中华人民共和国国家标准  
 
GB 4789.14—xxxx 
 
 
食品安全 国家标准  
食品微生物学检验  蜡样芽胞杆菌检验  
 
  
 
（征求意见稿）  
 
 
中华人民共和国卫生部    发布 xxxx -xx-xx发布  xxxx -xx-xx实施  GB 4789.14—xxxx  
I 前    言 
本标准代替 GB/T 4789.14 -2003《食品卫生微生物学检验  蜡样芽胞杆菌检验》。  
本标准与 GB/T 4789.14 -2003相比，主要修改如下：  
——修改了标准的中英文名称；  
——增加了第二法  蜡样芽胞杆菌 MPN 计数法；  
——将选择性分离培养基 （ MYP） 培养条件由 37 ℃培12 h～20 h改为 30 ℃± 1 ℃培养 24 h～48 h； 
——增加了根状生长试验和溶菌酶试验。  
——增加了附录 A、附录 B。 GB 4789.14—xxxx  
1 食品安全国家标准  
食品微生物学检验  蜡样芽胞杆菌检验  
1  范围 
本标准规定了食品中蜡样芽胞杆菌（ Bacillus cereus ）的检验方法。  
本标准第一法适用于 蜡样芽胞杆菌 含量较高的食品中 蜡样芽胞杆菌 的计数； 第二法 适用
于蜡样芽胞杆菌 含量较低 的食品样品中蜡样芽胞杆菌 的计数。  
2  设备和材料  
除微生物实验室常规 灭菌及培养设备外，其 它设备和材料如下：  
2.1  冰箱： 2 ℃～5 ℃。 
2.2  恒温培养箱： 30 ℃± 1 ℃、36 ℃± 1 ℃。 
2.3  均质器。  
2.4  电子天平：感量 0.1 g 。 
2.5  无菌锥形瓶： 100 mL、500 mL。 
2.6  无菌吸管： 1 mL（具 0.01 mL刻度） 、 10 mL（具 0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。  
2.7  无菌平皿：直径 90 mm。 
2.8  无菌试管： 16 mm× 160 mm 。 
2.9  显微镜： 10×～100×。 
3  培养基和试剂  
3.1  磷酸盐缓冲液（ PBS） ：见附录 A中A.1。 
3.2  甘露醇卵黄多粘菌素 (MYP)琼脂：见附录 A中A.2。 
3.3  胰酪胨大豆多粘菌素肉汤：见附录 A中A.3。 
3.4  营养琼脂：见附录 A中A.4。 
3.5  胰酪胨大豆羊血 (TSSB)琼脂：见附录 A中A.5。 
3.6  酪蛋白琼脂：见附录 A中A.6。 
3.7  动力培养基：见附录 A中A.7。 
3.8  V-P培养基：见附录 A中A.8。 
3.9  硝酸盐肉汤： 见附录 A中A.9。 
3.10   西蒙氏柠檬酸培养基： 见附录 A中A.10。 
3.11   明胶培养基： 见附录 A中A.11。 
3.12  糖发酵管： 见附录 A中A.12。 
3.13   溶菌酶营养肉汤： 见附录 A中A.13。 GB 4789.14—xxxx  
2 3.14  过氧化氢溶液： 见附录 A中A.14。 
第一法 蜡样芽胞杆菌 平板计数法  
4  检验程序  
蜡样芽胞杆菌平板计数法检验程序见图 1。 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
    
 
 
 
 
 
 
           
 
