribuir en porciones de 225 mL, en frascos de 50 0 mL. 
Esterilizar durante 15 min a 121ºC ± 1ºC. 
B 7.4.2.2  Medios de enriquecimiento 
B 7.4.2.2.1  Caldo selenito-cistina 
Ingredientes Cantidades 
Tristona o polipeptona 5,0 g 
Lactosa 4,0 g 
Fosfato disódico 10,0 g 
Selenito ácido de sodio 4,0 g 
L- cistina 0,01 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 7,0 +  2 a 25° C  
 
Preparación 
Disolver los ingredientes en un litro de agua desti lada estéril y distribuir en volúmenes de 10 y 225 mL en 
recipientes estériles, según se requiera. 
El caldo así preparado es transparente. De preferen cia usarlo el mismo día de su preparación. 
Si se desea conservar el medio por varios días, pue de exponerse al calor en autoclave por 5 min a 110º C 
± 1ºC, tomando entonces un color salmón. 
B 7.4.2.2.2 Caldo tetrationato 
Ingredientes Cantidades 
Proteosa peptona o triptona 5,0 g 
Sales biliares 1,0 g 
Carbonato de calcio 10,0 g 
Tiosulfato de sodio pentahidratado 30,0 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 7,0 +  0,1 
 
Preparación 
Disolver los ingredientes en un litro de agua desti lada estéril. 
Distribuir, agitando constantemente, en porciones d e 10 y 225 mL, en recipientes estériles. Guardar  e n 
refrigeración. 
Antes de usar el medio, agregar 2 mL de una solució n yodo-yoduro y 1 mL de solución de verde brillante  al 
0,1% por cada 100 mL de caldo. El medio una vez adi cionado de yodo no debe calentarse y debe usarse el  
mismo día de su preparación.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
B 7.4.2.2.3  Vassiliadis-Rappaport 
Solución A 
Ingredientes Cantidades 
Tristona 5,0 g 
Cloruro de sodio 8,0 g 
Fosfato de potasio hidrogenado 1,6 g 
Agua destilada 1,0 l 
Disolver los componentes en agua por calentamiento cercano a 70ºC. 
 
Solución B 
Ingredientes Cantidades 
Cloruro de magnesio hexahidratado 400 g 
Agua destilada 1,0 l 
 
Disolver el cloruro de magnesio en agua. 
Como esta sal es muy higroscópica es conveniente di solver el contenido entero de cloruro de magnesio 
desde un recipiente recientemente abierto de tal mo do que la concentración de la solución sea de 0,4 g /mL. 
Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente. 
Solución C 
Ingredientes Cantidades 
Oxalato de verde de malaquita 0,4 g 
Agua destilada 100 mL 
 
Disolver el oxalato de verde de malaquita en agua. 
Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente. 
Medio completo 
Ingredientes Cantidades 
Solución A 1,000 mL 
Solución B 100 mL 
Solución C 10 mL 
 
Preparación 
Adicionar 1 000 mL de la solución A, 100 mL de la s olución B y 10 mL de la solución C. 
Ajustar el pH si es necesario, de tal manera que de spués de la esterilización sea de 5,2. 
Distribuir antes de usar dentro de tubos en cantida des de 10 mL. 
Almacenar en refrigeración. 
B 7.4.2.2.4  Caldo de soya tripticasa 
Ingredientes Cantidades 
Tripticasa o triptosa 17,0 g 
Fitona  3,0 g 
Glucosa  2,5 g 
Cloruro de sodio 2,5 g 
Agua destilada 1,0 g 
pH final 7,3 +  0,2 
 
Preparación 
Disolver los ingredientes en 1 litro de agua destil ada, calentando lentamente hasta su disolución comp leta. 
Distribuir porciones de 225 mL dentro de matraces d e 500 mL y esterilizar en autoclave durante 15 min a 
121ºC ± 1ºC. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 7.4.2.2.5  Leche descremada reconstituida 
Suspender 100 g de leche descremada en polvo en un litro de agua destilada. Agitar circularmente hasta  
disolución. Distribuir en volúmenes de 225 mL en ma traces Erlenmeyer de 500 mL. Esterilizar a 121ºC ± 1ºC 
por 15 min. El volumen final debe corregirse para m antener 225 mL. 
B 7.4.2.2.6  Caldo soya tripticasa estéril adicionado con sulfi to de potasio 
Adicionar al caldo soya tripticasa 5 g de sulfito d e potasio por cada 1000 mL de medio, quedando una 
concentración final de sulfito de potasio del 0,5%.  Adicionar el sulfito de potasio antes de esteriliz ar en 
autoclave en la forma habitual. 
B 7.4.2.3 Medios de aislamiento 
B 7.4.2.3.1  Agar verde brillante (VB) 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de levadura 3,0 g 
Polipeptona (proteosa peptona No. 3) 10,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Lactosa 10,0 g 
Sacarosa 10,0 g 
Rojo de fenol 0,08 g 
Agar 20,0 g 
Verde brillante 0,0125 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 6,9 ± 0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en un litro de agua dest ilada y calentar a ebullición, hasta disolución com pleta. 
Ajustar el pH. 
Esterilizar en autoclave por 15 min a 121ºC ± 1ºC. El sobrecalentamiento del medio disminuye su 
selectividad. 
Enfriar el medio a 50ºC y distribuirlo en cajas de petri estériles. El aspecto del medio es obscuro, d e color 
marrón. 
B 7.4.2.3.2  Agar con sulfito de bismuto 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne de res 5,0 g 
Mezcla de peptonas 10,0 g 
Glucosa 5,0 g 
Fosfato disódico (anhidro) 5,0 g 
Sulfato ferroso (anhidro) 0,3 g 
Sulfito de bismuto 8,0 g 
Verde brillante 0,025 g 
Agar 20,0 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 7,6 +  0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en un litro de agua. Cal entar hasta su disolución completa, agitando 
frecuentemente. Ajustar el pH. 
Enfriar a 45ºC y verter en cajas de petri estériles , distribuyendo de manera homogénea el precipitado 
propio del medio. 
El aspecto de las placas es opaco, de color verde p álido y deben usarse el mismo día de su preparación . 
Si la coloración es parda, no deben utilizarse. 
El medio no debe esterilizarse en autoclave; el sob recalentamiento afecta su selectividad.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
B 7.4.2.3.3  Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) 
Ingredientes Cantidades 
Xilosa 3,75 g 
L- lisina 5,0 g 
lactosa 7,5 g 
Sacarosa 7,5 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Extracto de levadura 3,0 g 
Rojo de fenol 0,08 g 
Agar 15,0 g 
Desoxocolato de sodio 2,5 g 
Citrato férrico- amónico 0,8 g 
Tiosulfato de sodio 6,8 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 6,9 +  0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en un litro de agua dest ilada, y calentar en baño de agua a 55ºC, agitando 
frecuentemente, hasta disolución completa. Ajustar el pH. 
Enfriar a 50ºC y verter en cajas de petri estériles . No se esterilice. 
El sobrecalentamiento produce una precipitación; la  reactividad del medio puede ser satisfactoria, per o las 
colonias suelen ser muy pequeñas. 
El aspecto del medio es claro y de color rojo brill ante. 
B 7.4.2.3.4  Agar para Salmonella  y Shigella  (SS) 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 5,0 g 
Polipeptona 5,0 g 
Lactosa 10,0 g 
Sales biliares 8,5 g 
Citrato de sodio dihidratado 8,5 g 
Tiosulfato de sodio pentahidratado 8,5 g 
Citrato férrico 1,0 g 
Agar 13,5 g 
Rojo neutro 0,025 g 
Verde brillante 0,33 mg 
Agua destilada 1,0 L 
pH final 7,0 +  0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en un litro de agua dest ilada estéril y calentar a ebullición hasta disoluc ión 
completa. Ajustar el pH. No esterilizar en autoclav e. 
Enfriar a 50ºC y distribuir en cajas de petri estér iles en condiciones asépticas. 
El aspecto del medio fundido es claro y de color ro sado. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 7.4.2.3.5  Agar entérico Hektoen 
Ingredientes Cantidades 
Proteosa peptona 12,0 g 
Extracto de levadura 3,0 g 
Lactosa 12,0 g 
Sacarosa 12,0 g 
Salicilina 2,0 g 
Sales biliares 9,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Tiosulfato de sodio 5,0 g 
Citrato amónico férrico 1,5 g 
Azul de bromotimol 0,064 g 
Fascina ácida 0,1 g 
Agar 13,5 g 
Agua 1,0 L 
pH final 7,5 +  0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en agua destilada, hervi r con agitación hasta completa disolución del agar.  
No sobrecalentar. 
Dejar enfriar a 55-60ºC y distribuir en cajas de pe tri estériles en condiciones asépticas. 
B 7.4.2.4  Medios para pruebas bioquímicas 
B 7.4.2.4.1  Agar de tres azúcares y hierro (TSI) 
Ingredientes Cantidades 
Peptona de carne 1,0 g 
Paptona de caseína 1,0 g 
Cloruro de sodio 0,5 g 
Lactosa 1,0 g 
Sacarosa 1,0 g 
Glucosa 0,1 g 
Agar 1,3 g 
Rojo de fenol 2,5 mg 
Sulfato ferroso amónico 
pentahidratado 20,0 mg 
Tiosulfato de sodio 20,0 mg 
Agua destilada 100 mL 
pH final 7,3 +  0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en 100 mL de agua destil ada. Calentar a ebullición, agitando ocasionalmente , 
hasta disolución completa. 
Enfriar a 60ºC y ajustar el pH. 
Distribuir en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 10 0 mm y esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 min. 
Inclinar los tubos de manera que el medio de cultiv o en el fondo alcance una altura de 3 cm y una 
profundidad de 4 cm. El medio es de color rojo.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
B 7.4.2.4.2  Agar de hierro y lisina (LIA) 
Ingredientes Cantidades 
Peptona de gelatina 0,5 g 
Extracto de levadura 0,3 g 
Glucosa 0,1 g 
L-lisina 1,0 g 
Citrato férrico amónico 50 mg 
Tiosulfato de sodio anhidro 4,0 mg 
Púrpura de bromocresol 2,0 mg 
Agar 1,5 g 
Agua destilada 100 mL 
pH final 6,7 +  0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en el agua destilada y m ezclar bien, calentar hasta ebullición con agitació n 
frecuente hasta conseguir la disolución completa. A justar el pH. 
Distribuir en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 10 0 mm, con tapón de rosca. 
Esterilizar en autoclave a 121ºC ± 1ºC durante 12 m in. Dejar que los tubos se enfríen en posición 
inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 4 cm y una superficie inclinada de 2 cm. 
El medio ya preparado es de color púrpura. 
B 7.4.2.4.3  Agar nutritivo 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 3,0 g 
Peptona 5,0 g 
Agar 15,0 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 6,8 +  0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en agua. Dejar reposar d e 5 a 10 min. 
Calentar a ebullición hasta disolución completa. Di stribuir en tubos de 13 x 100 mm, en cantidades de 1/3 
de su volumen. 
Esterilizar a 121ºC ± 1ºC por 15 min. Inclinar los tubos antes que el agar solidifique. 
B 7.4.2.4.4  Medio de SIM (para Sulfuro, Indol y Movilidad) 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 3,0 g 
Peptona 30,0 g 
Hierro peptonizado 0,20 g 
Tiosulfato de sodio 0,025 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 7,3 +  0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en el agua destilada, ca lentar a ebullición agitando frecuentemente hasta 
lograr una disolución completa. 
Enfriar a 50ºC y ajustar el pH. 
Distribuir el medio en volúmenes de 3 mL en tubos d e 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121ºC ± 
1ºC durante 15 min. Se dejan enfriar los tubos en p osición vertical. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 7.4.2.4.5  Agar citrato de Simmons 
Ingredientes Cantidades 
Fosfato de amonio 1,0 g 
Fosfato dipotásico 1,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Citrato de sodio 2,0 g 
Sulfato de magnesio 0,20 g 
Azul de bromotimol 0,08 g 
Agar 15,0 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 6,8 +  0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en el agua destilada, ca lentar a ebullición agitando frecuentemente hasta 
lograr una disolución completa. 
Ajustar el pH. 
Distribuir el medio en volúmenes de 3 mL en tubos d e 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121ºC ± 
1ºC durante 15 min. 
Dejar enfriar los tubos en posición inclinada. 
B 7.4.2.4.6  Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer) 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 7,0 g 
Dextrosa 5,0 g 
Difosfato de potasio 5,0 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 6,9 +  0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en el agua destilada, ca lentar a ebullición agitando frecuentemente hasta 
lograr una disolución completa. 
Ajustar el pH. 
Distribuir el medio en volúmenes de 3 mL en tubos d e 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121ºC ± 
1ºC durante 15 min. 
B 7.4.2.4.7 Caldo manitol 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 1,0 g 
Proteosa peptona 10,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Rojo de fenol 0,018 g 
Manitol 10,0 g 
Agua 1,0 l 
pH final 7,4 +  0,2 
 
Preparación 
Suspender 26 g del medio deshidratado en un litro d e agua, mezclar y ajustar el pH. 
Distribuir en volúmenes de 2 a 3 mL en tubos de 13 x 100 mm. 
Esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 min.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
B 7.4.2.4.8 Caldo malonato 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de levadura 1,0 g 
Sulfato de amonio 2,0 g 
Fosfato dipotásico 0,6 g 
Fosfato monopotásico 0,6 g 
Cloruro de sodio 2,0 g 
Malonato 3,0 g 
Glucosa 0,250 g 
Azul de bromotimol 0,025 g 
Agua 1,0 l 
pH final 6,7 +  0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en agua, mezclar y ajust ar el pH. 
Distribuir en tubos de 13 x 100 mm en cantidades de  3 mL. 
Esterilizar en autoclave a 121ºC ± 1ºC durante 15 m in. 
B 7.4.2.4.9  Caldo urea 
Ingredientes Cantidades 
Urea  20,0 g 
Extracto de levadura 0,1 g 
Fosfato monopotásico 9,10 g 
Fosfato dipotásico 9,5 g 
Rojo de fenol 0,01 g 
Agua  1,0 l 
pH final 6,8 +  0,2 
 
Preparación 
Disolver los ingredientes en agua destilada. 
NO CALENTAR. Esterilizar por filtración a través de  membrana 0,45 µm o en autoclave de 5 a 8 lb de 
presión durante 15 min. 
Distribuir asépticamente de 1,5 a 3 mL en tubos est ériles de 13 x 100 mm. 
B 7.4.2.4.10  Caldo de urea rápido 
Ingredientes Cantidades 
Urea 20, 0 g 
Extracto de levadura 0,10 g 
Fosfato monopotásico 0,091 g 
Fosfato dipotásico 0,095 g 
Rojo de fenol 0,010 g 
Agua 1,0 l 
pH final 6,8 +  0,2 
 
Preparación 
Disolver los ingredientes en agua destilada. 
NO CALENTAR. Esterilizar por filtración a través de  membrana 0,45 µm. 
Distribuir asépticamente de 1,5 a 3 mL en tubos est ériles de 13 x 100 mm. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 7.4.2.4.11  Caldo infusión cerebro corazón 
Ingredientes Cantidades 
Infusión cerebro corazón 200,0 g 
Infusión de corazón de res 250,0 g 
Proteosa peptona 10,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Fosfato disódico dodecahidratado 2,5 g 
Dextrosa 2,0 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 7,4 ± 0,2 
 
Preparación 
Disolver los ingredientes en agua destilada, calent ar suavemente. 
Distribuir y esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 m in. 
B 7.4.2.5  Soluciones 
B 7.4.2.5.1  Solución verde brillante al 0,1% (1:1000) 
Ingredientes Cantidades 
Verde brillante 0,1 g 
Agua destilada estéril 100,0 mL 
 
Disolver 0,1 g de verde brillante en agua destilada  estéril hasta completar 100 mL. 
B 7.4.2.5.2  Solución de yodo-yoduro 
Ingredientes Cantidades 
Cristales de yodo 6,0 g 
Yoduro de potasio 6,0 g 
Agua destilada 100,0 mL 
 
Disolver los cristales y el yoduro de potasio en ag ua destilada hasta completar 100 mL. 
Conservar en frasco ámbar. 
B 7.4.2.5.3  Solución salina al 0,85% 
Ingredientes Cantidades 
Cloruro de sodio 0,85 g 
Agua destilada 100,0 mL 
 
Disolver el cloruro de sodio en el agua y esteriliz ar a 121° C ± 1° C durante 15 min. 
B 7.4.2.5.4  Solución salina formalizada 
Ingredientes Cantidades 
Solución de formaldehído (36-38 %) 6,0 mL 
Cloruro de sodio 8,5 g 
Agua destilada 1,0 L 
 
Disolver 8,5 g de cloruro de sodio en 1 litro de ag ua destilada. Esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 min. 
Enfriar a temperatura ambiente. Adicionar 6 mL de l a solución de formaldehído. No esterilizar después de 
la adición de formaldehído.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
B 7.4.2.5.5  Reactivo de Kovac 
Ingredientes Cantidades 
p-dimetil-aminobenzaldehído 5,0 g 
Alcohol amílico 75,0 mL 
Acido clorhídrico concentrado 25,0 mL 
 
Disolver el p-dimetil-aminobenzaldehído en el alcoh ol amílico y después agregar el ácido clorhídrico 
lentamente. Conservar en frasco ámbar en refrigerac ión. 
B 7.4.2.5.6 Solución de alfa-naftol al 5% 
Ingredientes Cantidades 
Alfa-naftol 5,0 g 
Alcohol 100,0 mL 
 
Disolver 5 g de alfa-naftol en alcohol hasta comple tar 100 mL. 
B 7.4.2.5.7 Solución de rojo de metilo 
Ingredientes Cantidades 
Rojo de metilo 0,10 g 
Alcohol etílico 300,0 mL 
Agua destilada c.b.p. 500,0 mL 
 
Disolver el rojo de metilo en el alcohol etílico y adicionar agua hasta completar 500 mL. 
B 7.4.2.5.8 Solución de hidróxido de potasio al 40% 
Ingredientes Cantidades 
Hidróxido de potasio 40,0 g 
Agua destilada  100,0 mL 
 
Disolver 40 g de hidróxido de potasio en agua hasta  completar 100 mL. 
B 7.4.2.5.9  Solución de gelatinasa al 5% 
Ingredientes Cantidades 
Gelatinasa 5,0 g 
Agua 100,0 mL 
 
