Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
SECRETARIA DE SALUD 
NORMA Oficial Mexicana NOM-218-SSA1-2011,  Productos y servicios.  Bebidas saborizadas no alcohólicas, sus 
congelados, productos concentrados para prepararlas y bebidas adicionadas con cafeína. Especificaciones y disposiciones sanitarias. Métodos de prueba. 
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.- Secretaría de  Salud. 
MIKEL ANDONI ARRIOLA PEÑALOSA, Comisionado Federal para la Protección contra Riesgos 
Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacio nal de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, 
con fundamento en el artículo 39 de la Ley Orgánica de la  Administración Pública Federal; 4 de la Ley Federal 
del Procedimiento Admi nistrativo; 3 fracción XXII, 17 bis fracciones II y III, 17 Bis 2, 115 fracciones IV y VI, 194 
fracción I, 195, 199, 210, 212, 215 fracciones II, III y IV y 216 de la Ley General de Salud; 3 fracción XI, 38 
fracción II, 40 fracciones I, XI y XII, 41, 43, 47 fracci ón IV y 52 de la Ley Fe deral sobre Me trología y 
Normalización; 28 del Reglamento de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 1 fracción VI, 4, 8, 14, 
15, 25, 30, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 200, 201, 202, 203, 204, 206, 211 y 214  del Reglamento de Control 
Sanitario de Productos y Servicios; 2 inciso C fracción X y 36 del Reglamento Interior de la Secretaría de 
Salud; 3 fracciones I incisos d y l, y II, 10 fracciones IV y VIII del Reglamento de la Comisión Federal para la 
Protección contra Riesgos Sanitarios, y 
CONSIDERANDO 
Que en cumplimiento a lo previsto en el artículo 46 fracción I de la Ley Federal sobre Metrología  y 
Normalización, el 20 de agosto de 2009, el Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, aprobó el anteproyecto de Norma Oficial Mexicana; 
Que con fecha 22 de diciembre de 2010 en cumplimiento del acuerdo del Comité y lo previsto en el 
artículo 47 fracción I de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización, se publicó en el Diario Oficial de la 
Federación el proyecto de la presente norma, a efecto de que dentro de los siguientes sesenta días naturales 
posteriores a dicha publicación, los interesados present arán sus comentarios al Comité Consultivo Nacional 
de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario. 
Que con fecha previa, fue publicada en el Diario Oficial de la Federación la respuesta a los comentarios 
recibidos por el menc ionado Comité, en términos de l artículo 47 fracción III de la Ley Federal sobre Metrología 
y Normalización. 
Que en atención a las anteriores consideraciones, contando con la aprobación del Comité Consultivo 
Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, tengo a bien expedir y ordenar la publicación 
en el Diario Oficial de la Federación de la NO RMA OFICIAL MEXICANA NOM-218-SSA1-2011, PRODUCTOS 
Y SERVICIOS. BEBIDAS SABORIZADAS NO ALCO HOLICAS, SUS CONGELADOS, PRODUCTOS 
CONCENTRADOS PARA PREPARARLAS Y BEBIDAS ADICIONADAS CON CAFEINA. 
ESPECIFICACIONES Y DISPOSICIONES SANITARIAS. METODOS DE PRUEBA. 
PREFACIO 
En la elaboración de la presente norma participar on las siguientes Dependencias, Instituciones  y 
Organismos: 
Secretaría de Salud Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios 
Secretaría de Salud del Estado de Michoacán 
Secretaría de Salud del Estado de Nuevo León Secretaría de Economía 
Procuraduría Federal del Consumidor 
Dirección General de Investigación Instituto Politécnico Nacional 
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas 
Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Química 
Confederación de Cámaras Industriales de los Estados Unidos Mexicanos 
Cámara Nacional de la Industria de la Transformación Cámara Nacional de la Industria de Conservas Alimenticias       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
Asociación Nacional de Productores de Refrescos y Aguas Carbonatadas, A.C. 
Asociación Nacional de Fabricantes  de Productos Aromáticos, A.C. 
Bebidas Sanas, S.A. de C.V. 
Bebidas Energizantes en México A.C. 
Cadbury Bebidas, S.A. de C.V. Café Internacional de Córdoba, S.A. de C.V. Centro de Capacitación de Calidad Sanitaria, S.A. de C.V. Centro de Control Total de Calidades, S.A. de C.V. Coca Cola de Méxi co, S.A. de C.V. 
Concentrados Sandy´ s, S.A. de C.V. 
DULCO, S.A. de C.V. Embotelladora AGA de México, S.A. de C.V. GAF Distribuciones Industriales, S.A. de C.V. Grupo JUMEX Helados Siberia, S.A. de C.V. 
Innovadora de Esencias, Aromas  y Sabores, S.A. de C.V. 
Jarabes el Manantial, S.A. de C.V. Jugos del Valle, S.A. de C.V. KRAFT Foods de México, S. de R.L. de C.V. Manantiales Peñafiel, S.A. de C. V. Mead Johnson de México, S. de R.L. de C.V. 
Nestle México, S.A. de C.V. 
OMNILIFE, S.A. de C.V. Paleterías la Michoa cana, S.A. de C.V. 
Parmalat de México, S.A. de C.V. Procesadora de Frutas La Cima, S.A. de C.V. Procter & Gamble México, S. de R.L. de C.V. 
Productora Nacional de Conc entrados, S.A. de C.V. 
SABORMEX, S.A. de C.V. Santa Clara Productos Lá cteos, S.A. de C.V. 
SAROMA, S.A. de C.V. Super Sopas, S.A. de C.V. UNILEVER de México, S.A. de C.V. 
INDICE 
1.  Objetivo y campo de aplicación 
2.  Referencias 
3.  Definiciones 
4.  Símbolos y abreviaturas 
5.  Disposiciones generales 
6.  Bebidas saborizadas no alcohólicas y bebidas adicionadas con cafeína 
7.  Productos  congelados 
8.  Productos concentrados para preparar bebidas saborizadas no alcohólicas 
9.  Muestreo 
10.  Métodos de prueba Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
11.  Etiquetado 
12.  Envase 
13.  Concordancia con normas internacionales 
14.  Bibliografía 
15.  Observancia de la norma 
Apéndice Normativo A. Listado de Aditivos 
Apéndice Normativo B. Métodos de prueba 
1. Objetivo y campo de aplicación. 
1.1 Esta norma establece las disposiciones y especific aciones sanitarias que deben cumplir las bebidas 
saborizadas no alcohólicas (incluye bebidas para deportistas), sus congelados, los productos concentrados 
para prepararlas y las bebidas adicionadas con cafeína. 
1.2 Esta norma no aplica a productos que cuenten con una regulación sanitaria particular, los cuales 
deben ajustarse a las especificaciones sanitarias que para cada uno de ellos determine la Secretaría de Salud. 
1.3 Esta norma es de observancia obligatoria en el Terri torio Nacional para las personas físicas o morales 
que se dedican a su proceso o importación. 
2. Referencias. 
Esta norma se complementa con las siguientes Normas Oficiales Mexicanas, sus modificaciones o las que 
las sustituyan: 
2.1 Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA1-2006. Salu d ambiental. Requisitos sanitarios que debe 
satisfacer el etiquetado de pinturas , tintas, barnices, lacas y esmaltes. 
2.2 Norma Oficial Mexicana NOM-086-SSA1-1994. Bienes y servicios. Alimentos y bebidas no alcohólicas 
con modificaciones en su composición. Especificaciones nutrimentales. 
2.3 Norma Oficial Mexicana NOM-051-SCFI/SSA1-2010.  Especificaciones Generales de Etiquetado para 
Alimentos y Bebidas no alcohólicas preenv asados-Información comercial y sanitaria. 
2.4 Modificación a la Norma Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994. Salud ambiental, agua para uso y 
consumo humano. Límites permisibles de calidad y tr atamientos a que debe someterse el agua para su 
potabilización. 
2.5 Norma Oficial Mexicana NOM-130-SSA1-1995. Bienes y servicios. Alimentos envasados en recipientes 
de cierre hermético y sometido a tratamiento térmi co. Disposiciones y especificaciones sanitarias. 
2.6 Norma Oficial Mexicana NOM-201-SSA1-2002. Prod uctos y servicios. Agua y hielo para consumo 
humano, envasados y a granel. Especificaciones sanitarias. 
2.7 Norma Oficial Mexicana NOM-251-SSA1-2009. Prácticas de higiene para el proceso de alimentos, 
bebidas o suplementos alimenticios. 
3. Definiciones. 
Para fines de esta no rma se entiende por: 
3.1 Adicionar, añadir uno o más nutrimentos, contenidos  o no normalmente en el producto.  
3.2 Aditivo, cualquier sustancia permitida que, sin tener propiedades nutritivas, se incluya en la 
formulación de los productos y que actúe como estabilizante, conservador o modificador de sus características organolépticas, para favorecer ya sea su estabilidad, conservación, apariencia o aceptabilidad. 
3.3 Agua para uso y consumo humano (agua potable), agua que no contiene contaminantes objetables, 
químicos o agentes infecciosos y que no causa efectos nocivos para la salud.  
3.4 Bebida no alcohólica, cualquier líquido, natural o transfo rmado, que proporcione al organismo 
elementos para su nutrición. 
3.5 Bebidas no alcohólicas con modi ficaciones en su composición, a los que se les disminuyen, 
eliminan o adicionan uno a más nutrimentos, tales como hidratos de carbono, proteínas, lípidos, vitaminas, 
minerales o fibras dietéticas. 
3.6 Bebida para deportistas, a las bebidas saborizadas no alcohólicas que son elaboradas por la 
disolución de sales minerales, edulcorantes u otros ingr edientes con el fin de reponer el agua, energía y 
electrolitos perdidos por el cuer po humano durante el ejercicio.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
3.7 Bebidas saborizadas no alcohólicas, a los productos elaborados por la disolución en agua para uso 
y consumo humano, de edulcorantes e ingredientes opcionales, adicionados o no de aditivos, que pueden 
estar o no carbonatadas. Incluye bebidas para deportistas. 
3.8 Bebida adicionada con cafeína, a los productos elaborados por la disolución en agua para uso y 
consumo humano, de azúcares, ingredi entes opcionales, adicionados o no de aditivos que pueden estar o no 
carbonatadas y con un contenido mayor de 20 mg de ca feína por 100 ml de producto. No incluye al café, 
sucedáneos del café, té e infusiones de hierbas. 
3.9 Buenas Prácticas de Fabricación (BPF), en el caso de los aditivos se refiere a la cantidad mínima 
indispensable para lograr el efecto deseado. 
3.10 Concentrado, al producto para preparar bebidas saborizadas no alcohólicas, que se elabora a partir 
de derivados vegetales o, sabor izantes naturales, idénticos a los natural es o sintético artificiales, adicionado o 
no de otros aditivos para alimentos y de ingredientes op cionales, destinado para su venta al consumidor. 
3.11 Concentrado de manufactura, al producto para preparar bebidas no alcohólicas, que se elabora a 
partir de derivados vegetales o saborizantes naturales, idénticos a los naturales o sintético artificiales, adicionado o no de otros aditivos para alimentos y de ingredientes opcionales y, que no está destinado para 
su venta al consumidor. 
3.12 Congelado de bebidas no alcohólicas, al producto elaborado con agua para uso y consumo 
humano, edulcorantes e ingredientes  opcionales, adicionados o no de aditivos para alimentos con o sin 
incorporación de aire y que puede ser mold eado, envasado o empalillado, entre otros. 
3.13 Consumidor, persona física o moral que adquiere o disfruta como destinatario final productos 
alimenticios y bebidas no alcohólicas preenvasados. 
3.14 Contaminación, presencia de materia extraña, sustancias tóxicas o microorganismos, en cantidades 
que rebasen los límites permisibles establecidos por la  Secretaría de Salud o en cantidades tales que 
representen un riesgo a la salud. 
3.15 Derivados vegetales, a las materias primas comestibles e inocuas obtenidas de las diferentes partes 
de la plantas. Los saborizantes de origen natural son considerados aditivos.  
3.16 Envase, cualquier recipiente, o envoltura en el cual es tá contenido el producto preenvasado para su 
venta al consumidor. 
3.17 Etiqueta, cualquier rótulo, marbete, inscripción, imagen u otra materia descriptiva o gráfica, escrita, 
impresa, estarcida, marcada, grabada en alto o bajo relieve, adherida, sobrepues ta o fijada al envase del 
producto preenvasado o, cuando no sea posible por las características del producto, al embalaje. 
3.18 Ingrediente, cualquier sustancia o producto, incluidos los aditivos, que se emplee en la fabricación, 
elaboración, preparación o tratamiento de un alimento o bebida no alcohólica y esté presente en el producto 
final, transformado o no. 
3.19 Inocuo, lo que no hace o causa daño a la salud. 
3.20 Jarabe, al producto elaborado con agua para consumo humano, con una concentración de azúcares 
en cantidad suficiente para lograr la consistencia desea da y que haya sido sometido a tratamiento térmico que 
asegure su conservación. 
3.21 Límite máximo, a la cantidad establecida de aditivos, mi croorganismos, parásitos, materia extraña, 
plaguicidas, metales pesados y metaloides, que no se deben exceder en un alimento, bebida o materia prima. 
3.22 Lote, a la cantidad de un producto, elaborado en un mismo ciclo, integrado por unidades 
homogéneas e identificado con un código específico. 
3.23 Materia extraña, cualquier sustancia, resto, desecho o material que se presenta en el producto pero 
que no forma parte de la composición normal de éste. 
3.24 Metal pesado y metaloide, a los elementos químicos que causan efectos indeseables en el 
metabolismo aun en concentraciones bajas. Su toxi cidad depende de las dosis en que se ingieran así como 
de su acumulación en el organismo. 
3.25 Método de prueba, al procedimiento analítico utilizado para comprobar que un producto, satisface 
las especificaciones que establece la norma. 
3.26 Nutrimento, cualquier sustancia incluyendo a las pr oteínas, aminoácidos, grasas o lípidos, 
carbohidratos o hidratos de carbono, agua, vitami nas y nutrimentos inorgánicos (minerales) consumida 
normalmente como componente de un alimento o bebida no alcohólica que: Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
a) Proporciona energía; o 
b) Es necesaria para el crecimiento, el de sarrollo y el mantenimiento de la vida; o 
c) Cuya carencia haga que se produzcan cambios químicos o fisiológicos característicos. 
3.27 Polvo para preparar  bebidas no alcohólicas, al producto con o sin azúcares, con o sin 
edulcorantes calóricos y no calóricos, adicionados o no de jugo, leche y aditivos para alimentos. 
3.28 Proceso, al conjunto de actividades relativas a la obt ención, elaboración, fabr icación, preparación, 
conservación, mezclado, acondicionamiento, enva sado, manipulación, transporte, distribución, 
almacenamiento y expendio o suministro al público de productos. 
3.29 Productos concentrados para preparar bebidas no alcohólicas, a los productos obtenidos por la 
mezcla de algunos de los siguientes: azúcares, ingredi entes opcionales y aditivos, que requieren diluirse o 
disolverse para su consumo. 
3.30 Producto preenvasado, al producto que cuando es colocado en un envase de cualquier naturaleza, 
no se encuentra presente el consumidor y la cantidad de producto contenido en él no puede ser alterada, a 
menos que el envase sea abiert o o modificado perceptiblemente.  
3.31 Tratamiento térmico, al método físico que consiste en someter a una fuente de calor suficiente por 
un tiempo apropiado al producto, antes o después de ser envasado con el fin de lograr una estabilidad biológica y que garantice la eliminación de microorganismos patógenos. 
4. Símbolos y abreviaturas. 
Cuando en esta norma se haga referencia a los siguientes símbolos y abreviaturas se entiende por: 
BPF  buenas prácticas de fabricación 
cm  centímetro 
g  gramo 
kg  kilogramo 
L, l  litro 
M  masa 
µg  microgramos 
mg  miligramo 
mL, ml  mililitro 
n.a.  no aplica 
nm  nanómetro 
NMP  número más probable 
/  por 
%  por ciento 
UFC  unidades formadoras de colonia 
UV  ultravioleta 
pH  potencial de hidrógeno 
v  volumen 
v/v  relación volumen-volumen 
°C  grado Celsius 
<  menor que 
PEPS  primeras entradas , primeras salidas 
Cuando en la presente norma se mencione al: 
Acuerdo de aditivos , debe entenderse que se trata del Acuerdo por el que se determinan las sustancias 
permitidas como aditivos y coadyuvantes en alimen tos, bebidas y suplementos alimenticios vigente. 
Acuerdo de plantas , debe entenderse que se trata del Acuerdo por el que se determinan las plantas 
prohibidas o permitidas para tés, infusiones  y aceites vegetales comestibles, vigente. 
Reglamento,  debe entenderse que se trata del Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios. 
Secretaría,  debe entenderse que se trata de la Secretaría de Salud.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
5. Disposiciones generales. 
5.1 En el proceso de los productos objeto de esta norma , además de cumplir con lo establecido en el 
Reglamento, deberán ajustarse a las siguientes disposiciones: 
5.1.1  Los establecimientos que se dediquen al proceso de los productos objeto de esta norma, deben 
cumplir con lo establecido en la Norma citada en el numeral 2.7 del apartado de referencias. 
5.1.2  Instalaciones físicas. 
5.1.2.1  Cuando por las características del envase se requiera un área de lavado de envases, ésta debe 
ser específica, localizarse dentro del establecimiento y contar con pisos, paredes y techos. En caso de que no exista comunicación directa entre esta área y la de llenado, se deben tomar las medidas necesarias para 
evitar la recontaminación de los envases. 
5.1.3 Materia prima. 
5.1.3.1 La materia prima empleada en la elaboración de los productos objeto de esta norma, debe cumplir 
con lo establecido en el Reglamento y en las Normas Oficiales Mexicanas correspondientes. 
5.1.3.2  El agua que se utilice en el proceso de los productos debe ser para uso y consumo humano, 
conforme a lo establecido en las Normas citadas en los numerales 2.4 y 2.6 del apartado de referencias y en 
caso de ser necesario, se debe contar con un sistema de potabilización adicional que garantice su inocuidad. 
El mantenimiento del mismo es responsabilidad del parti cular, de acuerdo con las especificaciones emitidas 
por el fabricante. 
5.1.3.3 La materia prima de origen vegetal fresca o congelada, se debe lavar con agua para uso y consumo 
humano, y desinfectar con sustancias inocuas para su  uso en alimentos, de conformidad con lo siguiente: 
5.1.3.3.1 El agua debe cambiarse con una frecuencia suficiente para prevenir la acumulación de materia 
orgánica y evitar la contaminación cruzada. 
5.1.3.3.2 Debe realizarse el secado o drenado para eliminar el agua después del lavado. 
5.2 Especificaciones generales. 
5.2.1  Los productos sujetos a tratamiento térmico en vasados en recipientes de cierre hermético, además 
de cumplir con lo establecido en este ordenamiento, de ben cumplir con la Norma citada en el numeral 2.5 del 
apartado de referencias. 
5.2.2  Los productos modificados en su composición, además de cumplir con lo establecido en este 
ordenamiento, deben cumplir con la Norma citada en  el numeral 2.2 del apartado de referencias. 
5.2.3 Contenido de alcohol. 
5.2.3.1 El contenido de alcohol etílico en el producto terminado no debe exceder del 1,99% y cuando 
provenga de sabores no debe exceder el 0,5%; ambos porcentajes expresados v/v a 20°C. 
5.2.4 Metales pesados y metaloides. 
5.2.4.1 El fabricante de los productos objeto de esta norma , debe establecer mecanismos de control que 
permitan determinar la presencia y cantidad de metales pesados y metaloides en las materias primas, en el producto en proceso de elaboración o en el producto te rminado, de acuerdo a las regulaciones aplicables a la 
categoría del producto. La información generada debe esta r a disposición de la Secretaría cuando ésta así lo 
requiera. 
5.2.5 Los productos objeto de esta norma que empleen como materia prima derivados vegetales, deben 
sujetarse a lo establecido en el Acuerdo de plantas, as í mismo no podrán utilizar aquellas que se encuentran 
listadas en la Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos. 
5.2.6 Los obsequios o promociones que se proporcionen  con los productos objeto de esta norma deben 
ser inocuos, no ceder sustancias tóxicas al producto y, en su caso, cumplir con los ordenamientos jurídicos 
aplicables. 
5.2.7 Aditivos. 
5.2.7.1  En la elaboración de los productos objeto de esta norma, únicamente se permite el empleo de los 
aditivos listados en el Apéndice normativo A. 
5.2.7.2 Los límites establecidos para cada aditivo sólo son aplicables al uso de dichas sustancias como 
aditivos, sin considerar su empleo como nutrimentos. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
5.2.7.3 En la elaboración de los productos objeto de esta norma adicionalmente a lo especificado en el 
5.2.7.1, se permite el empleo de sa borizantes naturales, sintéticos idén ticos a los naturales y sintéticos 
artificiales, señalados en el Acuerdo de aditivos conforme a las BPF. 
5.2.7.4 En la elaboración de congelados a granel pued en emplearse los colorantes listados en los límites 
señalados en el Apéndice normativo A, de los cuales debe monitorearse y registrarse la concentración en el 
producto terminado. La presencia de otros aditivos se deberá únicamente al principio de transferencia, cuando 
se elaboren a partir de concentrados, jarabes o bebidas no alcohólicas preenvasadas. 
5.2.8  Las bebidas de quina no deberán contener más de 0,001% de quinina o 0,01% de bisulfato de 
quinina o de clorhidrato de quinina. 
5.2.9 Especificaciones físicas. 
5.2.9.1 El límite máximo de ma teria extraña debe ser: 
Tabla 1. Materia extraña 
Materia extraña Con derivados vegetales Sin derivados vegetales 
Bebidas, congelados, 
jarabes y concentrados Polvos Bebidas, congelados, 
jarabes y concentrados Polvos 
Pelo 1/100 g 1/50 g 1/250 mL 1/50 g 
Fragmentos de Insectos  20/ 100 g 20/50 g exento 10/50 g 
Fibras  5/100 g 5/50 g 5/100 mL 5/50 g 
 
6. Bebidas saborizadas no alcohólicas y bebidas adicionadas con cafeína. 
6.1 Disposiciones sanitarias. 
6.1.1 Además de lo señalado en el punto 5, las em presas productoras de bebidas saborizadas no 
alcohólicas preenvasadas y las bebidas adicionadas  con cafeína deben cumplir con lo siguiente: 
6.1.1.1 Para el caso de envases no retornables vacíos, éstos deben almacenarse en condiciones 
higiénicas, protegidos de polvo y de materia extraña. Previo a su llenado, deben ser sometidos a un proceso 
que garantice la inocuidad del producto terminado. 
6.1.1.2  Cuando se utilicen envases retornables, éstos deben ser sometidos a un proceso de desinfección 
interna y de lavado externo con soluciones desinfectant es, enjuagados con agua apta para consumo humano 
y escurridos de manera que no queden residuos de los desinfectantes. 
6.1.1.3 Los tapones, tapas, hermetapas o corcholatas deben ser nuevos de material no tóxico, y 
mantenerse durante todo el proceso en condiciones higiénicas libres de polvo y de materia extraña. En caso 
de contaminación, éstas deberán lavarse y desinfectarse  con soluciones que no modifiquen, reaccionen  o 
alteren las características de éstos, ev itando la contaminación por arrastre. 
6.2 Especificaciones Microbiológicas. 
6.2.1  Las bebidas saborizadas no alcohólicas y las bebidas adicionadas con cafeína no deben sobrepasar 
los siguientes límites: 
Tabla 2. Especificaciones microbiológicas 
Microorganismos Límite máximo 
Mesófilos aerobios UFC/g o mL 50 
Coliformes totales NMP/mL o g 10 
Coliformes fecales NMP/mL o g n.a. 
Salmonella  spp en 25 mL o g  ausente * 
E. coli NMP/g o mL n.a. 
V. cholerae  O1 en 50 g o mL  ausente * 
Enterotoxina estafilocóccica negativa* 
* Sólo en casos de cont ingencia sanitaria. 
6.3 Las bebidas adicionadas con cafeína no deben contener más de 33mg de cafeína/100mL de producto.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
6.4 Las bebidas para deportistas deben contener, por lo menos sodio e hidratos de carbono en forma de 
azúcares, en las siguientes concentraciones: 
6.4.1  Sodio entre 230 y 575 mg/L 
6.4.2  Hidratos de carbono (azúcares) máximo 80 g/L 
7. Productos congelados. 7.1 Clasificación 
Los productos objeto de este capítulo se clasifican en: 
7.1.1 Preenvasados y 
7.1.2 A granel 
7.2 Disposiciones sanitarias. 
7.2.1 Además de lo señalado en el apartado 5 se deben cumplir con las siguientes disposiciones: 
7.2.1.1 En todo momento se debe evitar que la salmuer a entre en contacto con el producto terminado. 
7.2.1.2 El agua que se utilice durante el desmolde de los productos debe ser para uso y consumo humano. 
7.2.1.3 No se permite colocar hielo en contacto directo con el producto terminado, a menos que éste se 
encuentre preenvasado, de tal forma que evite su contaminación. 
7.2.1.4 La cámara de congelación y congeladores o neveras deben mantenerse a una temperatura de  -
12°C o menos, con termómetro visible o dispositivos de registro de temperaturas funcionando y en buen 
estado; y permitir el flujo de aire entre los productos. 
7.2.1.5 Los congelados de bebidas saborizadas no alcohólicas adicionadas con cafeína deben de cumplir 
con los límites establecidos en el numeral 6.3. 
7.3 Especificaciones Microbiológicas. 
7.3.1 Los congelados de bebidas saborizadas no alcohó licas no deben sobrepasar los siguientes límites: 
Tabla 3. Especificaciones microbi ológicas para los congelados de  las bebidas saborizadas no 
alcohólicas 
Microorganismos Congelados de 
bebidas saborizadas no alcohólicas preenvasados Congelados de bebidas saborizadas no 
alcohólicas a granel 
sin derivados vegetales con derivados vegetales 
Con 
tratamiento térmico Sin 
tratamiento térmico 
Coliformes totales NMP/mL o g 10 10 50 n.a. 
Coliformes fecales NMP/mL o g n.a. n.a. n.a. <3** 
Salmonella spp. / 25 mL o g  ausente*  ausente  ausente  ausente  
E. coli NMP/mL o g n.a. n.a. n.a. <3  
V. cholerae  O1 / 50 mL o g  ausente* ausente*  ausente* ausente* 
Enterotoxina estafilocóccica negativa***  negativa*** negativa*** negativa*** 
* Sólo en casos de cont ingencia sanitaria. 
** Confirmar la presencia de E. Coli  por el método de NMP cuando el parámetro de coliformes fecales esté 
fuera de especificaciones. 
*** Sólo en productos adicionados con leche y sus derivados y en casos de contingencia sanitaria. 
8. Productos concentrados para preparar bebidas saborizadas no alcohólicas. 
8.1 Clasificación 
Los productos objeto de este capítulo, por su proceso se clasifican en: 
8.1.1 Jarabes y Concentrados 
8.1.1.1 Con tratamiento térmico 
8.1.1.2 Sin tratamiento térmico Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
8.1.2 Concentrados de manufactura, y 
8.1.3 Polvos 
8.2 Disposiciones sanitarias. 
8.2.1  Además de lo señalado en el punto 5 las empr esas productoras de concentrados de manufactura 
deben cumplir con lo siguiente: 
8.2.1.1 Las características y especificaciones sanitarias  de los concentrados de manufactura, utilizados 
como materia prima para la elaboración de bebidas sa borizadas no alcohólicas deben garantizar la inocuidad 
de estas últimas, a fin de cumplir con las especificacio nes sanitarias establecidas en esta norma y demás 
disposiciones aplicables. 
8.2.1.2  Los concentrados de manufactura utilizados como materia prima, deben contar con un certificado 
de calidad que incluya, entre otros, los siguientes da tos: nombre o clave o código del producto, identificación 
del responsable de proceso, número de lote, leyendas de conservación y la declaración de ingredientes misma información que debe ser declarada en la etiqueta, a excepción de los ingredientes. Cuando se requiera utilizar una clave o código para referirse al nombr e del producto o a los ingredientes, la persona física 
o moral, licenciatario o causahabiente, propietaria  de la marca debe contar con la documentación que 
respalde la identificación de los mismos, la cual debe estar a disposición de la Secretaría cuando ésta lo 
requiera. 
8.3 Especificaciones Físicas y Químicas. 
8.3.1 Los polvos para preparar bebidas saborizadas no alcohólicas no deben exceder de 5% de humedad. 
8.4 Especificaciones Microbiológicas. 
8.4.1 Los jarabes y concentrados para preparar bebidas  saborizadas no alcohólicas deben cumplir con los 
límites máximos siguientes: 
Tabla 4. Especificaciones microbiológicas en ja rabes y concentrados para preparar bebidas 
saborizadas no alcohólicas. 
Microorganismo Con tratamiento 
térmico Sin tratamiento térmico. 
sin derivados 
vegetales. con derivados 
vegetales. 
Coliformes totales UFC/ g o mL <10 10 n.a. 
Coliformes fecales NMP/ g o mL n.a. n.a. <3** 
Salmonella  spp. / 25 g o mL ausente* ausente* ausente 
E. coli  NMP/mL o g n.a. n.a. <3 
Enterotoxina estafilocóccica neg ativa * negativa * negativa * 
* En caso de contingencia sanitaria. 
** Confirmar la presencia de E. coli  por el método de NMP cuando el parámetro de coliformes fecales esté 
fuera de especificaciones. 
8.4.2 Los polvos para preparar bebidas saborizadas no alcohólicas deben cumplir lo siguiente: 
Tabla 5. Especificaciones microbiológicas en polvos para preparar bebidas saborizadas no 
alcohólicas. 
Microorganismos Límite máximo 
Mesofílicos aerobios UFC/g 5000 * 
Coliformes totales NMP/g <10 
Escherichia coli NMP/g <3 ** 
Salmonella  spp. en 25 g  ausente ** 
*Para aquellos que contengan cacao o lec he el límite máximo es de 7000 UFC/g. 
**En aquellos productos que contengan cac ao, huevo o leche (incluyendo sus derivados) 
9. Muestreo. 
El procedimiento de muestreo para los productos objeto de esta norma, debe sujetarse a lo que establece 
la Ley General de Salud y otras disposiciones jurídicas aplicables.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
10. Métodos de prueba. 
Para la verificación oficial de las especificaciones sanitarias que se establecen en esta norma, se deben 
aplicar los métodos de prueba establecidos en el Apéndice normativo B.  
11. Etiquetado. 
Las etiquetas o envases de los productos preenvasados  objeto de esta norma, además de cumplir con lo 
establecido en el Reglamento y en la Norma citada en el numeral 2.3 del apartado de referencias, deben 
cumplir con lo siguiente: 
11.1 Requisitos generales. 11.1.1 Los productos que hayan sido modificados en su composición, deben cumplir con la Norma citada 
en el numeral 2.7 del apartado de referencias. 
11.1.2 En el caso de que el producto haya sido objeto de  tratamiento térmico, par a asegurar la inocuidad 
del producto, esta condición debe señalarse en cualquier parte de la etiqueta. Si el producto ha sido sujeto a 
otro tipo de tratamiento se puede indicar el nombre de éste. 
11.2 Lista de ingredientes. 11.2.1 En las bebidas adicionadas con cafeína debe declararse en la lista de ingredientes la cafeína, el o 
los ingredientes base o la mezcla de éstos, seguido de l contenido exacto de cafeína expresado en  mg/100 
mL, que debe corresponder al total ya sea por el saboriz ante, el o los ingredientes base o la mezcla de éstos. 
11.3 Instrucciones de uso. 
11.3.1 Los jarabes o concentrados, cuando aplique, deben ostentar la leyenda: “Agítese antes de su 
consumo” o cualquier otra equivalente. 
11.4 Leyendas de conservación. 
11.4.1  Los congelados de bebidas no alcohólicas preenv asados deben ostentar la leyenda: “Manténgase 
en congelación” o “Consérvese en congelación” o cualquier otra equivalente. 
11.4.2 Los polvos deben ostentar la leyenda: "Consérv ese en un lugar fresco y seco” o cualquier otra 
equivalente. 
11.4.3 Para los jarabes o concentrados deben ostentar la leyenda: “Refrigérese después de abrirse”  o 
“Manténgase en congelación” o cualquier otra equivalente. 
11.5 Etiquetado nutrimental. 
11.5.1 Las bebidas para deportistas además, de la inform ación nutrimental obligatoria que establece la 
Norma citada en el numeral 2.3 del apartado de referencias, deben incluir los electrolitos y minerales que 
aporten. 
11.5.2  Quedan exceptuados de incluir la informació n nutrimental los concentrados de manufactura. 
11.6 Leyendas precautorias. 
11.6.1 En productos que contienen quinina debe indicarse la presencia de la misma, ya sea que se utilice 
la palabra “quinina” en la denominación del producto o empleando una leyenda por separado, la cual deben 
escribirse con caracteres mayores a la de los ingredientes. 
11.6.2 En congeladas, debe incluirse la leyenda: “Para protección de la salud, deben lavarse las manos  y 
el envase del producto antes de consumirlo” o leyenda análoga. 
11.6.3 Las bebidas adicionadas con cafeína, deben incluir las siguientes leyendas: “No consumir más de 
___ unidades al día” (en el espacio en blanco indicar la cantidad correspondiente, dependiendo de la 
concentración de cafeína, en ningún caso la inges ta de cafeína por el consumo de estas bebidas debe 
exceder de 165 mg de cafeína por día). 
En un recuadro en letras mayores a la de los ingredientes, se establecerán las siguientes leyendas de 
advertencia “No se recomienda su consumo por niños menores de 12 años, mujeres embarazadas o lactando, 
personas sensibles a la cafeína, ni la mezcla con bebidas alcohólicas”. 
11.7 Especificaciones para  productos a granel. 
11.7.1 Durante el expendio de los congelados a granel y en caso de que contengan cafeína adicionada en 
cantidad superior a 20mg/100ml, deben indicar por cualquier medio que el producto contiene dicho 
ingrediente. 
11.7.2  Durante el expendio de congelados a granel y en  caso de que contengan quinina, deben indicar por 
cualquier medio que el producto contiene dicho ingrediente. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
12. Envase. 
12.1 Debe garantizarse la inocuidad de las tintas emplea das en la etiqueta cuando por las características 
del producto y el envase primario, se presente el riesgo de ingerirlas; según lo que establece la Norma citada 
en el numeral 2.1 del apartado de referencias. 
13. Concordancia con normas internacionales. 
Esta norma no es equivalente con ninguna norma internacional. 14. Bibliografía. 
14.1 Ley Federal sobre Metrología y Normalización. 
14.2 Reglamento de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización. 
14.3 Ley General de Salud. 
14.4 Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios. 
14.5 American Public Health Association  (APHA). Standard Methods for the Examination of Water and 
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14.12 Codex Alimentarius Commission. 2001. Informe de la 33a. Reunión del Comité del Codex sobre 
aditivos alimentarios y contaminantes de los alimentos. La Haya, Países Bajos. 
14.13 Comité Mixto FAO/OMS de expertos en Aditivos Alim entarios 1995. Evaluación de ciertos aditivos 
alimentarios y contaminantes de los alimentos. 44a. Informe Roma Italia. 
14.14 Couturier-EG; Laman-DM; VAN-Duijn-MA; VAN-Duijn-H. 1997. Influence of caffeine and caffeine 
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and alcohol intake on fecundability. Am -J-Epidemiol. 146(1):32-41. 
14.16 Directiva 92/2/CEE de la Comisión, de 13 de enero de 1992, por la que se establece el 
procedimiento de muestreo y el método comunitario de aná lisis para el control oficial de las temperaturas de 
los alimentos ultracongelados destinados al consumo humano. 
14.17 Directiva 2010/69/UE de la Comisión, de 22 de oc tubre de 2010 por la que se modifican los anexos 
de la Directiva 95/2/CE del Parlamento Europeo y del Consej o, relativa a aditivos alimentarios distintos de los 
colorantes y edulcorantes. 
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15. Vigencia. 15.1 La presente norma entrará en vigor a los 365 días naturales posteriores al de su publicación en el 
Diario Oficial de la Federación. 
16. Observancia de la norma. 
16.1 La vigilancia en el cumplimiento de la presente nor ma corresponde a la Secretaría de Salud y a los 
gobiernos de las Entidades Federativas, en sus respectivos ámbitos de competencia. 
Sufragio Efectivo. No Reelección. 
México, Distrito Federal, a 9 de diciembre de 2011.- El Comisionado Federal para la Protección contra 
Riesgos Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento 
Sanitario, Mikel Andoni Arriola Peñalosa .- Rúbrica. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
Apéndice normativo A. Listado de aditivos 
Aditivo Productos Límite máximo en el 
producto listo para 
consumo  mg/L 
Aceite vegetal bromado1 Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 15 
Acetato isobutirato de sacarosa Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 500 
Acido benzoico, benzoato de sodio, 
benzoato de potasio y benzoato de 
calcio3 (expresado como ácido 
benzoico) Bebidas, jarabes, polvos, c oncentrados y concentrados 
de manufactura 600 
Acido fosfórico Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 700 
Acido L (+ ) – tartárico  Bebidas, c ongelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 2000 
Acido sórbico, sorbato de sodio, 
sorbato de potasio3 (expresado 
como ácido sórbico ) Bebidas, polvos, jarabes, c oncentrados y concentrados 
de manufactura 1000 
Alginato de propilenglicol Bebidas, congel ados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 500 
Amarillo ocaso FCF y sus lacas4 
Amarillo alimentos 3 y sus lacas 
N° C.I. 15895 (SIN 110) Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 100 
Azorrubina y sus lacas4 
Rojo alimentos 3 y sus lacas Carmoisina N° C.I. 14720 (SIN 122) Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 100 
Azul brillante FCF y sus lacas4 
Azul alimentos 2 y sus lacas 
N° C.I. 42090 Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 100 
Beta-apo-8’-carotenal 
Anaranjado alimentos 6 
N° C.I. 40820 Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 100 
Beta caroteno sintético 
Anaranjado alimentos 5 Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 100 
Beta-ciclodextrina Bebidas, congelados , polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 500 
Bisulfito de potasio6,7 Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados 
de manufactura 70 
Butilhidroxianisol 2 Bebidas, congelados, polvos,  jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 1000 
Butilhidroxitolueno 2 Bebidas y congelados 1000 
Cafeína Bebidas, congelados, polvo s, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 200 
Cantaxantina 
Anaranjado alimentos 8 
N° C.I. 40850 Congelados 100 
Carotenos naturales 
Anaranjado alimentos 5 N° C.I. 75130 Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 100 
Cera de abeja5 Bebidas, congelados, polvos,  jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 200 
Cera de candelilla5 Bebidas, congelados, polvos,  jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 200 
Cera de carnauba5 Bebidas, congelados, polvos,  jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 200 
Citrato de amonio férrico Polv os, jarabes y concentrados 10 
       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
Citrato de estearilo Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 500 
Citrato de isopropilo2 Bebidas, polvos, jarabes, c oncentrados y concentrados 
de manufactura 200 
Citrato trietilo Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 200 
Cloruro de estaño Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 20 
Color caramelo Clase III Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 5,000 
Color caramelo Clase IV Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 50,000 
d-alfa- tocoferol concentrado Bebidas, congelados y concentrados de manufactura 20 
Dicarbonato de dimetilo Bebidas, polvos, jarabes, c oncentrados y concentrados 
de manufactura 250 
Dioctil sulfosuccinato de sodio Bebidas, congelados, polvos y concentrados de 
manufactura 10 
Dióxido de azufre6,7 Bebidas, polvos, jarabes, c oncentrados y concentrados 
de manufactura 70 
dl–alfa-tocoferol Bebidas, congelados, polvos y concentrados de 
manufactura 20 
Eritrosina 
Rojo alimentos 14 N° C.I. 45430 Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 100 
Estearato de ascorbilo Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 1000 
Estearato de polioxietileno (40) Bebidas, congelados y concentrados de manufactura 500 
Estearoil 2 lactilato de calcio Bebidas, congelados, polvos y concentrados de 
manufactura 2000 
Estearoil 2 lactilato de sodio Bebidas, congelados, polvos y concentrados de 
manufactura 2000 
Ester de glicerol de madera rosina Bebidas, congelados, polvos y concentrados de 
manufactura 150 
Ester de glicerol de goma rosina Bebidas, congelados, polvos y concentrados de 
manufactura 150 
Esteres de glicerol de ácidos grasos 
y ácido diacetil tartárico Bebidas, congelados, jar abes, concentrados y 
concentrados de manufactura 1000 
Esteres de poliglicerol de ácidos 
grasos Bebidas y congelados 300 
Esteres de poliglicerol del ácido 
ricinoléico interésterificado Bebidas y congelados 300 
Esteres de propilenglicol de ácidos 
grasos Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 500 
Esteres de ácidos grasos y 
sacarosa Bebidas y congelados 1000 
Etilendiamino tetracetato disódico Bebidas, polvos, jarabes, c oncentrados y concentrados 
de manufactura 200 
Etilendiamino tetracetato cálcico 
disódico Bebidas, polvos, jarabes, c oncentrados y concentrados 
de manufactura 200 
Extracto de annato (Extracto de 
semillas de Bixa orellana ) 
Anaranjado natural 4 N° C.I. 75120 Concentrados de manufactura 50 
Extracto de cochinilla 
Extracto de Coccus cacti L 
Rojo Natural 4 Carmín N° C.I. 75470 Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 100 Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
 
