Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
TERCERA SECCION  
PODER EJECUTIVO  
SECRETARIA DE SALUD  
NORMA Oficial Mexicana NOM -218-SSA1 -2011, Productos y servicios. Bebidas saborizadas no alcohólicas, sus 
congelados, productos concentrados para prepararlas y bebidas adicionadas con cafeína. Especificaci ones  y 
disposiciones sanitarias. Métodos de prueba.  
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos. - Secretaría de  Salud.  
MIKEL ANDONI ARRIOLA PEÑALOSA, Comisionado Federal para la Protección contra Riesgos 
Sanitarios y Pres idente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, 
con fundamento en el artículo 39 de la Ley Orgánica de la Administración Pública Federal; 4 de la Ley Federal 
del Procedimiento Administrativo; 3 fracción XXII, 17 bi s fracciones II y III, 17 Bis 2, 115 fracciones IV  y VI, 194 
fracción I, 195, 199, 210, 212, 215 fracciones II, III y IV y 216 de la Ley General de Salud; 3 fracción XI, 38 
fracción II, 40 fracciones I, XI y XII, 41, 43, 47 fracción IV y 52 de la Ley Feder al sobre Metrología y 
Normalización; 28 del Reglamento de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 1 fracción VI, 4, 8, 14, 
15, 25, 30, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 200, 201, 202, 203, 204, 206, 211 y 214  del Reglamento de Control 
Sanitario de Pro ductos y Servicios; 2 inciso C fracción X y 36 del Reglamento Interior de la Secretaría de 
Salud; 3 fracciones I incisos d y l, y II, 10 fracciones IV y VIII del Reglamento de la Comisión Federal para la 
Protección contra Riesgos Sanitarios, y  
CONSIDERANDO  
Que en cumplimiento a lo previsto en el artículo 46 fracción I de la Ley Federal sobre Metrología  y 
Normalización, el 20 de agosto de 2009, el Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación  y 
Fomento Sanitario, aprobó el anteproyecto de Norma Oficial Mexicana;  
Que con fecha 22 de diciembre de 2010 en cumplimiento del acuerdo del Comité y lo previsto en el 
artículo 47 fracción I de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización, se publicó en el Diario Oficial de la 
Federación el proyecto de la  presente norma, a efecto de que dentro de los siguientes sesenta días naturales 
posteriores a dicha publicación, los interesados presentarán sus comentarios al Comité Consultivo Nacional 
de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario.  
Que con fecha pr evia, fue publicada en el Diario Oficial de la Federación la respuesta a los comentarios 
recibidos por el mencionado Comité, en términos del artículo 47 fracción III de la Ley Federal sobre Metrología 
y Normalización.  
Que en atención a las anteriores consi deraciones, contando con la aprobación del Comité Consultivo 
Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, te ngo a bien expedir y ordenar la  publicación 
en el Diario Oficial de la Federación de la NORMA OFICIAL MEXICANA NOM -218-SSA1 -2011, PR ODUCTOS 
Y SERVICIOS. BEBIDAS SABORIZADAS NO ALCOH OLICAS, SUS CONGELADOS, PRODUCTOS 
CONCENTRADOS PARA PREPARARLAS Y BEBIDAS ADICIONADAS CON CAFE INA. 
ESPECIFICACIONES Y DISPOSICIONES SANITARIAS. M ETODOS DE PRUEBA.  
PREFACIO  
En la elaboración de la presente no rma participaron las siguientes Dependencias, Instituciones  y 
Organismos:  
Secretaría de Salud  
Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios  
Secretaría de Salud del Estado de Michoacán  
Secretaría de Salud del Estado de Nuevo León  
Secretaría  de Economía  
Procuraduría Federal del Consumidor  
Dirección General de Investigación  
Instituto Politécnico Nacional  
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas  
Universidad Nacional Autónoma de México  
Facultad de Química        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
Confederación de Cámaras Industriales de los Estados Unidos Mexicanos  
Cámara Nacional de la Industria de la Transformación  
Cámara Nacional  de la Industria de Conservas Alimenticias  
Asociación Nacional de Productores de Refrescos y Aguas Carbonatadas, A.C.  
Asociación Nacional de Fabricantes de Pro ductos Aromáticos, A.C.  
Bebidas Sanas, S. A. de C. V. 
Bebidas Energizantes en México A.C.  
Cadbury Bebidas, S.A. de C. V. 
Café Inter nacional de Córdoba, S.A. de C. V. 
Centro de Capacitación d e Calidad Sanitaria, S.A. de C. V. 
Centro de Control Total de Cali dades , S.A. de C. V. 
Coca Cola de México, S.A. de C. V. 
Concentrados Sandy´s, S.A. de C. V. 
DULCO, S.A. de C. V. 
Embotell adora AGA de México, S.A. de C. V. 
GAF Distribu ciones Industriales, S.A. de C. V. 
Grupo JUMEX  
Helados Siberia, S.A. de C. V. 
Innovadora de Esencia s, Aromas y Sabores, S.A. de C. V. 
Jarabes el Manantial, S.A. de C.V.  
Jugos del Valle, S.A. de C.V.  
KRAFT Foods de México, S. de R.L. de C.V.  
Manantiales Peñafiel, S.A. de C. V.  
Mead Johnson de México, S. de R.L. de C. V. 
Nestle México, S.A. de  C.V. 
OMNILIFE,  S.A. de C.V.  
Palet erías la Michoacana, S.A. de C. V. 
Parmalat de México, S.A. de C. V. 
Procesador a de Frutas La Cima, S.A. de C. V. 
Procter & Gamble México, S. de R.L. de C. V. 
Productora Nacio nal de Concentrados, S.A. de C. V. 
SABORMEX, S.A. de C. V. 
Santa Cla ra Productos Lácteos, S.A. de C. V. 
SAROMA, S.A. de C. V. 
Super Sopas, S.A. de C. V. 
UNILEVER de México, S.A. de C. V. 
INDICE  
1.  Objetivo y campo de aplicación  
2.  Referencias  
3.  Definiciones  
4.  Símbolos y abreviaturas  
5.  Disposiciones generales  
6.  Bebida s saborizadas no alcohólicas y bebidas adicionadas con cafeína  
7.  Productos  congelados  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
8.  Productos concentrados para preparar bebidas saborizadas no alcohólicas  
9.  Muestreo  
10.  Métodos de prueba  
11.  Etiquetado  
12.  Envase  
13.  Concordancia con normas  internacionales  
14.  Bibliografía  
15.  Observancia de la norma  
Apéndice Normativo A. Listado de Aditivos  
Apéndice Normativo B. Métodos de prueba  
1. Objetivo y campo de aplicación.  
1.1 Esta norma establece las disposiciones y especificaciones sanitarias qu e deben cumplir las bebidas 
saborizadas no alcohólicas (incluye bebidas para deportistas), sus congelados, los productos concentrados 
para prepararlas y las bebidas adicionadas con cafeína.  
1.2 Esta norma no aplica a productos que cuenten con una regulació n sanitaria particular, los cuales 
deben ajustarse a las especificaciones sanitarias que para cada uno de ellos determine la Secretaría  de 
Salud.  
1.3 Esta norma es de observancia obligatoria en el Territorio Nacional para las personas físicas o morales 
que se dedican a su proceso o importación.  
2. Referencias.  
Esta norma se complementa con las siguientes Normas Oficiales Mexicanas, sus modificaciones o las que 
las sustituyan:  
2.1 Norma Oficial Mexicana NOM -003-SSA1 -2006. Salud ambiental. Requisitos sanitari os que debe 
satisfacer el etiquetado de pinturas, tintas, barnices, lacas y esmaltes.  
2.2 Norma Oficial Mexicana NOM -086-SSA1 -1994. Bienes y servicios. Alimentos y bebidas no alcohólicas 
con modificaciones en su composición. Especificaciones nutrimentales.  
2.3 Norma Oficial Mexicana NOM -051-SCFI/SSA1 -2010. Especificaciones Generales de Etiquetado para 
Alimentos y Bebidas no alcohólicas preenvasados -Información comercial y sanitaria.  
2.4 Modificación a la Norma Oficial Mexicana NOM -127-SSA1 -1994. Salud ambie ntal, agua para uso y 
consumo humano . Límites permisibles de calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su 
potabilización.  
2.5 Norma Oficial Mexicana NOM -130-SSA1 -1995. Bienes y servicios. Alimentos envasados en recipientes 
de cierre hermétic o y sometido a tratamiento térmico. Disposiciones y especificaciones sanitarias.  
2.6 Norma Oficial Mexicana NOM -201-SSA1 -2002. Productos y servicios. Agua y hielo para consumo 
humano, envasados y a granel. Especificaciones sanitarias.  
2.7 Norma Oficial Mex icana NOM -251-SSA1 -2009. Prácticas de higiene para el proceso de alimentos, 
bebidas o suplementos alimenticios.  
3. Definiciones.  
Para fines de esta norma se entiende por:  
3.1 Adicionar, añadir uno o más nutrimentos, contenidos o no normalmente en el produc to. 
3.2 Aditivo, cualquier sustancia permitida que, sin tener propiedades nutritivas, se incluya en la 
formulación de los productos y que actúe como estabilizante, conservador o modificador de sus características 
organolépticas, para favorecer ya sea su es tabilidad, conservación, apariencia o aceptabilidad.  
3.3 Agua para uso y consumo humano (agua potable), agua que no contiene contaminantes objetables, 
químicos o agentes infecciosos y que no causa efectos nocivos para la salud.  
3.4 Bebida no alcohólica, cualquier líquido, natural o transformado, que proporcione al organismo 
elementos para su nutrición.  
3.5 Bebidas no alcohólicas con modificaciones en su composición, a los que se les disminuyen, 
eliminan o adicionan uno a más nutrimentos, tales como hidratos  de carbono, proteínas, lípidos, vitaminas, 
minerales o fibras dietéticas.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
3.6 Bebida para deportistas, a las bebidas saborizadas no alcohólicas que son elaboradas por la 
disolución de sales minerales, edulcorantes u otros ingredientes con el fin de repone r el agua, energía y 
electrolitos perdidos por el cuerpo humano durante el ejercicio.  
3.7 Bebidas saborizadas no alcohólicas, a los productos elaborados por la disolución en agua para uso 
y consumo humano, de edulcorantes e ingredientes opcionales, adicion ados o no de aditivos, que pueden 
estar o no carbonatadas. Incluye bebidas para deportistas.  
3.8 Bebida adicionada con cafeína, a los productos elaborados por la disolución en agua para uso y 
consumo humano, de azúcares, ingredientes opcionales, adicionado s o no de aditivos que pueden estar o no 
carbonatadas y con un contenido mayor de 20 mg de cafeína por 100 ml de producto. No incluye al café, 
sucedáneos del café, té e infusiones de hierbas.  
3.9 Buenas Prácticas de Fabricación (BPF), en el caso de los adi tivos se refiere a la cantidad mínima 
indispensable para lograr el efecto deseado.  
3.10 Concentrado, al producto para preparar bebidas saborizadas no alcohólicas, que se elabora a partir 
de derivados vegetales o, saborizantes naturales, idénticos a los nat urales o sintético artificiales, adicionado o 
no de otros aditivos para alimentos y de ingredientes opcionales , destinado para su venta al consumidor.  
3.11 Concentrado de manufactura, al producto para preparar bebidas no alcohólicas, que se elabora a 
partir de derivados vegetales o saborizantes naturales, idénticos a los naturales o sintético artificiales, 
adicionado o no de otros aditivos para alimentos y de ingredientes opcionales y, que no está destinado para 
su venta al consumidor.  
3.12 Congelado de beb idas no alcohólicas, al producto elaborado con agua para uso y consumo 
humano, edulcorantes e ingredientes opcionales, adicionados o no de aditivos para alimentos con o sin 
incorporación de aire y que puede ser moldeado, envasado o empalillado, entre otros . 
3.13 Consumidor, persona física o moral que adquiere o disfruta como destinatario final productos 
alimenticios y bebidas no alcohólicas preenvasados.  
3.14 Contaminación, presencia de materia extraña, sustancias tóxicas o microorganismos, en cantidades 
que rebasen los límites permisibles establecidos por la Secretaría de Salud o en cantidades tales que 
representen un riesgo a la salud.  
3.15 Derivados vegetales, a las materias primas comestibles e inocuas obtenidas de las diferentes partes 
de la plantas. Lo s saborizantes de origen natural son considerados aditivos.  
3.16 Envase, cualquier recipiente, o envoltura en el cual está contenido el producto preenvasado para su 
venta al consumidor.  
3.17 Etiqueta, cualquier rótulo, marbete, inscripción, imagen u otra m ateria descriptiva o gráfica, escrita, 
impresa, estarcida, marcada, grabada en alto o bajo relieve, adherida, sobrepuesta o fijada al envase del 
producto preenvasado o, cuando no sea posible por las características del producto, al embalaje.  
3.18 Ingredien te, cualquier sustancia o producto, incluidos los aditivos, que se emplee en la fabricación, 
elaboración, preparación o tratamiento de un alimento o bebida no alcohólica y esté presente en el producto 
final, transformado o no.  
3.19 Inocuo, lo que no hace o  causa daño a la salud.  
3.20 Jarabe, al producto elaborado con agua para consumo humano, con una concentración de azúcares 
en cantidad suficiente para lograr la consistencia deseada y que haya sido sometido a tratamiento térmico que 
asegure su conservación . 
3.21 Límite máximo, a la cantidad establecida de aditivos, microorganismos, parásitos, materia extraña, 
plaguicidas, metales pesados y metaloides, que no se deben exceder en un alimento, bebida o materia prima.  
3.22 Lote, a la cantidad de un producto, el aborado en un mismo ciclo, integrado por unidades 
homogéneas e  identificado con un código específico . 
3.23 Materia extraña, cualquier sustancia, resto, desecho o material que se presenta en el producto pero 
que no forma parte de la composición normal de és te. 
3.24 Metal pesado y metaloide, a los elementos químicos que causan efectos indeseables en el 
metabolismo aun en concentraciones bajas. Su toxicidad depende de las dosis en que se ingieran así como 
de su acumulación en el organismo.  
3.25 Método de prueb a, al procedimiento analítico utilizado para comprobar que un producto, satisface 
las especificaciones que establece la norma.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
3.26 Nutrimento, cualquier sustancia incluyendo a las proteínas, aminoácidos, grasas o lípidos, 
carbohidratos o hidratos de carbo no, agua, vitaminas y nutrimentos inorgánicos (minerales) consumida 
normalmente como componente de un alimento o bebida no alcohólica que:  
a) Proporciona energía; o  
b) Es necesaria para el crecimiento, el desarrollo y el mantenimiento de la vida; o  
c) Cuya  carencia haga que se produzcan cambios químicos o fisiológicos característicos.  
3.27 Polvo para preparar bebidas no alcohólicas, al producto con o sin azúcares, con o sin 
edulcorantes calóricos y no calóricos, adicionados o no de jugo, leche y aditivos pa ra alimentos.  
3.28 Proceso, al conjunto de actividades relativas a la obtención, elaboración, fabricación, preparación, 
conservación, mezclado, acondicionamiento, envasado, manipulación, transporte, distribución, 
almacenamiento y expendio o suministro al p úblico de productos.  
3.29 Productos concentrados para preparar bebidas no alcohólicas, a los productos obtenidos por la 
mezcla de algunos de los siguientes: azúcares, ingredientes opcionales y aditivos, que requieren diluirse o 
disolverse para su consumo.  
3.30 Producto preenvasado, al producto que cuando es colocado en un envase de cualquier naturaleza, 
no se encuentra presente el consumidor y la cantidad de producto contenido en él no puede ser alterada, a 
menos que el envase sea abierto o modificado perce ptiblemente.  
3.31 Tratamiento térmico, al método físico que consiste en someter a una fuente de calor suficiente por 
un tiempo apropiado al producto, antes o después de ser envasado con el fin de lograr una estabilidad 
biológica y que garantice la eliminac ión de microorganismos patógenos.  
4. Símbolos y abreviaturas.  
Cuando en esta norma se haga referencia a los siguientes símbolos y abreviaturas se entiende por:  
BPF  buenas prácticas de fabricación  
cm  centímetro  
g  gramo  
kg  kilogramo  
L, l  litro 
M  masa  
µg  microgramos  
mg  miligramo  
mL, ml   mililitro  
n.a.  no aplica  
nm  nanómetro  
NMP   número más probable  
/  por 
%  por ciento  
UFC  unidades formadoras de colonia  
UV  ultravioleta  
pH  potencial de hidrógeno  
v  volumen  
v/v  relación volumen -volumen  
°C  grado Ce lsius 
<  menor que  
PEPS   primeras entradas, primeras salidas  
Cuando en la presente norma se mencione al:  
Acuerdo de aditivos , debe entenderse que se trata del Acuerdo por el que se determinan las sustancias 
permitidas como aditivos y coadyuvantes en alimen tos, bebidas y suplementos alimenticios vigente.  
Acuerdo de plantas , debe entenderse que se trata del Acuerdo por el que se determinan las plantas 
prohibidas o permitidas para tés, infusiones y aceites vegetales comestibles, vigente.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
Reglamento,  debe enten derse que se trata del Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios.  
Secretaría,  debe entenderse que se trata de la Secretaría de Salud.  
5. Disposiciones generales.  
5.1 En el proceso de los productos objeto de esta norma, además de cumplir con lo establecido en el 
Reglamento, deberán ajustarse a las siguientes disposiciones:  
5.1.1  Los establecimientos que se dediquen al proceso de los productos objeto de esta norma, deben 
cumplir con lo establecido en la Norma citada en el numeral 2.7 del aparta do de referencias.  
5.1.2  Instalaciones físicas.  
5.1.2.1  Cuando por las características del envase se requiera un área de lavado de envases, ésta debe 
ser específica, localizarse dentro del establecimiento y contar con pisos, paredes y techos. En caso de qu e no 
exista comunicación directa entre esta área y la de llenado, se deben tomar las medidas necesarias para 
evitar la recontaminación de los envases.  
5.1.3 Materia prima.  
5.1.3.1 La materia prima empleada en la elaboración de los productos objeto de esta norma, debe cumplir 
con lo establecido en el Reglamento y en las Normas Oficiales Mexicanas correspondientes.  
5.1.3.2  El agua que se utilice en el proceso de los productos debe ser para uso y consumo humano, 
conforme a lo establecido en las Normas citadas en los numerales 2.4 y 2.6 del apartado de referencias y en 
caso de ser necesario, se debe contar con un sistema de potabilización adicional que garantice su inocuidad. 
El mantenimiento del mismo es responsabilidad del particular, de acuerdo con las especi ficaciones emitidas 
por el fabricante.  
5.1.3.3 La materia prima de origen vegetal fresca o congelada, se debe lavar con agua para uso y consumo  
humano, y desinfectar con sustancias inocuas para su uso en alimentos, de conformidad con lo siguiente:  
5.1.3.3. 1 El agua debe cambiarse con una frecuencia suficiente para prevenir la acumulación de materia 
orgánica y evitar la contaminación cruzada.  
5.1.3.3.2 Debe realizarse el secado o drenado para eliminar el agua después del lavado.  
5.2 Especificaciones generale s. 
5.2.1  Los productos sujetos a tratamiento térmico envasados en recipientes de cierre hermético, además 
de cumplir con lo establecido en este ordenamiento, deben cumplir con la Norma citada en el numeral 2.5 del 
apartado de referencias.  
5.2.2  Los product os modificados en su composición, además de cumplir con lo establecido en este 
ordenamiento, deben cumplir con la Norma citada en el numeral 2.2 del apartado de referencias.  
5.2.3 Contenido de alcohol.  
5.2.3.1 El contenido de alcohol etílico en el producto  terminado no debe exceder del 1,99% y cuando 
provenga de sabores no debe exceder el 0,5%; ambos porcentajes expresados v/v a 20°C.  
5.2.4 Metales pesados y metaloides.  
5.2.4.1 El fabricante de los productos objeto de esta norma, debe establecer mecanismos de control que 
permitan determinar la presencia y cantidad de metales pesados y met aloides en las materias primas,  en el 
producto en proceso de elaboración o en el producto terminado, de acuerdo a las regulaciones aplicables a la 
categoría del producto. La  información generada debe estar a disposición de la Secretaría cuando ésta así lo 
requiera.  
5.2.5 Los productos objeto de esta norma que empleen como materia prima derivados vegetales, deben 
sujetarse a lo establecido en el Acuerdo de plantas, así mismo n o podrán utilizar aquellas que se encuentran 
listadas en la Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos.  
5.2.6 Los obsequios o promociones que se proporcionen con los productos objeto de esta norma deben 
ser inocuos, no ceder sustancias tóxicas a l producto y, en su caso, cumplir con los ordenamientos  jurídicos 
aplicables.  
5.2.7 Aditivos.  
5.2.7.1  En la elaboración de los productos objeto de esta norma, únicamente se permite el empleo de los 
aditivos listados en el Apéndice normativo A.  
5.2.7.2 Los límites establecidos para cada aditivo sólo son aplicables al uso de dichas sustancias como 
aditivos, sin considerar su empleo como nutrimentos.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
5.2.7.3 En la elaboración de los productos objeto de esta norma adicionalmente a lo especificado en el 
5.2.7.1,  se permite el empleo de saborizantes naturales, sintéticos idénticos a los naturales y sintéticos 
artificiales, señalados en el Acuerdo de aditivos conforme a las BPF.  
5.2.7.4 En la elaboración de congelados a granel pueden emplearse los colorantes listad os en los límites 
señalados en el Apéndice normativo A, de los cuales debe monitorearse y registrarse la concentración en el 
producto terminado. La presencia de otros aditivos se deberá únicamente al principio de transferencia, cuando 
se elaboren a partir de concentrados, jarabes o bebidas no alcohólicas preenvasadas.  
5.2.8  Las bebidas de quina no deberán contener más de 0,001% de quinina o 0,01% de bisulfato de 
quinina o de clorhidrato de quinina.  
5.2.9 Especificaciones físicas.  
5.2.9.1 El límite máximo de  materia extraña debe ser:  
Tabla 1. Materia extraña  
Materia extraña  Con derivados vegetales  Sin derivados vegetales  
Bebidas, congelados, 
jarabes y concentrados  Polvos  Bebidas, congelados, 
jarabes y concentrados  Polvos  
Pelo 1/100 g  1/50 g  1/250 mL  1/50 g  
Fragmentos de Insectos  20/100 g  20/50 g  exento  10/50 g  
Fibras  5/100 g  5/50 g  5/100 mL  5/50 g  
 
6. Bebidas saborizadas no alcohólicas y bebidas adicionadas con cafeína.  
6.1 Disposiciones sanitarias.  
6.1.1 Además de lo señalado en el punto 5, las empres as productoras de bebidas saborizadas no 
alcohólicas preenvasadas y las bebidas adicionadas con cafeína deben cumplir con lo siguiente:  
6.1.1.1 Para el caso de envases no retornables vacíos, éstos deben almacenarse en condiciones 
higiénicas, protegidos de polvo y de materia extraña. Previo a su llenado, deben ser sometidos a un proceso 
que garantice la inocuidad del producto terminado.  
6.1.1.2  Cuando se utilicen envases retornables, éstos deben ser sometidos a un proceso de desinfección 
interna y de lavado externo con soluciones desinfectantes, enjuagados con agua apta para consumo humano 
y escurridos de manera que no queden residuos de los desinfectantes.  
6.1.1.3 Los tapones, tapas, hermetapas o corcholatas deben ser nuevos de material no tóxico, y 
mantener se durante todo el proceso en condiciones higiénicas libres de polvo y de materia extraña. En caso 
de contaminación, éstas deberán lavarse y desinfectarse con soluciones que no modifiquen, reaccionen  o 
alteren las características de éstos, evitando la con taminación por arrastre.  
6.2 Especificaciones Microbiológicas.  
6.2.1  Las bebidas saborizadas no alcohólicas y las bebidas adicionadas con cafeína no deben sobrepasar 
los siguientes límites:  
Tabla 2. Especificaciones microbiológicas  
Microorganismos  Límite m áximo  
Mesófilos aerobios UFC/g o mL 50 
Coliformes totales NMP/mL o g 10 
Coliformes fecales NMP/mL o g n.a. 
Salmonella  spp en 25 mL o  g  ausente *  
E. coli NMP/g o mL n.a. 
V. cholerae  O1 en 50 g o mL ausente *  
Enterotoxina estafilocóccica  negativa*  
* Sólo en casos de contingencia sanitaria.  
6.3 Las bebidas adicionadas con cafeína no deben contener más de 33mg de cafeína/100mL de producto.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
6.4 Las bebidas para deportistas deben contener, por lo menos sodio e hidratos de carbono en forma de 
azúcares, en  las siguientes concentraciones:  
6.4.1  Sodio entre 230 y 575 mg/L  
6.4.2  Hidratos de carbono (azúcares) máximo 80 g/L  
7. Productos congelados.  
7.1 Clasificación  
Los productos objeto de este capítulo se clasifican en:  
7.1.1 Preenvasados y  
7.1.2 A granel  
7.2 Disposiciones sanitarias.  
7.2.1 Además de lo señalado en el apartado 5 se deben cumplir con las siguientes disposiciones:  
7.2.1.1 En todo momento se debe evitar que la salmuera entre en contacto con el producto terminado.  
7.2.1.2 El agua que se utilice dur ante el desmolde de los productos debe ser para uso y consumo humano.  
7.2.1.3 No se permite colocar hielo en contacto directo con el producto terminado, a menos que éste se 
encuentre preenvasado, de tal forma que evite su contaminación.  
7.2.1.4 La cámara d e congelación y congeladores o neveras deben mantenerse a una temperatura de  -
12°C o menos, con termómetro visible o dispositivos de registro de temperaturas funcionando y en buen 
estado; y permitir el flujo de aire entre los productos.  
7.2.1.5 Los congel ados de bebidas saborizadas no alcohólicas adicionadas con cafeína deben de cumplir 
con los límites establecidos en el numeral 6.3.  
7.3 Especificaciones Microbiológicas.  
7.3.1 Los congelados de bebidas saborizadas no alcohólicas no deben sobrepasar los sig uientes límites:  
Tabla 3. Especificaciones microbiológicas para los congelados de las bebidas saborizadas no 
alcohólicas  
Microorganismos  Congelados de 
bebidas 
saborizadas  no 
alcohólicas 
preenvasados  Congelados de bebidas saborizadas no 
alcohólicas a granel  
sin derivados 
vegetales  con derivados vegetales  
Con 
tratamiento 
térmico  Sin 
tratamiento 
térmico  
Coliformes totales NMP/mL o g  10 10 50 n.a. 
Coliformes fecales NMP/mL o g  n.a. n.a. n.a. <3** 
Salmonella spp. / 25 mL o g  ausente*  ausente  ausente  ausente  
E. coli NMP/mL o g n.a. n.a. n.a. <3  
V. cholerae  O1 / 50 mL o g  ausente*  ausente*  ausente*  ausente*  
Enterotoxina estafilocóccica  negativa***  negativa***  negativa***  negativa***  
* Sólo en casos de contingencia sanitaria.  
** Confirmar la pres encia de E. Coli  por el método de NMP cuando el parámetro de coliformes fecales esté 
fuera de especificaciones.  
*** Sólo en productos adicionados con leche y sus derivados y en casos de contingencia sanitaria.  
8. Productos concentrados para preparar bebida s saborizadas no alcohólicas.  
8.1 Clasificación  
Los productos objeto de este capítulo, por su proceso se clasifican en:  
8.1.1 Jarabes y Concentrados  
8.1.1.1 Con tratamiento térmico  
8.1.1.2 Sin tratamiento térmico  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
8.1.2 Concentrados de manufactura, y  
8.1.3 Polvos  
8.2 Disposiciones sanitarias.  
8.2.1  Además de lo señalado en el punto 5 las empresas productoras de concentrados de manufactura 
deben cumplir con lo siguiente:  
8.2.1.1 Las características y especificaciones sanitarias de los concentrados de manufactu ra, utilizados 
como materia prima para la elaboración de bebidas saborizadas no alcohólicas deben garantizar la inocuidad 
de estas últimas, a fin de cumplir con las especificaciones sanitarias establecidas en esta norma y demás 
disposiciones aplicables.  
8.2.1.2  Los concentrados de manufactura utilizados como materia prima, deben contar con un certificado 
de calidad que incluya, entre otros, los siguientes datos: nombre o clave o código del producto, identificación 
del responsable de proceso, número de lote,  leyendas de conservación y la declaración de ingredientes 
misma información que debe ser declarada en la etiqueta, a excepción de los ingredientes. Cuando se 
requiera utilizar una clave o código para referirse al nombre del producto o a los ingredientes, la persona física 
o moral, licenciatario o causahabiente, propietaria de la marca debe contar con la documentación que 
respalde la identificación de los mismos, la cual debe estar a disposición de la Secretaría cuando ésta  lo 
requiera.  
8.3 Especificaciones  Físicas y Químicas.  
8.3.1 Los polvos para preparar bebidas saborizadas no alcohólicas no deben exceder de 5% de humedad.  
8.4 Especificaciones Microbiológicas.  
8.4.1 Los jarabes y concentrados para preparar bebidas saborizadas no alcohólicas deben cumplir con los 
límites máximos siguientes:  
Tabla 4. Especificaciones microbiológicas en jarabes y concentrados para preparar bebidas 
saborizadas no alcohólicas.  
Microorganismo  Con tratamiento 
térmico  Sin tratamiento térmico.  
sin derivados 
vegetales.  con deriva dos 
vegetales.  
Coliformes totales UFC/ g o mL  <10 10 n.a. 
Coliformes fecales NMP/ g o mL  n.a. n.a. <3** 
Salmonella  spp. / 25 g o mL  ausente* ausente*  ausente  
E. coli  NMP/mL o g  n.a. n.a. <3 
Enterotoxina estafilocóccica  negativa *  negativa *  negativa *  
* En caso de contingencia sanitaria.  
** Confirmar la presencia de E. coli  por el método de NMP cuando el parámetro de coliformes fecales esté 
fuera de especificaciones.  
8.4.2 Los polvos para preparar bebidas saborizadas no alcohólicas deben cumplir lo si guiente:  
Tabla 5. Especificaciones microbiológicas en polvos para preparar bebidas saborizadas no 
alcohólicas.  
Microorganismos  Límite máximo  
Mesofílicos aerobios UFC/g  5000 * 
Coliformes totales NMP/g  <10 
Escherichia coli NMP/g  <3** 
Salmonella  spp. en 25  g  ausente ** 
*Para aquellos que contengan cacao o leche el límite máximo es de 7000 UFC/g.  
**En aquellos productos que contengan cacao, huevo o leche (incluyendo sus derivados)  
9. Muestreo.  
El procedimiento de muestreo para los productos objeto de esta n orma, debe sujetarse a lo que establece 
la Ley General de Salud y otras disposiciones jurídicas aplicables.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
10. Métodos de prueba.  
Para la verificación oficial de las especificaciones sanitarias que se establecen en esta norma, se deben 
aplicar los métodos  de prueba establecidos en el Apéndice normativo B.  
11. Etiquetado.  
Las etiquetas o envases de los productos preenvasados  objeto de esta norma, además de cumplir con lo 
establecido en el Reglamento y en la Norma citada en el numeral 2.3 del apartado de ref erencias , deben 
cumplir con lo siguiente:  
11.1 Requisitos generales.  
11.1.1 Los productos que hayan sido modificados en su composición, deben cumplir con la Norma citada 
en el numeral 2.7 del apartado de referencias.  
11.1.2 En el caso de que el producto ha ya sido objeto de tratamiento térmico, para asegurar la inocuidad 
del producto, esta condición debe señalarse en cualquier parte de la etiqueta. Si el producto ha sido sujeto a 
otro tipo de tratamiento se puede indicar el nombre de éste.  
11.2 Lista de ingr edientes.  
11.2.1 En las bebidas adicionadas con cafeína debe declararse en la lista de ingredientes la cafeína, el o 
los ingredientes base o la mezcla de éstos, seguido del contenido exacto de cafeína expresado en  mg/100 
mL, que debe corresponder al total  ya sea por el saborizante, el o los ingredientes base o la mezcla de éstos.  
11.3 Instrucciones de uso.  
11.3.1 Los jarabes o concentrados, cuando aplique, deben ostentar la leyenda: “Agítese antes de su 
consumo” o cualquier otra equivalente.  
11.4 Leyendas de conservación.  
11.4.1  Los congelados de bebidas no alcohólicas preenvasados deben ostentar la leyenda: “Manténgase 
en congelación” o “Consérvese en congelación” o cualquier otra equivalente.  
11.4.2 Los polvos deben ostentar la leyenda: "Consérvese en un lugar fresco y seco” o cualquier otra 
equivalente.  
11.4.3 Para los jarabes o concentrados deben ostentar la leyenda: “Refrigérese después de abrirse”  o 
“Manténgase en congelación” o cualquier otra equivalente.  
11.5 Etiquetado nutrimental.  
11.5.1 Las bebid as para deportistas además, de la información nutrimental obligatoria que establece la 
Norma citada en el numeral 2.3 del apartado de referencias, deben incluir los electrolitos y minerales  que 
aporten.  
11.5.2  Quedan exceptuados de incluir la información n utrimental los concentrados de manufactura.  
11.6 Leyendas precautorias.  
11.6.1 En productos que contienen quinina debe indicarse la presencia de la misma, ya sea que se utilice 
la palabra “quinina” en la denominación del producto o empleando una leyenda po r separado, la cual deben 
escribirse con caracteres mayores a la de los ingredientes.  
11.6.2 En congeladas, debe incluirse la leyenda: “Para protección de la salud, deben lavarse las manos  y 
el envase del producto antes de consumirlo” o leyenda análoga.  
11.6.3 Las bebidas adicionadas con cafeína, deben incluir las siguientes leyendas: “No consumir más de 
___ unidades al día” (en el espacio en blanco indicar la cantidad correspondiente, dependiendo de la 
concentración de cafeína, en ningún caso la ingesta d e cafeína por el consumo de estas bebidas debe 
exceder de 165 mg de cafeína por día).  
En un recuadro en letras mayores a la de los ingredientes, se establecerán las siguientes leyendas de 
advertencia “ No se recomienda  su consumo por niños menores de 12 año s, mujeres embarazadas o lactando, 
personas sensibles a la cafeína, ni la mezcla con bebidas alcohólicas”.  
11.7 Especificaciones para productos a granel.  
11.7.1 Durante el expendio de los congelados a granel y en caso de que contengan cafeína adicionada en  
cantidad superior a 20mg/100ml, deben indicar por cualquier medio que el producto contiene dicho 
ingrediente.  
11.7.2  Durante el expendio de congelados a granel y en caso de que contengan quinina, deben indicar por 
cualquier medio que el producto contiene dicho ingrediente.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
12. Envase.  
12.1 Debe garantizarse la inocuidad de las tintas empleadas en la etiqueta cuando por las características 
del producto y el envase primario, se presente el riesgo de ingerirlas; según lo que establece la Norma citada 
en el nu meral 2.1 del apartado de referencias.  
13. Concordancia con normas internacionales.  
Esta norma no es equivalente con ninguna norma internacional.  
14. Bibliografía.  
14.1 Ley Federal sobre Metrología y Normalización.  
14.2 Reglamento de la Ley Federal sobre M etrología y Normalización.  
14.3 Ley General de Salud.  
14.4 Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios.  
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14.16 Directiva 92/2/CEE de la Comisión, de 13 de enero de 1992, por la que se establece el 
procedimiento de muestreo y el método comunitario de análisis para el control oficial de las te mperaturas de 
los alimentos ultracongelados destinados al consumo humano.  
14.17 Directiva  2010/69/UE de la Comisión,  de 22 de octubre de 2010 por la que se modifican los anexos 
de la Directiva 95/2/CE del Parlamento Europeo y del Consejo, relativa a aditiv os alimentarios distintos de los 
colorantes y edulcorantes.  
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15. Vigencia.  
15.1 La presente norma entrará en vigor a los 365 días naturales posteriores al de su publicación en el 
Diario Oficial de la Federación.  
16. Observancia de la norma . 
16.1 La vi gilancia en el cumplimiento de la presente norma corresponde a la Secretaría de Salud y a los 
gobiernos de las Entidades Federativas, en sus respectivos ámbitos de competencia.  
Sufragio Efectivo. No Reelecció n. 
México, Distrito Federal, a 9 de diciembre de  2011. - El Comisionado Federal para la Protecció n contra 
Riesgos Sanitarios y Presidente del Comité  Consultivo Nacional de Normalizació n de Regulaci ón y Fomento 
Sanitario , Mikel Andoni Arriola Peñalosa .- Rúbrica.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Apéndice normativo A. Listado de aditivos  
Aditivo  Productos  Límite máximo en el 
producto listo para 
consumo   mg/L 
Aceite vegetal bromado1 Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  15 
Acetato isobutirato de sacarosa  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, conce ntrados y 
concentrados de manufactura  500 
Acido benzoico, benzoato de sodio, 
benzoato de potasio y benzoato de 
calcio3 (expresado como ácido 
benzoico)  Bebidas, jarabes, polvos, concentrados y concentrados 
de manufactura  600 
Acido fosfórico  Bebidas, conge lados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  700 
Acido L (+ ) – tartárico  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  2000  
Acido sórbico, sorbato de sodio, 
sorbato de potasio3 (expresado 
como ác ido sórbico )  Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados 
de manufactura  1000  
Alginato de propilenglicol  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  500 
Amarillo ocaso FCF y sus lacas4 
Amarillo alimentos 3 y  sus lacas  
N° C.I. 15895 (SIN 110)  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  100 
Azorrubina y sus lacas4 
Rojo alimentos 3 y sus lacas  
Carmoisina  
N° C.I. 14720 (SIN 122)  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentra dos y 
concentrados de manufactura  100 
Azul brillante FCF y sus lacas4 
Azul alimentos 2 y sus lacas  
N° C.I. 42090  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  100 
Beta-apo-8’-carotenal  
Anaranjado alimentos 6  
N° C.I. 408 20 Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  100 
Beta caroteno sintético  
Anaranjado alimentos 5  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  100 
Beta-ciclodextrina  Bebidas, congel ados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  500 
Bisulfito de potasio6,7 Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados 
de manufactura  70 
Butilhidroxianisol 2 Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados d e manufactura  1000  
Butilhidroxitolueno 2 Bebidas y congelados  1000  
Cafeína  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  200 
Cantaxantina  
Anaranjado alimentos 8  
N° C.I. 40850  Congelados  100 
Carotenos naturales  
Anaranj ado alimentos 5  
N° C.I. 75130  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  100 
Cera de abeja5 Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  200 
Cera de candelilla5 Bebidas, congelados , polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  200 
Cera de carnauba5 Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  200 
Citrato de amonio férrico  Polvos, jarabes y concentrados  10 
       (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
Citrato de estearilo  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  500 
Citrato de isopropilo2 Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados 
de manufactura  200 
Citrato trietilo  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
conce ntrados de manufactura  200 
Cloruro de estaño  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  20 
Color caramelo Clase III  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  5,000  
Color carame lo Clase IV  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  50,000  
d-alfa- tocoferol concentrado  Bebidas, congelados y concentrados de manufactura  20 
Dicarbonato de dimetilo  Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concen trados 
de manufactura  250 
Dioctil sulfosuccinato de sodio  Bebidas, congelados, polvos y concentrados de 
manufactura  10 
Dióxido de azufre6,7 Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados 
de manufactura  70 
dl–alfa-tocoferol  Bebidas, congelados, po lvos y concentrados de 
manufactura  20 
Eritrosina  
Rojo alimentos 14  
N° C.I. 45430  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  100 
Estearato de ascorbilo  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados  de manufactura  1000  
Estearato de polioxietileno (40)  Bebidas, congelados y concentrados de manufactura  500 
Estearoil 2 lactilato de calcio  Bebidas, congelados, polvos y concentrados de 
manufactura  2000  
Estearoil 2 lactilato de sodio  Bebidas, congelados , polvos y concentrados de 
manufactura  2000  
Ester de glicerol de madera rosina  Bebidas, congelados, polvos y concentrados de 
manufactura  150 
Ester de glicerol de goma rosina  Bebidas, congelados, polvos y concentrados de 
manufactura  150 
Esteres de glicer ol de ácidos grasos 
y ácido diacetil tartárico  Bebidas, congelados, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  1000  
Esteres de poliglicerol de ácidos 
grasos  Bebidas y congelados  300 
Esteres de poliglicerol del ácido 
ricinoléico interésterificado  Bebidas y congelados  300 
Esteres de propilenglicol de ácidos 
grasos  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  500 
Esteres de ácidos grasos y 
sacarosa  Bebidas y congelados  1000  
Etilendiamino tetracetato disódico  Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados 
de manufactura  200 
Etilendiamino tetracetato cálcico 
disódico  Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados 
de manufactura  200 
Extracto de annato (Extracto de 
semillas de Bixa orellana ) 
Anaranja do natural 4  
N° C.I. 75120  Concentrados de manufactura  50 
Extracto de cochinilla  
Extracto de Coccus cacti L  
Rojo Natural 4  
Carmín  
N° C.I. 75470  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  100 Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
 
