Version 15.12.2009/se  1 
Hochpathogene-Influenza-Impfstoff (inaktiviert) 2 
für Hühner 3 
Vaccinum influenzae infectivae inactivatum ad 4 
pullum 5 
 6 
1. Definition 7 
Hochpathogene-Influenza-Impfstoff (inaktiviert) für  Hühner ist eine Zubereitung aus einem 8 
geeigneten Stamm des aviären  Influenza-Virus (zum Beispiel Subtyp H5). Das Virus  wird so 9 
inaktiviert, dass angemessene immunogene Eigenschaf ten erhalten bleiben. Viren geeigne- 10 
ter Stämme enthalten sowohl Hämagglutinin als auch Neuraminidase. Diese Monographie 11 
gilt für Impfstoffe, die zur aktiven Immunisierung von Hühnern gegen hochpathogene Geflü- 12 
gel-Influenza bestimmt sind. 13 
 14 
2. Herstellung 15 
2-1 Impfstoffherstellung 16 
Das Impfvirus wird in Bruteiern von Hühnern oder in  Zellkulturen vermehrt. Die Virusernte 17 
wird inaktiviert. Der Impfstoff kann Adjuvanzien en thalten. 18 
 19 
2-2 Substrat für die Virusvermehrung 20 
2-2-1 Bruteier : Wenn das Impfvirus in Bruteiern von Hühnern verme hrt wird, müssen diese 21 
aus gesunden Beständen oder SPF-Herden (5.2.2) stam men. 22 
 23 
2-2-2 Zellkulturen : Wenn das Impfvirus in Zellkulturen vermehrt wird,  müssen diese den 24 
Anforderungen an Zellkulturen für die Herstellung v on Impfstoffen für Tiere (5.2.4) entspre- 25 
chen. 26 
 27 Hochpathogene-Influenza-Impfstoff (inaktiviert) für  Hühner 2  
Version 15.12.2009/se 2-3 Saatgut 1 
2-3-1 Fremde Agenzien : Das Mastersaatgut muss den Prüfungen auf fremde A genzien in 2 
Saatgut (2.6.24) entsprechen. Bei diesen Prüfungen am Mastersaatgut dürfen die verwende- 3 
ten Saatviren zu Beginn der Prüfungen höchstens 5 P assagen vom Mastersaatgut entfernt 4 
sein. 5 
 6 
2-4 Auswahl der Impfstoffzusammensetzung 7 
Der Impfstoffstamm sollte vorzugsweise von einem ni edrigpathogenen Stamm abgeleitet 8 
sein und die Auswahl des für die Impfstoffherstellu ng verwendeten Stamms beruht auf epi- 9 
demiologischen Daten. 10 
Der Impfstoff muss für die Hühner, für die er besti mmt ist, nachweislich hinsichtlich Unschäd- 11 
lichkeit (5.2.6) und Wirksamkeit (5.2.7) zufrieden stellende Ergebnisse aufweisen. 12 
Zum Nachweis der Wirksamkeit muss mindestens die Pr üfung auf Immunogenität (Abschnitt 13 
2-4-1) durchgeführt werden. Wenn möglich sollte zud em gezeigt werden, dass der Impfstoff 14 
eine Übertragung von Viren über den direkten Kontak t von geimpften und anschliessend 15 
infizierten Hühnern auf ungeimpfte Hühner verhinder t. 16 
 17 
2-4-1 Immunogenität : Die Prüfung wird für jede für die Impfung empfohl ene Art und Metho- 18 
de der Anwendung durchgeführt. In jedem Fall werden  Hühner aus SPF-Herden (5.2.2) im 19 
für die Impfung empfohlenen Mindestalter verwendet.  Die jedem Huhn verabreichte Impf- 20 
stoffmenge darf höchstens die geringstmögliche in d er Beschriftung angegebene Wirksam- 21 
keit haben. 22 
Für die Prüfung werden mindestens 30 Hühner derselb en Herkunft verwendet. Mindestens 23 
20 Hühner werden mit jeweils einer Impfstoffdosis g eimpft. Mindestens 10 Hühner werden 24 
als Kontrolle mitgeführt. Nach 21 Tagen werden den Hühnern Blutproben entnommen und in 25 Hochpathogene-Influenza-Impfstoff (inaktiviert) für  Hühner 3  
Version 15.12.2009/se jedem Serum wird der Antikörpertiter mit einer geei gneten Methode wie einem Hämaggluti- 1 
nationshemmtest 1 bestimmt. 2 