图1 蜡样芽胞杆菌平板计数法 检验程序  
5  操作步骤  
5.1 样品处理  
冷冻样品应在 45 ℃以下不超过 15 min或在 2 ℃～5 ℃不超过 18 h解冻，若不能及时检
验，应放于 -15 ℃左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应
置于 2 ℃～5 ℃冰箱保存， 24 h内检验。  
5.2 样品制备  
称取样品 25 g，放入盛有 225 mL PBS 或生理盐水的无菌均质杯内，用旋转刀片式均质
器以 8000 r/min ～10000 r/min 均质 1 min～2 min，或放入盛有 225 mL PBS 或生理盐水的无
菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min。若样品为液态，吸取 25 mL 样品至盛有
225 mL PBS 或生理盐水的无菌锥形瓶 (瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠 )中，振荡混匀，作
为1：10的样品匀液。  
5.3 样品的稀释  10倍系列稀释  检样 
25 g(mL) 样品+225 mL稀释液，均质  
选取 2个~3个适宜的连续稀释度的样品 匀液，涂
布MYP琼脂平板   
典型菌落计数 及确证试验  
报 告 30 ℃±1 ℃ 24 h～48 h GB 4789.14—xxxx  
3 吸取上述 1：10的样品匀液 1 mL加到装有 9 mL PBS 或生理盐水的稀释管中，充分混
匀制成 1：100的样品匀液。据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系
列稀释样品匀液。每递增稀释 1次，换用 1支1mL无菌吸管或吸头。  
5.4 样品接种  
根据对样品污染状况的估计，选择 2 个～ 3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包
括原液） ，以 0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接种量分别入三块 MYP琼脂平板，然后用无菌 L 棒
涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如 MYP琼脂平板表面有水珠，可放在
25 ℃～50 ℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。  
5.5 分离、培养 
5.5.1 分离 
在通常情况下，涂布后，将平板静置 10 min。如样液不易吸收，可将平板放在培养箱
30 ℃±1℃培养 1 h，等样品匀液 吸收后翻转平皿，倒置于培养箱， 30 ℃± 1 ℃培养 24 h± 2 h。
如果菌落不典型 ,可继续培养 24 h± 2 h 再观察。在MYP琼脂平板上， 典型菌落为微粉红色 (表
示不发酵甘露醇 )，周围有白色至淡粉红色沉淀环（表示产卵磷脂酶） 。  
5.5.2纯培养 
从每种稀释度（按 7.1.1要求需要计数的稀释度）的平板中至少挑取 5个典型菌落（小
于5个全选），分别划线接种于营养琼脂平板做纯培养， 30 ℃± 1 ℃培养 24 h± 2 h，进行确证
实验。在营养琼脂平板上，典型菌落为灰白色，偶有黄绿色，不透明，表面粗糙似毛玻璃状
或融蜡状，边 缘常呈扩展状，直径为 4 mm～10 mm。 
6 确证实验  
6.1 染色镜检  
挑取纯培养的单个菌落，革兰氏染色镜检。蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性芽胞杆菌，大小
为（1μm～1.3μm）×（3μm～5μm） ，芽胞呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不膨大于菌体，菌
体两端较平整，多呈短链或长链状排列。   
6.2 生化鉴定  
挑取纯培养的单个菌落，进行过氧化氢酶试验、动力试验、硝酸盐还原试验、酪蛋白分
解试验、溶菌酶耐性试验、 V-P试验、葡萄糖利用 (厌氧 )试验、根状生长试验、溶血试验、
蛋白质毒素结晶试验。 蜡样芽胞杆菌生化特征与其它芽 胞杆菌的区别见 表1。 
6.2.1 溶血试验  
挑取纯培养的单个可疑菌落接种于 TSSB琼脂平板上， 30 ℃± 1 ℃培养 24 h± 2 h。蜡样
芽胞杆菌菌落为浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状，有草绿色溶血环或完全溶血环。苏云金
芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈现弱的溶血现象，而多数炭疽芽胞杆菌为不溶血，巨大芽胞杆菌
为不溶血。  
6.2.2 根状生长试验  
挑取单个可疑菌落按间隔 0.5cm左右距离划平行直线于营养琼脂平板上， 30 ℃± 1 ℃培
养24 h± 2 h。蕈状芽胞杆菌形成根状生长的特征。蜡样芽胞杆菌菌株不具形成根状生长的特
征。  
6.2.3 蛋白质毒素结晶试验  
取经 30 ℃± 1 ℃培养 24 h± 2 h 并于室温放置 3 d～4 d的营养琼脂培养物少许于载玻片GB 4789.14—xxxx  