Extracto de quilaya Bebidas, congelados , polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 508 
Extracto de tegumento de uva 
(extracto de piel de uva)  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 3009 
Fosfato dihidrogenado de calcio Bebidas, c ongelados y concentrados de manufactura 500 
Fosfato dihidrogenado de sodio Bebidas, c ongelados y concentrados de manufactura 500 
Fosfato hidrogenado disódico Bebidas, c ongelados y concentrados de manufactura 500 
Fosfato tricálcico Bebidas, congelados , polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 700 
Fosfato tripotásico Bebidas, congelados , y concentrados de manufactura 700 
Fosfato trisódico Bebidas, congelados  y concentrados de manufactura 700 
Galato de propilo2 Bebidas, congelados, polvos,  jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 1000 
p-hidroxibenzoato de metilo Bebidas, polvo s, jarabes, concentrados y concentrados 
de manufactura 500 
Indigotina y sus lacas4 
Azul alimentos 1 y sus lacas N° C.I. 73015 Bebidas, polvos, jarabes, c oncentrados y concentrados 
de manufactura 100 
L (+) Tartrato de potasio  Bebidas  y concentrados de manufactura 300 
L (+) Tartrato de sodio Bebidas y concentrados de manufactura 300 
Metabisulfito de potasio6,7 Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados 
de manufactura 70 
Metabisulfito de sodio6,7 Bebidas, polvos, jarabes, concentrados y concentrados 
de manufactura 70 
Monoestearato de sorbitán Bebidas , congelados, polvos y concentrados de 
manufactura 500 
Monoestearato de sorbitán 
polioxietilenado (20) Bebidas, congelados y concent rados de manufactura 500 
Monolaurato de sorbitán 
polioxietilenado (20) Bebidas, congelados y concent rados de manufactura 100 
Monooletato de sorbitán 
polioxietilenado (20) Bebidas, congelados y concent rados de manufactura 500 
Oxido de hierro negro 
Pigmento negro 11 Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 100 
Oxido de hierro rojo 
Pigmento rojo 101 Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 100 
Oxido de hierro amarillo 
Pigmento amarillo 42 Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 100 
Oxiestearina Bebidas, congelados y concentrados de manufactura BPF 
Palmitato de ascorbilo Bebidas, congel ados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 1000 
Polidimetilsiloxano Bebidas, c ongelados, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 20 
Polietilenglicol Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 1000 
Polifosfato de potasio Bebidas, congel ados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 1000 
Polifosfato de sodio  Bebidas, congelados, polvos y concentrados de 
manufactura 1000 
Polivinilpirrolidona Polvos 500 
Ponceau 4R4 
Rojo alimentos 7 N° C.I. 16255  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 50 
Resina de guayaco Bebidas, congelados y concentrados de manufactura 1000 
Riboflavina Bebidas, congelados, pol vos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 50 
Riboflavina- 5’- fosfato de sodio Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 50       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
 
Rojo allura AC y sus lacas4 
Rojo alimentos 17 y sus lacas 
N° C.I. 16035  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 300 
Sulfito ácido de calcio6,7 Bebidas y concentrados de manufactura 70 
Sulfito ácido de sodio6,7 Bebidas, polvos, jarabes, c oncentrados y concentrados 
de manufactura 70 
Sulfito de potasio6,7 Bebidas, polvos, jarabes, c oncentrados y concentrados 
de manufactura 70 
Sulfito de sodio6,7 Bebidas, polvos, jarabes, c oncentrados y concentrados 
de manufactura 70 
Tartrazina y sus lacas4 
Amarillo alimentos 4 y sus lacas 
N° C.I. 19140  Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 100 
Tiosulfato de sodio6,7 Bebidas, polvos, jarabes, c oncentrados y concentrados 
de manufactura 70 
Tocoferoles concentrados (mezcla) B ebidas, congelados, polvos y concentrados de 
manufactura 20 
Triestearato de sorbitán 
polioxietilenado (20) Congelados y concentrados de manufactura 500 
Verde rápido FCF y sus lacas4 
Verde alimentos 3 y sus lacas 
N° C.I. 42053 Bebidas, congelados, polvos, jarabes, concentrados y 
concentrados de manufactura 100 
 
1Indice de yodo = 16,0; Acidos grasos libres (como ácido oleico) = 2,5% 
2 Cantidad máxima referida al peso total de los aceites esenciales. 
3 La mezcla no debe exceder de 1000 mg/L tomando en cuenta el límite máximo de cada aditivo. 
4 Si se utiliza una mezcla de colorantes artificiales, ésta no deberá exceder de 100 mg/L en el producto 
listo para el consumo, tomando en cuenta el límite máximo de cada colorante. 
5 Como resultado de la utilización de aspartame como vehículo de sabor. 
6 Según se sirve al consumidor. 
7 Como SO 2 residual. 
8 130 mg/kg extracto seco en bebidas semicongeladas. 
9 Expresado como antocianina. 
Edulcorantes Además de los edulcorantes establecidos en la NOM-086-SSA1-1994, establecida en el apartado de 
referencias, se podrán utilizar los siguientes  edulcorantes bajo los límites establecidos. 
Aditivo Productos Límite máximo en el 
producto listo para 
consumo  mg/L 
Alitame Bebidas, congelados, polvos, jarabes, 
concentrados y concentrados de 
manufactura 40 
Aspartame-acelsufame potásico  B ebidas, congelados, polvos, jarabes, 
concentrados y concentrados de 
manufactura 350 
Ciclamato y sus sales de sodio y calc io Bebidas, congelados, polvos, jarabes, 
concentrados y concentrados de 
manufactura 350 
Eritritol Bebidas, congel ados, polvos, jarabes, 
concentrados y concentrados de 
manufactura BPF 
Estevia o glucósidos de estevia Bebidas, congelados, polvos, jarabes, 
concentrados y concentrados de 
manufactura 200 
Jarabe de maltitol Bebidas, congelados, polvos, jarabes, 
concentrados y concentrados de 
manufactura BPF Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
Jarabe de poliglicitol Bebidas , congelados, polvos, jarabes, 
concentrados y concentrados de manufactura BPF 
Jarabe de sorbitol Bebidas, congelados, polvos, jarabes, 
concentrados y concentrados de 
manufactura BPF 
Lactitol Bebidas, congel ados, polvos, jarabes, 
concentrados y concentrados de 
manufactura BPF 
Maltitol Bebidas, congelados, polvos, jarabes, 
concentrados y concentrados de 
manufactura BPF 
Manitol Bebidas, congelados, polvos, jarabes, 
concentrados y concentrados de 
manufactura BPF 
Neotame Bebidas, congelados, polvos, jarabes, 
concentrados y concentrados de 
manufactura 33 
 
Lista de aditivos para uso conforme a las Buenas Prácticas de Fabricación: 
Acetato de almidón 
Acetato de amonio 
Acetato de calcio 
Acetato de potasio 
Acetato de sodio 
Acido acético glacial 
Acido algínico 
Acido ascórbico, ascorbato de sodio, ascorbato de pot asio y ascorbato de calcio (expresado como ácido 
ascórbico) 
Acido cítrico 
Acido clorhídrico 
Acido D-L-tartárico 
Acido eritórbico (expresado como ácido eritórbico) 
Acido fumárico 
Acido L-glutámico 
5’-ácido guanílico 
Acido inosínico 
Acido láctico 
Acido D,L- málico 
Acido propiónico (no se permite su uso en congelados) 
Acido tánico 
Adipato acetilado de dialmidón 
Agar 
Alginato de amonio 
Alginato de calcio 
Alginato de potasio 
Alginato de sodio 
Almidón acetilado oxidado 
Almidón blanqueado 
Almidón hidroxipropilado, Hidroxipropil de almidón       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
Almidón oxidado 
Almidones tratados con ácidos Almidones tratados con álcalis Almidones tratados con enzimas 
Carbonato de amonio 
Carbonato hidrogenado de amonio Carbonato de calcio Carbonato de magnesio Carbonato de potasio Carbonato de sodio 
Carbonato hidrogenado de magnesio 
Carbonato hidrogenado de potasio Carbonato hidrogenado de sodio Carboximetilcelulosa de sodio Carboximetilcelulosa sódica reticulada 
Carboximetilcelulosa sódica hidrolizada mediante enzimas 
Carragenina 
Celulosa en polvo Celulosa microcristalina Alfa-ciclodextrina Gamma-ciclodextrina Citrato de triamonio 
Citrato diácido de potasio 
Citrato diácido de sodio Citrato tricálcico Citrato tripotásico Citrato trisódico Clorofilas, Verde natural 3, N° C.I. 75810 
Cloruro de amonio 
Cloruro de calcio Cloruro de magnesio Cloruro de potasio Color caramelo Clase I y II Dextrinas 
Dextrinas, almidón tostado 
Dialmidón glicerol Dialmidón glicerol acetilado Dióxido de carbono Dióxido de silicio amorfo Dióxido de titanio, Pigment o blanco 6,N° C.I. 77891 
Eritorbato de sodio (expresado como ácido eritórbico) 
Esteres acéticos y de ácidos grasos del glicerol Esteres cítricos y de ácidos grasos del glicerol Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
Esteres lácticos y de ácidos grasos del glicerol 
Etil celulosa 
Etilhidroxietilcelulosa 
Fosfato de dialmidón acetilado Fosfato de dialmidón 
Fosfato de hidroxipropil dialmidón 
Fosfato fosfatado de dialmidón Fosfato de monoalmidón 
Fumarato de sodio 
Glicerol Gluconato de calcio 
Gluconato de magnesio 
Gluconato de potasio Gluconato de sodio 
Glucono delta lactona 
Glutamato de calcio Glutamato de magnesio 
Glutamato monoamónico 
Glutamato monopotásico Glutamato monosódico 
Goma arábiga 
Goma damar Goma de algarrobo 
Goma gellana 
Goma ghatti Goma guar 
Goma karaya 
Goma tara Goma tragacanto 
Goma xantana 
5’-guanilato disódico Hidróxido de amonio 
Hidróxido de calcio 
Hidróxido de magnesio 
Hidróxido de potasio 
Hidróxido de sodio 
Hidroxipropil almidón 
Hidroxipropilcelulosa 
Hidroxipropil dialmidón glicerol 
Hidroxipropilmetilcelulosa 
5’-inosinato de calcio 
5’-inosinato de potasio 
5’-inosinato disódico       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
Lactato de amonio 
Lactato de calcio 
Lactato de magnesio 
Lactato de potasio Lactato de sodio 
Lecitina 
Licopeno Metil celulosa 
Metiletilcelulosa 
Monoestearato de gliceril o (Mono y diglicéridos) 
Monopalmitato de glicerilo (Mono y diglicéridos) 
Nitrógeno 
Octenilsuccinato sódico de almidón Oleorresina de paprika 
Oxido de calcio 
Oxido de magnesio Pectinas 
Polidextrosa 
Propionato de calcio (no se permite su uso en congelados) Propionato de potasio (no se permite su uso en congelados) 
Propionato de sodio (no se permite su uso en congelados) 
Rojo betabel Silicato de aluminio 
Silicato de aluminio y calcio 
Silicato de aluminio y sodio Silicato de calcio 
Silicato de magnesio 
Sulfato ácido de sodio Sulfato de calcio 
Sulfato de magnesio 
Sulfato de potasio Sulfato de sodio 
APENDICE NORMATIVO B. 
METODOS DE PRUEBA B.1. DETERMINACION DE CAFEINA EN BEBIDAS NO ALCOHOLICAS. B.1.1  Principio del método. 
La cafeína es extraída de la muestra con clorofo rmo y determinada espectrométricamente a una longitud 
de onda de 276 nm. 
B.1.2  Equipo. 
B.1.2.1  Espectrómetro de UV-Visible disponible para utilizarse a 276 nm. 
B.1.2.2  Balanza analítica con una precisión de 0,1 mg. 
B.1.3  Materiales. 
B 1.3.1  Matraces volumétricos de 100 mL. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 1.3.2  Probetas de 100 mL. 
B 1.3.3  Vasos de precipitados de 250 mL. 
B 1.3.4  Embudos de separación de 125 mL. 
B 1.3.5  Pipetas graduadas de 1 y 10 mL. 
B 1.4  Reactivos. 
Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por agua se 
entiende agua destilada. 
B 1.4.1 Sulfito de sodio anhidro (Na 2SO 3) 
B 1.4.2  Tiocianato de potasio (KSCN). 
B 1.4.3  Acido fosfórico (H 3PO 4). 
B 1.4.4  Hidróxido de sodio (NaOH). 
B 1.4.5  Cloroformo (CHCl 3). 
B 1.4.6  Cafeína (C 8H10N4O2) 
B 1.4.7  Permanganato de potasio (KMnO 4). 
B 1.4.8  Solución reductora. 
Disolver 5 g de Na 2SO 3 y 5 g de KSCN en agua y llevar a un volumen de 100 mL. 
B 1.4.9  Solución diluida de ácido fosfórico. 
Diluir 15 mL de H 3PO 4 con 85 mL de agua. 
B 1.4.10  Solución de hidróxido de sodio. 
Disolver 25 g de NaOH en 75 mL de agua. B 1.4.11  Solución patrón de cafeína de 1 mg/mL. 
Disolver exactamente 100 mg de cafeína en cloroformo y llevar a un volumen de 100 mL con el mismo 
solvente. 
B 1.4.12  Solución de permanganato de potasio al 1,5%. 
Pesar 1,5 g de KMnO
4 y disolver en 100 mL de agua. 
B 1.5  Procedimiento. 
B 1.5.1  Preparación de la curva patrón. 
B 1.5.1.1  Medir los siguientes volúmenes de solución patrón de cafeína, de acuerdo con la Tabla número 1 
y llevar a un volumen de 100 mL con cloroformo. 
Tabla No. 1 
Matraz mL solución patrón de cafeína mg cafeína/100 mL 
1 0,00 Blanco 
2 0,10 0,10 
3 0,25 0,25 
4 0,50 0,50 
5 1,00 1,00 
6 1,50 1,50 
7 2,00 2,00 
 
B 1.5.1.2  Determinar la absorbancia de cada una de las soluciones patrón a 276 nm. 
B 1.5.1.3  Elaborar una gráfica de la lectura de absorbancia para cada una de las soluciones patrón en 
función de su concentración (en mg/100mL). Ajustar la curva mediante regresión lineal (método de mínimos 
cuadrados). Lo anterior, puede llevar se a cabo en equipos que se programan directamente en los cuales sólo 
es necesario leer los estándares y marcar su concentración teórica.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 1.5.2  Preparación de la muestra. 
B 1.5.2.1  Eliminar el gas de la muestra por agitación o con ultrasonido. 
B 1.5.2.2  Medir 10 mL de muestra en un embudo de separación de 125 mL, adicionar 5 mL de solución de 
permanganato de potasio al 1,5% y mezclar. 
B 1.5.2.3  Después de exactamente 5 minutos, añadir 10 mL de la solución reductora y mezclar. 
B 1.5.2.4  Adicionar 1 mL de solución diluida de ácido fosfórico, mezclar, añadir 1 mL de solución de 
hidróxido de  sodio y mezclar. 
B 1.5.2.5  Extraer con 50 mL de cloroformo durante un minut o. Dejar separar las fases y drenar la fase 
inferior filtrando a través de papel filtro. Colectar en un matraz volumétrico de 100 mL. 
B 1.5.2.6  Añadir de 2-3 mL de cloroformo al embudo de separación y drenar a través del papel. 
B 1.5.2.7  Lavar el papel con 2-3 mL de cloroformo. Extr aer nuevamente con 40 mL de cloroformo filtrando 
y lavando el papel filtro como se describió ant eriormente y diluir al volumen con cloroformo. 
B 1.5.2.8  Determinar la absorbancia a 270 nm. 
B 1.6  Cálculos 
De la ecuación de la recta obtenida. 
y = mx + b 
Donde: 
y = Absorbancia obtenida en la muestra ya procesada. 
m = Pendiente (coeficiente de absortividad). x = mg cafeína/100 mL en la muestra. b = Ordenada al origen. Despejar “ x” y obtener directamente los mg de cafeína/100 mL de bebida. 
mg cafeína/100 mL = mg de cafeína/100 mL  obtenidos de la curva X 100 X F.D. 
 10 
Donde: F.D. = Factor de dilución. B 1.7  Expresión de resultados. 
mg cafeína/100 mL. 
 
B 2 DETERMINACION DE MATERIA EXTRAÑA. 
B 2.1  Principio del método. 
La materia extraña se separa de la muestra mediante flotación o sedimentación de acuerdo a la naturaleza 
del producto y posteriormente se filtra para su identificación al microscopio. 
B 2.2  Equipo. 
B 2.2.1  Balanza granataria con una precisión de 0.1 g. 
B 2.2.2  Equipo de filtración al vacío. 
B 2.2.3  Microscopio binocular estereoscópico con objetivos que pueden ser de 3, 6, 7 y 10X y oculares 
apareados de amplio campo visual de 10, 30 y 100X, respectivamente. 
B 2.2.4  Lámpara para el microscopio o luz natural equivalente. 
B 2.2.5  Parrilla de calentamiento con agitación magnética. 
B 2.3 Materiales. 
B 2.3.1  Matraz trampa de Wildman, formado por un matraz Erlenmeyer de 1 o 2 L, provisto de una varilla 
metálica con un tapón de émbolo de hule en un extremo. 
B 2.3.2  Embudo de Hirsch o Buchner para filtración al vacío. 
B 2.3.3  Caja de Petri. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 2.3.4  Papel de filtración rápida del número 8 rayado para conteo o rayado a lápiz con líneas paralelas de 
aproximadamente 5 mm de separación. 
B 2.3.5  Aguja de disección. 
B 2.3.6  Material de uso común en el laboratorio. 
B 2.4  Reactivos. 
Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por agua se 
entiende agua destilada. 
B 2.4.1  Heptano (C 7H16). 
B 2.4.2  Acido clorhídrico (HCl) de 36,5 a 38,0% de pureza. 
B 2.4.3  Aceite mineral. Aceite de parafina, blanco y li gero. Con un peso específico de 0,840-0,860 (24ºC). 
B 2.4.4  Glicerina (C 3H8O3) 
B 2.4.5  Mezcla de glicerina: etanol 1:3 (v/v). 
B 2.4.6  Mezclar un volumen de glicerina con 3 volúmenes de etanol. 
B 2.5  Procedimiento. 
B 2.5.1 Determinación de materia extraña en bebidas no alcohólicas embotelladas o en lata. 
B 2.5.1.1  Homogeneizar bien la muestra y filtrar 250 mL sobre un embudo de succión, preparado con 
papel filtro para conteo, trat ando de verterlo uniformemente. 
B 2.5.1.2  Colocar el filtro con residuo en una caja de Petri, y humedecerla con la mezcla de glicerina/ 
etanol (opcional). Examinar al microscopio utilizando una luz suficientemente fuerte para que muestre los 
detalles en el papel filtro. 
B 2.5.1.3  Contar explorando con una aguja de disección sobr e toda la superficie del papel, línea por línea, 
y explorar cada pieza del material, porque algunos fragmentos son irreconocibles a menos que se muevan. 
B 2.5.2 Determinación de materia extraña en concentrados y jarabes. 
B 2.5.2.1  Homogeneizar bien la muestra. En el caso de concentrados y jarabes reconstituir la muestra 
siguiendo las instrucciones de la etiqueta. 
B 2.5.2.2  En un matraz trampa de Wildman medir 250 mL de muestra, adicionar 15 mL de aceite mineral y 
agregar agitando vigorosamente suficiente cantidad de  agua caliente (70ºC), hasta que la capa de aceite 
llegue al cuello del matraz. Dejar reposar 30 minutos. 
B 2.5.2.3 Girar suavemente la varilla de metal, para atrapar la capa de aceite, levantándolo  e 
introduciéndolo lo más que se pueda en el cuello del matraz. 
B 2.5.2.4  Mantener el émbolo en su lugar y decantar el líquido que está sobre él a un embudo de succión 
preparado con un filtro par a conteo, tratando de ve rterlo uniformemente. 
B 2.5.2.5  Colocar el filtro con residuo en una caja de Petri, y humedecerla con la mezcla de glicerinaetanol 
(opcional). Examinar al microscopio utilizando una luz suficientemente fuerte para que muestre los detalles en 
el papel filtro. 
B 2.5.2.6  Contar explorando con una aguja de disección sobr e toda la superficie del papel, línea por línea, 
y explorar cada pieza del material, porque algunos fragmentos son irreconocibles a menos que se muevan. 
B 2.5.2.7  En caso de que la muestra contenga tejidos de frutas emplear el siguiente procedimiento: 
B 2.5.2.7.1  Pesar en un vaso 100 g de la muestra y adicionar 200 mL de agua caliente (Aprox. a 50ºC). 
Transferir al matraz trampa, adicionar 10 mL  de ácido clorhídrico y hervir por 3 minutos. 
B 2.5.2.7.2  Enfriar a temperatura ambiente, adicionar 25 mL de heptano y agitar perfectamente. Bajar la 
varilla de metal y el tapón émbolo de hule, añadir el agua necesaria para que la capa de heptano suba al cuello del matraz. 
B 2.5.2.7.3  Dejar reposar por 15 minutos. Girar suavemente la varilla de metal, para remover el sedimento 
fino que se acumuló en la superficie del tapón émbolo. 
B 2.5.2.7.4  Atrapar la capa de heptano levantándolo e introduciéndolo lo más que se pueda en el cuello 
del matraz. Mantener el émbolo en su lugar y decantar el líquido que está sobre él a un embudo de succión 
preparado con un papel filtro para cont eo, tratando de verterlo vigorosamente. 
B 2.5.2.7.5 Añadir nuevamente 25 mL de heptano al matraz trampa para hacer una segunda extracción 
heptano sobre el embudo de succión, lavar la varilla y el  cuello del matraz con heptano y verterlo sobre el 
mismo embudo.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 2.5.2.7.6  Examinar al microscopio utilizando una luz suficientemente fuerte para que muestre los 
detalles en el papel filtro. Contar ex plorando con una aguja de disección sobre toda la superficie del papel, 
línea por línea, voletear y explorar cada pieza del mate rial, porque algunos fragmentos son irreconocibles a 
menos que se muevan. No contar material dudoso. 
B 2.5.3  Determinación de materia extraña en polvos para preparar bebidas. 
B 2.5.3.1  Homogeneizar la muestra. Pesar en un vaso 50 g de muestra y adicionar de 400-500 mL de 
agua agitar bien hasta que toda la muestra se disuelva  y aplicar el mismo proced imiento seguido en B 2.5.1 
B 2.6  Expresión de resultados. 
Presencia o ausencia de insectos enteros, fragmentos de insectos, pelo s de roedor, excretas o cualquier 
materia extraña encontrada en 50 g, 100 g o 250 mL de producto, según corresponda. 
 
B 3 DETERMINACION DE QUININA EN BEBIDAS CARBONATADAS. 
B 3.1  Principio del método. 
La quinina es determinada espectrométricamente en me dio ácido a una longitud de onda de 347.5 nm. 
B 3.2  Equipo. 
B 3.2.1  Espectrómetro de UV-Visible disponible para utilizarse a 347.5 nm. 
B 3.2.2  Balanza analítica con una precisión de 0.1 mg. 
B 3.2.3  Agitador magnético. 
B 3.3  Materiales. 
B 3.3.1  Matraces volumétricos de 100 mL. 
B 3.3.2  Probetas de 100 mL. 
B 3.3.3  Vasos de precipitados de 250 mL. 
B 3.4  Reactivos. 
Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por agua se 
entiende agua destilada. 
B 3.4.1  Quinina (C 20H24N2O2). Secada a 100ºC durante 3 horas. 
B 3.4.2  Acido clorhídrico concentrado (HCl). 
B 3.4.3  Solución de ácido clorhídrico 0,5 N. 
B 3.4.4  Solución patrón de quinina de 1 mg/mL. Pesar exactamente 100 mg de quinina en un matraz 
volumétrico de 100 mL. Adicionar 20 mL de ácido clorhí drico 0,5 N y llevar al volumen con agua. Mezclar. 
B 3.5  Procedimiento. 
B 3.5.1  Preparación de la curva patrón. 
B 3.5.1.1  Medir los siguientes volúmenes de solución patrón de quinina, de acuerdo con la Tabla No. 2, en 
matraces volumétricos de 100 mL. 
Tabla No.2 
Matraz mL solución patrón de quinina mg quinina/L 
1 0,00 Blanco 
2 0,50 5,0 
3 1,00 10,0 
4 2,00 20,0 
5 3,00 30,0 
6 4,00 40,0 
7 5,00 50,0 
8 6,00 60,0 Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 3.5.1.2  Adicionar a cada matraz 20 mL de ácido clorhídric o 0.5 N. Llevar al volumen con agua y mezclar. 
B 3.5.1.3  Determinar la absorbancia de cada las soluciones patrón a 347,5 nm. 
B 3.5.1.4  Elaborar una gráfica de la lectura de absorbancia para cada una de las soluciones estándar en 
función de su concentración (en mg/L). Ajustar la curva mediante regresión lineal (método de mínimos 
cuadrados). Lo anterior, puede llevars e a cabo en equipos que se programan directamente, en los cuales sólo 
es necesario leer los estándares y marcar su concentración teórica. 
B 3.5.2  Preparación de la muestra. 
B 3.5.2.1  Vaciar el contenido de la botella o lata en un  vaso de precipitados. Ag itar magnéticamente hasta 
eliminar el gas. 
B 3.5.2.2  Medir 50 mL de la muestra degasificada en un matraz volumétrico de 100 mL y adicionar 20 mL 
de ácido clorhídrico 0,5 N y llevar  al volumen con agua. Mezclar. 
B 3.5.2.3  Determinar la absorbancia a 347,5 nm. 
B 3.6 Cálculos. 
De la ecuación de la recta obtenida. 
y = mx + b 
Donde: y = Absorbancia obtenida en la muestra ya procesada. 
m = Pendiente (coeficiente de absortividad). 
x = mg quinina/L en la muestra. b = Ordenada al origen. 
Despejar “ x” y obtener directamente de la curva los mg de quinina/L. 
Para obtener la cantidad de quinina en la muestra aplicar la siguiente ecuación: mg quinina/L = mg quinina/L obtenidos de la curva estándar X 100 X F.D. 50 
Donde: 
F.D. = Factor de dilución. B 3.7  Expresión de resultados. 
mg quinina/L. 
 
B 4 DETERMINACION DE SULFITOS EN ALIMEN TOS. METODO OPTIMIZADO DE  MONIER-
WILLIAMS. 
B 4.1  Principio del método. 
El método mide sulfitos libres más porciones repr oducibles de sulfitos ligados, tales como productos 
carbonílicos, en alimentos. La muestra es calentada co n ácido clorhídrico (HCl) en reflujo para convertir el 
sulfato a SO 2 (sulfitos). El nitrógeno introducido a la solución arrastra el SO 2 a través del condensador enfriado 
por agua y pasa a una solución del H 2O2 al 3% donde el SO 2 se oxida a ácido sulfúrico (H 2SO 4). El contenido 
de sulfito es directamente relacionado al H 2SO 4 generado, el cual es determinado por titulación con hidróxido 
de sodio (NaOH) estandarizado. 
Aplicable para la determinación de  10 ppm de sulfitos en alimentos. Aplicable en presencia de otros 
compuestos volátiles de azufre, no aplicab le a cebollas secas, puerros y calabazas. 
B 4.2  Equipo. 
B 4.2.1  Aparato de Destilación (nota: En  este método la presión dentro del aparato está limitada a la 
presión propia de la solución de H 2O2 al 3% encima del extremo del burbu jeador, mantener la presión baja 
para evitar la pérdida del SO 2 a través del goteo). Usar una películ a delgada de vaselina en las superficies 
que sellan en todas las juntas, excepto en la junta en tre el matraz y el embudo de separación. Poner pinza en 
cada junta para asegurar que sellen completamente.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
 
B 4.2.2  Ensamblar el aparato según se muestra en la figura siguiente: 
B 4.2.3  Bureta de 10 mL con tubo de sobrellenado y conexiones para tubo Ascarita o el equivalente para 
permitir mantener una atmósfera libre de CO 2 sobre el hidróxido de sodio 0,01N estandarizado. 
B 4.3 Reactivos.  
Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por agua se 
entiende agua desionizada. 
B 4.3.1  Acido clorhídrico (HCl) acuoso 4N. Para cada análisis, preparar 90 mL de esta solución mezclando 
30 mL de HCl y 60 mL de agua desionizada. 
B 4.3.2  Indicador de rojo de metilo. Disolver 250 mg de rojo de metilo en 100 mL de etanol. 
B 4.3.3  Titulante estandarizado. Hidróxido de sodio (N aOH) 0,010N Estandarizar la solución con estándar 
de ftalato ácido de potasio. 
B 4.3.4  Solución de peróxido de hidrógeno al 3% (H 2O2). Para cada análisis, diluir 3 mL de H 2O2 al 30% 
con 30 mL de agua desionizada. Justo antes de usarse, agregar 3 gotas de indicador de rojo de metilo y titular 
con hidróxido de sodio (NaOH) 0,010N a un punto final amarill o, si el punto final excedió, descartar la solución. 
B 4.3.5  Nitrógeno de alta pureza. Usar un regulador para mantener el flujo de 200 mL/min. Para evitar 
oxígeno en el nitrógeno se usa una trampa tipo cromatografía de gases. 
B 4.4 Preparación de la muestra.  
B 4.4.1  Sólidos. 
Transferir 50g de alimento o la cantidad que contenga de 500 a 1500 g de SO 2, a un procesador de 
alimentos o licuadora. Agregar 100 mL de etanol - agua (5+95 v/v) y mezclar. Licuar sólo hasta que el alimento pueda pasar por la junta 24/40 del matraz. 
B 4.4.2  Líquidos. 
Mezclar 50g de muestra, o la cant idad que contenga de 500 a 1500 g de SO 2 con 100 mL de la mezcla 
etanol – agua. 
Nota: Llevar a cabo la preparación de la muestra y el análisis tan rápido como sea posible para evitar la 
pérdida de formas lábiles de sulfito. 
B 4.5 Preparación del sistema.  
B 4.5.1  Usando el aparato ensamblado y el matraz pues to en la manta de calentamiento, agregar 400 mL 
de agua al matraz. 
B 4.5.2  Cerrar la llave del embudo de separación y agregar 90 mL de HCl 4N. 
B 4.5.3  Empezar con el flujo de nitrógeno. Iniciar el flujo en el refrigerante. 
B 4.5.4  Colocar el recipiente con 30 mL de H 2O2, el cual ha sido titulado a punto final amarillo con NaOH 
0,010N. 
B 4.5.5  Después de 15 min, el aparato y el agua estarán completamente desoxigenadas y la porción de 
muestras debe ser introducida al sistema. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 4.5.6  Remover el embudo de separación y cuantitativamente transferir la muestra al matraz. 
B 4.5.7  Limpiar la junta y rápidamente aplicar gr asa de silicón y regresarlo a su lugar. 
B 4.5.8  El flujo de nitrógeno a través de la solución de H 2O2 al 3% se reanuda tan pronto como se coloca 
el embudo en la junta del matraz. Examinar cada junta para asegurar que esté sellado. Usar un bulbo con 
válvula para aplicar presión sobre el HCl. Abrir la llave y dejar pasar el HCl al matraz. Continuar sosteniendo la 
válvula para mantener la suficiente pr esión sobre la solución de ácido para forzarla a pasar. Cerrar la llave 
antes de que los últimos 2-3 mL drenen para evitar que el SO 2 escape hacia el embudo de separación. 
B 4.5.9  Calentar la manta al calentamiento y regular par a calentar lo suficiente, obteniendo de 80 a 90 
gotas/min del condensador. 
B 4.5.10 Dejar 1 h 45 min y remover el vaso. 
B 4.6  Procedimiento 
Inmediatamente titular el contenido del vaso o probeta c on hidróxido de sodio 0,010N a punto final amarillo 
y que persista  20 segundos. 
B 4.7  Cálculos. 
Calcular el contenido de sulfitos, como sigue: 
g SO 2,/g =32,03 x VB x N x 1000 
peso de muestra 
Donde: 
32,03 = peso milequivalente del SO 2 
VB = Volumen (ML) del NaOH 
N = Normalidad del NaOH 
1000 = Factor para convertir milequivalentes a microequivalentes 
Peso de muestra: cantidad de muestra que se introdujo al matraz 
B 5 DETERMINACION DE SULFITOS POR GRAVIMETRIA (OPCIONAL). 
B 5.1  Después de la titulación, llevar el contenido del recipiente a un vaso de 400 mL agregar 4 gotas de 
HCl 1N y un exceso de solución de BaCl 2 al 10% y dejar reposar toda la noche. 
B 5.2 Lavar el precipitado por decantación 3 veces con agua caliente a través de un Gooch previamente 
pesado. Lavar con 20 mL de alcohol etílico y 20 mL de éter y secar a 105°-110°C. 
B 5.3  Determinar el blanco de reactivos para la titulación y para el método gravimétrico y considerarlo en 
el cálculo de los resultados. 
B 5.4  Preparación del Aparato de Filtración 
B 5.4.1 Unir el receptáculo con un filtro de fibra de vidrio. 
B 5.4.2 Colocar lo anterior en el matraz kitasato. 
B 5.4.3  Lavar el filtro con 10 mL de agua caliente, de sionizada y después con 10 mL de etanol usando 
vacío. 
B 5.4.4  Quitar el filtro y secarlo a 110°C durante 12 hor as o más. Transferir a desecador para enfriar a 
temperatura ambiente. Pesar (Wb). 
B 5.4.5  Colocar el filtro en el receptáculo de vidrio. 
B 5.5  Precipitado de BaSO 4 
B 5.5.1  Pasar el precipitado por el filtro. Lavar c on agua para asegurar que todo ha sido filtrado. 
B 5.5.2  Pasar 10 mL de etanol a través del precipitado y filtrar con vacío. 
B 5.5.3  Remover el filtro y secar en estufa a 110°C durante toda la noche. 
B 5.5.4  Transferir a desecador, enfriar y pesar (Wp). 
B 5.6 Cálculos.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
Calcular el contenido de sulfitos como sigue: 
g SO 2,/g =(Wp – Wb) x 274,46  
g muestra 
Donde: 
Wp = Peso de papel filtro con el precipitado de BaSO 4 a peso constante 
Wb = Peso de papel filtro preparado y puesto a peso constante B 5.7 Ensayos de Recuperación. 
B 5.7.1  Para familiarizarse y eficientizar el método antes de realizar la rutina, analizar porciones de 
muestra que contengan canti dades conocidas de sulfitos. 
B 5.7.2  Realizar los análisis de manera que se omita cual quier pérdida de sulfitos por oxidación o reacción 
con los componentes en el alimento. 
B 5.7.3  Debido a que los sulfitos son reactivos con el aire y con algunas matrices alimenticias y dado que 
carecen de estabilidad, se debe fortific ar con fuentes estables de sulfitos, no sulfito de sodio o sales similares. 
B 5.7.4  El hidroximetil sulfonato de sodio (HMS), el c ual es estructuralmente similar a algunas formas 
combinadas de sulfitos en alimentos, es útil para preparar porciones de prueba fortificada. 
B 5.7.5  Para el análisis, transferir 50g de muestra de alimento libre de sulfitos al matraz. Agregar una 
alicuota de solución de la sal sódica de hi droximetil sulfonato. Ana lizar inmediatamente. 
B 5.7.6  Recuperaciones de 
 80% del HMS con matrices alimenticias de 10 ppm son recomendables para 
asegurar una adecuada exactitud analítica. 
B 5.8  Informe de las pruebas. 
g SO 2,/g 
 
