Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
SEGUNDA SECCION 
PODER EJECUTIVO 
SECRETARIA DE SALUD 
PROYECTO de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-247-SSA 1-2005, Productos y servicios. Cereales y sus 
productos. Cereales, harinas de cereales, sémolas o  semolinas. Alimentos a base de: cereales, semillas  comestibles, 
de harinas, sémolas o semolinas o sus mezclas. Prod uctos de panificación. Disposiciones y especificaci ones 
sanitarias y nutrimentales. Métodos de prueba. 
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice : Estados Unidos Mexicanos.- Secretaría de Salud. 
MIGUEL ANGEL TOSCANO VELASCO, Comisionado Federal p ara la Protección contra Riesgos 
Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacio nal de Normalización de Regulación y Fomento Sanita rio, 
con fundamento en el artículo 39 de la Ley Orgánica  de la Administración Pública Federal; 4o. de la Le y 
Federal del Procedimiento Administrativo; 3o. fracc ión XXIV, 13 apartado A, fracciones I y II, 17 bis fracciones 
II y III, 17 bis2, 114, 115, fracción VII, 194 frac ción I, 197, 199, 201, 205, 210, 212, 215 fracción I, 216 y demás 
aplicables de la Ley General de Salud; 38 fracción II, 40 fracciones I, II y XI, 41, 43, 46, 47 fracci ón I de la Ley 
Federal de Metrología y Normalización; 28 y 33 del Reglamento de la Ley Federal sobre Metrología y 
Normalización; 1o. fracción VII, 4o., 8o., 13, 15, 25, 30, 112, 113, 116, quinto transitorio y demás a plicables 
del Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios; 2o. inciso C, fracción X y 36 del Reglam ento 
Interior de la Secretaría de Salud; 3o. fracción I inciso C y fracción II, 10 fracciones IV y VIII, 12  fracción III y 
demás aplicables del Reglamento de la Comisión Fede ral para la Protección contra Riesgos Sanitarios, m e 
permito ordenar la publicación en el Diario Oficial  de la Federación el Proyecto de Norma Oficial Mexi cana 
PROY-NOM-247-SSA1-2005, Productos y servicios. Cere ales y sus productos. Cereales, harinas de cereales , 
sémolas o semolinas. Alimentos a base de cereales, semillas comestibles, de harinas, sémolas o semolin as o 
sus mezclas. Productos de panificación. Disposicion es y especificaciones sanitarias y nutrimentales. M étodos 
de prueba. 
El presente Proyecto se publica a efecto de que los  interesados, dentro de los siguientes 60 días 
naturales, contados a partir de la fecha de su publ icación, presenten sus comentarios por escrito y co n el 
sustento técnico suficiente ante el Comité Consulti vo Nacional de Normalización de Regulación y Foment o 
Sanitario, sita en Monterrey número 33, planta baja , colonia Roma, código postal 06700, México, D.F. t eléfono 
50 80 52 00, extensión 1131, correo electrónico rfs @salud.gob.mx. 
Durante el plazo mencionado, los documentos que sir vieron de base para la elaboración del Proyecto 
estarán a disposición del público para su consulta en el domicilio del Comité. 
PROYECTO DE NORMA OFICIAL MEXICANA PROY-NOM-247-SSA 1-2005, PRODUCTOS Y SERVICIOS. 
CEREALES Y SUS PRODUCTOS. CEREALES, HARINAS DE CERE ALES, SEMOLAS O SEMOLINAS. 
ALIMENTOS A BASE DE: CEREALES, SEMILLAS COMESTIBLES , DE HARINAS, SEMOLAS O 
SEMOLINAS O SUS MEZCLAS. PRODUCTOS DE PANIFICACION.  DISPOSICIONES Y 
ESPECIFICACIONES SANITARIAS Y NUTRIMENTALES. METODO S DE PRUEBA 
PREFACIO 
En la revisión de la presente Norma participaron lo s siguientes organismos e instituciones: 
SECRETARIA DE SALUD 
Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios 
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD PUBLICA 
INSTITUTO NACIONAL DE CIENCIAS MEDICAS Y DE NUTRICI ON “SALVADOR ZUBIRAN” 
PRODUCTOS ALIMENTICIOS LA MODERNA, S.A. DE C.V. 
DEUTSCHE QUIMICA S.A. DE C.V. 
MUHLENCHEMIE GMBH 
UNILEVER DE MEXICO S. DE R.L. DE C.V. 
COMPAÑIA NESTLE, S.A. DE C.V. 
KELLOGG COMPANY MEXICO, S. DE R.L. DE C.V. 
GRUPO ALTEX S.A. DE C.V.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
GRUPO TRIMEX S.A. DE C.V. 
MOLINO DE TRIGO EL PILAR, S.A. DE C.V. 
PROBST S.A. DE C.V. 
DSM NUTRITIONAL PRODUCTS MEXICO S.A. DE C.V. 
CANIMOLT 
GRUPO MINSA S.A. DE C.V. 
FABRICA DE HARINAS ELIZONDO S.A. DE C.V. 
CANAINPA 
CAMARA NACIONAL DE MAIZ INDUSTRIALIZADO 
AMEXIGAPA 
KRAFT FOODS DE MEXICO S. DE R.L. DE C.V. 
INDICE 
1.  OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACION 
2.  REFERENCIAS 
3.  DEFINICIONES 
4.  SIMBOLOS Y ABREVIATURAS 
5.  ESPECIFICACIONES SANITARIAS 
5.1  GENERALES 
5.2.  ESPECIFICAS 
5.2.1 ALMACENAMIENTO DE CEREALES DESTINADOS PARA CONSUMO HUMANO.  
5.2.2  HARINAS DE CEREALES, SEMOLAS O SEMOLINAS 
5.2.3 ALIMENTOS A BASE DE CEREALES, SEMILLAS COMESTIBLES,  HARINAS, SEMOLAS O 
SEMOLINAS, O SUS MEZCLAS 
5.2.4 PRODUCTOS DE PANIFICACION 
6. MUESTREO 
7. METODOS DE PRUEBA  
8. ETIQUETADO 
9. ENVASE Y EMBALAJE  
10. CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES 
11.  BIBLIOGRAFIA 
12. OBSERVANCIA DE LA NORMA 
13. VIGENCIA 
14. ANEXOS 
15.  APENDICES 
15.1  Apéndice Normativo A: Muestreo de cereales 
15.2  Apéndice Normativo B: Métodos de prueba 
1. Objetivo y campo de aplicación 
1.1 Esta Norma Oficial Mexicana establece las disposici ones y especificaciones sanitarias que deben 
cumplir el transporte y almacenamiento de cereales destinados para consumo humano, las harinas de 
cereales, sémolas o semolinas, así como los aliment os preparados a base de cereales, de semillas 
comestibles, de harinas, de sémolas o semolinas o s us mezclas y los productos de panificación. 
1.2  No son objeto de esta norma, los alimentos a base de cereales para lactantes y niños de corta edad. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
1.3  Esta Norma Oficial Mexicana establece los nutrimen tos que se deben adicionar en las harinas de trigo 
y de maíz nixtamalizado y su nivel de adición, exce ptuándose las utilizadas para: frituras, como textu rizantes o 
espesantes y base para harinas preparadas. 
1.4  Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obli gatoria en el Territorio Nacional para las personas  
físicas o morales que se dedican al proceso o impor tación de los productos objeto de esta Norma destin ados 
a los consumidores en el Territorio Nacional. 
2. Referencias 
Esta norma se complementa con lo siguiente: 
NOM-028-FITO-1995  Por la que se establecen los req uisitos fitosanitarios y especificaciones para la 
importación de los granos y semillas, excepto para siembra. 
NOM-086-SSA1-1994 Bienes y servicios. Alimentos y B ebidas no alcohólicas con modificaciones en su 
composición. Especificaciones nutrimentales. 
NOM-120-SSA1-1994 Bienes y Servicio. Prácticas de H igiene y Sanidad para el proceso de alimentos, 
bebidas no alcohólicas y alcohólicas. 
NOM-127-SSA1-1994 Salud Ambiental, agua para uso y consumo humano. Límites permisibles de 
calidad y tratamientos a que debe someterse el agua  para su potabilización. 
3. Definiciones 
Para fines de esta norma se entiende por: 
3.1 Adicionar , añadir uno o más componentes, tanto si están o no  contenidos normalmente en el 
producto. 
3.2 Aditivo , cualquier sustancia permitida que, sin tener prop iedades nutritivas, se incluya en la 
formulación de los productos y que actúa como estab ilizante, conservador o modificador de sus caracter ísticas 
organolépticas  para favorecer ya sea su estabilidad, conservación,  apariencia o  aceptabilidad.  
3.3 Aflatoxinas , a los metabolitos secundarios producidos por hong os Aspergillus flavus, Aspergillus 
parasiticus  y Aspergillus nomius , que tienen efectos tóxicos y cancerígenos en anim ales, incluido el hombre. 
3.4 Alimentos y bebidas no alcohólicas con modifica ciones en su composición , a los productos a los 
que se les han introducido cambios por adición, dis minución o eliminación de uno o más de sus nutrimen tos, 
tales como hidratos de carbono, proteínas, lípidos,  vitaminas y minerales, y que forman parte de la di eta 
habitual. 
3.5 Alimentos preparados a base de: cereales, semil las comestibles, de harinas, sémolas o 
semolinas o sus mezclas , a los productos alimenticios, elaborados a base d e granos de cereales u otros 
granos y semillas comestibles, enteros o sus partes  o molidos (harinas, sémolas o semolinas), preparad os 
mediante procesos físicos, aptos para ser consumido s directamente o previa cocción, adicionados o no d e 
aditivos y de otros ingredientes opcionales. Estos productos se pueden preparar por procesos tales com o: 
inflado, laminado, recubrimiento, tostado, extruido , aglomeración u otros. 
3.6 Azúcares,  todos los monosacáridos y disacáridos presentes en  un alimento o bebida no alcohólica.  
3.7 Biodisponibilidad, propiedad de un nutrimento que indica la proporción  de éste que es absorbida y 
utilizada por el organismo a partir de un alimento cuantificada por métodos experimentales reconocidos . 
3.8 Buenas prácticas de fabricación , conjunto de lineamientos y actividades relacionad as entre sí, 
destinadas a garantizar que los productos tengan y mantengan las especificaciones sanitarias requerida s para 
su uso o consumo. En particular en el caso de los a ditivos se refiere a la cantidad mínima indispensab le para 
lograr el efecto deseado. 
3.9 Cereales , a los granos comestibles de ciertas plantas perte necientes a la familia de las gramíneas de 
un solo cotiledón tales como: trigo, maíz, arroz, a vena, centeno, cebada, sorgo y amaranto, entre otro s. 
3.10 Cobertura , al ingrediente que se adiciona al producto de pan ificación de forma que lo cubra total o 
parcialmente. 
3.11  Consumidor, persona física o moral,  al que adquiere o disfruta como destinatario final  productos 
alimenticios y bebidas no alcohólicas preenvasados.  No es consumidor quien adquiera, almacene o utilic e 
alimentos y bebidas no alcohólicas preenvasados, co n objeto de integrarlos en proceso de producción 
transformación, comercialización o prestación de se rvicios a terceros.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
3.12 Dosis, al contenido de un principio activo de cada compone nte en la fórmula de las premezclas de 
micronutrimentos, independientemente del peso del c ompuesto químico que lo contiene y que ha sido 
recomendado. 
3.13 Embalaje , embalaje, al material que envuelve, contiene o pr otege debidamente a los envases 
primarios, secundarios, multiunitarios, que facilit a y resiste las operaciones de almacenamiento y tra nsporte, 
no destinado para su venta al consumidor en dicha p resentación. 
3.14 Envase o envase primario , a todo recipiente destinado a contener un product o y que entra en 
contacto con el mismo. 
3.15 Envase colectivo o múltiple, cualquier recipiente o envoltura en el que se encue ntran contenidos 
dos o más unidades iguales o diferentes de producto s preenvasados, destinados para su venta al consumi dor 
final en dicha presentación. 
3.16 Etiqueta , al  marbete, rótulo,  imagen, gráfica  u otra forma descriptiva que se haya escrito  impreso, 
marcado, en relieve, o hueco, grabado, adherido, pr ecintado o anexado al empaque o envase del producto . 
3.17 Fecha de caducidad , a la fecha límite en que se considera que un prod ucto preenvasado 
almacenado en las condiciones sugeridas por el fabr icante, reduce o elimina las características sanita rias que 
debe reunir para su consumo. Después de esta fecha no debe comercializarse ni consumirse. 
3.18 Fecha de consumo preferente , fecha en que, bajo determinadas condiciones de al macenamiento, 
expira el periodo durante el cual el producto preen vasado es totalmente comercializable y mantiene cua ntas 
cualidades específicas se le atribuyen tácita o exp lícitamente, pero después de la cual el producto 
preenvasado puede ser consumido, siempre y cuando n o exceda la fecha de caducidad. 
3.19 Fortificar , es adicionar una o varias vitaminas, minerales o proteínas (aminoácidos) que 
normalmente no contiene el producto o en cantidad m ayor a la que contiene de manera natural. 
3.20 Galleta , al producto elaborado fundamentalmente, por una m ezcla de harina de trigo u otros cereales, 
grasas, aceites comestibles o sus mezclas y agua, c on o sin relleno, adicionada o no de azúcares, de o tros 
ingredientes opcionales y aditivos para alimentos, sometida a proceso de amasado o batido, y otros pro cesos 
como fermentación, modelado, troquelado y posterior  tratamiento térmico, dando lugar a un producto de 
presentación muy variada, caracterizado por su bajo  contenido en agua. 
3.21 Grano entero, cereal de granos intactos que al someterse a un pro ceso de molienda, rompimiento, 
hijuelado entre otros conserva sus principales comp onentes anatómicos y están presentes en una proporc ión 
relativamente igual a la existente en el grano inta cto original.  
3.22 Harina o Harina de trigo , a la obtenida de la molienda del trigo del grano maduro, entero, quebrado, 
y seco del género Triticum , L; de las especies T. vulgare , T. compactum  y T. durum  o mezclas de éstas, 
limpio, en el que se elimina gran parte del salvado  y germen y el resto se tritura hasta obtener un gr ano de 
finura adecuada. 
3.23 Harina de arroz , al producto resultante de la molienda del grano d e arroz; maduro, limpio, entero o 
quebrado y seco de la especie Oriza  sativa , L; blanco o ligeramente amarillento, el cual pued e presentarse 
con o sin pericarpio, sin glumas y pulido. 
3.24 Harina de avena , al producto resultante de la molienda del grano d e avena; maduro, limpio, entero y 
seco de la especie Avena sativa , L; y que además está libre de sus envolturas celu lósicas. 
3.25 Harina de cebada , al producto resultante de la molienda del grano d e cebada; maduro, limpio, entero 
y seco de la especie Hordeum vulgare . 
3.26 Harina de centeno , al producto resultante de la molienda del grano d e centeno; maduro, limpio, 
entero y seco, de la especie Secale cereale ; sin envolturas celulósicas. 
3.27 Harina de cereales , al producto resultante de la mezcla de 2 o más, c ereales o harinas de cereales. 
3.28 Harina de grano entero, al producto obtenido de la molienda del grano de ce real que conserva la 
cáscara y sus otros constituyentes en una proporció n relativa similar a la del grano intacto original,  lográndose 
esto ya sea de manera natural o por medios tecnológ icos. 
3.29 Harina de maíz , al producto resultante de la molienda húmeda o se ca de los granos de maíz; 
maduro, limpio y seco del género Zea , L; especies Z. mays  y otras. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
3.30 Harina de maíz nixtamalizado , al producto deshidratado que se obtiene de la molie nda de los 
granos del maíz nixtamalizado. 
3.31 Harina integral , al producto obtenido de la molienda del grano de cereal que conserva su cáscara y 
sus otros constituyentes. 
3.32 Ingredientes opcionales , a los que se pueden adicionar al producto, tales como azúcares naturales, 
mieles, frutas, jugos u otros productos comestibles . 
3.33 Inocuo , aquello que no causa daño a la salud. 
3.34 Límite máximo , a la cantidad establecida de aditivos, microorgan ismos, parásitos, materia extraña, 
plaguicidas, radionúclidos, biotoxinas, residuos de  medicamentos, metales pesados y metaloides que no se 
deben exceder en un alimento, bebida o materia prim a. 
3.35 Lote , a la cantidad de un  producto, elaborado en un mismo ciclo, integrado po r unidades 
homogéneas. 
3.36 Maíz nixtamalizado o nixtamal , al maíz (quebrado o entero) sano y limpio que ha sido sometido a 
cocción parcial con agua en presencia de hidróxido de calcio (cal), u otro material alcalino. 
3.37 Materia extraña , al material orgánico o inorgánico, ligero o pesad o, cuya presencia en el producto no 
es deseable y que por arriba de un límite máximo se  estima contaminante, considerándose entre otros: 
excretas, pelos de cualquier especie, fragmentos de  insectos, material plástico y otros objetos. 
3.38 Metal pesado o metaloide , a los elementos químicos que causan efectos indes eables en el 
metabolismo aun en concentraciones bajas. Su toxici dad depende de las dosis en que se ingieran así com o 
de su acumulación en el organismo. 
3.39 Métodos de prueba , a los procedimientos analíticos utilizados en el laboratorio para comprobar que 
un producto satisface las especificaciones que esta blece esta Norma. 
3.40 Mezcla de Vitaminas y Minerales o premezclas , al conjunto de ingredientes que se deben adiciona r 
a los alimentos objetos de esta Norma, en los térmi nos y cantidades especificados para cada caso. 
3.41 Molienda o molturación, al mecanismo mediante el cual los granos de los cer eales son triturados y 
reducidos a partículas de diversos tamaños, separab les entre sí por medios mecánicos. 
3.42 Muestra,  al número total de unidades de producto provenient es de un lote y que representan las 
características y condiciones del mismo. 
3.43 Nutrimento , a la sustancia que juega un papel metabólico y es tá habitualmente presente en la dieta. 
3.44 Pan blanco , al producto que resulta de hornear una masa obten ida de harina fermentada agua y sal, 
acondicionadores y mejoradores de masa, adicionado o no de aceites y grasas comestibles, leche, otros 
ingredientes y aditivos para alimentos. 
3.45 Pan de harina integral , al producto que resulta de la panificación de la masa fermentada, preparada 
con harina de trigo, harinas de cereales integrales  o de leguminosas, agua, sal, azúcares, grasas come stibles, 
otros ingredientes opcionales y aditivos para alime ntos . 
3.46 Pan dulce , al producto que puede ser elaborado con harina, a gua, huevo, azúcares, grasas o aceites 
comestibles, levaduras, al que se le pueden o no in corporar aditivos para alimentos, frutas en cualqui era de 
sus presentaciones, sal y leche; amasado, fermentad o, moldeado y cocido al horno o por fritura en gras as o 
aceites comestibles.  
3.47 Pastel o panqué , al producto que se somete a batido y horneado, pr eparado con harinas de cereales 
o leguminosas, azúcares, grasas o aceites, leudante  y sal; adicionada o no de huevo y leche, crema bat ida, 
frutas y otros ingredientes opcionales y aditivos p ara alimentos. 
3.48 Pay , al producto elaborado con harina de cereales o ga lleta molida, azúcares, agua y sal, con o sin 
leudante, grasas o aceites comestibles, fruta, crem a pastelera, ingredientes opcionales y aditivos par a 
alimentos; moldeado en forma de corteza para conten er un relleno dulce o salado, puede ser cubierto 
horneado, frito o congelado. 
3.49 Plaguicidas , a cualquier sustancia o mezcla de sustancias util izadas para prevenir, destruir, repeler o 
mitigar cualquier forma de vida que sea nociva para  la salud, los bienes del hombre o del ambiente, ex cepto la 
que exista sobre o dentro del ser humano y los prot ozoarios, virus, bacterias, hongos y otros microorg anismos 
similares sobre o dentro de los animales.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
3.50 Proceso , al conjunto de actividades relativas a la obtenci ón, elaboración, fabricación, preparación, 
conservación, mezclado, acondicionamiento, envasado , manipulación, transporte, distribución, 
almacenamiento y expendio o suministro al público d e productos. 
3.51 Producto a granel , al producto que debe pesarse, medirse o contarse en presencia del consumidor 
por no encontrarse preenvasado al momento de su ven ta. 
3.52 Productos de bollería , a los que son cocidos por horneado de la masa fer mentada preparada con 
harina de trigo, u otros cereales, agua, sal, azúca res, grasas comestibles, leudante, aditivos para al imentos e 
ingredientes opcionales.  
3.53 Productos de panificación , a los obtenidos de las mezclas de harinas de cere ales o harinas 
integrales o leguminosas, agua potable, fermentados  o no, que pueden contener: mantequilla, margarina,  
aceites comestibles, sal, leudantes, polvo de horne ar y otros aditivos para alimentos, especias y otro s 
ingredientes opcionales tales como, azúcares, miele s, frutas, jugos, granos y semillas comestibles, en tre 
otros; sometidos a proceso de horneado, cocción o f ritura; con o sin relleno o con cobertura, pueden s er 
mantenidos a temperatura ambiente, en refrigeración  o en congelación según el caso. 
3.54 Producto preenvasado , a los productos que cuando son colocados en un en vase de cualquier 
naturaleza no se encuentra presente el consumidor y  la cantidad de producto en éste no puede ser alter ada, 
al menos que el envase sea abierto o modificado per ceptiblemente. 
3.55 Refrigeración , al método de conservación físico con el cual se m antiene el producto a una 
temperatura máxima de 7° C (280 K). 
3.56 Relleno , al ingrediente agregado antes o después del horne ado y que se encuentra en la parte 
interna o entre dos o más unidades de los productos  de panificación. 
3.57 Sémolas o semolinas , a las fracciones de granulometría diferentes a la s de las harinas derivadas de 
la molienda de cereales, libre de tegumentos y germ en. 
3.58 Semillas comestibles, a las que se consumen de forma directa o se utiliza n en la elaboración de 
otros productos, como: leguminosas, semillas de cal abaza y girasol, entre otras. 
4. Símbolos y abreviaturas 
Cuando en esta norma se haga referencia a los sigui entes símbolos y abreviaturas se entiende por: 
AF  aflatoxinas 
Alc. Vol. alcohol volumen 
As arsénico 
BPF buenas prácticas de fabricación 
CE coeficiente de extinción 
Cd cadmio 
cm centímetro 
cSt centistoke 
CI color index 
spp cualquier especie 
° C grado Celsius 
IDR Ingesta Diaria Recomendada 
K grado Kelvin 
g gramo 
h hora 
= igual 
kg kilogramo 
L levógiro Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
LMR límite máximo residual 
± más - menos 
> mayor que 
< menor que 
< menor o igual a 
Hg mercurio 
HPLC cromatografía líquida de alta resolución 
µg microgramo 
mg miligramo 
ml mililitro 
µl microlitro 
µm micrómetro 
mm milímetro 
m/m masa masa 
MM  milimolar 
min minuto 
M  molar 
N  normal 
Ng  nanogramo 
nm  nanómetro 
NMP número más probable 
Ø  diámetro 
p peso 
Pb plomo 
PBS  solución amortiguadora de fosfatos 
pH  potencial de hidrógeno 
t  toneladas 
t/min  toneladas por minuto 
X poder de resolución 
/ por 
x por 
% por ciento 
UFC unidades formadoras de colonias 
v volumen 
Cuando en la presente norma se mencione a: 
Secretaría,  debe entenderse que se trata de la Secretaría de S alud. 
Reglamento , debe entenderse que se trata del Reglamento de Co ntrol Sanitario de Productos y Servicios. 
CICOPLAFEST , debe entenderse que se trata de la Comisión Inter secretarial para el Control del Proceso 
y uso de Plaguicidas, Fertilizantes y Sustancias Tó xicas.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
Acuerdo,  debe entenderse que se trata del Acuerdo por el qu e se determinan las sustancias permitidas 
como aditivos y coadyuvantes en alimentos, bebidas y suplementos alimenticios y sus modificaciones. 
5. Especificaciones sanitarias 
5.1  Generales  
Las materias primas que se empleen para la elaborac ión de los productos objeto de esta norma, deben 
cumplir con lo establecido en el Reglamento vigente  y en las Normas Oficiales Mexicanas correspondient es. 
5.1.1  En el proceso de los productos objeto de esta Norm a, se deben aplicar las prácticas de higiene y 
sanidad establecidas en la NOM-120-SSA1-1994, señal ada en el apartado de referencias o la que la 
sustituya. 
5.1.2  El agua que se utilice en el proceso deberá cumpli r con el límite permisible de cloro residual libre y 
de organismos coliformes totales y fecales establec idos en la NOM-127-SSA-1-1994. 
5.1.3  Los productos objeto de esta norma con modificacio nes en su composición, deben sujetarse a lo 
establecido en el Reglamento y en la NOM-086-SSAI-1 994, Bienes y servicios. Alimentos y Bebidas no 
alcohólicas con modificaciones en su composición. E specificaciones nutrimentales o la que la sustituya . 
5.1.4  El proveedor de las materias primas, las unidades de transporte y los establecimientos en donde se 
procesen o comercialicen los productos objeto de es ta Norma, cada uno en el ámbito de su responsabilid ad, 
sólo podrán utilizar plaguicidas autorizados por la  Secretaría en el marco de coordinación de la 
CICOPLAFEST. 
5.2 Específicas  
5.2.1 Transporte y almacenamiento de cereales destinados para consumo humano. 
5.2.1.1 Las unidades de transporte deben someterse a limpie za, hasta eliminar suciedad, residuos 
vegetales, suelo, excretas, restos de animales, fau na nociva, telarañas, productos químicos, sus envas es, o 
cualquier producto o sustancia nociva para el produ cto. 
5.2.1.2 Cereales de importación deben sujetarse a lo que se  establece en la NOM-028-FITO-1995 
señalada en el apartado de referencias. 
5.2.1.3 Las bodegas y almacenamiento en intemperie deben da r aviso de funcionamiento conforme lo 
indica el artículo 200 bis de la Ley General de Sal ud mediante trámite SSA-04-001-A Aviso de funcionam iento, 
además de cumplir con lo siguiente: 
i) Establecer por escrito, en su caso, los lugares en los que se almacenarán cereales que rebasen el lími te 
máximo de AF señalado en esta Norma. 
ii)  En el caso de los almacenamientos en intemperies, deben contar con dispositivos que eviten el contact o 
de los cereales con el suelo y contar con termopare s. Los contenedores no deben presentar filtraciones  o 
roturas. 
iii)  Las bodegas deben ser edificios provistos de pared es, pisos y puertas, techados o que puedan ser 
cubiertos, en los que no deben existir goteras, nid os, fisuras o puertas en mal estado. Asimismo deben  contar 
con termopares y estar colocados en diferentes punt os del almacén para el monitoreo de la temperatura.  
iv) Durante el almacenamiento. 
iv.1) No deben almacenarse en la misma bodega cereales co n concentraciones mayores de 20 µg/kg de AF. 
iv.2)  Durante la recepción, el grano debe ser secado a l a brevedad hasta alcanzar una humedad menor o 
igual 14,5%, misma que se debe conservar o disminui r durante todo el tiempo que permanezca almacenado.  
iv.3)  Se permite la aplicación a los cereales de fungist ato, siempre y cuando se emplee de acuerdo con las 
instrucciones del fabricante especificadas en la et iqueta. 
iv.4)  Los cereales no podrán estar en contacto con el su elo. 
v) Contaminantes. 
Determinación Límite máximo 
Aflatoxinas 20 µg/kg Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
vi)  Para efectos de control el almacenamiento debe doc umentarse en bitácoras o registros de manera que 
garantice los requisitos establecidos en la Tabla 1 . Los registros o bitácoras incluyendo los que se e laboren 
por medios electrónicos deben: 
vi.1) Contar con respaldos que aseguren la veracidad de l a información y un procedimiento para la 
prevención de acceso y correcciones no controladas.  
vi.2) Conservarse por lo menos durante un año y estar a d isposición de la autoridad sanitaria cuando así 
lo requiera. 
vi.3) El diseño del formato queda bajo la responsabilidad  del particular. 
Tabla 1. Información mínima de las bitácoras o regi stros 
Registro de: Información 
Almacenamiento a) Lugares donde se almacenarán los cereales que re basen el límite 
máximo. 
b) Origen de los productos. 
c) Fechas de recepción y de movilización de los pro ductos. 
d) Localización de los puntos de calentamiento (en su caso). 
Análisis del producto. a) Físicos del grano: 
- Porcentaje de humedad. 
- Porcentaje de grano dañado. 
- Porcentaje de plagas. 
- Temperatura. 
- Resultados. 
- Fechas. 
b) Aflatoxinas: 
- Resultados. 
- Zonas muestreadas. 
- Fechas. 
- Método(s) utilizado(s). 
 
5.2.2 Harinas de cereales, sémolas o semolinas 
Los cereales que se empleen como materia prima en l a elaboración de los productos objeto de este 
apartado deben ajustarse a la siguiente disposición : 
5.2.2.1  El productor de grano, el comercializador del mism o y el industrial, cada uno en el ámbito de su 
responsabilidad deben observar que los plaguicidas que se empleen en el tratamiento de granos y semill as 
almacenados, en medios de transporte, en áreas de a lmacenamiento, espacios vacíos y para el control de  
roedores, así como para la desinfestación y protecc ión de granos almacenados a granel o en costales, 
cumplan con los límites de uso y no excedan los niv eles máximos residuales establecidos en el Catálogo  
Oficial de Plaguicidas vigente. 
5.2.2.2  Los productos objeto de este apartado (5.2.2), ade más de sujetarse a lo establecido en el 
Reglamento deben cumplir con las siguientes especif icaciones: 
5.2.2.3  Físicas 
Determinación Límite máximo 
Humedad 15% 
Materia extraña No más de 50 fragmentos de insectos, no más de un p elo de 
roedor y estar exentos de excretas, en 50 g de prod ucto.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
5.2.2.4  Microbiológicas 
 Mesofílicos 
aerobios UFC/g Coliformes totales 
UFC/g 
Harina de trigo, sémolas o semolinas 50,000 NA 
Harina de maíz 100,000 100 
Harina de maíz nixtamalizada 50,000 100 
Harina de centeno 100,000 100 
Harina de cebada 100,000 100 
Harina de avena 50,000 50 
Harina de arroz 100,000 100 
Harinas integrales de trigo 500,000 NA 
Harinas integrales  500,000 500 
 NA = No Aplica 
5.2.2.5  Contaminantes. 
Determinación Límite máximo 
µg / kg 
Aflatoxinas  20 
Aflatoxinas para harina de maíz nixtamalizado 12 
 
5.2.2.6  Los productos objeto de este apartado deberán some terse a análisis para las determinaciones de 
plomo (Pb) y cadmio (Cd) periódicamente para efecto s de monitoreo. Los niveles de referencia (informat ivos) 
se establecen en el siguiente cuadro. 
Metales Pesados Límite máximo 
mg/kg 
Plomo (Pb) 0,5 
Cadmio (Cd) 0,1 
5.2.2.7  Aditivos . 
i)  En la elaboración de estos productos se permite el  empleo de los siguientes aditivos y coadyuvantes: 
Aditivo Límite máximo mg/kg de harina 
Peróxido de benzoilo 100 
Peróxido de calcio 50 
Dióxido de cloro 30, en harina para productos ferme ntados con 
levadura 
Cloro 1500, en harina para pasteles de elevada 
proporción de azúcar y materia grasa 
Azodicarbonamida 45, en harina para pan leudado 
Acido L- ascórbico y su sal de sodio* BPF 
Hidrocloruro de L- cisteína 75 
Dióxido de azufre 200, en harina para bizcochos y f abricación de 
pastas solamente 
Fosfato monocálcico 2500 
Lecitina 200 
* Uso exclusivo como aditivo, no como nutrimento. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
ii)  Enzimas, en la elaboración de los productos objeto  de este apartado se pueden emplear únicamente las 
enzimas listadas en el Acuerdo, derivadas de las fu entes que ahí se establecen y conforme a las BPF. 
5.2.2.8  Especificaciones nutrimentales. 
Las harinas de trigo y de maíz nixtamalizado deben ser adicionadas con todos los nutrimentos y en los 
niveles que se indican en la tabla siguiente. 
Nutrimento Nivel mínimo de adición mg/kg 
de harina Fuente recomendada 
Acido fólico 2 Acido fólico 
Hierro (como ión ferroso) 40 Sulfato o fumarato fer roso 
Tiamina (vitamina B 1) 5 Mononitrato de tiamina 
Riboflavina (vitamina B 2) 3 Riboflavina 
Niacina (vitamina B 3) 35 Nicotinamida 
Zinc 40 Oxido de zinc 
 
i) Cuando se utilice sulfato ferroso como fuente de hi erro, el aporte es de 31.61% como ión ferroso; si s e 
utiliza fumarato ferroso el aporte será de 31.4% 
ii) Cuando se utilice óxido de zinc como fuente de zinc , el aporte del mismo corresponderá al 79.54%.  
iii)  Se podrán utilizar otras fuentes de hierro y zinc,  siempre que la cantidad biodisponible sea, al meno s, 
equivalente a la de las fuentes recomendadas . 
iv)  Quedan exentas de la adición de micronutrimentos l os siguientes productos: 
iv.1)  Harinas para uso industrial distinto al consumo hu mano. 
iv.2)  Las sémolas y semolinas para pastas , en las que la adición podrá hacerse en la elaboraci ón de la 
pasta, debiendo cumplir con los mismos niveles de a dición; excepto para zinc.  
v)  Para efectos de control, los establecimientos que procesan harinas de trigo y de maíz nixtamalizado 
deberán contar con la siguiente información relativ a a la adición de nutrimentos: 
v.1)  Procedimientos escritos del proceso de adición y d e los controles aplicados para garantizar su 
eficiencia, incluidas las medidas correctivas que s e aplicarán en caso de desviaciones. 
v.2)  Registro de las variables críticas del proceso que  demuestren que se cumplen los procedimientos de 
adición, incluyendo reportes de las acciones correc tivas aplicadas cuando se detecten desviaciones o 
incumplimiento de las especificaciones nutrimentale s y resultados de análisis de producto terminado 
(autocontroles). 
vi) Las premezclas de nutrimentos deberán cumplir con l o siguiente: 
vi.1) La dosis deberá ser suficiente para alcanzar el niv el mínimo de cada nutrimento para la adición en 
mg/kg de harina. 
vi.2)  El envase debe de garantizar la estabilidad e inte gridad de los nutrimentos, es necesaria la 
protección a la luz, los materiales deben ser grado  alimenticio. 
vi.3)  Para estabilidad y almacenamiento se deben seguir las indicaciones del fabricante, en la 
especificación, hoja de seguridad y/o certificado d e análisis. 
vii) Deberá contarse con la evidencia documental que gar antice que las harinas que no han sido 
adicionadas serán destinadas para: frituras, como t exturizante o espesante o como base para harinas 
preparadas.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
5.2.3 Alimentos a base de cereales, de semillas com estibles, harinas, sémolas o semolinas o sus 
mezclas 
Los productos objeto de este apartado, deben cumpli r con las siguientes especificaciones: 
5.2.3.1  Microbiológicas. 
Especificaciones Límite máximo 
Mesofílicos aerobios 10 000 UFC/g 
Coliformes totales <30 UFC/g 
*Salmonella spp en 25 g negativa 
  * Sólo para pastas con huevo 
5.2.3.2  Los productos objeto de este apartado deberán some terse a análisis para las determinaciones de 
Pb y Cd, periódicamente para efectos de monitoreo. Los niveles de referencia se establecen en el cuadr o del 
numeral 5.2.2.6. 
5.2.3.3  Materia extraña. 
No más de 50 fragmentos de insectos, no más de un p elo de roedor y estar exentos de excretas, en 50 g 
de producto. 
5.2.3.4 Aditivos.  
En la elaboración de estos productos, se permite el  empleo de los siguientes aditivos y coadyuvantes 
i) Acentuadores de sabor 
Aditivos Límite máximo mg/kg de producto 
Cloruro de sodio BPF 
Glutamato monosódico BPF 
ii)  Antioxidantes  
Aditivos Límite máximo mg/kg 
Acido L-ascórbico BPF 
Acido palmitil-6-L-ascórbico 
(palmitato de ascorbilo) 300 mg/kg de grasa* 
Alfa tocoferol 85 cereales para el desayuno. 
200 pastas y fideos precocidos y 
productos análogos. 
2000 pastas y fideos deshidratados y 
productos análogos. 
150 postres a base de cereales. 
Butilhidroquinona terciaria (TBHQ) 200 mg/kg de gra sa 
Butilhidroxianisol (BHA) 50 
Butilhidroxitolueno (BHT) 50 
L-ascorbato cálcico BPF 
L-ascorbato sódico BPF 
Tocoferoles mezclados BPF 
*La cantidad máxima de uso como antioxidante, será independiente de la cantidad utilizada como 
nutrimento. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
iii)  Colorantes  
Aditivos Límite máximo mg/kg de producto 
Amarillo 2G 
Amarillo alimentos 5 
No C.I. 18965 100 mg/kg**** 
Amarillo ocaso FCF 
Amarillo alimentos 3 
No C.I. 15985 300 mg/kg**** 
Antocianinas BPF 
Azorrubina y sus lacas 
Rojo alimentos 3 y sus lacas 
Carmoisina 
No. C.I. 14720 200 mg/kg 
Azul brillante FCF 
Azul alimentos 2 y sus lacas 
No C.I. 42090 100 mg/kg 
Beta-apo 8'carotenal 
Anaranjado alimentos 6 
No C.I. 40820 30 
Cantaxantina 
Anaranjado alimentos 8 
No C.I. 40850 BPF 
Caramelo 
Clases I, II, III y IV BPF 
Carotenos naturales 
Anaranjado alimentos 5 
No C.I. 75130 BPF 
Clorofilas 
Verde natural 3 
No C.I.75810 BPF 
Clorofilina BPF 
Cúrcumina 
No C.I. 75300 BPF 
Dióxido de titanio 
Pigmento blanco 6 
No C.I. 77891 10 000 
Eritrosina 
Rojo alimentos 14 
No C.I. 45430 100 *       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
Extracto de annato 
(Extracto de semillas de Bixa 
orellana ). 
Anaranjado natural 4 
No C.I. 75120 25 
Extracto de cochinilla 
Rojo natural 4 
Carmín 
No. C.I, 75470 200 mg/kg 
Extractos de vegetales y frutas BPF 
Indigotina 
Azul alimentos 1 
No C.I. 73015 300 
Jugos de frutas BPF 
Jugos de vegetales BPF 
Oleorresina de paprika o 
extracto de paprika BPF 
Oxido de hierro amarillo 75 
Oxido de hierro negro 75 
Oxido de hierro rojo 75 
Ponceau 4R 
Rojo alimentos 7 
Rojo 6 200 
Riboflavina BPF 
Rojo allura AC 
Rojo alimentos 17 
No C.I. 16035 500 * 
Verde rápido F.C.F 
Verde alimentos 3 
No C.I. 42053 500 * 
Se pueden utilizar las lacas de aluminio de los col orantes sintéticos antes mencionados, 
en una concentración de uso que no exceda la concen tración permitida del colorante del 
que proceda. 
* La suma de estos colorantes artificiales no debe exceder de 500 mg/kg de producto. 
iv) Edulcorantes 
Aditivos Límite máximo mg/kg 
Lactitol BPF 
Maltitol BPF Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
v) Estabilizantes 
Aditivos Límite máximo g/kg de harina. 
Agar-agar BPF 
Alginato de calcio BPF 
Almidón modificado BPF 
Carboximetilcelulosa BPF 
Carboximetilcelulosa de sodio BPF 
Carragenina BPF 
Celulosa microcristalina BPF 
Esteres de ácido diacetil tartárico BPF 
Esteres de poliglicerol de ácidos 
grasos 10 Solo o combinado con otro éster 
Goma arábiga BPF 
Goma guar 12 
Goma xantano BPF 
Grenetina BPF 
Hidroxipropilmetilcelulosa BPF 
Lactitol BPF 
Lecitina BPF 
Maltodrextrina BPF 
Metil celulosa BPF 
Mono y diglicéridos de los ácidos 
grasos BPF 
Monoestearato de glicerilo BPF 
Monoglicéridos acetilados BPF 
Pectina BPF 
 