Extracto de quilaya  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  508 
Extracto de tegumento de uva 
(extracto de piel de uva)  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  3009 
Fosfato dihidrogenado de calcio  Bebidas, congelados y concentrados de manufactura  500 
Fosfato dihidrogenado de sodio  Bebidas, congelados y concentrados de manufactura  500 
Fosfato hidrogenado disódico  Bebidas, congelados y concentrados de manufactura  500 
Fosfato tricálcico  Bebidas, co ngelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  700 
Fosfato tripotásico  Bebidas, congelados, y concentrados de manufactura  700 
Fosfato trisódico  Bebidas, congelados y concentrados de manufactura  700 
Galato de propilo2 Bebidas, cong elados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  1000  
p-hidroxibenzoato de metilo  Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados 
de manufactura  500 
Indigotina y sus lacas4 
Azul alimentos 1 y sus lacas  
N° C.I. 73015  Bebidas, polv os, jarabes, concentrados y concentrados 
de manufactura  100 
L (+) Tartrato de potasio  Bebidas y concentrados de manufactura  300 
L (+) Tartrato de sodio  Bebidas y concentrados de manufactura  300 
Metabisulfito de potasio6,7 Bebidas, polvos, jarabes, conc entrados y concentrados 
de manufactura  70 
Metabisulfito de sodio6,7 Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados 
de manufactura  70 
Monoestearato de sorbitán  Bebidas, congelados, polvos y concentrados de 
manufactura  500 
Monoestearato de sorbitán  
polioxietilenado (20)  Bebidas, congelados y concentrados de manufactura  500 
Monolaurato de sorbitán 
polioxietilenado (20)  Bebidas, congelados y concentrados de manufactura  100 
Monooletato de sorbitán 
polioxietilenado (20)  Bebidas, congelados y concentra dos de manufactura  500 
Oxido de hierro negro  
Pigmento negro 11  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  100 
Oxido de hierro rojo  
Pigmento rojo 101  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados d e manufactura  100 
Oxido de hierro amarillo  
Pigmento amarillo 42  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  100 
Oxiestearina  Bebidas, congelados y concentrados de manufactura  BPF 
Palmitato de ascorbilo  Bebidas, conge lados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  1000  
Polidimetilsiloxano  Bebidas, congelados, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  20 
Polietilenglicol  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  1000  
Polifosfato de potasio  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  1000  
Polifosfato de sodio  Bebidas, congelados,  polvos y concentrados de 
manufactura  1000  
Polivinilpirrolidona  Polvos  500 
Ponceau 4 R4 
Rojo alimentos 7 N° C.I. 16255  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  50 
Resina de guayaco  Bebidas, congelados y concentrados de manufactura  1000  
Riboflavina  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados  y 
concentrados de manufactura  50 
Riboflavina - 5’- fosfato de sodio  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  50       (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
 
Rojo allura AC y sus lacas4 
Rojo alimentos 17 y sus lacas  
N° C.I. 16035  Bebidas, congelados, polvos,  jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  300 
Sulfito ácido de calcio6,7 Bebidas y concentrados de manufactura  70 
Sulfito ácido de sodio6,7 Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados 
de manufactura  70 
Sulfito de potasio6,7 Bebidas,  polvos, jarabes, concentrados y concentrados 
de manufactura  70 
Sulfito de sodio6,7 Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados 
de manufactura  70 
Tartrazina y sus lacas4 
Amarillo alimentos 4 y sus lacas  
N° C.I. 19140  Bebidas, congelados, polvo s, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  100 
Tiosulfato de sodio6,7 Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados 
de manufactura  70 
Tocoferoles concentrados (mezcla)  Bebidas, congelados, polvos y concentrados de 
manufactura  20 
Triestearato de sorbitán 
polioxietilenado (20)  Congelados y concentrados de manufactura  500 
Verde rápido FCF y sus lacas4 
Verde alimentos 3 y sus lacas  
N° C.I. 42053  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura  100 
 
1Indic e de yodo = 16,0;  Acidos grasos libres (como ácido oleico) = 2,5%  
2 Cantidad máxima referida al peso total de los aceites esenciales.  
3 La mezcla no debe exceder de 1000 mg/L tomando en cuenta el límite máximo de cada aditivo. 
4 Si se utiliza una mezcla de colorantes artificiales, ésta no deberá exceder de 100 mg/L en el producto 
listo para el consumo, tomando en cuenta el límite máximo de cada colorante.  
5 Como resultado de la utilizació n de aspartame como vehículo de sabor.  
6 Según se sirve al consumidor.  
7 Como SO 2 residual.  
8 130 mg/kg extracto seco en bebidas semicongeladas.  
9 Expresado como antocianina.  
Edulcorantes  
Además de los edulcorantes establecidos en la NOM -086-SSA1 -1994, est ablecida en el apartado de 
referencias, se podrán utilizar los siguientes edulcorantes bajo los límites establecidos.  
Aditivo  Productos  Límite máximo en el 
producto listo para 
consumo   mg/L 
Alitame  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, 
concentrados y conc entrados de 
manufactura  40 
Aspartame -acelsufame potásico  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, 
concentrados y concentrados de 
manufactura  350 
Ciclamato y sus sales de sodio y calcio  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, 
concentrados y concentrados de 
manufactura  350 
Eritritol  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, 
concentrados y concentrados de 
manufactura  BPF 
Estevia o glucósidos de estevia  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, 
concentrados y concentrados de 
manufactura  200 
Jarabe de maltitol  Bebidas,  congelados, polvos, jarabes, 
concentrados y concentrados de 
manufactura  BPF Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Jarabe de poliglicitol  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, 
concentrados y concentrados de 
manufactura  BPF 
Jarabe de sorbitol  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, 
concentrados  y concentrados de 
manufactura  BPF 
Lactitol  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, 
concentrados y concentrados de 
manufactura  BPF 
Maltitol  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, 
concentrados y concentrados de 
manufactura  BPF 
Manitol  Bebidas, congelados, p olvos, jarabes, 
concentrados y concentrados de 
manufactura  BPF 
Neotame  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, 
concentrados y concentrados de 
manufactura  33 
 
Lista de aditivos para uso conforme a las Buenas Prácticas de Fabricación:  
Acetato de almidón  
Acetato de amonio  
Acetato de calcio  
Acetato de potasio  
Acetato de sodio  
Acido acético glacial  
Acido algínico  
Acido ascórbico, ascorbato de sodio, ascorbato de potasio y ascorbato de calcio (expresado como ácido 
ascórbico)  
Acido cítrico  
Acido clorhídrico  
Acido D-L-tartárico  
Acido eritórbico (expresado como ácido eritórbico)  
Acido fumárico  
Acido L -glutámico  
5’-ácido guanílico  
Acido inosínico  
Acido láctico  
Acido D,L - málico  
Acido propiónico (no se permite su uso en congelados)  
Acido tánico  
Adipato acetilado de dia lmidón  
Agar  
Alginato de amonio  
Alginato de calcio  
Alginato de potasio  
Alginato de sodio  
Almidón acetilado oxidado  
Almidón blanqueado  
Almidón hidroxipropilado, Hidroxipropil de almidón        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
Almidón oxidado  
Almido nes tratados con ácidos  
Almidones tratados con álc alis 
Almidones tratados con enzimas  
Carbonato de amonio  
Carbonato hidrogenado de amonio  
Carbonato de calcio  
Carbonato de magnesio  
Carbonato de potasio  
Carbonato de sodio  
Carbonato hidrogenado de magnesio  
Carbonato hidrogenado de potasio  
Carbonato hidrogena do de sodio  
Carboximetilcelulosa de sodio  
Carboximetilcelulosa sódica reticulada  
Carboximetilcelulosa sódica hidrolizada mediante enzimas  
Carragenina  
Celulosa en polvo  
Celulosa microcristalina  
Alfa-ciclodextrina  
Gamma -ciclodextrina  
Citrato de triamonio  
Citrato diácido de potasio  
Citrato diácido de sodio  
Citrato tricálcico  
Citrato tripotásico  
Citrato trisódico  
Clorofilas, Verde natural 3, N° C.I. 75810  
Cloruro de amonio  
Cloruro de calcio  
Cloruro de magnesio  
Cloruro de potasio  
Color caramelo Clase I y II  
Dextrinas  
Dextrinas, almidón tostado  
Dialmidón glicerol  
Dialmidón glicerol acetilado  
Dióxido de carbono  
Dióxido de silicio amorfo  
Dióxido de titanio,  Pigmento blanco 6,N° C.I. 77891  
Eritorbato de sodio (expresado como ácido eritórbico)  
Esteres acéticos y de ác idos grasos del glicerol  
Esteres cítricos y de ácidos grasos del glicerol  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Esteres lácticos y de ácidos grasos del glicerol  
Etil celulosa  
Etilhidroxietilcelulosa  
Fosfato de dialmidón acetilado  
Fosfato de dialmidón  
Fosfato de hidroxipropil dialmidón  
Fosfato fosfatado de dialmidón  
Fosfato de monoalmidón  
Fumarato de sodio  
Glicerol  
Gluconato de calcio  
Gluconato de magnesio  
Gluconato de potasio  
Gluconato de sodio  
Glucono delta lactona  
Glutamato de calcio  
Glutamato de magnesio  
Glutamato monoamónico  
Glutamato monop otásico  
Glutamato monosódico  
Goma arábiga  
Goma damar  
Goma de algarrobo  
Goma gellana  
Goma ghatti  
Goma guar  
Goma karaya  
Goma tara  
Goma tragacanto  
Goma xantana  
5’-guanilato disódico  
Hidróxido de amonio  
Hidróxido de calcio  
Hidróxido de magnesio  
Hidróxido de po tasio  
Hidróxido de sodio  
Hidroxipropil almidón  
Hidroxipropilcelulosa  
Hidroxipropil dialmidón glicerol  
Hidroxipropilmetilcelulosa  
5’-inosinato de calcio  
5’-inosinato de potasio  
5’-inosinato disódico        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
Lactato de amonio  
Lactato de calcio  
Lactato de magnesio  
Lactato de potasio  
Lactato de sodio  
Lecitina  
Licopeno  
Metil celulosa  
Metiletilcelulosa  
Monoestearato de glicerilo (Mono y diglicéridos)  
Monopalmitato de glicerilo (Mono y diglicéridos)  
Nitrógeno  
Octenilsuccinato sódico de almidón  
Oleorresina de paprika  
Oxido  de calcio  
Oxido de magnesio  
Pectinas  
Polidextrosa  
Propionato de calcio (no se permite su uso en congelados)  
Propionato de potasio (no se permite su uso en congelados)  
Propionato de sodio (no se permite su uso en congelados)  
Rojo betabel  
Silicato de alumin io 
Silicato de aluminio y calcio  
Silicato de aluminio y sodio  
Silicato de calcio  
Silicato de magnesio  
Sulfato ácido de sodio  
Sulfato de calcio  
Sulfato de magnesio  
Sulfato de potasio  
Sulfato de sodio  
APENDICE NORMATIVO B.  
METODOS DE PRUEBA  
B.1. DETERMINACI ON DE CAFE INA EN BEBIDAS NO ALCOH OLICAS.  
B.1.1  Principio del método.  
La cafeína es extraída de la muestra con cloroformo y determinada espectrométricamente a una longitud 
de onda de 276 nm.  
B.1.2  Equipo.  
B.1.2.1  Espectrómetro de UV -Visible disponible para u tilizarse a 276 nm.  
B.1.2.2  Balanza analítica con una precisión de 0,1 mg.  
B.1.3  Materiales.  
B 1.3.1  Matraces volumétricos de 100 mL.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 1.3.2  Probetas de 100 mL.  
B 1.3.3  Vasos de precipitados de 250 mL.  
B 1.3.4  Embudos de separación de 125 mL.  
B 1.3.5  Pipetas graduadas de 1 y 10 mL.  
B 1.4  Reactivos.  
Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por agua se 
entiende agua destilada.  
B 1.4.1 Sulfito de sodio anhidro (Na 2SO 3) 
B 1.4.2  Tiocianato de potasio (KSCN).  
B 1.4.3 Acido fosfórico (H 3PO 4). 
B 1.4.4  Hidróxido de sodio (NaOH).  
B 1.4.5  Cloroformo (CHCl 3). 
B 1.4.6  Cafeína (C 8H10N4O2) 
B 1.4.7  Permanganato de potasio (KMnO 4). 
B 1.4.8  Solución reductora.  
Disolver 5 g de Na 2SO 3 y 5 g de KSCN en agua y llevar a un volumen  de 100 mL.  
B 1.4.9  Solución diluida de ácido fosfórico.  
Diluir 15 mL de H 3PO 4 con 85 mL de agua.  
B 1.4.10  Solución de hidróxido de sodio.  
Disolver 25 g de NaOH en 75 mL de agua.  
B 1.4.11  Solución patrón de cafeína de 1 mg/mL.  
Disolver exactamente 100 mg d e cafeína en cloroformo y llevar a un volumen de 100 mL con el mismo 
solvente.  
B 1.4.12  Solución de permanganato de potasio al 1,5%.  
Pesar 1,5 g de KMnO 4 y disolver en 100 mL de agua.  
B 1.5  Procedimiento.  
B 1.5.1  Preparación de la curva patrón.  
B 1.5.1.1  Medir los siguientes volúmenes de solución patrón de cafeína, de acuerdo con la Tabla número 1 
y llevar a un volumen de 100 mL con cloroformo.  
Tabla No. 1  
Matraz  mL solución patrón de cafeína  mg cafeína/100 mL  
1 0,00 Blanco  
2 0,10 0,10 
3 0,25 0,25 
4 0,50 0,50 
5 1,00 1,00 
6 1,50 1,50 
7 2,00 2,00 
 
B 1.5.1.2  Determinar la absorbancia de cada una de las soluciones patrón a 276 nm.  
B 1.5.1.3  Elaborar una gráfica de la lectura de absorbancia para cada una de las soluciones patrón en 
función de su concentra ción (en mg/100mL). Ajustar la curva mediante regresión lineal (método de mínimos 
cuadrados).  Lo anterior, puede llevarse a cabo en equipos que se programan directamente en los cuales sólo 
es necesario leer los estándares y marcar su concentración teórica.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 1.5.2  Preparación de la muestra.  
B 1.5.2.1  Eliminar el gas de la muestra por agitación o con ultrasonido.  
B 1.5.2.2  Medir 10 mL de muestra en un embudo de separación de 125 mL, adicionar 5 mL de solución de 
permanganato de potasio al 1,5% y mezclar.  
B 1.5.2.3  Después de exactamente 5 minutos, añadir 10 mL de la solución reductora y mezclar.  
B 1.5.2.4  Adicionar 1 mL de solución diluida de ácido fosfórico, mezclar, añadir 1 mL de solución de 
hidróxido de  sodio y mezclar.  
B 1.5.2.5  Extraer con 50 mL de clor oformo durante un minuto. Dejar separar las fases y drenar la fase 
inferior filtrando a través de papel filtro. Colectar en un matraz volumétrico de 100 mL.  
B 1.5.2.6  Añadir de 2 -3 mL de cloroformo al embudo de separación y drenar a través del papel.  
B 1.5 .2.7 Lavar el papel con 2 -3 mL de cloroformo. Extraer nuevamente con 40 mL de cloroformo filtrando 
y lavando el papel filtro como se describió anteriormente y diluir al volumen con cloroformo.  
B 1.5.2.8  Determinar la absorbancia a 270 nm.  
B 1.6  Cálculos  
De la ecuación de la recta obtenida.  
y = mx + b  
Donde:  
y = Absorbancia obtenida en la muestra ya procesada.  
m = Pendiente (coeficiente de absortividad).  
x = mg cafeína/100 mL en la muestra.  
b = Ordenada al origen.  
Despejar “ x” y obtener directamente los mg d e cafeína/100 mL de bebida.  
mg cafeína/100 mL = mg de cafeína/100 mL obtenidos de la curva X 100 X F.D.  
 10 
Donde:  
F.D. = Factor de dilución.  
B 1.7  Expresión de resultados.  
mg cafeína/100 mL.  
 
B 2 DETERMINACI ON DE MATERIA EXTRAÑA.  
B 2.1  Principio del méto do. 
La materia extraña se separa de la muestra mediante flotación o sedimentación de acuerdo a la naturaleza 
del producto y posteriormente se filtra para su identificación al microscopio.  
B 2.2  Equipo.  
B 2.2.1  Balanza granataria con una precisión de 0.1 g.  
B 2.2.2  Equipo de filtración al vacío.  
B 2.2.3  Microscopio binocular estereoscópico con objetivos que pueden ser de 3, 6, 7 y 10X y oculares 
apareados de amplio campo visual de 10, 30 y 100X, respectivamente.  
B 2.2.4  Lámpara para el microscopio o luz natu ral equivalente.  
B 2.2.5  Parrilla de calentamiento con agitación magnética.  
B 2.3 Materiales.  
B 2.3.1  Matraz trampa de Wildman, formado por un matraz Erlenmeyer de 1 o 2 L, provisto de una varilla 
metálica con un tapón de émbolo de hule en un extremo.  
B 2.3.2 Embudo de Hirsch o Buchner para filtración al vacío.  
B 2.3.3  Caja de Petri.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 2.3.4  Papel de filtración rápida del número 8 rayado para conteo o rayado a lápiz con líneas paralelas de 
aproximadamente 5 mm de separación.  
B 2.3.5  Aguja de disección.  
B 2.3.6 Material de uso común en el laboratorio.  
B 2.4  Reactivos.  
Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por agua se 
entiende agua destilada.  
B 2.4.1  Heptano (C 7H16). 
B 2.4.2  Acido clorhídrico (HCl) de 36,5 a  38,0% de pureza.  
B 2.4.3  Aceite mineral. Aceite de parafina, blanco y ligero. Con un peso específico de 0,840 -0,860 (24ºC).  
B 2.4.4  Glicerina (C 3H8O3) 
B 2.4.5  Mezcla de glicerina: etanol 1:3 (v/v).  
B 2.4.6  Mezclar un volumen de glicerina con 3 volúmenes d e etanol.  
B 2.5  Procedimiento.  
B 2.5.1 Determinación de materia extraña en bebidas no alcohólicas embotelladas o en lata.  
B 2.5.1.1  Homogeneizar bien la muestra y filtrar 250 mL sobre un embudo de succión, preparado con 
papel filtro para conteo, tratando d e verterlo uniformemente.  
B 2.5.1.2  Colocar el filtro con residuo en una caja de Petri, y humedecerla con la mezcla de glicerina/ 
etanol (opcional). Examinar al microscopio utilizando una luz suficientemente fuerte para que muestre los 
detalles en el papel  filtro.  
B 2.5.1.3  Contar explorando con una aguja de disección sobre toda la superficie del papel, línea por línea, 
y explorar cada pieza del material, porque algunos fragmentos son irreconocibles a menos que se muevan.  
B 2.5.2 Determinación de materia ex traña en concentrados y jarabes.  
B 2.5.2.1  Homogeneizar bien la muestra. En el caso de concentrados y jarabes reconstituir la muestra 
siguiendo las instrucciones de la etiqueta.  
B 2.5.2.2  En un matraz trampa de Wildman medir 250 mL de muestra, adicionar 15  mL de aceite mineral y 
agregar agitando vigorosamente suficiente cantidad de agua caliente (70ºC), hasta que la capa de aceite 
llegue al cuello del matraz. Dejar reposar 30 minutos.  
B 2.5.2.3 Girar suavemente la varilla de metal, para atrapar la capa de a ceite, levantándolo  e 
introduciéndolo lo más que se pueda en el cuello del matraz.  
B 2.5.2.4  Mantener el émbolo en su lugar y decantar el líquido que está sobre él a un embudo de succión 
preparado con un filtro para conteo, tratando de verterlo uniformeme nte. 
B 2.5.2.5  Colocar el filtro con residuo en una caja de Petri, y humedecerla con la mezcla de glicerinaetanol 
(opcional). Examinar al microscopio utilizando una luz suficientemente fuerte para que muestre los detalles en 
el papel filtro.  
B 2.5.2.6  Cont ar explorando con una aguja de disección sobre toda la superficie del papel, línea por línea, 
y explorar cada pieza del material, porque algunos fragmentos son irreconocibles a menos que se muevan.  
B 2.5.2.7  En caso de que la muestra contenga tejidos de fr utas emplear el siguiente procedimiento:  
B 2.5.2.7.1  Pesar en un vaso 100 g de la muestra y adicionar 200 mL de agua caliente (Aprox. a 50ºC). 
Transferir al matraz trampa, adicionar 10 mL de ácido clorhídrico y hervir por 3 minutos.  
B 2.5.2.7.2  Enfriar a t emperatura ambiente, adicionar 25 mL de heptano y agitar perfectamente. Bajar la 
varilla de metal y el tapón émbolo de hule, añadir el agua necesaria para que la capa de heptano suba al 
cuello del matraz.  
B 2.5.2.7.3  Dejar reposar por 15 minutos. Girar sua vemente la varilla de metal, para remover el sedimento 
fino que se acumuló en la superficie del tapón émbolo.  
B 2.5.2.7.4  Atrapar la capa de heptano levantándolo e introduciéndolo lo más que se pueda en el cuello 
del matraz. Mantener el émbolo en su lugar y decantar el líquido que está sobre él a un embudo de succión 
preparado con un papel filtro para conteo, tratando de verterlo vigorosamente.  
B 2.5.2.7.5 Añadir nuevamente 25 mL de heptano al matraz trampa para hacer una segunda extracción  
heptano sobre el  embudo de succión, lavar la varilla y el cuello del matraz con heptano y verterlo sobre el 
mismo embudo.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 2.5.2.7.6  Examinar al microscopio utilizando una luz suficientemente fuerte para que muestre los 
detalles en el papel filtro. Contar explorando con una aguja de disección sobre toda la superficie del papel, 
línea por línea, voletear y explorar cada pieza del material, porque algunos fragmentos son irreconocibles a 
menos que se muevan. No contar material dudoso.  
B 2.5.3  Determinación de materia extraña  en polvos para preparar bebidas.  
B 2.5.3.1  Homogeneizar la muestra. Pesar en un vaso 50 g de muestra y adicionar de 400 -500 mL de 
agua agitar bien hasta que toda la muestra se disuelva y aplicar el mismo procedimiento seguido en B 2.5.1  
B 2.6  Expresión de  resultados.  
Presencia o ausencia de insectos enteros, fragmentos de insectos, pelos de roedor, excretas o cualquier 
materia extraña encontrada en 50 g, 100 g o 250 mL de producto, según corresponda.  
 
B 3 DETERMINACI ON DE QUININA EN BEBIDAS CARBONATADAS.  
B 3.1  Principio del método.  
La quinina es determinada espectrométricamente en medio ácido a una longitud de onda de 347.5 nm.  
B 3.2  Equipo.  
B 3.2.1  Espectrómetro de UV -Visible disponible para utilizarse a 347.5 nm.  
B 3.2.2  Balanza analítica con una precisi ón de 0.1 mg.  
B 3.2.3  Agitador magnético.  
B 3.3  Materiales.  
B 3.3.1  Matraces volumétricos de 100 mL.  
B 3.3.2  Probetas de 100 mL.  
B 3.3.3  Vasos de precipitados de 250 mL.  
B 3.4  Reactivos.  
Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por agua se 
entiende agua destilada.  
B 3.4.1  Quinina (C 20H24N2O2). Secada a 100ºC durante 3 horas.  
B 3.4.2  Acido clorhídrico concentrado (HCl).  
B 3.4.3  Solución de ácido clorhídrico 0,5 N.  
B 3.4.4  Solución patrón de quinina de 1 mg/mL . Pesar exactamente 100 mg de quinina en un matraz 
volumétrico de 100 mL. Adicionar 20 mL de ácido clorhídrico 0,5 N y llevar al volumen con agua. Mezclar.  
B 3.5  Procedimiento.  
B 3.5.1  Preparación de la curva patrón.  
B 3.5.1.1  Medir los siguientes volúmene s de solución patrón de quinina, de acuerdo con la Tabla No. 2, en 
matraces volumétricos de 100 mL.  
Tabla No.2  
Matraz  mL solución patrón de quinina  mg quinina/L  
1 0,00 Blanco  
2 0,50 5,0 
3 1,00 10,0 
4 2,00 20,0 
5 3,00 30,0 
6 4,00 40,0 
7 5,00 50,0 
8 6,00 60,0 Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 3.5.1.2  Adicionar a cada matraz 20 mL de ácido clorhídrico 0.5 N. Llevar al volumen con agua y mezclar.  
B 3.5.1.3  Determinar la absorbancia de cada las soluciones patrón a 347,5 nm.  
B 3.5.1.4  Elaborar una gráfica de la lectura de absorbancia p ara cada una de las soluciones estándar en 
función de su concentración (en mg/L). Ajustar la curva mediante regresión lineal (método de mínimos 
cuadrados). Lo anterior, puede llevarse a cabo en equipos que se programan directamente, en los cuales sólo 
es necesario leer los estándares y marcar su concentración teórica.  
B 3.5.2  Preparación de la muestra.  
B 3.5.2.1  Vaciar el contenido de la botella o lata en un vaso de precipitados. Agitar magnéticamente hasta 
eliminar el gas.  
B 3.5.2.2  Medir 50 mL de la muest ra degasificada en un matraz volumétrico de 100 mL y adicionar 20 mL 
de ácido clorhídrico 0,5 N y llevar al volumen con agua. Mezclar.  
B 3.5.2.3  Determinar la absorbancia a 347,5 nm.  
B 3.6 Cálculos.  
De la ecuación de la recta obtenida.  
y = mx + b  
Donde:  
y = Absorbancia obtenida en la muestra ya procesada.  
m = Pendiente (coeficiente de absortividad).  
x = mg quinina/L en la muestra.  
b = Ordenada al origen.  
Despejar “ x” y obtener directamente de la curva los mg de quinina/L.  
Para obtener la cantidad de quinina  en la muestra aplicar la siguiente ecuación:  
mg quinina/L = mg quinina/L obtenidos de la curva estándar X 100 X F.D. 50  
Donde:  
F.D. = Factor de dilución.  
B 3.7  Expresión de resultados.  
mg quinina/ L. 
 
B 4 DETERMINACI ON DE SULFITOS EN ALIMENTOS. M ETODO OPT IMIZADO DE  MONIER -
WILLIAMS.  
B 4.1  Principio del método.  
El método mide sulfitos libres más porciones reproducibles de sulfitos ligados, tales como productos 
carbonílicos, en alimentos. La muestra es calentada con ácido clorhídrico (HCl) en reflujo para co nvertir el 
sulfato a SO 2 (sulfitos). El nitrógeno introducido a la solución arrastra el SO 2 a través del condensador enfriado 
por agua y pasa a una solución del H 2O2 al 3% donde el SO 2 se oxida a ácido sulfúrico (H 2SO 4). El contenido 
de sulfito es directam ente relacionado al H 2SO 4 generado, el cual es determinado por titulación con hidróxido 
de sodio (NaOH) estandarizado.  
Aplicable para la determinación de  10 ppm de sulfitos en alimentos. Aplicable en presencia de otros 
comp uestos volátiles de azufre, no aplicable a cebollas secas, puerros y calabazas.  
B 4.2  Equipo.  
B 4.2.1  Aparato de Destilación (nota: En este método la presión dentro del aparato está limitada a la 
presión propia de la solución de H 2O2 al 3% encima del extre mo del burbujeador, mantener la presión baja 
para evitar la pérdida del SO 2 a través del goteo). Usar una película delgada de vaselina en las superficies 
que sellan en todas las juntas, excepto en la junta entre el matraz y el embudo de separación. Poner p inza en 
cada junta para asegurar que sellen completamente.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
 
B 4.2.2  Ensamblar el aparato según se muestra en la figura siguiente:  
B 4.2.3  Bureta de 10 mL con tubo de sobrellenado y conexiones para tubo Ascarita o el equivalente para 
permitir mantener una atmósfera libre de CO 2 sobre el hidróxido de sodio 0,01N estandarizado.  
B 4.3 Reactivos.  
Todos los reactivos deben  ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por agua se 
entiende agua desionizada.  
B 4.3.1  Acido clorhídrico (HCl) acuos o 4N.  Para cada análisis, preparar 90 mL de esta solución  mezclando 
30 mL de HCl y 60 mL de agua desionizada.  
B 4.3.2  Indicador de rojo de metilo.  Disolver 250 mg de rojo de metilo en 100 mL de etanol.  
B 4.3.3  Titulante estandarizado. Hidróxido de sodio (N aOH) 0,010N Estandarizar la solución con  estándar 
de ftalato ácido de potasio.  
B 4.3.4  Solución de peróxido de hidrógeno al 3% (H 2O2). Para cada análisis, diluir 3 mL de H 2O2 al 30% 
con 30 mL de agua desionizada. Justo antes de usarse, agregar 3 gotas de i ndicador de rojo de metilo y titular 
con hidróxido de sodio (NaOH) 0,010N a un punto final amarillo, si el punto final excedió, descartar la solución.  
B 4.3.5  Nitrógeno de alta pureza. Usar un regulador para mantener el flujo de 200 mL/min. Para evitar 
oxígeno en el nitrógeno se usa una trampa tipo cromatografía de gases.  
B 4.4 Preparación de la muestra.  
B 4.4.1  Sólidos.  
Transferir 50g de alimento o la cantidad que contenga de 500 a 1500 g de SO 2, a un procesador de 
alimentos  o licuadora.  Agregar 100 mL de etanol - agua (5+95 v/v) y mezclar. Licuar s ólo hasta que el 
alimento pueda pasar por la junta 24/40 del matraz.  
B 4.4.2  Líquidos.  
Mezclar 50g de muestra, o la cantidad que contenga de 500 a 1500 g de SO 2 con 100 mL de la mezcla 
etanol – agua.  
Nota: Llevar a cabo la preparación de la muestra y el análisis tan rápido como sea posible para evitar la 
pérdida de formas lábiles de sulfito.  
B 4.5 Preparación del sistema.  
B 4.5.1  Usando el aparato ens amblado y el matraz puesto en la manta de calentamiento, agregar 400 mL 
de agua al matraz.  
B 4.5.2  Cerrar la llave del embudo de separación y agregar 90 mL de HCl 4N.  
B 4.5.3  Empezar con el flujo de nitrógeno.  Iniciar el flujo en el refrigerante.  
B 4.5.4  Colocar el recipiente con 30 mL de H 2O2, el cual ha sido titulado a punto final  amarillo con  NaOH 
0,010N.  
B 4.5.5  Después de 15 min, el aparato y el agua estarán completamente desoxigenadas y la porción de 
muestras debe ser introducida al sistema.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 4.5.6  Remover el embudo de separación y cuantitativamente transferir la muestra al matraz.  
B 4.5.7  Limpiar la junta y rápidamente aplicar grasa de silicón y regresarlo a su lugar.  
B 4.5.8  El flujo de nitrógeno a través de la solución  de H 2O2 al 3% se reanuda tan pronto como se coloca 
el embudo en la junta del matraz. Examinar cada junta para asegurar que esté sellado.  Usar un bulbo con 
válvula para aplicar presión sobre el HCl. Abrir la llave y dejar pasar el HCl al matraz. Continuar sosteniendo la 
válvula para ma ntener la suficiente presión sobre la solución de ácido para forzarla a pasar. Cerrar la llave 
antes de que los últimos 2 -3 mL drenen para evitar que el SO 2 escape hacia el embudo de separación.  
B 4.5.9  Calentar la manta al calentamiento y regular para cal entar lo suficiente, obteniendo de 80 a 90 
gotas/min del condensador.  
B 4.5.10 Dejar 1 h 45 min y remover el vaso.  
B 4.6  Procedimiento  
Inmediatamente titular el contenido del vaso o probeta con hidróxido de sodio 0,010N a punto final amarillo 
y que persist a  20 segundos.  
B 4.7  Cálculos.  
Calcular el contenido de sulfitos, como sigue:  
g SO 2,/g = 32,03 x VB x N x 1000  
peso de muestra  
Donde:  
32,03 = peso milequivalente del SO 2 
VB = Volumen (ML) del NaOH  
N = Normalidad del NaO H 
1000 = Factor para convertir milequivalentes a microequivalentes  
Peso de muestra: cantidad de muestra que se introdujo al matraz  
B 5 DETERMINACI ON DE SULFITOS POR GRAVIMETR IA (OPCIONAL).  
B 5.1  Después de la titulación, llevar el contenido del recipiente a un vaso de 400 mL agregar 4 gotas de 
HCl 1N y un exceso de solución de BaCl 2 al 10% y dejar reposar toda la noche.  
B 5.2 Lavar el precipitado por decantación 3 veces con agua caliente a través de un Gooch previamente 
pesado. Lavar con 20 mL de alcohol et ílico y 20 mL de éter y secar a 105° -110°C.  
B 5.3  Determinar el blanco de reactivos para la titulación y para el método gravimétrico y considerarlo en 
el cálculo de los resultados.  
B 5.4  Preparación del Aparato de Filtración  
B 5.4.1 Unir el receptáculo con  un filtro de fibra de vidrio.  
B 5.4.2 Colocar lo anterior en el matraz kitasato.  
B 5.4.3  Lavar el filtro con 10 mL de agua caliente, desionizad a y después con 10 mL de etanol  usando 
vacío.  
B 5.4.4  Quitar el filtro y secarlo a 110°C durante 12 horas o más.  Transferir a desecador para enfriar a 
temperatura ambiente. Pesar (Wb).  
B 5.4.5  Colocar el filtro en el receptáculo de vidrio.  
B 5.5  Precipitado de BaSO 4 
B 5.5.1  Pasar el precipitado por el filtro. Lavar con agua para asegurar que todo ha sido filtrado.  
B 5.5.2  Pasar 10 mL de etanol a través del precipitado y filtrar con vacío.  
B 5.5.3  Remover el filtro y secar en estufa a 110°C durante toda la noche.  
B 5.5.4  Transferir a desecador, enfriar y pesar (Wp).  
B 5.6 Cálculos.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
Calcular el contenido de sulfitos co mo sigue:  
g SO 2,/g = (Wp – Wb) x 274,46  
g muestra  
Donde:  
Wp = Peso de papel filtro con el precipitado de BaSO 4 a peso constante  
Wb = Peso de papel filtro preparado y puesto a peso constante  
B 5.7 Ensayos de Recuperación.  
B 5.7.1  Para familiarizarse y eficientizar el método antes de realizar la rutina, analizar porciones de 
muestra que contengan cantidades conocidas de sulfitos.  
B 5.7.2  Realizar los análisis de manera que se omita cualquier pé rdida de sulfitos por oxidación o reacción 
con los componentes en el alimento.  
B 5.7.3  Debido a que los sulfitos son reactivos con el aire y con algunas matrices alimenticias y dado que 
carecen de estabilidad, se debe fortificar con fuentes estables de sul fitos,  no sulfito de sodio o sales similares.  
B 5.7.4  El hidroximetil sulfonato de sodio (HMS), el cual es estructuralmente similar a algunas formas 
combinadas de sulfitos en alimentos, es útil para preparar porciones de prueba fortificada.  
B 5.7.5  Para el  análisis, transferir 50g de muestra de alimento libre de sulfitos al matraz.  Agregar una 
alicuota de solución de la sal sódica de hidroximetil sulfonato. Analizar inmediatamente.  
B 5.7.6  Recuperaciones de  80% del HMS con ma trices alimenticias de 10 ppm son recomendables para 
asegurar una adecuada exactitud analítica.  
B 5.8  Informe de las pruebas.  
g SO 2,/g 
 
