Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
TERCERA SECCION  
SECRETARIA DE SALUD  
PROYECTO de Norma Oficial Mexicana PROY -NOM -131-SSA1 -2011, Productos y servicios. Fórmulas de inicio, 
continuación y para necesidades especiales de nutrición. Alimentos y bebidas no alcohólicas para lactantes y niños 
de corta edad. Disposiciones y especificaciones sanitarias y nutrimentales. Etiquetado y métodos de prueba 
(Continúa de la Segunda Sección)  
(Viene de la Segunda Sección)  
 
Tabla No. 5 Número más probable (NMP) para 100 ml de muestra cuando  se usan 5 porciones en cada 
una de 3 diluciones con series geométricas . 
No. de Tubos 
Positivos  No. de Tubos 
Positivos  No. de Tubos 
Positivos  No. de Tubos 
Positivos  No. de Tubos 
Positivos  No. de Tubos 
Positivos  
10 1 0,1 10 1 0,1 10 1 0,1 10 1 0,1 10 1 0,1 10 1 0,1 
ml ml ml N 
M 
P ml ml ml N 
M 
P ml ml ml N 
M 
P ml ml ml N 
M 
P ml ml ml N 
M 
P ml ml ml N M 
P 
0 0 0   1 0 0 2 2 0 0 4,5 3 0 0 7,8 4 0 0 13 5 0 0 23 
0 0 1 1,8 1 0 1 4 2 0 1 6,8 3 0 1 11 4 0 1 17 5 0 1 31 
0 0 2 3,6 1 0 2 6 2 0 2 9,1 3 0 2 13 4 0 2 21 5 0 2 43 
0 0 3 5,4 1 0 3 8 2 0 3 12 3 0 3 16 4 0 3 25 5 0 3 58 
0 0 4 7,2 1 0 4 10 2 0 4 14 3 0 4 20 4 0 4 30 5 0 4 76 
0 0 5 9,0 1 0 5 12 2 0 5 16 3 0 5 23 4 0 5 36 5 0 5 95 
0 1 0 1,8 1 1 0 4 2 1 0 6,8 3 1 0 11 4 1 0 17 5 1 0 33 
0 1 1 3,6 1 1 1 6,1 2 1 1 9,2 3 1 1 14 4 1 1 21 5 1 1 46 
0 1 2 5,5 1 1 2 8,1 2 1 2 12 3 1 2 17 4 1 2 26 5 1 2 64 
0 1 3 7,3 1 1 3 10 2 1 3 14 3 1 3 20 4 1 3 31 5 1 3 84 
0 1 4 9,1 1 1 4 12 2 1 4 17 3 1 4 23 4 1 4 35 5 1 4 110 
0 1 5 11 1 1 5 14 2 1 5 19 3 1 5 27 4 1 5 42 5 1 5 130 
0 2 0 3,7 1 2 0 6,1 2 2 0 9,3 3 2 0 14 4 2 0 22 5 2 0 49 
0 2 1 5,5 1 2 1 8,2 2 2 1 12 3 2 1 17 4 2 1 26 5 2 1 70 
0 2 2 7,4 1 2 2 10 2 2 2 14 3 2 2 20 4 2 2 32 5 2 2 95 
0 2 3 9,2 1 2 3 12 2 2 3 17 3 2 3 24 4 2 3 38 5 2 3 120 
0 2 4 11 1 2 4 15 2 2 4 19 3 2 4 27 4 2 4 44 5 2 4 150 
0 2 5 13 1 2 5 17 2 2 5 22 3 2 5 31 4 2 5 50 5 2 5 180 
0 3 0 5,6 1 3 0 8,3 2 3 0 12 3 3 0 17 4 3 0 27 5 3 0 79 
0 3 1 7,4 1 3 1 10 2 3 1 14 3 3 1 21 4 3 1 33 5 3 1 110 
0 3 2 9,3 1 3 2 13 2 3 2 17 3 3 2 24 4 3 2 39 5 3 2 140 
0 3 3 11 1 3 3 15 2 3 3 20 3 3 3 28 4 3 3 45 5 3 3 180 
0 3 4 13 1 3 4 17 2 3 4 22 3 3 4 31 4 3 4 52 5 3 4 210 
0 3 5 15 1 3 5 19 2 3 5 25 3 3 5 35 4 3 5 59 5 3 5 250 
0 4 0 7,5 1 4 0 11 2 4 0 15 3 4 0 21 4 4 0 34 5 4 0 130 
0 4 1 9,4 1 4 1 13 2 4 1 17 3 4 1 24 4 4 1 40 5 4 1 170 
0 4 2 11 1 4 2 15 2 4 2 20 3 4 2 28 4 4 2 47 5 4 2 220 
0 4 3 13 1 4 3 17 2 4 3 23 3 4 3 32 4 4 3 54 5 4 3 280 
0 4 4 15 1 4 4 19 2 4 4 25 3 4 4 36 4 4 4 62 5 4 4 350 
0 4 5 17 1 4 5 22 2 4 5 28 3 4 5 40 4 4 5 69 5 4 5 430 
0 5 0 9,4 1 5 0 13 2 5 0 17 3 5 0 25 4 5 0 41 5 5 0 240 
0 5 1 11 1 5 1 15 2 5 1 20 3 5 1 29 4 5 1 48 5 5 1 350       (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
0 5 2 13 1 5 2 17 2 5 2 23 3 5 2 32 4 5 2 56 5 5 2 540 
0 5 3 15 1 5 3 19 2 5 3 26 3 5 3 37 4 5 3 64 5 5 3 920 
0 5 4 17 1 5 4 22 2 5 4 29 3 5 4 41 4 5 4 72 5 5 4 1600  
0 5 5 19 1 5 5 24 2 5 5 32 3 5 5 45 4 5 5 81          
Tabla No. 6 Ejemplos para determinar el NMP estimado en  series de tres tubos con 1g (ml) de muestra 
por tubo.  
  Cantidad de muestra (g o ml) a Valores 
positivos 
reportados  NMP estimado/g o ml b 
Ejemplo  0,10 ,001 0,001  0,0001  0,00001    
A 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3 3-2-0 930 
B 3/3 3/3 3/3 2/3 0/3 3-2-0 9300  
C 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3 0-1-0 30 
D 3/3 3/3 2/3 1/3 1/3 3-2-2 2100  
E 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3-3-3 110000  
                
a Numerador/denominador = núme ro de tubos positivos/número de tubos inoculados.  
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (ml) por 100 para expresarlos como NMP/100 g (ml).  
Tabla No. 7 Ejemplos para determinar el NMP estimado en  series de 5 tubos con 1 g (ml) de muestra 
por tubo.  
  Cant idad de muestra (g o ml) a Valores 
positivos  NMP estimado/g o ml b 
Ejemplo  0,1, 0,01 0,001  0,0001  0,00001  reportados    
A 5/5 5/5 2/5 0/5 0/5 5-2-0 490 
B 5/5 5/5 5/5 2/5 0/5 5-2-0 4900  
C 0/5 0/5 1/5 0/5 0/5 0-1-0 20 
D 5/5 5/5 3/5 1/5 1/5 5-2-2 1400  
E 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5-5-5 160000  
a Numerador/denominador = número de tubos positivos/número de tubos inoculados.  
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (ml) por 100 para expresarlos como NMP/100 g (ml).  
C.6.3.3  Determinación de bacterias coliformes, coli formes fecales y Escherichia coli  por la técnica 
de diluciones en tubo múltiple.  
C.6.3.3.1  Fundamento  
Este método se basa en la propiedad de los microorganismos coliformes para producir gas a partir de 
glucosa y fermentación de lactosa dentro de las 48 hor as de incubación a 35 0,5°C (coliformes) y 44,50,2°C 
(coliformes fecales y E. coli ). 
C.6.3.3.2  Equipo y materiales  
■ Además de los mencionados en el método Preparación y dilución de muestras de alimentos para 
análisis microbiológico, lo siguiente:  
■ Baño de agua con agitación continua cubierto y con termostato que evite variaciones mayores  a 
0,1°C.  
■ Termómetro calibra do y verificado 1/10  
■ Tubos de cultivo de 20x200 y de 16x160 mm con tapón de rosca  
■ Campanas de fermentación (tubos de Durham)  
■ Gradillas  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
■ Asas bacteriológicas de 3 mm de diámetro  
■ Lámpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts.  
■ Lentes prote ctores.  
■ Medios de cultivo  
Caldo lauril  
Ingredientes:  
Bacto triptosa  20,0 g  
Bacto lactosa  5,0 g  
Fosfato potásico, dibásico  2,75 g  
Fosfato potásico, monobásico  2,75 g  
Cloruro de sodio  5,0 g  
Lauril sulfato de sodio  0,1 g  
Agua destilada  1000,0 ml  
pH final: 6,8 0,2 a 25°C.  
Preparación:  Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada.  Ajustar el pH. Distribuir en tubos de 
ensaye con campanas de Durham. Adicionar 10 ml de medio para cada tubo. Esterilizar en autoclave durante 
15 minutos a 121C. An tes de abrir el autoclave, dejar bajar la temperatura a 75C para que no queden burbujas 
en las campanas de Durham.  
Preparación de caldo lauril triptosa  
INOCULO  (ml) CANTIDAD DE MEDIO 
POR TUBO (ml)  VOLUMEN DE MEDIO 
MAS INOCULO (ml)  CALDO LAURIL TRIPTOSA 
REQ UERIDO g/L  
1 10 o más  11 o más  35,6 
10 10 20 71,2 
10 20 30 53,4 
20 10 30 106,8  
100 50 150 106,8  
100 35 135 137,1  
100 20 120 213,6  
 
Caldo EC ( E. coli .) 
Ingredientes:    
Bacto triptosa  20,0 g  
Bacto lactosa  5,0 g  
Bacto sales biliares No. 3  1,5 g  
Fosfato dipotásico  4,0 g  
Fosfato monopotásico  1,5 g  
Cloruro de sodio  5,0 g  
Agua destilada  1000,0 ml        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
pH final: 6,9 0,2 a 25°C.  
Preparación:  Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar ligeramente para que se 
disuelva por completo. A justar el pH. Distribuir en tubos de ensaye con campanas de Durham. Adicionar 10 ml 
de medio para cada tubo. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Antes de abrir el autoclave, 
dejar bajar la temperatura a 75°C para evitar que queden burbujas  en las campanas de Durham.  
Agar McConkey  
Ingredien tes:  
Proteasa peptona o polipeptona  3,0 g  
Peptona o gelizante  17,0 g  
Lactosa  10,0 g  
Sales biliares No. 3  1,5 g  
Cloruro de sodio  5,0 g  
Rojo neutro  0,03 g  
Cristal violeta  0,001 g  
Agar  13,5 g  
Agua d estilada  1000,0 ml  
pH final: 7,1 0,2 a 25°C  
Preparación:  Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada. Calentar hasta ebullición para 
disolver por completo.  Ajustar el pH.  Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 50 -60°C y vaciar en 
cajas Petri.  
Agar eosina azul de metileno de Levin (EMB -L) 
Ingredientes:    
Peptona  10,0 g  
Lactosa  10,0 g  
K2HPO 4 2,0 g  
Eosina Y  0,4 g  
Azul de metileno  0,065 g  
Agua destilada  1000 ml  
pH final: 7,1 0,2  
Preparación:  Disolver la peptona, el fosfato y el ag ar en un litro de agua.  Calentar hasta ebullición para la 
disolución completa.  Distribuir en porciones de 100 o 200 ml y esterilizar a no más de 121°C por 15 minutos. 
Fundir antes de su uso y adicionar a cada porción de 100 ml.  
a) 5 ml de solución de lacto sa al 20%  
b) 2 ml de solución acuosa de eosina al 2%  
c) 4,3 ml de solución acuosa de azul de metileno al 0,15%.  
Cuando se use el producto deshidratado, disolver todos los ingredientes de acuerdo con las instrucciones 
del fabricante.  
Caldo triptona al 1% (t riptofano)  
Ingredientes:   
Triptona o tripticasa  10 g 
Agua destilada  1000 ml  
pH final: 6,9 0,2  
Preparación:  Disolver los ingredientes. Distribuir en porciones de 5 ml en tubos de ensaye de 16 x 125 o 
16 x 150 mm. Esterilizar a 121°C por 15 minutos.  
Caldo  MR-VP 
Medio 1  
Ingredientes:   
Peptona tamponada  7 g Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Glucosa  5 g 
K2HPO 4 5 g 
Agua destilada  1000 ml  
pH final: 6,9 0,2  
Preparación:  Disolver los ingredientes con calentamiento suave si es necesario. Distribuir en volúmenes 
de 10 ml en tubos de ensaye de 16x150 mm. Esterilizar a 121°C por 15 minutos.  
Caldo citrato de Koser  
Ingredientes:   
NaNH 4HPO 4 •4H 2O 1,5 g  
KH2PO4 (monobásico)  1,0 g  
MgSO 4 •7H 2O 0,2 g  
Citrato de sodio  •2H 2O 3,0 g  
Agua destilada  1000 ml  
pH final: 6,7 0,2.  
Preparación:  Distribuir pref erentemente en tubos de ensaye con tapa de rosca. Esterilizar a 121°C por  15 
minutos. Esta formulación se recomienda en los Métodos de Análisis Oficial de AOAC y en los Métodos 
Estándares para el Análisis de Agua y Aguas de Desecho (APHA). Este difiere de la composición del medio 
deshidratado disponible comercialmente y es recomendable su uso.  
Reactivos  
Reactivo de Kovacs  
Ingredientes:   
p-imetilaminobenzaldehído  5 g 
Alcohol amílico (normal)  75 ml  
HCI concentrado  25 ml  
Preparación:  Disolver el p -Dimetila minobenzaldehído en alcohol amílico normal. Adicionar lentamente el 
HCl. Almacenar a 4°C.  
Para la prueba de indol  
1. Adicionar 0,2 -0,3 ml del reactivo a 5 ml del cultivo de bacteria en caldo triptona.  
Se considera una prueba positiva cuando desarrolla un c olor rojo en la superficie del tubo.  
Reactivo de Voges -Proskauer (VP)  
Solución 1  
Ingredientes:   
alfa-naftol  5 g 
Alcohol absoluto  100 g  
Solución 2  
Ingredi entes:   
Hidróxido de potasio  40 g 
Agua destilada  para llevar a 100 ml  
Prueba de Voges -Proskauer ( VP). 
1. Transferir 1 ml del cultivo a probar con 48 horas de incubación a un tubo de ensaye.  
2. Adicionar 0,6 ml de la solución 1 y 0,2 ml de la solución 2.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
3. Agitar después de la adición de cada solución.  
4. Para intensificar y acelerar la reacción adici onar unos cuantos cristales de creatina y mezclar.  
5. Dejar a temperatura ambiente.  
6. Leer resultados después de 4 horas de adicionar los reactivos.  
El desarrollo de una coloración rosa es una prueba positiva.  
Reactivos para la coloración de Gram  
Cristal violeta  
Solución A    
Cristal violeta (colorante 90%)  2 g 
Etanol 95%  20 ml  
Solución B  
Oxalato de amonio  0,8 g  
Agua destilada  80 ml  
Indicador rojo de metilo (R44)  
1. Mezclar la solución A y B. Almacenar por 24 horas  
2. Filtrar a través de un papel filtr o áspero.  
lodo de Gram  
Ingredientes:     
lodo 1g 
Ioduro de potasio (Kl)  2 g 
Agua destilada  300 ml  
1. Colocar el Kl en un mortero.  
2. Adicionar el yodo.  
3. Triturar con el pistilo por 5 -10 segundos.  
4. Adicionar 1 ml de agua y triturar  
5. Adicionar 5 ml de agua y triturar  
6. Adicionar 10 ml de agua y triturar  
7. Vaciar esta solución en una botella de reactivo.  
8. Enjuagar el mortero y el pistilo con la cantidad de agua necesaria para completar 300 ml.  
Colorante de contraste (solución concentrada)  
Ingredie ntes:     
Safranina O  2,5 g  
Etanol al 95%  100 ml  
Solución de trabajo: Adicionar 10 ml de la solución concentrada a 90 ml de agua destilada.  
Procedimiento para la tinción de Gram  
1. Fijar con calor moderado los frotis de la muestra a teñir.  
2. Adicionar l a solución de cristal violeta al frotis.  
3. Dejar actuar por un minuto.  
4. Lavar con agua corriente y escurrir.  
5. Aplicar la solución de yodo por un minuto.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
6. Lavar con agua corriente y escurrir.  
7. Decolorar con etanol al 95% hasta que la coloración azu l deje de fluir (aproximadamente 30 segundos).  
8. Inmediatamente después enjuagar con agua corriente  
9. Escurrir.  
10. Aplicar el colorante de contraste (safranina) por 30 segundos.  
11. Enjuagar, escurrir y secar al aire. Examinar al microscopio.  
Medio EC -MUG 
Preparar el caldo EC y adicionar 50 mg de 4 -metilumbelliferyl -beta-D-glucurónido (MUG) por litro antes de 
esterilizar (121°C por 15 minutos). El caldo EC -MUG está comercialmente disponible.  
C.6.3.3.3  Procedimiento  
C.6.3.3.3.1 Alimentos  
C.6.3.3.3.1.1 Prueba presuntiva.  
C.6.3.3.3.1.1.1 Preparar la muestra como se indica en el método Preparación y dilución de muestras de 
alimentos para análisis microbiológico; y de acuerdo con el tipo de producto, utilizar las diluciones apropiadas, 
según se indica en el pr ocedimiento de la densidad microbiana por la técnica del número más probable.  
Utilizar como medio de enriquecimiento caldo lauril triptosa y continuar como en el punto C.6.3.3.3.1.1.2  
C.6.3.3.3.1.2 Prueba confirmativa. Continuar como en el punto C.6.3.3.3. 1.3 
C.6.3.3.3.1.3 Prueba confirmatoria.  
Confirmar la presencia de Escherichia coli  en por lo menos el 10% de las pruebas con resultados positivos 
a coliformes fecales por cultivo en placas de agar McConkey a partir de los tubos que demostraron la 
presencia  de gas en la prueba confirmativa. Incubar las placas a 35±0,5°C durante 24±2 horas, observar las 
colonias típicas fermentadoras de color rojo rodeadas de un halo opaco de precipitación de sales biliares. 
Seleccionar 1 o más colonias aisladas y pasar a tub os de fermentación con caldo lauril triptosa, continuar 
como se indica en el punto C.6.3.3.3.1.1 Hacer tinción de Gram para observación de la morfología de las 
colonias.  
C.6.3.3.3.1.4 Interpretación de resultados.  
La formación de gas en el tubo de fermenta ción secundario dentro de las 48±3 horas y la demostración de 
bacilos Gram ( -) no esporulados confirma un resultado positivo de la prueba demostrándose la presencia del 
grupo coliforme.  
C.6.3.3.3.1.5 Cálculos  
Calcular la densidad microbiana en número más p robable conforme al procedimiento señalado 
anteriormente, para estimar la población de bacterias coliformes y bacterias coliformes fecales de acuerdo con 
las diluciones empleadas y expresar en NMP/g o ml para alimentos y NMP/100 ml para agua. En el caso de  
usar volúmenes de 20 ml de muestras de agua en 5 tubos o 10 ml de muestras de agua en 10 tubos, utilizar 
las siguientes tablas:  
TABLA 1. Indice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados 
positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con 20 ml de muestra de agua o hielo.  
No. DE TUBOS  
Positivos  NMP/100 ml  95% DE LI MITE DE CONFIANZA 
(APROXIMADO)  
  Inferior  Superior  
0 1,1 0 3,0       (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
1 1,1 0,05 6,3 
2 2,6 0,3 9,6 
3 4,6 0,8 14,7 
4 8,0 1,7 26,4 
5 8,0 4,0 Infinito  
 
TABLA 2. Ind ice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados 
positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con 10 ml de muestra de agua o hielo.  
No. de Tubos  
Positivos  NMP/100 ml  95% de Límite de Confianza 
(aproximado)  
  Inferior  Superior  
0 1,1 0,0 3,0 
1 1,1 0,03 5,9 
2 2,2 0,26 8,1 
3 3,6 0,69 10,6 
4 5,1 1,3 13,4 
5 6,9 2,1 16,8 
6 9,2 3,1 21,1 
7 12,0 4,3 27,1 
8 16,1 5,9 36,8 
9 23,0 8,1 59,5 
10 23,0 13,5 Infinito  
 
C.7. M ETODO DE PRUEBA PARA EL AN ALISIS MICROBIOL OGICO DE ALIME NTOS ENVASADOS 
HERM ETICAMENTE. ESTERILIZADOS COMERCIALMENTE  
C.7.1 Fundamento  
C.7.1.1 Examen microbiológico de latas no alteradas  
Este examen tiene por objeto determinar la presencia de microorganismos viables latentes, que resistieron 
el tratamiento  térmic o debidamente aplicado y que en determinadas circunstancias pudieran desarrollarse, 
produciendo alteraciones en el alimento y representando un riesgo para el consumidor.  
Los envasados, aun los bien procesados, pueden contener esporas de bacilos termofílico s, las cuales son 
muy resistentes al calor, pero no se desarrollan en las condiciones normales de almacenamiento y no 
producen problemas de descomposición del producto ni representan un peligro para el consumidor.  
La prueba de esterilidad comercial, puede efectuarse por la observación y análisis del contenido del 
producto, su apariencia, color, olor, pH y examen microscópico.  
Estas observaciones se hacen después de la incubación de las latas y siempre comparándolas con otras 
no incubadas.  
Si es necesario ef ectuar el cultivo o si el producto después de incubarse presenta cualquier cambio, ya 
sea en apariencia, olor, color, pH, o bien presencia de gas o espuma, proceder como se indica en C.7.1 o 
C.7.2, dependiendo del pH del alimento.  
7.1.2  Examen microbiológi co de latas alteradas  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Este análisis tiene por objeto determinar el origen de la alteración, la cual puede ser causada por 
microorganismos que sobreviven al tratamiento térmico o por la introducción de éstos después  del 
tratamiento, por defectos de las cerr aduras o por golpes que lesionen el envase. Conociendo la naturaleza del 
alimento y su tratamiento, es posible predecir el tipo de organismo responsable de la alteración.  
Numerosas investigaciones han demostrado que el tipo de alteraciones guarda relación con el grado de 
acidez del alimento procesado, por lo que éstos se dividen en dos grandes grupos:  
C.7.1.2.1  Alimentos de baja acidez, con pH > 4,6, entre los que se encuentran productos cárnicos, lácteos, 
marinos, algunos vegetales, guisados, sopas, etcéte ra. 
C.7.1.2.2  Alimentos ácidos, con pH < 4,6, entre los que se encuentran tomates, frutas, jugos de cítricos, 
encurtidos, entre otros.  
C.7.2 Reactivos y materiales  
A continuación se presentan las fórmulas y los procedimientos para preparar los medios y rea ctivos 
empleados en el análisis microbiológico de los productos envasados herméticamente y sometidos a 
esterilización comercial. En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas equivalentes, se 
deben seguir las instrucciones del fabricante.  
C.7.2.1 Medios de cultivo y soluciones  
C.7.2.1.1 Caldo glucosa púrpura de bromocresol (CGPB)  
FORMULA  
Glucosa  100 g  
Extracto de carne  30 g 
Peptona (P. Ej. caseína)  50 g 
Púrpura de bromocresol  20 ml  
(1 6% en etanol)  
Agua destilada  1 0000 ml  
pH final  = 7,0 ± 0,2  
Disolver los ingredientes en el agua, ajustar el pH y envasar en tubos de 22 x 175 mm, en volúmenes de 
12 a 15 ml. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C por 15 min.  
7.2.1.2  Caldo de hígado picado o caldo carne cocida (CH o CCC)  
FORMULA  
Hígado o carne magra de res  500,0 g  
Agua destilada  800,0 ml  
Peptona  10,0 g  
Fosfato dipotásico  1,0 g  
Almidón soluble  1,0 g  
pH final = 7,0 ± 0,2  
Poner el hígado o la carne picada en agua, calentar a ebullición y dejar a fuego lento durante una hora. 
Enfriar, retirar la capa de grasa, ajustar el pH y hervir otros 10 min. Filtrar a través de gasa o manta de cielo, 
presionando para quitar el exceso de líquido. Enfriar y agregar al caldo la peptona, el fosfato y el almidón 
soluble. Ajustar el pH y llevar el vo lumen del caldo a 1 000 ml con agua destilada. Filtrar a través de papel 
filtro grueso; en este paso el caldo y la carne pueden guardarse en refrigeración, si el medio no puede 
terminarse el mismo día. Envasar en tubos de 22 x 175 mm volúmenes de 10 a 12 m l de caldo y depositar 
suficiente hígado o carne picada para que ocupe una altura de 1,25 cm de l fondo del tubo. Esterilizar a  121 ± 
1°C por 15 min.  
C.7.2.1.3 Caldo extracto de malta  
FORMULA        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Extracto de malta  6,0 g  
Maltosa  1,5 g  
Glucosa  6,0 g  
Extrac to de levadura  1,0 g  
Agua destilada  1 000,0 ml  
pH final = 4,7 ± 0,2  
Disolver los ingredientes con agitación constante. Ajustar el pH a 4,7 ±  0,2, envasar en tubos de 22 x 175 
mm en volúmenes de 12 -15 ml. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C por 15 min.  Exponer al calor el menor 
tiempo posible.  
C.7.2.1.4  Caldo ácido  
FORMULA  
Proteosa peptona  5,0 g  
Extracto de levadura  5,0 g  
Glucosa  5,0 g  
Fosfato dipotásico  4,0 g  
Agua destilada  1 000,0 ml  
pH final = 5,0 ± 0,2  
Disolver los ingredientes en 1 l de agua y envasar en tubos de 22 x 175 mm en volúmenes de 12 a 15 ml. 
Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C por 15 min.  
C.7.2.1.5  Agar papa dextrosa o dextrosa Sabouraud  
C.7.2.1.5.1 Agar papa dextrosa  
FORMULA  
Infusión de papa  200,0 ml  
Glucosa  20,0 g  
Agar  15,0 g  
Agua destilada  1 000,0 ml  
pH final = 3,5  
Lavar, pelar y rebanar papas de tamaño mediano (250 g). Hervir durante 30 min en 290 ml de agua 
destilada. Filtrar varias veces a través de gasa y algodón. En esta infusión, disolver los demás ingrediente s. 
Añadir agua destilada hasta completar el volumen (1000 ml). Calentar a ebullición, hasta la disolución total de 
los ingredientes. Ajustar el pH a 5,6 ± 0,2. Distribuir en volúmenes de 100 ml y esterilizar e n autoclave  a 121 ± 
1°C. Enfriar a 45 - 48°C y acidificar a pH 3,5 con solución estéril de ácido tartárico al 10% (aproximadamente 
1,4 ml de ácido por cada 100 ml de medio). Una vez que se ha agregado el ácido tartárico, no se vuelve a 
calentar el medio.  
C.7.2.1.5.2  Agar dextrosa Sabouraud  
FORMULA  
Polipeptona o neopeptona  10,0 g  
Dextrosa  40,0 g  
Agar  15,0 g  
Agua destilada  1 000,0 ml  
pH final = 5,6 ± 0,2  
Calentar hasta disolución completa. Esterilizar en autoclave a 118 - 121°C por 15 min, no exceder  de 121 
± 1°C.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
C.7.2.1.6  Agar hígado de ternera  
FORMULA  
Infusión de hígado  50,0 g  
Infusión de ternera  500,0 g  
Proteosa peptona  20,0 g  
Neopeptona  1,3 g  
Triptona  1,3 g  
Glucosa  5,0 g  
Almidón soluble  10,0 g  
Caseína isoeléctrica  5,0 g  
Cloruro de sodio  5,0 g  
Nitrato de sodio  2,0 g  
Grenet ina  20,0 g  
Agar  15,0 g  
Agua destilada  1 000,0 ml  
pH final = 7,3 ± 0,2  
Mezclar los ingredientes con agua destilada y calentar a ebullición hasta su disolución total. Ajustar el pH y 
esterilizar a 121 ± 1°C por 15 min.  
C.7.2.1.7  Agar nutritivo  
FORMULA  
Extracto de carne  3,0 g  
Peptona  5,0 g  
Agar  15,0 g  
Agua destilada  1 000,0 ml  
pH final = 7,3 ± 0,2  
Suspender los ingredientes en agua destilada y disolverlos por ebullición. Ajustar el pH. Distribuirlo en 
volúmenes adecuados en matraces o botellas y  esterilizar a 121 ± 1°C por 15 min.  
C.7.2.1.8  Solución estéril de ácido tartárico al 10%  
Disolver 10,0 g de Acido tartárico y llevar a 100 ml con agua destilada. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C.  
C.7.2.1.9  Colorante de azul de metileno  
Solución A Azul  de metileno (pureza no < 90%) 0,3 g Etanol (95%) 90,0 ml  
Solución B Solución 0,01% de hidróxido de 100,0 ml potasio  
Mezclar A y B  
C.7.2.1.10 Colorante de cristal violeta  
Cristal violeta (pureza no < 90%) 2,0 g  
Etanol (95%) 20,0 ml  
Agua destilada 80,0 ml  
C.7.2.1.11  Colorante de Gram  
Solución A Cristal violeta (pureza no < 90%) 2,0 g Etanol (95%) 20,0 ml  
Solución B Oxalato de amonio 0,8 g Agua destilada 80,0 ml  
Mezclar solución A y B dejar reposar 24 h al abrigo de la luz, filtrar por papel filtro grueso.  
Solución de yodo para Gram  
Yodo (cristales) 1,0 g        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Yoduro de potasio 2,0 g  
Agua destilada 300,0 ml  
Mezclar el Yodo y el Yoduro de potasio en un mortero y triturar hasta fino polvo. Agregar 1 ml de agua y 
mezclar, agregar 5 ml de agua y mezclar, agregar 10 ml de agua y mezclar. Vaciar esta solución a un frasco 
reactivo, lavar el mortero y el pistilo con suficiente agua hasta completar los 300 ml.  
C.7.2.2  Materiales  
■ Mecheros de Bunsen o Fischer.  
■ Abrelatas sanitarios.  
■ Pinzas, espátulas y cucharas.  
■ Charolas.  
■ Pipetas serológicas de 10 ml con tapón de algodón.  
■ Pipetas despuntadas o tubos de 8 mm de diámetro con tapón de algodón.  
■ Propipeta o bulbo para pipeta . 
■ Tubos de cultivo de 18 x 150 o de 22 x 175 mm.  
■ Embudos grandes de tallo corto.  
■ Portaobjetos.  
■ Cajas de Petri estériles.  
■ Punzón para latas.  
■ Asa de platino o nicromel en porta -asas.  
■ Cepillo para lavar las latas.  
■ Toallas o gasas estériles.  
■ Solución de yodo al 4% (en etanol al 70%).  
■ Sistema de anaerobiosis.  
■ Varillas de vidrio de 20 cm de longitud y 3 mm de grueso, dobladas en ángulo recto de 5 cm en uno 
de sus extremos.  
■ Azul de metileno, cristal violeta o equipo para tinción de Gram.  
C.7.3 Aparatos e instrumentos  
■ Autoclave con termómetro o manómetro.  
■ Horno para esterilizar a 180°C.  
■ Incubadoras con termómetro y termostato que evite variaciones > de 0,1°C.  
■ Potenciómetro de escala expandida.  
■ Microscopio compuesto.  
C.7.4 Preparació n de las muestras  
C.7.4.1  Llevar un registro en el laboratorio en donde se anoten:  
C.7.4.1.1  El número de lote (o señalar si éste no existe o está incompleto)  
C.7.4.1.2  Todos los datos importantes para la identificación del producto que aparezcan en la eti queta; 
identificar la muestra en forma indeleble, antes de  remover la etiqueta. Conservar el envase y la etiqueta.  
C.7.4.1.3  Los defectos físicos que se observen en el envase como abolladuras, golpes que lo deformen, 
oxidación, derrames, defectos aparentes  de las cerraduras, abombamiento, etcétera.  
Según su apariencia externa clasificarlas como sigue:  
C.7.4.2  Latas  
C.7.4.2.1  Latas planas o normales.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
C.7.4.2.2  Abombamiento ligero (Flipper), Grado I. Unicamente uno de los extremos de la lata se encuentra 
ligeramente abombado, pero puede comprimirse fácilmente.  
C.7.4.2.3  Abombamiento elástico (Springer), Grado II. Uno de los extremos se encuentra abombado; al 
presionarle el extremo opuesto se abulta.  
C.7.4.2.4  Hinchazón (Soft swell), Grado III. Ambos extremos s e encuentran abombados, pero pueden 
comprimirse o ceden ligeramente a la presión.  
C.7.4.2.5  Hinchazón (Hard swell), Grado IV. Ambos extremos se encuentran abombados y no pueden 
comprimirse: la lata puede reventar.  
C.7.4.3  Frascos de vidrio  
C.7.4.3.1 Tapa n ormal  
C.7.4.3.2  Tapa abombada  
C.7.4.4  Incubación de los envases  
C.7.4.4.1  Incubación de productos en envases de apariencia normal.  
La prueba más confiable para determinar la esterilidad comercial es la incubación del producto a 
temperaturas apropiadas y po r un tiempo suficiente para que cualquier microorganismo que se encuentre 
pueda desarrollarse bajo las condiciones del producto envasado, dando origen a manifestaciones ya sea en el 
envase o en el producto. Incubar de 30 a 35°C por 10 a 14 días.  
Observar d iariamente los envases. La manifestación de crecimiento es la hinchazón en diferentes grados y 
en los envases de vidrio se pueden observar los cambios en el alimento o la formación de burbujas. En cuanto 
se detecte hinchazón en el producto o cualquier otra  desviación suspender la incubación.  
Al final del periodo de incubación, abrir las latas para descubrir descomposición ácida (flat sour), por 
cambios en el color, olor, consistencia y pH del alimento. Preparar extensiones, teñirlas con azul de metileno o 
tinción de Gram y observarlas microscópicamente. El hallazgo de cualquier anormalidad indica que el 
producto no está comercialmente estéril y se debe proceder como para los envases alterados.  
C.7.4.4.2 Incubación de envases sospechosos o alterados  
Analizar de inmediato una o varias unidades de la muestra e incubar el resto de las latas que no presenten 
alteración evidente o con abombamiento de grado I de 30 a 35°C por 10 a 14 días.  
Los envases con abombamiento muy evidente no deben incubarse.  Aquellas que se  clasifiquen como 
grado III o IV de no analizarse en el momento, deberán refrigerarse.  
C.7.4.5  Apertura de las latas o envases  
C.7.4.5.1 Area de trabajo  
Se debe trabajar preferentemente en un gabinete de flujo laminar que proporcione un ambiente  ultra-
limpio, clase 100*  
La desinfección de la superficie de trabajo se puede hacer con alcohol o sales cuaternarias de amonio a la 
concentración recomendada por el fabricante. Posteriormente se debe poner a trabajar el flujo, 30 min antes 
de efectuar el trabajo.  
Para controlar la eficacia del flujo, se deben poner como testigos cajas con medio de cultivo abiertas, a los 
lados y al centro del área de trabajo, durante todo el tiempo que dure la operación.  
Si no se tiene el equipo necesario, se puede utilizar un cuart o o cubículo perfectamente limpio, lavado con 
agua y jabón, desinfectándolo con un agente bactericida apropiado. En este caso se trabajará entre dos 
mecheros Bunsen.  
C.7.4.5.2 Personal        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
El personal debe trabajar con bata limpia. Si tiene el pelo largo, debe  usar turbante. El uso de mascarillas 
quirúrgicas es opcional. El personal enfermo con gripe o cualquier otro problema infeccioso no debe intervenir 
en el análisis.  
C.7.4.6  Preparación de latas o envases  normales  
Lavar el envase con un cepillo, usando agua  caliente y jabón; enjuagar y dejar secar.  
Remojar con un sanitizante durante 10 a 15 min, la tapa contraria a donde está grabado el lote. Escurrir el 
líquido y secar con la flama de un mechero.  
Destapar con un abridor de latas sanitario estéril.  
En las la tas de cierre de anillo o dispositivos abre fácil, abrir por la cara opuesta.  
* El equipo debe proveer un ambiente libre de partículas de 0,3 micras con una eficiencia del 99,99% en 
un flujo de 100 pies  3/min.  
C.7.4.6.1 Frascos de vidrio  
Lavar la tapa del frasco y sumergirlo durante 15 min en una solución sanitizante, de manera que quede 
cubierta la tapa; esta solución puede ser cloro 100 mg/kg. Colocar un algodón estéril en torno a la tapa y con 
un punzón estéril hacer un orificio en el centro, a fin de qu e se pierda el vacío y pueda abrirse con facilidad. 
Abrir el frasco sin contaminar los bordes del mismo.  
C.7.4.7 Preparación de latas o envases alterados  
Lavar el envase con un cepillo, con agua caliente y jabón; enjuagar y secar. Si la lata está muy infla da, 
mantener en el refrigerador antes de abrirla. Limpiar y sanitizar la tapa con una solución de cloro 100 mg/kg o 
yodo al 2% en alcohol al 70%; limpiar con una gasa estéril.  
En latas muy infladas de pH muy ácido, es necesario hacer una prueba para hidróg eno, con objeto de 
conocer si el gas se debe a la acción del ácido sobre el metal.  
Para ello, practicar una pequeña puntura en el centro de la tapa y recibir el gas en un tubo de ensayo 
invertido; inmediatamente ponerlo sobre la flama. Una pequeña explosió n indica la presencia de hidrógeno. 
No debe flamearse directamente el orificio de la lata.  
Para abrir latas infladas, colocar un embudo invertido con un algodón estéril  sobre la tapa y picar con un 
picahielo estéril, hasta desalojar el gas antes de abrir l a lata.  
C.7.5 Procedimiento  
Abrir la lata entre dos mecheros Bunsen o en el gabinete de flujo laminar vertical. Tomar porciones tanto 
del contenido sólido como del líquido; si es posible, homogeneizar. Utilizando utensilios adecuados a la 
naturaleza del pr oducto (espátulas, pinzas, tubos de vidrio, pipetas, etcétera) transferir aproximadamente 2 g 
o 2 ml del producto a los tubos con el medio que se va a utilizar, dependiendo del pH del alimento.  
Conservar una muestra en un frasco estéril, para cualquier acl aración o para efectuar pruebas biológicas.  
Hacer una extensión en un portaobjetos del contenido de la lata, ya que muchas veces los gérmenes 
causantes del deterioro mueren durante el almacenamiento y sólo el examen microscópico puede dar una 
idea de los m icroorganismos involucrados en la descomposición. Preparar las extensiones mediante un asa 
de platino. Si el alimento es sólido o muy espeso, agregar una pequeña cantidad de agua estéril. Si es muy 
grasoso, depositar sobre la extensión una pequeña cantidad  de xilol con posterioridad a su fijación por calor.  
Una vez tomada la muestra, anotar el estado del alimento: su olor, cambios en su color, consistencia, 
etcétera. No debe probarse. Determinar el pH y vaciar el contenido de la lata. Observar su interior, anotando 
el estado del barniz, la presencia de manchas, defectos del frasco o de la tapa, etcétera.  
C.7.5.1 Examen de alimentos envasados de baja acidez (pH > a 4,6)  
Inocular aproximadamente 2 g o 2 ml, en cada uno de 4 tubos con caldo hígado, previamente calentado a 
100°C para expulsar el oxígeno disuelto, y enfriar rápidamente.  
Inocular asimismo, 4 tubos de caldo púrpura de bromocresol.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Incubar según el siguiente esquema:  
MEDIO DE CULTIVO  TUBOS  TEMPERATURA  TIEMPO  INVESTIGACIO N 
Caldo hígado o CCC  2 35°C  96 h/120 h  Mesofílicos anaerobios  
Caldo hígado o CCC  2 55°C  24 h/72 h  Termofílicos anaerobios  
Caldo púrpura de bromocresol  2 35°C  96 h/120 h  Mesofílicos aerobios  
Caldo púrpura de bromocresol  2 55°C  24 h/48 h  Termofílicos aerobios  
 
Transferir los aliment os líquidos por medio de una pipeta, utilizando un bulbo o p ropipeta. ¡Precaución! 
Tener cui dado al manipular el producto, incluso cuando provenga de envases aparentemente normales. ¡La 
Toxina botulínica puede estar presente! Observar los tubos diariamente , hasta el término del tiempo de 
incubación si no hay crecimiento en todos los tubos, descartar e informar como NEGATIVO.  
Cuadro 1 DIAGRAMA DEL PROCEDIMIENTO DE CULTIVO PARA ALIMENTOS ENLATADOS  DE BAJA 
ACIDEZ (> 4,6).  
CULTIVO 
ORIGINAL  TEMPERATURA  SUBCULTIV O  CULTIVO 
PURO  IDENTIFICACION  
CH o CCC  
y 
CGPB   
35°C  
96/120 h  AN o AHT  
Aeróbico  
AN o AHT  
Anaeróbico  Crecimiento  
Crecimiento  Frotis  
CH o 
CCC  
Frotis  
CH o 
CCC  Tinción de Gram  
Anaeróbico  
AN o AHT  
Tinción de Gram  
Aeróbico  
AN o AHT  
CH o CCC  
y 
CGPB   
55°C  
24/72 h AN o AHT  
Aeróbico  
AN o AHT  
Anaeróbico  Crecimiento  
Crecimiento  Frotis  
CH o 
CCC  
Frotis  
CH o 
CCC  Tinción de Gram  
Anaeróbico  
Tinción de Gram  
Aeróbico  
AN o AHT  
CH = Caldo Hígado de Ternera AN = Agar Nutritivo  
CCC = Caldo Carne Cocida AHT = Agar Hígado de Ter nera 
CGPB = Caldo Púrpura de Bromocresol  
DIAGRAMA DEL PROCEDIMIENTO DE CULTIVO PARA ALIMENTOS ENLATADOS ACIDOS ( > 4,6). 
CULTIVO 
ORIGINAL  TEMPERATURA  SUBCULTIVO   CULTIVO 
PURO  IDENTIFICACION  
 
CA,CEM   
30°C  
96/120 h  AN, ADS o 
ADP 
Aeróbico  
AN, ADS o 
ADP 
Anaeró bico Crecimiento  
Crecimiento  Frotis  
CA, CEM  
Frotis  
CA, CEM  Tinción de Gram  
Anaeróbico  
AN, ADS o ADP  
Tinción de Gram  
Aeróbico  
AN, ADS o ADP  
CA  
55°C  
24/72 h  AN 
Aeróbico  
AN 
Anaeróbico  Crecimiento  
Crecimiento  Frotis  
CA 
Frotis  
CA Tinción de Gram  
Anaeróbico  
AN 
Tinción de Gram        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Aeróbico  
AN 
CA = Caldo Acido AN = Agar Nutritivo  
CEM = Caldo Extracto de Malta ADS = Agar Dextrosa Sabouraud  
ADP = Agar Papa Dextrosa  
Si hay crecimiento, hacer frotis y teñir -resembrar a placas de agar hígado de ternera (sin yema de huevo ) 
o agar nutritivo. Incubar a 35°C y 55°C una placa en aerobiosis y anaeróbico (ver cuadro 1) continuar la 
incubación a 35°C de caldo de hígado (CH) o caldo carne cocida (CCC) hasta un máximo de 5 días y guardar 
para determinación de toxina (cuando proceda ). 
Observar los agares y seleccionar un número representativo de los diferentes tipos de colonias y 
resembrar a CH y CCC a la temperatura y las condiciones según se especifica en el cuadro 1 (a 35°C por 
96/120h y 55°C por 24/72h).  
Expulsar el oxígeno inmed iatamente antes de utilizar el CH que se va a incubar en anaerobiosis. Mantener 
viables los cultivos puros aislados. Hacer tinción de Gram.  
C.7.5.1.1  Cuando se presente crecimiento microbiano durante las pruebas para esterilidad comercial en un 
enlatado y no haya evidencia de descomposición del alimento, efectuar la confirmación de la siguiente forma:  
C.7.5.1.1.1 Obtener cultivos puros de la cepa o cepas encontradas.  
C.7.5.1.1.2 Seleccionar otro envase del mismo producto y el mismo lote que el anterior.  
C.7.5.1.1.3  En condiciones asépticas, practicar una pequeña perforación en el extremo de la lata o cerca 
del cierre.  
C.7.5.1.1.4 Inocular el producto con la cepa por abajo de la superficie.  
C.7.5.1.1.5  Flamear el orificio para crear vacío y sellar asépticamen te con soldadura o un material similar.  
C.7.5.1.1.6  Después de inocular, incubar a 30 -35°C durante 10 días.  
C.7.5.1.1.7  Abrir el enlatado y examinar el producto.  
El aspecto del producto debe ser igual al que se observó en el envase de donde se obtuvo el cu ltivo. Si en 
el primer enlatado el producto fue de apariencia normal, pero se obtuvo crecimiento y en el segundo, 
inoculado con la flora microbiana aislada del primero, se encuentra el producto alterado (gas, consistencia 
diferente, olor, etcétera), debe c onsiderarse que el primer enlatado era comercialmente estéril y que el 
crecimiento fue el resultado de un procedimiento deficiente por el laboratorio. Si se encuentra flora mixta 
únicamente en el CGPB, hacer informe de los tipos morfológicos. Si hay flora mixta en CH/CCC entre la cual 
se incluyan bacilos, hacer prueba toxina. Si se observan únicamente bacilos Gram positivo o Gram variable 
típicos del género Bacillus  o Clostridium  investigar presencia de esporas. En algunos casos las células 
vegetativas enve jecidas pueden dar la apariencia de Gram negativo y debe considerarse como si fuera Gram 
positivo. Determinar la presencia de toxina. Esta prueba la podrá realizar un laboratorio oficialmente 
acreditado por las autoridades correspondientes.  
C.7.5.2 Examen microbiológico de alimentos envasados de acidez alta (pH < 4,6) 
Inocular 2 g o 2 ml de alimento en 4 tubos de caldo ácido y 2 tubos de caldo extracto de malta.  
Incubar según el esquema:  
MEDIO DE CULTIVO  TUBOS  TEMPERATURA  TIEMPO  INVESTIGACIO N 
Caldo ácido  2  30°C  96 h Lactobacilos, hongos y levaduras  
Caldo ácido  2 55°C  48 h Termofílicos de descomposición 
ácida  
Caldo extracto de 
malta  2 30°C  96 h Lactobacilos, hongos y levaduras  
 
