中华人民共和国国家标准  
 
GB 4789.11—xxxx 
 
 
食品安全 国家标准  
食品微生物学检验  溶血性链球菌 检验 
 
（征求意见稿）  
中华人民共和国卫生部    发布 xxxx -xx-xx发布  xxxx -xx-xx实施  GB 4789.11—xxxx  
I 前    言 
本标准代替 GB/T 4789.11 －2003《食品卫生微生物学检验  溶血性链球菌检验》 。  
本标准与 GB/T  4789. 11－2003相比主要变化如下：  
——  删除了以无菌生理盐水稀释样品的步骤；  
——  增菌培养基以改良胰蛋白胨大豆肉汤代替了葡萄糖肉浸液肉汤和匹克氏肉汤；  
——  分离培养基以哥伦比亚 CNA血琼脂和哥伦比亚血琼脂代替了血琼脂平板；  
——  完善了操作步骤；   
——  在人血浆的基础上增加了 兔血浆和绵羊血浆；  
——  增加了规范性附录 A。 GB 4789.11—xxxx  
1 食品安全国家标准  
食品微生 物学检验   溶血性链球菌检验  
1 范围 
本标准规定了食品中溶血性链球菌（ Streptococcus  hemolyticus ）的检验方法。  
本标准适用于食品中 β型溶血性链球菌的检验。  
2 术语和定义 
β型溶血：在菌落周围形成完全透明的溶血环，红细胞完全溶解。  
3  设备和材料  
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：  
3.1  恒温培养箱：  36 ℃± 1 ℃。 
3.2  冰箱： 2 ℃～5 ℃。 
3.3  厌氧培养装置。  
3.4  天平：感量 0.1 g。 
3.5  均质器与配套均质袋 。 
3.6  显微镜：10×～ 100×。 
3.7  无菌吸管： 1 mL（具 0.01 mL刻度） 、 10 mL（具 0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。  
3.8  无菌锥形瓶：容量 100 mL、200 mL、2 000 mL 。 
3.9  无菌培养皿：直径 90 mm。 
3.10  pH计或 pH比色管或精密 pH试纸。  
3.11   水浴装置 : 36 ℃±1 ℃。 
3.12  离心机：离心速度≥ 20000×g。 
3.13   微生物生化鉴定系统。  
4  培养基和试剂  
4.1  改良胰蛋白胨大豆肉汤 （modified tryptone soy bean broth, m TSB）：见附录 A中A.1。 
4.2  哥伦比亚 CNA血琼脂 (columbia CNA blood agar) ：见附录 A中A.2。 GB 4789.11—xxxx  
2 4.3  哥伦比亚血琼脂 (columbia blood agar) ：见附录 A中A.3。 
4.4  革兰氏染色液 ：见附录 A中A.4。 
4.5  胰蛋白胨大豆肉汤 （tryptone soybean broth, TSB）：见附录 A中A.5。 
4.6  草酸钾血浆 ：见附录 A中A.6。 
4.7  无菌 0.85%生理盐水。  
4.8  0.25％氯化钙 (CaCl 2)溶液。  
4.9  3％过氧化氢 (H2O2)溶液。  
4.10  杆菌肽药敏纸片（含 0.04 IU）。 
4.11  生化鉴定试剂盒。  
4.12 生化鉴定 卡。 
5 检验程序  
溶血性链球菌 检验程序见图 1。 GB 4789.11—xxxx  
3  
6 操作步骤  
6.1样品处理及增菌  
按无菌操作称取检样 25 g（或 mL） ，加入盛有 225 mL m TSB的均质袋中，用拍击式均质器均质
1 min～2 min；或加入盛有 225 mL m TSB的均质杯中，以 8000 r/min ～10000 r/min 均质 1 min～2 min。
若样品为液态，振荡均匀即可。 36 ℃± 1 ℃培养 18 h～24 h。 
6.2 分离  