Disolver 5 g de gelatinasa en 100 mL de agua destil ada. NO CALENTAR. 
B 7.4.2.6 Antisueros 
B 7.4.2.6.1 Antisuero polivalente somático (O) 
B 7.4.2.6.2 Antisuero polivalente flagelar (H) 
B 7.4.2.6.3 Antisuero Vi 
B.7.4.3 Material 
B 7.4.3.1 Matraces Erlenmeyer de 500 mL 
B 7.4.3.2 Recipientes de boca ancha, de capacidad apropiada p ara contener las muestras simples y 
compuestas 
B 7.4.3.3 Angulos de vidrio 
B 7.4.3.4 Cucharas, bisturíes, cuchillos y pinzas 
B 7.4.3.5 Tubos de ensaye de 16 x 150 mm y de 20 x 100 mm Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 7.4.3.6 Tubos para serología de 10 x 75 mm o de 13 x 100 mm  
B 7.4.3.7  Pipetas bacteriológicas de 10,0 y 5,0 mL, graduada s en 0,1 mL y protegidas con tapón de 
algodón 
B 7.4.3.8  Pipetas de 1 mL, con graduaciones de 0,01 mL 
B 7.4.3.9  Cajas de petri estériles de vidrio o desechables 
B 7.4.3.10  Rejillas para tubos de ensaye 
B 7.4.3.11  Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de diámetro 
B 7.4.3.12  Papel pH (intervalo de 6-8) con graduaciones máxim as de 0,4 unidades de pH para cambios de 
color 
B 7.4.3.13  Todo el material que tenga contacto con las muestr as bajo estudio debe esterilizarse mediante: 
B 7.4.3.14  Horno, durante 2 horas a 170-175ºC o autoclave, du rante 15 min como mínimo a 121ºC ± 1ºC 
B 7.4.4 Equipo  
B 7.4.4.1  Horno para esterilizar que alcance los 180ºC 
B 7.4.4.2  Incubadora con termostato para evitar variaciones mayores de ± 0,1ºC y termómetro 
B 7.4.4.3  Autoclave con termómetro o manómetro, probado con termómetro de máximas 
B 7.4.4.4  Baño maría con termostato y termómetro 
B 7.4.4.5  Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g 
B 7.4.4.6  Licuadora de una o dos velocidades controladas por  un reóstato, con vasos esterilizables (vidrio 
o aluminio) 
B 7.4.4.7  Mecheros Bunsen o Fisher 
B 7.4.4.8  Potenciómetro 
B.7.4.5 Procedimiento 
Los siguientes métodos se basan en el análisis de 2 5 g de la muestra analítica en una proporción de 1: 9 
de muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse siem pre que se mantenga la misma proporción. Se 
recomienda una muestra de 25 g o más. 
B 7.4.5.1 Procedimiento general para la preparación de muestr as 
B 7.4.5.1.1  Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso estéril de licuadora o en bolsa estéril para 
trabajar en homogeneizador peristáltico (stomacher) . Adicionar 225 mL del medio de preenriquecimiento 
estéril (generalmente caldo lactosado, a menos que se indique otro) y licuar si es necesario durante u n min. 
B 7.4.5.1.2  Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a  un recipiente estéril de boca ancha con 
tapón de rosca y dejar reposar por 60 min a tempera tura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar b ien y 
determinar el pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6,8 ± 0,2 con hidróxido de  sodio 
1N o ácido clorhídrico 1N estériles. Mezclar y cubr ir el recipiente enroscando suavemente la tapa. Inc ubar 24 
± 2 h a 35ºC. Continuar como se indica en el punto i) del numeral 7.4.5.2 
B 7.4.5.2 Aislamiento de Salmonella 
B 7.4.5.2.1 Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces  con los cultivos de preenriquecimiento y 
agitar suavemente, transferir respectivamente 1 mL de la mezcla a un tubo que contenga 10 mL de caldo 
tetrationato y a otro con 10 mL de caldo selenito c istina. Como alternativa, en sustitución del caldo tetrationato 
puede emplearse el medio Vassiliadis-Rappaport. 
B 7.4.5.2.2 Incubar de 18 a 24 h a 35ºC o, para alimentos fuert emente contaminados a 42ºC por el mismo 
periodo. Estriar los productos que fueron directame nte enriquecidos en medios selectivos. 
B 7.4.5.2.3 Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estria r en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), 
agar verde brillante (VB) y una tercera caja con cu alquiera de los medios selectivos adicionales (agar  entérico 
Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS). Efectu ar el mismo procedimiento para el caldo tetrationat o. 
Incubar las placas 24 ± 2 h a 35ºC. 
B 7.4.5.2.4 Examinar las placas para investigar la presencia de  colonias típicas de Salmonella, de acuerdo 
con las siguientes características: 
B 7.4.5.2.5  Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser tr ansparentes con o sin centro negro. En 
algunos casos las colonias pueden aparecer completa mente negras. 
B 7.4.5.2.6  Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser tra nsparentes rodeadas por medio enrojecido; 
las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colon ias amarillas. 
B 7.4.5.2.7  Agar entérico Hektoen: colonias verdes o azulverde s con o sin centro negro. En algunos casos 
las colonias pueden aparecer completamente negras.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
B 7.4.5.2.8  Agar Sulfito de Bismuto: las colonias típicas de Salmonella pueden ser cafés, grises o negras; 
con o sin brillo metálico. Generalmente el medio ci rcundante (halo) es café, tornándose posteriormente  negro. 
Algunas cepas producen colonias verdes sin la forma ción del halo oscuro. Si las placas no muestran col onias 
típicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h a dicionales. 
B 7.4.5.2.9  Agar SS: colonias translúcidas, ocasionalmente opa cas. Algunas colonias dan centro negro. 
Las colonias fermentadoras de la lactosa son rojas.  
B 7.4.5.3 Identificación bioquímica 
B 7.4.5.3.1 Seleccionar al menos dos colonias típicas de cada m edio selectivo, que se encuentren bien 
aisladas. Tocar levemente el centro de cada colonia  e inocular dos tubos, uno con agar triple azúcar h ierro 
(TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), por estr ía en la superficie inclinada y por punción en el f ondo. Incubar 
por 24 ± 2 h a 35ºC. Almacenar en refrigeración de 5 a 8ºC las placas con medios selectivos por si es 
necesario retomar más colonias. Observar el crecimi ento en los tubos y considerar presuntivamente posi tivas 
para Salmonella las colonias que den las siguientes reacciones: 
B 7.4.5.3.2 Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentación de la 
glucosa; en la superficie del medio se observa un c olor rojo más intenso que el medio original debido a la no 
fermentación de la lactosa ni de la sacarosa. En la  mayoría de los casos se observa coloración negra a  lo 
largo de la punción debido a la producción de ácido  sulfihídrico. 
B 7.4.5.3.3 Agar LIA, se observa intensificación del color púrp ura en todo el tubo por la descarboxilación 
de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivo s que produzcan claramente color amarillo en el fon do del 
agar. La mayoría de las cepas de Salmonella  spp.  producen ácido sulfihídrico en este medio con 
ennegrecimiento a lo largo de la punción. 
B 7.4.5.3.4 Retener todos los cultivos que muestren las reaccio nes características de Salmonella en los 
medios TSI y LIA para las pruebas adicionales, indi cadas en el punto B.7.4.5.3.5. 
B 7.4.5.3.5 Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones en LIA 
típicos, deben trabajarse como cultivos presuntivos  positivos, ya que en estos casos, el medio LIA per mitirá 
detectar S. arizonae y cepas atípicas de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solament e los 
cultivos que muestren reacciones atípicas en ambos medios. 
B 7.4.5.3.6 Continuar el análisis a partir de los tubos de TSI con reacciones típicas. Si el cultivo presenta 
reacciones atípicas en este medio, tomar colonias a dicionales de las placas de donde se obtuvo el cult ivo 
atípico anterior y sembrar las pruebas bioquímicas nuevamente. 
B 7.4.5.3.7 Continuar la identificación bioquímica y serológica  a partir de los cultivos recuperados de TSI. 
Se recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analítica seleccionando colonias proceden tes de 
ambos medios de enriquecimiento. 
B 7.4.5.3.8 Prueba de ureasa 
B 7.4.5.3.8.1 Prueba de ureasa (convencional). 
Con un asa estéril, tomar crecimiento del cultivo p resumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e  
inocular tubos de caldo urea. Utilizar un control d e medio para comparar el vire púrpura de las reacci ones 
positivas con el color del medio original. Incubar 24 ± 2 h a 35ºC. 
B 7.4.5.3.8.2 Prueba de ureasa (rápida). Tomar dos asadas de crec imiento del cultivo presumiblemente 
positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos  de caldo urea (rápida). Incubar 2 h a 37 ± 0,5ºC e n baño 
de agua. 
B 7.4.5.3.8.3 Descartar todos los cultivos que den ureasa positiv a. Retener los cultivos que den la prueba 
negativa (sin cambio de color del medio). 
B 7.4.5.4 . Identificación serológica 
B 7.4.5.4.1 Ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella (Antisuero polivalente O) 
B 7.4.5.4.1.1 Colocar con una asa dos gotas separadas de solución  salina estéril sobre un portaobjetos o 
en dos secciones de una placa para aglutinación. Su spender en cada una de las gotas, una porción del c ultivo 
desarrollado en TSI. 
B 7.4.5.4.1.2 Agregar a una de ellas una gota del antisuero poliv alente somático (O) y mezclar con el 
canto del asa o empleando aplicadores de madera. 
B 7.4.5.4.1.3 Agitar inclinando la lámina hacia atrás y hacia ade lante durante aproximadamente un min. 
Observar bajo buena iluminación sobre un fondo oscu ro. 
B 7.4.5.4.1.4 Considerar cualquier grado de aglutinación como pos itiva. 
La prueba positiva resulta cuando se presenta aglut inación en la gota con el cultivo y el antisuero y no 
aglutinación en la gota que contiene el cultivo y l a solución salina. Si se observa aglutinación en am bas gotas, 
la prueba no es definitiva y se debe continuar con las pruebas bioquímicas complementarias. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 7.4.5.4.1.5 Cuando la aglutinación es positiva con el suero pol ivalente O, puede determinarse el 
subgrupo empleando antisueros para los diferentes s ubgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los má s 
frecuentes). 
B 7.4.5.4.1.6 Si la aglutinación con el antisuero O es negativa, utilizar antisuero Vi y efectuar la prueba. Si 
hay aglutinación con Vi calentar el cultivo a ebull ición y repetir la aglutinación con el antisuero po livalente O. 
B 7.4.5.4.1.7 Si no se cuenta con los sueros grupoespecíficos, so licitar la tipificación de la cepa al 
Laboratorio de Enterobacterias del Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia de la Secretaría de Sal ud o  
al Laboratorio Nacional de Salud Pública. 
B 7.4.5.4.2 Si se requiere, practicar el ensayo de los antígeno s flagelares de Salmonella (Antisuero 
polivalente H). 
B 7.4.5.4.2.1 Inocular el crecimiento del tubo de TSI en agar inf usión de cerebro corazón e incubar de 4 a 
6 h a 35ºC hasta que se observe crecimiento (para e nsayo en el mismo día), o bien, en caldo soya 
tripticaseina e incubar por 24 ± 2 h a 35ºC (para e nsayo al día siguiente). Adicionar 2,5 mL de soluci ón salina 
formalizada a 5 mL del cultivo en caldo o al cultiv o en agar cerebro corazón (BHI). 
B 7.4.5.4.2.2 Colocar 0,5 mL del antisuero polivalente flagelar ( H) preparado en un tubo para serología (13 
x 100 mm aproximadamente). Adicionar 0,5 mL del cul tivo formalizado. Preparar un control de solución s alina 
mezclando 0,5 mL de solución salina formalizada con  0,5 mL del antígeno formalizado. Incubar las mezcl as en 
baño de agua a 48-50ºC. Observar a intervalos de 15  min por espacio de una h. Una prueba positiva es 
cuando se observa aglutinación en la mezcla de prue ba pero no en el control. Debe interpretarse como 
negativa una prueba en la que ninguna de las mezcla s muestre aglutinación. Cuando ambas mezclas se 
aglutinan, se considera la prueba inespecífica. 
B 7.4.5.5 Pruebas bioquímicas complementarias 
Cuando las pruebas serológicas o bioquímicas inicia les, dan resultados atípicos o no concluyentes, 
realizar las pruebas que se describen a continuació n. Inocular los cultivos positivos provenientes de TSI y LIA 
en: medio SIM, agar citrato de Simmons, caldo manit ol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para confirma r la 
presencia de la especie S. arizonae. 
Interpretar los cambios en los medios inoculados co nforme lo siguiente: 
B 7.4.5.5.1 Agar citrato Simmons 
Inocular por estría el tubo. 
Incubar 96 ± 2 h a 35 ± 2ºC. 
Prueba positiva: crecimiento acompañado de un cambi o de color de verde a azul. 
Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin camb io de color. 
B 7.4.5.5.2 Medio SIM 
Inocular por punción. 
Incubar 24 h a 35 ± 2ºC. 
B 7.4.5.5.2.1  Movilidad. 
Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la punci ón y en el seno del medio de cultivo. 
Prueba negativa: crecimiento a lo largo de la punci ón exclusivamente. 
B 7.4.5.5.2.2  Producción de ácido sulfihídrico. 
Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la punción que puede extenderse a todo el 
medio. 
Prueba negativa: ausencia de color negro. 
B 7.4.5.5.2.3  Producción de indol 
Adicionar al tubo con medio SIM que presente crecim iento de 0,2 a 0,3 mL de reactivo de Kovac. 
Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color r ojo. 
Prueba negativa: sin cambio de color. 
B 7.4.5.5.3 Caldo RM-VP 
Inocular un tubo con el medio. 
Incubar 48 ± 2 h a 35 ± 2ºC para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM. 
B 7.4.5.5.3.1 Prueba de Voges-Proskauer (VP) 
Transferir a un tubo un mL del cultivo de 48 h. 
Adicionar 0,6 mL de solución de alfa naftol. 
Adicionar 0,2 mL de solución de hidróxido de potasi o 40%. 
Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional ). 
Interpretar los resultados después de incubar 2 h a  35 ± 2ºC o 4 h a temperatura ambiente. 
Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo.  
Prueba negativa: sin cambio de color. 
Reincubar el resto del medio RM-VP 48 h más a 35 ± 2ºC.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
B 7.4.5.5.3.2 Prueba de rojo de metilo (RM) 
Adicionar al medio de cultivo de 96 h de incubación  de dos a tres gotas de solución de rojo de metilo.  
Interpretar los resultados inmediatamente. 
Prueba positiva: desarrollo de color rojo. 
Prueba negativa: desarrollo de color amarillo. 
B 7.4.5.5.4 Caldo malonato 
Inocular un tubo conteniendo el medio. 
Incubar 40 ± 2 h a 35 ± 2ºC. 
Prueba positiva: desarrollo de color azul. 
Prueba negativa: sin cambio de color. 
B 7.4.5.5.5 Caldo manitol 
Inocular un tubo conteniendo el medio. 
Incubar 24 ± 2 h a 35 ± 2ºC. 
Prueba positiva: desarrollo de color amarillo. 
Prueba negativa: sin cambio de color. 
B 7.4.5.5.6 Consultar los resultados obtenidos en el cuadro 2 p ara la identificación de los géneros de las 
bacterias investigadas. 
Nota:  los sistemas bioquímicos comerciales validados pued en ser usados como alternativa para las 
pruebas bioquímicas convencionales. 
B 7.4.6 Cálculo y expresión de resultados 
B 7.4.6.1 Interpretación de reacciones bioquímicas y serológi cas. 
CUADRO 1 
Reacciones bioquímicas Reacciones serológicas Inter pretación 
Típica Antígeno O, Vi o H positivo Cepas considerad as como 
Salmonella spp . 
Típica Todas las reacciones negativas  
Típica No probada Puede ser Salmonella  
Reacciones atípicas Antígeno O, Vi o H positivo  
Reacciones atípicas Todas las reacciones negativas No debe ser considerada 
Salmonella  
Nota: ver figura 1 
CUADRO 2 
Prueba o sustrato Positivo Negativo Reacción 
Glucosa (TSI) Amarillo Rojo + 
Lisina descarboxilasa (LIA) Púrpura Amarillo + 
H2S (TSI y LIA) Negro No negro + 
Ureasa Rojo- púrpura No hay cambio de color - 
Caldo de lisina descarboxilasa Púrpura Amarillo + 
Caldo dulcitol rojo de fenol Amarillo o gas No hay cambio de color ni gas + b 
Caldo KCN Crecimiento No hay crecimiento - 
Caldo malonato Azul No hay cambio de color - c 
Prueba de indol Superficie color violeta Superficie  color amarillo - 
Prueba del antígeno flagelar Aglutinación No hay ag lutinación + 
Prueba del antígeno somático Aglutinación No hay ag lutinación + 
Caldo lactosa rojo fenol Amarillo o gas No hay camb io de color ni gas - c 
Caldo sacarosa rojo fenol Amarillo o gas No hay cam bio de color ni gas - 
Prueba Voges- proskauer De rosa a rojo No hay cambi o de color - 
Prueba rojo de metilo Rojo difuso Amarillo difuso +  
Citrato de Simmons Crecimiento color azul No hay cr ecimiento, no hay 
cambio de color v 
a +, 90% o más positivos en 1 o 2 días; -, 90% o má s negativas en 1 o 2 días; v, variable. 
b La mayoría de los cultivos S. arizonae son negativos. 
c La mayoría de los cultivos S. arizonae son positivos. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 7.4.6.2  Informe de resultados 
Informar: presencia o ausencia de Salmonella spp . en __________ g o ____________ mL de muestra. 
Figura 1 
DIAGRAMA DE FLUJO PARA LA IDENTIFICACION DE SALMONE LLA       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
 Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
 
B 7.5 Determinación de bacterias coliformes. Técnica del número más probable 
B 7.5.1 Fundamento 
El método se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a 35 ± 1° C durante 2 4 
a 48 horas, resultando una producción de ácidos y g as el cual se manifiesta en las campanas de 
fermentación. 
B 7.5.2 Reactivos 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben  ser grado analítico. Cuando se indique agua debe 
entenderse como agua destilada con pH cercano a la neutralidad. 
B 7.5.2.1 Soluciones diluyentes 
B 7.5.2.1.1  Solución reguladora de fosfatos (solución concentr ada) 
Ingredientes Cantidades 
Fosfato monopotásico 34,0 g 
Agua  1,0 l 
 
Preparación: 
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1 N. 
Llevar a un litro con agua. 
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0 ° C. 
Conservar en refrigeración (solución concentrada). 
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a  un litro con agua. 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se r equiera. 
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1 ° C. 
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes  finales de la solución de trabajo deben ser iguale s a 
los iniciales. 
B 7.5.2.1.2  Agua peptonada 
Ingredientes Cantidades 
Peptona  1,0 g 
Cloruro de sodio 8,5 g 
Agua  1,0 l 
 
Preparación: 
Disolver los componentes en un litro de agua. 
Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1 N. 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualq uier volumen múltiplo de nueve según se requiera. 
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0 ° C. 
Después de la esterilización los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los 
iniciales. Si este diluyente no es usado inmediatam ente, almacenar en lugar obscuro a una temperatura entre 
0 a 5 ° C por un tiempo no mayor de un mes, en condi ciones tales que no alteren su volumen o composició n. 
B 7.5.2.2 Medios de cultivo. 
Caldo lactosado (medio de enriquecimiento para agua  potable y hielo). 
Caldo lauril sulfato triptosa (medio de enriquecimi ento selectivo). 
Caldo lactosa bilis verde brillante (medio de confi rmación). 
En el caso del análisis de agua potable y hielo pue de utilizarse caldo lactosado o caldo lauril sulfat o 
triptosa con púrpura de bromocresol (concentración 0,01 g/l de medio), como alternativa al uso de camp anas 
de fermentación. Los tubos positivos se manifiestan  por el vire del indicador a color amarillo.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
B 7.5.2.2.1  Caldo lactosado 
CUADRO 1  
Ingredientes Medio de concentración 1,5 Medio de co ncentración 
sencilla 
Extracto de carne 4,5 g 3,5 g 
Peptona de gelatina 7,5 g 5,0 g 
Lactosa 7,5 g 5,0 g 
Agua destilada 1000 mL 1000 mL 
Disolver los ingredientes en 1 l de agua, calentand o si es necesario o el medio completo deshidratado,  
siguiendo las instrucciones del fabricante. 
Ajustar el pH final de tal manera que después de la  esterilización éste sea de 6,9 ± 0,2 a 25 ° C. 
Distribuir en volúmenes de 10 mL en tubos con dimen siones de 16 x 160 mm el medio de concentración 
sencilla y de 20 mL en tubos de 20 x 200 mm el medi o de concentración 1,5, cada tubo debe tener campan a 
de fermentación. 
Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ± 1,0  ° C. 
Enfriar rápidamente para evitar una exposición exce siva al calor. El aspecto del caldo es claro y de c olor 
beige. 
Se puede utilizar una concentración doble del medio  de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 mL del 
caldo preparado, cuando se agreguen 10 mL de la mue stra. 
B 7.5.2.2.2  Caldo lauril sulfato triptosa. 
CUADRO 2 
Ingredientes Medio de concentración  1,5 Medio de c oncentración  
sencilla 
Triptosa 30 g 20 g 
Lactosa 7,5 g 5,0 g 
Fosfato dipotásico 4,125 g 2,75 g 
Fosfato monopotásico 4,125 g 2,75 g 
Cloruro de sodio 7,5 g 5,0 g 
Laurel sulfato de sodio 0,15 g 0,1 g 
Agua destilada 1000 mL 1000 mL 
 
Disolver los componentes en 1 l de agua, calentando  si es necesario o el medio de cultivo completo 
deshidratado, siguiendo las instrucciones del fabri cante. 
Ajustar el pH de tal manera que después de la ester ilización éste sea de 6,8 ± 0,2 a 25 ° C. 
Distribuir en volúmenes de 10 mL en tubos con dimen siones de 16 x 160 mm el medio de concentración 
sencilla y de 20 mL en tubos de 20 x 200 mm el medi o de concentración 1,5, cada tubo debe tener campan a 
de fermentación. 
Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ± 1,0  ° C. 
Se recomienda almacenar el medio una vez preparado.  
Las campanas de fermentación no deben de contener b urbujas de aire después de la esterilización. 
Se puede utilizar una concentración doble del medio  de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 mL de 
caldo preparado, cuando se agreguen 10 mL de muestr a. 
B 7.5.2.2.3  Caldo lactosa bilis verde brillante 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 10,0 g 
Lactosa 10,0 g Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
Sales biliares 20,0 g 
Verde brillante 0,013 g 
Agua 1,0 L 
 
Disolver los componentes o el medio completo deshid ratado en agua, calentar si es necesario. Ajustar e l 
pH, de tal manera que después de la esterilización éste sea de 7,2 a 25 ° C. 
Distribuir el medio en cantidades de 10 mL en tubos  de 16 X 160 mm conteniendo campana de 
fermentación. Esterilizar en autoclave por 15 minut os a 121 ± 1,0 ° C. 
Las campanas de fermentación no deben contener burb ujas de aire después de la esterilización. 
B 7.5.2.3 Materiales 
B 7.5.2.3.1  Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 11 y 2 mL), con tapón de 
algodón. 
B 7.5.2.3.2 Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes igual es a una décima de su volumen total. 
B 7.5.2.3.3  Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca. 
B 7.5.2.3.4  Utensilios esterilizables para la obtención de mue stras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, 
espátulas, etc. 
B 7.5.2.3.5  Tubos de cultivo 20 x 200 mm y de 16 x 160 mm con tapones metálicos o de rosca. 
B 7.5.2.3.6  Campanas de fermentación (tubos de Durham). 
B 7.5.2.3.7  Pipetas bacteriológicas graduadas de 10 y 1 mL. 
B 7.5.2.3.8  Gradillas. 
B 7.5.2.3.9  Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de diámetro. 
B 7.5.2.3.10  Todo el material que tenga contacto con las muestr as bajo estudio debe esterilizarse 
mediante: 
B 7.5.2.3.11  Horno, durante 2 horas a 170 a 175 ° C o 1 h a 180 ° C o autoclave, durante 15 minutos como 
mínimo a 121 ± 1,0 ° C. 
B 7.5.2.3.12  El material de vidrio puede sustituirse por materi al desechable que cumpla con las 
especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por las esterilizaciones repetidas  y éste 
debe ser químicamente inerte. 
B 7.5.2.4 Aparatos e instrumentos  
B 7.5.2.4.1  Horno para esterilizar que alcance una temperatura  mínima de 170 ° C. 
B 7.5.2.4.2  Incubadora con termostato que evite variaciones ma yores de ± 1,0 ° C, provista con termómetro 
calibrado. 
B 7.5.2.4.3  Termómetro de máximas y mínimas. 
B 7.5.2.4.4  Autoclave que alcance una temperatura mínima de 12 1 ± 1,0 ° C. 
B 7.5.2.4.5  Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidade s de pH a 25 ° C. 
B 7.5.2.5 Preparación de la muestra 
Seguir el procedimiento como lo indica el punto B.7 .1 “Procedimiento para la preparación y dilución de  
muestras de alimentos para su análisis microbiológi cos”. 
B 7.5.2.6 Procedimiento 
B 7.5.2.6.1 Para agua potable y hielo 
B 7.5.2.6.1.1 Prueba presuntiva 
B 7.5.2.6.1.1.1  Inoculación. Agitar la muestra. Transferir volúmen es de 10 mL de muestra a cada uno de 5 
tubos con 20 mL de caldo lactosado de mayor concent ración y 1,0 mL y 0,1 mL de muestra a cada uno de l os 
tubos de las series de 5 respectivamente con 10 mL de caldo lactosado de concentración sencilla o cald o 
laurel sulfato triptosa con púrpura de bromocresol.  
B 7.5.2.6.1.1.2  Incubación. Incubar los tubos a 35 ° C. Examinar a las 24 ± 2 h y observar si hay formación 
de gas o la formación de gas no se observa en este tiempo, incubar por 48 ± 2 h. 
B 7.5.2.6.1.2 Prueba confirmativa       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
De cada tubo que muestre formación de gas, tomar un a azada y sembrar en un número igual de tubos con 
medio de confirmación, caldo lactosa lauril bilis v erde brillante. Incubar a 35 ± 0,5 ° C por 24 ± 2 ho ras o si la 
formación de gas no se observa en este tiempo, incu bar por 48 ± 2 horas. 
En esta Norma Oficial Mexicana, para el análisis de  agua potable, agua purificada así como hielo, se 
emplea la serie de 5 tubos inoculados, 5 tubos con 10 mL, 5 tubos con 1 mL y 5 tubos con 0,1 mL, véase  el 
cuadro 4. 
B 7.5.2.6.2 Para sólidos. 
Preparar suficiente número de diluciones para asegu rar que todos los tubos correspondientes a la últim a 
dilución rindan un resultado negativo. 
B 7.5.2.6.2.1 Prueba presuntiva 
B 7.5.2.6.2.1.1  Inoculación. Tomar tres tubos de medio de enriquec imiento de mayor concentración. Usar 
una pipeta estéril para transferir a cada tubo 10 m L de la muestra si es líquida o 10 mL de la dilució n primaria 
inicial, en el caso de otros productos. 
B 7.5.2.6.2.1.2 Tomar tres tubos de concentración sencilla del medi o selectivo de enriquecimiento. Usar 
una pipeta estéril para transferir a cada uno de es tos tubos 1 mL de la muestra si es líquida o 1 mL d e la 
dilución primaria en el caso de otros productos. 
B 7.5.2.6.2.1.3  Para las diluciones subsecuentes, continuar como s e indica en el párrafo anterior, usando 
una pipeta diferente para cada dilución. Mezclar su avemente el inóculo con el medio. 
B 7.5.2.6.2.1.4 Incubación. Incubar los tubos a 35 ± 0,5 ° C por 24 ± 2 horas y observar si hay formación de 
gas, en caso contrario prolongar la incubación hast a 48 ± 2 horas. 
B 7.5.2.6.2.2 Prueba confirmativa 
De cada tubo que muestre formación de gas, tomar un a azada y sembrar en un número igual de tubos con 
medio de confirmación. Incubar a 35 ± 0,5 ° C por 24  ± 2 horas o si la formación de gas no se observa e n este 
tiempo, prolongar la incubación por 48 ± 2 horas. 
En esta Norma Oficial Mexicana se considera una com binación de tres tubos por cada dilución de la seri e. 
Para algunos productos y siempre que se requiera un a mayor precisión en los resultados, será necesario  
inocular una serie de cinco o diez tubos. 
B 7.5.2.7 Expresión de los resultados  
Tomar la serie de tubos de la prueba confirmativa q ue dé formación de gas después del periodo de 
incubación requerido y buscar el NMP en los cuadros  correspondientes. 
B 7.5.2.7.1 El cuadro 3 muestra algunos ejemplos que se pueden presentar. 
Ejemplos: Ejemplo 1. Cuando sólo una dilución muest ra tres tubos positivos, elegir ésta y las dilucion es 
mayores posteriores. 
B 7.5.2.7.2 Ejemplo 2. Cuando más de una dilución muestra tres tubos positivos y la última da menos de 
tres, elegir esta última y las dos diluciones anter iores más bajas. 
B 7.5.2.7.3 Ejemplo 3. Cuando en ninguna dilución hay tres tubo s positivos y éstos se encuentran en más 
de tres diluciones, seleccionar las dos diluciones mayores positivas y la siguiente. 
B 7.5.2.7.4  Ejemplos 4 y 5. Cuando los tubos positivos sólo se  encuentran en la muestra sin diluir (10 mL o 
1 g) y en la primera dilución (1 mL o 10-1 g), sele ccionar las tres primeras diluciones para el cálcul o del 
número más probable. En cada caso se obtiene un núm ero de tres cifras, lo cual es representado en los 
cuadros 4 al 7, según corresponda. En la columna qu e indica el número de tubos positivos se busca el í ndice 
del NMP. La técnica de NMP puede admitir gran canti dad de variaciones. Los resultados obtenidos con es ta 
técnica deben ser utilizados con precaución. Los lí mites de confianza están representados en los cuadr os 4 al 
7. Por ejemplo, para una muestra sólida con un NMP de 70 coliformes por gramo, los límites de confianz a en 
el 95% de los casos variarán de 10 a 230 coliformes  por gramo (ejemplo 3 del cuadro 3) y en un product o con 
24 de NMP de coliformes por gramo, los límites de c onfianza son de 3,6 a 130 coliformes por gramo (eje mplo 
2 cuadro 3). Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
 