C.7.6 Expresión de resultados  
C.7.6.1  Envases normales  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Conviene extremar los cuidados al efectuar los ensayos, seleccionar las muestras e interpretar los 
resultados de las pruebas para demostrar la esterilidad comercial, ya que cualquier error basado en fallas de 
manipulación o interpretación, puede originar la destrucción de un lo te comercialmente estéril, como 
contaminado. Al incubar el enlatado o al recibirse la lata, la presencia de hinchazón, principalmente cuando es 
muy acentuada, indica contaminación microbiana. Estas condiciones deben ser confirmadas demostrando la 
presencia  de un gran número de microorganismos en las extensiones preparadas directamente a partir del 
alimento, descubriendo cambios en el aspecto del producto (consistencia, olor, coloración anormal) o 
variaciones en el pH, en comparación siempre con un producto normal. Los cultivos se practican por 
duplicado, cuando hay contaminación, en ambos tubos se debe hallar una flora similar a la encontrada en las 
extensiones de la muestra original. Encontrar sólo uno de los tubos de cultivo positivo y otro negativo, puede  
indicar una contaminación por manipulación en el laboratorio, a menos que se compruebe que existe el mismo 
tipo de flora que en la extensión de la muestra original.  
A veces existe alguna dificultad en diferenciar partículas del alimento de microorganismos . Otras veces las 
levaduras o lactobacilos participan en la producción del alimento, como sucede en algunos productos 
obtenidos por fermentación. En estos casos, aunque ya no sean viables, los microorganismos pueden 
aparecer en la extensión, y sólo la expe riencia y el conocimiento de los procesos permite n interpretar 
correctamente los resultados.  
C.7.6.2 Envases alterados, con pH > de 4,6  
C.7.6.2.1  Presencia de mesofílicos aerobios  
La flora presente en este caso, puede estar constituida por bacilos o ser mi xta. 
C.7.6.2.1.1 Presencia de bacilos esporulados  
Generalmente consiste en esporas termorresistentes de diferentes especies de bacilos. Regularmente el 
alimento no presenta alteraciones, ya que las esporas no pueden desarrollarse en condiciones de 
anaerobi osis; sin embargo, se han encontrado alteraciones producidas por bacilos con esporas resistentes 
(Bacillus  mesentericus  y Bacillus subtilis ), en alimentos de acidez media, con tratamiento térmico adecuado, 
pero con vacío incompleto. También se ha encontrad o Bacillus ß nigrificans , en conservas de betabeles con 
ennegrecimiento del producto.  
C.7.6.2.1.2 Presencia de flora mixta  
La presencia de flora mixta se debe generalmente a la penetración de gérmenes, con posterioridad al 
proceso térmico, actuando como ve hículo el agua de enfriamiento. La flora que se observa puede ser muy 
variada.  
La penetración de los gérmenes se debe a defectos en las cerraduras, que permiten el paso de los 
microorganismos. Las latas generalmente se encuentran infladas y pueden mostrar defectos o derrames.  
El pH y el aspecto del producto varían.  
C.7.6.2.2 Presencia de mesofílicos anaerobios  
Consiste de anaerobios del género Clostridium , entre los que se encuentran C. sporogenes , C. putrificans, 
C. hystoliticum, C. bifermentans, C. perfri ngens  y C. botulinum ; este último es el de mayor importancia 
sanitaria, por producir una toxina muy potente. Las latas pueden estar parcialmente infladas y el producto 
parcialmente digerido; el olor es pútrido. El pH aumenta. En este caso, es necesario pra cticar la prueba en 
animales, tanto del producto como del filtrado del cultivo, para investigar la presencia de la toxina. Esta prueba 
la podrá realizar un laboratorio oficialmente acreditado por las autoridades correspondientes.  
C.7.6.2.3 Presencia de ter mofílicos aerobios  
Consta de bacilos termofílicos estrictos o facultativos, que poseen esporas muy resistentes al calor 
(especie tipo B. stearothermophilus , causante de la descomposición ácida flat sour). Las latas son planas, sin 
alteración y con marcado aumento de la acidez del producto; puede haber olor anormal o enturbiamiento del 
líquido.  
C.7.6.2.4 Termofílicos anaerobios  
Pertenecen también al género Clostridium , con esporas muy resistentes al calor.  
La especie tipo C. thermosaccharolyticum,  es un anae robio estricto no productor de sulfhídrico; las latas se 
encuentran infladas.  
Otro tipo de descomposición poco común, puede ser causada por C. nigrificans, que produce sulfhídrico 
con ennegrecimiento del producto.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
C.7.6.3  Interpretación de resultados en al imentos de acidez alta  
C.7.6.3.1 Presencia de mesofílicos aerobios  
C.7.6.3.1.1 Presencia de Lactobacillus . La descomposición por bacterias acidúricas no formadoras de 
esporas, puede deberse a varias especies del género Lactobacillus . Se han aislado L. lyco perci, L. 
pentoaceticus, L. menitipolum  y L. pleofructi . 
C.7.6.3.1.2 Presencia de levaduras. El hallazgo de levaduras indica falta de procesamiento. Las latas 
contaminadas generalmente se presentan muy hinchadas y el olor del producto es característico de levadura 
(olor ácido). Entre las levaduras se han aislado esporas del género Torula.  
C.7.6.3.1.3 Presencia de hongos. Otro tipo de descomposición puede ser causada por hongos como 
Byssochlamys fulva , que forma esporas muy resistentes al calor. Se han encon trado también algunas cepas 
de Penicillium; en estos casos generalmente las latas se encuentran planas, sin alteración y el hongo crece en 
la superficie del producto.  
C.7.6.3.2  Mesofílicos anaerobios  
Clostridium pasteurianum  causa una descomposición poco f recuente, en que las latas se encuentran 
infladas y con olor butírico. Si se sospecha este tipo de contaminación, sembrar un tubo con medio o caldo 
ácido en anaerobiosis a 35°C.  
C.7.6.3.3 Termofílicos aerobios  
La descomposición por termofílicos aerobios pr oduce el tipo flat -sour, o sea la descomposición ácida. Las 
latas se encuentran planas y se observan cambios en el vacío; entre los gérmenes causantes está B. 
coagulans , que es el responsable de la descomposición de productos derivados del jitomate y de la  
producción de grumos de leche evaporada.  
C.7.6.3.4 Termofílicos anaerobios  
La descomposición por termofílicos anaerobios es poco frecuente en productos ácidos. La producen 
anaerobios butíricos.  
En productos de acidez muy alta, con pH inferior a 3,7, como col agria, encurtidos, etcétera, la 
descomposición puede deberse a las bacterias ya señaladas, pero generalmente la acidez inhibe el desarrollo 
de gérmenes. En muchos casos, la hinchazón de la lata se debe a causas químicas, por formación de 
hidrógeno.  
C.7.6.4 Observaciones generales  
Algunas veces se pueden encontrar cultivos negativos, procedentes de latas anormales, o de latas 
normales con productos descompuestos. Esto puede deberse a que la alteración ocurrió antes del 
procesamiento térmico del enlatado y han muerto los microorganismos que la originaron, o bien a que en un 
producto contaminado, los gérmenes murieron al agotarse el oxígeno o los nutrientes.  
En estos casos, un examen microscópico del producto puede ayudar al diagnóstico.  
METODOS FISICOQU IMICOS  
C.8. M ETODO DE PRUEBA PARA LA DETERMINACI ON DE CADMIO, ARS ENICO, PLOMO, ESTAÑO, 
COBRE, FIERRO, ZINC Y MERCURIO EN ALIMENTOS, AGUA POTABLE Y AGUA PURIFICADA POR 
ESPECTROMETR IA DE ABSORCI ON AT OMICA.  
C.8.1 Fundamento  
El método de absorción atómica se basa  en hacer pasar un haz de luz monocromática de una frecuencia 
tal que puede ser absorbido por el analito que se encuentra presente en forma de vapor atómico. La medida 
de la intensidad luminosa antes y después de su paso por el vapor atómico permite determ inar el porciento de 
absorción. La cantidad de absorción aumenta con la concentración de los átomos en el medio absorbente, es 
decir, la medida de la absorción aumenta con la concentración del elemento en la muestra, ya sea que esté en 
su condición origina l o sujeta a pretratamiento.  
C.8.2 Reactivos y materiales  
C.8.2.1  Reactivos  
■ Soluciones estándares de referencia certificadas de cada uno de los metales.  
■ Agua, debe ser destilada deionizada, con un grado máximo de conductividad de 1 µmho/cm a 25ºC.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
■ Acido nítrico (densidad específica 1,41), grado suprapuro.  
■ Acido nítrico (densidad específica 1,41), contenido de mercurio muy bajo.  
■ Acido perclórico (densidad específica 1,67), grado suprapuro.  
■ Acido clorhídrico (densidad específica 1,19), grado supra puro.  
■ Acido sulfúrico (densidad específica 1,84), grado suprapuro.  
■ Acido sulfúrico 1 N a partir de la solución grado suprapuro.  
■ Acido nítrico 65% v/v grado RA.  
■ Peróxido de hidrógeno (densidad específica 1,12).  
■ Hidróxido de sodio granalla reactivo  RA. 
■ Aire comprimido seco y limpio.  
■ Gases: acetileno, óxido nitroso, argón y nitrógeno, grado absorción atómica.  
■ Solución de Nitrato de Magnesio hexahidratado al 7% p/v. Disolver 70 g de Mg(NO3)2.6H2O en 1000 
ml de HCl 1 N.  
■ Acido clorhídrico 1 N. D iluir 8,3 ml de HCl y llevar a 100 ml de agua.  
■ Acido nítrico al 50% v/v. Diluir 50 ml de HNO3 al 65% v/v grado suprapuro en 50 ml de agua.  
■ Acido clorhídrico 8 M. Diluir 66,0 ml de HCl y llevar a 100 ml con agua.  
■ Acido clorhídrico 0,5 N. Diluir 4,15 m l de HCl y llevar a 100 ml con agua.  
■ Solución de Yoduro de Potasio al 15% p/v. Disolver 15 g de KI en 100 ml de agua (esta solución 
debe prepararse en el momento de usarse).  
■ Solución de Yoduro de Potasio al 20% p/v. Disolver 20 g de KI en 100 ml de agu a (esta solución 
debe prepararse en el momento de usarse).  
■ Solución de Cloruro de Potasio (10 mg/ml de K). Disolver 1,91 g de KCl en agua y diluir a 100 ml con 
agua.  
■ Solución de Nitrato de Magnesio al 50% p/v. Disolver 50 g de Mg(NO3)2.6H2O en 100 ml d e agua.  
■ Solución de ácido clorhídrico al 1,5% p/v. Diluir 1,5 ml de HCl en 100 ml de agua destilada 
deionizada.  
■ Solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 1 g de hidróxido de sodio y diluir a 100 ml con agua 
destilada deionizada.  
■ Solución de bor ohidruro de sodio al 4% p/v en solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 4 g de 
borohidruro de sodio en 100 ml de una solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Filtrar al vací o. 
■ Solución reductora para mercurio. Mezclar 50 ml de ácido sulfúrico con centrado con 
aproximadamente 300 ml de agua. Enfriar a temperatura ambiente y disolver 15 g de cloruro de 
sodio, 15 g de sulfato o cloruro de hidroxilamina y 25 g de cloruro o sulfato estanoso en solución. 
Diluir a 500 ml.  
■ Solución de dilución para mercu rio. En un matraz de 1 l, conteniendo de 300 a 500 ml de agua 
destilada deionizada, agregar 58 ml de ácido nítrico concentrado de muy baja concentración de 
mercurio y 67 ml de ácido sulfúrico concentrado. Diluir al volumen con agua.  
■ Solución de trabajo d e As de 1 µg/ml. Diluir 1 ml de la solución patrón de 1000 µg/ml a 1 l con ácido 
sulfúrico 1N preparada a partir de la solución grado suprapuro. Preparar fresca cada día.  
C.8.2.2  Materiales  
■ Matraces Kjeldahl de 500 ml y 800 ml.  
■ Sistema de reflujo con r efrigerante.  
■ Crisoles Vycor de 40 a 50 ml de capacidad.  
■ Crisoles de platino de 40 a 50 ml de capacidad.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
■ Matraces Erlenmeyer de diferentes capacidades.  
■ Matraces volumétricos de diferentes capacidades.  
■ Matraces redondos de fondo plano de 50 ml.  
■ Bombas Parr.  
■ Micropipetas o pipetas de Eppendorf de diferentes capacidades.  
■ Puntas de plástico para micropipetas.  
■ Papel filtro Whatman No.  2. 
■ Perlas de ebullición.  
■ Varillas de plástico.  
■ Tubos de ensayo graduados de propilen o propileno de 15 ml.  
■ Recipientes de propilen o propileno.  
■ Embudos de filtración de diferentes capacidades.  
■ Material común de laboratorio.  
Todo el material utilizado debe someterse a lavado de acuerdo con las siguientes instrucciones:  
● El jabón que se use debe ser de pr eferencia neutro.  
● Enjuagar perfectamente con agua corriente.  
● Sumergir el material de vidrio o plástico en un recipiente (de preferencia plástico) que contenga 
una solución de ácido nítrico grado RA al 30 %. 
● Dejarlo tapado y reposando por un lapso de 2 4 horas.  
● Quitar el exceso de ácido nítrico con varios enjuagues (5 o 6 veces) con agua deionizada.  
● Dejar escurrir y secar.  
● Guardar en cuanto esté seco para evitar contaminación por partículas en el aire.  
C.8.3 Aparatos e instrumentos  
C.8.3.1  Aparatos  
■ Lámparas de cátodo hueco o de descarga sin electrodos para determinar arsénico, cadmio, cobre, 
estaño, fierro, mercurio, plomo y zinc.  
■ Fuente de radiofrecuencia en caso de usar lámparas de descarga.  
■ Automuestreador y recirculador de agua.  
■ Placa de  calentamiento con regulador que alcan ce una temperatura de 400 a 450 ºC. 
■ Horno de microondas.  
■ Autoclave que alcance 121 ± 5ºC o 15 lb de presión.  
■ Centrífuga de laboratorio capaz de mantener 1600 rpm.  
C.8.3.2  Instrumentos  
Los instrumentos que a contin uación se indican deben estar calibrados y ajustados antes de su operación.  
■ Espectrómetro de absorción atómica equipado con los accesorios para flama, horno de grafito, 
generador de hidruros o vapor frío, dependiendo del método a seguir.  
■ Balanza analít ica con sensibilidad de 0,1 mg.  
■ Mufla capaz de mantener una temperatura de 550 ± 10ºC.  
■ Horno de calentamiento (estufa) con intervalo de temperatura de 120 ± 5ºC.  
C.8.4 Preparación de la muestra  
C.8.4.1  Digestión para la determinación de Cd, Cu, Fe, Pb y Zn.  
C.8.4.1.1  Digestión por vía húmeda.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
C.8.4.1.1.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad apropiada de muestra.  
Para la determinación por el método de absorción por flama pesar como máximo 40 g de jugo o bebida,  
20 g de alimentos que contengan d el 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos sólidos o semisólidos. Limite el 
contenido de grasa o aceite a un máximo de 4 g y el total de materia orgánica a 5 g.  
C.8.4.1.1.2  Añadir 10 ml de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar dir ectamente 
la digestión.  
C.8.4.1.1.3  Usar matraz de Kjeldhal o matraz conectado al sistema de refrigerantes.  
C.8.4.1.1.4  Calentar suavemente.  
C.8.4.1.1.5  Digerir la muestra 3 horas o más tiempo si es necesario (algunas muestras requieren la adición 
de mayor  cantidad de ácido nítrico) hasta la aparición del color traslúcido, si queda ámbar, adicionar peróxido 
de hidrógeno gota a gota con agitación continua (reacción exotérmica).  
C.8.4.1.1.6  Enfriar.  
C.8.4.1.1.7  Recuperar, filtrar y llevar a un volumen conocid o en matraz volumétrico.  
C.8.4.1.1.8  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.  
C.8.4.1.1.9  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica por flama u horno de 
grafito).  
8.4.1.2  Digestión por vía se ca. 
8.4.1.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad apropiada de muestra.  
Para la determinación por el método de absorción por flama pesar como máximo 40 g de jugo o bebida,  
20 g de alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos  sólidos y semisólidos. Limite el 
contenido de grasa o aceite a un máximo de 4 g y el total de materia orgánica a 5 g.  
C.8.4.1.2.2  Añadir 10 ml de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar directamente 
la digestión. En productos con  alta concentración de proteínas adicionar una solución de nitrato de magnesio 
al 7,0% p/v y mezclar completamente, llevar a sequedad aproximadamente durante 6 horas en estufa a una 
temperatura de 90 a 95ºC.  
C.8.4.1.2.3  Colocar la muestra en una mufla y el evar la temperatura lentamente de 2 a 4ºC por minuto 
hasta 350°C. Mantener la temperatura hasta que cesen los humos.  
C.8.4.1.2.4  Elevar gradualmente la temperatura de 500 a 550ºC para evitar que la muestra se incinere y 
mantener esa temperatura durante 16 horas o toda la noche.  
C.8.4.1.2.5  Apagar la mufla y dejar enfriar.  
C.8.4.1.2.6  Un segundo paso de calcinación puede ser requerido para remover algunos residuos de 
carbón, mediante el siguiente procedimiento:  
Lavar las paredes del crisol con 2 ml de ácido nítrico al 50%. Colocar la muestra en una placa de 
calentamiento puesta a 120ºC para remover el exceso de ácido. Colocar la muestra en una mufla fría y elevar 
la temperatura gradualmente de 500 a 550ºC, manteniéndola por el tiempo necesario. Repetir este 
procedimiento cuantas veces sea necesario hasta que quede libre de carbón remanente.  
C.8.4.1.2.7  Disolver las cenizas completamente en 5 ml de ácido clorhídrico 1N, transferir la muestra 
disuelta a un tubo de propileno o a un matraz de volumen conocido, enj uagar el crisol con dos alícuotas de 5 
ml de ácido clorhídrico 1 N y transferir al mismo tubo o matraz para obtener un volumen de 15 ml en el 
primero y llevar al aforo en el segundo, tapar y mezclar, si existe presencia de partículas o materia insoluble, 
filtrar en papel Whatman No. 2, antes de la determinación.  
C.8.4.1.2.8  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.  
C.8.4.1.2.9  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica: flama u horno de grafito) . 
C.8.4.2  Digestión por vía húmeda para la determinación de Sn.  
C.8.4.2.1  Proceder igual que en el punto  C.8.4.1.1.1.  
C.8.4.2.2  No adicionar ácido nítrico si no se lleva cabo la digestión total en el mismo día.  
C.8.4.2.3  Adicionar 30 ml de ácido nítrico co ncentrado al matraz y calentar suavemente por 15 minutos en 
campana para iniciar la digestión, evitando una excesiva producción de espuma.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
C.8.4.2.4  Hervir suavemente hasta tener un remanente de 3 a 6 ml o hasta que la muestra empiece a 
secarse en el fondo . No dejar que la muestra se calcine.  
C.8.4.2.5  Retirar la muestra del calor.  
C.8.4.2.6  Al mismo tiempo correr dos blancos de reactivos.  
C.8.4.2.7  Adicionar 25 ml de ácido clorhídrico concentrado, calentar suavemente durante 
aproximadamente 15 minutos, has ta que todo el cloro sea liberado. Aumentar la temperatura gradualmente 
hasta ebullición.  
C.8.4.2.8  Evaporar hasta obtener de 10 a 15 ml, usando un matraz similar con 15 ml de agua como patrón 
de volumen.  
C.8.4.2.9  Adicionar aproximadamente 40 ml de agua.  
C.8.4.2.10  Agitar y pasar a un matraz de 100 ml y enjuagar con 10 ml de agua.  
C.8.4.2.11  Cuando el ácido clorhídrico está presente en la digestión, las muestras se pueden quedar toda 
la noche o por más tiempo.  
C.8.4.2.12  Agregar 1 ml de solución de cloruro  de potasio en cada matraz.  
C.8.4.2.13  Enfriar a temperatura ambiente.  
C.8.4.2.14  Diluir con agua y agregar más agua para compensar el volumen de grasa en el matraz.  
C.8.4.2.15  Mezclar perfectamente y filtrar de 30 a 50 ml a través de un papel filtro Whatm an No. 2 y 
recoger el filtrado en un recipiente de propileno, polipropileno o polietileno.  
C.8.4.2.16  No filtrar los blancos. Tapar las botellas durante el análisis. Las soluciones son estables por 
varios meses.  
C.8.4.2.17  Correr un blanco de reactivos y m uestra fortificada por cada serie de digestión.  
C.8.4.2.18  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica: flama u horno de grafito).  
C.8.4.3  Digestión por vía húmeda para la determinación de Hg.  
C.8.4.3.1  Sistema de reflujo.  
C.8.4.3.1. 1 Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad apropiada de muestra, dependiendo el tipo de 
ésta, en un matraz de digestión y adicionar perlas de ebullición.  
C.8.4.3.1.2  Conectar el matraz al sistema de reflujo y agregar poco a poco la cantidad necesaria d e ácido 
nítrico concentrado y calentar durante media hora o hasta que no se observen cambios en la digestión.  
C.8.4.3.1.3  Dejar enfriar y agregar una mezcla de ácido nítrico y ácido sulfúrico concentrados (1 + 1).  
C.8.4.3.1.4  Calentar y agregar más ácido n ítrico gota a gota sobre las paredes del recipiente, hasta que el 
color obscuro de la solución desaparezca.  
C.8.4.3.1.5  Enfriar.  
C.8.4.3.1.6  Si existe grasa o cera filtrar la solución.  
C.8.4.3.1.7  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cad a serie de digestión.  
C.8.4.3.1.8  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica de vapor frío).  
C.8.4.3.2  Sistema cerrado.  
C.8.4.3.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad apropiada de muestra, dependiendo el tipo de 
ésta, en e l recipiente de digestión.  
C.8.4.3.2.2  Agregar la cantidad necesaria de ácido nítrico concentrado.  
C.8.4.3.2.3  Tapar y sellar perfectamente el recipiente de digestión.  
C.8.4.3.2.4  Si el recipiente de digestión es un matraz Erlenmeyer, colocar éste en una a utoclave a 15 lb 
por 30 minutos. Si se utiliza bomba Parr, calentar en parrilla controland o la temperatura a un máximo de  
300ºC por 30 minutos.  
C.8.4.3.2.5  Enfriar a temperatura ambiente.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
C.8.4.3.2.6  En caso de que la digestión no sea completa adicionar pe róxido de hidrógeno y repetir la 
digestión.  
C.8.4.3.2.7  Filtrar en caso de que exista grasa o cera y analizar el contenido de Hg.  
C.8.4.3.2.8  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.  
C.8.4.3.2.9  Leer en el aparato de  elección (espectrómetro de absorción atómica de vapor frío).  
C.8.4.4  Digestión para la determinación de As.  
C.8.4.4.1  Digestión por vía húmeda -seca.  
C.8.4.4.1.1  Proceder como en el punto C.8.4.3.2 hasta que la digestión sea completa y posteriormente 
conti nuar con los siguientes pasos.  
C.8.4.4.1.2  Con una pipeta tomar una alícuota de la solución de muestra digerida y colocarla en un crisol 
Vycor o vaso de precipitados.  
C.8.4.4.1.3  Añadir 1 ml de solución de nitrato de magnesio al 7% p/v y calentar en una pa rrilla a 
temperatura baja, hasta sequedad.  
C.8.4.4.1.4  Incrementar el calor de la placa a un máximo de 375ºC.  
C.8.4.4.1.5  Colocar el matraz en la mufla a 450ºC para oxidar cualquier residuo de carbón y descomponer 
el exceso de nitrato de magnesio, por un t iempo mayor o igual a 30 minutos.  
C.8.4.4.1.6 Enfriar y disolver el residuo en 2,0 ml de ácido clorhídrico 8 M.  
C.8.4.4.1.7 Añadir 0,1 ml de yoduro de potasio al 20% p/v para reducir el As(V) a As(III).  
C.8.4.4.1.8  Dejar reposar por un tiempo mayor a 2 min utos y transferir a un matraz y llevar al aforo con agua.  
C.8.4.4.1.9  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.  
C.8.4.4.1.10  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica con adaptación para 
horno  de grafito o generador de hidruros).  
C.8.4.4.2  Digestión por vía seca.  
C.8.4.4.2 .1 Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad necesaria de muestra en un crisol Vycor o de platino.  
C.8.4.4.2.2  Añadir el volumen necesario de nitrato de magnesio al 50% p/v . 
C.8.4.4.2.3  Homogeneizar con una varilla limpia de plástico extendiendo la mezcla en el crisol.  
C.8.4.4.2.4  Colocar la muestra en una mufla subiendo gradualmente la temperatura hasta 300ºC por  2 
horas. Posteriormente subir gradualmente la temperatura ha sta 500ºC por 16 horas o durante toda la noche.  
C.8.4.4.2.5 Enfriar a temperatura ambiente y humedecer las cenizas con ácido nítrico al 50% v/v.  
C.8.4.4.2.6  Calentar en parrilla hasta la eliminación del ácido.  
C.8.4.4.2.7  Llevar los crisoles a una mufla el evando gradualmente la temperatura de 23 a 500ºC, 
manteniendo ésta 30 min hasta evaporación total.  
C.8.4.4.2.8 Transferir las cenizas del crisol a un matraz aforado usando una porción de 10 ml de ácido 
clorhídrico 0,5 N.  
C.8.4.4.2.9  Enjuagar los crisoles c on 5 ml de agua destilada y transferir al matraz, añadir 1 ml de solución 
de yoduro de potasio al 15% y mezclar.  
C.8.4.4.2.10  Dejar reposar durante 15 minutos y llevar al aforo.  
C.8.4.4.2.11  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada seri e de digestión.  
C.8.4.4.2.12 Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica con adaptación para 
horno de grafito o generador de hidruros).  
C.8.4.5  Digestión para la determinación de Cd, As, Pb, Sn, Cu, Fe, Zn y Hg por horno de microonda s. 
Pesar con precisión de ± 0,1 mg, 0,500 g como máximo de muestra, añadir 6 ml de ácido nítrico 
concentrado y 2 ml de agua oxigenada al 30%, cerrar perfectamente el envase de reacción y proceder según 
el manual del fabricante.  
C.8.5 Procedimiento        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
C.8.5.1  Espectrometría de absorción atómica por flama.  
C.8.5.1.1  Calibración. Es necesario comprobar que se tiene una calibración inicial y periódica aceptable.  
C.8.5.1.1.1  Se inicia la configuración operacional del instrumento y en el sistema de adquisición de da tos. 
Permitir un periodo no menor a 30 minutos para el calentamiento de las lámparas de descarga sin electrodos.  
C.C.8.5.1.1.2  Se debe verificar la estabilidad del instrumento mediante el análisis de una solución estándar 
20 veces más concentrada que el lí mite de detección del instrumento (LDI) para el analito, leída un mínimo de 
cinco veces y calculando la desviación estándar resultante, la cual debe ser menor al 5%.  
C.8.5.1.1.3  El instrumento debe calibrarse para el analito a determinar usando el blanco d e calibración y 
los estándares de calibración preparados a 3 o 4 niveles de concentración dentro del intervalo dinámico de 
concentración del analito.  
C.8.5.1.1.4  Ajustar el instrumento a 0 con el blanco de calibración. Introducir los estándares de calibrac ión 
del analito de menor a mayor concentración y registrar al menos tres réplicas de la absorbancia de cada uno.  
C.8.5.1.1.5  Elaborar una curva de calibración graficando absorbancia en función de la concentración.  
Lo anterior puede llevarse a cabo en equip os que se programan directamente, en los cuales sólo es 
necesario introducir los estándares y marcar su concentración teórica.  
C.8.5.1.2  Operación del instrumento.  
El desempeño del instrumento se verifica mediante el empleo de blancos de calibración, están dares de 
calibración y una muestra de control de calidad (MCC).  
C.8.5.1.2.1  Después de que se ha realizado la calibración, se debe verificar que el instrumento trabaje 
adecuadamente para el analito. Para ello se analiza una muestra de control de calidad. S i las mediciones 
varían en ± 10% o más, al valor establecido para la MCC, el análisis debe interrumpirse y buscar la posible 
causa de error, el instrumento se debe recalibrar y verificar la nueva calibración.  
C.8.5.1.2.2  Para verificar que el instrumento n o presenta deriva, por cada 10 análisis se debe analizar el 
blanco de calibración. Si el valor verdadero del analito difiere ± 10% o más, el instrumento debe recalibrarse. 
Si el error persiste debe identificarse el problema y corregirse.  
Si la matriz de la  muestra es responsable de la deriva o afecta la respuesta del analito puede ser 
necesario trabajar por adiciones estándar.  
C.8.5.1.2.3  La demostración de la operatividad inicial del instrumento se hace estableciendo los límites de 
detección del método (LD M) para el analito y el intervalo de calibración lineal. Para determinar el LDM se usa 
un blanco de reactivos fortificado con una concentración del analito equivalente de 2 a 5 veces el límite de 
detección estimado. Se hacen al menos 4 réplicas de lectura de absorbancia del blanco de reactivos 
fortificado procesado a través de todo el método analítico. Los LDM se calculan de acuerdo a:  
LDM= t x s  
t = valor de la "T" de Student a un intervalo de confianza de 99% y una desviación estándar estimada para 
n-1 grados de libertad. t = 3,14 para 7 réplicas.  
s = desviación estándar de las réplicas del análisis.  
El intervalo lineal de calibración se establece a partir de por lo menos 4 estándares de diferente 
concentración, uno de los cuales debe estar próximo al lími te superior del intervalo lineal.  
C.8.5.1.3  Determinación  
C.8.5.1.3.1 Ajustar el instrumento de absorción atómica en las condiciones adecuadas para la 
determinación del analito de acuerdo a las indicaciones del manual del instrumento.  
C.8.5.1.3.2 Introduci r el blanco de reactivos y la muestra a analizar y registrar los valores de absorbancia. 
Se debe analizar al menos un blanco de reactivos con cada grupo de muestras. Los valores obtenidos ponen 
de manifiesto la calidad de los reactivos usados y el grado de  contaminación del laboratorio.  
C.8.5.1.3.3 En los equipos que pueden programarse, la lectura obtenida da directamente la concentración 
del elemento en las unidades de concentración utilizadas.  
C.8.5.1.3.4 Se debe analizar al menos un blanco de reactivos f ortificado para cada grupo de muestras. Se 
calcula la exactitud como el porciento de recuperación (de acuerdo al apartado C.8.5.1.3.6).  
C.8.5.1.3.5 Se debe fortificar al menos una muestra por grupo o el 10% de ellas lo que resulte mayor. La 
concentración a ñadida debe ser de aproximadamente 0,1 unidades de absorbancia.  
C.8.5.1.3.6 Se debe calcular el porciento de recuperación para el analito, de acuerdo a:  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
CM - C 
R = --------------  x 100  
CA 
R = % recuperación  
CM = Concentración de la muestra fortificada  
C = Concentración de la muestra  
CA = Concentración equivalente de analito añadido a la muestra.  
Si la recuperación del analito en la muestra fortificada está fuera del intervalo previamente establecido y el 
blanco de reactivos fortificado está correcto, puede existir un problema relacionado con la matriz de la 
muestra. Los datos se deben verificar por el método de las adiciones estándar.  
C.8.5.2  Espectrometría de absorción atómica por horno de grafito.  
C.8.5.2.1  Calibración.  
C.8.5.2.1.1  Proceder de acuerdo a lo s puntos  C.8.5.1.1.1 a  C.8.5.1.1.4  
C.8.5.2.1.2  Elaborar una curva de calibración graficando área de pico o altura máxima contra 
concentración del analito.  
La calibración mediante el uso de una computadora o una calculadora basada en el ajuste sobre los dat os 
de concentración respuesta es aceptada.  
Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se programan directamente, en los cuales sólo es 
necesario introducir los estándares y marcar su concentración teórica.  
C.8.5.2.2  Operación del instrumento.  
C.8.5.2 .2.1 Proceder de acuerdo a  C.8.5.1.2.1 a  C.8.5.1.2.3  
C.8.5.2.3  Determinación.  
C.8.5.2.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómica en las condiciones adecuadas para la 
determinación del analito, de acuerdo a las recomendaciones del manual del instrument o. 
El programa de temperaturas para el horno de grafito puede variar dependiendo de la matriz de la 
muestra. En el caso de existir interferencias no específicas (absorción molecular o dispersión de la luz), se 
recomienda consultar la bibliografía existente  en cuanto a los métodos disponibles para eliminarlas, así como 
en el caso de interferencias de matriz.  
C.8.5.3  Espectrometría de absorción atómica por generador de hidruros.  
C.8.5.3.1  Calibración.  
C.8.5.3.1.1  Proceder de acuerdo a los puntos  C.8.5.1.1.1 a  C.8.5.1.1.4  
C.8.5.3.1.2  A partir de la solución estándar de As de 1000 mg/l, preparar una solución de As de 1 mg/l en 
ácido clorhídrico de concentración apropiada al método. Trazar una curva de calibración de absorbancia 
(máximo de la altura de pico) en f unción de la concentración del analito para un intervalo de concentración de 
0 a 10 µg/l de As bajo las mismas condiciones de la matriz de la muestra.  
C.8.5.3.2  Operación del instrumento.  
C.8.5.3.2.1  Proceder de acuerdo a los puntos  C.8.5.1.2.1 a C.8.5.1.2 .3 
C.8.5.3.3  Determinación.  
C.8.5.3.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómica en las condiciones adecuadas para la 
determinación de As: longitud de onda de 193,7 nm y lámpara de descarga sin electrodos. Colocar y ajustar la 
celda de absorción de acue rdo al manual del fabricante. Ajustar el flujo de gas (nitrógeno o argón).  
C.8.5.3.3.2  Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibración de ácido clorhídrico al 1,5% siguiendo 
las instrucciones del manual del fabricante.  
C.8.5.3.3.3  Optimizar con un estándar de calibración la respuesta del instrumento al analito (por lo general, 
10 ml de una solución de 5 µg/l de As da una absorbancia de 0,2), ajustando el tiempo de purga I, el tiempo 
de reacción y el tiempo de purga II.  
C.8.5.3.3.4  Tomar un volumen c onocido de la muestra dirigida y seguir el mismo procedimiento que con 
los estándares de calibración.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
C.8.5.4  Espectrometría de absorción atómica por vapor frío.  
C.8.5.4.1  Calibración.  
C.8.5.4.1.1  Proceder igual que en los puntos  C.8.5.1.1.1 a C.8.5.1.1.4.  
C.8.5.4.1.2  A partir de la solución de trabajo de 1 µg/ml preparar estándares de calibración que contengan 
0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1,0 µg de Hg a frascos de reacción. A cada frasco agregar 100 ml de la solución de 
dilución y 20 ml de la solución de reducc ión. Trazar la curva de calibración de absorbancia (altura máxima  de 
pico) en función de la concentración del analito.  
C.8.5.4.2  Operación del instrumento.  
C.8.5.4.2.1  Proceder de acuerdo a los puntos C.8.5.1.2.1 a  C.8.5.1.2.3.  
C.8.5.4.3  Determinación.  
C.8.5.4.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómica en las condiciones adecuadas para la 
determinación de Hg: longitud de onda de 253,6 nm, slit 0,7 nm y lámpara de cátodo hueco. Colocar y ajustar 
la celda de absorción de acuerdo al manual del fabricante . Ajustar el flujo de gas (nitrógeno o argón).  
C.8.5.4.3.2  Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibración (solución de dilución y de reducción) 
siguiendo las instrucciones del manual del fabricante.  
C.8.5.4.3.3  Optimizar con un estándar de calibra ción la respuesta del instrumento al analito.  
C.8.5.4.3.4  Tomar 25 ml de la muestra digerida y seguir el mismo procedimiento que con los estándares 
de calibración.  
8.6 Expresión de resultados  
8.6.1 Método de cálculo.  
Interpolar los valores de absorbancia o  altura de pico de la muestra analizada en la curva de calibración y 
obtener los mg/kg del elemento en la muestra y realizar los cálculos empleando la siguiente fórmula:  
A x B  
mg/ kg = --------  
C 
en donde:  
A = Concentración en mg/kg de la muestra a interpo lar en la curva de calibración.  
B = Volumen final al que se llevó la muestra (ml).  
C = Peso de la muestra (g) o volumen de la muestra (ml) en el caso de agua.  
En los equipos que pueden programarse, la lectura obtenida da directamente la concentración del 
elemento en mg/kg o µg/kg.  
C.8.7 Informe de la prueba  
Los resultados se informarán en mg/kg o µg/kg del elemento a determinar.  
C.9. DETERMINACI ON DE VITAMINA A POR CROMATOGRAF IA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCI ON 
(HPLC EN FASE REVERSA).  
C.9.1 Principio del método.  
Los lípidos son ésteres que en presencia de un álcali cáustico se hidrolizan liberando el material 
insaponificable, el cual es extraído con un disolvente orgánico. Posteriormente la vitamina A contenida en este 
material, es cuantificada por medio de Cromat ografía de Líquidos de Alta Resolución.  
C.9.2 Equipo.  
C.9.2.1. Sistema de HPLC que incluye:  
C.9.2.1.1 Bomba binaria LC.  
C.9.2.1.2 Inyector automático o manual de muestras.  
C.9.2.1.3 Detector espectrofotométrico de longitud de onda variable UV -Visible LC.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
C.9.2.1.4 Integrador computarizado LC.  
C.9.2.1.5 Columna Octadecil ODS (20), tamaño de partícula 5 µm, longitud 250 mm x diámetro interno  4,6 
mm. 
C.9.2.2 Balanza analítica, con capacidad de 160 g, lectura 0,1 mg.  
C.9.2.3 Placas de agitación con calentamien to. 
C.9.2.4 Cilindro para gas comprimido de nitrógeno pureza 95%.  
C.9.2.5 Cilindro para gas comprimido de helio pureza 95%.  
C.9.2.6 Evaporador rotatorio con elevador rápido y baño maría.  
C.9.2.7 Equipo de filtración para la preparación de la fase móvil.  
C.9.2.8 Cronómetro o reloj.  
C.9.3 Materiales.  
C.9.3.1 Matraces volumétricos actínicos o de color marrón con tapón de vidrio o teflón de 50 y 100 mL.  
C.9.3.2 Matraces actínicos o de color marrón de fondo plano, cuello corto de 250 mL.  
C.9.3.3 Matraces, en for ma de pera actínicos o de color marrón, de cuello corto y boca esmerilada de 500 mL 
(que embone en el rotavapor).  
C.9.3.4 Matraces volumétricos actínicos o de color marrón de 10 mL.  
C.9.3.5 Vasos de precipitados de 500 mL.  
C.9.3.6 Embudo de separación cóni co, actínicos o de color marrón, con llave de teflón 500 mL.  
C.9.3.7 Embudo tallo corto diámetro 12 cm.  
C.9.3.8 Tapones de teflón huecos hexagonales o actínicos o de color marrón.  
C.9.3.9 Refrigerante con macho y hembra, manguito 300 mL, de 50 cm de longit ud aproximadamente.  
C.9.3.10 Manguera de látex.  
C.9.3.11 Papel filtro mediano No. 1 con diámetro de 18,5 cm.  
C.9.3.12 Pipetas volumétricas con marca de 5 y 4 mL.  
C.9.3.13 Jeringa de vidrio sin aguja desechable de 10 mL.  
C.9.3.14 Jeringa de vidrio de 50 µL con aguja sin punta.  
C.9.3.15 Filtros para jeringa (acrodiscos para HPLC) de 0,45  µm de tamaño de poro y diámetro de 25 mm, 
para solventes orgánicos y fase móvil.  
C.9.3.16 Membranas de filtración de fluoruro de polivinilideno, utilizada para fases móviles (solventes 
orgánicos y acuosos), cuyos extractables sean de absorción en UV, u otro filtro para fines similares.  
C.9.3.17 Magnetos para placa de agitación.  
C.9.4 Reactivos.  
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico y por agua debe entenderse 
agua destilada.  
C.9.4.1 Estándar de retinol (vitamina A) cristalizada (C20H30O) all trans RETINOL con certificado de pureza.  
C.9.4.2 Hidróxido de potasio en lentejas (KOH).  
C.9.4.3 Alcohol etílico absoluto (C2H5OH).  
C.9.4.4 Eter de petróleo  intervalo de ebullición 40 - 60°C.  
C.9.4.5 Fenolftaleína en solución etanólica al 1%, indicador ( C20H14O4).  
C.9.4.6 Metanol grado HPLC (CH3OH).  
C.9.4.7 Agua destilada filtrada (sólo para la preparación de fase móvil).  
C.9.4.8 Agua destilada que se utiliz ará en los lavados del saponificado (verificar que el valor de pH no sea 
mayor de 6,0).  
C.9.4.9 Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4).  
C.9.4.10 Acido ascórbico (C6H8O6).        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
C.9.4.11 Fase móvil metanol: agua (95:5) para HPLC.  
Pasar agua destilada a través de una m embrana de filtración para soluciones acuosas. Pasar metanol a 
través de una membrana de filtración para solventes orgánicos. Posteriormente mezclar 50 mL de agua 
destilada en 950 mL de metanol (fase móvil). Degasificar la fase móvil pasando una ligera cor riente de gas 
helio o por ultrasonido 15 minutos a temperatura ambiente.  
C.9.4.12 Soluciones patrón de vitamina A.  
C.9.4.12.1 Solución concentrada (150 µg equivalentes de retinol). Justo antes de emplearse, pesar 15 mg 
de retinol cristalizado (A - OH) y re gistrar el peso exacto. Colocar el estándar pesado en un matraz 
volumétrico de 100 mL. Disolver con metanol y llevar al volumen.  
C.9.4.12.2 Solución intermedia (15 µ g equivalentes de retinol).  
Diluir 5 mL de la solución concentrada a 50 mL con el mismo met anol para obtener una solución de 
aproximadamente 50 UI/mL.  
C.9.4.12.3 Solución de trabajo (6 µg equivalentes de retinol).  
Añadir 4 mL de la solución estándar intermedia al matraz marcado como estándar y adicionar los reactivos 
al igual que al blanco y mue stra como se indica en el apartado de saponificación. Esta solución tendrá 
aproximadamente 20 UI/mL de vitamina A, al final del proceso de recuperación, en el matraz volumétrico de 
10 mL.  
Nota 1: Si el certificado de % de pureza en el estándar es inferior al 85% no debe prepararse la solución 
patrón, siendo necesario un nuevo estándar de otro lote con una purez a superior a la antes indicada.  Nota 2: 
La vitamina A -OH (A -alcohol) se oxida con gran rapidez y es muy sensible a la luz. Al abrir  una ampolleta 
nueva de vitamina A -cristalizada, pesar la cantidad de estándar requerida y guardar la ampolleta bajo 
atmósfera de nitrógeno o en condiciones similares.  
C.9.5 Procedimiento  
Nota 3: La vitamina A es sensible a la luz. Utilizar material actínico o de color marr ón o bien, proteger el 
material con papel aluminio. Por otra parte efectuar las evaporaciones con rotavapor a una temperatura 
máxima de 40ºC. No evaporar a sequedad. Romper el vacío e inmediatamente introducir nitrógeno al sistema 
o al matraz. Evaporar los  últimos mililitros mediante una corriente de nitrógeno sin llegar a la sequedad.  
C.9.5.1 Toma de muestra.  
En el caso de productos deshidratados, reconstituir con agua, de acuerdo con las instrucciones señaladas 
en la etiqueta o 130 g del producto llevados  a 1 L con agua. Disolver y agitar la muestra a fin de 
homogeneizarla por completo.  
Medir de preferencia por duplicado una cantidad de muestra tal, que contenga de 30 a 90 ìg equivalentes 
de retinol (100 a 300 UI de vitamina A) o la cantidad correspondient e a lo declarado en la etiqueta de la 
muestra. En caso de no contar con esta información no es conveniente realizar el análisis.  
C.9.5.2 Saponificación.  
C.9.5.2.1 Marcar 4 matraces actínicos de cuello corto y esmerilado con fondo plano de 250 mL (cuando la  
muestra se trabaje por duplicado) de la siguiente manera: blanco, estándar y muestra.  
C.9.5.2.2 Añadir los siguientes reactivos a cada uno de los matraces antes mencionados: 7 g de hidróxido 
de potasio y a continuación añadir 60 mL de alcohol absoluto. Me zclar para disolver. Agregar 0,5 g de ácido 
ascórbico así como una barra magnética. Adicionar una ligera corriente de nitrógeno a cada uno de  los 
matraces.  
C.9.5.2.3 Montar un sistema de reflujo y calentar durante 30 minutos en placas de calentamiento o b año 
de agua en ebullición con agitación constante.  
Nota 4: Durante la saponificación, asegurar una buena agitación del medio de reacción.  
C.9.5.3 Extracción del insaponificable.  
C.9.5.3.1 Una vez concluido el tiempo de saponificación, enjuagar con máximo 3 0 mL de agua destilada 
(evitar el exceso de agua para prevenir la formación de emulsiones) por las paredes internas del refrigerante 
sin quitar el matraz del saponificado. Enfriar el matraz aún instalado al refrigerante sumergiéndolo 
parcialmente en un vas o de precipitados que contenga agua fría, lo anterior con la finalidad de llevarlo a 
temperatura ambiente, evitando enfriarlo demasiado. Trasvasar la suspensión a un embudo de separación de 
500 mL.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
C.9.5.3.2 Enseguida enjuagar el matraz con 100 mL de éter de petróleo que se añaden al embudo de 
separación. Extraer la vitamina A agitando ligeramente. Dejar separar las fases. Vaciar la fase acuosa a otro 
embudo de 500 mL. Recoger la fase orgánica a un tercer embudo de separación de 500 mL. Repetir la 
operación  dos veces más, enjuagando el matraz con dos porciones de 100 mL de éter cada una.  
C.9.5.3.3 Efectuar esta extracción 3 veces en total (un lavado de 50 mL y 2 lavados de 100 mL). Hacer las 
agitaciones con mucho cuidado para evitar emulsiones.  
C.9.5.3.4 Lavar la solución orgánica con porciones de 100 mL de agua adicionándola por las paredes del 
embudo, agitando suavemente, hasta que el agua del lavado ya no dé reacción colorida con la fenolftaleína. 
Después del último lavado, esperar de 15 a 30 minutos antes  de vaciar la fase acuosa y volver a revisar con el 
indicador que no exista reacción colorida.  
C.9.5.3.5 Filtrar la solución lavada en continuo a través de un filtro que contiene aproximadamente 10 g de 
sulfato de sodio anhidro y recoger el filtrado en un matraz de pera de 500 mL, sin dejar secar el filtro. Al final 
enjuagar el sulfato de sodio contenido en el filtro con 50 mL de éter de petróleo.  
C.9.5.3.6 Evaporar el disolvente en un rotavapor a 40ºC y dejar un remanente de aproximadamente 6 mL. 
Tratar de  reducir esta cantidad del disolvente a un volumen de 2 mL aproximadamente mediante una corriente 
de nitrógeno.  
C.9.5.3.7 Disolver el remanente obtenido con 3 mL de la fase móvil y recolectar cuantitativamente la 
solución con una jeringa de vidrio. Filtrar  la solución a través de un filtro acrodisco de 0,45 µm a un matraz 
actínico de 10 mL. Lavar el matraz pera con porciones de 2 mL de fase móvil y repetir el mismo procedimiento 
hasta llegar al aforo del matraz. Hacer lo mismo para cada filtro de blanco, es tándar y probar por duplicado.  
Nota 5: Se recomienda acondicionar el acrodisco de 0,45 µ m con metanol antes de utilizarlo en la filtración 
del recuperado.  
C.9.5.4 Condiciones cromatográficas.  
C.9.5.4.1 Fijar los siguientes parámetros de acuerdo con las ins trucciones de operación del cromatógrafo. 
Columna Octadecil ODS (20), tamaño de pa rtícula 5 µ m, longitud 250 mm x diámetro interno 4,6 mm.  
Loop de inyección: 20 µ L. 
Fase móvil: metanol: agua 95:5.  
Flujo: 1 mL/min.  
Detector: Longitud de onda ajustada a 325 nm. 
Registrador: 5 mm/min.  
C.9.5.5 Determinación de vitamina A.  
Inyectar dos veces los s iguientes analitos: primero 20 µL del blanco, después 20 µ L de la solución 
estándar para HPLC (20  UI/mL aprox.) y por último 20 µ L de la muestra (del saponificado).  
C.9.5.5.1 En el cromatograma, identificar el pico y tiempo de retención de la vitamina A correspondiente al 
estándar. Con estos datos, identificar el pico y tiempo de retención de la vitamina A contenida en la muestra.  
C.9.5.5.2 Calcular la altura del pico de  la solución patrón y de las muestras en los cromatogramas 
obtenidos.  
C.9.6 Cálculos.  
El contenido de vitamina A, expresado en Unidades Internacionales por L de producto es igual a:  
hs x m  
hp x C x V x 1000  
Ul vitamina A/L =  
En donde:  
m = toma de ensayo en  g o mL.  
hp = altura del pico de la muestra, en mm.  
hs = altura del pico de la solución estándar final, en mm.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
C = concentración de la solución estándar final inyectada, en UI/mL para la vitamina A.  
V = volumen de solución estándar final, en el cual ha sid o diluido el remanente antes de la cromatografía.  
Los resultados deben reportarse como µ g equivalentes de retinol.  
9.7 Expresión de resultados.  
µg equivalentes de retinol/ L 
1 UI = 0,3 µ g equivalentes de retinol (todos los retinoles trans)  
C.10.  DETERMINACI ON DE VITAMINA D 3 – HPLC  
C.10.1 Preparación de la muestra.  
En el caso de productos deshidratados reconstituir con agua, de acuerdo con las instrucciones señaladas 
en la etiqueta o 130 g de producto llevado a 1 L con agua. Disolver y agitar la muestra a fin  de 
homogeneizarla por completo. Medir de preferencia por duplicado una cantidad de m uestra que contenga  de 
0,5 a 1 µ g de vitamina D 3 (20 a 40 UI).  
C.10.2 Fundamento  
Saponificación alcalina de la muestra; extracción con éter de compuestos insaponificables ; evaporación 
del éter; solución del residuo seco en hexano e inyección de una alícuota en columna preparativa de HPLC 
(fase normal, Sílice). Colección del eluato que contiene la fracción de vitamina D; evaporación de esta fracción  
a sequedad, disolución e n la fase móvil de HPLC (Analítica, Acetonitrilo: Cloruro de metileno: Isopropanol), 
inyección en HPLC (fase reversa C18) y determinación de la vitamina D con el pico máximo a 264 nm por 
calibración del estándar externo.  
C.10.3 Material  
Instalación HPLC is ocrática  
Uno o dos registradores  
Balanza analítica, con capacidad de 160 g, lectura 0,1 mg  
Balanza de precisión, con capacidad de 1600 g, lectura 0,01 g  
Estufa de laboratorio (para productos con almidón)  
Baño de agua con agitadores magnéticos, 4 plazas  
Evaporador rotatorio con elevador rápido y baño  
Matraces aforados, vidrio marrón, tapón de vidrio de 5, 50 y 100 ml  
Matraz de fondo plano, cuello corto, vidrio marrón de 250 ml  
Matraces, en forma de pera, vidrio marrón de 10 y 500 ml  
Embudo de separación cóni co, vidrio marrón, con llave de 500 ml  
Embudo, vidrio marrón, diámetro 12 cm  
Tapones huecos hexagonales, vidrio marrón  
Refrigerante con macho y hembra, manguito 300 mm  
Alargadera para introducción de gas  
Filtro plisado mediano con diámetro de 18,5 cm  
Pipet a aforada, con una marca de 2 ml  
Jeringuillas de 1 y 5 ml  
Aguja para jeringuillas  
Cilindro para gas comprimido, nitrógeno  
Monodetentor para gas comprimido, N2  
Filtro de 0,45 µ de diámetro  
2 Columnas de 5 µ, 4,6 X 250  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Aparato de filtración  
Filtro 0,5 µ  
C.10 .4 Reactivos  
Colecalciferol, vitamina D 3, cristalizada para fines bioquímicos (C27H44O)  
Hidróxido de potasio en lentejas para análisis (KOH)  
Alcohol etílico absoluto, para análisis (C 2H5OH) 
Hidroquinona (C6H4 (OH)2)  
Eter de petróleo para análisis intervalo  de ebullición 40 -60°C  
Fenolftaleína en solución etanólica al 1%, indicador (C 6H4OH) 2COC 6H4CO) 
Diastasa (para productos de almidón)  
2-propanol (CH 3)2CHOH  
Acetonitrilo (CH 3CN) 
Diclorometano (CH 2C12) 
Sulfato de sodio anhidro para análisis (Na 2SO4) 
Nitrógeno  (N2) 
Acido ascórbico (C 6H8O6) 
C.10.4.1 Fase móvil para HPLC preparativa, 2 -propanol al 1% en n -hexano  
Degasificar el n -hexano bajo presión reducida y pasar sobre un filtro. Mezclar 100 ml de diclorometano con 
900 ml de acetonitrilo degasificado.  
1C.0.4.2 Fase móvil para HPLC analítica  
Degasificar 1 l de acetonitrilo bajo presión reducida y pasar a través de un filtro. Mezclar 100 ml de 
diclorometano con 890 ml de acetonitrilo degasificado y 10 ml de 2 -propanol.  
Nota: La proporción diclorometano/acetonitril o debe adaptarse de modo que la vitamina D3 dé un tiempo 
de retención de aproximadamente 8 -9 min. Sin embargo, no debería rebasar 20:100.  
C.10.4.3 Fase móvil para lavar la columna preparativa, 2 -propanol al 10% en n -hexano  
Mezclar 100 ml de 2 -propanol con 900 ml de n -hexano degasificado.  
C.10.4.4 Solución patrón de vitamina D 3 para HPLC preparativa  
En un matraz aforado de 100 ml, pesar exactamente 50,0 mg de colecalciferol (D 3) cristalizado, disolver en 
n-hexano y llevar al volumen con el mismo disolvente ( = solución de 20,000 U.I./ml).  
Diluir esta solución 1000 veces con el mismo disolvente para obtener una solución de 20 U.I./ml. Esta 
solución permanec e estable de 3 a 4 semanas a +4 °C. 
C.10.4.5 Solución patrón de vitamina D 3 para HPLC analítica  
Evaporar 2 ml de solución patrón de 20 U.I./ml (C.10.4.4) y tomar el residuo en 2 ml de fase móvil 
(C.10.4.2).  
C.10.5 Procedimiento  
Notas: La vitamina D 3 es sensible a la luz. Utilizar material de vidrio marrón o proteger el material corriente 
con papel aluminio.  
Efectuar todas las evaporaciones de disolventes bajo presión reducida a una temperatura máxima de 
40°C. No se debe evaporar a sequedad. Romper el vacío introduciendo nitrógeno en el sistema. Evaporar los 
últimos ml mediante una corriente de nitrógeno.  
Al fina l de la jornada, lavar la columna preparativa durante 15 min. con 2 -propanol al 10% en n -hexano 
(10.4.3) con un caudal de 2 ml/min.  
C.10.5.1 Toma de ensayo  
Mezclar o moler la muestra a fin de homogeneizarla por completo. Pesar, con una precisión de 10 mg, una 
toma de ensayo que contenga 20 -40 U.I. de vitamina D 3, lo que corresponde en general a 10 g.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
C.10.5.1.1 Productos con almidón  
En un matraz redondo de fondo plano de 250 ml con cuello esmerilado, mezclar la toma de ensayo con 
10% de su peso de diastasa.  Añadir máximo 30 ml de agua destilada a 45 -50°C. Mezclar bien para obtener 
una suspensión homogénea. Eliminar el aire del matraz mediante nitrógeno, tapar y colocar el matraz durante 
30 min. en una estufa a 45°C.  
C.10.5.1.2 Productos sin almidón  
En un mat raz redondo de fondo plano de 250 ml con cuello esmerilado, mezclar la toma de ensayo con 
máximo 30 ml de agua destilada a 45 -50°C.  
C.10.5.2 Saponificación  
Añadir 7 g de hidróxido de potasio grado analítico en el matraz (C.10.5.1.1 o C.10.5.1.2), y mezclar   para 
disolver.  
A continuación añadir 60 ml de alcohol absoluto y 0,5 g de ácido ascórbico o hidroquinona.  
Montar sobre el matraz una alargadera para introducción de un gas refrigerante. Introducir una ligera 
corriente de gas nitrógeno, y calentar durante  30 min. a 70°C en un baño de agua ebulliendo provisto de 
agitadores magnéticos.  
Nota: Durante la saponificación, asegurar una buena agitación del medio de reacción.  
C.10.5.3 Extracción del insaponificable  
Una vez terminada la saponificación, enfriar el ma traz a temperatura ambiente y transvasar la suspensión 
a un embudo de separación de 500 ml.  
Enjuagar con máximo 30 ml de agua fría en 3 porciones de 10 ml que se añaden al contenido del embudo 
de separación. Evitar un exceso de agua, ya que favorece la for mación de emulsiones.  
En seguida enjuagar el matraz con 50 ml de éter de petróleo (rango de 40 -60°C) en varias porciones que 
se añaden al embudo de separación.  
Extraer la vitamina D 3 agitando ligeramente.  
Dejar separar las fases.  
Vaciar la fase acuosa a ot ro embudo de separación de 500 ml. Recoger la fase orgánica en un tercer 
embudo de separación de 500 ml.  
Efectuar esta extracción 5 veces en total. Haciendo las agitaciones con mucho cuidado para evitar 
emulsiones.  
Lavar la solución orgánica con porciones de 100 ml de agua adicionándola por las paredes del embudo, 
sin agitar, hasta que el agua de lavado ya no dé reacción coloreada con fenolftaleína. Después del último 
lavado, esperar al menos 15 min. antes de vaciar la fase acuosa.  
Filtrar la solución lavad a en continuo a través de un filtro que contiene aproximadamente 5 g de sulfato de 
sodio anhidro o en un papel separador de fases tipo 1 PS, y recoger el filtrado en un matraz en forma de pera 
de 500 ml, sin dejar secar el filtro. Y al final enjuagar el fi ltro con 50 ml de éter de petróleo.  
Evaporar el disolvente bajo presión reducida en un rotavapor a 40°C, y eliminar los últimos mililitros 
mediante una corriente de nitrógeno.  
Transvasar el residuo cuantitativamente a un matraz aforado de 5 ml, mediante pe queñas porciones de 
fase móvil (C.10.4.1) llevar al volumen y filtrar la solución inmediatamente a través de un filtro de 0,45 μ de 
tamaño de poro y adecuado para solventes orgánicos, por ejemplo Acrodisc -CR o equivalente; recoger el 
filtrado en un matraz en forma de pera. El filtrado debe ser límpido.  
La solución está lista para la cromatografía.  
C.10.5.4 Cromatografía preparativa  
Condiciones:  
Columna: Spherisorb Si, 5 mcm, 4,6 X 250 mm  
Loop de inyección: 500 μl 
Fase móvil: 1% 2 -propanol en n -hexano (C.2.3 .1) 
Caudal: 1 -3 ml/min. (el tiempo de retención de la vitamina D3 debe ser de aproximadamente 5 min.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Detector: espectrofotómetro, longitud de onda variable, ajustada a 264 nm (o eventualmente 
espectrofotómetro de longitud de onda fija a 254 nm, únicamente utilizable para la etapa preparativa), 0,05 
AUFS para el patrón y 0,5 AUFS para el extracto de muestra  
Registrador: 10 mm/min.  
Inyectar primero 500 μl de solución patrón de vitamina D 3 (C.10.4.4) y determinar el tiempo de retención:  
Debe ser aproximadamente 5 min. Inyectar a continuación la solución de la muestra obtenida bajo el 
numeral C.10.5.3 y recoger la fracción que contiene la vitamina D 3 en un  matraz en forma de pera de 10 ml.  
Comenzando a recoger aproximadamente 1 min. antes de la elución de la vitamina D 3 y parar 
aproximadamente 1 min. después de la elución de la vitamina D 3. 
C.10.5.5 Cromatografía analítica  
Evaporar a seco la fracción recogi da bajo 10.5.4, mediante una ligera corriente de nitrógeno.  
Enfriar el matraz a fin de evitar errores de volumen a una evaporación eventual de disolvente; luego tomar 
el residuo en 300 μl de fase móvil (10.4.2), agitar ligeramente para disolver bien el residuo. Condiciones:  
Columna: Spherisorb ODS, 5 mcm, 4,6 X 250 mm  
Loop de inyección: 100 μl 
Fase móvil: 10% diclorometano, 89% acetonitrilo y 1% de 2 -propanol  
Caudal: 2 ml/min.  
Detector: espectrofotómetro, longitud de onda variable, ajustada a 264 nm; 0,01 AUFS  
Registrador: 10 mm/min.  
Aproximadamente 8-9 min. (adaptar la proporción de diclorometano/acetonitrilo si es necesario). Luego 
inyectar 100 μl de la fracción obtenida bajo 10.5.4.  
C.10.6 Cálculo, expresión e interpretación de los resultados  
C.10.6.1 Evaluación  
Identificar el pico de la vitamina D3 en el cromatograma de la muestra mediante el tiempo de retención 
definido por cromatografía de la solución patrón. Medir la altura de los p icos obtenidos durante la 
cromatografía de la solución patrón y de la solución muestra.  
El contenido en vitamina D 3, expresado en Unidades Internacionales por 100 g de producto, es igual a:  
hp x C x Vo x V2 x 100  
Hs x m x V1  
En donde:  
m = toma de ensayo, e n gramos  
hp = altura del pico de la muestra, en mm  
hs = altura del pico de la solución patrón, en mm  
C = concentración de la solución patrón inyectada, en U.I./ml  
Vo = volumen en el cual ha sido diluido el residuo antes de la cro matografía preparativa (10. 5.3) (en 
general 5 ml = matraz aforado)  
V1 = volumen del extracto inyectado en la columna preparativa (en general 0,500 ml=volumen del loop  de 
inyección)  
V2 = volumen en el cual ha sido diluida la fracción después de la cromatografía preparativa (en gener al 
0,300 ml)  
Nota: es superfluo un factor de corrección para la isomerización de la vitamina D 3, en previtamina D 3, ya 
que este fenómeno es despreciable en las condiciones de saponificación aplicadas.  
C.10.6.2 Límite de detección de acuerdo a la sensibilid ad del equipo.  
Aproximadamente: 20 U.I./100 g  
C.10.6.3 Repetibilidad        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
La diferencia entre dos resultados individuales obtenidos con la misma muestra para ensayo, en las 
mismas condiciones (analista, aparato, laboratorio) en un corto intervalo de tiempo, no debe exceder 10% de 
la media entre ambos resultados.  
Cuando las vitaminas han sido añadidas por mezcla en seco, la repetibilidad está fuertemente influida por 
el grado de homogeneidad del producto  
C.11. DETERMINACI ON DE SODIO (NA)  
C.11.1 Método de espectro fotometría de absorción atómica con aditamento de flama.  
C.11.2.1 Fundamento  
La muestra se somete a una digestión ácida con ácido nítrico concentrado para que el analito liberado sea 
cuantificado por espectrofotometría de absorción atómica.  
C.11.2.2 Reacti vos y materiales  
C.11.2.2.1 Reactivos  
Acido nítrico (HNO 3) concentrado grado suprapuro  
Acido nítrico (HNO 3) concentrado G.R.  
Estándar certificado de Na de 1000 μg/ml 
Agua deionizada  
C.11.2.2.2 Materiales  
Sistema de reflujo  
Material común de laboratorio  
Papel filtro No. 1  
C.11.2.3 Aparatos e instrumentos  
Balanza analítica con una sensibilidad de 0,1 mg  
Espectrofotómetro de absorción atómica con aditamento de flama  
Parrilla de calentamiento  
Lámpara de cátodo hueco de sodio  
C.11.2.3 Preparación de la muestra p ara ensayo  
C.11.2.3.1 Productos sólidos  
Tomar una cantidad representativa de la muestra a analizar. Si es necesario moler el producto mediante 
un molino o un mortero. Evitar cualquier contaminación durante esta manipulación. Mezclar bien.  
C.11.2.3.2 Produc tos líquidos  
Mezclar bien el producto antes de abrir el recipiente. A continuación transvertir a un recipiente de vidrio o 
de plástico descontaminado. Guardar en el refrigerador (4°C). Mezclar bien antes del uso.  
C.11.2.4 Descontaminación del material  
En una cubeta de polietileno (volumen aproximado de 15 l) introducir 10 l de mezcla ácido nítrico/agua (1:1).  
En este baño descontaminar durante una noche todos los matraces aforados, tapones, recipientes de 
polietileno o de polipropileno, así como todo el mat erial de vidrio necesario. Enjuagar con agua destilada.  
Secar.  
C.11.2.5 Procedimiento  
Se pesa de 1,0 a 2,0 g de muestra en un matraz de fondo plano de 250 ml con boca esmerilada, se le 
añaden 10 ml de HNO3 grado suprapuro y se digieren por calentamiento en  un sistema de reflujo durante 2 h 
o hasta digestión completa.  
La muestra se enfría y se filtra a través de papel filtro No. 1 y se recibe en un matraz aforado de 100 ml.  
Se lava tres veces el matraz de la digestión con tres porciones de 10 ml de agua deio nizada y los lavados 
se filtran y se reciben en el matraz aforado, se lleva a volumen con agua deionizada.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Ajustar el espectrofotómetro de acuerdo a las recomendaciones del fabricante usando un estándar 
certificado. Se leen las muestras y se anotan los res ultados obtenidos en μg/ml.  
Longitud de onda: 589,6 nm  
Llama: aire -acetileno, oxidante  
Nota:  Se recomienda meter una muestra añadida para valorarla y hacer un blanco de reactivos para cada 
serie de digestiones.  
C.11.2.6 Cálculo  
mg/kg Na+ = (A -B) x C D  
En donde:  
A = μg/ml de Na + en la muestra  
B = μg/ml de Na+ en el blanco  
C = ml de aforo de la muestra  
D = peso de la muestra en g tomada para el análisis  
11.2.7 Sensibilidad del método  
0,15 μg/ml para 1% de absorción  
C.12. DETERMINACI ON DE MATERIA EXTRAÑA EN LECHE, F ORMULA L ACTEA O  PRODUCTO 
LACTEO COMBINADO.  
C.12.1.  Principio del método.  
Los insectos enteros, fragmentos de los mismos, pelos de roedor o alguna materia extraña se separan de 
la muestra por filtración para su identificación al microscopio.  
C.12.2. Equipo.  
C.12.2.1. Balanza analítica con 0,1 mg de sensibilidad.  
C.12.2.2. Equipo de filtración al vacío.  
C.12.2.3.  Microscopio binocular estereoscopio con objetivos que pueden ser de 3, 6, 7 y 10 X, oculares 
apareados de amplio campo visual de 10, 30 y 100 X, respectivamente.  
C.12.2.4. Lámpara para el microscopio o luz natural equivalente.  
C.12.3.  Materiales.  
C.12.3.1. Embudo Büchner.  
C.12.3.2. Matraz Kitazato.  
C.12.3.3. Vasos de precipitados de 1000 mL.  
C.12.3.4. Caja Petri.  
C.12.3.5. Papel de filtración rápida para conteo con líneas paralelas de aproximadamente 5 mm de separación.  
C.12.3.6. Material común de laboratorio.  
C.12.4. Reactivos.  
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico a menos que se indique otra 
especificación y por agua debe entenders e agua destilada.  
C.12.4.1.  Solución de carbonato de sodio (Na 2 CO3) al 2%.  
Disolver 2 g de carbonato de sodio en agua y llevar al volumen de 100 mL.  
C.12.4.2.  Solución de oxalato de sodio (Na 2 C2 O4) al 3%.  
Disolver 3 g de oxalato de sodio Na 2 C2O4 en agu a y llevar al volumen de 100 mL.  
C.12.4.3.  Mezcla de glicerina:etanol 1:3 (v/v) (opcional).  
C.12.5.  Procedimiento.  
C.12.5.1. Preparación de la muestra.  
C.12.5.1.1.  Productos líquidos.  
Mezclar bien todo el contenido de la muestra.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
C.12.5.1.2.  Productos desh idratados.  
Pesar por duplicado 50 g de leche descremada o 65 g de leche entera y reconstituir ajustando el volumen 
a 500 mL con agua a 40ºC.  
C.12.5.2.  Determinación.  
C.12.5.2.1. Filtrar toda la muestra sobre un embudo de succión preparado con papel filtro para conteo, 
tratando de vertirlo uniformemente.  
C.12.5.2.2. Durante la filtración lavar continuamente el papel filtro con agua a 80ºC aproximadamente, 
para evitar la acumulación de partículas que tapen los poros del papel.  
C.12.5.2.3. Pasar el papel filtr o a una caja Petri y humedecerla con la mezcla glicerina -etanol (opcional). 
Examinar al microscopio utilizando una luz suficientemente fuerte que muestre los detalles en el papel filtro.  
C.12.5.2.4. Contar con una aguja de disección sobre toda la superfici e del papel, línea por línea y explorar 
cada pieza del material dado que algunos fragmentos son irreconocibles a menos que se muevan.  
C.12.6. Expresión de resultados.  
C.12.6.1. Productos deshidratados.  
Presencia o ausencia de insectos enteros, fragmentos d e insectos, pelos 
de roedor y cualquier materia extraña que se encuentre en 50 g o 65 g 
de muestra  
 