B 6 DETERMINACION DE SODIO (Na) POR ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORCION ATOMICA 
CON ADITAMENTO DE FLAMA 
B 6.1 Fundamento 
La muestra se somete a una digestión ácida con ácido nítrico concentrado para que el analito liberado sea 
cuantificado por espectrofotom etría de absorción atómica. 
B 6.2 Reactivos 
B 6.2.1  Acido nítrico (HNO 3) concentrado grado suprapuro 
B 6.2.2  Acido nítrico (HNO 3) concentrado G.R. 
B 6.2.3  Estándar certificado de Na de 1000 g/mL 
B 6.2.4  Agua deionizada 
B 6.3  Materiales 
B 6.3.1  Sistema de reflujo 
B 6.3.2  Material común de laboratorio 
B 6.3.3  Papel filtro No. 1 
B 6.4  Equipo 
B 6.4.1  Balanza analítica con una sensibilidad de 0.1 mg 
B 6.4.2  Espectrofotómetro de absorción atómica con aditamento de flama 
B 6.4.3  Parrilla de calentamiento 
B 6.4.4  Lámpara de cátodo hueco de sodio 
B 6.5  Preparación de la muestra para ensayo 
B 6.5.1 Productos sólidos 
Tomar una cantidad representativa de la muestra a ana lizar. Si es necesario moler el producto mediante 
un molino o un mortero. Evitar cualquier contami nación durante esta manipulación. Mezclar bien. 
B 6.5.2  Productos líquidos Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
Mezclar bien el producto antes de abrir el recipiente. A continuación transvertir a un recipiente de vidrio  o 
de plástico descontaminado. Guardar en el refr igerador (4°C). Mezclar bien antes del uso. 
B 6.5.3  Descontaminación del material 
En una cubeta de polietileno (volumen aproximado de 15L ) introducir 10L de mezcla ácido nítrico/agua (1:1). 
En este baño descontaminar durante una noche todos los matraces aforados, tapones, recipientes de polietileno 
o de polipropileno, así como todo el material de vidrio necesario. Enjuagar con agua destilada. Secar. 
B 6.6 Procedimiento 
B 6.6.1  Se pesa de 1,0 a 2,0 g de muestra en un matraz  de fondo plano de 250 mL con boca esmerilada, 
se le añaden 10 mL de HNO 3 grado suprapuro y se digieren por ca lentamiento en un sistema de reflujo 
durante 2 h o hasta digestión completa. 
B 6.6.2  La muestra se enfría y se filtra a través de pape l filtro No. 1 y se recibe en un matraz aforado de 
100 mL. 
B 6.6.3  Se lava tres veces el matraz de la digestión con tres porciones de 10 mL de agua deionizada y los 
lavados se filtran y se reciben en el matraz aforado, se lleva a volumen con agua deionizada. 
B 6.6.4  Ajustar el espectrofotómetro de acuerdo a las recomendaciones del fabr icante usando un estándar 
certificado. 
B 6.6.5  Se leen las muestras y se anotan los resultados obtenidos en g/mL, de acuerdo a lo siguiente: 
B 6.6.5.1  Longitud de onda: 589,6 nm 
B 6.6.5.2  Llama: aire-acetileno, oxidante 
Nota: Se recomienda meter una muestra añadida para valorarla y hacer un blanco de reactivos para cada 
serie de digestiones. 
B 6.6.6  Cálculo 
mg/kg Na+ = (A-B) x C
 D 
En donde: 
A = g/mL de Na+ en la muestra 
B = g/mL de Na+ en el blanco 
C = mL de aforo de la muestra D = peso de la muestra en g tomada para el análisis 
B 6.6.6.1  Sensibilidad del método: 0,15 g/mL para 1% de absorción. 
B 7 ANALISIS MICROBIOLOGICO DE PRODUCTOS OBJETO DE ESTA NORMA 
B 7.1 Procedimiento para la preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis 
microbiológico. 
B 7.1.1  Fundamento 
La dilución primaria tiene por objeto obtener un a distribución lo más uniforme posible de los 
microorganismos contenidos en la muestra destinada para el análisis. La preparación de diluciones decimales 
adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el número de microorganismos por unidad de volumen, para permitir, después de la incubación, la obs ervación de la prueba en el caso de tubos o matraces 
y la cuenta de colonias en el caso de placas. 
B 7.1.2  Reactivos 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico. Cuando se indique agua debe 
entenderse como agua destilada. 
B 7.1.2.1  Preparación de reactivos 
B 7.1.2.1.1  Solución de hidróxido de sodio 1,0 N 
Ingredientes Cantidades 
Hidróxido de sodio 4,0 g 
Agua 100 mL 
Preparación:       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
Disolver el hidróxido de sodio y llevar a 100 mL con agua. 
B 7.1.2.1.2  Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada). 
Ingredientes Cantidades 
Fosfato de sodio monobásico 34,0 g 
Agua 1,0 L 
 
Preparación: Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0 N. Llevar a un litro con agua. 
Esterilizar durante 15 minutos a 121° ± 1,0°C. 
Conservar en refrigeración (solución concentrada). Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar  a un litro con agua (solución de trabajo). 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera. Esterilizar a 121° ± 1,0°C durante 15 minutos. Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales  a 
los iniciales. 
B 7.1.2.1.3  Agua peptonada 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 1,0 g 
Cloruro de sodio 8,5 g 
Agua 1,0 L 
 
Preparación: Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustar el pH a 7 ± 0,1 con hidróxido de sodio 1,0 N. 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera. 
Esterilizar a 121 ± 1,0°C durante 15 minutos. Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales  a 
los iniciales. 
Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar oscuro a una temperatura entre 0 a 5°C 
por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición. 
B 7.1.3 Materiales 
B 7.1.3.1  Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 1 mL y 2 mL), con tapón 
de algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total. 
B 7.1.3.2  Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca. 
B 7.1.3.3  Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca. 
B 7.1.3.4  Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, 
espátulas, etc. 
B 7.1.3.5  Todo el material e instrumentos que tengan c ontacto con las muestras  bajo estudio deberán 
esterilizarse mediante: Horno, dur ante 2 h a 170 a 175°C o 1 h a 180°C o en autoclave, durante 15 minutos 
como mínimo a 121 ± 1,0°C. 
B 7.1.3.6  El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las 
especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por esterilización repetida y éste debe 
ser químicamente inerte. 
B 7.1.4 Aparatos e instrumentos Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 7.1.4.1  Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C. 
B 7.1.4.2  Autoclave con termómetro y manómetro, calib rada con termómetro de máximas y mínimas. 
B 7.1.4.3  Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro 
calibrado con divisiones de 0,1°C y q ue mantenga la temperatura a 45 ± 0,5°C. 
B 7.1.4.4 Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador 
peristáltico (Stomacher). 
B 7.1.4.5  Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico. 
B 7.1.4.6  Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g. 
B 7.1.5  Procedimiento 
B 7.1.5.1 Preparación de la dilución primaria. 
B 7.1.5.1.1 Para muestras congeladas de un alimento origi nalmente líquido o licuable,  fundir por completo 
en baño de agua de 40 a 45°C un tiempo máximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente. 
B 7.1.5.1.2 Para la parte líquida de una muestra heterog énea la cual sea considerada suficientemente 
representativa de la muestra total. 
B 7.1.5.1.2.1  Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm 
efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 mL de la  muestra y diluir con 9 mL del diluyente el cual 
debe encontrarse a una temperatura similar a ésta, evita ndo el contacto entre la pipeta y el diluyente. 
B 7.1.5.1.2.2  Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alícuotas mayores, por ejemplo 
volúmenes de 10 u 11 mL, diluidos con 90 o 99 mL, de la misma forma que se describió anteriormente 
B 7.1.5.1.3 A partir de muestras sólidas o semisólidas. 
Las muestras sólidas y semisólidas congeladas, deben descongelarse en refrigeración de 4 a 8ºC durante 
8 horas y no más de 24 horas antes de proceder a su análisis. 
B 7.1.5.1.3.1  Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plástica 
estériles de tamaño adecuado. 
B 7.1.5.1.3.2  Adicionar un volumen de 90 a 99 mL del diluyente llevado a una temperatura similar a la de 
la muestra. 
B 7.1.5.1.3.3  Operar la licuadora o el homogeneizador peri stáltico de 1 a 2 minutos hasta obtener una 
suspensión completa y homogénea según se indique en la técnica correspondiente para cada alimento. Aún 
en los equipos más lentos, este tiempo no debe exceder de 2,5 minutos. 
B 7.1.5.1.3.4  Permitir que las partículas grandes se sediment en, y transferir la cantidad deseada tomando 
de las capas superiores de la suspensión. 
B 7.1.5.1.3.5  Cuando la dilución primaria es muy viscosa o peg ajosa, adicionar más diluyente, lo cual debe 
tomarse en cuenta para las operaciones su bsecuentes o expresión de resultados. 
B 7.1.5.1.3.6  El homogeneizador peristáltico (Stomacher) puede no ser adecuado para algunos productos 
(por ejemplo, aquellos con partículas agudas o consti tuyentes que no se dispersen fácilmente). Debe ser 
utilizado sólo cuando exista evidencia (publicada o por ensayos comparativos) de que los resultados 
obtenidos no difieren significativamente con aquellos obtenidos con licuadora. 
B 7.1.5.2 Preparación de las diluciones decimales adicionales. 
B 7.1.5.2.1 Transferir 1 mL o un múltiplo, por ejemplo, 10 u 11 mL de la dilución primaria 1 + 9 (10 -1), en 
otro recipiente conteniendo nueve veces el volumen del diluyente estéril a la tem peratura apropiada, evitando 
el contacto entre la pipeta y el diluyente. 
B 7.1.5.2.2 Mezclar cuidadosamente cada botella de dilu yente siempre de la misma manera que se 
describe en el punto B 7.1.5.1. 
B 7.1.5.2.3 La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, 
dependen del número esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de análisis 
previos y de la información que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado. En ausencia 
total de información, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta. 
B 7.1.5.2.4 Utilizar pipetas diferentes para cada dilución  inoculando simultáneamente las cajas que se 
hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la 
pipeta.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 7.1.5.2.5 Si la pipeta es terminal y se transfiere un vo lumen de líquido equivalente a su capacidad total, 
escurrir aplicando la punta de la pipeta una sola vez en una área de la caja Petri sin líquido. 
B 7.1.5.2.6 Mientras se afora el líquido de la pipeta, la punta de ésta debe apoyarse en el interior del cuello 
del frasco y mantenerla en posición vertical, para lo cual este último debe inclinarse lo necesario. 
B 7.1.5.2.7 En estudios donde se busca la presencia o ausencia de una determinada especie de 
microorganismos en 0,1 mL o 0,1 g, no es necesario preparar diluciones mayores. 
B 7.1.5.2.8 El criterio para seleccionar las diluciones a preparar de acuerdo con el número  de 
microorganismos esperado es: 
B 7.1.5.2.8.1  Para la técnica del número más probable utilizar tres tubos: donde sea posible demostrar el 
microorganismo en 10 mL de la dilución más alta. 
B 7.1.5.2.8.2  Para la técnica de cuenta en placa, considerar  aquellas en las que se puedan contar de 25 a 
250 colonias en un mínimo de una de tres diluciones en el método de cuenta de bacterias aerobias en placa. 
En el caso de otros grupos microbianos, considerar el número especificado de colonias en la Norma Oficial 
Mexicana correspondiente. 
B 7.1.6  Duración del procedimiento. 
En general, las diluciones de la muestra deben ser pr eparadas inmediatamente antes del análisis y éstas 
deben ser usadas para inocular el medio de cultivo dent ro de los 20 minutos posteriores a su preparación. 
B 7.2 Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa. 
B 7.2.1  Fundamento 
El fundamento de la técnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio de elección 
después de un cierto tiempo y temperatura de incubaci ón, presuponiendo que cada colonia proviene de un 
microorganismo de la muestra bajo estudio. El método admite numerosas fuentes de variación, algunas de 
ellas controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores. 
B 7.2.2  Reactivos 
Los reactivos que a continuación se mencionan, deben ser grado analítico. Cuando se indique agua, debe entenderse agua destilada, con pH cercano a la neutralidad. B 7.2.3  Medios de Cultivo. 
B 7.2.3.1  Agar Triptona-Extracto de Levadura (agar para cuenta estándar). 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de levadura 2,5 g 
Triptona 5,0 g 
Dextrosa 1,0 g 
Agar 15,0 g 
Agua 1,0 L 
 
Preparación del medio de cultivo. Suspender los componentes del medio deshidratado en  un litro de agua. Hervir hasta total disolución. 
Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables  de capacidad no mayor de 500 mL, cantidades de 
aproximadamente la mitad del volumen del mismo. Esteri lizar en autoclave a 121 ± 1,0ºC, durante 15 minutos. 
El pH final del medio debe ser 7,0 ± 0,2 a 25ºC. 
Si el medio de cultivo es utiliz ado inmediatamente, enfriar a 45ºC ± 1, 0 ºC en baño de agua y mantenerlo  
a esta temperatura hasta antes de su uso. El medio no debe de fundirse más de una vez. 
En caso de medios deshidratados seguir las instrucciones del fabricante. El medio de cultivo anterior es el de uso más generalizado. Para algunos alimentos en particular se 
requerirá de un medio de cultivo especial que se debe indicar al describir la técnica para ese alimento. 
B 7.2.4  Materiales 
Todo el material que tenga contacto con las muestras o los microorganismos debe estar estéril.  Se 
requiere, los materiales mencionados en el apartado B 7.1 Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 7.2.5  Aparatos e instrumentos 
Se requiere, además de los mencionados en B.7.1, los siguientes: 
B 7.2.5.1  Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1,0ºC, provista con termómetro 
calibrado. 
B 7.2.5.2  Contador de colonias de campo obscuro, con lu z adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente 
amplificador. 
B 7.2.5.3  Registrador mecánico o electrónico. 
B 7.2.5.4  Microscopio óptico. 
B 7.2.5.5  Baño de agua con o sin circulación mecánica, pr ovista con termómetro calibrado con divisiones 
de hasta 1,0°C y que mantenga la  temperatura a 45 ± 1,0°C. 
B 7.2.6 Preparación de la muestra 
Para la preparación de la muestra seguir el numeral B 7.1. 
B 7.2.7  Procedimiento 
B 7.2.7.1  Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación; la adición de 
medio de cultivo y homogenización, se puedan realizar cómoda y libremente. Marcar las cajas en sus tapas 
con los datos pertinentes previamente a su inoculación y correr por duplicado. 
B 7.2.7.2  Después de inocular las diluciones de las muestras preparadas según en B 7.1 en las cajas 
Petri, agregar de 12 a 15 mL del medio preparado, mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie 
lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje 
la cubierta de las cajas. Dejar solidificar. 
B 7.2.7.3  Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de 
esterilidad. 
B 7.2.7.4  El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que 
finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos. 
B 7.2.7.5  Incubar las cajas en posición invertida (la tapa ha cia abajo) por el tiempo y la temperatura que se 
requieran, según el tipo de alimento y microorg anismo de que se trate, véase el cuadro 1. 
CUADRO 1 
Grupo bacteriano Temperatura Tiempo de incubación 
Termofílicos aerobios 55 ± 2ºC 48 ± 2 h 
Mesofílicos aerobios 35 ± 2ºC 48 ± 2 h 
Psicrotróficos 20 ± 2ºC 3 - 5 días 
Psicrofílicos 5 ± 2ºC 7 - 10 días 
 
B 7.2.7.6  En la lectura seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250 UFC, para disminuir el 
error en la cuenta. 
B 7.2.7.7  Contar todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas (excepto las de mohos y 
levaduras), incluyendo las colonias puntiformes. Hacer us o del microscopio para resolver los casos en los que 
no se pueden distinguir las colonias de las pequeñas partículas de alimento.  
B 7.2.8 Cálculos del método. 
B 7.2.8.1 Después de la incubación, contar las placas que se encuentren en el intervalo de 25 a 250 
colonias, usando el contador de colonias y el registrador . Las placas de al menos una de tres diluciones deben 
estar en el intervalo de 25 a 250. Cuando sólo una dilución está en el intervalo apropiado, véase el cuadro 2, ejemplo 1. Calcular la cuenta promedio por gramo o mililitro de dicha dilución y reportar. 
B 7.2.8.2 Cuando dos diluciones están en el intervalo apropiado, determinar la cuenta promedio dada por 
cada dilución antes de promediar la cuenta de las dos diluciones para obtener la cuenta en placa por gramo  o mililitro, véase el cuadro 2, ejemplo 2.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 7.2.8.3 Con el fin de uniformar los criterios para el reporte de las cuentas en ensayos donde las placas 
presenten situaciones no contempladas en los ejem plos anteriores, se presentan las siguientes guías: 
B 7.2.8.4 Placas con menos de 25 colonias.- Cuando las placas corridas para la menor dilución muestran 
cuentas de menos de 25 colonias, contar el número de colonias presentes en dicha dilución, promediar el 
número de colonias y multiplicar por el factor de diluci ón para obtener el valor estimado de cuenta en placa. 
Aclarar en su informe esta situación agregando la leye nda "valor estimado", véas e el cuadro 2, ejemplo 3. 
B 7.2.8.5 Placas con más de 250 colonias.- Cuando el número de colonias por placa exceda de 250, 
contar las colonias en aquellas porciones de la plac a que sean representativas de la distribución de colonias. 
Contar por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del área de la caja y multiplicar el valor obtenido por 4 ó 2, 
respectivamente. Si solamente pueden contarse algunos  cuadros, considerar que el fondo de una caja Petri 
de 100 mm de diámetro contiene 65 cuadros de la cu adrícula del contador. Aclarar en el informe esta 
situación agregando la leyenda "valor estimado", véase el cuadro 2, ejemplo 4. 
B 7.2.8.6 Colonias extendidas.- Las colonias extendidas pueden presentarse en las siguientes formas: 
B 7.2.8.6.1  Cadenas de colonias no separadas claramente entre sí, que parecen ser causadas por la 
desintegración de un cúmulo de bacterias. 
B 7.2.8.6.2  Colonias que se desarrollan en película entre el agar y el fondo de la caja. 
B 7.2.8.6.3 Colonias que se desarrollan en película en la orilla de la caja sobre la superficie del agar. 
B 7.2.8.6.4  Colonias de crecimiento extendido y en algu nas ocasiones acompañadas de inhibición del 
crecimiento, que en conjunto exceden el 50% de la caja o represión del crecimiento que por sí mismo excede 
el 25% de la superficie de la caja. 
B 7.2.8.6.5 Cuando es necesario contar en cajas que contienen colonias extendidas que no están 
incluidas en el numeral B 7.2.8.6.4,  contar cualquiera de los demás tipos especificados en el numeral B 
7.2.8.6.4, como provenie ntes de una sola fuente. 
B 7.2.8.6.6 En el caso de las colonias de las que se habla en el  primer guion, del nume ral B 7.2.8.6.1, si la 
caja contiene una sola cadena, contar como una sola colo nia, si la caja contiene varias cadenas que parecen 
originarse de fuentes separadas, contar cada cadena como  colonia individual. No contar cada colonia de la 
cadena individualmente. 
B 7.2.8.6.7 Las colonias mencionadas en el primer y te rcer guion, generalmente se observan como 
crecimiento diferenciable de otras colonias y se cuent an como tales. Los crecimientos mencionados en el 
cuarto apartado, reportarlos como crecimiento extendido.  En caso de que una dilución se encuentre dentro del 
rango y otra dilución presente coloni as de crecimiento extendido, reportar  la dilución en la que se pueden 
contar las colonias, véase el cuadro 2, ejemplo 5 
B 7.2.8.7 Placas sin colonias.- Cuando las placas de todas las diluciones no muestran colonias, reportar la 
cuenta en placa como menor que una vez el valor de la di lución más baja usada, véase el cuadro 2,  ejemplo 
6. 
B 7.2.8.8 Placas corridas por duplicado, una con crecimiento dentro del intervalo adecuado y otra con más 
de 250 colonias.- Cuando una placa tiene entre 25 y 250 colonias y su duplicado más de 250 colonias, contar ambas placas incluyendo la que está fuera del interval o para determinar la cuenta en pl aca, véase el cuadro 2, 
ejemplo 7. 
B 7.2.8.9 Placas corridas por duplicado, una placa de cada dilución dentro del intervalo de 25 a 250 
colonias.- Cuando una placa dentro de diferentes diluci ones contiene el número de colonias especificadas en 
el intervalo, contar el número de colonias de las cuat ro placas para calcular la cuenta en placa, véase el 
cuadro 2, ejemplo 8. 
B 7.2.8.10 Placas corridas por duplicado, ambas placas de una dilución dentro del intervalo de 25 a 250  y 
sólo una de la otra dilución dentro del mismo. Contar  las cuatro en placa, véase el cuadro 2, ejemplo 9. 
B 7.2.8.11 Después de contabilizar las colonias en las plac as seleccionadas, multiplicar por la inversa de 
la dilución para obtener el número de UFC por mililitro o gramo de la muestra. Redondear la cifra obtenida en 
la cuenta de manera que sólo aparezcan dos dígitos signifi cativos al inicio de esta cifra. Para redondear, 
elevar el segundo dígito al número inmediato superior c uando el tercer dígito de la derecha sea cinco o mayor 
(por ejemplo: 128 redondear a 130). Si el tercer dígito es cuatro o menos, reemplazar el tercer dígito con cero 
y el segundo dígito mantenerlo igual (Por ejemplo: 2417 a 2400). 
B 7.2.9 Informe de la prueba 
Reportar como: Unidades formadoras de colonias, ___ UFC/g o mL, de bacterias aerobias en placa en 
agar triptona extracto de levadura o agar para c uenta estándar, incubadas ________ horas a _______ ºC.  Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
CUADRO 2 
Cálculo de los valores de la cuenta en placa (ensayos por duplicado) 
Ejemplo  Colonias contadas  UFC/g o mL 
Número 1:100 1:1,000 1:10,000  
1 >250 178 16 180,000 
 >250 190 17  
2 >250 220 25 250,000 
3 18 2 0 1,600 
 14 0 0  
4 >250 >250 512 5,000,000 
 >250 >250 495  
5 >250 235 Crecimiento extendido  
6 0 0 0 <100 
7 >250 240 24 250,000 
 >250 268 19  
8 >250 216 23 280,000 
 >250 262 42  
9 >250 215 20 23,000 
 >250 235 26  
 >250 275 32 270,000 
 >250 225 26  
 
B 7.3 Método para la cuenta de microor ganismos coliformes totales en placa. 
B 7.3.1 Fundamento 
El método permite determinar el número de microorganismos coliformes presentes en una muestra, 
utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis) en el que se desarrollan bacterias a 35°C en aproximadamente 24 h, dando como resultado la produ cción de gas y ácidos orgánicos, los cuales viran el 
indicador de pH y precipitan las sales biliares. 
B 7.3.2 Reactivos 
Los reactivos que a continuación se mencionan, deben ser grado analítico y cuando se indique agua debe 
entenderse como agua destilada. 
B 7.3.2.1  Soluciones diluyentes 
Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada) 
Ingredientes Cantidades 
Fosfato monopotásico 34,0 g 
Agua 1,0 l 
 
Preparación Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0 N. Llevar con agua a un litro. Esterilizar a 121± 1,0°C durante 15 minutos. C onservar en refrigeración (solución concentrada). 
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar  a un litro con agua (solución de trabajo). 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0°C. 
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a 
los iniciales. 
Agua peptonada 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 1,0 
NaCl 8,5 g 
Agua 1,0 l 
 
Preparación: Disolver los componentes en un litro de agua. 
Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1,0 N. 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera. Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0°C. Después de la esterilización, los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los 
iniciales. 
Si este diluyente no es usado inmediatamente, alma cenar en lugar obscuro a una temperatura entre  0 a 
5°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición. 
B 7.3.2.2  Medio de cultivo 
Agar-rojo- violeta-bilis -lactosa (RVBA) 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 7,0 g 
Extracto de levadura 3,0 g 
Lactosa 10,0 g 
Sales biliares 1,5 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Rojo neutro 0,03 g 
Cristal violeta 0,002 g 
Agar 15,0 g 
Agua 1,0 l 
 
Preparación: 
Mezclar los componentes en el agua y dejar reposar durante algunos minutos. 
Mezclar perfectamente y ajustar el pH a 7,4 con ácido clorhídrico 0,1N o con hidróxido de sodio 0,1N  a 
25°C, de forma que después del calentam iento se mantenga en este valor. 
Calentar con agitación constant e y hervir durante 2 minutos. 
Enfriar inmediatamente el medio en un baño de agua hasta que llegue a 45°C. 
Evitar el sobrecalentamiento del medio. No debe esterilizarse en autoclave. 
Usar el medio dentro de las tres primeras horas después de su preparación. 
En el caso de utilizar medio de cultivo deshid ratado, seguir las instrucciones del fabricante. 
B 7.3.3  Materiales 
B 7.3.3.1  Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 11 y 2 mL), con tapón  de 
algodón. 
B 7.3.3.2  Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total. 
B 7.3.3.3  Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 7.3.3.4  Tubos de 16 X 150 mm con tapón de rosca. 
B 7.3.3.5  Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, 
espátulas, etc. 
B 7.3.3.6  Cajas Petri. 
B 7.3.3.7  Todo el material e instrumentos que tengan c ontacto con las muestras bajo estudio debe 
esterilizarse mediante: 
B 7.3.3.8  Horno, durante 2 h a 170 - 175°C, o 1 h a 18 0°C; o en autoclave, durante 15 minutos como 
mínimo a 121 ± 1,0°C. 
B 7.3.3.9  El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las 
especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por las esterilizaciones repetidas y éste debe ser químicamente inerte. 
B 7.3.4  Aparatos e instrumentos 
B 7.3.4.1  Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C. 
B 7.3.4.2  Autoclave con termómetro y manómetro, calib rada con termómetro de máximas y mínimas. 
B 7.3.4.3  Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro 
calibrado con divisiones de 0,1°C y q ue mantenga la temperatura a 45 ± 1,0°C. 
B 7.3.4.4  Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador 
peristáltico (Stomacher). 
B 7.3.4.5  Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico. 
B 7.3.4.6  Incubadora con termostato que evite variacione s mayores de ± 1,0°C, provista con termómetro 
calibrado. 
B 7.3.4.7  Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente 
amplificador. 
B 7.3.4.8  Registrador mecánico o electrónico. 
B 7.3.4.9  Microscopio óptico. 
B 7.3.4.10  Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25 °C. 
B 7.3.5 Preparación de la muestra 
La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la sección B 7.1 “ Preparación  y 
dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico .” 
B 7.3.6 Procedimiento 
B 7.3.6.1 Colocar en cajas Petri por duplicado 1 mL de la muestra líquida directa o de la dilución primaria, 
utilizando para tal propós ito una pipeta estéril. 
B 7.3.6.2 Repetir el procedimiento tantas veces como dilu ciones decimales se requi era sembrar, utilizando 
una pipeta estéril diferente para cada dilución. 
B 7.3.6.3 Vertir de 15 a 20 mL del medio RVBA fundido y m antenido a 45 ± 1,0°C en baño de agua. En el 
caso de utilizar cajas de Petri de plástico se vierte de 10 a 15 mL del medio. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que se  vierte el medio de cultivo, no debe exceder de  20 
minutos. 
B 7.3.6.4 Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, 
seis movimientos en el sentido de las manecillas del relo j, seis movimientos en el sentido contrario al de las 
manecillas del reloj y seis de atrás para adelante, so bre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla 
solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fría. 
B 7.3.6.5 Preparar una caja control con 15 mL de medio para verificar la esterilidad. 
B 7.3.6.6 Después de que está el medio completamente solidificado en la caja, verter aproximadamente  4 
mL del medio RVBA a 45 ± 1,0°C en la superficie del medio inoculado. Dejar que solidifique. 
B 7.3.6.7 Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35°C, durante 24 ± 2 horas. 
B 7.3.6.8 Después del periodo especificado para la incubaci ón, contar las colonias con el contador de 
colonias.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 7.3.6.9 Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias típicas son de color 
rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un ha lo de precipitación debido a las sales biliares, el 
cual es de color rojo claro o rosa, la morfología coloni al es semejante a lentes biconvexos con un diámetro  de 
0,5 a 2,0 mm. 
B 7.3.7 Cálculos del método 
B 7.3.7.1 Placas que contienen entre 15 y 150 colonias características. 
Separar las placas que contienen el número ant es mencionado de colonias características en dos 
diluciones consecutivas. Contar las colonias presentes . Calcular el número de coliformes por mililitro o por 
gramo de producto, multiplicando el número de colonias por el inverso de la dilución correspondiente, 
tomando los criterios del punto B 7.2.8.1  ”Método para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa.” 
B 7.3.7.2 Placas que contienen menos de 15 colonias características. 
Si cada una de las placas tiene menos de 15 colonias  características, reportar el número obtenido seguido 
de la dilución correspondiente. 
B 7.3.7.3 Placas con colonias no características. 
Si en las placas no hay colonias características, r eportar el resultado como: menos de un coliforme por  
1/d por gramo, en donde d es el factor de dilución. 
B 7.3.8 Informe de la prueba 
Informar: UFC/g o mL en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35°C durante 24 ± 2h. En caso de 
emplear diluciones y no observar cr ecimiento, informar utilizando como referencia la dilución más baja 
utilizada, por ejemplo dilución 10-1. En caso de no obse rvar crecimiento en la muestra sin diluir se informa: 
"no desarrollo de coliformes por mL". 
B 7.4 Método para la determinación de Salmonella spp. en alimentos. 
B 7.4.1  Fundamento 
La presente técnica para la detección de Salmonella spp. en alimentos, describe un esquema general que 
consiste de 5 pasos básicos: 
B 7.4.1.1  Preenriquecimiento, es el paso donde la mu estra es enriquecida en un medio nutritivo no 
selectivo, que permite restaurar las células de Salmonella spp. dañadas a una condición fisiológica estable. 
B 7.4.1.2  Enriquecimiento selectivo, empleado con el pr opósito de incrementar las poblaciones de 
Salmonella spp. e inhibir otros organismos presentes en la muestra. 
B 7.4.1.3  Selección en medios sólidos, en este paso se utilizan medios selectivos que restringen el 
crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella spp. y permite el reconocimiento visual de colonias 
sospechosas. 
B 7.4.1.4  Identificación bioquímica, este paso permite la  identificación genérica  de los cultivos de 
Salmonella spp. y la eliminación de cultivos sospechosos falsos. 
B 7.4.1.5  Serotipificación, es una técnica serológica que pe rmite la identificación específica de un cultivo. 
B 7.4.2  Reactivos  
En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, se deben seguir las instrucciones 
impresas en la etiqueta respectiva para su preparación. 
Las sustancias químicas usadas para preparar los medios de cultivo y los reactivos deben ser grado analítico. 
B 7.4.2.1  Medios de pre-enriquecimiento 
B 7.4.2.1.1  Agua de peptona tamponada 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 10,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Fosfato sódico dibásico 3,5 g 
Fosfato potásico monobásico 1,5 g 
Agua 1,0 L Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
Preparación 
Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario. Ajustar el pH, si es necesario, después de la esterilización a 7,0. 
Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables co n la capacidad necesaria para obtener las porciones 
necesarias para la prueba. 
Esterilizar por 20 min a 121 ± 1ºC. B 7.4.2.1.2  Caldo lactosado 
Ingredientes Cantidades
Extracto de carne 3,0 g
Peptona 5,0 g
Lactosa 5,0 g
Agua destilada 1,0 g
pH final 6,9 + 0,2
 
Preparación Disolver los ingredientes en agua, calentando a 65ºC. Distribuir en porciones de 225 mL, en frascos de 500 mL. Esterilizar durante 15 min a 121ºC ± 1ºC. B 7.4.2.2  Medios de enriquecimiento 
B 7.4.2.2.1  Caldo selenito-cistina 
Ingredientes Cantidades
Tristona o polipeptona 5,0 g
Lactosa 4,0 g
Fosfato disódico 10,0 g
Selenito ácido de sodio 4,0 g
L- cistina 0,01 g
Agua destilada 1,0 l
pH final 7,0 + 2 a 25 °C
 
Preparación Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estéril y distribuir en volúmenes de 10 y 225 mL en 
recipientes estériles, según se requiera. 
El caldo así preparado es transparent e. De preferencia usarlo el mismo día de su preparación. 
Si se desea conservar el medio por varios días, puede exponerse al calor en autoclave por 5 min  a 110ºC 
± 1ºC, tomando entonces un color salmón. 
B 7.4.2.2.2 Caldo tetrationato 
Ingredientes Cantidades
Proteosa peptona o triptona 5,0 g
Sales biliares 1,0 g
Carbonato de calcio 10,0 g
Tiosulfato de sodio pentahidratado 30,0
Agua destilada 1,0 l
pH final 7,0 + 0,1      (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
Preparación 
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estéril. 
Distribuir, agitando const antemente, en porciones de 10 y 225 mL, en recipientes estériles. Guardar en 
refrigeración. 
Antes de usar el medio, agregar 2 mL de una solución yodo-yoduro y 1 mL de solución de verde brillante al 
0,1% por cada 100 mL de caldo. El medio una vez adicionado de yodo no debe calentarse y debe usarse  el 
mismo día de su preparación. 
B 7.4.2.2.3  Vassiliadis-Rappaport 
Solución A 
Ingredientes Cantidades 
Tristona 5,0 g 
Cloruro de sodio 8,0 g 
Fosfato de potasio hidrogenado 1,6 g 
Agua destilada 1,0 l 
 
 Disolver los componentes en agua por calentamiento cercano a 70ºC. 
Solución B 
Ingredientes Cantidades 
Cloruro de magnesio hexahidratado 400 g 
Agua destilada 1,0 l 
 
Disolver el cloruro de magnesio en agua. 
Como esta sal es muy higroscópica es conveniente di solver el contenido entero de cloruro de magnesio 
desde un recipiente recientemente abierto de tal modo que la concentración de la solución sea de 0,4 g/mL. 
Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente. 
Solución C 
Ingredientes Cantidades 
Oxalato de verde de malaquita 0,4 g 
Agua destilada 100 mL 
 
Disolver el oxalato de verde de malaquita en agua. 
Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente. 
Medio completo 
Ingredientes Cantidades 
Solución A 1,000 mL 
Solución B 100 mL 
Solución C 10 mL 
 
Preparación Adicionar 1 000 mL de la solución A, 100 mL de la solución B y 10 mL de la solución C. 
Ajustar el pH si es necesario, de tal manera que después de la esterilización sea de 5,2. 
Distribuir antes de usar dentro de tubos en cantidades de 10 mL. 
Almacenar en refrigeración. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 7.4.2.2.4  Caldo de soya tripticasa 
Ingredientes Cantidades 
Tripticasa o triptosa 17,0 g 
Fitona  3,0 g 
Glucosa  2,5 g 
Cloruro de sodio 2,5 g 
Agua destilada 1,0 g 
pH final 7,3 + 0,2 
 
Preparación Disolver los ingredientes en 1 litro de agua destilada, calentando lentamente hasta su disolución completa. 
Distribuir porciones de 225 mL dentro de matraces de 500 mL y esterilizar en autoclave durante 15 min  a 
121ºC ± 1ºC. 
B 7.4.2.2.5  Leche descremada reconstituida 
Suspender 100 g de leche descremada en polvo en un litro de agua destilada. Agitar circularmente hasta 
disolución. Distribuir en volúmenes de 225 mL en matrac es Erlenmeyer de 500 mL. Esterilizar a 121ºC ± 1ºC 
por 15 min. El volumen final debe corregirse para mantener 225 mL. 
B 7.4.2.2.6  Caldo soya tripticasa estéril adicionado con sulfito de potasio 
Adicionar al caldo soya tripticasa 5 g de sulfito de potasio por cada 1000 mL de medio, quedando una 
concentración final de sulfito de potasio del 0,5%. Adic ionar el sulfito de potasio antes de esterilizar en 
autoclave en la forma habitual. 
B 7.4.2.3 Medios de aislamiento 
B 7.4.2.3.1  Agar verde brillante (VB) 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de levadura 3,0 g 
Polipeptona (proteosa peptona N° 3) 10,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Lactosa 10,0 g 
Sacarosa 10,0 g 
Rojo de fenol 0,08 g 
Agar 20,0 g 
Verde brillante 0,0125 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 6,9 ± 0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar a ebullición, hasta disolución completa. 
Ajustar el pH. 
Esterilizar en autoclave por 15 min a 121ºC ± 1ºC.  El sobrecalentamiento del medio disminuye su 
selectividad. 
Enfriar el medio a 50ºC y distribuirlo en cajas de Petri estériles. El aspecto del medio es obscuro, de color 
marrón.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 7.4.2.3.2  Agar con sulfito de bismuto 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne de res 5,0 g 
Mezcla de peptonas 10,0 g 
Glucosa 5,0 g 
Fosfato disódico (anhidro) 5,0 g 
Sulfato ferroso (anhidro) 0,3 g 
Sulfito de bismuto 8,0 g 
Verde brillante 0,025 g 
Agar 20,0 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 7,6 + 0,2 
 
Preparación Suspender los ingredientes en un litro de agua. Ca lentar hasta su disolución completa, agitando 
frecuentemente. Ajustar el pH. 
Enfriar a 45ºC y verter en cajas de Petri estériles,  distribuyendo de manera homogénea el precipitado 
propio del medio. 
El aspecto de las placas es opaco, de color verde pálido y deben usarse el mismo día de su preparación. 
Si la coloración es parda, no deben utilizarse. 
El medio no debe esterilizarse en autoclave; el sobrecalentamiento afecta su selectividad. 
B 7.4.2.3.3  Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) 
Ingredientes Cantidades 
Xilosa 3,75 g 
L- lisina 5,0 g 
lactosa 7,5 g 
Sacarosa 7,5 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Extracto de levadura 3,0 g 
Rojo de fenol 0,08 g 
Agar 15,0 g 
Desoxocolato de sodio 2,5 g 
Citrato férrico- amónico 0,8 g 
Tiosulfato de sodio 6,8 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 6,9 + 0,2 
 