4 上，滴加蒸馏水混匀并涂成薄膜。经自然干燥，微火固定后，加甲醇作用 30 s后倾去，再
通过火焰干燥，于载玻片上滴满 0.5％碱性复红，放火焰上加热（微见蒸气，勿使染液沸腾 )
持续 1 min～2 min，移去火焰，再更换染色液再次加温染色 30 s，倾去染液用洁净自来水彻
底清洗、晾干后镜检。观察有无游离芽胞（浅红色）和染成深红色的菱形、正方形或其它形
状的蛋白结晶体。 如发现游离芽胞形成的不丰富， 应再将培养物置室温 2 d～3 d后进行检查。
除苏云金芽胞杆菌外其它芽胞杆菌不产生蛋白结晶体。  
6.2.4  溶菌酶耐性试验  
用接种环取纯菌悬液一环，接种于溶菌酶肉汤中， 36 ℃± 1 ℃培养 24 h。蜡样芽胞杆菌
在本培养基 (含0.001 ％溶菌酶 )中能生长。如出现阴性反应，应继续培养 24 h。巨大芽胞杆
菌不生长。  
表1 蜡样芽胞杆菌生化特征与其它芽胞杆菌的区别  
 项目  蜡样芽胞杆菌  
Bacillus cereus  苏云金芽胞杆菌  
Bacillus 
thuringiensis  蕈状芽胞杆菌  
Bacillus 
mycoides  炭疽芽胞杆菌  
Bacillus 
anthracis  巨大芽胞杆菌  
Bacillus 
megaterium  
革兰氏染色  +a + + + + 
过氧化氢酶  + + + + + 
动力  +/-b +/- -c - +/- 
硝酸盐还原  + +/- + + -/+ d  
酪蛋白分解  + + +/- -/+ +/- 
溶菌酶耐性  + + + + - 
卵黄反应  + + + + - 
葡萄糖利用 （厌
氧）  + + + + - 
V-P试验  + + + + - 
甘露醇产酸  - - - - + 
溶血  
（羊红细胞）  + + + -/+ - 
根状生长  - - + - - 
蛋白质毒素晶
体 - + - - - 
a：+ 表示 90%～100%的菌株阳性；  
b：+/- 表示大多数的菌株阳性；  
c：- 表示 90%～100%的菌株阴性；  
d：-/+ 表示大多数的菌株阴性。  GB 4789.14—xxxx  
5 6.3 生化分型 (可选做) 
根据对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、 V-P试验反应、明胶液化试验，将蜡样芽
胞杆菌分成不同生化型别，见表 2。 
表2 蜡样芽胞杆菌生化分型试验  
型别  生化试验  
柠檬酸盐  硝酸盐  淀粉  V-P 明胶  
1 ＋a ＋ ＋ ＋ ＋ 
2 －b ＋ ＋ ＋ ＋ 
3 ＋ ＋ － ＋ ＋ 
4 － － ＋ ＋ ＋ 
5 － － － ＋ ＋ 
6 ＋ － － ＋ ＋ 
7 ＋ － ＋ ＋ ＋ 
8 － ＋ － ＋ ＋ 
9 － ＋ － － ＋ 
10 － ＋ ＋ － ＋ 
11 ＋ ＋ ＋ － ＋ 
12 ＋ ＋ － － ＋ 
13 － － ＋ － － 
14 ＋ － － － ＋ 
15 ＋ － ＋ － ＋ 
注：a：＋表示 90%～100%的菌株阳性； b：－表示 90%～100%的菌株阴性。  
7  结果计算：  
7.1  典型菌落计数和确认  
7.1.1  选择有典型蜡样芽胞杆菌菌落的平板，且同一稀释度 3 个平板所有菌落数合计在 20 
CFU～200 CFU 之间的平板，计数典型菌落数。如果：  
a）只有一个稀释度的平板菌落数在 20 CFU～200 CFU 之间且有典型菌落，计数该稀释度
平板上的典型菌落；  
b）所有稀释度的平板菌落数均小于 20 CFU且有典型菌落，应计数最低稀释度平板上的典
型菌落；  GB 4789.14—xxxx  
6 c）某一稀释度的平板菌落数大于 200 CFU 且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型
菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；  
d）若所有稀 释度的平板菌落数大于 200 CFU 且有典型菌落，应计数最高稀释度平板上的
典型菌落；  
e）若所有稀释度的平板菌落数均不在 20 CFU～200 CFU 之间且有典型菌落，其中一部分
小于 20 CFU 或大于 200CFU 时， 应计数最接近 20 CFU 或200 CFU 的稀释度平板上的典型菌
落。  
以上按公式（ 1）计算。  
f）若 2 个连续稀释度的平板菌落数均在 20 CFU～200 CFU 之间，按公式（ 2）计算  
7.1.2从典型菌落中至少挑取 5个典型菌落（小于 5个全选） ，划线接种于营养琼脂平板做纯培
养， 30 ℃± 1 ℃培养 24 h± 2 h。 
7.2  结果计数  
公式（1）：T = 
CdAC   ……………………………………………………………   （1） 
式中： 
T——样品中蜡样芽胞杆菌菌落数；  
A——某一稀释度蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数；  
B——鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数；  
C——用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数；  
d ——稀释因子 。 
 