CUADRO 4. Indice del NMP y límites de confianza 95%  para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados varios números de tubos . (Diluciones 10, 1,0 y 0,1 g) 
Combinación 
de positivos Indice del 
NMP por g 3 tubos por dilución 
95 % límites de confianza  5 tubos por 
dilución 
Indice del 
NMP por g  95 % límites de confianza 
  bajo alto  bajo alto 
0-0-0 <0,03 <0,005 <0,09 <0,02 <0,005 <0,07 
0-0-1 0,03 <0,005 <0,09 0,02 <0,005 0,07 
0-1-0 0,03 <0,005 0,13 0,02 <0,005 0,07 
0-2-0 -- -- -- 0,04 <0,005 0,11 
1-0-0 0,04 <0,005 0,20 0,02 <0,005 0,07 
1-0-1 0,07 0,01 0,21 0,04 <0,005 0,11 
1-1-0 0,07 0,01 0,23 0,04 <0,005 0,11 
1-1-1 0,11 0,03 0,36 0,06 <0,005 0,15 
1-2-0 0,11 0,03 0,36 0,06 <0,005 0,15 
2-0-0 0,09 0,01 0,36 0,05 <0,005 0,13 
2-0-1 0,14 0,03 0,37 0,07 0,01 0,13 
2-1-0 0,15 0,03 0,44 0,07 0,01 0,17 
2-1-1 0,20 0,07 0,89 0,09 0,02 0,17 
2-2-0 0,21 0,04 0,47 0,09 0,02 0,21 
2-2-1 0,28 0,10 1,50 -- -- 0,21 
2-3-0 -- -- -- 0,12 0,03 --       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
3-0-0 0,23 0,04 1,20 0,08 0,01 0,28 
3-0-1 0,39 0,07 1,3 0,11 0,02 0,19 
3-0-2 0,64 0,15 3,80 -- -- -- 
3-1-0 0,43 0,07 2,1 0,11 0,02 0,25 
3-1-1 0,75 0,14 2,3 0,14 0,04 0,34 
3-1-2 1,20 0,30 3,3 -- -- -- 
3-2-0 0,93 0,15 3,80 0,14 0,04 0,34 
3-2-1 1,50 0,30 4,40 0,17 0,05 0,46 
3-2-2 2,10 0,35 4,70 -- -- -- 
3-3-0 2,40 0,36 13,0 -- -- -- 
3-3-1 4,60 0,71 24,0 -- -- -- 
3-3-2 11,0 1,50 48,0 -- -- -- 
3-3-3 >11,0 >1,50 >48 -- -- -- 
4-0-0 ---   0,13 0,03 0,31 
4-0-1 ---   0,17 0,05 0,46 
4-1-0 ---   0,17 0,05 0,46 
4-1-1 ---   0,21 0,07 0,63 
4-1-2 ---   0,26 0,09 0,78 
4-2-0 ---   0,22 0,07 0,,67 
4-2-1 ---   0,26 0,09 0,78 
4-3-0 ---   0,27 0,09 0,80 
4-3-1 ---   0,33 0,11 0,93 
4-4-0 ---   0,34 0,12 0,93 
5-0-0 ---   0,23 0,07 0,70 
5-0-1 ---   0,31 0,11 0,89 
5-0-2 ---   0,43 0,15 1,14 
5-1-0 ---   0,33 0,11 0,93 
5-1-1 ---   0,46 0,16 1,2 
5-1-2 ---   0,63 0,21 1,5 
5-2-0 ---   0,49 0,17 1,3 
5-2-1 ---   0,70 0,23 1,7 
5-2-2 ---   0,94 0,28 2,2 
5-3-0 ---   0,79 0,25 1,9 
5-3-1 ---   1,10 0,31 2,5 
5-3-2 ---   1,4 0,37 3,4 Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
5-3-3 ---   1,80 0,44 5,0 
5-4-0 ---   1,30 0,35 3,0 
5-4-1 ---   1,70 0,43 4,9 
5-4-2 ---   2,20 0,57 7,0 
5-4-3 ---   2,80 0,90 8,5 
5-4-4 ---   3,50 1,20 10,0 
5-5-0 ---   2,40 0,68 7,5 
5-5-1 ---   3,50 1,60 10,0 
5-5-2 ---   5,40 1,80 14,0 
5-5-3 ---   9,20 3,0 32,0 
5-5-4 ---   16,09 6,40 58,0 
5-5-5 ---   -- -- -- 
 
CUADRO 5. Indice del NMP y límites de confianza 95%  para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados varios números de tubos . (Diluciones 1,0, 0,1 y 0,01 g) 
Combinación 
de positivos Indice del 
NMP por g 3 tubos por dilución 
95 % límites de confianza  5 tubos por 
dilución 
Indice del 
NMP por g  95 % límites de confianza 
  bajo alto  bajo alto 
0-0-0 <0,3 <0,05 <0,9 <0,2 <0,05 <0,7 
0-0-1 0,3 <0,05 <0,9 0,2 <0,05 0,7 
0-1-0 0,3 <0,05 1,3 0,2 <0,05 0,7 
0-2-0 -- -- -- 0,4 <0,05 0,11 
1-0-0 0,4 <0,05 2,0 0,2 <0,05 0,7 
1-0-1 0,7 0,1 2,0 0,4 <0,05 1,1 
1-1-0 0,7 0,1 2,3 0,4 <0,05 1,1 
1-1-1 1,1 0,3 3,6 0,6 <0,05 1,5 
1-2-0 1,1 0,3 3,6 0,6 <0,05 1,5 
2-0-0 0,9 0,1 3,6 0,5 <0,05 1,3 
2-0-1 1,4 0,3 3,7 0,7 0,1 1,7 
2-1-0 1,5 0,3 4,4 0,7 0,1 1,7 
2-1-1 2,0 0,7 8,9 0,9 0,2 2,1 
2-2-0 2,1 0,4 4,7 0,9 0,2 2,1 
2-2-1 2,8 1,0 15,0 -- -- -- 
2-3-0 -- -- -- 1,2 0,3 2,8       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
3-0-0 2,3 0,4 12,0 0,8 0,1 1,9 
3-0-1 3,9 0,7 13,0 1,1 0,2 2,5 
3-0-2 6,4 1,5 38,0 -- -- -- 
3-1-0 4,3 0,7 21,0 1,1 0,2 2,5 
3-1-1 7,5 1,4 23,0 1,4 0,4 3,4 
3-1-2 12,0 3,0 38,0 -- -- -- 
3-2-0 9,3 1,5 38,0 1,4 0,4 3,4 
3-2-1 15,0 3,0 44 1,7 0,5 4,6 
3-2-2 21,0 3,5 47 --- -- --- 
3-3-0 24,0 3,6 130 --- -- --- 
3-3-1 46,0 7,1 240 --- -- --- 
3-3-2 110 15,0 480 --- -- --- 
3-3-3 >110 >15,0 >480,0 --- -- --- 
4-0-0 ---   1,3 0,3 3,1 
4-0-1 ---   1,7 0,5 4,6 
4-1-0 ---   1,7 0,5 4,6 
4-1-1 ---   2,1 0,7 6,3 
4-1-2 ---   2,6 0,9 7,8 
4-2-0 ---   2,2 0,7 6,7 
4-2-1 ---   2,6 0,9 7,8 
4-3-0 ---   2,7 0,9 8,0 
4-3-1 ---   3,3 1,1 9,3 
4-4-0 ---   3,4 1,2 9,3 
5-0-0 ---   2,3 0,7 7,0 
5-0-1 ---   3,1 1,1 8,9 
5-0-2 ---   4,3 1,5 11,4 
5-1-0 ---   3,3 1,1 9,3 
5-1-1 ---   4,6 1,6 12,0 
5-1-2 ---   6,3 2,1 15,0 
5-2-0 ---   4,9 1,7 13,0 
5-2-1 ---   7,0 2,3 17,0 
5-2-2 ---   9,4 2,8 22,0 
5-3-0 ---   7,9 2,5 19,0 
5-3-1 ---   11,0 3,1 25,0 Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
5-3-2 ---   14,0 3,7 34,0 
5-3-3 ---   18,0 4,4 50,0 
5-4-0 ---   13,0 3,5 30,0 
5-4-1 ---   17,0 4,3 49,0 
5-4-2 ---   22,0 5,7 70,0 
5-4-3 ---   28,0 9,0 85,0 
5-4-4 ---   35,0 12,0 100,0 
5-5-0 ---   24,0 6,8 75,0 
5-5-1 ---   35,0 12,0 100,0 
5-5-2 ---   54,0 18,0 140,0 
5-5-3 ---   92,0 30,0 320,0 
5-5-4 ---   161,0 64,0 580,0 
5-5-5 ---   >161,0 >64,0 >580,0 
CUADRO 6. Indice del NMP y límites de confianza 95%  para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados varios números de tubos . (Diluciones 0,1, 0,01 y 0,001 g) 
Combinación 
de positivos Indice del 
NMP por g 3 tubos por dilución 95 % 
límites de confianza  5 tubos por 
dilución 
Indice del 
NMP por g  95 % límites de confianza 
  bajo alto  bajo alto 
0-0-0 <3 <0,5 <9 <2 <0,5 <7 
0-0-1 3 <0,5 9 2 <0,5 7 
0-1-0 3 <0,5 13 2 <0,5 7 
0-2-0 -- -- -- 4 <0,5 11 
1-0-0 4 <0,5 20 2 <0,5 7 
1-0-1 7 1 21 4 <0,5 11 
1-1-0 7 1 23 4 <0,5 11 
1-1-1 11 3 36 6 <0,5 15 
1-2-0 11 3 36 6 <0,5 15 
2-0-0 9 1 36 5 <0,5 13 
2-0-1 14 3 37 7 1,0 17 
2-1-0 15 3 44 7 1,0 17 
2-1-1 20 7 89 9 2,0 21 
2-2-0 21 4 47 9 2,0 21 
2-2-1 28 10 150 -- -- -- 
2-3-0 -- -- -- 12 3,0 28       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
3-0-0 23 4 120 8 1,0 19 
3-0-1 39 7 13 11 2,0 25 
3-0-2 64 15 380 -- -- -- 
3-1-0 43 7 210 11 2,0 25 
3-1-1 75 14 230 14 4,0 34 
3-1-2 120 30 380 -- -- -- 
3-2-0 93 15 380 14 4,0 34 
3-2-1 150 30 440 17 5,0 46 
3-2-2 210 35 470 --- -- -- 
3-3-0 240 36 130 --- -- -- 
3-3-1 460 71 240 --- -- -- 
3-3-2 1100 150 480 --- -- -- 
3-3-3 >1100 >150 >480 --- -- -- 
4-0-0 ---   13 3,0 31 
4-0-1 ---   17 5,0 46 
4-1-0 ---   17 5,0 46 
4-1-1 ---   21 7,0 63 
4-1-2 ---   26 9,0 78 
4-2-0 ---   22 7,0 67 
4-2-1 ---   26 9,0 78 
4-3-0 ---   27 9,0 80 
4-3-1 ---   33 11,0 93 
4-4-0 ---   34 12,0 93 
5-0-0 ---   23 7,0 70 
5-0-1 ---   31 11,0 89 
5-0-2 ---   43 15,0 114 
5-1-0 ---   33 11,0 93 
5-1-1 ---   46 16,0 120 
5-1-2 ---   63 21,0 150 
5-2-0 ---   49 17,0 130 
5-2-1 ---   70 23,0 170 
5-2-2 ---   94 28,0 220 
5-3-0 ---   79 25,0 190 
5-3-1 ---   110 31,0 250 
5-3-2 ---   140 37,0 340 Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
5-3-3 ---   180 44,0 500 
5-4-0 ---   130 35,0 300 
5-4-1 ---   170 43,0 490 
5-4-2 ---   220 57,0 700 
5-4-3 ---   280 90,0 850 
5-4-4 ---   350 120,0 1000 
5-5-0 ---   240 68,0 750 
5-5-1 ---   350 120 1000 
5-5-2 ---   540 180 1400 
5-5-3 ---   920 300 3200 
5-5-4 ---   1600 640 5800 
5-5-5 ---   >1600 >640 >5800 
 
CUADRO 7. Indice del NMP y límites de confianza 95%  para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados varios números de tubos . Diluciones 0,01, 0,001 y 0,0001 g) 
Combinación 
de positivos Indice del 
NMP por g 3 tubos por dilución 95 % 
límites de confianza 5 tubos por 
dilución 
Indice del 
NMP por g 95 % límites de confianza 
  bajo alto  bajo alto 
0-0-0 <30 <5 <90 <20 <5 <70 
0-0-1 30 <5 <90 20 <5 70 
0-1-0 30 <5 130 20 <5 70 
0-2-0 -- -- -- 40 <5 110 
1-0-0 40 <5 200 20 <5 70 
1-0-1 70 10 210 40 <5 110 
1-1-0 70 10 230 40 <5 110 
1-1-1 110 30 360 60 <5 150 
1-2-0 110 30 360 60 <5 150 
2-0-0 90 10 360 50 <5 130 
2-0-1 140 30 370 70 10 170 
2-1-0 150 30 440 70 10 170 
2-1-1 200 70 890 90 20 210 
2-2-0 210 40 470 90 20 210 
2-2-1 280 100 1500 -- -- --       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
2-3-0 -- -- -- 120 30 280 
3-0-0 230 40 1200 80 10 190 
3-0-1 390 70 1300 110 20 250 
3-0-2 640 150 3800 -- -- -- 
3-1-0 430 70 2100 110 20 250 
3-1-1 750 140 2300 140 40 340 
3-1-2 1200 300 3800 -- -- -- 
3-2-0 930 150 3800 140 40 340 
3-2-1 1500 300 4400 170 50 460 
3-2-2 2100 350 4700 -- -- -- 
3-3-0 2400 360 13000 -- -- -- 
3-3-1 4600 710 24000 -- -- -- 
3-3-2 11000 1500 48000 -- -- -- 
3-3-3 >11000 >1500 >48000 -- -- -- 
4-0-0 --   130 30 310 
4-0-1 --   170 50 460 
4-1-0 --   170 50 460 
4-1-1 --   210 70 630 
4-1-2 --   260 90 780 
4-2-0 --   220 70 670 
4-2-1 --   260 90 780 
4-3-0 --   270 90 800 
4-3-1 --   330 110 930 
4-4-0 --   340 120 930 
5-0-0 --   230 70 700 
5-0-1 --   310 110 890 
5-0-2 --   430 150 1140 
5-1-0 --   330 110 930 
5-1-1 --   460 160 1200 
5-1-2 --   630 210 1500 
5-2-0 --   490 170 1300 
5-2-1 --   700 230 1700 
5-2-2 --   940 280 2200 
5-3-0 --   790 250 1900 Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
5-3-1 --   1100 310 2500 
5-3-2 --   1400 370 3400 
5-3-3 --   1800 440 5000 
5-4-0 --   1300 350 3000 
5-4-1 --   1700 430 4900 
5-4-2 --   2200 570 7000 
5-4-3 --   2800 900 8500 
5-4-4 --   3500 1200 10000 
5-5-0 --   2400 680 7500 
5-5-1 --   3500 1200 10000 
5-5-2 --   5400 1800 14000 
5-5-3 --   9200 3000 32000 
5-5-4 --   16000 6400 58000 
5-5-5 --   >16000 >6400 >58000 
B 7.5.2.8 Informe de la prueba 
B 7.5.2.8.1  Informar "Número más probable (NMP) de coliformes por gramo o mililitro de muestra". 
B 7.5.2.8.2  En caso de muestras de agua informar NMP/100 mL. 
B 7.6 De la estimación de la densidad microbiana por la t écnica del número más probable. Determinación 
de bacterias coliformes, coliformes fecales y E scherichia coli por la técnica de diluciones en tubo múltiple. 
B 7.6.1  Fundamento. 
Se basa en la dilución de la muestra en tubos múlti ples, de tal forma que todos los tubos de la menor 
dilución sean positivos y todos los tubos de la dil ución más alta sean negativos. El resultado positiv o se 
demuestra por la presencia de gas o crecimiento mic robiano. 
Para obtener el Número Más Probable (NMP) en los re sultados se aplica la teoría de la probabilidad, lo  
cual tiene como condición lo siguiente: 
B 7.6.1.1  Una distribución aleatoria de las bacterias que ex isten en la muestra. 
B 7.6.1.2  Las bacterias se encuentran como entidades no agru padas. 
B 7.6.1.3  Los microorganismos presentes en la muestra crecer án en el medio, cuando son incubados y se 
mantengan en las condiciones adecuadas para su desa rrollo. 
Si se espera una cuenta microbiana alta, la muestra  deberá diluirse para dar cumplimiento a las 
condiciones. La forma más común de realizar esta pr ueba es mediante diluciones decimales y usando un 
inóculo en series de 3, 5 o 10 tubos en serie. A me dida que el número de tubos inoculados para cada di lución 
aumentan se reducen los límites de confianza. 
B 7.6.2 Procedimientos. 
B 7.6.2.1  Uso de tablas de NMP con 95% de límite de confianz a. 
B 7.6.2.1.1  Las tablas 1-3 presentan la estimación estadística  de los valores del NMP que corresponden al 
95% de límite de confianza cuando se utilizan 3, 5 y 10 tubos. Otras combinaciones de resultados posit ivos y 
negativos no encontrados en estas tablas, tienen mu y baja probabilidad de que se presenten. Si los res ultados 
no están incluidos en las tablas, se  deberá repetir la prueba a partir  de la muestra original. Si no es posible, el 
NMP se puede obtener (para las combinaciones de 3 y  5 tubos) de las tablas 4 y 5; también se puede apl icar 
una ecuación para obtener el NMP aproximado.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
B 7.6.2.1.2  El intervalo del 95% de confianza se interpreta co mo sigue: si el analista supone que el número 
real de microorganismos cae dentro de los límites, entonces se asume que será correcto el 95% de las v eces. 
El valor del NMP tabulado representa un intervalo y  no un valor absoluto. 
B 7.6.2.1.3  Cuando se preparan más de 3 diluciones de una mues tra, el NMP deberá determinarse a partir 
de tres diluciones consecutivas (usando tablas 1-3) . Primero, para todas las diluciones que tengan tod os los 
tubos positivos, seleccionar la dilución mayor. Des pués usar las 2 siguientes diluciones mayores (A y B en las 
tablas 6 y 7). Cuando en ninguna de las diluciones probadas hubiera crecimiento en todos los tubos, 
seleccionar (si es posible) las primeras tres diluc iones consecutivas (volumen de muestra) para que la  dilución 
media contenga resultados positivos (C de tablas 6 y 7). 
B 7.6.2.1.4  Con frecuencia es necesario el NMP desde el inicio  con volúmenes diferentes de los enlistados 
en las tablas 1-5. Si el volumen de muestra es mayo r que 0,01 g multiplicar el NMP enlistado en la tab la por 
10. El resultado de una determinación de 5 tubos qu e dé 3 tubos positivos en 0,01 g; 2 tubos positivos  en 
0,001 g y 1 tubo positivo en 0,0001 g (3-2-1) leer en la tabla No. 2 como 17 y multiplicar por 10 para  así 
obtener 170 como el NMP actual por gramo de muestra . De igual forma si la cantidad más grande utilizad a 
para la tabla de referencia es 1 g en lugar de 0,1 g, dividir el NMP derivado de la tabla entre 10. Po r ejemplo el 
resultado de la determinación del NMP en 3 tubos pa ra Salmonella spp  que dé 3 tubos positivos en 1 g; 1 tubo 
positivo en 0,1 g y ningún positivo en 0,01 g (3-1- 0) leer en la tabla 1 como 43 y dividir entre 10, l o que da 4,3 
como el NMP presuntivo por gramo de muestra. 
B 7.6.2.1.5  Un método alternativo para obtener el número más p robable es usando la siguiente fórmula: 
(NMP/g de la tabla - 100) X factor de dilución del tubo de en medio = NMP/g 
Para calcular el NMP/100 g multiplicar por 100. 
B 7.6.2.2  Cálculo aproximado del NMP y 95% de límite de conf ianza. 
Debido a la inherente complejidad para calcular los  límites de confianza del NMP lo más común es el us o 
de tablas. Generalmente estas tablas están limitada s al uso de 3, 5 y 10 tubos por dilución, incluso u sando un 
método aceptado, pueden presentarse datos irregular es o accidentes de laboratorio que causan pérdida d e 1 
o más tubos de dilución. En este caso una serie de diluciones de por ejemplo: 5,4,4 puede dar una lect ura de 
5-2-0. Para estos casos se puede aplicar una fórmul a sencilla, la cual no corresponde exactamente con los 
resultados obtenidos teóricamente; sin embargo, las  desviaciones generalmente son pequeñas, esta fórmu la 
no debe ser aplicada para fines de regulación. La f órmula no restringe el número de tubos o las diluci ones y 
puede aplicarse para todo tipo de pruebas. El cálcu lo aproximado está dado por la siguiente ecuación: NMP/g 
= P/(N T )1/2  
Donde: P es el número de tubos positivos, N es la c antidad total de muestra (g) en todos los tubos 
negativos y T  es la cantidad total de muestra (g) en todos los t ubos. 
Por ejemplo, considerando que se tuvieran serie de diluciones al doble: 
MUESTRA (g) No. DE TUBOS No. DE TUBOS POSITIVOS 
8 
4 
2 
1 
0,5 
0,25 5 
5 
5 
5 
5 
5 5 
4 
2 
0 
1 
0 
 
El número de tubos positivos es: P = (5 + 4 + 2+ 1)  = 12; N  = (8x0) + (4x1) + (2x3) + (1x5) + (0,5x4) + 
(0,25x5) = 18,25; y T  = 5 (8+4+2+1+0,5+0,25) = 78,75 
NPM/g = 12/(18,25 x 78,75) 1/2  = 0,32/g o 32/100 g Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
Los límites de confianza del 95% estimados, pueden obtenerse del antilogaritmo de base 10 con la 
siguiente ecuación: 
log (NMP/g) 1,08 (log a)/n) 1/2  
Donde: a es el radio de dilución y n es el número d e tubos por dilución. Esta expresión asume que el r adio 
de dilución es diferente de 1:10 (por ejemplo 1:2).  Para diluciones de 1:10, la cantidad por restar o sumar 
deberá ser de 1,14(n) ½ para la mejor estimación. Si el número de tubos po r dilución (n i) es desigual (por 
ejemplo: un accidente de laboratorio) para la diluc ión k reemplazar n por la expresión n H (media armónica) por el 
número de tubos por dilución (n i). 
La media armónica se define como: 
nH = k / (1/ n i ) 
k es el número de diluciones. Por ejemplo: Suponien do que el resultado de 3 diluciones en n i fuera 5-4-4. 
Por lo tanto n H = 3/ (1/5) + (1/4) + (1/4)  ½ = 3/0,70 = 4,3 i 
Para el ejemplo anterior el NMP con n = 5 y un lími te de confianza aproximado de 95% será el siguiente : 
log 0,32 (1,08) (log 2)/5)  ½ 
-0,495 0,265 
Entonces el límite inferior es el antilogaritmo (-0 -76) = 0.17/g o 17/100 g y el límite inferior es el  
antilogaritmo (-0,23) = 0,59/g o 59/100 g. Cuando s e compara con las tablas el NMP podría ser 0,31/g c on 
límites de confianza de 0,16/g y 0,57/g. 
Tabla No. 1 Selección del NMP con un límite de conf ianza de 95% para la prueba de fermentación 
utilizando 3 tubos: con porciones de 0,1, 0,01 y 0, 001 g (mL) de muestra 
No. de tubos positivos  95% de límite de confianza 
0,1  0,01  0,001  NMP/g (mL) b Inferior Superior 
0 0 0 3 - - 
0 1 0 3+ 1 17 
1 0 0 4 1 21 
1 0 1 7+ 2 27 
1 1 0 7 2 28 
1 2 0 11+ 4 35 
2 0 0 9 2 38 
2 0 1 14+ 5 48 
2 1 0 15 5 50 
2 1 1 20+ 7 60 
2 2 0 21 8 62 
3 0 0 23 9 130 
3 0 1 39 10 180 
3 1 0 43 10 210 
3 1 1 75 20 280 
3 2 0 93 30 380 
3 2 1 150 50 500 
3 2 2 210+ 80 640 
3 3 0 240 90 1400 
3 3 1 460 100 2400 
3 3 2 1100 300 4800       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
3 3 3 1100 - - 
a Los resultados normales, obtenidos en un 95% de la s pruebas no están seguidos por un símbolo más 
(+). Menos del 4% de los resultados de las pruebas obtenidos están marcados por un símbolo más (+). 
Combinaciones de tubos positivos no encontrados en esta tabla se presentan en menos del 1% de las 
pruebas y si se presentaran con mayor frecuencia in dican un error de técnica o que el valor del número  más 
probable se encuentra en el límite. El NMP de combi naciones que no aparecen en la tabla, se puede obte ner 
por extrapolación a la combinación cercana más elev ada. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por 10 0 para expresarlos como NMP/100 g (mL). 
Tabla No. 2 Selección del NMP con un límite de conf ianza de 95% para la prueba de fermentación 
utilizando 5 tubos: con porciones de 0,1, 0,01 y 0, 001 g (mL) de muestra a 
No. de tubos positivos  95% de límite de confianza 
0,1  0,01  0,001  NMP/g (mL) b Inferior Superior 
      