C.12.6.2. Productos líquidos.  
Presencia o ausencia de insectos enteros, fragmentos de insectos, pelos 
de roedor y cualquier materia extraña que se encuentr e en la cantidad de 
mL que contenga el envase analizado  
 
METODOS NUTRIMENTALES  
C.13. DETERMINACI ON DE PROTE INA CRUDA (M ETODO KJELDAHL -GUNNING)  
C.13.1  Fundamento  
Las proteínas y demás materias orgánicas son oxidadas por el ácido sulfúrico y el nitrógeno or gánico de 
las proteínas se fija como sulfato de amonio; esta sal se hace reaccionar con una base fuerte para desprender 
amoniaco que se destila y se recibe en un ácido débil, en el cual se puede titular el amoniaco con un ácido 
fuerte. En este método de Kj eldahl -Gunning, se usa el sulfato de cobre como catalizador y el sulfato de sodio 
para aumentar la temperatura de la mezcla y acelerar la digestión.  
C.13.2 Material  
Matraz de Kjedahl de 800 ml  
Matraz Erlenmeyer de 500 ml  
Bureta de 50 ml  
Pipetas volumétrica s de 5 ml  
Probeta  
Cuerpos de ebullición  
Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg  
Digestor -destilador de Kjeldahl  
C.13.3 Reactivos  
Acido sulfúrico (H 2SO4) 
Sulfato de cobre (CuSO 4 5 H2O) 
Granalla de zinc (malla 20)  
Sulfato de sodio anhidro (Na 2SO4) 
Acido  bórico al 4% en agua (H 3BO3) 
Solución concentrada de hidróxido de sodio 1:1 m/v (NaOH)  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Acido clorhídrico 0,1 N (HCl)  
C.13.3.1 Indicador de Wesslow  
C.13.3.1.1 Rojo de metilo al 0,2% en una mezcla de 60 ml de alcohol etílico y 40 ml de agua 
(CH 3)NC 6H4N=NC 6H4COOH y C 2H5OH y H 2O. 
C.13.3.1.2  Azul de metileno al 0,2 % en agua C 16H18N3SCl.Cl 2Zn.H 2O. 
Mezclar dos partes de C.13.3.1.1 y una parte de C.13.3.1.2.  
C.13.4 Procedimiento  
Pesar exactamente 1 g de muestra en un matraz de Kjedahl, agregar 2 g de sulfato de co bre, 10 g de 
sulfato de sodio anhidro, 25 ml de ácido sulfúrico y unos cuerpos de ebullición; colocar a baja temperatura, 
hasta que todo el material esté carbonizado y aumentar gradualmente la temperatura hasta que el contenido 
del matraz esté completament e claro, dejar por 30 minutos más.  
Dejar enfriar y agregar 400 ml de agua destilada para disolver completamente el residuo del matraz; dejar 
enfriar, agregar 6 -7 granallas de zinc, estratificando, y sin agitar, agregar 50 ml de solución de hidróxido de sod io. 
Conectar el matraz al destilador y recibir el destilado en un matraz Erlenmeyer de 500 ml, que contenga 50 ml 
de ácido bórico y unas gotas del indicador de Wesslow (la parte terminal del tubo del destilador debe estar 
dentro del ácido). Destilar hasta aproximadamente 300 ml. Retirar el matraz y titular con ácido clorhídrico 0,1 N.  
C.13.5 Cálculos  
g/l de Proteínas = 
  
En donde:  
V = ml de ácido clorhídrico 0,1 N requeridos en la titulación  
N = normalidad del ácido clorhídrico  
M = ml de muestra  
6,38 = fact or para convertir nitrógeno a proteínas de la leche  
C.13.6 Según el método de Kjeldahl para determinar el contenido de nitrógeno total (N 2) de la fórmula, 
seguido del cálculo del contenido de proteína cruda como sigue:  
N2 x factor = proteína cruda  
Factores  que deben usarse  
Proteína de trigo  5,70 
Proteína de soja  6,25 
Proteína derivada de la leche  6,38 
Proteínas mixtas:  
Cuando el alimento contiene más de por ejemplo el 90% (peso seco) de proteína de trigo, soja o derivada 
de leche, el factor proteína debe se r 5,70; 6,25 y 6,38 respectivamente.  
Cuando el alimento está constituido por una cantidad importante conocida (por ejemplo 80%) de peso 
seco de proteína de trigo, soja o derivada de leche, el factor para dicha proteína debe ser el factor apropiado 
según se  indica arriba. Cuando la proteína remanente está constituida por una mezcla desconocida de estas 
proteínas, debe aplicarse el factor 6,25 a la cantidad remanente de proteína.  
Cuando se conoce la cantidad de cada una de las proteínas de trigo, de soja o de rivada de leche 
contenida en el alimento, el factor proteína empleado deberá ser el derivado proporcionalmente usando los 
factores arriba citados.  
C.13.7 Los resultados se expresan como g de proteína cruda por 100 g del alimento tal como se vende y 
por 100  kcal. 
C.14. DETERMINACI ON DE VITAMINA D 3-HPLC  
C.14.1 Fundamento  
Saponificación alcalina de la muestra; extracción con éter de compuestos insaponificables; evaporación 
del éter; solución del residuo seco en hexano e inyección de una alícuota en columna pre parativa de HPLC       (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
(fase normal, Sílice). Colección del eluato que contiene la fracción de vitamina D; evaporación de esta fracción 
a sequedad, disolución en la fase móvil de HPLC (Analítica, Acetonitrilo: Cloruro de metileno: Isopropanol), 
inyección en HPLC  (fase reversa C 18) y determinación de la vitamina D con el pico máximo a 264 nm por 
calibración del estándar externo.  
C.14.2 Material  
Instalación HPLC isocrática  
Uno o dos registradores  
Balanza analítica, con capacidad de 160 g, lectura 0,1 mg  
Balanza de precisión, con capacidad de 1600 g, lectura 0,01 g  
Estufa de laboratorio (para productos con almidón)  
Baño de agua con agitadores magnéticos, 4 plazas  
Evaporador rotatorio con elevador rápido y baño  
Matraces aforados, vidrio marrón, tapón de vidrio de 5, 5 0 y 100 ml  
Matraz de fondo plano, cuello corto, vidrio marrón de 250 ml  
Matraces, en forma de pera, vidrio marrón de 10 y 500 ml  
Embudo de separación cónico, vidrio marrón, con llave de 500 ml  
Embudo, vidrio marrón, diámetro 12 cm  
Tapones huecos hexagonale s, vidrio marrón  
Refrigerante con macho y hembra, manguito 300 mm  
Alargadera para introducción de gas  
Filtro plisado mediano con diámetro de 18,5 cm  
Pipeta aforada, con una marca de 2 ml  
Jeringuillas de 1 y 5 ml  
Aguja para jeringuillas  
Cilindro para gas co mprimido, nitrógeno  
Monodetentor para gas comprimido, N2  
Filtro de 0,45 µ de diámetro  
2 Columnas de 5 µ, 4,6 X 250  
Aparato de filtración  
Filtro 0,5 µ  
C.14.3 Reactivos  
Colecalciferol, vitamina D 3, cristalizada para fines bioquímicos (C 27H44O) 
Hidróxido de p otasio en lentejas para análisis (KOH)  
Alcohol etílico absoluto, para análisis (C 2H5OH) 
Hidroquinona (C 6H4(OH) 2) 
Eter de petróleo para análisis intervalo de ebullición 40 -60°C  
Fenolftaleína en solución etanólica al 1%, indicador ((C 6H4OH) 2COC 6H4CO) 
Diastas a (para productos de almidón)  
2-propanol (CH 3)2CHOH  
n-hexano CH 3(CH 2)4CH3 
Acetonitrilo (CH 3CN) Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Diclorometano (CH 2Cl2) 
Sulfato de sodio anhídro para análisis (Na 2SO4) 
Nitrógeno (N 2) 
Acido ascórbico (C 6H8O6) 
C.14.3.1 Fase móvil para HPLC preparativa, 2 -propa nol al 1% en n -hexano  
Degasificar el n -hexano bajo presión reducida y pasar sobre un filtro. Mezclar 100 ml de diclorometano con 
900 ml de acetonitrilo degasificado.  
C.14.3.2 Fase móvil para HPLC analítica  
Degasificar 1 l de acetonitrilo bajo presión reduc ida y pasar a través de un filtro. Mezclar 100 ml de 
diclorometano con 890 ml de acetonitrilo degasificado y 10 ml de 2 -propanol.  
Nota:  
La proporción diclorometano/acetonitrilo debe adaptarse de modo que la vitamina D 3 dé un tiempo de 
retención de aproxima damente 8 -9 min. Sin embargo no debería rebasar 20:100.  
C.14.3.3 Fase móvil para lavar la columna preparativa, 2 -propanol al 10% en n -hexano  
Mezclar 100 ml de 2 -propanol con 900 ml de n -hexano degasificado.  
C.14.3.4 Solución patrón de vitamina D 3 para HPLC  preparativa  
En un matraz aforado de 100 ml, pesar exactamente 50,0 mg de colecalciferol (D 3) cristalizado, disolver en 
n-hexano y llevar al volumen con el mismo disolvente (= solución de 20,000 U.I./ml).  
Diluir esta solución 1000 veces con el mismo disolv ente para obtener una solución de 20 U.I./ml. Esta 
solución permanec e estable de 3 a 4 semanas a +4 °C. 
C.14.3.5 Solución patrón de vitamina D 3 para HPLC analítica  
Evaporar 2 ml de solución patrón de 20 U.I./ml (C.14.3.4) y tomar el residuo en 2 ml de fase móvil 
(C.14.3.2).  
C.14.4 Procedimiento  
Notas:  la vitamina D 3 es sensible a la luz. Utilizar material de vidrio marrón o proteger el material corriente 
con papel aluminio.  
Efectuar todas las evaporaciones de disolventes bajo presión reducida a una temperatu ra máxima de  
40°C. No se debe evaporar a sequedad. Romper el vacío introduciendo nitrógeno en el sistema. Evaporar los 
últimos ml mediante una corriente de nitrógeno.  
Al final de la jornada, lavar la columna preparativa durante 15 min con 2 -propanol al 10%  en n -hexano 
(C.14.3.3) con un caudal de 2 ml/min.  
C.14.4.1 Toma de ensayo  
Mezclar o moler la muestra a fin de homogeneizarla por completo. Pesar, con una precisión de 10 mg, una 
toma de ensayo que contenga 20 -40 U.I. de vitamina D 3, lo que corresponde en general a 10 g.  
C.14.4.1.1 Productos con almidón  
En un matraz redondo de fondo plano de 250 ml con cuello esmerilado, mezclar la toma de ensayo con 
10% de su peso de diastasa. Añadir máximo 30 ml de agua destilada a 45 -50°C. Mezclar bien para obtener 
una s uspensión homogénea. Eliminar el aire del matraz mediante nitrógeno, tapar y colocar el matraz durante 
30 min en una estufa a 45°C.  
C.14.4.1.2 Productos sin almidón  
En un matraz redondo de fondo plano de 250 ml con cuello esmerilado, mezclar la toma de ens ayo con 
máximo 30 ml de agua destilada a 45 -50°C.  
C.14.4.2 Saponificación        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Añadir 7 g de hidróxido de potasio grado analítico en el matraz (C.14.4.1.1 o C.14.4.1.2), y mezclar para 
disolver. A continuación añadir 60 ml de alcohol absoluto y 0,5 g de ácido a scórbico o hidroquinona.  
Montar sobre el matraz una alargadera para introducción de un gas refrigerante. Introducir una ligera 
corriente de gas nitrógeno,  y calentar durante 30 min a 70 °C en un baño de agua ebulliendo provisto de 
agitadores magnéticos.  
Nota: Durante la saponificación, asegurar una buena agitación del medio de reacción.  
C.14.4.3 Extracción del insaponificable  
Una vez terminada la saponificación, enfriar el matraz a temperatura ambiente y transvasar la suspensión 
a un embudo de separación de 500 ml.  
Enjuagar con máximo 30 ml de agua fría en 3 porciones de 10 ml que se añaden al contenido del embudo 
de separación. Evitar un exceso de agua, ya que favorece la formación de emulsiones.  
En seguida enjuagar el matraz con 50 ml de éter de petróleo (r ango de 40 -60°C) en varias porciones que 
se añaden al embudo de separación. Extraer la vitamina D 3 agitando ligeramente. Dejar separar las fases. 
Vaciar la fase acuosa a otro embudo de separación de 500 ml. Recojer la fase orgánica en un tercer embudo 
de separación de 500 ml.  
Efectuar esta extracción 5 veces en total. Haciendo las agitaciones con mucho cuidado para evitar 
emulsiones.  
Lavar la solución orgánica con porciones de 100 ml de agua adicionándola por las paredes del embudo, 
sin agitar, hasta que el  agua de lavado ya no dé reacción coloreada con fenolftaleína. Después del último 
lavado, esperar al menos 15 min antes de vaciar la fase acuosa.  
Filtrar la solución lavada en continuo a través de un filtro que contiene aproximadamente 5 g de sulfato de 
sodio anhídro o en un papel separador de fases tipo 1 PS, y recojer el filtrado en un matraz en forma de pera 
de 500 ml, sin dejar secar el filtro. Y al final enjuagar el filtro con 50 ml de éter de petróleo.  
Evaporar el disolvente bajo presió n reducida en u n rotavapor a 40 °C, y eliminar los últimos mililitros 
mediante una corriente de nitrógeno.  
Transvasar el residuo cuantitativamente a un matraz aforado de 5 ml, mediante pequeñas porciones de 
fase móvil (C.14.3.1) llevar al volumen y filtrar la solución inm ediatamente a través de un filtro de 0,45 µ  de 
tamaño de poro y adecuado para solventes orgánicos, por ejemplo Acrodisc - CR o equivalente; recoger el 
filtrado en un matraz en forma de pera. El filtrado debe ser límpido.  
La solución está lista para la crom atografía.  
C.14.4.4 Cromatografía preparativa  
Condiciones:  
Columna:  Spherisorb Si, 5 mcm, 4,6 X 250 mm  
Loop de inyección:  500 µl  
Fase móvil:  1% 2 -propanol en n -hexano (14.3.1)  
Caudal:  1-3 ml/min (el tiempo de retención de la vitamina D 3 debe ser de 
aproximadamente 5 min  
Detector:  espectrofotómetro, longitud de onda variable, ajustada a 264 nm (o 
eventualmente espectrofotómetro de longitud de onda fija a 254 nm, únicamente 
utilizable para la etapa preparativa), 0,05 AUFS para el patrón y 0,5 AUFS para 
el extracto de muestra  
Registrador:  10 mm/min  
 Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Inyectar primero 500 µl de solución patrón de vitamina D 3 (C.14.3.4) y determinar el tiempo de retención: 
debe ser aproximadamente 5 min. Inyectar a continuación la solución de la muestra obtenida bajo C.14.4. 3  y 
recoger la fracción que contiene la vitamina D 3 en un matraz en forma de pera de 10 ml. Comenzando a 
recoger aproximadamente 1 min antes de la elución de la vitamina D 3 y parar aproximadamente 1 min 
después de la elución de la vitamina D 3. 
C.14.4.5 Cromatografía analítica  
Evaporar a seco la fracción recogida bajo C.14.4.4, mediante una ligera corriente de nitrógeno.  
Enfriar el matraz a fin de evitar errores de volumen a una evaporación eventual de disolvente; luego tomar 
el residuo en 300 µl de fase mó vil (C.14.3.2), agitar ligeramente para disolver bien el residuo.  
Condiciones:  
Columna:  Spherisorb ODS, 5 mcm, 4,6 X 250 mm  
Loop de inyección:  100 µl  
Fase móvil:  10% diclorometano, 89 % acetonitrilo y 1% de 2 -propanol  
Caudal:  2 ml/min  
Detector:  espectro fotómetro, longitud de onda variable, ajustada a 264 nm; 0,01 AUFS  
Registrador:  10 mm/min  
 
Inyectar primero 100 µl de solución patrón (C.14.3.5) y determinar el tiempo de retención: debe ser 
aproximadamente 8 -9 min (adaptar la proporción de diclorometano /acetonitrilo si es necesario). Luego 
inyectar 100 µl de la fracción obtenida bajo C.14.4.4.  
C.14.2.5 Cálculo, expresión e interpretación de los resultados  
C.14.5.1 Evaluación  
Identificar el pico de la vitamina D 3 en el cromatograma de la muestra mediante el tiempo de retención 
definido por cromatografía de la solución patrón. Medir la altura de los picos obtenidos durante la 
cromatografía de la solución patrón y de la solución muestra.  
El contenido en vitamina D 3, expresado en Unidades Internacionales por 100 g de producto, es igual a:  
 
En donde:  
m = toma de ensayo, en gramos  
hP = altura del pico de la muestra, en mm  
hS = altura del pico de la solución patrón, en mm  
C = concentración de la solución patrón inyectada, en U.I./ml  
V0 = volumen en el cual h a sido diluido el residuo antes de la cromatografía preparativa 
(14.4.3) (en general 5 ml = matraz aforado)  
V1 = volumen del extracto inyectado en la columna preparativa (en general 0,500 ml=volumen 
del loop de inyección)  
V2 = volumen en el cual ha sido diluida la fracción después de la cromatografía preparativa (en 
general 0,300 ml)  
 
Nota: es superfluo un factor de corrección para la isomerización de la vitamina D 3, en previtamina D 3, ya 
que este fenómeno es despreciable en las condiciones de saponifica ción aplicadas.  
C.14.5.2 Límite de detección de acuerdo a la sensibilidad del equipo.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Aproximadamente: 20 U.I./100 g  
C.14.5.3  Repetibilidad  
La diferencia entre dos resultados individuales obtenidos con la misma muestra para ensayo, en las 
mismas condicione s (analista, aparato, laboratorio) en un corto intervalo de tiempo, no debe exceder 10% de 
la media entre ambos resultados.  
Cuando las vitaminas han sido añadidas por mezcla en seco, la repetibilidad está fuertemente influida por 
el grado de homogeneidad d el producto.  
C.15. DETERMINACI ON DE VITAMINA B 1 Y B 2 POR CROMATOGRAF IA LIQUIDA DE ALTA 
RESOLUCI ON (HPLC).  
C.15.1 Fundamento  
La vitamina B 1, es extraída de la muestra por hidrólisis ácida y oxidada a tiocromo, su contenido es 
determinado por HPLC en fase in versa con detección fluorométrica.  
C.15.2 Reactivos y materiales  
C.15.2.1 Reactivos  
Acido clorhídrico fumante, 37% para análisis (HCl)  
Acetato de sodio trihidratado, para análisis.  
(CH 3 . CO 2Na . 3H 2O) 
Acido orto -fosfórico PO 4H3 (P2O5 . 3H 2O) 
Ferricianuro de potasio, para análisis Fe(CN)  6K4 . 3H 2O 
Hidróxido de sodio en lentejas, para análisis.  
Monohidrato de tiamina (nitrato de tiamina, Vitamina B1 monohidratada), calidad alimentaria 
(C12H17N5O4S) 
Papaína soluble.  
Amilasa  
Diastasa  
N,N - Dimetilformamida HC ON(CH 3) 3 
fosfato, ácido de -potasio, para análisis (K 2HPO 4 . 3H 2O) 
C.15.2.2 Materiales  
Matraces en forma de pera, 100 ml  
Tapones huecos hexagonales  
Matraces aforados, de vidrio de 1000, 100, 50 y 10 ml  
Embudos de vidrio de 100 mm de diámetro  
Matraces Erlen meyer, de cuello estrecho, 250 ml  
Refrigerante, Allihn, manguito 300 mm  
Filtros plisados medianos 185 mm de diámetro  
Pipetas aforadas con una marca de 2, 3, 5 y 40 ml  
Pipetas graduadas hasta la punta de 1 ml: 0,005  
Probetas graduadas, en forma alta, de 50 ml: 0,5;  100 ml: 1,0  
1000 ml: 10,0  
Todo el material de vidrio debe ser actínico o forrado con papel aluminio.  
C.15.2.3 Aparatos e instrumentos  
Balanza analítica, 162 g, lectura 0,1 mg  
Balanza de precisión electrónica, 2100 g, lectura 0,01 g  
Baño de agua en  línea con soportes, 6 plazas.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Estufa de laboratorio  
Jeringuilla para HPLC, de un 1 ml  
Aguja para jeringuilla  
Columna ODS o C 18, 5 µm, 250 X 4,6 mm; o equivalente  
Dispositivo de filtración sobre membrana  
Membrana para filtro  
C.15.4 Preparación de solucion es 
C.15.4.1 Solución de ácido clorhídrico  
En un matraz aforado de 1000 ml que contenga aproximadamente 500 ml de agua destilada, añadir con 
cuidado 82 ml de ácido clorhídrico al 37% y llevar a volumen con agua destilada. Trabajar en campana  de 
extracción.  
C.15.4.2 Solución de acetato de sodio 2,5 M.  
En un matraz aforado de 1000 ml disolver 340 g de acetato de sodio trihidratado en agua destilada y llevar 
a volumen.  
C.15.4.3 Hidróxido de sodio, solución de 150 g/l  
En un matraz aforado de 1000 ml, disolver 1 60 g de hidróxido de sodio en lentejas en agua destilada, 
llevar a volumen.  
Conservar en un matraz provisto de un tapón de polietileno.  
C.15.4.4 Solución de oxidación  
C.15.4.4.1 Solución de ferricianuro de potasio 1g/100  ml 
En un matraz aforado de 100 ml d isolver, 1 g de ferricianuro de potasio en agua destilada y llevar  a 
volumen.  
C.15.4.4.2 Solución a preparar justo antes del uso  
En un matraz aforado de 50 ml, llevar a volumen 2 ml de solución 15.4.4.1 con solución 15.4.3.  
C.15.5  Fase móvil para HPLC  
C.15.5.1 Solución de fosfato ácido de -potasio, 10 mM pH 7,2.  
En un vaso de 1000 ml pesar exactamente 2,28 g de fosfato de -potasio, disolver en aproximadamente  
800 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 7,2 con ácido clorhídrico 1 N (C.15.4.1). Transvasar a un  matraz 
aforado de 1000 ml y llevar a volumen con agua destilada. Degasificar bajo presión reducida y filtrar.  
C.15.5.2 Solución de dimetilformamida al 15% en fosfato ácido de potasio.  
En un matraz aforado de 1000 ml agregar 150 ml de dimetilformamida y ll evar a volumen con solución 
C.15.5.1  
C.15.6 Solución patrón de vitamina B 1 
C.15.6.1  Solución concentrada  
En un matraz aforado de 50 ml de vidrio, pesar exactamente 50,0 mg de monohidrato de tiamina y disolver 
en agua destilada. Añadir 5 ml de ácido clorhíd rico 1 N (C.15.4.1) y llevar a volumen con agua destilada. Esta 
solución contiene 1 mg/ml.  
C.15.6.2  Soluciones diluidas  
En un matraz aforado de 50 ml, agregar mediante una pipeta, 5 ml de solución C.15.6.1 y llevar a volumen 
con agua destilada. Luego verte r mediante una pipeta, 5 ml de esta solución (100 µg/ml) en un matraz aforado 
de 50 ml y llevar a volumen con agua destilada. Esta solución contiene 10 µg/ml.  
Verter, mediante una pipeta, 5 ml de esta solución en un matraz aforado de 50 ml y llevar a volum en con 
agua destilada. Esta solución contiene 1 µg/ml.  
C.15.6.3  Preparar de la misma manera solución concentrada de riboflavina y de manera subsecuente las 
soluciones diluidas. No es necesario utilizar matraces de vidrio.  
C.15.6.4 Solución patrón oxidada p ara HPLC        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Mediante una pipeta, verter 5 ml de solución C.15.6.2 en un matraz aforado de 10 ml de vidrio. Añadir 3 ml 
de solución de ferricianuro de potasio básico (C.15.4.4.2). Agitar durante 2 minutos, añadir 0,45 ml de ácido 
fosfórico concentrado, mezclar , enfriar y llevar a volumen con agua destilada. Cromatografiar esta solución 
inmediatamente.  
C.15.7 Procedimiento  
La vitamina B 1 no es sensible a la luz; en cambio el producto oxidado, el tiocromo, sí lo es. Durante la 
etapa de oxidación, utilizar materia l de vidrio actínico, o material de vidrio corriente protegido con  papel 
aluminio.  
C.15.7.1 Toma de ensayo  
Homogeneizar toda la muestra, mezclando o moliendo y pesar con una aproximación de 10 mg, una toma 
de ensayo de 5 g.  
Para la determinación de vitami na B 2 adicionar 0,5 g de amilasa y 0,25 g de papaína, independientemente 
de si el producto contiene almidón o no.  
C.15.7.1.1 Productos con almidón  
En un matraz en forma de pera de 100 ml de vidrio con cuello esmerilado, mezclar la toma de ensayo con 
0,5 g de diastasa y 0,25 g de papaína. Añadir máximo 15 ml de agua destilada de 45 - 50°C. Mezclar bien, a 
fin de obtener una suspensión homogénea. Tapar el matraz y colocarlo du rante 30 min en una estufa a 40 °C. 
Añadir a continuación 30 ml de agua destilada de 45 - 50°C. 
C.15.7.1.2 Productos sin almidón, inclusive polvos para bebidas que contengan cacao  
En un matraz en forma de pera de 100 ml de vidrio con cuello esmerilado mezclar la toma de ensayo con 
45 ml de agua destilada de 45 - 50°C. Mezclar bien, a fin d e obtener una suspensión homogénea.  
C.15.7.2 Hidrólisis  
C.15.7.2.1 Productos con o sin almidón, excepto polvos para bebidas que contengan cacao  
Añadir 5 ml de ácido clorhídrico 1 N al matraz (C.15.7.1.1 o C.15.7.1.2). Mezclar bi en, calentar durante  30 
min bajo el reflujo en un baño de agua ebullendo. Al cabo de 15 min, agitar el matraz para deshacer los 
aglomerados.  
Enfriar y añadir 5 ml de acetato de sodio 2,5 M (C.15.4.2). Mezclar bien. Transvasar cuantitativamente el 
contenido del matraz a un matraz afor ado de 100 ml y llevar a volumen con agua destilada.  
Filtrar a través de un filtro plisado. La solución está lista para la oxidación.  
C.15.7.2.2 Polvos para bebidas que contengan cacao  
Proceder según C.15.7.2.1 hasta el enfriamiento después de la hidrólisi s. Transvasar cuantitativamente el 
contenido del matraz a un matraz aforado de 100 ml y llevar a volumen con agua destilada.  
Filtrar a través de un filtro plisado. Luego verter, mediante una pipeta, 40 ml de filtrado en un matraz 
aforado de 50 ml (procedim iento especial para bebidas que contienen cacao por tener polifenoles que 
interfieren en la reacción de B 1). Añadir 5 ml de acetato de sodio 2,5 M (C.15.4.2) y llevar a volumen con  
agua destilada.  
La solución está lista para la oxidación  
C.15.7.3 Oxidació n 
En un matraz aforado de 10 ml de vidrio verter, mediante una pipeta, 5 ml de solución (C.15.7.2.1 o 
C.15.7.2.2). Añadir 3 ml de solución de ferricianuro de potasio básico (C.15.4.4.2). Agitar durante 2 minutos. 
Añadir 0,45 ml de ácido fosfórico concentra do, mezclar, enfriar y llevar a volumen con agua destilada. 
Cromatografiar esta solución inmediatamente.  
C.15.7.4 HPLC  
Condiciones  
Columna:  ODS o C 18, 5 µm; 250 X 4,6 mm o equivalente  
Loop de inyección:  50 µl  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Fase móvil:  ver punto 15.5.2  
Caudal:  1,5 ml /min 
*Detector:  espectrofluorímetro, excitación:  368 nm  
emisión: 440 nm  
Registrador:  10 mm/min  
 
*Para la determinación de vitamina B 2 se inyecta directamente del filtrado y se modifica la siguiente 
condición:  
Detector:  espectrofluorímetro; excitación:  450 nm  
 emisión:  530 nm  
 
Inyectar primero 50 µl de solución patrón oxidada (C.15.6.4) y determinar el tiempo de retención: debe ser 
de aproximadamente 5 - 6 min. A continuación inyectar 50 µl de la solución obtenida C.15.7.3  
C.15.8 Cálculo, expresión e in terpretación de los resultados  
C.15.8.1  Evaluación  
Identificar el pico del tiocromo o de la riboflavina en el cromatograma de la toma de ensayo mediante el 
tiempo de retención definido por cromatografía de la solución patrón. Medir la altura de los picos o btenidos al 
cromatografiar la toma de ensayo y la solución patrón.  
El contenido de vitamina B 1, expresado en mg por 100 g de producto, es igual a:  
 
  
En donde:  
m = masa de la toma de ensayo, en g  
hp = altura del pico del extracto, en mm  
hs = altura del p ico de la solución patrón, en mm  
C = concentración de la solución patrón, en µg/ml  
V = volumen, en mililitros, en el cual se ha diluido el extracto antes del análisis por HPLC (250 
para polvos para bebidas que contengan aromas, 200 para los demás product os) 
 
C.15.8.2 Repetibilidad  
La diferencia entre dos resultados individuales obtenidos con la misma muestra para ensayo, en las 
mismas condiciones (analista, aparato, laboratorio) en un corto intervalo de tiempo, no debe exceder 10% de 
la media entre ambos  resultados.  
C.16. DETERMINACI ON DE NIACINA. M ETODO MICROBIOL OGICO  
C.16.1 Fundamento  
Este método permite cuantificar concentraciones desconocidas de niacina utilizando Lactobacillus 
plantarum  ATCC 8014, microorganismo que no puede sintetizar esta vitamina,  relacionando directamente el 
crecimiento celular con la concentración de niacina. Para preparar la muestra y la curva estándar se utiliza un 
medio libre de niacina y el crecimiento celular se cuantifica turbidimétricamente. Por interpolación en la curva 
se determina la concentración de la muestra.  
C.16.2 Reactivos y materiales  
C.16.2.1 Reactivos  
Acido nicotínico para fines bioquímicos  
Acido clorhídrico fumante 37% para análisis  
Hidróxido de sodio en lentejas para análisis  
Cristales de cloruro de sodio para  análisis        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
C.16.2.2 Materiales  
Micropipeta  
Vasos de precipitados  
Pipetas volumétricas  
Matraces Erlenmeyer  
Matraces volumétricos  
Tubos de ensaye  
C.16.3 Aparatos e instrumentos  
Autoclave  
Incubadora a 35°C ± 1°C  
Espectrofotómetro  
Centrífuga  
C.16.4 Cepa y medio s de cultivo  
Lactobacillus plantarum ATCC 8014  
Leche descremada en polvo grado reactivo  
Caldo micro inoculum  
Agar bacteriológico  
Caldo Bacto Lactobacilli  
Medio de prueba para niacina  
C.16.4.1 Medio de mantenimiento de la cepa  
Bacto Lactobacilli MRS -agar (M RS-agar)  
Preparar 1 l de medio con 55 g de caldo Bacto Lactobacilli MRS + 15 g de agar bacteriológico según las 
indicaciones de la etiqueta del caldo MRS + 1,5% de leche descremada (reconstituida al 10% en agua 
destilada). Repartir a razón de 6 ml en tubos  (de preferencia con tapón de rosca), esterilizar y enfriar en 
posición vertical.  
Conservar en el refrigerador a 4° C. 
C.16.4.2 Mantenimiento de la cepa  
Inocular por punción Lactobacillus plantarum en profundidad en el medio C.16.4.1 cada cuatro semanas, 
efectuar un cultivo intermedio de 18 h en el medio líquido C.16.4.3. Preparar el número de tubos necesarios 
para el análisis y guardar por lo menos dos tubos para el mantenimiento de la cepa.  
Incubar durante 18 h a 35°C.  
C.16.4.3 Medio de cultivo para el des arrollo del microorganismo  
Caldo Micro Inoculum  
Preparar 1 l de solución según las indicaciones de la etiqueta y repartir a razón de 10 ml en tubos. Tapar 
los tubos con capuchones y esterilizar según las indicaciones del fabricante.  
Conservar en el refrige rador a 4°C.  
C.16.5 Preparación de soluciones  
C.16.5.1 Solución fisiológica  
Disolver 9 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos, 
taparlos con capuchones y esterilizar durante 15 min a 121°C.  
Conservar en el ref rigerador a 4°C.  
C.16.5.2 Solución de ácido clorhídrico aproximadamente 1 N  
Bajo una campana de extracción diluir 82 ml de ácido clorhídrico al 37% llevándolos a un volumen de  1000 
ml con agua destilada. Para ello verter el ácido en el matraz aforado que y a contiene agua.  
C.16.5.3 Solución de Hidróxido de sodio 60 g/100 ml  
Disolver 300 g de hidróxido de sodio en agua destilada, enfriando bajo agua del grifo. Completar a 500 ml 
en una probeta graduada. Conservar en un frasco con tapón de polietileno o de gom a. Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
C.16.5.4 Solución de Hidróxido de sodio aproximadamente 1 N  
Disolver 20 g de hidróxido de sodio en agua destilada y llevar a volumen en un matraz aforado de 500 ml 
con tapón de polietileno.  
C.16.5.5 Solución patrón  
Justo antes del uso, pesar exactamente  50,0 mg de ácido nicotínico; disolver en agua destilada y llevar a 
volumen en un matraz aforado de 500 ml.  
C.16.6 Procedimiento  
C.16.6.1 Desarrollo del microorganismo  
Un día antes subcultivar en 10 ml de caldo Micro Inoculum.  
Incubar durante 18 h a 35°C.  
Seis h antes de la inoculación del ensayo, inocular 2 gotas (aproximadamente 0,1 ml) del último cultivo de 
18 h en otro tubo de 10 ml de caldo Micro Inoculum.  
Incubar durante 6 h a 35°C.  
C.16.6.2 Preparación de la toma de ensayo  
En un matraz Erlenmeyer de 150 ml, pesar de 1 a 3 g de muestra homogénea, que contenga 
aproximadamente 200 µg de vitamina, añadir 50 ml de solución de ácido clorhídrico 1N en pequeñas 
cantidades pasando el matraz Erlenmeyer bajo el grifo de agua caliente después de cada adición.  
Cubrir el matraz con papel de aluminio y colocarlo en el autoclave durante 15 min a 120°C. Enfriar.  
Ajustar el pH a 4,6 añadiendo primero aproximadamente 3 ml de hidróxido de sodio de 60 g/100 ml 
mientras se enfría el matraz Erlenmeyer, y luego hidróxido de s odio 1 N. Transvertir cuantitativamente a un 
matraz aforado de 100 ml y llevar a volumen con agua destilada. Filtrar a través de un filtro plisado con 
velocidad de filtración media.  
Diluir el filtrado de modo que se obtenga una solución de aproximadamente 0,05 µg de vitamina por ml.  
C.16.6.3 Solución patrón, 0,05 µg/ml  
Justo antes del uso diluir la solución 16.5.5 como sigue:  
5 ml a 100 ml  
 
10 ml a 100 ml  
 
10 ml a 100 ml = 0,05 µg/ml  
 
C.16.6.4 Medio de cultivo para el ensayo  
Medio de prueba para niacina  
Preparar el volumen necesario en un matraz Erlenmeyer de vidrio actínico de 100 ml. Proceder según las 
indicaciones de la etiqueta, calentando la solución en una parrilla con agitación magnética.  
Cálculo del volumen necesario:  
patrón:  30 tubos 30 x 5 ml = 150 ml  
cada producto:  10 tubos 10 x 5 ml = 50 ml  
+ 50 a 100 ml de exceso  
 
C.16.6.5 Preparación del ensayo  
C.16.6.5.1 Serie patrón  
En un soporte metálico para tubos de ensaye, colocar tres filas de 10 tubos (180 x 18 mm), numerados bl, 
0, ..., 8; el prim ero corresponde al blanco (bl).        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Mediante una pipeta verter en triplicado en las tres series de tubos, volúmenes crecientes de la última 
dilución de la solución patrón, completar a 5 ml con agua destilada y mediante una bureta o una jeringa 
automática, añad ir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo según la tabla siguiente:  
Tubo No .: bl 0 1 2 3 4 5 6 7 8 
Solución 
patrón:  0,0 0,0 0,25 0,50 0,75 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 ml 
2,0 ml  
Agua:  5 5 4,75 4,5 4,25 4,0 3,5 3,5 2,0  
Medio de cultivo:  5 ml en cada  tubo 
 
Los tubos del ensayo en blanco (bl) no se inoculan.  
C.16.6.5.2 Serie producto  
En otro soporte colocar dos filas de 10 tubos (180 x 18 mm). Los primeros cinco tubos de ambas filas van 
destinados a un producto, los otros cinco de ambas filas, a otro producto. Nu merar de 9 a 13 y de 14 a 18, y 
así sucesivamente para todos los productos analizados.  
Mediante un pipeta verter en duplicado en ambas series de cinco tubos, volúmenes crecientes de la última 
dilución de la solución de la muestra, completar a 5 ml con agua  destilada y añadir 5 ml de medio de cultivo 
para el ensayo.  
Tubo No .: 9 10 11 12 13 
Solución de la 
muestra:  0,25 0,50 0,75 1,0 1,50 ml  
Agua:  4,75 4,50 4,25 4,0 3,50 ml  
Medio de cultivo:  5 ml en cada  tubo 
Tapar los tubos con capuchones o mediante una t apa adecuada que cubra ambas filas de tubos en el soporte.  
C.16.6.6 Esterilización del ensayo  
Esterilizar los tubos durante 15 min a 115°C, luego enfriarlos en un baño de agua fría.  
C.16.6.7 Inoculación  
C.16.6.7.1 Preparación y estandarización del inóculo  
Justo antes de inocular el ensayo, transvertir una cantidad suficiente del cultivo preparado bajo C.16.6.1 a 
un tubo de centrífuga estéril, centrifugar a 2600 rpm durante 5 min, decantar y resuspender el paquete celular 
en 10 ml de solución salina. Hacer d os lavados más. Transvertir a una cubeta de 1 cm y efectuar la lectura en 
el espectrofotómetro a 575 nm. Estandarizar el cultivo a fin de obtener siempre aproximadamente la misma 
extinción. No debe olvidarse sustraer de la extinción del cultivo la del medi o de ensayo, que es un  medio 
coloreado.  
Según la extinción, diluir "n" gotas del cultivo (C.16.6.1) en un tubo que contenga 10 ml de medio 
(C.16.6.4). Este tubo es el inóculo.  
Así pues, para una extinción del cultivo (C.16.6.1) entre 0,2 y 0,4 (después de  sustraer la extinción propia 
del medio), introducir de 4 a 8 gotas de cultivo en el tubo que contiene 10 ml de medio (C.16.6.4). Si la 
extinción no se encuentra en la zona arriba mencionada, adaptar la dilución como sigue:  
-extinción inferior a 0,2: intro ducir proporcionalmente  más gotas en el tubo (no más de 10 gotas).  
-extinción superior a 0,4: introducir menos gotas o diluir proporcionalmente con el medio (C.16.6.4).  
 