Preparación Suspender los ingredientes en un litro de agua des tilada, y calentar en baño de agua a 55ºC, agitando 
frecuentemente, hasta disolución completa. Ajustar el pH. 
Enfriar a 50ºC y verter en cajas de Petri estériles. No se esterilice. El sobrecalentamiento produce una prec ipitación; la reactividad del medio puede ser satisfactoria, pero las 
colonias suelen ser muy pequeñas. 
El aspecto del medio es claro y de color rojo brillante. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 7.4.2.3.4  Agar para Salmonella  y Shigella  (SS) 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 5,0 g 
Polipeptona 5,0 g 
Lactosa 10,0 g 
Sales biliares 8,5 g 
Citrato de sodio dihidratado 8,5 g 
Tiosulfato de sodio pentahidratado 8,5 g 
Citrato férrico 1,0 g 
Agar 13,5 g 
Rojo neutro 0,025 g 
Verde brillante 0,33 mg 
Agua destilada 1,0 L 
pH final 7,0 + 0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada  estéril y calentar a ebullición hasta disolución 
completa. Ajustar el pH. No esterilizar en autoclave. 
Enfriar a 50ºC y distribuir en cajas de Petri estériles en condiciones asépticas. El aspecto del medio fundido es claro y de color rosado. 
B 7.4.2.3.5  Agar entérico Hektoen 
Ingredientes Cantidades 
Proteosa peptona 12, 0 g 
Extracto de levadura 3,0 g 
Lactosa 12,0 g 
Sacarosa 12,0 g 
Salicilina 2,0 g 
Sales biliares 9,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Tiosulfato de sodio 5,0 g 
Citrato amónico férrico 1,5 g 
Azul de bromotimol 0,064 g 
Fascina ácida 0,1 g 
Agar 13,5 g 
Agua 1,0 L 
pH final 7,5 + 0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir con agitación hasta completa disolución del agar. 
No sobrecalentar. Dejar enfriar a 55-60ºC y distribuir en cajas de Petri estériles en condiciones asépticas.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 7.4.2.4  Medios para pruebas bioquímicas 
B 7.4.2.4.1  Agar de tres azúcares y hierro (TSI) 
Ingredientes Cantidades 
Peptona de carne 1,0 g 
Paptona de caseína 1,0 g 
Cloruro de sodio 0,5 g 
Lactosa 1,0 g 
Sacarosa 1,0 g 
Glucosa 0,1 g 
Agar 1,3 g 
Rojo de fenol 2,5 mg 
Sulfato ferroso amónico 
pentahidratado 20,0 mg 
Tiosulfato de sodio 20,0 mg 
Agua destilada 100 mL 
pH final 7,3 + 0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en 100 mL de agua destila da. Calentar a ebullición, agitando ocasionalmente, 
hasta disoluci ón completa. 
Enfriar a 60ºC y ajustar el pH. 
Distribuir en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 10 0 mm y esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 min. 
Inclinar los tubos de manera que el medio de cultivo en el fondo alcance una altura de 3 cm y una 
profundidad de 4 cm. El medio es de color rojo. 
B 7.4.2.4.2  Agar de hierro y lisina (LIA) 
Ingredientes Cantidades 
Peptona de gelatina 0,5 g 
Extracto de levadura 0,3 g 
Glucosa 0,1 g 
L-lisina 1,0 g 
Citrato férrico amónico 50 mg 
Tiosulfato de sodio anhidro 4,0 mg 
Púrpura de bromocresol 2,0 mg 
Agar 1,5 g 
Agua destilada 100 mL 
pH final 6,7 + 0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en el agua destilada y mezc lar bien, calentar hasta ebullición con agitación 
frecuente hasta conseguir la disolución completa. Ajustar el pH. 
Distribuir en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm, con tapón de rosca. 
Esterilizar en autoclave a 121ºC ± 1ºC durante 12 min. Dejar que los tubos se enfríen en posición 
inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 4 cm y una superficie inclinada de 2 cm. 
El medio ya preparado es de color púrpura. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 7.4.2.4.3  Agar nutritivo 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 3,0 g 
Peptona 5,0 g 
Agar 15,0 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 6,8 + 0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en agua. Dejar reposar de 5 a 10 min. 
Calentar a ebullición hasta disolución completa. Distri buir en tubos de 13 x 100 mm, en cantidades de 1/3 
de su volumen. 
Esterilizar a 121ºC ± 1ºC por 15 min. Incli nar los tubos antes que el agar solidifique. 
B 7.4.2.4.4  Medio de SIM (para Sulfuro, Indol y Movilidad) 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 3,0 g 
Peptona 30,0 g 
Hierro peptonizado 0,20 g 
Tiosulfato de sodio 0,025 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 7,3 + 0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta 
lograr una disolución completa. 
Enfriar a 50ºC y ajustar el pH. 
Distribuir el medio en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave  a 121ºC ± 
1ºC durante 15 min. Se dejan enfri ar los tubos en posición vertical. 
B 7.4.2.4.5  Agar citrato de Simmons 
Ingredientes Cantidades 
Fosfato de amonio 1,0 g 
Fosfato dipotásico 1,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Citrato de sodio 2,0 g 
Sulfato de magnesio 0,20 g 
Azul de bromotimol 0,08 g 
Agar 15,0 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 6,8 + 0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta 
lograr una disolución completa. 
Ajustar el pH.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
Distribuir el medio en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave  a 121ºC ± 
1ºC durante 15 min. 
Dejar enfriar los tubos en posición inclinada. 
B 7.4.2.4.6  Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer) 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 7,0 g 
Dextrosa 5,0 g 
Difosfato de potasio 5,0 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 6,9 + 0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta 
lograr una disolución completa. 
Ajustar el pH. Distribuir el medio en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave  a 121ºC ± 
1ºC durante 15 min. 
B 7.4.2.4.7 Caldo manitol 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 1,0 g 
Proteosa peptona 10,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Rojo de fenol 0,018 g 
Manitol 10,0 g 
Agua 1,0 l 
pH final 7,4 + 0,2 
 
Preparación Suspender 26 g del medio deshidratado en un litro de agua, mezclar y ajustar el pH. 
Distribuir en volúmenes de 2 a 3 mL en tubos de 13 x 100 mm. 
Esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 min. B 7.4.2.4.8 Caldo malonato 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de levadura 1,0 g 
Sulfato de amonio 2,0 g 
Fosfato dipotásico 0,6 g 
Fosfato monopotásico 0,6 g 
Cloruro de sodio 2,0 g 
Malonato 3,0 g 
Glucosa 0,250 g 
Azul de bromotimol 0,025 g 
Agua 1,0 l 
pH final 6,7 + 0,2 Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
Preparación 
Suspender los ingredientes en agua, mezclar y ajustar el pH. 
Distribuir en tubos de 13 x 100 mm en cantidades de 3 mL. 
Esterilizar en autoclave a 121ºC ± 1ºC durante 15 min. 
B 7.4.2.4.9  Caldo urea 
Ingredientes Cantidades 
Urea  20,0 g 
Extracto de levadura 0,1 g 
Fosfato monopotásico 9,10 g 
Fosfato dipotásico 9,5 g 
Rojo de fenol 0,01 g 
Agua  1,0 l 
pH final 6,8 + 0,2 
 
Preparación 
Disolver los ingredientes en agua destilada. 
NO CALENTAR. Esterilizar por filtración a través de membrana 0,45 µm o en autoclave de 5 a 8 lb de 
presión durante 15 min. 
Distribuir asépticamente de 1,5 a 3 mL en tubos estériles de 13 x 100 mm. 
B 7.4.2.4.10  Caldo de urea rápido 
Ingredientes Cantidades 
Urea 20, 0 g 
Extracto de levadura 0,10 g 
Fosfato monopotásico 0,091 g 
Fosfato dipotásico 0,095 g 
Rojo de fenol 0,010 g 
Agua 1,0 l 
pH final 6,8 + 0,2 
 
Preparación 
Disolver los ingredientes en agua destilada. 
NO CALENTAR. Esterilizar por filtra ción a través de membrana 0,45 µm. 
Distribuir asépticamente de 1,5 a 3 mL en tubos estériles de 13 x 100 mm. 
B 7.4.2.4.11  Caldo infusión cerebro corazón 
Ingredientes Cantidades 
Infusión cerebro corazón 200,0 g 
Infusión de corazón de res 250,0 g 
Proteosa peptona 10,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Fosfato disódico dodecahidratado 2,5 g 
Dextrosa 2,0 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 7,4 ± 0,2       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
Preparación 
Disolver los ingredientes en agua destilada, calentar suavemente. 
Distribuir y esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 min. B 7.4.2.5  Soluciones 
B 7.4.2.5.1  Solución verde brillante al 0,1% (1:1000) 
Ingredientes Cantidades 
Verde brillante 0,1 g 
Agua destilada estéril 100,0 mL 
 
Disolver 0,1 g de verde brillante en agua des tilada estéril hasta completar 100 mL. 
B 7.4.2.5.2  Solución de yodo-yoduro 
Ingredientes Cantidades 
Cristales de yodo 6,0 g 
Yoduro de potasio 6,0 g 
Agua destilada 100,0 mL 
 
Disolver los cristales y el yoduro de potasio en agua destilada hasta completar 100 mL. Conservar en frasco ámbar. B 7.4.2.5.3  Solución salina al 0,85% 
Ingredientes Cantidades 
Cloruro de sodio 0,85 g 
Agua destilada 100,0 mL 
 
Disolver el cloruro de sodio en el agua y esterilizar a 121°C ± 1°C durante 15 min. B 7.4.2.5.4  Solución salina formalizada 
Ingredientes Cantidades 
Solución de formaldehído (36-38%) 6,0 mL 
Cloruro de sodio 8,5 g 
Agua destilada 1,0 L 
 
Disolver 8,5 g de cloruro de sodio en 1 litro de agua destilada. Esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 min. 
Enfriar a temperatura ambiente. Adicionar 6 mL de la solución de formaldehído. No esterilizar después de 
la adición de formaldehído. 
B 7.4.2.5.5  Reactivo de Kovac 
Ingredientes Cantidades 
p-dimetil-aminobenzaldehído 5,0 g 
Alcohol amílico 75,0 mL 
Acido clorhídrico concentrado 25,0 mL 
 
Disolver el p-dimetil-aminobenzaldehído en el alcohol  amílico y después agregar el ácido clorhídrico 
lentamente. Conservar en frasco ámbar en refrigeración. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 7.4.2.5.6 Solución de alfa-naftol al 5% 
Ingredientes Cantidades 
Alfa-naftol 5,0 g 
Alcohol 100,0 mL 
 
Disolver 5 g de alfa-naftol en alcohol hasta completar 100 mL. 
B 7.4.2.5.7 Solución de rojo de metilo 
Ingredientes Cantidades 
Rojo de metilo 0,10 g 
Alcohol etílico 300,0 mL 
Agua destilada c.b.p. 500,0 mL 
 
Disolver el rojo de metilo en el alcohol etílico y adicionar agua hasta completar 500 mL. 
B 7.4.2.5.8 Solución de hidróxido de potasio al 40% 
Ingredientes Cantidades 
Hidróxido de potasio 40,0 g 
Agua destilada  100,0 mL 
 
Disolver 40 g de hidróxido de potasio en agua hasta completar 100 mL. 
B 7.4.2.5.9  Solución de gelatinasa al 5% 
Ingredientes Cantidades 
Gelatinasa 5,0 g 
Agua 100,0 mL 
 
Disolver 5 g de gelatinasa en 100 mL de agua destilada. NO CALENTAR. 
B 7.4.2.6 Antisueros 
B 7.4.2.6.1 Antisuero polivalente somático (O) 
B 7.4.2.6.2 Antisuero polivalente flagelar (H) 
B 7.4.2.6.3 Antisuero Vi 
B.7.4.3 Material 
B 7.4.3.1 Matraces Erlenmeyer de 500 mL 
B 7.4.3.2 Recipientes de boca ancha, de capacidad apropiada para contener las muestras simples  y 
compuestas 
B 7.4.3.3 Angulos de vidrio 
B 7.4.3.4 Cucharas, bisturíes, cuchillos y pinzas 
B 7.4.3.5 Tubos de ensaye de 16 x 150 mm y de 20 x 100 mm 
B 7.4.3.6 Tubos para serología de 10 x 75 mm o de 13 x 100 mm 
B 7.4.3.7  Pipetas bacteriológicas de 10,0 y 5,0 mL, gr aduadas en 0,1 mL y prot egidas con tapón  de 
algodón 
B 7.4.3.8  Pipetas de 1 mL, con graduaciones de 0,01 mL 
B 7.4.3.9  Cajas de Petri estériles de vidrio o desechables 
B 7.4.3.10  Rejillas para tubos de ensaye 
B 7.4.3.11  Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de diámetro 
B 7.4.3.12  Papel pH (intervalo de 6-8) con graduacione s máximas de 0,4 unidades de pH para cambios  
de color       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 7.4.3.13  Todo el material que tenga contacto con las mu estras bajo estudio debe esterilizarse mediante: 
B 7.4.3.14  Horno, durante 2 horas a 170-175ºC o autocla ve, durante 15 min como mínimo a 121ºC ± 1ºC 
B 7.4.4 Equipo  
B 7.4.4.1  Horno para esterilizar que alcance los 180ºC 
B 7.4.4.2  Incubadora con termostato para evitar variaciones mayores de ± 0,1ºC y termómetro 
B 7.4.4.3  Autoclave con termómetro o manómetro, probado con termómetro de máximas 
B 7.4.4.4  Baño María con termostato y termómetro 
B 7.4.4.5  Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g 
B 7.4.4.6  Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato, con vasos esterilizables (vidrio 
o aluminio) 
B 7.4.4.7  Mecheros Bunsen o Fisher 
B 7.4.4.8  Potenciómetro 
B.7.4.5 Procedimiento 
Los siguientes métodos se basan en el análisis de 25 g de la muestra analítica en una proporción de 1:9 
de muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse si empre que se mantenga la misma proporción. Se 
recomienda una muestra de 25 g o más. 
B 7.4.5.1 Procedimiento general para la preparación de muestras 
B 7.4.5.1.1  Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso estéril de licuadora o en bolsa estéril para 
trabajar en homogeneizador peristáltico (stomacher). Adicionar 225 mL del medio de preenriquecimiento 
estéril (generalmente caldo lactosado, a menos que se in dique otro) y licuar si es necesario durante un min. 
B 7.4.5.1.2  Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con 
tapón de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien y 
determinar el pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6,8 ± 0,2 con hidróxido de sodio 
1N o ácido clorhídrico 1N estériles. Mezclar y cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa. Incubar  24 
± 2 h a 35ºC. Continuar como se indica  en el punto i) del numeral 7.4.5.2 
B 7.4.5.2 Aislamiento de Salmonella  
B 7.4.5.2.1 Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y 
agitar suavemente, transferir respectivamente 1 mL  de la mezcla a un tubo que contenga 10 mL de caldo 
tetrationato y a otro con 10 mL de caldo selenito cistina.  Como alternativa, en sust itución del caldo tetrationato 
puede emplearse el medio Vassiliadis-Rappaport. 
B 7.4.5.2.2 Incubar de 18 a 24 h a 35ºC o, para alimentos fuertemente contaminados a 42ºC por el mismo 
periodo. Estriar los productos que fueron direct amente enriquecidos en medios selectivos. 
B 7.4.5.2.3 Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), 
agar verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquie ra de los medios selectivos adicionales (agar entérico 
Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS). Efectuar el mismo procedimiento para el caldo tetrationato. 
Incubar las placas 24 ± 2 h a 35ºC. 
B 7.4.5.2.4 Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella, de acuerdo 
con las siguientes características: 
B 7.4.5.2.5  Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En 
algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras. 
B 7.4.5.2.6  Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden se r transparentes rodeadas por medio enrojecido; 
las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas. 
B 7.4.5.2.7  Agar entérico Hektoen: colonias verdes o azulve rdes con o sin centro negro. En algunos casos 
las colonias pueden aparecer completamente negras. 
B 7.4.5.2.8  Agar Sulfito de Bismuto: las colonias típicas de Salmonella pueden ser cafés, grises o negras; 
con o sin brillo metálico. Generalmente el medio circund ante (halo) es café, tornándose posteriormente negro. 
Algunas cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscuro. Si las placas no muestran colonias 
típicas o no se observa crecimi ento, incubar 24 h adicionales. 
B 7.4.5.2.9  Agar SS: colonias translúcidas, ocasionalment e opacas. Algunas colonias dan centro negro. 
Las colonias fermentadoras de la lactosa son rojas. 
B 7.4.5.3 Identificación bioquímica Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 7.4.5.3.1 Seleccionar al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien 
aisladas. Tocar levemente el centro de cada colonia e i nocular dos tubos, uno con agar triple azúcar hierro 
(TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), por estría en la  superficie inclinada y por punción en el fondo. Incubar 
por 24 ± 2 h a 35ºC. Almacenar en refrigeración de 5 a 8ºC las placas con medios selectivos por si es 
necesario retomar más colonias. Observar el crecimi ento en los tubos y considerar  presuntivamente positivas 
para Salmonella las colonias que den las siguientes reacciones: 
B 7.4.5.3.2 Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentación de la 
glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo más intenso que el medio original debido a la no fermentación de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayoría de los casos se observa coloración negra a lo largo de la punción debido a la producción de ácido sulfihídrico. 
B 7.4.5.3.3 Agar LIA, se observa intensificación del color púrpura en todo el tubo por la descarboxilación 
de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos  que produzcan claramente color amarillo en el fondo del 
agar. La mayoría de las cepas de Salmonella  spp.  producen ácido sulfihídrico en este medio con 
ennegrecimiento a lo largo de la punción. 
B 7.4.5.3.4 Retener todos los cultivos que muestr en las reacciones características de Salmonella en los 
medios TSI y LIA para las pruebas adicionale s, indicadas en el punto B.7. 4.5.3.5. 
B 7.4.5.3.5 Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones en LIA 
típicos, deben trabajarse como cultivos presuntivos positi vos, ya que en estos casos, el medio LIA permitirá 
detectar S. arizonae y cepas atípicas de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los 
cultivos que muestren reacciones atípicas en ambos medios. 
B 7.4.5.3.6 Continuar el análisis a partir de los tubos de TSI c on reacciones típicas. Si el cultivo presenta 
reacciones atípicas en este medio, tomar colonias adic ionales de las placas de donde se obtuvo el cultivo 
atípico anterior y sembrar las pruebas bioquímicas nuevamente. 
B 7.4.5.3.7 Continuar la identificación bioquímica y serológi ca a partir de los cultivos recuperados de TSI. 
Se recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analítica seleccionando colonias procedentes de 
ambos medios de enriquecimiento. 
B 7.4.5.3.8 Prueba de ureasa 
B 7.4.5.3.8.1 Prueba de ureasa (convencional). 
Con un asa estéril, tomar crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e 
inocular tubos de caldo urea. Utilizar un control de me dio para comparar el vire púrpura de las reacciones 
positivas con el color del medio original. Incubar 24 ± 2 h a 35ºC. 
B 7.4.5.3.8.2 Prueba de ureasa (rápida). Tomar dos asadas de crecimiento del cult ivo presumiblemente 
positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea (rápida). Incubar 2 h a 37 ± 0,5ºC en baño 
de agua. 
B 7.4.5.3.8.3 Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Retener los cultivos que den la prueba 
negativa (sin cambio de color del medio). 
B 7.4.5.4 . Identificación  serológica 
B 7.4.5.4.1 Ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella (Antisuero polivalente O) 
B 7.4.5.4.1.1 Colocar con una asa dos gotas separadas de solución salina estéril sobre un portaobjetos o 
en dos secciones de una placa para aglutinación. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo desarrollado en TSI. 
B 7.4.5.4.1.2 Agregar a una de ellas una gota del antisuero polivalente somático (O) y mezclar con el 
canto del asa o empleando aplicadores de madera. 
B 7.4.5.4.1.3 Agitar inclinando la lámina hacia atrás y hacia adelante durante aproximadamente un min. 
Observar bajo buena iluminación sobre un fondo oscuro. 
B 7.4.5.4.1.4 Considerar cualquier grado de aglutinación como positiva. 
La prueba positiva resulta cuando se presenta aglutinac ión en la gota con el cultivo y el antisuero y no 
aglutinación en la gota que contiene el cultivo y la solu ción salina. Si se observa aglutinación en ambas gotas, 
la prueba no es definitiva y se debe continuar con las pruebas bioquímicas complementarias. 
B 7.4.5.4.1.5 Cuando la aglutinación es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el 
subgrupo empleando antisueros para los diferentes subgrupos  (los grupos B, C, D y E, suelen ser los más 
frecuentes). 
B 7.4.5.4.1.6 Si la aglutinación con el antisuero O es negativa,  utilizar antisuero Vi y ef ectuar la prueba. Si 
hay aglutinación con Vi calentar el cultivo a ebullición y repetir la aglutinación con el antisuero polivalente O.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 7.4.5.4.1.7 Si no se cuenta con los sueros grupoespecíficos, solicitar la tipificación de la cepa al 
Laboratorio de Enterobacterias del Centro Nacional de Di agnóstico y Referencia de la Secretaría de Salud  o 
al Laboratorio Nacional de Salud Pública. 
B 7.4.5.4.2 Si se requiere, practicar el ensayo de los antígenos flagelares de Salmonella (Antisuero 
polivalente H). 
B 7.4.5.4.2.1 Inocular el crecimiento del tubo de TSI en agar infusión de cerebro corazón e incubar de 4 a 
6 h a 35ºC hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el mismo día), o bien, en caldo soya 
tripticaseína e incubar por 24 ± 2 h a 35ºC (para ensayo  al día siguiente). Adicionar 2,5 mL de solución salina 
formalizada a 5 mL del cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazón (BHI). 
B 7.4.5.4.2.2 Colocar 0,5 mL del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para serología (13 
x 100 mm aproximadamente). Adicionar 0,5 mL del cultivo fo rmalizado. Preparar un control de solución salina 
mezclando 0,5 mL de solución salina formalizada con 0,5 mL del antígeno formalizado. Incubar las mezclas en 
baño de agua a 48-50ºC. Observar a intervalos de 15  min por espacio de una h. Una prueba positiva es 
cuando se observa aglutinación en la mezcla de prueba pero no en el control. Debe interpretarse como 
negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas  muestre aglutinación. Cuando ambas mezclas se 
aglutinan, se considera la prueba inespecífica. 
B 7.4.5.5 Pruebas bioquímicas complementarias 
Cuando las pruebas serológicas o bioquímicas iniciales, dan resultados atípicos o no concluyentes, 
realizar las pruebas que se describen a continuación. Inoc ular los cultivos positivos  provenientes de TSI y LIA 
en: medio SIM, agar citrato de Simmons, caldo manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para confirmar la 
presencia de la especie S. arizonae. 
Interpretar los cambios en los medios inoculados conforme lo siguiente: 
B 7.4.5.5.1 Agar citrato Simmons 
Inocular por estría el tubo. Incubar 96 ± 2 h a 35 ± 2ºC. Prueba positiva: crecimiento acompañado de un cambio de color de verde a azul. 
Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color. B 7.4.5.5.2 Medio SIM 
Inocular por punción. Incubar 24 h a 35 ± 2ºC. B 7.4.5.5.2.1  Movilidad. 
Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la punción y en el seno del medio de cultivo. 
Prueba negativa: crecimiento a lo la rgo de la punción exclusivamente. 
B 7.4.5.5.2.2  Producción de ácido sulfihídrico. 
Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la punción que puede extenderse a todo  el 
medio. 
Prueba negativa: ausencia de color negro. B 7.4.5.5.2.3  Producción de indol 
Adicionar al tubo con medio SIM que presente crec imiento de 0,2 a 0,3 mL de reactivo de Kovac. 
Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color rojo. Prueba negativa: sin cambio de color. B 7.4.5.5.3 Caldo RM-VP 
Inocular un tubo con el medio. Incubar 48 ± 2 h a 35 ± 2ºC para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM. B 7.4.5.5.3.1 Prueba de Voges-Proskauer (VP) 
Transferir a un tubo un mL del cultivo de 48 h. Adicionar 0,6 mL de solución de alfa naftol. Adicionar 0,2 mL de solución de hidróxido de potasio 40%. Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional). Interpretar los resultados después de incubar 2 h a 35 ± 2ºC o 4 h a temperatura ambiente. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo. 
Prueba negativa: sin cambio de color. 
Reincubar el resto del medio RM-VP 48 h más a 35 ± 2ºC. 
B 7.4.5.5.3.2 Prueba de rojo de metilo (RM) 
Adicionar al medio de cultivo de 96 h de incubación de dos a tres gotas de solución de rojo de metilo. 
Interpretar los resultados inmediatamente. 
Prueba positiva: desarrollo de color rojo. Prueba negativa: desarrollo de color amarillo. 
B 7.4.5.5.4 Caldo malonato 
Inocular un tubo conteniendo el medio. Incubar 40 ± 2 h a 35 ± 2ºC. 
Prueba positiva: desarrollo de color azul. 
Prueba negativa: sin cambio de color. B 7.4.5.5.5 Caldo manitol 
Inocular un tubo conteniendo el medio. 
Incubar 24 ± 2 h a 35 ± 2ºC. Prueba positiva: desarrollo de color amarillo. 
Prueba negativa: sin cambio de color. 
B 7.4.5.5.6 Consultar los resultados obtenidos en el cuadro 2 para la identificación de los géneros de las 
bacterias investigadas. 
Nota:  los sistemas bioquímicos comerciales validados pueden ser usados como alternativa para las 
pruebas bioquímicas convencionales. 
B 7.4.6 Cálculo y expresión de resultados 
B 7.4.6.1 Interpretación de reacciones bioquímicas y serológicas. 
CUADRO 1 
Reacciones bioquímicas Reacciones serológi cas Interpretación 
Típica Antígeno O, Vi o H positivo Cepas consideradas  como 
Salmonella spp. Típica Todas las reacciones negativas 
Típica No probada Puede ser Salmonella  
Reacciones atípicas Antígeno O, Vi o H positivo 
Reacciones atípicas Todas las reacciones negativas No debe ser considerada  
Salmonella  
Nota: ver figura 1 
CUADRO 2 
Prueba o sustrato Positivo Negativo Reacción 
Glucosa (TSI) Amarillo Rojo + 
Lisina descarboxilasa (LIA) Púrpura Amarillo + 
H2S (TSI y LIA) Negro No negro + 
Ureasa Rojo-púrpura No hay cambio de color - 
Caldo de lisina descarboxilasa Púrpura Amarillo + 
Caldo dulcitol rojo de fenol Amarillo o gas No hay cambio de color ni gas + b 
Caldo KCN Crecimiento No hay crecimiento - 
Caldo malonato Azul No hay cambio de color - c 
Prueba de indol Superficie color violeta Superficie color amarillo - 
Prueba del antígeno flagelar Aglutinación No hay aglutinación +       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
Prueba del antígeno somático Aglutinación No hay aglutinación + 
Caldo lactosa rojo fenol Amarillo o gas No hay cambio de color ni gas - c 
Caldo sacarosa rojo fenol Amarillo o gas No hay cambio de color ni gas - 
Prueba Voges-Proskauer De rosa a rojo No hay cambio de color - 
Prueba rojo de metilo Rojo difuso Amarillo difuso + 
Citrato de Simmons Crecimiento color azul No hay crecimiento, no hay 
cambio de color v 
a +, 90% o más positivos en 1 o 2 días; -, 90%  o más negativas en 1 o 2 días; v, variable. 
b La mayoría de los cultivos S. arizonae son negativos. 
c La mayoría de los cultivos S. arizonae son positivos. 
B 7.4.6.2  Informe de resultados 
Informar: presencia o ausencia de Salmonella spp. en __________ g o ____________ mL de muestra. 
 
 
 
B 7.5 Determinación de bacterias coliformes. 
Técnica del número más probable 
B 7.5.1 Fundamento 
El método se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a 35 ± 1°C durante 24 
a 48 horas, resultando una producción de ácidos y gas el cual se manifiesta en las campanas de fermentación. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 7.5.2 Reactivos 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico. Cuando se indique agua debe 
entenderse como agua destilada con pH cercano a la neutralidad. 
B 7.5.2.1 Soluciones diluyentes 
B 7.5.2.1.1  Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada) 
Ingredientes Cantidades 
Fosfato monopotásico 34,0 g 
Agua  1,0 l 
 
Preparación: Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1 N. Llevar a un litro con agua. Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0°C. Conservar en refrigeración (solución concentrada). Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a un litro con agua. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera. Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1°C. 
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales  a 
los iniciales. 
B 7.5.2.1.2  Agua peptonada 
Ingredientes Cantidades 
Peptona  1,0 g 
Cloruro de sodio 8,5 g 
Agua  1,0 l 
 
Preparación: Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1 N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera. Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0°C. 
Después de la esterilización los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los 
iniciales. Si este diluyente no es usado inmediatam ente, almacenar en lugar obscuro a una temperatura entre 
0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición. 
B 7.5.2.2 Medios de cultivo. 
Caldo lactosado (medio de enriquecimiento para agua potable y hielo). Caldo lauril sulfato triptosa (medio de enriquecimiento selectivo). Caldo lactosa bilis verde brillante (medio de confirmación). 
En el caso del análisis de agua potable y hielo pue de utilizarse caldo lactosado o caldo lauril sulfato 
triptosa con púrpura de bromocresol (concentración 0, 01 g/l de medio), como alternativa al uso de campanas 
de fermentación. Los tubos positivos se manifiestan por el vire del indicador a color amarillo.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 7.5.2.2.1  Caldo lactosado 
CUADRO 1  
Ingredientes Medio de concentración 
1,5 Medio de concentración 
sencilla 
Extracto de carne 4,5 g 3,5 g 
Peptona de gelatina 7,5 g 5,0 g 
Lactosa 7,5 g 5,0 g 
Agua destilada 1000 mL 1000 mL 
 Disolver los ingredientes en 1 l de agua, calentando si  es necesario o el medio completo deshidratado, 
siguiendo las instrucciones del fabricante. 
Ajustar el pH final de tal manera que después de la esterilización éste sea de 6,9 ± 0,2 a 25°C. Distribuir en volúmenes de 10 mL en tubos con dim ensiones de 16 x 160 mm el medio de concentración 
sencilla y de 20 mL en tubos de 20 x 200 mm el medi o de concentración 1,5, c ada tubo debe tener campana 
de fermentación. 
Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ± 1,0°C. Enfriar rápidamente para evitar una exposición excesiva al  calor. El aspecto del caldo es claro y de  color 
beige. 
Se puede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 mL del 
caldo preparado, cuando se agreguen 10 mL de la muestra. 
B 7.5.2.2.2  Caldo lauril sulfato triptosa. 
CUADRO 2 
Ingredientes Medio de concentra ción 1,5 Medio de concentración 
sencilla 
Triptosa 30 g 20 g 
Lactosa 7,5 g 5,0 g 
Fosfato dipotásico 4,125 g 2,75 g 
Fosfato monopotásico 4,125 g 2,75 g 
Cloruro de sodio 7,5 g 5,0 g 
Laurel sulfato de sodio 0,15 g 0,1 g 
Agua destilada 1000 mL 1000 mL 
 
Disolver los componentes en 1 l de agua, calentando si es necesario o el medio de cultivo completo 
deshidratado, siguiendo las in strucciones del fabricante. 
Ajustar el pH de tal manera que después de la esterilización éste sea de 6,8 ± 0,2 a 25°C. Distribuir en volúmenes de 10 mL en tubos con dim ensiones de 16 x 160 mm el medio de concentración 
sencilla y de 20 mL en tubos de 20 x 200 mm el medi o de concentración 1,5, c ada tubo debe tener campana 
de fermentación. 
Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ± 1,0°C. Se recomienda almacenar el medio una vez preparado. 
Las campanas de fermentación no deben de contener burbujas de aire después de la esterilización. 
Se puede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 mL de 
caldo preparado, cuando se agreguen 10 mL de muestra. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 7.5.2.2.3  Caldo lactosa bilis verde brillante 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 10,0 g 
Lactosa 10,0 g 
Sales biliares 20,0 g 
Verde brillante 0,013 g 
Agua 1,0 L 
 
Disolver los componentes o el medio completo deshidrat ado en agua, calentar si es necesario. Ajustar el 
pH, de tal manera que después de la esterilización éste sea de 7,2 a 25°C. 
Distribuir el medio en cantidades de 10 mL en tubos de 16 X 160 mm conteniendo campana de 
fermentación. Esterilizar en autoclav e por 15 minutos a 121 ± 1,0°C. 
Las campanas de fermentación no deben contener burbujas de aire después de la esterilización. B 7.5.2.3 Materiales 
B 7.5.2.3.1  Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 11 y 2 mL), con tapón  
de algodón. 
B 7.5.2.3.2 Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total. 
B 7.5.2.3.3  Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca. 
B 7.5.2.3.4  Utensilios esterilizables para la obtención de m uestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, 
espátulas, etc. 
B 7.5.2.3.5  Tubos de cultivo 20 x 200 mm y de 16 x 160 mm con tapones metálicos o de rosca. 
B 7.5.2.3.6  Campanas de fermentación (tubos de Durham). 
B 7.5.2.3.7  Pipetas bacteriológicas graduadas de 10 y 1 mL. 
B 7.5.2.3.8  Gradillas. 
B 7.5.2.3.9  Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de diámetro. 
B 7.5.2.3.10  Todo el material que tenga contacto con las muestras bajo estudio debe esterilizarse 
mediante: 
B 7.5.2.3.11  Horno, durante 2 horas a 170 a 175°C o 1 h a 180°C o autoclave, durante 15 minutos como 
mínimo a 121 ± 1,0°C. 
B 7.5.2.3.12  El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las 
especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por las esterilizaciones repetidas y éste 
debe ser químicamente inerte. 
B 7.5.2.4 Aparatos e instrumentos  
B 7.5.2.4.1  Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C. 
B 7.5.2.4.2  Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1,0°C, provista con termómetro 
calibrado. 
B 7.5.2.4.3  Termómetro de máximas y mínimas. 
B 7.5.2.4.4  Autoclave que alcance una temp eratura mínima de 121 ± 1,0°C. 
B 7.5.2.4.5  Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25°C. 
B 7.5.2.5 Preparación de la muestra 
Seguir el procedimiento como lo indica el punto B.7.1 “Procedimiento para la preparación y dilución de 
muestras de alimentos para su análisis microbiológicos” . 
B 7.5.2.6 Procedimiento 
B 7.5.2.6.1 Para agua potable y hielo 
B 7.5.2.6.1.1 Prueba presuntiva       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 7.5.2.6.1.1.1  Inoculación. Agitar la muestra. Transferir volúmenes de 10 mL de muestra a cada uno de 5 
tubos con 20 mL de caldo lactosado de mayor concentraci ón y 1,0 mL y 0,1 mL de muestra a cada uno de los 
tubos de las series de 5 respectivamente con 10 mL de caldo lactosado de concentración sencilla o caldo 
laurel sulfato triptosa con púrpura de bromocresol. 
B 7.5.2.6.1.1.2  Incubación. Incubar los tubos a 35°C. Exami nar a las 24 ± 2 h y observar si hay formación 
de gas o la formación de gas no se observa en este tiempo, incubar por 48 ± 2 h. 
B 7.5.2.6.1.2 Prueba confirmativa 
De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una azada y sembrar en un número igual de tubos con 
medio de confirmación, caldo lactosa lauril bilis verde br illante. Incubar a 35 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas o si la 
formación de gas no se observa en este tiempo, incubar por 48 ± 2 horas. 
En esta Norma Oficial Mexicana, para el análisis de agua potable, agua purificada así como hielo, se 
emplea la serie de 5 tubos inoculados, 5 tubos con 10 mL , 5 tubos con 1 mL y 5 tubos con 0,1 mL, véase el 
cuadro 4. 
B 7.5.2.6.2 Para sólidos. 
Preparar suficiente número de diluciones para asegurar  que todos los tubos correspondientes a la última 
dilución rindan un resultado negativo. 
B 7.5.2.6.2.1 Prueba presuntiva 
B 7.5.2.6.2.1.1  Inoculación. Tomar tres tubos de medio de enriquecimiento de mayor concentración. Usar 
una pipeta estéril para transferir a cada tubo 10 mL de la muestra si es líquida o 10 mL de la dilución primaria 
inicial, en el caso de otros productos. 
B 7.5.2.6.2.1.2 Tomar tres tubos de concentración sencilla del  medio selectivo de enriquecimiento. Usar 
una pipeta estéril para transferir a cada uno de estos tubos 1 mL de la muestra si es líquida o 1 mL de la 
dilución primaria en el caso de otros productos. 
B 7.5.2.6.2.1.3  Para las diluciones subsecuentes, continuar co mo se indica en el párrafo anterior, usando 
una pipeta diferente para cada dilución. Mezclar suavemente el inóculo con el medio. 
B 7.5.2.6.2.1.4 Incubación. Incubar los tubos a 35 ± 0,5°C po r 24 ± 2 horas y observar si hay formación de 
gas, en caso contrario prolongar la incubación hasta 48 ± 2 horas. 
B 7.5.2.6.2.2 Prueba confirmativa 
De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una azada y sembrar en un número igual de tubos con 
medio de confirmación. Incubar a 35 ± 0,5°C por 24 ± 2 horas o si la formación de gas no se observa en este 
tiempo, prolongar la incubación por 48 ± 2 horas. 
En esta Norma Oficial Mexicana se considera una combinación de tres tubos por cada dilución de la serie. 
Para algunos productos y siempre que se requiera un a mayor precisión en los resultados, será necesario 
inocular una serie de cinco o diez tubos. 
B 7.5.2.7 Expresión de los resultados  
Tomar la serie de tubos de la prueba confirmativa que dé formación de gas después del periodo de 
incubación requerido y buscar el NMP en los cuadros correspondientes. 
B 7.5.2.7.1 El cuadro 3 muestra algunos ejemplos que se pueden presentar. 
Ejemplos: Ejemplo 1. Cuando sólo una dilución muestra tres tubos positivos, elegir ésta y las diluciones 
mayores posteriores. 
B 7.5.2.7.2 Ejemplo 2. Cuando más de una dilución muestra tres tubos positivos y la última da menos de 
tres, elegir esta última y las dos diluciones anteriores más bajas. 
B 7.5.2.7.3 Ejemplo 3. Cuando en ninguna dilución hay tres tubos positivos y éstos se encuentran en más 
de tres diluciones, seleccionar las dos diluciones mayores positivas y la siguiente. 
B 7.5.2.7.4  Ejemplos 4 y 5. Cuando los tubos positivos sólo se encuentran en la muestra sin diluir (10 mL o 
1 g) y en la primera dilución (1 mL o 10-1 g), seleccio nar las tres primeras diluciones para el cálculo del 
número más probable. En cada caso se obtiene un númer o de tres cifras, lo cual es representado en los 
cuadros 4 al 7, según corresponda. En la columna que indica el número de tubos positivos se busca el índice del NMP. La técnica de NMP puede admitir gran cantidad  de variaciones. Los resultados obtenidos con esta 
técnica deben ser utilizados con precaución. Los límite s de confianza están representados en los cuadros 4 al 
7. Por ejemplo, para una muestra sólida con un NMP de 70 coliformes por gramo, los límites de confianza en 
el 95% de los casos variarán de 10 a 230 coliformes por gramo (ejemplo 3 del cuadro 3) y en un producto con 
24 de NMP de coliformes por gramo, los límites de confi anza son de 3,6 a 130 coliformes por gramo (ejemplo 
2 cuadro 3). Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
 