0 0 0 2 - - 
0 0 1 2+ 1 10 
0 1 0 2 1 10 
1 0 0 2 1 11 
1 0 1 4+ 1 15 
1 1 0 4 1 15 
1 2 0 6+ 2 18 
2 0 0 4 1 17 
2 0 1 7+ 2 20 
2 1 0 7 2 21 
2 1 1 9+ 3 25 
2 2 0 9 3 25 
3 0 0 8 3 24 
3 0 1 11 4 29 
3 1 0 11 4 30 
3 1 1 14+ 6 35 
3 2 0 14 6 35 
3 2 1 17+ 7 40 
3 3 0 17+ 7 41 
4 0 0 13 5 38 
4 0 1 17 7 45 
4 1 0 17 7 46 
4 1 1 21 9 55 
4 2 0 22 9 56 
4 2 1 26+ 12 65 
4 3 0 27 12 67 
4 3 1 33+ 15 77 
4 4 0 34+ 16 80 
5 0 0 23 9 68 
5 0 1 31 13 110 
5 1 0 33 14 120 
5 1 1 46 20 150 
5 1 2 63+ 22 180 
5 2 0 49 21 170 
5 2 1 70 30 210 Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
5 2 2 94+ 40 250 
5 3 0 79 30 250 
5 3 1 110 40 300 
5 3 2 140 60 360 
5 4 0 130 50 390 
5 4 1 170 70 480 
5 4 2 220 100 580 
5 4 3 280+ 120 690 
5 4 4 350+ 160 820 
5 5 0 240 100 940 
5 5 1 350 100 1300 
5 5 2 540 220 2000 
5 5 3 920 300 2900 
5 5 4 1600 600 5300 
5 5 5 1600 - - 
a Los resultados normales, obtenidos en un 95% de las  pruebas, no están seguidos por un símbolo 
más(+). Menos del 4% de los resultados de las prueb as obtenidos están marcados por un símbolo más (+).  
Combinaciones de tubos positivos no encontrados en esta tabla se presentan en menos del 1% de las 
pruebas y si se presentaran con mayor frecuencia in dican un error de técnica o que el valor del número  más 
probable se encuentra en el límite. El NMP de combi naciones que no aparecen en la tabla, se pueden obt ener 
por extrapolación a la combinación cercana más elev ada. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por 10 0 para expresarlos como NMP/100 g (mL). 
Tabla No. 3 Selección del NMP con un límite de conf ianza de 95% para la prueba de fermentación 
utilizando 10 tubos: con porciones de 0,1, 0,01 y 0 ,001 g (mL) de muestra a. 
No. de tubos positivos  95% de límite de confianza 
0,1  0,01  0,001  NMP/g (mL) b Inferior Superior 
0 0 0 1 - - 
0 0 1 1+ 1 5 
0 1 0 1 1 5 
0 2 0 2+ 1 7 
1 0 0 1 1 5 
1 0 1 2+ 1 7 
1 1 0 2 1 7 
1 2 0 3+ 1 8 
2 0 0 2 1 7 
2 0 1 3+ 1 9 
2 1 0 3 1 9 
2 1 1 4+ 1 10 
2 2 0 4 2 10 
2 3 0 5+ 2 12 
3 0 0 3 1 9 
3 0 1 4 2 11 
3 1 0 4 2 11 
3 1 1 5+ 2 13       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
3 2 0 5 2 13 
3 2 1 6+ 3 14 
3 3 0 6+ 3 14 
4 0 0 4 2 12 
4 0 1 6 2 13 
4 1 0 6 2 14 
4 1 1 7 3 15 
4 2 0 7 3 15 
4 2 1 8 4 17 
4 3 0 8 4 17 
4 4 0 9+ 5 19 
5 0 0 6 2 15 
5 0 1 7 3 16 
5 1 0 7 3 17 
5 1 1 9 4 18 
5 2 0 9 4 18 
5 2 1 10+ 5 20 
5 3 0 10 5 20 
5 3 1 11+ 6 22 
5 4 0 11+ 6 22 
6 0 0 8 3 18 
6 0 1 9 4 20 
6 1 0 9 4 20 
6 1 1 11 5 22 
6 2 0 11 5 22 
6 2 1 12 6 24 
6 3 0 12 6 25 
6 3 1 14+ 7 27 
6 4 0 14+ 7 27 
6 5 0 15+ 8 29 
7 0 0 10 5 22 
7 0 1 12 6 24 
7 0 2 13+ 7 27 
7 1 0 12 6 25 
7 1 1 13 7 27 
7 1 2 15+ 8 30 
7 2 0 13 7 27 
7 2 1 15 8 30 
7 2 2 17+ 9 32 
7 3 0 15 8 30 
7 3 1 17 9 33 Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
7 4 0 17 9 33 
7 4 1 19+ 10 36 
7 5 0 19+ 10 36 
8 0 0 13 6 28 
8 0 1 15 7 31 
8 0 2 17+ 8 34 
8 1 0 15 7 31 
8 1 1 17 9 34 
8 1 2 19+ 10 37 
8 2 0 17 9 35 
8 2 1 19 10 38 
8 2 2 21+ 12 42 
8 3 0 19 10 39 
8 3 1 21 12 42 
8 3 2 24+ 13 46 
8 4 0 22 12 43 
8 4 1 24 13 46 
8 5 0 24 13 47 
8 5 1 27+ 15 51 
8 6 0 27+ 15 52 
9 0 0 17 8 37 
9 0 1 19 10 41 
9 0 2 22+ 11 46 
9 1 0 19 10 42 
9 1 1 22 11 47 
9 1 2 25+ 13 52 
9 2 0 22 12 47 
9 2 1 25 13 53 
9 2 2 28+ 15 58 
9 3 0 25 13 54 
9 3 1 29 15 60 
9 3 2 32+ 18 66 
9 4 0 29 16 61 
9 4 1 33 18 67 
9 4 2 37+ 20 74 
9 5 0 33 18 69 
9 5 1 37 20 76 
9 5 2 42+ 23 83 
9 6 0 38 21 77 
9 6 1 43+ 24 85 
9 7 0 44+ 24 87       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
10 0 0 23 12 58 
10 0 1 27 14 67 
10 0 2 31+ 16 77 
10 1 0 27 14 69 
10 1 1 32 17 79 
10 1 2 38 20 92 
10 2 0 33 17 83 
10 2 1 39 20 96 
10 2 2 50 20 110 
10 2 3 50+ 30 120 
10 3 0 40 20 100 
10 3 1 50 20 120 
10 3 2 60+ 30 130 
10 3 3 70+ 30 150 
10 4 0 50 30 120 
10 4 1 60 30 140 
10 4 2 70 30 160 
10 4 3 80+ 40 170 
10 5 0 60 30 150 
10 5 1 70 40 170 
10 5 2 90 40 190 
10 5 3 100 50 210 
10 6 0 80 40 180 
10 6 1 90 50 200 
10 6 2 110 50 230 
10 6 3 120 60 250 
10 6 4 140+ 70 270 
10 7 0 100 50 220 
10 7 1 120 60 250 
10 7 2 140 70 280 
10 7 3 150 80 310 
10 7 4 170+ 90 340 
10 8 0 130 60 280 
10 8 1 150 80 320 
10 8 2 170 90 360 
10 8 3 200 100 400 
10 8 4 220 120 440 
10 8 5 250+ 140 480 
10 9 0 170 90 380 
10 9 1 200 100 430 
10 9 2 230 120 490 Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
10 9 3 260 140 560 
10 9 4 300 160 640 
10 9 5 350 180 720 
10 9 6 400+ 210 820 
10 10 0 240 120 610 
10 10 1 290 150 750 
10 10 2 350 170 910 
10 10 3 400 200 1100 
10 10 4 500 300 1400 
10 10 5 700 300 1700 
10 10 6 900 400 2100 
10 10 7 1120 600 2700 
10 10 8 1160 800 3700 
10 10 9 2300 1100 6000 
10 10 10 2300 - - 
a Los resultados normales, obtenidos en un 95% de la s pruebas, no están seguidos por un símbolo más 
(+). Menos del 4% de los resultados de las pruebas obtenidos están marcados por un símbolo más(+). 
Combinaciones de tubos positivos no encontrados en esta tabla se presentan en menos del 1% de las 
pruebas y si se presentaran con mayor frecuencia in dican un error de  técnica o que el valor del número más 
probable se encuentra en el límite. El NMP de combi naciones que no aparecen en la tabla, se pueden obt ener 
por extrapolación a la combinación cercana más elev ada. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por 10 0 para expresarlos como NMP/100 g (mL). 
Tabla No. 4 Número más probable (NMP) para 1g de mu estra cuando se usan 3 tubos con  porciones 
de 0,1, 0,01 y 0,001g 
Tubos Positivos Tubos Positivos Tubos Positivos Tub os Positivos 
0,1 0,01 0,001 NMP 0,1 0,01 0,001 NMP 0,1 0,01 0,00 1 NMP 0,1 0,01 0,001 NMP 
0 0 0 3 1 0 0 3,6 2 0 0 9,1 3 0 0 23 
0 0 1 3 1 0 1 7,2 2 0 1 14 3 0 1 39 
0 0 2 6 1 0 2 11 2 0 2 20 3 0 2 64 
0 0 3 9 1 0 3 15 2 0 3 26 3 0 3 95 
0 1 0 3 1 1 0 7,3 2 1 0 15 3 1 0 43 
0 1 1 6,1 1 1 1 11 2 1 1 20 3 1 1 75 
0 1 2 9,2 1 1 2 15 2 1 2 27 3 1 2 120 
0 1 3 12 1 1 3 19 2 1 3 34 3 1 3 160 
0 2 0 6,2 1 2 0 11 2 2 0 21 3 2 0 93 
0 2 1 9,3 1 2 1 15 2 2 1 28 3 2 1 150 
0 2 2 12 1 2 2 20 2 2 2 35 3 2 2 210 
0 2 3 16 1 2 3 24 2 2 3 42 3 2 3 290 
0 3 0 9,4 1 3 0 16 2 3 0 29 3 3 0 240 
0 3 1 13 1 3 1 20 2 3 1 36 3 3 1 460 
0 3 2 16 1 3 2 24 2 3 2 44 3 3 2 1100 
0 3 3 19 1 3 3 29 2 3 3 53 3 3 3 1100 
       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
Tabla No. 5 Número más probable (NMP) para 100 mL d e muestra cuando se usan 5  porciones en cada 
una de 3 diluciones con series geométricas 
No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos 
10 1 0,1 10 1 0,1 10 1 0,1 10 1 0,1 10 1 0,1 10 1 0 ,1 
mL  mL  mL  NMP  mL  mL  mL  NMP  mL  mL  mL  NMP  mL  mL  mL  NMP  mL  mL  mL  NMP  mL  mL  mL  NMP  
0 0 0  1 0 0 2 2 0 0 4,5 3 0 0 7,8 4 0 0 13 5 0 0 2 3 
0 0 1 1,8 1 0 1 4 2 0 1 6,8 3 0 1 11 4 0 1 17 5 0 1  31 
0 0 2 3,6 1 0 2 6 2 0 2 9,1 3 0 2 13 4 0 2 21 5 0 2  43 
0 0 3 5,4 1 0 3 8 2 0 3 12 3 0 3 16 4 0 3 25 5 0 3 58 
0 0 4 7,2 1 0 4 10 2 0 4 14 3 0 4 20 4 0 4 30 5 0 4  76 
0 0 5 9,0 1 0 5 12 2 0 5 16 3 0 5 23 4 0 5 36 5 0 5  95 
0 1 0 1,8 1 1 0 4 2 1 0 6,8 3 1 0 11 4 1 0 17 5 1 0  33 
0 1 1 3,6 1 1 1 6,1 2 1 1 9,2 3 1 1 14 4 1 1 21 5 1  1 46 
0 1 2 5,5 1 1 2 8,1 2 1 2 12 3 1 2 17 4 1 2 26 5 1 2 64 
0 1 3 7,3 1 1 3 10 2 1 3 14 3 1 3 20 4 1 3 31 5 1 3  84 
0 1 4 9,1 1 1 4 12 2 1 4 17 3 1 4 23 4 1 4 35 5 1 4  110 
0 1 5 11 1 1 5 14 2 1 5 19 3 1 5 27 4 1 5 42 5 1 5 130 
0 2 0 3,7 1 2 0 6,1 2 2 0 9,3 3 2 0 14 4 2 0 22 5 2  0 49 
0 2 1 5,5 1 2 1 8,2 2 2 1 12 3 2 1 17 4 2 1 26 5 2 1 70 
0 2 2 7,4 1 2 2 10 2 2 2 14 3 2 2 20 4 2 2 32 5 2 2  95 
0 2 3 9,2 1 2 3 12 2 2 3 17 3 2 3 24 4 2 3 38 5 2 3  120 
0 2 4 11 1 2 4 15 2 2 4 19 3 2 4 27 4 2 4 44 5 2 4 150 
0 2 5 13 1 2 5 17 2 2 5 22 3 2 5 31 4 2 5 50 5 2 5 180 
0 3 0 5,6 1 3 0 8,3 2 3 0 12 3 3 0 17 4 3 0 27 5 3 0 79 
0 3 1 7,4 1 3 1 10 2 3 1 14 3 3 1 21 4 3 1 33 5 3 1  110 
0 3 2 9,3 1 3 2 13 2 3 2 17 3 3 2 24 4 3 2 39 5 3 2  140 
0 3 3 11 1 3 3 15 2 3 3 20 3 3 3 28 4 3 3 45 5 3 3 180 
0 3 4 13 1 3 4 17 2 3 4 22 3 3 4 31 4 3 4 52 5 3 4 210 
0 3 5 15 1 3 5 19 2 3 5 25 3 3 5 35 4 3 5 59 5 3 5 250 
0 4 0 7,5 1 4 0 11 2 4 0 15 3 4 0 21 4 4 0 34 5 4 0  130 
0 4 1 9,4 1 4 1 13 2 4 1 17 3 4 1 24 4 4 1 40 5 4 1  170 
0 4 2 11 1 4 2 15 2 4 2 20 3 4 2 28 4 4 2 47 5 4 2 220 
0 4 3 13 1 4 3 17 2 4 3 23 3 4 3 32 4 4 3 54 5 4 3 280 
0 4 4 15 1 4 4 19 2 4 4 25 3 4 4 36 4 4 4 62 5 4 4 350 
0 4 5 17 1 4 5 22 2 4 5 28 3 4 5 40 4 4 5 69 5 4 5 430 
0 5 0 9,4 1 5 0 13 2 5 0 17 3 5 0 25 4 5 0 41 5 5 0  240 
0 5 1 11 1 5 1 15 2 5 1 20 3 5 1 29 4 5 1 48 5 5 1 350 
0 5 2 13 1 5 2 17 2 5 2 23 3 5 2 32 4 5 2 56 5 5 2 540 
0 5 3 15 1 5 3 19 2 5 3 26 3 5 3 37 4 5 3 64 5 5 3 920 
0 5 4 17 1 5 4 22 2 5 4 29 3 5 4 41 4 5 4 72 5 5 4 1600  
0 5 5 19 1 5 5 24 2 5 5 32 3 5 5 45 4 5 5 81     
 Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
Tabla No. 6 Ejemplos para determinar el NMP estimad o en series de tres tubos con 1g (mL)  de 
muestra por tubo 
 Cantidad de muestra (g o mL) a Valores 
positivos 
reportados NMP estimado/g o mL b 
Ejemplo 0,10 ,001 0,001 0,0001 0,00001    
A 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3 3-2-0 930 
B 3/3 3/3 3/3 2/3 0/3 3-2-0 9300 
C 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3 0-1-0 30 
D 3/3 3/3 2/3 1/3 1/3 3-2-2 2100 
E 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3-3-3 110000 
 
a Numerador/denominador = número de tubos positivos/ número de tubos inoculados. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por 10 0 para expresarlos como NMP/100 g (mL). 
Tabla No. 7 Ejemplos para determinar el NMP estimad o en series de 5 tubos con 1 g (mL)  de muestra 
por tubo 
 Cantidad de muestra (g o mL) a Valores positivos NMP estimado/g o mL b 
Ejemplo 0,1, 0,01 0,001 0,0001 0,00001 reportados  
A 5/5 5/5 2/5 0/5 0/5 5-2-0 490 
B 5/5 5/5 5/5 2/5 0/5 5-2-0 4900 
C 0/5 0/5 1/5 0/5 0/5 0-1-0 20 
D 5/5 5/5 3/5 1/5 1/5 5-2-2 1400 
E 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5-5-5 160000 
 
a Numerador/denominador = número de tubos positivos/ número de tubos inoculados. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por 10 0 para expresarlos como NMP/100 g (mL). 
B 7.6.3 Determinación de bacterias coliformes, coliformes f ecales y Escherichia coli  por la técnica de 
diluciones en tubo múltiple. 
B 7.6.3.1 Fundamento 
Este método se basa en la propiedad de los microorg anismos coliformes para producir gas a partir de 
glucosa y fermentación de lactosa dentro de las 48 horas de incubación a 35 0,5° C (coliformes) y 44,50 ,2° C 
(coliformes fecales y E. coli ).  
B 7.6.3.2 Equipo 
Además de los mencionados en el método Preparación y dilución de muestras de alimentos para análisis 
microbiológico, lo siguiente: 
B 7.6.3.2.1  Baño de agua con agitación continua cubierto y con  termostato que evite variaciones mayores 
a 0,1° C. 
B 7.6.3.2.2  Termómetro calibrado y verificado 1/10 
B 7.6.3.2.3  Tubos de cultivo de 20x200 y de 16x160 mm con tapó n de rosca 
B 7.6.3.2.4  Campanas de fermentación (tubos de Durham) 
B 7.6.3.2.5  Gradillas 
B 7.6.3.2.6  Asas bacteriológicas de 3 mm de diámetro 
B 7.6.3.2.7  Lámpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 w atts. 
B 7.6.3.2.8  Lentes protectores.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
B 7.6.3.3 Reactivos y medios de cultivo  
B 7.6.3.3.1 Medios de cultivo 
B 7.6.3.3.1.1  Caldo lauril 
Ingredientes Cantidad 
Bacto triptosa 20,0 g 
Bacto lactosa 5,0 g 
Fosfato potásico, dibásico 2,75 g 
Fosfato potásico, monobásico 2,75 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Lauril sulfato de sodio 0,1 g 
Agua destilada 1000 mL 
 
pH final: 6,8 0,2 a 25° C. 
Preparación: 
Disolver los ingredientes en un litro de agua desti lada. 
Ajustar el pH. 
Distribuir en tubos de ensaye con campanas de Durha m. 
Adicionar 10 mL de medio para cada tubo. 
Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121° C . 
Antes de abrir el autoclave, dejar bajar la tempera tura a 75° C para que no queden burbujas en las 
campanas de Durham. 
Preparación del caldo lauril triptosa 
INOCULO 
(mL) CANTIDAD DE MEDIO 
POR TUBO (mL) VOLUMEN DE MEDIO 
MAS INOCULO (mL) CALDO LAURIL TRIPTOSA 
REQUERIDO g/L 
1 10 o más 11 o más 35,6 
10 10 20 71,2 
10 20 30 53,4 
20 10 30 106,8 
100 50 150 106,8 
100 35 135 137,1 
100 20 120 213,6 
 
B 7.6.3.3.1.2  Caldo EC ( E. coli ) 
Ingredientes  
Bacto triptosa 20.0 g 
Bacto lactosa 5.0 g 
Bacto sales biliares No. 3 1.5 g 
Fosfato dipotásico 4.0 g 
Fosfato monopotásico 1.5 g 
Cloruro de sodio 5.0 g 
Agua destilada 1000 mL 
 
pH final: 6,9 0,2 a 25° C. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
Preparación: 
Disolver los ingredientes en un litro de agua desti lada y calentar ligeramente para que se disuelva po r 
completo. 
Ajustar el pH. 
Distribuir en tubos de ensaye con campanas de Durha m. 
Adicionar 10 mL de medio para cada tubo. 
Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121° C . 
Antes de abrir el autoclave, dejar bajar la tempera tura a 75° C para evitar que queden burbujas en las 
campanas de Durham. 
B 7.6.3.3.1.3  Agar McConkey 
Ingredientes  
Proteasa peptona o polipeptona 3,0 g 
Peptona o gelizante 17,0 g 
Lactosa 10,0 g 
Sales biliares No. 3 1,5 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Rojo neutro 0,03 g 
Cristal violeta 0,001 g 
Agar 13,5 g 
Agua destilada 1000,0 mL 
 
pH final: 7,1 0,2 a 25° C 
Preparación: 
Disolver los ingredientes en un litro de agua desti lada. 
Calentar hasta ebullición para disolver por complet o. 
Ajustar el pH. 
Esterilizar a 121° C durante 15 minutos. 
Enfriar a 50-60° C y vaciar en cajas Petri. 
B 7.6.3.3.1.4  Agar eosina azul de metileno de Levin (EMB-L) 
Ingredientes Cantidad 
 Peptona 10,0 g 
 Lactosa 10,0 g 
 K2HPO 4 2,0 g 
 Eosina Y 0,4 g 
 Azul de metileno 0,065 g 
 Agua destilada 1000 mL 
 
pH final: 7,1 0,2 
Disolver la peptona, el fosfato y el agar en un lit ro de agua. 
Calentar hasta ebullición para la disolución comple ta. 
Distribuir en porciones de 100 o 200 mL y esteriliz ar a no más de 121° C por 15 minutos. 
Fundir antes de su uso y adicionar a cada porción d e 100 mL: 
a) 5 mL de solución de lactosa al 20% 
b) 2 mL de solución acuosa de eosina al 2% 
c) 4,3 mL de solución acuosa de azul de metileno al  0,15%.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
Cuando se use el producto deshidratado, disolver to dos los ingredientes de acuerdo con las instruccion es 
del fabricante. 
B 7.6.3.3.1.5  Caldo triptona al 1% (triptófano) 
Ingredientes Cantidad 
Triptona o tripticasa 10 g 
Agua destilada  1000 mL 
pH final: 6,9   
 
Disolver los ingredientes 
Distribuir en porciones de 5 mL en tubos de ensaye de 16 x 125 o 16 x 150 mm. 
Esterilizar a 121° C por 15 minutos. 
B 7.6.3.3.1.6  Caldo MR-VP 
Medio 1 
Ingredientes Cantidad 
Peptona tamponada 7 g 
Glucosa 5 g 
K2HPO 4 5 g 
Agua destilada 1000 mL 
 
pH final: 6.9 
Disolver los ingredientes con calentamiento suave s i es necesario. 
Distribuir en volúmenes de 10 mL en tubos de ensaye  de 16x150 mm. 
Esterilizar a 121° C por 15 minutos. 
B 7.6.3.3.1.7  Caldo citrato de Koser 
Ingredientes Cantidad 
NaNH 4HPO 4 •4H 2O 1,5 g 
KH 2PO 4 (monobásico) 1,0 g 
MgSO 4 •7H 2O 0,2 g 
Citrato de sodio •2H 2O 3,0 g 
Agua destilada 1000 mL 
 
pH final: 6,7 0,2. 
Distribuir preferentemente en tubos de ensaye con t apa de rosca. 
Esterilizar a 121° C por 15 minutos. 
Esta formulación se recomienda en los Métodos de An álisis Oficial de AOAC y en los Métodos Estándares 
para el Análisis de Agua y Aguas de Desecho (APHA).  Este difiere de la composición del medio deshidrat ado 
disponible comercialmente y es recomendable su uso.  
B 7.6.3.3.2 Reactivos. 
B 7.6.3.3.2.1  Reactivo de Kovacs 
Ingredientes  
p-imetilaminobenzaldehído 5 g 
Alcohol amílico (normal) 75 mL Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
HCI concentrado 25 mL 
 
Disolver el p-Dimetilaminobenzaldehído en alcohol a mílico normal. 
Adicionar lentamente el HCl. Almacenar a 4° C. 
Para la prueba de indol 
Adicionar 0,2-0,3 mL del reactivo a 5 mL del cultiv o de bacteria en caldo triptona. 
Se considera una prueba positiva cuando desarrolla un color rojo en la superficie del tubo. 
B 7.6.3.3.2.2  Reactivo de Voges-Proskauer (VP) 
Solución 1 
Ingredientes Cantidad 
alfa-naftol 5 g 
Alcohol absoluto 100 g 
 
Solución 2 
Ingredientes Cantidad 
Hidróxido de potasio 40 g 
Agua destilada para llevar a 100 mL 
 
Prueba de Voges-Proskauer (VP). 
Transferir 1 mL del cultivo a probar con 48 horas d e incubación a un tubo de ensaye. 
Adicionar 0,6 mL de la solución 1 y 0,2 mL de la so lución 2. 
Agitar después de la adición de cada solución. 
Para intensificar y acelerar la reacción adicionar unos cuantos cristales de creatina y mezclar. 
Dejar a temperatura ambiente. 
Leer resultados después de 4 horas de adicionar los  reactivos. 
El desarrollo de una coloración rosa es una prueba positiva. 
B 7.6.3.3.2.3  Reactivos para la coloración de Gram 
Cristal violeta 
Solución A   
Cristal violeta (colorante 90%) 2 g 
Etanol 95% 20 mL 
 
Solución B  
Oxalato de amonio 8.0 g 
Agua destilada 80 mL 
 
Indicador rojo de metilo (R44) 
Mezclar la solución A y B. Almacenar por 24 horas 
Filtrar a través de un papel filtro áspero. 
B 7.6.3.3.2.4  lodo de Gram 
Ingredientes   
lodo 1g 
Ioduro de potasio (Kl) 2 g 
Agua destilada 300 mL       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
 
Colocar el Kl en un mortero. 
Adicionar el yodo. 
Triturar con el pistilo por 5-10 segundos. 
Adicionar 1 mL de agua y triturar 
Adicionar 5 mL de agua y triturar 
Adicionar 10 mL de agua y triturar 
Vaciar esta solución en una botella de reactivo. 
Enjuagar el mortero y el pistilo con la cantidad de  agua necesaria para completar 300 mL. 
B 7.6.3.3.2.5  Colorante de contraste (solución concentrada)  
Ingredientes:   
Safranina O 2,5 g 
Etanol al 95% 100 mL 
 