vi)  Humectantes 
Aditivos Límite máximo g/kg de producto 
Glicerina BPF 
Sorbitol 120 * 
* Su uso está limitado a dicha concentración tanto como humectante como edulcorante. 
vii)  Reguladores de pH  
Aditivos Límite máximo g/kg de producto 
Acetato de sodio 0,07 
Acido cítrico BPF 
Acido málico BPF 
Bicarbonato de sodio BPF 
Carbonato cálcico BPF       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
Citrato de sodio BPF 
D-L-ácido tartárico BPF 
Fosfato de calcio dibásico 5 * 
Fosfato de calcio monobásico 5 * 
Fosfato de calcio tribásico 5 * 
Fosfato de sodio dibásico 5 
Fosfato de sodio tribásico 5 
Pirofosfato de calcio 5 * 
*La cantidad máxima de uso como regulador(es) de ac idez, será 
independiente de la cantidad utilizada como aporte de calcio. 
viii) Saborizantes y aromatizantes  
En la elaboración de los productos objeto de este a partado, se permite el empleo de los saborizantes o  
aromatizantes establecidos en el Acuerdo. 
5.2.4 Productos de panificación 
5.2.4.1  Con el fin de establecer las especificaciones sani tarias por sus características, los productos objet o 
de este apartado se clasifican en: 
Galletas. 
Galletas con relleno o cobertura o sus combinacione s. 
Pan blanco. 
Pan dulce. 
Pan de harinas integrales. 
Pastel y panqué. 
Pays. 
Productos de bollería. 
5.2.4.2  Los productos objeto de este apartado, además de c umplir con lo establecido en el Reglamento 
deben ajustarse a las siguientes disposiciones: 
i)  Cuando se emplee alcohol etílico como ingrediente,  éste no debe exceder del 1,99% p/p 
ii)  Microbiológicas. 
ii.1)  Para el pan blanco, pan de harinas integrales y pr oductos de bollería: 
Especificaciones Límite máximo 
Mesofílicos aerobios 1000 UFC/g 
Coliformes totales <10 UFC/g 
ii.2) Pan  dulce: 
Especificaciones Límite máximo 
Mesofílicos aerobios 5000 UFC/g 
Coliformes totales 20 UFC/g 
Staphylococcus aureus  * < 100 UFC/g 
* Debe determinarse únicamente en el producto que c ontenga relleno o 
cobertura a base de huevo, leche, crema pastelera u  otro alimento 
preparado. 
ii.3)  Galletas: 
Especificaciones Límite máximo 
Mesofílicos aerobios 3000 UFC/g 
Coliformes totales <10 UFC/g Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
ii.4)  Galletas con relleno o cobertura o sus combinacion es: 
Especificaciones Límite máximo 
Mesofílicos aerobios 5000 UFC/g 
Coliformes totales 20 UFC/g 
ii.5)  Pasteles, panqués y pays: 
Especificaciones Límite máximo 
Mesofílicos aerobios 10000 UFC/g 
Coliformes totales 20 UFC/g 
Salmonella spp  en 25 g Negativo 
Escherichia coli * Negativo 
Staphylococcus aureus  ** 100 UFC/g 
*Se determinará únicamente bajo situaciones de emer gencia sanitaria, cuando 
la Secretaría de acuerdo al muestreo y los resultad os de los análisis 
microbiológicos detecte la presencia de dicho micro organismo. 
** Esta especificación debe determinarse únicamente  en pasteles y pays, que 
contengan relleno o cobertura a base de huevo, lech e, crema pastelera u otro 
alimento preparado. 
5.2.4.3 Materia extraña. 
No más de 50 fragmentos de insectos, no más de un p elo de roedor y estar exentos de excretas, en 50 g 
de producto. 
5.2.4.4  Los productos objeto de este apartado deberán some terse a análisis para las determinaciones de 
Pb y Cd periódicamente para efectos de monitoreo. L os niveles de referencia (informativos) se establec en en 
el cuadro del apartado 5.2.2.6. 
5.2.4.5  Aditivos para alimentos. 
En la elaboración de los productos objeto de este a partado, se permite el empleo de los aditivos y 
coadyuvantes siguientes: 
i)  Acentuadores de sabor 
Aditivos Límite máximo mg/kg de producto 
Acido glutámico BPF 
Cloruro de potasio BPF 
Etilmaltol 100 
Extracto de levadura de 
Sacharomyces cerevisae  BPF 
Guanilato disódico BPF 
Inosinato disódico BPF 
Sacarosa BPF 
 
ii) Acondicionadores de masa 
Aditivos Límite máximo g/kg de producto 
Acido ascórbico y sus sales de sodio 
y calcio BPF 
Carbonato de calcio BPF       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
Cloruro de amonio BPF 
Dióxido de silicio BPF 
Fumararo de calcio BPF 
Fumarato de potasio BPF 
Fumarato de sodio BPF 
Lactato de sodio o calcio BPF 
Mono y diglicéridos de ácidos grasos BPF 
Oxido de calcio BPF 
Sulfato de calcio 13 
Triacetina BPF 
 
iii) Antioxidantes 
Aditivos Límite máximo mg/kg de grasa 
Acido ascórbico BPF 
Acido fosfórico 1300 mg/kg 
Alfa-tocoferol 200 
Ascorbato de potasio BPF 
Ascorbato de sodio BPF 
Bisulfito de sodio 50 
Butilhidroxianisol (BHA) 200 
Butilhidroximetilfenol 200 
Butilhidroxitolueno (BHT) 200 
Galato de propilo 200 
Lecitina BPF 
Metabisulfito de sodio o potasio 50 
Oleorresina de paprika BPF 
Palmitato de Ascorbilo BPF 
Sulfito de potasio o sodio 50 
Terbutilhidroquinona (TBHQ) 200 
Tiosulfato de sodio 50 mg/kg 
Tocoferoles mezclados BPF 
 
iv) Colorantes 
Aditivos Límite máximo mg/kg de 
producto 
Amarillo 2G 
Amarillo alimentos 5 
No C.I. 18965* 100 
Amarillo ocaso FCF 
Amarillo alimentos 3 
No C.I. 15985* 300 
Azul brillante FCF 
Azul alimentos 2 y sus lacas 
No C.I. 42090*. 100 Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
Cantaxantina 
Anaranjado alimentos 8 
No C.I. 40850 BPF 
Caramelo 
Clases I, II, III y IV BPF 
Carotenos naturales 
Anaranjado alimentos 5 
No C.I. 75130 BPF 
Cúrcumina 
No C.I. 75300 BPF 
Dióxido de titanio 
Pigmento blanco 6 
No C.I. 77891 10 000 ** 
Eritrosina 
Rojo alimentos 14 
No C.I. 45430* 100 
Extracto de annato 
(Extracto de semillas de Bixa orellana ). 
Anaranjado natural 4 
No C.I. 75120 10 
Indigotina 
Azul alimentos 1 y sus lacas 
No C.I. 73015* 300 
Riboflavina BPF 
Rojo allura AC 
Rojo alimentos 17 
No C.I. 16035* 300 
ß-apo-8-carotenal 
Anaranjado alimentos 6 
No C.I. 40820 30 
Verde rápido F.C.F 
Verde alimentos 3 
No C.I. 42053 500* 
Se pueden utilizar las lacas de aluminio de los col orantes sintéticos antes mencionados, en 
una concentración de uso que no exceda la concentra ción permitida del colorante del que 
proceda. 
* Cuando se utilicen mezclas de colorantes artifici ales la suma de éstos no debe exceder 
de 500 mg/kg de producto, respetando la concentraci ón máxima de uso para cada uno de 
ellos. 
** Uso exclusivamente en productos de panificación con cobertura y relleno cremoso.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
v) Conservadores 
Aditivos Límite máximo mg/kg de producto 
Acido benzoico y sus sales de sodio 1000 solo o combinado con otro 
conservador permitido 
Acido propiónico y sus sales de sodio 
o calcio BPF 
Acido sórbico y sus sales de sodio y 
potasio 1000 solo o combinado con otro 
conservador permitido. 
Diacetato de sodio BPF 
Eritorbato de sodio BPF 
Propil parabeno 1000 solo o combinado con otro 
conservador permitido 
Sorbato de calcio 1000 
Sorbato de potasio 1000 
Sorbato de sodio 1000 
* Cuando se utilicen mezclas de conservadores la su ma de éstos no deberá exceder el límite 
máximo del conservador de mayor concentración. 
vi) Edulcorantes 
Aditivo Límite máximo 
Polidextrosa BPF 
 
vii)  Emulsivos, estabilizadores, espesantes y gelificant es 
Aditivos Límite máximo 
Agar agar BPF 
Alginato de amonio, calcio, potasio y 
sodio BPF 
Almidones modificados BPF 
Carboximetil celulosa de sodio BPF 
Carboximetilcelulosa BPF 
Carragenatos de calcio, potasio o 
sodio BPF 
Carragenina BPF 
Celulosa microcristalina BPF 
Cera de carnauba BPF 
Dextrinas BPF 
Estearoil 2-lactilato de sodio o calcio 5000 mg/kg de harina 
Esteres acéticos de los mono y 
diglicéridos de los ácidos grasos BPF 
Esteres de ácido diacetil tartárico BPF 
Esteres de poliglicerol de ácidos 
grasos 10000 mg/kg de harina solo o combinado con 
otro éster Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
Esteres de propilenglicol de ácidos 
grasos 3750 mg/kg de harina 
Esteres de sacarosa 3750 mg/kg de producto 
Esteres del ácido láctico de ácidos 
grasos BPF 
Fosfato de aluminio y sodio 1g/kg de harina 
Fosfato de sodio BPF 
Goma Arábiga BPF 
Goma de Algarrobo BPF 
Goma Guar BPF 
Goma Karaya BPF 
Goma laca  BPF 
Goma Tragacanto BPF 
Goma Xantano BPF 
Grenetina BPF 
Hidroxipropil metil celulosa BPF 
Lecitina BPF 
Metil celulosa BPF 
Metil etil celulosa BPF 
Mono y diglicéridos de los ácidos 
grasos BPF 
Monoestearato de Glicerilo BPF 
Monoestearato de sorbitán 6100 mg/kg de harina 
Monoglicéridos acetilados BPF 
Monoglicéridos succinilados 5g/kg de harina 
Monopalmitato de glicerilo BPF 
Pectinas BPF 
Polisorbato 60** 4600 mg/kg de producto 
Polisorbato 65** 3200 mg/kg de producto 
Polisorbato 80** 10000 mg/kg de producto 
Sales de amonio de ácido fosfatídico BPF 
Tripolifosfato de sodio BPF 
** Cuando se utilicen mezclas de polisorbatos, la s uma de éstos no debe exceder del 1%, 
respetando la concentración máxima de uso para cada  uno de ellos. 
viii) Gasificantes o polvos para hornear 
Aditivos Límite máximo mg/kg de harina 
Acido tartárico BPF 
Bicarbonato de amonio BPF 
Bicarbonato de potasio BPF 
Bicarbonato de sodio BPF       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
Carbonato de sodio, amonio o 
potasio BPF 
Fosfato monobásico de calcio 5000 
Pirofosfato ácido de sodio 2500 
Sulfato doble de aluminio y sodio BPF 
Tartrato ácido de potasio 2500 
 
ix) Humectantes 
Aditivos Límite máximo 
Alginato de propilenglicol 5000 mg/kg de producto 
Glicerina BPF 
Propilenglicol 5000 mg/kg de producto 
Sorbitol* 300 g/kg de producto 
* Su uso está limitado a dicha concentración tanto como humectante como edulcorante. 
La etiqueta del producto que contenga este aditivo alimentario se ajustará a lo 
establecido en la NOM-086-SSA1-1994 (véase referenc ias). 
x) Leudante 
Aditivos Límite máximo 
Levadura BPF 
 
xi) Reguladores de pH 
Aditivos Límite máximo 
Acetato de sodio 70 mg/kg de producto 
Acido acético BPF 
Acido cítrico BPF 
Acido clorhídrico BPF 
Acido fumárico y sus sales de sodio o 
potasio BPF 
Acido láctico BPF 
Acido málico BPF 
Carbonato de amonio BPF 
Carbonato de calcio BPF 
Citrato de sodio o potasio BPF 
Citrato dihidrogenado de sodio BPF 
Fosfato dibásico de calcio 2500 mg/kg de harina 
Fosfato dibásico de sodio 2500 mg/kg de harina 
Fosfato hidrogenado diamónico 9300 mg/kg de product o 
Fosfato tricálcico 5 mg/kg 
Hidróxido de calcio BPF 
Hidróxido de sodio BPF 
Lactato de amonio BPF 
Lactato de sodio o calcio BPF Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
xii) Saborizantes y aromatizantes 
En la elaboración de los productos objeto de este a partado, se permite el empleo de los saborizantes o  
aromatizantes establecidos en el Acuerdo. 
En la elaboración de los productos señalados en los  apartados 5.2.3 y 5.2.4 se pueden emplear las 
enzimas enlistadas en el Acuerdo, derivadas de las fuentes establecidas en dicho ordenamiento y confor me a 
las BPF. 
6. Muestreo  
El procedimiento de muestreo para los productos obj eto de esta norma, debe sujetarse a lo que establec e 
la Ley General de Salud. 
6.1 El método para el muestreo de los productos objeto de esta norma, debe llevarse a cabo como lo 
indica el numeral 15.1, apéndice normativo A muestr eo de cereales. 
7. Métodos de prueba 
7.1 Para la verificación de las especificaciones de los  productos objeto de esta norma, se deben aplicar l os 
métodos de prueba señalados en el apéndice normativ o B. 
8. Etiquetado 
Las etiquetas o envases impresos de los productos p reenvasados objeto de esta norma, además de 
cumplir con lo establecido en el Reglamento, deben cumplir con lo siguiente: 
8.1  Requisitos Generales  
8.1.1  Los productos objeto de esta norma que hayan sido modificados en su composición, deben sujetarse 
a lo establecido en el Reglamento y a la NOM-086-SS A1-1994, Alimentos y bebidas no alcohólicas con 
modificaciones en su composición. Especificaciones nutrimentales. 
8.1.2  Los productos destinados a ser comercializados en el mercado nacional, deben ostentar una etiqueta 
con la información a que se refiere esta Norma en i dioma español, independientemente de que también pu eda 
estar en otros idiomas, cuidando que los caracteres  sean al menos iguales en tamaño y proporcionalidad  
tipográfica y de manera igualmente ostensibles. 
8.1.3  La información contenida en las etiquetas debe pre sentarse y describirse en forma clara, veraz y 
comprobable. 
8.1.4  Las etiquetas que ostenten los productos preenvasa dos deben fijarse de manera tal que 
permanezcan disponibles hasta el momento de su uso y consumo en condiciones normales y deben aplicarse  
por cada unidad, envase múltiple o colectivo, con c aracteres claros, visibles, indelebles y en colores  
contrastantes, fáciles de leer por el consumidor en  circunstancias normales de compra y uso. 
8.1.5 Debe aparecer en la superficie principal de exhibic ión del envase del producto cuando menos, la 
denominación del producto preenvasado. El resto de la información a que se refiere esta Norma Oficial 
Mexicana puede incorporarse en cualquier otra parte  del envase del producto. 
8.1.6  Para el caso de envase múltiple o colectivo para s u venta al consumidor, la información a que se 
refiere esta Norma Oficial Mexicana debe figurar en  dicho envase. Sin embargo, la indicación del lote y la 
fecha de caducidad o de consumo preferente deben ap arecer en cada unidad y no tendrán que figurar en e l 
envase múltiple o colectivo. Además, en los product os se deberá indicar la leyenda "No etiquetado para  su 
venta individual" cuando los productos no declaren la información a que se refiere esta Norma. Esta le yenda 
no será necesaria cuando los envases individuales c ontenidos en un envase múltiple o colectivo, ostent en la 
información a que se refiere esta Norma Oficial Mex icana. 
8.1.7  Cuando el envase esté cubierto por una envoltura, debe figurar en ésta toda la información 
necesaria, excepto en los casos en que la etiqueta aplicada al envase pueda leerse fácilmente a través  de la 
envoltura exterior.        (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
8.1.8 Nombre o denominación del producto preenvasado 
8.1.8.1  El nombre o denominación del producto preenvasado debe corresponder con la establecida en los 
ordenamientos legales específicos, en ausencia de é stos, puede indicarse el nombre de uso común, o bie n, 
emplearse una descripción de acuerdo con las caract erísticas básicas de la composición y naturaleza de l 
producto, que no induzca a error o engaño al consum idor. En el caso de que haya sido objeto de algún t ipo de 
tratamiento se puede indicar el nombre de éste, con  excepción de aquellos que de acuerdo con los 
ordenamientos correspondientes sean de carácter obl igatorio. 
8.2 Declaración de ingredientes. 
8.2.1  En la etiqueta de los productos preenvasados cuya comercialización se haga en forma individual, 
debe figurar una lista de ingredientes, la cual pue de eximirse cuando se trate de productos de un solo  
ingrediente. 
8.2.2 La lista de ingredientes debe ir encabezada o prece dida por el término "ingredientes:" 
8.2.3 Los ingredientes deben enumerarse por orden cuantit ativo decreciente (m/m). 
8.2.4  Se debe declarar un ingrediente compuesto cuando c onstituya más del 25 por ciento y debe ir 
acompañado de una lista entre paréntesis de sus ing redientes constitutivos por orden cuantitativo decr eciente 
(m/m). Cuando constituya menos de ese porcentaje se  deben declarar los aditivos que desempeñan una 
función tecnológica en la elaboración del producto y aquellos ingredientes o aditivos que se asocien a  
reacciones alérgicas, de conformidad con los ordena mientos legales correspondientes. 
8.2.5 Cuando se trate de alimentos deshidratados o conden sados, destinados a ser reconstituidos, pueden 
enumerarse sus ingredientes por orden cuantitativo decreciente (m/m) en el producto reconstituido, sie mpre 
que se incluya una indicación como la que sigue: "i ngredientes del producto cuando se prepara según la s 
instrucciones de la etiqueta". 
8.2.6 En la lista de ingredientes debe emplearse una deno minación específica, excepto en las clases de 
ingredientes señalados en el Anexo I donde puede em plearse una denominación genérica. 
8.2.7  No obstante lo estipulado en el punto anterior, la  manteca de cerdo y el sebo se deben declarar 
siempre por su denominación específica.  
8.2.8  Los aditivos empleados en la elaboración de los pr oductos objeto de esta Norma, deben reportarse 
con el nombre común o los sinónimos establecidos en  el Acuerdo y sus modificaciones, a excepción de lo s 
saborizantes y las enzimas, los cuales pueden figur ar con la denominación genérica. 
8.2.9  Debe ser incluido en la lista de ingredientes todo  aditivo que haya sido empleado en los ingredientes  
y que se transfiera a otro producto en cantidad not able o suficiente para desempeñar en él una función  
tecnológica. 
8.2.10  Están exentos de su declaración en la lista de ing redientes los aditivos transferidos a los productos  
preenvasados que ya no cumplen una función tecnológ ica en el producto terminado, así como los 
coadyuvantes de elaboración, excepto aquellos que p uedan provocar reacciones alérgicas y de intoleranc ia. 
8.3.  Nombre y domicilio fiscal. 
8.3.1  Debe indicarse la denominación o razón social y el  domicilio fiscal del responsable del producto, est e 
último debe incluir de manera enunciativa mas no li mitativa: calle, número, código postal, ciudad y es tado. 
8.3.2  Para productos importados preenvasados debe indica rse en la etiqueta el nombre, denominación o 
razón social y domicilio fiscal del importador. Est a información puede incorporarse al producto preenv asado en 
territorio nacional, antes de la comercialización d el producto. 
Cuando en un establecimiento diferente al de la per sona física o moral, al licenciatario o causahabien te, 
propietario de la marca, participe en el proceso de  los productos, debe figurar en la etiqueta la leye nda 
“HECHO PARA...” o alguna equivalente, seguido del n ombre o domicilio (calle, número, colonia, código p ostal, 
ciudad y estado) del responsable del producto, asim ismo el lote debe permitir la identificación del o los 
establecimientos que intervienen en el proceso. 
8.4  País de origen  
Debe incorporarse la leyenda que identifique el paí s de origen del producto, por ejemplo: “Hecho en….” , 
“Producto de …”, “Fabricado en ….”, o leyenda equiv alente, seguida de país de origen. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
8.5  Identificación el lote. 
8.5.1  Cada envase debe llevar grabada o marcada de cualq uier modo, la identificación del lote al que 
pertenece, con una indicación en clave. 
8.5.2  La identificación del lote que incorpore el fabric ante en el producto preenvasado no debe ser alterad a 
u ocultada de forma alguna.  
8.5.3  Cuando se indique con el formato de fecha, antepon erse la palabra “Lote” o su abreviatura “L”. 
8.5.4  Si la identificación del lote corresponde a la fec ha de caducidad, anteponer las leyendas “Lote” y 
“Fecha de caducidad” o sus abreviaturas “L y Fech. Cad.” o “L y Cad.”,  
8.6 Fecha de caducidad 
8.6.1  Los productos objeto de esta norma que requieran r efrigeración, congelación o con una vida útil 
menor a tres meses, deben declarar la fecha de cadu cidad, anteponiendo las leyendas: “Fecha de 
caducidad___” ó “Caducidad___ ó “Cad”_ “ó “Fech Cad ___“; en el espacio en blanco citar la fecha señala ndo 
al menos día y mes, excepto los congelados que debe rán indicar mes y año. 
8.6.2  La fecha de caducidad que incorpore el fabricante en el producto preenvasado, no debe ser alterada 
en ningún caso y bajo ninguna circunstancia. 
8.7 Leyendas de conservación 
8.7.1  En las harinas de cereales y en los productos elab orados a base de cereales, de semillas 
comestibles, de harinas o sus mezclas y productos d e panificación, debe figurar la leyenda "Consérvese  en 
lugar seco y fresco". o leyenda equivalente. 
8.7.2  Para los productos objeto de esta norma que requie ren refrigeración o congelación deben incluirse 
según corresponda, las leyendas: "Manténgase o cons érvese en refrigeración o congelación", o una leyen da 
equivalente. 
8.8 Instrucciones de uso 
8.8.1  La etiqueta debe contener las instrucciones de uso  cuando sean necesarias sobre el modo de 
empleo, incluida la reconstitución, si es el caso, para asegurar una correcta utilización del producto  
preenvasado.  
8.9 Información Nutrimental 
8.9.1 Generales  
8.9.1.1  La declaración nutrimental en la etiqueta de los p roductos preenvasados es voluntaria. Sólo es 
obligatoria cuando se realice la declaración en for ma cuantitativa o cualitativa de alguna propiedad 
nutrimental. 
8.9.1.2  Cuando se incluya la declaración nutrimental, es o bligatorio declarar lo siguiente: 
a) Contenido energético; 
b) Las cantidades de proteínas, carbohidratos disponib les o hidratos de carbono disponibles y grasas o 
lípidos. 
c) La cantidad de sodio; 
d) La cantidad de cualquier otro nutrimento acerca del  cual se haga una declaración de propiedades, 
8.9.1.3  La declaración nutrimental debe hacerse por 100 gr amos o por porción o por envase, si éste 
contiene sólo una porción. 
8.9.1.4  La declaración nutrimental debe hacerse en las uni dades numéricas que correspondan. 
Adicionalmente se pueden emplear otras formas de pr esentación de los mismos. 
8.9.1.5  La declaración sobre el contenido energético debe expresarse en kilojoules. De manera adicional, 
podrá declararse en kilocalorías; en ambos casos, p odrá usar las abreviaturas kJ o kcal respectivament e. 
8.9.1.6  La declaración sobre la cantidad de proteínas, car bohidratos disponibles o hidratos de carbono 
disponibles y grasas o lípidos, que contienen los a limentos, debe expresarse en gramos. 
8.9.1.7  La declaración sobre el contenido de sodio debe ex presarse en miligramos.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
8.9.1.8  La declaración numérica sobre vitaminas y minerale s, debe expresarse en unidades métricas o en 
porcentaje de la ingestión diaria recomendada (IDR) , por 100 g o por porción o por envase si éste cont iene 
sólo una porción. En caso de declararse en porcenta je de la IDR, podrá citarse la leyenda: Ingestión d iaria 
recomendada para la población mexicana o leyenda si milar. 
Para estos casos, se debe emplear la tabla de recom endaciones ponderadas para la población mexicana 
del Anexo II de esta Norma. 
8.9.1.9  Los valores de composición bromatológica que figur en en la declaración de nutrimentos del 
producto, deben ser valores medios ponderados deriv ados de análisis, bases de datos o tablas reconocid as 
nacional e internacionalmente.  
8.9.1.10  Cuando en las etiquetas se declaren u ostenten en forma escrita, gráfica o descriptiva que los 
productos, su uso, aplicación, ingredientes o cualq uier otra característica están recomendados, respal dados o 
aceptados por centros de investigación, asociacione s, organizaciones, entre otros. Se deberá contar co n el 
sustento técnico respectivo, el que estará a dispos ición de la Secretaría en el momento que lo solicit e. Dichas 
declaraciones deben sujetarse a lo siguiente: la le yenda debe describir claramente la característica r eferida, 
estar precedida por el símbolo o nombre del organis mo y figurar con caracteres claros y fácilmente leg ibles. 
8.9.2 Requisitos específicos 
8.9.2.1 Las harinas de trigo y de maíz nixtamalizado preenv asadas fortificada con ácido fólico y 
adicionadas con vitamina B 1, vitamina B 2, vitamina B 3, hierro y zinc, deberán cumplir con lo siguiente: 
8.9.2.2 Sólo podrán utilizar la siguiente denominación: 
i)  Harina de trigo fortificada con ácido fólico o fol acina o folato (vitamina Bc o vitamina B 9)* y zinc, y 
adicionada con hierro, Vitamina B 1 (mononitrato de tiamina)*, Vitamina B 2 (riboflavina)* y Vitamina B 3 
(niacina)*. 
ii)  Harina de maíz nixtamalizado fortificada con ácido  fólico o folacina o folato (vitamina Bc o vitamina  B 9)*, 
y adicionada con Vitamina B 1 (mononitrato de tiamina), Vitamina B 2 (riboflavina)*, Vitamina B 3 (niacina)*, 
hierro y zinc. 
* Los términos entre paréntesis serán opcionales. 
8.9.2.3 No está permitido emplear, denominación distinta a la establecida en esta norma. En los productos 
preenvasados que las utilicen como materia prima po drán declararlas en el listado de ingredientes como  
“harina de trigo” o “harina de maíz nixtamalizado”.  
8.9.2.4  En el caso de las harinas de trigo y de maíz nixta malizado preenvasadas se debe indicar el 
contenido de ácido fólico, vitamina B 1, vitamina B 2, vitamina B 3, hierro y zinc, en mg por 100 g del producto. 
8.9.2.5  Las harinas de trigo y de maíz nixtamalizado preen vasadas deberán declarar en la lista de 
ingredientes la fuente de hierro utilizado. 
8.9.2.6  Cuando se utilice el ácido ascórbico en la harina de trigo preenvasada se debe reportar como 
aditivo y no como nutrimento. 
8.9.2.7  Las harinas de maíz nixtamalizado deben ostentar e n la superficie principal de exhibición el 
proceso de nixtamalización al que fue sometido. En el caso de que los productos hayan sido objeto de a lgún 
otro tratamiento aplicado para asegurar su inocuida d se puede indicar el nombre de éste con excepción de 
aquellos que de acuerdo con los ordenamientos corre spondientes sean de carácter obligatorio. 
8.10 Leyendas precautorias 
8.10.1  Los productos que contengan alcohol etílico o bebi das alcohólicas en cantidades superiores al 
0,5%, deben incluir en la superficie principal de e xhibición de la etiqueta, la siguiente leyenda: “Es te producto 
contiene ______% de alcohol. No recomendable para n iños”. (En el espacio en blanco citar el contenido de 
alcohol en %). 
8.10.2  .Los productos elaborados a base de cereales que c ontengan gluten; como trigo, avena, cebada y 
centeno deben incluir la siguiente leyenda precauto ria: “este producto contiene gluten”, o algún otra 
equivalente. 
8.10.3  Se pueden incluir leyendas precautorias que promue van una dieta recomendable. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
8.11 Información adicional 
8.11.1  En la etiqueta puede presentarse cualquier informa ción o representación gráfica así como materia 
escrita, impresa o gráfica, siempre que no esté en contradicción con los requisitos obligatorios de la  presente 
Norma. 
8.11.2  En la etiqueta puede presentarse cualquier informa ción o representación gráfica que indique que el 
envase que contiene el producto preenvasado, no afe cta al ambiente cuando ésta sea cierta. 
8.11.3  Información nutrimental complementaria (opcional).  
Se puede incluir información nutrimental complement aria de manera opcional, la cual en ningún caso deb e 
sustituir la declaración de los nutrimentos del apa rtado 8.9.1.2 y en caso de declararla, debe cumplir  con lo 
siguiente: 
a)  La declaración de uno de los siguientes nutrimento s no requiere declaración de uno de los otros y sól o 
se realiza si se tiene asignado una IDR y el conten ido de la porción esté por arriba del 5% de la IDR:  
Vitamina A (% IDR),Vitamina E (% IDR), Vitamina C ( % IDR), Vitamina B1 (Tiamina) (% IDR), Vitamina B2 
(Riboflavina) (% IDR), Vitamina B6 (Piridoxina) (% IDR), Vitamina B12 (Cobalamina) (% IDR), Acido fóli co 
(Folacina) (% IDR), Niacina (Acido nicotínico) (% I DR), Calcio (% IDR), Fósforo (% IDR), Magnesio (% I DR), 
Hierro (% IDR), Zinc (% IDR), Yodo (% IDR). 
b) Todos o ninguno de los siguientes: 
Grasa polinsaturada ___ g; grasa monoinsaturada __ g; grasa saturada ___ g; colesterol ___ mg. 
c) La declaración de uno de los siguientes no requiere  la declaración de los otros: 
Azúcar __ g; almidón ___ g; fibra dietética __ g. 
d)  Al expresar los tipos de constituyentes de carbohi dratos (hidratos de carbono) y de grasas (lípidos) 
referidos en b) y c) se debe anteponer el texto "de l cual..." o leyenda similar de tal manera que la i nformación 
sea clara para el consumidor. Esta leyenda se puede  omitir en caso que la distribución de la informaci ón en la 
etiqueta sea lo suficientemente clara. 
e) Número de porciones por presentación 
8.11.3 Fecha de consumo preferente 
8.11.3.1  La fecha de consumo preferente para la comercializ ación del producto preenvasado es opcional. 
De incluirse, se debe observar lo siguiente: 
i)  Debe estar precedida por una leyenda que especifiq ue “Fecha de consumo preferente __________” o 
“Consumir preferentemente antes de ____________ "; u otra leyenda similar o sus abreviaturas “Fech. Co ns. 
Pref.” o “Cons. Pref.” o abreviatura similar en el espacio en blanco citar la fecha, señalando: 
i.1)  El día y el mes para los productos de duración máx ima de tres meses; 
i.2)  El mes y el año para productos de duración superio r a tres meses. 
8.11.3.2 Cuando se declare la fecha de consumo preferente se  debe indicar en el envase o etiqueta 
cualesquiera condiciones que se requieran para la c onservación del producto preenvasado.  
8.11.3.3  La fecha de consumo preferente que incorpore el fa bricante en el producto preenvasado, no debe 
ser alterada en ningún caso y bajo ninguna circunst ancia. 
8.11.4 Declaraciones prohibidas de propiedades  
8.11.4.1  Se prohíbe el uso de las siguientes declaraciones:  
i)  De propiedades: 
- Que hagan suponer que una alimentación correcta a  base de alimentos ordinarios no puede suministrar 
cantidades suficientes de todos los elementos nutri tivos. 
- Que no pueden comprobarse. 
- Sobre la utilidad de un alimento para prevenir, a liviar, tratar o curar una enfermedad, trastorno o estado 
fisiológico. 
- De propiedades que pueden suscitar dudas sobre la  inocuidad de los alimentos análogos o puedan 
suscitar o provocar miedo al consumidor       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
ii) Que inducen a error 
- Declaraciones de propiedades sin significado, inc luidos los comparativos y superlativos 
- Declaraciones de propiedades respecto a prácticas  correctas de higiene o comercio, tales como 
"genuinidad", "salubridad", "sanidad", excepto las señaladas en otros ordenamientos legales aplicables . 
- Declaraciones de propiedades que afirmen la natur aleza u origen "orgánico" o "biológico" de un alime nto, 
excepto en aquellos casos en que se compruebe que e l producto tiene realmente esa característica. 
8.11.5 Cálculos  
8.11.5.1  Cálculo de nutrimentos  
i) Cálculo de energía 
La cantidad de energía que ha de declararse debe ca lcularse utilizando los siguientes factores de 
conversión: 
 Carbohidratos disponibles o Hidratos de carbono di sponibles  17 kJ o 4 kcal/g 
 Proteínas 17 kJ o 4 kcal/g 
 Grasas (Lípidos) 38 kJ o 9 kcal/g 
ii) Cálculo de proteínas 
La cantidad de proteínas que ha de indicarse, debe calcularse utilizando la siguiente fórmula: 
Proteína = contenido total de nitrógeno Kjeldahl X 6.25 
iii) En el caso de los productos derivados del trigo, ap lica la siguiente fórmula: 
Proteína = contenido total de nitrógeno Kjeldahl X 5.7 
9. Envase y embalaje 
9.1  Envase. 
9.1.1  Los productos preenvasados objeto de esta norma se  deben envasar en recipientes elaborados con 
materiales inocuos y resistentes a distintas etapas  del proceso, de tal manera que no reaccionen con e l 
producto o alteren sus características físicas, quí micas, sensoriales y microbiológicas. 
9.1.2  Para el caso de los productos de panadería que se comercialicen a granel, el material que 
proporcione el responsable del expendio para envolv erlos o empacarlos, debe ser limpio y nuevo, elabor ado 
con materiales inocuos y resistentes, de tal manera  que no reaccionen con el producto o alteren sus 
características físicas, químicas o sensoriales. 
9.2  Embalaje. 
Se deben usar embalajes de material resistente que ofrezcan la protección adecuada a los envases para 
impedir su deterioro exterior, a la vez que facilit en su manipulación, almacenamiento y distribución. 
10. Concordancia con normas internacionales 
Esta norma no es equivalente con normas internacion ales o normas mexicanas, excepto el apartado 5.2.2 
referente a harinas de cereales, sémolas o semolina s en donde es parcialmente equivalente a: 
Norma Codex para la harina de trigo. Codex Stan 152 -1985 (Rev. 1-1995). 
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11.35  Joseph Mulinare, MD, et-al, 1988. Periconceptional  use of multivitamins and the occurence of neural 
tube defects. JAMA, Vl. 260, No. 21. p. 3141-3145. 
11.36  Kumate Rodríguez, J. et-al. 1992. Manual para la v igilancia epidemiológica. Defectos del tubo 
neural. No. 16. Secretaría de Salud. 
11.37  Pérez Escamilla Rafael. 1995. Folic acid fortifica tion for the prevention of neural tube defects: 
consensus needed on potential adverse effects. Amer ican Journal of Public Health, Vol. 85. No. 11. 
11.38  Pomeranz Y. 1989. Wheat: Chemistry and Technology;  Vol. II. Edited by The American Association 
of Cereal Chemists, Inc. Minessota U.S.A. p. 118-12 3. 
11.39  Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambi ente y de la Organización Mundial de la 
Salud, Criterios de Salud Ambiental. 11. Micotoxina s, Publicación Científica No. 453. OPS. p. 2-7. 
11.40  Programa Universitario de Investigación en Salud. 1996. Universidad Nacional Autónoma de México. 
Coordinación para la Investigación Científica. Prim era Reunión sobre Investigación de Acido Fólico en 
Defectos del Tubo Neural. Memorias. 
11.41  Quaglia G. 1991. Ciencia y Tecnología de la Panifi cación. 2a. Ed. Acribia, S.A. Zaragoza, España. p. 
163-217 y 392. 
11.42  Reilly Conor. 1991. Metal Contamination of Food. 2 a. Edición. Edit. Elsevier Applied Science. UK. p. 
116, 137 y 154-155. 
11.43  Ruiz-Matus, Cuauhtémoc, et-al. Panorama epidemioló gico de los defectos del tubo neural en 
México. Gac. Méd. Mex. Vol. 131, No. 4, p. 485-489.  
11.44  Spivey Fox M.R. 1976. Cadmium Metabolism-A, Review  of Aspects Pertinent to Evaluating Dietary 
Cadmiun Intake by Man, The Nutrition Fundation a Mo nograph. Edited by Prasad A, S. Cap. 42. p. 403-408 . 
12. Observancia de la norma 
12.1  La vigilancia  de la presente norma oficial mexicana, una vez que sea publicada en el Diario Oficial de 
la Federación como norma definitiva, estará a cargo  de la Secretaría de Salud y de los Gobiernos de la s 
Entidades Federativas, en el ámbito de sus respecti vas competencias, y de los organismos de tercera pa rte 
habilitados para tal efecto. 
13. Vigencia 
13.1  La presente Norma Oficial Mexicana entrará en vigo r a los ciento ochenta días naturales contados a 
partir de la fecha de su publicación en el Diario O ficial de la Federación. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
13.2  A su entrada en vigor, la presente norma: 
Cancela la Norma Oficial Mexicana NOM-147-SSA1-1996 . Bienes y servicios. Cereales y sus productos. 
harinas de cereales, sémolas o semolinas. Alimentos  a base de cereales, de semillas comestibles, harin as, 
sémolas o semolinas o sus mezclas. Productos de pan ificación. Disposiciones y especificaciones sanitar ias y 
nutrimentales, y 
Deroga todos los numerales de la Norma Oficial Mexi cana NOM-188-SSA1-2002, Productos y servicios. 
Control de aflatoxinas en cereales para consumo hum ano y animal. Especificaciones sanitarias, a excepc ión 
del numeral 5.3.2 y el Apéndice Normativo A. 
Atentamente 
México, D.F., a 10 de abril de 2008.- El Presidente  del Comité Consultivo Nacional de Normalización de  
Regulación y Fomento Sanitario, Miguel Angel Toscano Velasco .- Rúbrica. 
14. Anexos 
Anexo I 
Clases de ingredientes  Denominación genérica  
Aceites refinados distintos del aceite de oliva  "A ceite", juntamente con el 
término "vegetal" o "animal", 
calificado con el término 
hidrogenado, según el caso.  
Grasas refinadas  "Grasas", juntamente con el 
término "vegetal" o "animal", 
según el caso.  
Almidones, distintos a los almidones modificados qu ímicamente.  "Almidón".  
Todos los tipos de carne de pescado, cuando el pesc ado constituya un 
ingrediente de otro alimento y siempre que en la et iqueta y presentación 
de dicho alimento no se haga referencia a una deter minada especie de 
pescado.  "Pescado".  
Todos los tipos de carne de aves de corral, cuando dicha carne 
constituya un ingrediente de otro alimento y siempr e que en la etiqueta y 
la presentación de dicho alimento no se haga refere ncia a un tipo 
específico de carne de aves de corral.  "Carne de ave".  
Todos los tipos de quesos, cuando el queso o una me zcla de quesos 
constituya un ingrediente de otro alimento y siempr e que en la etiqueta y 
la presentación de dicho alimento no se haga refere ncia a un tipo 
específico de queso.  "Queso".  
Todas las especias y extractos de especias en canti dad no superior al 
2% en peso, solos o mezclados en el alimento.  "Especia", "especias" o "mezclas 
de especias", según el caso.  
Todas las hierbas aromáticas o partes de hierbas ar omáticas en 
cantidad no superior al 2% en peso, solas o mezclad as en el alimento.  "Hierbas aromáticas" o "mezclas 
de hierbas aromáticas", según el 
caso.  
Todos los tipos de preparados de goma utilizados en  la fabricación de la 
goma de base para la goma de mascar.  "Goma de base".  
Todos los mono y disacáridos.  "Azúcares".  
La dextrosa anhidra y la dextrosa monohidratada.  " Dextrosa" o "glucosa".  
Todos los tipos de caseinatos.  "Caseinatos".  
Manteca de cacao obtenida por presión o extracción o refinada.  "Manteca de cacao".  
Todas las frutas confitadas, sin exceder del 10% de l peso del alimento.  "Frutas confitadas".  
Todos los condimentos en cantidad no superior al 2%  en peso, solos o 
mezclados en el alimento.  "Condimentos".        (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
Anexo II  
INGESTA DIARIA RECOMENDADA 
Nutrimentos  Valores  
Proteína g 75 
Vitamina A µg (equivalentes de retinol) 1 000 
Vitamina E mg (Tocoferoles) 10 
Vitamina B1 mg (Tiamina) 1,5 
Vitamina B2 mg (Riboflavina) 1,7 
Vitamina B6 mg (Piridoxina) 2 
Niacina mg eq Acido nicotínico) 20 
Acido fólico µg (Folacina) 200 
Vitamina B12 µg (Cobalamina) 2 
Vitamina C mg (Acido ascórbico) 60 
Calcio mg 800 
Fósforo mg 800 
Hierro mg 15 
Magnesio mg 350 
Zinc mg 15 
Yodo µg 150 
 