C.16.6.7.2 Inoculación  
Mediante una micropipeta con punta estéril, inocular 0,1 ml d el inóculo en cada tubo de las series patrón y 
producto. Los tubos del blanco (bl) no se inoculan.  
Después de inocular, agitar los tubos ligeramente a fin de repartir el microorganismo uniformemente  en el 
medio.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
C.16.6.8 Incubación  
Incubar los tubos inocu lados durante aproximadamente 16 h a 35°C. Observar los tubos con regularidad al 
cabo de las 16 h. Verificar si la diferencia de desarrollo del microorganismo es suficiente entre la primera y la 
última dilución de la solución patrón.  
Si es necesario, prolo ngar la incubación hasta que se obtenga un crecimiento óptimo del microorganismo.  
Después de la incubación se recomienda interrumpir el crecimiento del microorganismo simultáneamente 
en todos los tubos, colocándolos en un baño de agua fría.  
C.16.6.9 Lectur as 
Mediante un agitador para tubos de ensaye, poner en suspensión el depósito formado por el desarrollo del 
microorganismo. Transvertir la suspensión a un tubo o una cubeta óptica, según el fotómetro. Medir la 
transmitancia o absorbancia a 575 nm ajustando  el 100% de T o a 0% de A del aparato con el blanco (bl).*  
Agitar y leer un tubo después de otro, a fin de evitar la sedimentación del microorganismo.  
* Nota:  Si la determinación se hace en absorbancia buscar el equivalente de los valores de los ejemplos, 
dados en transmitancia.  
C.16.7 Cálculos  
C.16.7.1 Curva de calibración  
Trazar la curva de calibración en papel milimétrico, o utilizar una calculadora con regresión lineal, llevando 
la lectura media de cada grupo de tres tubos a la ordenada y los µg de vita mina a la abscisa.  
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml µg lecturas  media  
   1 2 3  
0 0,0 0,0 88,7 88,6 88,2 88,5 
1 0,25 0,0125  73,4 72,6 71,1 72,4 
2 0,50 0,025  62,1 61,5 62,6 62,1 
3 0,75 0,0375  53,3 53,2 55,5 54,0 
4 1,0 0,050  47,3 48,0 49,1 48,1 
5 1,5 0,075  36,8 37,7 40,5 38,3 
6 2,0 0,100  31,0 45,6 39,5 35,3 
7 2,5 0,125  30,5 27,2 27,2 28,3 
8 3,0 0,150  29,0 24,8 24,0 25,9 
 
Observaciones:  
La curva de calibración es característica de cada vitamina. Es mejor cuanto mayor sea la parte que ocupa 
la escala de transmis ión. 
Repetir el ensayo cuando la curva de crecimiento esté mal desarrollada, esto puede deberse a la cepa o al 
medio de cultivo para el ensayo; que deben verificarse por separado.  
C.16.7.2 Contenido de vitamina en el producto  
La media de las lecturas de ca da par de tubos permite leer en la curva de calibración la cantidad de 
vitamina y calcular su concentración en la última dilución de la muestra.  
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml lecturas  media  µg* µg/ml  
  1 2          (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
9 0,25 (88) 79,0 79,0 0,0145  0,058  
10 0,50 59,2 58,2 58,7 0,0300  0,060  
11 0,75 52,0 52,2 52,1 0,0413  0,055  
12 1,00 43,8 45,8 44,8 0,058  0,058  
13 1,50 35,1 35,5 35,3 0,086  0,057  
Media 0,0576=(C)  
( ) = valor aberrante  
 * = valores leídos en la curva de calibración  
Observación:  
Fluctuaciones pequeñas en los  valores de la última columna son prueba de un buen ensayo.  
Calcular el contenido de vitamina en mg/100 g de producto, teniendo en cuenta las diluciones sucesivas y 
la concentración en la muestra diluida.  
El contenido de vitamina, expresado en mg de ácido nicotínico por 100 g de producto es igual a:  
 
  
Donde:  
C = media de las concentraciones leídas en la curva de calibración, en µg/ml  
V1 = volumen en el que se ha disuelto la toma de ensayo, en ml  
V2 = parte alícuota de V1 en ml  
V3 = volumen al que se ha diluido la parte alícuota V2, en ml  
m = toma de ensayo, en g  
 
Ejemplo:  
2,072 g (m) de producto se han pesado en un matraz aforado de 100 ml (V1). Se ha tomado una parte 
alícuota de 2 ml (V2), que se ha diluido en un matraz aforado de 100 ml (V3).  
La medi a de las concentraciones de niacina leídas en la curva de calibración es 0,0576 µg/ml (C).  
El contenido de vitamina es:  
 
 = 13,9 mg/100 g  
C.17. DETERMINACI ON DE PANTOTENATO DE CALCIO. M ETODO MICROBIOL OGICO.  
C.17.1 Fundamento  
Este método permite cuantificar  pantotenato de calcio utilizando un microorganismo que no es capaz de 
sintetizarlo ( Lactobacillus plantarum ATCC 8014); el crecimiento celular se relaciona directamente con la 
concentración de pantotenato presente.  
Para preparar la muestra y la curva está ndar se utiliza un medio basal libre de pantotenato. El crecimiento 
celular se mide turbidimétricamente y por interpolación en la curva se determina la concentración de la muestra.  
C.17.2 Reactivos y materiales  
17.2.1 Reactivos  
Leche descremada en polvo gr ado reactivo  
Calcio D(+) pantotenato para fines bioquímicos  
Acido acético glacial 100% para análisis  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Hidróxido de sodio en lentejas para análisis  
Cristales de cloruro de sodio para análisis  
Papaína  
Diastasa  
C.17.2.2 Materiales  
Mortero de porcelana, interio r esmaltado, diámetro 80 mm.  
Pistilo de porcelana, cabeza esmaltada, longitud 75 -80 mm (serruchado, si es demasiado largo)  
Probeta graduada de 100 ml  
Material común de laboratorio  
C.17.3 Aparatos e instrumentos  
Autoclave  
Incubadora a 35 °C ± 1°C  
Espectrofot ómetro  
Micropipeta  
Centrífuga  
C.17.4 Cepa y medios de cultivo  
Lactobacillus plantarum , ATCC 8014  
Caldo Micro Inoculum  
Agar bacteriológico  
Caldo Bacto Lactobacilli MRS  
Medio de prueba para pantotenato  
C.17.4.1 Medio de mantenimiento de la cepa  
Bacto Lactoba cilli MRS -agar (MRS -agar)  
Preparar 1 l de medio de agar bacteriológico con 55 g de caldo Bacto Lactobacilli MRS + 15 g agar 
bacteriológico, según las indicaciones de la etiqueta del caldo MRS+1,5% de leche descremada (reconstituida 
al 10% en agua destilada ). Repartir a razón de 6 ml en tubos (de preferencia con tapón de rosca), esterilizar y 
enfriar en posición vertical.  
Conservar en el refrigerador a 4°C.  
C.17.4.2 Mantenimiento de la cepa  
Inocular por punción Lactobacillus plantarum en profundidad en el me dio C.17.4.1 cada cuatro semanas, 
efectuando un cultivo intermedio de 18 h en el medio líquido C.17.4.3. Preparar el número de tubos 
necesarios para el análisis y guardar por lo menos dos tubos para el mantenimiento de la cepa.  
Incubar durante 18 h a 35°C.  
C.17.4.3 Medio de cultivo para el desarrollo del microorganismo  
Caldo micro Inoculum  
Preparar 1 l de solución según las indicaciones de la etiqueta y repartir a razón de 10 ml en tubos. Tapar 
los tubos con capuchones y esterilizar según las indicaciones d el fabricante.  
Conservar en el refrigerador a 4°C.  
C.17.5 Preparación de soluciones  
C.17.5.1 Solución fisiológica  
Disolver 9 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos, 
taparlos con capuchones y esterilizar duran te 15 min a 121°C.  
Conservar en el refrigerador a 4°C.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
C.17.5.2 Solución de ácido acético aproximadamente 1 N  
Diluir 29 ml de ácido acético glacial en 500 ml con agua destilada.  
C.17.5.3 Solución de hidróxido de sodio, aproximadamente 1 N  
Disolver 20 g de hidróxido de sodio en agua destilada y llevar a volumen en un matraz aforado de 500 ml 
con tapón de polietileno.  
C.17.5.4 Solución tampón pH 4,6  
En un matraz aforado de 500 ml, mezclar 100 ml de ácido acético 1 N con 50 ml de hidróxido de sodio 
(C.17.5.3) y llevar a volumen con agua destilada.  
C.17.5.5 Solución patrón  
Justo antes del uso, pesar exactamente 50,0 mg de pantotenato de calcio; disolver en agua destilada y 
llevar a volumen en un matraz aforado de 500 ml.  
C.17.6 Procedimiento  
C.17.6.1 Desarrollo del microorganismo  
Un día antes, subcultivar en 10 ml de caldo Micro Inoculum (C.17.4.3).  
Incubar durante 18 h a 35°C.  
Seis h antes de la inoculación del ensayo, inocular 2 gotas (aproximadamente 0,1 ml) del último cultivo de 
18 h en otro tubo de 10 ml de caldo Micro Inoculum.  
Incubar durante 6 h a 35°C.  
C.17.6.2 Preparación de la toma de ensayo  
Próximo a la determinación, pesar en pequeños morteros de porcelana de 1 - 2 g de muestra homogénea, 
que contenga aproximadamente 50 µg de pantotenato de calcio. Añ adir 100 mg de papaína y 50 mg de 
diastasa. Moler todo cuidadosamente mediante el pistilo.  
Mojar la mezcla con 10 ml de solución tampón pH 4,6 (C.17.5.4). Cubrir los morteros y los pistilos con 
papel de aluminio y a continuación colocarlos en una estufa.  
Incubar una noche a 42°C.  
Después de la incubación, verificar el pH y ajustarlo a 4,6 si es necesario. Transvertir cuantitativamente a 
un matraz aforado de 100 ml y llevar a volumen con agua destilada. Filtrar a través de un filtro plisado con 
velocidad de filtración media.  
Diluir el filtrado de modo que se obtenga una solución de aproximadamente 0,05 µg de pantotenato de 
calcio por ml.  
Observación : Con cada nuevo lote de diastasa y de papaína, efectuar un ensayo en blanco:  
Tratar 5 g de papaína o de diastas a como la toma de ensayo. Sin diluir, proceder según C.17.6.5.2. El 
contenido de pantotenato de calcio de la enzima no debe rebasar 1 mg/100 g.  
C.17.6.3 Solución patrón, 0,05 µg/ml  
Justo antes del uso diluir la solución 17.5.5 como sigue:  
5 ml a 100 ml  
 
10 ml a 100 ml  
 
10 ml a 100 ml = 0,05 µg/ml  
 
C.17.6.4 Medio de cultivo para el ensayo  
Medio de prueba para pantotenato.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Preparar el volumen necesario en un matraz Erlenmeyer de vidrio de 1000 ml. Proceder según las 
indicaciones de la etiqueta, calentand o la solución en una parrilla con agitación magnética.  
Cálculo del volumen necesario:  
patrón:  30 tubos 30 x 5 ml = 150 ml  
cada producto:  10 tubos 10 x 5 ml = 50 ml  
+ 50 a 100 ml de exceso  
 
C.17.6.5 Preparación del ensayo  
C.17.6.5.1 Serie patrón  
En un so porte metálico para tubos de ensaye, colocar tres filas de 10 tubos (180 x 18 mm), numerados bl, 
0, ..., 8; el primero corresponde al blanco (bl).  
Mediante una pipeta verter en triplicado en las tres series de tubos, volúmenes crecientes de la última 
dilución de la solución patrón, completar a 5 ml con agua destilada y mediante una bureta o una jeringa 
automática añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo según la tabla siguiente:  
Tubo No.: bl  0 1 2 3 4 5 6 7 8 
Solución 
Patrón: 0,0   0,0  0,25  0,50  0,75  1,0  1,5  2,0  2,5  3,0 ml  
Agua: 5  5 4,75 4,5 4,25 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 ml  
Medio de cultivo:  5 ml en cada  tubo 
Los tubos del ensayo en blanco (bl) no se inoculan.  
C.17.6.5.2 Serie producto  
En otro soporte colocar dos filas de 10 tubos (180 x 18 mm). Los primeros cinco tubos de ambas filas van 
destinados a un producto, los otros cinco de ambas filas, a otro producto. Numerar de 9 a 13 y de 14 a 18 y 
así sucesivamente para todos los productos analizados.  
Mediante una pipeta verter en duplicado en ambas series de cinco tubos, volúmenes crecientes de la 
última dilución de la solución de la muestra, completar a 5 ml con agua destilada y añadir 5 ml de medio de 
cultivo para el ensayo.  
 
Tubo No.: 9  10 11 12 13 
Solución de  
la muestra:  0,25  0,50  4,75  1,0  1,50 ml 
Agua:  4,75 4,50 4,25 4,0 3,50 ml 
Medio de cultivo:  5 ml en cada  tubo 
 
Tapar los tubos con capuchones o mediante una tapa adecuada que cubra ambas filas de tubos en el soporte.  
Esterilizar los tubos durante 15 min a 115°C, luego enfriarlos en un  baño de agua fría.  
C.17.6.6 Inoculación  
C.17.6.6.1 Preparación y estandarización del inóculo  
Justo antes de inocular el ensayo, transvertir una cantidad suficiente del cultivo preparado bajo C.17.6.1 a 
un tubo de centrífuga estéril, centrífugar a 2600 rpm  durante 5 min, decantar y resuspender el paquete celular 
en 10 ml de solución salina. Hacer dos lavados más. Transvertir a una cubeta de 1 cm y efectuar la lectura en 
el espectrofotómetro a 575 nm. Estandarizar el cultivo a fin de obtener siempre aproxima damente la misma 
extinción. No debe olvidarse sustraer de la extinción del cultivo la del medio de ensayo, que es un  medio 
coloreado.  
Según la extinción, diluir "n" gotas del cultivo (C.17.6.1) en un tubo que contenga 10 ml de medio 
(C.17.6.4). Este tubo es el inóculo.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Así pues, para una extinción del cultivo (C.17.6.1) entre 0,2 y 0,4 (después de sustraer la extinción propia 
del medio), introducir de 4 a 8 gotas de cultivo en el tubo que contiene 10 ml de medio (C.17.6.4). Si la 
extinción no se encuentra en la zona arriba mencionada, adaptar la dilución como sigue:  
- extinción inferior a 0,2: introducir proporcionalmente más gotas en el tubo (no más de 10 gotas).  
- extinción superior a 0,4: introducir menos gotas o diluir proporcionalmente con el medio (C .17.6.4).  
 
C.17.6.6.2 Inoculación  
Mediante una micropipeta de punta estéril, inocular 0,1 ml del inóculo en cada tubo de las series patrón y 
producto. Los tubos del blanco (bl) no se inoculan.  
Después de inocular, agitar los tubos ligeramente a fin de rep artir el microorganismo uniformemente  en el 
medio.  
C.17.6.7 Incubación  
Incubar los tubos inoculados durante aproximadamente 16 h a 35°C. Observar los tubos con regularidad al 
cabo de las 16 h. Verificar si la diferencia de desarrollo del microorganismo es  suficiente entre la primera y la 
última dilución de la solución patrón.  
Si es necesario, prolongar la incubación hasta que se obtenga un crecimiento óptimo del microorganismo.  
Después de la incubación se recomienda interrumpir el crecimiento del microorga nismo simultáneamente 
en todos los tubos, colocándolos en un baño de agua fría.  
C.17.6.8 Lecturas  
Mediante un agitador para tubos de ensaye, poner en suspensión el depósito formado por el desarrollo del 
microorganismo. Transvertir la suspensión a un tubo o  una cubeta óptica, según el fotómetro. Medir la 
transmitancia o absorbancia a 575 nm ajustando el 100% T o a 0% de A del aparato con el blanco (bl). *  
Agitar y leer un tubo después de otro, a fin de evitar la sedimentación del microorganismo.  
* Nota:  Si la determinación se hace en absorbancia, buscar el equivalente de los valores de los ejemplos, 
dados en transmitancia.  
C.17.7 Cálculos  
C.17.7.1 Curva de calibración  
Trazar la curva de calibración en papel milimétrico, o mediante una calculadora con regresió n lineal 
llevando la lectura media de cada grupo de tres tubos a la ordenada y los µg de pantotenato de calcio  a la 
abscisa.  
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml µg lecturas  media  
   1 2 3  
0 0,0 0,0 99,0 98,9 99,7 99,2 
1 0,25 0,0125  93,0 92,2 91,0 92,0 
2 0,50 0,025  82,8 83,3 82,9 83,0 
3 0,75 0,0375  72,3 70,2 73,0 71,8 
4 1,0 0,050  57,4 58,9 64,2 60,1 
5 1,5 0,075  39,8 36,5 39,8 38,7 
6 2,0 0,100  26,9 27,0 27,2 27,0 
7 2,5 0,125  22,4 20,2 21,0 21,2 
8 3,0 0,150  18,9 17,1 18,9 18,3 
 Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Observaciones:  
La curva de calibra ción es característica de cada vitamina. Es tanto mejor cuanto mayor sea la parte que 
ocupa de la escala de transmisión.  
Repetir el ensayo cuando la curva de crecimiento esté mal desarrollada, esto puede deberse a la cepa o al 
medio de cultivo para el ensa yo; que deben verificarse por separado.  
C.17.7.2 Contenido de vitamina en el producto  
La media de las lecturas de cada par de tubos permite leer en la curva de calibración la cantidad de 
vitamina y calcular su concentración en la última dilución de la mues tra. 
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml lecturas  media  µg* µg/ml  
  1 2    
9 0,25 (81) 92,1 92,1 0,0119  0,0476  
10 0,50 82,7 81,7 82,2 0,0252  0,0504  
11 0,75 71,4 72,2 71,8 0,038  0,0507  
12 1,00 57,2 58,8 58,0 0,050  0,0500  
13 1,50 37,9 39,1 38,5 0,076  0,0507  
Media  0,0498(=C)  
() = valor aberrante  
* = valores leídos en la curva de calibración  
Observación:  
Fluctuaciones pequeñas en los valores de la última columna son prueba de un buen ensayo.  
Calcular el contenido de vitamina en mg/100 g de producto, teniendo en cuenta las diluciones sucesivas y 
la concentración en la muestra diluida.  
El contenido de pantotenato de calcio expresado en mg/100 g de producto es igual a:  
 
  
 
C = media de las concentraciones leídas en la curva de calibración, en µg/ml  
V1 = volumen en el que se ha disuelto la toma de ensayo, en ml  
V2 = parte alícuota de V1, en ml  
V3 = volumen al que se ha diluido la parte alícuota V2, en ml  
m = toma de ensayo, en g  
Ejemplo:  
1,127 g (m) de producto se han pesado en un matraz aforado de 100 ml(V1). Se ha tom ado una parte 
alícuota de 10 ml (V2), que se ha diluido en un matraz aforado de 100 ml (V3).  
La media de las concentraciones de pantotenato de calcio leídas en la curva de calibración es 0,0498 µg/ml (C).  
El contenido de pantotenato de calcio es:  
= 4,42 m g/100 g  
C.18. DETERMINACI ON DE ACIDO F OLICO. M ETODO MICROBIOL OGICO.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
C.18.1 Fundamento  
Este método permite cuantificar ácido fólico utilizando Lactobacillus casei  ATCC 7469, microorganismo 
que no puede sintetizar esta vitamina, relacionando directamente el crecimiento celular con la concentración 
de folato presente. Para preparar la muestra y la curva estándar se utiliza un medio comercial libre de folato. 
El crecimiento celular se mide turbidimétricamente y por interpolación en la curva se determina la 
conc entración en la muestra.  
C.18.2 Reactivos y materiales  
C.18.2.1 Reactivos  
Cloruro de calcio fundido o granulado para análisis  
Fosfato diácido de potasio anhidro  
Fosfato ácido di -potásico anhidro  
Hidróxido de sodio en lentejas para análisis  
Cristales de clo ruro de sodio para análisis  
Alcohol etílico absoluto  
-amilasa  
Lactosa  
C.18.2.2 Materiales  
Matraz Erlenmeyer de vidrio de 250 ml  
Matraz aforado de vidrio de 100, 250 y 500 ml  
Tapones de vidrio  
Micropipetas  
Material común de la boratorio  
Todo el material de vidrio debe ser actínico o forrado con papel aluminio.  
C.18.3 Aparatos e instrumentos  
Autoclave  
Incubadora a 3 5°C ± 1°C  
Espectrofotómetro  
Centrífuga  
C.18.4 Cepa y medios de cultivo  
Lactobacillus casei ATCC 7469  
Leche descremad a en polvo grado reactivo  
Caldo Micro Inoculum  
Agar bacteriológico  
Caldo Bacto Lactobacilli MRS  
Medio de prueba para ácido fólico  
C.18.4.1 Medio de mantenimiento de la cepa  
Bacto Lactobacilli MRS -agar (MRS -agar)  
Preparar 1 l de medio con 55 g de caldo Bact o Lactobacilli MRS + 15 g de agar bacteriológico, según las 
indicaciones de la etiqueta del caldo MRS + 1,5% de leche descremada (reconstituida al 10% en agua 
destilada). Repartir a razón de 6 ml en tubos (de preferencia con tapón de rosca), esterilizar y enfriar en 
posición vertical.  
Conservar en el refrigerador a 4°C.  
C.18.4.2 Mantenimiento de la cepa  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Inocular por punción Lactobacillus casei en profundidad en el medio C.18.4.1 cada cuatro semanas, 
efectuando un cultivo intermedio de 18 h en el medio líqui do C.18.4.3. Preparar el número de tubos 
necesarios para el análisis y guardar por lo menos dos tubos para el mantenimiento de la cepa.  
Incubar durante 18 h a 35°C.  
C.18.4.3 Medio de cultivo para el desarrollo del microorganismo  
Caldo Micro Inoculum  
Prepar ar 1 l de solución según las indicaciones de la etiqueta y repartir a razón de 10 ml en tubos. Tapar 
los tubos con capuchones y esterilizar según las indicaciones del fabricante.  
Conservar en el refrigerador a 4°C.  
C.18.5 Preparación de soluciones  
C.18.5.1  Solución fisiológica  
Disolver 9 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos, 
taparlos con capuchones y esterilizar durante 15 min a 121°C.  
Conservar en el refrigerador a 4°C.  
C.18.5.2 Solución tampón pH 6,1  
Disol ver 2 g de hidróxido de sodio en agua destilada y llevar a volumen en un matraz aforado de 500 ml 
con tapón de polietileno.  
C.18.5.3 Solución de cloruro de calcio, CaC 2, al 2%  
Disolver 2 g de cloruro de calcio en agua destilada y completar a 100 ml en un m atraz aforado.  
C.18.5.4 Solución patrón  
Pesar exactamente 50,0 mg de ácido fólico (ácido pteroilglutámico), disolver en agua destilada en un 
matraz aforado de vidrio de 500 ml, añadir 50 ml de NaOH 0,1 N, 100 ml de alcohol y llevar a volumen con 
agua desti lada.  
Conservar esta solución a 4°C durante máximo 6 meses.  
C.18.6 Procedimiento  
El ácido fólico es fotosensible. Por lo tanto, para todas las soluciones que contienen dicha vitamina se 
debe utilizar material de vidrio actínico o cubrir el material de vidr io corriente con papel de aluminio o un  paño 
negro.  
C.18.6.1 Desarrollo del microorganismo  
Un día antes, subcultivar en 10 ml de caldo Micro Inoculum (18.4.3).  
Incubar durante 18 h a 35°C.  
Seis h antes de la inoculación del ensayo, inocular 2 gotas (aprox imadamente 0,1 ml) del último cultivo de 
18 h en otro tubo de 10 ml de caldo Micro Inoculum.  
Incubar durante 6 h a 35°C.  
C.18.6.2 Preparación de la toma de ensayo  
C.18.6.2.1 Productos sin almidón  
En un matraz Erlenmeyer de 250 ml, pesar de 1 a 3 g de muest ra homogénea, que contenga 
aproximadamente 1 µg de ácido fólico. Disolver en 30 ml de solución tampón pH 6,1 (C.18.5.2). A fin de evitar 
la formación de grumos, añadir la solución tampón en pequeñas cantidades pasando el matraz Erlenmeyer 
bajo el grifo de agua caliente.  
Cubrir el matraz con papel de aluminio y colocar en el autoclave durante 20 min a 102°C. Enfriar.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Transvertir cuantitativamente a un matraz aforado de vidrio de 100 ml. Añadir al contenido del matraz 0,8 
ml de solución de cloruro de calcio a l 2% y agitar. Dejar reposar durante 15 minutos, luego llevar a volumen 
con agua destilada. Filtrar a través de un filtro plisado con velocidad de filtración media.  
Diluir el filtrado de modo que se obtenga una solución de aproximadamente 0,2 ng de ácido f ólico por ml.  
C.18.6.2.2 Productos con almidón  
Proceder según el primer apartado bajo 18.6.2.1.  
Antes de colocar la solución en el autoclave, añadir una cantidad de mezcla al 6% de -amilasa 
pancreática en lactosa, correspondi ente a 1% de la toma de ensayo.  
Incubar durante 30 min a 42°C. Cubrir el matraz con papel de aluminio y colocar en el autoclave durante 
20 min a 102°C. Enfriar. A continuación transvertir cuantitativamente a un matraz aforado de vidrio de 100 ml y 
prosegui r como se describe en C.18.6.2.1  
Nota:  Con cada nuevo lote de diastasa efectuar un ensayo en blanco.  
Mediante una pipeta tomar 10 ml de solución patrón (C.18.6.3) dilución d. Añadir 30 ml de agua. Añadir 
100 mg de mezcla al 6% de -amilasa pancreática en lactosa. Incubar durante 30 min a 42°C. Transvertir 
cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml. Llevar a volumen y filtrar.  
La curva de calibración obtenida con esta solución debe ser comparable a aquella obtenida con la s olución 
patrón no tratada.  
C.18.6.3 Solución patrón 0,2 ng/ml  
Justo antes del uso diluir la solución 18.5.4 como sigue:  
10 ml a 100 ml  
 
10 ml a 100 ml  
 
2 ml a 100 ml  
 
10 ml a 100 ml  
 
10 ml a 100 ml = 0,2 ng/ml  
 
C.18.6.4 Medio de cultivo para el ensayo  
Medio para prueba de ácido fólico.  
Preparar el volumen necesario en un matraz Erlenmeyer de vidrio de 1000 ml. Proceder según las 
indicaciones de la etiqueta, calentando la solución en una parrilla con agitación magnética.  
Cálculo del volumen necesario:  
patrón:  30 tubos 30 x 5 ml = 150 ml  
cada producto:  10 tubos 10 x 5 ml = 50 ml  
+ 50 ml a 100 ml de exceso  
 
C.18.6.5 Preparación del ensayo  
C.18.6.5.1 Serie patrón  
En un soporte metálico para tubos de ensaye, colocar 3 filas de 10 tubos (180 x 18 mm), nume rados bl, 
0,..., 8; el primero corresponde al blanco.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Mediante una pipeta vertir en triplicado en las tres series de tubos, volúmenes crecientes de la última 
dilución de la solución patrón, completar a 5 ml con agua destilada y mediante una bureta o una je ringa 
automática, añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo según la tabla siguiente:  
Tubo No.:  bl 0 1 2 3 4 5 6 7 8 
Solución  
patrón: 0,0   0,0  0,25  0,50  0,75  1,0  1,5  2,0  2,5  3,0 ml 
Agua: 5  5 4,75 4,5 4,25 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 ml 
Medio de  
cultivo: 5 ml en cada  tubo 
Los tubos del ensayo en blanco (bl) no se inoculan.  
C.18.6.5.2 Serie producto  
En otro soporte colocar dos filas de 10 tubos (180 x 18 mm). Los primeros cinco tubos de ambas filas van 
destinados a un producto, los otros cinco de amb as filas, a otro producto. Numerar de 9 a 13 y de 14 a 18 y 
así sucesivamente para todos los productos analizados.  
Mediante una pipeta verter en duplicado en ambas series de cinco tubos, volúmenes crecientes de la 
última dilución de la solución de la muest ra, completar a 5 ml con agua destilada y añadir 5 ml de medio de 
cultivo para el ensayo.  
Tubo No.:  9 10 11 12 13 
Solución  
de la  
muestra: 0,25   0,50  0,75  1,0  1,50 ml 
Agua: 4,75  4,50 4,25 4,0 3,50 ml 
Medio de  
cultivo:  5 ml en cada  tubo 
 
Tapar los tub os con capuchones o mediante una tapa adecuada que cubra ambas filas de tubos  en el 
soporte.  
C.18.6.6 Esterilización del ensayo  
Esterilizar los tubos durante 10 min a 121°C, luego enfriarlos en un baño de agua fría.  
C.18.6.7 Inoculación  
C.18.6.7.1 Prepara ción y estandarización del inóculo  
Justo antes de inocular el ensayo, transvertir una cantidad suficiente del cultivo preparado bajo C.18.6.1 a 
un tubo de centrífuga estéril, centrifugar a 2600 rpm durante 5 min, decantar y resuspender el paquete celular 
en 10 ml de solución salina. Hacer dos lavados más. Transvertir a una cubeta de 1 cm y efectuar la lectura en 
el espectrofotómetro a 575 nm. Estandarizar el cultivo a fin de obtener siempre aproximadamente la misma 
extinción. No debe olvidarse sustraer de l a extinción del cultivo la del medio de ensayo, que es un medio 
coloreado.  
Según la extinción, diluir "n" gotas del cultivo (C.18.6.1) en un tubo que contenga 10 ml de medio 
(C.18.6.4). Este tubo es el inóculo.  
Así pues, para una extinción del cultivo (C.1 8.6.1) entre 0,40 y 0,60 (después de sustraer la extinción 
propia del medio), introducir 5 gotas de cultivo en el tubo que contiene 10 ml de medio (C.18.6.4). Si la 
extinción no se encuentra en la zona arriba mencionada, adaptar la dilución como sigue:  
- extinción inferior a 0,40: introducir proporcionalmente más gotas en el tubo (no más de 10 gotas)        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
- extinción superior a 0,60: introducir menos gotas o diluir proporcionalmente con el medio (C.18.6.4).  
 
C.18.6.7.2 Inoculación  
Mediante una micropipeta de p unta estéril, inocular 0,1 ml del inóculo en cada tubo de las series patrón y 
producto. Los tubos del blanco (bl) no se inoculan.  
Después de inocular, agitar los tubos ligeramente a fin de repartir el microorganismo uniformemente  en el 
medio.  
C.18.6.8 Incubación  
Incubar los tubos inoculados durante aproximadamente 19 h a 35°C. Observar los tubos con regularidad al 
cabo de las 19 h. Verificar si la diferencia de desarrollo del microorganismo es suficiente entre la primera y la 
última dilución de la solución  patrón.  
Si es necesario, prolongar la incubación hasta que se obtenga un crecimiento óptimo del microorganismo.  
Después de la incubación se recomienda interrumpir el crecimiento del microorganismo simultáneamente 
en todos los tubos, colocándolos en un bañ o de agua fría.  
C.18.6.9 Lecturas  
Mediante un agitador para tubos de ensaye, poner en suspensión el depósito formado por el desarrollo del 
microorganismo. Transvertir la suspensión a un tubo o una cubeta óptica, según el fotómetro. Medir la 
transmitancia o  absorbancia a 575 nm ajustando el 100% de T o a 0% de A del aparato con el blanco (bl).  
Agitar y leer un tubo después de otro, a fin de evitar la sedimentación del microorganismo.  
C.18.7 Cálculos  
18.7.1 Curva de calibración  
Trazar la curva de calibración en papel milimétrico o mediante una calculadora con regresión lineal, 
llevando la lectura media de cada grupo de tres tubos a la ordenada y los ng de ácido fólico a la abscisa.  
*Nota:  Si la determinación se hace en absorbancia buscar el equivalente de los valores de los ejemplos, 
dados en transmitancia.  
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml ng lecturas  media  
   1 2 3  
0 0,0 0,0 88,1 87,6 87,5 87,7 
1 0,25 0,05 78,4 78,5 79,5 78,8 
2 0,50 0,1 70,5 70,4 71,3 70,7 
3 0,75 0,15 64,1 64,6 64,6 64,4 
4 1,0 0,20 58,9 59,6 59,3 59,3 
5 1,5 0,30 50,8 51,3 51,4 51,2 
6 2,0 0,40 44,7 44,1 45,5 44,8 
7 2,5 0,50 39,7 39,7 38,2 39,2 
8 3,0 0,60 35,6 36,1 35,2 35,6 
 
Observaciones:  
La curva de calibración es característica de cada vitamina. Es tanto mejor cuanto mayor sea la parte que 
ocupa de la escala de transmisión.  
Repetir el ensayo cuando la curva de crecimiento esté mal desarrollada, esto puede deberse a la cepa o al 
medio de cultivo para el ensayo; que deben verificarse por separado.  
C.18.7.2 Contenido de vitamina en el producto  
La media de las lecturas de cada par de tubos permite leer en la curva de calibración la cantidad de 
vitamina y calcular su concentración en la última dilución de la muestra.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml lecturas  media  ng* ng/ml  
  1 2    
9 0,25 80,2 79,4 79,8 0,045 0,18 
10 0,50 71,6 73,7 72,6 0,095  0,19 
11 0,75 66,1 67,7 66,9 0,135  0,18 
12 1,00 61,4 (56,5)  61,4 0,185  0,185  
13 1,50 53,7 52,1 52,9 0,280  0,187  
 Media  0,184 (=C)  
( ) = valor aberrante  
* = valores leídos en la curva de calibración  
Observación:  
Fluct uaciones pequeñas en los valores de la última columna son prueba de un buen ensayo.  
Calcul ar el contenido de vitamina en µg/100 g de producto, teniendo en cuenta las diluciones sucesivas y 
la concentración en la muestra diluida.  
El contenido de ácido fólic o, expresado en µg/100 g de producto es igual a:  
 
 
C= media de las concentraciones leídas en la curva de calibración, en ng/ml  
V1= volumen en el que se ha disuelto la toma de ensayo, en ml  
V2= parte alícuota de V 1, en ml  
V3= volumen al que se ha diluid o la parte alícuota V 2, en ml  
m = toma de ensayo, en g  
 
Ejemplo:  
1 g (m) de producto se han pesado en un matraz aforado de 100 ml(V 1). Se ha tomado una parte alícuota 
de 10 ml (V 2), que se ha diluido en un matraz aforado de 250 ml (V 3). 
La media de las c oncentraciones en ácido fólico leídas en la curva de calibración es 0,184 ng/ml (C).  
El contenido en ácido fólico es:  
 
C.19. DETERMINACI ON DE VITAMINA B 12. METODO MICROBIOL OGICO  
C.19.1 Fundamento  
Este método permite cuantificar cianocobalamina utilizando Lactobacillus leichmannii  ATCC 7830, 
microorganismo que no puede sintetizar esta vitamina, relacionando directamente el crecimiento celular con la 
concentración de cianocobalamina presente. Para preparar la muestra y la curva estándar se utiliza un medio 
comercial libre de cianocobalamina. El crecimiento celular se mide turbimétricamente y por interpolación en la 
curva se determina la concentración de la muestra. El análisis debe realizarse con baja intensidad de luz 
porque la vitamina B 12 es fotosensible.  
C.19.2 Reactivos y materiales  
C.19.2.1 Reactivos        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Vitamina B 12 para fines bioquímicos  
Acido clorhídrico fumante al 37% para análisis  
Cianuro de sodio (CN) para análisis  
Cristales de cloruro de sodio para análisis  
Hipoclorito de sodio  
Diastasa  
C.19.2.2 Mater iales 
Micropipetas  
Centrífuga  
Matraz en forma de pera de vidrio de 100 ml  
Matraz aforado de vidrio de 100 y 500 ml  
Matraz Erlenmeyer de vidrio de 250 ml  
Baño de agua  
Refrigerante Allihn  
Frascos con cápsula de polietileno a presión de 8 ml  
Tapón de vidrio  
Pera de goma, propipeta  
Material común de laboratorio  
Todo el material de vidrio debe ser actínico o forrado con papel aluminio.  
C.19.3 Aparatos e instrumentos  
Autoclave  
Incubadora a 35°C ± 1°C  
Espectrofotómetro  
C.19.4 Cepa y medios de cultivo  
Lactobacillus  leichmannii ATCC 7830  
Leche descremada en polvo grado reactivo  
Caldo micro inoculum  
Agar bacteriológico  
Caldo Bacto Lactobacilli MRS  
Medio de prueba para vitamina B 12 
C.19.4.1 Medio de mantenimiento de la cepa  
Bacto Lactobacilli MRS -agar (MRS -agar)  
Prepar ar 1 l de medio con 55 g de caldo Bacto Lactobacilli MRS + 15 g de agar bacteriológico, según las 
indicaciones de la etiqueta del caldo MRS + 1,5% de leche descremada (reconstituida al 10% en agua 
destilada). Repartir a razón de 6 ml en tubos (de preferenc ia con tapón de rosca), esterilizar y enfriar en 
posición vertical.  
Conservar en el refrigerador a 4°C.  
C.19.4.2 Mantenimiento de la cepa  
Inocular por punción Lactobacillus leichmannii en profundidad en el medio C.19.4.1 cada cuatro semanas, 
efectuando un cultivo intermedio de 18 h en el medio líquido C.19.4.3. Preparar el número de tubos 
necesarios para el análisis y guardar por lo menos dos tubos para el mantenimiento de la cepa.  
Incubar durante 18 h a 35°C.  
C.19.4.3 Medio de cultivo para el desarrollo de l microorganismo  
Caldo Micro Inoculum  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Preparar 1 l de solución según las indicaciones de la etiqueta y repartir a razón de 10 ml en tubos. Tapar 
los tubos con capuchones y esterilizar según las indicaciones del fabricante.  
Conservar en el refrigerador a 4° C. 
C.19.5 Preparación de soluciones  
C.19.5.1 Solución fisiológica  
Disolver 9 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos, 
taparlos con capuchones y esterilizar durante 15 min a 121°C.  
Conservar en el refrigerador a 4°C.  
C.19.5.2 Solución de ácido clorhídrico aproximadamente 1 N  
Bajo una campana de extracción diluir 82 ml de ácido clorhídrico al 37% llevándolos a un volumen de 1000 
ml con agua destilada, para ello vertir el ácido en el matraz aforado que ya contiene  agua.  
C.19.5.3 Solución de cianuro de sodio, 10 g /100 ml  
CUIDADO: VENENO. UTI LIZAR GUANTES.  
En un matraz aforado de 100 ml disolver 10 g de cianuro de sodio en agua destilada y llevar a volumen.  
Conservar en el refrigerador a 4°C  
C.19.5.4 Solución de cia nuro de sodio al 1%  
Justo antes del uso, tomar mediante una pipeta y una pera de goma, 1/ml de solución de cianuro de sodio 
(C.19.5.3) y diluir a 10 ml con agua destilada en un matraz aforado de 10 ml.  
Nota: La solución sobrante de cianuro de sodio al 1% d ebe destruirse mediante adición de solución de 
hipoclorito de sodio al 15% (aproximadamente 1 ml por 10 ml de solución de cianuro de sodio). Dejar 
reaccionar durante 2 días bajo una campana de extracción.  
C.19.5.5 Solución patrón  
Pesar exactamente 50,0 mg de vitamina B 12; disolver en agua destilada y llevar a volumen en un matraz 
aforado de vidrio de 500 ml. Verificar la concentración de la solución como sigue:  
Diluir 1 ml de solución con 3 ml de agua destilada. Medir la extinción de dicha solución en una c ubeta de  1 
cm a 360 nm.  
 
  
E = extinción leída  
f = contenido de vitamina B 12, en porcentaje  
Corregir la concentración de la solución proporcionalmente según el ejemplo:  
para f = 76  
  
Eliminar la solución si el valor de f es inferior a 70%  
Conservar esta s olución congelada en porciones de 5 ml en matraces actínicos durante máximo 6 meses.  
C.19.6 Procedimiento  
La vitamina B 12 es fotosensible. Por lo tanto, para todas las soluciones que contienen dicha vitamina se 
debe utilizar material de vidrio actínico o c ubrir el material de vidrio corriente con papel de aluminio o un  paño 
negro.  
C.19.6.1 Desarrollo del microorganismo  
Un día antes, subcultivar en 10 ml de caldo Micro Inoculum (C.19.4.3).  
Incubar durante 18 h a 35°C.  
Seis h antes de la inoculación del ensa yo, inocular 2 gotas (aproximadamente 0,1 ml) del último cultivo de 
18 h en otro tubo de 10 ml de caldo Micro Inoculum.  
Incubar durante 6 h a 35°C.  
C.19.6.2 Preparación de la toma de ensayo        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
En un matraz de 100 ml con esmerilado normalizado, pesar de 3 a 4 g de muestra homogénea, que 
contenga aproximadamente 100 ng de vitamina B 12. 
Disolver la toma de ensayo en 25 ml de agua destilada a 50°C. A fin de evitar la formación de grumos, 
añadir el agua destilada en pequeñas cantidades agitando cada vez.  
Añadir 0,2  ml de solución de cianuro de sodio (C.19.5.4) recién preparada (CUIDADO: VENENO) y agitar.  
Dejar la solución durante 30 min a temperatura ambiente, al abrigo de la luz y agitar de vez en cuando. Al 
cabo de este tiempo, ajustar el pH de 4,8 - 5 con solució n de ácido clorhídrico 1 N. A continuación calentar el 
matraz durante 35 min en un baño de agua en ebullición. Enfriar (*). Ajustar el pH a 4,6. Transvertir 
cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml y llevar a volumen con agua destilada. Filtrar a tr avés de un 
filtro plisado con velocidad de filtración media.  
* Para productos con almidón se recomienda aplicar un tratamiento enzimático a fin de obtener un filtrado 
límpido. Añadir a la solución la cantidad de diastasa equivalente al 10% de la toma de en sayo. Incubar 
durante 30 min a 42°C.  
Diluir el filtrado de modo que se obtenga una solución de aproximadamente 0,05 ng de vitamina B 12/ml. 
Nota: con cada nuevo lote de diastasa efectuar un ensayo en blanco.  
Tratar 3 g de diastasa como la toma de ensayo. El  contenido de vitamina B 12 de la diastasa no debe 
rebasar 0,5 µg/100 g.  
C.19.6.3 Solución patrón 0,05 ng/ml  
Justo antes del uso diluir la solución 19.5.5 como sigue:  
10 ml a 100 ml  
 
5 ml a 100 ml  
 
5 ml a 100 ml  
 
2 ml* a 100 ml = 0,05 ng/ml  
 
* + 0,2 ml de cianuro de sodio (CUIDADO VENENO)  
C.19.6.4 Medio de cultivo para el ensayo  
Medio para prueba de vitamina B 12 
Preparar el volumen necesario en un matraz Erlenmeyer de vidrio de 1000 ml. Proceder según las 
indicaciones de la etiqueta, calentando la soluci ón en una parrilla con agitación magnética.  
Cálculo del volumen necesario:  
patrón:  30 tubos 30 x 5 ml = 150 ml  
cada producto:  10 tubos 10 x 5 ml = 50 ml  
+ 50 ml a 100 ml de exceso  
 
C.19.6.5 Preparación del ensayo  
C.19.6.5.1 Serie patrón  
En un soporte m etálico para tubos de ensaye, colocar 3 filas de 10 tubos (180 x 18 mm), numerados bl, 
0,..., 8; el primero corresponde al blanco.  
Mediante una pipeta verter en triplicado en las tres series de tubos, volúmenes crecientes de la última 
dilución de la soluci ón patrón, completar a 5 ml con agua destilada y mediante una bureta o una jeringa 
automática, añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo según la tabla siguiente:  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Tubo No.: bl  0 1 2 3 4 5 6 7 8 
Solución patrón: 0,0   0,0  0,25  0,50  0,75  1,0  1,5  2,0  2,5  3,0 ml 
Agua: 5  5 4,75 4,5 4,25 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 ml 
Medio de cultivo:  5 ml en cada  tubo 
 
Los tubos del ensayo en blanco (bl) no se inoculan.  
C.19.6.5.2 Serie producto  
En otro soporte colocar dos filas de 10 tubos (180 x 18 mm). Los primeros c inco tubos de ambas filas van 
destinados a un producto, los otros cinco de ambas filas, a otro producto. Numerar de 9 a 13 y de 14 a 18, y 
así sucesivamente para todos los productos analizados.  
Mediante una pipeta verter en duplicado en ambas series de cin co tubos, volúmenes crecientes de la 
última dilución de la solución de la muestra, completar a 5 ml con agua destilada y añadir 5 ml de medio de 
cultivo para el ensayo.  
Tubo No.: 9  10 11 12 13 
Solución de la muestra: 0,25   0,50  0,75  1,0  1,50 ml 
Agua: 4,75 4,50 4,25 4,0 3,50 ml 
Medio de cultivo:  5 ml en cada  tubo 
 
Tapar los tubos con capuchones o mediante una tapa adecuada que cubra ambas filas de tubos en el 
soporte.  
C.19.6.6 Esterilización del ensayo  
Esterilizar los tubos durante 10 min a 115°C, lue go enfriarlos en un baño de agua fría.  
C.19.6.7 Inoculación  
C.19.6.7.1 Preparación y estandarización del inóculo  
Justo antes de inocular el ensayo, transvertir una cantidad suficiente del cultivo preparado bajo C.19.6.1 a 
un tubo de centrífuga estéril, cen trifugar a 2600 rpm durante 5 min, decantar y resuspender el paquete celular 
en 10 ml de solución salina. Hacer dos lavados más. Transvertir a una cubeta de 1 cm y efectuar la lectura en 
el espectrofotómetro a 575 nm. Estandarizar el cultivo a fin de obten er siempre aproximadamente la misma 
extinción. No debe olvidarse sustraer de la extinción del cultivo la del medio de ensayo, que es un medio 
coloreado.  
Según la extinción, diluir "n" gotas del cultivo (C.19.6.1) en un tubo que contenga 10 ml de medio 
(C.19.6.4). Este tubo es el inóculo.  
Así pues, para una extinción del cultivo (C.19.6.1) entre 1,10 y 1,25 (después de sustraer la extinción 
propia del medio), introducir 2 gotas de cultivo en el tubo que contiene 10 ml de medio (C.19.6.4). Si la 
extinción no se encuentra en la zona arriba mencionada, adaptar la dilución como sigue:  
-extinción inferior a 1,10: introducir proporcionalmente más gotas en el tubo (no más de 3 gotas)  
-extinción superior a 1,25: diluir proporcionalmente con el medio (C.19.6.4).  
 