B 6 DETERMINACI ON DE SODIO (Na) POR ESPECTROFOTOMETR IA DE ABSORCI ON AT OMICA 
CON ADITAMENTO DE FLAMA  
B 6.1 Fundamento  
La muestra se somete a una digestión ácida con ácido nítrico concentrado para que el analito liberado sea 
cuantificado por espectrofotometría de absorción atómica.  
B 6.2 Reactivos  
B 6.2.1  Acido nítrico (HNO 3) concentrado grado suprapuro  
B 6.2.2  Acido nítric o (HNO 3) concentrado G.R.  
B 6.2.3  Estándar certificado de Na de 1000 g/mL  
B 6.2.4  Agua deionizada  
B 6.3  Materiales  
B 6.3.1  Sistema de reflujo  
B 6.3.2  Material común de laboratorio  
B 6.3.3  Papel filtro No. 1  
B 6.4  Equipo  
B 6.4.1  Balanza analítica con una s ensibilidad de 0.1 mg  
B 6.4.2  Espectrofotómetro de absorción atómica con aditamento de flama  
B 6.4.3  Parrilla de calentamiento  
B 6.4.4  Lámpara de cátodo hueco de sodio  
B 6.5  Preparación de la muestra para ensayo  
B 6.5.1 Productos sólidos  
Tomar una cantidad  representativa de la muestra a analizar. Si es necesario moler el producto mediante 
un molino o un mortero. Evitar cualquier contaminación durante esta manipulación. Mezclar bien.  
B 6.5.2  Productos líquidos  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Mezclar bien el producto antes de abrir el recip iente. A continuación transvertir a un recipiente de vidrio  o 
de plástico descontaminado. Guardar en el refrigerador (4°C). Mezclar bien antes del uso.  
B 6.5.3  Descontaminación del material  
En una cubeta de polietileno (volumen aproximado de 15L) introduc ir 10L de mezcla ácido nítrico/ agua (1:1).  
En este baño descontaminar durante una noche todos los matraces aforados, tapones, recipientes de polietileno  
o de polipropileno, así como todo el material de vidrio necesario. Enjuagar con agua destilada. Secar.  
B 6.6 Procedimiento  
B 6.6.1  Se pesa de 1,0 a 2,0 g de muestra en un matraz de fondo plano de 250 mL con boca esmerilada, 
se le añaden 10 mL de HNO 3 grado suprapuro y se digieren por calentamiento en un sistema de reflujo 
durante 2 h o hasta digestión compl eta. 
B 6.6.2  La muestra se enfría y se filtra a través de papel filtro No. 1 y se recibe en un matraz aforado de 
100 mL.  
B 6.6.3  Se lava tres veces el matraz de la digestión con tres porciones de 10 mL de agua deionizada y los 
lavados se filtran y se recib en en el matraz aforado, se lleva a volumen con agua deionizada.  
B 6.6.4  Ajustar el espectrofotómetro de acuerdo a las recomendaciones del fabricante usando un estándar 
certificado.  
B 6.6.5  Se leen las muestras y se anot an los resultados obtenidos en g/mL , de acuerdo a lo siguiente:  
B 6.6.5.1  Longitud de onda: 589,6 nm  
B 6.6.5.2  Llama: aire -acetileno, oxidante  
Nota: Se recomienda meter una muestra añadida para valorarla y hacer un blanco de reactivos para cada 
serie de digestiones.  
B 6.6.6  Cálculo  
mg/kg Na + = (A-B) x C  
 D 
En donde:  
A = g/mL de Na+ en la muestra  
B = g/mL de Na+ en el blanco  
C = mL de aforo de la muestra  
D = peso de la muestra en g tomada para el análisis  
B 6.6.6.1  Sensibilidad del método: 0,15 g/mL para 1% de absorción.  
B 7 AN ALISIS MIC ROBIOL OGICO DE PRODUCTOS OBJETO DE ESTA NORMA  
B 7.1  Procedimiento para la preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis 
microbiológico.  
B 7.1.1  Fundamento  
La dilución primaria tiene por objeto obtener una distribución lo más uniforme pos ible de los 
microorganismos contenidos en la muestra destinada para el análisis. La preparación de diluciones decimales 
adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el número de microorganismos por unidad de 
volumen, para permitir, después d e la incubación, la observación de la prueba en el caso de tubos o matraces 
y la cuenta de colonias en el caso de placas.  
B 7.1.2  Reactivos  
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico. Cuando se indique agua debe 
entenderse como  agua destilada.  
B 7.1.2.1  Preparación de reactivos  
B 7.1.2.1.1  Solución de hidróxido de sodio 1,0 N  
Ingredientes  Cantidades  
Hidróxido de sodio  4,0 g  
Agua  100 mL  
Preparación:        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
Disolver el hidróxido de sodio y llevar a 100 mL con agua.  
B 7.1.2.1.2  Solució n reguladora de fosfatos (solución concentrada).  
Ingredientes  Cantidades  
Fosfato de sodio monobásico  34,0 g  
Agua  1,0 L  
 
Preparación:  
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0 N.  
Llevar a un litro con agua.  
Esterilizar durante 15 minutos a 121° ± 1,0°C.  
Conservar en refrigeración (solución concentrada).  
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a un litro con agua (solución de trabajo).  
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requi era. 
Esterilizar a 121° ± 1,0°C durante 15 minutos.  
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales  a 
los iniciales.  
B 7.1.2.1.3  Agua peptonada  
Ingredientes  Cantidades  
Peptona  1,0 g  
Cloruro de so dio 8,5 g  
Agua  1,0 L  
 
Preparación:  
Disolver los componentes en un litro de agua.  
Ajustar el pH a 7 ± 0,1 con hidróxido de sodio 1,0 N.  
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera.  
Esterilizar a 121 ± 1,0°C durante 15 minutos.  
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales  a 
los iniciales.  
Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar oscuro a una temperatura entre 0 a 5°C 
por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición.  
B 7.1.3 Materiales  
B 7.1.3.1  Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 1 mL y 2 mL), con tapón 
de algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total.  
B 7.1.3.2  Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca.  
B 7.1.3.3  Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca.  
B 7.1.3.4  Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinz as, tijeras, cucharas, 
espátulas, etc.  
B 7.1.3.5  Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio deberán 
esterilizarse mediante:  Horno, durante 2 h a 170 a 175°C o 1 h a 180°C o en autoclave, durante 15 minutos 
como mínimo  a 121 ± 1,0°C.  
B 7.1.3.6  El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las 
especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por esterilización repetida y éste debe 
ser químicamente inerte.  
B 7.1.4  Aparat os e instrumentos  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 7.1.4.1  Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.  
B 7.1.4.2  Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas.  
B 7.1.4.3  Baño de agua con control de temperatura y circulación m ecánica, provista con termómetro 
calibrado con divisiones de 0,1°C y que mantenga la temperatura a 45 ± 0,5°C.  
B 7.1.4.4 Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador 
peristáltico (Stomacher).  
B 7.1.4.5  Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico.  
B 7.1.4.6  Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g.  
B 7.1.5  Procedimiento  
B 7.1.5.1 Preparación de la dilución primaria.  
B 7.1.5.1.1 Para muestras congeladas de un a limento originalmente líquido o licuable, fundir por completo 
en baño de agua de 40 a 45°C un tiempo máximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente.  
B 7.1.5.1.2 Para la parte líquida de una muestra heterogénea la cual sea considerada  suficiente mente 
representativa de la muestra total.  
B 7.1.5.1.2.1  Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm 
efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 mL de la muestra y diluir con 9 mL del diluyente el cual 
debe enco ntrarse a una temperatura similar a ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.  
B 7.1.5.1.2.2  Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alícuotas mayores, por ejemplo 
volúmenes de 10 u 11 mL, diluidos con 90 o 99 mL, de la misma f orma que se describió anteriormente  
B 7.1.5.1.3 A partir de muestras sólidas o semisólidas.  
Las muestras sólidas y semisólidas congeladas, deben descongelarse en refrigeración de 4 a 8ºC durante 
8 horas y no más de 24 horas antes de proceder a su análisis.  
B 7.1.5.1.3.1  Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plástica 
estériles de tamaño adecuado.  
B 7.1.5.1.3.2  Adicionar un volumen de 90 a 99 mL del diluyente llevado a una temperatura similar a la de 
la muestra.  
B 7.1.5.1.3.3  Operar la licuadora o el homogeneizador peristáltico de 1 a 2 minutos hasta obtener una 
suspensión completa y homogénea según se indique en la técnica correspondiente para cada alimento. Aún 
en los equipos más lentos, este tiempo no debe exced er de 2,5 minutos.  
B 7.1.5.1.3.4  Permitir que las partículas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada tomando 
de las capas superiores de la suspensión.  
B 7.1.5.1.3.5  Cuando la dilución primaria es muy viscosa o pegajosa, adicionar más diluye nte, lo cual debe 
tomarse en cuenta para las operaciones subsecuentes o expresión de resultados.  
B 7.1.5.1.3.6  El homogeneizador peristáltico (Stomacher) puede no ser adecuado para algunos productos 
(por ejemplo, aquellos con partículas agudas o constituye ntes que no se dispersen fácilmente). Debe ser 
utilizado sólo cuando exista evidencia (publicada o por ensayos comparativos) de que los resultados 
obtenidos no difieren significativamente con aquellos obtenidos con licuadora.  
B 7.1.5.2 Preparación de las d iluciones decimales adicionales.  
B 7.1.5.2.1 Transferir 1 mL o un múltiplo, por ejemplo, 10 u 11 mL de la dilución primaria 1 + 9 (10 -1), en 
otro recipiente conteniendo nueve veces el volumen del diluyente estéril a la temperatura apropiada, evitando 
el co ntacto entre la pipeta y el diluyente.  
B 7.1.5.2.2 Mezclar cuidadosamente cada botella de diluyente siempre de la misma manera que se 
describe en el punto B 7.1.5.1.  
B 7.1.5.2.3 La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se va n a inocular, 
dependen del número esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de análisis 
previos y de la información que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado. En ausencia 
total de información, trabajar con l as diluciones de la primera a la sexta.  
B 7.1.5.2.4 Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas que se 
hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser men or al 10% de la capacidad total  de la 
pipeta.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 7.1.5.2.5 Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de líquido equivalente a su capacidad total, 
escurrir aplicando la punta de la pipeta una sola vez en una área de la caja Petri sin líquido.  
B 7.1.5.2.6 Mientras se afora el líquido de la pipe ta, la punta de ésta debe apoyarse en el interior del cuello 
del frasco y mantenerla en posición vertical, para lo cual este último debe inclinarse lo necesario.  
B 7.1.5.2.7 En estudios donde se busca la presencia o ausencia de una determinada especie de 
microorganismos en 0,1 mL o 0,1 g, no es necesario preparar diluciones mayores.  
B 7.1.5.2.8 El criterio para seleccionar las diluciones a preparar de acuerdo con el número  de 
microorganismos esperado es:  
B 7.1.5.2.8.1  Para la técnica del número más probabl e utilizar tres tubos: donde sea posible demostrar el 
microorganismo en 10 mL de la dilución más alta.  
B 7.1.5.2.8.2  Para la técnica de cuenta en placa, considerar aquellas en las que se puedan contar de 25 a 
250 colonias en un mínimo de una de tres diluci ones en el método de cuenta de bacterias aerobias en placa. 
En el caso de otros grupos microbianos, considerar el número especificado de colonias en la Norma Oficial 
Mexicana correspondiente.  
B 7.1.6  Duración del procedimiento.  
En general, las diluciones d e la muestra deben ser preparadas inmediatamente antes del análisis y éstas 
deben ser usadas para inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos posteriores a su preparación.  
B 7.2 Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa.  
B 7.2.1  Fundam ento 
El fundamento de la técnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio de elección 
después de un cierto tiempo y temperatura de incubación, presuponiendo que cada colonia proviene de un 
microorganismo de la muestra bajo estudio. E l método admite numerosas fuentes de variación, algunas de 
ellas controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores.  
B 7.2.2  Reactivos  
Los reactivos que a continuación se mencionan, deben ser grado analítico.  
Cuando se indique agua, debe entende rse agua destilada, con pH cercano a la neutralidad.  
B 7.2.3  Medios de Cultivo.  
B 7.2.3.1  Agar Triptona -Extracto de Levadura (agar para cuenta estándar).  
Ingredientes  Cantidades  
Extracto de levadura  2,5 g  
Triptona  5,0 g  
Dextrosa  1,0 g  
Agar  15,0 g  
Agua  1,0 L  
 
Preparación del medio de cultivo.  
Suspender los componentes del medio deshidratado en un litro de agua. Hervir hasta total disolución.  
Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables de capacidad no mayor de 500 mL, cantidades de 
aproximadament e la mitad del volumen del mismo. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1,0ºC, durante 15 minutos. 
El pH final del medio debe ser 7,0 ± 0,2 a 25ºC.  
Si el medio de cultivo es utilizado inmediatamente, enfriar a 45ºC ± 1,0 ºC en baño de agua y mantenerlo  
a esta temperatura hasta antes de su uso. El medio no debe de fundirse más de una vez.  
En caso de medios deshidratados seguir las instrucciones del fabricante.  
El medio de cultivo anterior es el de uso más generalizado. Para algunos alimentos en particular se 
requerirá de un medio de cultivo especial que se debe indicar al describir la técnica para ese alimento.  
B 7.2.4  Materiales  
Todo el material que tenga contacto con las muestras o los microorganismos debe estar estéril.   Se 
requiere, los materiales mencionados  en el apartado B 7.1  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 7.2.5  Aparatos e instrumentos  
Se requiere, además de los mencionados en B.7.1, los siguientes:  
B 7.2.5.1  Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1,0ºC, provista con termómetro 
calibrado.  
B 7.2.5.2  Contador de co lonias de campo obscuro, con luz a decuada, placa de cristal cuadri culada y lente 
amplificador.  
B 7.2.5.3  Registrador mecánico o electrónico.  
B 7.2.5.4  Microscopio óptico.  
B 7.2.5.5  Baño de agua con o sin circulación mecánica, provista con termómetro calibr ado con divisiones 
de hasta 1,0 °C y que man tenga la temperatura a 45 ± 1,0 °C. 
B 7.2.6 Preparació n de la muestra  
Para la preparación de la muestra seguir el numeral B 7.1.  
B 7.2.7  Procedimiento  
B 7.2.7.1  Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación; la adición de 
medio de cultivo y homogenización, se puedan realizar cómoda y libremente. Marcar las cajas en sus tapas 
con los datos pertinentes previamente a su inoculación y correr por duplicado.  
B 7.2.7.2  Después de inocula r las diluciones de las muestras preparadas según en B 7.1 en las cajas 
Petri, agregar de 12 a 15 mL del medio preparado, mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 
6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de at rás a adelante, sobre una superficie 
lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje 
la cubierta de las cajas. Dejar solidificar.  
B 7.2.7.3  Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y  diluyente preparado como testigo  de 
esterilidad.  
B 7.2.7.4  El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que 
finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.  
B 7.2.7.5  Incub ar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se 
requieran, según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate, véase el cuadro 1.  
CUADRO 1  
Grupo bacteriano  Temperatura  Tiempo de incubación  
Termofílico s aerobios  55 ± 2ºC  48 ± 2 h  
Mesofílicos aerobios  35 ± 2ºC  48 ± 2 h  
Psicrotróficos  20 ± 2ºC  3 - 5 días  
Psicrofílicos  5 ± 2ºC  7 - 10 días  
 
B 7.2.7.6  En la lectura seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250 UFC, para disminuir el 
error en  la cuenta.  
B 7.2.7.7  Contar todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas (excepto las de mohos y 
levaduras), incluyendo las colonias puntiformes. Hacer uso del microscopio para resolver los casos en los que 
no se pueden distinguir las colo nias de las pequeñas partículas de alimento.  
B 7.2.8 Cálculos del método.  
B 7.2.8.1 Después de la incubación, contar las placas que se encuentren en el intervalo de 25 a 250 
colonias, usando el contador de colonias y el registrador. Las placas de al menos una de tres diluciones deben 
estar en el intervalo de 25 a 250. Cuando sólo una dilución está en el intervalo apropiado, véase el cuadro 2, 
ejemplo 1. Calcular la cuenta promedio por gramo o mililitro de dicha dilución y reportar.  
B 7.2.8.2 Cuando dos dilu ciones están en el intervalo apropiado, determinar la cuenta promedio dada por 
cada dilución antes de promediar la cuenta de las dos diluciones para obtener la cuenta en placa por gramo  o 
mililitro, véase el cuadro 2, ejemplo 2.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 7.2.8.3 Con el fin de un iformar los criterios para el reporte de las cuentas en ensayos donde las placas 
presenten situaciones no contempladas en los ejemplos anteriores, se presentan las siguientes guías:  
B 7.2.8.4 Placas con menos de 25 colonias. - Cuando las placas corridas par a la menor dilución muestran 
cuentas de menos de 25 colonias, contar el número de colonias presentes en dicha dilución, promediar el 
número de colonias y multiplicar por el factor de dilución para obtener el valor estimado de cuenta en placa. 
Aclarar en su  informe esta situación agregando la leyenda "valor estimado", véase el cuadro 2, ejemplo 3.  
B 7.2.8.5 Placas con más de 250 colonias. - Cuando el número de colonias por placa exceda de 250, 
contar las colonias en aquellas porciones de la placa que sean rep resentativas de la distribución de colonias. 
Contar por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del área de la caja y multiplicar el valor obtenido por 4 ó 2, 
respectivamente. Si solamente pueden contarse algunos cuadros, considerar que el fondo de una caja Petri 
de 100 mm de diámetro contiene 65 cuadros de la cuadrícula del contador. Aclarar en el informe esta 
situación agregando la leyenda "valor estimado", véase el cuadro 2, ejemplo 4.  
B 7.2.8.6 Colonias extendidas. - Las colonias extendidas pueden presenta rse en las siguientes formas:  
B 7.2.8.6.1  Cadenas de colonias no separadas claramente entre sí, que parecen ser causadas por la 
desintegración de un cúmulo de bacterias.  
B 7.2.8.6.2  Colonias que se desarrollan en película entre el agar y el fondo de la caj a. 
B 7.2.8.6.3 Colonias que se desarrollan en película en la orilla de la caja sobre la superficie del agar.  
B 7.2.8.6.4  Colonias de crecimiento extendido y en algunas ocasiones acompañadas de inhibición del 
crecimiento, que en conjunto exceden el 50% de l a caja o represión del crecimiento que por sí mismo excede 
el 25% de la superficie de la caja.  
B 7.2.8.6.5  Cuando es necesario contar en cajas que contienen colonias extendidas que no están 
incluidas en el numeral B 7.2.8.6.4, contar cualquiera de los demá s tipos especificados en el numeral B 
7.2.8.6.4, como provenientes de una sola fuente.  
B 7.2.8.6.6 En el caso de las colonias de las que se habla en el primer guion, del numeral B 7.2.8.6.1, si la 
caja contiene una sola cadena, contar como una sola colonia , si la caja contiene varias cadenas que parecen 
originarse de fuentes separadas, contar cada cadena como colonia individual. No contar cada colonia de la 
cadena individualmente.  
B 7.2.8.6.7 Las colonias mencionadas en el primer y tercer guion, generalment e se observan como 
crecimiento diferenciable de otras colonias y se cuentan como tales. Los crecimientos mencionados en el 
cuarto apartado, reportarlos como crecimiento extendido. En caso de que una dilución se encuentre dentro del 
rango y otra dilución pr esente colonias de crecimiento extendido, reportar la dilución en la que se pueden 
contar las colonias, véase el cuadro 2, ejemplo 5  
B 7.2.8.7 Placas sin colonias. - Cuando las placas de todas las diluciones no muestran colonias, reportar la 
cuenta en placa  como menor que una vez el valor de la dilución más baja usada, véase el cuadro 2,  ejemplo 
6. 
B 7.2.8.8 Placas corridas por duplicado, una con crecimiento dentro del intervalo adecuado y otra con más 
de 250 colonias. - Cuando una placa tiene entre 25 y 250  colonias y su duplicado más de 250 colonias, contar 
ambas placas incluyendo la que está fuera del intervalo para determinar la cuenta en placa, véase el cuadro 2, 
ejemplo 7.  
B 7.2.8.9  Placas corridas por duplicado, una placa de cada dilución dentro del in tervalo de 25 a 250 
colonias. - Cuando una placa dentro de diferentes diluciones contiene el número de colonias especificadas en 
el intervalo, contar el número de colonias de las cuatro placas para calcular la cuenta en placa, véase el 
cuadro 2, ejemplo 8.  
B 7.2.8.10 Placas corridas por duplicado, ambas placas de una dilución dentro del intervalo de 25 a 250  y 
sólo una de la otra dilución dentro del mismo. Contar las cuatro en placa, véase el cuadro 2, ejemplo 9.  
B 7.2.8.11  Después de contabilizar las colon ias en las placas seleccionadas, multiplicar por la inversa de 
la dilución para obtener el número de UFC por mililitro o gramo de la muestra. Redondear la cifra obtenida en 
la cuenta de manera que sólo aparezcan dos dígitos significativos al inicio de esta  cifra. Para redondear, 
elevar el segundo dígito al número inmediato superior cuando el tercer dígito de la derecha sea cinco o mayor 
(por ejemplo: 128 redondear a 130). Si el tercer dígito es cuatro o menos, reemplazar el tercer dígito con cero 
y el segun do dígito mantenerlo igual (Por ejemplo: 2417 a 2400).  
B 7.2.9 Informe de la prueba  
Reportar como: Unidades formadoras de colonias, ___ UFC/g o mL, de bacterias aerobias en placa en 
agar triptona extracto de levadura o agar para cuenta estándar, incubadas ________ horas a _______ ºC.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
CUADRO 2  
Cálculo de los valores de la cuenta en placa (ensayos por duplicado)  
Ejemplo   Colonias contadas   UFC/ g o mL  
Número  1:100  1:1,000  1:10,000   
1 >250  178 16 180,000  
 >250  190 17  
2 >250  220 25 250,000  
3 18 2 0 1,600  
 14 0 0  
4 >250  >250  512 5,000,000  
 >250  >250  495  
5 >250  235 Crecimiento extendido   
6 0 0 0 <100  
7 >250  240 24 250,000  
 >250  268 19  
8 >250  216 23 280,000  
 >250  262 42  
9 >250  215 20 23,000  
 >250  235 26  
 >250  275 32 270,000  
 >250  225 26  
 
B 7.3 Método para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa.  
B 7.3.1 Fundamento  
El método permite determinar el número de microorganismos coliformes presentes en una muestra, 
utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis) en el que se  desarrollan bacterias a 35°C en 
aproximadamente 24 h, dando como resultado la producción de gas y ácidos orgánicos, los cuales viran el 
indicador de pH y precipitan las sales biliares.  
B 7.3.2 Reactivos  
Los reactivos que a continuación se mencionan, deben  ser grado analítico y cuando se indique agua debe 
entenderse como agua destilada.  
B 7.3.2.1  Soluciones diluyentes  
Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada)  
Ingredientes  Cantidades  
Fosfato monopotásico  34,0 g  
Agua  1,0 l 
 
Preparación  
Disolve r el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0 N.  
Llevar con agua a un litro.  
Esterilizar a 121± 1,0°C durante 15 minutos. Conservar en refrigeración (solución concentrada).  
Tomar 1,25 mL de la solución concentr ada y llevar a un litro con agua (solución de trabajo).  
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
Esterilizar durante 15 minutos a 121  ± 1,0°C.  
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deben se r iguales  a 
los iniciales.  
Agua peptonada  
Ingredientes  Cantidades  
Peptona  1,0 
NaCl  8,5 g  
Agua  1,0 l 
 
Preparación:  
Disolver los componentes en un litro de agua.  
Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1,0 N.  
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL o  en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera.  
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0°C.  
Después de la esterilización, los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los 
iniciales.  
Si este diluyente no es usado inmediat amente, almacenar en lugar obscuro a una temperatura entre  0 a 
5°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición.  
B 7.3.2.2  Medio de cultivo  
Agar -rojo- violeta -bilis -lactosa (RVBA)  
Ingredientes  Cantidades  
Peptona  7,0 g  
Extracto de levadura  3,0 g  
Lactosa  10,0 g  
Sales biliares  1,5 g  
Cloruro de sodio  5,0 g  
Rojo neutro  0,03 g  
Cristal violeta  0,002 g  
Agar  15,0 g  
Agua  1,0 l 
 
Preparación:  
Mezclar los componentes en el agua y dejar reposar durante algunos  minutos.  
Mezclar perfectamente y ajustar el pH a 7,4 con ácido clorhídrico 0,1N o con hidróxido de sodio 0,1N  a 
25°C, de forma que después del calentamiento se mantenga en este valor.  
Calentar con agitación constante y hervir durante 2 minutos.  
Enfriar i nmediatamente el medio en un baño de agua hasta que llegue a 45°C.  
Evitar el sobrecalentamiento del medio.  
No debe esterilizarse en autoclave.  
Usar el medio dentro de las tres primeras horas después de su preparación.  
En el caso de utilizar medio de cultiv o deshidratado, seguir las instrucciones del fabricante.  
B 7.3.3  Materiales  
B 7.3.3.1  Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 11 y 2 mL), con tapón  de 
algodón.  
B 7.3.3.2  Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales  a una décima de su volumen total.  
B 7.3.3.3  Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 7.3.3.4  Tubos de 16 X 150 mm con tapón de rosca.  
B 7.3.3.5  Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, 
espátul as, etc.  
B 7.3.3.6  Cajas Petri.  
B 7.3.3.7  Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio debe 
esterilizarse mediante:  
B 7.3.3.8  Horno, durante 2 h a 170 - 175°C, o 1 h a 180°C; o en autoclave, durante 15 minutos como 
mínimo a 121 ± 1,0°C.  
B 7.3.3.9  El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las 
especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por las esterilizaciones repetidas y éste 
debe ser químicamente inerte.  
B 7.3 .4 Aparatos e instrumentos  
B 7.3.4.1  Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.  
B 7.3.4.2  Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas.  
B 7.3.4.3  Baño de agua con control de temperatura y circ ulación mecánica, provista con termómetro 
calibrado con divisiones de 0,1° C y que mantenga la temperatura a 45 ± 1,0°C.  
B 7.3.4.4  Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador 
peristáltico (Stomacher).  
B 7.3.4.5  Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico.  
B 7.3.4.6  Incubadora con termostato que evit e variaciones mayores de ± 1,0° C, provista con termómetro 
calibrado.  
B 7.3.4.7  Contador de colonias de campo oscuro,  con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente 
amplificador.  
B 7.3.4.8  Registrador mecánico o electrónico.  
B 7.3.4.9  Microscopio óptico.  
B 7.3.4.10  Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25 °C.  
B 7.3.5 Preparación de la muest ra 
La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la sección  B 7.1 “ Preparación  y 
dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico .” 
B 7.3.6 Procedimiento  
B 7.3.6.1 Colocar en cajas Petri por duplicado 1 mL de la mue stra líquida directa o de la dilución primaria, 
utilizando para tal propósito una pipeta estéril.  
B 7.3.6.2 Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando 
una pipeta estéril diferente para cada dilución.  
B 7.3.6.3 Vertir de 15 a 20 mL del medio RVBA fundido y mantenido a 45 ± 1,0°C en baño de agua. En el 
caso de utilizar cajas de Petri de plástico se vierte de 10 a 15 mL del medio. El tiempo transcurrido entre la 
preparación de la dilución primaria y el momen to en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de  20 
minutos.  
B 7.3.6.4 Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, 
seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj, seis movimientos en e l sentido contrario al de las 
manecillas del reloj y seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla 
solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fría.  
B 7.3.6.5 Preparar una caja con trol con 15 mL de medio para verificar la esterilidad.  
B 7.3.6.6 Después de que está el medio completamente solidificado en la caja, verter aproximadamente  4 
mL del medio RVBA a 45 ± 1,0°C en la superficie del medio inoculado. Dejar que solidifique.  
B 7.3 .6.7 Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35°C, durante 24 ± 2 horas.  
B 7.3.6.8 Después del periodo especificado para la incubación, contar las colonias con el contador  de 
colonias.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 7.3.6.9 Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 1 50 colonias. Las colonias típicas son de color 
rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitación debido a las sales biliares, el 
cual es de color rojo claro o rosa, la morfología colonial es semejante a lentes biconvexos con un d iámetro  de 
0,5 a 2,0 mm.  
B 7.3.7 Cálculos del método  
B 7.3.7.1 Placas que contienen entre 15 y 150 colonias características.  
Separar las placas que contienen el número antes mencionado de colonias características en dos 
diluciones consecutivas. Contar las  colonias presentes. Calcular el número de coliformes por mililitro o por 
gramo de producto, multiplicando el número de colonias por el inverso de la dilución correspondiente, 
tomando los criterios del punto B 7.2.8.1  ”Método para la Cuenta de Bacterias Ae robias en Placa.”  
B 7.3.7.2 Placas que contienen menos de 15 colonias características.  
Si cada una de las placas tiene menos de 15 colonias características, reportar el número obtenido seguido 
de la dilución correspondiente.  
B 7.3.7.3 Placas con colonias n o características.  
Si en las placas no hay colonias características, reportar el resultado como: menos de un coliforme por  
1/d por gramo, en donde d es el factor de dilución.  
B 7.3.8 Informe de la prueba  
Informar: UFC/g o mL en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35°C durante 24 ± 2h. En caso de 
emplear diluciones y no observar crecimiento, informar utilizando como referencia la dilución más baja 
utilizada, por ejemplo dilución 10 -1. En caso de no observar crecimiento en la muestra sin diluir se informa: 
"no desarrollo de coliformes por mL".  
B 7.4 Método para la determinación de Salmonella spp. en alimentos.  
B 7.4.1  Fundamento  
La presente técnica para la detección de Salmonella spp. en alimentos, describe un esquema general que 
consiste de 5 pasos  básicos:  
B 7.4.1.1  Preenriquecimiento, es el paso donde la muestra es enriquecida en un med io nutritivo no 
selectivo, que permite restaurar las células de Salmonella spp. dañadas a una condición fisiológica estable.  
B 7.4.1.2  Enriquecimiento selectivo, em pleado con el propósito de incrementar las poblaciones de 
Salmonella spp. e inhibir otros organismos presentes en la muestra.  
B 7.4.1.3  Selección en medios sólidos, en este paso se utilizan medios selectivos que restringen el 
crecimiento de otros géneros d iferentes a Salmonella spp. y permite el reconocimiento visual de colonias 
sospechosas.  
B 7.4.1.4  Identificación bioquímica, este paso permite la identificación g enérica de los cultivos de 
Salmonella spp. y la eliminación de cultivos sospechosos falsos.  
B 7.4.1.5  Serotipificación, es una técnica serológica que permite la identificación específica de un cultivo.  
B 7.4.2  Reactivos  
En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, se deben seguir las instrucciones 
impresas en la etiqueta respectiva para su preparación.  
Las sustancias químicas usadas para preparar los medios de cultivo y los reactivos deben ser grado analítico.  
B 7.4.2.1  Medios de pre -enriquecimiento  
B 7.4.2.1.1  Agua de peptona tamponada  
Ingredientes  Cantidades  
Peptona  10,0 g  
Clorur o de sodio  5,0 g  
Fosfato sódico dibásico  3,5 g  
Fosfato potásico monobásico  1,5 g  
Agua  1,0 L  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Preparación  
Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario.  
Ajustar el pH, si es necesario, después de la esterilización a 7,0.  
Distribuir en reci pientes de vidrio esterilizables con la capacidad necesaria para obtener las porciones 
necesarias para la prueba.  
Esterilizar por 20 min a 121 ± 1ºC.  
B 7.4.2.1.2  Caldo lactosado  
Ingredientes  Cantidades  
Extracto de carne  3,0 g  
Peptona  5,0 g  
Lactosa  5,0 g  
Agua destilada  1,0 g  
pH final 6,9 + 0,2 
 
Preparación  
Disolver los ingredientes en agua, calentando a 65ºC.  
Distribuir en porciones de 225 mL, en frascos de 500 mL.  
Esterilizar durante 15 min a 121ºC ± 1ºC.  
B 7.4.2.2  Medios de enriquecimiento  
B 7.4.2.2. 1 Caldo selenito -cistina  
Ingredientes  Cantidades  
Tristona o polipeptona  5,0 g  
Lactosa  4,0 g  
Fosfato disódico  10,0 g  
Selenito ácido de sodio  4,0 g  
L- cistina  0,01 g  
Agua destilada  1,0 l 
pH final 7,0 + 2 a 25 ° C  
 
Preparación  
Disolver los ingrediente s en un litro de agua destilada estéril y distribuir en volúmenes de 10 y 225 mL en 
recipientes estériles, según se requiera.  
El caldo así preparado es transparente. De preferencia usarlo el mismo día de su preparación.  
Si se desea conservar el medio por v arios días, puede exponerse al calor en autoclave por 5 min  a 110ºC 
± 1ºC, tomando entonces un color salmón.  
B 7.4.2.2.2  Caldo tetrationato  
Ingredientes  Cantidades  
Proteosa peptona o triptona  5,0 g  
Sales biliares  1,0 g  
Carbonato de calcio  10,0 g  
Tiosu lfato de sodio pentahidratado  30,0 
Agua destilada  1,0 l 
pH final 7,0 + 0,1       (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
Preparación  
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estéril.  
Distribuir, agitando constantemente, en porciones de 10 y 225 mL, en recipientes estériles. Guardar e n 
refrigeración.  
Antes de usar el medio, agregar 2 mL de una solución yodo -yoduro y 1 mL de solución de verde brillante al 
0,1% por cada 100 mL de caldo. El medio una vez adicionado de yodo no debe calentarse y debe usarse  el 
mismo día de su preparación.  
B 7.4.2.2.3  Vassiliadis -Rappaport  
Solución A  
Ingredientes  Cantidades  
Tristona  5,0 g  
Cloruro de sodio  8,0 g  
Fosfato de potasio hidrogenado  1,6 g  
Agua destilada  1,0 l 
 
 Disolver los componentes en agua por calentamiento cercano a 70ºC.  
Solución B  
Ingredientes  Cantidades  
Cloruro de magnesio hexahidratado  400 g  
Agua destilada  1,0 l 
 
Disolver el cloruro de magnesio en agua.  
Como esta sal es muy higroscópica es conveniente disolver el contenido entero de cloruro de magnesio 
desde un recipiente recientem ente abierto de tal modo que la concentración de la solución sea de 0,4 g/mL.  
Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente.  
Solución C  
Ingredientes  Cantidades  
Oxalato de verde de malaquita  0,4 g  
Agua destilada  100 mL  
 
Disolver el oxalato de verde d e malaquita en agua.  
Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente.  
Medio completo  
Ingredientes  Cantidades  
Solución A  1,000 mL  
Solución B  100 mL  
Solución C  10 mL  
 
Preparación  
Adicionar 1 000 mL de la solución A, 100 mL de la solución B y 10 mL de l a solución C.  
Ajustar el pH si es necesario, de tal manera que después de la esterilización sea de 5,2.  
Distribuir antes de usar dentro de tubos en cantidades de 10 mL.  
Almacenar en refrigeración.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 7.4.2.2.4  Caldo de soya tripticasa  
Ingredientes  Cantidade s 
Tripticasa o triptosa  17,0 g 
Fitona  3,0 g  
Glucosa  2,5 g  
Cloruro de sodio  2,5 g  
Agua destilada  1,0 g  
pH final  7,3 + 0,2 
 
Preparación  
Disolver los ingredientes en 1 litro de agua destilada, calentando lentamente hasta su disolución completa.  
Distribuir porciones de 225 mL dentro de matraces de 500 mL y esterilizar en autoclave durante 15 min  a 
121ºC ± 1ºC.  
B 7.4.2.2.5  Leche descremada reconstituida  
Suspender 100 g de leche descremada en polvo en un litro de agua destilada. Agitar circularmente has ta 
disolución. Distribuir en volúmenes de 225 mL en matraces Erlenmeyer de 500 mL. Esterilizar a 121ºC ± 1ºC 
por 15 min. El volumen final debe corregirse para mantener 225 mL.  
B 7.4.2.2.6  Caldo soya tripticasa estéril adicionado con sulfito de potasio  
Adicionar al caldo soya tripticasa 5 g de sulfito de potasio por cada 1000 mL de medio, quedando una 
concentración final de sulfito de potasio del 0,5%. Adicionar el sulfito de potasio antes de esterilizar en 
autoclave en la forma habitual.  
B 7.4.2.3 Medios de  aislamiento  
B 7.4.2.3.1  Agar verde brillante (VB)  
Ingredientes  Cantidades  
Extracto de levadura  3,0 g  
Polipeptona (proteosa peptona N° 3)  10,0 g  
Cloruro de sodio  5,0 g  
Lactosa  10,0 g  
Sacarosa  10,0 g  
Rojo de fenol  0,08 g  
Agar  20,0 g  
Verde brillante  0,0125 g  
Agua destilada  1,0 l 
pH final  6,9 ± 0,2  
 
Preparación  
Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar a ebullición, hasta disolución completa. 
Ajustar el pH.  
Esterilizar en autoclave por 15 min a 121ºC ± 1ºC. El sobrecalentam iento del medio disminuye su 
selectividad.  
Enfriar el medio a 50ºC y distribuirlo en cajas de Petri estériles. El aspecto del medio es obscuro, de color 
marrón.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 7.4.2.3.2  Agar con sulfito de bismuto  
Ingredientes  Cantidades  
Extracto de carne de res  5,0 g  
Mezcla de peptonas  10,0 g  
Glucosa  5,0 g  
Fosfato disódico (anhidro)  5,0 g  
Sulfato ferroso (anhidro)  0,3 g  
Sulfito de bismuto  8,0 g  
Verde brillante  0,025 g  
Agar  20,0 g  
Agua destilada  1,0 l 
pH final  7,6 + 0,2 
 
Preparación  
Suspender los ingredientes  en un litro de agua. Calentar hasta su disolución completa, agitando 
frecuentemente. Ajustar el pH.  
Enfriar a 45ºC y verter en cajas de Petri estériles, distribuyendo de manera homogénea el precipitado 
propio del medio.  
El aspecto de las placas es opaco, de color verde pálido y deben usarse el mismo día de su preparación. 
Si la coloración es parda, no deben utilizarse.  
El medio no debe esterilizarse en autoclave; el sobrecalentamiento afecta su selectividad.  
B 7.4.2.3.3  Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD ) 
Ingredientes  Cantidades  
Xilosa  3,75 g  
L- lisina  5,0 g  
lactosa  7,5 g  
Sacarosa  7,5 g  
Cloruro de sodio  5,0 g  
Extracto de levadura  3,0 g  
Rojo de fenol  0,08 g  
Agar  15,0 g  
Desoxocolato de sodio  2,5 g  
Citrato férrico - amónico  0,8 g  
Tiosulfato de sodi o 6,8 g  
Agua destilada  1,0 l 
pH final  6,9 + 0,2 
 
Preparación  
Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada, y calentar en baño de agua a 55ºC, agitando 
frecuentemente, hasta disolución completa. Ajustar el pH.  
Enfriar a 50ºC y verter en cajas  de Petri estériles. No se esterilice.  
El sobrecalentamiento produce una precipitación; la reactividad del medio puede ser satisfactoria, pero las 
colonias suelen ser muy pequeñas.  
El aspecto del medio es claro y de color rojo brillante.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 7.4.2.3.4  Agar p ara Salmonella  y Shigella  (SS) 
Ingredientes  Cantidades  
Extracto de carne  5,0 g  
Polipeptona  5,0 g  
Lactosa  10,0 g  
Sales biliares  8,5 g  
Citrato de sodio dihidratado  8,5 g  
Tiosulfato de sodio pentahidratado  8,5 g  
Citrato férrico  1,0 g  
Agar  13,5 g  
Rojo neutro  0,025 g  
Verde brillante  0,33 mg  
Agua destilada  1,0 L  
pH final 7,0 + 0,2 
 