将增菌液划线接种于哥伦比亚 CNA血琼脂平板， 36 ℃±1 ℃厌氧培养 18 h～24 h，观察菌落形
态。  
溶血性链球菌 在哥伦比亚 CNA血琼脂平板上的 典型菌落 形态为灰白色、半透明、光滑、表面突
起、圆形、边缘整齐，并产生 β型溶血。  
6.3 鉴定  
6.3.1  分纯培养  18 h ~ 24 h 
图1 溶血性链球菌 检验程序  样品 25g（或mL）+ 225 mL m TSB 
划线接种 哥伦比亚 CNA血琼脂平板  
革兰氏染色镜检 /触酶试验  
 
 
确定鉴定  
生化鉴定试剂盒 或鉴定卡  链激酶试验  
报 告 挑取可疑菌落，接种哥伦比亚血琼脂平板和 TSB 36 ℃±1 ℃ 
18 h～24 h ，厌氧培养  
36 ℃±1 ℃ 
 18 h～24 h 36 ℃±1 ℃ 
杆菌肽敏感试验  GB 4789.11—xxxx  
4 挑取可疑菌落 分别接种哥伦比亚血琼脂平板 和接种 TSB增菌液，  36 ℃± 1 ℃培养 18 h～24 h。 
6.3.2  革兰氏染色镜检   
  挑取可疑 菌落染色镜检。 β型溶血性链球菌 为革兰氏染色阳性，球形或卵圆形，常排列成短链状。  
6.3.3  触酶试验  
    挑取可疑菌落于洁净的载玻片上，滴加适量 3%过氧化氢溶液，立即产生气泡者为阳性。 β型溶
血性链球菌触酶为阴性。   
6.3.4  链激酶试验  
吸取草酸钾血浆 0.2 mL于0.8 mL灭菌生理盐水中混匀，再加入经 36 ℃± 1 ℃培养 18 h～24 h的
可疑菌的 TSB培养液 0.5 mL及0.25%氯化钙溶液 0.25 mL， 振荡摇匀， 置于 36 ℃± 1 ℃水浴中 10 min，
血浆混合物自行凝固（凝固程度至试管倒 置，内容物不流动） 。继续 36 ℃± 1 ℃培养 24 h，凝固块重
新完全溶解为阳性，不溶解为阴性。 β型溶血性链球菌为阳性。  
6.3.5  杆菌肽敏感试验  
将可疑菌的TSB增菌液均匀涂布于哥伦比亚血琼脂平板上，用灭菌镊子夹取杆菌肽纸片，放于琼
脂表面， 36 ℃± 1 ℃培养 18 h～24 h，如出现抑菌圈即为敏感，同时用已知敏感菌株作为阳性对照。 β
型溶血性链球菌为杆菌肽敏感。  
6.3.6  可选择使用生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡对可疑菌落进行鉴定。  
7  结果与报告  
综合以上试验结果，报告每 25 g（mL）检样中检出或 未检出β型溶血性链球菌。  GB 4789.11—xxxx  
5 附录A 
培养基与试剂  
A.1  改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基 （modified tryptone soybean broth, mTSB ） 
A.1.1  基础培养基  
A.1.1.1 成分 
胰蛋白胨  17.0 g  
大豆蛋白胨  3.0 g  
氯化钠  5.0 g  
磷酸二氢钾  2.5 g  
葡萄糖  2.5 g  
A.1.1.2  制法  
称取 30.0 g培养基于 1000 mL蒸馏水中 ，加热溶解， 调节 pH为7.3± 0.2，121 ℃灭菌 15 min，分装备
用。  
A.1.2 抗生素溶液  
A.1.2.1 多粘菌素溶液  
称取 10 mg多粘菌素 B于10 mL灭菌蒸馏水中，振摇混匀 , 充分溶解后过滤除菌。  
A.1.2.2 萘啶酮酸钠溶液  
称取 10 mg萘啶酮酸于 10 mL 0.05 mol/L 氢氧化钠溶液中，振摇混匀 ,充分溶解后过滤除菌。  
A.1.3 完全培养基  
A.1.3.1 成分 
胰蛋白胨大豆肉汤 (TSB ) 1 000.0 mL 
多粘菌素溶液  10.0 mL 
萘啶酮酸钠溶液    10.0 mL 
A.1.3.2 制法 
无菌条件下，将上述各成分进行混合，充分混匀 ，分装备用。  
A.2 哥伦比亚 CNA血琼脂 (columbia CNA blood agar)  
A.2.1 成分 