19.6.7.2 Inoculación  
Mediante una micropipeta de punta estéril, inocular 0,1 ml del inóculo en cada tubo de las series patrón y 
producto. Los tubos del blanco (bl) no se inoculan.  
Después de inocular, agitar los tubos ligeramente a fin de repartir el microor ganismo uniformemente en  el 
medio.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
C.19.6.8 Incubación  
Incubar los tubos inoculados durante aproximadamente 14 h a 35°C. Obs ervar los tubos con regularidad al 
cabo de las 14 h. Verificar si la diferencia de desarrollo del microorganismo  es suficiente entre  la primera  y la 
última dilución de la solución patrón.  
Si es necesario, prolongar la incubación hasta que se obtenga un crecimiento óptimo del microorganismo.  
Después de la incubación se recomienda interrumpir el crecimiento del microorganismo simultáneam ente 
en todos los tubos, colocándolos en un baño de agua fría.  
C.19.6.9 Lecturas  
Mediante un agitador para tubos de ensaye, poner en suspensión el depósito formado por el desarrollo del 
microorganismo. Transvertir la suspensión a un tubo o una cubeta óptic a, según el fotómetro. Medir la 
transmitancia o absorbancia a 575 nm ajustando el 100% T o a 0% de A del aparato con el blanco (bl). *  
Agitar y leer un tubo después de otro, a fin de evitar la sedimentación del microorganismo.  
* Nota: Si la determinación s e hace en absorbancia buscar el equivalente de los valores de los ejemplos, 
dados en transmitancia.  
C.19.7 Cálculos  
C.19.7.1 Curva de calibración  
Trazar la curva de calibración en papel milimétrico o mediante una calculadora con regresión lineal, 
llevando la lectura media de cada grupo de tres tubos a la ordenada y los ng de vitamina B 12 a la abscisa.  
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml ng lecturas  media  
   1 2 3  
0 0,0 0,0 95,1 95,0 95,1 95,0 
1 0,25 0,0125  82,2 80,9 82,4 81,8 
2 0,50 0,025  67,5 67,0 66,1 66,9 
3 0,75 0,0375  55,0 56,5 57,5 56,3 
4 1,0 0,050  48,5 48,9 47,2 48,2 
5 1,5 0,075  37,1 37,8 36,8 37,2 
6 2,0 0,100  30,5 30,5 30,3 30,4 
7 2,5 0,125  25,4 23,2 24,4 24,3 
8 3,0 0,150  20,2 21,2 20,0 20,5 
 
Observaciones:  
La curva de calibración es característica de ca da vitamina. Es tanto mejor cuanto mayor sea la parte que 
ocupa de la escala de transmisión.  
Repetir el ensayo cuando la curva de crecimiento esté mal desarrollada, esto puede deberse a la cepa o al 
medio de cultivo para el ensayo; que deben verificarse po r separado.  
C.19.7.2 Contenido de vitamina en el producto  
La media de las lecturas de cada par de tubos permite leer en la curva de calibración la cantidad de 
vitamina y calcular su concentración en la última dilución de la muestra.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml lecturas  media  ng* ng/ml  
  1 2    
9 0,25 (93) 81,8 81,8 0,0131  0,0524  
10 0,50 66,1 65,3 65,7 0,0263  0,0526  
11 0,75 54,8 56,8 55,8 0,038  0,0507  
12 1,00 48,5 48,1 48,3 0,049  0,0490  
13 1,50 37,0 38,0 37,5 0,077  0,0513  
 Media  0,0512(=C)  
( ) = valor aberra nte 
* = valores leídos en la curva de calibración  
Observación:  
Fluctuaciones pequeñas en los valores de la última columna son prueba de un buen ensayo.  
Calcular el contenido de vitamina en µg/100 g de producto, teniendo en cuenta las diluciones sucesivas y  
la concentración en la muestra diluida.  
El contenido de vitamina B 12, expresado en µg/100 g de producto es igual a:  
 
  
 
C= media de las concentraciones leídas en la curva de calibración, en ng/ml  
V1= volumen en el que se ha disuelto la toma de ensayo, en  ml 
V2= parte alícuota de V 1, en ml  
V3= volumen al que se ha diluido la parte alícuota V 2, en ml  
m= toma de ensayo, en g  
 
Ejemplo:  
2,046 g (m) de producto se han pesado en un matraz aforado de 100 ml (V 1). Se ha tomado una parte 
alícuota de 20 ml (V 2), que se ha diluido en un matraz aforado de 100 ml (V 3). 
La media de las concentraciones en vitamina B 12 leídas en la curva de calibración es 0,0512 ng/ml (C).  
El contenido en vitamina B 12 es: 
 
C.20. DETERMINACI ON DE BIOTINA  
Método microbiológico  
C.20.1 Fundamento  
Este método permite cuantificar concentraciones desconocidas de biotina utilizando Lactobacillus 
plantarum  ATCC 8014, microorganismo que no puede sintetizar esta vitamina, relacionando directamente el 
crecimiento celular con la concentración de bi otina presente. Para preparar la muestra y la curva estándar se 
utiliza un medio libre de biotina y el crecimiento celular se cuantifica turbidimétricamente. Por interpolación en 
la curva se determina la concentración de la muestra.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
C.20.2 Reactivos y mate riales  
C.20.2.1 Reactivos  
D (+) - Biotina para fines bioquímicos  
Acido sulfúrico 95 -97% para análisis  
Hidróxido de sodio en lentejas para análisis  
Cristales de cloruro de sodio para análisis  
Alcohol etílico absoluto  
C.20.2.2 Material  
Micropipeta  
Material c omún de laboratorio  
C.20.3 Aparatos e instrumentos  
Centrífuga  
Autoclave  
Incubadora a 35°C ± 1°C  
Espectrofotómetro  
C.20.4 Cepa y medios de cultivo  
Lactobacillus plantarum ATCC 8014  
Leche descremada en polvo grado reactivo  
Caldo micro inoculum  
Agar bacteriol ógico  
Caldo Bacto Lactobacilli MR S (MRS -agar)  
Medio de prueba para biotina  
C.20.4.1 Medio de mantenimiento de la cepa  
Bacto Lactobacilli MRS -agar (MRS -agar)  
Preparar 1 l de medio con 55 g de caldo Bacto Lactobacilli MRS + 15 g de agar bacteriológico, según  las 
indicaciones de la etiqueta del caldo MRS + 1,5% de leche descremada (reconstituida al 10% en agua 
destilada). Repartir a razón de 6 ml en tubos (de preferencia con tapón de rosca), esterilizar y enfriar en 
posición vertical.  
Conservar en el refrigera dor a 4°C.  
C.20.4.2 Mantenimiento de la cepa  
Inocular por punción Lactobacillus plantarum en profundidad en el medio C.20.4.1 cada cuatro semanas, 
efectuar un cultivo intermedio de 18 h en el medio líquido C.20.4.3. Preparar el número de tubos necesarios 
para el análisis y guardar por lo menos dos tubos para el mantenimiento de la cepa.  
Incubar durante 18 h a 35°C.  
C.20.4.3 Medio de cultivo para el desarrollo del microorganismo  
Caldo Micro Inoculum  
Preparar 1 l de solución según las indicaciones de la etiqu eta y repartir a razón de 10 ml en tubos. Tapar 
los tubos con capuchones y esterilizar según las indicaciones del fabricante.  
Conservar en el refrigerador a 4°C.  
C.20.5 Preparación de soluciones  
C.20.5.1. Solución fisiológica  
Disolver 9 g de cloruro de sod io en 1000 ml de agua destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos, 
taparlos con capuchones y esterilizar durante 15 min a 121°C.  
Conservar en el refrigerador a 4°C.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
C.20.5.2  Solución de acido sulfúrico aproximadamente 3 N  
Disolver 85 ml de ácido sulfúric o 95 - 97% a 1000 ml con agua destilada. Para ello verter al ácido con 
PRECAUCION en el matraz aforado que ya contiene agua. Enfriar el matraz durante la operación. Llevar a 
volumen.  
C.20.5.3 Solución de Hidróxido de sodio, 60 g/100 ml  
Disolver 300 g de hi dróxido de sodio en agua destilada, enfriando bajo el agua del grifo. Completar a 500 
ml en una probeta graduada. Conservar en un frasco con tapón de polietileno o de goma.  
C.20.5.4 Solución de Hidróxido de sodio aproximadamente 1 N  
Disolver 20 g de hidróx ido de sodio en agua destilada y llevar a volumen en un matraz aforado de 500 ml 
con tapón de polietileno.  
C.20.5.5 Solución patrón  
Pesar exactamente 50,0 mg de biotina; disolver en  una mezcla 1:1 agua destilada/ alcohol etílico y llevar a 
volumen en un mat raz aforado de 500 ml. Conservar esta solución en un frasco actínico a 4°C durante 
máximo 6 meses.  
20.6 Procedimiento  
20.6.1 Desarrollo del microorganismo  
Un día antes, subcultivar en 10 ml de caldo Micro Inoculum.  
Incubar durante 18 h a 35°C.  
Seis h antes  de la inoculación del ensayo, inocular 2 gotas (aproximadamente 0,1 ml) del último cultivo de 
18 h en otro tubo de 10 ml de caldo Micro Inoculum.  
Incubar durante 6 h a 35°C.  
C.20.6.2 Preparación de la toma de ensayo  
En un matraz Erlenmeyer de 150 ml, pesa r de 1 a 2 g de muestra homogénea, que contenga 
aproximadamente 1 µg de vitamina, añadir 50 ml de ácido sulfúrico 3 N y dispersar bien el producto. A fin de 
evitar la formación de grumos, añadir el ácido en pequeñas cantidades pasando el matraz Erlenmeyer bajo el 
grifo de agua caliente después de cada adición.  
Cubrir el matraz con papel de aluminio y colocarlo en el autoclave durante 1 h a 120°C. Enfriar.  
Ajustar el pH a 4,6 añadiendo primero aproximadamnete 3 ml de hidróxido de sodio de 60 g/100 ml 
mientra s se enfría el matraz Erlenmeyer, y luego hidróxido de sodio 1 N. Transvertir cuantitativamente a un 
matraz aforado de 250 o 300 ml y llevar a volumen con agua destilada. Filtrar a través de un filtro plisado con 
velocidad de filtración media.  
Diluir el fi ltrado de modo que se obtenga una solución de aproximadamente 0,2 ng de vitamina por ml.  
C.20.6.3 Solución patrón, 0,2 ng/ml  
Justo antes del uso diluir la solución 20.5.5 como sigue:  
1 ml a 100 ml  
 
1 ml a 100 ml  
 
2 ml a 100 ml = 0,2 ng/ml  
 
C.20.6.4 Medi o de cultivo para el ensayo  
Medio de prueba para biotina  
Preparar el volumen necesario en un matraz Erlenmeyer de vidrio de material actínico de 1000 ml. 
Proceder según las indicaciones de la etiqueta, calentando la solución en una parrilla con agitación m agnética.  
Cálculo del volumen necesario:  
patrón:  30 tubos 30 x 5 ml = 150 ml  
cada producto:  10 tubos 10 x 5 ml = 50 ml  
+ 50 a 100 ml de exceso  
       (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
C.20.6.5 Preparación del ensayo  
C.20.6.5.1 Serie patrón  
En un soporte metálico para tubos de ensaye, colocar tres filas de 10 tubos (180 x 18 mm), numerados bl, 
0, ..., 8; el primero corresponde al blanco (bl).  
Mediante una pipeta verter en triplicado en las tres series de tubos, volúmenes crecientes de la última 
dilución de la solución patrón, completar a 5 ml c on agua destilada y mediante una bureta o una jeringa 
automática, añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo según la tabla siguiente:  
Tubo No.: bl  0 1 2 3 4 5 6 7 8 
Solución patrón: 0,0   0,0  0,25  0,50  0,75  1,0  1,5  2,0  2,5  3,0 ml  
Agua: 5  5 4,75 4,5 4,25 4,0 3,5 3,5 2,0 2,0 ml  
Medio de cultivo:  5 ml en cada  tubo 
 
Los tubos del ensayo en blanco (bl) no se inoculan.  
C.20.6.5.2 Serie producto  
En otro soporte colocar dos filas de 10 tubos (180 x 18 mm). Los primeros cinco tubos de ambas filas va n 
destinados a un producto, los otros cinco de ambas filas, a otro producto. Numerar de 9 a 13 y de 14 a 18, y 
así sucesivamente para todos los productos analizados.  
Mediante un pipeta verter en duplicado en ambas series de cinco tubos, volúmenes creciente s de la última 
dilución de la solución de la muestra, completar a 5 ml con agua destilada y añadir 5 ml de medio de cultivo 
para el ensayo.  
Tubo No.: 9  10 11 12 13 
Solución de la muestra: 0,25   0,50  0,75  1,0  1,50 ml  
Agua: 4,75  4,50 4,25 4,0 3,50 ml  
Medio de cultivo:  5 ml en cada  tubo 
 
Tapar los tubos con capuchones o mediante una tapa adecuada que cubra ambas filas de tubos en el 
soporte.  
C.20.6.6 Esterilización del ensayo  
Esterilizar los tubos durante 15 min a 115°C, luego enfriarlos en un baño de a gua fría.  
C.20.6.7 Inoculación  
C.20.6.7.1  Preparación y estandarización del inóculo  
Justo antes de inocular el ensayo, transvertir una cantidad suficiente del cultivo preparado bajo C.20.6.1 a 
un tubo de centrífuga estéril, centrifugar a 2600 rpm durante 5  min, decantar y resuspender el paquete celular 
en 10 ml de solución salina. Hacer dos lavados más. Transvertir a una cubeta de 1 cm y efectuar la lectura en 
el espectrofotómetro a 575 nm. Estandarizar el cultivo a fin de obtener siempre aproximadamente la  misma 
extinción. No debe olvidarse sustraer de la extinción del cultivo la del medio de ensayo, que es un medio 
coloreado.  
Según la extinción, diluir "n" gotas del cultivo (C.20.6.1) en un tubo que contenga 10 ml de medio 
(C.20.6.4). Este tubo es el inócu lo. 
Así pues, para una extinción del cultivo (C.20.6.1) entre 0.2 y 0,4 (después de sustraer la extinción propia 
del medio), introducir de 4 a 8 gotas de cultivo en el tubo que contiene 10 ml de medio (C.20.6.4). Si la 
extinción no se encuentra en la zona arriba mencionada, adaptar la dilución como sigue:  
- extinción inferior a 0,2: introducir proporcionalmente más gotas en el tubo (no más de 10 gotas).  
- extinción superior a 0,4: introducir menos gotas o diluir proporcionalmente con el medio (20.6.4)  
 Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
C.20.6.7.2  Inoculación  
Mediante una micropipeta con punta estéril, inocular 0,1 ml del inóculo en cada tubo de las series patrón y 
producto. Los tubos del blanco (bl) no se inoculan.  
Después de inocular, agitar los tubos ligeramente a fin de repartir el micr oorganismo uniformemente en  el 
medio.  
C.20.6.8  Incubación  
Incubar los tubos inoculados durante aproximadamente 18 h a 35°C. Observar los tubos con regularidad al 
cabo de las 18 h. Verificar si la diferencia de desarrollo del microorganismo  es suficiente en tre la primera  y la 
última dilución de la solución patrón.  
Si es necesario, prolongar la incubación hasta que se obtenga un crecimiento óptimo del microorganismo.  
Después de la incubación se recomienda interrumpir el crecimiento del microorganismo simultán eamente 
en todos los tubos, colocándolos en un baño de agua fría.  
C.20.6.9 Lecturas  
Mediante un agitador para tubos de ensaye, poner en suspensión el depósito formado por el desarrollo del 
microorganismo. Transvertir la suspensión a un tubo o una cubeta óp tica, según el fotómetro. Medir la 
transmitancia o absorbancia a 575 nm ajustando el 100% de T o a 0% de A del aparato con el blanco (bl).*  
Agitar y leer un tubo después de otro, a fin de evitar la sedimentación del microorganismo.  
* Nota:  Si la determinac ión se hace en absorbancia buscar el equivalente de los valores de los ejemplos, 
dados en transmitancia.  
C.20.7 Cálculos  
C.20.7.1 Curva de calibración  
Trazar la curva de calibración en papel milimétrico o utilizar una calculadora con regresión lineal, llev ando 
la lectura media de cada grupo de tres tubos a la ordenada y los ng de vitamina a la abscisa.  
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml ng lecturas  media  
   1 2 3  
0 0,0 0,0 96,6 96,5 96,8 96,6 
1 0,25 0,05 89,9 89,1 90,1 89,7 
2 0,50 0,10 80,9 82,0 82,1 81,7 
3 0,75 0,15 75,1 74,8 74,9 74,9 
4 1,0 0,20 69,0 68,1 68,9 68,7 
5 1,5 0,30 59,9 59,0 58,9 59,3 
6 2,0 0,40 51,8 51,8 51,2 51,6 
7 2,5 0,50 46,0 45,7 45,1 45,6 
8 3,0 0,60 41,5 40,5 40,0 40,7 
 
Observaciones:  
La curva de calibración es característica de cada vitami na. Es mejor cuanto mayor sea la parte que ocupa 
de la escala de transmisión.  
Repetir el ensayo cuando la curva de crecimiento esté mal desarrollada; esto puede deberse a la cepa o al 
medio de cultivo para el ensayo; que deben verificarse por separado.  
C.20.7.2 Contenido de vitamina en el producto  
La media de las lecturas de cada par de tubos permite leer en la curva de calibración la cantidad de 
vitamina y calcular su concentración en la última dilución de la muestra.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml lecturas  media  ng* ng/ml  
  1 2    
9 0,25 (82) 87,5 87,5 0,065  0,26 
10 0,50 80,2 78,2 79,2 0,120  0,24 
11 0,75 71,8 72,6 72,2 0,175  0,23 
12 1,00 64,7 66,1 65,4 0,235  0,24 
13 1,50 54,1 53,8 53,9 0,370  0,25 
 Media  0,244 =(C)  
( ) = valor aberrante  
 * = valores leídos en la curva de calibración  
Observación:  
Fluctuaciones pequeñas de los valores de la última columna son prueba de un buen ensayo.  
Calcular el contenido de vitamina en µg/100 g de producto, teniendo en cuenta las diluciones sucesivas y 
la concentración en la mu estra diluida.  
El contenido en vitamina, expresado en µg de biotina/100 g de producto es igual a:  
 
  
Donde:  
C= media de las concentraciones leídas en la curva de calibración, en ng/ml  
V1= volumen en el que se ha disuelto la toma de ensayo, en ml  
V2= parte alícuota de V 1 en ml  
V3= volumen al que se ha diluido la parte alícuota V 2, en ml  
m = toma de ensayo, en g  
 
Ejemplo:  
1,032 g (m) de producto se han pesado en un matraz aforado de 250 ml (V 1). Se ha tomado una parte 
alícuota de 20 ml (V 2), que se ha di luido en un matraz aforado de 100 ml (V 3). 
La media de las concentraciones de biotina leídas en la curva de calibración es 0,244 ng/ml (C).  
El contenido en vitamina es:  
 
  
C.21. DETERMINACI ON DE VITAMINA B 6 (PIRIDOXINA)  
Método microbiológico  
C.21.1 Fundame nto 
Este método permite cuantificar concentraciones desconocidas de vitamina B 6 utilizando Saccharomyces 
carlsbergensis ATCC 9080, microorganismo que no puede sintetizar esta vitamina, relacionando directamente 
el crecimiento celular con la concentración d e Piridoxina. Para preparar la muestra y la curva estándar se Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
utiliza un medio libre de Piridoxina y el crecimiento celular se cuantifica turbidimétricamente. Por interpolación 
en la curva se determina la concentración de la muestra.  
C.21.2 Reactivos y mat eriales  
C.21.2.1 Reactivos  
Clorhidrato de Piridoxina para fines bioquímicos  
Acido clorhídrico fumante al 37% para análisis  
Hidróxido de sodio en lentejas para análisis  
Cristales de cloruro de sodio para análisis  
Acetato de sodio trihidratado para análisis  
C.21.2.2 Materiales  
Micropipeta  
Matraz Erlenmeyer de vidrio de 250 ml  
Matraz aforado de vidrio de 100, 250 y 500 ml  
Tapón de vidrio  
Frascos con cápsula de polietileno a presión  
Material común de laboratorio  
Todo el material de vidrio debe ser actínico o fo rrado con aluminio.  
C.21.3 Aparatos e instrumentos  
Autoclave  
Incubadora a 30°C ± 1°C  
Espectrofotómetro  
Centrífuga  
C.21.4 Cepa y medios de cultivo  
Saccharomyces carlsbergensis ATCC 9080  
Agar de micro ensayo  
Medio de prueba para Piridoxina  
C.21.4.1 Medio de mantenimiento de la cepa  
Agar de microensayo  
Preparar 1 l de medio según las indicaciones de la etiqueta. Repartir a razón de 6 ml en tubos (de 
preferencia con tapón de rosca), esterilizar y enfriar en posición inclinada, a fin de obtener una pendiente lo 
más larga posible (agar inclinado).  
Conservar en el refrigerador a 4°C.  
C.21.4.2  Mantenimiento de la cepa  
Inocular por estría Saccharomyces carlsbergensis ATCC 9080 en superficie en el medio C.21.4.1 cada dos 
semanas. Preparar el número de tubos necesarios  para el análisis y guardar por lo menos dos tubos para el 
mantenimiento de la cepa.  
Incubar durante 24 h a 30°C.  
C.21.4.3 Medio de cultivo para el desarrollo del microorganismo  
Piridoxina y medio para prueba, solución 1:1, enriquecida con 1 ng de vitamina  B6/ml.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Diluir 1 ml de solución patrón C.21.5.7 a 100 ml. Añadir 1 ml de esta dilución a 500 ml de medio de cultivo 
C.21.6.4 y completar a 1 l con agua destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos. Tapar los tubos con 
capuchones y esterilizar según las in dicaciones del fabricante.  
Conservar en el refrigerador a 4°C.  
C.21.5  Preparación de soluciones  
C.21.5.1 Solución fisiológica  
Disolver 9 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos, 
taparlos con capuchones y ester ilizar durante 15 min a 121°C.  
Conservar en el refrigerador a 4°C.  
C.21.5.2 Solución de ácido clorhídrico aproximadamente 0,44 N  
Bajo una campana de extracción diluir 36,5 ml de ácido clorhídrico al 37% a 100 ml con agua destilada. 
Para ello verter el ácid o en el matraz aforado que ya contiene agua.  
C.21.5.3 Solución de ácido clorhídrico aproximadamente 0,055 N  
Bajo una campana de extracción diluir 4,5 ml de ácido clorhídrico al 37% a 1000 ml con agua destilada. 
Para ello verter el ácido en el matraz aforad o que ya contiene agua.  
C.21.5.4 Solución de hidróxido de sodio, 60 g/100 ml  
Disolver 300 g de hidróxido de sodio en agua destilada, enfriando bajo agua del grifo. Completar a 500 ml 
en una probeta graduada. Conservar en un frasco con tapón de polietileno o de goma.  
C.21.5.5 Solución de hidróxido de sodio aproximadamente 1 N  
Disolver 20 g de hidróxido de sodio en agua destilada y llevar a volumen en un matraz aforado de 500 ml 
con tapón de polietileno.  
C.21.5.6 Solución de acetato de sodio aproximadamente 2 ,5 M 
En un matraz aforado de 500 ml disolver 170 g de acetato de sodio trihidratado en agua destilada y llevar 
a volumen.  
C.21.5.7 Solución patrón  
Pesar exactamente 50,0 mg de piridoxina; disolver en agua destilada y llevar a volumen en un matraz 
aforado d e 500 ml. Conservar esta solución congelada en fracciones de 5 ml durante máximo 6 meses.  
C.21.6  Procedimiento  
La vitamina B 6 es fotosensible. Por lo tanto, para todas las soluciones que contienen dicha vitamina se 
debe utilizar material actínico o cubrir el material de vidrio corriente con papel de aluminio o paño negro.  
C.21.6.1 Desarrollo del microorganismo  
Tres días antes de la inoculación del ensayo, efectuar dos cultivos sucesivos de 24 horas en superficies de 
agar. Un día antes del ensayo, subcultiva r el microorganismo tomado del último cultivo sobre agar, en un tubo 
del medio líquido C.21.4.3.  
Incubar durante 24 h a 30°C.  
C.C.21.6.2 Preparación de la toma de ensayo  
En un matraz Erlenmeyer de 250 ml, pesar de 1 a 2 g de muestra homogénea, que contenga  por lo menos 
2 µg de vitamina. Poner en suspensión en 180 ml de:  
Solución de ácido clorhídrico 0,44 N si el producto contiene almidón.  
Solución de ácido clorhídrico 0,055 N si el producto no contiene almidón.  
Cubrir el matraz con papel de aluminio y coloc arlo en el autoclave durante 1 h a 125°C. Enfriar.  
Después de enfriar añadir:  
3 ml de solución de hidróxido de sodio (C.21.5.4) si el producto contiene almidón.  
8 ml de solución de acetato de sodio (C.21.5.6) si el producto no contiene almidón.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Ajustar el pH a 4,6 con solución de hidróxido de sodio 1 N. Transvertir cuantitativamente a un matraz 
aforado de 250 ml y llevar a volumen con agua destilada. Filtrar a través de un filtro plisado con velocidad de 
filtración media.  
Diluir el filtrado de modo que se o btenga una solución de aproximadamente 5 ng de vitamina por ml.  
C.21.6.3 Solución patrón, 5 ng/ml  
Justo antes del uso diluir la solución 9.5.7 como sigue:  
5 ml a 100 ml  
 
5 ml a 100 ml  
 
5 ml a 250 ml = 5 ng/ml  
 
C.21.6.4 Medio de cultivo para el ensayo  
Medio Y para prueba de piridoxina  
Preparar el volumen necesario en un matraz Erlenmeyer de vidrio de 1000 ml. Proceder según las 
indicaciones de la etiqueta, calentando la solución en una parrilla con agitación magnética.  
Cálculo del volumen necesario:  
patró n: 30 tubos 30 x 5 ml = 150 ml  
cada producto:  10 tubos 10 x 5 ml = 50 ml  
+ 50 a 100 ml de exceso  
 
C.21.6.5  Preparación del ensayo  
C.21.6.5.1 Serie patrón  
En un soporte metálico para tubos de ensayo, colocar tres filas de 10 tubos (180 x 18 mm), numerado s bl, 
0, ..., 8; el primero corresponde al blanco (bl).  
Mediante una pipeta verter en triplicado en las tres series de tubos, volúmenes crecientes de la última 
dilución de la solución patrón, completar a 5 ml con agua destilada y mediante una bureta o una jeringa 
automática, añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo según la tabla siguiente:  
Tubo No.: bl  0 1 2 3 4 5 6 7 8 
Solución 
patrón: 0,0   0,0  0,25  0,50  0,75  1,0  1,5  2,0  2,5  3,0 ml  
Agua: 5  5 4,75 4,5 4,25 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 ml  
Medio de  
cultivo:  5 ml en cada tubo   
 
Los tubos del ensayo en blanco (bl) no se inoculan.  
C.21.6.5.2 Serie producto  
En otro soporte colocar dos filas de 10 tubos (180 x 18 mm). Los primeros cinco tubos de ambas filas van 
destinados a un producto, los otros cinco  de ambas filas, a otro producto. Numerar de 9 a 13 y de 14 a 18 y 
así sucesivamente para todos los productos analizados.  
Mediante un pipeta verter en duplicado en ambas series de cinco tubos, volúmenes crecientes de la última 
dilución de la solución de la  muestra, completar a 5 ml con agua destilada y añadir 5 ml de medio de cultivo 
para el ensayo.  
Tubo No.: 9  10 11 12 13       (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Solución de la muestra: 0,25   0,50  0,75  1,0  1,50 ml  
Agua: 4,75  4,50 4,25 4,0 3,50 ml  
Medio de cultivo:  5 ml en cada  tubo 
Tapar lo s tubos con capuchones o mediante una tapa adecuada que cubra ambas filas de tubos en el soporte.  
C.21.6.6 Esterilización del ensayo  
Esterilizar los tubos durante 10 min a 115°C, luego enfriarlos en un baño de agua fría.  
C.21.6.7 Inoculación  
C.21.6.7.1 Preparación y estandarización del inóculo  
Justo antes de inocular el ensayo, transvertir una cantidad suficiente del cultivo preparado bajo C.21.4.1 a 
un tubo de centrífuga estéril, centrifugar a 1000 rpm durante 2 min. Decantar la solución y lavar el sedimen to 3 
veces con 10 ml de solución fisiológica estéril, centrifugando y decantando la solución después de cada 
lavado.  
Suspender el sedimento en 5 ml de solución fisiológica. Diluir de 3 a 4 gotas de esta suspensión en un 
tubo que contenga 10 ml de solución fisiológica. Este tubo es el inóculo.  
C.21.6.7.2 Inoculación  
Mediante una micropipeta con punta estéril, inocular 0,1 ml del inóculo en cada tubo de las series patrón y 
producto. Los tubos del blanco (bl) no se inoculan.  
Después de inocular, agitar los tub os ligeramente a fin de repartir el microorganismo uniformemente en  el 
medio.  
C.21.6.8 Incubación  
Incubar los tubos inoculados durante aproximadamente 19 h a 30°C. Dado que Saccharomyces 
carlsbergensis  es aerobio, inclinar los tubos al máximo a fin de que la superficie de contacto entre el líquido y 
el aire sea la mayor posible.  
Verificar si la diferencia de desarrollo del microorganismo es suficiente entre la primera y la última dilución 
de la solución patrón.  
Si es necesario, prolongar la incubación hasta  que se obtenga un crecimiento óptimo del microorganismo.  
Después de la incubación se recomienda interrumpir el crecimiento del microorganismo simultáneamente 
en todos los tubos, colocándolos en un baño de agua fría.  
C.21.6.9 Lecturas  
Mediante un agitador para tubos de ensaye, poner en suspensión el depósito formado por el desarrollo del 
microorganismo. Transvertir la suspensión a un tubo o una cubeta óptica, según el fotómetro. Medir la 
transmitancia o absorbancia a 575 nm ajustando el 100% de T o a 0% de A del aparato con el blanco (bl).*  
Agitar y leer un tubo después de otro, a fin de evitar la sedimentación del microorganismo.  
* Nota: Si la determinación se hace en absorbancia buscar el equivalente de los valores de los ejemplos, 
dados en transmitancia.  
C.21.7 Cálculos  
C.21.7.1 Curva de calibración  
Trazar la curva de calibración en papel milimétrico o utilizar una calculadora con regresión lineal, llevando 
la lectura media de cada grupo de tres tubos a la ordenada y los ng de vitamina a la abscisa.  
Ejempl o: 
Tubo 
No. ml ng lecturas  media  
   1 2 3  
0 0,0 0,0 91,2 90,6 90,5 90,7 
1 0,25 1,25 70,4 70,0 70,2 70,2 
2 0,50 2,5 51,5 54,6 55,5 53,9 
3 0,75 3,75 42,2 44,4 44,5 43,7 
4 1,0 5,0 33,8 33,2 34,5 33,8 Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
5 1,5 7,5 23,2 24,3 26,0 24,5 
6 2,0 10,0 20,0 18,5 19,2 19,2 
7 2,5 12,5 15,1 15,2 15,7 15,3 
8 3,0 15,0 14,2 13,2 13,2 13,5 
 
Observaciones:  
La curva de calibración es característica de cada vitamina. Es mejor cuanto mayor sea la parte que ocupa 
de la escala de transmisión.  
Repetir el ensayo cuando la cu rva de crecimiento esté mal desarrollada, esto puede deberse a la cepa o al 
medio de cultivo para el ensayo; que deben verificarse por separado.  
C.21.7.2 Contenido de vitamina en el producto  
La media de las lecturas de cada par de tubos permite leer en la curva de calibración la cantidad de 
vitamina y calcular su concentración en la última dilución de la muestra.  
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml lecturas  media  ng* ng/ml  
  1 2    
9 0,25 (80) 68,3 68,3 1,20 4,78 
10 0,50 51,5 54,5 53,0 2,435  4,85 
11 0,75 43,5 41,1 42,3 3,615  4,81 
12 1,00 34,9 33,7 34,3 4,95 4,95 
13 1,50 23,9 25,1 24,5 7,47 4,987  
 Media  4,87 =(C)  
( ) = valor aberrante  
 * = valores leídos en la curva de calibración  
Observación:  
Fluctuaciones pequeñas en los valores de la última columna son prueba de u n buen ensayo.  
Calcular el contenido de vitamina en mg/100 g de producto, teniendo en cuenta las diluciones sucesivas y 
la concentración en la muestra diluida.  
El contenido de vitamina, expresado en mg de clorhidrato de piridoxina por 100 g de producto es igual a:  
 
  
Donde:  
C= media de las concentraciones leídas en la curva de calibración, en ng/ml  
V1= volumen en el que se ha disuelto la toma de ensayo, en ml  
V2= parte alícuota de V 1 en ml  
V3= volumen al que se ha diluido la parte alícuota V 2, en ml  
m = toma de ensayo, en g  
 
Ejemplo:        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
2,032 g (m) de producto se han pesado en un matraz aforado de 250 ml (V 1). Se ha tomado una parte 
alícuota de 10 ml (V 2), que se ha diluido en un matraz aforado de 100 ml (V 3). 
La media de las concentraciones de piridoxina leídas en la curva de calibración es 4,87 ng/ml (C).  
El contenido de vitamina es:  
 
C.22. DETERMINACI ON DE INOSITOL  
Método microbiológico  
C.22.1 Fundamento  
Este método permite cuantificar Inositol utilizando Saccharomyces carlsbergensis ATCC 9080, 
microorg anismo que no es capaz de sintetizar inositol, relacionando directamente el crecimiento celular con la 
concentración de Inositol presente. Para preparar la muestra y la curva estándar se utiliza un medio comercial 
basal libre de Inositol. El crecimiento ce lular se mide turbidimétricamente y por interpolación en la curva se 
determina la concentración de la muestra.  
C.22.2 Reactivos y materiales  
C. C.22.2.1 Reactivos  
myo-inositol para fines bioquímicos  
Acido clorhídrico fumante al 37% para análisis  
Hidróxido de sodio en lentejas para análisis  
Cristales de cloruro de sodio para análisis  
Metanol para análisis  
- amilasa pancreática 25 U/mg  
Fosfatasa  
Lactosa monohidratada  
C.22.2.2 Materiales  
Micropipetas  
Material común de laboratorio  
C.22.3 Aparatos e instrumentos  
Autoclave  
Incubadora a 35°C ± 1°C  
Espectrofotómetro  
Centrífuga  
Termorreactor  
C.22.4 Cepa y medios de cultivo  
Saccharomyces carlsbergensis ATCC 9080  
Medio para la prueba de Inositol modificado. Por cada 100 ml agregar (NH 4) SO4: 1,5 g, Ascorbato de 
sodio: 25 g, ZnSO 4 7H2O: 15 mg, CuSO 4: 15 mg, NaMoO 4.2H2O:15 mg, Nitrato de tiamina: 0,5 mg, 
Nicotinamida: 5 mg, Lactosa: 23,45 g.  
Agar de microensayo  
C.22.4.1 Medio de mantenimiento de la cepa  
Agar de microensayo (Micro Assay)  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Prep arar 1 l de medio según las indicaciones de la etiqueta. Repartir a razón de 6 ml en tubos (de 
preferencia con tapón de rosca), esterilizar y enfriar en posición inclinada, a fin de obtener una pendiente lo 
más larga posible (agar inclinado).  
Conservar en el refrigerador a 4°C.  
C.22.4.2 Mantenimiento de la cepa  
Inocular por estría  Saccharomyces carlsbergensis en superficie en el medio C.22.4.1 cada dos semanas. 
Preparar el número de tubos necesarios para el análisis y guardar por lo menos dos tubos para el 
mantenimiento de la cepa.  
Incubar durante 24 h a 30°C.  
C.22.5 Preparación de soluciones  
C.22.5.1 Solución fisiológica  
Disolver 9 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos, 
taparlos con capuchones y esterilizar d urante 15 min a 121°C.  
Conservar en el refrigerador a 4°C.  
C.22.5.2 Solución de ácido clorhídrico aproximadamente 3 N  
Bajo una campana de extracción vertir en un matraz aforado de 1000 ml que ya contenga agua destilada, 
250 ml de ácido clorhídrico al 37% y  llevar a volumen.  
2 C.2.5.3 Solución de ácido clorhídrico - metanol 1:1  
En una probeta graduada de 500 ml, mezclar 250 ml de metanol con 250 ml de ácido clorhídrico 3 N  
C.22.5.4 Solución de hidróxido de sodio, 60 g/100 ml  
En una probeta graduada de 500 ml , disolver 300 g de hidróxido de sodio en agua destilada, enfriando 
bajo el agua del grifo. Completar a 500 ml. Conservar en un matraz con tapón de polietileno o de goma.  
C.22.5.5 Solución de hidróxido de sodio aproximadamente 1 N  
En un matraz aforado de 5 00 ml con tapón de polietileno, disolver 20 g de hidróxido de sodio en agua 
destilada y llevar a volumen.  
C.22.5.6 Solución patrón  
Justo antes del uso, pesar exactamente 25,0 mg de Inositol. Disolver en agua destilada y llevar a volumen 
en un matraz aforad o de 250 ml.  
C.22.5.7 Mezcla de enzimas para hidrólisis  
En un mortero, mezclar 0,50 g de -amilasa pancreática de aproximadamente 25 unidades/mg y 0,10 g de 
fosfatasa con 9,4 g de lactosa monohidratada.  
C.22.6 Procedimiento  
C.22.6.1 Desarrollo del microorganismo  
Tres días antes de la inoculación del ensayo, efectuar tres cultivos sucesivos de 24 h en superficie de agar.  
Incubar durante 24 h a 30°C.  
C.22.6.2 Preparación de la toma de ensayo e hidrólisis  
En un matraz aforado de 5 0 ml, pesar 5 g de muestra para ensayo. Añadir aproximadamente 40 ml de 
agua destilada a 50°C, luego agitar hasta obtención de una suspensión homogénea. Enfriar y llevar a volumen 
con agua.  
De cada muestra tomar una parte alícuota de 10 ml que contenga apr oximadamente 0,2 a 0,3 mg de 
inositol e introducir en un tubo de hidrólisis. En cada tubo añadir 100 mg de mezcla de enzimas C.22.5.7, 
cubrir con papel de aluminio e incubar durante 15 min a 42°C. A continuación añadir 20 mg de papaína e 
incubar otros 15 m in a la misma temperatura.  
Luego introducir en cada tubo 15 ml de solución de hidrólisis (C.22.5.3) y tres perlas de vidrio.  
Conectar los refrigerantes, luego calentar a reflujo a 110°C durante 6 h. Dejar enfriar.  
Nota:        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Los hidrolizados pueden conservarse una noche.  
Transvertir cuantitativamente el contenido de los tubos a matraces Erlenmeyer de 250 ml. Llevar el pH a 
5,2 con solución de hidróxido de sodio de 60 g/100 ml, luego con solución de NaOH 1 N. A continuación 
transvertir cuantitativamente a matrace s aforados de 100 o 150 ml. Llevar a volumen con agua destilada.  
Filtrar sobre papel filtro plisado con velocidad de filtración media. La solución final debe contener de 3 a 4 
µg de Inositol/ml.  
C.22.6.3 Solución patrón de 4/µg de Inositol por ml.  
Justo an tes del uso diluir la solución C.22.5.6 como sigue:  
10 ml a 250 ml = 4 µg/ml  
C.22.6.4 Medio de cultivo para el ensayo  
Medio para prueba de Inositol  
En un matraz Erlenmeyer de vidrio actínico de 1000 ml, preparar el volumen necesario para los tubos 
utilizad os en el ensayo. Proceder según las indicaciones de la etiqueta, calentando la solución en una parrilla 
con agitación magnética.  
Cálculo del volumen necesario:  
patrón:  30 tubos 30 x 5 ml = 150 ml  
cada producto:  15 tubos 15 x 5 ml = 75 ml  
+ 50 ml a 100 ml  de exceso  
 
C.22.6.5 Preparación del ensayo  
C.22.6.5.1 Serie patrón  
En un soporte metálico para tubos de ensaye, colocar 3 filas de 10 tubos (180 x 18 mm), numerados bl, 
0,...., 8; el primero corresponde al blanco.  
Mediante una pipeta verter en triplicado  en las tres series de tubos, volúmenes crecientes de la última 
dilución de la solución patrón, completar a 5 ml con agua destilada y mediante una bureta o una jeringa 
automática, añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo según la tabla siguiente:  
Tubo No.: bl  0 1 2 3 4 5 6 7 8 
Solución patrón: 0,0   0,0  0,25  0,50  0,75  1,0  1,5  2,0  2,5  3,0 ml  
Agua: 5  5 4,75 4,5 4,25 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 ml  
Medio de cultivo:  5 ml en cada  tubo 
 
Los tubos del ensayo en blanco (bl) no se inoculan.  
C.22.6.5.2 Serie  producto  
En otro soporte colocar tres filas de 10 tubos (180 x 18 mm). Los primeros cinco tubos de las tres filas van 
destinados a un producto, los otros cinco tubos de las tres filas, a otro producto. Numerar de 9 a 13 y de 14 a 
18 y así sucesivamente pa ra todos los productos analizados.  
Mediante una pipeta verter en triplicado en las tres series de cinco tubos, volúmenes crecientes de la 
última dilución de la toma de ensayo, completar a 5 ml con agua destilada y añadir 5 ml de medio de cultivo 
para el en sayo, según la tabla siguiente:  
Tubo No.: 9  10 11 12 13 
Solución de la muestra: 0,75   1,0  1,50  2,0  2,50 ml  
Agua: 4,25  4,0 3,50 3,0 2,50 ml  
Medio de Cultivo:  5 ml en cada  tubo 
 
Tapar los tubos con capuchones o mediante una tapa adecuada que cubra las  tres filas de tubos en el soporte.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
C.22.6.6 Esterilización del ensayo  
Esterilizar los tubos durante 10 min a 115°C, luego enfriarlos en un baño de agua fría.  
C.22.6.7 Inoculación  
C.22.6.7.1 Lavado del cultivo  
Unos instantes antes de la inoculación del ens ayo, poner en suspensión el microorganismo del último 
cultivo sobre agar (C.22.6.1), adicionando 10 ml de solución fisiológica en el tubo que contiene el cultivo. 
Transvertir a un tubo de centrífuga estéril y centrifugar durante 2 min a 1000 rpm (aproximad amente 100 g).  
Decantar la solución fisiológica. Tomar aproximadamente 2 ml de esta suspensión e introducirla en una 
cubeta óptica de 1 cm. Medir la absorbancia a 575 nm.  
C.22.6.7.2 Preparación del inóculo.  
Estandarizar el cultivo a fin de obtener siempre más o menos la misma extinción.  
Según la extinción obtenida, diluir en un tubo que contenga 10 ml de solución fisiológica "n" gotas del 
cultivo C.22.6.7.1; este tubo constituye el inóculo.  
Así pues, para una extinción del cultivo C.22.6.7.1 superior o igua l a 1,5 (después de sustraer la extinción 
propia del medio), es necesario introducir 1 gota del mismo en el tubo que contiene 10 ml del medio C.22.6.4. 
Si la extinción no se encuentra dentro de los valores arriba citados, adaptar la dilución como sigue:  
- extinción inferior a 1,5: introducir dos gotas en el tubo  
- extinción inferior a 1,2: introducir tres gotas  
 
C.22.6.7.3 Inoculación  
Mediante una micropipeta con punta estéril, inocular 0,1 ml del inóculo en cada tubo de las series patrón y 
producto. Los tubos del blanco (bl) no se inoculan.  
Después de inocular, agitar los tubos ligeramente a fin de repartir el microorganismo uniformemente en  el 
medio.  
C.22.6.8 Incubación  
Incubar los tubos inoculados durante aproximadamente 21 h a 30°C. Dado que Saccharomy ces 
carlsbergensis  es aerobio, inclinar los tubos al máximo a fin de que la superficie de contacto entre el líquido y 
el aire sea lo mayor posible. Verificar si la diferencia de desarrollo del microorganismo es suficiente entre la 
primera y la última diluc ión de la solución patrón.  
Si es necesario, prolongar la incubación hasta que se obtenga un crecimiento óptimo del microorganismo.  
Después de la incubación se recomienda interrumpir el crecimiento del microorganismo simultáneamente 
en todos los tubos, colo cándolos en un baño de agua fría.  
C.22.6.9 Lecturas  
Mediante un agitador para tubos de ensaye, poner en suspensión el depósito formado por el desarrollo del 
microorganismo. Transvertir la suspensión a un tubo o una cubeta óptica, según el fotómetro. Medir la 
transmitancia o absorbancia a 575 nm ajustando el 100% T o a 0% de A del aparato con el blanco (bl).  
NOTA:  si la determinación se hace en absorbancia buscar el equivalente de los valores de los ejemplos 
dados en transmitancia.  
Agitar y leer un tubo desp ués de otro, a fin de evitar la sedimentación del microorganismo.  
C.22.7 Cálculos  
C.22.7.1 Curva de calibración  
Trazar la curva de calibración en papel milimétrico o utilizar una calculadora con regresión lineal, llevando 
la lectura media de cada grupo de tres tubos a la ordenada y los µg de Inositol a la abscisa.  
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml ng lecturas  media  
   1 2 3  
0 0,0 0,0 95,7 95,9 96,0 95,8       (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
1 0,25 1,0 91,2 90,5 91,2 91,0 
2 0,50 2,0 85,6 85,9 85,1 85,5 
3 0,75 3,0 79,5 79,5 80,9 80,0 
4 1,0 4,0 73,5 72,6 72,5 72,9 
5 1,5 6,0 58,4 57,6 55,8 57,3 
6 2,0 8,0 50,4 50,4 50,1 50,3 
7 2,5 10,0 48,5 45,4 48,5 47,5 
8 3,0 12,0 4,0 41,6 44,3 42,6 
 
Observaciones:  
La curva de calibración es característica de cada vitamina.  
Es tanto mejor cuanto mayor sea la parte q ue ocupa de la escala de transmisión.  
Repetir el ensayo cuando la curva de crecimiento esté mal desarrollada, esto puede deberse a la cepa o al 
medio de cultivo para el ensayo, que deben verificarse por separado.  
C.22.7.2 Contenido de vitamina en el produc to 
La media de las lecturas de cada par de tubos permite leer en la curva de calibración la cantidad de 
vitamina y calcular su concentración en la última dilución de la muestra.  
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml lecturas   media  µg* µg/ml  
  1 2 3    
9 0,75 78,7 80,4 80,2 79,8 2,9 3,87 
10 1,0 73,7 74,6 74,2 74,2 3,7 3,70 
11 1,5 61,9 62,3 62,8 62,3 5,5 3,67 
12 2,0 49,0 49,6 49,8 49,5 8,3 4,15 
13 2,5 40,8 40,8 40,3 40,3 ** ** 
 Media  3,85 (=C)  
* = valores leídos en la curva de calibración  
** = punto fuera de la curva  
Observación:  
Fluctuaciones pequeñas en los valores de la última columna son prueba de un buen ensayo.  
Calcular el contenido de vitamina en mg/100 g de producto, teniendo en cuenta las diluciones sucesivas y 
la concentración en la muestra diluida.  
El conten ido de inositol, expresado en mg/100 g de producto es igual a:  
 
  
 
C= media de las concentraciones leídas en la curva de calibración, en µg/ml  
V1= volumen en el que se ha disuelto la toma de ensayo, en ml  
V2= parte alícuota de V 1, en ml  
V3= volumen al q ue se ha diluido la parte alícuota V 2, en ml  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
m = toma de ensayo, en g  
 
Ejemplo:  
5,025 g (m) de producto se han pesado en un matraz aforado de 50 ml (V 1). Se ha tomado una parte 
alícuota de 10 ml (V 2), que se ha diluido en un matraz aforado de 100 ml (V 3). 
La media de las concentraciones de Inositol leídas en la curva de calibración es 3,85 µg/ml (C).  
El contenido de Inositol es:  
 
C.23. LA DETERMINACI ON DE VITAMINA K 1 
Método: Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC).  
C.23.1  Fundamento  
Se extrae la fracción liposoluble de una muestra en un tubo de centrífuga o mediante una columna de 
tierra de infusorios. Se separan las grasas en una columna HPLC preparativa y se recoge la fracción que 
contiene la vitamina K 1. Se inyecta esta fracción en una columna HPLC analítica y se determina el contenido 
de vitamina K 1 mediante un detector espectrofotométrico.  
C.23.2 Reactivos y materiales  
C.23.2.1  
Dimetilsulfóxido (DNSO) para síntesis  
Alcohol etílico absoluto para análisis  
n-Hexano grado purísimo  
Isooctano para a nálisis  
Acetonitrilo para cromatografía  
Vitamina K 1 
Pirogalol para análisis  
Diclorometano para cromatografía  
Papaína soluble  
Tetrahidrofurano para análisis  
20 columnas preparadas para extracción de sustancias lipófilas de soluciones acuosas  
Envase de repue sto para 50 rellenos de la columna  
Diastasa  
C.23.2.2 Materiales  
Tubos para centrífuga de vidrio de 40 ml  
Tapones huecos hexagonales de diferentes medidas  
Matraces en forma de pera de 10 ml  
Matraces en forma de pera de vidrio de 25 y 250 ml  
Pipetas graduada s hasta la punta de 1 ml: 0,005; 5 ml: 0,05; 10 ml: 0,10 y 20 ml: 0,10  
Micromatraz aforado de precisión de 2 ml  
Matraces aforados de vidrio de 10, 50 y 100 ml  
Filtro con poro de 0,45 µm  
Nota:  Utilizar material de vidrio actínico cuidadosamente lavado, con el fin de evitar que sea fuente de 
contaminación.  
C.23.3 Aparatos e instrumentos        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Jeringuilla para HPLC de 1 ml y de aguja intercambiable  
Aguja para jeringuilla de HPLC  
Cilindro para gas comprimido, N 2 
Manodentor para gas comprimido, N 2 
Agitador para tubos de ensaye  
Estufa de laboratorio  
Instalación de HPLC que consta de:  
Para cromatografa preparativa: una bomba, un inyector (loop de 500 µl), una columna preparativa, un 
detector de longitud de onda variable, un registrador para cromatografía analítica: una b omba, un inyector 
(loop de 100 µl), una columna analítica, un detector de longitud de onda variable, un registrador.  
Para una determinación por día, basta con un detector de longitud de onda variable y un solo registrador 
para ambos sistemas.  
Balanza de pr ecisión  
Balanza analítica, 162 g; 0,1 mg  
Centrífuga  
Placa con pinzas para tubos de centrífuga  
Mesa vibrante, movimiento alternante  
Baño ultrasónico  
C.23.4 Preparación de soluciones  
C.23.4.1 Solución de pirogalol de 1 g/100 ml  
El día de la determinación dis olver en un matraz aforado de 25 ml, 250 mg de pirogalol en alcohol etílico.  
C.23.4.2 Fase móvil para HPLC preparativa: 1% de acetato de etilo en isooctano.  
En un matraz aforado de 1 000 ml, mezclar 10 ml de acetato de etilo con isooctano previamente 
degas ificado bajo presión reducida y filtrado. Llevar a volumen.  
C.23.4.3 Fase móvil para purificar la columna preparativa: 10% de acetato de etilo en isooctano.  
En un matraz aforado de 500 ml, mezclar 50 ml de acetato de etilo con isooctano previamente 
degasif icado bajo presión reducida y filtrado. Llevar a volumen.  
C.23.4.4 Fase móvil para HPLC analítica: acetonitrilo -diclorometano -propanol -2 89:10:1 v/v/v  
Degasificar 1 litro de acetonitrilo bajo presión reducida y filtrar sobre una membrana.  
En un matraz afor ado de 1 000 ml, mezclar 100 ml de diclorometano y 10 ml de propanol -2 con acetonitrilo 
y llevar a volumen.  
C.23.4.5 Soluciones patrón de vitamina K 1 
En un matraz aforado de 100 ml, pesar exactamente 40 mg de vitamina K 1 (fitomenadiona). Disolver y 
llevar a volumen con n -hexano. Esta es la solución 1 de 0,40 mg/ml. Se conserva una semana a 4°C.  
Justo antes de la determinación, efectuar las diluciones siguientes con n -hexano:  
Solución 2: diluir 5 ml de solución 1 en un matraz aforado de 50 ml (40 µg/ml).  
Solución 3: diluir 5 ml de solución 2 en un matraz aforado de 50 ml (4 µg/ml). Determinar la concentración 
exacta de vitamina K 1 midiendo la extinción (E) a 248 nm.  
E1% en n -hexano = 435  
1 cm  
 