公式（ 2）：                              …………………………………………  （2） 
 
式中： 
T ——样品中蜡样芽胞 杆菌菌落数；  
A1——第一稀释度（低稀释倍数）蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数；  
A2——第二稀释度（高稀释倍数）蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数；  
B1——第一稀释度（低稀释倍数）鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数 ； 
B2——第二稀释度（高稀释倍数） 鉴定结果为蜡样芽胞杆菌 的菌落数；  
C1——第一稀释度（低稀释倍数）用于 蜡样芽胞杆菌鉴定 的菌落数；  
C2——第二稀释度（高稀释倍数）用于 蜡样芽胞杆菌鉴定 的菌落数；  
1.1——计算系数 （如果第二稀释度 蜡样芽胞杆菌 鉴定结果为 0，计算系数 采用1）； 
d ——稀释因子（第一稀释度）。  
8  结果与报告  
8.1 根据 MYP平板上蜡样芽胞杆菌的典型菌落数，按 7中公式计算，报告每 g（mL）样品中
蜡样芽胞杆菌菌数，以 CFU/g(mL) 表示；如 T值为 0，则以小于 1乘以最低稀释倍数报告。  
8.2 必要时报告蜡样芽胞杆菌生化分型结果。  
.1d1222111CBACBA
T
GB 4789.14—xxxx  
7 第二法 蜡样芽胞杆菌 MPN计数法  
9 检验程序  
蜡样芽胞杆菌 MPN计数法检验程序见图 2。 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
     
 
           