Solución de trabajo: Adicionar 10 mL de la solución  concentrada a 90 mL de agua destilada. 
B 7.6.3.3.2.6  Procedimiento para la tinción de Gram 
Fijar con calor moderado los frotis de la muestra a  teñir. 
Adicionar la solución de cristal violeta al frotis.  
Dejar actuar por un minuto. 
Lavar con agua corriente y escurrir. 
Aplicar la solución de yodo por un minuto. 
Lavar con agua corriente y escurrir. 
Decolorar con etanol al 95% hasta que la coloración  azul deje de fluir (aproximadamente 30 segundos). 
Inmediatamente después enjuagar con agua corriente.  
Escurrir. 
Aplicar el colorante de contraste (safranina) por 3 0 segundos. 
Enjuagar, escurrir y secar al aire. Examinar al mic roscopio. 
B 7.6.3.3.2.7  Medio EC-MUG 
Preparar el caldo EC y adicionar 50 mg de 4-metilum belliferyl-beta-D-glucurónido (MUG) por litro antes  de 
esterilizar (121° C por 15 minutos). El caldo EC-MUG  está comercialmente disponible. 
B 7.6.3.4 Procedimiento 
B 7.6.3.4.1 Agua y hielo 
B 7.6.3.4.1.1 Prueba presuntiva 
B 7.6.3.4.1.1.1 Agitar la muestra y transferir volúmenes de 10 mL a  cada uno de 5 tubos con 20 mL de 
caldo lauril sulfato triptosa de doble concentració n, 5 tubos con 1 mL y 5 tubos con 0,1 mL de caldo l auril 
sulfato triptosa de concentración sencilla o las si guientes porciones: 10 tubos con 10 mL de muestra; 5 tubos 
con 20 mL de muestra o una porción de 100 mL, consu ltar la tabla del inciso 2 en la preparación del “c aldo 
lauril triptosa” para la concentración de caldo lau ril triptosa requerido. Los tubos deben contener un a campana 
de fermentación (Durham). 
B 7.6.3.4.1.1.2 Incubar los tubos a 35 0,5° C. Examinar los tubos a las 24 horas y observar si hay 
formación de gas; si la formación de gas no se obse rva, incubar 24 horas más. 
B 7.6.3.4.1.2 Prueba confirmativa 
B 7.6.3.4.1.2.1 De cada tubo que muestre formación de gas, tomar un a asada y sembrar en un número 
igual de tubos con medio de confirmación, para la d eterminación de bacterias coliformes referirse al m étodo 
de Determinación de bacterias coliformes. Técnica d el Número más probable, para la determinación de 
bacterias coliformes fecales, sembrar en caldo EC. Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli  
como control positivo y una de Enterobacter  aerogenes  como control negativo e incubar con las muestras. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 7.6.3.4.1.2.2 Para la determinación de coliformes fecales incubar  los tubos a 44,5 0,2° C en baño de 
agua con agitación durante 24 horas, observar si ha y formación de gas; si la formación de gas no se ob serva, 
continuar la incubación 24 horas más, hacer la lect ura. Utilizar estos resultados para calcular el núm ero más 
probable (NMP) de coliformes fecales. 
B 7.6.3.4.1.3 Prueba confirmativa para Escherichia coli (por iden tificación bioquímica) 
B 7.6.3.4.1.3.1 Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos y sembrar por estría cruzada en agar 
EMB-L para su aislamiento. 
B 7.6.3.4.1.3.2 Incubar las placas invertidas a 35° C por 18-24 hora s. 
B 7.6.3.4.1.3.3 Seleccionar dos colonias de cada placa con la sigui ente morfología colonial: Colonias con 
centro negro, planas con o sin brillo metálico y se mbrarlas en agar cuenta estándar para realizar las pruebas 
de morfología microscópica y pruebas bioquímicas. I ncubar las placas a 35° C por 18-24 horas. 
B 7.6.3.4.1.3.4  Si no hay colonias con morfología típica, probar u na o más colonias lo más parecido E. coli  
de cada placa. 
B 7.6.3.4.1.3.5  Hacer un frotis y teñirlo por Gram. Observar al mi croscopio la presencia de bacilos cortos o 
cocobacilos Gram-negativos. 
B 7.6.3.4.1.3.6  Pruebas bioquímicas Indol, Rojo de metilo, Voges P roskauer, Citrato (IMViC). 
B 7.6.3.4.1.3.6 .1 Producción  de indol 
Inocular un tubo en caldo triptona e incubarlo a 35 ° C por 24 horas. Adicionar 0,2-0,3 mL de reactivo d e 
Kovacs. La presencia de una coloración en la superf icie del tubo se considera una prueba positiva. 
B 7.6.3.4.1.3.6.2  Voges-Proskauer (VP) 
Inocular un tubo con caldo MR-VP e incubar a 35° C p or 48 horas. Transferir 1 mL a un tubo de 13X100 
mm. Adicionar 0,6 mL de solución de alfa naftol y 0 ,2 mL de hidróxido de potasio al 40% y agitar. Se c onsidera 
una prueba positiva cuando se desarrolla un color r osa. 
B 7.6.3.4.1.3.6.3  Rojo de metilo 
Inocular un tubo adicional con caldo MR-VP e incuba r a 35° C por 48 horas. Adicionar 5 gotas de solució n 
de rojo de metilo. Se considera una prueba positiva  cuando se desarrolla un color rojo. Un color amari llo es 
una prueba negativa. 
B 7.6.3.4.1.3.6.4  Citrato 
Inocular un tubo con caldo citrato de Koser un inóc ulo ligero para evitar turbiedad en el tubo. Incuba r a 
35° C por 96 horas. El desarrollo del cultivo que se  observa con la turbiedad del medio, se considera u na 
prueba positiva. 
B 7.6.3.4.1.3.6.5  Interpretación de resultados 
Todos los cultivos que: 1. Fermenten la lactosa con  producción de gas dentro de las 48 horas a 35° C; 2 . 
Sean bacilos o cocobacilos Gram negativos no esporu lados y 3. Se obtenga las siguientes combinaciones 
para el IMVIC: 
Biotipo 1--, o Biotipo 2---, son consideradas como E. coli. Calcular el NMP de E. coli  basada en la 
proporción de los tubos positivos de caldo EC. 
B 7.6.3.4.1.4 Prueba confirmativa para Escherichia  coli (por el método de EC-MUG) 
B 7.6.3.4.1.4.1 Fundamento. 
Alrededor del 94% de las cepas de E. coli  incluso las cepas no productoras de gas producen l a enzima 
beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato  específico 4-metilumbelliferyl-beta-D-glucurónido (MUG) 
en 4-metilumbelliferona (MU), que al ser expuesto a  una fuente de luz ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) 
produce una fluorescencia azul, fácil de observar. Cuando el MUG es incorporado al caldo EC se puede 
identificar E. coli . 
B 7.6.3.4.1.4.2 Prueba presuntiva. 
Seguir lo indicado en el punto B.7.6.3.4.1 
B 7.6.3.4.1.4.3 Prueba confirmativa        (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
De cada tubo que muestre formación de gas, tomar un a asada y sembrar en un número igual de tubos con 
medio de confirmación EC-MUG. Inocular dos tubos co n caldo EC-MUG una cepa de E. coli  como control 
positivo y K. pneumoniae  como control negativo. Incubar a estos tubos con u no adicional de caldo EC-MUG 
sin inocular a 44,5 0,5° C en baño de agua con los t ubos de las muestras durante 24 horas, observar si hay 
formación de gas; si la formación de gas no se obse rva continuar la incubación 24 horas más. Irradiar los 
tubos con una fuente de luz UV, observar fluorescen cia y hacer la lectura. Utilizar estos resultados p ara 
calcular el número más probable (NMP) de E. coli . 
B 7.6.3.4.2 Alimentos 
B 7.6.3.4.2.1 Prueba presuntiva. 
Preparar la muestra como se indica en el método “ Preparación y dilución de muestras de alimentos par a 
análisis microbiológico ;” y de acuerdo con el tipo de producto, utilizar l as diluciones apropiadas, según se 
indica en el procedimiento de la densidad microbian a por la técnica del número más probable. Utilizar como 
medio de enriquecimiento caldo lauril triptosa y co ntinuar como en el punto B.7.6.3.4.1.1 
B 7.6.3.4.2.2 Prueba confirmativa. 
Continuar como en el punto B.7.6.3.4.1.2 y confirma r la presencia de Escherichia coli  en por lo menos el 
10% de las pruebas con resultados positivos a colif ormes fecales por cultivo en placas de agar McConke y a 
partir de los tubos que demostraron la presencia de  gas en la prueba confirmativa. Incubar las placas a 35 
0,5° C durante 24 horas, observar las colonias típic as fermentadoras de color rojo rodeadas de un halo opaco 
de precipitación de sales biliares. Seleccionar 1 o  más colonias aisladas y pasar a tubos de fermentac ión con 
caldo lauril triptosa, continuar como se indica en B.7.6.3.4.1.2. Hacer tinción de Gram para observaci ón de la 
morfología microscópica. 
B 7.6.3.5 Interpretación de resultados. 
La formación de gas en el tubo de fermentación secu ndario dentro de las 48 horas y la demostración de 
bacilos Gram (-) no esporulados confirma un resulta do positivo de la prueba demostrándose la presencia  del 
grupo coliforme. 
B 7.6.3.6 Cálculos 
Calcular la densidad microbiana en número más proba ble conforme al procedimiento señalado 
anteriormente, para estimar la población de bacteri as coliformes y bacterias coliformes fecales de acu erdo con 
las diluciones empleadas y expresar en NMP/g o mL p ara alimentos y NMP/100 mL para agua. En el caso de  
usar volúmenes de 20 mL de muestras de agua en 5 tu bos o 10 mL de muestras de agua en 10 tubos, utiliz ar 
las siguientes tablas: 
TABLA 1. Indice del NMP con 95% de límite de confia nza para varias combinaciones de resultados 
positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con 20  mL de muestra de agua o hielo. 
No. de Tubos   95% de Límite de Confianza 
(aproximado) 
Positivos NMP/100 mL Inferior Superior 
0 1,1 0 3,0 
1 1,1 0,05 6,3 
2 2,6 0,3 9,6 
3 4,6 0,8 14,7 
4 8,0 1,7 26,4 
5 8,0 4,0 Infinito 
 
TABLA 2. Indice del NMP con 95% de límite de confia nza para varias combinaciones de resultados 
positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con 1 0 mL de muestra de agua o hielo. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
No. de Tubos 
Positivos NMP/100 mL 95% de Límite de Confianza (aproximado) 
  Inferior Superior 
0 1,1 0,0 3,0 
1 1,1 0,03 5,9 
2 2,2 0,26 8,1 
3 3,6 0,69 10,6 
4 5,1 1,3 13,4 
5 6,9 2,1 16,8 
6 9,2 3,1 21,1 
7 12,0 4,3 27,1 
8 16,1 5,9 36,8 
9 23,0 8,1 59,5 
10 23,0 13,5 Infinito 
 
B 7.7 Técnicas y procedimientos para la investigación de V ibrio cholerae  
B 7.7.1  Material y equipo 
B 7.7.1.1  Licuadora y vasos de licuadora estériles. 
B 7.7.1.2  Frascos de vidrio de boca ancha tipo tarro de 500 mL de capacidad con tapa de rosca. 
B 7.7.1.3  Varilla de vidrio de 3 mm de diámetro y 20 cm de l argo, con un doblez terminal en ángulo recto 
de 4 cm. 
B 7.7.1.4  Balanza granataria de 2000 g de capacidad y 0,2 g de sensibilidad. 
B 7.7.1.5  Balanza analítica de 120 g de capacidad y 5 mg de sensibilidad. 
B 7.7.1.6  Incubadoras de 39-40° C. 
B 7.7.1.7  Baño de agua de 42 ± 0,2° C y 35-37° C. 
B 7.7.1.8  Cucharas estériles u otros instrumentos apropiados  para transferir muestras de alimentos. 
B 7.7.1.9  Cajas Petri estériles de 15 x 100 mm de plástico. 
B 7.7.1.10  Pipetas estériles de 1 mL con graduación de 0,01 m L, de 5 y 10 mL con graduación de 0,1 mL. 
B 7.7.1.11  Asas bacteriológicas de 3 mm de diámetro de nicrom el o platino. 
B 7.7.1.12  Tubos de cultivo o de ensayo de 16 x 150 mm y 20 x  150 mm. 
B 7.7.1.13  Tubos para bioquímicas o ensaye de 10 x 75 mm o 13  x 100 mm. 
B 7.7.1.14  Tijeras y pinzas estériles. 
B 7.7.1.15  Lámpara (para observar reacciones serológicas). 
B 7.7.1.16  Mecheros. 
B 7.7.1.17  Papel pH (rango 1-14) con un máximo de graduación de 0,4 unidades de pH por cambio de 
color. 
B 7.7.1.18  Potenciómetro. 
B 7.7.1.19  Bolsas de polietileno de 28 x 37 cm con tapa resel lable. 
B 7.7.1.20  Aparato de filtración y membranas de 0,45 micras.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
B 7.7.2 Medios de cultivo 
B 7.7.2.1  Agua Peptonada Alcalina (APW) 
Peptona 10 g 
Cloruro de Sodio 10 g 
Agua destilada 1 000 mL 
 
Disolver los ingredientes. Ajustar el pH de tal for ma que después de esterilizar éste sea de 8,5± 0,2.  
Esterilizar en autoclave 10 minutos a 121° C. 
B 7.7.2.2  Agar Tiosulfato, Citrato, Sales Biliares y Sacaros a (TCBS) 
Extracto de levadura 5 g 
Proteosa peptona 10 g 
Sacarosa 20 g 
Tiosulfato de sodio·5H 2O 10 g 
Citrato de sodio·2H 2O 10 g 
Sales biliares 3 g 
Bilis de buey 5 g 
Cloruro de sodio 10 g 
Citrato férrico 1 g 
Azul de bromotimol 40 mg 
Azul de timol 40 mg 
Agar 15 g 
Agua destilada 1 000 mL 
 
Preparar en un matraz por lo menos tres veces más g rande que el volumen requerido de medio. Adicionar 
los ingredientes en agua destilada tibia y calentar  con agitación constante hasta ebullición e inmedia tamente 
retirar del calor. No esterilizar. Enfriar a 50° C y  colocar en cajas de Petri. Dejar secar las placas de 37-45° C 
antes de usar. 
B 7.7.2.3  Agar modificado con Celobiosa, Polimixina B y Coli stina (mCPC) 
SOLUCION 1  
Peptona 10 g 
Extracto de carne 5 g 
Cloruro de sodio 20 g 
Solución Stock de colorante 1 000 1 mL 
Agar 15 g 
Agua destilada 900 mL 
 
Ajustar el pH a 7,6. Hierva hasta que se disuelva e l Agar. 
Esterilizar por autoclave 15 minutos a 121° C. Enfrí e de 48-55° C. 
SOLUCION STOCK DE 
COLORANTES 1 000 X :  
Azul de Bromotimol 4 g Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
Rojo de cresol 4 g 
Etanol al 95% 100 mL 
 
Para obtener un color firme del medio usar una solu ción colorante stock en lugar de estar pesando 
repetidamente los colorantes en polvo. Disuelva el colorante en etanol hasta obtener una solución al 4 % 
(peso/volumen). Agregue 1 mL de esta solución a cad a litro de agar mCPC, la cual tendrá al final 40 mg  de 
Azul de Bromotimol y 40 mg de Rojo Cresol por litro . 
SOLUCION 2:  
Celobiosa 10 g 
Colistina 400 000 Ul 
Polimixina B 100 000 UI 
Agua destilada 100 mL 
 
Disuelva la celobiosa por calentamiento en agua des tilada. Enfríe y agregue los antibióticos. Esterili ce por 
filtración, agregue la solución 2 a la solución 1 m ezcle y distribuya en cajas Petri. 
B 7.7.2.4  Agar T 1N1 (Agar Triptona y Sal) 
Triptona o tripticasa 10 g 
Cloruro de sodio 10 g 
Agar 20 g 
Agua destilada 1 000 mL 
 
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolución  del agar, si lo desea inclinado, distribuya en tub os. 
Esterilice en autoclave 15 minutos a 121° C. Deje so lidificar los tubos inclinados, para placas enfríe el medio 
de 45-50° C y distribuya en cajas Petri estériles. 
B 7.7.2.5  Agar Gelatina (GA) 
Peptona 4 g 
Extracto de levadura 1 g 
Gelatina 15 g 
Agar 15 g 
Agua destilada 1 000 mL 
 
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolución  de la gelatina y el agar, ajuste el pH a 7,2 ± 0.2 . 
Esterilice en autoclave 15 minutos a 121° C. Enfríe de 45-50° C y distribuya en cajas Petri estériles. 
B 7.7.2.6  Agar Gelatina con Sal (GS) 
Preparar agar gelatina (GA), pero adicionando 30 g de Cloruro de Sodio por cada litro. Suspenda los 
ingredientes y hierva hasta disolver la gelatina y el agar. Ajuste el pH de 7,2 ± 0,2. Esterilice en a utoclave 15 
minutos a 121° C. Enfríe de 45-50° C, coloque en caja s Petri. Si es necesario para inhibir la diseminaci ón de 
Vibrio spp. tal como V. alginolyticus , use de 25-30 g de agar por litro. 
B 7.7.2.7 Caldo Glucosa de Hugh-Leifson 
Peptona 2 g 
Extracto de levadura 0,5 g 
Cloruro de Sodio 20 g 
Dextrosa 10 g 
Púrpura de Bromocresol 0,015 g 
Agar 3 g 
Agua destilada 1 000 mL 
       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolver e l agar. Ajuste el pH a 7,4 ± 0,2. Coloque en tubos y 
esterilice en autoclave 15 minutos a 121° C. 
B 7.7.2.8 Medio Base de Descarboxilasa (Arginina, Lisina y Or nitina) 
BASE  
Peptona 5 g 
Extracto de levadura 3 g 
Dextrosa (D-glucosa) 1 g 
Púrpura de Bromocresol 0.02 g 
Agua destilada 1 000 mL 
 
Para caldo de Arginina, Lisina y Ornitina, adicione  5 g de L-aminoácido a 1 litro de base. Como contro l, 
use base sin suplemento (aminoácido). Para Vibrio  spp. halofílicos, adicionar 15 g de Cloruro de Sod io por 
litro. Ajuste el pH de tal manera que después de la  esterilización sea de 6,5 ± 0,2. Distribuya en tub os y 
esterilice en autoclave 10 minutos a 121° C. 
B 7.7.2.9  Caldo Triptona y Caldos Triptona Sal T 1N0,T 1N1,T 1N3 
T1N6,T 1N8 y T 1N10  
Triptona o Tripticasa 10 g 
Cloruro de Sodio 0,10,30,60,80,o 100 g 
Agua destilada 1 000 mL 
 
Disuelva los ingredientes en agua destilada, para T 1N0 no agregue Cloruro de Sodio, para T 1N1 use 10 g 
de Cloruro de Sodio (1% w/v concentración de Clorur o de Sodio); así respectivamente. Para T 1N3 usar 30 g de 
NaCl por litro (3% w/v concentración de Cloruro de Sodio) Distribuya en tubos de tapón de rosca de 16 x 150 
mm, tape los tubos. Esterilice en autoclave durante  15 minutos a 121° C. Ajuste el pH a 7,2 ± 0,2. 
B 7.7.2.10 Caldo Soya Tripticasa (TSB) 
Peptona de Tripticasa (Triptona) 17 g 
Peptona de fitona (Soytona) 3 g 
Cloruro de Sodio 5 g 
Fosfato dipotásico 2,5 g 
Dextrosa 2,5 g 
Agua destilada 1 000 mL 
 
Suspenda los ingredientes en agua destilada y calie nte hasta disolución. Distribuya 225 mL en matraces  
de 500 mL o tubos. Esterilice en autoclave durante 15 minutos a 121° C. El pH final debe ser de 7,2 ± 0 ,2. 
B 7.7.2.11 Agar Soya Tripticasa (TSA) 
Peptona de fitona (Soytona) 5 g 
Peptona tripticasa (Triptona) 15 g 
Cloruro de Sodio 5 g 
Agar 15 g 
Agua destilada 1 000 mL 
 
Suspenda los ingredientes en agua destilada y hierv a durante un minuto hasta disolución del agar. Para  
Vibrio spp. halofílicos, agregar 15 g de Cloruro de Sodio.  Distribuya dentro de tubos o matraces. Esterilice en 
autoclave durante 15 minutos a 121° C. Deje solidifi car los tubos inclinados o deje enfriar de 45-50° C y 
distribuya en cajas Petri. El pH final debe ser de 7,3 ± 0,2. 
B 7.7.2.12  Agar de Hierro Kligler (KIA) Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
Peptona polipeptona 20 g 
Dextrosa 1 g 
Citrato férrico amoniacal 0.5 g 
Lactosa 20 g 
Cloruro de Sodio 5 g 
Tiosulfito de sodio 0.5 g 
Rojo de fenol 0.025 g 
Agar 15 g 
Agua destilada 1000 mL 
 
Suspender los ingredientes y hervir hasta disolució n del agar. Distribuir en tubos de tapón de rosca. 
Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121° C . Dejar solidificar los tubos inclinados. Ajustar e l pH de 7,4 
± 0,2. 
B 7.7.2.13 Agar Arginina Glucosa Inclinado (AGS) 
Peptona 5 g 
Extracto de levadura 3 g 
Tristona 10 g 
Cloruro de Sodio 20 g 
Glucosa 1 g 
L-Arginina (hidrocloruro) 5 g 
Citrato férrico amónico 0,5 g 
Tiosulfato de Sodio 0,3 g 
Púrpura de Bromocresol 0,2 g 
Agar 13,5 g 
Agua destilada 1 000 mL 
 
Suspender los ingredientes en agua destilada, hervi r hasta disolución del agar, y distribuir en cantid ades 
de 5 mL a tubos de 13 x 100 mm. Ajustar el pH de 6, 8 a 7,0. Esterilizar en autoclave de 10 a 12 minuto s a 
121° C. Deje solidificar el medio inclinado. 
B 7.7.2.14 Agar Triple Azúcar y Hierro (TSI) 
Polipeptona 20 g 
Cloruro de Sodio 5 g 
Lactosa 10 g 
Sacarosa 10 g 
Glucosa 1 g 
Sulfato ferroso amónico 0,2 g 
Tiosulfato de Sodio 0,2 g 
Rojo de fenol 0,025 g 
Agar 13 g       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
Agua destilada 1 000 mL 
 
Disolver los ingredientes en agua destilada. Mezcla r bien y calentar a ebullición, agitando ocasionalm ente 
hasta completa disolución. Enfriar a 60° C y ajuste el pH de 7,3 ± 0,1. 
B 7.7.2.15  Agar de Hierro y Lisina (LIA) 
Peptona o gelisato 5,0 g 
Extracto de levadura 3,0 g 
Glucosa 1,0 g 
L-Lisina 10,0 g 
Citrato férrico amónico 0,5 g 
Tiosulfato de sodio 0,04 g 
Púrpura de bromocresol 0,02 g 
Agar 15,0 g 
Agua destilada 1 000 mL 
 
Disolver los ingredientes en el agua destilada y me zclar bien; calentar hasta ebullición con agitación  
frecuente hasta conseguir la disolución completa. E sterilizar en autoclave 12 minutos a 121° C. Enfriar  de 50-
60° C y ajustar el pH de 6,7 ± 0,1. Distribuir en vo lúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm. Los tubos se 
enfrían en posición inclinada, de tal modo que se o btengan columnas de medio de 3 cm y una parte incli nada 
de 2 cm. 
B 7.7.2.16  Caldo Rojo de Metilo y Vogues Proskauer(RM-VP) 
Peptona 7 g 
Glucosa 5 g 
Fosfato dipotásico 5 g 
Agua destilada 1000 mL 
 
Disolver los ingredientes en 800 mL de agua tibia. Para Vibrio spp  halofílicos, agregar 15 g más de Cloruro 
de Sodio (para una concentración final del 2%). Fil trar, enfriar a 20° C y diluir a 1 litro. Distribuya  en tubos. 
Esterilizar en autoclaves durante 12 - 15 minutos a  121° C. Ajustar el pH de 6,9 +/- 0,2. 
B 7.7.2.17  Medio para prueba de movilidad (Semisólida) 
Peptona 10 g 
Extracto de carne 3 g 
Cloruro de Sodio 5 g 
Agar 4 g 
Agua destilada 1000 mL 
 
Calentar con agitación y hervir de 1 a 2 minutos ha sta disolución del agar. Para Vibrio spp  halofílicos 
agregar 15 g más de Cloruro de Sodio (para una conc entración final del 2%). Distribuir en tubos con ta pón de 
rosca. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121° C.  Ajustar el pH de 7,4 ± 0,2. 
B 7.7.3 Soluciones y reactivos para pruebas bioquímicas Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 7.7.3.1  Prueba de Rojo de Metilo. 
Rojo de metilo 0,1 g 
Alcohol etílico 300 mL 
Agua destilada 200 mL 
 
Disolver el Rojo de Metilo en el alcohol y diluir c on el agua destilada, para llevar a cabo la prueba,  añadir 5 
gotas de la solución a 5 mL del cultivo problema. 
Resultados: Un color rojo demuestra un pH menor a 4 ,5 y la prueba es Positiva. Un color amarillo se 
reporta como prueba Negativa. 
B 7.7.3.2  Prueba de Vogues-Proskauer. 
Esta prueba es para comprobar la presencia del Diac etilo. 
Alfa Naftol 5 g 
Alcohol Etílico absoluto 100 mL 
 
Añadir 0,6 mL de la solución de Alfa Naftol y 0,2 m L de una solución acuosa al 40% de KOH a 1 mL de 
cultivo. 
Resultados: El desarrollo de una coloración roja en  15 minutos constituye una reacción POSITIVA. 
B 7.7.3.3  Prueba de Oxidasa. 
N,N,N,N-Tetrametil-p-Fenilendiamino 0,5 g 
Agua destilada 100 mL 
 