15. Apéndices Normativos 
15.1 Apéndice Normativo A. Muestreo de cereales 
Generalidades 
1 El muestreo debe ser realizado por un técnico en m uestreo con un instrumento de muestreo que permita 
obtener la muestra. En el caso de producto en costa les, el instrumento debe llegar al centro de cada c ostal 
muestreado. 
1.1 Adicionalmente, en el caso de establecimientos, se debe tomar las muestras provenientes de las 
zonas de calentamiento. Si no existen durante la vi sita, las tomará de las últimas zonas de calentamie nto 
registradas. 
1.2 En los establecimientos, se debe solicitar tomar la  temperatura y la humedad de las muestras. 
1.3  Se debe registrar, según sea el caso, el área, núm ero de costales o unidades de transporte 
muestreadas. 
1.4  Las bodegas y almacenamientos en intemperie, se di viden en zonas o áreas que contengan hasta 
2000 t, obteniéndose de cada una, la muestra compue sta. 
1.5  Se tomarán una o más muestras primarias en cada un o de los puntos de muestreo que se establecen 
en C.3.1 cuando se trate de producto a granel, o en  2.2 cuando se trate de producto en costales. 
1.6  De la suma de las muestras primarias, se constitui rá una muestra compuesta, la que se 
homogeneizará, no debiendo ser menor a 5 kg. 
1.7  Dependiendo de la altura del volumen almacenado, s erá el número de extracciones para cada punto 
de muestreo. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
Tabla 1. Profundidad con que se efectúe el muestreo . 
Profundidad m. Instrumento de muestreo No. de extra cciones 
1 Sonda de alvéolos 1 
2 Sonda de bala, sonda de alvéolos. 3* 
3 Sonda de bala, sonda de alvéolos. 3* 
4 Sonda de bala. 3* 
5 Sonda de bala. 3* 
 
* Las muestras primarias deben obtenerse de diferen tes profundidades. 
2 Puntos de muestreo. 
2.1  Cereales almacenados a granel en bodegas o almacen amientos en intemperie. Vista superior. 
 
X 
   
X   
X 
 
  
X 
   
X  
 
X 
   
X   
X 
 
2.2  Cereales almacenados a granel en silos. Vista supe rior. 
   
X        X        X     
  
          X    
  
 X         X     X    
   
 
2.2.1 Cuando debido al diseño del silo no sea posible tom ar las muestras primarias de la parte superior, se 
tomarán de las escotillas. 
2.3  Cereales almacenados en costales. 
2.3.1 Se deben identificar las estibas, cada una de las c uales se debe muestrear en forma de “M” 
imaginaria, la que debe ir del primero al último te ndido, el ancho máximo de la parte inferior de la “ M” no debe 
ser mayor a 5 m. 
 
 
Esquema 3. Puntos de muestreo para producto en cost ales.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
2.3.2 Debe tomarse una muestra de cada uno de los costale s por donde pasen las líneas de la “M” trazada 
de acuerdo a lo señalado en el esquema anterior. 
2.3.3 El número mínimo de costales a muestrear por lote, se ajustará a lo señalado en la tabla 1, si el 
número de sacos almacenados es mayor que el número máximo considerado en la tabla, se muestrearán los 
restantes como si fuera otro lote. 
Tabla 2. Número mínimo de sacos a muestrear por lot e 
Número de costales 
En lote A muestrear 
hasta 99 10 
100-199 15 
200-299 20 
300-499 30 
500-799 40 
800-1299 55 
1300-3199 75 
3200-7999 115 
8000-21999 150 
22000-49999 225 
 
2.4  Muestreo de cereales en transportes. 
2.4.1 Las Secretarías están facultadas para efectuar el m uestreo en unidades de transporte en cualquier 
momento y lugar. 
2.4.2 Puntos de muestreo. 
 
 
Esquema 4. Contenedores terrestres de hasta 30 tone ladas. Vista superior. 
 