Solución 4: diluir 5 ml de solución 3 en un matraz aforado de 50  ml (0,4 µg/ml). Utilizar esta solución como 
patrón en la cromatografía preparativa para determinar el tiempo de retención.  
Solución 5: Mediante una pipeta, vertir 1 ml de solución 3 en un matraz aforado de 10 ml; evaporar a 
sequedad el disolvente bajo una  ligera corriente de nitrógeno. Disolver y llevar a volumen con la fase móvil 
23.4.4. Utilizar esta solución (0,4 µg/ml) como patrón en la cromatografía analítica.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
C.23.5 Procedimiento  
C.23.5.1 Preparación de la toma de ensayo  
C.23.5.1.1 Extracción en tubo s de centrífuga  
C.23.5.1.1.1 Productos sólidos  
Pesar 20,0 g de producto en un matraz aforado de 100 ml. Añadir 50 ml de agua a 45°C, luego 0,1 g de 
diastasa; a continuación, incubar durante 20 min a 40°C. Introducir 0,1 g de papaína e incubar de nuevo 
durante 20 min a 40°C. Llevar a volumen con agua a temperatura ambiente. La suspensión debe ser 
homogénea; si no, colocar el matraz en un baño ultrasónico durante unos 5 min. Tomar 5 ml de suspensión e 
introducir en un tubo de centrífuga de vidrio provisto de un esmerilado. Añadir 10 ml de dimetilsulfóxido y 
mezclar. Introducir 5 ml de solución de pirogalol y agitar. Luego añadir 10 ml de n -hexano y agitar el tubo 
vigorosamente durante 10 min mediante una mesa vibrante. Centrifugar el tubo, a fin de separar las  dos fases 
líquidas.  
Transvertir la fase superior a otro tubo de centrífuga.  
Añadir 10 ml de n -hexano al primer tubo y agitar, luego centrifugar igual que arriba. Tomar la fase superior 
y añadir a la que ya se ha recuperado.  
C.23.5.1.1.2 Productos líquidos  
Pesar 5 g de producto homogéneo en un tubo de centrífuga de vidrio provisto de un esmerilado. Añadir  10 
ml de dimetilsulfóxido y mezclar bien. Añadir 5 ml de solución de pirogalol y agitar. Luego añadir 10 ml de n -
hexano y agitar el tubo vigorosamente du rante 5 min mediante una mesa vibrante. Centrifugar el tubo, a fin de 
separar las dos fases líquidas.  
Transvertir la fase superior a otro tubo de centrífuga.  
Añadir 10 ml de n -hexano al primer tubo y agitar, luego centrifugar igual que arriba. Tomar la fas e superior 
y añadir a la que ya se ha recuperado.  
C.23.5.1.1.3 Lavado del extracto  
En el tubo de centrífuga que contiene la fase orgánica, añadir 10 ml de agua destilada. Agitar 
vigorosamente durante 5 min mediante la mesa vibrante y centrifugar.  
Mediante una pipeta Pasteur tomar lo mejor posible la fase orgánica, que debe ser límpida y transvertirla a 
un matraz en forma de pera de vidrio de 50 ml. Añadir 2 ml de n -hexano en la superficie de la fase acuosa, 
tomar de nuevo la fase orgánica e introducir en el  matraz.  
C.23.5.1.2 Extracción mediante la columna de tierra de infusorios.  
C.23.5.1.2.1 Productos sólidos  
En un matraz aforado de 100 ml de vidrio, pesar 2 g de producto. Añadir 0,200 g de papaína, luego 25 ml 
de agua a 45°C. Mezclar bien, utilizar un bañ o ultrasónico si es necesario para deshacer los grumos. Incubar 
durante 30 min en la estufa a 40°C. Añadir 10 ml de dimetilsulfóxido y agitar el matraz durante 5 min mediante 
una mesa vibrante. Enfriar el matraz si es necesario y añadir 40 ml de tetrahidro furano. Agitar el matraz 
vigorosamente durante 10 min. Llevar a volumen con agua y mezclar bien.  
C.23.5.1.2.2 Productos líquidos  
En un matraz aforado de 10 ml de vidrio, pesar 10 g de producto. Añadir 0,200 g de papaína y mezclar 
bien. Incubar durante 30 m in en la estufa a 40°C. A continuación añadir 20 ml de agua y 10 ml de 
dimetilsulfóxido y agitar el matraz durante 5 min mediante una mesa vibrante. Enfriar el matraz si es necesario 
y añadir 40 ml de tetrahidrofurano. Agitar el matraz vigorosamente durant e 10 min. Llevar a volumen con agua 
y mezclar bien.  
C.23.5.1.2.3  Preparación de la columna de extracción  
Colocar el filtro circular de 10 mm en el portafiltro inferior e introducir éste en el cuerpo de la columna. 
Rellenar la columna con el contenido de un  sobre y agitar de 10 a 20 segundos mediante un vibrador de 
reactivos.  
Presionar el filtro circular de 24 mm en el anillo con borde reforzado del recambio y deslizar éste dentro del 
cuerpo de la columna hasta que el filtro se encuentre sobre la superficie del relleno.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Fijar una aguja a la conexión Luer, situada en el extremo inferior de la columna; sujetar ésta mediante una pinza.  
C.23.5.1.2.4  Llenado de la columna y elución  
Mediante una pipeta aforada transvertir 20 ml del contenido del matraz aforado (C.2 3.5.1.2.1 o 
C.23.5.1.2.2) a la columna de extracción (C.23.5.1.2.3). Evitar arrastrar sedimento durante esta operación. Al 
cabo de 15 min eluir lentamente con 100 ml de n -hexano. La fase acuosa debe permanecer absorbida en la 
columna. Recoger el eluato en un matraz en forma de pera de 250 ml de vidrio. Interrumpir la operación a más 
tardar 30 min después que todo el n -hexano haya penetrado en la columna.  
C.23.5.2  Evaporación del extracto y preparación del extracto final de la toma de ensayo.  
Evaporar la sol ución (C.23.5.1.1.3 o C.23.5.1.2.4) bajo presión reducida y eliminar las últimas trazas de 
disolvente mediante una ligera corriente de nitrógeno. Recuperar el residuo cuantitativamente con la fase 
móvil y transvertir a un matraz aforado de 5 ml para la ext racción en tubos de centrífuga o de 2 ml para la 
extracción en columnas. Filtrar sobre una membrana antes de inyectar en la columna HPLC.  
C.23.5.3  Cromatografía preparativa  
Mantener el sistema HPLC preparativo con las características siguientes:  
Columna:  Lichrosorb -Si 60, 5 µm, 8 x 120 mm, o equivalente.  
Loop:  500 µl  
Fase móvil:  ver punto 23.4.2  
Caudal:  3 ml/min  
Detector:  Espectrofotómetro 254 nm, 0,05 AUFS  
Registrador:  10 mm/min  
 
Inyectar primero 0,500 ml de solución patrón 4 y determinar el tiempo d e retención aproximado debe ser 
de 5 a 7 min. A continuación inyectar 0,500 ml de solución de extracto y recoger la fracción que contiene la 
vitamina K 1 en un matraz en forma de pera de 10 ml de vidrio, comenzando unos 30 segundos antes de que 
se eluya la vitamina K 1; interrumpir la operación unos 30 segundos después de que haya sido eluida la 
vitamina K 1. 
C.23.5.4  Limpieza de la columna preparativa  
A fin de eliminar rápidamente todas las impurezas retenidas por la columna durante la cromatografía 
preparati va, aumentar la polaridad de la fase móvil utilizando una mezcla al 10% de acetato de etilo en 
isooctano (C.23.4.3). Esta operación dura aproximadamente de 10 a 15 min.  
Volver a introducir la fase móvil (C.23.4.2) y eluir hasta obtener una línea de base es table 
(aproximadamente 10 min). La columna está lista para otra inyección preparativa.  
C.23.5.5  Cromatografía analítica  
Evaporar a sequedad bajo una ligera corriente de nitrógeno la fracción recogida bajo C.23.5.3. Recuperar 
el residuo con 250 µl de fase m óvil (C.23.4.4); agitar suavemente para disolver bien el residuo.  
Montar el sistema HPLC analítico con las características siguientes:  
Columna:  Spherisorb ODS, 5 µm, 4,6 x 250 mm, o equivalente.  
Loop:  100 µl  
Fase móvil:  ver punto 23.4.4  
Caudal:  2 ml/min  
Detector:  espectofotómetro 248 nm, 0,01 AUFS  
Registrador:  10 mm/min  
 
Inyectar primero 0,100 ml de solución patrón 5 y determinar el tiempo de retención aproximado: debe ser 
aproximadamente de 5 min. A continuación inyectar 0,100 ml de la fracción obten ida más arriba.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Medir la altura de los picos correspondientes a la vitamina K 1 en el patrón así como en el extracto.  
Nota:  El grado de silanización de la columna en fase inversa puede variar. Si es necesario, ajustar el 
porcentaje de diclorometano contenid o en la fase móvil C.23.4.4 a fin de obtener un tiempo de retención de 
unos 5 min. Si el tiempo de retención es demasiado largo o demasiado corto, aumentar o disminuir 
respectivamente la cantidad de diclorometano.  
C.23.6  Cálculo y expresión de resultados.  
El contenido de vitamina K 1 (fitomenadiona), en µg/100 g de producto, es igual a:  
Productos líquidos, con tratamiento de extracción en tubos de centrífuga:  
 
Productos sólidos, con tratamiento de extracción en tubos de centrífuga; productos sólidos y líqui dos con 
tratamiento de extracción en columnas:  
 
donde:  
h2= altura del pico del extracto en mm  
C = concentración de la solución patrón, en µg/ml (en general 0,4 µg/ml)  
V0= volumen de extracto obtenido bajo 23.5.2 (en general 5 o 2 ml)  
V2 = volumen en el  cual ha sido diluida la fracción después de la cromatografía preparativa (en 
general 0,250 ml)  
V = volumen en el cual ha sido disuelta la toma de ensayo, en ml (en general 100 ml)  
h1 = altura del pico del patrón, en mm  
V3 = parte alícuota de V vertida en la columna de extracción en ml (en general 20 ml), o parte alícuota 
de V introducida en el tubo de extracción, en ml (para productos sólidos, en general 5 ml)  
V1 = volumen del extracto (V 0) inyectado en la columna preparativa (en general 0,500 ml)  
m = masa de la toma de ensayo, en g  
 
C.23.7  Sensibilidad del método  
El límite de detección es de aproximadamente 3 µg/100 g de producto; así pues, es posible medir con 
precisión aceptable contenidos de vitamina K 1 a partir de una concentración de 5 µg/100 g.  
C.23.8  Repetibilidad  
La diferencia entre dos resultados individuales obtenidos con la misma muestra para ensayo, en las 
mismas condiciones en un corto intervalo de tiempo, no debe exceder 10% de la media de los resultados.  
C.24. DETERMINACI ON DE ACIDO ASC ORBICO (VITAMINA C)  
C.24.1  Determinación visual  
C.24.1.1  Fundamento  
Extracción del ácido ascórbico mediante ácido metafosfórico. Valoración visual oxidométrica del ácido 
ascórbico en el extracto con una solución de 2,6 -diclorofenol -indofenol.  
C.24.1.2  Reac tivos y materiales  
C.24.1.2.1  Reactivos  
Acido ascórbico  
Acido sulfúrico  
Acido metafosfórico  
Yodo  
Sal sódico de 2,6 -diclorofenol -indofenol        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
C.24.1.2.2  Materiales  
Pipetas  
Matraces aforados  
Material común de laboratorio  
C.24.1.3  Aparatos e instrumentos  
Parrill a de calentamiento  
Estufa  
C.24.1.4  Preparación de soluciones  
C.24.1.4.1  Solución estándar de ácido ascórbico 0,5 mg/ml  
Pesar exactamente 50,0 mg de ácido ascórbico, introducirlos en un matraz aforado de 100 ml, si es 
posible, de vidrio pardo. Disolver con ácido metafosfórico al 2% y llevar a volumen con el mismo ácido. Esta 
solución debe prepararse inmediatamente antes del empleo.  
C.24.1.4.1.1  Verificación de la pureza del ácido ascórbico  
En caso de duda sobre la pureza del ácido ascórbico, pesar aproximada mente 400 mg con una precisión 
de 1 mg, disolver en una mezcla de 100 ml de agua destilada hervida y enfriada, y 25 ml de ácido sulfúrico al 
10%. Valorar rápidamente bajo luz difusa con una solución de yodo, 0,1 N en presencia de una solución de 
almidón co mo indicador.  
1 ml de yodo 0,1 N corresponde a 8,806 mg de ácido ascórbico.  
C.24.1.4.2  Solución de ácido meta -fosfórico al 2%  
24.1.4.2.1  Preparación de la solución base al 10%  
Pesar 60 -70 g de ácido meta -fosfórico. Eliminar la capa blanca que se forma gene ralmente en la 
superficie, lavando las barritas con agua destilada. Secarlas, con papel filtro y triturarlas en un mortero. Pesar 
50 g de este ácido limpio y triturado, y disolverlo sin calentar en 500 ml de agua destilada en un frasco pardo, 
agitando este  último mecánicamente hasta disolución.  
Filtrar, si es necesario, sobre un filtro plegado en un frasco de vidrio pardo.  
El ácido meta -fosfórico se transforma gradualmente en ácido orto -fosfórico, pero esta solución al 10% 
puede conservarse en un refrigerad or durante tres semanas.  
C.24.1.4.2.2 Preparación de la solución al 2%  
Preparar la cantidad necesaria en el día de empleo, diluyendo cinco veces con agua destilada un volumen 
dado de la solución al 10%.  
C.24.1.4.3  Solución de la sal sódica de 2,6 -diclorofe nol-indofenol (D.I.) al 0,05%  
Disolver 100 mg de D.I. en un vaso de 50 ml que contenga 20 ml de agua destilada. Llevar rápidamente a 
ebullición, removiendo con una varilla de vidrio. Enfriar y transferir a un matraz aforado de 200 ml. Llevar a 
volumen con agua destilada. Filtrar en un frasco pardo. Esta solución se conserva en un refrigerador durante  8 
días.  
Verificar la concentración antes de cada serie de determinaciones.  
La solución es azul en un medio alcalino (sal de Na+) y rosa en un medio ácido.  
C.24 .1.4.4  Acido acético al 10%  
Diluir 100 ml de ácido acético glacial a 1 l con agua destilada.  
C.24.1.4.5  Eventualmente: solución de yodo 0,1 N con factor conocido (determinado con tiosulfato).  
C.24.1.4.6  Eventualmente: solución de ácido sulfúrico al 10%  
Añadir cuidadosamente 57 ml de ácido sulfúrico concentrado a 500 ml de agua destilada. Enfriar a la 
temperatura ambiente y diluir a 1 l con agua destilada.  
C.24.1.4.7  Eventualmente: solución de almidón estabilizada al 1%  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Disolver 140 g de cloruro de sodio gra do purísimo en 375 ml de agua destilada, añadir 5 g de almidón 
soluble disuelto en 5 ml de agua destilada, calentar a ebullición durante 2 o 3 min, enfriar y filtrar.  
C.24.1.5  Procedimiento  
C.24.1.5.1  Determinación del título de la solución de 2,6 -diclorof enol-indofenol (D.I.)  
Pipetear 3 ml de solución estándar de ácido ascórbico (C.24.1.4.2) en un vaso de 100 ml, añadir 
aproximadamente 30 ml de ácido meta -fosfórico al 2% y 5 ml de ácido acético al 10%. Valorar con la solución 
D.I. utilizando un agitador me cánico hasta la aparición de una coloración rosa que persista durante 15 
segundos.  
Ejemplo:  
Para 2 ml de solución estándar (= 1,5 mg de ácido ascórbico), volumen empleado 5,84 ml de reactivo:  
 
es decir, 1 ml de solución D.I. corresponde a 0,257 mg de ácid o ascórbico.  
C.24.1.5.2  Preparación de la porción para ensayo  
C.24.1.5.2.1  Producto sin o con poco almidón. Por ejemplo leche en polvo.  
Pesar con una precisión de 0,1 g una cantidad del producto a analizar que contenga aproximadamente 5 a 
10 mg de ácido as córbico; en la mayoría de los casos se pesan 10 g en un matraz aforado de 100 ml.  
Añadir 20 ml de ácido meta -fosfórico al 10% y 50 ml de agua destilada a 55°C. Sacudir vigorosamente 
durante 10 min. Enfriar y llevar a volumen con agua destilada.  
Filtrar ráp idamente sobre un filtro plegado, al abrigo de la luz. Las soluciones que filtran demasiado lento 
deben centrifugarse a 3000 rpm durante 10 min, decantarse y filtrarse por un filtro plegado o sobre lana de vidrio.  
C.24.1.5.2.2  Productos con almidón, por ej emplo cereales  
En un vaso de 100 ml pesar exactamente una porción para ensayo de 10 a 20 g. Añadir 5% (0,5 a 1,0 g) 
de diastasa y 20 ml de agua destilada. Mezclar mediante una varilla de vidrio de modo que se obtenga una 
papilla homogénea e incubar 15 minu tos en una estufa a 40°C. Transvertir cuantitativamente a un matraz 
aforado de 100 ml con 20 ml de solución de ácido meta -fosfórico al 10%; llevar a volumen con agua destilada 
y agitar vigorosamente. Filtrar sobre un filtro plegado con una velocidad de fil tración media.  
C.24.1.5.2.3  Productos heterogéneos, por ejemplo verdura, fruta  
Homogeneizar una muestra de 50 a 100 g con un volumen de ácido meta -fosfórico de 10% representando 
1/5 del volumen total al que será ajustada la mezcla.  
Transvertir cuantitativa mente a un matraz aforado de 250 ml y llevar a volumen con agua destilada.  
Centrifugar o filtrar la solución obtenida sobre un filtro plegado.  
C.24.1.6  Determinación  
Tomar una parte alícuota del filtrado correspondiente, de 1 -2 mg de ácido ascórbico. Añadi r 5 ml de ácido 
acético al 10% (10 ml para un volumen de filtrado de 30 a 50 ml), valorar luego con D.I. hasta que se obtenga 
una coloración rosa que persista durante 15 segundos.  
Generalmente, deben utilizarse 5 a 10 ml de reactivo para la valoración. Un volumen de reactivo que 
excede 10 ml no es aconsejable, ya que la solución tiene tendencia a volverse grisácea en estas condiciones.  
Nota:  
Preparar las muestras a medida que se valoran.  
C.24.1.7  Cálculo y expresión de los resultados  
C.24.1.7.1  Cálculo y fó rmula  
El contenido de ácido ascórbico expresado en mg por 100 g de producto es igual a:  
 
en donde:        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
a = ml de reactivo empleados  
T = título del reactivo  
v = ml de filtrado empleados  
V = ml de solución de la toma de ensayo  
m = toma de ensayo  
 
Expresar el valor obtenido con una precisión de 0,1 mg.  
C.24.2  Valoración con un potenciómetro (medidor de pH)  
C.24.2.1  Preparación de la toma de ensayo  
La solución se prepara según las indicaciones dadas para la valoración visual.  
Tomar una parte alícuota de la so lución a valorar que contenga 1 a 2 mg de ácido ascórbico. Añadir 5 ml 
de ácido acético al 10%.  
C.24.2.2  Determinación  
Colocar el recipiente de valoración, que contiene la solución a valorar y una barrita magnética, sobre un 
agitador magnético.  
Sumergir un  electrodo de platino combinado en la solución.  
Ajustar el potenciómetro a una alta sensibilidad y llevar la aguja hacia el punto 0, o a un valor que 
corresponda a aproximadamente 1/6 de la escala, si el punto 0 se encuentra al comienzo de la misma.  
Añadir , mediante una bureta motorizada, porciones de reactivo de 0,1 ml a intervalos de 5 segundos. La 
aguja del potenciómetro sube ligeramente con cada adición de reactivo, pero baja de nuevo inmediatamente.  
El punto alcanzado por la aguja, 5 segundos después d e cada adición de reactivo comienza por ser cada 
vez más bajo para subir de nuevo progresivamente.  
Cuando la amplitud de oscilación de la aguja aumente y el punto alcanzado 5 segundos después de la 
adición del reactivo es netamente más alto, añadir el reac tivo en porciones de 0,05 ml y esperar antes de cada 
nueva adición hasta que la aguja baje de nuevo ligeramente.  
Proseguir de esta manera hasta que la aguja baje de nuevo muy poco, añadir luego muy pequeñas 
porciones de reactivo hasta que la aguja no baje más, sino que permanezca en el punto alcanzado después 
de la última adición de reactivo.  
Este punto será considerado como el punto de equivalencia. Anotar el número de ml de reactivo utilizados 
para alcanzar dicho punto.  
C.24.2.3  Cálculo y expresión de los  resultados  
C.24.2.3.1  Cálculo  
El contenido en ácido ascórbico expresado en mg/100 g de producto es igual a:  
 
en donde:  
a = ml de reactivo correspondiente al punto de equivalencia  
T = concentración del reactivo  
v = ml de filtrado empleados  
V = volumen en ml de la solución de la toma de ensayo  
m = toma de ensayo en g  
 Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
C.24.2.3.2  Expresar el valor obtenido con una precisión de 0,1 mg.  
C.24.2.4  Repetibilidad  
s = 0,24 mg (0 = 10)  
 
 
  
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones, simultáneame nte o rápidamente una después 
de otra por el mismo analista, no debe exceder 0,8 mg para un producto que contenga aproximadamente  50 
mg de ácido ascórbico por 100 g.  
C.25. DETERMINACI ON DE F OSFORO POR COLORIMETR IA CON AZUL DE MOLIBDENO  
C.25.1  Fundamento  
Calcinación de la muestra. Reacción del fósforo con molibdato de sodio y sulfato de hidracinio como 
reductor. Medir espectrofotométricamente a 700 nm la absorbancia del complejo de azul de molibdeno que se 
ha formado.  
C.25.2  Reactivos y materiales  
C.25.2.1  Reactivos  
Acido clorhídrico fumante 37% para análisis  
Acido nítrico 65% para análisis  
Acido sulfúrico 95 - 97% para análisis  
Sulfato de hidracinio para análisis  
Fosfato diácido de potasio para análisis  
Carbonato de sodio anhidro para análisis  
Molibdato de sodio dihidratado para análisis  
C.25.2.2  Materiales  
Vasos de forma alta de 1000 ml  
Varillas de vidrio de extremos redondeados, de 4 mm de diámetro y 100 mm de longitud  
Embudos 60° de 120 mm de diámetro  
Recipiente para guardar líquidos de 20 l  
Pipetas gradu adas hasta la punta de 10, 20 y 25 ml  
Pipetas ajustables de 5 ml  
Puntas blancas de polipropileno  
Filtros redondos rápidos de 125 mm de diámetro  
Baño de agua redondo y su tapa  
Cubeta de polietileno de 15 l  
Nota:  Evite utilizar detergentes a base de polifosf atos para lavar el material. Toda la vajilla debe 
enjuagarse abundantemente con agua destilada antes del uso.  
C.25.3  Aparatos e instrumentos  
Cubetas ópticas de vidrio de 10 x 10 mm  
Balanza analítica electrónica  
Cronómetro de mesa  
Placa calefactora  
Espectro fotómetro con accesorios  
Cápsulas de porcelana o platino        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Si es necesario, descontaminar durante una noche, en una cubeta de polietileno que contenga 15 l de 
mezcla de ácido nítrico/agua (1:1), todos los matraces aforados, tapones, recipientes de plástico, así como las 
cápsulas. Enjuagar con agua destilada. Secar en estufa a 80°C.  
C.25.4  Preparación de soluciones  
C.25.4.1  Solución de ácido clorhídrico 6 N  
En un matraz aforado de 1000 ml vertir 400 ml de agua destilada y 500 ml de ácido clorhídrico. Enfriar y  
llevar a volumen con agua destilada.  
C.25.4.2  Solución de ácido sulfúrico aproximadamente 10 N  
En un vaso de 1000 ml que contenga 500 ml de agua destilada, añadir con cuidado 270 ml de ácido 
sulfúrico. Mezclar bien y enfriar a temperatura ambiente. Transv ertir a un matraz aforado de 1000 ml, enjuagar 
el vaso y llevar a volumen con agua destilada.  
C.25.4.3  Solución de molibdato de sodio 2,5 g/100 ml  
En un matraz aforado de 500 ml, disolver 12,5 g de molibdato de sodio, en 200 ml de ácido sulfúrico 10 N. 
Dejar enfriar a temperatura ambiente, transvertir a un matraz aforado de 500 ml y llevar a volumen con 
C.25.4.2.  
C.25.4.4  Solución de sulfato de hidracinio, 0,15 g/100 ml  
CUIDADO: El sulfato de hidracinio es tóxico.  
En un matraz aforado de 200 ml introducir 0 ,30 g de sulfato de hidracinio. Disolver y llevar a volumen con 
agua destilada.  
C.25.4.5  Reactivo de molibdato de sodio y sulfato de hidracinio  
Justo antes del uso, mezclar 125 ml de solución C.25.4.3 y 50 ml de solución C.25.4.4 en un matraz 
aforado de 50 0 ml. Llevar a volumen con agua destilada.  
Nota:  Esta solución no se conserva.  
C.25.4.6  Solución patrón de fósforo, 1000 mg/l  
Secar 5 g de fosfato diácido de potasio, durante 2 h a 105°C.  
En un matraz aforado 500 ml introducir 2,197 g de fosfato diácido de  potasio seco. Disolver con agua 
destilada y añadir 15 ml de solución 25.4.1. Llevar a volumen con agua destilada y mezclar bien.  
En un recipiente de polietileno o de polipropileno, esta solución se conserva durante un mes.  
C.25.4.7  Solución patrón de fósf oro, 10 µg/ml  
El día del uso, verter mediante una pipeta, en un matraz aforado de 100 ml; 1,0 ml de solución C.25.4.6. 
Llevar a volumen con agua destilada y mezclar bien.  
C.25.4.8  Solución de carbonato de sodio e hidróxido de sodio  
En un matraz aforado de 200 ml, introducir 10,0 g de carbonato de sodio y 1,2 g de hidróxido de sodio. 
Disolver en agua destilada. Enfriar a temperatura ambiente y llevar a volumen con agua destilada.  
C.25.5  Preparación de la muestra para ensayo  
C.25.5.1  Productos sólidos  
Tomar u na cantidad representativa de la muestra a analizar. Si es necesario, moler el producto mediante 
un molino o mortero.  
C.25.5.2  Productos semi -líquidos  
Transvertir el contenido del bote a un vaso de capacidad suficiente. Homogenizar mediante una batidora. 
Mezclar bien.  
C.25.5.3  Productos líquidos  
Mezclar bien el producto antes de abrir el recipiente. A continuación transvertir a un recipiente de vidrio o 
de polipropileno. Guardar en el refrigerador (4°C). Deje alcanzar la temperatura ambiente antes de pesar.  
C.25.6  Procedimiento  
Efectuar cada determinación doble.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
C.25.6.1  Calcinación  
C.25.6.1.1  Productos no acidificados  
Calcinar a una temperatura máxima de 550°C.  
Mojar las cenizas con un poco de agua destilada, luego añadir 10,0 ml de ácido clorhídrico 6 N. C alentar 
sobre un baño maría en ebullición hasta disolución completa de las cenizas. Dejar enfriar a temperatura 
ambiente. Filtrar la solución a través de un filtro exento de cenizas y recoger el filtrado en un matraz aforado 
de 100 ml. Enjuagar la cápsula y el filtro con agua destilada. Llevar a volumen con agua destilada.  
C.25.6.1.2  Productos acidificados  
A fin de evitar pérdida de fósforo, proceder como sigue:  
En una cápsula de platino o equivalente, pesar con una aproximación de 0,1 mg de 2 a 5 g de mues tra 
para ensayo. Añadir 10,0 ml de solución. Mezclar bien con una varilla de vidrio. Enjuagar la varilla con un poco 
de agua destilada. En una campana, evaporar a sequedad la toma de ensayo sobre una placa calefactora. 
Luego calcinar el producto y disolver  las cenizas como se describe arriba.  
C.25.6.2  Dilución  
Si la concentración de fósforo en la solución de la toma de ensayo rebasa 90 µg/l, diluir con agua 
destilada. La solución a analizar debe contener entre 10 y 90 µg de fósforo/ml.  
C.25.6.3  Determinació n 
En matraces aforados de 50 ml, verter mediante una pipeta, según el esquema siguiente:  
Solución  Patrones (1) (ml)  Toma de ensayo (ml)  Blanco (ml)  
De la toma de ensayo  
Agua destilada  
C.13.4.7  
C.13.4.5   
 24 23 20 15 
 1 2 5 10 
 20 20 20 20  1,0 (2)  
24 (3)  
 
20  
25 
 
20 
 
(1) Estas soluciones contienen 10 - 20 - 50 y 100 µg de fósforo.  
(2) Verter más si el contenido en fósforo es muy bajo.  
(3) Ajustar el volumen de agua según el volumen de solución de la toma de ensayo, a fin de obtener un 
volumen total de apr oximadamente 25 ml.  
Mezclar bien, llevar a volumen con agua destilada. Tapar los matraces. Mezclar bien y dejar reaccionar 
durante 15 min en un baño de agua en ebullición para el revelado del color. Enfriar a temperatura ambiente.  
C.25.6.4  Medida espectrof otométrica  
Medir la extinción de las soluciones arriba indicadas en cubetas de vidrio de 10 mm a la longitud de onda 
de 700 nm contra el blanco (B).  
Notas:  
Todas las medidas, tanto las soluciones patrón como las tomas de ensayo, deben efectuarse en el 
intervalo de una h después del final de la reacción, debido a la inestabilidad de la coloración.  
El complejo de azul de molibdeno presenta el máximo de absorción a 830 nm, no obstante, la sensibilidad 
aún es buena a 700 nm. Así pues, es posible utilizar una ga ma más amplia de espectrofotómetros.  
C.25.7  Cálculo y expresión de resultados  
C.25.7.1  Cálculo  
Trazar la curva de calibración llevando a la abscisa el contenido en fósforo (en µg) y a la ordenada la 
extinción leída en el espectrofotómetro.  
Leer en la curva  de calibración el valor en µg de fósforo correspondiente a la extinción media (C).  
El contenido de fósforo, en mg/100 g de producto, es igual a:        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
 
donde:  
C = contenido de fósforo en la solución de la toma de ensayo, leído en la curva de calibración, en µg  
D = factor de dilución, si es necesario  
m = masa de la toma de ensayo en g  
V = volumen total de la solución de la toma de ensayo, en ml (100)  
A = parte alícuota de la solución de la toma de ensayo para la determinación  
 
C.25.7.2  Expresión de los resu ltados  
Expresar los resultados en mg/100 g con tres cifras significativas.  
C.25.8  Repetibilidad  
La diferencia entre dos resultados individuales obtenidos por el mismo método con la misma materia 
sometida al ensayo, en las mismas condiciones y corto interva lo de tiempo, no debe exceder 2% del valor 
medio.  
C.26. DETERMINACI ON DE CALCIO POR ABSORCI ON AT OMICA  
C.26.1  Fundamento:  
Hidrólisis parcial del producto con ácido clorhídrico. Filtración. Dilución y determinación por espectroscopía 
de absorción atómica.  
C.26.2 Reactivos y materiales  
C.26.2.1  Reactivos  
Acido nítrico mínimo 65% para análisis  
Oxido de lantano (III) (máximo 0,0005% Ca) para espectroscopía de absorción atómica  
Acido clorhídrico fumante mínimo 37% para análisis  
Solución patrón de calcio  
Solución patrón de calcio lista para el uso, 1000 mg/l  
C.26.2.2  Materiales  
Matraces aforados, 50, 100 y 1000 ml  
Micropipetas de 50 - 200 µl y 200 - 1000 µl  
Pipetas ajustables, 5 ml  
Puntas amarillas de 50 a 200 µl  
Puntas azules de 200 a 1000 µl  
Puntas blancas  
Probet as graduadas, forma alta, 10, 25 y 500 ml  
Matraces Erlenmeyer, cuello estrecho, 100 ml  
Embudos  
Filtros redondos (< 0,007% de cenizas)  
Frascos de polietileno flexible, cuello estrecho de 100, 1000 ml  
Cubeta de polietileno, 15 l  
Descontaminación del material : En una cubeta de polietileno introducir 10 l de mezcla de ácido 
nítrico/agua (1:1).  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
En este baño descontaminar una noche todos los matraces aforados, tapones, recipientes de polietileno o 
de polipropileno, así como todo el material de vidrio necesario. E njuagar con agua destilada y secar  
C.26.3  Aparatos e instrumentos  
Balanza de precisión, capacidad 4100/600g: 0,1/0,001  
Lámpara de calcio de tipo cátodo hueco  
Espectrofotómetro de absorción atómica  
Destilador de agua  
Baño de agua  
C.26.4  Preparación de soluc iones  
26.4.1  Solución de lantano, 5 g/100 ml  
En un matraz aforado de 1000 ml pesar 58,6 g de óxido de lantano. Añadir aproximadamente 200 ml de 
agua destilada, agitar hasta que todo el óxido esté bien mojado. Añadir lentamente 250 ml de ácido clorhídrico 
concentrado (mínimo 37%). Enfriar y llevar al volumen con agua destilada.  
Debe verificarse el contenido de calcio de cada nuevo lote de óxido de lantano preparando una solución 
de lantano de 1 g/100 ml y comparando su contenido en calcio con aquél de una so lución patrón de calcio de 
0 µg/ ml procedente de un lote anterior.  
C.26.4.2  Solución de ácido clorhídrico, 4 N  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir aproximadamente 500 ml de agua destilada y 330 ml de ácido 
clorhídrico concentrado. Enfriar. Llevar a l volumen con agua destilada.  
C.26.4.3  Solución de ácido clorhídrico, 6 N  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir aproximadamente 300 ml de agua destilada y 500 ml de ácido 
clorhídrico concentrado. Enfriar. Llevar al volumen con agua destilada.  
C.26.4.4  Solución patrón de calcio, 1000 mg/l  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir el contenido de una ampolleta de cloruro de calcio. Enjuagar la 
ampolleta y llevar al volumen con agua destilada.  
Conservar en un frasco de polietileno o polipropileno descont aminado, esta solución es estable durante 
aproximadamente un año a temperatura ambiente.  
También puede utilizarse una solución patrón de calcio de 1000 mg/l lista para el uso.  
C.26.4.5  Soluciones patrón diluidas de calcio  
En matraces aforados de 100 ml ver ter mediante una pipeta 0 - 100 - 200 - 300 - 500 y 1000 µl de solución 
patrón de calcio, 1000 mg/l. Añadir 20 ml de solución de lantano (C.26.4.1) y llevar al volumen con agua 
destilada. Estas soluciones contienen respectivamente 0 - 1,0 - 2,0 - 3,0 - 5,0 y 10,0 µg de calcio/ml. 
Transvertir inmediatamente a frascos de polietileno o polipropileno descontaminados.  
Estas soluciones deben prepararse cada semana. Se recomienda comparar las nuevas soluciones con 
otras preparadas anteriormente a fin de detectar c ualquier error grave de preparación.  
C.26.5  Preparación de la muestra para ensayo  
C.26.5.1  Productos sólidos  
Tomar una cantidad representativa de la muestra a analizar. Si es necesario moler el producto mediante 
un molino o un mortero. Evitar cualquier con taminación durante esta manipulación. Mezclar bien.  
C.26.5.2  Productos líquidos  
Mezclar bien el producto antes de abrir el recipiente. A continuación transvertir a un recipiente de vidrio o 
de plástico descontaminado. Guardar en el refrigerador (4°C). Mezc lar bien antes de su uso.  
C.26.6  Procedimiento  
C.26.6.1  Toma de ensayo        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
En un matraz aforado de 50 ml pesar, con una precisión de 0,01 g, 1,00 g de producto en polvo o 10,00 g 
de producto líquido. Añadir agua destilada hasta un volumen de aproximadamente 15  ml. Añadir 10 ml de 
solución de ácido clorhídrico 6 N. Calentar en un baño maría en ebullición durante 30 min. Dejar enfriar a 
temperatura ambiente. Llevar al volumen con agua destilada. Filtrar a través de un filtro exento de cenizas, 
eliminar los primer os 5 ml. Recolectar el resto del filtrado.  
C.26.6.2  Dilución  
En matraz aforado de 100 ml verter mediante una pipeta un volumen de la solución de toma de ensayo, 
que la concentración final esté comprendida entre 1 y 10 µg/ml. Añadir 20 ml de solución de lan tano. Llevar al 
volumen con agua destilada. Esta solución contiene 1 g de lantano/100 ml.  
C.26.6.3  Determinación  
Ajustar el aparato de absorción atómica según las indicaciones del fabricante. Se recomienda utilizar mejor 
un quemador provisto de un nebuliza dor de hélice, que un nebulizador con bola de impacto. Deben respetarse 
las siguientes condiciones:  
Lámpara de calcio de tipo cátodo hueco  
Longitud de onda: 422,7 nm  
Llama: aire -acetileno, reductora  
Dejar calentar la lámpara durante 15 - 20 min. Encender l a llama y esperar unos 15 min a que alcance el 
equilibrio. Colocar el quemador de manera óptima.  
Aspirar las soluciones patrón (C.26.4.5), luego las soluciones de la toma de ensayo (C.26.6.2). Después 
de cada medida, aspirar un poco de solución C.26.4.2, l uego agua destilada a fin de evitar que el capilar se 
obstruya. Después de aspirar diez soluciones de tomas de ensayo, verificar la calibración aspirando una 
solución patrón y efectuando un "reslope".  
Trabajar de preferencia con la opción "integración"; la  duración de las medidas debe ser de por lo menos 5 
segundos. Efectuar cada medida por lo menos tres veces. Ninguna solución de toma de ensayo no debe 
rebasar la concentración del patrón más concentrado. Efectuar una nueva dilución si es necesario (C.26.6. 2) 
C.26.7  Cálculo y expresión de resultados  
C.26.7.1  Modo de cálculo  
Calcular o trazar la curva de calibración llevando la absorbancia a la ordenada y la concentración de las 
soluciones patrón diluidas, en µg/ml, a la abscisa. Determinar la concentración d e las soluciones de las tomas 
de ensayo (C). Restar el valor del blanco (B) de aquellos de los productos.  
El contenido de calcio en el producto, en mg/100 g, es igual a:  
 
Donde:  
C = concentración de calcio en las soluciones de las tomas de ensayo, en µg/m l 
B = concentración de calcio en el blanco (solución patrón de 0 µg de calcio/ml)  
V = volumen inicial en las soluciones de las tomas de ensayo, en ml  
D = factor de dilución (C.26.6.2)  
m = masa de la toma de ensayo, en g  
 
C.26.7.2  Expresión de los resu ltados  
Contenidos inferiores a 100 mg/100 g: expresar los resultados con dos cifras significativas.  
Contenidos superiores a 100 mg/100 g: expresar los resultados con tres cifras significativas.  
C.26.8  Repetibilidad  
La diferencia entre dos resultados indivi duales obtenidos con la misma muestra, en las mismas 
condiciones, en un corto intervalo de tiempo, no debe exceder el 5% de su valor medio.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
C.27. DETERMINACI ON DE MAGNESIO POR ABSORCI ON AT OMICA  
C.27.1  Fundamento  
Hidrólisis parcial del producto con ácido cl orhídrico. Filtración. Dilución y determinación por espectroscopía 
de absorción atómica.  
C.27.2  Reactivos y materiales  
C.27.2.1  Reactivos  
Acido nítrico mínimo 65% para análisis  
Oxido de lantano (III) (máximo 0,0005% Ca) para espectroscopía de absorción ató mica.  
Acido clorhídrico fumante mínimo 37% para análisis  
Solución patrón de magnesio  
Solución patrón de magnesio lista para el uso, 1000 mg/l  
C.27.2.2  Materiales  
Matraces aforados, 50, 100 y 1000 ml  
Micropipetas de 50 - 200 µl y 200 - 1000 µl  
Pipetas ajust ables, 5 ml  
Puntas amarillas de 50 a 200 µl  
Puntas azules de 200 a 1000 µl  
Puntas blancas  
Probetas graduadas, forma alta, 10, 25 y 500 ml  
Matraces Erlenmeyer, cuello estrecho, 100 ml  
Embudos  
Filtros redondos (< 0,007% de cenizas)  
Frascos de polietileno fle xible, cuello estrecho de 100, 1000 ml  
Cubeta de polietileno de 15 l  
Descontaminación del material: En una cubeta de polietileno introducir 10 l de mezcla de ácido 
nítrico/agua (1:1).  
En este baño descontaminar una noche todos los matraces aforados, tapone s, recipientes de polietileno, 
así como todo el material de vidrio necesario. Enjuagar con agua destilada y secar.  
C.27.3  Aparatos e instrumentos  
Balanza de precisión, capacidad 4100/600g: 0,1/0,001  
Lámpara de calcio de tipo cátodo hueco  
Espectrofotómetro de absorción atómica  
Destilador de agua  
Baño de agua  
C.27.4  Preparación de soluciones  
C.27.4.1  Solución de lantano, 5 g/100 ml  
En un matraz aforado de 1000 ml pesar 58,6 g de óxido de lantano. Añadir aproximadamente 200 ml de 
agua destilada, agitar hasta q ue todo el óxido esté bien mojado. Añadir lentamente 250 ml de ácido clorhídrico 
concentrado (mínimo 37%). Enfriar y llevar al volumen con agua destilada.  
Debe verificarse el contenido de magnesio de cada nuevo lote de óxido de lantano preparando u na 
soluc ión de lantano de 1 g/ 100 ml y comparando su contenido en magnesio con aquel de una soluc ión patrón 
de magnesio de 0 µg/ ml procedente de un lote anterior.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
C.27.4.2  Solución de ácido clorhídrico, 4 N  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir aproximadament e 500 ml de agua destilada y 330 ml de ácido 
clorhídrico concentrado. Enfriar. Llevar al volumen con agua destilada.  
C.27.4.3  Solución de ácido clorhídrico, 6 N  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir aproximadamente 300 ml de agua destilada y 500 ml de  ácido 
clorhídrico concentrado. Enfriar. Llevar al volumen con agua destilada.  
C.27.4.4  Solución patrón de magnesio, 1000 mg/l  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir el contenido de una ampolleta de cloruro de magnesio. 
Enjuagar la ampolleta y llevar a l volumen con agua destilada.  
Conservada en un frasco de polietileno o polipropileno descontaminado, esta solución es estable durante 
aproximadamente un año a temperatura ambiente.  
También puede utilizarse una solución patrón de magnesio de 1000 mg/l lista  para el uso.  
C.27.4.5  Solución patrón de magnesio de 100 mg/l  
En un matraz aforado de 100 ml verter mediante una pipeta 10 ml de solución C.27.4.4. Llevar a volumen 
con agua destilada.  
Conservada en un frasco de polietileno o polipropileno descontaminado,  esta solución es estable durante 
aproximadamente un mes a temperatura ambiente.  
C.27.4.6  Soluciones patrón diluidas de magnesio  
En matraces aforados de 100 ml verter mediante una pipeta 0 - 0,2 - 0,5 - 1,0 y 1,5 ml de solución 
(C.27.4.5). Añadir 20 ml de solución de lantano (C.27.4.1) y llevar al volumen con agua destilada. Estas 
soluciones contienen respectivamente 0 0,2 - 0,5 - 1,0 y 1,5 µg de magnesio/ml. Transvertir inmediatamente a 
frascos de polietileno o polipropileno descontaminados.  
Estas solucion es deben prepararse cada semana. Se recomienda comparar las nuevas soluciones con 
otras preparadas anteriormente a fin de detectar cualquier error grave de preparación.  
C.27.5  Preparación de la muestra para ensayo  
C.27.5.1  Productos sólidos  
Tomar una canti dad representativa de la muestra a analizar. Si es necesario moler el producto mediante 
un molino o un mortero. Evitar cualquier contaminación durante esta manipulación. Mezclar bien.  
C.27.5.2  Productos líquidos  
Mezclar bien el producto antes de abrir el r ecipiente. A continuación transvertir a un recipiente de vidrio o 
de plástico descontaminado. Guardar en el refrigerador (4°C). Mezclar bien antes de su uso.  
C.27.6  Procedimiento  
C.27.6.1  Toma de ensayo  
En un matraz aforado de 50 ml pesar, con una precisió n de 0,01 g, 1,00 g de producto en polvo o 10,00 g 
de producto líquido. Añadir agua destilada hasta un volumen de aproximadamente 15 ml. Añadir 10 ml de 
solución de ácido clorhídrico 6 N (C.27.4.3). Calentar en un baño maría en ebullición durante 30 min. D ejar 
enfriar a temperatura ambiente. LLevar al volumen con agua destilada. Filtrar a través de un filtro exento de 
cenizas, eliminar los primeros 5 ml. Recolectar el resto del filtrado.  
27.6.2  Dilución  
En un matraz aforado de 100 ml verter mediante una pip eta un volumen de la solución de toma de ensayo 
(C.27.6.1), tal que la concentración final esté comprendida entre 0,2 y 1,5 µg/ml. Añadir 20 ml de solución de 
lantano. Llevar al volumen con agua destilada. Esta solución contiene 1 g de lantano/100 ml.  
C.27 .6.3 Determinación  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Ajustar el aparato de absorción atómica según las indicaciones del fabricante. Se recomienda utilizar mejor 
un quemador provisto de un nebulizador de hélice, que un nebulizador con bola de impacto. Deben respetarse 
las siguientes condici ones:  
Lámpara de magnesio de tipo cátodo hueco  
Longitud de onda: 282,2 nm  
Llama: aire -acetileno, reductora  
Dejar calentar la lámpara durante 15 - 20 min. Encender la llama y esperar unos 15 min a que alcance el 
equilibrio. Colocar el quemador de manera ópt ima. 
Aspirar las soluciones patrón (C.27.4.6), luego las soluciones de la toma de ensayo (C.27.6.2). Después 
de cada medida, aspirar un poco de solución C.15.4.2, luego agua destilada a fin de evitar que el capilar se 
obstruya. Después de aspirar diez solu ciones de tomas de ensayo, verificar la calibración aspirando una 
solución patrón y efectuando un "reslope".  
Trabajar de preferencia con la opción "integración"; la duración de las medidas debe ser de por lo menos 5 
segundos. Efectuar cada medida por lo me nos tres veces. Ninguna solución de toma de ensayo no debe 
rebasar la concentración del patrón más concentrado. Efectuar una nueva dilución si es necesario (C.27.6.2)  
27.7 Cálculo y expresión de resultados  
C.27.7.1  Modo de cálculo  
Calcular o trazar la curv a de calibración llevando la absorbancia a la ordenada y la concentración de las 
soluciones patrón diluidas, en µg/ml, a la abscisa. Determinar la concentración de las soluciones de las tomas 
de ensayo (C). Restar el valor del blanco (B) de aquellos de los  productos.  
El contenido de magnesio en el producto, en mg/100 g, es igual a:  
 