Preparación  
Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada estéril y calentar a ebullición hasta disolución 
completa. Ajustar el pH. No esterilizar en autoclave.  
Enfriar a 50ºC y distribuir en cajas de Petri estériles en condiciones asépticas.  
El aspecto del medio fundido es claro y de color rosado.  
B 7.4.2.3.5  Agar entérico Hektoen  
Ingredientes  Cantidades  
Proteosa peptona  12, 0 g  
Extracto de levadura  3,0 g  
Lactosa 12,0 g  
Sacarosa  12,0 g  
Salicilina  2,0 g  
Sales biliares  9,0 g  
Cloruro de sodio  5,0 g  
Tiosulfato de sodio  5,0 g  
Citrato amónico férrico  1,5 g  
Azul de bromotimol  0,064 g  
Fascina ácida  0,1 g  
Agar  13,5 g  
Agua  1,0 L  
pH final  7,5 + 0,2 
 
Preparaci ón 
Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir con agitación hasta completa disolución del agar.  
No sobrecalentar.  
Dejar enfriar a 55 -60ºC y distribuir en cajas de Petri estériles en condiciones asépticas.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 7.4.2.4  Medios para pruebas bioquímicas  
B 7.4.2.4.1  Agar de tres azúcares y hierro (TSI)  
Ingredientes  Cantidades  
Peptona de carne  1,0 g  
Paptona de caseína  1,0 g  
Cloruro de sodio  0,5 g  
Lactosa  1,0 g  
Sacarosa  1,0 g  
Glucosa  0,1 g  
Agar  1,3 g  
Rojo de fenol  2,5 mg  
Sulfato ferroso amónico  
pentahidratado  20,0 mg  
Tiosulfato de sodio  20,0 mg  
Agua destilada  100 mL  
pH final  7,3 + 0,2 
 
Preparación  
Suspender los ingredientes en 100 mL de agua destilada. Calentar a ebullición, agitando ocasionalmente, 
hasta disolución completa.  
Enfriar a 60ºC y aj ustar el pH.  
Distribuir en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 min.  
Inclinar los tubos de manera que el medio de cultivo en el fondo alcance una altura de 3 cm y una 
profundidad de 4 cm. El medio es de color roj o. 
B 7.4.2.4.2  Agar de hierro y lisina (LIA)  
Ingredientes  Cantidades  
Peptona de gelatina  0,5 g  
Extracto de levadura  0,3 g  
Glucosa  0,1 g  
L-lisina  1,0 g  
Citrato férrico amónico  50 mg  
Tiosulfato de sodio anhidro  4,0 mg  
Púrpura de bromocresol  2,0 mg  
Agar 1,5 g  
Agua destilada  100 mL  
pH final  6,7 + 0,2 
 
Preparación  
Suspender los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien, calentar hasta ebullición con agitación  
frecuente hasta conseguir la disolución completa. Ajustar el pH.  
Distribuir en volúmen es de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm, con tapón de rosca.  
Esterilizar en autoclave a 121ºC ± 1ºC durante 12 min. Dejar que los tubos se enfríen en posición 
inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 4 cm y una superficie inclinada de 2 cm.  
El medio ya preparado es de color púrpura.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 7.4.2.4.3  Agar nutritivo  
Ingredientes  Cantidades  
Extracto de carne  3,0 g  
Peptona  5,0 g  
Agar  15,0 g  
Agua destilada  1,0 l 
pH final  6,8 + 0,2 
 
Preparación  
Suspender los ingredientes en agua. Dejar reposar de 5  a 10 min.  
Calentar a ebullición hasta disolución completa. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm, en cantidades de 1/3 
de su volumen.  
Esterilizar a 121ºC ± 1ºC por 15 min. Inclinar los tubos antes que el agar solidifique.  
B 7.4.2.4.4  Medio de SIM (para Sulfu ro, Indol y Movilidad)  
Ingredientes  Cantidades  
Extracto de carne  3,0 g  
Peptona  30,0 g  
Hierro peptonizado  0,20 g  
Tiosulfato de sodio  0,025 g  
Agua destilada  1,0 l 
pH final  7,3 + 0,2 
 
Preparación  
Suspender los ingredientes en el agua destilada, calenta r a ebullición agitando frecuentemente hasta 
lograr una disolución completa.  
Enfriar a 50ºC y ajustar el pH.  
Distribuir el medio en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave  a 121ºC ± 
1ºC durante 15 min. Se dejan enfriar los tub os en posición vertical.  
B 7.4.2.4.5  Agar citrato de Simmons  
Ingredientes  Cantidades  
Fosfato de amonio  1,0 g  
Fosfato dipotásico  1,0 g  
Cloruro de sodio  5,0 g  
Citrato de sodio  2,0 g  
Sulfato de magnesio  0,20 g  
Azul de bromotimol  0,08 g  
Agar  15,0 g  
Agua destilada  1,0 l 
pH final  6,8 + 0,2 
 
Preparación  
Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta 
lograr una disolución completa.  
Ajustar el pH.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
Distribuir el medio en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave  a 121ºC ± 
1ºC durante 15 min.  
Dejar enfriar los tubos en posición inclinada.  
B 7.4.2.4.6  Caldo MR -VP (Rojo de metilo -Voges Proskauer)  
Ingredientes  Cantidades  
Peptona  7,0 g  
Dextrosa  5,0 g  
Difosfato de potasio  5,0 g  
Agua destilada  1,0 l 
pH final  6,9 + 0,2 
 
Preparación  
Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta 
lograr una disolución completa.  
Ajustar el pH.  
Distribuir el medio en volúmenes de 3 mL en tubos de 1 3 x 100 mm y esterilizar en autoclave  a 121ºC ± 
1ºC durante 15 min.  
B 7.4.2.4.7 Caldo manitol  
Ingredientes  Cantidades  
Extracto de carne  1,0 g  
Proteosa peptona  10,0 g  
Cloruro de sodio  5,0 g  
Rojo de fenol  0,018 g  
Manitol  10,0 g  
Agua  1,0 l 
pH final  7,4 + 0,2 
 
Preparación  
Suspender 26 g del medio deshidratado en un litro de agua, mezclar y ajustar el pH.  
Distribuir en volúmenes de 2 a 3 mL en tubos de 13 x 100 mm.  
Esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 min.  
B 7.4.2.4.8 Caldo malonato  
Ingredientes  Cantida des 
Extracto de levadura  1,0 g  
Sulfato de amonio  2,0 g  
Fosfato dipotásico  0,6 g  
Fosfato monopotásico  0,6 g  
Cloruro de sodio  2,0 g  
Malonato  3,0 g  
Glucosa  0,250 g  
Azul de bromotimol  0,025 g  
Agua  1,0 l 
pH final  6,7 + 0,2 Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Preparación  
Suspender los i ngredientes en agua, mezclar y ajustar el pH.  
Distribuir en tubos de 13 x 100 mm en cantidades de 3 mL.  
Esterilizar en autoclave a 121ºC ± 1ºC durante 15 min.  
B 7.4.2.4.9  Caldo urea  
Ingredientes  Cantidades  
Urea  20,0 g  
Extracto de levadura  0,1 g  
Fosfato  monopotásico  9,10 g  
Fosfato dipotásico  9,5 g  
Rojo de fenol  0,01 g  
Agua  1,0 l 
pH final  6,8 + 0,2 
 
Preparación  
Disolver los ingredientes en agua destilada.  
NO CALENTAR. Esterilizar por filtración a través de membrana 0,45 µm o en autoclave de 5 a 8 lb  de 
presión durante 15 min.  
Distribuir asépticamente de 1,5 a 3 mL en tubos estériles de 13 x 100 mm.  
B 7.4.2.4.10  Caldo de urea rápido  
Ingredientes  Cantidades  
Urea  20, 0 g  
Extracto de levadura  0,10 g  
Fosfato monopotásico  0,091 g  
Fosfato dipotásico  0,095 g 
Rojo de fenol  0,010 g  
Agua  1,0 l 
pH final  6,8 + 0,2 
 
Preparación  
Disolver los ingredientes en agua destilada.  
NO CALENTAR. Esterilizar por filtración a través de membrana 0,45 µm.  
Distribuir asépticamente de 1,5 a 3 mL en tubos estériles de 13 x 1 00 mm.  
B 7.4.2.4.11  Caldo infusión cerebro corazón  
Ingredientes  Cantidades  
Infusión cerebro corazón  200,0 g  
Infusión de corazón de res  250,0 g  
Proteosa peptona  10,0 g  
Cloruro de sodio  5,0 g  
Fosfato disódico dodecahidratado  2,5 g  
Dextrosa  2,0 g  
Agua destil ada 1,0 l 
pH final  7,4 ± 0,2        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
Preparación  
Disolver los ingredientes en agua destilada, calentar suavemente.  
Distribuir y esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 min.  
B 7.4.2.5  Soluciones  
B 7.4.2.5.1  Solución verde brillante al 0,1% (1:1000)  
Ingrediente s Cantidades  
Verde brillante  0,1 g  
Agua destilada estéril  100,0 mL  
 
Disolver 0,1 g de verde brillante en agua destilada estéril hasta completar 100 mL.  
B 7.4.2.5.2  Solución de yodo -yoduro  
Ingredientes  Cantidades  
Cristales de yodo  6,0 g  
Yoduro de potas io 6,0 g  
Agua destilada  100,0 mL  
 
Disolver los cristales y el yoduro de potasio en agua destilada hasta completar 100 mL.  
Conservar en frasco ámbar.  
B 7.4.2.5.3  Solución salina al 0,85%  
Ingredientes  Cantidades  
Cloruro de sodio  0,85 g  
Agua destilada  100,0 mL  
 
Disolver el cloruro de sodio en el agua y esterilizar a 121°C ± 1°C durante 15 min.  
B 7.4.2.5.4  Solución salina formalizada  
Ingredientes  Cantidades  
Solución de formaldehído (36 -38%) 6,0 mL  
Cloruro de sodio  8,5 g  
Agua destilada  1,0 L  
 
Disolver 8 ,5 g de cloruro de sodio en 1 litro de agua destilada. Esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 min.  
Enfriar a temperatura ambiente. Adicionar 6 mL de la solución de formaldehído. No esterilizar después de 
la adición de formaldehído.  
B 7.4.2.5.5  Reactivo de Ko vac 
Ingredientes  Cantidades  
p-dimetil -aminobenzaldehído  5,0 g  
Alcohol amílico  75,0 mL  
Acido clorhídrico concentrado  25,0 mL  
 
Disolver el p -dimetil -aminobenzaldehído en el alcohol amílico y después agregar el ácido clorhídrico 
lentamente. Conservar en f rasco ámbar en refrigeración.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 7.4.2.5.6 Solución de alfa -naftol al 5%  
Ingredientes  Cantidades  
Alfa-naftol  5,0 g  
Alcohol  100,0 mL  
 
Disolver 5 g de alfa -naftol en alcohol hasta completar 100 mL.  
B 7.4.2.5.7 Solución de rojo de metilo  
Ingredientes  Cantid ades  
Rojo de metilo  0,10 g  
Alcohol etílico  300,0 mL  
Agua destilada c.b.p.  500,0 mL  
 
Disolver el rojo de metilo en el alcohol etílico y adicionar agua hasta completar 500 mL.  
B 7.4.2.5.8 Solución de hidróxido de potasio al 40%  
Ingredientes  Cantidades  
Hidróxido de potasio  40,0 g  
Agua destilada  100,0 mL  
 
Disolver 40 g de hidróxido de potasio en agua hasta completar 100 mL.  
B 7.4.2.5.9  Solución de gelatinasa al 5%  
Ingredientes  Cantidades  
Gelatinasa  5,0 g  
Agua  100,0 mL  
 
Disolver 5 g de gelatinasa en 1 00 mL de agua destilada. NO CALENTAR.  
B 7.4.2.6 Antisueros  
B 7.4.2.6.1 Antisuero polivalente somático (O)  
B 7.4.2.6.2 Antisuero polivalente flagelar (H)  
B 7.4.2.6.3 Antisuero Vi  
B.7.4.3 Material  
B 7.4.3.1 Matraces Erlenmeyer de 500 mL  
B 7.4.3.2  Recipientes  de boca ancha, de capacidad apropiada para contener las muestras simples  y 
compuestas  
B 7.4.3.3 Angulos de vidrio  
B 7.4.3.4 Cucharas, bisturíes, cuchillos y pinzas  
B 7.4.3.5 Tubos de ensaye de 16 x 150 mm y de 20 x 100 mm  
B 7.4.3.6 Tubos para serología d e 10 x 75 mm o de 13 x 100 mm  
B 7.4.3.7  Pipetas bacteriológicas de 10,0 y 5,0 mL, graduadas en 0,1 mL y protegidas con tapón  de 
algodón  
B 7.4.3.8  Pipetas de 1 mL, con graduaciones de 0,01 mL  
B 7.4.3.9  Cajas de Petri estériles de vidrio o desechables  
B 7.4 .3.10  Rejillas para tubos de ensaye  
B 7.4.3.11  Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de diámetro  
B 7.4.3.12  Papel pH (intervalo de 6 -8) con graduaciones máximas de 0,4 unidades de pH para cambios  
de color        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 7.4.3.13  Todo el material que tenga contacto con las muestras bajo estudio debe esterilizarse mediante:  
B 7.4.3.14  Horno, durante 2 horas a 170 -175ºC o autoclave, durante 15 min como mínimo a 121ºC ± 1ºC  
B 7.4.4 Equipo  
B 7.4.4.1  Horno para esterilizar que alcance los 180ºC  
B 7.4.4.2  Incubado ra con termostato para evitar variaciones mayores de ± 0,1ºC y termómetro  
B 7.4.4.3  Autoclave con termómetro o manómetro, probado con termómetro de máximas  
B 7.4.4.4  Baño María con termostato y termómetro  
B 7.4.4.5  Balanza granataria con sensibilidad de 0, 1 g 
B 7.4.4.6  Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato, con vasos esterilizables (vidrio 
o aluminio)  
B 7.4.4.7  Mecheros Bunsen o Fisher  
B 7.4.4.8  Potenciómetro  
B.7.4.5  Procedimiento  
Los siguientes métodos se basan en el análisis de 25  g de la muestra analítica en una proporción de 1:9 
de muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporción. Se 
recomienda una muestra de 25 g o más.  
B 7.4.5.1 Procedimiento general para la preparación de muestras  
B 7.4.5 .1.1 Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso estéril de licuadora o en bolsa estéril para 
trabajar en homogeneizador peristáltico (stomacher). Adicionar 225 mL del medio de preenriquecimiento 
estéril (generalmente caldo lactosado, a menos que se indique otro) y licuar si es necesario durante un min.  
B 7.4.5.1.2  Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con 
tapón de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezcl ar bien y 
determinar el pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6,8 ± 0,2 con hidróxido de sodio 
1N o ácido clorhídrico 1N estériles. Mezclar y cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa. Incubar  24 
± 2 h a 35ºC. Continuar co mo se indica en el punto i) del numeral 7.4.5.2  
B 7.4.5.2 Aislamiento de Salmonella  
B 7.4.5.2.1 Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y 
agitar suavemente, transferir respectivamente 1 mL de la mezcla a u n tubo que contenga 10 mL de caldo 
tetrationato y a otro con 10 mL de caldo selenito cistina. Como alternativa, en sustitución del caldo tetrationato 
puede emplearse el medio Vassiliadis -Rappaport.  
B 7.4.5.2.2 Incubar de 18 a 24 h a 35ºC o, para alimentos fuertemente contaminados a 42ºC por el mismo 
periodo. Estriar los productos que fueron directamente enriquecidos en medios selectivos.  
B 7.4.5.2.3  Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), 
agar verde bri llante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios selectivos adicionales (agar entérico 
Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS). Efectuar el mismo procedimiento para el caldo tetrationato. 
Incubar las placas 24 ± 2 h a 35ºC.  
B 7.4.5.2.4 Exami nar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella, de acuerdo 
con las siguientes características:  
B 7.4.5.2.5  Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En 
algunos casos las colonias pu eden aparecer completamente negras.  
B 7.4.5.2.6  Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; 
las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas.  
B 7.4.5.2.7  Agar entérico Hektoen: colonias verdes  o azulverdes con o sin centro negro. En algunos casos 
las colonias pueden aparecer completamente negras.  
B 7.4.5.2.8  Agar Sulfito de Bismuto: las colonias típicas de Salmonella pueden ser cafés, grises o negras; 
con o sin brillo metálico. Generalmente el medio circundante (halo) es café, tornándose posteriormente negro. 
Algunas cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscuro. Si las placas no muestran colonias 
típicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales.  
B 7.4.5.2.9  Agar S S: colonias translúcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. 
Las colonias fermentadoras de la lactosa son rojas.  
B 7.4.5.3 Identificación bioquímica  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 7.4.5.3.1 Seleccionar al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que s e encuentren bien 
aisladas. Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular dos tubos, uno con agar triple azúcar hierro 
(TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), por estría en la superficie inclinada y por punción en el fondo. Incubar 
por 24 ± 2 h a  35ºC. Almacenar en refrigeración de 5 a 8ºC las placas con medios selectivos por si es 
necesario retomar más colonias. Observar el crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente positivas 
para Salmonella las colonias que den las siguientes reaccion es: 
B 7.4.5.3.2 Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentación de la 
glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo más intenso que el medio original debido a la no 
fermentación de la lactosa ni de la sa carosa. En la mayoría de los casos se observa coloración negra a lo 
largo de la punción debido a la producción de ácido sulfihídrico.  
B 7.4.5.3.3 Agar LIA, se observa intensificación del color púrpura en todo el tubo por la descarboxilación 
de la lisina. C onsiderar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo en el fondo del 
agar. La mayoría de las cepas de Salmonella  spp. producen ácido sulfihídrico en este medio con 
ennegrecimiento a lo largo de la punción.  
B 7.4.5.3.4 Retener todos  los cultivos que muestren las reacciones características de Salmonella en los 
medios TSI y LIA para las pruebas adicionales, indicadas en el punto B.7.4.5.3.5.  
B 7.4.5.3.5 Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones en LIA 
típicos, deben trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio LIA permitirá 
detectar S. arizonae y cepas atípicas de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los 
cultivos que muestren reacciones a típicas en ambos medios.  
B 7.4.5.3.6 Continuar el análisis a partir de los tubos de TSI con reacciones típicas. Si el cultivo presenta 
reacciones atípicas en este medio, tomar colonias adicionales de las placas de donde se obtuvo el cultivo 
atípico anterio r y sembrar las pruebas bioquímicas nuevamente.  
B 7.4.5.3.7 Continuar la identificación bioquímica y serológica a partir de los cultivos recuperados de TSI. 
Se recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analítica seleccionando colonias proce dentes de 
ambos medios de enriquecimiento.  
B 7.4.5.3.8 Prueba de ureasa  
B 7.4.5.3.8.1 Prueba de ureasa (convencional).  
Con un  asa estéril, tomar crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e 
inocular tubos de caldo urea. Util izar un control de medio para comparar el vire púrpura de las reacciones 
positivas con el color del medio original. Incubar 24 ± 2 h a 35ºC.  
B 7.4.5.3.8.2 Prueba de ureasa (rápida). Tomar dos asadas de crecimiento del cultivo presumiblemente 
positivo de ca da tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea (rápida). Incubar 2 h a 37 ± 0,5ºC en baño 
de agua.  
B 7.4.5.3.8.3  Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Retener los cultivos que den la prueba 
negativa (sin cambio de color del medio).  
B 7.4.5.4 . Identificación serológica  
B 7.4.5.4.1 Ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella (Antisuero polivalente O)  
B 7.4.5.4.1.1 Colocar con una asa dos gotas separadas de solución salina estéril sobre un portaobjetos o 
en dos secciones de una placa p ara aglutinación. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo 
desarrollado en TSI.  
B 7.4.5.4.1.2 Agregar a una de ellas una gota del antisuero polivalente somático (O) y mezclar con el 
canto del asa o empleando aplicadores de madera.  
B 7.4. 5.4.1.3 Agitar inclinando la lámina hacia atrás y hacia adelante durante aproximadamente un min.  
Observar bajo buena iluminación sobre un fondo oscuro.  
B 7.4.5.4.1.4 Considerar cualquier grado de aglutinación como positiva.  
La prueba positiva resulta cuand o se presenta aglutinación en la gota con el cultivo y el antisuero y no 
aglutinación en la gota que contiene el cultivo y la solución salina. Si se observa aglutinación en ambas gotas, 
la prueba no es definitiva y se debe continuar con las pruebas bioquím icas complementarias.  
B 7.4.5.4.1.5 Cuando la aglutinación es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el 
subgrupo empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los más 
frecuentes).  
B 7.4.5.4.1.6 Si la aglutinación con el antisuero O es negativa, utilizar antisuero Vi y efectuar la prueba. Si 
hay aglutinación con Vi calentar el cultivo a ebullición y repetir la aglutinación con el antisuero polivalente O.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 7.4.5.4.1.7 Si no se cuenta con los sueros gr upoespecíficos, solicitar la tipificación de la cepa al 
Laboratorio de Enterobacterias del Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia de la Secretaría de Salud  o 
al Laboratorio Nacional de Salud Pública.  
B 7.4.5.4.2 Si se requiere, practicar el ensayo de  los antígenos flagelares de Salmonella (Antisuero 
polivalente H).  
B 7.4.5.4.2.1 Inocular el crecimiento del tubo de TSI en agar infusión de cerebro corazón e incubar de 4 a 
6 h a 35ºC hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el mismo día), o  bien,  en caldo soya 
tripticaseí na e incubar por 24 ± 2 h a 35ºC (para ensayo al día siguiente). Adicionar 2,5 mL de solución salina 
formalizada a 5 mL del cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazón (BHI).  
B 7.4.5.4.2.2 Colocar 0,5 mL del antisuero po livalente flagelar (H) preparado en un tubo para serología (13 
x 100 mm aproximadamente). Adicionar 0,5 mL del cultivo formalizado. Preparar un control de solución salina 
mezclando 0,5 mL de solución salina formalizada con 0,5 mL del antígeno formalizado. Incubar las mezclas en 
baño de agua a 48 -50ºC. Observar a intervalos de 15 min por espacio de una h. Una prueba positiva es 
cuando se observa aglutinación en la mezcla de prueba pero no en el control. Debe interpretarse como  
negativa una prueba en la que n inguna de las mezclas muestre aglutinación. Cuando ambas mezclas se 
aglutinan, se considera la prueba inespecífica.  
B 7.4.5.5 Pruebas bioquímicas complementarias  
Cuando las pruebas serológicas o bioquímicas iniciales, dan resultados atípicos o no concluyen tes, 
realizar las pruebas que se describen a continuación. Inocular los cultivos positivos provenientes de TSI y LIA 
en: medio SIM, agar citrato de Simmons, caldo manitol y caldo RM -VP. Usar caldo malonato para confirmar la 
presencia de la especie S. arizo nae. 
Interpretar los cambios en los medios inoculados conforme lo siguiente:  
B 7.4.5.5.1 Agar citrato Simmons  
Inocular por estría el tubo.  
Incubar 96 ± 2 h a 35 ± 2ºC.  
Prueba positiva: crecimiento acompañado de un cambio de color de verde a azul.  
Prueba ne gativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color.  
B 7.4.5.5.2 Medio SIM  
Inocular por punción.  
Incubar 24 h a 35 ± 2ºC.  
B 7.4.5.5.2.1  Movilidad.  
Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la punción y en el seno del medio de cultivo.  
Prueba negativa: c recimiento a lo largo de la punción exclusivamente.  
B 7.4.5.5.2.2  Producción de ácido sulfihídrico.  
Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la punción que puede extenderse a todo  el 
medio.  
Prueba negativa: ausencia de color negro.  
B 7.4.5.5.2.3  Producción de indol  
Adicionar al tubo con medio SIM que presente crecimiento de 0,2 a 0,3 mL de reactivo de Kovac.  
Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color rojo.  
Prueba negativa: sin cambio de color.  
B 7.4.5.5.3 Caldo RM -VP 
Inocular un t ubo con el medio.  
Incubar 48 ± 2 h a 35 ± 2ºC para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM.  
B 7.4.5.5.3.1 Prueba de Voges -Proskauer (VP)  
Transferir a un tubo un mL del cultivo de 48 h.  
Adicionar 0,6 mL de solución de alfa naftol.  
Adicionar 0,2 mL de soluc ión de hidróxido de potasio 40%.  
Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional).  
Interpretar los resultados después de incubar 2 h a 35 ± 2ºC o 4 h a temperatura ambiente.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo.  
Prueba negativa: sin cambi o de color.  
Reincubar el resto del medio RM -VP 48 h más a 35 ± 2ºC.  
B 7.4.5.5.3.2 Prueba de rojo de metilo (RM)  
Adicionar al medio de cultivo de 96 h de incubación de dos a tres gotas de solución de rojo de metilo.  
Interpretar los resultados inmediatamente . 
Prueba positiva: desarrollo de color rojo.  
Prueba negativa: desarrollo de color amarillo.  
B 7.4.5.5.4 Caldo malonato  
Inocular un tubo conteniendo el medio.  
Incubar 40 ± 2 h a 35 ± 2ºC.  
Prueba positiva: desarrollo de color azul.  
Prueba negativa: sin cambi o de color.  
B 7.4.5.5.5 Caldo manitol  
Inocular un tubo conteniendo el medio.  
Incubar 24 ± 2 h a 35 ± 2ºC.  
Prueba positiva: desarrollo de color amarillo.  
Prueba negativa: sin cambio de color.  
B 7.4.5.5.6 Consultar los resultados obtenidos en el cuadro 2 par a la identificación de los géneros de las 
bacterias investigadas.  
Nota:  los sistemas bioquímicos comerciales validados pueden ser usados como alternativa para las 
pruebas bioquímicas convencionales.  
B 7.4.6 Cálculo y expresión de resultados  
B 7.4.6.1 Interpretación de reacciones bioquímicas y serológicas.  
CUADRO 1  
Reacciones bioquímicas  Reacciones serológicas  Interpretación  
Típica Antígeno O, Vi o H positivo  Cepas consideradas   como 
Salmonella spp. Típica Todas las reacciones negativas  
Típica  No probada  Puede ser Salmonella  
Reacciones atípicas  Antígeno O, Vi o H positivo  
Reacciones atípicas  Todas las reacciones negativas  No debe ser considerada   
Salmonella  
Nota: ver figura 1  
CUADRO 2  
Prueba o sustrato  Positivo  Negativo  Reacción  
Glucosa (TSI)  Amarill o Rojo + 
Lisina descarboxilasa (LIA)  Púrpura  Amarillo  + 
H2S (TSI y LIA)  Negro  No negro  + 
Ureasa  Rojo-púrpura  No hay cambio de color  - 
Caldo de lisina descarboxilasa  Púrpura  Amarillo  + 
Caldo dulcitol rojo de fenol  Amarillo o gas  No hay cambio de color ni gas  + b 
Caldo KCN  Crecimiento  No hay crecimiento  - 
Caldo malonato  Azul No hay cambio de color  - c 
Prueba de indol  Superficie color violeta  Superficie color amarillo  - 
Prueba del antígeno flagelar  Aglutinación  No hay aglutinación  +       (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
Prueba del antíge no somático  Aglutinación  No hay aglutinación  + 
Caldo lactosa rojo fenol  Amarillo o gas  No hay cambio de color ni gas  - c 
Caldo sacarosa rojo fenol  Amarillo o gas  No hay cambio de color ni gas  - 
Prueba Voges -Proskauer  De rosa a rojo  No hay cambio de colo r - 
Prueba rojo de metilo  Rojo difuso  Amarillo difuso  + 
Citrato de Simmons  Crecimiento color azul  No hay crecimiento, no hay 
cambio de color  v 
a +, 90% o más positivos en 1 o 2 días; -, 90% o más negativas en 1 o 2 días; v, variable.  
b La mayoría de los  cultivos S. arizonae son negativos.  
c La mayoría de los cultivos S. arizonae son positivos.  
B 7.4.6.2  Informe de resultados  
Informar: presencia o ausencia de Salmonella spp. en __________ g o ____________ mL de muestra.  
 
 
 
B 7.5 Determinación de bacteria s coliformes.  
Técnica del número más probable  
B 7.5.1 Fundamento  
El método se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a 35 ± 1°C durante 24 
a 48 horas, resultando una producción de ácidos y gas el cual se manifiesta en las camp anas de 
fermentación.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 7.5.2 Reactivos  
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico. Cuando se indique agua debe 
entenderse como agua destilada con pH cercano a la neutralidad.  
B 7.5.2.1 Soluciones diluyentes  
B 7.5.2.1.1  Solució n reguladora de fosfatos (solución concentrada)  
Ingredientes  Cantidades  
Fosfato monopotásico  34,0 g  
Agua  1,0 l 
 
Preparación:  
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1 N.  
Llevar a un litro con agua.  
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0°C.  
Conservar en refrigeración (solución concentrada).  
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a un litro con agua.  
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera.  
Esteriliz ar durante 15 minu tos a 121 ± 1 °C. 
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales  a 
los iniciales.  
B 7.5.2.1.2  Agua peptonada  
Ingredientes  Cantidades  
Peptona  1,0 g  
Cloruro de sodio  8,5 g  
Agua  1,0 l 
 
Preparación : 
Disolver los componentes en un litro de agua.  
Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1 N.  
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera.  
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0°C.  
Después de la  esterilización los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los 
iniciales. Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar obscur o a una temperatura entre 
0 a 5 °C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tal es que no alteren su volumen o composición.  
B 7.5.2.2 Medios de cultivo.  
Caldo lactosado (medio de enriquecimiento para agua potable y hielo).  
Caldo lauril sulfato triptosa (medio de enriquecimiento selectivo).  
Caldo lactosa bilis verde brillante (medio de  confirmación).  
En el caso del análisis de agua potable y hielo puede utilizarse caldo lactosado o caldo lauril sulfato 
triptosa con púrpura de bromocresol (concentración 0,01 g/l de medio), como alternativa al uso de campanas 
de fermentación. Los tubos po sitivos se manifiestan por el vire del indicador a color amarillo.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 7.5.2.2.1  Caldo lactosado  
CUADRO 1  
Ingredientes  Medio de concentración  
1,5 Medio de concentración  
sencilla  
Extracto de carne  4,5 g  3,5 g  
Peptona de gelatina  7,5 g  5,0 g  
Lactosa  7,5 g  5,0 g 
Agua destilada  1000 mL  1000 mL  
 
Disolver los ingredientes en 1 l de agua, calentando si es necesario o el medio completo deshidratado, 
siguiendo las instrucciones del fabricante.  
Ajustar el pH final de tal manera que después de la esterilización ést e sea de 6,9 ± 0,2 a 25°C.  
Distribuir en volúmenes de 10 mL en tubos con dimensiones de 16 x 160 mm el medio de concentración 
sencilla y de 20 mL en tubos de 20 x 200 mm el medio de concentración 1,5, cada tubo debe tener campana 
de fermentación.  
Esteriliz ar en autoclave por 15 minutos a 121 ± 1,0°C.  
Enfriar rápidamente para evitar una exposición excesiva al calor. El aspecto del caldo es claro y de  color 
beige.  
Se puede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 mL  del 
caldo preparado, cuando se agreguen 10 mL de la muestra.  
B 7.5.2.2.2  Caldo lauril sulfato triptosa.  
CUADRO 2  
Ingredientes  Medio de concentración 1,5  Medio de concentración 
sencilla  
Triptosa  30 g 20 g 
Lactosa  7,5 g  5,0 g  
Fosfato dipotásico  4,125 g  2,75 g  
Fosfato monopotásico  4,125 g  2,75 g  
Cloruro de sodio  7,5 g  5,0 g  
Laurel sulfato de sodio  0,15 g  0,1 g  
Agua destilada  1000 mL  1000 mL  
 
Disolver los componentes en 1 l de agua, calentando si es necesario o el medio de cultivo completo 
deshidratado , siguiendo las instrucciones del fabricante.  
Ajustar el pH de tal manera que después de la esterilización éste sea de 6,8 ± 0,2 a 25°C.  
Distribuir en volúmenes de 10 mL en tubos con dimensiones de 16 x 160 mm el medio de concentración 
sencilla y de 20 mL en tubos de 20 x 200 mm el medio de concentración 1,5, cada tubo debe tener campana 
de fermentación.  
Esterilizar en autocl ave por 15 minutos a 121 ± 1,0 °C. 
Se recomienda almacenar el medio una vez preparado.  
Las campanas de fermentación no deben de contene r burbujas de aire después de la esterilización.  
Se puede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 mL de 
caldo preparado, cuando se agreguen 10 mL de muestra.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 7.5.2.2.3  Caldo lactosa bilis verde brillante  
Ingred ientes  Cantidades  
Peptona  10,0 g  
Lactosa  10,0 g  
Sales biliares  20,0 g  
Verde brillante  0,013 g  
Agua  1,0 L  
 
Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en agua, calentar si es necesario. Ajustar el 
pH, de tal manera que después de la este rilización éste sea de 7,2 a 25°C.  
Distribuir el medio en cantidades de 10 mL en tubos de 16 X 160 mm conteniendo campana de 
fermentación. Esterilizar en autoc lave por 15 minutos a 121 ± 1,0 °C. 
Las campanas de fermentación no deben contener burbujas de air e después de la esterilización.  
B 7.5.2.3 Materiales  
B 7.5.2.3.1  Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 11 y 2 mL), con tapón  
de algodón.  
B 7.5.2.3.2  Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su  volumen total.  
B 7.5.2.3.3  Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca.  
B 7.5.2.3.4  Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, 
espátulas, etc.  
B 7.5.2.3.5  Tubos de cultivo 20 x 200 mm y de 16 x 160 mm  con tapones metálicos o de rosca.  
B 7.5.2.3.6  Campanas de fermentación (tubos de Durham).  
B 7.5.2.3.7  Pipetas bacteriológicas graduadas de 10 y 1 mL.  
B 7.5.2.3.8  Gradillas.  
B 7.5.2.3.9  Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de diámetro.  
B 7.5.2 .3.10  Todo el material que tenga contacto con las muestras bajo estudio debe  esterilizarse 
mediante:  
B 7.5.2.3.11  Horno, durante 2 horas a 170 a 175°C o 1 h a 180°C o autoclave, durante 15 minutos como 
mínimo a 121 ± 1,0 °C. 
B 7.5.2.3.12  El material de vidr io puede sustituirse por material desechable que cumpla con las 
especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por las esterilizaciones repetidas y éste 
debe ser químicamente inerte.  
B 7.5.2.4  Aparatos e instrumentos  
B 7.5.2.4.1  Horno para esterilizar que alcanc e una temperatura mínima de 170 °C. 
B 7.5.2.4.2  Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1,0°C, provista con termómetro 
calibrado.  
B 7.5.2.4.3  Termómetro de máximas y mínimas.  
B 7.5.2.4.4  Autoclave que alcance una temperatura mínima de 121 ± 1,0 °C. 
B 7.5.2.4.5  Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25°C.  
B 7.5.2.5 Preparación de la muestra  
Seguir el procedimiento como lo indica el punto B.7.1 “Procedimiento para la preparación y dilución de 
muestras de alimentos para su análisis microbiológicos” . 
B 7.5.2.6 Procedimiento  
B 7.5.2.6.1 Para agua potable y hielo  
B 7.5.2.6.1.1 Prueba presuntiva        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 7.5.2.6.1.1.1  Inoculación. Agitar la muestra. Transferir volúmenes de 10 mL de muestra a cada uno de 5 
tubos con 20 mL de caldo lactosado de mayor concentración y 1,0 mL y 0,1 mL de muestra a cada uno de los 
tubos de las series de 5 respectivamente con 10 mL de caldo lactosado de concentración sencilla o caldo 
laurel sulfato triptosa con púrpura de bromocre sol. 
B 7.5.2.6.1.1.2  Incubación. Incubar los tubos a 35 °C. Examinar a las 24 ± 2 h y observar si hay formación 
de gas o la formación de gas no se observa en este tiempo, incubar por 48 ± 2 h.  
B 7.5.2.6.1.2 Prueba confirmativa  
De cada tubo que muestre forma ción de gas, tomar una azada y sembrar en un número igual de tubos con 
medio de confirmación, caldo lactosa lauril bilis verde brillante. Incubar a 35 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas o si la 
formación de gas no se observa en este tiempo, incubar por 48 ± 2 horas . 
En esta Norma Oficial Mexicana, para el análisis de agua potable, agua purificada así como hielo, se 
emplea la serie de 5 tubos inoculados, 5 tubos con 10 mL, 5 tubos c on 1 mL y 5 tubos con 0,1 mL, véa se el 
cuadro 4.  
B 7.5.2.6.2 Para sólidos.  
Preparar su ficiente número de diluciones para asegurar que todos los tubos correspondientes a la última 
dilución rindan un resultado negativo.  
B 7.5.2.6.2.1 Prueba presuntiva  
B 7.5.2.6.2.1.1  Inoculación. Tomar tres tubos de medio de enriquecimiento de mayor concentra ción. Usar 
una pipeta  estéril para tran sferir a cada tubo 10 mL de la muestra si es líquida o 10 mL de la dilución primaria 
inicial, en el caso de otros productos.  
B 7.5.2.6.2.1.2 Tomar tres tubos de concentración sencilla del medio selectivo de enriquecim iento. Usar 
una pipeta estéril para transferir a cada uno de estos tubos 1 mL de la muestra si es líquida o 1 mL de la 
dilución primaria en el caso de otros productos.  
B 7.5.2.6.2.1.3  Para las diluciones subsecuentes, continuar como se indica en el párrafo  anterior, usando 
una pipeta diferente para cada dilución. Mezclar suavemente el inóculo con el medio.  
B 7.5.2.6.2.1.4  Incubación. Incubar los tubos a 35 ± 0,5°C por 24 ± 2 horas y observar si hay formación de 
gas, en  caso contrario prolongar la incubación  hasta 48 ± 2 horas.  
B 7.5.2.6.2.2 Prueba confirmativa  
De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una azada y sembrar en un número igual de tubos con 
medio de confirmación. Incubar a 35 ± 0,5°C por 24 ± 2 horas o si la formación de gas no se observa en este 
tiempo, prolongar la incubación por 48 ± 2 horas.  
En esta Norma Oficial Mexicana se considera una combinación de tres tubos por cada dilución de la serie. 
Para algunos productos y siempre que se requiera una mayor precisión en los resultados, será necesario 
inocular una serie de cinco o diez tubos.  
B 7.5.2.7 Expresión de los resultados  
Tomar la serie de tubos de la prueba confirmativa que dé formación de gas después del periodo de 
incubación requerido y buscar el NMP en los cuadros correspondientes.  
B 7.5.2.7.1 El cuadro 3 muestra algunos ejemplos que se pueden presentar.  
Ejemplos: Ejemplo 1. Cuando sólo una dilución muestra tres tubos positivos, elegir ésta y las diluciones 
mayores posteriores.  
B 7.5.2.7.2 Ejemplo 2. Cuando más de una dilución muest ra tres tubos positivos y la última da menos de 
tres, elegir esta última y las dos diluciones anteriores más bajas.  
B 7.5.2.7.3 Ejemplo 3. Cuando en ninguna dilución hay tres tubos positivos y éstos se encuentran en más 
de tres diluciones, seleccionar las dos diluciones mayores positivas y la siguiente.  
B 7.5.2.7.4  Ejemplos 4 y 5. Cuando los tubos positivos sólo se encuentran en la muestra sin diluir (10 mL o 
1 g) y en la primera dilución (1 mL o 10 -1 g), seleccionar las tres primeras diluciones para el cál culo del 
número más probable. En cada caso se obtiene un número de tres cifras, lo cual es representado en los 
cuadros 4 al 7, según corresponda. En la columna que indica el número de tubos positivos se busca el índice 
del NMP. La técnica de NMP puede admi tir gran cantidad de variaciones. Los resultados obtenidos con esta 
técnica deben ser utilizados con precaución. Los límites de confianza están representados en los cuadros 4 al 
7. Por ejemplo, para una muestra sólida con un NMP de 70 coliformes por gramo,  los límites de confianza en 
el 95% de los casos variarán de 10 a 230 coliformes por gramo (ejemplo 3 del cuadro 3) y en un producto con 
24 de NMP de coliformes por gramo, los límites de confianza son de 3,6 a 130 coliformes por gramo (ejemplo 
2 cuadro 3).  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
 