 
Esquema 5. Contenedores terrestres mayores de 30 to neladas. Vista superior. 
2.5  Muestreo en movimiento. 
2.5.1  Las muestras deben tomarse de los lugares o áreas donde el grano se encuentre en movimiento, 
como durante las operaciones de carga y descarga de  las bodegas, almacenamientos en intemperie o duran te 
los movimientos de transferencia entre silos. 
2.5.2 La cantidad de muestra a obtener, será aproximadame nte de 1 muestra primaria de 
aproximadamente 500 g por cada 12,5 t hasta obtener  una muestra compuesta no menor de 5 kg, pudiendo 
calcularse la frecuencia de introducción del instru mento de muestreo con la siguiente ecuación: Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
M = t/c 
Donde: 
M = frecuencia en min con que se debe introducir el  instrumento de muestreo. 
t = toneladas representadas por cada muestra primar ia (t/muestra). 
c = capacidad de la banda transportadora o capacida d de descarga del vehículo (t/min). 
3. Envío de muestras. 
Las muestras deben depositarse en bolsas nuevas de papel kraft, evitando su ruptura y etiquetarse al 
momento de la toma de muestra, las etiquetas se aju starán a lo establecido en el siguiente formato: 
3.1  Del etiquetado de muestras. 
3.1.1 Para muestras de bodega. 
Tipo de producto __________________________________ ____________________________________  
Centro:  __________________________________________ ___________________________________  
Ubicación:  _______________________________________ ____________________________________  
Bodega No.: _________________ Sección:  ___________ ______________________________________  
Fecha toma de muestra: ____________________________ _____________ 
Hora: _____________________________________________ __________________________________  
Observaciones: ____________________________________ ___________________________________  
Identificación de la muestra: 
3.1.2  Para muestras durante la movilización. 
Tipo de producto: _________________________________ _____________________________________  
Centro de envío:  _________________________________ _____________________________________  
Ubicación:  _______________________________________ ____________________________________  
Centro de destino:  _______________________________ ______________________________________  
Ubicación:  _______________________________________ ____________________________________  
Nombre o Cía.:  ___________________________________ ____________________________________  
Fecha y hora de la toma de muestra:  ______________ ________________________________________  
Datos del vehículo:  ______________________________ ______________________________________  
Identificación de la muestra: 
3.2  Reporte de laboratorio. 
Identificación de la muestra: 
Centro:  __________________________________________ ___________________________________  
Ubicación:  _______________________________________ ____________________________________  
Tipo de producto: _________________________________ _____________________________________  
Nombre de bodegas muestreadas:  ___________________ _____________________________________  
Número de muestras compuestas por bodega:  ________ ______________________________________  
Concentración en cada muestra compuesta:  _________ _______________________________________  
Concentración promedio de AF en cada bodega:  _____ ________________________________________  
Identificación de la muestra: 
Fecha de realización del análisis: 
Vehículo muestreado: ______________________________ __ 
Centro de origen: _________________________________ ___       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
Centro de destino: ________________________________ ___ 
Concentración de AF: __________________________ 
En caso de resultar la concentración de AF mayor o igual a 20 µg/kg reportar a:  ____________________  
___________________________________________________ _________________________________ 
Fecha de realización del análisis: ________________ _________________________________________ 
15.3 Apéndice normativo C. Métodos de Prueba 
Indice 
1 Determinación de materia extraña 
1.1  Método para la determinación de materia extraña pe sada en harinas de cereales 
1.2  Método para la determinación de materia extraña li gera en harina de trigo 
1.3  Método para la determinación de materia extraña li gera en harina de maíz 
1.4  Método para la determinación de materia extraña li gera en harina de arroz 
1.5  Método para la determinación de materia extraña li gera en harina de cebada, harina de avena y 
mezcla de cereales secos 
1.6  Determinación de materia extraña ligera en aliment os a base de cereales, de semillas comestibles, de 
harinas, sémolas o semolinas o sus mezclas 
1.7  Métodos para la determinación de materia extraña e n productos de panificación. 
1.7.1  Método para la determinación de materia extraña li gera (fragmentos de insectos, insectos enteros, 
pelos de roedor y fragmentos de plumas) en producto s horneados con frutas y nueces. 
1.7.2  Método para la determinación de materia extraña li gera en pan blanco y productos con alto contenido 
de grasa 
1.7.3  Método para la determinación de materia extraña li gera en panes con alto contenido de fibra 
2 Método para la Determinación de Humedad y Sólidos  Totales en Harina 
3 Método de prueba para la determinación de aflatox inas en cereales. 
4 Análisis microbiológico de productos objeto de es ta norma 
4.1  Procedimiento para la preparación y dilución de mu estras de alimentos para su análisis microbiológico . 
4.2  Método para la cuenta de bacterias aerobias en pla ca. 
4.3  Método para la cuenta de microorganismos coliforme s totales en placa. 
4.4  Método para la determinación de Salmonella en alim entos. 
4.5  Método para la determinación de Staphylococcus aureus  en productos objeto de esta norma 
5. Método de prueba para la determinación de cadmio, p lomo, fierro y zinc en productos objeto de 
esta norma alimentos por espectrometría de absorció n atómica. 
6. Determinación de Vitamina B1 y B2 por Cromatogra fía Líquida de Alta Resolución (HPLC). 
7. Determinación de Niacina. Método microbiológico 
8. Determinación de Acido Fólico. Método microbioló gico. 
1 Determinación de materia extraña 
1.1 Método para la determinación de materia extraña  pesada en harinas de cereales 
1.1.1  Fundamento. 
La materia extraña se separa por sedimentación y po steriormente se filtra para observación al 
microscopio. 
1.1.2  Reactivos y Materiales. 
Todos los reactivos que a continuación se mencionan  deben ser grado analítico a excepción de los que s e 
indican. 
Cuando se indique agua debe entenderse como agua de stilada. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
1.1.2.1  Reactivos. 
Cloroformo (CHCl 3). 
Isopropanol (C 3H8-OH). 
Mezcla glicerina - alcohol etílico 96% Alc. Vol. 1: 3 
(v/v) (C 3H5) (OH)  3 – C 2H5-OH). 
(Mezclar 1 volumen de glicerina con 3 volúmenes de alcohol etílico) 
1.1.2.2  Material. 
Vasos de precipitados de 250 ml. 
Papel de filtración rápida rayado para conteo con l íneas paralelas de aproximadamente 5 mm de 
separación. 
Embudo Büchner. 
Matraz Kitazato. 
Material común de laboratorio. 
1.1.3  Equipo. 
Balanza analítica con 0,1 mg de sensibilidad. 
Equipo de filtración al vacío. 
Microscopio binocular estereoscópico con objetivos que pueden ser de 3, 6, 7 y 10X y oculares apareado s 
de amplio campo visual de 10, 30 y 100 X respectiva mente. 
Lámpara para el microscopio o luz natural equivalen te. 
1.1.4  Procedimiento. 
1.1.4.1  Pesar por triplicado 50 g de muestra en un vaso de  precipitados de 250 ml. 
1.1.4.2  Añadir CHC 3 hasta 1 cm del borde, mezclar muy bien y dejar rep osar por lo menos 30 min. 
Revolver varias veces durante este lapso la capa qu e sube hasta la superficie. 
1.1.4.3  Decantar el CHC 3 y el tejido flotante a un papel filtro en un embud o Büchner. Cuidar de no remover 
los residuos pesados del fondo del vaso. Antes de d ecantar hay que cuidar que la capa que queda flotan do no 
se haga tan compacta que dificulte esta operación. 
1.1.4.4  Añadir una cantidad de isopropanol igual a la cant idad de cloroformo y sedimento que queda en el 
vaso de precipitados; dejar que vuelva a reposar y decantar como antes. 
1.1.4.5  Repetir este proceso con una mezcla a partes igual es de cloroformo e isopropanol hasta que 
quede muy poco tejido en el vaso. Debe tenerse cuid ado de no decantar ningún fragmento de materia extr aña 
pesada que pueda estar presente. 
1.1.4.6  Filtrar a través de un papel filtro rayado y lavar  los residuos del vaso con una fracción de 
cloroformo o isopropanol. 
1.1.4.7  Pasar el papel filtro con el residuo a una caja Pe tri humedecida con la mezcla de glicerina - alcohol  
etílico y así mantenerlo. 
1.1.4.8  Contar al microscopio utilizando una luz suficient emente fuerte para que muestre todos los detalles 
a través del microscopio. Contar y explorar con la aguja de disección sobre toda la superficie del pap el, línea 
por línea. 
1.1.4.9  Voltear y explorar cada pieza del material ya que algunos fragmentos son irreconocibles a menos 
que se muevan. 
1.1.4.10  No contar material dudoso (una amplificación de 30 X en algunos casos es útil para examinar 
piezas dudosas). 
1.1.4.11  Marcar el papel en un lado de cada fragmento y con tar por medio de un lápiz graso, para futuros 
chequeos y para evitar cuentas erróneas. 
1.1.5  Reportar el promedio de las 3 determinaciones como  excretas, arena y alguna otra materia extraña 
pesada encontrada en 50 g de muestra.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
1.2 Método para la determinación de materia extraña  ligera en harina de trigo 
1.2.1  Fundamento. 
Después de someter la muestra a una hidrólisis ácid a, el material considerado como materia extraña lig era 
se captura por flotación en aceite mineral y poster iormente retenido en papel filtro para su observaci ón al 
microscopio. 
1.2.2  Reactivos y materiales. 
Todos los reactivos que a continuación se mencionan  deben ser grado analítico a menos que se indique 
otra especificación. 
Cuando se indique agua debe entenderse como agua de stilada. 
1.2 2.1  Reactivos. 
Acido clorhídrico (HCl) de 36,5 a 38,0% de pureza, con un peso específico de 1,185 - 1,192. 
Acido clorhídrico al 3%. Diluir 3 volúmenes de ácid o clorhídrico en 97 volúmenes de agua (v/v). 
Solución de detergente al 5% (p/v). 
i)  En un vaso de precipitados de 100 ml pesar 5 g de laurilsulfato de sodio. 
ii) Disolver con agua y trasvasar cuantitativamente a u n matraz volumétrico de 100 ml enjuagando varias 
veces con agua y llevar al aforo. 
Aceite mineral ligero con un peso específico (24° C)  de 0,840 - 0,860 y una viscosidad (40° C) de 45 - 5 5 
cSt. 
Mezcla glicerina - alcohol etílico 96% Alc. Vol. 1: 3 (v/v) (C 3H5) (OH) 3 - C 2H5-OH) 
i)  Mezclar 1 volumen de glicerina con 3 volúmenes de alcohol etílico. 
1.2.2.2  Materiales. 
Vasos de precipitados de 100, 250, 1000 y 2000 ml. 
Matraz Kitazato. 
Embudo Büchner. 
Embudo percolador o embudo Kilborn. 
Caja Petri. 
Aguja de disección. 
Parrilla de calentamiento con agitación. 
Papel de filtración rápida rayado para conteo con l íneas paralelas de aproximadamente 5 mm de 
separación. 
Material común de laboratorio. 
1.2.3  Equipo. 
Balanza analítica con 0,1 mg de sensibilidad. 
Equipo de filtración al vacío. 
Agitador magnético. 
Microscopio binocular estereoscópico con objetivos que pueden ser de 3, 6, 7 y 10X y oculares apareado s 
de amplio campo visual de 10, 30 y 100X respectivam ente. 
Lámpara para el Microscopio o luz natural equivalen te. 
1.2.4 Procedimiento. 
1.2.4.1  Digerir por triplicado 50 g de harina en un vaso d e precipitados de 2000 ml con 600 ml de ácido 
clorhídrico al 3% en un autoclave por 5 min a 121° C . Dejar que la presión baje a cero y abrir la válvu la de 
ventilación. Transferir inmediatamente el digerido a un vaso de precipitados de 1000 ml, enjuagando co n ácido 
clorhídrico al 3% a temperatura ambiente. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
1.2.4.2  Adicionar 50 ml de aceite mineral y agitar magnéti camente por 5 min, transferir a un embudo 
percolador conservando el vaso. Dejar reposar por 3 0 min y agitar muy suavemente con una varilla de vi drio 
varias veces, durante los primeros 10 min. 
1.2.4.3  Drenar la capa inferior hasta aproximadamente 3 cm  de la interfase. Lavar los lados con agua fría y 
dejar que las capas se separen por un tiempo aproxi mado de 2 a 3 min. Repetir el drenado y lavado con agua 
hasta que la fase inferior esté clara. Después del lavado final, drenar la capa de aceite en el vaso o riginal y 
enjuagar los lados del embudo con agua y alcohol et ílico. 
1.2.4.4  Agregar ácido clorhídrico al 3% y llevar a ebullic ión por 3 a 4 min en una parrilla de calentamiento.  
Filtrar (usando un embudo Büchner y sistema de vací o) la solución caliente a través de un papel filtro  rayado y 
enjuagar perfectamente el vaso y embudo con agua, a lcohol y una solución de detergente al 5%. Filtrar en 
forma separada cada enjuague a través del mismo pap el filtro. 
1.2.4.5  Examinar el papel en el microscopio como en el mét odo 1 según los puntos 1.1.4.7 al 1.1.4.11 
1.2.4.6  Reportar el promedio de las 3 determinaciones como  fragmentos de insectos, pelos de roedor y 
alguna otra materia extraña ligera encontrados en 5 0 g de muestra. 
1.3 Método para la determinación de materia extraña  ligera en harina de maíz 
1.3.1  Fundamento. 
Después de someter la muestra a una hidrólisis ácid a, el material considerado como materia extraña lig era 
se captura por flotación en aceite mineral y poster iormente retenido en papel filtro para su observaci ón al 
microscopio. 
1.3.2  Reactivos y Materiales. 
Todos los reactivos que a continuación se mencionan  deben ser grado analítico a menos que se indique 
otra especificación. 
Cuando se indique agua debe entenderse agua destila da. 
1.3.2.1  Reactivos. 
Acido clorhídrico (HCl) de 36,5 a 38,0% de pureza y  con un peso específico de 1,185 - 1,192. 
i)  Acido clorhídrico al 5%. Diluir 5 volúmenes de áci do clorhídrico en 95 volúmenes de agua (v/v). 
Solución de detergente al 5% (v/v). 
i)  En un vaso de precipitados de 100 ml pesar 5 g de laurilsulfato de sodio. 
ii) Disolver con agua y trasvasar cuantitativamente a u n matraz volumétrico de 100 ml enjuagando varias 
veces con agua y llevar al aforo. 
Aceite mineral ligero. Con un peso específico (24° C ) de 0,840-0,860 y una viscosidad (40° C) de 45 - 55  
cSt. 
Keroseno deodorizado. 
Mezcla glicerina - alcohol etílico 96% Alc. Vol. 1: 3 (v/v) (C 3H5) (OH) 3 – C 2H5-OH) 
i)  Mezclar 1 volumen de glicerina con 3 volúmenes de alcohol etílico. 
1.3.2.2  Material. 
Vasos de precipitados de 100, 250, 1000 y 2000 ml. 
Matraz Kitazato. 
Embudos de extracción. 
Embudo de Hirsch. 
Caja Petri. 
Aguja de disección. 
Parrilla de calentamiento con agitación. 
Papel de filtración rápida rayado para conteo con l íneas paralelas de aproximadamente 5 mm de 
separación. 
Material común de laboratorio.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
1.3.3  Equipo. 
Balanza analítica con 0,1 mg de sensibilidad. 
Equipo de filtración al vacío. 
Agitador magnético. 
Microscopio binocular estereoscópico con objetivos que pueden ser de 3, 6, 7 y 10X y oculares apareado s 
de amplio campo visual de 10, 30 y 100X respectivam ente. 
Lámpara para el microscopio o luz natural equivalen te. 
1.3.4  Procedimiento. 
1.3.4.1  Dispersar por triplicado 50 g de harina en vasos d e precipitados de 1000 ml con 400 ml de ácido 
clorhídrico al 5% (v/v) y de 20 ml de aceite minera l. Colocar el vaso en una parrilla de calentamiento  y llevar a 
ebullición agitando constantemente (con agitador ma gnético). Hervir por 10 min. 
1.3.4.2  Quitar el vaso de la parrilla de calentamiento y p asar su contenido a un embudo de extracción. 
Enjuagar el vaso y la varilla con 50 ml de agua cal iente, pasar los enjuagues al embudo de extracción y 
retener el vaso y la varilla. Llenar el embudo con agua fría hasta aproximadamente 3 cm abajo de la pa rte 
superior. 
1.3.4.3  Dejar sedimentar por espacio de 30 min y drenar la  capa inferior hasta aproximadamente 5 cm de 
la interfase. Adicionar 25 ml de Keroseno al embudo  y drenar la capa de aceite en el vaso retenido. Si  se 
separó una gran cantidad de material almidonoso jun to con la capa de aceite, hidrolizar con 100 a 200 ml de 
ácido clorhídrico al 5% antes de continuar. 
1.3.4.4  Lavar las paredes del embudo de extracción con una  solución de detergente al 5% y colectar los 
lavados en el vaso retenido. Filtrar el contenido c ompleto del vaso con una solución de detergente al 5% y 
filtrar a través del mismo papel. 
1.3.4.5  Examinar el papel en el microscopio como en el mét odo 1 según los puntos 1.1.4.7 al 1.1.4.11. 
1.3.4.6  Reportar el promedio de las 3 determinaciones como  fragmentos de insectos, pelos de roedor y 
alguna otra materia extraña ligera encontrados en 5 0 g de muestra. 
1.4 Método para la determinación de materia extraña lig era en harina de arroz 
1.4.1 Fundamento. 
Después de someter la muestra a una hidrólisis ácid a, el material considerado como materia extraña lig era 
se captura por flotación en aceite mineral y poster iormente retenido en papel filtro para su observaci ón al 
microscopio. 
1.4.2 Reactivos y Materiales. 
Todos los reactivos que a continuación se mencionan  deben ser grado analítico a menos que se indique 
otra especificación. 
Cuando se indique agua debe entenderse como agua de stilada. 
1.4.2.1  Reactivos. 
Acido clorhídrico (HCl) de 36,5 a 38,0% de pureza y  con un peso específico de 1,185 - 1,192. 
i)  Acido clorhídrico al 5%. Diluir 3 volúmenes de áci do clorhídrico en 97 volúmenes de agua (v/v). 
Solución de detergente al 1% (p/v). 
i)  En un vaso de precipitados de 100 ml pesar 1 g de laurilsulfato de sodio. 
ii)  Disolver con agua y trasvasar cuantitativamente a un matraz volumétrico de 100 ml enjuagando varias 
veces con agua y llevar al aforo. 
Aceite mineral ligero. Con un peso específico (24° C ) de 0,840 - 0,860 y una viscosidad (40° C) de 45 - 55 
cSt. 
Isopropanol (CH 3)2 CHOH al 40% (v/v). 
Diluir 40 ml de isopropanol con agua en un matraz v olumétrico de 100 ml y llevar al volumen. 
Mezcla glicerina - alcohol etílico 96% Alc. Vol. 1: 3 (v/v) (C 3H5) (OH) 3 – C 2H5-OH). Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
i) Mezclar 1 volumen de glicerina con 3 volúmenes de a lcohol etílico. 
1.4.2.2 Material. 
Vasos de precipitados de 100, 250, 1000 y 2000 ml. 
Matraz Kitazato. 
Embudos Büchner. 
Embudo percolador o embudo Kilborn. 
Caja Petri. 
Aguja de disección. 
Parrilla de calentamiento con agitación. 
Papel de filtración rápida rayado para conteo con l íneas paralelas de aproximadamente 5 mm de 
separación. 
Tamiz con número de malla 230. 
Material común de laboratorio. 
1.4.3  Equipo. 
Balanza analítica con 0,1 mg de sensibilidad. 
Equipo de filtración al vacío. 
Agitador magnético. 
Microscopio binocular estereoscópico con objetivos que pueden ser de 3, 6, 7 y 10X y oculares apareado s 
de amplio campo visual de 10, 30 y 100X respectivam ente. 
Lámpara para el Microscopio o luz natural equivalen te. 
1.4.4  Procedimiento. 
1.4.4.1  Preparación de la muestra. 
i)  Precalentar la parrilla a la máxima temperatura. C olocar la barra magnética en un vaso de precipitado s 
de 2000 ml. Adicionar 100 g de muestra y 100 ml de agua caliente de forma rápida y vigorosa. Agregar 7 5 ml 
de ácido clorhídrico y llevar a la marca de 800 ml con agua caliente. Hacer esta determinación por tri plicado. 
ii)  Colocar la mezcla caliente en la parrilla con agit ación y agitar vigorosamente hasta ebullición. Herv ir por 
espacio de 5 min. 
iii)  En pequeñas cantidades transferir la mezcla calien te a través de un tamiz con número de malla 230. 
Guardar el vaso de precipitados. 
iv)  Lavar el residuo que queda en el tamiz con agua ca liente a chorro constante hasta que disminuya el 
espumado y el agua salga cristalina. 
v)  Transferir el residuo a un vaso de 2000 ml con iso propanol al 40%. Colocar la barra magnética y lleva r 
con isopropanol al 40% hasta la marca de 800 ml. Co locar en la parrilla y calentar a ebullición con ag itación 
constante. Adicionar 95 ml de aceite mineral y llev ar a ebullición durante 3 min. 
vi)  Fijar el embudo de separación (percolador) y adici onar 300 ml de isopropanol al 40%. Transferir la 
mezcla caliente por la parte superior del embudo (p ercolador). Enjuagar el vaso de 2000 ml con isoprop anol al 
40% y vaciar el enjuagado en el embudo de separació n (percolador). Con el mismo vaso adicionar suficie nte 
isopropanol al 40% (aproximadamente 1000 ml) hasta 3 cm antes de la parte superior del embudo. 
vii)  Dejar reposar 5 min y drenar el contenido hasta 5 cm antes del fondo de la capa de aceite. 
viii)  Repetir el llenado a intervalos de 2 min con agua caliente hasta que la fase acuosa sea clara. 
ix)  Drenar la capa de aceite dentro de un vaso de prec ipitados de 1000 ml. Enjuagar el embudo de 
separación (percolador) por las paredes con constan tes lavados de agua e isopropanol al 40%, colectar los 
lavados en el mismo vaso de precipitados de 1000 ml  y enjuagar finalmente con una solución de detergen te al 
1%. Filtrar a través del papel filtro rayado. 
x)  Examinar el papel en el microscopio como en el mét odo 1 según los puntos 1.1.4.7 al 1.1.4.11.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
xi)  Reportar el promedio de las 3 determinaciones como  fragmentos de insectos, pelos de roedor y alguna 
otra materia extraña ligera encontrados en 50 g de muestra. 
1.5 Método para la determinación de materia extraña lig era en harina de cebada, harina de avena y 
mezcla de cereales secos 
1.5.1  Fundamento 
Después de someter la muestra a una hidrólisis ácid a el material considerado como materia extraña lige ra 
se captura por flotación en aceite mineral y poster iormente retenido en papel filtro para su observaci ón al 
microscopio. 
1.5.2  Reactivos y Materiales 
Todos los reactivos que a continuación se mencionan  deben ser grado analítico a menos que se indique 
otra especificación. 
Cuando se indique agua debe entenderse como agua de stilada. 
1.5.2.1  Reactivos 
Acido clorhídrico (HCl) de 36,5 a 38,0% de pureza y  con un peso específico de 1,185 - 1,192. 
i)  Acido clorhídrico al 3%. Diluir 3 volúmenes de áci do clorhídrico en 97 volúmenes de agua (v/v). 
Aceite mineral ligero. Con un peso específico (24° C ) de 0,840 - 0,860 y una viscosidad (40° C) de 45 - 55 
cSt. 
Mezcla glicerina - alcohol etílico 96% Alc. Vol. 1: 3 (v/v) (C 3H5) (OH) 3 - C 2H5-OH) 
ii) Mezclar 1 volumen de glicerina con 3 volúmenes de a lcohol etílico. 
Isopropanol (CH 3)2 CHOH al 40% (v/v). 
iii)  Diluir 40 ml de isopropanol con agua en un matraz volumétrico de 100 ml y llevar al aforo. 
Mezcla isopropanol al 40% - tween 80 o equivalente (1:1) 
iv) A 40 ml de tween 80, adicionar 210 ml de isopropano l al 40%, mezclar y filtrar (se pueden preparar 
volúmenes proporcionales). 
Mezcla isopropanol al 40%- Sal disódica de ácido et ilendiaminotetraacético (EDTA) 
v)  Disolver 5 g de sal disódica de EDTA en 150 ml de agua, agregar 100 ml de isopropanol al 40% mezclar 
y filtrar (se pueden preparar volúmenes proporciona les). 
Igepal (Dialquilfenoxipolietilenoxietanol) o emulsi ficante equivalente. 
1.5.2.2  Material 
Vasos de precipitados de 100, 600, 1000 y 2000 ml 
Matraz trampa de Wildman de 1000 o 2000 ml 
Embudos para polvos 
Embudo de Büchner 
Matraz Kitazato 
Caja Petri 
Tamiz con número de malla 230 
Aguja de disección 
Parrilla de calentamiento con agitación 
Papel de filtración rápida rayado para conteo con l íneas paralelas de aproximadamente 5 mm de 
separación. 
Material común de laboratorio. 
1.5.3  Equipo 
Balanza analítica con 0,1 mg de sensibilidad 
Equipo de filtración al vacío 
Agitador magnético 
Microscopio binocular estereoscópico con objetivos que pueden ser de 3, 6, 7 y 10X y oculares apareado s 
de amplio campo visual de 10, 30 y 100X respectivam ente. 
Lámpara para el Microscopio o luz natural equivalen te. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
1.5.4  Procedimiento 
1.5.4.1  Pesar por triplicado 50 g de muestra en un vaso de  precipitados de 2000 ml con una corriente 
fuerte de agua caliente (55-70° C) dirigida a una pa red del vaso, agregar 1 litro de agua, adicionar 80  ml de 
ácido clorhídrico. Si la lista de ingredientes del producto incluye aceite vegetal, adicionar 20 ml de  
emulsificante Igepal. 
1.5.4.2  En la parrilla precalentada al máximo calor, coloc ar el vaso. Al inicio agitar vigorosamente para 
evitar que se queme, después volver a agitar suavem ente para mezclar y calentar durante 20 min. Si el 
producto se obscurece, reducir la intensidad de la temperatura. 
1.5.4.3  Transferir el contenido del vaso a un tamiz con nú mero de malla 230 y lavarla bajo una fuerte 
corriente de agua, hasta que ésta salga clara, lava r el residuo colocando la muestra sobre uno de los lados del 
tamiz. 
1.5.4.4  Empapar el residuo húmedo con isopropanol y dejarl o drenar. Formar una copa de papel filtro y 
envolver éste alrededor de un vaso de precipitados de 600 ml e introducir la copa de papel en el vaso de 
precipitados de 1000 ml. 
1.5.4.5  Con la ayuda de un embudo para polvos, llevar el m atraz trampa con isopropanol al 40% dejándolo 
caer lentamente por la varilla de agitación. Dejar reposar por 30 min y atrapar. Adicionar 35 ml de ac eite 
mineral agitar suavemente a mano por 30 segundos y dejar reposar 10 min. Volver a entrampar, filtrar s obre 
papel filtro rayado. 
1.5.4.6  Examinar el papel en el microscopio como en el mét odo 1 según los puntos 1.1.4.7 al 1.1.4.11. 
1.5.4.7  Reportar el promedio de las 3 determinaciones como  fragmentos de insectos, pelos de roedor y 
alguna otra materia extraña ligera encontrados en 5 0 g de muestra. 
1.6 Determinación de materia extraña ligera en alimento s a base de cereales, de semillas comestibles, de 
harinas, sémolas o semolinas o sus mezclas 
1.6.1  Fundamento 
Después de someter la muestra a una hidrólisis ácid a el material considerado como materia extraña lige ra 
se captura por flotación en aceite mineral y poster iormente retenido en papel filtro para su observaci ón al 
microscopio. 
1.6.2  Reactivos y materiales 
Todos los reactivos que a continuación se mencionan  deben ser grado analítico a menos que se indique 
otra especificación. 
Cuando se indique agua debe entenderse agua destila da. 
1.6.2.1  Reactivos 
Acido clorhídrico (HCl) de 36,5 a 38,0% de pureza y  con un peso específico de 1,185-1,192. 
Aceite mineral ligero. Con un peso específico (24° C ) de 0,840-0,860 y una viscosidad (40° C) de 45-55 c St. 
Mezcla glicerina - alcohol etílico de 96% alc. vol.  1:3 (v/v) 
(C 3H5)(OH) 3-C2H5-OH) 
i)  Mezclar 1 volumen de glicerina con 3 volúmenes de alcohol etílico. 
Isopropanol (CH 3)2CHOH al 40% (v/v). 
ii)  Diluir 40 ml de isopropanol con agua en un matraz volumétrico de 100 ml y llevar al aforo. 
Igepal (Dialquilfenoxipolietilenoxietanol) o el equ ivalente como tween. 
1.6.2.2  Material 
Vasos de precipitados de 100, 600, 1000 y 2000 ml 
Matraz trampa de Wildman de 1000 o 2000 ml o percol ador o embudo de Kilborn 
Embudo Büchner 
Matraz Kitazato 
Caja Petri       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
Agitador magnético 
Tamiz con número de malla 230 
Aguja de disección 
Papel de filtración rápida rayado para conteo con l íneas paralelas de aproximadamente 5 mm de 
separación 
Material común de laboratorio 
1.6.3  Aparatos e Instrumentos 
Parrilla de calentamiento con agitación 
Balanza analítica con 0,1 mg de sensibilidad 
Equipo de filtración al vacío 
Microscopio binocular estereoscópico con objetivos que pueden ser de 3, 6, 7 y 10X y oculares apareado s 
de amplio campo visual de 10, 30 y 100X respectivam ente 
Lámpara para el microscopio o luz natural equivalen te. 
1.6.4  Procedimiento 
1.6.4.1  Para productos de bajo contenido de grasas o aceit es: 
Pesar por triplicado 50 g de muestra en un vaso de precipitados de 1 o 1,5 litros (dependiendo del 
volumen del producto) adicionar 500 ml de agua cali ente (55-70° C) y 40 ml de HCl. Colocar en una parri lla con 
agitación magnética, calentar la mezcla hasta ebull ición agitando suavemente durante 20 min. 
Transferir el contenido del vaso a un tamiz con núm ero de malla 230 y lavarla bajo una fuerte corrient e de 
agua, hasta que ésta salga clara, lavar el residuo colocando la muestra sobre uno de los lados del tam iz, 
lavando con isopropanol al 40%. Transferir el conte nido del tamiz al matraz trampa de Wildman o regres arlo al 
vaso original si se va a emplear el percolador. 
i)  Procedimiento con el matraz trampa 
Con isopropanol al 40% llevar a un volumen de 800 m l y adicionar 30 ml de HCl, colocar el matraz sobre  
una parrilla con agitación magnética. Subir la vari lla de agitación arriba del nivel del líquido soste niéndola con 
una pinza. Colocar una barra magnética y con agitac ión suave hervir la muestra durante 5 min. Adiciona r 50 
ml de aceite mineral y agitar 3 min. Quitar el matr az de la parrilla y lavarlo con isopropanol al 40%.  Dejar 
reposar 10 min y entrampar enjuagando el cuello del  matraz con isopropanol o alcohol. Filtrar sobre pa pel filtro 
rayado. Examinar al microscopio. 
ii)  Procedimiento para el percolador o embudo de Kilbo rn 
En el vaso original de la muestra llevar a un volum en de 600 ml con isopropanol al 40% y adicionar 25 ml 
de HCl. Llevar a ebullición con agitación suave, he rvir durante 5 min, agregar 50 ml de aceite mineral  y agitar 
3 min. 
Transferir el contenido del vaso al percolador enju agando el vaso sobre éste con isopropanol al 40%. 
Si el residuo en el separador es pesado, resuspende rlo con una varilla de vidrio, enjuagándola dentro del 
percolador. 
Dejar reposar por 3 min y drenar el contenido hasta  3 cm antes de llegar a la parte superior de la cap a de 
aceite, volver a llenar con agua caliente (55-70° C) , repetir la operación de drenado y llenar con agua  caliente 
con intervalos de 3 min hasta que la fase acuosa qu ede libre de "material plant" (material entrampable ). 
Desechar los drenados. Drenar la capa oleosa, recib iéndola en el vaso original, lavando las paredes de l 
percolador alternativamente con isopropanol o agua caliente y alcohol, usando un gendarme de hule para  
lavar las paredes. 
Filtrar el contenido del vaso sobre papel rayado. E xaminar al microscopio. 
1.6.4.2  Para productos que contienen alto contenido de gra sas o aceite: 
Proceder como en 1.6.4.1, previa adición de 20 ml d el emulsificante (Igepal o su equivalente). 
1.6.5  Informe de la prueba 
Reportar el promedio de las tres determinaciones co mo fragmentos de insectos, pelos de roedor y alguna  
materia extraña ligera encontradas en 50 g de muest ra. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
1.7 Métodos para la determinación de materia extraña en  productos de panificación. 
1.7.1 Método para la determinación de materia extraña lig era (fragmentos de insectos, insectos enteros, 
pelos de roedor y fragmentos de plumas) en producto s horneados con frutas y nueces. 
Método por Hidrólisis Acida. 
1.7.1.1  Fundamento 
Después de someter la muestra a una hidrólisis ácid a el material considerado como materia extraña lige ra 
se capta por flotación en heptano y es posteriormen te retenido en papel filtro para su observación al 
microscopio. 
1.7.1.2  Reactivos y Materiales 
Todos los reactivos que a continuación se mencionan  deben ser grado analítico a menos que se indique 
otra especificación. 
Cuando se indique agua deberá entenderse agua desti lada. 
i)  Reactivos. 
Acido clorhídrico (HCl) de 36,5 a 38,0% de pureza y  con un peso específico de 1,185 - 1,192 
Alcohol etílico (C 2H5OH) al 95% puede emplearse alcohol comercial sin de snaturalizar. 
Alcohol etílico al 60% 
En un matraz volumétrico de 1 litro adicionar 631,6  ml de alcohol de 95% y llevar al volumen con agua.  
Cloroformo (CHCl 3) 
Heptano C 7H6 puede emplearse n-heptano comercial con un conteni do máximo de 8% de tolueno. 
Mezcla glicerina-alcohol etílico (C 3H5 (OH)  3 C2H5OH) 1:3 v/v 
Mezclar 1 volumen de glicerina con 3 volúmenes de a lcohol etílico al 95%. 
Solución de acetato de etilo (C 4H8O2) solución acuosa saturada. 
Solución antiespumante: Diluir 1g de antiespumante con 20 ml de solución de acetato de etilo, usar el 
sobrenadante y mantener el envase perfectamente cer rado. 
ii)  Materiales. 
Vaso de precipitados de 100, 250, 1000 y 2000 ml. 
Vidrios de reloj. 
Matraces volumétricos de diferentes capacidades. 
Matraz trampa de Wildman, compuesto de Imetraz. 
Matraz Erlenmeyer de 1 a 12 litros previsto de un t apón émbolo de hule sujeto al extremo de una varill a 
metálica. 
Embudo Büchner. 
Caja Petri. 
Aguja de disección. 
Papel de filtración rápida rayado para conteo con l íneas paralelas de aproximadamente 5 mm de 
separación. 
Tamiz con No. de malla 140 de 5 a 8 pulgadas de diá metro. 
1.7.1.3 Equipo 
Autoclave 
Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg 
Sistema para filtrar al vacío 
Placa de calentamiento 
Microscopio binocular estereoscópico con objetivos que pueden ser 3, 6, 7, 10X y oculares apareados de  
amplio campo visual de 10, 30 y 100X respectivament e. 
Lámpara para el microscopio o luz natural equivalen te.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
1.7.1.4 Procedimiento 
Agregar 225 g de muestra a un vaso de precipitados de 2 litros que contenga 1 litro de agua y 30 ml de  
ácido clorhídrico concentrado. 
Humedecer completamente el producto y agitar hasta que la suspensión esté prácticamente libre de 
grumos. Agregar la solución antiespumante y tapar c on un vidrio de reloj, calentar de 15 a 20 min en a utoclave 
a 121° C. Dejar que la presión baje a 0 antes de abr ir la válvula de ventilación. 
Transferir el digerido en pequeñas porciones al tam iz de malla No. 140 y lavar perfectamente entre 
adiciones con la pasta rociadora de una piseta. Des pués de que toda la muestra ha sido transferida, co ntinuar 
con el lavado hasta que no haya reducción en la can tidad del residuo. 
Después de completar los lavados (sin material almi donoso visible libre de salvado), lavar dos veces e n 
forma alternativa con alcohol y cloroformo en ese o rden, después enjuagar perfectamente con alcohol y 
finalmente con agua. 
Transferir el material a un papel filtro si es que hay poco residuo a un matraz trampa de 1 o 2 litros  si hay 
mucho residuo. 
Usar una cuchara para transferir la mayor parte del  material. 
Enjuagar el residuo del tamiz con una piseta que co ntenga alcohol al 60%, lavar la malla con un chorro  
constante de agua caliente, colectando el residuo f inal en un borde de la malla, pasarlo al matraz tra mpa con 
la ayuda de la piseta de alcohol al 60%. Agregar 40 0 o 900 ml de alcohol al 60% dependiendo del tamaño  del 
matraz. 
Hervir por 20 min. Enfriar abajo de 20° C y adiciona r 20 o 40 ml de heptano, llevar al matraz con alcoh ol al 
60% y sifonear 2 veces. 
Tener cuidado en la agitación y adición del alcohol  para prevenir emulsiones o inclusión de aire si el  
residuo en el matraz tiende a elevarse, agitar el m aterial hacia abajo 2 o 3 veces. 
Filtrar con el fin de retener el material y examina r el microscopio. 
Pasar el papel filtro con el residuo o una caja Pet ri humedecida con la mezcla de glicerina-alcohol et ílico y 
así mantenerlo. 
Contar al microscopio utilizando una luz suficiente mente fuerte para que muestre todos los detalles a 
través del microscopio, contar y explorar con la ag uja de disección sobre toda la superficie del papel , línea por 
línea voltear y explorar cada pieza del material, y a que algunos fragmentos son irreconocibles a menos  que se 
muevan. 
No contar material dudoso, una amplificación de 30X  en algunos casos es útil para examinar piezas 
dudosas. 
Marcar el papel en un lado de cada fragmento contad o, por medio de un lápiz graso, para futuros 
chequeos y para evitar cuentas erróneas. 
Repetir el conteo para los fragmentos de insectos, pelos de roedor, incrustados en 225 g de muestra. 
1.7.2 Método para la determinación de materia extraña lig era en pan blanco y productos con alto contenido 
de grasa 
1.7.2.1 Fundamento 
Después de someter a la muestra a una digestión el material considerado como materia extraña ligera se  
capta por flotación en aceite y es posteriormente r etenido en papel filtro para su observación al micr oscopio. 
1.7.2.2 Reactivos y Materiales 
i)  Reactivos 
Acido Clorhídrico HCl de 36,5 a 38,0% de pureza y c on un peso específico de 1,185 - 1,192 
Aceite mineral ligero con peso específico (24° C) de  0,840 - 0,860 y una viscosidad (40° C) de 45 - 55 c St. 
Alcohol etílico (C 2H5OH) al 95% se puede emplear alcohol comercial sin d esnaturalizar. 
Isopropanol (CH 3)2CHOH 
Solución de acetato de etilo (C 4H8O2), solución acuosa saturada. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
Solución antiespumante. Diluir 1 g de antiespumante  con 20 ml de solución de acetato de etilo, usar el  
sobrenadante y mantener el envase perfectamente cer rado. 
Emulsificantes. Surfactantes no iónicos, solubles e n agua, A-Nonilfenoxipoli (etilenoxi) etanol; Igepa l CO-
730 o equivalente. 
Beta- Dialquilfenoxi Poli (etilenoxi) etanol Igepal  DM-710 
Detergente al 5% (p/v). Disolver 5 g de lauril sulf ato de sodio y llevar al volumen de 100 ml 
ii)  Material 
Vasos de precipitados de 100, 250, 1000 y 2000 ml 
Matraces volumétricos de diferentes capacidades 
Vidrios de reloj 
Caja Petri 
Aguja de disección 
Embudo percolador o Embudo Kilborn 
Varilla de vidrio 
Tamiz con malla No. 230 
Papel de filtración rápida rayado para conteo con l íneas paralelas de aproximadamente 5 mm de 
separación. 
iii)  Equipo 
Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg 
Agitador magnético 
Placa de calentamiento con agitación magnética 
Microscopio binocular estereoscópico con objetivos que pueden ser 3, 6, 7 y 10X y oculares apareados d e 
amplio campo visual de 10, 30X y 100X respectivamen te 
Lámpara para el microscopio o luz natural equivalen te 
1.7.2.3  Procedimiento 
Agregar 1 litro de agua caliente (55 a 70° C) a un v aso de 2 litros añadir 20 ml del emulsificante B y 5 ml 
del emulsificante A y mezclar bien. 
Agregar 225 g de muestra y cortar el pan en trozos de menos de 1 pulgada cuadrada y agitar bien. 
La digestión puede efectuarse de dos formas: 
i)  Autoclave. Agregar con agitación 30 ml de ácido cl orhídrico concentrado. Añadir 1 ml de solución 
antiespumante, calentar en el autoclave por 30 min a 121° C, dejar que la presión baje a 0 antes de abr ir la 
válvula de ventilación. 
ii)  Baño de vapor. Agregar con agitación 90 ml de ácid o clorhídrico concentrado. Calentar en baño de 
vapor por 10 min. Agregar 1 ml de solución antiespu mante. Hervir 15 min sobre una placa de calentamien to 
con agitación magnética, mantener el vaso cubierto con un vidrio de reloj. 
iii)  Humedecer la malla No. 230, moviéndola en zigzag, con agua caliente (55 a 75° C). Tamizar hasta que 
el chorro esté claro y la espuma desaparezca. Trans ferir el residuo retenido en la malla al vaso origi nal 
(Precaución. No permitir que la muestra en el vaso o la malla se enfríe). Agregar 30 ml de ácido clorh ídrico 
concentrado y diluir a 1 litro con agua. Agitar en el agitador magnético y llevar a ebullición. Hervir  por 6 min y 
agregar 50 ml de aceite mineral y continuar con el calentamiento hasta que se reanude la ebullición. T ransferir 
el vaso a una placa de calentamiento fría con agita ción magnética y agitar por 3 min. 
iv)  Inmediatamente pasar el contenido del vaso a un pe rcolador que contiene aproximadamente 250 ml de 
agua. Enjuagar el vaso en el percolador y llevar el  volumen a la marca de 1700 con agua. Después de 1 min, 
agitar el contenido del percolador con una varilla de vidrio. Colocar la varilla en el vaso y apartarl a para recibir 
el drenado final de aceite. Dejar reposar 2 min. Dr enar el aceite hasta la marca de 250 ml y descartar  los 
drenados. Volver a llenar el percolador con agua. C ontinuar con el drenado y llenado hasta que la fase  acuosa 
inferior esté casi clara. Drenar el aceite hasta la  marca de 250 ml. Drenar el aceite en el vaso origi nal. Lavar 
las paredes del percolador con al menos 50 ml de ag ua y alcohol o isopropanol. Si las paredes no se ve n 
limpias, siga los lavados con agua y detergente al 5%. Filtrar sobre un papel rayado y examinar al 
microscopio. 
Examinar al microscopio como en el método 1.7.1 
Reportar los fragmentos de insectos, pelos de roedo r encontrados en 225 g de muestra.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
1.7.3 Método para la determinación de materia extraña lig era en panes con alto contenido de fibra 
1.7.3.1  Fundamento 
Después de someter la muestra a una digestión, el m aterial considerado como materia extraña ligera se 
capta por flotación en aceite y es posteriormente r etenido en papel filtro para su observación al micr oscopio. 
1.7.3.2  Reactivos y Materiales. 
i) Reactivos. 
Acido Clorhídrico HCL de 36,5 a 38,0% de pureza y c on un peso específico de 1,185-1,192 
Aceite mineral ligero con un peso específico (24° C)  de 0,840 - 0,860 y una viscosidad (40° C) de 45-55 cSt. 
Alcohol etílico (C 2H5OH) al 95%, se puede emplear alcohol comercial sin desnaturalizar. 
Isopropanol (CH 3)2CHOH 
Solución de Acetato de Etilo (C 4H8O2), solución acuosa saturada. 
Solución antiespumante. Diluir 1 g de antiespumante  con 20 ml de acetato de etilo, usar el sobrenadant e y 
mantener el envase perfectamente cerrado. 
Detergente al 5% (p/v). Disolver 5 g de lauril sulf ato de sodio y llevar al aforo a 100 ml. 
Solución alcohol-ácido. Mezclar una parte de ácido clorhídrico concentrado, con 9 partes de isopropano l al 
40%. 
ii) Material 
Vaso de precipitados de 100, 250, 1000 y 2000 ml. 
Matraces volumétricos de diferentes capacidades. 
Embudo percolador o embudo Kilborn 
Varilla de vidrio 
Gendarme 
Tamiz con No. de malla 140 
Papel de filtración rápida rayado para conteo con l íneas paralelas de aproximadamente 5 mm de 
separación. 
iii)  Equipo 
Autoclave 
Balanza analítica con 0,1 mg de sensibilidad. 
Agitador magnético. 
Placa de calentamiento con agitación magnética 
Microscopio binocular estereoscópico con objetivos que pueden ser 3, 6, 7, 10X y oculares apareados de  
amplio campo visual de 10, 30 y 100X respectivament e. 
Lámpara para el microscopio o luz natural equivalen te. 
1.7.3.3 Procedimiento  
i)  Agregar 225 g de muestra a un vaso de 2 litros con teniendo aproximadamente 1 litro de agua y 50 ml de  
ácido clorhídrico concentrado. Agitar bien, añadir 1ml de solución antiespumante. Calentar al autoclav e 15 min 
a 121ºC, dejar que la presión baje a 0 antes de abr ir la válvula de ventilación. Pasar el digerido en pequeñas 
porciones a través de la malla No. 140 con agua cal iente (55 - 70° C) hasta que la cantidad del residuo  
permanezca constante. Colocar la malla en una charo la, cubrir el residuo con una capa de aproximadamen te 
2 cm de alcohol o isopropanol, dejar reposar 5 min y drenar. 
Repetir este paso 3 veces con cloroformo, luego 2 v eces más con alcohol o isopropanol y drenar 
completamente. Inmediatamente transferir cuantitati vamente el residuo retenido en la malla a un vaso d e 1 
litro con ayuda de la mezcla alcohol-ácido, diluir el contenido a aproximadamente 600 ml con la mezcla  de 
alcohol-ácido. Agregar 50 ml de aceite mineral y ag itar magnéticamente durante 5 min. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
ii)  Pasar completamente el contenido del vaso al perco lador o al embudo Kilborn y retener el vaso. Dejar 
reposar 30 min, agitar en forma suave aproximadamen te cada 5 min con un agitador largo de vidrio, dura nte 
los primeros 20 min; drenar el contenido hasta casi  250 ml. Agregar mezcla alcohol-ácido hasta 3 cm ab ajo de 
la parte superior y dejar reposar 30 min, agitando con la varilla como se hizo anteriormente. Drenar o tra vez 
hasta 250 ml. Llenar el embudo con agua fría, dejar  sedimentar por un tiempo aproximado de 1,5 min y d renar 
hasta 250 ml. Continuar con el drenado y llenado ha sta que la fase acuosa inferior esté clara y libre de 
material en suspensión. 
iii)  Después del último lavado, drenar la interfase agu a-aceite en el vaso retenido. Inmediatamente lavar 
las paredes del percolador con porciones de 50 a 10 0 ml de agua caliente, isopropanol o alcohol y si f uera 
necesario con solución de detergente al 5%. Filtrar  a través de papel filtro rayado, lavando las pared es del 
vaso con porciones de 50 a 100 ml de agua caliente,  isopropanol o alcohol y si fuera necesario con sol ución 
de detergente al 5%. Filtrar a través de papel filt ro rallado, lavando las paredes del vaso con porcio nes de 50 a 
100 ml de agua caliente, isopropanol o alcohol y si  fuera necesario con solución de detergente al 5%, usando 
un gendarme de hule. Examinar al microscopio como e n el método 1.7.1 
Reportar los fragmentos de insectos y pelos de roed or, encontrados en 225 g de muestra. 
2. Método para la Determinación de Humedad y Sólido s Totales en Harina  
2.1  Fundamento 
Cuando un producto es sometido a secado en condicio nes específicas, presenta una pérdida de peso, 
debido a la evaporación del agua que contiene, la c ual se reporta como valor de humedad. 
2.2  Material 
Cajas de aluminio de 55 mm de diámetro por 15 mm de  altura, con tapa. 
Desecador hermético con agente desecante apropiado,  tales como silica gel, cloruro de calcio o 
equivalentes y excluyendo el ácido sulfúrico. 
Pinzas de crisol. 
2.3  Equipo 
Balanza analítica con sensibilidad de 0,0001 g 
Estufa de secado capaz de mantenerse a 130 ± 3ºC y provista de un orificio para ventilación. 
2.4  Procedimiento 
2.4.1  Pesar 2 g de harina en una caja de aluminio la cua l previamente se ha secado por una hora a 130 ± 
3ºC y enfriada en desecador durante una hora. 
2.4.2  Colocar la caja con la muestra dentro de la estufa  y secar durante una hora a 130 ± 3ºC. El tiempo 
debe empezar a contar a partir de que la temperatur a en la estufa con la muestra alcance los 130 ± 3ºC . La 
caja deberá estar semitapada. 
2.4.3  Después de una hora, tapar la caja dentro de la es tufa. Sacar la caja y colocarla en el desecador y 
dejarla enfriar hasta que alcance la temperatura am biente (aproximadamente una hora). 
2.4.4  Una vez que se haya enfriado pesarla y reportar la  pérdida de peso como humedad, y el residuo de 
la harina como Sólidos Totales. 
2.5  Cálculos 
(A-B) x 100 
  % Humedad = ----------------------- 
W 
 % Sólidos Totales = 100 - % Humedad 
En donde: 
A = Peso de la caja con muestra en g 
B = Peso de la caja con muestra desecada en g 
W = Peso de la muestra en g       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
2.6  Repetibilidad 
La diferencia entre dos resultados sucesivos obteni dos en las mismas condiciones en la misma muestra 
no debe exceder de ± 0,2%. En caso contrario repeti r las determinaciones. 
2.7  Precauciones 
El agente desecante debe estar en buenas condicione s. 
3 Método de prueba para la determinación de aflatox inas en cereales. 
3.1 Preparación de la Muestra analítica. 
3.1.1 Pesar 25 g de muestra y adicionarla al vaso de la l icuadora. 
3.1.1.1 Adicionar 5 g de cloruro de sodio y 125 mL de metan ol grado analítico al 60%. 
3.1.1.2 Licuar durante un minuto a la más alta velocidad. 
3.1.1.3 Filtrar a través de papel aflautado de 24 cm de diá metro. 
3.1.2 Extracción de las AF por medio de columnas de inmun oafinidad. 
3.1.2.1 Medir 20 mL del filtrado y adicionar 20 mL de agua destilada. Mezclar y filtrar a través de papel 
fibra de vidrio. 
3.1.2.2 Medir 10 o 15 mL del filtrado (de acuerdo con las i nstrucciones de la columna de inmunoafinidad 
empleada). 
3.1.2.3 Quitar la tapa de la columna de inmunoafinidad y pa sar el filtrado a través de ella a razón de un 
flujo de dos gotas por segundo. Colectar en el fras co para residuos. 
3.1.2.4 Lavar la columna dos veces, con 10 mL de agua cada vez, llevando a sequedad. 
3.1.2.5 En caso de haber utilizado 10 mL de filtrado, añadi r 1 mL de metanol grado HPLC eluir y recibir en 
una celda de borosilicato. 
3.1.2.6 En caso de haber utilizado 15 mL de filtrado, añadi r 2,3 mL de metanol grado HPLC eluir y recibir 
en una celda de borosilicato. 
3.1.2.7 Seguir con el resto de la metodología especificada en cualquiera de los métodos de prueba 
establecidos en el apartado 3 Método de prueba para  la determinación de aflatoxinas en cereales 
3.2 Extracción por columnas de inmunoafinidad. 
3.2.1  Fundamento. 
Las AF son extraídas de la muestra, con metanol al 80%, el extracto es filtrado y diluido con agua, fi ltrado 
y pasado a través de una columna de inmunoafinidad la cual contiene un anticuerpo monoclonal específic o 
para AF. En este estado la aflatoxina se liga al an ticuerpo de la columna. La columna es entonces lava da con 
agua para eliminar impurezas. Posteriormente, despu és de pasar metanol a través de la columna, las AF son 
removidas del anticuerpo, esta solución es medida e n un fluorómetro previa derivatización con solución  diluida 
de bromo. Las AF son cuantificadas en forma total. 
3.2.2 Materiales. 
Columnas de inmunoafinidad. 
Papel filtro aflautado de 24 cm Ø Whatman No. 1 o e quivalente. 
Papel filtro fibra de vidrio de 11 cm Ø Whatman No.  934AH o equivalente. 
Matraces Erlenmeyer de 125 mL. 
Vasos de precipitados de 100 mL. 
Embudos de plástico de 100 mm Ø. 
Embudos de plástico de 60 mm Ø. 
Dosificador de 1 a 5 mL. 
Dosificador de 5 a 10 mL. 
Dosificador de 20 a 100 mL. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
Probeta de 1000 mL. 
Pipetas volumétricas de 10 mL. 
Pipetas volumétricas de 5 mL. 
Pipetas volumétricas de 1 mL. 
Auxiliar de macropipeteado. 
Jeringas de vidrio de 10 mL. 
Estándares de calibración de 3 niveles. 
Celdas de borosilicato de 12x75 mm. 
Gradilla de plástico para celdas de 12x75 mm. 
Preparación de patrones de calibración. De no conta r con los estándares provistos por el fabricante, 
preparar el estándar de calibración de la siguiente  manera: use como testigo ácido sulfúrico (H 2SO 4) 0.1N. 
Como patrón de AF de 20 ng, use 34 mg de sulfato de  quinina dihidratada/mL de H 2SO 4 0.1N. 
3.2.3  Equipo. 
Licuadora de alta velocidad con vaso de acero inoxi dable o de vidrio de 250 mL. 
Bomba manual. 
Mezclador tipo vórtex. 
Fluorómetro con lámpara pulsada de Xenón o cuarzo-h alógeno y filtros de excitación de 360 nm y de 
emisión de 450 nm. 
3.2.4  Reactivos. 
Solución de metanol al 80%. 
Medir 800 mL de metanol grado analítico y mezclar c on 200 mL de agua destilada en probeta graduada de 
1000 mL. 
Cloruro de sodio. 
Metanol grado HPLC. 
Solución reveladora de bromo al 0,03%. 
i)  Solución de bromo al 0,03%. 
ii) Se mide 1 mL de solución reveladora de concentració n al 0,03% y se añaden 9 mL de agua destilada. 
Preparar el día de su uso. 
 Solución PBS pH 7.3 *. 
* En caso que se requiera por parte del fabricante de la columna. 
i) Preparación PBS pH 7.3. En caso de ser necesaria la  preparación de la solución se tienen las siguiente s 
alternativas: 
a)  Pesar las siguientes sales: 
Cloruro de potasio 1 g. 
Ortofosfato dihidrogenado de potasio 1 g. 
Ortofosfato hidrogenado de sodio (anhidro) 5,8 g. 
Cloruro de sodio 40,0 g. 
Disolver las sales en aproximadamente 4,5 litros de  agua destilada. 
Ajustar el pH de la solución a 7.3 utilizando ácido  clorhídrico (HCI) o hidróxido de sodio (NaOH), seg ún 
corresponda. 
Completar el volumen final a 5 litros y volver a ve rificar el pH. 
b) Tomar una tableta de PBS y disolver en 100 mL de ag ua destilada. 
Las soluciones permanecen estables durante un mes.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
3.2.5  Preparación de la muestra analítica. 
3.2.5.1  Pesar 50 g de la muestra molida e introducirla en el vaso de la licuadora. 
3.2.5.2 Adicionar 5 g de cloruro de sodio y 100 mL de metan ol al 80%. 
3.2.5.3 Licuar durante un minuto a alta velocidad. 
3.2.5.4  Filtrar a través de papel aflautado de 24 cm de Ø.  (Filtrado 1). 
3.2.6  Extracción de las AF por medio de columnas de inmu noafinidad. 
3.2.6.1  Medir 10 mL del filtrado 1 y adicionar 40 mL de ag ua destilada. Mezclar y filtrar a través de papel 
fibra de vidrio (filtrado 2). 
3.2.6.2 Medir 5 mL del filtrado 1 y adicionar 35 mL de agua  destilada. Mezclar y filtrar a través de papel 
fibra de vidrio (filtrado 2). 
3.2.6.3 Conectar una columna de inmunoafinidad a la punta d e una jeringa de vidrio colocada en la bomba 
manual. En caso de ser necesario pasar a través de la columna 20 mL de PBS. 
3.2.6.4 En el caso de seguir el procedimiento descrito en e l punto anterior 3.2.6.1, medir 10 mL filtrado 2 
en la jeringa. 
3.2.6.5 En el caso de seguir el procedimiento descrito en e l punto anterior 3.2.6.2, medir 15 mL del filtrado 
2 en la jeringa. 
3.2.6.6  Quitar la tapa de la columna de inmunoafinidad y p asar el filtrado  2 a través de ella a razón de un 
flujo de dos gotas por segundo. Colectar en el fras co para residuos. 
3.2.6.7  Lavar la columna dos veces, con 10 mL de agua cada  vez. 
3.2.6.8 Pasar aire por la columna llevándola a sequedad. 
3.2.6.9 En caso de seguir el procedimiento descrito en el p unto 3.2.6.4, añadir 1 mL de metanol grado 
HPLC, eluir y recibir en una celda de borosilicato.  
3.2.6.10  En caso de seguir el procedimiento descrito en  3.2.6.5, añadir 2,3 mL de metanol grado HPLC, 
eluir y recibir en una celda de borosilicato. 
3.3  Cuantificación por fluorometría. 
3.3.1 Calibración de los fluorómetros. 
La calibración del fluorómetro debe hacerse de acue rdo con la que señale el "Manual del fabricante". 
3.3.2 Procedimiento de cuantificación. 
3.3.2.1  Una vez separadas las AF de conformidad con lo señ alado en el puntoanterior “extracción de la AF 
por medio de las columnas de inmunoafinidad”, proce der con los siguientes pasos: 
3.3.2.2 Adicionar solución reveladora 1 mL (si se siguió el  punto 3.2.6.1). o 2 mL (si se siguió el punto 
anterior 3.2.6.2). 
3.3.2.3 Agitar la celda en el agitador tipo vórtex (elimina r las burbujas que se forman). 
3.3.2.4  Colocar la celda en el fluorómetro previamente cal ibrado. 
3.3.2.5 Leer la concentración de AF totales después de 60 s egundos, directamente en µg/kg. 
3.4 Método HPLC. 
3.4.1 Fundamento. 
Las AF son extraídas de la muestra, con metanol al 80%, el extracto es filtrado, diluido con agua y pa sado 
a través de una columna de inmunoafinidad la cual c ontiene un anticuerpo monoclonal específico para AF  B 1, 
B2, G 1 y G 2. Las AF son aisladas, purificadas y concentradas e n la columna y posteriormente son eluidas con 
acetonitrilo. El eluido es derivatizado con ácido t rifluoroacético. Las AF son cuantificadas en forma individual 
por cromatografía en fase reversa y detectadas por fluorometría. 
3.4.2  Materiales. 
Columnas de inmunoafinidad. 
Papel filtro aflautado de 24 cm Ø. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
Papel filtro fibra de vidrio de 11 cm Ø. 
Matraces Erlenmeyer de 125 mL. 
Vasos precipitados de 100 mL. 
Embudos de plástico de 100 mm Ø. 
Embudos de plástico de 60 mm Ø. 
Dosificador de 1 a 5 mL. 
Dosificador de 10 a 50 m. 
Micropipetas digitales de 10 a 100 µL; 100 a 1000 µ L. 
Filtros para solventes orgánicos de 47 mm y poro de  0,45 µm. 
Filtros para solventes acuosos de 47 mm y poro de 0 ,45 µm. 
Equipo de filtración Millipore o similar. 
Dosificador de 20 a 100 mL. 
Probeta de 1000 mL. 
Pipetas volumétricas de 10 mL. 
Pipetas volumétricas de 5 mL. 
Pipetas volumétricas de 1 mL. 
Auxiliar de macropipeteado. 
Jeringas de vidrio de 10 mL. 
Probeta graduada de 100 mL. 
Frascos vial de vidrio ámbar con tapón de rosca cap acidad de 4 mL. 
Frascos de vidrio de 1 litro para almacenamiento de  fase móvil. 
Viales de vidrio ámbar de 1,8 mL con septum de rosc a. 
Filtros para muestras de politetrafluoretileno de 1 3 mm y poro de 0,45 µm. 
Matraces aforados color ámbar de 50 y 100 mL. 
Matraces volumétricos de 1 y 2 L. 
Jeringas desechables de 5 mL con aguja. 
Frascos color ámbar de 100 mL con tapón. 
Celdas de cuarzo para espectrofotómetro de 1 cm de paso de luz. 
Pipetas Pasteur. 
Pipetas volumétricas de 25 mL. 
3.4.3 Equipo. 
Sistema de degasificación de solventes por membrana  de vacío, inyección de helio u otro equivalente. 
Bombas de gradiente con válvula para mezclado de cu atro solventes o sistema isocrático de bombas. 
Inyector automático o manual de muestras con loop d e 50 µL o más y sistema de autolimpieza. 
Columna HPLC C-18 de 4,6 x 250 mm o 4,6 x 150 mm, 5  µm de tamaño partícula. 
Detector de fluorescencia con lámpara pulsada de Xe nón y filtros de excitación a 360 nm y de emisión d e 
450 nm. 
Graficador, integrador de datos o computadora perso nal con el software adecuado para el control del 
equipo y procesamiento de datos. 
Balanza granataria con una precisión de 0,1 g. 
Baño de agua con temperatura controlada 65° C. 
Molino para granos. 
Licuadora a alta velocidad con jarra de acero inoxi dable de 250 mL. 
Espectrofotómetro de Ultravioleta - visible capaz d e hacer barrido de 330 a 370 nm.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
3.4.4  Preparación de reactivos. 
Agua grado HPLC filtrada a través de poro de 0,45µm . 
Acetonitrilo grado HPLC filtrado a través de poro d e 0,45µm. 
Metanol grado HPLC filtrado a través de poro de 0,4 5µm. 
Fase móvil: agua 60%, acetonitrilo 20%, metanol 20% , para columna de 4,6 x 250 mm y agua 70%, 
acetonitrilo 12% y metanol 18% para columna de 4,6 x 150 mm. Las proporciones de la fase móvil pueden 
ajustarse a fin de obtener una buena resolución de las AF. 
Acido trifluoroacético. 
Agua destilada. 
Acido acético glacial. 
Solución derivatizadora. 
Mezclar 10 mL de ácido trifluoroacético, 5 mL de ác ido acético glacial y 35 mL de agua destilada. Filt rar a 
través de poro de 0,45µm. 
Benceno grado espectrométrico. 
Acetonitrilo grado espectrométrico. 
Patrones individuales certificados de AFB 1, B 2, G 1 y G 2 en cristales o películas. 
Mezcla de benceno-acetonitrilo (98+2). 
Medir 98 mL de benceno y mezclar con 2 mL de aceton itrilo. Guardar en frasco color ámbar bien tapado. 
Acido sulfúrico concentrado. 
Dicromato de potasio. 
Solución de ácido sulfúrico 0,018 N. 
Disolver 1 mL de ácido sulfúrico concentrado y afor ar a 2 L con agua. 
Soluciones patrón de dicromato de potasio.  
Aproximadamente 0,25 mM. Pesar exactamente 78 mg de  dicromato de potasio previamente secado en 
estufa a 100 – 105°  C durante 2 h, y aforar a 1 L c on ácido sulfúrico 0,018 M. 
i)  Aproximadamente 0,125 mM. Diluir 25 mL de la soluc ión de 0,25 mM a 50 mL con ácido sulfúrico 0,018 M.  
ii)  Aproximadamente 0,0625 mM. Diluir 25 mL de la solu ción de 0,125 mM a 50 mL con ácido sulfúrico 
0,018 M. 
3.4.5  Preparación de soluciones patrón de AF. 
3.4.5.1 Inyectar con jeringa desechable y sin abrir los fra scos que contienen la aflatoxina, 
aproximadamente 4 mL de mezcla de benceno: acetonit rilo 98+2. Agitar en mezclador vórtex hasta complet ar 
disolución. 
3.4.5.2  Abrir con mucho cuidado cada uno de los frascos y,  trasvasar analíticamente a un matraz aforado 
de 100 mL. Aforar con mezcla de benceno: acetonitri lo (concentración aproximada de 100 µg/mL). 
3.4.5.3  Medir exactamente 10 mL de esta solución y aforar a 100 mL con benceno: acetonitrilo 98+2 
(concentración aproximada de 10 µg/mL). 
3.4.5.4 Trasvasar las soluciones anteriores a un frasco col or ámbar con tapón y debidamente identificado, 
y guardar en congelación hasta su uso. 
3.4.6  Obtención del espectro de absorción. 
3.4.6.1 Dejar equilibrar a temperatura ambiente cada una de  las soluciones estándar de aproximadamente 
10 µg/mL. 
3.4.6.2 Calibrar el espectrofotómetro a 0 de absorbancia ut ilizando una solución de benceno: acetonitrilo 
98+2 como blanco. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
3.4.6.3  Efectuar un barrido de 330 a 370 nm de cada una de  las soluciones y obtener el valor de 
absorbancia a la longitud de máxima absorción, la c ual debe estar cercana a 350 nm. 
Aflatoxina Absorbancia máxima 
(A) Peso molecular (PM) Coeficiente de extinción 
(CE) 
B1  312 19,800 
B2  314 20,900 
G1  328 17,100 
G2  330 18,200 
 