Spätestens 21 Tage nach der Impfung werden die Hühn er mit einem epidemiologisch rele- 3 
vanten, hochpathogenen Stamm von Geflügel-Influenza -Virus in einer genügend grossen 4 
Menge (zum Beispiel 10 6 EID50  je Huhn) durch Anwendung am Auge oder nasal belast et. 5 
Nach der Belastung werden von jedem Huhn Abstriche im Mund-Rachen-Bereich und von 6 
der Kloake gewonnen und auf vorhandenes Belastungsv irus mit einer ausreichend empfind- 7 
lichen Methode 1 geprüft. Proben werden an den Tagen 1, 2, 3, 4, 7 und danach 2-mal wö- 8 
chentlich gewonnen. Die Hühner werden nach der Bela stung mindestens 1-mal täglich beo- 9 
bachtet, bis bei allen geimpften Hühnern in 2 aufei nander folgenden Proben keine Virusaus- 10 
scheidung mehr nachgewiesen werden kann. 11 
 12 
Die Prüfung ist nur gültig, wenn 13 
/square4 alle Kontrolltiere innerhalb von 3 Tagen nach der Belastung sterben, 14 
/square4 Virus in Abstrichen von mindestens 90 Prozent der Kontrolltiere nachweisbar ist, 15 
/square4 bei keinem Kontrolltier zum Zeitpunkt der Belastun g Antikörper gegen Influenza-Virus 16 
nachweisbar sind. 17 
 18 
Der Impfstoff entspricht der Prüfung, 19 
/square4 wenn zum Zeitpunkt der Belastung mindestens 90 Pro zent der geimpften Hühner einen 20 
Titer von mindestens 6 log 2 an Antikörpern gegen den Subtyp des Virus im Impfs toff auf- 21 
weisen. 22 
/square4 in Fällen, in welchen der Anspruch erhoben wird, k linische Symptome zu vermindern, 23 
wenn mindestens 90 Prozent der geimpften Hühner übe rleben und keine Anzeichen ei- 24 
ner Infektion mit Geflügel-Influenza-Virus aufweise n. 25 
                                                
1 Eine geeignete Methode ist im „Manual of Diagnostic  Tests and Vaccines for Terrestrial Animals“, 
die von der OIE (Office Internationale des Epizooti es) herausgegeben wird, beschrieben.  Hochpathogene-Influenza-Impfstoff (inaktiviert) für  Hühner 4  
Version 15.12.2009/se /square4 in Fällen, in welchen der Anspruch erhoben wird, d ie Virusausscheidung zu vermindern, 1 
wenn in höchstens 20 Prozent der Abstriche von geim pften Hühnern Virus nachgewiesen 2 
wird und die Menge des ausgeschiedenen Virus um 3 l og 10  geringer ist als in Abstrichen 3 
der Kontrolltiere. 4 
 5 
2-5 Prüfungen durch den Hersteller 6 
2-5-1 Restliches vermehrungsfähiges Virus : Die Amplifikationsprüfung auf restliches ver- 7 
mehrungsfähiges Virus wird nach Methode 2-5-1-1 ode r 2-5-1-2 durchgeführt, wobei die 8 
empfindlichere Methode angewendet wird. 9 
Die Menge der für die Prüfung verwendeten inaktivie rten Virusernte muss mindestens 10 10 
Impfstoffdosen entsprechen. 11 
 12 
2-5-1-1 Prüfung in Zellkulturen : Die inaktivierte Virusernte wird in geeignete Zel len inokuliert. 13 
Nach einer Inkubationszeit von 8 Tagen wird eine Su bkultur hergestellt, anschliessend wird 14 
weitere 6 bis 8 Tage lang inkubiert. Etwa 0,1 ml de s Überstands werden mit einem Hämag- 15 
glutinationstest auf vermehrungsfähiges Virus unter sucht. Wenn Hämagglutination auftritt, 16 
wird eine weitere Passage in der Zellkultur durchge führt und erneut auf Hämagglutination 17 
geprüft.  18 
Die inaktivierte Virusernte entspricht der Prüfung,  wenn im Überstand der zweiten Passage 19 
oder, falls erforderlich, im Überstand der dritten Passage keine Hämagglutination mehr 20 
nachweisbar ist. 21 
 22 