胰酪蛋白胨  12.0 g  
动物组织蛋白消化液    5.0 g  
酵母提取物  3.0 g  
牛肉提取物  3.0 g  
玉米淀粉    1.0 g  
氯化钠  5.0 g  
琼脂  13.5 g  
多粘菌素  0.01 g  
萘啶酸  0.01 g 
A.2.2 制法 
称取 42.5 g于1000 mL 蒸馏水中 ，加热溶解，调节 pH为7.3  0.2，121 ℃灭菌 12 min，待冷却
至50 ℃左右时加 5％无菌脱纤维绵羊血，摇匀后倒平板。  
A.3  哥伦比亚血琼脂 (columbia blood agar)  
A.3.1  基础培养基   GB 4789.11—xxxx  
6 A.3.1.1  成分 
动物组织酶解物  23.0 g  
淀粉  1.0 g  
氯化钠  5.0 g  
琼脂  8.0 g～18.0 g  
水 1 000.0 mL 
A.3.1.2 制法  
将基础培养基成分溶解于水中， 加热促其溶解。 分装至合适的三角瓶内， 121 ℃ 高压灭菌 15 min。 
A.3.2  无菌脱纤维绵羊血  
    无菌操作条件下，将绵羊血加入到盛有灭菌玻璃珠的容器中，振摇约 10 min，静置后除去附有血
纤维的玻璃珠 即可。  
A.3.3  完全培养基  
A.3.3.1 组分 
基础培养基  (A.3.1)  1 000.0 mL  
无菌脱纤维绵羊血  (A.3.2)  50 mL  
A.3.3.2 制法 
当基础培养基的温度为 45 ℃左右时，无菌加入绵羊血，混匀。将完全培养基的 pH值调至 7.2±
0.2（25 ℃） 。倾注 15 mL于无菌平皿中，静置至培养基凝固。使用前需预先干燥平板。可将平皿盖打
开，使培养基面朝下，置于干燥箱中约 30 min，直到琼脂表面干燥。预先制备的平板未干燥时在室温
放置不得超过 4 h，或在  4 ℃左右冷藏不得超过 7 d。 
A.4  革兰氏染色液  
A.4.1  结晶紫染色液基础培养基   
A.4.1.1  成分 
结晶紫  1.0 g 
95％乙醇    20.0 mL 
1％草酸铵水溶液    80.0 mL 
A.4.1.2 制法 
将结晶紫完全溶解于乙醇中 ，然后与草酸铵溶液混合。  
A.4.2 革兰氏碘液  
A.4.2.1 成分 
碘 1.0 g 
碘化钾  2.0 g 
蒸馏水  300.0 mL 
A.4.2.2 制法 
将碘与碘化钾先进行混合 ，加入蒸馏水少许充分振摇 ，待完全溶解后 ，再加蒸馏水至 300 mL。 
A.4.3 沙黄复染液  
A.4.3.1 成分 
沙黄  0.25 g 
95％乙醇  10.0 mL 
蒸馏水  90.0 mL 
A.4.3.2 制法 
将沙黄溶解于乙醇中 ，然后用蒸馏水稀释。  GB 4789.11—xxxx  
7 A.4.4 染色法 
a. 将涂片在酒精灯火焰上固定 ，滴加结晶紫染色液 ，染1 min，水洗。  
b. 滴加革兰氏碘液 ，作用 1 min，水洗。  
c. 滴加 95％乙醇脱色 ，约15 s～30 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。滴加复染液，复染
1 min。水洗、待干、镜检。  
A.5 胰蛋白胨大豆肉汤 （tryptone soybean broth, TSB ） 
A.5.1 成分 
胰蛋白胨  17.0 g  
大豆蛋白胨  3.0 g  
氯化钠  5.0 g  
磷酸二氢钾  2.5 g  
葡萄糖  2.5 g  
A.5.2  制法  
称取 30.0 g培养基于 1000 mL蒸馏水中 ，加热溶解， 调节 pH为7.3± 0.2，121 ℃灭菌 15 min，分装备
用。  
A.6 草酸钾血浆  
A.6.1 成分 
草酸钾  0.01 g  
人血、兔血或绵羊血  5.0 mL 
A.6.2 制法 
草酸钾 0.01 g放入灭菌小试管中，再加入 5 mL人血、兔血或绵羊血，混匀，经离心沉淀，吸取上
清液即为草酸钾血浆。