CUADRO 4. Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados varios números de tubos.  
(Diluciones 10, 1,0 y 0,1 g)  
Combinación de 
positivos  Indice del 
NMP por g  3 tubos por dilución   95% 
límites  de confianza  5 tubos por 
dilución  
Indice del 
NMP por g  95% límites de confianza  
bajo alto bajo alto 
0-0-0 <0,03  <0,005  <0,09  <0,02  <0,005  <0,07  
0-0-1 0,03 <0,005  <0,09  0,02 <0,005  0,07 
0-1-0 0,03 <0,005  0,13 0,02 <0,005  0,07 
0-2-0 -- -- -- 0,04 <0,005 0,11 
1-0-0 0,04 <0,005  0,20 0,02 <0,005  0,07 
1-0-1 0,07 0,01 0,21 0,04 <0,005  0,11 
1-1-0 0,07 0,01 0,23 0,04 <0,005  0,11 
1-1-1 0,11 0,03 0,36 0,06 <0,005  0,15 
1-2-0 0,11 0,03 0,36 0,06 <0,005  0,15 
2-0-0 0,09 0,01 0,36 0,05 <0,005  0,13 
2-0-1 0,14 0,03 0,37 0,07 0,01 0,13 
2-1-0 0,15 0,03 0,44 0,07 0,01 0,17 
2-1-1 0,20 0,07 0,89 0,09 0,02 0,17 
2-2-0 0,21 0,04 0,47 0,09 0,02 0,21 
2-2-1 0,28 0,10 1,50 -- -- 0,21 
2-3-0 -- -- -- 0,12 0,03 -- 
3-0-0 0,23 0,04 1,20 0,08 0,01 0,28 
3-0-1 0,39 0,07 1,3 0,11 0,02 0,19 
3-0-2 0,64 0,15 3,80 -- -- -- 
3-1-0 0,43 0,07 2,1 0,11 0,02 0,25 
3-1-1 0,75 0,14 2,3 0,14 0,04 0,34 
3-1-2 1,20 0,30 3,3 -- -- -- 
3-2-0 0,93 0,15 3,80 0,14 0,04 0,34 
3-2-1 1,50 0,30 4,40 0,17 0,05 0,46 
3-2-2 2,10 0,35 4,70 -- -- -- 
3-3-0 2,40 0,36 13,0 -- -- --       (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
3-3-1 4,60 0,71 24,0 -- -- -- 
3-3-2 11,0 1,50 48,0 -- -- -- 
3-3-3 >11,0  >1,50  >48 -- -- -- 
4-0-0 ---   0,13 0,03 0,31 
4-0-1 ---   0,17 0,05 0,46 
4-1-0 ---   0,17 0,05 0,46 
4-1-1 ---   0,21 0,07 0,63 
4-1-2 ---   0,26 0,09 0,78 
4-2-0 ---   0,22 0,07 0,,67  
4-2-1 ---   0,26 0,09 0,78 
4-3-0 ---   0,27 0,09 0,80 
4-3-1 ---   0,33 0,11 0,93 
4-4-0 ---   0,34 0,12 0,93 
5-0-0 ---   0,23 0,07 0,70 
5-0-1 ---   0,31 0,11 0,89 
5-0-2 ---   0,43 0,15 1,14 
5-1-0 ---   0,33 0,11 0,93 
5-1-1 ---   0,46 0,16 1,2 
5-1-2 ---   0,63 0,21 1,5 
5-2-0 ---   0,49 0,17 1,3 
5-2-1 ---   0,70 0,23 1,7 
5-2-2 ---   0,94 0,28 2,2 
5-3-0 ---   0,79 0,25 1,9 
5-3-1 ---   1,10 0,31 2,5 
5-3-2 ---   1,4 0,37 3,4 
5-3-3 ---   1,80 0,44 5,0 
5-4-0 ---   1,30 0,35 3,0 
5-4-1 ---   1,70 0,43 4,9 
5-4-2 ---   2,20 0,57 7,0 
5-4-3 ---   2,80 0,90 8,5 
5-4-4 ---   3,50 1,20 10,0 
5-5-0 ---   2,40 0,68 7,5 
5-5-1 ---   3,50 1,60 10,0 
5-5-2 ---   5,40 1,80 14,0 
5-5-3 ---   9,20 3,0 32,0 
5-5-4 ---   16,09  6,40 58,0 
5-5-5 ---   -- -- -- 
 
CUADRO 5. Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados varios números de tubos.  
(Diluciones 1,0, 0,1 y 0,01 g)  
Combinación de 
positivos  Indice del 
NMP por g  3 tubos por dilución   95% 
límites de confianza  5 tubos por 
dilución  
Indice del 
NMP por g  95% límites de confianza  
  bajo alto  bajo alto 
0-0-0 <0,3 <0,05  <0,9 <0,2 <0,05  <0,7 
0-0-1 0,3 <0,05  <0,9 0,2 <0,05  0,7 
0-1-0 0,3 <0,05  1,3 0,2 <0,05  0,7 
0-2-0 -- -- -- 0,4 <0,05  0,11 
1-0-0 0,4 <0,05  2,0 0,2 <0,05  0,7 
1-0-1 0,7 0,1 2,0 0,4 <0,05  1,1 
1-1-0 0,7 0,1 2,3 0,4 <0,05  1,1 
1-1-1 1,1 0,3 3,6 0,6 <0,05  1,5 Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
1-2-0 1,1 0,3 3,6 0,6 <0,05  1,5 
2-0-0 0,9 0,1 3,6 0,5 <0,05  1,3 
2-0-1 1,4 0,3 3,7 0,7 0,1 1,7 
2-1-0 1,5 0,3 4,4 0,7 0,1 1,7 
2-1-1 2,0 0,7 8,9 0,9 0,2 2,1 
2-2-0 2,1 0,4 4,7 0,9 0,2 2,1 
2-2-1 2,8 1,0 15,0 -- -- -- 
2-3-0 -- -- -- 1,2 0,3 2,8 
3-0-0 2,3 0,4 12,0 0,8 0,1 1,9 
3-0-1 3,9 0,7 13,0 1,1 0,2 2,5 
3-0-2 6,4 1,5 38,0 -- -- -- 
3-1-0 4,3 0,7 21,0 1,1 0,2 2,5 
3-1-1 7,5 1,4 23,0 1,4 0,4 3,4 
3-1-2 12,0 3,0 38,0 -- -- -- 
3-2-0 9,3 1,5 38,0 1,4 0,4 3,4 
3-2-1 15,0 3,0 44 1,7 0,5 4,6 
3-2-2 21,0 3,5 47 --- -- --- 
3-3-0 24,0 3,6 130 --- -- --- 
3-3-1 46,0 7,1 240 --- -- --- 
3-3-2 110 15,0 480 --- -- --- 
3-3-3 >110  >15,0  >480,0  --- -- --- 
4-0-0 ---   1,3 0,3 3,1 
4-0-1 ---   1,7 0,5 4,6 
4-1-0 ---   1,7 0,5 4,6 
4-1-1 ---   2,1 0,7 6,3 
4-1-2 ---   2,6 0,9 7,8 
4-2-0 ---   2,2 0,7 6,7 
4-2-1 ---   2,6 0,9 7,8 
4-3-0 ---   2,7 0,9 8,0 
4-3-1 ---   3,3 1,1 9,3 
4-4-0 ---   3,4 1,2 9,3 
5-0-0 ---   2,3 0,7 7,0 
5-0-1 ---   3,1 1,1 8,9 
5-0-2 ---   4,3 1,5 11,4 
5-1-0 ---   3,3 1,1 9,3 
5-1-1 ---   4,6 1,6 12,0 
5-1-2 ---   6,3 2,1 15,0 
5-2-0 ---   4,9 1,7 13,0 
5-2-1 ---   7,0 2,3 17,0 
5-2-2 ---   9,4 2,8 22,0 
5-3-0 ---   7,9 2,5 19,0 
5-3-1 ---   11,0 3,1 25,0 
5-3-2 ---   14,0 3,7 34,0 
5-3-3 ---   18,0 4,4 50,0 
5-4-0 ---   13,0 3,5 30,0 
5-4-1 ---   17,0 4,3 49,0 
5-4-2 ---   22,0 5,7 70,0 
5-4-3 ---   28,0 9,0 85,0 
5-4-4 ---   35,0 12,0 100,0 
5-5-0 ---   24,0 6,8 75,0 
5-5-1 ---   35,0 12,0 100,0  
5-5-2 ---   54,0 18,0 140,0  
5-5-3 ---   92,0 30,0 320,0  
5-5-4 ---   161,0  64,0 580,0  
5-5-5 ---   >161,0  >64,0  >580,0        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
CUADRO 6. Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinacione s de resultados 
positivos cuando son usados varios números de tubos.  
(Diluciones 0,1, 0,01 y 0,001 g)  
Combinación de 
positivos  Indice del 
NMP por g  3 tubos por dilución   95% 
límites de confianza  5 tubos por 
dilución  
Indice del 
NMP por g  95% límites de conf ianza  
  bajo alto  bajo alto 
0-0-0 <3 <0,5 <9 <2 <0,5 <7 
0-0-1 3 <0,5 9 2 <0,5 7 
0-1-0 3 <0,5 13 2 <0,5 7 
0-2-0 -- -- -- 4 <0,5 11 
1-0-0 4 <0,5 20 2 <0,5 7 
1-0-1 7 1 21 4 <0,5 11 
1-1-0 7 1 23 4 <0,5 11 
1-1-1 11 3 36 6 <0,5 15 
1-2-0 11 3 36 6 <0,5 15 
2-0-0 9 1 36 5 <0,5 13 
2-0-1 14 3 37 7 1,0 17 
2-1-0 15 3 44 7 1,0 17 
2-1-1 20 7 89 9 2,0 21 
2-2-0 21 4 47 9 2,0 21 
2-2-1 28 10 150 -- -- -- 
2-3-0 -- -- -- 12 3,0 28 
3-0-0 23 4 120 8 1,0 19 
3-0-1 39 7 13 11 2,0 25 
3-0-2 64 15 380 -- -- -- 
3-1-0 43 7 210 11 2,0 25 
3-1-1 75 14 230 14 4,0 34 
3-1-2 120 30 380 -- -- -- 
3-2-0 93 15 380 14 4,0 34 
3-2-1 150 30 440 17 5,0 46 
3-2-2 210 35 470 --- -- -- 
3-3-0 240 36 130 --- -- -- 
3-3-1 460 71 240 --- -- -- 
3-3-2 1100  150 480 --- -- -- 
3-3-3 >110 0 >150  >480  --- -- -- 
4-0-0 ---   13 3,0 31 
4-0-1 ---   17 5,0 46 
4-1-0 ---   17 5,0 46 
4-1-1 ---   21 7,0 63 
4-1-2 ---   26 9,0 78 
4-2-0 ---   22 7,0 67 
4-2-1 ---   26 9,0 78 
4-3-0 ---   27 9,0 80 
4-3-1 ---   33 11,0 93 
4-4-0 ---   34 12,0 93 
5-0-0 ---   23 7,0 70 
5-0-1 ---   31 11,0 89 
5-0-2 ---   43 15,0 114 
5-1-0 ---   33 11,0 93 
5-1-1 ---   46 16,0 120 
5-1-2 ---   63 21,0 150 
5-2-0 ---   49 17,0 130 
5-2-1 ---   70 23,0 170 
5-2-2 ---   94 28,0 220 Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
5-3-0 ---   79 25,0 190 
5-3-1 ---   110 31,0 250 
5-3-2 ---   140 37,0 340 
5-3-3 ---   180 44,0 500 
5-4-0 ---   130 35,0 300 
5-4-1 ---   170 43,0 490 
5-4-2 ---   220 57,0 700 
5-4-3 ---   280 90,0 850 
5-4-4 ---   350 120,0  1000  
5-5-0 ---   240 68,0 750 
5-5-1 ---   350 120 1000  
5-5-2 ---   540 180 1400  
5-5-3 ---   920 300 3200  
5-5-4 ---   1600  640 5800  
5-5-5 ---   >1600  >640  >5800  
 
CUADRO 7. Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados varios números de tubos.  
Diluci ones 0,01, 0,001 y 0,0001 g)  
Combinación de 
positivos  Indice del 
NMP por g  3 tubos por dilución   95% 
límites de confianza  5 tubos por 
dilución  
Indice del 
NMP por g  95% límites de confianza  
  bajo alto  bajo alto 
0-0-0 <30 <5 <90 <20 <5 <70 
0-0-1 30 <5 <90 20 <5 70 
0-1-0 30 <5 130 20 <5 70 
0-2-0 -- -- -- 40 <5 110 
1-0-0 40 <5 200 20 <5 70 
1-0-1 70 10 210 40 <5 110 
1-1-0 70 10 230 40 <5 110 
1-1-1 110 30 360 60 <5 150 
1-2-0 110 30 360 60 <5 150 
2-0-0 90 10 360 50 <5 130 
2-0-1 140 30 370 70 10 170 
2-1-0 150 30 440 70 10 170 
2-1-1 200 70 890 90 20 210 
2-2-0 210 40 470 90 20 210 
2-2-1 280 100 1500  -- -- -- 
2-3-0 -- -- -- 120 30 280 
3-0-0 230 40 1200  80 10 190 
3-0-1 390 70 1300  110 20 250 
3-0-2 640 150 3800  -- -- -- 
3-1-0 430 70 2100  110 20 250 
3-1-1 750 140 2300  140 40 340 
3-1-2 1200  300 3800  -- -- -- 
3-2-0 930 150 3800  140 40 340 
3-2-1 1500  300 4400  170 50 460 
3-2-2 2100  350 4700  -- -- -- 
3-3-0 2400  360 13000  -- -- -- 
3-3-1 4600  710 24000  -- -- -- 
3-3-2 11000  1500  48000  -- -- -- 
3-3-3 >11000  >1500  >48000  -- -- -- 
4-0-0 --   130 30 310 
4-0-1 --   170 50 460       (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
4-1-0 --   170 50 460 
4-1-1 --   210 70 630 
4-1-2 --   260 90 780 
4-2-0 --   220 70 670 
4-2-1 --   260 90 780 
4-3-0 --   270 90 800 
4-3-1 --   330 110 930 
4-4-0 --   340 120 930 
5-0-0 --   230 70 700 
5-0-1 --   310 110 890 
5-0-2 --   430 150 1140  
5-1-0 --   330 110 930 
5-1-1 --   460 160 1200  
5-1-2 --   630 210 1500  
5-2-0 --   490 170 1300  
5-2-1 --   700 230 1700  
5-2-2 --   940 280 2200  
5-3-0 --   790 250 1900  
5-3-1 --   1100  310 2500  
5-3-2 --   1400  370 3400  
5-3-3 --   1800  440 5000  
5-4-0 --   1300  350 3000  
5-4-1 --   1700  430 4900  
5-4-2 --   2200  570 7000  
5-4-3 --   2800  900 8500  
5-4-4 --   3500  1200  10000  
5-5-0 --   2400  680 7500  
5-5-1 --   3500  1200  10000 
5-5-2 --   5400  1800  14000  
5-5-3 --   9200  3000  32000  
5-5-4 --   16000  6400  58000  
5-5-5 --   >16000  >6400  >58000  
 
B 7.5.2.8 Informe de la prueba  
B 7.5.2.8.1  Informar "Número más probable (NMP) de coliformes por gramo o mililitro de muestra".  
B 7.5 .2.8.2  En caso de muestras de agua informar NMP/100 mL.  
B 7.6 De la estimación de la densidad microbiana por la técnica del número más probable. 
Determinación de bacterias coliformes, coliformes fecales y Escherichia  coli por la técnica de 
diluciones en tu bo mú ltiple.  
B 7.6.1  Fundamento.  
Se basa en la dilución de la muestra en tubos múltiples, de tal forma que todos los tubos de la menor 
dilución sean positivos y todos los tubos de la dilución más alta sean negativos. El resultado positivo se 
demuestra por la presencia de gas o crecimiento microbiano.  
Para obtener el Número Más Probable (NMP) en los resultados se aplica la teoría de la probabilidad, lo 
cual tiene como condición lo siguiente:  
B 7.6.1.1  Una distribución aleatoria de las bacterias que existen e n la muestra.  
B 7.6.1.2  Las bacterias se encuentran como entidades no agrupadas.  
B 7.6.1.3  Los microorganismos presentes en la muestra crecerán en el medio, cuando son incubados y se 
mantengan en las condiciones adecuadas para su desarrollo.  
Si se espera u na cuenta microbiana alta, la muestra deberá diluirse para dar cumplimiento a las 
condiciones. La forma más común de realizar esta prueba es mediante diluciones decimales y usando un 
inóculo en series de 3, 5 o 10 tubos en serie. A medida que el número de tubos inoculados para cada dilución 
aumentan se reducen los límites de confianza.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 7.6.2 Procedimientos.  
B 7.6.2.1  Uso de tablas de NMP con 95% de límite de confianza.  
B 7.6.2.1.1  Las tablas 1 -3 presentan la estimación estadística de los valores del NMP q ue corresponden al 
95% de límite de confianza cuando se utilizan 3, 5 y 10 tubos. Otras combinaciones de resultados positivos y 
negativos no encontrados en estas tablas, tienen muy baja probabilidad de que se presenten. Si los resultados 
no están incluidos  en las tablas, se  deberá repetir la prueba a partir de la muestra original. Si no es posible, 
el NMP se puede obtener (para las combinaciones de 3 y 5 tubos) de las tablas 4 y 5; también se puede 
aplicar una ecuación para obtener el NMP aproximado.  
B 7.6. 2.1.2  El intervalo del 95% de confianza se interpreta como sigue: si el analista supone que el número 
real de microorganismos cae dentro de los límites, entonces se asume que será correcto el 95% de las veces. 
El valor del NMP tabulado representa un interv alo y no un valor absoluto.  
B 7.6.2.1.3  Cuando se preparan más de 3 diluciones de una muestra, el NMP deberá determinarse a partir 
de tres diluciones consecutivas (usando tablas 1 -3). Primero, para todas las diluciones que tengan todos los 
tubos positivos,  seleccionar la dilución mayor. Después usar las 2 siguientes diluciones mayores (A y B en las 
tablas 6 y 7). Cuando en ninguna de las diluciones probadas hubiera crecimiento en todos los tubos, 
seleccionar (si es posible) las primeras tres diluciones cons ecutivas (volumen de muestra) para que la dilución 
media contenga resultados positivos (C de tablas 6 y 7).  
B 7.6.2.1.4  Con frecuencia es necesario el NMP desde el inicio con volúmenes diferentes de los enlistados 
en las tablas 1 -5. Si el volumen de muestr a es mayor que 0,01 g multiplicar el NMP enlistado en la tabla por 
10. El resultado de una determinación de 5 tubos que dé 3 tubos positivos en 0,01 g; 2 tubos positivos en 
0,001 g y 1 tubo positivo en 0,0001 g (3 -2-1) leer en la tabla No. 2 como 17 y mult iplicar por 10 para así 
obtener 170 como el NMP actual por gramo de muestra. De igual forma si la cantidad más grande utilizada 
para la tabla de referencia es 1 g en lugar de 0,1 g, dividir el NMP derivado de la tabla entre 10. Por ejemplo el 
resultado de la determinación del NMP en 3 tubos para Salmonella spp que dé 3 tubos positivos en 1 g; 1 tubo 
positivo en 0,1 g y ningún positivo en 0,01 g (3 -1-0) leer en la tabla 1 como 43 y dividir entre 10, lo que da 4,3 
como el NMP presuntivo por gramo de muestra.  
B 7.6.2.1.5  Un método alternativo para obtener el número más probable es usando la siguiente fórmula:  
(NMP/g de la tabla - 100) X factor de dilución del tubo de en  medio = NMP/g  
Para calcular el NMP/100 g multiplicar por 100.  
B 7.6.2.2  Cálculo aproximado d el NMP y 95% de límite de confianza.  
Debido a la inherente complejidad para calcular los límites de confianza del NMP lo más común es el uso 
de tablas. Generalmente estas tablas están limitadas al uso de 3, 5 y 10 tubos por dilución, incluso usando un 
méto do aceptado, pueden presentarse datos irregulares o accidentes de laboratorio que causan pérdida de 1 
o más tubos de dilución. En este caso una serie de diluciones de por ejemplo: 5,4,4 puede dar una lectura de 
5-2-0. Para estos casos se puede aplicar una fórmula sencilla, la cual no corresponde exactamente con los 
resultados obtenidos teóricamente; sin embargo, las desviaciones generalmente son pequeñas, esta fórmula 
no debe ser aplicada para fines de regulación. La fórmula no restringe el número de tubos o las diluciones y 
puede aplicarse para todo tipo de pruebas. El cálculo aproximado está dado por la siguiente ecuación: NMP/g 
= P/(N T )1/2 
Donde: P es el número de tubos positivos, N es la cantidad total de muestra (g) en todos los tubos 
negativos y T es la cantidad total de muestra (g) en todos los tubos.  
Por ejemplo, considerando que se tuvieran serie de diluciones al doble:  
MUESTRA (g)  No. DE TUBOS  No. DE TUBOS POSITIVOS  
8 
4 
2 
1 
0,5 
0,25 5 
5 
5 
5 
5 
5 5 
4 
2 
0 
1 
0 
 
El número de tubos positivos es: P = (5  + 4 + 2+ 1) = 12; N = (8x0) + (4x1) + (2x3) + (1x5) + (0,5x4) + 
(0,25x5) = 18,25; y T = 5 (8+4+2+1+0,5+0,25) = 78,75  
NPM/g = 12/(18,25 x 78,75)1/2 = 0,32/g o 32/100 g        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
Los límites de confianza del 95% estimados, pueden obtenerse del antilogaritmo de base 1 0 con la 
siguiente ecuación:  
log (NMP/g) 1,08 (log a)/n)1/2 
Donde: a es el radio de dilución y n es el número de tubos por dilución. Esta expresión asume que el radio 
de dilución es diferente de 1:10 (por ejemplo 1:2). Para diluciones de 1:10, la cantidad por restar o sumar 
deberá ser de 1,14(n) ½ para la mejor estimación. Si el número de tubos por dilución (n i) es desigual (por 
ejemplo: un accidente de laboratorio) para la dilución k reemplazar n por la expresión n H (media armónica) por 
el número de tubos p or dilución (n i). 
La media armónica se define como:  
nH = k / (1/ n i ) 
k es el número de diluciones. Por ejemplo: Suponiendo que el resultado de 3 diluciones en n i fuera 5 -4-4. 
Por lo tanto n H = 3/ (1/5) + (1/4) + (1/4) ½ = 3/0,70 = 4,3 i 
Para el ejemplo ante rior el NMP con n = 5 y un límite de confianza aproximado de 95% será el siguiente:  
log 0,32 (1,08) (log 2)/5) ½ 
-0,495 0,265  
Entonces el límite inferior es el antilogaritmo ( -0-76) = 0.17/g o 17/100 g y el límite inferior es el 
antilogaritmo ( -0,23) = 0,59 /g o 59/100 g. Cuando se compara con las tablas el NMP podría ser 0,31/g con 
límites de confianza de 0,16/g y 0,57/g.  
Tabla No. 1 Selección del NMP con un límite de confianza de 95% para la prueba de fermentación 
utilizando 3 tubos: con porciones de 0,1, 0 ,01 y 0,001 g (mL) de muestra.  
No. de tubos positivos   95% de límite de confianza  
0,1 0,01 0,001  NMP/g (mL)b Inferior  Superior  
0 0 0 3 - - 
0 1 0 3+ 1 17 
1 0 0 4 1 21 
1 0 1 7+ 2 27 
1 1 0 7 2 28 
1 2 0 11+ 4 35 
2 0 0 9 2 38 
2 0 1 14+ 5 48 
2 1 0 15 5 50 
2 1 1 20+ 7 60 
2 2 0 21 8 62 
3 0 0 23 9 130 
3 0 1 39 10 180 
3 1 0 43 10 210 
3 1 1 75 20 280 
3 2 0 93 30 380 
3 2 1 150 50 500 
3 2 2 210+  80 640 
3 3 0 240 90 1400  
3 3 1 460 100 2400  
3 3 2 1100  300 4800  
3 3 3 1100  - - 
a Los resultados normal es, obtenidos en un 95% de las pruebas no están seguidos por un símbolo más 
(+). Menos del 4% de los resultados de las pruebas obtenidos están marcados por un símbolo más (+). 
Combinaciones de tubos positivos no encontrados en esta tabla se presentan en me nos del 1% de las 
pruebas y si se presentaran con mayor frecuencia indican un error de técnica o que el valor del número más 
probable se encuentra en el límite. El NMP de combinaciones que no aparecen en la tabla, se puede obtener 
por extrapolación a la co mbinación cercana más elevada.  
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por 100 para expresarlos como NMP/100 g (mL).  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Tabla No. 2 Selección del NMP con un límite de confianza de 95% para la prueba de fermentación 
utilizando 5 tubos: con porciones de 0 ,1, 0,01 y 0,001 g (mL) de muestraa. 
No. de tubos positivos   95% de límite de 
confianza  
0,1 0,01 0,001  NMP/g (mL)b Inferior  Superior  
      
0 0 0 2 - - 
0 0 1 2+ 1 10 
0 1 0 2 1 10 
1 0 0 2 1 11 
1 0 1 4+ 1 15 
1 1 0 4 1 15 
1 2 0 6+ 2 18 
2 0 0 4 1 17 
2 0 1 7+ 2 20 
2 1 0 7 2 21 
2 1 1 9+ 3 25 
2 2 0 9 3 25 
3 0 0 8 3 24 
3 0 1 11 4 29 
3 1 0 11 4 30 
3 1 1 14+ 6 35 
3 2 0 14 6 35 
3 2 1 17+ 7 40 
3 3 0 17+ 7 41 
4 0 0 13 5 38 
4 0 1 17 7 45 
4 1 0 17 7 46 
4 1 1 21 9 55 
4 2 0 22 9 56 
4 2 1 26+ 12 65 
4 3 0 27 12 67 
4 3 1 33+ 15 77 
4 4 0 34+ 16 80 
5 0 0 23 9 68 
5 0 1 31 13 110 
5 1 0 33 14 120 
5 1 1 46 20 150 
5 1 2 63+ 22 180 
5 2 0 49 21 170 
5 2 1 70 30 210 
5 2 2 94+ 40 250 
5 3 0 79 30 250 
5 3 1 110 40 300 
5 3 2 140 60 360 
5 4 0 130 50 390 
5 4 1 170 70 480 
5 4 2 220 100 580 
5 4 3 280+  120 690 
5 4 4 350+  160 820 
5 5 0 240 100 940       (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
5 5 1 350 100 1300  
5 5 2 540 220 2000  
5 5 3 920 300 2900  
5 5 4 1600  600 5300  
5 5 5 1600  - - 
a Los resultados normales, obtenidos en un 95% de las pruebas , no están seguidos por un símbolo 
más(+). Menos del 4% de los resultados de las pruebas obtenidos están marcados por un símbolo más (+). 
Combinaciones de tubos positivos no encontrados en esta tabla se presentan en menos del 1% de las 
pruebas y si se pres entaran con mayor frecuencia indican un error de técnica o que el valor del número más 
probable se encuentra en el límite. El NMP de combinaciones que no aparecen en la tabla, se pueden obtener 
por extrapolación a la combinación cercana más elevada.  
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por 100 para expresarlos como NMP/100 g (mL).  
Tabla No. 3 Selección del NMP con un límite de confianza de 95% para la prueba de fermentación 
utilizando 10 tubos: con porciones de 0,1, 0,01 y 0,001 g (mL) de muestraa. 
No. de tubos positivos   95% de límite de confianza  
0,1 0,01 0,001  NMP/g (mL)b Inferior  Superior  
0 0 0 1 - - 
0 0 1 1+ 1 5 
0 1 0 1 1 5 
0 2 0 2+ 1 7 
1 0 0 1 1 5 
1 0 1 2+ 1 7 
1 1 0 2 1 7 
1 2 0 3+ 1 8 
2 0 0 2 1 7 
2 0 1 3+ 1 9 
2 1 0 3 1 9 
2 1 1 4+ 1 10 
2 2 0 4 2 10 
2 3 0 5+ 2 12 
3 0 0 3 1 9 
3 0 1 4 2 11 
3 1 0 4 2 11 
3 1 1 5+ 2 13 
3 2 0 5 2 13 
3 2 1 6+ 3 14 
3 3 0 6+ 3 14 
4 0 0 4 2 12 
4 0 1 6 2 13 
4 1 0 6 2 14 
4 1 1 7 3 15 
4 2 0 7 3 15 
4 2 1 8 4 17 
4 3 0 8 4 17 
4 4 0 9+ 5 19 
5 0 0 6 2 15 
5 0 1 7 3 16 
5 1 0 7 3 17 
5 1 1 9 4 18 
5 2 0 9 4 18 
5 2 1 10+ 5 20 Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
5 3 0 10 5 20 
5 3 1 11+ 6 22 
5 4 0 11+ 6 22 
6 0 0 8 3 18 
6 0 1 9 4 20 
6 1 0 9 4 20 
6 1 1 11 5 22 
6 2 0 11 5 22 
6 2 1 12 6 24 
6 3 0 12 6 25 
6 3 1 14+ 7 27 
6 4 0 14+ 7 27 
6 5 0 15+ 8 29 
7 0 0 10 5 22 
7 0 1 12 6 24 
7 0 2 13+ 7 27 
7 1 0 12 6 25 
7 1 1 13 7 27 
7 1 2 15+ 8 30 
7 2 0 13 7 27 
7 2 1 15 8 30 
7 2 2 17+ 9 32 
7 3 0 15 8 30 
7 3 1 17 9 33 
7 4 0 17 9 33 
7 4 1 19+ 10 36 
7 5 0 19+ 10 36 
8 0 0 13 6 28 
8 0 1 15 7 31 
8 0 2 17+ 8 34 
8 1 0 15 7 31 
8 1 1 17 9 34 
8 1 2 19+ 10 37 
8 2 0 17 9 35 
8 2 1 19 10 38 
8 2 2 21+ 12 42 
8 3 0 19 10 39 
8 3 1 21 12 42 
8 3 2 24+ 13 46 
8 4 0 22 12 43 
8 4 1 24 13 46 
8 5 0 24 13 47 
8 5 1 27+ 15 51 
8 6 0 27+ 15 52 
9 0 0 17 8 37 
9 0 1 19 10 41 
9 0 2 22+ 11 46 
9 1 0 19 10 42 
9 1 1 22 11 47 
9 1 2 25+ 13 52 
9 2 0 22 12 47       (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
9 2 1 25 13 53 
9 2 2 28+ 15 58 
9 3 0 25 13 54 
9 3 1 29 15 60 
9 3 2 32+ 18 66 
9 4 0 29 16 61 
9 4 1 33 18 67 
9 4 2 37+ 20 74 
9 5 0 33 18 69 
9 5 1 37 20 76 
9 5 2 42+ 23 83 
9 6 0 38 21 77 
9 6 1 43+ 24 85 
9 7 0 44+ 24 87 
10 0 0 23 12 58 
10 0 1 27 14 67 
10 0 2 31+ 16 77 
10 1 0 27 14 69 
10 1 1 32 17 79 
10 1 2 38 20 92 
10 2 0 33 17 83 
10 2 1 39 20 96 
10 2 2 50 20 110 
10 2 3 50+ 30 120 
10 3 0 40 20 100 
10 3 1 50 20 120 
10 3 2 60+ 30 130 
10 3 3 70+ 30 150 
10 4 0 50 30 120 
10 4 1 60 30 140 
10 4 2 70 30 160 
10 4 3 80+ 40 170 
10 5 0 60 30 150 
10 5 1 70 40 170 
10 5 2 90 40 190 
10 5 3 100 50 210 
10 6 0 80 40 180 
10 6 1 90 50 200 
10 6 2 110 50 230 
10 6 3 120 60 250 
10 6 4 140+  70 270 
10 7 0 100 50 220 
10 7 1 120 60 250 
10 7 2 140 70 280 
10 7 3 150 80 310 
10 7 4 170+  90 340 
10 8 0 130 60 280 
10 8 1 150 80 320 
10 8 2 170 90 360 
10 8 3 200 100 400 
10 8 4 220 120 440 Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
10 8 5 250+  140 480 
10 9 0 170 90 380 
10 9 1 200 100 430 
10 9 2 230 120 490 
10 9 3 260 140 560 
10 9 4 300 160 640 
10 9 5 350 180 720 
10 9 6 400+  210 820 
10 10 0 240 120 610 
10 10 1 290 150 750 
10 10 2 350 170 910 
10 10 3 400 200 1100  
10 10 4 500 300 1400  
10 10 5 700 300 1700  
10 10 6 900 400 2100  
10 10 7 1120  600 2700  
10 10 8 1160  800 3700  
10 10 9 2300  1100  6000  
10 10 10 2300  - - 
a Los resultados normales, obtenidos en un 95% de las pruebas, no están seguidos por un símbolo más 
(+). Menos del 4% de los resultados de las pruebas obtenidos están marcados por un símbolo más(+). 
Combinaciones de tubos positivos no encontrados en esta tabla se presentan en menos del 1% de las 
pruebas y si se presentaran con mayor frecuencia indican un error de  técni ca o que el valor del número más 
probable se encuentra en el límite. El NMP de combinaciones que no aparecen en la tabla, se pueden obtener 
por extrapolación a la combinación cercana más elevada.  
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por 100 para e xpresarlos como NMP/100 g (mL).  
Tabla No. 4 Número más probable (NMP) para 1g de muestra cuando se usan 3 tubos con porciones de 
0,1, 0,01 y 0,001g.  
Tubos Positivos  Tubos Positivos  Tubos Positivos  Tubos Positivos  
0,1 0,01 0,001  NMP  0,1 0,01 0,001  NMP  0,1 0,01 0,001  NMP  0,1 0,01 0,001  NMP  
0 0 0 3 1 0 0 3,6 2 0 0 9,1 3 0 0 23 
0 0 1 3 1 0 1 7,2 2 0 1 14 3 0 1 39 
0 0 2 6 1 0 2 11 2 0 2 20 3 0 2 64 
0 0 3 9 1 0 3 15 2 0 3 26 3 0 3 95 
0 1 0 3 1 1 0 7,3 2 1 0 15 3 1 0 43 
0 1 1 6,1 1 1 1 11 2 1 1 20 3 1 1 75 
0 1 2 9,2 1 1 2 15 2 1 2 27 3 1 2 120 
0 1 3 12 1 1 3 19 2 1 3 34 3 1 3 160 
0 2 0 6,2 1 2 0 11 2 2 0 21 3 2 0 93 
0 2 1 9,3 1 2 1 15 2 2 1 28 3 2 1 150 
0 2 2 12 1 2 2 20 2 2 2 35 3 2 2 210 
0 2 3 16 1 2 3 24 2 2 3 42 3 2 3 290 
0 3 0 9,4 1 3 0 16 2 3 0 29 3 3 0 240 
0 3 1 13 1 3 1 20 2 3 1 36 3 3 1 460 
0 3 2 16 1 3 2 24 2 3 2 44 3 3 2 1100  
0 3 3 19 1 3 3 29 2 3 3 53 3 3 3 1100        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
Tabla No. 5 Número más probable (NMP) para 100 mL de muestra cuando se usan 5 porciones  en cada 
una de 3 diluciones con serie s geométricas.  
No. de Tubos  
Positivos  No. de Tubos 
Positivos  No. de Tubos 
Positivos  No. de Tubos 
Positivos  No. de Tubos 
Positivos  No. de Tubos 
Positivos  
10 1 0,1  10 1 0,1  10 1 0,1  10 1 0,1  10 1 0,1  10 1 0,1  
mL mL mL NMP  mL mL mL NMP  mL mL mL NMP  mL mL mL NMP  mL mL mL NMP  mL mL mL NMP  
0 0 0  1 0 0 2 2 0 0 4,5 3 0 0 7,8 4 0 0 13 5 0 0 23 
0 0 1 1,8 1 0 1 4 2 0 1 6,8 3 0 1 11 4 0 1 17 5 0 1 31 
0 0 2 3,6 1 0 2 6 2 0 2 9,1 3 0 2 13 4 0 2 21 5 0 2 43 
0 0 3 5,4 1 0 3 8 2 0 3 12 3 0 3 16 4 0 3 25 5 0 3 58 
0 0 4 7,2 1 0 4 10 2 0 4 14 3 0 4 20 4 0 4 30 5 0 4 76 
0 0 5 9,0 1 0 5 12 2 0 5 16 3 0 5 23 4 0 5 36 5 0 5 95 
0 1 0 1,8 1 1 0 4 2 1 0 6,8 3 1 0 11 4 1 0 17 5 1 0 33 
0 1 1 3,6 1 1 1 6,1 2 1 1 9,2 3 1 1 14 4 1 1 21 5 1 1 46 
0 1 2 5,5 1 1 2 8,1 2 1 2 12 3 1 2 17 4 1 2 26 5 1 2 64 
0 1 3 7,3 1 1 3 10 2 1 3 14 3 1 3 20 4 1 3 31 5 1 3 84 
0 1 4 9,1 1 1 4 12 2 1 4 17 3 1 4 23 4 1 4 35 5 1 4 110 
0 1 5 11 1 1 5 14 2 1 5 19 3 1 5 27 4 1 5 42 5 1 5 130 
0 2 0 3,7 1 2 0 6,1 2 2 0 9,3 3 2 0 14 4 2 0 22 5 2 0 49 
0 2 1 5,5 1 2 1 8,2 2 2 1 12 3 2 1 17 4 2 1 26 5 2 1 70 
0 2 2 7,4 1 2 2 10 2 2 2 14 3 2 2 20 4 2 2 32 5 2 2 95 
0 2 3 9,2 1 2 3 12 2 2 3 17 3 2 3 24 4 2 3 38 5 2 3 120 
0 2 4 11 1 2 4 15 2 2 4 19 3 2 4 27 4 2 4 44 5 2 4 150 
0 2 5 13 1 2 5 17 2 2 5 22 3 2 5 31 4 2 5 50 5 2 5 180 
0 3 0 5,6 1 3 0 8,3 2 3 0 12 3 3 0 17 4 3 0 27 5 3 0 79 
0 3 1 7,4 1 3 1 10 2 3 1 14 3 3 1 21 4 3 1 33 5 3 1 110 
0 3 2 9,3 1 3 2 13 2 3 2 17 3 3 2 24 4 3 2 39 5 3 2 140 
0 3 3 11 1 3 3 15 2 3 3 20 3 3 3 28 4 3 3 45 5 3 3 180 
0 3 4 13 1 3 4 17 2 3 4 22 3 3 4 31 4 3 4 52 5 3 4 210 
0 3 5 15 1 3 5 19 2 3 5 25 3 3 5 35 4 3 5 59 5 3 5 250 
0 4 0 7,5 1 4 0 11 2 4 0 15 3 4 0 21 4 4 0 34 5 4 0 130 
0 4 1 9,4 1 4 1 13 2 4 1 17 3 4 1 24 4 4 1 40 5 4 1 170 
0 4 2 11 1 4 2 15 2 4 2 20 3 4 2 28 4 4 2 47 5 4 2 220 
0 4 3 13 1 4 3 17 2 4 3 23 3 4 3 32 4 4 3 54 5 4 3 280 
0 4 4 15 1 4 4 19 2 4 4 25 3 4 4 36 4 4 4 62 5 4 4 350 
0 4 5 17 1 4 5 22 2 4 5 28 3 4 5 40 4 4 5 69 5 4 5 430 
0 5 0 9,4 1 5 0 13 2 5 0 17 3 5 0 25 4 5 0 41 5 5 0 240 
0 5 1 11 1 5 1 15 2 5 1 20 3 5 1 29 4 5 1 48 5 5 1 350 
0 5 2 13 1 5 2 17 2 5 2 23 3 5 2 32 4 5 2 56 5 5 2 540 
0 5 3 15 1 5 3 19 2 5 3 26 3 5 3 37 4 5 3 64 5 5 3 920 
0 5 4 17 1 5 4 22 2 5 4 29 3 5 4 41 4 5 4 72 5 5 4 1600  
0 5 5 19 1 5 5 24 2 5 5 32 3 5 5 45 4 5 5 81     
 