Donde:  
C = concentración de magnesio en las soluciones de las tomas de ensayo, en µg/ml  
B = concentración de magnesio en el blanco (solución patrón de 0 µg de magnesio/ml)  
V = volumen inicial en las soluciones de las tomas de ensayo, en ml  
D = factor de dilución (15.6.2)  
m = masa de la toma de ensayo, en g  
C.27.7.2  Expresión de los resultados  
Contenidos inferiores a 100 mg/100 g: expresar los resultados con dos cifras significat ivas. 
Contenidos superiores a 100 mg/100 g: expresar los resultados con tres cifras significativas.  
C.27.8  Repetibilidad  
La diferencia entre dos resultados individuales obtenidos con la misma muestra, en las mismas 
condiciones, en un corto intervalo de tie mpo, no debe exceder el 5% de su valor medio.  
C.28. DETERMINACI ON DE ZINC POR ABSORCI ON AT OMICA  
C.28.1  Fundamento  
Hidrólisis parcial del producto con ácido clorhídrico. Filtración. Dilución y determinación por espectroscopía 
de absorción atómica.  
C.28.2  Reactivos y materiales  
C.28.2.1  Reactivos  
Acido nítrico mínimo 65% para análisis  
Acido clorhídrico fumante mínimo 37% para análisis        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Solución patrón de zinc  
Solución patrón de zinc lista para el uso, 1000 mg/l  
C.28.2.2  Materiales  
Matraces aforados, 50, 100 y 1000 ml  
Micropipetas de 50 - 200 µl y 200 - 1000 µl  
Pipetas ajustables, 5 ml  
Puntas amarillas de 50 a 200 µl  
Puntas azules de 200 a 1000 µl  
Puntas blancas  
Probetas graduadas, forma alta, 10, 25 y 500 ml  
Matraces Erlenmeyer, cuello estrecho, 100 ml  
Embudos  
Filtros redondos (< 0,007% de cenizas)  
Frascos de polietileno flexible, cuello estrecho de 100, 1000 ml  
Cubeta de polietileno, 15 l  
Descontaminación del material: En una cubeta de polietileno introducir 10 l se mezcla de ácido nítrico/agua (1:1).  
En este b año descontaminar durante una noche todos los matraces aforados, tapones, recipientes de polietileno  
o de polipropileno, así como todo el material de vidrio necesario. Enjuagar con agua destilada y secar.  
C.28.3  Aparatos e instrumentos  
Balanza de precisión , capacidad 4100/600g: 0,1/0,001  
Lámpara de zinc de tipo cátodo hueco  
Espectrofotómetro de absorción atómica  
Destilador de agua  
Baño de agua  
C.28.4  Preparación de soluciones  
C.28.4.1  Solución de ácido clorhídrico 1,2 N  
En un matraz aforado de 1000 ml intro ducir aproximadamente 500 ml de agua destilada y 100 ml de ácido 
clorhídrico concentrado. Enfriar. Llevar a volumen con agua destilada.  
C.284.2  Solución de ácido clorhídrico, 4 N  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir aproximadamente 500 ml de agua des tilada y 330 ml de ácido 
clorhídrico concentrado. Enfriar. Llevar al volumen con agua destilada.  
C.28.4.3  Solución de ácido clorhídrico, 6 N  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir aproximadamente 300 ml de agua destilada y 500 ml de ácido 
clorhídrico c oncentrado. Enfriar. Llevar al volumen con agua destilada.  
C.28.4.4  Solución patrón de zinc, 1000 mg/l  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir el contenido de una ampolleta de cloruro de zinc. Enjuagar la 
ampolleta y llevar al volumen con agua destilada . 
Conservada en un frasco de polietileno o polipropileno descontaminado, esta solución es estable durante 
aproximadamente un año a temperatura ambiente.  
También puede utilizarse una solución patrón de zinc de 1000 mg/l lista para el uso.  
C.28.4.5  Solución patrón de zinc de 10 mg/l  
En un matraz aforado de 100 ml verter mediante una pipeta 1,0 ml de solución C.28.4.4. Llevar a volumen 
con ácido clorhídrico.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Conservada en un frasco de polietileno o polipropileno descontaminado, esta solución es estable durante  
aproximadamente una semana a temperatura ambiente.  
C.28.4.6  Soluciones patrón diluidas de zinc  
En matraces aforados de 100 ml verter mediante una pipeta 0 - 1 - 2,5 - 5 - 7,5 y 10 ml de solución 
(C.28.4.5). Añadir 20 ml de solución de ácido clorhídrico 6 N y llevar al volumen con agua destilada. Estas 
soluciones contienen respectivamente 0 - 0,1 - 0,25 - 0,50 - 0,75 y 1,0 µg de zinc/ml. Transvertir 
inmediatamente a frascos de polietileno o polipropileno descontaminados.  
Estas soluciones deben prepararse ca da semana. Se recomienda comparar las nuevas soluciones con 
otras preparadas anteriormente a fin de detectar cualquier error grave de preparación.  
C.28.5  Preparación de la muestra para ensayo  
C.28.5.1  Productos sólidos  
Tomar una cantidad representativa de la muestra a analizar. Si es necesario moler el producto mediante 
un molino o un mortero. Evitar cualquier contaminación durante esta manipulación. Mezclar bien.  
C.28.5.2  Productos líquidos  
Mezclar bien el producto antes de abrir el recipiente. A continuac ión transvertir a un recipiente de vidrio o 
de plástico descontaminado. Guardar en el refrigerador (4°C). Mezclar bien antes de su uso.  
C.28.6  Procedimiento  
C.28.6.1  Toma de ensayo  
En un matraz aforado de 50 ml pesar, con una precisión de 0,01 g; 1,00 g de  producto en polvo o 10,00 g 
de producto líquido. Añadir agua destilada hasta un volumen de aproximadamente 15 ml. Añadir 10 ml de 
solución de ácido clorhídrico 6 N (C.28.4.3). Calentar en un baño maría en ebullición durante 30 min. Dejar 
enfriar a tempera tura ambiente. Llevar al volumen con agua destilada. Filtrar a través de un filtro exento de 
cenizas, eliminar los primeros 5 ml. Recolectar el resto del filtrado.  
C.28.6.2  Dilución  
En matraz aforado de 100 ml verter mediante una pipeta un volumen de la so lución de toma de ensayo 
(C.28.6.1), tal que la concentración final esté comprendida entre 0,1 y 0,8 µg/ml. Llevar al volumen con 
solución de ácido clorhídrico 1,2 N.  
C.28.6.3  Determinación  
Ajustar el aparato de absorción atómica según las indicaciones del  fabricante. Se recomienda utilizar mejor 
un quemador provisto de un nebulizador de hélice, que un nebulizador con bola de impacto. Deben respetarse 
las siguientes condiciones:  
Lámpara de zinc de tipo cátodo hueco  
Longitud de onda: 213,9 nm  
Llama: aire -acetileno, oxidante (azul, pobre en acetileno)  
Dejar calentar la lámpara durante 15 - 20 min. Encender la llama y esperar unos 15 min a que alcance el 
equilibrio. Colocar el quemador de manera óptima.  
Aspirar las soluciones patrón (C.28.4.6), luego las soluci ones de la toma de ensayo (C.28.6.1 o C.28.6.2). 
Después de cada medida, aspirar un poco de solución C.28.4.2, luego agua destilada a fin de evitar que el 
capilar se obstruya. Después de aspirar diez soluciones de tomas de ensayo, verificar la calibración aspirando 
una solución patrón y efectuando un "reslope".  
Trabajar de preferencia con la opción "integración"; la duración de las medidas debe ser de por lo menos 3 
segundos. Efectuar cada medida por lo menos tres veces. Ninguna solución de toma de ensayo n o debe 
rebasar la concentración del patrón más concentrado. Efectuar una nueva dilución si es necesario (C.28.6.2).  
C.28.7  Cálculo y expresión de resultados  
C.28.7.1  Modo de cálculo        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Calcular o trazar la curva de calibración llevando la absorbancia a la ord enada y la concentración de las 
soluciones patrón diluidas, en µg/ml, a la abscisa. Determinar la concentración de las soluciones de las tomas 
de ensayo (C). Restar el valor del blanco (B) de aquellos de los productos.  
El contenido de zinc en el producto, en mg/100 g, es igual a:  
 
Donde:  
C = concentración de zinc en las soluciones de las tomas de ensayo, en µg/ml  
B = concentración de zinc en el blanco (solución patrón de  0 µg de zinc por ml)  
V = volumen inicial en las soluciones de las tomas de ensayo, en ml 
D = factor de dilución (C.28.6.2)  
m = masa de la toma de ensayo, en g  
C.28.7.2  Expresión de los resultados  
Expresar los resultados con dos cifras significativas.  
C.28.8  Repetibilidad  
La diferencia entre dos resultados individuales obtenidos con la misma  muestra, en las mismas 
condiciones, en un corto intervalo de tiempo, no debe exceder el 4% de su valor medio.  
C.29. DETERMINACI ON DE HIERRO POR ABSORCI ON AT OMICA  
C.29.1  Fundamento  
Hidrólisis parcial del producto con ácido clorhídrico. Filtración. Dilución  y determinación por espectroscopía 
de absorción atómica.  
C.29.2  Reactivos y materiales  
C.29.2.1  Reactivos  
Acido nítrico mínimo 65% para análisis  
Acido clorhídrico fumante mínimo 37% para análisis  
Solución patrón de hierro  
Solución patrón de hierro lista p ara el uso, 1000 mg/l  
29.2.2  Materiales  
Matraces aforados, 50, 100 y 1000 ml  
Micropipetas de 50 - 200 µl y 200 - 1000 µl  
Pipetas ajustables, 5 ml  
Puntas amarillas de 50 a 200 µl  
Puntas azules de 200 a 1000 µl  
Puntas blancas  
Probetas graduadas, forma alta, 10, 25 y 500 ml  
Matraces Erlenmeyer, cuello estrecho, 100 ml  
Embudos  
Filtros redondos (< 0,007% de cenizas)  
Frascos de polietileno flexible, cuello estrecho de 100, 1000 ml  
Cubeta de polietileno, 15 l  
Descontaminación del material: En una cubeta de polieti leno introducir 10 l se mezcla de ácido nítrico/agua (1:1)  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
En este baño descontaminar durante una noche todos los matraces aforados, tapones, recipientes de polietileno  
o de polipropileno, así como todo el material de vidrio necesario. Enjuagar con agua de stilada y secar.  
C.29.3  Aparatos e instrumentos  
Balanza de precisión, capacidad 4100/600g: 0,1/0,001  
Lámpara de hierro de tipo cátodo hueco  
Espectrofotómetro de absorción atómica  
Destilador de agua  
Baño de agua  
C.29.4  Preparación de soluciones  
C.29.4.1  Solución de ácido clorhídrico 1,2 N  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir aproximadamente 500 ml de agua destilada y 100 ml de ácido 
clorhídrico concentrado. Enfriar. Llevar a volumen con agua destilada.  
C.29.4.2  Solución de ácido clorhídrico, 4 N  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir aproximadamente 500 ml de agua destilada y 330 ml de ácido 
clorhídrico concentrado. Enfriar. Llevar al volumen con agua destilada.  
C.29.4.3  Solución de ácido clorhídrico, 6 N  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir a proximadamente 300 ml de agua destilada y 500 ml de ácido 
clorhídrico concentrado. Enfriar. Llevar al volumen con agua destilada.  
C.29.4.4  Solución patrón de hierro, 1000 mg/l  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir el contenido de una ampolleta de clor uro de hierro. Enjuagar la 
ampolleta y llevar al volumen con agua destilada.  
Conservada en un frasco de polietileno o polipropileno descontaminado, esta solución es estable durante 
aproximadamente un año a temperatura ambiente.  
También puede utilizarse una  solución patrón de hierro de 1000 mg/l lista para el uso.  
C.29.4.5  Soluciones patrón diluidas de hierro  
En matraces aforados de 100 ml verter mediante una pipeta 0 - 100 - 200 - 500 y 1000 µl de solución 
(C.29.4.4). Añadir 20 ml de solución de ácido clorh ídrico 6 N y llevar al volumen con agua destilada. Estas 
soluciones contienen respectivamente 0 - 1,0 - 2,0 - 5,0 y 10,0 µg de hierro/ml. Transvertir inmediatamente a 
frascos de polietileno o polipropileno descontaminados.  
Estas soluciones deben prepararse  cada semana. Se recomienda comparar las nuevas soluciones con 
otras preparadas anteriormente a fin de detectar cualquier error grave de preparación.  
C.29.5  Preparación de la muestra para ensayo  
C.29.5.1  Productos sólidos  
Tomar una cantidad representativa de la muestra a analizar. Si es necesario moler el producto mediante 
un molino o un mortero. Evitar cualquier contaminación durante esta manipulación. Mezclar bien.  
C.29.5.2  Productos líquidos  
Mezclar bien el producto antes de abrir el recipiente. A contin uación transvertir a un recipiente de vidrio o 
de plástico descontaminado. Guardar en el refrigerador (4°C).  
Mezclar bien antes de su uso.  
C.29.6  Procedimiento  
C.29.6.1  Toma de ensayo  
En un matraz aforado de 50 ml pesar, con una precisión de 0,01 g; 1,00 g  de producto en polvo o 10,00 g 
de producto líquido. Añadir agua destilada hasta un volumen de aproximadamente 15 ml. Añadir 10 ml de 
solución de ácido clorhídrico 6 N (C.29.4.3). Calentar en un baño maría en ebullición durante 30 min. Dejar 
enfriar a temp eratura ambiente. Llevar al volumen con agua destilada. Filtrar a través de un filtro exento de 
cenizas, eliminar los primeros 5 ml. Recolectar el resto del filtrado.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
C.29.6.2  Dilución  
En matraz aforado de 100 ml verter mediante una pipeta un volumen de la  solución de toma de ensayo 
(C.29.6.1), tal que la concentración final esté comprendida entre 1 y 8 µg/ml. Llevar al volumen con solución 
de ácido clorhídrico 1,2 N.  
C.29.6.3  Determinación  
Ajustar el aparato de absorción atómica según las indicaciones del fabricante. Se recomienda utilizar mejor 
un quemador provisto de un nebulizador de hélice, que un nebulizador con bola de impacto. Deben respetarse 
las siguientes condiciones:  
Lámpara de hierro de tipo cátodo hueco  
Longitud de onda: 248,3 nm  
Llama: aire -acetileno, oxidante (azul, pobre en acetileno)  
Dejar calentar la lámpara durante 15 - 20 min. Encender la llama y esperar unos 15 min a que alcance el 
equilibrio. Colocar el quemador de manera óptima.  
Aspirar las soluciones patrón (C.29.4.5), luego las soluc iones de la toma de ensayo (C.29.6.1 o C.29.6.2). 
Después de cada medida, aspirar un poco de solución C.29.4.2, luego agua destilada a fin de evitar que el 
capilar se obstruya. Después de aspirar diez soluciones de tomas de ensayo, verificar la calibración  aspirando 
una solución patrón y efectuando un "reslope".  
Trabajar de preferencia con la opción "integración"; la duración de las medidas debe ser de por lo menos 5 
segundos. Efectuar cada medida por lo menos tres veces. Ninguna solución de toma de ensayo no debe 
rebasar la concentración del patrón más concentrado. Efectuar una nueva dilución si es necesario.  
C.29.7  Cálculo y expresión de resultados  
C.29.7.1  Modo de cálculo  
Calcular o trazar la curva de calibración llevando la absorbancia a la ordenada y la  concentración de las 
soluciones patrón diluidas, en µg/ml, a la abscisa. Determinar la concentración de las soluciones de las tomas 
de ensayo (C). Restar el valor del blanco (B) de aquellos de los productos.  
El contenido de hierro en el producto, en mg/10 0 g, es igual a:  
 
Donde:  
C = concentración de hierro en las soluciones de las tomas de ensayo, en µg/ml  
B = concentración de hierro en el blanco (solución patrón de 0 µg de hierro por ml)  
V = volumen inicial (C.29.6.1), en ml (en general 50)  
D = factor de  dilución (C.29.6.2)  
m = masa de la toma de ensayo, en g  
C.29.7.2  Expresión de los resultados  
Expresar los resultados con dos cifras significativas.  
C.29.8  Repetibilidad  
La diferencia entre dos resultados individuales obtenidos con la misma muestra, en las  mismas 
condiciones, en un corto intervalo de tiempo, no debe exceder el 10% de su valor medio.  
C.30. DETERMINACI ON DE POTASIO POR ABSORCI ON AT OMICA  
C.30.1  Fundamento  
Hidrólisis parcial del producto con ácido clorhídrico. Filtración. Dilución y determinaci ón por emisión de llama.  
C.30.2  Reactivos y materiales  
C.30.2.1  Reactivos  
Acido nítrico mínimo 65% para análisis  
Acido clorhídrico fumante 37%  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Solución patrón de potasio mínimo para análisis  
Solución patrón de potasio lista para el uso, 1000 mg/l  
C.30.2.2  Materiales  
Matraces aforados, 50, 100 y 1000 ml  
Micropipetas de 50 - 200 µl y 200 - 1000 µl  
Pipetas ajustables, 5 ml  
Puntas amarillas de 50 a 200 µl  
Puntas azules de 200 a 1000 µl  
Puntas blancas  
Probetas graduadas, forma alta, 10, 25 y 500 ml  
Matraces Erle nmeyer, cuello estrecho, 100 ml  
Embudos  
Filtros redondos (< 0,007% de cenizas)  
Frascos de polietileno flexible, cuello estrecho de 100, 1000 ml  
Cubeta de polietileno, 15 l  
Descontaminación del material: En una cubeta de polietileno introducir 10 l se mezcl a de ácido nítrico/agua (1:1)  
En este baño descontaminar durante una noche todos los matraces aforados, tapones, recipientes de polietileno  
o de polipropileno, así como todo el material de vidrio necesario. Enjuagar con agua destilada y secar.  
C.30.3  Apara tos e instrumentos  
Balanza de precisión, capacidad 4100/600g: 0,1/0,001  
Lámpara de potasio de tipo cátodo hueco  
Espectrofotómetro de absorción atómica  
Destilador de agua  
Baño de agua  
C.30.4  Preparación de soluciones  
C.30.4.1  Solución de ácido clorhídrico 1 ,2 N 
En un matraz aforado de 1000 ml introducir aproximadamente 500 ml de agua destilada y 100 ml de ácido 
clorhídrico concentrado. Enfriar. Llevar a volumen con agua destilada.  
C.30.4.2  Solución de ácido clorhídrico, 4 N  
En un matraz aforado de 1000 ml in troducir aproximadamente 500 ml de agua destilada y 330 ml de ácido 
clorhídrico concentrado. Enfriar. Llevar al volumen con agua destilada.  
C.30.4.3  Solución de ácido clorhídrico, 6 N  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir aproximadamente 300 ml de agu a destilada y 500 ml de ácido 
clorhídrico concentrado. Enfriar. Llevar al volumen con agua destilada.  
C.30.4.4  Solución patrón de potasio, 1000 mg/l  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir el contenido de una ampolleta de cloruro de potasio. Enjuagar 
la ampolleta y llevar al volumen con agua destilada.  
Conservada en un frasco de polietileno o polipropileno descontaminado, esta solución es estable durante 
aproximadamente un año a temperatura ambiente.  
También puede utilizarse una solución patrón de potasi o de 1000 mg/l lista para el uso.  
C.30.4.5  Soluciones patrón diluidas de potasio  
En matraces aforados de 100 ml vertir mediante una pipeta 0 - 100 - 200, 500 y 1000 ml de solución 
(C.30.4.4). Y llevar al volumen con solución C.30.4.1. Estas soluciones cont ienen respectivamente 0 - 1,0 - 2,0 
- 5,0 y 10,0 µg de potasio/ml. Transvertir inmediatamente a frascos de polietileno o polipropileno 
descontaminados.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Estas soluciones deben prepararse cada semana. Se recomienda comparar las nuevas soluciones con 
otras pr eparadas anteriormente a fin de detectar cualquier error grave de preparación.  
C.30.5  Preparación de la muestra para ensayo  
C.30.5.1  Productos sólidos  
Tomar una cantidad representativa de la muestra a analizar. Si es necesario moler el producto mediante 
un molino o un mortero. Evitar cualquier contaminación durante esta manipulación. Mezclar bien.  
C.30.5.2  Productos líquidos  
Mezclar bien el producto antes de abrir el recipiente. A continuación transvertir a un recipiente de vidrio o 
de plástico descontamina do. Guardar en el refrigerador (4°C). Mezclar bien antes de su uso.  
C.30.6  Procedimiento  
C.30.6.1  Toma de ensayo  
En un matraz aforado de 50 ml pesar, con una precisión de 0,01 g; 1,00 g de producto en polvo o 10,00 g 
de producto líquido. Añadir agua destil ada hasta un volumen de aproximadamente 15 ml. Añadir 10 ml de 
solución de ácido clorhídrico 6 N (C.30.4.3). Calentar en un baño maría en ebullición durante 30 min. Dejar 
enfriar a temperatura ambiente. Llevar al volumen con agua destilada. Filtrar a travé s de un filtro exento de 
cenizas, eliminar los primeros 5 ml. Recolectar el resto del filtrado.  
C.30.6.2  Dilución  
En matraz aforado de 100 ml verter mediante una pipeta un volumen de la solución de toma de ensayo 
(C.30.6.1), tal que la concentración final esté comprendida entre 1 y 10 µg/ml. Llevar al volumen con solución 
de ácido clorhídrico 1,2 N.  
C.30.6.3  Determinación  
Ajustar el aparato de absorción atómica según las indicaciones del fabricante. Se recomienda utilizar mejor 
un quemador provisto de un ne bulizador de hélice, que un nebulizador con bola de impacto. Deben respetarse 
las siguientes condiciones:  
Longitud de onda: 766,5 nm  
Llama: aire -acetileno, oxidante  
Encender la llama y esperar unos 15 min a que alcance el equilibrio. Colocar el quemador y ajustar el 
fotomultiplicador de manera óptima; para ello aspírese el patrón más concentrado.  
Aspirar las soluciones patrón (C.30.4.5), luego las soluciones de la toma de ensayo (C.30.6.2). Después 
de cada medida, aspirar un poco de solución 30.4.2, luego a gua destilada a fin de evitar que el capilar se 
obstruya. Después de aspirar diez soluciones de tomas de ensayo, verificar la calibración aspirando una 
solución patrón y efectuando un "reslope".  
Trabajar de preferencia con la opción "integración"; la durac ión de las medidas debe ser de por lo menos 5 
segundos. Efectuar cada medida por lo menos tres veces. Ninguna solución de toma de ensayo no debe 
rebasar la concentración del patrón más concentrado. Efectuar una nueva dilución si es necesario (C.30.6.2)  
C.30.7 Cálculo y expresión de resultados  
C.30.7.1  Modo de cálculo  
Calcular o trazar la curva de calibración llevando la absorbancia a la ordenada y la concentración de las 
soluciones patrón diluidas, en µg/ml, a la abscisa. Determinar la concentración de las soluciones de las tomas 
de ensayo (C). Restar el valor del blanco (B) de aquellos de los productos.  
El contenido de potasio en el producto, en mg/100 g, es igual a:  
 
Donde:  
C = concentración de potasio en las soluciones de las tomas de ensayo, en µg/ml  
B = concentración de potasio en el blanco (solución patrón de 0 µg de potasio por ml)  
V = volumen inicial en las soluciones de las tomas de ensayo, en ml  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
D = factor de dilución  
m = masa de la toma de ensayo, en g  
C.30.7.2  Expresión de los resultados  
Contenid os inferiores a 100 mg/100 g: expresar los resultados con dos cifras significativas.  
Contenidos superiores a 100 mg/100 g: expresar los resultados con tres cifras significativas.  
C.30.8  Repetibilidad  
La diferencia entre dos resultados individuales obtenido s con la misma muestra, en las mismas 
condiciones, en un corto intervalo de tiempo, no debe exceder el 5% de su valor medio.  
C.31. DETERMINACI ON DE CLORURO (CL -) POR VALORACI ON 
C.31.1  Fundamento  
Haciendo una solución o suspensión del producto en ácido nítr ico, se valora por potenciometría directa 
mediante un electrodo de vidrio y una solución valorada de nitrato de plata hasta un potencial final 
previamente establecido.  
C.31.2  Reactivos y materiales  
C.31.2.1  Reactivos  
Solución de nitrato de plata de 0,1 mol  o nitrato de plata para análisis  
Solución de cloruro de sodio 0,1 mol o cloruro de sodio para análisis  
Gelatina en polvo  
Acido nítrico mínimo 65% para análisis  
C.31.2.2  Materiales  
Vasos de forma alta de 150 ml  
Pipetas automáticas de báscula de 1 ml  
Materi al común de laboratorio  
Bureta de 20 o 25 ml  
Agitador magnético  
C.31.3  Aparatos e instrumentos  
Los aparatos de medidas descritos se refieren al método más utilizado, es decir, la determinación 
semiautomática.  
Desecadores  
Pesafiltros de forma alta con tapón  esmerilado de 10 ml  
Soportes para desecadores  
Estufa de laboratorio  
Electrodo anular de plata  
La valoración potenciométrica puede efectuarse de tres maneras y el equipo para cada una de ellas es  el 
siguiente:  
C.31.3.1  Determinación manual  
Medidor de pH/mi livoltímetro con escala de lectura de ± 700 mV  
Electrodo de plata con superficie tan grande como sea posible (para mayor estabilidad), y electrodo de 
referencia. O bien un solo electrodo anular de plata combinado.  
C.31.3.2  Determinación semiautomática  
Pues to de valoración automático, compuesto de: aparato de medida (milivoltímetro); aparato de mando 
programable (valorador, generador de impulsos) y bureta de pistón motorizada.  
Imprimente o trazador de curvas (facultativo)        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Electrodo (ver C.31.3.1)  
C.31.3.3  Determinación automática  
Además de los aparatos citados en C.31.3.2:  
Cambiador de muestras automático con unidad de mando y puesto de valoración  
Valorador según C.31.3.2 con bureta de pistón motorizada, pero con distribución y llenado a control 
remoto, así c omo trasmisión de datos a la imprimente.  
Nota:  Según los instrumentos disponibles se puede optar por una solución intermedia.  
C.31.4  Preparación de soluciones  
C.31.4.1  Solución de nitrato de plata 0,1 N  
En un matraz aforado de 1000 ml diluir el contenido d e una ampolleta de solución 0,1 N lista para el uso, o 
bien: si no se dispone de solución valorada lista para el uso, pesar, con una aproximación de 0,5 mg;  16,9890 
g de nitrato de plata previamente secado durante 2 h a 102°C ± 2°C. Disolver en agua desti lada y llevar a 
volumen en un matraz aforado de 1000 ml. Comprobar el título, por valoración según C.31.5.3, de 20 ml de 
solución exactamente 0,1 N de cloruro de sodio.  
C.31.4.2  Solución de cloruro de sodio 0,1 N  
En un matraz aforado de 1000 ml diluir el c ontenido de una ampolleta de solución 0,1 N lista para uso, o 
bien: si no se dispone de solución valorada lista para el uso, pesar, con una aproximación de 0,5 mg; 5,8440 g 
de cloruro de sodio previamente secado durante 2 h a 102 ± 2°C. Disolver en agua de stilada y llevar a 
volumen en un matraz aforado de 1000 ml.  
C.31.4.3  Solución de gelatina aproximadamente 5g/100 ml (volumen aproximado de 15 ml), justo antes del 
uso, disolver, calentando 1 g de gelatina en 20 ml de agua destilada. Enfriar.  
C.31.5  Procedi miento  
La preparación de la muestra, la toma de ensayo y la disolución son idénticas para las tres variantes. No 
es preciso clarificar la solución a valorar, ya que ni el color del producto ni su contenido en sustancias 
insolubles influyen en el potencial final. En general, una adición de ácido nítrico elimina las interferencias.  
C.31.5.1  Toma de ensayo y disolución  
En un recipiente de valoración o en un vaso pesar con una aproximación de 0,1 mg, entre 1 y 5 g de 
producto, según el contenido supuesto en clo ruro y la homogeneidad del producto. Para productos líquidos, 
añadir mediante una pipeta un volumen exacto correspondiente a los mismos criterios. La toma de ensayo 
debe consumir entre 1 y 15 ml de nitrato de plata. Añadir agua destilada para obtener un vo lumen final de 
unos 50 ml, así como un imán mezclador. Colocar sobre un agitador magnético y agitar hasta obtener una 
solución o una suspensión fina, sin grumos. La duración varía entre 1 y 30 min, según la naturaleza del 
producto. Mediante una pipeta auto mática añadir 1 ml de ácido nítrico concentrado y mezclar. El pH de la 
solución debe ser inferior a 1,5. En caso de duda, verificarlo mediante un medidor de pH y, si es necesario 
añadir más ácido nítrico.  
C.31.5.2  Determinación manual  
C.31.5.2.1  Preparació n del aparato  
Conectar los electrodos al aparato de medida y, si es necesario, precalentar el mismo según las 
instrucciones del fabricante. Sumergir el o los electrodos, pero nunca la punta de la bureta, en una mezcla de 
50 ml de agua destilada y 1 ml de á cido nítrico concentrado (solución de calibración) y colocar sobre un 
agitador magnético. Ajustarlo de modo que mezcle bien sin salpicar durante las valoraciones ulteriores. 
Consultar el manual del aparato para ajustar la escala de los milivoltios mediante  una contratensión a fin de 
obtener un potencial cercano al medio de la escala de lectura (ese será el potencial final). Después de esta 
calibración no se deben efectuar más ajustes en el milivoltímetro.  
Ver notas (C.31.8)  
C.31.5.2.2  Valoración  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Sumergir lo s electrodos en la solución acidificada de la toma de ensayo. Si se utiliza un agitador 
magnético y una bureta de pistón, sumergir asimismo la punta de la bureta a media altura del electrodo de 
plata, o a la altura del anillo de plata si se utiliza un elec trodo combinado, a aproximadamente 1 cm delante de 
éste (en el sentido de rotación del líquido). Así es posible valorar con la mayor precisión, ya que el electrodo 
señala inmediatamente un exceso de reactivo.  
Agitando continuamente, sin tocar los electrodo s, valorar mediante la solución de nitrato de plata 0,1 N, 
primero rápidamente hasta unos 100 mV antes del potencial final, luego lentamente con porciones cada vez 
más pequeñas hasta el potencial final, que debe permanecer estable durante al menos 10 segun dos. Una 
ejecución minuciosa con bureta de pistón permite determinar el punto final con una precisión de 0,01 ml.  
Variante: Para determinaciones aún más precisas, sobre todo para determinar contenidos muy bajos en 
cloruro, la valoración a "potencial final"  puede reemplazarse ventajosamente por la valoración "en 
incrementos" o porciones. El volumen de reactivo correspondiente al punto de equivalencia puede encontrarse 
ya sea gráficamente, ya sea por cálculo.  
C.31.5.2.3  Enjuague de los electrodos  
Enjuagar los  electrodos con agua destilada inmediatamente después de cada valoración. Si se pega 
materia grasa a los electrodos, eliminarla sumergiéndolos brevemente en acetona.  
C.31.5.2.4  Verificación del potencial de fin de reacción  
Al efectuar grandes series de val oraciones hasta potencial final, debe verificarse la concordancia entre el 
potencial final fijado y aquel medido por los electrodos sumergidos en la mezcla agua/ácido nítrico. Para ello, 
después de 30 a 60 min de valoración y después de apartar la punta de  la bureta, sumergir los electrodos en 
el vaso que contiene la mezcla agua/ácido nítrico y agitar. Si es necesario, corregir el potencial. (Una 
diferencia de más de 10 mV indica que los electrodos están sucios)  
C.31.5.2.5  Verificación del método  
Periódicam ente valorar según el punto C.31.5.2.2; 20 ml de solución exactamente 0,1 N de cloruro de sodio.  
Al valorar soluciones puras de Cl -, el cloruro de plata precipitado tiende a adherirse a la superficie activa 
del electrodo de plata o al anillo de plata del e lectrodo combinado, lo cual impide el buen funcionamiento. Para 
evitar este inconveniente, se recomienda añadir antes de comenzar la valoración unos mililitros de solución de 
aproximadamente 5g/100 ml de gelatina recién preparada. Corregir mediante un ensa yo en blanco si la 
gelatina contiene cloruro.  
C.31.5.3  Determinación semiautomática  
C.31.5.3.1  Preparación del aparato  
Montar el aparato, efectuar las manipulaciones y verificar el funcionamiento del valorador según las 
instrucciones del fabricante.  
La dis posición de los electrodos y de la punta de la bureta en el recipiente de valoración debe ser 
exactamente la misma como para la valoración manual.  
Antes de cada valoración comprobar:  
El llenado del sistema de la bureta y, si es necesario, la posición de la  llave.  
La puesta a cero de la bureta y, si es necesario, del registrador.  
La posición de la punta de la bureta  
La velocidad del motor de la bureta si es manual. La velocidad mínima ofrece mayor precisión.  
La velocidad del agitador  
La velocidad del papel y  la escala deseada en el registrador.  
C.31.5.3.2  Valoración  
Dado que la valoración es automática se necesita vigilar el aparato cuando menos la primera vez después 
del ajuste. El valorador se para automáticamente en caso de valoración a potencial final; en  cambio, si la 
valoración se registra gráficamente, debe interrumpírsele cuando el milivoltímetro indica unos 120 mV más 
allá del punto final.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Al efectuar grandes series de valoraciones hasta potencial final, debe verificarse la concordancia entre el 
poten cial final fijado y aquel medido por los electrodos sumergidos en la mezcla agua/ácido nítrico. Apartar la 
punta de la bureta. (Ver punto C.31.5.2.4)  
Para la limpieza de los electrodos después de cada valoración, ver C.31.5.2.3 y C.31.8  
C.31.5.4  Determinac ión automática  
Montar y utilizar la instalación siguiendo estrictamente las instrucciones del fabricante.  
Normalmente ajustar el valorador como para la determinación semiautomática. Sólo pueden efectuarse 
valoraciones a potencial final.  
Deben observarse es trictamente todos los detalles indicados más arriba: disposición de los electrodos en 
el recipiente de valoración, tratamiento de los electrodos, etc.; si es necesario puede adaptarse el volumen de 
la solución a valorar a la capacidad del recipiente de val oración. La cantidad de ácido nítrico debe ser de al 
menos 1 ml por 50 ml de solución a valorar.  
Antes de comenzar la valoración, además de los controles indicados bajo C.31.5.3.1, ajustar el 
programador del cambiador de muestras y comprobar los puntos sig uientes:  
Posición correcta de los recipientes de valoración en el cambiador de muestras.  
Cantidad suficiente de reactivo, de agua de enjuague y de papel en el registrador.  
Comprobar el buen funcionamiento del aparato durante la primera valoración. Basta co n verificar de vez 
en cuando la reserva de reactivo, de agua de enjuague y de papel en el registrador, así como el 
funcionamiento correcto de la valoración y de la impresión.  
C.31.6  Cálculo y expresión de resultados  
C.31.6.1  Cálculo  
El contenido de cloruro  en el producto, expresado en porcentaje de masa, es igual a:  
 
donde:  
A = número de ml de solución de nitrato de plata 0,1 N utilizados para la valoración (lectura en la 
bureta o determinados gráficamente o por cálculo)  
35,45 =  peso atómico del cloro  
N = normalidad exacta de la solución de nitrato de plata (0,1)  
m = masa de la toma de ensayo, en g; o volumen en ml.  
 
C.31.6.2  Expresión de resultados  
Expresar los resultados en g de cloruro/100 g o 100 ml.  
Para expresar el resultado en mg de cloruro/100 g , multiplicar el porcentaje por 100.  
Si es necesario, también se puede dar el resultado en cloruro de sodio, reemplazando en la fórmula de 
cálculo, el peso atómico del cloro (35,45) por el del cloruro de sodio (58,44)  
C.31.7  Repetibilidad  
La diferencia ent re dos resultados individuales obtenidos con la misma muestra para ensayo, en las 
mismas condiciones en un corto intervalo de tiempo, no debe exceder 1% de su valor medio.  
La heterogeneidad de una muestra puede influir desfavorablemente en la repetibilidad  y la 
reproducibilidad.  
C.31.8  Notas  
C.31.8.1  Agua destilada  
Utilizar agua destilada totalmente exenta de cloruro.  
C.31.8.2  Mantenimiento de los electrodos  
C.31.8.2.1  Electrodo de plata  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
- Normalmente: enjuagar con agua destilada y secar.  
- Electrodo grasi ento: sumergir en acetona, enjuagar con agua destilada y secar.  
- Electrodo manchado, sucio u oscuro (violeta): frotar con un paño mojado y detergente para vajilla, 
enjuagar con agua destilada y secar.  
- Conservar en un lugar seco, en una caja u otro rec ipiente hermético, a fin de retrasar la oxidación de la 
plata.  
 
C.31.8.2.2  Electrodo de referencia  
- Enjuagar con agua destilada y secar.  
- Para el mantenimiento, sírvase consultar las instrucciones del fabricante. En general debe renovarse 
periódicamente  el electrolito.  
- Conservar en un lugar seco o en agua.  
C.31.8.2.3  Electrodo anular de plata combinado  
- Enjuagar con agua destilada y secar.  
- Tratar la parte de plata como un electrodo de plata.  
- Para el mantenimiento, sírvase consultar las instruccion es del fabricante. En general debe renovarse 
periódicamente el electrolito.  
- Conservar en un lugar seco o en agua.  
C.31.8.2.4  Enjuague de los electrodos  
Cuidado:  Enjuagar los electrodos previamente con agua destilada y apartar la punta de la bureta, ya qu e 
incluso trazas de iones Ag+ o C1 - pueden interferir en la calibración y acarrear errores en toda la serie de 
análisis. Esta observación también es válida para las calibraciones de control, que deben efectuarse 
aproximadamente cada 60 min durante las seri es de análisis. Un desvío importante en estas calibraciones 
indica que los electrodos están sucios.  
C.31.9  Cálculos para la valoración con adiciones constantes  
Después de cada adición, leer el potencial cuando se haya estabilizado. Calcular la diferencia d e potencial 
entre las adiciones. El punto de equivalencia se sitúa entre los dos volúmenes con la mayor diferencia de 
potencial.  
Sean V 1, V2, V3, V4 los volúmenes cuyos potenciales son P 1, P2, P3, P4; las diferencias de potencial son 
P2 - P1, P3 - P2, P4 - P3, y P 3 - P2 es la diferencia mayor. V 2 = V1 + V; V 3 = V2 + V; V 4 = V3 + V; V = volumen 
de la adición.  
El punto de equivalencia exacto se sitúa en:  
 
Ejemplo numérico:  
AgNO3  Lectura  diferencia  
[ml] [mV]  [mV]  
9,0 58,0  
9,1 59,6 1,6 para 0,1 ml AgNo 3 
9,2 62,5 2,9 
9,3 64,6 2,1 
9,4 68,1 3,5 
9,5 70,9 2,8 
9,6 73,9 3,0 
9,7 79,3 5,4 
9,8 83,9 4,6       (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
9,9 92,4 8,5 
10,0 102,7 P 1 10,3 
10,1 114,9 P 2 12,2 
10,2 155,7 P 3 40,8 mayor  
10,3 196,0 P 4 40,3 
10,4 218,5  22,5 
10,5 227,3  8,8 
10,6 234,2  6,9 
 V2 = 10,1  ml V = 0,1 ml  
 
C.32. DETERMINACI ON DE IODO (I-). METODO DEL ELECTRODO DE I ON SELECTIVO  
C.32.1  Fundamento  
La proteína es removida por precipitación con ácido. El iodo en el filtrado se mide usando el electrodo de 
ión selectivo, seguida de otra medición de spués de agregar una solución estándar de adición conocida. Las 
interferencias para las respuestas del electrodo son eliminadas con Nitrato de Níquel.  
C.32.2  Aparatos  
Balanza analítica con sensibilidad de ± 0,1 mg.  
Potenciómetro digital con escala de 0,1 m V. 
Licuadora con motor a prueba de explosión.  
Electrodos:  1) Electrodo de ión -selectivo de I- 
 2) Electrodo de referencia Ag/AgCl  
C.32.3  Reactivos y materiales  
C.32.3.1  Materiales  
Matraces volumétricos  
Frascos de vidrio color ámbar  
Material común de labora torio 
Agitador magnético, cubierto con una capa de estireno espumoso o material aislante para prevenir 
calentamiento de la muestra.  
Papel filtro, de filtración rápida, doblados, con retención de partículas de 20 -25 µm (sustitutible por papel 
filtro No. 541 ) 
C.32.3.2  Reactivos  
C.32.3.2.1  Agua destilada  
C.32.3.2.2  Solución de ácido acético glacial (C 2H40) al 3% v/v. Transferir 15 ml de ácido acético glacial a 
un matraz volumétrico de 500 ml que contenga aproximadamente 250 ml de agua. Llevar a volumen con agu a 
y mezclar bien.  
C.32.3.2.3  Yoduro de potasio (KI) o yoduro de sodio (NaI), se recomienda usar preferentemente 
estándares de referencia.  
C.32.3.2.4  Solución estándar de Iodo  
C.32.3.2.4.1  (Solución I) Solución estándar de referencia de I -, de 0,100 ± 0,001  M (12,6 g de iodo/l) 
estandarizada. Pesar 16,998 g de KI o 14,898 de NaI y disolverlos en un matraz aforado de 1000 ml, llevar al 
volumen con agua, almacenar en un frasco ámbar a temperatura ambiente y protegido de la luz, descartar 12 
meses después de la  estandarización o 6 meses después de haberse abierto el frasco.  
C.32.3.2.4.1.1  Estandarización de la solución I  
Preparar los siguientes reactivos:  
- Solución estándar titulante de nitrato de plata (AgNO 3) 0,0141 M (0,0141). Disolver 2,395 g de AgNO 3 en 
agua destilada y diluir a un litro con agua destilada, almacenar en frasco ámbar.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
- Solución indicadora de cromato de potasio (K 2CrO 4). Disolver 50 g de K 2CrO 4 en un poco de agua, 
agregar de la solución de nitrato de plata anteriormente preparada hasta que s e forme un precipitado rojo. 
Dejar reposar por 12 h, filtrar y diluir a un litro con agua destilada.  
- Acido Sulfúrico (H 2SO4) 0,1 N o  
- Hidróxido de sodio (NaOH) 0,1 N  
Procedimiento: medir lo más exactamente posible 10 ml de la solución I de referencia de  Iodo y transferir a 
un matraz volumétrico de 100 ml y diluir a la marca con agua destilada, llevar a un pH entre 7 y 10 usando 
ácido sulfúrico o hidróxido de sodio 0,1 N. Tomar alícuotas de 25 ml y completar con agua destilada hasta 
aproximadamente 100 ml , agregar 1,0 ml de la solución indicadora de cromato de potasio y titular con la 
solución de nitrato de plata, hasta un vire color rojizo, asegurar la consistencia del punto final. Correr 
paralelamente un blanco de reactivos.  
Cálculos  
 
en donde:  
A = ml g astados de nitrato de plata en la muestra  
B = ml gastados de nitrato de plata en el blanco  
N = Normalidad del nitrato de plata  
126 900 = miliequivalentes del I - por 100 ml  
C.32.3.2.4.2  Solución II. Solución stock de Iodo 101,5 mg/l. Colocar 8 ml de solució n estándar de 
referencia de Iodo dentro de un matraz volumétrico de 1 l. Diluir a volumen con agua y mezclar bien. Guardar 
en frasco de color ámbar o en otro que proteja de la luz. Desechar después de dos semanas.  
C.32.3.2.4.3  Solución III. Solución estánd ar intermedia de I -, 1,0 mg/l. Colocar con una pipeta 5 ml de la 
solución II (stock de Iodo), dentro de un matraz volumétrico de 500 ml. Diluir a un volumen con agua y mezclar 
bien. Guardar en frasco de color ámbar o en otro que proteja de la luz. Desechar  después de dos semanas.  
C.32.3.2.4.4  Solución IV. Solución estándar intermedia de I -, 0,1 mg/l. Colocar con una pipeta 10,0 ml de 
solución III (estándar intermedia de Iodo, dentro de un matraz de 100 ml. Diluir a volumen con agua y mezclar 
bien. Guardar e n frasco de color ámbar o en otro que proteja de la luz. Desechar después de dos semanas.  
C.32.3.2.4.5  Solución V. Solución estándar de adición conocida. Colocar con una pipeta 10 ml de solución 
II (stock de Iodo), dentro de un matraz volumétrico de 1 l. D iluir a volumen con agua y mezclar bien. Tomar 
una alícuota de 100 ml de esta solución y adicionar 1,0 ml de cada una de las siguientes soluciones: AFI, 
solución de nitrato de níquel y agua. Preparar solución fresca diariamente.  
C.32.3.2.5  Solución para gu ardar el electrodo. Solución de Iodo 0,1 mg/l. Diluir 1 ml de la solución II (stock 
de Iodo) a 1 l con agua y mezclar bien. Guardar en frasco de color ámbar o en otro que proteja de la luz. 
Desechar la solución después de 3 meses. Guardar el electrodo de i ón selectivo en esta solución cuando no 
se use, reemplazar la solución semanalmente.  
C.32.3.2.6  Ajustador de fuerza iónica (AFI). Solución de nitrato de sodio 5 M. Disolver 42,5 g de nitrato de 
sodio, NaNO 2, en aproximadamente 50 ml de agua en un matraz vo lumétrico de 100 ml, diluir al volumen con 
agua y mezclar bien.  
C.32.3.2.7  Solución de nitrato de níquel 2,0 M, Ni(NO 3)2 6H20. Disolver 58,2 g de nitrato de níquel 
hexahidratado en aproximadamente 50 ml de agua en un matraz volumétrico de 100 ml. Diluir a volumen con 
agua y mezclar muy bien.  
C.32.4  Preparación de la muestra  
Si la muestra es líquida tomar directamente 100 ml. Si la muestra es sólida, pesar una cantidad de 
muestra tal que contenga entre 75 y 150 µl/l de Iodo y reconstituirla con agua hasta un  volumen de 100 ml.  
Colocar la muestra en un matraz volumétrico de 250 ml, adicionar 10 ml de solución de ácido acético al 
3%, diluir al volumen con agua y mezclar bien. Pasar el contenido del matraz a una licuadora y mezclar a baja 
velocidad por 2 min. Fi ltrar para obtener un filtrado claro, si el filtrado es turbio descartar los primeros 10 ml.  
C.32.5  Determinación        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Precaución: Agitar todas las soluciones con agitador magnético antes de medir el potencial con el electrodo.  
C.32.5.1  Calibración de la pendie nte del electrodo. En un vaso de precipitados tomar 100 ml de la solución 
IV estándar intermedia de iodo (0,1 mg/l), introducir los electrodos y agregar con agitación 1 ml de cada una 
de las siguientes soluciones: solución AFI, solución de nitrato de níque l y agua, cuando la lectura del potencial 
sea estable aproximadamente de 2 a 5 min, registrar hasta décimas de mV como E1.  
Retirar los electrodos, enjuagarlos con agua y secarlos.  
En otro vaso de precipitados colocar 100 ml de la solución III estándar inte rmedia de iodo (1,0 mg/l), 
introducir los electrodos y adicionar con agitación 1 ml de las siguientes soluciones: solución AFI, solución de 
nitrato de níquel y agua, cuando la lectura del potencial sea estable aproximadamente de 2 a 5 min registrar la 
lectura hasta décimas de mV como E2.  
Retirar los electrodos enjuagarlos con agua y secar.  
Calcular la pendiente (S) del par de electrodos de la siguiente manera:  
S=E2 -E1. 
Medir la pendiente cada 4 h cuando el electrodo esté en uso continuo. Usar el valor de la  pendiente más 
reciente para calcular los resultados de las subsecuentes mediciones de iodo.  
C.32.5.2  Valoración de la muestra. En un vaso de precipitados tomar 100 ml de la muestra filtrada y 
agitarla con un agitador magnético, adicionar 1,0 ml de las sig uientes soluciones: solución AFI, solución de 
nitrato de níquel y ácido nítrico concentrado. Colocar los electrodos en la solución a analizar. Cuando la 
lectura del potencial sea estable aproximadamente 2 min registrar la lectura hasta décimas de mV como E 3, 
inmediatamente con una pipeta adicionar 10 ml de la solución V estándar de adición conocida y agitar. 
Cuando sea estable aproximadamente 2 min registrar hasta décimas de mV como E4.  
C.32.5.3  Cálculos  
Calcular el contenido de Iodo (C) de la muestra como sigue:  
C = Q X 0,9854 ml/l X 2,50 X 1,03  
 
donde:  
0,9854 mg/l = concentración de iodo de la solución de estándar de adición conocida  
2,50 = Factor de corrección por dilución de 100 ml de muestra a 250 ml.  
1,03 = Factor de corrección de 100 ml de muestra fi ltrada con el volumen total de reactivos de 103 ml y  
S = E2 - E1 
 