CUADRO 4. Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados varios números de tubos. 
(Diluciones 10, 1,0 y 0,1 g) 
Combinación de 
positivos Indice del 
NMP por g 3 tubos por dilución  95% 
límites de confianza  5 tubos por 
dilución 
Indice del 
NMP por g  95% límites de confianza 
bajo alto bajo alto 
0-0-0 <0,03 <0,005 <0,09 <0,02 <0,005 <0,07 
0-0-1 0,03 <0,005 <0,09 0,02 <0,005 0,07 
0-1-0 0,03 <0,005 0,13 0,02 <0,005 0,07 
0-2-0 -- -- -- 0,04 <0,005 0,11 
1-0-0 0,04 <0,005 0,20 0,02 <0,005 0,07 
1-0-1 0,07 0,01 0,21 0,04 <0,005 0,11 
1-1-0 0,07 0,01 0,23 0,04 <0,005 0,11 
1-1-1 0,11 0,03 0,36 0,06 <0,005 0,15 
1-2-0 0,11 0,03 0,36 0,06 <0,005 0,15 
2-0-0 0,09 0,01 0,36 0,05 <0,005 0,13 
2-0-1 0,14 0,03 0,37 0,07 0,01 0,13 
2-1-0 0,15 0,03 0,44 0,07 0,01 0,17 
2-1-1 0,20 0,07 0,89 0,09 0,02 0,17 
2-2-0 0,21 0,04 0,47 0,09 0,02 0,21 
2-2-1 0,28 0,10 1,50 -- -- 0,21 
2-3-0 -- -- -- 0,12 0,03 -- 
3-0-0 0,23 0,04 1,20 0,08 0,01 0,28 
3-0-1 0,39 0,07 1,3 0,11 0,02 0,19 
3-0-2 0,64 0,15 3,80 -- -- -- 
3-1-0 0,43 0,07 2,1 0,11 0,02 0,25 
3-1-1 0,75 0,14 2,3 0,14 0,04 0,34 
3-1-2 1,20 0,30 3,3 -- -- -- 
3-2-0 0,93 0,15 3,80 0,14 0,04 0,34 
3-2-1 1,50 0,30 4,40 0,17 0,05 0,46 
3-2-2 2,10 0,35 4,70 -- -- -- 
3-3-0 2,40 0,36 13,0 -- -- --       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
3-3-1 4,60 0,71 24,0 -- -- -- 
3-3-2 11,0 1,50 48,0 -- -- -- 
3-3-3 >11,0 >1,50 >48 -- -- -- 
4-0-0 ---   0,13 0,03 0,31 
4-0-1 ---   0,17 0,05 0,46 
4-1-0 ---   0,17 0,05 0,46 
4-1-1 ---   0,21 0,07 0,63 
4-1-2 ---   0,26 0,09 0,78 
4-2-0 ---   0,22 0,07 0,,67 
4-2-1 ---   0,26 0,09 0,78 
4-3-0 ---   0,27 0,09 0,80 
4-3-1 ---   0,33 0,11 0,93 
4-4-0 ---   0,34 0,12 0,93 
5-0-0 ---   0,23 0,07 0,70 
5-0-1 ---   0,31 0,11 0,89 
5-0-2 ---   0,43 0,15 1,14 
5-1-0 ---   0,33 0,11 0,93 
5-1-1 ---   0,46 0,16 1,2 
5-1-2 ---   0,63 0,21 1,5 
5-2-0 ---   0,49 0,17 1,3 
5-2-1 ---   0,70 0,23 1,7 
5-2-2 ---   0,94 0,28 2,2 
5-3-0 ---   0,79 0,25 1,9 
5-3-1 ---   1,10 0,31 2,5 
5-3-2 ---   1,4 0,37 3,4 
5-3-3 ---   1,80 0,44 5,0 
5-4-0 ---   1,30 0,35 3,0 
5-4-1 ---   1,70 0,43 4,9 
5-4-2 ---   2,20 0,57 7,0 
5-4-3 ---   2,80 0,90 8,5 
5-4-4 ---   3,50 1,20 10,0 
5-5-0 ---   2,40 0,68 7,5 
5-5-1 ---   3,50 1,60 10,0 
5-5-2 ---   5,40 1,80 14,0 
5-5-3 ---   9,20 3,0 32,0 
5-5-4 ---   16,09 6,40 58,0 
5-5-5 ---   -- -- -- 
 
CUADRO 5. Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados varios números de tubos. 
(Diluciones 1,0, 0,1 y 0,01 g) 
Combinación de 
positivos Indice del 
NMP por g 3 tubos por dilución  95% 
límites de confianza  5 tubos por 
dilución 
Indice del 
NMP por g  95% límites de confianza 
  bajo alto  bajo alto 
0-0-0 <0,3 <0,05 <0,9 <0,2 <0,05 <0,7 
0-0-1 0,3 <0,05 <0,9 0,2 <0,05 0,7 
0-1-0 0,3 <0,05 1,3 0,2 <0,05 0,7 
0-2-0 -- -- -- 0,4 <0,05 0,11 
1-0-0 0,4 <0,05 2,0 0,2 <0,05 0,7 
1-0-1 0,7 0,1 2,0 0,4 <0,05 1,1 
1-1-0 0,7 0,1 2,3 0,4 <0,05 1,1 
1-1-1 1,1 0,3 3,6 0,6 <0,05 1,5 Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
1-2-0 1,1 0,3 3,6 0,6 <0,05 1,5 
2-0-0 0,9 0,1 3,6 0,5 <0,05 1,3 
2-0-1 1,4 0,3 3,7 0,7 0,1 1,7 
2-1-0 1,5 0,3 4,4 0,7 0,1 1,7 
2-1-1 2,0 0,7 8,9 0,9 0,2 2,1 
2-2-0 2,1 0,4 4,7 0,9 0,2 2,1 
2-2-1 2,8 1,0 15,0 -- -- -- 
2-3-0 -- -- -- 1,2 0,3 2,8 
3-0-0 2,3 0,4 12,0 0,8 0,1 1,9 
3-0-1 3,9 0,7 13,0 1,1 0,2 2,5 
3-0-2 6,4 1,5 38,0 -- -- -- 
3-1-0 4,3 0,7 21,0 1,1 0,2 2,5 
3-1-1 7,5 1,4 23,0 1,4 0,4 3,4 
3-1-2 12,0 3,0 38,0 -- -- -- 
3-2-0 9,3 1,5 38,0 1,4 0,4 3,4 
3-2-1 15,0 3,0 44 1,7 0,5 4,6 
3-2-2 21,0 3,5 47 --- -- --- 
3-3-0 24,0 3,6 130 --- -- --- 
3-3-1 46,0 7,1 240 --- -- --- 
3-3-2 110 15,0 480 --- -- --- 
3-3-3 >110 >15,0 >480,0 --- -- --- 
4-0-0 ---   1,3 0,3 3,1 
4-0-1 ---   1,7 0,5 4,6 
4-1-0 ---   1,7 0,5 4,6 
4-1-1 ---   2,1 0,7 6,3 
4-1-2 ---   2,6 0,9 7,8 
4-2-0 ---   2,2 0,7 6,7 
4-2-1 ---   2,6 0,9 7,8 
4-3-0 ---   2,7 0,9 8,0 
4-3-1 ---   3,3 1,1 9,3 
4-4-0 ---   3,4 1,2 9,3 
5-0-0 ---   2,3 0,7 7,0 
5-0-1 ---   3,1 1,1 8,9 
5-0-2 ---   4,3 1,5 11,4 
5-1-0 ---   3,3 1,1 9,3 
5-1-1 ---   4,6 1,6 12,0 
5-1-2 ---   6,3 2,1 15,0 
5-2-0 ---   4,9 1,7 13,0 
5-2-1 ---   7,0 2,3 17,0 
5-2-2 ---   9,4 2,8 22,0 
5-3-0 ---   7,9 2,5 19,0 
5-3-1 ---   11,0 3,1 25,0 
5-3-2 ---   14,0 3,7 34,0 
5-3-3 ---   18,0 4,4 50,0 
5-4-0 ---   13,0 3,5 30,0 
5-4-1 ---   17,0 4,3 49,0 
5-4-2 ---   22,0 5,7 70,0 
5-4-3 ---   28,0 9,0 85,0 
5-4-4 ---   35,0 12,0 100,0 
5-5-0 ---   24,0 6,8 75,0 
5-5-1 ---   35,0 12,0 100,0 
5-5-2 ---   54,0 18,0 140,0 
5-5-3 ---   92,0 30,0 320,0 
5-5-4 ---   161,0 64,0 580,0 
5-5-5 ---   >161,0 >64,0 >580,0       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
CUADRO 6. Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados varios números de tubos. 
(Diluciones 0,1, 0,01 y 0,001 g) 
Combinación de 
positivos Indice del 
NMP por g 3 tubos por dilución  95% 
límites de confianza  5 tubos por 
dilución 
Indice del 
NMP por g  95% límites de confianza 
  bajo alto  bajo alto 
0-0-0 <3 <0,5 <9 <2 <0,5 <7 
0-0-1 3 <0,5 9 2 <0,5 7 
0-1-0 3 <0,5 13 2 <0,5 7 
0-2-0 -- -- -- 4 <0,5 11 
1-0-0 4 <0,5 20 2 <0,5 7 
1-0-1 7 1 21 4 <0,5 11 
1-1-0 7 1 23 4 <0,5 11 
1-1-1 11 3 36 6 <0,5 15 
1-2-0 11 3 36 6 <0,5 15 
2-0-0 9 1 36 5 <0,5 13 
2-0-1 14 3 37 7 1,0 17 
2-1-0 15 3 44 7 1,0 17 
2-1-1 20 7 89 9 2,0 21 
2-2-0 21 4 47 9 2,0 21 
2-2-1 28 10 150 -- -- -- 
2-3-0 -- -- -- 12 3,0 28 
3-0-0 23 4 120 8 1,0 19 
3-0-1 39 7 13 11 2,0 25 
3-0-2 64 15 380 -- -- -- 
3-1-0 43 7 210 11 2,0 25 
3-1-1 75 14 230 14 4,0 34 
3-1-2 120 30 380 -- -- -- 
3-2-0 93 15 380 14 4,0 34 
3-2-1 150 30 440 17 5,0 46 
3-2-2 210 35 470 --- -- -- 
3-3-0 240 36 130 --- -- -- 
3-3-1 460 71 240 --- -- -- 
3-3-2 1100 150 480 --- -- -- 
3-3-3 >1100 >150 >480 --- -- -- 
4-0-0 ---   13 3,0 31 
4-0-1 ---   17 5,0 46 
4-1-0 ---   17 5,0 46 
4-1-1 ---   21 7,0 63 
4-1-2 ---   26 9,0 78 
4-2-0 ---   22 7,0 67 
4-2-1 ---   26 9,0 78 
4-3-0 ---   27 9,0 80 
4-3-1 ---   33 11,0 93 
4-4-0 ---   34 12,0 93 
5-0-0 ---   23 7,0 70 
5-0-1 ---   31 11,0 89 
5-0-2 ---   43 15,0 114 
5-1-0 ---   33 11,0 93 
5-1-1 ---   46 16,0 120 
5-1-2 ---   63 21,0 150 
5-2-0 ---   49 17,0 130 
5-2-1 ---   70 23,0 170 
5-2-2 ---   94 28,0 220 Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
5-3-0 ---   79 25,0 190 
5-3-1 ---   110 31,0 250 
5-3-2 ---   140 37,0 340 
5-3-3 ---   180 44,0 500 
5-4-0 ---   130 35,0 300 
5-4-1 ---   170 43,0 490 
5-4-2 ---   220 57,0 700 
5-4-3 ---   280 90,0 850 
5-4-4 ---   350 120,0 1000 
5-5-0 ---   240 68,0 750 
5-5-1 ---   350 120 1000 
5-5-2 ---   540 180 1400 
5-5-3 ---   920 300 3200 
5-5-4 ---   1600 640 5800 
5-5-5 ---   >1600 >640 >5800 
 
CUADRO 7. Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados varios números de tubos. 
Diluciones 0,01, 0,001 y 0,0001 g) 
Combinación de 
positivos Indice del 
NMP por g 3 tubos por dilución  95% 
límites de confianza 5 tubos por 
dilución 
Indice del 
NMP por g 95% límites de confianza 
  bajo alto  bajo alto 
0-0-0 <30 <5 <90 <20 <5 <70 
0-0-1 30 <5 <90 20 <5 70 
0-1-0 30 <5 130 20 <5 70 
0-2-0 -- -- -- 40 <5 110 
1-0-0 40 <5 200 20 <5 70 
1-0-1 70 10 210 40 <5 110 
1-1-0 70 10 230 40 <5 110 
1-1-1 110 30 360 60 <5 150 
1-2-0 110 30 360 60 <5 150 
2-0-0 90 10 360 50 <5 130 
2-0-1 140 30 370 70 10 170 
2-1-0 150 30 440 70 10 170 
2-1-1 200 70 890 90 20 210 
2-2-0 210 40 470 90 20 210 
2-2-1 280 100 1500 -- -- -- 
2-3-0 -- -- -- 120 30 280 
3-0-0 230 40 1200 80 10 190 
3-0-1 390 70 1300 110 20 250 
3-0-2 640 150 3800 -- -- -- 
3-1-0 430 70 2100 110 20 250 
3-1-1 750 140 2300 140 40 340 
3-1-2 1200 300 3800 -- -- -- 
3-2-0 930 150 3800 140 40 340 
3-2-1 1500 300 4400 170 50 460 
3-2-2 2100 350 4700 -- -- -- 
3-3-0 2400 360 13000 -- -- -- 
3-3-1 4600 710 24000 -- -- -- 
3-3-2 11000 1500 48000 -- -- -- 
3-3-3 >11000 >1500 >48000 -- -- -- 
4-0-0 --   130 30 310 
4-0-1 --   170 50 460       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
4-1-0 --   170 50 460 
4-1-1 --   210 70 630 
4-1-2 --   260 90 780 
4-2-0 --   220 70 670 
4-2-1 --   260 90 780 
4-3-0 --   270 90 800 
4-3-1 --   330 110 930 
4-4-0 --   340 120 930 
5-0-0 --   230 70 700 
5-0-1 --   310 110 890 
5-0-2 --   430 150 1140 
5-1-0 --   330 110 930 
5-1-1 --   460 160 1200 
5-1-2 --   630 210 1500 
5-2-0 --   490 170 1300 
5-2-1 --   700 230 1700 
5-2-2 --   940 280 2200 
5-3-0 --   790 250 1900 
5-3-1 --   1100 310 2500 
5-3-2 --   1400 370 3400 
5-3-3 --   1800 440 5000 
5-4-0 --   1300 350 3000 
5-4-1 --   1700 430 4900 
5-4-2 --   2200 570 7000 
5-4-3 --   2800 900 8500 
5-4-4 --   3500 1200 10000 
5-5-0 --   2400 680 7500 
5-5-1 --   3500 1200 10000 
5-5-2 --   5400 1800 14000 
5-5-3 --   9200 3000 32000 
5-5-4 --   16000 6400 58000 
5-5-5 --   >16000 >6400 >58000 
 
B 7.5.2.8 Informe de la prueba 
B 7.5.2.8.1  Informar "Número más probable (NMP) de coliformes por gramo o mililitro de muestra". 
B 7.5.2.8.2  En caso de muestras de agua informar NMP/100 mL. 
B 7.6 De la estimación de la densidad microbiana por la técnica del número más probable. 
Determinación de bacterias coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli por la técnica de 
diluciones en tubo múltiple. 
B 7.6.1  Fundamento. 
Se basa en la dilución de la muestra en tubos múltiples, de tal forma que todos los tubos de la menor 
dilución sean positivos y todos los tubos de la dilución más alta sean negativos. El resultado positivo se demuestra por la presencia de gas o crecimiento microbiano. 
Para obtener el Número Más Probable (NMP) en los result ados se aplica la teoría de la probabilidad, lo 
cual tiene como condición lo siguiente: 
B 7.6.1.1  Una distribución aleatoria de las bacterias que existen en la muestra. 
B 7.6.1.2  Las bacterias se encuentran como entidades no agrupadas. 
B 7.6.1.3  Los microorganismos presentes en la muestra crec erán en el medio, cuando son incubados y se 
mantengan en las condiciones adecuadas para su desarrollo. 
Si se espera una cuenta microbiana alta, la muestra deberá diluirse para dar cumplimiento a las 
condiciones. La forma más común de realizar esta prueba es mediante diluciones decimales y usando un inóculo en series de 3, 5 o 10 tubos en serie. A medida qu e el número de tubos inoculados para cada dilución 
aumentan se reducen los límites de confianza. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 7.6.2 Procedimientos. 
B 7.6.2.1  Uso de tablas de NMP con 95% de límite de confianza. 
B 7.6.2.1.1  Las tablas 1-3 presentan la estimación estadí stica de los valores del NMP que corresponden al 
95% de límite de confianza cuando se utilizan 3, 5 y 10  tubos. Otras combinaciones de resultados positivos y 
negativos no encontrados en estas tablas, tienen muy baja probabilidad de que se presenten. Si los resultados 
no están incluidos en las tablas, se  deberá repetir la prueba a partir de la muestra original. Si no es posible, 
el NMP se puede obtener (para las combinaciones de 3 y 5 tubos) de las tablas 4 y 5; también se puede 
aplicar una ecuación para obtener el NMP aproximado. 
B 7.6.2.1.2  El intervalo del 95% de confianza se interpreta como sigue: si el analista supone que el número 
real de microorganismos cae dentro de los límites, entonces se asume que será correcto el 95% de las veces. 
El valor del NMP tabulado representa un intervalo y no un valor absoluto. 
B 7.6.2.1.3  Cuando se preparan más de 3 diluciones de una muestra, el NMP deberá determinarse a partir 
de tres diluciones consecutivas (usando tablas 1-3). Primero, para todas las diluciones que tengan todos los 
tubos positivos, seleccionar la dilución mayor. Después usar las 2 siguientes diluciones mayores (A y B en las 
tablas 6 y 7). Cuando en ninguna de las diluciones  probadas hubiera crecim iento en todos los tubos, 
seleccionar (si es posible) las primeras tres diluciones  consecutivas (volumen de muestra) para que la dilución 
media contenga resultados positivos (C de tablas 6 y 7). 
B 7.6.2.1.4  Con frecuencia es necesario el NMP desde el inicio con volúmenes diferentes de los enlistados 
en las tablas 1-5. Si el volumen de muestra es mayo r que 0,01 g multiplicar el NMP enlistado en la tabla por 
10. El resultado de una determinación de 5 tubos que dé  3 tubos positivos en 0,01 g; 2 tubos positivos en 
0,001 g y 1 tubo positivo en 0,0001 g (3-2-1) leer en la  tabla No. 2 como 17 y multiplicar por 10 para así 
obtener 170 como el NMP actual por gramo de muestra.  De igual forma si la cantidad más grande utilizada 
para la tabla de referencia es 1 g en lugar de 0,1 g, di vidir el NMP derivado de la tabla entre 10. Por ejemplo el 
resultado de la determinación del NMP en 3 tubos para Salmonella spp que dé 3 tubos positivos en 1 g; 1 tubo 
positivo en 0,1 g y ningún positivo en 0,01 g (3-1-0) leer en la tabla 1 como 43 y dividir entre 10, lo que da 4,3 
como el NMP presuntivo por gramo de muestra. 
B 7.6.2.1.5  Un método alternativo para obtener el número más probable es usando la siguiente fórmula: 
(NMP/g de la tabla - 100) X factor de dilución del tubo de en medio = NMP/g 
Para calcular el NMP/100 g multiplicar por 100. 
B 7.6.2.2  Cálculo aproximado del NMP y 95% de límite de confianza. 
Debido a la inherente complejidad para calcular los lí mites de confianza del NMP lo más común es el uso 
de tablas. Generalmente estas tablas están limitadas al  uso de 3, 5 y 10 tubos por dilución, incluso usando un 
método aceptado, pueden pres entarse datos irregulares o accidentes de laboratorio que causan pérdida de 1 
o más tubos de dilución. En este caso una serie de dilu ciones de por ejemplo: 5, 4,4 puede dar una lectura de 
5-2-0. Para estos casos se puede aplicar una fórmula sencilla, la cual no corresponde exactamente con los resultados obtenidos teóricamente; sin embargo, las desviaciones generalmente son pequeñas, esta fórmula 
no debe ser aplicada para fines de regulación. La fórmula no restringe el número de tubos o las diluciones y puede aplicarse para todo tipo de pruebas. El cálculo aproximado está dado por la siguiente ecuación: NMP/g 
= P/(N T)
1/2 
Donde: P es el número de tubos positivos, N es la  cantidad total de muestra (g) en todos los tubos 
negativos y T es la cantidad tota l de muestra (g) en todos los tubos. 
Por ejemplo, considerando que se tuvieran serie de diluciones al doble: 
MUESTRA (g) No. DE TUBOS No. DE TUBOS POSITIVOS 
8 
4 2 
1 
0,5 
0,25 5 
5 5 
5 
5 5 5 
4 2 
0 
1 0 
 
El número de tubos positivos es: P = (5 + 4 + 2+ 1) = 12; N = (8x0) + (4x1) + (2x3) + (1x5) + (0,5x4) + 
(0,25x5) = 18,25; y T = 5 (8+4+2+1+0,5+0,25) = 78,75 
NPM/g = 12/(18,25 x 78,75)1/2 = 0,32/g o 32/100 g       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
Los límites de confianza del 95% estimados, puede n obtenerse del antilogaritmo de base 10 con la 
siguiente ecuación: 
log (NMP/g) 1,08 (log a)/n)1/2 
Donde: a es el radio de dilución y n es el número de tubos por dilución. Esta expresión asume que el radio 
de dilución es diferente de 1:10 (por ejemplo 1:2). Para diluciones de 1:10, la cantidad por restar o sumar 
deberá ser de 1,14(n) ½ para la mejor estimación. Si el número de tubos por dilución (n i) es desigual (por 
ejemplo: un accidente de laboratorio) para la dilución k reemplazar n por la expresión n H (media armónica) por 
el número de tubos por dilución (n i). 
La media armónica se define como: 
nH = k / (1/ n i ) 
k es el número de diluciones. Por ejemplo: Suponiendo que el resultado de 3 diluciones en n i fuera 5-4-4. 
Por lo tanto n H = 3/ (1/5) + (1/4) + (1/4) ½ = 3/0,70 = 4,3 i 
Para el ejemplo anterior el NMP con n = 5 y un lími te de confianza aproximado de 95% será el siguiente: 
log 0,32 (1,08) (log 2)/5) ½ 
-0,495 0,265 
Entonces el límite inferior es el antilogaritmo (-0 -76) = 0.17/g o 17/100 g y el límite inferior es el 
antilogaritmo (-0,23) = 0,59/g o 59/100  g. Cuando se compara con las tablas el NMP podría ser 0,31/g con 
límites de confianza de 0,16/g y 0,57/g. 
Tabla No. 1 Selección del NMP con un límite de confianza de 95% para la prueba de fermentación 
utilizando 3 tubos: con porciones de 0,1,  0,01 y 0,001 g (mL) de muestra. 
No. de tubos positivos  95% de límite de confianza 
0,1 0,01 0,001 NMP/g (mL)b Inferior Superior 
0 0 0 3 - - 
0 1 0 3+ 1 17 
1 0 0 4 1 21 
1 0 1 7+ 2 27 
1 1 0 7 2 28 
1 2 0 11+ 4 35 
2 0 0 9 2 38 
2 0 1 14+ 5 48 
2 1 0 15 5 50 
2 1 1 20+ 7 60 
2 2 0 21 8 62 
3 0 0 23 9 130 
3 0 1 39 10 180 
3 1 0 43 10 210 
3 1 1 75 20 280 
3 2 0 93 30 380 
3 2 1 150 50 500 
3 2 2 210+ 80 640 
3 3 0 240 90 1400 
3 3 1 460 100 2400 
3 3 2 1100 300 4800 
3 3 3 1100 - - 
a Los resultados normales, obtenidos en un 95% de las pruebas no están seguidos por un símbolo más 
(+). Menos del 4% de los resultados de las pruebas  obtenidos están marcados por un símbolo más (+). 
Combinaciones de tubos positivos no encontrados en esta tabla se presentan en menos del 1% de las pruebas y si se presentaran con mayor frecuencia indican un error de técnica o que el valor del número más probable se encuentra en el límite. El NMP de combi naciones que no aparecen en la tabla, se puede obtener 
por extrapolación a la combinación cercana más elevada. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por  100 para expresarlos como NMP/100 g (mL). Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
Tabla No. 2 Selección del NMP con un límite de confianza de 95% para la prueba de fermentación 
utilizando 5 tubos: con porciones de 0, 1, 0,01 y 0,001 g (mL) de muestraa. 
No. de tubos positivos  95% de límite de 
confianza 
0,1 0,01 0,001 NMP/g (mL)bInferior Superior 
      
0 0 0 2 - - 
0 0 1 2+ 1 10 
0 1 0 2 1 10 
1 0 0 2 1 11 
1 0 1 4+ 1 15 
1 1 0 4 1 15 
1 2 0 6+ 2 18 
2 0 0 4 1 17 
2 0 1 7+ 2 20 
2 1 0 7 2 21 
2 1 1 9+ 3 25 
2 2 0 9 3 25 
3 0 0 8 3 24 
3 0 1 11 4 29 
3 1 0 11 4 30 
3 1 1 14+ 6 35 
3 2 0 14 6 35 
3 2 1 17+ 7 40 
3 3 0 17+ 7 41 
4 0 0 13 5 38 
4 0 1 17 7 45 
4 1 0 17 7 46 
4 1 1 21 9 55 
4 2 0 22 9 56 
4 2 1 26+ 12 65 
4 3 0 27 12 67 
4 3 1 33+ 15 77 
4 4 0 34+ 16 80 
5 0 0 23 9 68 
5 0 1 31 13 110 
5 1 0 33 14 120 
5 1 1 46 20 150 
5 1 2 63+ 22 180 
5 2 0 49 21 170 
5 2 1 70 30 210 
5 2 2 94+ 40 250 
5 3 0 79 30 250 
5 3 1 110 40 300 
5 3 2 140 60 360 
5 4 0 130 50 390 
5 4 1 170 70 480 
5 4 2 220 100 580 
5 4 3 280+ 120 690 
5 4 4 350+ 160 820 
5 5 0 240 100 940       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
5 5 1 350 100 1300 
5 5 2 540 220 2000 
5 5 3 920 300 2900 
5 5 4 1600 600 5300 
5 5 5 1600 - - 
a Los resultados normales, obtenidos en un 95% de las pruebas, no están seguidos por un símbolo 
más(+). Menos del 4% de los resultados de las pru ebas obtenidos están marcados por un símbolo más (+). 
Combinaciones de tubos positivos no encontrados en esta tabla se presentan en menos del 1% de las pruebas y si se presentaran con mayor frecuencia indican un error de técnica o que el valor del número más probable se encuentra en el límite. El NMP de combinaciones que no aparecen en la tabla, se pueden obtener por extrapolación a la combinación cercana más elevada. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por  100 para expresarlos como NMP/100 g (mL). 
Tabla No. 3 Selección del NMP con un límite de confianza de 95% para la prueba de fermentación 
utilizando 10 tubos: con porciones de 0,1, 0,01 y 0,001 g (mL) de muestraa. 
No. de tubos positivos  95% de límite de confianza 
0,1 0,01 0,001 NMP/g (mL)b Inferior Superior 
0 0 0 1 - - 
0 0 1 1+ 1 5 
0 1 0 1 1 5 
0 2 0 2+ 1 7 
1 0 0 1 1 5 
1 0 1 2+ 1 7 
1 1 0 2 1 7 
1 2 0 3+ 1 8 
2 0 0 2 1 7 
2 0 1 3+ 1 9 
2 1 0 3 1 9 
2 1 1 4+ 1 10 
2 2 0 4 2 10 
2 3 0 5+ 2 12 
3 0 0 3 1 9 
3 0 1 4 2 11 
3 1 0 4 2 11 
3 1 1 5+ 2 13 
3 2 0 5 2 13 
3 2 1 6+ 3 14 
3 3 0 6+ 3 14 
4 0 0 4 2 12 
4 0 1 6 2 13 
4 1 0 6 2 14 
4 1 1 7 3 15 
4 2 0 7 3 15 
4 2 1 8 4 17 
4 3 0 8 4 17 
4 4 0 9+ 5 19 
5 0 0 6 2 15 
5 0 1 7 3 16 
5 1 0 7 3 17 
5 1 1 9 4 18 
5 2 0 9 4 18 
5 2 1 10+ 5 20 Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
5 3 0 10 5 20 
5 3 1 11+ 6 22 
5 4 0 11+ 6 22 
6 0 0 8 3 18 
6 0 1 9 4 20 
6 1 0 9 4 20 
6 1 1 11 5 22 
6 2 0 11 5 22 
6 2 1 12 6 24 
6 3 0 12 6 25 
6 3 1 14+ 7 27 
6 4 0 14+ 7 27 
6 5 0 15+ 8 29 
7 0 0 10 5 22 
7 0 1 12 6 24 
7 0 2 13+ 7 27 
7 1 0 12 6 25 
7 1 1 13 7 27 
7 1 2 15+ 8 30 
7 2 0 13 7 27 
7 2 1 15 8 30 
7 2 2 17+ 9 32 
7 3 0 15 8 30 
7 3 1 17 9 33 
7 4 0 17 9 33 
7 4 1 19+ 10 36 
7 5 0 19+ 10 36 
8 0 0 13 6 28 
8 0 1 15 7 31 
8 0 2 17+ 8 34 
8 1 0 15 7 31 
8 1 1 17 9 34 
8 1 2 19+ 10 37 
8 2 0 17 9 35 
8 2 1 19 10 38 
8 2 2 21+ 12 42 
8 3 0 19 10 39 
8 3 1 21 12 42 
8 3 2 24+ 13 46 
8 4 0 22 12 43 
8 4 1 24 13 46 
8 5 0 24 13 47 
8 5 1 27+ 15 51 
8 6 0 27+ 15 52 
9 0 0 17 8 37 
9 0 1 19 10 41 
9 0 2 22+ 11 46 
9 1 0 19 10 42 
9 1 1 22 11 47 
9 1 2 25+ 13 52 
9 2 0 22 12 47       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
9 2 1 25 13 53 
9 2 2 28+ 15 58 
9 3 0 25 13 54 
9 3 1 29 15 60 
9 3 2 32+ 18 66 
9 4 0 29 16 61 
9 4 1 33 18 67 
9 4 2 37+ 20 74 
9 5 0 33 18 69 
9 5 1 37 20 76 
9 5 2 42+ 23 83 
9 6 0 38 21 77 
9 6 1 43+ 24 85 
9 7 0 44+ 24 87 
10 0 0 23 12 58 
10 0 1 27 14 67 
10 0 2 31+ 16 77 
10 1 0 27 14 69 
10 1 1 32 17 79 
10 1 2 38 20 92 
10 2 0 33 17 83 
10 2 1 39 20 96 
10 2 2 50 20 110 
10 2 3 50+ 30 120 
10 3 0 40 20 100 
10 3 1 50 20 120 
10 3 2 60+ 30 130 
10 3 3 70+ 30 150 
10 4 0 50 30 120 
10 4 1 60 30 140 
10 4 2 70 30 160 
10 4 3 80+ 40 170 
10 5 0 60 30 150 
10 5 1 70 40 170 
10 5 2 90 40 190 
10 5 3 100 50 210 
10 6 0 80 40 180 
10 6 1 90 50 200 
10 6 2 110 50 230 
10 6 3 120 60 250 
10 6 4 140+ 70 270 
10 7 0 100 50 220 
10 7 1 120 60 250 
10 7 2 140 70 280 
10 7 3 150 80 310 
10 7 4 170+ 90 340 
10 8 0 130 60 280 
10 8 1 150 80 320 
10 8 2 170 90 360 
10 8 3 200 100 400 
10 8 4 220 120 440 Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
10 8 5 250+ 140 480 
10 9 0 170 90 380 
10 9 1 200 100 430 
10 9 2 230 120 490 
10 9 3 260 140 560 
10 9 4 300 160 640 
10 9 5 350 180 720 
10 9 6 400+ 210 820 
10 10 0 240 120 610 
10 10 1 290 150 750 
10 10 2 350 170 910 
10 10 3 400 200 1100 
10 10 4 500 300 1400 
10 10 5 700 300 1700 
10 10 6 900 400 2100 
10 10 7 1120 600 2700 
10 10 8 1160 800 3700 
10 10 9 2300 1100 6000 
10 10 10 2300 - - 
a Los resultados normales, obtenidos en un 95% de la s pruebas, no están seguidos por un símbolo más 
(+). Menos del 4% de los resultados de las pruebas  obtenidos están marcados por un símbolo más(+). 
Combinaciones de tubos positivos no encontrados en esta tabla se presentan en menos del 1% de las pruebas y si se presentaran con mayor frecuencia indican un error de  técnica o que el valor del número más 
probable se encuentra en el límite. El NMP de combinaciones que no aparecen en la tabla, se pueden obtener por extrapolación a la combinación cercana más elevada. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por  100 para expresarlos como NMP/100 g (mL). 
Tabla No. 4 Número más probable (NMP) para 1g de muestra cuando se usan 3 tubos con porciones de 
0,1, 0,01 y 0,001g. 
Tubos Positivos Tubos Positivos Tubos Positivos Tubos Positivos 
0,1 0,01 0,001 NMP 0,1 0,01 0,001 NMP 0,1 0,01 0,001 NMP 0,1 0,01 0,001 NMP
0 0 0 3 1 0 0 3,6 2 0 0 9,1 3 0 0 23 
0 0 1 3 1 0 1 7,2 2 0 1 14 3 0 1 39 
0 0 2 6 1 0 2 11 2 0 2 20 3 0 2 64 
0 0 3 9 1 0 3 15 2 0 3 26 3 0 3 95 
0 1 0 3 1 1 0 7,3 2 1 0 15 3 1 0 43 
0 1 1 6,1 1 1 1 11 2 1 1 20 3 1 1 75 
0 1 2 9,2 1 1 2 15 2 1 2 27 3 1 2 120 
0 1 3 12 1 1 3 19 2 1 3 34 3 1 3 160 
0 2 0 6,2 1 2 0 11 2 2 0 21 3 2 0 93 
0 2 1 9,3 1 2 1 15 2 2 1 28 3 2 1 150 
0 2 2 12 1 2 2 20 2 2 2 35 3 2 2 210 
0 2 3 16 1 2 3 24 2 2 3 42 3 2 3 290 
0 3 0 9,4 1 3 0 16 2 3 0 29 3 3 0 240 
0 3 1 13 1 3 1 20 2 3 1 36 3 3 1 460 
0 3 2 16 1 3 2 24 2 3 2 44 3 3 2 1100
0 3 3 19 1 3 3 29 2 3 3 53 3 3 3 1100      (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
Tabla No. 5 Número más probable (NMP) para 100 mL de muestra cuando se usan 5 porciones  en cada 
una de 3 diluciones con series geométricas. 
No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos No. de Tubos 
Positivos 
10 1 0,1  10 1 0,1  10 1 0,1  10 1 0,1  10 1 0,1  10 1 0,1  
mL mL mL NMP mL mL mL NMP mL mL mL NMP mL mL mL NMP mL mL mL NMP mL mL mL NMP 
0 0 0  1 0 0 2 2 0 0 4,5 3 0 0 7,8 4 0 0 13 5 0 0 23 
0 0 1 1,8 1 0 1 4 2 0 1 6,8 3 0 1 11 4 0 1 17 5 0 1 31 
0 0 2 3,6 1 0 2 6 2 0 2 9,1 3 0 2 13 4 0 2 21 5 0 2 43 
0 0 3 5,4 1 0 3 8 2 0 3 12 3 0 3 16 4 0 3 25 5 0 3 58 
0 0 4 7,2 1 0 4 10 2 0 4 14 3 0 4 20 4 0 4 30 5 0 4 76 
0 0 5 9,0 1 0 5 12 2 0 5 16 3 0 5 23 4 0 5 36 5 0 5 95 
0 1 0 1,8 1 1 0 4 2 1 0 6,8 3 1 0 11 4 1 0 17 5 1 0 33 
0 1 1 3,6 1 1 1 6,1 2 1 1 9,2 3 1 1 14 4 1 1 21 5 1 1 46 
0 1 2 5,5 1 1 2 8,1 2 1 2 12 3 1 2 17 4 1 2 26 5 1 2 64 
0 1 3 7,3 1 1 3 10 2 1 3 14 3 1 3 20 4 1 3 31 5 1 3 84 
0 1 4 9,1 1 1 4 12 2 1 4 17 3 1 4 23 4 1 4 35 5 1 4 110 
0 1 5 11 1 1 5 14 2 1 5 19 3 1 5 27 4 1 5 42 5 1 5 130 
0 2 0 3,7 1 2 0 6,1 2 2 0 9,3 3 2 0 14 4 2 0 22 5 2 0 49 
0 2 1 5,5 1 2 1 8,2 2 2 1 12 3 2 1 17 4 2 1 26 5 2 1 70 
0 2 2 7,4 1 2 2 10 2 2 2 14 3 2 2 20 4 2 2 32 5 2 2 95 
0 2 3 9,2 1 2 3 12 2 2 3 17 3 2 3 24 4 2 3 38 5 2 3 120 
0 2 4 11 1 2 4 15 2 2 4 19 3 2 4 27 4 2 4 44 5 2 4 150 
0 2 5 13 1 2 5 17 2 2 5 22 3 2 5 31 4 2 5 50 5 2 5 180 
0 3 0 5,6 1 3 0 8,3 2 3 0 12 3 3 0 17 4 3 0 27 5 3 0 79 
0 3 1 7,4 1 3 1 10 2 3 1 14 3 3 1 21 4 3 1 33 5 3 1 110 
0 3 2 9,3 1 3 2 13 2 3 2 17 3 3 2 24 4 3 2 39 5 3 2 140 
0 3 3 11 1 3 3 15 2 3 3 20 3 3 3 28 4 3 3 45 5 3 3 180 
0 3 4 13 1 3 4 17 2 3 4 22 3 3 4 31 4 3 4 52 5 3 4 210 
0 3 5 15 1 3 5 19 2 3 5 25 3 3 5 35 4 3 5 59 5 3 5 250 
0 4 0 7,5 1 4 0 11 2 4 0 15 3 4 0 21 4 4 0 34 5 4 0 130 
0 4 1 9,4 1 4 1 13 2 4 1 17 3 4 1 24 4 4 1 40 5 4 1 170 
0 4 2 11 1 4 2 15 2 4 2 20 3 4 2 28 4 4 2 47 5 4 2 220 
0 4 3 13 1 4 3 17 2 4 3 23 3 4 3 32 4 4 3 54 5 4 3 280 
0 4 4 15 1 4 4 19 2 4 4 25 3 4 4 36 4 4 4 62 5 4 4 350 
0 4 5 17 1 4 5 22 2 4 5 28 3 4 5 40 4 4 5 69 5 4 5 430 
0 5 0 9,4 1 5 0 13 2 5 0 17 3 5 0 25 4 5 0 41 5 5 0 240 
0 5 1 11 1 5 1 15 2 5 1 20 3 5 1 29 4 5 1 48 5 5 1 350 
0 5 2 13 1 5 2 17 2 5 2 23 3 5 2 32 4 5 2 56 5 5 2 540 
0 5 3 15 1 5 3 19 2 5 3 26 3 5 3 37 4 5 3 64 5 5 3 920 
0 5 4 17 1 5 4 22 2 5 4 29 3 5 4 41 4 5 4 72 5 5 4 1600 
0 5 5 19 1 5 5 24 2 5 5 32 3 5 5 45 4 5 5 81     
 