3.4.6.4 Regresar las soluciones de cada una de las AF a su frasco original. 
3.4.6.5 Cálculo de la concentración. 
µg AF/mL = A x PM x 1000 x FC  
CE 
donde: 
FC = Factor de corrección (confrontar instrucciones  para el cálculo de factor de corrección). 
Cada una de las soluciones debe presentar una conce ntración entre 8 y 10 µg/mL. 
3.4.7  Cálculo del factor de corrección (FC). 
3.4.7.1  Calibrar el espectrómetro a 0 de absorbancia utili zando ácido sulfúrico 0,018 N como blanco. 
3.4.7.2  Leer la absorbancia de las tres soluciones de dicr omato de potasio de menor a mayor 
concentración, a la longitud de onda de máxima abso rción, la cual debe ser cercana a 350 nm. 
3.4.7.3  Llenar la siguiente tabla con los valores de absor bancia obtenidos y los cálculos realizados: 
Sol. Dicromato de potasio (mM) Absorbancia a 350 nm  (A) CE= A x 1000/mM 
0,25   
0,125   
0,0625   
  CE promedio = 
 
3.4.7.4  Calcular el factor de corrección (FC) aplicando la  siguiente ecuación: 
3160 promedio  
FC ε
=
 
donde: 
3160 es el coeficiente de extinción (CE) para soluc iones de dicromato de potasio. 
El valor de FC debe estar en el intervalo de 0,95 a  1,05, de no ser así verificar el instrumento o la técnica 
para determinar y eliminar la causa. 
3.4.8  Preparación de la solución madre de AF de 1000 ng/ mL. 
De las soluciones madre de AF individuales y de con centración conocida (10 µg/mL), medir las cantidade s 
en microlitros que correspondan a 500 ng de B 1, 300 ng de B 2, 100 ng de G 1 y 100 ng de G 2 para preparar 50 
mL de la misma. Aforar a 50 mL con solución de benc eno: acetonitrilo (98+2) y agitar. Guardar en frasc o vial 
de vidrio color ámbar perfectamente identificado y en congelación. Cada µL de solución equivale a un n g de 
AF totales. 
3.4.9  Preparación de las soluciones patrón de trabajo. 
Medir 20, 50, 100, 150 y 200 µL de la solución madr e (1000 ng/mL) en viales de vidrio ámbar. Evaporar a 
sequedad con nitrógeno. Añadir 1 mL de acetonitrilo  grado HPLC. Agitar y guardar en congelación hasta su 
uso.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
3.4.10  Curva estándar de AF en ng/mL. 
AF B1 B2 G1 G2 Totales 
Conc. 1 10 2 6 2 20 
Conc. 2 25 5 15 5 50 
Conc. 3 50 10 30 10 100 
Conc. 4 75 15 45 15 150 
Conc. 5 100 20 60 20 200 
3.4.11  Preparación de las muestras. 
Una vez separadas las AF de conformidad con lo seña lado en el punto 3.2.6, proceder con los siguientes  
pasos: 
3.4.11.1 Añadir acetonitrilo 1 mL (si se siguió el procedimi ento descrito en el punto 3.2.6.1) o 1,5 mL (si se 
siguió el procedimiento descrito en el punto 3.2.6. 2). 
3.4.11.2 Eluir y colectar en un frasco vial color ámbar. Gua rdar en congelación hasta su uso. 
3.4.12  Derivatización de las AF B 1 y G 2. 
3.4.12.1 Sacar del congelador las mezclas patrón de trabajo y las muestras preparadas. Llevar a 
temperatura ambiente. 
3.4.12.2 Medir 200 µL de cada una de ellas y adicionar 700 µ L de solución derivatizadora, todo en un 
frasco vial de 1,8 mL. Mezclar por 30 seg. 
3.4.12.3  Incubar a 65° C durante 10 min en baño de agua. 
3.4.12.4 Enfriar al chorro de agua. Filtrar a través de filt ro para muestras de 0,45 µL. 
3.4.12.5  Guardar en congelación hasta su uso. 
3.4.13  Acondicionamiento del cromatógrafo de líquidos. 
3.4.13.1 Encender todos los componentes del sistema de croma tografía. 
3.4.13.2 Fijar los siguientes parámetros cromatográficos de acuerdo con las instrucciones de operación del 
equipo: 
Fase móvil:  
Para columna de 4,6 x 250 mm: agua 60%, acetonitril o 20%, metanol 20%. 
Para columna de 4,6 x 150 mm: agua 70%, acetonitril o 12%, metanol 18%. 
Flujo: 1 mL/min. 
Volumen de inyección: 50 µL. 
Tiempo de análisis: 15 min. 
Detector de fluorescencia:  
Excitación: 360 nm. 
Emisión: 440 nm. 
3.4.13.3 Ajustar la atenuación y el factor de respuesta del detector a fin de obtener una sensibilidad 
óptima. 
3.4.13.4 Purgar las bombas del sistema con cada uno de los c omponentes de la fase móvil usando un flujo 
de 10 mL/min. Colectar aproximadamente 20 mL. 
3.4.13.5 Correr la fase móvil a través de todo el sistema a un flujo de 1 mL/min, hasta obtener una línea 
base estable (aproximadamente 30 min). 
3.4.14  Acondicionamiento del método. 
3.4.14.1 Inyectar 50 µL de la mezcla estándar de trabajo der ivatizada equivalente a 100 ng/mL de AF 
totales. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
3.4.14.2  Verificar una buena resolución de las 4 AF así com o optimizar el tiempo de corrida 
(aproximadamente 15 min). Las AF eluyen en el sigui ente orden: G 1, B 1, G 2 y B 2. Considerar el tiempo de 
retención de cada aflatoxina. 
3.4.14.3 Inyectar por triplicado 50 µL de cada una de las cinco mezclas patrón de trabaj o. 
3.4.14.4 Obtener e imprimir el cromatograma de cada una de e llas. 
3.4.14.5  Graficar la concentración de cada aflatoxina contr a el área promedio del pico obtenida. Calcular 
mediante regresión lineal la pendiente, el factor d e correlación y la ordenada al origen de cada uno d e los 
gráficos. 
1. µL solución madre de 1000 ng/mL totales. 
2. Cantidad de AFG 1 en ng. 
3. Area promedio de pico de AFG 1 en ng. 
4. Cantidad de AFB 1 en ng. 
5. Area promedio de pico de AFB 1 en ng. 
6. Cantidad de AFG 2 en ng. 
7. Area promedio de pico de AFG 2 en ng. 
8. Cantidad de AFB 2 en ng. 
9. Area promedio de pico de AFB 2 en ng. 
1 2 3 4 5 6 7 8 9 
20 6  10  2  2  
50 15  25  5  5  
100 30  50  10  10  
150 45  75  15  15  
200 60  100  20  20  
 
3.4.15  Inyección de muestras. 
3.4.15.1  Inyectar 50 µL de cada una de las muestras derivatizadas. 
3.4.15.2  Obtener e imprimir el cromatograma de cada una de ellas. 
3.4.15.3  Identificar cada una de las AF comparando el tiemp o de retención contra el obtenido para cada 
uno de los patrones. 
3.4.15.4  Obtener el valor del área de cada AF en la muestra . 
3.4.16  Expresión de resultados. 
µg/kg de AF en la muestra = Area de pico - ordenada al origen x 1 o 1,5 x dilución   
pendiente 
Se utilizará 1 o 1,5 dependiendo de la cantidad de acetonitrilo que se agregó al eluato. 
El resultado será la sumatoria de los valores de la s distintas AF. 
3.4.17 Limpieza del sistema de cromatografía. 
3.4.17.1  Al terminar los análisis, apagar el detector y el inyector automáticos. 
3.4.17.2  Bombear acetonitrilo o metanol por espacio de medi a hora. 
3.4.17.3  Posteriormente apagar el sistema de bombas y la co mputadora. 
3.4.18 Del procedimiento de limpieza y descontaminación de l material de vidrio y área de trabajo para la 
determinación de aflatoxinas. 
3.4.18.1  Objetivo. 
Establecer directrices para la descontaminación del  material, equipo y área de trabajo utilizados, así  como 
los procedimientos a seguir en caso de derrames y r emanentes de extractos de las muestras.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
3.4.18.2  Generalidades. 
El trabajo de limpieza y descontaminación será real izado por personal capacitado y que cuente con equi po 
protector como bata, guantes impermeables y lentes de seguridad. 
3.4.18.3 Descontaminación del material de laboratorio. 
Todo el material de vidrio que haya sido utilizado durante el análisis, debe sumergirse en una solució n de 
hipoclorito de sodio, la cual se prepara diluyendo una parte de solución comercial de hipoclorito (con  una 
concentración entre 5 y 6%), con diez partes de agu a. 
Después del tratamiento, el material debe enjuagars e abundantemente con agua corriente, seguido de 
agua destilada, y secar por escurrimiento o en estu fa de 90-100° C. 
3.4.18.4  Descontaminación del área de trabajo. 
Después del análisis, las superficies de las áreas de trabajo deben limpiarse con una toalla desechabl e 
impregnada en solución de hipoclorito de sodio. 
3.4.18.5  Descontaminación de material desechable. 
Todo el material desechable, debe sumergirse durant e un mínimo de 5 min en la solución de hipoclorito de 
sodio. La solución descontaminante usada debe elimi narse por el drenaje y los materiales desechables 
tratados, deben empacarse en una bolsa de plástico sellada para colocarse en el depósito de desechos. 
3.4.18.6 Tratamiento de derrames. 
Los derrames de soluciones de AF deben tratarse inm ediatamente con hipoclorito de sodio, vertiéndolo 
directamente del envase, recoger los líquidos con u n papel absorbente, el cual también se colocará en una 
bolsa de plástico. 
3.4.18.7  Tratamiento de remanentes de extracto de muestras.  
Una vez que se ha separado una alícuota del extract o de la muestra es frecuente que permanezca un 
remanente del mismo. Estos restos de extractos debe n tratarse con una cantidad de hipoclorito de sodio  
equivalente a la unidad de volumen del residuo a tr atar. Los líquidos resultantes se deben acumular en  un 
recipiente para desechos líquidos y eliminarse en u n lugar destinado especialmente para éstos. 
4. Análisis microbiológico de productos objeto de e sta norma 
4.1 Procedimiento para la preparación y dilución de  muestras de alimentos para su análisis 
microbiológico. 
4.1.1 Introducción  
Esta norma está orientada a proporcionar las guías generales para la preparación de diluciones para el  
examen microbiológico de alimentos. En vista de la gran cantidad de productos en este campo de aplicac ión, 
estas guías pueden ser inapropiadas para todos ello s en forma detallada y para otros requerirse otros 
métodos diferentes. Sin embargo, en todos los casos  donde sea posible se recomienda apegarse a estas 
guías y modificarse únicamente cuando sea necesario . 
La dilución primaria tiene por objeto obtener una d istribución lo más uniforme posible de los 
microorganismos contenidos en la muestra destinada para el análisis. 
La preparación de diluciones decimales adicionales,  si son necesarias, tiene como objetivo reducir el 
número de microorganismos por unidad de volumen, pa ra permitir, después de la incubación, la observaci ón 
de la prueba en el caso de tubos o matraces y la cu enta de colonias en el caso de placas. 
4.1.2  Reactivos y materiales 
4.1.2.1  Reactivos 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben  ser grado analítico. Cuando se indique agua debe 
entenderse como agua destilada. 
Preparación de reactivos 
Solución de hidróxido de sodio 1,0 N 
FORMULA 
INGREDIENTES CANTIDADES 
Hidróxido de sodio 4,0 g 
 
Agua 100 ml Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
Preparación: 
Disolver el hidróxido de sodio y llevar a 100 ml co n agua. 
Soluciones diluyentes 
Solución reguladora de fosfatos (solución concentra da). 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades  
Fosfato de sodio monobásico 34,0 g 
 
Agua 1,0 l 
 
Preparación: 
Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0 N. 
Llevar a un litro con agua. 
Esterilizar durante 15 minutos a 121°  ± 1,0° C. 
Conservar en refrigeración (solución concentrada). 
Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y llevar a  un litro con agua (solución de trabajo). 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se r equiera. 
Esterilizar a 121°  ± 1,0° C durante 15 minutos. 
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes  finales de la solución de trabajo deberán ser igua les a 
los iniciales. 
Agua peptonada 
Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Peptona  1,0 g 
Cloruro de sodio 8,5 g 
Agua  1,0 l 
Preparación: 
Disolver los componentes en un litro de agua. 
Ajustar el pH a 7 ± 0,1 con hidróxido de sodio 1,0 N. 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cualq uier volumen múltiplo de nueve según se requiera. 
Esterilizar a 121 ± 1,0° C durante 15 minutos. 
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes  finales de la solución de trabajo deberán ser igua les a 
los iniciales. 
Si este diluyente no es usado inmediatamente, almac enar en lugar oscuro a una temperatura entre 0 a 5° C 
por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones ta les que no alteren su volumen o composición. 
4.1.2.2  Materiales 
Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 ml ( o si es necesario de 1 ml y 2 ml), con tapón de alg odón. 
Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes igual es a una décima de su volumen total. 
Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca. 
Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca. 
Utensilios esterilizables para la obtención de mues tras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátul as, etc.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
Todo el material e instrumentos que tengan contacto  con las muestras bajo estudio deberán esterilizars e 
mediante: 
Horno, durante 2 h a 170 a 175° C o 1 h a 180° C o Au toclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 
1,0° C. 
El material de vidrio puede sustituirse por materia l desechable que cumpla con las especificaciones 
deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por esterilización repetida y éste debe ser química mente 
inerte. 
4.1.3  Aparatos e instrumentos 
Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170° C. 
Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con  termómetro de máximas y mínimas. 
Baño de agua con control de temperatura y circulaci ón mecánica, provista con termómetro calibrado con 
divisiones de 0,1° C y que mantenga la temperatura a  45 ± 0,5° C. 
Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador peristáltico 
(Stomacher). 
Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bols as estériles para homogeneizador peristáltico. 
Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g. 
4.1.4  Procedimiento 
4.1.4.1  Preparación de la dilución primaria. 
Para muestras congeladas de un alimento originalmen te líquido o licuable, fundir por completo en baño de 
agua de 40 a 45° C un tiempo máximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente. 
Para la parte líquida de una muestra heterogénea la  cual sea considerada suficientemente representativ a 
de la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales). 
i)  Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos d e arriba a abajo en un arco de 30 cm efectuados 
en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 ml de la muestr a y diluir con 9 ml del diluyente el cual debe enco ntrarse 
a una temperatura similar a ésta, evitando el conta cto entre la pipeta y el diluyente. 
ii)  Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tom ar alícuotas mayores, por ejemplo volúmenes de 10 
u 11 ml, diluidos con 90 o 99 ml, de la misma forma  que se describió anteriormente 
4.1.4.2  A partir de muestras sólidas o semisólidas. 
Las muestras sólidas y semisólidas congeladas, debe n descongelarse en refrigeración de 4 a 8ºC durante  
18 horas y no más de 24 horas antes de proceder a s u análisis. 
i) Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por a nalizar en un recipiente o bolsa plástica estériles  de 
tamaño adecuado. 
ii)  Adicionar un volumen de 90 a 99 ml del diluyente l levado a una temperatura similar a la de la muestra . 
iii)  Operar la licuadora o el homogeneizador peristálti co de 1 a 2 minutos hasta obtener una suspensión 
completa y homogénea según se indique en la técnica  correspondiente para cada alimento. Aún en los 
equipos más lentos, este tiempo no debe exceder de 2,5 minutos. 
iv)  Permitir que las partículas grandes se sedimenten,  y transferir la cantidad deseada tomando de las 
capas superiores de la suspensión. 
Cuando la dilución primaria es muy viscosa o pegajo sa, adicionar más diluyente, lo cual debe tomarse e n 
cuenta para las operaciones subsecuentes o expresió n de resultados. El homogeneizador peristáltico 
(Stomacher) puede no ser adecuado para algunos prod uctos (por ejemplo, aquellos con partículas agudas o 
constituyentes que no se dispersen fácilmente). Deb e ser utilizado sólo cuando exista evidencia (publi cada o 
por ensayos comparativos) de que los resultados obt enidos no difieren significativamente con aquellos 
obtenidos con licuadora. 
4.1.4.2  Preparación de las diluciones decimales adicionale s. 
i)  Transferir 1 ml o un múltiplo, por ejemplo, 10 u 1 1 ml de la dilución primaria 1 + 9 (10-1), en otro 
recipiente conteniendo nueve veces el volumen del d iluyente estéril a la temperatura apropiada, evitan do el 
contacto entre la pipeta y el diluyente. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
ii)  Mezclar cuidadosamente cada botella de diluyente s iempre de la misma manera que se describe en el 
punto i) del numeral 4.1.4.1 
iii)  La selección de las diluciones que se vayan a prep arar y de aquellas que se van a inocular, dependen 
del número esperado de microorganismos en la muestr a, con base a los resultados de análisis previos y de la 
información que se obtenga del personal de inspecci ón que la haya colectado. En ausencia total de 
información, trabajar con las diluciones de la prim era a la sexta. 
iv)  Utilizar pipetas diferentes para cada dilución ino culando simultáneamente las cajas que se hayan 
seleccionado. El volumen que se transfiera nunca de be ser menor al 10% de la capacidad total de la pip eta. 
v)  Si la pipeta es terminal y se transfiere un volume n de líquido equivalente a su capacidad total, escu rrir 
aplicando la punta de la pipeta una sola vez en una  área de la caja Petri sin líquido. 
vi)  Mientras se afora el líquido de la pipeta, la punt a de ésta debe apoyarse en el interior del cuello d el 
frasco y mantenerla en posición vertical, para lo c ual este último debe inclinarse lo necesario. 
En estudios donde se busca la presencia o ausencia de una determinada especie de microorganismos en 
0,1 ml o 0,1 g, no es necesario preparar diluciones  mayores. 
El criterio para seleccionar las diluciones a prepa rar de acuerdo con el número de microorganismos 
esperado es: 
Para la técnica del número más probable utilizar tr es tubos: donde sea posible demostrar el 
microorganismo en 10 ml de la dilución más alta. 
Para la técnica de cuenta en placa, considerar aque llas en las que se puedan contar de 25 a 250 coloni as 
en un mínimo de una de tres diluciones en el método  de cuenta de bacterias aerobias en placa. En el ca so de 
otros grupos microbianos, considerar el número espe cificado de colonias en la Norma Oficial Mexicana 
correspondiente. 
4.1.4.3  Duración del procedimiento. 
En general, las diluciones de la muestra deben ser preparadas inmediatamente antes del análisis y ésta s 
deben ser usadas para inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos posteriores a su preparaci ón. 
4.2 Método para la cuenta de bacterias aerobias en plac a. 
4.2.1 Introducción  
Cuando se requiere investigar el contenido de micro organismos viables en un alimento, la técnica 
comúnmente utilizada es la cuenta en placa. En real idad esta técnica no pretende poner en evidencia to dos 
los microorganismos presentes. La variedad de espec ies y tipos diferenciables por sus necesidades 
nutricionales, temperatura requerida para su crecim iento, oxígeno disponible, etc., hacen que el númer o de 
colonias contadas constituyan una estimación de la cifra realmente presente y la misma refleja si el m anejo 
sanitario del producto ha sido el adecuado. 
Por otra parte el recuento de termofílicos, psicrof ílicos y psicotróficos es importante para predecir la 
estabilidad del producto bajo diferentes condicione s de almacenamiento. 
Para obtener resultados reproducibles y por lo tant o significativos, es de suma importancia seguir fie lmente 
y controlar cuidadosamente las condiciones. 
Esta técnica puede aplicarse para la estimación de microorganismos viables en una amplia variedad de 
alimentos. 
4.2.2 Fundamento  
El fundamento de la técnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio de elecció n 
después de un cierto tiempo y temperatura de incuba ción, presuponiendo que cada colonia proviene de un  
microorganismo de la muestra bajo estudio. El métod o admite numerosas fuentes de variación, algunas de  
ellas controlables, pero sujetas a la influencia de  varios factores. 
4.2.3 Reactivos y materiales  
4.2.3.1 Reactivos 
Los reactivos que a continuación se mencionan, debe n ser grado analítico. 
Cuando se indique agua, debe entenderse agua destil ada, con pH cercano a la neutralidad.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
Medio de Cultivo. 
Agar Triptona-Extracto de Levadura (agar para cuent a estándar). 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de levadura  2,5 g  
Triptona  5,0 g  
Dextrosa  1,0 g 
Agar  15,0 g  
Agua  1,0 l  
 
Preparación del medio de cultivo. 
Suspender los componentes del medio deshidratado en  un litro de agua. Hervir hasta total disolución. 
Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables de capacidad no mayor de 500 ml, cantidades de 
aproximadamente la mitad del volumen del mismo. Est erilizar en autoclave a 121 ± 1,0 ºC, durante 15 
minutos. El pH final del medio debe ser 7,0 ± 0,2 a  25ºC. 
Si el medio de cultivo es utilizado inmediatamente,  enfriar a 45ºC ± 1,0 ºC en baño de agua y mantener lo a 
esta temperatura hasta antes de su uso. El medio no  debe de fundirse más de una vez. 
En caso de medios deshidratados seguir las instrucc iones del fabricante. 
El medio de cultivo anterior es el de uso más gener alizado. Para algunos alimentos en particular se 
requerirá de un medio de cultivo especial que se de be indicar al describir la técnica para ese aliment o. 
4.2.3.2 Materiales 
Todo el material que tenga contacto con las muestra s o los microorganismos debe estar estéril. 
Se requiere, los materiales mencionados en 4.1 Prep aración y Dilución de Muestras de Alimentos para su  
Análisis Microbiológico. 
4.2.4 Aparatos e instrumentos  
Se requiere, además de los mencionados en 4.1, Prep aración y dilución de muestras de alimentos para su  
análisis microbiológico, los siguientes: 
Incubadora con termostato que evite variaciones may ores de ± 1,0ºC, provista con termómetro calibrado.  
Contador de colonias de campo obscuro, con luz adec uada, placa de cristal cuadrículada y lente 
amplificador. 
Registrador mecánico o electrónico. 
Microscopio óptico. 
Baño de agua con o sin circulación mecánica, provis ta con termómetro calibrado con divisiones de hasta  
1,0° C y que mantenga la temperatura a 45 ± 1,0° C. 
4.2.5 Preparación de la muestra  
Para la preparación de la muestra seguir la 4.1, Pr eparación y dilución de muestras de alimentos para su 
análisis microbiológico. 
4.2.6 Procedimiento  
4.2.6.1 Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabaj o de manera que la inoculación; la adición de 
medio de cultivo y homogenización, se puedan realiz ar cómoda y libremente. Marcar las cajas en sus tap as 
con los datos pertinentes previamente a su inoculac ión y correr por duplicado. 
4.2.6.2 Después de inocular las diluciones de las muestras preparadas según en B.5.1 Preparación y 
dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico, en las cajas Petri, agregar de 12 a  15 ml 
del medio preparado, mezclarlo mediante 6 movimient os de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las 
manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de  atrás a adelante, sobre una superficie lisa y hori zontal hasta 
lograr una completa incorporación del inóculo en el  medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las 
cajas. Dejar solidificar. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
4.2.6.3 Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio  y diluyente preparado como testigo de 
esterilidad. 
4.2.6.4 El tiempo transcurrido desde el momento en que la m uestra se incorpora al diluyente hasta que 
finalmente se adiciona el medio de cultivo a las ca jas, no debe exceder de 20 minutos. 
4.2.6.5 Incubar las cajas en posición invertida (la tapa ha cia abajo) por el tiempo y la temperatura que se 
requieran, según el tipo de alimento y microorganis mo de que se trate, véase el cuadro 1. 
CUADRO 1 
Grupo bacteriano Temperatura Tiempo de incubación 
Termofílicos aerobios 55 ± 2ºC  48 ± 2 h 
 
Mesofílicos aerobios 35 ± 2ºC  48 ± 2 h 
Psicrotróficos 20 ± 2ºC  3 - 5 días 
Psicrofílicos  5 ± 2ºC  7 - 10 días 
 
4.2.6.6 En la lectura seleccionar aquellas placas donde apa rezcan entre 25 a 250 UFC, para disminuir el 
error en la cuenta. 
4.2.6.7 Contar todas las colonias desarrolladas en las plac as seleccionadas (excepto las de mohos y 
levaduras), incluyendo las colonias puntiformes. Ha cer uso del microscopio para resolver los casos en los que 
no se pueden distinguir las colonias de las pequeña s partículas de alimento. 
4.2.7 Expresión de resultados  
4.2.7.1 Cálculo del método. 
i)  Después de la incubación, contar las placas que se  encuentren en el intervalo de 25 a 250 colonias, 
usando el contador de colonias y el registrador. La s placas de al menos una de tres diluciones deben e star en 
el intervalo de 25 a 250. Cuando sólo una dilución está en el intervalo apropiado, véase el cuadro 2, ejemplo 
1. Calcular la cuenta promedio por gramo o mililitr o de dicha dilución y reportar. 
ii)  Cuando dos diluciones están en el intervalo apropi ado, determinar la cuenta promedio dada por cada 
dilución antes de promediar la cuenta de las dos di luciones para obtener la cuenta en placa por gramo o 
mililitro, véase el cuadro 2, ejemplo 2. 
iii)  Con el fin de uniformar los criterios para el repo rte de las cuentas en ensayos donde las placas 
presenten situaciones no contempladas en los ejempl os anteriores, se presentan las siguientes guías: 
iv)  Placas con menos de 25 colonias.- Cuando las placa s corridas para la menor dilución muestran 
cuentas de menos de 25 colonias, contar el número d e colonias presentes en dicha dilución, promediar e l 
número de colonias y multiplicar por el factor de d ilución para obtener el valor estimado de cuenta en  placa. 
Aclarar en su informe esta situación agregando la l eyenda "valor estimado", véase el cuadro 2, ejemplo  3. 
v)  Placas con más de 250 colonias.- Cuando el número de colonias por placa exceda de 250, contar las 
colonias en aquellas porciones de la placa que sean  representativas de la distribución de colonias. Co ntar por 
ejemplo, una cuarta parte o una mitad del área de l a caja y multiplicar el valor obtenido por 4 o 2, 
respectivamente. Si solamente pueden contarse algun os cuadros, considerar que el fondo de una caja Pet ri 
de 100 mm de diámetro contiene 65 cuadros de la cua drícula del contador. Aclarar en el informe esta 
situación agregando la leyenda "valor estimado", vé ase el cuadro 2, ejemplo 4. 
vi)  Colonias extendidas.- Las colonias extendidas pued en presentarse en las siguientes formas: 
vii)  Cadenas de colonias no separadas claramente entre sí, que parecen ser causadas por la 
desintegración de un cúmulo de bacterias. 
viii) Colonias que se desarrollan en película entre el ag ar y el fondo de la caja. 
ix)  Colonias que se desarrollan en película en la oril la de la caja sobre la superficie del agar.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
x)  Colonias de crecimiento extendido y en algunas oca siones acompañadas de inhibición del crecimiento, 
que en conjunto exceden el 50% de la caja o represi ón del crecimiento que por sí mismo excede el 25% d e la 
superficie de la caja. 
xi) Cuando es necesario contar en cajas que contienen c olonias extendidas que no están incluidas en 
punto x) del numeral 4.2.7.1, contar cualquiera de los tipos vii), viii) o ix) del numeral 4.2.7.1, co mo 
provenientes de una sola fuente. En el caso de las colonias del tipo vii) del numeral 4.2.7.1, si la c aja contiene 
una sola cadena, contar como una sola colonia, si l a caja contiene varias cadenas que parecen originar se de 
fuentes separadas, contar cada cadena como colonia individual. No contar cada colonia de la cadena 
individualmente. Las colonias del tipo vii) y ix) d el numeral 4.2.7.1, generalmente se observan como 
crecimiento diferenciable de otras colonias y se cu entan como tales. Los crecimientos tipo x) del nume ral 
4.2.7.1, reportarlos como crecimiento extendido. En  caso de que una dilución se encuentre dentro del r ango y 
otra dilución presente colonias de crecimiento exte ndido, reportar la dilución en la que se pueden con tar las 
colonias, véase el cuadro 2, ejemplo 5. 
xii)  Placas sin colonias.- Cuando las placas de todas l as diluciones no muestran colonias, reportar la 
cuenta en placa como menor que una vez el valor de la dilución más baja usada, véase el cuadro 2, ejem plo 6. 
xiii)  Placas corridas por duplicado, una con crecimiento  dentro del intervalo adecuado y otra con más de 
250 colonias.- Cuando una placa tiene entre 25 y 25 0 colonias y su duplicado más de 250 colonias, cont ar 
ambas placas incluyendo la que está fuera del inter valo para determinar la cuenta en placa, véase el c uadro 2, 
ejemplo 7. 
xiv)  Placas corridas por duplicado, una placa de cada d ilución dentro del intervalo de 25 a 250 colonias.-  
Cuando una placa dentro de diferentes diluciones co ntiene el número de colonias especificadas en el 
intervalo, contar el número de colonias de las cuat ro placas para calcular la cuenta en placa, véase e l cuadro 
2, ejemplo 8. 
xv)  Placas corridas por duplicado, ambas placas de una  dilución dentro del intervalo de 25 a 250 y sólo 
una de la otra dilución dentro del mismo. Contar la s cuatro cajas incluyendo aquella con menos de 25 o  más 
de 250 colonias, para calcular la cuenta en placa, véase el cuadro 2, ejemplo 9. 
xvi)  Después de contabilizar las colonias en las placas  seleccionadas, multiplicar por la inversa de la 
dilución para obtener el número de UFC por mililitr o o gramo de la muestra. Redondear la cifra obtenid a en la 
cuenta de manera que sólo aparezcan dos dígitos sig nificativos al inicio de esta cifra. Para redondear , elevar 
el segundo dígito al número inmediato superior cuan do el tercer dígito de la derecha sea cinco o mayor  (por 
ejemplo: 128 redondear a 130). Si el tercer dígito es cuatro o menos, reemplazar el tercer dígito con cero y el 
segundo dígito mantenerlo igual (Por ejemplo: 2417 a 2400): 
4.2.8 Informe de la prueba  
Reportar como: Unidades formadoras de colonias, ___  UFC/g o ml, de bacterias aerobias en placa en agar  
triptona extracto de levadura o agar para cuenta es tándar, incubadas ________ horas a _______ ºC. 
CUADRO 2 
Cálculo de los valores de la cuenta en placa 
(ensayos por duplicado) 
Ejemplo  Colonias contadas  UFC/g o ml 
número 1:100 1:1,000 1:10,000  
1 >250 178 16 180,000 
 >250 190 17  
2 >250 220 25 250,000 
3 18 2 0 1,600 
 14 0 0  Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
4 >250 >250 512 5,000,000 
 >250 >250 495  
5 >250 235 Crecimiento 
extendido  
6 0 0 0 <100 
7 >250 240 24 250,000 
 >250 268 19  
8 >250 216 23 280,000 
 >250 262 42  
9 >250 215 20 23,000 
 >250 235 26  
 >250 275 32 270,000 
 >250 225 26  
 
4.3 Método para la cuenta de microorganismos coliformes  totales en placa. 
4.3.1 Introducción  
El grupo de los microorganismos coliformes es el má s ampliamente utilizado en la microbiología de los 
alimentos como indicador de prácticas higiénicas in adecuadas. 
El uso de los coliformes como indicador sanitario p uede aplicarse para: 
La detección de prácticas sanitarias deficientes en  el manejo y en la fabricación de los alimentos. 
La evaluación de la calidad microbiológica de un pr oducto, aunque su presencia no necesariamente 
implica un riesgo sanitario. 
Evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias  e higiénicas del equipo. 
La calidad sanitaria del agua y hielo utilizados en  las diferentes áreas del procesamiento de alimento s. 
La demostración y la cuenta de microorganismos coli formes, puede realizarse mediante el empleo de 
medios de cultivos líquidos o sólidos con caracterí sticas selectivas o diferenciales. 
4.3.2 Fundamento  
El método permite determinar el número de microorga nismos coliformes presentes en una muestra, 
utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bi lis) en el que se desarrollan bacterias a 35° C en 
aproximadamente 24 h, dando como resultado la produ cción de gas y ácidos orgánicos, los cuales viran e l 
indicador de pH y precipitan las sales biliares. 
4.3.3 Reactivos y materiales 
4.3.3.1 Reactivos 
Los reactivos que a continuación se mencionan, debe n ser grado analítico y cuando se indique agua debe  
entenderse como agua destilada. 
i)  Soluciones diluyentes 
Solución reguladora de fosfatos (solución concentra da) 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades  
Fosfato monopotásico 34,0 g 
Agua  1,0 l       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
Preparación: 
Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0 N. 
Llevar con agua a un litro. 
Esterilizar a 121± 1,0° C durante 15 minutos. Conser var en refrigeración (solución concentrada). 
Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y llevar a  un litro con agua (solución de trabajo). 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se r equiera. 
Esterilizar durante 15 minutos a 121± 1,0° C. 
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes  finales de la solución de trabajo deben ser iguale s a 
los iniciales. 
ii)  Agua peptonada 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 1,0 
NaCl 8,5 g 
Agua 1,0 l 
 