Conservar en frasco oscuro a 5-10° C. El reactivo se  conserva durante 14 días. 
Sembrar en un tubo de base de gelosa para sangre. I ncubar 18 horas a 35° C. Agregar 0,3 mL de reactivo.  
Resultado: La reacción positiva se observa por la p roducción de un color azul en un minuto. 
B 7.7.3.4  Reacción de Indol. 
REACTIVO DE KOVAC 
p-dimetilaminobenzaldehído 5.0 g 
Alcohol amílico o alcohol isoamílico 750 mL 
Acido clorhídrico concentrado 25 mL 
Disolver el p-dimetilaminobenzaldehído en el alcoho l amílico y agregar el ácido clorhídrico lentamente , 
gota a gota y agitando. Debe conservarse en frasco ámbar con tapón esmerilado; el color del reactivo v a del 
amarillo al café claro. Se debe conservar a 4° C. 
Sembrar un tubo con 5 mL de caldo triptona. Incubar  48 horas a 35° C. Agregar de 0,2 a 0,3 mL del 
reactivo. El desarrollo de un color intenso, consti tuye una prueba Positiva para indol. 
B 7.7.4 Toma de muestra 
La toma de muestra para análisis microbiológicos, s e deberá hacer en condiciones asépticas y en 
recipientes estériles. 
B 7.7.5  Preparación de la muestra . 
B 7.7.5.1 Líquidos.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
De cada muestra tomar 25 mL e introducirlas en un m atraz que contenga 225 mL de agua peptonada 
alcalina (APW) y homogeneizar por 2 min. Esta es la  dilución 1:10. De esta dilución preparar la diluci ón 1:100 
y 1:1000, en 9 o 90 mL de agua peptonada alcalina. 
Incubar las tres diluciones de 35 a 37° C. 
B 7.7.5.2 Sólidos.  
De cada muestra pesar 50 g y colocar en un matraz q ue contenga 450 mL de agua peptonada alcalina 
(APW). Esto hace la dilución 1:10. Preparar dos ser ies de diluciones de 1:100 y 1:1000. Por lo tanto t enemos 
dos series de 3 diluciones. Incubar una serie de 35  a 37° C y la otra a 42° C. 
B 7.7.6  Resembrar 
Después de la incubación, y sin agitar, transferir el inóculo de la película (crecimiento superficial)  con un 
asa de 3-5 mm de diámetro a una placa por lo menos,  de cada uno de los medios de cultivo selectivos: A gar 
con tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa (TCBS) o al agar modificado con celobiosa, polimixi na B y 
colistina (mCPC), la polimixina inhibe al biotipo C lásico de V. cholerae . Incubar el agar TCBS durante 18 a 24 
horas de 35-37° C y el agar mCPC durante 18 a 24 hor as de 39-40° C. 
B 7.7.6.1  Morfología colonial. 
Examinar las placas a fin de determinar si se prese ntan las características coloniales que a continuac ión 
se describen, seleccionar por lo menos 3 colonias s ospechosas de cada placa y aplicarlas con estría cr uzada 
para aislar en agar T 1N1 o en agar soya tripticasa con sal (al 2% de concen tración de NaCl) e incubar durante 
12-18 horas a 35-37° C. Es necesario hacer un cultiv o en un medio no selectivo a fin de garantizar la p ureza 
de las colonias, antes de las pruebas bioquímicas, se puede inocular a los agares gelatina (GA) y gela tina sal 
(GS) en el segundo día. Los resultados serán confia bles si las placas de aislamiento muestran colonias  puras. 
B 7.7.6.1.1  Agar TCBS . Las colonias de V. cholerae  (El Tor y Clásico) son grandes, lisas, amarillas 
(positivas para la fermentación de la sacarosa) y l igeramente achatadas, con el centro opaco y los bor des 
translúcidos. 
Nota: Las especies de Vibrio  no producen colonias pequeñas de color crema en ag ar TCBS. Las colonias 
de V. mimicus , que están estrechamente relacionadas con la espec ie anterior, son verdes (sacarosa 
negativas). La mayoría de las demás especies de Vibrio  crecen en agar TCBS y producen colonias amarillas y 
verdes. 
B 7.7.6.1.2  Agar mCPC . Las colonias de V. cholerae  El Tor son púrpuras (negativas para la fermentació n 
de la celobiosa). El V. vulnificus  produce colonias amarillas achatadas, con el centr o opaco y los bordes 
translúcidos. La mayoría de las demás especies de Vibrio  no crecen fácilmente en agar mCPC. 
B 7.7.6.2 Diferenciación. 
Diferenciación de los vibrios sospechosos de los mi croorganismos que no son vibrios. 
B 7.7.6.2.1  TSI,KIA y agar inclinado de Arginina y Glucosa (AG S). Inocular las colonias individuales en 
medios de cultivo TSI (Agar de Triple Azúcar y Hier ro), KIA (Agar de Hierro Kliger) y AGS, picar y est riar en el 
agar inclinado. Incubar los tubos inoculados, con e l tapón no muy apretado, durante 18 a 24 horas de 3 5-
37° C. Se recomiendan estos medios porque las reacci ones permiten efectuar una diferenciación presuntiv a 
entre la mayoría de las especies de Vibrio , Aeromonas , Plesiomonas,  Shigella  y otras bacterias. 
B 7.7.6.2.2  Caldo triptona al 3% de NaCl (T 1N3). Inocular las colonias en los caldos T 1N0 y T 1N3 e incubar 
durante 18 a 24 horas de 35-37° C. El V. cholerae  y el V. mimicus  crecerán en T 1N0 y T 1N3. Algunas especies 
de bacterias que no son vibrios y que presentan rea cciones similares a las de V. cholerae  en medios de TSI y 
LIA no crecen en T 1N3. La mayoría de las especies Vibrio  spp, incluyen algunos V. cholerae  No. 01, crecerán 
en T 1N3 unicamente de la familia Vibrionaceae crece solamente en T 1N3. 
B 7.7.6.2.3  Una alternativa consiste en usar agar gelatina (GA ) y agar gelatina con 3% de NaCl (GS) para 
determinar la tolerancia de los cultivos puros a la  sal. Dividir las placas en ocho sectores, inocular  una línea 
recta en el centro de un sector de las placas, tant o de GA como de GS con cada cultivo puro. Incubar d urante 
18 a 24 horas de 35 - 37° C. El V. cholerae  y el V. mimicus  crecerán. El Vibrio spp halofílico crecerá en ambas 
placas, porque ellos no requieren de sal. Sólo en l a placa con GS. Para leer la reacción de la gelatin asa 
sostener la placa sobre una superficie negra, obser vará un halo opaco alrededor de la colonia de los 
microorganismos gelatinasa positivos. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 7.7.6.2.4  Caldo glucosa de Hugh-Leifson. Inocular colonias i ndividuales en tubos duplicados con caldo 
de glucosa de Hugh-Leifson. Recubrir un tubo con un a capa de aceite mineral estéril o vapor líquido (5 0% de 
petrolato y 50% de parafina) unos dos centímetros d e grueso. Incubar ambos tubos durante 18 a 24 horas  de 
35-37° C. Las especies de Vibrio spp utilizan la glucosa tanto para la oxidación com o para la fermentación. Las 
especies de Pseudomonas  que comúnmente se aíslan del pescado y los marisco s con métodos de 
enriquecimiento que se usan para las especies de Vibrio , utilizan la glucosa sólo para la oxidación. 
B 7.7.6.2.5  Prueba de oxidasa. Realizar la prueba de oxidasa c on cultivos puros de agar soya tripticasa 
(2% de NaCl) u otro medio que no contenga carbohidr atos fermentables. Un método fácil consiste en colo car 
un círculo de papel filtro en una caja de Petri y h umedecerlo con algunas gotas de reactivo de oxidasa . Con un 
palito aplicador de madera, un mondadientes o una a sa de platino estéril, sacar un poco de cultivo de la placa 
y tocar el papel humedecido, si hay microorganismos  oxidasa positivos, el papel se tornará púrpura osc ura o 
azul en pocos segundos. Las especies patógenas de Vibrio  spp. son oxidasa positivas (excepto el V. 
metschnnikovii ). 
B 7.7.6.3  Identificación y Confirmación de V. cholerae  01, V.cholerae  NO 01 y V. mimicus . 
B 7.7.6.3.1  Leer los resultados de las prueba bioquímicas de T SI, KIA, AGS, T 1N0 y T 1N3 o GA Y GS, y 
caldo glucosa de Hugh-Leifson. 
B 7.7.6.3.2  Hacer una tinción de Gram a un cultivo de 18 a 24 horas en caldo o agar. 
NOTA: Los cultivos puros que se someterán a las dem ás pruebas serológicas y bioquímicas para el V.  
cholerae  son sacarosa positivos (amarillo) en agar TCBS y s acarosa negativos (verdes) en el caso de V. 
mimicus  o son celobiosa negativos (verde-púrpura) en agar mCPC, crecen en caldo T 1N0 o en placas con GA; 
presentan reacciones características en TSI, KIA y AGS. Son gelatina y oxidasa positivos, son bacilos curvos 
gram negativos y producen ácido a partir de la gluc osa, tanto en la oxidación como en la fermentación,  en el 
caldo de cultivo de Hugh-Leifson. 
B 7.7.6.3.3  Pruebas bioquímicas. Las reacciones bioquímicas pa ra identificación de V. cholerae  y otras 
especies bacterianas afines figuran en el cuadro an exo. La fórmula para todos los medios bioquímicos d eberá 
contener por lo menos un 2% de NaCl. En vez de medi os convencionales se pueden usar tiras AP120E, con 
2% de NaCl como diluyente. Para el V. cholerae  se puede usar solución salina fisiológica (0,85% d e NaC1) 
como diluyente. 
B 7.7.6.3.4  Prueba serológica de aglutinación. Usar antisuero de diagnóstico del grupo 01 y del subgrupo 
Inaba (factores AC) y Ogawa (Factores AB) para el a ntígeno del serotipo 01. Usar cultivos de 16 a 24 h oras 
producidos en TSA. Incluir cultivos positivos y neg ativos, y los controles salinos para cada antisuero  usado. 
Seguir las instrucciones del antisuero. Como es pos ible que los antígenos de los antisueros estén 
relacionados entre sí, hay que realizar pruebas bio químicas para confirmar que el cultivo puro sea de V. 
cholerae  01 o No 01. 
Nota: Anticuerpos monoclonales están disponibles, p ero el anti-B y anti-C reaccionan opuestamente con 
bacterias de otras especies. Uso de anticuerpos pol iclonales y/o monoclonales será para el antígeno de l 
complejo 01. 
B 7.7.6.3.4.1 Los cultivos que aglutinan con el antisuero del gru po 01, pero no en solución salina 
fisiológica simple, son de V. cholerae  del grupo 01 si las reacciones bioquímicas confirm an que el cultivo puro 
es de V. cholerae . Los cultivos que se aglutinan con este antisuero para grupos específicos pueden ser 
clasificados según el subtipo con anticuerpos Inaba  y Ogawa. 
B 7.7.6.3.4.2 Los cultivos que aglutinan con el suero polivalente  (grupo 01) y con los antisueros Inaba y 
Ogawa, tienen los 3 factores (A, B y C) y son del s erotipo Hikojima. 
B 7.7.6.3.4.3 Los cultivos que aglutinan con el antisuero polival ente pero no aglutinan con antisueros Inaba 
y Ogawa, no se pueden tipificar con estos antisuero s. 
B 7.7.6.3.4.4 Los cultivos de V. cholerae  cuya identidad se haya confirmado con métodos bioq uímicos y 
que no aglutinen con el antisuero del grupo 01 son V. cholerae  No 01. El suero para la clasificación de V. 
cholerae  No 01 según el tipo se puede obtener de R.J. Siebel ing. 
B 7.7.6.3.4.5 Los cultivos que se aglutinan en el antisuero del g rupo 01 y en solución salina, no se pueden 
clasificar según el tipo. Sin embargo, si se usa un  medio más rico, como en TSA o agar infusión cerebr o 
corazón (BHI), se puede eliminar esta autoaglutinac ión. 
B 7.7.6.3.5 Características mínimas para la identificación de V. cholerae .       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
Las características que permiten suponer la presenc ia de V. cholerae  como mínimo son las siguientes: 
B 7.7.6.3.5.1 Morfología. 
B 7.7.6.3.5.2 Bacilo o bacilo encorvado, esporogénico y gram nega tivo. 
B 7.7.6.3.5.3 Aspecto en TSI. 
B 7.7.6.3.5.4 Estría ácido, picadura ácido, gas negativo y H2S ne gativo. 
B 7.7.6.3.5.5 . Prueba de Hugh-Leifson. 
B 7.7.6.3.5.6 Fermentación de la glucosa y oxidación positiva. 
B 7.7.6.3.5.7 Citocromo-oxidasa positivo. 
B 7.7.6.3.5.8 Prueba de la Dihidrolasa arginina: negativo. 
B 7.7.6.3.5.9 Prueba de la Lisinadescarboxilasa: positivo. 
B 7.7.6.3.5.10  Prueba de VP: Positivo El Tor, negativo Clásico y V. mimicus . 
Crecimiento a 42° C: positivo. 
B 7.7.6.3.5.11  Prueba de halofilia con NaCl. 0% : positivo, 3% : positivo, 6%: usualmente negativo. 
Algunas cepas de V. cholerae  NO 01 se desarrollan a 0% de NaCl. 
B 7.7.6.3.5.12  Fermentación de la sacarosa: positivo para V. cholerae  (negativo para V. mimicus ). 
B 7.7.6.3.5.13  Prueba de ONPG: positivo. 
B 7.7.6.3.5.14  Fermentación de la arabinosa: negativo. 
B 7.7.6.3.5.15  0/129 sensitiva: sensible para 10 y 150 µg 0/129 
REACCIONES DE ALGUNOS Vibrio  spp. EN AGAR KIA, TSI Y AGS. 
Microorganismos KIA TSI AGS 
Estría Picadura Estría Picadura Estría Picadura 
V.cholerae K A A(K)* A K a 
V.mimicus K A K(A)* A K A 
V.parahaemolyticus K A K A K A 
V.alginolyticus K A A A K A 
V.vulnificus K o A A K(A)* A K A 
Aeromonas 
hidrophyla K o A A K o A A K K 
Plesiomonas shigelloides K o A A K o A A N N 
* = Raramente K = Alcalino A = Acido a = Ligerament e ácido N = Neutro 
Ninguna de las especies enumeradas produce sulfuro de hidrógeno en medios KIA, TSI o AGS, ni una 
cantidad perceptible de gas a partir de glucosa en medios KIA, TSI o AGS. Algunas especies de Aeromonas  
spp. Pueden producir gas a partir de glucosa en est os medios. 
B 7.8 Método  para la determinación de Staphylococcus aureus  
B 7.8.1  Fundamento  
Este método permite hacer una estimación del conten ido de Staphylococcus aureus en alimentos, se 
efectúa directamente en placas de medio de cultivo selectivo y diferencial, con la confirmación median te las 
pruebas de coagulasa y termonucleasa. Este método e s adecuado para el análisis de alimentos en los cua les 
se esperen más de 100 células de Staphylococcus aureus por g. 
B 7.8.2 Reactivos 
En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshi dratadas, para su preparación se deben seguir las 
instrucciones impresas en la etiqueta respectiva. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
Cuando se mencione agua debe entenderse que se trat a de "agua destilada". 
Los reactivos a emplear en el método objeto de esta  norma deben ser grado analítico. 
B 7.8.2.1  Soluciones diluyentes 
B 7.8.2.2  Solución reguladora de fosfatos (Solución concentr ada) 
Ingredientes Cantidad 
Fosfato monopotásico 34,0 g 
Agua  1 L 
 
Preparación 
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1 N, af orar 
con agua a 1 L. 
Esterilizar durante 15 min a 121ºC ±1, conservar en  refrigeración (solución concentrada). 
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a  1 L con agua (solución de trabajo). 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se r equiera. 
Esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 min. 
Después de la esterilización, los volúmenes finales  y el pH de la solución de trabajo deben ser iguale s a 
los iniciales. 
B 7.8.2.3  Agua peptonada 
Ingredientes Cantidad 
Peptona  1,0 g 
Cloruro de sodio 8,5 g 
Agua  1 L 
 
Preparación 
Disolver los componentes en un litro de agua. 
Ajustar el pH a 7,0 con solución de hidróxido de so dio 1N. 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se r equiera. 
Esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 min. 
Después de la esterilización los volúmenes finales y el pH de la solución de trabajo deben ser iguales  a los 
iniciales. 
B 7.8.2.4  Medios de cultivo 
B 7.8.2.5  Medio de Baird-Parker 
Ingredientes Cantidad 
Medio base 
(numeral B 7.8.2.6) 95,0 mL 
Solución de telurito de potasio (numeral B 7.8.2.7)  1,0 mL 
Emilsión de yema de huevo (numeral B 7.8.2.9) 5,0 m L 
       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
Preparación 
Cuando el medio base esté a 45ºC, agregar los demás  ingredientes y mezclar. 
Colocar de 15 a 20 mL del medio completo, enfriar y  dejar solidificar. 
Las placas pueden almacenarse por 48 h a temperatur a de 0 a 5ºC. 
B 7.8.2.6  Medio base de Baird-Parker 
Ingredientes Cantidad 
Tripona  10 g 
Extracto de levadura 1,0 g 
Extracto de carne  5,0 g 
Glicina  12,0 g 
Cloruro de litio 5,0 g 
Piruvato de sodio 10,0 g 
Agar  20,0 g 
Agua  1,0 l 
 
Preparación 
Disolver los ingredientes o el agar base en agua y calentar con agitación constante y hervir durante 1  min. 
Esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 min. 
Enfriar y mantener el medio a 45ºC. 
B 7.8.2.7  Solución de telurito 
Ingredientes Cantidad 
Telurito de potasio 1,0 g 
Agua  100,0 mL 
 
Preparación 
Disolver el telurito de potasio en agua y esteriliz ar. 
La solución puede ser almacenada por varios meses a  temperatura de 0 a 5ºC. 
B 7.8.2.8  Solución salina isotónica 
Ingredientes Cantidad 
Cloruro de sodio 0,85 g 
Agua  100,0 mL 
 
Preparación 
Disolver el ingrediente en agua y esterilizar a 121 ºC ±1 durante 15 min. 
B 7.8.2.9  Emulsión de yema de huevo 
Preparación 
Lavar con agua y jabón los huevos frescos que sean necesarios y limpiarlos con una solución de tintura  de 
yodo (solución alcohólica al 2%) o sumergirlos en s olución de cloruro mercúrico (1:1000). Enjuagar con  agua 
estéril y secar con gasa estéril. 
En campana de flujo laminar o en condiciones asépti cas, abrir los huevos y vaciarlos en un separador d e 
claras estéril. Transferir las yemas a una probeta hasta un volumen de 60 mL y completar a 90 mL con 
solución salina isotónica. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
Verter la emulsión a un matraz Erlenmeyer con perla s de vidrio estéril y agitar fuertemente para forma r la 
emulsión. 
Filtrar a través de gasa. 
Las placas deben utilizarse dentro de las 48 h sigu ientes a su preparación. 
B 7.8.2.9  Caldo de infusión cerebro-corazón (BHI) 
Ingredientes Cantidad 
Infusión de cerebro de ternera 200,0 mL 
Infusión de corazón de res 250,0 mL 
Peptona de gelatina 10,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Fosfato disódico dodecahidratado 2,5 g 
Glucosa  2,0 g 
Agua  1,0 mL 
 
Preparación 
Disolver los ingredientes en agua y calentar ligera mente si es necesario. 
Distribuir y esterilizar durante 15 min a 121ºC ±1.  
B 7.8.2.10  Acido desoxirribonucleico helicoidal de timo de te rnera. 
Ingredientes Cantidad 
Acido desoxirribonucléico helicoidal de timo de ter nera 
o equivalente 0,03 g 
Agar  1,0 g 
Cloruro de calcio anhídro (solución 0,01 M) (numera l B 
7.8.2.11) 0,10 mL 
Cloruro de sodio 1,0 g 
Azul de toluidina (solución 0,1 M) (numeral B 7.8.2 .12) 0,30 mL 
Tris-( hidroximetil-aminometano)  (Tris solución 0, 05 
M, pH 9) (numeral B 7.8.2.13) 100 mL 
 
Preparación 
Disolver los ingredientes, excepto el azul de tolui dina agitando hasta completar la disolución del áci do 
desoxirribonucleico y calentar a ebullición. 
Agregar el azul de toluidina. Distribuir en frascos  pequeños con tapón de hule. No es necesario esteri lizar. 
Este medio es estable a temperatura ambiente hasta 4 meses y funciona perfectamente aun después de 
fundirlo varias veces. 
Tomar un porta objetos limpio y agregar 3 mL del me dio fundido esparciéndolo por la superficie. 
Cuando el agar solidifique, hacer orificios con la punta de una pipeta Pasteur. 
Conservar en refrigeración para evitar la deshidrat ación. 
B 7.8.2.11  Solución de cloruro de calcio anhidro 0,01 M 
Cloruro de calcio PM = 110,99 
Disolver 0,1199 g de cloruro de calcio en 100 mL de  agua. 
B 7.8.2.12  Solución de azul de toluidina 0,1 M 
Disolver 3,05 g de azul de toluidina en 100 mL de a gua. 
B 7.8.2.13  Solución amortiguadora 0,05 M Tris-(hidroximetilam inometano) 
(Tris pH 9) PM = 121,1       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
Disolver 6,055 g de Tris en 100 mL de agua. 
B 7.8.2.14  Plasma de conejo 
Emplear plasma deshidratado o rehidratado de conejo  siguiendo las instrucciones del fabricante y agreg ar 
ácido etilendiaminotetracético (EDTA) en solución a l 0,1% en plasma rehidratado. Si se utiliza plasma 
deshidratado diluir con agua estéril en proporción de 1:3. 
Puede emplearse plasma de conejo liofilizado adicio nado de EDTA. No debe emplearse sangre citratada. 
B 7.8.3 Materiales 
Todos los instrumentos que se utilicen para trabaja r la muestra deben esterilizarse mediante horno, 
durante 2 h de 170-175ºC o como alternativa en auto clave durante 15 min como mínimo a 121ºC ±1. 
B 7.8.3.1  Cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas y separador de huevo. 
B 7.8.3.2  Tubos de cultivo de 16 mm x 150 mm o frascos de 12 5 a 250 mL de capacidad. 
B 7.8.3.3  Tubos de cultivo de 10 mm x 75 mm. 
B 7.8.3.4  Cajas Petri de 90 a 100 mm de diámetro. 
B 7.8.3.5  Pipetas bacteriológicas de 1 mL y 10 mL de capacid ad graduadas en 0,1 mL y 1 mL 
respectivamente y diámetro de 2 a 3 mm. 
B 7.8.3.6  Pipetas Pasteur. 
B 7.8.3.7  Probetas. 
B 7.8.3.8  Varillas de vidrio de 3,5 mm de diámetro aproximad amente y 20 cm de largo dobladas en ángulo 
recto. 
B 7.8.3.9  Matraz Erlenmeyer con perlas de vidrio 
B 7.8.3.10  Cámara húmeda: consiste en una caja Petri en la cu al se coloca una varilla de vidrio en forma 
de "V" rodeada de algodón humedecido con agua. 
B 7.8.4 Aparatos 
B 7.8.4.1  Horno para esterilizar que alcance 180° C. 
B 7.8.4.2  Autoclave con termómetro. 
B 7.8.4.3  Baño de agua con regulador de temperatura de 35 ± 0,5ºC. 
B 7.8.4.4  Baño de agua con regulador de temperatura de 45 ± 0,5ºC. 
B 7.8.4.5  Balanza con capacidad no mayor de 2,500 g y sensib ilidad de 0,1 g. 
B 7.8.4.6  Incubadora a 35 ± 1ºC. 
B 7.8.5 Preparación de la muestra 
La preparación de la muestra se debe realizar de ac uerdo a lo establecido en B 7.1  "Preparación y 
Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico".  
B 7.8.6 Procedimiento 
B 7.8.6.1 Utilizando diferentes pipetas de 1 mL para cada dil ución, depositar 0,1 mL sobre la superficie de 
las placas de agar Baird-Parker. 
B 7.8.6.2 Distribuir el inóculo sobre la superficie del agar con varillas estériles de vidrio en ángulo recto, 
utilizando una para cada dilución. 
B 7.8.6.3 Mantener las placas en su posición hasta que el inó culo sea absorbido por el agar. 
B 7.8.6.4 Invertir las placas e incubar de 45 a 48 h a 35ºC. 
B 7.8.6.5 Seleccionar las placas que tengan entre 15 y 150 co lonias típicas de Staphylococcus aureus ; si 
no es posible, seleccionar las placas de las diluci ones más altas no obstante tengan más de 150 coloni as. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 7.8.6.6 Cuando las placas tengan menos de 15 colonias típic as también pueden ser utilizadas y al 
informe se debe agregar la nota de "valor estimado" . 
B 7.8.6.7 Las colonias típicas son negras, circulares, brilla ntes, convexas, lisas, de diámetro de 1 a 2 mm y 
muestran una zona opaca y un halo claro alrededor d e la colonia. 
B 7.8.6.8 Seleccionar las colonias de acuerdo con el siguient e cuadro para realizar las pruebas de 
coagulasa y termonucleasa: 
CUADRO 1 
Número de colonias sospechosas en 
caja Número de colonias por 
probar 
Menos de 50 3 
51 a 100 5 
101 a 150 o más 7 
 