C.33. DETERMINACI ON DE VITAMINA A POR CROMATOGRAF IA LIQUIDA  DE ALTA RESOLUCI ON 
(HPLC EN FASE REVERSA).  
C.33.1. Principio del método.  
Los lípidos son ésteres que en presencia de un álcali cá ustico se hidrolizan liberando el material 
insaponificable, el cual es extraído con un disolvente orgánico. Posteriormente la vitamina A contenida en este 
material, es cuantificada por medio de Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución.  
C.33.2. Equipo.  
C.33.2.1.  Sistema de HPLC que incluye:  
C.33.2.1.1.  Bomba binaria LC.  
C.33.2.1.2.  Inyector automático o manual de muestras.  
C.33.2.1.3.  Detector espectrofotométrico de longitud de onda variable UV -Visible LC.  
C.33.2.1.4.  Integrador computarizado LC.  
C.33.2. 1.5. Columna Octadecil ODS (20), tamaño de partícula 5 m m, longitud 250 mm x diámetro  interno 
4,6 mm.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
C.33.2.2. Balanza analítica, con capacidad de 160 g, lectura 0,1 mg.  
C.33.2.3. Placas de agitación con calentamiento.  
C.33.2.4. Cilindro para gas comprim ido de nitrógeno pureza 95%.  
C.33.2.5. Cilindro para gas comprimido de helio pureza 95%.  
C.33.2.6. Evaporador rotatorio con elevador rápido y baño maría.  
C.33.2.7. Equipo de filtración para la preparación de la fase móvil.  
C.33.2.8. Cronómetro o reloj.  
C.33.3. Materiales.  
C.33.3.1.  Matraces volumétricos actínicos o de color marrón con tapón de vidrio o teflón de 50 y 100 mL.  
C.33.3.2.  Matraces actínicos o de color marrón de fondo plano, cuello corto de 250 mL.  
C.33.3.3.  Matraces, en forma de pera actínicos o de color marrón, de cuello corto y boca esmerilada de 
500 mL (que embone en el rotavapor).  
C.33.3.4.  Matraces volumétricos actínicos o de color marrón de 10 mL.  
C.33.3.5.  Vasos de precipitados de 500 mL.  
C.33.3.6.  Embudo de separación cónico, actínicos o  de color marrón, con llave de teflón 500 mL.  
C.33.3.7.  Embudo tallo corto diámetro 12 cm.  
C.33.3.8.  Tapones de teflón huecos hexagonales o actínicos o de color marrón.  
C.33.3.9.  Refrigerante con macho y hembra, manguito 300 mL, de 50 cm de longitud aproxi madamente.  
C.33.3.10. Manguera de látex.  
C.33.3.11. Papel filtro mediano No. 1 con diámetro de 18,5 cm.  
C.33.3.12. Pipetas volumétricas con marca de 5 y 4 mL.  
C.33.3.13.  Jeringa de vidrio sin aguja desechable de 10 mL.  
C.33.3.14.  Jeringa de vidrio de 50 m L con aguja sin punta.  
C.33.3.15.  Filtros para jeringa (acrodiscos para HPLC) de 0,45 m m de tamaño de poro y diámetro de 25 
mm, para solventes orgánicos y fase móvil.  
C.33.3.16. Membranas de filtración de fluoruro de polivinilideno, utilizada para fases m óviles (solventes 
orgánicos y acuosos), cuyos extractables sean de absorción en UV, u otro filtro para fines similares.  
C.33.3.17.  Magnetos para placa de agitación.  
C.33.4. Reactivos.  
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico y por agua debe entenderse 
agua destilada.  
C.33.4.1. Estándar de retinol (vitamina A) cristalizada (C 20H30O) all trans RETINOL con certificado de pureza.  
C.33.4.2. Hidróxido de potasio en lentejas (KOH).  
C.33.4.3. Alcohol etílico absoluto (C 2H5OH).  
C.33.4. 4. Eter de petróleo intervalo de ebullición 40 - 60°C.  
C.33.4.5. Fenolftaleína en solución etanólica al 1%, indicador ( C 20H14O 4). 
C.33.4.6. Metanol grado HPLC (CH 3OH).  
C.33.4.7. Agua destilada filtrada (sólo para la preparación de fase móvil).  
C.33.4.8. Agua destilada que se utilizará en los lavados del saponificado (verificar que el valor de pH no 
sea mayor de 6,0).  
C.33.4.9. Sulfato de sodio anhidro (Na 2SO4). 
C.33.4.10. Acido ascórbico (C 6H8O6). 
C.33.4.11. Fase móvil metanol: agua (95:5) para HPLC.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Pasar  agua destilada a través de una membrana de filtración para soluciones acuosas. Pasar metanol a 
través de una membrana de filtración para solventes orgánicos. Posteriormente mezclar 50 mL de agua 
destilada en 950 mL de metanol (fase móvil). Degasificar la fase móvil pasando una ligera corriente de gas 
helio o por ultrasonido 15 minutos a temperatura ambiente.  
C.33.4.12. Soluciones patrón de vitamina A.  
C.33.4.12.1. Solución concentrada (150 m g equivalentes de retinol).  
Justo antes de emplearse, pesar 15 mg  de retinol cristalizado (A - OH) y registrar el peso exacto. Colocar 
el estándar pesado en un matraz volumétrico de 100 mL. Disolver con metanol y llevar al volumen.  
C.33.4.12.2. Solución intermedia (15 m g equivalentes de retinol).  
Diluir 5 mL de la solu ción concentrada a 50 mL con el mismo metanol para obtener una solución de 
aproximadamente 50 UI/mL.  
C.33.4.12.3. Solución de trabajo (6 m g equivalentes de retinol).  
Añadir 4 mL de la solución estándar intermedia al matraz marcado como estándar y adiciona r los reactivos 
al igual que al blanco y muestra como se indica en el apartado de saponificación. Esta solución tendrá 
aproximadamente 20 UI/mL de vitamina A, al final del proceso de recuperación, en el matraz volumétrico  de 
10 mL.  
Nota 1:  
Si el certificad o de % de pureza en el estándar es inferior al 85% no debe prepararse la solución patrón, 
siendo necesario un nuevo estándar de otro lote con una pureza superior a la antes indicada.  
Nota 2:  
La vitamina A -OH (A -alcohol) se oxida con gran rapidez y es muy s ensible a la luz. Al abrir una ampolleta 
nueva de vitamina A -cristalizada, pesar la cantidad de estándar requerida y guardar la ampolleta bajo 
atmósfera de nitrógeno o en condiciones similares.  
C.33.5.  Procedimiento.  
Nota 3:  
La vitamina A es sensible a la luz. Utilizar material actínico o de color marrón o bien, proteger el material 
con papel aluminio. Por otra parte efectuar las evaporaciones con rotavapor a una temperatura máxima de 
40ºC. No evaporar a sequedad. Romper el vacío e inmediatamente introducir  nitrógeno al sistema o al matraz. 
Evaporar los últimos mililitros mediante una corriente de nitrógeno sin llegar a la sequedad.  
C.33.5.1. Toma de muestra.  
En el caso de productos deshidratados, reconstituir con agua, de acuerdo con las instrucciones señal adas 
en la etiqueta o 130 g del producto llevados a 1 L con agua. Disolver y agitar la muestra a fin de 
homogeneizarla por completo.  
Medir de preferencia por duplicado una cantidad de muestra tal,  que contenga de 30 a 90 m g equivalentes 
de retinol (100 a 3 00 UI de vitamina A) o la cantidad correspondiente a lo declarado en la etiqueta de la 
muestra. En caso de no contar con esta información no es conveniente realizar el análisis.  
C.33.5.2. Saponificación.  
C.33.5.2.1.  Marcar 4 matraces actínicos de cuello co rto y esmerilado con fondo plano de 250 mL (cuando 
la muestra se trabaje por duplicado) de la siguiente manera: blanco, estándar y muestra.  
C.33.5.2.2.  Añadir los siguientes reactivos a cada uno de los matraces antes mencionados: 7 g de 
hidróxido de potasi o y a continuación añadir 60 mL de alcohol absoluto. Mezclar para disolver. Agregar 0,5 g 
de ácido ascórbico así como una barra magnética. Adicionar una ligera corriente de nitrógeno a cada uno de 
los matraces.  
C.33.5.2.3.  Montar un sistema de reflujo y ca lentar durante 30 minutos en placas de calentamiento o baño 
de agua en ebullición con agitación constante.  
Nota 4:  
Durante la saponificación, asegurar una buena agitación del medio de reacción.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
C.33.5.3.  Extracción del insaponificable.  
C.33.5.3.1. Una vez concluido el tiempo de saponificación, enjuagar con máximo 30 mL de agua destilada 
(evitar el exceso de agua para prevenir la formación de emulsiones) por las paredes internas del refrigerante 
sin quitar el matraz del saponificado. Enfriar el matraz aún in stalado al refrigerante sumergiéndolo 
parcialmente en un vaso de precipitados que contenga agua fría, lo anterior con la finalidad de llevarlo a 
temperatura ambiente, evitando enfriarlo demasiado. Trasvasar la suspensión a un embudo de separación de 
500 mL . 
C.33.5.3.2. Enseguida enjuagar el matraz con 100 mL de éter de petróleo que se añaden al embudo de 
separación. Extraer la vitamina A agitando ligeramente. Dejar separar las fases. Vaciar la fase acuosa a otro 
embudo de 500 mL. Recoger la fase orgánica a un tercer embudo de separación de 500 mL. Repetir la 
operación dos veces más, enjuagando el matraz con dos porciones de 100 mL de éter cada una.  
C.33.5.3.3. Efectuar esta extracción 3 veces en total (un lavado de 50 mL y 2 lavados de 100 mL). Hacer 
las agi taciones con mucho cuidado para evitar emulsiones.  
C.33.5.3.4. Lavar la solución orgánica con porciones de 100 mL de agua adicionándola por las paredes del 
embudo, agitando suavemente, hasta que el agua del lavado ya no dé reacción colorida con la fenolfta leína. 
Después del último lavado, esperar de 15 a 30 minutos antes de vaciar la fase acuosa y volver a revisar con el 
indicador que no exista reacción colorida.  
C.33.5.3.5. Filtrar la solución lavada en continuo a través de un filtro que contiene aproximad amente 10 g 
de sulfato de sodio anhidro y recoger el filtrado en un matraz de pera de 500 mL, sin dejar secar el filtro. Al 
final enjuagar el sulfato de sodio contenido en el filtro con 50 mL de éter de petróleo.  
C.33.5.3.6. Evaporar el disolvente en un ro tavapor a 40ºC y dejar un remanente de aproximadamente 6 
mL. Tratar de reducir esta cantidad del disolvente a un volumen de 2 mL aproximadamente mediante una 
corriente de nitrógeno.  
C.33.5.3.7. Disolver el remanente obtenido con 3 mL de la fase móvil y rec olectar cuantitativamente la 
solución con una jeringa de vidrio. Filtrar la solución a través de un filtro acrodisco de 0,45 µm a un matraz 
actínico de 10 mL. Lavar el matraz pera con porciones de 2 mL de fase móvil y repetir el mismo procedimiento 
hasta l legar al aforo del matraz. Hacer lo mismo para cada filtro de blanco, estándar y probar por duplicado.  
Nota 5:  
Se recomienda acondicionar el acrodisco de 0,45 m m con metanol antes de utilizarlo en la filtración del 
recuperado.  
C.33.5.4. Condiciones cromat ográficas.  
C.33.5.4.1.  Fijar los siguientes parámetros de acuerdo con las instrucciones de operación del 
cromatógrafo.  
Columna Octadecil ODS (20), tamaño de partícula 5 m m, longitud 250 mm x diámetro interno 4,6 mm.  
Loop de inyección: 20 m L. 
Fase móvil: m etanol: agua 95:5.  
Flujo: 1 mL/min.  
Detector: Longitud de onda ajustada a 325 nm.  
Registrador: 5 mm/min.  
C.33.5.5.  Determinación de vitamina A.  
Inyectar dos veces los siguientes analitos: primer o 20 mL del blanco, después 20 m L de la solución 
estándar para  HPLC (20 UI/mL aprox.) y por último 20 m L de la muestra (del saponificado).  
C.33.5.5.1. En el cromatograma, identificar el pico y tiempo de retención de la vitamina A correspondiente 
al estándar. Con estos datos, identificar el pico y tiempo de retención  de la vitamina A contenida en la 
muestra.  
C.33.5.5.2. Calcular la altura del pico de la solución patrón y de las muestras en los cromatogramas 
obtenidos.  
C.33.6. Cálculos.  
El contenido de vitamina A, expresado en Unidades Internacionales por L de producto  es igual a:        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
En donde:  
m = toma de ensayo en g o mL.  
hP = altura del pico de la muestra, en mm.  
hS = altura del pico de la solución estándar final, en mm.  
C = concentración de la solución estándar final inyectada, en UI/mL para la vitamina A.  
V = volumen d e solución estándar final, en el cual ha sido diluido el remanente antes de la cromatografía.  
Los resultados deben reportarse como m g equivalentes de retinol.  
C.33.7. Expresión de resultados.  
m g equivalentes de retinol/ L  
1 UI = 0,3 m g equivalentes de r etinol (all trans RETINOL)  
 
C.34. DETERMINACI ON DE LAS VITAMINAS A Y E POR CROMATOGRAF IA LIQUIDA DE ALTA 
PRESI ON (HPLC EN FASE NORMAL)  
C.34.1 Fundamento  
Saponificación de la muestra; extracción de los compuestos insaponificables; evaporación y redisolució n 
en n-hexano e inyección en la columna en fase normal  
C.34.2 Material y Equipo  
Todo el material utilizado debe estar estéril  
Instalación HPLC isocrática  
Uno o dos registradores  
Balanza analítica, con capacidad de 160 g, lectura 0,1 mg  
Balanza de precisión , con capacidad de 1600 g lectura 0,01 g  
Estufa de laboratorio (para productos con almidón)  
Baño maría con agitadores magnéticos, 4 plazas  
Evaporador rotatorio con elevador rápido y baño  
Matraces aforados, vidrio marrón, tapón de vidrio de 50 y 100 ml  
Matraz de fondo plano, cuello corto, 250 ml  
Matraces, en forma de pera, vidrio marrón de 10 y 500 ml  
Embudo de separación cónico, vidrio marrón, con llave de 500 ml  
Embudo, vidrio marrón, diámetro 12 cm  
Tapones huecos hexagonales, vidrio marrón  
Refrigerante co n macho y hembra, manguito 300 mm  
Alargadera para introducción de gas  
Ampolleta de vidrio marrón de 5 ml  
Filtro plisado mediano con diámetro de 18,5 cm  
Pipetas aforadas, con una marca, de 3 y 5 ml  
Jeringuillas de 1 y 5 ml  
Aguja para jeringuillas  
Cilindro p ara gas comprimido, nitrógeno  
Monodetentor para gas comprimido, N2  
Filtro de 0,45 µ de diámetro  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Columna de 5 µ, 4,6 X 250  
Aparato de filtración  
Filtro 0,5 µ  
C.34.3 Reactivos  
Retinol (vitamina A) cristalizada (C 20H30O) 
DL-alfa-tocoferol (vitamina E) para fi nes bioquímicos (C 29H50O2) 
Hidróxido de potasio en lentejas para análisis (KOH)  
Alcohol etílico absoluto, para análisis (C 2H5OH) 
Hidroquinona (C 6H4(OH) 2) 
Eter de petróleo para análisis intervalo de ebullición 40 - 60ºC  
Fenolftaleína en solución etanólica a l 1%, indicador ((C 6H4OH) 2COC 6H4CO) 
diastasa (para productos de almidón)  
2-propanol ((CH 3)2CHOH)  
n-hexano (CH 3(CH 2)4CH3) 
Sulfato de sodio anhidro para análisis (Na 2SO4) 
Nitrógeno (N 2) 
Acido ascórbico (C 6H8O6) 
C.34.3.1 Fase móvil para HPLC, 2 -propanol al 1%  en n-hexano.  
Degasificar el n -hexano bajo presión reducida y pasar a través de un filtro. Mezclar 10 ml de 2 propanol 
con 990ml de n -hexano degasificado.  
C.34.3.2 Solución patrón de vitamina A  
C.34.3.2.1 Solución concentrada  
Justo antes del uso, pesar en un matraz aforado de 100 ml aproximadamente 15 mg de retinol cristalizado 
(A - OH) y tomar el peso exacto, disolver en n -hexano y llevar a volumen con el mismo disolvente (= solución 
de aproximadamente 500 UI/ml).  
Esta solución permanece estable 1 semana a  4ºC. 
C.34.3.2.2 Solución para HPLC  
Diluir 5 ml de solución C.34.3.2.1 a 50 ml con el mismo disolvente para obtener una solución de 
aproximadamente 50 UI/ml  
Medir la extinción (E) a 325 nm y determinar la concentración de la vitamina A -OH, en UI/ml, según:  
 1% 
E1cm en n-hexano = 1815  
Para 1 UI A -OH/ml E = 0,0545  
Si el contenido es inferior a 85 % del valor teórico, no puede utilizarse esta solución patrón, es necesaria 
una nueva preparación. Si se obtiene otro valor debe considerarse en los cálculos finales . 
NOTA:  
La vitamina A -OH (A - alcohol) se oxida con gran rapidez y es muy sensible a la luz. Al abrir una nueva 
ampolleta de vitamina A - alcohol cristalizada, distribuir el contenido a razón de 50 mg en pequeñas 
ampolletas marrones. Trabajar en una cámara  oscura. Las ampolletas deben cerrarse inmediatamente bajo 
nitrógeno.  
C.34.3.3 Solución patrón de vitamina E        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
En un matraz aforado de 100 ml, pesar exactamente 100 mg de alfa - tocoferol (E -OH), disolver en  n-
hexano y llevar al volumen con el mismo disolven te. 
Diluir esta solución 5 veces con el mismo disolvente para obtener una solución de 0,2 mg/ml. Esta solución 
permanece estable 1 semana a 4ºC.  
C.34.4 Procedimiento  
NOTAS:  
Las vitaminas A y E son sensibles a la luz. Utilizar material de vidrio marrón, o p roteger el material 
corriente con papel aluminio.  
Efectuar todas las evaporaciones de disolventes bajo presión reducida a una temperatura máxima de 
40ºC. No debe evaporarse a seco. Romper el vacío introduciendo nitrógeno en el sistema. Evaporar los 
últimos  mililitros mediante una corriente de nitrógeno.  
C.34.4.1 Toma de ensayo  
Mezclar o moler la muestra a fin de homogeneizarla por completo. Pesar, con una precisión de 10 mg, una 
toma de ensayo que contenga 100 - 300 UI de vitamina A y 0,5 - 1 mg de vitamina  E, lo que corresponde en 
general a 10 g.  
C.34.4.1.1 Productos con almidón  
En un matraz redondo de fondo plano de 250 ml con cuello esmerilado, mezclar la toma de ensayo con 
10% de su peso de diastasa. Añadir máximo 30 ml de agua destilada a 45 - 50 ºC. Me zclar bien para obtener 
una suspensión homogénea. Eliminar el aire del matraz mediante nitrógeno, tapar y colocar el matraz durante 
30 minutos en una estufa a 45 ºC.  
C.34.4.1.2 Productos sin almidón  
En un matraz redondo de fondo plano de 250 ml con cuello esmerilado, mezclar la toma de ensayo con 
máximo 30 ml de agua destilada a 45 - 50 ºC.  
C.34.4.2 Saponificación  
Añadir 7 g de hidróxido de potasio grado analítico en el matraz (C.34.3.3.1 o C.34.3.1.2), y mezclar para 
disolver. A continuación añadir 60 ml d e alcohol absoluto y 0,5 g de ácido ascórbico o hidroquinona.  
Montar sobre un sistema de reflujo, introducir una ligera corriente de gas nitrógeno y calentar durante 30 
minutos en un baño maría ebulliendo provisto de agitadores magnéticos.  
NOTA:  
Durante la  saponificación, asegurar una buena agitación del medio de reacción.  
C.34.4.3 Extracción del insaponificable  
Una vez terminada la saponificación, enfriar el matraz a temperatura ambiente y trasvasar la suspensión a 
un embudo de separación de 500 ml.  
Enjuag ar con máximo 30 ml de agua fría en 3 porciones de 10 ml que se añaden al contenido del embudo 
de separación. Evitar un exceso de agua, ya que favorece la formación de emulsiones.  
Enseguida enjuagar el matraz con 50 ml de éter de petróleo (rango de 40 - 60 ºC) en varias porciones que 
se añaden al embudo de separación. Extraer las vitaminas A y E agitando ligeramente. Dejar separar las 
fases. Vaciar la fase acuosa a otro embudo de separación de 500 ml. Recoger la fase orgánica en un tercer 
embudo de separaci ón de 500 ml.  
Efectuar esta extracción 5 veces en total. Haciendo las agitaciones con mucho cuidado para evitar 
emulsiones.  
Lavar la solución orgánica con porciones de 100 ml de agua adicionándola por las paredes del embudo, 
sin agitar, hasta que el agua d e lavado ya no dé reacción coloreada con fenolftaleína. Después del último 
lavado, esperar al menos 15 minutos antes de vaciar la fase acuosa.  
Filtrar la solución lavada en continuo a través de un filtro que contiene aproximadamente 5 g de sulfato de 
sodio  anhidro o en un papel separador de fases tipo 1 PS, y recoger el filtrado en un matraz en forma de pera 
de 500 ml, sin dejar secar el filtro. Y al final enjuagar el filtro con 50 ml de éter de petróleo.  
Evaporar el disolvente bajo presión reducida en un r otavapor a 40ºC, y eliminar los últimos mililitros 
mediante una corriente de nitrógeno.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Disolver el residuo en 3 ml de la fase móvil (C.34.2.1) y filtrar la solución inmediatamente a través de un 
filtro de 0,45 µ de tamaño de poro y adecuado para solventes  orgánicos, recoger el filtrado en un matraz. El 
filtrado debe ser limpido.  
La solución está lista para la cromatografía.  
C.34.5 Cromatografía  
Condiciones:  
Columnna:  Spherisorb Sílice, 5 µm, 4,6 X 250 mm  
Loop de inyeccción:  20 µl  
Fase móvil:  1% 2 -propano l en n -hexano (34.3.1)  
Caudal:  2 ml/min  
Detector:  ya sea:  espectrofotómetro, longitud de hondavariable, ajustada a 292 nm, 0,2 
AUFS  
ya sea: espectrofotómetro, longitud de onda variable, ajustada a 325 nm, 0,2 
AUFS, para la vitamina A, en serie con espect rofluorímetro para vitamina E.  
Ex: 294 nm, Em: 236 nm.  
Registrador:  10 mm/min  
 
Inyectar primero 20 µl de solución patrón de vitamina E (C.34.3.3) y determinar el tiempo de retención: 
debe ser aproximadamente 8 min. En seguida inyectar 20 µl de extracto obtenido bajo C.34.3.  
C.34.6 Cálculo, expresión e interpretación de los resultados  
C.34.6.1 Evaluación  
Identificar los picos de las vitaminas A y E en el cromatograma de la muestra mediante el tiempo de 
retención definido por cromatografía de la solución d e la muestra y de la solución patrón correspondiente.  
El contenido en vitamina A, expresado en Unidades Internacionales por 100 g de producto, y el contenido 
en vitamina E, expresado en mg por 100 g de producto, es igual a:  
hp x C x V x 100  
hs x m  
En donde : 
m = toma de ensayo, en g.  
hP = altura del pico de la muestra, en mm  
hS = altura del pico de la solución patrón, en mm  
C = concentración de la solución patrón inyectada, en UI/ml para la vitamina A, y en mg/ml para la vitamina E  
V = volumen, en ml, en el cual ha sido diluido el residuo antes de la cromatografía (3.3)  
C.34.6.2 Límite de detección de acuerdo a la sensibilidad del equipo.  
1 mg de D - α - tocoferil acetato es = 1 UI de vit. E  
1 mg de DL - α - tocoferol = 1,1 UI de vit E  
Vitamina A: aproximadamente 50 UI/ 100 g  
Vitamina E: espectrofotometría: aprox. 0,5 mg/100 g  
fluorimetría : aprox. 0,2 mg/100 g  
C.34.6.3 Repetibilidad  
La diferencia entre  dos resultados individuales obtenidos con la misma muestra para ensayo, en las 
mismas condiciones (analista, aparato, laboratorio) en un corto interval o de tiempo, no debe exceder 10 % de 
la media entre ambos resultados.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Cuando las vitaminas han sido añadi das por mezcla en seco, la repetibilidad está fuertemente influida por 
el grado de homogeneidad del producto.  
NOTA: Para la determinación de vitamina A, en leche seguir la metodología anterior leyendo con el 
detector de UV a 325 nm.  
La determinación de vit amina A y E puede hacerse de manera conjunta contando con un detector de UV 
programable o con detector de UV y un fluorómetro. Si no se cuenta con detector de UV programable o 
fluorómetro, inyectar dos veces la muestra para determinar las vitaminas por sep arado.  
C.34.6.4 El contenido de tiamina en los productos objeto de esta Norma no debe ser inferior a 100 g/100 
g del producto listo para ser consumido.  
Debe decir:  
C.34.6.5 El contenido de tiamina en los productos objeto de esta N orma no debe ser inferior a 100 g/100 kcal.  
C. 35  DETERMINACI ON DE GRASA  
C.35.1 Método del Extracto etéreo. Para productos como chocolates, granos, polvos con chocolate, 
entre otros.  
C.35.1.1 Fundamento  
El método para la extracció n de los lípidos libres, utiliza un agente deshidratante que absorbe la humedad 
de la muestra y arena de mar que provoca un medio poroso que permite que el disolvente pase con mayor 
facilidad a través de ésta, extrayendo la grasa presente. En la extracción  de lípidos combinados se utiliza el 
medio ácido para disolver las proteínas y así permitir la separación de la grasa.  
C.35.1.2 Reactivos y materiales  
C.35.1.2.1 Reactivos  
Acido clorhídrico (HCl) diluido al 33% v/v. Diluir 100 ml de HCl concentrado con 200  ml de agua destilada.  
Arena de mar tratada  
Eter de petróleo G.R. (P.E. 30 - 60°C), libre de grasa o éter etílico G.R. libre de peróxidos.  
Sulfato de sodio anhidro G.R.  
Tierra de diatomáceas (celite 503)  
C.35.1.2.2 Materiales  
Agitador de vidrio de 20 cm  
Algodón libre en grasa  
Cartucho de extración de tamaño adecuado al extractor  
Cuerpo de ebullición  
Embudo de vidrio de 9 cm de diámetro  
Extractor de Soxhlet  
Matraz de boca esmerilada 24/40 de 250 ml  
Matraz Erlenmeyer de 250 ml  
Papel filtro Whatman No. 1 y No.  540 
Papel indicador de pH  
Material común de laboratorio  
Vaso de precipitado de 50 ml  
Vidrio de reloj de 4 cm de diámetro  
C.35.1.3 Aparatos e instrumentos  
Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg  
Baño de agua  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
Estufa con regulador de temperatura para ma ntener a 100 ± 2°C  
C.35.1.4 Procedimiento  
C.35.1.4.1 Extracción de lípidos libres  
Pesar de 1 -2 g de muestra finamente molida dentro de un cartucho de extracción, agregar igual cantidad 
de sulfato de sodio, mezclar con un agitador de vidrio.  
Agregar de 1 -2 g de arena de mar, mezclar nuevamente y sin retirar el agitador, colocar el cartucho en un 
vaso de precipitado de 50 ml. Secar en la estufa durante 6 h.  
Cubrir la mezcla contenida en el cartucho, con una porción de algodón, colocar en el extractor de Soxhl et, 
ajustar en la parte inferior del extractor un matraz con cuerpos de ebullición a peso constante. Lavar el vaso 
donde fue secada la muestra con varias porciones de éter adicionando los lavados al extractor. Agregar 
suficiente éter hasta obtener de 2 -3 descargas del extractor. Conectar el refrigerante al extractor y hacer 
circular el agua. Calentar el matraz hasta obtener un mínimo de condensación de 3 -6 gotas por segundo.  
Efectuar la extracción durante 4 -6 h. Suspender el calentamiento, quitar el extract or del matraz y dejar 
caer una gota de éter del extractor sobre un papel filtro o un vidrio de reloj, si al evaporarse el éter se observa 
una mancha de grasa, ajustar el Soxhlet de nuevo al matraz y continuar la extracción.  
Terminada la extracción, evapora r a baja temperatura el disolvente del matraz; secar en la estufa a 100°C 
hasta peso constante, enfriar en desecador y pesar.  
C.35.1.4.2 Extracción de lípidos combinados  
Pesar de 1 -2 g de muestra finamente molida dentro de un matraz Erlenmeyer de 250 ml, a gregar 50 ml de 
HCl diluido, unos cuerpos de ebullición y tapar con un vidrio de reloj.  
Calentar en baño de agua durante una hora manteniendo el volumen constante por la adición de agua 
destilada.  
Agregar 150 ml de agua caliente, alrededor de un gramo de t ierra de diatomáceas o alrededor de 100 cm2 
de papel filtro cortado en pequeñas piezas.  
Filtrar a través de papel filtro Whatman No. 540 húmedo de 15 cm de diámetro (si se prefiere se puede 
usar doble), lavar el matraz Erlenmeyer y el vidrio de reloj con a gua caliente agregando los lavados al papel 
filtro. Secar el matraz y el vidrio de reloj en la estufa.  
Continuar lavando el papel filtro con agua caliente hasta que el filtrado esté libre de ácido.  
Secar el papel filtro a 120°C sobre un vidrio de reloj o a  60°C por toda la noche si fue agregado de papel 
filtro cortado en piezas.  
Con la ayuda de unas pinzas pasar el papel filtro seco al cartucho de extracción, tapar con una porción de 
algodón y colocar en el extractor de Soxhlet, ajustar en la parte inferior  del extractor un matraz con cuerpos de 
ebullición a peso constante. Lavar el matraz Erlenmeyer y el vidrio de reloj secos con éter adicionando los 
lavados al extractor. Agregar suficiente éter hasta obtener de 2 -3 descargas del extractor.  
Proceder como se  indica en la extracción de lípidos libres donde dice: "Conectar el refrigerante al 
extractor..."  
C.35.1.4.3 Cálculos  
% de grasa = PG - PB X 100  
PM 
En donde:  
PG = Peso del matraz con grasa seca en g  
PB = Peso del matraz con cuerpos de ebullición a peso con stante en g  
PM = Peso de la muestra en g  
C.35.2 M ETODO DE ROESE -GOTTLIEB (HIDR OLISIS ALCALINA). PARA F ORMULAS PARA 
LACTANTES, F ORMULAS DE CONTINUACI ON, LECHES EN POLVO, ENTRE OTROS.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
C.35.2.1 Fundamento  
El método descrito es una modificación al de Roese -Gottlieb. Se utiliza amoniaco para suavizar la caseína, 
alcohol etílico para romper la emulsión y la combinación grasa -proteína, así como favorecer la extracción  de 
la grasa por el éter etílico. Se usa también éter de petróleo que disminuye la solubilidad de l éter etílico en la 
capa acuosa. Extraída la grasa ésta se estima por diferencia de peso.  
C.35.2.2  Reactivos y materiales  
C.35.2.2.1 Reactivos  
Hidróxido de amonio G.R.  
Alcohol etílico de 96°  
Eter etílico (libre de peróxidos)  
Eter de petróleo (P.E. 30 - 60°C) 
C.35.2.2.2 Materiales  
Tubos de Roese -Gottlieb o de Mojonier  
Vasos de precipitados de 125 ml  
Pipetas de 10 ml graduadas en 0,1 ml  
Perlas de vidrio  
C.35.2.3 Aparatos e instrumentos  
Desecador  
Estufa para secar que alcance una temperatura entre 70 a 80°C  
Baño de agua caliente o placa caliente  
Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg  
C.35.2.4 Procedimiento  
C.35.2.4.1  Pesar de 1 a 2 g de muestra y colocarlos en el tubo, agregar 9 ml de agua hirviendo y agitar 
vigorosamente hasta que la muestra esté disuel ta, enfriar a la temperatura ambiente. Agregar 1,5 ml de 
hidróxido de amonio y mezclar perfectamente. Agregar 10 ml de alcohol etílico, tapar y agitar fuertemente; 
agregar 25 ml de éter etílico, tapar y agitar vigorosamente por 90 segundos. Agregar 25 ml d e éter de 
petróleo, tapar y volver a agitar suavemente por 90 segundos. Centrifugar a 600 rpm o dejar reposar hasta 
que el líquido superior esté prácticamente claro. Decantar la capa etérea en un vaso de precipitado a peso 
constante. Lavando el labio y el tapón del tubo con una mezcla de partes iguales de los dos éteres. Agregar 
estos lavados al vaso. Repetir la extracción del líquido sobrante en el tubo, dos veces más utilizando 25 ml de 
cada disolvente. Efectuar una tercera extracción con 20 ml de cada di solvente. Evaporar los disolventes del 
vaso en una placa caliente o un baño de vapor, a una temperatura apropiada que permita la eficiente 
evaporación, secar la grasa en estufa a 80°C, enfriar y pesar.  
C.35.2.4.2  Después de introducir el producto en el tub o Mojonnier, añadir aproximadamente 0,1 g de 
amilasa y un agitador magnético, para facilitar la suspensión, luego adicionar de 8 a 10 ml de agua destilada a 
45°C, evitando que el nivel de agua suba demasiado.  
Colocar el tubo Mojonnier tapado por 2 h al bañ o de agua a 65°C. Remuévase ligeramente de vez  en 
cuando.  
Comprobar que el almidón se haya degradado por completo: al añadir dos gotas de solución de yodo 
aproximadamente 0,1 N no debe formarse coloración azul. En caso contrario, volver a colocar el tubo a l baño 
de agua hasta que desaparezca la coloración. Enfriar el tubo Mojonnier y continúe con el procedimiento.  
C.35.2.5 Cálculos  
 PG x 100  
% G=___________  
  Pm 
En donde:  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
% G = Por ciento de grasa  
PG = Peso de la grasa extraída  
PM = Peso de la muestra  
C.35. 2.6 Reproducción de la prueba  
En la reproducción de la prueba, la diferencia máxima permisible para la determinación efectuada por 
duplicado, no debe ser mayor de 0,1%, en caso contrario se recomienda repetir la determinación.  
C.35.3 POR HIDR OLISIS ACIDA. PARA HARINAS, PAN, CEREALES Y AQUELLOS PRODUCTOS 
CUYA PRESENTACI ON SEA EN GALLETAS, BARRAS, ENTRE OTROS.  
C.35.3.1 Fundamento  
Se basa en la disolución de la proteína en el ácido y la grasa que se separa, puede ser extraída utilizando 
como disolvente orgánic o, una mezcla de éter etílico -éter de petróleo.  
C.35.3.2 Reactivos y materiales  
C.35.3.2.1 Reactivos  
Acido clorhídrico (25+11) v/v  
Alcohol etílico, G.R.  
Eter de petróleo (P.E. 40 - 60°C), G.R. libre de grasa  
Eter etílico, grado reactivo libre de grasa  
C.35 .3.2.2 Materiales  
Algodón absorbente libre de grasa  
Cuerpos de ebullición  
Embudo de filtración, tallo corto  
Probetas graduadas  
Tubo de extracción de Mojonnier  
Vasos de precipitados, cápsulas de vidrio, níquel o aluminio de 125 ml  
Material común de laborato rio 
C.35.3.3 Aparatos e instrumentos  
Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg  
Baño de agua con sistema eléctrico para mantener a 70 - 80°C  
Estufa con regulador de temperatura para mantener a 100°C  
C.35.3.4 Procedimiento  
C.35.3.4.1  Pesar de 1 a 2 g de m uestra finamente molida en un vaso de precipitado de 50 ml (la muestra 
puede ser pesada directamente en el tubo de extracción de Mojonnier), agregar 2 ml de alcohol etílico y agitar 
adecuadamente para humedecer la muestra. Agregar 10 ml de ácido clorhídric o 25:11, 2 cuerpos de 
ebullición, mezclar y colocar en baño de agua durante 30 -40 min, agitando ocasionalmente durante este 
tiempo. Agregar 10 ml de alcohol etílico, mezclar y dejar enfriar.  
C.35.3.4.2  Vaciar la mezcla al tubo de extracción, lavar el vaso con 3 porciones y un total de 25 ml de éter 
etílico (pasando cada lavado al tubo de extracción). Tapar el tubo con un tapón de hule sintético y agitar 
vigorosamente durante un min. Agregar 25 ml de éter de petróleo y agitar nuevamente durante un min. Dejar  
el tubo en posición vertical hasta que el líquido superior esté prácticamente claro o centrifugar 20 min a 
aproximadamente 600 rpm.  
C.35.3.4.3  Decantar tanto como sea posible la solución éter -grasa, sobre un filtro de algodón empacado 
con firmeza en el em budo de filtración, recibiendo el éter en un vaso o cápsula de 125 ml a peso constante 
(puede ser llevado a peso constante con cuerpos de ebullición). Lavar la boca del tubo de extracción y el 
tapón con varios ml de una mezcla de disolventes en partes igua les recibiendo en el mismo vaso.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
C.35.3.4.4  Reextraer el líquido sobrante del tubo dos veces más, utilizando para este propósito 15 ml de 
cada disolvente en cada ocasión. Agitar bien después de cada adición de éter. Decantar la solución éter -grasa 
en el mi smo embudo utilizado anteriormente; lavar el embudo y el tallo del embudo con varios ml de una 
mezcla de disolventes en partes iguales.  
C.35.3.4.5  Evaporar la mezcla de disolventes lentamente sobre baño de vapor (en un sistema de 
extracción) secar la grasa  en una estufa a 100°C hasta peso constante, enfriar en desecador y pesar.  
Corregir el resultado por la determinación de un blanco de reactivos.  
C.35.3.5 Cálculos  
     P2 - P1 
% de grasa =  Pm 
donde:  
P2 = Peso del vaso o cápsula con grasa a peso constante  
P1 = Peso del vaso o cápsula vacía a peso constante  
PM = Peso de la muestra en g  
PRECAUCION: El éter etílico es un disolvente orgánico extremadamente flamable. Se pueden formar 
peróxidos inestables cuando se almacenan mucho tiempo o se exponen a la luz sola r. Puede reaccionar con 
explosión cuando está en contacto con el óxido de cloro, litio o con agentes fuertemente oxidantes. Por ello es 
recomendable el empleo de extractores de vapores efectivos y evitar la electricidad estática.  
C.36. DETERMINACI ON DE ARS ENICO, CADMIO, COBRE, CROMO, ESTAÑO, HIERRO, MERCURIO, 
NIQUEL, PLATA, PLOMO, SELENIO Y ZINC  
C.36.1 Principio del método  
La propiedad que tienen los elementos en su estado atómico basal de absorber radiación 
electromagnética emitida por una fuente constitui da por el mismo elemento de tal manera que al hacer pasar 
un haz de luz monocromática de una frecuencia específica pueda ser absorbido por el analito que se 
encuentra presente. La cantidad de radiación absorbida es proporcional a la concentración de los át omos de 
acuerdo a la Ley de Lambert -Beer.  
C.36.2 Equipo  
C.36.2.1 Espectrofotómetro de absorción atómica equipado con:  
C.36.2.1.1 Sistema de atomización por flama directa.  
C.36.2.1.2 Horno de grafito.  
C.36.2.1.3 Sistema generador de hidruros y vapor frío.  
C.36.2.1.4 Sistem a de corrector de fondo (Deuterio, Zeeman o Smith -Hieftje).  
C.36.2.1.5 Automuestreador, aspiración o inyección manual.  
C.36.2.1.6 Sistema de lectura directa, digital o analógica, registrador o sistema de datos apropiado para el 
control del  instrumento.  
C.36.2.2 Fuente de radiofrecuencia en caso de usar lámparas de descarga sin electrodos.  
C.36.2.3 Horno de digestión por microondas.  
C.36.2.4 Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg.  
C.36.2.5 Mufla.  
C.36.2.6 Parrilla de calentamiento con control de temperatura.  
C.36.2.7 Autoclave que alcance las 15 lb de presión u horno de calentamiento.  
C.36.3 Materiales  
C.36.3.1 Lámparas de cátodo hueco o de descarga sin electrodos para determinar Ag, As, Cd, Cr, Cu, Fe, 
Hg, Ni, Pb, Se, Sn y Zn.  
C.36.3.2  Tubos de grafito pirolizados.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
C.36.3.3 Vasos para digestión de teflón. Enjuagar con acetona, lavar con agua desionizada, y mantener 
los vasos cubiertos con una solución de ácido nítrico 1 M por al menos 30 minutos. Enjuagar con agua 
desionizada y secar.  
C.36.3.4 Matraces volumétricos de 10, 25, 50, 100, 250 y 1000 mL.  
C.36.3.5 Matraces apropiados para el generador de hidruros.  
C.36.3.6 Recipientes y tapas de plástico.  
C.36.3.7 Micropipeta o dosificador.  
C.36.3.8 Matraces Kjeldahl.  
C.36.3.9 Sistema de reflu jo con refrigerante.  
C.36.3.10 Bombas Parr (opcionales).  
C.36.3.11 Crisoles o cápsulas adecuados.  
C.36.3.12 Material común de laboratorio.  
Lavar todo el material de vidrio y plástico primero con agua y detergente. En seguida enjuagar con agua 
de la llave y  después con agua destilada. Sumergir en un recipiente que contenga una solución de ácido 
nítrico al 30%. Tapar y dejar en reposo por un lapso de 24 horas. Quitar el exceso de ácido nítrico con varios 
enjuagues (5 o 6 veces) de agua desionizada. Dejar escu rrir y secar.  
C.36.4 Reactivos  
Todos los reactivos deben ser grado suprapuro o su equivalente a menos que se indique otra 
especificación y por agua se entiende agua desionizada o tridestilada.  
C.36.4.1 Soluciones patrón de referencia certificadas de Ag, As, Cd, Cr, Cu, Fe, Hg, Ni, Pb, Se, Sn y Zn a 
una concentración de 1000 mg/L.  
C.36.4.2 Acido nítrico concentrado, 65% p/p (HNO3).  
C.36.4.3 Peróxido de hidrógeno al 30% p/p (H2O2).  
C.36.4.4 Acido sulfúrico  concentrado, 96% p/p (H2SO4).  
C.36.4.5 Acido clorhídrico concentrado, 37% p/p (HCl).  
C.36.4.6 Fosfato monobásico de amonio RA (NH4)H2PO4.  
C.36.4.7 Nitrato de magnesio hexahidratado RA (Mg(NO3) 2.6H2O).  
C.36.4.8 Borohidruro de sodio RA (NaBH4).  
C.36.4.9 Cloruro de potasio RA (KCl).  
C.36.4.10 Permanganato de potasio RA (KMnO4).  
C.36.4.11 Cloruro estanoso (SnCl 2).  
C.36.4.12 Yoduro de potasio (KI).  
C.36.4.13 Modificador de matriz.  
Pesar 10 g de fosfato monobásico de amonio y 0,5 g de nitrato de magnesio en un  matraz volumétrico de 
200 mL, disolver y llevar al volumen con agua.  
C.36.4.14 Solución de nitrato de magnesio al 7% p/v.  
Pesar 7 g de nitrato de magnesio y mezclar con 100 mL de ácido clorhídrico 1 N.  
C.36.4.15 Acido clorhídrico 1 N.  
Medir 8,3 mL de HCl y llevar a 100 mL con agua.  
C.36.4.16. Solución de ácido nítrico al 50% v/v.  
Diluir 50 mL de HNO3 concentrado en 50 mL de agua.  
C.36.4.17 Solución de nitrato de magnesio al 50% p/v.  
Pesar 50 g de nitrato de magnesio y mezclar con 100 mL de ácido clorhídric o 1 N.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
C.36.4.18 Solución de ácido clorhídrico 0,5 N.  
Diluir 4,15 mL de HCl y llevar a 100 mL con agua.  
C.36.4.19 Solución de cloruro de potasio de 10 mg de K/mL.  
Pesar 1,91 g de KCl y llevar a un volumen de 100 mL con agua.  
C.36.4.20 Solución de permangan ato de potasio al 5 % p/v.  
Pesar 5 g de KMnO4 y mezclar con 100 mL de agua.  
C.36.4.21 Solución reductora.  
Preparar de acuerdo con el manual de operación del equipo.  
C.36.4.22 Solución de ácido nítrico al 2% v/v.  
Agregar lentamente 2 mL de ácido nítrico conc entrado a 100 mL de agua.  
C.36.4.23 Aire comprimido seco y limpio.  
C.36.4.24 Acetileno grado absorción atómica.  
C.36.4.25 Oxido nitroso grado absorción atómica.  
C.36.4.26 Argón grado absorción atómica.  
C.36.4.27 Nitrógeno grado absorción atómica.  
C.36.5 Pr eparación de la muestra.  
C.36.5.1 Digestión por microondas para la determinación de As, Cd, Cr, Cu, Fe, Hg, Ni, Pb, Sn y Zn.  
C.36.5.1.1 Pesar en un vaso de digestión como máximo 0,5 g de muestras secas y de 5 a 10 g de 
muestras líquidas.  
C.36.5.1.2 Adicion ar 5 mL de ácido nítrico concentrado y 2 mL de peróxido de hidrógeno al 30%. Tapar los 
vasos y colocarlos en el horno de microondas.  
C.36.5.1.3 Fijar el programa de calentamiento del horno de acuerdo con las instrucciones del fabricante.  
C.36.5.1.4 Sacar l os vasos del horno y dejar enfriar a temperatura ambiente. Transferir la solución digerida 
a un matraz volumétrico adecuado y llevar al volumen con agua.  
C.36.5.2 Digestión por vía húmeda para la determinación de Cd, Cr, Cu, Fe, Ni, Pb y Zn.  
C.36.5.2.1 Pesar como máximo 40 g de jugo o bebida, 20 g de alimentos que contengan de 50 al 75% de 
agua y 10 g de alimentos sólidos o semisólidos. Limitar el contenido de grasa o aceite a un máximo de 4 g y el 
total de materia orgánica a 5 g.  
C.36.5.2.2 Añadir 10 mL de  ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar directamente 
la digestión, dependiendo del comportamiento de la muestra.  
C.36.5.2.3 Digerir en un sistema Kjeldahl o en un sistema de reflujo refrigerante e iniciar el calentamiento 
gradual mente para evitar pérdidas de muestra.  
C.36.5.2.4 Digerir la muestra durante 3 horas o más tiempo si es necesario (algunas muestras requieren la 
adición de mayor cantidad de ácido nítrico) hasta que la solución sea traslúcida. Si esto no sucede, adicionar 
peróxido de hidrógeno gota a gota con agitación continua hasta lograr una solución traslúcida.  
C.36.5.2.5 Enfriar, filtrar y llevar a un volumen conocido con agua.  
C.36.5.3 Digestión por vía seca para la determinación de Cu, Fe, Cr, Ni y Zn.  
C.36.5.3.1 Pesar en un crisol o cápsula como máximo 40 g de jugo o bebida, 20 g de alimentos que 
contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos sólidos o semisólidos. Limitar el contenido de grasa o 
aceite a un máximo de 4 g y el total de materia orgánica a 5 g.  
C.36.5.3.2 Añadir 10 mL de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar directamente 
la digestión dependiendo del comportamiento de la muestra. En productos con alta concentración de proteínas 
adicionar una solución de nitrato de magnesi o al 7% p/v y mezclar completamente. Llevar a sequedad 
aproximadamente durante 6 horas en estufa a una temperatura de 90 -95°C.  Lunes 13 de febrero de 2012  DIARIO OFICIAL  (Tercera Sección)      
C.36.5.3.3 Colocar la muestra en mufla y elevar la temperatura lentamente de 2 a 4°C por minuto hasta 
350°C. Mantener la temperat ura hasta que cesen los humos.  
C.36.5.3.4 Eleva r gradualmente la temperatura hasta 500 a 550°C para evitar que la muestra se incinere y 
mantener esta temperatura durante 16 horas o toda la noche.  
C.36.5.3.5 Un segundo paso de calcinación puede ser requerid o para remover algunos residuos, para ello 
lavar las paredes del crisol con 2 mL de ácido nítrico al 50%. Colocar la muestra en una parrilla de 
calentamiento a 120°C para remover el exceso de ácido y hasta la eliminación de vapores. Colocar la muestra 
en m ufla fría y elevar la temperatura gradualmente hasta 500 a 550°C, manteniéndola por el tiempo necesario. 
Repetir este procedimiento cuantas veces sea necesario hasta que la muestra quede libre de carbón 
remanente.  
C.36.5.3.6 Disolver las cenizas completame nte en ácido clorhídrico 1 N. Transferir la muestra disuelta a un 
matraz volumétrico adecuado, enjuagando el crisol con dos porciones de 5 mL de ácido clorhídrico 1 N.  
Adicionar los enjuagues al matraz y llevar al volumen con agua.  
C.36.6 Procedimiento.  
C.36.6.1 Determinación de Cd, Cr, Cu, Fe, Ni, Pb, Sn y Zn. EAA por flama directa.  
C.36.6.1.1 Preparación de las curvas patrón.  
Preparar un blanco y al menos 3 diluciones de la solución patrón para cada metal, en el intervalo lineal de 
trabajo utilizar ácido nítrico al 2% para hacer las diluciones.  
Nota: Las soluciones patrón de Sn deben contener 1 mL de solución de cloruro de potasio por cada 100 mL.  
C.36.6.1.2 Determinación.  
C.36.6.1.2.1 Dejar estabilizar el equipo y fijar las condiciones para cada metal de acuerdo con las 
instrucciones del fabricante. Utilizar como guía el siguiente cuadro:  
Elemento  Longitud de onda (nm)  Mezcla de gases  
Cd 228,8  Aire/acetileno  
Cr 357,9  Aire/acetileno  
Cu 324,7  Aire/acetileno  
Fe 248,3  Aire/acetileno  
Ni 232,0  Aire/acetilen o 
Pb 217,3 o 283,3  Aire/acetileno  
Sn 235,5  Oxido nitroso/acetileno  
Zn 213,8  Aire/acetileno  
 
C.36.6.1.2.2 Ajustar el instrumento a 0 de absorbancia con el blanco de calibración. Aspirar las soluciones 
patrón de calibración del analito de menor a mayor c oncentración y registrar al menos dos réplicas de la 
absorbancia de cada uno.  
C.36.6.1.2.3 Elaborar una curva de calibración, graficando la absorbancia en función de la concentración 
de cada metal. Ajustar la curva por medio de mínimos cuadrados (regresión  lineal).  
C.36.6.1.2.4 Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se programan directamente, en los cuales 
sólo es necesario introducir los estándares y marcar su concentración teórica.  
C.36.6.1.2.5 Aspirar las muestras preparadas en C.36.5.1 o C.36. 5.3 y registrar la absorbancia de cada 
una ellas. Calcular la concentración de cada metal a partir de la curva de calibración correspondiente.  
Se debe analizar al menos un blanco de reactivos con cada lote de muestras.  
C.36.6.1.2.6 Asegurarse de que las co ncentraciones de las muestras caen dentro del intervalo de 
calibración de la curva patrón. De no ser así, efectuar la dilución correspondiente y volver a analizar.        (Tercera Sección)  DIARIO O FICIAL  Lunes 13 de febrero de 2012  
Nota: Esta metodología no aplica para la determinación de Cd y Pb cuando las muestras son di geridas por 
horno de microondas.  
C.36.6.2 Determinación de As y Se. EAA por generador de hidruros.  
C.36.6.2.1 Preparación de la curva patrón.  
C.36.6.2.1.1 Preparar un blanco y al menos 3 soluciones patrón en el intervalo lineal de trabajo.  
C.36.6.2.1.2 Antes de aforar adicionar la solución reductora de acuerdo con el manual del fabricante. Dejar 
reposar =  30 minutos y llevar al volumen con agua.  
C.36.6.2.2 Determinación.  
C.36.6.2.2.1 Conectar el generador de hidruros al espectrofotómetro y ajustar la longit ud de onda, la celda, 
el flujo de gases y tiempos de purga de acuerdo con las instrucciones del fabricante.  
C.36.6.2.2.2 Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibración y optimizar la respuesta del 
instrumento con la solución patrón establecida en el manual de operación del equipo.  
C.36.6.2.2.3 Llevar a cabo la reacción para la formación de hidruros con cada una de las soluciones patrón 
de menor a mayor concentración y registrar al menos dos réplicas de la absorbancia de cada uno.  
C.36.6.2.2.4 Elabo rar una curva de calibración, graficando la absorbancia en función de la concentración 
de As. Ajustar la curva por medio de mínimos cuadrados (regresión lineal).  
C.36.6.2.2.5 Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se programan directamente, en lo s cuales 
sólo es necesario introducir los estándares y marcar su concentración teórica.  
C.36.6.2.2.6 Analizar la muestra digerida en C.36.5.1, de la misma forma que las soluciones patrón. 
Analizar un blanco de reactivos con cada lote de muestras.  
C.36.6.2. 2.7 Asegurarse de que las concentraciones de las muestras caen dentro del intervalo de 
calibración de la curva patrón. De no ser así, repetir la determinación con una alícuota más pequeña.  
C.36.7 Expresión de resultados  
C.36.7.1. Cálculos  
Para alimentos, b ebidas alcohólicas y no alcohólicas y aditivos.  
mg metal/kg = (A – B) V 
 M 
Para agua y hielo  
μg metal/L = (A -B) 
A = concentración del metal en la muestra leído directamente del instrumento o de la curva de calibración.  
B = concentración del metal en el blanco de reactivos del instrumento leído directamente del instrumento o 
de la curva de calibrac ión. 
V = volumen de la solución de la muestra digerida.  
M = peso de la muestra.  
Si la muestra ha sido diluida, el factor de dilución debe ser tomado en cuenta.  
C.36.8 Informe de la prueba  
 
_____________________