Tabla No. 6 Ejemplos para determinar el NMP estimado en series de tres tubos con 1g (mL) de   
muestra por tubo.  
 Cantidad de muestra (g o mL)a Valores 
positivos 
reportados  NMP estimado/g o mLb 
Ejemplo  0,10 ,001 0,001  0,0001  0,00001    
A 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3 3-2-0 930 
B 3/3 3/3 3/3 2/3 0/3 3-2-0 9300  
C 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3 0-1-0 30 
D 3/3 3/3 2/3 1/3 1/3 3-2-2 2100  
E 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3-3-3 110000  
 
a Numerador/denominador = número de tubos positivos/número de tubos inoculados.  
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por 100 para expresarlos como NMP/100 g (mL).  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Tabla No. 7 Ejemplos para determinar el NMP estimado en series de 5 tubos con 1 g (mL) de  muestra 
por tubo.  
 Cantidad de muestra (g o mL)a Valores positivos  NMP estimado/g o mLb 
Ejemplo  0,1, 0,01 0,001  0,0001  0,00001  reportados   
A 5/5 5/5 2/5 0/5 0/5 5-2-0 490 
B 5/5 5/5 5/5 2/5 0/5 5-2-0 4900  
C 0/5 0/5 1/5 0/5 0/5 0-1-0 20 
D 5/5 5/5 3/5 1/5 1/5 5-2-2 1400  
E 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5-5-5 160000  
 
a Numerador/denominador = número  de tubos positivos/número de tubos inoculados.  
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por 100 para expresarlos como NMP/100 g (mL).  
B 7.6.3  Determinación de bacterias coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli  por la técnica de 
diluciones en  tubo múltiple.  
B 7.6.3.1 Fundamento  
Este método se basa en la propiedad de los microorganismos coliformes para producir gas a partir de 
glucosa y fermentación de lactosa dentro de las 48 horas de incubación a 35 0,5°C (coliformes) y 44,50,2°C 
(coliformes fecales y E. coli ). 
B 7.6.3.2 Equipo  
Además de los mencionados en el método Preparación y dilución de muestras de alimentos para análisis 
microbiológico, lo siguiente:  
B 7.6.3.2.1  Baño de agua con agitación continua cubierto y con termostato que evite vari aciones mayores 
a 0,1°C.  
B 7.6.3.2.2  Termómetro calibrado y verificado 1/10  
B 7.6.3.2.3  Tubos de cultivo de 20x200 y de 16x160 mm con tapón de rosca  
B 7.6.3.2.4  Campanas de fermentación (tubos de Durham)  
B 7.6.3.2.5  Gradillas  
B 7.6.3.2.6  Asas bacteriológic as de 3 mm de diámetro  
B 7.6.3.2.7  Lámpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts.  
B 7.6.3.2.8  Lentes protectores.  
B 7.6.3.3 Reactivos  y medios de cultivo  
B 7.6.3.3.1 Medios de cultivo  
B 7.6.3.3.1.1  Caldo lauril  
Ingredientes  Cantidad  
Bacto triptos a 20,0 g  
Bacto lactosa  5,0 g  
Fosfato potásico, dibásico  2,75 g  
Fosfato potásico, monobásico  2,75 g  
Cloruro de sodio  5,0 g  
Lauril sulfato de sodio  0,1 g  
Agua destilada  1000 mL        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
pH final: 6,8 0,2 a 25°C.  
Preparación:  
Disolver los ingredientes en un lit ro de agua destilada.  
Ajustar el pH.  
Distribuir en tubos de ensaye con campanas de Durham.  
Adicionar 10 mL de medio para cada tubo.  
Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C.  
Antes de abrir el autoclave, dejar bajar la temperatura a 75°C para que  no queden burbujas en las 
campanas de Durham.  
Preparació n del caldo lauril triptosa  
INOCULO  
(mL) CANTIDAD DE MEDIO 
POR TUBO (mL)  VOLUMEN DE MEDIO 
MAS INOCULO (mL)  CALDO LAURIL TRIPTOSA 
REQUERIDO g/L  
1 10 o más  11 o más  35,6 
10 10 20 71,2 
10 20 30 53,4 
20 10 30 106,8  
100 50 150 106,8  
100 35 135 137,1  
100 20 120 213,6  
 
B 7.6.3.3.1.2 Caldo EC ( E. coli ) 
Ingredientes  Cantidad  
Bacto triptosa  20.0 g  
Bacto lactosa  5.0 g  
Bacto sales biliares No. 3  1.5 g  
Fosfato dipotásico  4.0 g  
Fosfato monopotásico  1.5 g 
Cloruro de sodio  5.0 g  
Agua destilada  1000 mL  
 
pH final: 6,9 0,2 a 25°C.  
Preparación:  
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar ligeramente para que se disuelva por 
completo.  
Ajustar el pH.  
Distribuir en tubos de ensaye con c ampanas de Durham.  
Adicionar 10 mL de medio para cada tubo.  
Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C.  
Antes de abrir el autoclave, dejar bajar la temperatura a 75°C para evitar que queden burbujas en las 
campanas de Durham.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 7.6.3.3.1.3  Agar Mc Conkey  
Ingredientes:  Cantidad  
Proteasa peptona o polipeptona  3,0 g  
Peptona o gelizante  17,0 g  
Lactosa  10,0 g  
Sales biliares No. 3  1,5 g  
Cloruro de sodio  5,0 g  
Rojo neutro  0,03 g  
Cristal violeta  0,001 g  
Agar  13,5 g  
Agua destilada  1000,0 mL  
 
pH fin al: 7,1 0,2 a 25°C  
Preparación:  
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada.  
Calentar hasta ebullición para disolver por completo.  
Ajustar el pH.  
Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.  
Enfriar a 50 -60°C y vaciar en cajas Petri.  
B 7.6.3.3.1.4  Agar eosina azul de metileno de Levin (EMB -L) 
Ingredientes:  Cantidad  
Peptona  10,0 g  
Lactosa  10,0 g  
K2HPO 4 2,0 g  
Eosina Y  0,4 g  
Azul de metileno  0,065 g  
Agua destilada  1000 mL  
 
pH final: 7,1 0,2  
Disolver la peptona, el fosfato y el agar en un litro de  agua.  
Calentar hasta ebullición para la disolución completa.  
Distribuir en porciones de 100 o 200 mL y esterilizar a no más de 121°C por 15 minutos.  
Fundir antes de su uso y adicionar a cada porción de 100 mL:  
a) 5 mL de solución de lactosa al 20%  
b) 2 mL  de solución acuosa de eosina al 2%  
c) 4,3 mL de solución acuosa de azul de metileno al 0,15%.  
Cuando se use el producto deshidratado, disolver todos los ingredientes de acuerdo con las instrucciones 
del fabricante.  
B 7.6.3.3.1.5  Caldo triptona al 1% (trip tófano)  
Ingredientes  Cantidad  
Triptona o tripticasa  10 g 
Agua destilada  1000 mL  
pH final: 6,9         (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
Disolver los ingredientes  
Distribuir en porciones de 5 mL en tubos de ensaye de 16 x 125 o 16 x 150 mm.  
Esterilizar a 121°C por 15 minutos.  
B 7.6.3.3.1.6  Caldo MR -VP 
Medio 1  
Ingredientes  Cantidad  
Peptona tamponada  7 g 
Glucosa  5 g 
K2HPO 4 5 g 
Agua destilada  1000 mL  
 
pH final: 6.9  
Disolver los ingredientes con calentamiento suave si es necesario.  
Distribuir en volúmenes de 10 mL en tubos de ensaye de 16x15 0 mm.  
Esterilizar a 121°C por 15 minutos.  
B 7.6.3.3.1.7  Caldo citrato de Koser  
Ingredientes  Cantidad  
NaNH 4HPO 4 •4H 2O 1,5 g  
KH2PO 4 (monobásico)  1,0 g  
MgSO 4 •7H 2O 0,2 g  
Citrato de sodio  •2H 2O 3,0 g  
Agua destilada  1000 mL  
 
pH final: 6,7 0,2.  
Distribuir preferentemente en tubos de ensaye con tapa de rosca.  
Esterilizar a 121°C por 15 minutos.  
Esta formulación se recomienda en los Métodos de Análisis Oficial de AOAC y en los Métodos Estándares 
para el Análisis de Agua y Aguas de Desecho (APHA). Este difiere  de la composición del medio deshidratado 
disponible comercialmente y es recomendable su uso.  
B 7.6.3.3.2 Reactivos.  
B 7.6.3.3.2.1  Reactivo de Kovacs  
Ingredientes:  Cantidad  
p-imetilaminobenzaldehído  5 g 
Alcohol amílico (normal)  75 mL  
HCI concentrado  25 mL 
 
Disolver el p -Dimetilaminobenzaldehído en alcohol amílico normal.  
Adicionar lentamente el HCl. Almacenar a 4°C.  
Para la prueba de indol  
Adicionar 0,2 -0,3 mL del reactivo a 5 mL del cultivo de bacteria en caldo triptona.  
Se considera una prueba positiv a cuando desarrolla un color rojo en la superficie del tubo.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 7.6.3.3.2.2  Reactivo de Voges -Proskauer (VP)  
Solució n 1 
Ingredientes:  Cantidad  
alfa-naftol  5 g 
Alcohol absoluto  100 g  
 
Solució n 2 
Ingredientes  Cantidad  
Hidróxido de potasio  40 g 
Agua desti lada para llevar a 100 mL  
 
Prueba de Voges -Proskauer (VP).  
Transferir 1 mL del cultivo a probar con 48 horas de incubación a un tubo de ensaye.  
Adicionar 0,6 mL de la solución 1 y 0,2 mL de la solución 2.  
Agitar después de la adición de cada solución.  
Para intensificar y acelerar la reacción adicionar unos cuantos cristales de creatina y mezclar.  
Dejar a temperatura ambiente.  
Leer resultados después de 4 horas de adicionar los reactivos.  
El desarrollo de una coloración rosa es una prueba positiva.  
B 7.6.3. 3.2.3  Reactivos para la coloración de Gram  
Cristal violeta  
Solución A  Cantidad  
Cristal violeta (colorante 90%)  2 g 
Etanol 95%  20 mL  
 
Solución B  Cantidad  
Oxalato de amonio  8.0 g  
Agua destilada  80 mL  
 
Indicador rojo de metilo (R44)  
Mezclar la solución A y B. Almacenar por 24 horas  
Filtrar a través de un papel filtro áspero.  
B 7.6.3.3.2.4  lodo de Gram  
Ingredientes:  Cantidad  
lodo 1g 
Ioduro de potasio (Kl)  2 g 
Agua destilada  300 mL  
 
Colocar el Kl en un mortero.  
Adicionar el yodo.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
Triturar con el pistil o por 5 -10 segundos.  
Adicionar 1 mL de agua y triturar  
Adicionar 5 mL de agua y triturar  
Adicionar 10 mL de agua y triturar  
Vaciar esta solución en una botella de reactivo.  
Enjuagar el mortero y el pistilo con la cantidad de agua necesaria para completar 3 00 mL.  
B 7.6.3.3.2.5  Colorante de contraste (solución concentrada)  
Ingredientes:  Cantidad  
Safranina O  2,5 g  
Etanol al 95%  100 mL  
 
Solución de trabajo: Adicionar 10 mL de la solución concentrada a 90 mL de agua destilada.  
B 7.6.3.3.2.6  Procedimiento par a la tinción de Gram  
Fijar con calor moderado los frotis de la muestra a teñir.  
Adicionar la solución de cristal violeta al frotis.  
Dejar actuar por un minuto.  
Lavar con agua corriente y escurrir.  
Aplicar la solución de yodo por un minuto.  
Lavar con agua c orriente y escurrir.  
Decolorar con etanol al 95% hasta que la coloración azul deje de fluir (aproximadamente 30 segundos).  
Inmediatamente después enjuagar con agua corriente.  
Escurrir.  
Aplicar el colorante de contraste (safranina) por 30 segundos.  
Enjuagar , escurrir y secar al aire. Examinar al microscopio.  
B 7.6.3.3.2.7  Medio EC -MUG  
Preparar el caldo EC y adicionar 50 mg de 4 -metilumbelliferyl -beta-D-glucurónido (MUG) por litro antes de 
esterilizar (121°C por 15 minutos). El caldo EC -MUG está comercialment e disponible.  
B 7.6.3.4 Procedimiento  
B 7.6.3.4.1 Agua y hielo  
B 7.6.3.4.1.1 Prueba presuntiva  
B 7.6.3.4.1.1.1  Agitar la muestra y transferir volúmenes de 10 mL a cada uno de 5 tubos con 20 mL de 
caldo lauril sulfato triptosa de doble concentración, 5 tubo s con 1 mL y 5 tubos con 0,1 mL de caldo lauril 
sulfato triptosa de concentración sencilla o las siguientes porciones: 10 tubos con 10 mL de muestra; 5 tubos 
con 20 mL de muestra o una porción de 100 mL, consultar la tabla del inciso 2 en la preparación de l “caldo 
lauril triptosa” para la concentración de caldo lauril triptosa requerido. Los tubos deben contener una campana 
de fermentación (Durham).  
B 7.6.3.4.1.1.2 Incubar los tubos a 35 0,5°C. Examinar los tubos a las 24 horas y observar si hay 
formación d e gas; si la formación de gas no se observa, incubar 24 horas más.  
B 7.6.3.4.1.2 Prueba confirmativa  
B 7.6.3.4.1.2.1 De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una asada y sembrar en un número 
igual de tubos con medio de confirmación, para la determi nación de bacterias coliformes referirse al método 
de Determinación de bacterias coliformes. Técnica del Número más probable, para la determinación de 
bacterias coliformes fecales, sembrar en caldo EC. Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli  
como control positivo y una de Enterobacter  aerogenes  como control negativo e incubar con las muestras.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 7.6.3.4.1.2.2 Para la determinación de coliformes fecales incubar los tubos a 44,5 0,2°C en baño de 
agua con agitación durante 24 horas, observar si h ay formación de gas; si la formación de gas no se observa, 
continuar la incubación 24 horas más, hacer la lectura. Utilizar estos resultados para calcular el número más 
probable (NMP) de coliformes fecales.  
B 7.6.3.4.1.3 Prueba confirmativa para Escherichi a coli  (por identificación bioquímica)  
B 7.6.3.4.1.3.1 Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos y sembrar por estría cruzada en agar 
EMB -L para su aislamiento.  
B 7.6.3.4.1.3.2 Incubar las placas invertidas a 35°C por 18 -24 horas.  
B 7.6.3.4.1.3.3 Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfología colonial: Colonias con 
centro negro, planas con o sin brillo metálico y sembrarlas en agar cuenta estándar para realizar las pruebas 
de morfología microscópica y pruebas bioquímicas. Incuba r las placas a 35°C por 18 -24 horas.  
B 7.6.3.4.1.3.4  Si no hay colonias con morfología típica, probar una o más colonias lo más parecido E. coli  
de cada placa.  
B 7.6.3.4.1.3.5  Hacer un frotis y teñirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de baci los cortos  o 
cocobacilos Gram -negativos.  
B 7.6.3.4.1.3.6  Pruebas bioquímicas Indol, Rojo de metilo, Voges Proskauer, Citrato (IMViC).  
B 7.6.3.4.1.3.6 .1 Producción  de indol  
Inocular un tubo en caldo triptona e incubarlo a 35°C por 24 horas. Adicionar 0,2 -0,3 mL de reactivo de 
Kovacs. La presencia de una coloración en la superficie del tubo se considera una prueba positiva.  
B 7.6.3.4.1.3.6.2  Voges -Proskauer (VP)  
Inocular un tubo con caldo MR -VP e incubar a 35°C por 48 horas. Transferir 1 mL a un tubo de 13X1 00 
mm. Adicionar 0,6 mL de solución de alfa naftol y 0,2 mL de hidróxido de potasio al 40% y agitar. Se considera 
una prueba positiva cuando se desarrolla un color rosa.  
B 7.6.3.4.1.3.6.3  Rojo de metilo  
Inocular un tubo adicional con caldo MR -VP e incubar a 35°C por 48 horas. Adicionar 5 gotas de solución 
de rojo de metilo. Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color amarillo es 
una prueba negativa.  
B 7.6.3.4.1.3.6.4  Citrato  
Inocular un tubo con caldo citrato de Koser un in óculo ligero para evitar turbiedad en el tubo. Incubar a 
35°C por 96 horas. El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad del medio, se considera una 
prueba positiva.  
B 7.6.3.4.1.3.6.5  Interpretación de resultados  
Todos los cultivos que: 1. Fer menten la lactosa con producción de gas dentro de las 48 horas a 35°C;  2. 
Sean bacilos o cocobacilos Gram negativos no esporulados y 3. Se obtenga las siguientes combinaciones 
para el IMVIC:  
Biotipo 1 --, o Biotipo 2 ---, son consideradas como E. coli. Calcular el NMP de E. coli  basada en la 
proporción de los tubos positivos de caldo EC.  
B 7.6.3.4.1.4 Prueba confirmativa para Escherichia  coli (por el método de EC -MUG)  
B 7.6.3.4.1.4.1 Fundamento.  
Alrededor del 94% de las cepas de E. coli  incluso las cepas no productoras de gas producen la enzima 
beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato específico 4 -metilumbelliferyl -beta-D-glucurónido  (MUG ) 
en 4-metilumbelliferona  (MU), que al ser expuesto a una fuente de luz ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm)  
produce una fluorescencia azul, fácil de observar. Cuando el MUG es incorporado al caldo EC se puede 
identificar E. coli . 
B 7.6.3.4.1.4.2 Prueba presuntiva.  
Seguir lo indicado en el punto B.7.6.3.4.1        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 7.6.3.4.1.4.3 Prueba confirmativa  
De cada tubo que mu estre formación de gas, tomar una asada y sembrar en un número igual de tubos con 
medio de confirmación EC -MUG. Inocular dos tubos con caldo EC-MUG una cepa  de E. coli  como  control  
positivo  y K. pneumoniae  como  control  negativo . Incubar a estos tubos con u no adicional de caldo EC -MUG sin 
inocular a 44,5 0,5°C en baño de agua con los tubos de las muestras durante 24 horas, observar si hay 
formación de gas; si la formación de gas no se observa continuar la incubación 24 horas más. Irradiar los 
tubos con una f uente de luz UV, observar fluorescencia y hacer la lectura. Utilizar estos resultados para 
calcular el número más probable (NMP) de E. coli . 
B 7.6.3.4.2 Alimentos  
B 7.6.3.4.2.1  Prueba presuntiva.  
Preparar la muestra como se indica en el método “ Preparación  y dilución de muestras de alimentos para 
análisis microbiológico;”  y de acuerdo con el tipo de producto, utilizar las diluciones apropiadas, según se 
indica en el procedimiento de la densidad microbiana por la técnica del número más probable. Utilizar com o 
medio de enriquecimiento caldo lauril triptosa  y continuar como en el punto B.7.6.3.4.1.1  
B 7.6.3.4.2.2 Prueba confirmativa.  
Continuar como en el punto B.7.6.3.4.1.2 y confirmar la presencia de Escherichia coli  en por lo menos el 
10% de las pruebas con r esultados positivos a coliformes fecales por cultivo en placas de agar McConkey a 
partir de los tubos que demostraron la presencia de gas en la prueba confirmativa. Incubar las placas a 35 
0,5°C durante 24 horas, observar las colonias típicas fermentadoras  de color rojo rodeadas de un halo opaco 
de precipitación de sales biliares. Seleccionar 1 o más colonias aisladas y pasar a tubos de fermentación con 
caldo lauril triptosa, continuar como se indica en B.7.6.3.4.1.2. Hacer tinción de Gram para observación de la 
morfología microscópica.  
B 7.6.3.5 Interpretación de resultados.  
La formación de gas en el tubo de fermentación secundario dentro de las 48 horas y la demostración de 
bacilos Gram ( -) no esporulados confirma un resultado positivo de la prueba demostr ándose la presencia del 
grupo coliforme.  
B 7.6.3.6 Cálculos  
Calcular la densidad microbiana en número más probable conforme al procedimiento señalado 
anteriormente, para estimar la población de bacterias coliformes y bacterias coliformes fecales de acuerdo  con 
las diluciones empleadas y expresar en NMP/g o mL para alimentos y NMP/100 mL para agua. En el caso de 
usar volúmenes de 20 mL de muestras de agua en 5 tubos o 10 mL de muestras de agua en 10 tubos, utilizar 
las siguientes tablas:  
TABLA 1. Indice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados 
positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con 20 mL de muestra de agua o hielo.  
No. de Tubos   95% de Límite de Confianza 
(aproximado)  
Positivos  NMP/100 mL  Inferior  Superior  
0 1,1 0 3,0 
1 1,1 0,05 6,3 
2 2,6 0,3 9,6 
3 4,6 0,8 14,7 
4 8,0 1,7 26,4 
5 8,0 4,0 Infinito  
 
TABLA 2. Indice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados 
positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con 10 mL de muestra de agua o hielo.  
No. de Tubos  
Positivos  NMP/100 mL  95% de Límite de Confianza (aproximado)  
Inferior  Superior  
0 1,1 0,0 3,0 
1 1,1 0,03 5,9 Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
2 2,2 0,26 8,1 
3 3,6 0,69 10,6 
4 5,1 1,3 13,4 
5 6,9 2,1 16,8 
6 9,2 3,1 21,1 
7 12,0 4,3 27,1 
8 16,1 5,9 36,8 
9 23,0 8,1 59,5 
10 23,0 13,5 Infinito  
 
B 7.7 Técnicas y procedimientos para la investigación de V ibrio cholerae  
B 7.7.1  Material y equipo  
B 7.7.1.1  Licuadora y vasos de licuadora estériles.  
B 7.7.1.2  Frascos de vidrio de boca ancha tipo tarro de 500 m L de capacidad con tapa de rosca.  
B 7.7.1.3  Varilla de vidrio de 3 mm de diámetro y 20 cm de largo, con un doblez terminal en ángulo recto 
de 4 cm.  
B 7.7.1.4  Balanza granataria de 2000 g de capacidad y 0,2 g de sensibilidad.  
B 7.7.1.5  Balanza analítica de 120 g  de capacidad  y 5 mg de sensibilidad.  
B 7.7.1.6  Incubadoras de 39 -40°C.  
B 7.7.1.7  Baño de agua de 42 ± 0,2°C y 35 -37°C.  
B 7.7.1.8  Cucharas estériles u otros instrumentos apropiados para transferir muestras de alimentos.  
B 7.7.1.9  Cajas Petri estériles  de 15 x 100 mm de plástico.  
B 7.7.1.10  Pipetas estériles de 1 mL con graduación de 0,01 mL, de 5 y 10 mL con graduación de 0,1 mL.  
B 7.7.1.11  Asas bacteriológicas de 3 mm de diámetro de nicromel o platino.  
B 7.7.1.12  Tubos de cultivo o de ensayo de 16 x 1 50 mm y 20 x 150 mm.  
B 7.7.1.13  Tubos para bioquímicas o ensaye de 10 x 75 mm o 13 x 100 mm.  
B 7.7.1.14  Tijeras y pinzas estériles.  
B 7.7.1.15  Lámpara (para observar reacciones serológicas).  
B 7.7.1.16  Mecheros.  
B 7.7.1.17  Papel pH (rango 1 -14) con un máxi mo de graduación de 0,4 unidades de pH por cambio  de 
color.  
B 7.7.1.18  Potenciómetro.  
B 7.7.1.19  Bolsas de polietileno de 28 x 37 cm con tapa resellable.  
B 7.7.1.20  Aparato de filtración y membranas de 0,45 micras.  
B 7.7.2  Medios de cultivo  
B 7.7.2.1  Agua  Peptonada Alcalina (APW)  
Ingredientes  Cantidad  
Peptona  10 g 
Cloruro de Sodio  10 g 
Agua destilada  1 000 mL  
 
Disolver los ingredientes. Ajustar el pH de tal forma que después de esterilizar éste sea de 8,5  ± 0,2. 
Esterilizar en autoclave 10 minutos a 12 1°C.       (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 7.7.2.2  Agar Tiosulfato, Citrato, Sales Biliares y Sacarosa (TCBS)  
Ingredientes  Cantidad  
Extracto de levadura  5 g 
Proteosa peptona  10 g 
Sacarosa  20 g 
Tiosulfato de sodio·5H 2O 10 g 
Citrato de sodio·2H 2O 10 g 
Sales biliares  3 g 
Bilis de buey  5 g 
Cloruro de sodio  10 g 
Citrato férrico  1 g 
Azul de bromotimol  40 mg  
Azul de timol  40 mg  
Agar  15 g 
Agua destilada  1 000 mL  
 
Preparar en un matraz por lo menos tres veces más grande que el volumen requerido de medio. Adicionar 
los ingredientes en agu a destilada tibia y calentar con agitación constante hasta ebullición e inmediatamente 
retirar del calor. No esterilizar. Enfriar a 50°C y colocar en cajas de Petri. Dejar secar las placas de 37 -45°C 
antes de usar.  
B 7.7.2.3  Agar modificado con Celobiosa, Polimixina B y Colistina (mCPC)  
SOLUCION 1  Cantidad  
Peptona  10 g 
Extracto de carne  5 g 
Cloruro de sodio  20 g 
Solución Stock de colorante 1 000  1 mL  
Agar  15 g 
Agua destilada  900 mL  
 
Ajustar el pH a 7,6. Hierva hasta que se disuelva el Agar.  
Esteriliz ar por autoclave 15 minutos a 121°C. Enfríe de 48 -55°C.  
SOLUCION STOCK DE  
COLORANTES  1 000 X :  Cantidad  
Azul de Bromotimol  4 g 
Rojo de cresol  4 g 
Etanol al 95%  100 mL  
 
Para obtener un color firme del medio usar una solución colorante stock en lugar de estar pesando 
repetidamente los colorantes en polvo. Disuelva el colorante en etanol hasta obtener una solución al 4% 
(peso/volumen). Agregue 1 mL de esta solución a cada litro de agar mCPC, la cual tendrá al final 40 mg de 
Azul de Bromotimol y 40 mg de Ro jo Cresol por litro.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
SOLUCION  2: Cantidad  
Celobiosa  10 g 
Colistina  400 000 Ul  
Polimixina B  100 000 UI  
Agua destilada  100 mL  
 
Disuelva la celobiosa por calentamiento en agua destilada. Enfríe y agregue los antibióticos. Esterilice por 
filtración, agreg ue la solución 2 a la solución 1 mezcle y distribuya en cajas Petri.  
B 7.7.2.4  Agar T 1N1 (Agar Triptona y Sal)  
Ingredientes  Cantidad  
Triptona o tripticasa  10 g 
Cloruro de sodio  10 g 
Agar  20 g 
Agua destilada  1 000 mL  
 
Suspenda los ingredientes y hierva  hasta disolución del agar, si lo desea inclinado, distribuya en tubos. 
Esterilice en autoclave 15 minutos a 121°C. Deje solidificar los tubos inclinados, para placas enfríe el medio 
de 45 -50°C y distribuya en cajas Petri estériles.  
B 7.7.2.5  Agar Gelatina  (GA)  
Ingredientes  Cantidad  
Peptona  4 g 
Extracto de levadura  1 g 
Gelatina  15 g 
Agar  15 g 
Agua destilada  1 000 mL  
 
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolución de la gelatina y el agar, ajuste el pH a 7,2 ± 0.2. 
Esterilice en autoclave 15 minut os a 121°C. Enfríe de 45 -50°C y distribuya en cajas Petri estériles.  
B 7.7.2.6  Agar Gelatina con Sal (GS)  
Preparar agar gelatina (GA), pero adicionando 30 g de Cloruro de Sodio por cada litro. Suspenda los 
ingredientes y hierva hasta disolver la gelatina y  el agar. Ajuste el pH de 7,2 ± 0,2. Esterilice en autoclave 15 
minutos a 121°C. Enfríe de 45 -50°C, coloque en cajas Petri. Si es necesario para inhibir la diseminación de 
Vibrio spp. tal como V. alginolyticus , use de 25 -30 g de agar por litro.  
B 7.7.2.7 Caldo Glucosa de Hugh -Leifson  
Ingredientes  Cantidad  
Peptona  2 g 
Extracto de levadura  0,5 g  
Cloruro de Sodio  20 g 
Dextrosa  10 g 
Púrpura de Bromocresol  0,015 g  
Agar  3 g 
Agua destilada  1 000 mL  
 
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolver el agar . Ajuste el pH a 7,4 ± 0,2. Coloque en tubos y 
esterilice en autoclave 15 minutos a 121°C.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 7.7.2.8 Medio Base de Descarboxilasa (Arginina, Lisina y Ornitina)  
BASE  Cantidad  
Peptona  5 g 
Extracto de levadura  3 g 
Dextrosa (D -glucosa)  1 g 
Púrpura de Bromo cresol  0.02 g  
Agua destilada  1 000 mL  
 
Para caldo de Arginina, Lisina y Ornitina, adicione 5 g de L -aminoácido a 1 litro de base. Como control, 
use base sin suplemento (aminoácido). Para Vibrio  spp. halofílicos, adicionar 15 g de Cloruro de Sodio por 
litro. Ajuste el pH de tal manera que después de la esterilización sea de 6,5 ± 0,2. Distribuya en tubos  y 
esterilice en autoclave 10 minutos a 121°C.  
B 7.7.2.9  Caldo Triptona y Caldos Triptona Sal  T1N0,T1N1,T1N3 
T1N6,T1N8 y T1N10 
Ingredientes  Cantidad  
Triptona o Tripticasa  10 g 
Cloruro de Sodio  0, 10, 30, 60, 80, ó 100 g  
Agua destilada  1 000 mL  
 
Disuelva los ingredientes en agua destilada, para  T1N0  no agregue Cloruro de Sodio, para T1N1  use  10 g 
de Cloruro de Sodio (1% w/v concentración de Cloruro de S odio); así respectivamente. Para T1N3 usar 30 g 
de NaCl por litro (3% w/v concentración de Cloruro de Sodio) Distribuya en tubos de tapón de rosca de 16 x 
150 mm, tape los tubos. Esterilice en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Ajuste el pH a 7,2 ± 0,2.  
B 7.7.2.10 Caldo Soya Tripticasa (TSB)  
Ingredientes  Cantidad  
Peptona de Tripticasa (Triptona)  17 g 
Peptona de fitona (Soytona)  3 g 
Cloruro de Sodio  5 g 
Fosfato dipotásico  2,5 g  
Dextrosa  2,5 g  
Agua destilada  1 000 mL  
 
Suspenda los ingredientes en ag ua destilada y caliente hasta disolución. Distribuya 225 mL en matraces 
de 500 mL o tubos. Esterilice en autoclave durante 15 minutos a 121°C. El pH final debe ser de 7,2 ± 0,2.  
B 7.7.2.11 Agar Soya Tripticasa  (TSA)  
Ingredientes  Cantidad  
Peptona de fitona  (Soytona)  5 g 
Peptona tripticasa (Triptona)  15 g 
Cloruro de Sodio  5 g 
Agar  15 g 
Agua destilada  1 000 mL  
 
Suspenda los ingredientes en agua destilada y hierva durante un minuto hasta disolución del agar. Para 
Vibrio spp. halofílicos, agregar 15 g de C loruro de Sodio. Distribuya dentro de tubos o matraces. Esterilice en 
autoclave durante 15 minutos a 121°C. Deje solidificar l os tubos inclinados o deje enfri ar de 45 -50°C y 
distribuya en cajas Petri. El pH final debe ser de 7,3 ± 0,2.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 7.7.2.12  Agar de H ierro Kligler  (KIA)  
Ingredientes  Cantidad  
Peptona polipeptona  20 g 
Dextrosa  1 g 
Citrato férrico amoniacal  0.5 g  
Lactosa  20 g 
Cloruro de Sodio  5 g 
Tiosulfito de sodio  0.5 g  
Rojo de fenol  0.025 g  
Agar  15 g 
Agua destilada  1000 mL  
 
Suspender los ingr edientes y hervir hasta disolución del agar. Distribuir en tubos de tapón de rosca. 
Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Dejar solidificar los tubos inclinados. Ajustar el pH de  7,4 
± 0,2.  
B 7.7.2.13 Agar Arginina Glucosa Inclinado (AGS)  
Ingredientes  Cantidad  
Peptona  5 g 
Extracto de levadura  3 g 
Tristona  10 g 
Cloruro de Sodio  20 g 
Glucosa  1 g 
L-Arginina (hidrocloruro)  5 g 
Citrato férrico amónico  0,5 g  
Tiosulfato de Sodio  0,3 g  
Púrpura de Bromocresol  0,2 g  
Agar  13,5 g  
Agua destilad a 1 000 mL  
 
Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir hasta disolución del agar, y distribuir en cantidades 
de 5 mL a tubos de 13 x 100 mm. Ajustar el pH de 6,8 a 7,0. Esterilizar en autoclave de 10 a 12 minutos a 
121°C. Deje solidificar el med io inclinado.  
B 7.7.2.14 Agar Triple Azúcar y Hierro  (TSI)  
Ingredientes  Cantidad  
Polipeptona  20 g 
Cloruro de Sodio  5 g 
Lactosa  10 g 
Sacarosa  10 g 
Glucosa  1 g 
Sulfato ferroso amónico  0,2 g  
Tiosulfato de Sodio  0,2 g  
Rojo de fenol  0,025 g  
Agar  13 g 
Agua destilada  1 000 mL  
 
Disolver los ingredientes en agua destilada. Mezclar bien y calentar a ebullición, agitando ocasionalmente 
hasta completa disolución. Enfríar a 60°C y ajuste el pH de  7,3 ± 0,1.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 7.7.2.15  Agar de Hierro y Lisina  (LIA)  
Ingrediente s Cantidad  
Peptona o gelisato  5,0 g  
Extracto de levadura  3,0 g  
Glucosa  1,0 g  
L-Lisina  10,0 g  
Citrato férrico amónico  0,5 g  
Tiosulfato de sodio  0,04 g  
Púrpura de bromocresol  0,02 g  
Agar  15,0 g  
Agua destilada  1 000 mL  
 
Disolver los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien; calentar hasta ebullición con agitación 
frecuente hasta conseguir la disolución completa. Esterilizar en aut oclave 12 minutos a 121°C. Enfri ar de  50-
60°C y ajustar el pH de 6,7 ± 0,1. Distribuir en volúmenes de 3 mL en tu bos de 13 x 100 mm. Los tubos se 
enfrían en posición inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 3 cm y una parte inclinada 
de 2 cm.  
B 7.7.2.16  Caldo Rojo de Metilo y Vogues Proskauer(RM -VP) 
Ingredientes  Cantidad  
Peptona  7 g 
Glucosa  5 g 
Fosfato dipotásico  5 g 
Agua destilada  1000 mL  
 
Disolver los ingredientes en 800 mL de agua tibia. Para Vibrio spp  halofílicos, agregar 15 g más de Cloruro 
de Sodio (para una concentración final del 2%). Filtrar, enfríar a 20°C y diluir a 1 litro. Distrib uya en tubos. 
Esterilizar en autoclaves durante 12 - 15 minutos a 121°C. Ajustar el pH de 6,9 +/ - 0,2. 
B 7.7.2.17  Medio para prueba de movilidad (Semisólida)  
Ingredientes  Cantidad  
Peptona  10 g 
Extracto de carne  3 g 
Cloruro de Sodio  5 g 
Agar  4 g 
Agua d estilada  1000 mL  
 
Calentar con agitación y hervir de 1 a 2 minutos hasta disolución del agar. Para Vibrio spp  halofílicos 
agregar 15 g más de Cloruro de Sodio (para una concentración final del 2%). Distribuir en tubos con tapón de 
rosca. Esterilizar en au toclave 15 minutos a 121°C. Ajustar el pH de 7,4 ± 0,2.  
B 7.7.3 Soluciones y reactivos para pruebas bioquímicas  
B 7.7.3. 1 Prueba de Rojo de Metilo.  
Ingredientes  Cantidad  
Rojo de metilo  0,1 g  
Alcohol etílico  300 mL  
Agua destilada  200 mL  
 