B 7.8.6.9 Seleccionar el número de colonias y sembrar cada un a en tubos con 0,5 mL de caldo de infusión 
cerebro-corazón. 
B 7.8.6.10 Incubar a 35ºC durante 24 h. 
B 7.8.6.11 Inocular en la misma forma cepas conocidas de Staphylococcus aureus y Staphylococcus 
epidermidis como testigos positivo y negativo. 
B 7.8.6.12 Después del periodo de incubación pasar con una pip eta de 1 mL, 0,3 mL de cada cultivo a otro 
tubo de 10 mm x 75 mm y conservarlo para la prueba de termonucleasa. El resto del cultivo se usa para la 
prueba de coagulasa. 
B 7.8.6.13 Prueba de coagulasa 
B 7.8.6.13.1  Agregar a los 0,2 mL del cultivo anterior, 0,2 mL de plasma de conejo diluido volumen a 
volumen con solución salina estéril. 
B 7.8.6.13.2  Incubar en baño de agua de 35 a 37ºC y observar du rante 6 h a intervalos de 1 h; si no hay 
formación de coágulo, observar a las 24 h. Consider ar positiva la prueba si hay formación de coágulo. 
B 7.8.6.13.3  Para comprobar la coagulabilidad del plasma de con ejo se añade una gota de cloruro de 
calcio al 5% a 0,5 mL de plasma reconstituido emple ado, formándose un coágulo en 10-15 seg. 
B 7.8.6.14  Prueba de termonucleasa 
B 7.8.6.14.1 Calentar durante 15 min, 0,3 mL de cultivo en caldo  de infusión cerebro-corazón en baño de 
agua hirviendo. 
B 7.8.6.14.2  Pasar una gota de cada cultivo por medio de una pi peta Pasteur a un orificio del medio, 
incluye testigo. 
B 7.8.6.14.3  Incubar a 35ºC en cámara húmeda de 4 a 24 h. 
B 7.8.6.14.4  La aparición de un halo color rosa extendido de po r lo menos 1 mm alrededor de la 
perforación se califica como positiva. 
B 7.8.7 Cálculo y expresión de resultados 
B 7.8.7.1 Cálculo 
Hacer el cálculo del contenido de microorganismos e n el producto tomando en cuenta el número de 
colonias totales, el número de colonias confirmadas , la dilución y el volumen inoculado (0,1 mL). 
Ejemplo 1: 
Si la caja tiene 80 colonias en la dilución 1:1000       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
Se toman 5 colonias para la prueba, de éstas dan 4 positivas, el cálculo es: 
80 x 4  = 64 x 1000 x 10 = 640 000 
 5 
Ejemplo 2: 
Si la caja tiene 14 colonias en la dilución 1:10 
Se toman 3 colonias para la prueba, de éstas dan 2 positivas, el cálculo es: 
14 x 2  = 9,3 x 10 x 10 = 930 
 3 
B 7.8.7.2 Expresión de los resultados: 
Según ejemplo 1: 
Informar como Staphylococcus aureus 640 000 UFC/g 
Según ejemplo 2: 
Informar como Staphylococcus aureus 930 UFC/g valor estimado 
Si las pruebas confirmativas resultan negativas en todas las colonias probadas, informar como: 
0 UFC/g en muestras directas 
-10 UFC/g en muestras de dilución 1:10 
-100 UFC/g en muestras de dilución 1:100 
En la práctica los resultados pueden variar, esto d ependerá del técnico que trabaje el método y el gra do de 
confiabilidad del mismo, que en el 95% de los casos  es de ± 16% a ± 52%. 
B 7.9 Determinación de enterotoxina estafilocóccica  por el método de ELISA . 
B 7.9.1  Principio del método. 
Este método se basa en un inmunoensayo visual el cu al proporciona una prueba rápida (4 h), sensible (1 ,0 
ng o más por mL o g), y específica para la identifi cación de las enterotoxinas A-E estafilocóccicas. S in 
embargo, con esta prueba no se identifican los sero tipos de enterotoxina, en forma individual. La prue ba de 
Elisa se realiza en configuración de “sandwich”. 
B 7.9.2  Materiales y Equipo 
B 7.9.2.1  Algodón absorbente. 
B 7.9.2.2  Micropipetas de 50-200 µL y 5-20 µL. 
B 7.9.2.3  Puntas de plástico para micropipeta. 
B 7.9.2.4  Plástico para envolver o sellar recipientes de plá stico. 
B 7.9.2.5  Papel pH (intervalo 0-14). 
B 7.9.2.6  Frascos de plástico de 500 mL. 
B 7.9.2.7  Jeringas de plástico de 25 mL. 
B 7.9.2.8  Tubos para centrífuga. 
B 7.9.2.9  Tubos de polipropileno de 12 x 75 mm. 
B 7.9.2.10  Polietilen glicol (PEG, peso molecular de 15,000-2 0,000). 
B 7.9.2.11  Tubo de diálisis (12,000-14,000 peso molecular exc lusión). 
B 7.9.2.12  Vasos de precipitados de 250 mL. 
B 7.9.2.13  Filtros tipo jeringa  (para filtrar los alimentos). Preparar jeringas de plástico desechables (0,25 
mL) e insertar suficiente cantidad de algodón absor bente, para hacer un empaque de 0,5 cm. Pasar 5,0 m L de 
agua destilada, presionar con el émbolo para asegur arse de formar un paquete firme. Preparar 
inmediatamente antes de filtrar los extractos de al imento, para tratar con el aditivo provisto con el equipo.  
B 7.9.2.14  Placa de 48 o 96 pozos recubiertos con el grupo de  antisueros *. 
B 7.9.2.15  Soporte para sostener la placa *. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 7.9.2.16  Instructivo del método *. 
B 7.9.2.17  Comparador de color *. 
B 7.9.2.18  Hoja de resultados *. 
*Materiales suministrados por el fabricante. 
B 7.9.2.19  Equipo TECRA TM  
B 7.9.2.20  Incubadora a 35-37° C. 
B 7.9.2.21  Omnimixer, licuadora (o equivalente) para la prepa ración de los extractos de alimentos. 
B 7.9.2.22  Centrífuga a 1000 -3000 x g. 
B 7.9.2.23  Agitador de microplacas (opcional). 
B 7.9.2.24  Lector de microplacas (opcional). 
B 7.9.2.25  Balanza. 
B 7.9.3  Reactivos. 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben  ser grado analítico a menos que se indique otra 
especificación y por agua debe entenderse agua dest ilada. 
B 7.9.3.1  Solución amortiguadora Tris 0,25 M (30,28 g TRIS/L , pH 8,0). 
B 7.9.3.2  Solución de hidróxido de sodio 1,0 N (NaOH). 
B 7.9.3.3  Acido clorhídrico (HCl). 
B 7.9.3.4  Agua destilada o deionizada. 
B 7.9.3.5  Hipoclorito de sodio. 
B 7.9.3.6  BHI con 0,7% de agar (m/v). 
B 7.9.3.7  Solución de lavado. Contiene: 1,5 g de tris(hidrox imetil) aminometano (Tris), 6g de NaCl, 2,0 g 
polioxietilen sorbitan monolaurato (Tween 20), y 0, 001 g de timerosal en 25,0 mL de H 2O * 
B 7.9.3.8  Aditivo para la muestra. Es una solución que conti ene: 2 g de Tween 20 y 0,001 g de timerosal 
en 6,0 mL de H 2O *. 
B 7.9.3.9 Control positivo: Diluir 25 µL de control positivo concentrado (toxina estafiloc óccica tipo B, 0,1 g 
Na 2B4O7, 0,1 g de NaCl y 0,001 g de timerosal en 4,0 mL de  H 2O), en 2,5 mL de sol. de lavado (7.10.5.1) *. 
B 7.9.3.10  Control negativo. Contiene: 0,0072 g de Tris, 0,1 g de NaCl, 0,001 g de timerosal y 0,01 g de 
Tween 20 en 6,0 mL de H 2O *. 
B 7.9.3.11  Diluyente del Conjugado. Contiene: 0,2 g Na 2B4O7, 0,1 g de NaCl, 0,1 g de gelatina, y 0,001 g 
de timerosal en 13,5 mL de H 2O *. 
B 7.9.3.12  Conjugado liofilizado. Un frasco que contiene anti suero polivalente (A-E) liofilizado, conjugado; 
0,003g de Na 2B4O7, 0,002 g de CaCl 2, y 0,0001 g de timerosal. Para su uso, agregar al frasco 13 mL del 
diluyente del párrafo anterior*. 
B 7.9.3.13  Aditivo para la muestra Diluyente del Substrato. C ada 26 mL de H 2O contienen 0,2 g de ácido 
acético y 0,01 g de H 2O2*. 
B 7.9.3.14  Substrato.  Un frasco de liofilizado que contiene; 0,01 g de 2, 2´-di-azino(sulfonato de 3-etil 
benzotiazolin), 0,01 g de EDTA, y 0,1 g de NaH 2PO 4. Para su uso, agregar al frasco 26mL del diluyente  del 
substrato. 
B 7.9.3.15  Solución para detener la reacción (solución stop).  Cada 6,0 mL contienen; 1,5 g de NaF en 6,0 
mL de agua 
*Reactivos suministrados por el fabricante 
B 7.9.4  Procedimiento. 
B 7.9.4.1  Preparación de las muestras. 
B 7.9.4.1.1  Productos fluidos y productos deshidratados.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
Pesar 25 g de leche deshidratada y agregar 125 mL d e solución Tris 0,25 M pH 8.0 Solución 
amortiguadora Tris. Continuar como se indica para l eche fluida. En muestras de 5,0 mL, verificar que e l pH 
esté en un intervalo de 7,0-8,0. Agregar 50 µL de Aditivo para la muestra. En el caso de extract os más claros, 
ajustar el pH a 4,0 con HCl concentrado. Para muest ras de leche de 50 mL, verificar que el pH esté en un 
intervalo de 7,0-8,0. Agregar 50 µL de aditivo Aditivo para la muestra. Centrifugar l a muestra 10 min a 1000-
3000 x g. Decantar el extracto y pasar 5,0 mL aprox imadamente, a través de una jeringa empacada con 
algodón absorbente humedecido previamente, y recibi r en un tubo de polipropileno. Ajustar nuevamente e l pH 
a 7,0-8,0 (usar papel pH). Agregar 50 µL de aditivo Aditivo para la muestra y mezclar. 
B 7.9.4.1.2 Ingredientes deshidratados. 
Agregar 125 mL de solución Tris 0,25 M pH 8,0 a 25 g de muestra, homogeneizar en licuadora (a 
velocidad alta), durante 3 min. Centrifugar la mues tra 10 min a 1000-3000 x g y recoger el extracto 
(sobrenadante). Quitar el émbolo de la jeringa de p lástico que contiene el empaque de algodón absorben te 
humedecido previamente y con cuidado, pasar el extr acto a través del empaque y recibir el eluido. Toma r 5,0 
mL de eluido y ajustar el pH a 7,0-8,0. Agregar 50 µL de aditivo, y mezclar. 
B 7.9.4.1.3  Otros alimentos. 
Agregar 50 mL de solución Tris 0,25 M pH 8,0 a 25 g  de muestra, y homogeneizar en licuadora durante 3 
min a velocidad alta. Centrifugar la muestra durant e 10 min a 1000-3000 x g. Quitar el émbolo de la je ringa de 
plástico que contiene el empaque de algodón absorbe nte humedecido previamente, y pasar 5,0 mL de 
extracto a la jeringa, insertar el émbolo y con cui dado presionar el émbolo y recoger el eluido. Tomar  5 mL del 
eluido, ajustar a pH 7,0-8,0, si es necesario; agre gar 50 µL de aditivo, y mezclar. 
Nota 1: Preparar los extractos de alimentos inmediatamente antes de realizar la prueba. 
Precauciones generales. 
En caso de alimentos crudos fermentados, procesados  o enlatados, con evidentes defectos; o de cultivos  
fluidos obtenidos en el laboratorio, que pudieran d ar como resultado el crecimiento de microorganismos  
productores de peroxidasa, es necesario, antes de h acer la determinación de toxina, verificar si los e xtractos 
de alimentos o preparados a partir del cultivo en e l laboratorio, contienen peroxidasa, debido a que e sta 
enzima podría interferir con la interpretación de l os resultados. 
Para determinar la presencia de peroxidasa, agregar  50 µL del substrato, en una placa de microtitulación 
sin tratar (no contiene anticuerpos para la enterot oxina estafilocóccica). Dejar en reposo 10 min. Si el color 
cambia a azul o azulverdoso, indica que la muestra contiene peroxidasa intrínseca; la cual debe inacti varse. Si 
la muestra permanece incolora (o con el color origi nal), realizar el análisis de enterotoxina. Para in activar la 
peroxidasa intrínseca, preparar una solución al 30%  (m/v) de azida de sodio y agregar 1 mL de esta sol ución a 
4 mL de muestra (la concentración final de la azida  de sodio es de 6% (m/v). Mezclar y agregar un poco  de 
aditivo, dejar en reposo 1-2 min a temperatura del laboratorio (20-25ºC). Repetir la prueba para deter minar 
presencia de peroxidasa, como se describió anterior mente. Si la reacción es incolora o presenta el col or 
original, continuar con la prueba. 
Nota 2: Para alimentos crudos (ejemplo: verduras), seguir l as precauciones generales señaladas 
anteriormente. 
B 7.9.4.2 Preparación de reactivos. 
B 7.9.4.2.1 Reconstitución de la solución de lavado. 
Diluir, en un frasco de reactivos la solución conce ntrada (como lo indique el fabricante), con agua de stilada 
o deionizada, para obtener 2 L. Utilizar esta "solu ción de lavado" para lavar los pozos y diluir el co ntrol 
positivo. Es recomendable el uso de pizeta. Almacen ar a 4° C, cuando no se use. 
B 7.9.4.2.2  Preparación del conjugado. 
Agregar el diluyente del conjugado y rehidratar a t emperatura del laboratorio. Mezclar  suavemente. Esta 
preparación es el "Conjugado reconstituido". 
B 7.9.4.2.3 Preparación del substrato. 
Disolver el substrato con el diluyente asegurarse q ue el contenido se haya disuelto completamente. Dej ar 
a la temperatura del laboratorio (20-25° C), antes d e su uso. 
B 7.9.4.2.4 Precauciones generales:  Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 7.9.4.2.4.1  Observar la fecha de caducidad del equipo adquirid o. Es la última fecha en la cual el 
producto debe utilizarse. Preparar todos los reacti vos con cuidado y anotar la fecha de reconstitución , en la 
etiqueta externa de la caja. Usar los reactivos den tro de los 65 días a la fecha anotada en la etiquet a. 
Refrigerar todos los componentes (2-8° C) cuando no estén en uso. NO CONGELAR. 
B 7.9.4.2.4.2  El equipo de inmunoensayo visual está preparado pa ra utilizarse como una unidad integral; 
por tanto, no se deben mezclar los componentes de d iferentes lotes. 
B 7.9.4.2.4.3  Utilizar puntas nuevas para cada muestra de alimen to. Evitar la contaminación cruzada al 
llenar los pozos. Si se usan propipetas de plástico  para distribuir el conjugado y el substrato, se de ben 
mantener siempre por separado. Asegurarse de no con fundir las tapas de los reactivos. 
B 7.9.4.2.4.4  Usar controles positivos y negativos en cada prueb a. 
B 7.9.4.2.4.5  Preparar recipientes con solución al 2% de hipoclo rito de sodio para desechar todas las 
muestras y materiales que contengan toxina. 
Mantener los pozos removibles que no se usen dentro  del paquete y volver a sellar con cinta, después d e 
cada uso. 
B 7.9.4.5 Determinación de la enterotoxina. 
B 7.9.4.5.1 Preparación de los pozos. 
Tomar del paquete el número necesario de pozos; uno  para cada muestra, uno para control positivo y uno  
para control negativo. Si se requiere, pueden utili zarse pozos adicionales (control positivo y negativ o en 
alimento). 
B 7.9.4.5.2 Prelavado. 
Con la ayuda de una piceta llenar cada pozo con sol ución de lavado y dejar en reposo durante 10 minuto s 
a la temperatura de laboratorio (20-25ºC). Vaciar l os pozos por inversión rápida del soporte (placa); eliminar 
completamente todo residuo de líquido, golpeando va rias veces, firmemente hacia abajo la placa, sobre una 
toalla de papel absorbente. 
B 7.9.4.5.3 Colocación de las muestras. 
Pasar alícuotas de 200 µL de los controles y muestras (extractos de aliment o o de cultivos) dentro de 
pozos individuales. Registrar la posición de cada m uestra en la hoja de registro específica. Golpear 
suavemente la placa para asegurarse de la distribuc ión homogénea y del contacto de las muestras con la s 
paredes de los pozos; el uso de un agitador de micr oplacas durante 30 segundos, es opcional. Cubrir lo s 
pozos con una película plástica, estirable, autoadh erible o sello especial de microplacas; para evitar  la 
evaporación. Incubar 2 hrs. a 35-37° C. 
B 7.9.4.5.4  Segundo lavado. 
Presionar firmemente los pozos en la placa e invert ir rápidamente. Vaciar el contenido de los pozos en  el 
recipiente de desecho (con hipoclorito de sodio al 2%). Eliminar el residuo de líquido golpeando 
enérgicamente, varias veces la placa invertida, sob re una toalla de papel absorbente; llenar completam ente 
los pozos con solución de lavado, y repetir el lava do en la misma forma, de 2 a 3 veces más y finalmen te 
vaciar los pozos. 
Nota 3: El lavado profundo de los pozos es un paso crítico y asegurará una clara interpretación de los 
resultados. 
B 7.9.4.5.5 Adición de conjugado. 
Agregar 200 µL del conjugado reconstituido (enzima) a cada pozo.  Volver a cubrir la placa e incubar 1 h a 
temperatura de laboratorio (20-25° C). Vaciar las pl acas y lavar profundamente, 5 veces, como se descri bió 
anteriormente en el segundo lavado. 
B 7.9.4.5.6  Adición del substrato. 
Agregar, a cada pozo, 200 µL del substrato reconstituido. Dejar a temperatura del laboratorio (20-25° C) 
durante 30 min, como mínimo, hasta que el control p ositivo alcance la máxima absorbancia (mayor a 1,0)  o al 
color más intenso que el número 4 del comparador de  color. El desarrollo de color tiende a concentrars e       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
alrededor de las orillas de los pozos. Para obtener  resultados más precisos, golpee con suavidad los e xtremos 
de la placa, con el propósito de que el contenido d e los pozos se mezcle bien antes de la lectura. Agr egar a 
cada pozo 20 µL de solución stop; golpear con suavidad, para mezc lar los contenidos. 
B 7.9.4.5.7 Determinar los resultados visualmente o mediante un  lector de microtitulación. 
B 7.9.4.6  Interpretación de los resultados: 
Colocar la placa que sostiene los pozos sobre un fo ndo blanco. Comparar el color de cada pozo con el 
comparador de color. El control positivo de toxina (y el control positivo de alimento, si se usó) debe n dar un 
color verde intenso, lo que indica que todos los re activos han funcionado. Si el control negativo es 
significativamente más oscuro que el representado e n comparador de color, significa que hubo, 
probablemente, un lavado inadecuado y la prueba deb e repetirse. 
La muestra se considera positiva , si cumple los siguientes criterios: 
B 7.9.4.6.1  El control negativo está dentro del intervalo de c olor negativo, representado en el comparador 
de color, y las muestras presentan un color verde o  azul más oscuro que el intervalo negativo represen tado en 
el comparador de color. 
La prueba de enterotoxina se considera negativa , si se cumplen los siguientes criterios: 
B 7.9.4.6.2  El control negativo está dentro del intervalo de c olor negativo, representado en el comparador 
de color, y 
B 7.9.4.6.3  La muestra es incolora o tiene el color dentro del  intervalo negativo, representado en el 
comparador de color. 
B 7.9.4.7  Expresión de resultados. 
Prueba positiva o negativa para enterotoxina estafi locóccica 
 