2-5-1-2 Prüfung in Bruteiern:  0,2 ml Impfstoff werden jeweils in die Allantoishö hle von zehn 9 23 
bis 11 Tage alten Bruteiern aus einer SPF-Hühnerher de (5.2.2) inokuliert und 3 bis 4 Tage 24 
lang bei 37 bis 42 oC inkubiert. 0,5 ml Allantoisflüssigkeit jedes über lebenden Embryos wer- 25 
den gewonnen und gepoolt. 0,2 ml der gepoolten Flüs sigkeit werden auf die gleiche Art in 26 
jeweils weitere 10 Bruteier derselben Herkunft inok uliert und 3 bis 4 Tage lang bei 37 bis 42 27 
oC inkubiert. Von jedem überlebenden Embryo werden 0 ,1 ml Allantoisflüssigkeit gewonnen 28 Hochpathogene-Influenza-Impfstoff (inaktiviert) für  Hühner 5  
Version 15.12.2009/se und einzeln mit einem Hämagglutinationstest auf ver mehrungsfähiges Virus geprüft. Wenn 1 
bei einer Allantoisflüssigkeit Hämagglutination nac hgewiesen wird, erfolgt mit dieser Flüssig- 2 
keit eine weitere Passage in Eiern. Die jeweiligen Überstände werden auf Hämagglutination 3 
geprüft. Wenn mehr als 20 Prozent der Embryonen in einem der Stadien sterben, wird die 4 
Prüfung in diesem Stadium wiederholt. 5 
Die inaktivierte Virusernte entspricht der Prüfung,  wenn nach der letzten Passage in Eiern in 6 
keiner Allantoisflüssigkeit Hämagglutination nachwe isbar ist. 7 
 8 
2-5-2 Hämagglutinin-Gehalt : Der Hämagglutinin-Gehalt der inaktivierten Viruss uspension 9 
wird, falls zutreffend nach Reinigung und Konzentra tion, mit einer geeigneten immunchemi- 10 
schen Methode (2.7.1) wie der einfachen radialen Im mundiffusion unter Verwendung einer 11 
geeigneten Hämagglutinin-Referenzzubereitung bestim mt. 12 
Die inaktivierte Virussuspension entspricht der Prü fung, wenn der Gehalt nachweislich inner- 13 
halb der Grenzen liegt, welche die Herstellung eine s zufriedenstellenden Impfstoffs ermögli- 14 
chen. 15 
 16 
2-5-3 Bestimmung der Wirksamkeit einer Charge : Die „Bestimmung der Wirksamkeit“ 17 
(Abschnitt 3-6) an jeder Impfstoffcharge ist nicht erforderlich, wenn die Prüfung an einer 18 
Impfstoffcharge mit der geringstmöglichen Wirksamke it durchgeführt wird. Wenn diese Be- 19 
stimmung nicht durchgeführt wird, muss eine alterna tive, validierte Methode angewendet 20 
werden, wobei sich die Akzeptanzkriterien nach eine r Impfstoffcharge richten, mit der nach 21 
der unter „Bestimmung der Wirksamkeit“ beschriebene n Methode zufrieden stellende Ergeb- 22 
nisse erzielt wurden. Dabei wird auch der Antikörpe rtiter in den Sera der Hühner berücksich- 23 
tigt, die bei der Belastungsprüfung wie unter „Immu nogenität“ (2-4-1) beschrieben vor patho- 24 
genem Virus geschützt werden. Die folgenden Prüfung en können durchgeführt werden: 25 
 26 Hochpathogene-Influenza-Impfstoff (inaktiviert) für  Hühner 6  
Version 15.12.2009/se Eine geeignete Impfstoffdosis wird 10 Hühnern im Al ter von 21 Tagen derselben Herkunft 1 
und aus einer SPF-Herde (5.2.2) auf eine der empfoh lenen Arten der Anwendung verab- 2 
reicht. Mindestens 5 Hühner werden als Kontrolle mi tgeführt. 3 
 4 
Serumproben von jedem Huhn werden unmittelbar vor d er Verabreichung des Impfstoffs und 5 
zu einem festgelegten Zeitpunkt 14 bis 21 Tage nach  der Impfung gewonnen. Der Antikör- 6 
pertiter in jedem Serum wird mit einem Hämagglutina tionshemmtest 1 bestimmt. 7 
Der Impfstoff entspricht der Prüfung, wenn der Mitt elwert der Antikörpertiter in den Sera der 8 
geimpften Hühner mindestens dem festgelegten Akzept anzkriterium entspricht. 9 