Disolver el Roj o de Metilo en el alcohol y diluir con el agua destilada, para llevar a cabo la prueba, añadir 5 
gotas de la solución a 5 mL del cultivo problema.  
Resultados: Un color rojo demuestra un pH menor a 4,5 y la prueba es Positiva. Un color amarillo se 
reporta c omo prueba Negativa.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 7.7.3.2  Prueba de Vogues -Proskauer.  
Esta prueba es para comprobar la presencia del Diacetilo.  
Soluciones  Cantidad  
Alfa Naftol  5 g 
Alcohol Etílico absoluto  100 mL  
 
Añadir 0,6 mL de la solución de Alfa Naftol y 0,2 mL de una solució n acuosa al 40% de KOH a 1 mL de 
cultivo.  
Resultados: El desarrollo de una coloración roja en 15 minutos constituye una reacción POSITIVA.  
B 7.7.3.3  Prueba de Oxidasa.  
Soluciones  Cantidad  
N,N,N,N -Tetrametil -p-Fenilendiamino  0,5 g  
Agua destilada  100 mL  
 
Conservar en frasco oscuro a 5 -10°C. El reactivo se conserva durante 14 días.  
Sembrar en un tubo de base de gelosa para sangre. Incubar 18 horas a 35°C. Agregar 0,3 mL de reactivo.  
Resultado: La reacción positiva se observa por la producción de un color az ul en un minuto.  
B 7.7.3.4  Reacción de Indol.  
REACTIVO DE KOVAC  
Soluciones  Cantidad  
p-dimetilaminobenzaldehído  5.0 g  
Alcohol amílico o alcohol isoamílico  750 mL  
Acido clorhídrico concentrado  25 mL  
 
Disolver el p -dimetilaminobenzaldehído en el alcohol a mílico y agregar el ácido clorhídrico lentamente, 
gota a gota y agitando. Debe conservarse en frasco ámbar con tapón esmerilado; el color del reactivo va del 
amarillo al café claro. Se debe conservar a 4°C.  
Sembrar un tubo con 5 mL de caldo triptona. Incub ar 48 horas a 35°C. Agregar de 0,2 a 0,3 mL del 
reactivo. El desarrollo de un color intenso, constituye una prueba Positiva para indol.  
B 7.7.4 Toma de muestra  
La toma de muestra para análisis microbiológicos, se deberá hacer en condiciones asépticas y en 
recipientes estériles.  
B 7.7.5  Preparación de la muestra . 
B 7.7.5.1 Líquidos.  
De cada muestra tomar 25 mL e introducirlas en un matraz que contenga 225 mL de agua peptonada 
alcalina (APW) y homogeneizar por 2 min. Esta es la dilución 1:10. De esta dilución  preparar la dilución 1:100 
y 1:1000, en 9 o 90 mL de agua peptonada alcalina.  
Incubar las tres diluciones de 35 a 37°C.  
B 7.7.5.2 Sólidos.  
De cada muestra pesar 50 g y colocar en un matraz que contenga 450 mL de agua peptonada alcalina 
(APW). Esto hace la  dilución 1:10. Preparar dos series de diluciones de 1:100 y 1:1000. Por lo tanto tenemos 
dos series de 3 diluciones. Incubar una serie de 35 a 37°C y la otra a 42°C.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 7.7.6  Resembrar  
Después de la incubación, y sin agitar, transferir el inóculo de la pel ícula (crecimiento superficial) con un 
asa de 3 -5 mm de diámetro a una placa por lo menos, de cada uno de los medios de cultivo selectivos: Agar 
con tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa (TCBS) o al agar modificado con celobiosa, polimixina B y 
colistina (mCPC), la polimixina inhibe al biotipo Clásico de V. cholerae . Incubar el agar TCBS durante 18 a 24 
horas de 35 -37°C y el agar mCPC durante 18 a 24 horas de 39 -40°C.  
B 7.7.6.1  Morfología colonial.  
Examinar las placas a fin de determinar si se pres entan las características coloniales que a continuación 
se describen, seleccionar por lo menos 3 colonias sospechosas de cad a placa y aplicarlas con estrí a cruzada 
para aislar en agar T 1N1 o en agar soya tripticasa con sal (al 2% de concentración de NaCl) e incubar durante 
12-18 horas a  35-37°C. Es necesario hacer un cultivo en un medio no selectivo a fin de garantizar la pureza 
de las colonias, antes de las pruebas bioquímicas, se puede inocular a los agares gelatina (GA) y gelatina sal 
(GS) en el segundo día. Los resultados serán confiables si las placas de aislamiento muestran colonias puras.  
B 7.7.6.1.1  Agar TCBS . Las colonias de V. cholerae  (El Tor y Clásico) son grandes, lisas, amarillas 
(positivas para la fermentación de la sacarosa) y ligeramente ach atadas, con el centro opaco y los bordes 
translúcidos.  
Nota: Las especies de Vibrio  no producen colonias pequeñas de color crema en agar TCBS. Las colonias 
de V. mimicus , que están estrechamente relacionadas con la especie anterior, son verdes (sacarosa 
negativas). La mayoría de las demás especies de Vibrio  crecen en agar TCBS y producen colonias amarillas  
y verdes.  
B 7.7.6.1.2  Agar mCPC . Las colonias de V. cholerae  El Tor son púrpuras (negativas para la fermentación 
de la celobiosa). El V. vulnificus  produce colonias amarillas achatadas, con el centro opaco y los bordes 
translúcidos. La mayoría de las demás especies de Vibrio  no crecen fácilmente en agar mCPC.  
B 7.7.6.2 Diferenciación.  
Diferenciación de los vibrios sospechosos de los microorganismos que no  son vibrios.  
B 7.7.6.2.1  TSI,KIA y agar inclinado de Arginina y Glucosa (AGS). Inocular las colonias individuales en 
medios de cultivo TSI (Agar de Triple Azúcar y Hierro), KIA (Agar de Hierro Kliger) y AGS, picar y estriar en el 
agar inclinado. Incubar l os tubos inoculados, con el tapón no muy apretado, durante 18 a 24 horas  de 35 -
37°C. Se recomiendan estos medios porque las reacciones permiten efectuar una diferenciación presuntiva 
entre la mayoría de las especies de Vibrio , Aeromonas , Plesiomonas,  Shigella y otras bacterias.  
B 7.7.6.2.2  Caldo triptona al 3% de NaCl (T 1N3). Inocular las colonias en los caldos T 1N0 y T1N3 e incubar 
durante 18 a 24 horas de 35 -37°C. El V. cholerae  y el V. mimicus  crecerán en T 1N0 y T1N3. Algunas especies 
de bacterias que n o son vibrios y que presentan reacciones similares a las de V. cholerae  en medios de TSI y 
LIA no crecen en T 1N3. La mayoría de las especies Vibrio  spp, incluyen algunos V. cholerae  No. 01, crecerán 
en T 1N3 únicamente de la familia Vibrionaceae crece solam ente en T 1N3. 
B 7.7.6.2.3  Una alternativa consiste en usar agar gelatina (GA) y agar gelatina con 3% de NaCl (GS) para 
determinar la tolerancia de los cultivos puros a la sal. Dividir las placas en ocho sectores, inocular una línea 
recta en el centro de un  sector de las placas, tanto de GA como de GS con cada cultivo puro. Incubar durante 
18 a 24 horas de 35 - 37°C. El V. cholerae  y el V. mimicus  crecerán. El Vibrio spp halofílico crecerá en ambas 
placas, porque ellos no requieren de sal. Sólo en la placa c on GS. Para leer la reacción de la gelatinasa 
sostener la placa sobre una superficie negra, observará un halo opaco alrededor de la colonia de los 
microorganismos gelatinasa positivos.  
B 7.7.6.2.4  Caldo glucosa de Hugh -Leifson. Inocular colonias individual es en tubos duplicados con caldo 
de glucosa de Hugh -Leifson. Recubrir un tubo con una capa de aceite mineral estéril o vapor líquido (50% de 
petrolato y 50% de parafina) unos dos centímetros de grueso. Incubar ambos tubos durante 18 a 24 horas  de 
35-37°C.  Las especies de Vibrio spp utilizan la glucosa tanto para la oxidación como para la fermentación. Las 
especies de Pseudomonas  que comúnmente se aíslan del pescado y los mariscos con métodos de 
enriquecimiento que se usan para las especies de Vibrio , utilizan la glucosa sólo para la oxidación.  
B 7.7.6.2.5  Prueba de oxidasa. Realizar la prueba de oxidasa con cultivos puros de agar soya tripticasa 
(2% de NaCl) u otro medio que no contenga carbohidratos fermentables. Un método fácil consiste en colocar 
un círc ulo de papel filtro en una caja de Petri y humedecerlo con algunas gotas de reactivo de oxidasa. Con un 
palito aplicador de madera, un mondadientes o una asa de platino estéril, sacar un poco de cultivo de la placa 
y tocar el papel humedecido, si hay micro organismos oxidasa positivos, el papel se tornará púrpura oscura o 
azul en pocos segundos. Las especies patógenas de Vibrio  spp. son oxidasa positivas (excepto el V. 
metschnnikovii ). Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 7.7.6.3  Identificación y Confirmación de V. cholerae  01, V.cholerae  NO 01 y V. mimicus . 
B 7.7.6.3.1  Leer los resultados de las prueba  bioquímicas de TSI, KIA, AGS, T 1N0 y T1N3 o GA Y GS, y 
caldo glucosa de Hugh -Leifson.  
B 7.7.6.3.2  Hacer una tinción de Gram a un cultivo de 18 a 24 horas en caldo o agar.  
NOTA: Los cultivos pur os que se someterán a las demás pruebas serológicas y bioquímicas para  el V. 
cholerae  son sacarosa positivos (amarillo) en agar TCBS y sacarosa negativos (verdes) en el caso de V. 
mimicus  o son celobiosa negativos (verde -púrpura) en agar mCPC, crecen en c aldo T 1N0 o en placas con GA; 
presentan reacciones características en TSI, KIA y AGS. Son gelatina y oxidasa positivos, son bacilos curvos 
gram negativos y producen ácido a partir de la glucosa, tanto en la oxidación como en la fermentación, en el 
caldo de  cultivo de Hugh -Leifson.  
B 7.7.6.3.3  Pruebas bioquímicas. Las reacciones bioquímicas para identificación de V. cholerae  y otras 
especies bacterianas afines figuran en el cuadro anexo. La fórmula para todos los medios bioqu ímicos deberá 
contener por lo men os un 2% de NaCl. En vez de medios convencionales se pueden usar tiras AP120E, con 
2% de NaCl como diluyente. Para el V. cholerae  se puede usar solución salina fisiológica (0,85% de NaC1) 
como diluyente.  
B 7.7.6.3.4  Prueba serológica de aglutinación. Usar antisuero de diagnóstico del grupo 01 y del subgrupo 
Inaba (factores AC) y Ogawa (Factores AB) para el antígeno del serotipo 01. Usar cultivos de 16 a 24 horas 
producidos en TSA. Incluir cultivos positivos y negativos, y los controles salinos para cada ant isuero usado. 
Seguir las instrucciones del antisuero. Como es posible que los antígenos de los antisueros estén 
relacionados entre sí, hay que realizar pruebas bioquímicas para confirmar que el cultivo puro sea de V. 
cholerae  01 o No 01.  
Nota: Anticuerpos monoclonales están disponibles, pero el anti -B y anti -C reaccionan opuestamente con 
bacterias de otras especies. Uso de anticuerpos policlonales y/o monoclonales será para el antígeno del 
complejo 01.  
B 7.7.6.3.4.1 Los cultivos que aglutinan con el antisue ro del grupo 01, pero no en solución salina 
fisiológica simple, son de V. cholerae  del grupo 01 si las reacciones bioquímicas confirman que el cultivo puro 
es de V. cholerae . Los cultivos que se aglutinan con este antisuero para grupos específicos pueden s er 
clasificados según el subtipo con anticuerpos Inaba y Ogawa.  
B 7.7.6.3.4.2 Los cultivos que aglutinan con el suero polivalente (grupo 01) y con los antisueros Inaba y 
Ogawa, tienen los 3 factores (A,  B y C) y son del serotipo Hikojima.  
B 7.7.6.3.4.3 Los cultivos que aglutinan con el antisuero polivalente pero no aglutinan con antisueros Inaba 
y Ogawa, no se pueden tipificar con estos antisueros.  
B 7.7.6.3.4.4 Los cultivos de V. cholerae  cuya identidad se haya confirmado con métodos bioquímicos y 
que no a glutinen con el antisuero del grupo 01 son V. cholerae  No 01. El suero para la clasificación de V. 
cholerae  No 01 según el tipo se puede obtener de R.J. Siebeling.  
B 7.7.6.3.4.5 Los cultivos que se aglutinan en el antisuero del grupo 01 y en solución salin a, no se pueden 
clasificar según el tipo. Sin embargo, si se usa un medio más rico, como en TSA o agar infusión cerebro 
corazón (BHI), se puede eliminar esta autoaglutinación.  
B 7.7.6.3.5 Características mínimas para la identificación de V. cholerae . 
Las c aracterísticas que permiten suponer la presencia de V. cholerae  como mínimo son las siguientes:  
B 7.7.6.3.5.1 Morfología.  
B 7.7.6.3.5.2 Bacilo o bacilo encorvado, esporogénico y gram negativo.  
B 7.7.6.3.5.3 Aspecto en TSI.  
B 7.7.6.3.5.4 Estría ácido, picad ura ácido, gas negativo y H 2S negativo.  
B 7.7.6.3.5.5 . Prueba de Hugh -Leifson.  
B 7.7.6.3.5.6 Fermentación de la glucosa y oxidación positiva.  
B 7.7.6.3.5.7 Citocromo -oxidasa positivo.  
B 7.7.6.3.5.8 Prueba de la Dihidrolasa arginina: negativo.  
B 7.7.6.3.5.9  Prueba de la Lisinadescarboxilasa: positivo.  
B 7.7.6.3.5.10  Prueba de VP: Positivo El Tor, negativo Clásico y V. mimicus . 
Crecimiento a 42°C: positivo.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 7.7.6.3.5.11  Prueba de halofilia con NaCl. 0% : positivo, 3%: positivo, 6%: usualmente negativo. Algun as 
cepas de V. cholerae  NO 01 se desarrollan a 0% de NaCl.  
B 7.7.6.3.5.12  Fermentación de la sacarosa: positivo para V. cholerae  (negativo para V. mimicus ). 
B 7.7.6.3.5.13  Prueba de ONPG: positivo.  
B 7.7.6.3.5.14  Fermentación de la arabinosa: negativo.  
B 7.7.6.3.5.15  0/129 sensitiva: sensible para 10 y 150 µg 0/129  
REACCIONES DE ALGUNOS Vibrio  spp. Y G ENEROS RELACIONADOS EN AGAR KIA, TSI Y AGS.  
Microorganismos  KIA TSI AGS  
Estría  Picadura  Estría  Picadura  Estría  Picadura  
V. cholerae  K A A(K)*  A K a 
V. mimicus K A K(A)* A K A 
V. parahaemolyticus  K A K A K A 
V. alginolyticus  K A A A K A 
V. vulnificus  K o A  A K(A)*  A K A 
Aeromonas  
hidrophyla  K o A  A K o A  A K K 
Plesiomonas shigelloides  K o A  A K o A  A N N 
 
* = Raramente K = Alcalino A = Acido a = Ligera mente ácido N = Neutro  
Ninguna de las especies enumeradas produce sulfuro de hidrógeno en medios KIA, TSI o AGS, ni una 
cantidad perceptible de gas a partir de glucosa en medios KIA, TSI o AGS. Algunas especies de Aeromonas  
spp. Pueden producir gas a parti r de glucosa en estos medios.  
B 7.8 Método para la determinación de Staphylococcus aureus  
B 7.8.1  Fundamento  
Este método permite hacer una estimación del contenido de Staphylococcus aureus en alimentos, se 
efectúa directamente en placas de medio de cultivo  selectivo y diferencial, con la confirmación mediante las 
pruebas de coagulasa y termonucleasa. Este método es adecuado para el análisis de alimentos en los cuales 
se esperen más de 100 células de Staphylococcus aureus por g.  
B 7.8.2 Reactivos  
En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, para su preparación se deben seguir las 
instrucciones impresas en la etiqueta respectiva.  
Cuando se mencione agua debe entenderse que se trata de "agua destilada".  
Los reactivos a emplear en el método objet o de esta norma deben ser grado analítico.  
B 7.8.2.1  Soluciones diluyentes  
B 7.8.2.2  Solución reguladora de fosfatos (Solución concentrada)  
Ingredientes  Cantidad  
Fosfato monopotásico  34,0 g  
Agua  1 L 
 
Preparación  
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1 N, aforar 
con agua a 1 L.  
Esterilizar durante 15 min a 121ºC ±  1, conservar en refrigeración (solución concentrada).  
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a 1 L con agua (solución de trab ajo). Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera.  
Esterilizar a 121ºC ±  1 durante 15 min.  
Después de la esterilización, los volúmenes finales y el pH de la solución de trabajo deben ser iguales a 
los iniciales.  
B 7.8.2.3  Agua peptonada  
Ingredientes  Cantidad  
Peptona  1,0 g  
Cloruro de sodio  8,5 g  
Agua  1 L 
 
Preparación  
Disolver los componentes en un litro de agua.  
Ajustar el pH a 7,0 con solución de hidróxido de sodio 1N.  
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera.  
Esterili zar a 121ºC ±1 durante 15 min.  
Después de la esterilización los volúmenes finales y el pH de la solución de trabajo deben ser iguales a los 
iniciales.  
B 7.8.2.4  Medios de cultivo  
B 7.8.2.5  Medio de Baird -Parker  
Ingredientes  Cantidad  
Medio base  
(numeral B 7.8.2.6)  95,0 mL  
Solución de telurito de potasio (numeral B 7.8.2.7)  1,0 mL  
Emulsión de yema de huevo (numeral B 7.8.2.9)  5,0 mL  
 
Preparación  
Cuando el medio base esté a 45ºC, agregar los demás ingredientes y mezclar.  
Colocar de 15 a 20 mL del medio com pleto, enfriar y dejar solidificar.  
Las placas pueden almacenarse por 48 h a temperatura de 0 a 5ºC.  
B 7.8.2.6  Medio base de Baird -Parker  
Ingredientes  Cantidad  
Tripona  10 g 
Extracto de levadura  1,0 g  
Extracto de carne  5,0 g  
Glicina  12,0 g  
Cloruro d e litio  5,0 g  
Piruvato de sodio  10,0 g  
Agar  20,0 g  
Agua  1,0 l 
 
Preparación  
Disolver los ingredientes o el agar base en agua y calentar con agitación constante y hervir durante 1 min. 
Esterilizar a 121ºC ±  1 durante 15 min.  
Enfriar y mantener el medio  a 45ºC.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 7.8.2.7  Solución de telurito  
Ingredientes  Cantidad  
Telurito de potasio  1,0 g  
Agua  100,0 mL  
 
Preparación  
Disolver el telurito de potasio en agua y esterilizar.  
La solución puede ser almacenada por varios meses a temperatura de 0 a 5ºC.  
B 7.8. 2.8 Solución salina isotónica  
Ingredientes  Cantidad  
Cloruro de sodio  0,85 g  
Agua  100,0 mL  
 
Preparación  
Disolver el ingrediente en agua y esterilizar a 121ºC ±  1 durante 15 min.  
B 7.8.2.9  Emulsión de yema de huevo  
Preparación  
Lavar con agua y jabón los huevos frescos que sean necesarios y limpiarlos con una solución de tintura de 
yodo (solución alcohólica al 2%) o sumergirlos en solución de cloruro mercúrico (1:1000). Enjuagar con agua 
estéril y secar con gasa estéril.  
En campana de flujo laminar o en co ndiciones asépticas, abrir los huevos y vaciarlos en un separador de 
claras estéril. Transferir las yemas a una probeta hasta un volumen de 60 mL y completar a 90 mL con 
solución salina isotónica.  
Verter la emulsión a un matraz Erlenmeyer con perlas de vid rio estéril y agitar fuertemente para formar  la 
emulsión.  
Filtrar a través de gasa.  
Las placas deben utilizarse dentro de las 48 h siguientes a su preparación.  
B 7.8.2.9  Caldo de infusión cerebro -corazón (BHI)  
Ingredientes  Cantidad  
Infusión de cerebro de ternera  200,0 mL  
Infusión de corazón de res  250,0 mL  
Peptona de gelatina  10,0 g  
Cloruro de sodio  5,0 g  
Fosfato disódico dodecahidratado  2,5 g  
Glucosa  2,0 g  
Agua  1,0 mL  
 
Preparación  
Disolver los ingredientes en agua y calentar ligeramente si es nec esario.  
Distribuir y esterilizar durante 15 min a 121ºC ±  1. Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 7.8.2.10  Acido desoxirribonucleico helicoidal de timo de ternera.  
Ingredientes  Cantidad  
Acido desoxirribonucléico helicoidal de timo de ternera 
o equivalente  0,03 g  
Agar  1,0 g  
Cloruro de ca lcio anhídro (solución 0,01 M) (numeral B 
7.8.2.11)  0,10 mL  
Cloruro de sodio  1,0 g  
Azul de toluidina (solución 0,1 M) (numeral B 7.8.2.12)  0,30 mL  
Tris-(hidroximetil -aminometano) (Tris solución 0,05 M, 
pH 9)  
(numeral B 7.8.2.13)  100 mL  
 
Preparación  
Disolver los ingredientes, excepto el azul de toluidina agitando hasta completar la disolución del ácido 
desoxirribonucleico y calentar a ebullición.  
Agregar el azul de toluidina. Distribuir en frascos pequeños con tapón de hule. No es necesario esterilizar.  
Este medio es estable a temperatura ambiente hasta 4 meses y funciona perfectamente aun después de 
fundirlo varias veces.  
Tomar un portaobjetos limpio y agregar 3 mL del medio fundido esparciéndolo por la superficie.  
Cuando el agar solidifique, hacer orifi cios con la punta de una pipeta Pasteur.  
Conservar en refrigeración para evitar la deshidratación.  
B 7.8.2.11  Solución de cloruro de calcio anhidro 0,01 M  
Cloruro de calcio PM = 110,99  
Disolver 0,1199 g de cloruro de calcio en 100 mL de agua.  
B 7.8.2.12  Solución de azul de toluidina 0,1 M  
Disolver 3,05 g de azul de toluidina en 100 mL de agua.  
B 7.8.2.13  Solución amortiguadora 0,05 M Tris -(hidroximetilaminometano)  
(Tris pH 9) PM = 121,1  
Disolver 6,055 g de Tris en 100 mL de agua.  
B 7.8.2.14  Plasma de conejo  
Emplear plasma deshidratado o rehidratado de conejo siguiendo las instrucciones del fabricante y agregar 
ácido etilendiaminotetracético (EDTA) en solución al 0,1% en plasma rehidratado. Si se utiliza plasma 
deshidratado diluir con agua estéril en proporci ón de 1:3.  
Puede emplearse plasma de conejo liofilizado adicionado de EDTA. No debe emplearse sangre citratada.  
B 7.8.3 Materiales  
Todos los instrumentos que se utilicen para trabajar la muestra deben esterilizarse mediante horno, 
durante 2 h de 170 -175ºC o como alternativa en autoclave durante 15 min como mínimo a 121ºC ±  1. 
B 7.8.3.1  Cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas y separador de huevo.  
B 7.8.3.2  Tubos de cultivo de 16 mm x 150 mm o frascos de 125 a 250 mL de capacidad.  
B 7.8.3.3  Tubos de cultivo de 10 mm x 75 mm.  
B 7.8.3.4  Cajas Petri de 90 a 100 mm de diámetro.  
B 7.8.3.5  Pipetas bacteriológicas de 1 mL y 10 mL de capacidad graduadas en 0,1 mL y 1 mL , 
respectivamente y diámetro de 2 a 3 mm.  
B 7.8.3.6  Pipetas Pasteur.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 7.8.3.7  Probetas.  
B 7.8.3.8  Varillas de vidrio de 3,5 mm de diámetro aproximadamente y 20 cm de largo dobladas en  ángulo 
recto.  
B 7.8.3.9  Matraz Erlenmeyer con perlas de vidrio  
B 7.8.3.10  Cámara húmeda: consiste en una caja Petri en la cual se coloca una varilla de vidrio en forma 
de "V" rodeada de algodón humedecido con agua.  
B 7.8.4 Aparatos  
B 7.8.4.1  Horno para esterilizar que alcance 180°C.  
B 7.8.4.2  Autoclave con termómetro.  
B 7.8.4.3  Baño de agua con regulador de temperatura de 35 ± 0,5ºC.  
B 7.8.4.4  Baño de agua con regu lador de temperatura de 45 ± 0,5ºC.  
B 7.8.4.5  Balanza con capacidad no mayor de 2,500 g y sensibilidad de 0,1 g.  
B 7.8.4.6  Incubadora a 35 ± 1ºC.  
B 7.8.5 Preparación de la muestra  
La preparación de la muestra se debe realizar de acuerdo a lo establecido en  B 7.1  "Preparación y 
Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico".  
B 7.8.6 Procedimiento  
B 7.8.6.1 Utilizando diferentes pipetas de 1 mL para cada dilución, depositar 0,1 mL sobre la superficie de 
las placas de agar Baird -Parker.  
B 7.8.6.2 Distribuir el inóculo sobre la superficie del agar con varillas estériles de vidrio en ángulo recto, 
utilizando una para cada dilución.  
B 7.8.6.3 Mantener las placas en su posición hasta que el inóculo sea absorbido por el agar.  
B 7.8.6.4 Invertir l as placas e incubar de 45 a 48 h a 35ºC.  
B 7.8.6.5 Seleccionar las placas que tengan entre 15 y 150 colonias típicas de Staphylococcus aureus ; si 
no es posible, seleccionar las placas de las diluciones más altas no obstante tengan más de 150 colonias.  
B 7.8.6.6 Cuando las placas tengan menos de 15 colonias típicas también pueden ser utilizadas y al 
informe se debe agregar la nota de "valor estimado".  
B 7.8.6.7 Las colonias típicas son negras, circulares, brillantes, convexas, lisas, de diámetro de 1 a 2 mm y 
muestran una zona opaca y un halo claro alrededor de la colonia.  
B 7.8.6.8 Seleccionar las colonias de acuerdo con el siguiente cuadro para realizar las pruebas de 
coagulasa y termonucleasa:  
CUADRO 1  
Número de colonias   sospechosas en 
caja Número de colo nias  por 
probar  
Menos de 50  3 
51 a 100  5 
101 a 150 o más  7 
 
B 7.8.6.9 Seleccionar el número de colonias y sembrar cada una en tubos con 0,5 mL de caldo de infusión 
cerebro -corazón.  
B 7.8.6.10 Incubar a 35ºC durante 24 h.  
B 7.8.6.11 Inocular en la mism a forma cepas conocidas de Staphylococcus aureus y Staphylococcus 
epidermidis como testigos positivo y negativo.  
B 7.8.6.12 Después del periodo de incubación pasar con una pipeta de 1 mL,  0,3 mL de cada cultivo a otro 
tubo de 10 mm x 75 mm y conservarlo pa ra la prueba de termonucleasa. El resto del cultivo se usa para la 
prueba de coagulasa.  
B 7.8.6.13 Prueba de coagulasa  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 7.8.6.13.1  Agregar a los 0,2 mL del cultivo anterior, 0,2 mL de plasma de conejo diluido volumen a 
volumen con  solución  salina estéril.  
B 7.8.6.13.2  Incubar en baño de agua de 35 a 37ºC y observar durante 6 h a intervalos de 1 h; si no hay 
formación de coágulo, observar a las 24 h. Considerar positiva la prueba si hay formación de coágulo.  
B 7.8.6.13.3  Para comprobar la coagulabilidad del  plasma de conejo se añade una gota de cloruro de 
calcio al 5% a 0,5 mL de plasma reconstituido empleado, formándose un coágulo en 10 -15 seg.  
B 7.8.6.14  Prueba de termonucleasa  
B 7.8.6.14.1 Calentar durante 15 min, 0,3 mL de cultivo en caldo de infusión cer ebro-corazón en baño de 
agua hirviendo.  
B 7.8.6.14.2  Pasar una gota de cada cultivo por medio de una pipeta Pasteur a un orificio del medio, 
incluye testigo.  
B 7.8.6.14.3  Incubar a 35ºC en cámara húmeda de 4 a 24 h.  
B 7.8.6.14.4  La aparición de un halo col or rosa extendido de por lo menos 1 mm alrededor de la 
perforación se califica como positiva.  
B 7.8.7 Cálculo y expresión de resultados  
B 7.8.7.1 Cálculo  
Hacer el cálculo del contenido de microorganismos en el producto tomando en cuenta el número de 
coloni as totales, el número de colonias confirmadas, la dilución y el volumen inoculado (0,1 mL).  
Ejemplo 1:  
Si la caja tiene 80 colonias en la dilución 1:1000  
Se toman 5 colonias para la prueba, de éstas dan 4 positivas, el cálculo es:  
80 x 4  = 64 x 1000 x 10 =  640 000  
5 
Ejemplo 2:  
Si la caja tiene 14 colonias en la dilución 1:10  
Se toman 3 colonias para la prueba, de éstas dan 2 positivas, el cálculo es:  
14 x 2  = 9,3 x 10 x 10 = 930  
3 
B 7.8.7.2 Expresión de los resultados:  
Según ejemplo 1:  
Informar como Staphylococcus aureus 640 000 UFC/g  
Según ejemplo 2:  
Informar como Staphylococcus aureus 930 UFC/g valor estimado  
Si las pruebas confirmativas resultan negativas en todas las colonias probadas, informar como:  
0 UFC/g en muestras directas  
-10 UFC/g en muestras  de dilución 1:10  
-100 UFC/g en muestras de dilución 1:100  
En la práctica los resultados pueden variar, esto dependerá del técnico que trabaje el método y el grado de 
confiabilidad del mismo, que en el 95% de los casos es de ± 16% a ± 52%.  
B 7.9 Determinac ión de enterotoxina estafilocóccica por el método de ELISA . 
B 7.9.1  Principio del método.  
Este método se basa en un inmunoensayo visual el cual proporciona una prueba rápida (4 h), sensible  
(1,0 ng o más por mL o g), y  específica para la identificación de  las enterotoxinas A -E estafilocóccicas. Sin 
embargo, con esta prueba no se identifican los serotipos de enterotoxina, en forma individual. La prueba de 
Elisa se realiza en configuración de “sandwich”.  
B 7.9.2  Materiales y Equipo  
B 7.9.2.1  Algodón absorben te.       (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 7.9.2.2  Micropipetas de 50 -200 L y 5-20 L. 
B 7.9.2.3  Puntas de plástico para micropipeta.  
B 7.9.2.4  Plástico para envolver o sellar recipientes de plástico.  
B 7.9.2.5  Papel pH (intervalo 0 -14). 
B 7.9.2.6  Frascos de plástico de 500 mL.  
B 7.9.2.7  Jeringas de plástico de 25 mL.  
B 7.9.2.8  Tubos para centrífuga.  
B 7.9.2.9  Tubos de polipropileno de 12 x 75 mm.  
B 7.9.2.10  Polietilen glicol (PEG, peso molecular de 15,000 -20,000).  
B 7.9.2.11  Tubo de diálisis (12,000 -14,000 peso molecular exclusión).  
B 7.9.2.12  Vasos de precipitados de 250 mL.  
B 7.9.2.13  Filtros tipo jeringa  (para filtrar los alimentos). Preparar jeringas de plástico desechables  (0,25 
mL) e insertar suficiente cantidad de algodón absorbente, pa ra hacer un empaque de 0,5 cm. Pasar 5,0 mL de 
agua destilada, presionar con el émbolo para asegurarse de formar un paquete firme. Preparar 
inmediatamente antes de filtrar los extractos de alimento, para tratar con el aditivo provisto con el equipo.  
B 7.9. 2.14 Placa de 48 o 96 pozos recubiertos con el grupo de antisueros *.  
B 7.9.2.15  Soporte para sostener la placa *.  
B 7.9.2.16  Instructivo del método *.  
B 7.9.2.17  Comparador de color *.  
B 7.9.2.18  Hoja de resultados *.  
*Materiales suministrados por el fabr icante.  
B 7.9.2.19  Equipo TECRA TM. 
B 7.9.2.20  Incubadora a 35 -37°C.  
B 7.9.2.21  Omnimixer, licuadora (o equivalente) para la preparación de los extractos de alimentos.  
B 7.9.2.22  Centrífuga a 1000 -3000 x g.  
B 7.9.2.23  Agitador de microplacas (opcional).  
B 7.9.2.24  Lector de microplacas (opcional).  
B 7.9.2.25  Balanza.  
B 7.9.3  Reactivos.  
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico a menos que se indique otra 
especificación y por agua debe entenderse agua destilada.  
B 7.9.3.1  Soluci ón amortiguadora Tris 0,25 M (30,28 g  TRIS/L, pH 8,0).  
B 7.9.3.2  Solución de hidróxido de sodio 1,0 N (NaOH).  
B 7.9.3.3  Acido clorhídrico (HCl).  
B 7.9.3.4  Agua destilada o deionizada.  
B 7.9.3.5  Hipoclorito de sodio.  
B 7.9.3.6  BHI con 0,7% de agar (m/v).  
B 7.9.3.7  Solución de lavado. Contiene: 1,5 g de tris(hidroximetil) aminometano (Tris), 6g de NaCl, 2,0 g 
polioxietilen sorbitan monolaurato (Tween 20), y 0,001 g de timerosal en 25,0 mL de H 2O * 
B 7.9.3.8  Aditivo para la muestra. Es una solución que contien e: 2 g de Tween 20 y 0,001 g de timerosal 
en 6,0 mL de H 2O *. 
B 7.9.3.9 Control positivo: Diluir 25 L de control positivo concentrado (toxina estafilocóccica tipo B, 0,1 g 
Na2B4O7, 0,1 g de NaCl y 0,001 g de timerosal en 4,0 mL de  H2O), en 2,5 mL de sol. de lavado (7.10.5.1) *.  
B 7.9.3.10  Control negativo. Contiene: 0,0072 g de Tris, 0,1 g de NaCl, 0,001 g de timerosal y 0,01 g de 
Tween 20 en 6,0 mL de H 2O *. Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 7.9.3.11  Diluyente del Conjugado. Contiene: 0,2 g Na 2B4O7, 0,1 g de NaC l, 0,1 g de gelatina, y 0,001 g 
de timerosal en 13,5 mL de H2O *. 
B 7.9.3.12  Conjugado liofilizado. Un frasco que contiene antisuero polivalente (A -E) liofilizado, conjugado; 
0,003g de Na2B4O7, 0,002 g de CaCl 2, y 0,0001 g de timerosal. Para su uso, agrega r al frasco 13 mL del 
diluyente  del párrafo anterior*.  
B 7.9.3.13  Aditivo para la muestra Diluyente del Substrato. Cada 26 mL de H 2O contienen 0,2 g de ácido 
acético y 0,01 g de H 2O2*. 
B 7.9.3.14  Substrato.  Un frasco de liofilizado que contiene; 0,01 g de 2,2´-di-azino(sulfonato de 3 -etil 
benzotiazolin), 0,01 g de EDTA, y 0,1 g de NaH 2PO 4. Para su uso, agregar al frasco 26mL del diluyente del 
substrato.  
B 7.9.3.15  Solución para detener la reacción (solución stop). Cada 6,0 mL contienen; 1,5 g de NaF en 6,0 
mL de agua  
*Reactivos suministrados por el fabricante  
B 7.9.4  Procedimiento.  
B 7.9.4.1  Preparación de las muestras.  
B 7.9.4.1.1  Productos fluidos y productos deshidratados.  
Pesar 25 g de leche deshidratada y agregar 125 mL de solución Tris 0,25 M pH 8.0 So lución 
amortiguadora Tris. Continuar como se indica para leche fluida. En muestras de 5,0 mL, verificar que el pH 
esté en un intervalo de 7,0 -8,0. Agregar 50 L de Aditivo para la muestra. En el caso de extractos más claros, 
ajusta r el pH a 4,0 con HCl concentrado. Para muestras de leche de 50 mL, verificar que el pH esté en un 
intervalo de 7,0 -8,0. Agregar 50 L de aditivo Aditivo para la muestra. Centrifugar la muestra 10 min a  1000 -
3000 x g. Decantar el extracto y pasar 5,0 mL aproximadamente, a través de una jeringa empacada con 
algodón absorbente humedecido previamente, y recibir en un tubo de polipropileno. Ajustar nuevamente el pH 
a 7,0 -8,0 (usar papel pH). Agregar 50 L de ad itivo Aditivo para la muestra  y mezclar.  
B 7.9.4.1.2 Ingredientes deshidratados.  
Agregar 125 mL de solución Tris 0,25 M pH 8,0 a 25 g de muestra, homogeneizar en licuadora (a 
velocidad alta), durante 3 min. Centrifugar la muestra 10 min a 1000 -3000 x g y r ecoger el extracto 
(sobrenadante). Quitar el émbolo de la jeringa de plástico que contiene el empaque de algodón absorbente 
humedecido previamente y con cuidado, pasar el extracto a través del empaque y recibir el eluido. Tomar 5,0 
mL de eluido y ajustar e l pH a 7,0 -8,0. Agregar 50 L de aditivo, y mezclar.  
B 7.9.4.1.3  Otros alimentos.  
Agregar 50 mL de solución Tris 0,25 M pH 8,0 a 25 g de muestra, y homogeneizar en licuadora durante 3 
min a velocidad alta. Centrifugar la muestra du rante 10 min a 1000 -3000 x g. Quitar el émbolo de la jeringa de 
plástico que contiene el empaque de algodón absorbente humedecido previamente, y pasar 5,0 mL  de 
extracto a la jeringa, insertar el émbolo y con cuidado presionar el émbolo y recoger el eluid o. Tomar 5 mL del 
eluido, ajustar a pH 7,0 -8,0, si es necesario; agregar 50 L de aditivo, y mezclar.  
Nota 1: Preparar los extractos de alimentos inmediatamente antes de realizar la prueba.  
Precauciones generales.  
En caso de alimen tos crudos fermentados, procesados o enlatados, con evidentes defectos; o de cultivos 
fluidos obtenidos en el laboratorio, que pudieran dar como resultado el crecimiento de microorganismos 
productores de peroxidasa, es necesario, antes de hacer la determin ación de toxina, verificar si los extractos 
de alimentos o preparados a partir del cultivo en el laboratorio, contienen peroxidasa, debido a que esta 
enzima podría interferir con la interpretación de los resultados.  
Para determinar la presencia de peroxida sa, agregar 50 L del substrato, en una placa de microtitulación 
sin tratar (no contiene anticuerpos para la enterotoxina estafilocóccica). Dejar en reposo 10 min. Si el color 
cambia a azul o azulverdoso, indica que la muestra cont iene peroxidasa intrínseca; la cual debe inactivarse. Si 
la muestra permanece incolora (o con el color original), realizar el análisis de enterotoxina. Para inactivar la 
peroxidasa  intrínseca, preparar una solución al 30% (m/v) de azida de sodio y agregar 1 mL de esta solución a 
4 mL de muestra (la concentración final de la azida de sodio es de 6% (m/v). Mezclar y agregar un poco de 
aditivo, dejar en reposo 1 -2 min a temperatura del laboratorio(20 -25ºC). Repetir la prueba para determinar 
presencia de peroxi dasa, como se describió anteriormente. Si la reacción es incolora o presenta el color 
original, continuar con la prueba.  
Nota 2: Para alimentos crudos (ejemplo: verduras), seguir las precauciones generales señaladas 
anteriormente.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 7.9.4.2 Preparación de reactivos.  
B 7.9.4.2.1 Reconstitución de la solución de lavado.  
Diluir, en un frasco de reactivos la solución concentrada (como lo indique el fabricante), con agua destilada 
o deionizada, para obtener 2 L. Utilizar  esta "solución de lavado" para lavar los pozos y diluir el control 
positivo. Es recomendable el uso de pizeta. Almacenar a 4°C, cuando no se use.  
B 7.9.4.2.2  Preparación del conjugado.  
Agregar el diluyente del conjugado y rehidratar a temperatura del laboratorio. Mezclar  suavemente. Esta 
preparac ión es el "Conjugado reconstituido".  
B 7.9.4.2.3 Preparación del substrato.  
Disolver el substrato con el diluyente asegurarse que el contenido se haya disuelto completamente. Dejar 
a la temperatura del laboratorio (20 -25°C), antes de su uso.  
B 7.9.4.2.4 Precauciones generales:  
B 7.9.4.2.4.1  Observar la fecha de caducidad del equipo adquirido. Es la última fecha en la cual el 
producto debe utilizarse. Preparar todos los reactivos con cuidado y anotar la fecha de reconstitución, en la 
etiqueta externa de la  caja. Usar los reactivos dentro de los 65 días a la fecha anotada en la etiqueta. 
Refrigerar todos los componentes (2 -8°C) cuando no estén en uso. NO CONGELAR.  
B 7.9.4.2.4.2  El equipo de inmunoensayo visual está preparado para utilizarse como una unidad int egral; 
por tanto, no se deben mezclar los componentes de diferentes lotes.  
B 7.9.4.2.4.3  Utilizar puntas nuevas para cada muestra de alimento. Evitar la contaminación cruzada al 
llenar los pozos. Si se usan propipetas de plástico para distribuir el conjuga do y el substrato, se deben 
mantener siempre por separado. Asegurarse de no confundir las tapas de los reactivos.  
B 7.9.4.2.4.4  Usar controles positivos y negativos en cada prueba.  
B 7.9.4.2.4.5  Preparar recipientes con solución al 2% de hipoclorito de sod io para desechar todas las 
muestras y materiales que contengan toxina.  
Mantener los pozos removibles que no se usen dentro del paquete y volver a sellar con cinta, después de 
cada uso.  
B 7.9.4.5 Determinación de la enterotoxina.  
B 7.9.4.5.1 Preparación de los pozos.  
Tomar del paquete el número necesario de pozos; uno para cada muestra, uno para control positivo y uno 
para control negativo. Si se requiere, pueden utilizarse pozos adicionales (control positivo y negativo en alimento).  
B 7.9.4.5.2 Prelavado.  
Con la ayuda de una piceta llenar cada pozo con solución de lavado y dejar en reposo durante 10 minutos 
a la temperatura  de laboratorio (20 -25ºC). Vaciar los pozos por inversión rápida del soporte (placa); eliminar 
completamente todo residuo de líquido, gol peando varias veces, firmemente hacia abajo la placa, sobre una 
toalla de papel absorbente.  
B 7.9.4.5.3 Colocación de las muestras.  
Pasar alícuotas de 200 L de los controles y muestras (extractos de alimento o de cultivos) dentro de 
pozos individuales. Registrar la posición de cada muestra en la hoja de registro específica. Golpear 
suavemente la placa para asegurarse de la distribución homogénea y del contacto de las muestras con las 
paredes de los pozos; el uso de un agitador de m icroplacas durante 30 segundos,  es opcional. Cubrir los 
pozos con una película plástica, estirable, autoadherible o sello especial de microplacas; para evitar la 
evaporación. Incubar 2 hrs. a 35 -37°C.  
B 7.9.4.5.4  Segundo lavado.  
Presionar firmemente los po zos en la placa e invertir rápidamente. Vaciar el contenido de los pozos en el 
recipiente de desecho (con hipoclorito de sodio al 2%). Eliminar el residuo de líquido golpeando 
enérgicamente, varias veces la placa invertida, sobre una toalla de papel absorb ente; llenar completamente 
los pozos con solución de lavado, y repetir el lavado en la misma forma, de 2 a 3 veces más y finalmente 
vaciar los pozos.  
Nota 3: El lavado profundo de los pozos es un paso crítico y asegurará una clara interpretación de los 
resultados.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 7.9.4.5.5 Adición de conjugado.  
Agregar 200 L del conjugado reconstituido (enzima) a cada pozo. Volver a cubrir la placa e incubar 1 h a 
temperatura de laboratorio (20 -25°C). Vaciar las placas y lavar profundamente, 5 v eces, como se describió 
anteriormente  en el segundo lavado.  
B 7.9.4.5.6  Adición del substrato.  
Agregar, a cada pozo, 200 L del substrato reconstituido. Dejar a temperatura del laboratorio (20 -25°C) 
durante 30 min, como mínimo, has ta que el control positivo alcance la máxima absorbancia (mayor a 1,0) o al 
color más intenso que el número 4 del comparador de color. El desarrollo de color tiende a concentrarse 
alrededor de las orillas de los pozos. Para obtener resultados más precisos,  golpee con suavidad los extremos 
de la placa, con el propósito de que el contenido de los pozos se mezcle bien antes de la lectura. Agregar a 
cada pozo 20 L de solución stop; golpear con suavidad, para mezclar los contenidos.  
B 7.9.4.5.7 Determinar los resultados visualmente o mediante un lector de microtitulación.  
B 7.9.4.6  Interpretación de los resultados:  
Colocar la placa que sostiene los pozos sobre un fondo blanco. Comparar el color de cada pozo con el 
comparador de color. El  control positivo de toxina (y el control positivo de alimento, si se usó) deben dar un 
color verde intenso, lo que indica que todos los reactivos han funcionado. Si el control negativo es 
significativamente más oscuro que el representado en comparador de color, significa que hubo, 
probablemente, un lavado inadecuado y la prueba debe repetirse.  
La muestra se considera positiva , si cumple los siguientes criterios:  
B 7.9.4.6.1  El control negativo está dentro del intervalo de color negativo, representado en el  comparador 
de color, y las muestras presentan un color verde o azul más oscuro que el intervalo negativo representado en 
el comparador de color.  
La prueba de enterotoxina se considera negativa , si se cumplen los siguientes criterios:  
B 7.9.4.6.2  El contro l negativo está dentro del intervalo de color negativo, representado en el comparador 
de color, y  
B 7.9.4.6.3  La muestra es incolora o tiene el color dentro del intervalo negativo, representado en el 
comparador de color.  
B 7.9.4.7  Expresión de resultados.  
Prueba positiva o negativa para enterotoxina estafilocóccica  
 