Tabla No. 6 Ejemplos para determinar el NMP estimado en series de tres tubos con 1g (mL) de  
muestra por tubo. 
 Cantidad de muestra (g o mL)aValores 
positivos 
reportados NMP estimado/g o mLb 
Ejemplo 0,10 ,001 0, 001 0,0001 0,00001   
A 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3 3-2-0 930 
B 3/3 3/3 3/3 2/3 0/3 3-2-0 9300 
C 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3 0-1-0 30 
D 3/3 3/3 2/3 1/3 1/3 3-2-2 2100 
E 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3-3-3 110000 
 
a Numerador/denominador = número de tubos positivos/número de tubos inoculados. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por  100 para expresarlos como NMP/100 g (mL). Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
Tabla No. 7 Ejemplos para determinar el NMP estimado en series de 5 tubos con 1 g (mL) de  muestra 
por tubo. 
 Cantidad de muestra (g o mL)aValores positivos NMP estimado/g o mLb 
Ejemplo 0,1, 0,01 0,001 0,0001 0,00001 reportados  
A 5/5 5/5 2/5 0/5 0/5 5-2-0 490 
B 5/5 5/5 5/5 2/5 0/5 5-2-0 4900 
C 0/5 0/5 1/5 0/5 0/5 0-1-0 20 
D 5/5 5/5 3/5 1/5 1/5 5-2-2 1400 
E 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5-5-5 160000 
 
a Numerador/denominador = número de tubos positivos/número de tubos inoculados. 
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por  100 para expresarlos como NMP/100 g (mL). 
B 7.6.3 Determinación de bacterias coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli  por la técnica de 
diluciones en tubo múltiple. 
B 7.6.3.1 Fundamento 
Este método se basa en la propiedad de los micr oorganismos coliformes para producir gas a partir de 
glucosa y fermentación de lactosa dentro de las 48 horas  de incubación a 35 0,5°C (coliformes) y 44,50,2°C 
(coliformes fecales y E. coli ). 
B 7.6.3.2 Equipo 
Además de los mencionados en el método Preparación y dilución de muestras de alimentos para análisis 
microbiológico, lo siguiente: 
B 7.6.3.2.1  Baño de agua con agitación continua cubierto y con termostato que evite variaciones mayores 
a 0,1°C. 
B 7.6.3.2.2  Termómetro calibrado y verificado 1/10 
B 7.6.3.2.3  Tubos de cultivo de 20x200 y de 16x160 mm con tapón de rosca 
B 7.6.3.2.4  Campanas de fermentación (tubos de Durham) 
B 7.6.3.2.5  Gradillas 
B 7.6.3.2.6  Asas bacteriológicas de 3 mm de diámetro 
B 7.6.3.2.7  Lámpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. 
B 7.6.3.2.8  Lentes protectores. 
B 7.6.3.3 Reactivos y medios de cultivo  
B 7.6.3.3.1 Medios de cultivo 
B 7.6.3.3.1.1  Caldo lauril 
Ingredientes Cantidad 
Bacto triptosa 20,0 g 
Bacto lactosa 5,0 g 
Fosfato potásico,  dibásico 2,75 g 
Fosfato potásico, monobásico 2,75 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Lauril sulfato de sodio 0,1 g 
Agua destilada 1000 mL       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
pH final: 6,8 0,2 a 25°C. 
Preparación: 
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada. 
Ajustar el pH. Distribuir en tubos de ensaye con campanas de Durham. 
Adicionar 10 mL de medio para cada tubo. 
Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Antes de abrir el autoclave, dejar bajar la temper atura a 75°C para que no queden burbujas en las 
campanas de Durham. 
Preparación del caldo lauril triptosa 
INOCULO 
(mL) CANTIDAD DE MEDIO 
POR TUBO (mL) VOLUMEN DE MEDIO 
MAS INOCULO (mL) CALDO LAURIL TRIPTOSA 
REQUERIDO g/L 
1 10 o más 11 o más 35,6 
10 10 20 71,2 
10 20 30 53,4 
20 10 30 106,8 
100 50 150 106,8 
100 35 135 137,1 
100 20 120 213,6 
 
B 7.6.3.3.1.2 Caldo EC ( E. coli ) 
Ingredientes Cantidad 
Bacto triptosa 20.0 g 
Bacto lactosa 5.0 g 
Bacto sales biliares No. 3 1.5 g 
Fosfato dipotásico 4.0 g 
Fosfato monopotásico 1.5 g 
Cloruro de sodio 5.0 g 
Agua destilada 1000 mL 
 
pH final: 6,9 0,2 a 25°C. 
Preparación: Disolver los ingredientes en un litro de agua destil ada y calentar ligeramente para que se disuelva por 
completo. 
Ajustar el pH. 
Distribuir en tubos de ensaye con campanas de Durham. Adicionar 10 mL de medio para cada tubo. 
Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C. 
Antes de abrir el autoclave, dejar bajar la temper atura a 75°C para evitar que queden burbujas en las 
campanas de Durham. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 7.6.3.3.1.3  Agar McConkey 
Ingredientes: Cantidad 
Proteasa peptona o polipeptona 3,0 g 
Peptona o gelizante 17,0 g 
Lactosa 10,0 g 
Sales biliares No. 3 1,5 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Rojo neutro 0,03 g 
Cristal violeta 0,001 g 
Agar 13,5 g 
Agua destilada 1000,0 mL 
 
pH final: 7,1 0,2 a 25°C 
Preparación: 
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada. Calentar hasta ebullición para disolver por completo. 
Ajustar el pH. 
Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 50-60°C y vaciar en cajas Petri. 
B 7.6.3.3.1.4  Agar eosina azul de metileno de Levin (EMB-L) 
Ingredientes: Cantidad 
Peptona 10,0 g 
Lactosa 10,0 g 
K2HPO 4 2,0 g 
Eosina Y 0,4 g 
Azul de metileno 0,065 g 
Agua destilada 1000 mL 
 
pH final: 7,1 0,2 
Disolver la peptona, el fosfato y el agar en un litro de agua. Calentar hasta ebullición para la disolución completa. 
Distribuir en porciones de 100 o 200 mL y esterilizar a no más de 121°C por 15 minutos. 
Fundir antes de su uso y adicionar a cada porción de 100 mL: a) 5 mL de solución de lactosa al 20% 
b) 2 mL de solución acuosa de eosina al 2% 
c) 4,3 mL de solución acuosa de azul de metileno al 0,15%. 
Cuando se use el producto deshidratado, disolver todo s los ingredientes de acuerdo con las instrucciones 
del fabricante. 
B 7.6.3.3.1.5  Caldo triptona al 1% (triptófano) 
Ingredientes Cantidad 
Triptona o tripticasa 10 g 
Agua destilada  1000 mL 
pH final: 6,9         (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
Disolver los ingredientes 
Distribuir en porciones de 5 mL en tubos de ensaye de 16 x 125 o 16 x 150 mm. 
Esterilizar a 121°C por 15 minutos. 
B 7.6.3.3.1.6  Caldo MR-VP 
Medio 1 
Ingredientes Cantidad 
Peptona tamponada 7 g 
Glucosa 5 g 
K2HPO 4 5 g 
Agua destilada 1000 mL 
 
pH final: 6.9 
Disolver los ingredientes con calentamiento suave si es necesario. Distribuir en volúmenes de 10 mL en tubos de ensaye de 16x150 mm. 
Esterilizar a 121°C por 15 minutos. 
B 7.6.3.3.1.7  Caldo citrato de Koser 
Ingredientes Cantidad 
NaNH 4HPO 4 •4H 2O 1,5 g 
KH2PO 4 (monobásico) 1,0 g 
MgSO 4 •7H 2O 0,2 g 
Citrato de sodio •2H 2O 3,0 g 
Agua destilada 1000 mL 
 
pH final: 6,7 0,2. Distribuir preferentemente en tubos de ensaye con tapa de rosca. 
Esterilizar a 121°C por 15 minutos. 
Esta formulación se recomienda en los Métodos de Análisis Oficial de AOAC y en los Métodos Estándares 
para el Análisis de Agua y Aguas de Desecho (APHA). Este difiere de la composición del medio deshidratado 
disponible comercialmente y es recomendable su uso. 
B 7.6.3.3.2 Reactivos. 
B 7.6.3.3.2.1  Reactivo de Kovacs 
Ingredientes: Cantidad 
p-imetilaminobenzaldehído 5 g 
Alcohol amílico (normal) 75 mL 
HCI concentrado 25 mL 
 
Disolver el p-Dimetilaminobenzaldehído en alcohol amílico normal. 
Adicionar lentamente el HCl. Almacenar a 4°C. 
Para la prueba de indol Adicionar 0,2-0,3 mL del reactivo a 5 mL del cultivo de bacteria en caldo triptona. 
Se considera una prueba positiva cuando desarrolla un color rojo en la superficie del tubo. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 7.6.3.3.2.2  Reactivo de Voges-Proskauer (VP) 
Solución 1 
Ingredientes: Cantidad 
alfa-naftol 5 g 
Alcohol absoluto 100 g 
 
Solución 2 
Ingredientes Cantidad 
Hidróxido de potasio 40 g 
Agua destilada para llevar a 100 mL 
 
Prueba de Voges-Proskauer (VP). 
Transferir 1 mL del cultivo a probar con 48 horas de incubación a un tubo de ensaye. Adicionar 0,6 mL de la solución 1 y 0,2 mL de la solución 2. 
Agitar después de la adición de cada solución. 
Para intensificar y acelerar la reacción adicionar unos cuantos cristales de creatina y mezclar. Dejar a temperatura ambiente. 
Leer resultados después de 4 horas de adicionar los reactivos. 
El desarrollo de una coloración rosa es una prueba positiva. B 7.6.3.3.2.3  Reactivos para la coloración de Gram 
Cristal violeta 
Solución A Cantidad 
Cristal violeta (colorante 90%) 2 g 
Etanol 95% 20 mL 
 
Solución B Cantidad 
Oxalato de amonio 8.0 g 
Agua destilada 80 mL 
 
Indicador rojo de metilo (R44) 
Mezclar la solución A y B. Almacenar por 24 horas Filtrar a través de un papel filtro áspero. 
B 7.6.3.3.2.4  lodo de Gram 
Ingredientes: Cantidad 
lodo 1g 
Ioduro de potasio (Kl) 2 g 
Agua destilada 300 mL 
 
Colocar el Kl en un mortero. 
Adicionar el yodo.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
Triturar con el pistilo por 5-10 segundos. 
Adicionar 1 mL de agua y triturar Adicionar 5 mL de agua y triturar Adicionar 10 mL de agua y triturar Vaciar esta solución en una botella de reactivo. Enjuagar el mortero y el pistilo con la cantidad de agua necesaria para completar 300 mL. B 7.6.3.3.2.5  Colorante de contraste (solución concentrada)  
Ingredientes: Cantidad 
Safranina O 2,5 g 
Etanol al 95% 100 mL 
 
Solución de trabajo: Adicionar 10 mL de la solución concentrada a 90 mL de agua destilada. B 7.6.3.3.2.6  Procedimiento para la tinción de Gram 
Fijar con calor moderado los frotis de la muestra a teñir. Adicionar la solución de cristal violeta al frotis. Dejar actuar por un minuto. Lavar con agua corriente y escurrir. Aplicar la solución de yodo por un minuto. Lavar con agua corriente y escurrir. Decolorar con etanol al 95% hasta que la coloración azul deje de fluir (aproximadamente 30 segundos). Inmediatamente después enjuagar con agua corriente. Escurrir. Aplicar el colorante de contrast e (safranina) por 30 segundos. 
Enjuagar, escurrir y secar al aire. Examinar al microscopio. B 7.6.3.3.2.7  Medio EC-MUG 
Preparar el caldo EC y adicionar 50 mg de 4-metilumb elliferyl-beta-D-glucurónido (MUG) por litro antes de 
esterilizar (121°C por 15 minutos). El cal do EC-MUG está comercialmente disponible. 
B 7.6.3.4 Procedimiento 
B 7.6.3.4.1 Agua y hielo 
B 7.6.3.4.1.1 Prueba presuntiva 
B 7.6.3.4.1.1.1 Agitar la muestra y transferir volúmenes de 10 mL a cada uno de 5 tubos con 20 mL de 
caldo lauril sulfato triptosa de doble concentración, 5 tubos con 1 mL y 5 tubos con 0,1 mL de caldo lauril 
sulfato triptosa de concentración sencilla o las siguientes  porciones: 10 tubos con 10 mL de muestra; 5 tubos 
con 20 mL de muestra o una porción de 100 mL, consulta r la tabla del inciso 2 en la preparación del “caldo 
lauril triptosa” para la concentración de caldo lauril tr iptosa requerido. Los tubos deben contener una campana 
de fermentación (Durham). 
B 7.6.3.4.1.1.2 Incubar los tubos a 35 0,5°C. Examinar los tubos a las 24 horas y observar si hay 
formación de gas; si la formación de gas no se observa, incubar 24 horas más. 
B 7.6.3.4.1.2 Prueba confirmativa 
B 7.6.3.4.1.2.1 De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una asada y sembrar en un número 
igual de tubos con medio de confirmación, para la dete rminación de bacterias coliformes referirse al método 
de Determinación de bacterias coliformes. Técnica del Número más probable, para la determinación de 
bacterias coliformes fecales, sembrar en caldo EC . Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli  
como control positivo y una de Enterobacter  aerogenes  como control negativo e incubar con las muestras. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 7.6.3.4.1.2.2 Para la determinación de coliformes fecales incubar los tubos a 44,5 0,2°C en baño de 
agua con agitación durante 24 horas, observar si hay formación de gas; si la formación de gas no se observa, continuar la incubación 24 horas más, hacer la lectura.  Utilizar estos resultados para calcular el número más 
probable (NMP) de coliformes fecales. 
B 7.6.3.4.1.3 Prueba confirmativa para Escherichia coli  (por identificación bioquímica) 
B 7.6.3.4.1.3.1 Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos y sembrar por estría cruzada en agar 
EMB-L para su aislamiento. 
B 7.6.3.4.1.3.2 Incubar las placas invertidas a 35°C por 18-24 horas. 
B 7.6.3.4.1.3.3 Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfología colonial: Colonias con 
centro negro, planas con o sin brillo metálico y sembrarl as en agar cuenta estándar para realizar las pruebas 
de morfología microscópica y pruebas bioquímicas . Incubar las placas a 35°C por 18-24 horas. 
B 7.6.3.4.1.3.4  Si no hay colonias con morfología típica, probar una o más colonias lo más parecido E. coli  
de cada placa. 
B 7.6.3.4.1.3.5  Hacer un frotis y teñirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos cortos  o 
cocobacilos Gram-negativos. 
B 7.6.3.4.1.3.6  Pruebas bioquímicas Indol, Rojo de metilo, Voges Proskauer, Citrato (IMViC). 
B 7.6.3.4.1.3.6 .1 Producción  de indol 
Inocular un tubo en caldo triptona e incubarlo a 35°C por 24 horas. Adicionar 0,2-0,3 mL de reactivo de 
Kovacs. La presencia de una coloración en la superfi cie del tubo se considera una prueba positiva. 
B 7.6.3.4.1.3.6.2  Voges-Proskauer (VP) 
Inocular un tubo con caldo MR-VP e incubar a 35°C por 48 horas. Transferir 1 mL a un tubo de 13X100 
mm. Adicionar 0,6 mL de solución de alfa naftol y 0,2 mL de hidróxido de potasio al 40% y agitar. Se considera 
una prueba positiva cuando se desarrolla un color rosa. 
B 7.6.3.4.1.3.6.3  Rojo de metilo 
Inocular un tubo adicional con caldo MR-VP e incubar a 35°C por 48 horas. Adicionar 5 gotas de solución 
de rojo de metilo. Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color amarillo es una prueba negativa. 
B 7.6.3.4.1.3.6.4  Citrato 
Inocular un tubo con caldo citrato de Koser un inóculo ligero para evitar turbiedad en el tubo. Incubar a 
35°C por 96 horas. El desarrollo del cultivo que se obser va con la turbiedad del medio, se considera una 
prueba positiva. 
B 7.6.3.4.1.3.6.5  Interpretación  de resultados 
Todos los cultivos que: 1. Fermenten  la lactosa con producción de gas dentro de las 48 horas a 35°C;  2. 
Sean bacilos o cocobacilos Gram negativos no esporulados  y 3. Se obtenga las siguientes combinaciones 
para el IMVIC: 
Biotipo 1--, o Biotipo 2 ---, son consideradas como E. coli. Calcular el NMP de E. coli  basada en la 
proporción de los tubos positivos de caldo EC. 
B 7.6.3.4.1.4 Prueba confirmativa para Escherichia  coli (por el método de EC-MUG) 
B 7.6.3.4.1.4.1 Fundamento. 
Alrededor del 94% de las cepas de E. coli  incluso las cepas no productoras de gas producen la enzima 
beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato es pecífico 4-metilumbelliferyl-beta-D-glucurónido (MUG) 
en 4-metilumbelliferona (MU), que al ser expuesto a una fuente de luz ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) produce una fluorescencia azul, fácil de observar. Cuando el MUG es incorporado al caldo EC se puede identificar E. coli . 
B 7.6.3.4.1.4.2 Prueba presuntiva. 
Seguir lo indicado en el punto B.7.6.3.4.1       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 7.6.3.4.1.4.3 Prueba confirmativa  
De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una asada y sembrar en un número igual de tubos con 
medio de confirmación EC-MUG. Inocular dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli  como control 
positivo y K. pneumoniae  como control negativo. Incubar a estos tubos con uno adicional de caldo EC-MUG sin 
inocular a 44,5 0,5°C en baño de agua con los tubos de las muestras durante 24 horas, observar si hay 
formación de gas; si la formación de gas no se observa continuar la incubación 24 horas más. Irradiar los 
tubos con una fuente de luz UV, observar fluorescencia y hacer la lectura. Utiliz ar estos resultados para 
calcular el número má s probable (NMP) de E. coli . 
B 7.6.3.4.2 Alimentos 
B 7.6.3.4.2.1 Prueba presuntiva. 
Preparar la muestra como se indica en el método “ Preparación y dilución de muestras de alimentos para 
análisis microbiológico;”  y de acuerdo con el tipo de producto, utilizar las diluciones apropiadas, según se 
indica en el procedimiento de la densidad microbiana por  la técnica del número más probable. Utilizar como 
medio de enriquecimiento caldo lauril triptosa y continuar como en el  punto B.7.6.3.4.1.1 
B 7.6.3.4.2.2 Prueba confirmativa. 
Continuar como en el p unto B.7.6.3.4.1. 2 y confirmar la presencia de Escherichia coli  en por lo menos el 
10% de las pruebas con resultados positivos a coliformes fecales por cultivo en placas de agar McConkey a 
partir de los tubos que demostraron la presencia de gas en la prueba confirmativa. Incubar las placas a 35 
0,5°C durante 24 horas, observar las colonias típicas fermentadoras de color rojo rodeadas de un halo opaco 
de precipitación de sales biliares. Seleccionar 1 o más colonias aisladas y pasar a tubos de fermentación con 
caldo lauril triptosa, continuar como se indica en B.7.6. 3.4.1.2. Hacer tinción de Gram para observación de la 
morfología microscópica. 
B 7.6.3.5 Interpretación de resultados. 
La formación de gas en el tubo de fermentación secundario dentro de las 48 horas y la demostración de 
bacilos Gram (-) no esporulados confir ma un resultado positivo de la prueba demostrándose la presencia del 
grupo coliforme. 
B 7.6.3.6 Cálculos 
Calcular la densidad microbiana en número más probable conforme al procedimiento señalado 
anteriormente, para estimar la població n de bacterias coliformes y bacterias coliformes fecales de acuerdo con 
las diluciones empleadas y expresar en NMP/g o mL para alimentos y NMP/100 mL para agua. En el caso de 
usar volúmenes de 20 mL de muestras de agua en 5 tu bos o 10 mL de muestras de agua en 10 tubos, utilizar 
las siguientes tablas: 
TABLA 1. Indice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados 
positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con 20 mL de muestra de agua o hielo. 
No. de Tubos  95% de Límite de Confianza 
(aproximado) 
Positivos NMP/100 mL Inferior Superior 
0 1,1 0 3,0 
1 1,1 0,05 6,3 
2 2,6 0,3 9,6 
3 4,6 0,8 14,7 
4 8,0 1,7 26,4 
5 8,0 4,0 Infinito 
 
TABLA 2. Indice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados 
positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con 10 mL de muestra de agua o hielo. 
No. de Tubos 
Positivos NMP/100 mL 95% de Límite de Confianza (aproximado) 
Inferior Superior 
0 1,1 0,0 3,0 
1 1,1 0,03 5,9 Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
2 2,2 0,26 8,1 
3 3,6 0,69 10,6 
4 5,1 1,3 13,4 
5 6,9 2,1 16,8 
6 9,2 3,1 21,1 
7 12,0 4,3 27,1 
8 16,1 5,9 36,8 
9 23,0 8,1 59,5 
10 23,0 13,5 Infinito 
 
B 7.7 Técnicas y procedimientos  para la investigación de V ibrio cholerae  
B 7.7.1  Material y equipo 
B 7.7.1.1  Licuadora y vasos de licuadora estériles. 
B 7.7.1.2  Frascos de vidrio de boca ancha tipo tarro de 500 mL de capacidad con tapa de rosca. 
B 7.7.1.3  Varilla de vidrio de 3 mm de diámetro y 20 cm de largo, con un doblez terminal en ángulo recto 
de 4 cm. 
B 7.7.1.4  Balanza granataria de 2000 g de capacidad y 0,2 g de sensibilidad. 
B 7.7.1.5  Balanza analítica de 120 g de capacidad y 5 mg de sensibilidad. 
B 7.7.1.6  Incubadoras de 39-40°C. 
B 7.7.1.7  Baño de agua de 42 ± 0,2°C y 35-37°C. 
B 7.7.1.8  Cucharas estériles u otros instrumentos apr opiados para transferir muestras de alimentos. 
B 7.7.1.9  Cajas Petri estériles de 15 x 100 mm de plástico. 
B 7.7.1.10  Pipetas estériles de 1 mL con graduación de 0,01 mL, de 5 y 10 mL con graduación de 0,1 mL. 
B 7.7.1.11  Asas bacteriológicas de 3 mm de diámetro de nicromel o platino. 
B 7.7.1.12  Tubos de cultivo o de ensayo de 16 x 150 mm y 20 x 150 mm. 
B 7.7.1.13  Tubos para bioquímicas o ensaye de 10 x 75 mm o 13 x 100 mm. 
B 7.7.1.14  Tijeras y pinzas estériles. 
B 7.7.1.15  Lámpara (para observar reacciones serológicas). 
B 7.7.1.16  Mecheros. 
B 7.7.1.17  Papel pH (rango 1-14) con un máximo de graduación de 0,4 unidades de pH por cambio  de 
color. 
B 7.7.1.18  Potenciómetro. 
B 7.7.1.19  Bolsas de polietileno de 28 x 37 cm con tapa resellable. 
B 7.7.1.20  Aparato de filtración y membranas de 0,45 micras. 
B 7.7.2 Medios de cultivo 
B 7.7.2.1  Agua Peptonada Alcalina (APW) 
Ingredientes Cantidad 
Peptona 10 g 
Cloruro de Sodio 10 g 
Agua destilada 1 000 mL 
 
Disolver los ingredientes. Ajustar el pH de tal forma  que después de esterilizar éste sea de 8,5 ± 0,2. 
Esterilizar en autoclave 10 minutos a 121°C.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 7.7.2.2  Agar Tiosulfato, Citrato, Sale s Biliares y Sacarosa (TCBS) 
Ingredientes Cantidad 
Extracto de levadura 5 g 
Proteosa peptona 10 g 
Sacarosa 20 g 
Tiosulfato de sodio·5H 2O 10 g 
Citrato de sodio·2H 2O 10 g 
Sales biliares 3 g 
Bilis de buey 5 g 
Cloruro de sodio 10 g 
Citrato férrico 1 g 
Azul de bromotimol 40 mg 
Azul de timol 40 mg 
Agar 15 g 
Agua destilada 1 000 mL 
 
Preparar en un matraz por lo menos tres veces más gr ande que el volumen requerido de medio. Adicionar 
los ingredientes en agua destilada tibia y calentar c on agitación constante hasta ebullición e inmediatamente 
retirar del calor. No esterilizar. Enfriar a 50°C y colo car en cajas de Petri. Dejar secar las placas de 37-45°C 
antes de usar. 
B 7.7.2.3  Agar modificado con Celobiosa, Polimixina B y Colistina (mCPC) 
SOLUCION 1 Cantidad 
Peptona 10 g 
Extracto de carne 5 g 
Cloruro de sodio 20 g 
Solución Stock de colorante 1 000 1 mL 
Agar 15 g 
Agua destilada 900 mL 
 
Ajustar el pH a 7,6. Hierva hasta que se disuelva el Agar. 
Esterilizar por autoclave 15 minutos a 121°C. Enfríe de 48-55°C. 
SOLUCION STOCK DE 
COLORANTES 1 000 X : Cantidad 
Azul de Bromotimol 4 g 
Rojo de cresol 4 g 
Etanol al 95% 100 mL 
 
Para obtener un color firme del medio usar una solución colorante stock en lugar de estar pesando 
repetidamente los colorantes en polvo. Disuelva el co lorante en etanol hasta obtener una solución al 4% 
(peso/volumen). Agregue 1 mL de esta solución a cada litro de agar mCPC, la cual tendrá al final 40 mg de Azul de Bromotimol y 40 mg de Rojo Cresol por litro. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
SOLUCION 2: Cantidad 
Celobiosa 10 g 
Colistina 400 000 Ul 
Polimixina B 100 000 UI 
Agua destilada 100 mL 
 
Disuelva la celobiosa por calentami ento en agua destilada. Enfríe y agregue los antibióticos. Esterilice por 
filtración, agregue la solución 2 a la solución 1 mezcle y distribuya en cajas Petri. 
B 7.7.2.4  Agar T 1N1 (Agar Triptona y Sal) 
Ingredientes Cantidad 
Triptona o tripticasa 10 g 
Cloruro de sodio 10 g 
Agar 20 g 
Agua destilada 1 000 mL 
 
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolución del  agar, si lo desea inclinado, distribuya en tubos. 
Esterilice en autoclave 15 minutos a 121°C. Deje solidi ficar los tubos inclinados, para placas enfríe el medio 
de 45-50°C y distribuya en cajas Petri estériles. 
B 7.7.2.5  Agar Gelatina (GA) 
Ingredientes Cantidad 
Peptona 4 g 
Extracto de levadura 1 g 
Gelatina 15 g 
Agar 15 g 
Agua destilada 1 000 mL 
 
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolución de  la gelatina y el agar, ajuste el pH a 7,2 ± 0.2. 
Esterilice en autoclave 15 minutos a 121°C. Enfríe de 45-50°C y distribuya en cajas Petri estériles. 
B 7.7.2.6  Agar Gelatina con Sal (GS) 
Preparar agar gelatina (GA), pero adicionando 30 g de Cloruro de Sodio por cada litro. Suspenda los 
ingredientes y hierva hasta disolver la gelatina y el agar. Ajuste el pH de 7,2 ± 0,2.  Esterilice en autoclave 15 
minutos a 121°C. Enfríe de 45-50°C, coloque en cajas Petr i. Si es necesario para inhibir la diseminación de 
Vibrio spp. tal como V. alginolyticus , use de 25-30 g de agar por litro. 
B 7.7.2.7 Caldo Glucosa de Hugh-Leifson 
Ingredientes Cantidad 
Peptona 2 g 
Extracto de levadura 0,5 g 
Cloruro de Sodio 20 g 
Dextrosa 10 g 
Púrpura de Bromocresol 0,015 g 
Agar 3 g 
Agua destilada 1 000 mL 
 
Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolver el  agar. Ajuste el pH a 7,4 ± 0,2. Coloque en tubos y 
esterilice en autoclave 15 minutos a 121°C.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 7.7.2.8 Medio Base de Descarboxilasa (Arginina, Lisina y Ornitina) 
BASE Cantidad 
Peptona 5 g 
Extracto de levadura 3 g 
Dextrosa (D-glucosa) 1 g 
Púrpura de Bromocresol 0.02 g 
Agua destilada 1 000 mL 
 
Para caldo de Arginina, Lisina y Ornitina, adicione 5 g de L-aminoácido a 1 litro de base. Como control, 
use base sin suplemento (aminoácido). Para Vibrio  spp. halofílicos, adicionar 15 g de Cloruro de Sodio por 
litro. Ajuste el pH de tal manera que después de la es terilización sea de 6,5 ± 0,2. Distribuya en tubos  y 
esterilice en autoclave 10 minutos a 121°C. 
B 7.7.2.9  Caldo Triptona y Caldos Triptona Sal T 1N0,T1N1,T1N3 
T1N6,T1N8 y T 1N10 
Ingredientes Cantidad 
Triptona o Tripticasa 10 g 
Cloruro de Sodio 0, 10, 30, 60, 80, ó 100 g 
Agua destilada 1 000 mL 
 
Disuelva los ingredientes en agua destilada, para T1N0 no agregue Cloruro de Sodio, para T1N1 use  10 g 
de Cloruro de Sodio (1% w/v concentración de Cloruro de Sodio); así respectivamente. Para T1N3 usar 30 g 
de NaCl por litro (3% w/v concentración de Cloruro de Sodio) Distribuya en tubos de tapón de rosca de 16 x 
150 mm, tape los tubos. Esterilice en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Ajuste el pH a 7,2 ± 0,2. 
B 7.7.2.10 Caldo Soya Tripticasa (TSB) 
Ingredientes Cantidad 
Peptona de Tripticasa (Triptona) 17 g 
Peptona de fitona (Soytona) 3 g 
Cloruro de Sodio 5 g 
Fosfato dipotásico 2,5 g 
Dextrosa 2,5 g 
Agua destilada 1 000 mL 
 
Suspenda los ingredientes en agua destilada y calient e hasta disolución. Distribuya 225 mL en matraces 
de 500 mL o tubos. Esterilice en autoclave durante 15 mi nutos a 121°C. El pH final debe ser de 7,2 ± 0,2. 
B 7.7.2.11 Agar Soya Tripticasa (TSA) 
Ingredientes Cantidad 
Peptona de fitona (Soytona) 5 g 
Peptona tripticasa (Triptona) 15 g 
Cloruro de Sodio 5 g 
Agar 15 g 
Agua destilada 1 000 mL 
 
Suspenda los ingredientes en agua destilada y hierva  durante un minuto hasta disolución del agar. Para 
Vibrio spp. halofílicos, agregar 15 g de Cloruro de Sodio. Distribuya dentro de tubos o matraces. Esterilice en 
autoclave durante 15 minutos a 121°C. Deje solidificar los tubos inclinados o deje enfriar de 45-50°C y 
distribuya en cajas Petri. El pH final debe ser de 7,3 ± 0,2. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 7.7.2.12  Agar de Hierro Kligler (KIA) 
Ingredientes Cantidad 
Peptona polipeptona 20 g 
Dextrosa 1 g 
Citrato férrico amoniacal 0.5 g 
Lactosa 20 g 
Cloruro de Sodio 5 g 
Tiosulfito de sodio 0.5 g 
Rojo de fenol 0.025 g 
Agar 15 g 
Agua destilada 1000 mL 
 
Suspender los ingredientes y hervir hasta disolu ción del agar. Distribuir en tubos de tapón de rosca. 
Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Dejar solidificar los tubos inclinados. Ajustar el pH de 7,4 
± 0,2. 
B 7.7.2.13 Agar Arginina Glucosa Inclinado (AGS) 
Ingredientes Cantidad 
Peptona 5 g 
Extracto de levadura 3 g 
Tristona 10 g 
Cloruro de Sodio 20 g 
Glucosa 1 g 
L-Arginina (hidrocloruro) 5 g 
Citrato férrico amónico 0,5 g 
Tiosulfato de Sodio 0,3 g 
Púrpura de Bromocresol 0,2 g 
Agar 13,5 g 
Agua destilada 1 000 mL 
 
Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir ha sta disolución del agar, y distribuir en cantidades 
de 5 mL a tubos de 13 x 100 mm. Ajustar el pH de 6,8 a 7,0. Esterilizar en autoc lave de 10 a 12 minutos a 
121°C. Deje solidificar el medio inclinado. 
B 7.7.2.14 Agar Triple Azúcar y Hierro (TSI) 
Ingredientes Cantidad 
Polipeptona 20 g 
Cloruro de Sodio 5 g 
Lactosa 10 g 
Sacarosa 10 g 
Glucosa 1 g 
Sulfato ferroso amónico 0,2 g 
Tiosulfato de Sodio 0,2 g 
Rojo de fenol 0,025 g 
Agar 13 g 
Agua destilada 1 000 mL 
 
Disolver los ingredientes en agua destilada. Mezclar bien y calentar a ebullició n, agitando ocasionalmente 
hasta completa disolución. Enfríar a 60°C y ajuste el pH de 7,3 ± 0,1.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 7.7.2.15  Agar de Hierro y Lisina (LIA) 
Ingredientes Cantidad 
Peptona o gelisato 5,0 g 
Extracto de levadura 3,0 g 
Glucosa 1,0 g 
L-Lisina 10,0 g 
Citrato férrico amónico 0,5 g 
Tiosulfato de sodio 0,04 g 
Púrpura de bromocresol 0,02 g 
Agar 15,0 g 
Agua destilada 1 000 mL 
 
Disolver los ingredientes en el agua destilada y me zclar bien; calentar hasta ebullición con agitación 
frecuente hasta conseguir la disolución completa. Esteri lizar en autoclave 12 minutos a 121°C. Enfriar de  50-
60°C y ajustar el pH de 6,7 ± 0,1. Distribuir en volúme nes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm. Los tubos se 
enfrían en posición inclinada, de tal modo que se obteng an columnas de medio de 3 cm y una parte inclinada 
de 2 cm. 
B 7.7.2.16  Caldo Rojo de Metilo y Vogues Proskauer(RM-VP) 
Ingredientes Cantidad 
Peptona 7 g 
Glucosa 5 g 
Fosfato dipotásico 5 g 
Agua destilada 1000 mL 
 
Disolver los ingredientes en 800 mL de agua tibia. Para Vibrio spp  halofílicos, agregar 15 g más de Cloruro 
de Sodio (para una concentración final del 2%). Filtrar, enfríar a 20°C y diluir a 1 litro. Distribuya en tubos. 
Esterilizar en autoclaves durante 12 - 15 minuto s a 121°C. Ajustar el pH de 6,9 +/- 0,2. 
B 7.7.2.17  Medio para prueba de movilidad (Semisólida) 
Ingredientes Cantidad 
Peptona 10 g 
Extracto de carne 3 g 
Cloruro de Sodio 5 g 
Agar 4 g 
Agua destilada 1000 mL 
 
Calentar con agitación y hervir de 1 a 2 minutos hasta disolución del agar. Para Vibrio spp  halofílicos 
agregar 15 g más de Cloruro de Sodio (para una concent ración final del 2%). Distribuir en tubos con tapón de 
rosca. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121°C. Ajustar el pH de 7,4 ± 0,2. 
B 7.7.3 Soluciones y reactivos para pruebas bioquímicas 
B 7.7.3.1  Prueba de Rojo de Metilo. 
Ingredientes Cantidad 
Rojo de metilo 0,1 g 
Alcohol etílico 300 mL 
Agua destilada 200 mL 
 
Disolver el Rojo de Metilo en el alcohol y diluir con el  agua destilada, para llevar a cabo la prueba, añadir 5 
gotas de la solución a 5 mL del cultivo problema. 
Resultados: Un color rojo demuestra un pH menor a 4,5 y la prueba es Positiva. Un color amarillo se 
reporta como prueba Negativa. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 7.7.3.2  Prueba de Vogues-Proskauer. 
Esta prueba es para comprobar la presencia del Diacetilo. 
Soluciones Cantidad 
Alfa Naftol 5 g 
Alcohol Etílico absoluto 100 mL 
 