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
图2 蜡样芽胞杆菌 MPN计数法检验程序  
10  操作步骤  
10.1 样品处理  
冷冻样品应在 45 ℃以下不超过 15 min或在 2 ℃～ 5 ℃不超过 18 h解冻，若不能及时检
验，应放于 -15 ℃左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置
于2 ℃～ 5 ℃冰箱保存， 24 h内检验。  
10.2 样品制备  10倍系列稀释  
选取 3个适宜连续稀释度的样品 匀液，各吸取
1mL，分别接种于 3管胰酪胨大豆多粘菌素肉 汤 
接种 MYP琼脂平板  
确证试验  
查MPN表 检样 
25 g(mL) 样品+225 mL稀释液，均质  
报告结果  30 ℃±1 ℃     24 h～48 h 30 ℃±1 ℃       48 h±2 h GB 4789.14—xxxx  
8 称取样品 25 g，放入盛有 225 mL PBS 或生理盐水的无菌均质杯内，用旋转刀片式均质器
以8000 r/min ～10000 r/min 均质 1 min～2 min， 或放入盛有 225 mL PBS或生理盐水的无菌均质
袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min。若样品为液态，吸取 25 mL 样品至盛有 225 mL PBS
或生理盐水的无菌锥形瓶 (瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠 )中，振荡混匀，作为 1：10的样
品匀液。  
10.3 样品的稀释  
吸取上述 1：10的样品匀液 1 mL加到装有 9 mL PBS 或生理盐水的稀释管中，充分混匀制
成1：100的样品匀液。根据对 样品污染 状况的估计，按上述操作，依次 制成十倍递增系列 稀释
样品匀液。每递增稀释 1次，换用 1支1mL无菌吸管或吸头。  
10.4 样品接种  
取三个适宜连续稀释度的样品 匀液（液体样品可包括原液） ，接种于 10 mL胰酪胨大豆多
粘菌素肉汤中，每一 稀释度接种 3管，每管接种 1 mL（如果接种量需要超过 1 mL，则用双料
胰酪胨大豆多粘菌素肉汤） 。于 30 ℃± 1 ℃培养 48 h±2 h。 
10.5 培养 
用接种环从各管中 分别移取 1环，划线接种到 MYP琼脂平板上， 30 ℃± 1 ℃培养 24 h±2 
h。如果菌落不典型 ,可继续培养 24 h±2 h再观察。  
10.6 确证实验  
从每个平板选取至少 5个典型或可疑菌落， 划线接种于营养琼脂平板做纯培养， 30 ℃± 1 ℃
培养 24 h±2 h，进行确证实验，见 6。 
11  结果与报告  
根据证实为蜡样芽胞杆菌阳性的试管管数，查 MPN检索表（见附录 B），报告每 g（mL）
样品中蜡样芽胞杆 菌的最可能数，以 MPN/g（mL）表示。  
 
 
 
 
 
 
 
