中华人民共和国国家标准
GB xxxx—201x
  
 
 
 
201x -xx-xx发布  201x -xx-xx实施食品安全国家标准  
食品营养强化 剂  硒蛋白  
（征求意见稿 ） 
 
GB xxxx —201x 
 食品安全国家标准  
食品营养强化剂  硒蛋白 
1  范围 
本标准适用于 以动植物 、真菌为原料，经提取、精制而成 ，富含有机硒的 蛋白质。（其中有机硒中
的硒是以硒代半胱氨酸 、硒代蛋氨酸 的形式存在 ） 。 
 
2  定义 
本标准硒蛋白是 动物中硒以硒代半胱氨酸 或植物、真菌中硒以硒代蛋氨酸为主要形式存在 的蛋白
质。 
 
3  技术要求  
3.1  感官要求 ：应符合表 1 的规定。 
 
表1  感官要求  
          项    目 要    求           检验方法  
色泽 白色略带浅 黄色或浅棕色 取适量试样 ，置于洁净 、干燥的
器皿中，于自然光线下采用目测 、
鼻嗅的方法观察其色泽及外观形
态，嗅其气味 。 气味 具有硒化合物 特有的气味  
组织状态  粉末状 
 
3.2  理化指标 ：应符合表 2 的规定。 
 
表2  理化指标  
项    目 指  标 检验方法  
蛋白硒含量(以Se计)/(mg/kg)          1000～2500 附录A中A5 
蛋白质含量 /%                          40～80 GB 5009.5  凯氏定氮法  
水分/%                               ≤ 5 GB 5009.3  直接干燥法  
灰分/%                               ≤ 5 GB 5009.4  
砷(以As计)/(mg/kg)                   ≤ 2 GB/T 5009.11  氢化物原子荧光法  
铅(以Pb计)/(mg/kg)                   ≤ 2 GB 5009.12  石墨炉原子吸收光谱
法 
汞(以Hg计)/(mg/kg)                   ≤ 0.01 GB/T 5009.17 原子荧光光谱分析
法 
镉(以Cd计)/(mg/kg)                   ≤ 0.01 GB/T 5009.15  石墨炉原子吸收光
谱法  
 
 GB xxxx —201x 
  
 
3.3微生物指标 ：应符合表 3的规定。 
 
表3  微生物指标 
致病菌 采样方案及限量 （若非指定 ，均以/25g或/25ml表示） 
检验方法  n c m M 
沙门氏菌  8 0 0 - GB 4789.4  
金黄色葡萄球
菌 8 0 0 - GB 4789.10  
 GB xxxx —201x 
 附录A 
检验方法  
 
A.1  安全提示 
本检验方法中使用的部分试剂具有毒性和腐蚀性 ，操作时须小心谨慎 。如溅到皮肤上应立即用水冲
洗，严重者应立即治疗 。使用易燃品时 ，严禁使用明火加热 。 
 
A.2  一般规定  
除另有说明外 ，所用试剂均为分析纯 试剂，检验用水符合 GB/T 6682 —2008 中规定的水 。检验中所
用标准滴定溶液 、杂质测定用标准溶液 、制剂及制品 ，在没有注明其他要求时 ，均按GB/T 601、GB/T 602
和GB/T 603 的规定制备 。本标准所用溶液在未注明用何种溶剂配制时 ，均指水溶液 。 
 
A.3  原理 
样品经酶解前期处理后 ，导入高效液相色谱 -电感耦合等离子体质谱中 ，利用离子交换色谱 法分离，
电感耦合等离子体质谱检测 ，保留时间定性 ，外标法定量 。 
 
A.4  鉴别试验  
A.4.1  高效液相色谱定性鉴别试验  
在硒代半胱氨酸 (SeCys)和硒代蛋氨酸 (SeMet)含量试验的色谱操作条件下 ，试样溶液与标准溶
液硒代半胱氨酸 (SeCys)和硒代蛋氨酸 (SeMet)的色谱峰的保留时间相对差值不超过 2%。硒代半胱氨酸
(SeCys)和硒代蛋氨酸 (SeMet)标准溶液的参考色谱 示意图见附录 B图B.1。 
 