B 8 Método de prueba para la determinación de cadmio, a rsénico, plomo, estaño, cobre, fierro, zinc y 
mercurio en alimentos. 
B 8.1  Fundamento 
El método de absorción atómica se basa en hacer pas ar un haz de luz monocromática de una frecuencia 
tal que puede ser absorbido por el analito que se e ncuentra presente en forma de vapor atómico. La med ida 
de la intensidad luminosa antes y después de su pas o por el vapor atómico permite determinar el por ci ento 
de absorción. 
La cantidad de absorción aumenta con la concentraci ón de los átomos en el medio absorbente, es decir, la 
medida de la absorción aumenta con la concentración  del elemento en la muestra, ya sea que esté en su 
condición original o sujeta a pretratamiento. 
B 8.2 Reactivos 
Soluciones estándares de referencia certificadas de  cada uno de los metales. 
Agua, debe ser destilada deionizada, con un grado m áximo de conductividad de 1 µmho/cm a 25ºC. 
B 8.2.1  Acido nítrico (densidad específica 1,41), grado su prapuro. 
B 8.2.2  Acido nítrico (densidad específica 1,41), contenid o de mercurio muy bajo. 
B 8.2.3  Acido perclórico (densidad específica 1,67), grado  suprapuro. 
B 8.2.4  Acido clorhídrico (densidad específica 1,19), grad o suprapuro. 
B 8.2.5  Acido sulfúrico (densidad específica 1,84), grado suprapuro. 
B 8.2.6  Acido sulfúrico 1 N a partir de la solución grado suprapuro. 
B 8.2.7  Acido nítrico 65% v/v grado RA. 
B 8.2.8  Peróxido de hidrógeno (densidad específica 1,12). 
B 8.2.9  Hidróxido de sodio granalla reactivo RA. 
B 8.2.10  Aire comprimido seco y limpio. 
B 8.2.11  Gases: acetileno, óxido nitroso, argón y nitrógeno , grado absorción atómica. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 8.2.12  Solución de Nitrato de Magnesio hexahidratado al 7 % p/v. Disolver 70 g de Mg(NO3)2·6H2O en 
1000 mL de HCl 1 N. 
B 8.2.13  Acido clorhídrico 1 N. Diluir 8,3 mL de HCl y llev ar a 100 mL de agua. 
B 8.2.14  Acido nítrico al 50% v/v. Diluir 50 mL de HNO3 al 65% v/v grado suprapuro en 50 mL de agua. 
B 8.2.15  Acido clorhídrico 8 M. Diluir 66,0 mL de HCl y lle var a 100 mL con agua. 
B 8.2.16  Acido clorhídrico 0,5 N. Diluir 4,15 mL de HCl y l levar a 100 mL con agua. 
B 8.2.17  Solución de Yoduro de Potasio al 15% p/v. Disolver  15 g de KI en 100 mL de agua (esta solución 
debe prepararse en el momento de usarse). 
B 8.2.18  Solución de Yoduro de Potasio al 20% p/v. Disolver  20 g de KI en 100 mL de agua (esta solución 
debe prepararse en el momento de usarse). 
B 8.2.19  Solución de Cloruro de Potasio (10 mg/mL de K). Di solver 1,91 g de KCl en agua y diluir a 100 
mL con agua. 
B 8.2.20  Solución de Nitrato de Magnesio al 50% p/v. Disolv er 50 g de Mg(NO3)2.6H2O en 100 mL de 
agua. 
B 8.2.21  Solución de ácido clorhídrico al 1,5% p/v. Diluir 1,5 mL de HCl en 100 mL de agua destilada 
deionizada. 
B 8.2.22  Solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 1 g de hidróxido de sodio y diluir a 100 mL con 
agua destilada deionizada. 
B 8.2.23  Solución de borohidruro de sodio al 4% p/v en solu ción de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 4 g 
de borohidruro de sodio en 100 mL de una solución d e hidróxido de sodio al 1% p/v. Filtrar al vacío. 
B 8.2.24  Solución reductora para mercurio. Mezclar 50 mL de  ácido sulfúrico concentrado con 
aproximadamente 300 mL de agua. Enfriar a temperatu ra ambiente y disolver 15 g de cloruro de sodio, 15  g 
de sulfato o cloruro de hidroxilamina y 25 g de clo ruro o sulfato estanoso en solución. 
B 8.2.25  Diluir a 500 mL. Solución de dilución para mercuri o. En un matraz de 1 L, conteniendo de 300 a 
500 mL de agua destilada deionizada, agregar 58 mL de ácido nítrico concentrado de muy baja concentrac ión 
de mercurio y 67 mL de ácido sulfúrico concentrado.  Diluir al volumen con agua. 
B 8.2.26  Solución de trabajo de As de 1 µg/mL. Diluir 1 mL de la solución patrón de 1000 µg/mL a 1 L con 
ácido sulfúrico 1N preparada a partir de la solució n grado suprapuro. Preparar fresca cada día. 
B 8.3  Materiales 
B 8.3.1  Matraces Kjeldahl de 500 mL y 800 mL. 
B 8.3.2  Sistema de reflujo con refrigerante. 
B 8.3.3  Crisoles Vycor de 40 a 50 mL de capacidad. 
B 8.3.4  Crisoles de platino de 40 a 50 mL de capacidad. 
B 8.3.5  Matraces Erlenmeyer de diferentes capacidades. 
B 8.3.6  Matraces volumétricos de diferentes capacidades. 
B 8.3.7  Matraces redondos de fondo plano de 50 mL. 
B 8.3.8  Bombas Parr. 
B 8.3.9  Micropipetas o pipetas de Eppendorf de diferentes capacidades. 
B 8.3.10  Puntas de plástico para micropipetas. 
B 8.3.11  Papel filtro Whatman No. 2. 
B 8.3.12  Perlas de ebullición. 
B 8.3.13  Varillas de plástico. 
B 8.3.14  Tubos de ensayo graduados de propilen o propileno de 15 mL. 
B 8.3.15  Recipientes de propilen o propileno. 
B 8.3.16  Embudos de filtración de diferentes capacidades.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
B 8.3.17  Material común de laboratorio. 
B 8.3.18  Todo el material utilizado debe someterse a lavado  de acuerdo con las siguientes instrucciones: 
B 8.3.19  El jabón que se use debe ser de preferencia neutro . 
B 8.3.20  Enjuagar perfectamente con agua corriente. 
B 8.3.21  Sumergir el material de vidrio o plástico en un re cipiente (de preferencia plástico) que contenga 
una solución de ácido nítrico grado RA al 30 %. 
B 8.3.22  Dejarlo tapado y reposando por un lapso de 24 hora s. 
B 8.3.23  Quitar el exceso de ácido nítrico con varios enjua gues (5 o 6 veces) con agua deionizada. 
B 8.3.24  Dejar escurrir y secar. 
B 8.3.25  Guardar en cuanto esté seco para evitar contaminac ión por partículas en el aire. 
B 8.4  Aparatos e instrumentos 
B 8.4.1  Aparatos 
B 8.4.1.1  Lámparas de cátodo hueco o de descarga sin electro dos para determinar arsénico, cadmio, 
cobre, estaño, fierro, mercurio, plomo y zinc. 
B 8.4.1.2  Fuente de radiofrecuencia en caso de usar lámparas  de descarga. 
B 8.4.1.3  Automuestreador y recirculador de agua. 
B 8.4.1.4  Placa de calentamiento con regulador que alcance u na temperatura de 400 a 450 ºC. 
B 8.4.1.5  Horno de microondas. 
B 8.4.1.6  Autoclave que alcance 121 ± 5ºC o 15 lb de presión . 
B 8.4.1.7  Centrífuga de laboratorio capaz de mantener 1600 r pm. 
B 8.4.2  Instrumentos 
Los instrumentos que a continuación se indican debe n estar calibrados y ajustados antes de su operació n. 
B 8.4.2.1  Espectrómetro de absorción atómica equipado con lo s accesorios para flama, horno de grafito, 
generador de hidruros o vapor frío, dependiendo del  método a seguir. 
B 8.4.2.2  Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg. 
B 8.4.2.3  Mufla capaz de mantener una temperatura de 550 ± 1 0ºC. 
B 8.4.2.4  Horno de calentamiento (estufa) con intervalo de t emperatura de 120 ± 5ºC. 
B 8.5 Preparación de la muestra 
B 8.5.1 Digestión para la determinación de Cd, Cu, Fe, Pb y  Zn. 
B 8.5.1.1 Digestión por vía húmeda. 
B 8.5.1.1.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad apro piada de muestra. 
Para la determinación por el método de absorción po r flama pesar como máximo 40 g de jugo o bebida, 20  
g de alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos sólidos o semisólidos. Limite e l 
contenido de grasa o aceite a un máximo de 4 g y el  total de materia orgánica a 5 g. 
B 8.5.1.1.2  Añadir 10 mL de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar directamente 
la digestión. 
B 8.5.1.1.3  Usar matraz de Kjeldhal o matraz conectado al sist ema de refrigerantes. 
B 8.5.1.1.4  Calentar suavemente. 
B 8.5.1.1.5  Digerir la muestra 3 horas o más tiempo si es nece sario (algunas muestras requieren la adición 
de mayor cantidad de ácido nítrico) hasta la aparic ión del color traslúcido, si queda ámbar, adicionar  peróxido 
de hidrógeno gota a gota con agitación continua (re acción exotérmica). 
B 8.5.1.1.6  Enfriar. 
B 8.5.1.1.7  Recuperar, filtrar y llevar a un volumen conocido en matraz volumétrico. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 8.5.1.1.8  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificad a por cada serie de digestión. 
B 8.5.1.1.9  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de a bsorción atómica por flama u horno de 
grafito). 
B 8.5.1.2 Digestión por vía seca. 
B 8.5.1.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad apro piada de muestra. 
B 8.5.1.2.2  Para la determinación por el método de absorción p or flama pesar como máximo 40 g de jugo 
o bebida, 20 g de alimentos que contengan del 50 al  75% de agua y 10 g de alimentos sólidos y semisóli dos. 
Limite el contenido de grasa o aceite a un máximo d e 4 g y el total de materia orgánica a 5 g. 
B 8.5.1.2.3  Añadir 10 mL de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar directamente 
la digestión. En productos con alta concentración d e proteínas adicionar una solución de nitrato de ma gnesio 
al 7,0% p/v y mezclar completamente, llevar a seque dad aproximadamente durante 6 horas en estufa a una  
temperatura de 90 a 95ºC. 
B 8.5.1.2.4  Colocar la muestra en una mufla y elevar la temper atura lentamente de 2 a 4ºC por minuto 
hasta 350° C. Mantener la temperatura hasta que cese n los humos. 
B 8.5.1.2.5  Elevar gradualmente la temperatura de 500 a 550ºC para evitar que la muestra se incinere y 
mantener esa temperatura durante 16 horas o toda la  noche. 
B 8.5.1.2.6  Apagar la mufla y dejar enfriar. 
B 8.5.1.2.7  Un segundo paso de calcinación puede ser requerido  para remover algunos residuos de 
carbón, mediante el siguiente procedimiento: 
B 8.5.1.2.8  Lavar las paredes del crisol con 2 mL de ácido nít rico al 50%. Colocar la muestra en una placa 
de calentamiento puesta a 120ºC para remover el exc eso de ácido. Colocar la muestra en una mufla fría y 
elevar la temperatura gradualmente de 500 a 550ºC, manteniéndola por el tiempo necesario. Repetir este  
procedimiento cuantas veces sea necesario hasta que  quede libre de carbón remanente. 
B 8.5.1.2.9  Disolver las cenizas completamente en 5 mL de ácid o clorhídrico 1N, transferir la muestra 
disuelta a un tubo de propileno o a un matraz de vo lumen conocido, enjuagar el crisol con dos alícuota s de 5 
mL de ácido clorhídrico 1 N y transferir al mismo t ubo o matraz para obtener un volumen de 15 mL en el  
primero y llevar al aforo en el segundo, tapar y me zclar, si existe presencia de partículas o materia insoluble, 
filtrar en papel Whatman No. 2, antes de la determi nación. 
B 8.5.1.2.10  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificad a por cada serie de digestión. 
B 8.5.1.2.11  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de a bsorción atómica: flama u horno de 
grafito). 
B 8.5.1.3 Digestión por vía húmeda para la determinación de S n. 
B 8.5.1.3.1  Proceder igual que en el punto I) de B 8.5.1.1 
B 8.5.1.3.2  No adicionar ácido nítrico si no se lleva cabo la digestión total en el mismo día. 
B 8.5.1.3.3  Adicionar 30 mL de ácido nítrico concentrado al ma traz y calentar suavemente por 15 minutos 
en campana para iniciar la digestión, evitando una excesiva producción de espuma. 
B 8.5.1.3.4  Hervir suavemente hasta tener un remanente de 3 a 6 mL o hasta que la muestra empiece a 
secarse en el fondo. No dejar que la muestra se cal cine. 
B 8.5.1.3.5  Retirar la muestra del calor. 
B 8.5.1.3.6  Al mismo tiempo correr dos blancos de reactivos. 
B 8.5.1.3.7  Adicionar 25 mL de ácido clorhídrico concentrado, calentar suavemente durante 
aproximadamente 15 minutos, hasta que todo el cloro  sea liberado. Aumentar la temperatura gradualmente  
hasta ebullición. 
B 8.5.1.3.8  Evaporar hasta obtener de 10 a 15 mL, usando un ma traz similar con 15 mL de agua como 
patrón de volumen. 
B 8.5.1.3.9  Adicionar aproximadamente 40 mL de agua. 
B 8.5.1.3.10  Agitar y pasar a un matraz de 100 mL y enjuagar co n 10 mL de agua.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
B 8.5.1.3.11  Cuando el ácido clorhídrico está presente en la di gestión, las muestras se pueden quedar toda la 
B 8.5.1.3.12  noche o por más tiempo. 
B 8.5.1.3.13  Agregar 1 mL de solución de cloruro de potasio en cada matraz. 
B 8.5.1.3.14  Enfriar a temperatura ambiente. 
B 8.5.1.3.15  Diluir con agua y agregar más agua para compensar el volumen de grasa en el matraz. 
B 8.5.1.3.16  Mezclar perfectamente y filtrar de 30 a 50 mL a tr avés de un papel filtro Whatman No. 2 y 
recoger el filtrado en un recipiente de propileno, polipropileno o polietileno. 
B 8.5.1.3.17  No filtrar los blancos. Tapar las botellas durante  el análisis. Las soluciones son estables por 
varios meses. 
B 8.5.1.3.18  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificad a por cada serie de digestión. 
B 8.5.1.3.19  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de a bsorción atómica: flama u horno de 
grafito). 
B 8.5.1.4  Digestión por vía húmeda para la determinación de Hg. 
B 8.5.1.4.1 Sistema de reflujo. 
B 8.5.1.4.1.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad aprop iada de muestra, dependiendo el tipo de 
ésta, en un matraz de digestión y adicionar perlas de ebullición. 
B 8.5.1.4.1.2  Conectar el matraz al sistema de reflujo y agregar  poco a poco la cantidad necesaria de 
ácido nítrico concentrado y calentar durante media hora o hasta que no se observen cambios en la diges tión. 
B 8.5.1.4.1.3  Dejar enfriar y agregar una mezcla de ácido nítric o y ácido sulfúrico concentrados (1 + 1). 
B 8.5.1.4.1.4  Calentar y agregar más ácido nítrico gota a gota s obre las paredes del recipiente, hasta que 
el color obscuro de la solución desaparezca. 
B 8.5.1.4.1.5  Enfriar. 
B 8.5.1.4.1.6  Si existe grasa o cera filtrar la solución. 
B 8.5.1.4.1.7  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificad a por cada serie de digestión. 
B 8.5.1.4.1.8  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de a bsorción atómica de vapor frío). 
B 8.5.1.4.2 Sistema cerrado. 
B 8.5.1.4.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad aprop iada de muestra, dependiendo el tipo de 
ésta, en el recipiente de digestión. 
B 8.5.1.4.2.2  Agregar la cantidad necesaria de ácido nítrico con centrado. 
B 8.5.1.4.2.3  Tapar y sellar perfectamente el recipiente de dige stión. 
B 8.5.1.4.2.4  Si el recipiente de digestión es un matraz Erlenme yer, colocar éste en una autoclave a 15 lb 
por 30 minutos. Si se utiliza bomba Parr, calentar en parrilla controlando la temperatura a un máximo de 
300ºC por 30 minutos. 
B 8.5.1.4.2.5  Enfriar a temperatura ambiente. 
B 8.5.1.4.2.6  En caso de que la digestión no sea completa adicio nar peróxido de hidrógeno y repetir la 
digestión. 
Filtrar en caso de que exista grasa o cera y analiz ar el contenido de Hg. 
B 8.5.1.4.2.7  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificad a por cada serie de digestión. 
B 8.5.1.4.2.8  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de a bsorción atómica de vapor frío). 
B 8.5.1.5 Digestión para la determinación de As. 
B 8.5.1.5.1 Digestión por vía húmeda-seca. 
B 8.5.1.5.1.1  Proceder como en el punto 8.4.3.2 hasta que la dig estión sea completa y posteriormente 
continuar con los siguientes pasos. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 8.5.1.5.1.2  Con una pipeta tomar una alícuota de la solución d e muestra digerida y colocarla en un crisol 
Vycor o vaso de precipitados. 
B 8.5.1.5.1.3  Añadir 1 mL de solución de nitrato de magnesio al 7% p/v y calentar en una parrilla a 
temperatura baja, hasta sequedad. 
B 8.5.1.5.1.4  Incrementar el calor de la placa a un máximo de 37 5ºC. 
B 8.5.1.5.1.5  Colocar el matraz en la mufla a 450ºC para oxidar cualquier residuo de carbón y 
descomponer el exceso de nitrato de magnesio, por u n tiempo mayor o igual a 30 minutos. 
B 8.5.1.5.1.6  Enfriar y disolver el residuo en 2,0 mL de ácido c lorhídrico 8 M. 
B 8.5.1.5.1.7  Añadir 0,1 mL de yoduro de potasio al 20% p/v para  reducir el As(V) a As(III). 
B 8.5.1.5.1.8  Dejar reposar por un tiempo mayor a 2 minutos y tr ansferir a un matraz y llevar al aforo con 
agua. 
B 8.5.1.5.1.9  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificad a por cada serie de digestión. 
B 8.5.1.5.1.10  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de a bsorción atómica con adaptación para 
horno de grafito o generador de hidruros). 
B 8.5.1.5.2 Digestión por vía seca. 
B 8.5.1.5.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad neces aria de muestra en un crisol Vycor o de 
platino. 
B 8.5.1.5.2.2  Añadir el volumen necesario de nitrato de magnesio  al 50% p/v. 
B 8.5.1.5.2.3  Homogeneizar con una varilla limpia de plástico ex tendiendo la mezcla en el crisol. 
B 8.5.1.5.2.4  Colocar la muestra en una mufla subiendo gradualme nte la temperatura hasta 300ºC por 2 
horas. Posteriormente subir gradualmente la tempera tura hasta 500ºC por 16 horas o durante toda la noc he. 
B 8.5.1.5.2.5  Enfriar a temperatura ambiente y humedecer las cen izas con ácido nítrico al 50% v/v. 
B 8.5.1.5.2.6  Calentar en parrilla hasta la eliminación del ácid o. 
B 8.5.1.5.2.7  Llevar los crisoles a una mufla elevando gradualme nte la temperatura de 23 a 500ºC, 
manteniendo ésta 30 min hasta evaporación total. 
B 8.5.1.5.2.8  Transferir las cenizas del crisol a un matraz afor ado usando una porción de 10 mL de ácido 
clorhídrico 0,5 N. 
B 8.5.1.5.2.9  Enjuagar los crisoles con 5 mL de agua destilada y  transferir al matraz, añadir 1 mL de 
solución de yoduro de potasio al 15% y mezclar. 
B 8.5.1.5.2.10  Dejar reposar durante 15 minutos y llevar al aforo . 
B 8.5.1.5.2.11  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificad a por cada serie de digestión. 
B 8.5.1.5.2.12  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de a bsorción atómica con adaptación para 
horno de grafito o generador de hidruros). 
B 8.5.1.6 .Digestión para la determinación de Cd, As, Pb, Sn,  Cu, Fe, Zn y Hg por horno de microondas. 
Pesar con precisión de ± 0,1 mg, 0,500 g como máxim o de muestra, añadir 6 mL de ácido nítrico 
concentrado y 2 mL de agua oxigenada al 30%, cerrar  perfectamente el envase de reacción y proceder seg ún 
el manual del fabricante. 
B 8.5.1.7 Determinación de metales en agua potable y agua pur ificada. 
Las muestras incoloras, transparentes e inodoras y de una sola fase, pueden analizarse directamente po r 
espectrometría de absorción atómica, sin digestión.  
Previo a dicho análisis, adicionar a 100 mL de mues tra, 1 mL de ácido nítrico, en caso de que se obser ve 
un precipitado, realizar una digestión adicionando 1 mL más de ácido nítrico concentrado, calentar a 8 5ºC 
hasta reducir el volumen a 20 mL cuidando de que no  hierva. Calentar a reflujo 30 minutos y transferir  a un 
matraz volumétrico de 50 mL. Centrifugar a 1600 rpm  por 30 minutos o dejar reposar toda la noche y ana lizar 
el sobrenadante. 
B 8.6  Procedimiento       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
B.8.6.1  Espectrometría de absorción atómica por flama. 
B.8.6.1.1  Calibración. 
Es necesario comprobar que se tiene una calibración  inicial y periódica aceptable. 
B 8.6.1.1.1  Se inicia la configuración operacional del instrum ento y en el sistema de adquisición de datos. 
B 8.6.1.1.2  Permitir un periodo no menor a 30 minutos para el calentamiento de las lámparas de descarga 
sin electrodos. 
B 8.6.1.1.3  Se debe verificar la estabilidad del instrumento m ediante el análisis de una solución estándar 
20 veces más concentrada que el límite de detección  del instrumento (LDI) para el analito, leída un mí nimo de 
cinco veces y calculando la desviación estándar res ultante, la cual debe ser menor al 5%. 
B 8.6.1.1.4  El instrumento debe calibrarse para el analito a d eterminar usando el blanco de calibración y 
los estándares de calibración preparados a 3 o 4 ni veles de concentración dentro del intervalo dinámic o de 
concentración del analito. 
B 8.6.1.1.5  Ajustar el instrumento a 0 con el blanco de calibr ación. Introducir los estándares de calibración 
del analito de menor a mayor concentración y regist rar al menos tres réplicas de la absorbancia de cad a uno. 
B 8.6.1.1.6  Elaborar una curva de calibración graficando absor bancia en función de la concentración. 
B 8.6.1.1.7  Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que s e programan directamente, en los cuales 
sólo es necesario introducir los estándares y marca r su concentración teórica. 
B.8.6.1.2  Operación del instrumento. 
El desempeño del instrumento se verifica mediante e l empleo de blancos de calibración, estándares de 
calibración y una muestra de control de calidad (MC C). 
B 8.6.1.2.1  Después de que se ha realizado la calibración, se debe verificar que el instrumento trabaje 
adecuadamente para el analito. Para ello se analiza  una muestra de control de calidad. Si las medicion es 
varían en ± 10% o más, al valor establecido para la  MCC, el análisis debe interrumpirse y buscar la po sible 
causa de error, el instrumento se debe recalibrar y  verificar la nueva calibración. 
B 8.6.1.2.2  Para verificar que el instrumento no presenta deri va, por cada 10 análisis se debe analizar el 
blanco de calibración. Si el valor verdadero del an alito difiere ± 10% o más, el instrumento debe reca librarse. 
Si el error persiste debe identificarse el problema  y corregirse. 
B 8.6.1.2.3  Si la matriz de la muestra es responsable de la de riva o afecta la respuesta del analito puede 
ser necesario trabajar por adiciones estándar. 
B 8.6.1.2.4  La demostración de la operatividad inicial del ins trumento se hace estableciendo los límites de 
detección del método (LDM) para el analito y el int ervalo de calibración lineal. Para determinar el LD M se usa 
un blanco de reactivos fortificado con una concentr ación del analito equivalente de 2 a 5 veces el lím ite de 
detección estimado. Se hacen al menos 4 réplicas de  lectura de absorbancia del blanco de reactivos 
fortificado procesado a través de todo el método an alítico. Los LDM se calculan de acuerdo a: 
LDM= t x s donde: t = valor de la "T" de Student a un intervalo de confianza de 99% y una desviación 
estándar estimada para n-1 grados de libertad. t = 3,14 para 7 réplicas. s = desviación estándar de la s réplicas 
del análisis. 
B 8.6.1.2.5  El intervalo lineal de calibración se establece a partir de por lo menos 4 estándares de 
diferente concentración, uno de los cuales debe est ar próximo al límite superior del intervalo lineal.  
B 8.6.1.3 Determinación 
B 8.6.1.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómica en las  condiciones adecuadas para la 
determinación del analito de acuerdo a las indicaci ones del manual del instrumento. 
B 8.6.1.3.2 Introducir el blanco de reactivos y la muestra a an alizar y registrar los valores de absorbancia. 
Se debe analizar al menos un blanco de reactivos co n cada grupo de muestras. Los valores obtenidos pon en 
B 8.6.1.3.3  de manifiesto la calidad de los reactivos usados y  el grado de contaminación del laboratorio. 
B 8.6.1.3.4  En los equipos que pueden programarse, la lectura obtenida da directamente la concentración 
del elemento en las unidades de concentración utili zadas. Miércoles 22 de diciembre de 2010 DIARIO OFICIAL (S egunda Sección)      
B 8.6.1.3.5 Se debe analizar al menos un blanco de reactivos fo rtificado para cada grupo de muestras.  Se 
calcula la exactitud como el por ciento de recupera ción. 
B 8.6.1.3.6 Se debe fortificar al menos una muestra por grupo o  el 10% de ellas lo que resulte mayor.  La 
concentración añadida debe ser de aproximadamente 0 ,1 unidades de absorbancia. 
B 8.6.1.3.7 Se debe calcular el por ciento de recuperación para  el analito, de acuerdo a: 
CM - C 
R = -------------- x 100 
CA 
R = % recuperación 
CM = Concentración de la muestra fortificada 
C = Concentración de la muestra 
CA = Concentración equivalente de analito añadido a  la muestra. 
Si la recuperación del analito en la muestra fortif icada está fuera del intervalo previamente establec ido y el 
blanco de reactivos fortificado está correcto, pued e existir un problema relacionado con la matriz de la 
muestra. Los datos se deben verificar por el método  de las adiciones estándar. 
B 8.6.2  Espectrometría de absorción atómica por horno de g rafito. 
B 8.6.2.1 Calibración. 
B 8.6.2.1.1  Proceder de acuerdo al punto B.8.6.1.1 
B 8.6.2.1.2  Elaborar una curva de calibración graficando área de pico o altura máxima contra 
concentración del analito. 
B 8.6.2.1.3  La calibración mediante el uso de una computadora o una calculadora basada en el ajuste 
sobre los datos de concentración respuesta es acept ada. 
B 8.6.2.1.4  Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que s e programan directamente, en los cuales 
sólo es necesario introducir los estándares y marca r su concentración teórica. 
B 8.6.2.2  Operación del instrumento. 
Proceder de acuerdo a B.8.6.1.2 
B 8.6.2.3  Determinación. 
B 8.6.2.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómica en las  condiciones adecuadas para la 
determinación del analito, de acuerdo a las recomen daciones del manual del instrumento. 
B 8.6.2.3.2  El programa de temperaturas para el horno de grafi to puede variar dependiendo de la matriz 
de la muestra. En el caso de existir interferencias  no específicas (absorción molecular o dispersión d e la luz), 
se recomienda consultar la bibliografía existente e n cuanto a los métodos disponibles para eliminarlas , así 
como en el caso de interferencias de matriz. 
B 8.6.3  Espectrometría de absorción atómica por generador de hidruros. 
B 8.6.3.1 Calibración. 
B 8.6.3.1.1  Proceder de acuerdo al punto B.8.6.1.1 
B 8.6.3.1.2  A partir de la solución estándar de As de 1000 mg/ L, preparar una solución de As de 1 mg/L en 
ácido clorhídrico de concentración apropiada al mét odo. Trazar una curva de calibración de absorbancia  
(máximo de la altura de pico) en función de la conc entración del analito para un intervalo de concentr ación 
B 8.6.3.1.3  de 0 a 10 µg/L de As bajo las mismas condiciones de la matriz de la muestra. 
B.8.6.3.2 Operación del instrumento. 
B 8.6.3.2.1  Proceder de acuerdo al punto B.8.6.1.2 
B 8.6.3.3 Determinación. 
B 8.6.3.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómica en las  condiciones adecuadas para la 
determinación de As: longitud de onda de 193,7 nm y  lámpara de descarga sin electrodos. Colocar y ajus tar la 
celda de absorción de acuerdo al manual del fabrica nte. Ajustar el flujo de gas (nitrógeno o argón).       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Miércoles 22  de diciembre de 2010 
B 8.6.3.3.2  Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibr ación de ácido clorhídrico al 1,5% siguiendo 
las instrucciones del manual del fabricante. 
B 8.6.3.3.3  Optimizar con un estándar de calibración la respue sta del instrumento al analito (por lo general, 
10 mL de una solución de 5 µg/l de As da una absorbancia de 0,2), ajustando el tiempo de purga I, el tiempo 
de reacción y el tiempo de purga II. 
B 8.6.3.3.4  Tomar un volumen conocido de la muestra dirigida y  seguir el mismo procedimiento que con 
los estándares de calibración. 
B 8.6.4 Espectrometría de absorción atómica por vapor frío.  
B 8.6.4.1 Calibración. 
B 8.6.4.1.1  Proceder de acuerdo al punto B.8.6.1.1 
B 8.6.4.1.2  A partir de la solución de trabajo de 1 µg/mL preparar estándares de calibración que conteng an 
0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1,0 ìg de Hg a frascos de r eacción. A cada frasco agregar 100 mL de la solució n de 
dilución y 20 mL de la solución de reducción. Traza r la curva de calibración de absorbancia (altura má xima de 
pico) en función de la concentración del analito. 
B 8.6.4.2 Operación del instrumento. 
B 8.6.4.2.1  Proceder de acuerdo al punto B.8.6.1.2 
B 8.6.4.3 Determinación. 
B 8.6.4.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómica en las  condiciones adecuadas para la 
determinación de Hg: longitud de onda de 253,6 nm, slit 0,7 nm y lámpara de cátodo hueco. Colocar y aj ustar 
la celda de absorción de acuerdo al manual del fabr icante. Ajustar el flujo de gas (nitrógeno o argón) . 
B 8.6.4.3.2  Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibr ación (solución de dilución y de reducción) 
siguiendo las instrucciones del manual del fabrican te. 
B 8.6.4.3.3  Optimizar con un estándar de calibración la respue sta del instrumento al analito. 
B 8.6.4.3.4  Tomar 25 mL de la muestra digerida y seguir el mis mo procedimiento que con los estándares 
de calibración. 
B 8.7  Expresión de resultados 
B 8.7.1  Método de cálculo. 
Interpolar los valores de absorbancia o altura de p ico de la muestra analizada en la curva de calibrac ión y 
obtener los mg/kg del elemento en la muestra y real izar los cálculos empleando la siguiente fórmula: 
A x B 
mg/ kg = -------- 
C 
en donde: 
A = Concentración en mg/kg de la muestra a interpol ar en la curva de calibración. 
B = Volumen final al que se llevó la muestra (mL). 
C = Peso de la muestra (g) o volumen de la muestra (mL) en el caso de agua. 
En los equipos que pueden programarse, la lectura o btenida da directamente la concentración del 
elemento en mg/kg o µg/kg. 
B 8.7.2  Informe de la prueba 
Los resultados se informarán en mg/kg o µg/kg del elemento a determinar. 
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