 GB 4789.14—xxxx  
9 附录A 
培养基和试剂  
A.1 磷酸盐缓冲液（ PBS） 
A.1.1  成分 
磷酸二氢钾（ KH 2PO 4）                            34.0 g  
蒸馏水                                     500.0 mL 
pH 7.2  
A.1.2  制法  
贮存液：称取 34.0 g的磷酸二氢钾溶于 500 mL蒸馏水中，用大约 175 mL的1 mol/L氢氧
化钠溶液调节 pH至7.2，用蒸馏水稀释至 1000 mL 后贮存于冰箱。  
稀释液：取贮存液 1.25 mL，用蒸馏水稀释至 1000 mL，分装于适宜容器中， 121 ℃高压灭
菌15 min。 
A.2 甘露醇卵黄多粘菌素 (MYP)琼脂 
A.2.1  成分 
蛋白胨  10.0 g  
牛肉粉  1.0 g  
甘露醇  10.0 g  
氯化钠  10.0 g  
琼脂  15.0 g  
0.2 %酚红溶液  13.0 mL  
50 %卵黄液 50.0 mL  
多粘菌素 B 100,000 IU  
蒸馏水  1 000.0 mL  
pH 7.2± 0.2   
A.2.2  制法 
将前五种成分加入于蒸馏水中，加热溶解，校正 pH，加入酚红溶液。分装，每瓶 100 mL，
121 ℃高压灭菌 15 min。临用时加热溶化琼脂，冷却至 50 ℃，每瓶加入 50%卵黄液 5 mL和浓
度为 10000 IU 的多粘菌素 B溶液  1 mL，混匀后倾注平板。  
A.2.2.1  50 ％卵黄液  
取鲜鸡蛋，用硬刷将蛋壳彻底洗净，沥干，于 70%酒精溶液中浸泡 1 h。以无菌操作取出
卵黄，加入等量灭菌生理盐水，混匀后备用。   
A.2.2.2  多粘菌素 B溶液 
在50 mL灭菌蒸馏水中溶解 500 000 IU的无菌硫酸盐多粘菌素 B。  
A.3 胰酪胨大豆多粘菌素肉汤  
A.3.1 成分  
胰酪胨  17.0 g  
植物胨  3.0 g  
氯化钠  5.0 g  
无水磷酸氢二钾  2.5 g  
葡萄糖  2.5 g  GB 4789.14—xxxx  
10 多粘菌素 B 100 IU/mL  
蒸馏水  1 000.0 mL  
pH 7.3± 0.1   
A.3.2 制法 
将前五种成分加入于蒸馏水中，加热溶解，校正 pH，121℃高压灭菌 15 min。临用时加入
多粘菌素 B溶液混匀即可。多粘菌素 B溶液制法同附录 A.2.2.2。 
A.4 营养琼脂  
A.4.1 成分 
蛋白胨  10.0 g  
牛肉粉  3.0 g  
氯化钠  5.0 g  
琼脂  15.0g  
蒸馏水  1 000.0 mL  
A.4.2 制法 
将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，用 15%氢氧化钠溶液校正 pH 7.2± 0.2 。加入琼脂，
加热煮沸，使琼脂溶化。分装， 121℃高压灭菌 15 min。 
A.5 胰酪胨大豆羊血 (TSSB)琼脂 
A.5.1 成分 
胰酪胨  15.0 g  
大豆胨  5.0 g  
氯化钠  5.0 g 
琼 脂 15.0 g  
蒸馏水  1 000.0 mL  
pH 7.2± 0.2   
A.5.2 制法 
将上述各成分于蒸馏水中加热溶解。校正 pH后，分装烧瓶，每瓶 100 mL。121 ℃高压灭
菌15 min。水浴中冷却至 45 ℃～ 50 ℃，加入 5 mL无菌脱纤维羊血，混匀后倾注平板。  
A.6 酪蛋白琼脂   
A.6.1 成分 
酪蛋白  10.0 g  
牛肉粉  3.0 g  
无水磷酸氢二钠  2.0 g  
氯化钠  5.0 g  
琼 脂 15.0g  
蒸馏水  1 000.0 mL  
0.4 %溴麝香草酚蓝溶液  12.5 mL  
pH7.4± 0.1   
A.6.2 制法 
将除指示剂外的各成分于蒸馏水中加热溶解（但酪蛋白不会溶解） 。校正 pH后，加入指示
剂，分装。 121 ℃高压灭菌 15 min。临用时加热溶化琼脂，冷却至 45 ℃～ 50 ℃后倾注平板。  
A.6.3 试验方法  GB 4789.14—xxxx  
11 用接种环挑取可疑菌落，接种于酪蛋白琼脂培养基上 ，36 ℃± 1 ℃培养 48 h±2 h，阳性
反应菌落周围培养基应出现澄清透明区 (表示产生酪蛋白酶 )。阴性反应时应继续培养 72 h再观
察。  
A.7 动力培养基  
A.7.1 成分 
胰酪胨  10.0 g  
酵母粉  2.5 g  
葡萄糖  5.0 g  
无水磷酸氢二钠  2.5 g  
琼 脂 3.0 ～5.0g 
蒸馏水  1 000.0 mL  
pH 7.0± 0.2   
A.7.2 制法 
 将上述各成分于蒸馏水加热溶解并稀释至 1000 mL。校正 pH后，分装，每管 2 mL～3 
mL。115 ℃高压灭菌 20 min，备用。   
A.7.3 试验方法  
用接种针挑取培养物穿刺接种于动力培养基中， 30 ℃± 1 ℃培养 48 h±2 h。蜡样芽胞杆