B 8 Método de prueba para la determinación de cadmio, arsénico, plomo, estaño, cobre, fierro, zinc 
y mercurio en alimentos.  
B 8.1  Fundamento  
El método de absorción atómica se basa en hacer pasa r un haz de luz monocromática de una frecuencia 
tal que puede ser absorbido por el analito que se encuentra presente en forma de vapor atómico. La medida 
de la intensidad luminosa antes y después de su paso por el vapor atómico permite determinar el por ci ento 
de absorción.  
La cantidad de absorción aumenta con la concentración de los átomos en el medio absorbente, es decir, la 
medida de la absorción aumenta con la concentración del elemento en la muestra, ya sea que esté en su 
condición original o sujeta a pretratamiento.  
B 8.2 Reactivos  
Soluciones estándares de referencia certificadas de cada uno de los metales.  
Agua, debe ser destilada deionizada, con un grad o máximo de conductividad de 1 mho/cm a 25ºC.  
B 8.2.1  Acido nítrico (densidad específica 1,41), gr ado suprapuro.  
B 8.2.2  Acido nítrico (densidad específica 1,41), contenido de mercurio muy bajo.  
B 8.2.3  Acido perclórico (densidad específica 1,67), grado suprapuro.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 8.2.4  Acido clorhídrico (densidad específica 1,19), grado suprapuro.  
B 8.2.5  Acido sulf úrico (densidad específica 1,84), grado suprapuro.  
B 8.2.6  Acido sulfúrico 1 N a partir de la solución grado suprapuro.  
B 8.2.7  Acido nítrico 65% v/v grado RA.  
B 8.2.8  Peróxido de hidrógeno (densidad específica 1,12).  
B 8.2.9  Hidróxido de sodio granalla re activo RA.  
B 8.2.10  Aire comprimido seco y limpio.  
B 8.2.11  Gases: acetileno, óxido nitroso, argón y nitrógeno, grado absorción  atómica.  
B 8.2.12  Solución de Nitrato de Magnesio hexahidratado al 7% p/v. Disolver 70 g de Mg(NO3)2·6H2O en 
1000 mL de HCl 1 N.  
B 8.2.13  Acido clorhídrico 1 N. Diluir 8,3 mL de HCl y llevar a 100 mL de agua.  
B 8.2.14  Acido nítrico al 50% v/v. Diluir 50 mL de HNO3 al 65% v/v grado suprapuro en 50 mL de agua.  
B 8.2.15  Acido clorhídrico 8 M. Diluir 66,0 mL de HCl y llevar a 100 mL co n agua.  
B 8.2.16  Acido clorhídrico 0,5 N. Diluir 4,15 mL de HCl y llevar a 100 mL con agua.  
B 8.2.17  Solución de Yoduro de Potasio al 15% p/v. Disolver 15 g de KI en 100 mL de agua (esta solución 
debe prepararse en el momento de usarse).  
B 8.2.18  Solución de Yoduro de Potasio al 20% p/v. Disolver 20 g de KI en 100 mL de agua (esta solución 
debe prepararse en el momento de usarse).  
B 8.2.19  Solución de Cloruro de Potasio (10 mg/mL de K). Disolver 1,91 g de KCl en agua y diluir a 100 
mL con agua.  
B 8.2.20  Solución de Nitrato de Magnesio al 50% p/v. Disolver 50 g de Mg(NO3)2.6H2O en 100 mL de agua.  
B 8.2.21  Solución de ácido clorhídrico al 1,5% p/v. Diluir 1,5 mL de HCl en 100 mL de agua destilada 
deionizada.  
B 8.2.22  Solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. P esar 1 g de hidróxido de sodio y diluir a 100 mL con 
agua destilada deionizada.  
B 8.2.23  Solución de borohidruro de sodio al 4% p/v en solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 4 g 
de borohidruro de sodio en 100 mL de una solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Filtrar al vací o. 
B 8.2.24  Solución reductora para mercurio. Mezclar 50 mL de ácido sulfúrico concentrado con 
aproximadamente 300 mL de agua. Enfriar a temperatura ambiente y disolver 15 g de cloruro de sodio, 15 g 
de sulfato o cloruro de hid roxilamina y 25 g de cloruro o sulfato estanoso en solución.  
B 8.2.25  Diluir a 500 mL. Solución de dilución para mercurio. En un matraz de 1 L, conteniendo de 300 a 
500 mL de agua destilada deionizada, agregar 58 mL de ácido nítrico concentrado de muy baja  concentración 
de mercurio y 67 mL de ácido sulfúrico concentrado. Diluir al volumen con agua.  
B 8.2.26  Solución de trabajo de As de 1 g/mL. Diluir 1 mL de la solución patrón de 1000 g/mL a 1 L con 
ácido sulfúrico 1N preparada a partir de la solución gra do suprapuro. Preparar fresca cada día.  
B 8.3  Materiales  
B 8.3.1  Matraces Kjeldahl de 500 mL y 800 mL.  
B 8.3.2  Sistema de reflujo con refrigerante.  
B 8.3.3  Crisoles Vycor de 40 a 50 mL de capacidad.  
B 8.3.4  Crisoles de platino de 40 a 50 mL de capacidad.  
B 8.3.5  Matraces Erlenmeyer de diferentes capacidades.  
B 8.3.6  Matraces volumétricos de diferentes capacidades.  
B 8.3.7  Matraces redondos de fondo plano de 50 mL.  
B 8.3.8  Bombas Parr.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 8.3.9  Micropipetas o pipetas de Eppendorf de diferentes capacidades.  
B 8.3.10  Puntas de plástico para micropipetas.  
B 8.3.11  Papel filtro Whatman No.  2. 
B 8.3.12  Perlas de ebullición.  
B 8.3.13  Varillas de plástico.  
B 8.3.14  Tubos de ensayo graduados de propilen o propileno de 15 mL.  
B 8.3.15  Recipientes de propilen o propilen o. 
B 8.3.16  Embudos de filtración de diferentes capacidades.  
B 8.3.17  Material común de laboratorio.  
B 8.3.18  Todo el material utilizado debe someterse a lavado de acuerdo con las siguientes instrucciones:  
B 8.3.19  El jabón que se use debe ser de preferenc ia neutro.  
B 8.3.20  Enjuagar perfectamente con agua corriente.  
B 8.3.21  Sumergir el material de vidrio o plástico en un recipiente (de preferencia plástico) que contenga 
una solución de ácido nítrico grado RA al 30%.  
B 8.3.22  Dejarlo tapado y reposando por  un lapso de 24 horas.  
B 8.3.23  Quitar el exceso de ácido nítrico con varios enjuagues (5 o 6 veces) con agua deionizada.  
B 8.3.24  Dejar escurrir y secar.  
B 8.3.25  Guardar en cuanto esté seco para evitar contaminación por partículas en el aire.  
B 8.4  Apara tos e instrumentos  
B 8.4.1  Aparatos  
B 8.4.1.1  Lámparas de cátodo hueco o de descarga sin electrodos para determinar arsénico, cadmio, 
cobre, estaño, fierro, mercurio, plomo y zinc.  
B 8.4.1.2  Fuente de radiofrecuencia en caso de usar lámparas de descarga.  
B 8.4.1.3  Automuestreador y recirculador de agua.  
B 8.4.1.4  Placa de calentamiento con regulador que alcance una temperatura de 400 a 450 ºC.  
B 8.4.1.5  Horno de microondas.  
B 8.4.1.6  Autoclave que alcance 121 ± 5ºC o 15 lb de presión.  
B 8.4.1.7  Centrífuga d e laboratorio capaz de mantener 1600 rpm.  
B 8.4.2  Instrumentos  
Los instrumentos que a continuación se indican deben estar calibrados y ajustados antes de su operación.  
B 8.4.2.1  Espectrómetro de absorción atómica equipado con los accesorios para flama, hor no de grafito, 
generador de hidruros o vapor frío, dependiendo del método a seguir.  
B 8.4.2.2  Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg.  
B 8.4.2.3  Mufla capaz de mantener una temperatura de 550 ± 10ºC.  
B 8.4.2.4  Horno de calentamiento (estufa) con inter valo de temperatura de 120 ± 5ºC.  
B 8.5 Preparación de la muestra  
B 8.5.1 Digestión para la determinación de Cd, Cu, Fe, Pb y Zn.  
B 8.5.1.1 Digestión por vía húmeda.  
B 8.5.1.1.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad apropiada de muestra.  
Para la de terminación por el método de absorción por flama pesar como máximo 40 g de jugo o bebida, 20 
g de alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de ali mentos sólidos o semisólidos. Lí mite el 
contenido de grasa o aceite a un máximo de 4 g y el total d e materia orgánica a 5 g.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 8.5.1.1.2  Añadir 10 mL de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar directamente 
la digestión.  
B 8.5.1.1.3  Usar matraz de Kjeldhal o matraz conectado al sistema de refrigerantes.  
B 8.5.1.1.4  Calentar suav emente.  
B 8.5.1.1.5  Digerir la muestra 3 horas o más tiempo si es necesario (algunas muestras requieren la adición 
de mayor cantidad de ácido nítrico) hasta la aparición del color traslúcido, si queda ámbar, adicionar peróxido 
de hidrógeno gota a gota con agitación continua (reacción exotérmica).  
B 8.5.1.1.6  Enfriar.  
B 8.5.1.1.7  Recuperar, filtrar y llevar a un volumen conocido en matraz volumétrico.  
B 8.5.1.1.8  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.  
B 8.5.1.1.9  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica por flama u horno de grafito).  
B 8.5.1.2 Digestión por vía seca.  
B 8.5.1.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad apropiada de muestra.  
B 8.5.1.2.2  Para la determinación por el método  de absorción por flama pesar como máximo 40 g de jugo 
o bebida, 20 g de alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos sólidos y semisólidos. 
Limite el contenido de grasa o aceite a un máximo de 4 g y el total de materia orgánica a 5 g.  
B 8.5.1.2.3  Añadir 10 mL de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar directamente 
la digestión. En productos con alta concentración de proteínas adicionar una solución de nitrato de magnesio 
al 7,0% p/v y mezclar completamente, ll evar a sequedad aproximadamente durante 6 horas en estufa a una 
temperatura de 90 a 95ºC.  
B 8.5.1.2.4  Colocar la muestra en una mufla y elevar la temperatura lentamente de 2 a 4ºC por minuto 
hasta 350°C. Mantener la temperatura hasta que cesen los humos.  
B 8.5.1.2.5  Elevar gradualmente la temperatura de 500 a 550ºC para evitar que la muestra se incinere y 
mantener esa temperatura durante 16 horas o toda la noche.  
B 8.5.1.2.6  Apagar la mufla y dejar enfriar.  
B 8.5.1.2.7  Un segundo paso de calcinación puede s er requerido para remover algunos residuos de 
carbón, mediante el siguiente procedimiento:  
B 8.5.1.2.8  Lavar las paredes del crisol con 2 mL de ácido nítrico al 50%. Colocar la muestra en una placa 
de calentamiento puesta a 120ºC para remover el exceso de ácido. Colocar la muestra en una mufla fría y 
elevar la temperatura gradualmente de 500 a 550ºC, manteniéndola por el tiempo necesario. Repetir este 
procedimiento cuantas veces sea necesario hasta que quede libre de carbón remanente.  
B 8.5.1.2.9  Disolver l as cenizas completamente en 5 mL de ácido clorhídrico 1N, transferir la muestra 
disuelta a un tubo de propileno o a un matraz de volumen conocido, enjuagar el crisol con dos alícuotas de 5 
mL de ácido clorhídrico 1 N y transferir al mismo tubo o matraz par a obtener un volumen de 15 mL en el 
primero y llevar al aforo en el segundo, tapar y mezclar, si existe presencia de partículas o materia insoluble, 
filtrar en papel Whatman No. 2, antes de la determinación.  
B 8.5.1.2.10  Correr un blanco de reactivos y mue stra fortificada por cada serie de digestión.  
B 8.5.1.2.11  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica: flama u horno de grafito).  
B 8.5.1.3 Digestión por vía húmeda para la determinación de Sn.  
B 8.5.1.3.1  Proceder igual que en el p unto I) de B 8.5.1.1  
B 8.5.1.3.2  No adicionar ácido nítrico si no se lleva cabo la digestión total en el mismo día.  
B 8.5.1.3.3  Adicionar 30 mL de ácido nítrico concentrado al matraz y calentar suavemente por 15 minutos 
en campana para iniciar la digestión , evitando una excesiva producción de espuma.  
B 8.5.1.3.4  Hervir suavemente hasta tener un remanente de 3 a 6 mL o hasta que la muestra empiece a 
secarse en el fondo. No dejar que la muestra se calcine.  
B 8.5.1.3.5  Retirar la muestra del calor.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 8.5.1.3.6  Al mismo tiempo correr dos blancos de reactivos.  
B 8.5.1.3.7  Adicionar 25 mL de ácido clorhídrico concentrado, calentar suavemente durante 
aproximadamente 15 minutos, hasta que todo el cloro sea liberado. Aumentar la temperatura gradualmente 
hasta ebullic ión. 
B 8.5.1.3.8  Evaporar hasta obtener de 10 a 15 mL, usando un matraz similar con 15 mL de agua como 
patrón de volumen.  
B 8.5.1.3.9  Adicionar aproximadamente 40 mL de agua.  
B 8.5.1.3.10  Agitar y pasar a un matraz de 100 mL y enjuagar con 10 mL de agua.  
B 8.5.1.3.11  Cuando el ácido clorhídrico está presente en la digestión, las muestras se pueden quedar 
toda la  
B 8.5.1.3.12  noche o por más tiempo.  
B 8.5.1.3.13  Agregar 1 mL de solución de cloruro de potasio en cada matraz.  
B 8.5.1.3.14  Enfriar a temperatura  ambiente.  
B 8.5.1.3.15  Diluir con agua y agregar más agua para compensar el volumen de grasa en el matraz.  
B 8.5.1.3.16  Mezclar perfectamente y filtrar de 30 a 50 mL a través de un papel filtro Whatman No. 2 y 
recoger el filtrado en un recipiente de propi leno, polipropileno o polietileno.  
B 8.5.1.3.17  No filtrar los blancos. Tapar las botellas durante el análisis. Las soluciones son estables por 
varios meses.  
B 8.5.1.3.18  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.  
B 8.5.1.3.19  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica: flama u horno de grafito).  
B 8.5.1.4  Digestión por vía húmeda para la determinación de Hg.  
B 8.5.1.4.1 Sistema de reflujo.  
B 8.5.1.4.1.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantid ad apropiada de muestra, dependiendo el tipo de 
ésta, en un matraz de digestión y adicionar perlas de ebullición.  
B 8.5.1.4.1.2  Conectar el matraz al sistema de reflujo y agregar poco a poco la cantidad necesaria de 
ácido nítrico concentrado y calentar dur ante media hora o hasta que no se observen cambios en la digestión.  
B 8.5.1.4.1.3  Dejar enfriar y agregar una mezcla de ácido nítrico y ácido sulfúrico concentrados (1 + 1).  
B 8.5.1.4.1.4  Calentar y agregar más ácido nítrico gota a gota sobre las paredes d el recipiente, hasta que 
el color obscuro de la solución desaparezca.  
B 8.5.1.4.1.5  Enfriar.  
B 8.5.1.4.1.6  Si existe grasa o cera filtrar la solución.  
B 8.5.1.4.1.7  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.  
B 8.5.1.4. 1.8 Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica de vapor frío).  
B 8.5.1.4.2 Sistema cerrado.  
B 8.5.1.4.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad apropiada de muestra, dependiendo el tipo de 
ésta, en el recipiente de digestión.  
B 8.5.1.4.2.2  Agregar la cantidad necesaria de ácido nítrico concentrado.  
B 8.5.1.4.2.3  Tapar y sellar perfectamente el recipiente de digestión.  
B 8.5.1.4.2.4  Si el recipiente de digestión es un matraz Erlenmeyer, colocar éste en una autoclave a 15 lb 
por 30 minutos. Si se utiliza bomba Parr, calentar en parrilla controlando la temperatura a un máximo de 
300ºC por 30 minutos.  
B 8.5.1.4.2.5  Enfriar a temperatura ambiente.  
B 8.5.1.4.2.6  En caso de que la digestión no sea completa adicionar peróxido de hidróg eno y repetir  la 
digestión.  
Filtrar en caso de que exista grasa o cera y analizar el contenido de Hg.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 8.5.1.4.2.7  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.  
B 8.5.1.4.2.8  Leer en el aparato de elección (espectrómetro  de absorción atómica de vapor frío).  
B 8.5.1.5 Digestión para la determinación de As.  
B 8.5.1.5.1 Digestión por vía húmeda -seca.  
B 8.5.1.5.1.1  Proceder como en el punto 8.4.3.2 hasta que la digestión sea completa y posteriormente 
continuar con los siguien tes pasos.  
B 8.5.1.5.1.2  Con una pipeta tomar una alícuota de la solución de muestra digerida y colocarla en un crisol 
Vycor o vaso de precipitados.  
B 8.5.1.5.1.3  Añadir 1 mL de solución de nitrato de magnesio al 7% p/v y calentar en una parrilla a 
tempera tura baja, hasta sequedad.  
B 8.5.1.5.1.4  Incrementar el calor de la placa a un máximo de 375ºC.  
B 8.5.1.5.1.5  Colocar el matraz en la mufla a 450ºC para oxidar cualquier residuo de carbón y 
descomponer el exceso de nitrato de magnesio, por un tiempo mayor o igual a 30 minutos.  
B 8.5.1.5.1.6  Enfriar y disolver el residuo en 2 ,0 mL de ácido clorhídrico 8 M.  
B 8.5.1.5.1.7  Añadir 0,1 mL de yoduro de potasio al 20% p/v para reducir el As(V) a As(III).  
B 8.5.1.5.1.8  Dejar reposar por un tiempo mayor a 2 minutos y  transferir a un matraz y llevar al aforo  con 
agua.  
B 8.5.1.5.1.9  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.  
B 8.5.1.5.1.10  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica con adaptación para 
horno de grafito o generador de hidruros).  
B 8.5.1.5.2 Digestión por vía seca.  
B 8.5.1.5.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad necesaria de muestra en un crisol Vycor o  de 
platino.  
B 8.5.1.5.2.2  Añadir el volumen necesario de nitrato de magnesio al 5 0% p/v.  
B 8.5.1.5.2.3  Homogeneizar con una varilla limpia de plástico extendiendo la mezcla en el crisol.  
B 8.5.1.5.2.4  Colocar la muestra en una mufla subiendo gradualmente la temperatura hasta 300ºC por 2 
horas. Posteriormente subir gradualmente la tempe ratura hasta 500ºC por 16 horas o durante toda la noche.  
B 8.5.1.5.2.5  Enfriar a temperatura ambiente y humedecer las cenizas con ácido nítrico al 50% v/v.  
B 8.5.1.5.2.6  Calentar en parrilla hasta la eliminación del ácido.  
B 8.5.1.5.2.7  Llevar los crisoles  a una mufla elevando gradualmente la temperatura de 23 a 500ºC, 
manteniendo ésta 30 min hasta evaporación total.  
B 8.5.1.5.2.8  Transferir las cenizas del crisol a un matraz aforado usando una porción de 10 mL de ácido 
clorhídrico 0,5 N.  
B 8.5.1.5.2.9  Enjuagar los crisoles con 5 mL de agua destilada y transferir al matraz, añadir 1 mL de 
solución  de yoduro de potasio al 15% y mezclar.  
B 8.5.1.5.2.10  Dejar reposar durante 15 minutos y llevar al aforo.  
B 8.5.1.5.2.11  Correr un blanco de reactivos y muestra fo rtificada por cada serie de digestión.  
B 8.5.1.5.2.12  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica con adaptación para 
horno de grafito o generador de hidruros).  
B 8.5.1.6 .Digestión para la determinación de Cd, As, Pb, Sn, Cu, Fe, Zn y Hg por horno de microondas.  
Pesar con precisión de ± 0,1 mg, 0,500 g como máximo de muestra, añadir 6 mL de ácido nítrico 
concentrado y 2 mL de agua oxigenada al 30%, cerrar perfectamente el envase de reacción y proceder según 
el manual del fabricante.  
B 8.5.1.7 Determinación de metales en agua potable y agua purificada.  
Las muestras incoloras, transparentes e inodoras y de una sola fase, pueden analizarse directamente por 
espectrometría de absorción atómica, sin digestión.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Previo a dicho análisis, adicio nar a 100 mL de muestra, 1 mL de ácido nítrico, en caso de que se observe 
un precipitado, realizar una digestión adicionando 1 mL más de ácido nítrico concentrado, calentar a 85ºC 
hasta reducir el volumen a 20 mL cuidando de que no hierva. Calentar a reflu jo 30 minutos y transferir a un 
matraz volumétrico de 50 mL. Centrifugar a 1600 rpm por 30 minutos o dejar reposar toda la noche y analizar 
el sobrenadante.  
B 8.6  Procedimiento  
B.8.6.1  Espectrometría de absorción atómica por flama.  
B.8.6.1.1  Calibración.  
Es necesario comprobar que se tiene una calibración inicial y periódica aceptable.  
B 8.6.1.1.1  Se inicia la configuración operacional del instrumento y en el sistema de adquisición de datos.  
B 8.6.1.1.2  Permitir un periodo no menor a 30 minutos para el cale ntamiento de las lámparas de descarga 
sin electrodos.  
B 8.6.1.1.3  Se debe verificar la estabilidad del instrumento mediante el análisis de una solución estándar 
20 veces más  concentrada que el límite de detección del instrumento (LDI) para el analito, leíd a un mínimo de 
cinco veces  y calculando la desviación estándar resultante, la cual debe ser menor al 5%.  
B 8.6.1.1.4  El instrumento debe calibrarse para el analito a determinar usando el blanco de calibración y 
los estándares de calibración preparados a 3 o 4 niveles de concentración dentro del intervalo dinámico de 
concentración del analito.  
B 8.6.1.1.5  Ajustar el instrumento a 0 con el blanco de calibración. Introducir los estándares de calibración 
del analito de menor a mayor concentración y registrar al  menos tres réplicas de la absorbancia de cada uno.  
B 8.6.1.1.6  Elaborar una curva de calibración graficando absorbancia en función de la concentración.  
B 8.6.1.1.7  Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se programan directamente, en los cuales 
sólo es necesario introducir los estándares y marcar su concentración teórica.  
B.8.6.1.2  Operación del instrumento.  
El desempeño del instrumento se verifica mediante el empleo de blancos de calibración, estándares de 
calibración y una muestra de control de calidad (MCC).  
B 8.6.1.2.1  Después de que se ha realizado la calibración, se debe verificar que el instrumento trabaje 
adecuadamente para el analito. Para ello se analiza una muestra de control de calidad. Si las mediciones 
varían en ± 10% o más, al valor establecido para la MCC, el análisis debe interrumpirse y buscar la posible 
causa de error, el instrumento se debe recalibrar y verificar la nueva calibración.  
B 8.6.1.2.2  Para verificar que el instrumento no presenta deriva, por cada 10 análisis se debe a nalizar el 
blanco de calibración. Si el valor verdadero del analito difiere ± 10% o más, el instrumento debe recalibrarse. 
Si el error persiste debe identificarse el problema y corregirse.  
B 8.6.1.2.3  Si la matriz de la muestra es responsable de la deriva o afecta la respuesta del analito puede 
ser necesario trabajar por adiciones estándar.  
B 8.6.1.2.4  La demostración de la operatividad inicial del instrumento se hace estableciendo los límites de 
detección del método (LDM) para el analito y el intervalo de calibración lineal. Para determinar el LDM se usa 
un blanco de reactivos fortificado con una concentración del analito equivalente de 2 a 5 veces el límite de 
detección estimado. Se hacen al menos 4 réplicas de lectura de absorbancia del blanco de reactivo s 
fortificado procesado a través de todo el método analítico. Los LDM se calculan de acuerdo a:  
LDM= t x s donde: t = valor de la "T" de Student a un intervalo de confianza de 99% y una desviación 
estándar estimada para n -1 grados de libertad. t = 3,14 par a 7 réplicas. s = desviación estándar de las réplicas 
del análisis.  
B 8.6.1.2.5  El intervalo lineal de calibración se establece a partir de por lo menos 4 estándares de 
diferente concentración, uno de los cuales debe estar próximo al límite superior del in tervalo lineal.  
B 8.6.1.3 Determinación  
B 8.6.1.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómica en las condiciones adecuadas para la 
determinación del analito de acuerdo a las indicaciones del manual del instrumento.        (Tercera Sección)  DIARIO OFICIAL  Viernes 10 de febrero de 2012  
B 8.6.1.3.2 Introducir el blanco de rea ctivos y la muestra a analizar y registrar los valores de absorbancia. 
Se debe analizar al menos un blanco de reactivos con cada grupo de muestras. Los valores obtenidos ponen 
de manifiesto la calidad de los reactivos usados y el grado de contaminación del  laboratorio.  
B 8.6.1.3.3  En los equipos que pueden programarse, la lectura obtenida da directamente la concentración 
del elemento en las unidades de concentración utilizadas.  
B 8.6.1.3.4 Se debe analizar al menos un blanco de reactivos fortificado para ca da grupo de muestras. Se 
calcula la exactitud como el porciento de recuperación.  
B 8.6.1.3.5 Se debe fortificar al menos una muestra por grupo o el 10% de ellas lo que resulte mayor. La 
concentración añadida debe ser de aproximadamente 0,1 unidades de abso rbancia.  
B 8.6.1.3.6 Se debe calcular el porciento de recuperación para el analito, de acuerdo a:  
R = CM - C 
x 100  
CA 
R = % recuperación  
CM = Concentración de la muestra fortificada  
C = Concentración de la muestra  
CA = Concentración equivalente de anal ito añadido a la muestra.  
Si la recuperación del analito en la muestra fortificada está fuera del intervalo previamente establecido y el 
blanco de reactivos fortificado está correcto, puede existir un problema relacionado con la matriz de la 
muestra. Los d atos se deben verificar por el método de las adiciones estándar.  
B 8.6.2  Espectrometría de absorción atómica por horno de grafito.  
B 8.6.2.1 Calibración.  
B 8.6.2.1.1  Proceder de acuerdo al punto B.8.6.1.1  
B 8.6.2.1.2  Elaborar una curva de calibración grafi cando área de pico o altura máxima contra 
concentración  del analito.  
B 8.6.2.1.3  La calibración mediante el uso de una computadora o una calculadora basada en el ajuste 
sobre los datos de concentración respuesta es aceptada.  
B 8.6.2.1.4  Lo anterior puede l levarse a cabo en equipos que se programan directamente, en los cuales 
sólo es necesario introducir los estándares y marcar su concentración teórica.  
B 8.6.2.2  Operación del instrumento.  
Proceder de acuerdo a B.8.6.1.2  
B 8.6.2.3  Determinación.  
B 8.6.2.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómica en las condiciones adecuadas para la 
determinación del analito, de acuerdo a las recomendaciones del manual del instrumento.  
B 8.6.2.3.2  El programa de temperaturas para el horno de grafito puede variar dependien do de la matriz 
de la muestra. En el caso de existir interferencias no específicas (absorción molecular o dispersión de la luz), 
se recomienda consultar la bibliografía existente en cuanto a los métodos disponibles para eliminarlas, así 
como en el caso de interferencias de matriz.  
B 8.6.3  Espectrometría de absorción atómica por generador de hidruros.  
B 8.6.3.1 Calibración.  
B 8.6.3.1.1  Proceder de acuerdo al punto B.8.6.1.1  
B 8.6.3.1.2  A partir de la solución estándar de As de 1000 mg/L, preparar una solución  de As de 1 mg/L en 
ácido clorhídrico de concentración apropiada al método. Trazar una curva de calibración de absorbancia 
(máximo de la altura de pico) en función de la concentración del analito para un intervalo de concentración  
B 8.6.3.1.3  de 0 a 10 g/L de As bajo las mismas condiciones de la matriz de la muestra.  
B.8.6.3.2 Operación del instrumento.  Viernes 10 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
B 8.6.3.2.1  Proceder de acuerdo al punto B.8.6.1.2  
B 8.6.3.3 Determinación.  
B 8.6.3.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómica en las condiciones adec uadas para la 
determinación de As: longitud de onda de 193,7 nm y lámpara de descarga sin electrodos. Colocar y ajustar la 
celda de absorción de acuerdo al manual del fabricante. Ajustar el flujo de gas (nitrógeno o argón).  
B 8.6.3.3.2  Ajustar a 0 de absor bancia con el blanco de calibración de ácido clorhídrico al 1,5% siguiendo 
las instrucciones del manual del fabricante.  
B 8.6.3.3.3  Optimizar con un estándar de calibración la respuesta del instrumento al analito (por lo general, 
10 mL de una solución de 5  g/l de As da una absorbancia de 0,2), ajustando el tiempo de purga I, el tiempo 
de reacción y el tiempo de purga II.  
B 8.6.3.3.4  Tomar un volumen conocido de la muestra dirigida y seguir el mismo procedimiento que con 
los estándares de calibración.  
B 8.6 .4 Espectrometría de absorción atómica por vapor frío.  
B 8.6.4.1 Calibración.  
B 8.6.4.1.1  Proceder de acuerdo al punto B.8.6.1.1  
B 8.6.4.1.2  A partir de la solución de trabajo de 1 g/mL preparar estándares de calibración que contengan 
0, 0,2, 0,4, 0,6, 0, 8 y 1,0 g de Hg a frascos de reacción. A cada frasco agregar 100 mL de la solución de 
dilución y 20 mL de la solución de reducción. Trazar la curva de calibración de absorbancia (altura máxima de 
pico) en función de la concentración del analito.  
B 8.6.4.2  Operación del instrumento.  
B 8.6.4.2.1  Proceder de acuerdo al punto B.8.6.1.2  
B 8.6.4.3 Determinación.  
B 8.6.4.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómica en las condiciones adecuadas para la 
determinación de Hg: longitud de onda de 253,6 nm, slit 0,7  nm y lámpara de cátodo hueco. Colocar y ajustar 
la celda de absorción de acuerdo al manual del fabricante. Ajustar el flujo de gas (nitrógeno o argón).  
B 8.6.4.3.2  Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibración (solución de dilución y de reducció n) 
siguiendo las  instrucciones del manual del fabricante.  
B 8.6.4.3.3  Optimizar con un estándar de calibración la respuesta del instrumento al analito.  
B 8.6.4.3.4  Tomar 25 mL de la muestra digerida y seguir el mismo procedimiento que con los estándares 
de calibración.  
B 8.7  Expresión de resultados  
B 8.7.1  Método de cálculo.  
Interpolar los valores de absorbancia o altura de pico de la muestra analizada en la curva de calibración y 
obtener los mg/kg del elemento en la muestra y realizar los cálculos empleand o la siguiente fórmula:  
mg/ kg =  A x B  
 
C 
en donde:  
A = Concentración en mg/kg de la muestra a interpolar en la curva de calibración.  
B = Volumen final al que se llevó la muestra (mL).  
C = Peso de la muestra (g) o volumen de la muestra (mL) en el caso de agua.  
En los equipos que pueden programarse, la lectura obtenida da directamente la concentración del 
elemento en mg/kg o g/kg.  
B 8.7.2  Informe de la prueba  
Los resultados se informarán en mg/kg o g/kg del elemento a determinar.  
______________________ ______