A.5  硒蛋白中硒代半胱氨酸 、硒代蛋氨酸 含量(以Se计)的测定 
A.5.1  试剂和材料  
A.5.1.1  硒代半胱氨酸(SeCys)标准品。 
A.5.1.2  硒代蛋氨酸 (SeMet)标准品。 
A.5.1.3  硒代半胱氨酸(SeCys)标准溶液(1000μg/L )：准确称取 21mg(精确至0.1mg) 硒代半胱氨酸
(SeCys) 标准品（A.5.1.1）于10mL容量瓶中 ，加纯水稀释至刻度 ，摇匀，得到1000μg/ mL的标准储GB xxxx —201x 
 备液，稀释1000倍后得到 1000μg/L 的标准使用液 。进样前采用 0.2μm微孔膜过滤 。 
A.5.1.4  硒代蛋氨酸 (SeMet)标准溶液 (1000μg/L )：准确称取 24mg(精确至0.1mg) 硒代蛋氨酸
(SeCys) 标准品（A.5.1.2）于10ml容量瓶中 ，加纯水稀释至刻度 ，摇匀，得到1000μg/ mL的标准储
备液，稀释1000倍后得到 1000μg/L 的标准使用液 。进样前采用 0.2μm微孔膜过滤 。 
A.5.1.5  胰蛋白酶 （Trypsin）。 
A.5.1.6  蛋白酶K （Proteinase K ）。 
A.5.1.7  链霉蛋白酶 （Pronase）。 
A.5.1.8  流动相 
A.5.1.8.1  柠檬酸铵 （AR）。 
A.5.1.8.2  甲醇（色谱级）。 
A.5.1.8.3  柠檬酸（AR）。 
A.5.1.8.4  氨水（AR，25%～28%）。 
A.5.1.8.5   5 mmol/L 柠檬酸铵 +2%甲醇：准确称取 1.2114g柠檬酸铵 (A.5.1.8.1) 于1000mL容量瓶，
加入20ml甲醇（A.5.1.8.2 ）使其溶解 ，用纯水稀释至刻度 ，摇匀。 
A.5.1.8.6  运用柠檬酸（A.5.1.8.3）和氨水（A.5.1.8.4）精准调节 5mM柠檬酸铵 +2%甲醇pH至4.9。
临用前，过0.45μm滤膜。 
A.5.1.9  5%硝酸溶液 ：取5mlHNO3于100mL容量瓶，用纯水稀释至刻度 ，摇匀。 
A.5.1.10  滤膜：0.45μm，有机相。 
A.5.1.11  0.1mmol/LTris ：准确称取 12.16g三(羟甲基)氨基甲烷 于烧杯中 ，加入适量纯水使其溶解 ，
并转移至 1000mL容量瓶中 ，用纯水稀释至刻度 ，摇匀。 
A.5.1.12  0.1mmol/LHCL ：取9mLHCL于1000mL容量瓶中 ，加入适量纯水使溶解 ，并稀释至刻度 ，摇
匀。 
A.5.1.13  Tris-HCL（pH7.2）：取50mL0.1mmol/LTris (A.5.1.11 )和44.7ml0.1mmol/LHCL (A.5.1.12)
于100mL容量瓶中 ，加入纯水 ，并稀释至刻度 ，摇匀。 
A.5.1.14  超滤离心管 (3KDa)。 
A.5.1.15  高纯度氩气 (纯度> 99.99%)。 
A.5.1.16  高纯度氢气 (纯度> 99.99%)。 
A.5.1.17  标准工作溶液的配制  GB xxxx —201x 
 分别取0.2mL、0.4mL、0.6mL、1mL、2mL硒代半胱氨酸 (SeCys)标准溶液 (A.5.1.3)及硒代蛋氨酸
(SeMet)标准溶液 (A.5.1.4)于5个10 mL容量瓶中 ，用纯水稀释至刻度 ，摇匀。标准工作 溶液的浓度
分别为20ng/mL、40 ng/mL、60 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL制成标准工作曲线 。 
A.5.2  仪器和设备  
A.5.2.1  分析天平，感量0.1 mg。 
A.5.2.2  超声清洗器 。 
A.5.2.3  恒温水浴震荡仪 。 
A.5.2.4  离心机：配有50mL与10mL离心管适配器 ，最大转速 10 000r/min 。 
A.5.2.5  高效液相色谱 (HPLC)。 
A.5.2.6  电感耦合等离子体质谱 (ICP/MS)。 
A.5.3 定量分析  
A.5.3.1 试液的制备 
A.5.3.1.1样品溶液的制备  
称取经制备均匀的样品约 0.1g(精确至0.1mg)置于2ml的塑料具塞离心管中 ，加入1ml5%的硝酸
溶液（A.5.1.9） ，立即盖紧盖子剧烈振摇后 ，在恒温水浴震荡仪 上震摇15s后，以12000r/min 离心
5min，去除上清液 ，用纯水洗涤两次后保留沉淀物质 ，备用。 
将沉淀物质至于 250ml三角瓶中 ，加入30mlTris-HCL(0.5mmol·L-1／pH7.2)（A.5.1.13 ），超声5 min；
每隔12 h依次加入 15 mg胰蛋白酶 （A.5.1.5）、10 mg蛋白酶K（A.5.1.6）及15 mg链霉蛋白酶 （A.5.1.7），
在37℃下振荡酶解 (摇速为100～120 r／min)共36 h。，酶解后，以4000 r／min离心l0 min；上清液用
截留分子量为 3 kDa的超滤管 （A.5.1.14）离心除去蛋白酶及大分子物质 ，0.45μm的滤膜（A.5.1.10）
过滤，备用。 
A.5.3.1.2 空白溶液的制备  
除不加试样外按 （A.5.3.1.1）所述方法进行处理 。 
A.5.3.1.3 标准工作溶液处理  
分别准确吸取 （A.5.1.17）中系列标准工作溶液 2 mL于10 mL带盖离心管中 ，以下按（A.5.3.1.1）
自“加入30mLTris-HCL(0.5mmol·L-1／pH7.2)（A.5.1.13 ）……0.45μm的滤膜（A.5.3.1.10）过滤，
备用。”操作。 
A.5.3.2  测定 
A.5.3.2.1  液相色谱 (HPLC)条件 GB xxxx —201x 
 a)色谱柱：阴离子交换色谱柱 （长250mm，内径4.1mm，粒径10μm）或相当，推荐使用 Hamilton 
PRP-Xl00(250 mm ×4 mm)分析柱或预柱 。 
b)柱温：室温。 
c)载气：氩气（A.5.1.15）。 
d)流动相：流动相为  5 mmol/L  柠檬酸铵溶液 +2%(V/V) 甲醇，精准调节pH至4.9。 
e)流速：1mL/min。 
f)进样量：100μL。 
A.5.3.2.2  电感耦合等离子体质谱 (ICP/MS)参考条件  
ICP/MS参考条件  
参数选项  参数值  
质荷比 /m/z 78 
射频功率 /ICP RF Power  1400 W 
等离子气流速 /Plasma Gas Flow  18.0 L·min-1 
雾化器流速 /Nebulizer Gas Flow  0.98 L·min-1 
辅助气流速 /Auxiliaxy  Gas Flow  1.8 L·min-1 
碰撞气流速 /CRI Skimmer Gas Flow(H 2) 60 ml·min-1 
 