Preparación: 
Disolver los componentes en un litro de agua. 
Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1,0 N. 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cualq uier volumen múltiplo de nueve según se requiera. 
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0° C. 
Después de la esterilización, los volúmenes finales  de la solución de trabajo deben ser iguales a los 
iniciales. 
Si este diluyente no es usado inmediatamente, almac enar en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 
5° C por un tiempo no mayor de un mes, en condicione s tales que no alteren su volumen o composición. 
iii)  Medio de cultivo 
Agar-rojo- violeta-bilis -lactosa (RVBA) 
Fórmula 
Ingredientes  Cantidades  
Peptona 7,0 g 
Extracto de levadura 3,0 g 
Lactosa 10,0 g 
Sales biliares 1,5 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Rojo neutro 0,03 g 
Cristal violeta 0,002 g 
Agar 15,0 g 
agua 1,0 l Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
Preparación: 
Mezclar los componentes en el agua y dejar reposar durante algunos minutos. 
Mezclar perfectamente y ajustar el pH a 7,4 con áci do clorhídrico 0,1N o con hidróxido de sodio 0,1N a  
25° C, de forma que después del calentamiento se man tenga en este valor. 
Calentar con agitación constante y hervir durante 2  minutos. 
Enfriar inmediatamente el medio en un baño de agua hasta que llegue a 45° C. 
Evitar el sobrecalentamiento del medio. 
No debe esterilizarse en autoclave. 
Usar el medio dentro de las tres primeras horas des pués de su preparación. 
En el caso de utilizar medio de cultivo deshidratad o, seguir las instrucciones del fabricante. 
4.3.3.2 Materiales 
Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 ml ( o si es necesario de 11 y 2 ml), con tapón de algod ón. 
Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes igual es a una décima de su volumen total. 
Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca. 
Tubos de 16 X 150 mm con tapón de rosca. 
Utensilios esterilizables para la obtención de mues tras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátul as, etc. 
Cajas Petri. 
Todo el material e instrumentos que tengan contacto  con las muestras bajo estudio debe esterilizarse 
mediante: 
Horno, durante 2 h a 170 - 175° C, o 1 h a 180° C; o en autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 
± 1,0° C. 
El material de vidrio puede sustituirse por materia l desechable que cumpla con las especificaciones 
deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por las esterilizaciones repetidas y éste debe ser 
químicamente inerte. 
4.3.4 Aparatos e instrumentos  
Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170° C. 
Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con  termómetro de máximas y mínimas. 
Baño de agua con control de temperatura y circulaci ón mecánica, provista con termómetro calibrado con 
divisiones de 0,1° C y que mantenga la temperatura a  45 ± 1,0° C. 
Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador peristáltico 
(Stomacher). 
Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bols as estériles para homogeneizador peristáltico. 
Incubadora con termostato que evite variaciones may ores de ± 1,0° C, provista con termómetro calibrado.  
Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecu ada, placa de cristal cuadriculada y lente 
amplificador. 
Registrador mecánico o electrónico. 
Microscopio óptico. 
Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades  de pH a 25° C. 
4.3.5 Preparación de la muestra  
La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en 4.1 Preparación y dilución de 
muestras de alimentos para su análisis microbiológi co. 
4.3.6 Procedimiento  
4.3.6.1 Colocar en cajas Petri por duplicado 1 ml de la mue stra líquida directa o de la dilución primaria, 
utilizando para tal propósito una pipeta estéril.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
4.3.6.2 Repetir el procedimiento tantas veces como dilucion es decimales se requiera sembrar, utilizando 
una pipeta estéril diferente para cada dilución. 
4.3.6.3 Vertir de 15 a 20 ml del medio RVBA fundido y mante nido a 45 ± 1,0° C en baño de agua. En el 
caso de utilizar cajas de Petri de plástico se vier te de 10 a 15 ml del medio. El tiempo transcurrido entre la 
preparación de la dilución primaria y el momento en  que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder  de 20 
minutos. 
4.3.6.4 Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, 
seis movimientos en el sentido de las manecillas de l reloj, seis movimientos en el sentido contrario a l de las 
manecillas del reloj y seis de atrás para adelante,  sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que  la mezcla 
solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre u na superficie horizontal fría. 
4.3.6.5 Preparar una caja control con 15 ml de medio para v erificar la esterilidad. 
4.3.6.6 Después de que está el medio completamente solidifi cado en la caja, verter aproximadamente 4 ml 
del medio RVBA a 45 ± 1,0° C en la superficie del me dio inoculado. Dejar que solidifique. 
4.3.6.7 Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a  35° C, durante 24 ± 2 horas. 
4.3.6.8 Después del periodo especificado para la incubación , contar las colonias con el contador de 
colonias. 
4.3.6.9 Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150  colonias. Las colonias típicas son de color 
rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de  un halo de precipitación debido a las sales biliar es, el 
cual es de color rojo claro o rosa, la morfología c olonial es semejante a lentes biconvexos con un diá metro de 
0,5 a 2,0 mm. 
4.3.7 Expresión de los resultados  
4.3.7.1 Cálculo del método 
i)  Placas que contienen entre 15 y 150 colonias carac terísticas. 
Separar las placas que contienen el número antes me ncionado de colonias características en dos 
diluciones consecutivas. Contar las colonias presen tes. Calcular el número de coliformes por mililitro  o por 
gramo de producto, multiplicando el número de colon ias por el inverso de la dilución correspondiente, 
tomando los criterios del punto 4.2. Método para la  Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa. 
ii)  Placas que contienen menos de 15 colonias caracter ísticas. 
Si cada una de las placas tiene menos de 15 colonia s características, reportar el número obtenido segu ido 
de la dilución correspondiente. 
iii) Placas con colonias no características. 
Si en las placas no hay colonias características, r eportar el resultado como: menos de un coliforme po r 1/d 
por gramo, en donde d es el factor de dilución. 
4.3.8 Informe de la prueba 
Informar: UFC/g o ml en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35° C durante 24 ± 2 h. 
En caso de emplear diluciones y no observar crecimi ento, informar utilizando como referencia la diluci ón 
más baja utilizada, por ejemplo dilución 10-1. 
En caso de no observar crecimiento en la muestra si n diluir se informa: "no desarrollo de coliformes p or 
ml". 
4.4 Método para la determinación de Salmonella en alime ntos. 
4.4.1 Introducción  
Los miembros del género Salmonella  han sido muy estudiados como patógenos cuando se e ncuentran 
presentes en los alimentos. El control de este micr oorganismo, tanto por parte de las autoridades sani tarias, 
como en las plantas procesadoras de alimentos, depe nde en cierta medida del método analítico utilizado  para 
su detección. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
Este microorganismo fue inicialmente identificado e n muestras clínicas y los métodos empleados para 
estos casos se adaptaron posteriormente para su det ección en alimentos. Las modificaciones a los métod os 
consideraron dos aspectos principales, el primero e s el debilitamiento o daño a las células bacteriana s 
presentes en un alimento, debido al proceso a que e stá sujeto (por ejemplo: tratamiento térmico, secad o, etc.) 
y segundo, la variabilidad inherente a la naturalez a del producto bajo estudio. Para diversos alimento s existen 
diferentes protocolos para el aislamiento de Salmon ella, todos ellos son esencialmente similares en pr incipio y 
emplean las etapas de preenriquecimiento, enriqueci miento selectivo, aislamiento en medios de cultivo 
selectivos y diferenciales, identificación bioquími ca y confirmación serológica de los microorganismos . 
4.4.2 Fundamento  
La presente técnica para la detección de Salmonella  en alimentos, describe un esquema general que 
consiste de 5 pasos básicos: 
4.4.2.1 Preenriquecimiento, es el paso donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, 
que permite restaurar las células de Salmonella  dañadas a una condición fisiológica estable. 
4.4.2.2 Enriquecimiento selectivo, empleado con el propósit o de incrementar las poblaciones de 
Salmonella  e inhibir otros organismos presentes en la muestra . 
4.4.2.3 Selección en medios sólidos, en este paso se utiliz an medios selectivos que restringen el 
crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella  y permite el reconocimiento visual de colonias 
sospechosas. 
4.4.2.4 Identificación bioquímica, este paso permite la ide ntificación genérica de los cultivos de Salmonella  
y la eliminación de cultivos sospechosos falsos. 
4.4.2.5 Serotipificación, es una técnica serológica que per mite la identificación específica de un cultivo. 
4.4.3 Reactivos y materiales  
En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshi dratadas, se deben seguir las instrucciones 
impresas en la etiqueta respectiva para su preparac ión. 
Las sustancias químicas usadas para preparar los me dios de cultivo y los reactivos deben ser grado 
analítico. 
4.4.3.1 Reactivos 
i)  Medios de pre-enriquecimiento 
Agua de peptona tamponada 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Peptona  10,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Fosfato sódico dibásico 3,5 g 
Fosfato potásico monobásico 1,5 g 
Agua  1,0 l 
 
Preparación 
Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario. 
Ajustar el pH, si es necesario, después de la ester ilización a 7,0. 
Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables con la capacidad necesaria para obtener las porcion es 
necesarias para la prueba. 
Esterilizar por 20 min a 121 ± 1ºC.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
Caldo lactosado 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 3,0 g 
Peptona  5,0 g 
Lactosa  5,0 g 
Agua destilada 1,0 g 
pH final 6,9 +  0,2 
 
Preparación 
Disolver los ingredientes en agua, calentando a 65º C. 
Distribuir en porciones de 225 ml, en frascos de 50 0 ml. 
Esterilizar durante 15 min a 121ºC ± 1ºC. 
ii) Caldo de enriquecimiento 
Caldo selenito-cistina 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Tristona o polipeptona 5,0 g 
Lactosa  4,0 g 
Fosfato disódico 10,0 g 
Selenito ácido de sodio 4,0 g 
L- cistina 0,01 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 7,0 +  2 a 25° C  
 
Preparación 
Disolver los ingredientes en un litro de agua desti lada estéril y distribuir en volúmenes de 10 y 225 ml en 
recipientes estériles, según se requiera. 
El caldo así preparado es transparente. De preferen cia usarlo el mismo día de su preparación. 
Si se desea conservar el medio por varios días, pue de exponerse al calor en autoclave por 5 min a 110º C 
± 1ºC, tomando entonces un color salmón. 
Caldo tetrationato 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Proteosa peptona o triptona 5,0 g 
Sales biliares 1,0 g 
Carbonato de calcio 10,0 g 
Tiosulfato de sodio pentahidratado 30,0  
Agua destilada 1,0 l 
pH final 7,0 +  0,1 Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
Preparación 
Disolver los ingredientes en un litro de agua desti lada estéril. 
Distribuir, agitando constantemente, en porciones d e 10 y 225 ml, en recipientes estériles. Guardar en  
refrigeración. 
Antes de usar el medio, agregar 2 ml de una solució n yodo-yoduro y 1 ml de solución de verde brillante  al 
0,1% por cada 100 ml de caldo. El medio una vez adi cionado de yodo no debe calentarse y debe usarse el  
mismo día de su preparación. 
Vassiliadis-Rappaport 
Fórmula 
Solución A 
Ingredientes Cantidades 
Tristona  5,0 g 
Cloruro de sodio 8,0 g 
Fosfato de potasio hidrogenado 1,6 g 
Agua destilada 1,0 l 
 
Disolver los componentes en agua por calentamiento cercano a 70ºC. 
Solución B 
Ingredientes Cantidades 
Cloruro de magnesio hexahidratado 400 g 
Agua destilada 1,0 l 
 
Disolver el cloruro de magnesio en agua. 
Como esta sal es muy higroscópica es conveniente di solver el contenido entero de cloruro de magnesio 
desde un recipiente recientemente abierto de tal mo do que la concentración de la solución sea de 0,4 g /ml. 
Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente. 
Solución C 
Ingredientes Cantidades 
Oxalato de verde de malaquita 0,4 g 
Agua destilada 100 ml 
 
Disolver el oxalato de verde de malaquita en agua. 
Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente. 
Medio completo 
Ingredientes Cantidades 
Solución A 1,000 ml 
Solución B 100 ml 
Solución C 10 ml 
Preparación 
Adicionar 1 000 ml de la solución A, 100 ml de la s olución B y 10 ml de la solución C. 
Ajustar el pH si es necesario, de tal manera que de spués de la esterilización sea de 5,2.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
Distribuir antes de usar dentro de tubos en cantida des de 10 ml. 
Almacenar en refrigeración. 
Caldo de soya tripticasa 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Tripticasa o triptosa 17,0 g 
Fitona  3,0 g 
Glucosa  2,5 g 
Cloruro de sodio 2,5 g 
Agua destilada 1,0 g 
pH final 7,3 +  0,2 
 
Preparación 
Disolver los ingredientes en 1 litro de agua destil ada, calentando lentamente hasta su disolución comp leta. 
Distribuir porciones de 225 ml dentro de matraces d e 500 ml y esterilizar en autoclave durante 15 min a 
121ºC ± 1ºC. 
Leche descremada reconstituida 
Suspender 100 g de leche descremada en polvo en un litro de agua destilada. Agitar circularmente hasta  
disolución. Distribuir en volúmenes de 225 ml en ma traces Erlenmeyer de 500 ml. Esterilizar a 121ºC ± 1ºC 
por 15 min. El volumen final debe corregirse para m antener 225 ml. 
Caldo soya tripticasa estéril adicionado con sulfit o de potasio 
Adicionar al caldo soya tripticasa 5 g de sulfito d e potasio por cada 1000 ml de medio, quedando una 
concentración final de sulfito de potasio del 0,5%.  Adicionar el sulfito de potasio antes de esteriliz ar en 
autoclave en la forma habitual. 
iii)  Medios de aislamiento 
Agar verde brillante (VB) 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de levadura 3,0 g 
Polipeptona (proteosa peptona No. 3) 10,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Lactosa  10,0 g 
Sacarosa  10,0 g 
Rojo de fenol 0,08 g 
Agar 20,0 g 
Verde brillante 0,0125 g 
Agua destilada 1,0 l 
 
pH final 6,9 ± 0,2 
 Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
Preparación 
Suspender los ingredientes en un litro de agua dest ilada y calentar a ebullición, hasta disolución com pleta. 
Ajustar el pH. 
Esterilizar en autoclave por 15 min a 121ºC ± 1ºC. El sobrecalentamiento del medio disminuye su 
selectividad. 
Enfriar el medio a 50ºC y distribuirlo en cajas de Petri estériles. El aspecto del medio es obscuro, d e color 
marrón. 
Agar con sulfito de bismuto 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne de res 5,0 g 
Mezcla de peptonas  10,0 g 
Glucosa  5,0 g 
Fosfato disódico (anhidro)  5,0 g 
Sulfato ferroso (anhidro) 0,3 g 
Sulfito de bismuto 8,0 g 
Verde brillante 0,025 g 
Agar  20,0 g 
Agua destilada  1,0 l 
pH final 7,6 +  0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en un litro de agua. Cal entar hasta su disolución completa, agitando 
frecuentemente. Ajustar el pH. 
Enfriar a 45ºC y verter en cajas de Petri estériles , distribuyendo de manera homogénea el precipitado 
propio del medio. 
El aspecto de las placas es opaco, de color verde p álido y deben usarse el mismo día de su preparación . 
Si la coloración es parda, no deben utilizarse. 
El medio no debe esterilizarse en autoclave; el sob recalentamiento afecta su selectividad. 
Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Xilosa  3,75 g 
L- lisina 5,0 g 
lactosa 7,5 g 
Sacarosa  7,5 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Extracto de levadura  3,0 g 
Rojo de fenol 0,08 g 
Agar  15,0 g 
Desoxocolato de sodio 2,5 g       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
Citrato férrico- amónico 0,8 g 
Tiosulfato de sodio 6,8 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 6,9 +  0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en un litro de agua dest ilada, y calentar en baño de agua a 55ºC, agitando 
frecuentemente, hasta disolución completa. Ajustar el pH. 
Enfriar a 50ºC y verter en cajas de Petri estériles . No se esterilice. 
El sobrecalentamiento produce una precipitación; la  reactividad del medio puede ser satisfactoria, per o las 
colonias suelen ser muy pequeñas. 
El aspecto del medio es claro y de color rojo brill ante. 
Agar para Salmonella  y Shigella  (SS) 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 5,0 g 
Polipeptona  5,0 g 
Lactosa  10,0 g 
Sales biliares 8,5 g 
Citrato de sodio dihidratado 8,5 g 
Tiosulfato de sodio pentahidratado  8,5 g 
Citrato férrico 1,0 g 
Agar  13,5 g 
Rojo neutro 0,025 g 
Verde brillante 0,33 mg 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 7,0 +  0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en un litro de agua dest ilada estéril y calentar a ebullición hasta disoluc ión 
completa. Ajustar el pH. No esterilizar en autoclav e. 
Enfriar a 50ºC y distribuir en cajas de Petri estér iles en condiciones asépticas. 
El aspecto del medio fundido es claro y de color ro sado. 
Agar entérico Hektoen 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Proteosa peptona 12,0 g 
Extracto de levadura  3,0 g 
Lactosa  12,0 g 
Sacarosa  12,0 g Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
Salicilina  2,0 g 
Sales biliares 9,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Tiosulfato de sodio 5,0 g 
Citrato amónico férrico 1,5 g 
Azul de bromotimol 0,064 g 
Fascina ácida 0,1 g 
Agar  13,5 g 
Agua  1,0 l 
pH final 7,5 +  0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en agua destilada, hervi r con agitación hasta completa disolución del agar.  
No sobrecalentar. 
Dejar enfriar a 55-60ºC y distribuir en cajas de Pe tri estériles en condiciones asépticas. 
iv)  Medios para pruebas bioquímicas 
Agar de tres azúcares y hierro (TSI) 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Peptona de carne 1,0 g 
Paptona de caseína 1,0 g 
Cloruro de sodio 0,5 g 
Lactosa  1,0 g 
Sacarosa  1,0 g 
Glucosa  0,1 g 
Agar  1,3 g 
Rojo de fenol  2,5 mg 
Sulfato ferroso amónico 
pentahidratado 20,0 mg 
Tiosulfato de sodio 20,0 mg 
Agua destilada 100 ml 
pH final 7,3 +  0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en 100 ml de agua destil ada. Calentar a ebullición, agitando ocasionalmente , 
hasta disolución completa. 
Enfriar a 60ºC y ajustar el pH. 
Distribuir en volúmenes de 3 ml en tubos de 13 x 10 0 mm y esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 min. 
Inclinar los tubos de manera que el medio de cultiv o en el fondo alcance una altura de 3 cm y una 
profundidad de 4 cm. El medio es de color rojo.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
Agar de hierro y lisina (LIA) 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Peptona de gelatina 0,5 g 
Extracto de levadura 0,3 g 
Glucosa  0,1 g 
L-lisina  1,0 g 
Citrato férrico amónico 50 mg 
Tiosulfato de sodio anhidro 4,0 mg 
Púrpura de bromocresol 2,0 mg 
Agar  1,5 g 
Agua destilada 100 ml 
pH final 6,7 +  0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en el agua destilada y m ezclar bien, calentar hasta ebullición con agitació n 
frecuente hasta conseguir la disolución completa. A justar el pH. 
Distribuir en volúmenes de 3 ml en tubos de 13 x 10 0 mm, con tapón de rosca. 
Esterilizar en autoclave a 121ºC ± 1ºC durante 12 m in. Dejar que los tubos se enfríen en posición 
inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 4 cm y una superficie inclinada de 2 cm. 
El medio ya preparado es de color púrpura. 
Agar nutritivo 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 3,0 g 
Peptona 5,0 g 
Agar 15,0 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 6,8 +  0,2 
Preparación 
Suspender los ingredientes en agua. Dejar reposar d e 5 a 10 min. 
Calentar a ebullición hasta disolución completa. Di stribuir en tubos de 13 x 100 mm, en cantidades de 1/3 
de su volumen. 
Esterilizar a 121ºC ± 1ºC por 15 min. Inclinar los tubos antes que el agar solidifique. 
Medio de SIM (para Sulfuro, Indol y Movilidad) 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 3,0 g 
Peptona  30,0 g 
Hierro peptonizado 0,20 g Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
Tiosulfato de sodio 0,025 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 7,3 +  0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en el agua destilada, ca lentar a ebullición agitando frecuentemente hasta 
lograr una disolución completa. 
Enfriar a 50ºC y ajustar el pH. 
Distribuir el medio en volúmenes de 3 ml en tubos d e 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121ºC ± 
1ºC durante 15 min. Se dejan enfriar los tubos en p osición vertical. 
Agar citrato de Simmons 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Fosfato de amonio 1,0 g 
Fosfato dipotásico 1,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Citrato de sodio 2,0 g 
Sulfato de magnesio 0,20 g 
Azul de bromotimol 0,08 g 
Agar  15,0 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 6,8 +  0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en el agua destilada, ca lentar a ebullición agitando frecuentemente hasta 
lograr una disolución completa. 
Ajustar el pH. 
Distribuir el medio en volúmenes de 3 ml en tubos d e 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121ºC ± 
1ºC durante 15 min. 
Dejar enfriar los tubos en posición inclinada. 
Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer) 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 7,0 g 
Dextrosa  5,0 g 
Difosfato de potasio  5,0 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 6,9 +  0,2 
Preparación 
Suspender los ingredientes en el agua destilada, ca lentar a ebullición agitando frecuentemente hasta 
lograr una disolución completa.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
Ajustar el pH. 
Distribuir el medio en volúmenes de 3 ml en tubos d e 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121ºC ± 
1ºC durante 15 min. 
Caldo manitol 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 1,0 g 
Proteosa peptona 10,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Rojo de fenol 0,018 g 
Manitol  10,0 g 
Agua  1,0 l 
pH final 7,4 +  0,2 
Preparación 
Suspender 26 g del medio deshidratado en un litro d e agua, mezclar y ajustar el pH. 
Distribuir en volúmenes de 2 a 3 ml en tubos de 13 x 100 mm. 
Esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 min. 
Caldo malonato 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de levadura 1,0 g 
Sulfato de amonio 2,0 g 
Fosfato dipotásico 0,6 g 
Fosfato monopotásico 0,6 g 
Cloruro de sodio 2,0 g 
Malonato  3,0 g 
Glucosa  0,250 g 
Azul de bromotimol 0,025 g 
Agua  1,0 l 
pH final 6,7 +  0,2 
 
Preparación 
Suspender los ingredientes en agua, mezclar y ajust ar el pH. 
Distribuir en tubos de 13 x 100 mm en cantidades de  3 ml. 
Esterilizar en autoclave a 121ºC ± 1ºC durante 15 m in. 
Caldo urea 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Urea  20,0 g Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
Extracto de levadura 0,1 g 
Fosfato monopotásico 9,10 g 
Fosfato dipotásico 9,5 g 
Rojo de fenol 0,01 g 
Agua  1,0 l 
pH final 6,8 +  0,2 
Preparación 
Disolver los ingredientes en agua destilada. 
NO CALENTAR. Esterilizar por filtración a través de  membrana 0,45 µm o en autoclave de 5 a 8 lb de 
presión durante 15 min. 
Distribuir asépticamente de 1,5 a 3 ml en tubos est ériles de 13 x 100 mm. 
Caldo de urea rápido 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Urea  20,0 g 
Extracto de levadura 0,10 g 
Fosfato monopotásico 0,091 g 
Fosfato dipotásico 0,095 g 
Rojo de fenol 0,010 g 
Agua  1,0 l 
pH final 6,8 +  0,2 
Preparación 
Disolver los ingredientes en agua destilada. 
NO CALENTAR. Esterilizar por filtración a través de  membrana 0,45 µm. 
Distribuir asépticamente de 1,5 a 3 ml en tubos est ériles de 13 x 100 mm. 
Caldo infusión cerebro corazón 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Infusión cerebro corazón 200,0 g 
Infusión de corazón de res 250,0 g 
Proteosa peptona 10,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Fosfato disódico dodecahidratado 2,5 g 
Dextrosa  2,0 g 
Agua destilada 1,0 l 
pH final 7,4 ± 0,2 
 
Preparación 
Disolver los ingredientes en agua destilada, calent ar suavemente. 
Distribuir y esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 m in.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
v)  Soluciones 
Solución verde brillante al 0,1% (1:1000) 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Verde brillante 0,1 g 
Agua destilada estéril 100,0 ml 
 
Disolver 0,1 g de verde brillante en agua destilada  estéril hasta completar 100 ml. 
Solución de yodo-yoduro 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Cristales de yodo 6,0 g 
Yoduro de potasio 6,0 g 
Agua destilada 100,0 ml 
 
Disolver los cristales y el yoduro de potasio en ag ua destilada hasta completar 100 ml. 
Conservar en frasco ámbar. 
Solución salina al 0,85% 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Cloruro de sodio 0,85 g 
Agua destilada 100,0 ml 
 
Disolver el cloruro de sodio en el agua y esteriliz ar a 121° C ± 1° C durante 15 min. 
Solución salina formalizada 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Solución de formaldehído (36-38 %) 6,0 ml 
Cloruro de sodio 8,5 g 
Agua destilada 1,0 l 
 
Disolver 8,5 g de cloruro de sodio en 1 litro de ag ua destilada. Esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 min. 
Enfriar a temperatura ambiente. Adicionar 6 ml de l a solución de formaldehído. No esterilizar después de 
la adición de formaldehído. 
Reactivo de Kovac 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
p-dimetil-aminobenzaldehído 5,0 g 
Alcohol amílico 75,0 ml 
Acido clorhídrico concentrado 25,0 ml Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
Disolver el p-dimetil-aminobenzaldehído en el alcoh ol amílico y después agregar el ácido clorhídrico 
lentamente. Conservar en frasco ámbar en refrigerac ión. 
Solución de alfa-naftol al 5% 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Alfa-naftol 5,0 g 
Alcohol  100,0 ml 
 
Disolver 5 g de alfa-naftol en alcohol hasta comple tar 100 ml. 
Solución de rojo de metilo 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Rojo de metilo 0,10 g 
Alcohol etílico  300,0 ml 
Agua destilada c.b.p. 500,0 ml 
 
Disolver el rojo de metilo en el alcohol etílico y adicionar agua hasta completar 500 ml. 
Solución de hidróxido de potasio al 40% 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Hidróxido de potasio 40,0 g 
Agua destilada  100,0 ml 
 
Disolver 40 g de hidróxido de potasio en agua hasta  completar 100 ml. 
Solución de gelatinasa al 5% 
Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Gelatinasa  5,0 g 
Agua  100,0 ml 
 
Disolver 5 g de gelatinasa en 100 ml de agua destil ada. NO CALENTAR. 
vi)  Antisueros 
Antisuero polivalente somático (O) 
Antisuero polivalente flagelar (H) 
Antisuero Vi 
4.4.3.2 Material 
Matraces Erlenmeyer de 500 ml 
Recipientes de boca ancha, de capacidad apropiada p ara contener las muestras simples y compuestas 
Angulos de vidrio 
Cucharas, bisturíes, cuchillos y pinzas       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
Tubos de ensaye de 16 x 150 mm y de 20 x 100 mm 
Tubos para serología de 10 x 75 mm o de 13 x 100 mm  
Pipetas bacteriológicas de 10,0 y 5,0 ml, graduadas  en 0,1 ml y protegidas con tapón de algodón 
Pipetas de 1 ml, con graduaciones de 0,01 ml 
Cajas de petri estériles de vidrio o desechables 
Rejillas para tubos de ensaye 
Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm d e diámetro 
Papel pH (intervalo de 6-8) con graduaciones máxima s de 0,4 unidades de pH para cambios de color 
Todo el material que tenga contacto con las muestra s bajo estudio debe esterilizarse mediante: 
Horno, durante 2 horas a 170-175ºC o autoclave, dur ante 15 min como mínimo a 121ºC ± 1ºC 
4.4.4 Equipo 
Horno para esterilizar que alcance los 180ºC 
Incubadora con termostato para evitar variaciones m ayores de ± 0,1ºC y termómetro 
Autoclave con termómetro o manómetro, probado con t ermómetro de máximas 
Baño maría con termostato y termómetro 
Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g 
Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato, con vasos esterilizables (vidrio o 
aluminio) 
Mecheros Bunsen o Fisher 
Potenciómetro 
4.4.5 Procedimiento 
4.4.5.1 Preparación de los alimentos para el aislamiento de  Salmonella 
Los siguientes métodos se basan en el análisis de 2 5 g de la muestra analítica en una proporción de 1: 9 
de muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse siem pre que se mantenga la misma proporción. Se 
recomienda una muestra de 25 g o más. 
i)  Procedimiento general para la preparación de muest ras 
Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso e stéril de licuadora o en bolsa estéril para trabaja r en 
homogeneizador peristáltico (stomacher). Adicionar 225 ml del medio de preenriquecimiento estéril 
(generalmente caldo lactosado, a menos que se indiq ue otro) y licuar si es necesario durante un min. 
Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con tapón de 
rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambi ente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien y 
determinar el pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6,8 ± 0,2 con hidróxido de  sodio 
1N o ácido clorhídrico 1N estériles. Mezclar y cubr ir el recipiente enroscando suavemente la tapa. 
Incubar 24 ± 2 h a 35ºC. Continuar como se indica e n el punto i) del numeral 4.4.5.2  
ii)  Procedimiento específico para la preparación de mu estra según el producto 
iii)  Huevo en polvo, claras de huevo en polvo, yema de huevo en polvo, huevos líquidos pasteurizados y 
congelados, fórmulas infantiles y mezclas preparada s en polvo (harinas para hot cakes, galletas, donas , 
bisquets y pan). 
De preferencia no descongelar la muestra. Si se req uiere, preparar los alimentos congelados justo ante s 
de tomar la muestra analítica descongelándolos a 45 ºC por 15 min aproximadamente con agitación constan te 
en un baño de agua o por 18 h a una temperatura ent re 2-5ºC. Los productos que no son en polvo se trab ajan 
como indica el procedimiento general en el punto i)  del numeral 4.4.5.1. Para los productos en polvo, pesar 25 
g de muestra analítica en el medio de preenriquecim iento, dejando que el polvo se humecte lentamente. Si es 
necesario homogeneizando poco a poco con una varill a de vidrio estéril u otra herramienta también esté ril. 
Continuar igual que el procedimiento general. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
iv)  Productos que contienen huevo en su formulación (p astas para sopa, rollos chinos, etc.); que en el 
punto iii) del numeral 4.4.5.1 utilizando caldo lac tosado como medio de preenriquecimiento, licuar dos  min. 
Continuar después de la incubación como en el punto  i) del numeral 4.4.5.2 
v)  Productos procesados térmicamente y productos seco s. Se sigue el procedimiento señalado en i) de 
4.4.5.1 hasta la homogeneización. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse. 
Después de reposar, mezclar bien y ajustar el pH co mo se indica en el procedimiento general. Para 
emulsionar las grasas, agregar los detergentes en l as mismas proporciones y con las mismas 
recomendaciones que para el coco. La cantidad de lo s mismos dependerá en gran medida de la composición  
del alimento. Los detergentes no serán necesarios e n los productos glandulares en polvo. 
Incubar las muestras como se indica en el punto i) del numeral 4.4.5.1 
4.4.5.2 Aislamiento de Salmonella  
i)  Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matrace s con los cultivos de preenriquecimiento y agitar 
suavemente, transferir respectivamente 1 ml de la m ezcla a un tubo que contenga 10 ml de caldo tetrati onato 
y a otro con 10 ml de caldo selenito cistina. Como alternativa, en sustitución del caldo tetrationato puede 
emplearse el medio Vassiliadis-Rappaport. 
ii)  Incubar de 18 a 24 h a 35ºC o, para alimentos fuer temente contaminados a 42ºC por el mismo periodo. 
Estriar los productos que fueron directamente enriq uecidos en medios selectivos. 
iii)  Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estri ar en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar v erde 
brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de  los medios selectivos adicionales (agar entérico H ektoen, 
agar Sulfito de Bismuto o Agar SS). 
Efectuar el mismo procedimiento para el caldo tetra tionato. Incubar las placas 24 ± 2 h a 35ºC. 
iv)  Examinar las placas para investigar la presencia d e colonias típicas de Salmonella , de acuerdo con las 
siguientes características: 
Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser tra nsparentes con o sin centro negro. En algunos casos  
las colonias pueden aparecer completamente negras. 
Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser tran sparentes rodeadas por medio enrojecido; las 
bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas. 
Agar entérico Hektoen: colonias verdes o azulverdes  con o sin centro negro. En algunos casos las 
colonias pueden aparecer completamente negras. 
Agar Sulfito de Bismuto: las colonias típicas de Salmonella  pueden ser cafés, grises o negras; con o sin 
brillo metálico. Generalmente el medio circundante (halo) es café, tornándose posteriormente negro. 
Algunas cepas producen colonias verdes sin la forma ción del halo oscuro. Si las placas no muestran 
colonias típicas o no se observa crecimiento, incub ar 24 h adicionales. 
Agar SS: colonias translúcidas, ocasionalmente opac as. Algunas colonias dan centro negro. Las colonias  
fermentadoras de la lactosa son rojas. 
4.4.5.3 Identificación bioquímica 
i) Seleccionar al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien aisladas. 
Tocar levemente el centro de cada colonia e inocula r dos tubos, uno con agar triple azúcar hierro (TSI ) y 
otro con agar hierro lisina (LIA), por estría en la  superficie inclinada y por punción en el fondo. 
Incubar por 24 ± 2 h a 35ºC. 
Almacenar en refrigeración de 5 a 8ºC las placas co n medios selectivos por si es necesario retomar más  
colonias. 
ii)  Observar el crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente positivas para Salmonella  las 
colonias que den las siguientes reacciones: 
iii)  Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del  indicador debido a la fermentación de la glucosa; en 
la superficie del medio se observa un color rojo má s intenso que el medio original debido a la no ferm entación 
de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayoría de l os casos se observa coloración negra a lo largo de la 
punción debido a la producción de ácido sulfihídric o.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
iv)  Agar LIA, se observa intensificación del color púr pura en todo el tubo por la descarboxilación de la 
lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo en el fondo del  agar. La 
mayoría de las cepas de Salmonella  producen ácido sulfihídrico en este medio con enne grecimiento a lo largo 
de la punción. 
v)  Retener todos los cultivos que muestren las reacci ones características de Salmonella  en los medios TSI 
y LIA para las pruebas adicionales, indicadas en el  punto vi) del numeral 4.4.5.3.  
vi)  Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella  pero que presentan reacciones en LIA típicos, 
deben trabajarse como cultivos presuntivos positivo s, ya que en estos casos, el medio LIA permitirá de tectar 
S. arizonae  y cepas atípicas de Salmonella  que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamen te los cultivos 
que muestren reacciones atípicas en ambos medios. 
vii)  Continuar el análisis a partir de los tubos de TSI  con reacciones típicas. Si el cultivo presenta 
reacciones atípicas en este medio, tomar colonias a dicionales de las placas de donde se obtuvo el cult ivo 
atípico anterior y sembrar las pruebas bioquímicas nuevamente. 
viii)  Continuar la identificación bioquímica y serológic a a partir de los cultivos recuperados de TSI. Se 
recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analítica seleccionando colonias procedentes  de 
ambos medios de enriquecimiento. 
ix)  Prueba de ureasa 
x)  Prueba de ureasa (convencional). Con una asa estér il, tomar crecimiento del cultivo presumiblemente 
positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos  de caldo urea. Utilizar un control de medio para c omparar 
el vire púrpura de las reacciones positivas con el color del medio original. Incubar 24 ± 2 h a 35ºC. 
xi)  Prueba de ureasa (rápida). Tomar dos asadas de cre cimiento del cultivo presumiblemente positivo de 
cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo ur ea (rápida). Incubar 2 h a 37 ± 0,5ºC en baño de ag ua. 
Descartar todos los cultivos que den ureasa positiv a. Retener los cultivos que den la prueba negativa (sin 
cambio de color del medio). 
4.4.5.4 Identificación serológica 
i)  Ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella  (Antisuero polivalente O) 
ii) Colocar con una asa dos gotas separadas de solución  salina estéril sobre un portaobjetos o en dos 
secciones de una placa para aglutinación. Suspender  en cada una de las gotas, una porción del cultivo 
desarrollado en TSI. 
iii) Agregar a una de ellas una gota del antisuero poliv alente somático (O) y mezclar con el canto del asa o 
empleando aplicadores de madera. 
iv) Agitar inclinando la lámina hacia atrás y hacia ade lante durante aproximadamente un min. 
Observar bajo buena iluminación sobre un fondo oscu ro. 
v) Considerar cualquier grado de aglutinación como pos itiva. 
La prueba positiva resulta cuando se presenta aglut inación en la gota con el cultivo y el antisuero y no 
aglutinación en la gota que contiene el cultivo y l a solución salina. 
Si se observa aglutinación en ambas gotas, la prueb a no es definitiva y se debe continuar con las prue bas 
bioquímicas complementarias. 
vi) Cuando la aglutinación es positiva con el suero pol ivalente O, puede determinarse el subgrupo 
empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los más frecuen tes). 
vii) Si la aglutinación con el antisuero O es negativa, utilizar antisuero Vi y efectuar la prueba. Si hay 
aglutinación con Vi calentar el cultivo a ebullició n y repetir la aglutinación con el antisuero poliva lente O. 
viii) Si no se cuenta con los sueros grupoespecíficos, so licitar la tipificación de la cepa al Laboratorio d e 
Enterobacterias del Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia de la Secretaría de Salud o a la Comis ión de 
Control Analítico y Ampliación de la Cobertura (CCA YAC). 
ix) Si se requiere, practicar el ensayo de los antígeno s flagelares de Salmonella  (Antisuero polivalente H). Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
x) Inocular el crecimiento del tubo de TSI en agar inf usión de cerebro corazón e incubar de 4 a 6 h a 35º C 
hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el  mismo día), o bien, en caldo soya tripticaseína e incubar 
por 24 ± 2 h a 35ºC (para ensayo al día siguiente).  Adicionar 2,5 ml de solución salina formalizada a 5 ml del 
cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro coraz ón (BHI). 
xi) Colocar 0,5 ml del antisuero polivalente flagelar ( H) preparado en un tubo para serología (13 x 100 mm  
aproximadamente). Adicionar 0,5 ml del cultivo form alizado. Preparar un control de solución salina mez clando 
0,5 ml de solución salina formalizada con 0,5 ml de l antígeno formalizado. Incubar las mezclas en baño  de 
agua a 48-50ºC. Observar a intervalos de 15 min por  espacio de una h. Una prueba positiva es cuando se  
observa aglutinación en la mezcla de prueba pero no  en el control. Debe interpretarse como negativa un a 
prueba en la que ninguna de las mezclas muestre agl utinación. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se 
considera la prueba inespecífica. 
4.4.5.5 Pruebas bioquímicas complementarias 
Cuando las pruebas serológicas o bioquímicas inicia les, dan resultados atípicos o no concluyentes, 
realizar las pruebas que se describen a continuació n: 
i) Inocular los cultivos positivos provenientes de TSI  y LIA en: medio SIM, agar citrato de Simmons, cald o 
manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para con firmar la presencia de la especie S. arizonae . 
ii) Interpretar los cambios en los medios inoculados co nforme lo siguiente: 
iii) Agar citrato Simmons. 
Inocular por estría el tubo. 
Incubar 96 ± 2 h a 35 ± 2ºC. 
Prueba positiva: crecimiento acompañado de un cambi o de color de verde a azul. 
Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin camb io de color. 
iv) Medio SIM 
Inocular por punción. 
Incubar 24 h a 35 ± 2ºC. 
Movilidad. 
Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la punci ón y en el seno del medio de cultivo. 
Prueba negativa: crecimiento a lo largo de la punci ón exclusivamente. 
Producción de ácido sulfihídrico. 
Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la punción que puede extenderse a todo el 
medio. 
Prueba negativa: ausencia de color negro. 
Producción de indol. 
Adicionar al tubo con medio SIM que presente crecim iento, de 0,2 a 0,3 ml de reactivo de Kovac. 
Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color r ojo. 
Prueba negativa: sin cambio de color. 
v) Caldo RM-VP 
Inocular un tubo con el medio. 
Incubar 48 ± 2 h a 35 ± 2ºC para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM. 
vi) Prueba de Voges-Proskauer (VP) 
Transferir a un tubo un ml del cultivo de 48 h. 
Adicionar 0,6 ml de solución de alfa naftol. 
Adicionar 0,2 ml de solución de hidróxido de potasi o 40%. 
Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional ).       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
Interpretar los resultados después de incubar 2 h a  35 ± 2ºC o 4 h a temperatura ambiente. 
Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo.  
Prueba negativa: sin cambio de color. 
Reincubar el resto del medio RM-VP 48 h más a 35 ± 2ºC. 
viii) Prueba de rojo de metilo (RM) 
Adicionar al medio de cultivo de 96 h de incubación  de dos a tres gotas de solución de rojo de metilo.  
Interpretar los resultados inmediatamente. 
Prueba positiva: desarrollo de color rojo. 
Prueba negativa: desarrollo de color amarillo. 
ix) Caldo malonato 
Inocular un tubo conteniendo el medio. 
Incubar 40 ± 2 h a 35 ± 2ºC. 
Prueba positiva: desarrollo de color azul. 
Prueba negativa: sin cambio de color. 
x) Caldo manitol 
Inocular un tubo conteniendo el medio. 
Incubar 24 ± 2 h a 35 ± 2ºC. 
Prueba positiva: desarrollo de color amarillo. 
Prueba negativa: sin cambio de color. 
xi) Consultar los resultados obtenidos en el cuadro 2 p ara la identificación de los géneros de las bacteri as 
investigadas. 
Nota: los sistemas bioquímicos comerciales validados pued en ser usados como alternativa para las 
pruebas bioquímicas convencionales. 
4.4.6 Cálculo y expresión de resultados 
4.4.6.1 Interpretación de reacciones bioquímicas y serológi cas. 
CUADRO 1 
Reacciones bioquímicas Reacciones serológicas Inter pretación 
Típica  Antígeno O, Vi o H positivo Cepas considera das como 
Salmonella  
Típica Todas las reacciones negativas  
Típica No probada Puede ser Salmonella  
Reacciones atípicas Antígeno O, Vi o H positivo  
Reacciones atípicas Todas las reacciones negativas No debe ser considerada 
Salmonella  
Nota: ver figura 1 Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
CUADRO 2 
Prueba o sustrato Positivo Negativo Reacción 
Glucosa (TSI) Amarillo  Rojo  + 
Lisina descarboxilasa 
(LIA) Púrpura  Amarillo  + 
H2S (TSI y LIA) Negro  No negro  + 
Ureasa Rojo-púrpura No hay cambio de color -  
Caldo de lisina 
descarboxilasa Púrpura  Amarillo  + 
Caldo dulcitol rojo de 
fenol Amarillo o gas No hay cambio de color 
ni gas + b 
Caldo KCN Crecimiento  No hay crecimiento - 
Caldo malonato Azul  No hay cambio de color - c 
Prueba de indol Superficie color violeta Superficie  color amarillo - 
Prueba del antígeno 
flagelar Aglutinación  No hay aglutinación  + 
Prueba del antígeno 
somático  Aglutinación  No hay aglutinación + 
Caldo lactosa rojo fenol Amarillo o gas No hay camb io de color 
ni gas - c 
Caldo sacarosa rojo fenol  Amarillo o gas No hay cambio de color 
ni gas - 
Prueba Voges-proskauer De rosa a rojo No hay cambio  de color - 
Prueba rojo de metilo Rojo difuso Amarillo difuso +  
Citrato de Simmons Crecimiento color azul No hay cr ecimiento, no 
hay cambio de color v 
a +, 90% o más positivos en 1 o 2 días; -, 90% o má s negativas en 1 o 2 días; v, variable. 
b La mayoría de los cultivos S. arizonae  son negativos. 
c La mayoría de los cultivos S. arizonae  son positivos. 
4.4.6.2 Informe de resultados 
Informar: presencia o ausencia de Salmonella  en __________ g o ____________ ml de muestra.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
Figura 1 
DIAGRAMA DE FLUJO PARA LA IDENTIFICACION DE SALMONE LLA 
 