菌应沿穿刺线呈扩散生长，而蕈状芽胞杆菌常常呈绒毛状生长，形成蜂巢状扩散。动力试验也
可用悬滴法检查。蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌通常运动极为活泼，而炭疽杆菌则不运动。  
A.8 V-P培养基  
A.8.1成分 
磷酸氢二钾  5.0 g  
蛋白胨  7.0 g  
葡萄糖  5.0 g  
氯化钠  5.0 g  
pH 7.0± 0.2   
A.8.2 制法 
将上述各成分溶解于蒸馏水并稀释至 1000 mL。校正 pH后分装试管，每管 1 mL。115 ℃
高压灭菌 20 min，备用。   
A.8.3 试验方法  
用营养琼脂培养物接种于本培养基中， 36 ℃± 1 ℃培养 48 h～72 h。加入 6 %α-萘酚 -乙
醇溶液 0.5 mL和40 %氢氧化钾溶液 0.2 mL，充分振摇试管，观察结果，阳性反应立即或于数
分钟内出现红色。如为阴性，应放在 36 ℃± 1 ℃培养 4 h再观察。  
A.9 硝酸盐肉汤  
A.9.1 成分  
牛肉粉  3.0 g  
蛋白胨  5.0 g  
硝酸钾  1.0 g  
蒸馏水  1 000.0 mL  
pH 7.4   
                GB 4789.14—xxxx  
12 A.9.2 制法 
将上述各成分溶解于蒸馏水并稀释至 1000 mL。校正 pH后分装试管，每管 5 mL，121 ℃
高压灭菌 15 min。  
A.9.3 硝酸盐还原试剂  
甲液：将 对氨基苯磺酸 0.8 g溶解于 2.5 mol/L 乙酸溶液 100 mL中。  
乙液：将甲萘胺 0.5 g溶解于 2.5 mol/L 乙酸溶液 100 mL中。  
A.9.4 试验方法  
接种后在 36 ℃± 1 ℃培养 24 h～72 h。加甲液和乙液各 1滴，观察结果，阳性反应立即
或数分钟内显红色。如为阴性，可再加入锌粉少许，如出现红色，表示硝酸盐未被还原，为阴
性。反之，则表示硝酸盐已被还原，为阳性。  
A.10 西蒙氏柠檬酸盐培养基  
A.10.1 成分 
氯化钠  5.0 g  
硫酸镁（ MgSO 4· 7 H 2O） 0.2 g  
硫酸二氢 钠 1.0 g  
柠檬酸钠  1.0 g  
琼脂  5.0 g  
蒸馏水  1 000.0 mL  
0.2 %溴麝香草酚蓝溶液  40.0 mL  
pH 7.1± 0.1   
A.10.2 制法 
先将盐类溶解于蒸馏水内，校正 pH，再加琼脂，加热溶化。然后加入指示剂，混合均匀后
分装试管， 121 ℃高压灭菌 15 min。制成斜面。  
A.10.3 试验方法  
挑取少量琼脂培养物接种于西蒙氏柠檬酸培养基，  36 ℃± 1 ℃培养 72 h。 每天观察结果，
阳性者斜面上有菌落生长，培养基从绿色转为蓝色。  
A.11 明胶培养基  
A.11.1 成分 
蛋白胨  5.0 g  
牛肉粉  3.0 g  
明胶  120.0 g  
蒸馏水  1 000.0 mL  
A.11.2 制法 
将上述成分混合，置流动蒸汽灭菌器内，加热溶解，校正 pH至7.0～7.2，用绒布过滤。分
装试管， 121 ℃高压灭菌 15 min，备用。  
A.11.3 试验方法  
挑取可疑菌落接种于明胶培养基， 36 ℃± 1 ℃培养 24 h±2 h，取出， 2 ℃～ 8 ℃放置 30 
min，取出，观察明胶液化情况。  
A.12 糖发酵管  
A.12.1 成分  
牛肉粉  5.0 g  GB 4789.14—xxxx  
13 蛋白胨  10.0 g  
氯化钠 3.0 g  
磷酸氢二钠（ Na2HPO4˙12H 2O） 2.0 g  
0.2 %溴麝香草酚蓝溶液  12.0 mL  
蒸馏水  1 000.0 mL  
pH 7.2± 0.2   
A.12.2 制法 
A.12.2.1  葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按 0.5 %加入葡萄糖，分装于一个有倒置小管
的小试管内， 115 ℃高压灭菌 15 min。 
A.12.2.2  其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶 100 mL，115 ℃高压灭菌 15 
min。另将各种糖类分别配好 10 %溶液，同时 115℃高压灭菌 15 min。将5 mL糖溶液加入于 100 mL
培养基内，以无菌操作分装小试管。  
注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。  
A.12.3 试验方法  
挑取可疑菌落接种于酚红葡萄糖肉汤中 ，厌氧条件下 36 ℃± 1 ℃培养 24 h±2 h。培养基
由红色变为黄色者表明该菌在厌氧条件下能发酵葡萄糖。  
A.13 溶菌酶营养肉汤  
A.13.1 成分 
牛肉粉  3.0 g  
蛋白胨  5.0 g  
蒸馏水  1 000.0 mL  
0.1%溶菌酶溶液  10.0 mL  
pH 6.8± 0.1   