A.5.3.2.3 标准曲线的绘制  
按(A.5.3.2.1)和（A.5.3.2.2 ）所列测定条件 ，将酶解后的标准工作溶液依次进样 ，测量硒代半胱
氨酸(SeCys)和 硒代蛋氨酸 (SeMet)的峰面积 。硒代半胱氨酸(SeCys)和硒代蛋氨酸 (SeMet)的浓度成正
比。以标准工作溶液中 硒代半胱氨酸(SeCys)和硒代蛋氨酸 (SeMet)的浓度（mg/mL）为横坐标 ，以硒代
半胱氨酸(SeCys)和硒代蛋氨酸 (SeMet)的峰面积比为纵坐标 ，绘制标准曲线 。 
按公式（A.1）计算回归参数 ： 
y = a x＋b…………………………… （A.1） 
式中： 
y——硒代半胱氨酸(SeCys)或硒代蛋氨酸 (SeMet)的峰面积 ； 
a——回归曲线的斜率 ； 
x——标准工作溶液中 硒代半胱氨酸(SeCys)或硒代蛋氨酸 (SeMet)的浓度，单位为纳 克每毫升
(ng/mL)； 
b——回归曲线的截距 。 
A.5.3.2.4 试液的测定  
将空白溶液 （A.5.3.1.2）和试样溶液 （A.5.3.1.1）依次进样 ，扣除空白值，获得硒代半胱氨酸GB xxxx —201x 
 (SeCys)/硒代蛋氨酸 (SeMet)的峰面积 。 
A.5.3.2.5.结果计算  
                  ) ........( .......... ..........1000mV C-CX2X 0
 
式中： 
X—试样中硒的含量 ，单位为毫 克每千克 （mg/kg） ； 
C0—标准曲线计算得到上机试样中目标物 浓度，单位为纳克每毫升 （ng/mL） ； 
V—加入Tris-HCL的体积，单位为毫升 （mL）； 
CX—空白式样 中硒代半胱氨酸 (SeCys)或硒代蛋氨酸 (SeMet)的测定浓度单位为纳克每毫升
（ng/mL）； 
m—试样质量 ，单位为克 （g） 。 
根据上式可直接计算出 硒代半胱氨 酸、硒代蛋氨酸含量 。 
A.5.3.2.6 重复性 
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 GB xxxx —201x 
 附  录  B 
硒蛋白两 种标准样品色谱图  
 
按上述色谱 、质谱条件下 ，SeCys 2、SeCys、Se(Ⅳ)、SeMet 、Se(Ⅵ)的保留时间分别为 2.3min， 
3.0min，3.7min，5.0min, 9.7min 。 
图B.1：硒蛋白两种标准品  SeCys 2 SeCys  
Se(Ⅳ) 
SeMet  Se(Ⅵ)