Añadir 0,6 mL de la solución de Alfa Naftol y 0,2 mL de una solución acuosa al 40% de KOH a 1 mL de 
cultivo. 
Resultados: El desarrollo de una coloración roja en 15 minutos constituye una reacción POSITIVA. B 7.7.3.3  Prueba de Oxidasa. 
Soluciones Cantidad 
N,N,N,N-Tetrametil-p-Fenilendiamino 0,5 g 
Agua destilada 100 mL 
 
Conservar en frasco oscuro a 5-10°C. El reactivo se conserva durante 14 días. 
Sembrar en un tubo de base de gelosa para sangre. Incubar 18 horas a 35°C. Agregar 0,3 mL de reactivo. Resultado: La reacción positiva se observa por la producción de un color azul en un minuto. 
B 7.7.3.4  Reacción de Indol. 
REACTIVO DE KOVAC 
Soluciones Cantidad 
p-dimetilaminobenzaldehído 5.0 g 
Alcohol amílico o alcohol isoamílico 750 mL 
Acido clorhídrico concentrado 25 mL 
 
Disolver el p-dimetilaminobenzaldehído en el alcohol amílico y agregar el ácido clorhídrico lentamente, 
gota a gota y agitando. Debe conservarse en frasco ámba r con tapón esmerilado; el color del reactivo va del 
amarillo al café claro. Se debe conservar a 4°C. 
Sembrar un tubo con 5 mL de caldo triptona. Incubar 48 horas a 35°C. Agregar de 0,2 a 0,3 mL del 
reactivo. El desarrollo de un color intenso, constituye una prueba Positiva para indol. 
B 7.7.4 Toma de muestra 
La toma de muestra para análisis microbiológicos,  se deberá hacer en condiciones asépticas y en 
recipientes estériles. 
B 7.7.5  Preparación de la muestra . 
B 7.7.5.1 Líquidos. 
De cada muestra tomar 25 mL e introducirlas en un matraz que contenga 225 mL de agua peptonada 
alcalina (APW) y homogeneizar por 2 min. Esta es la dilu ción 1:10. De esta dilución preparar la dilución 1:100 
y 1:1000, en 9 o 90 mL de agua peptonada alcalina. 
Incubar las tres diluciones de 35 a 37°C. 
B 7.7.5.2 Sólidos.  
De cada muestra pesar 50 g y colocar en un matraz que contenga 450 mL de agua peptonada alcalina 
(APW). Esto hace la dilución 1:10. Pr eparar dos series de diluciones de 1:100 y 1:1000. Por lo tanto tenemos 
dos series de 3 diluciones. Incubar una serie de 35 a 37°C y la otra a 42°C.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 7.7.6  Resembrar 
Después de la incubación, y sin agitar, transferir el inóculo de la película (crecimiento superficial) con un 
asa de 3-5 mm de diámetro a una placa por lo menos, de cada uno de los medios de cultivo selectivos: Agar 
con tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa (TC BS) o al agar modificado con celobiosa, polimixina B y 
colistina (mCPC), la polimixina inhibe al biotipo Clásico de V. cholerae . Incubar el agar TCBS durante 18 a 24 
horas de 35-37°C y el agar mCPC durante 18 a 24 horas de 39-40°C. 
B 7.7.6.1  Morfología colonial. 
Examinar las placas a fin de determinar si se present an las características coloni ales que a continuación 
se describen, seleccionar por lo menos 3 colonias sos pechosas de cada placa y aplicarlas con estría cruzada 
para aislar en agar T 1N1 o en agar soya tripticasa con sal (al 2% de concentración de NaCl) e incubar durante 
12-18 horas a 35-37°C. Es necesario hacer un cultivo en  un medio no selectivo a fin de garantizar la pureza 
de las colonias, antes de las pruebas bioquímicas, se pu ede inocular a los agares gelatina (GA) y gelatina sal 
(GS) en el segundo día. Los resultados  serán confiables si las placas de  aislamiento muestran colonias puras. 
B 7.7.6.1.1  Agar TCBS. Las colonias de V. cholerae  (El Tor y Clásico) son grandes, lisas, amarillas 
(positivas para la fermentación de la sacarosa) y li geramente achatadas, con el centro opaco y los bordes 
translúcidos. 
Nota: Las especies de Vibrio  no producen colonias pequeñas de color crema en agar TCBS. Las colonias 
de V. mimicus , que están estrechamente relacionadas con la especie anterior, son verdes (sacarosa 
negativas). La mayoría de las demás especies de Vibrio  crecen en agar TCBS y producen colonias amarillas  
y verdes. 
B 7.7.6.1.2  Agar mCPC . Las colonias de V. cholerae  El Tor son púrpuras (negativas para la fermentación 
de la celobiosa). El V. vulnificus  produce colonias amarillas achata das, con el centro opaco y los bordes 
translúcidos. La mayoría de las demás especies de Vibrio  no crecen fácilmente en agar mCPC. 
B 7.7.6.2 Diferenciación. 
Diferenciación de los vibrios sospechosos de los microorganismos que no son vibrios. 
B 7.7.6.2.1  TSI,KIA y agar inclinado de Arginina y Glucos a (AGS). Inocular las colonias individuales en 
medios de cultivo TSI (Agar de Triple Azúcar y Hierro), KI A (Agar de Hierro Kliger) y AGS, picar y estriar en el 
agar inclinado. Incubar los tubos inoculados, con el  tapón no muy apretado, durante 18 a 24 horas  de 35-
37°C. Se recomiendan estos medios porque las reacci ones permiten efectuar u na diferenciación presuntiva 
entre la mayoría de las especies de Vibrio , Aeromonas , Plesiomonas,  Shigella  y otras bacterias. 
B 7.7.6.2.2  Caldo triptona al 3% de NaCl (T 1N3). Inocular las colonias en los caldos T 1N0 y T 1N3 e incubar 
durante 18 a 24 horas de 35-37°C. El V. cholerae  y el V. mimicus  crecerán en T 1N0 y T 1N3. Algunas especies 
de bacterias que no son vibrios y que presentan reacciones similares a las de V. cholerae  en medios de TSI y 
LIA no crecen en T 1N3. La mayoría de las especies Vibrio  spp, incluyen algunos V. cholerae  No. 01, crecerán 
en T 1N3 únicamente de la familia Vibrionaceae crece solamente en T 1N3. 
B 7.7.6.2.3  Una alternativa consiste en usar agar gelati na (GA) y agar gelatina con 3% de NaCl (GS) para 
determinar la tolerancia de los cultivos puros a la sal.  Dividir las placas en ocho sectores, inocular una línea 
recta en el centro de un sector de las placas, tanto de GA como de GS con cada cultivo puro. Incubar durante 
18 a 24 horas de 35 - 37°C. El V. cholerae  y el V. mimicus  crecerán. El Vibrio spp halofílico crecerá en ambas 
placas, porque ellos no requieren de sal. Sólo en la placa con GS. Para leer la reacción de la gelatinasa 
sostener la placa sobre una superfic ie negra, observará un halo opaco alrededor de la colonia de los 
microorganismos gelatinasa positivos. 
B 7.7.6.2.4  Caldo glucosa de Hugh-Leifson. Inocular colonias individuales en tubos duplicados con caldo 
de glucosa de Hugh-Leifson. Recubrir un tubo con una ca pa de aceite mineral estéril o vapor líquido (50% de 
petrolato y 50% de parafina) unos dos centímetros de gr ueso. Incubar ambos tubos durante 18 a 24 horas  de 
35-37°C. Las especies de Vibrio spp utilizan la glucosa tanto para la oxi dación como para la fermentación. Las 
especies de Pseudomonas  que comúnmente se aíslan del pescado y los mariscos con métodos de 
enriquecimiento que se usan para las especies de Vibrio , utilizan la glucosa sólo para la oxidación. 
B 7.7.6.2.5  Prueba de oxidasa. Realizar la prueba de oxidas a con cultivos puros de agar soya tripticasa 
(2% de NaCl) u otro medio que no contenga carbohidratos fermentables. Un método fácil consiste en colocar un círculo de papel filtro en una caja de Petri y humedec erlo con algunas gotas de reactivo de oxidasa. Con un 
palito aplicador de madera, un mondadientes o una asa de pl atino estéril, sacar un poco de cultivo de la placa 
y tocar el papel humedecido, si hay microorganismos oxidasa positivos, el papel se tornará púrpura oscura o azul en pocos segundos. Las especies patógenas de Vibrio  spp. son oxidasa positivas (excepto el V. 
metschnnikovii ). Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 7.7.6.3  Identificación y Confirmación de V. cholerae  01, V.cholerae  NO 01 y V. mimicus . 
B 7.7.6.3.1  Leer los resultados de las prueba bioquímicas de TSI, KIA, AGS, T 1N0 y T 1N3 o GA Y GS, y 
caldo glucosa de Hugh-Leifson. 
B 7.7.6.3.2  Hacer una tinción de Gram a un cultivo de 18 a 24 horas en caldo o agar. 
NOTA: Los cultivos puros que se someterán a las demás pruebas serológicas y bioquímicas para  el V. 
cholerae  son sacarosa positivos (amarillo) en agar TCBS y sacarosa negativos (verdes) en el caso de V. 
mimicus  o son celobiosa negativos (verde-púrpura) en agar mCPC, crecen en caldo T 1N0 o en placas con GA; 
presentan reacciones características en TSI, KIA y AGS.  Son gelatina y oxidasa positivos, son bacilos curvos 
gram negativos y producen ácido a partir de la glucosa,  tanto en la oxidación como en la fermentación, en el 
caldo de cultivo de Hugh-Leifson. 
B 7.7.6.3.3  Pruebas bioquímicas. Las reacciones bioquímicas para identificación de V. cholerae  y otras 
especies bacterianas afines figuran en el cuadro anexo. La fórmula para todos los medios bioquímicos deberá 
contener por lo menos un 2% de NaCl. En vez de medios convencionales se pueden usar tiras AP120E, con 2% de NaCl como diluyente. Para el V. cholerae  se puede usar solución salina fisiológica (0,85% de NaC1) 
como diluyente. 
B 7.7.6.3.4  Prueba serológica de aglutinación. Usar anti suero de diagnóstico del grupo 01 y del subgrupo 
Inaba (factores AC) y Ogawa (Factores AB) para el antí geno del serotipo 01. Usar cultivos de 16 a 24 horas 
producidos en TSA. Incluir cultivos positivos y negat ivos, y los controles salinos para cada antisuero usado. 
Seguir las instrucciones del antisuero. Como es posible que los antígenos de los antisueros estén 
relacionados entre sí, hay que realizar pruebas bi oquímicas para confirmar que el cultivo puro sea de V. 
cholerae  01 o No 01. 
Nota: Anticuerpos monoclonales están disponibles, pero el anti-B y anti-C r eaccionan opuestamente con 
bacterias de otras especies. Uso de anticuerpos policlonales y/o monoclonales será para el antígeno del 
complejo 01. 
B 7.7.6.3.4.1 Los cultivos que aglutinan con el antisuero del grupo 01, pero no en solución salina 
fisiológica simple, son de V. cholerae  del grupo 01 si las reacciones bioquímicas confirman que el cultivo puro 
es de V. cholerae . Los cultivos que se aglutinan con este antisuero para grupos específicos pueden ser 
clasificados según el subtipo con anticuerpos Inaba y Ogawa. 
B 7.7.6.3.4.2 Los cultivos que aglutinan con el suero polivalente (grupo 01) y con los antisueros Inaba y 
Ogawa, tienen los 3 factores (A, B y C) y son del serotipo Hikojima. 
B 7.7.6.3.4.3 Los cultivos que aglutinan con el antisuero poli valente pero no aglutinan con antisueros Inaba 
y Ogawa, no se pueden tipificar con estos antisueros. 
B 7.7.6.3.4.4 Los cultivos de V. cholerae  cuya identidad se haya confirmado con métodos bioquímicos y 
que no aglutinen con el antisuero del grupo 01 son V. cholerae  No 01. El suero para la clasificación de V. 
cholerae  No 01 según el tipo se puede obtener de R.J. Siebeling. 
B 7.7.6.3.4.5 Los cultivos que se aglutinan en el antisuero del grupo 01 y en solución salina, no se pueden 
clasificar según el tipo. Sin embargo, si se usa un medio más rico, como en TSA o agar infusión cerebro 
corazón (BHI), se puede eliminar esta autoaglutinación. 
B 7.7.6.3.5 Características mínimas para la identificación de V. cholerae . 
Las características que permiten suponer la presencia de V. cholerae  como mínimo son las siguientes: 
B 7.7.6.3.5.1 Morfología. 
B 7.7.6.3.5.2 Bacilo o bacilo encorvado, esporogénico y gram negativo. 
B 7.7.6.3.5.3 Aspecto en TSI. 
B 7.7.6.3.5.4 Estría ácido, picadura ácido, gas negativo y H 2S negativo. 
B 7.7.6.3.5.5 . Prueba de Hugh-Leifson. 
B 7.7.6.3.5.6 Fermentación de la glucos a y oxidación positiva. 
B 7.7.6.3.5.7 Citocromo-oxidasa positivo. 
B 7.7.6.3.5.8 Prueba de la Dihidrolasa arginina: negativo. 
B 7.7.6.3.5.9 Prueba de la Lisinadescarboxilasa: positivo. 
B 7.7.6.3.5.10  Prueba de VP: Positivo El Tor, negativo Clásico y V. mimicus . 
Crecimiento a 42°C: positivo.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 7.7.6.3.5.11  Prueba de halofilia con NaCl. 0%: positivo, 3% : positivo, 6%: usualmente negativo. Algunas 
cepas de V. cholerae  NO 01 se desarrollan a 0% de NaCl. 
B 7.7.6.3.5.12  Fermentación de la sacarosa: positivo para V. cholerae  (negativo para V. mimicus ). 
B 7.7.6.3.5.13  Prueba de ONPG: positivo. 
B 7.7.6.3.5.14  Fermentación de la arabinosa: negativo. 
B 7.7.6.3.5.15  0/129 sensitiva: sensible para 10 y 150 µg 0/129 
REACCIONES DE ALGUNOS Vibrio  spp. Y GENEROS RELACIONADOS EN AGAR KIA, TSI Y AGS. 
Microorganismos KIA TSI AGS 
Estría Picadura Estría Picadura Estría Picadura 
V. cholerae K A A(K)* A K a 
V. mimicus K A K(A)* A K A 
V. parahaemolyticus K A K A K A 
V. alginolyticus K A A A K A 
V. vulnificus K o A A K(A)* A K A 
Aeromonas 
hidrophyla K o A A K o A A K K 
Plesiomonas shigelloides K o A A K o A A N N 
 
* = Raramente K = Alcalino A = Acido a = Ligeramente ácido N = Neutro Ninguna de las especies enumeradas produce sulfuro de  hidrógeno en medios KIA, TSI o AGS, ni una 
cantidad perceptible de gas a partir de glucosa en  medios KIA, TSI o AGS. Algunas especies de Aeromonas  
spp. Pueden producir gas a partir de glucosa en estos medios. 
B 7.8 Método para la determinación de Staphylococcus aureus  
B 7.8.1  Fundamento  
Este método permite hacer una estimación del contenido de Staphylococcus aureus en alimentos, se 
efectúa directamente en placas de medi o de cultivo selectivo y diferencial,  con la confirmación mediante las 
pruebas de coagulasa y termonucleasa. Este método es a decuado para el análisis de alimentos en los cuales 
se esperen más de 100 células de Staphylococcus aureus por g. 
B 7.8.2 Reactivos 
En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, para su preparación se deben seguir las 
instrucciones impresas en la etiqueta respectiva. 
Cuando se mencione agua debe entenderse que se trata de "agua destilada". 
Los reactivos a emplear en el método objeto de esta norma deben ser grado analítico. 
B 7.8.2.1  Soluciones diluyentes 
B 7.8.2.2  Solución reguladora de fosfatos (Solución concentrada) 
Ingredientes Cantidad 
Fosfato monopotásico 34,0 g 
Agua  1 L 
 
Preparación Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1 N, aforar 
con agua a 1 L. 
Esterilizar durante 15 min a 121ºC ± 1, conser var en refrigeración (solución concentrada). 
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a 1 L con agua (solución de trabajo). Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera. 
Esterilizar a 121ºC ± 1 durante 15 min. Después de la esterilización, los volúmenes finales y el pH de la solución de trabajo deben ser iguales a 
los iniciales. 
B 7.8.2.3  Agua peptonada 
Ingredientes Cantidad 
Peptona  1,0 g 
Cloruro de sodio 8,5 g 
Agua  1 L 
 
Preparación 
Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustar el pH a 7,0 con solución de hidróxido de sodio 1N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera. Esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 min. Después de la esterilización los volúmenes finales y el pH de la solución de trabajo deben ser iguales a los 
iniciales. 
B 7.8.2.4  Medios de cultivo 
B 7.8.2.5  Medio de Baird-Parker 
Ingredientes Cantidad 
Medio base 
(numeral B 7.8.2.6) 95,0 mL 
Solución de telurito de potasio (numeral B 7.8.2.7) 1,0 mL 
Emulsión de yema de huevo (numeral B 7.8.2.9) 5,0 mL 
 
Preparación Cuando el medio base esté a 45ºC, agre gar los demás ingredientes y mezclar. 
Colocar de 15 a 20 mL del medio completo, enfriar y dejar solidificar. Las placas pueden almacenarse por 48 h a temperatura de 0 a 5ºC. 
B 7.8.2.6  Medio base de Baird-Parker 
Ingredientes Cantidad 
Tripona  10 g 
Extracto de levadura 1,0 g 
Extracto de carne  5,0 g 
Glicina  12,0 g 
Cloruro de litio 5,0 g 
Piruvato de sodio 10,0 g 
Agar  20,0 g 
Agua  1,0 l 
 
Preparación 
Disolver los ingredientes o el agar base en agua y cale ntar con agitación constant e y hervir durante 1 min. 
Esterilizar a 121ºC ± 1 durante 15 min. 
Enfriar y mantener el medio a 45ºC.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 7.8.2.7  Solución de telurito 
Ingredientes Cantidad 
Telurito de potasio 1,0 g 
Agua  100,0 mL 
 
Preparación Disolver el telurito de potasio en agua y esterilizar. La solución puede ser almacenada por varios meses a temperatura de 0 a 5ºC. B 7.8.2.8  Solución salina isotónica 
Ingredientes Cantidad 
Cloruro de sodio 0,85 g 
Agua  100,0 mL 
 
Preparación Disolver el ingrediente en agua y esterilizar a 121ºC ± 1 durante 15 min. B 7.8.2.9  Emulsión de yema de huevo 
Preparación 
Lavar con agua y jabón los huevos frescos que sean necesarios y limpiarlos con una solución de tintura de 
yodo (solución alcohólica al 2%) o sumergirlos en solución de cloruro mercúrico (1:1000). Enjuagar con agua estéril y secar con gasa estéril. 
En campana de flujo laminar o en condiciones asépticas, abrir los huevos y vaciarlos en un separador de 
claras estéril. Transferir las yemas a una probeta hasta un volumen de 60 mL y completar a 90 mL con 
solución salina isotónica. 
Verter la emulsión a un matraz Erlenmeyer con perlas  de vidrio estéril y agitar fuertemente para formar la 
emulsión. 
Filtrar a través de gasa. Las placas deben utilizarse dentro de las 48 h siguientes a su preparación. B 7.8.2.9  Caldo de infusión cerebro-corazón (BHI) 
Ingredientes Cantidad 
Infusión de cerebro de ternera 200,0 mL 
Infusión de corazón de res 250,0 mL 
Peptona de gelatina 10,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Fosfato disódico dodecahidratado 2,5 g 
Glucosa  2,0 g 
Agua  1,0 mL 
 
Preparación Disolver los ingredientes en agua y ca lentar ligeramente si es necesario. 
Distribuir y esterilizar durante 15 min a 121ºC ± 1. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 7.8.2.10  Acido desoxirribonucleico helicoidal de timo de ternera. 
Ingredientes Cantidad 
Acido desoxirribonucléico helicoidal de timo de ternera 
o equivalente 0,03 g 
Agar  1,0 g 
Cloruro de calcio anhídro (solución 0,01 M) (numeral B 
7.8.2.11) 0,10 mL 
Cloruro de sodio 1,0 g 
Azul de toluidina (solución 0,1 M) (numeral B 7.8.2.12) 0,30 mL 
Tris-(hidroximetil-aminometano ) (Tris solución 0,05 M, 
pH 9) 
(numeral B 7.8.2.13) 100 mL 
 
Preparación 
Disolver los ingredientes, excepto el azul de toluidi na agitando hasta completar la disolución del ácido 
desoxirribonucleico y calentar a ebullición. 
Agregar el azul de toluidina. Distribuir en frascos pequeños con tapón de hule. No es necesario esterilizar. 
Este medio es estable a temperatura ambiente has ta 4 meses y funciona perfectamente aun después de 
fundirlo varias veces. 
Tomar un portaobjetos limpio y agregar 3 mL del medio fundido esparciéndolo por la superficie. Cuando el agar solidifique, hacer orificios con la punta de una pipeta Pasteur. 
Conservar en refrigeración para evitar la deshidratación. 
B 7.8.2.11  Solución de cloruro de calcio anhidro 0,01 M 
Cloruro de calcio PM = 110,99 
Disolver 0,1199 g de cloruro de calcio en 100 mL de agua. 
B 7.8.2.12  Solución de azul de toluidina 0,1 M 
Disolver 3,05 g de azul de toluidina en 100 mL de agua. 
B 7.8.2.13  Solución amortiguadora 0,05 M Tris-(hidroximetilaminometano) 
(Tris pH 9) PM = 121,1 Disolver 6,055 g de Tris en 100 mL de agua. 
B 7.8.2.14  Plasma de conejo 
Emplear plasma deshidratado o rehidratado de conejo siguiendo las instrucciones del fabricante y agregar 
ácido etilendiaminotetracético (EDTA) en solución al 0,1% en plasma rehidrata do. Si se utiliza plasma 
deshidratado diluir con agua estéril en proporción de 1:3. 
Puede emplearse plasma de conejo liofilizado adicion ado de EDTA. No debe emplearse sangre citratada. 
B 7.8.3 Materiales 
Todos los instrumentos que se utilicen para trabajar  la muestra deben esterilizarse mediante horno, 
durante 2 h de 170-175ºC o como alternativa en autoclave durante 15 min como mínimo a 121ºC ± 1. 
B 7.8.3.1  Cuchillos, pinzas, tijeras, cuchar as, espátulas y separador de huevo. 
B 7.8.3.2  Tubos de cultivo de 16 mm x 150 mm o frascos de 125 a 250 mL de capacidad. 
B 7.8.3.3  Tubos de cultivo de 10 mm x 75 mm. 
B 7.8.3.4  Cajas Petri de 90 a 100 mm de diámetro. 
B 7.8.3.5  Pipetas bacteriológicas de 1 mL y 10 mL de capacidad graduadas en 0,1 mL y 1 mL, 
respectivamente y diámetro de 2 a 3 mm. 
B 7.8.3.6  Pipetas Pasteur.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 7.8.3.7  Probetas. 
B 7.8.3.8  Varillas de vidrio de 3,5 mm de diámetro aproximadamente y 20 cm de largo dobladas en ángulo 
recto. 
B 7.8.3.9  Matraz Erlenmeyer con perlas de vidrio 
B 7.8.3.10  Cámara húmeda: consiste en una caja Petri en la cual se coloca una varilla de vidrio en forma 
de "V" rodeada de algodón humedecido con agua. 
B 7.8.4 Aparatos 
B 7.8.4.1  Horno para esterilizar que alcance 180°C. 
B 7.8.4.2  Autoclave con termómetro. 
B 7.8.4.3  Baño de agua con regulador de temperatura de 35 ± 0,5ºC. 
B 7.8.4.4  Baño de agua con regulador de temperatura de 45 ± 0,5ºC. 
B 7.8.4.5  Balanza con capacidad no mayor de 2,500 g y sensibilidad de 0,1 g. 
B 7.8.4.6  Incubadora a 35 ± 1ºC. 
B 7.8.5 Preparación de la muestra 
La preparación de la muestra se debe realiz ar de acuerdo a lo establecido en B 7.1  "Preparación y 
Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico".  
B 7.8.6 Procedimiento 
B 7.8.6.1 Utilizando diferentes pipetas de 1 mL para cada d ilución, depositar 0,1 mL sobre la superficie de 
las placas de agar Baird-Parker. 
B 7.8.6.2 Distribuir el inóculo sobre la superficie del agar c on varillas estériles de vidrio en ángulo recto, 
utilizando una para cada dilución. 
B 7.8.6.3 Mantener las placas en su posición hasta que el inóculo sea absorbido por el agar. 
B 7.8.6.4 Invertir las placas e incubar de 45 a 48 h a 35ºC. 
B 7.8.6.5 Seleccionar las placas que tengan entre 15 y 150 colonias típicas de Staphylococcus aureus ; si 
no es posible, seleccionar las placas de las diluciones más altas no obstante tengan más de 150 colonias. 
B 7.8.6.6 Cuando las placas tengan menos de 15 colonias típicas también pueden ser utilizadas y al 
informe se debe agregar la nota de "valor estimado". 
B 7.8.6.7 Las colonias típicas son negras, circulares, brilla ntes, convexas, lisas, de diámetro de 1 a 2 mm y 
muestran una zona opaca y un halo claro alrededor de la colonia. 
B 7.8.6.8 Seleccionar las colonias de acuerdo con el siguiente cuadro para realizar las pruebas de 
coagulasa y termonucleasa: 
CUADRO 1 
Número de colonias  sospechosas en 
caja Número de colonias  por 
probar 
Menos de 50 3 
51 a 100 5 
101 a 150 o más 7 
 
B 7.8.6.9 Seleccionar el número de colonias y sembrar cada una en tubos con 0,5 mL de caldo de infusión 
cerebro-corazón. 
B 7.8.6.10 Incubar a 35ºC durante 24 h. 
B 7.8.6.11 Inocular en la misma forma cepas conocidas de Staphylococcus aureus y Staphylococcus 
epidermidis como testigos posi tivo y negativo. 
B 7.8.6.12 Después del periodo de incubación pasar con una pipeta de 1 mL, 0,3 mL de cada cultivo a otro 
tubo de 10 mm x 75 mm y conservarlo para la prueba de  termonucleasa. El resto del cultivo se usa para la 
prueba de coagulasa. 
B 7.8.6.13 Prueba de coagulasa Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 7.8.6.13.1  Agregar a los 0,2 mL del cultivo anterior, 0,2 mL de plasma de conejo diluido volumen a 
volumen con solución salina estéril. 
B 7.8.6.13.2  Incubar en baño de agua de 35 a 37ºC y observar durante 6 h a intervalos de 1 h; si no hay 
formación de coágulo, observar a las 24 h. Considerar positiva la prueba si hay formación de coágulo. 
B 7.8.6.13.3  Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo se añade una gota de cloruro de 
calcio al 5% a 0,5 mL de plasma reconstituido empleado, formándose un coágulo en 10-15 seg. 
B 7.8.6.14  Prueba de termonucleasa 
B 7.8.6.14.1 Calentar durante 15 min, 0,3 mL de cultivo en  caldo de infusión cerebro-corazón en baño de 
agua hirviendo. 
B 7.8.6.14.2  Pasar una gota de cada cultivo por medio de una pipeta Pasteur a un orificio del medio, 
incluye testigo. 
B 7.8.6.14.3  Incubar a 35ºC en cámara húmeda de 4 a 24 h. 
B 7.8.6.14.4  La aparición de un halo color rosa extendido de por lo menos 1 mm alrededor de la 
perforación se califica como positiva. 
B 7.8.7 Cálculo y expresión de resultados 
B 7.8.7.1 Cálculo 
Hacer el cálculo del contenido de microorganismos en el producto tomando en cuenta el número de 
colonias totales, el número de colonias confirmadas, la dilución y el volumen inoculado (0,1 mL). 
Ejemplo 1: 
Si la caja tiene 80 colonias en la dilución 1:1000 Se toman 5 colonias para la prueba, de éstas dan 4 positivas, el cálculo es: 
80 x 4 = 64 x 1000 x 10 = 640 000 
5 
Ejemplo 2: Si la caja tiene 14 colonias en la dilución 1:10 
Se toman 3 colonias para la prueba, de éstas dan 2 positivas, el cálculo es: 
14 x 2 = 9,3 x 10 x 10 = 930 
3 
B 7.8.7.2 Expresión de los resultados: 
Según ejemplo 1: 
Informar como Staphylococcus aureus 640 000 UFC/g 
Según ejemplo 2: 
Informar como Staphylococcus aureus 930 UFC/g valor estimado 
Si las pruebas confirmativas resultan negativas  en todas las colonias probadas, informar como: 
0 UFC/g en muestras directas 
-10 UFC/g en muestras de dilución 1:10 
-100 UFC/g en muestras de dilución 1:100 
En la práctica los resultados pueden variar, esto dependerá del técnico que trabaje el método y el grado de 
confiabilidad del mismo, que en el 95% de los casos es de ± 16% a ± 52%. 
B 7.9 Determinación de enterotoxina estafilocóccica por el método de ELISA . 
B 7.9.1  Principio del método. 
Este método se basa en un inmunoensayo visual el cual proporciona una prueba rápida (4 h), sensible  
(1,0 ng o más por mL o g), y específica para la identif icación de las enterotoxinas A-E estafilocóccicas. Sin 
embargo, con esta prueba no se identifican los sero tipos de enterotoxina, en forma individual. La prueba de 
Elisa se realiza en configuración de “sandwich”. 
B 7.9.2  Materiales y Equipo 
B 7.9.2.1  Algodón absorbente.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 7.9.2.2  Micropipetas de 50-200 L y 5-20 L. 
B 7.9.2.3  Puntas de plástico para micropipeta. 
B 7.9.2.4  Plástico para envolver o sellar recipientes de plástico. 
B 7.9.2.5  Papel pH (intervalo 0-14). 
B 7.9.2.6  Frascos de plástico de 500 mL. 
B 7.9.2.7  Jeringas de plástico de 25 mL. 
B 7.9.2.8  Tubos para centrífuga. 
B 7.9.2.9  Tubos de polipropileno de 12 x 75 mm. 
B 7.9.2.10  Polietilen glicol (PEG, peso molecular de 15,000-20,000). 
B 7.9.2.11  Tubo de diálisis (12,000-14,000 peso molecular exclusión). 
B 7.9.2.12  Vasos de precipitados de 250 mL. 
B 7.9.2.13  Filtros tipo jeringa  (para filtrar los alimentos). Preparar je ringas de plástico desechables (0,25 
mL) e insertar suficiente cantidad de algodón absorbe nte, para hacer un empaque de 0,5 cm. Pasar 5,0 mL de 
agua destilada, presionar con el émbolo para asegurarse de formar un paquete firme. Preparar inmediatamente antes de filtrar los ex tractos de alimento, para tratar con el aditivo provisto con el equipo.  
B 7.9.2.14  Placa de 48 o 96 pozos recubiertos con el grupo de antisueros *. 
B 7.9.2.15  Soporte para sostener la placa *. 
B 7.9.2.16  Instructivo del método *. 
B 7.9.2.17  Comparador de color *. 
B 7.9.2.18  Hoja de resultados *. 
*Materiales suministrados por el fabricante. 
B 7.9.2.19  Equipo TECRA TM. 
B 7.9.2.20  Incubadora a 35-37°C. 
B 7.9.2.21  Omnimixer, licuadora (o equivalente) para la  preparación de los extractos de alimentos. 
B 7.9.2.22  Centrífuga a 1000 -3000 x g. 
B 7.9.2.23  Agitador de microplacas (opcional). 
B 7.9.2.24  Lector de microplacas (opcional). 
B 7.9.2.25  Balanza. 
B 7.9.3  Reactivos. 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico a menos que se indique otra 
especificación y por agua debe  entenderse agua destilada. 
B 7.9.3.1  Solución amortiguadora Tris 0,25 M (30,28 g TRIS/L, pH 8,0). 
B 7.9.3.2  Solución de hidróxido de sodio 1,0 N (NaOH). 
B 7.9.3.3  Acido clorhídrico (HCl). 
B 7.9.3.4  Agua destilada o deionizada. 
B 7.9.3.5  Hipoclorito de sodio. 
B 7.9.3.6  BHI con 0,7% de agar (m/v). 
B 7.9.3.7  Solución de lavado. Contiene: 1,5 g de tris(hid roximetil) aminometano (Tris), 6g de NaCl, 2,0 g 
polioxietilen sorbitan monolaurato (Tween 20), y 0,001 g de timerosal en 25,0 mL de H
2O * 
B 7.9.3.8  Aditivo para la muestra. Es una solución que co ntiene: 2 g de Tween 20 y 0,001 g de timerosal 
en 6,0 mL de H 2O *. 
B 7.9.3.9 Control positivo: Diluir 25 L de control positivo concentrado (tox ina estafilocóccica tipo B, 0,1 g 
Na2B4O7, 0,1 g de NaCl y 0,001 g de timerosal en 4,0 mL de H 2O), en 2,5 mL de sol. de lavado (7.10.5.1) *. 
B 7.9.3.10  Control negativo. Contiene: 0,0072 g de Tris, 0,1 g de NaCl,  0,001 g de timerosal y 0,01 g de 
Tween 20 en 6,0 mL de H 2O *. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 7.9.3.11  Diluyente del Conjugado. Contiene: 0,2 g Na 2B4O7, 0,1 g de NaCl, 0,1 g de gelatina, y 0,001 g 
de timerosal en 13,5 mL de H 2O *. 
B 7.9.3.12  Conjugado liofilizado. Un frasco que contiene antis uero polivalente (A-E) liofilizado, conjugado; 
0,003g de Na 2B4O7, 0,002 g de CaCl 2, y 0,0001 g de timerosal. Para su uso, agregar al frasco 13 mL del 
diluyente del párrafo anterior*. 
B 7.9.3.13  Aditivo para la muestra Diluyente del Substrato. Cada 26 mL de H 2O contienen 0,2 g de ácido 
acético y 0,01 g de H 2O2*. 
B 7.9.3.14  Substrato.  Un frasco de liofilizado que contiene; 0,01  g de 2,2´-di-azino(sulfonato de 3-etil 
benzotiazolin), 0,01 g de EDTA, y 0,1 g de NaH 2PO 4. Para su uso, agregar al frasco 26mL del diluyente del 
substrato. 
B 7.9.3.15  Solución para detener la reacción (solución stop ). Cada 6,0 mL contien en; 1,5 g de NaF en 6,0 
mL de agua 
*Reactivos suministrados por el fabricante B 7.9.4  Procedimiento. 
B 7.9.4.1  Preparación de las muestras. 
B 7.9.4.1.1  Productos fluidos y productos deshidratados. 
Pesar 25 g de leche deshidratada y agregar 125 mL de solución Tris 0,25 M pH 8.0 Solución 
amortiguadora Tris. Continuar como se indica para lech e fluida. En muestras de 5,0 mL, verificar que el pH 
esté en un intervalo de 7,0-8,0. Agregar 50 L de Aditivo para la muestra. En el caso de extractos más claros, 
ajustar el pH a 4,0 con HCl concentrado. Para muestr as de leche de 50 mL, verificar que el pH esté en un 
intervalo de 7,0-8,0. Agregar 50 L de aditivo Aditivo para la muestra. Centrifugar la muestra 10 min a  1000-
3000 x g. Decantar el extracto y pasar 5,0 mL apr oximadamente, a través de una jeringa empacada con 
algodón absorbente humedecido previamente, y recibir en un tubo de polipropileno. Ajustar nuevamente el pH 
a 7,0-8,0 (usar papel pH). Agregar 50 L de aditivo Aditivo para la muestra y mezclar. 
B 7.9.4.1.2 Ingredientes deshidratados. 
Agregar 125 mL de solución Tris 0,25 M pH 8,0 a 25 g de muestra, homogeneizar en licuadora (a 
velocidad alta), durante 3 min. Centrifugar la m uestra 10 min a 1000-3000 x g y recoger el extracto 
(sobrenadante). Quitar el émbolo de la jeringa de plásti co que contiene el empaque de algodón absorbente 
humedecido previamente y con cuidado, pasar el extracto a través del empaque y recibir el eluido. Tomar 5,0 
mL de eluido y ajustar el pH a 7,0-8,0. Agregar 50 L de aditivo, y mezclar. 
B 7.9.4.1.3  Otros alimentos. 
Agregar 50 mL de solución Tris 0,25 M pH 8,0 a 25 g de muestra, y homogeneizar en licuadora durante 3 
min a velocidad alta. Centrifugar la muestra durante 10 min a 1000-3000 x g. Quitar el émbolo de la jeringa de plástico que contiene el empaque de algodón absorb ente humedecido previamente, y pasar 5,0 mL  de 
extracto a la jeringa, insertar el émbolo y con cuidado presionar el émbolo y recoger el eluido. Tomar 5 mL del 
eluido, ajustar a pH 7,0-8,0, si es necesario; agregar 50 L de aditivo, y mezclar. 
Nota 1: Preparar los extractos de alimentos inmediat amente antes de realizar la prueba. 
Precauciones generales. 
En caso de alimentos crudos fermentados, procesados o enlatados, con evidentes defectos; o de cultivos 
fluidos obtenidos en el laboratorio, que pudieran dar  como resultado el crecimiento de microorganismos 
productores de peroxidasa, es necesario, antes de hacer la determinación de toxina, verificar si los extractos 
de alimentos o preparados a partir del cultivo en el la boratorio, contienen peroxidasa, debido a que esta 
enzima podría interferir con la interpretación de los resultados. 
Para determinar la presencia de peroxidasa, agregar 50 L del substrato, en una placa de microtitulación 
sin tratar (no contiene anticuerpos para la enterotoxina estafilocóccica). Dejar en reposo 10 min. Si el color 
cambia a azul o azulverdoso, indica que la muestra cont iene peroxidasa intrínseca; la cual debe inactivarse. Si 
la muestra permanece incolora (o con el color original), realizar el análisis de enterotoxina. Para inactivar la 
peroxidasa intrínseca, preparar una solución al 30% (m/v) de azida de sodio y agregar 1 mL de esta solución a 4 mL de muestra (la concentración final de la azida de sodio es de 6% (m/v). Mezclar y agregar un poco de aditivo, dejar en reposo 1-2 min a temperatura del la boratorio(20-25ºC). Repetir la prueba para determinar 
presencia de peroxidasa, como se describió anteriorment e. Si la reacción es incolora o presenta el color 
original, continuar con la prueba. 
Nota 2: Para alimentos crudos (ejemplo: verduras), seguir las precauciones generales señaladas 
anteriormente.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 7.9.4.2 Preparación de reactivos. 
B 7.9.4.2.1 Reconstitución de la solución de lavado. 
Diluir, en un frasco de reactivos la solución concentrada (como lo indique el fabricante), con agua destilada 
o deionizada, para obtener 2 L. Utiliz ar esta "solución de lavado" para lavar los pozos y diluir el control 
positivo. Es recomendable el uso de pizeta. Almacenar a 4°C, cuando no se use. 
B 7.9.4.2.2  Preparación del conjugado. 
Agregar el diluyente del conjugado y rehidratar a temperatura del laboratorio. Mezclar  suavemente. Esta 
preparación es el "Conjugado reconstituido". 
B 7.9.4.2.3 Preparación del substrato. 
Disolver el substrato con el diluyente asegurarse que el contenido se haya disuelto completamente. Dejar 
a la temperatura del laboratorio (20-25°C), antes de su uso. 
B 7.9.4.2.4 Precauciones generales:  
B 7.9.4.2.4.1  Observar la fecha de caducidad del equipo adquirido. Es la última fecha en la cual el 
producto debe utilizarse. Preparar todos los reactivos con cuidado y anotar la fecha de reconstitución, en la 
etiqueta externa de la caja. Usar los reactivos dentro de los 65 días a la fecha anotada en la etiqueta. 
Refrigerar todos los componentes (2-8°C) cuando no estén en uso. NO CONGELAR. 
B 7.9.4.2.4.2  El equipo de inmunoensayo visual está preparado para utilizarse como una unidad integral; 
por tanto, no se deben mezclar los componentes de diferentes lotes. 
B 7.9.4.2.4.3  Utilizar puntas nuevas para c ada muestra de alimento. Evitar la contaminación cruzada al 
llenar los pozos. Si se usan propipetas de plástico pa ra distribuir el conjugado y el substrato, se deben 
mantener siempre por separado. Asegurarse de no confundir las tapas de los reactivos. 
B 7.9.4.2.4.4  Usar controles positivos y negativos en cada prueba. 
B 7.9.4.2.4.5  Preparar recipientes con solución al 2% de hipoclorito de sodio para desechar todas las 
muestras y materiales que contengan toxina. 
Mantener los pozos removibles que no se usen dentro de l paquete y volver a sellar con cinta, después de 
cada uso. 
B 7.9.4.5 Determinación de la enterotoxina. 
B 7.9.4.5.1 Preparación de los pozos. 
Tomar del paquete el número necesario de pozos; un o para cada muestra, uno para control positivo y uno 
para control negativo. Si se requiere, pueden utilizarse pozos  adicionales (control positivo y negativo en alimento). 
B 7.9.4.5.2 Prelavado. 
Con la ayuda de una piceta llenar cada pozo con solución de lavado y dejar en reposo durante 10 minutos 
a la temperatura de laboratorio (20-25ºC). Vaciar los po zos por inversión rápida del soporte (placa); eliminar 
completamente todo residuo de líquido, golpeando varias  veces, firmemente hacia abajo la placa, sobre una 
toalla de papel absorbente. 
B 7.9.4.5.3 Colocación de las muestras. 
Pasar alícuotas de 200 L de los controles y muestras (extract os de alimento o de cultivos) dentro de 
pozos individuales. Registrar la posición de cada muestra en la hoja de registro específica. Golpear suavemente la placa para asegurarse de la distribuci ón homogénea y del contacto de las muestras con las 
paredes de los pozos; el uso de un agitador de microp lacas durante 30 segundos, es opcional. Cubrir los 
pozos con una película plástica, estirable, autoadherible  o sello especial de microplacas; para evitar la 
evaporación. Incubar 2 hrs. a 35-37°C. 
B 7.9.4.5.4  Segundo lavado. 
Presionar firmemente los pozos en la placa e invertir rápidamente. Vaciar el contenido de los pozos en el 
recipiente de desecho (con hipoclorito de sodio al 2%). Eliminar el residuo de líquido golpeando 
enérgicamente, varias veces la placa invertida, sobre una toalla de papel absorbente; llenar completamente 
los pozos con solución de lavado, y repetir el lavado en la misma forma, de 2 a 3 veces más y finalmente 
vaciar los pozos. 
Nota 3: El lavado profundo de los pozos es un paso crítico y asegurará una clara interpretación de los 
resultados. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 7.9.4.5.5 Adición de conjugado. 
Agregar 200 L del conjugado reconstituido (enzima) a cada poz o. Volver a cubrir la placa e incubar 1 h a 
temperatura de laboratorio (20-25°C). Vaciar las placas  y lavar profundamente, 5 veces, como se describió 
anteriormente en el segundo lavado. 
B 7.9.4.5.6  Adición del substrato. 
Agregar, a cada pozo, 200 L del substrato reconstituido. Dejar a temperatura del laboratorio (20-25°C) 
durante 30 min, como mínimo, hasta que el control posit ivo alcance la máxima absorbancia (mayor a 1,0) o al 
color más intenso que el número 4 del comparador de color. El desarrollo de color tiende a concentrarse 
alrededor de las orillas de los pozos. Para obtener resu ltados más precisos, golpee con suavidad los extremos 
de la placa, con el propósito de que el contenido de los pozos se mezcle bien antes de la lectura. Agregar a cada pozo 20 L de solución stop; golpear con suavidad, para mezclar los contenidos. 
B 7.9.4.5.7 Determinar los resultados visualmente o me diante un lector de microtitulación. 
B 7.9.4.6  Interpretación de  los resultados: 
Colocar la placa que sostiene los pozos sobre un fondo blanco. Comparar el color de cada pozo con el 
comparador de color. El control positivo de toxina (y el  control positivo de alimento, si se usó) deben dar un 
color verde intenso, lo que indica que todos los r eactivos han funcionado. Si el control negativo es 
significativamente más oscuro que el representado en comparador de color, significa que hubo, 
probablemente, un lavado inadecuado y la prueba debe repetirse. 
La muestra se considera positiva, si cumple los siguientes criterios: 
B 7.9.4.6.1  El control negativo está dentro del intervalo de color negativo, representado en el comparador 
de color, y las muestras presentan un color verde o azul más oscuro que el intervalo negativo representado en 
el comparador de color. 
La prueba de enterotoxina se considera negativa, si se cumplen los siguientes criterios: 
B 7.9.4.6.2  El control negativo está dentro del intervalo de color negativo, representado en el comparador 
de color, y 
B 7.9.4.6.3  La muestra es incolora o tiene el color dent ro del intervalo negativo, representado en el 
comparador de color. 
B 7.9.4.7  Expresión de resultados. 
Prueba positiva o negativa para enterotoxina estafilocóccica 
 