 10 
Die Prüfung ist nur gültig, wenn in den Sera nicht geimpfter Hühner (Kontrolltiere) keine Anti- 11 
körper gegen Influenza-Virus nachgewiesen werden, d .h. der Titer im Hämagglutinations- 12 
hemmtest höchstens 2,0 log 2 ist. 13 
 14 
3. Prüfungen an jeder Charge 15 
3-1 Prüfung auf Identität 16 
Nach Impfung von Tieren, die frei von Antikörpern g egen Geflügel-Influenza-A Virus sind, 17 
stimuliert der Impfstoff die Bildung spezifischer A ntikörper gegen Hämagglutinin und Neura- 18 
minidase des im Impfstoff enthaltenen Subtyps des G eflügel-Influenza-Virus. 19 
 20 
3-2 Bakterien, Pilze 21 
Der Impfstoff muss der Prüfung „Sterilität“ der Mon ographie Impfstoffe für Tiere (Vaccina 22 
ad usum veterinarium)  entsprechen. 23 
 24 
3-3 Unschädlichkeit 25 
Die Prüfung wird mit 10 Hühnern höchstens im für di e Impfung empfohlenen Mindestalter, 26 
die aus einer SPF-Herde (5.2.2) stammen, durchgefüh rt. 27 Hochpathogene-Influenza-Impfstoff (inaktiviert) für  Hühner 7  
Version 15.12.2009/se Jedem Huhn wird eine doppelte Dosis des Impfstoffs auf eine der empfohlenen Arten der 1 
Anwendung verabreicht. Die Hühner werden 21 Tage la ng mindestens 1-mal täglich beo- 2 
bachtet. 3 
 4 
Der Impfstoff entspricht der Prüfung, wenn kein Huh n deutliche Anzeichen von Geflügel- 5 
Influenza aufweist oder aus Gründen stirbt, die auf  den Impfstoff zurückzuführen sind. 6 
 7 
3-4 Restliches vermehrungsfähiges Virus 8 
Die Prüfung auf restliches vermehrungsfähiges Virus  wird durchgeführt, um die Inaktivierung 9 
des Geflügel-Influenza-Virus zu bestätigen. 10 
9 bis 11 Tage alte Bruteier von Hühnern aus einer S PF-Herde (5.2.2) werden verwendet. In 11 
die Allantoishöhle von 10 Bruteiern werden je 0,2 m l des Impfstoffs inokuliert. Die Bruteier 12 
werden 3 bis 4 Tage lang bei 37 bis 42 oC inkubiert. Von jedem überlebenden Embryo wer- 13 
den 0,5 ml Allantoisflüssigkeit gewonnen und einzel n mit einem Hämagglutinationstest auf 14 
vermehrungsfähiges Virus geprüft. Tritt in einer Al lantoisflüssigkeit Hämagglutination auf, 15 
wird mit dieser Flüssigkeit eine weitere Passage in  Bruteiern durchgeführt und die dabei ge- 16 
wonnene Allantoisflüssigkeit auf Hämagglutination g eprüft. Wenn mehr als 20 Prozent der 17 
Embryonen in einem Stadium sterben, wird die Prüfun g in diesem Stadium wiederholt. 18 
 19 
Der Impfstoff entspricht der Prüfung, wenn keine Hä magglutination in der Allantoisflüssigkeit, 20 
die nach dieser letzten Passage gewonnen wird, auft ritt. 21 
 22 
3-5 Fremde Agenzien 23 
Die Prüfung auf fremde Agenzien wie Aviäre-Enzephal omyelitis-Virus, Infektiöse-Aviäre- 24 
Bronchitis-Virus, Aviäre-Leukose-Virus, Egg-Drop-Sy ndrom-Virus, Infektiöse-Aviäre-Bursitis- 25 
Virus, Infektiöse-Aviäre-Laryngotracheitis-Virus, M arek’sche-Krankheit-Virus und Newcastle- 26 
Krankheit-Virus erfolgt durch Verfahren zur Amplifi kation von Nukleinsäuren (2.6.21). 27 
 28 Hochpathogene-Influenza-Impfstoff (inaktiviert) für  Hühner 8  
Version 15.12.2009/se Die aufgeführten fremden Agenzien dürfen nicht nach weisbar sein. 1 
 2 
3-6 Bestimmung der Wirksamkeit 3 
Der Impfstoff muss den Anforderungen der unter „Imm unogenität“ (Abschnitt 2-3-2) be- 4 
schriebenen Bestimmung entsprechen, wenn er auf ein e der empfohlenen Arten und Metho- 5 
den der Anwendung verabreicht wird. 6