 
4.5 Método para la determinación de staphylococcus aureus  en productos objeto de esta norma  
4.5.1 Introducción  
El crecimiento de Staphylococcus aureus  en alimentos tiene gran importancia por tratarse d e un 
microorganismo capaz de producir una poderosa enter otoxina que al ingerirse causa intoxicaciones 
alimentarias. 
Entre las razones para determinar el Staphylococcus aureus  en alimentos están: 
Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de una enfermedad de origen 
alimentario. 
Determinar si un alimento o ingrediente es fuente p otencial de este microorganismo enterotoxigénico. 
Demostrar la contaminación postproceso la cual es u sualmente debida a contacto humano o con 
superficies inadecuadamente sanitizadas. 
Los alimentos sujetos a contaminación postproceso c on tipos enterotoxigénicos de Staphylococcus aureus  
representan un riesgo por la ausencia de flora comp etitiva que normalmente restringe el crecimiento de l 
Staphylococcus aureus  y la producción de enterotoxinas. 
Este tipo de alimentos se vuelven más peligrosos, s i además son sujetos a un inadecuado manejo o son 
mantenidos a temperaturas de conservación inapropia das. 
Los alimentos perecederos tales como: carnes crudas  y procesadas, ensaladas, productos de pastelería y  
productos de leche, son los más comúnmente asociado s con intoxicación estafilocóccica. 
4.5.2 Fundamento  
Este método permite hacer una estimación del conten ido de Staphylococcus aureus  en alimentos, se 
efectúa directamente en placas de medio de cultivo selectivo y diferencial, con la confirmación median te las 
pruebas de coagulasa y termonucleasa. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
Este método es adecuado para el análisis de aliment os en los cuales se esperen más de 100 células de 
Staphylococcus aureus  por g. 
4.5.3 Reactivos y materiales  
En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshi dratadas, para su preparación se deben seguir las 
instrucciones impresas en la etiqueta respectiva. 
Cuando se mencione agua debe entenderse que se trat a de "agua destilada". 
Los reactivos a emplear en el método objeto de esta  norma deben ser grado analítico. 
4.5.3.1 Reactivos 
i)  Soluciones diluyentes 
Solución reguladora de fosfatos (Solución concentra da) 
Fórmula 
Ingredientes Cantidad 
Fosfato monopotásico 34,0 g 
Agua  I,0 l 
Preparación 
Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1 N, af orar 
con agua a 1 l. 
Esterilizar durante 15 min a 121ºC ±1, conservar en  refrigeración (solución concentrada). 
Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y llevar a  1 l con agua (solución de trabajo). 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se r equiera. 
Esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 min. 
Después de la esterilización, los volúmenes finales  y el pH de la solución de trabajo deben ser iguale s a 
los iniciales. 
Agua peptonada 
Fórmula 
Ingredientes Cantidad 
Peptona  1,0 g 
Cloruro de sodio 8,5 g 
Agua  1,0 l  
 
Preparación 
Disolver los componentes en un litro de agua. 
Ajustar el pH a 7,0 con solución de hidróxido de so dio 1N. 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se r equiera. 
Esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 min. 
Después de la esterilización los volúmenes finales y el pH de la solución de trabajo deben ser iguales  a los 
iniciales. 
ii)  Medios de cultivo 
iii)  Medio de Baird-Parker 
Fórmula 
Ingredientes Cantidad 
Medio base 
Punto iv) del numeral 4.5.3.1 95,0 ml 
Solución de telurito de potasio 
Punto v) del numeral 4.5.3.1 1,0 ml 
Emilsión de yema de huevo Punto 
vi) del numeral 4.5.3.1 5,0 ml       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
Preparación 
Cuando el medio base esté a 45ºC, agregar los demás  ingredientes y mezclar. 
Colocar de 15 a 20 ml del medio completo, enfriar y  dejar solidificar. 
Las placas pueden almacenarse por 48 h a temperatur a de 0 a 5ºC. 
iv)  Medio base de Baird-Parker 
Fórmula 
Ingredientes Cantidad 
Tripona  10 g 
Extracto de levadura 1,0 g 
Extracto de carne  5,0 g 
Glicina  12,0 g 
Cloruro de litio 5,0 g 
Piruvato de sodio 10,0 g 
Agar  20,0 g 
Agua  1,0 l 
 
Preparación 
Disolver los ingredientes o el agar base en agua y calentar con agitación constante y hervir durante 1  min. 
Esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 min. 
Enfriar y mantener el medio a 45ºC. 
v)  Solución de telurito 
Fórmula 
Ingredientes Cantidad 
Telurito de potasio 1,0 g 
Agua  100,0 ml 
 
Preparación 
Disolver el telurito de potasio en agua y esteriliz ar. 
La solución puede ser almacenada por varios meses a  temperatura de 0 a 5ºC. 
vi)  Emulsión de yema de huevo 
Preparación 
Lavar con agua y jabón los huevos frescos que sean necesarios y limpiarlos con una solución de tintura  de 
yodo (solución alcohólica al 2%) o sumergirlos en s olución de cloruro mercúrico (1:1000). Enjuagar con  agua 
estéril y secar con gasa estéril. 
En campana de flujo laminar o en condiciones asépti cas, abrir los huevos y vaciarlos en un separador d e 
claras estéril. Transferir las yemas a una probeta hasta un volumen de 60 ml y completar a 90 ml con s olución 
salina isotónica. 
Verter la emulsión a un matraz Erlenmeyer con perla s de vidrio estéril y agitar fuertemente para forma r la 
emulsión. 
Filtrar a través de gasa. 
Las placas deben utilizarse dentro de las 48 h sigu ientes a su preparación. 
vii)  Solución salina isotónica 
Fórmula 
Ingredientes Cantidad 
Cloruro de sodio 0,85 g 
Agua  100,0 ml Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
Preparación 
Disolver el ingrediente en agua y esterilizar a 121 ºC ±1 durante 15 min. 
viii Caldo de infusión cerebro-corazón (BHI) 
Fórmula 
Ingredientes Cantidad 
Infusión de cerebro de ternera 200,0 ml 
Infusión de corazón de res 250,0 ml 
Peptona de gelatina 10,0 g 
Cloruro de sodio 5,0 g 
Fosfato disódico dodecahidratado 2,5 g 
Glucosa  2,0 g 
Agua  1,0 ml 
Preparación 
Disolver los ingredientes en agua y calentar ligera mente si es necesario. 
Distribuir y esterilizar durante 15 min a 121ºC ±1.  
iv)  Acido desoxirribonucléico helicoidal de timo de te rnera. 
Fórmula 
Ingredientes Cantidad 
Acido desoxirribonucléico helicoidal de timo de 
ternera o equivalente 0,03 g 
Agar  1,0 g 
Cloruro de calcio anhidro (solución 0,01 M) (punto x 
del numeral 4.5.3.1) 0,10 ml 
Cloruro de sodio 1,0 g 
Azul de toluidina (solución 0,1 M) (punto xi del 
numeral 4.5.3.1) 0,30 ml 
Tris-(hidroximetil-aminometano) (Tris solución 0,05  M, 
pH 9) 
(punto xii del numeral 4.5.3.1) 100 ml 
 