B 8 Método de prueba para la determinación de cadmio, arsénico, plomo, estaño, cobre, fierro, zinc 
y mercurio en alimentos. 
B 8.1  Fundamento 
El método de absorción atómica se basa en hacer pasar un haz de luz monocromática de una frecuencia 
tal que puede ser absorbido por el analito que se encu entra presente en forma de vapor atómico. La medida 
de la intensidad luminosa antes y después de su paso por el vapor atómico permite determinar el por ciento 
de absorción. 
La cantidad de absorción aumenta con la  concentración de los átomos en el  medio absorbente, es decir, la 
medida de la absorción aumenta con la concentración del  elemento en la muestra, ya sea que esté en su 
condición original o sujeta a pretratamiento. 
B 8.2 Reactivos 
Soluciones estándares de referencia certificadas de cada uno de los metales. Agua, debe ser destilada deionizada, con un grado máximo de conductividad de 1 mho/cm a 25ºC. 
B 8.2.1  Acido nítrico (densidad específica 1,41), grado suprapuro. 
B 8.2.2  Acido nítrico (densidad específica 1,41), contenido de mercurio muy bajo. 
B 8.2.3  Acido perclórico (densidad específica 1,67), grado suprapuro.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 8.2.4  Acido clorhídrico (densidad específica 1,19), grado suprapuro. 
B 8.2.5  Acido sulfúrico (densidad específica 1,84), grado suprapuro. 
B 8.2.6  Acido sulfúrico 1 N a partir de la solución grado suprapuro. 
B 8.2.7  Acido nítrico 65% v/v grado RA. 
B 8.2.8  Peróxido de hidrógeno (densidad específica 1,12). 
B 8.2.9  Hidróxido de sodio granalla reactivo RA. 
B 8.2.10  Aire comprimido seco y limpio. 
B 8.2.11  Gases: acetileno, óxido nitroso, arg ón y nitrógeno, grado absorción atómica. 
B 8.2.12  Solución de Nitrato de Magnesio hexahidratado al 7% p/v. Disolver 70 g de Mg(NO3)2·6H2O en 
1000 mL de HCl 1 N. 
B 8.2.13  Acido clorhídrico 1 N. Diluir 8,3 mL de HCl y llevar a 100 mL de agua. 
B 8.2.14  Acido nítrico al 50% v/v. Diluir 50 mL de HNO3 al 65% v/v grado suprapuro en 50 mL de agua. 
B 8.2.15  Acido clorhídrico 8 M. Diluir 66,0 mL de HCl y llevar a 100 mL con agua. 
B 8.2.16  Acido clorhídrico 0,5 N. Diluir 4,15 mL de HCl y llevar a 100 mL con agua. 
B 8.2.17  Solución de Yoduro de Potasio al 15% p/v. Disolver 15 g de KI en 100 mL de agua (esta solución 
debe prepararse en el momento de usarse). 
B 8.2.18  Solución de Yoduro de Potasio al 20% p/v. Disolver 20 g de KI en 100 mL de agua (esta solución 
debe prepararse en el momento de usarse). 
B 8.2.19  Solución de Cloruro de Potasio (10 mg/mL de K). Disolver 1,91 g de KCl en agua y diluir a 100 
mL con agua. 
B 8.2.20  Solución de Nitrato de Magnesio al 50% p/v. Disolver 50 g de Mg(NO3)2.6H2O en 100 mL de agua. 
B 8.2.21  Solución de ácido clorhídrico al 1,5% p/v.  Diluir 1,5 mL de HCl en 100 mL de agua destilada 
deionizada. 
B 8.2.22  Solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 1 g de hidróxido de sodio y diluir a 100 mL con 
agua destilada deionizada. 
B 8.2.23  Solución de borohidruro de sodio al 4% p/v en solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 4 g 
de borohidruro de sodio en 100 mL de una solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Filtrar al vacío. 
B 8.2.24  Solución reductora para mercurio. Mezclar 50 mL de ácido sulfúrico concentrado con 
aproximadamente 300 mL de agua. Enfriar a temperatura ambiente y disolver 15 g de cloruro de sodio, 15 g 
de sulfato o cloruro de hidroxilamina y 25 g de  cloruro o sulfato estanoso en solución. 
B 8.2.25  Diluir a 500 mL. Solución de dilución para mercurio. En un matraz de 1 L, conteniendo de 300 a 
500 mL de agua destilada deionizada, agregar 58 mL de ácido nítrico concentrado de muy baja concentración de mercurio y 67 mL de ácido sulfúrico concentrado. Diluir al volumen con agua. 
B 8.2.26  Solución de trabajo de As de 1 g/mL. Diluir 1 mL de la solución patrón de 1000 g/mL a 1 L con 
ácido sulfúrico 1N preparada a partir de la soluci ón grado suprapuro. Preparar fresca cada día. 
B 8.3  Materiales 
B 8.3.1  Matraces Kjeldahl de 500 mL y 800 mL. 
B 8.3.2  Sistema de reflujo con refrigerante. 
B 8.3.3  Crisoles Vycor de 40 a 50 mL de capacidad. 
B 8.3.4  Crisoles de platino de 40 a 50 mL de capacidad. 
B 8.3.5  Matraces Erlenmeyer de diferentes capacidades. 
B 8.3.6  Matraces volumétricos de diferentes capacidades. 
B 8.3.7  Matraces redondos de fondo plano de 50 mL. 
B 8.3.8  Bombas Parr. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 8.3.9  Micropipetas o pipetas de Eppe ndorf de diferentes capacidades. 
B 8.3.10  Puntas de plástico para micropipetas. 
B 8.3.11  Papel filtro Whatman No. 2. 
B 8.3.12  Perlas de ebullición. 
B 8.3.13  Varillas de plástico. 
B 8.3.14  Tubos de ensayo graduados de propilen o propileno de 15 mL. 
B 8.3.15  Recipientes de propilen o propileno. 
B 8.3.16  Embudos de filtración de diferentes capacidades. 
B 8.3.17  Material común de laboratorio. 
B 8.3.18  Todo el material utilizado debe someterse a lavado de acuerdo con las siguientes instrucciones: 
B 8.3.19  El jabón que se use debe ser de preferencia neutro. 
B 8.3.20  Enjuagar perfectamente con agua corriente. 
B 8.3.21  Sumergir el material de vidrio o plástico en un recipiente (de preferencia plástico) que contenga 
una solución de ácido nítrico grado RA al 30%. 
B 8.3.22  Dejarlo tapado y reposando por un lapso de 24 horas. 
B 8.3.23  Quitar el exceso de ácido nítrico con varios enjuagues (5 o 6 veces) con agua deionizada. 
B 8.3.24  Dejar escurrir y secar. 
B 8.3.25  Guardar en cuanto esté seco para evitar  contaminación por partículas en el aire. 
B 8.4  Aparatos e instrumentos 
B 8.4.1  Aparatos 
B 8.4.1.1  Lámparas de cátodo hueco o de descarga sin electrodos para determinar arsénico, cadmio, 
cobre, estaño, fierro, mercurio, plomo y zinc. 
B 8.4.1.2  Fuente de radiofrecuencia en caso de usar lámparas de descarga. 
B 8.4.1.3  Automuestreador y recirculador de agua. 
B 8.4.1.4  Placa de calentamiento con regulador que alcance una temperatura de 400 a 450 ºC. 
B 8.4.1.5  Horno de microondas. 
B 8.4.1.6  Autoclave que alcance 121 ± 5ºC o 15 lb de presión. 
B 8.4.1.7  Centrífuga de laboratorio ca paz de mantener 1600 rpm. 
B 8.4.2  Instrumentos 
Los instrumentos que a continuación se indican deben estar calibrados y ajustados antes de su operación. 
B 8.4.2.1  Espectrómetro de absorción atómica equipado con los accesorios para flama, horno de grafito, 
generador de hidruros o vapor frío, dependiendo del método a seguir. 
B 8.4.2.2  Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg. 
B 8.4.2.3  Mufla capaz de mantener una temperatura de 550 ± 10ºC. 
B 8.4.2.4  Horno de calentamiento (estufa) con in tervalo de temperatura de 120 ± 5ºC. 
B 8.5 Preparación de la muestra 
B 8.5.1 Digestión para la determinación de Cd, Cu, Fe, Pb y Zn. 
B 8.5.1.1 Digestión por vía húmeda. 
B 8.5.1.1.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad apropiada de muestra. 
Para la determinación por el método de absorción por flama pesar como máximo 40 g de jugo o bebida, 20 
g de alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos sólidos o semisólidos. Límite el contenido de grasa o aceite a un máximo de 4 g y el total de materia orgánica a 5 g.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 8.5.1.1.2  Añadir 10 mL de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar directamente 
la digestión. 
B 8.5.1.1.3  Usar matraz de Kjeldhal o matraz conectado al sistema de refrigerantes. 
B 8.5.1.1.4  Calentar suavemente. 
B 8.5.1.1.5  Digerir la muestra 3 horas o más tiempo si es necesario (algunas muestras requieren la adición 
de mayor cantidad de ácido nítrico) hasta la aparición de l color traslúcido, si queda ámbar, adicionar peróxido 
de hidrógeno gota a gota con agitación continua (reacción exotérmica). 
B 8.5.1.1.6  Enfriar. 
B 8.5.1.1.7  Recuperar, filtrar y llevar a un volumen conocido en matraz volumétrico. 
B 8.5.1.1.8  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión. 
B 8.5.1.1.9  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica por flama u horno de grafito). 
B 8.5.1.2 Digestión por vía seca. 
B 8.5.1.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad apropiada de muestra. 
B 8.5.1.2.2  Para la determinación por el método de absorción por flama pesar como máximo 40 g de jugo 
o bebida, 20 g de alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos sólidos y semisólidos. 
Limite el contenido de grasa o aceite a un máximo de 4 g y el total de materia orgánica a 5 g. 
B 8.5.1.2.3  Añadir 10 mL de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar directamente 
la digestión. En productos con alta concentración de pr oteínas adicionar una solución de nitrato de magnesio 
al 7,0% p/v y mezclar completamente, llevar a se quedad aproximadamente durante 6 horas en estufa a una 
temperatura de 90 a 95ºC. 
B 8.5.1.2.4  Colocar la muestra en una mufla y elevar la  temperatura lentament e de 2 a 4ºC por minuto 
hasta 350°C. Mantener la tem peratura hasta que cesen los humos. 
B 8.5.1.2.5  Elevar gradualmente la temperatura de 500 a 550ºC para evitar que la muestra se incinere y 
mantener esa temperatura dur ante 16 horas o toda la noche. 
B 8.5.1.2.6  Apagar la mufla y dejar enfriar. 
B 8.5.1.2.7  Un segundo paso de calcinación puede ser requerido para remover algunos residuos de 
carbón, mediante el siguiente procedimiento: 
B 8.5.1.2.8  Lavar las paredes del crisol con 2 mL de ácido nítrico al 50%. Colocar la muestra en una placa 
de calentamiento puesta a 120ºC para remover el exce so de ácido. Colocar la muestra en una mufla fría y 
elevar la temperatura gradualmente de 500 a 550ºC, manteniéndola por el tiempo necesario. Repetir este 
procedimiento cuantas veces sea necesario hasta que quede libre de carbón remanente. 
B 8.5.1.2.9  Disolver las cenizas completamente en 5 mL de ácido clorhídrico 1N, transferir la muestra 
disuelta a un tubo de propileno o a un matraz de volume n conocido, enjuagar el crisol con dos alícuotas de 5 
mL de ácido clorhídrico 1 N y transferir al mismo tubo  o matraz para obtener un volumen de 15 mL en el 
primero y llevar al aforo en el segundo, tapar y mezclar, si  existe presencia de partículas o materia insoluble, 
filtrar en papel Whatman No. 2,  antes de la determinación. 
B 8.5.1.2.10  Correr un blanco de reactivos y muestra fo rtificada por cada serie de digestión. 
B 8.5.1.2.11  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica: flama u horno de grafito). 
B 8.5.1.3 Digestión por vía húmeda para la determinación de Sn. 
B 8.5.1.3.1  Proceder igual que en el punto I) de B 8.5.1.1 
B 8.5.1.3.2  No adicionar ácido nítrico si no se lleva cabo la digestión total en el mismo día. 
B 8.5.1.3.3  Adicionar 30 mL de ácido nítrico concentrado al  matraz y calentar suavemente por 15 minutos 
en campana para iniciar la digestión, evitando una excesiva producción de espuma. 
B 8.5.1.3.4  Hervir suavemente hasta tener un remanente de 3 a 6 mL o hasta que la muestra empiece a 
secarse en el fondo. No dejar que la muestra se calcine. 
B 8.5.1.3.5  Retirar la muestra del calor. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 8.5.1.3.6  Al mismo tiempo correr dos blancos de reactivos. 
B 8.5.1.3.7  Adicionar 25 mL de ácido clorhídrico c oncentrado, calentar suavemente durante 
aproximadamente 15 minutos, hasta que todo el cloro se a liberado. Aumentar la temperatura gradualmente 
hasta ebullición. 
B 8.5.1.3.8  Evaporar hasta obtener de 10 a 15 mL, usando un matraz similar con 15 mL de agua como 
patrón de volumen. 
B 8.5.1.3.9  Adicionar aproximadamente 40 mL de agua. 
B 8.5.1.3.10  Agitar y pasar a un matraz de 100 mL y enjuagar con 10 mL de agua. 
B 8.5.1.3.11  Cuando el ácido clorhídrico está presente en la digestión, las muestras se pueden quedar 
toda la 
B 8.5.1.3.12  noche o por más tiempo. 
B 8.5.1.3.13  Agregar 1 mL de solución de cloruro de potasio en cada matraz. 
B 8.5.1.3.14  Enfriar a temperatura ambiente. 
B 8.5.1.3.15  Diluir con agua y agregar más agua para compensar el volumen de grasa en el matraz. 
B 8.5.1.3.16  Mezclar perfectamente y filtrar de 30 a 50 mL  a través de un papel filtro Whatman No. 2 y 
recoger el filtrado en un recipiente de propileno, polipropileno o polietileno. 
B 8.5.1.3.17  No filtrar los blancos. Tapar las botellas durante  el análisis. Las soluciones son estables por 
varios meses. 
B 8.5.1.3.18  Correr un blanco de reactivos y muestra fo rtificada por cada serie de digestión. 
B 8.5.1.3.19  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica: flama u horno de grafito). 
B 8.5.1.4  Digestión por vía húmeda para la determinación de Hg. 
B 8.5.1.4.1 Sistema de reflujo. 
B 8.5.1.4.1.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad apropiada de muestra, dependiendo el tipo de 
ésta, en un matraz de digestión y adicionar perlas de ebullición. 
B 8.5.1.4.1.2  Conectar el matraz al sistema de reflujo y agregar poco a poco la cantidad necesaria de 
ácido nítrico concentrado y calentar durante media hora o hasta que no se observen cambios en la digestión. 
B 8.5.1.4.1.3  Dejar enfriar y agregar una mezcla de ácido nítrico y ácido sulfúrico concentrados (1 + 1). 
B 8.5.1.4.1.4  Calentar y agregar más ácido nítrico gota a go ta sobre las paredes del recipiente, hasta que 
el color obscuro de la solución desaparezca. 
B 8.5.1.4.1.5  Enfriar. 
B 8.5.1.4.1.6  Si existe grasa o cera filtrar la solución. 
B 8.5.1.4.1.7  Correr un blanco de reactivos y muestra fo rtificada por cada serie de digestión. 
B 8.5.1.4.1.8  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica de vapor frío). 
B 8.5.1.4.2 Sistema cerrado. 
B 8.5.1.4.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad apropiada de muestra, dependiendo el tipo de 
ésta, en el recipiente de digestión. 
B 8.5.1.4.2.2  Agregar la cantidad necesaria de ácido nítrico concentrado. 
B 8.5.1.4.2.3  Tapar y sellar perfectamente el recipiente de digestión. 
B 8.5.1.4.2.4  Si el recipiente de digestión es un matraz Erlenmeyer, colocar éste en una autoclave a 15 lb 
por 30 minutos. Si se utiliza bomba Parr, calentar en parrilla controlando la temperatura a un máximo de 
300ºC por 30 minutos. 
B 8.5.1.4.2.5  Enfriar a temperatura ambiente. 
B 8.5.1.4.2.6  En caso de que la digestión no sea completa adicionar peróxido de hidrógeno y repetir la 
digestión. 
Filtrar en caso de que exista grasa o cera y analizar el contenido de Hg.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 8.5.1.4.2.7  Correr un blanco de reactivos y muestra fo rtificada por cada serie de digestión. 
B 8.5.1.4.2.8  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica de vapor frío). 
B 8.5.1.5 Digestión para la determinación de As. 
B 8.5.1.5.1 Digestión por vía húmeda-seca. 
B 8.5.1.5.1.1  Proceder como en el punto 8.4.3.2 hasta que la digestión sea completa y posteriormente 
continuar con los siguientes pasos. 
B 8.5.1.5.1.2  Con una pipeta tomar una alícuota de la solución de muestra digerida y colocarla en un crisol 
Vycor o vaso de precipitados. 
B 8.5.1.5.1.3  Añadir 1 mL de solución de nitrato de magn esio al 7% p/v y calentar en una parrilla a 
temperatura baja, hasta sequedad. 
B 8.5.1.5.1.4  Incrementar el calor de la placa a un máximo de 375ºC. 
B 8.5.1.5.1.5  Colocar el matraz en la mufla a 450ºC para oxidar cualquier residuo de carbón y 
descomponer el exceso de nitrato de magnesio, por un tiempo mayor o igual a 30 minutos. 
B 8.5.1.5.1.6  Enfriar y disolver el residuo en 2,0 mL de ácido clorhídrico 8 M. 
B 8.5.1.5.1.7  Añadir 0,1 mL de yoduro de potasio al 20% p/v para reducir el As(V) a As(III). 
B 8.5.1.5.1.8  Dejar reposar por un tiempo mayor a 2 minutos y transferir a un matraz y llevar al aforo  con 
agua. 
B 8.5.1.5.1.9  Correr un blanco de reactivos y muestra fo rtificada por cada serie de digestión. 
B 8.5.1.5.1.10  Leer en el aparato de elección (espectróm etro de absorción atómica con adaptación para 
horno de grafito o generador de hidruros). 
B 8.5.1.5.2 Digestión por vía seca. 
B 8.5.1.5.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad necesaria de muestra en un crisol Vycor o  de 
platino. 
B 8.5.1.5.2.2  Añadir el volumen necesario de nitrato de magnesio al 50% p/v. 
B 8.5.1.5.2.3  Homogeneizar con una varilla limpia de plástico extendiendo la mezcla en el crisol. 
B 8.5.1.5.2.4  Colocar la muestra en una mufla subiendo gradualmente la temperatura hasta 300ºC por 2 
horas. Posteriormente subir gradualme nte la temperatura hasta 500ºC por 16 horas o durante toda la noche. 
B 8.5.1.5.2.5  Enfriar a temperatura ambiente y humedecer las cenizas con ácido nítrico al 50% v/v. 
B 8.5.1.5.2.6  Calentar en parrilla hasta la eliminación del ácido. 
B 8.5.1.5.2.7  Llevar los crisoles a una mufla elevan do gradualmente la temperatura de 23 a 500ºC, 
manteniendo ésta 30 min hasta evaporación total. 
B 8.5.1.5.2.8  Transferir las cenizas del crisol a un matraz aforado usando una porción de 10 mL de ácido 
clorhídrico 0,5 N. 
B 8.5.1.5.2.9  Enjuagar los crisoles con 5 mL de agua destilada y transferir al matraz, añadir 1 mL de 
solución de yoduro de potasio al 15% y mezclar. 
B 8.5.1.5.2.10  Dejar reposar durante 15 minutos y llevar al aforo. 
B 8.5.1.5.2.11  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión. 
B 8.5.1.5.2.12  Leer en el aparato de elección (espectróm etro de absorción atómica con adaptación para 
horno de grafito o generador de hidruros). 
B 8.5.1.6 .Digestión para la determinación de Cd, As, Pb, Sn, Cu, Fe, Zn y Hg por horno de microondas. 
Pesar con precisión de ± 0,1 mg, 0,500 g como má ximo de muestra, añadir 6 mL de ácido nítrico 
concentrado y 2 mL de agua oxigenada al 30%, cerrar pe rfectamente el envase de reacción y proceder según 
el manual del fabricante. 
B 8.5.1.7 Determinación de metales en agua potable y agua purificada. 
Las muestras incoloras, transparentes e inodoras y de  una sola fase, pueden analizarse directamente por 
espectrometría de absorción atómica, sin digestión. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
Previo a dicho análisis, adicionar a 100 mL de muestra,  1 mL de ácido nítrico, en caso de que se observe 
un precipitado, realizar una digestión adicionando 1 mL  más de ácido nítrico concentrado, calentar a 85ºC 
hasta reducir el volumen a 20 mL cuidando de que no hierva. Calentar a reflujo 30 minutos y transferir a un 
matraz volumétrico de 50 mL. Centrifugar a 1600 rpm por  30 minutos o dejar reposar toda la noche y analizar 
el sobrenadante. 
B 8.6  Procedimiento 
B.8.6.1  Espectrometría de absorc ión atómica por flama. 
B.8.6.1.1  Calibración. 
Es necesario comprobar que se tiene una calibración inicial y periódica aceptable. B 8.6.1.1.1  Se inicia la configuración operacional del in strumento y en el sistema de adquisición de datos. 
B 8.6.1.1.2  Permitir un periodo no menor a 30 minutos para el calentamiento de las lámparas de descarga 
sin electrodos. 
B 8.6.1.1.3  Se debe verificar la estabilidad del instrument o mediante el análisis de una solución estándar 
20 veces más concentrada que el límite de detección del instrumento (LDI) para el analito, leída un mínimo de 
cinco veces y calculando la desviación estándar resultante, la cual debe ser menor al 5%. 
B 8.6.1.1.4  El instrumento debe calibrarse para el analit o a determinar usando el blanco de calibración y 
los estándares de calibración preparados a 3 o 4 nive les de concentración dentro del intervalo dinámico de 
concentración del analito. 
B 8.6.1.1.5  Ajustar el instrumento a 0 con el blanco de calibr ación. Introducir los estándares de calibración 
del analito de menor a mayor concentración y registrar al  menos tres réplicas de la absorbancia de cada uno. 
B 8.6.1.1.6  Elaborar una curva de calibración graficando  absorbancia en función de la concentración. 
B 8.6.1.1.7  Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se programan directamente, en los cuales 
sólo es necesario introducir los estándar es y marcar su concentración teórica. 
B.8.6.1.2  Operación del instrumento. 
El desempeño del instrumento se verifica mediante el  empleo de blancos de calibración, estándares de 
calibración y una muestra de control de calidad (MCC). 
B 8.6.1.2.1  Después de que se ha realizado la calibración,  se debe verificar que el instrumento trabaje 
adecuadamente para el analito. Para ello se analiza una muestra de control de calidad. Si las mediciones 
varían en ± 10% o más, al valor establecido para la MCC,  el análisis debe interrumpirse y buscar la posible 
causa de error, el instrumento se debe re calibrar y verificar la nueva calibración. 
B 8.6.1.2.2  Para verificar que el instrumento no presenta deriva, por cada 10 análisis se debe analizar el 
blanco de calibración. Si el valor verdadero del analit o difiere ± 10% o más, el instrumento debe recalibrarse. 
Si el error persiste debe identificarse el problema y corregirse. 
B 8.6.1.2.3  Si la matriz de la muestra es responsable de la  deriva o afecta la respuesta del analito puede 
ser necesario trabajar por adiciones estándar. 
B 8.6.1.2.4  La demostración de la operatividad inicial del in strumento se hace estableciendo los límites de 
detección del método (LDM) para el analito y el intervalo de  calibración lineal. Para determinar el LDM se usa 
un blanco de reactivos fortificado con una concentración del analito equivalente de 2 a 5 veces el límite de 
detección estimado. Se hacen al menos 4 réplicas de  lectura de absorbancia del blanco de reactivos 
fortificado procesado a través de todo el método analítico. Los LDM se calculan de acuerdo a: 
LDM= t x s donde: t = valor de la "T" de Student a un intervalo de confianza de 99% y una desviación 
estándar estimada para n-1 grados de libertad. t = 3,14 para 7 réplicas. s = desviación estándar de las réplicas 
del análisis. 
B 8.6.1.2.5  El intervalo lineal de calibración se establece a partir de por lo menos 4 estándares de 
diferente concentración, uno de los cuales debe estar próximo al límite superior del intervalo lineal. 
B 8.6.1.3 Determinación 
B 8.6.1.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atóm ica en las condiciones adecuadas para la 
determinación del analito de acuerdo a las in dicaciones del manual del instrumento.       (Tercera Sección) DIARIO OFICIAL Viernes 10 de febrero de 2012 
B 8.6.1.3.2 Introducir el blanco de reactivos y la muestra a analizar y registrar los valores de absorbancia. 
Se debe analizar al menos un blanco de reactivos con cada grupo de muestras. Los valores obtenidos ponen 
de manifiesto la calidad de los reactivos usados  y el grado de contaminación del laboratorio. 
B 8.6.1.3.3  En los equipos que pueden programarse, la le ctura obtenida da directam ente la concentración 
del elemento en las unidades de concentración utilizadas. 
B 8.6.1.3.4 Se debe analizar al menos un blanco de reactivo s fortificado para cada grupo de muestras. Se 
calcula la exactitud como el porciento de recuperación. 
B 8.6.1.3.5 Se debe fortificar al menos una muestra por grupo  o el 10% de ellas lo que resulte mayor. La 
concentración añadida debe ser de aproximadamente 0,1 unidades de absorbancia. 
B 8.6.1.3.6 Se debe calcular el porciento de recuperación para el analito, de acuerdo a: 
R =CM - C 
x 100 
CA 
R = % recuperación 
CM = Concentración de la muestra fortificada C = Concentración de la muestra 
CA = Concentración equivalente de analito añadido a la muestra. 
Si la recuperación del analito en la muestra fortificada está fuera del intervalo previamente establecido y el 
blanco de reactivos fortificado está correcto, puede existir un problema relacionado con la matriz de la 
muestra. Los datos se deben verificar por el método de las adiciones estándar. 
B 8.6.2  Espectrometría de absorción at ómica por horno de grafito. 
B 8.6.2.1 Calibración. 
B 8.6.2.1.1  Proceder de acuerdo al punto B.8.6.1.1 
B 8.6.2.1.2  Elaborar una curva de calibración grafic ando área de pico o altura máxima contra 
concentración del analito. 
B 8.6.2.1.3  La calibración mediante el uso de una computadora o una calculadora basada en el ajuste 
sobre los datos de concentración respuesta es aceptada. 
B 8.6.2.1.4  Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se programan directamente, en los cuales 
sólo es necesario introducir los estándar es y marcar su concentración teórica. 
B 8.6.2.2  Operación del instrumento. 
Proceder de acuerdo a B.8.6.1.2 B 8.6.2.3  Determinación. 
B 8.6.2.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atóm ica en las condiciones adecuadas para la 
determinación del analito, de acuerdo a las re comendaciones del manual del instrumento. 
B 8.6.2.3.2  El programa de temperaturas para el horno de grafito puede variar dependiendo de la matriz 
de la muestra. En el caso de existir interferencias no  específicas (absorción molecular o dispersión de la luz), 
se recomienda consultar la bibliografía existente en cuanto a los métodos disponibles para eliminarlas, así 
como en el caso de interferencias de matriz. 
B 8.6.3  Espectrometría de absorción at ómica por generador de hidruros. 
B 8.6.3.1 Calibración. 
B 8.6.3.1.1  Proceder de acuerdo al punto B.8.6.1.1 
B 8.6.3.1.2  A partir de la solución estándar de As de 1000 mg/L, preparar una solución de As de 1 mg/L en 
ácido clorhídrico de concentración apropiada al méto do. Trazar una curva de calibración de absorbancia 
(máximo de la altura de pico) en función de la concentración del analito para un intervalo de concentración 
B 8.6.3.1.3  de 0 a 10 g/L de As bajo las mismas condiciones de la matriz de la muestra. 
B.8.6.3.2 Operación del instrumento. Viernes 10 de febrero de 2012 DIARIO OFICIAL (Tercera Sección)      
B 8.6.3.2.1  Proceder de acuerdo al punto B.8.6.1.2 
B 8.6.3.3 Determinación. 
B 8.6.3.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atóm ica en las condiciones adecuadas para la 
determinación de As: longitud de onda de 193,7 nm y lámpara de descarga sin electrodos. Colocar y ajustar la celda de absorción de acuerdo al manual del fabric ante. Ajustar el flujo de gas (nitrógeno o argón). 
B 8.6.3.3.2  Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de cali bración de ácido clorhídrico al 1,5% siguiendo 
las instrucciones del manual del fabricante. 
B 8.6.3.3.3  Optimizar con un estándar de calibración la respuesta  del instrumento al analito (por lo general, 
10 mL de una solución de 5 g/l de As da una absorbancia de 0,2), ajustando el tiempo de purga I, el tiempo 
de reacción y el tiempo de purga II. 
B 8.6.3.3.4  Tomar un volumen conocido de la muestra dirigida y seguir el mismo procedimiento que con 
los estándares de calibración. 
B 8.6.4 Espectrometría de absorción atómica por vapor frío. 
B 8.6.4.1 Calibración. 
B 8.6.4.1.1  Proceder de acuerdo al punto B.8.6.1.1 
B 8.6.4.1.2  A partir de la solución de trabajo de 1 g/mL preparar estándares de calibración que contengan 
0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1,0 g de Hg a frascos de reacción. A cada frasco agregar 100 mL de la solución de 
dilución y 20 mL de la solución de reducción. Trazar la curva de calibración de absorbancia (altura máxima de pico) en función de la concentración del analito. 
B 8.6.4.2 Operación del instrumento. 
B 8.6.4.2.1  Proceder de acuerdo al punto B.8.6.1.2 
B 8.6.4.3 Determinación. 
B 8.6.4.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atóm ica en las condiciones adecuadas para la 
determinación de Hg: longitud de onda de 253,6 nm, slit  0,7 nm y lámpara de cátodo hueco. Colocar y ajustar 
la celda de absorción de acuerdo al manual del fabr icante. Ajustar el flujo de gas (nitrógeno o argón). 
B 8.6.4.3.2  Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibración (solución de dilución y de reducción) 
siguiendo las instrucciones del manual del fabricante. 
B 8.6.4.3.3  Optimizar con un estándar de calibración la respuesta del instrumento al analito. 
B 8.6.4.3.4  Tomar 25 mL de la muestra digerida y seguir el mismo procedimiento que con los estándares 
de calibración. 
B 8.7  Expresión de resultados 
B 8.7.1  Método de cálculo. 
Interpolar los valores de absorbancia o altura de pico de la muestra analizada en la curva de calibración y 
obtener los mg/kg del elemento en la muestra y realizar los cálculos empleando la siguiente fórmula: 
mg/ kg =A x B 
 
C 
en donde: 
A = Concentración en mg/kg de la muestra a interpolar en la curva de calibración. 
B = Volumen final al que se llevó la muestra (mL). 
C = Peso de la muestra (g) o volumen de la muestra (mL) en el caso de agua. En los equipos que pueden programarse, la lectura obtenida da directamente la concentración del 
elemento en mg/kg o g/kg. 
B 8.7.2  Informe de la prueba 
Los resultados se informarán en mg/kg o g/kg del elemento a determinar. 
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