A.13.2 制法  
将上述成分（溶菌 酶溶液除外）溶解于蒸馏水并稀释至 1000 mL 。校准 pH后，分装于，
每瓶 99 mL。121 ℃高压灭菌 15 min。每瓶加入 0.1 %溶菌酶溶液 1 mL，混匀后分装灭菌试管，
每管 2.5 mL。 
A.13.2.1  0.1% 溶菌酶溶液配制  
在65mL灭菌的 0.1 mol/L 盐酸中加入 0.1 g溶菌酶，隔水煮沸 20 min溶解后，再用灭菌的
0.1 mol/L 盐酸稀释至 100 mL。 或者称取 0.1g溶菌酶溶于 100mL的无菌蒸馏水后， 用孔径为 0.45 
μm 硝酸纤维膜过滤。使用前测试是否无菌。  
A.13.3 试验方法 
用接种环取纯菌悬液一环 ，接种于溶菌酶肉汤中 ，36 ℃± 1 ℃培养 24 h。蜡样芽胞杆菌
在本培养基 (含0.001  ％溶菌酶 )中能生长。如出现阴性反应 ，应继续培养 24 h。 
A.14  过氧化氢酶溶液  
A.14.1  试剂  
 3%过氧化氢溶液：临用时配制，用 H2O配制。  
A.14.2  试验方法  
用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落 , 置于洁净试管内， ,滴加 3 %过氧化氢溶液 2 mL，
观察结果。  
A.14.3  结果   于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。GB 4789.14—xxxx  
14 
 附录B 
蜡样芽胞杆菌最可能数（ MPN）检索表  
B.1 每g(mL)检样中蜡样芽胞杆菌最可能数（ MPN）的检索见表 B.1。 
表B.1 蜡样芽胞杆菌最可能数（ MPN）检索表  
阳性管数  
MPN  95%置信区间  阳性管数  
MPN  95%置信区间  
0.10 0.01 0.001  下限  上限  0.10 0.01 0.001  下限  上限  
0 0 0 <3.0 -- 9.5 2 2 0 21 4.5 42 
0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94 
0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94 
0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94 
0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94 
0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94 
1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110 
1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180 
1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180 
1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200 
1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420 
1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420 
1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420 
1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420 
2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430 
2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000  
2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1,000  
2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2,000 
2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100  180 4,100  
2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100  420 -- 
注１：本表采用 3个稀释度 [0.1 g(mL) 、0.01 g(mL) 和0.001 g(mL)] 、每个稀释度接种 3管。  
注２：表内所列检样量如改用 l g（mL）、0.1 g(mL) 和0.01 g(mL) 时，表内数字应相应降低 10倍；如改
用0.01 g(mL) 、0.001 g(mL) 、0.0001 g(mL) 时，则表内数字应相应增高 10倍，其余类推。