Preparación 
Disolver los ingredientes, excepto el azul de tolui dina agitando hasta completar la disolución del áci do 
desoxirribonucléico y calentar a ebullición. 
Agregar el azul de toluidina. Distribuir en frascos  pequeños con tapón de hule. No es necesario esteri lizar. 
Este medio es estable a temperatura ambiente hasta 4 meses y funciona perfectamente aun después de 
fundirlo varias veces. 
Tomar un porta objetos limpio y agregar 3 ml del me dio fundido esparciéndolo por la superficie. 
Cuando el agar solidifique, hacer orificios con la punta de una pipeta Pasteur. 
Conservar en refrigeración para evitar la deshidrat ación. 
x)  Solución de cloruro de calcio anhidro 0,01 M 
Cloruro de calcio PM = 110,99 
Disolver 0,1199 g de cloruro de calcio en 100 ml de  agua. 
xi)  Solución de azul de toluidina 0,1 M 
Disolver 3,05 g de azul de toluidina en 100 ml de a gua. 
xii)  Solución amortiguadora 0,05 M Tris-(hidroximetilam inometano) 
(Tris pH 9) PM = 121,1 
Disolver 6,055 g de Tris en 100 ml de agua.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
xii)  Reactivo biológico: 
Plasma de conejo 
Emplear plasma deshidratado o rehidratado de conejo  siguiendo las instrucciones del fabricante y agreg ar 
ácido etilendiaminotetracético (EDTA) en solución a l 0,1% en plasma rehidratado. Si se utiliza plasma 
deshidratado diluir con agua estéril en proporción de 1:3. 
Puede emplearse plasma de conejo liofilizado adicio nado de EDTA. No debe emplearse sangre citratada. 
4.5.3.2 Materiales 
Todos los instrumentos que se utilicen para trabaja r la muestra deben esterilizarse mediante horno, 
durante 2 h de 170-175ºC o como alternativa en auto clave durante 15 min como mínimo a 121ºC ±1. 
Cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas y s eparador de huevo. 
Tubos de cultivo de 16 mm x 150 mm o frascos de 125  a 250 ml de capacidad. 
Tubos de cultivo de 10 mm x 75 mm. 
Cajas Petri de 90 a 100 mm de diámetro. 
Pipetas bacteriológicas de 1 ml y 10 ml de capacida d graduadas en 0,1 ml y 1 ml respectivamente y 
diámetro de 2 a 3 mm. 
Pipetas Pasteur. 
Probetas. 
Varillas de vidrio de 3,5 mm de diámetro aproximada mente y 20 cm de largo dobladas en ángulo recto. 
Matraz Erlenmeyer con perlas de vidrio 
Cámara húmeda: consiste en una caja Petri en la cua l se coloca una varilla de vidrio en forma de "V" 
rodeada de algodón humedecido con agua. 
4.5.4 Aparatos  
Horno para esterilizar que alcance 180° C. 
Autoclave con termómetro. 
Baño de agua con regulador de temperatura de 35 ± 0 ,5ºC. 
Baño de agua con regulador de temperatura de 45 ± 0 ,5ºC. 
Balanza con capacidad no mayor de 2,500 g y sensibi lidad de 0,1 g. 
Incubadora a 35 ± 1ºC. 
4.5.5 Preparación de la muestra  
La preparación de la muestra se debe realizar de ac uerdo a lo establecido en B.6.1  "Preparación y 
Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico".  
4.5.6 Procedimiento  
4.5.6.1 Utilizando diferentes pipetas de 1 ml para cada dil ución, depositar 0,1 ml sobre la superficie de las 
placas de agar Baird-Parker. 
4.5.6.2 Distribuir el inóculo sobre la superficie del agar con varillas estériles de vidrio en ángulo recto, 
utilizando una para cada dilución. 
4.5.6.3 Mantener las placas en su posición hasta que el inó culo sea absorbido por el agar. 
4.5.6.4 Invertir las placas e incubar de 45 a 48 h a 35ºC. 
4.5.6.5 Seleccionar las placas que tengan entre 15 y 150 co lonias típicas de Staphylococcus aureus ; si no 
es posible, seleccionar las placas de las dilucione s más altas no obstante tengan más de 150 colonias.  
4.5.6.6 Cuando las placas tengan menos de 15 colonias típic as también pueden ser utilizadas y al informe 
se debe agregar la nota de "valor estimado". 
4.5.6.7 Las colonias típicas son negras, circulares, brilla ntes, convexas, lisas, de diámetro de 1 a 2 mm y 
muestran una zona opaca y un halo claro alrededor d e la colonia. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
4.5.6.8 Seleccionar las colonias de acuerdo con el siguient e cuadro para realizar las pruebas de coagulasa 
y termonucleasa: 
CUADRO 
Número de colonias 
sospechosas en caja Número de colonias 
por probar 
Menos de 50 3 
51 a 100 5 
101 a 150 o más 7 
4.5.6.9 Seleccionar el número de colonias y sembrar cada un a en tubos con 0,5 ml de caldo de infusión 
cerebro-corazón. 
4.5.6.10 Incubar a 35ºC durante 24 h. 
4.5.6.11 Inocular en la misma forma cepas conocidas de Staphylococcus aureus  y Staphylococcus 
epidermidis  como testigos positivo y negativo. 
4.5.6.12 Después del periodo de incubación pasar con una pip eta de 1 ml, 0,3 ml de cada cultivo a otro 
tubo de 10 mm x 75 mm y conservarlo para la prueba de termonucleasa. El resto del cultivo se usa para la 
prueba de coagulasa. 
4.5.6.13 Prueba de coagulasa 
i)  Agregar a los 0,2 ml del cultivo anterior, 0,2 ml de plasma de conejo diluido volumen a volumen con 
solución salina estéril. 
ii)  Incubar en baño de agua de 35 a 37ºC y observar du rante 6 h a intervalos de 1 h; si no hay formación 
de coágulo, observar a las 24 h. Considerar positiv a la prueba si hay formación de coágulo. 
Para comprobar la coagulabilidad del plasma de cone jo se añade una gota de cloruro de calcio al 5% a 0 ,5 
ml de plasma reconstituido empleado, formándose un coágulo en 10-15 seg. 
4.5.6.14 Prueba de termonucleasa 
i) Calentar durante 15 min, 0,3 ml de cultivo en caldo  de infusión cerebro-corazón en baño de agua 
hirviendo. 
ii) Pasar una gota de cada cultivo por medio de una pip eta Pasteur a un orificio del medio, incluye testig o. 
iii) Incubar a 35ºC en cámara húmeda de 4 a 24 h. 
iv) La aparición de un halo color rosa extendido de por  lo menos 1 mm alrededor de la perforación se 
califica como positiva. 
4.5.7 Cálculo y expresión de resultados  
4.5.7.1 Cálculo 
Hacer el cálculo del contenido de microorganismos e n el producto tomando en cuenta el número de 
colonias totales, el número de colonias confirmadas , la dilución y el volumen inoculado (0,1 ml). 
Ejemplo 1: 
Si la caja tiene 80 colonias en la dilución 1:1000 
Se toman 5 colonias para la prueba, de éstas dan 4 positivas, el cálculo es: 
80 x 4  = 64 x 1000 x 10 = 640 000 
  5 
Ejemplo 2: 
Si la caja tiene 14 colonias en la dilución 1:10 
Se toman 3 colonias para la prueba, de éstas dan 2 positivas, el cálculo es: 
14 x 2  = 9,3 x 10 x 10 = 930 
  3       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
4.5.7.2 Expresión de los resultados: 
Según ejemplo 1: 
Informar como Staphylococcus aureus  640 000 UFC/g 
Según ejemplo 2: 
Informar como Staphylococcus aureus  930 UFC/g valor estimado 
Si las pruebas confirmativas resultan negativas en todas las colonias probadas, informar como: 
0 UFC/g en muestras directas 
-10 UFC/g en muestras de dilución 1:10 
-100 UFC/g en muestras de dilución 1:100 
En la práctica los resultados pueden variar, esto d ependerá del técnico que trabaje el método y el gra do de 
confiabilidad del mismo, que en el 95% de los casos  es de ± 16% a ± 52%. 
5. Método de prueba para la determinación de cadmio , plomo, fierro y zinc en productos objeto de 
esta norma alimentos por espectrometría de absorció n atómica. 
5.1 Introducción  
La presencia de ciertos elementos químicos en alime ntos, bebidas, agua potable y agua purificada, 
constituye un serio problema para la salud del homb re debido a su toxicidad. 
5.2 Fundamento  
El método de absorción atómica se basa en hacer pas ar un haz de luz monocromática de una frecuencia 
tal que puede ser absorbido por el analito que se e ncuentra presente en forma de vapor atómico. La med ida 
de la intensidad luminosa antes y después de su pas o por el vapor atómico permite determinar el porcie nto de 
absorción. 
La cantidad de absorción aumenta con la concentraci ón de los átomos en el medio absorbente, es decir, la 
medida de la absorción aumenta con la concentración  del elemento en la muestra, ya sea que esté en su 
condición original o sujeta a pretratamiento. 
5.3 Reactivos y materiales  
5.3.1 Reactivos 
Soluciones estándares de referencia certificadas de  cada uno de los metales. 
Agua, debe ser destilada deionizada, con un grado m áximo de conductividad de 1 µmho/cm a 25ºC. 
Acido nítrico (densidad específica 1,41), grado sup rapuro. 
Acido nítrico (densidad específica 1,41), contenido  de mercurio muy bajo. 
Acido perclórico (densidad específica 1,67), grado suprapuro. 
Acido clorhídrico (densidad específica 1,19), grado  suprapuro. 
Acido sulfúrico (densidad específica 1,84), grado s uprapuro. 
Acido sulfúrico 1 N a partir de la solución grado s uprapuro. 
Acido nítrico 65% v/v grado RA. 
Peróxido de hidrógeno (densidad específica 1,12). 
Hidróxido de sodio granalla reactivo RA. 
Aire comprimido seco y limpio. 
Gases: acetileno, óxido nitroso, argón y nitrógeno,  grado absorción atómica. 
Solución de Nitrato de Magnesio hexahidratado al 7%  p/v. Disolver 70 g de Mg(NO3)2 .6H2O en 1000 ml 
de HCl 1 N. 
Acido clorhídrico 1 N. Diluir 8,3 ml de HCl y lleva r a 100 ml de agua. 
Acido nítrico al 50% v/v. Diluir 50 ml de HNO3 al 6 5% v/v grado suprapuro en 50 ml de agua. 
Acido clorhídrico 8 M. Diluir 66,0 ml de HCl y llev ar a 100 ml con agua. 
Acido clorhídrico 0,5 N. Diluir 4,15 ml de HCl y ll evar a 100 ml con agua. 
Solución de Yoduro de Potasio al 15% p/v. Disolver 15 g de KI en 100 ml de agua (esta solución debe 
prepararse en el momento de usarse). Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
Solución de Yoduro de Potasio al 20% p/v. Disolver 20 g de KI en 100 ml de agua (esta solución debe 
prepararse en el momento de usarse). 
Solución de Cloruro de Potasio (10 mg/ml de K). Dis olver 1,91 g de KCl en agua y diluir a 100 ml con 
agua. 
Solución de Nitrato de Magnesio al 50% p/v. Disolve r 50 g de Mg(NO3)2.6H2O en 100 ml de agua. 
Solución de ácido clorhídrico al 1,5% p/v. Diluir 1 ,5 ml de HCl en 100 ml de agua destilada deionizada . 
Solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 1 g  de hidróxido de sodio y diluir a 100 ml con agua 
destilada deionizada. 
Solución de borohidruro de sodio al 4% p/v en soluc ión de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 4 g de 
borohidruro de sodio en 100 ml de una solución de h idróxido de sodio al 1% p/v. Filtrar al vacío. 
Solución reductora para mercurio. Mezclar 50 ml de ácido sulfúrico concentrado con aproximadamente 
300 ml de agua. Enfriar a temperatura ambiente y di solver 15 g de cloruro de sodio, 15 g de sulfato o cloruro 
de hidroxilamina y 25 g de cloruro o sulfato estano so en solución. Diluir a 500 ml. 
Solución de dilución para mercurio. En un matraz de  1 l, conteniendo de 300 a 500 ml de agua destilada  
deionizada, agregar 58 ml de ácido nítrico concentr ado de muy baja concentración de mercurio y 67 ml d e 
ácido sulfúrico concentrado. Diluir al volumen con agua. 
Solución de trabajo de As de 1 µg/ml. Diluir 1 ml d e la solución patrón de 1000 µg/ml a 1 l con ácido 
sulfúrico 1N preparada a partir de la solución grad o suprapuro. Preparar fresca cada día. 
5.3.2 Materiales 
Matraces Kjeldahl de 500 ml y 800 ml. 
Sistema de reflujo con refrigerante. 
Crisoles Vycor de 40 a 50 ml de capacidad. 
Crisoles de platino de 40 a 50 ml de capacidad. 
Matraces Erlenmeyer de diferentes capacidades. 
Matraces volumétricos de diferentes capacidades. 
Matraces redondos de fondo plano de 50 ml. 
Bombas Parr. 
Micropipetas o pipetas de Eppendorf de diferentes c apacidades. 
Puntas de plástico para micropipetas. 
Papel filtro Whatman No. 2. 
Perlas de ebullición. 
Varillas de plástico. 
Tubos de ensayo graduados de propilen o propileno d e 15 ml. 
Recipientes de propilen o propileno. 
Embudos de filtración de diferentes capacidades. 
Material común de laboratorio. 
Todo el material utilizado debe someterse a lavado de acuerdo con las siguientes instrucciones. 
El jabón que se use debe ser de preferencia neutro.  
Enjuagar perfectamente con agua corriente. 
Sumergir el material de vidrio o plástico en un rec ipiente (de preferencia plástico) que contenga una 
solución de ácido nítrico grado RA al 30%. 
Dejarlo tapado y reposando por un lapso de 24 horas . 
Quitar el exceso de ácido nítrico con varios enjuag ues (5 o 6 veces) con agua deionizada. 
Dejar escurrir y secar. 
Guardar en cuanto esté seco para evitar contaminaci ón por partículas en el aire.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
5.4 Aparatos e instrumentos  
5.4.1 Aparatos 
Lámparas de cátodo hueco o de descarga sin electrod os para determinar arsénico, cadmio, cobre, estaño,  
fierro, mercurio, plomo y zinc. 
Fuente de radiofrecuencia en caso de usar lámparas de descarga. 
Automuestreador y recirculador de agua. 
Placa de calentamiento con regulador que alcance un a temperatura de 400 a 450ºC. 
Horno de microondas. 
Autoclave que alcance 121 ± 5ºC o 15 lb de presión.  
Centrífuga de laboratorio capaz de mantener 1600 rp m. 
5.4.2 Instrumentos 
Los instrumentos que a continuación se indican debe n estar calibrados y ajustados antes de su operació n. 
Espectrómetro de absorción atómica equipado con los  accesorios para flama, horno de grafito, generador  
de hidruros o vapor frío, dependiendo del método a seguir. 
Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg. 
Mufla capaz de mantener una temperatura de 550 ± 10 ºC. 
Horno de calentamiento (estufa) con intervalo de te mperatura de 120 ± 5ºC. 
5.5 Preparación de la muestra  
5.5.1 Digestión para la determinación de Cd, Fe, Pb y Zn.  
5.5.1.1 Digestión por vía húmeda. 
i)  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad apro piada de muestra. 
Para la determinación por el método de absorción po r flama pesar como máximo 20 g de alimentos que 
contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos  sólidos o semisólidos. Limite el contenido de gras a o 
aceite a un máximo de 4 g y el total de materia org ánica a 5 g. 
ii)  Añadir 10 ml de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar directamente la 
digestión. 
iii) Usar matraz de Kjeldhal o matraz conectado al siste ma de refrigerantes. 
ix) Calentar suavemente. 
v) Digerir la muestra 3 horas o más tiempo si es neces ario (algunas muestras requieren la adición de 
mayor cantidad de ácido nítrico) hasta la aparición  del color traslúcido, si queda ámbar, adicionar pe róxido de 
hidrógeno gota a gota con agitación continua (reacc ión exotérmica). 
vi) Enfriar. 
vii) Recuperar, filtrar y llevar a un volumen conocido e n matraz volumétrico. 
viii) Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada  por cada serie de digestión. 
ix) Leer en el aparato de elección (espectrómetro de ab sorción atómica por flama u horno de grafito). 
5.5.1.2 Digestión por vía seca. 
i) Pesar con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad aprop iada de muestra. 
Para la determinación por el método de absorción po r flama pesar como máximo, 20 g de alimentos que 
contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos  sólidos y semisólidos. Limite el contenido de gras a o 
aceite a un máximo de 4 g y el total de materia org ánica a 5 g. 
ii) Añadir 10 ml de ácido nítrico concentrado y dejar r eposar toda la noche o iniciar directamente la 
digestión. En productos con alta concentración de p roteínas adicionar una solución de nitrato de magne sio al 
7,0% p/v y mezclar completamente, llevar a sequedad  aproximadamente durante 6 horas en estufa a una 
temperatura de 90 a 95ºC. 
iii) Colocar la muestra en una mufla y elevar la tempera tura lentamente de 2 a 4ºC por minuto hasta 
350° C. Mantener la temperatura hasta que cesen los humos. 
Iv) Elevar gradualmente la temperatura de 500 a 550ºC p ara evitar que la muestra se incinere y mantener 
esa temperatura durante 16 horas o toda la noche. 
v) Apagar la mufla y dejar enfriar. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
vi) Un segundo paso de calcinación puede ser requerido para remover algunos residuos de carbón, 
mediante el siguiente procedimiento: 
Lavar las paredes del crisol con 2 ml de ácido nítr ico al 50%. Colocar la muestra en una placa de 
calentamiento puesta a 120ºC para remover el exceso  de ácido. Colocar la muestra en una mufla fría y e levar 
la temperatura gradualmente de 500 a 550ºC, manteni éndola por el tiempo necesario. Repetir este 
procedimiento cuantas veces sea necesario hasta que  quede libre de carbón remanente. 
vii) Disolver las cenizas completamente en 5 ml de ácido  clorhídrico 1N, transferir la muestra disuelta a u n 
tubo de propileno o a un matraz de volumen conocido , enjuagar el crisol con dos alícuotas de 5 ml de á cido 
clorhídrico 1 N y transferir al mismo tubo o matraz  para obtener un volumen de 15 ml en el primero y l levar al 
aforo en el segundo, tapar y mezclar, si existe pre sencia de partículas o materia insoluble, filtrar e n papel 
Whatman No. 2, antes de la determinación. 
viii) Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada  por cada serie de digestión. 
ix) Leer en el aparato de elección (espectrómetro de ab sorción atómica: flama u horno de grafito). 
5.5.2 Digestión para la determinación de Cd, Pb, Fe y Zn por horno de microondas. 
Pesar con precisión de ± 0,1 mg, 0,500 g como máxim o de muestra, añadir 6 ml de ácido nítrico 
concentrado y 2 ml de agua oxigenada al 30%, cerrar  perfectamente el envase de reacción y proceder seg ún 
el manual del fabricante. 
5.6 Procedimiento  
5.6.1 Espectrometría de absorción atómica por flama. 
5.6.1.1 Calibración. Es necesario comprobar que se tiene un a calibración inicial y periódica aceptable. 
i)  Se inicia la configuración operacional del instrum ento y en el sistema de adquisición de datos. Permi tir 
un periodo no menor a 30 minutos para el calentamie nto de las lámparas de descarga sin electrodos. 
ii)  Se debe verificar la estabilidad del instrumento m ediante el análisis de una solución estándar 20 vec es 
más concentrada que el límite de detección del inst rumento (LDI) para el analito, leída un mínimo de c inco 
veces y calculando la desviación estándar resultant e, la cual debe ser menor al 5%. 
iii)  El instrumento debe calibrarse para el analito a d eterminar usando el blanco de calibración y los 
estándares de calibración preparados a 3 o 4 nivele s de concentración dentro del intervalo dinámico de  
concentración del analito. 
iv)  Ajustar el instrumento a 0 con el blanco de calibr ación. Introducir los estándares de calibración del  
analito de menor a mayor concentración y registrar al menos tres réplicas de la absorbancia de cada un o. 
v)  Elaborar una curva de calibración graficando absor bancia en función de la concentración. Lo anterior 
puede llevarse a cabo en equipos que se programan d irectamente, en los cuales sólo es necesario introd ucir 
los estándares y marcar su concentración teórica. 
5.6.1.2 Operación del instrumento. 
El desempeño del instrumento se verifica mediante e l empleo de blancos de calibración, estándares de 
calibración y una muestra de control de calidad (MC C). 
i)  Después de que se ha realizado la calibración, se debe verificar que el instrumento trabaje 
adecuadamente para el analito. Para ello se analiza  una muestra de control de calidad. Si las medicion es 
varían en ± 10% o más, al valor establecido para la  MCC, el análisis debe interrumpirse y buscar la po sible 
causa de error, el instrumento se debe recalibrar y  verificar la nueva calibración. 
ii)  Para verificar que el instrumento no presenta deri va, por cada 10 análisis se debe analizar el blanco  de 
calibración. Si el valor verdadero del analito difi ere ± 10% o más, el instrumento debe recalibrarse. Si el error 
persiste debe identificarse el problema y corregirs e. 
Si la matriz de la muestra es responsable de la der iva o afecta la respuesta del analito puede ser 
necesario trabajar por adiciones estándar. 
iii) La demostración de la operatividad inicial del inst rumento se hace estableciendo los límites de 
detección del método (LDM) para el analito y el int ervalo de calibración lineal. Para determinar el LD M se usa 
un blanco de reactivos fortificado con una concentr ación del analito equivalente de 2 a 5 veces el lím ite de 
detección estimado. Se hacen al menos 4 réplicas de  lectura de absorbancia del blanco de reactivos 
fortificado procesado a través de todo el método an alítico. Los LDM se calculan de acuerdo a: 
LDM= t x s       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
t = valor de la "T" de Student a un intervalo de co nfianza de 99% y una desviación estándar estimada 
para n-1 grados de libertad. t = 3,14 para 7 réplic as. 
s = desviación estándar de las réplicas del análisi s. 
El intervalo lineal de calibración se establece a p artir de por lo menos 4 estándares de diferente 
concentración, uno de los cuales debe estar próximo  al límite superior del intervalo lineal. 
5.6.1.3 Determinación 
i) Ajustar el instrumento de absorción atómica en las  condiciones adecuadas para la determinación del 
analito de acuerdo a las indicaciones del manual de l instrumento. 
ii) Introducir el blanco de reactivos y la muestra a an alizar y registrar los valores de absorbancia. Se d ebe 
analizar al menos un blanco de reactivos con cada g rupo de muestras. Los valores obtenidos ponen de 
manifiesto la calidad de los reactivos usados y el grado de contaminación del laboratorio. 
iii) En los equipos que pueden programarse, la lectura o btenida da directamente la concentración del 
elemento en las unidades de concentración utilizada s. 
iv)  Se debe analizar al menos un blanco de reactivos f ortificado para cada grupo de muestras. Se calcula 
la exactitud como el porciento de recuperación (de acuerdo al punto vi del numeral 5.6.1.3). 
v)  Se debe fortificar al menos una muestra por grupo o el 10% de ellas lo que resulte mayor. La 
concentración añadida debe ser de aproximadamente 0 ,1 unidades de absorbancia. 
vi)  Se debe calcular el porciento de recuperación para  el analito, de acuerdo a: 
CM - C 
R = -------------- x 100 
CA 
R = % recuperación 
CM = Concentración de la muestra fortificada 
C = Concentración de la muestra 
CA = Concentración equivalente de analito añadido a  la muestra. 
Si la recuperación del analito en la muestra fortif icada está fuera del intervalo previamente establec ido y el 
blanco de reactivos fortificado está correcto, pued e existir un problema relacionado con la matriz de la 
muestra. Los datos se deben verificar por el método  de las adiciones estándar. 
5.6.2 Espectrometría de absorción atómica por horno de gr afito. 
5.6.2.1 Calibración. 
i)  Proceder de acuerdo a los puntos  i)  al iv) del numeral 5.6.1.1 
ii) Elaborar una curva de calibración graficando área d e pico o altura máxima contra concentración del 
analito. 
La calibración mediante el uso de una computadora o  una calculadora basada en el ajuste sobre los dato s 
de concentración respuesta es aceptada. 
Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se  programan directamente, en los cuales sólo es 
necesario introducir los estándares y marcar su con centración teórica. 
5.6.2.2 Operación del instrumento. 
i) Proceder de acuerdo a los puntos i) a iii) del nume ral 5.6.1.2 
5.6.2.3 Determinación. 
i) Ajustar el instrumento de absorción atómica en las condiciones adecuadas para la determinación del 
analito, de acuerdo a las recomendaciones del manua l del instrumento. 
El programa de temperaturas para el horno de grafit o puede variar dependiendo de la matriz de la 
muestra. En el caso de existir interferencias no es pecíficas (absorción molecular o dispersión de la l uz), se 
recomienda consultar la bibliografía existente en c uanto a los métodos disponibles para eliminarlas, a sí como 
en el caso de interferencias de matriz. 
5.6.3 Espectrometría de absorción atómica por generador d e hidruros. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
5.6.3.1 Calibración. 
i)  Proceder de acuerdo a los puntos  i) a iv) del numeral 5.6 
ii)  A partir de la solución estándar de As de 1000 mg/ l, preparar una solución de As de 1 mg/l en ácido 
clorhídrico de concentración apropiada al método. T razar una curva de calibración de absorbancia (máxi mo de 
la altura de pico) en función de la concentración d el analito para un intervalo de concentración de 0 a 10 µg/l 
de As bajo las mismas condiciones de la matriz de l a muestra. 
5.6.3.2 Operación del instrumento. 
i)  Proceder de acuerdo a los puntos  i) a iii) del numeral 5.6.1.2 
5.7 Expresión de resultados  
Método de cálculo. 
Interpolar los valores de absorbancia o altura de p ico de la muestra analizada en la curva de calibrac ión y 
obtener los mg/kg del elemento en la muestra y real izar los cálculos empleando la siguiente fórmula: 
 A x B 
mg/ kg = -------- 
 C 
en donde: 
A = Concentración en mg/kg de la muestra a interpol ar en la curva de calibración. 
B = Volumen final al que se llevó la muestra (ml). 
C = Peso de la muestra (g) o volumen de la muestra (ml) en el caso de agua. 
En los equipos que pueden programarse, la lectura o btenida da directamente la concentración del 
elemento en mg/kg o µg/kg. 
5.8 Informe de la prueba  
Los resultados se informarán en mg/kg o µg/kg del e lemento a determinar. 
6. Determinación de Vitamina B1 y B2 por Cromatogra fía Líquida de Alta Resolución (HPLC). 
6.1 Fundamento 
La vitamina B1, es extraída de la muestra por hidró lisis ácida y oxidada a tiocromo, su contenido es 
determinado por HPLC en fase inversa con detección fluorométrica. 
6.2 Reactivos y materiales 
6.2.1 Reactivos 
Acido clorhídrico fumante, 37% para análisis (HCl).  
Acetato de sodio trihidratado, para análisis. (CH 3 . CO 2Na . 3H 2O). 
Acido orto-fosfórico PO 4H3 (P 2O5 . 3H2O). 
Ferricianuro de potasio, para análisis Fe(CN) 6K4 . 3H 2O. 
Hidróxido de sodio en lentejas, para análisis. 
Monohidrato de tiamina (nitrato de tiamina, Vitamin a B1 monohidratada), calidad alimentaria 
(C 12 H17 N5O4S). 
Papaína soluble. 
Amilasa. 
Diastasa. 
N,N - Dimetilformamida HCON(CH 3)2. 
fosfato, ácido de-potasio, para análisis (K 2HPO 4 . 3H 2O). 
6.2.2 Materiales. 
Matraces en forma de pera, 100 ml.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
Tapones huecos hexagonales. 
Matraces aforados, de vidrio de 1000, 100, 50 y 10 ml. 
Embudos de vidrio de 100 mm de diámetro. 
Matraces Erlenmeyer, de cuello estrecho, 250 ml. 
Refrigerante, Allihn, manguito 300 mm. 
Filtros plisados medianos 185 mm de diámetro. 
Pipetas aforadas con una marca de 2, 3, 5 y 40 ml. 
Pipetas graduadas hasta la punta de 1 ml: 0,005. 
Probetas graduadas, en forma alta, de 50 ml: 0,5;10 0 ml: 1,0 1000 ml: 10,0 
Todo el material de vidrio debe ser actínico o forr ado con papel aluminio. 
6.2.3 Aparatos e instrumentos 
Balanza analítica, 162 g, lectura 0,1 mg. 
Balanza de precisión electrónica, 2100 g, lectura 0 ,01 g. 
Baño de agua en línea con soportes, 6 plazas. 
Estufa de laboratorio. 
Jeringuilla para HPLC, de un 1 ml. 
Aguja para jeringuilla. 
Columna ODS o C 18, 5 µm, 250 X 4,6 mm; o equivalen te. 
Dispositivo de filtración sobre membrana. 
Membrana para filtro. 
6.4 Preparación de soluciones 
6.4.1 Solución de ácido clorhídrico 
En un matraz aforado de 1000 ml que contenga aproxi madamente 500 ml de agua destilada, añadir con 
cuidado 82 ml de ácido clorhídrico al 37% y llevar a volumen con agua destilada. Trabajar en campana d e 
extracción. 
6.4.2 Solución de acetato de sodio 2,5 M. 
En un matraz aforado de 1000 ml disolver 340 g de a cetato de sodio trihidratado en agua destilada y ll evar 
a volumen. 
6.4.3 Hidróxido de sodio, solución de 150 g/l. 
En un matraz aforado de 1000 ml, disolver 160 g de hidróxido de sodio en lentejas en agua destilada, 
llevar a volumen. 
Conservar en un matraz provisto de un tapón de poli etileno. 
6.4.4 Solución de oxidación 
6.4.4.1 Solución de ferricianuro de potasio 1g/100ml. 
En un matraz aforado de 100 ml disolver, 1 g de fer ricianuro de potasio en agua destilada y llevar a 
volumen. 
6.4.4.2 Solución a preparar justo antes del uso 
En un matraz aforado de 50 ml, llevar a volumen 2 m l de solución 6.4.4.1 con solución 6.4.3. 
6.5 Fase móvil para HPLC 
6.5.1 Solución de fosfato ácido de-potasio, 10 mM pH 7,2.  
En un vaso de 1000 ml pesar exactamente 2,28 g de f osfato de-potasio, disolver en aproximadamente 800 
ml de agua destilada. Ajustar el pH a 7,2 con ácido  clorhídrico 1 N (6.4.1). Transvasar a un matraz af orado de 
1000 ml y llevar a volumen con agua destilada. Dega sificar bajo presión reducida y filtrar. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
6.5.2 Solución de dimetilformamida al 15% en fosfato ácid o de potasio. 
En un matraz aforado de 1000 ml agregar 150 ml de d imetilformamida y llevar a volumen con solución 
6.5.1 
6.6 Solución patrón de vitamina B1 
6.6.1 Solución concentrada 
En un matraz aforado de 50 ml de vidrio, pesar exac tamente 50,0 mg de monohidrato de tiamina y disolve r 
en agua destilada. Añadir 5 ml de ácido clorhídrico  1 N (6.4.1) y llevar a volumen con agua destilada.  Esta 
solución contiene 1 mg/ml. 
6.6.2 Soluciones diluidas 
En un matraz aforado de 50 ml, agregar mediante una  pipeta, 5 ml de solución 6.6.1 y llevar a volumen 
con agua destilada. Luego verter mediante una pipet a, 5 ml de esta solución (100 µg/ml) en un matraz a forado 
de 50 ml y llevar a volumen con agua destilada. Est a solución contiene 10 µg/ml. Verter, mediante una pipeta, 
5 ml de esta solución en un matraz aforado de 50 ml  y llevar a volumen con agua destilada. Esta soluci ón 
contiene 1 µg/ml. 
6.6.3 Preparar de la misma manera solución concentrada de  riboflavina y de manera subsecuente las 
soluciones diluidas. No es necesario utilizar matra ces de vidrio. 
6.6.4 Solución patrón oxidada para HPLC 
Mediante una pipeta, verter 5 ml de solución 6.6.2 en un matraz aforado de 10 ml de vidrio. Añadir 3 m l de 
solución de ferricianuro de potasio básico (6.4.4.2 ). Agitar durante 2 minutos, añadir 0,45 ml de ácid o fosfórico 
concentrado, mezclar, enfriar y llevar a volumen co n agua destilada. Cromatografiar esta solución 
inmediatamente. 
6.7 Procedimiento 
La vitamina B1 no es sensible a la luz; en cambio e l producto oxidado, el tiocromo, sí lo es. Durante la 
etapa de oxidación, utilizar material de vidrio act ínico, o material de vidrio corriente protegido con  papel 
aluminio. 
6.7.1 Toma de ensayo 
Homogeneizar toda la muestra, mezclando o moliendo y pesar con una aproximación de 10 mg, una toma 
de ensayo de 5 g. 
Para la determinación de vitamina B2 adicionar 0,5 g de amilasa y 0,25 g de papaína, independientement e 
de si el producto contiene almidón o no. 
6.7.1.1 Productos con almidón 
En un matraz en forma de pera de 100 ml de vidrio c on cuello esmerilado, mezclar la toma de ensayo con  
0,5 g de diastasa y 0,25 g de papaína. Añadir máxim o 15 ml de agua destilada de 45-50° C. Mezclar bien,  a fin 
de obtener una suspensión homogénea. Tapar el matra z y colocarlo durante 30 min en una estufa a 40° C. 
Añadir a continuación 30 ml de agua destilada de 45  - 50° C. 
6.7.2 Oxidación 
En un matraz aforado de 10 ml de vidrio verter, med iante una pipeta, 5 ml de solución (6.7.2.1 o 6.7.2 .2).  
Añadir 3 ml de solución de ferricianuro de potasio básico (6.4.4.2).  Agitar durante 2 minutos. Añadir 0,45 ml de 
ácido fosfórico concentrado, mezclar, enfriar y lle var a volumen con agua destilada. Cromatografiar es ta 
solución inmediatamente. 
6.7.3 HPLC 
Condiciones 
Columna: ODS o C 18, 5 µm; 250 X 4,6 mm o equivalente 
Loop de inyección: 50 µl 
Fase móvil: ver punto B.6.5.2 
Caudal: 1,5 ml/min       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
*Detector: espectrofluorímetro, excitación: 368 nm 
 emisión: 440 nm 
Registrador: 10 mm/min 
*Para la determinación de vitamina B2 se inyecta di rectamente del filtrado y se modifica la siguiente 
condición: 
Detector: espectrofluorímetro; excitación: 450 nm y  emisión: 530 nm 
Inyectar primero 50 µl de solución patrón oxidada ( B.7.6.4) y determinar el tiempo de retención: debe ser 
de aproximadamente 5 - 6 min. A continuación inyect ar 50 µl de la solución obtenida B.7.7.3  
6.8 Cálculo, expresión e interpretación de los resultad os 
6.8.1 Evaluación 
Identificar el pico del tiocromo o de la riboflavin a en el cromatograma de la toma de ensayo mediante el 
tiempo de retención definido por cromatografía de l a solución patrón. Medir la altura de los picos obt enidos al 
cromatografiar la toma de ensayo y la solución patr ón. El contenido de vitamina B1, expresado en mg po r 100 
g de producto, es igual a: 
hp x C x V x 100  
hs x m x1000 
En donde: 
m = masa de la toma de ensayo, en g 
hp = altura del pico del extracto, en mm 
hs = altura del pico de la solución patrón, en mm 
C = concentración de la solución patrón, en µg/ml 
V = volumen, en mililitros, en el cual se ha diluid o el extracto antes del análisis por HPLC (200 para  estos 
productos) 
6.8.2 Repetibilidad 
La diferencia entre dos resultados individuales obt enidos con la misma muestra para ensayo, en las 
mismas condiciones (analista, aparato, laboratorio)  en un corto intervalo de tiempo, no debe exceder 1 0% de 
la media entre ambos resultados. 
7 Determinación de Niacina. Método microbiológico  
7.1 Fundamento 
Este método permite cuantificar concentraciones des conocidas de niacina utilizando Lactobacillus 
plantarum ATCC 8014, microorganismo que no puede si ntetizar esta vitamina, relacionando directamente e l 
crecimiento celular con la concentración de niacina . Para preparar la muestra y la curva estándar se u tiliza un 
medio libre de niacina y el crecimiento celular se cuantifica turbidimétricamente. Por interpolación e n la curva 
se determina la concentración de la muestra. 
7.2 Reactivos y materiales 
7.2.1 Reactivos 
Acido nicotínico para fines bioquímicos. 
Acido clorhídrico fumante 37% para análisis. 
Hidróxido de sodio en lentejas para análisis. 
Cristales de cloruro de sodio para análisis. 
7.2.2 Materiales 
Micropipeta. 
Vasos de precipitados. 
Pipetas volumétricas. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
Matraces Erlenmeyer. 
Matraces volumétricos. 
Tubos de ensaye. 
7.3 Aparatos e instrumentos 
Autoclave. 
Incubadora a 35° C ± 1° C. 
Espectrofotómetro. 
Centrífuga. 
7.4 Cepa y medios de cultivo 
Lactobacillus plantarum  ATCC 8014. 
Leche descremada en polvo grado reactivo. 
Caldo micro inoculum. 
Agar bacteriológico. 
Caldo Bacto Lactobacilli. 
Medio de prueba para niacina. 
7.4.1 Medio de mantenimiento de la cepa 
Bacto Lactobacilli MRS-agar (MRS-agar) 
Preparar 1 l de medio con 55 g de caldo Bacto Lacto bacilli MRS + 15 g de agar bacteriológico según las  
indicaciones de la etiqueta del caldo MRS + 1,5% de  leche descremada (reconstituida al 10% en agua 
destilada). Repartir a razón de 6 ml en tubos (de p referencia con tapón de rosca), esterilizar y enfri ar en 
posición vertical. 
Conservar en el refrigerador a 4° C. 
7.4.2 Mantenimiento de la cepa 
Inocular por punción Lactobacillus plantarum  en profundidad en el medio 7.4.1 cada cuatro seman as, 
efectuar un cultivo intermedio de 18 h en el medio líquido 7.4.3. Preparar el número de tubos necesari os para 
el análisis y guardar por lo menos dos tubos para e l mantenimiento de la cepa. Incubar durante 18 h a 35° C. 
7.4.3 Medio de cultivo para el desarrollo del microorgani smo 
Caldo Micro Inoculum 
Preparar 1 l de solución según las indicaciones de la etiqueta y repartir a razón de 10 ml en tubos. T apar 
los tubos con capuchones y esterilizar según las in dicaciones del fabricante. Conservar en el refriger ador a 
4° C. 
7.5 Preparación de soluciones 
7.5.1 Solución fisiológica 
Disolver 9 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua  destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos, 
taparlos con capuchones y esterilizar durante 15 mi n a 121° C. 
Conservar en el refrigerador a 4° C. 
7.5.2 Solución de ácido clorhídrico aproximadamente 1 N 
Bajo una campana de extracción diluir 82 ml de ácid o clorhídrico al 37% llevándolos a un volumen de 10 00 
ml con agua destilada. Para ello verter el ácido en  el matraz aforado que ya contiene agua. 
7.5.3 Solución de Hidróxido de sodio 60 g/100 ml 
Disolver 300 g de hidróxido de sodio en agua destil ada, enfriando bajo agua del grifo. Completar a 500  ml 
en una probeta graduada. Conservar en un frasco con  tapón de polietileno o de goma. 
7.5.4 Solución de Hidróxido de sodio aproximadamente 1 N 
Disolver 20 g de hidróxido de sodio en agua destila da y llevar a volumen en un matraz aforado de 500 m l 
con tapón de polietileno.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
7.5.5 Solución patrón 
Justo antes del uso, pesar exactamente 50,0 mg de á cido nicotínico; disolver en agua destilada y lleva r a 
volumen en un matraz aforado de 500 ml. 
7.6 Procedimiento 
7.6.1 Desarrollo del microorganismo 
Un día antes subcultivar en 10 ml de caldo Micro In oculum . 
Incubar durante 18 h a 35° C. 
Seis h antes de la inoculación del ensayo, inocular  2 gotas (aproximadamente 0,1 ml) del último cultiv o de 
18 h en otro tubo de 10 ml de caldo Micro Inoculum.  
Incubar durante 6 h a 35° C. 
7.6.2 Preparación de la toma de ensayo 
En un matraz Erlenmeyer de 150 ml, pesar de 1 a 3 g  de muestra homogénea, que contenga 
aproximadamente 200 µg de vitamina, añadir 50 ml de  solución de ácido clorhídrico 1N en pequeñas 
cantidades pasando el matraz Erlenmeyer bajo el gri fo de agua caliente después de cada adición. 
Cubrir el matraz con papel de aluminio y colocarlo en el autoclave durante 15 min a 120° C. Enfriar. 
Ajustar el pH a 4,6 añadiendo primero aproximadamen te 3 ml de hidróxido de sodio de 60 g/100 ml 
mientras se enfría el matraz Erlenmeyer, y luego hi dróxido de sodio 1 N. Transvertir cuantitativamente  a un 
matraz aforado de 100 ml y llevar a volumen con agu a destilada. Filtrar a través de un filtro plisado con 
velocidad de filtración media. 
Diluir el filtrado de modo que se obtenga una soluc ión de aproximadamente 0,05 µg de vitamina por ml. 
7.6.3 Solución patrón, 0,05 µg/ml 
Justo antes del uso diluir la solución 7.5.5 como s igue: 
5 ml a 100 ml 
10 ml a 100 ml 
10 ml a 100 ml = 0,05 µg/ml 
7.6.4 Medio de cultivo para el ensayo 
Medio de prueba para niacina 
Preparar el volumen necesario en un matraz Erlenmey er de vidrio actínico de 100 ml. Proceder según las  
indicaciones de la etiqueta, calentando la solución  en una parrilla con agitación magnética. 
Cálculo del volumen necesario: 
patrón: 30 tubos 30 x 5 ml = 150 ml 
cada producto: 10 tubos 10 x 5 ml = 50 ml 
+ 50 a 100 ml de exceso 
7.6.5 Preparación del ensayo 
7.6.5.1 Serie patrón 
En un soporte metálico para tubos de ensaye, coloca r tres filas de 10 tubos (180 x 18 mm), numerados b l, 
0, ..., 8; el primero corresponde al blanco (bl). 
Mediante una pipeta verter en triplicado en las tre s series de tubos, volúmenes crecientes de la últim a 
dilución de la solución patrón, completar a 5 ml co n agua destilada y mediante una bureta o una jering a 
automática, añadir 5 ml de medio de cultivo para el  ensayo según la tabla siguiente: Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
Tubo No.  bi 0 1 2 3 4 5 6 7 8 
Sol. 
Patrón 0,0 0,0 0,25 0,5 0,75 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 
Agua 5 5 4,75 4,5 4,25 4,0 3,5 3,5 3,5 2,0 
Medio de 
cultivo  5 ml en cada tubo 
Los tubos del ensayo en blanco (bl) no se inoculan.  
7.6.5.2 Serie producto 
En otro soporte colocar dos filas de 10 tubos (180 x 18 mm). Los primeros cinco tubos de ambas filas v an 
destinados a un producto, los otros cinco de ambas filas, a otro producto. Numerar de 9 a 13 y de 14 a  18, y 
así sucesivamente para todos los productos analizad os. 
Mediante un pipeta verter en duplicado en ambas ser ies de cinco tubos, volúmenes crecientes de la últi ma 
dilución de la solución de la muestra, completar a 5 ml con agua destilada y añadir 5 ml de medio de c ultivo 
para el ensayo. 
Tubo No. 9 10 11 12 13 
Sol. De la 
muestra: 0,25 0,5 0,75 1,0 1,5 
Agua 4,75 4,5 4,25 4,0 3,5 
Medio de cultivo  5 ml en cada tubo 
Tapar los tubos con capuchones o mediante una tapa adecuada que cubra ambas filas de tubos en el 
soporte. 
7.6.6 Esterilización del ensayo 
Esterilizar los tubos durante 15 min a 115° C, luego  enfriarlos en un baño de agua fría. 
7.6.7 Inoculación 
7.6.7.1  Preparación y estandarización del inóculo 
Justo antes de inocular el ensayo, transvertir una cantidad suficiente del cultivo preparado bajo 7.6. 1 a un 
tubo de centrífuga estéril, centrifugar a 2600 rpm durante 5 min, decantar y resuspender el paquete ce lular en 
10 ml de solución salina. Hacer dos lavados más. Tr ansvertir a una cubeta de 1 cm y efectuar la lectur a en el 
espectrofotómetro a 575 nm. Estandarizar el cultivo  a fin de obtener siempre aproximadamente la misma 
extinción. No debe olvidarse sustraer de la extinci ón del cultivo la del medio de ensayo, que es un me dio 
coloreado. 
Según la extinción, diluir "n" gotas del cultivo (7 .6.1)  en un tubo que contenga 10 ml de medio (7.6.4). Est e 
tubo es el inóculo. 
Así pues, para una extinción del cultivo (7.6.1) en tre 0,2 y 0,4 (después de sustraer la extinción pro pia del 
medio), introducir de 4 a 8 gotas de cultivo en el tubo que contiene 10 ml de medio (7.6.4).  Si la extinción no 
se encuentra en la zona arriba mencionada, adaptar la dilución como sigue: 
- extinción inferior a 0,2: introducir proporcional mente más gotas en el tubo (no más de 10 gotas). 
- extinción superior a 0,4: introducir menos gotas o diluir proporcionalmente con el medio (7.6.4). 
7.6.7.2 Inoculación 
Mediante una micropipeta con punta estéril, inocula r 0,1 ml del inóculo en cada tubo de las series pat rón y 
producto. Los tubos del blanco (bl) no se inoculan.  
Después de inocular, agitar los tubos ligeramente a  fin de repartir el microorganismo uniformemente en  el 
medio. 
7.6.8 Incubación 
Incubar los tubos inoculados durante aproximadament e 16 h a 35° C. Observar los tubos con regularidad a l 
cabo de las 16 h. Verificar si la diferencia de des arrollo del microorganismo es suficiente entre la p rimera y la 
última dilución de la solución patrón.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
Si es necesario, prolongar la incubación hasta que se obtenga un crecimiento óptimo del microorganismo . 
Después de la incubación se recomienda interrumpir el crecimiento del microorganismo simultáneamente 
en todos los tubos, colocándolos en un baño de agua  fría. 
7.6.9 Lecturas 
Mediante un agitador para tubos de ensaye, poner en  suspensión el depósito formado por el desarrollo d el 
microorganismo. Transvertir la suspensión a un tubo  o una cubeta óptica, según el fotómetro. Medir la 
transmitancia o absorbancia a 575 nm ajustando el 1 00% de T o a 0% de A del aparato con el blanco (bl) .* 
Agitar y leer un tubo después de otro, a fin de evi tar la sedimentación del microorganismo. 
* Nota: Si la determinación se hace en absorbancia buscar el equivalente de los valores de los ejemplo s, 
dados en transmitancia. 
7.7 Cálculos 
7.7.1 Curva de calibración 
Trazar la curva de calibración en papel milimétrico , o utilizar una calculadora con regresión lineal, llevando 
la lectura media de cada grupo de tres tubos a la o rdenada y los µg de vitamina a la abscisa. 
Ejemplo: 
Tubo  ml µg Lecturas  media N°  
   1 2 3  
0 0,0 0,0 88,7 88,6 88,2 88,5 
1 0,25 0,0125 73,4 72,6 71,1 72,4 
2 0,5 0,025 62,1 61,5 62,6 62,1 
3 0,75 0,0375 53,3 53,2 55,5 54,0 
4 1,0 0,050 47,3 48,0 49,1 48,1 
5 1,5 0,075 36,8 37,7 40,5 38,3 
6 2,0 0,10 31,0 45,6 39,5 35,3 
7 2,5 0,125 30,5 27,2 27,2 28,3 
8 3,0 0,15 29,0 24,8 24,0 25,9 
Observaciones: 
La curva de calibración es característica de cada v itamina. Es mejor cuanto mayor sea la parte que ocu pa 
la escala de transmisión. 
Repetir el ensayo cuando la curva de crecimiento es té mal desarrollada, esto puede deberse a la cepa o  al 
medio de cultivo para el ensayo; que deben verifica rse por separado. 
7.7.2 Contenido de vitamina en el producto 
La media de las lecturas de cada par de tubos permi te leer en la curva de calibración la cantidad de 
vitamina y calcular su concentración en la última d ilución de la muestra. 
Ejemplo: 
Tubo ml Lecturas media µg* µg/ ml No. 
  1 2    
9 0,25 (88) 79,0 79,0 0,0145 0,058 
10 0,5 59,2 58,2 58,7 0,0300 0,060 
11 0,75 52,0 52,2 52,1 0,0413 0,055 
12 1,0 43,8 45,8 44,8 0,0580 0,058 
13 1,5 35,0 35,5 35,3 0,086 0,057 
Media 0,0576 (c) Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
 ( ) = valor aberrante 
* = valores leídos en la curva de calibración 
Observación: 
Fluctuaciones pequeñas en los valores de la última columna son prueba de un buen ensayo. 
Calcular el contenido de vitamina en mg/100 g de pr oducto, teniendo en cuenta las diluciones sucesivas  y 
la concentración en la muestra diluida. 
El contenido de vitamina, expresado en mg de ácido nicotínico por 100 g de producto es igual a: 
C x V 3 x V 1 x 100  
m x V 2 x 1000 
Donde: 
C = media de las concentraciones leídas en la curva  de calibración, en µg/ml 
V1 = volumen en el que se ha disuelto la toma de ensa yo, en ml 
V2 = parte alícuota de V1 en ml 
V3 = volumen al que se ha diluido la parte alícuota V 2, en ml 
m = toma de ensayo, en g 
Ejemplo: 
2,072 g (m) de producto se han pesado en un matraz aforado de 100 ml (V1). Se ha tomado una parte 
alícuota de 2 ml (V2), que se ha diluido en un matr az aforado de 100 ml (V3). 
La media de las concentraciones de niacina leídas e n la curva de calibración es 0,0576 µg/ml (C). 
El contenido de vitamina es: 
   0,0576 x 100 x 100 x 100 ___ = 13,9 mg/100 g 
 2,072 x 2 x 1000 
8. Determinación de Acido Fólico. Método microbioló gico. 
8.1 Fundamento 
Este método permite cuantificar ácido fólico utiliz ando Lactobacillus casei  ATCC 7469, microorganismo 
que no puede sintetizar esta vitamina, relacionando  directamente el crecimiento celular con la concent ración 
de folato presente. Para preparar la muestra y la c urva estándar se utiliza un medio comercial libre d e folato. 
El crecimiento celular se mide turbidimétricamente y por interpolación en la curva se determina la 
concentración en la muestra. 
8.2 Reactivos y materiales 
8.2.1 Reactivos 
Cloruro de calcio fundido o granulado para análisis . 
Fosfato diácido de potasio anhidro. 
Fosfato ácido di-potásico anhidro. 
Hidróxido de sodio en lentejas para análisis. 
Cristales de cloruro de sodio para análisis. 
Alcohol etílico absoluto. 
α-amilasa. 
Lactosa. 
8.2.2 Materiales 
Matraz Erlenmeyer de vidrio de 250 ml. 
Matraz aforado de vidrio de 100, 250 y 500 ml.       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
Tapones de vidrio. 
Micropipetas. 
Material común de laboratorio. 
Todo el material de vidrio debe ser actínico o forr ado con papel aluminio. 
8.3 Aparatos e instrumentos 
Autoclave. 
Incubadora a 35° C ± 1° C. 
Espectrofotómetro. 
Centrífuga. 
8.4 Cepa y medios de cultivo 
Lactobacillus casei  ATCC 7469. 
Leche descremada en polvo grado reactivo. 
Caldo Micro Inoculum. 
Agar bacteriológico. 
Caldo Bacto Lactobacilli MRS. 
Medio de prueba para ácido fólico. 
8.4.1 Medio de mantenimiento de la cepa. 
Bacto Lactobacilli MRS-agar (MRS-agar). 
Preparar 1 l de medio con 55 g de caldo Bacto Lacto bacilli MRS + 15 g de agar bacteriológico, según la s 
indicaciones de la etiqueta del caldo MRS + 1,5% de  leche descremada (reconstituida al 10% en agua 
destilada). Repartir a razón de 6 ml en tubos (de p referencia con tapón de rosca), esterilizar y enfri ar en 
posición vertical. 
Conservar en el refrigerador a 4° C. 
8.4.2 Mantenimiento de la cepa 
Inocular por punción Lactobacillus casei  en profundidad en el medio 8.4.1 cada cuatro seman as, 
efectuando un cultivo intermedio de 18 h en el medi o líquido 8.4.3. Preparar el número de tubos necesa rios 
para el análisis y guardar por lo menos dos tubos p ara el mantenimiento de la cepa. 
Incubar durante 18 h a 35° C. 
8.4.3 Medio de cultivo para el desarrollo del microorgani smo 
Caldo Micro Inoculum 
Preparar 1 l de solución según las indicaciones de la etiqueta y repartir a razón de 10 ml en tubos. T apar 
los tubos con capuchones y esterilizar según las in dicaciones del fabricante. 
Conservar en el refrigerador a 4° C. 
8.5 Preparación de soluciones 
8.5.1 Solución fisiológica 
Disolver 9 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua  destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos, 
taparlos con capuchones y esterilizar durante 15 mi n a 121° C. 
Conservar en el refrigerador a 4° C. 
8.5.2 Solución tampón pH 6,1 
Disolver 2 g de hidróxido de sodio en agua destilad a y llevar a volumen en un matraz aforado de 500 ml  
con tapón de polietileno. 
8.5.3 Solución de cloruro de calcio, CaCl2, al 2% 
Disolver 2 g de cloruro de calcio en agua destilada  y completar a 100 ml en un matraz aforado. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
8.5.4 Solución patrón 
Pesar exactamente 50,0 mg de ácido fólico (ácido pt eroilglutámico), disolver en agua destilada en un 
matraz aforado de vidrio de 500 ml, añadir 50 ml de  NaOH 0,1 N, 100 ml de alcohol y llevar a volumen c on 
agua destilada. 
Conservar esta solución a 4° C durante máximo 6 mese s. 
8.6 Procedimiento 
El ácido fólico es fotosensible. Por lo tanto, para  todas las soluciones que contienen dicha vitamina se 
debe utilizar material de vidrio actínico o cubrir el material de vidrio corriente con papel de alumin io o un paño 
negro. 
8.6.1 Desarrollo del microorganismo 
Un día antes, subcultivar en 10 ml de caldo Micro I noculum (8.4.3). 
Incubar durante 18 h a 35° C. 
Seis horas antes de la inoculación del ensayo, inoc ular 2 gotas (aproximadamente 0,1 ml) del último 
cultivo de 18 h en otro tubo de 10 ml de caldo Micr o Inoculum. 
Incubar durante 6 h a 35° C. 
8.6.2 Preparación de la toma de ensayo 
8.6.2.1 Productos sin almidón 
En un matraz Erlenmeyer de 250 ml, pesar de 1 a 3 g  de muestra homogénea, que contenga 
aproximadamente 1 µg de ácido fólico. Disolver en 3 0 ml de solución tampón pH 6,1 (8.5.2). A fin de ev itar la 
formación de grumos, añadir la solución tampón en p equeñas cantidades pasando el matraz Erlenmeyer baj o 
el grifo de agua caliente. 
Cubrir el matraz con papel de aluminio y colocar en  el autoclave durante 20 min a 102° C. Enfriar. 
Transvertir cuantitativamente a un matraz aforado d e vidrio de 100 ml. Añadir al contenido del matraz 0,8 
ml de solución de cloruro de calcio al 2% y agitar.  Dejar reposar durante 15 minutos, luego llevar a v olumen 
con agua destilada. Filtrar a través de un filtro p lisado con velocidad de filtración media. 
Diluir el filtrado de modo que se obtenga una soluc ión de aproximadamente 0,2 ng de ácido fólico por m l. 
8.6.2.2 Productos con almidón 
Proceder según el primer apartado bajo 8.6.2.1. 
Antes de colocar la solución en el autoclave, añadi r una cantidad de mezcla al 6% de α-amilasa 
pancreática en lactosa, correspondiente a 1% de la toma de ensayo. 
Incubar durante 30 min a 42° C. Cubrir el matraz con  papel de aluminio y colocar en el autoclave durant e 
20 min a 102° C. Enfriar. A continuación transvertir  cuantitativamente a un matraz aforado de vidrio de  100 ml y 
proseguir como se describe en 8.6.2.1 
Nota: Con cada nuevo lote de diastasa efectuar un ensayo en blanco. 
Mediante una pipeta tomar 10 ml de solución patrón (8.6.3) dilución d. Añadir 30 ml de agua. Añadir 10 0 
mg de mezcla al 6% de α-amilasa pancreática en lactosa. Incubar durante 30  min a 42° C. Transvertir 
cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml. Ll evar a volumen y filtrar. 
La curva de calibración obtenida con esta solución debe ser comparable a aquella obtenida con la soluc ión 
patrón no tratada. 
8.6.3 Solución patrón 0,2 ng/ml 
Justo antes del uso diluir la solución 8.5.4 como s igue: 
10 ml a 100 ml 
10 ml a 100 ml 
2 ml a 100 ml 
10 ml a 100 ml 
10 ml a 100 ml = 0,2 ng/ml       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
8.6.4 Medio de cultivo para el ensayo 
Medio para prueba de ácido fólico. 
Preparar el volumen necesario en un matraz Erlenmey er de vidrio de 1000 ml. Proceder según las 
indicaciones de la etiqueta, calentando la solución  en una parrilla con agitación magnética. 
Cálculo del volumen necesario: 
patrón: 30 tubos 30 x 5 ml = 150 ml 
cada producto: 10 tubos 10 x 5 ml = 50 ml 
+ 50 ml a 100 ml de exceso 
8.6.5 Preparación del ensayo 
8.6.5.1 Serie patrón 
En un soporte metálico para tubos de ensaye, coloca r 3 filas de 10 tubos (180 x 18 mm), numerados bl, 
0,..., 8; el primero corresponde al blanco. 
Mediante una pipeta vertir en triplicado en las tre s series de tubos, volúmenes crecientes de la últim a 
dilución de la solución patrón, completar a 5 ml co n agua destilada y mediante una bureta o una jering a 
automática, añadir 5 ml de medio de cultivo para el  ensayo según la tabla siguiente: 
Tubo No. 
bi 0 1 2 3 4 5 6 7 8 
Sol. 
Patrón: 
0,0 0,0 0,25 0,50 0,75 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 ml 
Agua: 5 5,0 4,75 4,5 4,25 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 
Medio de 
cultivo 5 ml en cada tubo 
Los tubos del ensayo en blanco (bl) no se inoculan.  
8.6.5.2 Serie producto 
En otro soporte colocar dos filas de 10 tubos (180 x 18 mm). Los primeros cinco tubos de ambas filas v an 
destinados a un producto, los otros cinco de ambas filas, a otro producto. Numerar de 9 a 13 y de 14 a  18 y 
así sucesivamente para todos los productos analizad os. 
Mediante una pipeta verter en duplicado en ambas se ries de cinco tubos, volúmenes crecientes de la 
última dilución de la solución de la muestra, compl etar a 5 ml con agua destilada y añadir 5 ml de med io de 
cultivo para el ensayo. 
Tubo No. 9 10 11 12 13 
Sol. de la muestra: 
0,25 0,5 0,75 1,0 1,5 ml 
Agua: 4,75 4,5 4,25 4,0 3,5 
Medio de cultivo 5 ml en cada tubo 
Tapar los tubos con capuchones o mediante una tapa adecuada que cubra ambas filas de tubos en el 
soporte. 
8.6.6 Esterilización del ensayo 
Esterilizar los tubos durante 10 min a 121° C, luego  enfriarlos en un baño de agua fría. 
8.6.7 Inoculación 
8.6.7.1 Preparación y estandarización del inóculo 
Justo antes de inocular el ensayo, transvertir una cantidad suficiente del cultivo preparado bajo 8.6. 1 a un 
tubo de centrífuga estéril, centrifugar a 2600 rpm durante 5 min, decantar y resuspender el paquete ce lular en 
10 ml de solución salina. Hacer dos lavados más. Tr ansvertir a una cubeta de 1 cm y efectuar la lectur a en el 
espectrofotómetro a 575 nm. Estandarizar el cultivo  a fin de obtener siempre aproximadamente la misma 
extinción. No debe olvidarse sustraer de la extinci ón del cultivo la del medio de ensayo, que es un me dio 
coloreado. Lunes 2 de junio de 2008 DIARIO OFICIAL (Segunda Se cción)      
Según la extinción, diluir "n" gotas del cultivo (B .8.6.1) en un tubo que contenga 10 ml de medio (8.6 .4). 
Este tubo es el inóculo. 
Así pues, para una extinción del cultivo (8.6.1) en tre 0,40 y 0,60 (después de sustraer la extinción p ropia 
del medio), introducir 5 gotas de cultivo en el tub o que contiene 10 ml de medio (8.6.4). Si la extinc ión no se 
encuentra en la zona arriba mencionada, adaptar la dilución como sigue: 
- extinción inferior a 0,40: introducir proporciona lmente más gotas en el tubo (no más de 10 gotas) 
- extinción superior a 0,60: introducir menos gotas  o diluir proporcionalmente con el medio (8.6.4). 
8.6.7.2 Inoculación 
Mediante una micropipeta de punta estéril, inocular  0,1 ml del inóculo en cada tubo de las series patr ón y 
producto. Los tubos del blanco (bl) no se inoculan.  
Después de inocular, agitar los tubos ligeramente a  fin de repartir el microorganismo uniformemente en  el 
medio. 
8.6.8 Incubación 
Incubar los tubos inoculados durante aproximadament e 19 h a 35° C. Observar los tubos con regularidad a l 
cabo de las 19 h. Verificar si la diferencia de des arrollo del microorganismo es suficiente entre la p rimera y la 
última dilución de la solución patrón. 
Si es necesario, prolongar la incubación hasta que se obtenga un crecimiento óptimo del microorganismo . 
Después de la incubación se recomienda interrumpir el crecimiento del microorganismo simultáneamente 
en todos los tubos, colocándolos en un baño de agua  fría. 
8.6.9 Lecturas 
Mediante un agitador para tubos de ensaye, poner en  suspensión el depósito formado por el desarrollo d el 
microorganismo. Transvertir la suspensión a un tubo  o una cubeta óptica, según el fotómetro. Medir la 
transmitancia o absorbancia a 575 nm ajustando el 1 00% de T o a 0% de A del aparato con el blanco (bl) . 
Agitar y leer un tubo después de otro, a fin de evi tar la sedimentación del microorganismo. 
8.7 Cálculos 
8.7.1 Curva de calibración 
Trazar la curva de calibración en papel milimétrico  o mediante una calculadora con regresión lineal, 
llevando la lectura media de cada grupo de tres tub os a la ordenada y los ng de ácido fólico a la absc isa. 
*Nota: Si la determinación se hace en absorbancia buscar e l equivalente de los valores de los ejemplos, 
dados en transmitancia. 
Ejemplo: 
Tubo  ml ng Lecturas Media No. 
   1 2 3  
0 0,0 0,0 88,1 87,6 87,5 87,7 
1 0,25 0,05 78,4 78,5 79,5 78,8 
2 0,50 0,1 70,5 70,4 71,3 70,7 
3 0,75 0,15 64,1 64,6 64,6 64,4 
4 1,0 0,2 58,9 59,6 59,3 59,3 
5 1,5 0,3 50,8 51,3 51,4 51,2 
6 2,0 0,4 44,7 44,1 45,5 44,8 
7 2,5 0,5 39,7 39,7 38,2 39,2 
8 3,0 0,6 35,6 36,1 35,2 35,6       (Segunda Sección) DIARIO OFICIAL Lunes 2 de j unio de 2008 
Observaciones: 
La curva de calibración es característica de cada v itamina. Es tanto mejor cuanto mayor sea la parte q ue 
ocupa de la escala de transmisión. 
Repetir el ensayo cuando la curva de crecimiento es té mal desarrollada, esto puede deberse a la cepa o  al 
medio de cultivo para el ensayo; que deben verifica rse por separado. 
8.7.2 Contenido de vitamina en el producto 
La media de las lecturas de cada par de tubos permi te leer en la curva de calibración la cantidad de 
vitamina y calcular su concentración en la última d ilución de la muestra. 
Ejemplo: 
Tubo ml Lecturas media ng* Ng/ml N°  
  1 2    
9 0,25 80,2 79,4 79,8 0,045 0,18 
10 0,50 71,6 73,7 72,6 0,095 0,19 
11 0,75 66,1 67,7 66,9 0,135 0,18 
12 1,0 61,4 (56,5) 61,4 0,185 0,185 
13 1,5 53,7 52,1 52,9 0,280 0,187 
 ( ) = valor aberrante 
* = valores leídos en la curva de calibración 
Observación: 
Fluctuaciones pequeñas en los valores de la última columna son prueba de un buen ensayo. 
Calcular el contenido de vitamina en µg/100 g de producto, teniendo en cuenta las dilucio nes sucesivas y 
la concentración en la muestra diluida. 
El contenido de ácido fólico, expresado en µg/100 g  de producto es igual a: 
C x V 3 x V 1 x 100  
m x V 2 x 1000 
C= media de las concentraciones leídas en la curva de calibración, en ng/ml 
V1= volumen en el que se ha disuelto la toma de ens ayo, en ml 
V2= parte alícuota de V1, en ml 
V3= volumen al que se ha diluido la parte alícuota V2, en ml 
m = toma de ensayo, en g 
Ejemplo: 
1 g (m) de producto se han pesado en un matraz afor ado de 100 ml(V 1). Se ha tomado una parte alícuota 
de 10 ml (V 2), que se ha diluido en un matraz aforado de 250 ml  (V 3). 
La media de las concentraciones en ácido fólico leí das en la curva de calibración es 0,184 ng/ml (C). 
El contenido en ácido fólico es: 
0,184 x 250 x 100 x 100  = 46 µg /100 g 
   1 x 10 x 1000 
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